REPUBLIQUE DE COTE D'IVOIRE
Union-Discipline-'fravail
FACULTE
DES SCIENCES ET TECHNIQUES
Présentée à la Faculté des Sciences et T§chniQue_~~
_
de l'Université Nationale de Côte 1;I~~ll AFRICAIN ET MAlGA HE
POUR L'ENSEIGNEMENT SU PERI UR
1
• C. A. M. E. S. -
OUAGAOpU
U
Pour obtenir le grade de
l'Arrivée ...3.,. Ote. 2.001.. ..
DOCTEUR DE 3ème CYCLE ès-SCIENc~~~fi~':. :
Spécialité: BIOCHIMIE
Par
KOUAME LUCIEN-PATRICE
(Maître-ès-Sciences de BIOCHIMIE)
THEME:
~'
lf •
~.
~1
~r·
Soutenue le.Ül.l.12.11994 devant la commission d'examen composée de :
Président
Monsieur DIOPOH K. Jacques
Professeur à l'Université
Nationale de Côte d'Ivoire
Examinateurs:
Monsieur KAMENAN Alphonse
Professeur à l'Université
Nationale de Côte d'Ivoire
Monsieur
TANO Yao
Maître de Conférences à l'Université
Nationale de Côte d'Ivoire
Monsieur YEBOlJA A. François
Maître-Assistant à j'Université
Nationale de Côte d'Ivoire

---

REMERCIEMENTS
Ce travail a été effectué au Laboratoire de Biochimie Appliquée de la
Faculté des Sciences et Techniques de l'Université Nationale de Côte
d'Ivoire.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Monsieur le Professeur DIOPOH
Koré Jacques. Malgré ses nombreuses tâches, il n'a pas hésité à consacrer
une partie de son temps à orienter ce travail et présider ce jury. Qu'il
trouve ici le témoignage de mon profond respect, de ma sincère
admiration et de mon fidèle attachement.
Je tiens également à remerCIer Monsieur le Professeur KAMENAN
Alphonse pour la sollicitude qu'il m'a témoignée et les conseils judicieux
qu'il m'a donnés. C'est un réel plaisir pour moi de le retrouver comme
membre de ce jury et de pouvoir ainsi lui exprimer le témoignage de ma
respectueuse reconnaissance.
Au Docteur YEBOUA
Aka
François,
je
lui
expnme
toute
ma
reconnaissance pour avoir consacré une partie de son temps à m'initier à
la recherche. Je lui témoigne mon profond respect et de ma sincère
admiration.
Je SUIS sensible à l'honneur que me fait le Docteur TANO Yao en
acceptant de faire partie de ce jury et l'assure de
mes
sincères
remerciements.

---

Que le Professeur GUEDE Guina Fréderic, Directeur du département de
Biochimie trouve ici ma reconnaissance et mes remerciements les plus
vifs.
Je remercie également le Professeur YAPÛ Abbé, Doyen de la Faculté de
Phannacie pour ses conseils et encouragements.
Que le Docteur DlûMANDE Mahama trouve ici le témoignage de ma
sincère reconnaissance.
A tous les enseignants du Département de Biochimie, je les prie de bien
vouloir accepter mes remerciements pour l'importance qu'ils ont accordé
à ma fonnation.
Ma reconnaissance va aussi au Docteur DIAN Kouadio et à Monsieur
KOFFI Koublan Edmond, Chercheurs à l'Institut des Forêts, Département
des plantes à Latex (IDEFÛR-DPL) pour cette fructueuse collaboration.
Je suis reconnaissant envers tous mes amis des laboratoires de Biochimie
appliquée et d'Antigène qui m'ont pennis de vivre dans une ambiance
chaleureuse. Je nomme:
- BA Bocar Ciré,
- SORO Yadé René,
- KIKI-Mvouaka Solange,
- SEA Téhi Bernard,
- KOUADIû N'guessan Eugène Jean-Parfait,
- EZÛUA Pierre,
- KOU AME Akissi Françoise,

---

- KOUAME Jean-Sébastien,
- KOFFI Kouakou Mathias,
- NIAMKEY Lamine Sébastien,
- BAHI Calixte,
- DJYH Bernard Nazaire,
- DJAMAN Allico Joseph,
- N'GUESSAN Jean-David,
- MOBIO Philomène.
Je ne saurais oublier le personnel administratif et technique, en particulier
Messieurs N'DOUME Clément et YAPI Yapi Daniel pour leur aide très
utile dans divers domaines.

---

A Ma Mère,
je te remercie infiniment pour les sacrifices énormes que tu as bien voulu
consentir pour moi. Que le seigneur te garde longtemps en bonne santé
sur cette terre. Ce travail n'est qu'un modeste témoignage de mon amour
filial et de ma reconnaissance.
A Mon arrière Grande-Mère,
je te remercie du fond du coeur pour tout ce que tu as fait pour moi. Paix
à ton âme.
A Mon Père,
que ce travail soit un gage sincère de mon immense amour.
A Ma Fiancée Josephine KOMAN,
tu m'as épaulé dans tous les domaines. Je t'en suis reconnaissant. Je n'ai
aucun mot pour traduire la profondeur de mes sentiments à ton égard.
A mon grand oncle AYEKOE N'cho,
Je te remercie infiniment pour le soutien moral et matériel que tu m'as
apporté tout au long de mes études. Que le seigneur te garde longtemps
sur cette terre.
A Ma petite soeur Ines-Kady Reine-Désirée AYEKOE,
en témoignage de mon profond amour, je te dédie ce travail.

---

A Mon Oncle ASSI Ben,
je te remercie pour tes encouragements et conseils.
A tous mes parents pour qui cette réussite constitue une source
de joie,
Je vous remerCIe.
A tous mes amis :
en particulier,
ASSAMÜI Assamoi Barthélemy,
ASSAMÜI Isidore Dos Abbé,
N'GUESSAN N'guessan Vincent,
ASSIKA Alain,
ce travail est le fruit de notre profonde amitié.
A Madame Gbocho,
Jete remercie pour ton soutien moral et financier
A tous les collègues de service de ma mère pour qui ce travail
constitue une source de joie,
Je vous remercie.

---

LISTE DES FIGURES
Page
fig.!: Activités hétérosidasiques des castes neutres de Macrotermes
subhyalinus
'"
,
31
fig.2: Activités oligosaccharidasiques des castes neutres de Macrotermes
subhyalinus
31
fig.3: Activités polysaccharidasiques des castes neutres de
Macrotermes subhyalinus
33
fig.4: Chromatographie sur colonne MONO Q de l'extrait brut
décoloré sur le charbon actif
.36
fig.5: Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12 des protéines
issues du pic 1
37
fig.6: Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12 des protéines
issues du pic II
38
fig.7: Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12 de la
B-glycosidase 1
40
fig.8: Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12 de la
B-glycosidase II
40

---

fig.9: Influence du pH sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside par les
B-glycosidases 1 et n
.43
fig.IO: Int1uence de la température sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside
par les B-glycosidases 1 et n
.43
fi g.ll: Thermostabilité des B-glycosidases 1 et n
.45
fig.12: Détermination des KM et Vm des B-glycosidases 1 et n sur le
B-pNPgIucoside
47
fi g.13: Détermination des KM et Vrn des B-glycosidases 1 et n sur le
B-pNPgalactoside
47
fig.14: Détermination des KM et Vm des B-glycosidases 1 et n sur le
B-pNPxyloside
48
fig.15: Détermination des KM et Vrn des B-glycosidases 1 et n sur le
cellobiose
48
fi g.16: Détermination des poids moléculaires des B-glycosidases 1 et n
par gel filtration sur SUPEROSE 12
51
fi g.l 7: Détermination des poids moléculaires des B-glycosidases 1 et n
par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS .51
fig.l8: Hydrolyse trypsique des B-glycosidases 1 et II
53
fig.19: Dosage des groupements thiols des B-glycosidases 1 et II
53

---

fig.20: Actions de Cu++ et de Sr++ sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
54
fig.2I: Actions de Ca++ et de Hg++sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
54
++
fig.22: Actions de Cd++ et de Co sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
55
fig.23: Actions de
~ l'EDTA
sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
,
'" ..55
fig.24: Actions
de K+ et de Ni++
sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
56
fig.25: Actions de Na+ et de Mn++ sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
56
fig.26: Actions de Ba++ et de Fe+++sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
58
fï g.2 7: Action de Mg++ et de Zn++sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
58
fig.28: Actions du benzoate et de l'hydrogénophosphate sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
59

---

fig.29: Action du Tris sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et 11..
59
fig.30: Action de l'azide de sodium sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et 11.
61
fig.3I: Action inhibitrice du glucose sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside
par la B-glycosidase 1..
62
fig.32: Action inhibitrice du glucose sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside
par la B-glycosidase II
62
fig.33: Action inhibitrice du galactose sur l'hydrolyse du
B-pNPglucoside par la B-glycosidase 1..
63
fig.34: Action inhibitrice du galactose sur l'hydrolyse du
B-pNPglucoside par la B-glycosidase II
63
fig.35: Action inhibitrice du xylose sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside
par la B-glycosidase 1
64
fig.36: Action inhibitrice du xylose sur l'hydrolyse du B-pNPglucoside
par la B-glycosidase II
64
fig.37 Actions du mercaptoéthanol et du pHMB sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
66

---

LISTE DES TABLEAUX
Page
Tableau 1 : Bilan global de la purification des B-glycosidases 1 et II
provenant de l'extrait brut des ouvriers de Macrotermes
subhyalinus.."
41
Tableau II : Paramètres cinétiques apparents pour l'hydrolyse de
quelques glycosides par les B-glycosidases 1 et II
.49
Tableau III : Etude de compétition entre substrats libérant du
pNP
50
Tableau IV: Constantes d'inhibition du galactose, du glucose et du
xylose sur les B-glycosidases 1 et II
'"
65
Tableau V: Valeurs des activités spécifiques pour divers extraits
bruts
69
Tableau VI: Valeurs des PM et des pH optimums pour diverses
B-glycosidases l···· .. ··············································· .....72

---

LISTE DES PHOTOS
Page
Photo 1 : Une termitière de Macrotermes subhyalinus dans le centre
d'élevage de la Faculté des Sciences et Techniques de
l'Université Nationale de Côte d'Ivoire
9
Photo 2: Différentes castes neutres de Macrotermes subhyalinus ..... .15
Photo 3: Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS
42

---

ABREVIATIONS
a-pNPglucoside
: para-Nitrophényl-a-D-glucoside
B-GI
: B-glycosidase 1
B-GII
: B-glycosidase II
Cellulose micro.
: Cellulose microcristalline
CMC
: Carboxyméthylcellulose
Conc.
: Concentration
Da
:Dalton
DTNB
: Acide dinitro-2,2'-dithio-5,5'-dibenzoïque
EDTA
: Ethylène diamine tétra-acétate
G-Pdéshydrogénase
: Glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase
Kda
: Kilodalton
Ilmole
: Micromole
pHMB
: para-Hydroxymercuribenzoate
PM
: Poids Moléculaire
pNP
: para-Nitrophénol
pNPglycoside
: para-Nitrophényl D-glycoside
SAB
: Serum Albumine Bovine
SDS
: Sodium Dodécyl Sulfate
B-pNPgalactoside ou Gal: para-Nitrophényl-B-D-galactoside
B-pNPglucoside ou Glu : para-Nitrophényl-B-D-glucoside
B-pNPxyloside ou Xyl
: para-Nitrophényl-B-D-xyloside
TNB
: Thionitrobenzoate
Tris
: Tris-(hydroxyméthyl) aminométhane
UI
: Unité internationale (activité relative)

---

SOMMAIRE
Page
1. INTRODUCTION
1
II. MATERIEL ET METHODES
12
1. MATERIEL
13
1.1. Provenance des produits chimiques
13
1.1.1. Sigma chemical company st Louis, USA
13
1.1.2. Merck, Darmstadt, Allemagne
13
1.1.3. Pro1abo, Paris-France
13
1.1.4. BDH Laboratory reagents, Angleterre
.13
1.2. Provenance et biologie de l'espèce Macrotennes
subhyalinus
14
2. METHODES
14
2.1. Extraction des osidases
14
2.2.Techniques de dosage
16
2.2.1 Mesure des activités enzymatiques
16
2.2.1.1. Choix des substrats
16
2.2.1.2. Dosage du para- Nitrophénol..
17
2.2.1.3. Dosage du glucose par la glucose
oxydase.... .!7
2.2.1.4. Dosage des sucres réducteurs
.18
2.2.2. Dosage des protéines
19
2.3. Techniques chromatographiques
20
2.3.1. Colonne d'échangeurs anioniques
(MONOQ HR 5/5 PHARMACIA)
20
2.3.2. Colonne d'exclusion moléculaire
(SUPEROSE 12 HR 10/30 PHARMACIA)
21
2.3.3. Détennination des poids moléculaires
des B-glycosidases 1 et II par gel filtration
21
2.4. Techniques électrophorétiques
22
2.4.1. Préparation du gel et migration
23
2.4.2. Révélation au nitrate d'argent.
23
2.5. Détennination des caractéristiques cinétiques des
B-glycosidases 1 et II
24
2.5.1. PH optimum
24
2.5.2. Température optimale
'"
25
2.5.3. Thermostabilité
25

---

2.5.4. Stabilité en fonction du temps de
conservation
25
2.5.5. Constantes de MICHAELIS et MENTEN
26
2.5.6. Compétition entre substrats libérant du
para-Nitrophénol..
26
2.5.7. Hydrolyse trypsique
27
2.5.8. Actions des effecteurs sur l'activité
catalytique
27
2.5.9. Dosage des fonctions thiols
28
III. RESULTATS ET DISCUSSION
29
1. RESULTATS
30
1.1. Dégradation des osides chez Macrotermes
subhyalinus
30
1.1.1. Hétérosides
30
1.1.2. Oligosaccharides
30
1.1.3. Polysaccharides
32
1.2. Purification
34
1.2.1. Décoloration de l'extrait brut sur du
charbon actif
34
1.2.2. Chromatographie sur colonne MONO Q
35
1.2.3. Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12..35
1.2.4. Chromatographie à nouveau sur colonne
SUPEROSE 12
39
1.3. Propriétés cinétiques des B-glycosidases 1 et 11..
39
1.3.1. pH optimum
39
1.3.2. Température optimale
39
1.3.3. Thermostabilité
.44
1.3.4. Stabilité et conservation
.44
1.3.5. Spécificité de substrats
.44
1.3.6. Détermination des KM et Vm
.46
1.3.7. Compétition entre substrats libérant du
para- Nitrophénol.
.46
1.4. Propriétés moléculaires
.46
1.4.1. Détermination des poids moléculaires par
gel filtration
46
1.4.2. Détermination des poids moléculaires
par électrophorèse en présence de SDS
.46
1.4.3. Hydrolyse trypsique
52
1.4.4. Dosage des fonctions thiols
52

---

1.5. Actions de quelques effecteurs sur l'activité
catalytique
52
1.5.1. Actions des cations
52
1.5.2. Actions des anions
57
1.5.3. Actions des amines
57
1.5.4. Actions des produits d'hydrolyse
60
1.5.5. Actions de quelques réactifs de marquage
60
2. DISCUSSION
67
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
76
V. BIBLIOGRAPHIE
80

---

1
1 I.INTRODUCTION 1

---

2
La cellulose est le polymère essentiel des végétaux. Elle constitue une
source de sucres (glucose) disponible pour les êtres vivants. C'est un
homopolysaccharide linéaire non ramifié, formé de 10 000 (ou plus)
unités de D-glucose unies par des liaisons glycosidiques B(1-4). Son
hydrolyse en glucose est réalisée par un complexe enzymatique appelé
complexe cellulasique. Ce complexe est constitué de trois enzymes qui
sont:
-l'exo-1,4-B-D-glucanase ou
1,4-B-D-glucane
cellobiohydrolase,
Ec.3.2.1.91.,
-1'endo-1,4-B-D-glucanase
ou
1,4-B-D-glucane
glucohydrolase,
Ec.3.2.1.4.,
-la B-1,4-glucosidase ou B-D-glucoside glucohydrolase, Ec.3.2.1.21.
(REESE et coll., 1950).
L'endo-1,4-B-D-glucanase clive au hasard
les
liaisons
B(1-4)
internes à partir de l'extrémité réductrice de la chaîne de cellulose
(HALLIWELL et RIAZ, 1970).
L'exo-1,4-B-D-glucanase libère des
unités
de
cellobiosyles à
l'extrémité non réductrice de la molécule de cellulose (WOOD et MAC
CRAE, 1972 ; HALLIWELL et GRIFFIN, 1973 ; BERGHEM et
PETTERSSON,1974).
La B-1,4-glucosidase hydrolyse le cellobiose (LI et coll., 1965) ou
des cellodextrines de faibles poids moléculaires en donnant du glucose
(UMEZURIKE, 1979).
Beaucoup de microorganismes sont capables de sécréter des cellulases.
Les meilleures souches reconnues
sont celles de
Trichoderma
et
particulièrement
Trichoderma
reesei.
Elles
secrètent
le
complexe
cellulasique pour l'hydrolyse de la cellulose microcristalline en glucose
(RYU et MANDELS, 1980); mais ces microorganismes ne produisent pas
une quantité suffisante de cellulase pour une utilisation pratique. Afin de

---

3
proposer de nouvelles sources cellulasiques utilisables dans les processus
de transformation biotechnologique, des chercheurs se sont intéressés à
l'étude des processus de cellulolyse chez les termites.
Les termites ne peuvent vivre isolés. Ils sont tous étroitement
solidaires dans une société. Ce sont des insectes sociaux. Les essaimants
possèdent deux paires d'ailes membraneuses presque semblables et
sensiblement égales. Pour cette raison, on les appelle isoptères. Ils se
nourrissent essentiellement de matières végétales. On les divise en deux
grands groupes: les termites inférieurs et les termites supérieurs.
Les termites inférieurs sont constitués de cinq familles:
- les Mastotermitidae (BACHELIER, 1978): ils sont représentés par
une seule espèce primitive d'Australie septentrionale ; Mastotermes
darwiniensis,
- les Kalotermitidae (BACHELIER, 1978): ce sont des termites
primitifs sans ouvriers. Ils forment des colonies renfermant au maximum
5 000 individus. Le genre Cryptotermes est commun à toute l'Afrique
occidentale,
- les Hodotermitidae (BACHELIER, 1978): ils forment des colonies
complètes avec des ouvriers et des soldats. Les espèces sont peu
nombreuses dans cette famille,
- les Rhinotermitidae (BACHELIER, 1978) : cette famille renferme
peu de genres. On y trouve le genre Coptotermes dont les soldats
possèdent une glande frontale rejetant un liquide blanc visqueux, d'où le
nom "termite à latex" donné à ces insectes,
- les Serritermitidae du Brésil : ils représentaient une anCIenne
sous-famille des Rhinotermitidae (BACHELIER, 1978).
Les termites inférieurs possèdent dans leur tube digestif des zooflagellés,
des spirochètes, et des bactéries (CLEVELAND, 1923 ; BREZNAK et
PANKRATZ, 1977). Les bactéries et les spirochètes forment sur les

---

4
flagellés une vêture schizophitique (DUBOSCQ et GRASSE, 1926
GRASSE, 1926a et 1926b). Les bactéries des termites appartenant aux
genres Reticulitermes, Parotermes, Kalotermes, Zootermopsis, Neotermes
et Amitermes sont capables de dégrader la cellulose (BECKWITH et
ROSE, 1929). FRENCH (1975) constate que les bactéries isolées à partir
de la panse de Coptotermes lacteus ne digèrent pas certains sucres tels que
le glucose, le mannose, le galactose, mais produisent une cellulase et
plusieurs autres enzymes. La quantité des protozoaires est considérable eu
égard à la taille du termite. Ainsi KATZIN et KIRBY (1939) ont montré
que
chez
le
termite
Zootermopsis
angusticollis,
les
protozoaires
représentent 31 à 34 pour cent de la masse de la nymphe et 16 à 19 pour
cent de la masse du soldat. CLEVELAND (1923) supposait que les
zooflagellés, grâce à leurs enzymes, transformaient la cellulose en
glucose. TRAGER (1932), après
avoir découvert
l'existence
d'une
cellulase dans l'intestin du termite Zootermopsis angusticollis, supposait
que cette enzyme
était produite par des zooflagellés symbiotiques. En
1934, il a cultivé certains d'entre eux en milieu artificiel contenant de la
cellulose (papier whatman N°40). Il a trouvé que les zooflagellés digèrent
la cellulose. YAMIN (1978), Y AMIN et TRAGER (1979) ont réalisé la
culture pure sans aucune bactérie (culture axénique) de Trichomitopsis
démontrant que le zooflagellé est bien l'agent responsable de la digestion
du bois car il est dépourvu de bactéries symbiotiques intracytoplasmiques.
MONTALENTI (1932) constatait que la cellulose est attaquée par le suc
intestinal de Kalotermes jlavicollis. YAMAOKA et NAGATANI (1975)
ont trouvé une cellulase dans la glande salivaire du termite Reticulitermes
speratus. Une faible activité est détectée dans les intestins antérieur et
moyen. Les travaux de HUNGATE (1936, 1946) lui ont permis de
conclure que le ZLJotermopsis, sans l'aide de ses flagellés, digère par lui
même un tiers de la cellulose alimentaire. Le reste est digéré par les

---

5
flagellés symbiotiques. HUNGATE ne trouvant pas de glucose dans le
tube digestif des tennites, en déduit que les zooflagellés font subir au
glucose provenant de l'action des cellulases sur la
cellulose
une
fermentation anaérobie. Les produits issus de cette fermentation diffusent
dans le fluide de la panse et sont utilisés par l'insecte en tant que
métabolites. Ainsi YAMIN (1980) a étudié les produits de dégradation de
la cellulose marquée par le zooflagellé
Trichomitopsis
termopsis,
symbiote intestinal des Zootermopsis. Il a trouvé que le dioxyde de
carbone et l'acétate libérés étaient marqués. Toutes ces découvertes ont
pennis à GRASSE (1982) de conclure que l'intestin moyen des termites à
zooflagellés produit des cellulases et des cellobiases aboutissant à la
dégradation complète de la cellulose. Les zooflagellés de la panse rectale
digèrent le bois en totalité et rejettent dans le liquide de la panse des
cellulases et de la cellobiase. La production des enzymes cellulolytiques
explique la survie des termites pendant les quelques semaines qui suivent
la disparition de leurs zooflagellés.
Les termites supérieurs représentent les deux tiers de l'ensemble
des isoptères. Ils sont regroupés dans une seule grande famille appelée
Termitidae, Nestwood Les Termitidae représentent les neuf dixièmes des
termites africains. Cette grande famille est subdivisée en quatre sous-
familles qui sont:
- les Apicotermitinae,
- les Nasutitermitinae,
- les Termitinae,
- les Macrotermitinae.
Les
Macrotermitinae
regroupent
l'ensemble
des
termites
champignonnistes. De part leur taille et l'importance de leurs colonies, ils
sont parmi les plus actifs. Ils confectionnent dans leur nid des meules à
champignons composées de fragments de bois, de feuilles et de chaumes

---

6
de graminées malaxés par les pièces buccales et imbibées de salive
(BATHELLIER, 1927 ; GRASSE, 1937 ; GRASSE et NOIROT, 1958).
Ces meules constituent un milieu favorable au développement de
champignons dont les mycéliums prospèrent dans leur épaisseur et à la
surface. les Termitomyces (Basidiomycètes) notamment donnent sur les
meules des mycotêtes qui sont des sphérules d'un blanc pur constitué de
filaments conidiophores. Les Xylaria (Ascomycètes) y végètent mais n'y
fructifient pas (GRASSE, 1970 ; JOSENS, 1971). La germination et la
croissance des champignons autres que le champignon symbiotique sont
inhibées dans la termitière par cinq facteurs qui sont:
- le mécanisme d'activité du termite,
- l'inhibition par la salive et autres sécrétions du termite,
- le microclimat du nid,
- les antibiotiques produits par les Termitomyces,
- la composition chimique de la meule (THOMAS, 1987 a).
Les mycotêtes sont consommées
par
les
ouvriers,
peut-être
leur
apportent-elles certaines vitamines ? (GRASSE,
1970). Macrotennes
subhyalinus dans un écosystème semi-aride (Kajiado, Kenya) consomme à
lui seul 20 à 30 pour cent de la totalité de l'herbe disponible. En période
de disette, il peut subsister quelques temps grâce à sa réserve (LEPAGE,
1979). Chez Macrotennes michaelseni, les grands ouvriers représentent la
majorité des castes récoltantes à la surface du sol (60 à 85 pour cent). Les
petits ouvriers sont peu abondants (10 à 15 pour cent) (LEPAGE, 1981).
Les Macrotennitinae
peuvent être attaqués pendant la récolte par les
fourmis Megaponera foetens (LONGHURST et HOWSE, 1979). Dans le
tube digestif du termite
champignonniste Macrotennes natalensis se
trouve le complexe enzymatique nécessaire à l'hydrolyse de la cellulose.
Ainsi, la B-glucosidase et l'endo-B-D-glucanase seraient secrétées par les
glandes salivaires ou par les cellules épithéliales de l'intestin moyen du

---

7
tennite et la sécrétion de l'exo-B-D-glucanase serait l'oeuvre
des
champignons symbiotiques (MARTIN et MARTIN, 1978). ROULAND
(1986) a montré que le tennite Macrotermes mulleri possède dans son
tube digestif un équipement osidasique varié et très actif au niveau des
polysaccharides.
L'ensemble de ces résultats met en relief la complexité et la
diversité des relations symbiotiques entre les microorganismes et les
tennites. Il permet de comprendre l'impressionnante capacité des termites
de dégrader les différents composés du bois (cellulose, hémicellulose etc.)
qui sont des molécules difficiles à transformer et dont une valorisation
économique serait essentielle pour la Côte-d'Ivoire. C'est pour cette
raison que le Laboratoire de Biochimie appliquée de la Faculté des
Sciences et Techniques de l'Universite Nationale de Côte-d'Ivoire a
entrepris l'étude des propriétés cellulolytiques des termites de Côte-
d'Ivoire et leur utilisation pour l'hydrolyse des matières végétales
cellulosiques en sucres fennentescibles nécessaires à la fermentation
alcoolique.
Notre choix s'est porté sur les tennites Macrotermes subhyalinus parce
qu'ils sont facilement disponibles et possèdent dans leur tube digestif une
grande activité cellulasique (ABO-KHATWA, 1978 ; KAMAYEN, 1989).
On les rencontre dans les savanes sèches et les steppes (NOIROT, 1955).
Leur nid est épigé et présente un aspect mamelonné composé d'un seul
cône ou d'un cône principal avec un ou plusieurs cône(s) accessoire(s). Il
est protégé par une muraille massive très épaisse et sans exoécie. Sous
cette muraille de 40 cm d'épaisseur en moyenne, se trouve en contact
direct l'habitacle dans lequel sont entreposés des amas de sciure de bois
(GRASSE, 1982). Il n'y a pas de paraécie dans le nid adulte contrairement
à ce qu'on trouve chez Macrotermes bellicosus (GRASSE, 1984).
L'habitacle est fonné de lamelles d'argile fonnant de petites chambres

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8
reliées entre elles. Ces chambres renferment des meules à champignons
étroitement liées les uns les autres. Les meules possèdent des structures
irrégulières (THOMAS, l 987b). La cellule royale, située dans une zone
feuilletée de l'habitacle a une forme ovoïde et aplatie. Le nid ne possède
pas de caves, ni de socles, ni de piliers (GRASSE et NOIROT, 1958;
HAN, 1987). L'évolution du nid conduit à une construction lourde et
massive (BODOT, 1964) (photo 1).
La tête de l'ouvrier de Macrotermes subhyalinus est large. Elle
porte une capsule marron dont les côtés sont légèrement convexes et les
bords postérieurs arrondis.
Les grands soldats possèdent de grosses mandibules noires avec une
base rougeâtre. La tête est rectangulaire et porte une capsule également
rectangulaire légèrement étroite en avant. Les bords du thorax sont
marrons. Les tibias sont plus sombres que les fémurs.
Quant aux petits soldats, leur tête est allongée et leurs côtés presque
droits. La fontanelle est toujours bien visible. La capsule de la tête est
moins sombre que celle du grand soldat. Les mandibules sont minces,
noires avec une base rougeâtre. Le thorax, les fémurs et les tibias ont la
même couleur que l'abdomen (sombre) (RUELLE, 1970).
Chez Macrotermes subhyalinus, la récolte de matériaux est faite par
des ouvriers accompagnés de soldats et presque toujours nuitamment. Les
termites sortent de leur nid après le coucher du soleil par des orifices de
la périécie le plus souvent creusés à deux ou trois mètres dans le sol. De la
termitière épigée, les sorties se font en rangs serrés. Les insectes forment
alors une colonie qui s'élargit au fur et à mesure qu'elle s'éloigne du nid.
Sur les lieux de récolte, les termites s'égaillent mais ne s'éloignent guère
les uns des autres (4,5 ou 6 cm, rarement plus). Ils découpent les
chaumes, les feuilles de graminées gisant sur le sol ou grimpent sur les
plantes sèches et les coupent en petits tronçons. Ils les tiennent entre les

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Photo 1 : Une termitière de M'acrotermes subhyalinus dans Je centre
d'élévage de la Faculté des Sciences et Techniques de
l'Université Nationale de Côte-d'Ivoire

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1 0
mandibules et les transportent jusqu'au nid. A l'aube, tous les termites
regagnent leur demeure. Pendant le jour, les termites Macrotermes
subhyalinus récoltent des particules de bois pour faire de la sciure. Les
ouvriers se nourrissent aussi de bois et autres matières végétales riches en
cellulose qu'ils digèrent par l'intermédiaire de leurs enzymes (GRASSE,
1982).
Le champignon symbiotique de Macrotermes subhyalinus est un
Termitomyces. Le tube digestif ne contient pas de protozoaires. L'intestin
moyen contient en plus des conidiophores, quelques petites chaînes de
Streptococcus (bactéries). La panse contient une grande population de
bactéries gram positif (probablement des Clostridium) et en plus, un
grand nombre de Streptococcus. Les conidiophores des Termitomyces de
la meule de la termitière contiennent des activités exo et endocellulasiques
importantes et une faible activité cellobiasique. Chez le termite, le tube
digestif contient une forte activité cellobiasique et des activités exo et
endocellulasiques importantes. Cintestin moyen produit 75,3 pour cent de
l'activité exocellulasique et 50 pour cent de l'activité endocellulasique
totale du tube digestif du termite. La panse produit 50 pour cent de
l'activité endocellulasique. Tandis que l'intestin postérieur produit 52,3
pour cent de l'activité cellobiasique. Ce qui permet de dire que les exo et
endocellulases ne sont pas produites par le termite lui même ou par des
bactéries symbiotiques, elles peuvent être produites par le champignon
symbiotique. Les cellobiases sont produites soit par les glandes salivaires
soit par les cellules épithéliales de l'intestin moyen du termite (ABO-
KHATW A, 1978).
Au niveau de cette espèce de termite supérieur champignonniste, nous
nous sommes intéressés d'une part à la dégradation des osides, d'autre
part à la purification des B-glucosidases. L'étude de la dégradation des
osides nous permettra de détecter les différentes osidases présentes dans le

---

1 1
tube digestif du tennite. Ce qui pourra nous situer sur la richesse de ce
matériel biologique en osidases et nous donner par la même occasion
quelques éclairages sur l'alimentation par trophallaxie (alimentation à la
becquée) des soldats par les ouvriers (GRASSE, 1982). Quant à la
purification, elle nous permettra de détenniner les propriétés physico-
chimiques des B-glucosidases pour une meilleure compréhension de leur
mode d'action.

---

1 2
1 II.MATERIELS
ET METHODES 1

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1 3
1.MATERIELS
1.1.Provenance des produits chimiques
1.1.1.Sigma chemical conl pany st Louis, USA
Glucose
oxydase,
catalase,
B-pNPxyloside,
cellobiose,
carboxymé-
thylcellulose, cellulose microcristalline, bleu de coomassie G 250,
ovalbumine, persulfate d'ammonium, trypsine, chymotrypsinogène A,
glycéraldéhyde
phosphate
déshydrogénase,
anhydrase
carbonique,
inhibiteur trypsique, a-lactalbumine, NN'-méthylènebis-acrylamide.
1.1.2.Merck, Darmstadt, RFA
a-pNPglucoside, B-pNPglucoside, B-pNPgalactoside, glycogène, amidon,
NaCI, S.D.S, sérum albumine bovine, Tris, glycine, charbon, galactose,
Folin ciocalteus, acrylamide.
1.1.3.Prolabo, Paris, France
O.onizidine, glucose, ribose.
1.1.4.BDH Laboratory reagents, Angleterre
NNN' N'-tétraméthyléthYlènediamine.

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1 4
1.2.Provenance de l'espèce Macrotermes subhyalinus
Les termites Macrotennes subhyalinus étudiés proviennent du centre
d'élevage d'insectes de l'Université Nationale de Côte d'Ivoire dirigé par
le professeur HAN SUN HEAT.
2.METHODES
2.l.Extraction des osidases
Pour les études sur les activités osidasiques, différents broyats totaux ont
été obtenus à partir de grands et petits ouvriers, de grands et petits soldats
dont les poids varient respectivement entre 15 et 27 mg ; 6,3 et 13 mg ;
100 et 165 mg ; 16 et 25 mg (photo 2). En ce qui concerne la purification
des B-glycosidases, nous avons utilisé des broyats totaux de grands et
petits ouvriers de Macrotennes subhyalinus.
Dix grammes de tennites Macrotennes subhyalinus sont lavés à l'eau
distillée, essorés sur papier filtre puis placés dans un récipient disposé
dans un bac à glace. Ils sont ensuite broyés dans 50 ml de NaCI 0,9 pour
cent (Plv) à l'aide d'un microbroyeur ULTRA-TlJRRAX (type T 25). Le
broyat obtenu est centrifugé pendant 30 minutes à 20 ooOg dans une
centrifugeuse réfrigérée SIGMA 3K 20, à une température compnse
entre 0 et SOC. Le surnageant obtenu est filtré sur filtre millipore
(SARTORIUS) pour éliminer les débris de pattes qui s'y trouvent. Les
protéines du filtrat sont précipitées à l'acétone jusqu'à 75 pour cent de
saturation. La solution est maintenue à 4°C pendant plus de 12 heures puis
centrifugée à nouveau dans les mêmes conditions que précédemment. Le
culot obtenu est repris dans 20 ml d'acétone et centrifugé puis séché sous

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Photo 2 : Différentes castes neutres
de Macrotermes-subhyallnus
a-petits ouvriers
b-grands ouvriers
c-petits soldats
d-grands soldats

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1 6
vide. On obtient alors une poudre protéique qui, dissoute dans un tampon,
constitue l'extrait brut.
2.2.Techniques de dosage
2.2.1 Mesure des activités enzymatiques
2.2.1.1 Choix des substrats
Pour l'ensemble des études, nous avons utilisé plusieurs substrats:
- Hétérosides synthétiques
* a et B-pNPglucosides
* B-pNPgalactoside
* B-pNPxyloside
- Olygosaccharides naturels
* cellobiose
* maltose
* saccharose
- Polysaccharides
* amidon
* carboxyméthylcellulose
* cellulose microcristalline
* glycogène

---

1 7
2.2.1.2 Dosage du para-Nitrophénol
Le mélange réactionnel est composé de :
- tampon citrate 0,021 M phosphate 0,058 M pH 5,6 (25 /Jl),
- préparation enzymatique (50 /Jl),
- pNPglycoside 20 mM (50 /Jl).
Le mélange est incubé pendant 15 minutes à 3TC. La réaction
enzymatique est arrêtée par addition de 3 ml d'une solution de carbonate
de sodium à 2 pour cent. L'activité enzymatique se manifeste par
l'apparition d'une coloration jaune caractéristique du para-Nitrophénol
produit par la réaction d'hydrolyse du pNPglycoside. La quantité du para-
Nitrophénol libérée est déterminée au spectrophotomètre à une longueur
d'onde de 400 llffi. Les densités optiques obtenues sont converties en
micromole
de
para-Nitrophénol
grâce
à une
droite
d'étalonnage.
L'activité enzymatique est exprimée soit en activité spécifique (micromole
de para-Nitrophénol par minute par milligramme de protéine), soit en
activité relative (micromole de para-Nitrophénol par minute par millilitre
de solution protéique; micromole de para-Nitrophénol par minute).
2.2.1.3 Dosage du glucose par la glucose oxydase
Le milieu réactionnel est composé de:
- tampon citrate 0,021 M, phosphate 0,058 M pH 5,6 (50 /Jl),
- solution enzymatique (100 /Jl),
- oligosaccharide naturel réducteur 20 mM (100 /Jl).
Le mélange est incubé pendant 20 minutes à 3TC. Le glucose libéré est
dosé par une technique utilisant la glucose oxydase. Trois ml d'une
solution de glucose oxydase préparée selon la technique de WERNER et
coll. (1970) sont ensuite ajoutés. La coloration se développe à l'obscurité

---

1 8
et à la température ambiante pendant 45 minutes. L'intensité de la
coloration est déterminée au spectrophotomètre à une longueur d'onde de
400 nm. Une courbe d'étalonnage nous a permis de convertir les densités
optiques en micromole de glucose. L'activité enzymatique est exprimée en
micromole de glucose par minute par milligramme de protéine ou en
micromole de glucose par minute.
2.2.1.4 Dosage des sucres réducteurs
Pour déterminer la quantité de sucres réducteurs présents dans les
préparations enzymatiques ou produits par l'hydrolyse de polysaccharides
ou du saccharose, nous avons utilisé la méthode au DNS (BERNFERD,
1955). Le réactif utilisé contient:
- 1 g de DNS,
- 1,6 g de soude en pastilles,
- 30 g de tartrate double de potassium et de sodium pour un volume
total de 100 ml.
Le milieu réactionnel est composé de :
- tampon citrate 0,021 M, phosphate 0,058 M pH 5,6 (50 ~ll),
- polysaccharide soluble (1 à 2 pour cent (p/v)) dans le tampon
citrate 0,021 M, phosphate 0,058 M pH 5,6 (100 Ill),
- solution enzymatique (100 Ill).
Pour la cellulose microcristalline non soluble dans le tampon citrate
phosphate, le milieu réactionnel est constitué de la manière suivante:
- tampon citrate 0,021 M phosphate, 0,058 M pH 5,6 (200 Ill),
- solution enzymatique (200 Ill),
- cellulose microcristalline (l0 mg).
L'incubation a lieu à 3rC pendant 20 minutes pour les polysaccharides
solubles en milieu aqueux et 1 heure pour la cellulose microcristalline non

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1 9
soluble dans ce milieu. Puis, 250 III d'une solution de DNS sont ajoutés au
milieu réactionnel pour les substrats solubles en milieu aqueux et 400 pl
de DNS pour la cellulose microcristalline. Les milieux réactionnels sont
chauffés au bain marie bouillant pendant 5 minutes puis refroidis dans la
glace. Les densités optiques sont mesurées à 540 nm au spectrophotomètre
après avoir ajouté 6 ml d'eau distillée dans chaque tube à essai. Elles sont
converties en équivalents glucose grâce à une droite d'étalonnage obtenue
à partir d'une solution de glucose à 0,1 pour cent. L'activité enzymatique
est exprimée en micromole de glucose par minute par milligramme de
protéine.
2.2.2.Dosage des protéines
Les protéines ont été dosées par la méthode de LOWRY et coll. (1951).
Les réactifs utilisés pour le dosage sont les suivants:
Solution A : réactif de FOLIN-CIOCALTEUS dilué de moitié,
Solution B : Na2Co3 à 2 pour cent (plv) dans NaOH 0,1 N,
Solution Cl : CuS04 à 0,5 pour cent (plv) dans de l'eau distillée,
Solution C2 : tartrate double de sodium et de potassium à 1 pour cent
(plv) dans l'eau distillée,
Solution D : préparée extemporanément à partir de 100 III de solution
Cl, 100 JlI de solution C2 et de 10 ml de solution B.
Le dosage s'effectue sur 200 III de préparation protéique et de 2 ml de
solution D. Le mélange est agité et incubé pendant 10 minutes à la
température ambiante. Ensuite, 200 III de solution A y sont ajoutés. Le
milieu réactionnel est agité et laissé reposer pendant 30 minutes pour
pennettre le développement de la coloration. La densité optique de l'essai
est mesurée à 710 nm contre le témoin ne contenant pas d'extrait
protéique. Cette densité optique est ensuite convertie en micromole de

---

20
protéine grâce à une droite d'étalonnage obtenue à l'aide d'une solution de
sérum albumine bovine 0,2 mg/ml.
Pendant la purification, la quantité de protéine est déterminée par mesure
d'absorbance à 280 nm grâce au
détecteur
(SPECTRA
100)
du
chromatographe.
2.3. Techniques chromatographiques
Nous avons utilisé la chromatographie liquide à haute performance
(CLHP). Ce système de haute résolution a été développé par la firme
SPECTRA- PHYSICS, pour la séparation des biomolécules.
2.3.1. Colonne d'échangeurs anioniques (MONO Q HR 5/5
PHARMACIA)
La matrice contient uniquement des amines quaternaires comme groupes
chargés. La colonne a un diamètre de 0,5 cm pour une hauteur de 5 cm.
L'échantillon protéique est déposé avec une seringue ordinaire de 2 ml.
La vitesse d'écoulement est de 60 ml par heure. Nous avons recueilli des
fractions de 1 ml. Pour l'élution des protéines, nous avons appliqué un
gradient linéaire de 0 à 0,8 M de NaCI contenu dans du tampon acétate 20
mM pH 5,6 pendant 40 minutes puis stabilisé à 1 M pendant 10 minutes.
Cinquante fractions sont recueillies grâce à un collecteur GILSON TDC
220 A. Un enregistreur SPECTRA-PHYSICS nous a permis de suivre
l'apparition des pics.

---

21
2.3.2 Colonne d'exclusion moléculaire (SUPEROSE 12 HR
10/30 PHARMACIA)
C'est une colonne qui a une matrice d'agarose. Elle permet une séparation
des protéines de poids moléculaires de 10 à 300 Kda. Elle a 1 cm de
diamètre pour 30 cm de longueur. Les échantillons protéiques sont
déposés sur la colonne avec une seringue ordinaire de 1 ml. Les protéines
sont éluées avec du tampon acétate 20 mM pH 5,6 avec un débit de 60 ml
par heure pendant 50 minutes. Cinquante fractions de 0,5 ml sont
recueillies. Le même enregistreur SPECTRA-PHYSICS nous a permIS
d'obtenir des chromatogrammes.
Après chaque étape de purification, nous avons procédé aux
opérations suivantes:
- dosage systématique des activités enzymatiques dans toutes les
fractions collectées avec le B-pNPglucoside comme substrat,
- les fractions
présentant
une
activité
B-glucosidasique
sont
rassemblées et concentrées grâce à un appareil à dialyse sous vide utilisant
une membrane de type SARTORIUS MEMBRANER FILTER contre le
tampon acétate 20 mM pH 5,6,
- après la dialyse, dosage de l'activité B-glycosidasique et des
protéines,
- une aliquote est prélevée pour l'électrophorèse.
2.3.3.Détermination des poids moléculaires des 8-glycosidases
1 et II par gel filtration
Pour la détermination des poids moléculaires des B-glycosidases 1 et II,
nous avons utilisé des protéines étalons de poids moléculaires connus:
- catalase (240 Kda),

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22
- sérum albumine bovine (68 Kda),
- ovalbumine (45 Kda),
- chymotrypsinogène A (25 Kda),
Les différentes protéines de référence sont chargées séparément sur la
colonne SUPEROSE 12. Le temps d'élution de chaque protéine est
marqué sur le chromatogramme. Connaissant donc les poids moléculaires
des différentes protéines de référence et leur temps d'élution, nous avons
pu alors tracer la courbe des poids moléculaires en fonction des temps
d'élution. Cette courbe d'étalonnage, nous a permis de déterminer les
poids moléculaires des B-glycosidases 1 et II.
2.4.Techniques électrophorétiq ues
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide est réalisée selon la méthode
décrite par LAEMMLI (1970). L'appareil utilisé est de type BIO-RAD
PROTEAN II SLAB CELL. Cette méthode électrophorétique est en effet
compatible avec une coloration des protéines au nitrate d'argent,
coloration très sensible qui permet de détecter jusqu'à 5 nanogrammes de
protéine (GORG et Coll, 1985). Cette méthode permettra non seulement
de suivre la purification des deux formes de B-glycosidases mais aussi
d'estimer leur poids moléculaire en comparant leur migration relative à
celles des marqueurs protéiques de poids moléculaires connus. Nous avons
utilisé:
- la sérum albumine bovine (68 Kda),
- l'ovalbumine (45 Kda),
- la glycéraldéhyde phosphate déshydrogénase (36 Kda),
- l'anhydrase carbonique (29 Kda),
- l'inhibiteur trypsique (20 Kda),
- l'a-lactalbumine (14,2 Kda).

---

23
2.4.l.Préparation du gel et migration
Entre les deux plaques de verre, nous avons coulé d'abord un socle de 0,5
cm d'agarose 1 pour cent (p/v), ensuite le gel de résolution à 12,5. pour
cent d'acrylamide (p/v) jusqu'à 4 cm du bord supérieur de la petite
plaque. Nous avons recouvert cette solution de n-butanol qui assure le
dégazage. Après la polymérisation du gel de résolution, le n-butanol est
enlevé et le gel bien rincé par de l'eau déionisée et distillée. Nous avons
inséré le peigne et coulé alors le gel de concentration (5 pour cent
dfacrylamide (p/v)) sur le gel de résolution. Après la polymérisation, le
peigne est retiré, laissant ainsi apparaître des alvéoles. L'ensemble plaque-
gel est disposé sur un support vertical qui permet de mettre en relation,
par le biais du tampon d'électrophorèse, le haut du gel à la borne négative
du générateur et le bas à la borne positive. La migration est réalisée
durant environ 12 heures sous une intensité de 9,8 mA dans le gel de
concentration et 12 mA dans le gel de résolution avec un tampon Tris
0,25 mM, glycine 194 mM et SDS 0,1 pour cent (p/v) pH 8,7.
2.4.2.Révélation au nitrate d'argent
La révélation est faite au nitrate d'argent selon la méthode décrite par
HELMUT et coll., (1987).
Le gel est traité avec une solution de nitrate d'argent 0,02 pour cent (p/v)
et de formaldéhyde 37 pour cent (v/v) pendant 20 minutes sous agitation.
Il est ensuite rincé avec de l'eau déionisée et distillée pendant 40 minutes.
La coloration du gel est développée en 10 minutes dans une solution
contenant 6 pour cent de carbonate de sodium (p/v), 4.10-5 pour cent de
thiosulfate de sodium (p/v) et de 0,018 pour cent de formaldéhyde (v/v).
Le gel est encore rincé avec de l'eau déionisée et distillée pendant 4

---

24
minutes. Sa coloration est stoppée par immersion pendant 10 minutes dans
une solution d'éthanol/acide acétique/eau déionisée et distillée (5/3, 8/1,
2). Il est lavé avec une solution d'éthanol/eau déionisée et distillée (1/1)
pendant 20 minutes. Après lavage, le gel peut être conservé dans cette
solution à 4°C pendant plusieurs mois.
2.5.Détermination des caractéristiques cinétiques des
fi-glycosidases 1 et II.
2.5.1. pH optimum
Toutes les enzymes sont sensibles aux variations du pH du milieu. Il existe
une zone de pH pour laquelle l'activité enzymatique est maximale.
Le pH optimum d'activité des B-glycosidases 1 et II a été déterminé dans
le tampon citrate, phosphate pH 3 à 7.
2.5.2. Tem pérature optimale
L'activité catalytique des enzymes dépend de l'intégrité de leur structure
en tant que protéine. Une exposition à des températures inappropriées
provoque une dénaturation qui entraîne une perte de leur activité
catalytique. Il est nécessaire de connaître donc la température optimale à
laquelle chaque enzyme présente un maximum d'activité.
L'effet
de
la
température
sur
l'activité
catalytique
des
B-
glycosidases purifiées a été étudié en milieu tampon citrate 0,021 M,
phosphate 0,058 M pH 5,6 à différentes températures (30 à 80°C).

---

25
2.5.3 Thermostabilité
Pour évaluer le degré de stabilité des B-glycosidases purifiées des
ouvriers de Macrotermes subhyalinus, nous avons d'abord incubé chaque
préparation enzymatique à sa température optimale dans le tampon citrate
phosphate correspondant à son pH optimum. Toutes les 10 minutes, nous
avons qjouté dans chaque tube préincubé, 50 1..11 de B-pNPglucoside 20 mM
pour permettre le dosage de l'activité résiduelle dans les conditions
habituelles.
2.5.4.Stabilité en fonction du temps de conservation
Nous avons étudié la stabilité des B-glycosidases 1 et II purifiées dans le
tampon acétate 20 mM pH 5,6 : les solutions protéiques sont conservées à
deux températures (4°C, 2YC) et les activités résiduelles sont dosées
chaque jour.
2.5.5.Constantes de MICHAELIS et MENTEN
Pour la détermination des constantes de MICHAELIS et MENTEN (KM),
nous avons utilisé la méthode de LINEWEAVER et BURK (1934).
2.5.6 Compétition entre substrats libérant du para-
Nitrophénol
Les hétérosides tels que le B-pNPglucoside, le B-pNPgalactoside et le B-
pNPxyloside sont hydrolysés par chacune des deux formes
de B-
glucosidase des ouvriers de Macrotermes subhyalinus. Pour vérifier si ces
activités proviennent d'un ou de plusieurs sites catalytiques de chaque type

---

26
de B-glycosidase, nous avons fait une étude de compétition entre les
substrats hydrolysés. Le schéma réactionnel simplifié en présence d'un
mélange de deux substrats SI et S2 peut s'écrire de la manière suivante:
E + SI <=>ES1 - - - - > E + Pl
Dans le cas où les deux substrats sont hydrolysés par deux enzymes
différentes ou par deux sites de la même enzyme, la vitesse totale (VV de
la réaction en présence d'un mélange de deux substrats doit être la somme
des vitesses des réactions effectuées en présence de chaque substrat.
Dans le cas où on observe une compétition: SI agit comme inhibiteur
compétitif de S2 et réciproquement.
La vitesse totale de la réaction CVt) est alors donnée par la réaction
proposée par DIXON (1964) :
VI (1 + [Sl]IKMI) + V2(1 + [S2]IKM2)
Vt = - - - - - - - - - - - - -
où [S 1] et [S2] représentent les concentrations respectives des substrats SI
et S2. KM1 et KM2 sont les constantes de MICHAELIS ET MENTEN
correspondantes. V 1 est la vitesse mesurée en présence de SI seul à la
concentration [SI] et V2, celle mesurée en présence de S2 seul à la
concentration [S2]. Pour cette étude nous avons utilisé les substrats
suivants en les associant deux à
deux
:
B-pNPglucoside
et
B-
pNPgalactoside; B-pNPglucoside et B-pNPxyloside ; B-pNPxyloside et B-
pNPgalactoside.

---

27
2.5.7. Hydrolyse trypsique
Dans 2 ml d'une solution de 13-glycosidase purifiée (0,020 mg/ml pour la
13-glycosidase II et 0.014 mg/ml pour la 13-glycosidase 1), nous avons
ajouté 2 ml de solution trypsique 0,1 pour cent (PN). Nous avons porté le
mélange à préincuber à 3TC. Des aliquotes de 50 ~l sont prélevées aux
temps indiqués et les activités résiduelles sont déterminées sur le 13-
pNPglucoside 20 mM. Des témoins sans trypsine sont préparés dans les
mêmes conditions. L'activité enzymatique est exprimée en pourcentage de
l'activité en l'absence de trypsine.
2.S.S.Actions des effecteurs sur l'activité catalytique
L'activité d'une enzyme peut être modifiée par la présence de composés
autres que le substrat : on les appelle effecteurs. Ils jouent un rôle
important dans les phénomènes de régulation et sont également forts utiles
dans l'étude des mécanismes d'action des enzymes. On peut les classer en
deux catégories :
-les
activateurs
qUi
augmentent
la
vitesse
de
la
réaction
enzymatique,
-les inhibiteurs qui la réduisent et les inactivateurs qui n'ont aucun
effet.
Pour étudier l'action des effecteurs sur l'activité catalytique des 13-
glycosidases, nous avons réalisé le milieu réactionnel suivant:
-25 ~l de tampon citrate 0,021 M, phosphate 0,058 M pH 5,6,
-50 ~l de solution de 13-glucosidase purifiée,
-50 Ml d'effecteur préparé dans
le tampon citrate 0,021
M,
phosphate 0,058 M pH 5,6.
Ce milieu réactionnel est préincubé pendant 30 minutes à 3TC. Ensuite

---

28
50 III de B-pNPglucoside 20 mM y sont ajoutés pour une incubation de 15
minutes à 3TC. Des témoins sans effecteurs sont préparés dans les mêmes
conditions. L'activité enzymatique est exprimée en pourcentage de
l'activité en l'absence d'effecteurs.
2.5.9. Dosage des fonctions thiols
Le dosage est effectué selon la méthode de ELLMAN (1959) en utilisant
le DTNB.
Les groupements thiols réagissent avec le DTNB pour donner du TNB
qui a un maximum d'absorbance
à
412 nm. Le dosage de ce
chromophore CL M 412=14600) permet de quantifier la substitution des
groupements thiols des B-glycosidases des ouvriers de Macrotermes
subhyalinus.
Un ml d'une solution enzymatique (0,015 mg/ml pour la B-glycosidase II
et 0,012 mg/ml pour la B-glycosidase 1) est incubée dans 1)9 ml de
tampon acétate pH 7 (20 mM) contenant de l'urée 8 M (dénaturant). Nous
avons ajouté ensuite 50 III d'une solution de DTNB 0,01 M. Après
incubation à différents temps à la température ambiante (2Yc), nous
avons mesuré la densité optique à 412 nm contre un témoin ne contenant
pas d'enzymes. Un autre essai a été préparé sans dénaturant pour doser les
groupements thiols accessibles des B-glycosidases natives.

---

29
IIIIoRESULTATS ET DISCUSSION 1

---

30
l.RESULTATS
1.1.Dégradation des osides chez Macrotermes subhyalinus
1.1.1.Hétérosi des
L'étude sur la dégradation des hétérosides nous a pennis de savoir que les
soldats et les ouvriers de Macrotermes subhyalinus possèdent des activités
hétérosidasiques. Ces activités enzymatiques sont plus élevées chez les
ouvriers que chez les soldats (fig. 1). Au niveau des ouvriers, nous avons
observé une différence d'activité hétérosidasique entre les petits et les
grands sur tous les hétérosides étudiés. Ce comportement catalytique est
aussi observé chez les soldats où les petits sont plus actifs que les grands.
Les plus grandes activités hétérosidasiques ont été obtenues avec
l'hétéroside a-pNPglucoside (fig.1). L'activité spécifi.que que nous avons
obtenue pour ce substrat avec les petits ouvriers est 1,5 fois supérieure à
celle des grands ouvriers, 2 fois à celle des petits soldats et 3,8 fois à celle
des
grands
soldats.
Nous
avons
noté
de
faibles
activités
B-
pNPxylosidasiques tant chez les ouvriers que chez les soldats. Cependant,
l'activité spécifique obtenue avec les petits ouvriers est 1,7 fois supérieure
à celle des grands ouvriers, 4 fois à celle des petits soldats et 8 fois à celle
des grands soldats.
1.1.2.0ligosaccharides
Les castes neutres de Macrotermes subhyalinus possèdent des activités
oligosaccharidasiques à travers leur action catalytique sur le saccharose, le
maltose et le cellobiose (fig.2). Sur l'ensemble de ces substrats étudiés,

---

31
UI/mg de protéine
1 ,5
1 ,0
0,5
0,0
Petits ouvriers Grands ouvriers Petits soldats Grands soldats
Catégories de castes neutres
Fig.1 : Activités hétérosidasiques des castes
neutres de Macrotermes subhyalinus
III a - pNPglucoside
liII ~- PNPgalactoside
III ~- PNPglucoside
~ ~-pNPxyloside
VI/mg de protéine
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Petits ouvriers Grands ouvriers
Petits soldats
Grands soldats
Catégories de castes neutres
Fig.2
Activités oligosaccharidasiques des castes
neutres deMacrotermes subhyalinus
•
Cellobiose
Il Maltose
Il Saccharose

---

32
nous avons observé des activités enzymatiques plus élevées chez les
ouvners
que
chez
les
soldats.
Les
plus
grandes
activités
oligosaccharidasiquesont été obtenues avec le cellobiose. Pour ce substrat,
l'activité spécifique obtenue avec les petits ouvriers est sensiblement égale
à celle des grands ouvriers. Elle est cependant 1,2 fois supérieure à celle
des petits soldats et 1,5 fois à celle des grands soldats. Chez les petits
ouvriers, la plus faible activité oligosaccharidasique a été obtenue avec le
maltose. Par contre, chez les grands ouvriers, petits et grands soldats, elle
a été obtenue avec le saccharose. L'activité spécifique obtenue pour la
dégradation du maltose avec les petits ouvriers est 1,4 fois supérieure à
celle des grands ouvriers, 1,7 fois à celle des petits soldats et 1,8 fois à
celle des grands soldats. Quant à la dégradation du saccharose, celle
obtenue avec les petits ouvriers est 2,2 fois supérieure à celle des grands
ouvriers, 2,8 fois à celle des petits soldats et 3,5 fois à celle des grands
soldats.
1.1.3.Polysaccharides
Les
castes
neutres
de
Macrotennes
subhyalinus
hydrolysent
la
carboxyméthylcellulose, la cellulose micro cristalline,
l'amidon
et
le
glycogène (fig.3). Elles possèdent donc des activités polysaccharidasiques.
Ces activités enzymatiques sont plus élevées chez les ouvriers que chez les
soldats. Au niveau des ouvriers, nous avons observé une différence
d'activité polysaccharidasique entre les petits et les grands sur tous les
polysaccharides étudiés. Ce comportement catalytique a été observé aussi
chez les soldats où les petits sont plus actifs que les grands.
Les plus grandes activités polysaccharidasiques ont été obtenues avec la
carboxyméthylcellulose. Pour ce substrat, l'activité spécifique obtenue
avec les petits ouvriers est 1,2 fois supérieure à celle des grands ouvriers,

---

33
DI/mg de protéine
0,3
0,2
0,1
0,0
Petits ouvriers Grands ouvriers Petits soldats Grands soldats
Catégories de castes neutres
Fig.3
Activités
polysaccharidasiques
des castes
neutres de Macrotermes subhyalinus
III CMC
liiI Glycogène
III Amidon
rz:l Cellulose micro.

---

34
3 fois à celle des petits soldats et 6,6 fois à celle des grands soldats. Nous
avons
noté
de
faibles
activités
cellulasiques
avec
la
cellulose
microcristalline qui est un substrat difficile à hydrolyser. Néanmoins nous
avons pu noter que les petits ouvriers sont 1,3 fois plus actifs que les
grands ouvriers, 3 fois plus actifs que les petits soldats et 6,6 fois plus
actifs que les grands soldats. Au niveau de l'amidon, il n'y a pas eu de
différence d'activité amylasique
entre' les
petits et grands soldats.
/-~
Cependant, au niveau des ouvriers nous avons noté une différence
d'activité amylasique. Ainsi nous avons trouvé que les petits ouvriers sont
1,5 fois plus actifs que les grands ouvriers.
1.2.Purification
La purification des B-glycosidases de l'extrait brut des ouvners de
Macrotermes subhyalinus s'est faite en quatre étapes:
-lére étape; décoloration de l'extrait brut sur du charbon actif,
-2ème étape; chromatographie sur colonne MONO Q,
-3ème étape; chromatographie sur colonne SUPEROSE 12,
-4ème étape; chromatographie à nouveau sur colonne
SUPEROSE 12.
1.2.l.Décoloration de l'extrait brut sur du charbon actif
Nous avons dissous 34 mg (trente quatre milligrammes) de poudre
protéique dans 100 ml de tampon citrate 20 mM pH 5,6. La solution
obtenue est appelée extrait brut. Elle a une concentration protéique de
0,25 mg/ml avec une activité spécifique de 0,66 UI/mg. Cette solution est
colorée en rouge brun. Son passage sur du charbon actif (1 °mg sur un

---

35
filtre millipore SARTORIUS) permet de retenir cette coloration et
d'éliminer toutes les substances visqueuses. Nous avons ainsi obtenu une
solution incolore et limpide avec une activité spécifique de 3,70 Ul/mg et
un facteur de purification de 5,60 (tableau 1). L'électrophorèse sur gel de
polyacrylamide nous a révélé tant au niveau de l'extrait brut qu'au niveau
de l'extrait décoloré, plusieurs bandes protéiques (photo 3a, 3b).
1.2.2.Chromatographie sur colonne MONO Q
La solution protéique précédemment décolorée est chromatographiée sur
colonne MONO Q. Cette chromatographie nous a pennis de séparer deux
pics possédant chacun une activité B-glycosidasique (figA). Le premier
pic (B-glycosidase 1) possède une activité spécifique de 3,80 UI/mg, tandis
que le deuxième pic (B-glycosidase II) possède une activité spécifique de
9,20 UI/mg. Les facteurs de purification sont respectivement de 5,75 et
14,00 (tableau 1). L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide nous a
révélé 7 bandes protéiques, pour le pic 1 et 6 bandes protéiques pour le
pic II (photo 3c, 3d).
1.2.3.Chromatographie sur colonne SUPEROSE 12
Les fractions actives recueillies des pics 1 et II sont chromatographiées
sur colonne SUPEROSE 12. Dans chaque cas, nous avons noté une seule
activité B-glycosidasique (fig.5,6). La B-glycosidase 1 a une activité
spécifique de 4,50 Ul/mg contre Il,5 UI/mg pour la B-glycosidase II.
Les rendements sont respectivement de 9,27 pour cent et 54,83 pour
cent. Quant aux facteurs de purification, ils sont de 6,81 et 17,42
respectivement (tableau 1). L'électrophorèse nous a montré 4 bandes
protéiques pour le pic 1 et 5 bandes pour le pic II (photo 3e, 3f).

---

36
Absorbance à 280 nm
0,2
0,1
1
0,0 . .fOI*IIlL..-L.-.L....---1..-----'--oUM-~_+
.......................
- - - - ' - -
o
10
20
30
40
50
60
Nombre de tubes
Fig.4 : Chromatographie sur colonne Mono Q de
l'extrait brut décoloré sur le charbon actif
- - a - -
Absorbance à 280 nm
•
Activité~-glycosidasiqueQJI/ml)

---

37
----.
s---......
8
0,05
?-
c::
QJ
0
00
=
'C'
.-
N
rr2
,C':l
~
-e
(l)
0,04
u
3
.-rr2
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0
C':l
~
~
~
cJ:l
-el),
.0
0,03
<t:
0
'.$
">
".;3
u
0,02
1,5 ~
0,01
0,00 ~e--IFL--'-'--~~----L--+-""",,+---.L---+,B+-''+-+-'''----4-'
°
10
20
30
40
Nombre de tubes
Fig.5 : Chromatographie sur colonne Superose 12
des protéines issues du pic 1
- - - a -
Absorbance à 280 nm
•
Activité B-glycosidasique

---

38
E
c=
-..
..-
0
00
0,12
<"l
,~
§
(1.)
"1!5
()
~
c=
0,10
0'
.-
~
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~
~
Of)
5,25 ~
.-rJ:J
.0
0,08
0
<
u
>.
-bJ)1co.
0,06
3,5
'(1.)
.....
.....>
.....
.....
()
<
0,04
1,75
0,02
0,000,0
10,0
20,0
30,0
40,0
Nombre de tubes
Fig.6
Chromatographie sur colonne Superose 12
des protéines issues du pic II
Absorbance à 280 nm
•
Activité B-glycosidasique

---

39
1.2.4.Chromatographie à nouveau sur colonne SUPEROSE 12
Afin de parfaire la purification, les fractions actives issues de la première
chromatographie
sur colonne SUPEROSE
12
sont rassemblées
et
chromatographiées à nouveau sur la colonne SUPEROSE 12 (fig.7,8).
Nous avons obtenu une activité spécifique de 6,12 UI/mg, un rendement
de 8,6 pour cent et un facteur de purification de 9,27 pour la B-
glycosidase 1. Pour la B-glycosidase II, nous avons obtenu une activité
spécifique de 12,12 DI/mg, un rendement de 53,77 pour cent et un facteur
de purification de 18,36 (tableau 1). Les activités spécifiques obtenues sont
à peu près constantes. Ce qui nous a fait penser à des enzymes pures. Cette
hypothèse a été confirmée par les résultats d'électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS qui nous ont donnés une seule bande
protéique pour chaque forme de B-glycosidase (photo 3f, 3h).
1.3.Propriétés cinétiques des 8-glycosidases 1 et II
1.3.1.pH optimum
Les pH optimums d'activité des B-glycosidases 1 et II purifiées des ouvriers
de Macrotennes subhyalinus sont respectivement de 5,4 et 5,6 (fig. 9).
1.3.2.Tem pératu re optimale
Les températures optimales des B-glycosidases 1 et II sont respectivement
de 5YC et 4YC (fig. 10).

---

40
:::::::;-
ê
6
......
0,04
0
--
;:J
00
'--"
N
Il)
'ro
.g.
Il)
VJ
u
ro
c:
0,03
3,5 "0
ro
·Vi
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l-<
0
0
U
VJ
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.0
-bD
<t::
1
co.
0,02
'Il)
.......
.;;
1,75 ·B
<t::
0,01
0,00 WUl~~__..L.--"".....-=~lf---4
6
16
26
Nombre de tubes
Fig.7
Chromatographie sur colonne Superose 12
de la B-glycosidase 1
Absorbance à 280 nm
•
Activité B-glycosidasique
ê
0
0,05
00
N
'ro
Il)
u
c:
0,04
ro
.0
l-<
0
VJ
.0
<t::
0,03
0,02
0,01
0,00 __......__---L--....L.-~...................-4R--.,J
12,0
17,0
22,0
27,0
Nombre de tubes
Fig.8
Chromatographie sur colonne Superose 12
de la B-glycosidase II
Absorbance à 280 nm
•
Activité B-gl~cosidasique (UI/ml)

---

41
Tableau 1
Bilan global de la purification des B-glycosidases
1 et II provenant de l'extrait brut des ouvriers de
Macrotermes subhyalinus
Etapes de
Activités
Protéines
Activités
Facteurs de
Rendements
purification
totales (Ul)
(mg)
spécifiques purification
(%)
(UI/mg)
Extrait brut
15,10
22,64
0,66
1
100
Décoloration
de l'extrait
12,58
3,4
3,7
5,6
83,31
brut
Pic 1
2,12
0,56
3,8
5,75
14,03
MonoQ
Pic II
9,56
1,04
9,2
14
63,31
Pic 1
1,4
0,31
4,5
6,81
9,27
Superose 12
Pic II
8,28
0,72
Il,5
17,42
54,83
Pic 1
1,3
0,28
6,12
9,27
8,6
Superose 12
Pic II
8,12
0,67
12,12
18,36
53,77

---

h
c r i e
f
g
h
i
Photo 3 : Electrophorese sur gel de polyacrylamide
cn présence de SDS. Révélation (des protéines) :
a. de l'extrait brut
b. de l'extrait décoloré
c. du pic 1 (Mono Q)
d. du pic II (Mono Q)
e. du pic 1 (Superose 12)
f. de la (3-g1ycosidase 1
g. du pic II (Superose l2) h. de la (3-glycosidase 1
i. de réference
6. a-lactalbumine (14,2 Kda)
1. SAB (68 Kda)
2. Ovalbumine (45 Kda)
3. G-Pdéshydrogenase (36 Kda)
4. Anhydrase carbonique (29 Kda)
5. fnhibiteur trvDsique (20 Kda)

---

43
VI/mg de protéine
14
12
10
8
6
4
2
0'
,
,
l
,
1
l
,
,
,
l
,
,
2
3
4
5
6
7
8
pH
Fig.9 : Influence du pH sur l'hydrolyse du (3-pNPglucoside
par les Jj-glycosidases 1 et Il
~ (3-g1ycosidase f
•
(3-g1ycosidase II
VI/mg de protéine
2 0
1 0
0 ' ,
1 " ,
1
1
l ,
~ I
1
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
Température (OC)
Fig.l0
Influence de la température sur l'hydrolyse du
(3-pNPglucoside par les (3-g1ycosidases 1 et Il
~ B-21vcosidase 1
..- (3-g1ycosidase II

---

44
1.3.3.Thermostabilité
Nous avons noté pour la B-glycosidase II une activité résiduelle de 50
pour cent après 10 minutes et de 38 pour cent à partir de 30 minutes de
préincubation. Quant à la B-glycosidase l, nous avons noté une activité
résiduelle de 38 pour cent après 10 minutes de préincubation. Cette valeur
reste constante pendant 20 minutes puis varie légèrement pour atteindre 29
pour cent au bout de 30 minutes de préincubation (fig. Il).
1.3.4.Stabilité et conservation
Les B-glycosidases 1 et II conservées à 4°C perdent 50 pour cent de leur
activité catalytique en 24 heures et 100 pour cent de leur activité en 48
heures. Alors qu'à 25°C, elles perdent 80 pour cent de leur activité en 24
heures.
1.3.5 Spécificité de substrats
Les B-glycosidases 1 et II purifiées n'ont aucune action catalytique sur:
- la carboxyméthylcellulose,
- la cellulose microcristalline,
- l'U-pNPglucoside.
Cependant, elles hydrolysent:
-le B-pNPglucoside,
-le B-pNPgalactoside,
-le B-pNPxyloside,
-le cellobiose.

---

45
% d'activité
120
100
80
60
40
20 l
,
1
,
!
,
l
,
o
w
~
00
Temps (min)
Fig.ll : Thermostabilité des f)-glycosidase r 1
-----{:}-f)-glycosidase 1(55°C)
-----+-f)-glycosidase n~45°C)

---

46
1.3.6.Détermination des KM et Vm
Nous avons déterminé à partir de la représentation de LINEWEAVER et
BURK (1934) les valeurs de KM et de Vm des substrats étudiés (fig. 12,
13, 14 et 15). Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II.
1.3.7.Compétition entre substrats libérant du para-
Nitrophénol
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau III. Ce tableau montre
qu'il existe une très bonne concordance entre les valeurs expérimentales et
les valeurs théoriques calculées à partir de la représentation précédente,
établie pour le cas de deux substrats hydrolysés à un même site.
1.4.Propriétés moléculaires
1.4.l.Détermination des poids moléculaires par gel filtration
Les poids moléculaires des B-glycosidases l et II obtenus par gel
filtration sont respectivement de 64 plus ou moins 3 Kda et 68 plus ou
moins 1 Kda (fig. 16).
1.4.2.Détermination des poids moléculaires par
électrophorèse en présence de SDS.
Les poids
moléculaires
des
B-glycosidases l
et II
obtenus
par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS sont
identiques (67 Kda) (fig. 17).

---

47
IN (minlmicromole) x 102
20
1 8
1 6
1 4
1 2
1 0
8
6
4
- 1 0
- 5
o
5
1 0
liS (mMt 1 x 10- 1
Fig.I2 : Détermination des Km et Vm des ~-glycosidases
1 et II sur le I3-pNPglucoside
• ~-glycosidase 1
D~-glycosidase II
IN (minlmicromole) x 103
1 6
1 4
1 2
1 0
8
6
I--~Q 1
1
1
1 .
-2
0
2
4
6
liS (mMt 1 x 10- 1
Fig.I3 : Détermination des KM et Vm des ~-glycosidases
1 et II sur lef3-pNpgalactoside
• f3-glycosidase 1
Df3-glycosidase II

---

48
IN (min/micromo1e) x loS
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1 ,5
1
J----...'O g 1
1
1
1 ~
- 2
o
2
4
6
1/S (mMt 1 x 10- 1
Fig. 14 : Détermination des KM et Vm des B-glycosidases
1 et II sur le f3'-pNP"yloside
• f3-glycosidase 1
D B-glycosidase II
IN (min/micromole) x 3 x 102
1 6
1 4
1 2
1 0
8
6
1
---..
- 2
- 1
o
1
2
l/S (mMt 1 x 10- 1
Fig.15 : Détermination des KM et Vm des B-glycosidases
1 et II sur le cellobiose
• B-glycosidase 1
oB-glycosidase II

---

49
Tableau II : Paramètres cinétiques apparents pour l'hydrolyse de
quelques glycosides par les B-glycosidases 1 et II
Enzymes
B-glycosidase 1
B-glycosidase II
Paramètres
KM
Vm
KM
Vm
cinétiques
(mM)
(J-lmole/min).10-4
(mM)
(J-lmole/min).10-4
Cellobiose
0,90
41
3,33
16
B-pNPglucoside
3,57
23
1,62
47
B-pNPgalactoside
6,66
10
8,33
37
B-pNPxyloside
10
0,19
13,33
0,2

---

Tableau III : Etude de compétition entre substrats libérant du
pNP
Substats
Valeurs
Valeurs
utilisés
calculées
observées
Sites distincts
Sites communs
Glu
Xyl
Gal
Gal Gal Glu
Gal Gal Glu
Gal
Gal
. Glu
5
5
5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
mM mM mM Glu XVI XVI
Glu XVI XVI
Glu
XVI
XVI
I3-GI
130
0,66
47
177
47,66
130,6
125,1
15,81
108
128,3
16,5
110,7
I3-Gll 380
0,55
13
393
13,55
380,5
335,7
3,13
348,7
340,1
4,7
350

---

51
Poids moléculaire .103 Da
250
200
150
100
~-glycosidaseII et SAB
~-glYcosidase l
50
Ovalbwnine
Chymotrypsinogène A
O-l----+----+----t------ir-----I
o
5
1 0
15
20
25
Temps (min)
Fig.16 : Détermination des poids moléculaires des
B-glycosidases 1 et II par gel filtration
sur Superose 12
Poids moléculaire .103 Da
SAB
70
~-glycosidases l et II
60
50
40
G-P déshydrogénase
Anhydrase carbonique
30
Inhibiteur trypsique
20
• a -Lactalbwnine
1 0
0 + - - - - - - - 1 - - - - - - + - - - - -..............
o
5
1 0
1 5
Mobilité relative (Cm)
Fig.17 : Détermination des poids moléculaires des
B-glycosidases 1 et II par électrophorèse sur gel
de polyacrylamide en présence de SDS

---

52
1.4.3.Hydrolyse trypsique
Les B-glycosidases 1 et II sont hydrolysées par la trypsine (fig. 18). Pour
Il heures de préincubation, elles présentent respectivement des activités
résiduelles de 21 pour cent et 27 pour cent. Ces B-glycosidases présentent
à peu près le même profil d'hydrolyse trypsique.
1.4.4.Dosage des fonctions thiols
Le dosage des groupements thiols avec le DTNB 0,01 M dans des
conditions de dénaturation par l'urée nous a révélé l'existence de
fonctions thiols dans les structures moléculaires de la B-glycosidase II (22
fonctions thiols/mole de B-glycosidase II) et de la B-glycosidase 1 (15
fonctions thiols/mole de B-glycosidase 1). Par contre, l'utilisation de ce
même réactif ne nous a pas permis de révéler la présence de groupements
thiols accessibles au niveau des conformations natives de ces deux fOffiles
de B-glycosidase des ouvriers de Macrotennes subhyalinus (fig. 19).
1.5.Actions de quelques effecteurs sur l'activité catalytique
1.5.l.Actions des cations
Pour les cations étudiés, nous avons constaté que Cu++, Hg++ et Co++
exercent une action inhibitrice sur les deux formes de B-glycosidase dans
la gamme de concentrations utilisées (fig. 20, 21 et 22). Par contre Sr++,
ea++, EDTA, Ni++, Mn++, y exercent une action activatrice (fig. 20, 21,
23, 24 et 25). K+ et Na+ ne présentent aucun effet sur les deux formes de
B-glycosidase (fig. 24 et 25).

---

53
% d'activité
120
100
80
60
40
20 L-.........----'-_-'-----L_'----l.....-----.L_...L.----'-_-'--...;;:L:L..----J
o
2
4
6
8
10
12
Temps (Heures)
Fig.18 : Hydrolyse trypsique des B-glycosidases 1 et II
- - a - - B-glycosidase II
•
B-glycosidase 1
Nombre de SR/mole de B-glycosidase
30
20
10
0 .......--------;-----""11--------41----""11--------11
-10 L...-_""----_...L.-_---'--_---L-_---'-_----l._----''------I
a
5
la
15
20
Temps (Heures)
Fig.19
Dosage des groupements thiols des B-glycosidases 1 et II
~B-glycosidase 1 avec dénaturant
- ......·t--B-gly~osidase II avec dénaturant
a
B-glucosidase 1 ou II sans dénaturant

---

54
% d'activité
300
250
200
150
100
50
oL-~_----I..._----'-----'---'--_.L...-----'~----'----'
o
10
20
30
40
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 20
Actions de Cu 2 + et de Sr 2 + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
~ Cu2+, B-gI.9cosidase 1
- - -
Cu2+, f) -g19cosidase II
- - - -
Sr2+,(3.-g19cosidase 1
- -
Sr2+, f)-glycosidase II
% d'activité
140
120
80
60
40
20
o'---~-------'--~-----'--~---'----'---....L...-.~
o
10
20
30
40
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 21
Actions de Ca 2 + et de Hg 2 + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
Ca2+, (3-g1ycosidase 1
•
Ca2+, B-gl!1cosidase II
D
Hg2+ ,B ;-glycosidase 1 ~oo-- Hg2+, B-glycosidase Il

---

55
% d'activité
120
100
80
60
40
20 0
10
20
30
40
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 22 : Actions de Cd 2 +- et de Co 2 + sur les 'activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
- - e - -
Cd1+, B,-gl~cosidase1
•
Cd1+, ~-glycosidaseII
III
Co2 +,!J:-gI9cosidase 1 ----0--
Co2 +, f) -glycosidase II
% d'activ ité
150
140
130
120
110
100
90 L------'-_----L_-'---_..L.------'_----'-_--'-_-'-------'
o
10
20
30
40
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 23
Actions de l'EDTA sur les activités
catalytiques
des B-glycosidases 1 et II
- - e - -
EDTA, B-glycosidase 1
EDTA, {)-gI9cosidase II

---

56
% d'activité
200
150
100 ao----c:~_---_--____tlt__--__
50
oL.-----'----'--~-...L.-->----------'--~----L.-~
o
10
20
30
40
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 24 -: Actions de K + et de Ni 2 + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
-----0--
K+, B-gycosidase 1
- - + -
K+, \\3-g1ycosidase II
- -
Ni2+, B-glycosidase 1
----<>--
Ni2+,f)-glycosidase II
% d'activité
1000
800
600
400
200
OL.-----L_---L_---'-_--L-_.L...------'L.----'-_---.i.-----'
o
10
20
30
40
, .
Conc.effect~urs (mM)
Fig. 25 : Actions de Na + et de Mn .l + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
- - a -
Na+, 6,-gJycosidase 1
Na+, 13-g1ycosidase II
•
Mn2+, ()-gl,9cosidase 1
0
Mn2+,13,-glycosidase II

---

57
Nous avons obtenu aussi des comportements cinétiques opposés vis-
à-vis de certains cations au niveau des deux formes de B-glycosidase.
Ainsi avec Fe+++, pour la B-glycosidase II, nous avons constaté une
légère activation entre 0 et 8 mM. Au-delà de ces concentrations, Fe+++
exerce une action inhibitrice sur l'activité catalytique de la B-glycosidase
II. Quant à la B-glycosidase 1 entre 0 et 8 mM, Fe+++ n'exerce aucun
effet et au delà de ces concentrations, provoque une activation (fig. 26).
Ba++ exerce une action inhibitrice sur la B-glycosidase 1 et active la B-
glycosidase II à partir de 5 mM (fig. 26). Pour Mg++, nous avons noté
une activation pour la B-glycosidase 1 et une légère inhibition pour la B-
glycosidase II dans la gamme de concentrations utilisées. Quant aux Zn++
et Cd++, ils activent légèrement la B-glycosidase II aux concentrations
comprises respectivement entre 0 et 7 mM ; 0 et 5 mM. Au-delà de ces
concentrations respectives, Zn++ et Cd++ inhibent l'activité catalytique de
la B-glycosidase II. Nous avons noté une inhibition de la B-glycosidase 1
par toutes les concentrations de Zn++ et de Cd++ utilisées (fig. 22 et 27).
1.5.2.Actions des anions
La
B-glycosidase
1
est
activée
par
l'hydrogénophosphate
aux
concentrations comprises entre 0 et 20 mM. Quant à la B-glycosidase II,
elle est activée par ce même effecteur aux concentrations étudiées (fig.
28). Les ions acétate, benzoate, citrate, sulfate, et thiosulfate ne présentent
aucun effet significatif sur les deux fonnes de B-glycosidase des ouvriers
de Macrotennes subhyalinus.
1.5.3.Actions des amines
Le Tris inhibe la B-glycosidase 1 à 25 pour cent et la B-glycosidase

---

58
% d'activité
200
150
50
oL------'------L-~-----'-----'---...1---'--___""'I__----'
o
10
20
30
40
Corrc.effecteurs (mM)
Fig. 26
Actions de Ba 2 + et de Fe 3 + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
-----Q---
Ba2+,fl-g!Jcosidase l
- - -
Ba2+,B;-glycosidase Il
- - -
Fe3 +,\\3 -gl!jcosidase l
- - 0 - -
Fe3 +,13 -glycosidase II
% d'activité
160
140
120
100
80
60
40
20 L-~_---L-~~-----L_--,-------,_~_-,---------,-_-,
o
10
20
30
40
50
Conc.effecteurs (mM)
Fig. 27
Actions de Mg 2 + et de Zn 2 + sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
- - - - 0 - - -
Mg 2 +,B .-glycosidase 1
•
Mg2 +, B-gl9cosidase Il
Il
Zn2+, B-gl9cosidase 1
Zn2+, ~.-gI9cosidaseIl

---

59
% d'activité
200
150
100 &e::~__---1i======_---......------tI
50
OL---'--------!-------'------'---'----'-----'---.......L...--'
o
10
20
30
40
Conc. effecteurs (mM)
Fig.28
Actions du benzoate et de H2P04- sur les activités
catalytiques des B-glycosidases 1 et II
Benzoate, f5-gIJcosidase 1
Benzoate, t3-gl,9cosidase li
•
H2P04-, (3 -glycosidase 1
H2P04-, B-gI,9cosidase II
% d'activité
120
100
80
60
40
O'------'-----'-----'-----'----'----'--'----L------'
o
10
20
30
40
Conc. effecteurs (mM)
Fig.29
Action du Tris sur les activités catalytiques des
B-glycosidases 1 et II
Tris,(3-glycosidase 1
Tris, (3-glycosidase II

---

60
II à 6 pour cent à la concentration de 40 mM (fig. 29). Par contre l'azide
de sodium n'exerce aucun effet sur la b-glycosidase 1 entre 0 et 3 mM.
Au-delà de 3 mM, il exerce un effet activateur sur la b-glycosidase 1 pour
atteindre un peu plus de 140 pour cent d'activité à 40 mM. Quant à la l3-
glycosidase II, l'azide de sodium y exerce une action activatrice entre 0 et
1 mM pour atteindre 155 pour cent d'activité. Entre 1 et 10 mM, l'azide
de sodium exerce une action inhibitrice sur la B-glycosidase II pour
atteindre à peu près 120 pour cent d'activité. Au-delà de 10 mM, l'activité
reste constante (fig. 30).
1.5.4.Actions des produits d'hydrolyse
Le glucose, le galactose et le xylose sont des inhibiteurs compétitifs pour
les deux formes de B-glycosidase (fig. 31 à 36). En se référant aux
constances d'inhibition, nous pouvons classer l'effet inhibiteur par ordre
décroissant: glucose> galactose> xylose (tableau IV).
1.5.5.Actions de quelques réactifs de marquage
Pour les concentrations comprises entre 0 et 10 mM, le DTNB n'affecte
pas l'activité catalytique des B-glycosidases 1 et II. Par contre, le pHMB
inhibe les deux formes de B-glycosidase. Cette inhibition est plus marquée
chez la B-glycosidase II que chez la B-glycosidase I. Le mercaptoéthanol
active la B-glycosidase 1 et inhibe légèrement la B-glycosidase II lorsque
sa concentration atteint 10 mM (fig. 37).

---

61
% d'activité
160
150
140
130
120
110
100 ..
90
0
5
10
15
20
25
Conc.effecteur (mM)
Fig.30
Action de NaN3 sur les activités catalytiques
des B-glycosidases 1 et II
NaN3, 6-g19cosidase 1
•
NaN3, B-gl9cosidase Il

---

62
uv (minlmicromole).I02
Q
1
•
-200
o
200
400
600
Concentration du glucose (mM)
Fig.31
Action inhibitrice du glucose sur l'hydrolyse
duB-pNPglucoside par la J}:-glycosidase 1
IN (minimicromole).102
5mM
20
1 8
1 6
10mM
1 4
20 mM
1 2
1 0
8
6
4
1.
- 200
o
200
400
600
Concentration du glucose (mM)
Fig.32
Action inhibitrice du glucose sur l'hydrolyse
du B-pNPglucoside par lal3-glycosidase II

---

63
IN (minlmicromole).I02
5mM
10mM
20 mM
1
~
- 2 0 0
o
200
400
600
Concentration du galactose (mM)
Fig.33
Action inhibitrice du galactose sur l'hydrolyse
du6-pNPglucoside par la B-glycosidase 1
IN (minlmicromole).l02
5mM
10mM
20 mM
1-1---I:~f-t----+------+-I ----I~...
-200
0
200
400
600
Concentration du galactose (mM)
Fig.34
Action inhibitrice du galactose sur l'hydrolyse
du B-pNPglucoside par la 5-glycosidase II

---

64
IN (minfmicomole).102
gt
5mM
10mM
20mM
1"
- 2 0 0
o
200
400
600
Concentrayion du xylose (mM)
Fig. 35
Action inhibitrice du xylose sur l'hydrolyse du
1j-pNPglucoside par la '{3-glycosidase 1
IN (minfmicromole).102
5mM
10mM
20 mM
- 2 0 0
o
200
400
600
Concentration du xylose (mM)
Fig.36
Action inhibitrice du xylose sur l'hydrolyse
du 15-,pNPglucoside sur la f)-glycosidase II

---

Tableau IV
Constantes d'inhibition du galactose, du glucose
et du xylose sur les B-glycosidases 1 et II
Effecteurs
Glucose
Galactose
Xylose
Enzymes
KI (mM)
KI (mM)
KI (mM)
B- glycosidase 1
45
80
95
B- glycosidase II
65
90
115

---

66
% d'activité
120
100
80
60
40
20
oL-----a_-----l._.-----.L.._---I...._--'-_--l-_----'--_---.L..----J
o
10
20
30
40
Conc. effecteurs (mM)
Fig. 37 : Actions du Mercaptoéthanol et du vHMB sur
les activités catalytiques desf}-glycosidases 1 et II
Mercaptoé~hanol, p-glycosidase 1---..- Mercaptoéthanol, f}-glycosidase II
a
pHMB, -p-glycosidase 1
----<>--
pHMB, B-glycosidase II

---

67
2.DISCUSSION
Les soldats de Macrotermes subhyalinus sont incapables de se nournr
seuls. Ils se nourrissent par conséquent par trophallaxie stomodéale
d'aliments élaborés grâce aux ouvriers. L'aliment trophallactique est
composé de menus fragments de bois additionnés d'une quantité plus ou
moins grande de salive qui les fluidifie (GRASSE, 1982). La cause de
l'incapacité des soldats à se nourrir seuls n'a pas été déterminée. Est-ce un
problème comportemental, mécanique, enzymatique ? L'étude de la
dégradation des osides par les extraits bruts de broyats totaux des
différentes catégories de castes neutres de Macrotermes subhyalinus nous
a permis de savoir que toutes les osidases présentes chez les ouvriers se
retrouvent chez les soldats mais toujours avec des activités plus faibles. Ce
comportement enzymatique a été obtenu chez le termite Macrotermes
mulleri (ROULAND, 1986). Nous pouvons donc dire à partir des
résultats obtenus que le soldat se nourrit essentiellement de matières
cellulosiques et que la transformation des osides peut se faire dans son
tube digestif soit par des enzymes produites par le termite lui même, soit
grâce à la persistance d'enzymes provenant de l'ouvrier, ingérées avec
l'aliment trophallactique. En raison de cette situation alimentaire, le
termite qu'il soit soldat ou ouvrier constitue sans aucun doute une source
potentielle d'enzymes cellulasiques qui pourrait pallier à l'insuffisance des
cellulases de source microbienne dans leur utilisation biotechnologique.
Nous notons en effet à partir de notre travail sur la dégradation des osides
par les broyats totaux de Macrotermes subhyalinus que les ouvriers de ce
termite sont riches en diverses glycosidases dont l'action s'excerce aussi
bien sur la cellulose, l'amidon et les diholosides tels que le saccharose, le
cellobiose et le maltose. Les petits ouvriers sont plus actifs que les grands
ouvriers.
Ce
comportement
enzymatique
pourrait
expliquer
la

---

68
disponibilité dans la termitière de Macrotermes subhyalinus, des petits
ouvriers de moins de 30 jours à consommer seuls la meule et à réaliser la
trophallaxie alors
que les
plus âgés
sont préposés
à
la
récolte
(BADERTSCHER et coll., 1983). Au niveau des hétérosides testés,
l'activité Œ-pNPglucosidase est la plus élevée. Les activités spécifiques
obtenues chez les petits ouvriers (les plus actifs) sont importantes. Elles.
sont supérieures aux activités spécifiques des extraits bruts de Allium
fistulosum
(SUZUKI
et
UCHIDA,
1984),
des
petits
ouvriers
de
Macrotermes mulleri (ROULAND, 1986) de Bacillus licheniformis
(THIRUNAVAKKA et PRIEST, 1984). Quant aux oligosaccharides,
l'activité cellobiasique reste la plus importante. La valeur obtenue avec les
petits ouvriers est supérieure à celle observée avec les petits ouvriers de
Macrotermes mulleri (ROULAND, 1986). Pour les polysaccharides
testés, l'activité carboxyméthylcellulasique qui est la plus élevée chez les
petits ouvriers est faible par rapport à celles obtenues avec les extraits
bruts d'Aspergillus japonicus (KUNDU et coll., 1988) de la souche
thermophile anaérobie NAI0 (SOTA et coll., 1989), de Penicillium
pinophilum (BHAT et coll., 1989) du suc digestif de l'escargot Achatina
balteata (SORO, 1991) de Bacillus sp KSM-330 (OZAKI et ITO, 1991).
La valeur est par contre beaucoup plus élevée que celle de Clostridium
josui (FUJINO et coll., 1990) (Tableau V).
La différence d'activité osidasique entre les petits et les grands
ouvriers peut nous permettre de prendre certaines précautions pour la
préparation de la poudre protéique de Macrotermes subhyalinus. En effet,
pour avoir des activités osidasiques élevées, il est souhaitable de récolter,
pour l'extraction des osidases, de jeunes ouvriers.
La purification d'enzymes par les techniques de chromatographie

---

69
Tableau V
Valeurs des activités spécifiques (A.S.) pour
divers extraits bruts
Espèces
A.S.
Auteurs
(UI/mg)
a -pNPglucosidase
Bacillus licheniformis
0,736
THIRUNAVAKKA et PRIEST, 1984
Allium fistulosum
0,520
SUZIKI et UCHIDA, 1984
Petits ouvriers Macrotennes mulleri
1,070
ROULAND, 1986
Petits ouvriers Macrotermes subhyalinus
1,210
LE PRESENT TRAVAIL
Cellobiase
Petits ouvriers Macrotennes mulleri
0,280
ROULAND, 1986
Petits ouvriers Macrotermes subhyalinus
0,320
LE PRESENT TRAVAIL
Carboxyméthylcellulase
Aspergilus japonicus
0,570
KUNDU et coll, 1988
Souche thermophi1e NA 10
0,710
SOTA et coll, 1989
Penicilliwn pinophilwn
6,500
BHAT et coll, 1989
Clostridium josui
0,040
FUJINO et coll, 1990
Achatina balteata
0,870
SORO,1991
Bacillus sp
16,20
OZAKI et rro, 1991
Petits ouvriers Macrotermes subhyalinus
0,25
LE PRESENT TRAVAIL

---

70
liquide à haute performance nécessite des quantités importantes de
protéine que nous ne pouvIons
pas obtenir par dissection de tubes
digestifs des termites Macrotennes subhyalinus. L'extrait brut a été
obtenu à partir de broyats totaux de mélange de grands et de petits
ouvriers de Macrotennes subhyalinus. Cet extrait brut est fortement
coloré en rouge brun. Cette coloration a été notée chez d'autres espèces de
termites
telles
que
Macrotennes
mulleri
(champignonniste),
Sphaerotennes sphaerothorax (xylophage) (ROULAND, 1986) et est due
à la présence de pigments dans la solution enzymatique.
Les colonnes chromatographiques utilisées pour la chromatographie en
phase liquide à haute performance (MONO Q et SUPEROSE 12)
nécessitent un certain nombre de précautions : les solutions à injecter
doivent être limpides et incolores. Pour cette raison, nous avons décoloré
notre extrait protéique en utilisant le charbon actif; ce qui nous a permis
d'avoir un extrait protéique limpide et incolore et d'améliorer l'activité
spécifique des B-glycosidases. Le rendement obtenu au niveau des
protéines n'est pas satisfaisant. Ceci est dû au fait que la décoloration sur
le charbon actif nous a fait perdre plus de 80 pour cent des protéines
totales. Les essais de séparation des protéines des pigments effectués avec
le sulfate d'ammonium et les solvants organiques (acétone, éthanol etc.) ne
nous ont pas permis de résoudre le problème. Nous avons eu recours aux
méthodes chromatographiques en utilisant des gels SEPHADEX et
SEPHAROSE qui ne nous ont pas donné satisfaction
malgré
les
changements de tampon et de pH. Cependant, nous restons convaincus que
l'utilisation de gels capables d'assurer la décoloration de cet extrait brut
nous permettra d'améliorer ce rendement et peut-être
d'augmenter
l'activité spécifique. La solution protéique décolorée, chromatographiée
sur la colonne MONO Q, nous a permis d'isoler deux formes
de

---

13-glycosidase ; la 13-glycosidase 1 et la 13-glycosidase II. Ainsi UZIIE et
SASAKI (1987) ont mis en évidence deux formes de 13-glycosidase dans
l'extrait brut de Robillarda sp Y-20. Les extraits bruts de Penicillium
funicolosum et de Penicillium pinophilum contiennent chacun deux
formes
de
13-glycosidase
(WOOD
et
coll.,
1989).
JACKSON
et
TALBURT (1988) ont isolé une seule forme de 13-glycosidase chez
Trichoderma reesei. Les deux formes de 13-glycosidase des ouvriers de
Macrotermes subhyalinus purifiées présentent chacune une seule bande
protéique en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS confirmant ainsi la pureté relative de nos enzymes. La 13-glycosidase
II est à peu près deux fois plus active sur le 13-pNPglucoside que la 13-
glycosidase 1. Ce comportement enzymatique a été noté au niveau des
deux formes de 13-glycosidase purifiées chez Robillarda sp Y-20 (UZIIE
et SASAKI, 1987). Les 13-glycosidases 1 et II purifiées des ouvriers de
Macrotermes subhyalinus ont des activités spécifiques inférieures à celle
d'Aspergillus japonicus purifiée par SANYAL et coll. (1988). Par contre
ces
activités
sont
supérieures
à
celles
de
Macrotermes
mulleri
(ROULAND, 1986) et d'Aspergillus sp. (GOKHALE et coll., 1984).
Les pH optimums des 13-glycosidases 1 et II sont très voisins et se situent dans
la zone générale de pH d'activité optimale (4-6) (tableau VI). Les poids
moléculaires obtenus par gel filtration
sont identiques à ceux obtenus par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Les 13-
glycosidases 1 et II ont les mêmes poids moléculaires. Ils sont supérieurs à
ceux obtenus au niveau des insectes tels que Ergates faber (CHARARAS,
1981), Rhagium inquisitor (CHIPOULET et CHARARAS, 1985).
Par
contre, ils sont inférieurs aux poids moléculaires des insectes tels que
Macrotermes
mulleri
(ROULAND,
1986),
Phoracanta
semipuncta
(CHARARAS et CHIPOULET, 1982), des champignons

---

12
Tableau VI : Valeurs des PM et des pH optimums pour diverses
~-glycosidases
Espèces
PM
pH optimums
Auteurs
Lévure:
Saccharomyces
315000
6,6
HU et coll., 1960
fraRilis
Champignons:
Trichodenna viride
76000
4,9
LI et coll., 1965
Aspergilus
jùnigatus
340000
4,5
RUDICK et ELBEIN, 1975
Fusariwn solani
400000
6
WOOD, 1971
Boryodiploma
theobromae
350-380000
5
UMEZURIKE, 1979
170-180000
5
Schizophyllum
commune
83-87000
5,5
DESROCHERS et coll., 1981
Thielavia terrestris
97000
5
MARGARITIS et MERCHANT,
1983
Insectes:
Ergates fober
57000
5,2
CHARARAS, 1981
Phorancata
semipuncta
100000
5-5,5
CHARARAS et CHIPOULET,
1982
Ragium inquisitor
35000
5-6
CHIPüULET et CHARARAS,
1985
Macrotermes
subhyalinus
67000
5,4
LE PRESENT TRAVAIL
67000
5,6

---

73
Trichoderma viride (LI et coll., 1965), Fusarium solani (WOOD, 1971),
Aspergillus funigatus
(RUDICK et ELBEIN,
1975),
Boryodiploma
theobromae
(UMEZURIKE,
1979),
Schizophyllum
commune
(DESROCHERS et coll., 1981) et Thielavia terrestris (MARGARITIS et
MERCHANT, 1983), de la levure Saccharomyces fragilis (HU et coll.,
1960) (tableau VI). Les courbes de variation d'activité en fonction de la
température des B-glycosidases 1 et II nous ont donnés des températures
optimales inférieures à celles des B-glycosidases d'Aspergillus japonicus et
d'Aspergillus sp. GOKHALE et coll., 1984; SANYAL et coll., 1988). La
B-glycosidase 1 a une température optimale égale à celle de Macrotermes
mulleri (ROULAND, 1986). Les deux enzymes purifiées chez les
ouvriers de Macrotermes subhyalinus sont capables d'hydrolyser les B-
pNPglucoside, B-pNPgalactoside, B-pNPxyloside et le cellobiose. Ce
comportement aurait pu s'expliquer par une
hétérogénéité de
nos
préparations enzymatiques. Mais, cette éventualité est à écarter car les
deux enzymes présentent chacune une homogénéité en électrophorèse sur
gel de polyacrylamide en présence de SDS. Les études cinétiques de
compétition entre substrats libérant du para-Nitrophénol et les essais
d'inhibition par les produits d'hydrolyse de la réaction (xylose, glucose,
galactose)
permettent d'affirmer
que
les
différents
substrats testés
reconnaissent le même site catalytique. Les deux formes de B-glycosidase
sont spécifiques de la liaison B et sont sans action sur l' a -pNPglucoside,
la carboxyméthylcellulose et la cellulose microcristalline comme cela a été
le cas des B-glucosidases de Trichodenna viride (LI et coll., 1965)
d'Aspergillus roseus (VODJANI, 1981) et Ergatesfaber (CHARARAS et
coll.,
1983).
L'examen
des
paramètres
cinétiques,
notamment
les
constantes de MICHAELIS et MENTEN montrent que la B-glycosidase 1
se caractérise par une activité cellobiasique importante.
Ce qui nous fait penser à une cellobiase. Par contre, la B-glycosidase II se

---

74
comporte à la fois comme une B-pNPglucosidase B-pNPgalactosidase par
sa grande activité respectivement sur le B-pNPglucoside et le B-
pNPgalactoside.
Les deux formes de B-glycosidase présentent une
cinétique de type michaelien et sont hydrolysées par la trypsine. Ce qui
nous permet de dire que les deux enzymes des ouvriers de Macrotennes
subhyalinus possèdent dans leur structure moléculaire des liaisons
peptidiques au niveau desquelles est impliqué l'arginine ou la lysine.
Les effecteurs tels que Hg++ et pHMB exercent une action
inhibitrice sur les deux formes de B-glycosidase des ouvriers de
Macrotennes subhyalinus. Cette inhibition peut se traduire par le fait que
ces réactifs se fixent sur les groupements thiols accessibles de ces
protéines enzymatiques, démontrant ainsi que ces enzymes possèdent des
groupements thiols accessibles dans leur structure moléculaire. Cette
assertion est confirmée par le mercaptoéthanol qui protège bien l'action
catalytique de ces enzymes. Mais, le dosage de ces groupements thiols
accessibles n'a pas été possible par la méthode de ELLMAN (1959) en
présence de DTNB 0,01 M, en raison de la faible action de ce dernier sur
la conformation native des enzymes. On peut donc penser à partir de ce
constat que le nombre de groupements thiols déterminés en présence de
l'urée et du DTNB par la méthode de ELLMAN (1959) pourrait être une
sous estimation du nombre réel de groupements thiols présents dans la
structure moléculaire des deux formes de B-glycosidase purifiées. Ce
comportement enzymatique s'apparente à ceux de la phosphorylase de
patate (KAMAGAWA et coll., 1971) et de la B-amylase de Bacillus cereus
(NANMORI et coll., 1983). Par contre, il les distingue de celui de la
phosphorylase du muscle (BATTELL et Coll., 1968).
Les deux formes de B-glycosidase sont aussi inhibées par Cu++, Co++.
Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés par COLAS (1980) qui
notait même une inhibition complète des deux formes de B-fucosidase du

---

75
suc digestif de l'escargot Achatina balteaJa par Cu++. Ce comportement
enzymatique, vis-à-vis de ces effecteurs, apparente les deux formes de 13-
glycosidase des ouvriers de Macrotermes subhyalinus à la 13-glycosidase
des ouvriers de Macrotermes mulleri (ROULAND, 1986).
Nous pouvons donc dire que les deux formes de 13-glycosidase de
Macrotermes subhyalinus sont plus résistantes vis-à-vis de ces cations que
les deux formes de 13-fucosidase du suc digestif de AchaJina balteaJa. Le
Tris inhibe fortement les 13-glycosidases 1 et II. Pour cette raison, nous
déconseillons l'utilisation du tampon Tris
dans
les
opérations
de
purification et de dosage d'activité cellulolytique de l'extrait brut des
ouvriers de Macrotermes subhyalinus. Cependant, le Mn++ et le Sr++ qui
sont de très grands activateurs peuvent être conseillés dans la préparation
des tampons. Les 13-glycosidases 1 et II sont aussi activées par EDTA,
NaN3, Ca++, Ni++. Ce comportement les distingue nettement de la 13-
glycosidase d'Aspergillus japonicus purifiée par SANYAL et coll. (1988).
Ba++ et Fe++ sont des activateurs pour la 13-glycosidase II et inhibiteurs
pour la 13-glucosidase 1. Au niveau des deux formes de 13-glycosidase de
Robillarda sp Y-20, USIIE et SASAKI (1987) ont noté que ces effecteurs
sont des inhibiteurs. ABUSHAMA et KAMBAL (1975) ont montré que le
zinc, pour des concentrations allant jusqu'à 2M, jouerait un rôle
activateur dans la dégradation de la cellulose chez le termite Macrotermes
tragardi. Le test effectué sur les deux formes de 13-glycosidase des
ouvriers de Macrotermes subhyalinus nous a montré un effet contraire.
Pour les effecteurs tels que l'acétate, le sulfate, l'ion potassium, l'ion
sodium et le citrate, nous n'avons pas noté d'effet significatif sur nos deux
enzymes purifiées. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par
COLAS (1980).

---

9L.

---

'77
L'extrait protéique des ouvriers de Macrotermes subhyalinus. contient un
équipement osidasique varié et très actif. L'étude sur la dégradation des
osides nous a permis de savoir qu'il contient des enzymes capables
d'hydrolyser la cellulose et l'amidon en glucose. En plus de ces avantages,
il contient d'autres enzymes qui hydrolysent le B-pNPxyloside et le
saccharose.
Toutes
les osidases
présentes chez
les
ouvriers
de
Macrotermes
subhyalinus se trouvent chez les soldats avec toujours des activités plus
faibles. Ce qui nous permet de dire que la transfonnation des osides peut
se faire dans le tube digestif du soldat du tennite Macrotermes
subhyalinus.
L'extrait brut des ouvriers de Macrotermes subhyalinus contient
deux fonnes de B-glycosidase. Ces enzymes ont été purifiées en 4 étapes.
Ces deux formes de B-glycosidase présentent chacune une seule bande
protéique en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS. Cette pureté satisfaisante nous a pennis d'étudier leurs propriétés
cinétiques et moléculaires. Ainsi, elles possèdent des pH optimums très
voisins (5,4 et 5,6) et des poids moléculaires identiques (67 Kda). ,Ces
protéines enzymatiques présentent les mêmes profils
thermiques et
d'hydrolyse trypsique. Les deux fonnes de B-glycosidase sont spécifiques
de la liaison B car elles sont sans action sur l'U-pNPglucoside. Elles
n'hydrolysent
pas
aussi
la
carboxyméthylcellulose
et
la
cellulose
microcristalline.
Elles catalysent par contre
l'hydrolyse
de
divers
substrats
tels
que
le
B-pNPglucoside,
le B-pNPgalactoside,
le
B-
pNPxyloside et le cellobiose. Ces substrats reconnaissent le même site
catalytique comme le montre les études de compétition entre substrats
libérant dupara-Nitrophénol et les expériences d'inhibition par les
produits d'hydrolyse tels que le xylose, le galactose, et le glucose. Les
deux fonnes d'enzymes purifiées présentent une cinétique michaelienne.

---

78
Les constantes de MICHAELIS et MENTEN nous permettent de penser
que la B-glycosidase 1 est une cellobiase et la B-glycosidase II, une B-
pNPglucosidase. De façon générale ces deux enzymes sont très peu
sensibles à la présence des anions et du DTNB et sont fortement inhibées
par le Tris, le cation Hg++ et le pHMB. Cependant, elles sont très activées
par les cations Mn++, Sr++. Les deux B-glycosidases des ouvriers de
Macrotennes subhyalinus diffèrent, d'une part par leur température
optimale, d'autre part par l'action opposée de certains effecteurs comme
Mg++, Ba++ et Cd++. Au niveau des autres effecteurs que nous avons
étudiés, nous avons enregistré des comportements cinétiques très variés.
Nous pouvons donc dire que les B-glycosidases 1 et II des ouvriers de
Macrotennes
subhyalinus
ont
des
caractéristiques
cinétiques
et
moléculaires identiques. Cependant elles ont des diversités fonctionnelles.
La l3-glycosidase 1 qui est une cellobiase, complète de façon synergique
les actions des exo et endocellulases. Ce qui nous permettra d'obtenir des
molécules de glucose au cours de l'hydrolyse des matières cellulosées.
Une étude sur la répartition de l'activité osidasique dans le tube
digestif du soldat du termite Macrotennes subhyalinus nous permettra de
très bien comprendre le problème d'alimentation par trophallaxie chez les
soldats de termite.
La détermination des acides aminés impliqués d'une part dans le site
actif de chaque B-glcosidase, d'autre part dans la structure moléculaire de
chaque enzyme nous permettra certainement de comprendre le mécanisme
réactionnel de ces deux protéines enzymatiques.
Lorsque nous aurons fini la purification et l'étude des propriétés
physico-chimiques des endo et exo-B-D-glucanases des
ouvriers de
Macrotennes subhyalinus, nous étudieront leurs actions synergiques avec
les deux formes de B-glycosidase que nous avons purifiées et caractérisées
chez cette même espèce de termite.

---

79
Les résultats que nous avons obtenus dans
ce travail sont
encourageants sur le plan analytique; car ils nous conduiront sur le plan
industriel vers l'hydrolyse des matières cellulosées en sucres simples
fennentescibles en vue d'une fermentation alcoolique.

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13IHdVHDOI~HIg·AI
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