,:l.c.--\\DaIIE DE ,\\IO:\\TPELLIER
U\\ 1\\' FR SITE DES SU E\\C ES ET TECHN l QUES DU LANGUEDOC
THE S E
pr§sentée a l'UniveTsit§ des Sciences et Techniques du Languedoc
pour obtenir le grade de
Docteur de Sème (vele de PARASITOLOGIE
RECHERCHES SUR UN VIRUS DE ,\\jACROPIPUS DEPURATOR LINNE '
ISOLE A L'AIDE DE LIGNEES CELLULAIRES DE POISSONS
.- ._. ~- - .- - . ~~.-.:~~.. ~..~'~~~~-':-
.. -
~......---,...._.~.- ,
: CONSEil AfRiCAIN ET MALGACHE;I
POUR \\,,'ENSE1GNf':Mr:NT SUp~mEUR
1
1
I
r ' ) ' ~ , '-"~UGOU
C. lI. {,\\ E. 5, .-' ,):.. I-\\v/-\\lJU
1 ;:',rrivé'è ·2' 3- JAN,' 1998 .. " '';' i
\\
~:\\I":" .•..•:. ",::.U:" Il" # 0 -2 ,2,8 '1+' i,
...•._• .J...... ....;...-_._-
p a r
F~~~c~-Lu~~
CLOTILDE
soutenue le
19 Juillet
1984
devant la Commission d'examen,
JURY
C. VAGO
,Membre de l'Institut,
PRËSIDENT
L.
EUZET
G.
~
BOUIX
ASSESSEURS
J.R.
BONAMI
) INVITÉ

---

AVA,"./T - PROPOS
Mon~ieu~ le P~o6e~~eu~ c. VAGO, Memb~e de l'In~titut,
Je ~ui~ heu~eu~e de t~ouve~ ici l'occa~ion de vou~
pn~~e~te~ me~ plu~ vi5~ ~eme~ciement~ pou~ l'accue~l que vou~
m'avez ~~~e~v~ dan~ vot~e labo~atoi~e, et pou~ l'~nt~~~t que
vou~ avez po~té à me~ t~avaux.
Mon~ieu~ le P~o6e~~eu~ L.
EUZET,
Il m' e~t ext~è.mement ag~éable de vou~ ad~e~~e~ me~
jinc~~e~ ~eme~ciementj pou~ vot~e en~eignement et pou~ la
~ympathie que vou~ avez toujou~~ mani6e~té à l'éga~d de vo~
étudiant~.
Mo~~ieu~ le P~o6e~~eu~ G. BOUIX;
Je vou~ ~eme~cie d'avoi~ bien voulu accepte~, mal-
a~~ vo~ nomb~eu~e~p~éoccupation~, de pa~ticipe~ à ce Ju~y,
et de jUDe~ ce t~avail.
Mon~ieu~ J.R.
BONAMl,
Cha~gé de ~eche~che~ au CNRS,
De ce~ annéej ra~~ée~ ~ou~ vot~e di~ection, je ~e­
tiend~ai e~ p~emie~ lieu, vot~e compétence, ainhi que la bonne
entente et la hympathie qui ~'eht inhtallée ent~e nouh, malg~é
leh peti~ et le~ g~and6 P!l.O blèmeh, (.oftt.U"1\\CUi'\\C tnooa
t ....a.V"~t. .
. . . /

---

1
1
1
Enn~n , qu'~l m~ ~o~t p~~m~~ de ~~m~~c~e~ t~~~
s<. 11 C è ~ L m~ nt Mo IH){ eu~ F.
COU S S ER ANS,
l n9 é nI. eu~ 1. N. R • A "
~ e,S -
1
pon~abl~ du S~~v~c~ d~~ CultuAe~ C~llula~~~~ au LaboAatoi~e
d~ Patholog~e CompaJLé~ ru.s.T.L.),
c;,;:.~-:
t'aid~, la patience,
et l~~ con~~il~ d~ qu~, c~ t~ava~l n'auAait pa~ abouti.
1
Qu~ c~tt~ thè~~ ~oit pou~ lui, l'~xp~~~~ion d~ ma
1
p~onond~ g~atitud~.
1
Pou~ t~~mine~,
j~ n'oubli~~ai
pa~ dan~ m~~ ~~m~~­
1
c~~m~nt~,
m~~ ami~ du Labo~ato~~~ de Pathologi~ Compa~é~, à
l'U.S.T.L.,
~n pa~t~culie~ Jo,
pou~ ~on ét~oit~ collabo~at~on;
m~~ ami~ d~ la Statio n d~ R~ch~~ch~~ (1. N. R. A. ) d~ Saint-
1
CHRISTOL-l~~-ALES, a~n~i que l'équ~p~ d~ p~che d~ M.
BRITTO
à Sète.
1
M~~c~ à tou~.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

F-......
A me~ am~~ à qu~ je d~~
JI
K~mbé tta~d, pa mo-t~
Bod'-tan mè pa -tw~n".
( Proverbes Créoles ).

---

s 0 ~j ~l .-\\ 1 R E
l \\TRODUCT l 0\\
.
CHAPITRE l - LES ~~LADIES A VIRUS NON ENVELOPPES
ICOSAEDRIQUES ET CYTOPLASMIQUES DES CRUSTACES
ET DES f-l0LLUSQUES
.
I:-JT kODUCT I01\\
.
3
1.
\\'IROSES A ETIOLOGIE SIMPLE.
.
4
AI LES AFFECTIONS DUES A DES REOVIRUS
.
5
1.
Che:
les crustacés
.
5
Mac~oripu~ d~pu~atu~
Linné
Ca~tin~ct~~ ~apidu~ Rathbun
H~mig~ap~u~ o~~gon~n~~~
Che z 1 e s ~1 a 11 us que s
.
Î
S~pia 0nnicinati~
Linné
CfUH ~('~t:t(~.(l I.'Z-:.gélo,é:.a
Gmej ln
~FFECJlûNS DUES A DES TRIDOVIRUS
.
1.
Chez
les Huîtres
.
C~a~~o~~'~a angulata
Lmk.
C~a~~J~t},t?a giga~ Thunben!.
~
Chez les C€phalopocies
,
.
10
Octopu~ vutqa~i~
Linné
Cl LES AFFECTIONS DUES A DES PICORNAVIRUS
.
10
1.
Chez Catlin~cte~
Rathbun
11
?
Chez
Penaeu~ ~tyt~~o~~~~~ Strimpsun
1 1
II. VIROSES A ETIOLOGIE COMPLEXE
.
1 1
Mac~opipu~ d~pu~a~o~
Linné
Pc~tunion con6o~mi~.
Simocephatu~ eXpino~u~.
Pc.na~u~ monodoVi
Fabricius
P2.Vl6i$U6
japonicu~
Bate
....
you
11ft,,,
~~
DISCUSSION ET CO\\lCLUSION
v • • • • • • • /';- .•
1 6
~..;j

---

--1
1
1
GI\\I'TTRE
Il
-
LES
BIR\\:\\\\"lRUS
CHE::'
LES A!\\HlAUX AQUATI-
QUES,
lES OISEAU\\" ET
LES
I\\SECTES
.
1 8
1
I\\TRODIJCTIO\\
'"
"
.
1 8
1.
LES
BIRNAVIRUS D'A\\I~lAUX AqUATIqUES
.
1 9
1
AI LES \\lRUS DE POISSONS
.
1 9
1.
Le
virus
de
la
Nécrose
Pancréatique
Infec-
1
tieù::>\\:'
(:\\Yl
)
des Sa-<'.muYl-Z.dae.
..
l 9
~. Les virllS de type NPI isolé chez d'autres
pOIssons
.
21
1
al -
Chez
le wh-Z.:te. f>Uciz.e.1l.
(Ca:tof>iorna.h
c.omme.tl.-
-
.
,
-60 il'{'
Lacepede
.
b) -
Chez
le
Brochet
(ExO-6
f.uc.-Z.Uf>
Lümé).
1
_J.
Le virus
de
l'Anguille européenne
(An-
gu-Z.f.f.a,
aYlgu-Z.f.f.a
L.
)
:EVE
.
:4.
La maladie virale
de
la "Chatte
de
l ' Est U
24
(No:te.m~qoYluf> 0ItYf>of.e.ucaf> Mitchill : Gsvn ...
1
BI LE GROUPE DES "TELLINA-VIRUS"
.
25
1
1.
Le virus
de
]a Telline(TrPPIV)(7 rrn1uJA j)" (',
~_'~TU
~s
)
Les
virus
d'Huîtres:
O.V
.
26
Ct)
-
L,ùèZ
v.:,:tILe.a e.du[-Z..~
L.
LO
b)
-
Ch e z
CItaf> f>
1
0 f> :tlt (' a
9 -Z. 9 a6
Th u 11 he r JZ
26
l 1.
Li-\\ lvLA.LAD lE DE GOMBUkU
:
Llo b . \\ .lJ . ) . . . . . . "
. . .
1
III.
LES BIRNAVIRUS D'INSECTES . • . . . . • • . . . . . " f ' "
1 8
AI LE VIRUS X DE LA DROSOPHILE (Vltof>oph-Z.f.a me.f.ano-
1
gaf>:te.Il., 1>;\\'ti ~_
) .DXV
.
28
BI LE VIRUS DE Cuf.-Z.coZdef> f>p. 1 Diptère, Celta:topogo-
f1-Z.dae)
.
29
1
CI L'IBVD ISOLE D'UN MOUSTIQUE: Aedef> vPXQn.<> (Dip-
t ère)
.
30
1
DISCUSSION ET
CONCLUSION
.
30
1
CHAPITRE
III
-
~~TERIEL ET TECHNIqUES . . . . • . . . . . . . . . . . .
32
AI LE ,MATERIEL VIVANT
.
1
1 .. Mac.lt0pA.-pUf>
de.puJiii:to-1t -Linn-ê ..- . . . . . . . • . . . . . .
32-
-
Classification
32
-
Provenance.
32
1
..
-Elevage et maintien au
laboratoire.
33
.'
1
1
,

---

,. '-'-
Lescllitures cellulaires
.
- Dc~:ription Jes lignées cellulaires.
- Entretien.
Repiquage.
Congélation,
Décongélation.
BI
36
TECHSIQUES DE PATHOLOGIE EXPERIME~TALE
.
1.
Infection àes cultures cellulaires
.
36
2.
Inoculation des crabes
.
.)1
CI TECHNIQUES VIROLOGIQUES
.
38
1.
Titrage àe virus
.
L.
Pyrification du virus
"
,
.
:).
Determir.atior.
de
l'acide
nucléique
viral
..
4. Mesure de la densité des virions
.
DI TEHC\\IQUES BIOCHIMIqUES
.
4 1
1.
Electrophorèse des protéines virales
.
4 1
2.
El e c t r 0 p h 0 r è s e d L; g é nome V ira l . . . . . . . . . . . . .
42
3.
Détermination de l'acide nucléique viral ..
Ll2
El TECHNIQUES HISTOLOGIqUES
.
.43
1. Microscopie photonique
.
43
2. Microscopie électronique.!
.
4 '3
FI TECHNIQUES SEROLOGIqUES
.
44
1. Production d'anticorps
.
Ll4
)
Immunodi ffus ion
.
45
3.
Immunoé_lectrophorèse
.
45
4.
Immunofluorescence
.
46
G/ TECHNIQUE DE~RQUAGE
ISOTOPIqUE,
.
47
1. Production de virus marqués à l'Uridine
tritiée
3H
.
47
2.
La scintillation liquide
,
..
48
CHAPITRE IV - TENTATIVE DE REPLICATION SUR CELLULES BF)
EN CULTURE DES VIRUS "s" ET "P" DE MACROPIPUS
VEPURATOR
L.
.
50
INHWDUCTION
,
.
50
AI ETUDE DES
CELLULES BF
50
Z SAINES
.
1. Microscopie à contraste de phase
.
50
Z. Histologie
.
5 1
3.
Etude ultrastructurale
..
52

---

1
1
1
BI INOCULATION DES CULTURES PAR DES BROYATS D'OR-
GANES DE M.
dcpu~ato~
ATTEI~TS
PAR LE SYNDROME
"S-P",
-
--
.
1
1.
Inoculation des BF')
.
2.
Développement d'un~effet cytopathogène
.
1
3. Modifications ultrastructurales des cellules
infectées
,
.
DISCUSSION ET CONCLUSION
.
1
CHAPITRE V - CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'AGE~T VIRAI
N
n
rOBSEFVE SUR LES CELLULES BF 2 EN CULTURE
.
66
1
l _ Tl{ _DU _-TION
.
6é
AI ETUDE DU POUVOIR P4THOGENE DU VIRUS SUR
Mac~o-
pipu,s dcpu~a:tofl L
,
.
1
1. Test de pathogén cité vis à vis des crabes ..
6 i
2. Examen histopathologique des M.dcpu~ato~ ino-
culés
.
6E
1
a)
Histologie
.
63
b) Microscopie électronique
.
70
1
U /
i:E-ISOLD1E:\\T SCR L.\\ L~G::EE CELLULAIP.E BF~ DE
L'AGENT INOCULE A Mac~opipu,s dcpu~a:ton . . :
.
1.
Inoculation des cultures
.
1
2.
Effets observés
.
j .
Interprétation des tableaux . . • . . . . . . . . . . . . . .
ï l
1
Cl ESSAI DE DEVELOPPEMENT DE L'AGENT SUR D'AUTRES
SYSTEMES CELLULAIRES DE POISSONS
.
1. Description des lignées . . . . . . . . . . . • • . . . . . . . .
1
2.
Inoculation des cultures
,
,
.
82
3. Observation d'un effet cytopathogène
.
Cl?
1
DISCUSSION ET CONCLUSION
.
CHAPITRE VI - CARACTERISATIOt\\ DU VIRUS
.
d7
1
Ij\\,'TRODUCTION
.
C, !
AI PURIFICATION
.
1
1. Protocole expérimental inlti.:ll
,
.
83
2. Méthode adopt ée
,
.
Bn
,";
1
~ .Ré sul t a t s . . . . . . . . . .
.
01
1
1
1
1

---

BI ETUDE ULTRASTRUCTLJR.;LE DES ELD1E\\TS VIRAUX.,
92
1. Ultrastructure des particules virales ....
2.
ur trastructure des tubules •.•. '
" ..
cl PROPRIETES PHYSIQUES DU VIRUS ..•...... , .....
94
1.
Densité
,
.
94
2.
Stabilité
, .. ,
,.
94
DI
ETUDE BIOCHIMIQUE DES VIRIONS,
.
94
1.
Nature de l'acide nucléique . . . . . . . • . . . . . .
2.
Structure du génome viral .. o' ••••••••••••
95
3.
Les polypeptides viraux . . . . . . . . • • . , ..•..•
95
El ETUDE SEROLOGIQUE DU VIRUS
,
'
96
1.
En irnrnunodiffusion
.
96
2.
En irnmunoéJëctrophorèse
.
97
DISCUSSIO~ ET CONCLUSION
.
98
CH,-'lP 1TRE VII -
DFTECT 1ON DU BI RN; VI RI1S PAR LA. FLljn-
RESCENCE ET PAR LA SCINTILLATION LIQUIDE
102
1 !\\'TRODUCT 101\\ . ,
.
10?
AI LOCALISATION DU VIRUS DE M. d~pu~ato~ DANS
LES CULTURES CELLULAIRES PAR LA FLUORESCENCE.
103
1.
Titrage
des
virus. . • . . . . . . . . . . . . . . . .
103
2.
Cytochirnie par l'Acridine orange.........
104
3.
Irnrnunofluorescence.......................
108
BI DETECTIOA DU VIRUS PAR LA SCINTILLATION LT-
QurDE CHEZ Ma~~opipUh
d~pu~ato~..............
111
1.
Inoculation des crabes
. . . . .
111
7
Distribution du virus chez M~ depu~ato~
au cours du ternDs~...
111
3.
Evol~tion du rapport de la radioactivitp
de l'organe sur la radio-activité de 11hé-
mol)'mphe au COÛYS d.u temps c.hez
M. de-pl.J.Â.C1-to~.
114
DLSCUSSION ET CONCLUSION........................
117
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES.....................
118
BIBLIOGRAPHIE..........................................
122

---

-
-
"
C I{ .-\\
l'
l
T R L
LES ~l.-\\L-\\D[ES.-\\ ',-IRUS \\0\\ E\\\\"ELOPPES
lCOSAEDRlQUES ET CYTO-
l'L.-\\S~IIQLJ~S DES CRUSTACES ET DES MOLLUSQUES .
. ~ -;--:-RODllCT 10\\
;.'é.~t~;: actuel des connél155~lnces en pélthologie des
] n \\-e rt é h l' é 5 P e :. :;J<? t
cl e Ll ire que
]:1
\\ i r 0 log i e
des Cru s tac é s
et
Jes \\lo]]uslj',2:: L'onstitue un L'h:lpitrc important.
Cela,
en
1':oson ciu nOl1lbr2 oe \\-lr05es qui peu\\ent être recensées d ce
~iol1r, El:lis dllSSl
du
l:lit de
la di\\ersité des élgents qui,
à
l ' é che] l e d e
Li
\\ i r 0 ] 0 g i e g é n é r il le,
5 e
rat tac 11 en t a u :\\ d i f ré -
l' en tes
f:1 mil les
cl e \\' i rus.
Par mi
ces 3 g e n t s,
les
\\-l HI S non en-
\\-eloppés et
icosaédriques sont très
répandus.
Ainsi
au cours de nos
travaux nous avons mIS en
é\\-idence un VIrus de ce type,
che: un Crustacé des côtes mé-
diterranéennes.
C'est pourquoI,
nous nous
sommes
limité à ne ré-
pertorier dans ce mémoire,
que
les affections des Crustacés
et des ~lollusques, associées à des \\'irus de structure icosaé-
drique et dont
le développement
se localise dans le cytoplas-
me des cellules atteintes.
Il
ressort de cette démarche que

---

1
1
- 4 -
1
trois familles de VIrus sont concern§es: les
I~idovi~idac
1
les R~cvi~ida~ et les Pico~navi~idae. Les repr§sentants
de ces groupes VIraux peuvent seuls avoir une action patho-
1
gène sur 1 'hôte, ou encore agir de manière simultan§e avec
un autre type de virus, constituant alors un syndrôme
par-
1
fois pathogène pour l'hôte.
Ceci nous a donc amené à consid§rer ces maladies
1
virales des Crustlc§S et des Mollusques sous deux aspects:
celui des viroses à §tiologie simple, et celui des viroses
1
à étiologie complexe.
1
l
-
VIROSES A ETIOLOGIE SIMPLE
1
Les particules virales impliqu§es en plus grand
1
nomhre dans ce type de maladies, appaTtie~~ent 2 12 f2~ill~
des Réovi~idae. Elles sont caract§ris§es par une sym§trie
1
cubique, avec un diamètre de 61
à 70 mm.
La capside form§e
de deux couches prot§iniques, entoure l'acide nucléique,
1
qui est de l'ARN.
L'augre grande famille de VIrus représent§e est
1
celle des Itidovi~idae. Bien que ces virus aient pour acide
nucl§ique de l'ADN, ils ont un développement cytoplasmique.
1
Ce sont des particules de grande taille de l'ordre de 200
à 300 nm.
1
Enfin, les Pico~navi~idae, petits virus à ARN,
1
icosaédriques sont aussi représentés chez des Crustac§s.
1
1
1
1

---

-
-
:>
-
,\\
1. L S \\ F f LCliO \\ S DU L 5 :\\ DES RE 0 V l RUS
1. Che:
les Crustacés
·.iac"c/·'<pu.'>
dC'l-'u,"atc,~ L.
Le premIer cas de VIrose décrit
che:
les Crusta-
cés
fut
la p:ual::çie lente de M.
depu!'Lato,:
(VAGO,
1966).
L'Jf~ection se traduit par un tremblement des pattes, sui-
l'J
j'une p~!l'~llysic progressi,'c entraînant la mort des anl-
mau\\:.
lin ::s;;ombrissement de
l'e\\:osquelette est observé en
lIn
je JllaLlllle.
L'Jgent,
isolé et obsen'é au nncroscope
é'lect!'oniquc,
est un l'jrus non
2I1\\eloppé,
para5phérique de
,~I,! j
()\\.Î
IF
l1C
di:iJilè't1'e,
qui
inoculé 3. des animaux
saIns,
:'ep l'·::>du i t
l c;::, mcmes
symptômes.
-'lise en évidence en
1976 par BOi\\AMI,
13 VIrose
appellée "maladie des branchies" de C.
méd,Lte''l.fLanéu ..'>
doit
son nom à la
localisation spécifique des virions dans cet
organe.
L'agent
responsable,
une particule icosaédrique
de 55nm de diamètre,
présente après contraste négatif à
l ' ,--\\ j' T,
LI n
cor e cl en 5 eau x é 1 e c t r 0 n s,
en t 0 u réd ' une do u b 1 e
coucne protéinique.
[n outre,
la microscopie électronique
des
tissus
infectés révèle qu'il
se développe dans le cyto-
plasme des cellules épithéliales
(BONAMl,
1977), 00 il
pro\\'oque une nécrose des feuillets branchiaux.
Une dispo-
sition en anneaux ou "rosettes" des virions,
a été obser-
\\'ée par
l'auteur
(BOi\\,:\\Jl.-11,
1980),
-en plus des
zones a

---

1
1
- 6 -
1
structures membranaires circulaires dans le cytoplasme des
1
cellules atteintes. C'est la première fois qu'une telle
disposition est rapportée pour des particules de type Réo-~
1
virus. Expérimentalement, on reproduit la maladie soit en
inoculant
à des animaux sains des virus purifiés, soit en
1
les nourrissant avec du tissu infecté.
1
Ce crabe des côtes américaines, encore appelé
1
crabe bleu, fut suspecté en 1974, d'être atteint d'une ma-
ladie d'origine virale. Les recherches entreprises par
1
JOHNSON et BODAMMER (1975) conclurent, à tort, à la présence
d'un Picornavirus dans les tissus de l'hôte. Car JOHNSON en
1
1~7ï, s'appuyant sur des études histopathologiques remet-
tait en cause le ge~re du virus observé. et indiquait que la
virose était due à un Réovirus.
1
Cette affection entraîne chez les anlmaux at-
1
teints une paralysie partielle ou complète avec tremblement
des pattes et décoloration de l'exosquelette. Les branchies
1
prennent une teinte rouge brun sombre et ,l' hépato----pancréas
devient petit et pâle. Tous les tissus sont endommâgés,
mais ce sont surtout les hémocytes et le tissu hématopoïé-
1
tique qui subissent le plus de dégradations. Dans ces der-
niers, des phénomènes de caryorhexie, de pycnose et de lyse
1
cellulaire sont notés
(JOHNSON, 1977). Il Y a aussi invasion
du tissu nerveux, des connectifs de l'hépatO--pancréas et
1
de l'intestin moyen par des hémocytes infectés. La microico-
pie photonique montre dans le cytoplasme des hémocytes et
1
des cellules du tissu hématopoïétique, des formations cris~
tallines, basophiles, Feulgen négatif. L'examen ultra
1
1
1
1

---

5 t r lie t u r :.l l
il e
ces : 0 n e .5 li é fil 0 rH r e qu' i l s ' agi t
d' un arr a n -
gelTlen::
liné~iire de particules \\-irales de :i:inm de diamè-
tre,
composées d'une double couche externe de sous-unités,
qui
entoure un centre dense aux électrons.
Des formations
tubulaires leur sont associées.
Cette ~irose mortelle pour
(' .
Hlt-' { du)
est
r e r r n r1 u i tee he:: è. es:::. ;'. ~ ;;;;l U :.: sai '-1 5 P ~ u S l;;l -
pidement par inoculatio~ d~hfmGly~phe infecté que par ln-
gestion de tissu malade
(JOH;\\;SO\\,
19ï8).
-
HC J)I_{ 9 l ([ )J S l;)
[' l cg (' f1 C-I1S -C6
L.
:\\u cours d'in\\-estig:ltions
sur un par3site d'Ho
c ~ e -:7 l-' ;: C Il ·S ( ),
J\\ LI R l C;
e t
L 0] 1.
(1~) - SI l 0 n t
Dl e TI t ion née 11 e = l e
cr3be
la présence de virus Je tll
nm de diamètre.
Le fait
Cl Il e
',- e 5
\\ j r 1 ,-' Tl <:
" 0 i (';;:-
:' :1;= ;= :. :~, ~ ;-, é.c, ,:," ;~: u \\ i l U :C;,
t i e n t
en c e
que
1 ellre:
\\1 ro:,:'ê'Tl'~"'2 ,,' CJ:'2~'::lIC ljjJ~cjl'Çjllt:nt dan,::;
le
cytoplas-
me,
ceci
en
l'absence de tout df~eloppelllent viral observé
dl1!;S
le ;1:J"'[1L:.
J}
n',: pas
t":té
jJo:::'siDle en ellet :lUX auteurs
d'1501er 1[1 particule pour entreprendre sa caractérisation.
Dans 1 'estolllac de ce Céphalopode,
un phénomène
de l\\'se cellulaire d'origine virale,
a été décrit par DE-
VAUCHELLE et VA GO
(1971).
Des masses cytoplasmiques denses
aux électrons et riches en ribosomes furent observées.
Elles
correspondraient à des \\'iroplasmes.
Autour de ces
zones,
se
développent des particules parasphériques,
de 7--5nm de dia--
mètre,
allxquelles sont associées des structures tubulaires.

---

1
1
-
8 -
1
Les virions groupés en plage paracristalline, sont libé-
rés par éclatement des cellules à un stade avancé de
1
l'infection.
1
- CTLa~o~tTLea viTLginica Gmel.
1
Un vlrus, désigné 13
a été isolé de tissus de
p2
jeunes hU1tres américaines. MEYERS (1979), a obtenu in vitTLO
1
le développement des virions. Ceux-ci produisent sur cultu-
res cellulaires BF , un effet cytopathogène entraînant la
2
1
lyse des cellules. Sur coupes ultrafines, les BF
infectées
2
présentent un développement viral intracytoplasmique. Mor-
phologiquement, ce virus apparaît comme une particule icosaé-
1
drique de ï9nm de diamètre avec un core interne et une dou-
ble capside externe.
Il ne semble pas toutefois que ce Réovi-
1
rus soit pathogène pour les huîtres C.
viTLginica
(MEYERS,
1980). C'est l'étude ultrastructurale des virions,~isolés à
1
partir des cellules infectées, qui permit à MEYERS et HIRAI
(1980)
de rapprocher le virus 13
des ReoviTLidae.
p2
1
BI LES AFFECTIONS DUES A DES IRIDOVIRUS
1
1
Les Iridovirus sont un groupe très répandu dans
la nature. Longtemps considérés comme inféodés aux Insectes,
1
ils sont aussi pathogènes vis-à-vis des animaux aquatiques,
dont les Poissons et surtout les Mollusques.
1
1.
Chez les huîtres
----------------
1
1
Pendant les années 1966 à 1969, la maladie des
branchies de cette huître portugaise
cultivée en France, a
1
1

---

-
9 -
été a t tri bu é C' 3 l'é P0 q li C' à l':l C t ion J' un pro t i 5 t e
( FR.-\\ NC
et _-\\RVY,
19b9).
Il aura fal lu attendre l'étude de CO~jPS et
DUTHOIT
(197b,
19-9) pour que soit reconnue la cause VIra-
le de l'épizootie qui décima les élevages de C.
angulata,
trois années durant.
En effet,
un réexamen des lésions branchi21e~
sur coupes semi-fines a montré la présence de cellules hy-
pertrophiées qui ont pu être interprétées comme étant des
protistes parasites.
Le cytoplasme de ces cellules renferme
des :ones fuschinophiles Feulgen positif,
ainsi que des
granulations.
La r:iicroscopie électronique révèle que ces aI-
res correspondent à des \\-iroplasmes à partir desquels se
forment
les virions, par différenciation de membranes qui
englobent le mat?riel dense.
Il
en r~sul!~ l~
f~~~2t~~~ ~:
paT tic u les Je:':; Cl n Il1 cl e dia mè t r e,
p (' c: s é rl 3 Tl. t
'.1 T'
C (' r '2
~ '2 T' S 'ë:
auxélectrons,
et limitées par deux membranes unitaires.
L'autre i ridovi rose qui affecta C.
angulata provo-
qua de 1970 â 1973 des mortalités massives chez cette espè-
ce, entraînant sa disparition des parcs ostréicoles français.
Dans ce cas, c'est l'apparition de cellules atypiques dans
le conjonctif qui représente le symptôme caractéristique de
1a ma lad i e ( CO Î'1 PSet colI.,
1 97 6).
Ces c e Il u 1 es
h yp e r t r 0 -
phiées renferment,
après coloration de ~eulgen des zones po-
sitives qui
correspondent en microscopie électronique â des
plages virogènes.
La \\-irogénèse s'effectue de la même ma-
nière que dans le cas de la maladie des branchies, et abou-
tit à la formation de particules de même type que celles
décrites précédemment.

---

1
1
- 10 -
1
-
CJta-5-50.6:tJte..a 9~9a-5 Thun
1
COMPS et BONAMI
(1977) ont mis en évidence une
1
Vlrose chez cette huître du Pacifique qui a été introduite
"
en France à la suite des mortalités massives de C. angula:ta.
1
RérntPE'S rp~jst?~tes à la mal::lrlie~ certaines huîtres pré-
ser.tèrent ce:?e~~d2.nt, après six années d'acclimatation, les
mêmes lésions virales que cell~~~,~,er:y"~es chez C. angula:ta
1
lors de l'épizootie des annéelJ~~>1/970~à~1~y.~.
4" 1BP 'J.j 0
(:,.,"\\
{!i
1
l I a g l l : .
r.....
"
nt -
çJ
2. Ç!!~~ _1 ~~ _ç~2~~r.g:eq<!~J~i lOt ~IOn
".
~'?J
1
./
"
/
Une maladie mortelle a"~~'~'/à la présence de
;,aTti~'-.:2-'25 '.'~T?2-'2c dans les muscles
1
d'rlt:tnp"A
\\'UjJ::(UL~-5 L.
fut ObS'2TV§e paT RUNGGER et coll., en 1971. Elle est carac-
térisée par l'apparition de nodules tumoraux oedémateux
1
sur les tentacules de l'2~~mal. Ces ced2~es, en histologie,
consistent en l'accumulation de fibres musculaires nécro-
1
sées, et de cellules hypertrophiées à noyau pycnotique. La
microscopie électronique de ces lésions révèle la présen-
1
ce de virions de 120nm à 140nm de diamètre, de forme hexa-
gonale, avec un centre dense aux électrons. L'automutila-
tion apparaît comme un moyen de défense contre la maladie.
1
1
cl LES AFFECTIONS DUES A DES PICORNAVIRUS
1
Chez les Mollusques, la présence de Picornavirus
1
n'a jamais été démontrée_,,<:oI1tra~_rem_entaux Crustacés où
1
1
1
1

---

- 11
-
cie:" ricorna\\'i~'ose~
ont été fortuitement
rapportées. Ces
\\'iru5 semblent él\\"oir une gr'-lnde affinité pour les tissus
ectoJermiques.
- Chez Callintcte~ ~apidu~ Rath.
En 1978, JOH;\\SO\\
mentionne un cas \\'iral affec-
tant de jeunes C.
~apiduj
récoltés dans la Chesapeake bay
Ularyland,
US,-\\).
La présence de particules icosaédriques
dans le c)'toplasme,
le plus souvent groupées au sein des
t i s .5 \\.~:" e c t 0 der mi que ses t
s li cci n ct en: en t déc rit e .
tre et ~ développement intracytoplasmique, a été mIS en cau-
se
(LICHT\\ER
et coll.,
1921). Les lésions consistent en une
hypertrophie nucléaire des cellules ectodermiques et méso-
dermiques, a\\'ec formation de matrices protéiniques denses à
l'intérieur de ces noyaux.
Le nom d'
"IHHN"
,"infection
hypodermal and hématopoïetic necrosis" a été attribuée à la
maladie.
Il
-
\\'lROSES,-,\\ ETIOLOGIE CO~1PLEXE
Les affections virales dont il est fait état dans
ce paragraphe font intervenir deux types de particules VIra-
les, qui se développe~t simultanément chez un même hôte.

---

1
1
-
1 2 -
1
Les VIrus peuven~ se rencontrer au sein d'une même cellu-
1
le, ou se développer dans des tissus différents. De cette
manière, on ouvre un autre volet de la virologie des Crus~
1
tacés, celui des affections multiples.
1
Che: }.{ac."~c:p.~pu~ di2;:,u.!l.atC'~
(IPlIX
:;yndrômes VIraux
ont été observés et décr:ts, mais ~n se~l a fait l'objet
d'une étude approfondie du fait de sa fréquence d'apparition
1
cL~z le crabe.
1
Le complexe viral qui présente un caractère en-
démique pour M.dépu!l.ato!l.
est constitué d'une particule
1
icosaédrique, virus P , et d'une particule enveloppée, VI-
rus S, d'où le nom de syndrôme liS-pli, pour désigner la mala-
1
Gie.
La pathagénicité des \\~~~~:~ 2 ~'t?~~-r~ de l'hôte C:A tT?-
d~it p~~ lIn tYembleme~t
des pattes,
5ui,ri d'une paralysie
provoquant la mort des animaux atteints en quelques jours.
1
Le site de prAdilection de ce~~e aifectiG~ est ~8 tiss~ i~-
tersticiel de tous les organes, mais principalement de l'hé-
1
patopancréas. Dans ce tissu, il est possible d'observer en
microscopie photonique des cellules en voie de nécrose.
1
Celles-ci renferment des inclusions cytoplasmiques fuschi-
nophiles d'apparence cristalline (BONAMI et coll., 1975)
ainsi que de nombreuses vésicules de quelques nm de diamè-
1
tre (BONAMI, 1980). L'étude ultrastructurale de ces cellu-
les révèle que l'état de nécrose et de dégénérescence est
1
associé à la présence de deux types de virus.
1
Le premier type, non enveloppé de 60nm de dia-
mètre, se développe dans le cytoplasme des cellules à par-
1
tir de plages V'l rogènes denses aux électrons,_e_t est sou-
vent observé groupé en plages paracristallines. Ce virus
1
1
1
1

---

-
1~ -
e::tconstitllé p~Jr un AR\\ bicaténairf' multisegmenté, et sa
capside renferme deux polypeptides majeurs de 87 et 28,5.16 3
J~ltons
3
et un polypeptide mineur de 107.10
daltons. De par
ses caractéristiques morphologiques et physicochimiques,
il
a été rapproché de la famille des Recu~~~dae (BONAMI,1973;
BONAMI
1980).
Le second type de virus désigné S, mIS en cause
est pléomorphe et a été rapproché des Bunyau~~~dae (BONAMI
et VAGG,
1971; BO\\AMI et coll.,
Î 971).
Les formes en bâton-
nets mesurent
50 ~ 70nm de large sur 24Q ~ 320 nm de long.
Les virions sont entourés d'une enveloppe de 20nm d'épais-
seur, présentant des spicules caractéristiques
(BONAMI et
coll.,
1975). Ce virus,
constitué de deux polypeptides ma-
jeurs et de cinq polvpeptides mineurs.
renferme un ARN mono-
catén;lire en trois segments
(BONAMI,
1980).
L'a II t r e 5 v n d r Ôme (1 D ne 1 é "F. N."
( BONAM l,
1 97 6)
a
été mIS en évidence che: M.
dep~~a~ox
lors de l'étude du
complexe viral "S-P".
Les deux virus concernés sont nus et présentent une struc-
ture icosaédrique. Le diamètre du virus F est de 31nm, celui
du virus N,
de 24nm.
Ces deux types de particules ont été
retrouvées dans le cytoplasme des cellules du tissu inters-
ticiel et des hémocytes, mais n'ont jamais été observées si-
multanément ~ l'intérieur d'une même cellule (BONAMI,1980).
L'étude ultrastructurale des lésions montre les virions de
type F réunis en plage cytoplasmique sans arrangement par-
ticulier et entourés de systèmes membranaires,
alors que les
particules N sont groupées en plage cristalline au seIn
d'une matrice dense aux électrons. Ces deux agents viraux
de par leur taille,
leur structure et leur site de déve-
loppement ont été rapprochés des P~coxnau~x~dae. Mais il
]

---

1
1
-
14 -
1
n'est pas certain ~ue les mortalités de l'espèce M. dcpu-
1
fLatofL,
soient directement liées au syndrôme "F-N".
- Chez POfLtunion ~on6ofLmi~.
1
KURIS et coll., rapportent en 1979, l'isolement
1
de deux virus différents dans les tissus de cet isopode
marin parasite d'un crabe. Les virions se retrouvent le
1
plus souvent dans les cellules de l'épiderme et de l'hépa-
topancréas. La microscopie électronique des animaux infec-
1
tés révèle la présence particulièrement abondante de VIrIons
de 25nm de diamètre, disposés en plages cristallines dans
1
le cytoplasme cellulaire. Ces particules ont été rappro-
chées des Picornavirus. Les autres particules, mesurant
61nm de diamètre ont été comparés par les auteurs à des Réo-
1
virus.
Ces deux VIrus ont été fréquemment observés au seIn du cy-
1
top]asme d'nne même cellule.
1
- Chez Simo~epha!u~ expino~u~.
Un I~idovirus
et un VIrus de polyédrie ont été
1
mIS en évidence chez des spécimens de S.
expino~u~ prove-
nant de deux étangs de la Floride (USA),
(FEDERICI et HA-
1
ZARD, 1975). Le signe
apparent de l'infection est l'opales-
cence des animaux atteints observés sous lumière U.V.
1
Il a été démontré que la virogénèse de ces parti-
1
cules n'a pas lieu dans le même tissu. Ainsi, sur coupes
ultra-fines observées au microscope électronique, l'Irido-
virus se rencontre dans les tissus adipeux, l'endocuticule
1
et occasionnellement dans le tissu nerveux.
Il s'y développe
1
1
1
1

---

15 -
de nombreuses particules ne
formant paS de plages cristal-
lines typiques du groupe.
Par contre,
le VIrus de la polyédrie cytoplasmi-
que ou Réovirus,
est observé dans les cellules épithéliales
rie l'intestin moyen.
De meme des maladies à deux virus ont aussi dé-
celées che: des crevettes d'élevage,
telles Penae~6
japoni-
CLd
Bate
et P.t110110dOIl
Fabr .
.'\\ i n s i c he: des P.
In (' Il (1 d C 11
j U Vé n i 1 es,
L l GHTNERet
coll.
(lCJS'=)
ont
isolé un Baculo\\-irus des cellules épithé-
liales de l 'hépatopancréas et de l'intestin antérieur de
les ont
été obserd's.
Ceux-ci
renferment des \\-irions enve-
loppés ;;Îesur3n~ .=..,0 n;:~ de long
Associée à ce BacuJovirus, une petite particule icosaédri-
que a été décelée dans les tissus ecto et mésodermiques de
la crevette,
ceci à un stade avancé de nécrose.
Le type de
lésions causées font que les auteurs rapprochent cet agent
du Picornavirus responsable de la nécrose hématopoïétique
et hypodermique infectieuse ou "IHHN". Mais la présence
simultanée des deux virus dans une même cellule n'est pas
rapportée.
Che: P.
japOn~CU6,
ce sont deux virus icosaé-
driques qui ont été observés au cours de mortalités.
Le
premier de 61nm de diamètre est de type Réovirus,
et le se-
cond de 20nm a été comparé à un Picornavirus.
L~stissus
affectés sont l'hépatopancréas et l'organe hématopoïétique

---

1
-
16
-
1
où le Réovirus 2 été rencontré en plus forte proportion
1
que le Picornavirus
(BONAMI, communication personnelle).
1
CONCLUSION
1
Des maladies virales des Crustacés et des Mol-
lusques causées par des virus non enveloppés, icosaé-
1
driques à localisation cytoplasmique, plusieurs aspects
peuvent retenir l'attention.
1
Du point de vue pathologique, d'une part, nous
1
pouvons constater que Sl bon nombre de viroses ont été m1-
ses en évidence chez les Invertébrés, leur description pour
:~ plupart, ~e tie~~ S~'~ ~es ~~Ser\\T2ticns fOTtuites de5 lé-
1
sions engendrées par les virus che: le~Ts hôtes.
1
En plus, si 13 morphologie des agents ~~~~ux est
bien décrite, leur rattachement à une famille connue de vi-
1
rus résulte le plus souvent de la seule étude ultrastructu-
raIe de particules. Car l'isolement de ces virus étant peu
1
ou pas rapporté leur caractérisation biochimique est de ce
fait limitée, sauf pour le cas du syndrôme viral "S-P" du
crabe Ma~~op~pu~ d~pu~ato~.
1
D'autre part, le caractère multiple de certaines
1
affections des Crustacés et des Mollusques, fait ressortir
le rôle d'hôtes réservoir ou de vecteurs de virus que jouent
1
certains Invertébrés dans le milieu marin. Leur importance
est donc capitale, car ces viroses complexes qui ne sont
1
pas forcément mortelles
pour les animaux porteurs, peu-
vent l'être pour d'autres espèces.
1
1
1
1

---

-
1 ï
-
Enfin, le c~ractère épizootique des maladies
des Crustacés et des 1'101] usques cul ti \\'és n'est pas moins
négligeable. C'est le cas pour le crabe Callincctc6 ~api­
U,5,
les huîtres C:a':-5c5t'l.ea
angulatc.. et g<:'ga.o,
les cre-
y e t tes
Pc Il Ct C Li 5 j CL).l C' l'{ cu ô et 1)10 VLO d C' n . Vu l' i mpo r tan ce é co -
nomio,uE' de c'?s :l;:::;:;2,::~, c;', COÎliprelld :J. ~ iJilpact yue peuvent
avoir de telles 6pi:ooties dans l'aquaculture et la com-
mercialisation de ces espêces.

---

-
1 8 -
C H . - \\ P I T R E
Il
LES
BIR\\,t\\VIRUS
U'A~lMAUX AQUATIQUES, DES OISEAUX ET
Des I\\SECTLS.
IJ\\TRODUCTIO\\
Les
Bil-n3\\'iru~
constituent un nouveau groupe de
virus mélis qui
3.
l 'heure actuelle n'est pas classé du fait
",._
::::û;;,it(
InLC'lndlional
de Jaxonomie des virus n'ait pas
encore ::-,ccci=-l:C Cè" lclille pour le désigner.
L'expression de
"Bi-segmentcd- dS-R\\i\\ druses", rend bien compte de qu'ils sont
S l.il -
lep l a Il d u g é n0 lI1 e:
ces 0 n t des \\' i rus à AR.I\\ bic a t é n air e ,
6
bisegmenté, dont un brin a pour poids moléculaire 2,5.10
6
daltons,
et l'autre 2,3 10
daltons.
Ce~ Vlrus ont une morphologie semblable à celle
des Réovirus.
Ils en diff~rent çependant par l'absence de la
douche couche protéinique des Reov~~~dae. Les particules ico-
saédriques ont un diam~tre moyen de 60nm.
Elles présentent
en coupes ultra-fines un core de 45nm de diamètre.
Les carac-
téristiques biophysiques et biochimiques des virus ont été
bien déterminées
(MATTHEWS,
1982). De même, le développement
.Z.f1
v{.;ttLO
de ces particules a été réalisé.
La -réplication virale s'effectue dans le cytoplas-
me des cellules atteintes,
avec formation de structures tu-
bulaires.

---

--1
1
- 19 -
1
1
En ce qui concerne la distribution de ce groupe
de Vlrus dans le monde animal, on peut dire qu'elle est très
vaste. On constate en effet que les Birnavirus touchent une
1
grande variété d'hôtes phylogéniquement différents: les Pois-
sons en particulier les
Salmonidae, les Mollusques, les Oi-
1
seaux et les lnsectes. Mals ils présentent vis à vis de ces
anlmaux une pathogénicité variable en fonction du groupe
1
animal, et aussi de l'âge de l'hôte.
1
l - LES BIRNAVIRUS D'ANIMAUX AQUATIQUES
1
1
Ce sont chez ces Vertébrés aquatiques que le pre-
1
mler Birnavirus a été isolé, avec la découverte du virus de
la Nécrose Pancréatique Infectieuse (NPI) des Satmonidae
1
(WOOD et coll., 1955). Depuis, bon nombre de virus de ce ty-
pe ont été mis en évidence chez d'autres _Poissons.
1
1
1
La nécrose pancréatique infectieuse est une viro-
se contagieuse, qui est à l'origine d'épizooties et de for-
tes mortalités dans les élevages de Salmonidae, plus parti-
1
culièrement en pisciculture des alevins et jeunes truitelles.
Le premier rapport sur cette maladie date de 1940 (Mac GONIGLE)
1
1

---

-
.::0 -
et G('pui::: la \\l'l .:::: donné lieu à de très
che5 et expérimentations dont les résultats ont été très
contloversés d'une année ~ l'autre.
L'étiologie \\-irale de cette affection a été démon-
trée par WOLF et coll.,
(lQ~O) et les premières €~uJes mor-
phologiques Je l'agent conclurent
que c'était un Picornavi-
rus
(~tUSBERGER et CERI!'.:l, 1963) ou un Réovirus
(MOSS et
GRA YEL L,
1 9b 9). 1: EL LYe t
La I-l (1 97 2)
a van c ère nt que lev 1 ru s
de la \\PT n'est nI l'un, ni l'autre, mais doit être considé-
ré comme appartenant à un nouveau type de virus.
Plus tard,
DOBOS
l19-b),
Mac DO\\_-\\LD et YA}.L-\\}.10TO
(1977)
sur la base d'a-
nal)-ses électrophorétiques de l'acide nucléique et des poly-
peptides \\-irau.\\ concluent que la présence d'un ARN en deux
Cl g en t
?
liT'
"nll1 T' e C Q rl 1"! Il d? ': in: s.
Dès l 0 r s,
l c \\ i j - u s cie l a
\\]'1
constituait le protot)-pe d'un nouveau groupe ùe \\-irus
Ce \\-irus est une particule nue,
icosaédrique d'un
diamètre variant entre 55 et 60 nm
(DOBOS,
1977).
Il provo-
que la nécrose des cellules acineuses du pancréas et des
cellules épithéliales de l'intestin antérieur
(WOLF et QUIM-
BY,
1967), avec apparition de noyaux pycnotiques.
Son dévelop-
pement est
intracytoplasmique, et 0D le rencontre soit sous
forme d'agrégats en figure paracristalline
(LIGHTNER et POST,
1969) ou alors réparti dans tout le cytoplasme. De longues
structures tubulaires lui sont associées
(1:ELLY et LOH 1972).
L'isolement des particules après développement
~n v~tno
sur de nombreuses lignées cellulaires de Poissons a permis
à
bon nombre d'auteurs~'~n pré~iser la composition biochimi-
que.
D'abord considérés comme renfermant trois polypeptides
(CHA\\G et coll.,
1973; COHEN et coll.,
1973)
DOBOS et coll.,

---

1
1
- 21
-
1
en 1~77 démontraient que le VIrus de la NPI était constitué
1
.d~ quatre polypeptides, regroupés en trois classes ( r ,B et
a 1-2)'
1
Les anImaux atteints présentent un
gonflement de
l'abdomen, une exophtalmie, et se déplacent en nage spira-
1
lée, ces symptômes étant caractéristiques chez les jeunes
Sa{mon~dae (ROBERTS, 1973). Cet auteur rapporte que l'atta-
1
que des Salmo~~dae âgés par le Birnavirus a peu de conséquen-
ces, mais fait de ces derniers des hôtes-réservoirs.
Il a
1
pû
être établi que les poissons adultes répondaient à une
infection de type NPI par une production d'anticorps neutra-
1
lisants (WOLF et QUIMBY, 1969; J0RGENSEN,
1974).
Le virus de la NPI a une répartition géographique
1
très large et son identification est basée sur différents
tests sérologiques. De nombreux cas de maladie ont été sIgna-
1
lés aux U.S. A, en France, en Norvège, au Danemark, et récem-
ment au Japon (PILCHER et FRYER, 1978).
1
Plusieurs sérotypes du virus sont connus
(WOLF et QUIMBY,
1971; De KINKELIN, 1972); certains ayant un fort pouvoir
pathogène, d'autres, non (J0RGENSEN et KEHLET, 1971).
1
1
2.
~~_~!I~~_Q~_!Y2~_~~!_!~2~é~_~h~~_g~~~!E~~_~2!~:
sons.
1
Des Téléostéens autres que les Salmon~dae sont aus-
1
SI atteints par la nécrose pancréatique infectieuse, mais sans
que de graves mortalités dans les élevages aient été observées
1
ou que_l~ virus ne soit mis en cause dans les cas d'épizoo-
ties occasionnées.
1
1
1
1

---

cepeàe)
Lors d'une expérience menée afin de déterminer
l'incidence du ~lrus de la \\PI che: des poissons sauvages,
SO~STEGARD et coll.
(19~2) ont mIS en évidence chez ce pois-
son des particules virales de type NPI. La récolte de ces
poissons a eu lieu pr~s d'un centre d'élevage de truites at-
teintes ~ 34~ de la ~PI. Des cellules RTG
infectées â par-
Z
tir de broyats de rein et de l'ale des poissons, ont montré en
microscopie électronique 1:1 présence des \\'jrions.
Bien que le
t i t r e cl e s \\ j rus ci Cl n.s les cul tu re 5 .i 11.t e ct é e s soi t é l e \\' é,
il
n '3 P a.5 été }J l'OU \\' é que
l'i n r e c t i 0 11 d u pOl S son .n a r I e v i rus
élit été :lctive.
Les auteurs suggèrent que le"\\\\~hite sucker' Il
jouerait un rôle dans l'écolocie et
l'épi=oC'tinlC'<~i'.:' ,~, 1 ,- -, _
rus de la .\\]'J.
-
Che = 1 e ~J, roc h e t : f x (' ~
LIl r ,. ~I ~ L."
Des particules virales, nues,
icosaédriques de 60nm
de diamètre ont été isolées d'alevins de Brochet
(AHNE,1978).
Elles sont neutralisées par un sérum normal de truite,
et mon-
trent une étroite relation sérologique avec deux sérotypes
connus des virus de la NPI.
Le virus se multiplie aussi bien
sur cellules primaires de truite et de brochet que sur des li-
gnées cellulaires établies.
En 1977, ANHE rapporte l'infection
persist::Jnte clP ce11111pc; (H5E-214 par ce virus, pendant 3U passa-
Qes et suggère que telles infections pourraient se produire ~n
v~\\,'o .
L'isolat, cu:J.tivé sur cellules et testé sur des alevins et de
jeunes brochets ne s'est pourtant pas révélé pathogène.

---

-
'23 -
1
3.
~~-~~~~~-~~_!~~~g~~!!~-~~~~p~~~~~_i~~8~{~~~
~~g~~~~~_~_2_~_iIV~2
1
De fortes mortalités se produisant de l'automne au
1
p~intemps, dans des élevages d'anguilles au Japon) ont ~t~
rapportées par SAND en 1976. Ces épizooties sont dues â un
virus, qui avait été au préalable isolé d! anguilles euro-
1
p.éennes (PILCHER.. et FRYER, 1978)
1
L'affection se manifeste par une rigidité du corps
des animaux, associée â une congestion des branchies et de
1
l'abdomen. Le rein est souvent hypertrophié et des phénomè-
nes d'ascites sont quelques fois observés. L'examen histopa-
1
Lhu~ügi~u~ rfvê:~ des nécroses des glomérules de la
du foie.
L'agent responsable, qui a pu être isolé par SAND (1976) ,sur
1
llgnées cellulaires RTG
entraîne une pycnose des noyauxx et
Z
une élongation du cytoplasme des cellules. En microscopie
1
électronique, les cellules rénales d'anguilles malades ou les
RTG Z infectées, contiennent des particules virales â profil
1
hexagonal, de diamètre variant entre 68 et 77nm. Ces virions
sont observés soit dispersés dans le cytoplasme, soit inclus
1
dans des vésicules.
Des tests de neutralisation réalisés avec des anti-
1
sérums contre 5 sérotypes de l'IPN ont montré une forte rel~­
tion antigénique entre ce virus de ll~nguille et une souche
1
française d'IPN.
Expérimentalement, la maladie est reproduisible, et provoque
1
une mortali~é élevfe ~hez les jeunes anguilles inoculées.
1
1
1
--1

---

~ J
-
-1;'
h~_1~\\~l~0i~_~lL~l~_~~_l~~Çb-~!~~_~~_~~t~!~
( I~ ~ i ~ ~1 ~ g ~ ~ ~ ~ _S~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ s. ~ ~ _..!'li_t_cJ!.. ~1)) .
l'LU~1R et coll.,
(1979)
ont décrit une maladie à n -
rus che: ce poisson d'Amérique du Nord.
Bien que les morta--
li[~s norées d~ns les étangs d'elevage n'ont pu ~tre directe-
,~ment attribuées à l'action du virus, les animaux atteints
présetitent cependant de sérieux troubles de comportement
ils sont apathiques,
nagent en surface et les fl]uS affectés
nagent en spirale.
Il
v
a atteinte du muscle dorsal
et des
petechies hémorragiques sont obsen'ées sur le ventre,
dans le
tissu adipeux et
13 muqueuse
intestinale.
Le viruti 3
pu être identifié après inoculation de cultures
cel luI air es F]-{J\\'\\ p:1 r des br 0 y a t s fil t rés de po i s son s ma 1 ad es.
i l
se produit sur ces cellules un eliet L')topathogÈ'ne qui se
J~\\eioppe en _-1 heures J 30(, ~\\ec formation de nombreuses
\\élcuoles cytoplasmiques et de nO~'aux multiples. Ces cellules
Inlectées observées au microscope électronique ont
montré
des :ones c~'toplasll1iques paracristallines formées de particu-
les icosaédriques, nues,
de 70nm de diamètre.
Outre ces espèces,
il a été fait état
d'isolement
de VIrus de type \\1'1
che: d'autres poissons tels la Perche,
la Carpe,
l'Ombre, le Gardon
(AH\\E,
19(8),
la Morue
(Mac DO-
\\f\\LD et GOl\\'ER,
1981),
et le Hareng
(HILL,
communication per-
sonnellei, le Loup
(RO\\Al'Jl
et coll.
1983)
sans qu'il ne soit
rIen connu de l'effet des virus sur leurs hôtes.

---

1
1
-
25 -
1
1
1
Le terme de "Tellina virus" désigne les virus de
type NPI qUl ont été isolés ces dernières années de Mollus-
1
q~~5 Bivalves. C'est tout d'abord chez une Telline T~Le~nŒ
~~~~[b da Costa, que HILL (1976a) décrit la présence du Bir-
navirus . Puis des isolats du même type ont pu être obtenŒ
1
à partir d'autres
Bivalves, en particulier des Huîtres:
Ob:t:rLa ed1LU.J.J
l .CJtabbobtJtea gigab, C. viJtginic.a, mais aussi je
1
Palourdes
MeJtc.enaJtia meJtc.enaJtia L.,et de
Patella vulgata
L., ainsi queLittoJtina littoJtea L.
1
1
1
A la suite de travaux de BUCHANAN (1973) sur une
population de Tellines, où il mit en évidence dans la glande
digestive des Bivalves, des particules d'allure virale,
1
HILL
(1976a) décrit l'isolement d'un virus sur des cultures
de cellules (BF ) à partir de broya~s de la glande digestive
1
2
de la Telline.
1
Des recherches ultérieures ont montré que la par-
ticule observée par BUCHANAN en 1973 était en réalité le
1
phage d'une rickettsie
(BUCHANAN, 1978).
Morphologiquement, le virus isolé par HILL(1976a)
1
est semblable à celui de la NPI. Ses caractéristiques bio-
chimiques ainsi que ses propriétés physicochimiques et
1
- - - - - - -
biophysiques-ont été déterminées
(U1\\lDERWO-OD et coll .. 1977) .11
1
1
1
1

---

1 - ~......_
-
26
-
renferme un AR\\
bic2ténaire bi.segrnenté et
trois
polypepti-
des
le constituent,
dont
un m2jeur de P~I 110.10.) daltons et -,
3
mineurs de PM 67.10
et 40. iO ::i daltons.
r-.lais ce \\irus n'est
pas neutralisé par l 'antisérum polyvalent contre tous les
sérotypes connus du virus de la i\\PI.
Par contre,
la réac-
tion croisée obtenue entre le virus de la Telline et celui
de la \\P l
par des
techniques immuno,logiques permi t
aux au-
teurs de conclure que ces deux virus appartiennent
à un
même groupe
(U\\DER\\\\OOD et
coll.,
1977).
"O. rIT
Ce type de
Birn~l' iru5 (] :1l15S1 été isolé de popu;
lations sau'"ages d'huîtres,
.1l1lenant
HILL
(1976b)
à les
' .
-
-
\\ \\...J •
\\
) ,
l,.::"I
Li
..... l
d
:. _..... c- l
l e 5
J i r Cé r c· n t s
hi'"al'"es en trois
séro\\2roupes.
L'existence d'un anti~ène commun
entre tous ces
iSOlats aY::lJlt
i0té àémontré pOl' des
tests d'an-
ticorps
fluorescents.
a)
Che: O~t~ca cdul~~ .
Expérimentalement,
HILL et ALDERM.I\\N
(1977)
ont
démontré que certains sérotypes du virus de la Telline et
des ,"irus d'huîtres,
étaient pathogènes à basse température,
surtout pour G.
cduf.tô,
causant dans
la glande digestive du
Bivalve des oedèmes,
des nécroses,
avec
infiltration
d'hé-
mocytes dans les
tissus.
b)
-
Chez C~a~~o~t~ca g~ga~
La
pathogénécité
d1J VIrus de la Telline a aUSSI
été
testée vis-à-vis d'une autre espèce d'huître cultivée,

---

1
-
'17
_
,--,
1
C.g..tgaJ.>.
Les expériences menées prouvent que le "T.V" pou-
1
vait être détecté dans les tissus de l'hôte, au mOlns 3
mois après inoculation (HILL, 1976b), sans qu'aucune patholo-
1
gie nette ne soit observée en histologie, si ce nlest une dé-
térioration du conjonctif associée â une infiltration d'hé-
mocytes (HILL et coll .. 1982).
1
1
1+ - LA MALADIE DE GOMBORO
1
1
Encore appelée, la maladie de la Bourse de Fabri-
C1US du
Poulet (IBVD), cette affection est due â un virus qui
a été J2Tgement rlécrit mais pour lequel l'affiliation â un
1
grollpe taxonomio.ue de virus a été très controversée
(CHEVILLE.
1967; CHO et EDGAR, 1969; KOSTERS et coll., 1972).
1
Cet agent viral attaquant le tissu lymphoide de
1
la Bourse de Fabricius
est à l'origine d'importantes mortali-
tés dans l'industrie du Poulet. Considérés comme étant diffé-
1
rents des autres Réovirus d'Oiseaux (NICK et coll., 1976), ce
virus selon PATTISON et coll.
(1975) et HARKNESS et coll.,
(1975) a des similitudes avec l'agent de la NPI.
1
La particule icosaédrique, mesure en moyenne 60nm de diamè-
tre. Sur les préparations virales qu'ils ont observées, HARK-
1
NESS et coll., en 1975 ont noté en plus la présence de trois
autres éléments viraux; d'une part des petites particules
1
de 18 â 20nm de diamètre, d'autre part deux types de tubules
de diamètre proche de ceux des virions. Les deux types de
1
virions, présentent,
se~o~ AL~EIpA et MORRIS (1973), des re-
lations antigéniques. Mais KAUFER et WEISS (1976) n'ont pas
retrouvé ces éléments en microscopie électronique d'animaux
1
expérimentalement infectés.
1
1
1

---

Difù;rents <Juteurs ont
r3pporté
la présence de
particules \\irJles
icosaédriques,
nues de 60 nm de diamètre
en p ct r tic u ] i e l' che = ci e s
Di P t è l' es,
Li' i n tél' ê t
mé cl i cal.
L' I-
dentification et
1 'a11al:'se des
propriétés biochimiques des
\\'irus amenèrent
ces auteurs
2\\
rapprocher les
isolats du \\'irus
,\\/
LL \\'lHU:;}.. DE 1.,\\ D1HhCIPflll.L
(D'l'~l'~Jh,{ta
__________________________________ c
mc.i:anc-
__
~
ll~.S ~~'l)
"1)\\\\''' .
..:.-------------
1("'5
;',!n,,-,"t)n]e ,10 I)]'osophiles non
infectées par
le \\l]'~IS Sigm::
lEhabdo\\iILlS)
lequel
induit une sensibilité au
étaient
sensibles à
l':lno,\\ie,
et qu'elles
en mourraient.
Les
broyats de ces mouches,
e.'\\J.minés en électronique,
ont
révélé
la présence de particules virales autres que le Rhabdovirus.
Ces virus,
de b2nm de diamètre
sont
icosaédriques et ne possè-
dent pas d'enveloppe.
Sur coupes ultra-fines,
les virions ont été
retrouvés dans
tous
les organes
(tractus digestif,
cerveau,
muscles,
thorax
et
0\\3i]'es)
a l n S J
que d:ll1S
les
cellules des
trachées.
L'inva-
sior. de ces
L1el'ni('res
sCl':Jit
1<1 cause àe
l'anoxie,
et
est
considérée comme
le pre~ier symptôme de l'infection.
Les \\'irions peuvent
être dispersés ou disposés en plage para-
cristalline dans
le cytoplasme,
ou accumulés
sous la membrane
plasm~que. Oc~~sionnellement la présence de tubules a été
notée.
Le \\'irus X se cultive
~n U~~~C
sur cellules de

---

1
1
-
~~)
-
1
Il
est considér§ par les auteurs comme tr~s
1
proche du virus de la NPI et de la Telline mais son origine
est discutée.
(TEi\\INGES et coll., 1979a ).
1
BI ~f_YI~~~_Q~_Ç~f~s~;~~~_~E~_iQ~E!~~~~~_Ç~r~!2:_
1
EQgQ~~2~~_1_~_ÇY~
1
MIALHE et coll., en 1983, rapportent l'isolement
d'un virus d'une population naturelle de Diptères, Ceratopo-
1
gonidés, du genre Culico~de~
sp., provenant de la région de
Strasbourg.
1
Le virus a été décelé par passages successifs sur Vft.OMphita.
metanoqa~teft.,
mais ne provoque pas de symptômes chez cet in-
1
tion d'effets sur ces cellules.
1
L'affection virale se manifeste principalement dans
1
les tissus adipeux,
trachéens et épidermiques.
Dans les broyats purifiés de C.sp.
et de V.metan09a~teft. , des
1
virions nus,
icosaédriques, de 54nm de diamètre ont été ob-
servés. Sur coupes ultra-fines de matériel infecté, les virus
1
etles viroplasmes se situent dans le cytoplasme et s'y orga-
nisent,
en fin de virogénèse pour former un réseau pseudo-
cristallin.
1
Les virions ont une densité en gradient de chlorure de Cesium
de 1,32 et sont constitués de six polypeptides de poids molé-
1
culaires variant entre
24.500 et 105.000 (MIALHE,
1982).
Les auteurs rapprochent le virus de Cul~coZde~ sp. du groupe
1
des
Birnavirus, et plus particulièremen~ du virus~ X de la
Drosophile.
1
1
1
1

---

-
30 -
Un virus désigné 743 , et isolé de
maringou Ins
Aede.6 vexanl.> , a été comparé
avec une souche de v il us àe la
maladie infectieuse de la Bourse de Fabricus du Poulet
(HOWIE et THORSEN, 1981).
La comparaison entre ces deux virus portait sur leur crois-
sance dans diverses lignées cellulaires: les modifications
cellulaires consécutives à leur replication , leur courbe
de croissance, leurs propriétés physiçachimiques, ainsi que
leur parenté antigénique. Sur tous ces points, les deux VI-
rus s'avérèrent semblables,
et les auteurs conclurent qu'ils
correspondaient 8 de~ c:.01_\\C!-:~: d''..::i TI',êr.<8 virus.
Mais le virus 743 isolé c1'--"
!TIC''--"~t~C;'..:2,
n Ç
:;'est péiS révélé
pathogène pour les poulets.
DISCUSSION ET CONCLUSION
L'isolement de
Birnavirus
de
animales prouve bien que ce groupe de virus a un spectre
d'hôtes très large et très diversifié.
Pour chaque représentant du groupe, les caracté-
ristiques morphologiques, physico-chimiques et biochimiques
ont été déterminées et nous les avons regroupées dans un ta-
bleau faisant suite à ce chapitre. Les divergences remarquées
quant. àla ·taill e des virions ou à leur composition biochi-
mique
montrent une certaine
spécificité de chaque virus

---

•
1
-
~ 1 -
1
vis-a-vis de chaque hôte.
1
Quant à la transmission de ces virus, on constate
1
que peu de choses sont connues pour la plupart d'entre eux.
Seul pour le virus de NPI, une transmission verticale
1
(WOLF et coll., 1963) et une transmission horizontale (RO-
BERTS, 1973) sont reconnues. Tandis que pour le virus X de
la Drosophile, son origine est discutée (TENINGES, 1979b).
1
Malgré les nombreux isolements, la diagnose d'af-
1
fectionpar Birnavirus reste difficile à démontrer. En témoi-
gne la nécessité d'utiliser des cultures cellulaires pour
1
mettre en évidence ces virus chez des individus âgés entre
autres, faisant de ces derniers des vecteurs potentiels. On
1
voit donc que l'aspect biologique des affections Dar Birna-
virus, est à l'heure actuelle encore mal défini.
1
1
,
1
1
1
1

---

TABLEAU RECAPITULATIF DES
PROPRIETES
des
BIR NA VIRUS
PROPRIETES
POLYPE-
GENOME
Neutrali-
DIAMETRE
SUSCEPTIBILITE
RESISTANCE
ET
HOTES
TIDES,
dS-HNA r saU.on
VIRUS
tNM)
CELLULAIR.E
STABILITE
PM x 10 .
PM x 10-
par serum
DaI tons
DaI ton.'3 anti IPN
~
-.
Nf-'I
Poissons
59.2
RTG
3 pH 9
2
90
? .11
Nécrose pancréa-
(Salmonidés)
Chaleur 56°
60
~
2.2
1
BF
tique infectieuse
2
Ether : 20 %
29
(3 )
FHM
27
1
!
T.V
Mollusques
58.8
BF
3 pli 9
2
90
?
JI
Te l 1 i na
Bivalves
Ether
20 %
57
??
-
FHt1
Vi t' U 2, (h)
(Te 11ine)
RTG 2
-_._._- ..,_..._---
(). V.
Mo Il uSf]ues
58.3
BF
3 pH 'J
q()
;' . /,
2
llY:'Jtet'S
Bivalves
F.ther
20 %
')7
??
-
RTC
Vi t'Il:" (c)
(Hujtres)
2
FHM
21
_..
._-
_ - - - _ . ~
'.
fHlJV
Maladie
1 Oiseaux
59.2
Drosophila
Ché'lleur
(n
? . [~)
Infect i ellse cie
(poulet)
ln e lé'lnog.:ister
Eth,:;r
20 %
56
~-l
Î
{ • r:.
],'1.
hourse de
Insectes
cell. embryolma 1 res
'":3
j.
F:;ht'ic i.us ( ct )
Diptères
de poulet
')0
(moustiques)
Aedes ;18gypt 1.
il')
30
2 11
1
1
"'____ ...-
. ..
-._- ----------
---_ .. -
..
-- -- .-_._-_.----
.L
- .._----- .- .-._-.-'--.'-- ---- _._----_.__._----_._-_._- ___o. ____."_"___.__ ..- ......
. -_.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

---

DXV
Virus X
Insp-ctes
59.0
Drosophi la
21~ h
à
37°C
100
2.6
de la ctrosophile
Di ptères
,. elanogaster'
24 h
à
4°C
59
2.5
(e)
(drosophile)
Aèdes aegypti
Actinomycine
49
N.D.
D=O, Sug/ml/lh
44
33
27
C.V.
Virus de
Insectes
54
105
2.6
Cu licoïdes sp.
Diptères
50
2.S
( f)
(culicoïdes sp)
N.D.
48
N.D.
Cerel topogonid és
42
31
211
---_._----~-
G S V
Virus de
Poisson.'!
70
FHM
Ether : 20 %
N.D.
N.D.
Golder Stlinner
(Cyprinidés)
Chaleur SooC
-
ou Chat te de
30 1
l'Est
(g ,
3 pH 10
a
::
TENINGES et ço 11 . 1 (1979
DOBOS et coll., (1979)
b
=
DOSaS et Coll., (1979)
UNDERWOOD et coll.,
(1977 1
c
::
HILL (1976b)'
;
DOBaS et coll. (1979)
;
Mc DONALD et GOWER (1981)
(j
::
TODD et Mc NULTY (1979)
e
::
TENINGES et coll., ( 1979)
f'
::
MIAUlE et co),I.,
(1983)
g
::
PLUMB et coll.,
(1979)
N. D.
::
ré,sul ta ts ,non donnés
résulLi'lts négatifs

---

- 32 -
CHA PIT R E
III
MATERIEL
ET
TECHNIQUES
A - LE ~~TERIEL VIVANT
- Classification.
Nos travaux ont essentiellement porté sur une es-
pèce de CI"abë5, :'~. di::-pU;LatofL L. ahondant sur les côtes médi-
terranéeTI~es, mais qui présente peu d'intérêt économique.
Son importance en tant que matériel expérimental vient du
fait qu'il est atteint de manière endémique par un syndrôme
à deux virus
(BONAMI, 1980).
Ce crabe anciennement appelé POfLtunu~ depufLatofL
est un Crustacé, Décapode, Brachyoure, et appartient à la
famille des
PoJttunidae.
La caractéristique de cette famille est son adap-
tation à la vie benthique et à la nage, cela par modifica-
tion de la cinquième paire de périopodes: les propodites et
les dactylopodites sont
ovales, aplatis en palette mince et
à bord cilié. De même, M.
diLpUAatofL
présente un aplatisse-
ment des pinces. Sa carapace est rugueuse, de couleur rouge
brun clair, et atteint 55mm de large. Elle comporte trois
dents frontales et cinq dents antéro-latérales, très aigües
séparées par un espace
profond (Planche l, fig.1).
M. depufLatofL, espèce sub-littorale, est pê0hé en
mer au chalut.
Ils nous ont été fournis tout au long de
notre travail par des pêcheurs de Sète. Les crabes étaient

---

J
- :n -
1
maintenu~ dans un bac d'eau de mer, convenablement oxygénée,
1
et ce,jusqu'à leur transfert dans les circuits d'élevage au
laboratoire.
1
Maintien au laboratoire.
1
Les crabes ont été élevés et maintenus au labora-
toire à une température de 18 à ZO°C dans un circuit d'eau
1
de mer constamment- filtrée et oxygénée. Quinze à vingt cra-
bes étdient répartis par bac de 50 litres d'eau de mer, et
1
nourris tous les deux jours avec des moules.
1
1
- Description des lignées .
1
Nous avons utilisé des lignées cellulaires éta~
blies, c'est-à-dire que ce sont des lignées qui peuvent se
1
reproduire in vi~~o indéfiniment. Nous nous sommes particu-
lièrement attachés aux cellules de Poissons: BF ' RTG ' FHM
Z
Z
1
et SBL.
Celles-ci nous ont été fournies, soit par le "Fish Diseases
1
Laboratory", Weymouth (Angleterre), soit par les Laboratoi-
res "Flow" (Angleterre), ou encore par le laboratoire Na-
tional de Pathologie des animaux aquatiques (COB, BREST).
1
- La lignée SBL : "Sea Bass Larvae", provient du Bar
(Vi-
~~n~~a~~hu~ fab~ax,
L .1758) mais la culture de ces cel-
1
lules n'a pas encore été homologuée.
La lignée FHM (3RAVEL et MALSBERGER,
1965)
ce sont des
1
cellules_épithéli~le$ dérivant du tissu anal du poisson
1
1
1
---1

---

'. ',. ,- '.~ ::
1
1
?ê:ticüles
vi:2~es du
syndrome
SP
de
M.
depurator
est
icosaédrique
la
G2rticL;le
S
s
est
pléomorphe.
Contraste
1
~~~atif à l'APT.Microscopie électronique
x
60
000
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

CD

---

,
'ot
- 34 -
"Tête en boule" ou Fathead minnow
(P-ime.phaf.e.-6
pJz.ome.f.a-6,
Kafinesq~e,
1820).
- La lignée RTG
(WOLF et QUIMBY, 1962), provient de cel-
2
lules fibroblastiques de gonades de la truite arc-en-
cie l
( SaI m0 ga r dn e ri i), Rie h a r d son, 1 8 3 6) •
- La lignée BF
(WOLF et QUIMBY, 1966) a été obtenue à
2
partir de la culture de fibroblastes du tissu caudal du
Bluegill au Le.pom-i-6 ma~Jz.o~h-iJz.u-6
(Rafinesque, 1819).
-Entretien des lignées.
La culture des lignées cellulaires a été réali-
sée dans le milieu de EAGLE modifié selon GLASGOW,
(Mac
PHFRSCli\\! et .sTOCKE~,) 1?'52;
~:..: ~!E~~G, ccrr.plété par ~C~ de
BOlJillor Tryptose Phosphate (BTP) et 10"u èc Sél'Liil, de ':""dU
Foetal (SVF). Pour un litre de milieu, de pH 7,4 la compo-
MEMG (x10):
100ml
BTP :
100 ml
Tampon Tris-HCI 0,16 m:
100ml
pH 7,4
L Glutamine 200 mM:
10 ml
Bicarbonate de Na:
234 g
Pénicilline
100 ug
Streptomycine
100 ug
SVF
100 ml
Eau distillée:
590 ml
Le milieu est stérilisé par filtration sur membra-
ne Millipoxe__ en nit]ate de cellulose de _porosité 0,2 u.
Avant utilisation, on teste la stérilité du milieu en pla-
çant une fraction aliquote à 37°C pendant une nuit.

---

)
-
35 -
1
Pour maintenir les cultures, nous les avons re-
1
piquées par la méthode de trypsination. La trypsine, enzy-
œe pancréatique, permet, en présence d'un agent chélateur,
1
l'EDTA, de détacher les cellules les unes des ~utres et
de les décoller de leur
support.
1
... ".
E~E~~1~_g~_~~1~~g~_IEYE~!~~_:É~I~_iI~ÉL
ç.
Trypsine
(1/25;))
0, H
1
EDTA
0,07.%
1
PBS (Solution salée tamponnée au phosphate pH 7,4 sans
Ca++ ni Mg++)
100 ml
1
Les cultures présentant un tapis cellulaire
confluent et uniforme étaient en général
repiquées au bout
1
d'une semaine.
Pour cela, et dans des conditions d'aseptie to-
1
tale, la culture est débarrassée de son milieu de crois-
sance, rincée au PBS, puis ce dernier élimité, elle est
1
recouverte de T.E. à raison de 2ml pour une fiole de cul-
ture Falcon de 25 cm2 et de 5ml pour une fiole de 75cm2.
1
Après une à deux minutes d'action, le mélange T.E est enle7
vé et les cellules dissociées, sont remises en suspension
1
dans du MEMG, par forte aspiration à la pipette.
Un comptage 2 la cellule de THO~4, en présence
1
de Bleu Trypan, est effectué avant de répartir cette sus-
pension cellulaire dans de nouvelles fioles de culture.
1
5
D'une manière générale 5.10
cellules/ml sont ensemencées
6
pour une fiole de 25 cm2 et 1 ,5-10
cellules/ml pour une
1
fiole de 75 cm2. On ajoute ensuite le milieu de culture.
1
1
1
1

---

-
36 -
Les cultures ainsi repiquées,
sont mises à incuber à 30°C
pour les FHM et les SBL,
tandis que les RTG
et les BF
2
2
sont maintenues à 25°C.
- Congélation , Décongélation .
Cette technique consiste,
après avoir trypsiné
une culture 3 à 4 jours,
à remettre les cellules en sus-
pension dans du mi~ieu nutritif additionné de 10% d'un
conservateur,
le DMSO. La température des cellules est en-
suite abaissée par congélation à -70°C,
et leur conserva-
tion assurée à -180°C dans l'azote liquide.
Pour la remise
en culture des cellules,
il suffit de les ensemencer,
après
décongélation,
dans le milieu nutritif et de les mettre à
incuber à leur te~nér~~llre de cTois5a~ce.
B - TECHNIQUES DE PATHOLOG!E EXPERI~E~rALE
1.
Inoculation des cultures cellulaires.
------------------------------------
Nous avons réalisé ces inoculations sur des ce}-
Iules saines,
dont le tapis était confluent,
24 h à 48 h
après le repiquage. Les cultures ont été inoculées soit à
partir de broyats d'organes clarifiés de Mac~opipu~ depu~a­
to~, soit à partir d'hémolymphe, ou d'extraits du tube di-
gestif postérieur du crabe,
ou encore de surnageant décon-
gelé de culture cellulaire présentant un fort effet cytopa-
thogène.
Dans le cas des broyats d'hépatopancréas et de

---

-
?7
-
branchies, ou d'extraits du tube digestif, les suspensions
obtenues ont été additionnées de Pénicilline
(10ug/œl)
PU1S
stockées une nuit à 4°C, avant d'être diluées au 1/10
dans du PBS lors de l'emploi.
1
Les cellules ont toutes été inoculées suivant
1
le même protocole, quelle que soit l'origine du matériel
viral. Les cultures sont d'abord débarrassées de leur mi-
1
~ieu de croissance, puis lavées soit par du PBS, soit par
du milieu d'infecti0n, qui est du MEMG à 2% de SVF. Le
1
milieu de lavage étant éliminé, l'inoculum ,de 0,2 à 1ml
est ajouté et laissé en contact avec les cellules,
h.
à température ambiante. Les cellules sont
ensuite mises
1
à incuber à 15°C, après avoir été préalablement recouver-
tes Dar le milieu pour infection. Une culture témoin ad-
1
ditionnée de MEMG à 2% de SVF est mise à incuber en même
temps.
1
Ces cultures sont contrôlées chaque jour au microscope
à contraste de phase de manière à déceler un éventuel
1
effet cytopathogène.
2.Inoculation des crabes.
1
----------------------
Deux lots de 10 spécimens de M. depu~ato~ ont
1
été inoculés par du surnageant cellulaire infecté clarifié
à 2000 g, puis concentré à 25.000t/mn pendant 1h.30. Le
1
culot de centrifugation repris dans 2ml de PBS est addi-
tionné d'antibiotiques, et conservé un~ nuit à 4°C avant
1
d'être inoculé à raison de 0,1ml par crabe. 10 crabes ont
reçu la suspension au niveau de l'articulation de la Sème
1
paire de pattes avec le thorax tandis que les 10 autres
1
1
1
1

---

'"',
- 38
ont été inoculés per 'os" à l'aide d'une aiguille rodée,
en écartant les mandibules des animaux.
Les conditions de maintien ,et d'alimentation de ces anI-
maux ont §té les mêmes que pour les crabes témoins.
~. TECHNIQUES VIROLOGIQUES
~es ~laques Ce
titrage
(Falcon)
à 6 puits,
en-
semencées avec une suspension cellulaire saine de 1ml ti-
4
trant 5.10
c /ml ont été infectées à confluence des tapis,
avec des d Ol
d
d
10- 1 '10- 10
,
d
0
0
0
1
utlons
e VIrus,
e
a
, a raIson
e
0,2ml par dilution. Trois puits ont été inoculés pour cha-
que dilution.
Après une heure d'adsorption à température am-
biante, l'inoculum est éliminé et les puits sont recouverts
d'un mélange à volume égal
d'agarose à 1% et de MEMG(2 X).
Après quoi, les plaques sont mises à incuber en chambre hu-
mide à 15°C. Au bout de 72 h., les tapis cellulaires sont
fixés par une solution tamponnée de formaldéhyde à 10% puis
colorés au Bleu de Méthylène à 1%. Le résultat est donné
par le comptage des plages de lyse, exprimé en Unité Forma-
trice de Plage/ml (U.F.P/ml).
2. Purification des virus.
-----------------------
Les cultures BF
dont la destruction ~es tapis
7
'-
auait lieu en 72 h., étaient congelées à -20°C. C'est à par-
tir de ces cellules que nous avons purifié les virus.

---

1
41
-
1
1
1
Après ultracentrifugation à l'équilibre en gra-
dient de densité de CsCl, les fractions contenant les virions
1
sont collectées à l'AUTO DENSI FLOW
et analysées au réfractomè-
t re de ABBE. La dens i té
est cal culée à part ir
de
1
l'indice de réfraction
1
0/
TECHKIQUES BIOCHIMIQUES
1
.. ..
~
,..
---..;---
1
Les élec~rc~~~~~s2~ C~~ 5~é faites sur p12ques de
1
selon les méthodes de WEBER et OSBORNE (1959)
avec des
gels de 8% d'acrylamide.
1
Ces gels sont constitués de
1
- 36ml de tampon phosphate 0,2M pH 7,8
( à 2g de SOS/litre),
- 25,2 ml d'une solution stock d'acrylamide (22,2g d'acrylamide/
1
0,6g de bis-acrylamide dans 100ml d'eau distillée),
- 7,5 ml d'eau distillée,
- 3,6ml de persulfate
d'ammonium à 1%,
1
- 0,110 ml de Temed.
1
Les échantillons à analyser sont traités par un
milieu dissociant composé de 1% de SDS, 1% de ~-mercaptoéthanol
1
et de 5M d'urée dans le tampon phosphate, 1 minute à 100°C.
1
1
1
1
1

---

-
42
-
Les gels son t c 0 1 0 rés pen dan t 2 h. par l e Ble u
de
Coomassie à 0,05% dans 45% de méthanol et 10% d'acide acé-
tique.
Ils sont ensuite décolorés dans plusieurs bains
d'acide acétique à 10% et de méthanol à 45%.
Les acides nucliques ont été analysés en utili-
sant des gels composés à 2,5% d'acrylamide et de 0,4% d'a-
garose, dans le tampon de TOOD et Mc.NULTY (1979) concentré
deux fois:
- Tampon (2 .x. )
Tris 0,36 M
~':lU
pn
0,30 1':1
..... ··2· ~ 4
l::D1A
0,01 M
SDS
0, 1 %•
Le gel, à base d'acrylamide et d'agarose, a la
composition suivante:
Solution A:
acrylamide à 5%.
Sml de tampon (2X )
2,2ml d'acrylamide stock (22,2g d'acrylamide/O,6 g de
bis
acrylamide dans 100ml d'eau distillée).
2,3 ml d'eau.
Solution B : agarose à 0,8%
Sml de tampon (2 X)
Sml d'eau distillée
- 0,08 g d'agarose.

---

1
1
-
lj 3
-
1
Les solutions A et B sont chauffées à 45°C,
1
mélangées et additionnées de 0,5ml de persulfate d'am-
monium à 2% et de 0,03ml de Temed avant d'être coulées
1
sur plaque de 20x10 cm. Avant analyse,
les échantillons
de virus sont chauffés 2 h à 37°C en présence du milieu
dissociant.
1
Les gels sont colorés par une solution de Bromure d'éthi-
dium à 0,001% dans l'acétate de sodium
(20~M) pH 7,7. Ils
1
sont ensuite décolorés dans l'acétate puis observés sous
lumière U.V.
1
El
1
TECHNIQUES HISTOLOGIQUES
1
1
T p S
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---
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\\.
..........
22mm)
dans des boîtes de Pétri stériles, ont été fixées par
1
le mélange de CARNOY
(1886) pendant 15 minutes, avant d'être
colorées. Différentes colorations décrites par MARTOJA et
1
MARTOJÂ
(1967)
ont été utilisées
la Gallocyanine, l'Héma-
lum-éosine,
la réaction nucléale de Feulgen et Rosenberg,
1
ainsi que le mélange de Unna-Pappenheim.
Dans le cas de la coloration par l'Acridine oran-
1
ge,
le fluorochrome a été
dilué dans le tampon Mc Ilvaine
pH 3,8,
à la concentration da 0,01%.
1
Un test de digestion par la Ribonucléase pancréatique
à
0,05%
a aussi été réalisé pendant 30 minutes à 37°C,avant
1
la coloration à l'acrid)ne,
surdes. cellules témoins_~t
infectées. Les observations en lumière U.V.
ont été effec-
1
tuées à l'aide d'un appareil Olympus
équipé d'un filtre
1
1
1

---

_ 44
_
d'excitation EY 455 et d'un filtre d'arrêt 0530.
Les branchies, l'hépatopancréas et le tube diges-
tif postérieur de Ma~~op~pu~ depu~a~o~, préalablement fi-
xés au mélange de DAVIDSON
(MARTOJA et MARTOJA, 1967), ont
été déshydratés par une série de bains d'alcool, puis pro-
gressivement imprégnés de paraffine à 60°C, avant l'inclu-
sion définitive dans la paraffine pure.
Les coupes de 5 p d'épaisseur de ces organes ont été colo-
rées soit par le Trichrome de Masson, la Gallocyanine ou
1 'Hémalium-éosine.
Les
tapis cellulai~es des BF , décollés de leur
2
support
io~ ont subi une double fixation:
d'abord au glutaraldéhyde
2 2,5~, 1 heure à 4°C, suivie d'une post-fixation dans l'a-
cide osmique à 1%, une heure à 4°C. Les coupes fines et ul-
tra-fines de ces éléments inclus dans l'épon 812,ont
été
obtenues à l'ultratome LKB V, et
colorées par la méthode
de REYNOLDS (1963).
FI TECHNIQUES SEROLOGIQUES
Une suspension virale purifiée, mélangée en par-
ties égales à l'adjuvent de FREUND a été inoculée à un la-
pin. Deux rappels, à une semaine d'intervalle chacun, ont

---

1
1
_ 45
_
1
~t~ effectu~s avant de saigner le lapin. Le sang frais, r~cu­
1
p~r~ dans des tubes à h~molyse est alors centrifugé pendant
3 minutes à 2000 t/mn, et
le sérum ainsi obtenu conservé
1
à -20°C.
1
2.
Immunodiffusion .
1
Le support solide de la réaction antigène-anticorps
est constitué par un gel d'agarose à 1% dans un tampon Bar-
bital sodique-Barbital acide de pH 8,6.
1
Dans ce gel, sont percés un puit central recevant l'antigène
et des puits périphériques destinés aux anticorps. Ces der-
1
niers sont au préalables dissociés par du Sarkosyl à 1% dans
du tampon T. N. E.
1
Après une nuit d1incubation en chambre humide à 4°(, les
gels sont lavés par du NaCl à 0,9% puis
rincés à l'eau dis-
1
tillée. Après séchage, ils sont colorés 1 h. par le Bleu
de Coomassie à 0,5% dans un tampon: éthanol à 45% - acide
acétique à 10% - eau distillée 45%, puis décolorés dans le
1
tampon.
1
Ce test a été réalisé avec des anticorps du virus
isolé de M.d~pu~ato~, ceux du virus de la NPI, ceux des vi-
1
rus S.P, ainsi que du
Tellina-virus.
1
1
Cette technique a été réalisée avec les mêmes gels
qu'en immunodiffusion mais répartis dans des tubes à rai-
1
son de 16,5ml/tube .A la température de 58°C, 200pl d'im-
mun-sérum de lapin sont ajoutés à l'agarose et après forte
agitation, le mélange est coulé sur une plaque de verre
1
(9cm xllcm). Dès la prise du gel, des puits sont percés et
remplis par les solutions d'antigènes. Le Bleu de
1
1
1

---

-
46
-
bromophénol à 0,05% a servi d'indicateur coloré.
L'électrophorèse du gel a été effectué pendant 4 h. à 70
volt, sur une cuve LKB 21ï Multiphor.
4. Immuno-fluorescence .
Pour réal i s er ce stes ts d' immuno-fl uore scence, __
nous avons utilisé la méthode indirecte préconisée par CA-
SALS (1967). La solution d'Tg de mouton anti-globuline de
lapin, couplée à l'isothiocyanate de fluorescéine nous a été
fournie par l'Institut Pasteur. Lors de l'emploi
cette
solution est diluée au 1/100 dans du PBS. Les tests ont
été
effectués sur les cellules BF
saines et infectées cultivées
2
sur lamelles.
Toutes les opérations ont eu lieu à ~empérature
ambiante. Les lamelles sont fixées 20 minutes par l'acéto-
;-Lé:
(f-'IIRÇ;,FLI, et
COLE, 19ï6). Tandis que les cellules infec-
tées sont recouvertes d'anticorps de lapin, les témoins re-
çoivent de l'eau distillée pendant 30 minutes.
Elles sont ensuite rincées 10 minutes dans deux bains de
PBS, et recouvertes de la solution d'anti-immuno-globulines
de lapin couplée à la fluorescéine, pendant 30 minutes.
De nouveau, les préparations sont lavées dans du PBS pen -
dant 10 minutes, et montées dans l'albumine glycérinée.
Les lamelles sont ensuite lutées avant d'être ob-
servées au microscope à fluorescence.

---

1
_
47
_
1
G/ TECHNIQUE DE ~4RQUAGE
ISOTOPIQUE
1
1
1
Seize
fioles de culture (75 cm3)
de BF , inf~ctée5 8
2
48 h. du repiquage par le virus isolé de Ma~~0p.tpu~ depu-
hatoh ont reçu de l'uridine tritiée, d'activité 6uCi/ml.
1
Nous nous sommes basés pour le protocole sur la méthode
d'UNDERWOOD et coll., (1977) que nous avons légèrement mo-
1
difiée:
- Infection des cultures par lml de surnageant cellulaire
1
infecté et décongelé,
- adhésion des virus 2h. à température ambiante, avec homo-
1
g~néisation de la suspensio~ vi~~le s~r :: ~::~~~~e ~D
~e~J.ps ?j autre,
- Puis addition de Sml du milieu pour infection (MEMG à
1
2% de SVF) dans chaque fiole.
Cell~scci sont alors p~t­
o
incubées à lS C, pour une période de 4 h.
1
- Après ce temps d'incubation, 30pl d'uridine tritiée puis
Sml de MEMG à 2% de SVF ont été introduits dans les fio-
1
les.
A ce stade les cultures ont été ré-incubées à lSoC jus-
1
qu'à observation d'un effet cytopathogène.
La purification des virus marqués s'est faite
1
selon la méthode précédemment décrite
(en 2.C.). L'uridine
tritiée nous a été fournie par le C.E.A.
(Commissariat
1
à l'Energie Atomique, SACLAY, FRANCE).
1
1
1
1
1

---

- 48
Pour suivre la distribution du virus chez Mae~opi­
pu~ depu~ato~, nous avons infecté des crabes par le virus
radioactif purifié titrant 1,6 de DO à 260 nm. A des temps
dorinés, les organes de M.
depu~ato~
ont été prélevée, et
la radio-activité mesurée au scintillateur liquide.
Les animaux ont reçu 10ul de suspension virale
purifiée au niveau de l'articulation de la Sème paire de
pattes avec le thorax. Le liquide a été injecté à l'aide
d'une micro-seringue, au travers d'un fin cathéter.
Pour connaître la perte de la radio-activité, lors
de l'injection, les crabes sont m8jpten l 15 pendant 3 min~tes
dans un bac contenant 1 1. d'eau de mer. Ce temps q~i est
standardisé, correspond à la coagulation de l'hémolymphe
lors de ]~ ~i~0Te.
Les anlmaux sont ensuite placés individuellement
dans une autre série de bacs contenant 1 1 d'eau de mer,
dans lequel ils séjourneront jusqu'au moment du prélève-
ment des organes.
Aux temps prévus, 24h, 72h, 5 jours et 8 jours,
l'hépatopancréas, l'intestin postérieur, les branchies,
prélevés et pesés, sont broyés au mortier en présence d'a-
zote liquide. Ces préparations sont
alors additionnées
d'lml de toluéne-isopropanol, solvant qui entraîne la di-
gestion des membranes.
L' hémolymphed_e _chaque animal est aussi recueillie à
raison de 50 yI par crabe.

---

1
1
-
49
-
1
100 à 200 pl du premler bain après infection des
1
crabes, ainsi que du bain dans lequel les crabes ont sé-
journé sont prélevés. Cette dernière valeur exprimant le
1
rejet urinaire du produit marqué.
Le comptage au scintillateur, des différentes fractions
s'effectue en présence de liquide scintillant lequel est
1
aj outé.aux pré lévements à rai son de 10 ml/pot. Les ré sul-
tats sont exprimés en désintégrations/mn/mg.
1
Les expérimentations ont été réa~isées sur un appareil
de la marque PACKARD
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

-
:)U
-
CHA PIT R E
IV
TENTATIVE DE REPLICATION SUR CELLULES BF
EN CULTURE DES VIRUS liS et pli
2
DE Macropipus depurator L.
It\\TRODUCTION
Les virus S (BunyavirusJ et P (Réovirus) du cra-
be Mac. tLOp-ipU.6 de.putta-tott L.
(Crustacés, décapode) ont fai t
l'objet d'une étude approfondie quant à leur ultrastructure,
leur biochimie et à la pathologie qu'ils entraînent chez
l'animal
(BONAMI et coll., 1976; BONAMI, 1980).
Cependant, aucun essai de développement ~n v-ittto
de ces particules n'avait été tenté jusqu'ici probablement
à cause des difficultés que soulève la culture cellulaire
de_Crustacés.
A la suite des travaux de HILL (1976) et de MEYERS
(1979)
rapportant l'isolement de VIrus sur des lignées cel-
lulaires de Poissons, nous avons tenté de développer l~virus
S et P sur ces systèmes cellulaires. Ainsi nous avons isolé
sur la lignée BF
(Bluegil Fibroblast) un virus provenant
2
d'organes de M. de.putta-tott.
AI ETUDE DES CELLULES BF
SAINES
2
Dès vingt-quatre heures après le repiquage , nous
avons pu observer en microscopie à contraste de phase, l'as-
pect des cellules et la morphQIQgie du~apjs qu'elles cons-
tituaient sur le fond de la fiole de culture.

---

1
1
-
51
-
1
Les cultures BF
sont constituées par de petites
1
Z
cellules fibroblastiques de forme variable, mais à tendance
hexagonale . De courts pseudopodes les prolongent à chaque
1
pôle. Elles forment un tapis dense, donnant l'impression
que les cellules sont imbriquées les unes dans les autres,
1
et aussi empilées les unes sur les autres (Planche II, fig. 3 j.
Le cytoplasme renferme de fines granulations et quel-
ques vacuoles.
1
Cette lignée requiert un repiql';:lge par semaine.
1
Mais il est aussi possible d'entretenir les cultures au-
delà de ce délai, en changeant fréquemment le milieu de
1
croissance.
1
Î
1
Outre l'observation des BF
dans les fioles de
Z
culture, l'aspect des cellules a aussi été examiné sur des
préparations fixées et colorées. Nous avons alors pu no-
1
ter plus en détail les caractéristiques morphologiques des
cellules.
1
Ainsi, les colorations réalisées ont permis d'ob-
1
server que ces cellules possèdent un volumineux noyau à
position souvent excentrée (Planche
II , fig. 4). Le rap-
1
port nucléoplasmique des cellules est donc élevé.Dans ces
noyaux la chromatine est uniformément répartie.
1
Le nombre de nucléoles varie de un à quatre,
mais plus généralement la présence de deux nucléoles a été
1
1
i

---

i' L. .-\\ \\ ( Il E J l
Figure .:;
Tapis cellulaire de BF: saines, formé de pe-
tites cellules imbriquées les unes dans les
autres.
Microscopie â contraste de phase
x
350
Figure 4
BF 2 saInes. Noter les nombreux nucléoles Cn)
dans les volumineux noyaux
CN). Laque de
Gallocyanine X
1
540
1
Figure J
BF~ saines
. Différentes phases de mitose(
~)
i.
sont visibles. Hémalun-Eosine X
620
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

---

~.......
-
"12 -
notée à l'intérieur des noyaux (Planche II, fig. 4,5)._
Par endroits, on note aussi la présence de va-
cuoles dans le cytoplasme des cellules (Planche II, fig. 5).
Dans les vingt-quatre à quarante-huit heures sui-
vantle repiquage , la multiplication cellulaire est active.
De nombreuses phases de mitose
sont donc visibles dans le
tapis
(Planche II, fig.S).
D'une manière générale, nous avons constat~quelle
que soit la coloration réalisée, que l'aspect fibroblasti-
que des cellules apparaît de manière plus nette qu'en micros-
copie à contraste de phase. On observe mieux les contours et
les prolongements des cellules, bien que celles-ci soient
souvent les unes sur les autres.
J.
Etude ultrastructurale.
Le mode de prélévement des tapis cellulaires avant
fixation,
influe beaucoup sur l'aspect des cellules obser-
vées en microscopie électronique.
Ainsi les cellules décollées de leur support par
la trypsine, apparaissent plus ou moins rondes et sont pro-
longées par de courts pseudopodes. Mais la présence de nom-
breuses cristallisations dues à la trypsine ou à l'EDTA, qui
s'éliminent difficilement, rend les observations pratiquement
impossibles.

---

1
1
1
F i ~Llrt::
tJ
Dr:,
s3ines.
Rem:nquer Gans le noyau
(1\\)
1<:'
1
nucléole granuleux
C
ri
)la disposition
homogène de la chromatine. Dans le cytoplasme
1
les mitochondries
(Mt) et
les vacuoles
(Va)
sont
nombreus-:?s
1
Microscopie ~lectroni~~p X l~.OOO
1
Figure -
Coupe semi-fine de BF) saine, Observer la po-
sition du noyau
(~) et les vacuoles (Va).
1
Bleu de Toluidine X
1
200
1
Figure 8
Détail de la figure 6 montrant les vésicules
1
de ninocvtocp
(Vn'
lnng
de ]2 membrane rlacmi-
que
(Mpi.
~.!icroscopie électronique X 21.500.
1
1
Figure 9
Pôle d'une cellule BF
saine. L'ergastoplasme
2
(Eg) est développé.
Les mitochondries
(Mt)
sont
1
sphériques.
Microscopie électronique X
34000
1
1
1
1
1

---

---

:;.........
- 5 Li
Le plan de coupe des cellules n'a permis d'obser-
ver que peu ou pas de nucléoles dans les noyaux, contraire-
ment à ce que nous avions observé en microscopie optique.
On peut remarquer que la membrane cytoplasmique
des cellules présente un contour régulier, et seules de ra-
res et petites vacuoles de pinocytose ont pu être observées
(Planche III, fig.8) .L'appareil de Golgi est situé assez près
du noyau.
BI INOCULATION DES CULTURES AVEC DES BROYATS D'ORGANES DE
M.de-pU!La-to!L ATTEINTS PAR LE SYNDROME "S-P".
A partir d'hépatopancréas et de branchies de Ma-
~!Lopipu~ de-pU!La-to!L L., nous avons réalisé un broyat que nous
avons inoculé à des cultures cellulaires BF
saines.
Z
Le broyat préalablement débarrassé de ses débris
par centrifugation est additionné d'antibiotiques et conser-
vé au froid.
Lors de l'emploi, il est dilué au 1/10 de maj
nière à diminuer pour les cellules les risques de toxicité
dûs, d'une part aux antibiotiques, d'autre part aux compo-
sés que libéreraient les cellules de M.
de-pu!La-to!L.

---

-
55 -
1
Un contrôle en microscopie électronique sur le
1
surnageant clarifié du broyat, nous a permis de vérifier
la présence des particules virales S et P que nous cher-
chions à développer in vit~o (Planche l, fig.2).
1
Les cultures ont été inoculées à raison de a,Sml
1
par culture, et mises à incuber à 15°C. Chaque jour nous en
avons suivi l'évolution, au microscope à contraste de phase.
1
L'inoculation du broyat aux cultures, correspon-
1
dant au premier passage, ne nous a pas permis, pendant les
cinq premiers jours d'incubation des cultures, d'observer
1
de réels changements dans l'aspect des cellules. Nous avons
simplement noté l'apparition de cellules réfringentes dans
] e tapis.
1
Au bout du sixième jour d'incubation, lml du sur-
1
nageant cellulaire des cultures inoculées a été prélevé et
inoculé à une autre série de BF
saines, constituant ainsi
Z
1
le deuxième passage du broyat. Comme précédemment les cellu-
les ont été mises à incuber à 15°C et observées chaque jour
1
au microscope à contraste de phase.
1
C'est à partir du deuxième passage du broyat que
1
nouS avons obtenu sur les cultures BF Z' un effet cytopatho-
gène
(ECP).
1
Cet effet se caractérise par l'apparition de pla-
1
gesde lyse dans le tapis cellulaire, donnant naissance à
des "trous" qui correspondent à la destruction des cellules
1
attaquées.
1
1
1

---

-
56
-
C'est environ vingt-quatre heures après l'ino-
culation, que nous avons observé dans le tapis cellulaire
des plages de lyse de faible diamètre, dispersées dans la
culture.
A ce 5tade~ Ips
cellules commencent à s'arron-
dir et à devenir réfringentes
(Planche IV, fig. 10).
Vingt-quatre heures plus tard, le nombre et la
dimension des plages ont augmenté (PlancheIV,fig.ll1. Ces
plages peuvent avoir un contour régulier ( Planche V,
fig.13) ou dentelé (Planche V, fig.14) .. Certaines sont bor-
dées par des cellules étirées ou par des cellules arrondies
et réfringentes. Mais on trouve aussi ces deux types de
cellule5 é1uton r
cl 'une !]'1PTl1'ê' ~l.?ge de lyse CP 12n r hp If,
-Fi.S; 111·1.
Dans le surnageant des cultures, de nombreux dé-
bris cellulaires flctteilt.
Parrr..i c:e"L:x-c:)
i~ jr a be:::ucoup
de formations arrondies, limitées par une membrane, sembla-
bles à des "bulles", qui peuvent être vides, ou alors conte-
nlr un matériel granulaire (Planche IV,fig".11.et 12).Ces éléments
correspondent certainement à des cellules nécrosées et qui
se seraient
vidées de leur contenu. Car nous avons observé
aux abords des places de lyse des cellules qui étaient en
train d'éclater et qui rejetaient leur contenu sous forme
de "bulles".
Concernant l'aspect du tapis, on note qu'il est
formé de cellules allongées, étirées en fuseau.
Les cel-
lules sont très vacuolisées. A côté de celà, la présence
de cellules agrandies ou hypertrophiées pe~t être relevée
(Planche V, fig.13).

---

-
') 7 -
Au fur et à mesure que l'effet €volue~ les cel-
lules s'arrondissent, deviennent r€fringentes
et se d€ta-
chent du tapis. On note aussi que l'activit€
mitotique des
cellules cesse
(Planche IV,
Fig.
12).
1
A soixante-douze heures après inoculation, la
1
presque totalit€
du tapis est lys€.
Mais on observe, fix€es
sur le fond des fioles infect€es,
des cellules qui sont hy-
1
pertrophi€es.
1
Et c'est entre soixante-douze heures et quatre
jours d'incubation à 15°C, que l'effet cytopathogène abou-
tit à la lyse totale du tapis cellulaire.
1
Pour mieux visualiser les modifications cellulai-
1
res cons€cutives
à l'ECP,
les BF? cultiv€es
sur lamelles
ont €t€
infect€es.
Après coloration, elles ont €t€
obser-
1
vées au microscope photonique.
1
Ainsi, après coloration à la Gallocyanine, ou à
l'H€malum-Eosine,
nous avons constat€
que certaines cellu-
les montrent une forte affinit€,
pour les colorants, et ce-
1
ci dès seize heures après l'infection.-
1
Dès vingt-quatre heures, le nombre de cellules
fortement color€es
est plus important, et on note à l'in-
1
t€rieur
de celles-ci des modifications nucl€aires.
En ef-
fet,
les noyaux sont d€form€s,
et même pycnotiques (Plan-
1
che VI, fig. 15i .Leur contour apparaît fonc€,
ce qui indique-
rait qu'il y a marginalisation de la chromatine.
Dans ces noyaux on distingue la pr€sence
des nu-
1
cl€oles.
1
1
1
1

---

1
1
1
i L \\ \\ Ci i ,.
i i.
1
1
Figure
10 : Début d'effet cytopathogène
(ECP)
sur les
1
BF~ infectées.
Noter la réfringence des cellu-
les arrondies
.. ).
Microscopie à contraste de phase X
too
1
1
Figure
11
ECP.
Plages de lyse (p.l.)
dans le tapis
de BF
infectées.
Noter les bulles contenant
7
1
un matériel granulaire
(
. ) .
Microscopie à contraste de phase.X
410
1
Figure
12
: ECr. Tapis de BF.., infectée en VOle de lyse
1
totéJle.
Noter ]a réfringence de cellules(-----.)
et l'étirement du cytoplasme d'autres cellu-
1
les
( ....... ). 3L:tcur des Dla.'Ses de 1 yse
(Pl
Microscopie à contraste de phaxe X
400
1
1
1
1
1
1
1
1
--1

---

---

1
1
1
PL'\\\\Ciil::.
\\
1
1
Figure
1:)
ECP.
Plages de lyse
( . . . . . . . )à contour
1
cellules hrpeytrophiée~.
1
Microscopie à contraste de phase X
430
1
Figure
i-l
:
ECP.
Plages de lyse
l ....
~) à contour
dentelé.
Des cellules rondes et réfringentes
1
--1.~ ) et des cellules étirées (
..
)
bordent les plages.
1
Microscopjp ~ C0~~r~c~e ~c n~~5e X
u30
1
1
1
1
1
J
1

---

---

-
')8
Le cytoplasme de ces cellules s'est généralement
rétracté, mais il peut aussi être étiré, et contenir de gran-
des va cu ole 5
( ,) ~ , r: c h '_
\\j l ,
( 5. ~ . 1 ') ) •
On peut remarquer que les cellules très colorées
se retrouvent surtout aux abords des plages de lyse (Plan-
che VI, fig.ln.
On observe aussi dans le tapis des cultures, des
cellules peu colo~§es dont le cytoplasme étalé renferme de
nombreuses vacuoles (Planche VI.fig.l7).Leurs noyaux, con-
tenant un à plusieurs nucléoles et montrant une chromatine
répartie de manière homogène, ressemble à celui des BF
té-
7
'"
mOIns.
Lorsque la dég~ad~tion cellulaire est avancée,
on compte un grand nombre de cellules nécrosées dans les-
quelles aucun détail n'est décelable. En même temps on obser-
ve de grandes cellules d'apparence normale.
Des résultats identiques concernant l'état de
nécrose ont été obtenus par la coloration de Feulgen. L'ab-
sence de masses Feulgen positives anormales dans le noyau
et dans le cytoplasme prouve bien cependant que l'effet cy-
topathogène est dû à un agent
à ARN.
Colorées par le vert de Méthyle-Pyronine, ou mé-
lange de Unna-Pappeneihm
, les cellules montrent les mêmes
modifications. Mais en plus, il est possible de distinguer
à l'intérieur du cytoplasme des cellules arrondies,
des
ponctuations présentant une affinité pour le vert de Méthyle.

---

- 59
3. Modifications ultrastructurales des cellules
infectées .
Afin de vérifier le développement des VIrus ino-
culés conduisant à un tel effet cytopathogène sur les cul-
1
tures, nous avons traité pour la lI1icrûscopie électrûnique,
des tapis de BF
à différents temps après inoculation.
1
'-
1
Les cellules ont été repiquées dans des boîtes
de Pétri, et aux temps de deux heures, vingt-quatre heures,
1
quarante-huit heures et soixante-douze heures après infec-
tion, une boîte a été prélevée et son tapis fixé.
1
Deux heures après inoculation, nous n'avons pas
1
observé sur coupes semi-fines ou ultra-fines des BF
de
Z
changements nucléaires ou cytoplasmiques dans les cellules.
Celles-ci ressemblent d'ailleurs aux cellules témoins.
1
Nous n'avons pas non plus retrouvé traces des
1
particules virales S et P, nI dans les cellules, ni même
aux abords de ces dernières.
1
C'est au temps de vingt-quatre heures après ino-
1
culation, que nous avons observé, sur coupes semi-fines
colorées au Bleu de Toluidine, des cellules à différents
stades d'infection. Ces cellules présentent les mêmes mo-
1
difications que celles que nous avions observé en micros-
copie photonique
(Plahcr:e VI,
Fig.
18).
1
La présence des cellules de petite taille, sphé-
1
riques et-tr~s colorées a été retrouvée. Dans certaines,
il est impossible de voir le noyau alors que dans d'autres
1
1
1
1

---

1
1
figurE'
l~
:
fer. Tapis cellulaire de BF
infectées,
Les
J
1
cell~les rondes
C
•
)
ont des noyaux pycno~
tiques.
Les cellules étirées
(
) ont
des noyaux clairs et sont vacuolisées
1
Laque de Gallocyanine X
1300
1
Figure
16
: Cellules infectées.
Noter la marginalisation
1
de la chromatine (
- ) et la présence de
cellule éclatée ( - -....~
).
1
1
l
,
;apis cellulaire de
iT'.:fectées.
Les
cellules peu colorées
(
. )
très vacuolisées
1
montrent un noyau normal
(N). Observer les cel-
lules fortement colorées autour de la plage de
1
lyse (p.l).
Hémal un- Eos ine X
1500
1
Figure 18
: Coupe semi-fine de BF
infectées. Cellules â
2
1
différents stades d'infection.
Bleu de Toluidine X
2000
1
1
1
1
1
1

---

~.
.,
,~'.'.
7'"",.~,:

---

P L.~ \\ U i ~
\\ j j
Figure
19
: Cellule BF, infectée,
contenant des VIrIons
(Vl
cl i 5 Pe !" 5 é 5
r1 ~ Tl S
] e
c :' top las me
( Cv),
No Ya u
( N) .
MicroscDpie ~lectronique X J60.000.
1
Figure 20 : Débris cellulaires renfermant des particules
1
\\' ira les.
Microscopie électronique X 37.400.
1
Fig '-l r':'
' 1
.
Cp} lu} f'
R'[:.
i Tl f e c t é e.
Not e r
les nombre use s va-
1
cuoles
(Vell
renfermant des systèmes membranaires
(
-
).
Le noyau
eN)
est pycnot ique,
1
Microscopie §lectr0~ique X
0
000
1
Figure 22
: Phénomène de phagocytose
: une vésicule eAtra~
cellulaire
(Ve)
est entourée par le pseudopOQe
1
dela cellule.
Microscopie électronique X 36.000.
1
1
1
1
1
1
1
1

---

",:
"". , .... ".
,"
-.
.0;.
.~Ii fi.

---

,- ...........
-
60
-
la présence d'un noyau déformé, recroquevillé, en fer à
cheval a été notée (Planche VI, fig.l~).
Le phénomène de marginalisation de la chromatine
s'observe bien plus
dans les noyaux pycnotiques et som-
bres, que dans des noyaux clairs et de taille normale
(Planche VI, fig.18). En général, les cellules
sont très va-
cuolisées.
De même, dans le culot fixé,
des cellules écla-
tées sont présentes. On remarquera que chacune des masses
qui s'échappe des cellules est fortement colorée par le
Bleu de Toluidine (Planche VI, fig 16). En outre, des I1bul-
les".
:ellules vidées de leur contenu, , et de nombreux dé-
hri5
ont ét~ ret~ouv§~ ~~~ !e~ ~8~pes semi;fines, ainsi que
des cellules qui semblent être hype~t~8phi§es (Planche VI,
fig. 18).
En plus de ces modifications, les coupes ultra-
fines ont montré la présence de particules virales à l'in-
térieur des cellules.
Les cellules contenant des virions renferment de
larges vacuoles ainsi que de nombreux systèmes
membranai-
res (Planche VII, fig.21).
Ces particules, d'environ 70nm de diamètre,
sont
dispersées dans le cytoplasme des cellules (Planche VII
fig.~19. Elles ont une structure et une taille semblables
à celles du Réovirus,
ou virus de P de Ma~hopipu~ depuha~
:tOh
(PI_a_nc_heJ, fi~. 2_ )
Elles présentent un core dense aux
électrons.
Ces mêmes systèmes ont été retrouvés hors des
cellules avec comme contenu des débris cellulaires et des
particules virales
(Planche VII, fig.2a).

---

1
]'I..-'\\.\\U!L
\\. l [ j
1
1
Figure =3
: Cellule BF
infectée.
Noter la pycnose du
2
nOY?I!
( \\ )
et
les vacuoles
(Va).
1
Microscopie électronique X 9.500.
1
Figure
2~
: Cellule BF
infectée.
Noter dans
le cytoplas-
2
1
me
CC;:)
le groupement de virus
(V,)
à proximité
de systèmes membranaires
(Sm).
Microscopie électronique X 70,000.
1
1
):;g'J":'
: 3 :
Cellule BF" infectée.
Plage virale paracristal""
line formée departicules pleines
(p.p) et de
1
p2"!'"!icules creuses
(pc).
Noter le décollement
des feuillets de la membrane nucléaire
(. . " ) ,
1
Noyau
(N).
Microscopie électronique X
95 000
1
Figure 26
: Cellule contenant une plage virale caractéris~
1
tique
(
~
) et des vacuoles
(Va)
riches en
débris
.
Microscopie électronique X 6.900.
1
1
1
1
1
1
1

---

·-
-,
~
';lI!.'
i~,
...
"
~.....-
t;"'~1
• 'N" " .
l ;
'
...
..
#C.
..
.
J. _,
....
• ·4 ....;·~

---

1
1
1
Figure
: Cellule BF,
infectée. Remarquer les nombreux
tubules
(Tub.)
à
côté de VIrus
(V,). Noter le
1
décollement
(~
~
) des feuillets de la
membrane nucléaire.
Noyau (N).
1
Microscopie électronique X
39 000
1
Figure '=8
: Vésicule extracellulaire
(Ve)
contenant des
1
tub u les
CT ub.) e t des v i rus
(V) .
Microscopie électronique X 34,000,
1
Figure
=CJ
:
Cellule BF..,
infectée. Rejet desvirus
(V) ac-
1
cumulés sous la membrane plasmique
(M,p .). Cyto-
plasme
(Cy).
1
Microscopie électronique X
31 200
1
Figure 30 : Cellule BF
infectée.
Noter les nombreuses
2
1
mitochondries
(Mt.)
et les systèmes membranai-
res de type myélinique dans le cytoplasme
(Cy),
1
Microscopie électronique X 38,000,
1
Figure 31
:
Détail de la figure 31 montrant la dégradation
des mitochondries
(
•
).
1
Microscopie électronique
X 64,000,
1
1
1
1

---

....
-~
.....,..
.
:-
...
®

---

- 62 -
plage para-cristalline à l'intérieur du cytoplasme (Plan-
che VIII,fig.25)~es cellules où ont pu être mis en éviden-
ce les virus, sont sphériques, et contiennent des vacuoles
très denses
(Planche VIII,
fig.26).
La plage virale peut être proche ou non du noyau
ou d'une zon~ ~ mât~riel granulaire dense aux électrons~et
peut être limitée ou non par un système membranaire (Planche
VIII.
fig.25 et 26). Dans cet arrangement géométrique, on
.
.
reconnait un grand nombre de particules virales montrant un
nucléoîde dense ou non,
suivant le plan de coupe.
En plus des virions, nous avons observé dans
les cellules, des formations tubulaires étroites, de lon-
gueur variable. Celles-ci snnt situées assez près du noyau;
(Planche IX,
fig.27).
Ces mêmes structures tubulaires ont été retrou-
vées associées à des particules virales dans des vacuoles
extra-cytoplasmiques (Planche IX, fig. 28).
On note en plus qu'il y a décollement des feuil-
lets de la membrane nucléaire (Planche VIII,fig.26)Celui-
ci peut être parfois visible tout au long de cette membra-
ne.
Un phénomène de rejet des particules, a aussi
été observé, à ce stade d'infection. Des virions groupés
et non entourés par une membrane, ont été observés accumu-
lés sous la membrane plasmique donnant naissance à une pro-
tubérance cellulaire (PlancheIX,fig. ~9). Les particules

---

1
-
63 -
1
semblent donc exercer une action mécanique, entraînant la
rupture de la membrane cytoplasmique, permettant alors la
1
libération des virions dans le milieu extérieur.
1
Outre l'apparition de vacuoles à matériel dense,
de systèmes membranaires , nous avons pu noter que le
1
cytoplasme des cellules infectées renfermait de nombreuses
mitochondries de taille et de forme différentes de celles
1
des cellules témoins
(Planche IX,
fig.30).
Il semblerait donc qu'au cours de l'ECP, il yait
1
dégradation des mitochondries (Planche IX, fig.3 1 ) en même
temps qu'il y a dégénérescence cellulaire.
1
1
DISCUSSION ET CONCLUSION
------------------------
1
L'inoculatioJi de broyats cl' Gl-g:::.nes de ::T3.be~ ~~a..-
c~opipu~ d~pu~a~o~
infectés par les virus S et P, a pro-
1
voqué, sur la lignée cellulaire de Poissons, BF ' le déve-
Z
loppement d'un effet cytopathogène ou ECP.
1
Cet effet, observé au cours d'un deuxième pas-
sage sur les cellules, se caractérise par l'apparition de
1
plages de lyse cellulaires aboutissant en une période de
trois jours, à la dégénérescence des cultures.
1
L'ECP, se traduit
au niveau cellulaire par des
1
changements nucléaires et cytoplasmiques. On obserue des
phénomènes de pycnose et carryc rexhie du noyau, et des
forma tions de vacuoles et de systèmes_m~mbranaJre? dans_
1
le cytoplasme. Ces systèmes ont été observés chez un Crus-
tacés (BONAMI, 1976), et un Mollusque (RUNGGER et
coll.,
1
1
1
1

---

- 64
1971),
respectivement infectés par un Réovirus et un Iri-
do~irus.
L'effet se développant, l'activité mitotique
des cellules cesse. On peut donc supposer qu'il y a inhi-
bition de la synthèse d'ADN cellulaire, lors de la repli-
cation virale.
Morphologiquement le virus observé dans les
cultures à une strc=ture icosaédrique et une taille sembla-
ble à celles du virus P de M. d~pu~ato~.
Sa virogenese s'effectue dans le cytoplasme des
cellules, où il s'organise en place para-cristalline.Cette
organisation ?éométrj~ue des particules~ ainsi que la pré-
sence de structures tubulaires qui l'accompagnent, sont
des phénomènes communément rapportés pour les virus de ty-
pe ?§c'.'iru5
(JnKLIK,
1974;
FENNER, 1976).
Ce cycle est à rapprocher de celui du VIrus dé-
crit chez le scorpion Buthu~ oQQ~tanu~ (MOREL, 1975; 1978)
ou de celui du virus des tum~urs des plantes (Wood tumour
virus)
(WOOD ,1973), ou encore de celui du virus de la
Nécrose Pancréatique Infectieuse
(NPI)
(MOSS et GRAVELL,
1969).
Cependant, les formations tubulaires observées au
cours de l'effet cytopathogène des cellules BF
rappel-
2
lent davantage de par leur forme rectiligne, celles du vi-
rus de la NPI.
Concernant le rejet des particules, il semble-
rait~u'~l se produise selon un processus mécanique,

---

65 -
entrainant l'éclatement des cellules, comme l'ont décrit
DEVAUCHELLE et VAGO (1971) pour la Réovirose de la Sei-
che Sepia o66icinaii~.
L'isolement de virus dans des cultures cel lu-
laires est chase courante en p~thologie virale. Mais, malgré
la spécificité des virus vis-à-vis de lpurs systèmes hôtes,
nous avons pu, à la manière de nombreux auteurs (MEYERS,
1980; HILL, 1976; MOEVUS -
KOBB, 1965), mettre en évi-
dence dans des cultures cellulaires de Poissons, un virus
provenant d'un Invertébré marin.
Mais bien que reposant sur des caractéristiques
1
morphologiques et une morphogénèse proches de celles du
v i rus P. de
Mc.. c'L C pi pu..!> ci c~:' ~~ ': o.J:{' Ir. > J' j d e TI t j fic a t ion du v i -
1
rus observé dans les cellules BF
avec celui du crabe, ne
2
peut être affirmée.
1
Seule l'étude biochimique des constituants de
1
l'agent nous permettra de rapprocher ce virus à un groupe
connu de virus.
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

-
66 -
CHA P I T R E
V
CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'AGENT VIRAL
OBSERVE SUR LES CELLULES
Bf
EN CULTURE
2
INTRODUCTION
L'agent viral isolé sur les cultures cellulaires BF '
Z
a été inoculé à des Ma~~opipu~ d~pu~ato~ en vue cie contrôler
sa
pathogénécité vis à vis du crabe.
Mais tant du point de vue symptômatologique que du
point de vue histopathologique, les crabes infectés n'ont pas
présenté une pathologie caractéristique au cours de leur main-
tien en élevage.
Il nous importait dès lors, de savoir si le
virus se maintenait et développait dans les hôtes expérimenta~
ou s'il en ~tait éliminé.
Afin de déterminer quel était le devenir du VIrus
inoculé chez les crabes, nous avons recherché, par la techni-
que des cultures cellulaires, la présence des virions dans les
tissus des animaux infectés, en fonction du temps.
Par la même
technique, nous avons essayé de le caractériser biologiquement
en essayant de le multiplier sur différentes lignées cellulai-
res de Poissons.
A - ETUDE DU POUVOIR PATHOGENE DU VIRUS SUR Ma~~opipu~
d~pu~a­
to~
Pour connaître l'incidence sur Ma~~o~ip4~ depu~ato~
des virus observés dans les cellules BF
nous les avons isolé
Z
à partir des cultures infectées et les avons
injectés à des
spécimens de M.
d~pu~ato~.
Nous avons inoculés les animaux soit
par voie orale, soit par voie sanguine, et avons étudié le

---

- 67
pouvoir pathogène de la particule vis à VIS des crabes.
1. Test de pathogénécité vis à vis des crabes.
Les cultures BF 2 présentant un fort effet cytopatho-
gène ont été centrifugées à 25.000 t/mn. Le culot de centri-
fugation,
dilué dans une solu~ior. ~alée tamponnée au phosphate,
L0US a servi à injecter les crabés à raison de 0,1 ml de sus-
pension virale par crabe.
1
Les dix crabes qui ont reçu la suspension par voie
buccale, aInSI que les dix 8utres qui ont été inoculés par
1
voie sanguine, ont été maintenus dans des conditions d'élevage
et d'alimentation identiques à celles des crabes témoins.
1
Mais l'inoculation expérimentale des Mac~opipu~ dé-
1
~u~ato~ n'a Das été suivie, dans les élevages de mortalités
significatives, par rapport aux crabes témoins. En effet, le
maintien des M.
dépu~a~o~ s'est poursuivi SUT une période de
1
quinze jours, aussi bien pour les animaux inoculés par voie
buccale que pour ceux inoculés par voie sanguine.
1
Du point de vue clinique, nous nravons pas noté
de sympôtes particuliers, ou de troubles de comportement chez
les animaux inoculés. Ces derniers, naturellement agressifs,
ont manifesté le même intérêt vis à vis de leur nourriture que
les crabes témoins.
Afin de rechercher la présence des virus dans
l_es ti_ssus_ de_s crabes inoculés nous avons sacrifié un spé-
1
cimen de chaque série, à des intervalles de temps réguliers.
1
1
1
1

---

-
6 J
-
Ainsi, au cinquième, dixième et quinzième Jours
suivant l'inoculation,
les organes des crabes ont été préle-
vés et traités en vue de leur examen histologique et cytolo-
gique.
2. Examen histopathologigue des M.
d~pu~ato~
inûculgs .
L'étude au microscope optique des branchies, de
l'hépatopancréas et de l'intestin
postérieur des crabes,
ne nous a pas permis de mettre en évidence dans ces organes,
la présence de plages fuschinophiles cytoplasmiques dues au
virus P , et qui ont été décrites par BONAMI et coll, en 1976.
Ces auteurs rapportent en effet l'observation de
zones de cinq à dix
~
de long, dans les cellules du tissu
connec tif deI 1 h ci pat 0 pan c réa set de l' in tes tin
de M.
d ~ pu -
~aton infectés par le virusP. Ces zones résultant de l'orga-
nisation ~n réseaux paracristallins des particules virales.
De telles zones n'ont pu être observées après
la coloration au Trichrome de Masson, ou à la Gallocyanine,
ou encore à l'Hémalun-Eosine, que nous avons effectué sur
les tissus.
En revanche, par ces colorations, nous ayons pu
observer dans ces organes une désorganisation du conjonc-
tif. Celle-ci est notable surtout dans l'hépatopancréas

---

Fi;ure .L
Intestin postérieur. ~oter la désorganisation
...
du tissu connectif (
),
Hémalun-Eosine X
1~O
1
Figure ~~ : Hépatopancréas. Noter la désorganisation du
1
tissu connectif (Tc).
T
= Tubule
Hém2lun-Eosine X
700
1
1
Figure ~j
:
Branchies.
Hémalun-Eosine X
930
1
Figure 35
Fragment d'hépatopancréas infecté.Noter les
1
':;:;. c ~ ~ les
(,.r:l)
e! 2 e 5 g T 2 )'11.J les de cal c i um ( -
)
dans les cellules.
1
Bleu de Toluidine X
540
1
Figure 36
: Virus S.
Contraste négatif à l'APT.
Microscopie électronique X
90 200
1
1
Figure 37
: Virus P. contraste négatif à l'APT.
Microscopie électronique X 130 000
1
Fig ure 38
: Not e r I ' ace um u 1a t ion de vi rus
S
(
S
)
1
et P (
P
)dans l'intestin postérieur.
Microscopie électronique X
16
1 ')0
1
1
1
1

---

~~~'~~~~~~~'Y:\\JF~~:Ô~'~~".t~':'"
-rh

---

-
7 \\Î _
De même à l'examen ultrastructural des organes des
M. dépu~ato~ infectés, les stades virémiques habituellement
observés chez les animaux infectés par le virus P, n'ont pas
été retrouvés.
En coupes semi-fines d'hépatopancréas fixé au
quinzième jour, nous avons observé dans les tubules hépato-
pancréatiques, des cellules présentant de volumineux Y(lt.lJa1t.5.
Mais l'ultrastructure de ce~ cellules n'a pas permis d'y
déceler des particules virales. CPlot)c...hf..
X 1 ~;\\ ~c; 0).
Toutefois, en microscopie électronique de l'intestin
nostériPllr des crabes, nous avons noté la présence de deU](
types de paT!icules viT21es. Celles-ci sont peu nombreuses,
et localisées au seul tissu cc~necti=. Les particules sont
groupées en amas au sein du tissu désorganisé, sans localisa-
'ticn pY§fécentielle.
(P2-a::c:t1e
x, fig.
38)
Les plus grosses particules qui ont soit une forme
en bâtonnet, ou qui sont sphériques, sont semblables au vi-
rus S, virus pléomorphe de M. dépu~ato~
(BONAMI et VAGO,1971).
Les virions présentent un nucléoide dense aux électrons
(Planche X , fig 36 ).
Les autres virus, plus petits, ont une structure
caractérisée par une capside icosaédrique entourant un core
dense aux électrons (Planche X , fig ~t). De par leur mor-
phologie, et leur disposition en figure géométrique, nous

---

-
73
-
Quoi qu'il en soit, la présence de cette particu-
le virale chez le crabe, ferait de ce dernier un vecteur
dans la transmission du virus, ou un hôte-réservoir de ce
virus.
1
Il ne nous restait plus qu'à nous assurer de la
1
présence des virus dans les organes des crabes, et du même
..,.~
coup, à vérifier laquelle des deux hypothèses était le
plus en accord avec nos observations.
1
C'est ce que nous avons réalisé, à l'aide des
1
cultures cellulaires BF Z' inoculées à partir de différents
prélévements des crabes infectés.
1
1
B - RE-ISOLEMENT SUR LA LIGNEE CELLULAIRi bF
DE L'AGENT
2
INOCULE A Ma~~opipu~ d~pu~a~o~
1
1
Lors du traitement des organes des crabes infec-
tés, en vue de l'étude histopathologique, nous avons prélevé
1
sur les animaux, l'hémolymphe ainsi que des fragments d'hé-
patopancréas, de branchies et de tube digestif postérieur,
1
que nous avons inoculé aux cultures cellulaires BF '
Z
1. Inoculation des cultures
.
1
Cinq, dix, quinze jours après l'infection des ani-
1
maux par injection ou "per os", des prélévements d'organes
ont été inoculés à des cultures BF Z'
1
1
1
1
---1

---

-
7 1: -
L'hémolymphe prélev~aseptiquement, a été inoculée
pure à raison de 0,2 ml par culture.
La portion de tube digestif postérieur a été mise
en suspension dans une solution salée tamponnée (PBS).
Il en
est de même pour les branchies et l'hépatopancréas qui ont
été préalablement broyés ensembles. Ces derniers centrifugés,
ont été dilués avant d'être inoculés.
Les cultures ont reçu de 0,2ml à O,Sml d'inoculum
Deux à quatre passages des surnageants cellulaires infectés
ont été effectués, afin de ne pas mettre en cause un éventuel
effet cytotoxique. Cela permet aussi de diluer l'inoculum
de départ, car un inoculum, éventuellement trop riche en vi-
rus, est un facteur de blocage pour l'apparition de l'effet
cytopathogène (WOLF et QUIMBY, 1967).
L'incubation des cul tures
a
été effectuée
à
lScC et nous avons recherché l'apparition de plages de lyse,
au microscope à contraste de phase.
2. Effets observés.
A la suite de ces inoculations,
les cellules BF 2
ont montré deux phénomènes:
D'une part,
le développement d'un effet cytopathogène,avec
l'apparition de plages de lyse dans les tapis cellulaires.
Cet effet a été quantifié, et nous avons utilisé une nota-
tion variant de un à quatre plus (+) pour le représenter.
D'autre part, nous avons eu à observer dans les cultures,
le développ~~e~t de cbnt~mfnations, notamment des levures
et des ciliés.
Quand la présence des contaminants était décelée

---

1
-
7 5 -
1
assez tôt, et que ces derniers existaient en faible propor-
tion,
le surnageant cellulaire de la culture contaminée était
1
filtré sur un Swinex stérile (Sartorius) muni d'une membra-
ne en nitrate de cellulose de porosité 0,45 ~. Le filtrat
1
pouvait être ensuite ré-inoculé à une culture saine.
1
Les résultats que nous avons obtenus sont ~ap­
portés sous forme de tableaux. Pour les établir, nous avons
tenu compte de l'origine et du temps de prélèvement des
1
inoculi, del'effet cytopathogène, de la présence ou de l'ab-
sence de contaminations, ainsi que du nombre de passage sur
1
les cultures.
1
Une seule fois,
lors de nos contr5les en micros-
copie électronique, des surnageants cellulaires infectés,
1
nous avons mis en évidence le virus S de Ma~~opipu~ d~puAa
to~ dans nos préparations. Il s'agit de la série de cultu-
res BF
qUI ont reçu comme inoculum l'hémolymphe de crabe
1
2
infecté par la voie sanguine.
1
Cette série a présenté dès le premier passage
de l'hémolymphe un très fort effet cytopathogène, et ne
1
contenait pas de contaminants. Les premier
et deuxième
passages ont donc été mélangés, puis soumis à une centri-
1
fugation d'une heure et demie à 25.000t/mn. Les culots ob-
tenus ont été contras~s négativement par l'acide phospho-
tungstique et observés au microscope électronique.
1
Associée à la particule virale S, le virus
1
icosaédrique de type Réovirus a aussi été observé dans
les culots d'ultracentrifugation de BF
infectés aux cin-
2
1
-quleme et quinzième jour du prélèvement de l'hémolymphe
des crabes. La coloration négative effectuée SUT le culot
1
1
1

---

-
76
des cellules infectées par l'hémolymphe prélevée le di-
xième jour, ne nous a pas permis de mettre en évidence la
présence de particules virales.
En plus de ces deux particules, nous avons ob-
servé dans le culot des cultures infectées au quinzième jour
quelques formations tubulaires.
Et c'est la présence de ces trois éléments et
surtout la richesse en virus S qUI nous a incité à pour-
suivre le développement
ln vl~4o
de cette particule.
Le culot a été additionné d'antibiotiques et
nous l'avons dilué au 1/2 , au 1/4 et au 1/10 dans du PBS.
Chaque dilution ainsi qu'une fraction aliquote du culot
pur ont été inocules a quatre cultures cellulaires BF "
2
Nous avons pu noter que seules deux cultures
ont présenté des changements, moins de vingt-quatre heu-
res après 1 'inoculation: cell~ ayant reçu l'inoculum pur,
et l'inoculum dilué de moitié.
Il ne nous a pas été possible en effet, de
poursuivre notre expérimentation, à cause du dévelop-
pement de contaminations dans les quatre cultures, dès
le deuxième jour suivant leur inoculation.
Malgré les précautions d'aseptie, prIses lors
de la purification, nous pensons que l'adjonction des
antibiotiques n'a pas été faite en quantité suffisante
pour enrayer le développement microbien.

---

1
1
_
ï 'f
1
3.
Interprétation des tableaux.
1
La premlere chose que l'on constate, au vu des
tableaux, c'est que l'hémolymphe et l~ organes des cra-
1
bes inoculés, provoquent un effet sur les cultures cellu-
laires BF ' Cette réponse est considérée comme le reflet
Z
1
de la présence des virus dans les organes de M.
d~pu~dto~,
pUlsque l'effet persiste au bout de trois à quatre passa-
ges sur les cultures.
1
Deuxièmement, à l'examen comparatif des ta-
1
bleaux, nous constatons que l'inoculation des cultures à
partir des prélèvements provenant de crabes inoculés par
1
la voie sanguine, a donné des résultats plus faibles que
ceux obtenus à partir d'une inoculation des animaux par la
1
VOle Ducca:ie.
Il .est peut être possible de mettre en cause
1
dans ce phénomène, le mode même àlinfestation des crabes.
1
En effet, au vu des effets cytopathogénes obte-
1
nus dans l'un et l'autre cas, on pourrait penser que la
pénétration des virions directement dans l'hémolymphe des
1
crabes doit faciliter la distribution de ces virus dans
les organes des animaux. Ce qui se traduit par une certai-
ne homogénéité dans l'apparition des effets cytopathogè-
1
nes reportés dans le tableau 1.
1
Par contre, les cultures inoculées à partir
de prélèvements d'organes de M. dépu~ato~
inoculés par voie
1
buccale, si elles-présentent notamment pour les broyats un
1
1
1

---

- 7d
effet, celui-ci est relativement faible pour l'hémolymphe
et décelable au troisième passage. Ceci pourrait s'expli-
quer par le fait que l'inoculation des crabes réalisée
par voie buccale , est dépendante de deux facteurs:
D'abord, le rejet par la bouche de l'animal d'une frac-
tion de l'inoculum lors de l'injection de la suspension
virale per "os". La quantité de virus dÛ1!\\: réellelilent ab-
sorbée par le crabe est de ce fai t ùirll.i.l1uée.
De plus, la dose absorbée, ne transitant que dans le trac-
tus digestif de l'animal, doit être en partie éliminée
dans les déjections du crabe.
CI - ESSAI DE DEVELOPPEMENT DE L'AGENT SUR D'AUTRES SYS-
CELLüLAIRES DE POISSû~S
Jusqu'à présent
nous n'avons illlS en évidence
le virus de M.
dépu~a~o~ que sur des cultures cellulaires
BF . Il était donc intéressant de savoir s'il se dévelop-
2
pait sur d'autres systèmes cellulaires de Poisson, définis-
sant ainsi des caractères biologiques. Trois systèmes cel-
lulaires ont été testés;
parmi ceux-ci deux proviennent
de Poissons d'eau douce, les lignées FHM et RTG, tandis
que la lignée SBL est issue d'un Poisson marin.
1. Description des lignées utilisées .
- La lignée SBL
Ces cultures sont constituées de cellules de
forme triangulaire et de cellules de forme variable.

---

1
1
-
79
-
1
Elles donnent nalssance à un tapis relativement hétérogè-
1
ne, dans lequel on note une vacuolisation générale des
cell ules (Planche XI , fig 39 ). Ces dernières contiennent
aussi beaucoup de granulations.
1
Ces cultures provenant d'un poisson marin ont pu être très
bien cultivées dans le MEMG,
sans addition de NaCI, con-
1
trairement à ce que préconisent CLEM et coll.
(1961),
pour les cultures cellulaires d'origine marine.
1
Les SBL ont un pouvoir de maintien à 30°C supérieur à
sept jours sans qu'il soit nécessaire de les repiquer. On
effectue alors un changement de milieu nutritif.
1
La lignée FHM
1
Le tapis de FHM, très dense est constitué de
1
petites cellules plus ou moins cubiques, jointives et
présentant peu de prolongements lPlanche ·>~Œ, fig ~ l-) .
1
I l
rappelle en celà, le tapis de la lignée BF Z' Ces cul-
tures, peu
vacuolisées, résistent aussi bien que les
SBL à 30°C.
1
La lignée RTG :
Z
1
Les cellules de cette lignée sont très allon-
1
gées et prolongées par deux
longs
pseudopodes (Plan-
che XI,
fig 43). Leur aspect fusiforme fait qu'elles ap-
1
paraissent rarement, comme formant un tapis confluent
vingt-quatre heures après le repiquage. Le cytoplasme ne
renferme pas de vacuoles.
1
La température optimale de croissance pour les
1
RTG
-e-st- de 250:.C. 1'I:.ais i l est possible de les conserver,
Z
quelques jours à 4°C ou une semaine à 15°C, sans qu'il y
1
ait trop d'altérations dans les cultures, comme le rap-
,
portent WOLF et MANN (1980).
1
1

---

-
80
-
T A BLE A U
l
Temps
Passage sur
Effet
Contamination
(j )
- BF 2
1
++
0
s
2
+++
0
3
+++
0
4
++++
0
TUBE
DIGESTIF
POSTERIEUR
lû
Î
.;-
0
2
+
0
3
++
0
4
+++
0
1 5
1
?
Ciliés:++
levures: ++
2
?
Ciliés: ++
levures
+++
5
1
+++
0
2
+++
0
HEMOLYMPHE
10
1
++++
0
2
+++
Û
Z
15
1
++++
0
~II
2
++++
0
~ -----------------------------------------------------------------
10
1
?
levures filtré
~I
2
++
0
BROYAT
3
++
0
D'HEPATO-
4
++
0
PANCREAS
ET DE
1 5
1
+++
0
BRANCHIES
2
+++
0
3
++
levures

---

1
1
-
'31
T A B L L
'
U
I I
1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Temps
Passage sur
Effet. cyto-
Contamination 1
(j )
BL)
pathogène
L.
5
1
+
0
2
+
Ciliés: ++
TUBE
3
?
Ciliés
1
DIGESTIF
POSTE-
10
1
+ ?
Ciliés:+ filtrél
·RIEUR
2
++
0
3
++
0
15
1
2
5
1
?
o
2
?
o
++
o
c:::
<
10
?
levures:++ filtl
c...
HEMOLYM-
+
o
z
o
PHI.
3
++
o
......
u
l 5
Champignons
filtré
Z
2
+
o
H
3
+++
o
10
1
++
o
BROYAT
2
++
o
D'HEPATO-
3
++
o
PANCREAS
4
+++
o
ET DE
BRANCHIES
1 5
+

---

1
1
1
Fig LI r e :; 9 : Tapi s cel luI air e d e SB L
sai n es.
1
~Ijcroscopie à contraste de phase X
560
1
Plage de lyse
lPl) dans le tapis de SBL
infectées.
1
Microscopie à contraste de phase X
390
1
Figure 41
: Tapis cellulaire de FHM saInes.
1
Microscopie à contraste de phase X
400
1
Figure 42
Plages àe
ly::>e
(Il)
dans le tapis des FHM
infectées.
1
MicroscopIe à contraste ùe phase A
1
Figure 43 : Tapis cellulaire de RTG
saines.
Z
1
Microscopie à contraste ·de phase X
390
1
Figure 44
: Plage de lyse
(Pl)
dans le tapis des RTG Z
,\\
/1
infectées. Noter
~es bulles
•
)
1
Microscopie à contraste de phase X
390
1
1
1
1
1
1

---

---

,..-.~
- 82 -
2.
Inoculation des cultures-
Les cultures débarrassées de leur milieu de
croissance sont lavées une fois avec la solution salée tam-
ponnée au phosphate. Elles ont été inoculées avec 0,3 ml se
surnageant cellulaire BF
infecté. L'inoculum est laissé une
7
heure,
en contact à 25° C
avec les cellules, puis il
est éliminé et les cellules reçoivent alors Sml de milieu
pour inf3ction. Elles sont ensuite mises à incuber à 1SoC.
3. Observation d'un effet cytopathogène.
L'effet observé dans les cultures SBL, FHM et
RTG ' s'est aUSSI traduit par l'apparition de plages de ly-
Z
se et de cellules réfringentes dans le tapis des cultures.
Mais la forme des plages de lyse des RTG
est différente de
7
celles observées pour les FHM et les SBL.
Dans le cas des lignées SBL
(Planche XI
,fig40)
et FHM
(Planche XI , fig 42 ) les plages de lyse sont plutôt
arrondies, et on note qu'il y a vacuolisation générale des
cellules.
Les RTG Z' quant à elles, présentent des plages
plus larges, et étirées, qui font plus penser à une dis-
jonction des cellules (Planche XI, fig 44) qu'à une véri-
table plage de lyse.
Toutefois,
cet effet n'apparaît pas dans ces
trois systèmes cellulaires aussi rapidement que dans les
cultures BF .
2

---

-
83 -
Pour les cultures RTG '
l'effet apparaît au
Z
bout de quatre jours d'inoculation, et pour les SBL, cela
varie entre quatre et six jours d'incubation. Les FHM sont
plus lentes à réagir, et ne présentent un effet qu'entre
dix à quinze jours après inoculation.
La dilution de l'inoculum intervient aussi
pour une large part dans la rapidité d'apparition de l'ef-
fet cytopathogène. Bien que le titre en virus de l'inoculum
n'ait pas été déterminé, avant que celui-ci soit introduit
1
d~ns les cultures, nous avons remarqué qu'un inoculum non
dilué entraînait rarement un effet cytopathogène dans les cul-
1
tures SEL, FHM et RTG , incubées à 15°C. Leur maintien à cet-
2
te température pourr~it se prolonger sur une période excédant
1
une vingtaine de jours sans que l'apparition de plages de
lyse puisse être observée, en microscopie à contraste de pha-
se.
1
Un changement du milieu d'infection à 2% SVF,
1
des cultures n'a pas non plus modifié ces résulta~s, pendant
le temps d'incubation des cultures.
1
Par contre, quand ces cultures avaient reçu un
1
inoculum dilué, et qu'au bout de quatre jours d'incubation à
15°C, elles ne présentaient pas de changements, nous les
avons sur-infectées, et laissées à 15°C. Dans ce cas, les cul-
1
tures RTG
présentent un effet entre six à sept jours d'incu-
2
bation, tandis que les FHM montrent de rares plages de lyse.
1
1
1
1
1
1
•••

---

-
84
-
DISCUSSION ET CONCLUSION
Le virus isolé des cultures BF '
morpholo-
Z
giquement proche du Réovirus P, ne provoque pas de mortali-
tés chez le crabe Ma~~op~pu~ dépu~a~o~. On ne retrouve pas,
à' la suite de 1; inoculation expérimentale àes animaux les
symptômes cliniques,
tels le tremblement des pattes puis la
""'paralysie des animaux. On ne retrouve pas non plus à l 'his-
topathologie les larges zones paracristallines déjà décrites
par BONAMI et coll.
(1976)
avec le virus P.
Des résultats identiques se retrouvent en mI-
croscopie électronique,
sauf un cas, observé au niveau de
l'intestin postérieur qui pourrait être attribué à une in-
fection naturelle par les virus S et P.
Par le biais des cultures cellulaires BFZ,nous
avons eu la réponse cependant que le virus était bien pré-
sent chez le crabe, et surtout dans 'l' hémolymphe.
Il semble-
rait, que dans certaines conditions, ce virus se maintient
dans M.
dépu~a~o~,
car il est retrouvé au bout de quinze
jours d'inoculation, et particulièrement dans l'hémolymphe.
Un cas semblable a été rapporté par BANG (1971,
1974) où un virus affectant les amoebocytes du crabe,
Ca~~~­
nu~ mo~na~ était retrouvé des semaines après l'infection ex-
périmentale des animaux, dans l'hémolymphe. Les mortalités
de l'espèce étaient peu significatives.
De la même manière, MOEVUS-KOBB (1965) décèle
la présence de virus de type NPI chez des invertébrés marins

---

- 85 -
en utilisant des cultures cellulaires; malS il n'observe pas
pour autant chez les animaux, de signes évidents de la mala-
.:J •
u le.
1
Il semble donc que sur le plan biologique, l'a-
gent viral isolé sur les cultures BF ' soit différent du vi-
Z
1
rus P, particule icosaédrique et nue du syndrôme "S-P", du
crabe. Aussi, certains aspects nes caractères biologiques de
1
cette particule v:rale peuvent être retenus.
En ce qui concerne la distribution du virus chez
1
le crabe,
il semble qu'elle soit facilitée par une inoculation
par voie sanguine, plus que par voie orale. Ce qui explique-
1
rait qu'à l'état naturel, et dans le milieu ambiant le virus
soit rapidement éliminé par l'animal, ou s'il persiste, ce
1
serait à un faible niveau de développement. Dans ce cas, on
peut, peut-être envisager une protection de type jrm.J.r:j.'taire
1
, limitant le développement viral chez le crabe.
D'autre part, cet agent viral se développe sur
1
différentes lignées cellulaires de Poissons, mais l'effet
cytopathogène provoqué apparaît différemment au cours du
1
temps, en fonction de la lignée. Ainsi, nous avons remarqué,
quant à la sensibilité des cultures cellulaires que les li-
1
gnées SBL et RTG
sont plus réceptives que les FHM. La li-
Z
gnée SEL a été rarement utilisée pour la production
~n V~­
1
t~o
de particules virales, contrairement aux deux autres
systèmes cellulaires. En comparant les travaux effectués
dans ce domaine, il apparaît que les cultures cellulaires
1
FHM, sont relativement peu efficaces dans la replication
in vit~o de virus (SCHERRER et COHEN,
1975; KELLY et coll.,
1
J978; NICHOLSON et coil~,1979).
1
1
1
1

---

-
86
-
La particule virale obseJvée sur les cellules
BF
pourrait donc être transportée par l'animal,
lequel doit
2
être considéré comme hôte-réservoir ou vecteur passif poten-
tiel pour d'autres espèces d'animaux aquatiques.

---

- 87
CHA PIT R E
VI
CARACTERISATION DU VIRUS
INTRODUCTION
La particule virale que nous avons mise en évidence
chez Mac~op~pu~ dépu~ato~, à l'aide de cellules de Poissons
en culture, la lignée BF
notamment, montre comme nous l'a-
2
vons décrit précédemment une ressemblance morphologique
Toutefois, nous avons voulu approfondir la compa-
~~isc~ de ces agents par une étude ul~rastructurale,biophy­
slque,
biochimique et sé {'_ologique de l'agent isolé.
AI PURIFICATION DU VIRUS
L'obtention d'un matériel viral purifié, en quan-
tité suffisante pour réaliser les différentes recherches
quant à la caractérisation du virus isolé a nécessité d'ef-
fectuer des infections de nombreuses cultures cellulaires
-- I3-.f 2-" -

---

1
1
_ 88
Pour chaque purification réalisée, un volume
de 150 à 200ml de suspension cellulaire infectée était
utilisé.
1
1.
Protocole expjrimental initial.
Nos premiers essais pour purifier le virus consis-
1
taient en une purification sommaire comprenant un broyage
aux ultra-sons, puis une clarification de la suspension cellu-
1
laire infectée. Le surnagean~
é~ait centrifug~
~ 25.000 t/mn
pendant 1h.30.
1
Le contraste négatif à l'acide phosphotungst~que(A.p.T.)
réalisé sur le culot issu de l'ultracentrifugation nous a
permis de vérifier la présence des virions.
1
En utilisant ce procédé nous avons pu mettre en
1
évidence dans nos préparations deux types d'éléments vi-
raux. Le premier est une particule virale mesurant environ
1
ïO nm de diamètre. Beaucoup de ces par~icules, Cleuses,
sont pénétrées par l'APT. De même des virions pieins, non
1
pénétrés par le colorant ont été observés
~ais en quanti-
té moindre.
A coté de cela nous avons relevé la présence de structu-
1
res tubulaires de longueur variable ayant un diamètre pro-
che de celui des virions.
1
Mais dans la plupart des cas
la quantité de virus que
nous observions au microscope électronique
était relati-
1
vement faible.
Ce résultat ne semblait pas correspondre à
celui auquel nous aurions pu nous attendre au vu de l'effet
cytopathogène observé dans les cellules infectées, en mi-
1
corscopie à contraste de phase.
1
La deuxième constatation concerne l'importance
des débris cellulaires observée dans nos préparations,
1
après contraste négatif à l'APT des culots.
1
1
1
1

---

- 89
De telles suspensions virales ne pouvaient alors
nous servir pour poursuivre l'étude de la caractérisation
du virus.
Ces résultats nous ont donc amené à rechercher
les causes de la perte de notre matériel viral en cours de
purification et à mettre en oeuvre une méthode plus adaptée
et plus rentable quantitativement et qualitativement.
2. Méthode ad optée
La méthode de purification que nous avons suivi
est celle de DOBOS et coll.,
(1979), qui a permis d'obtenir
de bons résultats
comparativement aux premières tentatives
de purification du virus.
Par la méthode de DOBOS et coll., (1979) qui inclue
dans la purification une concentration des virus par le
Polyéthylène-Glycol (P.E.G), une extraction des particules
virales dans la suspension infectée par le Fréon 113, et
deux cycles de ce~trifugation sur gradient de sucrose et
gradient de Chlorure de Cesium (CsCl), nous avons obtenu
des suspensions relativement riches en virus et contenant
beaucoup moins de débris que par le procédé initial.
A chaque étape de la purification, un contrôle
en microscopie électronique était effectué sur une frac-
tion aliquote des culots et des surnageants de manière à
nous assurer que les particules virales étaient présentes
en nombre suffisant.
Cependant,
il nous a-~emblé ~u~ lois de la concentration
des virus par le P.E.G.,
celui-ci, même au bout de 4 h.

---

1
1
'"
90
-
1
de dissolution ~ 4°C, retenait-enfermées dans des agglomé-
1
rats de nombreuses particules virales. Pour limiter la
perte de ces virions, nous avons prolongé le traitement au
1
P.E.G. à 8 heures, toujours à 4°C.
Alors que dans notre méthode,
le culot cellulaire après la
clarification à 2000 g était jetté, dans la méthode de DO-
1
BOS
et coll.,
(1979), c'est sur ce culot que porLe l'essen-
tiel de la purification.
1
Selon de nombreux auteurs,(MALSBERGER et CERINI,
1
1965; COHEN et coll.,
J973},les cellules du culot retien-
nent la plupart des virus, appelés "virus associés aux cel-
1
lules", en opposition aux virus libres ou "virus relâchés",
présents en plus faible quantité dans le surnageant cellu-
Jaire.
1
Le surnageant est d'ailleurs traité au NaCl, et au Polyé-
thylène-glycol (PEG) qui ont pour but de concentrer les virus
1
en suspension. Ces virions se retrouvent au culot après cen-
trifugation à 3.500 t/mn pendant 75 minutes.
1
Le culot de la clarification et celui de la cen-
1
trifugation sont alors mélangés et subissent une sonication
de faible durée, mais à la fréquence de 50 KHz,
permettant
de faire éclater les cellules, afin de libérer les virus.
1
L'utilisation du Fréon 113, solvant organique des lipides,
permet de séparer dans le culot, une phase aqueuse supérieu-
1
re contenant les virus, ~es phases organiques intermédiaire
et inférieure. En général, une seule réextraction de la
1
phase intermédiaire par le tampon TNE, suffit à libérer les
virions restants.
1
Les virus extraits au Fréon JJ3 sont centrifugés
sur un gradient de sucrose de 30 à 50%
(pds/pds) à
1
1
1
1

---

-
91
25.000 t/mn pendant 2 heures. Trois bandes sont visibles
dans les tubes à centrifuger à la fin de l'ultracentrifuga-
tion.
3. Résultats
Cesbandes sont extraites à l'aide d'un moniteur
UV ISeO et dilués dans le tampon TNE . Elles sont ensuite
centrifugées séparément à 2.000 t/mn pendant 1 heure. Le
culot obtenu est remis en suspension dans le tampon.
Une coloration négative des culots, à l'acide phosphotungs-
tique
(pH 7,0) permet de connaître la composition des ban-
des après observation au microscope électronique.
La première bande située au 1/3 supérieur du tube à centri-
fuger, conrienr cieux types cie particules Vlrales. Des par-
ticules non enveloppées icosaédriques de 70 nm de diamètre
dont les formes pénétrées par l'acide phosphotungstique
(particules creuses) sont plus nombreuses que celles qui
ne sont pas pénétrées par le colorant (particules pleines).
En plus
, on observe d'autres particules
icosaédriques et non enveloppées d'un diamètre avoisinant
20 nID.
La deuxième bande peu éloignée de la premlere,
apparaît plus opalescente que la première. La microscopie
électronique révèle qu'elle renferme surtout deux types
d'éléments viraux. D'une part les particules de 70 nm de
diamètre dont les formes pleines prédominent sur les for-
mes creuses. D'autre part, des formes tubulaires rectili-
gnes sont visibles. C'est à parti-r-de--cett-e b-ande que nous
avons poursuivi la caractérisation biochimique du virus.
Enfin,
la troisième bande, à position médiane

---

J
-
92 -
1
dans le tube~ comprend quelques particule~_ virales pleines
et creuses, ainsi qu'un grand nombre de tubules. Ces for-
J
mations tubulaires ont parfois été retrouvées au culot en
absence de cette troisième bande.
1
Le culot de la deuxième bande est déposé à la
1
surface d'un gradient préformé de CsCl
(30-50%) et centri-
fugé à l'équilibre 16 H à 30.000 t/mn.
1
Les deux bandes de virus présentes sont extraites par ponc-
tion directe sur le tube, puis après dil~tion dans le tam-
pon TNE, elles sont centrifugées à 20.000 t/mn pendant une
1
heure.
Les culots obtenus sont repris dans 0,5 à 1ml de
tampon.
1
1
B/ ETUDE ULTRASTRUCTURALE DES ELEMENTS VIRAUX
1
1. Ultrastructure des particules virales
1
Deux types de particules virales ont été obser-
vées dans les suspensions purifiées. Elles sont icosaédri-
1
ques malS diffèrent par leur taille.
1
Les petites particules virales sont nues,
icosaé-
driques, et mesurent approximativement 20 nm. Ces virions
1
n'ont pas été observés en microscopie éle~tTonique des cel-
lules infectées. A cause de leur faible nombre, elles n'ont
pu être isolées pour poursuivre plus en détail leur étude
1
(Planche XIII , fig. 41') .
La population de virus de grand diamètre est assez hété-
1
rogènetant pour la taflle que pour la forme des virus.
Les particules virales sont nues et ont un diamètre moyen
1
de 72nm pointe à pointe. A aucun moment nous n'avons obser-
vé de double couche protéinique sur ces particules.
1
1
1

---

,
, , "
l
:
;ure
1=,
\\1 :"l;S
purifiés en gradient de C.~Cl. Particules
l'le ines
(pp).
particules creuses
(Pcl.Observ,"'T
le::,
--i
capsomères
)
de
l'lcosaèdre
sur un côté.
1
Microscopie électronique X
1 0 8000
1
Figure
46
R~ovirus P du crabe, Observer la
double couche protéinique
(
===1: )de la
1
particule.
~1icToscopie électronique X 170.000.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

...
"'if'
\\..,.

---

'1
J
1
1
PL-\\\\CHL \\111
1
Figl!l'e -l~ : Particules \\'irales purifiées en gradient de
1
sucrose.
ùoserver les petites particules à côté ( ..... )
des grosses
... ).
1
Microscopie électronique X
17
000
1
Figure ~s
: Tubules à côté d'une particule virale, A no~
ter la striation en hélice du tubule.
1
Microscopie électronique X
80 000
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

,:
~-
®
.~ :~;~:
@

---

- 93
Les ,articules pleines et intactes , ont toujours un profil
hexagonal.
Il est possible d'observer sur ces virions qua-
tre capsomet:res
sur chaque arête de la capside
(Plan-che XII,
fig.4~). Cet alignement correspond à une triangulation T=9,
( CA SPA Ret KLU G,
196 2) .
La distribution des particules pleines en fonc-
tion de
leur àiamètre,
est rL-élatric8 de l' hétéè'8gér..éité
de taille des virions (Planche XIV ,
fig. 49 ). Ces tûilles va-
rient de 69 à 74 nm.
Le virus de référence utilisé est le
TMV virus
de la Mosaïque du Tabac mesurant 18 nm
Dans la population de VIrus creux,
deux sortes
de virions sont reconnaissables. A coté de virions de for-
me sphérique, entièrement pénétrés par l'APT,
on observe
des particules virales àe forme icosaé31iqüE, :;:,l~: C~ moins
pénétrées par le colorant.
Ces partic01es crc~ses sont rela-
tivement abondantes, et d'une manière générale, ont une tail-
le inférieure à celle des particules pleines.
2. Ultrastructure des tubules.
Dans les suspensions_contrastées négativement
par l'acide phosphotungstique,
les formations tubulaires
ont été observées sous plusieurs formes:
longues ou cour-
tes,
intactes ou altérées.
Ces forma~ions sont creuses,
rectilignes et composées de
sous-unités qui semblent être disposées suivant un modèle
hélicoïdal
(Planche XIII,
fig.4h).
Leur diamètre est variable-;certains tubules montrent W1 diamètre
proche de
celui des grandes particules, d'autres ont un
diamètre identique à celui des petites particules. Mais d'au-
tres
tubules ont des diamètres qui sont sans relation

---

•1
1
avec ceux des particules virales.
1
C; PROPRIETES PHYSIQUES DU VIRUS
1
--~-----~~-----~---~-~---~-----~.-
1
1. Densité
1
La densité des différentes fractions des pICS ob-
tenus lors dela centrifugation à l'équilibre en gradient
1
de CsCl,
a
été analysée
au réfractomètre de Abbé à la
température àe 25°C. Le deuxième pic, contenant les virions
pleins correspond à une densité de 1,34 ( PlancheXIV, fig. 50) .
1
1
2. Stabilité
1
Les virions se conservent plusieurs mois dans le
milieu de culture, congelés à -20°C.
1
Conservés à 4°C leur résistance est moindre.Des formes dégra-
dées sont observées au bout d'une semaine dans les suspensions
à cette température.
Les virus sont résistants à l'eau dis-
1
tillée (pH 7), au Fréon 113, mais ils sont dénaturés par le
Sarkosyl
à 0,1% et le SDS à 2%.
1
1
DI ETUDE BIOCHIMIQUE DES VIRIONS
1
1. Nature de l'acide nucléique viral
1
La méthode de
MEJBAiJM- (1939) pa-r le réactif à
l'orcinol a donné des résultats positifs dans nos analyses
1
indiquant la présence d'un acide nucléique de type ARN dans
les virus.
l
1

---

1
1
1
:~L.:\\\\Lf;~
1
1
Figure
Distribution du nOmbl"e des particules virales
en fonction Je la taille.
D:Diamètre
1
1
Figure
c::. I]
Densité des particules virales du deuxième
pic
(1,:)4).
1
1
Figure
~1
:
Mobilités électrophorétiques en gel de polyacry-
lamide}
8 ~ des polypeptides viraux du Birna-
virus par rapport aux différentes protéines de
1
référence.
1
a:
R~A polymerase
b:
Bovi~e-Serum-Albumine
1
c:
Catala..se
d:
Ovalbumine
e:
Chimotr'psinogêne A
1
f:
Trypsine-Inhibitor
g:
Cytochrome C
1
1
1

---

Nombre de virions
JO
,
;
J,8
,-
i
Densité
1,35
1,34
50
0,4
1,33
I l
I l
1 1
i
h ®
L--J',.---J.--+:--+-+---:7-:;t';Z~-:1;r:;5~-:r;-:I.r--:D~.:-(n-m-=-}
2
3
4
5
6 7 8
9
Fractt~,
155
6 8
60
43
25,7
20
12,5
o
500
700
mm
a
b
c
d
e
f
9

---

-
95 -
L'absence de coloration avec le réactif à la dé-
phénylamine selon la méthode de GILES et MYERS (1965)
indi-
que par contre que le virus ne contient pas d'ADN.
-
-
2. Electrophorèse de l'ARN viral.
Pour une migration de 9 heures dans un gel com-
posé agarose-acrylamide à 2,5%,
l'ARN viral se résoud en
deux bandes distinctes, d'épaisseur inégale (Planche xv
fig.55),
dont les poids moléculaires n'ont pu être détermi-
nés. Mais ce résultat renseigne exactement sur l'appartenan-
ce de
cet agent à un groupe connu de virus.
Ainsi,
la présence de deux segments d'ARN dans le génome
du virus, permet de rappvocher ce virus du groupe des
Birnavirus . Il ne peut donc pas être assimilé au virus
P. de M.
depu~ato~,
qUl contient dix segments d'ARN bicaté~
aire (BONAtvlI,
1980).
3. Electrophorèse desprotéines virales.
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide à 7,5%
selon la méthode de WEBER et OSBORNE (1969) a révélé la pré-
sence de 2 polypeptides dans ce virus (Planche XV
, fig. 52).
Les poids moléculaires de ces différents polypeptides sont
estimés d'après la migration de protéines de référence
(Planche XIV,
fig.51)
selon la méthode de SHAPIRO et coll.,
(1967). Les valeurs établies sont de 40.10 3 daltons pour le
polypeptide mineur, et de 72.10 3 daltons pour le polypep-
tide majeur.
Toutefois, nous devons signaler un résultat ir-
régulier obtenu à 11électrophorèse de virus détériorés: un
polypeptide mineur de poids moléculaire 82.10 3 daltons (Plan-
che XIV,
fig.~l; Planche XV, fig.52),
a été trouvé en rela-
tion avec un échantillon de virus provenant de la première
- j

---

- %
bande de virus obtenu après centrifugation en gradient de
-sucrase.
El ETUDE SEROLOGIQUE DU VIRUS
Des
tests d'immunodiffusion et d'immunoélectro-
phorèse ont été effectués: entre le Birnavirus provenant de
Ma~~opipu~ d~pu~a~o~, deux autres Birnavirus aquatiques,
le"Tellina-virus" (T.V) et le virus de la Nécrose Pancréatique
Infectieuse (NPI), et le5 virus S et P de M.
d~pu~a~o~.
1. En immunodiffusion
Par ce test, une relation antigénique a pu être
obtenue entre le virus provenant du crabe M. d~pu~a~o~ et le
virus de la Telline, T~llina ~~nu~~. Un arc de précipitation
s'est formé entre le puits central du gel d'agaroce conte-
nant les anticorps du virus de M.
d~pu~a~o~
et les deux
puits contenant les anticorps du virus de M.
d~pu~a~o~
et
celui de la Telline (Planche Xv , fig.54).
Sur cette base,
nous pouvons diTe que
1 e v i rus du crabe est proche de ce-
lui de la Telline.

---

Fi:s,'lë:'
-/
clcctrophorèse en gel
de polyacrylamide des
pol;-peptides du
Birnavirus
(
......
et des
pro t é i ne s d,. r· éJ é V' e nc.e..
( a , b ) c ) cl ) e ) f , g J )
Col 0 r a ~
tian 3U bleu de Coomassie.
d
= Ovalbumine
a
= RNA
polyrnerase
Chimotrypsinogène
A
e
=
b
= Bovine serum albumine
f
Trypsine
- Inhibitor
=
c
= Catalase
g
Cytochrome
C
=
Figure
S3
Electrophorèse
sur gel composé d'agarose et
d'acrvlamicie de
l'ARN viral.
Noter les deux
segments.
Figure- 54
Immunodiffusion en gel
d'agarose à
1~ des
vi rus
\\i PI
(1 Î,
VC (3),
S P
('-i)
et TV
(2)
con t r e
l'immunosérum VC du Birnavirus de M.depurator.
Figure 55
Immunoélectrophorèse:
VCp: Virus du crabe M. c~~u~ato~
VCd
: VC dilué
TV:pVirus de la ,Telline "Tellina virus";
TVd : TV dilué
SP
: Virus S et P de M.
depu~ato~.

---

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- •®
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(
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0
0
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1
2
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VC
TV
VC
TV
SP
o 0
p
p
d
d
4
3
'ô
®
@
- i

---

-
97
Par contre,
il n'y a pas eu de réaction entre le
virus de M.
de.pu!ta-to!t et les-anficorps du virus- de-la -Né---
crose Pancréatique Infectieuse
(NPI)
(Planche Xv , fig.
54). Cela suggère que le VIrus du crabe est différent de
celui de la NPI et qu'il appartiendrait à un sérogroupe dif-
férent dans la classe des Birnavirus.
L'absence d'un précipité entre le virus de M.
depu!ta-to!t et les anticorps des virus S et P du même crabe
indique et confirme que le virus isolé
rIe cet hôte est dif-
férent du virus P, et qu'il ne peut être classé parmi le
groupe des Réovirus.
2. En lHununoélect r~horèse
Le test d'immunoélectrophorèse a permis de con-
firmer les réactions d'identité exiscant
entfe le virus de
M.
depuJta-toJt et celui de la Telline. La migration des pro-
téines a duré quatre heures,
sous un courant de 70 volts.
Après séchage et coloration de gels, une faible
migration a été observée au nIveau des puits qui ont reçu
les antigènes viraux non dilués du Birnavirus de M.depuJta-
toJt
et ceux dela Telline. Cette migration se présente sous
la forme d'un seul arc de précipitation au-dessus de chaque
puits (Planche Xv , fig.5~).
Un arc plus faible et moins décelable est ob-
servé au niveau du puits contenant les antigènes viraux di-
lués de moitié de la Telline, tandis qu'une dilution iden-
tique du virus de M.
depuJtato!t
n'a pas provoqué de réac-
tion (P13'1che Xv , fig.:5).

---

98
Aucune réaction n'a été obtenue par ce test avec
les
VIrus S et P--ducrabe. Ce résul-tat-coïnci-de--avec ce-
lui obtenu en immunodiffusion et nous assure l'absence de
parenté entre les deux virus nus et icosaédriques de M.
d~­
Pllfta.,tOft.
DISCUSSION ET CONCLUSION
L'étude des caractéristiques du VIrus de M.
d~-
ptt!'tatoJt
isolé sur les cultures cellulaires BF Z' permet
de faire le point sur l'identification de la particule et
sur son appartenance à un groupe de virus. Elle démontre que
le virus observé n'est pas le VIrus P du crabe.
En effet,
l'étude ultrastructurale de cet agent
montre au' il ne possède !lélS 1 a double couche protéiniqlle dlJ
VIrus P,
caractéristique des Réovirus (VASQUEZ et TOURNIER,
1962; JOKLIK,
1974).
De même l'étude du génome viral montre que le
VIrus renferme deux segments d'ARN bicaténaire, contraire~
ment au virus P, ;qui en contient dLx (BONAMI,
J980),
comme
d'autres Réovirus (SHATKIN et coll., 1968).
La structuTe en deux segments de l'~cide p-ucléi-
que fait que l'on peut rapprocher l'agent viral isolé sur
les cellules BF Z' du nouveau groupe de virus, les
Birna-
virus, décrits par DOBOS et coll., 1979. Les caractéristi~
ques morphologiques de ce virus sont semblables à celles
déjà décrites pour des représentants de ce groupe: une ca-
pside non enveloppée, une structure icosaédrique (COHEN
et SCHERRER,
1972), et une taille variant entre 55 et 70nm.

---

-
99
D'autres similitudes dans le déroulement de la
morphogénèse du virus de M.
depu~ato~ sont aussi à rappro-
cher des autres
Birnavirus
Ainsi,la présence de tubules de diamètre varia-
ble. De telles
formations
ont été observée5 par ALMEIDA
et MORRIS (1973), HARKNESS et coll.,
(1975') associées au
virus de la Bourse de Fabricius du Poulet
(IBVD). TENINGES
et coll.
(1979) ainsi que MOSS et GRAVELL (1969) rapportent
respectivement l'association de structures identiques avec
le virus X de la Drosophile, V~o~ophifa méfano9a~te~ et le
virus de la NPI des
Safmonidae.
L'autre analogie se rapporte aux petites parti~
cules virales de 20 nm environ, que nous avons observé dans
les suspensions virales purifiées. ALMEIDA et MORRIS (1973)
ainsi que HARKNESS et coll.(19ï5)
les décrivent avec le virus
de l'IBVD, de même que UNDERWOOD et coll.
(1977) pour le
virus de la Telline, Teffina tenui~.
Selon ces différents auteurs, les formations tu~
bulaires ainsi que les petites particules virales ne sont
que des produits de dégradation des grosses particules.Elles
résulteraient d'un assemblage aberrant de protéines virales
en excès.
Un autre point intéressant à souligner est la
présence en grand nombre des particules creuses dans nos pré-
parations virales purifiées. La production importante de ces
particules et les facteurs responsables restent à déterminer.
Cependant nous pensons que ce phénomène est probablement ce-
lui de l'interférence décrit par HUANG (1973) et commun aussi
aux Réovirus (NONOYAMA et coll.,
1970). HUANG (1973)
suggère
que les virus
creux auxquels manque une partie ou la totalité du

---

-
100
génome,
seraient des particules virales défectives interf~­
rant sur la multiplication du virus standard. De-s particules
défectives ont été décelées par NICHOLSON et DUNN (1974),
che:
des Truites arc-en-ciel, Sa1.mogcU/l.dn.eJt.Ü
porteuses du vir-us
de la
NPI.
NICHOLSON et DEXTER (1975) pensent qU'ùl viL'to,
ces particules défectives seraient consécutives à des passa-
ges non dilués de virus,
ce que Mac DONALD et Yfu~\\10TO on: in-
firmé en 1978.
Du point de vue biochimique, et bien que TENINGES
(1982)
souligne que les Birnavirus aquatiques renferment trois
3 quatre polypeptides, deux polypeptides viraux ont été trouvés
en relation avec le virus plein. A ce résultat nous pouvons peut-être
incriminer notre méthode de coloration des gels qui n'est
peut-être pas suffisamment sensible pour révéler la présence
éventuelle de deux autres polypeptides .
\\f~,i5 T'.ous a.jouterons que !Jar une méthode semblable à la nôtre,
COHEN et coll., (19ï3)
indiquent qu'au moins deux polypeptides
peuvent être dissoci~s par 5lectrophorèse en gel de polyacryla-
mide du virus de la NPI.
Sur le plan sérologique, une parenté antigénique a
été mise en évidence
entre le nBirnavirus tl de M. de.puJta.:toJt
et celui de la Telline, Te.iiin.a. te.n.u~~, même si la composi~
tion polypeptidique ainsi que la densité en CsCl de ces deux
virllS diffèrent. Mac DONALD et GOWER (1981) notent d'ailleurs
pl~sieuTs divergences phénotypiques et génomiques entre les
différents
Birnavirus
aquatiques.
Le virus du crabe M. de.puJta.toJt est à classer au vu
de cette étude parmi les
Birnavirus
aquatiques.
Il ne pré-
sente pas de relations antigéniques avec le virus de la ~PI,
contrairement au virus de la Telline. Donc,
les virus de

---

-
101
M.
d~pu~a~o~
et de la Telline appartiennent certainement
à un même sérogroupe.

---

-
102
CHA PIT R E
VII
DETECTION DU BIRNAVIRUS DE Ma~~opipU6
depu~a~o~ PAR LA
FLUORESCENCE ET LA SCINTILLATION LIQUIDE.
l NT RODUCT ION
Outre la mise en évidence et la caractérisation
biochimique du Birnavirus de M.depu~a~o~,selon le3 métho-
des
~lassiques (Ch.IV et VI) avons cherché à localiser cet
agent dans les cultures cellulaires in vi~~o et chez le
crabe ,Ln J.Ji~l.L p;.il' Jes
iTIét~;:;èe~
-fines en matière d'ex-
ploratioIl et Je J~~sctic~ de ViT~S.
A près infection des cultures cellulaires BF Z
par suspension virale titrée
deux techniques basées sur
la fluorescence ont été utilisées pour déceler les virus
intracellulaires. Elles agissent à deux niveaux spécifiques
et diffèrent par les structures virales qu'elles mettent
en évidence. Ainsi,
la fluorescence par l'acridine orange
permet une détë~tion au niveau de l'acide nucléique viral,
tan dis que par l' i mIn un 0 f l ü ü r e sc e TI C e ces 0 1: t
les st ru c t ure s
antigéniques dela capside du virion qui sont décelées.
La scintillation liquide, après marquage à
l'uridine tritiée (~H uridine) de l'acide nucléique viral
a permis d'étudier le devenir des virions chez M.depu~ato~.
Ceci nous a amené à tirer des conclusions quant à la per-
sistance des Birnaviru5 chez cet hôte.

---

103 -
AI LOCALISATION
DU VIRUS DE Mac~op~pu~
d~pu~ato~DANS
LES
CULTURES CELLULAIRES.
Uns suspenslon virale
titr'ée
a été inoculée
à des cul tures cellulaires BF
. Puis au :moyen de la fluo-
Z
rescence,
nous avons révélé la présence des plages virales
à l'intérieur des cellules.
1. TITRAGE DES VIRUS
Ce titrage a été réalisé à partir d'une frac-
tion (un ml) d'un surnageanL de culLure cellulaire forte-
ment infecté.
Il a été effectué par la méthode deplages vi-
rales
(COOPER,
1967) sur des cellules BF ,
ensemencées
Î
dans des plaques de titrage Falcon.
Le principe est que les virus qui se dévelop-
pent sur des cultures cellulaires en formant de~plages de
lyse voient leur propagation limitée par une couche d'aga-
rose (DULBECCO et VOGT, 1954). Dans ces conditions, cha-
que plage de lyse observée n'est due qu'à une seule parti-
cule virale (JOKLIK et coll., 1980). Ces auteurs ainsi
qu' IS~~CS (1957) indiquent qu'il existe une relation li-
néaire entre la quantité de virus inoculés et le nombre
de plages produites.
Des dilutions de 10 en- 10 de l' inoculum sont
effectuées afin de déterminer la dilution pour laquelle les
plages sont de petit diamètre et non jointives. C'est à

---

-:
104
partir de cette dilution que l'on calcule ensuite le ti~
t re de l-a suspension inocul ée _
_
_
Les cellules qui n'ont pas été atteintes par le
virus fixent le colorant
(le Bleu de Méthylène). Aussi,
Jans les tapis colorés, apparaissent en blanc des plages
deI y s e qui peu ven t ê t r e co mpt é e s
( Pla ne he XVI, fig. 57) .
Ainsi c'est la dilution 10-6 qui nous a servi à calculer
le titre de la suspension.
Trois puits des plaques de titrage ayant été
inoculés pour chaque dilution, nous avons obtenu une
6
moyenne de 32 plages pour la dilution 10- , notre inocu-
lum titre donc:
~2 plages de lyse pour 0,2ml de suspension à la dilution
10- 6 .
32 x 5 plages de lyse pour 1 ml de suspension,
IbO plages de
1~!5P pour lml de suspension
Titre= 16.10 7 = 1,610 8 U.F.P/ml.
2. Cytochimie des cultures cellulaires BF Z
par l'acridine orange.
L'acridine orange est un fluorochrome qui a
été couramment employé en virologie, depuis que AMSTRONG
ct
NIVEN (1957) ont introduit leur utilisation en patho-
logie virale.
L'acridine orange. de manipulation aisée.
présente l'avantage d'être à la fois un colorant viral.
et un indicateur cytochimique pour l'identification des
acides nucléiques (AND~RSON. 1969; MAYOR, 1963").
Il
peut être incorporé dans les particules virales au cours
de leur cycle de réplication.

---

-
105
Cette coloration a été réalisée sur des cellu-
les BF
témoins et des cellules infectées par le virus
Z
provenant de Mac~opipu~ depu~a~o~. Par ce moyen, les cel-
lules acquièrent une forte propriété polychromatique qui
est activée par une irradiation avec une lumière ultra-
violette. Tous les détails visibles en histologie classi-
que sont observables par cette technique.
Dans les cellules saines on remarque un cyto-
plasme étalé et un noyau excentré renfermant plusieurs
nucléoles (PlancheXvII ,fig.58
) .Le noyau qui con-
tient de l'ADN est coloré en vert, tandis que les nucléo-
les et riches en ARN sont colorés en rouge.
Dans les cellules infectées, certaines cellu-
les présentent un érilem~nt ~u cytoplasme, et un noyau
déformé tandis que d'autres ont un voluffiineux nDyau a~ ce~­
tre d'un cytoplasme étalé, semblables aux cellules saines.
Au sein des cultures infectées, on observe des
cellules à cytoplasme 'coloré en rouge vif, soit totale-
ment, soit partiellement. Leurs noyaux sont très nette-
ment déformés. Beaucoup de ces cellules ont éclaté, ou
alors sont en voie de lyse. A leur niveau, dans le cyto-
plasme coloré en rouge vif et aussi à côté de ce dernier
on distingue très nettement des masses, ainsi que des ponc-
tuations fluorescentes de couleur jaune-vert. Nous avons
aussi remarqué que cette fluorescence se retrouve parti-
culièrement au niveau des noyaux des cellules qui sont en
cours de dégradation.
(Plar.che XVII.
fig.
59)
-- --Ces ma-sses cytoplasmiques -ou-extracytoplasmi-
ques, après lyse cellulaire correspondraient à une accu-
mulation de matériel viral, puisqu'elles ne sont pas ob-
servées dans les cellules saines.

---

1
1
1
\\ . "
'
1
1
Titration. Tapis cellulaire de BF, témoin.
~oter
"C':1soect uniforme Ju tapis.
1
:: Le ci Je \\1é t h Yl è ne.
1
Fig"re J-
:
Titration.
Plages virales
(
.)dans
le taDis
cellulaire d'une culture de BF, infectée par un
1
inoculum dedilution
6
10-
.
Bleu de Méthylène.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

'.~~~""';"':.;,,'" '\\,.,
;-:;Jr
.~. ',.0(';" ...
"!.
.. ~
.~··r' ;~.
>4'
·.i~~~t:.~

---

:e
de
BE"
Nct.er
2
~a~s
~e cytoplasme
(Cy\\
la
flLorescence
uniforme
Observer dans
~e noyau
(N)
:"e">r.'--Lcléoles(r.J.
x:
1250
2"igure
59
Tapis
cellulaire de
Bf
infectée.
Observer
l'état
2
1
dégradé
des
cellules.
Noter
au
niveau des
zones
rouges
Il) les masses vertes
.:\\.cridine orange
x
1250
1
1
Figure
60
-
Tapis
cellulaire de
8F
infectées.
Immuno-fluores-
2
~e~cQ
Noter
jans
le
cytoplasme
les granulations
1
~
et
autour du
noyau
la
vive
fluorescence
~)
1
~icroscopie à
fluorescence
x
250
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

•

---

106
-
Selon ~~YOR (1963)
les Virus â ARN sont détec-
tés dans
les cellules où ils se développent par une fluo-
rescence
rouge vi~
(brillante) après coloration â l'acri-
dine orange.
Les virus à ADN,
selon le même auteur,
fluo-
rescent en jaune-vert. Mais MAYOR (1963) ne semble pas fai-
re de distinction entre l'ARN mono et bicaténaire.
Or, d'après de nombreux auteurs la distinction
entre ces deux sortes d'ARN peut être révélée par l'acri-
dine orange. Ainsi sur la base d'une fluorescence jaune-
vert,
GO~~TOS et TAMM (1963) rapportent la mise en éviden-
ce du ~éovirus de type 3, qui est bicaténaire, dans les
cellules HeLa L. De la même manière, PLUMB et coll.,(1979)
HOWIE et THORSEN (1980) ainsi que AHNE (197]) décrivent
comme étant bicaténaires, les virus de type NPI qu'ils ont
cultivé ~n v~t~o, sur divers systèmes cellulaires. Par con-
tre,
!<:ELLY et LOH (1975),
NICHOLSON (1971),
indiquent que
12 ~irus de la NPI serait monocaténaire, après obtention
d'une fluorescence rouge dans des cultures cellulaires
qu'ils ont infectées. Une fluorescence identique a été ob-
tenue par HILL (1976a)
, après infection de culturecellu~
laire BF 2 par le virus de la Telline, Tett~na tenu~~, lui
permettant d'avancer que ce virus ne pouvait être de type
Reovirus.
Devant cette confusion dans la littérature,
nous ~~ons tenté d'expliquer les fluorescences rouges viÇ
et jaune-vert intra ou extracytoplasmiques que nous
avons observé dans les cellules BF
infectées par le Bir-
Z
navirus de M.
depu~ato~.
Ce virus comme il a été démontré
contient de l'ARN bicaténaire, et
est proche des virus
de type NPI. ALAYSE et coll., en 1975 étudiant la synthè~
se et la caractérisation dès ARNviraux du virus de la

---

-
10 t- -
\\Pl 03ns Jes ~ultures FHN et RTG~, ont démontré que deux
sa rt~e s~ cl r ,-\\ R.\\ -2 t aie n t s \\ n rhé t i s é s a u cou r s duc ycIe de
réplication Je cet agent.
Il s'agit d'un ARN monocaténai-
re correspondant à la presq~e :otalité des ARN synthéti-
sés et d'un ARN bicaténaire
, qui se retrouve au niveau
des virions
formés,
et dont la synthèse débute a'<'F": I:.t.\\\\t.. Jt.
1 'AR~ monoc0ténaire. Plus récemment, SOMOGYI et DOBOS
(1980)
ainsi que MERTENS et DOBOS (1982)
rapportent eux
aussi la synthèse Je ces deux types d'ARN lors de la répli-
cation du virus de la ~PI.
On doit alors admettre que dans les cellules
BF, infectées par le Birnavirus de M. dep~a~o~,
la fluo-
rescence rouge obtenue est vraisemblablement due à de
l'ARN monocaténaire. Ce dernier est d'ailleurs éliminé
après une digestion enzymatique des cellules BF ' par de
Z
la RNA
une heure à 37°C. [et ARN monocaténaire servi-
rait de modèle pour la synthèse des brins complémentai~
l "
d'
JOKLIK
(1 11 74)'
..\\~S
~ -,1\\
(l'lrl)':)",-
res, comme
ln lquent
, J ) r·',-,
1:.1...
("" •• J \\ .... \\;<
J
WERWOED (1970) â DrODOS de la réplication des génomes
de virus à '~NP-. Di'c;.Iti"no.il'"t..
De ce f3it,
les masses et ponctuations de cou-
leur jau~e-vert situées au niveau des zones cytoplasmi~
ques rouge vif, correspondraient 'à des plages virales
renfermant des virions formés et donc riches en ARN bi-
c3ténaire.
D'autre part, on pourrait s'interroger sur
la signification qu'il faut donner à la fluorescence pé-
rinucléaire observée dans les cellules infectées. On peut
envisager une augmentation de l'activité nucléolaire,
et peut-être une intervention du noyau tout entier. Car
nous devons rappeller que des décollements de feuillets
Je
la membrane nucléaire ont ~té notés en microscopie

---

;88
-
élec:ronique (Ch. TV). Ceux-ci pourraient souligner une
action dans La synthèse virale,
à moins qu'on ne doivent
.l.e~ interprpter que comme résultélnt de perturbations mé-
~3boliques consécutives à l'infection virale.
7.Immunof1uo r escence.
('est par l'immunofluorescence indirecte que
nous avons révélé la présence des Birnavirus dans les cel-
lules BF
infectées.
7
Dans :~~~~ réaction on met en contact dans un
premier
~_,,:.:'-.Yi, les anticorps préparés par inoculation de
.1
la souche virale à un lapin, directement avec les antigè-
nes viraux présents dans les cellules.
La réaction antigè~
ne-anticorps est ensuite révélée par là flucresçence émise;
sous
lumière ultra-viole[t~, par ü~ :lüoycçhrome couplé à
des immuno-glohulines anti~lapin. Nous avons utilisé des
immunoglobulines de mouton anti-lapin, couplées à l'iso-
thiocyanate de fluorescéine.
Cette réaction se produit de la manière sui-
vante,
selon le schéma donné par SPFNDLOVE (1967):
Antigen CA)
+
Rabbit antibody (Rab)
~ A..,.RAb -
A-RAb + Fluorescent ant~Yabbi~
-globulin antibody(x FAR
Cab )
A-RAb - X FAR
Gab (stained antigen).
Un lavage dans une solution salée tamponnée
311 phosph3te permet d' él iminer le fl uorochrome en excès,
et qui ne se serait pas fixé sur les sites antigéniques
3sso~iés aux anticorps.

---

-
10 C;
Seule lIne
fluorescence spécifique de la réac-
-
- -
- -
- -
tian antigène-anticorps, peut alors être observée rlans les
cellules sous
lumière ultra-violette .
..\\insi, dans
les cellules témoins,
nous n'avons
déc?lé aucune fluorescence,
puisque les antigènes VIraux
étant absents de ces cellules la réaction antigène-anti-
corps n'a pu avoir lieu.
En revanche,
dans les cellules infectées, nous
avons obtenu une fluorescence dans
le cytoplasme des cel-
lules
(P13nche XVII fig.bD).
Aucune fluorescence n'a été
notée à l'intérieur du noyau des cellules. Ceci confirme
ce que nous savions déjà,
à savoir le développement uni-
quement intracytoplasmique du Birnavirus.
Dans certains cytoplasmes, on observe distinc-
tement des petites masses très fluorescentes qui peuvent
être réparties dans le cytoplasme ou situées à proximité
de la membrane plasmique
(PlancheXVIl,fig.60 ). Plus rare.."
ment, elles sont observées aux alentours du noyau. Ces
masses représentent vraisemblablement des plages virogè-
nes ou des accumulations de virus, comme nous en avons
observé en microscopie électronique.
De plus, nous avons fréquemment nor~ autour
des noyaux.
une vive fluorescence formant un halo périnu-
clé air e
(P l an che XVl l,
fig. ô 0 ). Ce der nie r est par tic u .",
lièrement net dans les cellules infectées groupées en amas,
Une fluorescence dans le cytoplasme tout en-
tier des cellules BF
infectées avec le virus du Mollusque
Z
hivalve Tellina tenuij,
a été observée par HILL (1976b).

---

_
1 11]
_
et U\\DERIVOOD et coll.,
(1977).
Ces derniers rapportent
a us s i l a p ré se nce de g 1 0 bu le s in t racytopla sm-iq1J~eç in tens é-
ment ,.::olorés.
HEDRJCK et coll.,
(1978) ont aussi observé une
fluorescence généralisée mais limitée au cytoplasme de
celllJles STE-1:57,
après infection avec le virus de la Né-
~rose Pancréatique Infectieuse
(NPI).
Ils rapportent la
présence de globules cytoplasmiques semblables à ceux obser-
vés par PIPER et coll.,
(1973) et TU et coll.,
(1974) avec
le même virus.
PIPER et coll.,
(1973)
indiquent qu'il est
possible de détecter le virus de la NPI dès quatre heures
après infection des cellules mais
ils attribuent la faible
fluorescence autour des noyaux à une fluorescence parasite
relative a la dégradation des ce:l~le5. p~: contre pour
SPENDLOVE et coll.,
(1963)
le halo périnucléaire observé
en immunofluorescence dans les cellules HeLa L.
infect§es
par le Réovirus :5 tradul[ une étape ~ê :-éplication da~<:
le r:ycle de développement du virus.
Peut-être pourrions-nous associer la fluores-
cence notée à la périphérie des noyaux,
des cellules BF Z
à un phénomène
identique à celui décrit par SPENDLOVE et
coll.,
(1963). D'autant que de nombreux noyaux dans les
cellules
infectées par le Birnavirus de M.
depu~ato~,
ont
montré une brillante fluorescence après coloration à
l'acridine orange.
Il serait alors probable que ces zones perl-
nucléaires que nous avons observé dans les cellules BF Z
infectées, correspondent à du matériel viral induit par
le noyau. C'est sans doute à partir de ce matériel nu-
cléaire et protéjnique que s'effectuerait la morphogénèse
virale.

---

-
1 i i -
!3/ :':ETr~CTIO\\
DU VIRUS PAR L-\\ SCI~TILL-\\-:- ;-.:. :"'=QUIDE CHEZ--
Afin de suivre
la distributio~
:"-rus chez le
cr~be, et de tenter de le localiser da~s s~s divers orga-
nes,
nous avons
inoculé aux animaux dL:
:ir-..:s purifié préa-
lablement marqué à
l'uridine tritiée
(::..:
uridine).
1.
Inoculation des crabes M.
d~pu~~~o~
Une suspensIon virale purifiée de
10 ul corres-
nonJant il 3'1~C;o impulsions/mn/inoculum a été injectée à
chJque crabe.
au niveau de
l'articulation patte-thorax.
Vingt-quatre heures,
soixante-douze heures,
cinq jours
et huit jours après l'injection,
les crabes ont été sacri-
fiés.
Leurs organes
(branchies,
hépatopancréas,
intestin
postérieur) et l'hémolymphe ont été prélevés et analysés
au scintillateur liquide de manière à déterminer la quan-
tité de radioactivité qu'ils contenaient.
Cette radioactivité est exprimée en désintégrations/mn/mg
Pour chaque expérience,
trois à six crabes ont été analy-
sés,
et c'est la moyenne de ces analyses que nous repor-
tons dans nos résultats.
Distribution du VIrus che: M.
d~pu4a~o4
au
c~urs du temps.
L'étudedela radio-.activité au niveau de l'hémo-
l~mphe, des branchies, de l'hépatopancréas et de l'intes-
tin postérieur des animaux expérimentés. nous renseigne

---

1 12
-
sur
la distribution du VIrus,
en fonction du temps,
dans ces différents organes.
Hémolymphe :
Dans l'hémolymphe nous constatons qu'il y a une
chute d'abord importante dela Tadic-activitê entre 24 h.
et 72 h ,
pUIS celle-ci devient progressive à partir du
troisième Jour (Planche XVIII,
fig.6~). Ce scr:éma semble
correspondre à une distribution classique des viric~s
qui véhiculés par l'hémolymphe
, sont acheminés vers les
organes du crabe.
Intestin postérieur:
Dès les premières vingt-quatre heures, on cons-
tate que la radio-ac(ivité est très élevée au niveau de

---

1 1 3 -
l'intestin postérieur de M.
dcpu~a~o~.
Une chute est en-
registrée jusqu'au cinquième jour, mais elle est SUIVIe
par une remontée de sa valeur, sensiblement proche de
celle du troisième jour.
Il y aurait probablement
élimination du virus dans les vingt-quatre premières heu~
res,
puis stockage dans l'intestin postérieur à partir
du huitième jour
(Plar:che
XVIII.
f i g .
61)
Mais il aurait été certainement intéressant de connal-
tre la quantité de radio-activité présente dans l'organe
avant 24 h. de manière à savoir si l'élimination des vi~
rIons se fait peu de temps après l'inocula~ion, ou au con-
traire, après les 24 premières heures.
Branchies
:
r-~~~~:-------1--;~-~~---r--;;-~~-1---~-~~-1---~-~~--1
~-----------------~----------~--------~--------~---------~
Nombre cl 1 animaux
i
6
!
5
5
1
3
1
/par lot
. I !
, 1
.
:
1
I------------------,---------~--------- --------~---------1
!Désintégrations/·
: !
1
!
J
1
-
1
1
::~::
~~~~
-
~~~~_l ~~~~_J ~~~~ __ J
Peu de radio-activité se retrouve au niveau des
branchies et cela dès vingt-quatre heures après l'injec-
tion. Une chute progressive est enregistrée jusqu'au hui-
tième jour. On doit noter l'allure en palier (Planche XVIII,
fig.61)
de la distribution des virions dans les branchies
correspondant probablement à un rejet progressif des par-
ticules dans le milieu extérieur par cet organe.
sr

---

t:' L.\\ \\ C-I E \\ VII l
Figure 61
Distribution des 3irnavirus marqués ~ l'uridine
'-
tri t iée .:lU cours du temps che:::'·-· --
.. -::.
~"~.~;...
·~·'--.,Il

---

a t/ons /mll /l11g
Oesll1tegr
/
/
40
30
\\
~,,
Intestin
,,
pottterieur
,,,,
\\ ,,
\\ ,
10
,,
\\
\\ ,
tl..
'-1- 1- .... 1:-
-
r-~1=:"'_-. __0... 1 , ... --
Hê'patüpCln.:.eas
- " .
--,--
----~
1 - 1 - 1 - 1 - 1 -
h
'......... ,--:-
- -~.,_k-::...
'_'''1-1-1
-- --_".. -0 Hemolymp e
.................... .-0--._._._._._. -.-._._. -~Branchies
l_-~--"""'--j----'------rS----'-------'--~8~=:TPS(j)
@
3

---

1 14_
ilépatopancréas
:
-1- - - - - - - - - -
1
-r--------r-------- -------
, - -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1
i
-
Ternp -
-- --- --- -- l '4- LI
-; ')
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1 : : >
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1 .
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~~~~;;-~;~~~~~~;--i---~------l----~----r---~-------~-- 1
L
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1
I
------------------~----------ï---------:
l
--------
!
,par lot
.
;
------~
Désintégrations /
i
:
i
_
1
!::~~:_--
l__~~~~ j ~~~~__l__~~~~
~~~~J
Dans
l'hépatopancréas,
la radio-activité faible
dès les premières vingt-quatre heures,
décroît suivant un
schéma semblable à ce qui se passe au niveau des branchies
(Planche XVIII,
fig.61).
On peut déduire que l'hépato-
uancréas n'est pas l'organe cible du virus et qu'il s'y
trouve acheminé grâce au flux de l'hémolymphe.
J
Evolution du rapport de la radio-activité de
l'organe sur la radio-activité de l'hémolymphe
au cours du temps chez Ma~~opipu~ depu~a~o~
L'étude du rapport de la radio-activité d'un gram-
me d'organe par radioactivité d'un millilitre d'hémolym-
phe renseigne de façon précise sur le degré de fixation
de
l'élément marqué.
Ici.
il s'agit donc de la fixation
globale dl? vinls.
Il
y a fixation lorsque
le rapport est
supérieur à 1.

---

1 1 5 -
~
Moyenne
~~
écarts-types.
L'examen de ces rapports nous montre une fixation
importante et rapide des virus au niveau de l'intestin
postérieur de crabe. Celle-ci se manifeste nettement dès
le 3ème jour et atteint un maximum au Sème jour (Planche
XIX,
fig.62).
C'2
dernier point doit être mis en relation
avec la brusque remontée de la radio-activité enregistrée
lors de l'étude dela distribution des virions dans cet
organe.
Par contre,
au niveau de l'hépatopancréas,
la
fixation des virus est faible.
Cette fixation a
lieu tardivement, puisque le rapport de radio-activité de
l'hépatopancréas sur radio-activité de l'hémolymphe est
légèrement supérieur à
l OJ qu SOjour
après l'inoculation 4
Il n'est peut être pas exclu gu'une faible et lente ~ccu­
mulation des_ virIons se produise au sein de l'hépatopancréas
dès le 3ème jour après l'injection (Planche XIX,
fig.62).
En ce ~ui concerne les branchies, on peut dire qu'il
---
-
-- -
..-
-
n~y a pas fixation des virus à leur niveau (Planche XIX,
fig.62) .

---

-
--
- - - - - - - - - - -
Figure
62
Evolution du rapport de radioactivité d'un
gramme d'organe sur radio-activité d'un
millilitre d'hémolyrnphe che:
Il
Branchies
a:
b: Hepatopancréas
c:
Intestin postérieur
-'-

---

•
r\\ 0. ...... ,0 ~ L~ . .J 'l t e .
1
,
1
S
8

---

J 6-
De cette êtude de
la distribution et de
la fixa-
tion des virus -marqués à l'uridine trit'iée,-àu cours du
temps che: M.
depu~ato~
,
plusieurs points peuvent retenir
l'attention.
D'une part,
on peut s'interroger sur le peu de
radio-activité enregistrée.
Nous pensons que ceci est
principalement dû à la faible radio-activité de l'inocu-
lum, elle même consécutive soit à une technique de mar-
quage peu adaptée, ou alors à une production de V1rus
creux
en cours de réplication, ou encore à la purifica-
tian,
qui
dé&<;rél.de
le virus.
D'autre part,
l'uridine tritiée
OH
uridine)
ne
<:;'
i ne 1) r p 1) ra nt que cl ans
1'.'3. cid,:, 11 U C 1 p 1. q 11 ~ V j , a l 011 11 e peu t
par la scintillation liquide, mettre en évidence qu'une
fixatio~ ~~ st~ck~ge des virus, mais pas ~n développe-
ment
\\' 1. fal .
Car Sl les différences paraissent peu ou pas
significatives, quel que soit l'organe étudié au cours
du temps,
par contre,
il existe de fortes différences
entre les valeurs des rapports calculés pour l'intestin
postérieur et l'hépatopancréas d'une part et pour l'in~
testin postérieur et les branchies d'autre part.
Ce qU1 nous amène à penser que ~8 tous les cr~
ganes étudiés, c'est l'intestin postérieur qui présente
une plus grande capacité de fixation,donc de stockage
de virus. Cependant, celui-ci pourrait avoir lieu,alors
qu'une importante quantité de particules virales aurait
déjà été éliminée.

---

17-
DfSCUSSro\\ ET CO\\CLUSIO\\
Au terme de cette étude nous constatons que les
rfsult3ts obtenus apportent des confirmations et des
précisions quant au déroulement de l'infection virale
par
le Birnavirus tant ~n v~t~o sur les cellules BF"!-
qu'~n si~u chez le crabe.
Ainsi,
la coloration par l'acridine orange, et
l'immunofluorescence, nous avons confirmation du déve~
loppement
intracytoplasmique des virions.
Ces résul tats
po urraient laisser supposer une intervention possible du
noyau dans
la réplication virale.
Quant à la scintillation liquide,
qui permet
J'envisager un SCOCk:lgè J:lilS l'intestin postérieur, sur ...
tout,
et aussi Jans l'llépatopancréas,
... vLiS po,r;;:;:-:.s dire
qu'elle vient renforcer les observations faites en histo
et cytopathologie,
à savoir une désorganisation du connec-
tif,
dû probablement à la présence des virus.

---

_ 1 1 8 _
DIS C U S S ION
&
CON C LUS ION
G E N E R ALE
Le Vlrus que nous avons isolé sur les cultures
cellulaires BF Z' et provenant de broyats d'organes du Crus-
tacé décapode Ma~~opipU6 depu~ato~ est une particule nue
icosaédrique, mesurant 70 nm de dia~ètre. Ces caractéristi-
ques morphologiques ont fait que nous l'avons comparé à la
particule P du syndrôme viral S~P du crabe. Mais san étude
a révélé qu'il est différent du virus P. Sa capside, en
effet,
formée d'une seule couche de prot~ines et composée
de deux polypeptides de poids moléculaire 40 et ï2.~J3 Jâl-
tons entoure l'acide nucléique qui est de l'ARN bicaténai-
re,
bisegmenté.
Ces résultats nous ont permis de rapprocher la
particule isolée sur les cellules BF Z' du nouveau groupe de
virus,
les Birnavirus (DOBOS et coll., 1979), et plus par-
ticulièrement des Birnavirus aquatiques (Mac DONALD et
GOWER,
1981).
Cette parenté avec les Birnavirus est confirmée
par l'étude sérologique qui montre l'existence de relations
antigéniques entre le virus de M.
depu~ato~ et celui de la
Telline , Tellina tenui6
. Bien que, au niveau de la tail-
le , le virus du crabe semble plutôt proche du virus de
,\\
~
la Chatte de l'Est ou
Golden shinner
(PLUMB et coll.,
1979) .

---

-
1 1 9 -
Le Vlrus se développe ~n vi~~o, sur les cul-
tures cellulaires BF Z' en provoquant un effet cytopathogène
caractérisé par la formation de plages de lyse, qui abou-
tissent en trois jours à la dégénérescence des cultures. La
virogénèse s'effectue dans le cytoplasme des cellules et en-
traîne une pycnose nucléaire.
Le développement viral se fait
soit sous forme de particules dispersées dans le cytoplasme,
soit sous forme groupée, mais il s'achève en général, en
formant des plages paracristallines où les virions s'orga-
nisent en figure géométrique. Ces plages peuvent être révé-
lées par des techniques de fluorescence, notamment l'acridine
orange ou l'immunofluorescence.
Au cours de la réplication de cette particule,il
v a formation de structures tubulaires rectilignes de diamè-
tre variable et de petites particules icosaédriques
de 18
à
22 nm de diamètre .
L'origine de ces éléments est incertaine à l'heure actuelle
mais les petits virions ont souvent été assimilés dans la
littérature à des Picornavirus
(CHO et coll., 1969; CERI~I
et ~1ALSBERGER, 1965).
Sur le plan biologique, nous avons démontré que
le Birnavirus de M,
depa~a~o~ se réplique SUT différentes
lignées cellulaires, en donnant lieu à un effet cytopathogè-
ne variable en fonction du temps et de la culture cellulaire
utilisée. Ain~i, si la lignée BF:> est bien plus réceptive
que les lignées SBL et RTG 7 ,
la lignée FHM semble être ré~
t..
fractaire à la réplication du virus.
Du point de vue pathologique, ce virus n'induit
pas de graves mortalités chez les animaux expérimentalement
infectés, et il n'entraîne pas non pfus de symptômes ou
de pathologie nette chez les animaux. Cependant, nous avons
démontré qu'il persiste chez les crabes au niveau de certains

---

-
120 -
organ~s. Un marquage radio-actif à l'uridine tritiée a per-
mis d'établir que les virus sont dans un premier temps mas-
sivement éliminés, PU1S stockés surtout au niveau de l'in-
testin postérieur. Dans nos conditions d'expérimentation,
il n'y a pas eu pathogénécité et peut-être pourrions-nous
mettre ce fait en relation avec le lieu de stockage des vi-
rus.
Nous devons aussi faire remarquer, comme l'ont avancé
DORSON et coll.
(1975) que les particules virales ont peut-
être acquis une sensibilité à un facteur neutralisant après
passage sur cultures cellulaires, et donc que leur pouvoir
pathogène se soit ainsi trouvé inhibé.
Quoi qu'il en soit,
l'existence du Birnavirus
c~~= lp crabe, en plus des virus S et P met en avant le
côté multiple de cette affection. On peut aussi s'interro-
ger sur la 5~r~!e d'un animal,
infecté par trois virus dif-
férents ~~ s~r !e ~écanisme facilitant la persistance de ces
viroses complexes.
Enfin, ces résultats montrent l'isolement d'un
agent viral provenant d'un Crustacé décapode MaQ~opipu~
de.pu~a;to~, à l'aide d'unel_ignée
cell;ulaire de Poissons.
Ils
démontrent donc la possibilité de mettre en évidence un vi~
rus d'Invertébré marin grâce à un système cellulaire de
Vertébré.
Dans nos conditions expérimentales, la pathogé-
nécité du Birnavirus vis à vis du crabe n'a pu être éta-
blie, mais la persistance du virus dans les tissus de
l'hôte, ainsi qu'une possibilité de stockage-a été prouvée.
On peut alors s'interroger sur le rôle éventuel de réservoir
ou de vecteur de virus que pourraient jouer les Invertébrés
dont M.
depu~ato~
dans le milieu marin.

---

-
121-
Il serait donc intéressant dans les perspectives
furures de tester la pathogénécité du Birnavirus sur d'au-
tres espèces marines afin d'étudier l'impact qu'il pourrait
avoir sur celles-ci.
Les Birnavirus sont des agents à large spectre
d'hôtes, .pulsque ces virus ont été retrouvés aussi bien
chez des Vertébrés à sang chaud et froid que chez des In-
vertébrés. Mais les relations épizootiologiques entre les
différente_s "Birnaviroses"
ne sont pas touj our s é ta bl ie s. Pour
notre part,
nous envisageons d'entreprendre une étude ul-
trastructurale des ovaires et des oeufs des crabes, de maniè-
re à déterminer si une transmission verticale est à prendre
en compte ~ans la distribution du virus parmi la population
de ce crabe.
D'autre part, en complément à la localisation de
la particule virale par la scintillation liquide,
il seraiL
souhaitable de mettre en oeuvre une technique de comptage
de virus destinée à vérifier s'il y a multiplication ou non
du Birnavirus dans les tissus du crabe.
On comprend donc l'importance de ces recherches
qUI,
grâce à la culture ce~lulaire, permettent de mettre en
évidence des interactions virales entre différentes espèces
dans le biotope marin, pour lequel les phénomènes épidémio-
logiques sont encore,à l'heure actuelle,mal connus.

---

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I.a caractérisation biophy~,lque et
biochimique du virus
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isolé montre 'son arpartenance ,lU groupe des Birnavlrus.
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La virulence de
l' ;lgent,:a été
testée sur difffrente!
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Virus,
Mic';opiflfI6
depu!(a.totr.,
Cultures cellu-
laires de l'ai ;sons,
Virulence, Microscopie
1
électroni(l'le,
1:lu{îrCSCence, "lJridine triti~e
lH
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