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Examinateurs :
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À v A N T
PRO P 0 S
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Je rerœreie vivelTent Monsieur M. ME'lCHE" Professeur de
Biochimie à l'Ecole Nationale Supérieure d'Agronomi'è,et des Industries
c
Alirœntaires, d'mXJir accepté de superviser ce trava1~}l mené sous la
direction scientifique de Monsieur P. GFRMl IN, Chef,de Service de
Microbiologie industrielle Je l'E.N.S.A.I.A.
r'J-~~ "'- ,..
Je remercie Monsieur l?
G4Y, Professeur' de Biochimie.. à
l'Université de NAN; Y I, qui a suivi les débuts de ce travail ainsi que
Messieurs P. GERMlIN et A. MELO pour des conseils précieux qu'ils m'ont
p,'odigués tout au l mg de ce travai Z.
Je remercie égalerœnt le personne l du Laboratoire de Micro-
biologie industrielle de l'E.N.S.A.I.A. pour l'aide constante qu'il m'a
apportée.
( '
(
Au Président du Jury, Monsieur M. ME'IC HE et aux e~aminateurs
Messieurs R. G4Y et F. JACQUIN, Directeur de l'E.N.S.A.I.A.,,) je tiens
1
à e Xl' rime" toute nu grati tude pour a vai r aooe pU d' e""mrin e
oe t ra vai 1.
/ /
,
1
1
---'

---

INTRODUCTION
Ouverture des cycles
" . -. . . . . .
6
Coupure de la chaîne latérale de la cho1esténone •
9
MATERIEL ET METHODES
!
Souche . . . . . . .
• 13
II
Milieux de culture.
. . . .
13
III
Mesure de la c~üissance
17
IV
Préparation des extraits acellu1aires
. . • . 18
V
Isolement et identification des métabolites stéroides
. 21
VI
Méthodes utilisant l'incorporation de substrats marqués
. 24
VII
Mesure de la consommation d'oxygène
. . . . . • . .
25
VIn
Mutagènes et traitements mutagéniques
~._•..."
. . . .
26
/:.,\\~ePou~
IX
Méthodes d'isolement des mutants . .
~...\\. . . . ~~'P""~' •• 28
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Induction et répression catabolique
,2 - déshydrogénase • • . . . . . . . .
• • • • 30
II
P "oduction des mutants de catabolisme de
1androstène-dione . . • • • . . •
. . . • • • . . 35
III
Recherche des mutants constitutifs pour la
1,2 - déshydrogénase.
• • . . • . . . . •
. . 43
IV
Caractérisation des mutants ou de catabolisme de
l'androstène-dione • . • • . . . . • . . . • . .
50
V
Utilisation d'auxotrophie induite dans la détermination
de la voie catabo1ique • . . . . . . .
58
VI
Etude des voies centrales du métabolisme • . . . . .
• 64
VII
Catabolisme de la chaîne latérale de la cho1esténone par
le mutant M et le sauvage . . . . . . . . . . • . .
. 68
6
CONCLUSION
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
BIBLIOGRAPHIE
.
. .
• .
.
.
• • • .
• .
.
.
• .
• • • .
• .
.
. 77
1
r

---

' . -
\\ ~
-INTRODUCTION

---

J
•
-
1 -
L'utilisation des microorganismes pour effectuer des bioconversions des stéroï-
des de grand in~ér~t ouvre plusieurs voies :
1. La production d'hormones stéroides par coupure de la chaine latérale sans
dégradation des cycl~s à partir de stérols, notamment le cholestérol et les
phytostérols. Ceux-ci sont disponibles en grandes quantités dans la nature
et sont bon marché.
2. La possibilité d'ouverture "ménagée" des cycles d'hormones stéroides et
production de molécules pouvant servir de précurseurs pour la synthèse chi-
mique de rétrostéroides.
3. La production à partir de stéroides de molécules à propriétés pharmacodynami-
ques améliorées par mise en oeuvre d'une seule réaction,
;)ar exempl p
:
l'introduction d'une double liaison en 1,2 dans les cor.ticosté-
r, ides et .l'hydroxylation en lia uti!.isée pour la synthèse de l'hydrocortisone.
La sou, he Rhizopus nigricans produit la lIa hydroxyprogestérone à partir de la
progest··'rone avec un rendement de 80 % (1).
Nous nou~
sommes intére3sés aux deux premiers aspects du problème qui sont plus
spécifiquL5 aux Actynomycétaies. Plusieurs équipes travaillent sur ces problèmes
dont on co~çoit la résolution de cette façon
1. Coupure de la chaine latérale
Les Actinomycétales, particulièrement les MU~obgQ~~~igm, sont capables de dé-
grader aussi bien les cycles du stéroide que la chaine latérale. Les deux cata-
bolismes ont lieu simultanément, mais avec des vitesses différentes selon le mi-
croorganlsme.
STADTMAN et CL:.::'a.I.wrateurs (2) ont montré qu 'un t:!.Y..f2Q.è.gg'p..~~UlJJ. du sol dégradait
les cycles du stéroide quatre fois plus vite que la chaine latérale, alors que
l'équipe de PETERSON (3) trouvait des résultats contraires chez un êt~~tQ.~~~~~'

---

- 2 -
Cela montre que les mécanismes de ces deux grandes voies cataboliques sont très
différentes et engagent des enzymes bien distinctes. Actuellement, la solution
est d'inhiber spécifiquement l'ouverture des cycles du stéroide sans inhibition
de la coupure de a chaine latérale par usage d'inhibiteurs chimiques (4), la
1
8-hydroxyquinol;"~, la 1,10-phénantroline, la 2,2-dipyridyle notamment.
Ces agents inhibiteurs altèrent le processus de fermentation, bloquent la crOiS-
sance, obligeant à des transformations par cellules non proliférantes. On pense
aussi à l'utilisation des mutants incapables de la dégradation des cycles mais
coupant la chaine latérale (5). Cependant, peu de choses sont encore connues sur
ce point.
2. Ouverture ménagée des cycles
La dégradation partielle des cycles pour accumuler des produits précurseurs pour
la sy tthèse chimique de rétrostéroides est un problème qUi n'est pas encore abor-
dé sur le plan"de la modification génétique, mais il l'est déjà par optimisation
du mili,"u.
STRIJEWSK[ et coll.
(6) ont pu augmenter la production de l'acide ~erhydroindane
propioniqL~ par optimisation du mil:eu synthétique de croissance. Ils ont montré
que les iOLs ferreux sont non seulement nécessaires à la production, mais encore
ils influeQ ent directement la quantité de l'acide perhydroindane propionique
produite. Ils ont montré également que la concentration du calcium dans le milieu
synthétique ,~lgmente de façon importante l' efficaci té de la production du précur-
seur acide perhydroindane oropionique.
Dans l'étude de ces deux aspects que nous venons d'évoquer, nous avons pu isoler
deux types de mutants :
- ceux qui font la S-oxydation
ces mutants dégradent la chaine latérale,
malS pas les cycles,
- ceux qUi ne font pas la S-oxydation : ces mutants font une dégradation
ménagée des cycles, mais sont incapables de couper la chaine lctérale.

---

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·~1
- 3 -
Les stéroides sont des composés qui contiennent le noyau perhydro cyclopenténo-
phénanthrène. Ils sont classés en trois séries: la série androstane, la série
prégnane et la série cholestane.
J
J
3
3
série androstane
série prégnane
série cholestane
Pour mener à bien ces études, il est nécessaire de connaître le catabolisme
des stéroides comprenant globalement deux grandes voies :
- l'ouverture des cycles
- la coupure de la chaîne latérale
OUVERTURE DES CYCLES
L'aromatison du cycle A et l'ouvert~re du cycle B conduisant au phénol ]-111
est une réaction chimique qui se produit dès que la 1,2 déshydrogénation et la
9 a-hydroxylation sont faites. Les équipes de S1H et de SCHUBERT établirent pour
l'essentiel les voies du catabolisme des ~ 4-3-oxo-stéroides (7), SCHUBERT et
collaborateurs montrèrent l'existence d'une VOle similaire à celle décrite par
DOnSON et MU1R avec MuQ~QgQ!éri~_~~~q!is (8). E~ utilisant la progestérone
comme substrat (2.1), ils caractérisèrent le produit 2.11. Puis, en utilisant

---

2
•
~: J~
- 4 -
le cholestérol comme substrat, les mêmes auteurs (9) obtinrent une transforma-
tion identique des cycles A et B, ce qui conduit à penser que cette voie est
générale et fonctionne de la même manière, que ce soit sur les séries anèrostane,
prégnane que cholestane. Cette unicité des processus de dégradatio~ des cycles
est en effet dl3éutable comme nous le verrons ultérieurement. SIH et collabora-
teurs (10) en fournissant l'androst-4-ène-3,17-dione à des cellules intactes de
~~Qg~gig_Q~~qIIi~g~ ~~_~~QgQQ~g~~ ~ §gQiII~€_QU~IQQ~Ugg~~ou f~~~Q~Q~q€_f~€f~­
§f~~~~i purent isoler le produit 1 IV , 3,4- dihydro-xy-9,10-séco-androst-I,3,5
(10)-triène-9,17-dione
et le produit
1 VI, 3 a a-H-4 a 1 3' propVnate 1 -
7 a
8 méthyl - hexahydro-I,5 indanedione. Les extraits acellulaires de ~~~q~4ig
~~~f~iQf~§ convertissent aussi le produit I.IV en I.VI (Il) (12) (13) et en acide
2-oxo-4-hydroxycaproique (14). Cet acide est dérivé de J.VII . Il a été montré
que le composé I.IV était d'abord transformé en céto-a~ide I.V par des extraits
acellulaires de ~QQq~4fq_~~~t~i~t~~ selon une réaction de type métapyrocatéchase.
Au cours de cette réaction, une mole d'oxygène est consommée par mole de subs-
trat. La réaction est stimulée par les ions ferreux. L'incubation de ce composé
I.V
produit les composés I.VI et I.VIl . Les cellules entières de ~Q~q~4ig_~~~­
!~f~!us transforment le composé I.VII en présence de 0,001 M d'arsénite en aldé-
hyde propionique et acide pyruvique. L'ensemble des dégradations de l'and~'ost-4­
ène-3,J7-dione est rassemblée sur 'a figure 1.
Parallèlement à ces travaux de SIH et collaborateurs sur la série androstane,
SCHUBERT et collaborateurs (15) ont obtenu également un dérivé de l'acide perhy-
droindane propionique (2.111) provenant de la dégradation de la progestérone in-
cubée en présence de ~U~~~q~!~~i~_~~~a~qti~. Ils ont aussi observé le départ
d'un composé C6 venant du ~oyau A (16). Avec ~Q~q~qfq_Q2~q et aux fortes teneurs
en progestérone, l'acide perhydroindane propionique a été obtenu avec un rende-
ment de 70 % (17). Les résultats du catabolisme de la progestérone sont rassem-
blés dans la figure 2.

---

- 5 -
)
1. l
l
1.II
(
HO
H
OH
1. IV
1.TII
l
)
)
C Oo/i .
~
1. V
1. VI
1. VII
CH CO COoH
3
Figure 1 - Catabolisme de l'androst-4-ène-3~1?-dione par les Nocardiae

---

-
6 -
>
(.ùoH:
HO
V
2.1
2.11
2.111
\\ ,,
Figure 2 -
Dégradation de la progestérone par Nocardia opaca et ~~C??E~!~~~
~"!.~gT!Ic!!~~
Après la mise en évidence de l'acide perhydroindane propionique, il restait à
rendre compte des voies permettant la dégradation des cycles C et D.
A partir
d'acides perhydroindane-propionique de synthèse (3.1 et 3.IV), LEE et SIH (18)
montrèrent leur coupure en deux fragments. L'obtention d'un composé bicyclique
porteur d'une double liaison (3.111) à partir de 3.1 et d'un composé bicyclique
saturé (3.VI) à partir de 3.14 traduit le départ d'un composé à 2 atomes de car-
bone.
LEE et SIH émettent l'hypothèse que le départ d'une chaîne à 2 carbones se fait
?a~ mise en oeuvre de la 8-oxydation.
SCHUBERT et collaborateurs (19)
(20) mirent en évidence la production des acides
a-cétoglutarique et succinique en cultivant f!.Q.qg.rdi.çLœ.Q~Q en présence d'acide
,
pe rhyd roindane propioniquc portant la fonction acétyle en 18.
I4
Par la suite, en utilisant cet acide de synthèse, porteur d'un marquage au C
sur Cl et C
' ils parvinrent à analyser de l'acide succinique marqué sur les
3a
carbones des fonctions carboxyliques (21)
(22)
. Bien que les intermédiaires de
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---

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- 7 -
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C 0011
3.1
3. II
3. III
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(.0011
3. IV
3.V
3.VI
Figure 3 - Dégradation des deux dérivés de synthèse d'acide perhydroindane pro-
pionique par Nocardia restrictus

---

- 8 -
\\
l
l
l
COOH - C.o - CH - CH,l- (ooU
)f,
~
-+
Figure 4 - Schéma de dégradation par E~q~~~~q gea_cg d'un acide perhydroin~
propionique proposé par' SCHUBERT et coll.

---

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,"
- 9 -
la dégradation de l'acide perhydroindane proplonlque n'aient pas été isolés,
les résultats de SCHUBERT et coll. semblent fortement consolider l'hypothèse
selon laquelle, après B-o~ydation, les mécanismes ayant provoqué l'aromatisa-
tion du cycle A et l'ouverture du cycle B se reproduiraient de manière analo-
gue pour aromatiser le cycle C : couper la liaison entre les carbones 1 et 7a
(selon la numérotation de l'acide perhydroindane propionique I.VI), libérer un
acide à six atomes de carbone ainsi que l'acide a-cétoglutarique ou succinique.
La figure 4 rassemble les implications de cette hypothèse.
Cette étude du catabolisme des cycles du stéroide met en évidence' le rôle clé
de la 1,2-déshydrogénase et de la 9a-hydroxylase dans l'ouverture des cycles.
La 1, 2-déshydrogénase de t!.Q.c2~d1-c!:'_~§.st~i:..~!1:!;ii possède un groupement prosthéti-
que flavinique (23)
(24). C'est une enzyme inductible. Elle peut aussi intro-
duire des groupes fonctionnels dans le noyau du stéroide (25)
(26), par exem-
ple les hydroxylations en la et 2a obtenues par SAX et coll.
(27).
La 9a-hydroxylase de t!.Q~c!:'~4i:..c!:'_~§.~i:..~ (28) fonctionne avec NADH comme cofacteur
et les ions magnésium el, calcium comme activateurs. Elle présente une activité
maximale à pH 8,0 et est inductible. La 9a-hydroxylase contient un groupement
sulfuré et se compose de plusieurs protéines qui forment une chaine transpor-
teuse d'électrons.
COUPURE DE LA CHAINE LATERALE DE LA CHOLE5TENONE
Les fractions mitochondriales de foie de souris sont capables de produire du
I4
dioxyde de carbone quand elles sont incubées avec le cholestérol-26-C
. Elles
peuvent égalemer;.~ !:ydroxyler enzymatiquement en position 26 le 58-cholesta!1e-
3a, 7a, 12a-triol (29). Au cours de la conversion, il y a production de l'acide-
26-o1que (30). La chaîne latérale de cet acide-26-oique est dégradée entre les
carbones 24 et 25 pour fournir l'acide cholique et l'acide propionique.
STAPLE et coll. ont donc proposé une dégradation par thiolyse identique à celle
qui a lieu lors de la B-oxydation des acides gras (31). L'équipe de SIH en lncu-

---

" .
,~
.:~~·l
-
10 -
bant ~Q~~~4f~_~@~!~f~!~~ avec le cholestérol a montré que l'étape initiale de
la dégradation de la chaîne latérale est l'w-oxydation, suivie de la 8-oxydation
(32) (33). L'ensemble des réactions conduisant au catabolisme de la chaîne laté-
rale est représenté sur la figure 5.
Quant à l'étude de la régulation de ces catabolismes, elle est surtout faite sur
son aspect chimique que sur son aspect régulatoire proprement dit. Toutefois,
l'influence du milieu sur ces c~~abolismes a été montrée chez Nocardia corallina
par le fait que le taux d'induction de la 1,2-déshydrogénase varie en fonction
de la nature de la source carbonée et que le glucose exerce une répression ca ta-
bolique de la biosynthèse de la 1,2-déshydrogénase. LEFEBVRE et coll. ont aussi
montré que l'induction s'exprime d'autant mieux que la source carbonée est limi-
tante par rapport aux sources d'azote et qu 'e Ile ~a>s$,ure pas une croi ssance rapi-
~Po~
de (acide gras), Par aill~urs, dans ~e cas Où~~&OUrC~dg~g~,r~oneest en excès
et qu'elle assure une crOIssance rapIde (glucrose/ succIna~\\~l y a répression
f ..( " BP
3'l
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-
-
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13-101L.1PIl.
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catabollque partlelle de la 1,2-deshYdrogena~e. _C~t"~f.o;.reJress.v~n cata ollque
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la l, 2-déshydrogénase empêche donc la dégrad\\al' 6h cdres naYlclep.g
~~ . • IOn 1.
ç.~
J)
...
,/
,
Dans le cadre de notre travail, nous avons repr~s~é~~~de la régulation de
l'ouverture des cycles par ~Q~g!gf~_!@~!~f~!~~ qui n'est pas soumise à répression
catabolique pour :
- utiliser l'androsténe-dione sur milieu synthétique,
- appliquer la connaissance des études de croissance et régulation à la mIse au
point des te'c.;,niques permettant) a sélection des mutants incapables de croître
s~r androstène-dione
- enfin, caractériser ces mutants et les appliquer à l'étude de la coupure de la
chaîne latérale et de la production de métabolites intéressants.

---

-
Il -
)
1
l
\\
. )
(
+
Figure 5 - Schéma de la dégradation de la chaine latérale de la cholesténone

---

CHAPITRE 1
MAT E RIE l E T
MET H0 DES

---

-
13 -
1 -
SOU CHE
Nous utilisons la souch~ ~~~g~~f~_~€~t~~t~~ ATCC 14 887 provenant de l'Arneri-
can Type Culture Collection. Cette souche est conservée à + 4°C sur milieu nu-
tritif gélosé incliné; elle est repiquée tous les mois.
II - MIL 1 EUX
D E
CUL T URE
l - COMPOS Ir ION
Tous les milieux ont mêlile composition de base. Seules peuvent varier la nature
et la concentration du substrat carboné.
1.1 - Source d'azote
3 g
1.2 - Tampon
JO,5 g
Ce tampon phosphate assure un pH
7,2
1.3 - Minéraux: Par litre de milieu, on ajoute la ml d'une solution
minérale contenant pour 1 litre d'eau distillée

---

-
14 -
2 g CaC1
, 2 H 0
2
2
0,5 g FeS0
, 7 H 0
4
2
0,1 g MnSO/. ' 3 H 0
2
0,1 g ZnS0
, 7 H 0
4
2
,~
1.4 - Facteurs de croissance: Nous avons déterminé l'exigence en
thiamine. Aussi, pour 1 litre de milieu, on qjoute 1 ml d'une
solution de thiamine dans l'eau distillée à 0,4 mg/ml. Cet ap-
port est tel que ce facteur n'esL jamais limitant, même après
stérilisation à 120°C
1.5 - Source de carbone
Acétate de sodium à d~fférentes concentrations selon les besoins
expérimentaux. Au-delà de 10 g/l , il faut tamponner p1us forte-
ment à cause de l'augmentation du pH de la culture. Ce sei est
sous forme hydratée : NaCH COO, 3 H 0 (M
136,OB)
3
2
Pyruvate de sodium : CH CO COO Na
(M
110,05)
3
Androst-4-ène-3,17-dione : il est introduit dans le milieu après
dissolution dans le dimethylformamide (D.M.F.) de sorte que la
concentration de ce solvant dans le milieu soit 2 % en rapport
volumétrique.
Par la suite, on parlera de milieux "acétate 2 g/l" , de milieux
"androstène-dione 100 mg/l" , etc ... pour des milieux correspon-
dant à la composition de base définie ci-dessus, seul variant le
substrat carboné.
Lt~ milieux solides snnt obtenus par addition de gélose à 2 %
Hexanoate : CH (CH )4 COOH (M:
116,16)
3
2
\\
2 - STERILISATION
Généralement, les milieux sont stérilisés à l'autoclave à 120°C pendant 10 m~nu-
1
tes. Lorsque l'on procède à des mesures précises des paramètres de la croissance,

---

-
15 -
la stérilisation est faite par filtration des milieux au travers de membranes
Millipore de porosité 0,22 ~
3 - CULTURES
Elles se font à + 28°C dans une pièce thermostatée. L'agitation est suffisante
pour que l'oxygénation ne soit pas limitante. Des contrôles se font par observa-
tion au microscope après coloration de gram. Ces contrôles nous renseignent plus
sur l'état physiologique ~es cellules que sur d'éventuelles contaminations. En
effet, dans de tels milieux, nous n'avons jamais observé de contamination grave.
Par contre, du point de vue de la morphologie et de la physiologie, il y a une
nette différence entre des bactéries en phase exponentielle (gram +) et des bac-
téries en phase stationnaire (gram -). A taux de croissance élevé, il y a forma-
tion de pseudomycélium alors qu'à taux de croissance faible, ce sont les concoi-
des qui se forment.

---

-
16 -
0,7
0,6
0,:>
0,4
0,3
0,2
0, J
mg/ml
°
0, 1
0,2
0,3
0,4
Densité microbienne
Figure 6 - Courbe d'étalonnage D.O. densité microbienne
Colorimètre Beckman modèle C J
660 nm J
fioles de Wiame et Stor~k
0,2
0, 1
1
/
8
10
cellules/ml
2
3
4
Concentration cellulaire
Figure 7 - Courbe d'étalonnage D.O. concentration cellulaire
Colorimètre Beck~lan modèle C J 660 nm J fioles de Wiame et Storck

---

-
17 -
III -
~ESURE DE LA CROISSANCE
1 - ETALONNAGE DENSITE OPTIQUE (D.O.) - DENSITE MICROBIENNE
La figure 6 représente la courbe de correspondance entre densité optique et
densité microbienne (poids sec par unité de volume) pour le photomètre Beckman.
Les poids secs ont été obtenus par filtration de volumes déterminés de suspen-
sions cellul~i~~s de D.O. connues ; la filtration sur membrane millipore de po-
rosité 0,45 micron est suivie d'un lavage à l'eau distillée. Le même traitement
est appliqué à une autre membrane appariée avec du milieu stérile. Les membranes
sont pesées après dessication jusqu'à poids constant.
Dans la phase de proportionnalité entre D.O. et densité microbienne, à
unité
de D.O. du "Beckman" correspond une densité microbienne de 0,62 mg/ml.
2 - ETALONNAGE DENSITE OPTIQUE - CONCENTRATION CELLULAIRE
Les numérations se font par comptage des colonies sur boîte de Pétri. Les boîtes
sont ensemencées en surface d'un milieu nutritif acétate la g/l , gélosé à 2 % ,
par étalement de 0,1 ml de suspension bactérienne diluée dans l'eau phy9blogique
de manière à compter de l'ordre de 100
colonies.
Pendant les phases exponentiell~s, la numération de colonies obt~nues après
dilution de suspension cellulair~ à différentes D.O. montre une constance entre
la densité microbienne et la concentration cellulaire (figure 7).
D.O.
0,24
0,20
0,18
0,135
0,12
8
8
8
8
cellules/ml
2,6. la
2,2. la
1,75. JO
1,62. la
Remarque
Chez les actinomycétales~ une colonie ne correspond pas nécessairement à une
cellule puisque nous avons observé la formation de pseudomycelium en phase expo-
nentielle.

---

-
18 -
IV - PRËPARATION DES EXTRAITS ACELLULAIRES
1 - RECOLTE ET LAVAGE DES CELLULES
Les cellules de ~~~qr~iq_r~~~ri~!~~ sont récoltées par centrifugation à 4500 t/mn
(Janetzki T 32 B) à + 4°C , la croissance ayant été arrêtée par addition de chlo-
ramphénicol 200 g/ml. Le culot recueilli est suspendu dans le tampon de broyage
additionné de chloramphénicol. On centrifuge pendant la minutes à 2 800 g (Phywe-
"Pirouette"). Le précipité obtenu par lavage est suspendu dans 15 ml du meme
tampon que celui du lavage, mais sans chloramphénicol. On ajoute 15 g de billes de
verre (1 ml de tampon pour 1 g de billes) de diamètre 0,10 - 0,11 mm. Les cellules
sont broyées 2 x 1 minute au désintégrateur MSK-BRAUN réfrigéré par détente de
C02 . La suspep~i0n est alors soumise à centrifugation à 2 800 g (Phywe - "Pirouet-
te") pendant la minutes à + 4°C. On obtient l'extrait cellulaire.
2 - TRAITEMENT DE L'EXTRAIT CELLULAIRE
Dialyse: L'extrait enzymctlLque est dialysé pendant 4 h à + 3°C contre 400 ml
du tampon adéquat qui est renouvelé deux fois. La dialyse est faite dans les mem-
branes à dialyse Visking qui ont été auparavant plongées dans le benzène puis dans
l'acétone et qui sont finalement lavées et rincées à l'eau distillée.
Dosage des protéines : Il est effectué par la méthode de LOWRY (34) ou par la
spectrophotométrie différentielle des composés purine (35).
3 - MESURE D'ACTIVITE DE L'ISOCITRATE-LYASE
Principe: L'activité enzymatique est déterminée par mesure spectrophotométrique
de la quantité de glyoxylate formé à partir d'isocitrate pendant la minutes à
30°C. Cette mesure repose sur la propriété de la phénylhydrazine de former des
complexes avec les aldéhydes (ici l'acide glyoxylique). La formation de phényl-
hydrazone est suivie par l'augmentation de la densité optique à 324 nm.

---

-
19 -
Essai
tampon phosphate
0,1 M pH 7,0
2
ml
Phénylhydrazine
0,1 M
0,1 ml
Mg Cl
0, 1 M
0, 1 ml
2
Cystéine
0,06 M
0,1 ml
Isocitrate
U, 1 M
0, 1 ml
Extrait
0,05 ml
La réaction est initiée par l'addition d'isocitrate et les lectures de la densiti
optique sont faites teutes les 15 secondes pendant 7 minutes.
CHOH
COOH
1
CHO
CH
COOH
2
CH
COOH
'>
+
1
'"
COOH
CH
COOH
2
CH
COOH
2
isocitrate
glyoxylate
succinate
La cinétique de la réaction montre une petite période de latence puis la D.O.
croît linéairement en fonction du temps. L'activité enzymatique est mesurée pen-
dant cette partie linéaire. Une unité enzymatique (U.E.) se définira comme la
quantité d'enzyme qui entrainera dans les conditions de l'essai, une augmentatior
de 1 unité de D.O. par minute. L'activité spécifique sera l'activité enzymatique
d'un mg de protéine de l'essai.
4 - DOSAGE DE L'ACTIVITE SPECIFIQUE DE LA 1,2-DESHYDROGENASE
Principe: La 1,2-déshydrogénase transfère l'hydrogène du substrat, la testosté-
rone, à la phénazine méthosulfate (PMS) qui est alors capable de réduire le cyto·
chrome C. La réduction du cytochrome C est suivie par changement d'absorption à
550 nm.

---

-
20 -
Essai : La solution de PMS réagit avec le cytochrome C en absence de la testos-
térone
ce qui entraîne une augmentation supplémentaire d'absorption du cyto-
chrome C à 550 nm. Cette augmentation est prise en compte lors de la mesure. On
a intérêt à opérer dans
de la réaction est accrue
par la lumière.
Témoin
Tampon Tris HCl
Cytochrome C
0,2 ml (10 mg/ml tampon)
Extra it
0,01 ml
PMS
0,025 ml
Mesure
Tampon Tris HCl
2,8 ml
Cytochrome C
0,2 ml
Extrait
0,01 ml
PMS
0,025 ml
Testostérone
0,025 ml
La concentration de la testostérone correspond à celle donnant la vitesse InI-
tiale la plus grande, car il y a inhibition par excès de substrat (GERMAIN, ~.. é-
sultats non publiés).
La réaction montre deux phases, et la vitesse de la réaction enzymatique, c'est
la différence des vitesses obtenues entre l'essai témoin et la mesure.

---

-
21 -
,
v - ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES MËTABOLITES STËROIDES
1
1
Dans les bioconversions des stéroides par les microorganismes, le cours de la
fermentation est suivi à l'aide de la chromatographie sur couche mince. Nous
avons choisi la chromatographie parce que cette méthode permet l'emploi des
réactions ayant une grande bpécificité et une haute sensibilité pour visualiser
les composés analysés. Dans certains cas, nous utilisons ce procédé en conjonc-
tion avec la chromatographie sur colonne. Il est essentiel de stopper l'action
des enzymes sur les métabolites en temps voulu pour prévenir toutes les trans-
formations ultérieures non voulues. Les produits des conversions microbiennes'
des stéroides ont généralement un caractère plus polaire que le substrat sté-
roide utilisé (par saponification des esters, hydroxylation, augmentation de
doubles liaisons, etc ... )
1 - EXTRACTION DES sTEROIDES
Cette méthode est non seulement rapide, mais elle donne aussi des bons résultats.
Nous procédons comme suit :
acidification à pH 2-3 du milieu de fermentation par addition de HCl 4N pour
arrêter l'action des enzymes .
. addiLion deux fois d'un même volume de chloroforme et agitation pendant 30 mn
séchage des 2 fractions chloroformiqûes par passage sur sulfate de soude puis
évaporation a l'évaporateur rotatif pour éliminer le chloroforme (+ 55°C)
suspension du résidu dans 1 ml de chloroforme
. chromatographie sur couche mince.

---

- 22 -
2 - CHROMATOGRAPHI E SUR COUCHE ;·iINCE
Le choix du solvant de chromatographie du stéroide dépend des caractéristiques
et de la polarité du produit stéroide extrait. Les valeurs de Rf entre 0,15 et
0,70 donnent les meilleurs séparations. L'androstène-dione est relativement
peu polaire. Pour obtenir une plus grande sélectivité dans la séparation, ou
pour augmenter la capa~i[é à séparer, nous utilisons un système de mélange de
2 solvants
de polarité différente (36)
: hexane/acétate d'éthyle (2 V : 3 V).
Nous employons les plaques (20 x 20) CCM de gel de silice 60 et faisons une
double migration, la première à moitié pour avoir une meilleure séparation des
stéroides.
Les réactions colorées développées in situ ont la capacité de confirmer l'identi-
fication des stéroides à travers les réactions spécifiques de leurs différents
groupes fonctionnels. Pour ce f~;ce, nous utilisons la réaction
ùe ZIMMERMANN
(37), caracté~istique des cétones.
3 - SEPARATION DES STEROIDES PAR CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE
Le gel de silice + acide 0alicylique
est bien lavé dans le mélange des solvants
chloroforme-éther (9 : 1). Le gel est coulé dans la colonne (1,5 x 40 cm) où il
est tassé en éluant 300 ml du mélange des solvants. Les opérations sont ensuite
faites dans la chambre froide à O°C. On introduit 2 ml de l'échantillon à analy-
ser et on recueille dans les tubes à essai la ml d'éluant. L'éluant est évaporé
dans un bain-marie à 60°C. L'éluant est dissous dans 1 ml de chloroforme puis
chromatographié sur couche mInce.
4 - ANALYSE DES STEROIDES
. Les spectres IR sont effectués avec le spectrophotomètre PERKIN-ELMER nO 457
. Les spectres RMN sont obtenus avec le spectrophotomètre PERKIN-ELMER R-12 B

---

- 23 -
Principe d'extraction dans les phases acide, phénolique et neutre
Dissoudre l'extrait
dans benzène-éther ()
1)
Extraction NaH C0
6 %
3
Phase
l
aqueuse réacidifiée
PhasecÜher
avec Hel
extraction avec chloroforme
Extraction
laver, sécher, évaporer
Na OH
5 %
Phase aqueuse
Phase éther
Fraction
lacide dans la phase
laver à l'eau
chloroformique
l
sécher,
évaporer
Acidifier avec
acide acétique
l
Fraction
neutre
Extraction avec
chloroforme
laver, sécher,
évaporer
l
Fraction phénol

---

- 24 -
VI - MËTHODES UTILISANT L/I~C8RPORATION DE SUBSTRATS MARQUÉS
Les cellules des microorganismes ont la propriété de concentrer certains méta-
bolites. Nous utilisons cp.~te propriété pour mesurer l'incorporation intracel-
lulaire de l'androtène-dione marqué au carbone 4 par les cellules de ~QQ~~gf~
~~~!~f~!~~
La membrane ayant servi à la récolte des cellules est m~se dans une fiole de
scintillation puis séchée à l'étuve. On ajoute alors 10 ml de liquide de sc~n­
tillation pour faire le comptage de la radioactivité au compteur Geiger. La ra-
dioactivité retenue sur la membrane renseigne sur l'importance de l'accumulation
intracellulaire.
14
. And
-
rostene- d"lone- 4- C
Comptage de l'activité incorporée par les cellules
- scintillateur
NUCLEAR-CHICAGO modèle 4534
- scintillant : 4 g de PPO et 50 mg de POPOP dissous dans 1 l de toluène

---

- Z5 -
VII - MESURE DE LA CONSOMMATION D'OXYGÈNE
Nous utilisons l'appareil de Warburg pour su~vre les réactions du catabolisme
de l'androstène-dione par la consommation d'oxygène et le dégagement du eo .
Z
Nous employons aussi l'androstène-dione marqué au carbone 4 (androstène-dione-
4_e I4 ). Dans la fiole témoin, tous les réactifs sont présents, sauf le substrat
androstène-dione. Les fioles rattachées à leur manomètre sont placées dans une
cuve d'eau à Z8°e, le robinet du manomètre étant ouvert. Après 5 minutes de
stabilisation, le robinet du manomètre est fermé et le contenu du diverticule
est versé dans l~ ~iole. On mesure la consommation d'oxygène jusqu'à ce que le
diagramme de la consommation atteigne le palier.

---

-
26 -
VIII - MUTAGÈNES ET TRAITEMENTS MUTAGtNIQUES
1 - RADIATIONS
Rayons ionisants
Le mécanisme d'action de radiation ionisante, notamment les rayons gamma émis
par le cobalt, n'est pas encore élucidé. Le nombre de mutations produites par
ces rayons ionisants est proportionnel à la dose, leur mutagénicité semble at-
trtbuable à des chocs directs sur ie matériel génétique. Ces rayons ionisants
provoquent des délétions et donnent des mutants stables. Les cellules sont sus-
pendues dans 10 ml d'eau physiologique + Tween~(I%o) pour être soumises à l'ac-
tion de ces rayons.
Rayons ultraviolets
Les rayons ultraviolets n~ pénêtrent que faiblement la matiêre. Les longueurs
d'onde pour produire des mutat~ons s'étendent entre ZOO nm et 300 nm (38). Cette
zone correspond à celle de l'absorption des rayons ultraviolets par les acides
nucléiques eux-mêmes. On trouve un parallélisme entre le spectre UV et le spec-
tre d'action mutagêne (39). Comme source de rayons ultraviolets, nous utilisons
la lampe Philips qui a une longueur d'onde égale à 240 nm.
2 - MUTAGENE CHIMIQUE
1. Acide nitreux (NOZH)
Cet agent mutagêne transforme les bases puriques et pyrimidiques par désamina-
tion, notamment l'adénine en hypoxanthine et la cytosine en uracile. Il conduit
aux transitions suivantes: AT ----7GL
ou
GL
?AT , c'est-à-dire au rem-
placement dans l'ADN de l'adénine par la guanine, de la thymine par la cytosine
et inversement.

---

-
27 -
2. Ethylméthane sulfonate (EMS)
C'est un agent alkylant
(40). Il agit sur l'ADN en induisant aUSSI bien des
transversions que des transitions.
Il est connu également pour pouvoir entrainer des petites délétions suscepti-
bles d'amener à la production de mutants stables.

---

CHAPITRE 2
RESULTATS

---

- 30 -
INDUCTION ET RËPRESSION CATABOLIQUE
DE LA 6-1-DESHYDROGËNASE
1 - CULTURE
Une culture de ~Q~qrgfq_r-€€~~f~~~€ ATCC 1488 est mise à croître en présence
d'acétate la g/l. Pendant la phase exponentielle de croissance, on prélève un
inoculum de cette culture pour ensemencer 4 fioles contenant le milieu d'induc-
tion (acétate la g/l + androstène-dione 200 mg/l) de telle sorte que l'on ait
au départ une D.O. égale à 0,1, soit enViron 108 cellules/ml.
La crOissance cellulaire est suivie au photomètre. Elle est arr~tée à diffé-
rents stades de la croissance par addition d'une solution de chloramphénicol à
200 ~g/ml (la %). Les cellules sont centrifugées puis broyées pour obtenir un
extrait
acellulaire devant servir au dosage de la 6-I-déshydrogén~se. Les pro-
téines sont dosées par la méthode de LOUVRY. Outre l'acétate, nous avons utilisé,
~our des essais, l'hexanoate 2g/l et le pyruvate 5 g/l.
2 - RESULTATS
L'induction de la biosynthèse de la 6-I-déshydrogénase par adjonction d'androst-
4-ène-3,17-dione aux milieux de culture contenant l'acétate, l'hexanoate et le
pyruvate comme seules sources de carbone, montre que cette enzyme augmente son
activité spécifique (figure 9) et que sa biosynthèse est stoppée quand le niveau
maximal d'induction est atteint: cinq heures environ après l'adjonction de l'in-
ducteur. Si l'on prolonge le temps de croissance, la 6-I-déshydrogénase voit son
activité spécifique chuter.

---

- 31 -
dE
0.0.
Act. sp. x 0.0.
1
dX
Acétate JO g/l
0,1
1,6
16
0,2
3
1
0,3
4,69
1
1
0,5
7,9
!
Hexanoate 2 g/l
0,2
0,8
8
0,3
l ,6
0,4
2,5
0,6
4,4
Pyruvate 5 g/l
0, 1
0,091
11
0,2
0,2
0,3
3,2
0,5
5,3
-
Tableau l - Activité spécifique de la 6-1-Déshydrogénase à différents temps de
la croissance et sur différentes sou;ces carbonées
On constate, par la figure 8, qu'à partir du moment où l'androstène-dione est
ajouté, le rapport dE/dX (accroissement d'enzyme/accroissement de masse cellu-
laire) reste constant pendant toute la période d'induction, c'est-à-dire que
l'enzyme induite, le 6-I-déshydrogénase, représente une fraction constante des
protéines synthétisées à partir du moment où l'on ajoute l'androstène-dione
dans le mi lieu.
La bactérie ~~Qgr4ig_r~~~~Q~~~Arcc 14 887 a une activité spécifique de base
faible, de l'ordre de 2 à 3 DDO/mn/mg de protéines.
a
Le substrat ~Ï1ciucteur n'apporte ras d'information particulière, cependant aug-
mente la quantité d'enzyme 6-I-déshydrogénase sans en modifier les propriétés.
La figure 8 qui représente les taux différentiels de biosynthèse de la 6-I-déshy
1
drogénase pour les différentes sources carbonées (acétate, hexanoate, pyruvate)
1
l

---

'.
- 32 -
montre que ces sources carbonées n'exercent pas de répression catabolique,
quoique le taux de biosynthèse de la ~-I-déshydrogénase sur hexanoate (environ
8) soit moitié de celui sur acétate (environ 16).
Ces résultats indiquent que les ar.tivités métaboliques de la ~-I~léshydrogénase
peuvent être contrôlées par une r[gulation de la synthèse des enzymes.
Cependant, il est aussi possible que la concentration en androstène-dione soit
un facteur important dans le contrôle du taux de biosynthèse de cette enzyme.
Des expériences d'induction sur acétate, avec des concentrations initiales va-
riant de 200 à 10 mg/l en androstène-dione ont amené à observer un même taux dif-
férentiel de biosynthèse.
Donc, bien qu'inducteur non gratuit, l'androsiène-dione est â concentration sa-
turante et permet une biosynthèse à taux constant.

---

- 33 -
Act. sp. x D.O.
0,5
(3)
1,25
1
1
1
> _
---L
- - - - '
_
0,3
0,6 1
D.O.
Figure 8 -
Accroissement de la 6-1-déshydrogénase en fonction de l'accroissement
cellulaire
(]) Acétate
la g/l
(2) Pyruvate
5 g/l
(3) Hexanoate 2 g/l

---

.....
- 34 -
D.O.
Act. sp.
(2)
0,75
3
( 1)
A··, . -,~
\\,.-.
/
.
,
0,50
2
\\,
,
1
,
\\
•,.\\••1,
1
1
,
A
,
0,25
•
/
a
5
heures
JO
Figure 9 -
(1) Activité spécifique de la 6-1-déshydrogénase en fo~ction du temps
(2) Croissance: D.O. en fonction du temps

---

- 35 -
PRODUCTION DES MUTANTS DE CATABOLISME
DE L'ANDROSTËNE-DIONE
l - MUTAGENESE
Les cellules de ~~~q~qfq_~~~t~f~!~~ sont mises à croître dans le milieu acétate
\\0 g/l et récupérées en début de phase stationnaire de croissance. Ellffisont
centrifugées de façon stérile, puis le culot est suspendu dans l'eau physiolo-
J
gique. On suspend alors les cellules dans \\0 ml de tampon adéquat, contenant
ou ne contenant pas l'agent mutagène, avec une D.O. initiale de 0,1. La suspen-
sion reste au contact de l'agent mutagène pendant un temps déterminé selon
l'agent. La suspension est alors neutralisée avec la soude 0,\\ N pour l'acide
nitreux, avec le thiosulfate de. sodium 6 % pour l'EMS. Dans le cas des agents
physiques, rayons y et UV, il n'y a pas de neutralisation.
a) Rayons y et UV
L'irridiation se fait dans une boite de Pétri où sont suspendues les cellules
dans la ml d'eau physiologique contenant du Tween 80 (1 %0) de telle sorte que
l'on ait environ 108 cellules/ml.
Pour induire des mutations, nous avons choisi un temps d'irradiation qui donne
une viabilité d'environ 1 %
- 90 minutes pour les rayons y , soit environ 55 000 rad (tableau 2 et figur~ JO)
- 30 secondes pour les rayons UV ( À
240 nm ) (tableau 3 et figure II)

---

. ~. .~... . . .. .' . ,r:.•':.,. ~
.- .. ~"'1
- 36 -
Dilution
i
1
1
1
!
,
1
10-6
1
2
!
1
a
a
,
a
1
1
10-5
19
24
6
2
2
a
10-4
184
210
36
24
la
3
1
10- 3
1 000
1 000
204
200
1
93
25
,
Temps d'exposition
a
17
34
5 1
68
85
(mn)
Dose (rad)
a
la 000
20 000
30 000
40 000
50 000
N = nombre de
. 7
7
6
6
5
5
1,84. la
2,1.10
2,8. la
2,0. la
9,3.10
2,5.10
cellules/ml
log N
7,26
7,32
6,45
6.3
5,97
5,40
Tableau 2 - Mortalité en fonction du temps et de la dose des rayons y
1
.
Temps
a
la
1
20
30
40
50
60
{seconde)
1
Dilution
i
10-6
9
3
1
10-5
,
95
52
;
4
1
10-4
1
48
22
4
3
1
1
1
10- 3
1
1
143
37
16
3
1
1
1
1
!
10-2
1
157
51
7
7
6
6
5
5
4
N
9,5.10
5,2.10
4,8. la
1,4. la
3,7. la
1,6. la
5,1.10
log N
7,98
7,71
6,68
6,15
5,57
5.20
4,7J
Tableau 3 -
Mortalité en fonction du temps (À = 240 nm)

---

- 37 -
log N
7
•
6
•
5
10
20
30
40
50
60
Figure 10 - Log cellules viables en fonction de la dose des rayons y
Figure 11 - Gog cellules viables en fonction du temps d'action des rayons
uv (240 nm)
8
l
7
1
Temps de réduction décimale =+ 20"
1
6
1
5
1
1
..
4
. temps (secon
10
20
30
40
50
60
,

---

- 38 -
b) Acide nitreux (N0 2H) et Ethylméthane sulfonate (EMS)
. Acide ni treux
Les cellules en croissance dans le milieu complet acétate 2 g/l sont récupérées
en début de phase stationnaire de croissance. Apr~s centrifugation de façon sté-
rile. le culot suspendu dans l'eau physiologique puis dans 10 ml de tampon acé-
8
tate 0.1 M pH 4.5 + N0 2Na 0.004 M de sorte que l'on ait environ 10 cellules/ml
au départ. La suspension est agitée dans ce tampon pendant 80 minutes au bout
desquelles on la neutralise avec de la soude 0.1 N. On récup~re finalement les
cellules par centrifugation stérile. On fait des éta;ements à différentes dilu-
tions pour comp[er le nombre de cel:ules viables en fonction du temps d'action
de l'acide nitreux.
"""-,
dl V
10~ -
~Iulon
10-2
10-5
8
femp;
'.
N.IO
ceU/ml
log N
-'~,
1 (NIn)
0
191
1.91
8.28
20
91
9. 1
7.96
1
i
456
1
40
,
42
3.8
207
7.58
:
1
90
60
600
6
6.78
81
80
300
29
3
f .,48
1
100
403
39
4
5.60
Les résultats de ce tableau 4 donnent une viabilité de 1 % environ apr~s un
traitement de 80 minutes à l'acide nitreux
. EMS
On op~re comme dans le cas de l'acide nitreux. cependant. ici. le culot est sus-
pendu dans 10 ml de tampon Tris 0.038 M pH 7.4 à une D.O. de 0.1
... L'EMS est

---

· .
~..::
- 39 -
pipettédans cette suspension à UDP concentration finale de 1,5 % (~/V). Après un
traitement de 90 minutes, l'action oe l'EMS est stoppée par dilution dans une
solution de thiosulfate de sodium à 6 % , en prélevant 1 volume de suspension
cellulaire qui est ajouté dans la volumes de thiosulfate de sodium.
Tableau 5 - Numération des cellules viables en fonction du temps d'action de Z'EMS
Temps
10- 2
!
JO -3
JO -4
la -5
minute
N
log N
1
7
1
a
!,
90
9.10
7,95
\\
,
7
45
;
561
65
6,5.10
7,81
,,
7
90
400
4.10
7,6
7
135
225
2,25.10
7,35
7
195
230
23
,
0,23.10
6,3
6
225
26
2
0,26.10
5,41
Les résultats sur EMS donnent une viabilité de 2,5 % après 3 heures de contact.
2 - SELECTION PAR AMPICILLINE 5 mg/ml
Après arrêt de l'action de l'agent mutagène, les cellules sont mises sur milieu
ù'enrichissement (acétate la g/l) pour procéder aux réparations. Lorsque la
croissance est notable, elles sont placées sur milieu d'induction (acétate 2 g/l
+ Androstène-dione 100 mg/l). Quand la croissance se ralentit sur ce milieu,
on met les cellules sur milieu minimum (androstène-dione 200 mg/l). On attend
30 minutes pour que la croissance redémarre, on ajoute alors l'ampicilline de
sorte que sa concentration finale soit égale à 5 mg/ml. On laisse agir l'a:lti-
biotique ~endant 4 h 30 min, et sc~ action est arrêtée par filtrati=n sur mem-
brane.
La figure 12 met en évidence deux types d'activité aux fortes concentrations
j'ampicilline (0,5 mg/ml et 5 mg/ml)
:

---

- 40 -
log DO
(2)
1 ,5
(3)
. (4)
(5)
2
4
temps (heure)
l
Figure 12 - log DO en fonction du temps d'action d'ampicilline sur milieux
1
androstène-dione 100 mg/l
(1)
Témoin sans source de carbone ma~s DME 2 %
1
(2)
Témoin sans ampicilline
(3)
Concentration d'ampicilline 0~05 mg/ml
1
(4)
Concentration d'ampicilline O~5 mg/ml
(5)
Concentration d'ampicilline 5 mg/ml
1
1
1
1

---

· , _.~ __.._~ _:.._9:·f
- 41 -
- l'activité bactériostatique
- l'activité bactéricide
L'analyse sur ce milieu minimum montre que le temps de réduction décimale est
voisin de 2 h 15 min.
(figure 13). C'est ainsi que nous avons choisi de faire
agir l'ampicilline à la concentration finale de 5 mg/ml pendant 4 h 30 min pour
assurer une réduction cellulaire de l'ordre de 100 fois.
3 - ISOLEMENT
Après sélection à l'ampicilline et filtration, la membrane est mise sur milieu
complet (acétate la g/l). LorsqllP- la D.O. atteint 0,4 , les cultv~es sont diluées
puis étalées sur milieu gélosé 2 Z acétate la g/l + androstène-dione 100 mg/l,
de manière à avoir environ 50 colonies par boîte. Les répliques sont faites sur
milieu androstène-dione 200 mg/l et sur mili~u acétate la g/l.
4 - CONFI RMATION
Les présumés mutants qui, après réplique, ont poussé sur milieu acétate, mais
non sur milieu androstène-dione sont mis à croître sur milieu liquide androstène-
dione et sur milieu liquide acétate de manière à confirmer les présomptions rete-
nues sur milieux solides.
Les mutants confirmés sont repiqués sur milieu complet gélosé et conservés à
+ 4°C.
5 - CARACTERISATION
Les mutants sont soumis à différents tests pour connaître les VOles biochimiques
qUi
ont été touchées par les mutations : capacité respiratoire sur androstène-
dione, dégradation de l'androstène-dione et analyse des métabolites accumulés
par chromatographie sur couche mince essentiellement.

---

1
_ ~J.:". _~._. . _.~ :' __ .-..l.
1
- 42 -
1
1
Figure 13 - log aellules viables/ml en fonation du temps d'aation de 5 mg/ml
d'ampiailline sur milieu androstène-dione 200 mg/ml
1
1
log N
1
1
8
1
1
!
1
1
1
7
•
6
2
3
4
temps (heure)

---

1
- 43 -
1
1
1
RECHERCHE DES MUTANTS CONSTITUTIFS
POUR LA â-l-DËSHYDROGËNASE
1 - GENERALITES
On peut obtenir, pour la plupart des enzymes cataboliques, des mutations de
régulation correspondant à un seul évènement mutationnel portant sur ce carac-
tère inductible et constitutif : ceci quel que soit le processus de régulation.
qu'il soit positif (comme dans le cas de l'opéron maltose d'~coli avec inter-
vention d'une protéine régulatrice, appelée apoinducteur) ou négatif (comme dans
le cas de l'opéron lactose dIE. coli avec l'intervention d'une protéine régula-
trice, appelée aporépresseur).
L'étude des opérons maltose et lactose dIE. coli a permis de montrer que, quel
que soit le type de régulation, positif ou négatif. des mutations sur les genes
régulateurs codant pour la biosynthèse des protéines régulatrices (apoinducteur
ou aporépresseur selon le type de régulation). ou sur l'opérateur. peuvent. en
altérant les sites de reconnaissance opérateur-protéine régulatrice. amene~ à la
production constitutive d'enzymes. D'autre part. et indépendamment res mécanismes
de cette régulation, des mutations SJr le promoteur peuvent augmenter la produc-
tion d'une enzyme par accroissement de la transcription. Il est donc concevable
~e chercher à réaliser des conditions expérimentales tendant à donner un avan-
tage à une bactérie produisant davantage de ces enzymes.que les sauvages, et de
sélectionner des mutants correspondant à l'un ou l'autre de ces types.
Le système que nous utilisons répond aux caractères suivants
il n'y a pas de répression catabolique par l'androstène-dione, seul substrat.
de toute manière, la répression catabolique est insignifiante chez ~~~~rgi~
restrictus.
----------

---

1 •.• ~:
- .. ~~:
- 44 -
il doit fonctionner dans les conditions telles que l'inducteur soit en concen-
tration faible pour que la biosynthèse des enzymes inductibles de type sauvage
soit faiblement exprimée.
Par conséquent, pour une même concentration d'androstène-dione "substrat", il y
a avantage aux mutants ~onstitutifs ou aux mutants surproducteurs qui dispose-
raient ainsi d'une teneur en enzyme plus importante.
Ce système est réalisable dans le chémostat dont le taux de dilution est réglé
pour produire une faible induction des biosynthèses des enzymes inductibles chez
le sauvage.
2 - QUELQUES ASPECTS THEORIQUES DU CHEMOSTAT
Soit
V
volume utile du fermsnteur
F
débit du milieu frais veqant du réservoir
D
~ = taux horaire de dilution
Dans ce système, deux facteurs agissent sur la population cellulaire X
• Les cellules se divisent, la population cellulaire augmente proportionnellement
au taux de croissance ~
dX
~X
dt
• L'apport du milieu frais tend à diminuer la population cellulaire X proportion-
nellement au taux de dilution D
dX
- DX
d~
La sommation de ces deux tendances donne la variation globale de la population
dX
dt
(~- D) X

---

. ,
...
1
..
_...:!-.:..~~
...,:.
-' ..
- 45 -
1
1
dX
En état stationnaire,
= a , ce qui entraine ~
D
dt
1
En chémostat, on travaille à
~«
~
en imposant D
max
La concentration cellulaire est alors maximum et proportionnelle à la concentra-
tion du substrat limitant.
~max
il a été déterminé à partir de la crOissance en discontinu sur andro
stène-dione seul ~(;,nme substrat
g
temps de génération
2,25 h
-+
0,69 =i= a 3 h- I
Wmax
2,25
'
-1
1
80 ml h
44.10- 3
-1
Taux horaire de dilution
0
=i=
h
1 800 ml
Temps de générat_on dans le fermenteur
g
0,69
=i= 16 h
44.10-3 h- I
Ce taux horaire de dilution est tel que la concentration en substrat à taux pro-
duisant une induction est négligeable devant le taux de base, obtenu sans induc-
teur.
3 - METHODE
FERMENTATION CONTINUE
On sait qu'an cours de la phase exponentielle de croissance cellulaire, le miliel
s'appauvrit en substrat, tandis que les produits du métabolisme microbien s'ac-
cumulent. Dans ce système, continu et ouvert, la vitesse du flux du milieu frais
à l'entrée du fermenteur est constante et l'efflux permet une évacuation continul
du milieu en excès à la même vitesse. La culture se maintient de façon continue
en phase exponentielle: c'est un état stationnaire apparent.
On fait une préculture sur milieu acétate la g/l. On ensemence ensuite le fermen
teur (de 5 litres) contenant 1800 ml de milieu avec 180 ml (la %) de suspension
cellulaire de sorte que l'on ait une 0.0. de 0,1 environ.
La culture est suivie par mesure de la 0.0. et la 6-I-déshydrogénase est dosée
comme décrit précédemment.

---

1
..... !•
._1>:: .....:..... _~_:_~l.-:'~~
-4.
1
- 46 -
1
1
Composition des milieux du fermenteur et d'arrivée
1
Mi lieu du fermenteur
Milieu d'arrivée
Ingrédients
1
sans source carbonée
(avec androstène-dione)
----------------------------r-------------------------------------------------
1
1
1
(NH
0,5 g/l
0,5 g/l
4)2 504
1
KH
P0
0,4 g/l
0,4 g/l
2
4
1
Na H P0
, 12 H 0
3,5 g/l
3,5 g/l
2
4
2
1
Androstène-dione
0
50 mg dissous dans
le DMF
1
1
DMF
20 ml/l
1
20 ml/l
Minéraux (force 100)
10 ml/l
JO ml/l
Thiamine (force 1000)
tml/l
! ml/i
4 - ANALYSE DES RESULTATS
Temps (jours)
1
3
5
7
9
11
13
14
]6
18
20
Act. sp.
U. D. O. / mn / mg proto
3
2,9
5
3, 1
3,5
6
3,2
5,6
3
2,9
3,3
Tableau 6 - Activité spécifique de la !J.-l-déshydrogénase en fonction du temps
Les variations de l'activité de la !J.-I-déshydrogénase ne sont pas confirmées
dans le temps; elles pourraient être liées aux variations de débit occasion-
nées par la pompe aux performances souvent fluctuantes, augmentant ainsi la
concentration du substrGc dans le fermenteur.

---

1
- 47 -
1
1
1
Les mutants constitutifs ou surproducteurs peuvent n'avoir pas eu un avantage
,
3
- -
.
( 20 x 24 h)
"
.
sur les sauvages apres
0 generatlons
16 h
qUl seralent alors lnsuffi-
1
santes. Peut-être valait-il mieux travailler à une D.O. supérieure à 0,1 et un
volume utile plus grand de manière à augmenter le nombre de cellules, donc la
probabilité d'avoir des mutants intéressants.
Enfin, la probabilité d'avoir un mutant constitutif est relativement importante
si la dégradation de l'androstène-dione est régie par un opéron avec un seul
système de régulation. Cependant, si plusieurs opérons gouvernent cette dégrada-
tion, la probabilité est alors beaucoup plus faible.
1
1

---

.~ ~.~~
,1
:":1•,,j
:. :~::
~-
pompe à débit
constant
!
chémostat
sprtie d'air
ex>
!
--.
Milieu d'arrivée frais
~
fi:tre
•
•
•..
•
•
•
-"
•
- • ..îJ
·
-
-
'[-,0.
,
g.
--
Il
I~D " ~
lb~
Efflux
Milieu du fermenteur
- - - - - -

---

1
- <:- ..- . '-' .:,:~
- 49 -
1
1
1
1
r
1
1
1
1
ET UDES
BIO CHI M1 QUE S
1
1
1
1
1
1
1
1
,
1
1

---

1
- 50 -
1
CARACTÉRISATION DES MUTANTS DE CATABOLISME
DE L'ANDROSTËNE-DIONE
Les souches mutantes que nous avons isolées ne croissent pas sur milieu andro-
stène-dione, elles sont donc androstène-dione moins (A-). Nous avons caractérisé
ces mutants en analysant leur capacité respiratoire à partir du substrat andro-
stène-dione,
Si la dégradation est totale (jusqu'au stade H 0 et CO ), la consommation totale
2
2
d'oxygène doit être identique à celle produite par les sauvages. La vitesse de
cette consommation renseignera alors sur le niveau d'activité des enzymes cata-
bolysant l'androstène-dione. Si la dégradation est partielle (une étape enzyma-
tique totalement bloquée), le niveau de consommation totale sera inférieur à
celui des sauvages. D'autre part, l~ quantité de
CO
' produite à r~rtir du
2
substrat androstène-dione marqué sur le carbone 4, renseignera sur la dégrada-
tion des cycles B et A.
1 - CONSOMMATION D'OXYGENE PAR NOCARDIA RES-mICTUS
a) Obtention des cellules et préincubation
Les cellules de ~QQg~~fg_~~~t~fQt~~ sont mises à croître sur milieu acétate
10 g/l , puis quand elles sont en phase exponentielle, on ensemence le milieu
d'induction contenant l'acétate 2 g/l (facteur limitant) et l'androstène-dione
200 mg/l (inducteur). Les cellules sont récoltées en début de phase stationnaire
de la croissance. Elles sont soumises ensuite à une période de jeûœde 2 heures
afin de réduire les réserves endogènes par agitation à 28°C, en aérobiose, dans
le tampon phosphate 0,038 M pH 7,4 contenant les oligoéléments. Le temps dt ce
jeûre est calculé pour que la respL':'L:ion tombe à un niveau faible CÜilstant

---

1
1
- SI -
1
1
(respiration endogène). Les cellules sont centrifugées et lavées puis remIses
1
en suspension dans le même tampon à une D.O. égale à S.
Les essaIS de respiration menés au Warburg dans ces conditions, montrent que
1
la respiration endogène chute nettement après quelques temps à 28°C sous agita-
tion. Il y a dissociation des courbes uniquement après 40 minutes (figure 14).
1
Ce délai de 40 minutes correspond en fait à 1 h 30 environ après récolte des
ce llules.
1
b) Détermination de la cOizcentration cellulaire applicable aux essœ~s
1
4
Le substrat androstène-dione-4-CI
est placé dans l'appendice latéral de la fic
1
de Warburg. Il est préalablement dissous dans le DMF et mis au contact avec les
cellules au moment choisi en basculant la fiole. Afin de piéger le CO
formé pe
2
dant la respiration, ie puits central de la fiole est garni de 0,2 ml de KOH à
1
40 %.
1
Appendice
Puits central
Fiole
Essai
(androstène-dione)
KOH à 40 %
cellules + tampon
-------- ~------------------------~--------------------------------------------
1
0,2 ml ( 1 mg)
0,2 ml
2,7 ml
+
0 ml
2
"
Il
l ,3 ml
+
1,4 ml
3
"
Il
0,6 ml
+
2, 1 ml
4
Il
Il
0,3 ml
+
2,4 ml
1
S
1
0,2 ml (0 mg)
"
2,7 ml
+
0 ml
6
Il
Il
0,6 ml
+
2, 1 ml
Le~ expériences sur les essais 1 et S (figure 14) montrent qu'une très forte
concentration cellulaire arrête la respiration de l'androstène-dione, et même
la respiration endogène.

---

1
1
- 52 -
1
1
c) Détermination de La concentration optimaLe d'androstène-dione
1
Appendice
Puits central
Fiole
1 Essai
(androstène-dione)
KOH à 40 %
1
ce llules + tampon
ir------- ------------------------~------------------------------------ -------
1
0,2 ml (0,2 mg)
0,2 ml
2 ml
+
0,6 ml
2
Il
"
1 ml
+
1,6 ml
3
0,2 ml (0,1 mg)
1
Il
2 ml
+
0,6 ml
1
4
Il
Il
1 ml
+
1,6 ml
1
5
0,2 ml (0 mg)
Il
2 ml
+
0,6 ml
6
Il
Il
1 ml
+
1,6 ml
1
Les graphes de la consommation d'oxygène (figure 15) sont obtenus en retranchant
la respiration endogène de la respiration exogène.
:11..,.
Calcul de la vitesse spécifique d'utilisation d'oxygène lors de la consommation
d'androstène-dione : 250 ~l d'02/hr/mg de cellules (poids sec). La figure 15
montre une bonne proportionnalité entre la vitesse d'utilisation et la concentra-
tion cellulaire.
2 - RESULTATS
a) Nécessité du jeûne
Si l'on prend la précaution de faire jeûner au préalable les cellules, on cons-
tate que la respiration endogène a. suffisamment diminué pour permettre de mesurer
l'influence de la présence de stéroide sur la consommation d'oxygène par les
cellules.
b) Devenir de La radioactivité
4
L'androstène-dione-4-CI
permet de suivre la conversion de l'androstène-dione.
Cette expérience ne donne qu'une indication qualitative. La production du CO 2

---

.,.
1
.
- ."
. ~. ~"~;':::-_'~~~_:~;:..~~~
1
- 53 -
1
1
radioactif est déterminée lorsque la consommation d'oxygène est terminée (at-
1
teinte de paliir : figure 16).
c) Mesure de la respiration
1
Tableau 7 - Vitesse de consommation d'o~Jrène
1
souche
sauvage
MS
M
M
M
1
MIS
M6
Ml9
23
31
4
1
Q O
330
52
42
37
30
26
2
1
Palier
100
50
55
53
2,5
7
6
faible
1
numéro du mutant
1
vitesse de consommation d'oxygène en ~l OZ/h/I U.D.O.
1
Palier
quantité d'OZ/mg d'andr~~tène~dione en ~l (valeur 100 atLcibuée au
sauvage)
1
Ce tableau 7 montre que l'aptitude à réaliser la respiration de l'androstène-
dione a fortement baissé chez les mutants.
1
1
d) Mesure de la radioactivité
Quand la courbe de consommation d'oxygène atteint le palier, on place le papier
1
joseph du puits dans une fiole de scintillation. On rince ce puits deux fois
avec 0,2 ml d'eau ".:i est versée dans la fiole. On ajoute la ml du liquide de
1
scintillation puis on fait le comptage.
Ce corn tage de la radioactivité met en évidence les mutants qui ne dégradent
pas les cycles B et A (c'est le cas du mutant M ) et ceux qui les dégradent
4
part ie llement.

---

-
..
1
.J • ~";
~ '.~..:
.........
... ..~".." _... ,/~..; ;.
1
- 54 -
1
1
1
1
souclhe
sauvage
MIS
M
M
M
M
M
M
6
I9
8
23
31
4
1
cpm
550
178
149
1
256
5
55
16
1
1
1
% rad io-
150
32,3
27
46,5
1
10
3
0
activité
1
Tableau 8 - Comptage de la radioa~tivité
1
1
3 - CONCLUS ION
1
Ces expériences montrent que la respiration est modifiée
1
- soit par les étapes de dégradation de l'androstène-dione, ce qui entraine
un défaut d~ coenzyme réduit, véritable substrat respiratoire,
1
- soit par l'altération de la chaine respiratoire elle-même.
Dans ce deuxième cas, ces mutants ne devraient pas se développer sur acétate.
1
Or, la mise en culture de ces mutants sur acétate montrent un comportement
identique à celui des sauvages. Cela revient donc à dire que le proce~sus
1
respiratoire en lui-même n'est pas altéré.
1
1

---

1
- 55 -
1
1
Figure 14 - Mesure de la respiration endog~ne en fonction de la concentration
cellulaire applicable aux essais
1
1
\\.11 O2
(2)
(1)
essai 1
1
(2)
essai 2
400
(3)
essai 3
(4)
essa'Z- 4
1
(5)
essai 5
(6)
essai 6
1
1
1300
1
1
(3)
1200
c
(6)
0 ... -
.,
1
(4)
1
1
1100
1
1
(1) et (5)
1
- - - - , - f - .. - _ - , - ... - . - # -.1 - f -
:. -
'.
-
, - •
.-
r
-
ta -
( -
") -- .. -
• -
3
21
39
57
75
93
minute
1

---

. .:. ,. .. "- .: .'
1
- 56 -
1
1
Figure 15 - Respiration de l'androstène-dione : cMteromination de la concentration
1
optimale
Les groaphes de la consommation d'O~ sont obtenus en retranchant la respiration
1
endogène de la i'espiration exogène.
Pour (1) et (3) : on a utilisé un même témoin~ de même pOUl' (2) et (4)
1
1
J)
1
150
1
(2)
1
1
1
100
1
__ .~
(3)
0 - -
-
- -
1
(4)
_A _
--
-
-
-
-
1
50
1
1
1
1
o
60
120
minutes
1
1

---

---

- 58 -
UTILISA:iON D'AUXOTROPHIE INDUITE
DANS LA DËTERMINATION DE LA VOIE CATABOLIQUE
Les mutants analysés ont été obtenus par traitement mutagène aux rayons y
(cobalt). Ce sont des mutants "auxotrophes" qui ont perdu la capacité de pro- "
duire une ou plusieurs enzymes de la dégradation de l'androstène-dione et, à
cause de ce blocage métabolique, le métabolite ou les métabolites intermédiai-
,
res, situés juste avant le blocage dans la séquence métabolique, peuvent s'ac-
cumuler dans le milieu de fermentation. Nous pouvons ainsi trouver la conver-
sion chimique désirée chez un mutant.
1 - FERMENTATION DE L'ANDROSTENE~DIONE PAR LES MUTANTS
al CuLtwte.
Les cellules mutantes, après préculture sur milieu acétate ]0 g/l, sont trans-
férées dans les milieux de fermentation contenant, d'une part, l'androstène-
diane 200 mg/l comme seule source carbonée et, d'autre part, acétate 10"g/1 +
androstène-dione 200 mg/l. La D.O. initiale est de 0,1. Au bout de 24 heures
de fermentation, on extrait les stéroides qui sont ensuite chromatographiés.
b) Analy.6 e. du fLé..6 LLUah
En présence d'androstène-dione seul, tous les mutants sont incapables 'de le
dégrader complètement pendant 24 heures de fermentation, alors que la souche
sauvage catabolise entièrement ce substrat dans le même délai.
Ce résultat peut être, soit le fait de la mutation, soit le fait du substrat
utilisé qui ne serait pas très énergétique, les cellules ne trouvant pas assez
1
1

---

- 59 -
d'énergie pour élaborer les matériaux cellulaires. ~ussi, utilisons nous
l'acétate comme source d'énergie dans la fermentation.
En présence d'acétate + androstène-dione, nous avons deux types de mutants
- ceux qui, comme M ne dégradent pas l'androstène-dione,
4
- ceux qUi, comme M
le dégradent partiellement, accumulant ainSi un métabolit
6
intermédiaire (chromatogramme 1).
L'enseignement que l'on tire de cette expérience est que les mutants montrant
une faible activité respiratoire sur androstène-dione, ont un effet de biocon-
version lente de l'androstène-dione en absence d'une source d'énergie. Ce phé-
nomène ressemble au système de "co-oxydation" (41) (42). C'est un système où
un substrat est utilisé pour fournir de l'énergie et du carbone pour la syn-
thèse cellulaire et s~multanément. il y a conversion du second substrat.
2 - VITESSE DU CATABOLISME DE L'ANDROSTENE-DIONE ET PRODUCTION DU METABOLITE
.
INTERMEDIAIRE AVEC LE MUTANT M6
On fait une préculture de la souche mutante sur milieu acétate 10 gll. On ense-
mence ensuite 2 milieux de culture acétate 10 g/l i une 0.0. initi~le de 0,1.
Une culture est induite avec l;androstène-dione pendant 4 heures, l'autre reste
1
non induite : les deux cultures sont menées parallèlement. Après centrifugation
stérile, les culots de ces deux cultures sont suspendus chacun dans le milieu
1
de fermentation acétate 10 g/l + androstène-dione 200 mg/l. Puis, â chaque
heure, on procède i
l'extraction des stéroides sur 10 ml de milieu de fermen-
tation et on fait la chromatographie sur couche mince.
1
1
Le chromatogramme 2 a montre que les cellules induites métabolisent ~ussitôt
1
l'androstène-dione alors que les cellules non-induites le font après une pério-
1
machinerie enzymatique nécessaire au catabolisme de l'androstène-dione.
1

---

- 60 -
La vitesse de catabolisme de l'androstène-dione est rapide chez c~ mutant M6
(chromatogramme 2 b). Pratiquement, au bout de dix heures de ferme,ntation,
tout le substrat est transformé en un métabolite intermédiaire.
1
L'analyse par chromatogr~phie et le contrôle de certains paramètres de la
fermentation (pH, concentration optimale du stéroide, aération) nous ont permis
de produire le métabolite accumulé par le mutant M
Au cours de la fermenta-
1
6
tion, il y a formation d'une pigmentation jaunâtre.
1
1
!
3 - IDENTIFICATION DU METABOLITE ACCUMULE
ACIDE PERHYDROINDANE PROPIONIQUE
j
~~~ès fermentation de l'androstène-dione par le mutant M '
6
on procède à l'ex-
traction du métabolite accumulé d'abord par le chloroforme, ensuite au bicarbo-
nate. Lors de cette deuxième extraction, le produit reste dans la phase acide
(voir Matériel et Méthodes)
: ceci met en relief la fonction acide du métabolite
incriminé.
aJ An.al/fM. é.téme.n.:taJAe. du pJWdtUt bJtut
PF : J07,SoC -
109°C
Ce point correspond à celui donné par SIH (43) pour l'acide perhy-
droindane dione propionique
Teneurs de C, H et 0 exprimées en g sur JOO g du produit brut
C = 6S,32
H = 7,41
o == 26,64
formule brute du composé: C
H
0
I3
J8
4
b l An.al/f.6e. du .6pe.c..Vte. de. ma.6.6e.
Le spectre montre plusieurs principaux pics stables
M :
238
Fragments à
220 -
192 -
166 -
126 -
110 - 96

---

1
- 61 -
1
1
1
Interprétation du spectre de masse
r
\\
M : 238
1
cycle D : C
H 0 = 56
3
4
chaîne propionique
C
H
O
73
(
3
5
2
1
M - H 0 = M - 18
220
2
M - CO
- 2H (ou M - H COOH) = M - 46
2
192
1
M - chaîne proplonlque + H = 238 - 73 + 1 = 166
c.) Anal({6 e. du f.l pe.c.bLe. IR
1
5,65 lJ
groupe carbonyl du noyau ~ 5 carbones
1
5,8
lJ
groupe carbonyl du noyau ~ 6 carbones
6,18lJ
ion carboxylate
1
d) Analyf.le. du f.lpe.c.~e. RMN
1
Le spectre montre un pic ~ 8,5 r (H correspondant ~ 3 H (CH ) et un
3
autre pic ~ 7,85 r
1
e.l Le. métabolite. ac.c.umulé e.f.lt donc. l'acide. p~h~~oiYldaYle.-p~opionique.
1
1
!
1
1
1
r
r

---

1
- 62 -
1
1
Chromatogrannne
Fermentation pendant 24 heures
1
a
mutant 11
en présence d'acétate + androstène-dione
6
1
b
mutant M
en présence d'androstène-dione seul
6
1
c
sauvage en présence d'androstène-dione seul
d
stéroides témoins
1
e
mutant MIS en présence d'acétate + androstène-dione;
f
mutant M
en présence d'acétate + androstène-dione
4
1
1
1
androstène-dione
Front
e
•
e
1
•
1,4 androstadiène-dione
:!It, •••
1
1
1
,
1
•
(migration) ~
a
b
c
d
e
f
1
1
r

---

..
'
1
: . , , "
...
_
- 63 -
Chromatogramme 2 a : Vitesse de catabolisme de l'androstène-dione a~ec les
)
1
cellules induites et non induites du mutant M
(,
6
cellules non induites
cellules induites
• • • e/androstène-dionE
e-.
•
r
•
• •
• .- 1,4 androsta-
diène-dione
1
1
1
•2h
• 1 1
3h
4h
5h
témoin
Ih
2h
• t 1 métabolité
intermédiaire
1 Ih
3h
4h
5h
produit
\\,
1
Chromatogramme 2 b : Catabolisme .de l'androstène-dione et accumulation de l'aci-
de perhydroindane propionique avec les cellules induites du mutant M
1
".
f
1
1
cellules induites
\\\\
le ••
1. e e
•
1
1
1
, , l , ,
,
1 •
•
7h
• •
l'6h
9h
IOh
11 h
témoin
12h
13h
14h
18h
20h
24h
r

---

1
.....
- ~'.~.-~~~'~ ..~;~~::;~~.~~.
1
- 64 -
1
1
<
ËTUDE DES VOIES CENTRALES DU MËTABOLISME
1
1
1
1 - CROISSANCE SUR SOURCE CARBONEE
1
Pour différencier les mutants, ;~0US cherchons à déterminer si c~s mutants sont
1
capables de se développer sur les sources carbonées suivantes
- hexanoate
1
- propionate
- pyruvate
1
On laisse les mutants se développer dqns le milieu de préculture acétate la g/l
1
On les récupère par centrifugation, puis on les met à croître dans un milieu con-
tenant une des sources carbonées: le propionate 2 g/l , l'hexanoate 2 g/l ou
1
le pyruvate 5 g/l.
Tableau~: Croissance sur hexanoate, propionate et pyruvate
,
1
,
Mutant
Héxanoate
Propionate
Pyruvate
1
+
+
1
+
+
+
+
+
1
1
Tous les mutants obtenus poussent sur milieu contenant une des sources carbonées
en question, sauf les mutants M et M
qui ne se développent pas sur milieu à
6
I5
1
hexanoate.
1
Ceci nous conduit à émettre l'hypothèse que ces mutants M et M
ont perdu l'ap-
6
I5
titude à réaliser la 8-oxydation. Toutefois, on peut retenir l'idée que cette non-

---

''';'-~-'.
._:.
~_o.:_..~
._._ .=. __._--"-
~~.
_
1
- 65 -
1
1
croissance sur hexanoate peut être une conséquence de la modification des carac-
téristiques membranaires qui rena la réaction enzymatique impossib~e. Aussi.
1
nous allons étudier la perméation de l'androstène-dione chez le mutant M et son
6
aptitude â faire la B-oxydation par la dégradation de la chaine ~atérale de la
I4
1
cholesténone-26-C
•
r
Pyruvate
1
Acétate
Hexanoate
1
\\
1
Acétyl C A
o
r
1
citrate
!
Malate
Isocitrate
Glyoxylate
Succinate
......'- -----
Propionate
-~-' ------

---

1
1
- 66 -
1
1
2 - MESURE DE L'ACTIVITE DE L' ISOCITRATE-LYA5E
1
Généralement les bactéries aérobies accomplissent les étapes terminales du ca-
tabolisme par les réactions du cycle de Krebs. En plus de son rôle catabolique,
,
1
ce cycle sert aussi de point de départ pour beaucoup de biosynthèses.
La croissance sur acétate des bactéries de type f~~~~~~~_~q~ et des levures
1
nécessite les réactions du cycle de Krebs et deux réactions additionnelles exi-
geant les enzymes isocitrate-Iyase et malate synthase. La cr01ssance sur pyru-
1
vate (C ) chez ces organismes réprime ces deux enzymes du cycle glyoxyclique.
3
1
Nous avons dvG~ l'activité de l'~socitrate-Iyase qui convertit {'isocitrate en
une molécule de succinate et une molécule de glyoxylate.
1
Tableau~o'Acitivtté spécifique de l'isocitrate-Iyase
~DO/mn/m~ de protéines
1
Acétate
Pyruvate
<
M
6
4,6
"
1
6
M
7
4,7
I5
1
sauvage
6
5,5
1
1
3 - DISCUSSION ET CONCLUSION
1
Nous avons vu qu'il y a phénomène de "co-oxydation" entre, d'une part, l'acé-
tate qui fournit de l'énergie et du carbone et, d'autre part, l'androstène-
1
dione chez les mutants. Cela pose"le problème du couplage de conversion d'éner-
gie et du processus de biosynthèse.
Dans une étude antérielre, nous avons obtenu des résultats reproductibles pour
le système ~Qg~~~_~~~~~!~~ en termes de rendement pondéral : 0,68 g (poids
sec) de cellules produites par g d'androstène-dione catabolisé.
r
1

---

.....
. '. ' '.
1,'
..:......::"'~...'!~;
- 67 -
Il est difficile de relier cet accroissement cellulaire à la quantité d'ATP
produite lors du catabolisme de l'androstène-dione, la relation directe - pro-
duction cellulaire ATP - s'applique en effet lorsque la croissance se fait sur
milieu complexe (peptone, extrait de levure), la source carbon~e ne servant
alors que de substrat énergétique. Dans notre cas, la non croissance des mu-
tants sur androstène-dione peut être attribuée aussi bien, à un manque de pro-
duction d'ATP qu'à un défaut de production de métabolites centraux nécessaires
+
aux biosynthèses, puisque nous travaillons en milieu synthétique (NH
).
4
Il n'y a pas ~è difficulté d'int~rprétation pour le mutant M ; il ne transformE
4
pas l'androstène-dione, il ne produit donc sur ce milieu, ni ATP, n~ métabolite!
centraux nécessaires aux biosynthèses. Par contre, les mutants M et MIS produi-
6
sant l'acide perhydroindane propionique ont donc clivé le cycle A en un composé
en C
(figure 1) dont on sait qu'il est transformé, chez les fauches sauvages,
6
,
en pyruvate et propionaldéhyde. Ces mutants M et MIS poussen~ sur pyruvate et
6
propionate ; il se pose alors le problème de savoir si ce composé en C
est méta
6
balisé, car il fournirait alors de l'ATP et des métabolites centraux nécessaire~
ce qui permèttrait d'assurer une crolssance, même relativement faibie, par rappc
1
au sauvage. Nous avons, par conséquent, posé la question mais nous n'avons pas
cherché à la résoudre.
Les vo~es du métabolisme central ne semblent pas altérées chez ces mutants M
'
4
M et MIS qui se développent de façon identique au sauvage sur milieu acétate,
6
propionate et pyruvate. Les voies anaplérotiques doivent donc fonction~er norma-
1
lement. Le dosage de l'activité spécifique de l'isocitrate lyas p , chez le sauva-
ge et les mutants M et MIS ' vont dans le sens de cette affirmation.
6
1
Remarquons que, chez cette espèce, il semble que la source carbonée en C
n'exel
3
ce qu'une faible répression de la biosynthèse des enzymes du shunt de l'acide
1
glyoxylique, ce qui est assez différent de ce qui se passe chez E.coli et les
levures.
La perte d'aptitude à la S-oxydation des mutants M et MIS expliquent l'accumulé
6
1
tion de l'acide perhydroindane-propionique, car l'étape au cours de la dégrada-
tion ultérieure de cette molécule a été proposée comme étant due à ia S-oxyda-
1
tion (18). L'existence de tels mutants est donc une confirmation de la proposi-
tion de SCHUBERT.
1

---

- 68 -
CATABDLI ~~E DE LA CHAI NE I_ATÉRALE DE LA CHDLESTÉNDNE
PAR LE MUTANT M6 ET LE SAUVAGE
(
l - REPRESSION CATABOLIQUE DE LA CHAINE LATERALE
a) CuLtWte
On fait une préculture sur acétate la g/l pour la souche sauvage et pour la
souche mutante M
. On repique chaque souche sur milieu d'induction acétate
6
JO g/l + cholesténone 100 mg/l à une 0.0.
initiale de 0,1. Après/4 heures
d'induction, les cellules sont récuperees par centrifugation pui\\ suspend'les
I4
dans le milieu acétate 10 g/l + cholesténone-26-C
de telle sorte que l'on
1
ait, au départ, un~ 0.0. de 0,1 . Or prélève 10 ml de milieu chaque heure.
On procède à l'~xtraction totale des steroides et l'évaporation du solvant
1
d'extraction se fait dans la fiole de scintillation. On fait le comptage de
la radioactivité.
1
b 1 Ré-6 uLta..t6
1
La figure 17 nous montre qu'une période de 4 heures est nécessaire à l'induc-
1
tion des enzymes permettant la dégradation de la chaine latérale ; cette dé-
gradation se manifeste par la diminution de la radioactivité. C'est donc la
1
preuve que la chaine latérale est bien coupée,aussi bien chez la souche sauva-
ge que chez le mutant et qu'elle n'exerce pas une répression catabolique ~tale.
1
La diminution de la radioactivité par le mutant M
peut signifier que la
6
S-~xydation n'est pas en cause.
1
Ces expériences sont faites dans à2b conditions où il y a simultanément dégra-
dation des cycles du stéroide et celle de la chaine latérale. Il est difficile
1
de cette façon, de montrer la part dévolue aux deux clivages. Il est donc
l
1
1

---

-
69 -
3
10 .cpm
( 1)
30
•
(2)
20
- ()-
.. 0 - ...... -0'"",...c
""\\
\\
" oP,
{
...
\\ ,,•
heure
12
2
4
6
8
/
Figure 17 -
Répression catabolique de la chaine latérale
(1) chez le sauvage
(2) chez le mutant Me

---

"
° __0
•
_ _ ...:.
• • •
0-
_ _ • •
•
_
• •
1
-
70 -
1
1
1
1
0,2
(1)
1
D.O
1
/
1
(2)...
/ /
1
0,1
.
/ /
(3)
1
:;7~---.--,--~
1
(4)
•
•
1
heure
0,05
2
4
6
1
1
1
Figure 18 - Influence de 22' dipyridy le sur la croissance
1
(l) 22'_ dipyridyle
20 mgll
(2) 22 ~ dipyridy le
50 mgll
1
(3)
22 '_dipyr'idyle
100 mgll
1
(4)
22 '_dipyridyle
200 mgll
1
1
1

---

.
./;~
1
-" "_.-: -~"·i~·~:.·;",~", :,-,:;i~
-
71 -
nécessaire d'opérer dans des conditions qui permettent seulement la dégrada-
tion de la chaine latérale en inhibant l'ouverture des cycles de la cholesté-
none. C'est ainsi qUE nous utiliserons le 22' dipyridyle qui, en inhibant la
9 a-hydroxylase
empêche l'ouverture des cycles du stéroide.
2 - DEGRADATION DE LA CHAINE LATERALE
al MÙe. au point de. .ta c.onc.e.rtVtaUon optimale. de. 22' dipyJU..dy.te.
Effet sur la crOissance cellulaire
On induit les cellules pendant 4 heures dans le milieu acétate 10 g/l + andro-
stène-dione ln0 mg/l. On centrifuge, on recueille le culot dont les cellules
sont mises à croître à une D.O. de 0,1 dans les milieux acétate 10 g/l + andro-
stène-dione lOO mg/l + 22' dipyridyle.
La 22' dipyridyle réduit la vitesse de la croissance cellulaire comme le mon-
tre la figure 18. Au-delà de lOO mg/l, la croissance est inhibée.
Effet sur les cycles du stéroide
Des essais ont été faits à différentes concentrations de 22' dipyridyle.
L'expérience montre que 20 mg/l est la concentration la plus efficace,puisqu'à
cette concentration, l'ouverture des cycles est inhibée (chromatogramme 3)
et la croissance cellulaire se poursuit (fig.
18).
bl Ré~u.t.ta:U
Les cellules, après une induc r ;0n de 9 heures dans le milieu ac6tate 10 g/l
+ Cholesténone froid
lOO mg/l, ~ont récupérées, puis mises à croître sur milieu
I4
acétate 10 g/l + cholesténone-26-C
100 mg/l + 22' dipyridyle 20 mg/l.
Un essai, sans inhibiteur, est aussi mené parallèlement. On fait l'extraction
totale des stéroides et l'on compte la radioactivité.

---

1
1
-
73 -
1
(
l,
1
1 Front
• • •
•
androstène-dione
• • •
• 1,4 androstadiène-dione
1
1
a
b
c
d
e
f
1
1
1
1
1
Chromatogr~mme-l : Effet de ~ifférentes concentrations de 22~ dipyridyle
sur les cycles de l'androstène-dione
Analyse des produits après 6 heures de fermentation
1
a -
20 mg/l
2 heures de fermentation
1
b -
20 mg/l
6 heures de fe rinen t a t ion
c -
50 mg/l
2 hEures de fermentation
1
d -
50 mg/l
6 heures de fermentation
'~ - 100 mg/l
2 heures de fermentation
f -
100 mg/l
6 heures de fermentation

---

.
_ .
0
~
.
•
• • • •
""-
_"
..:..
.. _ . _
-
74 -
'<.
. CONCLUSION

---

- 75 -
La 1,2-déshydrogénase ~e ~QQ~4ig_~~~!~fQ!H2 est inductible comme celle de
~Q~gr4ig_gQ~gIIi~g. Cependant~ et contrairement à ce qui se passe chez cette
dernière bactérie, les sources carbonées acétate, hexanoate et pyruvate
n'exercent pas de répression catabolique. La régulation enzymatique de la
1,2-déshydrogénase ne s'effectue donc pas de la même manière chez ces deux
bactéries. Cette non-répression catabolique par ces sources carbonées, est
un facteur important que l'on retiendra pour optimiser le milieu synthétique
de croissance de Nocardia restrictus (apport en énergie), et- pour isoler des
-------------------
mutants incapables de dégrader les cycles des stéroides, notanunent l'androstène-
dione. Nous avons développé la méthodologie qui permet la production et la sé-
,
lection des mutants qui sont élLicirostène-dione moins (A-) .
L'échec que nous avons eu pour isoler des mutants constitutifs pour la 1,2-
déshydrogénase pourrait s'expliquer par le fait que le système de régulation
du catabolisme de l'androstène-dione fait intervenir plusieurs opérons diffé-
remment régulés. Certains paramètres de la fermentation continue' pourraient y
avoir contribué, les fluctuations du débit par exemple. Il aurait été très in-
téressant d'utiliser un volume utile plus important et de travailler à une
concentration cellulaire plus grande. Pendant 20 jours de fermentation continue,
nous n'avons pu avoir que 32 générations. Ce nombre de générations est peut-être
insuffisant pour que les mutants constitutifs ou surproducteurs aient traduit
leur avantage sur les sauvages.
La caractérisation des mutants nous a permis d'isoler, d'une part, ceux qUi
sont capables de couper la chaine latérale, mais incapables de dégrader les cy-
cles des stéroides, et d'autre part, ceux qui dégradent partiellement les cy-
cles, mais n"'. ~""1vent cliver la chaine latérale. Les premiers mutants font la
B-oxydation, alors que les derniers ont grandement perdu l'aptitude à réaliser
la B-oxydation.
L'obtention de ces mutants revêt un intérêt particulier sur le plan industriel.
En effet, le fait de couper la chaine latérale, sans dégrader les cycles, per-
met de produire des ho~mones stéroides à partir de stérols, par mise en oeuvre
1·
)
d'ùn système de fermentation à un stade. Jusqu'à présent, l'industrie utilise

---

- 76 -
un système de fermentation nécessitant au mOlns deux stades. Le premler stade
r
concerne la croissance cellulaire et c'est au cours du second stade qu'on fait
la bioconversion proprement dite du stéroide par addition des chélatants ou
autres inhibiteurs de l'ouverture des cycles
cette bioconversion survenant
donc au cours d'une phase stationnaire de croissance. Toujours sur le plan ln-
r
dustriel, le fait d'obtenir des mutants qui font une ouverture ménagée des cy-
,
cles sans couper la chaine latérale permet de produire des molécules
utilisées
comme précurseurs dans la synthèse chimique des rétrostéroides. Rappeluns qu'
r
actuellement, l'équipe de WAGNR~ produit ces précurseurs enjou&(lt sur les pa-
ramètres des milieux de culture ~45).
L'existence des mutants M et M
qui produisent l'acide perhyqroindane propio-
6
I5
nique (métabolite de l'ouverture ménagée des cycles) et qui ne font pas la S-
oxydation confirme la proposition de SCHUBERT selon laquelle l'étape de la dégra-
dation ultérieure de ce ~omposé est la 8-oxydation.
, -
14
S'agissant de la dégradation de la chaine latérale de la cholesténone-26-C
chez la souche sauvage de ~~~~E~i~_E~~~Ei~~~~, nos résultats concordent avec
ceux de SIH et WANG (44), à savoir que la dégradation des cycles A et B du
stérol inhibe la vitesse de dégradation de la chaine latérale.
1
Le mutant M s'est révélé incapable de pousser sur hexanoate et de faire la
6
1
\\
S-oxydation, confirmant ainsi la proposition de SCHUBERT que nous avons déjà
1
évoquée. Seul un dosage exhaustif des enzymes de la 8-oxydation nou& permettrait
1
de déterminer la séquence du mf~dbolisme d'acide gras impliquée. Enfin, une
autre considération s'ajoute, c'est que les Nocardiae pourraient posséâ~r 3
types d'enzymes permettant l'activation sélective des acides gras (46)
:
1
"\\
- enzymes d'activation pour acide gras à courte chaine
1
\\
- enzymes d'activation pour acide gras à chaine moyenne
- enzymes d'activa~ion pour acide gras à longue chaine
1
La ~on-crolssance sur hexanoate du mutant M
pourrait donc être due à l'absence
6
de l'enzyme activatrice pour acide gras à chaine moyenne, l'hexanoate notamment.
)
1
1

---

- 77 -
1
,
l .
BIBLIOGRAPHIE
r1
1
)
1
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1
1
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