~

J
t!
THÈSE
1
présentée à
L'UNIVERSITÉ SCIENTIFIQUE, TECHNOLOGIQUE ET MÉDICALE
DE GRENOBLE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L'U.S.T.M.G.
MENTION BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE
GÉNÉTIQUE DE LA FIXATION D'AZOTE
CHEZ LA BACTÉRIE Rhodobacter capsuJatus :
CLONAGE ET CARACTÉRISATION
D'UN GÈNE DE TYPE nifA.
Soutenue le 15 septembre 1986, devant la Commission d'Examen:
JURY
Président:
M.
R. MACHE
Examinateurs :
Mme P.-M. VIGNAIS
MM. J.-P. AUBERT
R. BARDIN
J.-C. WILLISON

Le travaiL présenté dans aette thèse a été réaLisé dans Le Laboratoire
de Bioahimie Miarobienne (Département de Reaherahe FondamentaLe) du Centre
d'Etudes NuaLéaires de GrenobLe, sous La direation de Mme PauLette M; VIGNAIS,
Direateur de Reaherahesau CNRS; Je La remeraie très sinaèrement de m'avoir
aaaueiLLi dans son équipe et de L'énorme soutien qu'eLLe m'a apporté tout au
Long de aes années de préparation.
Je suis partiauLièrement reaonnaissant au Dr John Co' WILLISON qui a
dirigé ae travaiL, pour La Liberté et La aonfianae qu'iL m'a aaaordées et pour
ses préaieux aonseiLs et enaouragements;
Je remeraie Monsieur Le Professeur Régis MACHE d'avoir bien vouLu
aaaepter La Présidenae de aette aommission d'Examen, ainsi que Messieurs Les
Professeurs Jean-PauL AUBERT et René BARDIN d'avoir aaaepté de juger ae
travaiL.
J'adresse aussi partiauLièrement mes remeraiements à Mmes JaaqueLine
BOYER et SyLvie SALANON pour Leurs soins attentifs dans La daatyLographie de
ae manusarit.
Enfin, j'assoaie dans un même témoignage de reaonnaissanae toutes Les
personnes des Laboratoires de Bioahimie Miarobienne et Bioahimie auprès
desqueLLes j'ai trouvé gentiLLesse et assistanae , ainsi ~e toutes Les
personnes qui, de près ou de Loin, ont partiaipé à L'éLaboration de ae
travaiL;

A La mémoire de mon Père, Joseph ATSOUTSOU
Que son corps repose en Paix.

SOMMAIRE
CHAPITRE l - INTRODUCTION
1- La fixation biologique de l'azote ••.... , ........•. , ...•.•.....•
1
1-1 Le cycle de l'azote ......••..•.... ,., .•.........••.•.•.•
1
1-2 Les organismes fixateurs d'azote .• ' ...••.•.••.......•.•.
1
1-3 La ni trogénase
2
w



































2- Les gènes nif' .•..•...........•.........• , ....•........•...•••••
3
2-1 Les gènes nif' de K. pneu.oniae .•..•..••••••..•••••••••..
3
2-2 Organisation des gènes nif' chez les autres
organismes fixateurs d'azote ..•..••.•••.••••..••••.••...
8
3- Rhodobacter capsulatus ••••..••.••..•..•..•.........•......•••••
10
3-1 Physiologie et taxonomie des bactéries pourpres non
sulfureuses .............................................
10
3-2 Fixation d'azote: physiologie et régulation ••••••••••..
11
3-3 Etudes génétiques chez R. capsulatus .•.
13
T
. - . .











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CHAPITRE II - IlATEBIEL f t IIETfIODES
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" ....
1- Souches et plasmides utilisés •.••••.••.• ~\\••••.•...,. : ~>1
17
1-1 Souches dt K. coli
~
C.u';le .n~••..•.:-. • • . •
17
"Ç.
, '"
.
1-2 Souches de R. capsulatus .•..•..•.. ~••.•.....•..••••.
18
1-3 Les plasmides
"
19
2- Milieux d~ culture et conditions de croissance ..••..•••.....•..
19
2-1 Milieux de culture dIE. coli
19
2-2 Milieux de culture de R. capsulatus •••••••.•••••••••.•..
20
2-3 Conditions de croissance de R. capsulatus •••.••.•••..••.
22
3- Techniques de génétique ••.••..•.••..••••.••.••.••.•..•..•.••• :.
22
3-1 Mutagénèse ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
22
3-2 Conjugaison entre les souches de R. capsulatus ••••••••••
23
3-3 Complémentation par conjugaison ••••••..•••••••.••••.••..
23
4- Les techniques biochimiques relatives aux protéines •••••.••.•..
23
4-1 Dosage des protéines •••••••••.••.••.••••••••••••.•••••••
23
4-2 Méthodes d'étude de la nitrogénase et des produits nif' ..
24
4-2-1 Dosage de la nitrogénase in vivo chez
R. capsulatus •••..••••.••••.••••..••.••••••.•.
24
4-2-2 Détection de la nitrogénase dans les souches
de R. capsulatus par immunodiffusion
24
4-2-3 Dérepression de la nitrogénase ..••••....•..•..
25

4-2-4 Détection de la synthèse de la nitrogénase de
R.c8psulatus dans les souches d'E.coli par
des immunoblots
e
_
25
0
CI
..
..
..
..
..
..
4-2-5 Cinétique d'apparition des produits et des
gènes nif chez R.c8psulatus •••••..•..•••••••••••
26
4-3 Analyse des protéines par électrophorèse sur gel •.•.•...
26
4-3-1 Séparation des protéines en électrophorèse
sur gel de polyacrylamide contenant du SDS
26
4-3-2 Séparation des. protéines sur gel de
polyacrylamide en double dimension •••••••••••.
27
4-3-3 Fixation, coloration et décoloration des
protéines sur gel de polyacrylamide
contenant du SDS
..
27
4-4 Autoradiographie
27
5- Techniques de biologie moléculaire •••••••••••••••••••••••••••••
28
5-1 Electrophorèse des acides nucléiques :
électrophorèse de l'ADN sur gel d'agarose •••••••••••••••
28
5-2 Purification des acides nucléiques •••.••••••••••••••••••
28
5-2-1 Purification de l'ADN plasmidique •••••••••••.•
28
5-2-2 Purification de l'ADN chromosomique de
R. capsulatus
..
30
5-3 Transformation d'E. coli par des plasmides •••.••.•••••••
31
5-3-1 Tampons utilisés pour la transformation ••••••.
31
5-3-2 Transformation par la méthode au CaCl
••.•••••
31
2
5-3-3 Transformation selon HANAHAN •••••••••••••••••.
31
5-4 Préparation des fragments de restriction ••••••.••.••••••
32
5-4-1 Digestion de l'ADN avec des enzymes de
restriction
32
CI
..
5-4-2 Elution des fragments d'ADN sur papier DE-81 ..
32
5-5 Clonage
..
33
5-5-1 Préparation des ADN . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
5-5-2 Ligature du plasmide avec l'ADN passager ••.•••
33
5-6 Construction de la banque de gènes de R. c8psulatus
33
5-6-1 Préparation des fragments de 10 à 20kb
d'ADN de RD caps'U1atus
34
Cl
0
..
5-6-2 Préparation du plasmide vecteur de clonage .••.
34
5-7 Utilisation de la nucléase Bal31 •••.••••••••.•.•••••.••.
35
5-7-1 Digestion avec
Bal31 ...•••....•..•...•.••.•
35

5-7-2 Clonage utilisant
Bal.31 ••••••••••••••••••••
35
5-8 Hybridation ••.••..•.••••••.••••••..•.••.••..•...••••.•••
35
5-8-1 Electrotransfert ••.••.••..•..•..••.••..•.•••••
35
5-8-2 Nick translation ...•.•.••..........•.••••..•..
36
5-8-3 Hybridation ••••••..•••.••.••..•.••••...•••••••
37
5-9 Expression des gènes clonés •••.•..•.••.••.••••••.•.•••..
37
5-9-1 Les minicellules ••..•.••..••.••..•......••.••.
37
5-9-2 Les maxicellules •••••••••••.•.•.•...••..•..•..
39
5-9-3 Les plasmides d'expression •••.•••••••••••••.••
40
CHAPI'l'BE III -
LOCALISATION DES IlUTATIONS NIF SUR LE CHROIIOSOIIE DE
R. CAPSULATUS
1- Isolement et caractérisation de mutants Nif- .••.••.•..•.•..••••
41
2- Localisation des mutations n1~ sur le chromosome de
R. capsula'b1s ••..•..•.•..••..•..••....•.••.•... •..•.••..•.•.•••
42
3- Caractérisation des mutants Nif- •••••..•.••.•••.•••.••••.•.••••
46
4- Discussion ••.••.•...•.••.••.•••••...•.•......•.•.....•.........
49
5- Canelusion ••.••.••••••••••••••••••••.••.••.•••..•.••.••••.•.•..
53
CHAPI'l'BE IV -
CONSTRUCTION D'UNE BANQUE DE GENES DE R. CAPSULATUS
B10 ET
RECHERCHE D'UN FRAGIID'l' CONTENANT LE GENE
DE TYPE NIFA
1- Banque de genes ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
55
2- Recherche du fragment contenant le gène type n1~A •••.••••••••••
57
3- Carte de restriction du fragment et localisation de la
partie qui complémente la mutation de type n1~A ••..•..••••..•..
59
4- Hybridation de l'ADN de R. capsulatua avec les gènes n1~
de K. pn~ae •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
63
5- Utilisation de l'exonucléase Bal31 pour la localisation
précise de la partie d'ADN de K. pneumoniae s'hybridant
avec le fragment EcoRI de 2,6kb de R. capsulatua ..•......•.....
67
6- Discussion •.•••••••••.•••••.••...•.••••..••.••••..••••...••.•..
70
7- Conclusion •..•••••••.•••••••••••••..••••••.•••.••.•..••..•••..•
72
CHAPI'l'BE V - EXPRESSION DES DIFFERENTS FRAGMENTS CLONES D'ADN
DE R. CAPSULATUS DANS LES SYSTEMES D'EXPRESSION
DES GENES D' E. COLI
1- Les minicellules ..••••••••...•.••.•.•.•.....••......•••.....•••
75
2- Les maxicellules •.•••.•••••.••.••••....•.•..•..•..••.•....•...•
80

3- Les vecteurs d'expression ••..••.•.••.
80
CI
• • •
O
• • • • • • • • •
O
• • • • • • • •
4- Les immunoblots c. ....
83
O C l O O I D O I l O O
• • • • • • • •
O
85
o . o o . g e O O O
..
I l I l C l O O O • • • • • •
oo
• • •
o . a
• •
o . a
• • • • • • • OID
• • • •
O
• • •
5- Discussion
86
. O
..
O O O O O O O O O O D I D . O
• • • • • • •
O . O
• • • • • • • •
O . O
• • • • • •
I > . O
• •
O O . 1 l
6- Conclusion
CHAPITRE VI - ETUDE DES PRODUITS NIF DE R. CAPSULATUS
1- Cinétique de réduction de l'acétylène
87
• • •
0
• • •
l l e
• • • • • • • • • • • • • • • • •
2- Cinétique d'apparition des produits nif ••....•••..•.........•..
89
3- Analyse des protéines nif sur gel en double dimension •••••.••••
94
4- Discussion .
95
CI
..
a CI .... CI .. CI CI CI CI • • CI CI CI • • CI • • • • • CI CI . . . . . . . . CI CI •
CI

CI
CI
CI

CI

ID
CI
CI

CI
CI
CI
CI
ID
5- Conclusion
97
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES
1- Organisation des gènes nif chez R. capsulatus
99
• •
CI
CI

CI
CI

CI
. . .
CI

CI
CI
CI
. . .
2- Régulation des gènes nif chez Ro capsulatus
100
CI
CI
CI
. . .
CI
• •
CI
CI

CI

CIo
• •
CI
CI
CI
..
3- Expression des gènes nif chez R. capsulatus
102
CI
• • • •
CI
. . . .
CI
CI
• •
CI
CI

CI
CI
CI
CI
CI
BIBLIOGRAPHIE oo.ooooo."o.oOOlitoa".Cl •••••••••••••••• O •••• O •••• O ••••• 105

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
======
FIGURES
I-1 Cycle de l'azote dans la biosphère •••••••••••••••••••••••••.
1
I-2 Carte des gènes ni~ de K. pn~iae •••••••••••••••••••••••.
4
I-3 Modèle de la régulation ni~ dans K. pneumoniae •••••••••••••.
8
I-4 Contenus in vivo de la nitrogénase et vitesses de
croissance sur N des bactéries pourpres non sulfureuses
11
2
III-1 Groupes de mutations ni~ sur le chromosome de
R. capsulatus
45
III-2 Caractérisation des mutants Nif- de R. capsulatus par
immunodi ffusion
47
III-3 Carte circulaire du chromosome de R. capsulatus montrant
l'emplacement des différents groupes de gènes ni~ •••••••••..
51
IV-1 Fractions d'ADN de R. capsulatus obtenues sur gradient
de saccharose
56
IV-2 Regroupement des différentes fractions du gradient en
4 fractions
56
IV-3 Gel d'agarose montrant la digestion par EcoRI du
plasmide pGA10 et ses dérivés •••••••••••••••••••••••••••••..
60
IV-4 Cartes de restriction du plasmide pGA10 et ses dérivés •••••.
61
IV-5 Carte de restriction du plasmide pGA10 montrant la
localisation du gène de type ni~A ..•.•••••.•••.•••.•.•••.•••
63
IV-6 Carte de restriciton du plasmide pMC71A •••.••••••••••••••••.
64
IV-7 Hybridation des ADN de R. capsulatus avec les gènes ni~
de K. pn~niae
65
IV-8 Digestion du plasmide pMC71A avec Bal31 et hybridation
avec le fragment EcoRI de 2,6kb de R. capsulatus ••••••••••••
68
IV-9 Localisation du gène de type nifB de R. capsulatus •.••..••••
69
V-1 Représentation des plasmides pGA16, pGA17 et pGA18 ••••••••••
76
V-2 Autoradiographie des protéines issues des minicellules
contenant les plasmides portant des fragments d'ADN de
R • capsulatus
79
V-3 Autoradiographie des immunoblots des protéines de
R. capsulatus B10 et des souches d'E •. coli contenant
les plasmides portant différents gènes de R. capsulatus
84

V1-1 Cinétique de réduction d'acétylène dans les souches de
Re capsulatus
e ••••••••••• e ••••••••••••••• "
88
0
0
0

Cl

"
• •
V1-1bis Détection des protéines de la nitrogénase par
immunoélectrophorèse dans le mutant complémenté
GAlll-14 et dans la souche sauvage B10 ••••••••••••••••••••.
87bis
V1-2 Cinétique d'apparition des produits nif de R. capsulatus ••.•
91
V1-3 Cinétique de synthèse de la protéine de 52kd •••••••••••••.••
93
TABLEAUX
111-1 Récapitulatif des immunodiffusions sur les souches de
R. capsulatus
48
1V-1 Colonies obtenues à partir de la banque de gènes de
R. capsulatus B10
57
1V-2 Complémentation des mutants de type NifA- et NifH- de
Ra capsulatus par le plasmide pGA10
59
1V-3 Complémentation des mutants de type NifA- et NifH- de
R. capsulatus par des plasmides dérivés de pGA10 ••••••••••••
62
1V-4 Récapitulatif des hybridations des échantillons obtenus
du plasmide pMC71A avec Bal31 avec le fragment EcoR1
de 2,6kb d'ADN de Ro capsulatus •••••••••••••••••••••••••••••
67
V-1 Cinétique d'incorporation de la (358 ) méthionine dans
les protéines synthétisées par les plasmides contenus
dans les minicel1ules .
77
0

0
• •
41
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
V1-1 Activité N ase dans les souches de R. capsulatus ••••••••••••
88
2
V1-2 Protéines de R. capsulatus réprimées par NH + 15 mM •••.•••••
90
4

LISTE DES ABREVIATIONS
-=-=-=-=-=-=-=-
Ap.
Ampicilline
B.B.P.
Bleu de bromphénol
B.S.A.
Bovin serum albumin
Cm
Chloramphénicol
DMSO
Diméthylsulfoxide
DTE
1,4-Dithioérythreit
DTT
Dithiothreit
EDTA
Acide éthylène diaminetétraacétique
EMS
Ethylméthane sulfonate
IPTG
Isopropyl 6-D-thiogalactoside
Km
Kanamycine
LA
Luria agar
LB
Luria broth
MAM
Méthionine assay medium
MOPS
Acide 3-(N-morpholino)-propane sulfonique
N ase
Nitrogénase
2
nif
Nitrogen fixation
nov
novobiocine
NTG
N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
ntr
Nitrogen regulation
PBS
Phosphate buffer salt
RCV
Rhodopseudomonas capsulata V
rif
Rifampicine
SDS
Sodium dodecyl sulfate
Sm ou str
Streptomycine
Sp.
Spectinomycine
SSPE
Saline sodium phosphate EDTA
TBE
Tris-borate EDTA
Tc
Tétracycline
TCA
Acide trichloroacétique
TE
Tris-EDTA
TEMED
Tétraméthyl éthylènediamine
YPS
Yeast peptone salts

RESUME DE LA THESE
-=;-=-=-==-=-:-

RESUME DE LA THESE
-=-=-=-=-=-=-
L:isolement des mutants Nif- (incapables de fixer l'azote atmosphérique)
de R. capsulatus à l'aide du NTG ou de l'EMS a permis de faire des études de
transfert des gènes par conjugaison entre les souches de R. capsulatus, en
utilisant le plasmide pTH10. Ces études nous ont permis de localiser au moins
trois groupes de gènes nif dans le chromosome de R. capsulatus. Les mutants
Nif- de chaque groupe ont été caractérisés immunologiquement pour la présence
ou l'absence des deux composants de la nitrogénase. Le groupe l comprend les
mutants ne sy~thétisant pas la protéine à fer (composant II) et des mutants
auxquels il manque les deux composants de la nitrogénase (mutants de type
NifA-). Les mutations du groupe l portent donc sur le gène de structure nifH
et sur le gène de type nifA.
Par construction d'une banque génomique de R. capsulatus B10 dans le
site EcoRI du plasmide pRK290, nous avons isolé un fragment EcoRI de 15,2kb
qui complémente le phénotype des mutants de type NifA- (RC16, RC24 et GA111)
et complémente aussi les mutants mutés dans le gène de structure nifH (RC1,
RC3 et RC8). La digestion complète de ce fragment avec EcoRI donne trois
fragments de 7,8 kb, 4,8kb et 2, 6kb. Le fragment de 7,8kb complémente tous
les mutants NifH-, le fragment de 4,8 kb complémente tous les mutants NifA- et
le fragment de 2, 6kb ne complémente aucun mutant Nif- testé.
La comparaison de la carte de restriction de ces fragments avec la carte
de restriction des gènes de structure de la nitrogénase, nous a permis de
déduire que le fragment de 7,8 kb contient les gènes de structure nifH et
nifD, le fragment adjacent de 4,8 kb contient le gène de structure nifK et le
gène de type nifA. Le gène de type nifA a été localisé dans un fragment
HindIII de 2,1 kb contenu dans le fragment de 4,8 kb. Les expériences
d'hybridation entre le fragment SalI de 2,8kb d'ADN de K. pneumoniae
(contenant les parties des gènes nifB et nifL et le gène nifA entier) et l'ADN
total de R. capsulatus B10 digéré avec EcoRI ou HindIII et les différents
fragments du fragment de 15,2kb de R. capsulatus ont permis de montrer que le
gène nifA de K. pneumoniae ne s'hybride pas avec le gène de type nifA de
R.capsulatus. Nous avons trouvé une hybridation entre le fragment de 2, 6kb de
R.capsulatus et la partie du gène nifB de K.pneumoniae. Le fragment de 15,2kb
de R.capsulatus contient donc les gènes de structure de la nitrogénase, le
gène de type nifA et le gène type nifB dont l'ordre dans le fragment est le
suivant :
nifH - nifD - nifK - "nifA" - "nifB"
Les essais d'expression du gène de type nifA dans les systèmes
d'expression d'E. coli n'ont pas permis d'obtenir une protéine de
R. capsulatus détectable.
Les expériences de dérepression de la nitrogénase de R. capsulatï~ et de
marquage des protéines avec les acides aminés uniformément marqués au
C, ont
permis de montrer, par analyse des produits sur gel de polyacrylamide
contenant du SDS, qu'il existe au moins 14 protéines nif. Les mutants de type
NifA- sont dépourvus en certaines protéines nif mais pas en toutes. Les
analyses des produits nif de R. capsulatus par gel en double dimension ont
confirmé qu'il existe au moins quinze (15) protéines nif. Une protéine de 52kd
pourrait être le produit du gène de type nifA (de pl 5,15).
Mots clés: Génétique, fixation d'azote, gènes nif, gène de régulation de type
nifA.

CHAPITRE l
-
INTRODUCTION
-=-=-:-=-=-=-=-=-=-

- 1 -
CHAPITRE 1 - INTRODUCTION
-=-=-=-=-==-=-=-=-=-
1- Fixation biologique de l'azote
1.1- Le cycle de l'azote
Une grande proportion de l'azote fixé entrant dans la composition
6
de la biosphère résulte de la fixation biologique: 175.10
Tian contre
5
6
200.10
par les précipitations et 20.10
par fixation industrielle
(BURNS et HARDY, 1975). Dans la fixation biologique, l'azote est
transformé en ammoniaque, qui est assimilé en protéines, ou oxydé en
nitrate par les bactéries nitrifiantes ; le nitrate peut être
réassimilé en ammoniaque ou dissimilé en N
donnant lieu au cycle de
2
l'azote qui est montré dans la Fig. 1-1.
prot6in• •
~
flu"••
(
....i ...'n_
miDëraliatioa
assimilation
~JJ
Fig. I-1 : Le cycLe de L'azote dans La biosphère (BLONDEAU
1980).
J
1.2- Les organismes fixateurs d'azote
Les organismes fixateurs d'azote sont capables de croître avec
l'azote moléculaire comme seul substrat azoté
ce sont donc les
diazotrophes. La fixation d'azote est une aptitude réservée aux
procaryotes : les bactéries et les cyanobactéries. Les espèces
diazotrophes sont très diverses. Parmi les bactéries, on trouve

- 2 -
- les aérobies strictes : ex. genre Azotobacter,
- les anaérobies facultatives : ex. Klebsiella pneumoniae, les
bactéries photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum
rubrum) ,
- les anaérobies strictes : ex. Clostridium pasteurianum.
Très récemment, la diazotrophie a été démontrée chez des
archaebactéries méthanogènes (MURRAY et ZINDER, 1984 ; BELAY et al.,
1984). Mis à part ces bactéries qui fixent l'azote en vivant librement
dans le sol, on retrouve les bactéries du genre Rhizobium qui fixent
l'azote en vivant en symbiose avec les plantes légumineuses, aussi bien
que les Frankia qui sont des actinomycètes associés à des plantes à
fleurs. Certaines cyanobactéries fixent l'azote en association avec des
plantes (ex. Azolla), tandis que la plupart des espèces fixent l'azote
à l'état libre.
1.3- Lanitrogénase (N ase)
2
1.3.1- Mécanismes catalytiques
L'enzyme responsable de la réduction de l'azote atmosphérique en
ammoniaque est la nitrogénase. Cet enzyme catalyse la réaction suivante
+
-
N
+ 8H
+ 8e
+ nMgATP,
~) 2NH
+ H
+ nMgADP + nPi
2
3
2
La réaction nécessite de l'énergie sous forme d'ATP et des électrons à
bas potentiel. Les donneurs d'électrons physiologiques sont souvent les
ferrédoxines et les flavodoxines qui ont un potentiel redox inférieur à
-400mV (MORTENSON et THORNELEY, 1979). Le dithionite est habituellement
utilisé comme réducteur chimique dans les expériences in vitro.
La nitrogénase catalyse aussi la réduction des composés à triple
liaison autre que l'azote moléculaire, comme le cyanure et l'acétylène.
La réduction d'acétylène en éthylène est le plus souvent utilisé pour
le dosage de l'activité nitrogénase par chromatographie gazeuse
(DILWORTH, 1966). La nitrogénase catalyse aussi la formation
d'hydrogène moléculaire à partir des protons de l'eau; ceci est une
propriété intrinsèque de la nitrogénase (MORTENSON, 1978). En présence
de N , au moins 25% du flux des électrons est utilisé pour la réduction
2
des protons (BURRIS, 1984). En l'absence de N
(ou d'autres accepteurs
2
d'électrons), la totalité des électrons sert à produire de l'hydrogène.

- 3 -
1.3.2- Caractéristiques moléculaires
La nitrogénase a été isoléede plusieurs bactéries (ex.
Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum et K. pneumoniae. La
sensibilité de la nitrogénase à l'oxygène rend sa purification
difficile. Toutes les nitrogénases isolées sont très similaires
(composition en acides aminés, structure quaternaire et fonctionnement)
(WINTER et BURRIS, 1976 ; MORTENSON et THORNELEY, 1979).
L'enzyme est formé de deux composants: le composant l appelé
aussi protéine à molybdène-fer (MoFe) ou dinitrogénase et le composant
II qui s'appelle aussi protéine à Fe ou dinitrogénase réductase.
Séparément, chacun de ces composants est inactif. Les deux composants
forment 'ensemble le complexe nitrogénase actif.
Le composant l est un tétramère de forme ~2a2' de masse
moléculaire allant de 200 à 250 000. Il contient deux atomes de
molybdène, environ 30 atomes de Fe et 30 atomes de soufre inorganique
présents sous forme de sulfure (S2-). Seize atomes des 30Fe sont
associés avec les S2- en 4 agrégats cubiques 14Fe-4SI. Les atomes des
métaux restants sont arrangés en deux copies d'un cofacteur, appelé
cofacteur à molybdène-fer (FeMoco) avec une stoechiométrie minimale de
MoFe S _
(NELSON et al., 1983). Le FeMoco est pensé être le site
6 8 9
actif, site de liaison du substrat et de réduction.
Le composant II est un dimère d'environ 60 000 de masse
moléculaire. Les deux sous-unités sont identiques et contiennent un
agrégat 14Fe-4SI qui forme un pont entre les deux sous-unités. Le
composant II présente deux sites différents' pour la fixation d'ATP-Mg
d'une part, et d'AnP-Mg d'autre part. Le composant II est beaucoup plus
sensible à l'oxygène que le composant 1. Le temps de demie-vie dans
l'air est de
30 secondes.
2- Les gènes nif
2.1- Les gènes nif de K. pneumoniae
2.1.1- Organisation des gènes nif
Les gènes codant pour des protéines responsables de la fixation

- 4 -
d'azote sont appelés les gènes nif (nitrogen fixation). Les gènes nif
ont été étudiés en détail chez la bactérie K. pneumoniae. Chez cette
bactérie, les systèmes d'études génétiques utilisés chez E. coli sont
applicables car elle est taxonomiquement proche d'E. coli. Chez
K. pneumoniae, on a montré que les gènes nif sont groupés en un seul
endroit du chromosome situé à côté de l'opéron his (STRE1CHER et al.,
1971 ; D1XON et POSTGATE. 1971). Les études montrant le groupement des
gènes nif de K. pneumoniae en un seul endroit du chromosome ont été
effectuées par complémentation en utilisant des plasmides R-primes
isolés de K pneumoniae (D1XON et al., 1977), par transduction utilisant
le phage Pl (KENNEDY, 1977) ou par l'utilisation des éléments
transposables (MERR1CK et al., 1978, 1980). Dix sept gènes nif ont été
trouvés groupés sur environ 24kb. Ces gènes sont transcrits en 7 ou 8
opérons. Les premières études ont montré que tous les gènes étaient
transcrits dans le même sens que l'opéron his. On a ensuite découvert
que deux gènes (le gène nifF et nifJ) étaient transcrits dans le sens
opposé aux autres gènes nif. L'organisation des gènes nif est montrée
dans la figure 1-2. Les gènes nif de K. pneumoniae, portés sur un
plasmide R-prime (pRD1) et transféré dans E. coli, font acquérir la
capacité de fixer l'azote chez cette bactérie (D1XON et POSTGATE,
1972) •
nitrogénase
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Fig. I-2 : Carte des gènes nif de x." pneumoniae indiquant te sens de
transcription et tes promoteurs nif (DIXON, 1984).

- 5 -
2.1.2- Fonction des gènes nif
Les composants de la nitrogénase de K pneumoniae sont appelés Kpl
pour le composant l et Kp2 pour le composant II. La nitrogénase est
codée par 3 gènes stucturaux : le gène nifH code pour le composant II,
le gène nife code pour la sous-unité a du composant l et le gène nifK
code pour la sous-unité e du composant l (DIXON et al., 1977 ; ROBERTS
et al., 1978). Le produit du gène nifM est impliqué dans la maturation
du composant II car les mutants affectés dans ce gène synthétisent le
composant II inactif (ROBERTS et al., 1978). Les mutants affectés dans
certains gènes nif affectent l'activité du composant l ; ces mutants
sont affectés dans la synthèse du FeMoco. Ce sont les mutants dans les
gènes nifB, nifN et nifE (SHAH et BRILL, 1977). Les mutants dans le
gène nifV synthétisent le cofacteur inactif (HAWKES et al., 1984). Le
produit du gène nifQ est impliqué dans l'utilisation du Mo (IMPERIAL et
al., 1984). Les produits des gènes nifS et nifU peuvent être impliqués
dans la maturation du composant l
(ROBERTS et al., 1978) mais leur
fonction précise n'est pas encore élucidée. Les produits des gènes nifJ
et nifF sont impliqués dans le transfert des électrons vers la
nitrogénase (ROBERTS et al., 1978 ; HILL et KAVANAGH, 1980). Le produit
du gène nifF est une flavodoxine (DEISTUNG et al., 1985) et le produit
du gène nifJ est une pyruvate : flavodoxine oxido réductase (SHAH et
~l., 1983). Les produits des gènes nifX et nifY ont été identifiés dans
les minicellules d'E. coli, leur fonction reste inconnue (PUHLER et
KLIPP, 1981). Les gènes nifL et nifA régulent la transcription de
chaque opéron nif. Leur rôle est discuté dans le paragraphe 2.1.3.
2.1.3- Régulation de la transcription des gènes nif
La régulation de la transcription des gènes nif chez
K. pneumoniae se fait en réponse à la concentration des ions ammonium
(NH4+) et à la tension en oxygène (TUBB et POSTGATE, 1973 ; EADY et
al., 1978). Des gènes de régulation du métabolisme azoté général (gènes
ntr) sont impliqués aussi bien que les gènes nifLA impliqués
spécifiquement dans la fixation d'azote.

- 6 -
Rôle des gènes ntr
Les gènes ntr régulent aussi bien la transcription des gènes nif
et d'autres gènes impliqués dans l'utilisation de différents substrats
azotés, comme des acides aminés. Les gènes ntr se trouvent aussi dans
des bactéries entériques non fixatrices d'azote comme E. coli ou
Salmonella typhimurium (MAGASANIK, 1982). Il existe 3 gènes ntr chez
ces bactéries. Deux gènes, ntrB et ntrC, sont contigus au gène de
structure de la glutamine synthétase (glnA) ; l'autre gène ntr est
éloigné des deux autres, c'est le gène ntrA.
Le produit du gène ntrA semble agir comme une sous-unité du
facteur(j dé l'ARN polymérase (HIRSCHMAN et al., 1985 ; MERRICK et
GIBBINS, 1985) et est nécessaire avec le produit du gène ntrC (LEONARDO
et GOLDBERG, 1980 ; De BRUIJN et AUSUBEL, 1981
ESPIN et al., 1981,
1982) pour la transcription de l'opéron nifLA , ou bien avec le produit
de nifA pour l'activation de la transcription des autres gènes nif.
Cette activation se produit dans des conditions de limitation en ions
ammonium. Le rôle du gène ntrB n'est pas très bien élucidé, mais il
semble moduler l'activité des deux autres gènes ntrA et ntrC, surtout
sur l'expression de l'opéron glnAntrBC.
Rôle des gènes nifLA
DIXON et al. (1977) ont observé que les mutations dans le gène
nifA affectent la synthèse des trois polypeptides de la nitrogénase,
suggérant que le produit du gène nifA a un rôle régulateur et agit
comme activateur positif de la transcription des gènes nif.
L'expression à partir de tous les promoteurs nif baisse
considérablement dans les mutants NifA- (ROBERTS et al., 1978). Cette
expression est rétablie par la présence en trans du gène nifA (DIXON et
al., 1980). Le produit du gène nifA, lorsqu'il est en quantité
suffisante, active son propre promoteur en l'absence du produit de ntrC
(DRUMMOND et al., 1983 ; OW et AUSUBEL, 1983). La substitution du
produit de ntrC par le produit de nifA pour l'activation du promoteur
nifLA peut être due à une grande homologie entre les gènes nifA et
ntrC. Il existe une homologie d'environ 52 à 58% sur les acides aminés
conservés en une région centrale d'environ 200 acides aminés, qui a été
déduite de la séquence nucléotidique des gènes nifA et ntrC de
K. pneumoniae. Cette grande homologie de séquence est indicative d'une
origine évolutive commune des gènes nifA et ntrC (MERRICK, 1983).

- 7 -
La structure des promoteurs nif
Comme les gènes nif, la structure des promoteurs nif a été
étudiée en détail chez K. pneumoniae (BEYNON et al., 1983 ; DRUMMOND et
al., 1983). Tous les promoteurs nif de K. pneumoniae et le promoteur du
gène glnA de deux bactéries entériques ont été séquencés. Le point de
départ de la transcription de ces promoteurs a été déterminé in vivo.
Ces promoteurs ne possèdent pas les séquences consensus -10 et -35
qu'on trouve dans les promoteurs de certains gènes d'E. coli. Tous les
promoteurs nif de K. pneumoniae ont une structure caractéristique de
26pb, localisé entre les positions -1 et -26 en amont du site
d'initiation de la transcription. Cette structure caractéristique est
-23
-10
GTGG--8bp---TTGCA---9bp---Pyr(+1).
Elle a été trouvée dans les promoteurs des gènes de structure de la
nitrogénase ou des différents gènes de régulation fix de différentes
espèces de Rhizobium (ALVAREZ-MORALES et HENNECKE, 1985).
Rôle de nifL
Le produit du gène nifL est impliqué dans la répression de la
transcription des gènes nif en présence d'oxygène. La première évidence
que la répression par l'oxygène es~ faite par un gène spécifique nif
est venue d'une analyse de souches mutantes de K. pneumoniae, dans
lesquelles la transcription des gènes de structure de la nitrogénase
était effectuée en présence d'oxygène, alors que ces gènes portaient
une mutation dans le gène nifL (HILL et al., 1981). Il a été montré par
la suite que le produit du gène nifL répond non seulement à l'oxygène,
mais intervient aussi dans la répression due à des intermédiaires
azotés (MERRICK et al., 1982). Quand le gène nifL est présent sur un
plasmide multicopies, son expression constitutive même en absence
d'oxygène inhibe la transcription nif dans des conditions de
dérepression de la nitrogénase (BUCHANAN-WOLLASTON et al., 1981 a, b ;
RIEDEL et al., 1983). Il a été proposé que le produit du gène nifL est
un antagoniste du produit de nifA qui inactive le produit de nifA
plutôt qu'il ne réprime son propre promoteur (DIXON et al., 1983). Le
modèle courant de la régulation de la transcription nif est donnée dans
la Figure 1-3 (ALVAREZ-MORALES et al., 1984).

- 8 -
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J
Fig. I-3 : ModèLe de La réguLation nif dans K. pneumoniae (ALVAREZ~ORALES et
aL., 1984).
2.2- Organisation des gènes nif chez les autres organisme
fixateurs d'azote
La découverte et l'analyse des gènes nif chez K. pneumoniae ont
apporté un outil très éfficace dans l'analyse des gènes nif chez les
autres bactéries, et surtout en ce qui concerne les gènes de structure
de la nitrogénase. Ainsi, le plasmide pSA30, qui contient les gènes de
structure de la nitrogénase de K. pneumoniae, a souvent été utilisé
comme sonde pour la reconnaissance des gènes de structure de la
nitrogénase clonés à partir d'autres bactéries.
Chez les espèces de Rhizobium, l'organisation des gènes de
structure de la nitrogénase varie, et ceci en fonction de la croissance
de l'organisme (WEINMAN et al., 1984). Les gènes de structure dans les
espèces de Rhizobium à croissance lente sont séparés et organisés en
deux opérons; cas de R. japonicum (FUHRMANN et HENNECKE, 1982
KALUZA
et al., 1983), de Bradyrhizobium japonicum (ADAMS et al., 1984
MASTERSON et al., 1985), de Rhizobium souche IRc78 (YUN et al., 1984)
et de Parasponia rhizobium souche ANU289 (WEINMAN et al., 1984). Par
contre, dans les espèces de Rhizobium à croissance rapide, les gènes de
structure de la nitrogénase sont groupés et organisés en un seul opéron
qui comporte un seul promoteur. C'est le cas de R. meliloti (ZIMMERMAN
et al., 1983 ; PUHLER et al., 1984), de R. trifolii (SCHOFIELD et al.,
1983), de R. leguminosarum (NUTI et al., 1979 ; DOWNIE et al., 1983) et
de Rhizobium ORS571 (ELMERICH et al., 1982 ; NOREL et al., 1985).

- 9 -
D'autres gènes nif chez les espèces de Rhizobium ont été clonés.
C'est le cas du gène nifB chez R. japonicum (FUHRMANN et al., 1985) qui
est localisé entre les opérons nifH et nifDK, des gènes nifB et nifA
chez R. 1eguminosarum (DOWNIE et al., 1983 ; ROSSEN et al., 1984) et
chez R. me1i1oti (BUIKEMA et al., 1985 ; AUSUBEL et al., 1985) où ils
sont contigus et sont éloignés des gènes nifHDK séparés par les gènes
de nodulation ou des gènes fix, du gène nifA de Bradyrhizobium
japonicum (ADAMS et al., 1984 ; LAMB et HENNECKE, 1986) localisé entre
les deux opérons nifH et nifDK et situé à côté du gène fixA~et du gène
nifE de Rhizobium ORS571 (NOREL et al., 1985) situé à côté de l'opéron
nifHDK. Chez ces espèces de Rhizobium, l'organisation des autres gènes
nif par rapport aux gènes nifHDK est similaire à celle de K. pneumoniae
pour le gène nifF de Rhizobium ORS571, des gènes nifB et nifA chez
R. 1eguminosarum et R. me1i1oti, en général dans les espèces à
croissance rapide. A la différence de K. pneumoniae, où les gènes nif
sont localisés sur le chromosome, chez certaines espèces de Rhizobium
comme R. leguminosarum (NUTI et al., 1979), R. meliloti (BANFALVI et
al., 1981 ; ROSENBERG et al., ~981), R. trifolii (SCHOFIELD et al.,
1983), les gènes nif sont localisés sur un mégaplasmide de masse
moléculaire supérieure à 300 mégadaltons.
Chez les autres espèces fixatrices d'azote, libres, les gènes de
structure de la nitrogénase ont été identifiés ainsi que plusieurs
autres gènes nif. Ceci est le cas de Azospirillum brasilense (ELMERICH
et al., 1985) où les gènes nifHDK sont groupés et organisés en un seul
opéron et des gènes nifN et nifE qui sont situés à côté de l'opéron
nifHDK comme chez K. pneumoniae ; chez A. vinelandii (BISHOP et al.,
1985 ; DEAN et BRIGLE, 1985), les gènes nifHDK ont été identifiés et
organisés en un seul opéron, ainsi que le gène nifE (DEAN et BRIGLE,
1985) qui est situé à côté de l'opéron nifHDK comme chez K. pneumoniae.
Les gènes de structure de la nitrogénase ont aussi été identifiés
chez les bactéries méthanogènes (SIBOLD et al., 1985) et chez les
cyanobactéries (MAZUR et al., 1980 ; RI CE et al., 1982 ; GOLDEN et al.,
1985). L'organisàtion des gènes de structure de la nitrogénase chez les
cyanobactéries dépend de l'état physiologique de la cellule (GOLDEN et
al., 1985 ; STEWART, 1985).

- 10 -
3- Rhodobacter capsulatus
3.1- Physiologie et taxonomie des bactéries pourpres non
sulfureuses
Les bactéries pourpres non sulfureuses sont capables de fixer
l'azote moléculaire. Cette observation a été faite en premier chez
Rhodospirillum rubrum (KAMEN et GEST, 1949) et ensuite, chez d'autres
espèces (MADIGAN et al., 1984). Une reclassificàtion des bactéries
photosynthétiques a été récemment proposée par IMHOFF et al. (1984).
Les bactéries pourpres non sulfureuses, autrefois groupées dans la
famille des Rhodospirillaceae (TRUPER et PFENNIG, 1981), sont à présent
réparties en 6 genres : le genre Rhodospirillum, le genre
Rhodomicrobium, le genre Rhodocyclus, le genre Rhodopseudomonas et deux
nouveaux genres : le genre Rhodopila et le genre Rhodobacter, qui
appartenaient auparavant aux Rhodopseudomonas. Ainsi, la bactérie
Rhodopseudomonas capsulata, auparavant classée dans le genre
Rhodopseudomonas, est à présent classée dans le genre Rhodobacter et
est actuellement dénommmée Rhodobacter capsulatus.
Dans des conditions où la synthèse de la nitrogénase est
déréprimée, en absence d'azote moléculaire (croissance en anaérobiose,
avec un acide aminé comme substrat azoté), les bactéries pourpres non
sulfureuses montrent un fort dégagement d'hydrogène; ce phénomène est
appelé photoproduction de l'hydrog~ne (GEST et KAMEN, 1949). Cette
capacité de photoproduction de l'hydrogène est plus forte chez
R. capsulatus (HILLMER et GEST, 1977 a, b ; MEYER et al., 1978 c ;
JOUANNEAU, 1982). Ce qui s'explique par le fait que R. capsulatus est
l'espèce qui possède l'activité nitrogénase spécifique la plus élevée
(Fig. 1-4). R. capsulatus montre aussi la vitesse de croissance la plus
élevée, avec un temps de doublement d'environ 3 h sur N
et un temps de
2
doublement minimum de 2 h avec l'ammoniaque comme substrat azoté
(WEAVER et al., 1975).

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Temps de génération (h)
Fig. I-4 : Contenus in vivo de La nitrogénase et vitesses de croissance sur N2
des bactéries pourpres non suLfureuses. Rps. : Rhodopseudomonas,
Rsp. : Rhodospiri1,1,wn, Rdm. : Rhodomiarobiwn (MADIGAN et aL.,
1984) •
3.2- Fixation d'azote
Physiologie et régulation
R. capsulatus possède des modes de croissance variés (WEAVER et
al., 1975 ; MADIGAN et GEST, 1979) :
une croissance anaérobie photohétérotrophe sur des sources de carbone
variées, la lumière étant la source d'énergie,
- une croissance anaérobie photoautotrophe, sur H
et CO , la lumière
2
2
étant la source d'énergie, H
donneur d'électrons et source
2
d'énergie,
une croissance anaérobie à l'obscurité, des sucres servant de source
de carbone et d'énergie, le diméthylsulfoxide étant accepteur
d'électrons,
une croissance aérobie chémohétérotrophe à l'obscurité,

- 12 -
- une croissance chémoautotrophe à l'obscurité avec H
comme source
2
d'électrons.
La fixation d'azote chez R. capsulatus se fait dans les
conditions suivantes:
- En anaérobiose, à la lumière, en autotrophie ou en hétérotrophie, en
absence d'02 et des ions NH +, car comme chez les autres espèces
4
fixatrices d'azote, la fixation d'azote est un phénomène sensible à
l'oxygène et aux ions NH +, et se fait de préférence en anaérobiose,
4
mais peut se faire en microaérobiose (SIEFERT et PFENNIG, 1978 ;
JOUANNEAU et al., 1980).
- Dans l'obscurité, en absence d'02 ou en anaérobiose.
Chez R. capsulatus, il a été montré que l'augmentation de
l'intensité lumineuse stimule l'activité (MEYER et al., 1978 b
JOUANNEAU, 1982) et la synthèse (JOUANNEAU et al., 1985) de la
nitrogénase. Les ions NH + inhibent réversiblement l'activité
4
nitrogénase dans des cellules de R. capsulatus. Cette inhibition dépend
des conditions de croissance. L'inhibition réversible a été découverte
chez R. rubrum (SCHICK, 1971) et a été découverte par la suite chez
d'autres bactéries. Ex. R. capsulatus (HILLMER et GEST, 1977 a, b ;
MEYER et al., 1978 c), R. palustris (ZUMFT et CASTILLO, 1978),
R. sphaeroides (JONES et MONTY, 1979) ou encore R. rubrum (SWEET et
BURRIS, 1981). Cette inhibition a été dénommée "switch-off" par ZUMFT
et CASTILLO(1978). Au moment de l'effet "switch-off", il y a
modification covalente de la protéine à Fe (LUDDEN et BURRIS, 1976
NORDLUND et al., 1977 ; JOUANNEAU et al., 1983 ; MICHALSKI et al.,
1983) et se fait par addition d'ADP-ribose sur une seule sous-unité de
la protéine à Fe (POPE et al., 1985 a, b).
La protéine à Fe est aussi activée par l'enzyme d'activation
(LUDDEN et BURRIS, 1976 ; GOTTO et YOCH, 1982 a, b) qui est une
2
protéine intrinsèque membranaire qui req~iert des ions Mn + et de l'ATP
et est très sensible à l'oxygène (ZUMFT et NORDLUND, 1981 ; TRIPLETT et
al., 1982 ; NORDLUND et LUDDEN, 1982). L'effet "switch-off", qui
apparaissait comme spécifique aux bactéries photosynthétiques, a été
observé dans certaines bactéries non photosynthétiques : ex. Rhizobium
ORS571 (KUSH et al., 1985), Desulfovibrio gigas (POSTGATE et KENT,
1984), Azotobacter chroococcum (CEJUDO et al., 1984), mais il n'a pas
encore été démontré qu'il s'agit d'une modification de la protéine à
Fe. Chez les bactéries photosynthétiques, la nitrogénase a été purifiée

- 13 -
à partir de R. rubrum (LUDDEN et BURRIS, 1978) et R. capsulatus
(HALLENBECK et al., 1982 a). Les propriétés physiques de l'enzyme sont
semblables à celles des nitrogénases isolées à partir des autres
bactéries fixatrices d'azote.
3.3- Etudes génétiques chez R. capsulatus
Parmi les bactéries pourpres non sulfureuses, R. capsulatus se
prête le plus facilement à des études génétiques, bien que l'espèce
Rhodobacter sphaeroides ait été aussi étudiée génétiquement (PEMBERTON
et al., 1983).
3.3.1- Les mécanismes de transfert génétique
Le GTA (Agent de Transfert de Gènes)
Le premier système de transfert génétique trouvé chez une
bactérie photosynthétique a été découvert dans R. capsulatus (MARRS,
1974). Les GTA sont des particules qui ressemblent aux phages, en
microscopie électronique, mais qui contiennent uniquement de l'ADN
chromosomique de R. capsulatus. Ils transfèrent des marqueurs
chromosomiques d'une souche à une autre, par un processus analogue à la
transduction. C'est un système spécifique à R. capsulatus. Le GTA
6
transfère des fragments d'ADN de petite taille de l'ordre de 3.10
daltons (4,6kb) (YEN et al., 1979) et il permet d'étudier les liaisons
entre des marqueurs séparés de moins de 2,7kb (WALL et BRADDOCK, 1984).
L'utilisation du GTA a permis d'établir une carte génétique fine des
gènes codant pour la biosynthèse des caroténoïdes et des
bactériochlorophylles de R. capsulatus (YEN et MARRS, 1976).
La conjugaison
Il n'y a pas chez R. capsulatus un système natif de conjugaison.
Certains plasmides du type R (porteurs de gènes de résistance aux
antibiotiques) appartenant au groupe Pl, à large spectre d'hôte, se
transfèrent par conjugaison chez R. capsulatus. Certains sont aussi
capables de transférer des gènes chromosomiques. Le transfert des gènes
d'auxotrophie de R. capsulatus souche 37b4 par conjugaison a été
effectué par les plasmides de type R qui sont RP1, R68.45 et RP4::Mu
cts6l (YU et al., 1981). Ces plasmides R transfèrent les gènes de

- 14 -
7
6
Ro capsulatus à une fréquence de l'ordre de 10-
à 10- • Chez
R. capsulatus B10, RP1 transfère les marqueurs avec une fréquence très
8
faible (10- ) (MARRS, 1981). Par contre, le transfert des gènes de
photosynthèse a été effectué par un plasmide, un dérivé de RP1 qui est
le plasmide pBLM2 (MARRS, 1981). Le plasmide pBLM2 mobilise les gènes
de photosynthèse de R. capsulatus avec une fréquence de l'ordre de
4
10- . Le plasmide pBLM2 donne lieu à la formation de R-primes à une
faible fréquence, et a donc été utilisé pour isoler un plasmide R-prime
qui contient tous les gènes de photosynthèse (MARRS, 1981).
Le génie génétique
Le génie génétique s'applique aussi bien chez R. capsulatus.
Ainsi, les gènes de photosynthèse ont été clonés à partir du plasmide
R-prime, avec des vecteurs à large spectre d'hôte (TAYLOR et al.,
1983). Les plasmides à large spectre d'hôte sont des plasmides dérivés
des plasmides de type R.. Ils ont aussi été utilisés pour le clonage
des gènes nif de R. capsulatus. Il est nécessaire d'utiliser ces
plasmides qui sont transférables à R. capsulatus par conjugaison parce
qu'il n'existe pas de système de transformation chez cet organisme.
3.3.2- Génétique de la fixation d'azote
Les mutants Nif- de R. capsulatus ont été isolés par mutagénèse
avec des agents mutagènes comme le NTG. Ces mutants ont été isolés par
enrichissement à la pénicilline (WALL et al., 1975) ou par
enrichissement sur le métronidazole (WILLISON et VIGNAIS, 1982). Parmi
les mutants isolés par WILLISON et VIGNAIS (1982), quelques mutants de
régulation ont été identifiés. Le transfert des marqueurs nif par le
GTA a été effectué (WALL et al., 1975). L'analyse génétique des mutants
Nif- par le GTA (WALL et BRADDOCK, 1984) a permis d'identifier six
groupes de liaison, qui sont séparés de plus de 2,7kb.
Le transfert des marqueurs nif par conjugaison a été effectué en
utilisant le plasmide pTH10 (WILLISON et al., 1983). Le plasmide pTH10
a été utilisé pour les études de la carte génétique du chromosome de
Ro capsulatus pour la localisation des gènes nif sur le chromosome. Une
partie de ce travail est traitée dans le chapitre III de cette thèse.

- 15 -
Les premiers gènes nif isolés et caractérisés chez R. capsulatus
ont été les gènes de structure nifHDK ; ces gènes de structure ont été
isolés à partir de la souche SB1003 (AVTGES et al., 1983). Par
construction d'une banque de gènes de cette souche, dans le site
HindIII du plasmide pRK292, ces auteurs ont isolé un fragment HindIII
de 11,8kb d'ADN de R. capsulatus qui s'hybridait avec les gènes nifHDK
de K. pneumoniae et d'Anabaena souche 7120. Les mutations par insertion
du transposon Tn5 dans les différentes régions du fragment de 11,8kb
ont permis à ces auteurs d'estimer la taille des gènes nifHDK de
R. capsulatus. L'organisation des gènes de structure nifHDK de
R. capsulatus est identique à celle de K. pneumoniae. Ces trois gènes
sont organisés en un seul opéron et sont transcrits à partir d'un
promoteur situé en amont de nifH (AVTGES et al., 1983). Les gènes
nifHDK de R. capsulatus ne complémentent pas les mutations dans les
gènes nifHDK de K. pneumoniae, et les gènes nif de K. pneumoniae ne
sont pas fonctionnels chez R. capsulatus (AVTGES et al., 1983). Les
gènes de structure nifHDK ont été clonés à partir d'autres souches de
R. capsulatus (1051, DN51 et 306) (SCOLNIK et HASELKORN, 1984). Ces
auteurs ont trouvé que dans les souches de R. capsulatus, il existe
deux régions contenant les gènes de structure de la nitrogénase : l'une
des régions contient des gènes fonctionnels qui, une fois mutés,
produisent le phénotype Nif-, et l'autre région contient des copies des
gènes de structure silencieux.
Des gènes nif de R. capsulatus ont été isolés dans le laboratoire
de PUHLER (PUHLER et al., 1984) en utilisant la formation des plasmides
R-primes à partir du plasmide R68.45. Ces auteurs ont isolé un plasmide
R-prime contenant un fragment d'ADN de 20kb de R. capsulatus. Par
insertion du transposon Tn5 dans différentes régions de ce fragment,
ces auteurs ont pu localiser 24 mutations nif dispersées sur le
fragment ; la nature de ces gènes reste inconnue.
Au début de ce travail de thèse, l'organisation d'autres gènes
nif par rapport aux gènes de structure n'avait pas encore été élucidée
et la caractérisation et l'organisation d'autres gènes nif sur le
chromosome étaient inconnues.

- 16 -
BUT DU TRAVAIL
-=-=-=-
Le travail présenté dans cette thèse traite de :
l'analyse des mutants Nif- de R. capsulatus par conjugaison afin de
savoir si les gènes nif sont dispersés sur le chromosome ou s'ils
sont groupés en un seul endroit du chromosome,
- l'analyse biochimique des mutants Nif- afin d'identifier des"mutants
de régulation de type NifA-.
- le clonage et l'analyse du gène complémentant les mutants de type
NifA-.

CHAPITRE II - MATERIEL ET METHODES
-=-=-=-=-=-=-=----=-=-=-==-

- 17 -
CHAPITRE II - MATERIEL ET METHODES
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-
1- Souches et plasmides
1.1- Souches dIE. coli
Souches
Génotype ou phénotype
Source ou référence
HB101
F- recA pro leu thi lacZ rpsL
Boyer et Roulland-
supE hsdM hsdR
Dussoix (1969)
e
ET8000
rbs lacZ::IS21 gyrA hut
Merrick (1983)
K
P678-54
thr leuB1 supE lacY toM gal
Adler (1967).
mal xyl ara mtl min
CSR603
F- thrl leuB6 proA2 phrl recA1
Sancar et Rupert (1978)
argE3 thi1 uvrA6 ara14 lacY1
galK2 xy15 mtll rpsl31 tsx33
SUFE44
K-12~H1~trp
Sm
lacZ amAbioAuvr trpEA2
Bernard et al. (1979)
(Nam7 Nam53 CI857 Hl)
JM105
thi rpsL endA sbcB15 hspR4
Yanisch-Perron et al.
~ (lac-pro~), (F' 1 traD36
(1985)
proAB lacI
Z~M15)
GAC10
HB101 (pGA10)
ce travail
GACll
HB101 (pGAll)
"
GAC12
HÉ101 (pGA12)
"
GAC13
HB101 (pGA13)
"
GAC14
HB101 (pGA14)
"
GAC15
HB101 (pGA15)
'1
GAC16
HB101 (pGA16)
GAC17
HB101 (pGA17)
"
GAC18
HB101 (pGA18)
GAC19
P678 54 (pGA15)

GAC20
P678-54 (pGA16)
GAC21
P678-54 (pGA17)
ce travail
GAC22
P678-54 (pGA18)
"
GAC23
CSR603 (pGA10)
"
GAC24
CSR603 (pGA11)
ce travail
GAC25
CSR603 (pGA12)
GAC26
CSR603 (pGA13)
GAC27
CSR603 (pGA14)
GAC28
CSR603 (pRK290)
GAC29
CSR603 (pBR322)
GAC30
CSR603 (pBR328)
GAC31
CSR603 (pGA15)
ce travail
GAC32
CSR603 (pGA16)
"
GAC33
CSR603 (pGA17)
"
GAC34
CSR603 (pGA18)
"
GAC35
K-12~H1~trp (pPLc2819)
"
GAC36
K-1~H ~trp (pGA20)
"
GAC37
K-12~H~~trp (pGA21)
GAC38
K-12~Hl~trp (pGA22)
"
GAC39
JM105 (pKK223-3)
"
GAC40
JM105 (pGA24)
"
GAC41
JM105 (pGA25)
"
GAC42
JM105 (pGA26)
"

- 18 -
1.2-- Souchesde R. capsulatus
Souche
Génotype ou phénotype
Source ou référence
BIO
Souche sauvage
Marrs (1974)
350
his-l
Genthner et Wall (1984)
RCI
nif-l (niflU)
Willison et Vignais (1982)
RC3
nif-3 (nifli3)
'"
RC4
nif-4
"
RC5
Nif-
"
RC6
Nif-
Il
RC7
nif-7
"
RC8
nif-8 (nifli8)
RC9
nif-9 (nifli9)
RClO
nif-lO
RCl!
Nif-
RC12
Nif-
RC13
Nif-
RC14
Nif-
RC15
nif-15
RC16
nif-16
RC17
nif-17
RC18
nif-18
RC19
nif-19
RC20
nif-20
..
RC2l
nif-2l
u
RC22
nif-22
"
RC23
nif-23
"
RC24
nif-24
"
RC25
Nif-
"
RC26
nif-26
"
RC27
ntr-27
"
RC32
nif-32
If
RC33
nif-33 (nifli33)
Il
RC34
ntr-34
"
RC35
nif 35
RC40
Nif-
RC4l
Nif-
RC92
ura-2
RC94
bio-2a
RClOl
ilv-lO rif-l (pTHlO)
RCl03
ilv-lO rif-l str-l (pTHlO)
GAlOO
ilv-lO nov-l (pTHlO)
ce travai
GAlOl
his-l Nif-
"
GAl02
his-l Nif-
"
GAl03
his-l Nif-
"
GAl04
his-l Nif-
"
GAl05
his-l Nif-
"
GAl06
his-l Nif-
"
GAl07
his-l Nif-
"
GAl08
his-l nif85
"
GAl09
his-l Nif-
"
GAllO
his-l Nif-
GAI 11
his-l nif88
"
GAll 2
his-l Nif-
"
GAlll-14
his-l Nif+ (GAlll (pGA14»
"
LS2
his-l trp-l
Laurence Sueur
LS6
his-l ade-2
"
LS8
ade-l ura-l
"

- 19 -
1.3- Plasmides
Plasmide
Génotype ou phénotype
Source ou référence
pTH10
Harayama et al. (1980)
pRK290
Ditta et al. (1980)
pHK292
Ditta et al. (1985)
pHK2013
"
pBH322
Boehringer
pBH328
Boehringer
pPLC2819
Bernard et al. (1979)
pHPA8
Avtges et al. (1983)
pMC71A
Buchanan-Wollaston et
al. (1981)
pKK223-3
A r
Pr
Pharmacia
pGA10
Tc
(pRK290) contenant le fragment
ce travail
leoHI de 15,2kb de R. eapsulatus
r
pGAll
Tc . (pRK290) contenant le fragment
"
leoHI de 7,8kb
r
pGA12
Tc
(pRK290) contenant le fragment
"
leoHI de 4,8kb
r
pGA13
Tc
(pRK290) contenant le fragment
"
leoHI de 2,6kb
r
pGA14
Tc
(pRK292) contenant le fragment
"
HindIII de 2,1kb
r
s
pGA15
Tc
Apr Cm
(pBH328) contenant le
"
fragment leoHI de 7,8kb
r
r
s
pGA16
Tc
Ap
Cm
(pBH328) contenant le
"
fragment leoHI de 4,8kb
r
r
s
pGA17
Tc
Ap
Cm
(pBH328) contenant le
"
fragment leoHI de 2,6kb
s
r
pGA18
Tc
Ap
(pBH322) contenant le
"
fragment HindIII de 2,1kb
r
pGA20
Ap
(pPLC2819) contenant l~
"
fragment leoHI de 4,8kb
r
pGA21
Ap
(pPLC2819) contenant le
"
fragment leoHI de 2,6kb
r
pGA22
Ap
(pPLC2819) contenant le
"
fragment HindIII de 2,1kb
r
pGA24
Ap
(pKK223-3) contenant le
"
fragment leoHI de 4,8kb
r
pGA25
Ap
(pKK223-3) contenant le
"
fragment leoHI de 2,6kb
r
pGA26
Ap
(pKK223-3) contenant le
"
fragment HindIII de 2,1kb
2- Milieux de culture et conditions de croissance
2.1- Milieux de culture d'I. coli
La stérilisation des milieux à l'autoclave se fait pendant 20 mn
à 120°C.

- 20 -
Milieu LB
Bacto Tryptone
lOg
Extrait de levure
5 g
NaCI
10 g
Eau distillée
à 1000 ml
Milieu LA
Milieu LB contenant 1 5 % d'agar,
J
Milieu LM (par litre)
Bacto Tryptone
10 g
Extrait de levure
5 g
NaCI
10 mM
MgSO
7H O
10 mM
2
Eau ~istl.llée
à 1000 ml
Agar
15 g
Milieu SOB (par litre)
Bacto Tryptone
20 g
Extrait de levure
5 g
NaCI
10 mM
KCI
10 mM
C0i"}~ nI
MgCl
6H O
10 mM
2
2
MgSO
7H O
10 mM
2
Eau ~istülée
à 1000 ml
'i6 ,,~
2
Autoclaver séparément 2M de Mg + (lM MgCI +6H 0 + lM MgS0
7H 0)
2
2
4
2
et additionner au milieu pour faire 20 mM de Mg
en concentrat10n
finale.
Milieu SOC: C'est le milieu SOB contenant 20 mM de glucose.
Dans les souches auxotrophes d'E. coli, les acides aminés sont
utilisés à une concentration
finale de 20 mg/l. Les antibiotiques,
pour les souches résistantes
sont utilisés à 10 ~g/ml pour la
tétracycline, 20 ~g/ml pour la kanamycine, 25 ~g/ml pour l'ampicilline,
50 ~g/ml pour le chloramphémicol et 100 ~g/ml pour la streptomycine.
2.2- Milieux de culture de R. capsulatus
Oligoéléments
0,3975 g
0,7000 g
0.0100 g
o 0600 g
0,1875 g
500 ml
Tampon phosphate 0,64 M pH 6,8
KH
P0
20 g
4
K2~ P0
30 g
4
Eau distillée
à
500 ml
Ajuster le pH à 6,8 avec HCI lN.
Solution concentrée en sels :
Fe-EDTA
0,29 g
20 % MgS0
7H O
20 ml
4
2
Oligoéléments
20 ml
7,5 % CaCl
2H O
20 ml
2
2
0,1 % Thiamine-HCI
20 ml
Eau distillée
à 1000 ml
Ces solutions sont conservées dans la chambre froide à 4 C.

- 21 -
Milieu YPS (par litre) milieu riche
Extrait de levure
3 g
Peptone
3 g
20 % MgS0
7H 0
2,5 ml
4
2
7,5 % CaCl
2R 0
4 ml
2
2
Eau distillée
à
1000 ml
Stériliser à l'autoclave 20 mn à 120°C.
Pour le milieu YPS solide, on ajoute 12 g d'agar par litre avant
de stériliser.
Milieu minimum RCV (par litre)
Liquide
. -foliil
10 % (NH4 )2 S04
10 % D-L Malate pH 6,8
40 ml
l M Na lactate
30 ml
Solution concentrée en sels
50 ml
50 ml
0,64 M tampon phosphate pH 6,8
15 ml
15 ml
Agar
12 g
Stériliser à l'autoclave 20 mn à 120°C.
Dans le milieu RCV liquide, le tampon phosphate est ajouté avant
la stérilisation alors que dans le milieu RCV solide, le tampon
phosphate est stérilisé séparément et ajouté après.
Milieu RCV--N
C'est le milieu RCV où le (NH )2 S04 est omis.
4
Milteu RCV-N + 2 mM de NH + : C'est le milieu RCV contenant 2mM de
4
NH
.
4
Milieu avec Métronidazole pour la sélection des mutants Nif-
Histidine (ou autre acide aminé ou base pour des
souches qui en sont auxotrophes)
20 mg/litre
l M Na-lactate
30 ml/l
Solution concentrée en sels
50 ml/l
Eau distillée
900 ml/l
Agar
12 g/l
Stériliser à l'autoclave 20 mn à 120°C.
0.64 M de tampon phosphate (stérilisé à part)
15 ml/l
Métronidazole 50 mM (10 mg/ml)
4 ml/l
Chauffer pour dissoudre puis stériliser par filtration.
1 M glutamate pH 7,0 (avec NaOH ou KOH ION)
7 ml/l
Stériliser par filtration.
Tampon de dilution (par litre)
Solution concentrée en sels
50 ml
0,64 M tampon phosphate pH 6 8
15 ml
Eau distillée
à 1000 ml
Stériliser à l'autoclave 20 mn à l20 g C.
Dans les souches auxotrophes de R. capsulatus, les acides am1nes
sont ajoutés à une concentration finale de 20 ~g/ml. Les antibiotiques
pour les souches résistantes sont ajoutés dans le milieu YPS, à 1 ~g/ml
pour la tétracycline, 25 ~g/ml pour la kanamycine et 100 ~g/ml pour la
streptomycine et dans le milieu RCV ou RCV-N à 0,5 ~g/ml pour la
tétracycline, 5 ~g/ml pour la kanamycine, 100 ~g/ml pour la
streptomycine, 40 ~g/ml pour la rifampicine et à 5 ~g/ml pour le
novobiocine.

- 22 -
2.3- Conditions de croissance de R. capsulatus
Les souches de R. capsulatus poussent en aérobiose ou en
anaérobiose.
En aérobiose, les cultures poussent sur le milieu riche YPS ou le
milieu minimum RCV dans des boites de Petri à l'étuve ou dans le milieu
liquide avec agitation dans un incubateur à 30°C à l'obscurité.
En anaérobiose, les cultures poussent sur milieu YPS ou RCV
liquide en tube ou solide en boite de Petri dans les jarres GasPak sous
H
+ CO
+ N
à la lumière à 30°C. Pour la croissance en diazotrophie,
2
2
2
les cultures poussent sur milieu RCV-N solide et incubation dans des
jarres GasPak sous H
+ CO
+ N
à la lumière à 30°C. La croissance des
2
2
2
cultures en milieu l~quide est mesurée par lecture de la densité
optique à 660 nm.
8
D.0
= 1 correspond à 3 x 10 cellules/ml (WILLISON et VIGNAIS,
660
1982).
Le poids sec bactérien est calculé selon JOUANNEAU (1982) :
P.(mg/ml) = D.O x 0,45.
3- Techniques de génétique
3.1- Mutagénèse
L'isolement des mutants Nif- ou auxotrophes se fait à l'aide des
agents mutagènes. Nous avons utilisé la mutagénèse avec l'éthylméthane
sulfonate (EMS) avec le N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG).
Mutagénèse avec l'EMS: L'EMS agit par modification des bases, mais la
phase de croissance n'est pas importante. La méthode utilisée est celle
donnée par MEYNELL et MEYNELL (1970). On ajoute avec précaution 20 ~l
d'EMS à 1,8 ml de KH PO
0,1 M pH 7,4 (utilisation des gants et
manipuler sous la ho~te1, on dissout et on ajoute 0,2 ml de culture. On
incube alors pendant 30 mn à l'étuve à 30'C à l'obscurité et la culture
est lavée. Après lavage, on ensemence 10 ml d'YPS avec 0,1 ml de la
culture mutagénisée. L'incubation dure 1 à 3 jours en anaérobiose. Les
mutants Nif- sont sélectionnés en utilisant le milieu avec le
métronidazole. On étale 0,1 ml de la culture mutagénisée sur boite
contenant le milieu avec métronidazole et l'incubation se fait en
anaérobiose dans la boit~ Gas-Pak sous H
+ CO
+ N
pendant 3 à
2
2
2
4 jours. Les mutants Nif
sont identifiés en repiquant, sur milieu
RCV-N et RCV, les cellules qui ont poussé sur milieu avec
métronidazole, et en incubant en anaérobiose. Les cellules, qui ne
poussent pas sur RCV-N mais qui poussent sur RCV, sont Nif-.
Mutagénèse avec le NTG : Le NTG agit par méthylation des bases, surtout
par modification des guanines donnant lieu à une transition des bases
G-C en A-T. Il agit au point de réplication, ceci signifie que la
culture doit se trouver en phase de croissance exponentielle.
La méthode utilisée est celle décrite par MILLER (1972). On
inocule 1,0 ml d'une préculture de 15 h dans 10 ml de milieu RCV
préchauffée à 30°C (ou de milieu YPS pour les auxotrophes). Après 3 à
4 heures d'incubation en anaérobiose à la lumière, la D.0
doit se
660
trouver aux environs de 1,0. C'est-à-dire que la culture do~t se
trouver en phase exponentielle de croissance. On prélève 2 ml de
culture et on lave deux fois avec du tampon Tris-maléate 50 mM pH 6.0
avec NaOH. Pour chaque lavage, on centrifuge 10 mn à vitesse maximum
d'une centrifugeuse de paillasse. Le surnageant est prélevé de façon
aseptique et le culot est remis en suspension dans 2 ml de tampon

- 23 -
Tris-maléate 50 mM pH 6.0. On ajoute 20 ~l de NTG à ces 2 ml de culture
(NTG stock 10 mg de NTG sont dissouts dans 0,1 ml de DMSO avant
d'ajouter 0,9 ml de tampon Tris-maléate 50 mM pH 6.0. Cela donne une
solution stock à 10 mg/ml) et l'on incube à l'étuve à 30°C à
l'obscurité pendant 30 mn. Après l'incubation, on centrifuge et le
culot est lavé 2 fois avec du tampon Tris-maléate 50 mM
pH 6.0 et
remis en suspension avec 2 ml de milieu YPS. On ensemence 10 ml de
milieu YPS avec 0,1 ml de la culture mutagénisée. L'incubation se fait
en anaérobiose pendant 3 à 4 jours. La sélection des mutants Nif- se
fait sur milieu avec métronidazole comme décrit avec l'EMS.
3.2- Conjugaison entre les souches de R. capsulatus
Le transfert des marqueurs chromosomiques entre les souches de
R. capsulatus se fait par conjugaison en utilisant une souche donneuse
qui contient le plasmide pTH10. Ce plasmide pTH10 est un dérivé du
plasmide de type R. RP4 qui a été isolé par HARAYAMA et al. (1980); il
est thermosensible chez les souches d'E. coli mais ne l'est pas dans
les souches de R. capsulatus, mais il est capable de mobiliser les
gènes de R. capsulatus. La conjugaison se fait sur boite de Petri
contenant le milieu de RCV pour la sélection des auxotrophes ou RCV-N
pour la fixation d'azote. On mélange 25 ~l de la souche receveuse avec
25 ~1 de la souche donneuse, on attend 1 à 2 mn et l'on étale et
l'incubation se fait en anaérobiose pour la sélection des recombinants
Nif+ ou en aérobiose pour la sélection des auxotrophes. La souche
donneuse est auxotrophe et contient le marqueur de résitance à
l'antibiotique, la sélection se fait pour la souche receveuse. La D.O
des cultures à croiser est entre 0,5 - 0,7.
La distance entre les marqueurs est calculée selon WU (1966)
(cf. 111-2) .
3.3·· Complémentation par conjugaison
La complémentation des souches mutants Nif- de R. capsulatus par
conjugaison se fait en mélangeant les souches d'E. coli contenant le
plasmide pRK290 ou ses dérivés portant le gène de R. capsulatus, avec
les mutants Nif- de R. capsulatus et une autre souche d'E. coli
contenant le plasmide mobilisateur pRK2013 permettant le transfert de
pRK290 ou de ses dérivés dans la souche de R. capsulatus sur une boîte
de Petri contenant le milieu YPS. (Le plasmide pRK290 tout seul ne se
transmet pas d'une souche à une autre par conjugaison, il faut un
plasmide mobilisateur). Le mélange se fait en mettant 10 ~l de chaque
souche d'E. coli avec 20 ~l de la souche de R. capsulatus. On mélange
et on laisse sécher sur la boite avant de le mettre pendant une nuit à
l'étuve à 30°C. La couche de cellules qui s'est développée est mise en
suspension dans 1 ml de milieu YPS !~quide et l'on étale 0,1 ml de la
culture et les dilutions jusqu'à 10
sur le milieu sélectif de
R. capsulatus c'est-à-dire le milieu RCV-N contenant l'antibiotique
dont le gène de résistance est porté par le plasmide. La croissance se
fait en anaérobiose à la lumière dans des jarres Gas Pak. Les colonies
apparaissent au bout de 2 à 3 jours.
4- Les techniques biochimiques relatives aux protéines
4.1- Dosage des protéines
Les' protéines sont dosées par la méthode de Bradford (1976).

- 24 -
Réactif de Bradford
Bleu de coomassie G-250
100 mg
Ethanol 95 %
50 ml
Acide o-phosphorique 85 %
100 ml
Eau distillée
à 1000 ml
Filtrer et garder à température ambiante. Ce réactif est
utilisable pendant 15 jours. 100 ~l d'échantillon contenant 0 à 20 ~g
de protéines sont rapidement mélangés à 2 ml de réactif. La coloration
se développe en 2 minutes. L'absorbance à 595 nm est lue contre un
témoin sans protéines. La teneur en protéines de l'échantillon est
déterminée grâce à une courbe d'étalonnage réalisée avec l'albumine
sériq~e de boeuf (0-20~g).
4.2
Méthodes d'étude de la nitrogénase et des produits
nif"
4.2.1- Dosage de la nitrogénase in vivo chez
R. capsulatus
Solution
Solution concentrée en sels
2,5
ml
10 % D-L malate
4
ml
0,64 M Tampon phosphate
2,25 ml
Eau distillée
41,25 ml
L'activité nitrogénase est mesurée par la méthode de réduction de
l'acétyléne (DILWORTH, 1966). Comme l'azote moléculaire, substrat
physiologique de l'enzyme, l'acétylène comporte une triple liaison et
cette analogie de structure lui vaut d'être réduit en éthylène.
Dans les flacons de 12 ml ou de 20 ml saturés en argon, 2 ou 4 ml
de culture (lavée avec le milieu ci-dessus, dégazée sous argon et
remise en suspension dans cette solution) sont injectés dans chaque
flacon. Les flacons sont incubés à 30°C dans le bain-marie d'un
appareil de Warburg (appareil Braun Melsungen AG), éclairé par dessous
par une rampe circulaire de lampes de 40 W fournissant un éclairement
moyen de 10 000 lux. Au temps zéro de la réaction 10 % d'acétylène (lml
ou 1,6 ml suivant le flacon) est injecté à la seringue dans la phase
gazeuse. La cinétique de formation d'éthylène est établie par l'analyse
en chromatographie en phase gazeuse d'échantillons de 50 ~l de gaz
prélevés avec une seringue Hamilton gas-tight. Les prélèvements sont
injectés dans la colonne d'un chromatographe de DELSI (Réf.
121DFL4757). Le gaz vecteur est l'azote circulant sous pression de
3 bars et la température du four est réglée à 45°C. L'acétylène et
l'éthylène sont séparés et sortent de la colonne à 2 secondes
d'intervalle, 15 à 20 secondes après l'injection. Un détecteur à
ionisation de flamme à hydrogène permet de convertir les quantités
respectives des deux gaz en signaux électriques enregistrés sur un
appareil de type Sefram. Le chromatographe est préalablement étalonné
avec des quantités connues d'éthylène pur à 99,5 % fourni par l'Air
Liquide. L'activité nitrogénase est exprimée en nanomoles d'éthyl~re _~
produit par minute et mg de poids sec de bactéries (nmoles C H mn
mg
J.
2 4
4.2.2- Détection de la nitrogénase dans les souches de
R. capsulatus par immunodiffusion
La nitrogénase, dans les souches de R. capsulatus, est détectée
par immunodiffusion.
On fait pousser la souche B10 et les mutants de R. capsulatus
dans les conditions permettant la s~nthèse de la nitrogénase, c'est-à-
dire dans le milieu RCV-N + 2mM NH
en tube de 10 ml à la lumière à
4

- 25 -
300C. Les cellules sont récoltées par centrifugation et le culot est
mis en suspension dans
500 ~l de tampon Tris-HCl 0,125M pH 8,0 dégazé
sous argon et contenant 2 mM de dithionite. On casse les cellules par
sonication avec la microsonde Branson puissance 3-4 (Réf. W-10). On
fait une centrifugation à l'Eppendorf pendant 2 mn, on garde le
surnageant qui est l'extrait brut qu'on utilise pour les dépôts
d'immunodiffusion.
Immunodiffusion :
Matériel : Tampon Tris-barbiturate (LKB)
Lames de verre microscopiques (LKB)
Table horizontale
Emporte pièce et matrice (LKB)
Préparer 10 ml d'agarose 1% dans le tampon Tris-barbiturate.
Déposer sur la lame à raison de 3 ml par lame microscopique. Attendre
que le gel se polymérise et faire une rosace à l'aide de l'emporte
pièce et de la matrice.
Dépôts : On dépose 10 ~l par puits. Le sérum anti-RcII ou anti-RcI dans
le puits central; les extraits à analyser dans les autres puits. La
diffusion se fait une nuit à température ambiante dans une boite
contenant un peu d'eau. On effectue le lavage pendant une nuit avec le
NaCl 0,1 M, on sèche le gel et on le colore avec le colorant de KAYO,
(Bleu de coomassie R250
0,25 %, méthanol 50 %, acide acétique 10 %)
pendant 10 mn et on fait une décoloration dans le méthanol/acide
acétique (5 %, 7 %).
4.2.3- Dérépression de la nitrogénase
La dérépression de la nitrogénase se fait dans le milieu de
dosage de l'activité nitrogénase comme décrit précédemment en
anaérobiose et à la lumière. Les cellules de R. capsulatus B10 et des
mutants ayant poussé dans des tubes de 10 ml dans le milieu RCV, à la
lumière, à 30°C, en anaérobiose pendant 48 heures (les cellules en état
stationnaire) sont récoltées par centrifugation et lavées trois fois
avec le milieu de dosage de la nitrogénase. Toutes les opérations se
font sous argon. Au dernier lavage, les cellules sont mises en
suspension dans le même milieu dégazé sous argon. On place 4 ml de
culture dans des flacons de 20 ml préalablement dégazés sous argon, on
injecte du bicarbonate de sodium à 0,3 mM en concentration finale et
1,6 ml d'acétylène, c'est-à-dire 10 % du volume gazeux. On mesure la
formation d'éthylène comme décrit en 4-2-1 du même sous chapitre.
4.2.4- Détection de la synthèse de la nitrogénase de
R. capsulatus dans les souches d'E. coli par des
immunoblots (GERSHONI et PALADE, 1982)
Solutions utilisées : Tampon de lyse :
2 % SDS
2 % a-mercaptoéthanol
10 % glycérol
100 mM Tris-HCl pH 6,8
Bleu de Bromophénol 0,001 %
Tampon PBS concentré 10 fois
0,1 M Na HP0
12H 0 pH 7,5
2
4
2
1,3 M NaCl
On prélève 1 ml de chaque échantillon que l'on centrifuge et le
culot est remis en suspension dans 100 ~l de tampon de lyse et placé
3 mn dans l'eau bouillante. Les échantillons sont centrifugés pendant
12 secondes dans une centrifugeuse Eppendorf 5414S. Les échantillons de

- 26 -
R. capsulatus souche B10 sont obtenus par sonication et mélangés en
rapport 1/1 avec le tampon de lyse puis chauffés 3 mn dans l'eau
bouillante et centrifugés pendant 12 secondes. Les protéines d'E. coli
contenant les plasmides et de R. capsulatus sont séparées par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du SDS comme décrit
dans le paragraphe 4-3. Après migration, le gel est placé dans le
tampon PBS pendant 5 mn. On découpe la membrane de nylon Hybond
(Amersham) aux dimensions du gel. La membrane est équilibrée 15 mn dans
le tampon PBS. Apr.ès équilibration, on effectue l'électrotransfert des
protéines du gel d'acrylamide sur filtre de nylon comme décrit dans le
paragraphe 5-2-8 sauf qu'ici, l'électrotransfert se fait dans le tampon
PBS pendant 2 h à 30-40 V. Après transfert, le filtre est enlevé et
incubé pendant 16 h dans le tampon PBS contenant 10 % de BSA à 42°C.
Les filtres nylon sont incubés avec les anticorps anti-protéine à Fe et
anti-protéine à MoFe de la nitrogénase de R. capsulatus. L'incubation
avec les anticorps se fait en mélangeant 100 ~l de chaque anticorps
avec 10 ml de PBS + 2 % BSA dans un sac de plastique contenant le
filtre de nylon et l'incubation se fait pendant 1 h. Après incubation
avec les anticorps, on enlève la solution et on la remplace par le PBS
7
+ 2 % BSA contenant la protéine A marquée à l'iode 125 à 10
cpm/ml et
l'incubation se fait pendant 1 h. Le filtre est ensuite lavé 5 x 20 mn
avec le PBS, séché et mis en autoradiographie.
4.2.5- Cinétique d'apparition des produits des gènes nif
chez R. capsulatus
La cinétique d'apparition des produits des gènes nif chez
R. capsulatus se fait par dérépression de la nitrogénase COmme décrit
dans le paragraphe 4-2-3. Au temps zéro, on injecr~ 2,5 ~Ci/ml de
mélange d'acides aminés uniformément marqués au C
et du bicarbonate
de sodium à 0,3 mM et à différents temps, les échantillons sont
prélevés et congelés dans l'azote liquide. Les cellules sont
décongelées, lysées avec le tampon de lyse décrit en 4-3-1, ou cassées
par sonication avec une microsonde (Branson Sonifier), centrifugées et
le surnageant récupéré. Les protéines sont ensuite séparées sur gel
SDS-polyacrylamide ou sur gel en double dimension. Les gels sont fixés
colorés, décolorés et séchés puis mis en autoradiographie pour révéler
les protéines qui ont été synthétisées.
4.3- Analyse des protéines par électrophorèse sur gel
4.3.1- Séparation des protéines en électrophorèse sur gel
de polyacrylamide contenant du SDS
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du SDS se
fait comme décrit par LAEMMLI (1970).
Solutions :
solution 1 : 1,5 M Tris-HCl pH 6,8
0,4 % SDS
- solution 2 : 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
0,4 % SDS
- solution stock d'acrylamide : 30 % d'acrylamide ; 0,8 % bis-
acrylamide
- tampon de lyse: 10 % glycerol, 5 % a-mercaptoéthanol,
2,3 % SDS, 0,0625 M Tris-Hcl pH 6,8, BBP 0,01 %
- tampon d'électrophorèse : 0,025 M Tris-base, 0,192 M glycine,
0,1 % SDS
Le gel contient un gel de résolution et un gel de conce~tration.
Il est coulé de la manière suivante : Entre deux plaques en verre, on

- 27 -
coule un gel de 1 mm d'épaisseur, les plaques étant séparés avec des
espaceurs de 1 mm d'épaisseur, les plaques étant séparés avec des
espaceurs de 1 mm sur les deux cotés verticaux et 1 espaceur en bas le
tout étant maintenu par des pinces métalliques. On coule le gel de
résolution on attend environ 15 à 20 mn pour qu'il se polymérise et on
coule le gel de concentration et place le peigne qui plonge dans le gel
de concentration et sert à former les puits pour les dépôts. On laisse
polymériser pendant 1 h. On enlève délicatement le peigne lorsque le
gel est polymérisé. La concentration du gel à couler est définie dans
le tableau ci-dessous.
Solutions
Concentrations du gel
4,5 %
10 %
12,5 %
20 %
ÔH 0
3,0 ml
9,7 ml
7,8 ml
2 ml
2
SolutionI
5,8 ml
5,8 ml
5,8 ml
Solution II
1,25 ml
Solution stock
d'acrylamide
0,75 ml
7,8 ml
9,8 ml
15,6 ml
10 % persulfate
d'ammonium
50 ~l
80 ~l
80 ~l
150 ~l
TEMEO
5 ~l
32 ~l
32 ~l
30 ~l
TabLeau II-l : Concentration d'acryLamide pour couLer Les geLs.
Les échantillons à faire migrer dans le gel sont préparés de la
manière suivante : prélever 500 ~l de culture, centrifuger et reprendre
le culot dans 50 ~l du tampon de lyse. Chauffer 3 mn à 100°C,
centrifuger 12 secondes dans une centrifugeuse Eppendorf 54l4S et
déposer 20 ~l sur le gel. L'électrophorèse se fait dans le tampon
d'électrophorèse à 20 mA dans le gel de concentration et à 30 mA dans
le gel de résolution.
4.3.2- Séparation des protéines sur gel de polyacrylamide
en double dimension
Les gels en double dimension sont faits comme décrit par O'FARREL
(1975) mais en omettant le NP-40. Les échantillons sont obtenus par
sonication et placés dans le tampon de lyse sans NP-40.
4.3.3- Fixation, coloration et décoloration des protéines
sur gel de polyacrylamide contenant du SOS
Les gels sont fixés dans une solution contenant 10 % de TCA et
20 % de méthanol pendant 30 mn colorés dans une solution contenant
0,25 % de bleu de coomassie R250, méthanol 50 % (V/V) acide acétique
10 % pendant 30 mn et décolorés pendant une nuit dans une solution
contenant 25 % d'éthanol et 7,5 % d'acide acétique.
4.4- Autoradiographie
L'autoradiographie des filtres nylon Hybond (Amersham) se fait

sur des films Fuji à -80°C pendant 1 à 7 jours selon le marquage et les
films sont révélés après dans une chambre noire en les plaçant
respectivement dans le révélateur jusqu'à visualiser les bandes, l'eau
(30 5) et le fixateur (jusqu'à ce que tout le film change de couleur).
5- Techniques de biologie moléculaire
5.1- Electrophorèse des acides nucléiques
électrophorèse de
l'ADN sur gel d'agarose
L'électrophorèse de l'ADN se fait dans le tampon Tris-Borate-EDTA
(TBE) pH 8,3 de MEYERS et al. (197S), HANSEN et OLSEN (1978).
Tampon TBE : Tris-base
89 mM
Acide borique
89 mM
pH 8,3
EDTA
2,5 mM
L'électrophorèse est effectuée à 100 V pendant 3 heures dans le
tampon TBE dans un gel d'agarose dissout dans le tampon TBE à une
concentration voulue contenant du bromure d'éthidium à une
concentration de 0,5 ~g/ml.
5.2- Purification des acides nucléiques
5.2.1- Purification de l'ADN plasmidique
Solutions utilisées
- Solution 1 :
Glucose
50 mM
Tris-HCI
25 mM
pH 8,0
EDTA
la mM
- Solution 2
NaOH
0,2 N
SDS
1 %
- Solution d'acétate de potassium pH 5,2
On prépare sa ml d'une solution d'acétate de potassium 5M, on
additionne 11,5 ml d'acide acétique pur et 28,5 ml d'eau distillée. La
solution finale fait 5M d'acétate et 3 M de potassium.
- Solution d'acétate de sodium
On prépare une solution d'acétate de sodium 3 M et ajuster le pH
à 5,2.
Tampon Tris-EDTA (TE)
Tris-base
la mM
pH 8,0
EDTA
1 mM
Purification quantitative du plasmide en gradient de CsCI
La purification quantitative du plasmide se fait par lyse
alcaline par la méthode de BIRNBOIM et DOLY (1979). On ensemence
1 litre de milieu LB avec la ml de préculture ayant poussé dans le
milieu LB à 37°C avec des antibiotiques appropriés. On fait pousser
pendant une nuit à 37°C avec agitation. La culture est répartie dans
deux pots de 1 l et on centrifuge 20 mn à 3 500 t/mn dans la
centrifugeuse IEC PR-SOOO à 15°C. Chaque culot est repris dans 80 ml
d'eau distillée stérile et réparti dans deux tubes Sorvall plastique de
50 ml ; les centrifugations qui suivent sont effectuées dans une
centrifugeuse Sorvall SSl. Centrifuger 5 mn à 4°C plot 40 (6000 t/mn)
;
chaque culot est repris dans 8 ml de solution 1. On agite au vortex
pour bien homogénéiser et incube gmn à la température du laboratoire.

- 29 -
Ajouter alors 16 ml de solution 2, chaque tube est bouché avec du
parafilm ; bien mélanger la suspension en la renversant doucement.
Incuber 10 mn dans la glace en mélangeant de temps en temps. Ajouter
12 ml de solution d'acétate de potassium 5M pH 5,2 et agiter le tube
recouvert d'un parafilm comme précédemment. Incuber 10 mn dans la glace
en mélangeant de temps en temps. Il se forme alors un précipité blanc :
protéines SDS plus ADN chromosomique. La solution est alors centrifugée
10 mn à 12000 t/mn à 4°C. On obtient un culot genre gomme et un
surnageant jaune (plasmide + ARN). On transfère le surnageant dans des
tubes corex de 30 ml et on précipite avec 0,6 volume d'isopropanol, on
agite le mélange, on laisse
10 mn à la température ampiante. La
solution est centrifugée 10 mn à 12000 t/mn à la température ambiante.
Les culots sont séchés et repris dans 1,5 ml de TE (regrouper 4 tubes
en 2) agitation douce à la main et laisser imprégner le TE pendant
10 mn à la température ambiante. Chaque tube est tamponné à pH 7-8 avec
quelques gouttes de Tris-base 1 M en utilisant le papier pH. Mesurer le
volume exact dans des tubes coniques gradués de 12 ml et ajouter le
bromure d'éthidium à une concentration finale de 600 ~g/ml et chlorure
de césium à une concentration finale de 19/ml. On fait une
centrifugation de nettoyage à 12000 t/mn, pendant 5 mn, à la
température ambiante. Mesurer l'indice de réfraction et ajuster à 1,392
pour chaque tube. Distribuer la solution dans des tubes à centrifuger.
Centrifuger à 15°C à 50 000 t/mn pendant 16 heures avec le rotor
vertical VTi 65 de Beckman ou à 40 000 t/mn pendant 44 h avec le rotor
SW50-1. On prélève la bande inférieure (ADN plasmidique) sous la
lumière UV grandes ondes à l'aide d'une pompe péristaltique. Extraire
le bromure d'éthidium avec du butanol-1 à volume égal jusqu'à
disparition de la teinte rosée dans la phase aqueuse. Dialyser l'ADN
contre le tampon TE pendant 3 à 4 h. L'ADN est précipité à l'éthanol
95 % (1 volume d'ADN + 1/10 volume d'acétate de sodium 3 M pH 5,2 +
2,5 volumes d'éthanol 95 %) et laisser une nuit à -20°C.
L'ADN plasmidique est récupéré par centrifugation à 4°C à
12000 t/mn pendant 10 mn. Le culot est séché au Speed Vac et l'ADN est
repris dans le TE : A
= 1 correspond à 50 ~g/ml d'ADN. Mesurer la
260
con~entration d'ADN par absorbance à 260 nm : le rapport A260/A280
var~e entre 1,8-2,0.
Purification rapide des plasmides
La purification rapide des plasmides se fait selon la méthode
d'ISH-HOROWICZ et BURKE (1981).
Mettre 1 ml de culture dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
Centrifuger 1 mn avec l'Eppendorf. Resuspendre le culot dans 100 ~l de
solution 1 et placer 5 mn à la température du laboratoire. Ajouter
200 ~l de solution 2, agitation douce pendant 5 mn à OOC. Ajouter
150 ~l de solution d'acétate de potassium 5 M pH 5,2 continuer
l'agitation douce à OOC pendant 5 mn. Centrifuger 5 mn à 4°C avec
l'Eppendorf, éliminer le culot et garder le surnageant. Additionner au
surnageant 2 volumes d'étahanol 95 %, mélanger et laisser 2 mn à la
température du laboratoire. Centrifuger 2 mn avec l'Eppendorf à la
température du laboratoire. Le culot est repris dans 100 ~l de TE.
Ajouter 100 ~l de phénol/chloroforme 1/1 (V/V). Agitation au vortex
pendant 30 s et centrifuger 1 mn. Transférer la phase aqueuse
supérieure dans un tube Eppendorf et ajouter 100 ~l d'éther; mélanger
au vortex et centrifuger 30 s avec l'Eppendorf. Enlever l'éther qui se
trouve à la phase supérieure et évaporer le reste dÎéther en plaçant
les tubes à 65°C pendant 10 mn. Précipiter à l'éthanol 95 % à -700C
pendant 20 mn. Centrifuger à 4°C avec l'Eppendorf pendant 10 mn sécher
le culot à l'aide du Speed Vac pendant 5 mn et reprendre le culot dans
30 à 50 ~l de TE.

- 30 -
5.2.2- Purification de l'ADN chromosomique de
R. capsulatus
Réactifs pour la purification de l'ADN chromosomique
- Saline-EDTA : 0,15 M NaCl + 0,1 M EDTA pH S,O
SDS 25 %
: 25 g de SDS pour 100 ml de solution
- Perchlorate de sodium 5M
- Chloroforme-alcool isoamylique 24/1 (V/V)
- Ethanol 95 %
- Saline citrate concentré
1,5 M NaCl + 0,15 M citrate de
- Saline citrate
0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium
- Saline citrate dilué
0,015 M NaCl + 0,0015 M citrate de sodium
- Ribonucléase A 0,2 % dans 0,15 M de NaCl pH 5,0. La solution est
chauffée 10 mn à SO"C pour inactiver les contaminants de
désoxyribonucléase.
- Acétate-EDTA : 3 M d'acétate de sodium + 0,001 M EDTA pH 7,0
- Isopropanol
Méthode de purification
L'ADN chromosomique de R. capsulatus est purifié selon la méthode
de MARMUR (1961). Les cellules de R. capsulatus (souche sauvage BIO)
qui ont poussé pendant une nuit en aérobiose dans un litre de milieu
YPS, sont récoltées par centrifugation et lavées avec 50 ml de solution
saline-EDTA dans des tubes Sorvall de 50 ml. Après centrifugation, les
cellules sont resuspendues dans un volume de 25 ml de saline-EDTA. Les
cellules sont lysées par addition de 2 ml de SDS 25 % dans chaque tube
Sorvall et le mélange est placé dans un bain marie à 60°C pendant
10 mn. Refroidir alors à la température ambiante. (La lyse des cellules
provoque une très forte augmentation de la viscosité due au relâchement
des acides nucléiques). Le perchlorate de sodium est additionné à une
concentration finale de 1 M à la solution visqueuse; l'ensemble est
mélangé par agitation avec un volume égal de ch~oroforme-alcool
isoamylique, dans un Erlenmeyer de 250 ml. Bien fermer et agiter
pendant .30 mn, c'est la première étape de la déprotéinisation.
L'émulsion résultante est séparée en 3 couches par une centrifugation à
10000 t/mn, pendant 5 mn, dans une centrifugeuse Sorvall SSl. La phase
aqueuse supérieure contient les acides nucléiques, elle est
soigneusement pipettée et transvasée dans des tubes Corex de 30 ml. Les
Les acides nucléiques sont précipités
par addition de 2 volumes
d'éthanol 95 % sur la phase aqueuse (formation d'un précipité
filiforme) .
Le précipité est récupéré par centrifugation à 12000 t/mn
(centrifugeuse Sorvall SSl) pendant 5 mn et remis en suspension dans
10 ml de citrate saline dilué. Mélanger doucement jusqu'à dissolution
complète de la suspension d'acides nucléiques. La solution est ajustée
à la concentration de citrate-saline standard par addition de citrate-
saline concentré. On mélange par agitation avec un volume de
chloroforme-alcool isoamylique pendant 15 mn et on centrifuge avec la
Sorvall à 10000 t/mn pendant 5 mn. La phase aqueuse supérieure est
récupérée. L'opération est reprise jusqu'à ce que très peu de protéines
soient observées à l'interface. Le surnageant obtenu après la dernière
des séries de déprotéinisation est précipité avec l'éthanol et le
précipité est remis en suspension dans la solution de citrate-saline
standard (environ 0,75 du volume du surnageant) comme décrit
précédemment. On digère avec la RNase A à une concentration finale de
50 ~g/ml et on incube pendant 30 mn à 37°C. La digestion est encore
suivie par une série de déprotéinisations successives jusqu'à ce qu'il
n'y ait que peu ou pas de protéines dénaturées visibles à l'interface

- 31 -
après centrifugation. Le surnageant obtenu après le dernier traitement
est encore précipité à l'EtOH et l'acide nucléique obtenu par
centrifugation est dissout dans 9 ml de citrate-saline dilué. Quand la
solution est obtenue, 1 ml d'acétate-EDTA est additionné et remuer
rapidement la solution. Additionner 2 volumes d'EtOH, mélanger
doucement et placer à 4°C pendant 12 h, l'ADN précipite en forme de
fibres. Centrifuger avec la Sorvall à 4°C à 12000 t/mn pendant 10 mn.
Dissoudre dans le précipité dans le tampon TE.
5.3- Transformation d'E. coli par des plasmides
J'ai utilisé dans mes expériences deux méthodes de
transformation : la première méthode de transformation au CaCl
est
2
décrite par MANDEL et HIGA (1970) et la seconde méthode qui s'est
révélée plus efficace et que j'ai utilisée dans la suite des
expériences de transformation est celle décrite par HANAHAN (1983).
5.3.1- Tampons utilisés pour la transformation
Tampon Tris-CaCI
:
Tris-HCI
10 mM pH 8,0
2
CaCl
50 mM
2
Stériliser à l'autoclave
Tampon TFB
K-MES
10 mM pH 6,2
RbCI
100 mM
MnCl
4H 0
45 mM
2
2
CaCI
2H 0
10 mM
2
HACOÊl
3 mM
3
Stériliser par filtration sur filtre Millipore 0,45 ~m.
HACoCl
: Hexamine Cobalt trichloride
3
5.3.2- Transformation par la méthode au CaCl
(MANDEL et
2
HIGA, 1970)
On inocule 100 ml de milieu LB avec 1 ml de culture ayant poussé
pendant la nuit. Agiter vigoureusement à 37°C pendant 2 à 4 heures
jusqu'à une D0
= 0,5. Prélever X ml de culture et refroidir 10 mn
550
dans la glace, centrifugation 5 mn avec la Sorvall à 5000 t/mn à 4°C,
pendant 10 mn. Le culot est remis en suspension dans~ml de tampon
Tris-CaCl2 (le tampon devant être froid et stérile) et incubé 15 mn
dans la glace. Centrifugation 5 mn avec la Sorvall à 4°C à 5000 t/mn ;
le culot est repris dans ~ ml de tampon Tris-CaCI • On dépose dans des
2
tubes Eppendorf de 1,5 ml préalablement refroidis, 200 ~l de la
suspension et mettre à 4°C pendant 2 h. Après incubation à 4°C, la
solution contenant l'ADN est ajoutée (40 à 100 ng d'ADN dans 100 ~l de
tampon de ligation ou de tampon TE). Agiter et garder 30 mn dans la
glace. On fait un choc thermique en plaçant les tubes à 42°C pendant
2 mn~ Après le choc thermique, 1 ml de milieu LB est ajouté et incubé à
37°C sans agiter pendant 1 h. On étale 100 ~l de culture sur les boites
de Pétri, contenant les milieux sélectifs et incubé à l'étuve à 370C.
Les colonies apparaissent après une nuit d'incubation.
5.3.3- Transformation selon HANAHAN (1983)
On fait pousser la culture d'E. coli dans le milieu SOB jusqu'à
une D0550 = 0,45 à 0,55 (10 à 30 ml de culture dans un Erlen de
300 ml). Les cultures sont ~lacées dans des tubes de polypropylène de
50 ml. Incuber le mélange 10 à 15 mn dans la glace et récolter les

- 32 -
cellules par centrifugation à 2500 t/mn, pendant 12 mn, à 4°C
(centrifugeuse Sorvall SSl). Le culot est remis en suspension dans 1/3
volume de tampon TFB j mélanger doucement au vortex. Incuber le mélange
10 à 15 mn dans la glace et récolter les cellules par centrifugation à
2 500 t/mn pendant 10 mn à 4°C. Le culot est remis en suspension dans
1/12,5 volume de TFB, ajouter du DMSO à 3,5 % (7 ~l pour 200 ~l)
mélanger par rotation douce du tube et garder dans la glace 5 mn,
ajouter du DTT à une concentration finale de 75 mM; mélanger par
rotation douce du tube et garder 10 mn dans la glace. Ajouter un autre
volume de DMSO (7 ~l pour 200 ~l) et incuber les cellules 5 mn dans la
glace. Placer 200 ~l des échantillons dans des tubes de polypropylène
de 10 ml préalablement refroidis et ajouter la solution d'ADN (10 à 100
ng dans 10 ~l) mélanger et incuber 30 mn dans la glace. Le choc
thermique est effectué en plaçant les tubes à 42°C pendant 90 s et en
refroidissant 1 à 2 mn dans la glace. Ajouter alors 800 ~l du milieu
SOC (~20oC) et incuber les tubes à 37°C avec agitation à 225 t/mn
pendant 1 h. Etaler 100 ~l de culture sur le milieu LM contenant les
antibiotiques appropriés mettre les boites à l'étuve à 37°C. Les
colonies apparaissent après une nuit d'incubation.
5.4- Préparation des fragments de restriction
5.4.1- Digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction
La digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction se fait
dans des tampons d'incubation spécifiques décrits par le fournisseur.
Actuellement nous utilisons le tampon d'incubation TAB (Tris-Acétate-
Buffer) décrit par O'FARRELL et al. (1980) qui fonctionne pour beaucoup
d'enzymes de restriction, sauf pour SmaI. BamHI et Bg!II qui
nécessitent des tampons spécifiques. L'incubation se fait pendant 1 h à
37°C et pour SmaI à 25°C. La digestion se fait dans un volume total de
30 ~l pour 1 ~g d'ADN. La réaction est arrêtée en ajoutant 10 ~l de
solution d'arrêt et en chauffant à 65°C pendant 5 mn.
Le plasmide obtenu par purification rapide est digéré en présence
de la
RNase à 0,05 % (préparée comme dans 5.2.2-).
Tampon TAB :
Tris-acétate
33 mM pH 7,9
Acétate de potassium
66 mM
Acétate de magnésium
10 mM
Dithiothreit
0,5 mM
Bovin sérum albumin (sans nucléases)
100 ~g/ml
Solution d'arrêt des enzymes de restriction:
Sucrose
50 %
Urée
4 M
EDTA
50mM
Bleu de Bromophénol 0,01 %
5.4.2- Elution des fragments d'ADN sur papier de DE81
(YANG et al. 1979)
L'élution des fragments d'ADN se fait sur les filtres Whatman
DE81.
Solution: solution 0,1 M NaCl dans du tampon TE
solution 1,5 M NaCl dans du tampon TE
On fait migrer l'ADN dans l'agarose 1% à 100 V. Vérifier à l'aide
de la lampe à UV (Transminator TM-36) si les fragments sont bien
séparés, couper sous UV à 1 mm en dessous de~ fragments et insérer les

- 33 -
papiers Whatman DE.81. Faire migrer 10 mn à 120 V, vérifier à la lampe
UV que les bandes sont fixées sur le papier. Enlever le papier du gel
et mettre dans les cones bleus comme dans le schéma ci-dessous.
Pê::::=It-------------- Tube Eppendorf
-+-------------- cone
~--;--------------DE81contenant l'ADN
/&-
Tube de 5 ml
Laver l'ADN avec du NaCl 0.1 M. changer de tube et éluer avec du
NaCl 1.5 M chaud (80°C). Récupérer la solution. Extraire avec du
phénol-chloroforme et précipiter l'ADN à l'éthanol 95 %. Reprendre le
culot dans 20 ~l de TE.
5.5- Clonage
Le clonage consiste à insérer un fragment d'ADN dans un plasmide.
Le plasmide est appelé vecteur et le fragment à insérer ADN passager.
5.5.1- Préparation des ADN
Préparation du plasmide vecteur
Digérer une quantité de plasmide avec un enzyme de restriction
qui a un site dans le plasmide (souvent site unique) et ajouter la
phosphatase alcaline à une concentration de 5 U/~g d'ADN, continuer
l'incubation pendant 1 h. Arrêter la réaction par addition de l'EDTA à
une concentration finale de 20 mM. Extraire avec le phénol-chloroforme
et à l'éther. Précipiter l'ADN à l'éthanol à 95 %. Centrifuger et
reprendre le culot dans du TE à une concentration de 1 ~g/~l d'ADN. Les
fragments à cloner sont préparés selon la méthode décrite en 5-4.
5.5.2- Ligature du plasmide avec l'ADN passager
La ligature consiste à lier les deux ADN avec-un enzyme qui est
la ligase du phage T4. L'ADN passager est le plus souvent obtenu par
digestion aveè le même enzyme de restriction qui a servi à digérer le
vecteur et éluer sur DE81.
Tampon de ligature
Tris-HCl
20 mM pH 7,6
MgC1
10 mM
2
DTE
10 mM
ATP
0,6 mM
Ligature: mélanger l'ADN vecteur et l'ADN passager en proportion
1/1 en concentration dans 50 ~l de tampon de ligature et ajouter la
ligase à une concentration de 1 U/~g d'ADN. Incuber à 16°C pendant une
nuit.
5.6- Construction de la banque de gènes de R. capsulatus
La banque de gènes de R. capsulatus est construite comme décrit
par MANIATIS et al. (1978, 1982).

- 34 -
5.6.1- Préparation des fragments de 10 à 20 Kb d'ADN de
R. capsulatus
On digère 500 ~g d'ADN de R. capsulatus de la souche B10 avec
40 U d'EcoRI soit 0,08 U/~g d'ADN. (La concentration d'enzyme pour
obtenir une bonne gamme de fragments étant dosée préalablement) ; le
tout amené à 800 ~l avec du tampon d'incubation d'EcoRI et l'incubation
est faite à 37°C pendant 1h. La réaction est arrêtée par refroidis-
sement à OOC puis addition d'EDTA à une concentration finale de 20 mM.
On prélève un aliquot (environ l~g) puis on analyse sur gel d'agarose à
0,5 % pour voir si les produits de la réaction sont dans la région
désirée. On sépare les protéines de l'ADN par addition· de deux fois un
volume de phénol-chloroforme (1:1) et une fois un volume d'éther pour
enlever le phénol-chloroforme. L'éther est enlevée en chauffant à 65°C
pendant 10 mn. L'ADN est précipité avec de l'éthanol à 95 % pendant
30 mn à -70°C. L'ADN est récupéré par centrifugation à 4°C pendant
10 mn avec l'Eppendorf. Le culot est lavé avec l'EtOH 70 %, centrifugé
et séché avec le Speed Vac, dissoudre l'ADN dans 500 ~l de tampon TE.
On prépare des gradients de sucrose 10 % à 40 % (les gradients sont
dissouts dans une solution contenant NaCl lM, Tris-Hel 20 mM, pH 8,0,
EDTA 5 mM) dans des tubes de 12 ml de rotor SW41. On place 250 ~l de la
solution d'ADN à la surface des tubes. Après centrifugation à
28000 t/mn pendant 22h30 avec le rotor SW 41 dans la centrifugeuse
KONTRON K-50 à 22°C. Les fragments d'ADN sont répartis selon leur
taille dans le gradient. Le recueil des fractions du gradient se fait
en perçant les tubes par le fond avec une aiguille ; on recueille par
écoulement le gradient par fractions de 0,5 ml. On recherche dans quels
tubes se trouvent les fragments recherchés en prélevant 20 ~l dans un
tube sur trois, mélangeant avec 5 ~l solution d'arrêt des enzymes de
restriction puis analysant par électrophorèse sur gel d'agarose à
0,5 %.
On prélève la fraction contenant les fragments de 10 à 20 Kb puis
on fait une dialyse contre 4 litres de tampon TE pH 8,0 à 4°e pendant
16 h, en changeant le tampon après 6 h. (En dialyse, les échantillons
augmentent 2 fois de volume). L'ADN est précipité à l'EtOH 95 % à -20 o e
pendant une nuit. L'ADN est dissout dans le tampon TE à une
concentration de 300 à 500 ~g/ml. Analyser un aliquot d'ADN (0,5 ~g
par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,5 % pour vérifier que la
distribution des produits de la digestion est correcte. Mesurer la
concentration d'ADN dans chaque échantillon.
5.6.2- Préparation du plasmide vecteur de clonage
Le plasmide vecteur utilisé pour la construction de la banque de
gènes est le plasmide pRK290.0n digère 20 ~g d'ADN plasmidique avec
EcoRI en excès (10 U/~g) et incubation 45 mn à 37°C, dans le tampon
d'incubation pour EcoRI, puis addition de la phosphatase alcaline à une
concentration de 8 U/~g d'ADN et on continue l'incubation à 37°e
pendant 45 mn. On arrête la réaction en refroidissant à OOC puis
addition d'EDTA à une concentration finale de 20 mM. L'ADN est traité
2 fois avec un volume de phénol-chloroforme et une fois avec un volume
d'éther. Enlever l'éther en chauffant pendant 10 mn à 65°C. L'ADN est
précipité à l'EtOH à 95 % pendant 30 mn à -70°C. Centrifuger à 4°C
pendant 10 mn avec l'Eppendorf. Sécher le culot au Speed vac et
dissoudre l'ADN dans le tampon TE.

- 35 -
5.7- Utilisation de la nucléase Bal31
La nucléase Bal31 est un enzyme qui dégrade l'ADN double brin à
partir de ses extrèmités 3' et 5' d'une manière progressive.
5.7.1- Digestion avec Bal31
On digère l'ADN plasmidique avec un enzyme de restriction (ayant
un site unique) pour le rendre linéaire. L'ADN est extrait avec le
phénol-chloroforme puis précipité à l'éthanol et l'ADN est repris dans
100 ~l d'eau distillée pour 10 ~g d'ADN.
Tampon d'incubation de Bal31:
Tris-HCl
20
mM
pH 7,2
NaCl
0,6 M
MgC1
12,5 mM
2
CaC1
12,5 mM
2
EDTA
1
mM
L'incubation se fait à 30°C ..Le tampon de Bal31 est préparé
concentré cinq fois. On ajoute une quantité de tampon spécifique pour
Bal31 (20 ~l de tampon concentré 5 fois pour 100 ~l) à l'ADN dissout
dans l'eau, on préincube 5 mn à 30°C. On ajoute l'enzyme à une
concentration de 0,5 U/~g d'ADN, on récupère à intervalles de 5 mn une
quantité de l'échantillon 10 ~l pour chaque prélèvement. On arrête la
réaction par addition de la solution d'arrêt des enzymes de
restriction. On voit ainsi progressivement la taille du plasmide
diminuer au fur et à mesure que la digestion se poursuit.
5.7.2- Clonage utilisant Bal31
On digère 50 ~g de plasmide avec un enzyme de restriction puis
on fait réagir Bal31 et on prélève les échantillons comme précédemment.
L'ADN de chaque échantillon est précipité à l'EtOH et le culot est
récolté par centrifugation dans l'eau. Comme Bal31 ne digère pas les
deux brins d~ADN à la même vitesse, il se forme donc des monobrins aux
extrémités. Pour cela on remplit les monobrins grâce à l'ADN polymérase
l
(fragment de Klenow) à 30°C pendant 30 mn comme suit.
Remplissage davec l'ADN polymérase l
(fragment de Klenow)
Tampon Nick-translation
10 pl
DTT
10 mM
10 ~l
Solution de chasse (mélange dNTP 0,5 mM)
6 ~l
Fragment de Klenow (Boehringer 5 U/~l)
1 ~l
ADN dans H 0 distillée
72 ~l
2
Incubation 45 mn à 25°C.
La réaction est arrêtée par addition d'EDTA (20 mM concentration
finale) et l'ADN est extrait avec un volume de phénol-chloroforme puis
un volume d'éther. L'éther est enlevé en chauffant à 65°C, l'ADN est
précipité à l'éthanol pendant 30 mn à -70°C. le culot est repris dans
le TE (30 ~l TE pour chaque échantillon). Digérer le plasmide avec un
enzyme de restriction et faire le clonage dans un site à bouts francs.
5.8- Hybridation
5.8.1- Electrotransfert
L'électrotransfert se fait comme décrit par BITTNER et al.
(1980). Photographier et découper le gel sous UV (l'exposition aux UV
introduit des coupures dans l'ADN et facilite le transfert), dénaturer

- 36 -
le gel deux fois 15 mn dans 200 ml d'une solution composée de 0,5 M
NaOH, l M NaCl sans agitation. Rincer le gel trois fois dans de l'eau
distillée puis équilibrer le gel trois fois 15 mn dans les 200 ml de
tampon T (25 mM NaH P0
pH 6,5), le tampon est fait en solution stock
2
4
concentrée 20 fois.
Découper le filtre Nylon Hybond N d'Amersham aux dimensions un
peu plus petites que celles du gel. Equilibrer le filtre de Nylon 5 mn
dans le tampon T. Découper deux feuilles de papier Whatman 3 MM.
Tremper la première feuille dans le tampon T et le poser sur une plaque
de scotch brite, poser le gel sur le papier Whatman, le filtre Hybond
sur le gel, la deuxième feuille Whatman trempée dans le tampon T sur le
gel et puis une deuxième plaque de scotch brite sur le papier. (Après
chaque étape, vérifier l'absence de bulles d'air entre les differentes
couches). Mettre l'ensemble dans un appareil de type IBI Horizontal
Blotting system, modèle HBS 40800 contenant 6 l de tampon T à 4°C.
Le transfert s'effectue à 4°C pendant l heure à 12 V (0,6 A) puis
l ou 2 h à 30 V (1,5 A) ou bien pendant une nuit à 0,45 A (8V). Après
le transfert, enlever le filtre et faire sécher à la température du
laboratoire pendant 20 à 30 mn. L'ADN est fixé· au filtre en exposant le
filtre aux UV pendant 3 à 5 mn. L'efficacité du transfert est vérifiée
en recolorant le gel avec le EtBr.
5.8.2- Nick translation (MANIATIS et al. 1982)
L'ADN qui va être utilisé comme sonde est marqué radioactivement
par nick translation, en utilisant le Kit nick translation N5000
d'Amersham.
Mettre dans un tube Eppendorf 1,5 ml dans l'ordre suivant:
X ~l d'ADN (au plus 20 ~l)
l~g
20 ~l Ki~2so1ution l
nucléotides + tampon
20 ~l a-
P-CTP
Amersham = 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml
(50-X) ~l H 0
distillée stérile
2
10 ~l Kit solution II
enzymes (ADN polymérase l et
endonucléases)
Mélanger en inversant trois fois le tube, centrifuger pendant
quelques secondes à l'Eppendorf et incuber à 15°C pendant 2 à 3 h. La
réaction est arrêtée par addition de 20 ~l d'EDTA 0,5 M pH 8,0.
Préparer une colonne avec l ml de Sephadex G50 Medium (3 g de Sephadex
+ 50 ml de 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 7,5.
Stériliser 15 mn à l'autoclave 1 bar) dans une seringue plastique de 1
ml bouchée avec un bout de laine de verre stérile. Rincer la colonne
avec 4 à 5 ml du même tampon et centrifuger dans une centrifugeuse
clinique IEC, à position 4 pendant 1 mn à température ambiante. Poser
la seringue dans un tube Eppendorf stérile, rajouter le mélange
réactionnel sur la colonne et centrifuger comme précédemment. L'ADN
marqué est récupéré dans le tube d'Eppendorf et peut être stocké à
-20 o C. L'incorporation de radioactivité qui doit être de l'ordre de
8
2 x 10
cpm/~g d'ADN est dosée par la méthode suivante: 1 ~l de
mélange réactionnel est dilué dans 100 ~l d'eau, 20 ~l de cette
dilution sont mélangés avec 50 ~l de kit solution III (ADN porteur) et
2 ml de TCA 10 % froid (20°C) et incuber à OOC pendant 10 mn. L'ADN
précipité est récupéré par filtration sur un filtre de papier de laine
de verre (Whatman GF/C) qui est rincé avec 2 ml de TCA 10 % froid,
sécher et faire le comptage.

- 37 -
5.8.3- Hybridation
Elle se fait comme décrit par SOUTHERN (1975), BEATTY et COHEN
(1983). Mettre le filtre dans un sachet plastique (type spécial
congélation), ajouter 10 ml de solution de préhybridation (préchauffée
à 42°C), éliminer les bulles d'air et sceller le sachet. Incuber le
sachet à 42°C pendant au moins 1 h dans un bain-marie ou à l'étuve sans
agitation.
Solution de préhybridation (pour 10 ml)
20X SSPE (3,5 M NaCl, 0,2 M NaH P0 , 0,1 M NaOH,
2
4
20 mM EOTA, pH 7,0)
2,5 ml
50X Oenhardt's solution (1% BSA, 1% Ficoll-400,
1% polyvinylpyrrolidone, PVP-40)
1,0 ml
ADN de sperme de saumon (10 mg/ml dans 10 mM Tris-HCl
pH 7,4, 1 mM EOTA, stériliser par autoclavage
et refroidir dans la glace
0,1 ml
Formamide (déionisé avec 1 g de Bio-Rad analytical
grade mixed bed resin AG 501-X8 (0) par
100 ml de formamide pendant 1 h)
5,0 ml
10 % SOS
0,3 ml
H 0 distillée
1,1 ml
2
Pendant la préhybridation, dénaturer la sonde : mélanger 10 à 20
~l de sonde avec 0,5 ml de solution d'hybridation et chauffer à 95°C
pendant 15 mn. Puis refroidir rapidement dans un mélange éthanol-glace
(2 mn). Vider le sachet et enlever l'excès de liquide à l'aide d'une
pipette ou une baguette en verre. Mélanger la sonde dénaturée avec
9,5 ml de solution d'hybridation, ajouter dans le sachet, éliminer les
bulles d'air et refermer le sachet. Incuber à 42°C pendant 16 à 48 h
sans agitation.
Solution d'hybridation (pour 10 ml)
20X SSPE
2,5 ml
50X Oenhardt's
0,2 ml
ADN de sperme de saumon 0,1 ml
Formamide
5,0 ml
10 % SOS
0,3 ml
H 0 distillée
1,9 ml
2
Après hybridation, reprendre le filtre et le laver 3 x 10 mn dans
200 ml de 2X SSPE, 0,2 % SOS à 45°C (lavage non stringent) ou 2 x 15 mn
dans 2XSSPE, 1 x 30 mn dans 2XSSPE, 0,1 % SOS et 1 x 10 mn dans 0,2SSPE
à 60°C (lavage stringent) avec agitation à 50 t/mn. Après le lavage le
filtre est séché et puis mis en autoradiographie.
5.9- Expression des gènes clonés
5.9.1- Les minicellules
Milieux de culture et tampons
- Milieu M9 sans acide aminé
Mg S04
1,0 M
10 ml
CaCl
0,1 M
10 ml
Solu~ion de sels 10 X
100 ml
Glucose
20 %
10 ml
Thiamine-HCl
4 mg/ml
1 ml
Complèter à
1000 ml

- 38 -
- Milieu Mg avec acides aminés
Casamino acid
20 %
20 ml
Thréonine
SO mg/l
1 ml
Leucine
40 mg/l
1 ml
- Solution de sels 10 X
Na2HPOJ12H20
70 g
KHl04
30 g
Na 1
50 g
NH~Cl
10 g
H
à 1 000 ml
2
- Tampon BSG 10 X (pH 7,0)
Na HP0 12H O
0,6 %
2
4
2
KHl04
0,3 %
Na 1
S,5 %
Gélatine'
1 mg/ml
- Tampon LI (pH 6,S)
Tris-HCl
125 mM
Lysozyme
1 mg/ml
- Tampon de lyse
Tris-HCl
125 mM
EDTA
12 mM
SDS
1,2 % (p/v)
Saccharose
12 %
Bleu de bromophénol
0,04 %
a. mercaptoéthanol
60 mM
Na C0
60 mM
2
3
Préparation des gradients
%
Percoll
Mg sans acide aminé
BSG
H 0
Volume total
2
5X
10 X
stérile
10 %
10 ml
20 ml
10 ml
60 ml
100 ml
15 %
15 ml
20 ml
10 ml
55 ml
100 ml
30 %
120 ml
SO ml
40 ml
160 ml
400 ml
Solution de méthionine à 20 mM dans l'eau et stériliser.
Solution MAM ("methionine assay medium" de Difco) : Dissoudre 10,5 g
dans 100 ml d'eau distillée et autoclaver.
Solution de TCA 5 % (p/v) contenant 0,1 % (p/v) de méthionine.
Culture de la souche P67S-54 et de ses transformants
Inoculer la veille 10 ml de milieu LB contenant l'antibiotique
approprié. Le lendemain inoculer 100 ml de milieu LB contenant les
divers antibiotiques selon les cas. Agiter à 37°C durant S h. Ajouter
la spectinomycine à 300 ~g/ml et laisser agir la nuit. Les cellules et
les minicellules sont récoltées par centrifugation à 10 000 t/mn durant
15 mn dans le rotor JA-14 avec la centrifugeuse BEKMAN J-21. Les
cellules sont lavées avec du milieu Mg et le culot est remis en
suspension dans 100 ml de milieu Mg contenant les acides aminés et les
antibiotiques appropriés. Agiter la culture la nuit.
Isolement des mini cellules
Mettre les cultures sur la glace, diluer avec un volume de Mg
froid, centrifuger à 2000 t/mn durant 5 mn dans le rotor JA-14 et
conserver le surnageant qui est enrichi de minicellules. On centrifuge
le surnageant à 10000 t/mn pendant 15 mn et on garde le culot. Le culot
est remis en suspension dans 2 ml de BSG froid, agiter avec le barreau
magnétique à froid sur la glace pendant 5 mn pour avoir une suspension
homogène. Préparer le gradient de Percoll transférer 1 ml de la
suspension sur le gradient, centrifuger à 5000 t/mn dans le rotor SW41

- 39 -
avec la centrifugeuse KONTRON-50 durant 5 mn à 4°C. Les minicellules
sont séparées des cellules en une couche supérieure du gradient.
Recueillir les bandes de minicellules avec une pipette Pasteur à bout
recourbé et mettre dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger 2 mn à
40C enlever le surnageant et remettre le culot en suspension dans
0,5 ml de BSG froid lentement pour éviter un choc osmotique. Transférer
la suspension sur un deuxième gradient et centrifuger à 5000 t/mn
durant 5 mn comme précédemment et recueillir les minicellules.
Centrifuger durant 2 mn à l'Eppendorf et le culot est remis en
suspension dans 1 ml de M9 sans acide aminé. Mesurer la 0.0 à 620 nm de
façon à obtenir une 0.0 de 0,6. Etaler quelques ~l sur milieu LB pour
voir le nombre de cellules viables.
Pré incubation
Ajouter à 400 ~l de minicellules, 100 ~l de milieu MAM, incuber
durant 15 mn à 37°C, centrifuger à 12000 g durant 40 s et bien se
débarasser du surnageant conserver les minicellules à OOC.
Incorporation
Resuspendre le culo
dans 400 ~l de M9 sans acide aminé et
g5
contenant 20 ~Ci/ml de (S
) méthionine (800 Ci/mmole de CEA-SACLAY),
plus 100 ~l de MAM. Incuber durant 30 mn à 37°C. Faire une cinétique
d'incorporation toutes les 5 mn. Ajouter 10 ~l de méthionine froide à
20 mM et incuber à 37°C durant 2 mn. Centrifuger à 12000 g durant 40 s,
décanter soigneusement et faire l'extraction immédiatement ou congeler
le culot à -20°C pour utilisation future.
Digestion des échantillons
Au culot des minicellules, ajouter 12 ~l de tampon LI, incuber à
40C pendant 15 mn, ajouter 37 ~l de tampon de lyse. Chauffer à 100°C
durant 1 mn, centrifuger à 12000 g pendant 30 s, déposer 20 ~l sur gel
de polyacrylamide contenant du SOS. Après migration, le gel est fixé,
coloré, décoloré et séché puis mis en autoradiographie.
5.9.2- Les maxicellules (SANCAR et al., 1979
PERBAL,
1984 ; PUHLER et TIMMIS, 1984)
La souche E. coli CSR603 est utilisée pour détecter les protéines
produites par des gènes portés sur un plasmide car elle est sensible
aux UV.
Cette souche portant un plasmide est ensemencée dans du milieu M9
contenant 1 % de casmino acides, les acides aminés pour lesquels la
souche est auxotrophe et les antibiotiques appropriés du plasmide. On
incube une nuit à 37°C.
Au deuxième jour, on inocule 10 ml de milieu M9 qui est dans des
Erlen meyer de 100 ml avec 0,5 ml de la préculture et incubation à 37°C
jusqu'à une 00
= 0,6. Transférer les cultures dans des boites de
590
Pétri stériles et faire une irradiation aux UV onde courte (254 nm)
lampe placée à 45 cm de la culture jusqu'à ce que la quantité de
cellules vivantes soit réduite à moins de 500 cellules par ml de
culture. Etaler 0,1 ml de culture sur milieu LA pour voir le nombre de
cellules vivantes. Transférer les cellules irradiées dans des Erlens de
100 ml stériles. Continuer l'incubation à 37°C avec agitation pendant
1h. De la D-cyclosérine (0,2 ml à 20 mg/ml) est ajoutée aux cultures
(l~ cyclosérine tue les cellules qui ont résisté à l'irradiation) et
continuer l'incubation à 37°C avec agitatio~ une nuit.
Le troisième jour prendre 1,5 ml de la culture irradiée et
centrifuger. Le culot est lavé avec du milieu M9 et est remis en

- 40 -
suspension dans 0,75 ml de M9. Les cellules lavées sont transférées
dans des tubes de §0 ml et incubées pendant 1 h à 37°C dans un bain-
3
marie. 25 ~ci de
S-méthionine sont additionnés à chaque échantillon
et incuber à 37°C pendant 1h. Centrifuger les cellules, laver avec du
milieu M9. Reprendre le culot en suspension dans 40 ~l de tampon de
lyse. Placer dans l'eau bouillante pendant 3 mn et déposer 20 ~l sur
gel SDS-polyacrylamide. Après électrophorèse, le gel est fixé, coloré
et décoloré et séché puis faire une autoradiographie des gels.
5.9.3- Les plasmides d'expression
Ce sont des plasmides qui portent des promoteurs forts thermo-
inductibles ou inductibles à l'IPTG (REMAUT et al., 1981, 1983 j AMANN
et al., 1983 j de BOER et al., 1983).
Le promoteur thermo-inductible est le promoteur pL du bactério-phage~
(REMAUT et al., 1981). Le plasmide utilisé est le plasmide pPLC2819 qui
porte le promoteur pL de ~ • On fait pousser la souche E. coli K-
12~H1~trp transformée avec ce plasmide ou ses dérivés dans 5 m1 de
8
milieu LB sans antibiotique, à 28°C jusqu'à une densité de 2.10
cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation et remises
en suspension dans 5 ml de milieu M9 supplémenté avec 1 mM MgS0
7H 0,
4
2
0,2 % glucose, 0,05 % de casmino acide, 0,01 % extrait de ~evure et 50
~g/ml de L-trytophane. Continuer l'incubation à 28°C pendant 1 h.
Transférer la moitié de la culture à 42°C et à diffé1ants temps ajouter
2,5 ~ci/ml d'un mélange d'acides aminés marqués au C
• Laisser incuber
à 42°C pendant 10 mn, centrifuger la culture et lyser dans le tampon de
lyse. Chauffer 5 mn dans l'eau bouillante et traiter l'échantillon
comme dans les maxicellules.
Le promoteur inductible par l'IPTG est le promoteur tac porté par le
plasmide pKK223-3 (Pharmacia). L'induction se fait comme décrit par
AMANN et al., (1983).
La souche E. coli JM105 transformée avec. le plasmide pKK223-3 ou
ses dérivés pousse sur milieu LB à 37°C jusqu'à une D0
= 0,7.
600
Additionner l'IPTG à une concentration finale de 1 mM, continuer
l'incubation à 37°C pendant 2 h. Traiter les échantillons pour
l'électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide comme dans les
maxicellules.

CHAPITRE III -
LOCALISATION DES MUTATIONS NIF SUR
LE CHROMOSOME DE ft. CAPSULATUS
-- --=-- - =-=-=-=-=-

-
41 -
CHAPITRE III - LOCALISATION DES MUTATIONS NIF SUR
LE CHROMOSOME DE R. CAPSULATUS
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-
La génétique des gènes nif de R. capsulatus au début de ce
travail était très peu étudiée. On savait que la bactérie R. capsulatus
avait une forte capacité pour fixer l'azote, mais du point de vue
génétique de la fixation d'azote, très peu de choses étaient connues.
Nous avons cherché à localiser les gènes nif de R. capsulatus sur le
chromosome et à en déterminer leur organisation.
1- Isolement et caractérisation des mutants Nif-
L'étude des gènes nif implique l'isolement de mutants Nif-
Les
mutants Nif- sont des mutants qui ne peuvent pas fixer l'azote, c'est-
à-dire qui sont incapables de pousser sur milieu où l'azote
atmosphérique est la seule source d'azote. Quand j'ai commencé ce
travail, certains mutants Nif- étaient déjà isolés au laboratoire ainsi
que certains mutants auxotrophes. (WILLISON et VIGNAIS, 1982).
Mutants obtenus à partir de la souche B10 : Les mutants isolés à partir
de la souche sauvage B10 ont été obtenus en mutagénisant cette souche
avec le NTG. Trois procédés de sélection ont été utilisés pour la
sélection des mutants Nif- : la sélection sur métronidazole en milieu
liquide, la sélection sur métronidazole en milieu solide et la
sélection par enrichissement à la pénicilline. La sélection des mutants
auxotrophes a été faite essentiellement par enrichissement à la
pénicilline. (WILLISON et VIGNAIS, 1982).
Mutants obtenus à partir de la souche J50 : J'ai effectué des
expériences de mutagénèse avec la souche R. capsulatus J50 obtenue de
J.D. WALL (Université du Missouri à Columbia, USA). Cette souche,
dérivée de B10, est auxotrophe pour l'histidine (his-1). J'ai utilisé
cette souche en vue de l'obtention de doubles mutants His-Nif- pour les
études de liaison entre his-1 et les mutations nif, car chez
K. pneumoniae, les gènes nif sont situés à côté de l'opéron histidine.
J'ai utilisé comme agent mutagène l'EMS et la sélection des mutants

- 42 -
Nif- s'est faite sur milieu solide contenant du métronidazole. Par
cette méthode, 50 % des cellules vivantes, mutagénisées et étalées sur
le milieu contenant le métronidazole ont été His-Nif-. Dans le témoin,
c'est-à-dire la souche J50, qui n'a pas été mutagénisée, l'étalement
des cellules sur boîte contenant du milieu avec métronidazole a permis
d'obtenir autant de mutants Nif-. On peut supposer que la plupart des
mutants obtenus par sélection sur métronidazole sont des mutants Nif-
spontanés. Le rôle du métronidazole dans la sélection des mutants Nif-
n'est pas très clair. Le métronidazole accepte les électrons à partir
de donneurs d'électrons à bas potentiel comme la ferrédoxine. La
ferrédoxine est effectivement un donneur d'électrons à la nitrogénase
(HALLENBECK et al., 1982c) et il a été montré par SCHMIDT et al. (1977)
que les produits de réduction du métronidazole, obtenus à la lumière,
sont toxiques pour les cellules photosynthétiques. D'autre part,
YAKUNIN et GOGOTOV (1983) ont montré qu'un deuxième type de ferrédoxine
(ferrédoxine I) était synthétisé par Ro capsulatus poussant en
diazotrophie. En conséquence, la sélection de mutants spontanés Nif-
pourrait résulter du fait que les cellules Nif+, en synthétisant
davantage de molécules de ferrédoxine capables de réduire le
métronidazole, donc de produits toxiques, seraient détruites
préférentiellement aux cellules Nif-. Néanmoins, nous n'avons pas
encore trouvé d'explication pour la sélection préférentielle de mutants
de type NifA-.
Douze des mutants His-Nif- obtenus (GAlOl à GAl12) ont été gardés
pour des études approfondies. Dans ces douze mutants, dix (GAlOl à
GAllO) proviennent de la souche ayant été traitée par l'EMS et deux
(GAlll et GAl12) proviennent de la souche non mutagénisée et seraient
donc des mutants spontanés.
2- Localisation des mutations nif' sur le chromosome de R. capsulatus
L'isolement des mutants Nif- nous a conduit à l'étude de la
localisation des mutations nif' et de l'organisation des gènes nif' chez
R. capsulatus. Nous nous sommes posés la question de savoir si les
gènes nif' de R. capsulatus se trouvent sur le chromosome ou bien s'ils
sont localisés sur un plasmide comme c'est le cas dans certaines
espèces de Rhizobium (ex: R. leguminosarum (NUTI et al., 1979».
L'étude de la localisation et de l'organisation des gènes nif' chez

- 43 -
R. capsulatus a été effectuée en utilisant la conjugaison qui présente
l'avantage, par rapport à l'agent de transfert des gènes (GTA), de
transférer de gros morceaux d'ADN, donc un grand nombre de gènes, alors
que le GTA transfère de petits morceaux d'ADN de 3 à 4kb (le GTA est
plutôt utilisé pour affiner la cartographie des gènes qui sont proches
(YEN et al., 1976)).
Pour la conjugaison, nous avons utilisé le plasmide pTH10
(HARAYAMA et al., 1980). Le plasmide pTH10 est un plasmide de type R,
dérivé du plasmide RP4. Il porte 3 gènes de résistance aux
antibiotiques (tétracycline, kanamycine et ampicilline). La résistance
à l'ampicilline n'est pas exprimée chez R. capsulatus (WILLISON et al.,
1985). Chez E. coli, le plasmide pTH10 est thermosensible mais il ne
l'est pas chez R. capsulatus (WILLISON et al., 1985). Le plasmide pTH10
mobilise les gènes de R. capsulatus et les transfère d'une souche à une
-6
-5
autre avec une fréquence de l'ordre de 10
à 10
par cellule
receveuse. Le transfert des gènes dans les souches de R. capsulatus à
l'aide du plasmide pTH10 s'effectue à partir de plusieurs origines
parce que tous les marqueurs sont transférés avec une fréquence
semblable.
Les souches de R. capsulatus RC101, RC103 et GA100 auxotrophes
pour l'isoleucine-valine ilv-10 portant le marqueur chromosomique très
stable et le plasmide pTH10, ont été utilisées comme souches donneuses
dans les expériences de conjugaison. En plus des résistances aux
antibiotiques portés par le plasmide pTH10, ces trois souches (RC101,
RC103 et GA100) sont résistantes aux antibiotiques suivants :
rifampicine (rif-l) pour RC101, rifampicine (rif-l) et streptomycine
(str-l) pour RC103 et novobiocine (nov-l) pour GA100. Les résistances à
ces antibiotiques sont chromosomiques. La résistance chromosomique à
l'antibiotique permet de calculer la fréquence de co transfert entre
deux marqueurs (auxotrophie ou résistance à antibiotique). On
sélectionne d'abord les mutants pour un marqueur donné (nif,
auxotrophie), puis on recherche si les colonies sont résistantes à
l'antibiotique. S'il y a résistance à l'antibiotique, c'est que les
deux gènes sont portés par le morceau transféré et sont donc liés.
La
fréquence de cotransfert est le rapport entre le nombre de colonies
résistantes à l'antibiotique (2ème caractère sélectionné) au nombre
total de colonies obtenues après conjugaison (1er caractère
sélectionné).

- M -
Nbre de colonies résistantes
fréquence de cotransfert c =
Nbre total de colonies sur milieu sélectif
En connaissant cette fréquence de cotransfert, c, on peut
calculer la distance entre les deux gènes. La distance entre les deux
~
gènes est calculée par la formule suivante: d = 1 -~
(WU, 1966).
Cette formule utilisée dans la transduction généralisée a été
aussi appliquée pour le transfert des gènes par conjugaison chez
Rhizobium meliloti en utilisant le plasmide R68.45 (KONDOROS1 et al.,
1977). Cette formule a été utilisée parce que les distances calculées
sont additives . Les mutants His
Nif- ont été utilisés pour établir la
liaison entre his-1 et les mutations nif. La distance entre l'allèle
his-1 et les allèles nif est calculée par la même formule en
sélectionnant d'abord pour Nif+ puis en déterminant parmi les colonies
Nif+ celles qui sont aussi His+ ou bien en
sélectionnant d'abord pour
His+ et en déterminant ensuite les colonies qui sont Nif+. Des mutants
auxotrophes ont aussi été utilisés pour ces expériences de conjugaison.
Ce sont ceux qui portent les allèles ura-1, ura-2, bio-2a, ade-2, his-
1. Les mutants double auxotrophes ont permis d'estimer la distance
entre les deux allèles.
Les résultats de ces expériences de conjugaison avec les mutants
Nif- sont les suivants
- Des mutations ·nif montrent une liaison avec les gènes de
résistance à la rifampicine et à la streptomycine (souche RC103). Les
gènes de résistance à la rifampicine et à la streptomycine sont très
proches dans le chromosome de R. capsulatus (Fig. 111-1). Les mutations
nif qui montrent une liaison avec rif-1 et str-1 sont : nif-l, nif-3,
nif-8 et nif-9 obtenues par mutagénèse avec le NTG et sélectionnées sur
métronidazole en milieu liquide, les mutations nif-16, nif-18, nif-24
obtenues par sélection sur milieu solide contenant du métronidazole,
ainsi que la mutation nif88 qui est spontanée et qui montre une liaison
avec rif-1 et str-1. La fréquence de cotransfert entre ces mutations
nif et les mutations rif-1 et str-1 est de l'ordre de 6 à 10 %.
- Un autre groupe de mutations nif montre une liaison avec le
gène de résitance à la novobiocine (nov-1) porté par GA100. Dans ce
groupe de mutations nif, i) la mutation nif-85, contenue dans GA108,
obtenue par sélection sur milieu solide contenant du métronidazole,
montre une fréquence de cotransfert de l'ordre de 70 % avec nov-1 ;

- 45 -
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1
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CO
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0,65-0,76


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b
,
,
0,07
~
0,17
4

0,3
4

0,49
4

Fig.. III-l : Différents groupes de mutations nif sur Le chromosome de
R. Cap8uLatUS montrant Les distances entres Les différentes
mutations.
a) Groupe de mutations nif montrant une Liaison avec rif-l et
str-l.
b) Groupe de mutations nif montrant une Liaison avec nov-l.

- 46 -
ii) l'autre mutation est la mutation nif-32 obtenue par enrichissement
à la pénicilline qui montre une fréquence de co transfert de l'ordre de
10 % avec nov-l.
- Les mutations nif du troisième groupe sont celles qui ne
montrent de liaison ni avec rif-l et str-l, ni avec nov-l. Dans ce
groupe de mutations figurent les mutations nif-4 et nif-IO obtenues par
sélection sur métronidazole en milieu liquide.
Les résultats des expériences avec les mutants auxotrophes sont
les suivants :
Les mutations his-l, ura-l et ade-2 montrent une liaison avec
rif-l et str-l (fig. III-1)
; les mutations ura-2 et bio-2a montrent
une liaison avec nov-l avec des fréquences de cotransfert
respectivement de 58 % et 37 %.
Les résultats des expériences avec des mutants His-Nif- ont
montré que toutes les mutations nif affectant les mutants montrent une
liaison avec his-l avec une fréquence de cotransfert de l'ordre de 10 %
sauf pour la mutation nif-85 qui ne montre pas de liaison avec his-le
Les résultats présentés ci-dessus indiquent que les gènes nif de
Ro capsulatus sont localisés sur le chromosome car certaines mutations
nif présentent des liaisons avec les gènes de résistance aux
antibiotiques portés par le chromosome. Du point de vue organisation,
ces gènes nif sont dispersés dans plusieurs endroits du chromosome
bactérien car nous avons au moins 3 groupes de gènes nif :
- groupe l des mutations nif qui montrent une liaison avec rif-l
et str-l
- groupe II des mutations nif qui montrent une liaison avec nov-l
- groupe III des mutations nif qui ne montrent pas de liaison ni
avec str-l et rif-l ni avec nov-le
3- Caractérisation des mutants Nif-
Du point de vue de la croissance sur milieu RCV-N où l'azote
atmosphérique est seule source d'azote, la plupart des mutants Nif- ne
présentent pas de croissance sauf pour certains mutants qui portent les
mutations nif-4 et nif-IO qui sont "leaky ", c'est-à-dire qui poussent
en confluence lentement mais sont Nif-.

- 47 -
A
8
7
12
6
12
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'0',
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C/
a
b
c
E
Fig. III-2 ~ RésuLtats des immunodiffusions des différents mutants Nif- et de
La souche sauvage B10.
Dans Les puits centraux, Les anticorps anti protéines à MoFe
(anti Rcl,(I)) et anti protéine à Fe (anti RcII, (II)) ont été
déposés; Les puits extérieurs ont reçu 10}-'-L d'extraits bruts des
souches suivantes :
- En A et B : 1 =RC1, 2 =RC2, 3 =RC4, 4 =B10 ayant poussé sur
+
2 mM NH
' 5 = RC5, 6 =RC6, ? =B10 ayant poussé sur 15 mM
4
+
NH4 ' 8 =RC8, 9 =RC9,
10
=RC10, 11 = RCll, 12 =RC12.
+
- En C : 1 =B10 ayant poussé sur 2 mM NH
' 2 =GA103,
4
3 = GA106, 4 =GA108, 5 =GAllO, 6 = GAlll.
- En D et E : 1 = B10 ayant poussé sur 2 mM NH +, 2 = RC?,
4
3 =RC13, 4 = RC14, 5 = RC15, 6 = RC16, ? = B10 ayant poussé
+
sur 15 mM NH
' 8 =RC1?, 9 =RC18, 10 =RC19, 11 =RC20,
4
12 = RC21.

- 48 -
Souche
Protéine à MoFe (Rel)
Protéine à Fe (RcII )
souche sauvage B10
+
+
RCl
+
RC3
+
RC4
+
+
RC5
+
+
RC6
+
+
RC7
:!:
RCS
+
RC9
+
+
RC10
+
+
RCll
+
+
RC12
+
+
RC13
+
+
RC14
+
+
RC15
+
-
RC16
RC17
RC1S
RC19
RC20
RC2l
RC22
RC23
RC24
RC25
+
+
RC26
±
+
RC27
+
+
RC32
±
RC33
RC34
+
RC35
+
+
RC40
:!:
RC4l
±
GA10l
GA102
GA103
GA104
GA105
GA106
GA107
GA10S
GAllO
GAl1l
TabLeau III-l : RésuLtats des expériences d'immunodiffusion avec Les souches
de R. cap8utatus ayant poussé sur 2 mM NH + .
4
+ : Synthèse de La protéine.
t
Très peu de synthèse de La protéine.
Pas de synthèse de La protéine.

- 49 -
Du point de vue activité nitrogénase in vivo, tous les mutants du
groupe l n'ont pas d'activité nitrogénase ainsi que les mutants du
groupe II. Les mutants du groupe III qui sont :'leaky" présentent 20 %
d'activité nitrogénase par rapport à la souche sauvage. (WILLISON et
VIGNAIS, 1982)
La caractérisation des mutants s'est faite essentiellement par
immunodiffusion selon OUCHTERLONY (1967) en utilisant les anticorps
dirigés contre les protéines de structure de la nitrogénase :
l'anticorps anti-RcI pour le composant l
(ou protéine à MoFe) ,
l'anticorps anti-RcII pour le composant II (ou protéine à Fe). Les
anticorps ont été purifiés au laboratoire par C. MEYER et Y. JOUANNEAU
(JOUANNEAU et al., 1983).
Pour témoin, nous avons utilisé la souche sauvage B10 qui a
poussé sous deux conditions: en excès d'ammoniaque (15 mM NH +) où il
4
n'y a pas synthèse des protéines de la nitrogénase, et en limitation
d'ammoniaque (2 mM NH +) où il y a synthèse des produits de la
4
nitrogénase. Le témoin a été utilisé pour tester la spécificité des
anticorps et quantifier la teneur des souches en composants l et II.
Les résultats de ces expériences sont montrés dans le tableau 111-1 et
la figure 111-2.
Les expériences d' immunodiffusion montrent que, :
- Chez certains mutants, il manque un composant de la
nitrogénase, soit le composant l ( cas des mutants RC15 ou RC32) , soit
le composant II ( cas des mutants RC1, RC3 et RC8).
- Chez d'autres mutants, il manque les deux composants de la
nitrogénase
(cas des mutants RC16, RC18, RC24 , GA108, GAllO, GA111).
- Chez d'autres mutants, les deux composants de la nitrogénase
sont présents mais ces mutants sont incapables de pousser (ou poussent
très lentement) en présence d'azote atmosphérique COmme seule source
d'azote (cas des mutants RC4, RC7, RC10 ou RC27).
Les résultats des expériences obtenus par immunodiffusion ont été
confirmés par immunoélectrophorèse et publiés dans l'article de
WILLISON et al. (1985).
4- Discussion
Les mutants Nif- de R. capsulatus ont été isolés après mutagénèse
par le NTG ou l'EMS et sélectionnés sur milieu contenant du
métronidazole. Le métronidazole donne un bon rendement de mutants Nif-,

50 -
mais l'inconvénient est que plusieurs mutants obtenus avec le
métronidazole sur milieu solide semblent être des mutants spontanés car
on obtient aussi beaucoup de mutants Nif- avec la souche non
mutagénisée (J50). Cette caractéristique dépend toutefo1s de la souche
sur laquelle a été faite la mutagénèse. Ave~la souche sauvage B10, un
faible taux de mutants Nif- (moins' de 2 %) est obtenu (J.C. WILLISON,
communication personnelle) alors que dans la souche J50, auxotrophe
pour l'histidine, on obtient autant de mutants Nif- spontanés. La
plupart des mutants spontanés sont identiques, c'est-à-dire que les
mutations sont localisées au même endroit du chromosome bactérien.
L'analyse génétique des mutants Nif- nous a permis de localiser
les mutations nif sur le chromosome de R. capsulatus, ce qui n'es~ pas
le cas de certaines souches de Rhizobium ou de Frankia où les gènes nif
sont localisés à la fois sur le chromosome et sur un mégaplasmide
(SIMONET et al., 1986). Contrairement à Ka pneumoniae où les gènes nif
sont groupés en un seul endroit du chromosome (DIXON 1984), chez
R. capsulatus il existe au moins trois groupes de gènes nif dispersés
en plusieurs endroits du chrom9some. Les expériences de transfert
génétique de WALL et BRADDOCK (1984), utilisant le GTA pour localiser
des gènes nif dans le chromosome de R. capsulatus ont abouti à la même
conclusion. Ces auteurs ont trouvé 5 groupes de gènes nif mais n'ont
pas montré l'organisation des gènes dans le chromosome de
R. capsulatus. Dans notre Laboratoire, Les expériences sur
l'organisation des gènes nif sur le chromosome de Ra capsulatus ont été
poursuivies et ont conduit à l'établissement d'une carte circulaire du
chromosome (WILLISON et al., 1985). Quatre grands groupes de gènes nif
ont été identifiés dispersés dans le chromosome de R. capsulatus. La
carte circulaire, représentée sur la fig. 111-3, montre la localisation
des gènes nif dans différentes parties du chromosome.
Les mutants Nif- ont été caractérisés immunologiquement et nous
avons obtenu trois types de mutants : des mutants auxquels il manque
les deux composants de la nitrogénase, des mutants qui possèdent les
deux composants de la nitrogénase mais inactifs et des mutants qui ne
synthétisent qu'un seul composant de la nitrogénase.
Dans les mutations nif du groupe 1, c'est-à-dire celles qui
montrent une liaison avec rif-l et str-l, nous avons identifié
plusieurs types de mutations. Les mutations dans le gène de structure
nifH, cas des mutations nif-l, nif-3 et nif-8, qui empêchent la

- 51 -
Ilif-4,IO,26 (~)
Ilif-7,/5,32
Iyr-/
ura-2
/eu-4
nif-85/nol'-/
bio-2a
i/t'-/O
\\ er)'-l
rif-J /slr-/
gillA
mr-27
ntr-28
/
ura-/
mr-29
IV
1
IlIr-J4
1lif-/7
nifH(D,K)
Ilif-J5
nifA (?)
his-J
~Ot'-9
--------
ade-2
Fig. III-J : Carte circuLaire du chromosome de R: capsuLŒtus indiquant
L'empLacement des différents groupes de gènes nif. Les mutations
nif-l, nif-3, nif-B et nif-9 sont représentées par nifU et Les
mutations de type nifA du groupe I (ex. nif-16, nif24, nif-BB)
sont représentées par nifA (?) sur La carte (WILLISON et aL.,
19B5) •

- 52 -
synthèse de la protéine à Fe. Un mutant affecté dans le gène nifH
(mutation nif-9) synthétise les deux composants de la nitrogénase.
Cette mutation nif-9 permet la synthèse d'une protéine à Fer identifiée
par immunodiffusion mais la protéine est inactive, l'activité
nitrogénase dans cette souche est rétablie quand on ajoute de la
protéine à Fe active. Le dernier type de mutations nif dans ce groupe l
(qui présente une liaison avec rif-1_ et str-1) sont les mutations nif-
16, nif-19, nif-24, nif-33 et nif-88. Ces mutations provoquent le
manque de synthèse des deux composants de la nitrogénase et
apparaissent être de type nifA car ces mutations ressemblent aux
mutations dans le gène nifA de K. pneumoniae (DIXON et al., 1977).
Les mutations nif du groupe l ont aussi été étudiées par le GTA
qui permet une analyse fine de la localisation des gènes ; deux groupes
de mutations séparées d'environ 2700 bp. ont ainsi pu être mis en
évidence (WILLISON et al., 1985) :
- Le groupe I-A contient les mutants RC1, RC3 et RC8 dépourvus en
protéine à Fe et le mutant RC9 qui, a une protéine à Fer inactive.
- Le groupe I-B contient les mutations nif obtenues par sélection
sur milieu solide contenant du métronidazole (WILLISON et VIGNAIS,
1982), toutes les mutations nif obtenues avec la souche J50 (sauf nif-
85), ainsi que toutes les mutations spontanées obtenues de J50 et les
mutations spontanées
obtenues sur cultures continues de BIO (ALLIBERT et al., 1984). Les
mutants du groupe I-B sont dépourvus des deux composants de la
nitrogénase et apparaissent être de type nifA.
Les mutants de type NifA- du groupe l (I-B) ont été étudiés en
détail à l'aide du GTA pour essayer de déterminer la longueur du gène.
Ces études ont montré que les mutations dans les mutants de type NifA-
sont localisées sur une longueur d'environ 1,4kb entre la mutation
nif-88 et la mutation nif-19 qui se trouvent aux 2 extrémités. Le gène
de type nifA occuperait donc sur le chromosome une longueur d'au moins
1,4kb (WILLISON et al., 1985).
Dans les mutations du groupe II, c'est-à-dire celles qui montrent
une liaison avec le gène de résitance à la novobiocine (nov-1), deux
types de mutations sont observées :
- La mutation nif-85 qui conduit à l'absence de synthèse des
2 composants de la nitrogénase et apparait donc aussi être une mutation
de type nifA. Lê mutant portant la mutation nif-85 a été obtenu par

- 53 -
sélection sur milieu solide contenant du métronidazole. C'est la seule
mutation du groupe qui montre un manque de synthèse des composants de
la nitrogénase, et l'on peut se demander si d'autres mutations dans ce
gène présenteraient le même phénotype.
- Les mutations nif-7, nif-15 et nif-32 qui ne permettent qu'une
faible synthèse de protéine à Fe et pas de synthèse de la protéine à
MoFe. Ces mutations sont localisées dans un gène affectant la synthèse
ou la stabilité du composant l
; la synthèse ou la stabilité du
composant II est affectée indirectement.
Dans le groupe III, on trouve les mutants portant les mutations
nif-4, nif-10 et nif-26, qui synthétisent les deux composants de la
nitrogénase. Ces mutants sont des mutants "leaky" pour la croissance
sur RCV-N mais la croissance est très lente et il est difficile de
distinguer les souches Nif+. L'activité nitrogénase dans ces mutants
est d'environ 20 % de la souche sauvage. Le composant l est moins actif
que le composant II dans ces souches. Ces mutants sont affectés dans
l'utilisation du molybdène (pour l'incorporation dans le composant 1),
l'activité nitrogénase dans ces souches est stimulée par addition du
molybdate (WILLISON et al., 1985). Ces mutants ressemblent
phénotypiquement aux mutations dans le gène nifQ de K. pneumoniae
(IMPERIAL et al., 1984).
5- Conclusion
L'utilisation des agents mutagènes, EMS et NTG, nous a permis
d'isoler des mutants Nif- de R. capsulatus. Les mutants isolés ont
surtout été obtenus par sélection sur milieu contenant du
métronidazole. Le métronidazole permet l'enrichissement en mutants Nif-
En utilisant la souche J50, la plupart des mutants obtenus par
sélection sur métronidazole sont des mutants Nif- spontanés.
L'utilisation du plasmide pTH10, introduit dans certaines souches
de R. capsulatus. nous a permis de faire des conjugaisons avec des
mutants Nif- et de localiser au mo1ns trois groupes de gènes nif. Le
groupe l contient les mutations présentant une liaison avec les gènes
de résistance à la rifampicine et la streptomycine ; le groupe II
comprend les mutations nif qui montrent une liaison avec le gène de
résistance à la novobiocine et dans le groupe III se trouvent des
mutations nif qui ne montrent de liaison avec aucun des gènes de

-
54 -
résistance à ces trois antibiotiques. L'emploi des anticorps dirigés
contre les composants de la nitrogénase de R. capsulatus nous a permis
de caractériser par immunodiffusion, les différents mutants Nif-. Nous
avons les mutants qui possèdent les deux composants de la nitrogénase,
des mutants qui ne possèdent qu'un seul composant de la nitrogénase et
les mutants chez lesquels les deux protéines de la nitrogénase sont
absentes.
Cette caractérisation à l'aide des anticorps nous a permis de
déterminer que les mutations nif contenues dans différents groupes
affectent plusieurs gènes du groupe.
Dans le groupe l, nous avons des mutations qui affectent la
synthèse du composant l de la nitrogénase, ce sont des mutations dans
le gène nifH et les mutations qui affectent la synthèse des deux
composants de la nitrogénase. ces mutations sont de type nifA. Le gène
de type nifA de R. capsulatus est voisin des gènes de structure de la
nitrogénase.

CHAPITRE IV -
CONSTRUCTION D'UNE BANQUE DE GENES DE R. CAPSULATUS BIO
ET RECHERCHE D'UN FRAGMENT CONTENANT LE GENE DE TYPE NIFA
-=-=-=-=-=-:-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-

- 55 -
CHAPITRE IV - CONSTRUCTION D'UNE BANQUE DE GENES DE R. CAPSULATUS BiO
ET RECHERCHE D'UN FRAGMENT CONTENANT LE GENE DE TYPE NIFA
-=--=-
=-=-=-=-=-==-:=-==-==-==-==-==-=-
Après l'étude de la localisation des gènes nif sur le chromosome
de R. capsulatus, notre étude s'est orientée vers la recherche du gène
de type nifA, qui se trouve dans la même région du chromosome que les
gènes de structure de la nitrogénase.
1- Banque de gènes
Pour l'identification des gènes, j'ai construit une banque de
gènes de R. capsulatus, souche B10, dans le site EcoRI du plasmide
pRK290. Les différents fragments EcoRI séparés par centrifugation sur
gradient de saccharose ont été analysés par électrophorèse sur gel
d'agarose à 0,5 %. (Fig. IV-1). Dans deux tubes semblables, A et B,
j'ai recueilli 10 fractions numérotées de Al à A
et B
à B
. En
10
1
10
fonction de la taille des fragments obtenus, j'ai rassemblé en
4 groupes les différentes fractions. Les 4 groupes sont les suivants
(Fig. IV-2)
Le groupe l
A
+ A
+ B
+ B
(fragments de 22kb à 19kb).
3
4
3
4
Le groupe II
A
+ A
+ B
+ B
(fragments de 21kb à 16,5kb).
5
6
5
6
Le groupe III A
+ A
+ B
+ B
(fragments de 19kb à 14 kb).
7
8
7
8
Le groupe IV
A
+ B
+ B
(fragments de 17kb à 11,5 kb).
9
9
10
L'ADN est concentré et remis en suspension dans 601-11 de tampon
TE. L'absorbance à 260 nm de ces 4 fractions est la suivante :
Fraction
~260
Concentration de l'ADN
l
1,8
90].lg/ml
II
1,4
70].lg/ml
III
1,4
70].lg/ml
IV
1,6
80].lg/ml
L'ADN de chaque fraction (5].11) est analysé sur un minigel
d'agarose à 0,6 %. (Fig. IV-2).
Les différents fragments d'ADN sont clonés dans le plasmide
pRK290. en son site unique EcoRI. La ligature s'est faite dans la
proportion 1:1 entre l'ADN du vecteur et l'ADN de chaque fraction. J'ai

- 56 -
A
B.
Fig. IV-1
A - GeL d'agarose à 0,5 % contenant en 2 et 3 L'ADN totaL de
R; capsuLatus (2,5 ~gJ digéré partieLLement avec EcoRI
(0,08U/~gJ; en 4, L'ADN totaL non digéré et en 1 et 5 L'ADN
du phage À digéré avec HindIII servant de marqueur de poids
moLécuLaires (23,6kb, 9,5kb, 6,6kb, 4,3kb, 2,3kb et
2kbJ.
B - GeL d'agarose à 0,6 % contenant différentes fractions d'ADN
recueiLLies sur gradient de saccharose pour identifier Les
fractions contenant des ADN d'environ 10 à 20kb.
ÀH -
ADN de À digéré avec HindIII.
Fig. IV-2
MinigeL d'agarose à 0,6 % contenant Les 4 fractions regroupant Les
fragments en fonction de Leur taiLLe. ÀH L'ADN du phage À digéré
avec HindIII.

- 57 -
ligaturé 4 ~g de chaque fraction avec 4 ~g du plasmide vecteur à l'aide
de 4,5 U de ligase T4. La ligature s'est faite à 15°C pendant 16 h dans
un volume total de 100 ~l. Après ligature, les ADN ligaturés sont
transférés dans la souche E. coli HB101 par transformation et la
sélection des souches transformées s'est faite sur milieu LB, contenant
de la streptomycine et aussi de la tétracycline pour la sélection du
plasmide car le plasmide pRK290 contient un gène de résistance à la
tétracycline. Pour témoin, j'ai utilisé le plasmide pRK290 digéré par
EcoRI et traité à la phosphatase alcaline. Les résultats des colonies
obtenues sont indiqués dans le tableau IV-l.
r
r
Numéro de la fraction
Nombre de colonies Tc
Sm
Nombre total de colonies
ligaturée
obtenues sur 12 boites
étalées
l
72
II
67
407
III
158
IV
110
Témoin
46
46
TabLeau IV-1 : Nombre de coLonies obtenues pour chaque fraction de La banque
de gènes de R; capsuLatus 810.
De ces résultats, on déduit qu'il doit y avoir aussi des colonies
qui ont des plasmides qui n'ont pas intégré le fragment car bien que le
vecteur ait été traité à la phosphatase alcaline, il doit exister un
certain nombre de molécules du vecteur qui n'ont pas été phosphatasées,
puisqu'on a obtenu des transformants avec le témoin.
2- Recherche du f'ragaent contenant le gêne type nif'A
Les colonies obtenues par transformation sont regroupées par
groupe de 20, ce qui donne
.. - 3 sous-fractions pour la fraction
l
• ',i.,
3 sous-fractions pour la fraction
II

- 58 -
- 7 sous-fractions pour la fraction III
(111
à 111 )
1
7
- S sous-fractions pour la fraction
IV
(IV
à IV )
1
S
Les différentes sous-fractions sont mises dans le milieu LB avec 40 %
de glycérol et sont conservées à -20°C pour le stock.
La recherche du fragment contenant le gène de type nif'A est
effectuée en complémentant par conjugaison les mutations de type nif'A.
J'ai choisi la souche GA111 qui comporte une mutation de type nif'A et
dont la conjugaison a montré que la mutation est située à cSté des
mutations dans le gène de structure de la nitrogénase nifH.
La conjugaison entre la souche E. coli HB101 contenant les
plasmides de différentes sous-fractions et la souche R. capsulatus
GA111 se fait sur milieu YPS pendant 24 h, la sélection pour la
fixation d'azote est faite en étalant les cellules obtenues par
conjugaison sur milieu RCV-N + histidine + TcO,S
(tétracycline à
O,S jJg/ml).
Les résultats des conjugaisons des différentes sous-fractions
avec la souche GA111 ont montré que seule la sous-fraction 1117
contient une colonie comportant le plasmide qui porte le fragment
complémentant la mutation de type nif'A. La sous-fraction 111
qui
7
comporte un mélange d'une vingtaine de colonies a été diluée et étalée
sur milieu LA contenant de la tétracycline à 10 jJg/ml et de la
10
100
streptomycine à 10Û)Jg/ml (LA + Tc
+ sm
). Les différentes colonies
obtenues sont croisées une à une
avec la souche GA111 et la sélection
pour la fixation d'azote est faite comme précédemment sur milieu RCV-N
+ histine + TcO,S. Dans la sous-fraction 111 , j'ai obtenu un clone, le
7
clone 111 _
qui complémentait la mutation de GA111 par conjugaison.
7 14
La souche qui contenait ce plasmide a été purifiée et le plasmide
isolé. La souche E. coli HB101 contenant le plasmide pRK290 qui a
inséré le fragment d'ADN de R. capsulatus B10 est dénommée GAC10 et le
plasmide pRK290 contenant le fragment d'ADN de B10 est dénommé pGA10.
La souche a été croisée avec les mutants de type NifA-,GA111, RC24 , et
avec les mutants affectés dans le gène de structure nifH, RC1, RC3 et
RCS. Les résultats sont montrés dans le tableau IV-2.
Les résultats obtenus avec ces croisements montrent que le
plasmide pGA10 complémente les mutants de type NifA- (GA111 et RC24
mais pas GA10S) et les mutants NifH- (RC1, RC3 et RCS). La
complémentation des mutants est totale c'est-à-dire les mutants
complémentés restaurent l'activité de fixation d'azote à 100 %, au

- 59 -
niveau de celle de la souche sauvage. Le gène de type ni~A se trouvesur
le même fragment que les gènes de structure de la nitrogénase. Ceci
confirme les expériences de conjugaison faites précédemment en vue de
localiser les gènes ni~ sur le chromosome et qui ont montré que le gène
de type ni~A et les gènes de structure de la nitrogénase sont situés
dans la même région du chromosome.
1
1
1
NifA-
Souche receveuse 1
NifH
1
phénotype ~-----------------------------j-----------------------
_....
1
1
Plasmide
-....
1 RCl
RC3
RC8
1
RC24
GAll1
- ........
1
1
---------------------~i------------------------------Î-----------------------
pGA10
1
+
+
+
1
+
+
________________________L
l
-------------------
TabLeau IV-2 : CompLémentation des mutants de type NifA
et NifH- par Le
pLasmide pGA10;
+ : compLémentation
- . pas de compLémentation
3- Carte de restriction du frapent et localisation de la partie qui
co.pléœente la autation de type ni~A
Le plasmide pGAIO a été purifié et digéré avec EcoRI. La
digestion complète de ce plasmide pGAIO avec leoRI a donné 3 fragments.
La taille de chacun de ces fragments est de 7,8kb, 4,8kb et 2,Skb.
L'utilisation des autres enzymes de restriction, HindIII, salI et PstI,
a permis d'établir la po~ition de ces fragments. Le fragment EcoRI de
4,8kb est situé au milieu des deux autres fragments. Le fragment EcoRI
inséré dans le plasmide pRK290 est un fragment de 15,2kb. L'orientation
de ce fragment dans le plasmide pRK290 a été montré par digestion avec
les enzymes de restriction utilisés pour élaborer la carte de
restriction du fragment (Fig. IV-3 et IV-4A).

- 60 -
4 5
Fig. IV-3 : Gel d'agarose à 1 % montrant la digestion avec EcoRI des plasmides
pGA10 (1), pGA11 (2), pGA12 (J) et pGA1J (4). Le dépôt 5
représente À digéré avec HindIII servant de marqueur de poids
moléculaires (2J,6kb, 9,5kb, 6,6kb, 4,Jkb, 2,Jkb et 2kb).
Les trois fragments EcoRI du fragment de 15,2kb de R. capsulatus
ont été élués sur papier filtre DE8l, sous-clonés dans le plasmide
pRK290, donnant les plasmides pGAIII, pGAl2 et pGAl3 pour les fragments
de, respectivement, 7,8kb, 4,8kb et 2,6kb. La représentation de ces
plasmides se trouve sur la Fig. IV-4B.
Les 3 plasmides pGAII, pGAl2 et pGAl3 ont été introduits par
transformation dans la souche 1. coli HBIOI donnant les souches GACII,
GACl2 et GACI3. Les croisements de ces souches avec les mutants de type
NifA- et NifH- de R. capsulatus ont été effectués. Les résultats de ces
expériences de croisements sont montrés dans le tableau IV-3 ci-après.

- 61 -
A
PGA10_.J.S_ _. . ._
. .
p. . .
S. . .
PSJ
. .
P~E__.....~....L__
E=EcoRI
H=HindIII S=SalI
P = Psti
' - J
1kb
B
5
E5
5
5
E
5 H
HE
E
_.!.. ....
pGA10_--lI_ _.....J'.
..'_.'
'
!_~
! _ _. . .' .
_
5
E5
5
5
E
,
pGAll
!
!
1
!
E
5 H
HE
5
pGA12
!
!
!
,
1
1
5
E
E
pGA13
1
!
!
H
H
5
pGA14
!
!
1
E=EcoRI
H=HindII1
5=5011
I--J
lkb
Fig. IV-4 : A - Carte de pestpiction du pLasmide pGA10 obtenue avec diffépents
enzymes de pestpiction.
B - Carte de pestpiction des diffépents pLasmides issus du
fpagme!lt de 15,2kb d'ADN de R. cap8utatus.

- 62 -
1
Souche receveuse
1
1
-
1
1
~-..........
phénotype
r------------------------------~---------------------
Plasmide
- .....
: RCl
RC3
R C S :
RC24
GAll1
- _
1
------------------------~------------------------------j----------------------
1
1
pGAll
1
+
+
+
1
1
1
------------------------1------------------------------~---------------------
1
1
pGA12
r
1
+
+
1
------------------------~------------------------------~---------------------
1
1
pGA13
1
1
________________________l1
1
_
~
TabLeau IV-3 : CompLémentation des mutants de type NifA- et NifY- par des
pLasmides portant des fragments d'ADN de R; capsutatus :
+ : compLémentation
- . pas de compLémentation
Les résultats montrent que le gène de structure nifH est porté
sur le fragment EcoRI de 7,Skb car ce fragment complémente les mutants
NifH-. Le fragment adjacent de 4,8kb contient le gène de type DifA car
il complémente les mutants de type NifA- et le fragment de 2,6kb,
adjacent de l'autre côté du fragment de 4,8kb, ne complémente aucun des
mutants Nif- testés. Le fragment EcoRI de 15,2kb porte le gène de
structure de la protéine à fer de la nitrogénase et le gène de type
DifA. J'ai comparé la carte de restriction de ce fragment avec la carte
de restriction des gènes de structure de la nitrogénase (nifHDK) de
R. capsulatus (AVTGES et al., 1983) et j'ai déduit que le fragment de
7,Skb contient les gènes nifH et nifD, le fragment de 4,Skb contient
les gènes DifK et le gène de type DifA. La séquence des gènes dans le
fragment est donc
nif8-nif'D-ni.fK-"nifA".

- 63 -
La partie du fragment EcoRI de 4,8kb qui complémente la mutation
de type nirA a été recherchée en faisant la carte de restriction de ce
fragment. Un fragment HindIII de 2,lkb a été obtenu et sous-cloné dans
le plasmide pRK292 dans son site unique HindIII et le plasmide
recombinant dénommé pGA14. Le plasmide pGA14 a été introduit dans la
souche E. coli HB10l par transformation formant la souche GAC14. La
souche GAC14 a été croisée avec les mutants de type NifA-. Les
résultats de ces expériences montrent que le plasmide pGA14 complémente
la mutation portée par les souches GAlll et RC24 avec la même fréquence
que les plasmides pGA10 et pGA12. Le gène de type nifA de R. capsulatua
se trouve donc adjacent au gène DirK. Les cartes de restriction et la
localisation du gène de type nirA sur le fragment sont montrés sur la
figure IV-5.
5
ES
S
S E S H
HE
E
pGA 10 _ ,
.11'
' _ . '
' _ _
' _ '_ _. 'J
It'
_
--------_.
nif
H
o
K
(A)
5
E5
5
5
E
,
,
,
pGAll "
!
!
E
SH
HE
S
pGA12
!
!
!
!
,
1
S
E
E
pGA13
!
!
1
H
H
S
,
pGA14
!
!
E:= EcoRI
H:= HindIII
S:= 5al l
'---J
1kb
Fig; IV-5 : Carte de pestpiation du ptasmide pGA10 montpant ta position du
gène de type nifA par pappopt aux gènes de struatupe de ta
nitpogénase ..
4- Hybridation de l'ADN de R. capsulatus avec les gènes nif de
K. pneu.oniae
Pour tester l'homologie de séquence entre le gène de type DifA de
R. capsulatus et le gène
nirA de K. pneumoniae, des expériences
d'hybridation ont été effectuées. Ces expériences ont été effectuées en
utilisant le plasmide pMC71A qui contient un fragment SalI de 2,8kb

- 64 -
contenant le gène DirA et des parties des gènes nifL et nifB de
K. pneuaoniae, cloné dans le site SalI du plasmide pACYC1S4 (BUCHANAN-
WOLLASTON et al., 19S1). Ce fragment SalI de 2,Skb a été marqué au 32p
pour être utilisé comme sonde dans les expériences d'hybridation avec
l'ADN de R. capsulatus. Le plasmide pMC71A est représenté sur la
Fig. IV-6. Dans les expériences rapportées sur la Fig. IV-7, j'ai
utilisé comme échantillon: l'ADN total de BIO digéré avec EcoRI (Al)
ou HindIII (A2), le plasmide pGAI0 digéré avec EcoRI (A3, 4), le
plasmide pGA14 digéré avec HindIII (AS) et le plasmide pMC71A digéré
avec SalI. Ces échantillons ont été soumis à l'électrophorèse sur gel
d'agarose et transférés sur papier filtre de nylon Hybond et hybridés
avec la sonde radioactive de K. pneumoniae contenant nirA et les
parties flanquantes de nifL et nifB.
EcoRI
,
,
1
ft
Q·5kb
HincII
HincII
Kp 1
B
A
L
Insertion (28kb)
Fig; IV-6 : Sites de restriction du pLasmide pMC71A (CHANG et COHEN, 1978 ;
BUCHANAN-WOLLASTON et a~., 1981b); La position du site KpnI a été
déterminée dans ce travaiL.
L'hybridation est observée avec le fragment EcoRI de 2,6kb de
pGA10 (A3, A4) et avec un fragment similaire dans l'ADN total de
R. c8psulatus digéré avec EcoRI (Al). Avec l'ADN total digéré avec
HindIII (A2), une bande est observée vers les hauts poids moléculaires
qui contient probablement le fragment EcoRI de 2,6kb. Avec le fragment

- 65 -
1 2 3 4 5
.0
:85
1·85
A
B
1 2 3 4
5
1 2
3
-
- 2 3 . 6 - .
9·6-
6·6 -
4·8-
._e 4·3-
t
-
2·9
2·6- . .
-2·6
2·3 -
2·1-
2,0-
. - 0 · 9
Fig; IV-7 : A - en-haut, geL d'agarose à 1 % contenant: en (1), 1 \\lg d'ADN
totaL de R: capsutatus Bl0 digéré avec EcoRI ; en (2), 1 \\lg d'ADN totaL de
Ro' capsutatus El0 digéré avec HindIII ; en (3), 0,1 \\lg de pGA10 digéré avec
EcoRI; en (4), 10 ng pGA10 digéré avec EcoRI ; en (5) 0,1 \\lg de pGA14 digéré
avec HindIII.- - en bas, hybridation du fragment SaLI de 2,8kb d'ADN de
Ko' pneumoniae contenant Les parties des gènes nifB et nifL et Le gène nifA
entier utiLisé comme sonde contre Les différents échantiUons du geL A;
B - en haut, geL d'agarose à 1 % contenant en (1), 300 ng du
pLasmide pGA10 digéré avec EcoRI ; en (2), pMC71A digéré avec SaLI; en (3),
pMC71A digéré avec HincII; - en bas, hybridation du fragment EcoRI de 2,6kb de
pGA10 utiLisé comme sonde contre Les différents échantiUons du geL B;

- 66 -
HindIII de 2 t1kb (A5)t une faible hybridation est observée t mais cette
hybridation n'est pas observée avec le fragment ReoRI de 4 t8kb (A3) qui
contient le gène DifA de R. eapsulatus (fragment de 2 t 1kb)t ni avec
l'ADN total de B10 digéré avec HindIII (A2)t au niveau correspondant à
2 t1kb (Fig. IV-7A).
Puisque le fragment ReoRI de 4 t8kb où se trouve localisé le gène
de type nifA ne s'hybride pas avec la sonde de K. pneumoDiae contenant
DifA t il apparait que l'hybridation avec la sonde de K. pneumoniae ne
se fait pas avec le gène de type nifA de R. C8psulatus. Cependant t
l'hybridation se fait avec le fragment de 2 t 6kb de R. C8psulatus
adjacent au fragment de 4 t8kb. Nous nous sommes donc posés la question
"de savoir quelle est la partie du fragment salI de 2 t 8kb de
K. pneumoniae qui s'hybridait avec le fragment ReoRI de 2 t 6kb de
R. capsulatus. Pour cela t nous avons refait les hybridations en
utilisant cette fois-ci le fragment ReoRI de 2 t 6kb comme sonde sur le
plasmide pMC71A digéré avec BineII et avec salI (Fig. IV-7B). Ce
plasmide digéré avec BineII donne les fragments de tailles respectives
suivantes : 3 tOkb t 1 t8kb t 1 tOkb et Ot9kb. Les fragments de 3 tOkb et
1 tOkb proviennent du vecteur pACYC184 alors que les fragments de 1 t 8kb
et 0 t 9kb proviennent du fragment salI de K. pneumoDiae (de 2 t 8kb)
inséré dans le plasmide. Le fragment de 1 t85kb correspond à la partie
contenant la partie DifL et la grande partie de nifA alors que le
fragment de Ot93kb correspond à la partie contenant la partie nifB et
la petite partie de DifA (Fig. IV-6). Les résultats de ces expériences
sont montrés dans la Fig. IV-7B.
La figure IV-7B (en bas) montre que le fragment de 2 t6kb de
R. capsulatua s'hybride avec deux fragments de K. pneumoniae : le
fragment salI de 2 t8kb et le fragment HineII de 0t93kb ; l'hybridation
concerne donc la partie d'ADN contenant le gène nifB et la petite
partie du DifA. Ce serait donc le gène nifB qui s'hybriderait avec le
fragment EcoRI de 2 t6kb de R. eapsulatus ou la petite partie du gène
nifA qui présenterait une région homologue avec ce fragment.

- 67 -
5- Utilisation de l' exonucléase Bal31 pour la localisation précise de
la partie d'ADN de K. pneumoniae s'hybridant avec le f'ragment EcoRI
de 2,6kb de R. capsulatus
Pour confirmer que c'est la partie du gène nifB de l'ADN de
K. pneumoniae qui s'hybride avec l'ADN de R. capsulatus, nous avons
utilisé la nucléase Bal31. Le plasmide pMC71A contient un site KpnI qui
est situé à l'extrémité du gène nif'A à côté du gène nifL et situé à
l,4kb du gène nifB de K. pneumoniae (Fig. IV-8A et 8B).
Le plasmide pMC71A a été linéarisé en le digérant avec l'enzyme
de restriction KpnI. Sur le plasmide linéarisé (9~g), j'ai fait agir
4,5U de Bal31, le tout dans un volume total de 70~1. Une fraction
aliquote (5~1) est prélevée toutes les 5 mn et l'on arrête la réaction
avec la solution d'arrêt des enzymes de restriction. Les échantillons
prélevés sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose, transférés
sur filtre de nylon Hybond, puis hybridés avec la sonde (qui est le
fragment EcoRI de 2,6kb de R. capsulatus marqué au 32p ). J'ai obtenu
une gamme de fragments allant de 6,9kb au début de la réaction, à l,9kb
en fin d'incubation, sur une 1 h d'hydrolyse. La vitesse de digestion
de Bal31 est d'environ 39 pb enlevées par minute et par extrémité d'ADN
(Tableau IV-4).
Temps de digestion
Taille du fragment du
Hybridation avec le fragment
avec B8131
plasmide pMC71A
EcoRI de 2,6kb provenant du
(kb)
plasmide pGA10
------------------------------------------------------------------------------
o
6,9
+
5
6,7
+
10
6,2
+
15
5,9
+
20
5,6
+
25
5,3
+
30
4,9
+
35
4,5
+
40
4,1
+
45
3,8
+
50
3,5
55
3,0
60
2,2
65
1,9
- - - - - - - - - - - - - -
Tableau IV-4 : Déterminati~n-de L;; -;;;tie-d~ z,.'in;e-;'tio;; de-PMC?1A-s 'h;b;rd~t-
avec l'ADN de R: capsuLatus, par digestion progressive avec BaLJL
+ : forte hybridation
±
faible hybridation
pas d'hybridation

- 68 -
A
" 1
\\
10' 15' 35'40'45'50'55' SO'S5!
1
1
1
1
1
1
1
1
1
8
Fig. IV-8
A - Cinétique de digestion du pLasmide pMC71A pal" Ba1,31; Le
pLasmide pMC71A (9,5 ~g) a été Linéarisé ave~ L'enzyme de
restriction KpnI; Sur Le pLasmide Linéarisé, on a fait agir
BaL31 et toutes Les 5 min, 5 ~L d'échantiLLon sont préLevés et
déposés sur gel,; On obtient une gamme de fragments du pLasmide
pMC71A dont La taiLLe décroit en fonction du temps, et qui
sont séparés par éLectrophorèse en gel, d'agarose à 1 %;
B - Hybridation des échantiLLons du pLasmide pMC71A obtenus après
chaque temps de digestion avec Ba1,31, utiLisant comme sonde Le
fragment EcoRI de 2,6kb du pLasmide pGA10 marqué au 32 p;
Les canaux aux extrémités correspondent au phage À digéré avec HindIII
servant de marqueur de poids moLéc~Zaire (23,6kb, 9,5kb, 6,6kb, 4,3kb, 2,3kb
et 2kb). L'hybridation des fragments du phage À s'est faite avec La sonde À
digérée avec HindIII et marquée au 3~?: IL a été au préaLabLe vérifié que'
L'ADN du phage À ne s 'hybride pas avec Le pLasmide pMC71A;

- 69 -
Bien que les plus petits fragments se voient mal sur la photo de
la Figure IV-8A), ces fragments étaient visibles sur le gel et celui
obtenu après 60 min d'incubation se situait au niveau du fragment
marqueur de 2,Okb de À • Sur la Fig. IV-8B, on observe une forte
hybridation jusqu'à 35 mn de digestion mais à partir de la 40ème min de
digestion, lorsque 1,4kb d'ADN a été enlevé à chaque extrémité d'ADN en
partant du site KpnI, l'intensité d'hybridation diminue. L'hybridation
disparaît totalement à 50 mn lorsque 1,7kb d'ADN a été enlevé, c'est-
à-dire lorsque la majeure partie du gène nifB a disparu (cf.Fig. IV-6).
Ce résultat confinne bien que c'est le gène nifB de K. pneuaoniae
qui s'hybride avec le fragment de 2,6kb EcoRI de R. capsulatus,
adjacent au fragment de 4;8kb qui contient le gène de type ni~A.
R. capsulatus contiendrait donc un gène de type nifB dans un fragment
EcoRI de 2,6kb, à côté du gène de type ni~A.
Le fragment de 15,2kb isolé lors de la construction de la banque
de gènes de R. capsulatus contient donc les gènes de structure de la
nitrogénase , le gène de type ni~A et le gène de type nifB. L'ordre de
ces gènes dans le chromosome de R. capsulatus serait le suivant
(Fig. IV-9)
ni:fH-nifD-nifK-"ni~A
"-"nifB" •
5
E5
5
5
E
5H
HE
E
,
pGAlü
!
!
!
!
!
!
!
!
!
-------- ------
nif
H
0
K
(A)
( B)
5
E5
5
5
E
,
pGAll
1
!
!
!
!
E
5H
HE
5
pGA12
!
!
!
!
!
1
5
E
E
pGA13
1
!
!
H
H
5
pGA14
!
!
1
E=EcoRI
H=HlndIII
5=5011
I...-J lkb
Fig. IV-9
PLasmide pGA10 et ses dérivés montrant La disposition des gènes de
type nifA et nifB par rapport aux gènes de structure {nifHDK}
ainsi que Les sites de restiction de EcoRI {E}, HindIII {H} et
SaLI {S}.

- 70 -
6- Discussion
Le gène DifA, comme les autres gènes nif, a été étudié en premier
dans la bactérie K. pneumoniae. Dans cette bactérie, le gène DifA est
séparé des gènes de structure de la nitrogénase par dix (10) gènes nif
(MAC NEIL et al., 1978).
Chez la bactérie R. capsulatus, l'organisation est différente;
le fragment que nous avons isolé montre que le gène de type nifA est
adjacent au gène de structure nifK. Les gènes de structure de la
nitrogénase ont été isolés dans plusieurs souches de R. capsulatus
(SB1003, 1051, DN51 et 306) par SCOLNIK et HASELKORN (1984). Ces
auteurs ont isolé un gros fragment EcoRI d'environ 16kb. Ce gros
fragment contient 3 fragments EcoRI de 3,7kb, 7,6kb et 5kb. Ce fragment
EcoRI de 16kb (qui renferme un fragment HindIII de Il,8kb) a été
particulièrement étudié pour la localisation des gènes de structure
nitHDK de R. capsulatus. D'après les cartes de restriction
(cf.Fig. IV-4A), le fragment EcoRI de 15,2kb que j'ai cloné chevauche
le fragment HindIII isolé par SCOLNIK et HASELKORN (1984). Néanmoins,
la carte de restriction donnée par ces derniers auteurs indique une
différence du côté du gène nifK car ceux-ci ne trouvent qu'un seul site
HindIII dans leur fragment EcoRI de 5kb, alors que dans notre fragment
EcoRI de 4,8kb, nous avons trouvé deux sites HindIII. Par la suite, le
même groupe (AVTGES et al., 1985) a iso1~ à partir de la même souche
(SB1oo3) des fragments EcoRI contenant les gènes de structure (de 4,8kb
et de 7,6kb). La carte de restriction du fragment de 4,8kb décrit par
AVTGES et al. (1985) est la même que celle que nous avons obtenue pour
notre fragment de 4,8kb.
L'originalité de nos résultats réside dans
l'identification et la position du gène de type nifA par rapport aux
gènes de structure de la nitrogénase. Ce gène n'a pas été identifié en
tant que tel par les auteurs américains mais ces derniers, au vu de la
carte de restriction que j'ai présentée au Symposium International sur
les Procaryotes Photosynthétiques à Grindelwald en Septembre 1985, ont
conclu que le gène régulateur nifR4 contenu dans la fragment EcoRI de
4,8kb qu'ils ont cloné pouvait être le gène DifA (voir plus loin).
Un fragment d'ADN de 20kb, contenant des gènes nif, a également
été isolé à partir de R. capsulatus B10 par PUHLER et al. (1984). Le
fragment a été muté par insertion du transposon Tn5. Sa réintroduction
dans R. capsulatus B10 a donné naissance à des souches Nif-. En

-
71 -
comparant les sites d'insertion de Tn5 et les cartes de restriction,
les auteurs allemands ont conclu que le fragment de 20kb contenait
plusieurs gènes nif. Néanmoins, étant donné les différences des cartes
de restriction entre le fragment de 20kb de PUHLER et al. (1984) et le
fragment de 15,2kb que j'ai isolé, il semble que ces fragments soient
différents et qu'ils proviennent de régions différentes du chromosome.
Le gène de type nifA que nous avons isolé ne semble pas présenter
de forte homologie de séquence avec le gène nifA de K. pneumoniae. Ce
résultat est confirmé par des résultats récemment publiés par le groupe
d'HASELKORN (AVTGES et al., 1985 ; KRANZ et HASELKORN, 1985) qui a
isolé 4 gènes régulateurs : les gènes nifR1, nifR2, nifR3 et nifRA. Le
gène de type nifA que nous avons isolé présente la même carte de
restriction que le gène nifR4, et ce gène nifRA ne s'hybride pas non
plus avec le gène nifA de K. pneuaoniae. KLIPP et al. (1985) ont trouvé
des hybridations entre certains gènes nif de K. pneumoniae et des gènes
nif de R. capsulatus. Ces auteurs ont identifié 3 régions : la région A
de 18kb qui s 'hybride avec les gènes nifA, nifE et nifS de
K. pnewaoniae, la région B de 4kb qui s'hybride avec nitD et nifH, et
la région C de 2kb qui ne donne pas d'hybridation avec les gènes nif de
K. pneumoniae. Il est vraisemblable que le fragment, que le groupe de
PUHLER a isolé, est différent du nôtre. Ces auteurs ont mentionné
qu'une autre région présentant des homologies de séquences avec nifH et
nifA de K. pneumoniae est située à environ 10kb des gènes de structure
de la nitrogénase nifHKD.
Le gène de type nifA a été localisé chez très peu d'autres
organismes fixateurs d'azote. Chez R. meliloti, il a été cloné,
séquencé et présente une forte homologie de séquence avec le gène nifA
de K. pneumoniae (BUlKEMA et al., 1985) ; chez R. legtœinosarwa, où i l
a été isolé à partir d'une banque de gènes, le gène nifA est éloigné
des gènes nifHDK dont il est séparé par des gènes de nodulation (DOWNIE
et al., 1983). Le gène nifA a aussi été cloné chez Bradyrhizobi\\D
Japonïcua (ADAMS et al., 1984) ; il est situé à côté du gène fixA (LAMB
et HENNECKE, 1986). Dans beaucoup d'autres bactéries, il n'a pas encore
été localisé.
Il est à noter que chez certaines bactéries, l'activation de la
fixation d'azote peut se faire par utilisation du gène nifA de
K. pneumoniae ; ceci est le cas des espèces d'Azotobacter,
A. vinelandii ou A. chroococcum (KENNEDY et ROBSON, 1983 ; KENNEDY et

- 72 -
DRUMMOND. 1985 ; JONES et al •• 1984). de R. japonicum (ALVAREZ-MORALES
et HENNECKE. 1985) et d'Azospirillum brasilense (PEDROSA et YATES.
1984). Chez ces espèces. il existerait un gène dont la fonction serait
similaire à la fonction du gène nifA de K. pneumoniae. On a montré
également que le gène nifA de K. pneumoniae active les promoteurs de la
nitrogénase de R. meliloti (SUNDARESAN et al •• 1983).
Les expériences décrites dans ce chapitre démontrent que
R. capsulatus, comme K. pnewaoniae. contient à côté du gène de type
nifA une séquence d'ADN qui présente des homologies avec le gène nifB
(de K. pneumoniae). On ne sait pas encore si ce gène est un gène
fonctionnel car on n'a pas actuellement de mutants Nif
qui soient
complémentés par ce gène. Pour avoir la preuve que c'est un gène nifB
fonctionnel. il faudrait isoler un mutant Nif
qui soit complémenté par
ce gène. Les résultats présentés par les groupes d'HASELKORN et PUHLER
n'ont pas démontré l'existence d'un gène de type nifB chez
R. capsulatus. C'est par hybridation avec le gène nifB de K. pneumoniae
que la présence d'un gène nifB a été aussi identifié chez d'autres
diazotrophes. C'est le cas. par exemple. de R. leguminosarua (ROSSEN et
al •• 1984) où le gène nifB est éloigné de l'opéron nifHDK et séparé par
des gènes fix. de R. japonicum (FURHMANN et al •• 1985) où le gène nifB
est situé entre les opérons nifKD et nifH. et de R. melllotl où le gène
nifB est séparé de l'opéron nlfHDK par les gènes fix (AUSUBEL et al ••
1985). Il apparaît que les gènes de structure de la nitrogénase ou les
gènes qui participent à la synthèse du cofacteur de la protéine à MoFe
présentent de grandes homologies de séquence dans plusieurs bactéries
fixatrices d'azote ; par contre. dans de nombreuses bactéries
fixatrices d'azote. comme on vient de le voir avec les gènes de type
nifA de R. capsulatus. il semblerait qu'il y ait moins d'homologie
entre les gènes de régulation de l'expression des gènes nif.
7- Conclusion
La construction d'une banque de gènes de R. capsulatus B10 dans
le plasmide pRK290 m'a permis d'isoler un fragment EcoRI de 15.2kb. Ce
fragment de 15.2kb. inséré dans le plasmide. forme le plasmide pGA10.
Le plasmide pGA10. complémente les mutations à la fois dans le gène de
structure nifH et dans le gène de type nifA de R. capsulatus.

- 73 -
La digestion complète du fragment de 15,2kb avec EcoRI a permis
d'obtenir 3 fragments EcoRI de taille respective: 7,8kb, 4,8kb et
2,6kb. Ces trois fragments ont été clonés dans le plasmide pRK290,
donnant les plasmides pGA11, pGA12 et pGA13. Ces 3 plasmides ont été
introduits par transformation dans la souche E. coli HB101 et ont donné
respectivement les souches GAC11, GAC12 et GAC13. Les croisements de
ces 3 souches avec différents mutants Nif- m'ont permis de déterminer
que le plasmide pGA11 complémente les mutants NifH-, le plasmide pGA12
complémente les mutants de type NifA- et le plasmide pGA13 ne
complémente aucun mutant Nif- testé.
La carte de restriction du fragment de 15,2kb a été établie avec
différents enzymes de restriction. Cette carte de restriction m'a
permis de trouver un fragment HindIII de 2,lkb situé dans le fragment
EcoRI de 4,8kb. Ce fragment ~dIII de 2,lkb a été cloné dans le
plasmide pRK292, formant ainsi le plasmide pGA14. Le plasmide pGA14 a
été introduit dans E. coli HB101 par transformation formant la souche
GAC14. Le croisement de la souche GAC14 avec les mutants de type NifA-
a démontré que le plasmide pGA14 est capable de complémenter tous les
mutants de type NifA-. En conséquence le gène de type nifA de
R. capsulatus se trouve dans le fragment HindIII de 2,15kb.
La carte de restriction du fragment EcoRI de 15,2kb de
R. capsulatus a été comparée avec la carte de restriction des gènes de
structure nifHDK de R. capsulatus (AVTGES et al., 1983), cette
comparaison a permis de déduire que le fragment EcoRI de 7,8kb contient
les gènes de structure nitR et nifD alors que le fragment adjacent de
4,8kb contient le gène nitlt et le gène de type nifA. Le gène de type
nifA est adjacent au gène nitlt. L'ordre d'arrangement des gènes sur le
fragment est : nifH-nifD-nitlt-l nifA".
L'utilisation d'une sonde de K. pneumoniae contenant le gène nifA
et des parties des gènes nifB et nifL a permis, par des expériences
d'hybridation, de tester les homologies de séquence entre ces gènes nif
de K. pneu.on.iae et les gènes de R. capsulatus. Le gène de type nifA de
R. capsulatus, porté sur un fragment HindIII de 2,lkb, ne s'hybride pas
avec le gène nifA de K. pn8U80niae. Une homologie de séquence a été
trouvée avec le fragment EcoRI de 2,6kb de R. capsulatus et la partie
du gène nifB de K. pneumoniae. Un gène de type nifB de R. capsulatus
serait donc porté sur le fragment de 2,6kb, situé à côté du fragment
EcoRI de 4,8kb contenant le gène de type nifA.

- 74 -
Le fragment de 15,2kb de R. capsulatus contient donc' les gènes de
structure de la nitrogénase, le gène de type nifA et' le gène d~ type
nifB organisés sur le chromosome de la façon suivante
nifH-nifD-ni:CK-"nifA"-ItnifBIt .
L'organisation des gènes de type DifA et de type nifB de
R. capsulatus est semblable à celle de K. pneumoniae, de
R. leguainosarua et de R. meliloti où le gène nifA est à côté du gène
nifB (MAC NEIL et al., 1978 i ROSSEN et al., 1984 i AUSUBEL et al.,
1985) et a été démontrée pour la première fois par ce travail.

CHAPITRE V - EXPRESSION DES DIFFERENTS FRAGMINTS CLONES D' ADN
DE R.CAPSULATUS DANS LE SYSTEIIE D'EXPRESSION
DES GENES D'E.COLI
-=-=-=-=---=-

- 75 -
CHAPITRE V -
EXPRESSION DES DIFFERENTS FRAGMENTS CLONES D'ADN
DE R. CAPSULATUS DANS LE SYSTEME D'EXPRESSION
DES GENES D' E. COLI
=
=-
Dans le but d'identifier le produit du gène de type nifA et les
produits des autres gènes contenus dans les fragments clonés d'ADN de
R. capsulatus, trois systèmes in vivo d'expression des gènes d'E. coli
ont été utilisés : les minicellules, les maxicellules et les vecteurs
d'expression.
1- Les ainicellules
Chez un mutant dIE. coli P678-54, il se produit en plus de la
division cellulaire normale, une scission de la cellule à un des pôles
entraînant la ségrégation du contenu cytoplasmique à l'intérieur d'une
vésicule presque sphérique que l'on appelle minicellule (ADLER et al.,
1967). Cette production est continue durant le cycle cellulaire et
persiste même durant la phase stationnaire. Il est possible d'obtenir
jusqu'à deux minicellules par cellule. La ségrégation du matériel
génétique bien qu'imparfaite à certains égards, contient la machinerie
transcriptionnelle et traductionnelle nécessaire à la synthèse
protéique. Comme la minicellule ne contient pas l'ADN chromosomique la
biosynthèse due à l'activité traductionnelle endogène est très faible.
Si la souche a été transformée par un plasmide. certaines mini cellules
contiennent une ou plusieurs copies de ce plasmide. Ce plasmide est
capable de réplication, de transcription et de traduction (MEAGHER et
al., 1977). Lorsque les minicellules, purifiées de leurs cellules mères
par gradient de densité, sont incubées en présence de méthionine
radioactive (marquée au 35S) , il se produit une transcription et une
traduction in vivo des gènes du plasmide. Les produits de cette
transcription peuvent être analysés électrophorétiquement et
immunologiquement.
Dans les expériences décrites ici, la souche P678-54 a été
transformée avec les plasmides pBR322, pBR328, pGA15, pGA16 , pGA17 et
pGA18. Les plasmides pGA15 , pGA16 , pGA17 résultent du clonage des 3
fragments EcoRI (du plasmide pGA10), respectivement de 7,8kb, 4,8kb et
2,6kb, dans le site unique EcoRI du plasmide pBR328 alors que le

- 76 -
i l
~
5
.f
:::
ëf.
---
......
...... Hind III ---
P1t/
Hindllf
SalI
<
,
1
!
,
>.J
pGA16
pGA17
!<:
7'
, /
pGA18
Fig. V-l : Représentation schématique des pLasmides pGA16, pGAl? et pGA18; Le
site EcoRI du pLasmide pBR328 se trouve dans Le gène de résistance
au chLoramphénicoL. Dans ce site a été cLoné aJ Le fragment EcoRI
de 4,8kb de pGAIO (pLasmide pGA16J bJ Le fragment EcoRI de 2~'6kb de
pGAIO (pLasmide pGAl?J. Le site HindIII de pBR322 se trouve sur Le
promoteur du gène de résistance à La tétracycLine. Dans ce site a
été cLoné Le fragment HindIII de 2,lkb de pGA14 (pLasmide pGA18J.

- 77 -
plasmide pGA18 résulte du clonage du fragment HindIII de 2,lkb (du
plasmide pGA14) dans le site unique HindIII du plasmide pBR322.
Les plasmides pGA15, pGA16, pGA17 et pGA18 (fig. V-l) ont été
introduits par transformation dans la souche E. coli P678-54. Les
minicellules ont été isolées sur gradient de percoll à partir de
chacune des souches transformées et de la souche p678-54 transformée
avec. les plasmides pBR322 ou pBR328. La suspension de minicellules a
été ramenée à une 00
=0,6 et l'incorporation avec la méthionine
620
marquée au 35S s'est faite pendant 30 mn. Les protéines synthétisées
35
sont marquées au
S. L'analyse des protéines se fait sur gel de
polyacrylamide contenant du SOS (LAEMMLI, 1970). Après électrophorèse,
le gel est coloré, décoloré puis séché. Les protéines marquées sont
révélées par autoradiographie. Pour voir s'il y a eu synthèse de
protéines, on fait une cinétique d'incorporation
sur 10 ~l
d'échantillon prélevés toutes les 5 mn. La réaction est arrêtée avec
l'acide trichloroacétique et le comptage de radioactivité se fait dans
un compteur à scintillation (Tableau V-l). A la fin de l'incubation
(30 mn), les minicellules sont lysées au SOS+lysozyme et leur contenu
protéique analysé par autoradiographie (Fig. V-2).
------------------------------------------------------------------------------
Plasmide contenu dans
Taux d'incorporation
les minicellules
(c.p.m.)
5
10
20
30
(mn)
------------------------------------------------------------------------------
pBR322
140
290
320
425
pBR328
18 186
22 600
23 785
26 960
pGA15
3 980
4 520
5 272
5 720
pGA16
12 010
14 350
15 676
21 207
pGA18
3 240
4 095
5 400
4 540
------------------------------------------------------------------------------
TabLeau V-] : Cinétique d'incorporation de La méthionine J5 S dans Les
protéines synthétisées par Les pLasmides contenus dans Les
miniceLLuLes. Radioactivité toaLe de La (35 S ) méthionine ajoutée
au départ 225 '/20 cpm.
La plus faible synthèse observée dans les minicellules contenant
le plasmide pBR322 est due à la faible quantité de minicellules
obtenues avec ce plasmide.

Les résultats avec les minicellules (Fig. V-2) nous montrent la
synthèse des produits issus des minicellules. Les canaux 1 et 2
correspondent aux protéines issues des minicellules contenant les
plasmides pGA18 (1) et pBR322 (2). Seules 3 bandes de protéines
correspondant aux produits du gène de résistance à l'ampicilline sont
observées (PUHLER et TIMMIS, 1984). On ne détecte pas le produit du
gène cloné de R. capsulatus (contenu dans le fragment HindIII de
2,1kb), ni le produit du gène de résistance à la tétracycline dans le
plasmide pBR322 (2). Les canaux 3, 4, 5 et 6 correspondent aux
protéines issues des minicellules contenant respectivement les
plasmides pGA15 , pGA16 , pGA17 et pBR328. Avec le plasmide pBR328 (canal
6), on observe le produit du gène de résistance au chloramphénicol et
les 3 protéines issues du gène de résitance à l'ampicilline mais on
n'observe toujours pas le produit du gène de résitance à la
tétracycline. Dans les plasmides pGA15 , pGA16 et pGA17 où les gènes ont
été clonés dans le gène de résistance au chloramphénicol du plasmide
pBR328, le produit de ce gène disparaît, mais on observe aussi d'autres
bandes. Dans les protéines issues des minicellules contenant le
plasmide pGA15, on observe une autre bande protéique ayant un PM de
55 000 daltons, qui pourrait correspondre à la sous-unité~ de la
protéine à MoFe ; mais les expériences répétées ont montré qu'il y
avait une variation sur l'apparition de cette bande. Il est difficile
de conclure avec certitude que cette bande provient d'un gène cloné de
R. capsulatus. On peut faire la même observation pour la protéine
observée à un PM de 45 000 daltons, parmi les protéines issues des
minicellules contenant le plasmide pGA16 (Fig. V-2, ligne 4).
Toutefois, une protéine de PM 22 000 daltons apparaît de manière stable
dans les minicellules contenant le plasmide pGA16 (Fig. V-2, ligne 4).
Cette protéine ne semble pas être le produit du gène de type ni fA , car
elle n'apparaît pas dans les protéine issues des minicellules contenant
pGA18 (Fig. V2, ligne 1) Ce produit serait peut-être le produit du gène
de résistance au chloramphénicol tronqué. Ce produit pourrait aussi
bien être le produit d'un gène de R. capsulatus. Les deux bandes
protéiques obtenues à partir des minicellules issues de pGA15 et pGA16
et dont l'obtention varie, ont été attribuées à des protéines provenant
de cellules entières contaminant les minicellules. Ces expériences
répétées plusieurs fois ont donné des résultats peu reproductibles et
n'ont, par conséquent, pas permis de discerner avec certitude la
présence de bandes protéiques spécifiques des gènes clonés de
R. capsulatus.

1
2
3
4
5
6
94
67
43
30
20 -
Fig. V-2 : Autoradiographie des protéines issues des miniceLLuLes contenant Le
pLasmide pGA18 (1), Le pLasmide pBR322 (2), Le pLasmide pGA15 (3),
Le pLasmide pGA16 (4), Le pLasmide pGA17 (5) et Le pLasmiàe pBR328
(6) •

- 80 -
2- Les maxicellules
Contrairement aux minicellules, avec les maxicellules, on
travaille avec des cellules entières qui sont irradiées aux ultra-
violets pour détruire le matériel génétique de l'hôte, mais le matériel
nécessaire à la transcription et à la traduction de l'hôte reste
intact. Quand on introduit les plasmides multicopies, l'irradiation
peut toucher certains plasmides (un petit nombre) mais la majorité
d'entre eux reste intacte.
La souche d'E. coli CSR603, qui est sensible aux UV, a été
transformée avec les plasmides pGA15, pGA16, pGA17 et pGA18 (cf. II
1.1). Comme témoin la souche a aussi été transformée avec les plasmides
pBR322 et pBR328. Les maxicellules ont été établies avec ces souches
par irradiation aux UV. La synthèse des protéines est observée par
incorporation de la méthionine 35S pendant une heure et les protéines
synthétisées sont analysées sur gel SDS-polyacrylamide et révélées par
autoradiographie COmme avec les minicellules.
Les résultats obtenus avec les maxicellules sont similaires à
ceux obtenus avec les minicellules, c'est-à-dire qu'on n'observe pas de
différence entre les maxicellules témoins contenant les plasmides sans
insertion et les plasmides contenant un fragment d'ADN de
R. capsulatus.
La conclusion de ces deux expériences est qu'il n'y a pas eu
expression des gènes nir de R. capsulatus chez E. coli ou que
l'expression était trop faible pour pouvoir conclure sur la synthèse
d'une protéine issue d'un gène de R. capsulatus chez E. coli.
3- Les vecteurs d'expression
Les vecteurs d'expression sont des vecteurs qui portent des
promoteurs à forte expression, c'est-à-dire des promoteurs qui portent
des séquences d'attache de l'ARN polymérase ou des ribosomes. En
insérant le fragment d'ADN étranger à côté d'un promoteur fort, le gène
étranger sera exprimé à partir du promoteur fort. J'ai utilisé deux
types de vecteurs d'expression.
Les vecteurs d'expression contenant le promoteur pL du phage À .
L'activité du promoteur pL est réprimée à basse température par un
répresseur thermolabile, produit du gène cI857 et peut être réactivée

- 81 -
par induction à température élevée. Les plasmides PL ne contiennent pas
le gène cl codant pour le répresseur. La transcription à partir du
promoteur pL peut être réprimée en maintenant les plasmides dans les
souches d'E. coli qui synthétisent le répresseur à partir d'un gène
chromosomique cl. La souche d'E. coli K-12ôH ôtrp contient un prophage
l
non excisable portant une mutation au niveau du gène cl. Le gène cl
code pour le répresseur thermosensible, cI857, et permet la
transcription à partir du promoteur pL. La répression est faite à 28°C
et l'induction est. faite à 42°C.
J'ai cloné les fragments EcoRI de 4,8kb et 2,6kb du plasmide
pGA10 dans le vecteur pPLc28l9 à son site unique EcoRI donnant les
plasmides pGA20 et pGA2l, ainsi que le fragment HindIII de 2,lkb du
plasmide pGA14 dans le pPLc28l9 à son site unique HindIII, formant le
plasmide pGA22. Ces trois plasmides, pGA20, pGA2l et pGA22 , ont été
introduits dans la souche E.coli K-l2àH ôtrp par transformation
l
donnant, respectivement, les souches GAC36 , GAC37 et GAC38. La souche
K-12ôH ôtrp a été aussi transformée avec le plasmide pPLc28l9 pour
l
servir de témoin dans les expériences d'expression.
Les résultats obtenus avec ces 4 souches après croissance à 28°C
puis induction à 42°C n'ont donné aucune synthèse des protéines
détectables provenant de l'ADN de R. capsulatus. Ces expériences
répétées en clonant les fragments dans les deux orientations ont donné
des résulatats similaires.
Le deuxième type de vecteur d'expression est le vecteur contenant
un promoteur inductible par l'isopropyl a-D-thiogalactoside (IPTG). Le
promoteur contenu dans ce vecteur d'expression est le promoteur tac.
C'est un promoteur hybride contenant une partie du promoteur lac
(région -10) et une partie du promoteur trp (région -35). Le promoteur
Q
tac est réprimé dans les souches lacI
et peut être induit par l'IPTG.
Le vecteur d'expression utilisé ici est le vecteur pKK223-3 acheté dans
le commerce chez Pharmacia. Ce vecteur porte le promoteur tac. Les deux
fragments EcoRI de 4,8kb et 2,6kb du plasmide pGA10 ont été clonés dans
le plasmide pKK223-3, dans son site unique EcoRI, formant les plasmides
pGA24 et pGA25 ; le fragment HindIII de 2,lkb de pGA14 a été aussi
cloné dans pKK223-3 dans un site unique HindIII formant le plasmide
pGA26. (Les deux fragments EcoRI de pGA10 ou le fragment HindIII de
2,lkb ont été clonés dans les deux orientations). La souche JM105 a été
transformée avec les 3 plasmides pGA24 , pGA25 et pGA26 formant,
.".,

- 82 -
respectivement, les souches GAC40, GAC4l et GAC42. Comme témoin pour
les expériences, la souche JM105 a été transformée avec le plasmide
pKK223-3 (sans insertion).
Les résultats obtenus après induction à l'IPTG n'ont montré
aucune synthèse de protéine issue du gène de R. capsulatus, résultats
qui sont comparables à ceux obtenus avec les minicellules et les
maxicellules.
Au vue de ces résultats avec les vecteurs d'expression, nous nous
sommes posés la question de savoir si la distance entre le promoteur
tac et le début de la transcription du gène n'était pas trop grande,
donnant un mauvais cadre de lecture pour l'ARN polymérase. Pour voir si
c'était le cas, les fragments clonés ont été raccourcis puis
réintroduits dans le plasmide afin de rapprocher les parties codantes
du promoteur tac. Pour cela, les plasmides pGA18A et pGA18B (fragment
HindIII de 2,lkb de pGA14 cloné dans pBR322 dans son site HindIII dans
les deux orientations) ont été digérés avec EcoRI ou EcoRV afin de les
linéariser. Les plasmides linéarisés (50 ~g d'ADN chacun) sont soumis à
l'action de la nucléase Bal3l en arrêtant la réaction toutes les 3 mn.
La réaction est faite dans un volume total de 60 ~l et l'on prélève
15 ~l à chaque fois. Les différentes fractions obtenues sont
déprotéinisées au phénol-chloroforme et précipitées à l'éthanol. Les
extrémités d'ADN sont remplies avec l'ADN polymérase l (fragment de
Klenow) et les dXTP j on hydrolyse avec HindIII et on sépare les
fragments par électrophorèse sur gel d'agarose. Les différents
fragments obtenus après chaque temps d'incubation sont récupérés par
élution sur DE8l puis clonés dans le site SmaI-HindIII du plasmide
pKK223-3. Les plasmides ligaturés sont introduits par transformation
dans la souche E. coli JM105. Les expériences d'induction sont faites
pour chaque plasmide correspondant aux différentes tailles des
fragments issus du fragment de 2,lkb digéré par Bal3l.
La gamme des fractions obtenues varie de 2,lkb à 1,4b pour les
quatre orientations possibles du fragment avec ces quatre échantillons
pour chaque orientation.
Les résultats obtenus avec ces expériences sont les mêmes que
ceux obtenus précédemment avec les mini cellules et les maxicellules,
c'est-à-dire qu'on n'observe pas de synthèse d'une protéine de
R. capsulatus détectable par analyse sur gel de polyacrylamide, ceci

- 83 -
comparé à la souche ne contenant que
le plasmide vecteur. Il apparait
donc bien que les gènes ni~ de R. capsulatus ne sont pas exprimés chez
E. coli ou sont très faiblement exprimés.
4- Les i.-unoblots
Pour voir si vraiment les gènes ni~ de R. capsulatus n'étaient
pas exprimés chez E. coli, j'ai utilisé un système spécifique
d'immunoblots pour détecter la synthèse des protéines de structure de
la nitrogénase de R. capsulatus chez E. coli, ces expériences sont
réalisées en utilisant la protéine A marquée à l'iode 125 et les
anticorps anti-protéines de structure de la nitrogénase de
R. capsulatus. La protéine A se fixe d'une manière covalente avec la
partie constante des IgG ; une fois les IgG fixés sur les protéines de
structure de la nitrogénase, la réaction est révélee par
autoradiographie. Dans ces expériences, j'ai utilisé la souche GAC10
qui contient le plasmide pGA10 contenant les gènes des protéines de
structure de la nitrogénase de R. capsulatus, la souche GAC11 qui
contient le plasmide pGA11 portant les gènes nifH et nifD de la
nitrogénase, la souche GAC12 qui contient le plasmide pGA12 portant le
gène de structure nifK et pour témoin la souche HB101 contenant le
plasmide pRK290 et la souche de R. capsulatus B10. J'ai fait pousser
ces souches dans le milieu M9 contenant de la~tra~ycline (à 10 ~g/ml),
pour la sélection du plasmide, dans deux conditions : en anaérobiose et
en aérobiose, dans le noir, à 37°C. La souche de R. capsulatus a poussé
à la lumière et en anaérobiose : dans le milieu RCV contenant 15 mM de
NH + (conditions de répression de la nitrogénase) et dans le milieu
4
RCV-N contenant 2 mM de NH + (permettant la synthèse de la
4
nitrogénase). Les protéines des souches d'E. coli et de R. capsulatus
ayant poussé dans les différentes conditions sont analysées sur gel
SDS-polyacrylamide et transférées sur filtre de nylon Hybond. On fait
agir les anticorps sur les protéines fixées sur le filtre puis la
protéine A marquée à l'iode 125. Les anticorps réagissent avec les
protéines de structure de la nitrogénase de R. capsulatus et la
protéine A se fixe sur les anticorps. Le filtre est lavé et séché puis
les protéines ayant fixé les anticorps et la protéine A marquée par
125l sont révélées par autoradiographie (Fig. V-3). Les résultats de
ces expériences montrent qu'il n'y a pas de synthèse détectable des
protéines de structure de la nitrogénase de R. capsulatus chez E. coli.

- 84 -
b
-
1. 2. 3 4 5
. . 678 9 la 11
. . 12
Fig. V-3 - Autoradiographie des immunobLots des protéin~s de R: capsuLatus 810
et des souches d'E: coLi contenant Les pLasmides portant différents
gènes de R. capsuLatus. Les protéines ont été séparées sur geL de
poLyacryLamide (10 %) contenant du SDS, puis transférées sur
membrane de nyLon Hybond.
2 - 810 ayant poussé sw' F.CV (contenant 15 mM NH4+ ) •
3, 4, 5, 6 - Souches d'E: coU GAC10, GACll, GAC12 et HB101
(pRK290) ayant poussé en aérobiose.
+
8 - 810 ayû.nt poussé sur RCV-N contenant 2 mM NH4 •
9, 10, 11 et 12 - Souches d'E. coLi GAC10, GACll, GAC12 et HB101
(pRK290) ayant poussé en anaérobiose.
Les marqueurs de poids moLécuLaires en 1 et 7 ont été LocaLisés
après autoradiographie par coLoration au bLeu de Cocmassie;

- 85 -
Dans les cellules de R. capsulatus ayant poussé en présence de
15 mM NH + (Fig. V-3, voie 2), il n'y a pas de synthèse de la
4
nitrogénase, car celle-ci est réprimée par l'ammoniaque en excès; par
contre, on observe les 4 bandes dues à la nitrogénase dans B10 ayant
+
poussé sur milieu RCV-N ne contenant que 2 mM NH4 . Les deux bandes
supérieures correspondant aux sous-unités a et e de la protéine à MoFe
et les deux bandes inférieures correspondant à la sous-unité de la
protéine à Fe modifiée et non modifiée.
5- Discussion
Les expériences d'expression in vivo, chez E. coli, des gènes nif
de R. capsulatus, n'ont pas permis de détecter avec certitude la
synthèse de produits de gènes nif de R. capsulatus. Ceci n'est pas dû à
une répression de la synthèse des gènes nif par l'ammoniaque, car j'ai
effectué des expériences de transcription-traduction dans les
minicellules en utilisant de l'arginine (0,5 mM) (car l'arginine à
cette concentration ne réprime pas la synthèse des produits nif) à la
place du NH Cl et les résultats obtenus étaient les mêmes que ceux
4
obtenus avec le NH Cl. De ces résultats, on pourrait déduire que les
4
gènes nif de R. capsulatus ne seraient pas transcrits chez E. coli. Ce
phénomène pourrait être dûe à des différences dans la machinerie de
transcription-traduction entre E. coli et R. capsulatus. En effet, il
existe des différences dans les séquences de l'ARN 168 (FOX et al.,
1980)
suggérant que les bactéries photosynthétiques pourpres
représentent des espèces gram-négatives plus primitives que E. coli.
Cette observation a été faite aussi chez la bactérie R. sphaeroides
(CHORY et KAPLAN, 1982). Une autre explication est que les séquences
consensus qui permettent à l'ARN polymérase de se positionner sur l'ADN
ne soient pas les mêmes chez R. capsulatus et chez E. coli. Cependant,
il a été possible de faire s'exprimer le gène de la ribulose
biphosphate carboxylase de R. rubrum en le mettant sous la dépendance
du promoteur tac, c'est-à-dire en juxtaposant le promoteur tac et la
séquence codante du gène de la ribulose biphosphate carboxylase de
R. rubrum (LARlMER et al., 1986). Un tel résultat n'est pas obtenu dans
nos expériences; ceci peut signifier que la position du promoteur tac
et le gène de type nifA n'a pas été la bonne, c'est-à-dire qu'on n'a

- 86 -
pas été dans le bon cadre de lecture qui permet à l'ARN polymérase de
transcrire le gène de type nifA ; ou bien il y a expression du gène et
dégradation du produit.
Les systèmes de transcription-traduction diE. coli ont été
utilisés dans d'autres bactéries que les bactéries photosynthétiques,
par exemple chez R. japonicum où les gènes nifD et nifK de la
nitrogénase ont été exprimés dans des minicellules diE. coli (FUHRMANN
et HENNECKE, 1982). Chez la bactérie K. pneumoniae, qui est très proche
d'E. coli, les gènes nif s'expriment sans restriction dans E. coli.
(PUHLER et KLIPP, 1981 ; SIBOLD et al., 1983 ; CANNON et al., 1985). On
note aussi que certaines espèces éloignées d'E. coli, comme Azotobacter
(KENNEDY et ROBSON, 1983 ; KENNEDY et DRUMMOND, 1985) ou
Azospirillum brasilense (PEDROSA et YATES, 1984), voient leurs gènes
nif activés par le gène nifA de K. pneumoniae. Ces exemples montrent
que l'expression des gènes étrangers dans E. coli dépend de l'organisme
d'où proviennent les gènes. L'utilisation des systèmes d'immunoblots
pour détecter la synthèse des produits de la nitrogénase de
R. capsulatus chez E. coli n'a pas permis d'obtenir des produits des
gènes de structure de la nitrogénase, signifiant qu'il n'y a pas
expression des gènes nif de R. capsulatus chez E. coli.
6- Conclusion
L'utilisation des systèmes de transcription-traduction in vivo
d'E. coli pour l'étude de l'expression des gènes nif de R. capsulatus
n'a pas permis de détecter les produits des gènes nif de R. capsulatus
chez E. coli. La machinerie de transcription-traduction d'E. coli
semble être différente de celle de R. capsulatus ; cette différence de
machinerie pourrait s'expliquer par la différence des séquences des ARN
16S constituant la petite sous-unité du ribosome (du point de vue
sytématique les bactéries photosynthétiques apparaissent comme moins
évoluées par rapport à E. coli). La difficulté d'expression des gènes
des autres bactéries photosynthétiques à s'exprimer chez E. coli est
retrouvée chez une autre bactérie photosynthétique R. sphaeroides.
L'utilisation des anticorps dirigés contre les composants de la
nitrogénase de R. capsulatus nous a permis, à l'aide des immunoblots,
de montrer qu'il n'y a pas synthèse de la nitrogénase de R. capsulatus
chez E. coli. Les gènes nif de R. capsulatus ne seraient pas ou
faiblement exprimés chez E. coli.

CHAPITRE VI - ETUDE DES PRODUITS NIF DE R.CAPSULATUS
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-

- S7 -
CHAPITRE VI - ETUDE DES PRODUITS NIF DE R. CAPSULATUS
-=-=-::-.=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
La compréhension du mécanisme de régulation de la fixation
d'azote nécessite, entre autre, l'identification des produits des gènes
impliqués dans ce mécanisme. Chez R. capsulatus, les seuls produits
connus dans la fixation d'azote sont les produits des gènes de
structure de la nitrogénase. Les autres produits des gènes nif sont
jusqu'à présent inconnus ainsi que leur fonction. Nous avons cherché à
identifier certains produits de gènes nif par dérépression de la
nitrogénase et marquage des produits synthétisés avec des acides aminés
.
-
-
l4
un1formement marques au
C.
1- Cinétique de réduction de l'acétylène
Les souches de R. capsulatus BIO, GAlaS, GAlll et GAlll-14, ayant
poussé dans le milieu RCV liquide en tubes, sont centrifugées, remises
en suspension dans le milieu de dosage de la nitrogénase (4 ml) (cf.
11-4-2) et placées sous argon dans les flacons fermés de 20 ml.
L'acétylène, 1,6 ml, est ajouté dans la phase gazeuse ainsi que du
bicarbonate de sodium à une concentration f-inale de 0,3 mM. L'activité
nitrogénase est suivie en fonction du temps par la mesure de la
réduction d'acétylène. Les résultats de ces mesures de réduction
d'acétylène dans les différentes souches sont représentées dans le
tableau VI-l et la figure VI-l.
On constate que la souche GAlll-14 réduit l'acétylène beaucoup
plus vite que la souche sauvage BIO. La souche GAlll-14 est le mutant
de type NifA-, GAlll, complémenté avec le plasmide pGA14 contenant le
gène de type nifA. A 30 mn d'incubation, on observe déjà une réduction
d'acétylène dans la souche GAlll-14 alors qu'elle n'est décelable dans
la souche BIO qu'après 100 mn d'incubation. L'activité de la
nitrogénase observée dans la souche GAlll-14 à 30 mn est quatre fois
plus élevée que celle observée dans la souche BIO à 100 mn
d'incubation. Cette activité nitrogénase dans la souche GAlll-14
augmente beaucoup plus vite et, à 110 mn, elle atteint une valeur trois
fois plus grande que celle de la souche sauvage BIO à 250 mn. Dans la
souche mutante GAlll, on n'observe aucune activité nitrogénase jusqu'à
250 mn d'incubation. Par contre, dans la souche mutante GAlaS, si

- 87 bis -
Fig. VI-l bis
Rocket d'immunoéLectrophorèse de La protéine à MoFe (A)
et de La protéine à fer (B).
+
a) Croissance sur' 15 mM NH4
1 et 11
Bl0
2 et 12
Bl0 (pGA14)
3 et 13
GAll 1 (pGA14 )
+
b) Croissance sur' 2 mM NH
4 et 14
Bl0
4
5 et 15
Bl0 (pGA14 )
6 et 16
Bl0 (pRK292)
7 et 17
GAlll (pGA14 )
8 et 18
GAlll

- 88 -
t(mn)
o
30
70
80
90
100
110
120
180
190
200
240
250
Souche
----------------------------------------------------------------------------------
810
0
0
0,89
1,85
4,81
8,1
10,32
20,8
24,5
GA111-14
0
7,48 34,03 42,92 47,37
70,04
GA108
0
0
0
0
0
0,546 0,524
GA111
0
0
0
0
0
0
----------------------------------------------------------------------------------
TabLeau VI-1 : Activ:té nitrogénase dans Les différentes souches de
Ro' capsuLatus à différents temps: Les activités sont exprimées
en nmoLes de C H pr(;duits pal" minute et pal" mg de poids sec.
2 4
- : non testé;
i.;10
"i
!eS'i-J
• 610
• GAl1l-14
• GA108

GAl 11
Fig; VI-1
Cinétique de réduction de L'acétyLène dans différentes souches de
.::.;
R.. capsuLatus : souche sauvage (B10), mutants de type NifA
(GA108
et GA111), mutant Nif- GA111 compLémenté pal" Le pLasmide pGA14
.....:•..
(GAl11-14).

- 89 -
jusqu'à 200 mn d'incubation aucune activité nitrogénase n'est observée,
une très faible activité commence à apparaître à 240 mn. L'activité
nitrogénase beaucoup plus élevée observée dans la souche GAlll-14 que
dans la souche sauvage B10 est dûe au fait que la souche GAlll-14
contient probablement plusieurs copies du gène de type nifA portées par
les plasmides. Le nombre de copies plus élevé du gène de type nifA dans
cette souche stimulerait considérablement la transcription des autres
gènes nif, donc la synthèse de nitrogénase, ce qui expliquerait que la
réduction de l'acétylène se fait plus vite que dans la souche sauvage.
Dans les souches de K. pneumoniae qui contiennent plusieurs
copies du gène nifA portées par des plasmides, on a observé également
une stimulation de la vitesse de réduction d'acétylène (de la synthèse
de la nitrogénase) par rapport à la souche sauvage qui ne contient
qu'une seule copie du gène nifA (OW et AUSUBEL, 1983 j CANNON et al
1985a).
2- Cinétique d'apparition des produits nif
Les souches de R. capsulatus (B10, GA108, GA111 et GA111-14)
ayant poussé 48 h sur 15 mM de NH + en tubes, puis lavées avec le
4
milieu de dosage de la nitrogénase (cf. 11-4-2-1) et remises en
suspension dans ce même milieu, se trouvent déréprimées et sont
utilisées pour le marquage des produits nif. A intervalles de temps
réguliers, on ajoute les acides aminés, uniformément marqués au 14C et
on laisse incuber pendant 1 h. On chasse les acides aminés radioactifs
par addition de casamino acides à 0,2 % et incubation pendant 5 mn
supplémentaires. Les échantillons (4 ml) sont congelés dans l'azote
liquide pour arrêter toutes les réactions et en particulier les
attaques, par les protéases, des protéines synthétisées. Les
échantillons témoins ont reçu 15 mM de NH + en même temps que les
4
acides aminés marqués. Dans ces témoins, aucune protéine nif n'est
synthétisée parce que l'ammoniaque réprime la synthèse des produits
nif. Ceci permet d'identifier les protéines qui sont sous le contrôle
de NH4+. Les analyses des produits sur gel de polyacrylamide contenant
du-SOS ont porté sur des échantillons obtenus soit par lyse en présence
de SOS, soit par sonication.
1) Première méthode : les cellules sont décongelées ; 1 ml de
q~tlules est centrifugé ; le culot est repris dans 100 ~l du tampon de

- 90 -
lyse et traité comme décrit en 11-4-3-1 (chauffage à 100°C pendant
3 mn, centrifugation 12 s). Vingt ~l du surnageant sont déposés sur gel
pour analyse des produits.
2) Dans la deuxième méthode (cf. 11-4-2-2), les cellules sont
décongelées (4 ml) et centrifugées ; le culot est repris dans 250 ~l du
tampon Tris-HCl 125 mM, pH 8,0 contenant 2 mM de dithionite
préalablement dégazé sous argon ; les cellules sont cassées par
ultrasons puis centrifugées, et le surnageant récupéré pour des
analyses des produits sur gel.
Dans la première méthode, on analyse les protéines solubles et
certaines protéines membranaires (Fig. VI-2A et 2B ; Tableau VI-2)
alors que dans la deuxième méthode, on n'analyse que les protéines
solubles (Fig. VI-3).
Souche
GA1l1-14 ou B10
GA108
GA1l1
Protéine "nif"
----------------------------------------------------------------
81kd
+
+
+
Protéine à MoFe 58,5 kd
+
55
kd
+
52
kd
+
+
+
47,5 kd
+
+
+
44,5 kd
+
41
kd
+
+
+
Protéine à Fe
39
kd
+
34,5 kd
+
31,5 kd
+
+
+
30,5 kd
+
+
+
20,5 kd
+
20,15kd
+
14,5 kd
+
+
+
+
TabLeau VI-2
P~otéines de R. capsuLatus ~ép~imées pa~ Le NH4
(15 mM) obse~vées su~ geL SDS poLyac~yLamide.

-
91- -
1 2
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69 .
46
A
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14·3
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Fig: VI~2 : Cinétique d'apparition des produits nif de R: capsuLatus. Les
échantiLLons obtenus par Lyse dans Le tampon contenant du SDS et séparés par
éLectrophorèse en geL de poLyacryLamide à 12.5 % contenant du SDS .. Le marquage
s'est fait pendant 1 h pour tous Les échantiLLons (sauf pour Les témoins A
et
2
A ) après addition des (14 C) aminoacides. à des temps différents. après Le
3
début de L'incubation (indiqués entre parenthèses);
A - E10 : voies 2 et 3 avec et sans NH +. témoins à 1 mn d'incubation.
4
E10 + NH + : voies 4 (90 mn). 7 (180 mn). 10 (240 mn);
4
E10 sans NH + : voies 5 (90 mn). 8 (180 mn). 11 (240 mn).
4
GA111-14 (souche GA111-compLémentée par Le pLasmide-pGA14) sans NH + :
4
voies 6 (90 mn) et 12 (150 mn).
B - GAl11-14 +·15 mM NH/ : voies 2 (20 mn). 4 (40 mn). 7 (80 mn);
.
+
GA111-14 sans NH
: voies 3 (20 mn). 5 (40 mn). 8 (80 mn) ..
4
GA111 (NifA-) sans NH + : voies 9 (60 mn) et 10 (180 mn).
4
CA108 (NifA-) : voies 11 (60 mn) et 12 (180 mn).
Les protéines réprimées par L'ammoniaque sont montrées par Les fLèches.

- 92 -
Comme dans les expériences de réduction d'acétylène, les produits
nif apparaissent beaucoup plus vite dans la souche complémentée
GAlll-14 (Fig. VI-2, voie A6) que dans la souche B10 (voie A5). Les
produits de la nitrogénase sont aussi synthétisés en plus grande
quantité dans cette souche que dans B10. Dans les cellules qui ont été
lysées, et plus particulièrement dans la souche GAlll-14 où on arrive à
comparer les protéines synthétisées en absence et en présence de NH +
4
(15 mM), on observe environ 14 protéines (Tableau VI-2). Dans la souche
B10, la comparaison est moins nette ; seulement 6 protéines peuvent
être observées, de masses moléculaires 58,5kd, 55kd, 52kd, 47,5kd, 39kd
et 34,5kd. Les protéines de 58,5kd et 55kd sont les protéines
constituant le composant l de la nitrogénase et la protéine de 34,5kd
est celle qui constitue le composant II de la nitrogénase. La protéine
observée à 39kd pourrait être la sous-unité de la protéine à Fe
modifiée. Les valeurs trouvées ici pour les protéines de la nitrogénase
diffèrent un peu de celles qui ont été préalablement obtenues par
HALLENBECK et al. (1982a, b), JOUANNEAU et al. (1983) qui étaient de
59,5kd et 55kd pour les sous-unités de la protéine à MoFe et de 33,5kd
et 38kd pour les sous-unités de la protéine à Fe non modifiée et
modifiée. Des conditions de migration et de préparation des
échantillons différents peuvent peut-être expliquer ces légères
différences. L'intensité des bandes des sous-unités de la protéine à
MoFe peut masquer la bande de la sous-unité de la glutamine synthétase
qui a une masse moléculaire de 56kd (MICHALSKI et al., 1983). Dans le
gel VI-2, on voit que la protéine de 52kd est très peu marquée dans la
souche GAlll-14 à 90 mn (voie A6) et ne l'est plus du tout à 150 mn
(voie A12) alors qu'elle est nettement visible, donc radioactive dans
B10 à partir de la 90ème minute d'incubation (voie A5) et jusqu'à
240 mn (voie A11). Afin de pouvoir mieux suivre la synthèse de la
protéine de 52kd, le marquage a été effectué plus tôt lors de
l'incubation. Ainsi, dans la souche GAlll-14, on observe la protéine de
52kd lorsque les acides aminés marqués sont ajoutés à la 20ème minute
(Fig. IV2B, voie B3), mais on ne la voit plus lorsque les acides aminés
radioactifs ont été ajoutés après la 40ème minute (voies B5 et B8). La
protéine observée à 52kd semble être synthétisée le plus rapidement et
apparaît la première avant les autres protéines nif sur le gels ; sa
radioactivité (donc sa synthèse) diminuant au fur et à mesure de
l'incubation, cette protéine pourrait être la protéine de type DirA.

-
93 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 'D 1415 16
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14-3-
Fig; VI-J : Cinétique d'apparition des produits nif avec des échantiLLons
obtenus par sonication; La même quantité de protéines (50 Il g) a
été déposée dans chaque puits; GeL de poLyacryLamide à 12,5 %. Le
marquage se fait pendant 1 h; Addition des (14 C) amino acides aux
temps indiqués entre parenthèses.
+
810 sans NH
: voies 2 (20 mn), J (60 mn), 4 et 16 (120 mn), 5
1
(180 mn).
+
810 + 15 mN NH
: voie 6 (120 mn).
1
+
GAlll~14 sans NH
: voies 8 (10 mn), 9 (JO mn), 10 (80 mn),
1
11 (180 mn).
+
8A111-14 + 15 mM NH
: voie 12 (120 mn);
1
GA108 (Ni~-) sans-NH1~ : voie 14 (180 mn).
GA111 (NifA
) sans-NH/ : voie 15 (180 mn);
La triangLe indique La protéine de 52kd.

- 94 -
Dans les échantillons obtenus par sonication (Fig. VI-3), on voit
nettement que la protéine de 52kd apparaît plus tôt, dans le temps,
dans la souche complémentée GAlll-14 (voies 8 et 9) que dans la souche
sauvage BIO (voies 2 et 3) et que son marquage s'arrête aussi plus tôt
que celui des autres protéines nif (voie Il, versus 5).
Dans les lysats des souches mutantes, GAl08 et GAlll, on ne
détecte que 7 des 14 protéines observables avec la souche complémentée,
GAlll-14 (indiquées par des flèches sur la Fig. VI-2B). Les sept
protéines, qui ne sont pas observées dans les mutants de type NifA-,
sont des protéines nif. Quant aux sept autres, leur identité reste à
être prec1ser. Elles peuvent être ou ne pas être des protéines nif. Les
mutants (GAl08 et GAlll) sont deux mutants de type NifA- portant des
mutations en des points différents du chromosome. Le fait qu'aucune des
protéines de la nitrogénase ne soit présente confirme le phénotype de
type Ni fA- car les mutants affectés dans le gène nifA de K., pneumoniae
ne synthétisent aucune des protéines de structure de la nitrogénase. Si
les 7 protéines, réprimables par l'ammoniaque, observées dans les
souches de type NifA-, sont effectivement des protéines nif, ceci
indique que le gène de type nifA de R. capsulatus ne régule pas la
transcription de tous les gènes nif comme c'est le cas chez
K. pneuaoniae (DIXON et al., 1977 ; BUCHANAN-WOLLASTON et al., 1981 a,
b ;FILSER et al., 1983).
3- Analyse des protéines nif sur gel en double dimension
Les gels en simple dimension ne permettent pas de distinguer
toutes les protéines et surtout les protéines de masses moléculaires
voisines qui peuvent être masquées par l'intensité des bandes de
protéines plus fortement marquées. En vue d'identifier tous les
produits nif de R. capsulatus, nous avons cherché à séparer en double
dimension les produits nif contenus dans les extraits solubles obtenus
par sonication. Nous avons comparé la souche complémentée GAlll-14 et
la souche mutante, de type NifA , GA1l1.
Comme pour l'analyse en simple dimension, on compare les
protéines qui sont présentes en absence d'ammonium 15 mM et absentes en
présence de NH +. Avec la souche GA1ll-14 où, on l'a vu sur la
4
Fig. VI-l, la réduction d'acétylène se fait à une vitesse beaucoup plus
grande que dans la souche sauvage, on observe au moins 15 proté;i;net;i
, .
. ".
\\....

- 95 -
nif i les protéines de structure de la nitrogénase apparaissent à un
pl de 5,3 pour la protéine à Fe, à un pl de 6,3 pour la sous-unité e de
la protéine à MoFe et à un pl de 6,0 pour la sous-unité a
de la
protéine à MoFe. Ces résultats sont similaires aux valeurs trouvées par
HALLENBECK et al. (1982 a,b) qui trouvent des pl de 6,25, 6,0 et 5,35
pour les sous-unités de la protéine à MoFe et de la protéine à Fe. La
protéine observéé à un pl de 5,5, serait la sous-unité de la glutamine
synthétase qui migre presqu'au même endroit que la sous-unité a de la
protéine à MoFe de la nitrogénase (MICHALSKI et al., 1983). La protéine
de 52kd qui apparait à un pl de 5,15 serait la protéine de type nifA.
On observe aussi plusieurs protéines vers les masses moléculaires plus
basses, parmi lesquelles doit se trouver la ferredoxine (HALLENBECK et
al., 1982 c).
4- Discussion
Dans R. capsulatus, certains produits réprimés par l'ammoniaque
14
ont été identifiés par marquage spécifique au C
et analyse des
produits sur des gels de polyacrylamide contenant du SDS ou en double
dimension. Parmi les protéines réprimées par l'ammoniaque se trouvent
les produits des gènes nif. Dans les mutants de R. capsulatus qui sont
de type NifA-, certaines protéines supposées nif, sont présentes. Le
fait que des protéines nif soient présentes dans les mutants NifA-
pourrait signifier que la régulation de la transcription des gènes nif
correspondants n'est pas sous le contrôle du produit d'un seul gène de
type nifA. En d'autres termes, le produit du gène de type nifA étudié
dans cette thèse ne contrôlerait pas l'expression de tous les gènes nif.
Dans cette hypothèse, il y aurait donc une différence dans la
régulation de l'expression des gènes nif entre R. capsulatus et
K. pneWDOniae.
On se souvient que
différents mutants de phénotype de type NifA-
ont été isolés (Chapitre III), les mutations se regroupant en deux
régions différentes du chromosome. Un mutant de type NifA- de chacun
des deux groupes, les mutants GA111 et GA108, ont été plus
particulièrement étudiés. Seul le mutant GA111 a pu être complémenté
par le gène cloné de type nifA. Il apparaît donc que R. capsulatus
1

- 96 -
pourrait contenir non pas un mais deux gènes de régulation nif,
contrairement à K. pneumoniae où seul le produit du gène nifA régule la
transcription de tous les autres gènes nif (ROBERTS et al., 1978).
Dans les expériences de marquage en cinétique des produits nif,
on observe une protéine de 52kd, qui est synthétisée très activement au
début de l'incubation, lors de l'apparition de la réduction
d'acétylène, mais chez laquelle l'incorporation d'aminoacides se
ralentit au fur et à mesure que la synthèse de la nitrogénase se fait.
La cinétique de synthèse de cette protéine de 52kd présente des
analogies avec celle du produit de nifA de K. pneumoniae. En effet, les
observations faites sur la cinétique d'apparition des ARNm de l'opéron
nifLA (KALUZA et HENNECKE, 1982 ; CANNON et al., 1985a) de
K. pneumoniae indiquent que la transcription de ces gènes régulateurs
atteint un niveau maximum avant la transcription des autres gènes nif
(CANNON et al., 1985a). Par ailleurs, la protéine nifA de K. pneumoniae
(CANNON et al., 1985) apparaît avant les autres protéines nif. La
protéine de 52kd qui serait le produit du gène de type nifA de
R. capsulatus est présente dans les mutants de type NifA-
elle est
observée dans le mutant GAlll caractérisé par la mutation nif-88 et
n'est synthétisée qu'en faible quantité dans le mutant GA108
caractérisé par la mutation nif-85 (Fig. VI-3). Si cette protéine
provient du gène de type nifA que nous avons cloné, alors elle serait
inactive dans le mutant GAlll et trop faiblement synthétisée dans
GA108.
La protéine de type nifA de R. capsulatus (de 52kd) a un pl de
5,15. Si la fonction du produit du gène de type nifA de R. capsulatus
ressemble à la fonction du produit de nifA de K. pneumoniae, les
propriétés physico-chimiques de ces deux protéines semblent très
éloignées puisque le produit nifA de K. pneumoniae est basique (ROBERTS
et BRILL, 1980). D'autre part, les poids moléculaires sont aussi
légèrement différents
52kd chez R. capsulatus et 57kd chez
K. pneumoniae (BUCHANAN-WOLLASTON et al., 1981b ; FILSER et al., 1983).
Ces différences sont peut être responsables de la non-hybridation entre
le gène de type nifA de R. capsulatus et le gène nifA de K. pneumoniae.
Le gène nifA de R. meliloti a été cloné et sequencé ; d'après la
séquence nucléotidique, on a déduit que la
masse moléculaire du C
produit du
gène est de 59.978 daltons. (BUIKEMA et al., 198~;?
'~:;;<?\\':;
~.

- 97 -
Le produit de nifA dans d'autres organismes diazotrophes n'a pas
encore été observé, ni caractérisé. La connaissance ou la
caractérisation d'un autre produit nifA chez d'autres organismes
fixateurs d'azote permettrait peut être de mieux comparer les
différents produits des gènes de type nifA.
5- Conclusion
La comparaison de la vitesse de réduction d'acétylène par les
souches de R. capsulatus : B10, GAlll-14 (souche complémentée), GA108
et GAlll (NifA-), nous a permis d'observer que la souche GAlll-14
réduit l'acétylène à une vitesse beaucoup plus élevée que la souche
sauvage B10. Ceci est dû à la présence, dans GAlll-14, de plusieurs
copies du gène de type nifA qui stimuleraient fortement la
transcription des autres gènes nif, même plus que dans la souche
sauvage B10. Dans le mutant GA108, qui porte la mutation n~f65
appartenant à un groupe différent de la mutation nif88 portée par GAlll
(cf. 111-2), une activité nitrogénase très faible n'est observée
qu'après des temps très longs d'incubation. Cette très faible activité
est attribuée à l'apparition de mutants de réversion de cette souche.
La mutation portée par cette souche serait donc instable. Par contre,
dans le mutant GAlll, qui est aussi de type NifA-, la mutation est
stable car on n'observe aucune activité nitrog~nase après de longues
périodes d'incubation.
Les expériences de marquage spécifique des produits nif avec des
acides aminés marqués au l4C ont permis, après analyse des produits sur
gel de polyacrylamide contenant du SDS, d'identifier 14 protéines
"nif". Dans les mutants de type NifA- (GA108 et GAlll) , i l n'y a que 7
protéines nif présentes (Tableau V1-2 ; Fig. V1-2). Les sept protéines
absentes sont des protéines nif et les sept autres, qui sont présentes,
peuvent être ou ne pas être des protéines nif. Dans l'hypothèse où ce
sont des protéines nif, la régulation de la synthèse des gènes nif de
R. capsulatus ne serait pas la même que celle de K. pneumoniae, puisque
dans les mutants de type NifA- certaines protéines "nif" sont encore
synthétisées dans R. capsulatus. Ceci peut résulter de l'organisation
des gènes nif dans le chromosome bactérien, cette organisation étant
diffétente dans chacune des espèces.
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- 98 -
L'observation des protéines nif sur gel de polyacrylamide
contenant du SDS a permis d'identifier un produit qui se marque plus
rapidement que les autres et se développe durant les premières minutes
d'incubation, puis au fur et à mesure que la réduction d'acétylène
s'effectue, sa synthèse s'arrête. Cette protéine a une masse
moléculaire de 52kd et a une cinétique de synthèse comparable à celle
de la protéine nifA de K. pneumoniae. On observe une différence dans
les échantillons obtenus à partir des cellules des mutants de type
NifA-, GAl08 (nif-85) et GAll1 (nif-88) cassées par sonication. Dans le
mutant GA111 la protéine de 52kd est accumulée alors que dans la souche
GA108, cette protéine n'apparaît que faiblement en autoradiographie, et
pourrait n'être que faiblement synthétisée.
L'analyse des protéines nif sur des gels en double dimension nous
a permis de détecter la présence de 15 protéines "nif" (au lieu des 14
observées sur les gels à une dimension) ainsi que la protéine de la
sous-unité de la glutamine synthétase. La protéine de 52kd pourrait
être la protéine de type nifA. Elle apparait à un pl de 5,15. Elle
diffèrerait de la protéine nifA de K. pneumoniae par son poids
moléculaire et son acidité (la protéine nifA de K. pneumoniae étant
basique et ayant un pM de 57kd).

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-

- 99 -
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-
1- Organisation des gènes nif chez R. capsulatus
Les études par conjugaison, utilisant le plasmide pTH10, ont
montré que ce plasmide mobilise les gènes de R. capsulatus, et les
-6
-5
transfère d'une souche à une autre avec une fréquence de 10
à 10
.
Ces études ont permis de déduire que les gènes nif de R. capsulatus
sont dispersés dans le chromosome en plusieurs groupes. J'ai pu
distinguer trois groupes de gènes nif qui présentent des liaisons avec
des gènes chromosomiques de résistance aux antibiotiques
(streptomycine, rifampicine et novobiocine). Ce travail a été poursuivi
dans notre Laboratoire et les expériences de conjugaison, à l'aide du
plasmide pTH10, ont abouti à l'établissement d'une carte circulaire du
chromosome de R. capsulatus (WILLISON et al., 1985). Quatre ou cinq
groupes de gènes nif ont été localisés
ils se trouvent dispersés dans
le chromosome de R. capsulatus.
Ces résultats sont en accord avec ceux de WALL et BRADDOCK
(1984), basés sur l'utilisation du GTA comme système de transfert, qui
ont conduit à l'identification de cinq groupes de gènes nif chez
R. capsulatus. Cependant, c'est par conjugaison que la disposition de
ces groupes de gènes nif sur le chromosome a été mise en évidence
(WILLISON et al., 1985).
Ces résultats sont compatibles aussi avec ceux du groupe PUHLER
(PUHLER et al., 1984) d'une part, et du groupe d'HASELKORN (AVTGES et
al, 1983 ; SCOLNIK et HASELKORN, 1984) d'autre part, portant sur
l'isolement de fragments d'ADN de R. capsulatus, de respectivement 20
et 16kb, contenant plusieurs gènes nif. Au vu des cartes de restiction,
le fragment EcoRI de 15,2kb que j'ai cloné (sur pGA10) semble avoir une
partie commune avec le fragment de 16kb isolé chez HASELKORN (SCOLNICK
et HASELKORN, 1984) mais paraît être totalement différent du fragment
de 20kb isolé par KLIPP et PUHLER (PUHLER et al., 1984). Ni dans le
laboratoire allemand, ni dans le laboratoire américain, la localisation
sur le chromosome des fragments clonés n'a été donnée. Par conséquent,
la démonstration que les gènes nif de R. capsulatus sont dispersés sur
le chromosome constitue l'une des originalités de ce travail de thèse
(Chapi tre III).

- 100 -
L'organisation des gènes nif de R. capsulatus est différente de
celle observée dans K. pneumoniae, où tous les gènes nif sont groupés
en un seul endroit du chromosome, et situés à côté de l'opéron
histidine (STREICHER et al., 1971 ; DIXON et POSTGATE, 1971). Chez
certains organismes fixateurs d'azote comme R. meliloti (BANFALVI et
al., 1981 ; ROSENBERG et al., 1981) et R. leguminosarum (NUTI et al.,
1979), certains gènes nif se trouvent groupés sur un mégaplasmide, ce
qui n'apparaît pas être le cas chez R. capsulatus.
2- Régulation des gènes nif chez R. capsulatus
L'organisation des gènes nif de R. capsulatus est différente de
celle de K. pneumoniae. En est-il de même pour la régulation? Pour
répondre à cette question, nous avons cherché à identifier des gènes de
régulation nif et à les étudier. Certains mutants Nif- de R. capsulatus
ont pû être caractérisés à l'aide d'anticorps dirigés contre les
composants de la nitrogénase de R. capsulatus, en particulier les
mutants chez lesquels les trois polypeptides de la nitrogénase sont
absents. Ces mutants, ayant un phénotype de type NifA- apparaissent
donc être affectés dans un gène de régulation spécifique pour la
fixation d'azote, un gène de type nifA.
Les études par conjugaison ont fait apparaitre deux types de
mutations de type nifA éloignées sur le chromosome ; plusieurs
mutations de type nifA (ex. nif-16, nif-24, nif-88) se trouvent dans le
même groupe que le gène de la protéine à Fer de la nitrogénase, le gène
nifH, mais une mutation de type nifA (nif-85) se trouve éloignée des
précédentes et située dans un groupe différent. L'existence de deux
types de mutations de type nifA chez R. capsulatus pourrait signifier
l'existence d'une régulation de la transcription des gènes nif
différente de celle de K. pneumoniae.
En vue d'isoler et d'identifier le fragment d'ADN contenant le
gène de type nifA qui est dans le même groupe que le gène de structure
nifH, une banque de gènes de R. capsulatus BIO a été construite. Un
fragment d'ADN de R. capsulatus a été isolé; ce fragment complémente
un des deux groupes de mutants de type NifA- et complémente aussi les
mutants mutés dans le gène de structure nifH. Le gène de type nifA de
R. capsulatus a été identifié sur un fragment HindIII de 2,lkb et

-'101 -
montré être localisé à côté des gènes de st~ucture (nifHDK) de
R. capsulatus, et plus précisément être adjacent au gène de structure
ni:fK.
Comme chez K. pneumoniae où le gène nifA permet l'expression de
l'opéron nifHDK (DIXON et al., 1977) et des autres opérons nif (ROBERTS
et al., 1978), ce gène de type nifA permet l'expression de l'opéron
nifHDK de R. capsulatus. La recherche des homologies de séquences entre
le gène de type nifA de R. capsulatus et le gène nifA de K. pneumoniae
a montré que les deux gènes ne s'hybrident pas, donc ne présentent pas
de fortes homologies de séquences. Une séquence d'ADN contiguë au gène
de type nifA de R. capsulatus s'hybride avec le gène nifB de
K. pneumoniae. Le gène de type nifA de R. capsulatus se trouverait donc
entre le gène de structure nifl{ et un gène de type nifB.
Des gènes de régulation nif de R. capsulatus ont été clonés dans
d'autres laboratoires. Ainsi deux gènes de type nifA ont été clonés
dans le laboratoire de PUHLER (KLIPP et al., 1985). Ces gènes ont été
identifiés par hybridation avec le gène nifA de K. pneumoniae. Ces deux
gènes sont situés dans deux régions différentes du chromosome, l'une
des régions se trouvant à 10kb des gènes de structure nifHDK de
R. capsulatus.
Quatre gènes régulateurs nif (nifRl, nifR2, nifR3 et nifR4) ont
été isolés dans le laboratoire de HASELKORN (AVTGES et al., 1985
KRANZ et HASELKORN, 1985). D'après les cartes de restriction, le gène
de type nifA que nous avons isolé correspondrait au gène nifR4 lequel,
comme notre gène de type ni fA , ne s'hybride pas avec le gène nifA de
K. pneumoniae. Les résultats présentés dans le Chapitre IV de cette
thèse ont montré qu'il n'existe pas d'hybridation entre le gène nifA de
K. pneumoniae et le gène de type nifA que
nous avons cloné ou l'ADN
total de la souche B10 digéré avec EcoRI ou HindIII (Fig. IV-7A). Par
contre, KLIPP et al. (1985) ont rapporté, dans un résumé d'une page,
que des fragments clonés d'ADN de R. capsulatus s'hybrident avec une
sonde nifA de K. pneumoniae. Etant donné le peu d'information dont on
dispose sur ce travail, il n'est pas possible de discuter sur ce point.
Le groupe de HASELKORN n'a pas démontré la liaison du gène de
type nifA avec les gènes de structure de la nitrogénase (nifHDK) et n'a
pas trouvé l'existence d'un gène de type nifB à côté du gène de type
nifA de R. capsulatus. D'après KRANZ et HASELKORN (1985), les produits
des gènes nifRl, nifR2, nifR3 et nifR4 sont nécessaires pour

- 102 -
l'activation du promoteur de l'opéron nifHDK car des mutations dans
l'un de ces gènes empêchent l'expression du produit de fusion
nifH::lacZ. Ces quatre gènes sont des candidats pour être le gène nifA
de R. capsulatus. Comme pour le gène nifA de K. pneumoniae, le gène de
type nifA que nous avons isolé et qui complémente la mutation nif88,
est sous le contrôle de l'ammoniaque (Fig. VI-2). Dans les gènes de
régulation isolés par KRANZ et HASELKORN, seuls les gènes nifR2 et
nifR4 sont sous le contrôle de l'ammoniaque alors que les deux autres
(nifRl, nifR3) ne le sont pas. D'après les cartes de restriction, le
gène de type nifA que nous avons isolé correspond probablement au gène
nifR4 de KRANZ et HASELKORN (1985).
3- Expression des gènes nif chez R. capsulatus
Chez K. pneumoniae, les mutations dans le gène nifA se traduisent
par le manque de synthèse de toutes les autres protéines nif. En
serait-il de même pour les mutations de type nifA de R. capsulatus ?
Les produits nif de R. capsulatus ont été étudiés par
dérépression de la nitrogénase. Certains produits réprimés par
l'ammoniaque ont été identifiés sur gels de polyacrylamide contenant du
SDS ou bien sur gel de polyacrylamide en double dimension. Les produits
"nif" dont la synthèse est réprimée par l'ammoniaque ont été
identifiés
14 protéines "nif" ont été identifiées sur gels SDS-
polyacrylamide et 15 protéines "nif" ont été identifiées sur gel de
polyacrylamide en double dimension.
Les études cinétiques par marquage des protéines répressibles par
NH + ont permis d'identifier une protéine "nif" qui est synthétisée
4
plus rapidement que les autres : son taux de synthèse est plus élevé
dans les premiers moments de l'incubation, puis décroît au fur et à
mesure que l'incubation se poursuit, alors que d'autres protéines "nif"
continuent à être synthétisées activement. L'expression des gènes nif de
K. pneumoniae suit une cinétique comparable: l'opéron nifLA est
transcrit avant les autres (KALUZA et HENNECKE, 1982 ; CANNON et al.,
1985a)
puis le produit de nifA apparaît en premier, puis disparaît au
fur et à mesure que les autres protéines nif sont synthétisées (CANNON
et al., 1985a). Le produit nif de R. capsulatus qui apparaît en premier
serait donc le produit de type nifA. Dans les expériences de marquage
en cinétique, on observe une différence dans la réduction d'acétylène

- 103 -
entre la souche sauvage B10 et la souche complémentée (GAIII-14)
;
cette dernière réduit l'acétylène beaucoup plus vite que B10 (grâce aux
copies du gène de type nifA portées par les plasmides).
Après complémentation du mutant de type NifA- (GA-Ill) par le
gène de type nifA que nous avons cloné, on a pu observer une activation
de la synthèse de la nitrogénase beaucoup plus forte dans la souche
comp1émentée (GAlll-14) que celle qui existe normalement dans la souche
sauvage (Chapitre IV, Fig. VI-1 et VI-2, Tableau VI-1). Ceci est encore
une des originalités de ce travail car, le gène nifR4 (qui correspond
probablement au gène de type nifA que nous avons cloné) n'a pas été
montré complémenter des mutants de type NifA-et activer l'expression de
la nitrogénase comme il est montré dans les figures VI-1 et VI-2.
La protéine de type nifA de R. capsulatus pourrait être la
protéine de PM de 52kd observée en gel SDS de polyacrylamide, et de
pl 5,15, qui a un taux de synthèse plus élevé que les autres protéines
nif au début de l'expression de la nitrogénase. Le produit du gène nifA
de K. pneumoniae a un PM de 57kd (BUCHANAN-WOLLASTON et al., 1981 a ;
FILSER et al., 1983) et un pl basique (ROBERTS et BRILL, 1980). Si le
produit de 52kd provient du gène de type nifA de R. capsulatus que nous
avons cloné, on pourrait alors conclure que, bien que la fonction du
produit du gène de type nifA de R. capsulatus ressemble à celle du
produit du gène nifA de K. pneumoniae, les propriétés physico-chimiques
de ces deux protéines sont différentes.

- 104 -
PERSPECTIVES
Pour identifier avec certitude le produit du gène de type nifA de
R. capsulatus, les études ultérieures devraient s'orienter vers
- le séquençage du gène pour déterminer le cadre de lecture ouverte,
afin de vérifier si celui-ci peut correspondre à la protéine de 52kd
- l'établissement d'un système d'expression de gènes in vitro chez
R. capsulatus car le gène de type nifA de R. capsulatus n'est pas
exprimé chez E. coli
- des expériences d'expression dans R. capsulatus, après s'être assuré
que le produit du gène de type nifA est absent. En effet, avec des
mutations ponctuelles, on pourrait avoir la synthèse d'un produit
inactif ou une synthèse réduite. C'est pourquoi il paraît préférable
de faire des insertions de t~ansposons (ex. Tn5) dans le gène afin
d'inactiver complètement l'expression de celui-ci (cf. DE BRUIJN et
LUPSKI, 1984) ;
l'étude de l'expression d'autres gènes nif par fusion de ces gènes
avec lacZ d'E. coli, en utilisant le phage miniMu::lac (KRANZ et
HASELKORN, 1985).

B l B LlO G R A PHI E
-=-=-=-=-=-=-=-=-

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RÉSUMÉ
L'isolement des mutants Nif (incapables de fixer l'azote atmosphérique) de R.capsulatus à l'aide du
NTG où de "EMS a permis de faire des études de transfert des gènes par conjugaison entre les souches de
Ff.capsulatus, en utilisant le plasmide pTH10. Ces études nous ont permis de localiser au moins trois
groupes de gènes nif dans le chromosome de R.capsulatus. Les mutants Nif de chaque groupe ont été
caractérisés immunologiquement pour la présence ou l'absence des deux composants de la nitrogénase.
Le groupe 1 comprend les mutants ne synthétisant pas la protéine à fer (composant Il) et des mutants
auxquels il manque les deux composants de lanitrogénase (mutants de type NifA\\ Les mutations du
groupe 1portent donc sur le gène de structure nifH et sur le gène de type nifA.
Par construction d'une banque génomique de R.capsulatus 810 dans le site- EcoRI du plasmide
pRK290, nous avons isolé un fragment EcoRI de 15,2Kb qui complémente le phénotype des mutants de
type NifA- (RC16, RC24 et GA111) et complémente aussi les mutants mutés dans le gène de structure
nifH (RC1, RC3 et RCS). La digestion complète de ce fragment avec EcoRI donne trois fragments de
7,80Kb, 4,85Kb et2,56Kb. Le fragment de 7,8Kb complémente tous les mutants NifH-, le fragment de
4,85Kb complémente tous les mutants NifA-
et le fragment de 2,56Kb ne complémente aucun mütant
Nif testÉ'
.
La comparaison de la carte de restriction.oe ces fragments avec la carte de restriction des gènes. de
structure de la nitrogénase, nous a permis de déduire que e fragment de 7,80Kb contient les gènes de ...
structure nifH et nifD, le fragment adjacent de 4,S5Kb contient les gènes de structure nifK et le gène type
. nifA. Le gène de type nifA a été localisé dans un fragment Hindll' de 2,15Kb contenu dans le fragment de
'o4,S5Kb. Les expériences d'hybridation entre le fragment Sali de 2,SKb d'ADN de K.pneumoniae (contenant
les parties des gènes nifB èt nifL et le gène nifA entier) et l'ADN total de R.capsulatus 810 digéré avec EcoRI
~
.
.
ou Hindlll 'et les différents fragments du fragment de 15,2Kb de R.capsulatus ont permis de mont~er que le
gène nifA de K.pneumoniae ne s'hybride pas avec le gène type nifA de R.capsulatus. Nous avons trouvé
une hybridation entre le fragment de 2,56Kb de R.capsulatus et là partie du gène nifB de K.pneùmoniae. Le
fragment d~_ \\5,2Kb de R.capsulatus contient donc les gènes de structure de la nitrogénase, le gène de
type nifA et le gène type nifB dont l'ordre dans Je fragment est le suivant:
,
nifH - nif0 - nifK - "nifA" - "nifB"
~
,
Les essais d'expression du gène de type nifA dan's les systèmes d'expression d'E.coli n'ont pas permis
d'obtenir une protéine de R.capsulatus détectable.
.
':~
Les expériences de dérepressi6n de la nitr<~p,énase de R.capSulatus et de marq~age des protéines avec
les acides aminés uniformément marqués au 1 C, ont permis de montrer par analysl. ',,') produitS sur gel
de polyacrylamide contenant du SOS qu'il existe au moins 14 protéines nif. Les mut"nts de type NifA- sont'
dépourvus en certaines protéines nif mais pas en toutes. Les analyses des produits nif de R.capsulatus par
gel en double dimension ont confirmé qu'il existe au moins quinze (15) protéines nif. Une protéine de 52Kd;
ressemblerait au produit du gène type nifA et a un pHi de 5,15.
MOTS CLÉS:
Génétique, fixation d'azote, gènes nif, gène de régulation de type nffA.