UNIVERSITE LOurS PASTEUR STRASBOURG 1
1989
THESE
présentée à
L'UFR DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE
pour obtenir
le titre de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR
Domaine: BIOWGIE MOLECULAIRE VEGETALE
par
Abdourahamane SANGARE
ETUDE DE LA STRUCTURE DES GENES DE tRNA DE LA
MITOCHONDRIE DE MAIS (Zea mays) ET COMPARAISON DE
LEUR LOCALISATION DANS LES LIGNEES MALE-FERTILE (N)
ET MALE-STERILE (erns-T)
Soutenue le 14 septembre 1989 devant la Commission d'Examen
MM.
G.
DIRHEIMER,
Président, Rapporteur interne
J.H.
WEIL,
Examinateur
F.
QUETIER,
Rapporteur externe
J.M. GRIENENBERGER,
Examinateur

---

;.
,
~
:1
CONSEIL ~iHC.l\\IN ET MALGACHE\\'
fOOR l'ENSE!GNEI\\'\\LN7 5UPE:::"EU~ \\
c. lA. M. E. 5. -- OUl,.GA:)O\\JC..30l.1
, Arrivée ·18· DEC.. Z001·
.
\\.:~re:.I~.tr~_ ~O\\)S n° -if)-e~ 5 7-~' .
\\
à Monsieur et Jiladanle Guissé
à mes Parents

---

Je tiens à remercier Monsieur le Professeur J.H. WEIL de m'avoir
accueilli dans son laboratoire à l'Institut de Biologie Moléculaire des Plantes du
CNRS à Strasbourg et de m'avoir aidé de ses conseils et encouragements.
Je suis reconnaissant à Monsieur le Professeur G. DIRHEIMER qui m'a
fait l'honneur de présider ce jury de thèse ainsi qu'à Monsieur le Professeur
F. QUETIER qui a accepté de juger ce travail.
Ce travail a été réalisé sous la direction de J.M. GRTENENBERGER à qui
je dois mon initiation aux techniques de la Biologie Moléculaire. Sans lui ce travail
n'aurait pu être mené à terme. Je tiens à lui exprimer toute ma reconnaissance.
Une partie du travail présenté ici a été réalisée avec la collaboration de
Valentin NEGRUK. Qu'il trouve ici l'expression de ma gratitude.
Je remercie également toutes les personnes, chercheurs et techniciens de
l'T.B.M.P. et de l'I.B.M.C., qui ont directement ou indirectement participé à la
réalisation de ce travail.
Je tiens aussi à remercier Carine Schwoob qui n'a pas ménagé ses efforts
pour la dactylographie de ce travail.

---

TABLE DES ABREVIATIONS
aa
acide aminé
BSA
sérum albumine bovine
Bis-acrylarnide
N, N'-méthylène-bis-acrylamide
CCAse
tRNA nucléotidyl-transférase
Ci
cune
ems
stérilité mâle cytoplasmique
dATP
2'-désox y-adénosine- S'-tri phos phare
dCTP
2'-désox y-cytidine-S'-tri phosphate
ddNTP
2',3' -didésox yn ucléoside-S'-trip hospha te
DEAE
diéthylaminoéthyl
dGTP
2-désoxy- guanidine-S'triphosp ha te
DMSO
diméthyl sulfoxyde
ONA
acide désoxyribonucléique
ONAseI
désoxyribonucléase 1
dNTP
2-désoxy-ribon ucléoside- 5' -tri phosphate
O.O·A
densité optique à A nm
OTT
dithiothréitol
dTTP
2-désoxy- th yrnidine- S'-triphosphate
EOTA
éthylène diamine triacétate de sodium
HEPES
acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique
IPTG
isopropyl ~-D-thiogalactoside
kb
kilo paires de bases (=lOOOpb)
mRNA
RNA messager
nm
nanomètre
POE
phosphodiestérase du venin de serpent
pb
paire(s) de bases
plv
poids à volume
PEG
polyéthylène glycol
qsp
quantité suffisante pour
RNA
acide ribonucléique
RNAse
Ribonucléase
rRNA
RNA ribosomique
RPC
reversed phase chromatographie
rprn
rotations par minute
SOS
dodécylsulfate de sodium
SSC
standard saline citrate
TCA
acide trichloro acétique
TEB
Tris-Borate-EDTA
TEA
Tris-Acétate- EDTA

---

TEMED
N, N, N', N'-tetraméthyléthylènediamine
Tris
tris(h ydroxyméth yl)aminométhane
tRNA
RNA de transfert
u.v.
ultra violet
v/v
volume à volume
X-gal
5- Bromo-4-chloro-3-indolyI ~- D-galacto-pyranoside
Abréviation des acides aminés
A
=
Ala
Alanine
C
Cys
Cystéine
0
Asp
Acide aspartique
E
Glu
Acide glutan:ique
F
Phe
Phénylalanine
G
=
Gly
Glycine
H
=
His
Hystidine
l
=
lle
Isoleucine
K
Lys
Lysine
M
Met
Méthionine
N
=
Asn
Asparagine
P
Pro
Pro li ne
Q
GIn
Glutamine
R
=
Arg
Arginine
S
=
Ser
Serine
T
=
Thr
Thréonine
V
Val
Valine
W
=
Trp
Tryptophane
y
=
Tyr
Tyrosine
nucléotide modifié
3-(3-amino-3-carboxyhydroxymeth yl) Uridine

---

ufNJTRODUJCTuOfNJ

---

Les génomes mitochondriaux des plantes supérieures se caractérisent par leur
grande taille el par la complexité de leur structure si on les compare aux autres génomes
mitochondriaux connus. Leur taille varie de 208 kb chez Brassica hirta (PALMER et
HERBON, 1987) à 2400 kb chez la pastèque (WARD et coll., 1981), alors que les
génomes mitochondriaux des mammifères mesurent entre 15 et 18 kb et ceux des
champignons entre 18 et 78 kb (pour une revue, voir GRIVELL, 1983). La complexité
structurale des génomes mitochondri aux des plantes supérieures s'explique par la
présence de séquences répétées, directes ou inversées, qui sont impliquées dans des
phénomènes de recombinaison intra- et inter- moléculaire. De nombreuses séquences
répétées directes et inversées peuvent être présentes dans le même génome (QUETIER et
coll., 1985 : LONS DALE et coll., 1984) et le nombre des différentes recombinaisons
dans lesquelles ces séquences sont impliquées peut être très élevé générant ainsi un très
grand nombre de molécules de tailles et de structures différentes (LONSDALE et coll.,
1984). De nombreuses observations en microscopie électronique (KOLODNER et
TEW ARr, 1972 ; VEDEL et QUETIER, 1974 ; QUETIER et VEDEL, 1977 ;
SYNENSKI et coll., 1978) et des études physico-chimiques (VEDEL et QUETIER,
1974; WARD et coll., 1981) avaient déja mis en évidence cette structure complexe et
hétérogène du DNA rnitochondriai des plantes supérieures.
Depuis les travaux de PALMER et SHIELDS (1984) sur le génome de Brassica
campestris, les études de cartographie sur les génomes mitochondriaux de plusieurs
plantes ont montré que la structure de ces génomes peut être représentée sous la forme
d'une seule molécule circulaire appelée cercle maître ou chromosome maître. Le cercle-
maître est une construction théorique déduite de la cartographie des cosrnides contenant le
DNA rnitochondrial cloné. Il comporte toute l'information génétique contenue dans la
mitochondrie et tous les jeux de séquences répétées. Les recombinaisons entre les
séquences répétées génèrent des molécules de plus petite taille lorsqu'il s'agit de
recombinaison entre des séquences répétées directes ou provoquent des inversions de
séquences lorsque les recombinaisons impliquent des séquences répétées inversées
(LONSDALE, 1988).

---

2
La présence de ces séquences répétées, bien que largement répandue parmi les
génomes mitochondriaux des plantes n'est pas universelle puisqu'il a été rapporté que le
génome de Brassica hirta est constitué de séquences uniques (PALMER et HERBON,
1987), organisées en une seule molécule circulaire.
Les différentes sortes de molécules issues de ces recombinaisons ne suffisent pas
à expliquer toute la complexité du DNA mitochondrial des plantes supérieures. Il existe
en effet, dans la mitochondrie de nombreuses plantes, d'autres molécules de DNA
circulaires (plasmides) et linéaires (réplicons) indépendantes du cercle-maître. Ces
plasmides et ces réplicons sont très répandus et le tableau A montre les différentes
molécules extra-chromosomiques retrouvées dans différentes plantes. Certaines de ces
molécules sont très spécifiques de certaines lignées à l'intérieur d'une même variété. Il est
possible par exemple, de classer différen tes lignées de maïs en fonction des épisomes qui
les caractérisent (tableau A). Le rôle de ces petites molécules n'est pas connu.
Il a été démontré que le DNA mitochondria1 de certaines plantes supérieures porte
des insertions de DNA chloroplastiques (STERN et LONS DALE, 1982 ; STERN et
PALMER, 1984b). Dans leur majorité, ces séquences ne sont pas exprimées
(MAKAROFF et PALMER, 1987 ; FEJES et coll., 1988). Il s'agît généralement de
séquences chloroplastiques qui sont très peu remaniées comme c'est le cas pour
l'insertion chloroplastique de 12 kb décrite chez le maïs et qui comporte le gène du rRNA
16S et les gènes de tRNALeu , de tRNAIle, de tRNA Val et la moitié du gène de tRNAAla
(STERN et LONS DALE, 1982) ou encore l'insertion comportant le gène de la grande
sous-unité de la ribulose-Lô-bisphosphate carboxylase (LONS DALE et coll., 1983). Il
semble que l'insertion de ces séquences chloroplastiques soit relativement récente dans la
mitochondrie des plantes mais le phénomène est assez répandu (STERN et PALMER,
1984 ; NUGENT et coll., 1988). Il a aussi été décrit des cas où des séquences
chloroplastiques transférées sont transcrites dans la mitochondrie. Il s'agit essentiellement
des gènes de tRNA tels que les gènes de tRNAHis (IAMS et coll., 1985), de tRNACys
(WINTZ et coll., 1988-b) et de tRNATrp (MARECHAL et coll., 1987) de la mitochondrie
du maïs ou du blé.
Par ailleurs, s'il est généralement admis que l'organisation du génome
mitochondrial ne varie pas sensiblement d'un individu à un autre dans la même lignée et
dans les conditions naturelles, de grandes variations ont été mises en évidence entre
différentes lignées d'une même espèce. Le cas le plus étudié est celui du maïs (FAURON
et HAVLIK, 1988 ; FAURON et coll., 1989) où l'organisation du cercle-maître est
complètement remaniée entre les lignées B37-N et B37-cmsT qui ont cependant le même
environnement nucléaire (figure 1). Le réarrangement de ces séquences entraîne:
a) la modification du nombre et de-la nature des séquences répétées (fig.I-a).
Dans la lignée normale B37-N, le génome porte 6 jeux de séquences répétées dont 5

---

TABLEAU A: PLASMIDES ET REPLICONS TROUVES DANS
LES MITOCHOI\\JDRIES VEGETALES
Plasmides
circulaires
Espèces
Tailles (en kb)
Références
Maïs
N, erns-T. cms-C, cms-S
1.9
1.4
Kemble et Bedbrook, 1980
cms-C
1.5
Dale et coll., 1981
cms-C
1.4
Beta vu/garis
1.3
Powling, 1981
1.4
1.45
Hansen et Marcker, 1984
1.5
cms 01113M4
7.3
Phaseo/us vu/gans
1.9
Dale et coll., 1981
Vieia faba
1.4
Gabiet et coll., 1983
1.7
Gabiet et coll.; 1985
1.75
Nikiforova et Négruk, 1983
cms35ü
1.5
Negruk et coll., 1986
Wahleithner et Wolstenholme, 1987
He/ianthus annus
1.45
Leroy et coll., 1985
1.41
Crouzillat et coll., 1989
1.8
Crouzillat et coll., 1989
Sorghum bicolot
2.3
Chase et Pring, 1985
1.7
1.36
Réplicons
linéaires
Espèces
Taille (en kb
Références
Brassica spp
11 .3
Palmer et coll., 1983
Erickson et coll., 1985
Sorghum bicolot
N1
5.8
N2
5.4
Chase et Pring, 1986
Zeamays
cytoplasme S
S2
6.4
Levings et Sederoff, 1983
S1
5.4
Paillard et coll., 1985
2.3L
2.3
Bedinger et coll., 1986
2.1 L
2.1
cytoplasme RU
R1
7.4
Weissinger et coll., 1982
R2
5.4
-
Zea diptoperennis
01
7.4
Timothy et coll., 1983
02
5.4

---

TABLEAU B : GENES DE rRNA SEQUENCES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
Gènes
Espèces
Références
rm26
Oenothère
Manna et Brennicke, 1985
Maïs
Dale et coll., 1984
Blé
Falconet coll., 1988
rrn 18
Soja
Grabau, 1985
Blé
Spencer et coll., 1984
Maïs
Chao et coll., 1984
Oenothère
Brennicke et coll., 1985
Zea diploperennis
Gwynn et coll., 1987
rmS
Soja
Morgens et coll., 1984
Blé
Spencer et coll., 1981
Maïs
Chao et coll., 1983
Oenothère
Brennicke et coll., 1985
Zea diploperennis
Gwynn et coll., 1987
TABLEAU C: GEI\\JES DE tRNA SEQUENCES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
Gènes
Anticodons
Espèces
Références
tmG
GCA-1
Maïs
Wintz et coll.,
1988b
GCA-2
Tomate
Izuchi et Sujita, 1989
tmO
GJC
Maïs
Parks et coll., 1985
Blé
Joyce et coll., 1988b
tmE
UUC
Blé
Gualberto et coll., 1989
Soja
Wintz et coll., 1987
Maïs
Ce travail
If tmF
UAA
Maïs
Wintz et coll., 1988b
tmF
AAA
Maïs
Ce travail
tmG
Gee
Lupin
Bartnick et Borsuk, 1986
tmH
GJC
Maïs
lams et coll., 1985
tmK
UUU
Maïs
Ce travail
If tm L
CAA
Brassica
Oron et coll., 1985
trnfM
CAU
Lupin
Borsuk et coll., 1986
Soja
Grabau, 1987
Maïs
Parks et coll., 1984
Blé
Gray et Spencer, 1983
Oenothère
Gottschalk et Brennicke,
1985
trnM-1
CAU
Maïs
Parks et coll., 1984
trnM-2
CAU
Maïs
Ce travail
A. thaliana
Wintz et coll., 1988a
Soja
Wintz et coll., 1988a
tmN
GJU
Lupin
Karpinska et Augustyniak, 1988
Phaseolus vulgaris
Bird et coll., 1989
mais
Ce travail
If ImP
LGG
Blé
Maréchal et coll., 1987
tmP
U33
Blé
Runeberg-Roos et coll., 1987
Blé
Joyce et coll., 1988a
Maïs
Ce travail
tmQ
ULJG
Blé
Joyce et coll., 1988a
Blé
Joyce et coll., 1989
If tmR
ACG
Maïs
Dewey et coll., 1986
tmS
GCU
Blé
Joyce et coll., 1988b
Maïs
Wintz et coll., 1988b
-
tmS
UGA
Blé
Joyce et coll., 1988b
Maïs
Ce travail
ImS
GGA
Oenothère
S:chLister et Brennicke, 1987a
tmW
CCA
Blé
Maréchal et coll., 1987
tmY
GUA
Blé
Joyce et coll., 1988b
Maïs
Ce travail

---

FIGURE 1 : Comparaison de l'organisation des génomes
mitochondriaux du mais B37-N et B37-cmsT
(FAURON et HAVLlK, 1989)
a) Réorganisation des gènes et des séquences répétées:
<\\.6
53 !.. 0.7
\\6
t 1.5
rrn26
b) Réarrangement des blocs de séquences entre les deux génomes:
u
x
N
K
1
:Gènes
o
Séquences d'insertion chloroplastique
o
:Séquences S2 et RI (Levings et Sederoff, 1983; Weisslnger et coll., 1982)
l/ /1
: Séquences répétées
J
C:======::::JJ : Séquences trouvées seulement dans l'un ou l'autre génome
K
=
_ _ _ _111 : Séquences communes aux deux génomes

---

3
(14 kb: l4B, 11 kb, 5.2 kb, 1 kb, 0.7 kb) sont des répétitions directes et la dernière (14
kb: l4A ) est une répétition inversée. Dans la lignée B37 -crns'T on ne trouve que 4 jeux de
séquences répétées. Seules les répétitions directes de 11 kb et de 0,7 kb sont conservées:
De plus, une partie (1.5 kb), située à une extrémité de la séquence répétée de Il kb est
retrouvée ailleurs dans le génome; la troisième copie est en orientation inverse par rapport
aux 2 premières portées par les deux copies de la séquence répétée de Il kb. Par contre,
de nouvelles séquences répétées de 6 kb (inversées) et de 4.6 kb (directes) apparaissent.
Les anciennes séquences répétées directes de 14 kb (14 B), 5.2 kb et 1 kb et la séquence
répétée inversée de 14 kb (14 A) ne sont plus présentes qu'en une seule copie.
b)
la perte d'information génétique. En effet, des blocs de séquences allant
jusqu'à 25 kb sont absents du génome T si on le compare au génome N (fig. 1-b).
c) le gain de nouvelles informations génétiques (jusqu'à 30 kb) par apparition de
séquences spécifiques au génome T.
Au total, il ya une perte globale de matériel génétique (en quantité surtout) dans la variété
mâle-stérile (dont le cercle maître mesure 540 kb ) par rapport à la variété fertile (dont le
cercle maître compte 570 kb).
d) une nouvelle distribution des gènes connus. Les conséquences de ces
remaniements affectent aussi les séquences chloroplastiques insérées dans le DNA
mitochondrial. En effet, seule une partie de l'insertion chloroplastique de 12 kb (STERN
et LüNSDALE, 1982) est présente dans le génome T. Il n'en reste plus que 3 kb (fig.1-b:
FA UR ON et coll., 1989). Ces séquences sont donc aussi des sites actifs de
recombinaison.
Le génome mitochondrial de plantes supérieures contient un certain nombre de
gènes. Comme dans le cas des mitochondries animales et fongiques, la mitochondrie des
plantes supérieures est serni-autonorne et ne possède pas tous les gènes qui pourraient
assurer son indépendance génétique. Jusqu'à présent, les gènes identifiés par clonage et
séquençage dans les génomes des plantes supérieures codent pour des rRNA (tableau B),
des tRNA (tableau C), et des protéines (tableau D). A ces gènes, il faut ajouter de
nombreuses urf (Unidentified Reading Frame) ou phases de lecture ouvertes, qui sont
présentes dans le génome mitochondrial des plantes supérieures (pour une revue, voir
LONSDALE, 1988).
Pour ce qui concerne les tRNA, plus d'une trentaine de gènes provenant de
diverses' plantes ont été déjà séquences (tableau C). Seuls, 16 gènes ponant des
anticodons différents et correspondant à 14 acides aminés ont été retrouvés dans les
mitochondries végétales. Les gènes trn/v, trnl, trnl., trnlc, trn'T et trns/ n'ont encore été
mis en évidence chez aucune plante. Dans la mitochondrie du maïs, les seules séquences
pouvant correspondre à quelques uns de ces gènes se sont avérées être des pseudo-gènes
ou des gènes incomplets (DEWEY et coll., 1986) et/ou des séquences étrangères non

---

TABLEAU 0 : GEI\\lES DE PROTEINES IDENTIFIES DANS LES
MITOCHONDRIES VEGETALES
Gènes
Espèces
Références
Complexe cytochrome oxydase
cox 1
Maïs
Isaac et coll., 1985b
Oenothère
Hiesel et col., 1987
sorgho: mil
Bailey-Serres et coll., 1986
sorgho: 9E
Bailey-Serres et coll., 1986
Blé
Bonen et coli., 1987
soja
Grabau, 1986
cox Il
Maïs-N
Fox et Leaver, 1981
Blé
Bonen et coll., 1984
Riz
Kao et coll., 1984
Pois
Moon et coll., 1985
Oenothère
Hiesel et Brennicke, 1983
Soja
Grabau,1987
Zea diploperetmis
Gwynn et coll., 1987
cox III
Oenothère
Hiesel et coll., 1987
Maïs
Mc cart y et coll., 1989
Complexe cytochrome bc1
ccb
Maïs
Dawson et coll., 1984
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1985
Blé
Boer et coll., 1985
Complexe Fo-F1 ATPase
Ma'ls-N
Isaac et coll., 1985
atpA
Ma'is-cmsT
Braun et Levings, 1985
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1986
Pois
Morikami et N akamura, 1987
atp6
Maïs-cmsT
Dewey et coll., 1985a
Maïs-cmsC
Dewey et coll., 1988
Tabac
Bland et coll., 1987
soja
Grabau et colt., 1988
oenothère
Schuster et Brennicke, 1987b
atp9
Maïs-N
Dewey et coll., 1985b
Tabac
Bland et coll., 1986
Pétunia:F
Young et coll., 1986
Rothenberg et Hanson, 1987
Pétunia:cms et SH
Rothenberg et Hanson, 1988
complexe NAD/Q1
nad1
Pastèque (incomplet)
Stern et coll., 1986
Tabac (incomplet)
Bland et coll., 1986
Maïs (incomplet)
Bland et coll., 1986
nad3
Maïs
Gualberto et c oll., 1988
Blé
Gualberto et coll., 1988
Pétunia:cms et F
Rasmussen et Hanson, 1988
nad4
Soja (incomplet)
Wintz et coll., 1989
nad5
Oenothère
Wissinger et coll., 1988
Protéines ribos ornales
pseudo-rps4
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1987a
rps12
Maïs
Gualberto et coll., 1988
Blé
Gualberto et coll., 1988
rps13
Oenothère
Schuster et Brennicke, 1987c
. 'Tabac
Bland et coll., 1986
Maïs:cmsC
Bland et coll., 1986
Blé
Bonen, 1987
rps14
Fève
Wahleilner el Wolstenholme, 1988

---

4
fonctionnelles (STERN et LONSOALE, 1982). Un pseudo-gène de tRNALcu a aussi été
identifié chez B rassica ( ORON et coll., 1985 ). De plus, à part le cas du gène unS pour
lequel 3 anticodons différents ont été trouvés (tableau C ), tous les gènes homologues
trouvés dans les mitochondries de différentes espèces végétales comportent les mêmes
anticodons ttrnli, trni', trnl) , trnt), tr nï', lrnN,: tableau C). Pour l'heure, le jeu complet
de gènes de tRNA n'est connu pour aucune mitochondrie de plante supérieure, mais les
premières constatations (JOYCE et coll., 1988-b) montrent que, comme dans les
mitochondries animales et fongiques, le nombre de gènes de tRNA est limité au maximum
à 22 (animaux) ou 24 (champignons). Par conséquent, il est possible que la théorie de
LAGERKVIST (1978) dite "two out of three" suggérant que l'appariement codon-
anticodon repose sur deux paires de bases au lieu de 3 (pour les familles de tRNA
spécifiés par 4 codons différents ), puisse s'appliquer aussi aux mitochondries végétales.
Cependant, le fait qu'aucun anticodon ne soit retrouvé pour certains gènes de tRN A,
suggere que les tRNA correspondants sont importés. Cela a été confirmé par des études
récentes sur les tRNALcu de la mitochondrie du haricot (MARECHAL-DRüUARD et
coll., 1988; MARECHAL-DROUARD et GUILLEMAUT, 1988). Il a en effet été
démontré chez cette plante, que 4 tRNALeu mitochondriaux ne diffèrent de leurs
homologues cytoplasmiques que par une modification post-rranscr iprionnelle. Ces
tRNALeu sont codés par le noyau puis importés dans la mitochondrie (GREEN et coll.,
1987; MARECHAL-DROUARD et coll., 1988).
Pour avoir des informations complètes sur le nombre et la nature des tRNA nécessaires à
la synthèse protéique mitochondriale, il est indispensable de:
a) déterminer la séquence nucléotidique de tous les gènes présent sur le ONA
mitochondrial
b) isoler et séquencer tous les tRNA présents dans l'organite
c) séquencer les gènes de tRNA rnitochondriaux présents sur le génome nucléaire.
Pour l'heure, en plus du nombre restreint de gènes de tRNA connus (tableau 3), très peu
de tRNA ont aussi été étudiés dans les mitochondries végétales (tableau E) et tous les
travaux effectués sur les tRNA ont porté sur le haricot.
Par ailleurs, aucune étude expérimentale n'a été faite sur l'expression des gènes de
tRN A mitochondriaux connus. Les seules données dont on dispose proviennent des
analyses de séquences en amont des gènes de tRNA mitochondriaux de plusieurs plantes,
effectuées par JOYCE et coll. (l988-b). Une séquence consensus 5'AAGAANRR3'
susceptible d'être impliquée dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA a été
trouvée par cet auteur, en amont de la majorité des gènes étudiés. Par contre, aucune
séquence consensus n'a pu être dégagée de l'analyse des séquences en aval de ces gènes
de tRNA.

---

TABLEAU E:tRNA DES MITOCHONDRIES VEGETALES SEQUENCES
Especes
tRNA
Anticodon
Références
Phaseolus vulgaris
Phe
Gf:;A
Marécllal et coll.,1985-a
Trp
CXA
Maréchal et coll., 1985b
Tyr - 1
NUA
Maréchal et coll.,1985-c
Ty r- 2
NUA
Maréchal et coll.,1985-c
Met
CAU
Maréchal et coll., 1986
IMet
CAU
Maréchal et coll., 1986
Pro
LŒ
Runeberg-Roos et coll., 1987
Leu -1
NAA
Green et coll., 1987
Leu-2
NAG
Maréchal-Drouaro et coll. , 1988
Leu-4
NAA
Maréchal-Drouard et
Guillemaut, 1988

---

s
Dans ce travail, notre étude a porté sur les gènes de tRNA rnitochondriaux du
maïs. L'objectif de notre recherche a été d'étudier les gènes de tRNA présent sur le DNA
mitochondrial du maïs, leur nombre et leur organisation dans 2 lignées de maïs (B37-N et
B37-cmsT), Nous avons aussi essayé de déterminer le nombre de tRNA rnitochondriaux
susceptibles d'être codés par le noyau. L'utilisation du code génétique est aussi discutée.
Par ailleurs, nos études ont aussi porté sur des régions du DNA rnitochondrial du
maïs comportant des insertions chloroplastiques. L'origine de ces séquences, le
mécanisme probable de leur distribution et le sens évolutif de leur présence dans la
mitochondrie du maïs sont discutés.
Nous avons aussi caractérisé et analysé un fragment de DNA mitochondrial du maïs
comportant une structure chimérique qui est exprimée dans l'organite.

---

CHAPJTRiE J
MA~~fRluEL ET ~:ltJET[f=(J()DES

---

I~~
6
1
1. MATERIEL D'ETUDE: LE MAIS
1
Le maïs, Zea mays, est une céréale (monocotylédone) appartenant à la tribu des
andropogoniacées. Bien que le maïs soit longtemps connu et sélectionné par l'homme,
l'origine phylogénétique de l'espèce Zea mays reste encore floue. En annexe 1 est
montrée l'origine probable des différentes variétés de maïs connues actuellement sur la
planète (source ENSA-ENSFA).
Dans notre étude, nous avons utilisé des variétés de maïs à cytoplasme normal (mâle
fertile) et des variétés à cytoplasme mâle-stérile. Trois variétés à cytoplasme mâle-fertile
ont été utilisés et ce, pour deux raisons essentielles:
- Les variétés fertiles B37-N et WF9-N, parce que la carte de restriction de leurs
génomes mitochondriaux est déjà établie ( FAURON et coll., 1988; LONSDALE et coll.,
1984 ). De plus, les mitochondries de ces deux variétés normales se trouvent dans deux
environnements nucléaires différents. Nous avons entrepris l'étude comparée des gènes
de tRNA dans les génomes mitochondriaux de ces deux variétés pour voir si le
changement de l'environnement nucléaire pourrait avoir une influence sur leur
organisation et/ou sur leur nature.
- La variété INRA 248 a été utilisée parce qu'elle est disponible en quantité suffisante
et peut servir par conséquent pour les études de transcription.
- Pour sa part, la variété B37 -cms'T qui est la variété à cytoplasme mâle stérile dont la
mitochondrie se trouve dans le même environnement nucléaire (B37) que la variété fertile
B37-N, a été utilisée parce que la carte de restriction de son génome mitochondrial est
aussi disponible (FAURüN et HA VLIK, 1988). Dans ce travail, les deux cartes de
restriction des génomes mitochondriaux B37-N et B37-cmsT ont servi de support pour
l'étude comparée de l'organisation et de l'expression des gènes de tRNA dans l'organite.
II. PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
A. EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUE MITOCHONDRIAUX
La méthode utilisée dérive de celle décrite par STERN et NEWTON (1984)
1. PRINCIPE
Les acides nucléiques sont extraits de mitochondries purifiées à partir
d'hypocotyles de maïs. Les graines de maïs sont mises à germer à l'obscurité à 25°C. Les
jeunes hypocotyles sont broyés dans des tampons appropriés et le broyat est soumis à
une série de centrifugations différentielles pour obtenir un enrichissement en
mitochondrie. La fraction mitochondriale est ensuite lysée et les acides nucléiques sont
purifiés par des méthodes adéquates.

---

7
2. PURIFICATION DES MITOCHONDRIES
a) Croissance des plantes
Les graines de maïs sont généralement conservées dans des conditions assurant
une faible humidité ambiante et sont, de préférence, traitées avec un antifongique. Avant
d'entreprendre la mise en germination des graines, il faut se débarrasser de l'antifongique
en les rinçant. De plus, il faut lever la dormance des graines en les incubant une nuit (à
l'obscurité) à 25°C dans une bassine remplie d'eau. Les graines sont ensuite semées sur
de la vermiculite stérilisée par autoclavage.Le semis est incubé à 25°C à l'obscurité et
régulièrement arrosé d'eau. La récolte des hypocotyles se fait entre 5 et 7 jours de
croissance. Il est préférable de récolter les hypocotyles avant le début de l'auxesis et de la
différenciation cellulaire pour avoir un meilleur rendement en mitochondries purifiées.
b) Broyage
Les hypocotyles récoltés sont découpés en fins morceaux et placés à aGe
Toutes les étapes qui suivent se dérouleront à 4°C au maximum. Les plantules sont
broyées dans un appareil de type Waring-Blendor dans le tampon d'extraction dont la
composition est la suivante:
- 0.35 M Sorbitol
- 50 mM Tris-HCI, pH 8
-5mMEDTA
- 0,19'0 BSA
- 0,25 g/l spcrrnine
- 0,25 g/l sperrnidine
- 1,25 ml/1 mercapto-éthanol (ajouté extemporanément)
On effectue généralement deux broyages à haute vitesse pendant 5 secondes
(2 x 5 sec). Le broyat est filtré sur 2 à 3 couches de gaze associées à un tamis nylon (45
I-1m). On élimine ainsi les gros débris de l'extrait cellulaire.
c) Centrifugations différentielles (KOLODNER et TEWARI, 1972)
Pour se débarrasser des noyaux, des chloroplastes des amidons et des autres
débris cellulaires, le broyat est centrifugé pendant la minutes à 1000 g (Beckman J6-B).
Le surnageant est récupéré et centrifugé la minutes à la 000 g. Le culot enrichi en
mitochondries est resuspendu dans 10 ml du tampon d'extraction. Il est très important à
ce stade que les mitochondries soient bien resuspendues à l'aide d'un porter avant de
diluer la suspension obtenue avec 90 ml de tampon d'extraction. Les deux
centrifugations précédentes sont répétées sur la suspension de mitochondries. Le culot
final est très doucement resuspendu dans 10 m de tampon d'extraction. Pour obtenir du
DNA mitochondrial pur, il est indispensable à cette étape, de resuspendre les
mitochondries dans une solution contenant du MgCh (l0 mM). La suspension est alors

---

8
traitée à la DNAse 1. L'action de la DNAse 1 est arrêtée par addition d'EDTA (10 mM).
La suspension est ensuite centrifugée à 10 000 g et le culot repris dans du tampon
d'extraction.
d) Purification des mitochondries sur gradient de saccharose
Les mitochondries peuvent être purifiées sur un gradient de saccharose.
Ce gradient est constitué par trois couches de saccharose à 30, 52 et 60% (de
haut en bas) dissous dans le tampon de lavage dont la composition est la suivante: .
- 0,35 M Sorbitol
- 50 mM Tris-HCl, pH 8
-io mM EDTA
On laisse le gradient s'équilibrer au moins l2h avant utilisation. Le gradient est
centrifugé lh à 4°C à 83 000 g (25 000 rpm). Les mitochondries sont collectées à
l'interphase 30%-52% avec une pipette stérile. La fraction mitochondriale est diluée avec
3 volumes du tampon de lavage. La dilution doit se faire très lentement et à 4°C afin
d'éviter les chocs osmotiques. La suspension est ensuite centrifugée à la 000 g pendant
20 minutes et le culot constitué de mitochondries est repris dans 2 à 10 ml de tampon de
lavage.
3. LYSE DES MITOCHONDRIES ET EXTRACTION DES ACIDES
NUCLEIQUES
Lorsqu'on veut éviter la dégradation du RNA, on peut ajouter des inhibiteurs des
RNA ses. Nous avons utilisé l'ATA (Acide Tri Aurintrocarboxylique ) à des
concentrations de l mM pendant la lyse et 50 ilM pour le stockage à long terme des
RNA. Cependant cet inhibiteur pose des problèmes car il est difficile à éliminer et inhibe
aussi certaines enzymes (par exemple, la polynucléotide-kinase). NOLIS ne l'avons utilisé
que pour la purification des RNA qui ont servi pour les expériences de transfert.
L'inhibiteur est rajouté dans le tampon de lyse. Les mitochondries sont lysées en ajoutant
0,25 volume du tampon de lyse à la suspension précédente. La composition du tampon
de lyse est la suivante:
- 10% (v/v) sarkosyl de sodium
- 25 mM Tris-HCl pH 7,5
- 20 mM EDTA
L'ensemble est homogénéisé par agitation lente. Le lysat est traité avec un volume
de phénol-chloroforme (v/v) contenant 0,8% d'hydroxyquinoline. Cette opération est
répétée jusqu'à la disparition de l'interphase. La phase aqueuse est finalement extraite
avec un volume de chloroforme. Les acides nucléiques sont récupérés par précipitation en

---

9
mélangeant la phase aqueuse avec 2,5 volumes d'éthanol pur et 1/10 volume d'acétate
de sodium 3 M, pH 5.
4. PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES
a) Purification des RNA de haut poids moléculaire
Les acides nucléiques totaux extraits des mitochondries SOnt précipités au
chlorure de lithium à une concentration finale de 2M. L'ensemble est gardé à 4°C pendant
au moins 6 heures avant d'être centrifugé à12000 rpm dans une centrifugeuse SlG\\L"'.,
pendant 20 minutes. Le culot contenant les RNA de grande taille est séparé du surnageant
contenant le DNA, les tRNA, le rRNA 5S et les produits de dégradation. Les grands
RNA sont redissous dans de l'eau et précipités de nouveau avec du chlorure de lithium.
On obtient ainsi une fraction exempte de contarninants en DNA et en RN A de petites
tailles.
b) Purification des tRNA
La méthode dérive de celle décrite par GUILLEMAUT (1972).
Les surnageants des précipitations précédentes contiennent du DNA et les
RNA de petite taille. Pour purifier les tRNA, on procède d'une part 2. la dégradai ion du
DNA et d'autre part à la séparation des tRNA des autres petites molécules de RNA par
chromatographie.
ex) Dégradation du DNA
Le surnageant de la précipitation au chlorure de lithium est précipité à l'aide
de 2 volumes d'éthanol. Le culot obtenu après centrifugation est séché et redissous dans
une solution contenant du MgC12 la mM et du Tris-HCl pH 7,550 mM sous agitation
magnétique à O°C. On rajoute à ce milieu, de la DNAse 1 à 5 ug/ml et on laisse incuber
30 minutes dans la glace (ou JO minutes à température ambiante). La réaction est arrêtée
par chauffage pendant JO minutes à 65°C. Les RNA sont ensuite précipités par addition
de 2 volumes d'éthanol et de I/JO d'acétate de Sodium 3M pH 5. Après centrifugation, le
culot de RNA est séché et dissous dans du tampon L (cf paragraphe suivant).
(3) Purification des tRNA par chromatographie
La fraction 45 du RNA rnitochondrial obtenu après avoir séparé les RNA de
haut poids moléculaire et dégradé le DNA, est composée de plusieurs autres molécules de
RNA de petites tailles. Pour séparer les tRNA des autres molécules de RNA, l'ensemble
de la fraction 45 est fractionné soit sur une colonne de DEAE-cellulose, soit sur une
colonne hydrophobe RPC-5 (KOTHARI et TA YLOR, 1973 ). Notre expérience nous a
montré que la purification sur RPC-5 est plus efficace en ce qui concerne les tRNA. Le
RNA de la fraction 45 est dissous dans du tampon' Low contenant:

---

10
- Tris-HCJ
10 mM pH 7,5
- NaCl
0,2 M
Ce milieu est déposé sur une colonne (DEAE ou RPC-S) et rincé
abondamment avec du tampon Low. Ceci permet l'élimination des petits produits de
dégradation des acides nucléiques mitochondriaux. Les tRNA sont élués avec du tampon
H contenant:
- Tris-HCJ
10 mM pH 7,5
- NaCI
lM
L'éluat est alors précipité à l'aide de 2 volumes d'éthanol. Après
centrifugation, les tRNA sont séchés et dissous dans de l'eau bidistillée.
5. DOSAGE DES RNA
Le dosage des RNA est effectué par la mesure de la densité optique à 260 nm.
Pour un chemin optique de 1 cm, à cette longueur d'onde, 1 0.0. représente une
concentration en RNA de 40 I-lg/ml. Pour évaluer la pureté des RNA, une autre mesure
est faite à 280 nm. Le rapport 0.0. 260 nm/D.O. ·280 nm doit être compris entre 1,8 et
2, traduisant ainsi une absence de contamination protéique.
6. ANALYSE DES RNA PAR ELECTROPHORESE
a) Fractionnement des RNA de grandes tailles
Les grands RNA (rRNA, mRNA et dsRNA) ont été fractionnés par
électrophorèse sur gel d'agarose 1,S% en conditions dénaturantes. La dénaturation des
molécules de RNA est assurée par la présence de formaldéhyde dans le gel d'agarose
(LEHRACH et coll., 1977).
On dissout I,S g d'agarose dans 72,8 ml d'eau par ébullition. L'agarose
dissous est refroidi à 60°C et on y ajoute 10 ml de tampon HEPES x 10 (200 mM
HEPES pH 8, la mM EDTA) et 16,2 ml de formaldéhyde. L'ensemble est coulé entre
deux plaques d'électrophorèse stériles. La base du gel est constituée par un socle de
polyacrylarnide fait avec:
- 3,6 ml d'acrylarnide-bisacrylarnide 50-2,5%
- 1 ml de tampon HEPES 10x
- 5,3 ml d'cau bidisiillée stérile
.
- 10 J..lI de T.E.M.E.D.
- 90 J..l1 de S.P.S. ou A.P.S. 10%
L'épaisseur du gel est de 2 mm.

---

Il
Avant de déposer J'échantillon de RNA sur le gel, on procède à une
dénaturation. On mélange ainsi 1 volume de la solution de RNA avec 3 volumes d'un
tampon de dénaturation contenant:
- 10 ~l de Tampon HEPES 10x
- 50 ul de Fonnamidc (75% final)
- 16 ul de Formaldéhyde (9% final)
L'ensemble est chauffé à 65°C pendant 5 minutes. On y ajoute ensuite 1 u l de
Bleu de Bromophénol 0,1% dans 50% de glycérol. L'échantillon dénaturé est alors
déposé sur le gel et la migration est faite à 120 V pendant 4 heures. On peut aussi faire
migrer à 40 V pendant 12 heures.
b) Fr?çtiQnnement des tRNA
Les tRNA ont été fractionnés sur gel de po lyacrylarnide 15% en conditions
dénaturantes (présence d'urée 8 M) par la méthode de SANGER et COULSON (1978)
Le gel est constitué de :
- 15% acrylamide (p/v)
- 0,75% bis-acrylarnide (p/v)
- 8 Murée
- 0,045 M T.E.B. (Tris-borate 45 mM, EDTA 1,25 mM)
- 0,07% de S.P.S. Cl 0,035% de T.E.M.E.O.
Le T.E.M.E.O. et le S.P.S., qui sont les catalyseurs de la polymérisation, sont
ajoutés juste avant de couler le gel entre les plaques d'électrophorèse. Le gel polymérisé
est soumis à une pré-migration pendant environ une heure. Avant d'être déposés sur le
gel, l'échantillon de tRNA est dénaturé en y ajoutant un volume égal de solution de dépôt
dont la composition est:
- 10 MUrée
- 25 mM Acide citrique
- 0,025% Xylène cyanol
"0,025% Bleu de Brornophénol
Le tampon d'électrophorèse est du T.E.B. 0,045 M et l'électrophorèse est
effectuée pendant 15 à 20 heures à 1000-1500 V.
Après migration, les bandes de RNA sont révélées en incubant le gel pendant
1 h dans du tampon T.E.B. 0,045 M contenant 0,5 Jlg/ml de bromure d'éthidium. Le
gel est ensuite débarrassé de l'excès de bromure d'éthidium par plusieurs lavages
successifs dans du tampon d'électrophorèse. Une photographie du gel est ensuite prise
sous éclairage U"V"

---

12
B. EXTRACTION DU DNA NUCLEAIRE
La méthode utilisée est inspirée de celle décrite par DA VIS et coll. (1986).
La croissance et la récolte des plantules se fait comme décrit précédemment.
Après la récolte, les plantules sont broyées dans un mortier contenant de l'azote liquide et
le broyat est dilué dans un tampon d'extraction (400 ml pour environ 60 g de plantules)
dont la composition est la suivante:
'- 10 mM
Tris -HCI pH 7,8
-0,25 M
Sucrosc
- 3 mM
KCl
- 25 mM
MgC12
- 50% (p/v)
Glycérol
- 0,5% (p/v)
Triton x 100
- 7 mM
~-Mercaplo-élhanol
Le broyat est homogénéisé avec un appareil polytrori, filtré sur un tamis de
nylon (25 urn) et centrifugé à 2000g pendant 10 minutes. Le culot est repris dans le
tampon d'extraction sans glycérol ni Triton, déposé sur une couche de sucrose 2M et
centrifugé à 2000 g pendant 10 minutes. Le culot de noyau est repris dans une solution
contenant 10% de Sarkosyl et 1 mg/ml de protéinase K, et laissé incuber au moins deux
heures. L'extrait est alors soumis à plusieurs extractions au phénol-chloroforme (v/v). La
phase aqueuse est ensuite déposée sur un coussin de CsCI (4 M) et centrifugée à
40000 rpm pendant 15 h dans une centrifugeuse LKB ( 2331 ,ultrospin 70 ). Le culot
translucide obtenu (contenant le DNA nucléaire) est resuspendu dans de l'eau bidistillée,
précipité avec 2 volumes d'éthanol et le DNA précipité est ensuite dissous dans 500 ~l
à 1 ml d'eau. La qualité du DNA est contrôlée par électrophorèse sur gel d'agarose. La
digestibilité du DNA nucléaire par des enzymes de restriction est aussi un contrôle de la
qualité de ce DNA.
C. EXTRACTION DES tRNA CHLOROPLASTIQUES
1. ISOLEMENT DES CHLOROPLASTES
Nous avons utilisé la technique décrite par GUILLEMAUTet coll.( 1972 ).
Les feuilles fraîches sont généralement récoltées après 10 jours de croissance.
Elles sont lavées, découpées et broyées dans un appareil de type "Waring Blendor". Le
broyat est dilué dans un tampon d'extraction Cl 1 pour 350 g de feuilles) dont la
composition est la suivante:
- 0,35 M
Mannitol
- 50 mM
Tris-HClpH 8
- 5 mM
EDTA
- 7 mM
~-mercapto-élhanol
- 1 g/I
BSA

---

13
L'ensemble est homogénéisé, filtré sur des toiles à bluter de 100 urn puis 25 urn
de vide de maille, et centrifugé à 3 500 rpm (BECKMAN, J6-B) pendant 2 minutes à
4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans le tampon
d'extraction ou l'EDTA est remplacé par du MgCl2 (14 mM). La suspension est
centrifugée de nouveau à 3200 rpm (BECKMAN, 16-B) pendant 3 minutes et le culot
chloroplastique récupéré est suffisamment pur pour extraire les tRNA.
2. PURIFICATION DES tRNA
Le culot de chloroplaste est repris dans un tampon de lyse identique à celui décrit
en II.A.3. Les tRNA sont purifiés comme décrits précédemment pour les tRNA
rnitochondriaux.
III. METHODES DE CLONAGE ET ANALYSE DES ACIDES
NUCLEIQUES
A. ivfETHODES DE CLONAGE
1. REALISATION ET CRIBLAGE DES MINI-BANQUES
Pour disposer de tous les fragments de restriction issus de l'hydrolyse par une
enzyme de restriction donnée d'un cosmide contenant du DNA mitochondrial, nous
avons souvent été amenés à réaliser des mini-banques. Puisque l'objectif de notre étude
est la détermination de la séquence nucléotidique des fragments comportant des gènes de
tRNA, nous avons choisi le vecteur de séquençage M 13. Ce vecteur sera décrit dans le
chapitre concernant le séquençage (ITl.B.2).
a) Digestion du DNA par les enzymes de restriction
La digestion du DNA par des enzymes de restriction se fait dans les conditions
conseillées par les fournisseurs. Elle est souvent réalisée dans un milieu réactionnel de 20
à 30 ~l contenant:
- 1 à 5 ug dc DNA
- 2 à 3 III du tampon de digestion 10 x
- 4 U d'enzymes par ug de DNA
- H20 qsp 20 à 30 III
Le milieu de réaction est incubé pendant au moins 40 minutes ou 2 heures
suivant l'enzyme utilisée. Quatre types de tampon de digestion sont utilisés et leur
composition est indiquée dans le tableau suivant:

---

14
NaCl
KCl
Tris-HCl
DIT
;',
---------------------------------------------------------------------------------------------
Tampon A
10 mM pH 7,4
10 mM
ImM
Tampon B
50 mM
10 mM pH 7,4
10mM
Tampon C
100 mM
50 mM pH 7,4
10mM
Tampon K
20 mM
10 mM pH 8
JO mM
1 mM
La réaction est arrêtée par addition de 1/4 du volume de tampon de charge qui
sert en même temps pour le dépôt des échantillons sur le gel d'agarose. Le tampon de
charge est composé de :
- 40%
Saccharose
- 5 mM
EDTA
- 0,1%
SDS
- 0,025%
de Bleu de Bromophénol
- 0,025%
de Xylène Cyanol
b) Analvse des fragments de restTÎction par électrophorèse sur gel d'agarose
Le fractionnement par électrophorèse sur gel d'agarose horizontal permet à la
fois d'analyser la taille des fragments de restriction et de s'assurer que la réaction
d'hydrolyse a été totale.
La concentration en agarose varie selon la taille des fragments à analyser, de
0,7% (500 pb à 8 kb) à 1,5% (de 300 pb à 2 kb).
Le gel est réalisé en fondant l'agarose par ébullition dans du tampon
d'électrophorèse T.E.B. (Tris-borate 89 mM pH 8, EDTA 2 mM). Après refroidissement
à 60°C, on rajoute au gel du bromure d'éthidium à une concentration finale de 0,5 ug/rnl.
On laisse le gel se solidifier à température ambiante en prenant soin d'aménager des
poches de dépôts. L'électrophorèse est effectuée à 5 V/cm et le niveau de migration est
contrôlé en exposant le gel sous une lampe U.V. Un témoin de migration, constitué par
une solution de "DNA ladder, BRL" est analysé en parallèle. En fin de migration, une
photo du gel est prise sous U.V. en utilisant le système Polaroïd.
c) Ligation des fragments de restriction avec le vecteur de clonage
La ligation des fragments de restriction avec le vecteur est effectuée grâce à la
T4 DNA ligase (WEISS et coll. 1968). La réaction de ligation est très importante dans le
processus de clonage c~r elle influe directement sur la quantité de recombinants et sur
leur qualité. Ceci est déterminé par le rapport molaire entre le vecteur et les inserts,

---

15
Généralement, un rapport de 5 molécules d'insert pour une molécule de
vecteur est utilisé. Il est cependant important de faire une gamme de ce rapport lorsqu'on
veut constituer une mini-banque car la taille des fragments et leur abondance sont des
facteurs qui influent sur la qualité de la ligation. Le milieu réactionnel comprend:
- DNA à insérer
100 à 1000 ng
- Vecteur
100 ng
- Tris-HeI pH 7,5 70 mM
- MgC 12
7mM
- DIT
5mM
- (r)ATP
ImM
- Spermidine 1 mM
- T4 DNA ligasc
lU
La réaction est effectuée à 14°C pendant au rnorns 12 heures ou bien à
température ambiante pendant 2 heures pour les fragments de DNA ayant des extrémités
cohésives. Dans le cas des fragments de restriction ayant des extrémités franches, il est
utile d'augmenter la concentration en enzyme (2 U nirés) et de favoriser le rapprochement
des extrémités par adjonction de chlorure d'bex amine cobalt (III) à une concenrration
finale de 1,25 mM.
On arrête la réaction par addi rion de 1 u l d'EDTA 0,5 M.
d) Transfomlation d'E,çQ/j par les plasmides recombinants
a) Souches d'E.coli utilisées
Deux souches d'E.coli K 12 nous ont servi pour la transformation : JM 103
et NM 522. Ces souches ont les phénotypes suivant:
lM 103 : thi, strA, end/v, sbc B15, hsd R4, ,1 (lac-proAB)/[F', tra D36,
proAB, lac IqZ.M15j, strep R, modification +, restriction-
NM 522: u« supE, L\\ hsds ,1 (lac-proAB)// F', proAB, laclqZ ,1M 15 t.
modification -, restriction -
Ces souches sont caractérisées par l'absence de l'opéron lactose dans le
DNA chromosomique. Elles contiennent un épisome F' porteur du gène de la ~-
galactosidase modifié et le répresseur de l'opéron lac est produit constitutivement à la
suite d'une mutation dans son promoteur (MESSING et coll., 1977).
{3) Transformation des bactéries par la méthode de Hanahan
~ Préparation des cellules compétentes
L'objectif de la préparation de cellules compétentes est de fragiliser la
paroi bactérienne pour permettre une meilleure pénétration du DNA. La méthode que
nous avons utilisée est une méthode chimique qui a été dévëloppée par HANAHAN
(1983).

---

16
Les cellules (lM 103 ou NM 522) sont conservées sur du milieu
déficient en proline afin de permettre la conservation de l'épisome F et d'empêcher la
contamination par d'autres souehes d'E.coli non porteuses de cet épisome. Pour avoir
des cellules vigoureuses, on procède à une préculture dans du milieu riche L.B. (cf
annexe2). 100 ul de cette culture est remis à pousser dans 50 ml de milieu SOB (cf
annexe 2) en présence d'ion Mg++ (l M MgCl} - MgS04) à 37°C sous agitation. La
croissance des bactéries est arrêtée lorsque la 0.0. à 550 nm atteint 0,6 en plaçant le
milieu de culture dans la glace pendant 15 mn. Le milieu est centrifugé à 2000 g (O°C) et
le culot bactérien est resuspendu dans 8 m de milieu T.F.B. (cf annexe 2) et placé dans la
glace pendant 15 minutes. Les bactéries sont une nouvelle fois sédimentées à 2000 g et
le culot est resuspendu dans 2 ml de T.F.B. On ajoute au milieu 70 ul de DMSO et on
laisse incuber 5 minutes dans la glace. 70 !lI de OTT 2,2 M sont ensuite additionnés au
milieu et l'ensemble est laissé 10 minutes dans la glace. Enfin, 70 ul de DMSO sont
rajoutés et l'incubation est prolongée de 5 minutes après lesquelles, les cellules sont
compétentes et prêtes à être transformées.
.: Transfonnation
Les cellules compétentes sont réparties (200 ul par tube) et on dépose
dans chaque tube une aliquote de ONA issue de la ligation. L'ensemble est homogénéisé
doucement et mis dans la glace. Après 40 minutes d'incubation, les cellules sont
soumises à un choc thermique (42°C, 2 minutes) ayant pour but de favoriser la
pénétration du ONA adsorbé sur la. paroi, dans les bactéries. Les tubes sont remis dans la
glace après le choc thermique pendant au moins 3 minutes. Les cellules transformées sont
ensuite diluées avec 800 ul de L.B., sédimentées à 2000 g pendant 10 minutes pour
éliminer le on' et le DMSO toxiques pour les cellules. Les bactéries sont ensuite
resuspendues dans 200 ul de L.B .
.: Sélection des bactéries transfomlées
Le vecteur M 13
U ne série de souches du bactériophage M 13 a été développée
(MESSING, 1983) dans le but de l'utiliser comme vecteur de clonage. Ces souches
dérivent de la souche sauvage par insertion dans une région intergénique, d'une séquence
portant des sites uniques de restriction. Ces sites sont utilisés pour l'insertion de
fragments de DNA étranger. Le bactériophage Ml3 est constitué d'une molécule de DNA
circulaire monocaténaire entourée d'une protéine capsidaire. Dans son cycle infectieux le
M13 passe par une forme bicaténaire qui est en fait la forme replicative. Cette forme
replicative a toutes les caractéristiques d'un plasmide et il est possible de l'utiliser comme
vecteur de clonage. Par les systèmes de clonage classique, on peut insérer du DNA
étranger dans cette molécule bicaténaire et transformer les souches Eicoli réceptrices. La

---

17
bactérie transformée produit alors des particules phagiques recombinantes. Le DNA
simple brin de l'insertion peut aussi être analysé et sa séquence nucléotidique déterminée
par la méthode de SANGER.
. Princip.s;.
Les vecteurs Ml3 (mpI8-mpI9) utilisés
pour le clonage dans nos
expériences comportent le gène du peptide a de la ~-galactosidase et les régions
régulatrices de l'opéron lactose. En transformant les souches d'E.cofi décrites plus haut
avec ce vecteur, on réalise une complémentation avec l'épisome F' pour l'activité ~­
galactosidase. La bactérie transformée est donc capable d'hydrolyser le lactose. En
utilisant des analogues structuraux du galactose, on peut sélectionner les bactéries qui ont
été transformées. Deux analogues sont utilisés à cet effet: l'IPTG (isopropyl/E-D
thiogalactoside) et le X-gal (S-bromo, 4-chloro ; 3-indolyl ~-D galactoside). L'IPTG
active l'opéron lactose et la ~-galactosidase produite hydrolyse le X-gal (qui est incolore)
en bromochloro-indole qui est un produit bleu. Toutes les bactéries comportant le vecteur
intact donnent par conséquent des plaques bleues sur un tapis bactérien. Par contre,
l'introduction d'un fragment de DNA dans le gène de la ~-galactosidase du vecteur
inactive son activité. Les plaques sont alors incolores. On reconnait ainsi les clones
recom binan ts.
. Culture et sélection des cellules recombinantes
Les bactéries transformées contenues dans les 200 ul de L.B. sont
réparties en 3 aliquotes (1/100, 1/10 et environ 8/10). Chaque aliquote est mélangée à
3 ml de L.B. agar 0,8% conservé à 42°C (cf annexe 1) contenant:
- 40 ll! de X-Gal dissout dans le diméthylforrnamide
- 20 III de IPTG 100 mM
- 50 III de bactéries non transformées en phase exponentielle de croissance
L'ensemble est étalé sur une boîte de pétri contenant du L.B. agar I,S%
(cf annexe 2) et laissé refroidir à température ambiante. Les boîtes sont renversées une
fois que le L.B. agar 0,8% s'est solidifié et sont gardés à 37°C. Les premières plaques
sont detectables après 4 h de culture mais l'induction de l'activité ~-galactosidase est
visible plus tardivement.
e) Analyse des clones recombinants
Le bactériophage M 13 présente l'avantage d'être sous deux formes: sous
forme de phage à DNA monocaténaire dans le milieu de culture, et sous forme de
plasmide (forme replicative) dans la bactérie. Les clones recombinants peuvent donc être
analysés sous ces deux formes.

---

18
Après la culture des transformants sur boîte de pétri pendant au moins
12 heures, on distingue des plaques bleues représentant les transformants ne contenant
que du M 13 narif et des plaques blanches représentant les transformants recombinés. Les
phages de ces plaques peuvent être repiqués dans 2 ml de L.B. contenant des cellules
fraîches non transformées. De cette manière, le clone est amplifié. La culture se fait
pendant 5 heures au minimum, à 3rC et sous une très forte agitation. Après la culture, le
milieu est centrifugé à 10 000 rpm pendant 10 minutes et le surnageant contenant les
phages est séparé du culot bactérien. Les bactéries contiennent le DNA recombinant sous
sa forme replicative bicaténaire.
ex) Analyse des phages
.:. Analyse directe
Le surnageant phagique peut être directement analysé par électrophorèse
sur gel d'agarose. Pour cela, 20 ul de surnageant sont mélangés avec 5 ).lI d'une solution
qui sert à la fois de tampon de charge et de tampon de lyse, dont la composition est la
suivante:
-60%
Formarnide
-3% S.D.S.
- 0,083%
Bleu de Brornophénol
- 25 mM
EDTA pH 8
L'ensemble est placé 5 minutes à 65°C, laissé refroidir 5 minutes et
déposé sur uu gel d'agarose contenant du B.E.T. (0,5 ug/rnl). L'électrophorèse se fait à
20-100 V. Les échantillons sont analysés en même temps qu'un témoin ne contenant que
du M 13 natif. On peut déterminer ainsi, d'une manière grossière, la taille des phages
recombinants. Cette méthode est indicative mais ne renseigne pas sur le nombre ni la
qualité des insertions .
.:. Analyse des phages après purification du DNA
Le DNA phagique peut être extrait avant d'être soumis à une
électrophorèse sur gel d'agarose. Pour cela, 1 ml de surnageant phagique est mélangé
avec 0,25 ml d'une solution de P.E.G. 20% - NaCl 2M. L'ensemble est homogénéisé en
vortexant et placé au moins 30 minutes dans la glace. La solution est ensuite centrifugée
20 minutes à 12000 rpm. Le culot contient les phages précipités. Le surnageant est
enlevé et les parois soigneusement nettoyées. Le culot est ensuite dissous dans 200 ul
d'eau et soumis à une série d'extractions au phénol-chloroforme (v/v). Le DNA de la
phase aqueuse finale est précipité en-y ajoutant 2,5 volume d'éthanol et 1/10 de volume
d'acétate de sodium 3 M pH 5 et placé à -20°C pendant au moins 2 heures. Après.
centrifugation à 12000 rpm, le culot de DNA est lavé avec de l'éthanol 70%, séché et

---

19
redissous dans 10 à 50 ul d'eau bidistillée. Une aliquote de cette solution peut être testée
sur gel d'agarose comme précédemment.
.::. Hybridation croisée des ONA phagiques :
Pour isoler deux à deux des phages contenant le même fragment de
ONA inséré dans les orientations opposées, on peut procéder à l'hybridation des ONA
simple-brins phagiques des clones recombinants. On peut faire cette hybridation en se
servant soit du surnageant phagique, soit des ONA simple-brin purifiés. Le milieu
réactionnel contient:
- DNA1
500 ng (ou l Oul de sumageant phagique)
-DNA2
500 ng (ou 1O!J.1 de surnageant phagique)
- NaCI
0.25 M
- SDS
1%
- Formamide déionisée
12%
-EDTA
5mM
- Bleu de bromophénol
0.02%
L'ensemble est placé à 65°C pendant 1 heure, puis laissé refroidir à
température ambiante pendant 15 minutes et analysé par électrophorèse sur gel d'agarose.
Quand les insertions des phages 1 et 2 sont constituées de séquences
complémentaires, leur hybridation donne une molécule plus lourde qui est retardée par
rapport aux simple-brins lors de la migration.
f3) Analyse des plasmides
.::. Méthodes de purification des plasmides
~Métllcxle alcaline
Cette méthode est inspirée de celle décrite par MANIATIS et coll.
(1986). C'est une méthode de choix pour la préparation de plasmide à partir de petites
cultures. Le culot bactérien (2ml) est resuspendu dans 120 ul d'une solution contenant:
- 50 mM
Glucose
- 25 mM
Tris-HCl pH 8
- 10 mM
EDTA
L'ensemble est homogénéisé et laissé dans la glace 10 minutes. La
présence du glucose assure la pression osmotique. A la suspension de bactéries, on
ajoute 80 ul de lysozyme (20 mg/ml) fraîchement préparé et on incube 10 minutes dans la
glace pour permettre une lyse ménagée de la paroi des bactéries. On procède ensuite à la
dénaturation des acides nucléiques et des protéines en ajoutant 160 ul d'une solution de
dénaturation (0,2 N NaOH, 1% SOS) et en incubant 5 minutes dans la glace. A ce stade,

---

20
il est important de ne plus agiter fortement dans le souci de ne pas casser le DNA
nucléaire qui pourrait éventuellement contaminer la préparation de plasmides.
A la solution précédente, on additionne 80 III d'une solution d'acétate de
potassium 5 M pH 4,8. Le changement brusque du pH du milieu qui s'en suit entraîne la
renaturation rapide des molécules de DNA. Les plasmides et autres petites molécules sont
reconstituées mais le DNA génomique bactérien forme un réseau désordonné qui
précipite avec les protéines dénaturées. Par centrifugation à 12 000 rpm pendant 20
. minutes, on sédimente ce réseau et le surnageant contenant les plasmides est récupéré,
traité deux fois au phénol-chloroforme et précipité par addition de 2,5 volumes d'éthanol
pur.
. Méthode du lysat clair
Cette méthode (DA VIS et coll., 1986) peut être aussi appliquée à la
purification du DNA cosmidique.
Les bactéries contenues dans 5 à 10 ml de culture sont centrifugées à
12 000 rpm (SIGMA) pendant la minutes. Le culot bactérien est resuspendu dans 50 fll
de tampon S.T. (25% Sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8). L'ensemble est mis dans la
glace; on y ajoute 25 ).11 de lysozyme (20 mg/ml) et on laisse incuber 5 minutes. On
ajoute ensuite 62,5 III d'EDTA (0,2 M) pour arrêter la réaction avant d'ajouter 162,5 fll
de tampon de lyse dont la composition est pour 100 ml :
. l ml
Triton 10%
- 31 ml
EDTA (2Na) 0,2 M pH 8
- 5 ml
Tris-HCl 1 M pH 8
- H20 qsp 100 ml
Sans vortexer, on laisse 15 minutes dans la glace et on congèle ensuite
l'ensemble à -80°C avant de laisser fondre à 37°C. Cette opération peut être répétée. Le
milieu est ensuite centrifugé à 12000 rpm (SIGMA) le surnageant plasmidique est
récupéré et le DNA extrait comme précédemment. Dans les deux cas, on peut purifier
d'avantage le DNA plasmidique sur un coussin de CsCl comme cela a été décrit par
MANIATIS et coll., (1986).
Les deux méthodes sont aussi applicables à de plus grands volumes de
cultures bactériennes. On ajuste alors les proportions des solutions utilisées.
y) Autres méthodes de criblage de la mini-banque
.: Criblage Qill: analyse des profils de restriction
Le criblage des clones recombinants peut être effectué en analysant le
profil de restriction du DNA plasmidique de ces clones. Le plasmide est alors soumis à

---

21
une ou plusieurs digestions enzymatiques permettant non seulement d'iden tifier les
clones recombinants mais aussi de les classer qualitativement.
: Criblage I@I hybridation
Lorsqu'on cherche à isoler un clone contenant un fragment de restriction déjà
caractérisé dans une mini-banque, on peut procéder par hybridation. Le fragment de
restriction concerné est alors purifié comme cela est décrit en IILA.2.a et marqué suivant
le protocole décrit en IILB. L'hybridation se fait dans les conditions décrites en III.C.
Pour transférer les plaques de la mini-banque on suit le protocole suivant qui dérive de la
méthode décrite par MANIATIS et coll., (1986) :
Des rondelles de nitrocellulose (S5 mm diamètre) sont déposés sur les boîtes
de Pétri contenant les phages. Des répères d'orientation sont marqués sur les filtres et le
transfert se fait pendant 5 minutes. Les phages fixés à la nitrocellulose sont alors traités
au SOS 10% pendant 5 minutes puis dénaturés (0,2 M NaOH) pendant 5 minutes et
enfin mis au contact d'un tampon de neutralisation (O,5M Tris-HCl pH S). Les filtres
sont ensuite séchés à température ambiante puis passés au four à SOGC pendant 2 heures.
Ces filtres sont hybridés avec la sonde radioactive. Les clones positifs révélés après
l'autoradiographie sont repiqués individuellement et analysés par les méthodes décrites
précédemment.
2. CLONAGE DE FRAGMENTS PURIFIÉS
Au lieu de réaliser une mini-banque, on peut effectuer le clonage d'un fragment
précis, déjà caractérisé. Pour cela, il faut purifier le fragment concerné. Nous avons
souvent purifié les fragments de restriction après les avoir fractionnés par électrophorèse
sur gel d'agarose.
a) Purifïcation des fragments de restriction
0.) Utilisation de gel d'agarose à basse température de fusion
Les gels d'agarose à basse température de fusion (FMC, Biocorp., USA)
ont les mêmes propriétés que les gels d'agarose normaux en ce qui concerne leur capacité
de fractionnement des fragments de DNA. Ils ont en plus l'avantage de pouvoir se
liquéfier en dessous de GOGC, ce qui permet une extraction plus facile des fragments de
DNA sans risquer leur dénaturation. L'électrophorèse a lieu dans les mêmes conditions
que les gels classiques. Le morceau de gel contenant le fragment de restriction d'intérêt
est découpé après la migration et incubé à GO°C pendant la minutes. Le gel fondu est
ensuite dilué 3 à 4 fois avec de l'eau distillée et extrait 3 à 4 fois avec du phénol. Nous
évitons le chloroforme qui favorise la formation d'un culot translucide-qui s'avère

---

22
inhibiteur pour les réactions de ligation. Le DNA de la phase aqueuse est précipité à l'aide
de 2,5 volumes d'éthanol.
{3) Filtration des morceaux d'agarose contenant du DNA
On peut aussi extraire les fragments à cloner en séparant la phase aqueuse
qui les contient de la phase solide du gel d'agarose. Pour cela, après l'électrophorèse, le
morceau d'agarose contenant le fragment d'intérêt est placé dans un tube de type Costar
contenant un filtre de nitrocellulose. Ce filtre se caractérise par sa faible rétention pour les
acides nucléiques. Le filtre sépare le morceau de gel du fond du tube. L'ensemble est
ensuite centrifugé à 12 000 rpm pendant au moins 20 minutes. La phase aqueuse
contenant le DNA se retrouve alorsau fond du tube et la phase solide est éliminée avec le
filtre. La phase aqueuse est extraite avec du phénol et le DNA est récupéré par
précipitation à l'aide d'éthanol.
b) Clonage des fragments purifiés
Tout le reste de l'opération se fait comme dans le cas d'une mini-banque.
L'avantage du clonage de fragments spécifiques est que le rapport de ligation est facile à
déterminer puisqu'on peut connaître la taille et la quantité de l'insert. De plus, le criblage
est plus facile.
3. SOUS-CLONAGE DES FRAGMENTS DE DNA EN VUE DE LEUR
SEQUENÇAGE
a) Sous-clonage basé sur la cartographie de restriction
Lorsqu'un fragment de restriction dépasse 500 pb en longueur, il est utile de le
découper en fragments de plus petites taille pour déterminer sa séquence nucléotidique.
Pour cela, on utilise une batterie d'enzymes de restriction à site de coupure fréquents
(enzymes comportant 4 nucléotides dans leur site de coupure) pour établir la carte
physique du fragment. Ces petits fragments sont sous-clonés et leur séquence
nucléotidique peut être facilement déterminée.
b) Utilisation d'oligonucléotides de synthèse
Il peut arriver que, dans certains cas, on ne retrouve pas de site de restriction
adéquat permettant de sous-cloner certaines régions d'un fragment de DNA. Ces régions
peuvent être séquencées en utilisant des oligonucléotides de synthèse. La séquence de ces
oligonucléotides est déterminée à partir de la séquence des régions déjà connues. Ils vont
servir d'amorce pour la détermination de la séquence nucléotidique des régions
inconnues par la méthode de SANGER (1977).

---

23
c) Sous-clonage par la technique du cyclone
Nous avons aussi utilisé la technique de sous-clonage par délétion séquentielle
à 1a.~T4 DNA polymérase développée par DALE (1984) et améliorée par les laboratoires
IBI. Le principe de cette méthode est schématisé sur la figure 2.
Cette méthode permet d'obtenir une population de clones dont les insertions
sont de plus en plus petits et se chevauchent. En sélectionnant les clones en fonction de la
taille de leurs inserts (lII.A.l), on peut aligner de manière ordonnée les séquences
obtenues.
La première étape de cette méthode consiste à hybrider un oligonucléotide au
DNA simple brin du phage recombinant. Cet oligonucléotide est situé en 3' de l'insert à
analyser et recouvre une partie du vecteur comportant un site de restriction EcoRI pour la
série impaire du vecteur M13 (mp9, mp Il, mp 19, etc ... ) ou HindIII pour la série paire
(mp8, mplO, mp l S, etc...). Après l'hybridation, le DNA est linéarisé à l'endroit où il est
bicaténaire par l'action de l'enzyme adéquat.
Dans la deuxième étape, le DNA linéarisé est soumis à l'action 3'
exonucléasique de la T4 DNA polymérase. La réaction est arrêtée à des intervalles de
temps réguliers de manière à avoir des inserts de moins en moins grands. Les différentes
aliquotes sont ensuite réunies et soumises à l'action de la Terminal-désoxyribonucléotidyl
transférase en présence de dATP ou de dGTP. Cet enzyme synthétise donc une queue
poly dA (pour les vecteurs pairs) et poly dG (pour les vecteurs impairs). Ces queues sont
complémentaires à la partie 5' des oligonucléotides utilisés plus haut. Ainsi, en
rehybridant les DNA simple brin avec ces oligonucléotidcs, on peut recirculariser les
fragments obtenus après l'action de la T4 DNA polymérase.
La troisième étape consiste à faire agir de la T4 DNA ligase sur le DNA
recircularisé de manière à refermer les molécules sur elles-mêmes. Ces molécules
serviront ensuite à transformer des bactéries (E.coli) par la méthode décrite en IILA.I.
Le criblage et la sélection des clones se font comme décrit précédemment. Pour la
réalisation de la technique, nous avons suivi les indications du fournisseur (lBI système
ROS). Il est indispensable de s'y conformer,
B. TECHNIQUES DE MARQUAGE RADIOACTIF DES SONDES
1. MARQUAGE DU DNA
a) Marquage à partir de DNA simple brin
Le principe des marquages utilisés dans nos expériences a été décrit par
FEINBERG et VOGELSTEIN ( 1983 ).
Il s'agit en fait de synthétiser le brin complémentaire du DNA simple-brin
matrice en y incorporant un ou plusieurs nucléotides marqués (suivant l'activité
spécifique recherchée). Le DNA phagique est hybridé préalablement avec. un

---

24
oligonucléotide de synthèse (il
peut s'agit de l'amorce universelle ou d'un
oligonucléotide spécifique). Le milieu d'hybridation contient:
- 10 à 100 ng de DNA simple brin
- 1 à 2,5 ng d'oligonucléotide
- 1 ill de tampon Klenow 10x (100 mM Tris pH 8, 50 mM MgC12)
- H20 qsp 10 ill
L'hybridation se fait à 65°C pendant 15 minutes. Le milieu est refroidi à
température ambiante. On dépose 5 ul de la solution précédente dans un tube contenant
10 uCi de a-[32P]dATP (400 Ci/mmoles) séchées et on mélange avec 5 u.l d'une
solution d'élongation contenant du dCTP, du dGTP et du dTTP à la concentration
uniforme de 0,5 u.M et 1 unité de l'enzyme de Klenow. L'ensemble
est vortexé,
brièvement centrifugé et mis à incuber pendant 10 minutes à 37°C. On y ajoute ensuite
2 ul d'une solution de chasse contenant les 4 désoxyribonucléotides à la concentration
uniforme de 0,5 ~M et on laisse incuber pendant 10 minutes supplémentaires. La
réaction est arrêtée en chauffant le milieu à 65°C pendant
la minutes. Les
désoxyribonucléosides en excès sont éliminés par chromatographie sur DEAE cellulose
ou par une série de précipitations à l'éthanol.
b) Marquage du DNA double brin
La méthode de marquage des DNA double brin que nous avons utilisée est
similaire à la méthode décrite pour les simple brins. Le DNA double brin est simplement
dénaturé par chauffage 5 minutes à 90°C et refroidissement immédiat avant de servir
comme matrice. Nous avons souvent utilisé pour la synthèse des brins complémentaires
une solution d'amorces multiples (Amersham).
c) Marquage des oligonucléotides de synthèse
Nous avons utilisé la méthode de marquage des oligonucléotides en 5' décrite
par MANIATIS et coll. (1986). Cette technique utilise la T 4 polynucléotide kinase
(P.N.K.) et du y_[32p] dATP pour fixer en 5', un nucléotide marqué. Le milieu
réactionnel contient :
- 10 ng de l'oligonucléotidc
- 10 unités de P.N.K.
- 1 III du tampon P.N.K. JOx
- JO ilCi "'(-[32p]_dATP (3000 Ci/rnrnole)
- H20 qsp la III

---

25
Le tampon P.N.K. 10x a la composition suivante:
- 0,5 M Tris-HCI pH 7,6
- 0,1 M MgCI2
- 50 mM DTT
- 1 mM spermidine
- 1 mM EDTA
La réaction se fait à 37°C pendant30 minutes et elle est arrêtée par addition de
2 III d'EDTA 0,5 M. Les désoxynucléotides radioactifs non incorporés sont éliminés par
une série de précipitations à l'éthanol.
2. MARQUAGE DES tRNA
a) Marquage en 3' à l'aide de la T4 RNA liggse
La technique utilisée dérive de celle d'ENGLAND et UHLENBECK (1978)
modifiée (BRUCE et UHLENBECK, 1978). La T4 RNA ligase catalyse la formation
d'une liaison phosphodiester entre le phosphate 5' (d'un RNA simple brin et l'hydroxyle
3' d'un autre DNA ou RNA simple brin (SUGlNO et coll., 1977). Cet enzyme est utilisé
pour incorporer le [32p] pCp à l'extrémité 3' des molécules de tRNA.
Les tRNA sont dénaturés avant le marquage par addition de DMSO (26% v/v)
et par chauffage à 100°C pendant 1 minute, suivit d'un brusque refroidissement à O°c. Le
milieu de marquage est composé de :
- 80 mM
Tris-HCI pH 7,5
- 25 mM
MgCl2
- 40 mM
DTT
- 0,2 mM
ATP
- 0,5 Unités
T4 RNA ligasc
- 5 ug
tRNA dénaturés
- 50 ~Ci
[32p] pCp (300 Ci/rnrnole)
La réaction est effectuée à 15°C pendant 3 heures et arrêtée par chauffage à
65°C pendant 5 minutes. Les tRNA marqués sont séparés du pCp résiduel par
chromatographie sur RPC-5 (II.A.4.b).
b) Marquage à l'extrémité 3' à l'aide de la tRNA nllcléotidyl transférase
La tRNA nucléotidyl transférase (CCAse) catalyse l'incorporation spécifique
des nucléotides C, C et A à l'extremité 3' des tRNA. Puisque nous extrayons des tRNA
matures qui comportent déjà ce trinucléotide, il est nécessaire par conséquent
d'hydrolyser ces tRNA de façon ménagée avant de procéder au marquage à l'aide de la
CCAse.

---

26
Les tRNA (5 ug) sont mis dans un milieu réactionnel contenant du MgCl2
(10 mM) et du Tris (50 mM pH 8) et traités avec 0,5 ug de phosphodiesterase du venin
de serpent (P.D.E.) à 20°C (SILBERKLANG et coll. 1979). Des aliquotes sont
prélevées à S, 10 et 15 minutes et traités immédiatement au phénol. Les phases aqueuses
sont ensuite réunies, extraites une nouvelle fois au phénol-chloroforme v/v) et les tRNA
sont précipités à l'éthanol. Les tRNA précipités sont repris dans un volume minimal
d'eau (1 à 5 ul) bidistillée.
La réaction de marquage se fait dans un milieu de 10 /lI qui contient:
- 5 ug
de tRNA traités à la P.D.E.
- 30 flM
a_[32p] ATP (3000 Ci/mrnole)
ug
-
ô
CCAse
- 25 mM
Tris-glycine pH 8,9
-lOmM
Mg C l2
- 50 IlM
CTP
- 8 mM
DIT
La réaction est arrêtée par addition de 1 ul d'EDTA 0,5 M. Les tRNA sont
purifiés comme précédemment.
Dans les deux cas, on peut analyser les tRNA marqués par électrophorèse sur
gel d'acrylarnide 15% en conditions dénaturantes (ILA.6.b).
C) TECHNIQUES DE TRANSFERT ET D'HYBRIDATION
1. METHODES DE TRANSFERT
a) Transfert des acides nucléiques par capillarité
Les fragments de DNA séparés sur gel d'agarose sont transférés sur membrane
de nylon (Genscreen plus, NEN ; Hybond, Amersham) d'après une méthode qui dérive
de celle décrite par SOUTHERN (1975). Après électrophorèse, le gel contenant les
fragments de restriction est plongé pendant 30 minutes dans une solution alcaline (0,5 N
NaOH, NaCl 1,5 M) afin de dénaturer le DNA. Le gel est ensuite rincé avec de l'eau
distillée puis replongé dans une solution de neutralisation (Tris-HCl 0,5 M pH 7,5 ; 1,5
M NaCl) pendant 30 minutes.
Le gel est ensuite placé dans un bac à électrophorèse horizontal sur 3 couches
de papier Whatman 3 MM. Les extrémités de la couche inférieure de papier trempent
dans le tampon de transfert 20 x SSC (NaCl 3 M, citrate de sodium 0,3 M) contenu dans
le réservoir du bac. On dépose sur le gel une membrane nylon découpée à sa taille. Deux
morceaux de papier 3 MM de même taille sont ensuite déposés -sur le filtre puis
recouverts par une pile de papier absorbant. Un poids de 1 kg environ est disposé sur
l'ensemble et le transfert du DNA se fait pendant que le tampon imbibe le papier
absorbant par capillarité. Le transfert dure au moins 12 heures.

---

a
~h
r
~
b
29-rror
~ transtcrrna1100
~
[ trans'''mal''''
n·1Tt)(
~ annaat 29-mor
U 8nrœ 1Z2-IT()(
OCORl'Il. o
[
"O'hoo
~ ctoave wlth 'frd 1
jl co avo wilh Ecom
G'
0'
~ ~~~nvcloaso diQ(lslkln
,
DNA oofvrr-or asa)
)
~(;~n~~a~~I:~eOrSal~~ ) alîneal;?9-rTPCr
,
~'
5 - - - - . . . . -
5~J'
,~'n~
- - - - - " " " " "
~ ~ ~.. )n
~ ~ ~ Q ~
---~~
dAtail
- - -.....
~
dG lail
- - - ~
---~~
FIGURE 2: Schéma montrant les différentes étapes du
sous-clonage par délétion séquentielle à la
T4- DNA polyillérase ( DALE et coll" 1985 )

---

27
La membrane est détachée du gel après le transfert et la position des poches et
l'orientation du gel sont marquées au crayon gras. La membrane est débarrassée des
morceaux d'agarose par un bain de 2 minutes dans du 2 x SSC puis le DNA y est
irréversiblement fixé par une irradiation de 5 minutes aux U.V.
Le transfert des RNA peut aussi se faire par capillarité mais le gel n'est pas
trai té à la ~oude avant le transfert.
b) Transfert des {RNA sur membrane nylon
LestRNA ont été fixés sur membrane nylon par transfert électrique
("electro-blotting"). Le procédé est inspiré du système 1. B.I. (I-IBS). Le bac à transfert
provien t du même laboratoire. A près l'électrophorèse, le gel d 'acry lamide con tenan t les
tRNA est mis à équilibrer (2 x 30 minutes) dans 300 ml de tampon 0,25 x TEA (cf
Annexe). Les dimensions du gel augmentent après cet équilibrage et il est par conséquent
préférable de ne découper le filtre aux dimensions du gel qu'après cette opération. Nous
avons utilisé des membranes Hybond-N (Amersham). Après avoir mis la membrane au
contact du gel, l'ensemble est fixé entre deux éponges de type "scotch-brire" et coincé par
deux grilles 'plastiques. Ce dispositif est placé dans un tampon (0,25 x TEA) contenu
dans une cuve à transfert. La cuve est munie de deux électrodes qui sont alors branchées
sur un générateur. Le transfert est effectué en' mettant le générateur.sous tension pendant
20 mn à 0,15 ampères puis 1 heure à 0,5 ampères. Après le transfert, la membrane est
rincée avec 0,25 x TEA et séché à l'air. Le filtre est ensuite passé au four à 80°C pendant
deux heures. Cette opération est très importante car elle améliore considérablement les
signaux d'hybridation.
2. TECHNIQUES D'HYBRIDATION
La composition des milieux d'hybridation change en fonction du type d'acide
nucléique fixé sur membrane.
a) Membranes comportant des fragments de DNA
ex) Préhybridation
La membrane sur laquelle est fixé le DNA est préhybridée pendant 2 à
12 heures dans le tampon d'hybridation dont la composition est:
- Tris-HCI
10 mM pH 8
-EOTA
ImM
- SOS
1%
-NaCI
lM

---

28
[3) Hybridation
La membrane préhybridée est replacée dans une nouvelle solution de
tampon d'hybridation. Cette solution contient la sonde radioactive que l'on a
préalablement dénaturé en chauffant à 100°C pendant 5 minutes et en refroidissant
brusquement dans la glace. L'hybridation a lieu entre 37°C et 65°C en fonction de la
sonde utilisée. Pour les désoxyoligonucléotides de
synthèse,
la température
d'hybridation est calculée de telle manière à être effectuée au moins 10 "C en dessous de
la température de dénaturation du désoxyoligonucléotide, selon la formule établie par
WALLACE et coll. (1979) : Td : 2x(A+T)+4x(G+C).
y) Lavage
Après l'hybridation, les membranes sont soumises à une série de lavages
pour éliminer les hybridations non-spécifiques.
La membrane est rincée deux fois de suite pendant 5 minutes dans 200 ml
de 2 x SSC à température ambiante. Elle est placée ensuite dans une solution contenant 2
x SSC ; 1% SOS et lavée deux fois pendant 30 minutes à la température d'hybridation,
Enfin, elle est trempée dans une solution 0,1 x SSC à température ambiante. Cette étape
peut être renouvelée. On peut agir sur la stringence de l'hybridation à cette étape en
faisant varier la température des lavages. La membrane est ensuite autoradiographiée à -
70°C au contact d'un film (KODAK XAR-5) et d'un écran amplificateur (Phil ips). Le
film est développé après 24 heures et l'autoradiographie est reconduite pour une plus
longue période si cela s'avère nécessaire.
b) Membranes portant du RNA
L'hybridation se fait suivant le même principe que précédemment mats
généralement à 42°C et dans un tampon d'hybridation dont la composition est:
- 5 x
SSPE
- 50%
Formamide (v:v)
- 5 x
Solution de Dcnhart
- 1%
S.O.S.
Avec: 20 x SSPE correspondant à :
- 3,6 M NaCI
- 0,2 M phosphate de Sodium pH 7,7
- 0,002 Na2 EOTA

---

The annealing reactlon
_ _ _ _ _ _ MCGGIACACG
------,
(~
J S'{\\()Lc·:;.lI.lnded
J'
5'
ONA rccoiate w,If'
.
.
clo~d ONA ..... OI1.SoC{\\o()t1
J
Y _ J '
~
MceelAcAce
~
(
)
UNA Poli
t(~0()....
f/;lIgf1'\\C1'lt
~
The sequcncing reaction
1-
A-
dCTP. ddC le
dCIP
oClP
dcrp
aGT?
dCle, ddGlP
OCT?
aGre
arT?
dne
anp"dodnp
orlP
lo·"P~jI\\IP
fo·Jlpj(tAIP
lo·L~p'jArp
la·)}PidATP, oo ... r!'
cm:lII!I- ri G G ddC
llIIIIIID -
ri cc r.A r6<>G
_ _ _ 1<>d1'
CIlDllJ!l- n CddC
1IIillIIIIl- IlddG
!
!
-.- ~T
_____-:.-__,..----__t
-'
l
Gel electrophorcsis and autoradiography
c
C
A
C
G
G
Seooeoce re eos
c
S' nccc-rcrcc J'
c
e
FIGURE 3
Schéma montrant les différentes étapes
du séquençage par la méthode de SANGER
(SANGER et coll., 1977 )

---

29
et la solution de Denhart (x 100) qui est composée de :
- 2%
B.S.A. (p/v)
- 2%
Ficoll (p/v)
- 2%
Polyvinylpyrolidone (p/v)
ç) Membrane çompQT1ant des tRNA
L'hybridation se fait dans les mêmes conditions que lorsque le DNA est fixé
sur la membrane.
D. SEQUENÇAGE DU DNA
1. PRINCIPE
La méthode de séquençage que nous avons utilisée dans nos travaux est celle
décrite par SANGER et coll. (1977). Cette méthode qui utilise le vecteur Ml3 a été
adaptée par plusieurs laboratoires à différents types de DNA polymérase (fragment de
KLENOW, D-DNA polymérase). La technique se réalise en trois étapes:
l ") Une amorce (oligonucléotide de synthèse) est hybridée à la matrice de DNA
simple brin.
2°) A partir de l'amorce, le brin complémentaire de la matrice de DN A est
synthétisé. Quatre réactions indépendantes sont réalisées: chacune se fait en présence de
trois désoxynucléotides triphosphates froids (dCTP, dGTP et dTTP) et d'un
désoxynucléotide triphosphate radioactif (a_[32p] dATP) mais chaque réaction se
caractérise par la présence d'un 2',3'-didésoxynucléotide (ddNTP) différent.
L'incorporation des ddNTP pour chaque réaction provoque l'arrêt de l'élongation de la
chaîne, créant un ensemble de fragments de DNA se terminant spécifiquement par la
même base.
3°) L'ensemble des oligodésoxynucléotides de chaque réaction est analysé par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide et la séquence est déduite de la position des
bandes observées.
La figure 3 schématise les différentes étapes du séquençage.
,-
2. LES REACTIONS
a) Hybridation de l'amorce
L'hybridation se fait à 65°C pendant 15 minutes. Le milieu réactionnel est
ensuite refroidi lentement à température ambiante. Sa composition est:

---

30
- DNA simple brin
500 -1000 ng
- amorce
2,5 ng
- Tampon de réaction l Ox
1,5 ill
- H20 qsp
10 ill
Le tampon de réaction 10x contient 100 mM Tris-HCl pH S,50 mM MgC12.
b) Elongation et arrêt de la synthèse
Les milieux réactionnels, la stratégie et les rapports entre les dNTP et les
ddNTP varient suivant les fournisseurs et suivant l'enzyme utilisé pour la détermination
de la séquence nucléotidique. Pour notre part, nous avons utilisé le fragment de Klenow
en nous référant aux indications du fournisseur Amersham, et la 1'7 DNA polymérase
conformément aux instructions du fournisseur USB (système sequenase).
Les réactions d'élongation sont arrêtées par addition du tampon de charge
contenant: 99% de fonnamide déionisé, 0,025% de bleu de bromophénol et 0,025% de
xylène cyanol.
c) Elecrrophorèse verticale sur gel de polyacTVlamide
L'électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide 6% en conditions
dénaturantes (6 M urée). Le gel est préparé comme indiqué en ILA.6.b. Il est soumis à
un pré-chauffage pendant au moins 30 minutes et l'électrophorèse se fait à 1500 V,
65 W constants.
Les milieux réactionnels sont chauffés à 95°C pendant 3 minutes et
immédiatement déposés dans les poches aménagées sur le gel. Plusieurs dépôts sont
effectués pour des migrations de 2, 4, et 8 h.
En fin d'électrophorèse, le gel est transféré sur une feuille de papier Whatman
3 MM. Le DNA est fixé, couvert d'une fine pellicule de plastique de Saran Wrap et
séché sous vide à SO°C pendant 45 minutes. Le gel séché est mis en autoradiographie
pendant 12 à 16 heures au contact d'un film (Fuji Photo film co., L1'0).
d) Analyse des séquences nucléQtidiques ;
Les séquences ont été analysées à l'aide du programme UWGCG (University
of Wisconsin Genetic Computer Group) de l'Université de Madison (Wisconsin, USA) à
l'aide d'un ordinateur microVAX (DEVEREUX et coll., 1984).
Les banques de données consultées sont: GENBANK de NIH (National
Institute of Health, USA) et EMBL (EMBO) pour les séquences nucléotidiques et la
banque NBRF (National Biochemical Research Foundation, USA) pour les séquences
protéiques.

---

CHAPiTRE ii
!ETUDE DES GENES DE flRNA MiTOCHONDRiAUX
DU MAiS

---

1
1
1
1
1
1
1
1
1
DElE~MI]~Al~ON DES COSM~D[ES
1
flO~lANl DES GENES DIE '~:[R\\N~
1
1
I-
I
1
1
1
1
1
1
1

---

3 1
1. DETERMINATION DES COSMIDES PORTANT DES GENES
DE tRNA
A) CARTES DE RESTRICTION DES GENOMES MITOCHONDRIAUX
B37-N ET B37-cms T
Les cartes de restriction 5m3I, XhoI et 5stII du génome mitochondrial de la variété
WF9 à cytoplasme mâle fertile (WF9-N) ont été établies par LON5DALE et coll.,
(1984). De même, les cartographies BamHI, Srnal et XhoI des génomes mitochondriaux
des variétés B37-N mâle fertile (FAURON et HA VLfK,1988) et B37 Cms-T mâle stérile
de type T (FAURON et coll., 1989) ont été récemment décrites. Les cartes de restriction
des différents génomes mitochondriaux de la variété B37 sont représentées sur les figures
4-a et 4-b de même que la localisation des fragments BamHI comportant des gènes de
tRNA.
Dans ce travail, nous avons utilisé des cosmides recouvranr la totalité des trois
génomes étudiés. Les positions des cosmides des génomes B37-N et B37-cmsT, sont
"indiquées sur les figure 4-a et 4-b. La localisation des cosmides du génome WF9-N a
déja été rapportée (Wintz, 1988; fig.4-c ). Dans le laboratoire, nos études avaient
commencé sur les cosmides contenant des insertions du génome mitochondrial WF9-N
mais, pour des problèmes de maintenance
et d'amplification de ces cosmides, nos
dernières études ont porté sur les cosmides contenant des insertions des génomes
mitochondriaux B37-N et B37-cmsT. C'est ainsi que dans ce travail, la séquence
nucléotidique des gènes des tRNA portés par les fragments BamHI de 22 kb, 4 kb et 3.5
kb (b) du génome B37-N (fig.4: cosmides N7D7 et N7F3) a été déterminée en utilisant
des fragments de restriction du cosmide 8-3B2 (chap.lI.II.E; fig.c-c) du génome WF9-
N. De même, le gène de tRNA porté par le fragment BamHI 3.2 kb du cosmide N7DlO
du génome B37-N (fig.4 et tableau F) a été séquencé sur un fragment Srnal de 1.25 kb
du cosmide 9-3H 10 du génome WF9-N (chap.I1.lI.A; fig.4-c). D'autres études ont
aussi été effectuées sur les cosmides 9-1 E8 (chap.I II.LA; fig.4-c) et 9-2C4
(chap.III.I.B; fig.4-c) contenant des insertions de DNA mitochondrial de maïs WF9-
N.Tous les autres cosmides utilisés pour le séquençage des gènes de tRNA proviennent
de la variété fertile B37-N. L'organisation des gènes de tRNA a été étudiée dans les deux
variétés B37-N et B37-cmsT.

---

o
10
20
30
40
50
60
70
80
30
100
N
\\
1
1
•
.N8C' 2 (2)
.ll
N704 (4)
,
:.
--N8F3(1)
s
'.0 li
\\0.3
X
J 2.6
B
18
o A 4.5
~ '1'\\".
,r \\
•
NB.CS (8)_
H7F3 (5)
• •
1
, - - - - - ,
••• 1
1 i
s
X
G
•
•
S
36
X I ) 1
8
1
7S
-
N7E5 (12)-
-.
85
1".2
•
•
S
X
B
N8F3(1)--
-N8A5(I9)
S 5.0
X
l-------1
5 ,. b
8
FIGURE 4·a:
LOCALISATION ET IDENTIFICATION DES COSMIDES COMPORTANT
DES GENES DE tRNA OU GENOME MITOCHONDRIAL 837·N
Les fragments BamHI cornoortarn des gènes de tRNA sont hachurés
S: Smal : B: BamHI ; X: Xhol
La position sur le cercle maître linéarisé est indiquée au dessus de la cane.

---

a
la
20
30
40
50
CO
70
00
90
100
T
l
!
!
!
I l !
!
I l !
s
X
B
•
s
X
B
_2G6 (8)
_2B10 (7)
•
• •
s
X
s
X
9,4
J2,6
F~="%"/0
;':;~;#'d;"T'/:;:;::;~/~~~,///".~/,/'T7/"
B
"'"77.//
----'-
-'-"-_--"----'-_---'_4_,_"_5 ~/0?&:ll}d//AV
•
ID2(18)
•
-3H10 (14)------
3E3 (15)
:<
0
4,E6 (16)
• •
IE4 (17)
X
o
s
X
I-----l
B
5kb
FIGURE 4-b
LOCALISATION ET IDENTIFICATION DES COSMIDES COMPORTANT
DES GENES DE tRNA DU GENOME MITOCHONDRIAL B37-cmsT
Les Iragments BamHI comportant des gènes de tRNA sont hachurés
S: Srnal ; B: BamHI ; X: Xhol.
La position sur le cercle maître linéarisé est indiquée au dessus de la carte,

---

o
100
200
1
1
1
5ma 1
SSI Il
~ I_lllluul_\\~ê&lnllul_ul_~llul__ul_~
Xho 1
AI
(B.J011)
A4
(B.JF2)
A6
(B·J B2)
A9
(B·JOB)
A12
(9·J01)
A2
(9·lES)
A5
(9·2G4)
A7
(2c65)
AIO
(9·JHB)
Cl
(9.1 CIO)
AJ
(9·JF2)
AS
(9-1 El)
AlI
(B·J05)
C2
(9·1 E5)
300
400
500
1
1
Sma 1
Ü
Il
1
1
1
III
1111 Il
Ifl
Il
I!f
1
1 I~I 111111I~rrr=1
Il
5.. Il
\\---l__
1
Il
Dli 1
~
1
1
JIl
1
1
1
1
1
_
Xho 1
:.
--'1 1
Il Il
1 1 11
11 Il I I I 1
III III ~
CJ
(9-102)
C6
(2c29)
C9
(2c70)
El
(2cl)
CI2
(9-J010)
C4
(9·2C4)
Cl
(9-JHIO)
CIO
(9-2F7)
E2
(2cJ)
Al
C5
(2c7)
CO
(2cl J)
c i i
(9-2E5)
Cl
FIGURE 4-c
LOCALISATION DES COSMIDES DU GENOME MITOCHONDRIAL WF9-N
La position sur le cercle maitre linéarisé est indiquée au dessus de la cane

---

32
B) LOCALISATION DES GENES DE tRNA SUR LES CERCLE-
MAITRES DES GENOMES N ET T
1) ANALYSE DES tRNA MITOCHONDRIAUX
a) Analyse sur gel d'agarose de la fraction 4S du RNA mitochondrial
Pour localiser les régions du génome mitochondrial du maïs qui codent pour
des gènes de tRNA, nous avons utilisé la méthode de marquage à la tRN A nucléotidyl
transférase (CCAse) qui est très spécifique des tRNA car elle est basée sur la
reconnaissance de leur structure tertiaire. Cependant,
il nous est apparu au fil des
expériences qu'il est indispensable de purifier les tRNA marqués par la CCAse, sur une
colonne RPC-S car, comme nous le verrons plus loin, le marquage à la CCAse présente
aussi des limites. Les tRNA sont élués de la colonne à une concentration saline inférieure
ou égale à 1 M NaCl. La figure 5 montre l'analyse électrophorétique de la fraction 4S
marquée soit au [32p] pCp en utilisant la T4 RNA ligase, soit au a-[32p] ATP en utilisant
la CCAse. Cette expérience met en évidence la spécificité du marquage à la CCAse par
rapport à la T4 RNA ligase qui marque aussi le rRNA 5s.
b) Absence de contarninants chloroplastiques
La méthode utilisée pour s'assurer que nos préparations de
tRNA
mitochondriaux sont exemptes de tRNA chloroplastiques a été antérieurement décrite par
WINTZ et coll. (1988-b). Cette méthode est basée sur le fait que le DNA rnitochondrial
du maïs contient des insertions de DNA chloroplastique (STERN et LONSDALE, 1982)
dont certaines comportent des gènes de tRNA. Il a été démontré que ces gènes de tRNA
ne sont pas exprimés dans la mitochondrie (\\VINTZ et coll., 1988-b).
Les préparations de tRNA mitochondriaux sont ainsi systématiquement testées
par hybridation avec un cosmide comportant
ces gènes de tRNA chloroplastiques
(cosmide 8-3 H4, LONSDALE 1984). Si cette hybridation révèle les fragments
comportant les gènes de tRNA chloroplastiques, c'est que la préparation de tRN A
mitochondriaux est contaminée par des tRNA chloroplastiques.
2) HYBRIDATION DES tRNA MITOCHONDRIAUX TOTAUX
Nous avons hybridé les tRNA mitochondriaux totaux, marqués au cx-[32Pl ATP à
l'aide de la CCAse et élués à lM NaCl, avec des filtres comportant des cosmides
représentatifs des cercles-maîtres des génomes mitochondriaux des maïs B37-N et B37-
.
.
cmsT. Ces expériences ont été effectuées avec des tRN A homologues extraits de la

---

œ
(/)
<Il
(J)
œ
11
<{
ü
z
Ü
0:
5s
+
tRNA
,
a
b
FIGURE 5 : Analyse comparative du marquage des tRNA
a): au a-e 2p]ATP à l'aide de la CCAse
b): au a _[32p]p Cp à l'aide de la T4-RNA ligase
La fraction 4S marquée par les deux méthodes a été fractionnée sur gel de polyacrylamide 15%.
Le gel a été exposé en autoradiographie pendant 1 heure au contact d'un film très sensible.

---

- - - - - - - - - - - -
_ .......
...
.~t"
......
..,
•
.~ . -.
.. ...
. .
• '._:'. ,.~" r-
;~ ..
'-••,.
. .~.
.'
~.
' •». .• ,.
..
,
..... _-:.
.....
1~
•
•
. ,.
FIGURE 6-a : Identification des fragments BarnHI du DNA rnitochondrial
du maïs de la variété B37-N comportant des gènes de tRNA
En haut: Électrophorèse sur gel d'agarose des fragments BamHl de cosmides représentant
la totalité du cercle-maître. Les cosmides sont numérotés de l à 20 (cf figA-a)
En bas : Hybridation des fragments BamHI avec les lRNA rnitochondriaux totaux de la
variété B37-N. Le même profil d'hybridation est obtenu en utilisant les tRNA
totaux extraits de mitochondries de la variété B37-cmsT

---

--r-~--~.----
r.:t
•
f ..
. " J--
. "
.
d
•
'-1.
--'-.- .. ;..:~:.
-
,-,.
. ~...~ l.: ,"':' .
••
..< .
•
•
FIGURE 6-b: Identification des fragments BarnHI du DNA mitochondrial
du maïs de la variété B37-cmsT comportant des gènes de tRNA
En haut: Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments BarnHI de cosmides représentant
la totalité du cercle-maître, Les cosmides sont numérotés de 1 à 18 (cf fig.c-b)
En bas : Hybridation des fragments BamHI avec les tRNA rnitochondriaux totaux de la
variété B37-N. Le même profil d'hybridation est obtenu en utilisant les tRNA
totaux extraits de mitochondries de la variété B37-cmsT.

---

TABLEAU F-1:
QRGANISATIQN DES GENES DE tRNA SUR LE GENOME B37-N
N° du tracé
Nom du cosmide
Taille des fragments
Gènes de tRNA
d'hybridation
BamHI (en kb )
ide ntifiés
11 .5
Asn
3
N8B11
4
mMet-1 -Asp
3.5a-1
Pro+Glu
4
N7D4
22
Lys
22
Lys , Tyr
5
. N7F3
4
mMet-1 +Asp
3.5a-2
Pro+Glu
3.5b
mMet-2
6
N8A1
2.75
Asn-i Phe
9
N787
1 .25
Pseudo-Pro
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
10
N7C9
3.6
Cys
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
11
N5G6
5.1
Gin
3.6
Cys
12
N7E5
3
fMet
12
His
13
N8D11
3
fMet
14
12
His
N7D10
3.2
Ser-2

---

TABLEAU F-2:
ORGANISATION DES GENES DE tRNA SUR LE GENOME B37-çmsT
N° du tracé
Nom du cosmide
Taille des fragments
Gènes de tRNA
d' hyb ridation
BamHI (en kb)
identifiés
5.9
Ser-1 +Pseudo-Phe
1
4E11
3.6
Cys
2
3H11
5.1
Gin
3.2
Ser-2
3
3G5
2.2
Phe
4
306
3
fMet
8
2G6
1.25
Pseudo-Pro
9
3B10
2.05
Pseudo-Asp
13
304
21.8
t.ys» Tyr
21.8
Lys» Tyr
14
3H10
3.5b
mMet-2
21.8
Lys-r Tyr
10
Asn
15
3E3
4
mM et-1 +Asp
3.5b
mMet-2
3.5a-2
Pro+Glu
17
IE4
12
His
18
102
12
His

---

33
mitochondrie des deux variétés de maïs (B37-N et B37-cmsT). Les filtres comportent des
cosmides digérés par BamHl.
Les résultats de ces hybridations sont consignés sur les figure 6-a et 6-b. Oans les
tableaux F-a et F-b est indiquée la taille des fragments BamHT qui s'hybrident aux tRNA,
les cosmides auxquels ils appartiennent et les gènes qui y ont été identifiés (chap./l.II et
chapII.II). Au total, 10 cosmides (dont certains chevauchent) de la variété fertile B37-N
comportent des fragments codant pour des gènes de tRNA. Parmis ces gènes un certain
nombre ont déja été séquençés et étudiés (cf introduction). Pour notre part, nous nous
sommes intéréssés aux cosmides dont les fragments comportent des gènes de tRNA qui
n'ont pas été décrits chez le maïs.

---

Ir
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
.
'.

---

34
II. SEQUENÇAGE ET ANALYSE DES GENES DE tRNA
.A. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSM1DE 9-3Hl0
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide 9-3H10 (C7: figA-c) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs WF9-N qui mesure environ 35 kb. Il est localisé sur le cercle maître entre les
positions 360 et 400 kb (fig.7), c'est-à-dire entre la région où a été localisé le gène
codant pour la sous-unité l de la cytochrome oxydase (I5AAC et coll., 1985) et celle
contenant le gène du rRJ'\\'A 265 (DALE et coll., 1984). Ce fragment de DNA s'est révélé
intéressant parce qu'il s'hybride aux tRNA totaux extraits de la mitochondrie du maïs. Il
ne s'hybride pas aux tRNA chloroplastiques. Nous avons entrepris son sous-clonage
dans le but d'identifier et établir la séquence nucléotidique des plus petits fragments
portant des gènes de tRNA.
370
390
1
1
- 8 - e - - - - - - - - - - c û s m i d e C7 - - - - - - - - - - - - -__e-
12
Xhol
1
2. 7~
25
BamHI
==1zo.g
8.8
1
3 . 2
1
3
1.,.,---_8._5---,------::,--------, --::--=-----.-_
.8
09 ilF07 5 7
1.2=§ ~~_~__"8"=...:::.3
----'-----'-'_ _........................'-------'-_
=-_
3
2 6
Smal
~~.-..- ..
............. -.
; '
100pb
•
-<l
ooeQ!
/lJ-
FIGURE 7: Localisation et stratégie de séquençage du gène de tRNA~(UGA)
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage du fragment SmaI de 1,25 kb. La petite flèche désigne le
sens de transcription du gène de tRN ASer. Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au dessus de ta ligne
supérieure indiquent la position sur le cercle maître.
2. ANALYSE DU COSMIDE
9·31-110 ET IDENTIFICATION DU
FRAGMENT PORTANT UN GENE DE tRNA
La carte de restriction Srnal de la région où se localise l'insertion du cosmide 9-
3H 10 (fig.7) a déja été publiée ( LON5DALE et coll., 1984). La digestion par Srnal du
DNA du cosmide est montrée sur la figure 8-a. Les fragments de restriction Srnal du
cosmide ont été transférés sur un filtre de nylon et hybridés avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux. Les résultats d'hybridation mC?ntrent (fig.8-b) que ce cosmide
contient un fragment Srnal de 1,25 kb comportant au moins un gène de tRNA.
L'ensemble des fragments Smal du cosmide a été sous-cloné dans le vecteur M 13 mp 19

---

0
0
(J)
0
(J)
0
I
N
~
N
I
N
N
,
n.
C')
C')
r--
r--
r--
r--
r-,
r-,
(J)
Ü
0
Ü
(J)
Ü
0
o
- - - -
kb
12
4
3
2
- -
a)
b)
FIGURE 8: Analyse du cosmide 9-3HlO
a) : Electrophorèse sur gel d'agarose des fragments SmaI du cosmide
9-3HlO et des sous-clones C7-19, C7-20 et C7-21
b) : Hybridation des fragments Smal avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux

---

3S
par la méthode décrite dans le chapitre I puis, la mini-banque ainsi obtenue a été criblée
en sélectionnant les clones suivant la taille de leur insertion par électrophorèse sur gel
d'agarose. Nous avons pu ainsi sélectionner un clone contenant un fragment SmaI de
1,25 kb nommé C7 -20. Le DNA de ce clone a été transféré sur un filtre nylon et hybridé
avec la sonde de tRNA rnitochondriaux pour vérifier qu'il s'agit du clone recherché. Un
contrôle supplémentaire a été effectué en marquant le fragment 1,25 kb du' clone C7 -20
et en l'hybridant avec les fragments Srnal du cosmide C7 (9-3H10).
3. SOUS-CLONAGE ET SEQUENÇAGE DU CLONE C7-2ü
Nous avons établi la carte de restriction du fragment SmaI de 1,25 kb ( fig.7 ) et
un seul site, en l'occurrence BamHI, s'est avéré utilisable pour le sous-clonage dans le
vecteur Ml3. Nous avons mis à profit ce site et la stratégie de séquençage est montrée sur
la figure 7. L'analyse de ces séquences a révélé la présence d'un gène codant pour un
tRNAScr(UGA)
Le sens de transcription du gène ainsi que l'orientation du fragment SmaI de 1,25
kb ont été obtenus en comparant les cartes BamHI (FAURON et HA VLIK, 1989) et
SmaI (LONSDALE et coll., 1984) de la région contenant l'insert du cosmide 9-3HlO
(fig.7). Le site BarnHl utilisé pour le sous-clonage a servi pour superposer les
deux cartes et définir l'orientation du fragment 1,25 kb par rapport aux fragments
voisins.
4. ANALYSE DU GENE DE tRNASerCUGA)
ex) Analyse de la partie codante du gène
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la partie codante du
gène de tRNASer(UGA) est représentée sur la figure 9. Le gène compte 87 nucléotides et
il se caractérise par la présence d'un appariement inhabituel UlO-A26 dans le bras
dihydro-U. En effet, on retrouve généralement à cette position, un appariement GlO-C26
ou plus rarement G10-U26 et le nucléotide GlO est très conservé dans tous les tRNA. De
plus, ce gène comporte une boucle variable très grande contenant 18 nucléotides dont 10
sont capables de s'apparier. Cette caractéristique, fréquente parmi les tRNASer, est
retrouvée aussi dans le gène de tRNASer(GCU) de la mitochondrie du maïs (WINTZ et
coll., 1988-b). Un seul appariement de faible énergie G50-U64 est retrouvé dans le bras
de la boucle \\jf. Le gène ne code pas pour la séquence CCA 3' terminale caractéristique
des tRNA matures.
Comparé aux autres gènes de tRNASer(UGA) décrits dans la littérature
(SPRINTZL et coll., ) 989), le gène de tRNAScr(UGA) est identique à celui de la
mitochondrie du blé (JOYCE et coll., 1988-b) et présente une homologie de séquence
d'environ 72% avec les tRNASer(UGA) chloroplastiques. Il n'e~t homologue qu'à 49%

---

G
G _C
G - C
A _
U
70
U
_A
G _C
G _C
60
A
A -U
U
C
G
A
A
10
U
C
U
C'C
C
G
G
G
U
C
U
G
1
1
1
1
1
G
1
1
1
G
G
G
G
G
A
A
G
A
C 50
C
U
U
U
A
G
C
U
G
U - A
A
/
A
C _ G
G
/
U
20
U
/
A
G - C
A
/
A
G
U
/
G
G-C
30
40
U
A
U -
A
G
U
A
C
A
U
A
U
A
G
FIGURE 9 : Structure secondaire en feuille de trèfle
déduite de la séquence du gène trnS de la mitochondrie
du maïs.

---

36
aux tRNAScr(UGA) de la mitochondrie de drosophile et qu'a 59% à celui de la
mitochondrie de la levure. Les tRNASer(UGA) et les gènes de tRNASer(UGA) de
différentes bacteries lui sont homologues à 67% tandis que le gène de tRNASer(UGA)
cytoplasmique de la levure ne l'est qu'à 54%. Nous avons comparé la séquence primaire
des gènes de tRNASer (GCU) et tRNASer(UGA) dans le but de voir si les deux gènes
pouraient avoir la même origine. Cette analyse a montré que:
-si l'on ampute les boucles variables des deux gènes, ils ont une homologie
de séquence de 70%.
-par contre, si l'on tient compte de ces boucles, l'homologie se réduit à
63%.
Ce degré de ressemblance ne plaide pas pour une origine commune
"récente" des deux gènes car il se range dans la catégorie des homologies retrouvées avec
les tRNASer(UGA) chloroplastiques étudiés (SPRINTZL et coll. 1989)
[3) Etude des régions flanquantes du gène de tRNASer( UGA)
Nous avons comparé les régions flanquantes des deux gènes de
tRNASer(UGA) mitochondriaux du blé et du maïs (fig.IO) et on trouve (sur 150
nucléotides), près de 95% d'homologie en amont de leurs régions codantes. En fait, pour
les séquences connues, une seule transition à la position -69 remplaçant un C (blé) par un
T (maïs) est observée dans cette région en plus d'une
délétion de 8 nucléotides
(S'CGCfAACC 3')à la position -107. Cette délétion prend place 3 nucléotides en amont
d'une "séquence consensus" (S' CTACCGGAAAAG 3') désignée par Cons-l décrite par
JOYCE (JOYCE et coll., 1988-b) dans le blé et retrouvée aussi dans le maïs (fig. 10).
Cependant, il faut signaler que nous avons trouvé une séquence S' ATATAGAAAGA 3'
(appelée Cons-2) située à quelques nucléotides en amont de cette séquence consensus,
qui ressemble plus à la séquence d'initiation de la transcription de la levure prise comme
référence par JOYCE (JOYCE et coll., 1988-b) , que Cons-L En prenant le signal
d'initiation de la transcription de la mitochondrie de la levure ( S'AT AT AAGT A 3')
comme un motif de base, JOYCE avait trouvé un très bon alignement (le meilleur parmi
toutes les autres séquences comparées) entre cette séquence et une séquence en amont du
gène de tRNAAsp du blé (S' ATATAAGAAAAG 3'). La séquence consensus Cons-2 que
nous avons retrouvée en amont du gène de tRNAScr(UGA) du maïs s'aligne mieux avec
la séquence identifiée en amont du gène de tRNAAsp, que celle de JOYCE (fig. Il). Une
autre séquence de type consensus ( appelée Cons-3 ) est retrouvée à environ 400 pb du
début du gène ( fig.lO et fig. Il ). A part ces séquences, dont la fonction reste à prouver,
nous n'avons pas trouvé de séquences consensus "-10" et "-35" caractéristiques des
régions promotrices des
gènes procaryotiques et identifiés également en amont de
certains gènes de tRNA chloroplastiques (STEINMETZ et coll. 1983).

---

FIGURE 10: Séquence nuc1éotidique du fragment Smal de
1,25kb du cosmide 9-3HIO(C7)
SmaI
CCCGGGCTAGCTTCTTCATTCATCCATTTAGGTCAGGGGCGGGCTTCTTCCCTTATATACGATGACATAG
ATAGAGCCTCCTTCTTTGATCCATTCATTGATAAAATAAAGTAGTCTTCGGGGGCAGTTTACCTTTTGAA
TCGACAGTAGAGTAGGTTTGATCTTGCTTTCTCAATCTTTCTCTGATCCTAGCCGTGTAGTAGATCCGGC
TTTATTCGGCTAAAAAGAAGTGTGTGCCCGTCGATCTGCTCGCCCCCTTCTTCATTCATCCATTTAGGTC
AGAATGGATCCAGGGAACCTGGCTCGGGAACAGCCCTGAAAAAACACAGTAAGAGAGTCCAATCTCTGAA
ATTTAGCATTTTATCTCCTAACCTAAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGAAGGCTTAGTATCTGACTTGATCCA
ATAGAGTAAGAACACACAGTAGATCCAGATTCCACACCTTGCTGTGGACTGGGGAGAGAGCAGCTCTGCG
AACGTGGGCGTTCTGTGTGATTATGGAGGAACTGTAGTACTCGCCCCAAAATGC&~GCCGGGATAGATAC
TT~g~GgGGGAGCGGTGGGCCTTCAÀAAAGGAGCGÂGGGAGTGATGGGCAACCTTÂGTCTATATGT
TGCTCGTGAGCCGCCAAGTACCAGTCTCGCAACAGTACTGGCGTTAAAGGATCGGTCCTTCACTTGCGGA
TCGTTCGCGAGTCGAACTCGCTCTCTTGCCACGCCTTTGACCACGAACTCGAGTCGGACTCATTCACTGC
TTACTTTTTTTAGGATCGTTCGTTCTTCACTCTCTTGCTATTACCCGCAGGGAGCGCAGCAACCGACGGT
cons-2
cons-1
CGCTAAC(-107)
GCATATTAT~TATAGAAAG4AGCGAAGCGTAGCGATTCGT~CTACCGGAAAAgTGTGCTAGGCAATAGA
1
C(-69)
GTCAGCTTACGGGGTGGGGCGCAAGTAAGCGTAGCGAATCACATAGAGTTGCCCCTACCTGCCAGCGCGC
.
.
- 1 .
.
.
.
.
AGATAGATAGGGCGGGCGAGCGCAqGC;bTG:GA.+.GTC'I'GAGCGGTTG~GAGTC:GGTCTTG~CÇG@
T
IGtÀltGAt~~GAAtAççGG~GGtidGAAtÇÇçtÇWQÇ~ÎddgCGAGGGCATAAGTTCTCTCTTGCCTTAT
T
A
G
CTATAGATAAGAACGAATCTCCTCGACTCGACGGATATGATGGATGGAATGGGT.G~AGGTTTAGGTTAT
TGTGTGTTGATTTAGTTAGGACTTTGTCTCCCTTTCGTTATGTTCCGCCCGGG
1
SmaI
La partie codante du gène /rnS est montrée par une boite grisée. Les séquences consensus alignées sur la
figure Il sont encadrées. Les nucléotides differents dans la séquence de la même région du blé sont
inscrits au dessus de la séquence du maïs. Les barres verticales en gras indiquent la fin de la séquence publiée
par Joyce et coll. pour le blé.
FIGURE Il : Alignement des séquences consensus trouvées en
amont du gène tITIS de la mitochondrie du maïs
ATATA-AGTA
cons-Levure
ATA A-GAAAG
cons-2
ATA AAGAAAA
cons-Asp
AAGAAA
cons-3
AAG
Consensus
Les séquences consensus sont alignées avec la séquence promotrice des gènes rnitochondriaux de la
levure et la séquence consensus trouvée en amont du gène trnD de la mitochondrie du blé.
cons-2 et cons-3 sont les deux autres séquences consensus potentielles différentes de celle publiées
par Joyce et coll.(cons-I) pour le blé.

---

37
En aval de la panie cod ante du gène, on trouve plus de 95% d'homologie
avec la région en aval du tRNASer(UGA) du blé sur environ 150 nucléotides.
y) Transcription du gène de tRNASer
Nous n'avons pas trouvé d'autre gène de tRNA sur le fragment SmaI de
1,25 kb codant pour le gène de tRNASer (UGA) décrit dans ce travail. Puisque ce
fragment s'hybride aux tRNA totaux rnitochondriaux, le tRNA correspondant se trouve
donc dans la mitochondrie. Nous avons' par ailleurs hybridé un oligonucléotide de
synthèse complémentaire au gène de tRNAScr(UGA) avec un filtre comportant du DNA
nucléaire du maïs hydrolysé par divers enzymes de restriction. Ces expériences ont
montré qu'il n'y avait pas de gène nucléaire homologue au gène séquencé dans ce travail.
Le tRNA mitochondrial qui s'hybride au fragment SmaI de 1.25 kb ne peut, par
conséquent, provenir que de la transcription du gène mitochondrial. En outre, il n'y a
qu'un exemplaire de ce gène dans la mitochondrie du maïs. Ce gène de tRNAScr(UGA)
est donc transcri 1.

---

b
38
1
1
B. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSMIDE N8Al
1. PRESENT ATION
Le cosmide N8AI (figA-a) contient une insertion de DNA mitochondrial de maïs
1
B37-N à cytoplasme mâle fertile qui mesure environ 35 kb. Cette insertion s'étend sur le
cercle maître en tre les coordonnées 120 et 165 (fig.12). Elle con tien t environ 4 kb de
1
l'une des deux copies de la répétition inversée de 14 kb et porte le gène codant pour
l'URF 25 (DEWEY et coll., 1986 ; STAMPER et coll., 1987). Notre intérêt s'est porté
1
sur le cosmide N8A 1 parce que des expériences préliminaires ont montré que son
insertion s'hybride à la fois aux tRNA totaux mitochondriaux et aux
tRNA totaux
1
chloroplastiques du maïs.
1
120
140
160
, - - - - - - - - - - - - , - - - - - - - - - - - - -
1
O----------Cosmide N8A 1- - - - - - - - - •
-
1.1
1
1.4
1
1
1
1
1
1
1
1
100pb
,'tRNlf'sn
ri Jil>
1 1
1 1
1
1
EHd
Hd E
HdH
X
li>-
\\j'lll-
-<11-----
1
E: EcoRI; H: Hindlll; Hd: Hindll; X: Xhol
FIGURE 12 : Localisation et stratégie de séquençage des gènes de tRNA
1
du fragment BamHI de 2,7 kb.
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage et les petites flèches, le
sens de transcription des gènes. Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au
1
dessus de la ligne supérieure indiquent la position sur le cercle maître.
2. IDENTIFICATION DU FRAGMENT
PORTANT DES GENES DE
1
tRNA
Le cosmide N8Al a été hydrolysé par l'enzyme de restriction BamHI. Les
1
fragments issus de cette hydrolyse ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose
avant d'être transférés sur un filtre nylon. c;e filtre a ensuite été hybridé avec une sonde
1
1
1

---

u
cr::
u
cr::
0
0
c
0
c
0
L
U
U
L
l
W
X
l
w
x
-.92
:::::
:::::
:::::
al
:::::
:::::
.::::
al
<ïï
U
U
U
U
=
U
U
U
U
L
C
C
C
C
L
C
C
C
C
Cl
Cl
kb
w
l
:r:
:r:
l
w
:r:
l
::c
l
i
1.6
1
0.5
0.2
a)
b)
Figure 13
Analyse du fragment BamHl de 2,7 kb du cosmide
N8Al
a)
Electrophorèse sur gel d'agarose 1.5%, des fragments
HindII, HindII/ HindIU, HindIII/ EcoRI et HindIIV XhoI
b)
Hybridation des fragments de restriction avec une
sonde de tRNA mitochondriaux totaux

---

39
1
constituée par les tRNA totaux extraits de la mitochondrie du maïs. Le résultat de cette
hybridation a montré qu'un fragment BamBl de 2,7 kb s'hybride aux tRNA.
1
L'ensemble des fragments BamHI du cosmide a donc été cloné dans le vecteur
M 13 mp 19 et la banque de fragments BamHI obtenue a été criblée en utilisant comme
1
sonde le fragment BamHI 2,7 kb purifié et marqué (Chapitre O, Les clones positifs
révélés par l'hybridation ont été repiqués individuellement et leurs DNA double-brins ont
1
été soumis à des digestions BamHI pour s'assurer qu'ils contiennent le fragment 2,7 kb.
Une douzaine de clones contenant le bon insert a été ainsi sélectionnée. Par des
1
hybridations croisées entre les DNA simple-brins de ces clones (Chapitre I), on a pu
identifier deux clones contenant le fragment recherché dans les deux orientations.
1
3. CARTOGRAPHIE DU FRAGMENT
BamHI DE 2,7 kb ET
DÉTERMINATION DE LA SÉQUENCE NUCLEOTIDIQUE DES
1
GENES DE tRNAAsn(GUU) ET DE tRNAPhe(GAA)
Une cartographie du fragment BamHl 2,7kb a été établie en utilisant divers
1
enzymes de restriction (fig.12). Les enzymes offrant la meilleure possibilité de
fractionnement du fragment 2,7 kb BamHI ont été sélectionnées.
Les fragments de
1
restriction obtenus par hydrolyse avec ces enzymes ont été séparés sur gel d'agarose (fig.
13-a), transférés sur une membrane de nylon puis hybridés avec la sonde de tRNA
1
mitochondriaux totaux. Les résultats de cette hybridation sont montrés sur la figure 13-b.
En utilisant la cartographie de restriction établie, on a pu déduire qu'un fragment de
BamHI-XhoI de 300 pb et un autre, EcoRI-Hindll de 400 pb, contiennent des gènes de
1
tRNA. De plus, la cartographie a montré que ces deux fragments sont situés chacun à une
extrémité du fragment BamHI de 2,7kb. On a donc déterminé la séquence nucléotidique
1
des deux extrémités de ce fragment en utilisant les deux orientations disponibles. A partir
des sites BamHI (qui ont servi au clonage), on a pu traverser d'une pm, le site XhoI qui
1
limite le fragment de 300 pb BamHI-XhoI et d'autre part, les sites EcoRI et HindII qui
marquent les extrémités du fragment de 400 pb EcoRI-HindII.
1
L'analyse de la séquence nucléotidique des deux fragments a montré que le
fragment de 300 pb code pour un gène de tRNAPhc(GAA) tandis que le fragment de 400
pb, comporte un gène de tRNAAsn(GUU). Ce dernier gène contient un site HindII dans
1
la boucle de l'anticodon et l'hydrolyse par cette enzyme coupe le gène en deux parties.
Ceci explique la présence de trois bandes s'hybridant aux tRNA totaux mitochondriaux
1
dont deux (220 pb et 450 pb ) correspondent au gène de tRNAAsn(GUU) et une (2 kb)
au gène de tRNAPhe(GAA), sur le tracé de la digestion du fragment 2,7 kb BamHI avec
1
l'enzyme HindII (fig.13-b). Les localisations ainsi que le sens de la transcription de
chaque gène, sont montrés sur la figure 12.
1
1
1

---

A
~-
IG -
Cl
U - G
C -G
70
A
-
U
G - C
G -
C
60
A
A - U
U
.G.
A
U
A
10
U
U
G
G
U
C
A
U
C
U
C
G
1
1
1
1
1
A
1
1 1
A
C
C
A
G
G
G
A
G
C
C
50
C
U
G
A
A
U
U
U
G -
C
G
G
U
20
A
_U
G _
C
FIGURE 14 : Structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la
séquence du gène trnF de la mitochondrie du maïs
Les nucléotides très conservés dans les gènes trnF sont encadrés.
Les purines soulignées, A (9; 26; 73) et G (15) sont aussi très conservées
parmi les gènes tmF.

---

1
40
1
4. ANALYSE DES GENES DE tRNA PRESENTS SUR LE
1
FRAGMENT BamBI
DE 2,7 kb
a) Etude du gène de tRNA~(GAA)
a )Analyse de la partie codance''-Ju gène de cRNAPhe(CM)
1
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la séquence du gène de
tRNAPhe(GAA) codé par le fragment BamHI-XhoI de 300 pb est montrée sur la figure
1
14. Ce gène comporte 73 nucléotides et ne présente pas de caractéristique particulière par
rapport aux tRNAPhc(GAA) ou gènes de tRNAPhc(GAA) déjà connus. Au contraire, il
1
conserve tous les points communs à ces tRNA tels que les appariements du bras dihydro-
U. Il garde aussi la purine A aux positions 9, 26 et 73 comme la plupart des
tRNAPhe(GAA), ainsi que le G en position 15. A ces traits communs s'ajoutent, d'une
1
part l'appariement G l-Cn, et d'autre part l'ensemble des nucléotides très conservés qui
constituent la boucle et une partie du bras de l'anticodon (fig. 14). Le gène ne code pas
1
pour le CCA 3' terminal. Un seul appariement de faible énergie U2-G71 est présent dans
la molécule. On retrouve ce même appariement à la même position dans le
1
tRNAPhc(GAA) de la mitochondrie de haricot (MARECHAL et col!., 1985-a).
La comparaison du gène de tRNAPhc(GAA) avec les tRNAPhe(GAA) et les
1
gènes correspondants décrits dans la littérature (SPRINTZL et coll., 1989) a montré que
ce gène est identique au gène de tRNAPhe(GAA) chloroplastique du maïs. Par contre, il
1
n'a que 78% d'homologie avec le tRNAPhe(GAA)
mitochondrial de haricot
(MARECHAL et coll., 1985-a). Il est peu probable que cette homologie rende compte
d'une origine commune récente entre les deux tRNAPhe(GAA) mitochondriaux, Il faut
1
rappeler à ce sujet que le tRNAPhe(GAA) purifié de la mitochondrie de haricot
(MARECHAL et coll., 1985-a) s'hybride à une région du DNA mitochondrial du maïs
1
différente et très éloignée de la région codant pour le tRNAPhe(GAA) décrit ici, et que le
gène correspondant y est non fonctionne!. Il a été démontré en effet, que la région du
1
DNA mitochondrial du maïs homologue au tRNAPhe(GAA) de la mitochondrie de haricot
comporte un pseudogène de tRNAPhc (WI.NTZ et coll., 1988-b).
1
La similitude observée entre le gène de tRNAPhe(GAA) mitochondrial et
son homologue chloroplastique nous a incité à comparer les régions flanquantes de ces
deux gènes dans leur environnements respectifs.
1
f3 )Analyse des régions flanquantes du gène de tRNAPhe
1
Nous avons utilisé le programme de comparaison des séquences d'acides
nucléiques "WORDSEARCH" (UWGCG) pour rechercher des-homologies de séquences
1
entre le fragment XhoI-BamHI de 300pb contenant le gène de tRNAPhe(GAA)
mitochondrial décrit dans ce travail et la séquence nucléotidique du fragment "Bam.S" du
1
DNA chloroplastique du maïs (STEINMETZ et coll., 1982) codant pour les gènes de
tRNASer3 (GGA), tRNAThr2(UGU), tRNALeu
et tRNAPhc(GAA). Le résultat de
2(CAA)
1
1

---

FIGURE 15:
Comparaison des séquences mitochondriales et
chloroplastiques dans la région codant pour le
gène tmF du maïs
ATTAATTCGTTTTTTTTAAGTATTATTAAGTAAGCCATCCACl'~.TGCATA
1 1
1 1
1 1
1
1
1 1 1 1 1
1 1 1 1 Il
1 I i i
1
1 1
2
ATGAACATATTATAGTATAGTATAGGCAAGTAATCCCTTATT~TTPAGTA
GG .. ACTACCCCTCCC . . . . CATTTCCTAATTTTGA .. ATGC0~TACTTT
1
1
1 1
1
1
1
1 Il 1 1
1 1 1 1
1
l
' 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2
AGTCATTATCATTATCCTGACATTTACTAAGTCCAATTTTAG~~TACTTT
"-35"
ATTGATTTTTTAGTCCCTTTAATTGACATAGATGCAA . . . . ATACTTTAC
1 1
Il 1 l "
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
1 1
1 \\ \\
1 1 1 1
1
2
.TTTCTTTTTTAGTCCC
ACATACATACAAGTACGTACTCTAC
"-10"
5,..-'
_
TAAGATGATGCACAAGAAAG
TCAGGATAGCTCAGTTGGTA~~GCAGAG
1 1
1 1 1 1 l "
1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Il 1 1 l , 1 1 1 1 I i i 1 1 1 1 1 1 1
2
TAGGATGATGCACAAGAAAT
TCAGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAGAG
GACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAATCTGGTTCCTGGCi' AGAAA
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Il 1 1 Il Il 1 1 Il 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I i i ! 1 1 1 1
1 1
2
GACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAATCTGGTTCCTGGC~ AG.AA
+109",-_ _
AAAAGGATCTACTGAATAGATATTGATACAAATATT
TTGAGA
1 1 1 1 1 1 1
1 1 1
Il 1 1 1 1
1 1
1 1 1 1 1
Il
1
1 1 1
1 1
2
AAAAGGA .. TACCGAATAG .. GTTACTACAATTACTCGAGAGGATTGGGA
+ 13""2=---
_
TGGATTGGGGTAAATATTTATTAAAAATëiACTiAGTëTT~
1 "
1 1 1 1
1
1 1
1
1 1
1 1 1
1
1 1
!
2
TACATATTCTAGAATAATATAGAAGGAAGTA.TTATTTTTAP.
1: séquences chloroplastiques
2: sequences mitochondriales
Les parties codantes des gènes trnF mitochondrial et chloroplastique sont encadrées.
La séquence homologue au consensus AAGAANRR est soulignée en gras. Les séquences
importantes pour la transcription du gène chloroplastique som représentés par des
lignes au dessus des séquences. Les lignes en pointillés désignent le début de la
structure secondaire impliquée dans la terminaison cl/ou la stabilisation du transcri [
chloroplastique.

---

41
cette analyse est présenté sur la figure 15. L'homologie entre la région comportant le gène
de tRNAPhe(GAA) mitochondrial et celle codant pour le gène de tRNAPhc(GAA)
chloroplastique du maïs, s'étend en dehors de la partie codante. En effet, la comparaison
montre que les séquences sont conservées sur 160 nucléotides en amont de la partie
coda nte du gène (environ 70%). L'analyse de ces homologies fait apparaître qu'il s'agit
en fait de blocs d'homologies allant de 2 à 16 nucléotides communs entre les deux
séquences. De même, sur 50 nucléotides en aval des deux régions codantes, on observe
une assez forte homologie (plus de 60%) entre les deux DNA. Un certain nombre de
remarques peuvent être faites à la suite de ces observations:
1°) Les deux domaines (-35 et -10) représentant potentiellement les
séquences promotrices de la transcription du gène de tRNAPhc(GAA) chlorop1astique
sont détruits en amont du gène mitochondrial . En effet, la séquence "-10" (STEINMETZ
et coll., 1983) est partiellement modifiée par la transition du A à la position -19 en un G
(fig. 15). En outre, le bloc "-35" perd 3 nucléotides sur 6 par suite d'une délétion
enlevant 8 nucléotides en amont du tRNAPhe mitochondrial.
2°) Comme ce qui est observé en amont, le gène mitochondrial présente en
aval des altérations affectant des régions importantes pour la transcription du gène
chloroplastique. C'est ainsi que la séquence répétée AAATAT'TT aux positions + 109 et
+ 132 du gène chloroplastique est détruite en aval du gène mitochondrial. Cette séquence
qui est impliquée dans la terminaison de la transcription du gène chloropl astique
(STEINMETZ et coll., 1983) ne semble pas être fonctionnelle dans la mitochondrie. A
cela s'ajoute le remaniement presque total des séquences impliquées dans la mise en place
de la structure secondaire en épingle à cheveux qui serait le signal d'arrêt potentiel de la
transcription du gène chloroplastique (STEINMETZ et coll., 1983). Il a toutefois été
démontré que ce signal servirait plutôt à la stabilisation des gènes chloroplastiques
(STERN et GRUISSEM, 1987) qu'à la terminaison de la transcription. Dans tous les
cas, la fonction éventuelle de ces structures est abolie pour le gène mitochondrial.
3°) Immédiatement en amont de la région ccxlante du gène chloroplastique,
on trouve une séquence riche en purine 5' AAGAAAGG 3', semblable au consensus
S'AAGAANRR 3' décrite par JOYCE. Cette séquence est conservée devant le gène
mitochondrial à pan une transversion ( fig.15 ) remplaçant un G (chloroplaste) par un T
(mitochondrie) .
Ainsi, en faisant la synthèse de toutes ces observations, il apparaît que le
gène de tRNAPhc(GAA) mitochondrial que nous avons étudié provient très probablement
d'une insertion du DNA chloroplastique dans le .génome mi toc ho ndrial du maïs mais que
ce gène a subi des modifications dans les régions flanquant sa partie ccxlante. Le fait que,
d'une part les tRNA totaux mitochondriaux s'hybrident au fragment BamHI-XhoI de
300 pb, et d'autre part que l'on.n'air trouvé que ce gène de tRNAPhc(GAA) sur ce

---

G
~-
U
A
C
G
C
G
70
U -
G
C
G
A
U
60
A
G -
U
U
G
A
U
A
10
U
C
A
U
C
C
A
G
C
U
C
G
G
G
U
A
G
G
c
G
50
G
A
G
C
C
U
U
U
U
A
Çi
@
G -
C
U
G
G
U _
A
C
G
30
G -
U
40
FIGURE 16 : Structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la
séquence du gène tmN de la mitochondrie du maïs
Les nucléotides conservés dans les gènes trnN sont encadrés.
Le nucléotide 20 encerclé est absent du gène.

---

1
1
42
fragment montre que ce gène est transcrit dans la mitochondrie du maïs. Nous savons par
1
ailleurs que les tRNA mitochondriaux totaux de maïs que nous utilisons comme sonde,
ne sont pas contaminés par des tRNA chloroplastiques (cf chap.lI- II). De plus, les
1
essais d'hybridation avec un oligonucléotide complémentaire à la partie 5' du gène de
tRNAPhe(GAA) sur le DNA nucléaire du maïs ont montré que ce gène n'est pas présent
1
dans le noyau.
Il est remarquable que le gène soit exprimé et qu'il ait conservé beaucoup
d'homologies dans les régions flanquantes avec le gène chloroplastique d'origine. Ceci
1
montre que l'insertion du DNA chloroplastique contenant le gène de tRNAPhe(GAA) est
récente et s'est produit très probablement dans la même "période" que l'insertion des
1
gènes de tRNACyS (WINTZ et coll., 1988-b) et de tRNAHis (IAMS et coll., 1985) qui
ont
aussi
conservé
leurs
environnements
chloroplastiques.
Ces
séquences
1
chloroplastiques insérées auraient subi des pressions de sélection suffisantes pour rendre
les gènes qu'ils comportent fonctionnels mais non suffisantes pour rendre leurs
environnements méconnaissables. Dans la mitochondrie du blé, les séquences flanquant
1
le gène de tRNAPhe sont mieux conservées (C.
AUBRY, C.
HARTMAN :
communication personnelle) par rapport au maïs et il sera intéressant de déterminer si ce
1
gène est aussi transcrit. En fait, on sait que le fragment KI du DNA mitochondrial du blé
(QUETIER et coll., 1985) comportant le gène de tRNAPhe s'hybride aux tRNA totaux
1
mitochondriaux et chloroplastiques du blé, mais on ne sait pas si le gène de tRNAPhe est
le seul gène de tRNA présent sur ce fragment.
b) Etude du gène de tRNAAsn(GUU)
a) Analyse de la partie codante du gène
Le gène de tRNAAsn(GUU) porté par le fragment EcoRI-HindII de 400 pb
est présenté sur la figure 16. Ce gène est long de 72 pb et on peut déduire de la séquence
du DNA, la structure secondaire en feuille de trèfle caractéristique des tRNA. Du point de
vue de sa séquence primaire, ce gène présente un certain nombre de caractéristiques
communes avec d'autres gènes de tRNAAsn(GUU) décrits dans la littérature (SPRINZL
et coll., 1989). En effet, la comparaison de ce gène aux tRNAAsn(GUU) et gènes de
tRNAAsn(GUU) de différents phages et divers espèces bactériennes connus, fait
apparaître que tous les nucléotides impliqués dans la constitution du bras dihydro-U sont
conservés chez toutes ces espèces. Cette caractéristique se retrouve chez certains gènes
(mais pas tous) de tRNAAsn(GUU) des mitochondries animales et de champignons.
Dans tous les cas analysés, les nucléotides GIO et CIl sont conservés. De la même
manière, on observe une très forte conservation des nucléotides de la boucle de
l'anticodon à l'exception du nucléotide 32. En ce qui concerne les appariements de faible
énergie, on en observe deux à savoir les paires G7-U66 et U4-G69'.,Ces appariements

---

43
sont fréquents dans les gènes de tRNAAsn(GUU) chloroplastiques. Par contre, chez
Halobacterium sp., la paire U4-G69 est remplacée par l'appariement G4-U69 tandis que
l'appariement G7-U66 n'existe pas.
L'absence du nucléotide 20 dans la structure secondaire du tRNAAsn(GUU)
est la caractéristique frappante de ce gène.
En fait, l'analyse et l'alignement des
séquences de différents gènes de tRNAAsn(GUU) nous a permis de constater que ce
caractère se retrouve dans tous les gènes de tRNAAsn(GUU)
mi tochondri au x ,
chloroplastiques et cytoplasmiques connus (fig. 17). La seule exception rapportée est
observée non pas au niveau d'un gène de tRNAAsn mais sur un tRNAAsn. Il s'agit du
tRNAAsn(GUU) cytoplasmique de Lupinus lutéus
(BARCISZEWSKA et JONES,
1988) qui comporte un nucléotide modifié X (acp-U) au niveau du nucléotide 20. Ceci
est d'autant plus surprenant que le gene de tRNAAsn(GUU) cytoplasmique de Petunia sp
(BAWNIK et coll. 1983) qui est aussi une dicotylédone, ne comporte pas le nucléotide
20. Chez le lupin, le nucléotide 20 (qui est un U modifié) serait-il ajouté au tRNA puis
modifié
après la transcription du gène? Seule, la détermination de la séquence
nucléotidique du gène nucléaire du lupin permettrait de répondre à cette question.
La recherche d'homologies de séquences entre le gène de tRNAAsn(GUU)
décrit dans ce travail et d'autres gènes de tRNAAsn(GUU) décrits dans la littérature
(SPRINZL et coll., 1989) a montré qu'il est très peu semblable aux gènes de
tRNAAsn(GUU) phagiques ( moins de 50% d'homologie) et qu'il a une homologie
d'environ 65% avec les gènes bactériens. Il a environ 60% d'homologie avec le gène de
tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie d'Aspergillus nidulans alors que le tRNAAsn(GUU)
de la mitochondrie du rat ne montre que 52% d'homologie.
Par contre, ce gène de tRNAAsn(GUU) présente une homologie parfaite
(100%) d'une pan avec le gène de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie du blé
(CRUZALEGUI et coll., 1989) et d'autre part avec le gène de tRNAAsn(GUU)
cytoplasmique de Petunia sp, (BAWNIK et coll. 1983). Ce gène a 99% d'homologie
avec le gène du chloroplaste de maïs; la seule différence entre les deux gènes étant la
délétion du nucléotide 47 (qui est un U dans le tRNA mitochondrial) de la boucle variable
du gène chloroplastique. Cependant, le nucléotide T47 (U47 sur le tRNA) est retrouvé
dans le gène de tRNAAsn(GUU) du chloroplaste de Pisum sativum (SHAPIRO et
TEWAR! 1986) .
Il s'agit là d'un cas particulier où les trois compartiments cellulaires
comportent des gènes montrant une telle ressemblance. En analysant d'autres gènes de
tRNA Asn(GUU) des plantes superieures, il est apparu que chez Lupinus luteus, le
compartiment mitochondrial comporte un gène de tRNAAsn(GUU) qui est homologue à
89% à son équivalent du noyau et ce gène a 97% d'homologie avec le gène de tRNAAsn
décrit ici (fig. 17). Il semble donc que les gènes de tRNAAsn(GUU) rnitochorïdriaux chez

---

44
les plantes superieures dérivent d'un ancêtre commun avec ceux du noyau et du
chloroplaste. Ceci pose évidemment le problème de l'origine du gène et de son évolution.
Pour disposer d'un minimum de données pouvant nous permettre d'aborder ce problème,
nous avons entrepris:
1
a) de vérifier si un gène homologue au tRNAAsn(GUU) mitochondrial était
présent dans le noyau du maïs. Les tRNAAsn(GUU) et les gènes de tRNAAsn(GUU)
1
nucléaires qui ont été décrits jusqu'à présent proviennent de deux dicotylédo.nes (lupin et
pétunia ). Il serait par conséquent utile de voir si le gène nucléaire de tRNAAsn(GUU)
1
des monocotylédones (répresentés ici par le maïs) ressemble à ses homologues nucléaires
et mitochondriaux des dicotylédones.
b) d'étudier les régions avoisinant les différents gènes de tRNAAsn(GUU) à
1
notre disposition afin d'établir les relations qui existent.
1
[3) Le noyau du maïs comporte-t-il le même gène de lRNAAsnIGUU) que la mitochondrie ?
En tenant compte de la forte homologie qui existe entre le gène de tRNAAsn
1
de la mitochondrie du maïs et le tRNAAsn du noyau de Petunia sp , il nous a paru utile de
chercher dans le génome nucléaire du maïs la présence d'un gène qui aurait la même
1
origine que le gène mitochondrial. Pour cela, nous avons utilisé un oligonucléotide de
synthèse (26-mer) complémentaire à la partie 3' du gène de tRNAAsn mitochondrial du
1
maïs. Cet oligonucléotide a été marqué en S' avec du y_[32p] ATP à l'aide de la
polynucléotide-kinase et hybridé avec du DNA nucléaire du maïs (variété INRA)
hydrolysé par divers enzymes de restriction. Les hybridations ont été faites dans des
1
conditions de stringence variées. On a ainsi fait une hybridation à SO°C et une autre à
3rc. Les résultats de nos hybridations ont montré qu'aucune hybridation n'est obtenue
1
dans ces deux conditions.
Bien qu'il soit difficile d'interpréter l'absence d'hybridation, on peut tout
1
de même affirmer que le gène de tRNAAsn(GUU) mitochondrial n'est pas homologue à
100% à son équivalent nucléaire.
1
Notons à ce sujet que nous avons obtenu
l'hybridation de cet
oligonucléotide décrit plus haut avec le DNA mitochondrial de pétunia (résultats non
1
montrés), ce qui suggère (compte tenu de l'homologie entre le gène de tRNAAsn
mitochondrial du maïs et le gène nucléaire chez le pétunia), que le gène mitochondrial est
identique au gène nucléaire chez le pétunia. Ainsi, chez le maïs, le compartiment nucléo-
1
cytoplasmique, au contraire de ce qui est observé chez Petunia sp, n'a pas le même gène
que la mitochondrie et le chloroplaste.
1
1
1
1

---

FIGURE 17:
Analyse et comparaison des séquences mitochondriales,nuc1éaires
et chloroplastiques codant pour des gènes tmN de différentes espèces
et du tRNA Asn cytoplasmique du lupin
mt Ble
CCGCCGCC CCCCTTGTCC TG
.
mt Maïs
CCGCCGCC CCCCTTGTCC TGTCCTGGGG
mt Lup
AATTAGTA TATGGGTGGA ATATAATGAA
mt Ble
GGGGATTG CTATCGTCAC CCTTTCTCCC GGTGTATGTG AAAGAG
mt Maïs
GGGGATTG CTATCGTCAC CCTTTCTCCC GG
A AAAGAG
mt Lup
CCTATGAAAT GAGGCATGGA ACGGAGCCAC TGCGAAGAAG TTCCACGAGT
mt Ble
mt Mais
mt Lup
cp Maïs
nu Pet
mt
mt
...à AAG TCC G.TTC
'"
T
AAG
TCC G.TTC
mt
AG. TC .. GAAGATTTCC CGTTG
cp
CTA
GGTC GAA .. TCTCC CCTTG
nu
... Œ]AATT . AAG ... TCC . GTTG
nu
mt Ble
CAGTAGCTCAGTGG'r.AGAG CGGTCGGCTGTTAACTGACTGGTCGTAGGT
mt Mais
CAGTAGCTCJ>.GTGGT;AGAG CGGTCGGCTGTTAACTGACTGGTCGTAGGT
mt Lu -
CAGTAGCTc.ACtGG1\\AGAG CGG'I'CGGcTG> 'J.''I'AACTGAC'I' GGTCGTAGGT
cp Maïs
CAGTAGCTCAGTCGT.AGAG CGGTCGGC'r'G-T1;AACTGACT GG;CGTAGGT
nu Pet
CÂGTAG<::rCÂG±CGT.Ac;AG·Cc;GTcGGCTG>tTAACCGATTCGTCCTAG(jt
nu Lup
CAG'I'AGCTCÂG'J.'GC;TTAGAG CGGTCGGCTGTTAACCGATA.GGTCGTAGGT
mt Ble
TTT.. GA. T
mt Mais
~g~~gg;}gf}ggG
TTT.. GA.T
g:~:f}g*g~ 1;~~â Jg~1
mt Lup
TCGAATCCTACTTGGGG
TTT.. GA. T
A.A.TTCTGA AT
G. GAA
cp Maïs
'l'CGAATCCTACTTGGGG
TTT.. GA. T
C.A.TTCTTT AATGT
GAA
nu Pet
TCGMTCCTACTTGGG
TTTTTGAGT
ATCGCTTTTC TGACCTAGCG
nuc Lup
TCGAGCCcTA·CTTGGGG·...}- - - - - - - - '
mt Ble
.... jTATAG CTTTTC)
TGAC
.
. ... TAGCGA
mt Mais
. . . . .TATCG CTTTTcJ .. , TGAC C
.
.........---::--.1
mt Lup
~ GATA .
ATA
.
.GAAA ...
. . . . . . . . .. IGGTTTCGCTll TG.C
cp Maïs
.. AAA
T TGAATTAAAA GGCTT.GCTJ TGAC
. TA
nu Pet
CGACCCCTGT CCTTCTTCTA GTTTCTAAAC TAGCAGAA~T~C~~~~~~
mt Ble
.... . . . . . C CCCTGTCCTT
mt Mais
'"
,. TGTC. TT
mt Lup
ACCTGTTCCC CCCTGTCTTT
cp Maïs
ACCCGTTCGC TA
TCCTT G
.
nu Pet
AAAGCGGTAA GTTGATTGTT GGTTTTTATT
mt Ble
m Maïs
mt Lup
cp Maïs
mt Ble
TCCTCACTC TCGTA
GG ~.~ TTCGTTCAAT GAAAA
mt Maïs
mt Lup
T
cgg ~~ ~~~~~~~~~ GAAAA
La boite grise représente la partie cod ante des gènes. Les boites blanches indiquent l'extension des homologies en
dehors de la partie codante. La séquence consensus S'AAGAANRR3' est soulignée en gras. La position du nucléotide
20 est indiquée au dessus du gène. Pour la séquence du tRNA, les U et les nucléotides modifiés ont été remplacés par
les désoxyribonucléotides correspondants.

---

45
.y) Etude des régions flanquantes du. gène de tRNAAsn (Gll U)
L'analyse de la partie codante des différents gènes de tRNAAsn(GUU) ou
du tRNAAsn(GUU) correspondant ayant montré une forte conservation des séquences de
ce gène dans différents compartiments cellulaires d'une même plante (cas du lupin et du
pétunia), nous avons comparé les régions entourant ces gènes. Puisqu'on dispose d'un
échantillon de séquences correspondant aux trois compartiments cellulaires, nous avons
effectué la comparaison des régions flanquantes du gène de tRN AAsn( GU U)
mitochondrial du maïs avec, séparément, les gènes de tRNAAsn(GUU) mitochondriaux
(blé, lupin), de tRNAAsn(GUU) chloroplastique (maïs) et de tRNAAsn(GUU) nucléaire
(pétunia).
Comparaison entre les régions flanquantes des gènes de tRNAAsnCGUU)
des mitochondries des plantes supérieures
z; Gènes de tRNAillD(GUU) mitochondriaux du blé et du maïs
Entre les deux monocotylédones, l'homologie de séquence s'étend au
delà de 200 pb en amont et en aval des parties codantes des gènes ( plus de 80% ). Les
différences observées sont essentiellement liées à des délétions et/ou des insertions et à
quelques substitutions de bases (fig.17 ).
Il a été décrit en amont du gène de tRi'\\l"AAsn de la mitochondrie du blé
(CRUZALEGUI, 1987), une structure secondaire en "épingle à cheveux" à environ 50
pb en amont du gène de tRNAAsn(GUU) (fig.18). Cette structure est retrouvée devant le
gène du maïs. Elle se caractérise par le fait qu'elle ressemble à un signal de terminaison
de la transcription procaryotique et/ou à une structure de stabilisation des transcrits
chloroplastiques (STERN et GRUISSEM, 1987). Cette structure précédée par une phase
de lecture ouverte (dont la séquence complète est en cours de détermination au laboratoire
) est exprimée dans la mitochondrie du blé. Il a été postulé (CRUZALEGUI, 1987) que
cette structure de terminaison de transcription et/ou de stabilisation des transcrits,
appartiendrait à une unité de transcription indépendante de celle du gène de
tRNAAsn(GUU). Si on admet cette hypothèse, on peut en déduire que la région
promotrice de la transcription du gène de tRNAAsn(G UU) de la mitochondrie du blé et
du maïs se situerait entre ce signal et le début du gène de tRNAAsn(GUU) (en admettant
aussi que le promoteur n'est pas interne au gène). Il est remarquable que la partie
comprise entre ce signal et le début du gène de tRNAAsn(GUU) soit aussi très conservée
devant les gènes mitochondriaux des deux organismes. En analysant cette région, on peut
remarquer qu'une séquence 5'AAGAACGA3' conforme à la séquence consensus 5'
AAGAANRR 3 (JOYCE et coll., 1988-b) est présente à 25 nucléotides du début de la
partie codante des gènes du maïs et du blé (fig.17). L'homologie stricte entre les régions

---

FIGURE 18:
Structure secondaire déduite de la séquence nucléoLidique de
la région en amont du gène tmN
T
G C
AT
TA
G
T
G
C
G
G
G
T
AA
C
CG_ C C A
G-C
A-T
G-T
G-T
G-C
5'CCCCJXX,CG- TCCCG
GGTIGGTIGGTCCMAGAACGA- ~:'~~ t RNA Asn
G-C
A-T
A-T
A-T
A-T
G-C
A-T
G-T
A-T
A-T
A-T
A-T
A-T
G-C
T
A
G
A
A
C
C
La boite représente la séquence consensus S'-AAGAANRR-3'
FIGURE 19:
Strurure secondaire déduite de la séquence du DNA en aval
du gène tmN du chloroplaste du m3JS (Dormann et col., 1986)
t r n N - ATTTG
- - -- - 3 '
A-T
T-A
T-A
C-G
A-T
T-A T
T-A
C-G
T-A
T-A
T-A
A-T
A
A
T
A
G
G
T
A
A

---

1
46
1
en amont des deux gènes s'achève seulement 1] pb en amont de la séquence 5'
1
AAGAACGA 3'. Ces observations renforcent l'idée selon laquelle cette séquence pourrait
avoir un rôle dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA des mitochondries
1
des plantes supérieures. Soulignons toutefois que ces interprétations ne sont fondées que
sur des analyses de séquences et qu'elles demandent à être confirmées par des études
fonctionnelles de ces gènes (transcription in organello, mutagénèse dirigée, etc ... ).
1
. Comparaison des gènes de tRNAA~nCGUUÎ mitochondriaux des
1
monocotylédones à celui du lupin
Les régions avoisinant le gène de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie de
1
Lupinus luteus montrent aussi des homologies avec celles des deux gènes
mitochondriaux du
blé et
du
maïs (fig.17). En
amont des gènes,
les deux
1
monocotylédones divergent du lupin au même point, c'est-à-dire à 10 pb en amont de la
séquence 5'AAG AANRR 3'. Cette dernière séquence
est légèrement remaniée chez
1
Lup inus sp par la transition du A en 5' en un G. En aval des gènes, des blocs
d'homologies sont retrouvés sur au moins 100pb.
1
Comparaison entre les ITois gènes de tRNA·-\\snCGUU) mitochondriallx et le
gène ~ tRNAAsnCGUU) du chloroplaste de maïs
1
L'alignement
des
séquences
entourant
les
différents
gènes
mitochondriaux analysés ci-dessus (maïs, blé et lupin) avec les régions flanquantes du
1
gène de tRNAAsn(GUU) du chloroplaste du maïs montre que:
- l'homologie de séquence dans ces
régions entre les gènes
1
mitochondriaux et chloroplastiques s'étend très loin en dehors des parties codantes. En
effet, en amont du gène, des blocs de séquences homologues séparées par des délétions
et/ou insertions sont observées sur environ 90 pb ( fig.17). De plus, on retrouve
la
1
séquence consensus 5' AAGAANRR 3' devant le gène chloroplastique mais elle s'aligne
mieux sur les séquences du lupin que celles des deux monocotylédones. La même
1
situation est rencontrée en aval de la partie codante du gène où des blocs d'homologie
sont retrouvés au delà de 130 pb. La structure en épingle à cheveux flanquant la partie 3'
1
du transcrit primaire (fig. 19) du gène de tRNAAsn(GUU) chloroplastique (OORMANN
et coll., .1986) est détruite au niveau des gènes mitochondriaux. Ceci est une indication
1
que la terminaison de la transcription des gènes de tRNAAsn(GUU) dans les deux
organites se fait suivant des processus différents confirmant ce qui a été montré pour le
gène de tRNAPhc(GAA).
1
- Les séquences des gènes mitochondriaux
du
lupin sont plus
conservées par rapport au gène chloroplastique que celles des deux monocotylédones.
1
1
1

---

47
Ainsi, au regard de ces observations, on peut conclure qu'à l'instar de ce
qui a été montré dans le cas du tRNAPhc (ce travail), du tRNACYs (WINTZ et coll.,
1988-b) et du tRNAHis (IAMS et 'coll., 1985), le gène de tRNAAsn(GUU) de la
mitochondrie du maïs dérive d'une insertion du DNA chloroplastique dans le génome
mitochondrial. Les homologies de séquences trouvées dans les régions environnantes du
gène font penser que cette insertion s'est faite après celle des séquences codant pour les
gènes de tRNAmMct(ce travail) et tRNACys mais probablement dans la même "période"
que celle du gène de tRNAHis et du tRNAPhc(GAA). Notons à ce propos que les gènes
de tRNAHis et de tRNAAsn(GUU) sont situés chacun, à une extrémité de la séquence
répétée inversée du chloroplaste du maïs. Nous verrons plus tard (chap./II-ILB) que
plus de 90% de cette séquence répétée sont retrouvés dans la mitochondrie du maïs et que
très probablement, l'ensemble d'une des deux copies de cette séquence y a été transféré
en une seule fois. Ce transfert aurait été suivi d'une redistribution de ces séquences
chloroplastiques dans le DNA de la mitochondrie et les blocs de séquences redistribués
auraient évolué indépendamment. Par ailleurs, s'il semble que les gènes de tRNAAsn et
de tRNAHis aient
été impliqués lors du transfert d'une des copies de la répétition
inversée, il est difficile d'associer ce transfert à celui qui concerne le gène de tRNAPhe,
car il ne s'agit pas de la même région du DNA chloroplastique. On peut par conséquent
,
.
supposer que plusieurs transferts de séquences choloroplastiques ont eu lieu à des
époques différentes dans la mitochondrie du maïs au cours de l'évolution. Cette
hypothèse a par ailleurs été confirmée
par l'analyse des différentes insertions
chloroplastiques dans le DNA mitochondrial chez plusieurs crucifères (NUGENT et
PALMER, 1988).
;t
'- Comparaison entre les gènes de tRNAAsnCGUU) mitochondriaux et
chloroplastiques d'une part et nucléaires d'autre part ~
Les analyses précédentes ont montré que, d'un côté les tRNAAsn(GUU)
et les gènes de tRN AAsn(GUU) de la mitochondrie et du chloroplaste ont une origine
commune, et de l'autre côté que ces gènes de tRNA sont très homologues aux gènes
correspondants du noyau de pétunia et du lupin. Nous avons été tentés comparer les
environnements nucléotidiques de ces gènes de tRNAAsn(GUU) dans les trois
compartiments et d'établir des relations permettant de déterminer la chronologie des
transferts à partir du gène original. Pour cela, nous avons comparé les séquences
flanquantes du gène de tRNAAsn(GUU) du noyau de pétunia aux régions entourant les
gènes mitochondriaux et chloroplastiques. Les résultats globaux des comparaisons de
séquences sont consignés sur la figure 17 et montrent que:
- En amont et en aval du gène, on retrouve de très fortes ho-mologies
entre les séquences nucléaires, mitochondriales et chloroplastiques. Il est remarquable

---

48
qu'en amont du gène, les séquences issues des trois compartiments conservent à peu près
les mêmes blocs de séquences et dans le même ordre. Ces blocs sont mis en évidence
sur la figure 17. Devant le gène nucléaire aussi, le bloc contenant la séquence consensus
est conservé mais cette séquence ressemble plus à la séquence consensus des gènes
mitochondriaux du blé et du maïs qu'à celui du gène mitochondrial
du lupin et
chloroplastique de maïs.
Au vu des observations faites plus haut, il apparait que tous les gènes de
tRNAAsn(GUU) cités dans ce travail dérivent probablement du même ancêtre. Chez les
dicotylédones, il est difficile avec les données dont on dispose, d'établir avec certitude le
compartiment d'origine de cet ancêtre mais il semble toutefois que le chloroplaste ait joué
un rôle central dans le processus du transfert du gène d'un compartiment à l'autre. En
effet, deux alternatives plausibles peuvent être envisagées: soit, le gène est à l'origine
nucléaire et dans ce cas le premier transfert aurait impliqué le noyau et le chloroplaste,
soit le gène est chloroplastique au départ et dans ces conditions, il y aurait eu deux
événements distincts ayant entraîné l'insertion du gène d'une part dans le noyau et d'autre
part dans la mitochondrie. En effet, on peut admettre que le gène n'est pas mitochondrial
à l'origine puisque nous avons des données suggérant que le tRNAAsn(GUU) a été
transféré du chloroplaste vers la mitochondrie du maïs. En se référant aux homologies
trouvées entre les gènes de tRNAAsn(GUU) de la mitochondrie du lupin et du
chloroplaste du maïs, on peut dire que ce gène a aussi été transféré du chloroplaste vers la
mitochondrie chez les dicotylédones. On peut alors penser que c'est le même évènement
qui a entrainé l'insertion du gène chloroplastique dans la mitochondrie d'un organisme
qui serait l'ancêtre commun des monocotylédones et des dicotylédones. Il faut rappeler à
cet effet que les séquences environnantes du gène mitochondrial du lupin
sont plus
homologues aux régions flanquantes du gène chloroplastique du maïs que celle du gène
mitochondrial du maïs.
Le fait que toutes les plantes supérieures ne semblent pas avoir le même
gène de tRNAAsn(GUU) dans leur noyau (comme le maïs) alors que tous les gènes
rnitochondriaux sont identiques, indique que:
- le transfert du gène du noyau au chloroplaste ou du chloroplaste au
noyau n'a probablement pas été un phénomène général a toutes les plantes supérieures. Il
est peut être limité aux dicotylédones ou seulement au lupin et pétunia. Ces indications
impliquent par conséquent que les deux types de transferts (chloroplaste-noyau et
chloroplaste-mitochondrie) se sont déroulés indépendamment l'un de l'autre.
- le gène nucléaire provien t très probablement du chloroplaste. En effet,
si c'etait le gène de tRNAAsn(GUU) nucléaire qui avait été transféré, on devrait trouver
ce même gène (au moins homologue à 90%) dans le noyau de toutes les plantes
supérieures. Le cas du maïs prouve le contraire.

---

49
Par ailleurs, puisque:
a) les tRNA mitochondriaux totaux s'hybrident au fragment de 400pb
EcoRI-HindII comportant le gène de tRNA Asn'(GUU) et que nous n'y avons identifié
que ce gène,
b) nos préparations de tRNA mitochondriaux ne sont pas contaminés
par des tRNA chloroplastiques Cchapitre JI-Il),
c) l'oligonucléotide de synthèse complémentaire au gène mitochondrial
ne s'hybride pas au DNA nucléaire,
on peut affirmer que le gène de tRNA étudié dans ce travail est transcrit.
De même, BA WNIK et coll. (1983) et DORMANN et coll., (1986) ont montré que les
gènes de tRNAAsoCGUU) sont transcrits respectivement, dans le noyau de pétunia et
dans le chloroplaste du maïs. Les gènes de tRNAAsnCGUU) des trois compartiments
cellulaires chez le pétunia sont par conséquent homologues et fonctionnels.
Les travaux de TIMMIS & SCOTr (1983) avaient déja mis en évidence
la présence de séquences chloroplastiques dans le DNA nucléaire de l'épinard mais ces
études n'avaient pas permis, ni d'établir le sens dans lequel les évènements se sont
déroulés, ni de démontrer que ces séquences pourraient avoir des rôles au point de vue
fonctionnel. L'exemple du gène de tRNAAsnCGUU) est le premier montrant l'existence,
dans les trois compartiments cellulaire de certaines plantes, de séquences de DNA
fonctionnelles ayant une origine commune "récente".

---

1
50
1
1
C. ETUDE DES GENES DE tRNA DU COSi\\1IDE N7F3
1
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide N7F3 (cf figA-a) contient une insertion de DNA mitochondri al
1
d'environ 40 kb issu de la souche de maïs normal B37 (B37-N). Cette insertion contient
la totalité d'une des copies de la répétition inversée de 14 kb. Elle est située sur le cercle
1
maître entre les positions 85 et 130 (fig.20). Des études préalables faites sur le cosmide
N7F3 ont montré qu'il s'hybride aux tRNA totaux rnitochondriaux et aux tRNA totaux
1
chloroplastiques de maïs. De plus, cinq oligonucléotides de synthèse, dont chacun est
complémentaire à un gène caractérisé et déjà publié dans la littérature, s'hybrident à ce
cosmide. Il s'agit des oligonucléotides complémentaires aux gènes de tRNAmMcl 1 et de
1
tRNAAsp du maïs (PARKS et coll., 1984; PARKS et coll., 1985), de tRNAGlu de soja
(WINTZ et coll., 1987), de tRNAPro du blé (RUNEBERG-ROOS et coll., 1987) et de
1
tRNAAsn décrit dans le paragraphe précédent. Ces gènes sont répétés sur le cercle maître
car ils font partie de la répétition inversée de 14 kb (l4-A). Outre le gène de tRJ.'\\JA Asn (ce
1
travail), les gènes de tRNAAsp et de tRNAmMcl1 de la mitochondrie du maïs ont déja été
séquencés. Ces derniers sont situés sur un fragment EcoRI de 4kb dont la séquence
1
nucléotidique a été établie par PARKS (1985) et ce fragment ne contient que ces deux
gènes.
Nous nous sommes intéressés au cosmide N7F3 pour plusieurs raisons:
1
1°) Notre objectif étant dans un premier temps de caractériser l'ensemble des
gènes de tRNA fonctionnels de la mitochondrie du maïs, il nous a paru indispensable de
1
déterminer la séquence nucléotidique des fragments de DNA qui s'hybrident
aux
oligonucléotides de synthèse car l'hybridation de ces derniers sur des fragments de DNA
1
ne saurait être la preuve que les séquences correspondantes comportent des gènes entiers
et fonctionnels de tRNA.
2°) En plus de la séquence de la région codante des gènes, il est important d'avoir
1
la séquence des régions tlanquantes de ces gènes. En effet, ces données peuvent être,
utiles d'une part pour la recherche d'éventuelles séquences consensus pouvant être
1
impliquées dans l'initiation de la transcription de ces gènes, et d'autre part pour étudier
les réarrangements que pouraient subir ces régions.
1
3°) Enfin, il s'agit dans notre étude, de s'assurer du nombre exact de gènes de
tRNA codés par cette partie du génome mitochondrial.
1
1
1
1

---

5 1
80
100
120
1
1
1
Cosmide N7F3--------t!~
... · - -
14Kb I.R.
Srnal
9.7
Xhol
BamHI
22
2.
Lys
tRNA
tRNATyr
tR'NK-sp tRNAAs n
tR~l~'MelR~APhe
....,,
1üüpb B
...
tRNAGlù.. B
- : ......---+-1- - - - + - - -. .
Il
-eo
ri
----+-+-------+-+-~ol!loa___+::__
Xb
X St
St
~
FIGURE 20 : Localisation et stratégie de séquençage des gènes de
tRNA du 'fragmeM BélmHI de 3.5kb
B: BamHI; Hd: Hindll; Sa: Sacl; St: Stul; X: Xhol; Xb: Xbal
Séquence répélée ailleurs dans le génome N
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage et les petites flèches, le sens de
transcription des gènes. Les tailles sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits au dessus de
la ligne supérieure indiquent la position sur le cercle maître. 14 kb I.R.: répétition Inversée
de 14kbA
2. ANALYSE DU COSMIDE N7F3 ET IDENTIFICATION DES
FRAGMENTS COMPORTANT DES GENES DE tRNA
Nous disposons des cartographies complètes BamHI (FAURON et HA VLIK,
1988), SmaI (LONSOALE et coll., 1984), et partielles XbaI, EcoRI (PARKS et coll.,
1985) de la région du ONA rnitochondrial couverte par le cosmide N7F3. L'hybridation
des tRNA totaux mitochondriaux avec les fragments BarnHI du cosmide N7F3 révèle (cf
chap.II-II fig.3-a, piste nOS) trois bandes (16 kb, 4 kb et 3,5 kb).
Le fragment BamHI de 16 kb compone le vecteur (PHC79) et les deux extrémités
de l'insertion correspondant d'une part, à la région du ON A mitochondrial codant pour

---

1
52
1
les gènes de tRNALys et de tRNATyr et d'autre pan, à celle codant pour le gène de
1
tRNAAsn (fig.20).
En comparant les cartes Smal, Xbal et EcoRI à la carte BamHI de la région
1
contenant l'insert du cosmide N7F3, nous avons pu déduire que le fragment de 4 kb
BamHI qui s'hybride aux tRNA totaux, chevauche presque totalement le fragment de 4
kb EcoRI comportant les gènes de tRNAAsp et de tRNAmMel 1 décrits par PARKS. Nous
1
avons hybridé avec la sonde de tRNA totaux, les fragments de restriction correspondant
aux régions qui ne se recouvrent pas entre ces deux fragments de 4 kb . Aucun de ces
1
fragments ne comporte des genes de tRNA. Ainsi, le fragment de 4 kb BamHl ne
comporte-t-il que les gènes de tRNAmMel 1 et de tRNAAsp.
1
La bande à 3,5 kb contient en réalité deux fragments BamHI. Le cosmide contient
en effet deux fragments BamHI de 3,5 kb (fig.20 ) qui contiennent tous les deux des
1
gènes de tRNA. La région contenant un des deux fragments sera caractérisée dans le
chapitre Il.I.E et comporte le gène de tRNAmMe~ (cosmide 8-3B2). L'autre fragment
correspond à la région qui s'hybride aux oligonucléotides complémentaires aux gènes de
1
tRNA Glu du soja (WINTZ et coll., 1987) et de tRNAPro du blé (RUNEBERG-ROOS et
coll., 1987). Nous avons entrepris de cloner ce dernier fragment dans le but, de
1
caractériser les gènes correspondant aux oligonucléotides précités et de voir si ce
fragment contient d'autres gènes de tRNA.
1
3. SOUS-CLONAGE DU FRAGMENT BamHI 3,5 kb DU COSMIDE
1
N7F3
Nous avons effectué le sous-clonage de l'ensemble des fragments BamHI du
cosmide N7F3 dans le vecteur M13mp19. La banque de phages recombinants a été
1
criblée en utilisant comme sonde la bande de 3,5 kb isolée du gel d'agarose et marquée.
Cinq clones positifs ont été obtenus. Les DNA plasmidiques extraits des bactéries de ces
1
clones ont été digérés par BamHI et les fragments de restriction ont été séparés par
électrophorèse sur gel d'agarose pour vérifier qu'ils contiennent bien le fragment BamHl
1
de 3,5 kb. Cependant, (comme on l'a signalé plus haut) puisque la bande à 3,5 kb de la
digestion BamHI du cosmide N7F3 contient deux fragments distincts, la sonde qu'on a
1
utilisée révèle donc deux types de clones correspondant chacun à un des deux fragments
BamHI de 3,5 kb . Par cartographie, on sait que le fragment de 3,5 kb qui compone le
gène de tRNAmMet contient un site SmaI situé à 750 pb de l'un des sites BamHI
1
(fig.20). Nous avons par conséquent utilisé la présence ou l'absence de ce site pour
différencier les clones contenant un fragment de 3,5 kb. Ainsi, deux clones ont été
1
sélectionnés parce qu'ils ne contenaient pas le site SmaI décrit plus haut.
1
1
1

---

o
ra
0
ra
.0
.c
ra
0
0
ra
U)
x
><
.0
.c
.c
E
Q)
X
x
><
~
~
~
Q)
TI
TI
TI
TI
~
~
:::::
.c
c
c
c
c
o
o
U
r:l
CU
0
U
ra
ra
CU
.0
.0
.c
w
kb
l
l
l
l
U)
U)
U)
X
X
X
:1
2
1.6
0.5
a)
o
ra
0
ra
.0
.c
cu
0
0
cu
U)
x
><
.0
.c
.c
E
Q)
x
x
x
:::::
:::::
:::::
U)
Qi
:::::
:::::
~
:::::
TI
TI
TI
TI
.c
c
c
c
c
o
o
o
~
cu
0
o
ra
ra
cu
.0
.c
W
l
l
l
l
U)
U)
x
U)
x
><
•
•
•
•
•
· •
•
_0
...
•
•
.*,;
•
·
,
.0
•
.
•
,
•
•
b)
FIGURE 21 :
Analyse du fragment BamHI de 3.5 kb du cosmide N7F3
a) Electrophorèse sur gel d'agarose 1.5% des fragments de restriction
b) Hybridation des fragments de restriction avec une sonde de tRNA
mitochondriaux totaux

---

1
53
1
1
4. CARTOGRAPHIE DU FRAGMENT BamHI 3.5 kb
ET
1
IDENTIFICATION DES REGIONS CODANT POUR DES GENES
DE tRNA
1
Le clone contenant le fragment BamHI de 3.5 kb a été
baptisé "3.5B". Une
cartographie du clone 3.5B utilisant plusieurs enzymes de restriction a été établie
(fig.20). Les enzymes utilisés pour cette cartographie ont servi pour le fractionner et les
1
fragments de restriction résultants ont été séparés par électrophorèse sur gel dagarose
(fig.21-a) avant d'être transférés sur une membrane de nylon. Ces fragments de
1
restriction ainsi fixés sur la membrane ont été hybridés avec la sonde de tRNA totaux
mitochondriaux. Les résultats de cette hybridation montrent (fig.21-b) qu'un fragment
1
Sacl-Hindii de 1,25kb et un autre, Barnl-Il-Xhol de 750 pb, codent pour des gènes de
tRNA. Le dernier fragment cité est situé à l'une des extrémités du fragment de 3,5 B
1
alors que le premier est interne à ce fragment (fig.20).
En utilisant le fragment 3,5 B dans l'orientation adéquate, nous avons établi la
séquence nucléotidique du fragment de 750 pb Barnl-Il-Xhol sur 600 pb (jusqu'au site
1
Stul montré sur la figure 20) et nous y avons identifié un gène de tRNA Glu(U UC). Ce
gène est identique à celui de la mitochondrie de soja (\\VINTZ et coll., 1987).
1
Par ailleurs, l'hybridation de l'oligonucléotide complémentaire à la partie 3' du
gène de tRNAPro (UGG) de la mitochondrie du blé (RUNEBERG-ROOS et coll., 1(87),
1
avec les fragments de restriction du clone 3,5 B a montré que le gène correspondant du
maïs est situé sur le fragment Sacl-Hind ll 1,25 kb cité plus haut. Nous nous sommes
servi de cet oligonucléotide pour déterminer la séquence de la partie S' du gène et de la
1
région en amont. A l'aide de cette séquence, nous avons synthétisé un nouvel
oligonucIéotide complémentaire cette fois-ci à la séquence en amont du gène. Cet
1
oligonucléotide nous a permis d'établir la séquence nucléotidique de la région en aval du
gène de tRNAPro(UGG) (fig.20).
1
5. ANALYSE DES GENES DE tRNA PRESENTS SUR LE
1
FRAG MENT 3.5 kb BarnHI
a) Etude du gène de tRNA.Gl.u.CUUC)
ex) Analyse de la panie codante du gène
1
La structure secondaire en feuille de trèfle déduite de la séquence
nucléotidique du gène de tRNAGlu(UUC) codé par le fragment de 750 pb Bam HI-Xho I
1
est représenté sur la figure 22. Ce gène est long de 72 pb. Il se caractérise par la présence
dans le bras de l'anticodon, d'un appariement U30*U40. Cette caractéristique retrouvée
1
dans le gène de tRNAGlu(UUC) dé la mitochondrie de soja, est absente dans les
1
1

---

A -.G (soja)
G-U
U-A
C - G 70
C-G
A (blé)
C - G
~
60
'\\
U-A
U A
GU GA
10
JJ-AUGCCCU
CCUG C
1 1 1 1 1
G
G
1
I l
1
ACGGG
GGA CA
A C"so
U U C
U
U A
U - A GA
20
C-G
G-C
30U· U 40
C-G
U
U
U
A
U U C
FIGURE 22 : Structure secondaire en feuille de trèfle
déduite de la séquence du gène trnE du maïs
L'appariement U30-U40 est désigné par une étoile.
La différence avec les gènes unE des mitochondries du blé et
du soja sont indiquées par une flèche.

---

54
tRNA Glu(UUC) des bactéries, des mitochondries des champignons et des animaux, et du
chloroplaste des plantes supérieures. En outre, le nucléotide 9, qui est en principe serni-
invariant et généralement une purine est remplacé par un C. Cene dernière caractéristique
n'est pas particulière au tRNA décrit ici, car le gène de tRNAGlu(UUC) de la
mitochondrie du soja et le tRNAGlu(UUC) d'E.coli ont un C à cette position.
Un appariement de faible énergie, est présent sur la molécule à la position
Gl-Un, et le gène ne code pas pour la séquence CCA 3' terminale.
Comparé aux gènes de tRNAGlu(UUC) décrits dans la littérature
(SPRINZL et coU., 1989) le gène de tRNA Glu(UUC) de la mitochondrie du maïs montre
une homologie de 99% avec le gène de tRNAGlu(UUC) de la mitochondrie du soja. En
fait, la seule différence entre les deux gènes est due à la transition du An (maïs) en un
Gn (soja).
Ce gène de tRNAGlu(UUC) a 73% d'homologie avec le tRNAGlu(UUC)
1
d'E.co/i et 70% d'homologie avec le gène de tRNAGIU(UUC) de la mitochondrie de la
levure. Il est plus proche de ces derniers que de ses homologues chloroplastiques des
1
plantes supérieures (65-66%).
(3) Analyse des régions flanquantes du gène
1
Nous avons comparé les séquences entourant les gènes de tRNA Glu(UU C)
de la mitochondrie du maïs (ce travail), du soja (WINTZ et coll., 1987) et du blé
1
(GUALBERTO et coll., 1989). Ces analyses (fîg.23) montrent que:
- en amont des gènes du soja et du maïs, on observe plus de 95%
1
d'homologies sur 120pb. Les différences sont dues à des délétions et/ou insertions
impliquant au maximum 4 nucléotides, et à des substitutions de bases. L'homologie que
1
l'on a observée continue jusqu'à la fin de la séquence publiée par WINTZ (1987). Il est à
noter qu'en amont du gène de tRNA Glu du soja il y a une séquence s' AAGAA TGG 3'
1
conforme à la séquence consensus de JOYCE, qui est située à 7 pb du début du gène
(fig.23). Dans la mitochondrie du maïs, un nucléotide de cette séquence a subit une
1
transversion, donnant une séquence 5' AAGAATTG 3' qui dévie quelque peu de la
séquence consensus. Cependant, 53 pb en amont du gène du maïs, il ya une séquence 5'
1
AAGAAAAG 3' conforme au consensus. En amont du gène de soja, la même région
présente une séquence 5' AACAAAAC 3' qui, elle, n'est pas conforme à la séquence
consensus.
1
L'homologie entre ces deux gènes et le gène rnitochondrial du blé s'arrête
83 pb en amont de la séquence codante. Une délétion de 10 nucléotides (par rapport au
1
maïs) ou 5 nucléotides (par rapport au soja) intervient 36 nucléotides avant le gène. Le
gène du blé a la même séquence consensus que son homologue du maïs.
1
- en aval des trois gènes, l'homologie s'arrête après seulement 19 pb.
1
1

---

FIGURE 23 :
Analyse et comparaison des séquences f1anquantes des
gènes trnE mitochondriaux du maïs, du blé et du soja.
0
MAIS
CGTATGGGCT GGAGTCAAAG GAGCTTTCAT AGACATAGAA ATGATAATAG
MAIS
AAAGf\\GCAGG CCTGCGAGCA GCGAGTGCCC TTTGTAAGTT GCGAGCCTGC
MAIS
CTGTCAAACC ATAGCGCCTT ACCGCCCCCC CTTTCTTTTT TGAATTAGAA
BLE
CTGGAGCGT TTTACCCTCG TGTCACTAGC
MAIS
AGGAAGGGAT GAAAGACAAA GAPAGAGATC AGGTTATTTA TGATCGGAGA
BLE
GCAACACGAG CCATTCAAAA AAAAGTCTTG GP.ACTGAAGA GAAATCCATC
t'lAIS
AAAGGAAGGG GCGTGGTTGA TGTGTCACTG GGAACCCGTA GGAAGGGGAG
BLE
TCTATACAAA CTCTTTATGT TCTTGATATT Goll.TTGAGTTA CGAGAATG.lI.A
SOJA
GAATTCACAT CAGAAATCGC CA .... GAAC ACAAACGk~~
MAIS
ACGACCGGCC TCATTCACAT CTGAAATCGC C~.ACATGAAC ACAAACGN~
BLE
GAAGCGTAGC Aql.CC-TTTTë- TC-TCA"A-TTCA- AGT-TTCCATT -CAATAAGTGC
1
SOJA
TC. TTGAATT GCGTATAGAA-Aë~ëGAA- ëëAë ~ .-.~ ~T TëfATTëTëG
HAIS
T~G.T.,ÇÇ2J2Al'I ].,ÇG,T....Al'lJ/~AJ:._"..:..G.NY::f\\S)r;;;.?.:A_ ç:;ÇP&IT....Cl'E:.'t l'Ç'tCl'Ic:..T~I
BLE
ATCAAGTATT TCGTATAGAA AGAAAAGGAA CCAC
TTCTCT
SOJA
GAGCTGAbGT ATATGAAGAA TGGCTTTTTG GTCCCTTTCG TCCAGTGGTT
t'lA rS
IU!;Ir1'ILG.f:. BTJcr:G&~ :rlG.c:n:I.'.i.:Th-..,..'-"1'..;;.._
,~r..............."'.:...i....:!-...J,..;..:""=.J..W.ll.;;..:....l.
BLE
TCTCTTAAGT ATATGAP.AAA TAG,CTTTTTG GTCCCTTTCG TCCAGAGGTT
SOJA
AGGACATCGT CTTTTCATGT CGAAGACACG
CCGTAAGGGA
t'lAIS
AGGACiTI'CG1'" "t T'I"I'TCJITGT -u;AAGAC.tl.U;.....,...,..,..".,~..,.,."...,'l"T""""~7"""'1'T"""'""'"'""'rT"""'"
BLE
AGGACATCGT CTTTTCATGT CGAAGACACG
CCGTAAGGGA
SOJA
TG.GCTACTC TTTCCCGGCC GCTTTCAGTT AGTGTTCATT GCTGAGTGAT
MAIS
TA .. TTACTT CATCCTGGCC TTCAAATCGT TGGTGCTGAT TATCATATAA
BLE
"TAPG.TAëTT - ATTëëCGëëc- ~GCGGTATCA AClI.ACCCGGA TAGTCAGTAG
549
SOJA
clu:GGtAT _CJ'..GGCJ'..GGAlL &AGGTGGTCC GGAAGCTT
HAIS
TGTCCTTGCT TTGGAGTGAA GAAAAGAAGT TCGATCAG
Les région codantes des gènes sont encadrées en traits pleins. L'extension
des homologies entre les séquences flanquantes est indiquée par des boites
-en pointillé. Les séquences soulignées désignent' la séquence consensus
5'AAGAANRR 3'

---

li
5S
1
1
bl Etude du gène de tRNAEmeUGG)
1
Ct) Analyse de la région codante du gène
Le gène de tRNAPro(UGG) de la mitochondrie du maïs (voir fig.26) est
1
entièrement homologue au gène de tRNAPro(UGG) de la mitochondrie du blé et au
tRNAPro(UGG) de la mitochondrie du haricot. Toutes les caractéristiques de ce gène,
qui semble être très conservé dans les mitochondries des plantes supérieures, ont été
1
décrits par RUNEBERG-ROOS et coll. (1987).
1
(3) Analyse des régions flanquantes du gène
Cette partie du travail sera traitée dans le chapitre suivant en comparaison
1
avec les régions flanquantes d'un gène de tRNAPro incomplet localisé dans une autre
région du cercle maître
1
1

---

56
D. ETUDE DU PSEUDO-GENE DE tRNAPro DU COSMIDE N7B7
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosmide N7B7 (cf figA-a) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs B37-N (FAURON et HAVLIK, 1988) mesurant environ 35 kb. Cette insertion est
localisée sur le cercle maître entre les coordonnées 205 et 250 (fig.24). Elle précède la
région contenant une des copies de la répétition directe de 5 kb . Notre intérêt s'est porté
sur ce cosmide parce que son in sert s'hybride aux tRN A totaux extraits de la
mitochondrie du maïs.
210
230
250
1
1
1
.. - ~.t-------- Cosmide N787 - - - - - - - C) - -
1.8
0.4
Smal
Xhol
BamHI
11.9
..
.
.
.
.
# .
#
pseudO
100pb
lRNAPro
~
.,
1
FIGURE 24:
Localisf\\tion et stratégie de séç]Uença~e du fragment BamHI de
1.25kb
Les grandes flèches réprésentent la stratégie de séquençage et la petite flèche désigne l'orientation
du pseudo gène de tRNAPro. Les tailles des fragments sont indiquées en kb. Les chiffres inscrits
au dessus de la ligne supérieure indiquent la position sur le cercle maître.
2. ANALYSE DU COSMIDE ET DETERMINATION DU FRAGMENT
PORT ANT UN GENE DE
tRNA
Nous-disposons de la carte SmaI, XhoI (LONSDALE et coll., 1984) et BamHI
(FAURON et HA VLIK, 1989) de la région contenant l'insertion du cosmide N7B7.
L'hybridation des fragments BarnHI du cosmide N7B7 avec les tRNA totaux

---

57
mitochondriaux a révélé qu'un fragment de 1,25 kb compone au mOInS un gène de
tRNA. Nous avons constitué une banque des fragments BamHI du cosmide N7B7 dans
le vecteur Ml3 mp19. Le fragment BamHI de 1,25 kb a été sélectionné par la méthode
décrite dans le chapitre I .
Nous avons aussi sélectionné des clones ayant le fragment inséré dans les deux
orientations opposées par la méthode d'analyse directe des phages (chapitreI).
3. DÉTERMINATION DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU
FRAGMENT BarnHI 1,25 kb
ET IDENTIFICATION D'UN GENE
INCOMPLET DE tRNAPro
Le fragment BamHI de 1,25 kb a été sous cloné par la méthode de délétion
séquentielle (cyclone) utilisant la T4 DNA polymérase. La stratégie de détermination de la
séquence nucléotidique du fragment BamHI de 1,25 kb est montrée sur la figure 24.
Nous avons trouvé sur ce fragment un gène de tRNA spécifique de la praline mais qui est
amputé de la boucle du dihydro-U, d'une partie constituant le bras dihydro-U et de la
partie 5' du gène (fig.25 et fig ..26).
4. LE DNA MITOCHONDRIAL DU MAIS A T-IL PERDU LA PARTIE
S' DU DEUXIEME GENE DE tRNAPro ?
Dans le blé, le cercle maître déduit de la cartographie du DNA mitochondrial
comporte deux gènes de tRNAPro (JOYCE et coll., 1988-c). Ces deux gènes ont des
environnements différents mais leurs parties codantes sont totalement conservées. 11
n'est pas surprenant par conséquent que l'on retrouve un deuxième gène de tRNAPro
dans la mitochondrie du maïs qui est évolutivement proche du blé. En fait, dans le maïs,
il y a trois régions codant pour des gènes de tRNAPro : le gène complet est répété dans
les variétés fertiles de maïs B37 et WF9 car il fait partie de la répétition inversée de 14 kb
alors que le gène incomplet est présent dans une autre région (N7B7). Ces données
laissent penser que, dans le cercle maître du maïs, la partie 5' du gène de tRNAPro
incomplet pourrait exister ailleurs dans un autre environnement. Pour vérifier cette
supposition, nous avons hybridé un oligonucléotide complémentaire à la partie 5' du
gène de tRNAPro avec un filtre comportant des cosmides représentatifs du cercle maître.
Les résultats de ces expériences ont montré qu'aucune autre région à part celles contenant
les gènes complets ne s'hybride avec l'oligonucléotide. Le maïs a donc perdu la partie 5'
du deuxième gène de tRNAPro.

---

FIGURE 25: Séquence nucléotidique et organisation des régions codant
pour les gènes LmP complet et irncornplct de la mitochondrie du nuus
o
ProCOt-1P
TAACCCTACG TTCGCCTAAG ATCGAAAATG CGATGTGACA TCACTCTTCA
TTCAGTTCAG TCCATTTGCT TAACACATGC ATGTCCAAAG AGATGGCGAT
100
GATCTGTCAA ATCGAGATTG TGTGGGTGTT CAGTGGATCA AJI.CCCTGTAT
Tx
150·····'
":>
\\,
TAATq;TTCT GGCGAGCTGC TGGCGTGGGA CTTCTTTCGC TGGGCCCTTjj
....
l'
S
200
IGGAGTCTP.AA TCCTTCCGGA GTGAGTGTTT CGATTCCACT CTCP.G.IV>.cê}A
, ::~
...
~
~
D
250
TCAAGTCATT efGAAAGAAA ATGCAAGTGA AACGAGPfGA GAATCMATA
300
E
-----).
.llliATTGTAGG CTT+TTCCTAAAAGCGGTG GTTC1FGCCT CCCTGTGCCG
-,._-, ..._~
F
350
CGGGGTGGGC GACTGefGTTCGAGTCTTTT TCGATCGGGT AGj\\TCCATAC 1
18
400
1
PROINC
GGATCCATCC CTCCAGGGGG TCAGCGCATC
ProCOMP
CATATGTTCC GGGGGGGAGA CGAGGTGTAG CGCAGTCTGG TCAGCGCATC
450
TGTTTTGGGT ACAGAGGGCC ATAGGTTCGA ATCCTGTCAC CTTGATGTGG
TGTTTTGGGT ACAGAGGGCC ATAGGTTCGA ATCCTGTCAC CTTGATGTGG
500
TATTCACAGG GGCCGAAGTT GCAAAGCCCC GTAGCCTATC CGTGGTCGC~
TATTCACAGGGGCCGCCGTT GCAAAGCCCC GTAGCCTATC CGTGGTCGGG .
----_._---------~~---_._------------------
550
AAGGCAGGCG AAAAGCACGC ACCAMMM AAGAMGCTA TAi\\TTTTCTT
----------------------------------------
ff.~~Gf~~!!:!':!:i:~C:i:~_A:::~_~:i:~~~A_ 2:~.!~~~
600
TTTTTCTTTT CTTCTTT.GT AGTACACGAG TGAAATTGGT TACGGTGGTA
----------------
TTTTTCTTTT CTTCTTTCGT GTTTCAAACC CATTATCAGG CTTTTGCTTT
La description des séquences encadrées est donnée dans le texte. Les séquences soulignées indiquent la région codante du
gène tmP et l'extension de l'homologie entre les séquences en aval des gènes complet et incomplet trnP est montrée par
des lignes en pointillés. proComp et prolnc désignent les séquences contenant respectivement les gènes complet et
incomplet de tmP. Le nucléotide du tRNA au niveau duquel s'arrête l'homologie entre les deux séquences est montré (I S).
La séquence rappelant le COnsensus AAGAANRR est soulignée en gras dans le bloc 0

---

A
i>:...
C -G
G -u
A -u
70
G - C
G -
C
U -A
60
U
G -
C
U
A
G
C
A
A
10
U
U
G
U
C
C
A
C
G
C
G
U
1
1
1
G
1>
1
1
1
1
A
U
A
G
G
G
G
C
G
C
C
C
50
U
A
C
U
G
A
C
U _A
G
G
U
G
C _
G
20
U_A
G _
C
30
40
U -
A
U
U
U
G
U
G
G
FIGURE 26 : Structure secondaire déduite de la séquence nucléotidique
du gène troP de la mitochondrie du maïs.
La flèche indique la limite de l'homologie entre les gènes tmP complet et incomplet

---

58
5. ANALYSE DES REGIONS FLANQUANTES DU GENE DE
tRNAPro(UGA) ET DU GENE INCOMPLET DE tRNAPro
a) Comparaison entre les régions flanquantes des deux gènes du ma'J's
L'alignement des
séquences
des
gènes complet
et
incomplet
de
tRNAPro(UGA) a montré que l'homologie entre les deux séquences s'arrête en 5' au
niveau du nucléotide 18 du tRNA codé par le gène complet (fig.25 et fig.26). En amont
du nucléotide 18, on ne retrouve plus aucune homologie entre les deux séquences
jusqu'à la fin du clone 1,25 kb BamHI qui contient le gène incomplet. Par contre, en
plus de la partie 3' de la région codante, l'homologie entre les deux régions en aval du
gène continue sur 120 pb. Elle s'arrête après une séquence riche en résidus T.
b) Comparaison entre les régions flanquantes des gènes de tRNAWCUGA) du
blé et du maïs
Comme on l'a indiqué plus haut, le cercle maître du DNA mitochondrial de blé
compone deux gènes de tRNA PrO(UGA) identiques qui sont cependant dans des
environnements différents. L'organisation des régions flanquantes des deux gènes qui a
été dé.crite par JOYCE et coll., (1988-c) est représentée sur la figure 27 -a . Pour
permettre une meilleure compréhension, nous appellerons HP-lIa région du DNA de blé
codant pour le tRNAfMcl, un des gènes de tRNAPro(UGA), les gènes rrn18 et rrn5
(fig.27a). L'autre région s'appellera HP-2, (nous utilisons en fait la nomenclature de
JOYCE). En comparant les séquences entourant les deux gènes du blé, JOYCE avait
remarqué que malgré la divergence des séquences. on pouvait retrouver (entre HP-1 et
HP-2) des blocs d'homologies situés à des distances variées. Il avait alors désigné ces
blocs par les lettres D, E et F. Les positions de ces blocs sont indiquées sur la figure 27-
a. Outre ces blocs, il a identifié des séquences baptisées "T éléments" qui peuvent
adopter une structure secondaire en feuille de trèfle rappellant la structure des tRN A. Ces
"T éléments" sont appelés Tl, T2, T3 ... etc. (fig.27-a). Ils se ressemblent tous mais
sont différents à des degrés divers et sont présents sur HP-1 et HP-2. De plus, JOYCE a
mis en évidence le caractère très recombinogène de la région HP-2 en y identifiant des
.
.
séquences homologues à des séquences contenues dans les gènes rrn26 et atpô (fig.27-
a).
Nous avons comparé la séquence des régions entourant les gènes de tRN APro
de la mitochondrie du maïs avec les séquences des régions HP-1 et HP-2. Les résultats
de ces comparaisons sont représentés sur la figure 27-a. Nous avons retrouvé en amont
du gène complet du maïs, la même structure que la région HP-2 du blé. Les blocs D, E et
F sont situés aux mêmes endroits et on retrouve une régioncorrespondant à un "T

---

FIGURE 27-a: Réprésentation schématique de l'organisation des régions Ilanquantes
des gènes trnP du maïs et du blé
T5
tRNA Pro
c==::J
atp6
rrn26
0
E
F
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - p I I i l I ! !
FG&
&
1
Cl
0
1
1
1----
HP-2(blé)
1
1
1
1
Tx
1
1
fmW0<:2M
~
:
1
D E I F
r
1
1
1
1
Cl
0
1
1
1
_
3.5 B(maïs)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1
1
1
c::!=J
trnfM
rrn18
rmS
T1
T2
T3
0
E
1 F
:
"
1
1
r I S : , S , " " " ' , S , ' i __ rzzJ
m
~
fUlL
Cl
0 :
J
1
HP-1(bI6)
1
t-
1
1 pseudo tRNJ P ro(3')
1
c:::::J
1
D E I F'
?
- - ,
r -
1
_ _ _ _ _ _ _ _ _ '- _ _ -
1__ • _ _ ~_- r
1
_ _
N787(maïs)
Les boites nommées atpô et rrn26 sont homologues à des séquences contenues dans les gènes atpô ct rrn26
Les gènes trnfM ,rmI8 et rmS ct les éléments T sont réprésentés à des échelles plus réduites par rapport aux
autres séquences schématisées.

---

FIGURE 27-b: Schéma théorique des recombinaisons qui seraient à l'origine
de la structure actuelle des régions codant pour le gène rmf
de la mitochondrie du maïs
rec.l
rec.2
I-IP-l
X HP-2
•
3.5 B
X Autres séquences
--. N7B7
~
+
pseudo LRNAPro
tRNA Pro
Tx
(5' )
c:::::::J
WSWî&&riêRfi
c::J
0
E
F
0
E
F"
Cl
0
U
~
Eliminés du génome mitochondrial du mais (B37 -N)
rcc l: recombinaison probable dans le maïs entre les séquences (ancêtres) de type HP-l et HP-2. Celte recombinaison
aurait engendré la structure retrouvée dans le fragment 3,5B en plus d'une autre structure qui, elle, a été éliminée par la
mitochondrie du maïs.
rec2: deuxième recombinaison entre les séquences du type 3,SB avec d'autres séquences (n'ayant pas de parenté avec les
séquences impliquées dans la première recombinaison). Celle recombinaison aurait été à l'origine du gène incomplet et
s'est probablement déroulé à l'intérieur du gène. La partie S' du gène incomplet ainsi que les régions en amont auraient
été aussi éliminés par la mitochondrie du mûs.

---

FIGURE 28: Structure secondaire en feuille de trèt1e
déduite de la séquence du DNA de l'élément Tx
trouvé en amont du gène trnP de la mitochondrie du
maïs
G
G - e
T - A
T
A
e
G
T
A
G
e
G
G
G
G
G
Tf/
A
T
T
T
G -
A
T
e
e
G
e
e T e A e e
A
T
A
A
T
e
G
G
G
A
T
1
1
A
G
T
G
G
T
e
e
e
e
e
e
T
G
T
T
e
e
CD
T
T
T
G
T
CD(Ç)
G
T
A
T
G
e
G
e
T
Ci)
CV@)
G
--Â-
~
G -
e
G e TG
G
A
T
- G
G
G
e
t
A
T
e
e
A
T
A
e
A
T
t
G
Les flèches désignent les nucléotides substitués par rapport au T5 du blé.
Les cercles indiquent les nucléotides absents du T5 alors que les séquences
absentes du maïs mais présentes sur le T5 du blé sont représentés par des
accolades

---

59
élément". La structure secondaire de ce "T élément" désigné par Tx est représentée sur la
figure 28. Il a les mêmes caractéristiques que T5 identifié sur HP-2 mais en diffère par
des particularités qui sont montrées sur la figure 28. L'homologie entre HP-2 et la région
du DNA du maïs en amont du gène complet de tRNAPro s'arrête immédiatement après la
séquence Tx et on n'y observe donc pas les homologies avec les gènes rrn26 et Q[p6.
L'analyse des régions en aval du gène a montré qu'au lieu de retrouver des homologies
entre la région en aval des gènes (complet et incomplet) du maïs avec celle de HP-2, on
en retrouve plutôt avec HP-l (fig.27-a). Le gène complet du maïs compone donc en
amont des régions homologues à HP-2 et en aval, des régions homologues à HP-\\.
Toutes ces observations nous amènent à tirer les conclusions suivantes:
1) Les gènes de tRNAPro du blé et du maïs dérivent sans aucun doute du même
ancêtre.
2) Dans le mais, une recombinaison intervenue dans le bloc F entre les ancêtres
des séquences du maïs équivalents à HP-l et HP-2 a donné la structure actuelle. Le
schéma de cette recombinaison est montré sur la figure 27 -b. 11 est probable que la
recombinaison est intervenue à l'intérieur du gène de tRNAPro car la présence d'un gène
incomplet de tRNAPro dans le maïs met en évidence le caractère recombinogène de ce
gène.
3) Les blocs D, E et la séquence "T élément" ont probablement une importance
au niveau de la transcription car on les retrouve devant tous les gènes de tRNAPro, même
si leurs positions changent d'un gène à l'autre. Notons à ce sujet que dans le maïs, le
bloc D contient une séquence 5'AAGAAAAT3' rappelant la séquence consensus mais
comportant un T en 3' au lieu d'une purine. Cependant, dans le blé, deux séquences
5'AAGAAAAA 3' et 5'AAGAAGAA3' sont retrouvées en amont du gène de tRNAPro
codé par le fragment HP-1 et ce, dans des régions différentes des blocs D et E.

---

1
1
1
E. ETUDE DES GENES DE 'l'RNA DU COSîv1IDE 8-3B2
Présentation d'un article sous presse à Current Genctics
1
Le co srnide 8-382 contient une insertion de Di\\A mitochondrial de maïs de la
variété WF9-N. Cette insertion est localisée sur le cercie-maître entre les coordonnées 85
1
et 120 (fig.4-c). Nous nous sommes intéressés à ce cosmide parce que son Insertion
s'hybride à la fois au tRNA totaux mitochondriaux el chloroplastiques. La cartographie
1
de restriction de ce cosmide a été établie et l'hybridation des différents fragments de
restriction avec les tRNA totaux rnitochondriaux a montré que 3 fragments comportent des
1
gènes de tRNA. Ces fragments ont été sous-clonés et leur séquence nucléotidique a été
établie. Des gènes de tRNATyr, tRNALys et tRNAMcl ont été identifiés respectivement sur
des fragments HindIII de 335 pb, RsaI-EcoRI de 295 pb et SstI-Sau3A de 324 pb.
1
Le gène de tRNALys mitochondrial qui est le premier décrit chez les plantes
1
supérieures a une homologie de 63 à 81 % avec des gènes de tRN ALys ch loroplastiques et
bactériens.
Le gène de tRNATyr de mitochondries de 11131'S est identique à son homologue du
blé (JOYCE et coll., 1988-b) et il ne diffère du tR[\\;ATyr de mitochondries de haricot
(MARECHAL et coil., 1987) que de 2 nucleotides (positions 16 et 47; 1) Le nucléotide 16
est l'une dés positions qUI différencient les 2 i soformcs du tRNATyr miiochondrial du
haricot (MARECHAL et coll., 1987-c).
Le gène de
tRNAMcl
a 95% d'homologie avec
les gènes de
tRNA
chloroplastiques. La comparaison de la région comportant ce gène avec celle comportant
son homologue chloroplastique du maïs a montré que l'homologie entre ces 2 régions est
limitée à la partie codante des 2 gènes. Ce gène qui a probablement une origine
chloroplastique provient donc d'une ancienne insertion de DNA chloroplastique dans le
génome mitochondrial du maïs.

---

Current Genetics
© Srningcr- Verlag 1989
sous presse
Sequence Analysis of the tRNATyr and tRNf\\Lys genes and evidence for
the transcription of a chloroplast - like tRNAMet in maize mitochondria.
Abdourahamane SANGARE, David LONSDALE1, Jacques-Henry WEIL and
Jean-Michel GRIENENBERGER·
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, 12 rue du Général ZIMMER,
67084 STRASBOURG - Cedex (FRANCE)
1- Institut for Plant Research, Maris lane, TRUMPINGTON
C82 2LO CAMBRIDGE (UK)
"Correspondinq author
KEYWORDS
Maize mitochondria, tRNA genes, transcription

---

2
SUMMARY
The nucleotide sequences of three tRNA genes and their flanking regions
from the maize mitochondrial genome is reported. These genes are located in the
same region of the genome between the 14 kb inverted repeats. These genes which
are transcribed in the mitochondria, are coding for tRNALys (anticodon UUU)
tRNAMet(CAU) and tRNATyr (GUA). Because of its very high homology with its
chloraplast counterpart, the tRNAMet gene probably originates fram a chloraplast
DNA insertion. The analysis of the upstream regions of these genes show that the
tRNATyr and the tRNALys genes possess the consensus sequence AAGAANRR
which could act as a pramoter sequence in higher plant mitochondria.

---

3
INTRODUCTION
Mitochondria possess ail the components necessary ta perform protein
synthesis. In higher plant mitochondria (mt) , it has been shawn that the genome
encodes the 268, 188 and 58 rRNAs, some ribosomal proteins (Gualberto et al.,
1988) and a number of tRNAs (for a review, see Lonsdale, 1988). Except for the
rRNAs (258, 188 and 58), the genes coding for the other components of the higher
plant mitochondrial protein synthesyzing system have not been fully described. This
is particularly the case for the genes coding for the set of tRNAs which are
necessary for protein synthesis.
A number of tRNA genes have been sequenced in the maize mitochondrial
genome, namely the genes coding for tRNAHis, (Iams et et.. 1985), tRNAAsp (Parks
et al.,1985), tRNAmMet and tRNAfMet (Parks et al., 1984), tRNASer and tRNACYs
(Wintz et al., 1988) and tRNATrp (Maréchal et al.,1987). It has not been proven that
ail these genes, especially not in the case of tRNAHis, tRNAAsp and tRNAmMet are
expressed in the mitochondrion into mature tRNAs which are active in protein
. synthesis. Because of the complexity of the molecular organization of higher plant
mitochondrial genome which are subjected ta recombination events, there are a
number of tRNA - pseudogenes which are not expressed in the mitochondria (Wintz
et al., 1988; Oron et al., 1985 ). It is therefore quite important, when describing tRNA
genes, ta be sure that these genes are functional.

---

4
Some mt tRNA genes and in their flanking regions, are very similar to their
chloraplast (cp) counterparts. It has been postulated that they originate fram
chloraplast DNA insertions in the mt DNA (Iams et al., 1985). In some cases, they
are expressed fram these insertions and this has been demonstrated for the maize
mt tRNATrp and tRNACYs genes ( Maréchal et al.,1987; Wintz et al., 1988 ).
ln addition, the import of cytoplasrnic tRNAsLeu into bean mitochondria has
been reported and it has been postulated that a number of other tRNAs could be
imported as weil (Maréchal et al., 1988). This phenomenon which also occurs in
Chlamydomonas reinhardii (Boer and Gray, 1989) and in Tetrahymena pyriformis
(Suyama et al., 1986) may be a feature common to many eukaryotes.
It is therefore of great importance to determine the total number of tRNA
genes which are encoded in the mt DNA of higher plants. The identification of ail
these mt tRNA genes will give an idea of the number and the identity of the mt tRNAs
which are coded outside the mitochondria and are imported.
Because of the diversity of the origin of the tRNAs which are involved in the
decoding of mitochondrial messenger RNAs in higher plants, the minimal number
of tRNAs which are necessary for mt pratein synthesis is not known. According to the
wobble hypothesis, this number should be 31, but in mammalian or in fungal
mitochondria, there are only 22-24 tRNAs (Heckman et al., 1980 ) and the rule of
"two out of three" should be used (Lagervist, 1978).
ln order to identify the tRNA genes which are encoded in the maize mt
genome, we have been analysing the restriction fragments of the maize
mitochondrial genome which hybridize with total mt tRNAs.
Recently, by comparison with the sequences of yeast mitochondrial
pramoters, Joyce et al., (1988) detected a purine-rich sequence AAGAANRR,

---

5
which could be a consensus sequence for the promoters of wheat mt tRNA genes.
This sequence is a1so present upstream of the maize mt tRNA Tyr and tRNALys genes
described in this report and it will be interesting to see wh ether this consensus
sequence is also present in other higher plant mitochondria.
ln this paper, we present the nucleotide sequence of three maize mt tRNA
genes and the analysis of their flanking regions. These genes, encoding a
tRNALys, a tRNA Tyr and a tRNAMet , are transcribed and are therefore functional
genes.

---

6
MATERIAL AND METHODS
Total mitochondrial tRNAs have been extracted from 5-7 days old etiolated
seedlings of Zea mays (WF9-N) as previously described (Runeberg-Roos et
al., 1987). Chloroplast tRNAs were extracted as already described (Wintz et al.,
1988).
Purified mt and cp tRNAs have been specifically labeled at their 3' end with
[32P]_ a ATP using yeast tRNA nucleotidyl transferase (Silberklang et al., 1979).
Total RNAs of the soluble fraction were tabeled at their 3' end with [32p]_pCp using
T4-RNA ligase as described by Bruce and Uhlenbeck (1978).
Cosmid and plasmid DNAs were prepared by the alkaline Iysis method
(Birnboin and Doly, 1979). DNA was digested with restriction enzymes using the
conditions specified by the manufacturer, analysed by agarose gel electrophoresis
and blotted ante nylon membranes as described (Maniatis et al., 1982).
Hybridization procedures were as described (Wintz et al., 1988).
DNA sequencing has been carried by the dideoxynucleotide chain
termination method (Sanger et al., 1977) using M13 single stranded DNA as
template. The templates were obtained by subcloning the fragments of interest in
M13mp18 and M13mp19 phages and creating a set of nested deletion as described
(Dale et al.
1985).
1
Nucleotide sequences were analysed using the programs obtained
..
_from the University of Wisconsin Genetic Computer Group (Devereux et a/., 1984).
Sequence comparison were done using the 'EMBL, Genbank and NBRF data banks
on a Digital MicroVax Il computer.

---

7
RESULT8 AND DISCUSSION
Specificity of the mt tRNA probe
ln arder ta localize the tRNA genes on the genome of maize mitochondria, a
complete set of cosmids covering the master circle (Lonsdale et al., 1984) was
hybridized with total mt tRNAs extracted from sucrase-gradient purified maize
mitochondria. Because these tRNAs were obtained from the LiCI-soluble fraction of
mt RNA, they are likely ta be contaminated by 58 rRNA and by degradation
fragments of rRNAs and mRNAs. The tRNAs were labeled by ex-[32P] ATP usi ng the
yeast tRNA nucleotidyl transferase. This enzyme is specifie for tRNAs, in contrast ta
T 4 RNA ligase which can add [32P]_pCp ta every 3'üH end. This is shawn in Figure
1B where, by using T4 RNA ligase, it is possible ta label 5S rRNA, in contrast with
the specifie labeling of tRNAs shawn in Figure 1A. This specifie labeling is due ta the
fact that tRNA nucieotidyl transferase recognize the tRNA structure in arder ta add
or ta exchange the 3' terminal CCA sequence (Orozco, 1982). The specificity of this
enzyme has been confirmed, on maize mt tRNAs, because it has not been possible
ta obtain any labeling, in the same conditions, using a-[32P] GTP which is not
incorporated into the CCA end of tRNAs, or [32P]pCp instead of a-[32p] ATP,
indicating that the enzymatic preparation is not contaminated by any aspecific RNA
polymerase and/or RNA ligase.

---

œ
(jJ
rd
0 )
œ
~
«
o
z
o
cr:
55
+
tRNA ~.
~
,
I~
l,
~
a
b
Figure 1.
Comparison of the labeling pattern of maize mt soluble RNAs with either tRNA
specifie tRNA nucleotidyl-transferase (A) or T4 RNA ligase (8). The labeled
RNAs were separated on a 15% polyacrylamide gel and autoradiographed.

---

8
Homologous hybridizatiorr of such specifically labeled maize mt tRNAs to a
maize mt DNA fragment containing only one tRNA gene, is the praof that this gene
is transcribed. It should be noted that this is not always the case when heteralogous
hybridizations are performed, as in the case of the hybridization of mt tRNAPhe in
bean (Maréchal et et., 1985) and the corresponding tRNAPhe pseudo-gene in maize
and wheat (Gualberto et al., 1988).
That the maize mt tRNAs probe was not contamined by chloraplastic tRNA
was tested as described earlier (Wintz et al., 1988).
Location and sequence of tRNA genes on the cosmid 8-382.
. The cosmid 8-382 is locateo between the two .14 kb inverted repeats of the
master circle of maize mt DNA (Lonsdale et al.. 1984). This cosmid which is about
40 kb long spans fram map coordinates 85 to 120 as shown in Figure 2. Total
specifically labeled maize mt tRNAs have been hybridized with the DNA frag ments
obtained by restriction of this cosmid with Bam HI, Eco RI, Hind III, Sma 1 and Sst 1
(Figure 3). These hybridization experiments indicate that three Eco RI fragments
contained at least one tRNA gene each. These three Eco RI fragments (A,B,C) are
respectively 3.0 kb, 5.0 kb and 4.0 kb long and their positions on the map are shown
in Figure 2. When the same digests were hybridized with specifically labeled maize
cp tRNAs, one of these fragments, namely the Eco RI fragment C (4.0 kb) was
shown to contain a tRNA gene with homologies with the chloraplast tRNAs
(Figure 3).
The localization of the tRNA genes was further refined after cloning DNA
subfragments (obtained fram the Eco RI fragments A, Band C) into the M13mp19

---

,..
ta
\\00
110
1/0
1
1
51! II'
111
S"" 1
B.,nHl
- ;
""
<.
, ,
"
"'11
P
"' ..
~
, ,
Tl'
,..
!. '".
~ 1
<.
"",
1
i
.. ,
.....,.......,--r--------'-'-
1
•
H
B
c
Figure 2.
Restriction map of cosmid 8-382. The position of one of the 14. kb repeats is
indicated on the top of the figure (open box). The Eco RI fragments which
hybridize to total mt tRNAs (dotted boxes) and total mt and cp tRNAs (hatched
box) are indicated. The respective positions and orientations of the tRNA
genes (arrowhead) which are described in this paper are indicated on the
extension of these Eco RI fragments. Restriction sites are abbreviated as
follows : B = Bam HI, H = Hind III, P = Pst l, S = Sst 1. The restriction fragment
containing the gene coding for tRNAMet1 is indicated as weil as the orientation
of the gene.

---

9
vector. Each of these subclones hybridizing with mt tRNAs was entirely sequenced
and was found to contain only one tRNA gene indicating that the three tRNA genes
are expressed in the maize mitochondria. The tRNAs encoded by these three genes
can be folded into the typical c1over-leaf secondary structure of tRNAs (Figure 4).
A tRNALys gene was found in a 295 bp Rsa 1 - Eco RI subfragment of Eco RI
fragment A. A tRNATyr gene was found in a Hind III - Hae III subfragment of 335 bp
of Eco RI fragment B and a tRNAMet gene was found in a Sst 1 - Sau 3A subfragment
of 324 bp of fragment C. The location of these tRNA genes is shown in Figure 2.
The tRNALys and tRNATyr genes are coded for by the same DNA strand, whereas
the tRNAMet gene has the opposite orientation. These sequences have been
submitted to the EMBL data bank and have been respectively given the following
accession numbers : X15681
X15682, X15680
1
The tRNALys (UUU) gene
On the basis of its anticodon (UUU), the tRNA gene which is contained in
fragment A is specifie for lysine. The gene is 73 nucleotide long and the 3' terminal
CCA sequence is not coded for by the gene. This tRNALys is the only one which is
necessary to decode both codons specifying lysine (AAA and AAG) according to the
wobble hypothesis.
This is the first tRNALys gene found in higher plant mitochondrial DNA.
When compared with other tRNAsLys and tRNALys genes, the maize mt tRNALys
gene has only 35 to 60% sequence homology with the mammalian and fungal
mitochondrial tRNALys genes and between 63 to 81 % sequence homology with

---

s:: :2S
Eo1!';l'::J
("j
u· ......
E Vl
~:.cl:r::VlVl
kb
~-.
~
5
.:_ ,~i
4
3
..
2
' ..
mttRNA
cpLRNA
FIGURE 3. Hybridisation of the 3' labeled maize total mt and cp tRNAs
on a restriction digest of cosmid
8-382

---

10
bacterial and chloraplastic tRNALys genes. These levels of similarity are commonly
found between these tRNA genes and higher plant mt tRNA and tRNA genes.
The tRNA Tyr (GUA) gene
Fragment B contains a tRNATyr gene according to its anticodon GUA.
The tRNATyr gene is 86 nucleotide long. When compared with to the other plant mt
tRNAs Tyr or tRNA Tyr genes, this gene is fully homologous to the mt tRNA Tyr gene
which has been sequenced in wheat (Joyce et al., 1988) and therefore has the
same large 0 loop and a low energy base pairing in the 0 stem.
The maize mt tRNATyr gene sequence is very homologous to the tRNATyr
sequence which has been purified fram bean mitochondrial (Maréchal et al.,
1985). It is therefore likely that this tRNATyr is also encoded in the mitochondrial
DNA in bean. There are only two differences between the bean mt tRNATyr and the
wheat and maize mt tRNATyr genes. One of them is the change of T in position
47;1
in the variable loop of bean mt tRNATyr to a G in the maize gene. The second
difference is the change of the U (or 0) into a C at position 16. This is one of the
positions which differentiate the two isoforms of bean mt tRNATyr.
On the other hand, the maize mt tRNATyr gene has only 46% of sequence
homology with the mt tRNATyr gene of Arabidopsis thaliana .This mt tRNATyr gene
(which bas the same anticodon GUA) is thought to have arisen fram a pseudogene
of tRNAPhe, following a number of DNA rearrangements (Chen et al., 1989). It has
not been established whether this gene is expressed or whether A. Thaliana
.
.
mitochondria also contains another tRNATyr gene similar to the one identified here. It
should be noted that the same pseudogene of tRNAPhe has been found in wheat

---

A
A
G- C
G- C
G _ C 70
T - A
Rsal
~
G- T
SC
G,'"CGAGCCCCATACAGAGCCGCGCCCTTGTGA TATGA
G 1
T -
A
60
o
T G
10
A -
T
T
GA
GGGCCAGGCCACCCTCnî'TCTTTTCCGCACCAAGCCTTCTTGTANlATA
T
ACT C G AT
~~ T~ ~
150
A
' I t l
GCAGG
('".ç;IGTAIAGCTCAGTTGCj'AGA',cAITGGC-ÇTTTTMCCTMTC{JICC-Ç
G
AGAGCA
C T "
TTC
200
G T
T _ AT
G 50
?C~TCAAGTCÇTC~'ATACCAAAAAAAACCACTCTTGTATTCGTAAGGA
T- A
G
20
G- T
TGCGGGACAf\\AGACCCT M TCACA TGCATCCATTfAC;::;TCAGAATTC
30 G-C
40
EcoRI
G-C
C
A
T
A
T T T
A
B
G-C
G - C
HlndII 1
50
G -
C 70
!'AGCTTTGCCCCTTGCTTTACATAMTTGTTATGAACTTACT!\\PATGACC
A -
T
100
T
G -
C
60
,
A_T
A
TTATTTATTCTCCCGGAACGCTAGCAAA1~TAATAGTTCCATCTGCTCTT
C
10
G _ C
T
A
150
G
G A G T
CG TC C
G CCG
, 1 1 l ,
G
CITAACTTAACT'tAAGAA1~C#GGCCGCCATCCT1~TTAITCAG
f i
GTAGG
200
G
AAGC
C",",--
TTC
G'.ACCCTTTGTTTGAGGAC;::;CCGTATCCCAGGGAAGGC-GF\\GAGT(',GCCr:i\\
T C A A
G
T T
AT
50
250
A-
G
C
C - G A T
GCC.t;jTCMMGCGACAGACIGIAMTCIGITGMGGTTITCIACGTF\\GGI
20
A_ T
A
T
300
30 G _ C 40
G G T
Tr.c,nATCCIGCCTCICCCI\\CTTGTIGIAGACTTAAGAGAAGAGAAAGIAG
A
T
T
C
-
'A
TI
T
A
GCGGAAGCCTAOGAGGGCCAACCGAGCGAAGCTCTTTC TIITTTTGGCC
HaeIII
G
TA
A
A
_ T
c
C _ G
S S r, 1
50
C - G 70
CCCJ:.c;::;GAACICIGGI1'GCGCT1'TGGT'fGGCTTTCTCTTTITTTC1'AI I I
T
- A
A - T
100
C - G
60
TCTCIGACIIGACTCAGC,'IGI\\CCTACTTGACTCAGCGGTTAGAGTATCG
150
G
lOT T - A TA A C CT A A
C
ACTCA G
CTTTCAJ'ACC«GAGAGTC 'ITTGGITCAMTCCAATAGTAC-GT ".AAACCG
G
I l
1 l
' I I
l i A
AT~TGGT
200
TC
G
GA GT A
"'
GCCGAAACCCCCGCITTTGCCAGCATGACAGCAAGCACAGACTGGCATCA
TT A
T _ A C T
50
250
20
C - G GAG
AOGAGTCGAATGACCAAAGCATCGGTTGCTTCCACGAGACTAfu\\CAATCA
G-C
300
30
C - G 40
ATGACCAATAAAAGACCJv\\CGAAACGACGAGTGAGAAAGATAAN:,PACGC
C-G
T
C
Gl-,CGTGG1"l'CATTGAAGTAGAGGTTTGATC
T
A
Sau3A
CAT
Figure 4.
Nucleotide sequence of the fragments and deduced cloverleat secondary
structures of the three maize mt tRNA genes. A : tRNALys gene ; B : tRNATyr
gene ; C tRNAMet2 gene. In the sequences. the genes are underligned. The
putative consensus sequences are boxed. On the mt tRNATyr gene secondary
structure, the two nucleotides which are different between this gene and the mt
tRNATyr of bean (Maréchal et al., 1985) are indicated.

---

1 1
and maize mitochondria and is not expressed in the two organelles (Gualberto et
al., 1988).
Ail mt tRNATyr genes sequenced up ta now have a GUA anticodon which is
is able ta decode both codons of tyrosine (UAU and UAC) according ta the wobble
hypothesis. In bean mitochondria the anticodon was found ta be NUA, N being an
unknown modified nucleotide (it is probable that N is a modified nucleotide derived
fram G).
The tRNAMet (CA U) gene
Fragment C was shawn ta hybridize with both total maize mt tRNAs and total
maize cp tRNA. Upon sequencing, one tRNA gene was found in this fragment. When
folded (figure 4), the deduced tRNA has a CAU anticodon and the gene was then
identified as coding for a mitochondrial tRNAMet . When compared with other
tRNAsMet or tRNAMet genes, the sequence of this gene appears ta be identical ta
the sequence of bean mt tRNAMet (Maréchal et al., 1986) as weil as ta the
sequence of the mt tRNAMet genes from soybean and A. thaliana (Wintz et
al.,1988). The maize mt tRNAMet gene displays a high level of homology (90 -
95 %) with the chloraplast elongator tRNAMet genes described sa far (Sprinzl et
al., 1989).
This tRNAMet gene is the only gene which could be found in fragment C and
hybridization ta total mt tRNAs shows that it is expressed in the maize
mitochondrion. This has not been demonstrated for the similar mt tRNAMet genes
which have been found in soybean a.n.d A. thaliana (Wintz et al., 1988)
The near complete homology of this maize mt tRNAMet with the
corresponding maize cp tRNAMet (95 %) (Steinmetz et al., 1983) and with other cp

---

Asp (Wheat)
AAGAAAAG
Lys 1
AAGAAGAA
.--53 n - . .
Lys 2
AAGAAAAG
....-- 5 0 n------.
Tyr 1
AAGAATAA
+-63 n----.
Tyr 2
AAGAACGA
.--57 n - .
C(:X\\jSENSUS
AAGAANRR
Figure 5.
Comparison of the putative consensus sequences found upstream of the
maize mt tRNA genes compared with the sequence described by Joyce et el.,
(1988) upstream 01 wheat mt tRNAAsp. The distance 01 these sequences to the
first nucleotide of the tRNA genes is indicated.

---

I?
tRNAMet genes could be explained if one assume that this tRNA originates from a
chloroplast DNA insertion into the mitochondrial genome. To study this assumption,
we have compared the flanking regions of the three mt tRNAMet genes with their
chloroplast counterpart. Ail mt tRNAMet genes are completely homologous up to 24
nucleotides in the upstream region, in the coding region and the 17 nucleotides
downstream except for a 4 nucleotides deletion in A. thaliana . The homology with
the immediate flanking regions of the corresponding gene in cp DNA is low « 50
%). It is therefore difficult to say that this gene originated from a cp DNA insertion.
However, in rice mitochondria, it has been shown (Moon et et., 1988) that a
fragment of cp DNA inserted into the mt genome does contain the gene of cp
tRN~Met together with rbcl, atpê, atpE and trnV. Furthermore, Nugent and Palmer
(1988) have studied the regions of the mt genome which contain fragments
homologous to the cp genome of 6 species of the crucifer family. One of these
regions consisted of a small restriction restriction fragment (Sac /, 1.6 Kb) containing
the atpE and the tRNAMet genes. This small fragment is present in ail mt genomes
studied by these authors. Considering these two exemples, it seems quite c1ear
that this region constitutes a "hot spot" of the cp genome for insertion into the mt
DNA. It can thus be considered that the mt tRNAMet genes from maize, soybean and
A.thaliana were inserted into their respective mt genome from the corresponding
cp DNA fragment and that their flanking regions have been deleted or transposed
as a result of genome rearrangements. The fact that the mt tRNAMet gene is
expressed in maize mitochondria could explain why these tRNAMet genes keep
such high sequence homology with their cp counterparts.
ln addition to the maize mt tRNAMet gene (trnM2) reported in this paper,
another tRNAMet gene (trnM1) has been sequenced in the maize mitochondrial

---

13
DNA (Parks et al., 1984). The expression of this gene has not been documented. By
hybridization with an oligonucleotide complementary to the 3' end of trnM1, this
gene was mapped on the maize mt genome. It is present in two copies in the 14 kb
inverted repeat in a Sma 1 - Bam HI restriction fragment of 2.7 kb from ordinate
39.3 to 42 and 122 to 127.7 respectively (one of these inverted repeats is shown in
Figure 2). Specifically labeled maize total mt tRNAs hybridize to this restriction
fragment which contains only this gene, showing that trnM1 is also expressed in
the mitochondria. According to their anticodon and sequences, both trnM1 and
trnM2 are coding for an elongator tRNAMet. It would be interesting to understand
why such a situation exists. It has been shown in spinach chloroplast DNA that a
tRNA gene having a CAU anticodon can encode a tRNAlle, because of an unknown
modification of the C at the wobble position (Kashdan and Dudock, 1982 ). The
same phenomenon has been described in E.col; where Iysidine, a novel type of
modified cytidine (with a lysine moiety) has been found at the first nucleotîde of the
anticodon of a tRNA with the anticodon LAU (Muramatsu et al., 1988). In this tRNA,
the presence of Iysidine at the wobble nucleotide allows the tRNA to decode AUA
(isoleucine) and not AUG (methionine). The tRNAMet coded for by the trnM2 gene
wnich is reported in this paper has been found to accept methionine in bean
mitochondria (Maréchal et al., 1986). One can wonder whether the tRNA encoded
by trnM1 is able to accept isoleucine. Up to now, no tRNAlle gene or tRNAlle has
been found in higher plant mitochondria. It would be of interest to isolate the product
of trnM1 in sufficient amount to see whether this tRNA has a modified anticodon
allowing it to function as a tRNA"e.
.
.

---

ILl
Analysfs of flanking regions.
When analysed ( Joyce et al., 1988) the upstream regions of five wheat mt
tRNA genes reveal a purine-rich motif which has some homology with the yeast mt
DNA promoter (Tabak et al., 1983). From these studies, it was possible to derive a
consensus sequence AAGAANRR which is likely to act as a promoter sequence in
higher plant mitochondria. When the upstream regions of the maize mt tRNA genes
coding for tRNA Tyr, tRNAMet and tRNALys were examined for such a purine-rich
motif, it was found for tRNALys and tRNATyr, as shown in figure 4 and figure 5. Two
motifs with a perfect homology with the consensus sequence are present 53
nucleotides and 50 nucleotides upstream of the tRNALys gene and 63 and 57
nucleotides upstream of the tRNA Tyr gene (Figure 5). This motif was not found
upstream of the tRNAMet gene at least in the determined sequence. However, it has
been shown that this region of the maize mt genome contains a transcribed protein
gene (unpublished results) and it is possible that the tRNAMet gene is
co-transcribed with this protein gene. In this case, the consensus sequence could
be present far away from the tRNA gene.

---

1;
1
1
1
1
1
IJ IJ~
1
1
©~@~~JO~~ uIJ©~J [Q)~~ @~[M~~ gg ~~[f!Jlù ~Q1J~ lL~~
(Ç~[Rl(ÇlL~o ITW&IJu~[g~ [Q)[g~ @[g[M©~~~ ~IJu©:çLO{]©~J[Q)[Rl~~M~
1
[Q)~ [M]~~~ [Q)~~ o/}~[Rl~~u~~ [ID~1o[M ~u ~~1C@[M)@u
1
1
1
l
1
1
1
1
1
1
r
1

---

61
III. ORGANISATION DES GENES DE tRNA SUR LES
CERCLE-l\\1AITRES DES GENOMES MITOCHONDRIAUX DE
l\\1AIS DES VARIETES B37-N ET B37-CMST'
Comme nous l'avions signalé plus haut (Introduction), il existe de très
grandes différences structurales entre les génomes rnitochondriaux B37-N et B37-cmsT.
Comme cela a été décrit par FAURON et coll., (1989), ces différences peuvent être mises
en évidence par la réorganisation de la structure linéaire du cercle maître (fig.29). En
outre, le génome B37-cmsT compone des séquences de DNA qui ne sont pas retrouvées
dans le génome B37-N et réciproquement. Ces pertes (ou gains) et ces réarrangements de
séquences pourraient être à l'origine du phénotype de stérilité mâle de type T (DE\\VEY et
coll., 1986).
Dans ce travail, nous avons entrepris de voir si les réarrangements génomiques
observés affectent aussi l'organisation et/ou le fonctionnement-des gènes de tRNA
mitochoridriaux et si, en particulier, les deux génomes N et T contiennent les mêmes
- gènes de tRNA spécifiques des mêmes amine-acides .
.A. HYBRIDATION AVEC DES OLIGONUCLEOTillES DE
SYNTHESE
Nous avons utilisé des oligonucléotides de synthèse qui correspondent à la séquence
de gènes de tRNA publiés dans la littérature et/ou à ceux dont les structures ont été
déterminées dans notre laboratoire. Ces oligonucléotides ayant des tailles qui varient entre
17 mer et 27 mer, les hybridations ont été faites en tenant compte de la température
optimale d'hybridation des oligonucléotides les plus courts (entre 42°C et SaOC).
Dans un premier temps, nous avons fait des hybridations avec l'ensemble des
oligonucléotides disponibles. Cette expérience avait pour but de voir si on pouvait
observer des différences entre les génomes mitochondriaux normaux B37-N et WF9-N
en ce qui concerne et la nature et la distribution des gènes de tRNA connus. Dans un
deuxième temps, nous avons utilisé individuellement chaque oligonucléotide que nous
avons hybridé avec des filtres comportant les cosmides recombinants réprésentatifs du
génome mitochondrial B37-cmsT. L'objectif de cette expérience a été de localiser les
gènes de tRNA connus sur le cercle maître du génome mitochondrial B37-cmsT.
Les résultats de ces hybridations sont résumés sur le tableau A du chapitre II.r.

---

FIGURE 29: Comparaison des structures linéarisées des cercles maîtres
des génomes mitocnondriaux 837-N et 837-cmsT
(Fauron et col.. 1989)
o
",.,
T
____l
f - - I _ - - L -_
_ _ _ _ L _ - - ' _ _~_ _L-_~_
_ ' _ __
_'____
____L_
1
.......
•
:~I~
•
~
Q
~'~ G
1
J " l
..
d
s
~I 1 tm-""-I-Tn-IJI--'-I-=;1~
x
-----nI
1I J
Il
1
Il
---==
- __
6'00
L
]
r -1Il r Il Il
]
..
Il
11
Il
1~ 1
1
~.,
.
~
:§ 1(IIR~JTdtJr-::::JTr-I:1-,-/"L..l...L11~-''1-------'-----"------'-
....<1,)
C:o. 1
CI-lI
"4~'n
~
Q
u
v
YI
l Y Z
-.;.,A;;.,A_ _
• •
cc
00
sx 1 ~
1
1
Ilill~ Il:1111]§t;t
6
1 1
4.t
"'l r,
0.1
l .....
~
9
Vl/2Z?Z-mz«-23
==
~
,.
l
fil:
U
•
s ~:iTII-rl
j
lï'i"'""'"'r""-...,......""'""'---.-:-........-
t
x
1
1
~
.
1-'-1---,---1
- l l - - L L . - 13S
1
11
r]
Il Il -
"
=
..
III
1
Il
1
1
Il
R
1 1
1
1
1
Il
III II
1
,., "
"'"
=
K
FF
.J.J
...
s
1 Il:~I 1/ J 11t§1 \\Il: ~ Il
x
1 1
1
1
1
e
1111
Il 1[]
1
1111
i]
1.~C:1"7 ~'g$ ~.l
100
•
1(1(
1
A.It.
II
F
0
H
s
t
j
1 j
x Irl III
III
6
1
~III Il:° ~I---~--
C oo .1.".I~I ...
o
•
H
....
a
v
-.;;G;.;;.G..,.......
.:~I:III:III~
Les blocs de séquences transférés par des recombinaisons multiples sont représentés en tra i rs gras cl désignés par
ces lettres capitales. Les séquences répétées sont indiquées par des boites hachurées ct les boites blanches désignent
les insertions chloropl asuqucs identifiees dans les deux génôllles. Les gènes connus soru localisés (bo i tcs noires).
La position sur le cercle maitre est montrée au dessus des canes.

---

62
.B) ANALYSE DE L'ORGANISATION DES GENES DE tRNA
M1TOCHONDRIAUX
.1) COMPARAISON ENTRE LES GENOMES 1337-N ET vVF9-N
L'hybridation des tRNA totaux mitochondriaux avec le DNA mitochondrial du
maïs WF9-N a été faite dans notre laboratoire par WI.t\\TTZ (1988). De même, les gènes
de tRNA connus ont été localisés sur ce génome en utilisant les oligonucléotides de
synthèse correspondant à ces gènes.
En comparant les hybridations obtenues
avec le génome B37-N ( chap.II.I:
fig.6-a) à celles obtenues avec le génome WF9-N (W INTZ , 1988) il est apparu qu'il n'y
a pas de différence fondamentale dans l'organisation et la localisation des différents
gènes de tRNA entre ces deux génomes fertiles. On a pu
simplement observer une
"micro-hétérogenéité" entre ces deux génomes. En effet, en aval du gène du rRNA 18S,
le génome WF9-N contient une séquence de DNA qui s'hybride à un oligonucléotide de
synthèse complémentaire à la partie S' du gène de tRNAAsp. Nous ne savons pas si cette
région comporte un pseudogène, un gène incomplet ou un gène de tRNAAsp ayant une
structure primaire légèrement différente de celle du gène de tRNAAsp décrit par PARKS
et coll. (1986). Nous savons cependant que les tRNA rnitochondriaux totaux
ne
s'hybrident à la région contenant ce gène que dans des conditions de stringence faible
(50°C) ; ce qui semble indiquer qu'il pourrait s'agir d'un pseudogène ou au moins d'un
gène incomplet.
2) COMPARAISON ENTRE LES GENOMES B37-N ET
B37-cmsT
La comparaison de l'organisation des gènes de tRNA rnitochondriaux du génome
mâle stérile B37-cmsT par rapport au génome fertile B37-N montre que:
a) Conformément à l'importante réorganisation de l'ensemble du génome, il y a
une nouvelle distribution des gènes de tRNA mitochondriaux dans le génome B37 -cmsT.
Tous les gènes de tRNA portés par les génomes normaux (B37-N et WF9-N) sont
retrouvés dans le génome B37 -cms'T. Dans la plupart des cas, ces gènes de tRNA
conservent leur environnement nuc1éotidique immédiat (sur au moins 1kb) ce qui fait que
la majeure partie des fragments BamHI du génome B37-N comportant des gènes de
tRNA sont retrouvés dans le génome B37-cmsT. Ce qui change, c'est la position relative
de ces fragments sur le cercle maître. Le cas des gènes de tRNAPhe, de tRNAAsn et de
tRNASer illustre bien ces remaniements (fig.30). Dans le génome normal B37-N, le gène
de tRNAAsn est répété car il est situé dans la répétition inversée de 14 kb. Une des copies
de ce gène se trouve sur le même fragment (2,7 kb BamHI) que le gène de tRNAPhe
(chap.Il.n.B ; chap.Il.I: fig.6-a, piste 6). Par contre, 'le gène "de tRNASer est contenu

---

FIGURE 30: Exemple de recombinaison entrainant la réorganisation
des gènes de tRNA entre les génomes fertiles
et mâle-stériles T
B
Ser
B
N7D1ü
r
1
fi!!
1
Lignées fertiles
1
Phe
1
Asn
Asp
mMet-1
( B37-N)
N8A1
1
• x cllil
1
9=>1
...
B
S
S
81
Asn
Asp
mMet-1
T3E3
{< 0lt1 è
~ .. !3 4tlI
Lignée mâle-stérile T
1
Phe
1
Ser
(B37-cmsT)
..
T3G5
...
1
)(
1
1
B
B
B
B: BamHl; S: Smal
Les petites flèches indiquent le sens de transcription des gènes de tRNA
Les noms des cosmides portant les fragments réarrangés sont inscrits
en face et à gauche des lignes correspondantes.
Les croix représentent les régions potentielles de recombinaison

---

63
dans un fragment BamHI de 3.2 kb, qui est situé sur le cercle maître à environ 250 kb de
ce fragment
BamHI de 2,7 kb (chap.Zr.Il.A ; chap.l/.I: fig.6-b, piste 14). Dans le
génome B37-cmsT, le gène de tRNAAsn est séparé du gène de tRNAPhe d'environ 350
kb (sur le cercle maître). Le gène de tRNAPhe est rapproché du gène de tRNASer et ils
sont portés par deux fragments BamHI contigus ( chap./I.I: fig.6-b piste 3).
b) Un bloc de DNA mitochondrial B37-N comportant des gènes de tRNA
disparait dans le génome B37-cmsT. En effet, la séquence répétée inversée de 14 kb du
génome B37-N codant pour les gènes de tRNAAsp, de tRNA m McL1, de tRNAGlu, de
tRNA Pro et de tRNAAsn, n'est plus présente qu'en un seul exemplaire dans le génome
B37-cmsT. Tous les gènes de tRNA qui étaient par conséquent dupliqués dans le
génome N ne le sont plus dans le génome T. Cette pene relative d'information, bien que
concernant une grande région de DNA (plus de 14 kb) ne semble pas dramatique pour la
mitochondrie. Cependant, nous ne savons pas si la disparition d'une des copies de la
répétition inversée de 14 kb a une influence sur l'expression des gènes qu'elle comporte.
Dans les chloroplastes, on a observé que les concentrations des tRNA codés par des
gènes présents en deux exemplaires (car situés dans la région inversée répétée) ne sont
pas supérieures aux concentrations des tRNA codés par un gène unique (PFITZINGER
et coll., 1987). Par ailleurs, dans le génome B37-cmsT, on retrouve l'hybridation du
gène de tRNAAsp en aval du gène de rRNA 185. Nous n'avons aucune donnée qui
puisse nous permettre d'expliquer pourquoi les génomes WF9-N et B37 erns-T
contiennent ce gène ou pseudo-gène de tRNAAsp alors que le génome B37-N ne l'a pas.
c) Tous les gènes de [RNA qui sont retrouvés sur le cercle maître du génome B37-
cmsT sont transcrits dans la mitochondrie du maïs B37-cmsT. En effet, on obtient le
même profil d'hybridation sur les filtres comportant le DNA rnitochondrial B37-cmsT,
quels que soient les tRNA totaux mitochondriaux utilisés (B37-cmsT, B37 -N ou INRA).
De même, les tRNA de la mitochondrie du maïs B37-cmsT révèlent toutes les régions du
génome B37-N comportant des gènes de tRNA. La réorganisation génomique n'affecte
donc pas la transcription des gènes de tRNA.

---

11
1
1
1
1
1
1
1
1
1
ETUDE fD~UTRlES REGdONS !DU D/NJA
1
MffTOCfHJONDRlAL DES VARff!ETES DE
1
fVJAffS fB37=N ,fET fB37=rcm~T
1
1
1
1
1
1
1
1

---

o
~1J~QlJ[Q)~ [Q)~ [Q)~QlJb:{ [F~,&@~~~[N]u~ [Q)~ [Q)[N]'& [M]IJu(Q)©[g]©[NJ[Q)~IJ,&[L
[Q)QlJ [MJ~IJ~ ~°[f{]W~~~[Q)'&[f\\']U ,& [L'& [F~,&(Ç;m©[f\\'] ~~ [Q)QlJ ~[f\\']~
[M]Ou(Q)(Ç;[)=[]©~~I[Q)~D,&[L [ij]&O~ [KI~ (Ç(Q)Q'dJ~©~U ~[NJu ~,&~ [Q)~ @~[f{]~
[Q)~ U~[\\~,&

---

1
64
1
I. ETUDE DE 2 FRAGMENTS DE DNA MITOCHÜNDRIAL DE
1
MAIS
S'HYBRIDANT
À
LA
FRACTION
4S
DU
RNA
MITOCHONDRIAL
MAIS
NE
COMPORTANT
PAS
DE
1
GENE DE TRNA
A.ETUDE DU FRAGMENT 1,25 kb XhoI DU COS!\\/l1DE 9-] E8(A2)
1. PRESENTATION DU COSMIDE
9-1E8
1
Le cosmide 9-1E8 (cf figA-c) contient une insertion de DNA mitochondrial de
maïs à cytoplasme fertile de la variété WF9-N. Cette insertion mesure environ 35 kb. Elle
1
est située entre les positions 0 et 40 du cercle maître (fig.Tl ). Nous nous sommes
intéressés à ce cosmide parce qu'il s'hybride aux tRNA mitochondriaux totaux du maïs
1
marqués au [32 P] pCp (à l'aide de la T4 RNr\\ ligase) ou avec de l'et.-[32p] ATP (à l'aide
de la tRNA nucléotidyl transférase: CCAse).
1
2. SOUS-CLONAGE
ET SEQUENCAGE D'UN FRAGMENT XHOJ
DU COSMIDE 9-1E8
Nous disposons de la cartographie XhoI (LüNSDALE el coll., 1984) de la région
1
du DNA mitochondrial couverte par le cosmide 9-1E8. Nous avons utilisé cette
cartographie pour rechercher les fragments du cosmide qui s'hybrident à la fraction 4S du
1
RNA mitochondrial du maïs. Les fragments XhoI de ce cosmide ont été clonés dans le
vecteur M13 um31. La figure 32-a montre l'électrophorèse sur gel d'agarose d'une
1
selection des clones qui représentent tous les fragments Xhol de ce cosmide. Ces
fragments ont été hybridés avec la sonde constituée par la fraction 4S (enrichie en tRN A
totaux) marquée au et.-[32p]ATP à l'aide de la CCAse. La figure 32-b montre que cette
1
sonde s'hybride à un fragment XhoI de 1,25 kb.
Nous avons établi une cartographie fine du fragment Xhol de 1,25 kb . A l'aide
1
de cette cartographie nous, avons pu obtenir des sous-clones de ce fragment pour le
séquençage. Dans les régions où nous ne disposions pas de sous-clones adéquats nous
1
avons aussi utilisé des oligonucléotides de synthèse pour compléter la séquence
nucléotidique du fragment étudié.
1
3. ANALYSE DE LA SEQUENCE DU FRAGMENT XHOI DE 1,25kb
La recherche de gènes de tRNA sur le fragment XhoI de 1.25kb, en utilisant les
1
caractéristiques qui permettent
leur identification (recherche de la boucle 'P) a été
infructueuse. Par contre, en utilisant le programme d'analyse de séquences UWGCG,
1
nous avons pu identifier sur ce fragment .une phase de lecture -ouverte de 240 acides
aminés. Cette URF (pour Unidentified Reading Frame) s'étend du nucléotide 1 du
1
fragment XhoI de 1,25 kb (1259 pb) au nucléotide 720 pb (fig.33). Nous avons cherché
dans les banques de données, des homologies de séquences entre l'ur! du fragment
1
1
1

---

FIGURE 31:
Localisation et représentation schématique de la structure
chimérique du fragment XhoI de 1,2skb du cosmide 9-1E8
o
20
40
60
5
1
0.7
14
c::::::::J
0
CJ
•
0.96
2.4
Smal
26
Xhol
14.8
11 .8
19.5
,
/
(
0.6
--
.... -
/
'-
/
/
1
(
--
1
'-
/
147
306
720
1259
) 1
5 S ' S '
5 $ > '
(, \\-:;;5;~' \\S
urf24 0
urf138
•
Régions homologues au fragment 2.7Kb du cosrnide 9-2C4
~
insertion
atpS
ES]
urf240
o
insertion
coxll
o
séquences répétées ailleurs dans le génôrne (les chiffres inscrits au dessus de ces boites
indiquent la taille des répétitions)
Les tailles des fragments sont indiquées en kb. Les coordonnées ( en nucléotides) désignant les
extrémités des différentes composantes de la structure chimérique sont indiquées au dessus du
fragment
Xhol de 1,25 kb. Les chiffres inscrits au dessus de la ligne supérieure désignent la
position des fragments sur le cercle maître.

---

1
1
65
1
XhoI de 1,25 kb et d'autres gènes de protéines connues (code universel). Les résultats
de ces recherches sont schématisés sur les figures 31 et 33 et montrent que:
- Du nucléotide 1 au nucléotide 306 (soit 102 acides aminés), on observe une
1
homologie de plus de 95% entre le fragment Xho1 de 1,25 kb et la région située en
amont du gène coxl l de la mitochondrie du maïs (FOX and LEA VER, 1981). Cette
1
région correspond en outre à une partie de la séquence répétée de 0,7 kb (LONSDALE et
coll., 1984) dont une copie se trouve en amont du gène coxll (fig.31)
1
- Du nucléotide 147 au nucléotide 306 (53 acides aminés) le fragment Xhol de
1,25 kb a une forte homologie avec une séquence interne au gène atpô (DEWEY et coll.,
1985a). Cette séquence est entièrement incluse dans la région précédente contenant les
1
séquences en amont du gène coxll.
- Du nucléotide 306 au nucléotide 720, correspondant au reste de Yur], on
1
n'observe aucune homologie avec les gènes connus dans la banque de données.
Au vu de ces observations, il apparaît que la région du DNA mitochondrial étudiée
1
compone une structure chimérique contenant une partie des gènes coxll et atpô et une
partie inconnue. Il nous a donc paru utile de déterminer si cette structure chimérique est
exprimée dans la mitochondrie du maïs. La phase de lecture ouverte de 240 acides aminés
1
sera appelée wf240 et la partie inconnue (138 acides aminés) sera nommée urf138 .
;.....L·llifJ}8 est-elle exprimée dansJa mjtochondri~du. maïs?
1
POLIr étudier la transcription de Yur]! 38, nous avons tenté d'identifier des
transcrits correspondants à cette urfpar hybridation du fragment Xhol de 1,25 kb avec
1
l'ensemble des RNA rnitochondriaux. De manière à faire la différence entre les transcrits
de Yatpt) et du coxll (qui vont être mis en évidence par les séquences homologues
contenues dans le fragment XhoI de 1,25 kb) et les transcrits spécifiques de l'urfI38.
1
nous avons utilisé deux sondes différentes: l'une correspond au fragment entier
(comportant donc [out l'wf240 ) et l'autre à un fragment de restriction BamHI-Stu1
1
(fig.34) ne contenant pas les insertions des gènes coxll et atpô et spécifique à l'urfl 38.
Ces sondes ont ainsi été hybridés séparément avec du RNA total de la mitochondrie du
maïs extrait des variétés B37-N et B37-cmsT. Les résultats de ces hybridations sont
présentés sur la figure 34. L'analyse de ces hybridations montre que:
- Le fragment entier Xho1 de 1259 pb s'hybride à plusieurs grands transcrits
distincts de la variété normale B37-N en plus de certaines petites molécules de RNA de la
fraction "5s-4s", Il s'agit de transcrits ayant 6.5 kb, 4.2 kb, 3.5 kb, 2.6 kb, 2.3 kb, 1.9
kb, 1kb, 0.8 kb et 0.65 kb (fig.34-a, piste N). Les transcrits de 3.5 kb, 2.6 kb et 0.65
kb correspondent à des RNA qui s'hybrident aussi avec une sonde du gène coxll du maïs
(FOX et LEA VER, 1981).
Par contre, le fragment XhoI de 1259 pb s'hybride à beaucoup plus de transcrits
de la mitochondrie de la variété stérile B37-cmsT par rapport à la variété fertile. Les

---

(")
(")
0
QJ
0
QJ
0J
œ
r-:
N
QJ
œ
~
0
.c
0J
0J
N
N
N
N
U
N
N
N
N
U
«
«
«
«
«
w
«
«
«
«
< W
- - -
-
- -
kb
2
1.6
0.5
•
a
b
FIGURE 32:
Analyse des sous-clones du cosmide 9-1 E8
a) Electrophorèse sur gel d'agarose 0.8% des fragments de
restriction XhoI des sous-clones du cosmide 9-1 E8
b) Hybridation des fragments de restriction avrc la fraction
4S du RNA mitochondrial marqué au a -( 2 p ] ATP à l'aide de
la CCAse

---

li
1
FIGURE 33: Séquence nucléotidique du fragment XhoI de 1,25kb
du cosmide 9-3E8
1
1
147
TCTC~ÀCAGCCCGTTGGATC~ÀTATCAATTTGG~ÀTTCACCCAATTCTGGATCTGAF.TATTGGTGAGTAC
1L N S P . ü · . U · · Q•••••• y Q F G > I i } t P I I i b r j N ·•·•••.. I.··C.·E>··Y<···· ···1
T ATC
306
rcll~'~r;~p.TT'@1'8G§p.TSPWSqGCCAGAAACGGGGAAGAGCCCATGCTGTCGTA~.::'GGCCTCGTCGAG
I X V F
< E s s g
Q
K
R
G
R
A
H
A
V
V
c,
P.
S
S
S
TGCTTCCGCTACGCCTAATTCTGAGGATGATGATAAGCGGAAAAAAGTGTCCCGCC?~GACGCCAATGGC
A
S
A
T
P
N
S E O
D
0
K R K
K
V
S
R
Q
D A N
G
?~"GAGTCAGAGCCGCCCATAAATGGGGCGCAACCTGAAGTACCATCCATTGCGTTCTTAAP.GAAAAGAA
K
E
S E P
P I N
G
A
Q
P
E
V
P S I
A
F
L
K
K
R
l
TT.~ACAGTTCTAAGGTCCTGTCGAGATAGGAACCCTAGGGAGAGCACATTACGCTCTACTTACGAGGA
K
T
V
L
R
S
C
R
0
R
N
P R E
S
T
L
R
S
T
y
E
D
TCTTCACCTTGAAACGGCGAGCGCCGAGAAGCGGGTAAAFÀTCGCCCAGGCCCTAGF~_~TCTGTACAGG
L
H
L E T
A
S
A
E
K
R
V
K
l
A
Q
A L E
N
L
Y
R
CGAAGCCAATATTTCCGGAGTAACAAAAGGCAGCAGCCCCATACCGACTTGATTATTC~J~;TCTGCGATT
?
S
Q
y
F
R
S
N
K
R
Q
Q
P
H
T
0
L
l
l
Q
l
C
0
W
720
GGGAGCGTACGAAGAGGTAAAGAAATTCACTGGTGTAGGCATAGGAAACCGAGGCCCCCCÀ~CCCATCT
E
R
T
K
R
*
ACTATACGGTTGAGGtGAGGGGGGG.~GAAGAGTGGGéATGTGGGCT~CTTTCACTG~GTCTTTTdTGA
AGCAAAGGëATCGCGGCG~ATCAACACC~GACTAGTTGëTGATTCAAT~GCTGACTTCdTTTC.~TATGI
IATATGAT"}ÀCACATCAGC~CGGCACCCTTGTTTCCC~CTAACTACTCATCTAGCTAGATCCGGATCAG
AAATGGTAGGAACTAGATCAAGAAATACGAGACTTTTCCTTCACTGGAAACTCCCGAGCCCGAGTCATCA
CCCTAGCCCGACTCATCCATTGAAGCGAGCCAGGTGGCAAATCCATTAATATAACTTCTGGAATCCCAGC
.~TAGAGCTGGCAAGGTTGAAGTGAAGCTGGAATGGATCCGATCTTCAGTGTGGAAAGAGCTTCAATCCT
CTGTAGC~GGAAAAGCCG~CCGCTCTTGTCTTGCCTTAAATAGCTGGAAGCGAAAGCAGiTCTCGAG
XhoI
La séquence pcptidiquc de l'urf240 et de l'urfl38 est représentée en dessous de la séquence nucléotidiquc,
Les boites en pointillé indiquent les séquences homologues à la région en amont du gène coxlI. Les limites
de l'insertion d'une partie du gène atpô sont indiquées (147; 306). La séquence de type Shinc et Delgamo de
la séquence 3' du rRNA 18s du maïs est montrée au dessus de la séquence qui lui est complémentaire en amont
de l'urfI38. Les nucléotides T ·ATC au dessus de la séquence indiquent la différence par rapport au gène coxll.
La séquence ATGGAA inseree comparativement au gène coxII est montrée par une barre au dessus de la séquencc..
La méthionine initiatrice potentielle est encerclée
Les boites blanches représentent des séquences homologues au fragment BamHI-XhoI de 1kb du cosmide
9-3C4(chapl//-II.B)

---

x cox /lia tp6
SI
urt 138
x
1
: (
(
(
,: (
(
(
(
(
(
l~$ $ <, $ S S <, S S S S S S s 3
1
..r
t
,..-
\\
"
urf240
--
",
,
",
\\
"
,..-
"
1
'"
..
'"
",
1
--
"
"
1
"
",
"
L
"
,
",
\\
"
"
--
\\ N
,..-
'"
T
N
T
",
'" ....
- - , .. -
....
"
_ -
DNA
DNA
>8
>8
6.8
6.8
6.5
4.2
4.6
3.5
3.3 4.0
2.6
2.3
2.2
1.6
1.6 1. 9
1.2
1.2
.....
"t'!!J
0.8
0.8
0.65
0.65
a
b
FIGURE 34 : Etude de la transcription de l'urf138
a)
Hybridation du fragment XhoI de 1.25 kb du cosmide 9-1ES
comportant LOutl'wf240 avec les RNA rnitochondriaux totaux
b) Hybridation du fragment Stul- XhoI comportant seulement
l'u.rf138
avec les RNA rnitochondriaux totaux
N: RNA total extrait de la mitochondrie du mals de la
variété normale B37-N
T:
RNA LOta! extrait de la mitochondrie du maïs de la
variété mâle stérile B37 -cmsT
La taille des transcrits est indiquée en kb
r::2I
insertion
coxlltatpô
ISJ
urf240
o
urf138
X: XhoI; St: StuI

---

~g~!"
66
1
transcrits de 2.6 kb, 2.3 kb, 1.9 kb, 1 kb et 0.8 kb de la variété rzrmalc sont retrouvées
1
alors que de nouveaux transcrits de 6.8 kb, 4.6 kb, 4.1 kb, 3.3 :-::~ ::l 1.6 kb apparaisent
dans la variété mâle stérile (fig.34~a, piste T). Parmi tous ces tT~::s=rits, ceux de 6.8 kb,
4.6 kb, 4.1 kb, 3.3 kb, 2.5 kb, 2.2 kb, 1.9 kb et 1.6 kb s'hybride:__ à une sonde du gène
1
mp6 de la mitochondrie du maïs (DEWEY et coll., 1985).
-
La sonde correspondant à l'ur/i38 seule révèle dar.
.a variété fertile, les
1
transcrits de 3.3 kb, 1.9 kb, 1 kb, 0.8 kb et 0.6 kb ainsi qu'un tL:-":::'.:::rit spécifique de 1.3
kb.
1
Dans la variété stérile, les 5 premiers transcrits identifiés .~ .ns la variété normale
sont retrouvés en plus des transcrits de 6.8 kb, 4.6 kb et 1.6 kb.
1
En récapitulant toutes ces informations, on peut dire que:
1°) L'ur/I38 est transcrite dans la mitochondrie du mai-
~m trouve en effet au
moins un transcrit spécifique de 1.3 kb qui ne s'hybride ni à la ~;~,:"~je coxll ni à la sonde
1
atpô,
2°) Il est probable que le transcrit primaire contenant' ::1138 contienne des
1
séquences homologues aux gènes atpô et coxll car la sonde cor.r mondant à l'urf240 et
celle correspondant à l'wj138 révèlent des transcrits communs .~:.::~lle que soit l'origine
1
des RNA sur lesquels les hybridations ont été réalisées.
3°) L'wj240 fait partie de d'unités de transcription différentes dans les lignées de
maïs à cytoplasme normal et à cytoplasme stérile. Ceci suggère l~ ~~. la région codant pour
1
ces urf subissent des remaniements importants d'un type de ::.'~oplasme à un autre.
L'analyse des régions codant pour l'urj240 el l'urfl38 au niveau ~-:::; différentes cartes de
1
restriction des génomes B37-N et B37-cmsT (FAURON et Hr.·:"'IK, 1988, FAURON
et coll., 1989) confirment ces observations.
1
Ces résultats de transcription nous ont incités à ..:.:;alyser la séquence
nucléotidique de l'urf138 et des régions qui l'entourent. Sacha!" eue la partie en amont
du coxll que l'on retrouve dans l'urf240 n'est pas contenue da"
.a protéine mature de
1
COXII (FOX et LEA VER, 1981) nous avons supposé que l'u,·,.'8 pourrait coder elle
aussi pour une protéine indépendante.
1
L'analyse des séquences en amont de l'ur/138 montre qu::"
- Le codon ATG (en position 284 sur la fig.33) qui ~écifie la méthionine
initiatrice du gène coxII est détruit devant l'urf138. Ce codon ":.TG est transformé en
AAG.
- A 5 nucléotides en aval du codon A TG potentiel
cu coxlI , on observe
l'insertion d'une séquence 5'A TGGAA3' ( par rapport à la sécuence du gène coxII ).
Cette séquence conserve la phase de lecture mais crée un nouveai, codon A TG. Ce codon
ATG pourrait servir de codon initiateur pour l'urfi38.

---

67
- 16 nucléotides en amont du nouveau codon initiateur potentiel, on a pu identifier
une séquence de type SHINE et DALGA~NO capable de s'apparier avec la région 3' du
rRNA l8S de la mitochondrie du maïs. Cette séquence est montrée sur la figure 33.
Ainsi, si l'on tient compte de toutes ces données, on peut soutenir l'hypothèse
suivant laquelle l'urf138 coderait pour une protéine indépendante du reste de l'urj240.
Nous ne savons toutefois pas s'il y a un intron qui intervient avant le codon stop
commun aux deuxurf ou si cette phase ouverte represente le dernier exon (extrémité
carboxy-terminale) d'une protéine plus grande. La taille du plus petit transcrit
correspondant à l'urfJ38 étant d'environ 650 pb (fig)4) alors que la taille de cette urf
représente 414 nucléotides (138 aa) il est difficile d'imaginer que cette urf code pour une
proteïne entière. Cependant, une autre méthionine est présente au niveau du nucléotide 69 .
de l'urf240 et si elle correspondait au début de la protéine, le transcrit mature
comporterait alors 651 nucléotides. Cette taille coïncide avec ce1le du plus petit transcrit
révélé par les différentes sondes. De plus, cette possibilité expliquerait pourquoi la sonde
spécifique à l'u.rfJ3 8 s'hybride avec des transcrits révélés par des sondes atpti et coxll.
En effet, le RNA correspondant à cette urf (qui coderait pour une protéine de 217 aa)
comporterait des séquences homologues à ces deux gènes. Le seul problème à ce niveau
est qu'on ne trouve pas de séquence de type SHINE et DALGARNO en amont de la
méthionine en position 69. Des études sont en cours pour élucider ces problèmes. Dans
tous les cas, l'analyse de la transcription de l'urfl38
suggère qu'il existe des grand
transcrits de plus de 8 kb impliqués dans des processus de maturation complexes.

---

1
68
1
1
B. ETUDE DU FRAGMENT SmaI DE 2.7 kb DU COSMIDE C9-2C4)
1
1. PRESENTATION DU COSMIDE
Le cosrnide 9-2C4 ( cf fig.d-c) contient une insertion de DNA rnitochondrial de
1
maïs à cytoplasme normal de la variété WF9-N. Ce fragment est situé sur le cercle maître
entre les positions 295 et 235. Il contient les régions codant pour les gènes cob
1
(DAWSON et col1.,1984), arp9 (DEWEY et coll., 1985-b) et de tRNAfMet (PARKS et
coll., 1984). Il comporte une partie de l'insertion chloroplastique de 12 kb
dans la
mitochondrie du maïs (STERN et LONS DALE, 1982). Nous nous sommes intéressés à
1
ce cosmide car son insertion s'hybride aux tRNA totaux mitochondri aux. En fait,
l'objectif de cette étude a été de rechercher les gènes de tRNA qui pourraient être codés
1
par ce cosmide en plus du gène de tRNAfMct
1
2. SOUS-CLONAGE DES FRAGMENTS DU COSMIDE 9-2C4
Le cosmide 9-2C4 a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Smal et les
fragments de restriction obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose,
1
puis transférés sur un filtre Nylon. Ces fragments ont alors été hybridés à une sonde de
tRNA totaux (plus précisément la fraction 4S enrichie en tRNA) marquée au cx-[32p]ATP
1
à l'aide de la CCAse. Les résultats de ces expériences ont montré qu'en plus du fragment
SmaI de 7,4 kb codant pour le gène de tRNAf}.·kt ( PARKS et coll., 1984) un fragment
1
de 2,7 kb s'hybride à la fraction 4S marquée au cx-r32PJATP à l'aide de la CCAse. Ce
fragment code aussi pour le gène atp'). Nous avons pensé que le gène arp9 pouvait être
proche d'un gène de tRNA.
1
Nous avons donc cloné spécifiquement le fragment SmaI de 2,7 kb dans le
vecteur M 13 rnp 19 et nous en avons établi une carte de restriction fine. Par des séries
1
d'hybridation des différents fragments de restriction du fragment de 2,7 kb avec les
tRNA totaux mitochondriaux, nous avons pu identifier un fragment BamlIl-Xhol de 1
1
kb qui s'hybride à la sonde. Ce fragment de 1 kb a été sous-cloné dans le vecteur M13
(um30 et um31) et sa séquence nucléotidique a été déterminée par la méthode de
SANGER.
1
3. ANALYSE DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU
FRAGMENT BarnHI-XhoI DE 1 kb
L'analyse de la séquence du fragment BamHI-XhoI de 1 kb
n'a révélé la
présence d'aucun gène de tRNA reconnaissable. En effet, à l'image du cas du fragment
1,25 kb XhoI du cosmide 9-1E8 (chap.lll-LA), la recherche des gènes de tRNA à l'aide
des caractéristiquesclassiques de ces gènes a été infructueuse. On ne retrouve sur ce

---

69
fragment, que le gène de l'atp9 . Nous essayerons, dans un chapitre consacré à cet effet
(chapitreIV), de savoir pourquoi des fragments de DNA mitochondrial ne contenant
aucun gène de tRNA s'hybrident à des molécules de tRNA marquées spécifiquement en
utilisant la CCAse.

---

li",
1
1
1
1
1
1
I]~
1
1
~u~[Q)~ [Q)~~ [~r~@I]©[M~ [Q)~ [Q)[N]~ !lli\\]~U'(QX~[}=D@[N][Q)~O&[L [Q)1D
[M]~~~ ©(Q)~JJ~©~lf~[Mlf [Q)~~ ~[N]~~L23GTI(Q)[N]~
1
(Ç["iJ~(Q)~©~[L~~tr1J@QlII2~
1
1
1
1
1
1

---

70
II.ETUDE DES REGIONS DU DNA MITOCHONDRIAL DU
MAIS PORTANT DES INSERTIONS CHLOROPLASTIQUES
'-c
A. ETUDE DU PLASMIDE 5.7 TB
L. PRESENTATION DU PLASMIDE
Le plasmide 5.7TB (fig.d-b) contient un fragment BamHI du DNA mitochondrial
de maïs à cytoplasme mâle stérile B37-T (FAURON et coll., 1989). Cette insertion
mesure 5,7 kb et se localise sur le cercle maître du génome T entre les posi tions 141 et
147 (FAURON et coll., 1989 ). Elle contient la totalité d'une séquence de 1,5 kb qui est
répétée trois fois dans le génome T (fïg.35). De plus, elle comporte un fragment de DNA
unique au génome T c'est à dire des séquence qui ne sont pas retrouvées dans les
génomes mitochondriaux des maïs à cytoplasme fertile (N) ni dans les autres types de
maïs à cytoplasme mâle stériles (S et C). Des études préliminaires ont montré que le
fragment BamHl de 5,7 kb s'hybride à la fraction 4S du RNA mitochondrial du maïs
extraite des mitochondries des génomes fertiles et stériles (B37-N et B37-cmsT) et
marquée avec du o:-l32p]ATP en utilisant la CCAse. Nous avons pensé que cette
hybridation pourrait être due à la présence d'un gène de tRNA sur le fragment de DNA
unique au génome T.
2. SOUS-CLONAGE ET SEQUENÇAGE DU FRAGMENT
S'HYBRIDANT AUX tRNA TOTAUX
La cartographie de restriction du fragment BamHI de 5,7 kb est montrée dans la
figure 35. L'hybridation de ces fragments de restriction avec la sonde de tRNA totaux
mitochondriaux a révélé un fragment HindIlI-XhoI de 1,7 kb . Ce fragment a été inséré
dans le vecteur M 13 et sa séquence nucléotidique a été determinée par la méthode de
Sanger.
3.ANALYSE DE LA SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU FRAGMENT
HindIII-XhoI DE 1,7 kb
La séquence nucléotidique du fragment HindIII-XhoI de 1,7 kb du plasmide
5,7TB est présentée dans la figure 36-a. L'analyse de ces séquences n'a pas permis de
révéler la présence d'un gène de tRNA mitochondrial sur le fragment. Ce cas est
comparable aux cas précédents du fragment XhoI de 1,2 kb contenant l'urf240 et du
fragment BarnHI-XhoI de 1 kb contenant le gène atpô, Nous avons néanmoins recherché
dans les banque de données des homologies avec des séquences de gènes connus. Les
résultats de ces recherches sont schématisés sur la figure 35 et montrent que le fragment
1,7 kb contient en fait une insertion d'une partie de la séquence inversée repétée du DNA
chloroplastique comportant la partie 3' de l'intron et l'exon 2 du gène de tRNAAla puis la

---

FIGURE 35: Organisation du fragment 5,7 TB
.... - - - - - - DNAcommun
.....
aux génomes N et T
~Insertion -~
chloroplastique
trn/;
23s
DNA unique au génôme T
cp
cp
1.5
10
..--1.7 k b - - .
250pb
I - - - -
1
+ - 1
+ - - - - - f 1
- - - - - - - - - t - - 1
- - - - f - -
1
+ -1- - - - 1
l
B
X s
X
H
H X
B
m~m
Séquences chloroplasiiqucs
EJ
Séquences retrouvées seulement dans le génome T
[::=J
Séquences répétées ailleurs dans le génome T
1.5:
Séquence répétée de I.5Kb
10
Séquence répétée de 10 Kb
Intron du gène tm.A chloroplastiquc
E2
Deuxième exon du gène trnA chloroplastique
B: BamHl; H: HindIII; S: Smal; X: Xhol
La séquence répétée de 1,5 kb est entièrement contenue dans celle de 10 kb mais clic est
répétée 3 fois dans le génôrnc T. La croix entre la région contenant du DNA unique au
génôme T ct
celle comportant l'insertion chloroplastique indique la zone probable de
recombinaison

---

7 1
partie S' du gène de rRNA 23S chloroplastique du maïs. Cette insertion chloroplastique
mesure environ 1,2 kb.
Ces observations nous ont conduits à nous poser certaines questions:
ex) L'hybridation observée est-elle due à la présence de l'exon 2 du gène
de tRNAAla chloroplastique ?
Avant de répondre à cette question, il faut rappeler que les tRNA
mitochondriaux (ou la fraction 4S) utilisés dans nos expériences sont exempts de
conta minants chloroplastiques (cf.chapitrell-I). Par conséquent, admettre que
l'hybridation sur le fragment est liée à l'exon 2 du gène de tRNAAb chlorop lastique
suppose que ce dernier est transcrit dans la mitochondrie. Dans la mesure où le gène
complet (les deux exons et l'intron entier) n'existe pas de manière continue dans le
génome mitochondrial, cette hypothèse est peu probable (sauf si on suppose un
phénomène de rrans-splicing dans mitochondrie impliquant d'une part cet exon et d'autre
part, l'exon 1 du gène de tRNAAla présent dans l'insertion chloroplastiq ue de l Zkb
situés à environ 250 kb l'un de l'autre). Néanmoins, pour plus d'assurance, nous avons
tenté de voir si dans nos conditions expérimentales d'hybridation (65:JC ; lM NaCI ; 1%
SDS) il est possible d'obtenir une hybridation entre l'exon 2 du gène de tRNAAla et le
tRNA chloroplastique correspondant. Nous avons ainsi hybridé les fragments de
digestion du plasmide S.7TB avec les tRNA chloroplastiques totaux du maïs marqués.
Comme témoin, nous avons utilisé le fragment de DNA codant pour le gène de
tRNAmMcl mitochondrial (cosmide 8-3B2) qui a 95% d'homologie avec son équivalent
chloroplastique. Les résultats de ces hybridations ont montré qu'aucune hybridation n'est
observée sur les fragments comportant l'ex on 2 du tRNAAla chloroplastique alors que les
fragments comportant le tRNAmMcl mitochondrial s'hybrident. L'interprétation de ces
résultats est simple: il n'y a pas de tRNAAla chloroplastique dans la mitochondrie du
maïs et même s'il y en avait, ce tRNA ne pourrait pas s'hybrider au fragment 1,7 kb dans
nos conditions d'hybridation. Par conséquent, l'hybridation observée sur le fragment 1,7
kb n'est pas due à la présence, sur ce fragment, de l'exon 2 du gène de tRNAAla.
{3) L'hybridation est-elle liée à la présence de séquences chloroplastiques
ou à la présence des gènes de rRNA ?
Pour répondre à cette question, nous avons pensé qu'il fallait élargir les
hybridations de la fraction 4S du RNA mitochondrial à l'ensemble des génomes
mitochondriaux B37-N et B37-cmsT. Nous avons donc utilisé des filtres comportant des
cosmides (digérés par BarnHI) représentatifs des génomes entiers des mitochondries des
maïs à cytoplasme fertile (B37-N) et à cytoplasme stérile (B37-cmsT). Ces "filtres ont été

---

FIGURE 36-a : Séquence nucléotidique du fragment Hindl ll-Xhol
de 1,7 kb du plasmide S. 7TB
CTCGAGCCCAGATATCGATTTACCATGGATGTCCGAAACGGGAAACAAGAAAAGTAATAGAAATCGTGTG
CCAGCGGGAGATACGAAATTCACTGGCAGACCGA~TTGGGCGCAGGTGCCAGATCCTCAAAGTATCGTAA
AGTTAAGTTAAGTATCGTAAAGTATCGATCAGCCTAGTGTACCAACCACGTGGTACGACGGGCACTCAAA
GACCTGGCGAATGAGGGCCCACCCAAGAGCGCTTATGTCATATGGGAACTCTTGGCTGGAAACAATCCTT
ATGGTTTTTATACCGGTTAGAATAATAAGAAAGAATCAAAGTCCAGGTTGGTTGGTGAGCCTAGTGATAG
GAGACTATCTkGCTTGGTTCGGAGAGCACTTGTTGGGTTTAGATTAGTTTTGCAAP.TGTTACGGCCTAAA
TGCTGAACTATTGACCCTACTTGTTCGGATGGGTGTTCACCCCAAAGTGTTCCCGGACTGCATGCATACA
TCCGTAAGTAACTTAGTGCAACATGGCAAATTTCATTGAGAGGAATCAGCAAAGAA~~Î-~~~TçrTçrçç
""'1
GG~TGnCTGG~TCGCCCCGG~~CCACAAGAATCCTTAGAATCCCATTCCAACTCAGCACCTTTTGTTTTG
GGATTTTGAGAAGAGTTGCTCTTTGGAGAGCACAGTACGATGPAAGTTGTAAGCTGTGTTAGGGGGGGAG
TTATTGCCTATCGTTGTCCTCTATGGTAGAACCCGTCGGGGAGGCCTGAGAGGCGGTGGTTTACCCTGTG
GCGGATGTCAGCGGTTCGAGTCCGCTTATCTCCAGCCCGTGAACTTAGCGGATACTATGATAGCACCGAA
GTTGCCAATTCGTCAGTTCGATCTATGATTTCGCATTCATGGACGTTGATAAGATCCTTCCATTTAGTAG
CACCTTAGGATGGCATAGCTTAACGTTAATGGCGAGGTTC~~GAGGAAAGGCTTGCGGTGGATACCTA
GGCACCCAGAGACGAGGAAGGGCGTAGCAAGCGACGAAATGCTTCGGGGAGTTGAAAATAAGCATAGATC
CGGAGATTCCCAAATAGGTCAACCTTTTGAACTGCCTGCTGAATCCATGAGCAGGCAAGAGACAACCTGG
CGAACTGAAACATCTTAGTAGCCAGAGGAAAAGAAAGCAAAAGCGATTCCGTACCGTACGTAGTAGCGGC
GAGCGAAATGGGAGCAGCCTAAACCGTGAAAACGGGTTGTGGGAGCAATACAAGCGTTGTGCTGCTAGCA
AGCGGTTGAGTGCCGCACCCTAGATGGCTAAAGTCCAGTAGCCGAAAGCATCACTACGTTACGCTCTGAC
CCGAGTAGCATGGGGCACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCAAGGAAAGGACCACCTTGCAP.GGCTAAATA
CTCCTGGGTGACCGATAGCGAAGTAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGAACCCCCAGTGGGTAGTGAAA
TAGAACGTGAAACCGTGCTGAGCTCCGCGGAGGGGAAGTGATCTCTGACCGCGTGCCTGTTGAAGAATGA
GCCGGCGAGTGATAGGCAGTGGCTTGGTTAAGGGAATGGAACCCACCGGAGCCGTAGCGAAAGCGAGTCT
TCATAGGGCGATTGTCACTGCTTATGGACCCGAACCTGGGTGATCTATCCATGACCAGGATGAAGCTT
FIGURE 36-b: Séquence nucléotidique de l'extrémité de l'insertion
chloroplastique de 12kb comportant l'intron du gène trnA cp
trnA
GGATCCCTGGGGAATAGGATCAAGTTGGCCCTTGCGAATAGCTTGATGCACTATCTCCCTTCAACCCTTT
GAGCGAATGTGGCAAAAGGAAGGAAAATCCATGGACCGACCCCATTGTCTCCACCCCGTAGGAACTACGA
GATCACCCCAAGGACGCCTTCGGCGTCCAGGGGTCACGGACCGACCAT.GATTCCTCTTCAATAAGTGGA
.
.
.
ACACATTAGCCGTCCGCTCTCCGGTGGGCAGTAAGGGTCGGAGAATGGCAATCACTCGTTCTTAAAACCA
ATCTAAGTAGTAGATTGCTTCCC
Les séquences homologues aux séquences chloroplastiqucs sont encadrées ct les séquences alignées sur la figure
39 sont soulignées en gras.

---

72
hybridés avec la fraction 4S du RNA mitochondrial marquée au a-[32PJATP à l'aide de
la CCAse. Deux types de résultas ont été obtenus:
-Si on élue d'une colonne RPC-5 la fraction 4S marquée à la CCAse à une ~
force ionique comprise entre O.7M NaCl et 1 M NaCl, on obtient le profil d'hybridation
déja étudié dans le chapitre II-I (fig.6-a et fig.6-b). Toutes les hybridations observées
correspondent à des fragments de DNA comportant des gènes de tRNA et ces fragments
ont été étudiés dans les chapitres précédents (chapitre II)
-Si on élue la fraction 4S marquée à une concentration saline supérieure à
1M NaCl, on obtient le profil d'hybridation montré sur la figure 37.
En comparant les deux profils d'hybridation obtenus, on note la présence de
plusieurs bandes additionnelles sur les filtres hybridés avec la fraction 4S marquée et
éluée à une concentration saline supérieure à 1M NaCI. On peut classer ces bandes
additionnelles en deux catégories. Certaines bandes présentent des signaux d'hybridation
très forts, suggérant que les RNA correspondants sont soit très abondants dans la
mitochondrie, soit des substrats privilégiés pour la CCAse. D'autres bandes
additionnelles ont des signaux d'hybridation beaucoup plus faibles. La nature des RNA
correspondant à ces derniers signaux sera discutée plus tard (ChapitreV).
En utilisant la cartographie de restriction des deux génomes N et T et en se
servant de la localisation des différents gènes connus, nous avons pu établir que toutes
les bandes de forte intensité correspondaient à des régions comportant des gènes de
rRNA. Dans le génome N, l'hybridation révèle les fragments suivants:
- le fragment BamHI de 5,2 kb du cosmide N7D4 (piste N°4) correspond à
la région du génome T que nous avons étudié c'est-à-dire au fragment 5,7TB. Comme ce
dernier, il s'hybride à la fraction 4S et contient la partie 5' du gène du rRNA 23S
chloroplastique.
- le fragment de 3,2 kb du cosmide N8D 1 1 (piste N° 13) comporte le gène
du rRN A 16S chloroplastique. Il fait partie de l'insertion des 12 kb chloroplastiq ue
(STE~1\\J et LONSDALE, 1984) dans le génome mitochondrial.
- le fragment à environ 14 kb du cosmide N5F6 (piste N°15) comporte le
gène du rRNA 26S mitochondrial (DALE et coll., 1984)
- le fragment à environ 16 kb du cosmide N8B1 (piste N°16) contient les
gènes des rRNA 55 (CHAO et coll., 1983) et rRNA 18S (CHAO et coll., 1984)
mitochondriaux.
- le fragment de 5,5 kb du cosmide N7E8 (piste N°18) comporte la partie 3'
du rRNA 235 chloroplastique. La séquence nucléotidique de la région comportant cette
insertion chloroplastique a été récemment établie par FEJE5 et coll. (1988).
Tous les fragments détectés dans le génome N ont leur éq uivalent dans le
génome T à l'exception du fragment BamHI de 3,2 kb contenant le gène de rRNA 165

---

a)
kb
;"'!..
16
1 4
5.5
5.2
3.2
.. '.'..
.. ."
•!
Q
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
b)
kb
-~.- ............... - - - - - -
.....
18
....:
16
-
5.7 5. 5
•-~ •
5.2
3
'-.
2
':. -
•
,;.
..
~
_.
•
•
FIGURE 37:
Hybridation des fragments BamHI : a) de cosmides représentatifs
du DNA mitochondrial du mals de la variété B37-N; b) de cosmides
représentatifs du DNA mitochondrial du maïs de la variété B37 -crns'T,
avec la fraction 45 totale marquée au a_[32p]ATP à l'aide de la CCAse

---

73
chloroplastique. En fait, l'insertion chloroplastique de 12 kb présente dans le génome
mitochondria1 du maïs fertile, a perdu environ 9 kb par une délétion intervenue lors du
passage du génome N au génome T (FAURON et coll., 1989; Cf cartes respectives N et
T ). Le fragment de 3,2 kb fait partie de ces 9 kb perdus.
A l'issus de ces analyses, il ressort que les fortes hybridations que nous
avons obtenues avec la fraction 4S du RNA mitochondrial du maïs sont beaucoup plus
liées à la présence de gènes de rRNA qu'à la présence de séquences d'insertion
chloroplastique. En effet, les autres fragments BamHI contenant des séquences
chloroplastiques ou des séquences homologues à des gènes chloroplastiques ne sont pas
systématiquement révélés lors de nos expériences d'hybridation. Par contre, tous les
fragments qui montrent des signaux d'hybridation très forts comportent des gènes de
rRNA. Ces observations posent des questions auxquelles nous tenterons de répondre
dans le Chapitre/II.II.B.
B. LE GENOME MITOCHONDRIAL DES VARIETES NORMALES
CONTIENT LA QUASI TOTALITE DE LA SEQUENCE REPETEE
DU DNA CHLOROPLASTIQUE DU MAIS
Les observations et les analyses faites précédemment ont montré que le
DNA mitochondrial contient plusieurs insertions d'origine chloroplastique. Pour notre
part, nous avons établi la séquence nucléotidique d'une région du DNA mitochondrial
comportant la partie 5' du gène du rRNA 23S, l'exon 2 et une partie de l'intron du
tRN ,D,AJa chloroplastique. Cette région se situe, dans la séquence du
DNA
. chloroplastique, entre d'une part, la région séquencée par FElES et coll. (1989)
comportant la partie 3' du gène du rRNA 23S, les gènes codant pour le rRNA 55, le
rRNA 4.5S
et le tRNAArg ( gène incomplet dans la mitochondrie)
et d'autre part
l'insertion chloroplastique de 12 kb. Autrement dit, on retrouve presque toute la séquence
répétée inversée du DNA chloroplastique dans la mitochondrie du maïs. A ces régions,
on peut ajouter les deux gènes de tRNAAsn (GUU) (ChapitreII-B) et de tRNAHis (IAMS
et coll., 1985 ) qui sont situés chacun à
une extrémité de la séquence répétée
chloroplastique. L'ensemble de ces régions et leur localisation dans les génomes
mitochondriaux N sont montrés sur la figure 38. Tout se présente comme si la séquence
répétée avait été transférée en une seule fois dans le DNA mitochondrial du maïs mâle
fertile. Cette insertion aurait été suivie d'une redistribution des blocs de séquences
chloroplastiques probablement à travers des recombinaisons et/ou des insertions de DNA
mitochondrial. Il est possible d'imaginer ce scénario car on cannait maintenant plusieurs
exemples de remaniements qui sont intervenus dans la mitochondrie du maïs:

---

FIGlKi::- 38: Schéma montrant la redistribution des séquences
chloroplastiques inserées dans le DNA mitochondrial
des souches fertiles de maïs.
ri
(2J
Sécuerices 51 et 52
1
Gè:::,w: connus (cf introduction)
D Sécuemces chloroplastiques insérées
~ Sé~nces répétées
Les séquences chloroplastiques d'origine sont réprésentées au centre et l'orientation de la
séquence ~tée chloroplastique est indiquée par la flèche. Les séquences d'origines ainsi
que leur locaiiisation sur le cercle-maître du génome mitochondrial B37-N sont montrées.

---

74
(a) lors du passage d'un type de cytoplasme à un autre (N vers T par
exemple; voir FA VRON et coll., 1989),
(b) lors de la réversion descytoplasmes stériles vers la fertilité (SMALL et
coll., 1988 ; FAURON et coll., 1987)
(c) entre différentes souches de maïs et un ancêtre du maïs appelé Téosinte
(SMALL et coll., 1987).
Ce type de réarrangement a aussi été remarqué lors de la culture de
protoplastes de diverses lignées de blé (RODE et coll., 1987). Cette hypothèse est, de
plus, supportée par le fait que le maïs à cytoplasme stérile T a perdu 9 kb des 12 kb
d'insertion chloroplastique à travers des recombinaisons intramoléculaires (FAURON et
coll., 1989) montrant le caractère recornbinogène de ces séquences chloroplastiques
étrangères. Plusieurs insertions et/ou recombinaisons ont certainement été nécessaires
pour aboutir à l'organisation actuelle de CèS séquences chloroplastiques dans la
mitochondrie. Nous ne sommes pas en mesure de définir la chronologie de ces
événements mais on peut supposer que les premières pressions de sélection qu'ont subies
ces séquences étrangères ont-opéré essentiellement aux extrémités de la séquence répétée.
Cela peut être remarqué par l'analyse des parties flanquantes des gènes de tRNA
(tRNAAsn et tRNAHis) qui sont localisés an extrémités de la séquence répétée
chloroplastique. Ces derniers, (qui ont fini p.?! ètre fonctionnels dans la mitochondrie),
ont conservé leur environnement immédiat mzis ne se trouvent pas dans un grand
ensemble d'insertion chloroplastique.
Restent cependant les questions suivantes dont les réponses sont par ailleurs
liées:
- y a -t-il eu vraiment un seul évécernent ayant entraîné le transfert de la
séquence répétée chloroplastique ?
- Si c'est le cas, y a-t-il eu un OL; plusieurs événements ayant entraîné la
redistribution des séquences chloroplastiques dans le génome mitochondrial ?
En fait, deux possibilités existent ;Jour rendre compte de la présence de
toute la séquence répétée chloroplastique :
- Soit, comme nous le supposons, il y a eu un seul transfert et par
conséquent, les différentes parties de la séquence répétée chloroplastique retrouvées dans
la mitochondrie doivent pouvoir se juxtaposer linéairement.
- Soit, il y a eu plusieurs transferts et on devrait retrouver les différentes
parties de la répétition avec des séquences manquantes et/ou des chevauchements entre
les différentes parties.
Il est très difficile en effet d'irnag.ner que le transfe:t se soit produit en
plusieurs étapes et qu'en fin de compte, tous les éléments transférés puissent être
ordonnés bout à bout de manière à reconstruire toute la séquence répétée.

---

75
Exemple de l'intron du gène de tRNAA.la-chlo[oplastique
Pour essayer de vérifier, à un niveau plus fin, l'hypothèse du transfert
unique, nous avons entrepris de voir si on pouvait aligner bout à bout les séquences de
l'intron du gène de tRNAAla chloroplastique inséré dans la mitochondrie. Pour ce faire,
nous avons cloné le fragment BarnHI de 1,5 kb du DNA mitochondrial B37-N contenant
la fin de l'insertion de 12 kb chloroplastique (qui contient une partie de I'inrron du gène
de tRNAAla). Nous avons déterminé la séquence nucléotidique de la région où s'arrête
l'homologie entre la séquence chloroplastique insérée et la séquence d'origine (fig.36-b).
Par la suite, nous avons aligné ces séquences avec d'une part, le gène chloroplastique
complet de tRNAAla et d'autre part avec la séquence du fragment HindII-XhoI de 1,7 kb
du plasmide 5,7 TB. Les résultats de ces comparaisons sont montrées sur la figure 39 et
indiquent qu'il y a une continuité entre les deux séquences insérées par rapport au gène
d'origine.
Seulement 17 pb semblent avoir été perdus lors des recombinaisons
successives ayant entraîné d'une part la séparation des deux exons du gène et d'autre
part l'intégration du fragment de DNA spécifique au génome T. Cependant les
substitutions de bases sont relativement fréquentes sur 100 pb autour de la région de
recom binaison.
12kb
CGGGCGGAAAAAGGGG TATCCTcnc--
1ntron trnAcp
CGGGCGGAAAAAGGGG GAGCTCCCCGnCCT
nCTCCTGTAGCTGGAnCCCCGGAA--
**
•••
1,7kb
CTCCGGG -CTGGTCGCCCCGGAA---
FIGURE 39:
Comparaison des extrémités des insertions chloroplastiques
contenant l'intron du gène trnA chloroplastique avec la
séquence du gène d'origine
12kb: Extrémité de l'insertion chloroplastique de 12 kb. 1,7 kb: Séquence du fragment
HindI1I-XhoI de 1,7 kb au niveau de l'insertion chloroplastique. Ces séquences sont extraites
de celles
montrées sur la figure 36. Les 17 nucléotides délétés lors des recombinaisons sont encadrés. L'étoile montre
les nucléotides substitués.
Ainsi, il apparaît que la coupure du gène de tRNAAla s'est produite dans la
mitochondrie après le transfert du gène entier. Le site de coupure situé dans l'intron
semble justement très actif dans la mitochondrie car c'est au niveau de la même séquence
que l'insertion du DNA spécifique au génome T s'est prodüite.

---

CHlAPffTRE ÜV
QUELQUES ANALYSES SUR] LES NYS/AP[ c~=ONS
([JE RNA MARQUES A L~ff!DE DE LA CCt~~~-;- ~ VEC
Dtt:S F[RlAGMENTS!DE !DNA NE C()MP01~Tc_.=PAS
DE GENE !DIE ~RNA

---

76
Dans les chapitres précédents, nous avons étudié trois fragments de DNA
1
rnitochondrial qui sont situés à de très grandes distances les uns des autres sur le cercle
maître, mais qui partagent néanmoins un certain nombre de caractéristiques. 11 s'agit des
1
fragments de:
1,25 kb Xho1 (Cosrnide 9-1 E8 ) qu'on nommera A, (chap.Ilf.LA)
1
1 kb BamHI-XhoI (Cosrnide 9-2C4) appelé fragment B (chap.Ilf.LB) et,
1,7 kb HindIII-XhoI (plasmide 5.7 TB: chap.Ilf.ILA).
1
Ces fragments ont en commun les caractéristiques suivantes:
1°) Ils s'hybrident tous à la fraction 45 extraite de la mitochondrie du maïs et
marquée au a-[32PJATP à l'aide de CCAse.
1
2°) Aucun de ces fragments ne contient un gène de tRNA mitochondrial
identifiable.
1
3°) ils comportent, par contre, soit un gène ccx:iant pour une protéine, soit un gène
codant pour un rRNA.
1
Ces observations sont assez troublantes car elles mettent en cause la spécificité du
marquage des tRNA avec la CCAse. En fait, plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces
1
"hybridations aspécifiques":
- la fraction enzymatique que nous avons utilisée contient une autre activité (RNA
1
ligase, RNA polymérase...) qui permettrait la fixation d'un (des) ribonucléotide(s) sur les
RNA,
- les tRNA marqués s'hybrident à des séquences homologues contenues dans les
1
gènes des rRNA et/ou des protéines,
-
nous ne disposons pas d'informations suffisantes pouvant nous permettre
1
d'identifier certains gènes de tRNA (présence dintrons séparant des régions non
reconnaissables, pseudogènes ou tRNA bizarres, n'ayant pas les caractéristiques
1
classiques, notamment au niveau de la boucle 'P).
- la CCAse de levure n'est pas assez spécifique pour discriminer les tRNA
1
mitochondriaux parmi d'autres molécules de RNA dans des conditions de réaction
hétérologue et in vitro,
- la CCAse marque spécifiquement les tRNA mais est aussi impliquée dans
1
d'autres mécanismes de maturation des RNA mitochondriaux.
Nous avons tenté de répondre à certaines des' questions posées:
1
1
1
1

---

1
1
,-
0)
-0)
(lJ
;.:::
fli
-L::
S2
:J
O-LQ
C
C
0
a
a CL
0:
u
u
~
rd
~
~
:J
1..L
1..L
(f)
tRNA
•
FIGURE 40 : Analyse par électrophorèse monodirnensionnelle sur gel
de polyacrylamide de la fraction 45 marquée au Œ- (32 P) ATP à l'aide de la CCAse
Les RNA contenus dans la fraction 4s ont été marqués a l'aide de la CCAse. Une partie a été
directement déposée sur le gel et une autre a été purifiée sur une colonne RPC-S avant d'être
déposée. Le résultat d'électrophorèse a été exposé pendant deux jours au contact d'un film
de grande sensibilité.

---

77
1) L'EXTRAIT ENZYMATIQUE UTILISE DANS NOS REACTIONS
POSSEDE-T-IL UNE AUTRE ACTIVITE?
Nous avons pensé que la fraction enzymatique utilisée dans nos réactions pouvait
contenir d'autres enzymes qui seraient à l'origine de marquages non spécifiques d'autres
petits RNA. Cependant, nous ne sommes jamais arrivé à marquer la fraction 45 ni avec
du [32p] pCp, ni du a:.-[32p] GTP en utilisant l'extrait enzymatique contenant la CCAse.
Cela montre que cette fraction ne contient ni RNA-ligase, ni RNA polymérase-DNA
indépendante. Par ailleurs, nous n'avons jamais remarqué de différence, dans les
expériences d'hybridation, effectuées avec des tRNA marqués au a-[32p] CTP (avec
l'ATP froid) et avec ceux marqués au o:-[32pJATP (avecdu CTP froid) en utilisant le
même extrait de CCAse. Cela montre que le marquage obtenu n'est pas lié à la présence
1
d'une polyA polymérase incorporant spécifiquement de l'ATP.
L'ensemble de ces observations nous ont conduit à admettre que la préparation de CCAse
1
ne contenait pas d'autres activités enzymatiques susceptibles de provoquer des
marquages aspécifiques. Par conséquent, il est probable que les molécules de RNA qui
1
s'hybrident aux fragments de DNA cités plus haut, aient été effectivement marquées par
la CCAse.
1
2) LES MOLECULES MARQUEES SONT-ELLES DES tRNA ?
1
Le problème qui s'est posé à propos de ces marquages était de savoir si les
hybridations observées étaient liées à la présence ou non de gènes de tRNA. Il est donc
important de savoir si les molécules marquées par la CCAse sont exclusivement des
1
tRNA.
1
a) Analyse de la fraction 45 marquée au ex -[.31P1ATP à l'aide de la CCAse
Si l'on surexpose la fraction 4S extraite de la mitochondrie du maïs et marquée
1
à la CCAse et séparée sur gel de polyacrylamide monodimensionnelle, on observe le
profil montré sur la figure 40. L'analyse de ce profil montre que plusieurs molécules de
1
RNA (plus grandes que les tRNA) sont aussi marquées. Ces marquages sont très faibles
mais leur intensité concorde
avec les signaux observés lors des hybridations de la
fraction 45 avec les fragments A et B. Ces "grands" RNA marqués ne sont pas présents
1
dans la fraction 45 purifiée sur une colonne RPC-S (figAO).
b) Analyse des régions de DNA s'hybridant à la fraction 45
1
DansIe chapitrelli-ll; nous avons montré que certaineshybridations étaient
liées à la présence de séquences codant pour des rRNA. Dans ce paragraphe, nous nous
1
sommes focalisés sur les deux fragments codant pour des gènes de protéines (A et B).
L'intensité d'hybridation des RNA marquées à la CCAse avec ces fragments est très
1
faible. Plusieurs questions se posent:
1
1

---

5'
or(240
3'
J
1
h
l's s s S S S S s S \\ } S S S S s S S \\ S S S S S S SI
!!PI
mm
Fragment A
l '
1
I l
X
St
89
Ba
x
1
h
3'
atp9
5'
DR
lliI
111111111111111111
1
1
1
Fragment B
B
85
X
FIGURE 41 : Carte de restriction des fragments A et B
B: BamHI; Ba: Banl: Bg: BglU; Bs: Bsù\\TJ; Hd: HindlI; St: StuI; X: XhoI
Les boites noires nommées h, i el j réprésentent les séquences homologues
entre les fragments A ct B.
r- A ----r- B --1
r- A - rB --1
pb' r-==-'=-==-===--,
1100
930
570
470
340
200
a)
b)
FIGURE 42:
Analyse des fragments A et B:
a)
Electrophorèse sur gel d'agarose 1.8% des
fragments de restriction des fragments A et B
b)
Hybridation des fragments de restriction avec
une sonde de tRNA mitochondriaux totaux marquée
au (J.- [32p]ATP à l'aide de la CCAse

---

1
1
78
1
ex) Y a-t-il des séquences communes entre les fragments A et B comportant
les gènes atp') et urf240 ?
On peut 'r·enser que l'hybridation, observée sur les régions codant pour des
1
gènes de protéines est due aux mêmes RNA qui reconnaitraient alors une séquence
commune. Nous avons donc comparé les séquences nucléotidiques des deux fragments
1
A et B en utilisant le programme d'analyse de séquences WORDSEARCH (UWGCG).
Ces recherches ont révélé la présence de certaines homologies qui sont représentées sur la
1
figure 41. Aucune des séquences homologues ne se localise dans les parties codantes des
gènes atp9 et urf240.
f3) L'hybridation est-elle liée QIU séquences communes?
1
Dans le but de mettre en évidence les parties de ces clones qui s'hybrident,
les fragments A et B ont été purifiés et analysés par restriction. Les fragments de
1
restriction ont ensuite été séparés sur gel d'agarose avant d'être transferés sur un filtre
Nylon. Ce filtre a été hybridé avec la fraction 45 marquée au a-[32p]ATP à l'aide de la
1
CCAse. Les résultats de ces hybridations sont montrés sur la figure 42
L'analyse de ces hybridations montre que dans les deux cas (A et B), les
hybridations sont confinées dans la partie codante des gènes. Par conséquent, elles ne
sont pas liées aux séquences communes aux deux fragments comportant les gènes atp9 et
urf240 puisque ces séquences sont localisées en dehors des parties codantes.
c) Hybridation des fragments A et B avec la fraction 4S
Dans le but de savoir si les hybridations obtenues sur les fragments A et B sont
dues à des molécules de RNA différentes des tRNA mais contenues dans la fraction 4s
du RNA mitochondrial du maïs, nous avons fait l'expérience suivante:
La fraction 45 du RNA mitochondr.ial a été fractionnée par électrophorèse
monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide et transféré sur filtre nylon (chapitrel).
Ce filtre a ensuite été hybridé avec des sondes radioactives constituées par les fragments
A et B purifiés. Le résultat de ces hybridations est montrés sur la figure 43. Les profils
d'hybridation obtenus montrent que pour le fragment B, il
y a principalement une
molécule de RNA d'environ 150 nucléotides qui s'hybride. Cette molécule est beaucoup
plus grande que les tRNA et semble relativement abondante. Pour ce qui concerne le
fragment A, plusieurs molécules sont mis en évidence mais elles sont toutes plus grandes
que les tRNA. La taille des molécules révélées est compatibles avec les "grands RNA" de
la fraction 45 qui sont marqués parla CCAse.

---

A
B
Cf)
<Il
"D
0
-œ
U::Jc
..
150
80
+
..
tRNA
•
.:
1
.... 1
a
b
c
FIGURE 43: Hybridation des fragments A et B avec la fraction 4s
du RNA mitochondrial:
a):
Electrophorèse monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide 15%
en condition dénaturantes de la fraction 4s.
Les bandes de tRNA sont révélées par incubation du gel dans un
tampon contenant du Bromure d'éthidium.
b)
Hybridation du fragment A avec la fraction 4s
c)
Hybridation du fragment B avec la fraction 4s

---

1
79
1
3)
DISCUSSIONS
1
En résumant les expériences et les observations décrites plus haut, il apparait que
la CCAse est susceptible de marquer d'autres molécules de RNA de la fraction 4S
1
mitochondriale du maïs, différentes des tRNA. Ceci est confirmé par le fait qu'il est
possible de séparer sélectivement les tRNA de ces molécules par fractionnement sur une
colonne hydrophobe RPC-5. Il faut cependant remarquer qu'aucune de ces molécules de
1
RNA n'est fortement marquée par la CCAse. Cela contraste avec la forte hybridation
obtenue pour les régions qui comportent des gènes de rRNA. Les molécules de RNA qui
1
s'hybrident aux gènes de rRNA ont très certainement le même comportement
électrophorétique que les tRNA mais elles sont probablement plus hydrophobes que ces
1
derniers car elles ne s'éluent pas à 1 M NaCI.
L'objectif de cette étude, c'est de montrer que toutes les hybridations obtenues en
utilisant une sonde constituée par la faction 4S marqués à la CCAse ne correspondent pas
1
forcément à des régions de DNA comportant des gènes de tRNA. Puisque toutes les
hybridations que l'on obtient en utilisant les tRNA totaux purifiés sur une colonne RPC-5
1
correspondent à des régions comportant des gènes de tRNA, pour l'étude de
l'organisation des gènes de tRNA mitochondriaux nous n'avons tenu compte que des
1
fragments de DNA qui s'hybrident dans ces conditions .
. En ce qui concerne les hybridations non-spécifiques, on peut penser qu'il s'agit
1
de pseudo-gènes de tRNA ou de gènes de tRNA comportant des introns. Cependant,
comme nous l'avons démontré dans le cas du gène de tRNAAla chloroplastique, dans nos
conditions d'hybridation (65°C, 1 M NaCl, 1% SDS), il est impossible de détecter une
hybridation avec la moitié d'un gène de tRNA. Aucun exon ne peut donc être détecté
dans des conditions d'hybridation aussi stringentes. Par conséquent, ces hybridations ne
sont pas liées à la présence de pseudo-gènes ou de gènes morcelés. Reste alors la
possibilité qu'il puisse y avoir des gènes codant pour des tRNA bizarres. Sans l'exclure,
nous n'avons aucune donnée permettant de supposer cette possibilité. Seule, l'analyse
complète des tRNA mitochondriaux peut confirmer ou infirmer cette possibilité.
De même, il est difficile de concevoir que les hybridations observées soient dues
au fait que des tRNA mitochondriaux reconnaissent des séquences contenues dans les
gènes de rRNA par exemple. Même si on admet la théorie de BLOCH (BLOCH et
coll.,1983; BLOCH et coll., 1985) suivant laquelle les tRNA et les rRNA auraient une
origine commune et par conséquent partageraient plusieurs séquences communes, on ne
peut pas expliquer pourquoi les tRNA élués de la colonne RPC-5 à 1 M NaCI ne
s'hybrident pas aux gènes de rRNA. Nous pensons plutôt que ce sont, dans ce cas-là,
soit des produits de dégradation des rRNA qui sont marqués par la CCAse soit des
molécules de RNA dont la structure est proche de celle des tRNA mais qui sont plus
hydrophobes que ces derniers. Ces molécules auraient aussi des homologies de séquence

---

80
avec les rRNA. On se rapprocherait du cas observé dans le RNA du virus de la mosaïque
jaune du navet (TYMV) décrit par HAENNI et coll. (1982) qui est en effet, capable
d'incorporer le CTP et l'ATP en présence de la CCAse. Cependant, il semble que les
situations soient différentes car le fait que les RNA marqués à la CCAse puissent
s'hybrider indifféremment à tous les gènes de rRNA (mitochondriaux et
chloroplastiques) implique qu'il y a plusieurs molécules de RNA différentes qui sont
concernées. En effet, le contraire supposerait qu'il y ait des homologies de séquences
entre les rRNA 23S/ 26S avec les rRNA 16S/ l8S ou SS/ 4,SS ce qui n'a jamais été
rapporté. Par ailleurs, on observe des hybridations avec des gènes qui n'ont aucune
homologie de séquence. Ceci renforce l'idée suivant laquelle plusieurs molécules de
RNA différentes sont concernées par le phénomène.
A partir de ces informations, on peut émettre l'hypothèse selon laquelle, la CCAse
marque les tRNA de manière très spécifique, mais est peut-être aussi impliquée dans
d'autres processus biologiques propres à la mitochondrie. L'enzyme que nous avons
utilisée est extraite de la levure et plusieurs exemples d'enzymes polyfonctionnels codés
par le noyau et actifs dans la mitochondrie de la levure ont été décrits (LABOUESSE et
coll., 1987). Il ne serait donc pas étonnant que la CCAse puisse avoir d'autres rôles dans
le cas de la mitochondrie végétale notamment, même s'ils sont mineurs.

---

1:;~
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
CONCfLUSffONS GENERAfLES SUR fLES GENrE'S DE
~RNA MffTOCHO!NJfDRffAUJ;( DU ff0AJJJDtS
1
1
1
1
1

---

8 1
1. ORIGINES DES GENES MITOCHONDRIAUX
Du point de vue évolutif, le degré de parenté entre différents organismes ou entre
des gènes homologues provenant de diverses espèces, s'évalue généralement à l'aide de
't la distance génétique qui est une valeur calculée à partir de différents paramètres
génétiques. Une des composantes essentielles de la distance génétique est la similarité
entre les gènes étudiés. Dans le cas des gènes de tRNA, cette similarité est évaluée à
travers le pourcentage d'homologie qui est lui même déterminé en faisant le rapport entre
le nombre de nucléotides conservés (entre différents gènes homologues) et le nombre de
nucléotides que comptent ces gènes. Le résumé des différentes homologies trouvées entre
les gènes de tRNA mitochondriaux du maïs et les gènes de tRNA bactériens et
eucaryotiques (nucléaires, mitochondriaux et chloroplastiques) est représenté sur le
Tableau G. L'analyse de ce tableau révèle deux caractéristiques:
1°) Si on compare les gènes de tRNA mitochondriaux du maïs aux tRNA
correspondants des autres organismes, on constate qu'ils sont en moyenne plus proches
des tRNA chloroplastiques (homologie supérieure à 75%) et bactériens (environ 75%)
qu'ils ne le sont des tRNA nucléaires (environ 60%) et des tRNA des mitochondries
d'animaux, d'algues et des champignons (homologie généralement inférieure à 50%).
Les gènes de tRNA de la mitochondrie du mars ont donc une nature procaryotique.
2°) Ces gènes mitochondriaux peuvent être classés en deux grands groupes:
a) Les gènes mitochondriaux très homologues à leurs équivalents
chloroplastiques: (entre 9S et 100%)
Il s'agit en l'occurrence des gènes de tRNAAsn, tRNAPhe, tRNAmMcl_2,
tRNAHis, tRNACys et tRNA Trp. A la suite des différentes analyses effectuées sur ces
gènes (voir chapitre II), il est clair que ce sont en fait des gènes chloroplastiques qui ont
été insérés dans le DNA mitochondrial et qui ont évolué pour être fonctionnels dans la
mi tochondrie.
b) les gènes mitochondriaux moyennement homologues à leur équivalents
chloroplastiques: (entre 6S et 75%)
Dans ce groupe, on retrouve la majorité des gènes de tRNA rnitochondriaux à
savoir les gènes de tRNAAsp, tRNAGln, tRNAGlu, tRNALys, tRNAfMet, tRNAPro,
tRNASer(UGA), tRNASer(GCU) et de tRNATyr. Ces gènes sont dans l'ensemble plus
proches des gènes bactériens que des gènes chloroplastiques.
Une seule exception à cette classification: le gène de tRNAmMeLl qui est très
éloigné des gènes chloroplastiques et des gènes bactériens «50%). Ce gène pourrait
constituer une troisième classe de gènes de tRNA mitochondriaux.
En se basant sur les homologies et sur la classification précédente, on peut
soutenir l'hypothèse suivant laquelle les gènes de tRNA mitochondriaux de plantes
supérieures dérivent d'une part d'ancêtres procaryotiques et d'autre part de gènes

---

TABLEAU G
Homologies de .séquences entre les gènes de tRNA mitochondriaux
du maïs et leurs homologues d'autres organismes procaryotiques
et eucaryotiques
Gènes
Gènes
Gènes
Autres gènes
Gènes d'
mt Maïs
nucléaires
cp
mt
eubactéries
Animaux
algues
champignons
Asp
50.7
72
<SA
"
55
71
Asn
50-100
98
52
-
60
65
Cys
<50
95
<SA
..
40
65-88
Gin°
<50
75
<50
76
<50
75
Glu
65
65
<SA
..
70
73
His
<50
98
<50
"
50
65
Lys
73
75
<SA
"
60
75
fMet
<SA
71
52
<50'
61
71
mMet-1
<SA
<50
<50
<50'
61
60
mMet-2
<50
95
<SA
50'
60
50
Phe
64
98
<50
"
60
73
Pro
52
75
51
"
..
-
<50
73
Ser(GCU)
65
63
<50
"
<30
61
Ser(UGA)
54
72
<50
"
<50
67
Trp
50
98
<SA
52
52
63
.
Tyr
56
67
55
<50
67
Les homologies sont exprimées en pourcentage et les chiffres représentent des
moyennes calculées à partir des séquences de plusieurs gènes homologues.
Le petit cercle (0) indique les gènes de tRNA séquencés dans la mitochondrie du blé et
localisés dans le maïs par hybridation avec des oligonucléotides. La transcription de
ces gènes a été confirmée dans le maïs par hybridation des plus petits fragments les
comportant avec les tRNA totaux extraits de la mitochondrie du maïs.
L'étoile (") signifie que les trois gènes trnM ont été comparés au _même gène trnM de
de la mitochondrie de Chlamydomonas reinhardtii. Le signe (") indique qu'il n'y a pas
de gène correspondant publié dans la littérature.

---

82
chloroplastiques. Cette hypothèse est en faveur de la théorie endosymbiotique des
organites cellulaires et confirme l'idée désormais acquise du transfert de matériel
génétique entre les organites. Si on analyse les homologies des gènes mitochondriaux
des
plantes supérieures par rapport aux gènes mitoc ho ndri aux des autres
embranchements, on voit qu'il est difficile de comprendre comment ces gènes
proviendraient du même événement endosymbiotique. Il y a en effet une très grande
différence entre les gènes des mitochondries des animaux, champignons et algues d'une
part et des plantes supérieures d'autre part. Il semble que les gènes du premier groupe
aient évolué pendant plus longtemps et/ou plus vite par rapport aux gènes procaryotiques
d'origine que ceux du deuxième groupe. De telles observations ont déjà été faites par
GRA y sur les gènes de rRNA (GR AY et coll., 1989) et d'après cet auteur, la grande
distance évolutive entre les gènes mitochondriaux des plantes supérieures et ceux des
autres mitochondries (algues, champignons, animaux) s'explique par le fait que l'ancêtre
des végétaux supérieurs aurait subit une deuxième endosymbiose. Cet événement serait
intervenu après la divergence entre les algues vertes et les végétaux supérieurs (fig.44).
Cette explication cadre parfaitement avec ce que l'on observe dans le cas des gènes de .
tRNA. En effet, dans la logique de deux endosymbioses successives, la présence de
deux génomes entraînerait (selon GRAY), une compétition entre le nouveau matériel
génétique (future mitochondrie) et l'ancien (issue de la première cndosymbiose). Le
résul rat de cette compétition serait alors l'élimination ou le transfert vers le noyau de
plusieurs gènes. Ceci pourrait évidemment provoquer un déficit en information génétique
dans les mitochondries des plantes supérieures. Dans le cas des gènes de tRNA, il
semble que tous les gènes issus de la première endosymbiose aient été éliminés. Le seul
vestige de ces anciens gènes de tRNA pourrait être le gène de tRNAmMeq décrit par
PARKS. Ce qui explique la position complètement atypique de ce gène dans le tableau
d'homologie. Cependant, la compétition entre les deux matériels génétiques a peut-être
aussi pu entraîner la perte de gènes de tRNA "nouvellement acquis" après la deuxième
endosymbiose. La conséquence de cette perte est que la mitochondrie pourrait ne pas
posséder tous les gènes dont elle a besoin. A partir du moment où ce besoin existe, tous
les événements cellulaires et moléculaires pouvant permettre la "capture de nouveaux
gènes" seront favorisés dans l'organelle; d'où la mise à profit des événements entraînant
l'insertion de séquences chloroplastiques dans le génome mitochondrial. De cette
manière, les gènes de tRNA chlorop1astiques susceptibles de completer l'ensemble des
gènes existant déjà dans la mitochondrie subissent une pression de sélection favorable à
leur mise en fonction.
Nous avons décrit dans notre étude un certain nombre de gènes
mitochondriaux d'origine chloroplastique qui sont fonctionnels. Il est très intéressant de
noter à ce sujet la complémentarité presque parfaite entre les gènes 'de tRNA.

---

anImai,
PROKARYOTES
FIGURE 44:
Arbre phylogénétique montrant les deux endosymbioses
probables qui seraient à l'origines des mitochondries.
( GRAY et coll., 1989)
Première endosymbiose qui est admise comme étant à l'origine de toutes les
mi tochondries.
Deuxième endosymbiose qui, selon GRAY, serait à l'origine des
mitochondries végétales, si l'on se base sur les homologies des rRNA .

---

83
chloroplastiques
qui sont encore non fonctionnels (contenus en particulier dans
l'insertion de 12 kb chloroplastique) et les gènes existant déjà dans la mitochondrie. Si
l'évolution suit son cours, on peut penser que ces gènes deviendront fonctionnels (voir
figure 38, chapitreIII-ILB). Cette évolution serait certainement plus économique
(énergétiquement) pour la mitochondrie qui éviterait ainsi d'importer ces tRNA ce qui est
le cas actuellement (cf paragraphe suivant). Le seul gène dont on n'a trouvé aucune trace
(même comme gène inactif ou comme pseudo-gène) chez aucune plante reste le gène de
tRNA Thr. Il est par conséquent possible que le tRNA correspondant soit importé dans la
mitochondrie de la plupart des plantes étudiés.
2.LE CODE GENETIQUE DANS LA MITOCHONDRIE DU MAIS
Selon la théorie du Wobble (CRICK, 1966), le nombre minimum d'anticodons
(donc de tRNA différents) nécessaires pour assurer la synthèse protéique est de 32.
Cependant, dans les mitochondries animales et de champignons, on ne trouve pas autant
de gènes de tRNA. Une autre théorie dite du "two out of three
a été proposée
(LAGERKVIST, 1978), selon laquelle, pour l'utilisation des codons dans le cas des
cases contenant 4 codons (tableau H), seuls les deux premiers nucléotides de ces codons
seraient indispensables. Cette théorie ramène le nombre minimal de tRNA différents
indispensables à 23; ce qui est en accord avec le nombre de gènes de tR:"JA trouvés dans
les mitochondries animales et fongiques (SIBLER et coll., 1986). Dans la mitochondrie
du maïs, le nombre de gènes de tRNA différents identifiés s'élève à 16. La détermination
de ce nombre repose sor l'hybridation de sondes spécifiques (tRN A marqués à la
CCAse) et/ou par le séquençage des gènes mis en évidence par ces hybridations. Ces 16
gènes correspondent à 13 acides aminés (cf tableau H) et portent 14 anticodons
différents. Par conséquent, la mitochondrie du maïs a besoin au minimum de 9 gènes de
tRNA supplémentaires pour mener à bien sa synthèse protéique. Logiquement, si ces
gènes ne sont pas codés par la mitochondrie, c'est que les tRNA correspondants sont
importés dans l'organite. Le cas des tRNALeu imprtés dans la mitochondrie du haricot
(GREEN et coll., 1987; MARECHAL-DRüUARD et coll., 1988) illustre cette situation.
Pour avoir une première information, nous avons effectué l'hybridation des
tRNA totaux extraits de la mitochondrie de maïs et purifiés sur une colonne RPC-5, avec
des fragments de restriction du DNA nucléaire du maïs. Les résultats de ces hybridations
sont montrés sur la figure 45. Au total, 4 fragments de restriction différents sont révélés
par les tRNA totaux mitochondriaux. Dans la mesure où ces hybridations correspondent
réellement à la présence de gènes de tRNA sur ces fragments nucléaires (nous avons vu
que n'e_st pas toujours le cas), ces résultats confirment d'une part que tous les tRNA 1
mitochondriauxne sont pas codés par le DNA mitochondrial et d'autre part, que certains.
tRNA sont importés dans l'organite. Cependant, 'ces hybridations restent des indications

---

T ABLEAU H:
Codons pour lesquels un gène de tRN A a été
identifié dans la mitochondrie du maïs.
...
-------Ph ---
.:-:. UU U :_:_:_:_:_:_:.
e -:-:-:
:-:-:-:_-::::_-:.(GAA J:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-
:::::"U 0 C.:.:.:.:-:-:-::::::::::::::::::::
UUA
Leu
(UAA)
UUG
...
..
....
. ....
.._. - - _...... _ .. -- .. _... _._.- ._--- .. -
CUU
Leu
CGU
Arg
(GAG)
(GCG:
CUC
CGC
~
CUA
§
(UAG)
CUG
AUU
Ile
ACU
Thr
(GAU)
(GGU;
AUC
::)
ACC
AUA ("CAU) §
ACA
( UAU)
(UGU)
.. -=- ."='. 7. ':"".. =-. =-. .:-. _-:..-= _-=."": .."'=."':"
:::::~:~g:~(ëÂ'ù) Met ::::::: ACG
GUU
Val
GCU
Ala
GGU
Gly
(GAC)
(GGC;
(GCC)
GUC
GCC
GGC
(.)
(.)
o
(.)
GUA
GCA
::::>
GGA
::::>
(UAC)
(UGC)
(UCC)
GUG
GCG
GGG
r.-_-::."":"."":".-:
L_-..:..-...:,.-..:..:-=--I
Codons-correspondant à des tRNA horneêogues à leurs équivalents chloroplasriques
(95-100% )
Codons correspondant à des tRNA moyeenernent homologues à leurs équivalents
chloroplastiques (60-75% )
Codons pour lesquels aucun gène de tRNA n'a été identifié
Les anticodons représentés entre parenthèses sont cCmot qui peuvent déchiffrer le code suivant
la théorie du Wobble alors que les anticodons nécessaires pour la lecture du code selon la
théorie du "two out of three" sont représentés en gras (verticalement)

---

li
1
0::=0
o
c
ü
. -
w I
>15
10
o
5
>15
4
10
5
4
•
0.5
a
b
FIGURE 45: Hybridation des tRNA mitochondriaux totaux avec des
fragments de restriction du DNA nucléaire du maïs
a) Longue migration du gel d'agarose 0.7%: plus de 24 heures à 50Y
b) Migration 15 heures à 50Y
Les tailles sont indiquées en kb

---

F1GURE 46 : Séquences consensus trouvées en amont de différents gènes de tRNA
Gènes de tRN A
Espèces
Différents
Séquences
consensus
trouvés
"-
[TnC (GCA)-l
Maïs
AAGTCAAGAATAATAA
[TnC (GCA)-2
Tomate
cons-I
GAAGGAAGAACAACCG
cons-Z
AGAAAAAGAAGGAGCG
[mD (GUC)
Blé
TATATAAGAAAAGTAC
[mE (UUC)
Maïs
ATAGAAAGAAAAGGAA
Blé
ATAGAAAGAAAAGGAA
Soja
ATATGAAGAATGGCTT
[mF (MA)
Maïs
TGCACAAGAAATGGTC
[mC (CCC)
Lupin
GAAAAAAGAGAAGTCG
[r-nH (CUC)
Maïs
GAAAAAAGAGAAAATC
[mK (UUU)
Maïs
cons-I
ATGATAAGAAGAAGAA
cons-Z
ATAAGAAGAAAAGGGG
tmM(CAU)
Lupin
AAGAAAAGAAAGAGAA
Soja
CGAGTAAGAAAATAAG
Oenothera
AGTGAAAGAAGAGAAG
[mM (CAU)-2
Soja
GGTTTAAGAAGGAGGC
Arabidopsis
CAAAAAAGAAAG~
[mN(GUU)
Lupin
TTACGAAGGAAACTTC
Phaseolus vulgaris
TGTCCAAGAACGAGAG
Maïs
GTCCAAAGAACGAGCA
Blé
GGCCAAAGAACGAGAG
[TnP (UCC)
Blé-l
GTAAGAAGAACGAGAG
Blé-2
cons-I
CAAGCAAGAAAAAGGT
cons-Z
CGAAAAAGAAAACCTA
[mQ (UUC)
Blé-1
TTCGTAAGAAAGAACT
Blé-2
CGGGAAAGAAGGAAGA
[mS (GCU)
Blé
CAGTAAAGAAGAGTAC
Maïs
CAGTAAAGAAGAGTAC
[TnS (UGA)
Blé
ACTACCGGAAAAGTGT
Maïs
cons-I
ACTACCGGAAAAGTGT
cons-2
TCATATAGAAAGAAGC
cons-3
ACTTAAAGAAAGGGGG
[TnS (GGA)
TATCAAAGAAAGTTCG
[mW (CCA)
Blé
GGCGTAAGAAAGCGCT
Maïs
G------GAAAGCGCT
[mY (GUA)
Blé
AACTTAAGAACGAAGG
Maïs
AGAATAAGAACGAAGG
CONSENSUS
AAGAANRR
Les différentes séquences consensus sont trouvées à des distances diverses du début des différent.
gènes. Pour le gène trnP, blé-I et blé-2 désignent des séquences consensus trouvées en amont ~
2 gènes identiques qui sont dans 2 environnements différents. Pour le gène trnQ ces même.
appellations désignent 2 gènes qui diffèrent en plus d'un nucléotide.

---

84
grossières car elles peuvent paradoxalement constituer en même temps une surestimation
et une sous-estimation du nombre de gènes de tRNA nucléaires dont les produits
d'expression sont destinés à la mitochondrie: En effet, le même gène peut se retrouver
dans plusieurs environnements nucléotidiques différents et dans ce cas, plusieurs
fragments de restriction peuvent le porter. Cela conduit à une sur-estimation. A l'opposé,
la présence de plusieurs gènes différents sur le même fragment peut conduire à en sous-
estimer le nombre.
Ainsi, on peut penser que plusieurs tRNA sont importés dans la mitochondrie du
1mais même si on n'en connait pas le nombre exact. Ceci expliquerai, alors le fait que
seulement 14 gènes différents soient trouvées dans le génome mitochondrial.
Restent cependant encore deux ambiguïtés dans le code génétique de la
l mitochondrie du maïs: ce sont des cas des gènes tRNAMcL 1 et de tRNATrp. En effet,
I nous ne savons pas si le tRNAMcL} est spécifique de la méthionine ou de l'isoleucine.
1
De même, l'ambiguïté concernant le codon CGG qui spécifierait l'arginine et/ou le
\\ tryptophane persiste. Rappelons que le tRNATrp trouvé dans la mitochondrie de haricot
(MARECHAL et coll., 1987) comporte l'anticodon CCA et qu'un gène correspondant à
ce tRNA a été localisé sur le réplicon linéaire de 2.3 kb du maïs (MARECHAL et coll.,
1987 ; BEDINGER et coll., 1986).
On peut donc supposer que, bien que des tRNA de spécificités complémentaires à
ceux codés par la mitochondrie soient importés du cytoplasme, il existe probablement
dans le système de synthèse protéique mirochondriale, d'autres mécanismes de
reconnaissance codon-anticodon permettant le déroulement de la traduction. Signalons à
cet effet que dans le cas des deux cases à 4 codons pour lesquelles il existe un tRNA codé
par le génome mitochondrial du maïs ·(tRNAPro, tRNASer), la première lettre de
l'anticodon est un U, ce qui est aussi en accord avec l'hypothèse de LAGERKVIST
(tableau H).
3. SIGNAUX DE TRANSCRIPTION DES GENES DE tRNA
MITOCHONDRIAUX
a) Recherche de séQuences consensus dans les régions flanquantes des gènes de
tRNA
Dans le chapitre traitant des gènes de tRNA, nous avons noté la présence d'une
séquence riche en purine: 5' AAGAANRR 3' en amont des gènes de tRNA. Cette
séquence est apparue lors d'une analyse faite sur plusieurs
gènes de tRNA
mitochondriaux de blé (JOYCE et coll., 1988-b) et on la retrouve devant la majorité des
gènes de tRNA mitochondriaux publiés dans la littérature (fig.46). Cependant, les
séquences retrouvées ne s'alignent pas toutes à 100% avec cette séquence et on retrouve
souvent d'autres séquences beaucoup plus riches en purines en amont de certains gènes.

---

FIGURE 47: Alignement des séquences codantes des gènes de tRNA
mitochondriaux du maïs
1
10
20
30
40
50
60
70
Trp
GCGCTCT TA GTTC AGTTCGGT .. A GAAC G TGTGT CTCCAAA ACCCA .... C GTAGG TTCAAAT CCTAC AGAGCGT G
SerUGA GGATGGA TG TCTG AGC .. GGTTGA AAG~G TCGGT CTTGAAA ACCGA .... C GGGGG TTCGAAT CCCTC TCCATCC G
SerGCU GGAGGTA TG GCTG AGT .. GGCTTA AGGC A TTGGT TTGCTAA ATCGA .... C ATGGG TTCGAAT CCCAT TTCCTCC G
Pro
CGAGGTG TA GCGC AGTCTGGTC.A GCGC A TCTGT TTTGGGT ACAGA .... C ATAGG TTCGAAT CCTGT CACCTTG A
Phe
GTCAGGA TA GCTC AGTT.GGT .. A GAGC A GAGGA CTGAAAA TCCTC .... C ACCAG TTCAAAT CTGGT TCCTGGC A
Met2
ACCTACT TG ACTC AGC .. GGTT.A GAGT A TCGCC TTCATAC GGCGA .... C ATTGG TTCAAAT CCAAT AGTAGGT A
MeU
GGGCTTA TA GTTT AATT.GGTT.G AAAC G TACCG CTCATAA CGGTG .... T GTAGG TTCGAGC CCTAC TAAGCCC A
Î~ .-
fMet
AGCGGGG TA GAGG AATT.GGTC.G ACTC A TCAGG CTCATGA CCTGA .... T GCAGG TTCGAAT CCTGT CCCCGCC T
Lys
GGGTGTA TA GCTC AGTT.GGT .. A GAGC A TTGGG CTTTTAA CCTAA .... C GCAGG TTCAAGT CCTGC TATACCC A
His
GGCGGATG TA GCCA AGT .. GGATCA AGGC A GTGGA TTGTGAA TCCAC .... C GCGGG TTCAATT CCCGT CGTTCGC C
(;111
(;'l'I:IT'I''I' '1'1: li'I'1 'l'
1\\(;'1'.,1;1 i'I"I', fI
1;1;1\\('
fI
'1'1'1;'1'1' '1"1"1"1'1' fIT
1;'I'I'(:f\\.
i :
fI{'I;,;r::
'1"/'1'(:1\\'1"1' ,'1 :1:(i'l'
f\\f'\\(~(;,':1\\'I' 1\\
I,i 1 Il
'!'I;IV\\I:i'I'/\\ '1'/\\ Iii '1;/\\
M;'I'., 1il ;'1'. , /\\
/\\1 il il;
/\\
'l'II il;'I' '1"1"1"1'1 ili'l' /\\'1'11;1;, , , , 1: /\\/\\/\\1 il; '1"1'1 '1 i/\\1\\'I'
1'1 :'1''1''1' 'l'/\\t,.:'I'1 :1,'/\\ 1;
Cys
GGCGGCA TG GCCA AGC .. GGT .. A AGGC A GGGGA CTGCAAA TCCTT .... C CCCAG TTCAAAT CTGGG TGTCGCC T
Asn
TCCTCAG TA GCTC AGT .. GGT .. A GAGC G GTCGG CTGTTAA CTGAC .... C GTAGG TTCGAAT CCTAC TTGGGGA G
Asp
GGGGAAA TA GCTC AGTT.GGTT.A GAGT G CTGGT CTGTCAC GCCAG .... C GCGGG TTCGAAC CCCGT TTTCCCC G
Tyr
GGGAAGG TG GCCG AGC .. GGTCAA AAGC G ACAGA CTGTAAA TCTGT .... C GTAGG TTCGAAT CCTGC CCTTCCC A
CONSENSUS
ITR RYYN MY .. G
R RRRY R
C
1
RG TTCRANY Cyl
R
TR RYNN ARY .. G
1 GG TTCRANT CC
BOITE A
BOITE B
Les boites A et B représentent les promoteurs internes des gènes de tRNA nucléaires et de certains gènes chlor opl ast iqucs.
Les nucléotides faisant exception à la séquence consensus sont soulignés. Le gène tmH comporte 8 nucléotides appariés dans
le bras de l'ami no acide.

---

8S
Dans la mesure où aucune donnée expérimentale n'a été publ,iée concernant cette
séquence consensus, celle-ci n'est valable qu'à titre indicatif. De plus, les différentes
séquences consensus retrouvées sont situées à des distances très variables du gène lui-
même, qui vont de 0 nucléotides dans le cas du gène de tRNAPhe (chap./ll.ILB) à plus
de 400 nucléotides pour le gène de tRNASCf(UGA) (chapitre II.ILA). En dehors de cette
séquence 5' AAGAANRR 3', aucune autre homologie n'est décelable dans les régions en
amont des différents gènes de tRNA. La même situation existe en aval des gènes de
tRNA où aucun signal commun n'est observé. Dans certains cas, comme celui du gène
de tRNASCf(UGA), on remarque de courtes séquences répétées directes ou inverses,
mais les structures secondaires que l'on peut déduire à partir de ces répétitions ne sont
pas thennodynamiquement stables. On peut donc difficilement leur assigner des rôles de
stabilisateur ou de signaux de terminaison des transcrits (STERN et coll., 1987).
b) Recherche de promoteurs internes
L'absence de mise en évidence de véritables signaux d'initiation de la
transcription des gènes de tRNA à l'image de ceux qui sont retrouvés devant les gènes
procaryotiques ou de mitochondrie de levure, nous a incité à analyser les régions
codantes de ces gènes. Dans les noyaux des cellules eucaryotes (SHARP et coll., 1985)
et pour certains gènes chloroplastiques (GRUISSEM et coll., 1986), la transcription des
gènes de tRNA se fait à partir de promoteurs internes constitués par deux blocs de
séquence nommées boites A et boites B. Les nucléotides impliqués dans la constitution
de ces blocs sont indispensables à la fois pour la transcription et la structure tertiaire de la
molécule de tRNA (Pour une revue, voir SHARP et coll., 1985).
Nous avons recherché ces blocs de séquences dans les gènes de tRNA de la
mitochondrie du maïs. L'alignement de ces gènes ainsi que les séquences consensus qui
en découlent sont montrés sur la figure 47. On peut constater sur cette figure que les
gènes mitochondriaux comportent eux aussi les boîtes A et B. Quelques déviations sont
observées dans la boîte A, mais la boîte B est très conservée.
La transcription des gènes de tRNA nucléaires est assurée par la RNA
polymérase III (FOLK et coll., 1982). Cette polymérase reconnait les promoteurs
internes A et B mais il semble que certains éléments extérieurs aux gènes soient aussi
impliqués dans l'initiation de la transcription des gènes de tRNA (DINGERMANN et
coll., 1982). Le fait qu'on retrouve les séquences correspondantes au promoteurs
internes dans les gènes de tRNA mitochondriaux amène à se demander si
la RNA
polymérase III est impliquée dans la transcription des gènes de tRNA mitochondriaux.
Cette question mérite d'être posée car en plus des séquences rappelant celles des
promoteurs internes des gènes nucléaires, certaines observations ont été faites qui vont
dans le sens de cette hypothèse. Le cas le plus remarquable est celui du gène de tRNAAsn

---

86
du noyau de pétunia. En effet, BA WNIK et coll. (1983) ont démontré que ce gène de
tRNAAsn était transcrit in vitro par la RNA polymérase III. Or, ce gène est identique à
e ,
sorr'homologue de la mitochondrie et comporte non seulement les boites A et B mais
aussi une séquence 5' AAGAANRR 3' située entre les nucléotides -38 et -30 (inclus).
Les gènes de tRNAAsn mitochondriaux qui lui sont homologues conservent aussi la
séquence 5' AAGAANRR 3'. Il serait donc important de voir si les gènes
mitochondriaux peuvent aussi être transcrits in vitro par la RNA polyrnérase III. On peut
signaler, par ailleurs les analyses faites par MARTIN et coll. (1987), montrant qu'il n'y a
pas plusieurs activités RNA polymérasiques dans la mitochondrie du blé.
4.
CONCLUSIONS
Un certain nombre de caractéristiques concernant les gènes de tRNA de la
mitochondrie du maïs peuvent être dégagées à l'issue de cette étude:
- Le génome mitochondrial ne code pas pour tous les gènes de tRNA nécessaires à
la synthèse protéique dans l'organite
- L'organisation des gènes de tRNA varie d'un génome à l'autre mais leurs
séquences sont toutes très conservées
- Il n'y a pas de déviation notable dans la structure secondaire des tRNA par
rapport au modèle classique en feuille de trèfle. Dans la majorité des cas, les nucléotides
invariants et semi-invariants sont conservés
- Aucun gène ne code pour la séquence CCA 3' terminale
- Ces gènes de tRNA ne sont pas organisés en familles. Ils sont tous indépendants
les uns des autres. Les plus proches (les gènes de tRNAAsp et de tRNAmMeLl) sont
codés par deux brins opposés. Leur expression n'est certainement pas coordonnée non
plus. Cependant, il est possible que certains gènes soient compris dans de grandes unités
de transcription et soient par conséquent co-transcrits avec des gènes de protéines (gène
de tRNA mMeL2 par exemple).
- Aucun gène de tRNA ne contient un intron
- Il n'y a pas de séquence consensus typique en amont et en aval des gènes. La
seule séquence trouvée en amont (S'A AGAANRR 3') n'est pas retrouvée de manière
stricte devant tous les gènes. De plus cette séquence se retrouve assez fréquemment
ailleurs dans des régions totalement indépendantes des gènes de tRNA.
- On retrouve des séquences homologues aux promoteurs internes des gènes de
tRNA des noyaux eucaryotiques
- Le noyau code vraisemblablement pour une partie des gènes de tRNA
mitochondriaux. Il s'agit essentiellement de gènes codant pour les tRNA correspondants
à des acides aminés qui peuvent être spécifiés par 3, 4 ou 6 codons. Les deux exceptions
constituent les gènes de tRNAPro et de tRNASer.

---

---

Il
87
1
1
BIBLIOGRAPHIE
'.
1
BAILEY-SERRES, J., MANSON, D. K., LIDDELL, D. K., FOX. T. D. and LEAVER
C. J. (1986). Mitochondrial genome rearrangement lead to extension and relocation of the'
1
cytochrome c oxydase subunit I gene in Sorghum. Cell 47,567 -576.
BARCISZEWSKA. M. and JONES, D. S. (1988). The nuc1eotide sequences of two
1
lupin us luteus asparagine tRNAs. Nucleic Acid Res. 16,9349.
BARTNIK. E. and BORSUK, P. (1986). A glycine tRNA gene from lupine
mitochondria. Nuc1eic Acids Res. 14, 2407.
1
BAWNIK, N., BECKMANN, J. S., SARID. S. and DANIEL, V. (1983). Isolation and
nucleotide sequence of a plant tRNA gene: petunia asparagine tRNA. Nucleic Acids Res.
1
Il,1117-1122.
BEDINGER, P., DE HOSTOS, E. L., LEON. P. and W ALBOT, V. (1986). Cloning and
1
characterisation of a linear 2.3 kb mitochondrial plasmid of maize. Mol. Gen. Genet. 205,
206-212.
BIRD, S., DUNCKER, B., GARBER. P. and BONEN, L. (1989). Nucleotide sequence
1
of the bean mitochondrial DNA region containing the tRNAAsn and tRNATyr genes.
Nucleic Acids Res. 17,4379.
1
BLAND, M. M., LEVINGS. C. S. III and MATZINGER, D. F. (1986). The tobacco
mitochondrial ATPase subunit 9 gene is closely linked to an open reading frame for a
ribosomal protein. Mol. Gen. Genet. 204, 8-16.
1
BLAND, M. M., LEVINGS. C. S. III and MA TZINGER, D. F. (1987). The ATPase
subunit 6 gene of tobacco mitochondria contains an unusual sequence. CUIT. Genet. 12,
475-481.
1
BLOCH, D. P., MCARTHUR. B. and MIRROP, S. (1985). tRNA-rRNA sequence
homologies: Evidence for an ancient modular format shared by tRNAs and rRNAs ..
1
Biosystems 17 209, 225- Yeast.
BLOCH, D. P., MCARTHUR, B., WIDDOWSON, R., SPECfROR, O.,
GUIMARAES. R. C. and SMITH, 1. (1983). tRNA-rRNA sequence homologies:
1
Evidence for a common evolutionary origin? J. Mol. Evol. 19,420-428.
BOER, P. H., MCINTOSH, J. E., GRAY. M. W. and BONEN, L. (1985). The wheat
1
mitocho ndri a1gene for apocytochrome b: absence of a prokaryotic ribosome binding site.
Nucleic Acids Res. 13, 2281-2292.
1
BONEN, L. (1987). The rnitochondrial S 13 ribosornal protein gene is silent in wheat
ernbryos and seedlings.. Nucleic Acids Res. 15, 10393-10404.
BONEN, L., BOER. P. H. and GRA Y, M. W. (1984). The wheat cytochrorne oxidase
1
subunit II gene has an intron insert and three radical aminoacid changes relative to rnaize.
EMBO J 3, 2531-2536.
1
1
1

---

88
BONEN, L., BOER, P. H., MCINTOSH. J. E. and GRA Y, M. W. (1987). Nucleotide
sequence of the wheat mitochondrial gene for subunit 1of cytochrome oxidase. Nucleic
Acids Res. 15,6734.
BORSUK, P., SIRKO. A. and BARTN1K, E. (1986). A methionine tRNA gene from
lupine mitochondria. Nucleic Acids Res. 14, 7508.
BRAUN. C. J. and LEVINGS, C. S. III (1985). Nucleotide sequence of the F1-ATPase
a subunit gene from maize mitochondria. Plant Physiol. 79, 571-577.
BRENNICKE, A., MOLLER. S. and BLANZ, P. (1985). The 18S and 5S ribosomal
RNA genes in Oenothera mitochondria: sequence rearrangements in the 18S and 5S
rRNA genes of higher plants. Mol. Gen. Genet. 198,404-410.
BRUCE. A. G. and UHLENBECK, O. C. (1978). Reaction at the tennini of tRNA with
T4 RNA ligase. Nucleic Acids Res. 3, 3665-3677.
CHAO, S., SEDEROFF. R. and LEVINGS, C. S. lIT (1983). Partial sequence analysis
of the 5S to 18S rRNA gene region of the maize mitochondrial genome. Plant Physiol.
71, 190-193.
CHAO, S., SEDEROFF. R. and LEVINGS, C. S. III (1984). Nucleotide sequence and
evolution of the 18S ribosomal RNA gene in maize mitochondria. Nucleic Acids Res. 12,
6629-6644.
CHASE. C. D. and PRING, D. R. (1985). Circular plasmid DNAs from mitochondria of
Sorghum bicolor. Plant Mol. Biol. 5, 303-311.
CHASE. C. D. and PRING, D. R. (1986). Properties of the linear NI and N2 plasmid-
like DNAs from mitochondria of cytoplasmic male-sterile Sorghum bicolor. Plant Mol.
Biol. 6, 53-64.
CRICK, F. H. C. (1966). codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis. J.Mol.Biol.
19, 548-555.
CROUZILLAT, O., GENZBITTEL, L., de la CANAL, L., VAURY, c., PERRAULT,
A., NICOLAS. P. and LE DOIGT, G. (1989). Properties and nucleotide sequence of a
mitochondrial plasmid from sunflower. CUIT. Genet. 15,283-289.
CRUZALEGUI, F. (1987). DEA de biologie moléculaire et cellulaire -option biologie
moléculaire végétale. Université LOUIS PASTEUR, Strasbourg, France.
CRUZALEGUI, F., WEIL. J. H. and GRIENENBERGER, J. M. (1989). Nucleotide
sequence of a wheat mitochondrial tRNAAsn gene. Nucleic Acids Res. submitted.
DALE, R. M. K., DUESING. J. H. and KEENE, D. (1981). Supercoiled mitochondrial
ON As from plant tissue culture cells. Nucleic Acids Res. 9, 4583-4593.
DALE, R. M. K., McCLURE. B. A. and HOUCHINS, J. P. (1985). A rapid single-
stranded cloning strategy for producing a sequential series of overlapping clones for.use
in DNA sequencing: Application to sequencing the corn mitochondrial 18 S rDNA.
Plasmid 13,31-40.
DALE, R. M. K., MENOU, N., GINSBURG. H. and KRIDL, J. C. (1984). Sequence
anal ysis of the maire mitochondrial 26S rRNA and flanking regions. Plasmid Il, 141-
150.· .

---

89
DAVIS, L. G., DIBNER. M. D. and BA TTEY, 1. F. (1986). Basic methods in
Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co, New York, Amsterdam, London.
DAWSON, A. 1., JONES. V. P. and LEA VER, C. 1. (1984). The apocytochrome b
gene in maize mitochondria does not contain introns and is preceeded by a potentia1
ribosome binding site. EMBO 1. 3, 2l07~2113.
DEVEREUX, J., HAEBERLI. P. and SMITHIES, O. (1984). A comprehensive set of
sequence ana1ysis programs for me VAX. Nucleic Acids Res. 12,387-395.
DEWEY, R. E., LEVINGS. C. S. III and TIMOTHY, D. H. (1985-a). Nucleotide
1
sequence of ATPase subunit 6 gene of maize mitochondria. Plant Physiol. 79, 914-919.
DEWEY, R. E., LEVINGS. C. S. III and TIMOTHY, D. H. (1986). Novel
1
recombinations in me maize mitochondrial genome produce a unique transcriptional unit
in the Texas male sterile cytop1asm.. Ce1l44, 439-449.
1
DEWEY, R. E., SCHUSTER, A. M., LEVINGS. C. S. III and TIMOTHY, D. H.
(1985-b). Nucleotide sequence of FO-ATPase proteolipid (subunit 9) gene of rnaize
mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,1015-1019.
1
DINGERMAN, T., BURJE, D. J., SHARP, S., SCHAAK. 1. and SOLL, D. (1982).
The 5' flanking sequences of Drosophi1a tRNAArg genes control their in vitro
1
transcription in Drosophi1a cell extract, J. Biol. Chem. ?57, 14738-.
DORMANN-PRZYBYL, D., STRITTMATTER. G. and KOSSEL, H. (1986). The
region distal to the rRNA operon from chloroplast of maize con tains genes coding for
1
tRNAArg(ACG) and tRNAAsnGUU). Plant Mol. Biol. 7, 419-431.
DRON, M., HARTMANN, c, RODE. A. and SEVIGNAC, M. (1985). Gene
1
conversion as a mechanism for divergence of a chlorop1ast tRNA gene in the
mitochondrial genome of Brassica oleracea. Nucleic Acids Res. 13, 8603-8610.
1
ENGLAND. T. E. and UHLENBECK, O. C. (1978). 3'-terminallabelling of RNA with
T4 RNA ligase. Nature 275, 560-561.
1
ERICKSON, L., GRANT. 1. and BEVERSDORF, W. (1986). Cytoplasmic male
sterility in rapeseed (Brassica napus L.) 1. Restriction patterns of chloroplast and
mitochondrial DNA. Theor. Appl. Genet. 72, 145-150.
1
FALCONET, D., SEVIGNAC. M. and QUETIER, F. (1988). Nucleotide sequence and
deterrnination of the extremities of me 26S ribosomal RNA gene in wheat rnitochondria:
evidence for sequence rearrangements in the ribosomal genes of higher plants. CUIT.
1
Genet. 13,75-82.
FAURON. C. M. R. and HA VLIK, M. (1988). The BamHI,XhoI,SmaI restriction
1
enzyme maps of me normal maize mitochondria1 genome genotype B37. Nucleic Acids
Res. 16, 10395-10396.
1
FAURON, C. M. R., HAVLIK, M., LON5DALE. D. and NTCHOLS, L. (1989).
Mitochondrial genome organization of me maize cytoplasmic male sterile type T. Mol.
Gen. Genet. 216,395-401.
1
FEINBERG. A. P. and VOGELSTEIN, B. (1983). Technique for radiolabeling DNA
restriction endonuclease fragments to high specifie activity. Anal. Biochem. 132,6.-13.
1
1
1

---

90
FEJES, E., MASTERS, B. S., MCCARTY. D. M. and HAUSWIRTH, W. W. (1988).
Sequence and transcriptional analysis of a chloroplast insert in the mitochondrial genome
ofZea mays. CUIT. Genet. 13,509-515.
"-
FOLK, W. R., HOFSTETER. H. and BIRNSTEIL, M. L. (1982). Sorne bacterial tRNA
genes are transcribed by eukaryotic RNA polymerase III. Nucleic Acids Res. 10,7153-.
FOX. T. D. and LEA VER, C. 1. (1981). The Zea mays mitochondrial gene coding
cytochrome oxydase subunit II has an intervening sequence and does not contain TGA
codons. Cell 26, 315-323.
GOBLET,1. P., BOUTRY, M., DUC. G. and BRIQUET, M. (1983). Mitochondrial
plasmid like molecules in fertile and male sterile Vicia Faba L.. Plant Mol. Biol. 2, 305-
309.
GOBLET, J. P., FLAMAND. M. C. and BRIQUET, M. (1985). A mitochondrial
plasmid specifically associated with male sterility and its relation with other mitochondrial
plasmids in Vicia faba L.. CUIT. Genet. 9,423-426.
GOTTSCHALK. M. and BRENNICKE, A. (1985). Initiator methionine tRNA in
Oenothera mitochondria. Cur. Genet. 9,165-168.
GRABA U, E. A. (1985). Nucleotide sequence of the soybean mitochondrial 18S rRNA
gene: evidence for a slow rate of divergence in the plant mitochondrial genome. Plant
Mol. Biol. 5, 119-124.
GRABAU, E. A. (1986). Nucleotide sequence of the cytochrome oxydase subunit I from
soybean mitochondria. Plant Mol. Biol. 7, 377-384.
GRABAU, E. A. (1987). Cytochrome Oxydase subunit II gene is adjacent to an initiator
methionine tRNA gene in soybean mitochondrial DNA. CUIT. Genet.· Il, 287-293.
GRABAU, E. A., HAVLIK. M. and GESTELAND, R. (1988). Chimeric organization
of two genes for the soybean mitochondrial ATPase subunit 6. CUIT. Genet. 13,83-89.
GRA Y, M. W., CEDERGREN, R., ABEL. Y. and SANKOFF, D. (1989). On the
evolutionary origin of the plant mitochondrion and its genome. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 2267-2271.
GRA Y. M. W. and SPENCER, D. F. (1983). Wheat mitochondrial DNA encodes a
eubacterial-like initiator methionine transfer RNA. FEBS Lett, 161,323-327.
GREEN, G., MARECHAL, L., WEIL. J. H. and GUILLEMAUT, P. (1987). A
Phaseolus vulgaris mitochondrial tRNALeu is identical to its cytoplasmic counterpart:
sequencing and in vivo transcription of the gene corresponding to the cytoplasmic
tRN ALeu. Plant Mol. Biol. 10, 13-19.
GRIVELL, L. (1983). Mitochondrial DNA. Scientific American 248, 60-73.
GRUISSEM, W., ELSNER-MENZEL, c., LATSHAW, S., NARITA, J. O.,
SCHAFFER. M. A. and ZURA WSKI, G. (1986). A subpopulation of spinach
chloroplast tRNA genes does not require upstream promoter elements for transcription.
Nucleic Acids Res. 14,7541-7556.
GUALBERTO, J. M., DOMO N, c, WEIL. J. H. and GRIENENBERGER, J. M.
(1989). Nucleotide sequence of the wheat mitochondrial tRNA Glu(UUC) gene. Nucleic
Acids Res. 17,3586.

---

91
GUALBERTO, J. M., WINTZ, H., WEIL. J. H. and GRIENENBERGER, J. M.
(1988). The genes coding for subunit 3 of NADH dehydrogenase and for ribosomal
prote in S12 are present in the wheat and maize mitochondrial genomes and are co-
.
transcri be,~. Mol. Gen. Genet. 215, 118-127.
GUILLEMAUT, P., BURKARD. G. and WEIL, J. H. (1972). Characterization of N-
1
formyl-methionyl-tRNA in bean mitochondria and etioplasts. Phytochem, Il,2217-
2220.
GWYNN, B., DEWEY, R. E., SEDEROFF, R. R., TIMOTHY. D. H. and LEVINGS,
1
C. S. III (1987). Sequence of the 18S-5S ribosomal gene region and the cytochrome
oxidase II gene from mtDNA of Zea diploperennis. Theor. Appl. Genet. 74, 781- 788.
1
HACK. E. and LEA VER, C. 1. (1983). The alpha subunit of the rnaize FI-ATPase is
synthesized in the mitochondria, EMBO J. 2, 1783-1789.
1
HAENNI, A. L., JOSHI. S. and CHAPEVILLE, F. (1982). tRNA-like structures in the
genome of RN A viruses. Prog. N ucleic Acids Res. Mol. Biol. 27, 85-104.
1
HANAHAN, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. 1.
Mol. Biol. 166, 557-580.
HANSEN. B. M. and MARCKER, L. A. (1984). DNA sequence and transcription of a
1
DNA minicircle isolated from male sterile sugar beet mitochondria. Nucleic Acids Res.
12, 4747-4756.
1
HIESEL. R. and BRENNICKE, A. (1983). Cytochrorne Oxydase subunit II in
rnitochondria of Oenothera has no intron. EMBO J. 2, 2173-2178.
1
HIESEL, R., SCHOBEL, W., SCHUSTER. W. and BRENNICKE, A. (1987). The
cytochrorne oxydase subunit l and III genes of Oenothera mitochondria are transcribed
from identical prornoter sequences. EMBO J. 6, 29-34.
1
IAMS, K. P., HECKMAN. J. E. and SINCLAIR, J. H. (1985). Sequence of histidyl
tRNA present as a chloroplast insert in mtDNA of Zea mays. Plant Mol. Biol. 4, 225-
232.
1
ISAAC, P. G., BRENNICKE, A., DUNBAR. S. M. and LEAVER, C. J. (1985-a). The
mitochondrial genome of fertile maize (Zea mays L.) contains two copies of the gene
1
encoding the alpha subunit of the FI ATPase. CUIT. Genet. 10,321-328.
ISAAC, P. G., JONES. V. P. and LEAVER, C. 1. (1985-b). The maize cytochrome c
1
oxydase subunit I gene: sequence,expression,and rearrangement in cytoplasmic male
sterile plants. EMBO J. 4, 1617-1623.
IZUCHl S. and SUGITA, M. (1989). Nucleotide sequence of a tornato mitochondrial
1
tRNACYS(GCA) gene. Nucleic Acids Res. 17, 1248.
JOYCE. P. B. M. and GRA Y, M. W. (1988-a). Nucleotide sequence of a wheat
1
rnitochondrial glutarnine tRNA gene. Nucleic Acids Res. 16,1210.
JOYCE, P. B. M., SPENCER, D. F., BONEN. L. and GRAY, M. W. (1988-b). Genes
1
for tRNAAsp, tRNAPro, tRNATyr and two tRNASer in wheat mitochondrial DNA. Plant
Mol. Biol. 10,251-262.
1
1
1

---

92
JOYCE, P. B. M., SPENCER. D. F. and GRA Y, M. W. (1988-c). Multiple sequence
rearrangements accompanying the duplication of a tRNAPro gene in wheat mitochondrial
DNA. Plant Mol. Biol. Il,833-843.
JOYCE, P. B. M., GRA Y, M. W. (1989). Nucleotide sequence of a second glutarnine
tRNA gene in wheat mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 17,4885
KAO, T. H., MOON. E. and WU, R. (1984). Cytochrome oxydase subunit II gene of
rice has an insertion sequence with intron. Nucleic Acids Res. 12, 7305-731 S.
KARPINSKA. B. and AUGUSTYNIAK, H. (1988). An asparagine tRNA gene from
lupine mitochondria. Nucleic Acids Res. 16, 6235.
KEMBLE. R. J. and BEDBROOK, J. R. (1980). Low molecular weight circular and
linear DNA in mitochondria from normal and male-sterile Zea mays cytoplasm.. Nature
284, 565-566.
KOLODNER. R. and TEW ARI, K. K. (1972). Physicochemical characterization of
mitochondrial DNA from pea leaves. Proc. Naù. Acad. Sci. USA 69,1830-1834.
LABOUESSE, M., HERBERT, C. J., DUJARDIN. G. and SLONIMSKI, P. P.
(1987). Three suppresor mutations which cure a mitochondrial RNA maturase deficiency
occur at the same codon in the open reading frame of the nuclear NAM2 gene. EMBO J.
6,713-721.
LAGERKVIST, U. (1978). "Two out of three": an alternative method for codon reading.
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1759-1762.
LEHRACH, H., DIAMOND, D., WOZNEY. J. M. and BOEDTKER, H. (1977). RNA
molecular weight determinationby gel electrophoresis under denaturating conditions, a
critical reexamination. Biochem. 16,4743-.
LEROY, P., BAZETOUX, S., QUETIER, F., DELBUT. J. and BERVILLE, A. (1985).
A comparison between rnitochondrial DNA of an isogenic male-sterile (S) and male-fertile
(F) couple (HA89) of sunfIower. CUIT. Genet. 9, 245-25l.
LEVINGS. C. S. III and SEDEROFF, R. R. (1983). Nucleotide sequence of the S2
mitochondrial DNA from S cytoplasm of maize. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80,4055-
4059.
LONS DALE, D. M. (1988). The plant mitochondrial genome. In "The biochemistry of
Plants". Springer, Berlin, New York, Tokyo, in press.
LONSDALE, D. M., HODGE. T. P. and FAURON, C. M. R. (1984). The physical map
and organisation of the mitochondrial genome from the fertile cytoplasm of maize.
Nucleic Acids Res. 12,9249-9261.
LONSDALE, D. M., HODGE, T. P., HOWE. C. J. and STERN, D. B. (1983). Maize
mitochondrial DNA con tains a sequence homologous to the ribulose-l,5-bisphosphate
carboxylase large subunit gene of chloroplast DNA. Cel! 34, 1007-1014.
. MAKAROFF. C. A. and PALMER, J. D. (1987). Extensive mitochondrial transcription
of the Brassica campestris rnitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 15, 5141-5156.
MANIATIS, T., FRITSCH. E. and SAMBROOK, J. (1982). Molecular cloning: A
laboratory manual. CoId Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.~.

---

93
MANNA. E. and BRENNICKE, A. (1985). Primary and secondary structure of 26S
ribosornal RNA of Oenothera mitochondria. CUIT. Genet. 9, 505-515.
MARECHAL-DROUARD. L. and GUILLEMAUT, P. (1988). Nucleotide sequence of
bean mitochondrial tRNALeu-4 and its cytoplasmic counterpart. Reexamination of the
modified nucleotide present in position 12 in bean rnitochondrial and cytoplasmic
tRNALeu_1 sequences. Nucleic Acids Res. 16, 11812.
MARECHAL-DROUARD, L., WEIL. J. H. and GUILLEMAUT, P. (1988). Irnport of
severa! tRNAs from the cytoplasm into the mitochondria in bean Phaseolus vulgaris.
Nucleic Acids Res. 16,4777-4788.
MARECHAL, L., GUILLEMAUT, P., GRIENENBERGER, J. M., JEANNIN. G. and
WEIL, 1. H. (1985-a). Structure of bean mitochondrial tRNAPhe and localization of the
tRNAPhe gene on the mitochondrial genomes of maize and wheat, FEBS Lett. 184,289-
293.
MARECHAL, L., GUILLEMAUT, P., GRIENENBERGER, J. M., JEANNIN. G. and
\\VEIL, 1. H. (1985-b). Sequence and codon recognition of bean mitochondria and
chloroplast tRNAsTrp. evidence for a high degree of homology. Nucleic Acids Res. 13,
4411-4416.
MARECHAL, L., GUILLEMAUT, P., GRIENENBERGER, J. M., JEANNIN. G. and
WEIL, J. H. (1986). Sequences of initiator and elongator methionine tRNAs in bean
mitochondria. Plant Mol. Biol. 7, 245-253.
MARECHAL, L., GUILLEMAUT. P. and WEIL, 1. H. (1985-c). Sequence of rwo bean
mitochondria tRNAsTyr which differ in the leve! of post-transcriptional modification and
have a prokaryotic-like large extra-loop. Plant Mol. Biol. 5,347-351.
MARECHAL, L., RUNEBERG-ROOS, P., GRIENENBERGER, J. M., COLIN, J.,
WEIL, J. H., LEJEUNE, B., QUETIER. F. and LONSDALE, D. M. (1987).
Homology in the region containing a tRNATrp gene and a (complete or partial) tRNAPro
gene in wheat mitochondrial and chloroplast genomes. CUIT. Genet. 12, 91-98.
MARTIN, M. T., ECHEVARRlA, M., LITVAK. S. and ARAYA, A. (1987). Studies of
transcription in isolated wheat rnitochondrial and organelle extracts. Plant Sei. 49, 199-
207.
MESSING,1. (1983). New Ml3 vectors for cloning. Methods in enzymology 101,20-
77.
MESSING, J., GRONENBORN, 8., MULLER-illLL. B. and HOFSCHNEIDER, P.
H. (1977). Filarnentous coliphages Ml3 as a cloning vehicle: Insertion of a Hind II
fragment of the lac regulatory region in Ml3 replicating form "in vitro". Proc .Natl. Acad.
Sei. USA 74, 3642-3646.
MOON, E., KAO. T. H. and WU, R. (1985). Pea cytochrome oxydase subunit II gene
has no intron and generates two rnRNA transcripts with different 5' tennini. Nucleic
Acids Res. 13, 3195-3212.
MORGENS, P. M., GRABAU. E. A. and GESTELAND, R. F. (1984). A nove!
soybean mitochondrîal transcript resulting from a DNA rearrangement involving the 5S
rRNA gene. Nuc1eic Acids Res. 12,5665-5684.

---

94
MORIKAMI. A. and NAKAMURA, K. (1987). Structure and expression of pea
mitochondrial FIATPase a subunit gene and its pseudogene involved in homologous
recombination. J. Biochem 101,967-976.
NEGRUK, V. 1., EISNER, G. 1., REDICI-IKINA, T. D., DUMANSKA YA, N. N.,
CHERNY, D. I., ALEXANDROV, A. A., SHEMYAKIN. M. F. and BUTENKO, R.
G. (1986). Diversity of Vicia faba circular mtDNA in whole plants and suspension
cultures. Theor. App!. Genet. 72, 541-547.
NIKIFOROVA. 1. D. and NEGRUK, V. 1. (1983). Comparative electrophoretical
analysis of plasmid-like mitochondrial DNAs in Vicia faba and in sorne other legumes.
Planta, 157 -81.
.
NUGENT. J. M. and PALMER, 1. D. (1988). Location, identity, amount and serial
entry of chloroplast sequences in crucifer mitochondrial DNAs. CUIT. Genet. 14,501-
509.
PAILLARD, M., SEDEROFF. R. R. and LEVINGS, C. S. III (1985). Nucleotide
sequence of the S-1 mitochondria1 DNA from the S cytoplasm of maize. EMBO 1. 4,
1125-1128.
PALMER. 1. D. and HERBON, L. A. (1987). Unicircular structure of the Brassica hirta
mi tochondrial genome. CUIT. Genet. Il, 565-570.
PALMER. J. D. and SHIELDS, C. R. (1984). Tripartite structure of Brassica campestris
mitochondrial genome. Nature 307, 436-440.
PALMER, J. D., SHIELDS, C. R., COHEN. D. B. and ORTON, T. J. (1983). An
unusual mitochondrial DNA p1asmid in the genus Brassica. Nature 301, 725-728.
PARKS, T. D., DOUGHERTY, W. G., LEVINGS. C. S. II1 and TIMOTHY, D. H.
(1984). Identification of two methionine transfer RNA genes in the maize mitochondrial
genome. Plant Physiol. 76, 1079-1082.
PARKS, T. D., DOUGHERTY, W. G., LEVINGS. C. S. III and TIMOTHY, D. H.
(1985). Identification of an aspartate rransfer RNA gene in maize mitochondrialDNA.
CUIT. Genet. 9, 517-519.
PEARSON, R. L., WEISS. J. F. and KELMERS, A. D. (1971). Improved separation,
of tRNAs on polychlorotrifluoroethylene supported reverse-phase chromatography
columns. Biochim. Biophys. Acta 228, 770-.
PFITZINGER, H., GUILLEMAUT, P., WEIL, J., H. and PILLAY, D., T., N. (1987).
Adjustment of the tRNA population to the codon usage in chloroplasts. Nucleic Acids
Res. 15, 1377-1386.
POWLING, A. (1981). Species,ofsmall DNA molecules found in mitochondria from
sugarbeet with notmal and male sterile cytoplasm~. Mol. Gen. Genet. 183;82-84.
QUETIER, F., LEJEUNE', B., DELORME. S. and FALCONET, D. (1985). Molecular
organization and expression of the mitochondrial genome of higher plants. In
"Encyclopedia od Plant Physiology" new series vol. 18, R.Douce and DA Day eds,
Springer Verlag, Berlin, pp. 25-35.
-
QUETIER. F. and VEDEL, F. (1977). Heterogenous population of mitochondrial DNA
molecu1es in higher plants. Nature 268,365-368.

---

1
1
95
RASMUSSEN. J. and HANSON, M. R. (1989). A NADH dehydrogenase subunit gene
1
is co-transcribed with the abnormal Petunia mitochondrial gene associated with
cytoplasrnic male sterility, Mol. Gen. Genet. 215, 332-336.
RODE, A., HARTMANN, c., FALCONET, D., LEJEUNE, B., QUETIER, F.,
1
BENSLIMANE, A., HENRY. Y. and DE BUYSER, J. (1987). Extensive rnitochondrial
variation in sornatic tissue cultures initiated from wheat immature embryos. Curr. Genet.
12, 369-376.
1
ROTHENBERG. M. and HANS ON, M. R. (1988). A functional mitochondrial ATP
synthase proteolipid gene produced by recornbination of parental genes in a petunia
somatic hybrid. Genetics 118, 155-] 61.
1
RUNEBERG-ROOS, P., GRIENENBERGER, J. M., GUILLEMAUT, P.,
MARECHAL, L., GRUBER. V. and WEIL, 1. H. (1987). Localization.sequence and
1
expression of the gene coding for tRNAPro(UGG) in plant mitochondria. Plant Mol. Biol.
9, 237-246.
SANGER. F. and COULSON, A. R. (1978). The use of chin acrylarnide gels for DNA
1
sequencing. FEBS Leu. 87,107-] 10.
SANGER, F., NICKLEN. S. and COULSON, A. R. (1977). DNA sequencing with
1
chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
SCHUSTER. W. and BRENNlCKE, A. (1985). TGA termination codon in the
1
apocytochrorne b gene from Oenothera mitochondria, CUIT. Genet. 9, 157-163.
SCHUSTER. W. and BRENNICKE, A. (1986). Pseudocopies of the ATPase (alpha)-
subunit gene in Oenothera mitochondria are present on different circular molecules. Mol.
1
Gen. Genet. 204, 29-35.
SCHUSTER. W. and BRENNICKE, A. (1987-a). Plastid,nuclear and reverse
1
transcriptase sequences in the mitochondrial genome of Oenothera: is genetic information
transferred between organelles via RNA? EMBO 1. 6, 2857-2863.
SCHUSTER. W. and BRENNICKE, A. (1987-b). Nucleotide sequence of the Oenothera
1
ATPase subunit 6 gene. Nucleic Acids Res. 15, 9092.
SCHUSTER. W. and BRENNlCKE, A. (1987-c). Plastid DNA in the mitochondrial
1
genome of Oenothera: intra- and interorganellar rearrangements involving pan of the
plastid ribosornal cistron. Mol. Gen. Genet. 210, 44-51.
SHAPIRO. D. R. and TEWARI, K. K. (1986). Nucleotide sequences of transfer RNA
1
genes in the Pisum sativum chloroplast D N A. Plant Mol. Biol. 6, 1-12.
SHARP, S. J., SCHAAK, 1., COOLEY, L., BURKE. D. 1. and SOLL, D. (1985).
1
Structure and transcription of eucaryote tRNA genes. CRC critical review in Biochemistry
19, 107-144.
SIBLER, A. P., DIRHEIMER. G. and MARTIN, R. P. (1986). Codon reading pattern
1
in Saccharomyces cerevisiae mitochondria based on sequences of mitochondrial tRNAs.
FEBS Lett. 194, 131-138.
1
SILBERKLANG, M. N., GILUM. A. M. and RAJBHANDARY, U. L. (1979). Use of
in vitro (32)P labelling in the sequence analysis od non radioactive tRNAs. Methods in
Enzymology 59,58-109.
1
1
1

---

96
SMALL, 1. D., EARLE, E. D., ESCOTE-CARLSON, L. J., GABAY-LAUGHAN, S.,
LAUGHAN.1. R. and LEA VER, C. J. (1988). A comparison of cytoplasmic revertants
to fenility from different cms-S maize sources. Theor. Appl. Genet. 76, 609-618.
'.
;c
SMALL, 1. D., ISAAC. P. G. and LEAVER, C. J. (1987). Stoichiometric differences in
DNA molecules containing the atpA gene suggest mechanisms for the generation of
rnitochondrial genome diversity in maize. EMBO J. 6, 865-869.
SOUTHERN, E. M. (1975). Detection of specifie sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis. 1. Mol. Biol. 98, 503-518.
SPENCER, D. F., BONEN. L. and GRAY, M. W. (1981). Primary sequence of wheat
mitochondrial 5S ribosomal ribonucleic acid: functional and evolutionary implications.
Biochem. 20,4022-4029.
SPENCER, D. F., SCHNARE. M. N. and GRAY, M. W. (1984). Pronounced
structural similarities between the small subunit ribosomal RNA genes of wheat
mitochondria and Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 493-497.
SPRINZL, M., HARTMANN, T., WEBER, 1., BLANK. J. and ZEIDLER, R. (1989).
Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes. Nucleic Acids Res.
17suppl, rl-rl72.
STAMPER, S. E., DEWEY, R. E., BLAND. M. M. and LEVINGS, C. S. III (1987).
Characterization of the gene urf13-T and an unidentified reading frame, ORF 25, in maize
and tobacco mitochondria. CUIT. Genet. 12, 457 -463.
STEINMETZ, A. A., KREBBERS, E. T., SCHWARZ, Z., GUBBINS. E. J. and
BCXJORAD, L. (1983). Nucleotide sequences of five maize chloroplast transfer RNA
genes and their flanking regions. 1. Biol. Chem. 258, 5503-5511.
STERN, D. B., BANG. A. G. and THOMPSON, W. F. (1986). The waterrnelon
rnitochondrial URF-1 gene: evidence for a complex structure. CUIT. Genet. 10,857-869.
STERN. D. B. and GRUISSEM, W. (1987). Control of plastid gene expression: 3'
inverted repeats act as mRNA processing and stabilizing elements, but not terminate
transcription. Cell 51,1145-1157.
STERN. D. B. and LONS DALE, D. M. (1982). Mitochondrial and chloroplast genomes
of maize have a 12-kilobase DNA sequence in common. Nature 299,698-702.
STERN. D. B. and NEWTON, K. 1. (1984). Isolation of intact plant mitochondrial RNA
using aurintricarboxylic acid. Plant Mol. Biol. Reporter 2, 8-15.
STERN. D. B. and PALMER, J. D. (1984). Extensive and widespread homologies
between rnitochondrial DNA and chloroplast DNA in plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA
81, 1946-1950.
SUGINO, A., GOODMANN, H. M., HEYNECKER, H. L., SHINE, J., BOYER. H.
W. and COZZARELLI, N. R. (1977). Interaction of the bacteriophage T4 RNA and
DNA ligases in joining of duplex DNA at base-paired ends. 1.Biol.Chem. 252,3987-.
SYNENSKl, R. M., LEVINGS. C. S. III and SHAH, D. M. (1978). Physicochemical
characterization of mitochondrial DNA from soybean. Plant Physiol. 61,460-464.
TIMMIS. J. N. and SCOTT, N. S:(1983). Sequence homology between spinach nuclear
and chloroplast genomes. Nature 305, 65-67.

---

1
97
1
TIMOTHY, D. H., LEVINGS, C. S. III, HU. W. W. L. and GOODMAN, H. H.
1
(I983). Plasmid-like mitochondrial DNAs in diploperennial ieosinte. Maydica 28, 139-
149.
VEDEL. F. and QUETIER, F. (I974). Physico-chemical chzracterization of
1
mitochondrial DNA from potato tubers. Biochim. Biophys..Acta 340,374-387.
W AHLEITHNER. J. A. and WOLSTENHOLME, O. R. (l9S7). Mitochondrial plasmid
1
DNAs of broad bean: nuc1eotide sequence, complex secondzry structures, and
transcription. CUIT. Genet. 12, 55-67.
WAHLEITHNER. J. A. and WOLSTENHOLME, D. R. (J938). Ribosomal protein S 14
1
in broad bean mitochondria1 ONk Nuc1eic Acids Res. 16,6897-6913.
WALLACE, R. B., SHAFFER, J., MURPHY, R. F., BOJ\\:-.ŒR, J.; HIROSE. T. and
1
ITAKURA, K. (1979). Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to f X 174
DNA: the effect of single base pair mismatch, Nuc1eic Acids Res. 6, 3543-3557.
1
WARD, B. L., ANDERSON. R. S. and BENDICH, A. J. (981). Mitochondrial
genome is large and variable in a family of plants (cucurbitaceae), Cell 26, 793-803.
WEISS, B., JACQUEMIN-SABLON, A., LIVE, T. R., FAREED. G. C. and
1
RICHARDSON, C. C. (1968). Enzymatic breakage and joining of deoxyribonuc1eic
acids. VI. Furtherpurification and properties of polynucleotide ligase from Escherichia
coli infected with bacteriophage T4. J.BioI.Chem. 243,4543-4555.
1
WEISSINGER, A. K., TIMOTHY, D. H., LEVINGS, C. 5. III, HU. W. W. L. and
GOODMAN, M. M. (1982). Unique plasmid-like rnitochoncrial DNAs from indigenous
1
maize races of latin America. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79. 1-5.
WINTZ, H. (1988). Contribution à l'étude de l'organisation ;:'1 de la structure des gènes
de tRNA mitochondriaux des plantes. Thèse de Doctorat, Université LOUIS PASTEUR,
1
Strasbourg, France.
WINTZ, H., CHEN. H. C. and PILLA Y, D. T. N. (1987). \\'uc1eotide sequence of a
1
soybean mitochondria tRNA Glu (TTC) gene. Nucleic Acids Res. 15, 10588.
WINTZ, H., CHEN. H. C. and PILLA Y, D. T. N. (1988-aJ. Presence of a chloroplast-
1
like elongator tRNAMet gene in the mitochondrial genomes 0-;- soybean and Arabidopsis
thaliana. CUIT. Genet. 13, 255-260.
WINTZ, H., CHEN. H. C. and PILLA Y, D. T. N. (1989). Partial characterization of the
1
gene coding for subunit IV of soybean mitochondrial NADH dehydrogenase. CUIT.
Genet. 15, 155-160.
1
WINTZ, H., GRIENENBERGER, 1. M., WEIL. J. H. and LONSDALE, D. M.
(1988-b). Location and nuc1eotide sequence of two tRNA genes and a tRNA pseudo-
gene in the maire mitochondrial genome: evidence for the trz..nscriprion of a chloroplast
1
gene in mitochondria. CUIT. Genet. 13, 247 -254.
WISSINGER, B., HIESEL, R., SCHUSTER. W. and BRL'JNICKE, A. (1988). The
NADH-dehydrogenase subunit 5 gene in Oenothera mitochondria contains two introns
1
ans is co-transcribed with the 5S rRNA gene. Mol. Gen. Gwet. 212, 56-65.
YOUNG, E. G., HANSON. M. R. and DIERKS, P. M. (1986). Sequence,and
1
transcription analysis of the Petunia mitochondrial gene for the ATP synthase proteolipid
subunit. Nucleic Acids Res. 14,7995-8006.
1
1

---

---

99
INl'RODUCTION
1
CHAPITRE 1 : MATERIELS ET METHODES
1. Matériel d'étude : le maïs
6
II. Purification des acides nucléiques
6
A. Extraction des acides nucléique mitochondriaux
6
1. Principe
~
6
1
2.
Purification des mitochondries
7
a) Croissance des plantes
7
b) Broyage
7
1
c) Centrifugations différentielles (Kolodner et
Tewari, 1972)
7
d) Purification des mitochondries sur gradient de
1
saccharose
8
3. Lyse des mitochondries et extraction des acides
1
nucléiques
8
4. Purification des acides nucléiques
9
a) Purification des RNA de haut poids
1
moléculaire
9
b) Purification des tRNA
9
1
ex) Dégradation du DN A
9
~) Purification des tRNA par
chromatographie
:
:
9
1
5. Dosage des RNA
~
l 0
6. Analyse des RNA par électrophorèse
10
1
a) Fractionnement des RNA de grandes tailles
10
b) Fractionnement des tRNA
11
B. Extraction du DNA nucléaire
12
1
C. Extraction des tRNA chloroplastiques
12
1. Isolement des chloroplastes
12
2. Purification des tRNA
13
1
IlI, Méthodes de clonage et analyse des acides nucléiques
13
1
A. Méthodes de clonage
13
1. Réalisation et criblage des mini-banques
13
a) Digestion du DNA par les enzymes de
1
restriction
13
b) Analyse des fragments de restriction par
1
électrophorèse sur gel d'agarose
14
c) Ligation des fragments de restriction avec le
vecteur de clonage
14
1
d) Transformation d'Eicoli par les plasmides
recombinants
15
1
1

---

100
a) Souches d'E.coli utilisées
1 5
~) Transformation des bactéries par la
méthode de
Hanahan
1 5 "-
- Préparation des cel Iules
compétentes
15
- Transformation
1 6
- Sélection des bactéries
transformées
16
· Le vecteur M13
16
· Principe
1 7
· Culture et sélection des cellules
recombinantes
1 7
e) Analyse des clones recombinants
:
17
a) Analyse des phages
1 8
- Analyse directe
1 8
- Analyse des phages après
purification du DNA
18
- Hybridation croisée des DN A
phagiques
:
19
~) Analyse des plasmides
1 9
- Méthodes de purification des
plasmides
19
· Méthode alcaline
1 9
· Méthode du lysat clair
20
y) Autres méthodes de criblage de la mini-
banque
20
- Criblage par analyse des profils de
restriction
20
- Criblage par hybridation
21
2. Clonage de fragments purifiés
2 1
a) Purification des fragments de restriction
2l
a) Utilisation de gel d'agarose à basse
température
de
fusion
21
~) Filtration des morceaux d'agarose
contenant du DNA
22
b) Clonage des fragments purifiés
22
3. Sous-clonage des fragments de DNA en vue de leur
séquençage
;
22
a) Sous-clonage basé sur la cartographie de
restriction
22
b) Utilisation d'oligonucléotides de synthèse
22
c) Sous-clonage par la technique du cyclone
23
B. Techniques de marquage radioactif des sondes
23
1. Marquage du DNA
:
···
23
a) Marquage à partir de DN A simple brin
23

---

1
101
1
b) Marquage du DNA double brin
24
1
c) Marquage des oligonucléotides de synthèse
24
2. Marquage des tRNA
~
25
a) Marquage à l'ex trérni té en 3' à l'aide de la T4
1
RNA ligase
25
b) Marquage à l'extrémité 3' à l'aide de la tRN A
nucléotidyl
transférase
25
1
C) Techniques de transfert et d'hybridation
26
1. Méthodes de
transfert
26
1
a) Transfert des acides nucléiques par capillari té
26
b) Transfert des tRNA sur membrane nylon
27
2. Techniques d'hybridation
2 7
1
a)
Membranes comportant des
fragments de
DNA
27
a) Préhybridation
2 7
1
~) Hybridation
28
y) Lavage
28
1
b) Membranes comportant du RNA
28
c) Membranes comportant des tRNA
:
29
D. Séquençage du DNA
29
1
1. Principe
29
2. Les réactions
29
a) Hybridation de l'amorce
2 9
1
b) Elongation et arrêt de la synthèse
30
c) Electrophorèse verticale sur gel de
1
polyacrylamide
30
d) Analyse des séquences nuc1éotidiques
30
1
Chapitre II : ETUDE DES GENES DE tRNA MITOCHONDRIAUX
DU MAIS
1
1. Détermination des cosrnides portant des gènes de tRNA
31
A) Cartes de restriction des génomes mitochondriaux 837-N
1
et 837-cms T
31
1
B) Localisation des gènes de tRNA sur les cercle-maîtres des
génomes
N et T
32
1) Analyse des tRNA mitochondriaux
3 2
1
a) Analyse sur gel d'agarose de la fraction 4S du
RNA mitochondrial.
~
32
b)
Absence de con taminants
chloroplastiques
32
1
2) Hybridation des tRNA mitochondriaux totaux
32
1
1
1

---

102
II. Séquençage et analyse des gènes de tRNA
34
A) Etude du gène de tRNA du cosmide 9-3H10
34
1. Présentation du cosmide
\\
34
2. Analyse du cosmide 9-3H 10 et identification du
fragment portant un gène de tRNA
34
3. Sous-clonage et séquençage du clone C7 -20
35
4. Analyse du gène de tRN ASer(U G A)
35
a) Analyse de la partie codante du gène
35
(3) Etude des régions flanquantes du gène de
tRNAScrCUGA)
36
y) Transcription du gène de tRNASer
37
B) Etude des gènes de tRN A du cosmide N8A 1
1.
Présentation
38
2. Identification du
fragment portant des gènes de
tRNA
38
3. Cartographie du fragment
BamHI de 2,7 kb et
détermination de la
séquence nucléotidique des gènes
de tRNAAsn(GUU) et de tRNAPhe(G AA)
3 9
4. Analyse des gènes de tRNA présents sur le fragment
BamI-II de 2,7 kb
40
a) Etude du gène de tRNAPhe(GAA)
.40
a) Analyse de la partie codante du gène de
tRNAPhc(GAA)
.40
~) Analyse des régions flanquantes du gène
Ph
.
de tRNA
e
40
b) Etude du gène de tRNAAsn(GUU)
.42
a) Analyse de la partie codante du gène
.42
~) Le noyau du maïs comporte-t-il le même
gène de tRNAAsn(GUU) que la
mitochondrie ?
44
y) Etude des régions flanquantes du gène de
tRNAAsn(GUU)
45
- Comparaison entre les régions flanquantes
des gènes de tRNAAsn(GUU) des
mitochondries des
plantes supérieures
.45
. Gènes de tRNAAsn(GUU)
mitochondriaux du
blé et du maïs
.45
. Comparaison des gènes de
tRNAAsn(GUU) mitochondriaux
des monocotylédones à celui du
lupin
46

---

1
1
103
- Comparaison entre les trois gènes de
1
tRN A Asn(GUU) mi tochondriaux et le gène de
tRNAAsn(GUU) du chloroplaste de maïs
:~ .46
- Comparaison entre les gènes de
1
tRNAAsn(GUU)
mitochondriaux
et
chloroplastiques d'une part et
nucléaire d'autre part..
.4 7
1
1
C) Etude des gènes de tRNA du cosmide N7F3
50
1. Présentation du cosmide
50
2. Analyse du cosmide N7F3 et identification des
1
fragments comportant des gènes de tRNA
51
3. Sous-clonage du fragment BamHI 3,5 kb du cosmide
N7F3
52
1
4. Cartographie du fragment BamHI 3.5 kb et
identification des régions codant pour des gènes de
1
tRNA
53
.5. Analyse des gènes de tRNA présents sur le fragment
3,5 kb BamHI
53
1
a) Etude du gène de tRNAGIU(UUC)
53
ex) Analyse de la partie codante du gène
53
~) Analyse des régions flanquantes du
1
gène
54
b) Etude du gène de tRNAPro(UGG)
55
1
ex) Analyse de la région codante du gène
55
~) Analyse des régions flanquantes du
gène
55
1
C. Etude du pseudogène de tRNAPro du cosmide N7B7
56
1. Présentation du cosmide
56
1
2. Analyse du cosmide et détermination du
fragment
portant un gène de tRN A
5 6
1
3. Détermination de la séquence nucléotidique du
fragment BamHI 1,25 kb et identification d'un gène
incomplet de tRNAPro
5 7
1
4. Le DN A mitochondrial du maïs a t-il perdu la partie
5' du deuxième gène de tRN APro ?
5 7
5. Analyse des régions flanquantes du gène de
1
tRN APro(UGA) et du gène incomplet de tRNAPro
5 8
a) Comparaison entre les régions flanquantes des
1
deux gènes du maïs
5 8
b) Comparaison entre les régions flanquantes des
gènes de !~NAPro(UGA) du blé et du maïs
58
1
E. Etude des gènes de tRNA du cosmide 8-3B2
60
1
1

---

104
. III. Organisation des gènes de tRNA sur les cercle-maîtres
des génomes mitochoadriaux de 'maïs des variétés B37-N \\(t
B 37 -cmsT
_
:
61
A. Hybridation avec des oligonucléotides de synthèse
61
B. Analyse de l'organisation des gènes de tRNA mitochondri aux
62
1) Comparaison entre les génomes B37 -N et WF9-N
62
2) Comparaison entre les génomes B37 -N et
B37cmsT
_
62
Chapitre III : ETUDE D'AUTRES REGIONS DU DNA
MITOCHONDRIAL DES VARIETES DE MAIS B37-N ET B37-
cmsT
1. Etude de deux fragments de DNA mitochondrial de maïs
s'hybridant à la fraction 4S du
RNA mitochondrial mais ne
comportant pas de gène de tRNA
64
A. Etude du fragment 1,25 kb XhoI du cosmide
9-1E8 (A2)
64
1. Présentation du cosmide 9-1 E8
64
2. Sous-clonage et séquençage d'un fragment Xhol du
cosmide 9-1 E8_
64
3. Analyse de Ha séquence du fragment Xhol de
1,25 kb
_
64
. L'urfl38 est-elle exprimée
dans la mitochondrie du maïs ?
65
B. Etude du fragment Smal de 2.7 kb du cosmide (9-2C4)
68
1. Présentation d!m cosmide
6 8
2. Sous-clonage des fragments du cosmide 9-2C4
68
3.
Analyse de fa séquence nucléotidique du fragment
BamHI-XhoI de nkb
68
II. Etude des régions du DN A mitochondrial du maïs
comportant
des
insertions
chloroplastiques
70
A. Etude du plasmide 5_7TB
70
1. Présentation dE plasmide
70
2.
Sous-clonage et séquençage du fragment
s'hybridant
aux tRNA totaux.,
70
3. Analyse de la séquence nucléotidique du fragment
HindIII-XhoI de 1,7 kb
70
a) L'hybridation observée est-elle due à la
présence de l'exon 2 du gène
7 1

---

1
105
1
~) L'hybridation est-elle liée à la présence
1
de
séquences
chloroplastiques
71
B. Le génome mitochondrial des variétés normales contient la
1
quasi totalité de la séquence répétée du
DNA chloroplastique
du ITIai·S
73
1
Chapitre IV : QUELQUES AN AL YSES SUR LES HYBRIDA TIüNS
DE RNA MARQUES À L'AIDE DE LA CCAse AVEC DES
FRAGMENTS DE DNA NE COMPORTANT PAS DE GENE DE tRNA
1
1) L'extrait enzymatique utilisé dans nos réactions
èd
'1
. . ,
')
77
1
posse e-t-i
une autre
acu vite
.
2) Les molécules marquées sont-elles des tRNA ?
77
a) Analyse de la fraction 45 marquée au
1
a-[32P]ATP à l'aide de la CCAse
77
b) Analyse des- régions de DNA s'hybridant à la
fraction 4S
77
1
a) y a-t-il des séquences communes entre
les fragments
A et B comportant les gènes
1
atp9 et urf240 ?
78
~) L'hybridation est-elle liée aux séquences
communes
?
78
1
c) Hybridation des fragments A et B avec la
fraction 4S
78
3).Discussion
7 9
1
1
Chapitre V : CONCLUSIONS GENERALES SUR LES GENES DE
tRNA MITOCHONDRIAUX DU MAIS
1
1. Origines des gènes mitochondriaux
81
2. Le code génétique dans la mitochondrie du maïs
83
3. Signaux de transcription des gènes de tRNA
1
mi toc h ondria ux
84
a) Recherche de séquences consensus dans les
,
régions flanquantes des gènes de tRNA
84
b)
Recherche de promoteurs internes
8 5
4. Conclusion
86
1
BIBLIOGRA·PHIE
87
1
1

---

ANNEXE 1 : ORIGINE PHYLOGENETIQUE (PROBABLE) DU MAIS
Environ
-Origine américaine (centre du Mexique)
20.000 av. J.C.
-Découvert lors du creusement d'un gratte
maïs primitif
(dernière période
ciel de Mexico à 70m de profondeur
1
interglacière)
1
-Morphologie inconnue (grain de pollen
1
1
seuls découverts)
1
1
1
1
1
1
1
--~-----------------~--------------------------------- - - - - - - - -
1
1
1
1
1
5000 av. J.C.
+
-monoïque
-pérenne
1 maïs ancestral~x~ Tripsacum 1
-inflo resce nce
-ramifiée
(mauvaise herbe
apicale mâle
-rnonoïcue
actuelle des champs
-inflorescence
-inflorescence
maïs -Mexique et
latérales femelle ou
apicale he rmaphrodite
Guatemala)
hermaphrodite
-inflorescence
-épillets vêtus
latérale hermaphrodite:
-taillage élévé
mâle à l'extrémité et
-épis de 2g environ
femelle à la base
-plante annuelle
introgression
génétique
Téosynte
~
x ----1 (Euchlaena ou
Zea maxicana)
CI!l
x--ITripsacum 1
2n= 20 chromosomes
Lm
Z.m
Z.m.
Z.m.
Z.m.
Z.m.
z.m.
indunata
indentata
everta
saccharata
amylacea
ceratina
tunicata
maïs corné maïs denté
pop-corn
maïs sucré
maïs farineux
maïs cireux maïs vêtu

---

1
1
ANNEXE 2:
Milieux ct tampons utilisés
1
1
rvlilieu S.O.B.:
par litre :
Bacto-tryptone:
20g
Ycast extract:
5g
1
NaCl:
O.5g
Ajuster le pH
7,5 avec du KOH
à
et stérilisa par autoclavagc.
1
1
Milieu L.G.:
par litre:
Bacto-Trypione:
lOg
Bacto-yeast extract:
Sg
1
NaCl:
lOg
Ajuster le pl-l à 7,5 avec du KOI-\\
1
MilieuL.13.-aQar: par litre:
1
Bacto-agar:
lSg(IS%)
Bacio-agar:
7g (7% )
clans le milieu L.B.
1
ajouter le bacto-agar juste
avant l'auroclavagc.
1
1
Tampon TFB :
KCl(ultrapure):
100m1\\'1
1
ivlnCl,4H20
4SmM
CaCl2,21-I:?O
1OmM
HACoCl3
3mM
K-~;1ES
IOmM
1
Filtrer et conserver ?i 4"C
1
Tampon TEA x 50 :
par litre:
1
Tris base:
242g
HCI glacial
57,lml
EDTA 0,5M; pH 8
100 ml
1
1
1
1

---