n" d'ordre:
Université Cheikh Anta Diop de Dakar
Faculté des Sciences et Techniques
THESE
Présentée par
Papa NDIAYE
pour obtenir le grade de
Docteur ès Sciences Naturelles
Bases biologiques de la fonction de reproduction de la femelle
d'Oreochromis niloticus, tilapia d'intérêt aquacole au Sénégal.
soutenue le 28 oct a b r e
1996, devant la commission d'examen:
Président:
M. Omar Thiom THIAW
Université Dakar
Membres:
Mme Françoise Le MENN
Université Bordeaux 1
M. René Le MENN
Université Bordeaux 1
M. Mady NDIA YE
Université Dakar
M. Abdoulaye SAMB
Université Dakar
M. Meissa TOURE
Université Dakar

---

A la mémoire de mon père.
A ma mère, à mes parents,
à mon épouse Seynabou, à mes enfants
et à mes amis.
51.va nt- propos
Le présent mémoire est ie ftuit de huit années de coopération. partagée entre
l'Llnioersité. Cfiei/(ft 51.nw 'Diop de ma/(gr (Sénéga[) et i'ïInioersi ü 'Bordeaux, I
errance}.
51. ma/(gr, te trauaii a été mené sous ra direction de Monsieur O tl, 'Ihiaza,
.- _._-_.
- -
- _._...-
:Maître de conférences dans ie Laboratoire de 9vficroswpie électronique. Je Cui suis
profondément reconnaissant de ses suggestions et conseils qui m'ont permis de
mener à terme mes recherches .
Je suis heureux d'exprimer ma profonde gratitude et ma reconnaissance à
:Madame :r. Le îMenn, 'Directeur du Laboratoire de 'BioCogie de {a ~production
des Poissons à l'Llnioersiti' 'Bordeaux 1. We a, non seulement guidé mon traoaii en
france, mais réussi à me faire oénéficier d'une bourse permanente afin de me
permettre d'aboutit au doctorat.
Je remercie sincèrement :M. :M. !J{Iiaye, du département de 'BioCogie animale,
:M. 51. Samb, che] du Laboratoire des Produits 9{sLtureCs et :M. :M.fJ'ouré, du
laboratoire de 'Biochimie de {a :Faculté de g..{édecine et Pliarmacie, qui ont bien.
voulu être membres du jury de cette thèse.
Je suis extrêmement reconnaissant à :M. ~ Le 9vfenn, :Maître de conférences au
Centre de 9vficroswpie électronique de {''Université 'Bordeaux I, pour son aide
durant les expérimentations de mien topie électronique. Son interêt pour mon
1
trauail, le conduit à être membre du jury.
9vfes remerciements s'adressent à tout te personnel du laboratoire bordelais.
:M. J.P. Bonnin, :Maître de conférences, m'a rargement dispensé de son savoir en
oioCogie ceûuiaire. Je l'en. remercie très chaleureusement. me 9Yfme 'B. Dauail-
Cuisset; :Maître de conférences dans Ce Laboratoire, je garderai Ce souvenir de son
attention assidue portée au dosage 'ELIS5I. que j'effectuais. Je voudrais égat:ement
remercier
9vfesdames Catherine
Péiissero-Benneteau, tEIisaoetfi
'Bon, Sy{via
'Branchu, 1J[{afi 'Barbe, Chantat j-{éCou, Luciane PerrazoCo et 9vfessieurs /Daniei
'Brajat et 51.ugustin Bauala.

---

:Nf. :Nf. Cornet, ingénieur de recherche au C9fRS dans fe Laboratoire
d'Océanoqtaphie 6io!ogiquel a su mettre sa genti[[esse et sa compétence à mon
service chaquefois que cela s'avérait nécessaire.
Je remercie :Nf. P/[acon pour les informations qu'if a bien. voufu me lioter sur
le comportementdesfemelies d'Oteochromis niloticus.
:Nfes remerciements, wnt également au personne! de î'unioersité Cheikfi 51nta
'Diop de 'Da!\\g.r et à mes coŒègues africains pour l'aide qu'ils m font appportée.
Texptime à :Mf fe professeur 'D. Sam6 'Directeur de {'I:r~ ma profonde
1
reconnaissance pour son aide concernant toutes [es démarches administratives et
son soutien à notre programme de recherche.
Ces recherches n'auraient jamais pu voir fe jour, sans fe concours de :Nf. S.
1\\f,ital Présitfent 'Directeur qénéra{ de {a S51'E'D qui m'a permis de traoailler à {a
pisciculture de 9{jangal de :Nf. :Nf. tJ>iouj 9rfinistre des '.1\\!-ssources anim ales qui a pu
me fournir l'aide !ogistique durant [es tfifftrents dépiacements et de :Nf. 51. 1'{Iiayel
9rfinistre de {a Pêcfte et des Transports Maritimes pour {a bourse accordée m'ayant
permis de terminerCa rédaction. de ce mémoire. J'e~me toute ma gratitude à leur
égartf.
Je remercie sincèrementM. queyel 'Directeur de {'ont :Nf. 'Ihiam, 'Directeur-
adjoint de Ca 'DoPM et :M. Loum, Conseiller technique au ministère de Ca Pêche et
des Transports maritimes qui ont su s'occuperactivement de mon dossier.
Je souhaiterais remercier en particulier :M. S. Bocoum, tfoyen des cliauffeursl
qui m'a conduit tians toutes [es missions sachant faire fi des contraintesv 'M. 51.
Djiba a su m'apporter toute sa compétence pour {a maintenance des poissons
uiuants, :Nfessieurs CO{YI 9{gom et 1'{Iao pour {a réalisation des blocs de
microscopie électronique et enfin:Nf. 'E.co{y pour le tirage des pliotos.
J'e~me toute ma reconnaissance envers :M. J. Lazard, Chef dù Programme
Pêche et 5lquacuCture dù CI1(51'D à 9.fontpeŒier et :M. J. L. :Nfessagerl 'DéCégué
!Rjgiona{ dù CI1(51'D à 'Da!\\g.r pour l'aide qu'ifs m'ont apportée pour rfJJ.HS Ca
)
réalisation de ce mémoire.
'Enfin, je gartfe le souvenir de I'accueii chaleureux. amicai et frateme! que
m'ont toujours réservé 5lssane Paye et son épouse 9{{lfissatou durant tous mes
séjours 6ordelais.

---

Sommaire
Introduction
1
Ch. 1 : Présentation de l'espèce
5
1.1 Les caractéristiques taxonomiques
5
1.1.1. Position systématique
1.1.2. Caractéristiques taxonomiques
1.1.3. Evolution taxonomique
1.2. Les caractéristiques morphologiques
6
1.3. Ecologie
7
1.31. Répartition géographique
1.3.2. Alimentation
1.3.3. Croissance
1.4 Biologie de la reproduction
8
1.4.1. Comportement reproducteur
1.4.2. Stratégies de reproduction
1.4.3. Cycle reproducteur
1.5. L'aquaculture du tilapia
12
1.5.1. Production du tilapia
1.5.2. Aquaculture du tilapia en Afrique
Ch. 2 : Matériel et méthodes
14
2.1. Les poissons
14
2.2. Prélèvements sur animaux vivants
15
2.2.1. Prélèvement du sang
2.2.2. Prélèvement des gonades
2.2.3. Prélèvement du foie
2 3
P "
tio
.
.
16
. .
repara 1 ns mIcroscopIques
.
2.3.1.
Microscopie photonique
16
2.3.1.1. Fixation
{
l )vS Jl
2.3.1.2. Déshydration et inclusion classique
1
( 2.3.1.3. (7oupes
\\ v~
2.3.1.4. Coloration
1
a) Coupes classiques
b) Coupes semi-fines
2.3.2. Microscopie électronique à transmission
17
2.3.2.1. Fixation et inclusion
a) Immersion directe de petites pièces
b) Perfusion d'ovaire
c) Fixateurs utilisés
2.3.2.2. Coupes ultrafines
2.3.2.3. Contrastage
2.3.2.4. Observations
2.3.3 (MicroSCOPie électronique à balayage
19
2.3.3.1. Fixation des œufs fécondés
2.3.3.2. Déshydratation
2.3.3.3. Point critique
2.3.3.4. Observations
2.3.4' CMicroscoPie pour analyse d'images
20
2.3.4.1. Fixation
2.3.4.2. Observations et analyses

---

2.4. Œstrogénisation
21
2.4.1. Solutions d'œstrogénisation
2.4.2. Protocole d'œstrogénisation
2.5. Techniques électrophorétiques
21
2.5.1. Electrophorèses en milieu non-dissociant (natif) :
21
2.5.1.1. Principe
2.5.1.2. Caractéristiques de la migration
2.5.1.3. Appareillage
2.5.1.4. Les solutions utilisées
a) Pour confectionner les gels:
b) Pour préparer les échantillons avant leur dépôt:
c) Pour effectuer la séparation et colorer les bandes obtenues
2.5.1.5. Mode opératoire
a) Préparation des plaques d'électrophorèse
b) Coulage des gels:
c) Installation des plaques et dépôts des échantillons
2.5.1.6. Révélation des électrophorégrammes
a) Coloration
b) Décoloration
c) Photographie
2.5.2. E1ectrophorèses en milieu dissociant.
25
2.5.2.1. PAGE SDS et B-mercaptoéthanol
a) Solutions particulières
solution de SDS
kit de poids moléculaires
b) Préparation des gels
c) Appareillage et mode opératoire
2.5.2.2. Electroélution
a) Extraction de la bande choisie
b) Cellule d'électroélution
c) Préparation des solutions
\\
d) Installation des cuves
\\
e) Préparation des échantillons
j) Conditions électriques
g) Récupération des protéines
5.2.2.3. Electrotransfert
\\
a) Support de transjen
b) Tampons de transfert
c) Protocole de transfert
d) Colorations de contrôle
2.6. Techniques chromatographiques
29
2.6.1. Chromatographie de filtration sur geI..
29
2.6.1.1. Principe
2.6.1.2. Matrice utilisée
a) Caractéristiques
b) Préparation de la colonne
2.6.1.3. Tampon d'élution
2.6.1.4. Mode opératoire
J 2.6.1.5. Lecture de l'absorbance des fractions
2.6.2. Chromatographie échangeuse d'ions sur colonne de DEAE-Trisacryl M...31
2.6.2.2. Matrice utilisée:
a) Caractéristiques:
1
b) Coulage de la matrice :
2.6.2.3. Tampons
a) Tampon d'équilibration:
b) Gradient d'élution :
2.6.2.4. Mode opératoire
2.6.2.5.. Lecture de l'absorbance des fractions

---

2.7. Techniques immunologiques
33
2.7.1. Rappel de notions de base
33
2. Zl.l. Définition des notions antigène et anticorps
2.7.1.2. Immunisation
2.7.2. Préparation de l'antigène
34
2.7.3 . Protocole d'immunisation des lapins
34
2.7.4. Contrôles de l'immunisation
34
2. Z4.1. Prélèvements de sang
2. Z4.2. Contrôle de l'immunsérum par immuno-précipitation
2. Z4.3. Contrôlede l'immunisation par ELISA direct
2.7 .5.Epuisementde
l'i mrnunsérum
36
2.8. Immunocytochimie
37
2.8.1. immunocytochimie
photonique
37
2.8.1.1. préparation des coupes
2.8.1.2. Saturation.
1
2.8.1.3. Incubation avec l'anticorps primaire
2.8.1.4. Incubation avec l'anticorps secondaire
2.8.1.5. Incubation du complexe PAP
\\
2.8.1.6. Révélation
2.8.2. ' Immunocytoc himie ultrastructurale
38
2.8.2.1. Réhydratation
\\ 2.8.2.2. Saturation
\\ 2.8.2.3. Incubation avec l'anticorps primaire
2.8.2.4. Incubation avec l'anticorps secondaire
2.9. Mise au point d'un dosage ELISA
39
2.9.1.
Généralités
39
2.9.2.
Les
solutions tampons
39
2.9.3.1. Greffage
(
2.9.3.2. Préincubation
2.9.3.4. Saturation des sites aspécifiques
/l2.9.3.5.Incubationavecl'anticorpsprimaire
2.9.3.6. Incubation avec l'anticorps secondaire
2.9.3. Z Incubation avec le complexe PAP
\\
2.9.3.8. Révélation
2.9.3.10. Arrêt et lecture
2.9.3.
Protocole
de
l'ELISA
.40
2.9.4.
Expression
des
résultats
.41
2.10. RIA ou dosages radioimmunologiques
.42
2.10.1. Extraction des stéroïdes plasmatiques
.42
2.10.2. Séparation des stéroïdes par chromatographie
.42
2.10.3.
Protocole du
dosage
.43
1
2.10.3.1. préparation des différents tubes
2.10.3.2. réactifs utilisés
2.10.3.3. principe du dosage
(
2.10.3.4. les étapes du dosage
2.10.3.5. l'expression des résultats
•-t $.-(IvU~ t '
Ch. 3 : Microscopie du développement ovocytaire
.45
3.1. Introduction
45
3.2. Les colorations en microscopie photonique
45
3.2.1. Coloo!ti:màfhémIi>xylineB:IueUIJXlqœ
3.2.2. Coloration à l'hématoxyline de Groat-éosine-vert lumière
3.2.3. Coloration au trichrome de Masson
3.2.4. Coloration par l'azan de Heidenhain
3.3. Résultats de microscopie photonique et électronique
.4 7
3.3.1. Les différents stades de l'ovogénèse
.47
3.3.1.1. ovogonies

---

3.3.1.2. stade 1
3.3.1.3. stade 2
a) microscopie photonique
b) microscopie électronique
1
1
3.3.1.4. stade 3
a) microscopie photonique
b) microscopie électronique
\\ 3.3.1.5. stade 4
a) microscopie photonique
\\
b) microscopie électronique
3.3.1.6 stade 5
3.3.1. Z oeufdans la cavité bucco-pharyngienne en MER
3.3.2. Evolution de la répartition des follicules ovariens en classe de taille
54
3.3.3. Les paramètres morphologiques ovariens
54
3.3.3.1. Rapport gonado-somatique (RGS)
3.3.3.2. Rapport h épato-somatique (RHS)
3.4. Discussion
55
3.4.l.Les étapes du développement ovocytaire
55
3.4.1.1. Les étapes de la vitellogénèse.
La prévitellogénèse
1
1
La vitellogén èse.
3.4.1.2. Les mécanismes de l'endocytose de la vitellogénine.
3.41. 3. Les mariees exou:r1luliiJFs dufollicule ovocytdn:
Elaboration de la zonaradiaia
Elaboration desfilaments granulosaires.
3.4.2. La répartition des follicules ovariens
62
3.4.3. Les paramètres morphométriques
63
Ch 4 : Purification de la vitellogénine et mise au
point de son ELISA
65
4.1. Introduction
65
4.2. Résultats
66
4.2.1.
Oestrogénisation
66
4.2.2. Purification de la vitellogénine
66
4.2.2.1. Purification par double chromatographie
a) chromatographie d'exclusion moléculaire
Séparation des pics
Préparation du matérielpour la deuxième chromatographie.
b) chromatographie échangeuse d'anions
1
Séparation des pics
Identification des pics en électrophorèse
Préparation des aliquotes de VTG purifiée.
4.2.2.2. Purification par électro élution
1
4.2.2.3. Evaluation du poids moléculaire de la VTG
4.2.3. Obtention d'anticorps spécifiques
71
4.2.3.1 Tests de spécificité des anticorps
a) immunoprécipitation
b) immunotransferts
c) immunocytochimie
photonique
électronique
d) ELISA direct
4.2.4. Mise au point d'un ELISA
74
4.2.4.1 Principe
4.2.4.2 Protocole standard
4.2.4.3 Concentrations de l'anticorps jaire et du greffage
4.2.4.4 Etape de préincubation

---

4.2.4.5 Vérification de la spécificité du dosage
4.3. Discussi on
78
4.3.1. Induction de la vitellogénine (VTG) par le benzoate d'œstradiol.;
78
4.3.2. L'identification de la VTG plasmatique
80
4.3.2.1. Généralités
a) PAGE -SDS
b) électrotransfert
4.3.2.2. Mise en évidence de protéines œstrogénodépendantes
4.3.2.3. Caractérisation éleetrophorétique de la vitellogénine
4.3.4. Purification de la vitellogénine par électro élution
83
4.3.5. Purification de la vitellogénine plasmatique par chromatographie
84
4.3.5.1. Chromatographie d'exclusion moléculaire
4.3.5.2. Chromatographie échangeuse d'ions
4.3.6. L'ELISA de vitellogénine d'Oreochromis niloticus..
86
4.3.3.6.2. Spécificité
4.436.3. Sensibilité
Ch. 5 : Corrélations hormonales au cours de la
vitellogénèse
88
5.1. Rappel sur le contrôle endocrinien de la vitellogênèse
88
5.2. Rappel sur le cycle reproducteur d'O.ni/oficus
89
5.4 Résultats
90
5.4.1. Dosages de la testostérone
90
5.4.1.1. chez les femelles prélevées dans le milieu naturel
5.4.1.2. chez les femelles élevées au laboratoire
5.4 .2.
Dosages
de
l'E2
90
5.4.2. 1.chez lesfemelles prélevées en milieu naturel
5.4.2.2. chez les femelles élevées au laboratoire
5.4.3. Dosages de la vitellogénine
91
5.4.3.1. chez les femelles prélevées en milieu naturel
5.4.3.2. chez les femelles élevée en laboratoire
5.3. Discussion
91
5.6. Conclusions
93
Conclusions et perspectives
94
Bibliographie
96

---

1
Introduction
Pendant les années 1950 et 1960 l'aquaculture des tilapias en étangs
connaît un développement spectaculaire dans un nombre croissant de pays
africains. Malheureusement depuis, on constate dans la plupart des pays
devenus indépendants, une nette régression des activités d'aquaculture.
Lazard et al., en 1990 ont mené une étude générale sur la pisciculture
dans
différents pays d'Afrique francophone.
Elle
est succinctement
résumée ci-dessous:
- Pourquoi, malgré les nombreux efforts (projets de développement,
programmes de recherche, financements sous toutes les formes) déployés
par les différents partenaires concernés, la pisciculture en Afrique
subsaharienne n'a-t-elle pas encore "décollé"
?
Elle
ne
représente
aujourd'hui qu'environ 1%0 de la production aquacole mondiale.
- L'examen de l'historique du développement de cette activité en
Afrique noire, dont les débuts ne remontent qu'à un demi-siècle, révèle
l'absence de véritables stratégies de développement aquacole, notamment
au niveau de sa finalité : elle n'était, ni un moyen efficace d'améliorer la
ration alimentaire de ceux qui la pratiquaient, ni une source substantielle
de revenus complémentaires pour ceux qui pratiquaient une agriculture
traditionnelle.
- Une analyse des différentes formes de pisciculture développées sur
le continent à partir d'études de cas, conduit à proposer un modèle
intégrant des critères de développement et de structuration des systèmes
de production.
Les travaux de recherche de nature biotechnique menés depuis une
trentaine d'années, en stations expérimentales et dans le cadre de projets
de recherche-développement, commencent à porter leurs fruits. L'espèce
pilote choisie reste le tilapia : Oreochromis niloticus, Cichlidae largement
utilisé pour l'aquaculture extensive ou intensive dans la zone tropicale
J ' mondiale (lSTA III, ;/ 'T he Third International Symposium on Tilapia in
o Aquaculture, Côte.0' Ivoire, 1991 ").
Paradoxalement, malgré les nombreuses publications scientifiques
dont cette espèce a fait l'objet, il existe peu
de
données sur la
gamétogenèse des femelles et en particulier sur la vitellogénèse ou
modalités d'accumulation des réserves de l'oeuf.

---

2
Oreochromis niloticus présente un cycle de reproduction continu
sauf pendant la période de fraîcheur (mi-décembre à mi-février) où les
gonades restent en repos sexuel. Il est un
des
rares
modèles
se
reproduisant très facilement en pisciculture. Son taux de reproduction
très élevé impose l'élaboration de méthodes de contrôle pour éviter
d'aboutir rapidement à des populations nanifiées. Seulement, les femelles
ne présentent pas un synchronisme de leur gamétogenèse et en particulier
diminuent notablement leur production d'œufs pendant la saison de
fraîcheur comme nous avons pu l'observer à la station de pisciculture de
Nianga.
La description de le développement des gonades et notamment
l'ovogenèse chez les tilapias a fait l'objet de quelques travaux (Von Kraft
& Peters, 1963 ; Smith & Halley, 1987, 1988). Mais il est à noter que peu
de données existent dans la littérature sur les cycles sexuels en rapport
avec les paramètres plasmatiques et endocriniens chez Oreochromis
niloticus malgré son intérêt économique dans le domaine de l'aquaculture.
En effet, la production de tilapias se situe au troisième rang mondial (en
tonnage) derrière la carpe et le milkfish (Lazard, 1990).
Le but de notre travail est donc d'acquérir des données plus
complètes sur cette fonction de reproduction, en particulier chez la
femelle. Nous nous sommes intéressés surtout à la vitellogénèse, qui
désigne l'ensemble des processus physiologiques par lesquels les femelles
ovipares synthétisent et accumulent dans leur ovocytes des réserves
vitellines (vitellus), destinées à être utilisées par l'embryon au cours des
premiers stades de son développement.
C'est grâce aux recherches sur la nature et l'origine de ces réserves
vitellines, que les mécanismes de la vitellogénèse ont été mieux élucidés.
Les premiers travaux ont porté sur les oiseaux (volaille en particulier)
puis se sont ensuite élargis à d'autres espèces telles que les amphibiens, les
insectes, les reptiles, les poissons et
les crustacés.
Les
substances
accumulées sont pour
la
plupart
d'origine
extérieure
à
l'ovocyte,
synthétisées au niveau du foie (ou au niveau du corps adipeux chez les
insectes ou les crustacés) et véhiculées par le sang jusqu'aux ovaires où
elles sont incorporées par les
ovocytes.
Le
déclenchement de
la
vitellogénèse
est
sous
la
dépendance
de
nombreux
facteurs
environnementaux (température, photopériode, qualité de l'eau, stress... )
qui, agissant sur le système nerveux central, provoquent chez les
Vertébrés non mammaliens une induction hormonale de la synthèse
d'œstrogènes par les cellules interstitielles de l'ovaire. Ces œstrogènes
induisent la biosynthèse hépatique du précurseur des réserves vitellines
sous forme
d'une
macromolécule spécifique des
femelles
ovipares
matures. Le terme de vitellogénine a été proposé par Pan et al. (1969) et
adopté par Wallace (1970) pour désigner ce précurseur. La vitellogénine
(VTG) est
intemalisée dans
les
ovocytes grâce
à
des
récepteurs
spécifiques.

---

3
Le début des travaux relatifs à la vitellogénine ou à ses dérivés dans
l'oeuf remonte à 1936 quand Laskowski décrivit une phosphoprotéine
dans le plasma de poules pondeuses. Cette molécule était insoluble dans
l'eau et il l'appelera "vitelline". Peu de temps après, Riddle (1942) (cité
par Schjeide & Urist,1960), mit en évidence la corrélation qui existe
entre l'apparition de cette vitelline et le taux élevé de calcium dans le sang
des poules pondeuses. Le
terme
"phosvitine"
fut
introduit pour la
première fois en 1949 par Mecham et ülcoot (cité par Schjeide & Urist,
1960) pour désigner une préparation phosphoprotéique isolée à partir du
jaune d'oeuf de poule, ainsi que pour évoquer sa haute teneur en
phosphore et le fait qu'elle constitue une source en cet élément pour
l'oeuf. Joubert et Cook (1958) (cité par Riazi ,1987), ont essayé de
différencier les protéines du jaune de l'oeuf de poule en protéines
phosphoprotéique et
lipoprotéique.
A
partir des
années
1960,
les
méthodes d'investigations se sont beaucoup développées et ont contribué à
l'approfondissement des connaissances sur la nature
des
protéines
vitellines et de leur précurseur plasmatique.
Ce sont Ho et Vanstone, qui révèlèrent en 1961 pour la première fois
chez un poisson (Oncorhynchus /dtsutch) la présence d'une protéine
caractéristique des femelles en vitellogénèse, la vitellogénine (VTG). Ces
mêmes auteurs montrèrent aussi, que la synthèse de cette protéine pouvait
être
induite
par
le
monobenzoate
d'œstradiol
chez
des
mâles
d'Oncorhynchus nerka (Ho & Vanstone, 1961).
Par la suite de nombreux travaux ont confirmé le rôle important des
œstrogènes et principalement de l'œstradiol 17B (E2) sur la synthèse de la
VTG (Market & Vanstone, 1971 ; Takashima et al., 1972 ; Aida et al.,
1973a) et des expériences in vivo (Plack & Fraser, 1971 ; Aida et al.,
1973b ; Shackley & King, 1977) et récemment in vitro (Maitre et al.,
1985 ; Pakdel et al., 1991) ont montré que cette synthèse a lieu au niveau
hépatique. Certains androgènes peuvent aussi stimuler cette synthèse (Hori
et al., 1979 ; Le Menn, 1979 ; Le Menn et al., 1980). Aida et al., en 1973
ont montré que l'E2 avait un effet dose-dépendant de la synthèse de la
VTG qui, de plus, peut être amplifiée par des
injections répétées
(Sundararaj & Nath, 1981).
L'induction de la synthèse de la VTG peut donc être obtenue par
administration d'E2 pour fournir les quantités importantes nécessaires à
sa purification.
Nous avons transposé sur notre tilapia les diverses techniques mises
au point depuis une vingtaine d'années pour obtenir les outils biologiques
sp~cifiques permettant d'aborder l'étude de la reproduction femelle de ce
poisson.
Nous avons purifié par des techniques chromatographiques en basse
pression, et électrophorétiques, la vitellogénine contenue dans le sang des
femelles, après l'avoir induite expérimentalement en quantité importante
dans le sang par traitements œstrogéniques.

---

4
Nous avons obtenu un immunserum spécifique antivitellogénine chez
des lapins. Ceci nous a permis d'adapter pour le tilapia un ELISA
(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay) ou dosage immuno-enzymatique
de la vitel1ogénine.
Une cinétique de la teneur des plasmas sanguins en vitellogénine au
cours du cycle sexuel a alors été réalisée.
Ces données ont été corrélées à l'étude de la microscopie photonique
et électronique des différents stades de développement de l'ovaire.
Sur ces mêmes prélèvements plasmatiques, nous avons dosé par RIA
(Radio Immuno Assay) , autre technique immunologique, les principaux
stéroïdes sexuels intervenant dans
la reproduction : testostérone et
œstradiol.
Le mémoire de Thèse se présente sous la forme de cinq chapitres
précédés par une introduction et cloturés par une discussion générale.
Le premier chapitre présente l'espèce, Oreochromis niloticus.
Le second chapitre décrit les diverses techniques utilisées.
Le troisième chapitre est relatif à l'étude en microscopie photonique
et électronique du développement ovocytaire.
Dans
le quatrième chapitre
nous
présentons
les
résultats
de
purification de la vitellogénine, l'élaboration d'un anticorps spécifique et
la mise en place d'un ELISA de vitellogénine.
Dans le dernier chapitre nous présentons les dosages des principaux
stéroïdes sexuels intervenant au cours de la reproduction de la femelle et
corrélons leurs taux à ceux de la vitellogénine au cours d'un cycle sexuel.
.. La disussion générale fait le point des acquis sur cette espèce et trace
les grandes lignes des travaux futurs que nous souhaiterions pouvoir
continuer.

---

Oreochr omi s Tlil oticu s

---

5
Ch 1 •• Présentation de l'espèce
1.1 Les caractéristiques taxonomiques
1.1.1. Position systématique
Super-classe
Poissons
Classe
Ostéichthyens
Sous-classe
Actinoptérygiens
Super-ordre
Téléostéens
Ordre
Perciformes
Sous-ordre
Percoïdés
Famille
Cichlidae
Genre
Oreochromis
Espèce
O. niloticus
1.1.2. Caractéristiques taxonomiques
Oreochromis niloticus (L. , 1758) fait partie comme les autres
tilapias de la famille des Cichlidae, ordre des Perciformes.
Les espèces de cette famille se reconnaissent aisément par les
caractéristiques suivantes:
- tête portant une seule narine de chaque côté,
- absence de dents au plafond buccal,
- os operculaire non épineux,
- corps comprimé latéralement couvert essentiellement d'écailles
cycloïdes et parfois d'écailles cténoïdes,
- longue nageoire dorsale à partie antérieure épineuse,
- nageoire anale avec au moins les 3 premiers rayons épineux.
1.1.3. Evolution taxonomique
Le genre Tilapia, essentiellement africain, a d'abord été divisé en 3
sous-genres
sur la base de différences
morphologiques
:
Tilapia ,
Sarotherodon (Ruppel, 1852) et Neotilapia (Regan, 1920). Mais , depuis le
début de ce siècle, le nombre d'espèces de tilapias a fortement augmenté
avec la découverte d'espèces nouvelles, ce qui a conduit les systématiciens
Fig. 1.1. : Oreochromis niloticus

---

A
B
m
c
1
l
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/
\\:pl
9
Fig. 1.2.

---

6
à revoir régulièrement la taxonomie rassemblant actuellement plus de 90
espèces. C'est ainsi que Tilapia nilotica dont seule la femelle pratique
l'incubation buccale, s'est vu regroupé avec tous les tilapias
incubateurs
buccaux dans un premier sous-genre : Sarotherodon , qui a été élevé
ensuite, au même titre que Tilapia (incubateur sur substrat), au niveau
générique (Trewavas, 1973).
Ce nouveau genre s'est vu alors éclaté en 5 à 7 sous-genres parmi
lesquels Sarotherodon regroupait les tilapias incubateurs biparentaux ou
uniparentaux paternels et Oreochromis regroupait les tilapias incubateurs
buccaux uniparentaux maternels. Dernièrement, certains taxonomistes
s'accordaient à diviser la tribu des tilapünés en 4 genres en se basant non
seulement sur les caractères anatomiques, mais aussi,
originalité en
taxonomie, sur le comportement reproducteur et la nutrition ( Trewavas,
1982; Trewavas, 1983) •
- incubation des oeufs sur le substrat avec garde biparentale (couple)
macrophytophages : Tilapia
-
incubation
buccale
avec
garde
biparentale
ou
paternelle,
planctonophages : Sarotherodon
incubation
buccale
ou
garde
uniparentale
maternelle,
planctonophages : Oreochromis
Comme il s'agit d'un domaine qui évolue régulièrement et que les
points de vue divergent, nous utiliserons la dénomination actuelle la plus
universellement répandue: Oreochromis
niloticus.
Les principaux synonymes de cette espèce, que l'on peut trouver
dans la littérature récente sont :
· Tilapia nilotica
· Sarotherodon niloticus.
1.2. Les caractéristiques morphologiques
Généralement, sur le terrain :
· le pisciculteur reconnaît les adultes de cette espèce par une
coloration grisâtre, avec poitrine et flancs rosâtres et une alternance de
bandes verticales claires et noires nettement visibles notamment sur la
nageoire caudale et la partie postérieure de la nageoire dorsale.
Fig. 1.2. : Caractéristiques morphologiques spécifiques
d 'Oreochromis niloticus
A : O.n, adulte avec les barres noires verticales typiques sur la nageoire
caudale.
B : détail de la tête avec le premier arc branchial découvert. 18 et 4
branchiospines respectivement sur la partie inférieure et supérieure (d'après Pullin FAa :
1989)
,
C : papilles génitales chez le mâle et la femelle.

---

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1
1
Fig. 1.3.

---

7
. le sexe se distingue en examinant la papille génitale qui chez
le mâle est protubérante en forme de cône et porte un pore urogénital à
l'extrémité, alors que chez la femelle, elle est arrondie avec une fente
transversale au milieu (pore génital) et un pore urinaire à l'extrémité.
1.3. Ecologie
1.31. Répartition géographique
O. niloticus présente une répartition originelle strictement africaine
couvrant les bassins du Nil, du Tchad, du Niger, des Volta, du Sénégal
ainsi que les lacs sud-africains jusqu'au Lac Tanganika (Philippart et
Ruvet, 1982).
Cette espèce est largement répandue en Afrique hors de sa zone
d'origine pour compléter le peuplement des lacs naturels ou des barrages
récents ou pauvres en espèces planctonophages ainsi que pour développer
la pisciculture. Ainsi Kestémont et al. (1989) signalent son introduction au
Burundi et au Rwanda en 1951, à Madagascar en 1956, en République
Centrafricaine et en Côte d'Ivoire en 1957, au Cameroun en 1958, en
Tunisie en 1966, en Afrique du Sud en 1976 et à des dates inconnues au
Zaïre et en Tanzanie.
A cela on peut ajouter que cette espèce est également élevée, hors de
sa zone originelle dans de petits bassins versants, au Gabon, au Ghana, au
Kenya, au Nigéria.
Ces introductions ne sont pas limitées à l'Afrique puisqu'on trouve
cette espèce
dans les lacs, les fleuves et les piscicultures aussi bien
d'Amérique Centrale, d'Amérique du Sud, d'Amérique du
Nord et
d'Asie, ce qui lui vaut une distribution actuelle pan-tropicale
Enfin, cette espèce commence également à être cultivée dans les eaux
chaudes industrielles associées à des centrales thermiques en régions
tempérées. C'est le cas en Europe (Allemagne, 1977 et Belgique, 1980).
De nombreuses études de terrain et de laboratoire (Pullin & Lowe-
Mc Connel, 1982 ; Fishelson & Yaron, 1983) montrent que O. niloticus
est une espèce relativement eurièce et eurytope adaptée à de larges
variations des facteurs écologiques du milieu aquatique et colonisant des
milieux extrêmement variés.
Fig. 1.3. : Répartition géographique originelle et introduction
d 'Oreochromis niloticus en Afrique
(modifié d'après Philippart & Ruwet, 1982)
- : limite de l'aire de répartition de l'espèce naturelle
• : capture de spécimens identifiés formellement
Il : lieux d'introduction de l'espèce

---

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5
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Fig. 1.4.

---

8
1.3.2. Alimentation
Les juvéniles jusqu'à la taille d'environ 5 centimètres se nourrissent
de phytoplancton. Au delà de cette taille l'alimentation est plus variée
adaptée aux conditions d'habitat. Naguib (1954) cité par Kestémont et al.
(1989), a examiné des contenus stomacaux et intestinaux à différents
moments de l'année. Il a trouvé une quantité importante (50%) de plantes
dans la nourriture de ce poisson: algues brunes, algues vertes, diatomées,
macrophytes. Ces observations ont été confirmées notamment par Pullin
et Lowe-Mc Connel (1982, 1984). Cette espèce se nourrit également de
copépodes et d'une grande variété d'insectes et de larves d'insectes
aquatiques.
1.3.3. Croissance
La croissance la plus importante (38 cm) et la longévité la plus
longue (7 ans) enregistrées ont été observées dans le lac Albert (Ouganda,
Zaïre). Dans le fleuve Niger la longueur maximale des mâles est de 42 cm
et celle des femelles de 32,8 cm (Kestémont et al., 1989). Toutefois, le
plus grand spécimen aurait été capturé dans le lac Turkana (Ethiopie) et
mesurait 64 cm de longueur totale. Dans le lac Victoria (sources du Nil,
Afrique équatoriale) Kestémont et al.,
ont
trouvé
qu'Oreochromis
niloticus pouvait atteindre 16 cm la première année, 24 cm la deuxième
et 30 cm la troisième année.
Une autre caractéristique d'O. niloticus concerne son dimorphisme
sexuel
de
croissance.
Dès
que
les
individus
atteignent
l'âge
de
reproduction (1 à 3 ans selon le sexe et le milieu), les individus mâles
présentent une croissance nettement plus rapide que les femelles et
atteignent une taille nettement supérieure. Ainsi dans
le lac Itasy
(Madagascar), les mâles vivent plus vieux et atteignent une
taille
maximale de 38 cm soit environ 2000g alors que les femelles ne dépassent
pas 28 cm soit environ 950g (Pullin & Lowe-Mc Connel, 1982).
1.4 Biologie de la reproduction
1.4.1. Comportement reproducteur
O. niloticus fait partie des tilapias relativement évolués
les
incubateurs buccaux uniparentaux maternels.
Fig. 1.4. : Comparaison de la croissance d'Dreochromis niloticus
(d'après Moreau, 1979)
A : avec sexes groupés dans différents lacs africains
B : avec sexes séparés dans le lac ltasy
(P : poids, Lst : longueur standard)

---

9
Lorsque les conditions de milieu deviennent favorables, les adultes
migrent vers la zone littorale peu profonde et les mâles se rassemblent en
arêne de reproduction vers une zone en pente faible à substrat meuble,
sablonneux ou argileux où ils délimitent chacun leur petit territoire et
creusent un nid en forme d'assiette creuse. Les femelles vivent en groupe
à l'écart des arênes de reproduction où elles effectuent de brefs passages.
Après une parade nuptiale de synchronisation sexuelle, la femelle s'arrête
au-dessus d'un nid et dépose un lot d'ovules que le mâle féconde
immédiatement et que la femelle reprend en bouche pour les incuber.
Cette opération peut être recommencée au cycle reproducteur suivant
avec le même mâle (Ruwet et al., 1976). Après chaque reproduction, la
femelle quitte l'arêne et va incuber ses oeufs fécondés a proximité,
toujours dans la zone peu profonde.
L'éclosion des oeufs a lieu dans la bouche 4 à 5 jours après la
fécondation. Une fois leur vésicule vitelline resorbée (autour de la jours)
les alevins capables de nager sont encore gardés par la femelle pendant
plusieurs jours. Toutefois, ils restent à proximité de leur mère et au
moindre danger, se réfugient dans sa cavité buccale. A la taille de la mm,
les alevins, capables de rechercher leur nourriture quittent définitivement
leur mère et vivent en petits bancs dans les eaux littorales peu profondes.
L'existence d'un comportement parental est un facteur important de
l'efficacité de la reproduction des tilapias et vise à protéger les oeufs dès
leur fécondation. Chez les espèces dites à "incubation buccale" comme O.
niloticus , les oeufs sont incubés dans la cavité buccopharyngienne,
comportement souvent associé en milieu naturel à une migration du
géniteur dans une zone riche en végétation aquatique et protégée.
Des soins parentaux persistent même après l'éclosion, au moins
jusqu'à la résorption de la vésicule. Baroiller et Jalabert (1989) ont
démontré la rythmicité du comportement sexuel des tilapias. Cependant,
de nombreux facteurs externes, comme la température et les facteurs
sociaux tels que les stimuli visuels ou olfactifs (phéromones) (Silvermann,
1978 a et b), sont susceptibles de faire varier cette rythmicité.
Trois stimuli sociaux sont généralement mis en cause.
-les
stimuli
sonores
provenant
des
mâles
suffisent
à
augmenter la fréquence d'oviposition des femelles d'O. mossambicus
isolées des autres stimuli.
-les stimuli visuels affectent aussi l'ovulation des femelles
matures.
-la femelle mature pourrait émettre une substance de type
phéromonal, activant le comportement de la cour du mâle, déjà stimulé
visuellement.
En
effet,
l'activité
de
cour
d'un
mâle
augmente
significativement avec l'approche du moment de la reproduction d'une ou
plusieurs femelles matures présentes dans un même aquarium.

---

1 0
Chez les Cichlidae, une étude ancienne sur Hemichromis bimaculatus
(Noble et al., 1938) a mis en évidence des effets de la prolactine sur
l'initiation du comportement parental. Néanmoins, des travaux réalisés
chez O. mossambicus ne semblent pas confirmer l'implication de la
prolactine dans la régulation des soins parentaux (Weendelear Bonga et
al., 1984).
1.4.2. Stratégies de reproduction
Dans les milieux naturels, la taille de prermere maturité de O.
niloticus varie généralement entre 14 et 20 cm (à peu près 2 ans) et peut
différer chez les mâles et les femelles. Selon Pullin et Lowe-Mc Connel
(1982), les facteurs qui influent sur la taille au moment de la première
reproduction sont:
- les dimensions réduites du milieu (confinement)
- le déficit alimentaire
- la pêche trop intensive.
On constate, en effet que les populations d'O. niloticus, qui vivent en
milieu lacustre stable, présentent une stratégie démographique de type K :
faible
fécondité
par
ponte,
maturité
tardive,
forte
compétition
intraspécifique et croissance rapide. Lorsque le milieu devient instable et
qu'il présente des variations fréquentes ces poissons adoptent une stratégie
de type r : fécondité élevée, maturité précoce, croissance lente. Ce
problème connu sous le terme de nanisme, est plutôt un phénomène de
néoténie (Fryer & Iles, 1972 ; Noakes & Balon, 1982) car il s'agit d'une
réponse adaptative aux fluctuations environnementales, par accélération
de l'ontogenèse.
C'est pourquoi en conditions optimales dans les lacs, O. niloticus
commence à se reproduire en général vers l'âge de 2 à 3 ans alors qu'en
conditions difficiles de pisciculture rurale mal conduite, il peut déjà se
reproduire vers l'âge de 3 mois .
La période de
reproduction
d'O.
niloticus est potentiellement
continue pendant toute l'année, si la température de l'eau est supérieure à
22°C. Toutefois, on constate des pics d'activité reproductrice induits par:
- une augmentation de la photopériode et de l'intensité
lumineuse
- une augmentation de la température de l'eau
- une augmentation du niveau de l'eau.
La fréquence des pontes varie également en fonction des conditions
environnementales. En conditions optimales et à température de 25 à
28°C, une femelle peut se reproduire tous les 30 à 40 jours (Ruwet et al.,
1976).
Toutes
ces
caractéristiques
de
reproduction
d'O.
niloticus
démontrent non seulement la plasticité de l'espèce à s'adapter à des
conditions diverses mais expliquent aussi sa haute résistance, à savoir sa/

---

1 1
rapidement après perturbation à un seuil optimum de densité dans son
milieu naturel (Kestémont et al., 1989).
1.4.3. Cycle reproducteur
mâle:
A partir du moment où le mâle a réalisé dans le milieu naturel sa
première spermiogénèse vers l'âge de 2 ans, des spermatozoïdes sont
présents en permanence dans la lumière centrale de chaque testicule.
femelle:
Les phénomènes de reproduction revêtent généralement un caractère
saisonnier et le cycle reproducteur correspond à une adaptation aux
variations de l'environnement.
D'après
le développement ovocytaire,
les
poissons Téléostéens
peuvent être classés en 3 types (Nagahama, 1983) :
-
les
poissons
à
développement
totalement
synchrone,
contenant dans
les ovaires des
ovocytes tous
au
même stade
de
développement. Les femelles ne pondent qu'une seule fois dans leur vie,
puis meurent.
- les
espèces à développement synchrone par groupes,
possédant un ovaire constitué par plusieurs populations d'ovocytes. Ces
espèces ne pondent qu'une seule fois par an pendant une saison très
courte.
- les espèces à développement asynchrone, dont la ponte a lieu
plusieurs fois par an pendant une période assez longue.
Oreochronis niloticus se rapproche du troisième cas. Il présente un
ovaire constitué par plusieurs populations d'ovocytes.
Les femelles
participent activement à la reproduction pendant toute l'année sauf durant
la courte période de fraîcheur (de mi-décembre à mi-février) comme
nous avons pu l'observer au Sénégal dans les étangs piscicoles de Nianga.
La ponte est fractionnée et elle est immédiatement suivie de la
fécondation. Les ovules sont ovoïdes et n'ont pas de substance collante
comme les tilapias qui pondent sur substrat.
La
taille,
le
poids
et
le
nombre
d'oeufs
émis
augmentent
généralement avec la taille des femelles. Mais à poids égal, le nombre
d'ovules constituant une ponte peut varier de façon importante. En effet,
la fécondité absolue d'O. niloticus (nombre d'ovules pondus en une fois)
est très variable puisqu'elle fluctue fortement comme le montre Moreau
(1979) en fonction :
- du poids dans un même lac (1200 ovules/femelle de 100g à 3800
ovules/femelle de 700g)
- et de l'endroit:
. dans le lac Itasy, 650 ovules/femelle de 200g
. dans le lac Mantosoa, 1800 ovules/femelle de 200g.
Babiker et Ibrahim (1979) ont trouvé que la fécondité d'O. niloticus
varie en fonction de la taille: chez les jeunes poissons en reproduction

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1 2
Babiker et Ibrahim (1979) ont trouvé que la fécondité d'O. niloticus
varie en fonction de la taille : chez les jeunes poissons en reproduction
(entre Il et 12,9 cm), elle est comprise entre 300 et 500 ovocytes/poisson
et croît avec la taille pour atteindre 2800 ovocytes/poisson chez les
individus de 29-32 cm, puis décroît avec la taille pour atteindre 800-2100
ovocytes/femelle chez O. niloticus de taille supérieure à 55 cm. Le
diamètre des ovocytes est compris entre 1100mm-2200mm, il varie selon
l'état de l'évolution sexuelle.
1.5. L'aquaculture du tilapia
L'absence relative de synchronisme dans les cycles reproducteurs de
géniteurs femelles d'une même population se traduit par une production
continue d'alevins. Ceci peut conduire en milieu confiné à une rapide
surpopulation avec une tendance au nanisme. Seul le suivi strict de la
reproduction permet d'améliorer et de rentabiliser les élevages.
Les
techniques
généralement
envisagées
pour
contrôler
la
reproduction des poissons cherchent à moduler l'activité de la gonade
(stimulation,
inhibition
temporaire
ou
définitive)
ou
à
l'orienter
préférentiellement vers le sexe qui possède les meilleures potentialités
aquacoles. C'est pourquoi le contrôle artificiel de la reproduction est très
important pour la réussite de l'élevage.
Selon les besoins, un tel contrôle peut consister soit à empêcher
complètement la reproduction dans une population pour améliorer la
croissance, soit à favoriser la reproduction massive pour la mise en
élevage de populations homogènes.
Actuellement, les techniques les plus intensives sont fondées sur
l'élevage séparé des mâles, dont le potentiel de croissance est plus
important, soit par un tri
manuel,
soit après
traitement hormonal
conduisant à une
population monosexe
mâle.
De
nouvelles
voies
d'obtention de telles descendances monosexes mâles
sont proposées,
fondées sur la viabilité et la fertilité d'un génotype nouveau YY
(Baroiller & Jalabert, 1989). Des travaux récents sur la différenciation du
sexe de la gonade de tilapia permettent de suggérer l'utilisation éventuelle
de stéroïdes identifiés in vitro pendant le développement testiculaire
précoce, et présentant de fortes potentialités masculinisantes, ainsi que
l'essai
d'inhibiteurs
spécifiques
de
certaines
activités
enzymatiques
conduisant à leur synthèse (Baroiller & Jalabert, 1989).
1.5.1. Production du tilapia
Les quantités totales de tilapias d'aquaculture produites actuellement
sont mal connues pour la simple raison que la distinction entre les tilapias

---

1 3
provenant de l'aquaculture et ceux résultant de l'activité de pêche n'est,
dans la plupart des pays tropicaux, pas faite (ou trè imprécise).
C'est ainsi que les évaluations de production de tilapias provenant de
l'aquaculture tournent autour de 250 ()()() tonnes (Pullin, 1991) et cette
production pourrait atteindre 500 ()()() tonnes à l'horizon 2000 selon le
même auteur. Cependant, selon Lazard (1990) les statistiques de la FAO
(1989) annoncent pour l'année 1986 une production de l'ordre de 280000
tonnes dont 39 ()()() tonnes pour l'Afrique, continent d'origine des tilapias.
L'Asie est actuellement le premier producteur de tilapias avec
220000 tonnes (Lazard, 1990).
1.5.2. Aquaculture du tilapia en Afrique
La vision du Professeur Honoraire Daget du Muséum National
d'Histoire
Naturelle,
sur
la
situation
de
l'aquaculture
en
Afrique
correspond à notre point de vue. "La pisciculture est-elle une nécessité
pour l'Afrique ? Oui, pour répondre aux goûts et à la demande de
nombreuses couches sociales. Oui, pour satisfaire les besoins en protéines
animales d'une population en accroissement rapide. Oui enfin, pour
suppléer la production de la pêche maritime qui stagne et celle des pêches
continentales qui régressent", cité par Lazard (1990).
Cependant, la pisciculture est pratiquée depuis des siècles en Asie, en
Europe et au
Moyen-Orient,
alors
qu'elle
était encore
totalement
inconnue sur le continent Africain il y a cinquante ans.
Aujourd'hui, l'aquaculture africaine cherche sa voie dans le cadre
des programmes de recherche-développement dont la perennité pourrait
être difficilement assurée par les structures mises en place. L'Afrique
améliorera sa part dans la production mondiale aquacole que si nous
arnvons:
- à apporter les
éléments prioritaires au niveau socio-
économique, scientifique et technique, avant le lancement d'une opération
de développement de l'aquaculture
- à intégrer l'aquaculture dans les systèmes de développement
existants et à impliquer les pisciculteurs dans cette activité nouvelle. Par
ailleurs, l'administration des Eaux et Forêts et de la Pêche maritime qui a
en charge dans la presque totalité des pays d'Afrique francophone le
secteur de l'aquaculture, ne peut pas réellement promouvoir cette activité
nouvelle.
Quoi qu'il en soit, l'évolution de la production halieutique maritime
et continentale est telle que l'avenir du développement de l'aquaculture
sur le continent africain est obligatoire.

---

1 4
CH : 2 - Matériel et méthodes
1
1
2.1. Les poissons
Les tilapias, Oreochromis niloticus, utilisés dans ce travail ont une
double origine.
Ils proviennent originellement tous de la station de pisciculture de
Nianga
dans
le
département
de
Podor
(Sénégal)
qui
relève
administrativement de la SAED.
Les poissons y sont élevés dans des étangs en terre, dont la superficie
varie de 3 à 23 ares, alimentés toute l'année à partir d'un canal
d'irrigation provenant du fleuve Sénégal. Les poissons préalablement
sexés sont répartis à raison d'environ un mâle pour trois femelles (70
mâles pour 210 femelles dans 4 ares). Les poissons sont nourris deux fois
par jour sauf pendant la période froide, de décembre à février, pendant
laquelle ils ne
reçoivent
qu'une
ration journalière.
Chaque
ration
correspond à 2,5% de la charge de chaque bassin (5 g/poisson de 200 g).
L'aliment est constitué par un mélange de son de riz (60%), de tourteau
d'arachide (20%) et de farine de poisson (20%). En outre des prédateurs
sont ajoutés pour maintenir l'équilibre de la population, à savoir 20 Lates
niloticus (d'un poids moyen de 2 kg) ou 40 Clarias gariepinus (d'un poids
moyen d'l kg) pour 4 ares.
Pour certains tilapias, des échantillons ont été prélevés sur place et
ramenés au laboratoire de Dakar dans un mélange glace-sel de mer (à
-12°C) et congelés à -20°C.
D'autres tilapias ont été ramenés vivants au laboratoire de Dakar,
transportés dans
un
bac
adapté,
dans
leur
eau d'origine dont la
température était abaissée à environ 15°C, sous une aération constante
d'oxygène. Au nombre total de 212 ils sont surtout constitués de femelles
assez homogènes, d'un poids moyen de loog et d'une taille moyenne de
18,14 cm.
Après un transport nocturne de 6 heures, les poissons sont sexés,
séparés et placés dans des bacs en polyéthylène de 250 litres recouverts de
grillage pour les empêcher de sauter, à raison de 12 poissons d'environ
100 g par bac . L'eau de transport est ajoutée à un même volume d'eau de
ville préparée, déchlorée et aérée en permanence pendant deux jours. Ce
traitement pennet de stabiliser la température (24-26°C), l'oxygénation et
le pH. Après 48 heures, l'eau ainsi vieillie est débarassée de la majeure
partie du chlore initial et son pH est stabilisé à 7,5.

---

1 5
24 heures après leur arrivée, les poissons sont nourris une fois par
jour ad libitum avec des aliments pour chat (croquettes Friskies enrichies
en calcium et sels minéraux) .
Pour éviter l'accumulation des produits toxiques en particulier les
nitrites, l'eau est filtrée (pompe Rena). Elle est également partiellement
renouvelée tous les deux jours (1/3 du volume environ) . Son aération
permanente assure des teneurs en oxygène supérieures à 7 mg.I- 1. Chaque
jour les paramètres physico-chimiques de l'eau sont mesurés avec un kit
pour vérifier les conditions d'élevage.
2.2. Prélèvements sur animaux vivants
2.2.1. Prélèvement du sang
Le sang recueilli à la seringue dans la veine de la ligne latérale, par
ponction entre la nageoire anale et la nageoire caudale, est déposé dans
des tubes de 5 ml préalablement héparinés. Après une centrifugation à
3000 g pendant 5
minutes,
le plasma
surnageant est
recueilli
et
immédiatement bocalisé dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml, étiquetés et
congelés, puis stockés à -20°C.
2.2.2. Prélèvement des gonades
Nous avons réalisé des prélèvements d'ovaire sur des Oreochromis
niloticus
matures et immatures à des intervalles réguliers (1 fois par
mois).
Les ovaires sont prélevés à l'aide de pinces à dissection, pesés, puis
des fragments sont fixés immédiatement au Bouin-Hollande, pour la
microscopie photonique
ou
au
glutaraldéhyde
pour
la
microscopie
électronique. Des ovaires ont été également fixés au Gil son pour étudier la
répartition des ovocytes par classes de taille.
2.2.3. Prélèvement du foie
Le foie est prélevé en même temps que les gonades sur des poissons
mâles et femelles, matures et immatures à des intervalles réguliers (une
fois par mois). Il est pesé comme les gonades à l'aide d'une balance
électronique,
enveloppé
dans
un
papier
aluminium,
étiqueté
et
immédiatement conservé au congélateur à -20°C.

---

.Alcools à ob/mir
9 ~ 0
9°°
800
7 0. 1Goo
~ot
4011
3°°
2011
la'
- -
- - -
-
- -
-
-
- - - - - - - - - -
Nom~re de \\ d'alcool à 1000
G
13
28
4 8
73
1°7
q8
242
408
907
ml
d eau
à . d'alcool à
9 ~ °
-
G
1. 1
39
63
96
144
224
382
S~~
ajouter à 100 { d'alcool à
900
-
-
.
14
31
~4
85
13 1
20G
3~6 S04
ml
Fig. 2.1.

---

1 6
2.3. Préparations microscopiques
Immédiatement aprés le sacrifice de la femelle , la cavité abdominale est
ouverte et un ovaire est fixé en parallèle pour la microscopie photonique et la
microscopie électronique.
2.3.1. Microscopie photonique
2.3.1.1.
Fixation
Les techniques utilisées en microscopie photonique sont décrites par
Martoja et Martoja -Pierson (1967) et par Gabe (1968).
Pour les gonades nous avons choisi le liquide de Bouin Hollande et
une fixation de 72 heures.
2.3.1.2. Déshydration et inclusion classique
Les pièces sont déshydratées dans une série graduée d'éthanol allant
de 70 à 95% puis transportées dans du butanol.
Elles sont alors placées à l'étuve à 60° C dans un mélange butanol-
paraffine (1: 1) suivi par trois bains de paraffine pure.
Les inclusions sont réalisées à l'aide de barres de Leukart.
2.3.1.3.
Coupes
Les coupes classiques de 7 urn d'épaisseur sont faites au microtome.
De sérieuses difficultés ayant été rencontrées pour la confection des
coupes d'ovocytes riches en vitellus, nous avons utilisé le procédé de
Baker (1941) cité par Martoja-Pierson (1967). L'auteur propose de traiter
les blocs entamés, non à l'eau comme dans le procédé classique, mais par
le mélange suivant:
- alcool éthylique à 60 %:
9 volumes
- glycérine
1 volume
Nous avons laissé les blocs entamés séjourner dans cette solution
pendant 48 h, avant de réaliser les coupes.
Les coupes semi-fines sont réalisées à partir de blocs d'Epon pour la
microcopie électronique, à l'ultramicrotome "Ultra eut E" , avec une
épaisseur de 0,95 nm et sont déposées sur lames de verre .
2.3.1.4.
Coloration
a) Coupes classiques
Préparation des coupes.
Les coupes, imprégrées de paraffine, doivent être déparaffinées et
réhydratées, la coloration se faisant en milieu aqueux.
Fig. 2.1. : tableau simplifié de la dilution des alcools
(d'après Gabe, 1968)

---

1 7
Les lames d'histologie sont placées dans deux bains successifs de
toluène
puis
réhydratées
progressivement
par
des
bains
d'alcool
d'hygrométrie croissante, jusqu'à un dernier bain d'eau distillée.
Coloration.
Plusieurs colorants et réactifs ont été utilisés pour cerner et identifier
les différents éléments des ovocytes.
Les techniques sont largement décrites par Martoja et Martoja-
Pierson (1967)
et Gabe (1968).
Elles
ne
sont donc
reprises
que
partiellement dans ce travail (Fig. 2.1.).
Il s'agit des:
a) trichrome de Masson variante de Goldner
b) hématoxyline de Groat., Eosine vert lumière
c) hématoxyline laque cuprique
d) azan de Heidenhain
e) PAS (Period Acid-Schiff).
b) Coupes semi-fines
Le
colorations
se
pratiquent directement sur les
coupes
sans
traitement préalable.
La coloration au bleu de toluidine classiquement utilisée pour ces
coupes est préparée comme suit:
solution A :
1 g de bleu de toluidine dans 100 ml d'eau
distillée
solution B :
1 g de bleu de méthylène + 1 g de borax
dans 100 ml d'eau distillée.
solution finale : 112 A + 112 B = filtrés
La coloration de Parry a aussi été employée. Cette technique se
pratique en chauffant le colorant (bleu de méthylène à 1% - Azur 2 à 1%,
111) pour qu'il puisse se fixer sur le tissu à étudier.
2.3.2. Microscopie électronique à transmission
2.3.2.1. Fixation et inclusion
a) Immersion directe de petites pièces
(au Sénégal)
Une lamelle ovarienne est prélevée sur le poisson juste après le
sacrifice et elle est placée dans le fixateur préparé extemporanément et
préalablement dégazé. Elle est découpée sous
loupe binoculaire, en
immersion, en tout petits cubes d'environ 1 millimètre de côté.
Les pièces sont fixées pendant toute la nuit à température ambiante
(25°C) et sous vide dans du paraformaldéhyde à 2 % et du glutaraldéhyde
(25% ) à 3% dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M contenant du
chlorure de calcium 8 mM, le pH étant équilibré à 7,2 (Fig.2.2).
Le lendemain matin, elles sont rincées trois fois pendant une demi-
heure avec du tampon cacodylate de sodium 0,1 M, puis post-fixées à
l'osmium à 1% pendant une heure.

---

Fixateur pour MET
avec contastage
liquide vecteur :
cacodylate de Na
100 mM
CaCl2
8,33 mM
tampon:
Concentration finale
glutaraldéhyde 25 %
6,0 ml
3%
parafonna1dehyde 8 %
12,5 ml
2%
liquide vecteur
31,5 ml
pH 7,4 et pression osmotique: 320 rrrOs
Fixateur pour MET et immunocytochimie
liquide vecteur :
cacodylate de Na
100 mM
CaCl2
8,33 mM
tampon
:
concentration finale
glutaraldehyde 25%
0,1 ml
0,1 %
parafonnaldehyde 8%
12,5 ml
4%
liquide vecteur
12,5 ml
pH 7,4 et pression osmotique: 320 mÛs
Post-fixateur osmique:
tampon:
concentration finale
osrruum
1%
cacodylate de sodium
0 ,1 M
ferricyanure de potassium
1,5%
pH 7 ,0 et pression osmotique: 655 mÛs
Fig. 2.2.

---

1 8
Après rinçage, elles sont déshydratées dans des bains successifs
d'éthanol (30%, 50%, 70%, 95%, 100%), puis imprégnées dans trois
bains de mélange oxyde de propylène-épon (113 - 2/3 ; 112 - 112 ; 2/3 -
1/3). Les pièces séjournent ensuite dans la résine pure pendant toute une
nuit.
L'inclusion a eu lieu le lendemain matin et les échantillons sont
polymérisés à l'étuve pendant 24 h à 60 oc.
b) Perfusion d'ovaire
(en France)
Les poissons sont sacrifiés par section bulbaire et rapidement incisés
selon une ligne médioventrale. Un ovaire est dégagé et l'artère ovarienne
cathétérisée en direction de la gonade alors que le coeur continue à battre.
L'extrémité de la gonade est coupée de façon à éviter une surpression du
fixateur dans l'organe.
Le fixateur de perfusion préparé extemporanément et dégazé, est
alors introduit. La progression du liquide est assurée par une pompe
péristaltique dont le flux est réglé à 700 microlitres à la minute. La
perfusion est poursuivie pendant une demi-heure. Puis la partie la plus
durcie de la gonade est découpée en tout petits cubes placés en immersion
dans du fixateur neuf pendant 1 heure, puis rincés dans le tampon
véhicule.
Les pièces destinées à une révélation immunocytochimiques ne sont
pas postfixées à l'osmium. Les autres sont traitées comme précédemment.
c) Fixateurs utilisés
(Fig. 2.2.)
Suivant l'utilisation ultérieure de la pièce nous avons employé deux
types de fixateurs :
pour microscopie électronique à transmission avec contrastage :
Nous avons utilisé un mélange de glutaraldéhyde du commerce à 3%
et de paraformaldéhyde à 2% dans du tampon cacodylate de sodium à
molarité finale de 0,1 M, contenant 8 mM de chlorure de calcium.
La pression osmotique de ce liquide fixateur est de 320 mOsmoles alors
que celle du plasma sanguin d' Oreochromis niloticus
est de 290 - 300
mOsmoles.
Après fixation, les blocs sont post-fixés à l'osmium à 1% dans le
même tampon contenant 1,5% de ferricyanure de potassium.
pour l'immunocytochimie ultrastructurale :
Nous avons utilisé du paraformaldéhyde à 4% contenant des traces de
glutaraldéhyde à 0,1 % dans le même tampon que prédédemment.
Pour cette utilisation la postfixation osmique est exclue.
2.3.2.2.
Coupes ultrafines
Ces coupes sont effectuées à l'Ultracut E à une épaisseur de 0,75 nm,
recueillies sur eau et déposées sur des grilles en nickel.
Fig. 2.2.
préparation des fixateurs pour la microscopie électronique

---

1 9
2.3.2.3.
Contrastage
Elles ont ensuite été contrastées à l'acétate d'uranyle en solution dans
l'alcool à 50% et au citrate de plomb.
2.3.2.4.
Observations
Elles ont
été
effectuées avec
les
microscopes électroniques à
transmission SIEMENS-ELMISKOP 101 et JEOL 100 CXII.
2.3.3. Microscopie électronique à balayage
2.3.3.1. Fixation
des
œufs fécondés
Au laboratoire, il nous a été impossible d'observer les pontes pendant
le jour. Elles ont toujours eu lieu la nuit, ce qui fait que l'heure exacte de
la ponte n'a pas pu être précisée.
C'est pourquoi, dès que les femelles arrivent à maturité sexuelle,
elles sont isolées dans un autre bac à raison de trois femelles pour un
mâle. Elles sont surveillées quotidiennement ce qui permet de récupérer
dès le lendemain matin à la première heure les ovocytes fécondés pendant
la nuit. En effet, elles incubent ces oeufs et les libèrent de la cavité
buccopharyngienne au moindre stress.
Les œufs fraîchement récupérés de la cavité buccopharyngienne sont
fixés pendant 24 heures.
2.3.3.2.
Déshydratation
Après trois séries de lavage de 30 min dans le tampon phosphate, les
échantillons sont deshydratés dans un gradient de solution d'acétone:
acétone 70%
2 fois pendant 30 min
acétone 90%
2 fois pendant 30 min
acétone 90%
2 fois pendant 1 h.
Puis, on les laisse séjourner dans l'acétone pendant une nuit.
2.3.3.3. Point critique
Ils sont ensuite desséchés selon la méthode du point critique du C02
dans un appareil "Samdu 790".
2.3.3.4.
Observations
Les
observations ont
été
effectuées à
Dakar
en
utilisant
un
microscope à balayage JEOL J.S.M. 35C.F.

---

PC-AT
carte dl: uiuuctisulion
- --~- - -
- - -
-
Ecran d'acqllÎ:;ilillll
lI11agt:
J1lI pri mu nte
Ecran dt: controle
llilagt:
Fig. 2.3.

---

20
2.3.4. Microscopie pour analyse d'images
2.3.4.1.
Fixation
Le fixateur de Gilson est composé de :
100 ml alcool à 60%
880 ml H20
15 ml acide nitrique à 68 % (Prolabo 20406)
15 ml acide acétique (Pro labo 20104)
20 g chlorure de mercure (Merck 1447).
Les ovaires fixés dans le Gilson sont agités quotidiennement afin
d'assurer une bonne pénétration du fixateur et la dissociation de l'ovaire.
Au bout de 8 jours, ils sont lavés dans deux volumes de NaCI à 0,9 %.
Les follicules restant accrochés à la paroi de l'ovaire sont enlevés
manuellement. Le plus grand diamètre des follicules est mesuré sous
loupe binoculaire avec micromètre.
2.3.4.2. Observations et analyses
Un sous-échantillonnage est réalisé à l'aide d'une cuve de Motoda
pour mesurer et dénombrer les ovocytes à l'analyseur d'images.
La technique d'analyse d'images (Bon, communication personnelle)
consiste à enregistrer les images des ovocytes en lumière réfléchie avec
une caméra vidéo-informatique. Les paramètres nécessaires à l'obtention
de la mesure réelle de l'ovocyte sont:
- le grandissement, c'est à dire le rapport entre la taille des
ovocytes filmés et celle percue sur l'écran d'acquisition d'images,
- le nombre de pixels, c'est à dire le nombre de points images
adressables à l'écran qui correspondent à la plus petite taille d'ovocyte
prise en compte,
- le coefficient de rétraction des ovocytes ayant longuement
séjourné dans le Gilson. Il est de 0,82 (Tacon, 1995).
Le montage de l'appareillage utilisé est représenté ci-contre (Fig.
2.3.)
Fig. 2.3.
schéma de l'analyseur d'images
(d'après Bon, 1992)

---

solution injectable de bE2 :
150 mg de bE2
1,5 ml d'alcool benzylique
28,5 ml de tampon gélatiné
Cette solution finale injectable est mise sous agitation pour bien
dissoudre le stéroide avant toute injection.
tampon gélatiné :
10 ml de tampon phosphate 20 mM à pH 7
100 mg de gélatine en poudre à dissoudre à 40°C
584 mg de NaCI
Ce tampon gélatiné est ajusté à 100 ml avec de l'eau distillée.
tampon phosphate 20 mM à pH 7 :
solution A : NaH2P04 2H20 (Prolabo) (3,1 g/l = 20 mM)
solution B : Na2 HP04 12H20 (Prolabo) (7,2 g/l = 20 mM)
Pour obtenir un pH de 7, 39 ml de la solution A ont été mélangés à
61 ml de la solution B.
Fig. 2.4.

---

2 1
2.4. Œstrogénisation
2.4.1. Solutions d'œstrogénisation
Nous préparons une solution de benzoate d'œstradiol (bE2) pré-
dissous dans 5% d'alcool benzylique, à une concentration finale de 0,5%
dans du tampon phosphate gélatiné (Fig. 2.4.).
2.4.2. Protocole d 'œstrogénisation
Les poissons ramenés de la station piscicole de Nianga sont d'abord
acclimatés à leur nouveau milieu, dans le laboratoire de Dakar, pendant
quinze jours au moins avant que ne commence l'induction.
Un prélèvement de plasma sur chaque mâle avant la première
injection sert de témoin.
Les femelles reçoivent la solution œstrogénique tous les deux jours et
pendant 20 jours, par injection dans la cavité générale et à travers la
couche musculaire latérale, à raison de 0, I mUIOOg de poisson.
A la fin du traitement, le sang hépariné est prélevé comme décrit
précédemment et le plasma aliquoté est congelé à -20°C.
Il est
ensuite transporté dans
une
glacière
remplie de glace
carbonique jusqu'à Bordeaux. La purification de la VTG a lieu au
Laboratoire de Biologie de la Reproduction des Poissons à l'Université
Bordeaux 1 (France).
2.5. Techniques électrophorétiques
2.5.1. Electrophorèses en milieu non-dissociant (natif)
2.5.1.1.
Principe
Cette méthode permet de séparer les protéines en fonction de leur
différence de mobilité dans un champ électrique à un pH déterminé. Les
protéines migrent en fonction de leur charge nette et de leur taille dans le
tampon de migration à l'intérieur d'un support constitué par un gel de
polyacrylamide. Ce gel est obtenu par polymérisation d'un monomère
principal, l'acrylamide et d'un monomère de liaison, la N- N' éthylène-
bis-acrylamide. La gélification se fait à l'abri de l'air en présence d'un
catalyseur et d'un oxydant.
La technique que nous avons adoptée utilise deux gels différents, gel
supérieur ou gel de concentration à larges pores et un gel inférieur ou gel
" de séparation à pores choisis par l'expérimentateur.
La
taille
des
Fig. 2.4.
protocole de préparation du benzoate d'œstradiol pour
œstrogénisation.

---

acrylamide 1 bisacrylamide 30% (Bio-Rad)
acrylamide
29,2%
14,6 g
N'-N'-bis-méthylène-acrylamide
0,8%
0,4 g
eau distillée
q.s.p.
50 ml
tris HCI
1,5 M
pH 8,8
tris-base (Sigma)
18,15 g
eau distillée
80 ml
Le pH est ajusté à l'aide d'acide chlorhydrique, puis
eau distillée
q.s.p.
100 ml
tris HCI
0,5 M
pH 6,8
tris-base (Sigma)
6g
eau distillée
60 ml
Le pH est ajusté avec de l'acide chlorhydrique fumant
eau distillée q.s.p.
100 ml
ammonium persulfate (péroxodisulfate) APS
(NH4)2 S208
APS
100 mg
eau distillée
1 ml
TEMED : N-N-N'-N'-Tétraméthyléthylènediamine (Bio-Rad)
La solution est achetée et se conserve à 4°C plusieurs mois .
Mélange pour un PAGE
Gel de séparation :
eau distillée
2,425 ml
tris HCI 1,5 M, pH 8,8
1,25 ml
acrylamidefbisacrylamide 30%
1,25 ml
Cette solution est dégazée pendant au minimum 5 minutes. Puis sont
ajoutés toujours dans l'ordre :
· 25 III d'A.P.S.
· et 10 III de TEMED.
Gel de concentration :
eau distillée
3,1 ml
tris HCI 0,5 M, pH 6,8
1,25 ml
acrylamidefbisacrylamide 30%
700 pl
Cette solution est dégazée pendant au minimum 5 minutes. Puis sont
ajoutés toujours dans l'ordre:
· 30 III d'A.P.S.
· et 10 III de TEMED.
Fig. 2.5

---

22
pores
du
gel
est
inversement
proportionnelle
à
la
quantité
de
bisacrylamide présente.
La polymérisation des gels se fait avec le système persulfate
d'ammoniumffemed dont l'action catalysante se manifeste à la lumière
solaire et à une température de l'ordre de 20°C.
Pour un gel à pores définis, la migration des protéines dépend, outre
de leur charge électrique, de leur structure quaternaire.
2.5.1.2. . Caractéristiques de la migration
La migration
électrophorétique
en
gel
de
polyacrylamide des
fractions de protéines plasmatiques dépend essentiellement de 3 facteurs :
- la vitesse électrophorétique : pour une
différence de
potentiel donnée, les fractions protéiques tendent à se déplacer vers
l'anode avec une vitesse d'autant plus grande que le pH de la solution est
plus alcalin par rapport à leur point isoélectrique.
- le flux d'électro-endosrnose : il se manifeste par un contre
courant liquide qui tend à entraîner les protéines en sens inverse de
l'entraînement électrophorétique, Il représente une force électrocinétique
qui découle de la répartition des charges négatives sur la totalité du
support. Sa vitesse est constante pour une solution tampon donnée et ce
flux est très réduit, voire nul dans les gels .
- l'effet de filtration : il provoque un retard d'autant plus
important que les molécules sont volumineuses et que le diamètre des
pores est restreint.
Dans la technique choisie, les pH du gel de séparation et celui du gel
de concentration sont différents (séparation: 8,8, concentration: 6,8).
2.5.1.3.
Appareillage
Dans le cadre de nos travaux, nous avons utilisé:
- un générateur : "Electrophoresis constant power" ECPS
3000/150 (Pharmacia)
- et une cuve verticale: "Mini-Protean II System" (Bio-Rad).
2.5.1.4. Les solutions utilisées
Différentes solutions sont préparées, stockées au réfrigérateur et les
dates limites de conservation bien respectées.
a) Pour confectionner les gels :
solution stock de bisacrylamide
Cette solution (Fig. 2.5.) est
filtrée avec une seringue de 20 ml
munie d'un porte-filtre de type Swinnex (Millipore) et de filtres en
microfibres de verre (Watman GF/C). Elle est conservée à 4°C et à
l'obscurité (entourée d'un papier aluminium) pour une durée limitée à 30
Jours.
Fig. 2.5.
solutions stocks pour gels de polyacrylamide

---

tampon d'échantillon
tris HCI 0,5 M (pH: 6,8)
0,5 ml
glycérol
0,4 ml
Bleu de bromophénol
2,5 mg
eau distillée q.s.p.
4 ml
tampon de migration
tris-base
,
15 g
glycine
72 g
eau distillée qsp.
1000 ml
colorant
Bleu de Coomassie (brillant R250) (Merck)
19
méthanol
400 ml
acide acétique
100 ml
eau distillée
500 ml
décolorant
méthanol
400 ml
acide acétique
100 ml
eau distillée
500 ml
Fig. 2.6.

---

23
solutions stocks de tampon tris
Deux solutions tris l'une de 1,5 M à pH 8,8 et l'autre de 0,5 M à pH
6,8 sont conservées à 4°C pour une durée maximale de deux mois.
les catalyseurs
L'ammonium persulfate (APS) et le Temed (N-N-N'-N'tétraméthyl-
éthylènediamine) se préparent extemporanément.
b) Pour
préparer les échantillons avant leur
dépôt:
tampon d'échantillon
(Fig. 2.6.)
Ce tampon, dans lequel on dilue les échantillons à faire migrer, se
conserve à la température ambiante pendant deux mois au maximum. Le
glycérol alourdit le mélange à séparer pour éviter toute contamination des
puits voisins lors
des
dépôts. Le Bleu de brornophénol pennet la
visualisation du front de migration (couleur bleu violet à ce pH).
c) Pour effectuer la séparation et colorer les
bandes obtenues
(Fig.: 2.6.)
tampon de migration pH 8,3
Ce tampon contient 7,5% de tris base et 36% de glycine. Il est cinq
fois concentré et se conserve à 4°C. Il est dilué au 1I5ème lors de chaque
utilisation. Pour la capacité de la cuve que nous utilisons, nous prenons 60
ml de la solution mère ajoutés à 240 ml d'eau distillée.
colorant
Il est à base de bleu de Coomassie brillant R 250. Il doit être bien
agité pendant une heure au minimum et filtré deux fois sur papier
"Watman" nOI. Il peut être utilisé plusieurs fois (en général 2 ou 3 fois).
décolorant :
Il correspond au véhicule du colorant précédent. Les gels colorés y
sont immergés sous agitation jusqu'à ce que le fond du gel soit décoloré.
Si la décoloration est trop prononcée, il est possible de recolorer le gel
puis de le décolorer à nouveau.
2.5.1.5. Mode
opératoire
Toutes ces préparations se font au moment de la manipulation et dans
l'ordre indiqué ci-dessous :
a) Préparation des plaques d'électrophorèse
Les plaques doivent être nettoyées à l'eau courante puis à l'eau
distillée uniquement, car des détergent ou d'autres produits chimiques
pourraient entrainer une adhérence du gel aux parois des plaques. Elles
doivent être également bien essorées et essuyées avec du papier absorbant
jusqu'à ce qu'elles soient sèches.
Fig. 2.6. : préparation des solutions nécessaires à la migration
électrophorétique et à la coloration des protéines.

---

j
ec
Fig . 2.7 .

---

24
Après fixation sur le support, le montage est vérifié en versant de
l'eau distillée entre les deux plaques qui doivent recevoir le gel de
polyacrylamide.
S'il
n'y
a
pas
de
fuite,
l'eau
est
éliminée
par
renversement et les bords des plaques bien essorés avec du papier
absorbant. Le montage est alors prêt pour abriter les gels.
b) Coulage des gels :
Ce sont des gels de 0,75 mm d'épaisseur coulés entre les plaques de
verre.
Le mélange des composants se fait dans l'ordre suivant:
. d'abord le gel de séparation à 7,5% :
Dès qu'il est prêt, dégazé et contenant les catalyseurs, il est aussitôt
coulé à l'aide d'une pipette Pasteur entre les deux plaques jusqu'au 2/3 de
leur hauteur. Il est complété par de l'eau distillée jusqu'au bord de la
petite plaque pour éviter tout desséchement.
La polymérisation est effectuée au bout de 30 minutes environ. Une
fois terminée, la limite entre le gel polymérisé et l'eau distillée apparaît
très nettement. On peut aussi contrôler la polymérisation en conservant
une partie de cette solution dans la pipette Pasteur.
. puis le gel de concentration à 4% :
Pendant que ce deuxième gel est en cours de dégazage, on retire par
renversement l'eau distillée placée au dessus du gel de séparation. Dès que
le gel est prêt on le coule, toutjours à la pipette Pateur, sur le premier
jusqu'au bord de la petite plaque. Un peigne formé par 10 dents, de même
épaisseur (0,75 mm) que celle de l'écartement des lames (Fig. 2.7.) est
alors inséré dans ce gel, en évitant toute formation de bulles, pour
permettre la réalisation de 10 puits de migration. La polymérisation dure
environ 30 minutes dans les mêmes conditions que pour le gel de
séparation.
Après polymérisation, le peigne est retiré et les puits sont rincés trois
fois à l'eau distillée de façon à éliminer toutes traces de gel non
polymérisé.
c)
Installation
des
plaques
et
dépôts
des
échantillons
Le module central "Mini Protean System" porteur des gels est
installé dans la cuve, formant une sorte de réservoir suspendu. Nous
remplissons d'abord l'intérieur du réservoir avec le tampon de migration
pour vérifier si les plaques contenant les gels ne fuient pas. Ensuite le
fond de la cuve est rempli de telle façon que la base des gels trempe dans
ce tampon (Fig. 2.8.).
Fig. 2.7. : cuve et accessoires pour l'électrophorèse (Mini-Protean il
Biorad)
c :
cuve pour l'électrophorèse
pc :
portoir de coulage des gels
ec:
écarteurs
pv :
plaques de verre
el :
porte électrodes
spv:
support des plaques de verre
p:
peigne

---

Cathode (-)
Puits pour échantillon
Anode (+)
-
/
-
- -
-
<,
1--
7
f---
1
Jt~i
il;
l -
J ampon de
11
;g
1""
~
1~.1li 1 1: ~
=
=
~
1 ~~~~~::~\\~~~ 1
=
1
migration
Gel de concentration
'- -
-
- - - - - - - - - - - - -
Gel de séparation
Sens de migration
1r
v---1'<,
~
. /
-
ampon de
......
(-)
(+ ) lf~ igration
Fig. 2.8.

---

25
Les échantillons dilués au 1120 avec le tampon d'échantillon sont
vortexés et déposés un à un à raison de 20 !JI par puits dans les 10 puits de
migration, à l'aide d'une seringue Hamilton bien rincée avec du tampon
de migration entre chaque dépôt. Le dépôt se fait très doucement pour
éviter les turbulences dans chaque puits. Le glycérol contenu dans le
tampon
d'échantillon
alourdit
le
poids
du
dépôt
et
évite
toute
contamination entre les puits.
Les électrodes sont alors branchées. Le générateur est allumé et réglé
à un voltage constant de 120 V pour une seule plaque et 150 V pour deux
plaques.
La migration s'effectue à la température du laboratoire (environ
20°C).
L'électrophorèse est arrêtée quand le frond de migration atteint le
bas du gel de séparation. Elle dure en moyenne une heure dans les
conditions utilisées.
2.5.1.6. Révélation des électrophorégrammes
a) Coloration
Dès la fin de la migration électrophorétique, le générateur est
débranché. Le module contenant le support d'électrophorèse est sorti de la
cuve. Les plaques sont dévissées et séparées. Le gel enlevé avec soin est
immergé immédiatement dans la solution colorante contenant l'acide
acétique qui fixe les protéines par insolubilisation. Une demi-heure est
nécessaire pour colorer le gel et fixer les fractions protéiques.
b) Décoloration
Le gel coloré est décoloré. Quand l'éclaircissement du fond paraît
suffisant (environ au bout d'une demi-heure), le gel décoloré est enlevé et
transporté dans une boîte contenant de l'eau distillée et un antibactérien,
de l'azide de sodium (NaN3) (Prolabo) à 0,01 %.
c) Photographie
Les gels sont photographiés sur fond transparent avec un film APX
noir et blanc.
2.5.2. Electrophorèses en milieu dissociant
Ces techniques se font en présence de SDS. Le SDS ou Sodium
Dodecyl Sulfate est un détergent ionique qui charge négativement,
uniformément, les protéines et dissocie leurs sous-unités, si elles existent,
par rupture des liaisons hydrogène. Traitées ainsi, les protéines vont
migrer uniquement en fonction de leur poids moléculaire, toutes les
charges étant identiques.
Fig. 2.8. schéma du montage d'une électrophorèse

---

--
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -;
sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% (Sigma) (C12 H25 04 SNa)
SOS
10 g
eau distillée q.s.p.
100 ml
tampon d'échantillon SDS
tris HCI 0,5 M à pH 6,8
0,5 ml
glycérol (C3 H8 03) Prolabo
0,4 ml
SOS (Sigma)10% dans l'eau distillée
(2% final)
0,8 ml
bleu de bromophénol
2,5 mg
eau distillée qsp
4 ml
tampon d'échantillon SDS et B-mercaptoéthanol
tris HCI 0,5 M pH 6,8
0,5 ml
glycérol
0,4 ml
SOS 10%
0,8 ml
bleu de bromophénol
2,5 mg
B-mercaptoéthanol
0,8 ml
eau distillée qsp
4 ml
tampon de migration SDS pH 8,3
tris-base
15 g
glycine
72 g
SDS
5g
eau distillée q.s.p.
1000 ml
kit de hauts poids moléculaires (Biorad)
1 ml kit est mélangé à
19 ml de tampon échantillon SOS
Fig. 2.9.

---

26
2.5.2.1. PAGE-Sns et
PAGE-SnS B-mercapto-
éthanol
Ces sigles correspondent à la désignation de la technique en anglais:
Poly Acrylamid Gel Electrophoresis en présence de SOS.
On peut également rajouter au SOS du B-mercaptoéthanol, agent
réducteur coupant les protéines au niveau des ponts disulfure.
Ainsi les électrophorèses peuvent être effectuées respectivement en
conditions dissociantes non-réductrices ou réductrices .
a) Solutions particulières
(Fig. 2.9).
solution de SDS
Les diverses solutions nécessaires à l'élaboration des gels et à la
migration électrophorétique contiennent du SOS.
Elles sont faites à partir d'une solution stock à 10%, conservable à la
température ambiante du laboratoire pendant plusieurs semaines. Placée à
basse température, la solution cristallise et doit être réchauffée.
kit de poids moléculaires
Les conditions électrophorétiques permettent de faire migrer des
molécules de poids moléculaires connus permettant d'établir une courbe
étalon de référence et de connaître le poids moléculaire des sous -unités
des protéines recherchées.
Nous avonsutilisé un kit de poids moléculaires élevés (Biorad) dilué
au 1I20ème dans du tampon échantillon et déposé à raison de 5 !JI par
puits. Les molécules sont les suivantes:
myosme :
200 000 Oa
B-galactosidase :
1162500a
phosphorylase b :
97400 Oa
albumine bovine sérique:
66000 Oa
ovalbumine :
45000 Oa
b) Préparation des gels
On ajoute 50 !JI de SOS 10% et on diminue d'autant la quantité d'eau
distillée utilisée, aussi bien pour fabriquer le gel de séparation à 7% que
le gel de concentration à 4%.
c) Appareillage et mode opératoire
Ils sont identiques à ceux de la technique native.
2.5.2.2.
Electroélution
a) Extraction de la bande choisie
Aussitôt après avoir réalisé une électrophorèse dans laquelle la bande
choisie se trouve, on découpe les deux bandes latérales du gel pour les
Fig. 2.9. : solutions stoks pour PAGE-SOS et SOS + B-mercapto-
éthanol.

---

A
13
Tampon ri!!.; (0,,1 1,1) • SDS 0,1 0/0
Tampon Nj-l., (0,4 M; 100 ul) + SD S 2 %
<,
:,l o rc e ilU ~ re gel _
1 --
-
-
Sens c o migr a: ion
L -
- : -_
".tembran.) a ~ i ~
Fig. 2.10.

---

27
colorer rapidement pendant que l'autre partie du gel est mise en attente en
atmosphère humide. Les bandes latérales du gel sont alors colorées,
décolorées et réhydratées jusqu'à obtenir la dimension initiale du gel
avant coloration. Elles vont permettre de choisir la portion du gel où est
localisée la protéine qu'on désire isoler à partir du reste du gel non
coloré.
Ces parties de gel sont coupées au rasoir et hachées au scalpel le plus
finement possible.
b)
Cellule d'électroélution
Chaque cellule d'électroélution est constituée par deux réservoirs
cylindriques de diamètre différent, réunis par un pont de communication
transversal (Fig. 2.10.). La base de chaque réservoir est munie d'une
membrane à dialyse filtrant à 10 000 Da.
lr-
Lors d'une électroélution, le matériel à électroéluer est déposé dans
I, le grand réservoir, côté cathode.(-). Du tampon d'électrophoëse remplit
les
deux
réservoirs
et
le pont de
communication.
Ad cours de
l'électroélution, les protéines désirées migreront dans le petit réservoir
)1 placé., u côté de l'anode (+) où elles seront récupérées à l'aide d'un
'f éâthéther souple de façon à ne pas léser la membrane de dialyse de
1
)
1ano ft.
G
ntre chaque électroélution, les cellules, après rinçage soigneux, sont
remplies et immergées dans de l'éthanol à 70% et conservées à 4°C pour
prévenir tout dessèchement des membranes.
c) Préparation des solutions
(Fig. 2.11).
Différents
tampons
sont
préparés
à
partir
du
bicarbonate
d'ammonium (NH4 )HC03 sous l'abréviation (AHC). Ils sont stockés et
prêts à être dilués au moment de l'emploi:
d) Installation des cuves
(Fig. 2.10).
Les deux cuves sont placées côte à côte. Elles sont remplies de
tampon d'électroélution : 0,05 M (AHC4) + 0,1 % SDS à raison de 600
ml par cuve. La mise à niveau du tampon des deux cuves est effectuée à
l'aide d'un cathéter en T pendant 10 min
e) Préparation des échantillons
(Fig. 2. 10.)
Les bandes identifiées et hachées sont placées dans le grand réservoir et
recouvertes de 100 pl de tampon concentré (ACH 1). Puis, le tampon
d'élution (AHC 4) est introduit dans l'ensemble de la cellule à partir du
petit réservoir par inclinaison pour éviter la formation des bulles d'air et
permettre à ce tampon de passer dans le grand réservoir. Les cellules sont
remplies juste
au-dessus
du
pont
de
communication
et
bouchées
simultanément. Chaque cellule est posée à cheval entre les deux cuves
Fig. 2.10. : cellule d'électroélution et montage de Il appareillage

---

tampon (AHC 1 ) 0,4 M
(NH4) HC03
31,624 g
eau distillée qsp
1 litre
pH 8,2
tampon (AHC 2) 0,4 M + 2 %
SOS
AHCO,4 M
20 ml
SDS
400 mg
tampon (AHC 3) 0,05 M
AHC 0,4 M
200 ml
eau distillée
1400 ml
tampon (AHC 4) 0,05 M + 0,1 %
SOS
revient à ajouter 1,6g de SDS à la solution précédente.
tampon de transfert
pour PAGE natif:
tris base
48mM
5,8 g
glycine
39mM
2 ,93 g
méthanol
20%
200 ml
eau distillée qsp
1000 ml
Le pH est ajusté à 8,3 avec HCL
pour PAGE-SDS
on rajoute
duSDS
0 ,035%
375 mg
Fig. 2.11.

---

2 8
d'électrophorèse, le grand réservoir côté de la cathode et le petit côté de
l'anode.
Les
fonds
des
réservoirs
baignent
dans
le
tampon
d'électrophorèse (AHC 1) de chacune des cuves de façon à ce que le
courant puisse passer.
Les bulles d'air qui auraient pu se coincer sous les membranes de
dialyse sont éliminées par aspiration avec une seringue munie d'une
aiguille courbe.
f) Conditions électriques
Le générateur est réglé à 50 V. La puissance affichée par cellule est
de l'ordre de 4 à 6 mA. Le temps de séparation des protéines est de
l'ordre de sept heures. Le voltage du générateur commence à changer
lorsque les protéines s'accumulent du côté du petit réservoir.
g) Récupération des protéines
Les protéines électroéluées sont récupérées dans le petit réservoir à
l'aide d'une seringue munie d'un cathéter afin de ne pas percer la
membrane de dialyse. Elles sont concentrées à l'aide d'une cellule Amicon
coupant à 30000 Da.
Une aliquote sert pour contrôle électrophorétique sur PAGE-SOS, et
une autre est utilisée pour déterminer par Bradford (1976), la quantité de
protéines récupérées.
5.2.2.3.
Electrotransfert
Le principe est de transférer les protéines séparées sur gel de poly-
acrylamide sur un support permettant des révélations ultérieures non
réalisables sur le gel.
a) Support de transfert
Nous avons utilisé de l'immobilon PVOF (polyvinylidène difluoride)
de 0,45 um de porosité. Avant utilisation, l'immobilon est rapidement
immergé dans du méthanol à 20% puis rincé à l'eau distillée.
b) Tampons de transfert (Fig. 2.11)
Pour transférer des PAGE natifs, nous utilisons un tampon de pH 8,3
contenant 48 mM de tris, 39 mM de glycine et 20% de méthanol
Pour un transfert de PAGE-SOS, nous ajoutons 0,035 % de SOS.
c) Protocole de transfert
(Fig. 2.12)
A la fin de la migration électrophorétique et avant fixation par
coloration, le gel est placé sur la feuille d'immobilon découpée à sa
dimension. Le tout est pris en sandwich entre deux couches de papier
buvard (3 feuilles) et les deux électrodes plates en carbone. L'ensemble
Fig. 2.11. : les tampons d'électroélution.

---

PROTEINES
8
-
Plaques
de
graphite
===========J- Papiers filtres
PAGE·SOS
- - PAGE·SOS
--- Membrane
de
tra n s te r
===========:=1- Papiers filtres
_ _ _ _. ._ . . . . . . . . . . .
-
Plaques
de
graphite
- - PAGE·SOS
...
t H
Fig. 2.12

---

29
est placé sur un support relié à un cryostat (Multitemp II, LKB) et
réfrigéré à 4°C.
L'alimentation est branchée de sorte que les protéines passent du gel
vers l'immobilon, sous une intensité de 0,8 mA/cm 2 de gel transferé, ceci
pendant 3 heures. La conduction électrique est assurée par le tampon de
migration imbibant le sandwich.
Après transfert, la feuille d'immobilon est séchée à l'air libre et
soigneusement conservée entre deux feuilles de papier Whatman jusqu'à
utilisation ultérieure.
d) Colorations
de contrôle
La feuille d'immobilon est éventuellement colorée au rouge Ponceau
pour vérifier le bon transfert des protéines. Après rinçage et séchage à
l'air, la feuille de transfert peut être utilisée sans inconvénients pour
d'autres révélations.
Le gel transféré est coloré au bleu de Coomassie afin de vérifier la
quantité de protéines transférées en comparant avec un PAGE coloré
témoin.
2.6. Techniques chromatographiques
2.6.1. Chromatographie de filtration sur gel
2.6.1.1.
Principe
La matrice de filtration sur gel est composée de minuscules billes
poreuses.
La solution protéique à séparer est placée en haut d'une colonne
remplie avec la matrice et est éluée par un tampon dont le flux est assuré
par une pompe péristaltique
Les molécules de dimensions supérieures restent dans le tampon
circulant entre les billes, alors que les molécules plus petites se déplacent
en pénétrant dans les canalicules creux des billes, plus
ou moins
profondément suivant leur dimension et leur forme. Les molécules sont
éluées de la matrice dans un ordre de masse moléculaire décroissant, les
plus grosses sortant les premières et les plus petites se retardant par suite
de leur pénétration dans la matrice. Ce type de chromatographie est
encore appelé tamisage moléculaire.
Du fait que les molécules traversent la matrice à des vitesses
différentes, elles sont à la sortie de la colonne, séparées les unes des
autres.
Fig. 2.12.
schéma du principe de l'électrotransfert.

---

solution
stock M
de tampon de filtration sur gel:
Trizma base M (Sigma)
121,1
g
CaCl2 2H20 10 mM (Prolabo)
1,47 g
eau distillée qsp
l litre
Le pH 7,8 est ajusté avec de l'acide chlorhydrique concentré fumant.
Fig. 2.13

---

30
Quand toutes les molécules ont été éluées du gel, la colonne est prête
pour l'opération suivante. La régénération est inutile. La même colonne
peut en règle générale être utilisée pour un grand nombre d'expériences.
A partir d'une courbe d'étalonnage obtenue par chromatographie de
protéines
de
poids
moléculaires connus,
le poids
moléculaire
des
substances séparées peut éventuellement être estimé.
2.6.1.2. Matrice utilisée
a) Caractéristiques
Nous avons choisi la sépharose 68 constituée par des particules
sphériques de gel d'agarose fabriquées par la Société Pharmacia en Suède
ayant un domaine de fractionnement des protéines s'étendant de 10 000 à
400 000 Daltons et utilisant comme éluant un tampon Tris base (Sigma).
b) Préparation de la colonne
Le plus grand soin est apporté au choix de la colonne afin d'obtenir
la meilleure efficacité en filtration sur gel.
Pour les travaux analytiques, une colonne de verre d'un diamètre
intérieur de l'ordre de 2,5 cm donne satisfaction. La hauteur du gel à
utiliser dépend de la nature de la séparation. Pour des .s éparations plus
difficiles, des hauteurs de gel plus longues doivent être utilisées. Nous
avons choisi une colonne verticale en verre d'une hauteur de 1 mètre.
La suspension de sépharose 68 telle qu'elle est fournie dans le
commerce est trop dense pour être versée directement dans la colonne.
Elle doit ainsi être diluée au préalable dans le tampon Tris base 100 mM,
pH 7,8 utilisé comme éluant et préalablement filtrée et dégazée sous
agitation très lente.
Le remplissage régulier de la colonne de filtration est très important
si l'on veut obtenir de bons résultats. Un remplissage irrégulier entraîne
inévitablement une augmentation de la dilution et peut causer le mélange
de zones qui normalement seraient parfaitement séparées. Si une pression
trop élevée est employée pendant le remplissage, le gel se trouve
comprimé et opposera une résistance élevée à l'écoulement.
Après décantation, le gel est équilibré de façon mécanique en faisant
passer le tampon d'élution pendant 24 heures à débit mesuré en sortie de
colonne (l ml/min) par réglage de la pompe péristaltique. Un débit trop
élevé entraîne une diminution du rendement final et la dilution du
produit.
2.6.1.3. Tampon
d'élution
(Fig. 2.13)
Nous utilisons un tampon tris 100 mM contenant 2 mM de chlorure
de calcium comme protecteur de la structure de la vitellogénine.
Nous préparons une solution mère 10 fois plus concentrée, stockée à
4°C et que nous diluons au 1110ème au moment de l'emploi.
Fig. 2.13. : tampons pour filtration sur gel.

---

Colorme
Pompe
L
= l fi
péristaltiqu e
diam. = 2, 5 cm
Rob inet
Coll ecteur de fraction s
Injec tion de plasma
induit d' O. niloticus.
T rizma base
( 100 mM , pH = 7,8 )
Fig. 2.14.

---

3 1
Une quantité suffisante est préparée, filtrée dans une fiole placée sous
agitation très lente, et dégazée pendant 10 min à l'aide d'une pompe à vide
pour éliminer les bulles d'air qui géneraient l'écoulement des molécules.
2.6.1.4. Mode opératoire
(Fig. 2.14)
L'échantillon dilué trois fois avec le tampon Tris base à 100 mM est
centrifugé pendant 5 min à 3000g et à 4°C de façon à récupérer en
surface et éliminer les lipides libres dans le plasma. Il est ensuite injecté
dans la circulation du tampon, en amont de la pompe péristaltique, à l'aide
d'un tuyau branché sur un robinet à trois voies. Une fois l'échantillon
passé dans le circuit, le sens du robinet est inversé pour permettre
l'écoulement du tampon directement dans la colonne pendant 10 heures.
Le volume des fractions recueillies avec le collecteur (Pharmacia
LKB) est de 10 ml/lOmin/tube.
2.6.1.5. Lecture de l'absorbance des fractions
L'absorbance
de
chaque
fraction
est
déterminée
au
spectro-
photomètre (Kontron Uvikon 810) à 280 nm en utilisant des cuves de
quartz. La valeur de la DO obtenue est reportée sur un graphique en
fonction des tubes d'élution.
2.6.2. Chromatographie échangeuse d'ions sur colonne de
DEAE-Trisacryl M (Pharmacia IBF)
2.6.2.1.
Principe
Un échangeur d'ions est une matrice insoluble qui contient des
groupes chargés fixes et des contre-ions mobiles. On parle d'échangeurs
anioniques ou cationiques suivant qu'ils ont une affinité pour les ions
négatifs ou pour les ions positifs.
La séparation des produits est obtenue par adsorption réversible. Elle
est fonction de la charge nette des molécules à même pH donné. La
chromatographie d'échange d'ions nécessite deux étapes:
- l'adsorption qui intervient dès l'application de l'échantillon.
Les substances non liées sont éliminées par lavage avec du tampon.
- l'élution sélective qui se fait soit :
. par une variation du pH du tampon d'élut ion vers le point
isoélectrique de la molécule entraînant une diminution de sa charge nette,
d'où une élution plus aisée
. ou par augmentation de la force ionique, c'est-à-dire augmentation
du nombre de contre ions compétitifs dans le tampon avec la molécule
chargée. Les molécules les plus chargées sont éluées les dernières. C'est
cette modalité que nous avons choisie.
Fig. 2.14. : schéma du montage d'une chromatographie de
filtration sur gel.

---

Colonne DEAE Trisacryl M
Pompe
1= 50 cm
péristaltique
diarn. = 1,8 cm
Robinet
Collecteur de fractions
--0~888---
Fr Injection de VTG
V
recueillie au Sépharose 6]
Trizma base
(lOG' mM, pH = 7,8 )
Gradient de trizma base
( 100 mM à 300 mM, pH = 7,8 )
Fig. 2.15

---

32
2.6.2.2. Matrice utilisée :
Nous avons choisi la DEAE-Trisacryl M (IBF) :
Elle est présentée sous forme d'une suspension aqueuse dans du NaCI
lM:
a) Caractéristiques:
La matrice Trisacryl est formée de deux monomères différents:
- le mono mètre principal est un groupement Tris jouant le
rôle de squelette rigide.
- l'autre monomère porte les groupements diéthylaminoéthyl
(DEAE)
qui confèrent au support chromatographique ses propriétés
d'échange d'anions.
b) Coulage de la matrice :
Nous utilisons une colonne en verre de 50 cm de longueur sur 1,8
cm de diamètre.
Le gel de la DEAE - Trisacryl M préparé dans le tampon Tris base à
100 mM et dégazé, est introduit par fractions dans la colonne. Apres
décantation, il est équilibré par la circulation du tampon pendant 16
heures à un débit de 3 ml/5 min.
2.6.2.3.
Tampons
La matrice échangeuse étant de nature anionique, nous avons choisi
des tampons cationiques, Tris base à pH 7,8.
a) Tampon d'équilibration :
Pour obtenir de bonnes séparations en chromatographie par échange
d'ions, il est essentiel que les conditions de l'expérience soient favorables
à l'établissement d'un équilibre. Le débit pour lequel est atteint cet
équilibre, surtout pour des solutés de poids moléculaires élevés, est assez
faible. Il faut donc que l'écoulement soit lent. Les conditions requises sont
obtenues à l'aide d'une pompe péristaltique.
Le tampon choisi, Tris base, est identique à celui qui a été utilisé
pour la filtration sur gel.
Toutes les protéines de point isoélectrique inférieur à pH 7,8 sont
chargées négativement et sont retenues sur la colonne.
b) Gradient d'ëlution :
L'élution se fait par utilisation de tampons à concentration ionique
croissante de 100 à 300 mM et à pH constant. On peut utiliser soit un
gradient de tris, soit un gradient de chlorure de sodium ajouté au tampon
tris 100 mM de l'élution.
Fig. 2.15. : schéma du montage d'une chromatographie échangeuse
dl ions.

---

3 3
2.6.2.4. Mode opératoire
(Fig. 2.15.)
L'élution des protéines non retenues sur la matrice se fait avec le
même tampon 100 mM à un débit de 3 mUS min pendant 110 min, temps
nécessaire pour obtenir l'exclusion.
L'élution des constituants protéiques retenus est réalisée avec un
gradient linéaire de 100 mM à 300 mM de tampon Tris base à pH 7,8
pendant 5 heures. Les protéines les moins chargées sont décrochées les
premières, les plus chargées les dernières. Les protéines résiduelles
restant accrochées sur la matrice sont éliminées par lavage avec un
tampon de forte force ionique (Tris M).
2.6.2.5.. Lecture de l'absorbance des fractions
L'absorbance des fractions est déterminée au spectrophotomètre à
une longueur de 280 nm, comme pour la filtration sur gel.
2.7. Techniques immunologiques
2.7.1. Rappel de notions de base
2.7.1.1. Définition des notions antigène et anticorps
Un antigène est une molécule étrangère protéique qui, introduite
dans un organisme, va entraîner la production par le système immunitaire
de celui-ci d'une molécule protéique "complémentaire" appelée anticorps.
Les anticorps appartiennent à une famille de protéines sériques de
type macroglobuline, appelées immunoglobulines ou Ig.
Une des caractéristiques de ces molécules est leur capacité de
s'accrocher
par
leurs
structures
complémentaires
à
l'antigène
correspondant, et de précipiter dans l'organisme ou in vitro : c'est la
réaction antigène - anticorps (ag-ac).
2.7.1.2.
Immunisation
C'est l'introduction de l'antigène dans l'organisme ou stimulation
antigénique, à laquelle le système immunitaire répond par la formation
d'anticorps ou réponse antigénique.
Les anticorps formés sont libérés dans le sang de l'animal immunisé.
Ils sont récupérés dans le sérum appelé immunsérum.
L'introduction de l'antigène se fait, en général, par injections intra-
musculaires ou sous-cutanées répétées.
Nous avons utilisé le lapin comme animal donneur.
L'immunsérum obtenu est aliquoté, éventuellement dilué de moitié
avec du glycérol et conservé au congélateur à -30°C.

---

Tr o m pe à e cu
Tuyau à vide
Lapin
Fig. 2.16.

---

34
2.7.2. Préparation de l'antigène
L'antigène injecté au lapin est composé du mélange suivant
- une aliquote contenant environ 200 ug
de
VTG
purifiée,
complétée à 500 III par du chlorure de sodium 0,9% .
- et 500 III d'adjuvant complet de Freund (Bio-Mérieux).
Les deux parties sont intimement mélangées en émulsion avant
injection.
2.7.3. Protocole d'immunisation des lapins
Après homogénéisation, chaque mélange antigénique est injecté à un
lapin par voie sous-cutanée, en une dizaine de points différents au niveau
du dos et du flanc, à raison d'un côté par immunisation.
Le protocole d'immunisation généralement pratiqué est le suivant:
- une injection par semaine pendant 4 semaines
- puis un arrêt d'injection durant 15 jours
- ensuite un rappel par mois, suivi d'un prélèvement sanguin une
semaine après pour tester le taux d'anticorps obtenus. Le rappel est arrêté
quand le taux d'anticorps est constant.
2.7.4. Contrôles de l'immunisation
2.7.4.1. Prélèvements de sang
(Fig. 2.16.)
Un prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de l'oreille
est effectué sur chaque lapin avant la première injection, et servira de
témoin d'absence d'anticorps spécifiques présents de façon naturelle chez
le donneur.
A partir de la 3ème immunisation, un prélèvement de sang est
effectué de la même façon une semaine après l'injection.
Chaque prélèvement est laissé quelques heures à la température
ambiante jusqu'à ce que le caillot se forme c'est-à-dire que le fibrogène
sanguin constitue un réseau de fibrine insérant les éléments figurés du
sang en laissant exsuder le sérum contenant les anticorps. Après une
centrifugation pendant 5 minutes àtOoog l'immunsérum est prélevé et
aliquoté soit par 500 III soit par un aliquote de 1 ml contenant 50% de
glycérol. Toutes ces aliquotes sont c nservées à -30°C.
Lorsque le titre de l'anticorps recueilli est satisfaisant un dernier
prélèvement de sang est effectué à raison de 15 mllkg de lapin.
L'immunsérum obtenu est conservé dans les mêmes conditions que les
échantillons précédents.
Fig. 2.16. : prélèvement de sang sur lapin.

---

tampon d'immunoprécipitation
Véronal sodé (0,05M)
10,309 g
Hel N
15 ml
Azide de sodium (NaN3)0; 1%
100 mg
Eau distillée qsp
1 ()()() ml
solution de coloration
Amidoschwarz
5%
5g
Méthanol
40%
40 ml
Acide acétique
10%
10 ml
Eau distillée
50%
50 ml
solution de décoloration
Acide acétique
2%
2 ml
Eau distillée
98%
98 ml
Fig. 2.17.
,
,
,
a
1
1
Fig. 2.18.

---

35
2.7.4.2.
Contrôle
de
l'immunsérum
par
immuno-
précipitation
(Ouchterlony,1953)
Une immunoprécipitation est réalisée pour tester la réaction ag-ac
entre l'imrnuns érum obtenu et l'antigène innoculé. Cette réaction suit le
protocole décrit par Ouchterlony en 1953.
Les diffusions se font en agarose (gélose purifiée, Merck) à 1,5 %
dans du tampon véronal 0,05 M (diéthylmalonylurée sodée) (Fig. 2.17.).
Ce tampon préparé est conservé à 4°C. Au moment de réaliser les
dépôts d'irnmunoprécipitation, une solution d'agarose à 3 % est préparée
avec de l'eau distillée (3 g d'agarose + 100 ml d'eau distillée) . Cette
solution est solubilisée au bain marie et elle est répartie dans des tubes en
verre à raison de 1,5 ml par tube. Puis, après avoir rajouté 1,5 ml de
tampon véronal sodé, le mélange (3 ml) est déposé sur une lame
d'histologie recouverte de gel-bond Pharmacia à l'aide d'une pipette en
verre à écoulement rapide, préalablement rechauffée dans le bain-marie.
Après solidification de la gélose à la température de la pièce, des puits
cylindriques de 20 IJ 1 sont réalisés grâce à un emporte-pièce. Les réactifs
y sont déposés jusqu'à ras bords à l'aide d'une pipette Pateur effilée à la
flamme d'un bec Bunsen.
Les affrontements se font par diffusions concentriques dans la gélose
de puits à puits (Fig. 2.18.a) au moins pendant 12 heures dans un milieu
humide contenant 0,01 % d'azide de
sodium.
Quand
les
traits
de
précipitation révélateurs de la réaction ag-ac sont apparus, les excédents
protéiques non précipités sont éliminés de la gélose par immersion dans
de l'eau distillée contenant de 0,01 %
d'azide de sodium, renouvelée
abondamment
pendant
plusieurs
jours.
La
coloration
des
traits
d'immunoprécipitation est réalisée avec de l'amidoschwarz (Fig. 2.18.)
durant une minute après déshydratation du gel par pression prolongée
contre du papier absorbant. Après décoloration le gel solidaire du gel-
bond est séché à l'étuve à 37°C.
2.7.4.3. Contrôle de l'immunisation par ELISA
direct
La technique d'ELISA direct ne fait pas intervenir de compétition: il
s'agit seulement de mettre en contact l'immunsérum avec les antigènes
possibles, sur un support qui est une plaque de microtitration.
Fig. 2.17. : solutions pour immunoprécipitations :
a) tampon
b) colorant
c) décolorant
Fig. 2.18. : principe de l'immunoprécipitation en agarose
a) traits de prjcipitations résultant de l'affrontement de deux
diffusions circulairr. .
b) arcs de précipitations résultant de l'affrontement d'une diffusion
circulaire et d'une diffusion linéaire.

---

ag
(ng/ml)
,
1000
500
250
125
1
1
1
1
1
1
1
ac ~
1/5000
1 1/10000
1 1/20000
1/40000
1 1/80000
1/160000
1
1
1
1
Fig. 2.19.

---

36
L'antigène est greffé, c'est à dire adsorbé , sur une plaque de
microtitration de 96 puits à fond plat, en plastique traité, en laissant
incuber toute une nuit à température ambiante ou 2 heures à 37°C la
solution antigénique dans les puits. On greffe une gamme de dilution de
l'antigène, de 1000 à 125 ng/ml.
Après rinçages, on dépose en sens perpendiculaire une gamme de
dilution de l'immunsérum du 1/5 OOOè~e au 1/160 Oooème (Fig. 2.19.).
Les étapes de révélation des comp xes antigène-anticorps formés sont
identiques à celles d'un ELISA norma (cf. paragraphe 2.8).
La lecture de la réaction colorée se fait de façon identique à l'aide
d'un lecteur de plaques. Nous considérons que le lapin a bien répondu, si
nous pouvons obtenir une
DO de
1,5 avec un anticorps dilué au
1/40000ème pour une dose d'antigène n'excédant pas 500 ng/ml.
L'obtention d'une réaction colorée avec un antigène supposé ne pas
réagir avec l'anticorps signifie que cet anticorps a été induit par un
antigène contaminé.
2.7.5. Epuisement de l'immunsérum
Il s'agit d'éliminer de l'immunsérum les anticorps non spécifiques
synthétisés par le lapin contre les protéines contaminant la solution de
VTG injectée, détectables en Ouchterlony par un trait de précipitation ou
en ELISA direct par une réaction colorée avec l'antigène témoin.
La première opération consiste à préparer la solution antigénique
d'épuisement: pool d'l ml de plasma mâle plus 1 ml d'extrait de foie
mâle lyophilisé. Ce mélange réagisant avec les anticorps correspondants
contenus dans l'immunsérum formera des complexes précipitables.
Le
premier
épuisement
est
obtenu
en
mélangeant
1
ml
de
l'immunsérum avec 330 III de la solution antigénique d'épuisement
pendant trois heures à la température ambiante ou durant une nuit à 4°C.
Il est ensuite centrifugé pendant 10 min à 3000g et le surnageant est
recueilli.
Le deuxième épuisement est réalisé en ajoutant 1,3 ml de ce
surnageant à 1,3 ml de la solution antigénique d'épuisement. Le mélange
est conservé pendant une nuit à 4°C. Il est centrifugé pendant 10 minutes à
3OO0g. L'immunsérum surnageant épuisé est alors réparti en aliquotes de
200 III et congelé à -30°C.
Fig. 2.19. : ELISA direct
ag : gamme de dilution de l'antigène
ac : gamme de dilution de l'anticorps

---

Greffage de l'ag
rinçage
8 ·C1
2
Iag
Incubat ion av ec Il anticorps sp écifique, ac 1
~ ac 2
rinçage
8 ·C1
3 ---Aag
Incubation avec l'anticorps secondai re, ac 2
'
rinçage
e -
Incubation avec les campi exes de PAP
4 __Aag
rinçage
Révélation des complexes fixés
Fig. 2.20.

---

37
2.8. Immunocytochimie
2.8.1. immunocytochimie
photonique (Fig. 2.20.)
Elle
sert
à tester
l'anticorps
spécifique
lorqu'on
connaît
la
localisation histologique de l'antigène correspondant, mais elle
sert
surtout à localiser cet antigène dans les tissus ou les cellules préalablement
traités en histologie.
Une série
de dilutions d'anticorps
primaire
spécifique
a
été
expérimentée en immunocytochimie photonique, comme suit,
à la
température du laboratoire. Celle qui a donné les meilleures révélations a
été retenue pour faire le marquage à l'or dans les grilles réservées pour la
microscopie électronique.
2.8.1.1. préparation des coupes
La réaction ag-ac, base de la révélation immunocytochimique, se
faisant en milieu aqueux, les coupes sont d'abord déparaffinée au toluène
puis progressivement réhydratées par des bains d'alcool d'hygrométrie
croissante. Après un bain dans de l'eau distillée, les coupes sont préparées
pour que la réaction immunologique puisse avoir lieu à leur surface. Elles
sont successivement rincées pendant cinq minute dans du carbonate de
lithium à 1%, de l'eau oxygénée à 30%, de l'eau ditillée et enfin
séjournent pendant au moins cinq minutes dans du tampon phosphate 0,1
M à pH 7,4 (Fig. 2.21.). C'est ce tampon qui est utilisé ultérieurement
pour saturer, incuber et rincer les coupes.
Le rinçage dure trois minutes après chacune des étapes suivantes.
2.8.1.2.
Saturation.
Les coupes sont saturées durant 20 minutes dans une solution
contenant 200 ml de tampon phosphate et 2 ml de NPS (normal pig
serum, c'est à dire sérum normal de porc). Cette étape à pour but de
bloquer tous le sites antigéniques aspécifiques.
2.8.1.3. Incubation avec l'anticorps primaire
Les coupes sont incubées pendant une heure dans différentes dilutions
d'anticorps spécifique, dit anticorps primaire parce qu'il est déposé en
premier. Au contact de l'antigène correspondant, les anticorps forment
des complexes ag-ac.
2.8.1.4. Incubation avec l'anticorps secondaire
Les coupes sont
incubées pendant une heure dans une dilution au
1/250ème d'anticorps de porc anti-IgG de lapin, constituant l'anticorps de
liaison entre le premier complexe ag-ac et le complexe de révélation. On
l'appelle également anticorps secondaire parce qu'il est déposé en second.
Fig. 2.20. : principe de la révélation immunologique d'un antigène.

---

tampon phosphate 0,1 M à PH 7,4
solution A
NaH2PÜ4H2Ü (Sigma)
3,864 g
eau distillée q.s.p.
280 ml
solution B
Na2HP04 (anhydre) (Sigma)
10,224 g
eau distillée q.s.p.
720 ml
La solution A est ajoutée à la solution B jusqu'à op tenir le pH de 7,4.
Le mélange est conservé à 4°C
révélateur : a-chhloronaphtol
tampon de révélation
200 ml
4 Chlora 1 a Naphtol
4 ml
H2Ü2 à 30 %
80 III
tam pon de révélation
acétate d'ammonium (NH4C2H2Ü2)
0,05 M ajustée au pH 5
7 volumes
acide citrique C6H8ü7,H2Ü
1 volume
solution d'a-chloronaphtol
4 Chlora 1 a Naphtol
20 mg
méthanol
4 ml
(dissous à l'obscurité)
tam pon de satu ration
ovalbumine à 0,1 % (Sigma)
6 ml
tampon phosphate
575 ml
sérum nonnal de chèvre
20 ml
Fig. 2.21.

---

3 8
2.8.1.5. Incubation du complexe PAP
Les coupes sont ensuite incubées avec une solution de PAP au
1I5000ème, solution qui contient l'enzyme permettant la coloration : la
peroxydase.
Le
PAP
ou
complexe
Péroxydase-anti-Péroxydase
est
constitué de deux immunoglobulines de type G (lgG) fixant
trois
molécules de péroxydase. Pendant cette incubation le PAP se fixe sur
l'anticorps secondaire de liaison.
2.8.1.6.
Révélation
Le tampon de révélation (Fig. 2.21.) est préparé extemporanément et
conservé à l'obscurité. Les coupes sont révélées pendant dix minutes
environ dans une solution d'œ-chloronaphtol. Cette molécule incolore à
l'état réduit, prend une teinte brun foncé lorqu'elle est oxydée par la
péroxydase. Elle sert donc de substrat de coloration.
Les coupes sont rincées, déshydratées pendant cinq minutes dans de
l'alcool à 100% et les lamelles montées avec du baume du Canada
2.8.2. Immunocytochimie ultrastructurale
Le tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4 va servir dans toutes les étapes.
L'expérience est réalisée à la température du laboratoire.
2.8.2.1.
Réhydratation
Les grilles sont passées rapidement dans de l'eau distillée, puis elles
restent 15 minutes dans le tampon phosphate.
2.8.2.2.
Saturation
La solution utilisée pour la saturation (Fig. 2.21.) est composée de
0,1% d'ovabulmine dans du tampon phosphate contenant 0,3 % de sérum
normal de chèvre. Les grilles sont laissées 20 minutes dans cette solution
et sont rincées successivement dans 6 bains de tampon phosphate.
2.8.2.3. Incubation avec l'anticorps primaire
La dilution de l'anticorps primaire qui a donné les meilleures
révélations
observées
en
microscopie
photonique
avec
les
coupes
d'histologie classique est choisie. Les grilles témoins sont incubées dans le
tampon phosphate. Les grilles à tester sont laissées dans la solution
d'anticorps pendant une heure. Les grilles sont rincées dans trois bains de
tampon phosphate, puis passées rapidement à la pissette d'eau distillée.
2.8.2.4. Incubation avec l'anticorps secondaire
Dans ce cas, l'anticorps de liaison est directement porteur du
marquage qui et ici de l'or. Les grilles traitées et les grilles témoins sont
Fig. 2.21. : tampons utilisés en immunocytochimie

---

a
b
c
:?{Q(
0
°
0 °
00
0
.: ~0°
0
r 0-<
1
°
°
1
b
A
0
00
0
00
1
0
00
d
-:
Fig. 2.22.
tampon PBST
tampon phosphate 0,1 M
100 ml
NaCIO,9%
9g
Tween 20 (Merck)
500 pl
eau distillée q.s.p.
1000 ml
tampon PBST NPS (normal pig serum)
NPS2%
4 ml
PBST q.s.p.
200 ml
Fig. 2.23.a

---

39
incubées dans cet anticorps secondaire ou G-GAR ( Gold labelled Goat
anti-rabbit IgG, Amersham) dilué au l/lOOème dans le tampon phosphate
pendant 40 minutes. Ensuite toutes les grilles sont rincées successivement
dans trois bains de tampon phosphate et passées rapidement à la pissette
d'eau distillée. Elles restent dans cette solution pendant trois minutes et à
l'obscurité, puis sont séchées à l'aide de papier filtre. Elles sont ainsi
prêtes pour être observées au microscope électronique.
2.9. Mise au point d'un dosage ELISA
2.9.1. Généralités
Cette technique consiste à révéler la formation d'un complexe
antigène-anticorps fixé sur une plaque de microtitration à 96 puits
(NUNC-Type II, Poly-Labo) .
La réaction ag-ac se fait en rajoutant sur l'ag greffé (en quantité
connue et constante) un mélange de l'anticorps spécifique correspondant
utilisé à une dilution déterminée et de l'antigène libre soit en quantité
connue (gamme étalon), soit en quantité inconnue (échantillon à doser).
Il y a alors compétition entre les antigènes greffés et les antigènes
libres rajoutés pour se lier aux anticorps. Plus il y aura d'ag libres, moins
les ac se lieront aux ag greffés et inversement. Ce .sont les complexes ag-
ac adsorbés sur la plaque de microtitration qui sont révélés (Fig. 2.22.).
Cette révélation se fait par une réaction colorée identique à celle
utilisée en immunocytochimie, visualisant une enzyme la péroxydase,
incluse dans un complexe Péroxydase-anti-Péroxydase ou PAP. Ce PAP
est fixé sur le complexe ag-ac à révéler par l'intermédiaire d'un anticorps
secondaire de porc anti-IgG de lapin.
Plus il y aura de protéines à doser (c'est-à-dire d'ag libres) moins la
réaction colorée sera
intense.
La
coloration est
ainsi
inversement
proportionnelle à la quantité de protéines présentes dans l'échantillon.
Une gamme étalon permet de tracer une courbe de la réaction
colorée en fonction de la quantité d'ag libres rajoutée et connue. Ensuite
la densité optique de l'échantillon inconnu permet, en se rapportant à la
courbe, de connaître sa teneur en ag recherchée.
2.9.2. Les solutions tampons
Les solutions qui nécessitent d'être stockés, sont conservés pour une
durée n'excédant pas trois semaines (Fig . 2.23.a et 2.23.b).
Fig. 2.22.
: schéma du principe de compétition immunologlque en
ELISA
Fig. 2.23.a : réactifs pour ELISA

---

tampon carbonate pH 9,6
solution A
Na2C03 (Merck) 0,05M
1,325 g
eau distillée q.s.p.
250 ml
Solution B
NaH CO) (Merck) 0,05 M
1,050 g
eau distillée q.s.p.
250 ml
La solution A est ajoutée à la solution B jusqu'à obtenir un pH de 9,6.
Ce tampon est conservé à 4°C.
tampon phosphate
0, lM, pH 7,4
solution A
NaH2P04H20 (Sigma) O,lM
3,864 g
eau distillée q.s.p.
280 ml
solution B
NA2HP04 (anhydre) (Sigma) O,lM
10,224 g
eau distillée q.s.p.
720 ml
La solution A est ajoutée à la solution B jusqu'à obtenir le pH 7,4 .
Ce mélange est conservé à 4°C.
tampon citrate-phosphate, pH 5
solution A
acide citrique C6H807 , H20 (Merck) 0,1 M
5,25 g
eau distillée q.s.p.
250 ml
solution B
Na2HP04 (anhydre) (Sigma) 0 ,2M
8,9 g
eau distillée q.s.p.
250 ml
La solution A est ajoutée à la solution B. Le pH est alors à 5.
Ce mélange est conservé dans l'obscurité à 4°C.
solution d'OPD (pour 10 plaques)
ortho-phénylène diamine (OPD) (Sig ma)
120 mg
eau distillée q.s.p.
12 ml
Elle est aliquotée à 1,2 ml dans des tubes d'Eppendorf et conservée à
l'obscurité à -30°C.
solution de révélation
tampon citrate-phosphate, pH
520,9 ml
OPD
1,1 ml
H2Û2 30%
5,5 ml
solution d'arrêt : acide sulfurique (H2S04) 4M.
Fig.
2.23.b

---

40
2.9.3. Protocole du dosage par ELISA de la vitellogénine
d 'Oreochromis niloticus
La démarche expérimentale comporte huit étapes.
Les puits sont soigneusement lavés après chacune de ces étapes. Les
lavages s'effectuent en retournant la plaque pour en vider le contenu et en
l'égouttant sur le papier absorbant afin d'en extraire les dernières gouttes.
Cette opération est renouvelée 3 fois et représente un cycle de lavage.
2.9.3.1. Greffage (coating)
L'antigène purifié, ici la vitellogénine du tilapia, et la solution servant de
témoin, ici le plasma de mâle témoin dépourvu de vitellogénine sont
greffés avec le tampon carbonate (200 ul/puits) (Fig. 2.23.b) dans les
puits de la plaque de microtitration.
Après une incubation de une nuit à 4°C ou de 2h à 37°C, la plaque est
retournée d'un coup sec au-dessus de l'évier pour vider tout ce qui n'est
pas accroché.
2.9.3.2.
Préincubation
Une gamme de vitellogénine purifiée est préparée en huit points de
concentration décroissante. Une gamme en 12 points de concentration
également décroissante est préparée pour le plasma femelle d'une part et
pour le plasma mâle d'autre part.
Une quantité constante d'anticorps primaire anti-VTG est ajoutée à
chaque point de concentration. Cette pré incubation sert à réaliser une
compétition entre la VTG du greffage, la VTG purifiée, le plasma de
femelle en vitellogénèse ou de mâle et l'anticorps spécifique.
La durée de cette préincubation est de une nuit à 4°C.
2.9.3.4. Saturation des sites aspëcifiques
200 JlI de PBST NPS (Fig. 2.23.a) sont déposés dans des puits de
microtitration. Les sites de fixation des parois restés libres sont saturés
avec ce tampon fortement concentré en protéines (à base de sérum de
porc). La durée de la saturation est de 30 min. à 37°C (étuve).
La plaque de microtitration est vidée. Elle est lavée trois fois avec du
PBST (Fig. 2.23.a) (1 minute par lavage).
2.9.3.5. Incubation avec l'anticorps primaire
L'anticorps primaire anti-VTG est déposé dans les puits témoins (N)
et dans ceux de la liaison maximale (Bo).
Les points de la gamme préincubée sont ajoutés dans les autres puits
de la plaque qui seront complétés par les points constitués par les plasmas
(femelle et mâle).
L'excès d'anticorps
réagira
ensuite
dans
les
puits
avec
la
VTG
Fig. 2.23.b : réactifs pour ELISA (suite)

---

4 1
greffée: plus il y a de la VTG dans l'échantillon, moins il reste d'anti-
VTG pour réagir avec le greffage et plus la coloration est faible.
Les dilutions sont faites avec le tampon PBST NPS. La durée de cette
incubation est de deux heures à 37°C (étuve). Les dépôts sont de 200
Ill/puits. Puis trois lavages au PBST à la pissette sont effectués.
2.9.3.6. Incubation avec l'anticorps secondaire
L'anticorps de porc anti-IgG de lapin est dilué au 1I2500ème dans le
tampon PBST NPS et déposé à raison de 200 Ill/puits sur la plaque.
La durée de l'incubation est de 45 minutes à 37°C (étuve).
Les puits seront ensuite lavés trois fois au PBST.
2.9.3.7. Incubation avec le complexe Péroxydase-
Anti-Péroxydase
(PAP)
Il est dilué au 1I5000ème dans le tampon PBST NPS et déposé à
raison de 200 Ill/puits. L'incubation dure 30 min à 37°C et permet de
révéler le complexe VTG/anti-VTG.
2.9.3.8.
Révélation
La solution de révélation de la péroxydase, la diaminobenzidine, est
préparée extemporanément pour chaque plaque, placée à l'abri de la
lumière et déposée à raison de 200 Ill/puits. C'est un substrat qui a l'état
réduit est incolore et qui oxydé par la peroxydase prend une couleur
orangée.
La coloration se développe à l'obscurité pendant 20 min à la
température ambiante.
2.9.3.10. Arrêt et lecture
La réaction enzymatique est stoppée par le dépôt de 50 pl/puits
d'acide sulfurique 4M (déposés sans vider la plaque).
La coloration est alors lue par un lecteur de microplaques (Titertek
Multiskan Plus UK II type 313, Flow Laboratories) à 492nm.
2.9.4. Expression des résultats
La gamme étalon permet de tracer une courbe des DO des rapports
Bi/BO en fonction de la dose d'antigène libre ajoutée.
Cette courbe est généralement exploitée sous forme linéaire du
logarithme du rapport BilBO en fonction de celui de la dose d'ag libre, où
Bi correspond à la liaison en présence de VTG libre
BO correspond à la liaison maximale en absence de VTG
libre,
suivant l'équation:
Logit Bi/BO = a . Log de la dose + b
où a et b sont des constantes de la droite.

---

a
0
A 0
o 0 0
o G~D0
i"'\\ GO 0
Ci)
G-1 )
O@
,c
Fig. 2.24.

---

42
2.10. RIA ou dosages radioimmunologiques.
La technique utilisée est basée sur le protocole RIA développé par
Fostier et al. (1978, 1982).
Cette technique comprend trois étapes:
- extraction du stéroïde plasmatique
- chromatographie de l'extrait sur colonne de Sephadex LH-
20 pour séparer les différentes classes de stéroïdes
- dosage.
2.10.1. Extraction des stéroïdes plasmatiques
Un volume de plasma est extrait par 4 volumes d'un mélange de
cyclohexane et d'acétate d'éthyle (1/1).
Les tubes sont alors congelés, puis la phase organique liquide
contenant le stéroïde est séparée de la phase aqueuse congelée. Celle-ci
décongelée est extraite une deuxième fois en suivant le même protocole.
Les deux phases organiques recueillies sont rassemblées et évaporées
en plaçant les tubes dans un bain-marie à 40°C sous courant d'air.
La fraction stéroïdienne extraite est reprise avec 2 x 100 ul d'éthanol
absolu (Merck) et conservée à -30°C.
Le rendement de récupération après extraction est calculé en ajoutant
2000 cpm de stéroïde tritié/1 00 ~l :
- d'une part, dans quelques tubes contenant 100 ul d'éthanol et 2,8
ml de scintillant (OCS : "Organic Counting Scintillant"). Ces tubes sont
mis à compter et servent de témoin de radioactivité avant extraction.
- d'autre part dans 500 ul de plusieurs plasmas avant extraction.
Il est nécessaire de tenir compte ensuite dans les calculs de ce
pourcentage de récupération.
2.10.2. Séparation des stéroïdes par chromatographie
La séparation des stéroïdes est effectuée par chromatographie sur
colonne de Sephadex LH 20 (Pharmacia-LKB 0,5 x 8 cm) en utilisant un
mélange dichlorométhane/méthanol (95/5) comme solvant d'élution.
Après évaporation du solvant d'extraction des fractions (ou de
l'éthanol si les fractions ont été conservées au congélateur avant la
chromatographie), l'échantillon extrait est repris par 300 ul de solvant de
chromatographie et déposé au sommet de la colonne. Les stéroïdes élués
sont recueillis dans des tubes séparés.
Fig. 2.24. : schéma du principe de compétition immunologique en
RIA

---

divers tampons
tampon RIA:
tampon phosphate 0,01 M, 7,25
tampon gélatiné à 0,01 % azoture de sodium
tampon d'anticorps:
tampon
RIA
additionné
de
0,5%
(poids/volume)
de
gamma-
globulines de lapin.
gamme étalon
La gamme étalon de stéroïdes non radioactifs purs est réalisée à partir
d'une solution mère à 100 Mg/ml du stéroïde dans l'éthanol absolu, par
dilution dans le tampon RIA.
traceur
Le traceur est constitué d'une solution de stéroïde tritié à 10000
cpm/IOûml dans le tampon RIA.
anticorps
L'anticorps est dilué dans le tampon RIA de façon à lier 40% à 50%
de la radioactivité ajoutée en incubation. En pratique, cette dilution
optimale est déterminée en incubant des dilutions sériées de l'anticorps
avec le traceur en concentration constante (l0000 cpm/IOû ml).
polyéthylène glycol 6000 (PEG Merck)
dilué à raison de 25% (poids/poids) dans du tampon phosphate.
Fig. 2.25.

---

43
0,5 ml de solvant sont ajoutés alors, puis cette fraction est recueillie
et éliminée. Ensuite 0,9 ml de solvant sont ajoutés, cette fraction est
recueilie : elle contient les androgènes. 3 ml de solvant enfin sont ajoutés
pour recueillir la fraction contenant les œstrogènes. Le solvant de
chromatographie est alors évaporé. Chaque tube est rincé par 2 x 100 pl
d'éthanol absolu (Merck) et conservé à -30°C jusqu'au dosage.
2.10.3. Protocole du dosage
2.10.3.1. préparation des différents tubes
Chaque dosage comprend
- 3 nuls (N)
- 6 tubes de liaison maximale (Bo), c'est à dire ne contenant
pas d'antigène
- la gamme étalon de stéroïde non radioactif pur (Steraloids)
en quantité connue, comprenant 12 points en triplicats
- les échantillons en duplicats.
2.10.3.2. réactifs utilisés
Ils sont décrits ci-après(Fig. 2.25)
2.10.3.3. principe du dosage
Comme pour l'ELISA, le complexe immunologique formé entre le
stéroïde et son anticorps spécifique est le résultat d'une compétition pour
se lier à cet anticorps spécifique entre le stéroïde non radioactif (froid)
présent dans la gamme ou les échantillons et le stéroïde radioactif (Fig.
2.24.).
Le marquage de l'antigène au lieu d'être enzymatique comme dans
l'ELISA est radioactif, et le tritium (3H) est utilisé. Mais le principe est
identique.
2.10.3.4. les étapes du dosage
Sont incubés, 100 Ml de plasma ou de gamme étalon avec 100 Ml
d'anticorps (anti-œstradiol ou anti-testostérone) dilués au
1/1000ème
pendant 2 heures à 4°C.
Puis on ajoute 100 Ml de traceur radioactif dilué à 20 000 cpm et on
incube toute la nuit à 4°C en présence de polyéthylèneglycol (PEG 6000,
Merck) de façon à favoriser la précipitation des complexes ag-ac formés.
Le lendemain matin, on centriguge le tout pendant 35 min à 2500g et
à 4°C. Le surnageant est éliminé par retournement des tubes sur papier
filtre.
Les culots contenant les complexes ag-ac froids et radioactifs sont
repris par 100 Ml d'éthanol permettant d'extraire tous les stéroïdes.
Fig. 2.25. : réactifs pour RIA

---

44
Sont ajoutés 2,8 ml d'OCS (Organic Counting Scintillant) et les tubes
sont passés dans un compteur à scintillation.
En RIA, comme dans le principe de l'ELISA, plus la radioactivité
décelée et élevée, plus la quantité de stéroïde froid, à doser est faible.
2.10.3.5. l'expression des résultats
Les résultats sont exprimés sous forme linéaire, correspondant au
logarithme du rapport Bi/Bo en fonction de celui de la dose de stéroïde
froid, où :
Bi représente la radioactivitée mesurée dans la gamme étalon ou
dans les échantillons au cours de la compétition,
Bo représente la radioactivité mesurée en absence de stéroïde froid
moins la radioactivité mesurée lorsqu'on place le stéroïde seul en présene
de tampons (NSB , non specifie binding),
et suivant l'équation
Logit Bi/Bo= a . Log(dose en pg) + b
a et b correspondant aux constantes de la droite obtenue.
Les résultats finaux tiennent compte de la dilution du dosage et du
rendement d'extraction du stéroïde.

---

Fig. 3.1

---

45
Ch 3 : Etudes microscopiques du
cycle
•
ovarien
3.1. Introduction
Le processus de développement des ovaires est très diversifié chez les
poissons (forme, coloration, volume).
Comme beaucoup d'auteurs, nous avons établi une description basée
à la fois sur l'observation microscopique des ovaires, tant en microscopie
photonique qu'en
microscopie électronique.
Nous
avons
également
analysé au cours du cycle, la répartition des ovocytes dans l'ovaire en
fonction de leur taille par analyse d'image après fixation dissociative.
Ceci nous a permis d'obtenir des résultats sur le cycle ovarien d'O.
niloticus.
3.2. Les colorations en microscopie photonique
Les méthodes de coloration qui ont été utilisées visaient à mettre en
évidence les différents constituants cellulaires de façon complémentaire.
3.2.1. Coloration à l'hématoxyline laque cuprique (Fig.3.!.)
Les membranes et les nucléoles apparaissent en brun alors que le
cytoplasme ovocytaire (ovoplasme) varie du brun très soutenu pour les
premiers stades du développement ovocytaire au beige rosé de plus en
plus clair au fur et à mesure que l'ovocyte grossit. Les globules vitellins
ont une couleur brun clair.
Cette coloration a le mérite de bien mettre en évidence les alvéoles
corticaux qui apparaissent incolores, encerclant la masse des globules
vitellins, à la base de l'ovoplasme périphérique.
Fig. 3.1.: Coloration à l'hématoxyline laque cuprique (x 63)
St 1 : stade 1; st 2 : stade 2 ; st 3j : jeune stade 3 ; st 4 : stade 4
~ : alvéoles corticaux
+:corps de Balbiani

---

Fig. 3.2
Fig. 3.3

---

46
3.2.2.
Coloration à l'hématoxyline de Groat-éosine-vert
lumière (Fig. 3.2)
L'ovoplasme passe du rose brun soutenu pour les ovogonies ou les
ovocytes de stade 1, à une couleur de plus en plus pâle et rosée au fur et à
mesure du dévelopement. Les inclusions vitellogéniques sont rose violacé
vif, donnant aux ovocytes une teinte d'autant plus rosée qu'elles sont en
nombre important.
3.2.3. Coloration au trichrome de Masson
(Fig. 3.6.)
Elle permet de distinguer rapidement les différents
stades
du
développement ovocytaire. Les ovocytes les plus jeunes apparaissent en
violet sombre tandis que le cytoplasme des plus âgés est très clair. La zona
radiata bien développée est colorée en brun jaune clair.
Cette coloration a le très grand avantage de très bien différencier les
inclusions
vitellines
par une
couleur rose
violacée,
permettant
la
visualisation des granules vitellins dans l'ovoplasme périphérique, ainsi
que celle des plaquettes vitellines, brun violacé, dans les gros globules
vitellins.
3.2.4. Coloration par l'azan de Heidenhain
(Fig. 3.3.)
L'ovoplasme varie du bordeaux sombre, pour les stades les plus
jeunes, au gris bleuté très clair pour les stades les plus âgés en passant par
de délicates teintes dégradées de plus en plus claires au fur et à mesure
que l'ovocyte se développe.
Les nucléoles et les noyaux prennent une teinte rouge éclatante. Les
matrices extracellulaires apparaissent en bleu soutenu, telle la lame basale
située entre la couche des cellules granulosaires et la thèque. La zona
radiata est brun jaune clair. Les globules vitellins varient du jaune clair à
l'orangé vif, alors que les alvéoles corticaux ont des teintes rose mauve.
Les hématies dans les vaisseaux sanguins sont rose carmin.
Fig. 3.2.: coloration à l'hématoxyline de Groat-éosine-vert lumière (x 63)
Fig. 3.3.: coloration à l'azan de Heidenhain (x 63)
+ : corps de Balbiani
st 1:
stade 1
st2 :
stade 2
st 3j: jeune stade 3
st 4j: jeuna stade 4
st 4:
stade 4
st 5:
stade 5

---

Fig. 3.4
Fig . 3.5

---

47
3.3. Résultats de microscopie photonique et électronique
3.3.1. Les différents stades de l'ovogénèse
Il s'agit d'observer le follicule ovocytaire, c'est-à-dire l'ovocyte
entouré de ses enveloppes.
De nombreux travaux ont été consacrés à l'étude du follicule de
diverses espèces de poissons par histologie en microscopie photonique.
Mais c'est l'immunocytochimie et la microscopie électronique qui ont
apporté des précisions sur la structure et la physiologie des ovocytes et
des oeufs pendant le déroulement de l'ovogénèse.
La différenciation ovogénétique à partir de
l'ovogonie est
un
phénomène progressif et complexe. Voici comment se présente l'échelle
en 6 stades de développement chez Oreochromis niloticus .
3.3.1.1.
ovogonies
Elles n'ont été observées qu'en microscopie photonique sur coupes
semi-fines incluses à l'Epon (Fig. 3.25.).
D'un diamètre d'environ 10 urn, elles sont caractérisées par un
rapport nucléo-cytoplasmique élevé. Le noyau ne présente pas de nucléole
et l'ADN est sous forme réticulée. Le cytoplasme est peu coloré par le
bleu de toluidine. Les rares ovogonies isolées possèdent une enveloppe de
cellules granulosaires très aplaties et en nombre limité.
3.3.1.2. stade 1
a) microscopie photonique
Ce stade ovocytaire est caractérisé par un cytoplasme présentant un
aspect homogène extrêmement dense et très colorable. Le rapport nucléo-
cytoplasmique est élevé. Le noyau présente très
tôt
un
début
de
fragmentation de ses nucléoles, dispersés dans le nucléoplasme pour les
ovocytes les plus jeunes, ou placés en périphérie nucléaire pour les plus
développés (Fig. 3.4., 3.5., 3.25.). Dans le cytoplasme périnucléaire un
matériel
très
colorable
semble
émerger
de
l'enveloppe
nucléaire
(Fig.3.5.)
Les ovocytes de ce stade dont la taille varie de 10 à 80 um présentent
tous un épithélium granulosaire séparé d'une thèque en monocouche par
une lame basale, les différentes couches étant très aplaties et les noyaux
très allongés. La Fig . 3.5 illustre la mise en place des premières cellules
thécales, migrant du tissu mésoépithélial vers la lame basale sécrétée par
les cellules granulosaires.
Fig. 3.4. : hematoxyline laque cuprique (x 63)
Fig. 3.5.: semi-fine colorée au bleu de toluidine (x 540)
atr : atrésie ; cg : cellule granulosaire ; ct : cellule thécale ; lb : lame
basale; st 1 : stade 1 ; st 2 : stade 2 ;
.,. : alvéoles corticaux,
.. : corps de Balbiani

---

a
ct
f
cg
gl
ac
n
n
N
\\en
Fig. 3.6
Fig. 3.7
Fig. 3.8

---

4 8
b) microscopie électronique
Nous n'avons pas eu la possibilité d'observer ce stade.
3.3.1.3. stade 2
Le début du stade 2 ou prévitellogénèse correspond à l'élaboration
des organites nécessaires à la synthèse et à l'accumulation des réserves
survenant pendant les étapes suivantes.
La fin du stade 2 correspond au début des synthèses ovocytaires et
constitue la vitellogénèse endogène encore appelée vitellogénèse de type 1.
a) microscopie photonique
Les ovocytes prévitellogéniques dont le diamètre varie de 80 à 120
um, sont caractérisés par un noyau possédant de nombreux nucléoles et
par un cytoplasme moins colorable qu'au stade 1. L'ovocyte est alors
entouré par des enveloppes constituées par une mince couche de cellules
granulosaires très aplaties, doublée par des cellules thécales également très
aplaties. La lame basale séparant la granulosa de la thèque est toutefois en
général bien visible en microscopie photonique à immersion lors de
l'utilisation de coloration spécifique tel l'Azan de Heidenhain.
Les ovocytes entrant en vitellogénèse de type 1 dont la taille varie de
120 à 200 um présentent quelques rares vacuoles à la périphérie de
l'ovoplasme de nature
PAS+
correspondant aux
premiers alvéoles
corticaux. Les premiers globules lipidiques sont identifiés par coloration
au bleu azur. La vitellogénèse glycoprotéique et lipidique au cours de
laquelle se mettent en place les alvéoles corticaux et les enclaves lipidiques
est
déclenchée
(Fig.
3.6).
Les
coupes
semi-fines
confirment
les
observations précédentes et soulignent la précocité d'apparition des
globules lipidiques et des alvéoles corticaux en fin de stade 2 (Fig. 3.7.).
b) microscopie électronique
Chez les plus jeunes ovocytes observés à ce stade, la membrane
plasmique ovocytaire ou ovolemme est à peu près lisse. Elle est séparée de
la couche de cellules de la granulosa par une matrice extracellulaire très
mince et peu dense aux électrons.
Fig. 3.6.: coloration au trichrome de Masson (x 63)
Fig. 3.7.: semi-fine colorée au bleu de toluidine (a) et au PAS (b)
(x 540)
Fig. 3.8.: micrographie électronique (x 3(00)
ac
: alvéoles corticaux ~
m
: mitochonchies
cg
: cellule granulosaire
meo: matrice extra ovocytaire.
ct
: cellule thécale
mvg
: microvillosités granulosaires
erg
: espace inter granulosaire
mvo
: microvillosités ovocytaires
en
: enveloppe nucléaire
N : noyau
gl
: globules lipidiques
n :
: nucléoles
lb
: lame basale
ovp
: ovoplasme périphérique

---

Fig. 3.9
Fig. 3.10

---

49
Le cytoplasme de ces ovocytes se présente sous forme de fines
granulations dépourvues de citernes de reticulum endoplasmique. Nous
avons observé dans certains d'entre eux de petites inclusions de lipides
ainsi que les premiers alvéoles corticaux caractérisés par un matériel
finement réticulé. Ces premières inclusions marquent le début de la
vitellogénèse de type l, autrefois dénommée vitellogénèse endogène.
L'examen de clichés pris lors des étapes successives d'accroissement de ce
stade indique que les mitochrondries très allongées et serpentiformes
migrent de l'ovoplasme périnucléolaire, où elles se multiplient, vers la
périphérie ovocytaire (Fig. 3.8.).
Chez les ovocytes de taille plus importante, en fin de stade 2,
l'ovolemme présente des microvillosités érigées vers les cellules de la
granulosa. Celles-ci émettent également des microvillosités en nombre
moins important, s'attachant de place en place à l'ovolemme, ménageant
entre elles des sortes de domes creux à l'intérieur desquels s'épanouissent
les microvillositées ovocytaires groupées par bouquets (Fig 3.8.). Les
mitochondries ovocytaires forment alors une couche très dense séparée de
l'ovolemme
par
une
zone
sans
organites
constituant
l'ovoplasme
périphérique.
Les enveloppes ovocytaires sont en place. L'épithélium granulosaire
est formé par des cellules encore aplaties séparées des cellules thécales par
une lame basale à structure irrégulière. En fin de stade 2 des espaces
intergranulosaires, se formant entre les desmosomes reliant les parois
latérales des cellules de la granulosa, commencent à apparaître.
3.3.1.4. stade 3
a) microscopie photonique
La taille varie de 200 à 600 um.
Le cytoplasme ovocytaire finement réticulé présente une série de 3
couronnes (Fig. 3.9., 3.26.). La première, la plus externe, est formée par
des alvéoles corticaux à la base de l'ovoplasme périphérique. La couronne
médiane est constituée par de petits globules vitellins. En position plus
centrale, la troisième couronne est constituée par des globules lipidiques.
Fig. 3.9.: stade 3 coloré à l'azan de Heidenhain (x 160)
Fig. 3.10.: stade 3 en semi-fme colorée au bleu detoluidine (x 540)
ac :
alvéoles corticaux
lb :
lame basale
cg :
cellules granulosaires
meo:
matrice extra ovocytaire
ct:
cellules thécales
N :
noyau
fg :
filaments granulosaires
n :
nucléoles
gl :
globules lipidiques
ov :
ovogonie
grv :
granules vitellins
zr :
zona radiata
st 2 : stade 2 ; st 3 : stade 3

---

ac
Fig. 3.11

---

50
Le nombre de nucléoles semble
moins
important qu'au
stade
précédent, mais ils sont beaucoup plus gros. La zona radiata est visible à
un grossissement de x 160 lors de colorations à l'azan de Heidenhain.
L'épithélium granulosaire est formé par des cellules cubiques à noyau
arrondi et on y devine de place en place des lacunes intercellulaires. La
lame basale de la granulosa est identifiable même à faible grossissement (x
63). Les cellules thécales pluristratifiées ont des noyaux toujours aplatis et
forment une thèque dont l'épaisseur est à peu près équivalente à celle de la
granulosa.
L'examen des semi-fines (Fig. 3.10.) conforte les observations
précédentes et permet de voir les petits granules vitellins dans l'ovoplasme
périphérique fusionnant pour donner de petits globules vitellins. Ils
migrent de façon centripète pour constituer la couronne moyenne bien
identifiable sur les coupes en paraffine. Les espaces entre les cellules de la
granulosa présentent des accumulations de matériel très fortement coloré
par le bleu de toluidine apparaissant soit sous forme de sections arrondies,
soit sous forme de filaments allongés suivant les plans de coupes. Nous les
avons appelés filaments granulosaires.
b) microscopie électronique
(Fig. 3.11.)
Ce stade est caractérisé par le dépôt de la zona radiata externa. C'est
une couche homogène, très dense aux électrons, déposée à la base des
microvillosités ovocytaires dans la matrice extracellulaire localisée entre
l'ovocyte et la granulosa, matrice qui apparaît beaucoup plus dense aux
électrons qu'au stade précédent.
L'ovolemme présente pour la première fois des puits d'endocytose et
des vésicules d'endocytose à clathrine, signalant les premières internali-
sations
ovocytaires
de
vitellogénine
d'origine
hépatique
principal
précurseur du vitellus, et le tout début de la vitellogénèse de type II. Les
premiers granules
vitellins
apparaissent à
la base
de
l'ovoplasme
périphérique mélangés à la partie supérieure de la couche dense de
mitochondries.
Plus
en
profondeur
les
alvéoles
corticaux
sont
observables, intercalés dans cette couche.
Les cellules de la granulosa présentent des lacunes intercellulaires
constantes à l'intérieur desquelles on peut voir des filaments très denses
aux électrons. Le cytoplasme de ces cellules a un aspect synthétique
caractéristique avec
un
dévelopement
du
reticulum
endoplasmique
(ergastoplasme) et un nombre important de mitochondries. Certaines
cellules thécales présentent des globules lipidiques et un développement de
reticulum lisse. La lame basale conserve son aspect très peu dense.
Fig.
3.11.:
micrographie d' un jeune follicule de stade 3 (x 5400)
ac :
alvéoles corticaux
lb :
lame basale
cg :
cellules granulosaires
m :
mitochondries
ct:
cellules thécales
ovp:
ovoplasme périphérique
eig :
espaces intergranulosaires
zre:
zona radiata extema
fg :
filaments granulosaires
+ : puits et vésicules
grv :
granules vitellins
d'endocytose

---

'sra
st3j
Fig. 3.12
Fig. 3.13
Fig_ 3.14

---

5 1
3.3.1.5. stade 4
a) microscopie photonique
C'est le stade de grand accroissement de l'ovocyte correspondant à la
pleine vitellogénèse ovocytaire de type II au cours duquel les processus
endocytotiques prennent le pas sur les processus de synthèse des alvéoles
corticaux et des globules lipidiques. Les ovocytes présentent alors un
diamètre allant de 600 à plus de 2000 um.
Les globules vitellins occupent alors tout le cytoplasme sauf au
niveau de l'ovoplasme périphérique (Fig . 3.12.). Ils fusionnent entre eux
pour former des globules énormes pouvant atteindre un diamètre de plus
de
60
um.
Leur
hétérogénéité
structurale
(Fig.
3.14.,
3.15.b),
parfaitement visible en microscopie photonique à immersion, correspond
à une condensation cristalline du
vitellus
en plaquettes fusiformes
disséminées dans une matrice d'aspect homogène (Fig. 3.17., 3.18.).
Les globules lipidiques sont en nombre relativement peu important,
disséminés dans l'ensemble du cytoplasme. Les alvéoles corticaux, de
taille beaucoup plus petite, environ 3 à 4 um cement l'ovoplasme
périphérique en une ligne continue. A la fin du stade 4 ils se regroupent
par paquets plaqués contre l'ovolemme formant des masses coniques
pénétrant le domaine des globules vitellins (Fig. 3.15.a et b). Leur
structure non homogène, reticulée, apparaît nettement sur les coupes
semi-fines (Fig. 3.18., 3.28.c, 3.29.).
Au fur et à mesure que l'ovocyte s'agrandit et se charge de réserves
vitellines , l'épaisseur de l'ovoplasme périphérique diminue. Lorsque la
vitellogénèse est terminée, il n'est plus
distingable
en
observation
photonique.
Les
coupes
serni-fines
permettent
de
suivre
l'évolution
des
enveloppes ovocytaires (Fig. 3.16.). En fin de stade 4, les filaments situés
dans les lacunes intergranulosaires sont toujours présents. En outre on
constate que les cellules thécales, pluristratifiées, présentent également de
larges lacunes intercellulaires à l'intérieur desquelles on distingue le
même type de filaments qui semblent orientés de façon perpendiculaires à
ceux liés à l'épithélium granulosaire.
Fig. 3.12.: jeune stade 4 coloré à l'hématoxyline de Groat-éosine (x 160)
Fig. 3.13. : détail de la zona radiata sur micrographie électronique (x 30000)
Fig. 3.14. : jeune stade 4 coloré à l'azan de Heidenhain (x 540)
ac:
alvéoles corticaux
mvg: microvillosités granulosaires
cg:
cellules granulosaires
mvo: microvillosités ovocytaires
dt:
clathrine
ovl :
ovolemme
cs:
capillaire sanguin
ovp:
ovoplasme périphérique
ct:
cellules thécales
pe:
puits d'endocytose
gl :
globules lipidiques
st3U)
stade 3 (jeune)
grv:
granules vitellins
zr :
zona radiata
gv :
globules vitellins
zre:
zona radiata externa
lb:
lame basale
zri:
zona radiata interna
meo:
matrice extra-ovocytaire
ve :
vésicules d'endocytose

---

ct
Fig. 3.16
Fig. 3.17
Fig. 3.18

---

52
b) microscopie électronique
Ce stade est caractérisé par la mise en place de la zona radiata
interna. Elle se développe se déposant entre les microvillosités ovocytaires
(Fig . 3.14.). Au fur et à mesure que les microvollosités granulosaires se
développent vers l'ovocyte, elles pénètrent dans les canaux de la zona
radiata où se trouvent les microvillosités ovocytaires. En effet, les
sections radiales montrent la coexistence dans les puits de chaque type de
microvillosités (Fig. 3.30.c). De façon identique les sections transversales
(Fig. 3.30.d) montrent plusieurs microvillosités coupées dans chaque trou,
dont on peut identifier l'origine. Les microvillosités ovocytaires ont une
section transversale plus faible que celle des microvillosités granulosaires
et apparaissent plus denses aux électrons par suite de la présence de
microfilaments d'actine, Cette zona radiata interna présente une structure
réticulée en arceaux, formée par un matériel fibrillaire noyé dans une
matrice homogène (Fig. 3.18., 3.30.b,c).
C'est à ce stade que l'endocytose de vitellogénine est la plus active.
De très nombreux puits à clathrine se détachent de l'ovolemme donnant
des vésicules à clathrine s'enfonçant dans l'ovoplasme périphérique (Fig.
3.13., 3.28.). Ces vésicules fusionnent probablement avec des vésicules
d'origine golgienne pour constituer les corps multivésiculaires. Nous
n'avons pas observé les phases de transition de ces corps multivésiculaires
en petits globules vitellins. Ces derniers fusionnent entre eux pour donner
des globules vitellins de plus en plus volumineux à l'intérieur desquels on
observe de nombreuses plaquettes vitellines fusiformes.
A la fin de ce stade, les filaments très denses aux électrons se situant
dans les espaces intergranulosaires présentent à leur surface, sur des
coupes transversales, des formations ramifiées semblant les relier plus ou
moins entre eux (Fig.3.31.c, d et e). Le cytoplasme des cellules de la
granulosa montre alors un aspect caractéristique de synthèse exogène avec
un ergastoplasme développé, laissant supposer que ces filaments sont
d'origine granulosaire (Fig. 3.31.c, 3.32.). Des filaments identiques
apparaissent à la base de la thèque le long de la lame basale de
l'épithélium granulosaire.
Fig. 3.15.: stade 4 évolué coloré à l'azan de Heidenhain
(a) x 63, (b) x 540
Fig. 3.16., 3.17. :en semi-fine colorée au bleu de toluidine (x 540)
Fig. 3.18.: micrographie de la périphérie du follicule
(x 12000)
ac:
alvéoles corticaux
gv:
globules vitellins
cg:
cellules granulosaires
lb:
lame basale
cmv: corps multivesiculaires
mvg: microvillosités granulosaires
ct:
cellules thécaIes
mvo: microvillosités ovocytaires
eig:
espaces intergranulosaires
pe:
puits d'endocytose
fg :
filaments granulosaires
pv:
plaquettes vitellines
gl :
globules lipidiques
zr:
zona radiata
grv :
granules vitellins
zn :
zona radiata interna

---

Fig. 3.19
~ ig. 3.20
F ig . 3.22
Fig. 3.21

---

5 3
3.3.1.6 stade 5
C'est la période de maturation ovocytaire précédant la ponte. Les
follicules ovocytaires ont atteint un diamètre d'environ 2,5 mm. Ce stade
très
fugace
se
caractérise par une
migration
du
noyau
(vésicule
germinative) vers la périphérie ovocytaire.
Après
la reprise de
la
première division méiotique et l'expulsion du premier globule polaire,
c'est à dire la première étape de transformation de l'ovocyte en ovule, les
ovocytes sont expulsables par légère pression sur l'abdomen. La femelle
ne mange presque pas. L'ovocyte est jaune foncé.
L'ovaire est au
maximum de son volume et il occupe une bonne partie de la cavité
abdominale.
La fin de ce stade est caractérisé par l'ovulation par la rétraction et
la disparition des microvillosités ovocytaires et folliculaires. La zona
radiata se transforme en un chorion plus mince dont les pores sont
partiellement bouchés. La rupture du follicule entraîne la libération de
l'ovocyte dans la cavité ovarienne. Le ROS est à 3%.
3.3.1. 7. oeuf dans la cavité bucco-pharyngienne
microscopie électronique à balayage
C'est la post-ponte. La gonade est flasque contenant de gros ovocytes
résiduels à divers degrés de dégénérescence ainsi qu'un nombre très
important de follicules post-ovulaires (Fig. 3.20.). Le ventre devient plus
petit, la femelle continue à ne pas manger à cause des oeufs incubés dans
la cavité bucco-pharyngienne.
Les observations faites en microscopie électronique à balayage sur
des oeufs récupérés dès le début de l'incubation bucco-pharyngienne ont
montré qu'ils ne sont entourés que par quelques filaments (Fig. 3.21.).
L'emplacement des canaux de la zona radiata est toujours apparent. Il ne
nous a pas été possible d'observer le micropyle.
Fig. 3.19.: stade 5 coloré à l'hématoxyline de Groat éosine (x 63)
Fig. 3.20.: follicules post-ovulaires, coloration à l'azan de
Heidenhain (x 63)
Fig. 3.21.: œuf prélevé dans la cavité buccale observé en MEB (x 92)
Fig. 3.22. : détail de sa surface en MEB (x 8000)
fg :
filaments granulosaires
fpo:
follicules post-ovulaires
st 2:
stade 2
st 5:
stade 5
tzr:
trous de la zona radiata

---

Fig.3.23:Rapport gonado-somatique chez la femelle d'Q. niloticus.
RGS
(en %)
4
3
2
1
1
2
3
4
5
cv
Stade de maturité
Fig. 3.24: Rapport hépato-somatique chez la femelle d'Q. Niloticus.
RHS
(en %)
1
4
3
2
1
1
2
3
4
5
cv
Stade de maturité

---

54
3.3.2. évolution de la répartition des follicules
ovariens
en classe de taille
L'examen de la distribution des
fréquences des diamètres des
follicules ovariens vitellogéniques (DFO) observée chez les femelles diO.
niloticus élevées à Rennes et prélevées à différentes phases du cycle sexuel
montre que cette distribution est bimodale (Fig. 3.33). Le premier mode
correspond aux follicules les plus jeunes, le second aux follicules les plus
avancés dans la vitellogenèse, évoluant vers une taille maximale au
moment de la ponte (2500 um). Les follicules non vitellogéniques d'un
diamètre inférieur à 500 um ne sont pas représentés sur le profil.
Cette évolution permet de définir différents stades de développement
ovarien en fonction de la valeur de la classe de taille la plus fréquente
dans l'ovaire. C'est ainsi qu'ont été définis 6 stades de développement
ovarien (Tacon, 1995) :
stades
modes
1
500-700
2
800-1000
3
1100-1300
4
1400-1600
5
> 1700
6
500-700 + > 1700
3.3.3. Les paramètres morphologiques ovariens
3.3.3.1. Rapport gonado-somatique (RGS)
(fig. 3.23.)
Le poids de la gonade est l'une des caractéristiques essentielles de
l'état de maturité du poisson. Ce poids est étroitement lié au poids et à la
taille du poisson. C'est pourquoi nous n'avons utilisé qu'une population
homogène de poissons pesant de 90 à 1oog.
Le rapport gonado-somatique qui a été utilisé se définit comme suit:
Pg
x 100
(Pg : poids de la gonade, Pp : poids du poisson éviscéré)
Ce RGS croît progressivement et atteint son maximum au stade
gonadique 5 où il est de l'ordre de 3% contre 0,4% au stade gonadique 1.
3.3.3.2. Rapport hépato-somatique (RHS)
(Fig. 3.24.)
Il se définit comme suit:
Ph
x 100
Pp
(Ph = poids du foie, Pp = poids du poisson éviscéré)
Quand les femelles sont immatures, et le RHS est de l'ordre de 1,2%.
Il décroît après le démarrage de la vitellogenèse de type II, où il est de
1%, et commence à augmenter pour atteindre le maximum au stade 4, où
il se trouve à 1,7 %. Puis il décroît avant la ponte.
Fig. 2.23. : R G S
Fig. 2.24.
RH S

---

Fig. 3.25

---

5 5
3.4. Discussion
La difficulté histologique essentielle est de pouvoir effectuer des
coupes lorsque l'ovocyte est riche en vitellus. Seule la technique proposée
par Baker (1941) et citée par Martoja et Martoja- Pierson (1967) a donné
les meilleurs résultats. Toutefois, Tacon (1991) obtient de très bonnes
préparations sur la même espèce en trempant la face des blocs contenant
les ovocytes entamés dans un détergent (Tergitol-7-Fluta) pendant Il
jours. Il peut ainsi ramollir le vitellus et faciliter la coupe.
Pour pouvoir interpréter les différentes étapes du développement
ovocytaire, nous avons entrepris une étude en microscopie électronique,
confortant et précisant nos observations en microscopie photonique.
3.4.l.Les étapes du développement ovocytaire
3.4.1.1. Les étapes de la vitellogénèse.
Nous avons observé au cours du développement ovocytaire les
différentes étapes caractéristiques de l'élaboration du gamète femelle.
La prévitellogénèse
Les premières étapes du développement ovocytaire, précédant celles
de l'accumulation de réserves, constituent la prévitellogénèse. Elles
correspondent au stade 1 et à la première partie du stade 2 du
développement
ovocytaire.
L'ovocyte
primaire
ou
auxocyte
à
2n
chromosomes commence à se développer et entame la première division
réductionnelle de sa méïose. Mais très vite les processus de division sont
bloqués en fin de prophase, au stade diplotène.
Le follicule ovocytaire, ou ovocyte entouré par ses enveloppes cellulaires
et acellulaires, est constitué dès le stade 1. La couche de cellules
granulosaires est alors formée par des cellules très aplaties, en nombre
restreint, mais ayant déjà sécrété leur matrice extra-cellulaire constituant
la lame basale. Les cellules thécales commencent à quitter le tissu
conjonctif extraovocytaire pour venir se placer sur la lame basale. Nous
avons constaté qu'à ce stade, chez le tilapia, elles sont en nombre très
limité (Fig. 3.25.) ne recouvrant pas encore dans certains cas toute la
surface de la lame basale (Fig. 3.5.).
Toujours dès ce stade 1, nous observons également l'initiation du
phénomène d'amplification nucléolaire. Il s'agit d'une multiplication très
importante des nucléoles se formant par l'amplification des organisateurs
nucléolaires (Clerot & Wegnez, 1977). Ces nucléoles migrent vers la
périphérie
du
noyau,
se
plaçant
à
proximité
de
la
Fig. 3.25. : Ovogonie et stade 1 colorées au PAS (x 540)
cme:
cellule mésoépithéliale
N:
noyau
cg:
cellule granulosaire
n:
nucléole
ct:
cellule thécale
ng:
nuage
lb:
lame basale
ov:
ovogonie
meo:
matrice extraovocytaire
st 1 :
stade 1

---

Fig. 3.26

---

56
membrane nucléaire interne, très souvent dans des replis qui forment sur
coupes transversales une crénélation générale de l'enveloppe nucléaire
(Fig. 3.4., 3.5., 3.7.). Cette proximité a été interprétée comme une
facilitation des échanges entre le noyau et le cytoplasme (Le Menn, 1984).
Cette augmentation du nombre des nucléoles correspond à l'amplification
des gènes 285 et 185, codant pour les ARN ribosomiques et restant
représsés pendant la pré-vitellogénèse. En effet, il a été démontré qu'à
partir de la fin du stade 2 l'activité nucléolaire aboutit à la formation
d'ARN ribosomique 55 et d'ARN de transfert, qui passent dans le
cytoplasme où ils sont stockés sous forme de particules nucléoprotéiques
sédimentant à 425 (Thomas, 1970 ; Denis & Mairy, 1972 ; Mazabraud et
al., 1975). Cette amplification caractérise généralement le stade 2 pour la
majorité des téléostéens (Yamamoto, 1964). Chez le tilapia, elle se
manifeste beaucoup plus précocément puisque nous pouvons l'observer
dès le stade 1.
Au même moment les chromosomes présentent une structure en
écouvillons, caractéristique d'une transcription intense (Callan, 1982)
pendant laquelle les ARN m nécessaires aux synthèses de l'étape suivante
vitellogénique passent du noyau au cytoplasme.
Le
matériel
périnucléaire
ovocytaire
très
colorable
que
nous
observons au cours du stade 1 (Fig. 3.25.) correspond aux "nuages"
(Clerot, 1968, 1976) présents dans les ovocytes prévitellogéniques de
nombreux téléostéens (revue Clérot, 1976 ; Bruslé, 1980 ; Wallace &
Selrnan, 1981 ; Selman & Wallace, 1989)). Ces nuages seraient formés de
ribonucléo-protéines (Guraya,1963 ; Riehl, 1978) à rôle restant inconnu.
La fin de ce stade prévitellogénique, correspondant au début du stade
2, est caractérisé par la mise en place des organites indispensables à
l'activité
synthétique
et
endocytotique
des
étapes
suivantes
qui
caractérisent la vitellogénèse. Il y a une multiplication importante des
mitochondries
productrices
d'énergie,
au
niveau
des
groupements
mitochondriaux (Toury et al., 1977) dans le cytoplasme périnucléaire.
Puis elles migrent dans l'ensemble du cytoplasme et en particulier vers
l'ovoplasme périphérique. On peut les trouver agglomérées en un point
du cytoplasme, en association avec des ribonucléoprotéines et d'autres
organites tels reticulum, dictyosomes ou corps multivésiculaires, formant
une masse appelée corps de Balbiani (Guraya, 1979 ; Bruslé, 1980 ;
Selrnan & Wallace, 1989) (Fig. 3.1., 3.3. et 3.4.). C'est également à la fin
de la prévitellogénèse que l'inhibition de la répression des gènes codant
pour les ribosomes est levée, et c'est à partir de ce moment là que les
ribosomes s'accumulent dans le cytoplasme, lui donnant en microscopie
électronique un aspect hétérogène.
Fig. 3.26. :
Irnrnunocytochirnie photonique sur cou pes en
paraffine a (x 40), b (x 1(0)
st 1,2 : stades 1 et 2 non vitellog éniques ; st 30), 4 : stades 3 (jeune) et 4
vitellogéniques.

---

Photoo èriode
!
( ~= )
1
Mélalonme
+
St ~rtid es
Hypothalamus. . : ..
. .
.':::.'
C" 1
1
sexoels J
Gnrti
GRIF
+ 1
1
St érrxdes
sex uels
r--------jl!s:i=~
H
GH
Gt H 1
GH
IGH
v<;
Foie
:% TAP
~~
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:::-
E2
lip idique
::::
...:::-:
\\
1
\\
Ha.
1
\\
\\
1
,
\\
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Jo4ét abolrs rne
Vtg
s t èro rc re n
\\
1
\\
1
\\
\\
1
St ér o d es
' -
S tér cso e s
_
- - sexoeis
sex oei s
Ovocyte
Fig. 3.27.

---

5 7
La vitellogénèse.
Chez Oreochromis niloticus, comme chez de nombreux téléostéens,
nous avons observé les premières manifestations vitellogéniques dès la fin
du stade 2.
Elles se traduisent par l'apparition dans l'ovoplasme de petits
globules lipidiques ainsi que de petits alvéoles corticaux. Ces derniers ne
font pas à proprement parler partie des réserves vitellines. Ils seront en
effet expulsés de l'ovocyte par exocytose au moment des processus de
maturation (Anderson, 1968 ; Selman et al., 1988) pour former le liquide
périvitellin isolant l'œuf de sa "coquille" ou chorion. Alvéoles corticaux
et
premiers
globules
lipidiques
correspondent
aux
premières
manifestations
d'une
activité
synthétique
vitellogénique
ovocytaire
constituant la vitellogénèse endogène de type 1. Une étude en microscopie
électronique montre que
c'est au cours de cette vitellogénèse que
l'ovolemme commence à émettre des microvillosités groupées en bouquets
en direction de la granulosa alors que les cellules granulosaires en
émettent de place en place vers l'ovocyte (Fig. 3.8.).
Cette première vitellogénèse, probablement très courte, compte tenu
de la rapidité de la croissance ovocytaire, est suivie par une étape
d'accumulation de vitellogénine plasmatique, synthétisée par le foie en
réponse à l'action des œstrogènes sécrétés par les enveloppes de l'ovocyte.
Cette vitellogénèse exogène se produit alors que l'endogène se poursuit,
constituant la vitellogénèse
de
type
II.
Parallèlement aux premières
images d'entrée de la vitellogénine dans
l'ovocyte,
la
microscopie
électronique montre la mise en place entre les microvillosités ovocytaires
d'une nouvelle matrice, très dense aux électrons, se déposant dans la
matrice extraovocytaire légère située entre l'ovocyte et la granulosa.
C'est la zona radiata externa dont le dépôt entre les microvillosités
implique
la
structure ponctuée.
Elle
serait
formée
par
exocytose
ovocytaire de matériel d'origine golgienne contenu dans des vésicules à
coeur dense (Fig. 3.28.) (Tesoriero, 1977, 1978) retraitant des protéines
dites vitellines (Oppen-Berntsen et al., 1992 ; Hyllner & Haux, 1992)
synthétisées par le foie sous induction œstrogénique (Hyllner et al., 1994 ;
Larson et al., 1994) et internalisées par une voie encore inconnue.
L'observation
simultanée
sur
les
micrographies
électroniques
de
l'endocytose de la vitellogénine et du dépôt de la zona radiata signe les
synthèses parallèles de ces deux types moléculaires (Fig. 3.30.a). Cette
simultanéité caractéristique des premières étapes de la vitellogénèse de
type II permet l'identification du début du stade 3 sur les coupes
observées à l'immersion en microscopie photonique avec une zona radiata
visible alors que les inclusions vitellogéniques ne le sont pas encore (Le
Menn & Burzawa-Gérard, 1985).
Nous pouvons distinguer aisément chez le tilapia comme chez la majorité
des téléostéens, deux phases dans cette vitellogénèse de type II. Lors de la
première qui correspond au stade 3, on constate une prédominance
Fig. 3.27.
Contrôle endocrinien de la vitellogénèse chez les
poissons (d'après Bon, 1996)

---

Fig. 3.28

---

5 8
des évènements autosynthétiques de l'ovocyte (formation des globules
lipidiques) sur les évènements hétérosynthétiques (synthèse hépatique de la
vitellogénine) se traduisant par l'endocytose de matériel exogène dans
l'ovocyte. Lors de la seconde, correspondant au stade 4, les mécanismes
sont inversés et l'endocytose de vitellogénine est très largement supérieure
aux synthèses endogènes (Wallace & Selman, 1981). C'est la phase de
grand accroissement de l'ovocyte.
L'ovocyte primaire ayant accumulé ses réserves possède à peu près
les dimensions et la structure de l'ovule. Pour parvenir à la maturité qui
le rend fécondable , il faut qu'il termine ses deux divisions méïotiques. La
maturation ovocytaire ou
transformation
de
l'ovocyte
primaire
en
ovocyte secondaire, qui commence par l'émission d'un premier globule
polaire, traduit la reprise des divisions méïotiques et la fin de la
vitellogénèse de type II. C'est souvent la pénétration du spermatozoïde qui
déclenche la
deuxième
division
méïotique entraînant l'emission
du
deuxième globule polaire et la transformation de l'ovocyte secondaire en
ovule. Ces processus sont très rapides chez le tilapia et ne nous ont pas
permis de pouvoir fixer les stades caractéristiques correspondants. En
effet, maturation, ovulation et fécondation ont en général lieu en quelques
heures pendant la nuit.
3.4.1.2. Les mécanismes de l'endocytose de la vitellogénine.
L'organisation des différents tissus constituant le follicule ovocytaire
du tilapia est identique à celle rencontrée chez les autres téléostéens. La
partie externe de la couche thécale est parcourue par de nombreux
capillaires sanguins. Il a été montré que, au cours de la vitellogénèse de
type
II,
la
vitellogénine
d'origine
hépatique
traverse
la
barrière
endothéliale des capillaires sanguins irriguant la thèque externe, traverse
la lame basale, passe entre les cellules de la granulosa, s'écoule dans la
matrice extraovocytaire localisée entre la granulosa et l'ovocyte, en se
glissant entre les microvillosités et la zona radiata et vient s'accumuler à
la surface de l'ovolemme à la base des microvillosités ovocytaires (Selman
& Wallace, 1982 ; Abraham et al., 1984 ; Le Menn & Burzawa-Gérard,
1985).
Les micrographies électroniques effectuées chez le tilapia montrent
Fig. 3.28. : Endocytose de la vitellogénine :
a) puits et vésicules à c1athrine (x 30000)
b) des puits d'endocytose aux corps multivésiculaires (x 300(0)
c) des corps multivésiculaires aux globules vitellins (x 6000)
ac :
alvéoles corticaux
ovl :
ovolemme
cmv: corps multivésiculaires
ovp:
ovoplasme périphérique
gl:
globule lipidique
pe:
puits d'endocytose
grv :
granule vitellin
pv :
plaquette vitelline
gv :
globule vitellin
vcd :
vésicule à cœur dense
m :
mitochondrie
ve :
vésicule d'endocytose
mvg: microvillosité granulosaire
zre :
zona radiata externa
mvo: microvillosité ovocytaire
zri:
zona radiata interna

---

Fig. 3.29

---

59
comme chez les autres téléostéens, une accumulation de matériel sur des
zones
privilégiées
de
l'ovolemme
invaginées
en
puits
à
clathri ne
(Fig.3.!3., 3.28.a et b). Ce sont des puits d'endocytose permettant l'incor-
poration de molécules de poids moléculaire élevé, mis en évidence pour la
première fois dans les années 60 (Roth & Porter, 1962 ; Fawcett, 1965).
Ces puits seraient des zones de concentration de récepteurs spécifiques de
la vitellogénine (Stifani et al., 1990 ; Le Menn & Nufiez-Rodriguez,
1991).
Ces récepteurs transmembranaires de
la famille des récepteurs
lipoprotéiques de faible densité (Bujo et al., 1994), sont reliés à la
clathrine par l'intermédaire d'une adaptine spécifique du
récepteur
(Pearse & Robinson, 1990). La clathrine est une protéine, commune à
tous les puits d'endocytose, polymérisée en triskélions accrochés les uns
aux autres en formant une sorte de panier (Pearse, 1976); et apparaît sur
les coupes ultra fines de microscopie électronique sous forme de points
denses aux électrons soulignant l'ovolemme (Fig. 3.13., 3.28.a et b). Elle
est
probablement
liée
au
cytosquelette
et
jouerait
un
rôle
dans
l'internalisation de la vitellogénine liée aux récepteurs. En effet ces puits
se referment en vésicules toujours entourées de clathrine entrant de façon
centripète dans l'ovoplasme périphérique (Fig. 3.28.a et b) pour fusionner
avec les corps multivésiculaires (Fig. 3.28.a). Ces corps multivésiculaires
sont des formations lysosomiales mises en place dans le cytoplasme chez la
truite arc en ciel
dès
la prévitellogénèse
(Sire et al.,
1994).
Ils
contiennent, outre de la phosphatase acide (Busson-Mabillot, 1984), de la
cathepsine D intervenant d'une part dans le clivage de la vitellogénine en
phosvitine et lipovitelline (Busson-Mabillot, 1984) et d'autre part dans la
formation des plaquettes vitellines (Wall & Patel, 1987). Les étapes
successives de transformation de ces corps multivésiculaires en petits
globules vitellins, puis en globules plus gros contenant des plaquettes
vitellines n'ont jamais été décrites en microscopie électronique chez le
poisson. Chez Oreochromis niloticus nous observons de la même façon
des structures différentes mais sans pouvoir affirmer comment se fait la
transformation dynamique entre elles (Fig. 3.28.a).
Une technique immunocytochimique ultrastructurale utilisant un anticorps
secondaire couplé à de l'or colloïdal (Fig. 3.29.) nous a permis de révéler
Fig. 3.29. : marquage immunocytochimique à l'or de la
vitellogénine au niveau :
a) de la périphérie du follicule (x 10000)
b) des pores de la zona radiata et des vésicules d'endocytose
(x 56(00)
c) des corps multivésiculaires et des globules vitellins
(x 56000).
ac:
alvéoles corticaux
mvo: micro villosités ovocytaires
cg:
cellule granulosaire
ovp:
ovoplasme périphérique
cmv: corps multivésiculaires
plv :
plaquette vitelline
gv:
globule vitellin
zre:
zona radiata externa
lb:
lame basale
zn :
zona radiata interna
+: puits et vésicules d'endocytose

---

fig. 3.30
c

---

60
chez notre tilapia le passage de la vitellogénine par les pores de la zona
radiata (Fig. 3.29.b) et sa localisation à la fois dans les corps multi-
vésiculaires et dans les petits globules vitellins (Fig. 3.29.a, c). Ces
observations
confirment
chez
ce
poisson
les
processus
généraux
d'endocytose de la vitellogénine par
l'intermédiaire
de
récepteurs
spécifiques (Chan et al., 1991).
3.4.1.3. Les matrices extracellulaires du follicule ovocytaire
Elaboration de la zona radiata
Les
premières
images
de
dépôt de
la
zona
radiata
extema
caractérisent le stade 3 avec le début de la vitellogénèse exogène (Fig.
3.10.et 3.11.). Cette zona radiata externa présente en ultrastructure un
aspect homogène dense aux électrons. Elle est déposée à l'intérieur de la
matrice extraovocytaire très peu dense aux électrons séparant l'ovolemme
de la couche granulosaire entre les microvillosités ovocytaires (Fig.
3.30a). De ce fait, elle forme une couche continue au dessus de l'ovocyte
percée de pores où passent les microvillosités. Chez Orechromis niloticus
nous n'observons qu'une seule couche dans cette zona radiata externa,
correpondant
à
la couche
C2,
décrite
chez
diverses
espèces
de
Cyprinodontidae par Thiaw (1993).
La zona radiata interna est déposée pendant la phase de grand
accroissement de l'ovocyte au cours du stade 4. Elle présente un aspect
réticulé formé par un matériel fibrillaire noyé dans une substance
homogène qui polymérise en formant des arceaux assurant à la couche
une structure relativement élastique (Fig. 3.14., 3.30.b et c). Ce type de
polymérisation
micro-fibrillaire
fréquemment
rencontré
dans
les
structures biologiques (Bouligand, 1972) constitue des structures souples,
déformables, souvent à fonction protectrice. La disposition des éléments
polymérisés est identique à celle que présentent in vitro les dérivés du
cholestérol, d'où le terme de structure cholestérique (Friedel, 1922 ;
Robinson, 1966). Cette architecture permet à cette enveloppe de s'étirer
au fur et à mesure que l'ovocyte accroît son volume.
Dès les premiers dépôts de la zona radiata interna, les cellules de la
granulosa émettent en direction de l'ovolemme des microvillosités qui
s'engagent dans les pores contenant déjà les microvillosités ovocytaires.
Les deux types de microvillosités sont alors observées à l'intérieur des
pores sur des coupes tangentielles de la zona radiata. Leur origine
granulosaire ou ovocytaire est distinguable. En effet (Fig. 3.30.d) les
Fig. 3.30. : Les étapes ultrastructurales de la formation de la zona
radiata :
a) stade 3 jeune (x 200(0), b) stade 4 (x 14(00), c) stade 4 âgé
(x 16(00), d) coupe tangentielle (x 28(00)
cg:
cellule granulosaire
ovp:
ovoplasrne périphérique
crnv:
corps rnultivésiculaires
zre:
zona radiata externa
rnvg:
rnicrovillo. granulosaires
zri :
zona radiata interna
rnvo:
rnicrovillo. ovocytaires

---

Fig. 3.31

---

6 1
microvillosités ovocytaires ont une section plus petite et apparaissent plus
denses aux électrons par suite de la présence d'un squelette de filaments
d'actine. La position de la zona radia interna entre la zona radiata externa
et l'ovolemme plaide en faveur d'une formation de l'ensemble de la zona
radiata par l'ovocyte (voir revue Le Menn, 1984). Des protéines d'origine
hépatique appelées protéines vitellines pénètreraient dans l'ovocyte et
seraient remaniées, probablement glycosylées au niveau des dictyosomes
de l'appareil de Golgi. L'ensemble des sécrétions golgiennes contenu dans
des petites vésicules lisses à coeur dense (Fig. 3.28.a et b) serait alors
déposé par exocytose au niveau de l'ovolemme (Tesoriero, 1977, 1978 ;
Le Menn, 1984). L'accroissement de la zona radiata se fait à partir de la
base, les dépôts récents repoussant les dépôts les plus anciens vers
l'extérieur comme cela a été observé chez les autres téléostéens.
Cette matrice extracellulaire (désignée par de multiples noms: zone
pellucide, enveloppe vitelline, corona radiata, chorion) peut être suivant
la définition de Ludwig (1874) considérée comme une enveloppe primaire
produite par l'ovocyte.
Elaboration des filaments granulosaires.
Leur sécrétion commence dès la vitellogénèse de type 1 (comparaison
Fig. 3.31.a et 3.31.bl). Elle semble latéro-latérale (Fig. 3.31.b1, c, e). Ils
apparaissent à l'intérieur des espaces intergranulosaires, répartis tout
autour des cellules de la granulosa, formant sur les coupes tangentielles
des dessins polygonaux (Fig. 3.31.b2) décrits de façon très précise par
Thiaw (1993) chez les cyprinodontes africains du genre Aphyosemion ou
Epiplatys , Ce type de sécrétion sans ordre bien précis correspondrait à ce
qui a été observé par Wourms & Sheldon (1976) chez Cynopoecilus
melanotaenia .
Un fort grosissement (Fig. 3.31.d) montre qu'ils sont formés par des
structures de type tubulaire, associées les unes aux les autres. Ces
filaments adhésifs seraient constitués de "tubules extracellulaires rigides à
disposition ordonnée élaborés par l'ergastoplasme, mais ne polymérisant
que dans les espaces intercellulaires" (Busson-Mabillot, 1977). Au cours
Fig. 3.31. : Formation des filaments granulosaires
a) stade 2 (x 3000 ),
b) stade 3 (1 = x 4000 ; 2 = x 560, coloration PAS)
c) détail au stade 3 des cellules granulosaires (x 6000 )
d) détail d'un filament granulosaire (x 40000)
e) l'épithélium granulosaire au stade 4 (x 8000)
cg:
cellule granulosaire
mv:
microvillosité
ct:
cellule thécale
mvo: microvillosité ovocytaire
eig :
espace intergranulosaire
N :
noyau
erg:
ergastoplasme
ovp:
ovoplasme périphérique
fg :
fùament granulosaire
ve :
vésicule d'endocytose
lb :
lame basale
zr :
zona radiata
m :
mitochondrie
zri :
zona radiata interna
...- :
tubule de fg isolés
fg en disposition polygonale

---

Fig. 3.32
~o
.0
STADE 1
STADE ..
JO
30
20
20
\\0
10
0
~o
'0
STADE 2
STADE 5
JO
JO
20
20
la
10
0
_ ~o
'0
.!!
w
0:
STADE 3
STADE 6
;C; JO
JO
-'
=>
~
-'
0 20
-
20
u,
w
0
Z
10
w
la
::>
0
w
0:
u,
0
soc
1000
iseo
2000
2500
500
1000
1500
2000
zsoo
Fig.
CLASSES DE TAILLE (jJml
3.33
CLASSES DE TAILLE 1~1

---

62
du stade 4 certaines polymérisations se font de façon isolée donnant, sur
coupes transversales des filaments granulosaires, un aspect périphérique
chevelu (Fig. 3.31.c, d).
L'ultrastructure granulosaire au cours de la vitellogénèse révèle une
activité synthétique certaine (Fig. 3.31.c, Fig. 3.32.). Le reticulum endo-
plasmique est développé, les mitochondries sont nombreuses et les
vésicules golgiennes évidentes. Les micrographies électroniques (Fig.
3.31.c, e ; 3.32.) plaident en faveur d'une sécrétion classique élaborée à
partir de l'ergastoplasme (reticulum endoplasmique) et des dictyosomes
de l'appareil de Golgi, puis évacuée par exocytose au niveau des
membranes latérales granulosaires à partir de vésicules de sécrétion
formées par la confluence des vésicules golgiennes.
L'absence de la plupart de ces filaments à la surface ovulaire (Fig.
3.21.) pose le problème de leur disparition en fin d'ovogénèse. Cette
absence chez une espèce à développement bucco-pharyngien mériterait
une étude spécifique anatomo-physiologique à mettre en relation avec une
présence de filaments adhésifs chez les espèces déposant leurs œufs sur le
substrat (Thiaw, 1993).
3.4.2. La répartition des follicules ovarrens
L'étude histométrique des follicules ovariens à partir de la mesure du
diamètre de follicules ovariens (DFO) fixés au Gilson a pour but de
fournir une référence quantifiée, alors que l'histologie fournit essentiel-
lement des informations qualitatives notamment sur l'initiation de la
vitellogénèse. Ces informations sont plus précises que le calcul du RGS ou
du RHS ainsi que l'ont démontré de Vlaming et al. (1982). La technique
histométrique des DFO présente surtout l'avantage d'être moins lourde à
réaliser que l'histologie.
Cette étude pratiquée sur des ovaires de différentes femelles à
différentes phases du cycle sexuel a permis de définir 6 stades typiques du
développement ovarien à partir du moment où les ovocytes sont en
vitellogénèse de type II (Fig. 3.33.) (Tacon, 1995). Ces stades sont plus
précis que le stade de développement proposé par d'autres auteurs
Fig. 3.32. : Sécrétion des filaments granulosaires (x 16000)
cg:
cellule granulosaire
fg :
filament granulosaire
d:
dictyosome
m :
mitochondrie
eig:
espace intergranulosaire
mv :
microvillosité
erg:
ergastoplasme
N:
noyau
~:
enveloppe nucléaire
...... :
sécrétion ergastoplasmique
/ :
vésicule golgienne
~:
vésicule de sécrétion
+:
exocytose
Fig. 3.33.: Profils de répartion des tailles des follicules dans un
ovaire (d <lJIès Tarn, lm)

---

63
(Peters, 1963 ; Dadzie, 1974 ; Babiker & Ibrahim, 1979 ; Hussein, 1984).
Ils correspondent aux stades 3, 4 et 5 du développement folliculaire.
L'analyse de ces stades montre que trois groupes d'ovocytes peuvent être
présents en même temps dans l'ovaire comme nous l'avons constaté en
microscopie photonique (Fig.3.!., 3.2., 3.3., 3.4.) : des ovocytes non
vitellogéniques (non mis en évidence sur les profils), des ovocytes en
stade 3, c'est à dire en début de vitellogénèse de type II et des ovocytes en
pleine vitellogénèse (stade 4 et 5). Comme l'ont déjà montré Babiker &
Ibrahim (1979) chez Oreochromis niloticus et Albaret (1982) chez
d'autres cichlidés, la présence simultanée de trois populations ovocytaires
dans l'ovaire avant ou pendant la saison de ponte range ces poissons dans
le type "group-synchronous " (de Vlaming, 1983 ; Wallace & Selman,
1981).
Nous constatons enfin qu'au moment de la ponte l'ovaire contient une
nouvelle vague d'ovocytes en vitellogénèse, comme nous l'avons observé
sur coupes histologiques (Fig. 3.20.).
Nous avons montré que la vitellogénèse de type 1 commence à la fin
du stade 2, c'est à dire pour des follicules ovocytaires de 120 à 200 urn de
diamètre. La vitellogénèse de type II correspondant à l'accumulation de
vitellogénine est initialisée chez des follicules d'une taille supérieure à 200
um. Von Kraft et Peters (1963) ont situé chez Oreochromis mossambicus
le début de la vitellogénèse à 300 um et considèrent que la vitellogénèse
est déjà très avancée entre 600 et 900 urn. Nos observations chez
Oreochromis niloticus montrent qu'elle est initialisée pour des diamètres
inférieurs. Il faut toutefois à nouveau faire remarquer que seule une
approche
en
microscopie
électronique
parallèle
à
la
microscopie
photonique pour le même stade, permet d'affirmer que des follicules de
200 um sont vitellogéniques. On se rend alors compte que la vitellogénèse
de type II commence très tôt alors qu'elle n'est pas détectable en
microscopie photonique.
3.4.3. Les paramètres morphométriques.
Etant donné que l'activité gonadique n'est pas saisonnière mais liée
exclusivement à la température de l'eau, nous avons établi les courbes
d'évolution du RGS et du RHS en fonction des stades de développement
ovocytaire lors de prélèvements effectués pendant un cycle complet de
reproduction à diverses périodes de l'année. Toutefois cette étude a été
effectuée sur des poissons issus toujours de la même population et du
même élevage à Nianga.
La courbe du RGS permet de comparer l'activité reproductrice de
diverses espèces de poissons et de déterminer les différentes étapes du
cycle reproducteur; mettant en valeur les faits spécifiques de l'évolution
de la gonade. Lorsque la ponte a lieu en une seule fois, le RGS est
toujours élevé: 27% chez la plie Pleunectes platessa (Lahaye, 1980), 25%
chez les Mormyridae (Albaret, 1982). Par contre chez le Cichlidae où la
ponte est étalée presque pendant toute l'année, le RGS est au maximum de

---

64
3% (Babiker & Ibrahim, 1979 ; Albaret, 1982 ; Adebisi, 1987). A la
station de pisciculture de Nianga, Oreochromis niloticus présente un RGS
de 3 %, valeur identique à celles indiquées pour cette espèce par les
auteurs précédemment cités.
Le RHS chez les femelles d'O. niloticus chute au stade 2 au moment
où la gamétogénèse est déclenchée et atteint une valeur maximale au stade
4 avant de rechuter pendant la maturité sexuelle et la période de
l'incubation
buccopharyngienne
des
œufs.
Ces
variations
sont
essentiellement dues à une mobilisation des lipides. Les auteurs distinguent
deux catégories de poissons (Rangis, 1937 ; Bougis, 1952 ; Lahaye, 1980)
- ceux qui accumulent les lipides au niveau du foie, nommés
"poissons maigres",
- et ceux qui accumulent les lipides dans le muscle, nommés
"poissons gras" .
Les variations du
RHS des
femelles
d'Oreochromis
niloticus
traduisent un métabolisme actif. Les graisses sont soit accumulées pour
préparer l'ovogénèse, pendant la phase de repos sexuel (stade 1) , ou la
ponte (stade 4). Elles sont alors mobilisées pour assurer les besoins
énergétiques reproductrices qui sont souvent anorexiques par suite de la
présence des œufs dans la cavité buccopharyngienne. Cette mobilisation
des graisses hépatiques a déjà été décrite chez d'autres espèces (Millot,
1928 ; Bougis, 1952 ; Le Gall, 1969). Plus récemment des auteurs ont
mené différentes recherches sur l'activité hépatique de plusieurs espèces
de téléostéen d'Europe pour aboutir à la même conclusion de la
participation du foie à l'ovogénèse (Billard & Breton, 1981 ; Nda, 1992).

---

65
Ch 4 •• Purification de la vitellogénine
et mise au point de son ELISA.
4.1. Introduction
Chez les Poissons, en particulier les Téléostéens, la VTG est une
lipoprotéine glycophosphorylée, de haut poids moléculaire variant de 300
à 600 kDa . Elle est synthétisée par le foie sous stimulation œstrogénique
et est stockée dans les ovocytes pour servir de réserves au futur embryon.
Les taux plasmatiques de VTG sont variables au cours du cycle sexuel,
passant de quelques ng/ml chez la femelle adultes n'ayant pas commencé
une nouvelle vitellogénèse à quelques dizaines de milligrammes par
millilitre en fin de vitellogénèse. Chez les Salmonidae, cette augmentation
commence plusieurs mois voire plus d'un an avant la ponte (Idler, 1979 ;
Sumpter, 1985 ; Copeland et al., 1986). Elle a été détectée chez le mâle
indépendamment d'un traitement œstrogénique (Ding et al., 1989 ;
Pelissero et al., 1991 ; Goodwin et al., 1992 ; Kishida et al., 1992). Quand
elle est détectable elle est indépendante de la maturité sexuelle (Copeland
et al., 1986).
La VTG est une molécule liant le calcium (Bailey, 1957 ; Booke,
1964 ; Woodhead, 1969). Certains auteurs ont aussi montré l'existence
d'un transport de fer (Hara et al., 1980). Elle se lierait également avec les
hormones thyroïdiennes (Mackensi et Ray, 1988).
Différentes méthodes ont été décrites pour déterminer le taux de la
VTG plasmatique, soit indirectes comme
la mesure
du
phosphore
protéique (Craik & Harvey, 1984 ; Nagler et al., 1987) ou du phosphore
alkali-labile (Wallace & Jared, 1968; Emmersen et al., 1979; Pelissero et
al., 1988) et du calcium liés aux protéines (Elliot et al., 1979 ; Hori et al.,
1979), soit directes
par reconnaissance
immunologique.
Parmi
ces
dernières,
certaines
sont
utilisables
sur
le
terrain,
comme
l'immunoagglutination (Le Bail & Breton, 1981). Si sa faible spécificité
permet de l'utiliser pour différentes espèces, son manque de sensibilité en
limite l'usage.
Un certain nombre de dosages radioimmunologiques (RIA) ont été
développés chez les poissons (la carpe : Tyler &
Sumpter, 1990 ;
l'anguille: Burzawa-Gèrard & Dumas-Vidal, 1991) et particulièrement
chez les Salmonidae (ldler et al., 1979 ; So et al., 1985 ; Sumpter, 1985 ;
Copeland & Thomas, 1988 ; Norberg & Haux, 1988 ; Benfey et al.,
1989). Ces dosages sont sensibles et spécifiques mais présentent des
difficultés de marquage radioactif de la VTG et une instabilité dans le
temps de ce complexe.

---

KDa
PM
t a
t 2
t 4
t 6 t 8
t10
t 12
t14
200 _
116 _
96 _
Fig . 4 .1 .

---

66
Les dosages immunoenzymatiques (ElA et ELISA) pallient ce défaut
car ils n'utilisent pas
d'antigènes marqués.
Ils
ont été
développés
notamment pour la VTG chez les poissons (l'esturgeon sibérien : Cuisset
et al., 1989 ; la sole : Nufiez Rodriguez et al., 1989 ; le poisson chat :
Goodwin et al., 1992 ; le bar : Mafianos et al., 1994 ; la sardine :
Matsubara et al., 1994 ; l'anguille japonaise : Okumura et al., 1995 ; la
truite : Mourot & Le Bail, 1995 et Bon et al., 1996). Ils ont des
sensibilités égales, voire supérieures à celles des RIA et leur spécificité
est très élevée.Un anti-sérum anti-VTG de truite Oncorhynchus mykis
n'offre pas de réactions croisées avec la VTG de la carpe Cyprinus carpio
ou du turbot Psetta maxima, les réactions d'immunoagglutination n'ayant
lieu qu'avec les Salmonidae (Le Bail & Breton, 1981).
Du fait de cette spécificité immunologique, la purification de la VTG
s'avère nécessaire pour chaque espèce afin d'obtenir des anticorps anti-
VTG
spécifiques.
C'est ce
que
nous
avons
réalisé
avec
l'espèce
Oreochromis niloticus.
4.2. Résultats
4.2.1. Oestrogénisation
Avant d'entamer une quelconque purification de la VTG, nous avons
vérifié par électrophorèse en PAGE-SDS la dynamique d'induction de
VTG par lm traitement au benzoate d'oestradiol (bE2) (FigA.l.) .
L'analyse électrophorétique permet de mettre en évidence quatorze
fractions protéiques, les plus légères étant les plus proches du front de
migration. Deux jours après la première injection de bE2 la VTG
commence à apparaître
sous forme de deux nouvelles bandes de poids
moléculaire élevé. L'intensité de ces bandes est constante à partir de la Se
injection d'œstrogène. Ceci s'explique par le fait qu'alors la capacité de
synthèse chez les poissons traités est maximum et a atteint un plateau.
4.2.2. Purification de la vitellogénine
Les échantillons dont l'électrophorèse présente une bonne induction
de la VTG sont alors utilisés pour la purification de cette molécule, soit
par la double chromatographie, soit par électroélution.
Fig. 4.1. : PAGE-SDS de contrôle de l'induction de la synthèse de
VTG par le bE2
Les flèches indiquent l'emplacement des fractions vitellogéniques
KDa
: kilodaltons
P.M.
: poids moléculaire
to
: plasma prélevé avant l'induction
t14
: plasma prélevé 14 jours après le début de l'induction

---

400
a
3 2
300
a
a
a
2S
200
ID
U
c
<Il
.0
0
li)
.0
«
100
Fract ion s (1 0 m il 10 min )
200
b
s-
a
a
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ID
100
u
c
<Il
.0
Ci
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«
1 5
o~=E:I;I'III!r.--'----'---r---r--r---.:;Œ.:np=~
o
10
20
30
~ o
50
60
fra ctions ( 10 mil 10 min)
500
C
3 8
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S-
a
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ID
u
c
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.0
200
Ci
li)
.0
«
100
0
0
20
40
60
Fra ction s
( 10 ml/10 min )
Fig. : 4.2 .

---

67
4.2.2.1. Purification par double chromatographie
La combinaison d'une chromatographie d'exclusion
moléculaire
(Sépharose 6B) avec une deuxième chromatographie échangeuse d'anions
(DEAE-Trisacryl-M) constitue une méthode progressive qui permet
d'obtenir une purification de la VTG en fonction de deux paramètres
physico-chimiques, le poids moléculaire et la charge électrique. Cette
technique a déjà été utilisée avec succès au laboratoire pour l'obtention de
plusieurs molécules, notamment la VTG de la sole Solea solea
(Nuiiez
Rodriguez, 1985), celle de l'esturgeon sibérien Acipenser baeri (Pelissero
et al., 1987), celle du bar Dicentrarchus labrax (Mafianos et al., 1994) et
celle de la truite arc en ciel Oncorhynchus myldss (Bon et al., 1996).
C'est pourquoi, nous l'avons choisie.
a) chromatographie d'exclusion moléculaire
La vitellogénine est une protéine de haut poids moléculaire; elle peut
donc
être
facilement
séparée
des
autres
protéines
sériques
par
chromatographie d'exclusion moléculaire, comme cela a été fait chez
Gadus morhua (Plack et al., 1971), Platichthys flesus (Emmersen &
Petersen, 1976), Salmo gairdneri (Hara & Hirai, 1978), Anguilla japonica
(Hara et al., 1980) et Heteropneustes fossilis (Nath & Sandararaj, 1981).
Séparation des pics
La VTG contenue dans un pool (3 ml) de plasmas induits par le bE2
est injectée sur la colonne contenant la Sépharose 6B. Ce volume
représente une quantité suffisante pour permettre la mise au point de cette
purification.
Le volume des fractions collectées en sortie de colonne est de 10
mUID min. Nous remarquons à l'examen de chaque chromatogramme
effectué que les profils d'élution des plasmas induits sont assez semblables
pour toutes les purifications. Nous présentons trois d'entre ceux qui nous
paraissent caractéristiques. Ils appellent toutefois certains commentaires :
Un premier pic est généralement obtenu aux alentours de 170 min. Il
correspond au pic d'exclusion de la colonne et contient les éléments les
plus volumineux ne passant pas par les pores de la sépharose. Ces
éléments sont souvent des goutellettes lipidiques de très faible diamètre et
des agrégats protéiques présents dans le plasma qui confèrent un aspect
irisé aux tubes contenant ces fractions. Ce pic n'a pas été observé avec le
plasma induit recueilli chez les individus ayant servi à étudier la
dynamique de l'induction de la VTG par le bE2. Ainsi dans la figure 4.2.a
le pic est totalement absent et dans la figure 4.2.b, il est d'une moindre
importance si on le compare à celui qui est observé pour un plasma
prélevé en fin d'induction œstrogénique comme c'est le cas
pour
Fig. 4.2. : Chromatographies d'exclusion en Sepharose 6B.
a et b : chromatogrammes de plasmas traités pour une dynamique d'induction de
la VTG.
c :
chromatogramme de plasma en fm d'œstrogénisation, sans prélèvements
séquentiels préalables.

---

KDa
PM 0
15
21
23
25
27
30
34
200 _
116 -
96 -
Fig . 4 .3.

---

68
le plasma représenté en figure 4.2.c. Ce plasma nous servira de référence
pour l'étude du profil d'élution en chromatographie.
Le deuxième pic dit d'élution de la VTG est obtenu au bout de cinq
heures. Il faut noter que l'absorbance ne revient jamais au niveau de base
entre l'exclusion et ce deuxième pic.
L'absorbance décroit très rapidement en fin délution du deuxième
pic puis réaugmente à nouveau, légèrement, pour former un troisième
pic. Celui-ci correspond à l'élution des dernières molécules plasmatiques
environ neuf heures après l'injection.
Identification des pics vitellogéniques en électrophorèse
Concernant
l'élution
représentée
à
la
figure
4.2.b,
l'analyse
électrophorétique des différentes fractions (Fig. 4.3.) montre que le tube
n? 15 contient essentiellement des constituants lipidiques. En effet dans
cette fraction, les bandes de la VTG ne sont pas visibles en électrophorèse
bien que la fraction présente une densité optique relativement élevée. Les
autres fractions 21, 23, 25 présentent le même type électrophorétique que
celui du tube 15. La VTG est localisée dans les fractions recueillies à
partir du tube 27 et jusqu'au tube 34. Il est tout à fait remarquable que la
VTG apparaisse dans le plasma induit sous forme de deux bandes d'un
poids moléculaire de 130 et 170 kDa alors qu'elle n'apparait que sous la
forme la plus légère de 130 kDa après cette première chromatographie
d'exclusion moléculaire. Nous constatons que lorsque la VTG apparaît, les
bandes des protéines de faible poids moléculaire diminuent d'intensité.
Les contrôles
électrophorétiques
correspondant
aux
chromato-
grammes 4.2.a et 4.2.c (non illustré) montrent que la VTG est localisées
respectivement des tubes 28 à 32 et des tubes 32 à 38.
Préparation du matériel pour la deuxième chromatographie.
Les tubes où la VTG est localisée sont identifiés, poolés, puis le
volume est concentré 10 fois sur cellule Amicon à l'aide d'une membrane
coupant à 30 000 Da. Nous obtenons ainsi un volume final de l'ordre de 3
ml, éliminant les protéines de poids moléculaire inférieur ou égal à 30000
Da.
b) chromatographie échangeuse d'anions
Séparation des pics
La solution de VTG nouvellement concentrée est aussitôt injectée sur
la colonne de la chromatographie échangeuse d'anions sur gel de DEAE-
Trisacryl-M. La fraction injectée est en solution dans du tampon Tris-
Base 100mM. L'élution se fait d'abord dans ce tampon pendant 100
Fig. 4.3. : Contrôle électrophétique de plusieurs fractions éluées
sur Sépharose 6B du chromatogramme représenté sur la
fig.4.2.b.
P.M.:
Standard de poids moléculaire
0: Plasma induit
15
tube n015
34
:
tube n034
La flèche correspond à la bande de viteIIogénine.

---

500
400
1 3
400
37
300
a
a
a
300
~
~
200
E
(1)
o
c:
(f)
m
200
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-e
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.0
100
ci
100
o-irm[]JJJ.--...--.!IiîrnIIÉ--,-ti~-r---=tL'llîImI;}-----.---+- o
o
20
40
60
80
100
Fra cti on s
(3m I/5 m i n .)
Fig . : 4.4 .
KDa
PM 0
'* 13 37 50 52 64
200 _
116 -
96
_
Fig.
4.5.

---

69
minutes environ de façon à éliminer les molécules non fixées sur la
résine. Puis on applique un gradient linéaire de Tris-Base allant de 100 à
300 mM pendant quatre heures. Le volume des fractions recueillies est de
3 ml. Elles sont collectées toutes les cinq minutes. Les densités optiques
des fractions éluées sont reportées sur une courbe en fonction de
l'absorbance à 280 nm.
La courbe obtenue (Fig. 4.4.) est cara ctéristique de toutes les OEAE
que nous avons réalisées. On observe :
. un premier pic d'élution de la colonne d'une intensité variable
suivant la nature
du pool
du
matériel
collecté
à
la
fin
de
la
chromatographie d'exclusion moléculaire.
. puis après la mise en route du gradient, trois pics successifs, bien
distincts, les deux premiers présentant des DO élevées.
Identification des pics en électrophorèse
L'identification des pics contenant la VTG se fait là encore, par
électrophorèse en PAGE-SOS. Les bandes obtenues montrent que:
- le premier pic élué est constitué par l'exclusion qui est
collectée au 13e tube (Fig. 4.4.a). Il correspond aux molécules qui ne se
sont pas fixées sur la colonne. La figure 4.5 . montre que ce pic analysé
dans le créneau 13 présente un électrophorégramme identique à celui du
pool concentré de la chromatographie d'exclusion moléculaire, analysé
dans le créneau marqué par une étoile (*). C'est un pic de rinçage,
souvent majoritaire, en particulier si la quantité injectée du pool
concentré de la chromatographie précédente est importante.
- le deuxième pic correspond au premier pic élué dès qu'on a
appliqué le gradient. Le contrôle électrophorétique de la fraction 37 de la
chromatographie 4.4. (Fig. 4.5.) montre qu'il s'agit de matériel lipidique
puisque bien que la DO soit très élevée, nous ne détectons pas de
protéines.
- la VTG est obtenue au niveau du troisième pic, c'est-à ·dire
dans le second pic suivant l'application du gradient.
L'analyse électrophorétique des fractions de ce pic (Fig. 4.5.) montre que
la VTG est en quantité plus importante dans la partie descendante de ce
pic : elle est présente dans les tubes 50 à 56. Elle apparait sous la forme
d'une seule bande d'un poids moléculaire d'environ 130 kOa.
Fig. 4.4.
Chromatographies échangeuses d'ions en DEAE
Trysacryl M.
Fig. 4.5.
Contrôle électrophorétique des fractions du
chromatogramme 4.4., en DEAE-Tr isacryl M.
P.M.
: standards de poids moléculaire
: plasma induit
0{c : pool vitellogénique purifié sur Sépharose 6 B
13
: pic d'exclusion
50
: pic vitellogénique
37
: pic lipidique
6 7 : pic protéique résiduel
Les fractions contenant de la VTG apparaissent en gras.

---

@
0
vtgl vtg2
~200
....
~116
~ 96
Fig . 4 .6 .

---

70
L'étude des différents gradients de concentration allant de 100 à
300mM de Tris base permet de constater que la VTG est décrochée de la
résine échangeuse d'ions autour de 200mM.
Préparation des aliquotes de VrG purifiée.
Les fractions où la VTG est localisée sont rassemblées et concentrées
sur cellule Amicon coupant à 10 000 Dalton de façon à obtenir une VTG
à environ 2 mg/ml. Ceci nécessite en général une concentration d'environ
8 fois.
Des aliquotes de 100 /JI sont préparées et stockées à -30°C. Une
aliquote est utilisée pour chaque injection à un lapin.
4.2.2.2. Purification par électroélution
L'électroélution de
la
VTG
est réalisée
à partir d'une sene
d'électrophorèses sur PAGE-SDS. Les deux bandes correspondant à la
VTG sont électroéluées séparément.
Une électrophorèse de contrôle est mise en route afin de vérifier
l'état de la VTG purifiée. Nous constatons qu'après électroélution,
chacune d'entre elle présente la même mobilité électrophorétique (Fig.
4.6.).
Dans la suite des étapes de purification, d'injection et de dosage
immunologique, seule la bande de poids moléculaire le plus élevé est
utilisée, c'est à dire la VTG2, parce que c'est celle qui apparaît en plus
grande quantité.
Un dosage par la méthode de Bradford (1976) est alors effectué
après concentration sur cellule Amicon (30 000 Da). La teneur en
protéines est de l'ordre de 200 ug/rnl. Des aliquotes de 400 /JI sont
préparées et stockées à -30°C. Une aliquote est utilisée pOUf chaque
injection à un lapin.
4.2.2.3. Evaluation du poids moléculaire de la VTG
Pour déterminer le poids moléculaire (PM) d'une protéine, on la fait
migrer parallèlement à un échantillon contenant des protéines de poids
moléculaire connu et ayant subi la même préparation. Nous avons utilisé
un kit de calibration électrophorétique Bio-Rad.
La comparaison des Rf, c'est à dire du rapport de la distance de
migration de la protéine sur la distance du front de migration, permet de
déterminer les poids moléculaires des protéines étudiées. On trace un
Fig. 4.6. : Contrôle électrophorétique de la purification de VTG
électroéluée
®
: plasma de mâle té
o
:plasma + VTG induite
vtgl
: fraction nOI électroéluée de la VTG induite
vtg2
: fraction n~ électroéluée de la VTG induite.
Les flèches indiquent la position des vitellogénines.

---

:!5
:A
:! J
, ,
-) :.1
116 ,2 5
1:
- :!.O
C'I
0
...J
1.')
t. X
y
1,6 5 - l, Dax
1.7
R = 0 ,991
1(,
15
-l l.i
-ll.1
un
(l.1
02
Log
(Rf)
Fig. 4.7.

---

7 1
graphe des Log des PM connus du kit en fonction du Log de leur Rf. En
se rapportant au graphique obtenu et en connaissant le Log du Rf de la
protéine inconnue, on peut en déduire son PM.
La VTG telle que nous pouvons l'observer en électrophorèse dans le
plasma induit comporte deux fractions Vtg 1 et Vtg 2 dont les P.M. sont
respectivement de 130 et 170 kDa (Fig. 4.7.).
4.2.3. Obtention d'anticorps spécifiques
Un prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de l'oreille
est effectué avant la première injection et servira de témoin d'absence
d'anticorps anti VTG d'O. niloticus chez le donneur.
A partir de la troisième immunisation, le sang est recueilli de la
même façon sept jours après l'injection.
Le titre de l'anticorps est testé par immunoprécipitation et par
ELISA. Une semaine après le dernier rappel, le sang est prélevé à raison
de 20 ml par kilogramme de lapin au niveau de la veine marginale de
l'oreille suivant le protocole décrit dans le chapitre 2.
Deux anticorps ont ainsi été développés, qui diffèrent par la nature
du matériel utilisé pour les injections :
- VTG purifiée par chromatographie
- ou VTG électroéluée (Vtg 2)
4.2.3.1 Tests de spécificité des anticorps
a) immunoprëclpitation
Les réactions d'immunoprécipitation ont été réalisées pour tester la
spécificité antigène-anticorps entre les deux anticorps anti-VTG et la VTG
purifiée.
La réaction immunologique se manifeste par la présence de
traits de précipitation entre le puits contenant l'immunsérum anti-VTG et
le puits contenant l'antigène correspondant.
Nous avons testé les immunsérums avant et après épuisement :
anti- VTG purifiée par chromatographie:
- non épuisé (Fig. 4.8.1a)
Nous observons une réaction nette entre l'anticorps et
.la VTG purifiée par double chromatographie, c'est à dire l'antigène
correspondant
· le broyat de vitellus
· le plasma induit
· le plasma de femelle en vitellogenèse
· et une très légère réaction avec le .plasma de mâle témoin.
Fig. 4.7. : Graphe du Log des Rf du kit de protéines standards en
fonction du Log de leurs poids moléculaire.

---

1
2
Fig. 4.8.

---

72
- épuisé (Fig. 4.8.1b)
Les traits de précipitations restent identiques honnis celui qui apparaissait
avec le plasma de mâle et qui disparaît alors.
anti- Vtg 2 électroéluée
- non épuisé (4.8.2a)
Nous observons une réaction nette entre l'anticorps et
· la VTG purifiée par double chromatographie
· le broyat de vitellus
· le plasma induit
· le plasma de femelle en vitellogénèse.
Il n'y a pas de réaction avec le plasma de mâle témoin.
- épuisé (Fig. 4.8.2b)
Nous observons une réaction nette entre l'anticorps et uniquement
· le plasma induit
· et le plasma de femelle en vitellogénèse.
b)
immunotransferts
Les immunsérums entiers ou épuisés, développés contre les deux
VTG ont également été testés en présence de différents antigènes séparés
en PAGE-SnS et transférés sur membrane d'immobilon (cf protocole,
chapitre 2).
Nous avons utilisé pour chaque blot :
· le plasma de mâle témoin
· le plasma induit
· la VTG purifiée par double chromatographie
· la Vtg 2 électroéluée
Nous avons ici encore testé les immunsérums avant et
après
épuisement.
l'anti- VTG purifiée par chromatographie révèle:
- non épuisé (Fig. 4.9.la)
· le plasma de mâle témoin sur toute la longueur du créneau
d'électrophorèse
· le plasma induit avec les deux bandes de VTG ainsi que d'autres
bandes protéiques plus légères
Fig. 4.8. : Immunoprécipitations par Ouchterlony
1 : avec anticorps anti-VTG purifiée par double chromatographie
1a : non épuisé
1b : épuisé
2 : avec anticorps anti- Ytg 2 électroéluée
2a : non épuisé
2b: épuisé
1 : plasma de mâle témoin
2 : YTG purifiée par double chromatographie
3: vitellus
4 : plasma de mâle témoin
5: plasma de femelle en vitellogénèse
6 : plasma induit par le bE2

---

cft é
o Vchr vtg 2 cfté
o
V chr
vts z
b
1
b
2
Fig. 4.9

---

7 3
· la VTG purifiée par chromatographie, sous forme d'une grosse
bande située au niveau de la Vtg 1 du plasma avec un poids moléculaire
proche de 130 kDa
· la Vtg 2 électroéluée qui se présente sous la même forme que celle
obtenue en PAGE-SDS, c'est -à-dire une seule bande de poids moléculaire
proche de 170 kDa.
- épuisé (Fig. 4.9.1b)
· les deux bandes vitellogéniques du plasma induit, les autres,
protéiques, étant pratiquement éteintes
· la VTG obtenue par double chromatographie avec une seule bande
très nette et sans contamination par des protéines sériques
· la Vtg 2 électroéluée, de façon identique au blot donné par
l'anticorps non épuisé.
Le plasma de mâle n'est pas du tout révélé.
l'anti- Vtg 2 électroéluée révèle :
- non épuisé (Fig. 4.9 .2a)
· les protéines de haut poids moléculaire du plasma de mâle
· le plasma induit caractérisé surtout par la présence des deux bandes
deVTG
· la VTG obtenue par double chromatographie, caractérisée par une
seule bande encadrée par des traces de protéines contaminantes
· la Vtg 2 électroéluée révélée par une bande encadrée de quelques
contaminations protéiques
- épuisé (Fig. 4.9.2b)
· le plasma induit qui présente les deux bandes vitellogéniques avec
seulement quelques très légères traces protéiques
· la VTG purifiée par chromatographie sous forme d'une seule bande
· la Vtg 2 électroéluée sous forme également d'une seule bande.
Comme pour l'anticorps précédent le plasma de mâle n'est pas du tout
révélé.
Fig. 4.9. : Immunotransferts (test de spécificité des anticorps anti-
VTG).
1 : avec anticorps anti-VTG purifiée par double chromatographie
la: non épuisé
lb: épuisé
2: avec anticorps anti-Ytg 2 électroéluée
2a : non épuisé
2b : épuisé
pl d'té
: plasma de mâle témoin
OPI + bE2
: plasma induit par le bE2
YTG chr.
: YTG purifiée par double chromatographie
Ytg2
: Ytg 2 électro éluée

---

Fi
4.10

---

74
c)
immunocytochimie
photonique
Nous avons seulement utilisé l'immunsérum anti-VTG purifiée par
électroélution et épuisé, à une dilution de 1/1OOOè.
La figure 4.10 permet de constater uniquement un marquage des
ovocytes en vitellogénèse de type II (stades 3, 4 et 5), alors que les
ovocytes de stade prévitellogénique restent totalement incolores (stades 1
et 2) . L'accumulation de vitellogénine apparaît sous forme d'inclusions
brunes, d'autant plus foncées qu'il y a de matériel vitellin.
Nous remarquons également sur cette coupe d'ovaire la présence de
follicules préovulaires atrétiques dont les restes apparaissent en brun noir.
électronique
C'est avec le même anticorps, utilisé à la même dilution (l/1000è)
que nous avons réalisé l'immunocytochimie ultrastructurale dont les
résultats sont présentés sur la Fig. 3. 29.
d) ELISA direct
Le contrôle immunologique a été également poursuivi en ELISA
direct,
technique
plus
sensible
que
les
précédentes.
Les
deux
immunsérums ont chacun été testés, épuisés ou non, en présence de plasma
de mâle témoin ou de vitellogénine purifiée par chromatographie ou par
électroélution.
Les résultats ont démontré une réaction avec le plasma de mâle
lorsque les immunsérums n'étaient pas épuisés, mais cette réaction non-
spécifique s'annulait après l'épuisement.
Les meilleures réactions immunologiques ont été obtenues avec
l'anticorps anti- Vtg 2 électroéluée, pour lequel on obtient une DO de 1,7
(condition optimale compte tenu du lecteur de plaque utilisé) en faisant
réagir
cet
anti-corps
dilué
au
1/40000è
sur
une
VTG
greffée
(indifféremment VTG 2 électroéluée ou VTG
purifiée par double
chromatographie) diluée à 600 ng/ml.
4.2.4. Mise au point d'un dosage immunoenzymatique de
type ELISA
4.2.4.1
Principe
Le but de notre travail était de mettre au point une méthode ELISA
pour l'anti-vitellogénine d'O. niloticus afin d'offrir une alternative aux
dosages radioimmunologiques déjà existants dans d'autres espèces.
Fig. 4.10. : Immunocytochimie photonique (test de spécificité des
anticorps anti- VTG)
stl
: stade 1
st2
: stade 2
st3
: stade 3
st4
: stade 4
fa
: follicule atrétique

---

7 5
Le dosage ELISA est basé sur la compétition entre la VTG libre (en
solution dans la gamme) et la VTG greffée (par adsorption) sur plaque de
microtitration, pour les sites de fixation de l'anticorps spécifique anti-
VTG. Lors de l'incubation de l'anticorps anti-VTG avec la VTG greffée
en présence ou non de la vitellogénine libre compétitrice, il y a formation
de complexe antigène-anticorps (VTG/anti-VTG).
Un
lavage permet
d'éliminer les complexes formés avec la VTG libre, tandis que ceux
formés avec la VTG greffée restent fixés sur la plaque et sont révélés par
une réaction enzymatique colorée utilisant le complexe peroxydase-anti-
peroxydase (PAP).
L'absorbance est mesurée à 495nm. L'intensité de la réaction est
proportionnelle à la quantité d'anticorps anti-VTG lié à la VTG greffée.
Bo : absorbance mesurée pour la liaison maximale de l'anticorps
anti-VTG sur la VTG greffée en absence de
VTG libre
compétitrice.
Bi: absorbance mesurée pour la liaison de l'anticorps anti-VTG sur
la VTG greffée, en présence de VTG libre compétitrice.
Nm : absorbance moyenne mesurée pour la liaison non spécifique de
l'anticorps anti-VTG, en présence de plasma de mâle témoin
greffé.
Les résultats sont exprimés en pourcentage de la liaison maximale
Bo. Puis ces résultats subissent une transformation de type Log-Logit, qui
permet par la suite leur linéarisation grâce à l'obtention d'une droite de
régression du type :
logit y = a + b log X
avec: logit Y = log (Y /1- Y)
et
Y = BilBo
a et b constants.
Les exigences de toute mise au point d'un dosage immunologique
restent classiquement toujours les mêmes:
Il s'agit d'obtenir pour notre méthode:
- une bonne sensibilité
- une grande spécificité
- une bonne reproductibilité
- une mise en oeuvre rapide, dans la mesure du possible.
Le protocole standard du dosage ELISA de la VTG d'O. niloticus, tel
qu'il est rapporté dans le chapitre 2, décrit les conditions définitives,
adoptées après avoir testé les conditions de différentes parties du dosage.
Notre propos dans le présent paragraphe, est de détailler les tests que
nous avons effectués au cours des différentes étapes de mise au point du
protocole standard.

---

76
4.2.4.2 Protocole standard
t-
Greffage: VTG ou plasma de mâle témoin à 600 ng/ml,
une nuit (15 h) à 4°C
1bis-
Préincubation de l'anticorps anti- VTG (Ac 1aire) à une
dilution finale de 1140 000, avec le standard de concentration connue en
VTG ou les échantillons à doser, 1 nuit à 4°C
2 -
Saturation : PBST NPS, 112 h à 37°C
suivi d'un cycle de lavage
3 -
Incubation de l'Ac taire à une dilution de 1140000, et
des échantillons, avec la VTG greffée, 2h à 37°C
et cycle de lavage
4 -
Incubation avec l'anticorps secondaire de porc-anti-
IgG de lapin, dilué 1/2500, 45 min à 37°C
et cycle de lavage
5 -
Incubation avec le complexe PAP dilué 115000, 30
min à 37°C
et cycle de lavage
6 -
Révélation: 30 min à température ambiante, à l'obscurité
7 -
Arrêt de la réaction enzymatique par ajout de 50
ul/puits de H2S04 4M
8 -
Lecture à 495 nm.
L'anticorps primaire utilisé est l'anticorps développé contre la Vtg 2
électroéluée, utilisé épuisé à une dilution finale de 1140 000.
Pour le greffage, nous avons utilisé la Vtg 2 électroéluée à une
concentration de 600 ng/ml.
4.2.4.3
Concentrations de
l'anticorps
Jaire et du
greffage
Notre souci lors de la mise au point du protocole a donc été, dans un
premier temps, d'établir les concentrations optimales de travail tout en
cherchant pour chaque étape à déterminer le temps minimum requis pour
que la réaction soit complète. Nous nous sommes d'abord limités à l'étude
des variations des densités optiques en
fonction
du temps
et des
concentrations optimales lors de chaque étape.
Chaque paramètre a donc été étudié de façon à ce que les valeurs des
densités optiques des "NSB" soient les plus basses possibles et celles des
Bo les plus fortes possibles.
Cependant le lecteur de densité optique "Titertek Multiskan Plus MK
II'', type 313 ne peut fonctionner qu 'entre 0 et 2.0 unités de densité
optique. Ainsi, il nous fallait éviter de mettre en place des conditions
expérimentales amenant la densité optique des puits Bo à dépasser 2.0,
limite au-delà de laquelle la lecture n'est plus possible. En conséquence,

---

BilBo (% )
100
80
60
a
40
20
10
100
1000
10000
Dose (ng/ml)
D
Préincubation 1 nuit à 37°C
o Préincubation 1 nuit à 4°C
•
Préincubation 2h à 37°C
A
Préincubation 2h à 4°C
•
Sans préincubation
Logit (BilBo)
3
2
b
·1
-2
-3
10
100
1000
10000
Dose (ng/m!)
D
Pr éincubation 1 nuit à 37°C
Y= 3,45 - 0,99x
R"2 = 0,98
0
Préincubation 1 nuit à 4°C
Y= 3,89 - 0,89x R"2 = 0,99
Pr éincubation 2h à 37°C
Y= 3,88 - 0,85x R"2= 0,99
6.
Préincubation 2h à 4°C
Y= 3,69 - 0,69x R"2=0,98
•
Sans préincubation
y = 3,05 - 0,53x R"2 = 0,95
Fig. 4.11

---

77
notre objectif a été de s'approcher d'une valeur d'environ 1.8 unités de
densité optique afin d'augmenter l'écart entre les valeurs des pu:its
"blancs" et celles des puits "NSB". En utilisant une dilution de l'AC jaire
au 1/40000 en présence d'un greffage de la VTG à 600 ng/ml, nous avons
obtenu des valeurs de Bo proches de 1.8 unité D.O. et des "NSB" voisins
de 0.1 unité D .O.
Ceci nous a permis, dans un second temps de passer à l'établissement
des courbes standards (BlBo et Logit BlBo) tout en sachant qu'un bon
écart entre les densités optiques des puits "NSB" et des puits "Bo"
permettrait un meilleur étalement et une meilleure observation de ces
courbes standards.
4.2.4.4 Etape de préincubation
Un des critères à respecter est l'obtention pour la gamme étalon,
d'une droite de régression présentant un bon coefficient de corrélation et
une pente proche le plus possible de -1, ce qui permet une bonne précision
de dosage.
Les conditions de préincubation de l'anticorps avec la VTG de la
gamme étalon ont donc fait l'objet d'un examen détaillé, dont les résultats
sont rapportés aux figures 4.11 .a et 4.11 .b.
Après
transformation
Logit-Iog
(Fig.
4.11.b),
les
régressions
linéaires apparaissent assez diverses. Si nous nous référons à la pente des
droites obtenues, nous constatons que trois des cinq conditions testées
donnent une pente suffisamment proche de -1 :
· la préincubation une nuit à 37°C,
· une nuit à 4°C
· et la préincubation 2h à 37°C.
Les autres conditions peuvent dors et déjà être écartées.
La préincubation durant une nuit à 37°C a été écartée parce que ne
présentant pas une corrélation suffisante, bien qu'elle soit caractérisée par
la meilleure sensibilité.
Enfin, entre une préincubation de une nuit à 4°C et celle de 2h à
37°C, nous avons retenu la première, dont la pente est la plus proche de
-1, et qui pennet plus de facilité dans l'aménagement de l'emploi du temps
pendant la manipulation.
La spécificité du dosage peut être éprouvée
en
vérifiant
le
parallélisme de la droite de régression de la gamme étalon avec celles de
dilutions sériées de diverses solutions antigéniques
Fig. 4.11. : Sélection des conditions de préincubation de
l'anticorps avec la VTG de la gamme étalon.
a) évolution des Bi/Bo en fonction du Log de la dose de la gamme étalon
b) régr éssions linéaires après transformation Logit-log.

---

Logit (BiIBo)
4
3
2
o
-1
-2
10
100
1000
10000
Dose (ng/ml)
a Standard VTG
y = 4,94 - 0,99x
R"'2 = 0,98
• Femelle n°l
y = 5,75 - 0,88x
R"'2 = 0,98
0
Femelle n02
y = 6,02 - 0,83x
R"'2 = 0,85
Fig. 4.12.

---

7 8
4.2.4.5 Vérification de la spécificité du dosage
Dans le cas présent, nous avons testé dans une même manipulation,
des dilutions sériées (de deux en deux) de plasmas de femelles en
vitellogénèse ou de mâles.
Nous savions déjà, pour l'avoir démontré précédemment, que notre
anticorps développé contre la Vtg 2 électroéluée, lorsqu'il est épuisé, ne
réagit
pas
avec
le
plasma
de
mâle
en
immunoblotting
ni
en
immunoprécipitation. Il nous fallait toutefois vérifier cette absence de
réaction en ELISA, qui est une technique beaucoup plus sensible que les
deux précédentes.
Sur la figure 4.12. sont représentées les droites de
régression
obtenues pour les dilutions de plasma de femelles en vitellogénèse : leur
parallélisme avec la gamme étalon de VTG prouve
l'identité entre
l'antigène reconnu dans ces plasmas de femelles et la VTG purifiée.
Sur cette même figure ne sont pas présentées les dilutions sériées de
plasma de mâles, qui auraient pu être figurées par un trait horizontal,
absolument pas parallèle à la gamme étalon.
4.3. Discussion
La vitellogénèse est une étape importante du développement ovarien.
L'embryon devra trouver dans l'oeuf, les substances nutritives qui lui
seront nécessaires pour assurer sa croissance. Ces substances constituent le
vitellus. Pour tous les Vertébrés inférieurs le vitellus est formé à partir
d'une protéine plasmatique précurseur: la vitellogénine (VTG). Elle est
synthétisée dans le foie chez la femelle pendant la période de l'ovogénèse,
et chez le mâle ou la femelle immature après une induction œstrogénique.
Elle est incorporée sous stimulation gonadotrope dans l'ovocyte en
croissance et transformée en vitellus. L'ensemble de ces phénomènes
constitue la vitellogénèse dite exogène (Wallace, 1985 ; Le Menn &
Pelissero, 1991).
Chez les poissons, en particulier les Téléostéens, la VTG est une
lipoprotéine glycophosphorylée, d'une masse moléculaire variant de 300 à
600 kDa. Chez certaines espèces, le contenu lipidique de cette VTG est
très élevé et représente environ 20% du poids de la protéine (Campbell &
Idler, 1980 ; De Vlaming et al., 1980) .
Fig. 4.12. : Droites de régression des dilutions de plasma de
femelles en vitellogénèse.
(standard VTG : gamme étalon)

---

79
L'objectif de notre travail sur la vitellogénine comporte plusieurs
points:
- son induction chez les mâles et les femelles immatures,
- son identification,
- sa purification,
- sa caractérisation,
pour enfin
comprendre
certains
mécanismes
d'action
de
quelques
hormones notamment l'œstradiol et la testostérone.
4.3.1.
Induction
de
la
vitellogénine
(VTG)
par
le
benzoate d'œstradiol
Depuis les travaux de Le Menn et Lamy (1976), Hori et al. (1979),
Le Menn (1979) et De Vlaming et al. (1980) qui ont induit la VTG par
l'œstrogénisation des mâles ou des femelles immatures, de nombreux
auteurs continuent encore à effectuer ces expériences sur différentes
espèces de poissons. Parmi ceux-ci nous pouvons citer : Bogomolnaya
&Aron (1984), Pelissero (1988), Waagboe & Sandnes (1988), Ding et al.
(1989), Tyler & Sumpter (1990), Chan et al. (1991), Hyllner et al.
(1991), Degani & Boker (1992), Kishida et al. (1992), Lee et al. (1992),
Silversand et al. (1993), Mafianos et al. (1994) et récemment Buerano et
al. (1995) sur Oreochromis niloticus
qui est le modèle de notre
recherche.
Au bout de sept injections de benzoate d'œstradiol chez les mâles et
les femelles immatures d'Oreochromis niloticus, le niveau des protéines
plasmatiques dosées par la méthode de Bradford (1976) est de l'ordre de
50mg/ml. Cette même valeur a été trouvée exactement par Maüanos et al.
(1992) chez des mâles de Dicerurarchus labrax après quatre injections
d'œstradiol-TIf de 5mg/kg de poisson. De même Lee et al. (1992) ont
induit de la VTG chez diverses espèces de Perciformes avec des doses de
17~-œstradiol de 4mg/kg de poisson et constatent que la VTG est induite
en quantité importante dès la quatrième injection.
Comme l'ont décrit plusieurs auteurs (chez Gobius niger : Le Menn,
1978 ; chez Oreochromis aureus : Ding et al., 1989 ; chez la truite arc en
ciel Oncorhynchus mykiss : Bon et al., 1996) nous constatons qu'une forte
induction de vitellogénine entraine une augmentation de la protéinémie
générale (93mg/ml au bout de 20 jours d'induction pour notre tilapia
contre 6 mg/ml pour les mâles témoins) qui tend à être régulée par un
abaissement du taux des protéines de faible poids moléculaire (cf Fig.
4.1.).

---

k Da
PM
a
b
c
d
e
f
9
h
2 00 __
116 __
96 __
Fig . 4 .13.

---

80
4.3.2.
L'identification
de
la
VTG
plasmatique
par
électrophorèses et techniques associées
4.3.2.1.
Généralités
a) PAGE -SDS
Les électrophorèses e~n gel de polyacrylamide nous ont permis de
localiser la VTG plasmatique, de suivre sa. dynamique d'apparition dans la
plasma sous l'action du benzoate d'œstradiol chez les mâles ou les femelles
immatures, et de préparer l'électroélution des fractions vitellogéniques
pour vérifier la pureté de la purification . pratiquée. Cette méthode a en
outre l'avantage de pouvoir, à partir d'un prélèvement sanguin non
traumatisant, séparer les poissons vitellogéniques des immatures et des
mâles sans passer par l'histologie qui est non seulement beaucoup plus
longue mais nécessite également de sacrifier les animaux.
Les études consacrées à l'électrophorèse des protéines sériques des
poissons sont déjà nombreuses. Diverses modalités de cette technique ont
prouvé leur application dans ce domaine. Les premiers travaux réalisés
sur gel d'amidon (Orillon et al. 1963 ; Creyssel et al., 1964) ont identifié
les différentes fractions plasmatiques qui
opposent les Téléostéens,
Sélaciens et Cyclostomes. L'électrophorèse sur gel d'acétate de cellulose a
ensuite permis une
meilleure définition
des
différents
constituants
plasmatiques et, pour la première fois, la visualisation en électrophorèse
native de deux formes de vitellogénine chez Gobius niger (Le Menn,
1978). Olivereau & Ridgway (1962) ont les premiers utilisé le PAGE-
SOS pour séparer les Oncorhynchus sp en vitellogénèse ou immatures.
Le gel de polyacrylamide est un excellent support pour la séparation
électrophorétique des différents constituants protéiques. Ce gel est formé
d'un réseau dont les mailles constituent un tamis qui retient les différentes
fractions suivant leur taille. La séparation des constituants du mélange
protéique se fait à l'intérieur du gel sous l'influence du courant électrique,
les protéines chargées différemment se déplacent et se séparent les unes
des autres. Lors d'une électrophorèse de type natif la séparation se fait en
fonction du poids moléculaire, de la forme et de la charge de la molécule.
Lors d'une électrophorèse en milieu SOS qui charge toutes les protéines
de façon négative, la séparation se fait uniquement en fonction du poids
moléculaire.
Fig. 4.13. : Contrôle électrophorétique en PAGE-SnS des
vitellogénines plasmatiques de poissons en présence ou
en absence d'un agent reducteur (ô-mercaptcêthanol).
+ t3-m : en prézence d'agent réducteur (b, d, f, h)
-û-rn
: en absence d'agent réducteur (a, c, e, g)
PM
: standard de poids moléculaire,
kDa: kilodalton
a, b
: plasma induit par le bE2
)
c, d
: Vtg 2 électroéluée
) d'Oreochromis niLoticus
e, f
: Vtg 1 électroéluée
)
g, h
: plasma induit par le bE2 de l'omble chevalier SaLveniLus aLpinus

---

8 1
b)
électrotransfert
Le principe de l'électrotransfert est d'apprécier la qualité de la VTG,
de la caractériser et de contrôler la pureté de l'anticorps. Les protéines
sont transférées
du
gel
de
concentration
PAGE-SDS
à
7,5%
sur
immobilon.
La
révélation
immunologique
de
l'électrotransfert
utilisant
un
anticorps spécifique de la vitellogénine a pour but de visualiser les
protéines
vitellogéniques
de
la
migration
électrophorétique.
Cette
révélation se fait sur du plasma induit par le bE2, sur du plasma de
femelle en vitellogénèse, du plasma de mâle témoin, sur les fradtions
purifiées de vitellogénine. Un duplicata du gel à transférer coloré au bleu
de coomassie sert de contrôle pour visualiser la migration des protéines.
Nagler et Idler (1990) ont utilisé la technique d'électrotransfert pour
montrer que les sous-unités protéiques du vitellus proviennent de la
vitellogénine en comparant les mêmes sous-unités de la VTG purifiée par
ultracentrifugation. Bon nombre de chercheurs ont utilisé cette technique
pour vérifier soit la pureté de la VTG obtenue, soit les différentes
fractions
du plasma mâle,
ou
plasma
femelle
en
vitellogénèse de
différentes espèces de poissons: Hyllner et al., 1991 ; Hyllner & Haux
(1992) ; Kishida et al., 1992 ; Silversand et al., 1993. Kishida & Specker
(1994) ont électrotransféré du gel sur PAGE-SDS à gradient de 7 à 12%
les deux formes de VTG découvertes dans le plasma et le mucus de
Oreochromis mossambicus . Récemment la technique a été reprise par
B uerano et al. (1995) sur PAGE-SDS ou gels natifs pour caractériser et
identifier les deux formes de VTG obtenues par précipitation avec Mg2+
combiné avec la chromatographie échangeuse d'anions DEAE-Sephacet
chez notre tilapia Oreochromis niloticus.
4.3.2.2. Mise en évidence de protéines
œstrogénodépendantes
Nous avons constaté qu'un plasma induit d'Oreochromis niloticus
présente en électrophorèse native 2 bandes vitellogéniques distinctes (non
illustré'[. Ces deux bandes sont visualisables en PAGE-SDS (Fig. 4.1.,
4.3., 4.5., 4.6.) et présentent un poids moléculaire de 130 kDa pour la
Vtg 1 et de 170 kDa pour la Vtg 2. Une électrophorèse en milieu
totalement dissociant, en présence de SDS et de ~-mercaptoéthanol, dont
le rôle est de dissocier les sous-unités existantes par rupture des ponts
disulfures, montre que les deux formes de VTG sont toujours présentes
(Fig. 4.13.). Les deux Vtg 130 et 170 ne sont donc pas formées de sous-
unités. Par contre le plasma induit de l'omble chevalier, traité en même
temps par le SDS et le ~-mercaptoéthanol ne présente plus qu'une seule
forme de vitelIogénine, la plus légère: Vtg 1. Dans ce cas, on peut en
conclure, comme cela a été démontré par Bon (1996) sur Oncorhynchus
mykiss, que la Vtg 2 est un polymère de la Vtg 1.
Concernant Oreochromis niloticus :
- les résultats en PAGE-SDS obtenus sur cette espèce par
Buerano et al. (1995) sont très proches des nôtres puisqu'ils identifient

---

82
deux formes de VTG l'une de 120 kDa et l'autre de 185 kDa. Compte
tenu des variations dans les migrations électrophorétiques, puisque ces
auteurs utilisent un gel de polyacrylamide à 6% alors que nous utilisons
un gel à 7,5 %1 et de la difficulté d'évaluation de la position des bandes
protéiques sur le gel pour calculer les Rf, nous pouvons considérer que ce
sont des résultats identiques aux nôtres.
- les résultats en PAGE-SDS, toujours sur la même espèce,
obtenus par Chan et al. (1991) présentent deux bandes fortement induites
par traitement œstrogénique sur un gel à gradient de 4 à 25 %, estimées à
300 kDa et 400 kDa.
Ici encore nous pensons que ces
bandes
correspondent aux deux bandes vitellogéniques que nous identifions avec
nos techniques bien que les estimations des poids moléculaires soient très
éloignées.
Concernant d'autres espèces de tilapia :
-
Kishida
&
Specker
(1993)
visualisent
deux
bandes
vitellogéniques chez Oreochromis mossambicus
par PAGE-SDS à 12%)
de 130 kDa et de 200 kDa.
- Ding et al. (1994) utilisant une séparation par PAGE-SDS à
8% trouvent deux bandes à 130 kDa et 180 kDa chez Oreochromis
aureus.
Si nous pouvons comparer nos résultats à ceux précédemment publiés
sur la même espèce ou sur des espèces voisines en ce qui concerne la
visualisation de protéines induites par les traitements œstrogéniques , il est
beaucoup plus
difficile de tirer des
conclusions sur l'identification
biochimique de ces bandes. En effet les méthodologies utilisées dans les
différentes
publications
ne
sont
pas
similaires
et
difficilement
comparables.
4.3.2.3. Caractérisation électrophorétique de la
vitellogénine
Dans la littérature nous trouvons que chez Oreochromis niloticus :
- Buerano et al. (1995) considèrent que les deux bandes
induites par l'œstradiol sont deux formes de vitellogénine parce qu'elles
sont toutes les deux glycosylées et phosphorylées et qu'elles croisent avec
un anticorps fabriqué à partir du vitellus. Elles croisent entre outre entre
elles partiellement et présenteraient des motifs antigéniques communs.
- Chan et al. (1991) identifient la VTG en utilisant un
anticorps fabriqué à partir de la VTG purifiée par DEAE, c'est à dire
migrant comme notre Vtg 1, la plus légère. Pour eux, seule la bande la
plus légère serait vitellogénique, l'anticorps ne révélant pas la bande de
haut poids moléculaire.
Chez
Oreochromis
mossambicus
Kishida
&
Specker
(1993)
considèrent que les deux protéines induites sont vitellogéniques, mais de
nature biochimique distincte puisque ne croisant pas entre elles.
Nos propres résultats confirment ou infirment suivant le cas les
données précédentes.

---

8 3
Nous
avons
par
électroélution
purifié
les
deux
formes
de
vitellogénine d 'Oreochromis nilotieus. Nous avons fabriqué un anticorps
avec la forme de poids moléculaire la plus élevée, c'est à dire la Vtg 2 de
170 kDa.
Nous avons
par ailleurs
purifié
la
VTG
par
double
chromatographie (nous allons
en
parler)
et
fabriqué
un
anticorps
spécifique. Nous avons testé ces anticorps par immunotransfert sur un
électrophorégramme contenant du plasma induit, de la Vtg 2 purifiée par
électroélution et de la VTG purifiée par double chromatographie (Fig.
4.9.). Nous constatons que chacun de ces
anticorps reconnait aussi bien
les deux Vtg du plasma induit que la Vtg 2 électroéluée ou la VTG
purifiée par chromatographie.
Il semble donc dans une première approche que la vitellogénine de
notre tilapia se présente sous deux formes d'une même molécule, l'une
aggrégée dans le cas de la Vtg 2 et l'autre monomèrique dans le cas de la
Vtg 1. Nos résultats sont en total désaccord avec ceux obtenus par Chan et
al. (1991) qui utilisant un anticorps obtenu à partir de la VTG purifiée
par DEAE ne pouvaient pas metttre en évidence la bande équivalente à
nôtre Vtg 2.
Nous avons également purifié ces deux formes de vitellogénine par
électroélution : Vtg 1 et Vtg 2. Nous constatons que chacune de ces
formes conserve ses caractéristiques électrophorétiques en PAGE-SDS,
l'une se déplaçant comme une protéine de 130 kDa et l'autre comme une
protéine de 170 kDa
(Fig. 4.6.). Qui plus est, nous avons réalisé des
contrôles électrophorétiques en présence de ~-mercaptoéthanol, c'est à
dire un agent réducteur rompant les doubles liaisons sulfures et libérant
les éventuelles sous-unités. Le plasma induit conserve dans ces conditions
ses deux formes vitellogéniques, et les deux Vtg électroéluées restent
intactes (Fig. 4.13). La Vtg 2 n'est donc pas un polymère de la Vtg 1.
4.3.4. Purification de la vitellogénine par électroélution
Cette technique de purification de la VTG semble être la meilleure.
La révélation par immunotransfert de la migration électrophorétique de
la Vtg 2 électroéluée ne révèle qu'une seule bande sans contaminants
plasmatiques. L'anticorps obtenu à partir de cette électroélution n'a pas
besoin d'être épuisé, puisqu'il n'y a aucune contamination antigénique par
des protéines plasmatiques (Fig . 4.9.). Nous constatons que cet anticorps
révèle parfaitement les deux bandes vitellogéniques du plasma induit (Fig.
4.9.2a et b).
Toutefois les quantités de fractions collectées par électroélution sont
faibles. Elles sont suffisantes pour pouvoir préparer les diverses doses
d'antigènes nécessaires à l'immunisation de lapins parce que nous n'avons
besoin que de 100 pg d'antigène pour chaque injection d'immunisation.
Mais il n'est techniquement pas possible d'envisager une telle purification
pour préparer la VTG greffée de chaque dosage. Nous avons alors eu
recours aux techniques de chromatographies.

---

84
4.3.5. Purification de la vitellogénine plasmatique par
chromatographie.
Ici encore nos résultats sont difficilement comparable à ceux trouvés
dans la littérature parce que les méthodologies utilisées diffèrent.
Nous avons choisi de purifier la vitellogénine de notre tilapia par une
chromatographie en deux étapes de façon à successivement agir sur la
taille, puis sur la charge des molécules.
4.3.5.1.
Chromatographie d'exclusion moléculaire
La
première
chromatographie
d'exclusion
moléculaire,
appelée
encore filtration sur gel ou tamisage moléculaire, sépare les proteines en
fonction de leur forme et de leur poids moléculaire.
Nous constatons que le profil général est tout à fait identique à ceux
obtenu dans le laboratoire avec des plasma induits d'autres espèces (Nufiez
Rodriguez, 1985 pour la sole; Pelissero, 1988 pour l'esturgeon sibérien ;
Cuisset, 1993 pour d'autres espèces d'esturgeons ; Bon, 1996, pour la
truite arc en ciel).
Le premier pic d'exclusion n'est présent que chez les poissons induits
sans qu'il y ait eu de prélèvements séquentiels de sang au cours de
l'œstrogénisation (Fig. 4.2.c). Son absence chez les poissons ayant servi à
suivre la dynamique de l'induction peut s'expliquer par les prélèvements
de sang effectués tous les deux jours qui diminuent considérablement la
teneur du plasma en lipides alors que les taux de VTG continuent à
augmenter.
La
VTG
est toujours
localisée
dans
le
premier
pic
suivant
l'exclusion. Compte-tenu des
observations sur les contrôles électro-
phorétiques, nous ne collectons que la partie ascendante de ce pic de façon
à ne pas récupérer les protéines de plus faible poids moléculaire qui
sortent à la suite.
Bien que la vitellogénine apparaîsse sous deux formes dans le plasma
induit, nous ne récupérons qu'une seule forme dès la filtration sur gel,
c'est à dire la Vtg 1 de 130 kDa (Fig. 4.3.).
Compte
tenu
de
nos
résultats
acquis
en
présence
de
b-
mercaptoéthanol nous ne comprenons pas ce que devient la Vtg 2 dès les
premières étapes de la chromatographie, puisque nous ne récupérons
qu'une
molécule
qui
migre
en
électrophorèse
comme
la
Vtg
1
plasmatique. Est-ce que la Vtg 2 correspondrait à une forme aggrégée de
la Vtg 1 dans le plasma par suite de la présence des autres protéines
plasmatiques
?
Sa
disparition
sur
les
électrophorégrammes
après
chromatographie d'exclusion moléculaire serait-elle alors liée à une
destructuration de la Vtg 2 en Vtg 1 par suite d'une dilution très grande
dans le tampon de chromatographie éliminant l'effet plasma ? Dans l'état
actuel de nos recherches nous ne pouvons pas encore donner de réponse.

---

85
4.3.5.2. Chromatographie échangeuse d'ions
La deuxième purification, qui se fait en fonction de la charge,
élimine
les
protéines
contaminantes
persistant
après
la
filtration
d'exclusion moléculaire et ne garde que cette même vitellogénine qui est
décrochée par du tampon tris à 200 mM et qui migre en électrophorèse
comme la Vtg 1 du plasma induit (Fig. 4.5.).
Ce résultat, a priori surprenant, a déjà été trouvé par Chan et al.
(1991) qui ont purifié la vitellogénine d'Oreochromis niloticus
par une
chromatographie en une seule étape sur DEAE-Sephacel avec un gradient
de NaCI de 0 à 400 mM, décrochant la vitellogénine avec 200 mM de
Nacl dans du Tris 50 mM.
Contrairement aux profils d'élution en filtration sur gel, les profils
d' élution de la VTG sur résines échangeuses d'ions sont très différents
d'une espèce à l'autre. L'hétérogénéité des différentes courbes montre la
nature et la charge spécifiques de la vitellogénine chez les poissons.
Norberg & Haux (1985) détachent la VTG de Salmo trutta avec du NaCI
à 200 mM dans du tris 50 mM, Pelissero (1988) détache celle d'Acipenser
baeri avec du bicarbonate d'ammonium à 200 mM, Silversand et Haux
(1989) détachent celle de Scopthalmus maximus avec du NaCI à un peu
plus de 300 mM dans du tris-HCI 25 mM, Tyler et Sumpter (1990)
utilisent une molarité saline globale d'un peu moins de 200 mM pour
purifier la VTG
de
Cyprinus carpio, Cuisset (1993)
reprenant
la
technique développée par Pelissero
décroche
avec
du
bicarbonate
d'ammonium la VTG d'Acipenser fulvescens à 100 mM, celle d'Acipenser
oxyrhynchus à 150 mM et celle d'Acipenser sturio à 120 mM, Maiianos et
al. (1994) détachent la vitellogénine de Dicentrarchus labrax
avec 250
mM de tris-HCI et enfin Bon (1996) utilise un peu moins de 100 mM de
NaCI dans du Tris 100 mM ou un peu moins de 300 mM de bicarbonate
d'ammonium pour récupérer la vitellogénine d'Oncorhynchus mykiss.
Il semble
chez
Oreochromis niloticus,
d'après
les
contrôles
électrophorétiques obtenus par Chan et al. (1991), que la purification sur
DEAE en une seule étape donne des résultats identiques à une purification
par double chromatographie avec filtration préalable sur gel. Ce procédé
en une seule étape a l'avantage d'être plus rapide donc de moins dénaturer
la vitellogénine et permet un taux de récupération plus important à partir
du plasma induit. C'est le mode de purification que certains auteurs ont
adopté
lorsqu'il
s'agit
d'avoir
une
vitellogénine
conservant
ses
caractéristiques biochimiques lui permettant de se lier à ses récepteurs
spécifiques même si elle n'est pas parfaitement purifiée (Nufiez Rodriguez
et al., 1996 ; Bon , 1996). Chan et ses collègues n'ayant pas fait
d'immunotransfert, il est impossible de préciser le degré de purification
de la vitellogénine de notre tilapia par cette technique.

---

8 6
4.3.6. L'ELISA de viteIlogénine d'Oreochromis niloticus
4.3.6.1.
Généralités
L'ELISA
adapté
sur
O.
niloticus a
pennis
de
quantifier
la
vitellogénine pour déterminer sa sensibilité en mettant en compétition la
VTG libre (en solution dans la gamme étalon ou dans l'échantillon à
doser) et la VTG greffée (par adsorbtion sur la plaque de microtitration),
pour les sites de fixation de l'anticorps spécifique anti-vitellogénine.
Le principe même de cette technique immunologique est de pouvoir
doser une quantité d'antigène présente dans une solution en comparant la
D.O. observée pour cet échantillon à celle obtenue pour une gamme
étalon d'antigène de concentration connue.
La technique ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay) que
nous avons utilisée tend maintenant à se généraliser parce qu 'elle présente
une sensibilité similaire à celle obtenue par RIA, voire meilleure, et
présente l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation de radio-isotopes. En
effet, le marquage préalable de l'antigène par des radioisotopes peut
entrainer une perte d'immunoréactivité de l'antigène marqué. D'autre
part, ces traceurs à cause de leur demi-vie assez courte, ne peuvent être
stockés durant de longues périodes. Aussi, depuis le travail réalisé par
Nufiez-Rodriguez et al. (1989) sur la VTG de Sole Solea vulgaris, la
technique ELISA a été pratiquée pour le dosage de la VTG de plusieurs
espèces de poissons : le poisson chat !ctalurus punctatus (Pacoli et al.,
1990), l'esturgeon sibérien Acipenser baeri (Cuisset et al., 1991 ; Cuisset,
1993), Anguilla anguilla et Labeo rohita (Burzawa-Gérard et al., 1991),
la truite fario Salmo trutta (Maisse et al., 1991), le bar Dicentrarchus
labrax
(Mafianos et al.,
1991),
et
récemment
sur
Oreochromis
mossambicus (Kishida & Specker, 1994).
4.3.6.2.
Spécificité
La spécificité du dosage est liée à celle de l'anticorps vis à vis de son
antigène. Nous avons dans une première étape mis au point cet ELISA en
utilisant l'anticorps anti-vitellogénine fabriqué avec la Vtg 2 électroéluée.
Nous avons choisi cet anticorps parce qu'il est hautement spécifique ne
reconnaissant pas les protéines plasmatiques autres que la vitellogénine
En choisissant des transformations statistiques de la dose beaucoup
d'auteurs comme Nufiez Rodriguez et al. (1989), Cuisset et al. (1991),
Cuisset (1993), Kishida et al. (1994), Mafianos et al. (1994) et nous-
mêmes avons observé un très bon parallélisme entre la droite de
régression de la gamme étalon de VTG et celles des différentes dilutions
de plasmas contenant de la vitellogénine : plasma induit, plasma de
poissons en vitellogéne et broyat de vitellus. Les plasmas de juvéniles ou
ceux des vrais mâles témoins ne sont pas parallèles, donnant une droite de
régression linéaire horizontale.
La comparaison des droites de régression est basée sur l'analyse de
covariance utilisant le test F (Snedecor & Cochran, 1957 ; Sokal & Rohlf,
1981), après avoir testé l'homogénéité de leur variance par le test de
Bartlett.

---

87
4.4.6.3.
Sensibilité
Les différents tests d'incubation de l'anticorps et de la VTG en
solution sont effectués pour doser la compétition entre l'antigène soluble
et l'antigène adsorbé par les plaques de microtitration pour les sites de
fixation de l'anticorps. Les complexes VTG-anticorps, adsorbés sur la
plaque sont révélés par la technique de péroxydase-anti-peroxydase.
L'intensité de la réaction étant proportionnelle à la quantité d'anticorps lié
à la VTG adsorbé, c'est pourquoi en choisissant des transformations Bi/Bo
= F [log (dose)] ou logit (Bo - Bi) (Bi - N), nous sommes arrivés à réaliser
une régression des droites qui
permet de
choisir le meilleur type
d'incubation, le plus proche possible de -1, pente pour laquelle on peut
utiliser une gamme assez étendue pour variations de DO suffisamment
di fférentes.
Pour l'ELISA qui a été adaptée, deux étapes ont été effectuées, une
préincubation pendant toute la nuit à 4°C et une incubation de trois heures
à 37°C. Une dilution au 1/40000 de l'anticorps avec une concentration de
600mg/ml de VTG fournit une densité optique de 1,8 adaptée à l'appareil
sur lequel nous quantifions nos résultats.
Nous obtenons ainsi une sensibilité de 10 ng/ml.
Nos résultats sont tout à fait comparables à ceux trouvés dans la
litérature. En effet, Nufiez Rodriguez et al. (1989) chez Solea vulgaris ,
Cuisset et al. (1993) chez Acipenser baeri ont obtenu une sensibilité de
l'ordre de 15 ng/ml comme Goodwin et al. (1992)
pour lctalurus
puncuuus . Kishida et al. (1992) ont effectué un ELISA chez Morone
saxitalis avec une sensibilité de 8 ng/ml, mais la procédure utilisée est très
longue car ils mettent trois jours avant de pouvoir révéler la réaction de
l'O .P.D. Maüanos et al. (1994) ont réalisé un ELISA très sensible
permettant de doser des échantillons de Dicentrarchus labrax
entre 1 et
60 ng/ml.
La sensibilité de cet ELISA est largement suffisante pour doser la
vitellogénine au cours du cycle sexuel puisque, comme nous allons le voir
dans le chapitre suivant, les femelles présentent des taux élevées de cette
molécule même au début du cycle.

---

8 8
Ch. 5 : Corrélations hormonales
au cours de la vitellogénèse
5.1. Rappel sur le contrôle endocrinien de la
vitellogénèse.
Il est acquis depuis longtemps que la fonction de reproduction
chez les vertébrés non mammaliens est sous la dépendance de facteurs
environnementaux agissant par l'intermédiaire des organes des sens sur
le
système
nerveux
central
et
déclenchant
la
sécrétion
de
neurohormones gonadotropes. La GnRH ainsi qu'un cocktail d'autres
hormones
agonistes
ou
antagonistes
agissent
sur
les
cellules
gonadotropes hypophysaires qui sécrètent dans la circulation sanguine
les hormones gonadotropes (Peter et al., 1986) ainsi que d'autres
hormones hypophysaires ayant une action régulatrice de la fonction de
reproduction (Beru & Madsen , 1992).
Il
est
actuellement
admis
qu'il
existe
deux
hormones
gonadotropes
hypophysaire,
GTHI
et
GTH2 ,
intervenant
à
des
moments différents du développement ovocytaire (revue Bon, 1996).
La GTH 1 agit sur des récepteurs spécifiques localisés au niveau de la
thèque ovocytaire
pour
induire
la
synthèse
de
testostérone.
La
testostérone est aromatisée en œstradiol au niveau des cellules de la
granulosa (Nagahama, 1987 ; Nagahama et al., 1995). L'œstradiol
distribué par la circulation sanguine induit au niveau du foie, par
l'intermédiaire de récepteurs spécifiques, la synthèse de vitellogénine.
La
vitellogénine,
transportée
par
le
sang
vient
s'accumuler
spécifiquement dans les ovocytes également grâce à la présence de
récepteurs spécifiques (Stifani et al., 1990 ; Le Menn &
Nufiez
Rodriguez, 1991 ; Nufiez Rodriguez et al., 1996). Il semblerait que la
GTH 1 ait en outre un rôle facilitateur de l'endocytose de vitellogénine
dans l'ovocyte (Tyler et al., 1991).
Lorsque la vitellogénèse est terminée, la GTH2 induit les processus de
maturation, c'est à dire de transformation de l'ovocyte en ovule par la
synthèse d'un MIS (maturational inducing steroid) (revue Swanson,
1991).
L'ensemble de ces intéractions est résumé dans la Fig. 3.27.

---

Femelles Incubantes
Arrêt
Sortie des alevins
Garde
Cannibalisme
22
27
Incubation buccale
Femelles Non Incubantes
Retrait des oeufs
J - - - -
o 1
15
Fig. 5.1.

---

89
5.2. Rappel sur le cycle reproducteur
d'Oreochromis niloticus
Les tilapias présentent des cycles de reproduction successifs
continuels si les conditions environnementales
sont
très
bonnes
(nourriture, température et oxygénation).
C'est en particulier ce qui se passe lorsqu'ils sont élevés en
aquarium au laboratoire où chaque cycle de 27 jours peut être répété
Il fois par an (cité par Tacon,1995). Il s'agit alors de femelles
incubant les oeufs et les alevins dans leur cavité buccopharyngienne
immédiatement après la ponte. L'éclosion a lieu en moyenne 5 jours
après la ponte et la sortie des alevins hors de la bouche de la mère en
moyenne 12 jours après la ponte, lorsque leur vésicule vitelline est
complètement résorbée et qu'ils sont capables de s'alimenter seuls.
Après leur sortie de la bouche de la mère les alevins peuvent y
retourner dès le moindre stress : c'est la période de garde buccale
facultative qui dure 7 jours après la sortie des alevins, c'est à dire en
moyenne 19 jours après la ponte (Tacon, 1995).
Si on retire les alevins de la bouche de la mère dès la fertilisation,
on constate que le cycle de la femelle non incubante est considéra-
blement raccourci et dure en moyenne 15 jours (Tacon, 1995). Ce
raccourcissement correspond en fait à la suppression des 12 jours
d'incubation (Fig. 5.1.). Tacon (1995) a montré que la garde des
alevins avait un rententissement important sur le déroulement de la
vitellogénèse.
A la pisciculture de
Nianga, la reproduction d'Oreochromis
niloticus constitue un véritable système de rotation, caractérisé par la
succession de la maturité sexuelle, de la ponte, de l'incubation bucco-
pharyngienne,
suivie
par
une
nouvelle
phase
de
recrudescence
ovarienne conduisant à une nouvelle ponte, et ainsi de suite.
En collaboration avec Ph. Tacon, nous avons analysé les plasma
d'un certain nombre de femelles incubantes, prélevés séquentiellement
au cours des cycles sexuels.
Nous avons souhaité dans une première étape suivre l'évolution
des stéroïdes sexuels et celui de la vitellogénine au cours d'un cycle de
reproduction chez Oreochromis niloticus.
Nous avons pour cela dosé par RIA la testostérone et l'œstradiol
plasmatique des femelles. Nous avons également utilisé l'ELISA de
vitellogénine mis au point, de façon à suivre en parallèle l'évolution
des taux de cette molécule pendant un cycle sexuel.
Fig. 5.1. : Les évènements du cycle reproducteur et leur durée en
jours chez la femelle incubante et non incubante
(d'après Tacon, 1995).

---

60
60
Il OESTRADIOL
~
E:a TESTOSTERONE
-e 50
50
- . - VTG
---0Jl
::
' - "
Q,I
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0
40
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10
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o
1
2
3
4
5
6
STADES
Fig. 5.2

---

90
5.4 Résultats
La Fig. 5.2. exprime les valeurs obtenues en fonction des stades de
développement ovocytaire chez les femelles prélevées mensuellement à
Nianga.
Dans les Fig. 5.3. et 5.4., les résultat des dosages effectués par Ph.
Tacon sont exprimés en fonction des jours du cycle sexuel et
correspondent à des femelles élevées en aquarium.
5.4.1. Dosages de la testostérone :
5.4.1.1. chez les femelles prélevées dans le milieu
naturel
Elles
présentent
une
augmentation
régulière
des
taux
de /
/ testostérone jusqu'au stade 4 de pleine vitellogénèse atteigant des valeur/ ')
/
maximalesde 20 ng/ml. Ces taux chutent brutalement en début dé
/
maturation ovocytaire retrouvant les valeurs initiales du cycle aux
alentours de 3 à 4 ng/ml.
5.4.1.2. chez les femelles élevées au laboratoire
Les taux de testostérone augmentent régulièrement au début du cycle
sexuel atteignant le 12ème jour 15 à 18 ng/ml. Ils redescendent
transitoirement de façon significative le 15ème jour à des valeurs
avoisinant lOng/ml puis continuent à augmenter jusqu'à la fin du cycle
avec un maximum de 25 ng/ml au moment de la ponte.
5.4.2. Dosages de l'E2 :
5.4.2.l.chez les femelles prélevées en milieu
naturel
En
fonction
des
stades
de
développement
ovocytaire
nous
constatons que la concentration d'œstradiol est élevée dès que la
vitellogénèse est déclenchée (stade 2) de l'ordre de 12. ng/ml. Elle
augmente au cours du développement pour atteindre un maximum
lorque les follicules ovocytaires les plus avancés entre en phase de
maturation (stade 4), avec un maximum de 23 ng/ml. Elle chute ensuite
rapidement au moment de la ponte pour retrouver lesdoses initiales du
début du cycle sexuel.
5.4.2.2. chez les femelles élevées au laboratoire
Les niveaux plasmatique d'E2 restent faibles pendant le 6 premiers
jours
du
cycle
(aux
environs
de
8
ng/ml)
puis
augmentent
régulièrement pour atteindre un maximum de 25 ng/ml le douzième
Fig. 5.2. : Profils plasmatiques de testotérone, d'E2 et de
vitellogénine chez des femelles sauvages, exprimés
en fonction des stades de développement ovocytaire.

---

7
a
6
5
-~ 4
CI)
o
3
c::
2
INe
G
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
JOURS
10
b
8
~
6
e
CI)
o
4
œ
2
0
2
3
4
5
6
STADES OVARIENS
Fig. 5.3.

---

9 1
jour. Les taux d'E2 diminuent ensuite significativement le 15ème jour,
puis restent ensuite à peu près constants jusqu'à la fin du cycle sexuel
avec quelques fluctuations autour d'une vingtaine de ng/ml.
5.4.3. Dosages de la vitellogénine :
5.4.3.1. chez les femelles prélevées en milieu
naturel
Elles présentent des taux relativement élevés de vitellogénine dès
les premiers stades vitellogéniques du développement ovarien (1 et 2)
avec des valeurs de l'ordre de 20 mg/ml. Les taux augmentent au stade
3 et stagnent pendant le stade 4 aux environs de 35 mg/ml, puis
atteignent leur maximum au stade 5 avec des valeurs dépassant les 50
mg/ml. Ils chutent ensuite au moment de la ponte jusqu'aux valeurs
observées en début de cycle.
5.4.3.2. chez les femelles élevée en laboratoire
Les dosages effectués montrent que les taux de vitellogénine en
début de cycle sont également élevés, supérieur à 20 mg/ml. Ils
augmentent progressivement de façon lente pour atteindre des valeurs
avoisinant 40 mg/ml le douzième jour. Puis ils chutent très fortement
de façon significative le 15ème jour, redescendant à des taux inférieur
à 20 mg/ml. Ils réaugmentent ensuite au cours de la deuxième partie du
cycle sexuel avec un maximum le 24ème jour aux environs de 60
mg/ml.
5.3. Discussion
L'analyse des résultats des paramétres plasmatiques obtenus chez
les femelles d 'Oreochromis niloticus
permettent de distinguer deux
phases de développement de la maturité sexuelle chez cette espèce :
avant et après le 12ème jour du cycle sexuel.
Chez les femelles prélevées au laboratoire, Tacon (1995) constate
que l'ensemble des paramètres étudiés présente une variation dans le
profil des données avec une chute significative temporaire des valeurs
au douzième jour du cycle (Fig. 5.4.).
L'évolution des ROS des
femelles
incubantes
montre
un
profil
similaire,
confirmant
un
ralentissement de la vitellogénèse pendant cette première partie du
cycle sexuel (Fig. 5.3.).
L'examen des
taux
de
vitellogénine chez
les
femelles
sauvages
prélevées à Nianga rapporté aux stades de développement ovocytaire
Fig. 5.3. : RGS et stades de développement ovariens chez des
femelles élevées en laboratoire
(d'après Tacon, 1995)

---

40
-
a
E
.....Ctc 30
W
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20
0:
W
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en
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JOURS
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JOURS
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0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
JOURS POST PONTE
Fig. 5.4.

---

92
montre également une chute ou tout au moins un plateau au cours des
stades 3 et 4. Si nous nous reportons aux RGS de cette même
population
de
femelles,
exprimés
en
fonction
des
stades
de
développement ovarien (Fig. 3.23.) nous constatons que ce rapport
évolue lentement jusqu'au stade 3, la croissance rapide de l'ovaire
n'intervenant que pour les stades 4 et 5. La corrélation entre les stades
de développement ovarien et le RGS, faite par Tacon (1995) sur des
femelles élevées en laboratoire, montre que le stade 3 correspond au
stade de développement ovarien acquis dans la première partie du cycle
sexuel, jusqu'aux environs
du
12ème jour,
les
stades
4
et
5
n'apparaissant que dans la deuxième partie du cycle (Fig. 5.3).
Or c'est à partir de ce 12ème jour que les alevins sortent de la
cavité buccopharyngienne de la mère qui commence leur garde se
poursuivant pendant une semaine.
Il semblerait que les soins parentaux aient
une
répercution
physiologique chez la mère, freinant temporairement le développement
ovocytaire en cours. Ce ralentissement de l'ovogénèse apparaît au
niveau des paramètres plasmatiques dont les profil présentent une chute
significative entre le 12ème et le 15ème jour du cycle de femelles
élevées en laboratoire. On le perçoit également dans les données
obtenues chez les femelles sauvages, avec une diminution des taux de
vitellogénine circulante pendant les stades 3 et 4 du développement
ovarien, stades présentés par l'ovaire pendant cette période de garde
parentale.
Nos résultats mettant en évidence l'existence de deux phases dans
le cycle sexuel confirment les données précédemment acquises chez
d'autres espèces de tilapia. Chez Oreochromis mossambicus,
la
croissance des ovocytes reste bloquée pendant la garde parentale, ne
reprenant qu'en fin de cycle.
L'analyse des profils d'E2
et de
testostérone confirment le ralentissement du développement ovarien
pendant les soins parentaux (Smith et Haley, 1987).
Si nous comparons les valeurs des paramètres plasmatiques
stéroidiens de testostérone et d'œstradiol obtenues dans les deux
populations de tilapia,
sauvage ou
élevée
au
laboratoire,
nous
constatons qu'elles sont très proches, présentant un maximum aux
environs de 20 ng/ml. Toutefois, les valeurs relativement élevées de
testostérone en fin de cycle, trouvées chez les femelles stabulées en
laboratoire, ne se retrouve pas chez les femelles
sauvages qui
présentent alors des taux très faibles, proche de ceux observés en début
de cycle. Il est très possible que les résultats obtenus chez les femelles
sauvages ne soient pas représentatifs de la réalité physiologique parce
que l'échantillonage est très faible.
Fig. 5.4. : Paramètres plasmatiques stéroidiens et vitellogénique
de femelles élevées en laboratoire.
(d'après Tacon, 1995)

---

93
Les valeurs élevées de testostérone en fin de cycle se retrouvent
chez
Oreochromis
mossambicus
et
chez
Oreochromis
aureus
(Bogomolnaya et al., 1984 ; Smith et Haley, 1988). Ces auteurs
suggèrent le rôle de cet androgène dans la régulation du comportement
parental. Ce rôle de la testotérone semble confirmé chez Sarotherodon
melanotheron pendant l'incubation buccale effectué par le mâle
(Kishida et al., 1995).
Les valeurs obtenues lors de nos dosages de vitellogénine semblent
très élevées lorsqu'on les compare à celles trouvées chez Oreochromis
mossambicus (Kishida & Specker, 1994) alors que la technique de
dosage utilisée (ELISA) est la même. Il est possible, d'une part que la
synthèse hépatique de vitellogénine chez O. mossambicus soit beaucoup
plus élevée que chez notre tilapia, et d'autre part que des différences
dans la purification de la vitellogénine entraînent des artéfacts de
dosages. Toutefois les valeur que nous obtenons restent tout à fait dans
la norme si on se rapporte à celles trouvées pour d'autres epèces de
téléostéens (revue Bon, 1996).
5. 6. Conclusions
Les variations des taux de stéroïdes sexuels et de vitellogénine au
cours du cycle sexuel chez Oreochromis niloticus s'incrivent dans les
mécanismes généraux de reproduction rencontrés chez la plupart des
poissons Téléostéens.
La vitellogénine semble être le paramètre plasmatique circulant le
plus déterminant pouvant être corrélée au RGS. Les courbes des taux de
testostérone et d'œstradiol se comparent aisément avec celle obtenue pour
le RHS (Fig. 3.24.).
L'ensemble des
paramètres plasmatiques étudiés soulignent
un
ralentissement temporaire de l'ovogénèse occasionné par le comportement
maternel lors de la garde des alevins.
Notre contribution, relativement modeste, s'inscrit dans le cadre
d'une collaboration avec nos collègues de l'INRA de Rennes. Nous avons
acquis les technologies nécessaires à la poursuite de ce travail pour
continuer cette étude, de façon
plus approfondie, sur les femelles
d 'Oreochromis niloticus en milieu naturel au Sénégal.

---

94
Conclusions et perspectives
Le travail que nous venons d'exposer, a été réalisé sur Oreochromis
niloticus, Cichlidae jouant un rôle important sur le plan économique tant
au niveau de la pêche que de l'aquaculture. Notre but était de posséder des
outils de bases biologiques pour une meilleure exploitation des ressources
locales disponibles.
Dans cette étude, nous nous sommes attachés à décrire les différents
stades de l'évolution des ovocytes à l'aide de la microscopie photonique,
de la microscopie électronique à transmission et à balayage, de l'analyse
d'images ainsi que de techniques immunologiques variées. Nous avons
déterminé 6 stades correspondant aux différentes étapes physiologiques de
l'ovogénèse.
Nous avons constaté que le développement des ovocytes n'est pas
synchrone. Chez les femelles matures il est fréquent de trouver toutes les
générations d'ovocytes du stade 1 au stade 6. Le cycle très court de
l'ovogenèse ne facilite pas les observations de tous les changements
ovocytaires.
L'étude
en
microscopie
électronique
associée
à de
l'immuno-
cytochimie
photonique
et
électronique
nous
a
permis
de
suivre
l'élaboration
du
follicule
ovocytaire
et
les
différentes
étapes
de
l'endocytose de la vitellogénine dans l'ovocyte.
La vitellogénine a été expérimentalement induite par des traitements
œstrogéniques, purifiée, caractérisée et quantifiée par ELISA.
La technique de purification de la vitellogénine par électro-élution a
pu préserver les propriétés de la molécule comme le montrent les tests de
caractérisation
par
immunoprécipitation
et
électrotransfert.
Cette
technique purifie mieux la vitellogénine que les techniques de chromato-
graphies qui altèrent la structure quaternaire de la molécule et n'éliminent
pas complètement les contaminants plasmatiques.
Des contrôles électrophorétiques en
gel
de
polyacrylamide ont
montré que la vitellog énine plasmatique existe sous deux formes natives,
l'une de 130 kDa , l'aute de 170 kDa. Ces résultats confirment les données
trouvées dans la littérature chez d'autres espèces de tilapia.

---

95
L'ELISA de vitellogénine que nous avons mis au point nous pennet
de doser cette molécule même lorsqu'elle se trouve en quantité très faible,
puisque la sensibilité du dosage est de l'ordre de 10 nanogrammes par
millilitres.
Cette sensibilité nous a permis de détecter des taux non négligeables
de vitellogénine chez les tilapias mâles élevés au laboratoire, alors que les
mâles sauvages en sont dépourvus. Ce résultat s'inscrit parmi les données
actuelles de la littérature montrant le rôle œstrogénique de l'alimentation
artificielle chez les poissons.
La mesure des taux plasmatiques de l'œstradiol et de la testostérone
chez notre tilapia montre que les valeurs obtenues s'inscrivent bien dans
les profils stéroïdiens établis lors du cycle de reproduction des autres
poissons téléostéens.
Cette étude a pennis de dégager des données nouvelles concernant la
physiologie de la reproduction des femelles d'Oreochromis niloticus
élevées en pisciculture. Notamment nous avons pu confirmer sur les
poissons prélevés dans le milieu naturel le ralentissement de l'ovogénèse
chez les femelles pratiquant l'incubation buccale et la garde des alevins,
soulignant le rôle perturbateur temporaire du comportement maternel
dans la physiologie de la reproduction de l'espèce.
Nous
souhaiterions reprendre ce travail par une
étude de
la
physiologie de la reproduction des femelles prélevées dans le milieu
naturel au Sénégal. Nous voudrions étudier les paramètres physiologiques
liés à un arrêt de la reproduction pendant la période de fraicheur.
Notre étude de la vitellogénine de cette espèce nous invite à
rechercher les parentés
immunologiques
pouvant exister
entre
les
différents tilapias présents au Sénégal.
Enfin, au cours de la vitellogénèse nous avons suivi la mise en place
des
filaments
granulosaires
à
l'intérieur des
couches
du
follicule
ovocytaire. Ces filaments ont un rôle adhésif de l'œuf chez les espèces
pondant sur un substrat. Or, chez Oreochromis niloticus pratiquant une
incubation buccopharyngienne des jeunes, nous
constatons que ces
filaments disparaissent à la fin de l'ovogénèse.
Nous aimerions reprendre cette étude de façon plus approfondie en
microscopie électronique et suivre l'évolution de ces structures chez les
différents Cichlidae pratiquant ou non l'incubation buccale.

---

96
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l
,~
"
"
TItre :
Bases biologiques deIa fonction de reproduction de là femelle
d 'Oreochromis niloticus, tilapia d'intérêt aquacole au Sénégal.
~,
..'
Nom du candidat:
Papa NDIAYE
Nature du mémoire: Thèse de Doctorat ès Sciences Naturelles
Jury :
Président:
OmarThiom
THIAW
Membres:
.Françoise
LEMENN
René
LEMENN
Mady
NDIAYE
Abdoulaye
SAMB
Meissa
'TOURE
soutenue le 28 0 C t 0 br e
1996
Résumé:
Cette étude a trait à certains aspects de la fonction de reproduction de la
femelle de Tilapia niloticus, poisson Cichlidae peuplant les eaux douces-du
Sénégal et objet du développement d'une aquaculture en Afrique.
_
Une, attention particulière a été portée à la mise au point de techniques
immunologiques associées aux techniques de biochimie analytique, pouvant eue
utilisées facilement au laboratoire. Nous avons induit la synthèse, •
la"
vitellogénine, précurseur plasmatique des réserves ovocytaires, par traitement
•
œstrogénique. Nous l'avons purifiée par double chrofltatographie de filtration
if
\\ sur gel et écbangëuse. d'ions ainsi que par électroélution, ~lle app~ît dans le
, plasma, en PAGE natif ou SOS, sous 'forme de deux glycohpoprotemes de haut
poipsmol~ulaire,un mon~mère de. 130 kOa e~ une forme a~~gée de 170 kOa.
N0US~~laboré sur lapm un anticorps spécifique de la fraction la plus lourde
(170 kD~), majoritaire dans le plasma des animaux traités ou des femelles en
vitellogénèse, Cette fraction croise immunologiquement avec la fraction la plus
légère,
Cet . anticorps
a
été
utilisé
pour
mettre. au
point
un
dosage
immuneenzymatique (ELISA) de cette vitellogénine de façon à pouvoir suivre
son apparition dans l~ plasma après synthèse hépatique au cou~ de la
gamétogénèse, Nous obtenons une sensibilité de 10 ng par ml-l.
Nous avons fait une étude parallèle en microscopie photonique et
électronique du développement. ovocytaire et avons déterminé 5 stades de
, développement. Nous avons particulièrement étudié en microscopie électronique
et ultra-immunocytochirnie les modalités d'endocytose de la vitellogénine.
Nous
avons
corrélé. les
stades, de
développement ovocytaire
à
l'environnement plasmatique, vitellogénique et endocrinien, en dosant par RIA _ -
les hormones stéroides sexuelles impliquées: œstradiol et testostérone.
, >
",
•
Mots clés :
Poisson - Cichneae - Reproduction - Ovogénèse - Vitellogénèse -
Vitellogénine - Ultrastrucrure . ELISA.

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