THESE DE DOCTORAT D'UNIVERSITE
présentée à
L'UNIVERSITE DES SCIENCES ET
TECHNIQUES DE LILLE
--
~---
-~---
iCONSEIL AFRICAIN ET MLGACHE~I
pour l'obtention du grade de
POUR L'ENSEIGNEMENT S PERIEUR
1
1
. C. A. M. E. S. -- OUAGA
UGOt!
•Arriv~e ',2~' OCT: ?Oô
.
DOCTEUR DE L'USTL LE~_reg'str~_~~u~__n__ :O'2~ ~"8~' Q' ,!
SPECIALITE: MICROBIOLOGIE
par
Ibrahima NDOYE
CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA
SYMBIOSE ENTRE AZORHIZOBIUMJ
RHIZOBIUM ET SESBANIA ROSTRATA
soutenue le 19 janvier 1990 devant la commission d'examen
composée de
MM.J. GUILLAUME
Président
R. TAILLIEZ
Directeur de thèse
G.TRUCHET
Rapporteur
B. DREYFUS
Rapporteur
11me M. HOLSTERS
Examinatrice
2
AVANT-PROPOS
La rédaction d'une thèse est toujours une tâche longue et souvent difficile. Il est
pourtant une page facile à écrire, la première où il est possible de remercier tous ceux
qui, de près ou de loin ont contribué à l'élaboration de cette thèse. Qu'ils me
pardonnent si je ne puis les citer tous ici.
Ce travail a été effectué en grande partie au laboratoire de Biologie des Sols de
l'ORSTOM à DAKAR (Sénégal).
Je remercie les autorités scientifiques Sénégalaises en particulier Monsieur
Mamadou MBOUP Directeur des Affaires Scientifiques et Techniques au Ministère
du Plan et de la Coopération et la Direction de l'ORSTOM qui m'ont permis de
réaliser ce travail.
Depuis plusieurs années, j'ai eu la chance de travailler à côté de Monsieur Bernard
DREYFUS, chef du laboratoire de l'ORSTOM sur la fixation biologique de l'azote.
Qu'il trouve ici toute ma sincère gratitude pour le soutien et l'intérêt porté à mes
recherches. Je le remercie tout particulièrement de son amitié et de sa confiance.
Une partie de ce travail a été réalisée au laboratoire de Biologie Moléculaire des
Relations Plantes-Microorganismes du Centre INRA-CNRS de Toulouse.
Je tiens à remercier Mrs. BOISTARD et DENARIE d'avoir bien voulu m'y
accueillir.
C'est Monsieur G. TRUCHET Directeur de recherche et chef du laboratoire de
Cytologie Végétale au Centre INRA-CNRS qui a eu la rude tâche de m'initier aux
techniques de cytologie. Malgré des occupations multiples, sa patience a supporté mes
incompétences en la matière; il a lu et corrigé on ne peut plus attentivement tous mes
documents. Même si ses remarques sont parfois un peu traumatisantes, il a réussi à
me faire transformer les différents manuscrits que je lui ai soumis en un document,
je l'espère, lisible et cohérent. Je lui en suis profondément reconnaissant. Je ne saurai
oublier dans son équipe, le dynanisme, l'enthousiasme et la précieuse collaboration
de Mr. J. VASSE, Mme Françoise de BILLY et Melle Sylvie CAMUT.
3
Avec la collaboration de l'ORSTOM, de l'ISRA et du laboratoire du Professeur
Van MONTAGU en Belgique, nous avons pu mettre en place et mener à bien des
essais en plein champ. J'ose espérer que ce travail profitera au monde paysan.
Monsieur J. GUILLAUME et Monsieur R. TAILLIEZ furent mes Professeurs à
Lille. Ils ont bien voulu retenir ma candidature pour une inscription en nouvelle thèse
et m'ont beaucoup aidé dans mes démarches administratives. Ils ont accepté de lire
ce manuscrit et de participer à ce jury, de même que Monsieur G. TRUCHET et
Madame M. HOLSTERS de l'Université de Gand en Belgique. Je tiens à leur
témoigner toute ma gratitude.
Je remercie tous les membres de l'équipe du laboratoire de Dakar. L'assistance de
Mrs. Saer NDIAYE, Lassana FALL et Jean BAKHOUM m'a été précieuse.
Je tiens à témoigner toute ma reconnaissance à Madame CISSE née Anne Marthe
KONTE qui a assuré la dactylographie du manuscrit,
Monsieur Jean Marc
LEBLANC pour la part prépondérante qu'il a prise dans la mise en forme pratique
de certains documents et Monsieur Marc DUCOUSSO pour l'aide apportée à la
réalisation des diapositives.
Une pensée affectueuse va à ma femme qui a su me comprendre et me soutenir
durant mes longs séjours hors du Sénégal.
4
Nom:NDOYE
Prénom: Ibrahima
TITRE : CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA SYMBIOSE ENTRE AZORHIZO-
BlUM, RHIZOBIUM ET SESBANIA ROSTRATA.
MOTS CLES
: AZORHIZOBIUM ; RHIZOBIUM; FIXATION D'AZOTE; NO-
DULES DE TIGE; SESBANIA ROSTRATA.
RESUME : La légumineuse tropicale Sesbania rostrata peut développer des nodules
fixateurs d'azote à la fois sur les racines et les tiges.
Après isolement d'un grand nombre de souches à partir de nodules de tige de S. ros-
trata et de nodules de racine de diverses espèces de Sesbania, des études taxonomiques,
physiologiques et de spectre de nodulation, nous ont permis de préciser la séparation de
ces souches en deux groupes distincts appartenant aux genres Azorhizobium et Rhizo-
bium.
Toutes les souches d'Azorhizobium induisent la formation de nodules effectifs aussi bien
sur les racines que sur les tiges de S. rostrata. Les souches de Rhizobium induisent égale-
ment des nodules effectifs sur les racines de cette plante, mais se répartissent en 4 caté-
gories selon leur aptitude ou non à induire des nodules sur la tige de S. rostrata et aussi
selon leurs degrés d'effectivité.
L'étude de l'ontogénèse des nodules racinaires de S. rostrata induits par Azorhizobium
ORS571 nous a permis de décrire:
- Un mode d'infection comportant trois étapes: invasion intercellulaire par les bactéries
suivie de la formation de poches d'infection intercellulaire et de cordons d'infection à
partir de ces poches.
- Un mode original de libération desAzorhizobium dans le cytoplasme de la cellule hôte
et un type de développement nodulaire encore jamais décrit à ce jour.
La quantification de la fixation d'azote par la méthode isotopique 15N nous a permis de
mettre en évidence le potentiel fixateur d'azote élevé de S. rostrata, soit 110 kg d'azote
fixé par hectare en 60 jours. Cette propriété nous a conduit à étudier S. rostrata comme
plante fourragère et à mener des essais en milieu paysan en utilisant S. rostrata comme
engrais vert dans les rizières. Nous avons ainsi obtenu sur plusieurs années un double-
ment des rendements du riz; l'apport de l'engrais vert étant dans tous les cas supérieur à
l'équivalent de 100 kg d'azote à l'hectare.
5
~:NDOYE
Surname : Ibrahima
TITLE : CONTRIBUTION TO THE STUDY OF THE AZORHIZOBIUM,
RHI-
ZOBIUM AND SESBANIA ROSTRA TA SYMBIOSIS.
KEYWORDS : AZORHIZOBIUM ; NITROGEN FIXATION; RHIZOBIUM,. STEM
NODULES; SESBANIA ROSTRATA.
SUMMARY: The tropical legume, Sesbania rostrata, can bear nitrogen fixing nodules
both on roots and stems.
We have isolated several bacterial strains from stem nodules of S. rostrata and from root
nodules of different Sesbania species.
After taxonomie, physiological and nodulation
spectrum studies we have precised the separation of these strains in two distinct groups
belonging to the generaAzorhizobium and Rhizobium. AllAzorhizobium strains form ni-
trogen fixing nodules both on the roots and stems of S. rostrata. Rhizobium strains isola-
ted from root nodules of other Sesbania species also form effective nodules on the roots
of Sesbania rostrata, but can be divided in four groups according to their ability to in-
duce effective nodules on S. rostrata stems. Root infection of S. rostrata by Azorhizobium
ORS571 involves both a direct intercellular invasion followed by the formation of inter-
cellular infection pockets and infection threads originating from these pockets.
Release of bacteria in the host cytoplasm and nodule development are very original and
have not yet been described.
The amount of Nz fixed by S. rostrata estimated by using ~ method, is about 110 kg ha-1
during a 60 day-growth. This high nitrogen-fixing potentialled us to study S. rostrata as
forage legume and made S. rostrata a useful green manure in paddy fields. Rice yields are
successfully doubled over several growing seasons. The introduction of green manure is
superior to the equivalent of 100 kg Nlha-1
6
ABREVIATIONS
ADF
Acide détergent fiber
partie disparue après à l'acide sulfurique IN
ADN
Acide désoxyribonucléique
AD RAO
Association pour le Développement de la Riziculture en Afrique de
l'Ouest
AlEA
Agence Internationale à l'Energie Atomique
ARA
Activité ribonucléique
DDSA
Anhydrique dodécényl succinique
DMP30
[2,4,6 - tris (Diméthyl amino méthyl)] phénol
ENA
Extractif non azoté
Hac
Hair curling
Had
Hair deformation
IEMVf
Institut d'Etude de Médecine Vétérinaire Tropicale
IRRI
International Rice Research Institute
ISRA
Institut Sénégalais de Recherches Agricoles
LNERV
Laboratoire National de l'Elevage et des Recherches Vétérinaires
(Sénégal)
MAT
Matière azotée totale
mn
minute
MNA
Anhydride méthyl norbornène
MS
Matière sèche
NDF
Neutral détergent fiber
partie disparue après attaque au lauryl sulfate de sodium
7
nm
nanomètre (10-9 mètre)
ORSTOM
Institut Français de Recherche Scientifique pour le Développement en
Coopération
PHB
Poly-p-hydroxybutyrate
pSym
plasmide symbiotique
q.s.p.
quantité suffisante pour
v/v
volume/volume
~
micromètre (10-6 mètre)
~ole
micromole (1O-6mole)
8
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE
13
Chapitre 1 : RHIZOBIUM ET AZORHIZOBIUM
19
1. Introduction
20
Il, Matériels et Méthodes
24
l-Souchesbactériennes
24
2 - Isolement des souches d'Azorhizobium et de Rhizobium
24
3 - Milieux de culture pour Rhizobium et Azorhizobium
24
3.1. Milieu YM
24
3.2. Milieu YL
26
3.3. Milieu pour la fixation d'azote in vitro
26
3.4. Milieu adapté à l'étude des caractères nutritionnels
et de la taxonomie numérique
26
4 - Milieu de culture pour les plantes hôtes
27
4.1. Stérilisation et germination des graines
27
4.2. Milieu de culture des plantes
27
5 - Culture des plantes
29
S.1. Cultures en tubes
29
S.2. Cultures en vases de végétation
29
6 - Inoculation des plantes
29
6.1. Inoculation des racines
29
6.2. Inoculation des tiges de S. rostrata
30
7 - Evaluation de la fixation symbiotique
30
7.1. Dosage de l'azote minéral
30
7.2. Dosage de l'activité nitrogénase
31
7.2.1. Activité réductrice d'acétylène
31
7.2.2. Principe de la méthode
31
7.2.3. Conditions expérimentales
32
7.2.4. Technique du dosage
32
7.2.S. Calcul de la quantité de Cili4 produite
32
9
ill. Résultats
1 - Caractérisation physiologique et taxonomique
35
1.1. Isolement des souches bactériennes
35
1.2. Test de fixation libre
35
1.3. Taxonomie numérique
35
2 - Le spectre d'hôte
38
2.1. La nodulation de racine
38
2.2. La nodulation de tige
38
3 - Effectivité des souches de Rhizobium et d'Azorhizobium
41
IV. Discussion et conclusion
45
Chapitre fi - INFECTION ET DEVELOPPEMENT DES NODULES
DE RACINE DE SESBANIA ROSTRATA
47
1 - Introduction
48
1. Infection
48
1.1. Infection par poils absorbants
48
1.2. Infection par pénétration intercellulaire
49
2 - Développement du nodule
50
2.1. Nodules radiculaires des légumineuses tempérées
51
2.1.1. La phase organogénique
51
2.1.3. Le nodule mature
52
2.2. Nodules radiculaires de légumineuses tropicales
53
2.3. Nodules caulinaires de légumineuses tropicales
54
2.3.1. L'infection
55
2.3.2. Développement du nodule
56
2.3.3. Le nodule mature
56
fi - Matériels et Méthodes
57
1 - Culture de S. rostrata
57
2 - Méthodes de fixation et d'inclusion
57
2.1. La fixation
57
2.2. La deshydratation
57
2.3. Imprégnation dans la résine d'inclusion
58
2.3.1. Préparation de l'Epon
58
2.3.2. Imprégnation des échantillons
58
2.4. Inclusion dans des gélules et polymérisation
58
10
3 . Microtomie et microscopie
59
3.1. Microscopie photonique
59
3.2. Microscopie électronique
59
4 - Méthode d'éclaircissement
59
4.1. Racines entières
59
4.2. Sections de nodules
60
III· Résultats
61
1 • Infection racinaire et développement des nodules
61
1.1. Sites de nodulation et mode d'infection
61
1.2. Développement du nodule
62
2 - Différenciation ultrastructurale des cellules végétales et des bactéroïdes
65
2.1. Poches d'infection intercellulaires
65
2.2. Filaments d'infection et libération bactérienne
66
2.3. Différenciation du tissu fixateur
67
IV - Discussion
70
Chapitre ID - QUANTIFICATION DE L'AZOTE FIXE PAR
S. ROSTRATA
79
1 - Introduction
80
II - Matériels et Méthodes
82
1 • Méthodes de culture
82
2 - Estimation de l'azote fixé par S. rostrata et S. sesban : méthode par
différence et isotopique 15N
82
2.1. Dispositif expérimental
82
2.2. Préparation du sol
82
2.3. Culture des plantes
83
2.4. Technique d'inoculation
83
2.5. Traitement
84
2.6. Estimation de la fixation d'azote
84
2.6.1. Méthode de la différence
85
2.6.2. Méthode directe de la dilution isotopique
85
2.7. Analyses statistiques
89
I l
ID • Résultats et Discussion
90
1 - Nodulation et activité flxatrice d'azote de S. rostrata et de S. sesban
90
2 - Estimation de l'azote fixé par S. rostrata et S. sesban
90
2.1. Influence des différents traitements sur le poids sec et la teneur
en azote total de S. rostrata et de S. sesban.
90
2.2. Influence de la submersion et du drainage du sol sur la nodulation
92
2.3. Influence des différents traitements sur l'excès isotopique et
l'utilisation de l'engrais appliqué
92
2.4. Effet des différents traitements sur la fixation d'azote
92
2.5. Nodulation et fixation d'azote
96
2.6. Estimation de la fixation d'azote par la méthode de dilution isotopique
96
2.7. Estimation de la fixation d'azote par la méthode de différence
96
2.8. Estimation de la fixation d'azote
97
2.9. Effet de la submersion du sol
97
2.10. Quantité d'azote dérivé du sol, de l'engrais azoté et coefficient
d'utilisation de l'engrais (F.U.E.)
98
2.11. Méthodologie relative à l'évaluation de la fixation d'azote
99
IV • Conclusion
102
Chapitre IV· UTILISATION DE SESBANIA ROSTRATA COMME
ENGRAIS VERT ET FOURRAGE
103
1 - Introduction
104
II - Matériels et Méthodes
107
1 - Utilisation de S. rostrata comme engrais vert
107
1.1. Les traitements
107
1.2. Dispositif expérimental
107
1.3. Analyse de sols
107
1.4. Fumures minérales
107
1.5. Analyse des résultats
111
1.6. Culture des légumineuses
111
1.6.1. Préparation des graines
111
1.6.2. Inoculation et semis
111
1.7. Culture du riz
111
1.7.1. Préparation d'une pépinière
111
1.7.2. Enfouissement des légumineuses
113
1.7.3. Repiquage du riz
113
1.7.4. Récolte du riz
113
1.8. Estimation de la quantité d'azote et de l'engrais vert enfoui dans les rizières
113
2 - Utilisation de S. rostrata comme fourrage
113
2.1. Productivité
113
12
2.1.1. Les traitements
113
2.1.2. Dispositif expérimental
117
2.1.3. Conditions agronomiques
117
2.1.4. Fumures minérales
117
2.1.5. Inoculation et semis
117
2.1.6. Coupes
117
2.1.7. Analyse des résultats
117
2.2. Fourrage
120
2.3. Digestibilité
120
2.4. Analyses chimiques
120
ID - Résultats
122
1 - Influence de S. rostrata utilisée comme engrais vert sur le rendement en riz.
122
1.1. Essais en parcelles expérimentales
122
1.2. Essais menés par les paysans
122
2 - Utilisation de S. rostrata comme fourrage
125,
2.1. Productivité
125
2.2. Valeur alimentaire de S. rostrata
125
IV - Discussion et Conclusion
129
CONCLUSION GENERALE
132
BIBLIOGRAPHIE
137
PLANCHES PHOTOGRAPHIQUES
152
13
INTRODUCTION GENERALE
14
La fixation biologique de l'azote qui consiste en la réduction de l'azote
atmosphérique (N2) en ammoniaque (NH3) a une importance majeure dans le
fonctionnement de la biosphère. Elle apparaît comme l'un des processus
fondamentaux parmi les cycles biogéniques se déroulant dans le sol. A côté des
microorganismes fixant seuls l'azote atmosphérique, tels que Klebsiellapneumoniae,
Azotobacter vinelandii, Anabaena cylindrica ou Clostridium pasteurianum, le sol
recèle des bactéries des genres Rhizobium et Azorhizobium capables de vivre en
association avec des légumineuses, du genre Bradyrhizobium susceptibles de
s'associer à des légumineuses et à la non légumineuse Parasponia ou du genre Frankia
qui induit la nodulation de non légumineuses comme Alnus et Casuarina. Ces
bactéries sont toutes capables de fixer l'azote au profit de la plante avec laquelle elles
entrent en symbiose. L'importance agronomique et écologique de ces symbioses
fixatrices de N2 est considérable. Ainsi,
les bactéries fixatrices qui vivent en
association avec les plantes de la famille des légumineuses sont responsables de la
plus grande partie de la fixation d'azote dans les sols agricoles et ont été étudiées
activement depuis un siècle (Nutman, 1981).
La symbiose entre les bactéries des genres Rhizobium, Bradyrhizobium ou
Azorhizobium et les plantes supérieures de la famille des légumineuses est le résultat
d'interactions complexes entre la bactérie et la plante hôte.
Plusieurs étapes de développement dont les modalités peuvent varier selon
l'association symbiotique considérée conduisent à la formation du nodule. D'une
manière très générale, l'infection d'une légumineuse par une espèce de Rhizobium,
de Bradyrhizobium ou d'Azorhizobium provoque la formation d'un méristème
nodulaire par dédifférenciation locale des cellules du cortex racinaire. L'activité
méristématique conduit ensuite au développement d'un organe spécialisé, le nodule
dont les cellules centrales sont envahies par les bactéries (voir les revues de Vincent,
1980 ; Newcomb, 1981 ; Verma et Long, 1983). La plante subvient aux besoins
énergétiques de la bactérie en fournissant des substances carbonées résultant de la
photosynthèse; elle fournit en outre un microenvironnement très particulier
nécessaire à la fixation de l'azote et synthétise les enzymes permettant l'assimilation
rapide de l'ammoniaque produit. Parallèlement, à l'intérieur du nodule, les bactéries
,
\\
se différencient en bactéroïdes capables de réduire l'azote moléculaire N2 en NH3,
au sein des nodules matures.
15
La bactérie comme la plante possède de nombreux gènes impliqués dans la
symbiose. Chaque étape est ainsi sous le contrôle génétique des deux partenaires.
L'identification des gènes intervenant dans la relation symbiotique passe par la
recherche, la sélection de variants génétiques ou mutants de la bactérie et de la plante
affectés dans leurs propriétés symbiotiques.
De nos jours, un certain nombre de mutants bactériens qui provoquent des arrêts
dans le programme de développement du nodule ont été obtenus. Ces mutants ont
permis
de définir les étapes successives menant à la formation d'un nodule,
notamment le stade d'invasion par les bactéries et d'identifier chez les bactéries, les
gènes codant pour la synthèse du complexe enzymatique, la nitrogénase. Plusieurs
gènes
impliqués
dans la nodulation ont été identifiés grâce aux méthodes de
génétique et de biologie moléculaire (mutagénèse, utilisation de
plasmides
conjugatifs, clonage et hybridations moléculaires de régions du génome,...) (Debellé
et Sharma, 1986; Van den Eede et al., 1987; Davis et al., 1988 ; voir les revues Rolfe
et Gresshoff, 1988 ; Long, 1989).
Les espèces de Rhizobium à croissance rapide possèdent généralement des
plasmides de grande taille appelés plasmides symbiotiques (pSym) car ils portent des
gènes essentiels pour la nodulation et la fixation d'azote. Chez les symbiontes des
genres Bradyrhizobium
et Azorhizobium, les gènes symbiotiques ne sont
apparemment pas situés sur les plasmides.
Certains des gènes identifiés, interviennent lors des
étapes précoces de la
symbiose, c'est le cas des gènes de nodulation appelés gènes nod qui sont subdivisés
en trois classes :
- Les
gènes
nad communs (nad ABC) ; ces gènes
sont physiquement
et
fonctionnellement conservés chez les Rhizobium, Bradyrhizobium et.Azorhizobium.
Des mutations dans ces gènes provoquent une perte complète de la capacité à infecter
et à noduler les plantes hôtes.
- Les gènes contrôlant la spécificité d'hôte (nad H. nad FE, nad G, nad MN, nod
.Q)... Ces gènes ne peuvent pas généralement être complémentés par des gènes
provenant d'autres espèces de Rhizobium et leur mutation provoque un retard, une
réduction de la nodulation ou une modification de leur spécificité d'hôte (Debellé et
Sharma, 1986 ; Horvath et al., 1986; Debelle et al., 1986; Cervantes et al., 1989 ).
16
- Les gènes nod D sont des gènes régulateurs des gènes nad communs et des gènes
de spécificité d'hôte, dont l'expression dépend aussi de facteurs présents dans les
exsudats racinaires et appartenant à la famille des flavones ou des isoflavones (Rolfe
et Gresshoff, 1988 ; Djordjevic et al., 1988). Chez Azorhizobium,
deux régions
chromosomiques Illld...l et nilli.2 essentielles à la nodulation caulinaire et racinaire ont
été mises en évidence (Van den Eede et al., 1987) ; l'une de ces régions montre une
homologie de séquence avec les gènes nod communs (ABC) (Van den Eede et al.,
1987) .L'expression des gènes nod de Azorhizobium ORS 571 est induite en présence
de fragments de racines et de tige de Sesbania rostrata (Goethals et al., 1989).
Des gènes intervenant dans le contrôle de l'infection ont été identifiés sur le
chromosome ou sur un second mégaplasmide (Finan et al., 1986) : ce sont les gènes
esa. et ....ndY. Des mutants EXO-
et Ndv de R. meliloti,
déficients dans la
production d'exopolysaccharides acides (Finan et al., 1986) ou de ~ glucane (Dylan
et al., 1986) induisent des nodules Fix- sur la luzerne.
Les autres gènes interviennent dans les étapes tardives de la symbiose et ont
été groupés en deux classes: les gènes nif et fix.
- Les gènes nif sont définis comme les gènes de fixation d'azote ayant une
homologie avec ceux de la bactérie Klebsiellapneumoniae.
L'étude génétique de Azorhizobium a été facilitée par rapport aux Rhizobium et
Bradhyrhizobium par la propriété que possède Azorhizobium de croître et de fixer
l'azote en culture pure; ce qui donne un moyen de sélection simple de mutants nif
en culture dans des boîtes de Petri. Après mutagénèse à l'Ethyl Methane Sulfonate
(E.M.S.), une collection de mutants nif a été obtenue par Elmerich et al. (1982).
Un certain nombre de gènes nifont été identifiés chezAzorhizobium (Norel et al.,
1985 , Denefle et al., 1987 ; Pawlowski et al., 1987, Van den Eede et al., 1987). Un
nouveau gène.nif a été identifié et localisé; sa séquence ne montre aucune homologie
avec les autres gènes nif décrits auparavant (Alexandre et Elmerich, 1988). Ratet et
al. (1988) ont étudié la régulation des gènes nif d'Azorhizobium
in planta et ~
planta (voir la revue de de Bruijn, 1988).
17
- Les gènes fix, ne semblent pas avoir d'équivalents homologues chez Klebsiella
pneumoniae. Ce sont des gènes propres àRhizobium qui sont nécessaires àla fixation
symbiotique de l'azote (Earl et al., 1987).
L'étude génétique du végétal a été plus longue du fait même de la complexité de
son génome et de plus on s'est d'abord intéressé à la bactérie. Néanmoins, des études
ont permis d'identifier des gènes végétaux impliqués dans la symbiose et dont certains
ont été clonés (Delauney et Verma, 1988 ; Rolfe et Gresshoff, 1988). L'expression de
ces gènes conduit à la synthèse de protéines spécifiques des nodules, les nodulines
(Govers et al., 1987). Cette expression est contrôlée en fonction des différentes étapes
de développement du nodule. On peut ainsi distinguer deux types de nodulines selon
le moment de leur apparition: les nodulines "précoces" et les nodulines "tardives ".
Certaines de ces nodulines identifiées comme les léghémoglobines, sont très
abondantes et représentent de 10 à 30% des protéines solubles dans un nodule
mature. Par leurs propriétés
de fixation de l'oxygène moléculaire, les
Iéghémoglobines contrôlent la concentration en oxygène libre des cellules du nodule,
tout en restant capables d'alimenter en oxygène la respiration intense des bactéroïdes
(voir Appleby, 1984). La synthèse de la léghémoglobine résulte d'une coopération
remarquable entre la bactérie et la plante hôte qui synthétisent respectivement l'hème
et la partie protéique. A présent, la séquence de plusieurs nodulines a été identifiée,
déterminée et
pour certaines, une fonction a pu leur être attribuée
(uricase,
glutamine synthétase, sucrose synthase, malate déshydrogénase, protéines de la
membrane péribactêroïdienne) (Turgeyet al., 1987 ; Govers, 1987 ; Thummler et
Verma, 1987). Certaines espèces végétales ont fait l'objet d'études particulièrement
approfondies dans ce sens: soja, pois, luzerne, lupin, Sesbania.
Contrairement à la plupart des légumineuses qui ne sont nodulées qu'au niveau
de leurs racines, quelques légumineuses tropicales portent des nodules à la fois sur
les racines et les tiges : c'est le cas des genres Neptunia ( Schaede, 1940),
Aeschynomene (Arora, 1954 ; Alazard, 1985 ; Alazard et Duhoux, 1988) et Sesbania
(Dreyfus et Dommergues, 1981).
Au cours cette étude nous nous sommes intéressés à S. rostrata, seule espèce de
Sesbania à porter des nodules caulinaires (Dreyfus et Dommergues, 1981).
Sesbania rostrata est une plante annuelle qui pousse durant la saison des pluies
dans les sols inondés du Sahel, zone s'étendant du Sénégal à l'Ethiopie (Berhaut,
18
1976) et que l'on trouve également
dans la zone climatique
équivalente de
l'hémisphère sud, en Angola, au Mozambique et à Madagascar. Au Sénégal, Sesbania
rostrata forme des peuplements denses au Nord, dans la vallée du fleuve Sénégal et
dans les mares temporaires du Ferlo. La vitesse de croissance de Sesbaniarostrata est
très grande et sa hauteur maximale atteinte en 3 mois, varie souvent entre 2m et 4m.
Une floraison précoce permet à la plante de fructifier à la fin de la courte saison des
pluies de ces régions sahéliennes. Bien que Sesbania rostrata puisse pousser en terrain
exondé mais humide, adulte, on la retrouve préférentiellement dans des zones de
bas-fonds inondée sous 10 à 15 cm d'eau.
L'objectif de notre travail a donc été l'étude de la symbiose entreAzorhizobium,
Rhizobium et Sesbania rostrata.
Dans une première partie, nous avons isolé et caractérisé un très grand nombre
de souches à partir de nodules de tige et de racine de S. rostrata et à partir des nodules
de racine de diverses espèces de Sesbania. Des études physiologiques, taxonomiques
et des tests de nodulation, nous ont permis ensuite de séparer les souches isolées en
deux genres, Rhizobium et Azorhizobium.
Dans un deuxième chapitre, l'étude structurale de l'infection et de l'organogénèse
des nodules racinaires de S. rostrata a été effectuée. Nos résultats ont été ensuite
comparés à ceux décrits dans le cas des nodules racinaires de légumineuses tropicales
et tempérées et en particulier dans le cas des nodules de tige de S. rostrata.
Dans un troisième chapitre, nous avons quantifié la fixation d'azote par S. rostrata,
par la méthode isotopique 15N, et montré ainsi le potentiel fixateur d'azote élevé de
S. rostrata.
La fixation d'azote très active de S. rostrata nous a enfin permis d'envisager
l'utilisation de cette plante à la fois comme engrais vert, en milieu paysan, et comme
fourrage pour l'alimentation animale.
19
CHAPITRE 1
RHIZOBIUM ET AZORHIZOBIUM
20
I. INTRODUCTION
Les microorganismes fixateurs d'azote isolés à partir des nodosités des
légumineuses sont des bactéries que l'on range classiquement dans la famille des
Rhizobiacea. Toutes ces bactéries fixatrices d'azote appartenaient initialement au
genre Rhizobium, classification au départ basée essentiellement sur le concept
d'inoculation croisée. En règle générale, il avait été reconnu qu'une souche de
Rhizobium ne pouvait former des nodules (souche infective) et fixer l'azote (souche
effective) que sur un nombre limité d'espèces de légumineuses. Cette spécificité
d'hôte fondée sur la nodulation d'un groupe de légumineuses, appelé groupe
d'inoculation croisée à conduit a la définition de plusieurs espèces de Rhizobium. Un
groupe d'inoculation croisée, est défini comme un groupe de plantes qui peuvent être
nodulées indifféremment par toutes les bactéries isolées à partir de nodosités d'une
plante de ce groupe.
Plus tard, les Rhizobium furent divisés en deux
genres, sur la base d'études
systématiques fondées sur la taxonomie numérique (T'Mannetje, 1967), sur des
méthodes d'hydridationADN-ADN ouADN-ARN ribosomale (Gibbins et Gregory,
1972) et sur d'autres critères tels que le taux de croissance en milieu complexe
mannitol-extrait de levure, la teneur en base G + C du génome et l'arrangement
flagellaire (Jordan, 1982 ; Jarvis et al., 1986). Ces deux genres sont: Rhizobium et
Bradyrhizobiuum
Le genre Rhizobium comprend quatre espèces toutes à croissance rapide et dont
le temps de génération est inférieur à 6 heures : Rhizobium meliloti, Rhizobium
leguminosarum, Rhizobium fredii et Rhizobium loti. Il existe aussi des rhizobia
tropicaux à croissance rapide, en particulier ceux qui nodulent les genres Leucaena,
Aeschynomene, Acacia et Sesbania (Trinick, 1980 ; Dreyfus et Dommergues, 1981 ;
Alazard, 1985).
Le genre Bradyrhizobium comprend toutes les bactéries classées auparavant
comme Rhizobium à croissance lente ou Rhizobium du groupe cowpea et dont le temps
de génération est supérieur à 6 heures (Jordan, 1984, 1987 ; Jarvis et al., 1986) : R.
japonicum, R. sp. vigna.
La souche ORS 571 isolée des nodules de tige de Sesbania rostrata (Dreyfus et
Dommergues, 1981 ; voir la revue de de Bruijn, 1989) possède par sa vitesse de
21
croissance 3 heures sur milieu YL les caractéristiques des Rhizobium à croissance
rapide. Toutefois, certains caractères physiologiques la place taxonomiquement plus
proche des Bradyrhizobium (Dreyfus, 1982; Dreyfus et al., 1984). Récemment, sur la
base d'études comparatives de caractères physiologiques, biochimiques, de profils
protéiques et d'homologies entre ADN total et ARN ribosomal, Dreyfus et al (1988)
ont montré que la souche ORS 571 appartenait à un nouveau genre bactérien, sous
branche des Rhodopseudomonas palustris, et qu'elle est plus étroitement liée à
Xan thobacter. Ce genre nouveau appelé Azorhizobium est distinct à la fois des
Rhizobium et des Bradyrhizobium ; il comprend une seule espèce Azorhizobium
caulinodans dont la souche type est ORS 571 (tableau 1).
On sait que certaines souches de Bradyrhizobium: [B. japonicum (Agarwal et
Keister, 1983), Bradyrhizobium sp. (cowpea) (Sindhu et Dardawal., 1986), 32 Hl
(Kurz et Larue, 1975 ; Keister, 1975), CB 756 (Benders et al., 1986)] et de Rhizobium
[Rhizobium IHP 100 isolée de Cajanus Cajan (Benders et al., 1986), Rhizobium de
Parasponia ANU 289 (Mohapatra et al., 1983), R. leguminosarum (Kurz et Larue,
1975; Stam et al., 1983), R. meliloti (Bedmar et Olivares, 1979) et R. trifolii 0403
(Urban et al., 1986)], manifestent une activité nitrogénase en culture pure et se
comportent donc comme les fixateurs libres.
La souche ORS 571 présente également une activité nitrogénase en culture pure,
mais a de plus la propriété exceptionnelle de pousser aux dépens de l'azote
moléculaire comme seule source d'azote. Récemment, il a été démontré, que deux
souches ORS 310 et ORS 322 isolées respectivement des nodules de tige de
Aeschynomene afraspera et de A. indica sont capables comme la souche
d'Azorhizobium ORS 571, de présenter une activité nitrogénase en culture pure et de
croître aux dépens de l'azote moléculaire (Alazard, communication personnelle).
D'un point de vue physiologique, la souche ORS 571 présente également des
originalités. D'une part, la tension d'oxygène optimale pour la fixation d'azote est de
3%, soit 30 fois supérieure aux valeurs connues pour la dérépression de la nitrogénase
chez les Bradyrhizobium (Bergersen et Turner, 1980) ; d'autre part, la nitrogénase de
la souche ORS 571 paraît tout aussi fonctionnelle in vivo à 42°C qu'à 30°C. Son activité
nitrogénase est très élevée, 1500 nanomoles Cili4lh/mg de protéine (Dreyfus et
Dommergues, 1981 ; Dreyfus et al., 1983). Cette activité est du même ordre de
22
Tableau 1
Classification des Rhizobium
1
1
1
Nouvelle classification
IAncienne classificationlPlantes-hôtesl
1
1
1
RHIZOBIUM
j Medicago
R.: mel.i.lot i
1
R.' mel.i.loti i
R.. Leguminosal'um bv .. tl'ifoLii
1
R. tl'ifoLii
TY'ifoLium
1
"
"
"
viciae
R.' l.equminoearum
Vicia
1
"
"
"
phaeeol.i
R.' phaeeol.i
PhaseoLus
1
R.. fl'edii
1
GLycine soja
1
R.. Loti
1
Lotus
1
1 R.: ep :
"arct iquee"
Astl'agaLus
1
R.' ep : ( Seeban ia )
1
Sesbania
R.' ep, (Acacia, Leuoaena , Proeopie )1
Acacia
R.' ep :
(Nept un ia )
1
Neptunia
1
BRADYRHIZOBIUM
1
r---------I
B.' japonicum
R. japonicum
GLycine max
B.' ep: (Lup inue )
R.' Lupini.
Lupinus
B.' ep: (ViÇJfla)
R.' ep : "coiapea gl'OUP"
Vigna
B.. sp (Pal'asponia)
Pal'asponia
B.' ep : (Lotus)
Lotus
AZORHIZOBIUM
A.' caul inodane
Sesbania
23
grandeur que celle de K pneumoniae, soit de dixfois supérieure à celle des Rhizobium
étudiés jusqu'alors (Elmerich et al., 1982; Dreyfus et al., 1983).
Dans ce chapitre, notre objectif a consisté dans un premier temps à isoler un grand
nombre de souches à partir de nodules de tige et de racine de Sesbania rostrata et à
partir de nodules de racine de diverses espèces de Sesbania. Par la suite, nous avons
précisé la séparation des souches isolées en deux genres Azorhizobium et Rhizobium,
sur la base de leurs différences taxonomiques et physiologiques. Enfin nous avons
étudié les différences de nodulation caulinaire et racinaire de S. rostrata inoculée
avec certaines des souches appartenant aux genres Azorhizobium et Rhizobium.
24
II MATERIELS ET METHODES
1. Souches bactériennes
La liste des souches ainsi que leur plante-hôte d'origine est donnée au tableau (2).
2. Isolement des souches d'Azorhizobium et de Rhizobium
L'isolement des souches se fait à partir de jeunes nodules de tige ou de racine
(Vincent, 1970). Sitôt prélevé, chaque nodule,
est stérilisé superficiellement par
immersion dans l'éthanol à 90% (30 secondes) puis
dans une solution
0,1%
d'HgCL2 pendant 3 mn. Une fois le nodule rincé abondamment à l'eau distillée
stérile puis broyé, on ensemence par épuisement à l'anse de platine sur milieu de
croissance gélosé YMA ou YLA en boite de Petri. L'incubation se déroule à 30°C.
Une seconde méthode d'isolement, plus rapide, consiste à sectionner aseptiquement
un nodule frais et à piquer avec un filament de platine sa partie centrale avant
d'ensemencer le milieu gélosé,
Après plusieurs cycles de purification, les souches sont testées pour leur aptitude
à former des nodules sur la plante-hôte et conservées sur gélose inclinée YMA et
YLA, en tubes à vis ou en boîtes de Petri et à 4°C. Pour de longues conservations, les
souches sont congelées à - 80°C dans 50% de glycerol, dans des tubes Eppendorf
stériles (lml culture + 1ml glycerol).
3. Milieux de culture pour Rhizobium etAzorhizobium
3.1. Milieu YM
Ce milieu à base d'extrait de levure et de mannitol avec ou sans agar (YM ou YMA
Vincent, 1970) est utilisé pour la croissance et la conservation des souches de
Rhizobium. Ce milieu a la composition suivante en gramme/litre : mannitol: lOg ; Na-
glutamate: 0,5g; K2HP04: 0,5g; MgS04 : 0,2g; NaCl: O,lg; extrait de levure: 19;
FeCh: 4mg; agar:20g. Le milieu ajusté à pH 6,8 est autoclavé à 120°Cpendant 20 mn.
25
Tableau 2
Liste des souches testées
l
Souches
Isolement
lorigines géographiQUffi
Sources
1
Reglon du Fleuve
Azol'hizobiwn
cauLinodans -
ORS ,5l1 :
S. l'oscl'ata nDd.tig~
1 (Nord Sénégal)
B. DREYFUS
10
10
l
Rég ion de Casamance
590
1. NDOYE
I (Sud
Sénégal)
10
10
591
, Ouest Madagascar
R. FETTIARISON
1
10
10
592
"
"
1
1.
593
NDOYE
"
"
1
"
1
1
10
"
594
"
"
1
1
Il
10
10
595
1
"
1
ORS
56
Région du Fleuve
B. DREYFUS
1
"
,
10
"
SR
P. de
LAJUDIE
1
1
Il
10
SR
1
"
"
2
1
Région de Kaolack
D. ALAZARD
"
S3
,
"
(Centre Est Sénégal)
10
1
S4
"
"
"
1
10
"
S6
"
"
1
10
,
10
10
S2
"
1
"
580
Région du Fleuve
B. DREYFUS
,
"
10
10
581
1
"
"
1
10
582
Région de Kaolack
B. DREYFUS
1
10
10
583
1
"
"
10
1
10
10
584
1. NDOYE
1
1
10
Rhizobiwn sp;
51
nOd.raci'l' Sénégal
B. DREYFUS
IS. l'ostl'ata
10
10
Il
"
52
1
1
10
10
I l
10
53
,
1
10
10
10
10
57
1
I l
10
10
502
iS.' pubeecene
1
Il
10
"
507
IS, pachycal'pa
1
Il
604
1S.' acul.eat a
Ethiopie
1. NDOYE
1
10
600
IS, pachycal'pa
Sénégal
1
Il
606
,S. cannabina
Nord Vietnam
"
1
10
10
609
S; cannabina
Sud Vietnam
1
"
611
Philippines
\\s. gl'andifLol'a l'ose
"
1
10
613
Ses bani a sesban
Inde
1. NDOYE
1
10
10
614
"
"
,
10
1
10
615
'
"
I
10
616
s , qrandiflora bLanch1
"
"
1
•
10
PL1
pubescens
Sénégal
P.
de LAJUDIE
IS'
1
" S
S
l'ostl'ata
"
D. ALAZARD
i
,
7
1
1
1
26
3.2. Milieu YL
Le milieu complet appelé YL est utilisé pour la croissance et la fixation d'azote des
souches d'Azorhizobium (Dreyfus et al.,1983). Il correspond à la base L supplémentée
par de l'extrait de levure et du sulfate d'ammonium. Il contient en gIlitre: D, L-
sodium lactate: lOg; K2HP04: 1, 67g; KH2P04: 0,87g; MgS04, 7H20: O,lg; NaCI
: 0,05g; CaCh 2H20: 40mg; FeCh, 6H20: 10mg; Na2Mo04, 2H20: 5mg; MnS04,
H20: 2,5mg; ZnS04, 7H20: 0,7mg; CoS04, 7H20: 0,14mg; CuS04, 5H20: 0,12mg
; H3B03: 0,03mg; extrait de levure (Difco) : Ig et (NH4)2S04: Ig. Le milieu ajusté
à pH 6,8 est autoclavé à l20°C pendant 20 mn.
3.3. Milieu pour la fixation d'azote in vitro Lü :
Le milieu sans azote LO qui contient la base L supplérnentée par les trois vita-
mines: biotine, 2mgll ; acide panthothénique, 4mgll ; acide nicotinique, 20 mgll est
utilisé pour la fixation d'azote en culture des souches d'Azorhizobium.
3.4. Milieu adapté à l'étude des caractères nutritionnels et de la taxonomie numé-
rIque
La croissance de toutes les souches de Rhizobium et d'Azorhizobium a été réalisée
sur le milieu de base suivant :K2HP04 : 1,67g ; KH2P04 : 0,87g ; (NH4)2S04 : Ig ;
NaCl: 0,05g; MgS04, 7H20: O,lg; CaCh: 40mg; FeCh: 4mg; agar noble (Difco):
15g ; substrat carboné 1 à 2g ; Iml d'une solution d'oligo- éléments (Dreyfus et al.,
1983) ; 2 ml d'une solution de vitamines (Dreyfus et al., 1983) ; eau distillée : 1 litre ;
pH 6,8.
La liste des composés organiques utilisés pour l'étude de la taxonomie numérique
est donnée au tableau (7). Les substrats organiques constituant l'unique source de
carbone ont été testés à raison de 2g1l pour les glucides et Ig/l pour les autres composés
tels que les alcools, les hydroxyacides, les acides organiques, les composés
aromatiques, les acides aminés, les amines et les acides gras. Toutes les sources de
carbone ont été stérilisées au filtre millipore de porosité de 0,45/-Lffi et ajoutées au
milieu de base décrit ci-dessus. Ce milieu contenant 2% d'agar est réparti dans des
boîtes de Petri stériles.
27
L'inoculation sur boîtes a été réalisée à l'aide d'un appareil multipointes (Lovelace
et Colwell, 1968).3 répétitions par souche sont réalisées. Comme témoins des boîtes
contenant le milieu de base sans source de carbone, avec mannitol ou avec l'actate de
sodium ont été utilisées. Après incubation à 30°C, les résultats sont notés à partir de
7 jours. La croissance est considérée comme positive ( +, + +, + + + ) ou négative
(-) par comparaison aux témoins.
4. Milieu de culture pour les plantes hÔtes
4.1. Stérilisation et ~erminationdes ~raines
Avant utilisation, les graines sont stérilisées superficiellement par immersion dans
l'acide sulfurique concentré pendant une durée déterminée par la dureté de
l'enveloppe propre à chaque espèce (tableau 3 ). Les graines sont abondamment
rincées à l'eau distillée stérile, déposées dans des boîtes de Petri contenant de l'eau
gélosée à 0,7% et mises à germer à 30°C à l'obscurité et en atmosphère humide, les
boîtes étant renversées afin que la radicelle ne s'enfonce pas dans l'agar. Les jeunes
plantules de 1 à 2 cm de long sont repiquées dans le sol en pots, ou en conditions
aseptiques en tube de gélose inclinée.
4.2. Milieu de culture des plantes
Le milieu Jensen (Vincent, 1970), est utilisé pour les cultures en tubes des plantes
et contient par litre: K2HP04 : 0,2g ; NaCI : 0,2g ; MgS04 (7H20) : 0,2g ; CaHP04 :
19 ; FeCh(6H20) : 0,14g; H3B03: 2,86mg; MnS04(4H20): 2,03mg;ZnS04(7H20)
0,22mg; CUS04 (5H20) : 0,08mg; Na2Mo04 (H20) : 0,09mg.
Le pH étant ajusté à 6,7, le milieu est autoclavé pendant 20 mn à 120°C.
28
Tableau 3
St~rilisation et germination des graines de sesbania.
Temps de st~rilisation
1
Plante-hôte
dans H
Temps de germination
1
2S04
1
Sesbania roet.rat:a vaY'. Sene gal
1
30 mn -
60 mn
24 H
1
Sesbania Y'ostY'ata vaY'. Madagascarl
30 mn -
60 mn
24 H
Sesbania sesban
1
30 mn -
60 mn
24 H
Sesbania pachycaY'pa
60 mn
48 H
Sesbania pubescens
60 mn
24 H
Sesbania acuZeata
30 mn
48 H
Sesbania acuZeata
Daïncha
30 mn
48 H
Sesbania cannabina Nord Vietnam
30 mn
24 H
Sesbania cannabina Sud
"
30 mn
24 H - 48 H
1
1
Sesbania paZudosa
60 mn
48 H
1
Sesbania gr'andifZoY'a
rose
60 mn
48 H
1
1
1
Sesbania Sp. Vietnam
30 mn
24
H
1
1
Sesbania fOY'mosa
1
30 mn -
60 mn
24 H
1
1
1
Sesbania aegyptiaca
1
30 mn -
60 mn
24 H
1
Sesbania &l9Y'icea
1
30 mn
24 H
1
1
1
Sesbania emeY'us
30 mn -
60 mn
24 H
1
1
Sesbania aZba
1
60 mn
24 H
1
1
1
Sesbania tetY'apteY'a
1
30 mn -
60 mn
24 H
1
Sesbania SP-, Richard-Toll
1
30 mn -
60 mn
24 H
1
1
1
Sesbania gr'andifZoY'a
blanche
60 mn
48 H
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
29
5. Culture des plantes
5.1. Cultures en tubes
La technique utilisée est celle mise au point par Gibson (1963). Après germination
des graines, chaque plantule est mise en culture sur un tube de 30 x 170 mm contenant
une gélose nutritive inclinée (Jensen) et muni d'un capuchon constitué par une feuille
d'aluminiun percée d'un trou. La racine est introduite dans le tube de façon à être en
contact avec la gélose, la tige restant à l'air libre. Pour éviter le dessèchement de
l'enveloppe cotylédonaire et permettre aux cotylédons de se libérer spontanément de
l'enveloppe de la graine, il est nécessaire de laisser les tubes en atmosphère humide
pendant 24 heures sous éclairage. Les plantes sont ensuite inoculées et placées en
serre. Elles sont récoltées après 3 et 4 semaines.
5.2. Cultures en vase de végétation (pots en terre cuite)
Du sol légèrement humidifié est stérilisé à l'autoclave pendant 1h à 120oe, puis
réparti dans des pots en terre cuite de 18cm de diamètre à raison de 2kg de sol par
pot. Les graines de Sesbania stérilisées dans l'acide sulfurique concentré sont ensuite
semées dans les pots à raison de 1 à 2 graines par pot. Lie sol de Bel-Air dont la
composition figure au tableau (4) a été utilisé.
6. Inoculation des plantes
6.1. Inoculation des racines
Les racines des plantes sont inoculées à l'aide de 5ml de culture pure de souches
8
bactériennes contenant environ 10 bactéries/ml et provenant d'une culture en phase
exponentielle de croissance en milieu YM et YL.
L'inoculation des tubes est faite 3 jours après le repiquage de la plantule dans le
tube. Le tube est alors rempli de milieu liquide de Jensen jusqu'au bord supérieur du
tube afin que toute la surface des racines soit en contact avec les bactéries en
suspension dans la solution nutritive.
30
6.2. Inoculation des tiges de Sesbania rostrata
Lorsque les jeunes plantes de Sesbania rostrata, ont atteint une taille de 25-30 cm
environ, leurs tiges sont inoculées par pulvérisation d'une culture bactérienne liquide
8
contenant 10 bactéries/ml.
7. Evaluation de la fixation symbiotique (effectivité)
Pour évaluer l'efficacité de la fixation symbiotique, nous avons déterminé d'une
part, les poids frais et secs et l'azote total des parties aériennes (après séchage du
matériel à 60°C pendant 48 h) et, d'autre part, l'activité nitrogénase des plantes.
7.1. Dosage de l'azote minéral
La teneur en azote des plantes a été dosée par la méthode de micro kjeldahl au
peroxyde d'hydrogène (Rinaudo, 1970).
Après minéralisation de 50mg de poudre végétale à l'acide sulfurique concentré
et à l'eau oxygénée (110 vol.), l'extrait est distillé dans un appareil de Parnas-Wagner
avec déplacement de l'azote ammoniacal par lOml de NaOH (lON). Le distillat est
recueilli dans une solution contenant le réactif de Tashiro (1 volume de bleu de
méthylène à 0,70% dans l'alcool 95° pour 5 volumes de rouge de methyl à 0,15%
dans l'alcool 95°). La coloration provoquée par ce réactif est verte en milieu alcalin,
mauve en milieu acide, et l'ammoniaque est dosé par l'acide chlorhydrique (NI70).
Le poids atomique de l'azote étant de 14, à 1ml de solution Hel N170 ajouté
correspond donc 0,2mg d'azote. La teneur en azote des parties aériennes est calculée
selon la formule:
0,2x 100
y%
50*
3 répétitions ont été effectuées par échantillon à doser.
* 50 mg de poudre végétale.
31
7.2. Dosage de l'activité nitrogénase
7.2..1. Activité réductrice d'acétylène
La mesure de l'activité réductrice d'acétylène est une mesure de l'activité
réductrice de la nitrogénase, complexe enzymatique responsable de la fixation de
l'azote (Dilworth, 1966).
7.2.2. Principe de la méthode
Le principe repose sur l'exploitation d'une des nombreuses réactions réductrices
potentielles de la nitrogénase et qui réside dans la formation d'éthylène (C2H4) à
partir de l'acétylène (C2H2) (Hardy et al., 1973). C2H2 + 2H+ + 2e- - - . C2H4.
La production d'éthylène nécessite donc 2 électrons.
D'autre part la nitrogénase réduit la triple liaison de la molécule d'azote en
ammoniaque avec utilisation de 6 électrons: N2 + 6H+ + ôe" - - . 2NH3.
Le coefficient de conversion théorique N2 réduit: C2H4 formé est donc de 3 : 1
c'est à dire qu'une mole d'éthylène est équivalente à 1/3 mole d'azote réduit.
Il est maintenant établi que la réaction de la nitrogénase est:
N2 + 8H+ + 8e-
- - .
2NH3 + H2
Les protons entrent en compétition avec l'acétylène, mais comme la quantité de
C2H2 utilisée est habituellement faible, l'hydrogène produit peut être
alors
négligeable (Hanus et al., 1981).
La mesure de l'ARA ne peut cependant constituer qu'une approche semi
quantitative de l'azote fixé; elle n'est pas une méthode directe de mesure. En effet la
première source d'erreur réside dans le fait que le coefficient de conversion théorique
varie considérablement en fonction des conditions environnementales (variations
journalières par exemple) et en fonction des facteurs intrinseques.
Actuellement, il n'y a pas de méthode adéquate pour calibrer l'éthylène formé
avec l'azote fixé, mais il semble que le rapport de conversion soit approximativement
4: 1 pour les légumineuses (Larue et Patterson, 1981).
32
7.2.3. Conditions expérimentales
La mesure de l'ARA a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse (Hardy
et al., 1973), sur un chromatographe Varian Aerograph serie 1400 équipé d'une
colonne de 120 cm remplie de sphérosil, Les températures ont été les suivantes :
injecteur 120°C; colonne 75°C; détecteur à ionisation de flamme: 150°C. Le débit
du gaz vecteur a été de 40 ml/mn. Cette technique autorise la détection facile du
substrat et de son produit, l'éthylène. De plus, elle présente une sensibilité très grande.
7.2.4. Techni<lJ.le du dosa~e
Elle consiste à transférer les racines ou les tiges des plantes portant des nodules
dans des flacons serums de 250 ou 500 ml ou des fioles de 20 ml fermés
hermétiquement. L'acétylène est injecté à la concentration finale de 10%. Pour les
mesures de fixation d'azote in vitro, une colonie de la souche à tester est ensemencée
par piqûre dans un tube de gélose profonde contenant le milieu sans azote (LÜ) ; le
tube est alors hermétiquement fermé, additionné d'acétylène (qsp 2% (VN). Les
flacons sont incubés à 30°C.
L'activité réductrice d'acétylène étant linéaire pendant 1 heure, des échantillons
gazeux de 0,5 ml sont prélevés après 30, 45 ou 60 mn et injectés dans le
chromatographe. La quantité d'éthylène présent dans l'échantillon est par la suite
mesurée.
7.2.5. Calcul de la quantité de CzH1 produite
La quantité d'éthylène formée dans ces conditions, pendant un temps donné,
correspond au flot total d'électrons transférés par la nitrogénase . La conversion des
hauteurs de pic d'éthylène en nanomoles de C2H4 se fait par référence à un étalon
standard. Une dilution étalon d'éthylène est préparée par l'introduction de 0,57 ml
d'éthylène dans un flacon hermétique de 570 ml (dilution 1/1000). La concentration
de cette dilution étalon est donc de
6
10 nrnoles
C2H4Iml
22.400
33
L'injection au chromatographe de 0,5 ml de cette dilution donne un pic de hauteur:
h x A (A = facteur d'atténuation; h = pic mesuré en cm).
Les hauteurs des pics étant proportionnelles aux quantités injectées, un pic de 1
cm correspond à :
106 x 0,5
1
x
nmoles Cili4/cm de pic
22.400
hxA
Pour un échantillon de volume V (ml), dont on a injecté un volume v (ml) au
chromatographe et qui donne un pic de x = hl x Al, la quantité d'éthylène totale
produite est donc
106 x 05
V
nmoles Cili4
22.400
v
hl = hauteur du pic Cili4 en cm
h = hauteur du pic standard en cm
Al = atténuation due à l'échantillon
A = atténuation due au témoin standard
V = volume du flacon d'incubation en ml
v = volume injecté dans le chromatographe = 0,5 ml.
L'ARA totale est exprimée en umoles de Cili4lh/plante. L'ARA spécifique est
exprimée par unité de poids sec de nodules (umoles C2H4Ih/g de nodules secs).
Pour déterminer la signification de certains résultats nous avons utilisé le test
statistique de Newman et Keuls, au seuil de 5% (Snedecor et Cochran, 1957).
Pour l'étude du spectre d'hôte, l'effectivité des souches a été exprimée en
pourcentage du poids sec de parties aériennes par rapport à la souche la plus effective
34
(100%) sur chacune des plantes hôtes. Une souche effective (E) correspond à un
pourcentage de 75 à 100% et une souche ineffective (1) correspond au même
pourcentage que le témoin non inoculé c'est à dire environ 20 à 30% du poids sec de
la plante inoculée avec une souche effective. Une souche peu effective correspond à
un pourcentage intermédiaire.
35
III. RESULTATS
1. Caractérisation physiologique et taxonomique
1.1. Isolement des souches bactériennes
Nous avons isolé dix neuf souches bactériennes à partir de nodules de tige de
Sesbania rostrata poussant dans des régions différentes du Sénégal: région Centre-Est
de Kaolack, région du fleuve Sénégal, région de Casamance et à l'Ouest
de
Madagascar. Dix sept souches ont été isolées à partir de nodules de racine de neuf
espèces de Sesbania, Sesbania rostrata, S. pachycarpa, S. aculeata, S. cannabina nord
Vietnam,
S. cannabina sud Vietnam, S. grandiflora rose, S. grandiflora blanche, S.
sesban et S. pubescens (tableau 2). Afin de déterminer si ces souches appartenaient
au genre Rhizobium ou Azorhizobium, nous avons testé leur capacité à fixer l'azote
librement et par analyse de taxonomie numérique.
1.2. Test de fixation libre
Le tableau ( 5 ) montre que toutes les souches isolées à partir de nodules de tige
de plantes de Sesbania rostrata présentent une activité nitrogénase en culture pure.
En revanche, aucune activité fixatrice n'a été décelée chez les souches isolées à partir
des nodules de racine des différentes espèces de Sesbania.
1.3. Taxonomie numérique
Le tableau (6) montre que les souches isolées des racines des différentes espèces
de Sesbania qui ne fixent pas l'azote en culture pure, assimilent la plupart des
hydrocarbones, alors que les souches fixant librement l'azote n'utilisent que le
glucose, l'acide mucique et l'acide gluconique. Aucune des 36 souches étudiées n'a
poussé sur l'inuline. Il est important de noter que les souches qui fixent l'azote en
culture pure n'assimilent pas le mannitol pourtant employé de façon classique dans
de nombreux milieux pour Rhizobium. En revanche, ces souches sont les seules à
croître sur le propane 1-2 diol et utilisent préférentiellement les composés tels que
Tableau 4 : Caractères physicochimiques du sol de Bel-Air
OX~des~
1
Texture (%)
pH
~atiè~orga~ue~ 1
\\
Fertilité (%0)
1
Limo~
S~ble: Sabl~
1
Argile:
L~mon 1
1
H 0lKCl
a s s i mil a b l e i
2
1
C
1
N
1
ClN
1
Fe 20
P2 05 total!
P
3total!
205
1
1
fln
1 grossler 1
fln
1 grosSler
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3,8
1
1,4
1
0,7
1 4 8 , 4
1
44,5
7,7
1
4,0
1
0,26
1 1 5 , 4
1
0,69
1
0,37
1
0,28
1
1 7 , 0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 5 : Test de fixation libre des
\\0
C"1
souches d'Azo~hizobium et
de Rhizobium
1-
1
Souches
rctivité Nitrogenase \\
1
1
1
1 Azoi-h ieob ium
1
+
1
1
1
1
1 Rhizobium
1
-
1
1
1
1
I !
1
+ Fixation d'azote; -
pas de fixation
d' a zo te .
Tableau 6
Co.paraison des principales caractéristiques nutritionnelles'" des Azu7+n~&~ et des .~l~~
1
1
Aaorhiaobium
Rhiaobium
Carac th..
nutritionnelles 1ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS ORS 1ORS 1ORS 1ORS 1ORS 1ORS 1ORS 1ORS lORS
1
1
571
590
591
592
593
594
595
56
RSI
RS2
S3
SI,
S6
580
581
582
583
584
S2
51
52
53
57
502
507 604
600 60,6
609 611
613!614 !615!6161pll !S7
1 Hydrocarbones
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
l
,
1
1
1
1
1
I i i
1
:
1
1
1 O-R ibose
1 -
1 - 1 -
-
: -
1 -
1 -
-
1 -
1 -
-
-
1 -
\\ -
-
1 -
1 -
1 -
1 -
-
++ 1 - 1++ 1+++ 1 ++ 1 - 1 ++ 1++. ++ 1 ++ 1 ++ 1- 1++ 1+++ 1++ 1+++ 1
1
1 D-xylose
1 -
- 1 -
- 1 - 1 - 1 -
- 1 - 1 -
-
- 1 -
-
- 1 - 1 -
- 1 -
-
++ 1 -
++ 1 ++ \\ ++ 1 - \\ ++ 1 ++ ++ 1++ 1 ++ 1+++ 1++ 1 ++ 1++ 1+++ 1
1
D(-)Arabinose
1 _
_ 1 _ _ 1 _ 1 _ 1 _
_ 1 _ 1 _
_
_ 1 _
_
_ 1 _ 1 _
_ 1 _
_ ++ 1 ++ ++ 1 ++ 1· ++ 1 _ 1 + 1++ _ 1 +1 ++ Il +++ Il +l'
+ ,1 + l' +++ 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
l
'
L(+)Arabinose
1 -
- 1 -
- 1 - 1 -
-
- 1 - 1 -
-
- 1 -
-
- 1 - 1 -
- 1 -
-
++ 1 + ++ 1+++ 1++
- 1++ 1+++
+ 1++ 1 ++ 1 ++ 1++ 1 +++ 1 ++ 1 ++
RaFFinose
i -
1 -
- 1
-
-
1 -
1 -
-
-
1 -
1 -
-
-
1 -
-
-
1 -
1 -
-
++ +++ 1 + ++ 1+++: -
++ 1 ++ 1+++
- 1 ++ 1 +1 ++ i ++: - 1 + 1+++
L-Rhaonose
1 -
- 1 -
- 1 - ,~
-
- 1 - 1 -
-
- 1 -
-
- 1 - 1 -
- , -
++
++ 1 ++ ++ 1 ++ 1++
++ 1++ 1++
++ 1++ 1 ++ 1+++ 1 +1 +++, ++ 1+++
D( +) Glucose
\\ +
++ 1 + + i + 1 +
+
+ i + 1 +
+ + : +
+
+ 1 + i +
+ 1 + +++
++ 1 ++ ++ 1 ++ 1 +++ ++ 1 ++ 1+++
++: ++: ++! +++ ++ i ++ i++ 1+++
O( +) "annose
1
-
- 1
-
-: -
1 -
-
- : -
-
-
-
i - - -: -1 - - 1 - - ++1 ++ ++ 1 ++ 1 ++ - 1++ 1 ++ ++1 ++ 1 ++ 1 + +1 +1++ 1+++
D( +) Gal ac tos e
1 -
- 1 -
- \\ - 1 -
-
- 1 -
-
- 1 - 1 -
-
- 1 - 1 -
- 1 -
-
+++ 1 + ++ 1+++ 1 ++ - \\ ++ 1+++
+1+++ 1 +1+++ +++1
++ 1++ 1+++
B-D(-) Fructose
1 -
-1 -
- i - 1 -
-
- 1 -
-
-1 - 1-
-
-1 -1 -
-1 - - 1+++1 ++ 1++ 1+++ 1 ++ - ++ 1+++ -1 ++ 1 ++1 ++
++1
++1 ++ 1+++
Sacharose
1 -
- 1 -
-\\ -
-
-
- 1 -
- 1 - 1 - 1 -
-
- 1 - 1 - 1 - 1 -
++ +++1 ++ 1 + 1+++
++ -
++ 1+++
- 1++ 1 ++1 ++
++1
++1 ++ 1++
Trehalose
1 -1 -1 -1 -1 -
-
-
-: -
-: -1 - 1 -
-
- 1 -1 - i - 1 - -
++i ++ i++ 1++
+ -
++ 1++
-1 +: ++ 1+++
+1
- 1++ 1+++ 1
"altose
1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
- 1 -
-
1 -
- 1 - 1 - 1 -
-
- 1 - 1 - 1 - 1 -
++
+1 ++ 1++ 1 ++
++ ++ ++ 1++
- 1 +1 ++1 +++ - 1
+\\ ++ 1+++ 1
r-
0(+) Cellobiose
1 _ 1 _ 1 _ 1 _ 1 _
- \\ -
- 1 -
-
1 - 1 - 1 -
-
- 1 - 1 - 1 - 1 _ ++ +++1 ++ 1++ 1+++ +++
+ ++ 1+++
++1 ++J ++! _
++11 ++,1 ++ 1'+++ "
1
M
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Lactose
1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
- 1 -
- 1 -
- 1 - 1 - 1·
-
-: - 1 - 1 - 1 -
++
++1 ++ ++ 1 ++
- 1 - ++ 1+++
++1 ++1 ++1 ++
_1
+1 ++ 1++ 1
1 1nu 1i ne
: - 1 -:
-:
- i -
- 1 - -: - - 1 - 1 . 1 - -
-! -i -! -: - - -: - -1 - - 1 - -: - 1 - : - 1 - 1 - - j -1 - 1 - 1
1 Gluconique acide \\ ++\\ ++1 ++1 ++1 + ++ 1 +
++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++, ++
++1 +01 ++1 ++/ ++ -
- 1 -
- 1 + -, -
+ 1- 1 - 1 - 1 - 1 ++ + 1 +1 + 1++ 1
1 "usique ac i de
1 +++1 ++1 +++1 +++1 +++, +++1 ++
+++1 +++: +++1 +++: +++1 +++1 "i +++1 +++1 +++1 +++1 +++ -
- 1 -
-1 -
- 1 ++
-: - : -1 - : -! .] - j
-1 - 1 + 1
1 "ethyl-D-glucosidel
- 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
- 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
++ +++1 ++
++1 ++
+ 1++
++1 ++ 1 + 1.+ 1 - 1 +++1 - 1 +1 - 1+++ 1
I~
1
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1
I l
i
1
1
1
1
1
11
11
1
1
l '
1 "annitol
1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1. - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
++1 +++1 ++
++1 ++1 ++1 ++
++1+++
++1 ++ 1 ++1 ++! ++f' ++f ++1 +++ 1
1 Propane 1-2-diol 1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++1 + 1 ++1 ++1 ++1 ++1 ++
-
-: -
-1 - 1 -1 -
-1 -
- i - -1 -1 - i
-1 - 1 -
1
1 HYdr0 xyac ïd e
1
1· 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
r
1 ~~~~:C:;::nique
1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1
++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++
-
+1 + +
+1 + 1 -
+ 1+
- 1 +
+:
+: -1
+1 + 1 + 1
1Itaconique acide 1+++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1
+1 +++1 +++\\ +++1 +~+I +++1 ++,1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++1 +++
-
- i -
-
-1 -1 -
-1 -
-: -
-1
-1 - i ++1 -1 - 1
1 Co.posé arooatiquel
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 Benroate
1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 . 1 -
- 1 - 1 - 1 -
-
- 1 - 1 -
-1 - 1 - 1 - 1 -
- 1 -
-1
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-' ++1 - 1
1 hi no ac i de
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 L-arginine
1 - 1 - 1 - i - 1 .'! - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - i - 1·
- 1 - 1 - 1 -
-
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1
1
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+J - 1 - 1 . +,1. +J
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1
1
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1
1
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1
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-
+ 1+ 1 -
- 1 - 1 - 1 - 1 - 1- 1 -
+1
-1 - 1
-1
-1
- 1
1 ~::~:~e!~':~ate
1 ++ 1 ++1 ++1 ++1
: - 1 - 1 ++1 + 1 ++1 ++1 ++1 ++1 - 1 ++
++ 1 ++ 1 ++ 1
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-
1 - 1 -
- 1 - 1 - 1 - 1 - 1-
1 - 1 ++1
1
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1
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1
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1
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i
i
i
1
i
i
i
i
i
i
1
1
1
1
I i i
(1) + : croissance:
++: bonne croissance; +++ : tr~s bonne crois~ance;
-: pas de croissance.
38
le DL-lactate (hydroxyacide), l'acide itaconique ( acide organique) et l'isovalérianate
(acide gras).
Les résultats présentés ci-dessus ont permis de séparer les 36 souches en deux
grands groupes: (1) le premier groupe comprend toutes les souches isolées à partir
de nodules de tige de S. rostrata et qui appartient au genre Azorhizobium, (2) le
deuxième groupe regroupe les souches de Rhizobium qui ont été isolées à partir des
nodules de racine de plusieurs espèces de Sesbania (Dreyfus et al., 1988).
Cette classification, a été confirmée par l'étude du spectre d'hôte des souches
d'Azorhizobium et de Rhizobium et la comparaaison de leur effectivité.
2. Le spectre d'hôte
2.1. La nodulation de racine
La capacité des souches à induire la nodualtion racinaire de Sesbania a été étudiée.
20 espèces ont été testées: S. rostrata var. Senegal; S. rostrata var. Madagascar;
S. paludosa ; S. grandiflora rose; S. grandiflora blanche; S. aculeata Ethiopie ; S.
aculeata Daïncha ; S. cannabina Nord Vietnam ; S. cannabina Sud Vietnam ; S.
pachycarpa ; S. pubescens ; S. formosa ; S . aegyptiaca ; S. sesban ,. S. sericea ; S .
emerus ; S. alba ; S. tetraptera ; S. sp. Vietnam ; S. sp. Richard Tol!.
Le tableau (7) montre, que sur les 20 espèces de Sesbania testées, les souches
d'Azorhizobium ne forment des nodules effectifs que sur la seule espèce, S. rostrata.
A l'exception de S. paludosa où les nodules formés sont partiellement effectifs, les
nodules formés chez toutes les autres espèces sont très peu développés et ineffectifs.
Par contre les souches de Rhizobium forment des nodules effectifs sur les racines de
presque toutes les espèces de Sesbania.
2.2. La nodulation de tige
L'aptitude des souches à noduler la tige de S. rostrata a été déterminée. Le tableau
(8) montre aussi que toutes les souches d'Azorhizobium forment des nodules
caulinaires effectifs chez Sesbania rostrata. Dans le cas des Rhizobium, les souches
r---
-,
Il
0
0
U LAT
1
0
lia
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1
1 .
1
Planh-h8h
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40
Tableau 8
: Capacité de nodulation caulinaire et de fixation
d'azote par S. postpata(lJcultivée en tubes et inoculée avec
des souches d'Azophizobium et de Rhizobium.
1
1
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(1)
Pour les mesures,deux plantes ont été utilisées par souche
testée.
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nodulation effective;
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pas de nodule.
41
se répartissent en quatre catégories selon leur aptitude ou non à former des nodules
effectifs sur la tige de S. rostrata (fig. 1 et tableau 8).
(1) Les souches ORS 53 forment des nodules effectifs.
(2) Les souches ORS 609 forment des nodules peu effectifs.
(3) Les souches ORS 507, ORS 502 forment des nodules ineffectifs
(4) Les souches ORS 52, ORS 616 ne forment aucun nodule
3. Effectivité des souches de Rhizobium et d'Azorhizobium
L'effectivité de 8 souches de Rhizobium et 4 souches d'Azorhizobium a été testée
sur les racines de S. rostrata cultivées en tubes. Il a été ainsi observé que, 21 jours
après l'inoculation, les souches d'Azorhizobium montrent une capacité à fixer l'azote
significativement plus élevée que celle des souches de Rhizobium (tableau 9).
Le même test a été appliqué à 2 souches d'Azorhizobium et 2 souches de Rhizobium
inoculées sur la tige de S. rostrata cultivées en pots. Les résultats du tableau (10)
montrent d'une part que l'activité nitrogénase des souches
d'Azorhizobium est
significativement plus élevée que celle des Rhizobium et que, d'autre part l'azote total
par plante est également plus élevé dans le cas des souches d'Azorhizobium.
42
Fig. 1 : Nodulation de tiges de S. rostrata inoculées à l'aide d'une souche d'Azorhi-
zobium (ORS 571 etpar différentes souches de Rhizobium. Flèches = nodules;
tetes de flèches = ébauches nodulaires
Tableau 9
: Nodulation et fixation d'azote
de S.
rostrata cultivée en tubes et inoculées àl'aide dedifférentes
souches de Rhizobium et d'Azorhizobium.
1 Traitements
1
-
-Partie
r'ac i na i.r-e
-
-
-
-
1
Partie aérienne
: Souches
i Nodules g/plante
i
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i Feuille + Tige g/plante---j
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en nanomoles
1 en
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1
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0,13
1
4 , 3 0
1
5,6
:
592
1
0,098a
1
0,015a
1
3015a
:
30516a
1
201.171a
1
0,73
:
0,12
: 4,20:
5,0
ITémoin
°
°
°
°
°
1
1
1
1
1
1
0,21
1
0,02
1
0,90 1
0,2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
l
,
Les chiffres sont la moyenne de 10 répétitions -
Les mesures ont été effectuées 21
jours après l'inoculation des racines.
Dans chaque colonne,
les chiffres affectés des mêmes lettres ne diffèrent pas significativement au seuil de 5%
(Test de NEWMAN et KEULS,
1957).
Tableau 10
Nodulation et fixation d'azote
de
S.
roet.rat:a cultivéesen pots et inoculée à l'aide de différentes
souches d'AzoY'hizobium et de Rhizobium.
1
Traitements
1 P~tie ~acin-air1
Partie aérienne
1
r
1
1
1
1 Activité nitrogenase
1
1
1
[
1
[
1
1
1
1 Po id s
sec en 9 1
1
N%
1
N t 0 t a I l
[Souches testéesl
Genre
INodule g/plantelNodule g/plantel~mole C2H41wmole C
Ih/g
[plante
IFeuille-Tigelen g/plantel
2H
1
r
1 poids
sec
[poids sec
I/h/plante
Ide noduIe~ sec IFeuille-Tige-Totall
1
1
1
1
1
1
1
[
r
[
1
r
1
:
1
:
1
1
:
1
:
:
[
[ .
.
1
1
1
1
1
1
[
1
lORS 571
,AZOY'h&zob&uml
0,19b
1
0,15a
1
10,S2b
1
72,14b
1
3,66d 5,1Sc S,S4d
4,72d 2,00b
0,27c
,
l
l
[
1 .
.
r
1
1
1
1
1
1
1
lORS 591
1 AZOY'h&zob&um
0,20b
[
0,14a
1
10,6Sb
1
76,30b
1
3,60d 5,25c S,S5d
4,S5d 1,9Sb
0,27c
1
l
l
r
1
1
.
.
1
1
1
1
1
1
1
1
o::r
lORS 611
IRh&zob&um
1
0,29b
[
0,09b
[
1,30a
1
14,43a
1
2,12b 3,19b 5,31b
4,51c 1,92b
0,15b
1
r
l
o::r
1
1
.
.
1
1
1
1
1
[
1
lORS
51
[Rh&zob&um
[
0,64a
1
0,005c
r
0,013c
1
2,00c
1
2,7Sc 3,56b 6,34C,
4,12b 1,SSb
0,1Sb
l
l
' .
1
1
1
1
1
1
1
1
[Temoln
[
°
°
°
°
[
1
1
1
1
1,30a 2,06a 3, 3 6 a l 3,12a 1,oSal
0,06a
1
1
1
1
1
[
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
[
1
1
1
1
Chaque chiffre est la moyenne de 10 répétitions.
Les mesures ont été effectuées au 36ème jour après semis.
Dans chaque colonne les chiffres suivis de la même lettre ne sont pas significativement différents au seuil
de 5% (NEWMAN et KEULS,
1957)
45
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
L'étude présentée ci-dessus a permis de confirmer que la légumineuse tropicale
Sesbania rostrata était associée aux
deux genres bactériens, Azorhizobium et
Rhizobium.
- Le genre Azorhizobium regroupe les bactéries qui ont été isolées à partir des
nodules de tige de S. rostrata. Les souches de ce genre montrent une activité
nitrogénase en culture pure et ne forment des nodules effectifs que sur la tige et les
racines de S. rostrata.
- Le genre Rhizobium regroupe les bactéries isolées à partir des nodules racinaires
de différentes espèces de sesbania. Contrairement auxAzorhizobium, les souches de
Rhizobium testées ne fixent pas l'azote en culture pure. En revanche, elles induisent
une nodulation effective sur les racines de la majorité des autres espèces de Sesbania,
y compris Sesbania rostrata.
Ainsi, il est clair que concernant l'effectivité des nodules des racines, les souches
de Rhizobium ont une spécificité d'hôte beaucoup plus large que les souches
d'Azorhizobium.
De même, le fait que dans la nature, les nodules de racine de S. rostrata induits
par les souches de Rhizobium soient beaucoup plus nombreux que ceux induits par
les Azorhizobium
montre que les Rhizobium sont plus compétitifs que les
Azorhizobium.
En revanche, les souches d'Azorhizobium apparaissent plus compétitives pour la
nodulation de tige de S. rostrata.C'est ainsi que les nodules formés spontanément sur
la tige de S. rostrata et provenant de sites géographiques différents, sont toujours
induits par des souches d'Azorhizobium.
Enfin et contrairmeent aux souches d'Azorhizobium capables d'induire de manière
homogène des nodules caulinaires abondants et très effectifs chez Sesbania rostrata,
l'inoculation des Rhizobium sur la tige de Sesbania rostrata a permis de mettre en
évidence une gamme de souches d'infectivité et d'effectivité bien inférieures.
En conclusion, il paraît possible d'affirmer que les souches d'Azorhizobium
représentent les souches typiques de la nodulation caulinaire de Sesbania
46
rostrata. Toutefois, la base de la spécificité des Azorhizobium pour la tige de Sesbania
rostrata reste à définir.
47
CHAPITRE II
INFECTION ET DEVELOPPEMENT
DES NODULES DE RACINE DE
S. ROSTRATA
48
I. INTRODUCTION
Les bactéries du genre Rhizobium sont capables d'infecter les plantes de la famille
des légumineuses et d'induire la formation de nodules fixateurs d'azote. Dans la
grande majorité des cas,les nodules sont initiés exclusivement sur la partie radiculaire
de la plante hôte. Il existe toutefois, des associations symbiotiques où les nodules se
développent à la fois sur la tige et sur la racine. Dans ce chapitre, les données relatives
à l'infection des légumineuses et au développement des nodules racinaires ou
caulinaires sont brièvement présentées.
1. L'infection
Deux mécanismes d'infection des racines des légumineuses par les Rhizobium ont
été décrits à ce jour.
1.1. Infection par les pons absorbants
Chez les légumineuses tempérées et chez certaines légumineuses tropicales
comme le soja ( Glycine max) (Turgeon et Bauer, 1982 ; Pueppke, 1983) ou le
"cowpea" (Vigna unguiculata) (Pueppke, 1983), le microsyrnbionte pénètre le plus
souvent au niveau des poils absorbants des racines de la plante hôte. Dans un premier
temps, les Rhizobium présents dans le sol, sont attirés dans le voisinage des racines
de la plante hôte (Bergman, et al., 1988 ; Caetano-Anolles et al., 1988), où ils
catabolisent des substances racinaires excrétées (Broughton, 1978).Après une phase
de multiplication active dans la rhizosphère, les bactéries se trouvant en contact avec
la plante hôte, s'adsorbent aux poils absorbants (Dazzo et al., 1984 ; Kijne et al.,
1986;
Smit
et
al., 1987). Des glycoprotéines végétales appelées lectines,
interviendraient dans l'adsorption spécifique entre symbiontes homologues (Kato et
al., 1981 ; Dazzo et Trochet, 1983; Dazzo et al., 1985 ; Bauer et al., 1985 ; Diaz et al.,
1989).
La déformation des poils absorbants (phénotype Had = Hair deformation) est
l'étape symbiotique qui suit l'adsorption des bactéries. Divers types de déformations
comme des boursouflements, des branchements, des courbures apicales plus ou
moins prononcées sont alors observées. (Yao et Vincent, 1976 ; Bhuvaneswari et
Solheim, 1985 ; Trochet et al., 1985 ; Zaat et al., 1987). Une de ces déformations
49
correspondant au phénotype Hac (Hair curling) est considérée comme spécifique et
caractéristique d'une association de type homologue (Vincent, 1980; Debellé et al.,
1986). Le phénotype Hac (IIShepherd's crook") correspond à un poil absorbant
présentant une déformation apicale d'au moins 360°, au centre de laquelle, un "spot"
réfringent, intensément coloré par le bleu de méthylène ( Vasse et Truchet, 1984)
correspond au site de pénétration des bactéries dans le poil absorbant (Vincent, 1980
;Truchetet al., 1984,1985). C'est à partir de ce point réfringent que se développe une
structure tubulaire, appelée cordon d'infection, dans laquelle les bactéries
progressent vers la base du poil absorbant puis vers le cortex externe de la plante (
Truchet et al., 1985). Il est important de noter que chez le soja, les cordons d'infection
peuvent se développer à partir d'un poil absorbant recourbé comme décrit ci-dessus,
mais aussi à partir d'un poil absorbant simplement accolé aux cellules épidermiques
adjacentes. Dans ce cas là, toutefois, l'infection semblerait toujours se produire au
niveau du poil absorbant et non des cellules épidermiques (Turgeon et Bauer, 1985).
1.2.Infection par pénétration intercellulaire ("crack entry")
Le mode d'infection par pénétration intercellulaire des racines des légumineuses
est le plus souvent observé chez les légumineuses tropicales et subtropicales. Le mode
d'infection intercellulaire où les bactéries s'immiscent entre les cellules épidermiques
et corticales de la plante se caractérise donc par l'absence de cordons d'infection et
ne se produit pas par l'intermédiaire des poils absorbants. Ce mode a été décrit chez
plusieurs légumineuses comme par exemple chez Arachis hypogea (Allen et Allen,
1940 ; Chandler, 1978), chez différentes espèces d'Aeschynomene (Arora, 1954 ;
Napoli et al., 1975 ; Alazard et Duhoux, 1988), chez différentes espèces de
Stylosanthes (Rango Rao; 1977 ; Chandler et al., 1982) et chez Mimosa scabrella
(Faria et al., 1988).
ChezArachis hypogea, les Rhizobium infectent la plante hôte entre les cellules de
l'épiderme racinaire. Cette phase initiale d'invasion se prolonge par une étape de
multiplication bactérienne aboutissant à la formation de zones intercellulaires
d'infection. Une phase ultérieure de pénétration intracellulaire par invagination des
parois des cellules conduit à l'invasion des cellules corticales de la plante qui limitent
la zone d'infection. L'infection se propage finalement par divisions successives des
50
cellules envahies. Le même mode d'infection racinaire a été décrit chez
Aeschynomene indica (Arora, 1954) etA. americana (Napoli et al., 1975).
Chez le genre Stylosanthes, l'infection initiale des racines de la plante hôte par les
Rhizobium s'effectue également par pénétration intercellulaire des cellules
épidermiques. Toutefois, et contrairement au cas d'Arachis hypogea, les premières
cellules envahies du cortex ne se divisent pas mais se désorganisent
après
la
dissolution
progressive de leur paroi. Ces cellules
envahies, désorganisées
et
compressées
par
les cellules corticales
saines, vont
constituer
des
zones
intercellulaires d'infection où les Rhizobium se divisent. Ainsi, par désorganisation
successive des cellules hôtes, les Rhizobium atteignent des cellules corticales plus
internes et résistantes, qu'ils infectent par invagination des parois cellulaires. La
différence essentielle entre le processus d'infection chez le genre Stylosanthes et chez
Arachis hypogea se résume donc à l'absence, chez Stylosanthes, de véritables zones
intercellulaires d'infection.
Enfin, chez Mimosa scrabrella, les Rhizobium pénètrent les racines entre les
cellules épidermiques et corticales, probablement par dégradation et/ou digestion des
parois cellulaires. Les Rhizobium progressent dans la région corticale, au niveau des
parois végétales tout en émettant des protubérances vers le cytoplasme des cellules
adjacentes qu'ils peuvent occasionnellement envahir selon un mode de pénètration
intracellulaire identique à celui décrit chez Stylosanthes.
Ce mécanisme d'infection par pénètration intercellulaire est à rapprocher de ce
qui a été observé chez la non légumineuse Parasponia qui, rappelons le, peut établir
une symbiose avec Rhizobium (Trinick, 1979. Lancelle et Torrey 1984, 1985).
Toutefois, chezParasponia, les bactéries ne sont pas "libérées" dans le cytoplasme des
cellules comme cela se produit chez les légumineuses, mais restent confinées par du
matériel pariétal (ressemblant ainsi à des cordons d'infection) durant la période de
fixation d'azote.
2. Déyeloppement du nodule
Les modalités du développement des nodosités varient selon l'association
symbiotique.
51
2.1. Nodules radiculaires des légumineuses tempérées
Les différentes phases du développement des nodosités sont analogues chez la
plupart des légumineuses tempérées (voir les revues de Newcomb, 1981 et de Verma
et Long, 1983).
2.1.1. La phase organogéniq.ue
La première étape de l'initiation du nodule est décelable au niveau des cellules
corticales internes situées entre l'extrémité de la trace infectieuse et l'un des pôles du
protoxylème (Libbenga et Harkes, 1973 ; Trochet, 1978). Les importantes variations
cytologiques qui affectent ces cellules marquent le début d'un processus de
dédifférenciation qui se traduit, dans un premier temps, par l'individualisation d'un
méristème nodulaire originel. Dans un deuxième temps, le méristème nodulaire se
développe grâce à l'actvité mitotique des cellules qui le composent (Vincent, 1980 ;
Trochet, 1978 ; Newcomb, 1981; Dudley et al., 1987) et à la dédifférenciation, puis
à l'incorporation de cellules corticales nouvelles en son sein (Trochet et al., 1980). Le
fait que les divisions cellulaires débutent avant que les bactéries n'atteignent le cortex
suggère que les Rhizobium induisent à distance la formation du méristème nodulaire
probablement par l'intermédiaire d'une substance diffusible (Libbenga et Harkes,
1973 ; Trochet et al., 1980).
Tandis que le nodule se développe à partir du méristème, les cordons d'infection,
passant entre ou à travers des cellules corticales, poursuivent leur croissance vers
l'intérieur de la racine en
se dichotomisant jusqu'à atteindre les cellules
méristématiques proximales.
2.1.2. La phase de maturation
Les Rhizobium sont ensuite libérés dans les cellules en position
subméristématique, La libération des Rhizobium dans le cytoplasme de la cellule hôte
semble intervenir à un niveau
du cordon infectieux où la gaine cellulosique fait
localement défaut; ainsi dans les instants qui précèdent leur libération, les bactéries
ne sont plus isolées du cytoplasme ambiant que par le plasmalemme du filament. Les
termes ultimes de la libération doivent alors
s'effectuer par un processus
52
d'endocytose (Robertson et al., 1978). Au terme de leur libération les bactéries se
retrouvent dans le cytoplasme de l'hôte, séquestrées à l'intérieur d'une membrane
qui les isole du cytoplasme végétal (Robertson et al., 1978) et qui dérive
essentiellement du plasmalemme des cellules envahies.
Sitôt après la libération bactérienne, les cellules végétales envahies augmentent
de volume et deviennent polyploïdes (Trochet et al., 1980). Parallèlement, la
différenciation des bactéries en bactéroïdes se traduit par des modifications
cytologiques importantes comme l'évolution du nucléoïde,
l'épaississement du
feuillet interne de la paroi des bactéries et l'édification d'un réseau d'invaginations
membranaires plus ou moins élaborées selon les espèces (Trochet, 1973). Ces
variations cytologiques s'accompagnent de variations morphologiques, telles que
l'augmentation de la taille et de la forme des bactéroïdes qui présentent souvent des
formes enx et y caractéristiques (Trochet, 1973; Gourret, 1975). Le polymorphisme
observé caractérise les bactéries qui ont perdu tout pouvoir de division. C'est au terme
de la différenciation des deux symbiontes que le nodule devenu mature, réduit l'azote
moléculaire.
2.1.3. Le nodule mature
Les nodules matures sont de véritables organes différenciés composés de zones
cytologiquement distinctes.
Dans le cas des légumineuses tempérées, l'activité continue du méristème apical
procure aux nodules une forme généralement allongée. Les nodules sont dits de type
indéterminé. Ils présentent plusieurs zones d'âges différents, les cellules les plus
anciennes étant situées le plus près de la racine. De l'extrémité nodulaire vers la
racine support, on observe successivement 4 zones cytologiquement différentes
(Trochet et al., 1980) :
- Une zone apicale (zone 1) méristématique dont le fonctionnement continu,
permet l'élongation du nodule.
- Une zone II d'infestation et d'accroissement cellulaire au niveau de laquelle, les
cellules se différencient et sont progressivement envahies par les bactéries. Cette zone
équivaut à la phase de maturation des nodules en développement décrits ci-dessus.
53
- Une zone III, dite zone rouge ou zone des bactéroïdes, dont la couleur est dûe à
une hémoprotéine, la léghémoglobine. La partie protéique de ce pigment qui
constitue environ 20 à 30% des protéines cellulaires des nodules est contrôlée
génétiquement par l'hôte (voir Appleby, 1984). En revanche, l'hème du pigment
semble être synthétisé par la bactérie. La synthèse de la léghémoglobine représente
une des conditions essentielles de la fixation azotée; l'hémoprotéine intervient en
effet en maintenant le flux d'oxygène à des valeurs suffisamment élevées pour
permettre la respiration et la phosphorylation oxydative des bactéroïdes et
suffisamment basses pour que l'action inhibitrice de l'oxygène sur la nitrogénase ne
puisse s'exercer. C'est au niveau de la zone III que le bactéroïde différencié, réduit
l'azote moléculaire en ammoniaque qui est par la suite assimilée généralement sous
forme d'amides par la plante hôte (voir la revue de Verma et Long, 1983).
- Une zone IV de dégénérescence est caractérisée par la nécrose des deux
symbiontes.
2.2. Nodules radiculaires de légumineuses tropicales
Les études sur le développement des nodules de légumineuses tropicales sont
beaucoup moins nombreuses que celles relatives à l'organogénèse des nodules de
légumineuses tempérées. Les rares études approfondies effectuées dans ce domaine
ont été réalisées chez le soja (Glycine max) (Bieberdorf, 1938 ; Newcomb et al., 1979).
La comparaison des études dévolues au développement des nodules radiculaires des
légumineuses tempérées et du soja montrent une grande similitude entre plusieurs
étapes symbiotiques : ainsi par exemple, l'adsorption des bactéries aux poils
absorbants de la plante, la déformation apicale des poils absorbants en crosse
(phénotype Hac), l'infection par filament d'infection progressant dans la lumière du
poil absorbant, l'initiation nodulaire au niveau des cellules corticales, la libération des
bactéries à partir de filaments d'infection intracellulaires, la différenciation
simultanée des deux symbiontes et l'histologie des nodules matures montrant une
région centrale faite de cellules envahies fixatrices et de cellules non envahies et qui
est limitée, vers l'extérieur par un cortex interne où cheminent les traces vasculaires,
un endoderme sclérifié périphérique et un cortex externe.
54
Plusieurs différences apparaissent toutefois de la même comparaison. Ainsi, tel
qu'il a été précisé plus haut, un mécanisme intercellulaire d'infection aboutissant à
l'organogénèse d'un nodule fixateur d'azote a été décrit chez le soja (Turgeon et
Bauer, 1985) ; de même, le méristème nodulaire (phénotype Nod) est initié au niveau
des cellules corticales externes alors que la trace infectieuse est encore dans le poil
absorbant de la cellule épidermique.
D'une manière schématique et contrairement aux légumineuses tempérées où les
cellules nodulaires subissent une différenciation étalée dans le temps, les cellules d'un
nodule de soja subissent une différenciation simultanée pour aboutir à un massif fait
de cellules centrales toutes capables de fixer l'azote atmosphérique en même temps.
Ce mode de différenciation par activité méristématique limitée dans le temps conduit
à l'organogénèse de nodules de forme arrondie. A maturité et quel que soit l'axe de
coupe, les nodules dits de type déterminé montrent une histologie simplifiée avec une
zone centrale unique, entièrement limitée par le cortex interne, les traces vasculaires
et le cortex externe. Le mode de développement résumé ci-dessus rappelle celui décrit
chez le cowpea (Bieberdorf 1938, Newcomb, 1981).
Chez A rachis hypogea (Allen et Allen, 1940; Chandler et al., 1982), Stylosanthes
(Chandler, 1978) et chezAeschynomene americana (Napoli et al., 1975), les nodules,
également de type déterminé sont initiés sans formation de cordons d'infection. Chez
ces légumineuses, l'infection se propage par division successive des cellules hôtes
envahies et le nodule ainsi formé se caractérise par l'absence de cellules non envahies.
2.3. Nodules caulinaires de légumineuses tropicales
Seules des légumineuses tropicales possèdent la capacité de former des nodules à
la fois sur les racines et les tiges: Sesbania rostrata (Dreyfus et Dommergues, 1981),
Neptunia oleracea (Schaede, 1940) et une quinzaine d'espèces d'Aeschynomene
(Alazard, 1985 ; Alazard et Duhoux, 1988a) dont les plus étudiées sont A. indica
(Arora, 1954 ; Yatazawa et Yoshida, 1979 ; Vaughn et Elmore, 1985 ; Alazard et
Duhoux 1988a) et A. afraspera (Alazard et Duhoux 1988a, 1988b).
55
2.3.1. L'infection
Dans tous les cas étudiés, l'infection des légumineuses à nodules caulinaires se
déroule au niveau de sites préexistants, distribués le long de la tige et qui représentent
autant d'ébauches potentielles à partir desquelles des racines adventives peuvent se
développer. C'est à la base de ces ébauches et après un mécanisme d'infection
intercellulaire, que les nodules se développent.
Chez Sesbania rostrata, les Rhizobium pénétrent directement au niveau de la
fissure circulaire occasionnée par l'émergence de massifs méristématiques caulinaires
décrits ci-dessus. Cette pénétration intercellulaire conduit à la formation de poches
d'infection intercellulaire où les Rhizobium se multiplient activement. Cette infection
restreinte aux cellules basales de l'ébauche racinaire n'affecte jamais l'apex en forme
de dôme. Des filaments d'infection intercellulaires se forment ensuite à partir de ces
poches de multiplication intercellulaires dont ils constituent des ramifications et
pénétrent sous la forme de doigts de gant dans le cytoplasme des cellules adjacentes
(Tsien et al., 1983; Duhoux, 1984).
Un mode d'infection équivalent à celui de S. rostrata a été décrit chez Neptunia
oleracea. Notons toutefois que chez Neptunia oleracea, l'infection ne débute qu'après
l'induction du développement des primordiums racinaires, produite par une
immersion de la tige (Schaede, 1940; Dreyfus et al., 1984).
Il est important de noter que chez Sesbania rostrata et Neptunia oleracea, le mode
d'infection des racines et des tiges, par pénétration intercellulaire identique à celui
décrit chez un grand nombre de légumineuses tropicales à nodules racinaires, conduit,
dans un second temps, à la formation de cordons d'infection, typique des
légumineuses des régions tempérées. En revanche, chezAeschynomene indica (Arora,
1954) et chezA. afraspera (Alazard et Duhoux, 1988b), le processus d'infection qui
débute également dans la fissure circulaire d'une ébauche racinaire, est équivalent à
celui décrit chezArachis hypogea (Chandler, 1978) ; il n' y a pas formation de cordons
d'infection et l'infection se propage exclusivement par divisions successives des
cellules hôtes envahies.
56
2.3.2. Déyeloppement du nodule
L'organogénèse des nodules caulinaires de S. rostrata, résulte d'une induction à
distance par les bactéries et se traduit par la dédifférenciation de cellules situées à la
base de l'ébauche racinaire préexistante (Tsien et al., 1983 ; Duhoux, 1984). Les
territoires méristématiques nouveaux vont alors constituer des massifs volumineux
qui confluent et repoussent le méristème racinaire apical, qui marque un arrêt de son
développement (Duhoux, 1984). La propagation des cordons d'infection qui affectent
en nombre croissant les cellules végétales différenciées, la libération des bactéries à
partir des filaments d'infection et leur différenciation en bactéroïdes conduisent au
développement nodulaire et à sa différenciation vers un type fixateur d'azote.
2.3.3. Le nodule mature
Le méristème nodulaire s'accroît progressivement et donne une forme
grossièrement sphérique au nodule. Arrivés à maturités, les nodules caulinaires sont
ovoïdes, verdâtres et atteignent 3-4 mm de diamètre en moyenne. leur organisation
interne, assez constante, se résume à un tissu central, entouré d'un parenchyme
chlorophyllien et à la périphérie, d'un cortex. Le tissu central est formé de cellules
envahies dont le cytoplasme est essentiellement encombré par de
volumineuses
enclaves de séquestration remplies de bactéroïdes. Un noyau dégénérescent et un
cytoplasme réduit à quelques mitochondries et quelques rares plages de ribosomes
occupent le reste du volume cellulaire.
Le parenchyme cortical du nodule est chlorophyllien. C'est dans ce tissu que
circulent les cordons vasculaires du nodule.
Les nodules caulinaires de légumineuses tropicales sont de type déterminé.
Dans ce chapitre, nous présentons les résultats relatifs à l'étude de l'infection et à
l'ontogénèse des nodules racinaires de Sesbania rostrata induits par l'Azorhizobium
ORS 571. Nos résultats sont ensuite comparés à ceux déjà décrits dans le cas des
nodules de tige de Sesbania rostrata et des nodules racinaires des légumineuses
tropicales et tempérées.
57
II. MATERIELS ET METHODES
La stérilisation, le milieu de culture de S. rostrata, le mode de culture en tube et
l'inoculation ont déjà été décrits au chapitre précédent.
2. Méthodes de fixation et d'inclusion
Les nodules prélevés à différents stades de développement ont été traités pour une
observation en microscopie photonique ou en microscopie électronique selon les
étapes suivantes:
2.1. La fixati on
Les échantillons sont préfixés pendant 15 min par la glutaraldéhyde (2,75% dans
le tampon cacodylate de sodium 0,2M ; pH 7,2). L'osmolarité du fixateur mesurée à
l'aide d'un microosmomètre automatique Roebling est d'environ 650 milliosmoles.
Une fois disséqués, les échantillons sont fixés dans le même fixateur pendant 30 min
sous vide, puis pendant lh30 min dans une solution renouvelée à la pression
atmosphérique et à température ambiante. Les échantillons fixés sont ensuite rincés
dans une solution tampon de cacodylate de Na(0,3M, pH 7,2, 600 mosm, 3 x lh) puis
post-fixés pendant lh dans une solution de tétroxyde d'osmium (OS04) à 1% dans un
tampon cacodylate 0,3M, pH 7,2.
2.2. La déshydratatioD
Une fois fixés, les échantillons sont rapidement lavés à l'eau distillée et déshydratés
progressivement par passages dans des solutions aqueuses de concentrations
croissantes en éthanol (25%, 50%, 70%,90%, lh pour chaque bain) et finalement par
3 bains d'lh dans de l'éthanol pur. Des bains dans l'oxyde de propylène (2 x 15 min)
précèdent l'imprégnation dans la résine d'inclusion.
58
2.3. Imprégnation dans la résjne d'inclusjon
2.3.1. Préparation de]a résjne
La résine d'inclusion choisie est l'Epon 812 aussi appelée glycidyl ether 100, qui
est le composant majeur du mélange d'inclusion. Celui-ci est composé de deux
solutions:
- Une solution A, préparée en mélangeant 62 ml de glycidyl ether 100 à 100 ml de
DDSA (C16H26 03).
- Une solution B constituée d'un mélange de 100 ml de glycidyl ether 100 et de 89
ml de MNA anhydre (ClOHlO 03).
La préparation des deux solutions se fait à la température du laboratoire. Le
mélange d'inclusion est obtenu en ajoutant deux volumes de la solution A à un volume
de la solution B, auquel on adjoint un durcisseur, le DMP30 (2%, v/v).
2.3.2. Imprégnation des échantillons
Les échantillons sont imprégnés progressivement dans des mélanges oxyde de
propylène - résine de composition suivante:
1) 3 volumes d'oxyde de propylène + 1 volume de mélange d'inclusion
2) 1 volume d'oxyde de propylène + 1 volume de mélange d'inclusion
3) 1 volume d'oxyde de propylène + 3 volumes de mélange d'inclusion
L'imprégnation est achevée après trois bains dans la résine pure.
Chaque bain dure au minimum 1h et se déroule à la température du laboratoire.
2.4. Inclusion dans des gélules et polymérisation
Chaque échantillon est déposé au fond d'une gélule avec une goutte de mélange
d'inclusion puis orienté sous la loupe binoculaire. On complète ensuite avec de la
résine d'inclusion. La polymérisation des gélules est achevée après 48 h dans une étuve
à 60°C.
59
3. Microtomie et microscopie
3.1. Microscopie photonique
Des sections de nodules fixés et inclus sont réalisées à l'aide d'un ultramicrotome
Reichert Jung ultracut E muni d'un couteau de verre. Les sections serni-fines
obtenues ont une épaisseur moyenne de 0,9ILm. Ces coupes sont déposées sur des
lames histologiques propres et séchées à l'étuve à 60°C. Elles sont ensuite colorées
selon la méthode de Huber, Parker et Odland (1968) par la fuchsine basique et le bleu
de méthylène. Les observations sont faites sur un microscope photonique Olympus
Vanox équipé d'un module automatique de prise de vues PM 10 AD. Des sections de
nodules plus épaisses de 100 à 300 micromètres ont été également obtenues à l'aide
d'un microtome à lame vibrante Microcut H1200. Ces coupes épaisses sont réalisées
à partir de nodules fixés par la glutaraldéhyde, mais ni déshydratées ni incluses. Les
sections sont ensuite colorées au bleu de méthylène (0,01 % dans l'eau distillée) selon
la méthode de Vasse et Trochet (1984) avant d'être montées entre lame et lamelle
dans de l'eau distillée et observées en microscopie photonique à fond clair.
3.2. Microscopie électronique
Des sections ultrafines de 70 à 80 nrn environ, réalisées au couteau de diamant sont
recueillies sur des grilles de microscopie électronique recouvertes d'une membrane
de formvar. Les coupes ultrafines sont ensuite contrastées selon la méthode de
Reynolds (1963) par l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb. Une fois sèches, les
grilles sont observées à l'aide d'un microscope électronique à transmission HITACHI
EM 600 sous une tension de 75 KV.
4. Méthode d'éclaircissement
4.1. Racines entières
Des racines entières de Sesbania rostrata éventuellement préfixées par la
glutaraldéhyde 2,75% (15 min sous vide puis 15 min à la pression atmosphérique) sont
éclaircies à l'aide d'une solution d'hypochlorite de sodium pendant 15 à 30 min sous
vide. Cette solution est préparée extemporanément, à partir d'une solution
60
commerciale d'hypochlorite de sodium concentrée contenant 12,5% de chlore actif
et diluée dans l'eau distillée (VN) (Truchet et al., 1989). Une fois éclaircies, les
racines sont rincées à l'eau distillée (2 x 5 min), débitées en segments de quelques mm
de longueur, montées entre lame et lamelle et observées en microscopie photonique
à fond clair.
4.2. Sections de nodules
Des sections de nodules de 100 à 300 urnréalisées à l'aide du microcut H1200, sont
préfixées par la glutaraldéhyde pendant 15 min puis éclaircies à l'aide d'hypochlorite
de sodium. Après éclaircissement (15 min à la température du laboratoire) les
sections sont rincées à l'eau distillée avant d'être observées en microscopie
photonique à fond clair.
Dans tous les cas ( racines entières ou
sections de nodules avec ou sans
éclaircissement), les échantillons peuvent être colorés 5 min par le bleu de méthylène
(0,01% dans l'eau distillée) avant d'être observés. Enfin, une dissection ayant pour
but d'enlever le cortex de la racine principale est généralement faite, après la fixation
ou l'étape d'éclaircissement.
61
III. RESULTATS
Les résultats relatifs à I'ontogénèse des nodules radiculaires de Sesbania rostrat
sont présentés en deux parties. Dans une première partie le mécanisme d'infection e
le développement des nodules sont décrits à partir d'observations réalisées e
microscopie photonique. Une seconde partie basée sur des observations en
microscopie électronique,
regroupe l'essentiel de nos résultats concernant la
différenciation ultrastructurale des deux symbiontes.
1. Infection racinaire et développement des nodules
1.1. Sites de nodu]ation et mode d'infection
Le système racinaire de Sesbania rostrata se compose d'une racine principale d'où
émergent un grand nombre de racines secondaires (Pl. 1, Fig. 2). Dans les conditions
de culture en tube que nous avons utilisées, la racine principale apparaît faiblement
piliée. Les poils absorbants de petite taille, droits ou légèrement ondulés, sont
uniformément répartis sur la racine principale et au niveau des jonctions avec les
racines secondaires. L'observation du système racinaire de S. rostrata permet
d'identifier les sites de nodulation 16 à 24 heures après l'inoculation de la souche
Azorhizobium ORS 571. Ces sites, particulièrement visibles après un éclaircissement
à l'hypochlorite de sodium, sont exclusivement localisés à la base des racines
secondaires et affectent plus particulièrement le segment de la radicelle enfoui dans
le cortex de la racine principale (Pl. 2, Fig. 3). C'est donc dans la cavité naturelle due
à l'émergence d'une radicelle que sont réalisées les conditions propices à l'infection
et à la nodulation.
Le mode d'infection de la racine par les bactéries a été recherché en observant la
région basale des radicelles dès la 12ème heure après l'inoculation. Cette recherche
a nécessité dans un premier temps, la dissection du cortex de la racine principale de
manière à dégager la partie enfouie de la radicelle et à mettre à jour les ébauches
méristématiques dès leur plus jeune âge (Pl. 2, Fig. 4 et 5). C'est à la surface de ces
ébauches, éventuellement éclaircies par l'hypochlorite de sodium, que l'infection a
été observée.
62
Le mode d'infection est du type intercellulaire, c'est à dire que les bactéries
pénètrent au niveau de la paroi commune à deux cellules épidermiques adjacentes,
au point de contact entre une cellule épidermique et un poil absorbant ou encore
entre deux poils absorbants adhérents (Pl. 3, Fig. 6, 7 et 8). En effet, et de manière
intéressante, il a été noté, après dissection, la présence de poils absorbants de petite
taille se développant à la surface du segment radicellaire enfoui dans le cortex de la
racine principale (Pl. 2, FigA et 5). Des observations répétées n'ont pas permis
toutefois de déceler des indices d'infection au niveau d'un poil individuel. En
particulier, aucune déformation correspondant au phénotype Hac (Shepherd's crook)
n'a été observée. Cependant, après coloration au bleu de méthylène et dès la 12ème
heure suivant l'inoculation, on peut souvent observer des structures d'infection
classiques intensément colorées, ayant la forme tubulaire classique de filaments
d'infection. Ces filaments sont initiés à partir de poches d'infection intercellulaires
ou au point de contact entre cellules (Pl. 3, Fig. 6 et 8). Des coupes semi-fines
d'ébauches méristématiques ou de segments radiculaires proximaux témoignent de
ce type d'infection intercellulaire (Pl. 4, Fig. 9,10, et Il) et de la relation existant entre
la formation d'une poche d'infection et la différenciation d'un filament d'infection à
partir de cette poche (Pl. 4, Fig. Il). En conclusion, l'infection des racines de S. rostrata
par Azorhizobium ORS 571 est de type intercellulaire et se propage sous la forme de
filaments d'infection.
1.2. Développement d)] nodule
L'apparition de boursouflures à la base d'une radicelle est la première
manifestation visible de la nodulation. L'étude du développement du nodule a donc
été réalisée à partir de coupes semi-fines d'environ lum ou de sections plus épaisses
(100 à 200fl.m) d'ébauches nodulaires prélevées et fixées à des temps variables suivant
l'inoculation. Les sections les plus épaisses ont été éclaircies par l'hypochlorite de Na
et colorées par le bleu de méthylène, avant d'être observées par microscopie
photonique à fond clair.
L'observation de sections de nodules de très jeunes âges (16 à 24 h. après
l'inoculation) montre la présence d'une trace infectieuse localisée au niveau des
cellules épidermiques, et celle d'un méristème nodulaire situé en position interne et
formé de cellules de petite taille (Pl. 5, Fig. 12 et 13). A cet âge, le méristème a une
63
forme arrondie et il est situé en regard de la trace infectieuse périphérique (Pl. 5, Fig.
12). Il prend naissance à partir de cellules corticales de la radicelle qui se
dédifférencient pour acquérir à nouveau l'ultrastructure et les potentialités de cellules
méristématiques classiques (Pl. 5, Fig. 12). Le fait que l'observation de plusieurs
ébauches initiales, n'ait pas permis de localiser la présence d'infection au sein de ces
massifs primordiaux, suggère très fortement que l'induction du méristème nodulaire
par le microsymbionte s'effectue à distance.
Des nodules un peu plus âgés (24 à 36 h après l'inoculation), montrent une
organisation interne différente. Le méristème prend progressivement la forme d'une
corbeille dont la partie concave se distribue autour du site infectieux originel (Pl. 6,
Fig. 14 et 15) ; ce site, en position centrale, est alors constitué de poches d'infection
intercellulaires et de filaments d'infection (Pl. 6, Fig. 16 et 17). Chez des nodules
arrivés à ce stade de développement, la trace infectieuse occupe un espace délimité
par les cellules corticales externes de la racine support et les cellules méristématiques
plus internes. Au cours de ce stade, la dédifférenciation des cellules corticales
nouvelles et/ou l'activité du méristème originel conduisent à une augmentation du
massif méristématique. Cette augmentation se produit selon un mode centrifuge par
rapport à l'axe central d'infection (Pl. 6, Fig. 14 et 15). L'accroissement de la taille du
nodule se fait donc en largeur mais non en longueur. C'est à ce stade, que débute la
différenciation des traces vasculaires du nodule qui assureront l'échange des
métabolites carbonés et azotés entre le nodule et la plante hôte (Pl. 6, Fig. 15).
Le type de développement et l'organisation interne décrits ci-dessus, se confirment
dans le temps. Des sections de nodules âgés de 48h à 72h montrent à la fois,
l'accentuation d'un goulet central où sont apparentes les structures d'infection (Pl.7,
Fig. 18 et 19), et la différenciation centrifuge des cellules du nodule (Pl. 7, Fig.18 et
19) ; les cellules les plus anciennes, déjà différenciées sont alors au centre de la
corbeille, tandis que les cellules les plus jeunes issues de l'activité méristématique et
nouvellement produites sont visibles à la périphérie (Pl. 7, Fig. 21). Il est important
de noter qu'à ce stade, les filaments d'infection constituent alors un réseau étendu qui
s'étale dans toutes les directions et atteint toutes les cellules centrales du nodule y
compris les cellules méristématiques de la périphérie (Pl. 7, Fig. 18, 19 et 20). C'est
au 3ème jour suivant l'inoculation que débute la synthèse de la léghémoglobine. La
présence de l'hémoprotéine est contemporaine du début de la fixation azotée, qui
atteindra son maximum environ 10jours après l'inoculation (Fig. 22). Précisons enfin,
64
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Ficure 22: Evolution de la fixation d'nole des nodules racinairea de S. roslrata
65
que les traces vasculaires et l'endoderme périphérique ont achevé leur différenciation
dès le 4ème-5ème jour après l'initiation du nodule; ils entourent alors le nodule sur
toute sa surface (Pl. 7, Fig. 21).
L'étude histologique des nodules fixés entre le Sème et le 7ème jour après
l'inoculation, montre le maintien d'une zone centrale non envahie correspondant au
goulet originel d'infection, et au niveau duquel quelques filaments d'infection sont
encore visibles (Pl. 8, Fig. 23). Le tissu bactéroïdien conserve sa forme en corbeille,
et le gradient de différenciation cellulaire décrit ci-dessus est alors bien visible (Pl.8,
Fig.23 et 24). Notons qu'à ces âges, le fonctionnement méristématique n'est pas
achevé tel qu'on peut le voir sur la figure 24 où l'on note la présence de filaments
d'infection au niveau de cellules périphériques. Les mêmes caractères d'ensemble
s'appliquent aux nodules matures fixés entre le 7ème et 14ème jour. En section, les
nodules montrent une forme ovale rappelant celle d'une citrouille et qui s'explique
par l'activité méristématique centrifuge décrite plus haut. De même, on note la
persistance de la dépression centrale vestige de la voie d'infection, entourée de tissu
bactéroïdien fixateur, où toute trace d'infection a alors disparu (Pl. 9, Fig. 25). Quant
aux tissus périphériques du nodule, ils se résument en un cortex externe limité à une
seule assise cellulaire, un endoderme nodulaire périphérique et des traces vasculaires
différenciées (Pl. 9, Fig. 26). Ces traces qui sont connectées au système vasculaire de
la plante hôte,sont limitées par un second endoderme, l'endoderme vasculaire (Pl.9,
Fig. 26). Les traces vasculaires cheminent dans un parenchyme nodulaire dont le
plastidome se différencie en chloroplastes à la lumière.
2. Différenciation ultrastructurale des cellules végétales et des bactéroïdes
2.1. Poches d'infection intercellulaires
Dès les premières heures suivant l'inoculation, les bactéries pénètrent dans la
plante hôte au niveau des espaces intercellulaires où elles se multiplient pour former
des poches d'infection intercellulaires. Ces poches limitées par les parois des cellules
adjacentes,sont essentiellement constituées d'un mucilage dans lequel se trouvent les
bactéries (Pl. ID, Fig.27). La nature fibrillaire du mucillage s'observe au niveau
d'auréoles électroniquement claires entourant les bactéries et au niveau desquelles
les fibrilles plus lâches du mucilage sont alors visibles. Ultrastructuralement les
66
bactéries montrent des membranes limitantes ondulées et un espace périplasmique
important. Le cytoplasme bactérien est lui même constitué de deux parties, l'une
périphérique dense aux électrons et l'autre centrale, plus claire, représentant le
nucléoïde. On note l'absence de toute inclusion cytoplasmique chez les bactéries, à
l'exception de très rares gouttelettes de poly p hydroxybutyrate (PHB). Dans le
cytoplasme des cellules végétales limitant les poches d'infection, la présence de
nombreux dictyosomes et une densité ribosomique importante sont les indications
d'une activité métabolique importante. On note également la production dans la
cellule végétale de gouttelettes électroniquement denses qui fusionnent avec le
plasmalemme puis s'immiscent au matériel cellulosique de la paroi.L'origine de ces
gouttelettes n'a pas pu être déterminée. Leur rôle présumé pourrait être le
renforcement des parois limitant les poches d'infection intercellulaires. Il n' y a donc
pas, comme dans d'autres cas décrits chez les légumineuses tropicales, de
désorganisation ou d'effondrement des cellules végétales primitivement envahies.
2.2. Filaments d'infection et libération bactérienne
Les filaments d'infection sont des structures tubulaires, initiées à partir des poches
d'infection intercellulaires; les filaments progressent dans les tissus de la plante par
les parois des cellules qu'ils peuvent pénétrer, par invagination. Un filament
d'infection est délimité par les assises cellulosiques de la paroi végétale qu'il emprunte
(Pl.ll, Fig. 29 et 30). Dans la lumière du filament, les bactéries dont l'ultrastucture
est en tout point identique à celle décrite plus haut, sont le plus souvent en ligne
noyées dans un mucilage dense aux électrons (Pl. 11,Fig. 30). Les filaments d'infection
sont souvent observés au sein même des cellules rnéristématiques nodulaires, cellules
de petit volume, mitotiquement actives, possédant un noyau central à gros nucléole,
un cytoplasme peu vacuolisé et riche en ribosomes et en dictyosomes et des parois
fines traversées par de nombreux plasmodesmes (Pl.lO, Fig. 28). Selon l'axe de
section, on remarque le plus souvent une désorganisation ultrastructurale à
l'extrémité du filament d'infection, où l'on note alors l'absence de la gaine
cellulosique périphérique, et une réduction du matériel mucilagineux (Pl.ll, Fig. 29
et 30). A cette extrémité, les bactéries d'aspect hétérogène ne sont plus alors séparées
du cytoplasme végétal que par le plasmalemme de la cellule hôte. Ces modifications
67
structurales localisées pourraient être l'indice de la libération des bactéries. Plusieurs
observations sont en faveur de cette hypothèse:
(1) L'impossibilité d'observer un mode de libération par endocytose, identique à
celui décrit chez plusieurs légumineuses (Kijne, 1975; Robertson et al., 1978).
(2) L'observation répétée dans des sections longitudinales ou transversales de
gouttelettes d'infection dont une partie est limitée par la paroi et une autre, libre de
toute entrave (Pl.12, Fig. 31-34).
(3) La présence de bactéries dans des" vacuoles" de libération dont l'origine est
révélée par des vestiges d'origine pariétale et/ou du mucilage des filaments d'infection
(Pl.12, Fig. 31-34).
(4) Enfin l'observation d'un nombre accru de gouttelettes infectieuses dans des
cellules hôtes végétales ayant amorcé leur différenciation et montrant, un espace
vacuolaire de plus en plus important (Pl.12, Fig. 33 et 34).
Il n'a pas pu être déterminé si les gouttelettes de libération observées,
représentaient une section transversale de l'extrémité d'un filament d'infection ou
bien des gouttelettes individuelles qui se seraient alors séparées de la digitation
infectieuse avant d'être le site d'une dégradation sélective de la paroi, puis du
mucilage. Quoiqu'il en soit, et dans les deux cas, la libération se traduit donc par
l'individualisation de gouttelettes àl'intérieur desquelles, selon la section, on observe
une à plusieurs bactéries qui ne sont plus séparées du cytoplasme végétal que par le
plasmalemme (Pl.12, Fig. 31-34).
2.3. Différenciation du tissu fixateur
Les quatre étapes de différenciation qui sont décrites ci-dessous ne correspondent
pas à des zones particulières du nodule, mais seulement à quatre types cellulaires les
plus souvent observés; elles résument l'essentiel des modifications ultrastructurales
qui affectent à la fois les cellules végétales et les bactéries. Contrairement à certaines
associations symbiotiques, le passage d'une étape à l'autre se fait de manière
progressive.
68
(1) - Les cellules végétales qui commencent à être envahies par les bactéries ont
un cytoplasme faiblement vacuolisé mais très riche en ribosomes, en profils
réticulaires et en dictysomes (Pl.13, Fig. 35 ; Pl.14, Fig. 37 et 38). Au sein de ce
cytoplasme, les bactéries sont enclavées, le plus souvent seules, et parfois à plusieurs,
dans une membrane qui dérive probablement du plasmalemme qui délimitait les
gouttelettes d'invasion décrites plus haut (Pl. 13, .Fig. 35 et 36). De nombreuses
vésicules cytoplasmiques renfermant parfois un matériel moyennement dense aux
électrons, fusionnent à ces membranes séquestrantes, leur donnant en section un
profil tourmenté (Pl. 14, Fig. 37 et 38). Dans les enclaves, les bactéries dont certaines
se divisent, conservent les caractérisques ultrastructurales qu'elles avaient dans les
poches intercellulaires ou les filaments d'infection, c'est à dire, des membranes
limitantes irrégulières séparées par un espace périplasmique pouvant être important,
et un cytoplasme dense où se reconnaissent les zones riches en ribosomes ou en ADN.
Notons, dès ce stade, la présence de cellules végétales envahies par les bactéries et
d'autres exemptes de toute invasion (Pl.13, Fig. 36).
(2) - La maturation des cellules envahies conduit à trois modifications
ultrastructurales d'importance. On observe en effet, la réduction du nombre de
vésicules du cytoplasme végétal, avec pour conséquence un profil plus homogène des
membranes entourant les bactéroïdes et une diminution progressive de la densité
cytoplasmique en ribosomes (Pl.15, Fig. 39 et 40). Parallèlement, le début de
différenciation des bactéroïdes d'aspect plus régulier et qui s'allongent (Pl.15, Fig.39),
s'accompagne d'une réduction de l'espace périplasmique due à un contact plus étroit
entre la paroi et la membrane cytoplasmique et de l'apparition dans le cytoplasme
bactéroïdien de granules de polyphosphates très osmiophiles (PU5, Fig. 40). Enfin,
àce stade, on remarque généralement la présence d'une seule bactérie par membrane
de séquestration mais aussi des zones de contact étroit entre membranes
séquestrantes (Pl.15, Fig. 40). Il Ya donc une réduction du nombre de bactéries par
sac si l'on compare les cellules végétales récemment envahies à celles qui ont amorcé
leur différenciation. Une telle variation ne peut s'expliquer, dans un premier temps,
que par le morcellement de chaque membrane péribactéroïdienne limitant une
gouttelette d'infection, en autant de sacs qu'il y a de bactéries enclavées; puis, dans
un second temps, par la division simultanée de chaque bactéroïde et de la membrane
qui lui est propre.
69
(3) - La troisième étape de différenciation se caractérise également par plusieurs
critères ultrastructuraux. D'un point de vue végétal, la cellule hôte, très large et de
forme généralement arrondie, est alors entièrement envahie par les bactéroïdes
(Pl.16, Fig. 41). Cette invasion a pour conséquence une réduction importante du
cytoplasme et le rejet contre les parois cellulaires des organites cytoplasmiques, tels
que les mitochondries ou les plastes (Pl.16, Fig. 42). Notons également, comme dans
la majorité des nodules de légumineuses étudiées à ce jour, la présence parmi les
cellules envahies, de cellules exemptes de toute invasion (Pl.16, Fig. 41). Ces cellules
de plus petite taille, se résument à un cadre cellulaire, délimitant un volume occupé
dans sa très grande partie par une vacuole très développée (Pl.16, Fig. 41). Entre la
paroi et la vacuole, on distingue une mince frange cytoplasmique où se distinguent
des organites classiques et des globules électroniquement denses et limités par une
simple membrane, les péroxysomes (Pl. 16, Fig. 41).
D'un point de vue bactérien, deux caractères principaux sont à retenir:
- Le profil régulier et l'aspect homogène des bactéroïdes dont les pôles sont le plus
souvent occupés par une accumulation importante de PRB (P1.16, Fig. 41 ; Pl.l7,
Fig.42).
- La concentration à nouveau de plusieurs bactéroïdes par sac péribactéroïdien
dont le profil en "rosace" est alors caractéristique (P1.16, Fig. 41; Pl.l7, Fig. 42). Les
deux hypothèses qui peuvent être émises pour expliquer une telle organisation,
division unilatérale des bactéroïdes ou fusion de membranes individuelles en un
compartiment plus vaste, restent encore en suspens. Toutefois, des indices tangibles
de fusion entre membranes semblent accréditer la seconde hypothèse (Pl.17, Fig. 42).
(4) - Le stade ultime de différenciation se caractérise chez la cellule végétale par
une perte importante de la densité ribosomique, un noyau de profil très irrégulier et
un cytoplasme réduit par la présence dans les cellules envahies de sacs
péribactéroïdiens renfermant jusqu'à plusieurs dizaines de bactéroïdes (Pl.18, Fig. 43
et 44). Ceux-ci possèdent un cytoplasme où le nucléoïde central est encore visible, et
dans lequel s'accumulent de larges gouttelettes de PRB et des inclusions très denses
de polyphosphate (PU8, Fig. 44). Ce stade de différenciation qui est le plus avancé
que nous ayons observé, correspond à un nodule de 14jours.
70
IV. DISCUSSION
L'organogénèse des nodules racinaires de S. rostrata induits par l'Azorhizobium
ORS 571 se subdivise en 3 phases principales:
Une phase d'jnfection intercellulaire des Awrhizobium qui se produit à la base
des racines secondaires, dans le segment de la radicelle enfoui dans le cortex de la
racine principale. Cette infection intercellulaire conduit à la formation de poches
d'infection intercellulaires où les bactéries se multiplient activement, puis à celle
ultérieure, de filaments d'infection intercellulaires. Les filaments qui se différencient
à partir des poches intercellulaires, essaiment enfin vers le cortex racinaire.
- Une phase d'jnduction méristématique qui s'effectue à distance de la trace
infectieuse et qui affecte les cellules corticales de la racine. L'activation du méristème
originel conduit à un développement nodulaire de type centrifuge, les cellules
néoformées se disposant en corbeille autour d'un axe infectieux central.
- Une phase de maturation, où les cellules méristématiques sont successivement
atteintes par un filament d'infection puis progressivement
envahies
par les
bactéroïdes. Les cellules envahies se différencient ensuite selon un gradient où les
cellules méristématiques se retrouvent en position excentrée, et les cellules fixatrices
en position médiane. Un endoderme et des traces vasculaires en continuité avec
le cylindre central de la racine support, sont observés à la périphérie du nodule
mature.
Certaines étapes du développement des nodules racinaires de S. rostrata rappellent
celles, déjà décrites, chez d'autres légumineuses. A ces étapes, communes à plusieurs
associations symbiotiques, s'ajoutent d'autres étapes propres à S. rostrata et qui ne
semblent pas avoir été décrites à ce jour. La discussion qui suit précise les caractères
communs ou spécifiques de la nodulation racinaire chez S. rostrata, selon l'ordre
chronologique où ils se manifestent pendant le développement.
Sites de nodulation
Chez la majorité des légumineuses tempérées comme la luzerne ou le trèfle, il n'est
pas possible de repérer à l'avance, les sites racinaires où les nodules vont se
développer. Chez ces plantes, il semble en effet, exister une sensibilité constante des
poils absorbants à l'infection, qui se traduit par une nodulation répartie uniformément
71
sur toute la racine (Bhuvaneswari et al., 1981).Chez le soja, Bhuvaneswari et al. (1980)
ont montré que les nodules sont concentrés sur le fragment de la racine où les poils
absorbants en développement sont particulièrement sensibles à l'infection. Chez
Sesbania rostrata, les sites de nodulation sont prédéterminés; au niveau de la tige, le
nodule se développe à partir de bourgeons caulinaires capables de se différencier en
racines latérales en cas d'immersion (Duhoux et Dreyfus, 1982; Tsien et al., 1983 ;
Duhoux, 1984). Au niveau de la racine, nous avons montré que la nodulation prenait
naissance au niveau du segment de la racine secondaire enfoui dans le cortex de la
racine principale. La présence de cavités naturelles, dues à l'émergence de bourgeons
ou de la radicelle, et où les bactéries se concentrent, semble donc une condition
nécessaire à la nodulation de S. rostrata. Cela parait être également le cas d'autres
légumineuses tropicales comme Aeschynomene afraspera (Alazard et Duhoux, 1987,
1988).
Mode d'infection
Le mode d'infection de la racine de S. rostrata par voie intercellulaire ("Crack
entry") est observé couramment chez les légumineuses tropicales. Il a aussi été décrit
dans le cas de la nodulation caulinaire chez S. rostrata (Tsien et al., 1983 ; Duhoux,
1984), chez Neptunia oleracea (Schaede, 1940 ; Dreyfus et al., 1984),Aeschynomene
americana (Napoli et al., 1975),Aeschynomene indica (Arora, 1954),Arachis hypogea
(Chandler, 1978), Stylosanthes (Chandler et a!., 1982), Mimosa scabrella (Faria et
al.,1988) et enfin chez le soja ( Turgeon et Bauer, 1985) où il coexiste toutefois avec
la voie classique d'infection par filaments d'infection au niveau des poils absorbants
(Turgeon et Bauer, 1982). Ce mode d'infection intercellulaire a également été décrit
chez la luzerne après inoculation d'une souche d'Agrobacterium tumefaciens portant
le plasmide symbiotique de R. meliloti (Trochet et al., 1984) ou d'une souche de
R.meliloti EXO-, déficiente dans la production d'exopolysaccharides acides (Finan et
a!., 1985). Ces deux derniers résultats suggèrent fortement que le mode d'infection
atypique par pénétration intercellulaire représente un type d'infection ancestral
particulièrement répandu chez les légumineuses tropicales. La formation de poches
intercellulaires, visibles dès les premières heures qui suivent l'inoculation apparaît en
revanche, comme une caractéristique de S. rostrata et n'avait été décrite à ce jour que
dans le cas de la nodulation caulinaire de cette légumineuse (Tsien et al., 1983 ;
Duhoux, 1984).Des poches intercellulaires ont également été décrites à la périphérie
de nodules de luzerne stimulés par Agrobacterium tumefaciens portant le plasmide
72
Sym (Trochet et al., 1984). Enfin, la présence de cordons d'infection, observés dans
les nodules racinaires de S. rostrata est un caractère de nodulation largement répandu.
Des filaments d'infection ont aussi été décrits dans les nodules de toutes les
légumineuses tempérées étudiées. [Le trèfle (Gourret, 1975),le pois (Kijne, 1975 ;
Trochet, 1976), la luzerne (Vasse et Trochet, 1984)... ] et de légumineuses tropicales
à nodules caulinaires [S. rostrata (Tsien et al., 1983 ; Duhoux, 1984), Neptuniaoleracea
(Schaede, 1940)] ou à nodules racinaires [Glycine max (Bauer, 1981 ; Pueppke, 1983),
Vigna unguiculata (Pueppke, 1983]. Rappelons que chez les légumineuses tempérées,
et quelques légumineuses tropicales comme le soja, les filaments d'infection sont
initiés au centre de la courbure d'un poil déformé en crosse ("Shepherd's crook,"
phenotype Hac). En revanche, chez S. rostrata, et quel que soit le type de nodulation
observé, les filaments d'infection sont initiés à partir d'une poche intercellulaire
d'infection. Ace titre, et contrairement à ce que OIson et Rolfe (1985) ont décrit dans
le cas de la nodulation racinaire chez S. rostrata, nous n'avons jamais observé
d'infection au niveau d'un poil absorbant, rappelant, celle classique des légumineuses
tempérées, aussi bien avec la souche d'Azorhizobium ORS 571 qu'avec les souches de
Rhizobium ORS 52 et ORS 611.
Quel que soit leur site d'initiation (poches intercellulaires ou courbure d'un poil
absorbant) et les légumineuses chez lesquelles ils ont été décrits, les filaments
d'infection montrent toujours la même organisation ultrastructurale. Les bactéries
sont incluses dans un mucilage d'origine indéterminée, lui même limité par la paroi
pectocellulosique et par le plasmalemme des cellules adjacentes. Cette organisation
structurale caractérise à la fois les filaments d'infection et les poches intercellulaires
d'infection décrites dans les nodules caulinaires (Tsien et al., 1983 , Duhoux, 1984),
les nodules racinaires de S. rostrata (notre étude), ainsi que les poches intercellulaires
d'infection observées dans les nodules de luzerne induits par Agrobacterium
tumefaciens pSyrn (Truchet et al., 1984). L'hypothèse selon laquelle un filament
d'infection se développerait par invagination de la paroi d'un poil absorbant
(Nutman, 1956) est de nos jours écartée. Lors d'une étude ultrastructurale à partir
de coupes sériées d'un poil de soja infecté, Callaham et Torrey (1981) ont en effet
montré, que le développement d'un filament d'infection s'effectuait par dégradation
locale de la paroi existante et la synthèse simultanée d'une paroi nouvelle autour du
site infectieux. Il est possible qu'un tel processus soit impliqué dans la formation de
73
cordons d'infection à partir de poches intercellulaires dans les nodules caulinaires de
S. rostrata (Duhoux, 1984).
Libératjon des bactéries
Le mode de libération par endocytose, répandu chez les légumineuses tempérées,
a été décrit par plusieurs auteurs. Chez ces plantes, les bactéries se libèrent le plus
souvent à partir de l'extrémité d'un filament d'infection qui n'est plus limité par la
paroi végétale et au niveau de laquelle les bactéries s'accolent contre le plasmalemme
limitant le filament d'infection. La phase finale de libération s'apparente à un
mécanisme d'endocytose, mécanisme par lequel les bactéries s'extrayent du filament
d'infection pour se retrouver en position intracellulaire. La libération serait la
résultante d'une coopération entre symbiontes dont les activités enzymatiques
respectives permettraient la dégradation des couches cellulosiques et du mucilage à
l'extrémité du filament d'infection (Verma et al., 1978),permettant ainsi l'étape finale
d'endocytose (Dixon, 1964; Kijne, 1975 ; Robertson et al., 1978). Notons que, selon
Roberston et al. (1978), l'absence de paroi cellulaire limitante serait une condition
nécessaire à la libération des bactéries, et qu'une activité phosphatasique acide, liée
à la libération bactérienne, a été localisée au sein du filament d'infection, dans les
nodules de pois (Truchet et Coulomb, 1973). Des modes de libération différents ont
toutefois été décrits chez d'autres légumineuses et essentiellement chez les
légumineuses tropicales. Ainsi chezArachis hypogea (Allen et Allen, 1940; Chandler,
1978), Stylosanthes (Chandler et al., 1982),Aeschynomene (Arora, 1954; Napoli et al.,
1975; Vaughn et Elmore, 1985), Mimosa scabrella (Faria et al., 1988), les bactéries
sont déversées directement dans le cytoplasme des cellules végétales, après
dissolution de la paroi des cellules ; les bactéries se propagent ensuite par mitoses
successives des cellules déjà infectées. Un mode plus élaboré a été décrit chez Vigna
radiata (Newcomb et McIntyre, 1981) où des gouttelettes d'infection véhiculent dans
un premier temps, les bactéries au sein du cytoplasme végétal. La libération du
microsymbionte intervient plus tardivement par un mécanisme d'endocytose
identique à celui décrit plus haut. Dans les nodules radiculaires de S. rostrata, un mode
intermédiaire semble exister. Comme chez Vigna, les gouttelettes d'infection ont été
observées. Ultrastructuralement, ces gouttelettes, localisées à l'extrémité sans paroi
d'un filament d'infection, ou libres dans le cytoplasme végétal, montrent une
dégradation importante de la paroi limitante et une diminution très poussée du
mucilage interne. Contrairement au mécanisme observé chez Vigna, le processus final
74
de libération par endocytose n'a pas été observé, dans le cas des nodules radiculaires
de Sesbania rostrata. En revanche, la réduction du nombre de bactéries, de quatre
dans les gouttelettes d'infection localisées au niveau des cellules méristérnatiques à
une seule bactérie par membrane enveloppe dans des cellules plus différenciées,
suggère fortement une division sélective de la membrane limitant les gouttelettes
d'infection en autant de compartiments qu'il y a de bactéries incluses. Ce mode
original de libération ne semble pas avoir été décrit à ce jour.
Induction du méristème nodulaire
Le méristème des nodules racinaires de S. rostrata est induit au niveau de cellules
corticales internes de la racine support, situées en regard de la trace infectieuse
périphérique. Le fait qu'aucun signe d'infection ne soit visible au niveau même des
cellules méristématiques originelles, suggère que l'induction s'effectue à distance, en
stimulant la dédifférenciation des cellules corticales de la plante. Le mode d'induction
à distance a été décrit lors de l'étude
de l' organogénèse des nodules chez les
légumineuses tempérées comme le pois (Libbenga et Harkes, 1973 ; Newcomb et al.,
1979) et la luzerne (Trochet et al., 1980). L'étude des propriétés symbiotiques de
plusieurs mutants de Rhizobium meliloti qui, bien que ne formant pas de filaments
d'infection (Trochet et al., 1984; Finan et al., 1985; Leigh et al., 1985) ou incapables
de se libérer dans les cellules végétales (Trochetet al., 1980; Leigh et al., 1985, 1987),
nodulent néanmoins spécifiquement la luzerne, a confirmé la notion d'induction à
distance. Selon Trochet et al. (1980), un principe inducteur de la nodulation, d'origine
bactérienne et de nature chimique encore inconnue, serait responsable de la
dédifférenciation des cellules corticales végétales. L'hypothèse d'un rôle de
phytohormones dans ce mécanisme a également été suggérée par Libbenga et al.
(1973). Les cellules cibles affectées lors de l'étape d'induction nodulaire sont
généralement les cellules corticales de la plante: cellules corticales internes comme
chez le pois (Libbenga et Harkes, 1973 ; Trochet, 1978 ; Newcomb et al., 1979) ou la
luzerne (Trochet et al., 1980) ; ou cellules corticales externes, en particulier chez le
soja (Newcomb et al., 1979; Turgeon et Bauer, 1982), le haricot (Vandenbosch et al.,
1985) ou l'arachide (Allen et Allen, 1940 ; Chandler, 1978).
Dans la majorité des travaux relatifs à la nodulation chez les légumineuses
tropicales, il n'est généralement pas fait mention des assises végétales initialement
réactivées. Dans le cas des nodules caulinaires de S. rostrata où, une induction
75
méristématique à distance a été décrite (Tsien et al., 1983 ; Duhoux, 1984), le nodule
serait induit à partir du cortex de la racine (Tsien ,1983) ou au niveau de tissus non
caractérisés, mais qui seraient localisés sous le méristème apical du bourgeon
caulinaire (Duhoux, 1984).
Activité méristématique et développement nodulaire
Une fois induit, le méristème nodulaire montre une activité mitotique importante,
et s'accroît en volume. Le mode de fonctionnement méristématique détermine la
morphologie des nodules. Deux types morphologiques ont été décrits:
- Les nodules de type indéterminé (pois,vesce,trèfle, luzerne,...) ont un méristème
qui se situe en position apicale et qui montre une activité ininterrompue pendant
plusieurs semaines. En conséquence, le nodule s'allonge selon un axe proximo distal
(de la racine vers l' extérieur) et se différencie en zones, où toutes les étapes de la
différenciation des cellules végétales et des bactéries sont observées. Au terme de
leur développement, les nodules
indéterminés montrent une forme oblongue
caractéristique.
- Le nodule de type détermjné (soja, haricot, nodules caulinaires de S. rostrata et
la majorité des légumineuses tropicales) ont un méristème dont l'activité est réduite
dans le temps. A l'arrêt de la prolifération méristématique, succède alors une phase
de différenciation cellulaire synchrone qui aboutit, à maturation, à l'individualisation
d'une seule zone centrale. Les nodules déterminés ont généralement une forme
sphérique ou ovoïde.
Les nodules racinaires de S. rostrata présentent des caractéristiques de
développement propres à chacun des types résumés ci-dessus. Dans les nodules
racinaires, nous avons décrit une activité méristématique de type centrifuge éloignant
les cellules méristématiques du goulet d'infection central et laissant dans l'intervalle,
une palette de cellules envahies dont les plus différenciées sont localisées au centre
du nodule. Ces critères sont propres aux nodules de type indéterminé. Toutefois, ce
mode de développement s'achève par l'arrêt de l'activité méristématique en
périphérie du nodule. La différenciation progressive des dernières cellules du
méristème conduit alors à l'homogéneisation cytologique des cellules internes du
nodule qui, en section, fait apparaître un type cellulaire unique. A la fin de leur
développement, les nodules radiculaires de S. rostrata sont alors de type déterminé,
76
et montrent un aspect ovoïde caractéristique. A notre connaissance, ce type
intermédiaire de développement n'a pas été décrit chez une autre légumineuse.
Différenciation des bactéroïdes
La différenciation des bactéroïdes intracellulaires comprend deux phases qui
peuvent être simultanées, une phase de multiplication qui aboutit à l'augmentation
sensible du nombre de bactéries par cellule envahie et une phase de maturation qui
s'accompagne souvent d'un polymorphisme.
La phase de multiplication peut se dérouler de deux manières. La plus répandue
implique la division de l'ensemble de l'unité structurale représentée par une bactérie
et sa membrane de séquestration ( membrane enveloppe). Ce type de division, qui
aboutit à un nombre croissant de bactéries séquestrées individuellement, est commun
à toutes les légumineuses tempérées étudiées à ce jour (pois, vesce, lupin, trèfle, ...)
et à plusieurs légumineuses tropicales comme Arachis hypogea (Chandler, 1978),
Aeschynomene indica (Yatazawa et al., 1984, Vaughn et Elmore, 1985) ou chez le
genre Stylosanthes (Chandler et al., 1972).
Le deuxième mode de multiplication implique la division exclusive de la bactérie
et non de la membrane séquestrante. Au terme de la phase de multiplication, plusieurs
bactéroïdes se retrouvent alors dans le même sac péribactéroïdien. Ce mode de
multiplication a été particulièrement décrit chez le soja (Bergersen et Briggs, 1958).
Chez S. rostrata, le premier mode de libération par divisions simultanées de
l'ensemble bactérie-membrane péribactéroïdienne a été observé. Ce mode de
multiplication caractérise à la fois les bactéroïdes intracellulaires des nodules
radiculaires ou caulinaires. Rappelons que dans les nodules racinaires, les bactéries
individuelles dérivent du morcellement préalable de gouttelettes d'infection
renfermant plusieurs bactéries; il est très probable que le même mécanisme se
déroule dans les nodules caulinaires.
La phase de maturation regroupe l'ensemble des modifications qui conduisent à
la différenciation des bactéroïdes fixateurs d'azote. Les paramètres les plus souvent
décrits sont la forme, le nombre, la taille et l'ultrastructure des bactéroïdes. Ainsi, par
exemple, dans les nodules de luzerne,le bactéroïde fixateur d'azote est allongé,
ceinturé par une membrane séquestrante qui lui est propre, et montre une
ultrastructure remarquable par l'alternance de zones claires à nucléoïdes et de zones
77
sombres à ribosomes ( Vasse et Truchet, communication personnelle). Chez le trefle,
ou le pois, un polymorphisme avec des formes en x et y a été décrit (Gourret et Arias,
1974) ; chez le soja, la différenciation conduit à la concentration de plusieurs
bactéroïdes arrondis par sac bactéroïdien (Werner et Morschel, 1978),tandis que,
chez l'arachide, un seul bactéroïde par sac est dénombré (Chandler, 1978). En réalité,
tous les cas de figures existent et ont été décrits au cours d'études réalisées sur le
développement nodulaire chez les légumineuses. On doit toutefois retenir que les
caractères de différenciation des bactéroïdes seraient contrôlés exclusivement par la
plante (Kidby et Goodchild, 1966) et il a été montré qu'une même bactérie se
différenciait de manière différente en fonction de l'hôte auquel elle est était inoculée
(Kidby et Goodchild, 1966 ; Dart, 1977).
Le fait que les bactéroïdes se différencient de manière identique dans les nodules
caulinaires et racinaires de S. rostrata,est conforme à cette hypothèse. Dans les deux
cas, au terme de cette différenciation, on dénombre dans un même sac
péribactéroïdien plusieurs bactéries de forme plus arrondie que les bactéroïdes
nouvellement libérés dans le cytoplasme. Le mécanisme par lequel, un nombre
croissant de bactéroïdes par sac est observé tout au long de la différenciation des
nodules radiculaires de S. rostrata, n'a pas été résolu. Deux possibilités demeurent,à
savoir la division unilatérale de la bactérie ou la fusion de plusieurs sacs
péribactéroïdiens en un sac individuel plus large. Une observation attentive de
micrographies de cellules nodulaires envahies montrant des contacts de plus en plus
fréquents entre les sacs bactéroïdiens de bactéries individuelles, le profil souvent en
" rosace " du sac péribactéroïdien délimitant plusieurs bactéries et les indices de
fusions membranaires à l'intérieur d'un sac regroupant plusieurs bactéroïdes, sont en
faveur de la deuxième hypothèse. Des fusions entre membranes séquestrantes ont été
décrites dans les nodules radiculaires de pois (Gunning, 1970), du haricot (Pladys et
Rigaud, 1988)ou de luzerne (Truchet et Coulomb, 1973). Ces fusions ne sont toutefois
visibles que dans la zone proximale du nodule, où une dégénérescence des symbiontes
est observée, et non dans la région centrale fixatrice. Dans les nodules radiculaires de
S. rostrata, les fusions supposées sont observées à un moment du développement
pendant lequel le nodule exprime sa plus grande capacité à réduire l'acétylène.
L'hypothèse selon laquelle, la forme du bactéroïde dont l'ultrastructure est présentée
sur la Planche 15, figure 40 représenterait la forme différenciée fixatrice d'azote du
microsymbionte reste à démontrer.
78
Le nodule mature
L'organisation histologique interne des nodules de S. rostrata est en tout point
comparable à celle des nodules caulinaires (Tsien et al., 1983; Duhoux, 1984) ou celle
des nodules d'autres légumineuses comme Glycine max (Newcomb et al., 1979), Vigna
unguiculata
(Dart, 1977) ou Arachis hypogea (Chandler, 1978). On notera en
particulier parmi les cellules fixatrices centrales du nodule, des cellules exemptes de
toute infection,qui pourraient être impliquées dans la transformation de l'ammonium
issu de la fixation en uréïdes. Il a été montré en effet chez le soja et le haricot
(Newcomb et al., 1985 ; Vandenbosch et Newcomb, 1986), que certaines enzymes
assurant cette transformation étaient localisées dans les peroxysomes des cellules non
envahies. S. rostrata étant une légumineuse à uréïdes (Thaler et Alazard,
communication personnelle) et des péroxysomes ayant été observés au sein des
cellules non envahies de la zone centrale, il est probable que ces cellules aient un rôle
équivalent dans l'assimilation de l'azote fixé.
79
CHAPITRE III
QUANTIFICATION DE L'AZOTE FIXE
PAR SESBANIA ROSTRATA
80
I. INTRODUCTION
Les données globales sur la fixation d'azote par les légumineuses sont très
variables. Ainsi chez les légumineuses tempérées, la fixation d'azote varie en général
de 20 à 150Kg Nz/ha/an (Gibson, 1977) tandis que certaines légumineuses tropicales
peuvent fixer plus de 300 kg Nz/ha/an (Quispel, 1974). Plusieurs méthodes ont été
développées pour estimer la fixation d'azote chez les légumineuses; les méthodes
les plus couramment employées sont:
- La méthode par différence de rendement (Weber, 1966 ; William et al., 1977 ;
Talbot et al., 1982) qui consiste à comparer la teneur en azote total des plantes
fixatrices et non fixatrices.
- La méthode consistant
en une mesure de l'activité nitrogénase ; l'enzyme
nitrogénase qui réduit N2 en NH3, peut également réduire l'acétylène C2H2 en
éthylène C2H4 (Dilworth, 1966 ; Hardy et al., 1973 ; Turner et Gibson, 1980).
- Les méthodes isotopiques fondées sur l'emploi d'isotopes stables permettant de
différencier l'azote provenant de chaque source, azote de l'air et azote du sol (Fried
et Middleboe, 1977 ; Kohl et al., 1980 ; Turner et Bergersen, 1980 ; Mariotti et al.,
1983 ; Guiraud, 1984).
S. rostrata pouvant porter des nodules fixateurs d'azote à la fois sur les racines et
les tiges, le nombre et le poids des nodules peuvent donc être beaucoup plus élevés
que chez la majorité des autres légumineuses (Dreyfus et Dommergues, 1981). La
mesure de la fixation azotée par la méthode de l'activité nitrogénase a montré que la
capacité de S. rostrata à fixer l'azote, considérable et voisine de
600ll-moles
C2H4Ih/plante (Dreyfus, 1982), est 4 à 5 fois plus élevée que celle du soja évaluée à
environ 120 Ilmoles C2h4lh/plante (Sloger et al., 1975); il s'agit là toutefois d'une
estimation indirecte de l'activité fixatrice d'azote qui ne donne pas une mesure exacte
de l'activité réductrice effective de la nitrogénase ; elle présente également le
désavantage de ne pas refléter exactement ce qui se passe dans la plante.
Une estimation faite par la méthode par différence de rendement a montré que
S. rostrata cultivée au champ fixe environ 200 kg Nz/ha pendant une période de 52
jours (Rinaudo et al., 1982).Cette valeur, toutefois, reste également criticable, du fait
même de la méthode utilisée et qui est basée sur le dosage de l'azote total, c'est à
dire l'azote fixé et l'azote minéral. En effet cette méthode implique que l'absorption
81
de l'azote combiné du sol est la même pour la plante fixatrice et la plante témoin.
Cette absence d'intéractions entre fixation et absorption d'azote minéral n'est pas
prouvée et peut conduire à une sous estimation de la fixation d'azote (Mariotti et al.,
1983).
L'objectif de cette étude a donc consisté tout d'abord à mesurer avec précision
l'azote fixé par S. rostrata par la méthode de dilution isotopique 15N. Cette méthode
qui a l'avantage d'être une méthode directe de mesure de la fixation d'azote, permet
d'intégrer la totalité de la saison de croissance de la plante (Mariotti et al., 1983) et
offre une sensibilité de l'ordre de 50 fois supérieure au test de Kjeldahl (Larue et
Patterson, 1981 ; Guiraud, 1984). Nous avons ensuite comparé les résultats obtenus
par cette méthode avec ceux obtenus en utilisant la méthode de la différence. De
même et dans le but de mieux évaluer les potentialités de fixation d'azote par les
nodules de tige chez Sesbania rostrata, nous avons comparé la fixation d'azote de
Sesbania rostrata à celle de Sesbania sesban, espèce de Sesbania sans nodules
caulinaires présentant un développement végétatif tout à fait comparable à celui de
Sesbania rostrata. Au cours de la présente étude, nous avons enfin cherché à
déterminer l'influence de la submersion du sol sur la capacité fixatrice des deux
espèces de Sesbania.
82
II. MATERIELS ET METHODES
1. Méthodes de culture
S. rostrata et S. sesban sont cultivées pendant 7 semaines sur sol de Bel-Air stérile,
en vase de végétation, 1 plante par vase. L'inoculation des racines est effectuée au
moment du semis des graines germées, respectivement avec les souches ORS 571 et
ORS 502. L'inoculation des tiges de S. rostrata a été effectuée aux 14ème et 28ème
jours par pulvérisation d'une culture d'ORS 571. A compter du 14ème jour suivant
l'inoculation, les plantes sont arrosées abondamment afin de maintenir le sol très
humide dans chaque vase. 4 répétitions par traitement sone réalisées. Les mesures,
nombre de nodules, poids sec des nodules, activité nitrogénase des nodules et l'azote
total des plantes sont effectuées à intervalle d'une semaine à compter de la 3ème
semaine de croissance. L'activité nitrogénase des nodules est mesurée par la méthode
de réduction de l'acétylène en éthylène (Hardy et al., 1973). L'azote total des parties
aériennes a été déterminée suivant la méthode de micro Kjeldahl (Rinaudo, 1970).
2. Estimation de l'azote fixé par S. rostrata et S. sesban ; méthode par différence
et isotopique N-15
2.1. Dispositif expérimental
L'expérience a été réalisée dans une serre de la station ORSTOM de Dakar
Sénégal, pendant la période allant de décembre 1985 à février 1986. A cette époque
de l'année, la température moyenne pendant le jour est de 24°C, la température de
nuit 20°C et la photopériode seulement de 12h.
2.2. Préparation du sol
Le sol utilisé est un sol sableux typique (psamment) répondant au nom
vernaculaire de Dior, ayant un pH de 7,0 et renfermant 93% de sable, 0,3% de C et
0,025% de N. ( cf. tableau 4). Pour éviter toute contamination par des Rhizobium
indigènes, le sol est préalablement stérilisé par fumigation au bromure de méthyle.
Le sol est ensuite réparti dans des seaux en plastique de 30 cm de diamètre à raison
83
de 20 kg de sol par seau. L'engrais azoté marqué lSN est alors appliqué dans tous les
seaux à la dose de 0,2 g N par seau, ce qui correspond, à l'application de 28,3 kg N
par ha. L'azote marqué est appliqué sous forme d'une solution de eSNH4)ZS0 4avec
un excès isotopique de 4,973% et enrichie en glucose (5g/seau) de façon à obtenir un
rapport C/N de 10. La fertilisation phosphopotassique consiste en l'application de 19
de KzHP04 par seau, ce qui correspond à 140 kg par ha.
2.3. Culture des plantes
Les graines sont stérilisées en surface à l'aide d'acide sulfurique concentré. La
durée de ce pré traitement est de 45 mn pour Sesbania rostrata et de 30 mn pour S.
sesban. Les graines, lavées plusieurs fois à l'eau stérile, sont mises à germer pendant
24h sur des boîtes de Petri contenant de l'agar semi-solide à 8%0. Les graines germées
sont ensuite semées dans les seaux. Quelques jours après le semis, les jeunes plantes
sont démariées de façon qu'il ne reste q'une seule plante par seau. Les plantes sont
maintenues pendant 2 mois en serre.
Sesbania rostrata étant une espèce
photopériodique dont le développement est fortement ralenti en période de jours
courts, les plantes reçoivent un éclairage complémentaire artificiel prolongeant la
durée du jour jusqu'à 14h.
2.4. Technique d'inoculation
N'ayant pu, à ce jour isoler de souche de Rhizobium capable de noduler
effectivement à la fois les tiges de Sesbania rostrata et les racines de Sesbania sesban,
nous avons sélectionné à partir de 36 souches, celles assurant la meilleure fixation
d'azote pour les deux espèces: la souche ORS 571 pour la nodulation des tiges et des
racines de Sesbania rostrata et la souche ORS 502 pour la nodulation des racines de
Sesbania sesban. La souche ORS 571 est cultivée sur milieu YL (Dreyfus et al., 1983)
et la souche ORS 502 sur milieu YM (Vincent, 1970).Pour inoculer les racines des
deux espèces de Sesbania, 10 ml d'une culture liquide de Rhizobium sont versés sur
le sol au moment de la mise en terre des graines germées. Pour inoculer les tiges de
Sesbania rostrata on pulvérise les tiges avec une culture de la souche ORS 571, 3
semaines après le semis. Les plantes témoins, c'est à dire non inoculées, n'ont jamais
été contaminées pendant la durée de l'expérience.
84
2.5. Traitement
L'expérience a consisté en l'étude des trois facteurs suivants:
Facteur A (espèce de Sesbania) : S. rostrata; S. sesban
Facteur B (régime hydrique) : sol drainé; sol submergé
Facteur C (inoculation) : pas d'inoculation; inoculation.
Le dispositif est un bloc randomisé avec 4 traitements, 4 répétitions et 2 régimes.
Les traitements sont les suivants:
Traitement 1 et 5 : Sesbania rostrata non inoculée
Traitement 2 et 6 : Sesbania sesban non inoculée
Traitement 3 et 7 : Sesbania rostrata inoculée
Traitement 4 et 8: Sesbania sesban inoculée
Dans le cas des plantes cultivées en sol submergé (1, 2, 3 et 4), une lame d'eau de
2 à 3 cm d'épaisseur est maintenue sur le sol à partir de la deuxième semaine. Dans
le cas des plantes cultivées en condition de drainage (5, 6, 7 et 8), la fréquence et
l'abondance de l'arrosage sont telles que la tension de l'eau du sol est maintenue au
voisinage de la capacité au champ.
La récolte des plantes intervient au bout de 60 jours, âge auquel les Sesbania
rostrata ont 1,6 m de haut et les Sesbania sesban l,lm de haut. Grâce au maintien
d'une photopériode de 14 h, aucune plante ne fleurit.
2.6. Estimatjon de la fixation d'azote
Les feuilles et les tiges sont échantillonnées séparément et sèchées à 60-70°C.
Chaque échantillon est ensuite broyé pour obtenir une poudre de 100!JlTI. L'azote
total de chaque échantillon est ensuite dosé en utilisant la méthode de micro Kje1dah1
(Rinaudo, 1970). Les analyses de 15N ont été réalisées au laboratoire de l'AlEA à
Seibersdorf (Vienne) en utilisant la méthode de Dumas et la spectométrie de masse
(Fiedler et Proksch, 1975). Pour chacune des plantes, les teneurs en N et 15N sont
85
calculées en prenant en compte les poids secs et les teneurs en N et 15N des feuilles
et des tiges.
Les potentialités fixatrices d'azote de Sesbania rostrata et Sesbania sesban ont été
estimées par les deux méthodes suivantes.
2.6.1. Méthode de la différence
La quantité d'azote fixée est mesurée par la différence entre la teneur en azote
total des parties aériennes des plantes inoculées fixatrices d'azote et la teneur en azote
total des plantes non inoculées non fixatrices d'azote et dont l'azote provient
uniquement du sol. Les plantes ayant reçu la même application d'engrais marqué à
l'15N, on calcule pour chaque plante fixatrice la différence entre la teneur en azote
total des parties aériennes de chacune d'entre elles et la moyenne de la teneur en
azote total des plantes non inoculées (Williams et al., 1977 ; Talbot et al., 1982).
2.6.2. Méthode directe de la dilution isotopique
Dans la nature, l'azote est un mélange de deux isotopes stables 1~ et 15N. En
1970, Delwiche et Steyn, observant des différences dans les abondances naturelles en
15N entre plantes fixatrices et non fixatrices, suggèrent la possibilité d'utiliser ces
différences pour la mesure de la fixation. Ainsi, plusieurs méthodes d'estimation de
la fixation d'azote se sont développées en utilisant l'isotope 15N comme traceur.
L'abondance isotopique A en 15N, exprimée en atome 15 N% est définie par
A=
Les techniques de marquage isotopique artificiel par 15N conduisent à l'expression
des compositions isotopiques en abondance absolue ou en excès isotopique. Cet excès
se définit comme la différence entre l'abondance isotopique de l'échantillon et celle
86
d'un étalon de référence. Pour l'azote, l'étalon de référence sera l'azote de l'air dont
l'abondance isotopique est: 0,3663% ± 0,0004. L'excès isotpique sera donc égal à:
e % : A échantillon - A air = A échantillon - 0,366
La mesure de l'abondance isotopique est effectuée avec un spectomètre de masse.
Le spectromètre de masse est un appareil qui produit des ions à partir de la
substance à étudier. Cet appareil mesure le rapport des intensités des courants d'ions
produits par les deux faisceaux d'ions correspondants aux deux isotopes, les sépare
suivant un rapport Mie de leur masse "M" à leur charge électrique "e" avant d'en
donner la répartition. Le spectomètre de masse mesure donc un rapport isotopique
R qui est égal au rapport des ions de Mie = 29 (14N 15N +) et Mie = 28 (1~ 14N +):
R=
A partir de la mesure des abondances ou des excés isotopiques, il est alors possible
de calculer les quantités de 15N dans l'échantillon (quantité totale d'azote multifiée
par l'abondance isotopique) et les quantités de 15N en excès (quantité totale d'azote
multipliée par l'excés isotopique). Dans la pratique nous utiliserons uniquement
l'excès isotopique.
La méthode de dilution isotopique (Fried et Broeshart, 1975 ; Legg et Sloger, 1975;
Fried et Middleboe, 1977 ; Bremmer, 1977 ; Wagner et Zapata, 1982 ; Vose et al.,
1982; Rennie et Rennie, 1983 ; Fried et al., 1983) consiste à enrichir l'azote du sol de
15N par ajout d'un engrais marqué; elle est basée sur le fait que les plantes non
fixatrices utilisent l'azote du sol et de l'engrais marqué alors que les plantes fixatrices
utilisent en plus l'azote de l'air, ce qui se traduit par une dilution de l'azote marqué
au sein de la légumineuse. La détermination du rapport en 15N des plantes inoculées
aux plantes non inoculées permet l'estimation de l'azote provenant du sol et par voie
de conséquence celle de l'azote fixé, ceci du fait que l'enrichissement en 15N est
moindre chez la plante fixatrice de N2. On cultive simultanément dans des parcelles
distinctes, des plantes fixatrices (Sesbania rostrata et Sesbania sesban inoculées) et des
87
plantes témoins non fixatrices (S. rostrata et S. sesban non inoculées), le sol ayant reçu
dans les deux cas, la même quantité d'engrais azoté 15N.
Le postulat de base de cette méthode est que l'isotope 15N soit accesible de
manière identique aux plantes témoins et aux plantes fixatrices et que celles-ci
utilisent dans les mêmes proportions l'azote du sol et l'azote de l'engrais. Si l'on
désigne par :
% Ndfso : "percent plant N derived from soil " : pourcentage
de l'azote de la
plante dérivé du sol pour les plantes non fixatrices d'azote
% Ndffo : " percent plant N derived from fertilizer": pourcentage de l'azote de la
plante dérivé de l'engrais pour les plantes non fixatrices d'azote
% Ndfsn: pourcentage de l'azote de la plante dérivé du sol pour les plantes fixatrices
d'azote
% Ndffn: pourcentage de l'azote de la plante dérivé de l'engrais pour les plantes fixa-
trices d'azote
on peut écrire:
% Ndffo
% Ndffn
=
(1)
% Ndfso
% Ndfsn
En outre, si l'on désigne y = % Ndfa " percent plant N derived from the
atmosphere" : le pourcentage de l'azote de la plante dérivé de la fixation dans la plante
fixatrice d'azote, on peut écrire:
- pour la plante non fixatrice
% Ndfso + % Ndffo = 100 (2)
- pour la plante fixatrice
% Ndfsn + % Ndffn + % Ndfa = 100 (3)
On tire des trois équations :
% Ndffn
y = % Ndfa = (1-
) x 100
% Ndffo
88
Si atom % 15N excess (fo) = excès isotopique dans les plantes non fixatrices
atom % 15N excess (fn) = excès isotopique dans les plantes fixatrices.
On peut écrire étant donné que les mêmes quantités d'engrais marqué de façon
identique, ont été appliquées dans les deux cas:
% Ndffn
atom %15N excess (fn)
=
% Ndffo
atom% 15N excess (fo)
et donc,
atom % 15N excess (fn)
y = % Ndfa = (1 -
) x 100
atom % 15N excess (fo)
Les valeurs individuelles de %Ndfa pour chaque plante fixatrice sont calculées à
partir des valeurs individuelles "atom % 15N ex. (fn)" et de la moyenne des valeurs"
atom % 15N ex. (fo)" des plantes non fixatrices.
La quantité d'azote fixé par plante est calculée comme suit:
% Ndfa
y
N2 fixé (glplante) = y =
100
100
total de chaque plante.
En outre on a calculé pour les plantes fixatrices et non fixatrices:
15
atom %
N ex. (plante)
- % Ndff (nitrogen derived from fertilizer) =
x 100
atom % 15N ex. (engrais)
89
- FUE (fertilizer use efficiency) ou coefficient d'utilisation de l'engrais en
pourcentage:
N x Ndff (fraction)
-FUE =
x 100, N étant toujours la
quantité d'engrais appliqué
teneur en azote total de la plante considérée.
2.7. Analyses statistiques
Les résultats ont été analysés par le test statistique de Newman et Keuls (Snedecor
et Cochran, 1957).
90
III. RESULTATS ET DISCUSSION
1. Nodulation et activité fjxatrice d'azote de S. rostrata et S. sesban
Les figures (45 A et B) montrent que le nombre et le poids sec des nodules de
racine de S. rostrata (8/plante ; 0,04 g/plante) sont très faibles par rapport aux nodules
de tige (527/plante; 0,74 g/plante), Dans le cas de S. sesban, le nombre et le poids sec
des nodules ont été évalués respectivement à 148/plante et 0,33 g/plante, Grâce à sa
nodulation caulinaire, S. rostrata a donc produit 4 fois plus de nodules que S. sesban
pendant la même période.
Des mesures d'ARA (Activité réductrice d'acétylène) effectuées à la fois sur les
nodules de tige et de racine de S. rostrata et sur les nodules de racine de S. sesban sont
présentées sur la figure 45C. Les résultats montrent que dans nos conditions
d'expérience, environ 97% de l'activité totale fixatrice d'azote de S. rostrata est due
essentiellement aux nodules de tige de S. rostrata ; l'activité des nodules de racine est
négligeable. Des résultats analogues ont été rapportés pour S. rostrata cultivée dans
le même sol en conditions submergées (Rinaudo et Moudiongui, 1985). Dans le cas
des nodules de racines de S. sesban l'ARA est moins élevée que celle des nodules de
tige de S. rostrata (fig. 45C).
L'azote accumulé dans les parties aériennes est beaucoup plus élevé (3 fois plus)
chez S. rostrata (0,32 g/plante) que chez S. sesban (0,1g/Plante) (Fig. 45 D). Cette
potentialité fixatrice d'azote chez S. rostrata est sans doute liée à l'abondance des
nodules de tige.
2. Estimation de l'azote fjxé par S. rostrata et S. sesban (Ndoye et Dreyfus, 1988)
2.1. Influence des différents traitements sur le pojds sec et la teneur en azote total
de Sesbania rostrata et de Sesbania sesban
Le tableau (11) rapporte les effets de l'inoculation sur le poids sec et la teneur en
azote total de S. rostrata et de S. sesban. L'inoculation de S. rostrata avec la souche
d'Azorhizobium ORS 571 a pour conséquence une augmentation du poids sec de 28%
en sol inondé et de 24% en sol drainé; l'augmentation de la teneur en azote total
91
nd Tot S,r.
500
•
700
ndt Ss.
400
600
nd Tot S.r.
1:
c~
Ô.
~OO
..
:; 300
-S
.~
J:>..
ln
<li
=ï
.",
/
0
•
Q
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200
.",
~300
ndr S.S.
//// "'..._.,-,,."", ndr S.s.
<li
..A
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'"
S
""
0
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"'0
;f200
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c
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100
rs-/
100
... -0-
--
--.----0'
o ..'
~~~:~--D---O-~tdtS,r.
0 -
ndr S.r.
1
,
o
l
,
!
!
!
/
28
35
42
49
~I
~B
35
4~
49
a~e de la planle (en jours)
A 21
B
age de la plante (en jours)
80
350
F+T S.r.
70
300
..,
....~60
Q...
';:;-
~
;: 50
..'-'.,
200
-0
~
E40
TS,f,
s
..=-.
' - '
[o;l
<;
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...0
~30
,..,
...
0..
:z
<,
100
~ 20
-<
"'0 FS,S,
10
-0 -_
TS,S,
_-O'
0
1
1
21
35
42
49
C
age de la plante (en jours)
age de la plante (en jours)
Fig. 45 - Comparaison de la fixation de l'azote entre Sesbania rostrata (S.r.) et
Sesbania sesban (S.s.) - ndr = nodule de racine, ndt = nodule de tige, ndTot = nodules
totaux, F = feuille, T = tige, F+T = feuilles + tiges
92
décelée dans le même temps est de 82% en sol inondé et SO% en sol drainé.
L'inoculation de Sesbania sesban avec la souche ORS S02 conduit à une augmentation
du poids sec de 20% en sol drainé mais n'a aucun effet en sol inondé.
2.2. Influence de la submersion et du drainage du sol sur la oodulation
Dans le sol submergé, le poids sec des nodules de racine de Sesbania rostrata est
très faible (0,03 g/plante) alors que celui des nodules de tige est très élevé (1,4 ± O,S
g/plante). Dans le sol drainé, le poids sec des nodules de racine de Sesbania rostrata
est de 0,3 ± 0,08 g/plante et celui des nodules de tige de 1,0 ± 0,3 g/plante (tableau
11).
Dans le cas de Sesbania sesban, le poids sec des nodules a été de 0,4S ± 0,Il
g/plante en sol drainé et de 0,10 ± D,OS en sol submergé.
2.3. Influence des différents traitements sur l'excès isotopique et l'utilisation de
l'engrais appliqué
Les résultats du tableau (12) montrent que l'inoculation de Sesbania rostrata avec
la souche ORS S71 diminue l'excès isotopique (atom % 15N excess.) des tiges et des
feuilles dans le sol drainé et inondé; l'effet apparaît toutefois moins marqué en sol
drainé. L'inoculation de Sesbania sesban avec la souche ORS S02
diminue
sensiblement, mais non significativement, l'excès isotopique des feuilles et des tiges.
Le coefficient d'utilisation de l'engrais (FUE) n'est pas affecté par l'inoculation.On
observe une tendance à la diminution du coefficient FUE sous l'effet de la
submersion.
2.4. Effet des différents traitements sur la fixation d'azote
Le pourcentage d'azote provenant de la fixation (% Ndfa) dans les tissus des
plantes est toujours plus élevé chez Sesbania rostrata que chez Sesbania sesban. La
submersion du sol n'augmente significativement le % Ndfa que chez Sesbania rostrata
(tableau 13). Les effets des différents traitements sur la quantité d'azote fixé mesurée
Tableau 11
Influence de
différents traitements sur le poids sec des nodules,
le poids sec et
la teneur en azote total des parties aériennes de Sesbania rostrata et Sesbania sesban
âgées de 60 jours et cultivées dans un
sol submergé
(W) ou drainé
(0) (1).
i
Traitement
i
Poids sec
(g/plante)
:
Teneur en azote
(%)
:
N total
1
1
1
(2) \\Régime
1
1
1
1
1
1
1 (g/plante)
1
1
Espèces
1 Inoc.
1 hydrique 1
Nodules
1
Tiges
1
Feuilles
1
Total
1
Tiges
1
Feuilles
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
b
.
1
1
1
1
cl
+
b
1
+
C
1
c
1
c
1
dl
ISe s ania rostrata\\
0
1
W
1
.
0
1
16,8±3,9
1
8,0_1,4
1
2 4 , 9 ±3 , 6
.0,71±0,07
1 3 , 8 0 ±O , 4
10,42±O,11
1
Rac i ne s 0,03
1
b
+
a
+
b
1
+
a
+
b
b
1
ban i
t
t
1
1
W
1 T'
1 4 + 0 3
20,5± 6,0
l
S
11,5-3,4132,0-9,5
11,14_0,04
14,48_0,07
1
0,76±0,21 1
1 es anw ros ra al+-
1
1
a qe
,
-
,
1
1
1
1
1
1
1
1
b
.
1
1
l i b 1
al
b
1
bc 1
c
1
c'
ISe s anw rostrata,
0
1
0
1
0+
1
21,7± 1,6
1
11,7 ±1,2
1
3 3 , 4 ± 0 , 5
1 0 , 8 2 ±0,31
,3,54± 0,61
1
0,58± 0,03 i
1 ·
1
1
1 Rac.0,3-0,08
1
1
1
1
abcl
a
1
a 1
a,
a
ISesban-w rostrata
+
1
0
1
Tige 1,0 ±0,3
1
29,6± 4,7
11,7 ±1,5
41,3 ±6,Oa
10,98 ±0,12
1 4 , 9 4 ± 0,31
1
0,87± 0,12
l
l
l
")
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
~
1
----------------t--------t--------t---------------t------------t------------t------------t------------t------------t----------- 1
b\\13,9
b
d
lsesbania sesban
1
0
1
W
1
0
1
5,9± 2,7d
1
7,9 ±1,5
±4,Od
1
1 , 0 1 ±0,~~cJ4,31± 0,31
: 0,40± 0,06 J
d
a/
lsesbania sesban
2 bI14,2
1
1
+
1
W
i 0,1 ±0,05
:
5,9± 1,od
1
8,3 ±1,
±1,7
1
, 1 5 ±0,32
4,61± 0, 1 2 a b l 0,45± 0, 0 4 di
c
c
Isesbania sesban
1
0
1
0
:
0
\\ 13,5± 2,6
1
11,5 ±0, 6 a l 24,9 ±3,Oc
1
0,97 ±0,~~cI3,84± 0,72
1
0,59± 0, 1 2 c i
c
b C)
b
lsesbania sesban
1
+
1
0
1
0,45 ±0,11
i 16,7± 1,7 1 12,5 ±0, 8a l 29,2 ±2,2
1,12 ±0,2~bI4,29± 0,11
: 0,71± 0, 0 7 bl
1
1
1
1
1
CV3 12,6
1
10,0
1
10,9
1
14,6
1
5,8
1
10,6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
(1)
Valeur moyenne ~ intervalle de confiance (P = 0,05)
(2)
Inoculation: 0,
plantes non inoculées;
+ plantes inoculées
(3)
Coefficient de
variation
(%)
Pour chaque expérience,
les nombres dans une m~lne colonne et suivis
de la même lettre ne diffèrent pas significativement pour P = 0,05
(NEWMAN et KEULS,
1957).
94
Tableau 12
Excès isotopique
(atom % j5N e x . ) et coefficient d'utilisation
de l'engrais
(FUE) de Sesbania rostrata et Sesbania sesban âgées
de 60 jours cultivées dans un sol submergé ou drainé.
1
T
i t
t E "
t
'
(1)
1
F
(2)
1
r-a i, emen s
xces
:LSO
op aqu e
1
U E
a
a
Sesbania roet.rat:a
°
1
1
W
O,511
0,450
1
28,8 ± 14,8
c
b
Sesbania roet.rat:a 1
+
1
W
0,239
0,219
J' 24, 7 ± 10,7
a b c
a b
Sesbania rostrata
°
1
1
0
0,404
0,353
1
31,1 ±
3,6
c
b
Sesbania roet.rat.a 1
+
1
0
0,249
1
0,235
: 30,1 ±
5,2
1
I-------------------~----------t------------------t-----------t----------t-------------- I
a b
a b
: Sesbania sesban
i
°
i
W
i 0,447
1
0,372
1
23,4 ± 9,8
:
a b c
a b
1
Sesbania ses ban
1
+
1
W
1
0, 397
1
0, 309
1
22,6 ± 6,4
1
a b c
a b
1
Sesbania eeeban
i
°
1
0
1
0,371
1
0,319
:
29,1 ± 4,9
1
b C
b
1
Sesbania sesban
1
+
1
0
1
0,318
1
0,250
1
28,7 ± 1,6
1
1
1
1
1
1
1
1
4
1
1
1
: CV
21, 6
1
21, 9
1
1
1
1
1
1
[
1
1
(1 )Pour chaque traitement,
les nombres dans une même colonne et suivis de la même lettre ne
diffèrent pas significativement pour P = 0,05 (Newman et KEULS,
1957)
(2)Valeurs moyennes ~ intervalle de confiance (P = 0,05)
(3)Inoculation: 0,
plantes non inoculées: + plantes inoculées
(4)Coefficient de variation
(%)
95
Tableau 13
Fixation d'azote par des plantes de S. roet rat:a
et Sesbania s eeban âgées de 60 jours et cultivées
dans un sol submergé (W) ou drainé
(0). Fixation
calculée par la méthode isotopique et par la méthode
de différence
( 1 ) .
1
1
1
Fixation d'azote
1
1
1
1 Rég ime 1 Méthode de
1
Azote fixé
1
1 Espèces
1 hydriqœl mesure
% Ndfa
(g/plante)
1
1
1
1
1
: Sesbania 1
1 Isotop ique 1 51
± 10,1
0,78 ± 0,31
1
W
1
1 rost.rat:a 1
Différence 145 ± 13,1
0,68 ± 0,21
1 Sesbania 1
Isotopique 1 3 6 ±
5,7
0,62 ± 0,06
1
D
1
1 roet rat a 1
Différence 135 ± 12,4
0,59 ± 0,31
: Sesbania 1
Isotopique 1 13 ±
8,0
0,06 ± 0,03
1
w
1
1 eesban
1
Différence 1 11 ±
5,2
0,05 ± 0,03\\
: Sesbania 1
Isotopique 1 18 ±
2,5
0,13 ±
1
0,03
1
D
1
1
1 sesban
1
Différence 1 18 ±
2,3
0,12 ± 0,11 1
1
1
1
1
Valeurs moyennes ± intervalle de confiance (P
0,05) .
96
par la méthode isotopique ou par la méthode de la différence sont similaires à ceux
observés pour % Ndfa.
2.5. Nodulation et fixation d'azote
Le tableau 11 montre que la nodulation des tiges chez Sesbania rostrata permet à
cette plante de produire trois fois plus de nodules que Sesbania sesban pendant la
même période que le sol soit drainé ou submergé. Ces résultats confortent ceux
rapportés dans l'expérience préliminaire et montrent
que Le potentiel fixateur
d'azote de Sesbania rostrata est probablement corrélé à l'abondance des nodules de
tige.
2.6. Estimation de la fixation d'azote par la méthode de dilution isotopique
Pour chaque plante correspondant aux traitements 3 et 7, 4 et 8 le pourcentage
d'azote provenant de la fixation de Nz (y = % Ndfa) a été calculé en utilisant les
valeurs individuelles des excès isotopiques des feuilles et des tiges des plantes
fixatrices et non fixatrices d'azote. Pour chaque plante nodulée, l'azote total fixé Y
(g/plante) a également été calculé. Ainsi, il a été estimé que 51 ± 10% (sol submergé)
et 36 ±5,7% (sol drainé) de l'azote des Sesbania rostrata nodulées proviennent de la
fixation d'azote atmosphérique contre 13,8% (sol submergé) et 18 ± 2,5% (sol
drainé) chez Sesbania sesban. Ce pourcentage d'azote provenant de la fixation est
donc significativement plus élevé chez Sesbania rostrata. En sol submergé ce
pourcentage augmente chez Sesbania rostrata mais par contre diminue chez Sesbania
sesban. Ceci représente pour chaque plante de Sesbania rostrata, une fixation de 0,78
± 0,31 g Nz en sol submergé ou 0,62 ± 0,06 g Nz en sol drainé, et pour chaque plante
de Sesbania sesban une fixation de 0,06 ± 0,03 g Nz en sol submergé ou 0,13 ± 0,03
g Nz en sol drainé (tableau 13).
2.7. Estimation de la fixation d'azote par la méthode de différence
Chaque plante de Sesbania rostrata inoculée fixe en 60 jours, 0,68 ± 0,21g Nz (sol
submergé) ou 0,59 ± 0,31g Nz (sol drainé). Chaque plante de Sesbania sesban fixe
97
dans le même temps, 0,05 ± 0,03 gN2 (sol submergé) ou 0,12 ± 0,11 g Nz ïsol drainé)
(tableau 13)
2.8. Estimation de la fixation d'azote
Au champ, la densité normale de plantation est de 120.000 à 160.000 plantes/ha.
En se basant sur une densité moyenne de 140.000 plantes/ha, et pour une période de
60 jours, la fixation d'azote par Sesbania rostrata représenterait l'équivalent de 95 -
109 kg Nz/ha en sol submergé et de 83 - 87 kg Nz/ha en sol drainé. Une telle
extrapolation doit toutefois être considérée avec prudence. Il y a probablement une
stimulation de la fixation d'azote due au fait que l'azote marqué 15N incorporé au sol
avec du glucose, induit une prolifération microbienne intense qui immobilise et met
à la disposition du végétal, des éléments nutritifs et de l'azote minéral du sol,
favorisant ainsi la fixation d'azote (Fried et al., 1983 ; Witty, 1984). En revanche, une
fixation plus importante aurait du être décelée si les plantes avaient été cultivées entre
les mois de juin et septembre, période pendant laquelle les conditions climatiques
sont beaucoup plus favorables pour la croissance et la fixation d'azote que celles qui
caractérisent la fin de l'année.
La même extrapolation permet d'évaluer la quantité d'azote fixé par Sesbania
sesban en 60 jours à 7 - 8 kg Nz/ha en sol submergé et à 17 - 18 kg Nz/ha en sol drainé.
2.9. Effet de la submersion du sol
La submersion du sol réduit de façon spectaculaire la nodulation des racines chez
les deux espèces de Sesbania, mais ne modifie que légèrement la quantité de nodules
de tiges de Sesbania rostrata (tableau 11).
Dans un sol drainé, le poids des nodules de tige est un peu inférieur à celui d'un
sol submergé. Il est intéressant de noter que la somme des poids de nodules de tige
et de racine est pratiquement la même pour les plantes cultivées en sol submergé ou
en sol drainé.
Comme le montre le tableau 13, la fixation d'azote par Sesbania rostrata n'est pas
affectée par la submersion contrairement au cas de Sesbania sesban où elle est
98
considérablement réduite. La différence de comportement des deux espèces de
Sesbania pourrait être expliquée par l'une des deux hypothèses suivantes:
(1) les nodules de racine et non les racines elles mêmes des deux espèces de
Sesbania se décomposent rapidement sous l'effet de la submersion, qui limite la
diffusion de l'oxygène dans le sol.
(2) les nodules de tige de par leur position même, ne sont soumis à aucune
contrainte.
2.10. Quantité d'azote dérivé du sol. de l'engrais azoté et coefficient d'utilisation
de l'engrais (FUE)
L'emploi de traceur 15N permet dans le végétal, de distinguer l'azote originaire
du sol et celui qui provient du sulfate d'ammonium ajouté. Les proportions relatives
à l'azote du sol, de l'engrais sont représentés sur les figures 46 et 47. Le pourcentage
de l'azote dérivé du sol chez des plantes de Sesbania rostrata fixatrices est de 43%
(sol submergé) ou 59% (sol drainé).
Pour les plantes de Sesbania sesban ces
pourcentages sont de 79,3% (sol submergé) ou 76,5% (sol drainé). Pour les plantes
non inoculées l'azote dérivé du sol représente 90,3% (sol submergé) ou 92,4% (sol
drainé) chez Sesbania rostrata et 91,8% (sol submergé) ou 93,0% (sol drainé) chez
Sesbaniasesban. Ces résultats suggèrent qu'une plante nodulée et fixant l'azote utilise
"mieux" l'azote du sol qu'une plante non nodulée et donc non fixatrice.
Les pourcentages d'azote dérivé de l'engrais restent faibles chez les deux espèces
de Sesbania. Dans le sol drainé, le coefficient FUE est plus élevé que dans le sol
submergé probablement parce que, dans le second cas, une fraction de l'azote engrais
a été dénitrifié. Cependant quel que soit le régime hydrique, le FUE est toujours faible
(23 - 31%) (tableau 12). Ainsi, en valeurs relatives, les plantes semblent utiliser moins
d'azote provenant de l'engrais mais plus d'azote du sol.
Cette situation est comparable a celle qui a été rapportée pour Casuarina
equisetifolia et Acacia holosericea cultivées dans le même sol (Gauthier et al., 1985 ;
Cornet et al., 1985) et avec le soja et le millet cultivés sur d'autres sols du Sénégal
(Ganry, Communication personnelle). Dans la plupart des sols de l'Afrique de
l'Ouest, le faible coefficient FUE explique que pour obtenir une réponse satisfaisante
99
à l'application d'engrais azoté, il faut apporter une quantité d'engrais beaucoup plus
élevée que celle nécessaire.
2.11 Méthodolo~ie relative à l'évaluation de la fixation d'azote
Le tableau (13) montre qu'il y a une très bonne corrélation entre les évaluations
obtenues par la méthode isotopique et celles obtenues avec la méthode de la
différence. Une telle concordance a déjà été rapportée par un certain nombre
d'auteurs (Talbot et al., 1982; Witty, 1983 ; Cornet et al., 1985).
Ainsi dans les conditions de croissance contrôlées que nous avons utilisées, les
méthodes d'estimation de la fixation d'azote sont fiables
et reproductibles.
Cependant les estimations par la méthode de la différence, diffèrent quelque peu de
la méthode isotopique. Selon Witty (1983), ces légères différences seraient dues au
fait que les plantes témoins et les plantes fixatrices n'utilisent pas l'azote de l'engrais
dans les mêmes proportions: 9,7 et 4,6% (sol submergé), 7,6 et 4,9 (sol drainé)
respectivement pour les plantes témoins et fixatrices de Sesbania rostrata et 8,2 et
7,1% (sol submergé), 7 et 5,7 % (sol drainé) pour les plantes témoins et fixatrices de
Sesbania sesban (Fig. 46 et 47).
100
Dilution isotopique
0.8
0.7
-- 0.6
<l)
.....,J
0
cô
,.....l
o.c
NF 52.4'l
0.5
~
cô
o.c
t:t()
NF 13.61-
' - '
0.4
<l)
.....,J
$.". - . ~••
..'Sil ..
0
.~.,. F'u;;.~ 4.&:
•••
,,6-
N
................
<
0.3
0.2
43.~
0.1
o
1
2
3
4
Fig-46
ContributIon de l'azote du sol (S), de l'azote de l'engrais
(F) et de l'azote de la fixation (NF) à la nutrition de
S. rostrata et S. sesban cultivées en conditions submergées.
101
Dilution isotopique
0.9_
0.8
36.lll:
0.7
NF
NF 17.8ll:
...-... 0.6
(1)
.....,>
~
~
-Pot 0.5
~
~
Pot
b.O
93.0ll:
76.5'1:
0.4
' - '
(1)
.....,>
0
N
<:
0.3
0.2-
0.1
0-
5
6
7
8
Fig-47
Contribution de l'azote du sol (S), de l'azote de l'engrais (F
et de l'azote de la fixation (NF) à la nutrition de S. rostraté
et S. sesban cultivées en conditions drainées.
102
IV. CONCLUSION
L'association symbiotique Azorhizobium - Sesbania rostrata présente une
nodulation abondante et très effective, due presque essentiellement aux nodules de
tige. L'estimation de la fixation d'azote par la méthode isotopique a montré que cette
association très performante, pouvait fixer au champ environ 110 kg d'azote à
l'hectare en 60jours.
Les résultats présentés ci-dessus confirment le potentiel fixateur d'azote élevé
d'une légumineuse à nodule de tige, Sesbania rostrata qui, en sol submergé ou drainé,
a un rendement exprimé en matière sèche ou en azote plus élevé que celui de S.sesban,
légumineuse à nodules racinaires. Il apparaît en conséquence que l'utilisation de
S.rostrata comme engrais vert en riziculture
peut être recommandée comme
alternative à la fertilisation chimique.
La différence entre les deux espèces de Sesbania, mise en évidence tout au long
de nos expériences, doit être rapprochée des résultats obtenus au champ, où il a été
observé que, pour une période de croissance de 45 jours, Sesbania rostrata produit
plus de 25 tonnes de matière fraîche /ha contre seulement 12 tonnes à Sesbania sesban
(I. Ndoye, 1988).
Important facteur d'adaptation, la nodulation caulinaire confére à
Sesbania
rostrata une grande capacité de fixation azotée dans des conditions de submersion
du sol.
103
CHAPITRE
IV
UTILISATION DE SESBANIA ROSTRATA
COMME ENGRAIS VERT ET FOURRAGE
104
I. INTRODUCTION
L'eau et l'azote constituent deux des facteurs majeurs régissant la production
agricole. Les exigences en azote des plantes cultivées sont considérables. C'est ainsi
que pour le riz, aliment de base de près de la moitié de la population mondiale, il a
fallu accroître la consommation des engrais azotés et phosphatés pour faire face à une
demande de plus en plus forte. Pour produire 100 kg de grains, le riz" consomme" de
1,8 à 2kg d'azote quel que soit le type de sol ou la date de plantation (Patnaik et Rao,
1979). Cependant, l'emploi des engrais azotés est souvent limité par leurs prix élevés,
sans cesse croissant, incompatibles avec les ressources financières de la majorité des
paysans des pays en voie de développement. La fixation biologique de l'azote
constitue une alternative attrayante et de moindre coût. L'enfouissement dans le sol,
des parties aériennes d'une plante fixatrice d'azote et les résidus végétaux en résultant
jouent alors le rôle d'engrais azoté organique susceptible de se substituer aux engrais
minéraux. Le nom d'engrais vert est donné à cette pratique.
L'utilisation des légumineuses comme engrais vert en vue d'améliorer les
rendements des rizières est une pratique ancienne, en particulier en Asie du Sud-Est
et en Inde où de nombreuses légumineuses sont utilisées, Aeschynomene americana,
Aeschynomene indica, Astragalus sinicus, Crotalaria juncea, Crotalaria stricta,
Indigofera tinctoria, Lablab purpureux, Medicago hispida Medicago officinalis, Vicia
officinalis, v: eracca, et plusieurs espèces du genre Sesbania qui ne portent pas de
nodules sur la tige,
Sesbania aculeata,
S. cannabina,
S. sesban,
S. paludosa
(Vachhani et Murty, 1964; Patnaik et Rao, 1979; Watanabe et App., 1979 ; Allen et
Allen, 1981; Singh, 1984; Roger et Watanabe, 1986; Brewbaker et Glover, 1988).
Des progrès ont été enregistrés dans le domaine des engrais verts avec la
découverte des légumineuses comme S. rostrata, dont la double nodulation conduit
à l'obtention de nodules 5 à 10 fois plus nombreux que chez la plupart des autres
légumineuses ( Dreyfus et Dommergues, 1981). Cela se traduit par une capacité de
fixation d'azote très supérieure à celle par exemple, d'autres espèces asiatiques de
Sesbania utilisées jusqu'alors comme engrais vert. S. rostrata ayant l'aptitude à
pousser dans de sols submergés pouvait donc être utilisée comme engrais vert en
riziculture.
2
2
Testée comme engrais vert, en parcelles de 1m ou 25m , S. rostrata a permis de
doubler le rendement en riz par rapport à la manière
traditionnelle et permet
105
l'obtention de riz dont la teneur en protéines est accrue de 37 à 50% par rapport aux
teneurs habituelles (Rinaudo et al., 1982, 1983 ; Dreyfus et al., 1985 ; Rinaudo et
Moudiongui, 1985; Diack, 1987). En outre, S. rostrata présente vis à vis du nématode
parasite du riz Hirschmanniella oryzae un effet piège très net. (Pariselle, 1987,
Pariselle et Rinaudo., 1988). L'utilisation de S. rostrata est donc doublement
bénéfique. Des expériences conduites en 1985-1986 aux Philippines à l'IRRI ont
montré que S. rostrata était la légumineuse la plus performante parmi les espèces
testées comme engrais vert. Son incorporation au sol de la rizière peut apporter
l'équivalent de 120 kg N par hectare (Ladha et al., 1988).
Parallèlement à ses propriétés d'engrais vert, Sesbania rostrata est très utilisée
comme fourrage vert donné aux animaux et en particulier aux bovins. L'étude de la
valeur fourragère de S. rostrata n'ayant jusqu'à présent jamais été abordée, il nous a
paru utile d'envisager son utilisation comme fourrage en introduisant sa production
parmi celle d'autres plantes fourragères dans la nouvelle zone économique du fleuve
Sénégal, zone naturelle d'élevage. De telles productions fourragères devraient donc
conduire à une amélioration de la nutrition animale et par voie de conséquence à une
augmentation de la production de viande et de protéines animales. Il en résulterait
une augmentation de la consommation par tête d'habitant, actuellement faible au
Sénégal.
Dans la première partie de ce chapitre, l'utilisation de Sesbania rostrata comme
engrais vert est envisagée avec pour objectifs la réduction des lourdes importations
de riz par le Sénégal et l'amélioration des rendements de rizières permettant
l'autonomie alimentaire du pays.
Des essais en milieu paysan ont eu pour but de tester la validité de la démarche,
d'identifier les éventuelles contraintes liées à l'introduction de cette biotechnologie
dans les habitudes et pratiques culturales des agriculteurs, et enfin éventuellement de
trouver des solutions aux problèmes liés à l'emploi des engrais verts.Un projet
Utilisation de Sesbania rostrata comme engrais vert a été mené en Casamance (Sud
du Sénégal), région de riziculture traditionnelle où les rizières présentent de graves
pénuries en azote. Les expériences réalisées ont été conduites en liaison avec
l'üRSTüM,l'ISRA et l'Université de Gand en Belgique.
Dans un deuxième temps, l'utilisation de S.rostrata comme plante fourragère pour
les animaux a été envisagée. En effet, la connaissance de la valeur alimentaire des
106
fourrages revêt une importance particulière au Sénégal où ils entrent dans la
composition de différentes rations. Les fanes en général, particulièrement celles
d'arachide et de niébé sont très recherchées. Récoltées avec soin, elles entrent, en
partie ou en totalité, dans la composition de rations d'embouche ovine ou bovine
(Roberges et al., 1984).
L'utilisation de Sesbania rostrata comme plante fourragère est menée depuis 1985,
en étroite liaison avec L.N.E.R.V.
107
II. MATERIELS ETMETHODES
1.Utilisation de Sesbania rostrata comme engrais vert
1.1. Les traitements
Les traitements ont été les suivants:
(1) Témoin T, aucune fumure minérale azotée
(2) Témoin N, avec fumure minérale azotée
(3) Engrais vert S. rostrata (S) inoculé et enfoui
(4) Engrais vertA. afraspera (A) inoculé et enfoui.
1.2. Dispositif expérimental (fig. 48)
C'est un dispositif en bloc à randomisation totale avec 4 traitements et 8 répétitions
sur un total de 32 parcelles élémentaires. La surface d'une parcelle est de 8m x Sm =
2
40m
1.3. Analyse des sols (tableau 14)
Le sol utilisé est un sol argileux (ustisol), à pH acide et dont la teneur en matière
organique est élevée. Contrairement à la plupart des sols tropicaux, ce sol a un
pourcentage en phosphore assimilable important. La proportion du sol en bases
échangeables, Ca et K, est forte mais un peu faible en Mg.
1.4. Fumures minérales (tableau 15)
La fumure phosphopotassique est épandue avant le semis, 30 jours après le semis
des légumineuses sur les parcelles (S) et (A) et au moment du repiquage du riz sur
l'ensemble des parcelles du champ d'essai. La dose appliquée est de 60 unités de P
sous forme de P20S et de 50 unités de K sous forme de K20. La fumure minérale
501
Sesbania
Azote
IAeschynomene
Temoin
S8
N7
A6
T5
N4
T3
A2
SI
8m
201
T8
87
N6
A5
S4
N3
T2
Al
co
o
M
N8
A7
T6
85
T4
A3
S2
NI
A8
T7
S6
N5
A4
83
N2
Tl
Fig. 48 - Utilisation de Sesbania rostrata comme engrais vert. (PLAN DE L'EXPERIMENTATION)
- 109 -
Tableau 14.: Principales caractéristiques chimiques de sols
de rizières de Fanghote (Casamance)
1
pH
Fertilité
1
Bases échangeables
1
1
r-
I
mé/160 9
1
1
1
1
H
KC1
C %0
N %0
C/N
o
Hg
K
Na
1
20
P20S
p2 S,ca
1
1
1
total ( 01 s e n[
1
%0
%0 1
1
1
1
1
, 4,2
3,7
52,2
1 ,7
29,8
1 ,43
0,28/2,9
0,7
0,26
0,67
1
1
-110-
Tableau 1S
Quantité de fumures minérales sur les différentes
parcelles
1
Fumure sur S. rostrata
1
Fumure sur le riz
Traitements 1
et A. afraspera
-
1
1
N
P20 S
K 0
N
P
K 0
1
2
20 S
2
1
Témoin (T)
1
0
0
0
0
60
50
1
Azote (N)
1
0
0
0
60/3
60
SO
1
A. afraspera ( A):
0
40/2
32/2
0
20
1 8
-
S. rostrata ( S ) 1
0
40/2
32/2
0
20
18
-
1
1
1
40/2
signifie 40 unités de P en 2 apports
32/2
"
32 unités de K en 2 apports
60/3
"
32 unités de N en 3 apports
I I I
azotée, sous la forme d'urée épandue uniquement sur les parcelles témoins (N), est
apportée à raison de 20 unités d'azote lors du repiquage du riz, du tallage, 3 semaines
plus tard et avant floraison 1 mois, et demi plus tard.
1.5. Analyse des résultats
Pour la signification des résultats le test statistique de Newman et Keuls au seuil
de 5% a été utilisé.
1.6. Culture des légumineuses
1.6.1. Préparation des graines
Afin d'obtenir une bonne germination, les graines sont préalablement scarifiées.
Le traitement mécanique consiste à ajouter du sable siliceux aux graines et à faire
tourner délicatement le mélange dans un mortier à l'aide d'un pilon afin de rayer le
tégument des graines.
1.6.2. Inoculation et semis
Les graines sont inoculées avant le semis par immersion dans un inoculum liquide
8
contenant environ 10 bactéries/ml. Les graines sont ensuite semées à la main, en ligne
dans la rizière humide. L'inoculation des tiges est effectuée environ 25 jours après le
semis, à l'aide d'un pulvérisateur à insecticide par pulvérisation de l'inoculum sur la
tige des légumineuses (Fig. 49).
1.7. Culture du riz
1.7.1. Préparation d'une pépinière
Une pépinière de riz est mise en place environ 20 jours après le semis des graines
de légumineuses.
112
..............
.
~
~
~
~
Fig. 49
Inoculation des tiges de S. rostrata
113
1.7.2. Enfouissement des légumineuses (fig. 50A et B)
Après 45 jours de croissance, les légumineuses sont coupées à la base des tiges, à
l'aide de faucilles ou de coupe-coupes. Elles sont ensuite étalées sur le sol de la rizière,
hachées en portions de 1O-20cm et réparties uniformément sur les parcelles
correspondantes. L'engrais vert est alors enfoui à une profondeur de 10-15 cm par un
labour au kadiendo, outil traditionnel servant à enfouir les chaumes et les herbes et
à effectuer des labours profonds, ou des billons.
1.7.3. Repiquage du riz (fig. 51A et B)
Environ une semaine après l'enfouissement de l'engrais vert, les plants de riz de
la pépinière sont prélevés et repiqués en rizière.
1.7.4. Récolte du riz (fig. 52)
Quand le riz atteint sa maturité (120 jours de cycle), la récolte est effectuée
manuellement. Le riz est alors séché pendant quelques jours et prêt à être pesé pour
le calcul des rendements.
1.8. Estimation de la quantité d'azote de l'engrais vert enfoui dans les rizières
Un échantillonnage du champ qui permet de connaître le nombre de plantes de
Sesbania rostrata à l'hectare est réalisé. Des plantes sont récoltées au hasard dans le
champ et séchées à l'étuve à 60°C. La teneur en azote des plantes est dosée et la
quantité d'azote de l'engrais vert enfouie dans les rizières est ensuite déterminée.
2. Utilisation de S. rostrata comme fourrage
2.1. Productivité
2.1.1. Les traitements
Les traitements ont été réalisés sur S. rostrata et S. sesban après inoculation.
114
Fig. 50A
Enfouissement a plat de S. rostrata
,..__ •..••••••••••..•...•...•••.•......"' .. __"".."".~__.."' .........•..•.•.••.•·.••·•·•.•.. ·.·.·.·.w."".,""
v
·.·.·.·.·.·.·.·.wu·
..
._,••·•·••·u~;·
Fig. 50B
Enfouissement en billon de S. rostrata
115
Fig. 51A
Repiquage à plat du riz
~·~.:,t..
~~+f%;
!:l.';:':~;:':;'::'!.:':,'~t:.':,'-~·:
«:'f.~
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....
i::,.!.Î.':
..:l..;;.'.;..
,:__~._ _W#.l
Fig. 518
Repiquage sur billon du riz
116
Fig. 52
Réco~e du riz
117
2.1.2. Dispositif expérimental
(fig. 53)
C'est un dispositif en bloc avec 2 traitements et 6 répétitions s'étendant sur 12
z
parcelles élémentaires. La surface d'une parcelle est de 4m x Sm = 20m
2.1.3. Condjtjons agronomiques
Les plantes sont semées sur des sols argilo sableux (tableau 16) de la ferme de
Sangalkam pendant la saison des pluies. Aucune irrigation n'est apportée
2.1.4. Fumures minérales
Une fertilisation de fond de 100unités P sous forme de PzOs, et une fertilisation
d'entretien de 50 unités de K sous forme de KzO, et 100 unités de P sous forme de
PzOs sont apportées. Aucune fumure azotée n'est épandue.
2.1.5. Inoculation et semis
Les graines de S. rostrata et de S. sesban inoculées au semis par immerssion
respectivement dans des suspensions d'ORS 571 et d'ORS 502 sont semées à la main,
en poquets de 25 x 25cm. Les tiges de S. rostrata sont inoculées à l'aide de la souche
ORS571, 3 semaines après le semis.
2.1.6. Coupes
Les coupes sont effectuées à 45 jours et les pesées de la biomasse réalisées
immédiatement.
2.1.7. Analyses des résultats
Le test statistique de Newman et Keuls au seuil de 5% a été utilisé.
118
SESBA N IA ROSTRATA ( S.R) ET
Fig.53 : PRODUCTIVITÉ DE I.SESBANIA SESBAN ( S.S )
Plan de l'essai
9m
1
2
SR
55
o
....._-_...'"
<
4m
>1 m <
1 m
r--
v
3
4
SS
5R
5
6
S5
SR
7
8
5R
55
9
10
SR
S5
11
12
S5
5R
- 119 -
Tableau 16
Principales caractéristiques chimiques de sol
de SANGALKAM
pH
1
Fertilité
1
Bases échangeables
1
1
1
1
mé 11 60 g
1
1
1
1
1
1
P
P
1
H
KC1
1C %0 1N %01 C/N 1
20 5
1
20 5
20
1 Ca
Ng
K
Na
1
1
[to t a l
%0 I(Olsen )%01
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6,7
5,7 11 7, 9 11, 20 11 '1 ,9
0,03
1
0,74
1
11 6 , 35 1 5, 2° 10,3°1 0, 58
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
120
2.2. Pourrage
Les graines de S. rostrata sont immergées dans un inoculum d'ORS 571 (108
bactéries/ml) et semées au mois d'août. L'inoculation des tiges avec la souche ORS
571 est effectuée 25jours après le semis. Sesbania rostrata est récoltée 55 jours après
l'inoculation. Les coupes effectuées à la faucille, sont séchées sur place pendant deux
jours, puis rentrées en grange. Les plantes faisant systématiquement l'objet
d'attaques d'insectes (Mesoplatys sineta : chrysomelideae, Coleoptere) à la fin du
mois de septembre sont traitées avant la récolte avec du dimétheoate, de l'acephate,
du Decis ou du Malathion.
2.3. Digestibilité
La valeur d'un fourrage peut être mesurée par des méthodes d'analyses chimiques
et de détermination de la digestibilité (Milford et Minson, 1966).
Les aliments ingérés par l'animal n'étant pas digéré en totalité, la partie non
utilisée est alors excrétée sous forme de matières fécales. La part absorbée après
digestion est appelée digestible et le terme de digestibilité rend compte du degré
d'utilisation des aliments ou des nutriments (Skerman, 1977; Rivière, 1978).
Les essais ont été effectués au LNERV sur moutons peul-peul, selon la méthode
classique (Boudet et Rivière, 1968).Cette méthode consiste à déterminer les aliments
digérés par les animaux, par la pesée des quantités offertes, des refus et des fèces et
par l'analyse chimique d'échantillons homogènes prélevés sur ces trois fractions. Le
rapport entre la quantité de chaque nutriment dans les produits ingérés et dans les
fèces permet de calculer les coefficients de digestibilité. Les mesures sont effectuées
dans des cages de digestibilité. La valeur fourragère dépend de deux éléments
essentiels: la valeur énergétique et la teneur en azote.
2.4. Analyses chimiques
Les analyses chimiques classiques (matières minérales et matière organique) ainsi
que les dosages des constituants pariétaux par la méthode de Van Soest qui consiste
à évaluer l'influence de la membrane végétale sur la transforrnation des aliments par
121
les animaux, ont été réalisées au laboratoire d'alimentation de l'IEMVT,
Maisons-Alfort,
France, et par le Laboratoire National de l'Elevage et des
Recherches Vétérinaires de Dakar, Sénégal.
122
III. RESULTATS
1. Influence de S. rostrata utilisée ou comme engrais vert sur le rendement en riz
1.1. Essais en parcelles expérimentales
Les résultats obtenus en 1985 montrent une très bonne croissance des plantes de
S. rostrata ainsi qu'une nodulation de tige importante. Au bout de 6 semaines, S.
rostrata peut ainsi atteindre une hauteur moyenne de deux mètres et produire une
biomasse de 37 t/ha. La croissance de S. rostrata illustrée sur la figure 54 peut, dans
la meilleure période c'est à dire après 3 semaines de croissance, atteindre 10 cm par
JOUr.
L'apport azoté de l'engrais vert durant 6 semaines de croissance est équivalent à
environ 150 kg/ha (tableau 17). L'inoculation deA. afraspera, légumineuse tropicale
à nodulation caulinaire n'a pas donné satisfaction en comparaison de la masse de
matière organique enfouie 27 t/ha.
Le rendement du riz en grains, exprimé par hectare a été évalué respectivement
à 2,0 t dans la parcelle témoin, à 2,9 t dans les parcelles ayant reçu de l'engrais azoté
et à 4,9 t dans le cas ou S. rostrata est utilisée comme engrais vert (tableau 17). Le
rendement dans les parcelles traitées avec A. afraspera, 2,4 t/ha, correspond àun gain
de rendement de seulement 20% par rapport au témoin.
1.2. Essais menés par les paysans
Les dispositifs utilisés, plus simples, se résument à des parcelles avec l'engrais vert
S. rostrata et des parcelles témoins sans engrais vert. Ces expériences se sont étendues
sur 4 années, 1986, 1987, 1988 et 1989. Les Sesbania ont été enfouies 5 semaines
après le semis en 1986 et 1987 et seulement après 4 semaines en 1988.
- En 1986, les essais ont été effectués sur une surface de 3000m2. Le rendement
du riz est passé de 1,7 t/ha dans la parcelle témoin à 3,2 t/ha dans la parcelle ayant
reçu l'engrais vert, soit un gain de rendement de 85% (tableau 18). La biomasse
produite et enfouie est d'environ 25 t/ha et correspond à plus de 100 kg N/ha.
- En 1987, à Fanghote, les essais ont été effectués sur une surface beaucoup plus
2
grande de 1O.000m (1 hectare). Au cours de cette année, la nodulation spontanée
123
en
Q.)
~
,Q.)
a 3
=
Q.)
es
-es~
~
enfouissement
-~~ 2
~
.~
~
~
- 0
~
~
Q.)
""0
1
J,..,
~
Q.)
~
=::l
t:tl
::c
10
20
30
40
50 temps en Jours
FIG. 54 Croissance de Sesbania rostrata
avant enfouissement
124
Tableau 17
Influence de Sesbania rostrata comme engrais vert sur
le rendement du riz (grains) == Essais sur parcelles expéri-
mentales(1985).
1
iEqUiValent
Rendements
Traitements
1
Biomasse
,azote total
2
1
Kg/40m
T/ha
T/ha
1
Kg/ha
1
Sesbania rostrata
37
153
19,83b
4,9b
1
(engrais vert)
1
1
Aeschynomene afraspera
27
9,51a
2,4a
1
(engrais vert)
1
1
Fumure azotée
11,55a
2,9a
1
(60 kg/N/ha)
1
1
Témoin (sans engrais ve rt)\\
8,21a
2,Oa
1
Les chiffres (moyenne de 8 répétitions) affectés des mêmes lettres
ne sont pas significativement différents au seuil de 5%
(Test de NEWMAN et KEULS).
Tableau 18
Influence de S. rostrata comme engrais
vert sur le rendement du riz :
Essais Paysans
1
Rendement
T/ha
1
Traitements
Fanghote
1
1
Bayottes
1
1
1
1
1986(1)
1
11987119881
1987
1
1
1
1
Sesbania rostrata
3,2
14,3
3,41
2,5
1
1
(engrais ve r t )
1
1
1
1
1
1
1
1
Témoin
1,7
2,11
1,3
1
12,2 1
(sans engrais vert)!
1
1
1
1
1
1
1
(1)La Biomasse de l'engrais vert est de 25 t/ha et
l'équivalent en azote enfoui de 110 kg/ha.
125
des tiges de S. rostrata étant limitée à la base de la tige, l'inoculation de la souche
ORS 571 a été réalisée afin que les plantes puissent exprimer totalement leurs
capacités de nodulation et de fixation Dans ces conditions le rendement en riz s'est
avéré de 2,2 t/ha dans la parcelle témoin à 4,3 t/ha dans le cas des parcelles à S.
rostrata (tableau 18). Dans un autre village, les Bayottes, sur une surface plus réduite
d'environ 1500 m2, le rendement est passé de 1,3 t/ha dans la parcelle témoin à 2,5
t/ha dans la parcelle avec engrais vert.
2
- En 1988,à Fanghote la surface de la parcelle a été de 1000 m . Cette année là,
aucune inoculation n'a été jugée nécessaire du fait de la présence d'Azorhizobium
dans le sol. Le rendement de 2,1 t/ha dans la parcelle témoin, à 3,4 t/ha dans la
parcelle avec engrais vert, a montré un gain de 62% (tableau 18).
2. Utilisation de S. rostrata comme fourrage
2.1. Productivité
Afin de mesurer la productivité de Sesbania rostrata, des essais de rendement ont
été réalisés en saison des pluies en sol exondé argilo sableux à Sangalkam dans la
région de Dakar. Les résultats obtenus montrent que S. rostrata a une bonne
productivité, 25 t de matière verte par ha pour une période de 45jours en comparaison
de S. sesban qui ne produit que 12 t (tableau 19). En outre S. rostrata est assez
prolifique du point de vue grainier. Coupé à 30 cm du sol, S. rostrata fournit en effet
des rejets permettant une deuxième coupe. Les rendements obtenus sur deux coupes
sont de 3,5 à 4 t de matière sèche alors que le niébé fourrager donne des rendements
de 4,5 t et les fanes d'arachide 1,3 t (Roberges et Faye, 1983).
2.2. Valeur alimentaire de S. rostrata
Des études de digestibilité, d'ingestibilité et des analyses bromatologiques ont été
réalisées sur du foin de S. rostrata. Les résultats sont représentés sur les tableaux 20
et 21. Le tableau 20 montre ainsi une teneur de la matière sèche du fourrage distribué
de 879 g/kg brut, une digestibilité de 51-53% et une ingestibilité de 38g de M.S./jour
et par kg de poids métabolique ou 26 g pour un mouton de 25 kg. Par comparaison,
les fanes d'arachide vulgarisées offrent une digestibilité de la matière sèche de 56%
.LL.O
Tableau 19
Productivité de S~sbania ~ost~ata comme fourrage après
45 jours de croissance à Sangalkam.
Traitements
Biomasse
T/ha
S. ~ost~ata
25a
S. sesban
12b
Les chiffres (moyennede6répétitions) affectés des mêmes lettres
ne différent pas au seuil de 5% (Test de NEWMAN et KEULS)
Tableau 20
Teneur en cendres, composition de la matière organique et
digestibilité des constituants (analyses faites à l'IEMVT,
Maisons-Alfort,
responsable H. GUERIN).
Digestibilité
1
Composition
1
des constituants d~
1
(g/kg MS)
Foin
Tiges
Feuilles
la plante entière
1
Constituants
1
1
ICendres
87
63
158
IMatière organique
913
937
842
54,7
IMatières azotées totales
163
115
305
75,3
!cellulose brut
424
528
114
36,6
IExtrait éthéré
17
9
42
1
1 E.N.A.
309
285
381
62,6
IN D F
610
751
186
38,8
lA D F
500
615
155
39,8
1
ILignine
98
118
38
1
°
Matière sèche du foin distribué
879 g/kg brut
Digestibilité de la matière sèche: 52,2
O,75
Consommation de matière sèche/jour 38,1 g/kg p
soit 426 g pour un mouton de 25 kg.
127
digestibilité de la matière sèche de 56% et une ingestibilité de 75-100g par kg de poids
métabolique équivalent à plus de 3kg de MS/jour pour 100 kg de poids vif (Roberges
et Perrot, 1987) ; la consommation moyenne normale étant de 2,5 kg de MS/jour
(Chenost, 1972). Pour le niébé fourrager cette consommation est d'environ 76g/kg de
poids métabolique (Milford et Minson, 1965).
On notera chez S. rostrata, une digestibilité moyenne de la matière organique et
une bonne digestibilité des matières azotées totales conforme à la teneur élevée en
MAT de la plante entière (tableau 20).
Le tableau 21 donne la composition de la teneur en éléments minéraux de S.
rostrata. Comparé aux besoins des animaux (Ouittet, 1969) et à la teneur des fanes
d'arachides (Rivière 1978) (tableau 22), l'apport de S. rostrata en éléments minéraux
apparaît donc satisfaisant.
128
Tableau 21
Composition minérale du Sesbania roet rat:a,
1
Plante
1
Feuilles
entière
Tiges
1
Cendres totales
1
87
63
158
1
Insoluble chlorhydrique
1
12,5
40,5
)
en
1
Ca
8,30
13,7
)
1
) g/kg 1
P
3,15
3,45
)
MS
1
K
18,20,
19,80
)
1
Mg
)
1
1,871
3,40
)
)
1
Na
2712
1
2861
2264
)
1
1
Cu
)
7,541
9,9
1
)
Zn
) ppm/kg MS
1
1
35,3
1
52,9
1
Mn
)
61,8
174,2
1
1
)
Fe
1
537
1
140
1730
)
1
1
Co
)
1
0,251
0,63
)
1
1
)
1
1
Tableau 22
Besoins des animaux en éléments minéraux des
plantes consommées (QUITTET, 1969) et compositions
minérales de fanes d'arachide
(R.
RIVIERE, 1978).
Besoins des animaux
Fanes d'arachides i
)
Ca
2
8
)
P
1,2
)
1,2
)
en g/kg MS
K
10
13
)
Mg
2
)
4,8
)
Na
0,8
)
Cu
10
)
)
Co
0,1
mg/kg/MS
)
Mn
40
)
)
Fe
8
)
Zn
50
)
)
129
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
Les résultats obtenus au cours des 4 dernières années montrent que S. rostrata
constitue un engrais vert tout à fait exceptionnel dans les sols inondés et en particulier
dans les rizières. Dans tous les cas l'apport d'engrais vert a été supérieur à 100 kg
d'azote à l'hectare. Les rendements du riz ont doublé dans les conditions de culture
en milieu paysan. Ces résultats ont depuis, été confirmés dans de nombreux pays et
en particulier en Asie du Sud Est, aux Philippines, et en Inde où l'apport en azote de
S. rostrata est du même ordre de grandeur (Ladha et al., 1988). L'apport d'engrais
doublé d'un apport de matière organique et probablement d'une diminution de la
population de nématodes phytoparasitaires, a donc permis de doubler les rendements
du riz sans avoir recours aux engrais chimiques dont le coût élevé est incompatible
avec les revenus modestes des paysans de ces pays.
Au Sénégal, Sesbania rostrata dont l'effet engrais vert est désormais reconnu, a
toutefois du mal à être intégrée dans les pratiques culturales paysannes et être utilisée
à grande échelle en riziculture. Plusieurs problèmes demeurent, contrairement aux
paysans asiatiques qui, traditionnellement utilisent les engrais verts dans la riziculture,
les paysans africains, en général et les sénégalais en particulier n'ont aucune pratique
des engrais verts. L'introduction de Sesbania rostrata demande donc un effort
multidirectionnel, allant de la modification des pratiques culturales à la prise en
compte des
aspects socio-éconorniques. En Casamance, les premières pluies
débutant vers le mois de juin-juillet et le repiquage du riz s'effectuant généralement
vers fin août et début septembre, la période intermédiaire comprise entre le 1er
juillet et le 15 août devrait toutefois permettre la culture de Sesbania rostrata en
rizière sans perturber le calendrier traditionnel de la riziculture.
L'enfouissement de l'engrais vert représente indéniablement la partie nécessitant
le travaille plus intense. En Casamance, les paysans ayant l'habitude d'enfouir de
grandes quantités d'herbe dans leur rizière, une différence de travail minime entre
l'enfouissement des mauvaises herbes ou l'enfouissement de l'engrais vert serait
nécessaire. Cet effort est fait par les paysans qui utilisent, à ce titre leur outillage
traditionnel efficace pour traiter de petites surfaces. Le traitement de surfaces plus
étendues demande en revanche la mise en place de moyens de mécanisation tractée
ou attelée adaptée à l'enfouissement rapide de l'engrais vert dans les rizières.
130
Les
résultats présentés dans ce
mémoire montrent par ailleurs que les
Azorhizobium une fois introduits sont capables de coloniser les rizières même dans
le cas de sols acides comme ceux de Fanghote. Cette propriété observée également
auxPhilippines et en Inde (Watanabe et Ladha, Communication personnelle), permet
donc aux paysans d'éviter toute pratique expérimentale liée à l'inoculation.
Un autre facteur limitant de l'emploi de Sesbania rostrata est la production de
semences. Les paysans devront garder un certain nombre de plantes pour récolter des
graines.
Notons, avec intérêt qu'à la suite des expériences menées depuis 1986, les paysans
de Casamance ont bien maitrisé la technologie de l'engrais vert S. rostrata qu'ils
jugent supérieure, en rendements en riz à l'utilisation d'engrais chimiques azotés.
Dans le futur, l'utilisation à grande échelle de Sesbania rostrata au Sénégal
dépendra d'une part, d'une collaboration accrue entre les différents Instituts de
recherche, ISRA, ORSTOM, ADRAO
et les organismes socio-éducatifs et de
développement, et d'autre part, d'une réelle volonté politique du gouvernement. Il
est urgent que l'engouement porté au Sesbania rostrata en Asie, le soit aussi au
Sénégal. Il serait en revanche incompréhensible que les excellents résultats obtenus
par l'utilisation de cette plante tant au plan fondamental qu'appliqué, soient exploités
dans les pays asiatiques et non au Sénégal où la plante a été découverte.
Les résultats relatifs à l'utilisation de S. rostrata comme fourrage sec (foin) sont
moins prometteurs. Un certain nombre de problèmes se posent:
(1) la sensibilité de S. rostrata aux insectes nécessitant des traitements chimiques
constitue un inconvénient majeur pour sa vulgarisation.
(2) S. rostrata perd une très grande partie de ses feuilles qui se séparent des tiges
en séchant et tombent sur le sol. La nécessité de peser les tiges et les feuilles pour
reconstituer un fourrage complet distribué aux animaux, paraît inconcevable.
(3) Le dernier problème est la faible ingestibilité du fourrage. En effet, la
consommation volontaire du fourrage de S. rostrata est faible
par rapport aux
légumineuses tropicales, qui en général, ont une ingestibilité assez élevée surtout en
début de floraison (Roberges, Communication personnelle). Cette faible
consommation est particulièrement due à la teneur élevée en constituants pariétaux
131
consommation est particulièrement due à la teneur élevée en constituants pariétaux
des tiges (forte teneur en cellulose et en lignine) qui ne sont pas digestibles. C'est ainsi
que sur des tiges hachées et distribuées, les taux de refus élevés atteignent environ
48%. Par rapport au foin brut, le poids des tiges représente 75% du poids total.
Il est clair qu'actuellement S. rostrata ne peut comme fourrage sec, concurrencer
les niébés, et fanes d'arachides vulgarisés au Sénégal (Roberge et al., 1984).
Toutefois, les résultats ne sont pas exhaustifs et on pourrait se poser les questions
suivantes; pour une légumineuse à forte croissance comme le S. rostrata, ne faudrait-il
pas l'exploiter en vert plutôt qu'en foin?
132
CONCLUSION GENERALE
133
L'étude de la symbiose fixatrice d'azote entreAzorhizobium, Rhizobium et Sesbania
rostrata a permis d'aborder plusieurs aspects fondamentaux et appliqués.
Dans une première partie, nous avons tout d'abord étudié les partenaires
bactériens. Nous avons caractérisé 36 souches isolées de nodules de tige et de racine
de Sesbania rostrata et de nodules de racine de plusieurs espèces de Sesbania.
Par des études de taxonomie numérique, de tests physiologiques de culture in vitro et
de nodulation croisée, nous avons confirmé que ces souches se répartissent en deux
groupes appartenant aux genres Azorhizobium (19 souches) et Rhizobium (17
souches).
Les souches d'Azorhizobium représentent les souches typiques de la nodulation
caulinaire de Sesbania rostrata. Elles forment toutes des nodules effectifs sur les
racines et sur les tiges de S. rostrata. Elles sont d'autre part les seules capables de fixer
l'azote en culture pure et de croître aux dépens de cet azote moléculaire. Par contre
aucune souche d'Azorhizobium n'est capable de fixer l'azote sur les racines des autres
espèces
de
Sesbania.
Nous avons aussi montré que les souches qui nodulent effectivement les racines des
espèces de Sesbania testées autres que S. rostrata appartiennent toutes au genre
Rhizobium. Ces souches présentent une spécificité d'hôte beaucoup plus large que les
Azorhizobium.
L'inoculation des souches de Rhizobium sur la tige de S. rostrata nous a permis de
mettre en évidence quatre classes de souches de Rhizobium.
- les souches qui forment des nodules effectifs comme lesAzorhizobium
- les souches qui forment des nodules peu effectifs
- les souches qui forment des nodules ineffectifs
- les souches qui ne forment aucun nodule.
L'utilisation des souches de Rhizobium appartenant à ces quatre groupes devrait
permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la spécificitéé de la
nodulation de tige.
Dans une deuxième partie, notre intérêt s'est porté sur l'étude des modalités de
l'infection et du développement des nodules racinaires de S. rostrata.Il était important
de préciser si le mode d'infection caulinaire était différent de celui de la racine.
134
Nous avons observé un mode d'infection équivalent à celui décrit sur la tige (Tsien et
al., 1983 ; Duhoux, 1984). Comme sur la tige, l'infection des racines de S. rostrata se
fait uniquement sur des sites privilégiés. Donc, contrairement à la majorité des
légumineuses tempérées comme la luzerne ou le trèfle, chez S. rostrata on connaît à
l'avance les sites où les nodules vont se former. Ceci constitue donc un avantage
certain dans les observations cytologiques. Ce mode d'infection par pénétration
intercellulaire des bactéries est suivie de la formation de poches intercellulaires
d'infection puis de la formation de cordons d'infection à partir de ces poches.
Ce processus d'infection est unique parmi les légumineuses connues. Il apparaît donc
comme une caractéristique de l'espèce Sesbania.
Notre étude nous a aussi permis d'observer pour la première fois chez une
légumineuse, un mode original de libération des bactéries des cordons d'infection
dans le cytoplasme de la cellule hôte. Nous avons montré que d~s gouttelettes
d'infection s'échappant de l'extrémité du cordon d'infection sans paroi, véhiculent
dans un premier temps les bactéries au sein du cytoplasme végétal; la libération des
bactéries se fait ensuite non pas par endocytose, mode très répandu chez les
légumineuses tempérées, mais par division sélective de la membrane limitant les
gouttelettes d'infection en autant de compartiments qu'il y a de bactéries incluses.
Nous avons d'autre part observé un type de développement nodulaire encore jamais
décrit à ce jour : en effet les nodules racinaires de S. rostrata présentent des
caractéristiques intermédiaires de développement propres à la fois aux nodules de
type indéterminé comme chez les légumineuses tempérées et aux nodules de type
déterminé observés chez la majorité des légumineuses tropicales.
Ces observations cytologiques devraient être un outil précieux dans l'étude de certains
mutants d'Azorhizobium et de Rhizobium. Notre étude a permis de connaître le
"timing" de différentes étapes de l'infection et du développement des nodules
racinaires de S. rostrata. On pourra ainsi voir à quel stade ces mutations provoquent
des arrêts dans le programme de développement des nodules racinaires de S. rostrata.
Dans une troisième partie, nous avons étudié la fixation d'azote par Sesbania
rostrata. Nous avons montré que la nodulation de tige chez S. rostrata permet à cette
plante de produire trois fois plus de nodules que Sesbania sesban, autre espèce de
Sesbania sans nodules de tige, mais dont le développement végétatif est tout à fait
comparable à celui de S. rostrata. Nous avons montré, en utilisant la méthode
isotopique N-15 que S. rostrata fixe environ 110 kg d'azote par hectare en 60 jours.
135
Pour la même période S. sesban fixe de 7 à 18 kg d'azote par hectare. Le potentiel
fixateur d'azote élevé de S. rostrata semble donc être lié à l'abondance des nodules
de tige qui donnent surtout dans les conditions inondées un avantage compétitif à la
plante.
Les résultats de plusieurs années d'expérience au champ sur l'utilisation de
Sesbania rostrata comme engrais vert en riziculture ont montré qu'il était possible de
faire passer les rendements en riz de 1,7 t à 4t/ha dans les conditions de riziculture en
milieu paysan.
Nos résultats confirmés dans différentes régions d'Afrique et d'Asie suggèrent que
l'engrais vert Sesbania rostrata équivaut à un apport d'engrais azoté de 100 kglha et
peut donc être recommandé pour la fertilisation des sols pauvres de nos rizières et
remplacer les engrais chimiques dont le coût élevé est incompatible avec le revenu
des paysans. Nous avons montré que la technologie de l'engrais vert peut être
maitrisée par les paysans sénégalais. Mais le Sesbania rostrata dont l'effet engrais vert
ne fait plus aucun doute peut-il passer dans les pratiques culturales paysannes et être
utilisé à grande échelle dans la riziculture africaine et en particulier sénégalaise? Si
l'introduction de cette biotechnologie en Asie connaît actuellement un succès
prometteur, par contre en Afrique, le système rencontre un certain nombre de limites
qui restent a améliorer.
En effet, l'exigence photopériodique de S. rostrata constitue une limitation
importante à son emploi dans les régions équatoriales, où jours et nuits ont la même
longueur. Une percée majeure serait donc d'améliorer la plante hôte afin d'obtenir
des lignées plus tolérantes à la photopériode.
En outre, l'utilisation de S. rostrata est souvent limitée aux sols submergés en raison
de sa très grande sensibilité aux nématodes appartenant plus particulièrement au
genre Meloidogyne. Il serait nécessaire de rechercher des cultivars résistants à ce
parasite.
En Asie les paysans ont l'habitude d'utiliser traditionnellement des engrais verts, en
Afrique cette pratique n'a jamais existé. L'insertion de cette technologie en milieu
africain pose donc des problèmes socioculturels.
Sur le plan fondamental, nous avons confirmé le potentiel fixateur d'azote très
élevé de S. rostrata. L'obtention récente de mutants de la plante sans sites de
nodulation devrait donc faciliter l'étude des gènes de la plante responsables de la
nodulation de tige et ainsi permettre le transfert de la nodulation de tige à des espèces
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mieux adaptées aux conditions sahéliennes utilisables soit en agriculture soit en
foresterie.
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152
PLANCHES PHOTOGRAPHIQUES
153
PLANCHEl
Fig.2A et 2B
Sesbania rostrata
Fig. 2A Sesbania rostrata, la plante entière. T = tige; S.R. = système racinaire ;
Flèches = nodules de tige
Fig. 2B. Agrandissement du système racinaire de Sesbania rostrata. R.S. = ra-
cines secondaires; têtes de flèches = nodules de racine.
154
PLANCHEZ
Fig. 3, 4 et 5 : Racines de S. rostrata éclaircies à l'hypochlorite de sodium avant
(Fig. 3) ou après dissection du cortex de la racine principale (Fig. 4 et 5).
Les renflements (astériques) à la base des racines latérales représentent des
ébauches nodulaires 24 h (Fig. 4) et 48 h (Fig. 5) après l'inoculation.
Fig. 4 et 5 : Les flèches localisent les poils absorbants du fragment de la radicelle
enfouie dans le cortex de la racine principale.
(Grandissements : Fig. 3: x 100 ; Fig. 4: x 80; Fig. 5 : x 80).
155
PLANCHE 3
Fig. 6. 7 et 8. Infection de la racine de S. rostrata par la souche d'Azorhizobium cau-
linodans ORS 571.
Eig.,.6. Infection à la base d'un poil absorbant (astérique) en contact avec une autre
cellule hors du plan de mise au point (flèche) ; tête de flèche: filament d'infection.
E.ig..1. Filament d'infection (flèche) au niveau des cellules épidermiques racinaires.
Ei.g."B. Relation entre une poche intercellulaire d'infection (flèche) et un filament
d'infection (têtes de flèches).
[coloration par le bleu de méthylène des racines entières sans traitement par l'hypo-
chlorite de sodium (fig. 6 et 8) ou après éclaircissement (fig. 7).]
(Grandissements : Fig. 6 : x 370; Fig. 7 : x 340; Fig. 8 : x 160).
\\
\\ \\\\
J.
* \\
\\
....-
156
PLANCHE 4
Fig. 9, 10 et Il : Infection intercellulaire de S. rostrata par Azorhizobium caulino-
dans ORS 571 (16 h après inoculation)
Infection intercellulaire (flèche), poches intercellulaires d'infection (doubles
flèches) et filaments d'infection (têtes de flèches).
(Coupes semi-fines ; coloration par la fuchsine basique et le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 9 : x 450; Fig. 10 : x 500 ; Fig. 11 : x 500).
157
PLANC.HE 5
Fig. 12 et 13 : Initiation d'un méristème nodulaire par dédifférenciation des cel-
lules corticales de la racine (16 h après l'inoculation).
Fig. 12: Vue générale montrant le début de la dédifférenciation corticale. RP: ra-
cine principale; RS : racine secondaire.
Fig,13 : Agrandissement de la zone infectée localisée par une large flèche sur la fi-
gure 12. Infection intercellulaire (flèche) et poches intercellulaires d'infection
(doubles flèches) sont visibles.
(Coupes semi-fines, coloration par la fuchsine basique et le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 12: x 120 ; Fig. 13 : x 450).
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158
PLANCHE 6
Fig. 14, 15, 16 et 17 : Développement nodulaire (24 h à 36 h après l'inoculation).
Fig. 14 et 15 : Organisation en corbeille du méristème (flèches) autour de la trace
infectieuse centrale (large flèche).
Noter le début de la différenciation des traces vasculaires du nodule (flèches
courbes) sur la figure 15
Fig. 16 et 17 : Agrandissement des goulets d'infection localisés par de larges flèches
sur les figures 14 et 15.
Les poches d'infection intercellulaires (flèches) et filaments d'infection (têtes de
flèches) sont visibles.
(Coupes serni-fines ;coloration par la fuchsine basique et le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 14: x 100; Fig. 15: x 80; Fig. 16: x 280; Fig. 17: x 280).
159
PLANCHE 7
Fjg. 18, 19, 20 et 21 : Développement nodulaire (48 à 72 h après l'inoculation).
Fig. 18: Goulet central d'infection (large flèche) et tissu central envahi (astérique).
Fig,19: Agrandissement de la figure 18. Goulet central et filaments d'infection
dans le tissu central.
Fig. 20 : Essaimage du réseau infectieux.
Fjg. 21 : Différenciation centrifuge. Les cellules méristématiques périphériques
(flèches) et les traces vasculaires tout autour du nodule (têtes de flèches) sont visi-
bles.
Fig. 18 et 20 :Sections de 100 urn, éclaircies par l'hypochlorite de sodium et colo-
rées par le bleu de méthylène; Fig. 21 : coupe semi- fine, coloration par la fuschine
basique et le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 18: x 60; Fig. 19: x 120 ; Fig. 20 : x 300; Fig. 21: x 70).
.. "':;-.
160
PLANCHES
Fig. 23 et 24 : Développement nodulaire ( 5 à 7 jours après l'inoculation)
Fig. 23 : Goulet central d'infection (astérique ) et différenciation en corbeille.
Têtes de flèches: Traces vasculaires du nodule.
Fig. 24 : Zone méristématique périphérique d'un nodule montrant la présence de
filaments d'infection (têtes de flèches).
(Sections de 100 urn, éclaircies et colorées par le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 23: x 100 ; Fig. 24 : x 200).
23
161
PLANCHE 9
Fig. 25 et 26: Nodule mature (14 jours après l'inoculation).
Fig. 25 : Vue générale montrant la dépression centrale ( astérique) et le tissu cen-
tral en corbeille.
Fig. 26 : Agrandissement de la figure 25.
Tissus périphériques du nodule. Têtes de flèches: traces vasculaires; flèches: en-
doderme vasculaire; astérique : parenchyme nodulaire; larges flèches: endo-
derme nodulaire périphérique.
(Sections de 100 urn éclaircies et colorées par le bleu de méthylène).
(Grandissements : Fig. 25 : x 100 ; Fig. 26 : x 250).
25
162
PLANCHE 1(1
Fig. 27 : Poche intercellulaire d'infection. Les bactéries (b) sont incluses dans un
mucilage (m) de nature fibrillaire ( têtes de flèches).
Noter dans les bactéries, l'espace périplasmique important (flèches), et dans la cel-
lule végétale, la fusion de gouttelettes électroniquement denses dans le plasma-
lemme (doubles flèches) ; ces gouttelettes se retrouvent ensuite dans le matériel
cellulosique de la paroi cellulaire (Pc) (doubles têtes de flèches)
Fig. 28 : Cellules méristématiques issues de la dédifférenciation du cortex végétal.
CY = cytoplasme; N = Noyau; flèches = plasmodesmes ; têtes de flèches = dic-
tyosomes ; large flèche = filament d'infection.
(Grandissements : Fig. 27: x 29000; Fig. 28 : x 6000).
163
PLANCHE Il
Fig. 29 et 30 : Filaments d'infection. Noter la continuité entre la paroi cellulaire et
la paroi des filaments d'infection (flèches) et l'absence de gaine cellulosique à l'ex-
trémité des filaments d'infection (astériques) - b = bactérie; m = mucilage.
Les têtes de flèches localisent le plasmalemme de la cellule hôte.
(Grandissements : Fig. 29: x 7000; Fig. 30 : x 7000).
164
PLANCHE 12
Fig. 31, 32, 33 et 34 : Gouttelettes d'infection dont certaines montrent une partie li-
mitée par une paroi (larges flèches) et une autre libre de toute entrave ( astérique).
Les flèches et les têtes de flèches montrent les vestiges du mucilage (Fig. 31 - 34) et
de la paroi du filament d'infection (Fig. 32).
v = vacuoles.
(Grandissements : Fig. 31 : x 9000 ; Fig. 32 : x 12000 ; Fig. 33 x 6000 ; Fig. 34 : x
5000).
165
PLANCHE 13
Fig. 35 et 36: Cellules végétales envahies - Bactéroïdes intracellulaires individuels
ou à plusieurs (larges flèches) dans un même sac péribactéroïdien (flèches).
Noter la richesse du cytoplasme végétal en dictyosomes (têtes de flèches; Fig. 35)
et la présence d'une cellule non envahie (astérique) au milieu des cellules à bacté-
roïdes (Fig. 36).
(Grandissements : Fig. 35 : x 5000.36 : x 7000).
166
.fLANCHE 14
Fig. 37 et 38: Différenciation du tissu fixateur (1ère étape).
Aspect irrégulier du couple bactéroïde - membrane péribactéroïdienne. Les têtes
de flèches soulignent les vésicules cytoplasmiques dont certaines fusionnent à la
membrane séquestrante des bactéroïdes (flèches). Les deux figures montrent la ri-
chesse du cytoplasme végétal en ribosomes, en profils réticulaires et en dictyo-
somes. Double flèche = bactéroïde en division.
(Grandissements : Fig. 37 : x 20000; Fig. 38; x 20000).
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167
PLANCHE IS
Fig. 39 et 40: Différenciation du tissu fixateur (2ème étape).
Fig. 39: Vue générale montrant l'évolution de l'ultrasctructure bactéroïdienne au
cours de la maturation des cellules envahies.Noter l'allongement des bactéroïdes
dans les cellules les plus différenciées ( partie droite de la figure).
Fig. 40 : Bactéroïdes en cours de différenciation montrant un profil plus régulier et
une réduction de leur espace périplasmique. Noter les zones de contact entre mem-
branes séquestrantes (flèches) et la présence d'un filament d'infection (large
flèche) dans le cytoplasme végétal.
(Grandissements : Fig. 39 : x 5000 ; Fig. 40 : x 19000).
169
PLANCHE1?
Fig. 42 : Différenciation du tissu fixateur (3ème étape). Vue partielle de deux cel-
lules envahies montrant le rejet des organites cellulaires contre la paroi cellulaire
(astériques blancs = plastes; flèches = mitochondries).
Noter la forme caractéristique "en rosace" des sacs péribactéroïdiens séquestrant
plusieurs bactéroïdes, dont les pôles sont occupés par de larges dépôts de polY-[3-
hydroxybutyrate (astériques noirs). A l'intérieur des sacs péribactéroïdiens, les
têtes de flèches localisent des vestiges membranaires qui pourraient être l'indice
d'une fusion entre membranes péribactéroïdiennes
(Grandissement: Fig. 42: x 15000).
170
PLANCHE 18
Fig. 43 - 44: Différenciation du tissu fixateur (nodule mature de 14 jours). On re-
marque la présence de sacs péribactéroïdiens renfermant de très nombreux bacté-
roïdes, l'accumulation de poly-s-hydroxybutyrate (astérique) et de polyphosphate
(sous forme de gouttelettes électroniquement denses) au niveau des bactéroïdes
(fig. 44) et la réduction de la densité ribosomique du cytoplasme végétal (CV).
(Grandissements : Fig. 43: x 6000; Fig. 44 : x 16000).