Série : C
N' d'ordre: 861
N' de Série : 340
THÈSE
présentée devant
L'UNIVERSITÉ DE RENNES l
V.E.R. Scîence5 de la Vie et de l'Environnement
PO/II
obtenir
Le Titre de Docteur en Troisi èlne Cycle
. -~~...,--.,..,.."..,~---
Spécialité: Écologie
-'C~;~SERAFRJCAINET MALGACHE
fOUr- L'ENSE!GNEMENT SUPERIEUR
C f.~. t·lI. f:. S. -
OU/\\GADOUGOI}
par
•.
•, A' .,
ln 8
lïïV'~8'l:J"': 1A 1\\'
U'l\\" 1998·······
.
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1
!
Joseph GO MA TCHIMBAKALA··---·----_·
NITRIFICATION AUTOTROPHE DANS UN SOL ACIDE DE LANDE:
ÉTUDE EN MILIEU RENOUVELÉ DE L'EFFET LITIÈRE SUR DES
POPULATIONS DE NITHOBACTER.
Soutenue le 6 Juillet 1984 devant la Co [Omission cl' Examen
MM.. J. TOUFFBT
Président
G. BERTRU
J. GOASGUEN
L. LABROUE
J.C. LEFEUVRE
F. ROZE

---

UNIVERSITE
de
RENNES
J
An née
1983-1984
U.E.R.
Sciences et
Philosophie
Doyens
Honoraires
M.
MILON
Y.
M.
LE
MOAL
H.
M.
MARTIN
Y.
M.
BOCLE
J.
Professeurs
honoraires
M.
FREYMANN
R.
M.
ROHMER
R.
M.
MI LON
Y.
M.
SALMOI\\J-LEGAGNEUR
F.
M.
VALLET
P.
M.
PH 1LI PPOT
A.
M.
VENE
J.
Mlle
CHARPENTIER
M.
M.
VACHER
M.
M.
VILLERET
S.
M.
VIGI\\JEROI\\J
L.
M.
LE
MOAL
H.
M.
PELTI ER
D.
Mlle
DURAND
S.
M.
LE
BOT J.
Maîtres
de
Conférences
Honoraires
M.
GRILLET
L.
Mlle
HAMON
M. R.
/...

---

2.
MATHEMATIQUES et
II\\IFORMATIQUE
Professeurs
Docteu rs
d'Etat
Mme
ANDRE
Françoise
M.
KOTT
Laurent
Mme
ALLAIN
Marie
France
Mme
BERLINE
Nicole
M.
LEGOUPI L
Jeân
M.
CIAVALDINI
Jean
François
M.
BERTHELOT
Pierre
M.
LENFANT
Jacques
Mme
COSTE-ROY
Marie France
M.
BREEI'J
Lawrence
M.
LERMAN
Israël
M.
G RAS
Régis
M.
CAMUS Jacques
M.
MARIE
Raymond
M.
HENNION
Hubert
M.
CONZE
Jean
Pierre
M.
MARTIN
Yves
Mme
LEROUX
Marie
Noëlle
M.
COSTE
Michel
M.
MET/VIER
Guy
M.
MAHE
Louis
M.
CROUZEIX
Michel
M.
MIGNOT
Alain
M.
MEMIN
Jean
M.
FERRAND
Daniel
M.
SEGU IN Jean (IUT Lannion)
M.
MERRIEN
Jean
M.
GERVAIS
Michel
M.
TOUGERON
Jean
Claude
M.
NOURRIGAT Jean
François
M.
GIORGIUTI
Italo
M.
TOU RN EM 1N E Georges
M.
PERRII'J
Gérard
M.
GUERINDON
Jeéln
M.
TR 1LLiNG
Laurent
M.
GUIVARC' H
Yves
M.
VERJUS. Jean
Pierre
M.
HOUDEBINE
Jean
M.
WOLF
Jacques (IUT Lannion)
PHYSIQUE
l@li1.\\I'4i#*~
Professeu rs
Docteurs
d'Etat
M.
ARQUES
Pierre-Yves
M.
HAEUSLER
Claude
M.
BALCOU
Yves
M.
LANGOUET
Laie
M.
BARON Alexis (IUT Rennes)
M.
LE
F LOCH
Albert
M.
BAUDOUR Jean
M.
LARVOR Maurice
M.
BENIERE
François
M.
LE ROUX
Emile
M.
BERNAR 0
M.
LECLEAC' H
M.
BERTEL Louis (IUT
L.l
M.
LE
TRAOI'J
André
Dominique
(IUT Lannion)
M.
BOU LET
Christian
M.
LEVASSEUR
Michel
M.
BESI\\IIER Gilbert
M.
LE
DOUCEN
Roger
M.
BRUN
Pierre
(IUT Rennes)
M.
BIDEAU Daniel
M.
LEMONNIER Jean Claude
M.
CO LI N Yves (1 UT Rennes)
M.
MALHERBE J.C.(lUT L.l M.
BOULIOU Alain
M.
LENORMAND Jean Michel
M.
CORAZZA M.(lUT Lannion)
M.
MEINNEL
Jean
M.
CAILLEAU Hervé M.
MESSAGER
Jean Claude
M.
DANI EL
Jean
Pierre
M.
MEVEL
Jean
Yves
M.
CHAGNEAU
M.
PI LET
Jean
Claude
M.
0 ECAMPS Edmond-Antoine
M.
NUSIMOVICI
Michel
(IUT Rennes)
M.
POEY
Pierre
M.
DUBOST
Gérard
M.
RIAUX Eugène (IUT R.)
M.
CHARBOI\\INEAU
M.
PRJOL
Marcel
M.
DURAND
Alain
M.
ROBIN
Stéphane
M.
DAUDE
André
M.
RABACHE P. (IUT L.l
M.
FOUCH E F. (IUT R.)
Mme
ROBIN
Simone
M.
DEFRANCEAndré M.
REBOURS B. (IUT L.l
M.
FUCHS Jean
Jacques
née
SALOMOND
M.
ECOLIVET Claude M.
SEIGNAC
André
M.
G ROSVALD (IUT R.)
M.
STEPHAN
Guy
M.
GIRARD Alain
M.
T' KINT
de
M.
GUIDII\\II
Joseph
M.
TERRET
Claude
M.
GOMET J.Claude
ROODENBEKE
A.
M.
VEZZOSI
Georges
M.
GOULPEAU
(IUT Rennes)
Louis
Mme
r KINT de
M.
HAGENE
B.
ROODENBE
M.
Mlle
HAGENE
M.
(IUT Rennes)
M.
LAMBERT
B.
M.
TONNARD
F.(IUT
R.J
(1 UT
Lannion)
/...

---

3.
CHIMIE
Professeu rs
Docteu rs
d' Eta t
M.
BARIOU
B.(IUT Rennes)
M.
LE
GUYADER Michel
M.
AUFFREDIC J.p, Mme
RIVET
Paulette
M.
B RAU LT
A. (IUT Rennes)
(IUR Rennes)
Mme
BARS Odile
née
LE
GUELLEC
M.
CARRIE
Robert
M.
LEVAS
Emile
née
BEAULIEU
Mlle
LEPLOUZENNEC M.
M.
DABARD
René
M.
L1SSI LOU R
Rola nd
M.
BOTREL
Alain
M.
MARTELLI
Jacques
M.
DIXNEUF
Pierre
M.
LUCAS
Jacques
Mme
DAI\\JION Renée M.
MEYER
André
M.
FOUCAUD
André
M.
MARTI N
Guy (ENSCR)
née
BOUGOT
M.
MOINET
Claude
M.
GRANDJEAN
Daniel
M.
MAUNAY E Marcel(ENSCR) M.
BROCHU
Robert M.
MORVAN Jean(ENSCR)
M.
GUERI LLOT
Claude
M.
SOYER
Noël(lUT Rennes) M.
CAl LLET Paul
M.
N ICOLLON
des
M.
HAMELIN
Jack
M.
TALLEC
André
M.
CAREL Claude
ABBAYES
Hervé
M.
KERFANTO M.(ENSCR)
M.
CARO
B.
M.
PATIN
Henri
M.
LANG
Jean
Mme
POMMERET
M.
PERSON
Hervé
M.
LAU RENT
Yves
née
CHASLEM.F.
Mme
de
COURVILLE
M.
LE
COR RE
Maurice
(IUT
Rennes)
née
PICHEVIN
Annick
M.
CORRE François
M.
PICOUAYS
Bernard
M.
DANION Daniel
M.
PLUSQUELLEC
M.
DARCHEN André
Daniel (ENSCR)
M.
DORANGE
M.
POCHAT
Francis
Gérard (ENSCR)
M.
POU LAI N
Marcel
M.
FAYATchristian
M.
PRIGENT
Yves
M.
GAD REAU Claude
(IUT Rennes)
M.
GAUDE
Jean
M.
RAOUL
Eugène
Mme
LOUER
M.
M.
RAPHALEN
Désiré
née
GAUDIN
(ENSCR)
M.
GUERII\\J Roland
M.
RAULET
Claude
M.
GUILLEVIC
J.
M.
ROBERT
Albert
M:
HAZARD Roland
Mme
CARLIER
J.
Mme
PAPILLON
née
ROLLAND
(IUT RJ
née
JEGOUDenise
M.
SAILLARD
Jean Yves
(IUT Rennes)
M.
SARRAZIN
Jean
M.
JOUCLA
Marc
Mme
TEXIER
Francoise
M.
JUBAUL T Michel
M.
VENIEN
Frédéric'
Mo.
LAPLANCH E A. M.
VERDI E R Patrick
(ENSCR)
M.
LEBORGN E Guy
M.
LE
COQ
André
M.
LE
F LOCH Yves
(ENSCR)
Mme
UTJES Monique
née
LE
GALL
CHIMIE
BIOLOGIQUE
Professeurs
Docteurs
d'Etat
M.
DAVI D Jean
Claude
M.
KERCRET
Henri
M.
DUVAL Jacques
M.
MERCIER
Louis
M.
VALOTA 1RE
Yves
/ ...

---

4.
GEOLOGIE
Professeu rs
Docteurs
d' Etat
M.
BONHOMMET
Norben
M.
HAMEURT Jean Marie
M.
AUVRAY Bernard M.
LE
CORRE
Claude
M.
CHAUVEL Jean Jacques
M.
JAH N Bor Ming
Mme
ESTEOULE
M.
LEFORT
Jean Pierre
M.
CHOUKROU NE Pierre
M.
LARDEU X Hubert
née
CHOUX Janine M.
MORZADEC Pierre
M.
COGNE Jean
M.
WILLAIME
Christian
M.
HEI\\J RY J.Louis
Mme
OLLIVIER M.F.
Mme
MORZADEC
née
PIERRE
née
KERFOURN M.T.
ZOOLOGIE
~
Professeu rs
Docteurs d' Etat
M.
ALLEGRET
Paul
M.
JOLY Jean Marie
M.
BARBIER
Roger M.
GUILLET Jean Oaude
M.
DAGUZAN Jacques
M.
MAI LLET Pierre
M.
BERNARD Jean
M.
GUYOMAR' CH
J.Charles
M.
FOLLIOT
Roger
M.
NENON Jean Pierre
M.
BOISSEAU Claude M.
HAMON
Claude
M.
GAUTI ER
Jean Yves
M.
RAZET Pierre
M.
CHAUV 1N Georges M.
J EGO
Patrick
M.
GOURANTO N Jean
M.
TREHEN
Paul
M.
COI LLOT J.Pierre Mme
URVOY Jeanne
M.
DENIS01ristian
née
LE
MASSON
M.
GOURRET J.Pierre M.
MICHEL
Raoul
Mme
HUBERT Monique
née GUERGADY
BOTAN lOUE
Professeurs
Docteu rs
d' Etat
M.
CITHAREL Jean
Mme
LEMOINE
Cécile
M.
BERNARD Th.
M.
LE
RU DULIER Olniel
M.
CLAUSTRES
Georges
M.
TOUFFET Jean
M.
BERTRU Georges
M.
SAVOURE
Bernard
Mlle
GOAS Gabrielle
M.
WROBLEWSKI Henri
M.
BR 1ENS Marcel
M.
HUON
André
PHILOSOPHIE
Professeu rs
Docteurs d' Etat
M.
DELEULE
Didier
M.
ORTIGUES
Edmond
M.
CLAI R André
M. JACOUES
Francis
M.
VETO
Miklos
1...

---

PERSONNEL
C.N.R.S.
5.-
fWi s\\1ê&tlm
Directeurs
de
Recherche
Maîtres
de
Recherche
Chargés
de
Recherche
MATHEMATIQUES
M.
CREPEL
Pierre
M.
HARDY
Jean
INFORMATIQUE
$$i!PQ'!@ZIJ9'#MitW"1i@lm
M.
DARONDEAU Philippe
CHIMIE
~
M.
SERGENT
Marcel
M.
CHEVREL
Roger
M.
BATAIL Patrick
M.
MARTIGNY
P.
M.
SIMONET Jacques
M.
COEURET (ENSCR)
M.
DEMERSEMAN
B. M.
MATECKI
Ma rc
M.
DENIS
Jean
Marc
M.
DENES
Georges
M.
MOREL
Georges
M.
GREE
René
M.
FONTENEAU
G.
M.
NOEL
Henri
M.
GUYADER Jean
M.
PADIOU
Jean
M.
HAMON
Jean
René
M.
PEI\\JA
M.
LAPINTE
Claude
M.
PERRIN
André
M.
LE
BOZEC
H.
M.
POTEL
Michel
M.
L" HARIDON
P.
M. SIMONNEAUX G.
M.
LOUER
Daniel
M.
VAULTIER
M.
M.
MARCHAND
R.
PHYSIQUE
M.
DANG
TRAI\\J
QUan
M.
SANQUER
Marc
GEOLOGIE
.mjll*n~
M.
CAPDEVILLA
R
M.
AUDREN
Claude
M.
COBBOLD
Peter
M.
BERNARD-
M.
VI DAL
Philippe
GRIFFS
Jean
M.
PARIS
Florentin
M.
PEUCAT J.Jacques
M.
ROBARDET
Michel
ETHOLOGIE
~fiWlm
Mme
CLOAREC
Anne
M.
V ANCASSE L
Michel
M.
VI DAL
J.Marie
ZOOLOGIE
Mme
GAUTIER
Annie
M.
GAUTIER
Jean
Pierre
ANTHROPOLOGIE
M.
GIOT
Pierre-Roland
M.
BRIARD
Jacques
M.
MONNIER
J.Laurent

---

REMERCIEMENTS
J'exprime ma reconnaissance à Monsieur le Professeur TOUFFET , pour
m'avoir accueilli dans le laboratoire d'Ecologie Végétale de l'Université
de Rennes l et pour avoir accepté de présider le jury de cette thèse.
C'est à Monsieur BERTRU, Maître-Assistant au laboratoire de Microbio-
logie de l'Université de Rennes l, que je dois mon initiation à la micro-
biologie. Il a suivi le travail tout au long de sa réalisation; ses cri-
tiques et ses suggestions judicieuses m'ont été d'un secours précieux.
Qu'il veuille bien trouver ici l'expression d'une fidèle reconnaissance.
Mademoiselle JOSSERfu~D, Maître-Assistante au laboratoire de Biologie
des sols à l'Université de Lyon l, nous a appris les techniques d'immuno-
fluorescence appliquée à l'écologie microbienne des sols. Je suis heureux
de lui adresser le témoignage de ma gratitude.
Ce travail doit beaucoup à Mademoiselle ROZE, Assistante à l'Univer-
sité de Rennes l, dont l'aide m'a été précieuse dans la partie terrain.
Qu'elle sache que j'ai hautement apprécié son concours et ses conseils.
Monsieur le Professeur LEFEUVRE, du Muséum d'Histoire Naturelle de
Paris, malgré ses nombreuses occupations, a trouvé le temps de s'intéresser
à notre travail en nous faisant l'honneur de participer à notre jury de thèse.
Qu'il trouve ici l'expression de ma respectueuse gratitude.
Monsieur LABROUE, Maître-Assistant à l'Université Paul Sabatter de
Toulouse, a témoigné un grand intérêt pour ce travail en acceptant de le
juger. Je suis très honoré de le compter dans ce jury.
Monsieur GOASGUEN, CHEF DE TRAVAUX à 'la Faculté de Médecine de Rennes l ,
a accepté de juger ce travail.Qu'il veuille trouver ici l'expression de ma
gratitude.
Je ne voudrais pas terminer sans remercier ma collègue R. SALAUN et
Monsieur GUBETTI et tous les autres membres des laboratoires de Microbio-
logie, d'Hématologie et d'Ecologie Végétale, qui ont aidé d'une façon ou
d'une autre à l'aboutissement de ce travail.
Je remercie également Madame JOUANNEAU qui a assuré la dactylographie
de cette thèse. Qu'elle soit assurée de toute ma sympathie.

---

SOMMAIRE
Pages
INTRODUCTION
.
7
CHAPITRE l : MATERIEL ET r-ŒTHODES
.
12
1) CADRE DE L'ETUDE ET MATERIEL BIOLOGIqUE
.
13
A) CADRE DE L'ETUDE
.
13
B) MATERIEL BIOLOGIQUE: SOUCHES BACTERIENNES
.
14
1) Enrichissement et isolement de Nitrobacter
.
14
2) Résultats
.
II)
16
TECHNIQUES DE DENOMBREr-ŒNT
.
17
A) L' IMMUNOFLUORESCENCE
.
17
1) Principe
.
17
2) Protocole sui vi
.
19
3) Application de la méthode d'immunofluorescence au comptage
de Ni trobacter
.
25
4) Dis cus sion
.
27
B) AUTRES METHODES DE DENOMBREMENT
.
28
1) Numération directe: méthode de ZIMt-Œlù'1AN et al..
(1978) .•...
29
2) Mesure de la densité optique
.
29
3) Numération indirecte: dosage de l'A.T.P.
cellulaire
.
30
C) AUTRES TECHNIQUES
.
30
1) Méthode d'investigation de la nitrifiCag;tio~~~~:~in
..
30
2) Dosage des nitrites et des nitrates
-b~.' ••••••••• '~<-i-,"'"
31
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31
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t
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B) SYSTEMES DE CULTURE
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32
1) S
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ys terne c os ou
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,~
.
32
_
;
.!J 118 61
~ ~~
2) Systeme ouvert : le chemostat
-._
"
.
32
C) MISE AU POINT D'UN DISPOSITIF EXPERIMENTAL
.
37
1) Modifications apportées au chémostat
.
37
2) Expérience préliminaire: vérification de l'établissement
des états d'équilibre
.
33
CHAPITRE II : CARACTERISATION P1ITSIOLOGIQUE DES SOUCHES DE NITRO-
BACTER
.
41
1) ETUDE DE LA CROISSANCE
.
4..
A) CROISSAl\\lCE EN MILIEU FERl'Œ
.
·42
B) CROISSANCE EN MILIEU OUVERT
.
44

---

II) ETUDE DE LA TRili1SFOR}~TION DU NITRITE
>.......
44
A) CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE EN MILIEU FERME....
45
B) DISCUSSION.....................................................
45
C) CALCUL DE L'ACTIVITE SPECIFIqUE................................
45
D) DISCUSSION.....................................................
50
III) INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR L'ACTIVITE NITRIFlk1TE.
51
A) INTRODUCT ION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
B) PROTOCOLE EXPERIMENTAL.........................................
52
C) RESULTATS......................................................
52
D) DISCUSSION.....................................................
54
IV) INFLUENCE DE LA MATIERE ORGk1IQUE..
. . . • . . . . . . . . . . . . . . . • . . •
57
A) INTRODUCT ION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
B) PROTOCOLE EXPERINENTAL
·...•.•..........•..
57
C) RESULTATS......................................................
58
D) DISCUSSION.....................................................
63
CHAPITRE III : ETUDE DES EFFETS D'UN APPORT DE CaC0
ET DES EFFETS
3
LITIERES SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE....
65
1) INTRODUCTION......................................................
66
II) ETUDE DES EFFETS DES APPORTS DE CaC0 · . · · · · . · · · .. ···
67
3
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL.........................................
67
1) Sur le t e r r a i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
2) Au l a b o r a t o i r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
B) RESULTATS EXPERI~ŒNTAUX....... ... ..•.... ..•.. . . . . . . . . • . . . . . . . . .
67
1) Résultats des expériences réalisées sur le terrain..........
67
2) Résultats des expériences réalisées au laboratoire.... ..•...
69
C) DISCUSSION.....................................................
70
III) ETUDE DES EFFETS LITIERES.......................................
71
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL.........................................
71
1) Modalités de la manipulation effectuée sur le terrain. .•..•.
71
2) Modalités de la manipulation effectuée au laboratoire.. .....
72
B) RESULTATS EXPERHŒNTAUX........................................
75
1) Résultats des expériences réalisées sur le terrain..........
75
2) Résultats des expériences réalisées en chémostat au
l a b o r a t o i r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
CONCLUS ION GENERALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100
BIBLIOGRAPHIE
.
104
LISTE DES FIGURES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . • . . . . . . . . . . . . . . . . .
112
LISTE DES TABLEAUX.................................................
114
ANNEXES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 15

---

INTRODUCTION GENERALE
Les végétaux chlorophylliens synthétisent leurs constituants cellulai-
res à partir du carbone provenant du COZ atmosphérique de l'eau et des élé-
ments minéraux puisés dans le sol. Parmi ces derniers, l'azote apparaît
primordial car il est l'un des constituants fondamentaux des tissus.
Après la mort des végétaux ou des an~maux les éléments minéralisés
inclus dans la matière organique sont inutilisables directement par les
plantes. Leur minéralisation est indispensable pour maintenir dans le sol
un taux suffisant d'éléments assimilables; les microorganismes ont à cet
égard un rôle prépondérant.
L'azote atmosphérique fixé par les végétaux et les microbes revient
au sol par le processus de minéralisation. La première étape de celle-ci
consiste en une libération d'ammonium. Cet azote ammoniacal formé par
ammonification est oxydé en nitrates
c'est la nitrification. Ce processus
se présente en deux étapes
+
la nitritation
+ 3/Z Oz
+ Z H
+ HZO + 63,8 kcal
la nitratation
+ l/Z Oz
+ 17,5 kcal
La nitrification est effectuée par un groupe de bactéries chimiolitho-
trophes : les Nitrobacteriaceae dont l'espèce la plus cocmune est Hitrcsor'lonas
europea qui intervient dans la première étape de ce processus et Nitrobac-
ter Winogradskyi dans la seconde étape. Les principales espèces connues
sont répertoriées dans le manuel de détermination de BERGEY (1974).
Les bactéries de ce groupe ont été pendant longtemps considérées coœme
des chimiolithotrophes strictes. Mais les travaux menés par DELWICHE et
FINSTEIN (1965), CLARK et al.
(1966), SNITH et HOARE (1968), WALKER (1975),
BOCK (1976), ~~TIN (1978) et récemment JOSSERfu~D (1983) et la discussion
de RITTENBERG (197Z) ont remis en question ce point de vue. Ces auteurs

---

-
8 -
ont montré que Nitrosomonas et Nitrobacter ont la capacité d'utiliser le
carbone organique. Ainsi donc l'autotrophie stricte au sens de WINOGRADSKYI
(1890) n'existe pas. Ces bactéries sont donc des chimiolithotrophes faculta-
tifs. Cette capacité leur permet de se maintenir et de survivre en absence
momentanée d'azote minéral. Ces exemples démontrent l'interpénétration des
cycles du carbone et de l'azote dans la nature. Il est donc nécessaire de
tenir compte des effets de la matière organique dans l'essai de compréhension
du cycle de l'azote.
Des deux bactéries intervenant dans la nitrification, Nitrobacter est
de loin la plus sensible aux facteurs de l'environnement. Cette sensibilité
fait de la dernière étape du processus un bon indicateur de l'activité glo-
bale du sol. C'est pourquoi de nombreux travaux ont été consacrés à la con-
naissance de Nitrobacter.
C'est une bactérie gram-, de petite taille:0,~1-2 p. La présence des
cytomembranes à disposition polaire est le principal critère de reconnais-
sance retenu par BUCHP~k~ et GIBBON dans la 8e édition de Bergey's Manuel
(1974) .
Nitrobacter tire son énergie principalement de l'oxydation du N0
en
2
N0
• Au cours de cette transformation l'atome d'azote subit un changement
3
de valence de +3 à +5.
Les électrons sont transférés grâce à un complexe multienzymatique qui
comprend la "Nitrite-oxydase'~le cytochrome a et c (ALEEi'l et NASON, 1959).
Ce complexe est localisé dans la membrane cellulaire/ENGEL (1941) cité par
RAUCK (1980), Yk'1ANAKA et al.
(1979). Outre le système du cytochrome l' oxy-
dation du N0
nécessiterait la présence du fer (LEES et SIrŒSON, 1957,
2
ALEEH et ALEXANDER,
1958) et d'une Flavine VAN GOOL et 1..AJ.~DELOUT (1966)
~n WALLACE et NICHOLAS (1969).
1
En utilisant de l' °2 ~EEH (1970) a montré que l'eau et l'oxygène par-
ticipent directement à la nitrification :
18
18
N0
+ H 0
NO ---H 0
2
2
2
2
18
3+
18
2+
+
N0
H 0
+
2 Cyt a
N0
+ 2
Fe
+ 2 H
2
2
l Fe
Cyt a
3
l
2+
+
3+
2 Cyt a Fe
+
2 H
+ 1/2 O
2 Cyt a Fe
+ H 0 + Energie
l
2
l
2
La réaction d'oxydation du N0
est exorgonique. L'énergie libérée est
2
stockée sous forme d'ATP. Les valeurs de PlO (nombre de phosphates assimilés

---

- 9 -
ou nombre de moles d'ATP produit par nombre d'atomes d'oxygène consommé)
est égale à 1, c'est-à-dire que pour une mole de NO
oxydée 1 ATP est
Z
produit.
La formation de l'ATP a lieu au n~veau àes structures membranaires.
L'ATP est utilisé comme source d'énergie dans le cycle de CALVIN pour
la synthèse de la matière organique par incorporation du COZ (KELLY,
1967).
ALEEM (1970) a montré que pour assimiler le COZ via le cycle de CALVIN,
3 ATP et Z NADH sont nécessaires. Ce processus implique l'oxydation d'au
mo~ns 13 moles de nitrite par Nitrobacter. Ila aussi montré que l'incorpo-
ration de l'azote provenant du NO
dans les protéines cellulaires demande
Z
7 ATP. Selon ce même auteur, la réduction du NADP+ par le NADH demande 1 ATP
En définitive, la fixation d'une molécule de COZ nécessite l'oxydation de
Z1 moles de nitrite.
La conséquence d'un tel métabolisme est un rendement de croissance très
faible d'où la difficulté rencontrée lors des essais de cultures pour obtenir
de fortes densités de populations de Nitrobacter.
Malgré cette lente croissance de Nitrobacter, la nitrification autotro-
phique, visible par l'importance des teneurs en N0 , est très répandue dans
3
la nature. Son intensité varie selon les conditions du milieu. Elle est bien
représentée dans les écosystèmes bien aérés par exemple: sols labourés,
boues activées. L'évidence de son existence reste problématique dans les
systèmes climaciques, les eaux polluées et certains sols acides. Dans ces
écosystèmes, la plus grande partie àe l'azote est sous forme ammoniacale.
Ces constatations rendent nécessaire l'étude de la relation qui lie
Nitrobacter et la nitrification. Il est
important pour aborder cet aspect
de connaître la physiologie et le comportement du microorganisme et de con-
naître sa niche écologique.
En fait, notre méconnaissance des lois régissant le développement et
la survie de ces microorganismes dans leur environnement est liée à l'in-
suffisance des techniques. Les méthodes traditionnelles utilisées en éco-
logie ne sont pas applicables à ces microorganisnes du fait de leur petite
taille.
A l'heure actuelle, les études sur le terrain sont remplacées par des
observations au laboratoire. Dans ce cas, pour rester le plus près possible
des conditions naturelles, la maîtrise de l'échantillonnage et la durée

---

-
10 -
entre la collecte et l'observation est un impératif. Les techniques bac-
tériologiques usuelles de comptage par étalement sur gelose et de comptage
~œN, à cause de leur durée, deviennent dans ce contexte inopérantes. L'inef-
ficience de ce dernier a même fait évoquer l'hypothèse d'une nitrification
hétérotrophique dans certains écosystèmes. Selon BELSER (1979) par exemple
une incubatton de sol in situ a donné 30 ppm de nitrate; le comptage HPN
4
effectué a donné 10
bactéries par gramme de sol alors que théoriquement
6
il eut fallu avoir 6 10
bactéries pour donner les 30 ppm de nitrate ; ce
8
nombre est encore plus faible que celui t~ouvé en culture pure (2 10
ger-
mes). Cet exemple montre bien que l'hypothèse de la nitrification hétéro-
trophe serait plutôt imputable aux erreurs de comptage introduites par la
méthode ~œN.
Toutefois, par des méthodes indirectes telle l'utilisation des inhibi-
teurs spécifiques de la nitratation (N-serve et chlorate); GHIORSE et
ALEXANDER (1978), MEVEL et ~ffiOUX (1981) ont pu mettre en évidence une
nitrification hétérotrophe. Le récapitulatif de FOCHT et VERSTRAETE (1977)
sur les études des souches hétérotrophes en culture pure et en conditions
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De tous ces fait, découle la nécess,{,ié (,dB' avoir des ~méthodes plus efficaces
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fluores cence (déj à appliquée en médecine ".,,""
cl'epu.i:s_L9.42~.
p'a,1 COONS in BOHLOOL
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et al., 1980) dans les études d'écologie microbïenne du sol, constitue une
avancée méthodologique intéressante. Cette technique permet une observation
et une quantification des germes moins d'une heure après la prise de l'é-
chantillon.
jl
Dans le cadre général de l'étude du cycle de l'azote dans les sols des
landes bretonnes, nos collègues se sont aperçus que les teneurs en N0 3
sont très faibles. Dans ces sols, l'ammonium représente la forme d'azote
la p lus abondante (ROZE et FORGEARD, 1980, 1982). Ces cons tatations ont
entraîné plusieurs types de réflexions dont :
- Existe-t-il une nitrification autotrophe et des germes responsables
de cette activité dans ce type de sol ?
- Quel rôle joue la matière organique apportée par les litières des
différentes espèces végétales présentes dans la station étudiée ?

---

-
11 -
Pour essayer d'apporter des réponses à toutes ces interrogations, nous
avons envisagé plusieurs types de manipulations in situ et au laboratoire.
Nous avons concentré nos efforts sur la nitratation et Nitrobacter parce ..
qu'ils sont de bons indicateurs du fonctionnement normal de la nitrification.
Etant donné que toute étude autoécologique d'un germe suppose son
obtention en culture pure, nous avons cherché à isoler une souche de Nitro-
bacter à partir du sol de la station d'étude.
Après une présentation sommaire du cadre de l'étude, nous avons exposé
dans le chapitre l
le matériel et les méthodes employés. Certaines d'entre
elles sont présentées et discutées à la lumière d'une expérimentation. La
technique de culture en milieu renouvelé a fait l'objet d'une mise au point
particulière. Elle nous a serv~ dans une grande partie de notre travail de
laboratoire.
Le chapitre II est consacré à l'étude comparative de la physiologie
de la souche isolée par rapport à une souche de Nitrobacter Winogradskyi
ATCC 25]9l~. Leur sensibilité par rapport aux facteurs de l'environnement
pH, température et leur capacité à utiliser la matière organique, ont été
explorés.
Dans le chapitre III, nous exposons les résultats de l'impact des
apports de CaCO] sur la nitrification in situ et in vitro des sols.
L'étude de l'effet litière ayant constitué l'essentiel de notre travail,
une large part lui est consacrée dans ce chapitre. Le chémostat conçu dans
le laboratoire nous a servi dans l'évaluation de l'effet litière in vitro.
~ Cette souche nous a été fournie par ~1ademoiselle Annie JOSSERJu~D.
Laooratoire de Biolof,ie des Sols de l'Université de LYON 1.
Nous lui exprimons notre gratitude.

---

CHA PIT REl
MATERIEL ET METHODES

---

-
13 -
1) CADRE DE L'ETUDE ET MATERIEL BIOLOGIQUE
A) CADRE DE L'ETUDE
La station d'étude est située dans le Hassif àe Paimpont au lieu-dit
Trécesson à 30 km de Rennes.
- Caractéristiques cliœatiques
Les températures moyennes estivales sont comprises entre 17 et 18°C.
En hiver, elles sont situées entre 7 et 8°C (fig.
1).
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Fig.
VARIATIONS DE LA TE~œERATURE MOYENNE (COURBE, EN OC) ET DE LA
PLUVIOSITE (HISTOGRAHt'fE, EN mm) A PAUœONT
(d'après ROZE et FORGEARD, 1982)
La pluviosité sur le Massif de Paimpont est de 800 à 1000 mm par an.
- Végétation
Au début de cette étude la végétation était composée par: Agrostis
setacea 4, Polytrichv~ piliferum 3, Polytrichum formosunl 2, Polytrichv~
juniperinum +, Erica cinerea l, Erica ciliaris l, Calluna vulgaris 1 ,
Ulex minor 1 , Ulex europaeus 1 , Molinia caerulea +, Carex caryophyllea +,
Betula verrucosa +.

---

-
14 -
- Sol
Le sol est de type brun acide. Il est développé sur schiste rouge
cambrien. Sa profondeur varie entre 30 et 60 cm. La figure 2 montre une
description du profil.
I~
L
_
v """'"" .......... -
-'
Litière de feuilles d'Agrostis et de Polytrics
....... '-
"- - "-" """"" ~
Horizon à structure cendreuse de couleur 10 YR 2,5/1.
Structure grumeleuse, texture limoneuse, fin chevelu
-~
racinaire dense, pas de caillou, limite inférieure nette
et horizontale. pH (H20) 4,2
- lb
Horizon de couleur 5 YR 3/2. Structure polyédrique, tex-
ture limoneuse, racines nombreuses et plus grosses, pas
de caillou, limite inférieure diffuse horizontale.
-.t()
pH (H 20) 4,4
Horizon de couleur 5 YR 4/2. Structure polyédrique,
B r texture limono-sableuse, racines rares, quelques
\\ cailloux et bloes. pH (H 0) 4,2
2
Roche mère
Fig. 2
PROFIL SCHEHATIQUE DU SOL DE LA LANDE ETUDIEE
B) MATERIEL BIOLOGIQUE
SOUCHES BACTERIENNES
Nous avons utilisé au cours de nos expériences
- une souche de Nitrobacter Winogradskyi ATCC 25391,
- une souche de Nitrobacter que nous avons isolée du sol de lande
employé pendant cette étude.
1) Enrichisseoent et isoleôent de Jitrobacter
Les échantillons de sol (70 g) sont hOQogénéisés tamisés à 2 mm,
mélangés avec 50 g de billes de verre de 4 mm.
Ils sont placés dans une colonne munie de dents intérieures pour
éviter le tassement
(schéma 1).
Une percolation est effectuée au no~r dans une enceinte à température
constante 28°C.

---

-
15 -
de verre
I~~---Colonne de percolation
Pompe à a~r
•
Coton de
verre
d'air
Réservoir de récupération
de l'effluent de percolation
Pompe péristaltique
Réservoir de
milieu de culture
Schéma 1
SYSTHlE DE PERCOLATION lJTEISE POUR L' ENRICHISSE11Ei~T DES SOLS EN NITROBACTET<

---

-
,16-
L'enrichissement de la colonne en germes nitrifiants se fait à l'laide
d'une solution de Schmidt (1973) contenant 100 ug/ml de N-N0 .
2
Après un mois de percolation, 5 g de sol sont prélevés et inoculés
dans 50 ml de milieu de culture à 1 g/l de NaN0
et contenus dans des erlens
Z
de 150 ml. Les incubations ont lieu à Z8°C.
A intervalles de temps réguliers, 0,2 ml de la suspens~on de sol sont
prélevés et la disparition du nitrite est su~v~e au réactif de Griess.
Lorsque tout l'azote nitreux a disparu,
ml d'inoculum est transféré dans
des tubes contenant 9 ml du même milieu de culture. Dix transferts succes-
sifs sont ainsi réalisés pour diminuer le maximum d'Hétérotrophes.
Après l'épuisement du nitrite au dixième repiquage, on réalise des
1
dilutions de 10-
à 10-10. Chaque dilution est ensuite ensemencée sur une
boîte de pétri contenant le milieu minéral à 0,5 g/l de NaN0
et additionné
Z
de 6 %~ d'Agar noble. Les incubations se font à 28°C et durent environ
15 Jours. Après ce laps de temps, les colonies de Nitrobacter (petites et
blanches) sont repérées, effleurées avec un capillaire stérile et trans-
férées aseptiquement dans des tubes contenant 5 ml de milieu de culture ~
0,5 g/l de NaN0 '
Z
Au bout d'une période d'incubation variable quelques tubes ne con-
tiennent plus de nitrite. Ces cultures sont repiquées dans des milieux frais
et testés pour déceler d'éventuels contaminants par ensemencement des mi-
lieux organiques complets (trypticase soja; bouillon nutritif, extrait
de levure ... ).
Si aucune contamination n'est décelée la souche est considérée comme
pure.
Les souches isolées sont conservées sur milieu liquide à 1 g/l NaN02
à ZO°C. Un repiquage sur milieu neuf est effectué tous les 15 jours.
Z) Résultats
Une seule souche a été isolée par cette technique. Elle correspond aux
2ritères d'autotrophie c'est-à-dire qu'elle ne se développe ~as sur les Bilieux
purement organiques. La coloration de la paroi montre qu'elle est gram négatif.
Dans le milieu terrestre Nitrobacter est la seule bactérie reconnue
comme pouvant former le nitrate en grande quantité à partir du nitrite
nous avons considéré la souche isolée comme étant un Nitrobacter. Nous
l'avons nommé Nitrobacter LB en référence à sa station d'origine qui est
une lande de Bretagne.
L'obtention de la souche a été très longue (9 mois) à cause de sa
faible croissance et du nombre de bactéries hétérotrophes qui l'accompagnent
sur le milieu de SCHHIDT (1973) gélosée à 6 %0' Ces dernières rendent très

---

_ 17_
délicate la manipulation de prélèvement des colonies apparues dans les boî-
tes et par conséquent leur transfert en milieu neuf pour l'obtention de
cultures pures.
La distinction en deux sérotypes, Nitrobacter Winogradskyi et Nitro-
bacter agilis, effectuée par FLIERMANS et al.
(1974), sur les Nitrobacters
provenant de divers sols, la diversité signalée par JOSSER&~D et al. (1979),
STANLEY et SCHMIDT (1981) grâce aux techniques immunologiques en microsco-
pie à fluorescence nous ont conduit à caractériser sérologiquement par
immunofluorescence la souche isolée afin de mieux discuter sa physiologie
et son comportement face aux facteurs de l'environnement.
II) TECHNIQUES DE DENOMBREMENT
A) PAR L'IMMUNOFLUORESCENCE
L'approche analytique de la dynamique des populations nitrifiantes
a longtemps été bloquée par l'absence de méthode réellement efficace et
rapide de numération. La technique des anticorps fluorescents
introciuite
?ar BOHLOOL et al.
(1974) a fait évoluer cette approc~e.
1) Principe
La technique est basée sur le fait que les anticorps fabriqués chez
un animal (Lapin)) rendus fluorescents réagissent spécifiquement avec les
antigènes (bactéries) qui ont induit leur fabrication en formant un complexe
stable et visible au m~croscope. Ainsi donc cette méthode combine à la fois
la sensibilité et la spécificité immunologique à l'observation microscopique.
La figure 3 résume les principales étapes de son application pour les
bactéries nitrifiantes.
Nous nous sommes servi des ouvrages de synthèse sur l'immunofluores-
cence de GOLD~Uh~ (1968), NAIRN (1976), FAURE (1977) pour faire le rappel
d'ordre théorique ci-après.
a) Propriétés liées au fluorochrome
Dans la fluorescence l'émission de lumière se produit pendant un ~n­
tervalle de temps très court et cesse en même temps que l'excitation. Pour
qu'un fluorochrome soit utilisable pour le mar~ge des protéines, il doit
présenter des groupements capables de réagir et d~'produire un complexe
stable avec la protéine. Il doit posséder un pouvoir fluorescent élevé.

---

Prélèvement cIe
Anticorps
Lapin ----~I 20 Illl de sang
I--~I l'urificotion du sérum 1
~
.'Inti-bactéries
,,.----------.1 . /
après
15 jours
9
Antigènes concentration
10
bactéries/ml
r - - - ~
-
lIain-marie 100°C
10 mn
'i"
Concentration sur
filtre millipore 0,454
Anticorps anti-
Anticorps onti-
Bactéries en
globuline de lapin
bactéries
culture pure
(fluorescents)
(fluorescents)
(Xl
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Cultures
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des bactéries
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Isolement
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1
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Observation et comptage
Echantlllon de sol
au microscope à
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C· ' )
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Réaction directe
~ + [~
Réaction indirecte
Fig.
3
APPLICATIONS DE LI H1NUNOFLU01ŒSCENCE EN NICROIUOLOGIE DU SOL

---

-
19 -
Il ne doit ni s'altérer pendant la conJuga~son, ni influencer les proprié-
tés immunologiques du complexe. L'isothiocyanate de fluoresceine réryonè à
ces critères.
b) Propriétés liées à la réaction sérologique
Deux méthodes sont employées en i~1uno::luores~ence ; elles sont
résulliées ~ans la fiGure 4.
- la méthode directe:
les anticorps spécifiques de l'antigène, rendus
fluorescents, sont directement placés sur les bactéries. Après l'incubation
l'excès d'anticorps est éliminé par lavage. Avantages: rapidité, risques
de réactions croisées minimisés.
-
la méthode indirecte : les anticorps spécifiques non marqués (Lapin)
sont appliqués à l'antigène. L'excès est lavé. On applique ensuite des
anticorps fluorescents antiglobulines de lapin. L'excès est éliminé par
lavage. Avantages : plus grande sensibilité ; inconvénients : durée plus
longue et augmentation risques
de réactions croisées.
2) Protocole suivi
a) Production des antigènes
Afin d'induire une réponse immunitaire satisfaisante chez le Lapin,
la suspension bactérienne injectée doit être dense (pas trop dense pour éviter
les phénomènes de tolérance). Pour les bactéries nitrifiantes, elle doit conte-
n~r
9
au moins 10
bactéries/ml (JOSSERfu~D, 1983 ; RENNIE, 1975). Ce sont les dé-
terminants de la paroi de la bactérie entière qui agissent ici comme antigène.
Pour obtenir le nombre requis de bactéries/ml il faut concentrer une grande
quantité de culture.
La culture des bactéries a été réalisée dans des fioles de Roux et
incubée à 28°C. Elles contiennent 600 ml de milieu minéral à 1,5 g/l de
N~~02 et ont l'avantage d'avoir une grande surface d'aération. Après
l'inoculation avec 50 ml de la solution antigénique mère, les fioles sont
agitées deux fois par Jour pendant l'incubation. La pureté des cultures
est vérifiée régulièrement sur du bouillon trypticase et sur gelose nutri-
tive. Au bout de 12 à 15 jours les cultures pures sont concentrées à l'aide
d'un appareil millipore sur membrane Sartorius SMN 0,45 p. Pour éviter tout
développement bactérien pendant la filtration longue et fastidieuse, du
merthiolate à la concentration de 0,001 % est ajouté à la suspension bac-
térienne. Les bactéries lavées sont reprises dans un minimum d'eau physio-
logique. Elles sont transférées dans des tubes et placées pendant une heure
à la vapeur d'eau à 100° pour inactivation des antigènes flagellaires.
Ces derniers sont en général responsables de nombreuses réactions croisées.
Avant emploi les antigènes sont conservés à -20°C.

---

Ag
+
+
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~g Q=
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3: Ac2
Ac
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1
Fig. 4
MODALITE
DE LA REACTION D'HIHUNOFLUORESCENCE (d'après GOLDMAN in FAURE et al.
(1977)
A) Immunofluorescence directe
Ag) Antigène
Ac) Anticorps
B) Immunofluorescence indirecte
Ag) Antigène
Ac}) Premier anticorps non fluorescent
Ac ) Deuxi~me anticorps fluorescent
Z

---

-
21 -
b) Préparation des antisérums
Les antisérums sont obtenus sur des lapins mâles de 3-4 mois de race
Néo-Zélandaise. Deux animaux sont utilisés par souche bactérienne. La
réponse immunitaire est induite par une série d'injections selon le pro-
tocole établi par SClli~IDT (1973) repris et corrigé par FLIERMANS et aZ.
(1974), RENNIE (1975). Le tableau 1 récapitule les différentes opérations.
Tab leau 1 : PROTOCOLE D' INJECT,ION DES SUSPENSIONS fu"ijTIGENIQUES
Quantité
Mode
Jours
Opérations
d'antigène
lf
d'injection
injectée
1
Injection
0,5 ml
LV
2
Injection
ml
LV
3
Inj ection
1,5 ml
LV
4-6
Repos
7
Injection
1 ,5 ml
LV
8
Inj ection
2
ml
LV
9
Inj ection
2
ml
LV
+ 2 ml S. C
10-15 Repos
16
Prélèvement du sang - Détermination du titre
17
Jeûne
18
Ponction cardiaque
21
Inj ection
2
ml
LV
22
Inj ection
2
ml
LV
+ 2 ml S.C
23
Inj ection
2
ml
LV
24-29 Repos
. \\
30
Détermination du t~tre
31
Jeûne
32
Ponction cardiaque
..I.V : Intravèineusedans la ve~ne mar3inale de
!'f
l'oreille
S.C : Sous cutanée
c) Détermination du titre par réaction d'immunofluorescence
indirecte
Seize Jours après la première injection un prélèvement de sang est
effectué à l'oreille de l'animal et le taux d'anticorps est déterminé par
réaction d'immunofluorescence indirecte. Le titre donne une indication
sur la richesse en anticorps spécifiques contenus àans le sérum.
Nous avons effectué une série de dilutions (1/10 à 1/2560) du sérum
de lapin. Des dépôts de suspension bactérienne de 105 cellules/ml sont

---

_ 22 _
réalisés sur les encoches de lames prévues à cet usage et fixés à la
chaleur. Quelques 80uttes des différentes dilutions du sérum sont déposées
sur les encoches. Après incubation de 30 ron, l'e~cès d'antisérum est
éliminé par lavage à l'eau physiologique tamponnée. Une goutte de sérum
de chèvre anti-globuline de lapin diluée au 1/100 e est ensuite appliquée
sur chaque dépôt. Après l'incubation l'excès éliminé, les bords èes laees
sont séchés et ces èernières sont sontêes èans la glycérine tamponnée à pH 7,6.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 2.
Tableau 2
DETERMINATION DU TITRE PAR REACTION D' IMl1UNOFLUORESCENCE INDIRECTE
~ 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560
Sérum
Anti N.W
++
+++
+++
+++
+++
+++
~+ -
Anti N B
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+
-
-
+++ Très bonne fluorescence
+ Paroi visible ma~s faible
fluorescence
++
Bonne fluorescence
- Pas de fluorescence
1
Tous les an~maux ayant un titre en anticorps au mo~ns égal à 1/640
subissent 24 heures de jeûne avant la ponction cardiaque ayant pour but de
réduire la teneur du sang en lipides. Chaque prélèvement permet de récolter
20 ml de sang.
d) Purification du sérum: précipitation des globulines
Le sang récolté est placé 1 heure à 37°C et douze heures au moins à
4°C afin d'obtenir une bonne coagulation. Après avoir été décanté, l'anti-
sérum est centrifugé 15 mn à 5000 g. Les opérations suivantes sont alors
réalisées pour précipiter les globulines :
- à 10 ml d'antisérum on ajoute 10 ml d'eau physiologique pH 7,2 pu~s
20 ml de sulfate d'ammonium 3,9 M sont ajoutés goutte à goutte. Toute
l'opération est réalisée à froid;
- après une nuit à 4°C la solution est centrifugée à 6000 g pendant
15 mn, le surnageant est rejeté; le culot de protéines est redissout dans
10 ml d'eau physiologique. Les opérations sont répétées deux fois, le culot
final est repris dans 5 ml d'eau physiologique
- afin d'éliminer le sulfate d'ammonium, la solution de protéine est
dialysée contre de l'eau physiologique à 4°C. La solution de dialyse est
fréquemment renouvelée jusqu'à ce qu'elle soit exempte de NH + au réactif
4
de Nessler ;

---

-
23-
- les globulines sont alors congelées ou conjuguées avec le fluorochrome.
e) Dosage des protéines
Dans le but d'obtenir un conjugué correct la conna~ssance de la teneur
en protéine de la solution de globuline est nécessaire. Elle détermine la
quantité optimale de fluorochrome à utiliser. La teneur en protéines des
solutions de globulines a été déterminée par la méthode LŒ.JRY et al.
(1951).
f) Conjugaison des protéines et du fluorochrome
Il faut une quantité d'I.T.C.F. de 1/50 du poids de globulines pour
obtenir un bon conjugué. L'opération conduite dans un tampon carbonate-
bicarbonate de sodium à pH 9,3 s'effectue à l'abri de la lumière à tempéra-
ture ambiante.
g) Purification du conjugué
L'excès de fluorochrome et le conjugué sont séparés en chromatographie
d'exclusion sur gel de seph~dex G50. L'eau physiologique sert d'éluant
(DETEfu'1AN, 196 7) .
h) Concentration du conjugué
Le conjugué a été concentré par dialyse à 4°C contre du carbowax
à
10% dans l'eau physiologique.
i) Contrôles des conjugués
L'utilisation de l'immunofluorescence exige la conna~ssance à la fois
du titre et de la spécificité des conjugués utilisés. Nous avons cherché à
déterminer ces paramètres sur les conjugués avec lesquels nous travaillons.
j) Titration des
anticorps
Deux modalités ont été retenues dans ce but : immunofluorescence
directe sur lames et sur membranes. Les résultats apparaissent dans le
tableau 3.
NB : la présence effective des germes dans les milieux utilisés pour le
dépôt a été vérifiée par la méthode de ZI~lliE~~.
Le tableau 3 montre qu'il y a une perte de fluorescence en passant
des lames aux filtres. Dans le cas du sérum anti N.W la dernière dilution
donnant une fluorescence compatible avec les besoins de la détection des
bactêries est 1/40 tandis qu'elle n'est que de 1/20 pour le sérum anti NLB.
Cependant tout au long de notre travail nous avons retenu la dilution 1/20
pour les deux sérums.

---

-
24-
Tableau 3
TITRATION DES llirl'ICORPS PAR IHHUNOFLUORESCENCE DIRECTE
SUR LM-fES ET SUR ~.lEMBRANES
~
1
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1 28 Oi
Sérum
sur
Anti N. \\.[
++++
+++
+++
++
++
++
-
-
lames
Anti NLB
++++
+++
++
++
+
+
-
-
1
1
1
1
sur
Anti N.W
++++
+++
++
+
-
-
-
-
1
membranes\\
Anti NLB
++++
+++
+
+
-
-
-
-
1
!
1
1
!
1
k) Test de contrôle de la spécificité des anticor~s
Tous les tests de spécificité ont été effectués sur lames. Les antisérums
N.W et NLB sont testés sur des organismes isolés ou maintenus en culture pure
au laboratoire. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4.
Tab leau 4
C&~CTERISATION SEROLOGIQUE DES SOUCHES
Souche testée
Sérum anti N.V
Sérum anti NLB
~
N•W•
\\
++++
1
.,-1
r:
1
1
g,o :~
NLB
+
++++
~
p.
,
;:; e r-------;N7~;-.t-r-o-s-o-m-o-n-a-s----rl------------i:-----------
I(\\)
0
-
-
<il
<il
Europea
I
'"d
CIl
E. coli
+
Klebsiella sp.
Actinomycète sp
(lJ
~
N. \\.J.
++++
0-
• .-1
ç::
g,o .3
NLB
1
++++
~
.u
o
p.
--~;_:_-------+-----------+------------~
H
H
Nitrosomonas
1
1
~
0
1
-
<Il
<Il
Europea
'"d
'~~ CIl
E. coli
1
• .-1
<Il
<:J
/(lJ
;~,~
• .-1
~~
Klebsiella sp.
-
1
1
'"
<:J
r - - - - - - - - - - - - t - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - i
I(lJ
1
[
~
Actinomycète sp
l
-
-
- ' - - - - - - - - - - - - - - - ' - - - - - _ - - - - - - - ! . . -_ _- - - . :

---

- 25
-
Nous obtenons une légère fluorescence entre le sérum anti N.W et la
souche isolée ; sa spécificité est plus grande par rapport aux autres ger-
mes testés. La spécificité du sérum anti NLB semble plus étroite par rap-
port à N.W. Une légère fluorescence a été observée avec E. coli. Ce sérum
a donc été passé sur un mélange de bactérie contenant E. coli, N.W,
Klebsiella (0,1 ml de chaque germe pour 7 ml d'eau physiologique) afin de
faire adsorber les anticorps non spécifiques. Les anticorps spécifiques
sont recueillis après 30 mn de contact par filtration (Protocole de
SCHMIDT (1974) adapté).
Les tests de spécificité montrent que la souche isolée n'appartient
pas au sérotype Nitrobacter Winogradskyi utilisé comme souche de référence.
D'autres tests doivent être envisagés pour voir si elle ne s'identifie pas
avec le sérotype Agilis ou un autre défini par STANLEY et SCHMIDT (1981).
Néanmoins à ce point de notre travail nous pouvons dire c~rnme RENNIE et
al.
(1977), STANLEY et SCHHIDT (1981), JOSSERAJ.\\lD et al. (1982) qu'il existe
bien dans le genre Nitrobacter plus d'un sérotype contrairement à ce qui
a été retenu par GIBBONS et al.
en 1974 dans le manuel de détermination
bactériologique de BERGEY.
Conclusion: les réactions en immunofluorescence sont spécifiques. Nous
avons en effet pu différencier les souches de-Nitrobacter entre elles,
les réactions croisées étant faibles avec d'autres microorganismes de la
même famille ou de familles différentes.
3) Application de la méthode d'immunofluorescence au comptage
de Ni trobacter
a) Technique de marquage en immunofluorescence sur membrane
de fi ltration
Les membranes utilisées (type millipore 0,45? gris) sont noircies
au nOLr Soudan. Les filtres sont laissés 24 h dans la solution (10 mg
de nOLr Soudan + 7,5 ml d'acétone + 7,5 ml H 0 distillée). Ils sont en-
2
suite rincés et conservés à 4°C.
Sur ces filtres, placés sur des appareils "Hillipore", on filtre une
quantité adéquate de culture bactérienne ou de suspension de sol (2 à 20 ml).
Les filtres sont repris et placés sur des lames porte-objet où ils
sont recouverts de deux gouttes de Gélatine-Rhodaoine
(préparée selon
les indications de BOHLOOL et SCHMIDT, 1968).
Le sérum fluorescent correspondant à l'antigène est ensuite appliqué.

---

26
Après une incubation de 30 mn les filtres sont lavés par filtration avec
de l'eau physiologique pH 7,2 et montés entre lame et lamelle dans la gly-
cérine tamponnée à pH 7,6.
La formule de calcul ci-après donne le nombre de bactéries/ml comptées
au m~croscope :
X.S.D
Nombre de bactéries par ml
s.V
avec
X
nombre de bactéries par champ microscopique
S
surface effective de filtration
s = surface du champ microscopique
D
facteur de dilution
V
volume de suspension utilisé
b) Efficacité de la méthode d'immunofluorescence dans la
quantification de Nitrobacter : étude du taux de récupé-
ration des bactéries inoculées dans un sol ou dans du
charbon actif.
Le sol séché à l'air est tamisé avant emploi.
la g de sol ou de char-
bon sont introduits dans des erlens de 100 ml et stérilisés à l'autoclave
pendant 1 h 30 mu puis inoculés avec 2 ml de suspension bactérienne et
4 ml d'eau physiologique stérile. Après 20 h d'incubation à 4°C les échan-
tillons sont traités de manière à récupérer le maximum de bactéries.
Des comptages sont ensuite réalisés par irnmunofluorescence sur filtre.
Les résultats portés dans le tableau 5 montrent que le taux de récu-
pération est meilleur pour la souche isolée dans le cas du sol et qu'il
l'est moins pour le charbon. Pour la souche N.W la récupération est bonne
pour le charbon. En comparant les deux souches nous remarquons qu'un bon
taux est obtenu pour NLB par rapport au taux de N.W.
La quantité de bactéries récupérées se situe dans la zone de valeurs
citée dans la littérature. Ces valeurs sont généralement comprises entre
20 et 100 % de récupération (BOHLOOL et al.,
1973 ; VIDOR et MILLER, 1980
JOSSERili~D, 1983).

---

_ 27-
Tableau 5
ETUDE DU TAUX DE RECUPERATION DES BACTERIES INOCL~EES Dk1S
UN SOL OU DANS DU CHARBON ACTIF
Nombre de
Subs trat
Nombre de
Nombre de
% de
1
filtres
+
bactéries
bactéries
récupération
utilisé
souche
apportées
récupérées
Sol de lande
105
105
4
+
5,63
1 , 17
20,78
N. 'i.J
1
Sol de lande
105
105
4
+
4,62
1, 19
25,75
NLB
Charbon
105
105
4
+
5,63
1,43
25,39
N.W
Charbon
105
105
4
+
5,25
1,2
22,85
NLB
1
4) Discussion
La technique d'immunofluorescence répond bien aux exigences imposées
par une étude autoécologique. En effet en raison de la spécificité de mar-
quage et de sa sensibilité, elle permet à la fois:
- la détection et l'identification des microorganismes particuliers
au sein d'une population hétérogène;
- la localisation de ces germes dans des environnements divers
sol,
eau, racines de plantes ;
- l'évaluation d'une manière satisfaisante du n~veau de la population
de l'organisme étudié;
- un ga~n de temps lorsque l'on possède les antisérums nécessaires.
En effet 1 h suffit pour avoir des résultats contrairement aux méthodes
classiques où le délai entre l'échantillonnage et l'obtention des résultats
est d'au moins 15 jours.
Les inconvénients pour la m~se en oeuvre de cette technique sont es-
sentiellement :
9
- la nécessité de posséder en grande quantité
(10
bactéries/ml) en
culture pure le germe à étudier
- la longueur de la période de préparation des antisérums correspondants

---

-
23-
aux microorganismes en étude.
La technique d'irnmunofluorescence
est
globale (elle prend en compte
même
les microorganismes morts).Elle est donc inadaptée pour les manipu-
lations dans lesquelles le nombre de germes viables doit être pris en
considération. Elle est avantageusement remplacée par la méthode dévelop-
pée par ZIMMER}Uili et al.
(1978). Cette dernière permet une distinction
entre les microorganismes viables (coloration rouge) et les germes non
viables (coloration verte).
B) AUTRES NETHODES DE DENOHBREt-IENT
Nous avons successivement employé au cours de cette étude la méthode
de dénombrement par microscopie à épifluorescence (ZIMME&~~ et al., 1978)
et la mesure de la densité optique par spectrophotométrie.
L'épifluorescence
En épifluorescence, le microscope est pourvu d'une source lumineuse
dont l'émission en tongueur d'onde courte (ultra violet principalement}
est importante et d'une série de filtres d'arrêt ne transmettant que le
rayonnement de la longueur d'onde émise par le fluorochrome employé.
C'est ici l'objectif qui joue le rôle de condensateur (fig. 5).
FA ~Wf;pz:zf3
FE
IF
--
FS
-
p
[F : Lumière
incidente
pour la fluorescen-
c
ce.
FE: Filtre d'excitation.
FS : Miroir
dichroique
partageant [es flux.
o : Objectif.
p
: Préparation.
C
: Condenseur.
M : l'vliroir.
1T : Lumière
incidclllC
pOur
['observation
par transparence.
<11--1 T
FA: Filtre d'arrêt.
Fig. 5 : SCHE~~ D'UN DISPOSITIF UTILISANT UN ILLUNINATEUR VERTICAL POUR
L'OBSERVATION PAR FLUORESCENCE EN LUMIERE INCIDENTE (d'après PLOEM, in
FAURE et al., 1977)

---

_
29_
Ce mode d'observation est idéal pour des travaux exécutés sur des
membranes de filtration ou des préparations microscopiques épaisses.
1 ) Numération directe : méthode de ZIMHERHAN et al.
(1978)
Cette méthode couple l'action de l'INT à celle de l'Acridine orange
ce qui permet la mise en évidence des systèmes transporteurs d'électrons
par l'observation au microscope à épifluorescence. Sous l'action des
déshydrogenases l'INT est réduit en INT fcrmazan qui apparaît sous forme
de petits points rouges à l'intérieur des organismes physiologiquement
actifs tandis que les germes non viables apparaissent colorés en vert.
Dans un erlen stérile de 50 ml nous plaçons 10 ml de l'échantillon
pu~s 1 ml d'une solution aqueuse à 0,2 % d'INT.
Après homogénéisation, une incubation est effectuée pendant 20 mn
dans le noir. La réaction est arrêtée par addition de 0,1 ml d'une solu-
tion à 37 % de formaldehyde. Une partie aliquote de 0,5 à 3 ml de l'échan-
tillon traité est filtrée sur filtre nucleopore 0,1 u, préalablement no~rc~
au noir soudan. Après la filtration nous déposons sur le filtre 1 ml d'une
solution d'acridine orange. L'élimination du surplus de fluorochrome s'ef-
fectue après 2 mn de contact.
- Préparation des filtres
Dissoudre 10 mg de no~r soudan dans 7,5 ml d'ethanol pur pu~s ajouter
7,5 ml d'eau distillée. Immerger le stock de filtres nucleopores dans la
solution obtenue (24 h). Avant l'emploi rincer abondamment à l'eau distillée.
- Préparation de l'acridine orange
Dissoudre 1 mg d'acridine orange dans 10 ml de tampon phosphate pH 6,7
(6,6 uM de phosphate).
2) Mesure de la densité optique
La densité optique (D.O.) a été mesurée à 580 nm à l'aide d'un spec-
trophotomètre Jouan. Cet appareil rend compte des variations de la D.O. au
cours de la croissance de Nitrobacter.

---

- 30 -
3) Numération indirecte: dosage de l'ATP cellulaire
L'ATP a été mesuré
selon la méthode de bioluminescence décrite par LEE
et al.
(1971) et repnse par KARL et HOLM-Hfu\\lSEN (1978), KARL (1980).
Ce dosage est basé sur la mesure de la lumière émise lors de l'in-
teraction de l'ATP avec la Luciferine-Luciferase et l'oxygène de l'air.
Selon la réaction :
++
Mg
ATP + Luciferine-Luciferase
'5:"====~!J Luciferase-Luciferine 'V AJ.'1P + P'V P
Luciferase-Luciferine
AtΠ+ O
pH 7 ) Luciferase + Luciferine oxydée + CO
+
2
2
AtlP + h Il
Les échantillons de sol sont prélevés dans deux horizons.
En surface dans le A -
entre 0 et 5 cm ; dans le A -
entre 5 et 15
1 1
Cffi.
1 2
Le sol de l'horizon est prélevé dans une cuvette; les grosses racines et
les cailloux sont éliminés, puis il est homogénéisé à la main sans tamisage.
Une partie de ce sol est emportée pour être analysée (cf ëhapitre III ..
tableaux
6, 7,11,12 e~ 13), l'autre partie est mise en incubation in situ.
Les méthodes d'incubation in situ utilisées ont déjà été employées par
de nombreux auteurs (LE~ŒE, 1967 ; LABROUE et LACOMBES, 1971 ; CAJ.'1PBELL et
az.., 1974 ; ROZE et al., 1980-1982 ; HERBAUT, 1983).
Les incubations sont faites dans des boîtes de plastique de 500 ml
retournées. La partie inférieure est fermée par un tulle de nylon et les
parois latérales perforées. Nous évitons ainsi les phénomènes de lessivage
par les eaux de pluie et d'absorption par les racines des végétaux sans
créer un confinement. Quatre boîtes sont préparées par horizon et replacées

---

- 31 -
au n~veau correspondant au prélèvement. Elles sont enlevées s~x sema~nes
après la mise en place et remplacées par d'autres.
2) Dosage des nitrites et des nitrates
Le dosage des nitrites est effectué par la méthode de GRIESS-ILOSVAY
(MORRIS et RILEY, 1963).
Le dosage des nitrates est aussi réalisé par la même technique après
passage de l'échantillon à doser sur une colonne de cadmium.
III) TECHNIQUES DE CULTURE
A) MILIEUX DE CULTURE
- Milieu de culture autotrophe
Il est composé par la solution minérale utilisée' par SOfr1IDT et al.
(1973) :
NaN° 2
g
Na HP
5 g
2
04
KH P0
0,5 g
2
4
Solution de Fer-E.D.T.A.
5 ml
Solution A
ml
Solution B
10 ml
HZO distillée
q.s.p.
1000 ml
Solution de Fer-E.D.T.A.
77 mg de FeS0 , 7 H 0 + 103 mg E.b.T.A.
4
2
pour 50 ml d'eau distillée
. Solution A
2 mg de ZnS0 , 7 H 0 + Z mg de CuS0 , 5 H 0 + 2 mg Na Mo0 ,
4
2
4
2
Z
4
2 H 0 pour 100 ml d'eau distillée
2
. Solution B
0,2 g de MgS0 , 7 H 0 dans 100 ml d'eau distillée.
4
2
Milieu mixte
Il est réalisé en apportant au milieu autotrophe soit 1 g/l de pyruvate
de sodium, soit 1 g de pyruvate, du peptone et de l'extrait de levure à rai-

---

- 32 -
son de 1,5 g/l chacun, soit en apportant seulement du peptone et l'extrait
de levure.
- Hilieu chimioorganotrophe
Il est composé par le milieu autotrophe sans nitrite additionné de
g/l de pyruvate de sodium, de peptone et d'extrait de levure 1,5 g/l
chacun.
B) SYSTErŒS DE CULTURE
1) Système clos ou "Batch"
Les cultures sont effectuées dans des erlens de 500 ml contenant 100 ml
de milieu minéral (à 150 ug N-N02/ml) ou organique à ra~son de trois erlens
par souche. L'incubation est effectuée à 28°C à l'obscurité. Des parties
aliquotes de 2 ml prélevées aseptiquement permettent de suivre la crois-
sance bactérienne et la disparition des nitrites.
2) Système ouvert : le Chémostat
a) Expression de la croissance
La variation de l'effectif (N) d'une population de microorganismes
est proportionnelle à cet effectif d'où l'équation différentielle:
dN
dt
)l N
où ~
est le coefficient d'accroissement
La population croît donc d'une manière exponentielle:
N(t) = No~t
où N(t) est le nombre d'organismes au temps t
No
est le nombre d'organismes au temps t = 0
Cette relation suppose que dans les conditions optimales toute cellule
donne naissance à des cellules filles viables sans modifier la croissance
et les possibilités de survie de la population.
Cette hypothèse a été utilisée par MONOD (1950) pour décrire la cro~s­
sance bactérienne. Elle est actuellement universellement admise pour su~­
vre l'évolution des microorganismes. Cependant la plupart des chercheurs
préfèrent utiliser la variante :

---

-
33-
rt
N = N02
qui découle du phénomène de division par bipartition.
r est ici égal au taux de croissance c'est-à-dire au nombre de divisions
. - d
L
N
par un~te
e temps:
og
N
i 0
Log N - Log No
r
t Log 2
La relation qu~ lie r et p
(taux népérien de croissance) est
.ut
N
Noe
N
N ?rt
0_
N
Log No
pt
N
Log No = rt Log2
b) Le chémostat
~ Critères de choix du chêmostat
Pendant l'enrichissement des sols (voir techniques d'enrichissement
et d'isolement de Nitrobacter) nous avons vu que le système d'étude en
colonnes n'offre ni la possibilité d'un dénombrement immédiat des germes
ni la vérification de leur qualité ni encore celle de contrôler l'homo-
généité du milieu. Selon Mc LAREN (1971), SAUNDERS et BAZIN (1979), le
développement des microorganismes en colonne est en relation avec leur évo-
lution en profondeur dans la colonne, le débit et le mode de percolation
d'où une grande hétérogénéité.
A cause de la possibilité qu'offre le chémostat de contrôler le taux
de croissance (habituellement variable du temps), d'obtenir des cellules
dans un état physiologique stable nous l'avons adapté pour étudier et mettre
en évidence l'influence réelle de la concentration en nitrite du milieu et
des différentes litières sur le comportement physiologique de Nitrobacter.
!Ct
Principe
Considérons une cuve contenant un volume fixé de culture V, vigou-
reusement agitée pour assurer l'homogénéité de la suspension cellulaire. Un
apport continu de milieu neuf contenant un seul substrat limitant S est
réalisé à vitesse fixe parallèlement à une évacuation au même taux par un sys-
tème Qe trop plein (s~héma 2). -Le milieu frais est ins~antan2ment mélangé et une
partie est consommée pour produire une nouvelle biomasse qui a une concen-
tration X.

---

-
34 -
Pompe à air
Cuve de
culture
--_ ........
- - - . . . . _
l,
-
--'.
./
-
-
----
-
- --..,
------ -----
--
Pompe
- .
péristaltique
t
L,
__I"
Réservoir de
Systême d'agitation magnétique
récupéracion
de l'effluent
Réservoir de ;
milieu de
culture

---

-
35 -
Un état d'équilibre s'instaure en fonction des conditions de l'envi-
ronnement. Dans un tel système les microorganismes peuvent se multiplier
indéfiniment s~ aucun changement n'intervient dans les conditions e~péri­
mentales.
Le maintien d'un tel équilibre ex~ge
- une bonne agitation pour éliminer les gradients de concentrations,
b
1 " .
1
dX
( ,
- un su strat
~m~tant te
que
dt = f
S)
- un flux inférieur au taux de croissance des cellules)
- l'existence dans le milieu d'une majorité de germes physiologiquement
actifs.
Les équations d'équilibre des cultures en chémostat sont basées sur
la conservation des masses. Des relations peuvent être établies entre le
taux de croissance p, la biomasse X, la concentration en substrat S et
le taux de dilution D. Les premières théories sur le chémostat ont été
émises par MONOD (1950), NOVIGK et SZIL~RD (1950 a et b). Ces dernières
ont été corrigées et complétées par HERBERT et al.
(1956), TEMPEST et
HERBERT (1965), TE~œEST (1970), PIRT (1975) .
. Biomasse, croissance et taux de dilution
Le taux de croissance spécifique des microorganismes dépend de la
concentration en substrat limitant, de la vitesse d'apport du milieu nu-
tritif et du facteur de dilution D établi lors de sa dispersion dans la
cuve deculture.Elle est donc fonction du rapport
F
D
(h -1)
V
avec V
Volume de la culture
F
Vitesse d'apport du milieu nutritif
qui est égal à la vitesse d'évacuation
. Influence sur la biomasse
Dans la cuve de culture simultanément les microorganismes se dévelop-
pent et sont entraînés par le flux du milieu. L'équation ci-après représente
le transfert de la biomasse ~
Augmentation de biomasse = Croissance - Evacuation
Pendant un intervalle de temps très court (dt) cette équation devient
pour l'ensemble de la culture V :
V dx = V.Y.X.dt - F.X. dt
F
En divisant tous les termes de l'équation par V et en remplaçant V par sa
valeur D nous obtenons
dx
Yx - DX
dt

---

-
36-
dx
dt
(P - D) X
si
dx
~ P <D, dt <0 et X décroît avec le temps
dx
? P >D, dt
>0 X croît avec le temps. Cependant dans les conditions
fixes du chémostat, la population tend à s'auto-
stabiliser en fonction du facteur limitant. A
l'équilibre la densité cellulaire dans la cuve de
culture est constante et p apparent s'ajuste au
taux de dilution. On peut alors écrire
l , -
. l' b
dx
0
~ \\;
D
equ~ ~ re dt
?
~ =
dx
D,
dt
0, X reste constant au cours du temps
Substrat limitant, taux de croissance, taux de dilution
L'équation de conservation des masses pour le substrat limitant peut
s'écrire:
Vitesse de changement
Vitesse d'arrivée - Vitesse de
- Vitesse de con-
-,.
de S
du mi lieu frais
sortie de S
sommation par X
Pour un iutervalle de temps bref (dt) et pour l'ensemble de la culture
nous pouvons écrire :
V ds
F. SR.dt - F.S - V.p.X dt/y
avec SR
concentration en substrat limitant dans le milieu d'alimentation
S
= concentration résiduelle en substrat limitant à l'équilibre
y
rendement de cro~ssance
F
En divisant par V tous les termes de l'équation et remplaçant V par
sa valeur D :
ds
dt
D (SR - S) - PX/y
si
'4<).1> D, ~< 0, S décroît
dt
1ft )J <D, ds >0, S croît
dt
ds
lj! )J =
D,
0, S est constant
dt
Lorsque p est égal à D et ne var~e pas avec le temps, la culture at-
teint un état d'équilibre simultanément pour la concentration en m~cro­
organismes et pour la concentration en substrat limitant, d'où:

---

-
37 -
ds
dx
0
D (S
- S)
PX/y
dt
dt
==9
R
X = Y (S
- S)
R
Ainsi la biomasse est fonction du rendement de croissance et du substrat
limi tant utilisé.
S
Ln2
D'autre part
D
P = y max: KS + S
-r
Les difficultés rencontrées dans la m~se en oeuvre de cette technique
résident essentiellement dans la maîtrise :
- du taux de dilution de sorte que la culture ne soit pas lavée,
- de l'agitation pour assurer la meilleure homogénéisation de la
culture.
Les avantages de la méthode sont multiples :
- la possibilité de travailler à des taux de croissance,
- le maintien de conditions stables pendant la période d'expérimentation,
- la présence dans le milieu à l'état d'une majorité de germes viables,
- la possibilité de l'étude des réponses des microorganismes' aux
contraintes de l'environnement par la facilité d'introduction de
variations du substrat, du pH, de la température, la tension
d'oxygène,
- la possibilité de réaliser des études de toxicité avec des métaux
lourds, des extraits de litières ...
C) MISE AU POINT D'UN DISPOSITIF EXPERIMENTAL
1) Modifications apportées au chémostat
Pendant la préparation des antigènes (méthode d'immunofluorescence)
nous nous sommes aperçu que le nombre de bactéries obtenu par millilitre
de milieu était faible. Nous avons cherché à pallier à cet inconvénient
en augmentant la surface de contact offerte aux bactéries pour leur
multiplication.
Pour ce faire, nous avons m~s dans le chémostat un support solide.
Nous avons cherché à nous replacer de cette manière dans les conditions
aussi naturelles que possible pour voir si le support avait un rôle dans
les phénomènes de toxicité des litières.
Mais compte tenu de la théorie du chémostat et de son fonctionnement,

---

-
38-
pour empêcher le lavage du support, il a fallu apporter une modification
en plaçant dans la cuve de culture un verre fritté. Le but de cette opé-
ration est d'obtenir deux chambres communicantes dont l'une puisse contenir
un support solide. Le verre fritté a été choisi de sorte que seules les
bactéries puissent le traverser (fig. 6).
2) Expérience préliminaire
vérification de l'établissement des
états d'équilibre
Nous avons voulu vérifier si les équations du chémostat son compatibles
avec la modification introduite. Pour ce faire, la cinétique d'apparition
du nitrate a été suivie pour différentes concentrations de nitrite dans la
réserve et ce, jusqu'à l'chtention de l'équilibre. L'expérimentation a été
menée pour un même p.
F
h-1
En considérant D = V = Y = 0,010
, nous constatons que pour un même
y, le taux de nitrification est fonction de la concentration en N-N02
apporté dans le milieu.
L'équilibre se déplace en faisant passer la concentration de 18 à 65)1g
N-N0 2!ml (fig. 7).
L'obtention de ces équilibres montre que l'introduction du verre fritté
n'entraîne aucune modification dans· le fonctionnement du chémostat.
Le maintien d'une proportion constante de cellules viables étant une
~
condition essentielle à l'établissement des équations du chémostat, ce point
a été contrôlé dans les deux parties de la cuve par la méthode de ZIMMER}~
(1978). Nous avons pu observer une majorité de germes viables dans les deux
cas.
La stérilité de la culture obtenue avec ce chémostat se maintient assez
longtemps (16 à 25 jours) pour permettre des études plus poussées de
Nitrobacter.
~
Ce chémostat conçu dans le laboratoire ayant donné des résultats satis-
faisants, nous l'avons urilisi ~our la suite du travail.
Le volume de la cuve de culture est de 1,6 1. L'4gitation e3t réa-
lisée grâce à un système d'agitation magnétique. L'aération est obtenue à
partir d'une pompe (RENA 301) reliée à un système de filtre stérile.
L'alimentation en milieu frais est effectuée à l'aide d'une pompe péris-
taltique à débit variable.
Le chémostat est placé à l'obscurité dans une enceinte dont la tempé-
rature est maintenue à 28°C.
Le nitrite par sa concentration dans le milieu de réserve constitue le
substrat limitant. '"

---

_ 39_
Sortie d'air
~Tube servant à introduire
combinée à la
1
l'inoculum
sortie de la
~
culture par
trop plein
Tube servant à introduire
le milieu neuf
Entrée d'air
Verre frittê
_.
Système de prélèvement
des échantillons
~-4+-_Barre maenétique
Agitateur magnétique
o
Fig. 6
SCHEHA DU DISPOSITIF UTILISE POUR LES ETUDES EN CHHI0STAT

---

H-N0
ug/ml
3
0° 28°C
70
~ (2)
60
50
40
30
l (1) :
~
o
1
20
.
n
al
.. 'tl
C
3
~ -
t
10~
1 \\
;,
0
- ..'-. "".-;'"
2
L
!~
I 8
72
96
120 14'4
168
192
2'16
240 264
288 J 1'2 336 360 38'4 L 08
I
432
45'6
LI 80
564
528 55'2 5 76
T~mps
°
h-I
Fig.
7
CHANGE!'iENT DU TAUX DE NITRIFICATION DANS UN CHEHOSTAT CONTENANT NITROBACTER HAINTENU A UN TAUX DE DILUTION DE 0,01
1) l.a culture est d'abord alimentêe avec lme solution de 20 ug N-N0 /ml jusqu'à l'~tat d'équilibre.
2
Au moment iqdiquê par la fêche (1) la concentration de réserve est portée â 65 ug,N-N0 /ml
2
2) La deuxiême flêche (2) indique le moment oa la concentration de rêserve est ramenêe à 18 ug N-N0 /ml
2

---

CHA PIT REl l
CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE DES SOUCHES DE NITROBACTER

---

1) ETUDE DE LA CROISSANCE
Elle a été effectuée en milieu clos et en milieu ouvert.
A) CROISSANCE EN MILIEU FEFJ.1E
Nous avons suivi la densité optique du milieu de culture en fonction
du temps. Elle traduit l'augmentation de la biomasse bactérienne. Elle nous
a permis de calculer la valeur du taux de croissance usuel de chaque sou-
che, selon la formule :
Log,N - Log No
r
t Log 2
Nous avons pour ce faire utilisé les paramètres de la figure 8 et
l'équation ci-dessus.
Nous avons considéré :
No égal à la D.O. minimale prise pendant la phase exponentielle de
croissance correspondant au temps t 1
N
égal à la D.O. maximale prise pendant la phase exponentielle de
croissance correspondant au temps t 2
t
égal à t
- t
en heure
2
l
Les valeurs de r sont calculées ci-àessous
• Pour la souche N.W
No
0,015
N
0,032
t
72
Log 0,032 - Log 0,015
soit i
r
0,0151
72 Log 2
• Pour la souche H.LB
No
0,013
N
0,030
t
120
Log 0,030- Log 0,013
soit r
r
0,0101
120 Log 2

---

-
43-
X10- 3
a
D.
•
30
1
«
25
0-- -0 souche N. W
e - --@ souche NLB
20
/
15
la
a
@
5
2
3
5
6
7
8
9
la
jours
Fig.
Cl
U
CINETIQUE DE CROISSAJ."lCE DE NITROBACTER EN HILIEU LIQUIDE
Température d'incubation 20°C
Milieu minéral à 200 pg N-N0 /ml contenu dans erlen de 500 ml
2
100 ml de milieu
Les points de la courbe représentent la moyenne des 3 valeurs

---

-
44-
B) CROrSSAi'iCE EN HILIEU OUVERT
Nous nous sommes serv~ de la =elation
)J
r Log Z
et de la valeur de r calculé ci-dessus pour évaluer le taux népérien de
croissance p. Ce dernier nous a permis de fixer le taux de dilution utilisée
pour les études en chémostat. En effet
)J
F
D
avec F
Flux
V
V
Volume de la culture
Nous obtenons a~ns~
• Pour la souche N.W
)J
r Log Z
r = 0,0151
JJ
0,0151 Log Z
)J
0,0105
Dans les cultures en chérnostat le taux de dilution à utiliser sera
donc
D
a OlOsh-l
,
lfr
Pour la souche NLB
)J
r Log Z
r = 0,0101
)J= 0,0101 LogZ
)J= 0,0059
Nous utiliserons donc pour les cultures en chémostat un taux de
dilution :
h 1
D
°,0669 -
II) ETUDE DE LA TRANSFORMATION DU NITRITE
La cinétique d'utilisation du nitrite par les souches de Nitrobacter
a été suivie en milieu clos et fermé. Elle nous a permis de calculer l'ac-
tivité spécifique des souches dans ces deux systèmes de culture.

---

- 45 -
A) CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE EN HUlEU FERME
Elle est différente selon la souche. Elle est relativement rapide pour
la souche N.W. Tout le nitrite est transformé en 156 heures.
La souche NLB oxyde plus lentement le nitrite. Ce dernier est totalement
utilisé au bout de 216 heures.
Tous les résultats sont portés sur la figure 9.
B) DISCUSSION
Nous avons obtenu un taux de cro~ssance différent pour les souches de
Nitrobacter. Dans les conditions expérimentales utilisées, la vitesse de
croissance de la souche N.W est plus grande que celle de la souche isolée.
Cette différence est confirmée au niveau du métabolisme du nitrite. En effet
les cinétiques d'utilisation du substrat sont nettement différenciées; la
souche N.W utilise tout le nitrite en six jours tandis qu'il en faut neuf
à la souche NiB.
Par transformation semi-logarithmique de la fonction S
f t ) ,
nous avons :
ds
qs
dt
ds
qdt
s
ds
qdt
s
Log S ~ qt + Log Sa
S
Log Sa = qt
S
qt
e
Sa
q est assimilable au taux de cro~ssance pendant la phase exponentielle.
Nous remarquons que la consommation du nitrite par Nitrobacter est liée
à la croissance. De l'équation ci-dessus nous pouvons calculer le taux de
croissance q (équivalent à r) de la bactérie en milieu clos. La valeur
trouvée par cette méthode est très proche de celle obtenue par le calcul à
partir de la DO. Il est donc possible par ce biais de calculer le taux de
crois&ance de deux manières.
C) CALCUL DE L'ACTIVITE SPECIFIQUE
Nous nous so~mes serv~ des résultats de la figure 10 pour calculer
l'activité spécifique.

---

-
46-
N-N0
mg/l
2
200
souche isolée
100
souche N.H
50
20
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 1
12
13
Jours
Fig.
9
CINETIQUE D'UTILISATION DES NITRITES EN MILIEU LIQUIDE PAR NllROBACTER
Température d'incubation 28°C
Milieu minéral à ZOO pg N-NOZ/ml contenu dans erlen de 500 ml
100 ml de milieu par erlen (3 erlens/souche)
Les points de la courbe sont des valeurs moyennes de 3 valeurs de
chaque prélèvement

---

-
47-
A
Nombre de
N-N0
en pg/mt
bactéries/ml
2
250
5
230
210
6
10
190
170
150
5
130
110
90
70
50
5
30
10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Il Jours
Fig.
10
CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE ET EVOLUTION DU
NmmRE DE NITROBACTER IHNOGRi...DSKYI EN CULTURE PURE
EJ)--@ courbe
d'oxydation du ni tri te
*-----* courbe d'évolution du nombre de bactéries
La culture est effectuée dans une fiole de Roux avec
GOa ml de milieu liquide contenant 250 pg de N-NO?/ml
La teQpérature d'incubation est de 28°C
Les points de
la courbe représentent la moyenne de 2 valeurs

---

-
48-
Cette dernière est égale à la quantité de produit formé par cellule
et par unité de temps. Le produit formé doit être obligatoirement lié à
la croissance microbienne.
Dans le cas présent, il est généralement admis que l'utilisation du
nitrite et la production du nitrate sont couplées à la croissance bacté-
rienne Hc LAREN (1969, 1971, 1973).
En considérant qu'une molécule de N0
donne par transformation m~cro­
2
bienne une molécule de N0 -, il est possible de calculer l'activité de
3
Nitrobacter en utilisant l'une ou l'autre quantité de composé mesurée dans
un intervalle de temps très court (avec un nombre de cellules connu).
+ En milieu fermé
Nous avons utilisé la formule
dP
q N
dt
P
dP
avec
activité spécifique
N dt
changement de la concentration en
produit formé en fonction du temps
N
nombre de cellules pendant l'intervalle
de temps considéré
dP
1.427
ug N
dt == 1 H
6
N
== 4,768
10
-6
qp
0,2993 10
pg N/cellule/heure
Nous divisons le tout par 14 (Poids moléculaire de l'azote) afin
d'obtenir le résultat en pH/cellule/heure. Nous obtenons:
qp == 0,021 pM.N/cellule/heure
+ En milieu ouvert
La formule employée est la suivante
dP
q N -
DP
avec
dP
variation en fonction du temps de la
dt
p
dt
concentration du produit formé
qp
quantité de produit formé par cellule
et par unité de temps
N
nombre de cellules pendant l'intervalle
de temps. Dans ce cas c'est le nombre
de cellules lorsque le système est à
l'état d'équilibre
DP
quantité de produit formé évacuée du
système

---

-
49-
A l'état d'équilibre
dP
dt
°
D
taux de dilution
q N - DP
P
° DP
soit
en remplaçant s par sa valeur y
qp
N
Nous obtenons :
qp
P
192,5 ).lg N/ml
h 1
u
0,0105 -
6
N
6 10-
bactéries/ml
192,5 x 0,0105
qp
6 10 6
-6
0,144375 10
~g N/cellule/heure
qp
Nous divisons ce chiffre 14 (Poids moléculaire de l'azote) pour ob-
tenir le résultat pM.N/cellule/heure
qp = 0,024 pM.N/cellule/heure
Nous avons voulu, en nous servant des données de la littérature, cal-
culer l'activité spécifique théorique de Nitrobacter.
D'après le Bergey's Manuel (1974) le volume d'un Nitrobacter est sen-
siblement égal à 1 p3, si nous considérons que sa densité est de l, le
-9
poids humide de cette bactérie sera de 1 10
mg. Ce dernier est composé
de 15 % de matière sèche. La moitié de celle-ci est constituée de carbone.
Toutes ces considérations nous permettent d'avoir le poids en carbone d'une
cellule de Nitrobacter selon l'équation:
Poids en carbone
Poids humide x Pourcentage de matière sèche x Pourcentage
d'une cellule
en carbone
15
50
P
ma
o
x 100 x 100
P
7,5 1o-II mg de carbone
Selon ALEEN (1970) la production de 12 mg de carbone demande l'oxyda-
tion de II à 13 moles de N0
' 3 ATP et 2 NADH. La figure II donne le dé-
2
tail du métabolisme du nitrite chez Nitrobacter.
Nous pouvons, connaissant le poids en carbone d'une bactérie, calculer
le nombre de Nitrobacter nécessaire à l'obtention des 12 mg de carbone.
Poids total en carbone
Nombre de bactéries
Poids en carbone d'une bactérie
12
N
7 , 5 10- 11
11
N
1,6 10
bactéries

---

! 1 NOZ- 7+
+
17.5 Kcal
A.
Production d'énergie au cours de l'oxydation de NO - en ~03­
Z
par Nitrobacter. 1 mole d'oxygène est consommé pour produire
1 ATP (PlO = 1)
c)( Cyt B \\~p flavo)( 1NADHZ + 34 Kcal
1co<", oh'"~~;;: 1;NAD' , 2H'
ATP
ATP
ATP
B.
Formation Gu pouvoir réducteur chez Nitrobacter
Fig.
Il
~ŒCfu~JSME DE PRODUCTION D'ENERGIE ET DE FOR}~TION DU POUVOIR
REDUCTEUR AU COURS DE L'OXYDATION DE N0
en N0
PAR NITROBACTER
2
3
(d'après ALEE1'f, 1968)
L'ol~~ation de 12 moles de N0
par Nitrobacter exige au rn1n1mum 20 heures.
2
En nous basant sur tous les facteurs: nombre de bactéries, quantité de subs-
trat oxydé et temps d'oxydation du composé, nous pouvons évaluer l'activité
spécifique théorique de Nitrobacter. Pour ce faire nous utilisons l'équation
P
qp
Nt
9
12 10
prIN
1,6 1011 x 20
0,0038 pM.N/cellule/heure
D) DISCUSSION
Les activités spécifiques obt~nues en milieu fermé sont relativement
proches de celles enregistrées en chémostat. Elles sont de l'ordre de
0,021 pM.N/cellule/heure pour les cultures en milieu fermé et de 0,024 pM.N/
cellule/heure en milieu renouvelé. Dans ce dernier, la majorité des cellules
est viable et physiologiquement active. Ce fait peut expliquer l'amélioration
de la valeur de l'activité spécifique dans ce mode de culture. Les valeurs
trouvées ne s'éloignent pas trop de celles contenues dans la littérature
(YOSHIOKA et t'Xl., 1982; BELSER, 1979).

---

51 _
En comparant les valeurs des activités spécifiques citées ci-dessus
avec celle du calcul théorique que nous avons effectué, nous remarquons
qu'il existe une différence de 0,020 pM.N oxydé en surplus par cellule.
AinsilQ.SO % de l'azote oxydé servirait non pas à la croissance mais à
produire l'énergie nécessaire à la biosynthèse des composés et à la main-
tenance de la bactérie. Ces faits sont une explication possible de la
difficulté d'obtenir en culture des biomasses importantes. Ils explique-
raient aussi les faibles densités de populations nitrifiantes observées
3
4
dans les sols (10
à 10
bactéries/gramwe de sol dans les sols agricoles
non fertilisés, PROSSER et aZ., 1982).
Dans le milieu fermé, l'oxydation du N-N0
est utilisée à la fois pour
2
produire une nouvelle biomasse carbonée et pour produire l'énergie néces-
saire à la maintenance de l'intégrité de la bactérie. Mais dans ce milieu
les cellules n'ont pas toutes le même taux de croissance, par conséquent
~as la même activité métabolique. L'activité spécifique trouvée dans ces
conditions est donc une valeur moyenne. Il est donc difficile d'évaluer
correctement l'énergie de maintenance dans ce milieu.
En milieu ouvert, toutes les cellules ont un même taux de croissance.
Par conséquent, chacune d'elles est capable d'une activité décelable. C'est
donc avec cet appareil qu'il faudrait rechercher l'énergie de maintenance.
III) INFLUENCE DU pH ET DE LA TE~œE~~TURE SUR L'ACTIVITE NITRIFlill~TE
A) INTRODUCTION
Les interrelations des facteurs de l'environnement affectent d'une
manière très sensible les processus microbiologiques d'oxydation du,nitrite
dans le sol. D'une manière générale, le pH et la température sont souvent
prlS en considération pour l'appréciation de l'activité nitrifiante.
Le pH, de l'avis de la plupart des auteurs, est l'un des facteurs
limitant la nitrification. Certains auteurs (BOON et aZ., 1962 ; ALEXN~­
DER,
1958) ont défini à la lumière de leurs travaux, une limite de tolé-
rance et un optimum compris entre 7,5 et 8,5 compatibles avec la crois-
sance des nitrificateurs.
La température a une grande influence sur le métabolisme des mlcro-
organismes. BOON et LAu~ELOUT (1962) en ont montré l'importance sur la

---

-
52-
consommation d'oxygène par une culture pure de Nitrobacter \\vinogradskyi.
Les auteurs ne sont pas unanimes à propos de ce facteur de l'environnement
Néanmoins dans le sol l'optimum serait situé entre 28 et 35°C. La nitrifi-
cation serait nulle en deçà de 4°C et au-delà de 45°C. Les températures
choisies pour notre travail tiennent compte à la fois de la température
moyenne du sol pris comme modèle et des données de la littérature.
Nous avons cherché à mettre en évidence des optimums physiologiques
différents en fonction du pH et de la température pouvant traduire une
adaptation des bactéries en notre possession à ces facteurs.
B) PROTOCOLE EXPERIHENTAL
Il s'agit pour nous de vo~r si les facteurs pH et température sont sus-
ceptibles d'expliquer l'activité physiologique et l'évolution quantitative
des populations bactériennes introduites dans un milieu. Pour cela, il coa-
vient de se placer dans des conditions aussi proches que possible de celles
rencontrées dans le sol. Nous avons, dans ce but, utilisé le milieu minéral
préconisé par scaMIDT (1973). L'ajustement des pH s'effectue par l'équilibre
de la solution tampon phosphate (NaHP0 -KHP0 ) pour les pH entre 7 et 8,
4
4
avec de la soude NilO pour les pH supérieurs à 8 ou avec de l'acide chlorhy-
drique NilO pour les pH inférieurs à 7. Après stérilisation à l'autoclave,
les milieux inoculés soit par la souche N.U, soit par la souche N Sp sont
incubés à trois températures différentes : 15°C, 23°C et 28°C.
Au temps zéro un comptage des bactéries viables dans le milieu est
effectué par la méthode de ZIMMER}Uu~. Le même type de dénombrement est à
nouveau réalisé après 144 heures d'incubation.
C) RESULTATS
Les résultats notés sur la figure 12 montrent une rapide utilisation
des nitrites en passant des pH acides aux pH légèrement basiques avec un
optimum à pH 7,6.
L'activité de la souche N.W est inexistante aux pH extrêmes
en-dessous
de 6,3 et au-dessus de 9,5.
Les performances des activités enregistrées à 15°C sont toujours infé-
rieures quel que soit le pH à celles observées à 23°C et 28°C. La meilleu-
re activité est observée pour les températures les plus élevées.

---

-
53-
~ 70 de N-N02 utilisé après
144 h d'incubation par
50
rapport au N-N02 de départ
o NLB
D
N. H.
25
f:-:-o
1·· ,
100
r:=
r- ::
r-- :.
75
..
~ ..."
50
-
25
n
r:
...
...
100
r--;
75
- :
50
25
n
.....
5 ,5
6,3
6,6
7
7,6
8,5
5 pH
9,
Fig.
12
IFFET DE LA TEMPERATURE 1T DU pH SUR L'ACTIVITE NITRIFIfu~TE DE NITROBACTER
Les cultures sont réalisées dans des erlens de 500 ml contenant 100 ml
de milieu à 200 ug de N-N02/ml
Les histogrammes représentent la moyenne de quatre valeurs

---

-
54-
La souche NLB montre la même tendance en ce qui concerne le pH. L'ac-
tivité maximale se situe aussi autour du pH légèrement basique de 7,6. La
souche s'avère sensible aux pH en-dessous de 6,3 et au-dessus de 8,5.
L'activité de la souche N LB qui n'est que de 50 % à 15°C pour l'optimum
de pH, augmente d'une manière significative aux fortes températures. La
performance la plus élevée (92,5 % d'activité) est enregistrée à 23°C.
Pour les températures de 23°C et 28°C une très faible activité de la souche
N LB est perceptible à pH 5,5.
Les comptages des bactéries ont été réalisés uniquement pour la tem-
pérature de 28°C. Les résultats présentés dans la figure 13 montrent que
le nombre de bactéries viables en fin d'expérience est faible ou nul pour
les valeurs de pH comprises entre 5,5 et 7. A pH 7,6 nous retrouvons la
totalité des bactéries mais cette proportion décroît rapidement pour n'être
que de 23 % pour N.W et 1,35 % pour N Sp à pH 9,5.
D) DISCUSSION
La souche NLB isolée apparaît dans les études au laboratoire très
sensi~~e au pH du milieu. Plusieurs auteurs l'avaient déjà constaté avec
la souche N.W notamment MEYEROF (1916), Mc LAREN et SKIUJINS(1963).
Le taux d'oxydation du nitrite devenait négligeable à pH 5-6,5 ; EOON et
LAUDELOUT (1962) n'ont pu mettre en évidence une consommation d'oxygène à
des pH inférieurs à 6,4 ou supérieurs à 8,5. Les mêmes effets sont rap-
portés par BAZIN et al.
(1982), JOSSERA"{D (1983) et GAY (1983). Tous notent
que l'activité nitrifiante a lieu principalement aux pH alcalins ou neutres.
Nous avons m1S en évidence ce phénomène au cours de notre travail. Cependant
PM~G et al. (1975) ont trouvé une nitrification dans un sol à pH 5,4 ;
LOSSAINT et ROUBERT (1964) observent une bonne nitrification à pH 4,9.
D'autres auteurs tels VAN PRAAG et ~1ANIL (1965), BRAAR et GIDDENS (1968),
LEMEE (1967), HEIL~UU"{ (1974), RENNIE et SCfu~IDT (1977) ; SARATCHfu"{DRA (1978),
WALKER et WICKRM1ASINGHE
(1979), JOSSERfu"{D et BARDIN (1981), ROZE et
FORGEARD (1980-1982) ont parfois constaté une production relativement
importante de nitrate en sol acide. Il est à noter que nous avons obtenu
une activité nitrifiante certes m1n1me à pH 5,5 traduisant une adaptation
de la souche à ce facteur. Ceci va dans le sens de Mc HARNESS et Hc CARTY
(1973) qui ont noté que les bactéries nitrifiantes pouvaient opérer avec
un maX1mum d'efficience d'une manière régulière à pH bas si elles ont été

---

- ,55 -
~~ Quantité de bactéries
retrouvées en fin d'expérience
par rapport au nombre de départ
o NLB
ON. IV.
100
~Tl•o.~
75
50
25
~
n
1'"
..~ ~
1
. . .
5,5
6,3
6,6
7
7,6
8,5
9,5
Fig. 13
INFLUENCE DU pH SUR LE NOUERE DE NITROBACTER
INCUBE A LA TEMPERATURE DE 28°C

---

~r
-
::JO-
maintenues longtemps à un pH acide.
Les différences observées dans les taux d'utilisation du nitrite peuvent
s'expliquer aussi par la différence dans les populations nitrifiantes à ces
différents pH. L'augmentation de la nitrification obsèrvée à pH 7,6 reflète
l'accroissement du nombre de bactéries. La baisse du nombre de bactéries
observées lorsque l'on passe de pH 7,6 à pH 5,5 ou pH 9,5 est essentiellement
due à une diminution graduelle de la proportion du nombre de bactéries via-
bles dans la population globale.
L'amplitude de la nitrification est gouvernée par la température d'in-
cubation. Les tests ont montré que la température idéale de la nitrifica-
tion est de 23°C par la souche NLB. KJ.'WHLES et al..
(1965), JOSSERAJ."lD (1983),
ADDISCOTT (1983) ont des résultats similaires au cours de leurs travaux.
Vues les températures moyennes qui règnent dans le sol utilisé, il ne serait
pas hasardeux d'affirmer que cette souche est mieux adaptée aux basses
températures. D'ailleurs selon r~ENDRAPPA et al.
(1966), ANDERSON et al.
(1971), MONIB et al.
(1979) les conditions climatiques de l'aire d'origine
du sol déterminent l'intervalle et la température optimale de croissance
des bactéries nitrifiantes. Ils affirment en outr·e "Les bactéries sont
acclimatées au régime de températures de leur aire".
Les températures de 23°C et 28°C semblent conven~r à la fois à la
souche N.W. Elles se situent dans l'intervalle de 28 à 35°C généralement
admis comme zone optimale d'activité nitrifiante (SABEY et al. 1959, NELSON
1931 in PAIi~TER 1970, DEPPE et EHGEL 1960, MONIB et al. 1979). Il faut
souligner qu'un optimum d'activité à 42°C a été rapporté par LAUDELOUT et
VAN TICHELEN (1960).
Dans les deux cas l'activité nitrifiante est fortement réduite à 15°C
c'est-à-dire 50 % seulement de l'activité totale enregistrée dans les
meilleurs cas pour les températures de 23 et 28°C. ALHER et al.
(1977)
observent une diminution de 30 % du taux de nitrification pour une baisse
de température de 1°C.
En comparant l'action combinée de ces deux facteurs nous nous aperce-
vons que :
- aux basses températures les deux souches sont totalement inhibées
aux pH <. à 6,3,
seule la souche NLB n'est pas reprimée au pH <à 6,3 aux tempéra-
tures élevées,
'- seule la souche N.W est capable de croître à pH 9,5 à basse température.

---

- 57 -
Tous ces faits ne permettent pas de mettre en lumière une corrélation
entre l'activité nitrifiante et le pH dans les conditions extrêmes. D'au-
tres facteurs entrent en ligne de compte.
On est amené à penser que le pH du sol prls globalement ne reflète pas
le pH effectif au niveau des microsites où se développent les microorganis-
mes. Dans ces endroits peuvent régner des conditions de pH et de température
compatibles avec l'activité physiologique des germes, ce qui expliquerait
la bonne nitrification rencontrée dans certains sols acides.
IV) INFLUENCE DE LA MATIERE ORGANIQUE
A) INTRODUCTION
La relation entre la nitrification et la présence de matière organlque
est complexe à saisir. Une action nocive lui est souvent attribuée dans la
littérature. KACZMARCK (1972 a) mentionne l'effet inhibiteur du glucose sur
la nitrification. En 1977, HOKENBURY attribue à plusieurs acides aminés
ce même effet. Les travaux deIVA et ALEXANDER (1965), BOCl( (1976) montrent
que les bactéries nitrifiantes sont capables de croître en condition de
mixotrophie. L'utilisation concomittante des sources d'énergie autotrophe
et organique
devient possible ; le bénéfice écologique pour le micro-
organisme est alors une question pertinente. C'est pourquoi il nous a paru
intéressant d'envisager le cas de la mixotrophie dans le cadre de cette
étude sur Nitrobacter.
B) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Nous avons pour ce faire utilisé le protocole décrit par BOCK (1976).
La composition des milieux de culture est portée dans le chapitre 1.
Les dénombrements bactéries ont été effectués par irnmunofluorescence
pour ne pas prendre en compte d'éventuels contarninants. La viabilité des
bactéries en fin d'expérience est vérifiée par la méthode de ZI~~ŒRMAN.
Toutes les cultures sont réalisées dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml du milieu adéquat et incubées à 28°C. Nous avons trois répétitions
par expérience. Les inoculums proviennent de précultures maintenues à 23°C.

---

C) RESULTATS
Les figures 14 et 15 indiquent que la vitesse d'oxydation du nitrite
n'est pas affectée par la présence des composés organiques dans le milieu.
L'oxydation du N-NO
en milieu autotrophe et rnixotrophe est effectuée
Z
en 9 jours par la souche NLB . La densité optique atteint à cet instant
0,03Z pour le milieu autotrophe et 0,065 en milieu mixotrophe. Elle con-
tinue d'augmenter après la disparition totale du N-NO
alors que les bac-
Z
téries ne disposent plus que de l'azote organique comme source d'énergie.
Dans ces conditions la D.O. atteint une valeur maximale de 0,117 après
30 jours d'incubation.
Dans les conditions chimioorganotrophes (fig.
16) nous observons auss~
une nette augmentation de la turbidité du milieu.
Dans les deux cas : mixotrophie et chimioorganotrophie, la croissance
la plus élevée est obtenue lorsque sont présents dans le milieu le pyruvate,
l'extrait de levure et le peptone. La croissance obtenue sur pyruvate seul
est inférieure à celle du cas précédent.
En milieu mixotrophe avec Extrait de levure et peptone après la dis-
parition du nitrite, la croissance est moins régulière que dans les autres
milieux.
Aucune cro~ssance n'est enregistrée sur le milieu Extrait de levure-
peptone en condition purement chimioorganotrophe.
Les dénombrements effectués au 3e, ge, ZOe et 30e jours d'expériences
montrent un accroissement régulier du nombre de bactéries (fig.
17).
Comme pour la souche N LB- .) la présence des composés organ~ques n'a pas
d'influence sur l'utilisation par la souche N. H du N-NO :
Contrairement au
Z
cas précédent, tout le nitrite est oxydé en 6 jours au lieu de 9. La dif-
férence de D.O. 0,03 en milieu autotrophe contre 0,055 en milieu mixotrophe
s'explique par un nombre de bactéries par ml de milieu plus élevé à la fin
de l'utilisation du N-NO .
Z
La meilleure croissance est observée sur le milieu pyruvate-Extrait
de levure-peptone-N-NO
avec une valeur maximale de densité optique de 0,103.
Z
Le milieu chimioorganotrophe ne permet pas d'observer une croissance
sans passage préalable de la souche par les conditions mixotrophes.

---

-
59-
X 10- 3
120
D.O. à 580 nm
N-NOZ + pyruvate + extrait de
ra-- 1llI
9---G
levure + peptone
/ ' ""
0,-,0
N-N02 + pyruvate
""
""
.10.--.06.
N-NOZ + extrait de levure
1!iI""
110
. - . N-N02
+ peptone I l
1
1
1
100
1
1
1
!li
/
1
90
1
1
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o
1
1
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1
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10
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1
i
1
j
j
t
1
~
4
8
12
16
20
24
28
jours
Fig.
14
CINETIQUE DE CROISSi\\NCE DE NITROBACTER EN CONDITION
D' AUTOTROPHlE
} Souche NLB
DE HIXOTROPHIE
Les cultures sont réalisées dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml de l'un ou l'autre milieu

---

- ôO -
X 10- 3
D.O. à 580 nm
1IiI---1lll
110
N-N0 2 + pyruvate + extrait de levure + peptone
0 ' - ' 0
N-NO.., + pyruvate
"-
4--,6.
N-N0
+ extrait de levure + peptone
2
+-+
N-N02
_---11---11
1IiI-
100
/
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/
/
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90
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20
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4
8
12
1Ci
20
24
28
jours
Fig.
15
CINETIQUE DE CROISSANCE DE NITROBACTER EN CONDITION
D'AUTOTROPHIE
l S h
ouc eN. l'i
DE MIXOTROPHIE
J
Les cultures sont réalisées dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml de milieu

---

61-
X 10- 3
0.0. à 580 nm
m---m
pyruvate - extrait de levure - peptone
0 ' - ' 0
pyruvate
70
60
..--0
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50
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30
./
/
o
20
10
4
8
12
16
20
24
28
jours
Fig.
16
CROISSA1\\lCE DE NITROBACTER SOUCHE NLB EN CONDITION CHHlIOORGANOTROPHE

---

-
62-
9
7
5
3
5
10
15
20
25
30
Jours
Fig. 17
EVOLUTION DU NOUERE DE BACTERIES EN FONCTION DU TE!1PS
DANS LES CONDEIONS DE tlIXOTROPHIE ET D'AU'lOTROPHIE
.Ml Milieu N-NOl + pyruvate + Extrait de levure + peptone
Ml
Milieu N-NO? + pyruvate
M
Milieu + extrait de levure + peptone
3
A
Milieu N-NO 1
Souche NLB

---

63 -
D) DISCUSSION
Nous avons remarqué au cours de nos manipulations une constance dans
le temps d'utilisation du N-NO
en condition mixotrophe et autotrophe~
Z
aussi bien par la souche N Sp que par N.W. Nos résultats s'accordent ainsi
avec les observations de SMITH et HOARE (1968) et ceux de JOSSERAND (1983).
En conformité avec ce dernier et en contradiction avec SMITH et HOARE (1968)
nous constatons une nette influence de la présence des composés organ~ques
sur la turbidité du milieu. En effet, nos résultats montrent une cinétique
de croissance nettement plus élevée en présence des composés organiques dans
le milieu. Cet effet stimulant est d'ailleurs corroboré par les expériences
menées par KRULWICH et FU}~ (1965) et STEINMULER et BOCK (1976) sur des
souches de Nitrobacter en présence de composés organiques.
Les comptages effectués à l'a~de de l'immunofluorescence nous ont per-
m~s de constater une légère différence du nombre de bactéries dans le milieu
mixotrophe par rapport au milieu autotrophe, ce qui expliquerait la plus
forte turbidité observée dans ce milieu.
LONDON et RITTENBERG (1966), RITTENBERG (1969) travaillant sur Thio-
bacillus intermedius constatent une stimulation du taux de croissance et du
rendement cellulaire après avoir ajouté dans le milieu autotrophe de l'ex-
trait de levure.
Les souches de N.W et de N LB en notre possess~on ont la capacité d'u-
tiliser les composés organiques comme source d'énergie pour croître en
absence de nitrite. Les auteurs tels SMITH et al.
(1968), BOCK (1976),
r~TIN (1978), KALTHUFF (1979), GAY (1983) ont aussi démontré cette propriété
avec certaines souches de Nitrobacter.
Notons que comme IDA et ALEXfu~DER (1965), Pfu~ (1971) et contrairement
à la plupart des auteurs cités ci-dessus, nous n'avons pu obtenir une crois-
sance même faible de la souche N.W en condition chimioorganotrophe sans
passage par la phase de mixotrophie.
Nous trouvons, comme BOCK (1976) et JOSSERfu~D (1983), une croissance
toujours moins élevée par rapport à celle observée en mixotrophie.
Les implications écologiques de cette capacité à utiliser les compo-
sés organiques peuvent être nombreuses. Elle peut intervenir dans la sé-
lection naturelle des souches lorsque les conditions de pH et de tempéra-
ture deviennent mauvaises. Elle aiderait ainsi le maintien de la souche
en condition limitant la source d'énergie autotrophe ce qui est probable-
ment le cas dans la plupart des environnements naturels où croît la bactérie.

---

L'aptitude de la souche NLB à résister à la présence de matière
organique et aussi à l'utiliser; nous a incité à étudier les différentes
litières présentes dans sa station d'origine. Cette question sera abordée
dans le chapitre suivant.

---

CHA PIT REl l l
ETUDE DES EFFETS cr'UN APPORT DE CaC0 3 ET DES EFFETS LITIERES
SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE

---

-
66-
1) INTRODUCTION
La nitrification dans le sol est conditionnée par la qualité des apports
en azote assimilable issus de différentes sortes de composés organiques : tissus
végétaux ou animaux morts, exudats ou produits de percolation d'organes aériens
ou souterrains, cadavres bactériens. Il en résulte que les microorganismes
du sol présentent une activité maximale dans les zones où s'accumulent
spontanément ou non ces matériaux, la litière et les horizons sous-jacents
sont à ce point de vue des zones privilégiées. Il est par conséquent néces-
saire de tenir compte de l'influence exercée par la litière sur la micro-
flore nitrifiante.
Dans quelques sols des systèmes climaciques de forêts et dans certains
sols acides comme les sols de lande, l'absence de nitrification a pour
conséquence d'arrêter les réactions de la minéralisation de l'azote au
stade ammoniacal (RICE et al.,
1972, 1973, 1974 ; BELSER, 1979).
Ces observations ont incité certains auteurs à rechercher les or~g~­
nes de l'inhibition et notamment à déterminer le rôle joué par les compo-
sés provenant des litières. C'est ainsi que BASARABA (1964) a montré l'as-
pect inhibiteur des tanins sur la nitrification. Les études menées par
NEAL (1969), BOCQUEL et al.
(1970), RICE (1964, 1969), LODHI (1976, 1978)
attribuent le faible taux de nitrification et celui des populations n~­
trifiantes au pouvoir antimicrobien des composés provenant des végétaux
présents sur le site.
La biodégradation des substances antimicrobiennes très lente dans
certains sols peut être accélérée par une élévation du pH et une amélio-
ration de l'aération. L'accélération de la détoxication sous l'influence
de ces facteurs expliquerait en partie tout au moins l'effet favorable
du chaulage sur la nitrification dans l'horizon de surface d'un mor sous
sapinière (BERNIER et ROBERGE, 1962).
Nous avons cherché à évaluer l'influence du relèvement du pH par
apport de CaC0
sur la nitrification des sols de lande.
3
Nous avons aussi étudié in situ et au laboratoire l'intensité des
processus d'inhibition sur l'activité nitrifiante. Pour ce faire, nous
avons employé des litières d'Ajonc (Ulex europaeus) , de Bruyère (Erica
ciliaris) et de Pin (Pinus maritimus). Les investigations de laboratoire
ont été menées en chémostat sur des populations constantes de nitrifiants
de même état physiologique. Dans ce cas ce sont les extraits aqueux des

---

-
67 -
litières précitées qu~ ont été utilisés.
II) ETUDE DES EFFETS DES APPORTS DE CaC03
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1) Sur le terrain
La manipulation consiste à répandre sur la surface du sol du CaC0 ;
3
la dimension des parcelles utilisées est de 1 m2. Cinq taux de CaC03
(100, 150, 250, 300 et 350 g/m2) ont été choisis.
Le but de la manipulation était de favoriser les bactéries nitrifiantes
du sol et de voir les conséquences sur la nitrification. Les variations de
cette dernière ont été suivies au cours de l'année, dans l'horizon supé-
rieur entre a et 5 cm et dans l'horizon inférieur entre 5 et 15 cm. Les
modes de prélèvement et d'incubation sont présentés dans la chapitre I.
2) Au laboratoire
L'effet sur l'activité nitrifiante est abordé en ajoutant à 100 g de
solS g ou la g de CaC0 . L'échantillon est ensuite placé dans des erlens
3
de 500 ml avec une arrivée d'air humide et stérile mis à incuber.
Dans les deux expériences nous avons dosé les nitrites et les nitra-
tes après une période de six semaines d'incubation.
B) RESULTATS EXPERIMENTAUX
1) Résultats des expériences réalisées sur le terrain
Les valeurs portées dans les tableaux 6 et 7 représentent respective-
ment les teneurs en azote nitrique et azote ammoniacal dans les sols après
" "
++
a dJonct~on de Ca
. Elles constituent la différence entre les quantités
d'azote dans le sol au moment du prélèvement et les quantités après une
incubation de six semaines.
Nous remarquons (tableau 6), entre la fin de l'été 1982 et l'automne
1982, qu'un apport de 1 à 1,5 équivalent de Ca++ occasionne une diminution
de la quantité d'azote minéralisé dans le sol. Quel que soit l'horizon,
++
avec un apport de 2,5 équivalent de Ca
,cette diminution n'a lieu qu'en

---

68 -
++
Tab leau 6
INFLUENCE DES APPORTS DE Ca
SUR LA NITRIFICATION DA.L\\lS LE SOL
DE LANDE.N-N0
+ N-N0
MINERALISE EN SIX SEMAINES D'INCUBATION
3
2
3
(exprimé en 10-
% du poids de sol sec)
~
[
Période
.
'équivalent
1
1,5
2,5
3
3,5
-
Ca++
Horizon
supérieur
de
-0,005
-0,034
-0,049
+0,027
+0,001
0-5 cm
Nov. 1982
à
inférieur
Déc. 1982
-0,025
-0,14
+0,027
+0,006
5-15 cm
°
supérieur
de
+0,002
0-5 cm
°
+1,302,~
+1,204
+0,294
Mars 1983
à
inférieur
Mai-1983
5-15 cm
°
+0,003
+0,316
+0, 121
+0,021
++
Tableau 7
INFLUENCE DES APPORTS DE Ca
SUR LA QUL~TITE DE NH
MINERALISE
4
3
EN SIX SEMAINES D'INCUBATION (exprimé en 10-
du poids de sol sec)
~
1
Période
'équivalent
1
1,5
2,5
3
3,5
Ca++
Horizon
supérieur
de
-0,30
-0,10
+0,06
+0,22
-0,55
0-5 cm
Nov. 1982
1
à
inférieur
Déc. 1982
5-15 cm
-0,45
+0, 1
+0,07
+0,04
+0,07
supérieur
de
°
°
+0,001
0-5 cm
°
traces
Hars 1983
à
inférieur
Mai 1983
5-15 cm
°
°
°
°
traces

---

-
69-
surface. Au-delà de ces valeurs nous observons un ga~n en azote minéralisé
dans presque tous les horizons.
Au printemps 1983, nous avons une stimulation de la nitrification dans
toutes les parcelles tous horizons confondus, sauf dans l'horizon inférieur
avec un apport de 1 équivalent de Ca++ et dans l'horizon supérieur avec 1,5
;
.
1
++
equ~va ent de Ca
.
Les valeurs moyennes en nitrates diminuent de l'horizon de surface à
3
3
l'horizon inférieur. Les meilleurs résultats (1,302 10-
% et 1,204 10-
%)
sont obtenus en surface avec un apport de 2,5 et 3 équivalents de Ca++
ce qui a amené le sol à un pH d'environ 6. L'apport de 2,5 équivalent
de
++
~
.
Ca
appara~t toujours le plus favorable pour la n~trification.
Le tableau 7 montre une diminution en azote ammoniacal dans l'horizon
de surface avec des apports de l, 1,5 et 3,5 équivalents de Ca++ pendant
l'automne 1982. Les quanti~és les plus élevées (0,22 % et 0,07 10-~) sont
++
enregistrées pour des adjonctions de 3 et 2,5 équivalents de Ca
. En mars-
ma~ 1983 les teneurs deviennent nulles.
Les taux de nitrification sont importants avec un apport de 2,5 équi-
valent de Ca++. Les valeurs calculées à la fin de l'automne 1982 et du
début du printemps 1983 sont respectivement de 27,83 et 99,92.
2) R€sultats
des expériences réalisées au laboratoire
Les valeurs portées dans le tableau 8 montrent une amélioration très
sensible de la nitrification dans le sol après un apport de 1/10 équivalent
++
. ;
++
de Ca
sous forme de CaC0 . Avec une plus forte quant~te de Ca
nous
3
n'avons pas obtenu de meilleurs résultats.
Tableau 8
TENEURS EN N-N0
DES SOLS DE LANDE INCUBE IN VITRO
3
INFLUENCE D'UN APPORT DE Ca++
Quantité
Teneur en
pH du sol
de Ca++
N-N03
5/100Equivalent
0,049
6,)
de Ca++
1
1110 Equivalent
0,093
6,7
de Ca++
1/5
Equivalent
0,023
6,8
de Ca++
----J

---

-
70-
C) DISCUSSION
Nous remarquons que l'apport de Ca++ est bénéfique à la nitrification
du sol acide de lande. Cet apport au sol montre en effet que la production
de N-N0
+ N-NO~, tout en restant relativement faible, augmente avec la
2
quantité de Ca+
ajouté. Nous remarquons au début de l'expérience une di-
minution des teneurs en azote après un ajout de 1 et 1,5 équivalent de
Ca++. Nous attribuons ce phénomène à une réorganisation de l'azote déclen-
chée par la reprise de l'activité de l'ensemble de la microflore. Mais le
rythme d'accroissement de l'activité des minéralisateurs est trop lent par
rapport à celui de l'ensemble. Dès que cette activité atteint son max~mum
le déficit est comblé et nous observons même que le stock d'azote augmente.
La faible nitrification enregistrée dans ces sols n'est pas due à un
manque de substrat assimilable car la quantité d'ammonium présent est sou-
vent élevée (RaZE et al., 1980-1982).
Ces faits révèlent que les nitrifiants autotrophes sont présents dans
ce sol acide et qu'ils résistent mais leur métabolisme est ralenti par le
pH. Ces constatations renforcent les résultats que nous avons obtenus cha-
pitres l et II. En effet nous avons isolé une souche de Nitrobacter. L'étude
de ses caractères physiologiques nous a révélé que son métabolisme fonc-
tionne m~eux à pH 7,6 donc légèrement alcalin. Nous avons observé une baisse
du nombre de bactéries comptabilisées aux pH <6.
,
TAJ.\\lDON et HISHRA (1969), BONNEAU (1967-1971), .:IONES ET HOOD (1980) ont
au~si constaté au cours de leurs travaux que l'apport de CaC0
favorisait la
3
nitrification des sols acides.
P,AJ.\\lG et al.
(1975) pensent que le nombre restreint des nitrifiants
rencontrés dans ce type de sol est à l'origine de leur faible nitrification.
L'apparente absence .de nitrification dans ces sols peut aussi s'expli-
quer par le fait que les nitrates produits en faible quantité sont rapide-
ment assimilés par les plantes ou lessivés. En effet lorsque l'on supprime
le lessivage et l'absorption par les racines nous nous apercevons qu'il y
a une faible nitrification dans ces sols.
Toutes ces observations ne nous permettent pas d'établir une relation
directe entre la quantité de CaC0
apportée dans le sol et son taux de
3
nitrification.
Nous sommes alors amené à nous poser la question sur le rôle exact du
CaC0
dans le processus de l'amélioration de la nitrification. Il est pos-
3
sible qu'il agisse au niveau du pouvoir tampon du sol améliorant le pH.

---

-
71 -
Nous avons vu que malgré son origine acide la souche de Nitrobacter isolé
avait sa meilleure croissance à pH 7,6. Le CaC0
pourrait agir sur la ni-
3
trification en favorisant la chelation des substances inhibitrices (si
elles existent) du métabolisme bactérien ou encore en constituant une
source de carbone. Nous n'avons pas personnellement vérifié ces hypothèses.
Elles peuvent constituer une base de travail pour la compréhension de la
nitrification dans les sols acides.
III) ETUDE DES EFFETS LITIERES
Nous désignerons sous l'expression "Effet litière" l'ensemble des
interrelations se manifestant entre les végétaux supérieurs et les micro-
organ~smes par l'intermédiaire des litières sous forme de résidus divers
déposés à la surface du sol,; au laboratoire les litières sont remplacées
par des solutions aqueuses de ces mêmes résidus.
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1) Modalités de la manipulation effectuée sur le terrain
Elles' consistent à simuler une litière en disposant du matériel végé-
tal sec à la surface du sol sur des parcelles de 1 m2 et non en l'enfouis-
sant artificiellement. Ce matériel est ainsi soum~s à la fois à la décom-
position et à l'incorporation au sol par des agents biotiques et abioti-
ques. Il a été récolté à la fin de la période de végétation en novembre 1981.
Nous avons testé les litières d'Agrostis setacea~ de Molinia caerulea~
d'Erica ciliaris~ d'Ulex europaeus~de Betula pubescens~ de Quercus peduncu-
lata et de Pinus maritimus. Ces espèces sont caractéristiques des diffé-
rents états d'évolution de la lande vers la forêt. La quantité de litière
utilisée est de 2 kg/m2. Elle a été déposée sur le terrain au mois de
décembre 1981.
Nous avons ensuite suivi les variations saisonnières de la teneur en
N-N0
+ N-N0
dans les horizons sous-jacents : horizon supérieur entre °
3
2
et 5 cm - horizon inférieur entre 5 et 15 cm. Les méthodes de prélèvements
et d'incubations sont décrites dans le chapitre 1.

---

-
72-
2) Modalités de la manipulation effectuée au laboratoire
Le matériel végétal employé est composé de feuilles et de petits rameaux
d'Ulex europaeus~ d'Erica ciliaris et des aiguilles de Pinus maritimus,
récolté en même temps que celui déposé sur le terrain en novembre 1981.
Le matériel végétal séché à l'air est réduit en poudre par broyage
en vue de l'extraction des substances hydrosolubles. Cette dernière se
fait en présence d'eau distillée à 4°C avec un rapport Poids de matière
végétale sur Volume d'eau égal à 5 g pour 100 ml (BEeK et al., 1969
BOCQUEL et al., 1970, LODHI et al., 1980). La durée de l'extraction est
de 12 heures.
Les extraits obtenus après centrifugation sont stérilisés sur filtre
millipore 0,45 u et congelés jusqu'au moment de l'emploi.
La stérilité de chaque extrait est vérifiée par incubation de 1 ml
sur trypticase à 28°C pendant 72 heures. Le tableau 9 résume toutes les
manipulations effectuées sur le matériel végétal.
Nous avons évalué l'effet des extraits sur des populations constantes
de nitrifiants et dans un même état physiologique, en chémostat. Pour ce
faire nous avons injecté directement dans la chambre de culture à l'état
d'équilibre 10 ml d'extrait de litière. Le chémostat est ensuite alimenté
par le même extrait contenant la source d'azote sous forme de N-N02
(200 ug/ml) et dont le pH a été ramené à 7,6. Cette manière de procéder
nous évite d'avoir, dans la cuve de culture~ un gradient de concentration
en extrait de litière
qui rendrait difficile l'interprétation d'éven-
tuels phénomènes d'inhibition. En ramenant le pH à 7,6 nous avons cherché
à éliminer ce facteur dont l'importance n'est plus à démontrer, comme va-
riable de l'expérience. Nous avons vu chapitre II que ce pH était idéal
pour la croissance de Nitrobacter.
Dans l'effluent, la concentration en N-N0
résiduel et celle de l'ATP
2
sont SUlVles en fonction du temps. Parallèlement des comptages de bactéries
sont réalisés.
Le tableau 10 donne le détail des manipulations effectuées sur les
parties aliquotes prélevées dans l'effluent.

---

-
73-
Matériel végétal sec :
Ulex europaeus~ Erica ciliaris~ Pinus maritimus
Broyage au Dangourneau
l
Extraction par eau froide
rapport Poids M.V./eau = 5/10
'Ii II'
Centrifugation à 5000 g 15 mn
des extraits obtenus
'11'
Stérilisation par filtration
sur Millipore 0,45 ~ des extraits obtenus
Congélation à -20°C
jusqu'au moment de l'emploi
Vérification de la stérilité sur
trypticase avant et pendant l'emploi
Tableau 9
SCHEMA DESCRIPTIF DES ~UillIPULATIONS EFFECTUEES POUR L'OBTENTION DES EXTRAITS

---

-
74-
j 20 ml Effluent 1
Filtration sur filtre millipore 0,45 p
Dosage du N-N0
Reprise du filtre dans
2 résiduel
par la méthode de GRIESS
sur le filtrat
2 ml d'eau stérile
tt.
Dilution de la suspension
bactérienne dans
Extraction de l'ATP
eau stérile
l
l
Coloration à l'INT
ou
Congélation à -20°C
avec anticorps fluorescent
l
l
Comptage au microscope
Dosage de l'ATP
à épifluorescence
par bioluminescence
Tableau 10: RECAPITULATIF DES ~UU~IPULATIONS EFFECTUEES SUR LES PARTIES
ALIQUOTES PRELEVEES Dfu~S L'EFFLUENT

---

-
75-
B) RESULTATS EXPERIMENTAUX
1) Résultats des expériences réalisées sur le terrain
Nous avons respectivement porté dans les tableaux Il, 12 et 13 les
valeurs des teneurs en azote nitrique et nitreux, l'azote ammoniacal et
les taux de nitrification, dans les sols sous-jacents des différentes li-
tières.Ces valeurs représentent la différence entre les teneurs des sols
au moment du prélèvement et après six semaines d'incubation.
Nous remarquons dans le tableau Il une absence d'azote nitrique et
nitreux dans l'horizon 0-5 cm des sols sous toutes les litières sauf pour
Pinus maritimus et Quercus pedunculata. La situation est identique dans
l'horizon inférieur mais les gains sous les litières d'Ulex europaeus et de
-3
Betula pubescens sont respectivement de 0,036 et 0,002 la
% en automne 1982.
Pendant le printemps 1983 quel que soit le niveau considéré 0-5 cm ou 5-15 cm,
les teneurs en azote deviennent importantes. Ceci n'est pas vrai pour le sol
sous Erica ciliaris et l'horizon 5-15 cm de Pinus maritimus.
C'est sous la
litière de cette dernière espèce que nous observons la plus importante accu-
3
mulation (0,057 10-
%). A l'automne 1983 la quantité d'azote devient nulle
sous toutes les litières et dans tous les horizons excepté sous les sols
sous-jacents des litières de Quercus pedunculata. Notons que toutes les
teneurs enregistrées, sauf pour pinus maritinn{s pendant cette période,
coïncident avec la disparition sur le terrain du matériel végétal apporté.
En analysant par espèce végétale les résultats portés dans le tableau
Il nous nous apercevons que:
- sous la litière d'Agrostis setacea,la quantité d'azote nitrique et
nitreux minéralisé est nulle dans les deux niveaux 0-5 cm et 5-15 cm pour
les deux automnes. Par contre il y a une accumulation de N-N0
durant le
3
printemps 1983
- sous la litière de Molinia caer1llea, la nitrification est nulle
dans les deux horizons 0-5 cm et 5-15 cm pendant l'automne 1982 et 1983.
Comme pour l'espèce précédente une augmentation du stock d'azote nitrique
et nitreux est visible pendant le printemps 1983 ;
- sous la litière d'Erica ciliaris, la nitrification est restée
inexistante pendant toute la manipulation
- :1 'horizon immédiatement en contact avec les litières d' Ulex euro-
paeus ne présente pas de nitrification à l'automne 1982. Nous retrouvons

---

Tableau Il
INFLUENCE DES APPORTS DE LITIERES SUR LES TENEURS EN
N0
+
N0
~lINERALISE EN SIX SEMAINES
3
2
3
(exprimé en 10-
% du poids de sol sec)
Litières
apportées
Agrostis
Molinia
Erica
Ulex
Betula
Pinus
Quercus
Témoin
Période
ur le sol
setacea
caerulea
ciliaris
eUl'opaeus
pubescens
maritimus
pedûnculata
Horizon
supérieur
du
0-5 cm
°
°
°
°
°
traces
traces
traces
28 sep.
1982
au
inférieur
7 nov.
1982
5-15 cm
°
a
°
+0,036
+0,002
traces
traces
traces
"-J
()\\
supérieur
du
+0,035
+0,016
0-5 cm
24 mars 1983
°
+0,016
+0,032
+0,057
+0,004
°
au
inférieur
4 mai
1983
+0,040
+0,008
5-15 cm
°
+O,OO!I
+0,015
°
+0,010
°
supérieur
du
°
°
°
°
°
°
+0,075
0-5 cm
traces
23 sep.
1983
au
inférieur
8 nov.
1983
5-15 cm
°
°
°
°
°
°
+0,007
°

---

-
77-
ce phénomène dans les deux horizons 0-5 cm et S-lS cm à l'automne 1983.
C'est au début de novembre 1982 que le maximum en azote N-N0
+ N-N0
est
3
2
enregistré. La nitrification diminue ensuite graduellement;
- au niveau des litières de Bet-ula pubescens,la nitrification est nulle
dans l'horizon o-S cm et dans les deux niveaux à l'automne 1982 et 1983.
3
Les meilleurs résultats (0,032 et O,OlS 10-
%) sont obtenus pour des in-
cubations ayant eu lieu au printemps 1983 ;
- au niveau de pinus maritimus,l'azote nitrique et nitreux existe sous
forme de traces dans les deux horizons étudiés entre la fin de l'été 1982
et l'automne 1982. La nitrification est relativement importante dans le
niveau O-S cm au printemps 1983. Elle devient nulle à l'autoITille de cette
même année
- sous les litières de Quercus pedunculata, il y a une progression
dans les gains en azote nitrique et nitreux, tous horizons confondus, de
la fin de l'été 1982 à l'automne 1983. Les m~~imum sont atteints à cette
période. Les valeurs sont approximativement égales dans les deux n~veaux
sauf pour l'horizon O-S cm au printemps 1983.
A l'automne 1982 la teneur en azote ammoniacal (tableau 12) est nulle
dans les horizons sous-jacents des différentes litières (sauf sous l'Ulex
europaeus : 0,17 et 0,12 %).
Au printemps 1983 les quantités d'azote ammoniacal augmentent dans
tous les horizons et sous toutes les litières. Les valeurs obtenues en
surface O-S cm sont toujours supérieures à celles de l'horizon inférieur
3
avec des maximum sous l'Ulex europa~As 0,S3 10-
% et sous Agrostis
-3
setacea 0,21 10
%.
C'est seulement sous l'Agrostis setacea et Molinia caerulea
que
nous observons une présence d'azote ammoniacal en automne 1983. Les te-
neurs en cet élément dans les sols situés sous les litières de ces deux
espèces végétales, n'augmentent qu'à partir du printemps 1983 ; elles
atteignent leurs maxima entre l'été et l'automne 1983.
Sous les litières d'Ulex europaeus les teneurs en azote ammoniacal
sont
élevées
dans les deux horizons O-S cm et S-lS cm de l'automne 1982
au printemps 1983. Nous observons une disparition de cet élément dans les
sols sous-jacents, entre la fin de l'été 1983 et l'automne de cette même
année.

---

Tableau 12
INFLUENCE DES APPORTS DE LITIERES SUR LES QUANTITES DE N1I
MINERALISE EN SIX SEMAINES D'INCUBATION
4
3
(exprimé en 10-
% du poids de sol sec)
Litières
apportées
Agrostis
Molinia
Erica
Ulex
Betula
Pinus
Quercus
Témoin
Période
sur le sol
setacea
caerulea
ciliaris
ew'opaeus
pubescens
mari t inru s
pedunculata
Horizon
supérieur
du
0-5 cm
°
°
°
+0,17
°
°
°
traces
28 sep.
1982
-
au
inférieur
7 nov.
1982
5-15 cm
°
°
°
+0,12
°
°
°
traces
-...J
co
1
supérieur
du
+0,21
+0,05
+0,15
+0,53
+0,19
+0,13
+0,12
0-5 cm
24 mars 1983
°
au
inférieur
4 mai
1983
+0,04
+0,04
+0,15
+0,09
+0,04
+0,005
+0,02
0,01
5-15 cm
supérieur
du
+0,65
+0,29
0-5 cm
°
°
°
°
°
traces
23 sep-. 1983
au
inférieur
8 nov.
1983
+0,09
+0,027
5-15 cm
°
°
°
°
°
traces

---

79 -
Sous les litières d'Erica ciliaris en période automnale l'ammonifica-
tion est nulle. L'azote assimilable n'est présent qu'enmars~mai 198};
Sous les ,litières de Be-tula pubescens~de
Pinus maritirrrus et de
Quercus pedunculata, l'azote d'ammonium n:est présent dans les horizons
que!:.pendant les mois de mars à mai 1983.
Les valeurs du tableau 13 indiquent que le taux de nitrification est
nul pendant les deux automnes 1982-1983. Ces taux augmentent au printemps
1983 avec des maximum dans l'horizon 5-15 cm sous Agrostis setacea 50 %
et Quercus pedunculata 33,33 %.
Les sols sous-jacents des litières des Graminées, c'est-à-dire Agros-
tis setacea et Molinia caerulea réagissent de la même manière. Nous pou-
vons attribuer l'absence de nitrification pendant l'automne 1983 soit à
une inhibition due à la présence de composés antimicrobiens soit au fait
que la quantité de N-N0
+ N-N0
produite est insuffisante pour couvrir
3
2
à la fois les besoins des microorganismes telluriques des plantes du site
et la constitution de réserve quantifiable. Nous observons une année après
une stimulation peut-être due au lessivage complet des substances inhibi-
trices et la mise à la disposition des bactéries nitrifiantes de composés
rapidement assimilables. L'évolution de ce phénomène rappelle les résultats
obtenus sur un sol auquel on a incorporé soit des litières (LOSSAINT, 1961),
soit de la paille (NO~lliIK, 1962). Ces auteurs attribuent l'apparente ab-
sence de nitrification au début de leurs expériences, à un processus de
réorganisation se déroulant en deux parties: une phase d'immobilisation
nette, qui dans notre cas dure près de six mois, suivie d'une phase de
minéralisation nette. Cette seule explication n'est pas satisfaisante car,
malgré des teneurs relativement importantes en azote ammoniacal pendant
la phase de stimulation, les quantités de N-N0
et ~-N02 restent faibles.
3
Il y a donc lieu de rechercher une autre explication. Nous écartons l'ab-
sence de nitrifiants autotrophes puisque nous avons isolé une souche de
Nitrobacter. Par contre, le nombre de ces derniers dans le sol pourrait
donner une indication. Il est en effet admis que la quantité des bactéries
conditionne les teneurs en N-N0
+ N-N0
observables dans un sol.
3
2
Nous pensons donc que c'est à ce niveau qu'il faudra rechercher les causes
de l'absence de nitrification.

---

N0
+ N0
3
2
Tableau 13
TAUX DE NITRIFICATION
x 100
SOUS DIFFERENTES LITIERES IN SITU
NH
+ N0
+ N0
4
3
2
~Litièr:s
apportees
Agrostis
MoZinia
Erica
UZex
BetuZa
Pinus
Quercus
Période
.s~ setacea
caeruZea
ci Ziaris
europaeus
pubescens
maritimus
peduncuZata
Hon.zon
supérieur
du
0
0
0
0
0
0
0
0-5 cm
28 sep. 1982
au
inférieur
7 nov.
1982
5-15 cm
0
0
0
23,07
-
0
0
C).)
o
supérieur
1
du
14,2
26,66
0
2,93
14,41
30,48
3,22
0-5 cm
24 mars 1983
au
inférieur
4 mai
1983
5-15 çm
50
16,66
0
4,25
27,27
0
33,33
supérieur
du
0
0
0
0
0
0
-
0-5 cm
23 sept. 1983
au
infédeuy
8 nov.
1983
0
0
0
0
0
0
-
5-15 cm
--

---

31-
Le phénomène d'inhibition de la nitrification est plus visible dans
le cas d'Erica ciliaris avec un taux de nitrification nul. Ces litières
contiendraient des substances antimicrobiennes très actives vis-à-vis du
métabolisme des nitrifiants. Ces composés agissent en complexant la source
d'énergie métabolisable par ces bactéries. Les résultats obtenus avec une
autre Bruyère, Calluna vulgaris (DO~ŒRGUES, 1971) corroborent ces
explications.
Sous les litières d'Ulex ~~ropaeus, les phénomènes de nitrification
sont stimulés dans les sols sous-jacents. La disparition de N-N0
+ N-N0
3
2
en automne 1983 est essentiellement provoquée par la décomposition complète
du matériel végétal apporté et la réorganisation de l'azote. Les observa-
tions de LEMEE (1967, 1975, 1982) sur l'évolution annuelle de la minérali-
sation apportent une caution à cette hypothèse. Cet auteur a m~s en évi-
dence un maximum de minéralisation au printemps suivi d'une brusque réor-
ganisation de l'azote en automne.
Les résultats obtenus avec pinus maritimus concordent avec la plupart
des données de la littérature. Dans cette dernière l'activité nitrifiante
est réduite vo~re inexistante sous les forêts de Conifères.
Nous nous sommes placé
dans des conditions telles qu'il n'y a pas
apport continuel de matière végétale fraîche et donc de substances anti-
microbiennes. Nos résultats ne peuvent surprendre pu~sque l'on sait que
l'activité antimicrobienne n'est pas constante et qu'elle baisse progres-
sivement après la chute au sol des résidus végétaux. Il a été démontré que
la teneur en polyphénols hydrosolubles (ayant une grande activité inhibi-
trice) de la litière de Pinus sylvestris atteint sa valeur minimale dès le
troisième mo~s après la chute des aiguilles (HAYES, 1965). Le fait que nous
ayons commencé nos manipulations huit mois après le dépôt sur le terrain
des litières, ne nous permet pas de dire si ces dernières ont une action
inhibitrice sur la nitrification. Du moins les résultats suggèrent qu'il y
a nitrification dans l'horizon supérieur du sol sous-jacent, la disparition
précoce en automne pouvant être imputée à la fois au phénomène de réorga-
nisation (LEMEE,
1982) et aux facteurs internes de la litière. Une expéri-
mentation de BEeK et al.
(1969) a en effet mis en évidence une action ~n­
hibitrice globale des processus de la nitrification par les litières.
Nous pouvons faire l'hypothèse que les substances hydrosolubles in-
hibitrices de la minéralisation libérées par la litière jeune migrent en
conditions naturelles dans la litière ancienne dont elles freinent la

---

_ 82-
minéralisation de l'azote.
Au n~veau du Quermls pedunmllata, nous assistons à un phénomène de libé-
ration progressif d'azote, directement assimilable par les nitrifiants.
Ceci expliquerait l'augmentation continuelle de la nitrification dans les
horizons sous-jacents.
Nous pensons qu'il y a d'une manière concommittante un lessivage des
substances antimicrobiennes contenues dans ces litières. BECK et al.
(1969)
ont montré que les litières de Quermls petraea récoltées au mo~s de novem-
bre sont plus toxiques que celles de décembre. De plus celles prélevées
au mois de janvier ont un effet stimulateur. Il y a donc bien une détoxi-
cation des litières par processus de lessivage ou de biodégradation.
C'est au moment où les litières tendent à disparaître sur le terrain que
nous observons le maximum de N-N0
+ N-N0
dans l'horizon directement en
3
2
contact avec la litière de Quermls pedunculata.
2) Résultats des expériences réalisées en chéoostat au laboratoire
a) Effet des litières d'Ulex europaeus
Après adjonction d'un extrait aqueux de litière d'Ulex europaeus au
milieu de la cuve de culture, nous ne remarquons aucune variation ni au
n~veau du métabolisme des nitrites n~ dans la concentration en ATP de
l'effluent. Dans ce dernier le nombre de bactéries comptabilisées par
immunofluorescence reste sensiblement le même. Les figures 18 à 21
résument les résultats obtenus.
Les observations ci-dessus sont valables pour les deux souches de
Nitrobacter en expérimentation et ceci quel que soit le support (charbon
actif ou sol) contenu dans la cuve de culture.
Les expériences menées par NEAL (1969) corroborent ces résultats.
Les souches de Nitrobacter peuvent rester insensibles à l'incorporation
dans leur milieu de culture, des extraits aqueux de certaines plantes.
Au cours de leurs travaux RENNIE et SClli~IDT (1977), SMITH et WOLDENDORP
(1981) ont signalé la présence de substances organiques favorables à
l'activité des bactéries nitrifiantes.
Nous pouvons dire que dans les conditions expérimentales choisies,
les substances contenues dans l'extrait aqueux d'Ulex europaeus n'ont
aucun effet sur l'activité nitrifiante.
b) Effet des litières d'Erica ciliaris
L'injection d'un extrait aqueux de litière d'Erica ciliaris dans la
cuve de culture du chémostat, entraîne des perturbations dans le compor-

---

ATP
N-NO
Nombre de
Pg/ml
flg/mt
bactéries/ml
x 10~
6
;c 10
O.·J'\\. - 0..
- 0 - 0
- - - 0 - -
- - 0 - - - - - --0--- -
II n-,,-O
. v
-'(J"- 'o-O-O~
- .
-
-
-
_ _ - 0
~'-'
2,5
6
>/.'-.
. ----~.~
- *-\\ /
~...- ...----*--:+-----~.
*
~ll""" 1>-*-:+:
~
0 - - - 0
Bactéries
5
*
ATP
N-NO
\\ l i - - -
*
--19
2
4
1/5
3
.q5
2
t A.
,r
..,
.~,........,I
... ...... _."' ................. - _._ - ,_ ~ - - - - ._ - - _. - 0-
•
-
-
-
-
-
-
~ ~ 1..",._._.
~
W
1
1
1
t---t-.----.
o
6-------,'2--~----2-4---30
36
4~2
48
IL 120 Heures
Fig.
18
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NüHllRE DE NITRDHACTER Ln CULTIVE EN CHEMOSTAT
La température d'incubation est de 28°C;
le pH du milieu a été ramené à 7,6 ; la
concentration en N-N0
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens
2
ont été effectués par iuullunofluorescence
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

ATP
i 1'1-1'102
Nombre de
Pg/ml
).lg/ml
bactéries/ml
x 10 3
x 106
-
0 -
_
0-0-0-°_0_0...-- 0 - - O - - 0 - -
- - 0 - - - - - - - 0 - - - - - - - -
-
--- -
-0-11-0-.0 -0
2,5
~-.\\'~*-~-*-;f-*-*--l'-*-*-*~
--------*
*~~~-
*
6
-* 11_,(*"-*
*~
5
0 - - - 0
Bactéries
;./4
tk
ATP
N-NO
15
1IlI--- - --ft
2
4
1
3
2
~5
~-_.-_.--._--
_________ •
•
- -- - --., a·-. _._ ..
...."...
-.-~.--.-.--- .---.----------.
10
(Xl
.po.
r
, - - - - - r : - - - - , - - - - - - - I - - - '
. - - - - - -.... 0-_--------------.; ~-- _
o
6
1 2 1 8
24
30
3 6 '
1!2
48 72
120
lleures
Fig.
19
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIEllliS D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NOH13RE DE NlTROBACTER LB CULTIVE EN CIIEMOSTAT
La ten~érature d'incubation est de 28°C; le pli du milieu a été ramené à 7,6 ; la
concentration en 1'1-1'102 dans le milieu de r~serve est 200 ug/ml. Les cOlnptages bactériens
ont été effectués par iWTIunofluorescence
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

ATP
N- N0 2
Nombre de
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Fig. 20
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NmmRE DE NITROI3ACTER HINOGRADSKYI CULTIVE EN CHEMOSTAT
Les conditions de cultures sont les mêmes que celles de la figure 18.

---

ATP
N- N02
Nombre de
Pg/ml
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fig. 21
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D1 ULEX EUROPIlEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE.
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NONlllΠDE NITR0131\\CTER HINOGRADSKYI CULTIVE EN CHEHOSTAT
Les conditions de cultures sont les m~mes que celles de la figure 18.

---

-
87-
tement bactérien (diminution de la concentration en ATP et du taux d'uti-
lisation des nitrites).
Comme dans le cas ci-dessus, nous n'avons pas enregistré de grandes
différences de réaction des souches entre les supports. Les résultats ob-
tenus sont portés dans les figures 22 à 25.
Dans l'effluent le nombre de bactéries dénombrées par la méthode
d'immunofluorescence ne varie pas. Les comptages effectués à l'aide de la
méthode de ZI~WŒRMfu~ et al. (1978) ne montrent pas de variations dans le
nombre de bactéries viable.
Par contre nous observons une chute brutale de la concentration en
ATP alors que le nombre de bactéries est resté constant. La concentration
en ATP n'est plus proportionnelle à la biomasse bactérienne. L'ATP est
dans ce contexte l'expression de l'activité cellulaire. Tout se passe
comme si la charge en adenylate du milieu diminue. Cette dernière est
la mesure linéaire du taux d'énergie métabolique momentanément stocké
dans les adenylates. Elle est égale à :
(ATP) + 1/2 (ADP)'
(ATP) + (ADP) + (AMP)
(ATKINSON, 1969 ; CHAPMk~ et al., 1971 ; KARL
et al.,
1978).
La chute de la concentration en ATP peut s'expliquer par sa dissociation
en ADP et fu~ libérant l'énergie nécessaire à une meilleure régulation
interne de la cellule. Une analyse en chromatographie en phase liquide par
HPLC nous aurait permis de monter que la diminution de la charge en
adenylate est due à l'augmentation des formes de nucléotide ci-dessus
citées. La régulation a pour but de permettre à la cellule de s'adapter
aux nouvelles conditions du milieu. Elle se fait par une mise hors circuit
de toutes les enzymes régulatrices des systèmes biosynthétiques et d'au-
tres consommatrices de l'ATP. Ce phénomène favorise en même temps le taux
de régénération de l'ATP faisant revenir la charge en adenylate à son ni-
veau antérieur. En effet, le taux initial en ATP est récupéré après quel-
ques heures d'expérimentation.
Le métabolisme du nitrite est aussi perturbé; nous remarquons une
légère inhibition du taux d'utilisation de cet élément par les souches de
Nitrobacter. Cet effet se traduit par une augmentation de la concentration
en N-N0
résiduel dans l'effluent. L'activité antimétabolique de l'extrait
2
n'est pas permanente. Elle devient reversible après quelques heures dans
les nouvelles conditions de culture. Les résultats ci-dessus suggèrent la
présence de substances faiblement inhibitrices dans les tissus d'Erica
ciZiaris.

---

ATP
N-NO
Nombre de
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Fig. 22
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D' ERICA CILlA RIS SUR LI ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER LB CULTIVE EN CllEMOSTAT
La température d'incubation est de 28°C; le pH du milieu a été ramené il 7>6 ; la concentration en N-N0 2
dalls le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens ont été effectués par immunofluorescence
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

ATP
N-NO
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Pg/ml
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Fig. 23
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ERICA CILIARIS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN AT1' ET LE NOMBRE DE NITIWBACTER LB CULTIVE EN CHEHOSTAT
La température d'incuGation est de 28°C; le pH du milieu a été ramené à 7,6 ; la concentration en N-N0 2
dans le milieu de réserve est 200 ug/nll. Les comptages bactériens ont été effectués par imnmnofluorescence
La flêche indique le moment du changement de milieu.

---

ATP
N-N0 2
Nombre de
Pg/ml
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Fig. 2!.
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIEHES DI ERICA CILTARIS SUR LI ACTIVITE NITIUFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOHI3IΠDE NI'l'ROnACTER \\]
CULTIVE EN CHEHOS1'AT
La température d'incubation est de 28°C; le pH du milieu a été ramené à 7,6 ; la concentration en N-N0 2
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les conlptages bactériens ont été effectués par irr~unofluorescencc
La fl~che indique le moment du changement de milieu.

---

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Fig. 25
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ERICA CILIARI8 SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NmmRE DE NITROBACTER ~'J
CULTIVE EN CHEHOSTAT
La température J'incubation est de 28°C; le plI du milieu a été ramené ~ 7,6 ; la concentration en N-N0 2
d~ms le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens ont été effectués par immunofluorescence
La flèche indique le moment Ju changement cie milieu.

---

92-
c) Effet des litières de pinus maritimus
Les extraits de Pinus maritimus entraînent une chute du nombre de
bactéries viables dans l'effluent tandis que la population globale de ni-
trifiants comptabilités par irnmunofluorescence reste à peu près identique.
Ce phénomène traduit la mortalité des cellules dans la cuve de culture
(figures 26 à 30). Les deux souches de Nitrobacter réagissent de manière
équivalente à l'influence des extraits aussi bien avec le sol qu'avec le
charbon actif comme support. L'effet litière n'est pas permanent. En effet
progressivement nous retrouvons le nombre initial de bactéries contenu
dans l'effluent. Ainsi donc la mortalité mentionnée ci-dessus n'est pas
due à une croissance.
RENNIE (1978) remarque les mêmes effets avec différentes souches de
Nitrobacter. Cet auteur note après l'incorporation au sol d'exudats ra-
cinaires ou de polyphenols tels les tanins, une baisse de 20 à 38 % du
nombre de bactéries dans les soixante douze premières heures de l'expé-
rience. Une remontée de la quantité des bactéries comptabilisées inter-
vient après la 100e heure ; il a même observé une stimulation de la crois-
sance après cette heure. RICE ET PANCHOLY (1972), LODHI, 1978 b) ont mon-
tré dans leurs expérienc~s que la présence de composés antimicrobiens
(tels les acides chlorogéniques, les polyphenols) entraînent une réduction
de 68 à 93 % des germes nitrifiants par rapport au témoin de la manipulation.
Après toutes ces constatations nous pouvons dire que Nitrobacter résiste
bien à la présence de matière organique dans son milieu de culture.
La chute brutale de la concentration en ATP peut s'expliquer:
- par sa dissociation en ADP et AMP, afin de mettre à la disposition de
la cellule le maximum d'énergie à sa régulation interne pour une meilleure
adaptation aux conditions du milieu. Ce phénomène entraîne une diminution
de la charge en adenylate qui a pour conséquence de stopper tous les sys-
tèmes utilisateurs d'ATP et de favoriser sa régénération;
- par la mortalité des cellules qui a entraîné un changement dans
la composition de la biomasse bactérienne. GUSTAFSON et al.
(1983) ont
remarqué en présence de toxiques une baisse allant jusqu'à 50 % de la
concentration en ATP. Elle est le reflet d'une réduction du nombre total
des bactéries viables
- par le changement dans l'activité de la biomasse présente dans la
cuve de culture. Cette activité réduite au maximum permet à la bactérie
de retirer juste l'énergie qu'il faut pour garder son intégrité.

---

ATP
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Nombre de
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Fig. 26
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINUS MARI2'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER LB CULTIVE EN CHEHOSTAT
La température'd'incubation est de 28°C;
le pH du milieu a été ramené à 7,6 ; la concentration en N-N0 2
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens ont été effectués par in~unofluorescence
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

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N- N0 2
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Fig. 27
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINUS MARIl'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER \\~ CULTIVE EN CHEMOSTAT
La tempêrature d'incubation est de 28°C; le plI du milieu a été ramené à 7,6 ; la concentration en N-N0 2
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens ont été effectués par i~Dunofluorescence
La flêche indique le momellt du changement de milieu.

---

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Fig. 28
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LI'rIERES DE PINUS MARI'PTMUS SUR LI ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMl3llli DE NlTROBACTER Ln CULTIVE EN CIIEMOSTAT
La temp§rature d'incubation est de 28°C; le pH du milieu a ~té ramené à 7,6 ; la concentration en N-N0 2
dans le milieu tle réserve est 200 ug/ml. Les cOl!lptages bac.térie,ns ont été effectués par la méthode de ZU!HElUIAN
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(1978)
La flèche indique le moment du changement de milieu.

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Fig.
29
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINlfS MARI2'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NmmRE DE NIT1WBACTER \\~ CULTIVE EN CHEHOSTAT
La temp§rature d'incubation est de 28°C;
le pH du milieu a été ramené à 7,6 ;
la concentration en N-N02
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml.
Les comptages bactériens ont été effectués par la méthode de
ZUlJvlERMAN et al.
(1978)
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

ATP
N- N0 2
Nombre de
Pg/ml
pg/ml
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x 106
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Fig. 30
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIElillS DE PINUS.MARITIMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN A'l'P ET LE NOMBRE DE NITROI3ACTER I-J CULTIVE EN CIJEMOSTAT
La temp6rature d'incubation est de 28°C; le pH du milieu ft été ramené à 7,6 ; la concentration en N-NOZ
dans le milieu de réserve est 200 ug/ml. Les comptages bactériens ont été effectués par la méthode de
ZUlHEflilAN et al.
(J 978)
La flèche indique le moment du changement de milieu.

---

-
98-
Après quelques heures d'accoutumance au nouveau milieu, la source d'é-
nergie qui est toujours disponible dans le milieu est mieux utilisée. Ce
phénomène entraîne un surplus d'énergie dans la cellule qui est alors
stockée. A cet instant, la quantité en ADP et AMP diminue augmentant ainsi
la charge en adenylates et par conséquent la concentration en ATP. Ceci
explique la remontée de cette dernière que nous observons dans l'effluent.
Les faits ci-dessus rejoignent l'affirmation de KARL (1980) "Lorsque les
cellules bactériennes sont maintenues sous des conditions environnementa-
les de stress (toxicité induite par des métaux lourds, des matières orga-
niques, l'absence du nitriment essentiel ou des antibiotiques) et que la
source d'énergie est disponible dans le milieu pour la régénération de
l'ATP, l'état originel de sa concentration est restauré même si les taux
d'utilisation et de biosynthèse sont significativement altérés ll •
L'effet litière se traduit par une nette augmentation du N-NO
rési-
Z
duel dans l'effluent. Elle est le reflet de la baisse du taux de nitrifi-
cation dans la cuve. Nous remarquons que cet effet est plus prononcé sur
le sol. Nous pouvons relier ces faits :
- à la baisse du nombre de bactéries dans la cuve de culture. Nous
avons démontré chapitre II que l'utilisation du nitrite est liée à la
croissance bactérienne, par conséquent au nombre de cellules présentes
dans le milieu ;
- à la diminution de l'activité des germes restants. Nous savons que
l'oxydation des nitrites pour la formation de la biomasse carbonée demande
beaucoup d'énergie: 3 ATP pour 13 Moles de NO
oxydés. Etant donné le
Z
déficit en ATP cette fonction est momentanément bloquée laissant ainsi
dans l'effluent un peu plus de N-NO
;
Z
- à la présence dans l'extrait de substances inhibitrices tels les
acides phénoliques, les tanins (polyphenols). LODHI et al.
(1980) a donné
la composition des substances contenues dans les extraits aqueux des ai-
guilles de Pin et ayant un pouvoir inhibiteur (tableau 14).
Selon RICE et Pk1CHOLY (1974), LODHI (1977), l'acide chlorogénique
a une forte action inhibitrice sur Nitrobacter. La présence de cet acide
dans les extraits aqueux des aiguilles de Pin est à considérer dans l'é-
valuation du phénomène dTinhibition partielle que nous observons. Ainsi
malgré le fait que nous ayons ramené le pH du milieu à 7,6 (valeur idéale
pour la croissance, chapitre II), cet acide a une action. Il existe peut-
être un phénomène de synergie avec les autres composés phénoliques tels

---

-
99-
Tableau 14
CO~ŒOSITION DES EXTRAITS AQUEUX DES AIGUILLES DE PIN EN
SUBST&~CES INHIBITRICES DE LA NITRIFICATION
(d'après LODHI et al., 1980)
Composé
Détermination par chromatographie
liquide sur pap~er Wathman N° 1
acide calcique
et caractérisation par fluorescence
acide ch1orogénique
dans le bleu
quercitine
tanins (po1yphéno1)
les tanins. RICE et al.
(1973) ont démontré que 8 ppm de ces derniers
inhibent totalement Nitrobacter. L'action inhibitrice de ces composés
résulterait de leur capacité à précipiter les enzymes mibrobiens mais
aussi à former des complexes avec le substrat métabo1isab1e, le rendant
momentanément inaccessible à la bactérie. Il faut cependant croire que
Nitrobacter a une grande résistance face à tous ces composés. En effet,
l'activité nitrifiante est restaurée quelques heures après le temps d'ac-
coutumance au milieu. Ce phénomène a lieu ou coïncide avec le retour de
l'ATP à son niveau compatible avec la reprise des fonctions biosynthéti-
ques. THIBAULT et aZ.
(1982) remarquent aussi que les processus de forma-
tion du N-N0
n'est jamais totalement affecté par la présence de substan-
3
ces antimicrobiennes provenant des feuilles de sapin.
Nous venons de vo~r que l'activité antimicrobienne des extraits aqueux
des litières varie en fonction de l'espèce végétale considérée. Mais cette
activité inhibitrice n'est ni totale, ni permanente. Ceci laisse supposer
que dans la nature l'inhibition de la nitrification ne semble pas provenir
d'une perturbation du métabolisme de Nitrobacter mais plutôt de celle de
Nitrosomonas. Dans ce cas nous obtenons une limitation du processus d'oxy-
+
-
dation de NH
en N0
. Si cette première étape dans la nitrification est
4
2
inhibée, la totalité du processus l'est effectivement.

---

CONCLUSION GENERALE
Au cours de ce travail, nous avons procédé à l'isolement d'une souche
de Nitrobacter à partir d'un sol à pH acide.
Les anticorps fluorescents correspondant à cette souche ont été pré-
parés. La méthode de l'immunofluorescence sur lame nous a permis de la ca-
ractériser sérologiquement par rapport à une souche Nitrobacter Winogradskyi
ATCC 25391 pr~s comme référence. Après adsorption réciproque des sérums
pour éviter les réactions croisées, les deux souches se sont révélées
différentes.
Cette différence sérologique recouvre-t-elle des particularités physio-
logiques ? Pour répondre à cette question, la physiologie des deux souëhes
a été comparée. Elles se sont montrées distinctes. En effet:
- dans les conditions de culture pure en milieu autotrophe, la souche
Nitrobacter Winogradskyi a une capacité de croissance plus élevée
que la souche isolée ;
la cinétique d'utilisation du nitrite par Nitrobacter Winogradskyi
est plus rapide que celle de Nitrobacter LB ;
la souche LB dans des conditions de pH bas résiste m~eux, ce qu~ est
en accord avec son origine. Cependant les deux souches ont leur ma-
ximum de croissance et d'activité à un pH légèrement alcalin. Ceci
pose le problème de ce dernier au niveau du micro site. En effet
si le pH du sol pris globalement est acide}dans les microsités
il
peut être plus élevé et favoriser la survie du microorganisme ;
- leur capacité à utiliser l'azote organique comme source d'énergie
est distincte. La souche LB s'est montrée plus apte dans cette
fonction. Cette dernière est peut-être l'une des plus importantes
dans la distribution des sites en condition de substrat limitant.

---

- 101-
Il semble bien que les différences sérologiques recoupent des diffé-
rences physiologiques. Ces deux souches occupent donc des niches écologiques
différentes.
si Nitrobacter Winogradskyi est le seul genre bactérien reconnu oxydant
le nitrite dans le sol, force est de constater qu'il existe en son sein une
grande diversité sérologique. Cette dernière est corroborée par les travaux
de JOSSERAN~ (1983), STMiLEY et SCfu~IDT (1981) qui ont reconnu sept séro-
groupes dans le genre Nitrobacter.
Pour compléter ces résultats, il serait intéressant d'étudier la sta-
bilité de cette diversité :
- par une recherche des plasmides
- par la méthode d'électrophorèse bidimentionnelle. Cette méthode per-
met de rechercher les protéines spécifiques à chaque souche afin de
diminuer la réactivité immunologique de proche en proche induite par
l'emploi de bactéries entières comme antigène dans l'obtention des
anticorps.
Nous avons employé la méthode d'immunofluorescence pour les comptages
bactériens de ce travail ; les anticorps sont longs à obtenir, cependant
cette technique permet un ga~n de temps par rapport aux méthodes classiques
de ~œN et d'étalement sur plaque. Les résultats sont obtenus en 2 heures
au maximum au lieu de 15 jours au moins dans le cas du comptage ~œN.
Haleré cet avantage au niveau du temps et compte tenu de la diversité
que nous avons soulignée ci-dessus, cette méthode n'est applicable que pour
l'étude autoécologique. Pour qu'elle ait une portée générale, il faudrait
posséder les anticorps de tous les sérotypes répertoriés. De plus, elle a
le désavantage d'être globale.Elle est donc inutilisable dans les études
dans lesquelles il est nécessaire de connaître le nombre de bactéries viables.
Sachant qu'il existe bien des bactéries responsables de la nitrifica-
tion dans les sols étudiés, il reste à expliquer quels sont les facteurs
qui ralentissent ce phénomène, c'est dans ce sens que nous avons recherché
l'influence que peuvent exercer les produits de la décomposition des li-
tières sur la nitrification. En conséquence de quoi nous avons réalisé
deux types d'expériences
- sur le terrain en disposant du matériel végétal sur des parcelles
de 1m2. Nous avons montré que la nitrification dans les sols sous-
jacents des litières variait selon l'espèce végétale;

---

- 102 -
- la nitrification est nulle en période automnale sous les litières
des deux Graminées : Agrostis setacea et MoZinia caeruZea. La
constitution de stock mesurable n'a lieu qu'au printemps;
- l'azote minéralisé sous les litières d'Erica ciZiaris compense
exactement l'assimilation par les microorganismes telluriques;
- la minéralisation est stimulée par les apports en azote assimilable
des produits de décomposition des litières d'UZex europaeus ;
- le phénomène ci-dessus est identique sous les litières de BetuZa
pubescens. Elle cesse avec la disparition des litières donc de la
source en azote assimilable par les nitrifiants. Ceci montre la
dépendance de ces microorganismes vis-à-vis des appotts externes
- la nitrification sous les litières de pinus maritimus est faible
et n'a lieu que pendant la première année de dépôt sur le terrain
- la libération de matière favorable à la nitrification est visible
sous les litières de Quercus peduncuZata.
A la lumière de toutes ces expériences d'incubation, l'information la
plus importante qui se dégage est l'absence d'une évolution brutale de la
nitrification après les apports de litières, l.es litières d'Erica ciZiaris
entraînent un arrêt dans la constitution de stock d'azote nitrique et ni-
treux mesurables. Toutes ces manipulations ne nous ayant pas donné d'in-
,
formation sur les bactéries responsables de cette activité, nous avons
envisagé une expérimentation au laboratoire avec les extraits aqueux de
trois espèces végétales.
Pour aborder le problème nous avons utilisé un chémostat conçu dans
le laboratoire. Après avoir surmonté toutes les difficultés de m~se au
point, il nous a donné satisfaction. Nous avons pu/obtenir des cultures
avec une majorité de germes viables et un bon maintien des conditions de
stérilité.
Ce dernier nous a perrns de r:J.ontrer sur des populations constantes de
nitrifiants dans le même état physiologique :
- que l'activité nitrifiante des germes n'est pas perturbée par la
présence des extraits de litière d'UZex europaeus. Qu'elle baisse
si le milieu contient soit des extraits aqueux d'Erica ciZiaris,
soit de Pinus maritimus. L'action des composés contenus dans ces

---

- 103.-
extrai ts
est de
courte durée, les bactéries devenant indifférentes
à leur présence au bout de quelques heures d'adaptation;
- que le nombre de germes dans le milieu n'est pas influencé par des
extraits d'Ulex europaeus. Par contre une petite mortalité est ~n­
duite par les extraits aqueux des litières d'Erica ciliaris ,
ceux
de Pinus maritimus ayant une action plus prononcée. Comme pour le
métabolisme une période d'accoutumance au niveau milieu annihile
tous ces effets
- que l'ATP cellulaire est très sensible à l'introduction des extraits
aqueux dans le milieu de culture. Elle indique le stress subi par
les nitrifiants en diminuant en proportion dans les cellules bactériennes.
Pour que ce travail pu~sse avoir une portée plus générale il eut fallu
pouvoir disposer d'un plus grand nombre de souches. Mais les difficultés
rencontrées pour leur obtention et leur culture interdisaient cela dans le
cadre d'une thèse de troisième cycle.
De même il aurait été souhaitable de disposer d'analyses plus fines
quant aux composés des extraits des litières afin de réaliser des expériences
mo~ns globales.
Ce chémostat s'est avéré être un système facilitant les observations
et les analyses tout en nous permettant de nous situer le plus près possi-
ble des conditions naturelles. Son utilisation apparaît ici comme une
1
technique originale dans ce genre d'approche écolQgique.
Toutefois, nos résultats montrent que Nitrobacter est indifférente
aux composés contenus dans certaines plantes tel Ulex europaeus, ce qui
expliquerait la bonne nitrification enregistrée sur le terrain, mais que
d'autres tels ceux d'Erica ciliaris et Pinus maritimus pourraient induire
une diminution du nombre de nitrifiants et par conséquent les produits
mesurables de leur métabolisme (NO
N0 ).
Z
3

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---

LISTE DES FIGURES
Figure
Variations de la température moyenne (courbe, en OC) et de la
pluviosité (histogramme en mm) à Paimpont (d'après ROZE et
FORGEARD, 1982)
Figure
2
Profil schématique du sol de la lande étudiée
Figure
3
Applications de l'immunofluorescence en microbiologie du sol
Figure
4
Modalité de la réaction d'immunofluorescence (d'après GOLDMAN
~n FAURE et al., 1977)
A) Immunofluorescence directe
Ag) antigène
Ac) anticorps
B) Immunofluorescence indirecte
Ag) antigène
ACl) premier anticorps non fluorescent
AC2) deuxième anticorps fluorescent
Figure
5
Schéma d'un dispositif utilisant un illurninateur vertical pour
l'observation par fluorescence en lumière incidente
(d'après PLOEM, in FAURE et al., 1979)
Figure
6 :Schéma du dispositif utilisé pour les études en chémostat
Figure
7
Changement du taux de nitrification dans un chémostat contenant
Nitrobacter maintenu à un taux de dilution de O,Ol h-l
Figure
8
Cinétique de croissance de Nitrobacter en milieu liquide
Figure
9
Cinétique d'utilisation des nitrites en milieu liquide par
Nitrobacter
Figure 10
Cinétique d'utilisation du nitrite et évolution du nombre de
Nitrobacter Winogradskyi en culture pure
Figure Il
Mécanisme de production d'énergie et de formation du pouvoir
réducteur au cours de l'oxydation de N0
en N0
par Nitro-
2
3
bacter (d'après ALEEN, 1968)
Figure 12
Effet de la température et du pH sur l'activité nitrifiante
de Nitrobacter
Figure 13
Influence du pH sur le nombre de Nitrobacter incubé à la
température de 28°C
Figure 14
Cinétique de croissance de Nitrobacter en condition
d'autotrophie et de mixotrophie sur souche NLB
Figure 15
Cinétique de croissance de Nitrobacter en condition
d'autotrophie et de mixotrophie sur souche N.W
Figure 16
Croissance de Nitrobacter souche NLB en condition chimioorganotrophe
Figure 17
Evolution du nombre de bactéries en fonction du temps dans les
conditions de mixotrophie et d'autotrophie
Figure 18
Influence des extraits aqueux des litières d'Ulex eu~opaeus sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultivé en chémostat
Figure 19
Influence des extraits aqueux des litières d'Ulex eu~opaeus sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultivé en chémostat

---

113 -
Figure 20
Influence des extraits aqueux des litières d'Ulex europaeus sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter Winogradskyi cultivé en chémostat
Figure 21
Influence des extraits aqueux des litières d'Ulex europaeus sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter Winogradskyi cultivé en chémostat
Figure 22
Influence des extraits aqueux des litières d'Erica ciliaris sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultivé en chémostat
Figure 23
Influence des extraits aqueux des litières d'Erica ciliaris sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultivé en chémostat
Figure 24
Influence des extraits aqueux des litières d'Erica ciliaris sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter
:·7 cultivé en chémostat
Figure 25
Influence des extraits aqueux des litières d'Erica ciliaris sur
l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter
H cultivé en chémostat
Figure 26
Influence des extraits aqueux des litières de Pinus maritimus
sur l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter LB cultivé en chémostat
Figure 27
Influence des extraits aqueux des litières de Pinus maritimus
sur l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter W cultivé en chémostat
Figure 28
Influence des extraits aqueux des litières de Pinus maritimus
sur l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter LB cultivé en chémostat
Figure 29
Influence des extraits aqueux des litières de Pinus maritimus
sur l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter W cultivé en chémostat
Figure 30
Influence des extraits aqueux des litières de Pinus maritimus
sur l'activité nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter W cultivé en chémostat

---

LISTE DES TABLEAUX
Tableau
1
Protocole d'injection des suspens~ons antigéniques
Tableau
Z
Détermination du titre par réaction d'immunofluorescence indirecte
Tableau
3
Titration des conjugués par irnmunofluorescence directe sur lames
et sur membranes
Tableau
4
Caractérisation sérologique des souches
Tableau
5
Etude du taux de récupération des bactéries inoculées dans un
sol ou dans du charbon actif
++
Tableau
6
Influence des apports de Ca
sur la nitrification dans le sol
de la~d: N-N0
+ N-NO
miné~alisé en six semaines d'incubation
3
Z
(expr~me en
10- 3 % du po~ds de sol sec)
Tableau
7
Influence des apports de Ca++ sur la quantité de NH4 minéralisé
en six semaines d'incubation (exprimé en 10-3 % du poids de
sol sec)
Tableau
8
Teneurs en N-N03 des sols de lande incubé ~n vitro
influence
d'un apport de Ca++
Tableau
9
Schéma descriptif des manipulations effectuées pour l'obtention
des extraits
Tableau 10
Récapitulatif des manipulations effectuées sur les parties
aliquotes prélevées dans l'effluent
Tableau Il
Influence des apports de litières sur les teneurs en N-N03+
N-NOZ minéralisé en six semaines d'incubation (exprimé en
10-3 % du poids de sol sec)
Tableau 1Z
Influence des apports de litières sur les quantités de NH4
minéralisé en six semaines d'incubation (exprimé en 10-3 %
du poids de sol sec)
N03 + .NOZ
Tab leau 13
Taux de nitrification
x
100
NH4 + N03 + NOZ
sous différentes litières in situ
Tableau 14
Composition des extraits aqueux des aiguilles de Pin en subs-
tances inhibitrices de la nitrification (d'après LODHI et
al., 1980)
....

---

ANNEXES

---

DOSAGE DE L'ADENOSINE TRIPHOSPHATE PAR BIOLUMINESCENCE
Le dosage de l'ATP par bioluminescence est basé sur la mesure de la lumière émise
lors de l'interaction ATP avec la Luciferine-Luciferase et l'oxygène de l'air.
La quantité de photons émis est proportionnelle à la concentration en ATP. Un seul
photon est émis par molécule d'ATP hydrolysée.
Le mécanisme de la réaction de bioluminescence peut se résumer par les réactions
chimiques de KARL et HOLM-Hfu~SEN 1976 :
++
ATP + Luciferine + Luciferase
~~__M~g~
Luciferase - Luciferine - ~~1P + PrP
'f
'f
.
pH 7 L
'f
L
' f '
) uc~ erase +
uc~ er~ne oxy d~
co
Luc~ erase - Luc~ er~ne - A}Π+ O
ee +
2 + fu~ +
2
hv
Le dosage de l'ATP par cette méthode nécessite une extraction préalable du
nucleotide intracellulaire.
De nombreuses méthodes d'extraction de l'ATP ont été proposées dans la littérature.
Pour être valable, chacune d'elle doit répondre aux critères suivants
- comporter un traitement énergique pour détruire la paroi bactérienne. Ce traitement
doit permettre la mise en solution de l'ATP et le blocage des ATlases qui transforment
ATP en ADP.
- ne pas permettre la m~se en solution de substances pouvant gêner ou inhiber la
réaction d'émission des photons pendant la mesure de l'ATP.
- permettre une grande stabilité à long terme de l'ATP extrait.
Le temps et la température d'extraction ont une grande importance sur la quantité
d'ATP. Afin d'éviter les pertes, il est nécessaire de contrôler rigoureusement ces
facteurs.
Les principales méthodes d'extraction sont résumées dans le tableau suivant.
L'extraction de l'ATP dans les sols et les sédiments pose des problèmes. Vue la
structure physique de ces milieux, l'extraction est difficilement complète et s'ac-
compagne souvent d'une libération de cations et d'anions. Ces derniers inhibent
l'émission des photons pendant la lecture de l'ATP. C'est ainsi que pour évaluer le
taux de récupération LEE et al.
(1971), JONES et SIMON (1977) ont-ils proposé l'emploi
d'étalons internes 8/7 de t
bactériennes vivantes et de concentration en ATP connue.
Le pourcentage d'efficacité en ATP est obtenu par:
(ATP échantillon + ATP étalon interne) - ATP échantillon
% de récupération de l' ATP = '---------.------------:-=,.....-::;----=-------,------------'---------------------
ATP étalon interne

---

PROCEDES D'EXTRACTION DE L'ATP
Volume de
Composition
Méthode
Température
l' échanti Hon
du milieu
Traitement après introduction de l'échantillon
d'extraction
(OC)
(ml)
d'extraction
DMSO
0, 1
0,9 ml DMSO
20
Vortex (15 s), repos 2 mn, addition de 5 ml de Mops
13,9 mol/l
AT CA
1 ml CCl COOH
o
Repos dans un bain de glace (15 mu). Extraction de l'ATCA à l'éther
3
0,5 mol/l
diethylique 5 x 10 ml ; évaporation sous vide de l'éther; addition de
8 ml de Tris-EDTA
APC
2
1 ml HC10
o
Vortex 10 s, extraction avec 8 ml de n-octanol, vortex 10 s, centrifuga-
4
1,2 mol/l
tion 0,72 mol/I-KC03 0,16 mol/l. Elimination du KCI0
par centrifugation
4
10 mn 2000 g + 4°C. Dilution 10- 1 avec Tris EDTA
H S0
Repos dans un bain de glace (15 mn), neutralisation avec KOH 0,6 mol/l,
2
4
1 ml H2S04
°
0,6 mol/l
amener à pH 7,8, compléter à 10 ml avec de l'eau distillée. Diluer à
10- 1 avec Tris-EDTA à l'emploi
Ethanol
5 ml Ethanol
78
Bain marie bouillant (5 mn), évaporation sous courant d'azote, reprise
à 96 %
du résidu sec par 5 ml de Mops
9 m Tris
Tris
100
Bain marie bouillant (5 mn)
20 m mol/l
+ EDTA 2 m mol/l
pH 7,75
4 ml Tris
Tris-MgS0
110
Bain marie bouillant (5 mn)
4
35 m mol/l
+ MgS0
16 m
4
mol/1
pH 7,6

---

METHODE DE LECTURE DE L'ATP
La lecture de l'ATP est basée sur la réaction de bioluminescence.
++
ATP + Luciferine + Luciferase
~/
M~g~__~ Luciferase - Luciferine - A}W - PrP
"
)
Luciferase - Luciferine - A}W + O
pH 7,
Luciferase + Luciferine oxydée + CO
+ AJ.'1P
2
2 hv
Préparation de la Luciferine
Dissoudre 10 mg de D-Luciferine (sigma LTd)
dans
6 ml de tampon tris 0,02 M/l pH 7,8 ajusté avec H S0
dilué
2
4
Répartir sous atmosphère d'azote dans 6 ampoules à raison d'r ml/ampoule
soit une concentration de 1,66 mg de Luciferine dans chaque ampoule
Stocker à -20°C jusqu'à utilisation.
Préparation de la Luciferase
Dissoudre 50 mg de Luciferase (sigma Ltd)
3 ml de sérum albumine bovine à 0,3 %
dans
9 ml de mélange
6 ml (EDTA 1,5 ~~, MgS0
15mM)
4
Ajuster le pH à 7,5 avec du KOH dilué
Préparation du réactif Luciferine - Luciferase
Mélanger
ml de Luciferine
à
9 ml de Luciferase
Conserver le mélange à 4°C pendant une nuit
Centrifuger ensuite à 18 000 g pendant 10 mn
Equilibrer le mélange pendant 1 h dans le noir, avant emploi, température ambiante.
Préparation des solutions Etalons d'ATP
Dissoudre
mg d'ATP (sigma)
dans
10 ml d'eau distillée déionisée et stérile

---

,
j
j
c;OURBE ETALON DE
j
L'ATP
Préparer les solutions
j
suivantes
Solution Mo
j
Dissoudre Img d'ATP
j
dans 10 ml d'Fi20 stérile
j
soit Une
Solution
solution à
Ml
100 ug/ml
j
Diluer
0, 1 ml de
j
la solution
dans
Mo
3 ml de
j
tampon tris 0,02 H soit
Solution
une solution
M
à
j
3,2258 ug/ml
2
Diluer
0, 1
j
ml de la solution
dans
3
Hl
ml
j
de tampon tris 0,02 M soit
Solution
une sOlution
M
à
j
3
0,104058 ug/ml
Diluer
j
3
ml de la solution
dans
M
9
j
ml
2
de tampon tris 0,02 M soit Une
Solution
solution
j
M
à
4
0,0260145 Ug/ml
Diluer
j
ml de la solution
dans
M
j
3
7, ° ml de tampon tris 0,02 M soit une
j
solution à 0,00325 ug/ml
j
Pour réaliser la Courbe prendre
j
Sol M4
j
dans
j
soit
Vml
soit
Tml
Vt ml
(
j
)266
0,092
ul
1,5
1,592
j
0,197
49,95
1,5
1,697
j
0,453
100,35
1,5
1,953
j
200,52
0,800
1,5
2,300
j
300,69
Sol M
j
3
j
dans
soit
Vml
Tml
soit
V
j
t ml
(
0,100
)266 ul
1,5
j
1,600
0,200
432,49
1,5
j
1,700
814,10
0,275
1,5
j
1,775
10 72,09
0,450
1,5
j
1> 950
1596,89
0,650
1> 5
j
2> 150
2092,05
0,850
j
1 >5
2,350
2502,93
j
j
j
j
j
j
j
j
J

---

/
..
Joseph Gama Tchimbakala : Nitrification autotrophe dans un sol acide de
lande. Etude en milieu renouvelé de l'effet litière sur des populations
de Nitrob.;:tcter.
Thèse 3e çycle.
IIBp. Université de Rennes I.
RESUME
Cette thèse est une étude écologiqu~' du phénomène de nitrification
autotrophe dans un sol acide de lande. De ce der'nier. nous avons isolé
•
f;..,
une souche de Nitrobacter. Nous avons montré. par la méthode d'irnrnunofluo-
.'.
rescence. qu'elle est différente du sérotype Nitrobacter Winogradskyi.
Cette diversité sérotypique. au. sein de la seule espèce reconnue dans le
genre Nitrobacter. pose le problème de l'existence de populations diffé-
,
rentes et de leur écologie dans l'habitat naturel.
l
Pour tenter de m~eux comprendre le comportement écologique. nous avons
défini la physiologie de chaque souche. En conditio~s ~utotrophes. l'acti- ,
i
.1
vité nitrifiante et la croissance de Nitrobacter Winogradskyi sont supé-
rieures. alors que la résistance aux bas pH et la crois~ance en tonditions
chimioorganotrophes sont meilleures pour la souche Nitrobacter isolée.
Nous avons m~s au point un système de milieu renouvelé afiri d'étudie~
l'effet litière au laboratoire car dans la nature les conditions d'auto-
trophie sont rarement réalisées.
Les résultats obtenu? montrent que la faible nitrific,ation s'ous les
Ericacées et les Conifères est due à une baisse d'activité et à la faible
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densité, des nitrifiants.
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Mots-clés
Nitrification - Isolement - Nitrobacter - Irnrnunoflûorescen
Sy'stème milieu renouvelé (chémostat) - Effet litière.
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