UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU
N° d'Ordre
FACULTE DES SCIENCES
ET TECHNI,QUES
LABORATOIRE
DE BIOTECHNOLOGIE
ET DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE
1t(f}NSEll ~mICAÎ~ EV MALGAC:HE i
, POUR l'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR'
MEMOIRE
j; C. A. M. le. S. -
QV~UGOU
Arrivée .. 0.9. JAl\\\\.. '\\J~.4
:
Présenté par
\\)_Enre~istré sous n° .10) {),·2~·'1 ~ 2. $ :
Idrissa SANOU
Docteur ,en Pharmacie
Pour obtenir le
DIPLOME D'ETUD'ES AP'PROFONDIES (D.,E.A)
EN SCIENCES BIOLOGIQUES APPUQUEES
OPTION: BIO;CHIMIE ET MICROBIO~OGIE APPLIQUEES
Sur le ThèlDe :
CONTRIBUTION A LA RECHERCHE D'ANTIBIOTIQUES
A PARTIR DES CHAMPIGNONS OU BURKINA FA,SO
"Recherche de microorganismes producteurs d'antibiotiqueU
Devant le Jury :
Président: Robert B. SOUDRE Professeur
Examinateurs: Pi,erre 1. GUISSOU
Maitre de Conférences Agrégé
Alf~ed S. TRAORE
Professeur
Juillet 1994

---

CONTRIBUTION A LA RECHERCHE D'ANTIBIOTIQUES A PARTIR DES
CHAMPIGNONS DU BURKINA FASO
IIRecherche de microorganismes producteurs d'antibiotiquell

---

DEDICACES
•
,

---

Il
JE DEDIE CE TRAVAIL
A DIEU LE TOUT PUISSANT
- A MON GRAND-PERE
- A MA GRAND-MERE
- A MON PERE in memorium
-AMAMERE
- A MES FRERES ET SOEURS
•
- A MES ONCLES ET TANTES
- A MES NEUVEUX ET NIECES
- A MES COUSINS ET COUSINES
- A MES AMIS ET AMIES
- A TOUS MES COLLABORATEURS
- A TOUS CEUX QUI SOUFFRENT ET QUI ESPERENT
- AU BURKINA FASO

---

'1
III
,
1
A NOS MAITRES
ET
..
JUGES

---

IV
A NOTRE MAITRE ET PRESIDENT DU JURY
LE PROFESSEUR ROBERT B. SOUDRE
C'est un grand honneur pour nous, de vous voir
présider ce jury de mémoire de D.E.A. malgré vos
multiples occupations dont nous avons pu nous rendre
compte chaque fois que nous avons émis le désir de
vous rencontrer.
•
Votre exigence dans le travail, fait de vous un
exemple que nous essayerons de suivre.
Permettez
nous
de
vous
exprimer
ici,
l'expression de nos sentiments très distingués et de
nos remerciements très sincères.
•

---

v
A NOTRE MAITRE ET JUGE
LE PROFESSEUR AGREGE PIERRE 1. GUISSOU
Nous sommes très sensibles à l'honneur que
vous nous faites en acceptant de juger notre travail.
Nous avons toujours apprécié votre compétence
professionnelle, ainsi que vos qualités humaines.
Votre présence en tant que pharmacologue dans
li
ce jury donnera à ce travail une autre dimension.
Nous vous prions de trouver ici le témoignage de
notre reconnaissance et respectueuse estime.

---

VI
•
A NOTRE MAITRE ET DIRECTEUR DE MEMOIRE
LE PROFESSEUR ALFRED S. TRAORE
Vous constituez pour nous une reférence en
matière de compétence scientifique.
Vos multiples occupations ne nous ont pas
permis de vous rencontrer aussi souvent que nous
l'aurions souhaité. Mais chaque fois que nous avons eu
l'occasion de vous approcher, nous avons été frappés
par la clarté et la haute maîtrise de votre enseignement,
la logique et la rigueur de votre raisonnement qui font
de vous un enseignant de qualité.
Trouvez en ce travail, les efforts d'un élève
voulant être un motif de satisfaction pour son maître.

---

•
INTRODUCTION:
BUT DU TRAVAIL

---

2
...
La découverte des
antibiotiques constitue à
coup
sûr un
des plus grands progrès dans le domaine de la santé.
En effet,
grâce
aux
antibiotiques,
on
a
pu
soigner
de
nombreuses
maladies
infectieuses
dont
la
plupart
connaissait
une
issue
irrémédiablement
fatale
c'était
le
cas
entre
autres
de
la
peste, du choléra, de la tuberculose et des méningites.
Mais si la découverte des premiers agents antibactériens
au
lendemain de
la
deuxième
guerre
mondiale avait
suscité
le
grand
espoir
de
voir
les
maladies
infectieuses
à
jamais
jugulées.
Malheureusement,
leur
introduction
en
médécine
humaine
fut
rapidement
sui vie
par
l' appari tion
de
bactéries
devenues résistantes.
Cela ajouté au fait que les antibiotiques sont absolument
indispensables
pour
le
traitement
de
la
quasitotalité
des
maladies
infectieuses
amènent
la
plupart
des
industries
pharmaceutiques
à
orienter
leurs
recherches
vers
deux
axes
principaux :
- recherche de nouveaux médicaments
- contrôle des phénomènes de résistance des bactéries aux
antibiotiques.
Au Burkina,
les
antibiotiques
représentent environ
40
%
des sorties de médicaments au niveau des officines (42).
En regard du faible pouvoir d'achat des populations,
nous
estimons
qu'il
est
grand
temps
pour
que
soient
initiés
au
niveau
national
des
projets
allant
dans
le
sens
d'un
allègement de la prise en charge des malades.
Dans cette optique,
certaines plantes du Burkina ont déjà
fait l'objet de thès~s et de mémoires.

---

3
Dans ce travail,
nous
nous proposons de nous
intéresser
aux
substances
antibactériennes
excrétées
par
certains
champignons du Burkina.
Ce travail doit porter naturellement sur plusieurs années
si nous voulons parvenir à
la détermination des propriétés et
des
structures
des
molecules
contenues
dans
les
substances
excrétées.
Au
cours
du
DEA,
nous
allons
tenter
d'effectuer
un
premier travail de prospection qui doit nous permettre au file
du temps de parfaire notre technique d'échantillonnage.
Il s'agira donc d'un essai qui va nous permettre dans un
premier temps d'isoler et de tester des souches de champignons
à
partir d'échantillons
de
terre
dans
le
but de sélectionner
quelques
unes
qui
seront
étudiées
pour
les
besoins
de
notre
mémoire.
Notre travail consistera donc à
:
- prélever des échantillon de terre
-
isoler des champignons
- étudier ceux qui sécrètent des substances
antibactériennes in vivo.
Cette étude sera menée en fonction des moyens dont nous
disposons
en
temps
et
en
matériels.
Il
est
donc
évident
que
nous ne pourrons étudier que quelques aspects.

---

4
CHAPITRE 1:
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE

---

8
Selon leur structure,
on distingue
-
les hétérosides qui possèdent une partie osidique et une
partie non osidique appelée genine pouvant être azotée ou
non.
.génine azotée
Ex.
Aminosides produits par Streptomyces griseus
.genine non azotée
Ex.
Macrolides produits par Streptomyces erythreus
Streptomyces antibioticus
Streptomyces ambofaciens
-
les Tétracyclines produits par Streptomyces aureofaciens
-
les antibiotiques à structures diverses tels que
.chloramphenicol produit par Streptomyces venezualae
.rifamycine produit par Streptomyces mediterranei.
c) Les antibiotiques produits par les champignons
Deux
genres
de
champignons
ont
été
particulièrement
étudiés pour la production des antibiotiques :
* Les Penicellium pour la production de penicillines
Ex.
- Penicillium notatum
-
Penicillium chrysogenum
- Penicillium griseofulvum
* Les ceph?losporium
Ex.
Cephalosporium acremorium

---

9
4) Structure chimique des antibiotiques naturels
(voir les autres structures en annexe)
a)
Famille des B Lactamines
Leur
structure
de
base
est
constituée
d'acide
6
aminopenicilliqu~
pour
les
periicillines
et
d'acide - 7
amino
cephalosporamique pour l~s cephalosporines.
Ces deux molécules
ayant en commun le cycle B Lactame.
s
CJ\\:,
R-c.-NHn~c.u
S
R-fto-tÜ\\I1"
\\1
n3
LR'
o
'/
N
," C.OOH
o
N---(
o
COOH
Acide 6 Aminopenicillique
Acide 7 Aminocephalosporanique
En fonction du radical R,
on aura
- pour les penicillines
groupe de la pénicilline G
V-CH2
benzyl
penicilline
· groupe de la phenoxypenicilline
00 - CH2 _. phenoxy
penicilline
· groupe de la Methicilline
E H3 : ° Methyl
~ 1.
penicilline
__
OCH3
.groupe de l'Ampicilline
Amino benzyl
penicilline
· groupe de la Carbenicilline
_ -Carboxy
penicilline

---

10
- pour les cephalosporines
. les cephalosporines de pre~ière génération (ex cefalotine ou
keflin)
les cephalosporines de deuxième génération
(ex Cefoxitine ou
Mexofin)
les cephalosporine de troisième génération
(ex Cefotaxime ou
Claforan)
b)
Famille des aminosides ou oligosaccharides ou
aminoglucosides
-
1.
groupe de la streptomycine
Streptomycine
Dehydrostreptomycine
-
2. groupe de la Desoxystreptamine
.sous groupe de la Neomycine
Neomycine
Frarnycetine
. sous groupe de la kanamycine
kanamycine
Tobramycine
Amikacine
Dibekacine
. sous groupe de la gentamycine
Gentarnicine
Sisornicine
Netilmicine
-
3. groupe de la spectinomycine

---

11
r
c)
Famille du chloramphenicol
92
CH]
o = S = 0
H o
H -
C - OH
C
OH
1
1
H -
C - NB -
C - CHCL2
H -
C -
NH - C -
CHCL2
-~H20H
1
0
0
CH20H
Chloramphenicol
Thiamphenicol
d)
Famille des Tétracyclines
OH
OH
OH
o
OH
OH
o
. Tetracyclines
oxytetracycline
chlortetracycline
. Desoxycycline
Doxycycline
. Minocycline
Minocine
e)
Famille des Macrolides et apparentés
.Macrolides vraies
Erythromycine
oleandomy~ine (TAO)
Spiramycine
(Rovamycine)
_
..
-_0_-
_
------ ._-- -._._------. J
. - - - - - ~ - - - - - _ _
~
_. Groupe des Lincosamines : Li,ncomycine
(Lincocine)
Clihdamycine
(Dalacine)
.Groupe des synergistines
Pristinamyci.ne
-Virginiamycine
(Staphy lomycine)

---

12
f)
Famille des polypeptides
.Polymyxine B
.Polymyxine E (colistine)
g)
Famille des Rifamycines
.Rifamycine
.Rifampicine
h)
Autres familles
sulfamides
1
Quinolones
Imidazoles
Ces
derniers
antibiotiques
ne
sont
pas
d'origine
naturelle .
..

---

13
..
Il . PRODUCTION DES ANTIBIOTIQUES
La
majorité
des
antibiotiques
naturels
utilisés
actuellement
en
thérapeutique
sont
produits
par
des
végétaux
inférieurs tels que les bactéries et les champignons.
1) Isolement des microorganismes producteurs
La
méthodolog ie
générale
s'adresse
aussi
bien
aux
bactéries
qu'aux
champignons.
Ainsi
pour
les
champignons,
on
part
d'un
sol
riche
en
matières
organiques
dont
les
échantillons
seront
déposés
sur
un
milieu
solide
gelosé
favorable
au
développement
de
ces
microorganismes
et
mis
en
culture
dans
des
conditions
bien
définies
de
température,
de
pH et d'humidité.
Les colonies qui se développent sur ces surfaces gelosée
sont
séparées
par
repiquage
successifs
pour
aboutir
à
une
souche
la
plus
pure
possible
et
présentant
les
meilleures
quali tés de
production d'antibiotique
tant
sur
le
plan
de
la
qualité que sur celui de la quantité.
2) Recherche d'une activité antibactérienne
La recherche de l'activité antibactérienne se fait selon
une méthode standardisée dite "Méthode des stries".
Pour cela,
on
réalise
un
ensemencement du
microorganisme
dans
une
boîte
de pétri contenant un milieu gelosé de 4 mm d'épaisseur
selon
une ligne perpendiculaire.
Le développement se
fera
à
l'étuve
pendant
5
à
6
jours
à
température
variable
en
fonction
du
microorganisme étudié
(40).
25° C pour les champignons
35° C pour les actinomycetales
37° C pour les bactéries
Pendant
le
développement,
l'antibiotique
diffusera
dans
le milieu
gelosé.
Puis
on
ensemence
les
bactéries
pathogènes
perpendiculairement
aux microorganismes.
Enfin
on
appréciera

---

14
les
zones
d'inhibition
qui
correspondent
à
l'absence
de
croissance des bactéries sensibles à
l'antibiotique après 18 à
24 heures d'incubation à 37° C
(16,17).
La
recherche
de
l'activité
antibactérienne
peut
être
également
effectuée
par
la
méthode
des
disques
pour
les
microorganismes
à
croissance
rapide
(24
à
48
heures).
Pour
cela, les
bactéries
sont
ensemencées
par
inondation
sur
une
surface
gelosée
de
telle
sorte
qu'on
puisse
obtenir
des
colonies
ni
trop
séparées,
ni
confluentes.
Puis
on
ensemence
les
microorganismes
par
piqûre
et
on
observe
les
diamètres
d'inhibition au bout de 24 à 48 heures
(8).
Il
est
également
possible
d'étudier
l'activité
antibactérienne
d'une
substance
par
la
méthode
de
dilution.
.
Différentes
concentrations
de
la
substance
étant
incorporées
dans
le
milieu
gelosé,
on
ensemence
les
bactéries
par
i
inondation
ou
par
stries
et
si
aucune
colonie
ne
s'y
développe,
on
pourra
conclure
que
la
gelose
renfermait
une
substance antibactérienne (8,24).
Il
faut
noter
que
le
milieu
usuel
le
plus
couramment
utilisé est
le milieu de Müller
Hinton
(MH)
de
4 millimètres
d'épaisseur
dans
une
boîte
de
pétri.
A
défaut,
on
peut
utiliser la gelose nutritive à la place du MH.
3) Amélioration des souches
Pour
obtenir
des
souches
à
très
haut
rendement
en
antibiotique,
il
s'avère
nécessaire
d'opérer
une
sélection
naturelle par modification

---

15
- soit des facteurs intrinsèques :
* composition du milieu (teneur en glucides, lipides,
protéines)
* teneur en eau du milieu
* pH du milieu
* potentiel d'oxydo réduction du milieu
- soit des facteurs extrinsèques
* température d'incubation
* humidité relative de l'environnement
* inhibiteurs
* radiations (UV, rayon X )
* produits chimiques (moutarde à l'azote)
4) Conservation des souches
La
conservation des souches peut se
faire
par repiquage
sur
milieu
approprié
de
conservation.
I l
existe
des
milieux
spécifiques
de
conservation
pour
chaque
espèce
de
microorganisme.
Mais pour éviter les phénomènes de
mutation qui
peuvent
se
traduire
par
une
perte
de
certaines
propr iétés
dont
les
propr iétés
antibactér iennes,
il
sera
souha i table
de
conserver
les
souches
sélectionnées
par
lyophilisation.
Le
stockage
se
fera dans des ampoules scellées et à basse température (24).
5) Production industrielle des antibiotiques
La
production
industrielle des
antibiotiques
fait
appel
aux
techniques
de
fermentation.
Elle
se
déroule
en
trois
étapes (31).
a)
Préparation de l'inoculurn
Les
souches
améliorées et
conservées
par
lyophilisation
sont ensemencées
sur milieu nutritif solide puis repiquées en
milieu
liquide
stérile
additionné
d'éléments
nutritifs
du
genre :

---

16
protéines
en
général,
on
utilise
des
résidus
industriels tels que farine de soja,
farine de poisson, ou
tourteaux d'arachide.
glucides
composée
de
mélasse
tel
que
le
jus
de
trempage du maïs ou "Corn steep"
- sels minéraux et des oligo éléments.
La
culture
est
réalisée
en
milieu
aérobie
et
est
homogenisée
par
agitation
continue
à
température
et
à
pH
constants en présence d'une substance antimousse.
b)
Culture industrielle proprement dite
Elle est réalisée soit en surface dans de grands flacons
soit le plus souvent en profondeur.
,
On utilisera alors des
fermenteurs de 100 à
200 m3
dans
lesquels
l' inj ection
de
l' inoculum
doit
se
faire
de
manière
stérile et le plus souvent,
on additionne des précurseurs des
antibiotiques qu'on veut préparer.
On procède périodiquement à
un contrôle de la production
d'antibiotique
ce
qui
permet
de
déterminer
le
temps
correspondant
à
une
fabrication
optimale
d'antibiotique
qui
varie de quelques
heures
pour
les
bactéries
à
quelques
jours
pour les champignons.
c)
Isolement des antibiotiques
Les antibiotiques
produits
seront extraits du
milieu de
culture
après
filtration
de
ce
dernier
pour
éliminer
les
microorgani smes-paras i tes
par· l'une
des
deux
grandes
méthodes
d'extraction:

---

17
.'
- Extraction liquide -
liquide
On opère à l'aide d'un solvant peu missible à l'eau et à
pH convenable.
On utilise des extracteurs centrifugeuses et on
purifie après concentration des phases organiques.
- Extraction sur résine échangeuse d'ions
On
utilisera
soit
des
résines
anioniques
pour
les
antibiotiques
à
caractère
acide
soit
des
résines
cationiques
pour les antibiotiques à caractères basiques.
Après
fixation
de
l'antibiotique
sur
la
résine,
on
le
déplace
par
une
solution
alcaline
pour
les
antibiotiques
,.
acides et une solution acide pour les antibiotiques basiques.
La
purification
sera
réalisée
par
précipitation
ou
par
cristallisation grâce aux différents solvants.
III : ESSAIS DES ANTIBIOTIQUES
Après
obtention
d'un
antibiotique
à
l'état
pur,
on
doitprocéder à des essais :
- Essais physico-chimiques
les essais portent généralement sur la détermination de la
température de fusion,
du pouvoir rotatoire et des dosages
calorimétrique.
- Essais biologiques
. Sur
les
animaux,
on
peut
déterminer
les
doses
lethales
(OL50; OLlOO • . . ) ,
la
durée
d'action,
les
effets
1
secondaires . . . .
. Sur
les
bactéries,
on
peut
déterminer
le
pouvoir
bactéricide
ou
bactériostatique
vis-à-vis
d'un
germe

---

18
donné.
Cette
étude
est
réalisée
in
vitro
selon
deux
méthodes.
1)
Méthode de diffusion sur milieu solide
(HEATLEY)
Elle
consiste
à
ensemencer
le
germe
sur
un
milieu
nutritif gelosé contenu dans une boîte de pétri et à déposer à
la surface de ce milieu de petits disques de papiers imprégnés
de la solution d'antibiotique à concentrations connues (8,24).
Le
tout
est
porté
à
l'étuve
à
37°
C pendant
18
à
24
heures.
Puis
on
apprécie
le diamètre
d' inhibi tion
autour
des
disques
de
papier.
On
remarque
que
cette
zone
est
proportionnelle à
la quantité d'antibiotique contenue dans
le
disque de papier.
2)
Méthode de dilution en milieu liquide
,
Elle se pratique dans des tubes à
essai
contenant
des
solutions
d'antibiotiques
a
concentrations
var iables
par
exemple
de
10- 1
à
10- 2 0g
On
apporte
une
même
quanti té
d'une
suspension
de
microorganismes
pathogènes
vis-à-vis
duquel
l'antibiotique est actif dans chaque tube.
Après
18
à
24
heures
d'incubation,
on
détermine
l'activité
antibactérienne
en
mesurant
par
turbidimétrie
la
diminution
de
l ' opaci té
correspondant
à
l' inhibi tion
plus
ou
moins
importante
de
la
croissance
du
germe.
Ainsi
on
pourra
déterminer
la
concentration
minimale
inhibitrice
(CMI)
qui
correspond
à
la
plus
petite
concentration
d'antibiotiques
capable d'empêcher la croissance de 100% de germes .
De plus on pourra dire si
l'antibiotique est bactéricide
DU
bactériostatique.
Dans le cas d'un antibiotique bactéricide,
la quantité de
germe
obtenue
après
incubation
est
inférieure
à
celui
de
J
l'inoculum
de
départ
alors
que
pour
un
antibiotique
bactériostatique,
cette
quantité
est
supérieure
à
celui
de
départ
mais
inférieure
à
celui
d'un
tube
témoin
sans
antibiotique (8,24).

---

19
IV: MECANISME D'ACTION DES ANTIBIOTIQUES
Les
antibiotiques
peuvent
agir
sur
différents
sites
au
niveau de la bactérie.
- Action sur la paroi
B Lactamines
-
Fosfomycine
- Vancomycine
Cette action se manifeste uniquement sur les bactéries en
croissance
car
elle
porte
essentiellement
sur
la
synthèse
du
peptidoglycane.
-
Action sur la membrane cytoplasmique
-
Polymyxines
- Gramicidine
- Tyrocydine
Ces
antibiotiques
agissent
comme
des
détergents
cationiques
qui
vont
altérer
la
couche
lipophile
de
la
membrane cellulaire en modifiant sa perméabilité.
-
Action sur la synthèse des protéines
- Aminosides
- Macrolides
- Tetracyclines
- Chloramphenicol
Ces
antibiotiques
entraînent
une
erreur
de
lecture
au
moment
de
l' appariément
des
bases
en
se
fixant
soit
sur
le
ribosome soit sur l'ARNt-
Les antibiotiques peuvent également agir par :
-
inhibition des acides nucléiques : - Nitrofurane
- -fnhibi tion de la synthèse des folates- -:
- -sulfamides
-
Cotrimoxazole

---

20
- inhibition de la synthèse de l'acide mycolique :
- Isoniazide
(INH)
- Pyrazinamide
Les
phénomènes
de
résistance
aux
antibiotiques
observés
chez les bactéries sont de deux ordres :
Une
résistance
chromosomique
qui
survient
par
mutation
qui
est
un
phénomène
rare,
brutal
discontinu, stable mais non absolument irréversible.
- Une résistance extrachromosomique ou plasmidique
est un phénomène qui se fait par l'intermédiaire des
plasmides qui sont des fragments d'ADN circulaires,
bicatenaires,
extrachromosomiques, portant des gènes
de résistance aux antibiotiques.

---

21
V : GENERALITE SUR LES CHAMPIGNONS
1)
Définition
Les
champignons
levuriformes
sont
des
protistes
eucaryotes
qui
sont
dépourvus
de
chlorophylle.
Ce
sont
des
hétérotrophes saprophytes ou parasites essentiellement classés
dans trois familles de l'embranchement des thallophytes (20)
.Les Endomycetaceae caractérisées par leur aptitude à
former dans certaines conditions des ascospores .
. Les sporobolomycetaceae qui peuvent donner des
spores externes à l'extrémité des sterigmates .
. Les cryptococcaceae qui ne forment jamais de spores.
~
,
Les
moisissures
sont
des
champignons
inférieurs
caractérisés
par
la
formation
d'un
réseau
mycelien
porteur
d'éléments
aériens
(stipes)
et
de
conidies
(improprement
appelés
spores)
capables
de
perpétrer
l'espèce.
Parmi
les
moisissures, on distingue entre autres
(20)
-
les phycomycetes
-
les fungi
imperfecti
(champignons imparfaits).
\\
,

---

22
2)
Classification
Cellules vivantes
-Procaryotes
Eucaryotes
Thallophytes
Mycomycophytes
Phyc6mycophytes
Mycophytes
Phycophytes
(champignons)
(algues)
.
Chapignons inférieurs
Champignons supérieurs
,-
-,
Myxomycetes
~
Archimycetes
Siphomycetes
Septomycetes
Phycomycetes
Ascomycetes
oomycetes
Basidiomycetes
Zygomycetes
Adelomycetes
moisissures.

---

23
2.1.
Les levures
-
Famille des Endomycetaceae
.Sous famille des Endomycetoideae
- genre schizosaccharomyces. Ex.
S.
pombe
.Sous famille des saccharomycetoideae :
- genre saccharomyces ex.
-
S.
cerevisiae
- S.
carlsbergensis
- genre pichia,
ex.
p. membranaefaciens
- genre Hansenula ex.
H.
anomala
-
Famille des sporobolomycetaceae
Peu répandue :donne des phénomènes de miroir
-
Famille des crytococcaceae
.Sous famille des cryptococcoïdeae
- genre Brettanomyces ex.
-
B.
Lambicus
-
B.
Bruxellensis
- genre Candida ex.
-
C.
albicans
-
C.
tropicalis
- genre Kloeckera ex.
K.
apiculata
- genre Torulopsis ex. T.
sake
.Sous famille des Rhodotoruloïdeae
A
- genre Rhodotorula.

---

24
2.2.
Les moisissures
2.2.1.
Les Fungi Imperfecti
(BARNETT HL)
- Phycomycetes asexués se retrouvent dans la
classification des mucorales selon MOREAU (20).
- Moniliales : se reproduisent
par
des
conidies
portées à l'extrémité des filaments
aériens,
le
mycelium
est
cloisonné
- Sphaeropsidiales : les
conidies
et
conidiophores
sont à l'intérieur d'un sac appelé pycnide
- Melanconiales
- Mycelia sterilia
2.2.2.
Les phycomycètes ou Mucorales
(MOREAU)
(20).
-
Mucoraceae
(présence d'une collumelle)
.Présence de rhizoïdes et de stolons
Ex. genre rhizopus
(sporange spherique)
genre Absidia
(sporange puriforme) .
. Absence de rhizoïdes et de stolons
Ex. genre Mucor (sporangiophore blanc ou
grisâtre)
genre phycomyces
(sporangiophore d'aspect
métallique ou de couleur foncée)
-
pilobolaceae
(présence d'une ampoule sous
sporangiale)
Ex. genre pilobolus et pilaria
-
Thadmidiaceae
(présence de sporangioles)
-
Mortierellaceae
-
Choetocladiaceae
Choanephoraceae
-
Cephalidaceae
-
cunninghamellaceae

---

25
2.2.3.
Les Aspergillales
Font
partie
des
mucorales
mais
en
raison
de
leur
importance
dans
l' i ndustr ie
pharmaceutique,
il
faut
signaler
au moins la famille des
- Aspergillaceae
.genre Aspergillus
.genre Penicillium
.genre citromyces.
3)
structure
L'appareil végétatif des champignons est constitué par un
thalle filamenteux ou non.
Dans
la plupart des cas,
ce thalle
est
constitué
par
des
filaments
grèles
et
ramifiés
dont
l'ensemble constitue le mycelium.
Le thalle peut
être cloisonné et constitué
par
des
cellules
séparées
par
des
cloisons
transversales
(septomycètes) .
. Le thalle peut être constitué
également
de
filaments
non
cloisonnés
contenant
chacun
de
nombreux
noyaux
(siphomycètes) .
Le thalle non filamenteux réduit l'appareil végétatif en
une cellule unique.
Dans ce groupe on distingue :
- Le thalle levuriforme
qui
est
une
cellule
plus
ou
moins arrondie à noyau unique
-
Le
thalle
fUmangoïde
qui
est
formé
de
cellules
."
arrondies
groupées
ou
isolées
de
couleur
noire
et
qui
se
divise en 4 par formation ~e 2 cloisons perpendiculaires.
Le
thalle
en
grain
dont
la
forme
et
la
taille
évoquent des grains.

---

26
certains champignons possèdent des spores et d'autres des
conidies qui sont des organes de reproduction
(5,20).
4)
Croissance
La
croissance
des
champignons
inférieurs
peut
se
faire
soit:
-
A partir d'un point végétatif vrai donnant naissance à
un vrai mycelium
- A partir
d'un
bourgéon
végétatif
donnant
naissance
à
un
pseudomycelium.
La reproduction se fait par des spores.
On distingue les
spores
de
la
reproduction
sexuelle
et
les
spores
de
la
reproduction asexuée.
4.1.
spores de la reproduction asexuée
-
Les
thallospores:
sont
formés
au
dépend
du
thalle.
On distingue :
·
les Arthrospores : formées par dissociation du
filament mycelien en articles
·
les Blastospores
formées de
bourgeons
se
détachant
d'un pseudomycelium
· les Chlamydospores
formées
à
l'intérieur du
filament.
Ils ont
une
paroi
épaisse
et
un cytoplasme dense
·
les Aleuriospores
sont
de
petites chlamydospores
terminales qui restent
adherées
au
mycelium même mort
-
Les conidiospores : sont des éléments néoformés à partir
d'un
point végétatif ou à
partir
d'un
élément
implanté
sur
le mycelium. Dans
certains cas,
les
conidiospores
se
différencient en un organe spécial appelé phialide.

---

27
4.2.
Spores de la reproduction sexuée
Ces spores sont formés après réduction chromatique.
Chez
les
champignons
inférieurs,
la
reproduction
sexuée
se
fait
par
des
gamètes
doués
de
motilité
dont
l'union
est
une
planogamie
qui
peut
être
isogame
ou
anisogame.
Chez
les
champignons
supérieurs,
deux
filaments
morphologiquement
identiques
mais
de
signes
contraires
s'approchent l'un de l'autre et émettent
chacun
un
tube qui
s'unissent par leur extrémité.
La cloison
se
résorbe donnant
une cellule dicaryotique qui va
émettre
un
grand
nombre de
filaments
contenant
chacun les deux noyaux
couplés qui vont
finir
par
fusionner
avant
que
ne
commence
la
division
chromatique
aboutissant
à
une
cellule
contenant
un nombre
variable
de
spores.
(Chez
les
Ascomycetes,
la
fusion
des
noyaux est suivie de trois divisions chromatiques donnant
une
cellule contenant huit ascospores) .

---

28
C HAPITR E 1\\ :
MATERIEL ET METHODES

---

29
1) Cadre de travail
Ce travail a été initié et réalisé dans le laboratoire de
Biochimie
et
Microbiologie
appliquée
de
la
Faculté
des
Sciences et Techniques de l'Université de Ouagadougou
(Burkina
Faso)
sous la direction du professeur Alfred TRAORE.
Le laboratoire du département de Biochimie Microbiologie
est constitué de deux annexes.
La
première
annexe
est
située
au
sein
même
de
l'Université.
Elle
a
pour
vocation
essentielle
d'accueillir
les
étudiants
pour
les
séances
de
travaux
pratiques
et
autres démonstrations.
La deuxième annexe est si tuée dans
la
cour du
Lycée
Bogodogo de Ouagadougou à quelques kilomètres de l'Université.
C'est là que sont réalisés la plupart des travaux de recherche
des étudiants du département inscrits en DEA et en Thèse.
Il - Matériel
1.
Echantillons de terre
2.
Matériel de
laboratoire
- Autoclave
- Etuve
- Hotte
- Centrifugeuse
- Spectrophotomètre
- Microscope optique
- pH mètre
- Dessicateur.

---

30
3.
Différents milieux de culture
- Sabouraud
- Müller Hinton
- Czapek
- Chapman
-
EMB.
- Gelose nutritive
4.
Différents réactifs et produits chimiques
-
Eau distillée
-
Eau oxygénée
- Colorants
- Acides
- Bases
- Alcool
5.
Autres petits matériels indispensables
- Lames
- Lamelles
- Papiers filtre
- Pipettes
6.
Microorganismes:
- Staphylococcus aureus
- streptocoques du groupe B
-
Escherichia coli
A défaut
de
souches
de
référence,
nous
avons
travaillé
sur des souches pathogènes isolés de malades en consultation à
l'hôpital
Yalgado
OUEDRAOGO
de
Ouagadougou.
Pour
plus
de
clarté,
nous
exposerons
le
matériel
utilisé
pendant
chaque
manipulation
dans
le
chapitre
méthodologie.
Ainsi
que
la
formule des différents milieux utilisés.

---

31
III . Méthodologie
111.1.
Prélèvements
111.1.1.
Choix des sites
Géographiquement,
le
Burkina
Faso
est
di visé
en
trois
zones climatiques.
- Au nord,
la zone sahélienne
- Au centre,
la zone soudano-sahélienne
- Au sud,
la zone soudano-guinéenne.
Mais d'une manière génerale , on distingue deux régions
-
le centre et le nord qui est "chaud et sec" avec pour
villes principales Ouagadougou, Koudougou, Ouahigouya et Dori.
le
sud
qui
est
moins
chaud
et
sec
avec
pour
villes
principales Bobo-Dioulasso, Banfora, Gaoua, Diébougou.
Normalement,
notre
échantillonnage
devrait
s'étendre
à
tout
le
territoire;
mais
compte
tenu
des
contraintes
(économies
et
temps),
nous
nous
sommes
limités
à
effectuer
deux
sér ies
d' échanti llonage
en
respectant
la
tendance
générale.
Nous
avons
donc
retenu
deux
zones
aux
abords
des
agglomérations de Ouagadougou et de Bobo-Dioulasso.
- Gampéla à environ 15 km à l'Est de Ouagadougou
Banankélédaga
à
environ
20
km
au
Nord
de
Bobo-
Dioulasso.
Ces sites étant situés en zone rurale,
ils ont.de fortes
chances de ne
pas· subir des
var iations au ni veau de
la
flore
du fait de l'action de l'homme.

---

32
111.1.2. Prélèvement proprement dit
Les prélèvements ont été effectués au pied de gros arbres
desséchés
partiellement
ou
totalement
ce
qui
augmentait
les
probabilités de trouver le maximum de champignons.
Pour chaque
prélèvement,
nous
avons élimine
la couche superficielle de
la
terre
en
creusant
un
trou
d'environ
10
centimètres
de
profondeur.
Environ
50
grammes
de
terre
ont
été
prélevés
à
l'aide
d'une spatule et consignés dans un sachet en plastique portant
un
numéro
de
code
permettant
de
retrouver
l'emplacement
du
prélèvement en
cas
de
besoin.
Ainsi
ont
été
collectionnés
20
échantillons de terre à Gampéla et 20 autres à Banankélédaga.
Après chaque prélèvement,
la spatule est nettoyée avec du
•
coton cardé
avant
une
nouvelle
utilisation.
De
plus,
nous
ne
sommes
pas
en
mesure
de
donner
des
garanties
quant
à
la
stérilité des sachets en plastique compte tenu du fait
qu'ils
proviennent du commerce.
111.1.3.
transport et conservation
Après prélèvement et conditionnement dans des sachets en
plastiques,
des
mesures
particulières
n'ont
pas
été
prises
pour
le
transport
et
la
conservation
des
différents
échanti lIons.
Tout
à
été
effectué
dans
des
conditions
naturelles de température c'est-à-dire que:
- Pour le transport,
les échantillons ont été placés dans
un "sac de voyage" en nylon pendant environ une heure entre le
laboratoire et Gampéla et entre 72 heures et une semaine entre
le laboratoire et Banankélédaga.

---

33
-
Pour
la
conservation,
les échantillons
ont
été
placés
dans
une
caisse
en
bois
non
fermé
qui
n ' était
ni
protégé
du
froid,
ni de la chaleur,
ni de l'humidité.
Toutefois,
nous
avons
tenu
à
nous
rendre
compte
de
l'étanchéité
des
emballages.
Il
faut
cependant
noter
que
les
durées de conservation ont été très variables :
-
De moins de 48 heures pour
les
prémiers
échantillons
à
être
traités
-
A plus de
3 mois pour
les derniers échantillons à
être
traités.
111.2.
Ensemencement
Il existe de nombreux milieux de culture pour l'isolement
des
champignons.
Mais
le
milieu
de
base
en
mycolog ie
est
le
milieu
de
sabouraud
dont
i l
existe
plusieurs
variantes.
Le
milieu que nous avons utilisé à
la formule suivante
(20)
-
P e p t o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 9
-
G l u c o s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 9
- G é l o s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20 9
-
E a u . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1000 ml
Il
est
préparé dans
un
erlenmayer,
homogeneisé
à
l'aide
d'un
agitateur
magnétique
et
porte
à
ébull i tion
pendant
deux
minutes pour dissoudre convenablement la gélose.
Il
est
stérilisé
à
l'autoclave
à
120 0
C
pendant
20
minutes.
Ils
sont
ensuite
répartis
dans
des
boîte-s
de
pétri
stériles.

---

34
III.2.1.
Préparation de l'inoculurn
Toutes les méthodes de préparation de suspension de terre
pour
quantitifer
et
identifier
les
microorganismes
du
sol
nécessitent un certain nombre de matériels tériles pour chaque
échantillon (20):
- Mortier de-300 ml et son pilon
- fiole de 500 ml graduée à 100 ml
- 9 tubes à essai de 22 ml stériles
- eau distillée stérile environ 300 ml
- tamis.
III.2.2. Mode opératoire
L'opération
se
déroule
schématiquement
en
plusieurs
étapes :
Placer
les
9
tubes
à
essai
sur
un
portoir
puis
les
numéroter successivement de 2 à 10
Introduire
dans
chaque
tube
18
ml
d'eau
distillée
stérile.
Introduire
dans
le mortier
10
mg
de
terre,
broyer
à
sec, tamiser et homogéneiser.
Broyer
à
nouveau
après
addition
de
20
ml
d'eau
distillée
stérile.
Broyer
encore
en
ajoutant
une
à
deux
fois
de
l'eau
distillée stérile.

---

35
- Transvaser dans la fiole graduée stérile et compléter à
100 ml le volume de la suspension qui correspondra alors à
une
dilution à 10- 1 de l'échantillon.
- Homogenéiser la suspension de terre en agitant la fiole
prélever 2 ml
de
la dilution à
10- 1 qui
seront ajoutées
dans
le
tube
numéro
2
dont
le
contenu
sera
homogéneisé
par
agitation pour donner une solution à 10- 2 .
-
Prélever
2 ml
du
tube
numéro
2
et
le mettre dans
le
tube numéro 3 qui après homogéneisation donnera une dilution à
10- 3 •
En
opérant
ainsi
jusqu'au
tube
numéro
10,
on
obtient
alors pour chaque tube,
la dilution correspondant à son numéro
en exponentiel négatif en base 10.
Ainsi pour le tube numéro 8,
la
dilution
sera
de 10- 8 .
-9
9 • • • . . • . . . . . . . . . . . . • . • . . .
10
-10
10
10
.
Il
est
conseillé
d'utiliser
le
pyrophosphate
de
sodium
qui
a
la
propriété
d'assurer
une
meilleure
dispersion
des
germes dans l'eau donc une meilleure homogéneisation (20).
111.2.3.
Ensemencement proprement dit
L'ensemencement des
boîtes de pétri
contenant
le milieu
de
culture
se
fait
par
inondation.
Pour
cela,
une
partie
aliquote
de
chaque
dilution
est
déposée
à
la
surface
de
la
gélose.
Le volume de cette partie aliquote étant généralement
fonction du diamètre de la boîte de pétri l'essentiel étant de
rapporter
le
résultat
au
volume
de départ.
Sur
chaque
boîte,
,"
nous avons
ensemencé,
0,20 ml de différentes dilutions.
Après
étalement
à
l'aide
de
la
boucle
d'une
pipette
pasteur,
les
boîtes qui sont consignées des mêmes numéros que
les tubes de
1.1

---

36
dilution utilisées pour
l'inoculation
sont portées
à
l'étuve.
La totalité de l'inoculum doit être absorbée par la gélose.
On
commence
le
décompte
des
colonies
après
72
heures
d'incubation à l'étuve à 25° C.
111.3.
Isolement des souches
Après 72 heures minimum d'incubation, différents types de
colonies sont sélectionnés en fonction de leur taille,
de leur
forme,
de
leur
couleur,
de
leur
aspect,
et
parfois
des
résultats de
l'examen microscopique.
Les souches sélectionnées
ont été purifiées par des repiquages successifs sur
la gélose
de Sabouraud puis conservees sur une gelose de Sabouraud qui à
la
différence
de
l'autre
ne
contient
pas
de
glucose
et
est
coulée
en
pente dans
des
tubes
à
essai.
Ainsi
nous
avons
pu
constituer
une
collection
de
48
souches
parmi
lesquelles
•
beaucoup se révèleront identiques.
111.4.
Détection de l'activité antibactérienne
La
recherche
d'une
activité
antibactérienne
exercée par
des
microorganismes
doit
être
effectuée
pendant
la
phase
de
croissance
exponentielle
(33).
Ainsi
nous
avons
opéré
en
plusieurs étapes.
L' acti vation
des
souches de
champignon
qui
sont
mis
en
culture sur gelose de Sabouraud pendant 48 heures
ainsi,
ces
champignons seront en phase de croissance.
-
La préparation de la boîte d'antibiogramme qui consiste
à
inonder
d'une
suspension
bactérienne, _une
boîte
de
pétri
contènant
une
gélose
mutr i ti ve
de
4
mi llimètres
d'épaisseur.
On évacue l'excès de liquide et on laisse sécher.

---

37
-
Repiquage des différentes souches de champignon sur la
boîte d'antibiogramme.
Lecture
des
diamètres
d'inhibition
après
24
heures
d'incubation à 37° C.
,

---

38
CHAPITRE III :
RESULTATS

---

39
111.1. Numération des échantillons de terre
1
Cette
numération
concerne
toutes
les
souches
de
bactéries
et
de
champignons capables de se développer sur milieu de Sabouraud à
partir dUIl
0,20
ml
d'inoculum
et
en
partant
du
principe
qu'une
cellule
donnJ,
naissance à une colonie (visible sur boîte de pétri).
Prélèvements de Gampéla
1
N°boîte
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
- Echant.
1
l
23
3
1
2
l
l
46
5
3
l
l
53
5
4
l
l
12
0
5
l
106
18
2
6
l
203
28
3
7
l
l
78
9
1
8
l
l
64
9
1
9
l
l
51
4
1
10
l
l
29
2
I l
l
l
39
3
12
l
l
58
6
2
13
l
l
53
7
0
14
l
l
101
8
2
15
l
l
I l
1
16
l
l
31
2
17
l
l
43
5
18
l
l
88
10
2
19
l
l
61
9
3
20
l
l
29
1
-
Tableau 1:
Nombre de colonies par boite de petri pour les
prélèvements de Gampela
l
Incomptable
(Nombre de colonies trop élévé)

---

40
Prélèvements de Banankélédaga
N°boîte
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Echant.
1
N
N
620
56
24
5
2
N
103
63
35
30
3
N
N
N
2
2
4
N
N
4
1
1
5
N
N
2
1
6
N
N
N
N
N
N
N
7
N
N
29
6
1
1
8
N
N
69
22
13
9
N
426
69
1
10
N
N
406
51
4
I l
N
N
N
58
9
1
12
N
N
N
30
-
13
N
N
N
16
2
14
N
N
N
N
N
N
N
15
2
2
1
16
8
2
1
17
N
N
N
N
N
N
N
18
N
N
N
N
N
N
N
19
N
N
N
N
N
N
N
20
N
N
N
N
N
N
N
Tableau II
Nombre de colonies par boite de petri pour
les prélèvements de Banankélédaga
..
N
Culture en Nappe qui envahit toute la surface de la gélose.
'
Sachant que le volume de l'inoculum était de 0,1
ml,
il
faut
donc
multiplier
le
résultat
par
10
pour
avoir le nombre de colonies par ml puis par le facteur

---

41
de
dilution
pour
avoir
le
nombre
de
micro
organismes
qui se développent sur un milieu de sabouraud à
partir
d'un gramme
de terre.
Dans
le tableau ci-dessous,
les
résul tats
sont
expr imés
en
nombre de micro-organismes
par
gramme
de
terre
en
faisant
la
moyenne
des
estimations du tableau précédent.
GAMPELA
BANANKELEDAGA
1
51 x 10 6 /g de terre
21 450 x 10 6 /g de terre
2
480 x 10 6
8 558 x 10 6
3
515
1 100
4
120
380
5
162
60
6
261
N
7
893
2 972
8
846
5 297
9
637
405
10
245
4 387
11
345
8 267
12
1 060
3 000
13
615
1 800
14
1 270
N
15
105
407
16
255
427
17
465
N
18
1 293
N
19
1 503
N
20
195
N
Tableau III
Nombre moyen de microorganismes par
gramme de terre

---

42
On constate que les résultats du dénombrement de la flore
à
partir
d'un
g
de
terre
et
en
utilisant
un
milieu
de
sabouraud pour l'isolement sont très variables:
. de 51 x 10 6 à 1,503 x 10 9 microorganismes par gramme de
terre de Gampéla .
.
de 60 x 10 6 à 21,558 x 10 9 microorganismes par gramme
de terre de Banankélédaga.
soit une moyenne de 565,8 +/-
440
x 10 6
pour Gampéla
et 3842,4 +/- 594
x 10 6 pour Banankélédaga.
On
remarque
que
les
microorganismes
du
sol
sont
très
difficiles
à
dénombrer
par
la
méthode
de
dilution
sur
le
milieu
gélosé
de
Sabouraud.
En
raison
entre
autres
de
la
propr iété
de
certaines
souches
de
prol i férer
très
rapidement
pour donner des
colonies
confluentes
voire
même
à
des
nappes
rendant toute numération impossible.
Normalement,
on
doit
considérer
les
boîtes
de
pétri
renfermant entre
30 et
150 colonies
(28).
La
question qui
se
pose
logiquement
est
donc
de
savoir
combien
de
colonies
renferme une nappe.
De
plus
la
forme
et
la
taille
des
nappes
étaient
très
variables d'une souche à
l'autre.
Ce phénomène ajouté au
fait
que la méthode de dénombrement par numération est déjà en elle
même
une
approximation
doit
nous
amener
à
expérimenter
d'autres méthodes de numération comme par exemple
la détermination des poids secs
la détermination des densités optiques
la numération à l'aide des cellules
(Nageotte, Malassez)
En
plus,
notre
expérience
quotfdienne
nous
a
permis de
..
nous rendre compte que pour certaines souches de champignons,
un
simple
ensemencement de
la
gélose de
sabouraud
par
piqure

---

43
centrale
entraînait
la
formation
d'une
nappe
gigantesque
qui
pouvait envahir toute la surface de
la gélose et cela quelque
soit
la
forme
et
la
taille
de
la
boîte
de
pétri
et
quelque
soit l'épaisseur de la gélose.
Il
est
possible
que
les
périodes
de
prélèvement
interviennent
dans
les
résultats
car
les
échantillons
de
Gampéla
qui
ont
été
assez
faciles
à
dénombrer
ont
été
recueillis
en
mai
période
pendant
laquelle
le
sol
e-st
aride
alors que les échantillons de Banankélédaga ont été recueillis
en
juillet
période
pendant
laquelle
le
sol
est
imbibé
d'eau
dans cette région.
III -
2.
Sélection des souches
Notre étude ayant pour but de
collectionner des souches
de
champignons
productrices d'antibiotiques,
nous
nous
sommes
intéressés
à
toutes
les
souches
de
notre
collection
qui
étaient
susceptibles
de
présenter
une
acti vi té
antibactérienne.
L'activité antibactérienne est détectée par la formation
d'une
zone
stéri le
(correspondant
à
une
absence
de
colonies)
autour
d'une
culture
de
champignon
appelée
diamètre
d'inhibition.
Ce diamètre d'inhibition peut être recherché sur
boîte de petri contenant une gélose nutritive ou le milieu de
Müller Hinton d'une épaisseur de 4 millimètres.
(voir formule
en annexes).
Après
24
heures
d'incubation
à
37°C,
nous
avons
retenu
trois souches qui seront étudiées au cours de ce travail.
Pour
toutes ces trois souches,
les diamètres d'inhibition sont plus
importants
sur
staphylococcus aureus
et
les streptocoques que
..'
sur
Escherichia
coli.
De
plus,
ces
diamètres
d'inhibition
restaient constants pendant toute -la durée de conservation des
souches
(plus
de
deux
mois
à
température
ambiante
au
laboratoire) .

---

44
Cès
souches
ont
été
rétrouvées
dans
les
deux
régions,
dans plusieurs prélèvements; associées ou non.
111.3.
Souche nOl
111.3.1.
Propriété antibacterienne
La
souche
n°
1
exerce
sur
Staphylococcus
aureus
et
le
streptocoque
B
un
diamètre
diinhibition
dont
les
limites
apparaissent à
environ deux millimètres des bords des cultures
de
la
souche.
Alors
qu'on
observe
pratiquement
pas
d'inhibition sur Escherichia coli.
111.3.2. Morphologie
En culture sur milieux gélosé de sabouraud,
elle montre
après
72
heures
d'incubation
à
37°C
des
colonies
d'aspect
blanc
laiteux
devenant
de
plus
en
plus
grlses
pendant
la
conservation.
En milieu de sabouraud non gélosé, on observe un voile en
surface alors que dans le tube on observe deux phases :
la
partie
superf icielle
au
contact
du
voi le
qui
est
violette
la
partie
profonde
qui
reste
inchangée.
Puis
devient
violette pendant la conservation (au bout d'une semaine)
Au
microscope
optique,
on
voit
qu'il
s'agit
bien
d'un
champignon dont :
les
conidies
sont
bien
arrondies
et
réfr ingentes
et
très nombreux
- l a tête conidienne est de couleur jaune
-
le conidiophore qui est constitué
d'une
membrane non
cloisonnée_et d'un cytoplasme translucide
se termine
par un
renflement
(tête conidienne)
portant les conidies
en chapelet
caractéristique du genre Aspergillus.

---

45
-.
111.3.3. Caractères métaboliques *
Oxydase -
Catalase +
Glucose + (faible)
Mannibol -
Inositol -
Sorbitol
Rhamnose -
Saccharose +
Melibiose +
Amygdaline +
Arabinose -
ONPG - Après 4 heures
+ après 24 heures
ADH +
.'~
LOC -
ODC -
citrate de sodium +
SH2 -
Urée -
INDOLE -
TDA -
VP -
Gelatinase -
Lecitinase -
Sur le milieu de kligler hajna,
on observe les caractères
suivants après 48 heures d'incubation
Glucose non fermenté
Lactose non oxydé
Pas de production de gaz
Pas de production de SH2
* Voir annexes

---

46
111.3.4.
Croissance
Compte
tenu
des
moyens dont
nous
disposons,
nous
avons
tenté d'étudier la croissance de la souche n° 1 en fonction du
temps
par
la
méthode
spectrophotometriques
à
450
nm
et
a
partir d'une culture dans le bouillon de Sabouraud.
Il se posait alors des problèmes
-
le champignon est formé à
la fois
de
mycelium
et de
spores qui
n'ont pas
les mêmes longueurs d'ondes d'absorption
maximale (Amax)
un
seul
filament
mycelien
peut
être
très
long
donc
impossible à compter sur cellule de Malassez.
Après
avoir
déterminé
la
longueur
d'onde
d'absorption
maximale
(Amax
=
450
nm),
on
lit directement
les
différentes
densités optiques (DO)
au spectrophotomètre
..

---

47
Temps en heures
DO 450 nm
Ln
(e)
2
43
3,76
4
41
3,71
6
90
4,50
8
100
4,60
10
75
4,32
12
150
5,51
14
351 x 5
7,47
16
184 x 5
6,82
18
342 x 5
7,44
20
356 x 5
7,48
22
389 x 5
7,57
24
323 x 5
7,38
36
321 x 5
7,38
48
401 x 5
7,60
72
324 x 5
7,40
144
366 x 5
7,51
Tableau III
Cinétique de la croissance
évolution de la densité
optique en fonction du temps
-
Pendant
cette
étude,
nous
n'avons
pas
observé
la
phase
de
décroisance
même
en
travaillant
à
partir
d'un
milieu
dépourvu
de
substrat
glucosé.
Dans
ce
cas,
on
observe
tout
simplement
une
dimunition du temps de croissance exponentielle qui débute
alors à
la
8è
heure
pour
s'arrêter
à
la
16è
heure.
Cette
phase
est
sui vie
du
plateau de la phase stationnaire qui continue au delà de 100 heures.

---

;
T
[
o
Fig.l
Croissance de
la
souche
n 1
DO
en
fonction
du temps
8
7,5
7
0
Cl
6,5
Qi
1
-
'd
------
6
Q)
co
~
6
.c:.;.J
5,5
,""H
(\\j
0lI
0
5
..-l
4,5
4
1
1
3,5
1
1
1
80 1
a
20
40
60
100
HEU RES
1
..
1
.. '
~
.-.

---

49
111.3.5.
Autres propriétés
-
Croissance en fonction du pH.
Dans une gamme de pH variant entre 4 et 10,
la souche n 0 1
est capable de se développer entre pH 4,7 et pH 8,5.
- Amélioration du diamètre d'inhibition
* Les
ions
minéraux
et
oligo
éléments
ne
semblent
pas
exercer
une
influence
sur
les
diamètres
d ' inhibition
lorsqu'on
les
incorpore dans
la
gélose
à
concentrations
variables.
- Action du filtrat d'un bouillon de culture du champignon nOl
* ce filtrat de culture qui est sensé renfermé
les
substances antibactériennes n'entrave pas le développement
des
bactér ies
si
on
les
incorpore dans
la
gélose
à
différents volumes et
à des temps différents:
1 er au 6e
jour.
Donc
la
substance
est
trop
diluée.
L'idéal
serait
donc
se
parvenir à
extraire ou à
défaut
à
concentrer
le
principe actif.

---

50
111.4.
Souche n° 2
111.4.1.
Propriétés antibactériennes
La
souche
n° 2
exerce
sur
Staphylococcus
aureus
et
le
streptocoque B une
inhibition dont
les
limites apparaissent à
environ
un
mi 11 imètre
des
bords
de
la
culture
du
champignon
n02.
Sur
Escherichia
coli,
l'inhibition
existe
mais
son
diamètre est très faible.
111.4.2.
Morphologie
Sur
milieu
gélosé
de
Sabouraud,
on
observe
après
72
heures
d'incubation
à
37°C
des
colonies
d'aspect
poudreux,
plates
de
couleur
blanc
sale
à
gris
fortement
adhérées
à
la
surface de la gélose.
Dans un bouillon de Sabouraud ou en bouillon nutritif,
on
observe un trouble homogène
avec depot au fond
du
tube
et un
voile
en
surface.
Au
microscope
optique,
il
s'agit
d'un
champignon avec
de très
nombreuses conidies
libres,
arrondies
et refringentes.
Les têtes
conidiennes très rares sont toujours couvertes
d'une masse dense de conidiophores rendant l'observation de la
tête impossible.
Le conidiophore est constitué d'un filament non cloisonné
de très grande dimension et à cytoplasme translucide.
Comme
dans
le
cas de
la
souche
n° l,
nous
pensons qu'il
s'agit d'un champignon du genre Aspergillus.

---

51
111.4.3. Caractères métaboliques *
Oxydase -
Catalase +
Glucose -
Mannitàl -
Inositol -
Sorbitol -
Rhamnose -
Saccharose -
Melibiose-
Amygdaline -
Arabinose -
ONPG -
ADH -
LDC -
ODC -
citrate de sodium +
SH2 -
Urée -
Inbole -
TDA -
VP -
Gelatinase -
Lecithinase -
Sur
le
milieu
de
kligler
hajna,
on
observe
après
72
heures d'incubation:
- Glucose non fermenté
- Lactose non oxydé
- pas de production de gaz
- Pas de production de SH2-
* Voir annexes

---

52
•
111.4.4.
Cro1ssance •
L'étude
de
la
croissance
par
la
méthode
spectrophotometr ique donne
les
résultats
suivants
en
fonction
du temps.
Temps en heures
DO 450 nm
Ln (e)
2
40
3,70
4
38
3,63
6
76
4,33
8
93
4,53
10
120
4,79
12
98
4,58
14
291 x 5
7,28
16
283 x 5
7,25
18
290 x 5
7,29
20
306 x 5
7,33
22
310 x 5
7,34
24
302 x 5
7,32
36
372 x 5
7,53
48
402 x 5
7,60
60
305 x 5
7,33
72
302 x 5
7,32
144
306 x 5
7,33
Tableau IV
Cinétique de la croissance : évolution de la
densité optique en fonction du temps
111.4.5.
Autres propriétés
-
Croissance en fonction du pH.
* La
souche
n° 2
est
capable
de
se
développer
entre pH 5,0 et pH 8,
5.
- Actions des ions minéraux
* Ces ions minéraux et les
oligo
éléments
ne
semblent
pas
avoir
une
action
sur
le
diamètre
d'inhibition.
-
Action du filtrat de culture
*
Il
ne
_se~ble
pas
empêcher
la
croissance
des
Bactéries
quand on les incorpore dans la gelose.
* Voir page 47 (111.3.4)

---

53
-.\\
Logarithn,-e
cle
DO
w
~
Ul
(J')
Ul
~
Ul
Ul
01
Ul
en
-+-_~---.JI"-----_------,I_ _-----,-I
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_ _~I~~I_ _~I_ _~I_ _-----j
o
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F-=' •
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Cf)
-
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Cf)
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B
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UJ
Cf)
a
C
-
()
~
(1)
- - -
------::J-~--_0-
0
ru
o
o

---

54
111.5.
Souche n°
3
111.5.1. Morphologie
La culture sur gélose de Sabouraud montre au bout de 72
heures
une
colonie
d'environ
1
centimètre
de
diamètre
de
couleur variant entre
le
gris-vert et
le
blanc.
Ces
colonies
sont parfois dentellees.
Au microscope optique,
les
conidies
sont bien arrondies
et réfringentes.
Le conidiophore est de longueur variable avec
un cytoplasme translucide et non cloisonné.
Ce conidiophore se
termine
par
une
tête
conidienne
non
renflée
et
de
couleur
grise.
En culture sur bllon de Sabouraud,
on observe un trouble
homogène et un voile à
la surface du
liquide.
Nous
pensons à
un champignon du genre Penicellium.
111.5.2. Activité antibactérienne
•
La souche n°
3 montre une
activité antibactérienne
très
var iable
sur
les
souches
bactér iennes
pathogènes.
En
effet,
sur
Staphylococcus
aureus,
le
diamètre
d'inhibition
très
important
d'abord
les
premiers
jours,
devient
de
moins
en
moins appréciable avec le temps au cours de la conservation.
Il
existe
donc
un
autre
phénomène
au
cours
de
la
conservation qui
rendait
les
souches de bactéries
insensibles
à
l' acti vi té
antibactérienne
du
champignon.
Ce
phénomène
est
également observé avec les streptocoque B et Escherichia coli.

---

55
111.5.3. Caractéres métaboliques *
catalase +
glucose +
Mannitol -
Inositol -
Sorbitol -
Rhamnose -
Saccharose -
Melibiose -
Amygdaline -
Arabinose -
ONPG -
ADH -
;
LOC -
ODC -
•
lactose -
SH2 -
ree -
Indol -
TDA -
VP -
Gelatinase -
Lecitinase -
citrate de sodium +
Sur Kligler-Hajna
,on observe:
- Glucose non fermente
- Lactose non attaque
-
Pas de production de Gaz
-
Pas de production de SH2
* Voir annexes

---

56
111.5.4
.
Cr01ssance *
L'étude de la densité optique en fonction du temps donne
les résultats suivants :
Temps en heures
DO 450 nm
Ln
(e)
2
53
3,97
4
49
3,89
6
56
4,02
8
74
4,30
10
324
5,78
12
324 x 5
7,39
14
306 x 5
7,33
16
317 x 5
7,37
18
311 x 5
7,35
20
298 x 5
7,31
22
296 x 5
7,30
24
310 x 5
7,35
36
318 x 5
7,37
t
48
299 x 5
7,31
72
303 x 5
7,32
96
300 x 5
7,31
120
301 x 5
7,31
144
316 x 5
7,36
Tableau VI
cinétique de la croissance : évolution de la
densité optique en fonction du temps
III 5.5.
Autres propriétés.
-
Croissance en fontion du PH
* La souche N°2 se developpe entre PH 4,3 et PH 8,7.
-
Action des ions mineraux
* Les ions mineraux ne semblent pas modifier les
diametres d'inhibition
-
Action du filtrat de culture
:
*
Il
ne
semble
pas
empecher
la
croissance
des
bacteries
quand
on
l'incorpore
dans
la
gélose
à
différentes concentrations.
* Voir page 47 (111.3.4)

---

i
i
i
0
Fig·.3
Croissance de
l·a
souclle ,n '3
i
DO
en fonction du temps
i
1
7,5
~
~
"-
i'
i
1
7 ~
1
1
6,5 -
0
Cl
6 -
Q)
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Q.)
Ë
5,5 ~
,.c:;
f'..
U)
oi-J
....
~
('j
5 -
on
0
~
4,5 ----j
4 ----j
3,5
1
1
0
20
40
60
80
100
II
E U
n E S
-,
~"
9

---

Inhibition d'une culture de Staphylococcus aureus
par les souches N° 1, 2, 3. (diamètre d'inhibition)

---

58
III. 6.
Propriétés
antibactériennes
sur
des
souches
pathogènes
Nous avons également testé l'activité antibactérienne des
trois souches de champignons sur d'autres bactéries pathogènes
isolées
des
produits
pathologiques
provenant
de
l'hôpital
Yalgado OUEDRAOGO de Ouagadougou.
Ces résultats sont consignés
dans le tableau ci-dessous.
Nombre
Existence de diamètre
d'inhibition
Total de
Souches souche1 souche2
souche3
Staphylococcus
24
24
13
19
aureus
streptocoques B
3
3
2
3
Escherichia coli
12
9
4
7
Salmorella typhi
2
1
a
1
Tableau V
Activité des souches N° 1,2,3 sur des souches
de bacteries pathogenes
Ces mêmes
résultats exprimés en pourcentage donnent
les
histogrammes ci-dessous en considérant que:
- 1 :correspond à Staphylococcus aureus
- 2 : correspond au Streptocoque B
- 3 : correspond à Escherichia coli
- 4 : correspond à Salmonella typhi

---

1.·'
;
0,9
0.8
0.1
III
0.6
{)l
.8c
III
0.5
u
'--
:J
0
n.
0,4
0.3
0,2
~
0.1
0
i
2
3
4
Histogramme 1
: Pourcentage de positivité sous l'action
de la souche n°
1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -----_. ---._.- .. ------- --- --

---

60
0.7 - - , - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
_
0.6
0.5
QJ
(J1
0.4
0
c
QJ
u
~
:J
0
0.3
CL
0,2·
0.1
2
3
4
Histogramme 2
:
Pourcentage de positivité sous l'action
de
la souche nO
2
"
0,9
0,8
0,7
,v
0.6
CJ1
0
r
QJ
0,5
u
:J
0
CL
0,4
0.3
0,2
0,1
Gl
0
2
3
4
Histogramme 3
-----
:
Pourcentage de positivité
de
la souche nO
3
sous l'action

---

CHAPITRE IV :
DISCUSSION / CONCLUSION GENERALE

---

62
IV.l. Discussion
Au
vu
de
ces
premiers
resultats,
des
remarques
s'imposent:
-
Les prélèvements ont été effectués à des périodes très
différentes
sur
le
plan
climatique.
L'échantillonnage
de
Gampéla qui a
été effectué sur des sols très secs et sous une
tempéra ture
de
plus
35 0
C a
permis
une
numération
aisée
en
donnant
des
colonies
bien
isolées
et
distinctes.
Tandis
que
l'échantillonnage de
Banankélédaga qui a
été effectue sur des
sols imbibés d'eau ne permettait pas une numération aisée des
.
.
mlcro-organlsmes
qui
se
développent
sur
le
milieu
de
Sabouraud.
Car ces derniers échantillons donnaient très souvent des
colonies
proliférantes
et
en
nappe
rendant
toute
numération
impossible sur boîte de pétri selon notre méthode.
Le prélèvement en période humide, montrait en réalité la
prédominance d'une même souche qui envahissait toute
la
boîte
de pétri en étouffant les autres micro-organismes.
Notre méthode de numération ne peut être cons idérée que
comme
une
approximation
car,
dans
la
réalité,
il
faut
considérer
les
boîtes
contenant
entre
30
et
300
colonies
ce
qui
est
pratiquement
impossible
avec
les
champignons
compte
tenu de la taille des colonies qui peut être très variable
(du
simple au dixième)
(3)
Ainsi,
nous avons préféré considérer les boîtes de pétri
qui
renfermaient
les
plus
faibles
nombres
de
colonies
(dernières)
et en faisant une moyenne.
En outre,
il faut tenir
Ir
également
compte
du
fait
qu'une
colonie
peut
en
cacher
une
autre.

---

63
La flore terrestr~ semble plus importante dans la région
de
Bobo-Dioulasso
mais
elle
semble
beaucoup
moins
variée
à
cause de
la souche proliférante.
Il y a de fortes chances que
cette différence
soit dûe
à
l' hygrométr ie des
sols au moment
des prélèvements c'est à dire au moins à la géographie .
Il aurait été intéressant de pouvoir inhiber les souches
prol i férantes
pour
permettre
aux
autres
de
se
développer
et
d'être ainsi prises en compte lors de la numération.
Pour
le choix des
souches
inhibitrices de
la croissance
bactérienne,
il aurait été préférable de tester chaque colonie
au
lieu
de
se
contenter
de
rechercher
cette
activité
sur
différents
types
de
colonies
en
fonction
des
variations
morphologiques.
En
effet,
deux
souches
phénotypiquement
identiques
peuvent être très différentes sur le plan génotypique.
Surtout
que
l'on sait que ces variations génotypiques qui
portent sur
le
chromosome
peuvent
conserner
la
sécrétion
de
substances
telles
que
les
toxines
et
enzymes
(donc
des
substances
antibactér iennes)
(24)
Il est évident que la gamme des souches serait étendue si
on
les
sélectionnait
à
partir
des
diamètres
d'inhibition
observés
sur
les
milieux
de
composition
différente
car
la
plupart
des
auteurs
(4,5
,33)
s'accordent
à
reconnaître
le
rôle
fondamental
joué
par
les
oligo-éléments
dans
la
production d'antibiotique.
Il faut donc utiliser différents types de milieux et pour
chaque milieu,
incorporer des
ions minéraux en faisant varier
leur concentration.
Ainsi,
par exemple,
Maurice Raimbault
(33)
soutient que
la
production de mycotoxine
par
culture
en milieu
solide
est
condi tionnée
par
une
faible
teneur
en
eau
du
substrat,
une
carence en sels minéraux et une agitation permanente.

---

64
De
même
que
dans
l'industrie,
on
ajoute
toujours
un
précurseur
de
l'antibiotique
désirée,
ce
qui
permet
d'accélérer la production (17).
Les
souches
qui
ont
été
retenues
présentent
toutes
une
activité
antibactérienne
qui
se
manifestait
par
la
formation
d'une
zone
d' inhibi tion.
Ces
souches
ont
été
étudiées
selon
les techniques classiques de la bactériologie et non selon les
techniques spécifiques de la mycologie .
Ainsi,
nous
avons
tenté
d'étudier
les
courbes
de
croissance
en
fonction
des
méthodes
spectrométriques
malheureusement,
nous
n'avons
pas
pu
observer
de
phase
de
décroissance au bout de 144 heures de croissance.
De plus,
ni
la
phase
d'accélération
ni
la
phase
de
ra lentissement
n'apparaît nettement selon nos études.
Pour
l'étude
des
courbes
de
croissance
par
la
méthode
spectrophotométrique,
le problème
fondamental
qui
se pose est
dû à
l'existence au niveau des champignons de deux structures
ayant
des
longueurs
d'onde
d'absorption
maximale
légèrement
différentes
450
et
520
nanomètres
respectivement
pour
le
mycelium
et
pour
les
conidies,
d'où
de
fortes
probabilités
d'interférence donc de résultats erronés.
La meilleure méthode
aurait été la détermination des poids secs qui prend en compte
à la fois le mycelium et les spores.
Sur
le
plan
métabolique,
on
note
que
la
plupart
des
caractères demeurent négatifs pour toutes les souches.
De plus,
pour une même souche,
l'activité antibactérienne
étant
variable
d'une
expérience
à
l'autre,
il
serait
donc
intéressant de déterminer pour chaque souche de champignon les
condi tions
permettant
une
production
optimale
de
ses
toxines
et
enzymes
afin
de
sélectionner
les
souches
productrices
de
substances antibactériennes.

---

65
IV.2.
Conclusion générale
Au
Burkina,
il
existe
donc
des
champignons
capables
d'exercer
une
action
inhibitrice
sur
certaines
souches
bactériennes.
C'est
le cas des souches numéro 1,
2,
3 qui déterminent
naturellement
une
zone
d'inhibition
sur
des
cultures
de
bactéries
en
boîte
de
pétri.
Ces
premiers
résultats
étant
encourageants,
il va donc falloir :
- étendre les recherches à l'ensemble du pays
-
améliorer les méthodes de recherche des micro-
organismes
- améliorer les méthodes de détection des substances
antibactériennes
- orienter les recherches vers une extraction et une
.'
purification des substances antibactériennes
- effectuer des essais biologiques,
bactériologiques et
physico-chimiques des substances antibactériennes.
Des études ont montré que ces substances
sont excrétées
surtout pendant la phase de croissance
(33,39)
En absence de
toute
indication,
nous
pouvons
considérer
que
les
substances
qui
nous
intéressent
dans
cette
étude
sont
des
toxines.
Il
peut donc s'agir des enzymes et autres protéines produits par
les micro-organismes pouvant avoir ou non des actions néfastes
sur les cellules humaines.
Ainsi en bactériologie par exemple,
RAY NAUD et ALOUF ont tenté de classer les toxines en fonction
de
leur
localisation
par
rapport
à
la
cellule
bactérienne
en
deux classes réparties en quatre groupes
(24)

---

66
-
classe A
toxines associées en permanence à la
bactérie
l
- toxines cytoplasmiques
de nature protéique
II - toxines pariétales : de nature lipopolysaccharidique
toxines membranaires
de nature protéique ou
glycoprotéique
toxines sporales
de nature protéique
-
classe B
toxines extracellulaires
111- exotoxines vraies et toxines périplasmiques
de nature protéique
IV
toxines à
localisation mixte endocellulaire et exo
cellulaire : de nature protéique.
Selon les méthodes utilisées lors de notre étude,
seules
seront
detectées
les
toxines
extracellulaires
qui
seront
retrouvées
dans
les
milieux
de
culture
c'est-à-dire
les
toxines des groupes III et IV de la classe B.
Il sera donc
intéressant d'orienter également les études
vers
la recherche de
substances
localisées à
l'intérieur ou à
la
surface
des
micro-organismes.
Il
faut
signaler
enfin
que
les résultats de notre étude ont été obtenus in vitro donc non
transposables
automatiquement
in
vivo.
En
effet,
un
antibiotique actif in vitro n'est pas forcément actif in vivo.
De nombreux facteurs peuvent intervenir :
- état du malade : diminution des défenses immunitaires
- type d'infection
foyer infectieux profond
(où le
médicament n'a pas accès)
- de même que des facteurs limitants peuvent empêcher la
diffusion
normale d'une substance dans un milieu
gélose.
Ce qui
contribue
à une diminution du diamètre
des zones d'inhibition.

---

67
.-
BIBLIOGRAPHIE

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75
"
ANNEXES
Gélose nutritive
(Biomerieux)
(formule prête à l'emploi)
Biogelytone
sg
Extrait de viande de boeuf .•••.• 3g
NaCl. ~
8g
Gélose
15g
Eau distillée
(qsp) •.••..•.••••• 1000ml
Autoclaver à 115 oC pendant 20 minutes
Gélose de MÜLLER HINTON
(MH).
(26)
Infusion de viande de boeuf . . • . . . . . 300mg
Hydrolysat de caseine
17,5g
Amidon . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1, 5g
",
Gélose
20g
Eau distillée
(qsp) • . . . . . . . . . • . . . . . 1000rnl
Ajuster le PH a 7.4
Autoclaver à 115 oC pendant 20 minutes.
Milieu de CZAPEK-DOX
(17)
(Bllon ou Gélose de)
NO] Na
2g
KCI
0,5g
S04 Mg
0,5g
S04Fe . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0, 01g
KH2 P04 . . • • . . • . . . . . . . • . . . • . . . . . . . . 1g
p
Saccharose . . . • . . . • . . . • . . . . . • . . . . . 30g
Agar-agar
(+/-) •..••••.......•.•• 20g
Eau distillée . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . 1000ml
Autoclaver à 115 oc pendant 20 minutes

---

76
i,
Milieu de CZAPEK-DOX (17)
(milieu pour production de penicilline)
Glucose
40g
N03Na • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 3g
KH2PO~ •••••••••••••••••••••• • 1g
RCI
0,5g
Agar
15g
Eau distillée •••..••••.•.••.. 1000ml
Autoclaver à 115 oC pendant 20 minutes
Milieu de HUGH-LEIFSON
(17)
(Pour l'étude du métabolisme des glucides)
Extrait de lévure • • . . . • . . . . . • • • . . 1g
peptone pancréatique de caseine .• 2g
NaCl • . . . . . . • . . • . . . . . . . . . . . . . . • . . . 5g
KH2P04 . . . . . • . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . 0,3g
Agar
3g
Bleu de Bromothymol • . . . . . . . . . . . . . 0.003g
Ajuster le PH à 7 -
7.2 et autoclaver à 115 oC pendant 20
minutes. Répartir en tube.
Les glucides seront ajoutés de façon à obténir une
concentration de 1% par tube.
Pour chaque sucre et après
ensémencement, un tube est étuvé tel quel alors qu'un autre
sera ré couvert d'une couche de 1 à 2 centimètre de paraffine
ou de vaseline stérile.
,.,
Après incubation,
si seulement le tube recouvert de
paraffine vire au jaune,
il y a fermentation.

---

77
••
Si les deux tubes virent au jaune, il y a oxydation.
Milieu de HAJNA-KLIGLER (17)
Extrait de viande de boeuf .••..••.•••....• 3g
Extrai t
de levure . • • . • . . • . . . . . . • . • . • • . . • . . 3g
Peptone
• . . • . . . . . . . • • . • . • . . • . . . . • • • . . • . . • • 2 og
NaCl
5g
citrate ferrique . . . . . . . . • . . . . . • . . • • • • . . • • • 0,3g
Thiosulfate de sodium . . . . . . . . • . • • . . • . • • . . • 0, 3g
Lactose
lOg
Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . . . 19
Rouge de phénol . . . . • . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . 0,05g
Agar
12g
Ajuster le PH à 7,4 et autoclaver à 120 oc pendant 15
minutes. Répartir en tube .
si pente jaune
lactose +
si culot jaune
glucose +
Si noircissement : SH2 +
si bulles d'air dans le culot
gaz +
Recherche de l'oxydas e
(POO)
(17 )
La phénylène-diamine-oxydase
(POO)
entraîne la
formation
d'une sémi quinone rouge quand on le fait agir sur un substrat
incolore.
La sémi quinone très instable,
s'oxyde rapidement en
donnant un composé noirâtre.
Dans la pratique,
on peut mettre
un
disque
de
papier
buvard
imbibé
de
POO
dans
0,5
ml
de
suspension microbienne.
Au bout de 30mn,
si la suspension vire
au noir : oxydase + sinon oxydase -
Recherche de la catalase (17)
C'est
une
emzyme
qui
décompose
l'eau
oxygènée
selon
la
réaction H202 -----> H20 + 1/2 02
Dans
la
pra~ique,
on
peut
déposer
une
goutte
d'eau
oxygènée sur uen colonie microbienne.
si bulles d'air : catalase +
sinon catalase -

---

78
Recherche de l'ONPG
(17)
(Ortho Nitro Phényl B.D Galacto pyranoside)
Elle
est
plus
sensible
et
confirme
la
recherche
du
lactose.
Il existe sous forme de disque de papier buvard qu'il
suffit de placer dans dans 0,5 ml d'une suspension microbienne
. Au bout de 4 heures
si suspension jaune
ONPG +
donc lactose +
sinon
·lactose -
Recherche de l'Uréase, de l'Indole et de la TDA (17)
Dans
le
commerce,
on
peut
trouver
un milieu permettant
ces trois recherches dont la formule est :
L-tryptophane ..•••..•..••.•....••.....•... 0, 3g
KH2P04 . . . • • • • . • • • • • • • • . . • • • • . . . • • • . . • • • • • . • 0, 19
K2HP04 • . • • . . • • • . . . . . . • • • . . . • • • . • . . . . • . . . . . • 0, 19
NaCl
0,5g
UREE
2g
Alcool à 95° . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1ml
Rouge de phénol à 1%
0,25ml
Eau ditillée
100ml
uréase
une
suspension
microbienne
aussi
dense
que
possible dans 0,5 ml de ce milieu est placée à
37 oc pendant 4
heures minimum.
si le milieu vire au rouge
uréase +
sinon uréase -
Indole
deux
gouttes
du
réactif
de
KOVACS,
qui
est
milieu
acide
commercialisé,
peut
entraîner
la
formation
d'un
anneau rouge à
la
surface
d'une
suspension microbienne de
24
heures.
Dans ce cas le microorganisme a dégradé le tryptophane
en indole grâce à une tryptophanase ; indole : +
La
TDA
(Tryptophane
Désaminase)
deux
gouttes
de
P'
perchlorure
de
fer
dans
une
suspension
microbienne
de
24
heures entraîne la formation d'une coloration brune resultante
de
l'action
du
perchlorure
de
fer
sur
l'acide
indole
pyruvique; TDA +

---

79
Recherche de l'Acétoïne ou réaction de Voges-
Proskauer (17)
Se fait
sur
le milieu de Klark et Lubs
dont
la
formule
est
Polypeptone
5g/ 1
Glucose
5g/1
Phospha te bipotass ique . . . . . • • . . . . • . . . • • . . . • . 5g / l
Polypeptone
~
Sg/l
On réalise une suspension bactérienne dans
0,5 ml de ce
1
milieu qu'on
introduit dans unr'tube, de 22.
Après
24
heures
d'incubation
à 37
oc, on ajoute 0,5 ml dé .solution alcoolique
d'alpha-naphtol
puis
0,5
ml
de
soude
4N.
Ensui te
on
chauffe
sur
un
bec
Bunsen
jusqu'à
émission
de
vapeur
puis
on
agi te
pendant une minute à la main.
si coloration jaune citrin : VP +
si coloration jaune saumon ou rose pâle
VP--
Recherche de la Gélatinase
(17)
Selon la méthode de Frazier, dans une gélose contenant 1
à
2 ml de gélatine coulée en boîte de pétri,
on ensémense en
strie. Après 3 jours d'incubation, on verse sur le milieu 1 ml
du réactif suivant :
Hgc12 . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15g
Hcl concentré . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . 20 ml
Eau distillée
100 ml
si
précipité
blanchâtre
gélatinase
sinon
gélatinase +
Recherche de la Lecithinase
(17)
Dans une gélose trypticase-soja maintenue en surfusion à
50
oc,
on ajoute
10
% de
jaune d'oeuf
dilué
au
démi
en
eau
physiologique stérile; homogénéisé et coulé en' boîte de Pétri.
On ens~mence
en points
la souche à
étudier avant d'incuber à
37 °C'pendant 1 à 5 jours.
si halo opaque blanc-jaunâtre à bords nets
lécithinase +
sinon lécithinase -

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BËTA-LACTAMINES - 1 - PÉNICIUINES
BËTA-LACTAMINES _ 1\\ _ CÉPHALOSPORINES
0
Groupe dB /8 pénidllinB G
Ces produits assccient les avantages d<:s pénicillines du groupe de la m~lh i-
cilline et des pénicillines à lar~e spcclrc. puisqu'ils resistent à la pcnicil!ina,c
Spectre: coques gram positifs et négatifs., bacilles gram positifs. à l'exception
du Staphylocoque ct sont actifs sur ce nains bacilles gram n~galifs. lh sc:,t
des Staphylocoques producteurs de pénicillinase.
beaucoup moins actifs que la pénicilline G sur les Streptocoques et le Pneu-
Pénicilline G (benzyl-péniciUine) :
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mocoque.
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Ses formes reard : •
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Patici Il ill<- proainc
Céf.loridine
IlénClhaminc-pénicillinc
o
Cd'aCdrilc
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ClCrnilOle-péniciÙinc
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o
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Ctfu.oline
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!loulthine·pénicilline
.
-......·0/
Ctf.pirinc (Ccfaprin)
II
cerradinc
- Pénicillines orales :
C
Cêfalexinc
cer.droxil
PhCooxypéniciliines :
Penicilline v
PhtnCthicilline
OLiGOSACCHARIDES OU AMINOSIDES
Propiciliine
....\\-
Clomttocilline
Spectre large.
- Néomycine
Groupe de /8 méthicilline
~~
- Str<plomycinc
Dihydrostrcptomycine
Framyce:tine
' .., "
Spectre: celui de la pénicilline G; ces produits sont moins actifs que cette
Kanamycinc
Paromomycine
dernière, mais ils ne sont pas inactivés par la pénicillinase du Staphylocoque.
Genlamicine
-
SpoectÎnomycine
Tobnmyeinc
o
D'où leur unique indication: infections à Staphylocoques producteurs de péni-
Lividomycine
cillinase.
CO
Amikacinc
,.
- Melhiciliine
GROUPE DU CHLORAMPHÉNICOL
- Oucillinc
d-
.
Cloxacilline
~ "lll~
Spectre large. Antibiotiques ~Iectifs des fièvres lypho-paratyphoïdiques.
Dicloxacllilnc ,
'.~ l~
~ -CH.
.
~,.()
Chloramphénicol
Thi.mphenicol
Pénicillines à/8rge spectre
Actives aussi sur certains bacilles gram négatifs,
Tous ces produits sont inactivés par les pénicil/inases. y compris celle du
TÉTRACYCLINES
Staphylocoque.
- Ampicilline.
Spectre large.
- Dérivés et analogues de l'ampicilline :
TêLr3cyclinc
Rolitc:tracyclinc
OX)1etraeycline
Melh'acyeline
Amoxieiiline
Chlonelr.n·c1ine
Doxycycline
Pivampicilline
Demtlhyl,-<:hlonetracyclJne
Minocycline
MélDmpicilline
ltêlacillÎne
Epicilline
MACROLIDES ET APPARENTÉS
- Carhénicilline : peul êlre a.:~il'e sur le /'yocyanique ct les Proteus résis-
(:lnts à l'nmpicillille.
Spectre limite: coques gram positifs el négatifs. bacilles gram positifs.
.....
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CLASSIFICATION
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CLASSIFICA TiON
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Macrolides vrais:
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Emhromycinc
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DÉRIVÉS DES NITROFURANES
Obndomyeine
spiramyeine
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Spectre large,
J
i
-
üncomycincs:
1
Nitrofuranloinc
j:
Furarolidonc
unct>mycir><
ii
NifunnaUck
Oindamycine
Synergistines (excellents anlistaphylococciques) :
SULFAMIDES
PrisliAamyeine
YlflÎmY':ine
Spectre large,
k
/
Il Sulfamides non Bssociés.-
0'-.,
Pour infC{:tions générales:
mFAMYCINES '
_ CompoJës ,; ;liminolion lenlt
Compost's ,; élimina/ion rapidt
Spectre limité: coques gram positifs et négatifs, bacilles gram positifs.
SulfapyYidine
Suif.methoxydiaLine
Rj{amycine SV
Sulf.lhi:uol
Sulf.molole
- Spectre large:
Sulf.diaLine
Sulfadimdhoxine
SulfamethaLine
' \\
Sulf.melomidioe
'"}.
Sulf.furaLol
Rifampicine
Sulf.melhoxypyrid "i ne
Sulf.meraline
",~'I".
c..
- Pour infections urinaires:
POL YPEPTIDES
q
••
SulfarnanoxaLOl<
-
Polymyxines (Polymyxine B - Polymyxine E ou coJistine):
SulfameWlol
Spectre étroit: bacilles gram négatifs sauf Proteus, Providencia, Serratia,
- Pour Înfections intestinales:
M
Bacteroides.
CO
- Bacitracine - Tyrothricine.
Sulf3~u;anidine:
Spectre étroit: bactéries gram positives,
S uc.:in ylsu Ifalh iaLol
Phlalyl",lfalhiazol
5.alazosulfapyrid i ne
QUINOLONES
•
Une association d'un sulfamide il une diaminopyrimidine
Spectre étroit: bactéries gram négatives,
Sulf.mi:lho'alole-trimi:lhoprime
Indication: infections urinaires essentiellement.
VANCOMYCINE
Acide nalidilique
Acide pipémidique
Acide ololinique (aurait un spectre plus large)
Spectre étroit : bactéries gram positives (surtout Staphylocoque et ~!lléro­
coque), Utilisation exceptionnelle, uniquement en milieu hospitalier.
DÉRIVÉS DE l'OXYQUINOlÉINE
NOVOBIOCINE ET ACIDE FUSIDIQUE
Spectre large,
Speclre Clroit
i1lllislaphylococciques mineurs,
Nil1llloline
ChloroioOOquine
Mrthyloline
MÊTRONlDAZOLE
Spectre: hactcrics anacrobies il l'exception des Propionibacterium,
i-

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LES OLIGOSACCHARIDES
ou AMINOSIDES OU AMINOGLUCOSIDES
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C~b
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:
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2
H2N'o-r---l-j
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Tobramycine
o~H20HOH
HO
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CHïNH2
H H-C-HN
2
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St rep.tomycine
HH
Néomycine
NH 2
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HO
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Cycle désoxystreptamirie
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Amikacine
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Cycle désoxys\\rep\\amlne
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Minocycline
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Acide oxolinique
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LES MACROLlDES
ET
ANTIBIOTIQUES APPARENTÉS
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3-Isolement des souches
4-Détection de l'activité antibactérienne
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CHAPITRE III:Résultats
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lIll-Numération des échantillons de terre
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2-Sélection des souches
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