'ordre:
THESE
présentée
A L'UNIVERSITE
DE PARIS-SUD
CENTRE D'ORSAY
pour obtenir
Le grade de Docteur ès Sciences Naturelles
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par
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c. A. ,M. E. S. 1-J~tt5~~Q" .... il
Arrivee .' .~l . '!!J.
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Delphin LOUEMBE \\\\ ~~~~gi~~_OU5 na ~ ~"' "2 Il
LE DIAGNOSTIC
SEROLOGIQUE DES INFECTIONS
A PASTEURELLA
MULTOCIDA
Soutenue le
1976 devant la Commission d'Examen
MM. P. SCHAEFFER
Prhidnll
P. PERREAU
Dira/fUr de Thhe
H.H. MOLLARET
Examinateurs
PA. CAZENAVE
P. CHRISTOL
A la.
mémoire
de
mon
frère
Paulin
LOEMBE
Au delà de la mort, puisse-t-il comprendre combien,
aujourd'hui, ma première pensée va vers lui.
A toute
ma
famille
Que ce modeste travail soit un témoignage de mon
amour filial et de ma reconnaissance pour tous
les sacrifices qu'ils se sont imposés pour moi.
Ce travail a été effectué au sein d'un Insti tut de Recherches Appliquées,
l'Insti tut d'Elevage et de Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux (I.E.M.V. T.)
à NAISONS-ALFORT, et je tiens à remercier 1"lonsieur M. 'lli0r-1E, Directeur Général
de l'I.E.M.V.T., pour l'hospitalité qui m'était accordée.
Ma dette envers le Docteur p. PERREAU est immense. C'est dans son labora-
toire et sous sa direction que cette étude a été effectuée. le profond respect
que ,je lui porte n'est que le faible tribut de ma. recormaissance.
Je suis très sensible à l'honneur que m'a fait Monsieur le Professeur P.
SCHAEFFER en acceptant de présid~r mon jury; qu'il me soit permis d'exprimer
ici les sentiments de déférence que je lui porte et de le remercier pour sa
bienveillance.
Messieurs les Professeurs H.H. ~ULLAP~T de l'Université Paris-Ouest, P.Ao
CAZEITAVE de l'Université Pierre et Marie Curie (Paris VI) et D. CHRIS'IOL de
l'Universi té Paris VII, ont bien voulll. accepter de faire partie de mon jury
de thèse; je leur en sais gré.
Je tiens aussi à remercier vivement
- Monsieur Mo roUlliE, du Laboratoire de Recherches Vétérinaires du Séné-
gal à Dakar, qui a bien voulu procéder à l'infection expérimentale de
deux bovins et m'en fouxnir les sérums.
- Monsieur Ao PROVOST, Directeur du laboratoire do It'archa, à N'Djamena
(Tchad) et ~kmsieur J.C. HAUMESSER, du Laboratoire de l'Elevage à
Niamey (Niger), qui m'ont approvisiormé en sérums de zébus.
Mes remerciements vont enfin à Messieurs C. IE GOFF, AG BREARD, Co
BRIERE pour leur concours technique et amical ; et à Madame M. SOHAIŒA
pour son dévouement inlassable dans la. dactylogr:-aphie de cette thèse.
.~........_~.•;..~-----~--~ ........
LE DIAGNOS'I'IC SEROLOGIC{UE DES IN7ECTIONS A ?A5'l'EURELLA NlJUrOCIDA
PREIvIIERE
A. I~ŒECTIONS A rA§TElùlli~~TOCID1\\ •••••••••••••••••••••••••••••
B. j'U CROBI OLOGIE De .rj\\....'f~.b1!..A IlULTOCI DA
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c. CONSTIYUTIO~ Al1TIGENIQUB ST C~)SIFICATION SSROLOGIQUE
DE 1?.l\\.3TEURE LL.A. lVfUL:rOC_1.l!.a. •• Il •• " •••••• li • o •••••••••• 0 • 0 0 0 0 • 0 • 0 •• 0 Go
9
D. C01'il'JAlSSANCES ACTUi:LLSS sm LA. ILSPONS~~ IM11UNITAIRE AUX
EIFECTIOl';S A l:A§TE1JRELLA HULTOClP.A •••••••••••••••••••••••••••••
15
E. OBJET DE LIE TU1JL •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
1 9
DEUXIENE
P1I.RTIE
A. SOUCHES IlE rAS~;UTI.Eu.A, fiIULTOCIDA ET HILIEU DE CULTü1Œ DO........
20
B. PlillPARATIONS DES IHI·'jUNSEHTJ}lS DE TYPE •••••••••••••••••••••••••••
21
C. SERUMS BTUDIES
22
D. NE'mODES D'EXTRACTION DES FRACTIONS AN'TIGENIQUES
24
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E. NETHODE BIOŒHiiIQUF. : ELECTROPHORESE EN GBL DE
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F. IIlETHODES SEROIDGIQUES
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A. Al'JALYSE ELECTROPHOHETIQUE EN GEL DE POLYACRY1.Ar'ITDE
DE LA STRUCTUIŒ PROTF':IQUE DE PASTEjJRELLA }lULTOCIDA ••••••••••• . 3 5
B. ~~ROTYPIE DES ANTIGENES SO~îATIQU~S ••••••••••••••••••••••••••••
40
C. IDFJ·iTIFICNrIOH DG L ' ANTIGEl'lE VACCINANT 0 ••••••• 000 •• 0 ...... .., ••••
44
D. STANDAfillISATION DES TESTS SEROLOGIQlJT2S
63
E. APPLICATIONS ET VA1El~ DE CES TESTS •••••••••••••••••••••••••••
78
QUATlUEHE
PAR'I'IE
LQONCw.sIQhs: :~frÜîKilil37 .....••..••.•..•..•••.•...•..•.•.....•...•.
103
1.- l N T R 0 DUC T ION
1) DEFINITI ON
2) PASTEURELLOSES ANIMAIES
3) PASTElffiELWSES H1JI\\1AINES
1) TAXONOmE
2) BACTERIOLOGIE
3) VARIATIONS DES CARACTERES DES COLONIES
4) POUVOIR PATHOGENE EXPERIMENTAL
5) PNrHOGENIE
6) RESERVOIRS DE ~TEUREIM }ruLWCIDÂ
C.
CONSTITUTION ANTIGENIQUE DE PASTEURELLA MULTOCIDA ET CLASSIFICATIONS
SEROLOGI -DES
1) CONSTITUTION ANTIGENIQUE
2) CLASSIFICATIONS SEROLOGIQUES
3) D.ISTIUËÜTION. DES SEHOTYPES DANS LES INF'ECTIO:NS
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3) REPONsE"'X ~1EDIA'l'ION CELLULAIRE
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-1-
1.- l N T R 0 DUC T ION
A. !nmsC1Û?NS APASTEURELLA MUL'IDCID:A7
1) DEFINITIO)i
Le terme de pasteurellose désigne de nos jours toutes les infections
dans lesquelles intervient à titre primaire ou secondaire l'un ou l'autre
des sérotypes de P. multocidé\\,. Répandues un peu partout dans le monde en"<J
tier, les pasteurelloses affectent aussi bien les animaux à sang chaud
(mammifères et oiseaux), que 11 homme. La. gravi té de certaines formes de
cette maladie, aux conséquences médicales et économiques parfois désas-
teuses, explique l'intérêt que, depuis fort longtemps, les pathologistes
attachen t à l'étude de ces infections.
2) PA,STEURELLOSES ANII1AŒ1i
Elles touchent surtout les ruminants domestiques et sauvages, les por-
cins, les rongeurs et les oiseaux ; dans les autres espèces animales (équi-
dés, carnivores), la pasteurellose à P • .m.ultocida est rarissime bien qu'on
ait montré qui elles hébergent en proportion variable (60 à 9::l %) des pas-
teurelles virulentes dans leurs premières voi~s respiratoires.
le pouvoir pathogène du germe varie également, depuis les souches bau-
tement virulentes (cas du choléra aviaire et de la septicémie hémorrag:i.q~
des bovins) jusqu'aux souches saprophytes des voies aériennes et digesti-
vos ..
Pendant longtemps et en raison des isolements fréquents de P. multocida
dans la majorité des cas de septicémie hémorragique des bovins, pasteurel-
J:u,se et septicémie hémorragique tendirent à devenir synonymes ; très vite
,il est apparu que nombre dl infections à P. m;yltocjj,a, ne provoquaient pas
de septicémie hémorragique et qu' inversemen t beaucc. ...p de cas de septicémie
hémorragique n'étaient pas dus au genre Pasteurella ; ce sont Roberts
(1947) et après lui Ochi (1952) qui montrèrent que la septicémie. hémorra-
gique était_ une forme particulière de la pasteurellose.
On distingue donc sur le plan clinique :
a) des septicémies à évolution foudroyante (Choléra aviaire, septicémie
hémorragique des boeufs et des buffles, septicémie des agneaux) mor-
telles en 24 heures.
des pneumonies et pleuropneumonies des ~lmjnants,.du porc, des ron-
geurs ; ce qui démontre le tropisme respiratoire fréquent de 1:.
multocida.
-2-
c) dos infections localisées à certains tissus
encéphalites, mammites,
arthrites, rhinites.
d) des abcès à localisatiol1fJ très diverses chez les bovins, les lapins,
les poules.
Dans le choléra aviaire et ln. septicémie hémorragique des bovins et des
buffles, la présence d'un agen t pathogène associ é à g. nrultQ.ci<!ê., n'a jamais
été établie, ce qui signifie que .P. multo_cj.~ en est le seul agent causal
l'inoculation expérimentale des souches provoque d'ailleurs une maladie
mortelle.
Chez l'homme, les infections à ~ultocida apr~s avoir été considérées
pendant longtemps comme exceptionnelles, apparaissent aujourd'hui comme non
rares bien qu'elles aient toujours un caractère d'accident. Nous distingue-
rons trois grands groupes de maniféstations cliniques :
a) des infections àr~A!tocidâ les plus fréquentes et les mieux con-
nues surviennent à la sui te soit de IIJOrsures (chien, chat, lapin,
rat), soit de griffades (chat, rat, volailles). le transmission peut
se faire aussi par l'intermédiaire d'un végétal piquant, par des ins-
truments ménagers, de laboratoire ou agricole, souillés par des se-
crétions ou déjeotions animales. Dans les infections non dues à des
morsures, des griffades ou des blessures, les voies respiratoire et
digestive servent probablement de porto d'entrée.
b) des infections septicémiques (Bearn, 1955), (Hannegan, 1966), (Nor-
mann, 1971), (Brisou, 1972), (Hérault, 1975).
c) des lésions purulentes assez fréquentes:
des méningites (Benoit et coll., 1972) souvent associées à des
traumatismes craniens,
- des bronchiectasies généralement associées à des sinusites (Olsen
et Needhnm, 1952),
- des otites, des mastoïdites, des péritonites (Coghlam, 1958), des
endocardites (Gump et coll., 1972), d'arthrites aiguës (Reinert
et coll., 1972), des pleurésies, des abcès du oerveau (Larsen,
1969), du foie, de l'appendice, des abcès péri-amygdaliens, des
conjonctivites, etc.
......---_.,. --".'-----,,"'.
-3-
1) TAXONOMIE
Les microorganismes classés aujourd'hui dans l'espèce PRste1!1'elJ-.a mult.Q-
.9l.<!,Q,. sont connus depuis 1878 lorsque Ki tt isola pour la première fois l' a-
gent causal d'une maladie du porc.
Sans faire l'historique, nous voudrions seulement rappeler que les pre-
miers isolements de souches de P. aultocida par divers chercheurs ont
introduit dans la littérature plusieurs appellations pour un m~me germe.
Hueppe en 1886 l'appela Bacillus se.:R.ticaemia haemorrhsgicae ; Lehmann
en 1889 BacteriumJultocidum ; Trovisan en 1889 .p.fl.steurella ; Ki tt en 1893
13Acterium biPRl!JJ;i~ et KrUS€)
en 1896 Baçillus boyisepticao
Ce n'est qu'en 1939 qu'apparaît le terme de P~teurella IDu}tocida propo-
sé par Rosenbusch et Merchant et définitivement admis aujourd'hui, lorsqu'
ils montr6nt que toutes 18s souches humaines et animales de ce germe sépa-
rées dans la cÙlssification zoologique publiée cn 1~1 par Lignières (olt
chaque souche est baptisée en fonction de l'espèce animale hOte) possèdent
les mêmes caractères biochimiques. Ces observations sont confirmées en An-
gleterre par l'équipe de Topley et Wilson, 1964.
Selon la classification de Prevost, la position de .~~ dans la
systématique bactérienne, était la suivante:
Embranchement : Schizomycètes
Sous-embranchement ; Eubacteria
Classe : Asporulales
Ordre : Bacteriales
Famille : Parvobacteriaceae
Tribu
Pasteurellae
Genre
lJ?s teure11a.
Espèce : Pasteurella multocida
A la sui te dl études taxonomiques (Ven loghem, 1944, Talbot et Sneath,
1960, Malleret, 1966) le genre Pasteurella, qui regroupait plusieurs espèces
très différentes les unes des autres tant par leurs exigences culturales que
par les maladies qu'elles entrainaient, est aujourd'hui demembré en trois
genres :
-4-
Genre .PD.ste'LJ.!'~
Genre Francisella
L-,pultoc:ldo.
Y. pestis (ex.: P. -p.e§ti~
.L-.m.lAssezzil. ou .l&~j;y.
W'culosi§. (ex.: l'.... pseudo.-
.tlJ..b8J:.Q.ulofli..a.)
F
novi
0
ciiÙ\\
Y. enterocoli tic,[l. (ex.: PoXo)
Po haeDolytica VD.rourcq§.
Ainsi le genre Paste~~~l~ nû renf8~e plus que quatre espèces dont P.
nultocida constituant l'espèce-typo.
- -
Ce déo0li1brement de l' nncicn genre Pastcurella et la création des genres
Yersinin, (rnngG actuellement dans ln fDLJille des Enterobacteriaceace) et
Frnncisclla concordent bien meux avec les réalités cliniquos et mcrobio-
logiques.
Dans L~ dernière édition du BergGY's Manual (1974), le genre PasteUl'el-
~ considéré co~e ayant une affiliation incertaine, est inclus dnns le
grand groupe des bactéries gram-négatives à anaérobiose facultative aux cÔ-
tés des genres Actinobacillus, Chromobacteriuo
~vobacteri~ Hemo~p~lus,
J
Streptobacill1ll'!..
2) BACTERIOLOGIE
a) l1orphologie
Observée à l'état frais, P. cultocida se présente sous la forDe d'un
peU t coccobo.cille isolé, long de 0,5 à 1,5". ; après plusieurs subcul-
tures, le polyoorphisme devient important et des fo~es très longues de
2 à 4)1 peuvent appa.ra1tre.
Les souches réceucent isolées possèdent une capsule Dise en évidence
par la néthode à l'encro de chine de Duguid (1951) ou colle au bleu al-
cian de Bnin (1953) et de Gurr (1956) ou encore celle de Smith (1958 )
cette capsulo varie grandement en épaisseur et en composition; selon
les sérotypes 0
Innobilc et non sporulée, cette bactérie gr~négative présente dans
les cultures jeunes et les produits pathologiques, un aspect caractéris-
tique de coloration bipolaire avec le bleu de toluidine, la thionine
phéniquée ou le Hay Grunwald-Gieosa.
..........
..
----_.._--.-._.. - - ..
- '
..,
·-5-
b) .9§:!:aetères culturaux
GDrme aérobie-anaérobie facultatif, .P"J!.uJJ:..Q2~ peut cultiver sur
les milieux nutritifs ordinaires non enrichis, mais la culture est très
améliorée par l'addition au mlieu de sa..'1g ou de sérum à 5 p. 100. L'op-
timUIJ de croissance est obtenu pour une température de 37-3S°C et un pH
do 7,2-7,4.
Après 18 h de culture en bouillon, on note la présence d'un trouble
homogène de fnible opacité, avec des ondes si on agite; quelquefois un
voile fin irisé envahit la surface. Sur gélose, les colonies jeunes sont
petites, plates, lisses, rondes, d'opalcscuncc bleuntre, de 1 à 2 mm de
diamètre, à contour régulier. A l'ouverture de la boîte, s'exhale une
odeur caract8ristiquc de la culture, qu'il est bien difficile de défir~r.
En gélose profonde, .P ... .JJlultocidn pousse sur toute la hnuteur du tubo
avec une petite zone sans culture à quelques mm sous la sttrfnce du m-
lieu.
c) Propriétés biocffi;ïigu"es
Elles sont résumées dans le tableau nO 1.
Parmi celles-ci, on retiendra particulièrement
l'absence de culturo en eau de levure, caractère différentiel im-
portant d'avec les Entérobactéries,
- l'absence d'uréaee et de gélatinase,
- la fermentation de nombreux hydrates de carbone sans production de
gaz,
- l'indole classiquement + peut être exceptionnellement - •
T A BLE A U
nO 1
Propriétés biochimiques
Température optimale
Hémolyse
Anaérobiose facultative
Lactose
Hobili té
~ -g:llactosidase
Eau de levure
Glucose
+
Oxydase
Saccharose
+
Indole
!1mmi toI
+
Hi'
Galactose
+
Levulose
Urée
+
l'lannose
Réduction des nitrates
+
+
Haltose
variable
A.H.C.
Rharnnosc
Catalase
+
Glycerol
Gélose Mac Conkey
Gélatine
Salicine
-6-
3) VAlUATIONS DES C.àRACTEnES DES COWNIES
--
.
,.,
.
a) Princj~les Sissocij4tions
Comme chez un grand nOBbre dl espèces bactériennos, les colonios de
P. nultocida peuvant facilement se dissocier. Cotte dissociation étudiée
pur De Kruif (1921) ; \\;lcbster ct Burn (1926) ; Pri tchett, Beaudette et
Hugues (1930) ; ~lberg ot coll. (1950) ; Carter (1953) ; London et coll.
(1 957) llpparaH après un certain noo.bre de repiquages ct d' autant plu.s
rapidooont que le r:rl.ileu n' n.pporte pas tous le3 éléments nutritifs ap-
propriés
le vieillissenent des cultures à la température de l'étuve
accélère cette dissociation.
En pratique, trois principaux types de colonies peuvent être distin-
gués sur milieu solide à l'aide du stéréomicroscope en lur:ri.ère transmise
obliquement à 45° ou par la réaction produite par les suspensions épais-
ses de bactéries dans J.'llcriflavino à 1 p. 1000 (Carter, 1957).
- les variants fluorescents ou irisés, à colonies Duqueuscs ou non,
- les variants bleus ou gris-bleu, qui ont perdu leur antigène cap-
sulaire,
les variants R, à colonies irrégulières, de couleur gris jaunâtre.
Carter (1957) pour éviter toute confusion entre les diverses dénomi-
nations données aux variants, a proposé les termes de Mucoïde, Smooth
et Rough pour les désigner.
b) Relation entre l.e pouvoir pathogène de P. nultocida. et l'état .de di~
.sociiJ,-ciQn
L'importance des phénomènes de dissociation a.pparaît aU niveau de ln
structure antigénique, du pouvoir Pllt~logène et immunisant. De Kruif cm
1923 avait déjà noté des différences de pouvoir pathogène entre les Vll-
riro1ts qu'il étudiait; cette constatation nia pu que sc confirmer et
l'ensemble des travaux (Carter et Bain, 1960) montre que
• les souches muqueuses sont de virulence très variable pour la sou-
ris, toujours capsulées et faciles à typer (Carter et Bigland,
1953) ,
• les souchos Smooth irisées sont considérées par tous les auteurs
comme la forme ln plus hautement virulente i elles sont capsulées
et faciles à typer,
.•
~""--.;:~,~.~.~.~-,!",,"'·I_-""'.,"""'--"""'_---
~~
~_''''''·''',"i,,,,,._o;o·O'''D~_"'''.o!!l
....~.,
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, .._.'-'"-t-.,.".
-7-
• les souches Smooth non-irisées (SR) ont une virulence en général
conservée, elles ont perdu leur antigène de type capsulaire et sont
donc non typu';.J1es (Carter, 1957) ,
• les souches Rough se montrent non pathogènes et sont impossibles à
typer ; cependa~t, on peut quelquefois identifier leur sérotype 80-
n~tique (antigène de paroi) (Anderson et coll., 1929).
Les souches Smooth qui ont perdu leur "iridescence" peuvent parfois
la retrouver par passage sur la souris ou l'embryon de poulet.
L'entretien et la conservation en bon état antigénique des souches de
P. pultocida exigent donc, à cause de la faculté remarquable de dissocia-
tion de ces souches, des conditions inpératives qu'il convient de signa-
ler ici, en conclusion de ce paragraphe.
En colture sur gélose ou en bouillon, les souches mises au réfrigéra-
teur à 4°C, disparaissent en une semine environ.
10 culturo en piqÜXe centrale dons la gélose demi-molle (5 po 1000),
à la teopérature du laboratoire et à l'abri de la lumière, assure aUX
souchas une survie de plusieurs seonines au moins.
Congelées à -20°C ou -30°C, elles se conservent six mois et si elles
sont lyophilisées, dix ons ; co sont donc les procédés de choix, qui
devront ~tre eoployés si on veut maintenir les souches au stade ~coïde
ou Smooth, soit sous forDe de sang virulent, soit sous fOrrJe de cultures
très jeunes, de 15 à 18 heures au I!larimum car les séjours plus longs à
l'étuve entrainent leur dissociation.
lorsque les cultures sont simplement à congeler, il es t nûcessaire
de leur ajouter une substance protectrice (sérum animal, lait écrémé,
po lyvinylpyrrolidone, etc.).
Notons enfin que les pasteurelles sont tuées par le simple chauffage
à 55 ou 6O·c et par l'action des antiseptiques habituels (eau de javel,
alcool, iode ••• )
dans les cadavres, la résistance à la putrefaction
est de durée très variable.
4) POUVOIR PATHOGENE EXPERIr.fSN~L
On peut reproduire expérimentalement chez un animal toutes les manifes-
tations cliniques observées au cours de l'infection spontanée. Les voies
d'inoculation sont diverses (voies sous-cutanGe, intraveineuse, intramus-
culaire, intrapéritonéale). le pouvoir pathogène expérimental varie avec
..~
-8-
les espèces animales selon les souches, leur état de dissociation et les
sérotypes (présentés à L~ page 12).
La grande najorité des souches virulentes de P. puJtocidJl est hautencnt
pathogénique pour la souris et le lapin qui sont les animaux de choix uti-
lisés au laboratoire ; uvec les souchee B et E, la dose léthale expérimen-
tale pour la souris est de 0,1 ml d'une culturo de 6 heures à la dilution
9
10- , c'est-à-dire 1 à 2 gerQes seulement par voie intrapéritonéale ; la
3
dose léthale pour un bouvillon de un an est de 1 ml x 10-
par voie sous-
cutanée. Les volailles se montrent réfractaires au sérotype B qui tue les
buffles et les boeufs par inoculation sous-cutanée ou intramusculaire à la
dose d'environ 20.000 organisIaes. Bain (1954) a montré que pour tuer des
porcs avec le sérotype B, il fallait 10.000 doses léthales/buffle.
Quant aux souches A et D, la dose létmle pour la souris est souvent de
0,1 ml x 10-4 ou 10-5 • Mais il arrive que cette valeur soi t plus faible
en effet au cours d'une de nos expériences, nous avons observé que certai-
nes souches de P. multocida type A isolées de canards, tuaient les souris
à la dose de 0,1 ml x 10-9 •
5) PATHOGENIE
Ln pathogénie de l'infection à J. multoci~ est encore assez mal connue.
La. virulence des germes est favorisée par l'affaiblissement de la résistan-
ce de l' hôte après une maladie infectieuse, un refroidisseœnt, un déséqui-
libre alimentaire, une infestation parusi taire ou tout autre facteur dï.m-
nuant les défenses de l'organisme. Seuls le choléra aviaire et la septicéIaie
hérJolTagique des bovins évoluent sans l'intervention de facteurs favorisants
connus.
Le pouvoir pathogène propre de la bactérie est imputable sans nul doute
àla présence d'une endotoxine dont les effets sont identiques à celle des
entérobactéries (Perreau et Petit, 1963 ; Rebers, Heddleston et Rhoades,
1967 et 1974) •
En plus de l'endotoxine, certains auteurs dont Muller et Krasemarin (1 974)
voient en la neuraminidase, enzyme isolée de souches virulentes de f~~
toci~, un des facteurs responsables de la disséIaination du germe dans
l'organisme atteint.
6) RESERVOIRS pEJlL M!J14.TOCIDA
Les animaux constituent en pratique
le vrai réservoir des pasteurelles.
Dans la majorité des cas, P. multocida se trouve à l'état saprophyte dans
-9-
les preoières voies respiratoires et ne devient pathogène par oultiplica-
tion que lors d'une dininution de la résistance du terrain. Les hun3ins
égnleoent peuvent héberger des pasteurclles dans leurs cavités naturelles
BOOS pour ce~.a présenter des signes cliniques de maladie.
Les porteurs sains, chez les bovins et le3 porcins, représentent un
pourcen tage variant de 8 à 12 p. 100 des onioaux exnBinés.
OONSTITUTION ANTIGEN"IQTJE DE P. :NULTOCID
C.
ET C~SSIFICATIONS SEROLOGI-UES
1) ,ÇONSTlTUTION ANTIGENIQUE
L'identification des antigènes de P. m.ultocidn, a fait l'objet de très
anciens et nombreux travaux dont certains I:léri ten t dl être rappelés ici.
Hoffenreich en 1928 et Dingla en 1934 obtiennent à partir de souche de
P. multocida des polysaccharides sérologiquement actifs.
Yusef (1935) isole d'une souche de P. multocida des substances capsu-
L~es douées de spécificité sérolOgique.
En 1938, Pirosky, utilisant la I!léthode de Boivin et Hesrobeanu, extrui t
un cODplexe lipopolyosidique auquel il reconna1t une spécificité sérologi-
que ainsi que des propriétés toxiques et ionunisantes.
Carter (1952) extrait, par chauffag-3 à 56°C d'une suspension en séruo.
physiologique de gernes entiers, des antigènes solubles spécifiques de type
et, en 1953, il en donne avec .Armau la nature chioiquc : cc sont des poly-
saccharides qu'ils distinguent de l'antigène de Boivin.
Un polysaccharide rendant inagglutinable les souches par leur antisérun
hODologue et identifié à l'acide hyaluronique est isolé en D~oe temps par
Carter (1953) et Bain (1953) à partir des souches A et D de P. oultocida.
Bain (1955), par précipitation isoélectrique d'une solution dialysée de
substances capsulaires extraites sclon la Déthode d'Amies (1951), isple à
côté de quantités variables de polyosides et de lipopolyosides, un cooplexe
protéique. Cotte fraction confère une iQmunité active aux souris, supprime
le pouvoir protecteur des antisérums de lapin contre les germes vivants et
fixe 10 complément dans les sérums de bovins.
Les analyses faites par Stamatin (1958), Dhanda (1960), Mukkur et coll.
(1972), donnent des résultats analogues et laissent pressentir l'importance
de ce complexe antigénique capsulaire sur le plan de l'iomunologie •
....
-10-
Mac Iennan et RondIe (1957) extraient du type V l.ID lipopolysaccharide
spécifique de type; en 1961, Bain et Knox vont aussi isoler du type l le
même lipopolysaccharide spécifique de type par extraction au phénol. Ils
mettent en évidence en outre leur propriété toxique et pyrob~ne et analy-
sent leur constitution chimique.
L'utilisation de bactéries traitées à l'acide chlorhydrique 1 N pendant
18 heures à 37°C a pernis à Nacri.oka et Nurata (1961), d'identifier 11 anti-
gènes somatiques, en plus des types capsulaires ùe Carter, grnce à des tests
d'agglutiIlf.ltion.
Heddleston et coll. (1966) isolent do deux souches aviaires avirulentes
de Pt D1.ÙtQcid.a (5 A et 8 A) un antigène particulnire doté de pouvoir toxi-
que et i.IJrlunogène.
En 1966, Prince et Smith publient les résultats de leurs travaux; 18
antigènes solubles sont identifiés par irnmunoélectrophorèse ; deux frac-
tions dont la première _nom.:mée
fornée en oajorité de protéines et la deu-
-Oou' 1";:--
xième nommée
d.%"ùre~li.W~;YOSidiqUe, constituent le coôplexe antigé-
nique capsulaire~spécifique ~~e ; une troisiène fraction appelée
f ~1-
li. <Il ~':',
constitue l'an1~g~~~rs0nRff~~e ; tes autres fractions seraient communes à
1 ~ (
rentre
0 ,
1
. . . ,
"C
toutes les pasteurel~es. LeomembOde d'extract~on util~see est une sinple
\\ ~ \\
OccUfllE ' ' ' '
/ ~ 1
agi tation à 37°C 'durant 30 mnutés dl une suspension de germes en sérum phy-
•
\\~v~
~~y
s~ologique ; le c&:~~~~GOC pendant une heure d'une suspension de
germes en s~ruo physiologique forwolé à 3 p. 1000 permet à Heddleston (1972)
d'obtenir, S2llS détériorer ses propriétés de spécificité de type, le lipopo-
lysacchaxide.
C'est par agitation à 4°C pendant 24 heures d'une suspension de germos
en eau physiologique suivie d'une ultra-centrifugation à 105.000 g, que
Rebers ct Kenneth (1967) isolent un conploxe a11tigénique lipopolysacchuri-
do-protéine doté de propriété toxique, iI:JI:lunisante et sérotypique.
Penn et Nagy en 1972 I:lontrent par les tests d'iLDuno-diffusion et d'iTIElu-
no-électrophorèse que les extraits bruts à l'eau physiologique ou à l'eau
phéniquée donnent deux lignes de précipitations: la première correspon-
drait à l'antigène capsulaire spécifique de type et la deuxième à l'endo-
to~e co~une aux souches E et B. Colle-ci peut donc appnraitrG COWL~e
tout ou partie de l'antigène de paroi qui détermine le sérotype somatique.
En résuné de l'ensemble des travaux concernDn t ce très complexe suje t,
ln composition chinùque de l'équipeI:lent antigénique peut être ainsi
-""::.......".-~~!'"'._............._.--~----""",."----~o:-"---.---,,,":,,----'''''---'''''''------- ...~._-_. ~
-Î1-
résunée
a) un ou des polyosides simples, constituants de la capsule et diffu-
sant dans le milieu (Knox et Bain, 1960) ; ils se cooportent COQffie
des haptènes
ils sont iomunologiqueuent actifs lorsqu'ils restent
associés à une fruction protéique. Ils absorbent une partie Th~is non
la totalité du pouvoir immunisant des serums contre les bactéries
entières ; ils sont spécifiques des types capsulaires.
b) de l'acide hyaluronique associé à la capsule des v~xicnts ~[ (Carter
et Annnu, 1953 ; Carter et Byrne, 1953 ; Carter, 1955 et 1957). Ce
oucopolyoside, sérologiqueoent et ioounologiqueuent inactif, masque
les Dl1 tigènes de typ8 dfl11s les réactions sérologiques
il est en
quantit6 abondante chez les sérotypes A ct D en phase M et absent
chez les sérotypes B ct E.
c) des lipopolyosides possédant tous les caractères des endotoxines
classiques des germes gram-négatifs. Ils sont facileoent libérés du
corps bactérien et i~nunologiqueDent actifs dès qu'ils restent asso-
ciés à des fractions protéiques (Knox et Bnin, 1961 ; Rebers et coll.,
1967). Ils inhibent en partie le pouvoir protecteur du séruo. Ils
sont adsorbés par les hématies de oammifères. Les propriétés ~e sont
pas supprioées par le chauffage ni par l'action de la trypsine.
d) certaines protéines ordinaireruent associées aux fractions précédentes
apporteraient le pouvoir protectelE ; les autres peuvent jouer le rô-
le d'adjuvant ou provoquer la fOrr:Jation d'anticorps opsonisan ts qui.
run~liorent l'igmunité conférée. Tout laisse à croire donc que plu-
sieurs antigènes participent au processus d'immunisation.
e) quant à la répartition des antigènes, on parle couramoent d'antigènes
capsulaires et d'antigènes somatiques quoiqu'une extraction à l'eaU
physiologique (isotonique ou hypertonique) ou au phénol, libère un
uclango d'antigènes en proportions variables dont la nultiplicité
peut être décelée par des tests de précipitation sur gélose ou bio-
logiquement par la toxicité, 10 pouvoir pyrogène et l' hélDnggl~tina
tion (Bain et Knox, 1961 ; Penn et Nagy, 1972 ••• ).
De tous ces travaux, il faut donc retenir ln difficulté d'obtenir des
. ientités antigéniques chiuiqucoent pures J1SDe avec des oéthodes élnborées.
1
En effet i l est presqu'inpossible de préparer des antib>Bnes de type ca~
sulaire qui n'aient pas de pouvoir toxique net, inversonent la oéthode do
Westphal no per@Bt pas d'isoler à l'état pur l'endotoxine toujours contmùi-
née par les polyosides capsulaires.
-12-·
n) lLcirotypes cfill-sulnires
Diverses réactions sérologiques ont été eôployées pour classer les
souches do Pt nultoçid..Q..
10 pre[uère classification Dlt celle de Little et Lyon (1943), éta-
blie au ~oyen de tests de séro-agglutination sur Inne ; ils divisèrent
leurs souches en trois types sérologiques : 1, 2, 3 ; co systène est
actuellenent abandolUlé.
Roberts (1947), étudinnt 37 souches de pastourelles par ln séropro-
tection chez la souris, troEve quntre groupes sérologiques qui il désigne
par les types l, II, III, IV.
Ocbi (1952), à l'aide de tests d'agglutination en tube, identifie
quatre types qu'il dénoWlle A, B, C, D.
Hudson (1954) décrit un sérotype supplénentnire qu'il désigne type V
dans le schéma de Roberts et qu' aujourd' hui il est bien difficile de
retrouver.
Carter (1955), par un test d'hémagglutination passive avec des hé~
ties sensibilisées par l'antigène capsulaire, sépare quatre types séro-
logiques A. B, C, D. A cette classification s'ajoute en 1961 un cinquiè-
ne sérotype, E (Carter, 1961 ; Perreau, 1961) ; mais peu après le type
C est abandonné (Carter, 1963).
Le tableau nO 2 tente d'établir des correspondances entre les diffé-
rents typ8S des principales classifications citées; il Y a lieu d'être
très réservé sur la valeur d'une telle cOGlparaison. En fait, on peut
seulement affimer que cos néthodes (protection de l~ souris et hénng-
glutination passive) définissent donc, selon leurs auteurs et c'est donc
tme chose prouvée pour 10. classification de Cartor, des sérotypes ~su
.~ ; l'antigène en cause SI adsorbe sur les héonties, nnis on ne sai t
pas encore avec certitude si c'est un sinple polyoside ou un lipopolyo-
side. La sérotypic par héuagg1utine,tion indirecte, selon le procédé de
Carter, est aujourd 1 hui ln seule rJéthode cOOL1ode pour identifier les
quatre sérotypes A, :3, D et L.
b) .Sé;::omes soqatiaues
Aucune étude n'avait été consacrée à l'identification et à la classi-
fication dos souches de P. Dg1tocida à partir de leurs antigènes
· ,.,
-13-
somatiques jusqu'en 1961, date à lnquelle Nar:ù.oka et r-1uratll firent con-
naître le parti qui peut être tiré de l'identification des antigènes
somatiques pour la classification sérologique de P. au.ltocida. Ils
ont
donc déterminé par un test d'agglutination utilisant des bactéries trai-
tées par l'acidechlorhydrique, 12 antigènes sOr.k~tiques spécifiques de
type. En combinant les antigènes capsulaires et les antigènes sooatiques
déjà déteroinés pour expriuer le type sérologique chez P. oult~cjdA, on
obtie~drait jusqu'à oaintenant 15 sérotypes chez P. nultoci~ (cf.
tableau nO 3).
T A BLE A U
nO 2
Correspondance entre les sérotypes capsulaires de Carter
et ceux de Roberts (selon Prodjohnrjono, Carter, Cormer, 1974)
•
Types Carter
A
B
D
pas
Types Roberts
II
III
IV
l
V
d'équivalent
T A BLE il U
nO 3
Rcl~tion ontr8 l~D typco c~pDulnirco
et les types somatiquûs actuels (d'après Namioka, 1970)
Il en ressort qu'à l'intGrLur d'ml neœ oérotype capsulaire, existent
plusieurs types somatiques.
Types capsulnires
A
B
D
E
Types sooatiques
1, 3, 5*, 7, 8*, 9*
6**, 11
1, 2, 3, 4, 10, 1 2
6**
* responnable du c1'.oléra aviaire
** sérot,ype responsable de la septicéoie hémorragique
Cependant la technique développée par NaDiokn et Murata pour la dé-
termination des antigènes sOBatiques n'est pas très utiJisée à cause
des difficultés d'obtention des sérums illonospécifiquos. Du fait de ces
très nombreuses réactions croisées, Carter et coll. (1972) ont préconi-
sé un test d'identification sérologique des antigènes somatiques par
agglutination sur plaque des g8I'I!1es de Pt R-uJ.tocim type A traités
-14-
durant 4 heures à 37°C par la hyaluronidase, à raison de 50 urùtés pour
3 Dl de suspension bactérienne.
En 1974, Prodjo~~jono, Carter et Conner tentent d'établir une nou-
vG11e cla..1Sification sooatique neLant en jeu trois détornirumts anti-
géniques baptisés a, b, c et présents sur do noobreuses souches de R.
gultocidjl de bovins. Selon quo les gerDes possèdent en Dê~e teops ou
non ces trois déterQinants antigéniques, ils identifient par aggluti-
nation rapide sur plaque quatre groupes sOLk'1tiques b, ab, bc ct abc à
11 intérieur de 30 souchos de J_'l.....llll:1J..1.Q.c.ifuJ. type A. Il restc à étondre un
tel protocole aux autres sérotypes capsulaires.
3) DISTRIBUTION DES SE.ft~S DANS ŒS INli'CC'l'IOHS (tabloau nO 4)
me A
Ce sérotype est l'agent principal du choléra aviaire; il est aussi
fréqueLIDent rencontré dans les cooplications pasteurelliques qui succè-
dent fréqueI:i1L'1ent aux infections viralos chez les porcs, les bovins, les
petits ruminants, les rongeurs. Pour autant o,u'on sache, les souches
isolées chez l' hOlllDe sont exclusiveElcnt du type A.
me B
Ce type est responsable de la septicéraie héIaorragique des bovins et
des buffles d'Asie, du Proche-Orient et d'Afrique Orientale, des bisons
d'AQérique. Il peut ~tre isolé très occasionnellcocnt chez d'autres es-
pèces aninales (ch8Val.l.'{, porcs, )Joutons).
Ce sérotypo a été fréqucwuent isolé à partir d1infcctions sporadiques
chez de no~breuses espèces. Sa distribution est tout à fait conpnrable à
celle du type A. Il apparaît, COD.1L18 cc dernier, rosponsable des pasteu-
ralloses secondaires qui, sur les diverses espèces de Ck~fères et
d'oiseaux, peuvent "sortir" à 11 occasion de causes favorables trè-:s VD.-
riées •
.Me E
Distinct du type B, il a été pour l'instant exclusivement isolé de
cas de septicémie hémorragique des bovins d'Afrique Occidentale, Cen-
trnle et Orientale.
---_.-
",.'* '-
• :ee
._--_._--,-_.._-~
-15-
T A B L 8 A U
nO 4 (sclon Perreau)
Classification sérologiquc actuelle de
~~JJa !Jultocid~
(types "capsulc.ires")
/
.E.§~scn ticlJcLent
Sc:pticéDie héoorrc.gique des
boeufs et des buffles d'.~ie,
~, ...
du Proche-06ent et de 11 Afri-
que Oriûntale, des bisons
Pas d'acide hynlu-!
" dl Ar':érique •
ronique dons le.
/
capsule •••
, Ex.c 1usi~!J.Elli.t
,
: SepticérJie héuorragique des bo-
!
1
.~.11. •••
! vins d'Afrique Occidentale et
1
,-.
LCentrale.
..-
(Noobreux types (ou sous-groupes)
1
1
! probables.
f
Très ubiauiste
- PasteuTcllose de l'homrJe
1. En quantité
- Pastcurellosû bovine
toujours ioportante
Pasteurellos8 des petits ruoi-
ÏYJ2Q..A ...
nants
Pasteurellose porcine
A9.ide hyaluro11i-
, - PasteurellosG du lapin
~capsMlaire•••
i,.- Pasteurellose des oiseaux
i 1Toobreux typos (ou nous-groupes)
e.
i probables.
En quantité variable
i
me D. •••
j
l
l,.lTbi.9.,uiste, C01:)1)O poUT le grou-
pe A.
1
1
1
1
-~.......~.,.....~~-----~~
CŒ4NAISSANCES ACTUELLES SUR LA REPONSE IMr-lliNI'I'AlRE
!
D.
i
UX INFCC'rIONS .il. P. HUL'l'OCIDA
i!
1
1
1) D1l'lUNI TE
1
1
Malgr0 la unsso considur:lblc de travaux consncrés à l'étude de l'iuf1uni-
1
!
té en Lllltière de pastcurellosc, notre conpréhension en reste encore liui tée.
1
!:
lléannoins de l'ensenble des publications quo nous avons pu lire (:3ain, 1954;
!j
ItLldson, 1954 ; Dhanda, 1966 ; C:J,llCrOn, 1970), sc dégagent eertain.:Js notions
!
de base. Chez les onil::1L'lux donestiques, cette ilJBuni té peut être natuTelle
1
(acquise grâce à une infection occulte ou clinique) ou artificielle (consé-
cutive à une vaccination).
1!l
-16-
a) II:lrluni té llq,turelle
Il en existe de noobreux exemples; c'est ainsi qu'au Tchad, Perreau,
PeUt et Tbooé (1 964), lors d'une cmq uête sur le bétail d'élevage exten-
sif, ont trouvé que 20 p. 100 des jeunes zébus eXalùnés possédaient une
ionunité relOotiveu:.ent acquise alors qu'aucun cas clinique n'avait jrunais
été signalé. En Thaïlande, Bain (1954) a enregistré chez les buffles non
vaccinés, un taux d'environ 10 p. 100 d'anioutŒ imuuns. Cette imounité
est consécutive à l'évolution d'une pasteurellose occulte le plus sou-
vent, clinique très rarCL:ent ; elle peut s'installer plus ou moins pré-
coceoent et sn durée est variable (Bain, 1954).
Elle succède à l'infection expérinentale faite par divers rodes d'i-
noculation (intrnrlusculaire, intraderoique, sous-cutanée, intraveineuse)
DaiS aussi à l'injection de vaccins dG types divers.
La nOoture de l'antigène VOocci~~t (c'est-à-dire conférant la protec-
tion) reste assez mal définie; selon Bain (1955 et 1960) et Staoatin
(1958), la fraction protéique du genre serait en grande partie responsa-
ble de l'iuounité.
Yaw et Kaknvas (1957) observent que les préparations brutes d'anti-
gènes capsulaires d'une soucbe de type B de P. Dultocida protègent les
poulets et les souris contre la souche virulente de rJêüc type, tandis
que seul
le poulot bénéficie dl un;é: protection à la sui te de l'adninis-
tration d'antigène somctique ; les facteurs ionunogènes sembleraient
donc différer avec les espèces.
Carter (1967) insiste sur la valeur de l'antigène capsulaire pour la
vaccination antipasteurellique tandis que Murata et coll. (1964) recom-
oandent que, dw1S toute iumunisation, l'antigène somatique soit prj.s en
considération.
Des expériences de protection passive réJalisées chez la souris [lvec
des antiséruos de lapins hyperiDmunisés ont uontré nettcuent (Perreau,
1961) que les antisérUBs ét.':'.ient uniqu8Elent efficaces contro l'infec-
tion par une souche de nêue type cOopsulaire ; puisque les deux séro-
types B et E utilisés dans cette expérience avaient le rJôL1c antigène
soontique (NQLùokn et Bruner, 1963), il ét[lit logique de conclure ~ue
l'antiGène capsulair(~ de tYI)G assurait seul lu protection. Penn et
-17-
Nagy en 1974 ont abouti à la nên0 conclusion. Sriv~stava (1970) estime
que les extraits de paroi protègent mieux la souris que les filtrats de
culture ou le cytoplasDG bactérien.
Il seoblerait que les gerillGS entiers iDrJunisent mieux le lapin que
des fractions séparées, c~psulaire ou somatique, CODDe le montrent les
expériences de Bapat et Sawhney (1972).
Enfin, l'efficacité d'un vaccin peut dépendre (d'une façon assez io-
précise) :
du pouvoir pathogène de la souche (HeddIeston et coll., 1970),
- de l'état de dissociation de la souche (Priestly, 1936),
- du fait que le geroe soit vivant ou tué (Sinkn, 1957).
Il est actuollenent difficile de préciser le oécanisoe d'action de
cette ionuni té.
Selon Bo.-in (1960), la phagocytose favorisée par l' activi té des anti-
corps opsonisan ts serait le ôécanisme le plus inportfu"l t,l'effet bactéri-
cide (des sérums ioouns) ne serait que très secondaire.
Bullen et Roger (1968 et 1969) invoquent surtout le pouvoir bactérios-
tatique et bactéricide des sérULls CODDe une ir:lportnnte base du nécanisoe
de défense. Paroi les facteurs sériques pt.rticipant au pouvoir bactérios-
tatique ou bactéricide en plus des anticorps spécifiques qui fixeraient
le fer, ils retiennent le complénent, car aucun effet bactériostatique
n'apparaît, lorsque l'on chauffe le sé~ protecteur à 56°C pendant 30
_oinutes. Ils constatent 8n outre que la protection produite contre ème
souche virulente de ~. oyltocid~ par l'antisérum spécifique est cooplè-
te@ent supprinée par l'injection préalable d'un composé ferrique et ils
suggèrent donc que le for qui joue un rôle important dans le métabolis-
oe bactérien est complexé par ln trnnsferrine et les inllmmoglobulines
3
1
et ?' du séruo, ce qui expliquerait en p~xtie l'effet bactériostati-
2
que, ces dernières, étant saturées et donc inactivées par l'injection
d'un sel de fer.
Elle Det en jeu des anticorps circulonts, révélés par de noobreuses ué-
thodes .sérologiques.
-18-
a) j\\.gglutina..:tion
Après sa Bise au point par Bain (1954-1955) pour détecter les aniDaux
à imuni té natureJ.1eruent acquise, ce test pratiqué sur le sé1"l.lD frais
non dilué n'ost plus, de nos jours, très utilisé pour la recherche des
anticorps.
Les oultiples essais d'euploi d'un tost d'agglutination en tubes à
des fins de sérodiagnostic, n'ont jaoais perDis d'en faire une néthode
utilisable avec confiance.
b) JWpw.ggl!!t.in..aj;J..~~
8ffectuée selon la méthode de Carter (1955), elle est de loin la plus
reconoandée (Trummet et Renky, 1959 ; Carter et Rappay, 1963 ; Perreau r
1963), tant par sa commodité technique que pour Sa sensibilité et sa hau-
te spécificité dans la recherche des anticorps sériques. Div~rs antigènes
ont été enployés : surnageant de suspension bactérienne chauffée à 56°C
pendant 30 minutes (Carter, 1955), lipopolysaccharide (Carter, 1963) ou
extraits de germes autoclavés (Baxi, 1966).
c) .:E;i,mtion Jiu ..90m"IÜéljlent
Elle est faite en général solon la technique de KOloer et euploie
souvent des antigènes totaux. Jusqu'à présent les résultats sont peu
commodes à interpréter ct les titres obtenus bien faibles, ce qui fait
que cette réaction n'est que raremc nt uti lisée.
d) I.oounoilllore.§cence
Depuis les travaux de Coons, cette néthode n'a pas encore reçu d'ap-
plication on matière de pasteurellose tant pour la recherche des anti-
'gènes (nicroorganismes figurés) que pour la recherche et le titrage des
anticorps spécifiques.
e) Séroprotectipn de J.a SQuris
Employée dl abord par Roberts (1947), cette épreuve donne satisfac-
tion pour évaluer l'~unité chez les sujets vaccinés
aucun résultat
fausseDent positif nia pas été signalé jusqu'à présent.
Elle démontre qu'une immunité certaine peut être transmise passive-
ment à un sujet neuf par injection d'immunsérum.
-19-
3) REPonSE ....\\l'1BDIATION CELLULADlE
Elle e::r..iste dans les pasteurelloses COOile dans la plupart des J:lB.laù.ies
infectieuses, mais les observations démontrant le rôle joué par les fac-
teurs ccllulairès duns Il ionnmi té globalo son t en~~re Î'é.:.rcs.
La méthode la plus utilisée pour la mettre en évidence est la recherche
de l'hypersensibilité par intradermoréaction. Vàse au point par Reilly et
coll. (1952), cette réaction pernet de détecter l'allergie des sujets. Ln
pratique, elle consiste à injecter dans le derme de l'ava~t-bras du lnalade,
0,1 cc de "pas teurelline" de Reilly (filtrat de culture). La réponse appa-
ro..ît entre la 18ène et la 24ème heure ; elle s' atténue dès la 30èmc heure
et nlest plus appréciable après trois jours. Les résultats satisfaisants
souvent donnés par cotte réaction en font une méthode de diagnostic tou-
jours utilisée aujourd'hui, mais il n'est pas certain qu'e1l8 soit très
spécifique 0
A la lUDière de cette brève~et-générale re~Je des connaissunces acquises
d.nn3 le domnine des pasteurelloses, il apparaît qu'un certain noobre de ques-
tions nlont pas encore reçu de réponse définitive, notOf,E~ent :
la connaissance de la structure nntigénique dG -p.o-f!ulJ.Q..cidJl (le. nature,
la localisation et le pouvoir imm~~ogène des différents antigènes),
le mécanisne de l' ir:uJuni té,
- la Dise au point des oéthodes sérologiques pour la détoction des anti-
corps chez les sujets infectés ou g~éris.
Ces problèmes exigent sans doute, pour être résolus, de multiples tra-
~aux expérimentaux ; nais il nous a seoblé pouvoir apporter notre contribu-
tion à l'étude des points suivants
- la valeur de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide comme moyen d'i-
dentification et d'analyse antigénique de L . .mg,J,toc~,
- les possibilités offertes par la sérologie des antigènes somatiques,
- la constitution antigénique et notamment le rôle joué par les deux
types principaux dl antigènes connus, dans l'élaboration de l'immunité
anti-pasteurellique,
- la valeur sur le plan du diagnostic sérologique de quatre méthodes ~
l'agglutination, l'hémagglutination passive, l'immunofluoreacence et
la fixation du complénlent, qu'elles mettent en jeu l'antigène capsu-
laire ou l'antigène somntiqueo
II o - MAT E RIE L E T
MET H 0 DES
1) SOUCHES
2) MILIEU DE CULTURE
c. L~tirs ETUDIE:>7
1) SERUMS DE LAPIN
2) SERUMS DE CHEVRE
3) SERUMS DE MOUTON
4) SERUMS DE PORC
5) SERUMS DE BOVIN
6) SERUMS HUMAINS
1) ANTIGENES SOLUBlES
2) ANTIGENES PARTICULAIRES
1) MATERIlï;L ET REACTIFS
2) PROTOCOill TECHNIQUE
1) IHMUNODIFFUSION EN GEL
2) AGGLUTINATION
3) HEMAGGLUTINATION PASSIVE
4) IMMUOOFLUORESCJ~NCE
5) FIXATION DU OOMPLEMENT
6) TEST DE SEROPHOTECTION
-----------------_. .-..~- ..- _.•._ ......
-20-
II.- MAT E RIE L
1'; T
METHODES
1) .SOUCHES
Nous nous sommes servis dans cette étude des souches ci-après
Origine
Espèce-hôte
r'ùl1adie
géOMa.Ema ue
Souches A
A.1
Veau
Pneumonie
France
A.5
Lapin
Pne1lI!lonie
France
A.7
Chien
Abcès
France
A.11
Homme
Septicémie
S&1égal
A.13
Veau
Broncho-pneumonie
A.14
Chèvre
Pneumonie
11..17
Canard
Choléra
A.19
Porc
Pneurnonie
A.193
HODll!le
A.1606
Souches B
B.3
Boeuf
Septicémie hémorragique
3.4
Boeuf
Septicémie hémorragiq\\w
Ethiopic
B.845
Boeuf
Septicémie hémorragique
Canbodge
B Dücze
Boeuf
Septicéüùe hémorragique
Turquie
B 1nseim
Buffle
Septicéme hémorragique
Birmanie
B Pendik
)3oeuf
Septicémie hémorragique
Turquie
Souches D
D.1
Porc
Pneumonie
Congo
D.3
Lapin
Pleuropneumonie
Tchad
D.X5
Lièvre
Pleuropneumonie
France
D.706
Porc
Complication de peste
France
porcine
D.739
Porc
Pneumonie
Grande-Bretagne
D.21 21/722
Porc
Pneumonie
Canada
D. Kobe rc
Porc
Japon
.
Pneumon;i"e
Souches E . J~. 2
Zébu
Septicémie hémorragique
Car:ieroun
E.4
Zébu
Septicémie hémorraglque
CtJ.IlJeroun
E.5
Zébu
Forme oedémateuse
Tchad
B.7
Zébu
Septicémie hénorragique
Cnmeroun
E.8
Zébu
Septicémie hé10rragiqua
Cameroun
E.12
Zébu
Septicémie hémorragique
Cameroun
Zo 14
Zébu
Septicémie hOnorragique
Cnneroun
8.15
Zébu
Septicémie hGmorragique
Cahleroun
E.11..
Zébu
Senticégi ©..lléL1orrggique
CnpcroW1
-21-
Toutes ces souches font partie de la collection du laboratoire de ~ücro
lJiologie de l'I.L.H.v.r~. à Maisons-Alfort. Elles sont conservées à +4°C,
sous forme lyophilisée.
Pour obtenir les variants gris bleu, les souches sont maintenues en sub-
cultures sur milieu solide au Tryptose sans sérum de cheval jusqu'à ce que
les colonies deviennent irreversi ~üeôent gris bleu. 10 perte de la capsu.le
est suivie par exanen au stéréor:rl.croscope en lumière transmise obliquoI:ilent.
2) HILn.:U DE CULTURE
Le ~ilieu 8ur lequel sont mises en cult'Jre toutes ces souches, a la COffi-
,fP.0:s:n-tioiî"'suivnnte
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20
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Bacto-l\\.go.r Difco ••••••••••••••
15
g
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r;xtrai t de levure Difco •••••••
2,5 g
Eau distilléo ••• Q.S.P.
1000
QI
pH ajust8 entre 7,4-7,6.
Au fJone!ü de l' eI:ilploi, ce rolieu est enrj.chi avec du sérum de cheval
décomplémenté à 5 p. 100.
Ils sont obtenus pur hyperirnounisation des lapins avec les germes entiers
selon le protocole d'imounisation suivant
Les germes constiturolt l'nnti6~ne proviennent de culture jeune de 18
heures sur gélose tryptose au sérum de cheval. Après une série de trois
lavages par centrifugation à 5000 g pendant 20 I:It1, les bactéries consti-
tuant le culot sont reprises dans du P.B.S. forool6 à 0,3 p. 100 en quan-
tité suffisante pour obtenir une suspension microbienne ajustée à l' opa--
ci té 10 du tube de Brown.
Les lupins reçoivent d'abord une preLuère injection sous-cutanée ou
meux in traI:ilusculaire de 2 Dl dl un oélange à parties égales d' adjuvan t
de Fround et de suspension bactérienne et, après un délai d'un Dois,
une serie de 7 à 8 injections intraveineuses de 1 Dl de la ~l~De sus-
pension bactérienne ajustée au tube 2,5 de Brown, è raison de detL~
injections par semaine •
-ac:::ooe--
...,....... .
... ..__ __'__
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1
1
1
-22-
1
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En cas d'insuffisance de titre d'anticorps au bout des huit injec-
i
i
tions, celles-ci sont interrompues et reprises après un nouveau délai
i
i
de un à de~~ mois, avec un résultat le plus souvent satisfaisant. Leur
1
titrage tertni!lé, les sérums sont lyophilisés et conservés à -15°C.
Celcr qui sont destinés à la déterillliiation des différents types soma-
tiques sont absorbés avec les souches hétérolo~~es afin d'éliminer les
réactions croisées. Cette absorption est faite de la façon suivante:
A 1 ml de sérum dilué au 1/10, on ajoute 0,1 ml de culot de cen-
trifugation de la suspension de bactérie de type hétérologue traitée
à la hyaluronidase. Ce mélange est laissé en contact quatre
heures
à. 37°C en agi tant fréquem:nent puis 18 heures à 4°C. Après cette opé-
ration, on ceni..-rifuge à 6000 g pendant 15 mn et le sérum décanté,
débarrassé des anticorps hétérologues sc montre généralement mono-
spécifique au test d'agglutination.
C. l [ j IUJ M S
Ils proviennent d'espèces animales diverses, infectées naturellement ou
expérimentalemant, et ont servi à définir des titres d'anticorps de valeur
sigrificativc ou à suivre la réponse immunitaire après l'infection.
1) 8pRUMS DE LAPIN
- 24 sérums de lapins adultes vi van t dans une animalerie infectée en
permanence par une souche do P. multocida A.
des sérums prélevés chaque semaine et durnnt q~~tr8 mois sur trois
lapins blanes du Bouscat, infectés par injection dans 18s coussinets
plantaires de 0,5 ml d'une culture de six heures diluée au 1/10.
Chez ces trois animaux, l'infection s'est traduite par un phelgmon gra-
ve b. tendance envaltissLUüe, remontCùlt le lor:>.g du membre inférieur et d.ont
l'évolution nia été arrêtée que par l'administration de Terramycine (25 mg
par jour pendant quatre jours).
- 131 sérums de chèvre provennnt d'une exploitation où des pneumopathies
infectieuses sévissaient de façon enzootique.
-23-
3) SERillIS J)]; HauroN
- un mouton, inoculé par la voie sous-cutanée avec 3 ml dl une culture
d'une souche D (Kobe 6), a servi à établir une courbe de réponse immu-
nitaire durant 14 l;:emaines. La réponse secondaire a été obtenue, di,x.
mois après l'infec·tion originelle, par une seconde infection (2 ml de
culture en s.c.) et suivie pendant 26 jours.
4) :SERUMS DE PORC
20 sérums de porcs sans signes cliniques de pasteurellose et 5 sérums
de porcs infectés 1~ois semaines auparavant par un aérosol de P. multQ-
5) SERillID DE BOVIN
Nous avons utilisé s\\œtout des sérums reçus au laboratoire de Microbiolo-
gie de III.E.N.V.T. pow~ divers sérodiagnostics:
• 500 sérums en provenance des Nouvelles-Hébrides,
160 sérums en provenance de Madagas car,
• 100 sérums en provenance du Tchad,
• 108 sérums de veaux en provenance de France.
Cependant, deux zéblUl infectés expérimentalement au laboratoire de
Dakar-Hann ont fourni dEls échantillons de sérum durant 12 semaines.
Zébu nO 369 : inoculô sous la peau du flanc avec 2 ml de la souche E.1 2
capsulée (culture de 6 heures).
Zébu nO 261
: inocul(~ dans les mÔmes conditions mais aveo la souche E. 1 2
sana capsule; ce variant R a été obtenu spontanément par vieillissement de
la culture sur un milieu pauvre.
Chez les deux animau;t, un oedème envahissant s'est installé en deux à
trois jours et il a fallu stopper l'infection por administration de Strep-
tomycine et Terramycine associées.
A signaler qu I un 3èml,~ zébu, inoculé lui aussi avec la souche E. 12 es t
llIOrt de septicémie en t':'Ois jours car ln souche R étant présumée moins pa-
thogène que la souche S, l' adminis tration dl antibio tiques avai t coIIUrencé
plus tardivement.
~."...
-.
-24-
6) SERUMS HUrlAINS
lbus avons disposé seulement de cinq sérums provenant de malades atteints
plusieurs semaines (voire plusieurs mois) auparavant de pasteurellose authen-
tique, trois après morsure de chien, un après griffade de chat et un après
une contamination de nature inconnue.
Il est très dommage de ni avoir pas pu en obtenir un plus grand nombre.
~~~O~S D'EXTRACTION DES
D.
FRACTIONS _ Ni'l:,IGENI ms
Chaque souche de P. muI toci9.g, est ensemencée en botte de Petri sur mi-
lieu Tryptose Difco au sérum de cheval à 5 p. 100. Après 18 heures d'incu-
bation à 37°C, dos colonies en phase S ou R sont choisies et repiquées dans
des tubes du marne milieu liquide ; après un séjour de six heures à 37°C,
ces tubes servent à ensemencer des bottes de Roux. Au bout de 18 heures de
culture à 37°C, les bactéries récoltées par agitation avec des billes de
verre et de l'eau physiologique sont lnvées une fois par cen trifugation à
5000 g pendant 20 mn. Ce lavage est unique pour réduire la perte des anti-
gènes de surface facilement diffusibles dans le diluant.
Tbutes les préparations sont faites à partir do suspensions bactérien-
nes de ml§me opacité et deux types dt antigènes sont préparés, en les con-
centrant toujours sous le même volume :
1) RES ANTIGENES SOLUBlllli (pour immunodiffusion, hémagglutination passive,
fixation du complément)
a) Mtigènes lipopoIYSllCchNidigues (L.P.S.)
Ils sont obtenus selon la méthode de Westphal et Jann (1965) dans
laquelle la suspension en eau distillée de germes de 13 heures, portée
à 65°C, est tr2itée par un volume égal d'une solution de phénol à 90 p.
100 à la m~me température pendnn t une demi-heure ; toutes les cinq mi-
nutes, le mélange phénol-suspension aqueuse est homogénéisé avec l'Ul-
trax Turrax.
.
Ce mélnnge est ensuite placé une nuit à 4°C , la couche aqueuse de
surface qui npparatt, est décantée et centrifugée à 5000 g pendant 15
minutes pour éliminer tout élémen t figuré.
-25-
Cette phase aqueus'~ est mise en dialyse continue (trois à quntre
jours) contre l' eau d<~ robinet, puis trni tée par six volwnes d'éthanol
glacé h 95 p. 100 en présence d'acétate de sodium (1 ml d'une solution
à 30 p. 1(10 pour 10 !!ll dl LU1tigène) pour fo.iro précipiter los lipopoly-
saccharides. 1'antigène ainsi purifié est recueilli par centrifugo.tion
à 37.000 g pendant 20 mn à 4°C et renùs en solution dans du P.E.S. mer-
thiolilté.
b) Antigènes chauffés (e)
La. suspension dePE-. multocid1!, en P.E.S. est mise à chauffer dans un
bain-marie de 1oooe p'~ndant une heure.
Le surnag13ant obtenu après centrifugation à .5000 g pendant 20 mn,
contient tous les nntLgènes diffusibles de surface et est utilisé pour
les différents tests comme antigène.
c) Aatigènes de lay~~ (1)
Ils sont préparés ,3elon deux procédés
le premier consiste à mettre
ln suspension bactéri,:mne sous agitation à la température du laboratoire
pendant 30 mn tandis 'lue dans le deuxième procédé, la suspension est pla-
cée sur un agitateur lnagnétiquo à 4°e pendant 24 heures.
Après l'un et l'autre de ces traitements, la suspension est centrifu-
gée à 5000 g pendant ,20 r.U1 ; le surnagennt décanté constitue la solution
antigéniqt.8.
d) Anti&!'èneJ! obtenus,~ tra-sons_ (U.S.)
Ln suspension de ~:n'Des cn eau physiologique est soumise à la désinté-
gration pendont 30 minutes par los ultra-sons à JI aide de l'appareil
Mullnrd M.S.E. (fréqu~nce
20 kilocycles). Après ce traiteQent, on ef-
fectue une centrifugation à 5000 g à 4°C pendant 20 mnutes afin dl éli-
miner les germes non ,lysés et les débris de paroi qui fOrI!lent le culot.
c) J\\!lti@nes solubili;,3és ]?W' le lll.1J1:'YJ. sulfate de sodium (1.S.S. *)
,
La. suspension bact',érienne est traitée avec du lauryl sulfate de so-
1
!
dium à la concentrati,)n finale de 0,25 p. 100, à la température de la
1
!11
ft
(encore connu sous le }10m de sodiwn dodécyle sulfate
S.D.S.).
1
1
-26-
. ,-:"
'.~:~
.
,
salle et sur agitateur magnétique jusqu'à la lyse· totale des germes. Ce
mélange, rais en dialyse contre 11 eau dis tillée péndan t qUatre jours pour
éliminer les traces de lauryl sulfate de sodium puis contre de l'eau
physiologique, constitue la préparation antigénique.
2) DES ANTIGENES PARTICULAI..Erill (pour agglutination et fixation du complérJent)
a) Anti.E:ènes "hYa-iwonidase"
Ils sont préparés d'après la technique de Carter (1972) et concernent
uniquement les souches de types A et D dont la capsule contient des quan-
tités importantes d'acide hyaluronique.
Les germes de_ Po multQcidJl capsulés sont recueillis avec 10 ml de
tampon phosphate à 0,1 M pH 6 et traités à la hyaluronidase à raison de
15 uni tés par ml de suspension bactérienne pendant quatre heures à 37°C.
Cette suspension après traitement est centrifugée à 5000 g pendant
20 minutes. Le culot bactérien récupéré est lavé avec 30 ml de P.B.S.
(tampon phosphate), pH 7,32 par une nouvelle centrifugation, puis repris
avec du P.B.S., pH 7,32 fOrQolé à 0,3 p. 100 (on utilise 2 ml de tampon
pour 0,1 ml de culo t bactérien).
Pour éviter le plus possible des l'éactions croisées dues à des restes
d'antigène capsulaire, les germes traités à la hyaluronidase sont "rin-
cés" au lauryl sulfate de sodium selon le protocole sui van t :
A la suspension de germes dans l'eau physiologique est ajouté du
lauryl sulfate de sodium à 0,02 p. 100 en concentration finale; ce
mélange, agité pendant 30 minutes à la température du laboratoire,
est centrifugé ensui te à 5000 g durant 20 oinutes. Le culot est re-
mis en suspension dans de l'eau physiologique, puis mis en dialyse
pendéU1 t trois à quatre jours con tre de l'eau physiologique, pour éli-
miner toute trace de détergent.
Après ce traitement, la suspension a sa densité optique ajustée à
cello du tube 2,5 de Brown.
b) Nltiggnes "HCl" de N.ami,ok.a. et coU. (1961) (HC1)
Les bactéries récoltées en eau physiologique sont lavées par centri-
fugation. Le culot repris avec 50 ml d'HCl 1 Most 10i906 à 37°C; 18
heures après, la suspension est lavée deux fois avec du tampon P.B.S.
par centrifugation à 5000 g pendant 20 minutes.
Le culot remis en suspension avec du P .B.S. merthiolaté est ajusté
à l'opacité 2,5 de Brown.
-27-
, r---: METHODE BIOCHIrlIQUE :
1
F.. i~~~PHORESE EN GBL DE POLYACRYW1IDEj
le techn.1 que de fractiormernen t par électrophorèse en gel d' acrylamide,
fai t intervenir deux phénomènes à la fois : le tamisage moléculaire et
l'électrophorèse.
1) MA'IERIEL lc;T REJ\\CTIFS
Nous nous SOElllleS inspirés de la méthode de Razin (1967) en introduisant
certaines modifications.
a) les échootillops ~. an;Üy~.§E.
Ils sont préparés à partir de3 souches précédewrlent citées. Les sus-
pensions bactériennes lavées ont été au préalable lyophilisées, pour
permettre de réaliser des pesées précises en poids sec, et d'avoir des
échnntillons quanti tative!.1ent rigoureux.
b) Le gel
Sa préparation SI effectue IÙIlsi : à 25 nI de la solution mère con te-
nant 1,875 g d' 8.crylamidc, 7,5 g d'urée et 0,05 g de N, N'méthylèno-bis
acrylumide et de l'acide acétique à 35 p. 100 sont ajoutés 0,09 g de
persulfate d'~onium et 0,12 ml de N, N, N', N'-tétrame-thyléthylène-
diamine.
Des tubes 6 x 65 mm bouchés à leur face inférieure sont remplis déli-
catenent avec 2 ml du. mélange précédent que l'on recouvre d'acide acéti-
que à 35 p. 100, puis sont portés à l'étuve à 37°C pendant une heure
pour la polymérisation.
c) L'APPareil à éle..Q..trophorèse
Il est de marque Fleuger CIDalytical Acrylophor model 140) avec un
gélérateur de tension de type V 0 300.
2) EE9TOCOLE TECHNIQUE
.......
A 6 cg de gernes lYOI;hilisé3 rehydratés avec 0,3 ml d'eau distillée,
sont ajoutés une goutte ,de Rhodamine (colorant témoin de r:ri.gration) et
0,6 cù d'un célange comI:osé de phénol, d'acide acétique et dl eaU distillée
dans 19S proportions en ,voluoe : 2 - 1 - 0,5. Après la lyse des germes, qui
peut ~tre instantnnée Ol\\ exiger un certain délai (15 à 20 minutes), la
1
s:.:spension est centrifugée pen dan t 5 minutes à 1000 g pour éliDiner les
gürr:;cs non lysés par ce trci ternen t.
A l'aide d'une pipette Pasteur, avec précaution, on dévosü successivû-
:-,~,;,t au dessus du gel, deux gouttes de l'échantillon (surnageant), 1.me gout-
te d'\\.D18 solution dG sacc1k.'U'ose à 40 p. 100 dans l'acide acéticlUe à 50 p.
',=0 et de J.'acide acétique à 35 p. 100 jusqu'à ras bord. Les tulles ainsi
?répar6s sont portés dans la cuve à électrophorèse, re~plie enS1.ute avec de
l'acide acétique à 10 p. 100.
La séparation des n~lécules en Bilieu acide acétique est effectuée à la
tCülpérature du laboratoire avec un courMt constant de 5 Gill par tube jus-
:;'J' ~ ce que la Hhodnnine arrive au bas du gel. Cette opération dure environ
:rois heures.
M fin d' électrophorèse, les gels sont sortis 8t ois à colorer d:ms une
solution de noir-arJide à 1 g/l dans l' 8.cidc acétique à 7 p. 100 ; 30 ui.nu-
tes :::.près, 18s ,gels co1or8s sont rincés à l' cau de robinet et iIJJ.lergés
?::l::d.t'.nt 48 heures en acide acétique [1. 7 p. 100 en aYLll1 t soin de changer
sOèlvent le bain. Les güls ainsi obtenus sont eX3J:1int~s sur une source de 1u-
:-.ière diffuse, photographiés ct :illéùysés au dcnsitoTJètre intégrateur 3.uto-
~~:iquc l~E1AB 2 pour l'obtention des trac0s densitométriques.
,) IM?flJNODIF~.§1.lli.'l" EN GEL
C'est ln méthode de double dj.ffusion en plaqUE; d'Oucherlony (1958) que
~o~ avons utilisée.
Le :rilieu gélosé eoployé contient, par litre d8 P.B.S.
Gélose noble Difco •••••••••
12
g
Merthiolate de sodilli~ .•••••
0,2 g
Lauryl sulfate de sodiun •••
g
Cette gélose est coulée dnns une bo~ te de Potri de 100 l!lD de dÙ31..iètre
):. laisse refroidir Il +4°C, puis dos nlvéoles de 4 on de diauètre sont
:ret~I:8::; :;IU L10yen dl un GLlporte-pièces à 6 l'liJ les W1CS des autres. On dis-
trioue à l',üde d ' u.'18 pipette Pasteur, l'antiséruLl d311S l'alvéole cüntrale
~t lcs différentes préparations antigéniques dQ11s les autres alvéoles (ou
-29-
Les boHes de Petri ainsi préparées sont placées à la température du la-
borntoire, dans une ch:ùnbre humide pour évi ter la dessica tion en surface
pc:1dant deux à quatre jours; ce n'est qu'au bout de ce délai, que les li-
€;!lOS
de précipitation apparaissent netteo.Gnt.
Les gels sont ensuite rincés
plusieurs fois avec du P. B.S., pour élimin0r les produits non précipitÉs ;
les boîtes sont ensui te e:m.r:linées et photographiées.
Cl Gst une méthode lentl~, quantitative effectuée en microplnques à fond
cor.iquG (Cooke) et à 31° C•
Les séruDs sont dilués du 1/10 au 1/10.240.
Les antigènes employés sont les antigènes particulnires décrits précé-
dament (H, Hel, H, geroes entiers non traités).
A 50 }Ù de c!L..'1.cli.l'J.e des dix dilutions réalisés dans les cupules à fond
conique, sont ajoutés 50 Fl de ln suspension antigénique titrée (;3. l' opaci té
2,5 de Brovm, à l'aide d'une pipette autoontique B.B.L. Les plaques sont
agitées sur un vibreur et laissées 18 heures à 31°C. Les téraoins sont pré-
pnrés de la r:J~Qe L1a11ièrc, mis en reUlplaçant les 50 }Ù de sérun dilué par
':":fJ ").Ù de P. B• S •
La lecture a lieu grâce au miroir concave grossissant. Une réaction po-
sitive oontre un culot sous forwe d'un voile avec éclaircissement total du
SZT~ant ; elle est négative, si le culot est dense et parfaitement cir-
cclnire.
C'est une méthode très intéressante en Qatière de pasteurellose car elle
~met le titrage des anticorps correspondant aux antig'ènes solubles.
La foroation du complexe anticorps-antigène fixé sur les henaties, se
'>:rduit par la fOI'Lk'ltion d'un culot d'hématies à "bords fr2.ngés qui ne peut
~~ dispersé que par une forte agitntion.
e) Technique
Le sang de mouton rlecueilJi sur un volULle égal d' Alsevlûr, est lavé
trois fois avec du P.E;.S. par centrifugetion à 1000 g pendant 5 oinutes.
1
j
-30-
A 0,2 nl de culot d'héoaties lavées sont ajoutés 2 Dl d'roltigène.
Cette suspension vigoureusement homogénéisée est portée à l'étuve à
37°C pendant deux heures et agitée fréqueQOent. Au sortir de l'étuve,
les hémaLes ainsi sensibilisées sont lavées trois fois avec du PoB.S.,
par centrifugation (5 oinutes à 1000 g). Le culot final est repris avec
du P.B.S. en quantité suffisante pour avoir une suspension à 1 p. 100.
Les sérums doivent être débarrassés de 18urs éventuelles agglutinines
naturelles nnti-hémntics de Douton ; pour ce faire, 0,1 Dl de culot
d'héLlaties lavées est ajouté à 1 l.Ü de sérum décoclplérwnté et dilué au
1/10 et laissé en contact deux heures avec agitation fréquente. Après
centrifugation, le sérum décilllté est prêt pour le test.
b) frotocoJe et lecture
Ln réaction est exécutée aussi en tricro-plaques et oet en présence p
par cupule, 50 pl de chaque dilution de sérum (du 1/10 au 1/10.240) à
l'aide de la pipette B.B.L. et 50 }-il de la dilution d'antigène. Dnns les
cupules tônoins (téillOins sérurJs et térJoins antigè}e~~~nr.lpon
reLlplacent, selon le cas, l'antigène ou le sérur11:."Ke tout est â' ',té sur
tn1 vibreur et laiss8 en contact pendant au ÜOi-ls~~de;~8'Îie~J;.S à ~~' eup6-.
~~ :) ......'J' /1'1('8 9
ruteur du labo ra toire.
III
(
.
1
1Il
ca.
cu~
d
e
~
II' lio ~t>:J
La lecture est faite à l'aide d'un ôiroir conc~v~e
gr.OSSiSSrJiavl~
'\\: ;:
......
,~/9
~~
Les cupules téI::loins (antigènes et sérums) ne doive~~~ r aucun
phénoI::lène d'héI:lagglutination. La réaction 8st négative lorsque les héna-
tics bien séè.iuen tées, sont tassées en une pastille bien circulaire ;
lorsqu'elle est positive, les globules rouges forment lm tapis rJince à
bords crénelés.
4) Ii'll-~JNOFLUORESCBIJCE
Nous avons préféré la I::léthode llldirecte parce qu'elle suppriue la néces-
sité de I::larquer autrolt d'anticorps qu'il y a de systèwe d'antig8ne à étudier.
~lle a servi surtout pour titrer les anticorps, moins souvent pour caract€-
riser les gerBes dans les frottis.
1
-31-
a) Prépa.r'iJ,tion des tr?llil?..
Les frottis réalis,és, doivent etre aussi r..J.nces que possible
plu-
sieu:r-s types de laDes ont été préparées
• à partir d'une c~lture do 5 heures en bouillon tryptose/sérUQ. A
l'1me des extréra'i. tés des la;:les préuJ.abloelcn t93.ssée à deux reprises
dans la flanme dl un bec Bunsen pui G refroidiE:, une goutte de ln cul-
ture pUTe est déposée puis étnlée à l'aide do la pipette Pasteur,
sur toute la longueur de la InDe.
à partir de foie prélevé sur une souris [lorte après infection par
ln voie intrapéritonéale : avec un fragu~nt dont la section a été
préalableoent "e ,ssorée" sur un papier filtre, des frottis sont réa-
lisés sur les lw~es t~nces parfaiteDcnt dégraissés •
• à partir de rate prélevée sur le nêBe aniD~l, des laues identiques
sont faites.
b) fixation et mp.r~,ge des Imes
Après séchnge des frottis à la températu.re du laboratoire, les DJ1ti-
- .
gènes sont f;!.xés :pJ'tr _:Cmmersion des lames dDJ1S 11 u.lcool méthylique pur
f ' ' ' -
-
,)
durant 5 ~n~{es.
' " "
lc/
., "~.
Une fois fixéés;-- 1,Ô)s laID8i3 sont quadrillées à 11 aide do vernis à
1:: 1
\\";,"' •
~ l,' '"
.
t ...: ~
ongle in6M9~e,·...pqurfidéÙmi.$~r des cases qui recevront chacune une des
\\~ \\
,', \\(\\
/....: (-
dilutions'&~\\se~um à 13xaillL~~r et ensuite le conjugué fluorescent.
'0~,,,-
;J,7
,~ il;8i:1,Z
)
c Réac ti.o& .:eroPrem:eÏJ.~I€· di te
Les sérms à exnoi:·1er son t dilu.és du 1/10 au 1/1250. Ces dilutions
sont ensui te répnrtie:s sur cbncun des frottis. A chaque série d' exnnen,
nous avons joint deux tér.loins :
- téooin négatif p:réparé comme los autres, 8. ln. seule différence qu' à
la place du sérun, on f:1et une goutte de r .:;.3. ,
ténoin positif préparé uvec un sérUIJ positif de Litre connu.
Ces J..ru::es sont ensui te: p].acées 837°C en uttlosphère hcu:lide pendant
3C- ninutes ClU bout de:squclles cJ.lcs sont sorties et :~.o.v6es délicatelilent
cU>.ns deux bains succe~3sifs d'une solution de P.B.S. durant CbnClill 5 m-'
nutos.
-32-
les lanes égouttées, mis encore hU2:Ùdes, sont recouvertes du conju-.
bué fluorescent <i-globulines de boeuf, de ôouton ou de lapin cooner-
ci~lisé par l'Institut Pasteur et dilué nu 1/100 ; elles sont r0placées
durnnt 30 oillutes à 37°C en cl1.w:lbr(l huraidc.
Les frottis son t à nouveau lavés, puis Llon tés sous 11:'.08 lIe en tampon
glycériné à 33 p. 100 8t à pH 7,2. L'expression des résultats est faite
selon la notation suivante
- forte fluorescence
+ + +
réaction
fluorescence oodGrée
+ +
positive
- fluorescence faible
+1 réaction douteuse
- absence de fluorescence
- i
ou négative
d) EW-J?ement o.ntig,ue
Hous nous sO!ùIIles servis de mat6riel Zeiss : Statif G.P.L. avec équi-
peDent de fluorescence II, lampe Èl vapeur de ooreure OsnAf.1 HBO, 200 1:1/1'"
filtres d'excitation BG3 et BG12, filtre oculaire d'arr@t 50.
Les objectifs les plus utilos ont été }_es Neofluar 16/0,40 et 40/0,75.
'foutes les lectures sont f!li tes on fond noir pour' avoir un L18illeur
contraste.
5) FIXATION DU COIlPLEJ'tYaIT
Nous avons utilisé la. Cléthode de Kolmar en raison de sa grande sensibi-
li té.
a) ~é.nar-l§, : inactivés avant la réaction par chauffage pendant 30 l:linutes
à 56°C et ensuite dilués selon une progression géonétrique de raison 2
du 1/10 au 1/12tJO.
b) ~~n8s : décrits pr6cédemnent et dilués à leur concentration opti-
mun, déteruinée par tm titrage préal<lble vis-à-vis d'un iru:nmséruin.
c) ~9~lél~t : c'est celui de l'Institut Pasteur de Paris et il est ti-
tré pour ~ue deux unités entrent en jeu dans la réaction.
d) IDtèRe Mmolytig,ue :
1) hématies de mouton recueillies en solution d'Alsewer et en suspen-
sion
à 2 p. 100 en P.B.S.
1 -
1
1
-33-
2) héoolysine : sérUû comLlercio.l de l' InsU tut Pasteur on ti-hénn ties
de oouton dilué nu 1/1000.
3) sensibilis,Üi.on des héEilties de Clouton, fdte cm additionnant D. un
VOlw:lO dlhéfldties 0 2 p. 100, un voluno égal d'h8:Jolysine dilué nu
titre indiqué.
e) Protocole tecP.piaue
Sont PllS en ?résence :
50 pl de chacune des dilutions succe.ssivos de sérUr:l.•
• 100 pl d'antigène équivalent à deux unités •
• 400 pl de coôpléuent équivnlont ~ deux unités.
Le tout est lnissé en contact pendant 18 heures à 4°C, puis 10 rrinu-
tes à 37°C. 200 ~l dl béoaties sensibilisées sont ajoutés à cc GJélnngc.
Les tubes vigoureuseuont ngités, sont remis à 37°C.
Lu lectlrre su fnit 10 Dinutes après la lyse des t~loins.
i
1
Des expériences }JI'é'nlables ayan t Don tré que }I adjonction aU sys tèlile
de sérur: frnis négntif de la oême espGco, auélior.::0.t 10 titre de fixa-
1~
tion, nous iwons p.'U' i'a sui te, pour toutes les rénctionrJ, er.lp2.oyé du
\\1
cOLipléJ.:,ent dilué au taux indiqué par le ti tr<'lgo préliDinaire dans du
1
P.J.S., contenant Î p. 100 de sérUD frnis n8@itif.
6) 'IES'r DE SEROPHOTECTION
-..--.--------~.
1
!
Dtilisé très généraler,en t pour déter];liner le pouvoir pro tecteur des S8-
1
r~, ce test est exécuté suivant la tcchniqUG décrite par Roberts (1947) :
1
- 0,1 Dl de sérun ost injecté par voie sous-cutanée à chaque souris dl un
lot déterniné i 24 h,eures plus tard, elles sont éprouvées par inoculo.-·
1
tion intrapéri tonéale avec les dilutions de la culture, faites nvec du
!
1
10
bouillon au tryptose de 10-
à 10-
, à la dose de 0,1 nI par souris.
lii
les souris une f.ois éprouvées, sont lnissées en observation pen-
1
dan t sept jours bien qu 1 après 72 heures, la Llortali té dans la popula-
tion survivante soit souvent très rédlute. Ll examen d'un frottis de
1
1
rate ou de foie perqet de contrôler si les souris sont bien wortes
r
1
d'\\.U1e infection past:eurellique.
1
i
1
t;
1
t
~...."'~.. _:....-. _ ~_ _
c .
_ . . . . .' . . ._ . . . - " ' "_~·iÜi_I"~."'~""'_ ...
- - - ' -
-_.
.
-34-
t
le d0noobreoent des gernes de la suspension infectante par l:c foroule
1
1 est effectué par conptnge des colonies, 24 heures après l'ensemence-
1
ncnt sur boîtcs de Petri des différentos dilutions do Ll cul tm·c ;
1
celui-ci est effectu8 en faism1t tonber dan2 les cadrans des boites,
i
1
50 ul de chc..cune des dilutions.
1
,
1
N
+ N
+
1
:N
2
3
1
1) 0 = ----------
1
n
+ b
1
1 + an2
n )
!
Iï
= nonbre total de colonies de n
échontillons de la dilution 1 r
1
1
1
N = noubre total de colonies de n
échantillons de la dilution 2,
2
2
1
t
N = nombre total de colonies de n
échantillons de la dih.:.tion 3,
3
3
n ct b sont le3 facteurs de dj.lutions par rapport à .ln dilution
prisfl COI:lDe unité.
!..a D.L.
( doso léthale entrnma'1t la illort de 50 p. 100 des aniLJaux
50
inoculés) est déterllUnée selon la oéthode des totaux cuolùatifs de Reed
et Nuench (1938) G l'aide de la for::nulo 2.
, 0 , 5 - N
2) log D.L. 0 = lor-:.. + ------ log
5
-1)
Il _ N
r
B = dilution la ylus élevée au dessous de la D.L·
,
50
H = pource,1 tage de mortalité CUDulée avec la dose E,
N = pourcentage de oortali té cunulée avec la dose A,
A= dilution L, ooins élevée au dessus dc) la D.L·
,
50
r = raison de ln progression des concen trr:tions.
ks séruas dilués au 1!5 et le 2-oercaptoéthanol à 0,2 M sont Délangés
à voluoe égal et laissés en contact pcnd&'1t une heure à ln teopérature du
Ùlborutoire.
Après une dialyse de 24 heures n L1,oC contre un grand vohme d' iodoacéta-
:;ide ~ 0,02 f.I dOllS du taupon P.f3.,'3. n p}1 è~,3, les sérums ainsi traités sont
utilisés en comparaison avec ceux qui ne le sont pas, pour déterEliner la
proportion relative dl rgG oercaptoéthanol résistante et rI' Igîl El8rcaptoétha-
nol sensibIc.
1
1
111.- RES U L T A T S
lu
ANALYSE ElliCTROPHORIi;TIQUE EN GEL DE POLYACRYLAMIDE DE LA STRUCTUR7E
"'-
...:P;.,;::R.QTI'J.S~ D8 PASTEURELLA MULTOCIDA
~
1
1
1
1
1) VERIFICATION EXPI;:RI11ENTALE DE L'EXISTENCE DES SEROT'iPES SOMATIQUES
!
i 2) MISE AU POINT DImm TECHNIQUE DE PREPARATION DES ANTIGENES POUR LA
SF..JWTYFIE Sm.1A'l'l C'lUE
i
3) CONCLUSIONS
f
f
1
i
1) CONSTITUTION ANTJ,:Gli:NIQUE DES SOUCH8S B ET E
2) ANTIGEl'fB VACCINNIT PROPHm'IEN'I' m'J'
t
3) CORRELATION ENTRI:; LES TITRJ:;S Dt HEMhGGLUTINATION PASSIV'2 r~T LE POU-
!
VOIR PROTECTEUR Il)ES SERffi-1S DES SJ~ROTYFES B ET E
1) AGGLUTDJATION SOl.,IATIQUE
2) HEMAGGLUTINATIOH· PASSIVE
1
3) FIXATION nu COt:IPJ,,srlliNT
4) HMUNOFLUORESCEI'JC::E 1NDIJ-lliCT:G
fj
1
t
1) ETUDE DE LA CDŒC;'IQUE Dl AFPART ION DES ANTICORPS
! 2) SEROLOGIE D:GS nni'LC'fIONS NATURELLES A.?~T~UREL1A NULTOCIM
3) COl1NENTAIRES SUR LA REPONSE IMMUNITAIRE HUMORAIE VIS-A-VIS DES
l'
INFECTIONS A PAS~Î:'EURE1L.A 11U1'rOCIDA ET LA. VALEUR. DES 1'ESTS SEROLO-
i1
GIQUES
--.,._._----------
-35-
III.- lt E SUL T A T S
riJ.
ANALYSE ELECTROPHORETIQUE EN GEL DE POLYACRY1A1ITDE
A. L],E LA STRUCTQRE PROJ~J..Q.UE DE PASTEURELIA rvIULTOCID
L'examen des différents profils électrophorétiques obtenus avec les
souches de P..L..J!l.1);ltocid.fi. étudiées, nous révèle les faits suiva..."lts :
1) Une composition très hétérogène des protéines constitutives de la cellu-
le de P. roultoc~da ; ces protéines se répartissent, en fonction de leur
charge et de leurs poids, en une quinzaine de bandes parflli temen t dis-
tinctes, que nous identifions par une série de lettres, dans l'ordre
alphabétique, de A à K (voir figures nO 1 et 2).
La. densité et la distance de migration de ces différentes bandes,
très similaires pour toutes les souches examinées, particulièrement
pour les fractions qui migrent le plus rapidement, dorment un schéma
général très reproductible et caractéristique de l'espèce de P. multo-
~ avec néanmoins de petites variations selon les sérotypes, varia-
tions dues au dédoublement constant ou occasionnel de telle ou telle
bande. C'est ainsi, qu'en nous référant aux sqhéma.s de la figure nO
2,
~ous constatons que
- pour les sérotypes A : la bande B paraH le plus souvent dédoublée
la bande F l'est peu souvent, tandis que la bande G est toujours
triple.
- pour les souches B : le dédoublement de la bande A est de règl~ ;
la bande C est presque toujours dédoublée, par contre les bandes
B et F ne le sont qu'accidentellement.
- avec les sérotypes D : c'est la bande D qui est toujours dédoublée;
les bandes B et F ne le sont que quelquefois et la G npparait pres-
que toujours triple.
- enfin pour les souches E, le dédoublement est constant au niveau de
la bande G ; il l'est souvent pour la F et pour la D, il est aléa-
toire.
En tout état de cause, nous devons noter qu'aucune de ces variations
n'affecte de façon significative les électrophorégrammes obtenus.
1
-36-
I.e tableau nO 5 établit donc une représentation nécessairement sché-
lllD.tique des possibilités de doooubleme"1ts des différentes bandes.
2) L'électrophorèse réal:i.sée avec les germes qui ont perdu leurs substances
cal)Sulaires par agita:don de 30 minutes en eaU physiologique, présente
lcs mêmes profils que les germes e::1tiers. Il en est de même des germes
e:1 état de dissociatüm H. Q1k"U1 t uux souches truitées à l'acide ohlo-
rhydrique 1 N pendant 1 ti heures et aux surnage an ts provena:.1t de la
centrifuga tion des germes agi tés pen dan t 30 minutes, leur électrophorèse
ne donne aucune bande coloréo distincte.
Ces résultats, comparés à c·;ux de Bruckler et coll. (1970) qui avaient
déj~ étudié ce mêl.ùe pl'oblèl'le, sont différents. Selon leurs observations,
les 28 souches (11 de type A;
4 de type B ; 1 de typG C ; 8 de type D ;
4 de type E) de f..t muJ.tQ.cJ~ cxami.:1ées, se répartissent selon quatre
combinaisons électropl:lOrétiques indépendantes des types sérologiques.
1
Nous pensons que cettE: divergence des résultats vient de la diffé:rence
de la méthode de prép~:œation des produits à analyser; Bruckler et coll.
Utilisent des germes de 72 heures ayant subi au préalable un trni teuent
à l'acide chlorhydriqtte 2 N (pH 3,6) pendant 18 à 24 heures à 4°C, tan-
dis que nous partons de germes de 24 heures qui, après récolte et lava-
ge par centrifugation dans du P.B.S., sont lyophilisés, sans avoir subis
aucun autre traitement.
Le but de ce trava:i.l effectué sur un grand nombre de souches était de
voir si on pouvai t trCtuver une corrélation entre les différents sérotypes
et leurs profils électrophorétiques r8spectifs. Les raisons de cette
recherche se trouvaieIh dans les résultats de Carter (1955 et 1959) et
ceux de Namioka et MUl'ata (1961) révélant qu'un certain nombre de sou-
ches de P. multociga r"e pouvaient être typées par leurs méthodes.
C'était donc a priori une possibilité très simple d'identifier ces dif-
férents sérotypes.
r~is nos résultats Imontrent que seules les souches de type B peuvent
~tre reconnues à parUT de leur électrophorégramme. Pour les autres,
aucune relation spécif;'ique ne peut ~tre établie entre le sérotype cap-
sulaire et le profil l''espectif ; bien au contraire nous constatons, en
dépi t de petites varilhions, une remarquable similitude des électropho-
1
régrammes de toutes ce:,s souches. Nous uvons été tout aussi incapables
de retrouver dans ces Iprofils une corrélation avec les sérotypes SOffiU-
tiques.
_
......._ _·itIl':lt........
-tf~I1ilJ'"
i...
'..u
...
·g""',%i..".
_ _...
·..lIiiIf"""·....._
........_ _ '
_
-37-
Deux faits expliquent ces réscitats :
D'une part, le fait que la spécificité antigénique est portée par
les polyosides, aussi bien pour les antigènes spécifiques de capsule
que pour les antigènes associés à la paroi.
D'autre port, ces polyosides éta.nt électriquement neutres ne mi-
grent pas, ce qui est confirmé par ce que nous aVOns dit plus haut,
à savoir que les antigènes de lavage qui contiennent nécessairement
les antigènes de type capsulaire, ne donnent en électrophorèse aucune
bande.
Il oat donc impossible d'envisager que les schémas obtenus à partir
de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide puissent remplacer les tests
sérologiques ou immunologiques qui demeurent les seules méthodes spéci-
fiques adaptées à ce type d'identification, la spécificité immunologique
restant pour une molécule un caractère incomparablement plus distinct
qu'aucun autre de ses caractères physico-chimiques.
Néanmoins nous pouvons en conclure que pour toutes les souches exami-
DéeS, le profil électrophorétique correspond à un sahéma général subis-
sant seulement de petites variations et qu'il peut donc être considéré
come un des critères de détermination de llespèce au mS8e titre que
l'un des critères biochimiques ou :nétaboliques.
On doit retenir aussi que la cellule de ..t.... IDultocida contient plu-
sieurs protéines différentes
la quinzaine de bandes visibles sur le
gel ne doi t représenter qu'une partie minime de protéines à moins que
chaque bande soit constituée de plusieurs protéines de même poids molé-
culaire et de I;~~l!le charge.
-38-
A
Jl
D
E
A.193
B.PK
D.706
FIG URE
nO 1
Comparaison des électrophorég:r8llllIles en gel de polyacrylamide
des quatrE' types capsulaires de P. multocida
IIous constatons, à part :'.Le dédoublement de la bande A chez le type B, que la sucees-
&I1Gn des bandes distinctes ùst, en gros, la même pour les quatre sérotypes.
les différences de densité de coloration constatées dans les bandes de même niveau
aœt dues davantage au fait que les souches ne se lysent pas autant les unes que les
atrea (avant l' électropbor;:~se) qu'à des différences quantitatives concernant la ou les
.1IlQœa tractions dans les so·:uches.
1
1
1
-39-
A
A
A
A
B
B
B
B
-------
C
C
C
C
D
D
D
D
;::
E
E
F
F
F
F
G
G
"
G
\\Z
H
H
H
H
l
l
l
l
J
J
J
J
K
K
K
K
~--
f-n.---
1 " - -
r---
...~.""'"
_....-
f.-._--
~...'u.... ~
qui peu-
T A BLE A U
nO 5
Possibilités de dédoublement des bandes protéiques
en fonction des sérotypes "capsulaires"
~ A B D E
Bandes
to..
·A
-
++
-
-
B
+
±
±
-
c
-
+
-
-
D
-
-
++
±
E
-
-
-
-
p
±
±
±
+
G
++
-
++
++
++ • 10 dédoublc~cnt est de rèGle
•
+ : la bande est le plu3 ~ouvcnt dédouoléQ
± 1 possibilité do dédoublement
- 1 pa~ de dédoublc::lcnt
<
'-4.'
-40-
1) VERIFICNION ExpERJ]18N~:ALE DE L'EJJ.m:g-rCE DES TYPES SOMaTIQUES
Nous avons vu précédeillJ:lent qu'en plus des quatre types capsulaires, il
a été mis en évidence che~; P .-Jllultociila, l' exis tence de douze séro types
somatiques. L'importDIlce de ce nouveau système de classification dÛ. à Nn-
moka et Nurata (1 961 ), confirmé par Carter (1 972), nous a inci té à en
entreprendre une vérification expérimentale sur 101 souches de P. multoci9.A
de la collection de l'LE .. N.V.T.
les sérums de référence utilisés pour ce travail, sont préparés par
hyperi.mmunisation de lapins é.1vec des antigènes "hyaluronidase", préparés
à ~tir de souches standf~s ou même avec des suspensions de germes entiers.
LI identification des t;~'~::~:1:'~~~s souches est pratiquée par la
technique d'hémagglutillat(~assive et ~e des types so!:lfltiques est
fai te comparativernent pJir1Lé~ 9Mé~}\\8d'êsQ dè
~!9 •oka et de Carter.
\\:,~
Centre
d
e
les résultats de cette~;I\\eéh:ea::c'helfd6'nneRfsur l'ensemble des souches exa-
. ,
l
é
mnees,
es fr quences
~~~:..~~
su: 'YI' . tes.
..
.J
'lt
"
'T'tif!l t\\6 6'\\
Nombre de
'l'ypes
Types
Pourcentage des
souches
capsulaires
somatiques
sérotypes sooatiques
1
2,6
3
71
38
5
2,6
7
10,5
8
8
9
5,2
29
:3
6
100
3
25
12
:D
4
75
------- ------~--------------------------
22
1"
."
6
100
On note, pour les 8ouc:1es A, presque toutes originaires de France, la
prévalence énorme des sou,~hes de type somatique 3.
-41-
2) rUSE AU POUIT D'mm TECHNIQUE DE PHEPARATION DES AlJTlGENES SERVANT A LA
SEROTYPIE SOrLA'flQUE
Nous avons cherché à simplifier les deux précédentes techniques, en em-
pêchant la formation de la caps1üe directement sur les germes en croissan-
ce, par addition dans le milieu de culture d'une enzyme provoquant
l'~olyse des constituants de la capsule.
a) Détermination des meilleures conditions expérimentales
Nous avons réalisé nos premiers essais en utilisant comme enzyme, la
hyaluronidase "Choay" lyophilisée; cependant, du fait qu'en présence
de cette dernière on observait aucune croissance de l' inoculum, très
vraisemblablement à cause d'un agent de conservation (antiseptique ?)
contenu dans ce produit, nous avons immédiatement employé la Thiomucase
lyophilisée injectable (laboratoire Solac) qui n'est autre qu'une muco-
po1ysaccharidase douéo d'activité hyaluronidasique. A cet effet, le
protocole expérimental mis au point est le suivant : les ~rmes sont
mis en culture pendant 24 heures en boite de Petri sur un milieu conte-
nant :
5
gouttes de sérum de cheval décomplémenté,
- 0,5
ml de Thiomucase,
- 5
ml de gélose tryptose.
Pour rechercher la concentration minimale active de la Thiomucase,
nous avons réalisé une gamme de concentrations décroissantes de l'enzy-
me : 100, 50, 25 et 10 unités sous un volume de 0,5 ml. Pour apprécier
les résultats, une boite témoin ne contenant donc pas d'enzyme était
préparée.
Dans les quatre cas, les résultats obtenus furent satisfaisants ; en
effet, à l'observation sous le stéréomicroscope avec une lumière obli-
que à 45°, on obtenait des germes qui, comparés à ceux cultivés sur la
botte témoin, étaient non muqueux et non irisés, donc dépolU'VUS de cap-
sule.
Ces germes récoltés et mis en suspension dans du P.E.S., furent la-
vés par trois centrifugations à 5000 g pendant 5 minutes avec le ~me
tampon. Le culot de ecn Tifugation final repris avec du p. B.S. pH 7,2,
à raison de 2 ml de tampon pour 0,1 ml de culot bactérien constituai t
notre suspension antigénique.
1
-42-
Utilisé pour la recherche des types somatiques dans le test d'agglu-
tination rapide réalisé sur plaque de laine, cet antigène nous donne
des résultats satisfaisants comparables, sinon meilleurs, à ceux obte-
nus par la méthode de Carter.
Cette technique e. été mse au point avec un certa.in nombre de sou-
ches de ~~ltocidQ\\ type A isolées de lapins et de volailles ; nous
n'avons pas réalisé des essais sur d!autres souches, mais il ne fait
guère de doute que cette technique soit applicable à toutes les souches
de .:r. !Oultocic!€l de type A.
b) Qualité$! de cette technique
La prer:ùère sans doute, et c'était notre but, réside drolS sa rapidi-
té et sa simplicité par rapport à la technique de Carter employée pour
la recherche des tYJes somatiques.
Une autre qualitÉ: de cotte technique de préparation des antigènes est
sa reproductibilité: chaque fois que les germes étaient mis en culture
en présence de Thiorr~case, ils se transformaient en souches non muqueuses
décapsulées, avec des antigènes de paroi démasqués.
Il faut reconnaitre qu'avec les souches D nous n'avons pas eu le
même succès.
Enfin la troisièrr.e qualité que nous reconnaissons à cette teclmique
est qu'il s'agit d"me microtechnique permettant d'obtenir, en moins
de 24 heures, sur d€:s
boites de P0tri de 5 cm de diamètre, des résul-
tats satisfaisants s. partir de faibles quantités d'antigène.
3) CONCLUSIons
Cette v8rification €'xpérimentale
de la sérotypie somatique réalisée en
dépi t des travaux de Nemioka et Hurata (1961) et de Carter (1972), nous
permet d' apporter les conclusions suivan tes :
- l'hétérogénéité et la complexité sérologique des antigènes somati-
ques à l'intérieuI' d'un m~~e sérotype capsulaire, principalement
pour les souches J. et D.
- l'existence des rE!actions croisées rendant compte de l' étroi te rela-
tion antigénique €Intre
les différents sérotypes somatiques.
- _ .
....
'!OI
.•
*'"
P'/ooll.....'...
-_ _..." " " " ' _ '
r...
' . _........
..
...,..
•
_
-43-
lanécessit8, à cause de 11 existence des réactions croisées, de pré-
parer des sér~s exclusivement monospécifiques pour avoir des résul-
tuts facilement interprétables.
- la possibilité de déterminer indirectement le sérotype capsulaire,
lorsque la sérotypie capsulaire par hémagglutination passive s'avère
impossible, grâce au tYJle somatique déterminé par (~es sérums mono-
spécifiques, étant donné que les types somatiques : 5, 7, 8, 9 sont
exclusifs du sérotyp€:
capsulaire A et 2, '1- , 10, 12 du D.
- la nGcessi té d'avoir des préparations ant i gér..ique s efficacGs
pour
se faire, il y a lieu de respecter les conditions suivantes:
• employer une hyaluronidase de bonne qualité et en dose suffi-
sante,
• achever la décapsulation par un rinçage au lauryl-sulfate de
sodium à 0,2 p. 1000 en concentration finale,
• sélectionner le plus possi1lle les colonies non-muqueuses.
la méthode de préparation des antigènes aematiques de Namioka par le
traitement à l'acide chlorhydrique 1 N paraît trop drastique et doit
altérer sans aUC1ID dO'..lte les structures moléculaires et parfois la
spécificité antigépi~ue, ce qui augmente dès lors les réactions croi-
sées ; les antigènes "hyaluronidase" semblent réellerJcnt être les
meilll:lurs.
- toutefoü, nous devons reconnaître que si les résultats sont réguliè-
re[;l8nt bons avec les souches A, il en est tout autrement de certaines
souches D qui ont été difficiles, voire mêmes impossibles 8 sérotyper.
- quant à la valeur de cette séroty~ie, elle prend toute son importance
avec les sérotypes A ou, comnill nous le verrons ultérieurement, l'anti-
gène somatique constitue la principale, sinon l'èxclusive fraction
vnccinante, dont il faut iopérativeL1ent tenir compte dans toute opé-
ration d'immunisation.
- avec le3 souches B et E, l'emploi de variants non irisés dispense de
la préparation des antigènes HC1, en donnMt d'aussi bons résultats.
Pour termner, nous devons dire que si, 3ctuellenent, la sél'otypie cap-
sulaire effectuée par le test d'hémagglutination passive est d'lme pratique
f~cile, la sérotypie somatique n'est relativement aisée qu'avec des antigè-
nes ct des sérums de type très soigneusement préparés et tll1e bonne expé-
rience de la méthode. Cetto sérotypie apporte sans aucun doute un l'affine-
!!lent supplémentaire à la détermination globale des antic;tmes des souches de
l. lIlultocid-ê.
..~
-44-
,) CONSTITUTION AH1'IGEIITQUE DES SERO'.{iPES 51l1E
a) Eisultats de ~!19diffusion en gel
Bien que. de multiples travaux aient été déjà pu·bl2.és sur ce sujet,
ils sont loiÉ d'~tre concordants et nous avons essayé de clarifier ce
problèoe.
Le système B-E a l~t é choisi, parca que las souches de ces sérotypes
ont une capsule sans acide hyaluronique, ce qui permet d'avoir des anti-
gènes plus actifs et dont la préparation est plus facile.
Avec une souche 5 (B.3) les antigènes suivants ont été préparés
-un antigène LoP .~:o obtenu par la méthode de \\!estphal (L.r.S. ),
-un antigène de lE.vage 30 Llinutes à la température ambiante (L.30),
1
-un antigène de l/wage 24 heures à 4°C (L. 24) ,
f
- un antigène ultrEl-sonné (U .S.),
- un antigène chauffé 100°C pendant une heure (C),
- un antigène lysé par le lauryl-sulfate de Na (L.S.S.).
Ces extrllits ont ét(: obtenus 8. la fois avec les souches S irisées 0t
les variants non irisE;s (n.• )
Nous avons préparé pour la comparaison, la m.§me sôrie dl antigènes
avec une souche de .?~._'p."!:!-..l..t<ll:.ic1l ty})e E (E. 12) •
Quatre imuunsérums de lapin ont servi à cette analyse
T:. tre en
Ti tre en
hémagglutiuation
passive
Agglutinati on
avec l'ant:·.gène capsulaire
aVéC l'roltigène son~qtique
~~._---~~---~--------~~--~
Sérum .8.3
+ 1/40.980
+ 1/40
Sérum B.850
+ 1/160
+ 1/1280
Sérum 0.6
o
+ 1/81.920
3érUBl E.12
+ 1
+ 1/640
1/1280
~"".-"o:;'.---.~-i!'C'!'i"T.liIlI·11IlJi19-""I2!_...·...,...
;,·......
_lIll1...
i ....
_ _
'.
1
-45-
On voit que le sérum D.3 est de loin plus riche en anticorps spécifi-
ques de l'antigène capslùaire qu1en anticorps correspondant à llantig~Je
~o:natique.
- le sérum 0.6 est exclusivement anti-soITk~tique,
- le sérum D.850 est intermédiaire entre les deux pr~cédents,
- le sérum E est aussi riche en anticorps anti-capsules qu'en anti-
corp3 anti-somatigucs.
Les premiers essais ont été réalisés simple~ent avec de ~a gélose
(Bacto-Agar Difco) pOUT immunodiff\\L..sion, puis ultérieurcl1len t dans le
':mt d'améliorer les r8sul tats, nous avons introduit dans le gel du
lauryl-sulfate de 30dium à la concentration finale de 0,1 p. 100, en
présence duquel les arcs de précipitation apparaissent PV1S distincte-
nent et plu..9 nonbreux.
En comparant chacune des préparations antigéniques par immunodiffu-
sion, nous constatons :
1) qu'avec ltantisérum B.3 essentiellement riche en anticorps spéci-
fique de la capsule, les préparations antigéniques (L.P.S., L.,
L.S.S., C, V.S.) donnent toutes le même arc de précipitation,
visualisant ainsi la présence de l'immunocomplexe spécifique de
type capsulaire (figure nO 3) ; il s'agit tien là de l'arc spéci-
fique de type capsulaire puisque la mise en présence de cet
antisérum avec les antigènes L.P.S. obtenus respectivement à par-
tir des souches
B (R) des souches de type E, et des germes trai-
tés préalablement à l'acide chlorhydrique 1 n selon la méthode de
Namioka et coll. (1961) ne fait apparaître aucune ligne de préci-
pitation (figure nO 4), ce qui est normal puisque les germes R
ou trai.. tés à l' acj.de chlorhydrique ne possèdent plus Il antigène
spécifique de capsule ; quant aux souches de type E, elles ne
contiennent que l'antigène qui leur est spécifique et qui est E.
Cette réaction nous révèle égalet;lent qUE; l'antigène (C) obte-
nu par chauffage [tU bain-narie il 100°C dl une suspension de germes
S, donne, malgré ce trniterJent, l'arc de précipitation caractéris-
tique et il faut donc croire qu'il s'agit bien là d'un antigène
thermorésistan t.
-46-
FIG URE
nO 3
~tea les préparations antigéniques faites à partir du sérotype B de P. mu1t9ci~
en phase S contiennent l'antigène spécifique du type capsulaire,
identifié par l'antigène L.30', simple liquide de lavage en milieu physiologique
A
.~
FIG URE
nO 4
Les germes des colonies Il (ou variants non irisés) ne contiennent pas l'antigène
spéoifique de type cfLpsulaire présent dans les préparations antigéniqueB
(L.,P.S. et U.S.) des germes en phase S
. - "--, -'1
-47-
.
®
ANTI-
B.3
.
®
ANTI-
B.3
@o
ANTI-
E.12
FIG URE
nO 5
~'a:ltigène U.S.B.3 contient d'une part l'antigène spécifique de type capsulaire,
:~élé par l'antisérum B, et d'autre part des antigènes (4 arcs dont 2 nets)
communs aux sérotypes B et E
: : : '
j.i.r.:-
:.3
©
.
.
®
ANTI-
E.12
FIG URE
nO 6
:~:~ confirme la figure précédente : les sérotypes B et E ont au moins 3 antigènes
communs, étrangers à la capsule puisque les sérums de cette boîte
sont presqu'exclusivement antisomatiques
FIG URE
nO 7
J.!s antigènes communs aux :,érotypes B et E sont ceux qui se trouvent localisés
.:.... ,j la paroi car l'antiséruIrl 0.6 contient exclusivement des an ticorps spécifiques
des antigènes de }aroi (déterminant le sérotype somatique 6
®.
ANTI-
0.6
FIG URE
nO 8
Elle confirme les observations de la figure nO 7
-------...;.----------_.. --- .-._- --_.__.
-49-
2) qu'avec llantisérum B.U50 plus riche en anticorps dirigés contre
les antigènes associés 8. J.a paroi ou 30matiqUGs, les préparations
nntigéniques D.S. et 1.3.S. donnent au ooins trois lignes de pré-
cipitation également co~uneG aux deux sérotypes B et E, ainsi que
le révèlent les figures(no 5 et 6) où sont mis en contact d'illle
part les antiglmes l1 ultra-sons" des germes de type B et les anti-
sérums B.850 et E.12 précipitants et d'autre part les antigènes
l1ultra-sons" des germes E et les J:lÔmes antisérums.
3) qu'uvec le sérum ant~-O.G qui contient exclusivement d~s alticorps
dirigés contre les antiglmes de paroi, les préparations an-cigéni-
ques totales D.S. et L.S.S. obtenues à partir dos souches B et E
Smooth font apparaître au moins deux arcs de précipitation CO~un3
aux souches B et E (figures nO 7, 8).
Ainsi, à partir de ce test d'immunodiffusion, apparaît donc une dua-
lité antigénique de la composition de P. multocida ; d'un côté un aDti-
~e spécifique de type, t~erillostablc, très superficiel, localisé dans
la. cllpoule d'où il difft\\.Se très facilement et de l'autre côté des anti-
gènes plus profonds, libérés lors d'une lyse cOI:lplète du gerL'le associés
à la paroi bactérienne car pr6sel1 ts dans les varian ts non irisés ou R
dépourvus de capsule.
b) Résultats
____
du test d'irnnunofluorescence
.•=-=;:;,,;:0,==-""""'..::0;;..........
Cette épreuve révèle de façon tout aussi nette, la mêoe dualité de la
constitution antigénique de y. mu1tocida.
Lorsque l'on oppose dlune part les antigènes B et E respectivement à
leurs antisérums B et E rendus monospécifiques par absorption pendant
quatre heures à 37°C puis 18 heures à 4°C avec les antigènes hétérolo-
gues, et, d'autre pert l'antisérum 0.6 et les germes R ou variants non
irisés provenant des souches B ou E, il Y a émission d'une fluorescence
révélant ainsi la formation d'immunocomplcxe. Aucune fluorescence n'est
émise lorsque l'on croise antisérum et antigène (voir tableau nO 6).
La réaction d'icrmunofluorescence par sa grande spécificité et sa
sensibili té, nons pcruet d'identifier et surtout de localiser les an-
tigènes de P. multocida ; il existe donc
- un antigène superficiel, spécifique et situé dans la capsule (1
et 2),
des antigènes profonds, associés à ln pc.roi, mis en ,5videncG
ii
~.
lorsque les souches ont perdu leur oapsule, et communs aux séro-
typee capsulaires TI et E (3).
-50-
En conclusion, de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons confirmer
que chez J?... mu! tocid~!. existent deux principaux types d'antiGène :
1) l'antigène spédfique de type présen t dans la capsule ; c' es t lui
qui a permis la classification des souches de P. JI!ul tocida" selon
Carter (1955) on quatre sérotypes capsuJ_aires A, B,D et E. Il est
absent chez toutes les souches non irisées ou en phase H, celles-
ci ayant perdu leur antigène de surface et restant donc intypables
par les méthodes sérologiques classiques mises à notre disposition.
Quant à sa nav.lre chimique, disons guI elle reste très controversée
pour les uns (Jain et Knox, 1961 ; Carter, 1963 ; Rebers et coll.,
1967), c'est U1 lipopolyoside, pour les autres comme Penn
et
coll., 1974, c'est tout simplement un polyoside.
2) un antigène de paroi qui, pour les sérotypes B et E est unique
(0 : 6) ; pour les sérotypes A ou D, les antigènes de paroi actuel-
lement connus sont au nombre de 12 et des réactions croisées impor-
tantes existent entre certains d'entr'eux les uns n'existent qu'à
l'intérieur d'un seul type capsulaire, les autres se rencontrent
aussi bien dans les souches A que dans les Bouches Do
Ces antigènes doivent être différents de l'endotoxine répartie
quant à elle à travers toute la capsule puisqu'elle est présente
dans les toutes premières eaux de rinçage ; elle est aussi présen-
te dans la paroi puisque
les souches non capsulées (Rebers et
coll., 1974 ; Heddleston et coll., 1966) en sont pourvues.
Pour expliquer le fait que l'endotoxine est aussi bien présente
dro1s les extraits capsulaires des germes capsulés, que dans les
extraits des é~rmes non capsulés, il faut admettre que chez P.
multocida, no~s avons :
- un antig~ne superficiel, support de la spécificité de type
capsulaiI'e, facilement diffusible, disparais san t vi te avec
des subcl~tures inopportunes,
- une endotoxine répartie dans la capsule et la paroi, aisé-
ment diffusible elle aussi,
- des antigènes plus profonds, associés à la paroi, qui vont
servir de: base Ci la clm;sification en types somatiques,
beaucoup plus complexe que celle des types capsulaires.
~I
-51-
T A BLE A U
nO 6
Réaction dl immunofluorescence : mise en évidence de la duo.li té
des an tigèj.1es chez P. mu! tocida
* Les chiffres indiquent le nombre de + correspondant à l'intensité de la
fluorescence.
1
1
-52-
2) AW'IGElJE VACCINANT PHOPRENENT DIT
a) S.ouches ~ sérotJ:I2§ c@sulaire B
Trois séries dl e:x:périence ont été réalisées pour déterminer la con-
tribution de chacun des deux principaux antigènes capsulaire et somati-
que dans 11 immuni té globale.
- unn première eJl:périence faite avec des souris protégées passivement
par llantisérunl B.3 et éprouvées le lendemain avec les germes de f .
9
.!!ll:kLtocida B.3 d.ont la suspension non diluée contient 1,71 x 10
germes.
- une deuxième e:x:périence effectuée avec des souris protégées par
llantisérum D.El50 et éprouvées avec la même souche D.3.
- enfin, dans une: troisième expérience, les souris sont protégées,
toujours passi~~ment, avec l'antisérum 0.6 et sont éprouvées pour
moitié avec la souche B.3 et l'autre moitié avec la souche E.12
9
dont la suspem:ion d'origine contient 1,6 x 10
germes.
Nous avons donné précédemment les caractéristiques des immunsérums
:;~.):que nous avons utilisés.
"',;"~ ."~,~.. ,.
'
:' \\ ;:.:'"
Les résultats de ces trois expériences, consignés dans le ta1:leau
,
nO 7, révèlent très netteroe'J.t que les trois sérums confèrent des degrés
de protection tout h fait différents.
En effet, Cl est Il antisérum B.3, p.e loin le plus riche fW.. gnticorps
hémagglutinants (1/40.960), qui confère la protection la plus solide :
7
les souris innnuniséEls avec cet anUsérum résistent à 8,9 x 10
n.L. a!
5
8
soms soit contre l.,01 )< 10
germes; sachant que cette D.L'
peut
50
Si exprimer par le logarithme de sa dilution
: -8,50 (correspondant à
quatre bactéries), ~Le degré de protection passiva de ce sérum B.3 peut
:.':\\"1'
l
t log. ]).L.I:;(\\ souris protégées
.
t ' i
d
>~:.>s expr:1.mer par
e rappor
-----~--- . " . ---
qm es
~c
e
;.,.~.<. .
log. D.L'50 sour~s témo~ns
;~+:,3,95, valeur qui peut être considérée comme 11 indice de protection.
Par contre, l'antisérum 0.6 dépourvu d'anticorps hémagglutinant, mais
très riche en anticorps dirigés contre les antigènes de paroi (titre
,,~" :;', 1/81.920) n'assure aucune immunité ; que les souris soiant éprouvées aV8C
';',,' /:.les souches 'B ou E, la protection est nulle, ces souris se comportent com-
- me les témoins n'ayant reçu aucun sérum•
..~
.,~' '.
T AB L EAU
nO 7
.'
Détermdllation des indices de protection
dos sérums anti-B.3, anti-B.850 et anti-~o6
,-,.
c'
:~~":
, Dilution de
. , souris mortes
Pourcentage de mortalité
la
Pourcentage de mortalite ----7----7-7~
suspension
sour~s ut~lisees
après l'épreuve par la
dl épreuve
après l'épreuve par la souche Bo 3
souche E.12
Sérum B.3
Sérum B.850
Sérum 0.6
Témoins
Sérum 0 .. 6
Témoins
"
1
8/8
}l.
10-1
1/8
8/8
10-2
0/8
8/8
8/8
8/8
1O~3
0/8
4/8 .
8/8
8/8
10-4
3/8
8/8
8/8
10-5
3/8
8/8
8/8
10-6
0/8
8/8
8/8
10-7
0/8
8/8
6/6
8/8
6/6
10-8
8/8
6/6
6/8
5/6
10-9
1/8
1/6
1/8
0/6
10-10
0/8
0/6
0/8
0/6
.~~~~. P.L.
- 0,63
- 3,86
- 8,63
50
- 8,58
- 8,48
- 8,40
": . ' .~'
1"'>
: 'Indice de
7,95,
4,72
:::.0
~o
protection
l
On constate que seuls les antisérums B.3 et B.850 possédant des anticorps hémagglutif
correspondant à 11 antigène capsulaire possèdent un pouvoir protec- i1
r
"!
-54-
Enfin, llantiséruul B.850 (de titre en anticorps hémagglutinants 1/160)
a un indice de protection de 4,72 log., avec une différence de 3,23 log.
par rapport à l'antü:érum B.3 ; cette différence se conçoit bien, au
regard des titres en anticorps hémagglutinants et laisse supposer une
nette corrélation entre le pouvoir protecteur et le titre en anticorps
hémagglutinants, que nous tenterons d'établir plus loin.
b) §ouches de type.A
Pour rechercher ici la nature de l'antigène vaccinant, nous avons
utilisé les sérums m:civants :
Titre en hÊ;magglutination
Titre en agglutination
passi,-e avec
avec
Sérotype
l'an tiuènEi
capsulaire
l'an tigène soma tique
.6.n ti- 11.4
1/80
1/10.240
A
An ti-P. 109
'1/10.240
1/5120
A
3
Anti-TS.S
1/2560
A
5
!nti-A.11
1/80
1/t~0. 960
A
7
Anti-1059
1/160
1/2560
A
8
!nti-Tz.lO
1/640
1/2560
A
9
Anti-A.14
1/640
A : 3
Le nombre de germl;s présents dans les suspensions pures à partir des-
quelles seront faite3 les différentes dilutions d'épreuve, est respecti-
vement de 1,03 x 109 ; 1,06 x 109
et 1,6 x 109 pour les souches A.14,
1.11 et 'rS.8 ..
Les expériences s<:mt effectuées comme suit:
- 40 souris sont protégées avec du sérum anti-P.109 ; une moitié est
éprouvée le lendemain par la souc11e homologue en type somatique
(A.14) et l'autre moitié
par la souche hétérologue en type soma-
tique (A.î 1 ) •
- 40 autres souris sont protégées avec du sérum anti-A.11 ; la pre-
, :~
mière moitié est éprouvée le lendùmain par la souche homologue
pour le type somatique ;\\..11 et la deuxième moitié par la souche
hétérologue (P..14).
-55-
80 souris réparties en quatre lots de 20, sont respectivement pro-
tégées par 18s antisérums M.4, TS.8, 1059 et ~z. 10 ; elles sont
ensui te toutes éprouvées par la souche hétérologue 11..11.
- 20 souris protégées par l'~~tisérum TS.G dépourvu d'anticorps hémag-
glutinant et éprouvées par la souche l1Omologue '.rS.8.
enfin, 20 souris protégées avec l'antisérum A.14 dépourvu d'anti-
corps agglutinant et éprouvées par la souche homologue 1.14.
Les résultats de toutes ces expériences sont récapitulées dells les
tableaux qui suivent nO 8, 9, 10. Nous constatons que
la protection est obtenue urliQuGment lorsque les souris protégées
sont éprouvées pur la souche homolo.~e en sérotvye somatigu~ :
c'est le cas des souris protégées soit pur l'antisérum P.109 et
éprouvées avec la souche A.14, soit par l'antisérum h.11 et éprou-
vées avec la souche h.11.
Lorsque les sérums sont dépourvus d'anticorps somatiques Qomologues,
la protection est nulle ; ainsi les antisérums N.4, 'rS.8, 1059 et 'rz.lO
qui contiennent des titres variebles en anticorps hémagglutinants (donc
capsulaires) et ayant les mêmes titres en anticorps agglutinants, sont
.,
~.
incapables de protéger les souris vis-à-vis de la souche A.11, hétérolo-
gue quant à l'antigène de paroi.
,
.'
18s anticorps spécifiques de l'antigène A capsulaire, ne semblent
'\\
donc pas intervenir; cela est confirmé en plus par le fait que le sé-
rum anti-TS.8 qui en est dépourvu assure une bonne protection, tandis
que l'antiséruID 1,.14 qui ne contient que cst anticorps ne protège pas
du tout contre l'infection par la souche homologueo
Dl; toutes ces constatations, il découle quI'} chez les sérotypes A,
l'antigène de type capsuJ.·ire, contrairement à ce qui se passe chez les
souches B et E, ne semble pas être un antigène vaccinant
la protection
'.,
paraît être assurée presqu'exclusivement par les anticorps agglutinants,
c'est-à-dire les anticorps dont l'élaboration dépend des antigènes spé-
cifiques de paroi.
c) ]1i,scussj,on
Ces résultats nous permettent de penser, sans pour autant exclure la
participation d'autres substances qui pourraient intervenir dans lléla-
boration de l'immunité globale anti-pasteurellique, que .l'Antigène
·'i
-56-
T A BLE A U nO 8
Détenrination des indices de protection des antisérur:is A~ 11 et Po 109
contre les souches de Po multQcida Ao14 et A.11
.
, souris mortes
.' Dilution de la
Pourcentaê:e de mortalite --"'--t"'li '
Pourcentage de mortalité aprè~
;', suspension
sour~s u ~
sees
l'épreuve par la souche Ao11
r
après J'épreuve par la souche A.14
d'épreuve
Sérum 1C'9
Sérum A.11
Témoins
Sérum Ao 11
S éI'1JlTl 1a9
Timoill:
',:o-m
~.
10-2
5/5
5/5
3/5
5/5
10-3
3/5
5/5
1/5
5/5
10-4
1/5
5/5
0/5
5/5
10-5
0/5
5/5
0/5
5/5
10-6
1/5
5/5
0/5
5/5
~.~'.
10-7
0/5
5/5
5/5
1/5
5/5
5/5
,;,~:
10-8
0/5
1/5
2/5
0/5
4/5
5/5
~i:~
',e
~,
10-9
0/5
1/5
0/5
0/5
,
.~;c,
log. DoLo
- 3,}
- 7,62
- 8
- 2,32
- 8,37
- 8,5
50
1)~
Indice de
4 ..,
0,38
6,18
0,13
protection
' 1
:.;
,'.
Il en ressort que la p~)tection n'a lieu que lorsque les souris sont éprouvées avec
! la souche correspondant au sérotype somatique de l'antisérum employé; aucune protection
',' croisée n'a lieu, bien que ces souches appartiennent au même sérotype capsulaire A ct
;' bien que certains sérums soient riches en anticorps anU-A.
~i'"
-57-
T A BLE A U nO 9
Détermination de l'indice de protection de différents sérums
des sérotypes somatiques 1,5,8,9
vis~à-vis d'une souche d'épreuve de type 7
Dilution de la
Pourcentage de
l i
' souris mortes
morta
te ----~--_:_:_7"-,
après l'épreuve
sourlS utllisees
suspension
par la souche
d'épreuve
Ao 11
::;érum No 4
Sérum TS o 8
Sérum 1059
Sérum Tz.10
'l'émoins
10-4
5/5
5/5
5/5
5/5
10-5
5/5
5/5
5/5
5/5
10-6
5/5
5/5
5/5
5/5
10-7
5/5
4/5
5/5
4/5
5/5
10-8
5/5
2/5
3/5
5/5
5/5
10-9
1/5
0/5
0/5
1/5
0/5
L:>go DoLo 50
- 8,63
- 7,62
- 8,17
- 8,48
- 8,5
Indice de
0
0,88
0,33
0,02
protection
Ces résultats confirment ceux du tableau précédent; bien que possédant
des anticorps hémagglutinants A, ces sérums ne protègent pas les so~is
car la souche d'épreuve possède un antigène somatique hétérologue (0 t 7)
",
. 'J.f..
T A BLE A U
nO 10
Détermination de l'indice de protection des antisérums TSoS et Ao 14
respectivement dépourvus dl anticorps hémagglutinants
et d'anticorps agglutinants
souris mortes
Dilution de la
Pourcenta@~ de mortalité
Pourcentage de mortalité aprBf;
souris utilis68S
6uspension
11 épreuve par la souche A.14
après l'épreuve par la souche TS.S
dl épreuve
Sérum TS.S
Témoins
Sérum 1>..14
Té:-:loin~
10-3
5/5
5/5
10-4
2/5
5/5
10-5
0/5
5/5
10-6
o/S
5/5
S/5
10-7
5/5
5/5
4/5
10-8
2/5
2/5
2/5
10-9
0/5
0/5
0/5
log. D.Lo50
- 3,84-
- 7,84-
- 7,84-
- 7,69
Indice de
4-
0
protection
~
Nous constatons que la protection nlest obtenue que par l'antisérum TS.8 contenant
.: les anticorps agglutinants ; ce qui revient à' dire que les anticorps hémagglutinants
:. n'interviennent pas dans la protection•
. '',W.
~...:lêi:èif3ia~.~*~~~"f;t';"'1"';'!ltH~~.t~':'""~:r~~.;"\\')h.~.f~
_ '.
;,';.
-59-
Wcifigqe•.Ae__t:œ.e c@.sulaire tel qu'il existe in si tu da.'1s la bactérie,
doit 0tre consiùéré con~e un antigène vaccinant provoquant donc ln for-
mation des anticorps protectC\\lr8 pOUT cc qui est des sérotypes B et E.
Quant aux antig8:H:~s ùe paroi des mêlUcs souches, ils ne semblent jouer
aucun rÔle ùans l'immunité. Ces résultats confirment les travaux de
Carter et ilnnau (1953) ; Carter (1955) ; Dhanda (1959) ; Perreau ct
Petit (1963) et réCCllilllC);l.t Perm ct Nagy (1 97/f) , dnns losquelo il appa-·
raît qU) l' on tigènr~ spécifique de type capsulaire confère la protection.
Chez les sérotypcs A par contre, ce sont les §11 ti.Bi;nes de moi. qui
induisent la formation d' a.nticorps agglutinants protecteurs ; ces résul-
tats rejoigncmt ceux de }'lurat, Horuichi et Namioka (1964) et ceux de
Eamiolc.a (1970) montrant respectiv0L:ent, pour les premiers, que les pou-
lets immunisés avec une souchr; 1\\.1 ni étaient pas protégés lorsqu 1 ils
étaient éprouvés ultérieurement par une souche ~\\.5 et vice-versa; et
pour IGS seconds, il n'y avait aucune protection croisée, chez les pou-
lets vaccinés avec une souche A.8 et éprouvés avec une souche ~.5 et
vico-versa.
Il est à rOillaTquer que los auteurs japonais ont effectué des expé-
riënces ùe vaccination donc d'immunisation active avec des bactéries
entières.
Hotre démonstration utilise exclusivement des tests d' irnrnuni té pas-
sive, mc'~tant en oeuvre des sérums de plusieurs sérotypes et aussi, des
anticorps sélectionn6s puisque nous disposions d0 c8rtains sérums exc:Lu-
sivement "anti-capsule" ou ";:1.11-ci-paroi Il.
Mais comment expliquer les résultats contrairûs de Dapat et Sawhey
(1972) selon lesquels l'antigène spécifique de paroi injecté à dose
répétée à des L~pins, TI' entraîne pas la formation d' nnticorps protec-
teur ? Eous pensons que l'antigène spécifique de t:!IJe somatique une
fois extrait, peut exister sous forme d'haptène et non de complexe an-
tigéni~ue.
L'utilisation pour la préparation d' immunséruIDs de g8!"jleS traités à
la hyaluronidase (pour décapsuler ce~x-ci) permet d'obtenir des sérums
très riches en anticorps agglutinants qui s' avc"rent protecteurs; c'esi
le cas des antisérums 1'S.8 et A. 11 •
.,
-60-
Nous pensons donc, il ln sui te de ces essais, que pour toute vaccina-
tion, il faut obligatoirement tenir compte du.~éJ:otvpe càRsulAir1L~
les souches B et E de ~ ; par contre .II.Q.W'.~~uchcs IL et
13..ws nul dQutc _l.~o~cj!2..§..j), qui ont une composition antigénique tout à
fai t parallèle, il fau.dra tenir compte bien plus du ~otYpe somatia~
que du sérotype capsulaire.
3) ~..k''J."1.Ql:T EnTRE IEê..1.l'IliES _D' EE11A.GGLU'l'INATION ET LE POUVOIR PHO'I'EC-
'illUR D8S S"LRillIS DES SERO'l'YFES B ET E
L'étude, 0n fonction des titres d'hémngglutination, des variations du
degré de protection évalué par l'indice de protection précédemment défir~,
montre (tableau nO 11, figure nO 9) que cette protection croit avec les ti~
~es selon une courb0 d'allure sigmoïde; en effet, nul pour les titres de
1/10 et 1/20, le pouvoir protecteur augmente ensuitG au fur et à mesure que
s'accroissent les titres d'une façon exponentielle; mais à partir du 1/320,
la courhe s'infléchit et pour des titres supérieurs, il n'y a plus d'aug-
mentation notable dE; ID. protection, laquelle tend assymptotiquement vers
une valeur maximale.
Ainsi les deux paramètres, htres en anticorps hérnagglutinants et pou-
voir protecteur sont bE,l ct bien liés selon une courb8 sigmoïde. Cette
COITélation n'est pas i;ellemcnt surprcmante puisque les réslùtats du para-
graphe 2 où nous avons vu que, chez les sérotypes B et E, les FlD ticorps
hémagglutinants partidpaien t à la protection de l' organisI'le, 11.;) laissaien 1;
pressen tir •
Un autre fait à retenir de cotte expérj.ence, c'est ClU' à. partir dl un cer-·
tain seuil, l'augmentation des titres des sérums n'entraîne ~u'un accrois-
/
sement relativement faible du degré de protection.
Nos rfsultats rejoi€~Gnt ceux de Carter (1964) et très récemment cet~
de Cameron et Gertruida (1970), encore que l'interprétation des résultats
de ces derniers auteè'.r~1 sus ci te quelque réserve, ils ont utilisé comme sou-
che d'expérience, 10. souche A.14 ; or, à la lumière de nos résultats donnés
précédeIJ1lllent, il ressort clairement que, chez les sérotypes A, le protection
f~it intervenir presqu1exclusivement que les anticorps spécifiques dirigés
contre los antiGènes cl,) paroi. Pour expliquer C8tte contradiction, on peut
penser, cotnllle nous 18 verrons plus loin, que des nnticorps somatiques ont
6té élaborés parallèlcr'lent aux anticorps capsulaires et Cp.lG la protection
conférée par ln vaccination dépendait bien davantage des px"cmiers que des
seconds, qui ont été les seuls révélés par le test d'hémagglutination pas-
sive.
.'~
-61-
T Â BLE A U nO 11
Corrélation entre le titre d'hémagglutination et l'indice de protection,
pour des sa.""UmS E de richesse variable en anticorps
-
l i t ' souris mortes
,
Dilution de la
Pourcen tage de morta
e ---:---.,---:--..,.- apres l'infection
sour~s ut~l~sees
suspension
par la souche E.12
d'épreuve
Sérums
nO 1
nO 2
nO 3
nO 4
nO 5
nO 6
nO 7
nO 8
Téinoir
1/10
1/ZJ
1/40
1/00
1/160
1/3ZJ
1/1280 1/51 ZJ
1
4/4
10-1
4/4
3/4
10-2
4/4
2/4
1/4
10-3
4/4
1/4
0/4
0/4
10-4
4/4
2/4
0/4
0/4
0/4
10-5
4/4
3/4
2/4
0/4
10-6
4/4
4/4
2/4
0/4
10-7
4/4
4/4
3/4
0/4
0/4
5/5
10-8
3/4
3/4
0/4
5/5
10-9
1/4
0/4
0/4
1/5
- 8,5
-8,34 - 7,34
- 5,77
- 4,5 - 2,67
- 2
- 1,5 _. 8,6:
Indice de
0,13
0,29
1,29
2,86
4,13
5,96
6,63
1,13
o
protection
~
s'"-:
.
,.,.0·
-62-
Indice de prot,=ction
(en log.)
10
9
8
... .
..'"
7
"
......
"
/0.·
.'
..'
.....
.
.' "
.'
.'
6
.'
."
."
!
!1
!i
5
;
!
i
i
4
i
/
1
1
1
3
/
i1
/
2
1
1
i,J
/
/
..-,_.1
Titres des sérums
o
...........
i
- "
.........
\\Jl
......
FIG URE
n09
Variation sigmoïdale de l'indice de protection
en fClnction des titres cn anticorps capsulaires
spécifiques du sérotype E
· i:..
,.""--';"'---~--------"""'--=--,,--,----
-----,. --" ....
' - -
"~.'-"---"- _. - ---
-63-
1'étude de la valeur des divers tests sérologiques utilisables en matière
de pasteurellose impliquaH un choix et 1.l..l1e standardisation de ceux-ci avant
leur mise en application.
Ont été retenues :
l'hémagglutinûtion indirecte ou passive,
• la fixation du complément,
• l'aGglutination de type somatique,
• 11 irùlJl1.l..l1ofluorescence indirecte.
1) j\\GGLUTI~lATlaN SŒWfI..illJE
Les ID8illcures pr6parations alltigéaiqu8s utilisE5es pour ce test son. t
cormuc nous l'avons dit au chapitre B, los antig~nes' "hyaluronidase ll pour
des sérotY7es A 8t D et les ~1tigènes constitués par les varixlts non
irisés (ayc:mt perdu leur ~apsule mais possédant encore leurs antigènes
de paroi) pour les sérotypcs TI et E.
Pour sa mise en oeuvre, nous avons étudié différeLtes préparations
roltigéni~~es afin de rechercher celles qui avaient le maximum d'activité
- antigène L.P.S. obtenu à partir des gerEles non irisés (ou il) de R•
.!Jllill2,.çj-'lll t~'P0 B et E,
- anti~>-ène L.P.;). obtenu à partir des germes S de F" Illultocida type
B et E (1.P.S.),
- antigèn:: obtenu par agitation YJ minutes à la tempérab..1.re du labo-
ratoire à partir ùes souches de P. multocida type D et E (1
),
30
- antigène obtenu par chauffage à 10aoe pendant une heure au bam-
marie (e),
- anti~èno obtccu par agitation pendant 24 heures à 4°e (1
),
24
- antigèn<J obtenu par ultra-sons (U.S.),
- antigène obtcmu par lyse des germ.es au détergent (1.S.S.).
Les sérums utilisés sont 1('S antisérums B.:5,8.12 ;:!t 0.6.
1
1
-64-
Le;) tableaux nO 1~:, 13, 14, 15, 16, 17 donnent les résultats des ti-
trages des différentes préparations antigéniques pour le système B. On
peut constater que ce sont les extraits obtenus soit par la méthode de
Westphal, soit par cf..lluffage au bain-marie à 100°C pendont une heure qui
sant les plus riches en antigène spécifique de type capsulaire (1/160
pour le premier et 1/80 pour le second).
Toutes les autres préparations contiennent mais en quantité relative-
ment moindre, l' antié:ène spécifique de type capsulaire ; les titres
n'excédent pas le 1/4 8t i l est même égal à
pour l'antigène obtenu par
agitation pendant 30 minutes à la température du laboratoire.
Cette réaction d'hémagglutination passive n'a pas lieu lorsque l'on
utilise la préparatic.n antigénique des gerl"iles en phase non irisée ou R,
obtenue selon la métl~de de Westphnl ; elle est également négative
lorsqu'on met en pré~:ence l' nntisérUUl 0.6 et les antigènes lipopolysac-
cbarides obtenus des souches à l'état S
elle reste négative aussi quand
les sérums B et E sont croisés avec les antigènes L.P.S. de type B et E,
alors que ces deux s~;rotypes ont les m~mes antigènes de paroi. En outre,
le test d'hémagglutinlltion passive permet de mettre en évidence, sans
aucune contestation, que le chauffage à 100°C pendant une heure ne dé-
tériore aucunement l'antigénicité et la spécificité de l'antigène de
type capsulaire, ce qui confirme les rJsu! tats du tests d' innnunodiffu-
sion
le tableau nO 17 montre l'absence de réaction croisée entre l'an-
tigène 100°C de type B et le sérum anti-E.
De tous ces faits, il en ressort que le test d'hémagglutination pas-
sive ne permet bien de révéler que les antigènes spécifiques de type
capsulaire ; la prép~œation antigénique idéale pour ce test est celle
obtenue selon la méthode de vlestphal et c'est donc cet antigène que
nous avons employé plœ la sui te •
.l
~-~.~!""'..--..---.=
-.,.-"'-':';""";"'';;';;--''-''~'"--''--''-'---'''--''--'-'-''-''''''~-'''
,
.
":1
i~
-65-
T AB LE A U
nO 12
Titrage par hémagglutination passive de l'antigène
obtenu par chauffage à 100°C du.r8-11t une heure
DILUTIONS
D l LUT ION S
DU
SERUH
DI AllTIGENE
10
20
40
80
160
320
640
1280
2560
5120
1/1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/(5)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/40
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/00
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/1 fIJ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
1/3tSJ
+
+
+
+
+
+
-
-
1/640
+
-
T AB LE A U
nO 13
Titrage par hémagglutination passive
du lipopolyoside B (méthode de Westphal)
DILUTIONS
D l LUT ION S
DU
SERUH
D'ANTIGENE
10
20
40
00
160
32)
640
1200
2560
5120
1/1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/tSJ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/40
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/00
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/1fIJ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/3(5)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
1/640
+
-
-66-
T A BLE A U
nO 14
Ti trage par hémagglutination passive de 11 antigène
obtenu. par agitation à 4°C dura~t 24 heures
-
DILUTIONS
DILUTIONS
D U
SERUM
D'ANTIGENE
10
20
40
m
160
320
640
1200
2560
5120
- 1/1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
1/2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
1/4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
1/8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
1/10
+
-
T A BLE A U
nO 15
fi trage par hémagglutination passive de 11 antigène
obten~ par agitation à la température ambiante durant 30 minutes
DILUTIONS
D l
LUTIONS
DU
SERUH.
Dl ANTIGEI'lE
10
20
40
m
160
320
640
1280
2560
51 ;;D
1/1
+
+
+
+
+
+
+
+
1/2
+
+
+
+
+
+
+
+
1/4
+
+
-
1/8
+
-
TA B L EA U
nO 16
Titrace par hémagglutination passive dhm antigène
obtenu par lavage des bactéries
avec du lauryl-sulfate de Na à 0,02 po 100
~,
DILUTIONS
D l LUT ION S
DU
S E R U M
DI ANTIG"uNE
10
20
40
80
160
320
640
12f'.{)
2560
513J
1/1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1/8
+
+
+
+
+
+
+
1/10
+
+
-
1/tSJ
T A BLE A U
nO 17
Réactions d'hémagglutination croisées
;.
· .~
avec les antigènes B et E (L.PoSo)
~
; '.:!
·
~
;: 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
· ~t'
DILUTIONS
DU
SERUN
A N T I-E
ci IJmGENFS
· ~'
: ~
10
20
40
80
160
320
640
1280
2560
5120
· .~----------------------------------------,
· "
· ~t..P.s. type E +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
"
!.
• ~L.P.S. type B
+
· r;
i~~
•
,: }' hltigme B
" b
~·o tenu par
.
~:- chauffage
., f,.' 100°C du-
·:if· rant une
: f heure
i
: ~~---------------------------------------~
, ,~
· !.::,
:t'
l,.~}'.\\
J
· ~
· ';~
.~
;:
~,
"
.~~.
:~
1
1
-68-
3) FIXATION DU Cor1PIENEIf~
Nous avons, pour dl§terminer le meilleur antigène en fixation du com-
plémen t selon le II'océ(lé de Kolmer, titré un certain nombre de prépara-
tions pouvant se c lasner en :
a) .w.tigènes parti(lulaire.e
• germes entierfl cul tivés sur gélose tryptose,
• germes entierfl cultivés en bouillon tryptose,
• germes traitéfl à la hyaluronidase,
• germes trai téfl à l'acide chlorhydrique,
• germes chauffés à 100°C pendant une heure.
b) .gntiRi::nes so lub]&§. (ou lysats)
• germes en prJafle S ultra-sonnés,
o
germes en phane R uJ. tra-sonnés,
• germes trai téH fi la hyaluronidase, puis uJ. tra-sonnés,
• germes trai tén à l'acide chlorhydrique, puis ultra-sormés,
• germes lysés par le lauryl sulfate de sodium.
Les résultats des titrages récapitulés dans les tableaux nO 18, 19,
20
montrent que, de toutes les préparations antigéniques, seules celles
lysées par les uJ.tra-~lons ou par le lauryl sulfate de sodium se révèlent
les plus sensibles. U!S autros préparations sont soit inactives, soit
anti-complémentaires.
Que l'antigène lYSE; provienne d'une souche R ou d'une souche S
ou
d'une souche traitée h la hyaluronidase, les titres sont les mêmes. Ces
faits sont vérifiés, que l'on soit dans le système A, B ou E. Avec le
sérotype B comme le E, les antigènes donnent avec l'antisérum 0.6, une
réaction de fixation élu complément positive au même titre. 1<>rsqu'on
sai t que les sérowefl B et E ont le même antigène de paroi et que le
sérum anti-0.6 contier.~t exclusivement des anticorps dirigés contre les
seuls antigènes assocj.és à la paroi, on est en droit de penser que la
réaction de fixation élu complément fait intervenir uniquement les anti-
gènes associés à la pEœoi (ou somatiques).
_--_
-_.-.
,
'
~<~ • ••,~,""'i""-""'.""""'.. ""---':I-~:.:' '.""',-.~.;-','''''-~ ••
_
'~
4-,,,
--
...
..__
....
~
'~'..,...
'..
""','"
"
...
~"'~"-'.........
' ...
-
-69-
TABLEAU
nO 18
Titrage des antigènes fixant le complément
.
• Sérums
anti-E.12 (capsuJ.e et paroi des souches E)
anti-0.6 (paroi des souches B et E)
.
. Antigènes des souches E.12 CS) et E
.
o 12
CR)
-
Ag E (S) US
: bactéries E en phase S lysées a~~ ultra-sons,
- Ag E (R) US
: bactéries E en phase R lysées aux ultra-sons,
.
- Ag E CS) I.SS
bactéries E en phase S lysées par le lauryl sulfate de Na
à 0,25 po 100.
Témoin
Sérum anti-E o12
1/10
1/20
1/40
1/00
1/160
1/320
antig'Jne
-
4; E (S) US
1/10
4*
4
3
3
3
-
-
1/25
4
4
4
4
4
2
-
1/50
4
4
4
4
4
2
-
1/100
4
4
4
4
4
1
-
1/200
4
4
4
4
4
2
-
1/400
4
4
3
2
-
-
-
Témoin sérum
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Témoin
Sérum anti"{).6
1/10
1/20
1/40
1/00
1/160
1/320
antigène
!:g E (S) US
1/10
4
4
4
4
3
-
-
1/25
4
4
4
4
4
2
-
_.
1/50
4
4
4
4
4
2
1/100
4
4
4
4
3
-
-
1/200
4
4
4
3
-
-
-
1/400
4
4
3
-
-
-
-
Témoin sérum
-
-
-
-
-
-
-
~ E (R) US 1/10
4
4
4
3
3
-
-
1/25
4
4
4
4
3
-
-
1/50
4
4
4
4
4
tr
-
1/100
<1-
4
4'
4
4
tr
-
1/2fXJ
4
4
4
4
4
tr
-
1/400
4
4
4
4
3
tr
-
Ténx>in sérum
-
-
-
-
-
-
-
!K E (S) LSS 1/10
4
4
4
4
4
3
-
1/25
4
4
4
4
4
3
-
1/50
4
4
4
4
4
3
-
1/100
4
4
4
4
4
3
-
1/200
4
4
4
4
4
2
-
1/400
4
4
4
4
3
2
-
Témoin sérum
-
-
-
-
-
-
-
• Les chiffres indiquent le nombre de croix correspondant ù la réaction positive.
-70-
TABLE AU
n019
Titrage des antigènes fixant le complément
• Sérums : enti-B.4 (capsule et paroi des souches B)
anti-O.6 (paroi des souches B et E)
• Antigènes des souches Bo3 (S) et Bo3 (R) :
- Ag B (S) US : bactéries B en phase S lysées aux ultra-sons,
- Ag B (R) US : bactéries B en phase R lysées aux ultra-sons,
- Ag capsulaire de type B (lavage 30 minutes)o
Témoin
Sérum anti-O 0 6
1/10
1/20
1/40
1/00
1/160
1/320
antigène
le B (S) US
1/10
4
4
4
4
4
3
1/25
4
4
4
4
4
3
1/50
4
4
4
4
4
3
1/100
4
4
4
4
4
3
1/200
4
4
4
4
4
3
1/400
4
4
4
3
2
1
Témoin sérum
Sérum anti-B
Témoin
o 4
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
antig~e
Ag B (R) US
1/10
4
4
4
1/25
4
4
4
4
1/50
4
4
4
4
3
1/100
4
4
4
4
4
3
1/200
4
4
4
4
4
3
1/400
4
4
4
4
4
3
Témoin sérum
Ag capsulaire 1/10
1/25
1/50
1/100
Témoin sérum.
De ces sept tableaux, il ressort que
- la fixation est indépendante de l'antigène de type capsulaire
celui-ci est en
effet inactif 0
- il y a peu de différence d'activité entre les germes lysés aux ultra-sons et
ceux lysés au L.SoS o
-71-
T li. BLE A U
nO 20
Ti trage des antigènes fixnnt le complément
.~ : anti-A.3371 (capsule A et paroi 0 : 3)
A~tigènes de la souche
1
A.13 (s) (m~me sérotype capsulaire et somatique)
- Ag T. US
bactéries entières lysées aU): ultra-sons,
-AgH
bactéries entières traitées à l'hyaluronidase,
- Ag H. US
bactéries entières traitées à l'hyaluronidase, puis lysées aux
ul t-.ca-sons,
- .Ag L.S.S o
b[·.ctériEs entières lysées par le lEtl.U'yl··sulfate de Na à 0,25
p. 1(;(),
- Ag nCl
bactéries traitées à l'HGl
N,
- Ag liCl. US: bactéries traitées à l'HCl
N, puis lysées alU ultra-sonso
Témoin
Sérum anti-A03371
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
antigè11e
Ag To US
.1/10
4
4
4
4
4
2
1/25
4
4
4
4
4
2
1/50
4
4
4
4
4
2
1/100
4
4
4
4
tr
Sérum tanoin
1/10
4
4
4
4
4
4
4
1/25
4
4
4
4
4
4
2
1/50
4
4
4
4
4
3
tr
1/100
4
4
3
3
2
1
Sérum témoin
Ag Ho US
1/10
4
4
4
4
4
1/25
4
4
4
4
4
1/r:.JJ
4
4
4
4
4
1/100
4
4
4
3
1
Sérum témoin
Ag L.S.S. 1/10
4
4
4
4
4
2
1/25
4
4
4
4
4
2
1/50
4
4
4
4
4
1/100
4
4
4
2
Sérum témoin
En comparant ces résultats, On note que l'Ag T. US, l'Ag Ho US et l'Ag L.S.S. donnent
les mOrnes résultats; quant à l'Ag TI il présente une activité anti-complémentaire. Tout
,
.
se passe comme si l'Ag capsulaire n' intervenéü t pas dnns cette réaction ; le trui t8Elent
aux ultra-sons semble faire dispara!tre 11 activi té anti-complémen taire de l'Ag H.
-72-
T AB LEAU
n020 (suite)
Ti trage des antigènes fixant le complément
Témoi~
Sérum anti-Ao3371
1/10
1/20
1/40
1/00
1/160
1/320
antigène
Ag HCl
1/10
4
4
4
4
4
4
2
1/25
4
4
2
1
tr
tr
1
1/50
3
2
1
tr
tr
1/100
tr
tr
Témoin sérum
AgHCl~US 1/10
4
4
4
4
1/25
4
4
4
1/50
4
4
1/100
tr
Témoin sérum
Notons la disparition de l'activité anti-éomplémentairè des Ag "HCl" après le trai-
tement aux ultra-sons.
-73-
T A BLE A U
n (1 21
Titrage des antigènes fixrolt le complément
• Sérum anti-A.3371 (capsule A ct paroi 0 : 3)
• Antigènes préparés avec la souche A.13 (même sérotype capsulaire et somatique)
- Ag (T) g
germes entiers cultivés sur milieu gélosé,
- Ag (T) b
germes entiers cultivés en bouillon,
- Ag (Tl) g: germes entiers cultivés sur milieu gélosé, puis chauffés une
heure à 100°C,
- Ag (T') b: germes entiers cultivés en bouillon, puis c}unûîés une heure
à 1QOoCo
Témoin
Sérum anti-Ao3371
1/10
1/20
1/40
1/00
1/160
1/320
antigène
Ag (T) g
1/10
4
4
4
4
4
4
4
1/25
3
3
3
3
3
3
2
1/50
3'
3
3
2
2
2
1
1/100
2
2
2
2
Tanoin sérum
Ag (T) b
1/10
4
4
2
2
1/25
3
2
2
1
1/50
2
2
1
tr
1/100
Témoin sérum
Ag (T') g
1/10
4
4
4
4-
4
4
4
1/25
4
4
4
4
4
4
4
1/50
4
4
4
4
4
4
3
1/100
4
4
4
4
tr
tr
tr
1/200
4
4
4
3
tr
tr
tr
Témoin sérum.
Ag (T') b
1/10
4
4
4
3
2
tr
1/25
4
4
3
3
2
tr
1/50
4
3
2
1
tr
1/100
2
2
2
tr
Témoin sérum
On voit que les germes totaux cultivés sur milieu gélosé,qu'ils soient chauffés ou non,
oot une activité anti-complémentaire, tandis que les germes cultivés en bouillon, chauffés
ou non, n'ont pas cc pouvoir anti-complémentaire ; par contre, lem' activité de fixation
du Cl semble assez fnible.
-74-
La. fixation du compléLlent mettant en jeu les antigènes de paroi, comme
nous venons de le voir, nous avons cherché à savoir si on pouvait retrou-
ver les types somatiques de Namioka et coll. (1961) par fixation du com-
plément selon Kolmer et non plus par aggutination simplo.
Pour réaliser cette expérience, nous avons utilisé comme antigène,
des préparations "ultra-sonnées" de germes préalablement traités à la
hyaluronidase ; les résultats de l'essai sont reportés dans le tableau
nO 22. Nous constatons, en dépit de l'existence des réactions croisées
entre les souclles représentatives des divers types somatiques, que les
titrefl les plus élevés sont obtenus malgré tout avec 18s sérums homolo-
gues.
Pour supprimer les réactions croisées, nous avons absorbé les sérums
avec les antigènes hétérologues ; ces sérums, une fois absorbés, ne se
révèlent positifs qu'avec l'antigène homologue COumle le montre le tableau
nO 23.
La fixation du complément peut donc servir, en dépit des bas titres
observés, à démontrer l'existence des divers sérotypes dits somatiques
correspondant aux divers an tigènes de paroi.
L'importance des réactions croisées est tout aussi nette qu'avec le
,test d'agglutination, ce qui montre que ces antigènes somatiques ont des
fractions communes.
-75-
T A BLE A Un':> 22
TABLEAU
nO 23
Fixation du complément et s_érotypes somat~ques
sérums absorbés
-
.~
M.4
A.3371
TS.8
A.11
1059
TZ.10
Kobe 6
H.17
anti 0:1
anti 0:3
anti-0:5
anti 0:7
anti 0:8
a.'1.ti 0:9
anti 0:2
anti. O:~
.. ~nes
o z 1
tr
-
_.
-
-
-
o z 3
-
1/10
-
-
-
-
o z 5
-
-
1/20
-
-
-
o : 7
-
-
-
1/10
-
-
-0 z 8
-
-
-
-
1/20
-
o : 9
-
-
-
-
-
1/20
o : 2
1/40
-
o : 4
-
1/20
•
-76-
1
On peut donc constater que :
1
- la réaction de fixa:ion du. complément dans le diagnostic de la pas-
teurellose, permet de révéler essentiellement les anticorps dirigés
1
contre les antigènes de paroi.
- les résultats obtenus en fixation du conplénent restent pEll'allèles
à ceux obtenus par agglutination en utilisi-Jnt les nntig9nes SOlllBti-
1
ques ; naanmoins, au vu des titres, 1/40.960 en agglutination et
1/160 en fixation du complément pour le
scrun enti-O.6 vis-à-vis
des mêmes a~tigènes de pEll'oi, on peut en conclure que l'agglutina-
tion est plus sensible que lu fixation ;,du complément.
4) IM!'1UNOFI1JOlŒSCENCE
les résultats présentés au tableau nO 24· indiquent que les trois mo-
des de préparation des antigènes utilisables pour cette réaction: frot-
tis réalisés à partir de la culture en bouillon, de foie ou encore de
rate de ~ouris infectée, sont tous les trois équivalents.
Néanmoins, nous avons préféré la culture en bouilJ.on étalée sur la-
me comme matériel antigénique pour la recherche des anticorps circulants
elle apparaît techniqueUlent la plus commode car il est possible de pré-
parer très rapidement et très facilement, un très grand nombre de lames
à partir de quelques ml de cult"Ure.
Quant aux pr8parations de frottis de rate ou de foie, nous pensons,
ù la lumière de notre expérience, qu'elles sont mieux adaptées à la re-
cherche directe du germe dans ces organes, à l'aide d'un illlI!nmsérum
il s'agit alors d'un diagnostic par identification dt l'antigène spéci-
fique.
Les résultats que nous venons de décrire ne concernent que les s&o-
types B et E de .p. roul tociful. avec lesqu81s la sérologie capsulaire est
facilement réalisable.
En effet tous les essais effectués avec des souches des sérotnJes
A et D se sont révélés infructueux lorsque les bactéries sont capsulées.
Nous pensons que l'acide hyaluronique constitutif de la capsule des
souches A et D, sérologiquement inactif, rend le test impossible tout
comme il masque 11 antigène capsulaire spécifique dans l' hémagglutina-
tion passive.
Cependant les résultats du tableau nO 6 contre que l'immunofluores-
cence peut aussi servir à l'identification des antigènes somntiques
lorsque les bactéries son t décapsulées.
-77-
T A BLE A U
nO 24
Titrage par immunofluorescence indirecte
de trois préparations antigéniques du sérotype B
D l LUT ION S
D U
S E R U 101
A N T I-B.4
SOURCES D' ANTI GENE
1/10
1/25
1/50
1/100
1/6J0
1/400
1/800
1/1600
1/3'6..10
Culture de 6 heures
2
3
3
3
3
3
2
2
2
en bouillon
Rate
2
2
3
3
3
3
3
2
2
Foie
2
3
3
3
3
3
2
2
2
TiiTage par immunofluorescence indirecte
de trois préparations antigéniques du sérotype E
DILUTIONS
DU
S E R U H
A NT I-E.12
SOURCES D'ANTIGENE
1/10
1/25
1/50
1/100
1/200
1/400
1/000
1/1600
"/3'JJO
Culture de 6 heures
2
3
3
3
3
3
2
2
en bouillon
Rate
2
2
2
2
2
2
2
Foie
2
3
2
2
2
2
2
2
De ces deux tableaux, il ressort que les trois préparations sont quasi-équivalentes
lIVec un très léger avontage des frottis réalisés avec la culture en bouillon ; il est
~ssible que, dans les frottis de tissus, les germes soient plus ou moins noy6~ dnns
~s.débris et les exsudats et fixent moins bien les anticorps, d'où une brillance moins
élevée.
-78-
1) ~E LA. CIN~W!-,JgUE D'APPARITION DES ANTICO,KP..§.
Grâce aux méthodes précédeD~ent définies, nous avons pu étudier la
cinétique ~'apparition et de réflanence des anticorps lors d'infections
expérimentales à.R.~ lIl\\.Ùtoc;i,dn chez deux zébus, "\\ID mouton et trois lapinse
Les figures nO 10, 11, 12, 13, 14 et les tableaux nO 25, 26, 27, 28,
29, 30 résument l'ensemble des expériences et de lellrS résultatse
Nous pouvons donc analyser la réponse immunitaire humorale, sn exami-
nant successivement les courbes correspondantes aux tests.
a) .1.'.pgglutinatiQn classique. (A.)
Effectuée avec des germes entiers (capsulés) est pratiquement inu-
tilisable. Les fausses réactions négatives ont été de règle avec les
zébus nO 261 et 369. Ce test a été ensuite abandonné.
b) l.'Aggllitimti9A somatig,ue (A.S.)
Les anticorps décelés par cette réaction sont présents à la fin de
la première semaine qui suit l'inoculation. leur titre est atteint
entre la deuxiè1!le et la sixième semaine. Ce taux varie selon les ani-
maux, il peut être bas, de l'ordre du 1/40 (zébus 261 et 369). ou au
contraire atteindre des chiffres élevés: 1/2560 parfois (1/5120 à
1/10.240 (lapins 36, 37 et 38). Ces anticorps peuvent encore rester
à ces taux pendant une à quatre semaines avant de diflinuer progres-
sivement ; mais la présence d'anticorps témoins de l'Ulfection, peut
persister pendant longtemps. Ajoutons en outre que cette réaction
est très intéressante en ce sens qu'elle permet de suivre l'évolution
des titres des ~~ticorps au cas où l'H.A.P. est impossible lorsque le
"",.
germe infect3l1t se trouve en état par exemple R, comme c'est le cas
avec le zébu 261.
c) l' hémagglutination passive (.HoA.P.)
Les anticorps spécifiques de l'Ag capsulaire révélés par cette
technique apparaissent très rapidement, entre le cinquième et le
septième jour après l'inf~ction. Le taux maximum atteint progessi-
vement entre la deuxième et la sixième semaine, varie selon les
-79-
animaux, du 1/40 au 1/5120 ; ces anticorps persistent pendant un temps
variable allant de deux à plusieurs mois; à la quinzième semaine, cer-
tains animaux (lapin 36) ti tren t encore 1/1 280.
Remarquons qu'avec cette réaction nous pouvons suivre les rechutes ou
les recontaminations révélées par une réascension de la courbe (cas du
la.pin 37) ou à la douzième semaine, nou.s voyons les titres d'anticorps
passer du 1/2fJ au 1/00 à la quinzième semaine et au 1/640 à. la dix seI>-
tième.
Lee anticorps fixant le complément, moins précocos que les anticorps
révélés par la réaction d'A.S., apparaissent entre le septième et le qua-
torzième jour ; ils sont mis en évidence à des taux variant du 1/10 au
1/80 ; le parallélisme entre la cinétique d'apparition des anticorps fi-
xant le complément et celle des anticorps somatiques confirme leur iden-
ti té quoique lG taux des premiers se si tue en général très au dessous de
celui des seconds. Néanmoins, cela n'ôte pas au test dc fixation du com-
plément son intérêt dans le sérodiagnostic, car l'utilisation de deux
réactions au lieu d'une permet de mieux l'assurer.
e) 'l'immypofluorescence (I.F.I.)
Les examens réalisés avec ce test dans l'étude de la clllétique d'appa-
ri tion dec anticorps n'ont pas été '1.ssez nombreux pour noua permettre de
mieux asseoir notre interprétation
néanmoins, à partir des seuls résul-
tats donnés par le zébu nO 369, nous constatons que cette réaction est
positive dès la fin de la première semaine qui, suit l'inoculation pres-
qu'en même temps que l'H.A.P. ; le titre maximum (1/160) est atteint en
deux semaines et baisse progressivement. C3S titres l.F.I. apparaissent
plus élevés (deux à trois dilutions) que les titres H.A.P. ; il existe
1.m. parallélisme relativement satisfaisant entre les deux cinétiques,
ce
qui se retrouvera avec les sérums dl animaux naturellement infectés. Ap-
plicable surtout à la recherche des anticorps capsulaires des souches
de sérotype B ou E, l'I.F.I. ne peut servir que de test de confirmation,
ce qui limi te nettement son utilisation dans la prati'~:ue généralisée du
diagnostic sérologique de la pasteurellose.
-00-
T A BLE A U
nO 25
Evolution du taux des anticorps du zébu nO 261
après l'infection par une souche de P. multocida
en phase R (variant non irisé)
Hémaeglutination
Agglutination
Fixation du
Imml.Ulofluorescence
Sérum
passive
- - - - - - - - - - -
complément
indirecte
classique
sOI!latique
Dates des
;rélèvements
S.N.T. SoT. S.N.T.
S.T. S.N.T.
S. T.
S.N. '1.'.
S.T.
J.O o
J.O o +
7
J.O. + 14
1/40
1/10
J.O. + 21
, 1/40
1/10
J.O o + 28
1/40
1/10
J.O. + 35
1/20
J.O. + 42
1/20
J.O o + 49
1/20
J.O. + 56
1/20
J.O. + 67
J.0. + 79
T A BLE A U
nO 26
Evolution du taux des anticorps du zébu nO 369
après l'infection par une souche de P. multocida
en phase S (variant irisé)
Hémagglutination
Agglu tination
Fixation du
Immunofluo:::,csccncf';
SéI'1llll.
passive
complément
indir(~ctc
classique
somatiquc
Dates des
prélèvements
S.H.'I'.
S.T.
S.N.To SoT. S.N.T.
S.T o
S.N.T.
S. T.
S.N.T.
S. T.
J.O o
J00 0 +
7
1/40
1/10
1/40
1/40
1/10
X20
J.O
1 160
o
+ 14
1/40
JoO. + 21
1/40
1/40
1/10
1/160
1/3:>
JoO o + 28
1/40
1/20
1/160
1/20
JoO. + 35
1/40
1/20
1/00
1/20
JoO. + 42
1/40
1/20
1/40
JoO o + 49
1/10
1/20
1/40
J.O o + 56
1/10
1/20
1/40
J.O. + 63
1/10
1/10
1/40
J.O. + 74
J.O. + 87
* S.N. T.
sérum non traité au 2 mercapto-éthanol.
**
S.'1'o
: sérum traité au 2 mcrcapto-éthonol.
-81-
,S en anticorps
(dilutions)
o
semaines après infection
.
sr--.
6
8
10
en a..'1ticorps (dilutions)
1
I.F.I. (lgH + IgG)
r-----~\\
LZébU
1
nO 369
/
'\\
i
"
,
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--l
_H.A.~~~~\\--_.
.~.
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F/2~_l~1)
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2
4
6
8
10
11
FIG URE
nO 10
:~nétique d'apparition des anticorps chez les zéhus 2h1 et 369 respectivement infectés
par les souches de P
muJ.tocida E
non iris8es(R) et E
irisées(S)
J
12
12
. t L'infection réali~ée avec le variant non irisé explique
l'absence des anticorps cap-
sulaires et donc la négativité de l'll.A.P .. ct l'LF.I.
-82-
T A B L S A U
nO 27
Evolution du tatlX des anticorps du mouton nO 02
après l'infection par la. souche P. multocida Kobe 6 (n.2)
Hémagglutination
1''iy.ation du
Agglutination
ImmunofluoTcscCr.cc
Sérum
passive
complément
somatique
indirecte
Dates des
prélèvemen ts
S .N • T.
S.T.
S.N.T.
s. T.
S.N.T.
S ,~
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J.O.
-*
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J.O. +
3
-
-
J.O. +
7
1/40
1/40
J.O. + 14
1/40
1/80
1/20
J.O. + 21
1/20
1/80
1/20
J.O. + 28
1/20
1/80
1/20
J.O. + 35
1/20
1/40
1/20
J.O. + 42
1/20
1/40
1/10
J.O. + 49
1/20
1/20
1/10
J.O. + 56
1/20
1/20
1/10
J.O. + 63
1/20
1/10
J.O. + 70
1/10
1/10
J.O. + 77
1/10
1/10
J.O. + 84
1/10
1/10
J.O. + 91
1/10
1/10
J.O. + 98
1/10
1/10
J.O. +105
1/10
1/10
J.O. + 10 mois
1/10
1/10
Evolution du taux des anticorps du mouton nO 02
après la 2ème infection (304 jours après la 1ère)
Phénomène de rappel
J.O •
1/10
1/10
.~
J.O. +
2
1/40
1/10
1/10
J.O~ + 3
%00
X40 1/40 1/20
J.O. +
7
1 320
1 160
1/80
1/20
J.O. + 10
1/640
1/320
1Iso
1/20
J.O. + 14
1/640
1/640
1/80
1/20
J.O. + 16
1/640
1/640
1/80
1/40
J.O. + 20
1/320
1/320
1/40
1/40
J.O. + zr
1/160
1/160
1/40
1/40
* l'agglutination somatique est "faussement" négative, par impossibilité de préparer un
antigène actif (caractère fréquent des souches n).
** l'immunofluoro8cence recte infructueuse par la préoence de l'acide hyaluronique il la
surface des bactéries.
1
..s en anticorps (dilutions)
1/00
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(IgH + IgG)
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12
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1
jours
2
5
10
15
20
25
30
FI GURE
nO 11
';in8tiqucs dl appnri tion des anticorps du mouton 02 aprèn la 1ère et la 2ème infection
avec P. rmÜ tQcidQ, Kobe 6
!
liB.
Lo phénomène de rappel à la sui te de 10. 2ème infection est net
• temps de latence très bref ; réponse plus inten3e à majorité IgG.
-84-
T A BLE A U
nO 28
Evolution du taux des anticorps du lapin nO 36
après l'infection par la souche P. multocida A.14 (A:3)
Sérum
R.A.P.
A.S.
F.C'
Dates des
prélèvements
S.N.T.
S.T.
S.N.T.
S.T.
S.N.T.
s.'r.
J.O.
J.O. +
7
1/10
1/20
J.O. + 14
1/40
1/320
1/40
1/20
J.O. + 21
1/00
+ 1/10
1/640
1/160
1/20
1/10
JoO. + 28
1/1 éO
1/10
1/2560
1/160
1/40
1/10
J.O. + 35
1/640
+ 1/20
1/5120
1/160
1/80
1/10
J.O. + 42
1/5120
1/00
1/10.240
1/2560
1/00
1/40
JoO. + 49
1/5120
1/160
1/100240
1/10.240
1/m
1/40
J.O. + 56
1/5120
1/320
1/100240
1/10.240
1/00
1/40
J.O. + 63
1/5120
1/1200
1/10.240
1/10.240
1/00
1/~.o
J.O o + 70
1/5120
1/1200
1/10.240
1/10.240
1/00
1/';5)
J.O. + 77
1/2560
1/1200
1/5120
1/2560
1/00
1/40
JoO. + 84
1/1200
1/640
1/2560
1/2560
1/40
1/40
J.O. + 91
1/1280
1/640
1/2560
1/2560
1/4D
1/40
J.O. +105
1/1280
1/640
1/1280
1/1280
1/40
1/3)
J.O. +119
1/1280
1/3'X>
1/640
1/640
1/40
1/'X>
N.B, : ws très hauts titres observés chez ce lapin s'expliQuent par l'infectior. grave
et prolongée (phle€Jllon
sous-cutané de grande étendue) qui a suivi l'injection de
la souche ; une antibiothérapie intensive a été nécessaire pour le maintenir en
vie.
-85-
• s en anticorps (dilutions)
Avant traitemcat aU ,1
.240
Nerco.ptoéthnnol
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A. S. (Igi·l + IgC)
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4
8
10
12
. ~ s en anticorps (dilutions)
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1
1
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2
4
6
10
2
14
FIGURE
Cinétiques d ' appar:i. tion des nn ticorps du lllpin 36
après infection nvûc P. ~ultocida A14
le. réponse obtenue est plus du type secondllire que primnire; olle SI explique
pur la sévérité de l'infection.
1
-80-
1
TABLEAU
nO 29
1
Evolution du taux des anticorps du lapin nO 37
après l'infection par la souche Po rolùtociQâAo14
1
1
sérum
H.A.P o
AoSo
F.C'
Dates des
prélèvcments
SoNoT.
SoT.
S.N.T..
SoTo
S.N.T.
S. To
1
J.O.
J.O. +
7
1/10
1/10
1
JoO o +
14
1/320
1/2560
1/00
J ..Oo +
21
1
1/160
1/1250
1/160
1/40
JoO o +
28
1/4.0
1/640
1/00
1/a:>
JoO. +
49
1/20
1/10
1/320
1/40
1/a:>
JoO o +
56
1/20
1/10
1/320
1/00
1/a:>
J.O. +
63
1/20
1/10
1/160
1/160
1/20
JoOs +
70
1/20
1/10
1/320
1/160
1/a:>
J.O. +
e4
1/'l!J
1/10
1/160
1/40
1/20
J.O. +
91
1/'l!J
1/10
1/160
1/40
1/'l!J
J.O. + 105
1/00
1/80
1/160
1/80
1/'l!J
1/10
J.O o + 119
1/640
1/640
1/3a:>
1/160
1/a:>
i /10
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.. en anticorps (dilutior..s)
i
Avant tra.itement au
f1ercaptocthanol
II • A•P • ( leI·; + l eC )
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1
1
1
1
t
semaines après i~f8c-
8
i 5
. - tian
10
anticorps (dilutions)
jAprès traitemer.t au
/ 14ercaptoét'rwnol
'y.A.P. (IgG)
//
/
A.S. (Ige.)
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seu1è.i:1es après
•
._ v
tion
1 0
2
10
14
16
i1
FIGURE
1
Cinétiquo dt apparition des [Jl1 ticorps du lapin 37
nprèn infection avec p.. I;ll).1J~i.s.J..o. A14
1
l!
1
T A BLE A U
nO 30
1Yolution du taux des anticorps du lapin nO 3S
après l'infection par la souche L? ~1~ltocid~A.14
Sérum
HoA.F o
AoSo
F.C'
Dates des
prélèvements
S.NoT.
S.T.
S.N. T.
S. 'l'.
S.H.T.
S.To
JoO.
i
J.O o +
7
1/10
1/10
;
J.O o +
14
î/320
1/2560
1/00
1/40
.-'1
.T.O. +
21
1/5120
1/10
1/2560
1/3éD
1/80
,, J.O. + 28
1/2560
1/20
1/2560
1/640
1/00
1/10
J.O. +
35
1/1200
1/10
1/2560
1/1280
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fJ
J.O. +
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1/10
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1/40
1/20
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J.Oo +
49
1/640
1/10
1/1280
1/640
1/40
1/20
i J.O. + 56
1/64D
1/10
1/1280
1/640
1/40
1/40
1
J.O. +
63
1/320
1/10
1/1220
1/1280
1/4D
1/20
J.O o +
70
1/640
1/10
1/1280
1/640
1/20
1/-:"J0
J.O o +
77
1/320
1/20
1/640
1/00
1/40
1/10
J J.O. + 84
1/640
1/20
1/640
1/00
1/(5)
1/10
J.O. +
91
1/640
1/20
1/640
1/00
1/40
1/10
~
.1
JoO o + 105
1/1280
1/640
1/320
1/160
1/20
1/20
J.O. + 119
1/64·0
1/640
1/3(5)
1/160
1/20
1/(5)
1
a
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4
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1
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(dilutions)
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traitement au 1
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1
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semaines !l'Jrès
. ~
t~
Jonlee-lon
2
4
6
8
10
12
14
16
anticorps (dilutions)
Après traitement au 1
Hereaptoéthar.ol
/
r--'-'-'--- H.A.P. (Ige)
1
1
i
/
i ,-----A.S. (1 go';)
/1
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ii
/
1
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"
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(Ige)
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semaines nnrès
"
,
2
4
6
10
12
14
16
F!GURE
Cinétique d'apparition des anticorps du lapin 3B
après infection uvec p. mul iocidi,l A14
Constatons la pr?dominDncc des IgG surtout en fin de réponse.
•
1
-9)-
2) RECHERCHE D'.A.JiT"I.Q.Q.RP.S D' INFECTIOP rIA,TlJRELill
1
Après l'étude cinétique de l'apparition des anticorps chez les ani-
maux infectés expérimentalement, nous avons poursuivi notre travail avec
1
des sérums d'espèces animales diverses, reçus au laboratoire de nicro-
biologie pour des sérodiagnostics de maladies infectieuses variées.
a) .§.érums dp lAPins
Dans le tableau nO 31 sont exposés les résultats de la recherche
des anticorps, par trois tests sérologiques (H.A.F., A.S., l''.C'),
dans des sérums de lapins vivant tous da.'1s un élevage olt la pasteu-
rellose sévit à l'état enzootique •
• le test d'H.A.P. nous révèle par sa spécificité que, des quatre
sérotypes capsulaires de P. m~ltocid~, c'est le sérotype A qui
est l'agent infectieux
les ti trefJ varient du 1/10 au 1/2560
pour le ].apin 20 •
• en comparant les résultats donnés par l'agglutination classique
et l'a8g1utination somatique, il apparaît une fois do plus que
le premier test est inutilisable car il ne founut que des réac-
tions négatives, de façon fausse comme le montre lr: second test
qui, au contraire, donne des résultats nettement sicnificatifs,
les titres observés s'échelonncr,t en"trG -,/'6:1 et '1/2.Y-JÛ pour le::
sérotype somatique 3 ; avec les autres antigènes somatiques
employés (1, 5, 7, 9), les réactions restent négatives ce qui
démontre la bonne spécificité de ce test.
L' A.~~. permet donc '\\.me détection satisfaisante des anticorps
et un diagnostic de valeur sûre.
A signaler que la souche qui sévit dans cet élevage a été iso-
lée et est de sérotype li : 3$
• la fixation du complément, comme il est apparu lors de la stan-
dardisation des tests et de l'étude cinétique de production
d'anticorps, donne des titres plus bas, mais qui restent paral-
lèles à ceux de l'A.S. ; comme elle, la F.C' révèle une spéci-
ficité de type somatique.
1l~1'1
-91-
T A BLE Il. U
nO 31
Titres des anticorps dcn3 les sérums de 24 lapins
provena..'1t d'un élevage où la pasteurellose sévit ft l'état enzootique
AGGLU'J'INA'.rr ON
H.A.P.
l<'. Cl
Sérums
Somatique
Classique
,
A
D
o : 1 o : 3
o : 5 o : 7 o : 9
o : 3
1/160
1/20
2
1/2560
1/1280
1/40
3
1/80
1/80
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4
1/40
1/40
1/10
5
1/640
1/2!J
6
1/10
1/80
1/CJ
7
1/32!J
1/640
1/40
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1/1280
1/00
1/2]
9
1/80
1/80
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10
1/640
1/00
1/10
11
1/80
1/160
1/20
12
1/2!J
1/160
1/';5)
.......,.,-J.'.
13
1/32:)
1/1280
-
1/40
14
1/1280
1/160
Î /2J
15 L
1/00
1/32!J
1/20
16
1/80
1/40
17
1/CJ
1/160
1/20
1 18
1/10
1/00
1/10
l
19
1/1EiO
1/160
1/CJ
~
20
1/2560
1/2560
1/80
j.'. 21
1/BO
1/80
1/10
.
1
22
1/32!J
1/3CJ
1/;S;
23
1/10
1/40
1/10
24
1/160
1/'XJ
l
•
1
-92-
b) Sérulll§ de chèvre"ê,
1
Dans un éJ.evD.ge où leG cas de pneumonie enzootique étaien ts fré-
quents, nous avons recilerché par la sérologie, l'intervention proba-
1
ble de souches de :t:.._~.cid..D..•
le seul test utilisé était l' hémagglutination passive avec les
sérotypes A et D.
les résultats obtenus à partir des 131 sérums sont consignés daDs
le tableau ci-dessous :
TABLEAU
Sérums de chèvres: titres en anticorps capsulaires
DILU~\\I () 1! S
DES
SERlIl'iS
i /10
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
Nombre de sérums
2
9
32
38
38
11
positifs avec l'Ag. A
nombre de sérums
39
25
27
15
21
4
positifs avec l'AG, D
Il apparatt clairement qu'avec le sérotype A, les titres ont une
moyenne beaucoup plus élevée, ce qui signe la donunance de cette in-
fection.
L'utilisation de l'H.A.P. dans cette recherche n'a fait que con-
firmer les qualités de simplicité, de spécificité et de sensibilité
reconnues à ce test. Cependant le principal prohlème posé ici est
celui de l'interprétation des résultats pOlœ le sérodiagnostic: à
partir de quel taux peut-on dire qu'une pasteurellose est en évolu-
tion chez tel ou tel animal ? Est-il possible de définir un seuil de
posi tivi té ?
c) SérllIDS de bmd ns
500 sérums de bovins des Nouvelles-Hébrides (reçus pour une enquê-
te sur l'existence de la péripneumonie) ont été examinés vis-à-vis
des antigènes de P. multocida.
-93-
Il est intéressant de rechercher si la septicémie hémorragique à
sérotype B ou E y existait; en fait, les tests n'ont montré que l'in-
fection occulte par le sérotype A.
Le tableau nO 33 résume les résultats pour les 35 animaux les plus
posi tifs.
Les titres en hémagglutination passive peuvent être particulière-
ment élevés (1/5120 et 1/10.240 pour les sérums nO 1 et 12).
.
.
L'agglutination somatique révèle que deux sérotypes 0
1 et 0
3
(à l'intérieur du groupe capsulaire A) sont responsables de ces in-
fections naturelles avec des titres à peu près comparables.
La présence simultanée de deux traces sérologiques dans le sérum
d'un même animal laisse entrevoir la possibilité d'infections succes-
sives à sérotypes somatiques différents; ce test permettrait donc
d~s enquêtes sérologiques assez fines.
La fixation du complément réalisée vis-à-vis du sérotype 0 : 3, en
raison de sa basse sensibilité par rapport à celle de lIA.S., se ré-
vèle d'utilité plus limitée au moins dans les enquêtes épidémiologi-
ques de ce genre •
• .sérums de zébus malgaches
Le tableau nO 34 résume les résultats obtenus chez 27 animaux,
les plus positifs des 160 examinés lors de l'enquête.
L'H.A.P. révèle que le sérotype capsulaire infectieux est de
type A.
LI A.S. montre, ce qui est apparu déjà avec les sérums des Nou-
velles-Hébrides, que les animaux peuvent s'infecter successivement
avec des germes à sérotypes somatiques différents.
Les réactions croisées, existant certes e~tre quelques uns des
sérotypes somatiq~es, sont insuffisantes pour expliquer de telles
associations de titres; aussi dans ce cas particulier, s'il fal-
lait préparer un vaccin, la meilleure solution serait-elle d'uti-
liser un mélange des quatre sérotypes en cause (0 : 1 ; 0 : 3
o : 7
0: 9) puisque, nous l'avons vu, l'antigène somatique des
souches A est celui qui possède essentiellement le pouvoir immuni-
sant. De ces résultats, ressort à nouveau l'utilité qui peut être
accordée au test d'A.S. dans le domaine de l'épidémiologie.
1
;l
,
-94-
T A BLE A U
nO 33
Titres des anticorps d&~s les sérums
1
de 35 bovins originaires des Nouvelles-Heorides
A.S.
Hémaeglutination
FixatiO!:1 du
Sérums
passive
complérnen t 0
:;
o : 3
o : 1
j
1
1/51LD
1/640
1/20
1/40
2
1/1200
1/320
1/20
1/20
3
1/1200
1
1/40
1/20
1/10
,1
4
1/1200
1/320
1/20
1/20
'l
;1
5
1/2560
1/40
1/40
1
i
6
' 1/2560
1/640
1/20
1/40
1
l
7
1/1200
1/640
j
1/40
1/20
!
:1
8
1/1280
1/1280
1/1200
1/40
9
1/1200
1/320
1/10
1/20
i
10
1/1200
1/320
1/10
1/20
~
{1
11
1/1200
1/40
1/20
1/10
,f
1
12
1/10.240
1/640
1/20
1/2!J
{
13
1/2560
1/640
1/80
1/'XJ
1
14
1/2560
1/640
1/40
1/20
1
15
1/1200
1/640
anti-C
,,4
~
16
1/1280
1/160
1/20
1/20
1
17
"J
1/1280
1/160
l/ZJ
1/20
)
J
18
1/1200
1/320
1/40
l
1/20
!
19
1/1200
1/40
1/20
1
20
1/1200
1/40
1/80
anti-C
21
1/1200
1/1200
1/40
1/40
1
22
1/5120
1/3ZJ
1/10
anti-C
1
23
1/1200
1/80
1/10
1/20
~
J
~':i
24
1/1200
1/40
1/20
~
.11",
25
1/1200
1/640
1/10
1/'XJ
26
1/2560
1/640
1/20
1
Z7
1/5120
1/1280
1/40
"
j
1
28
1/51 ZJ
1/640
1/10
1/40
,1
1
1
29
1/5120
1/640
1/40
,1
'1
30
1/2560
1/160
1/20
1/10
1
~
1/1280
1/40
1/10
i
31
1
1
32
1/1280
1/640
1/40
1/20
!
1
,
1
33
1/1200
1/160
1/40
1/20
~1
34
1/1280
1/320
1/20
1/20
,'~
1/1280
1/160
1/10
1/10
1
~
35
",~,~J
1
r
1
'.
-95-
T A BLE A U
n O ,4
Ti t-res des an ticorps dpJlS
zr sérums de zébus malgaches
-96-
• sérum.1:j de zébus du J'cOO
Sur les 100 sérums examinés vis-~-vis des sérotypes B et E, souls
9 se sont montrés po si tifs, et exclusivement vis-d.-vis du sérotypû
capsulaire E, ce qui est en parfaite corrélation avec la prédomi-
nance de ce sérotype dans cette zan€;
géographique ; les résultats
rapportés dans le tableau nO 35 font res30rtir u.'1e fois encore la
1
corrélation des titres H.A.P. ct LF. d'une part, A.S. et I:'C'
d'autre part, à l'avantage de l'I.F.I. et lIA.S. respectivement
sur l'H.A.P. et la }'.C~
les titres d'anticorps capsulaire::s et d'anticorps somatiques Gant
souvent très différents; il est difficile de fournir l'explication
de cette disparité, mais on sc souviendra qu'il s'agit de traces
sérologiques d'lllfoctions occultes (qui peuvent être anciennes) et
que les différents types d'anticorps peuvent ne pas persister de
la même façon. Des infections secondes peuvent aussi en "rappeler"
certains plus que d'autres.
TABLEAU
nO 35
Comparaison entre les tests d'héoagglutination passive,
d'agglutination, de fixation du complément et
d'immunofluorescence sur les sérums de zébus du Tchad
Hémagglutination
l'ïxation du
Imrnuncfluorescence
Sérums
Agglutina.tian
passive
C'
indirecte
E
B
B
E
0: 6
0 : 6
B
E
Tchad
1/10
1/80
1/20
1/20
Tchad
2
1/20
1/160
1/20
1/4-0
Tchad
3
1/40
1/160
1/20
1/160
Tchad
4
1/40
1/160
1/20
1/160
Tchad
5
1/00
1/4D
1/10
1/160
Tchad
28
1/320
1/20
tr
1/640
Tchad
35
1/1280
1/40
1/10
1/2560
Tchad 696
1/80
1/320
'rchad 698
1/1280
1/40
1/20
1/2560
-97-
Les sérums de 108 veaux de 2 à 3 n~is, destinés à la production
de "baby-beefs" et provenant de 6 exploitations, ont été exa.::.d.nés
en hémagglutination passive; le sérotype il s'est encore révélé
l' agen t infectieux ü:ajeur.
Les résultats sont consignés dans le tableau nO 36 qui s\\.ù t
T A BLE A U
nO 36
Titres en anticorps spécifiques
vis-à-vis de r~ult~. A, chez 108 V8aux de 2 à 3 mois
Négatifs
Î /10
Î /20
1/40
1/8]
1/160
1/320
Î /64C
Î /1280
1/2560
9
10
16
12
16
13
19
6
6
56,4 p. 100
la m.oyenne des titres d'anticorps calculée pour une exploitation
ou un lot de veaux à l'engraissement varie dans le temps et, à une
date donnée, varie d'un lot 8. l'autre, ce qui téooigne de conver-
sions sérologiques en série consécutives à des irûoctions absolu-
ment inapparentes cliniquerùent.
De tels résultats, comme les précédents, posent le problème de
la détermination d'un seuil significatif; cette question sera évo-
quée plus loin.
d) sérums humains
Bien que l'infection pasteurellique noit classique~ent reconnue choz
l'hoillDe, nous avons pu disposer seulement de quelques sérums de malades
infectés authentiquement par des souches de P& multocida, ce quo nous
regrettons.
Les résultats se résument dans le tableau nO 37 suivant
T A BLE A TI
nO 37
.._-_.. ..- _.-.-..-..-----
.
~~_ . .--...........-.
Délai en tre le.
Titre
Sérums
Contamination
contamination et le
Sérotype
en H.A.P.
sérodiagnostic
['1me B.
Morsure de ctien
6 semaines
+ 1/00
')
I-fule s.
(nécrose de la main)
?
+ 1/40
A
l'Ir!le B.
r1orsul'G de chien
3 mois
A
NUe D.
Norsure de chien
3 mois
+ 1/20
A
abcès du pied en évolu-
Griffure ou morsure
11me C.
tion depuis plusieurs
+ 1/40
7
de chat
mois
Contact avec des
IUle Ch.
6 semaines
1/1280
A
chats
les titres, pour assez faibles qu'ils soient, révèlent et confirment
que les infections humaines sont de type A en règle générale.
L'agglutli~ation somatique n'a pu être pratiquée que POtT doux sérums
(reçus le plus récemment, rUle Ch. et ~'Ime C.) seuls J'antigène 0 : 3
avec le premier de ces deux sérums et l'antigène 0 : 7 avec 10 second
ont fourni des réactions pos7.tives respectivement au 1/640 et '1/40, sans
réaction croisée aucune avec les autres sérotypeD somatiques A ; ce qui
identifie avec précision les sérotypes des souches infectantes arrivées
à notre laboratoirc à l'état non irisé et donc non typables par H.A.P.
A signaler que la ?C' Et été positive pour le premier sérum au 1/40 et
n~gati'Ve pour le second.
Les titres relativement élevés du sérum de MLle Ch. sont certainement
dÜS au fait qu'il s'agit d'une pastetTellose septicémique ù sa phase d'é-
tat. On peut donc penser que la réponse humorale de l' homme est c:u même
ordre quo celle observée chez les animaux domestiques.
Le test d'A.S. mériterait donc d'être effectué systématiquement afll1
que son intérêt soit confirmé ou non pour un tel diagnostic.
-99-
3) CDr.1H81iWBES SUR lA _REPONSE HUNORALE Y]S-k V]S DES nll:>~CTIONS A P.
~~fOClDA ET LA VAL8ù~ DtS 'rcSTS S~ROLOG~{QPS
Bien que l'étude expérim.:::mtale de la r8pOnSG iwmuni taire !l'Bit porté (IU8
sur six animaux (deux boeufs, un lJouton et trois 18.pins), les réfmltats ob-
tenus vont suffisamment dL~s le môme sen:3 pour qu'on puisse en til'er que 1.-
ques idées générales, d'au.tar"t plus qu'ils sont rc:coupés par ceux tirés d(~s
sérums d'infection naturelle:
- chez tous les animaux, J'infoction pastcurolJique expérimentale entrai-
ne une réaction humorale doubl(~, caractérisée par la présence de deux
types d'anticorps: ceux qui sont spécif~çues de l'antigène capsulaire
et les autres, spécifiques des illltigènes de paroi. Les premiers, nous
J.'avons vu, sont révélables par le test dIH.A.P. et dans \\IDG certaine
mesure celui de l'I.F.l. Les seconds le sont par l'A.S. avec les ger-
mes décapsulés et par la F.C' avec des germes lysés.
- la synthèse de ces deux types d'anticorps par l'organisme, se fait
d'une façon indépendante, ce qui revient à dire que théoriquement
l'organi sme peut répondre à la stimula tian antigénique par la synthèse,
soit des deux types d'anticorps à la fois, soit de l'un ou de l'autre
type d'anticorps sculument ; cc qui a été dé~ntré expérimentalement
avec le zébu nO 261, infecté par une souche E non irisée (donc dépour-
vu de l'antigène capsulaire spécifique). Cette éventualité est en
principe exclue dans la nature, les souches exist~~t chez los porteurs
dG germes à l'état S irisé.
- quant à l'ordre d'apparition des deux principales cla~se8 d'imm'~oglo
gulines, l'analyse des sérums faite après leur traitement au 2-mercapto-
éthanol, montre comml' l'indiquent les tableaux nO 25, 26, 27, 28, 29.
30 que, lors de la première stimulation, l'activité des anticorps est
essentiellement assurée pour un premier tempo par les l@'! ; lcn IgG
apparaissent soit à la fin d'une réponse primaire, soit plus nettement
après une infection seconde.
il est à remarquer aussi qu'après l'introduction premif:re de l'anti-
gène, la réponse peut être relativement faible, tandis que le tal~
d'illlticorps produit après la deuxième inoculation peut ~trc plus de
dix fois supérieur à celui résultant de l'infection primaire; en
outre l'organisme y réagit plus rapidoment : ce sont là les carac-
tères classiques de la réponse secondaire (phénomène de rappel).
-100-
on retiendra enfin que les anticorps ainsi produits persistent dans
l'organisme pendant au moins deux mois.
ks tests sérologiques vont révéler cl8UX complexes irnmunolog:i.ques
- le complexe antigène-anticorps spécifique de type capsulaire,
décelé par l'H.A.P. et l'I.F.I. dans certains cas,
- le complexe antigène de paroi-anticorps correspondan-l;, décelé par
l'A.S. et la F.C'.
A la lum.:i.ère des expériences décri tes, on peut conclure que J.e décalage
des titres existant entre l'H.A.P. et l'I.F.I. d'un côté, J,'A.S. et la F.C'
de 11 autre, définit une différence de sensibilité à J.' avantage respective-
ment de l'I.F.I. par rapport à l'H.A.P. et de lIA.0. par rapport à la F.C'.
Cependant, si l'H.A.P. donne des titres d'anticorps inférieurs à ceux
de J.'I.F.I., "Ile possède par contre l'avantage d'avoir un spectre d'appli-
cation beaucoup plus large, car l'immunofluorescence indirecte ne peut étre
utilisée que pour le diagnostic des sérotypes B et }:; ; e1l8 est inutilisa-
ble dans le cas des sérotypes A et D pour qui elle donne des réactions
faussement négatives ; ces échecs ne dépendent pas tellement de la techni-
que mais plutôt de la présence dans la capsule de ces souches d'une quanti-
té abondante d'acide hYaluronique masquant l'antigène spécifique.
Il est à retenir de la confrontation des quatre techniques vis-à-vis
des mêmes sérums, qu'elles présentent toutes l'avffi1tage de permettre un
diagnostic relativement précoce ; comme l'a montré l'étude des cinétiques,
la présence des anticorps correspondant aux principales fractions antigéni-
ques ost décelée avant 10 7ème jour suivant l'inoculation infect211te.
En bilan de cette analyse, nous dirons que, parmi '.os qUD.tre méthodes,
ce sont les tests d'H.A.P. et d'A.,'.). qui répondent le mioux à la cléh:)rrnina-
tion sérologique des anticorps faisant suite aux infections à P. multocida i
outre leurs caractères de spécificité, de sensibilité et de fidélité, cette
préférence tient essentiellement dans la facilité de leur exécution (leur
manipulation ne nécessite ni appareilla.ge, ni précaution particulière si ce
n'est une méthodologie soigneuse) ct surtout parce qu'ellGs ne souffrent
d'aucune restriction, au contraire des autres tests.
-101-
Ceux-ci à cause des limites de leurs possibilités, ne seront que partiel-
lement utiles, mais, pourront toutefois, selon le cas, servir à confirmer
les résultats donnés par les premières.
On. peut noter nussi que la classification des types somatiques de 1:..
~ultocida peut s'établir par le moyen de la fixation du complément.
I l reste enfin le problèmr:,' de l'interprétation de ces tests appliqués aU
sérodia@Postic, c'est-à-dire celui de la signification des titres.
Certains résultats seront d'interprétation r~lativement facile; ainsi
10rsqu'8.u COill'S dl Ille infection clinique évoql..kwt 1me pastourelloHc' authen-
tique, IG diagnostic séroloejqu0 apparaît positif avoc des titres élevés,
la conclusion ne soulève pas de diffi.cu1tés ; un nOUVEll examen pratiqué
quelques jours plèlS tard, montrera souvent une \\Slévation du titre des fu"'.ti-
corps (cf. ies courbes établi~s avec les lapins, figures nO 10, 11, 12, 13,
14).
Cependant les difficultés d'interprétation apparaissent lOl'sque le taux
d'anticorps est faible, le1u81 pourra faire évoquer plusieurs possibilités
• il pourra s'agir réellement d'une pasteurellose en évolution, mais la
malndie n'en est qu'à son début,
• le titre des w1ticorps peut être limité par un traitement énergique et
précoce aux anUbiotiques. C'est le caS des zébus 261 et 369, Clui au-
raient dÛ. avoir des titres beaucoup plus élevés; mais l'antibiothéra-
pie a été instituée systématiquement le 3èmo jour après l'infection,
de crain te do septicémie mortelle (CE: (l'li s'était d'ailleurs pas[lé avec
un premier animal),
chez les joun(::s animaux, et notWJillcmt 180 veaux, existent jusqu'à
l'âgû de 5 à 6 mois des anticorps d' orj.gill'.:: ma tern'311c transmis par le
colostrum (titr.;;s en rI.A.P. allant du 1/20 au 1/160)
dans ce cas, li:
traite~ent des sérums au mercaptoéthanol montre bien ql~ des IgG sont
présentes en quantité iQPortantB,
il pourra s'agir d'anticorps résiduels, ~émoins d'une pasteurellose
ancienne, passée inaperçue
dans ce cas, lt,s titres cl 1 anticorps ne
devraien t plus varü;r lors des eXWll:jnc ultérieurs.
Comment déterminer un taux limite de positivité? Sur ce sujet, nous pen-
sons donc élU vu de tout ce qui vient d'~tre dit plus haut, que l'apprécia-
tion d 'lm. seul clo..iffre, par rapport à un taux minimal de posi ti vi té exigible
est difficile.
-102-
Néanmoins, en ce qui concerne l'H.A.P., réaction très spécifique, sur-
tout si on utilise des L.P .S. purifiés comoe antigènes, i l semblE: hien que,
dans nos conditions techniques tous les titres égaux ou supérieurs à 1/320
chez les animaux, signent une infection récente ou en activité.
Les titres observés chez l'homme (allffilt du 1/20 au 1/30) correspondent
à des infections déjà nnci8nne8 et traitées par les ~~tibioti~ues ; ils ne
peuvent être cOlnparés à ceux observés couramment chez les animaux.
Il paraît intéressa..rlt (si nous nous rapportons aux courbes dl évolution
des titres d'anticorps) de proposer des eX~llilens répétés en moyenne à 7
jours d'intervalle, d'autant plus que, parmi les quatre tests sérologiques,
l'H.A.P. et l'A.S., d'exécution facile, sont très fiables. L'accroisseocl:t
des titres dura une grffilde signification.
1
1
1
1
1
1
1
-103-
v.- CON C 1 U S l 0 1'J S
De l'étude générale sur la consti~~tion antigénique de ?
multocida dont
J.a cormaissé'..nce plus pr(~cise constituait une nécessité prélimin,üre au diag-
nostic sérologique des :Lnfections à P. mul tocida. et de l'expérimentation
sérologique faite ensui te se dégagent l~s conclusions suivantes :
1) La présence d'une duali té antigénique che <; P. multocidFi dépendant dE:
la coerii,tencc Sill' la Q~Ule bactérie de deux -types d'antigène:
- le preoier, superficiel, localisé essentielleme..'1t dans l.a capsule
d'où i l diffuse très facilement, constitue le support de la classi-
f2.cntion sérologique, actueIleulel1t ad.crise de Lmultocida en quatre
sérotypes capsu..1.aires A, D, D, E,
- le second, plus profond., libéré lors de la lyse complète du gen18
et associé à la paroi bactérienne est à la base cl8 la classifica-
tion des souches de P. multo"Çi4.a en douze sérotypes sowatiques.
2) L'e.ri:Jtence dl une autre dualité opposant les sérotypes B et E aux
sérotypes A ~t D. Elle est fondée SlŒ :
• la présence exclusive dans les sérotypes A et D ùe J.'acide hyaluro-
hique, roapon8ablû du caractère muqueux et de l'inagglutinabilité
de ces souches p2.T leurs a..'1èiséruus corresp:mdants 1
• l'eyistence à l'intérieur des sérotypcs j et E, d'un sérotype soma-
tique unique (qui du reste est icl']ntique) opposé il lu multitude des
sérotypes sOùlatiClucs à l'intéric,cœ de,; souches A ût D,
• le rôle dévolu li chacun des doux principaux antigèn()iJ d~tns l'iraD.u-
ni-cé antipasteurellique.
En effE:t, avec J.GS sérotypes B et E Cl est l'antigène spécifique de
type capsulaire qui COè""èsti tue ]1 antigène vaccinant entraînant cbez le
sujet infecté la prod"L<ction c1' anticorps protecteurs contre les séro ty-
pes B et E et révélablos par l'H.A.P. et ;_'1.1:'.1.
Avec les sérotyp.;s A et Sè1l"lS doute D, c'est exclusi V8Llent. l' 8D.tigène
somatique qui cp.traîne l'élaboration par l'organiSl'le infecté ou vaccin;:}
des anticorps rroteeteurs i ces Gnticorps sont révélab19s par l' A.S. ct
1~1 F.C' •
1
1
-104-
Ainsi l'H.A.P. et l'I.F.I. pour les sérotypes B et E, l'A.S. et la
F.C' pour les sérotypes A et D, permettent de déterminer la qualité et
ln quantité de la protection immunitaire antipasteurellique.
3) L'existence d'une double corrélation entre les quatre tests sérolo-
giques :
- la première s'étabJissant entre l'I.F.I. et l'H.A.P o ; cette cor-
rélation SI explique par le fait que les deux tests font intervenir
le uême antigène; l'antigène de type capsula.ire,
- la seconde corrélation concerne l'A.S. et la FoC'
ces deux tests
mettent en oeuvre l'antigène somatique.
Parmi les quatre méthodes que nous avons essayées au cours de notre ex-
périmentation sérologique, les réactions d'A.S. et d'H.A.P. sont incontes-
tablement celles qui nous paraissent les plus indiquées pour établir la
preuve d'une infection à 1?.L....ma.1.t9~ chez un organisme. Ce sont des métho-
des simples, rapides et d'une spécificité satisfaisante, permettant de
suivre l'évolution ou de rechercher les anticorps anti-P. multoçida avec
une sécurité indéniable.
Sans les exclure totalement, nous pensons que les deux autres tests
(I.F.I., F.C') peuvent ~tre associés à l'un ou l'autre des deux premiers
tests ; il faut d'ailleurs reconna1 tre que 1.' association de plusieurs tests
sérologi~:J,1.es donne des résultats plus sOrs.
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