~~
:1
N
D'ORDRE
866
Année 1979
.:1'
:,1
THESE
il
PRESENTEE
DEVANT LUN IVERSITE CLAUDE BERNARD-LYON 1
:1
',1
POUR
OBHNIR
Il
LE
DOCTORAT
DE
TROISIEME CYCLE
SPECIAL/TE: CHIMIE
(BIOCHIMIE)
!I
PA R
~I
Marc eIl ine 0UABON li
11
~I
.'1
ETUDE STRUCTURALE DU LIPOPOLYSACCHARIDE
.1
DU MUTANT THERMOSENSIBLE TB3 DE ESCHERICHIACOLI K12
.1
•••••
JI
Soutenue le 18 Septembre 1979 devant la Commission If Examen :
:1
M Jean
CHOPI N. • . • . • .•
President
M
George MICHEL • . • • • • • • }
;1
Me
Maud
BRUNETEAU • • . • • • E
.
xammateurs
M
Olivier
CREACH • • • • • . • •
;1
t
1
1
1
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON I -
------------------------------------
1
Président honoraire: Mr. le Pro J. BOIDIN
Président: Mr. le Pro D. G~IN
Premier Vice-Président : Mr. le Pro E. ELBAZ
1
Deuxième Vice-Président : ~r. ROVSSET, Attaché de Recherche
Troisième Vice-Président : Mr. BRULA, Etudiant
1
Secrétaire Général de l'Vniversité : Mr. J. RAMBAUD, Administrateur
Civil
1
UNITES D' ENSEIGNBv1ENT ET DE RECHERGIE CU. E. R.)
1 V.E.R. de Médecine Grange-Blanche............. Mr. Bernard SALLE, M.C.A.
V.E.R. de Médecine Alexis-Carrel . ~............
Mr. le Pro René MORNEX
1 V.E.R. de Médecine Lyon-Nord
MT. J.P. NEIDHART, M.C.A.
V.E.R. de Médecine Sud-Ouest
Mr. le Pro Jean NORMAND
1 V.E.R. de Sciences Pharmaceutiques
Mr. le Pr. C.A. BIZOLLON
V.E.R. de Techniques de Réadaptation..........
MT. Alain MORGON, M.C.A.
V..E.R. de Biologie Humaine....................
Mr. J.P. REVILLARD, M.C.A.
1 V.E.R. 1.R.E.P.S.
Mr. A. MILLON, Professeur d 'E. P. S.
V.E.R. de Sciences Odontologiques
Mr. le Dr. Roger VINCENT
1 V.E.R. de Mathématiques
Mr. le Pro Philippe PICARD
V.E.R. de Physique.
Mr. le Pro Jean DELMAU
1 V.E.R. de ChTInie et Biochimie
Mr. le Pro Jean HUET
V.E.R. des Sciences de la Nature
Mr. le Pro René GlNET
1 V.E.R. de Sciences Physiologiques.
MIe le pro J.F. WORBE
V.E.R. de Physique Nucléaire...
Mr. le Pro Mark GUSAKOW
I.V.T. I
Mr. le Pro Albert VILLE
1 LV.T. II
: Mr. J. GALLET, Directeur E.N.S.A.M.
Observatoire de Lyon
: Mr. Guy MONNET, Astronome Adjoint
1 V.E.R. de Mécanique
: MIe le Pro Geneviève COMTE-BELLOT
1
1
1
1
il
1
1
1
1
1
1
A mes parents,
1
l'
1
1
A Antoine,
1
1
1
A Réassi et Likibi.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Biochimie Microbienne de
l'Université Claude Bernard de Lyon, que dirige Monsieur le Professeur
1 Georges Michel. Qu'il me permette de lui exprimer ma profonde gratitude
pour la canpréhension qu'il a su me montrer, même dans les moments dif-
1 ficiles.
1
Je remercie Monsieur le Professeur Chopin d'avoir bien voulu accepter
de présider le Jury de ma thèse.
1
Je remercie Monsieur Creach, Docteur d'Etat en Pharmacie, Maître de
Recherches du Service de Santé des Armées, d'avoir accepté de participer
1 à mon Jury.
1
A Madame Maud Bruneteau, Docteur ès-Sciences, Chargée de Recherches
au CNRS, qu'il me soit permis de lui exprimer toute ma reconnaissance pour
1 l'aide précieuse et efficace qu'elle m'a apportéetout au long de ce travail,
et de lui dire que je suis heureuse de pouvoir la compter parmi
les membres
de mon Jury.
1
Je tiens à remercier toutes les personnes qui, à quelque titre que ce
1 soit, m'ont aidée dans la réalisation de ce travail.
1
1
1
1
1
1
,1
1
PLAN
- 1 -
1
Liste des abréviations
1 Liste des figures
5
Liste des tableaux
7
1 Introduction
9
Première partie: Etude
bibliographique
11
1
A - Le lipide A.
. . . .
11
B - Les chaînes latérales O-spécifiques.
13
1
C - Le noyau polysaccharidique.
16
1) Chez les salmonelles.
16
1
2) Chez SlugeLe.a..
16
3) Chez E~~h~i~hia ~ofi.
18
1
4) Se/1Aa.;t{a mM~e,6~e.u~.
20
D - Région "KJ.X)".
21
1 Deuxième partie : Techniques expérimentales.
22
A - Isolement du lipopolysaccharide.
22
1
1) Culture des bactéries.
22
2) Extraction des LPS.
23
1
B - Purification du polysaccharide.
23
1) Traitement acide du LPS.
23
1
2)
23
Purification du PS. ~.~ . .
",,"lA~&.~~
C - Analyse qualitative des suc
.~
. . .
~~~.,
24
;;
'J/
6"",
"
... "
1) Chr
h
Qp
~
omatograp le sur;g
le~ 1) ••
~".
24
1
24
2) Electrophorèse sur ~t~ i~~"~~:'?~,~~
~ .
) R~ ~ 1
U
"'1,<
</
3
eve ateurs.
. . . . . '>/ •..'.'.
24
1
D - Analyse quantitative des dl.....
ents"/~&n
24
.l,
1) Dosages colorimétriques. 88 1 .-6- ft'
24
1
a) Dosage du glucose.
24
b) Dosage des heptoses.
25
1
c) Dosage du mannose.
25
d) Dosage de la glucosamine.
25
e) Dosage du KDO.
. . . . .
26
1
e-1) Dosage du KDO par l'acide thiobarbiturique.
26
e-2) Dosage du KOO au semicarbazide.
26
1
f) Dosage du pho sphore .
.
27
g) Dosage des groupements aminés libres.
27
1
2) Analyse des sucres réduits et acétylés par chromatographie
en phase gazeuse.
.
27
a) Préparation des acétates d'alditols
.
27
1
1
'1
- 2 -
.1
b) Analyse des acétates d'a1dito1s par chromatographie gazeuse.
28
1
E - Techniques diverses.
. . . . . .
28
1) Acéty1ation du LPS.
28
1
2) Méthy1ation du LPS acétylé et du polysaccharide.
28
3) Déphosphory1ation du polysaccharide.
. . . . . .
29
1
4) Réductions du polysaccharide déphosphory1é.
29
a) Réduction par NaBH4 du polysaccharide déphosphory1é.
29
1
b) Réduction par LiA1H4 du polysaccharide déphosphory1é,
réduit et méthy1é.
29
5) Oxydations périodiques.
30
1
a) Oxydation totale des LPS.
30
b) Dégradation de Smith du PS.
30
1
6) Hydrolyse enzymatique.
. . .
30
7) Analyse des oses phosphory1és.
30
1
8) Analyse des acides gras du lipide A.
31
F - Spectrométrie de masse.
31
G - Dosages spectrophotométriques.
31
1
1 Troisième partie : Résultats.
32
Chapitre l : Analyse du 1ipopo1ysaccharide et du polysaccharide du mutant
T 83 de E. ~ofi K 12 cultivé à 30°Cet à 40°C.
. . . . .
33
1
A - Isolement du 1ipopo1ysaccharide.
.
33
B - Composition du 1ipopo1ysaccharide.
33
1
1) Analyse qualitative.
33
2) Analyse quantitative.
3S
1
C - Préparation du lipide A et du polysaccharide.
35
1) Analyse du lipide A.
35
2) Analyse du polysaccharide.
40
1
D - Méthy1ation du 1ipopo1ysaccharide.
42
E - Conclusions.
44
1
Chapitre II : Structure du noyau po1ysaccharidique du mutant thermo-
sensible T 83 de E. ~oU. .
44
1
A - Identification des oses phosphorylés.
44
"
B - Déphosphorylation du PS.
. . . . . .
46
1) Analyse qualitative et quantitative.
46
1
2) Méthy1at ion du po1ysacchar ide déphosphorylé.
48
a) Principes généraux.
. . . .
48
1
b) Résultats de la méthy1ation.
48
1
~,
1
- 3 -
1
1
C - Action de l' a-D-galactosidase d' A.opeJtg~ Mg eJt sur le PS
déphosphorylé.
S7
1) Analyse du polysaccharide hydrolysé.
S7
1
2) Méthylation du polysaccharide hydrolysé.
~
D - Dégradation de Smith du polysaccharide.
60
1
- Analyse de l'oligoside S.
. . . .
60
1) Analyse qualitative et quantitative de l'oligoside S.
60
1
2) Structure de l'oligoside S.
.
. . . . . . . . .
64
E - Méth~la~ion et réduction par LiAlH4 du polysaccharide déphosphorylé
et redult.
.
.
64
1
F - Structure de la chaîne polysaccharidique du LPS isolé du mutant T 83
de E. c.ou.
.
.
67
Chapitre III : Analyse comparative de la structure des LPS isolés de la
1
souche mutante T 83 et de la souche parente CR 34 ..
69
A - Analyse du lipide A.
69
1
B - Analyse de la région KDO.
70
C - Analyse du noyau polysaccharidique.
76
1
D - Conclusion.
. . . .
. . . . .
79
Conclusions
80
1
Bibliographie
82
1
1
1
1
1
1
1
1
1
,1
1
1
- 4 -
1
LISTE DES ABREVIATIONS
1
1 LPS
1ipopolysacchar ide
PS
polysaccharide
L-Fucose
6-désoxy-L-galactose
1 Abe
abéquose ou 3,6-didésoxy-D-threo-D-glycérohexose
Col
colitose ou 3,6-didésoxy-D-érythreo-L-glycérohexose
1 Tyv
tyvélose ou 3,6-didésoxy-L-érythro-D-glycérohexose
D-Viosamine
~-amino-~-6-didésoxy-D-glucose
1 KDO
acide 2-céto-3-désoxyoctonique
Par
paratose ou 3,6-didésoxy-D-érythro-D-glycérohexose
1 Hep
L-glycéro-D-mannoheptose
Glc
glucose
Gal
galactose
1 Man
ma.nnose
Rha
rhamnose
1 GlcNHZ
glucosamine
GlcNAC
glucosamine-N-acétylée
1 EthNHZ
ethanolamine
P
esters phosphoriques
1 Glc-6-P
glucose-6-phosphate
X
composé non déterminé
1 Rib
ribose
GalNAc
galactosamine N-acétylée
Glyl
glycérol
1 FucNAc
6-désoxy-L-galactosamine-N-acétylée
GalAc
galactose acétylé
1 GlcAc
glucose acétylé
1
1
1
1
1
1
1
- 5 -
LISTE DES FIGURES
1
1 Figure
Structure du lipide A des entérobactéries.
1 Figure 2 Structure des chaînes O-spécifiques dans différentes souches
d'entérobactéries.
1 Figure 3 Structures des lipopolysaccharides extraits des formes R
1
des Salmonelles (58).
1 Figures 4, 5 Analyse des lipopolysaccharides de T 83 cultivés à 30°C et à 40°C
en chromatographie gazeuse des acétates d'alditols.
1 Figure 6 Diagramme d'élution du PS du mutant T 83 dIE. ~otz K 12 sur
Sephadex G 15.
1 Figures 7, 8 : Chromatogrammes des acides gras méthylés par le diazométhane
1
et analysés en chromatographie gazeuse.
1 Figures 9, 10 Analyse des polysaccharides de T 83 cultivé" à 3üoC et à 40°C.
Chromatogrammes des acétates d'alditols des PS.
1 Figures 11, 12 Analyse en chromatographie gazeuse des acétates d'alditols des
lipopolysaccharides partiellement méthylés.
1 Figure 13 Diagramme d'élution du polysaccharide déphosphorylé sur Sephadex G 15.
1 Figure 14 Analyse du polysaccharide déphosphorylé de T 83 cultivé à 30°C
1
par chromatographie en phase gazeuse.
1 Figure 15 Analyse par chromatographie en phase gazeuse du polysaccharide
déphosphorylé et méthylé.
1 Figure 16 Analyse par chromatographie gazeuse du polysaccharide déphosphorylé,
traité par l'a-D-galactosidase et méthylé.
1
1
1
1
- 6 -
1
1 Figure 17a Diagramme d'élution de l'oligoside S sur G 15.
1 Figure 17b Dégradation de Smith du polysaccharide.
1 Figure 18 Analyse de l'oligoside S par chromatographie gazeuse des acétates
d'alditols.
1 Figure 19 Détermination de la liaison heptose-acide 2-céto-3-désoxy-
octonique Cl([()).
1 Figure 20 Spectre de masse du 1,5-di-O-acétyl-2,4,6,7,8-penta-O-méthyl-3-
1
dés02l.!'octi toI.
1 Figure 21 Structure du noyau polysaccharidique de T 83.
1 Figure 22 Analyse du noyau polysaccharidique du LPS isolé du mutant
thermosensible T 83 de
E. ~oli K 12.
1 Figure 23 Structure de la région KDO du LPS des souches sauvage CR 34 et
mutante T 83 de E. ~oli
K 12.
1 Figure 24 Diagramme d'élution de la fraction f de CR 34 (A) sur Sephadex G 10.
1 Figure 25 Diagramme d'élution de la fraction F (figure 6) de T 83 (B) sur
1
Sephadex G 10.
Figure 26
Recherche de la présence d'un substituant sur la molécule latérale
1
de KDO.
1 Figure 27 Les deux possibilités pour l'oxydation de la molécule de KDO (III)
k ~
"d
d
d"
parvmetaperlo ate
e sa lUffi.
1
1
1
1
1
1
- 7 -
1
LISTE DES TABLEAUX
1 - Tableau 1 Nature des acides gras identifiés dans le lipide Ades différentes
1
souches d'entérobactéries.
1 - Tableau 2 Composition des chaînes O-spécifiques de quelques souches de
Protéùs.
1 - Tableau 3 Composition du noyau polysaccharidique des LPS isolés de différen-
tes souches de f. ~oti K 12.
1 - Tableau 4 Composition du noyau polysaccharidique des LPS isolés de S~atia
1
maJL~e6 ~e.lJ.!.l •
1 - Tableau 5 Inhibition de l'hemagglutination passive par les lipopolysaccharides
de mutants cultivés à 30°C et à 40°C vis-à-vis du système hemag-
glutinant E. ~oti K 12 CR 34.
1
- Tableau 6
Temps de rétention-des acétates d'alditols à la chromatographie
1
gazeuse.
1 - Tableau 7 Résultats des dosages enzymatiques et colorimétriques des consti-
tuants du LPS de T 83 cultivé à 30°C et à 40°C.
1 - Tableau 8a Analyse du lipide A du mutant thermosensible T 83 cultivé à 30°C
et à 40°C.
1
- Tableau 8b
Composition en acides gras des LPS de T 83 cultivé à 30°C et à
1
40°C.
1 - Tableau 9 Analyse quantitative des constituants du polysaccharide de T 83
cultivé à 30°C et à 40°C.
1 - Tableau 10 Temps de rétention des différents composés du LPS partiellement
méthylés.
1
- Tableau 11
Composition du polysaccharide déphosphorylé.
1 - Tableau 12 Temps de rétention des pics de fragmentation des acétates d'alditols
1
méthylés exprimé
par rapport au 1 ,5~i-O-acétyl-2,3,4,6-tétra
O-méthylglucitol.
1
1
- 8 -
1
- Tableau 13·
Variations des oses méthylés après action de l'a-D-galactosidase.
1
- Tableau 14
Composition du lipide A de la souche sauvage CR 34 et de la
1
souche mutante T 83 cultivée à 30°C et à 40°C.
1 - Tableau 1S Détermination du KDO dans le lipopolysaccharide des souches
sauvage
CR 34 et mutante T 83 de E. ~O~ K 12.
1 - Tableau 16 Analyse de la fraction 3 par chromatographie sur papier dans le
,1
solvant A
butanol-acide acétique-eau (65:10:25, v/v/v) et dans le
solvant B
butanol-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v).
'1 - Tableau 17 Analyse comparative du taux des oses méthylés présents dans
le lipopolysaccharide des souches sauvage
CR 34 et mutante T 83
1
de E. ~oü K 12.
:1
Il
II
)1
:1
~I
li
[1
11
li
li
li
1
- 10 -
1
1 CR 34 (9), ce qui laissait supposer l'existence, dans cette souche mutante,
d'un lipopolysaccharide distinct de celui de la souche sauvage CR 34. L'étude
1 structurale du LPS du mutant T 83 présentait donc un intérêt, elle a fait
l'objet de notre travail.
1
Après un rappel bibliographique sur la structure des lipopolysaccharides
des entérobactéries, nous exposerons les méthodes utilisées au cours de notre
1 analyse. Nous donnerons et discuterons ensuite nos résultats.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
- 11 -
1
1
PRIM IERE PARTIE
1
1
Etude bibliographique.
1
Le lipopolysaccharide des entérobactéries est construit selon le modèle
suivant
1
1
1
-1 H 1 1_1 D 1----..
~<__c_h_a-=:î_n..:..e.:,...s_O_-_s....JPLé'--C--'l=-·f_i_qu.L......:e_s_~) (
noyau ou ·'core·
) ~égion KD9 <4--_.=L.=i,.l;;,p.=i_d..:..e--,A~)
1
1
Tous les LPS renferment un composant lipidique : le lipide A, auquel
est lié par l'intermédiaire de l'acide 2-céto-3-désoxyoctonique (KDO), le
1 noyau polysaccharidique ou "core", Sur ce noyau se greffent les chaînes
latérales O-spécifiques responsables de la spécificité sérologique. Les
mutants R possèdent des lipopolysaccharides dépourvus des chaînes O-spéci-
1
fiques. Ils sont constitués du lipide A et du noyau ou d'une partie du noyau.
1
A - Le lipide A.
1
Chez les entérobactéries, la fraction lipidique des lipopolysaccharides,
1 le lipide A, possède des caractères structuraux communs : il est formé de
deux molécules de glucosamine liées par une liaison 6-1-6 (19,20,21,22).
1
1
1
1
1
---------------------
AG
N~ = Acides Cras
c/
o
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Il
)
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1
KDO
o
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o
Il
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1
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KDO
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, /
j-<>H
bH
1:~
o
,,,,-
(01 ).....-0'3
(C~)10
' C -
2 1'+
,
, /
6H3
chez CR 34
UK-=--_l. Structure du 1 ip ide ,\\ des enlé;roh;lct(;r i cs.
N
1
- 13 -
1
i
Un acide 3-hydroxylé amidifie le groupement aminé de la glucosamine. Des
'~,:i
1 acides gras saturés estérifient les hydroxyles de cet ose aminé (fig. 1).
;~1'
)
Le tableau
donne la nature des différents acides gras identifiés
1
dans le lipide A des différentes souches analysées.
1 Tableau 1. Nature des acides gras identifiés dans le lipide Ade différentes
souches d'entérobactéries.
1
Organismes
Hydroxy-acide
Acides saturés
Ref.
1 SMm0ne1.1a.
3-0H
14
o
12:0, 14:0, 16:0
(23)
E. c.oü
3-0H
14
o
12:0, 14:0, 16:0
(5)
1 ShigeW -60nnu
3-0H
14
o
12:0, 14:0, 16:0
(22)
YeM-<-Ma puill
3-0H
14
o
aucun
";i'<
(24)~)
k
YeM-<-Ma p-6eudotube~c.ulo-6J..-6
3-0H
14
o
12:0, 14:1, 16:0, 16:1 (25)
1
S e~a..t<.a mMc.u c.eU-6
3-0H
14
o
(26)
12:0, 14:0, 16:0
3-0H
12
o
(27)
1
3-0H
14
o
14:0, 16:0
(28)
1
Par ailleurs, Galanos et Rietschel ont montré que le lipide A est
responsable de l'activité endotoxique des lipopolysaccharides et, de plus,
ces auteurs ont démontré l'importance de la nature des acides gras du
1 lipide Adans cette activité biologique (29,30,31,32).
1 B - Les chaînes latérales O-spécifiques.
1
Les chaînes O-spécifiques sont responsables de l'antigénicité 0, elles
représentent la partie variable de la molécule. Elles sont constituées
1 d'unités répétitives d'oligosaccharides. La composition chimique de ces
unités d'oligosaccharides et le mode de liaison des différents sucres qui les
composent sont spécifiques pour chaque LPS. La fig. 2 décrit la structure
1 des chaînes latérales O-spécifiques analysées dans différentes souches
d'entérobactéries. Le tableau 2 donne la composition des chaînes O-spéci-
1 fiques de quelques souches de P~oteU-6.
"t 1
il!
(If
1
1
1
1
- 14 -
Figure 2.
1
IrfTanismes
Structure des chaînes O-spécifiques
ReL
J Vle.il.a. VlewpOfLt
OAc
1
1
1
1
2/3
Abe a1
D-Glc a1
l
l
(33)
3
-+ 4 L-Rha 61 -+ 2 D-Man a1 -+ 3 D-Gal 61 -+
2
1
1
1
OAc
OAc
1
,
2
(34)
Abe a1
D-Glc 1
l
J
3
4
-+ 4 L-Rha 61 -+ 2 D-Man a1 -+ 2 D-Man a1 -+ 3 D-Gal 61 -+
Tyv a1
D-Glc a1
J
~
1
(35 )
3
4
-+ 6 D-Man 61 -+ 4 L-Rha a1 -+ 3 D-Gal a1 -+
D-Glc 1
j
(36)
1
4
-+ 6 D-Man 61 -+ 4 L-Rha a1 -+ 3 D-Gal a1 -+
D-Glc 1
~
4
1
-+ 6 D-Man 61 -+ 4 L-Rha a1 -+ 3 D-Gal 61 -+
(37)
D-Glc a 1
J
6
-+ 6 D-Man 61 -+ 4 L-Rha a1 -+ 3 D-Gal a1 -+
-+ 3) 6-D-GlcNAc-(1-+2)-a-L-Rha-(1-+2)-a-L-Rha-(1-+3)-a-L-Rha-(1-+
(38)
1
1
1
1
1
- 15 -
Structures des chaînes O-spécifiques
Ref.
t üsmes
c-oü
a Col
(39)
l 1,4
1
- 0111 : 8 -a Col
-+ 48 - GlcNAc 1 -+ 2a-Glc -+ Gal
4
086 : 87-a
Gal
-+ 38 Gal 1 -+ 5 (ou 4) GalNAc
1
(40)
t
a Fuc
1
- serogroup 08 -+ 3-D Mana 1 -+ 2-D-Mana1 -+ 2-D-Man a-+
(41)
~l
~
li
1
- serogroup 0100 -+ GleNAc -+ Gal -+ Rha -+ Rha
(42)
- serogroup 032 -+ 4 D-GlcAc 81 -+ 3 L-FucNAc ? 1 -+ 3 D-GlcNAc ?
-+ 6D-Gal ?( 43)
1
- serogroup 075 -+ 3D-GlcNAc a 1 -+ 3D-Gal a 1 -+ 4L-Rha a 1 -+
(44)
~"nia p6eudotub~eu106<J Par f
type 1 B
;
1
-+ 2 D-Man 1 -+ 4-D-Man 1 -+ 3 L-Fuc 1 -+ 3-D-GlcNAc 1 -+
(45)
- serogroup 1
-+ 3-D-Gal a 1 -+
(46)
- serogroup 3
-+ 2-D-Mana l -+ 3-D-Mana 1 -+ 3-D-Mana 1 -+
(47)
1
-+ 2-D-Man a 1 -+ 2-D-Man a 1 -+
- serogroup 4
-+ 4-D-Gal a 1 -+ 2-D-Ribf 8 1 -+
(48)
1
- serogroup 5
-+ 3-D-Mana 1 -+ 2-D-Mana 1 -+ 3-D-Mana 1 -+
(49)
-+ 2-D-Mana 1 -+ 2-D-Mana 1 -+
1
- serogroup 7
-+ 2-L-Rha a 1 -+ 2-D-Ribf 8 1 -+ 3-L-Rhaa 1 -+ 3-L-Rha a 1 -+
(50)
1
- serogroup 8
OAc
OAc
OAc
1
1
1
1
1
1
(51)
2',6
:2
2~6
,
1
-+ 3 -D-Gal a 1 -+ 3-D-Galf a 1 -+ 3-D-Gal a 1 -+
- serogroup 9
OAc
1
.6
1
OAc
QAc
OAc
D-Gal a 1
OAc
,
1
1
,
1
~
,
(52)
2:6
2~6
6
,
3
6
-+ 3-D-Galf a 1 -+ 3-D-Gal a 1 -+ 3-D-Galf a 1 -+ 2-D-Gal a 1 -+
1
- serogroup 10
-+ 3-L-Rha a 1 -+ 3-D-Ribf 8 1 -+ 4-L-Rha a 1 -+ 3-D-Ribf 8 1 -+
(53)
4-L-Rhaa 1 -+
1
1Structures des chaînes O-spécifiques dans différentes souches d'entérobactéries. Tous
les oses sont sous la forme pyranique sauf ceux qui sont indiqués f.
1
1
1
- 16 -
1
Tableau 2.
Composition des chaînes a-spécifiques de quelques souches de
1 P/1.0te.LL6 .
Strain 1959
Glc, GlcNH2, GalNH2, GalAc, Lys, (GlcAc)
Strains 19 and VI
GalNHZ, Lys, acides uroniques
1
Strain D52
GlcNHZ, Gal, Rib, EtNH2, P
Strain 19
GlcNHZ, Gal, Ala, acides uroniques
a group 3
Glc, GalNHZ
1
a group 7
Glc, Gal, GlcNHZ
a group 13
Glc, GlcNHZ
a group 8 .
Glc, Gal, GlcNHZ, 6-désoxyhexosarnine
1
a grcup 12
Glc, Gal, GlcNHZ, GalNHZ, 6-désoxy-
hexosarnine
P~ote.LL6 mo~ga~
Strain NZ51 ..
Glc, Gal, GalNHZ
1
Strain N627
Glc, Gal, GlcNHZ
Strain Nll 0,
Man, GlcNHZ
1
C - Le noyau polysaccharidique.
1
L'analyse du noyau polysaccharidique des lipopolysaccharides a également
1 fait l'objet d'une étude assez approfondie chez un grand nombre d'entéro-
bactéries.
1
1) Chez les Sa1mone.fi~, sa structure est la même pour toutes les souches
sauvages. Il contient cinq sucres de base qui sont: D-glucose, D-galactose,
1
L-glycéro-D-mannoheptose, N-acétyl glucosarnine et acide Z-céto-3-désoxy-
mannooctonique. Lüderitz e.t al. (57) ont proposé la structure suivante pour
1 le noyau polysaccharidique des mutants Ra :
D-GlcNAc
D-Gal
1
l al,Z
1a1 ,6
1 Z
al 3
1 3
1 3
1 5
D-Glc~ D-Gal ~ D-Glc ~L-a-D-Hep ~L-a-D-Hep ~KDO
1
Les formes R sont des mutants dépourvus de la spécificité a qui apparaissent
dans les cultures vieillissantes. Les LPS de ces mutants contiennent soit tous
1 les sucres du noyau pour la forme Ra, soit une partie seulement pour les formes
Rb, Rc, Rd et Re (Fig. 3).
1
Z) Chez Shige.fia, en particulier Shige.fia 6fe.xn~, les formes R con-
1 tiennent les mêmes sucres que les LPS des Safmone.fia. La formule suivante re-
présente le noyau polysaccharidique caractérisé chez le mutant Ra de Shige.fia
Me.xne.ti (59).
1
1
1
1
- 17 -
1
Gal
1
P
pp -ETN
mo - P _ ET;\\]
1
~
I I I
1
GIC~He;J+[epl---'--"'~KDO-----:}l>K!X)1LiîJiJe _\\
~ 1 t 1
G1C;'~ -+ YI 1
:
1
Glc
1 Re
(- )
éll 1
0
1
1
1
1 a
.
1
1
-un.l t
IHhit*
1
1
1
1
1
!Rd 2 (-)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1Rd,
(-)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1Pc (+)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1Rb:; (-)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
~.b2 (-)
1
1
1
1
1
1
1
IP,bl
(+ )
1
1
1
1
1
ra (+)
1
1
1
1jSR
1
1Figure 3. Structure des lipopolysaccharides extraits des formes R des
salmonelles (58).
1
1
1
1
1
1
1
- 18 -
1
1
GleNAc
Glc
l al,4 l al,4
Glc al ,~ Gal g
Glc
1
1
La structure du noyau polysaccharidique dépend de la souche. Cinq types
1 de lipopolysaccharides ont été caractérisés : le type R1 de E. ~oli 08 K 27
avec: Gal:Glc:Hep 2:3:3 (rapports molaires) (60), le type R de E. ~oli
2
1 08 K 42 avec Gal:Glc:GlcN]{2:Hep 2:4:1 :4(61), le type R de E. ~oli 0111 avec
3
Gal:Glc:GlcNH2:H:p 1:2,4:2,5:2,5 (62), le type R4 de E. ~oli 014 K 7 avec Gal:
Glc:Hep 3:2:1 (63) et le type K 12 dont la composition, pour les souches CR 34,
1 P 678, D 21 et W3100 (3,4,6,8) est indiquée dans le tableau 3.
1
Les études effectuées jusqu'à présent ont porté essentiellement sur
la composition des lipopolysaccharid~, seules quelques souches ont fait l'objet
1 d'une étude structurale plus approfondie.
Tableau 3. Composition du noyau polysaccharidique des LPS isolés de diffé-
I-
rentes souches de E. ~oli K 12.
Souches
Gal
Glc
GlcNH
I
2
Hep
KDü
Rha
Ref.
D 21
1
2,3
2
4
3
0,4
(6)
I-
W3100
1
2,4
2
5
3
0,3
(8)
CR 34
1
3
3
6
4
(4)
I
P 678
1
3
2,4
7
3,5
(66)
M
1
La souche 0100, classée dans le groupe R2, a été alalysée par Hammerling
et al. (64). Ces auteurs ont proposé pour le noyau du LPS, la structure
suivante :
1 GleNac
Glc
11er
al,2
11,4
/
\\1,7
1
1
\\
1
al
1
\\
al,6"
'..i
~lC
1c "ëil,t Glc
i;3"' Ilep J;3' Hep T,4' KIXJ
1
1
1
1
1
- 19 -
1
Une autre souche E. ~oiZ B a été étudiée par Prehm et al. (6) et la
1 structure du noyau a été démontrée :
P
P-P-CH -CH -NH
2
2
2
1
L
~
Glc 22, Glc 22,
p 12.L
p
KDO
11 ,6
1
Hep
Le type K 12 a été étudié avec les souches CR 34, P 678, D 21, W3100
1 et avec les mutants obtenus à partir de ces souches. Le lipopolysaccharide
des souches sauvages CR 34 et P 678 renferme la glucosamine, l'acide 2-céto-
1 3-désoxyoctonique, le glucopyranose, le galactose et le L-glycéro-D-manno-
heptose. Ces deux oses sont sous les deux formes pyranique et furanique (3,4).
Les souches sauvages D 21 et W3100 renferment les mêmes sucres sous la
1
forme pyranique seulement avec en plus le rhamnose (6,8). Une séquence oligo-
sidique commune a été proposée par Prehm et al. (65) pour le noyau des
1 lipopolysaccharides de E. ~oti K12.
12
13
13
13
1 Glc ~ Glc ---L.., Glc ~He,f~~ep_KOü
j 1, 6
\\ \\ 1, 7/ /
Gal
Hep
1
Blache et al. (4) ont montré que le noyau polysaccharidique du LPS de
la souche sauvage CR 34 avait la même séquence, avec un substituant supplé-
1 mentaire fixé sur le glucose terminal, c'est également le cas des souches
W3100 et F 939. Dans la souche W 3100 le glucose est substitué par la N-
1 acétylglucosamine, dans la souche F 939 par l'acide N-acétylmannuronique
ou par la chaîne tétrasaccharidique 1AbeWManWRhaWGal1 C01ID11e le montrent
1 les formules suivantes :
Gal
,1
11 ,6
· 1 6
12
13
13
13
W3100
GlcNAc ---!....;> Glc-4 Glc ~ Glc ----!...." Hep ---4 Hep~KDO
(65)
'\\
'?l
/
:1
\\1,7/
Hep
i 1,7
:1
Hep
:1
:1
:1
1
1
- 20 -
1
F 939
Ab
1,3 M
1,4 Rh
1,3 G 1
e~
an ------+
a~ a
'\\
1
1-&
1 2
1 3
Man U ~lc~Glc~Glc_Hep~Hep-,;KOO
(65)
f
'\\
1
\\1,6
\\1,1
1
Gal
Hep
i 1,7
Hep
1
1
Gal
Hep
la1,6 11,7
1,6
1,3
1,5
CR 34
X ~ Gl
1,2Gl
1,3
c ~
1
C--'---4 Gl
1,3
C ~ Hep ~ Hep-----+KDO
(4)
1
i
r
p1,4
p1,4
p1,4
1
1
Par contre dans le cas de certains mutants R tels que PL
ou Gal 23,
Z
la chaîne polysaccharidique du noyau peut être raccourcie.
1
1 3
Glc -4Glc ~Hep~Hep-----+KlX)
'\\
l'
1
~ ,7/
(65)
Hep
i1,7
1
Hep
1 3
1
Hep~Hep~O
(65)
1
1
4) Se.Jr.Jta.;t{a mM.c. e!.l c. eYL6 •
1
Wang et al. (67) ont analysé le noyau polysaccharidique des deux souches
de SeJrJta.Ua mM.c.e!.l c.eYL6. Les mêmes sucres sont présents dans les deux souches
1 mais dans des rapports différents (Tableau 4).
1
1
1
1
1
- 21 -
1
Tableau 4. Composition du noyau polysaccharidique des LPS isolés de
S e/lJta.t<-a mMc..e;., c..eYl!.> •
1
Souches
1
Sucres
08
Bizio
](IX)
2
2
1
D-glycéro-D-mannoheptose 1
1
L-glycéro-D-mannoheptose 5
5
1
D-glucose
3
5
D-galactose
1
1
1
D-glucosamine
3
2
D - Rég ion "](IX)' , •
1
Dans les lipopolysaccharides, le noyau polysaccharidique est relié
1 au lipide Apar l'intermédiaire de l'acide 2-céto-3-désoxyoctonique (KDO).
Cette région interne des lipopolysaccharides ou région "KIlO" a été étudiée
1 plus particulièrement chez Sa1mo~~a et E. c..o~ (68,6). Dans toutes les
souches analysées, on retrouve le même enchaînement
1
_
Hep~ KDO 2,4/)5 KDO~lipid A
(II)2,7/8 t(1)2,4/5
1
1 2,7/8
KDO~ X
(III)
1
Dans E. c..o~ B, Prehm (6) a précisé la nature de la liaison 2~4 entre
1 les molécules de KDO (III) et KDO (1).
La nature du substituant X fixé sur la molécule de KDO (III) varle selon
1 les souches. Chez les Salmonelles, E. c..oli B et pour la souche W3100 de
E. c..o~ K 12, X a été identifié au fragment pyrophosphoryléthanolamine lié au
1 carbone 7 de la molécule de KDO. Chez E. c..oli 0100, Hilirumerling a démontré
la présence d'une molécule de galactose reliée par une liaison 1,8 au KDO
(III) (64).
1
Dans la souche D 21 de E. c..o~ K 12, Mayer U al. ont isolé un fragment
rhamnosyl ~ KDO (8).
1
Par contre, le substituant X est absent chez certaines souches (6).
1
1
1
,1
- 22 -
1
DEUXIB>1E PARTIE
TECHNIQUES EXPERIMENTALES
1
A - Isolement du lipopolysaccharide.
1
1) Culture des bactéries.
1
Nous avons utilisé au cours de ce travail la souche mutante thermo-
1 sensible T 83 F-, thr-, Leu-, Bl-, Thy-, Ile-, Val- et LacY1- issue de la
souche sauvage CR 34 d'E~~h~~~hia ~oti K 12 par action de la N-méthyl-N'-
1 nitro-N-nitrosoguanidine (10).
Les bactéries sont cultivées à 30°C et à 40°C en fermenteur Chanap
1 Mannedorf Zurich. Les cultures en fermenteur Chemap ont été faites au C.R.S.S.A.
- Division de Microbiologie, section de Biochlinie - Nous remercions le
1 Dr. R. Fontanges et le Dr. O. Creach qui ont bien voulu effectuer ces
cultures.
1
Le milieu de culture contient, par litre, les composés suivants
1
13,6 g
1
17 ,4 g
Extrait de levure Difco
10 g
1
L-thréonine
100 mg
L-leucine
100 mg
1
L-valine
100 mg
L-isoleucine
100 mg
1
L-thymine
50 mg
D-glucose
2 mg
Vitamine B
1 mg
1
1
Le pH est ajusté à pH 7,4. La culture est arrêtée au début de la phase
1 stationnaire. Les bactéries sont recueillies par centrihlgation, lavées à
l'eau distillée puis lyophilisées.
1
1
1
1
1
- 23 -
1
2) Extraction du LPS (69).
1
Les bactéries sèches sont mises en suspension dans un mélange de phénol-
1 eau (90 g de phénol pour 11 ml d'eau), chloroforme, hexane (2:5:8, v/v/v).
La suspension est homogénéisée et les bactéries sont éliminées par centrifu-
1 gation pendant 15 minutes à 3000 g, cette opération est répétée 2 fois. Les
surnageants sont réunis et filtrés. Après évaporation du chloroforme et de
l'hexane on ajoute goutte à goutte de l'eau distillée à la phase phénolique
1 jusqu'à floculation du LPS. Celui-ci est obtenu après centrifugation 10 minutes
à 3000 g. Le culot est lavé trois fois par le mélange phénol-eau (90 g de
1 phénol pour 11 ml d'eau), 3 fois par l'acétone et par l'éther. Il est ensuite
mis en suspension dans l'eau distillée et centrifugé à 100 000 g pendant
1 4 heures. Le culot obtenu représente le LPS pur.
1 B - Purification du polysaccharide.
1) Traitement acide du LPS.
1
250 mg de LPS sont traités par 15 ml d'acide acétique
%pendant
1 45 minutes à 100°C. L'hydrolysat est centrifugé 30 minutes à 3000 g. Le culot
représentant le lipide A est lavé 3 fois par l'acide acétique à 1 %. Les
1 surnageants réunis qui contiennent le PS brut sont concentrés, repris par
l'eau distillée puis lyophilisés.
1
2) Purification du PS (70).
1
Le PS est purifié sur colonne de Sephadex G 15 (110 cm x 1,6 cm). L'éluant
est le mélange pyridine-acide acétique-eau (10:4:100, v/v/v). On recueille
1 des fractions de 2 ml sur lesquelles on dose les groupements réducteurs
par la méthode au phénol-acide sulfurique (71). A 100 ~l d'éluat sont ajoutés
1 450 ~l de phénol-eau (5:150, g/v) et 1 ml d'acide sulfurique concentré. La
densité optique est lue à 445 TIm. La position du composé élué est caracté-
1 risée par le coefficient de distribution K .D
K = Ve - VA
1
D
Vi - Vo
Va = volume de la colonne (Dextrane bleu 2000)
1 Vi = volume d'élution d'un sel (NaCl)
Ve = volume d'élution du composé
1
1
1
- 24 -
1
C - Analyse qualitative des sucres.
1
1) Chromatographie sur papier.
1
Des chromatographies descendantes sur papier Whatman nOl dans les
1 solvants butanol-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v) et butanol-acide acétique-
eau (5:1 :2, v/v/v) ont été effectuées pour la recherche des oses libres
et des oligosides obtenus après hydrolyse ménagée.
1
2) Electrophorèse sur papier.
1
Les électrophorèses ont été faites sur papier Whatman nOl avec un
1 appareil Pherograph. Le tampon utilisé de pH 4,1 comprend le mélange pyri-
dine-acide acétique-eau (2,5:9:1000, v/v/v).
1
3) Révélateurs.
1
Les sucres et oligosides réducteurs sont révélés par le nitrate d'argent
en milieu alcalin selon Trevelyan et ai.
(72). Les chromatogrammes sont
1 immergés dans une solution de nitrate d'argent (1 ml d'une solution saturée
en AgN0
dissous dans 100 ml d'acétone avec un minimum d'eau) puis séchés.
3
1 Le développEment se fait par une solution de KOH à 2 %dans le méthanol. Les
feuilles sont fixées au moyen d'une solution aqueuse de thiosulfate de sodium
1 à 5 %. Les sucres aminés sont révélés à 110°C après vaporisation de ninhy-
drine préparée selon Russel (73). On mélange des volumes égaux d'une solution
0,33 Mde ninhydrine dans le butanol tertiaire et d'un mélange d'acide acé-
1 tique-eau-pyridine (1 :5:5, v/v/v).
1 D - Analyse quantitative des différents constituants du LPS.
1
1) Dosages colorimétriques.
a) Dosage du glucose (74).
1
1 mg de LPS ou de PS est hydrolysé par 0,5 ml d'acide chlorhydrique
1 0,1 N à 1000e pendant 48 heures. L'hydrolysat est neutralisé par l'amberlite
IRA 410.
1
1
1
1
- 25 -
1
A sa ~l des hydrolysats et des solutions témoins contenant la à 80
1 nmoles de D-glucose est ajouté 1 ml d'une solution de glucose-oxydase,
peroxydase et chromogène. L'absorption est lue au bout de 30 minutes à 436 nm.
1
b) Dosage des heptoses.
1
On utilise la méthode de Dische (75) modifiée par Osborn (76). Quand
on chauffe les échantillons de LPS et de PS en présence d'acide sulfurique,
1 les dérivés furfuryliques des heptoses donnent avec la cystéine un composé
coloré.
1
A un volume de ZOO ~l des échantillons et des solutions témoins conte-
1 nant de 15 à 50 nmoles de L-glycéro-D-mannoheptose maintenus à oOe sont
ajoutés 900 ~l d'une solution H S0 -H O (6:1, v/v). Après agitation, les
Z 4
Z
1 tubes sont placés 5 minutes à la température ambiante. On ajoute ensuite
ZO ~l d'une solution aqueuse à 9 %de chlorhydrate de cystéine. Après Incu-
1 bation à 1000e pendant la minutes les tubes sont maintenus Z heures à tem-
pérature ambiante. La différence.d'absorption à 505 et 545 nm permet de
calculer la teneur en heptoses.
1
c) Dosage du mannose.
1
1 mg de LPS ou de PS est hydrolysé par Hel 0,1 N 48 heures à 100 0 e.
1 L'hydrolysat est neutralisé par l'amberlite IRA 410.
A 180 ~l des hydrolysats ou des solutions témoins contenant de ZO
1
à
80 nmoles de mannose maintenus à oOe on ajoute 300 ~l du mélange H S0 -
2
4
eau (6: 1 : v/v) et on chauffe 3 minutes à 100 0 e. Après refroidissEment,
1 on ajoute ZO ~l de cystéine à 3 % puis après Z heures à tEmpérature am-
biante, l'absorption est mesurée à 415 et 378 nm, la différence permet
1 de calculer la teneur en mannose.
1
d) Dosage de la glucosamine.
1
Les hexosamines sont acétylées et dosées selon la méthode de ~lorgan
Elson (77). Les échantillons de LPS et de PS contenant la à 50 nmoles de
glucosamine sont hydrolysés par HO 4 N à 1000 e pendant 10 heures. L'acide
1
1
1
1
- 26 -
1 est éliminé sous pression réduite. Le résidu est dissous dans 30 \\.lI d'eau
1 distillée et N-acétylé par 10 \\.ll d'une solution d'anhydride acétique à 5 %
préparée extemporanément, en présence de 10 \\.ll d'une solution saturée de
1 ~aHCO~ pendant 10 minutes à température mnbiante. L'excès d'anhydride est
.)
détruit par chauffage des tubes 3 minutes à 100°C. Après addition de 50 \\.ll
1 Je tétraborate de potassium à 5 %et chauffage 7 minutes à 100°C, on ajoute
500 \\.lI d'acide acétique concentré et 100 \\.lI de réactif de Morgan-Elson :
p-diméthylaminobenzaldéhyde à 16 %dans CH~COOH-HCl (95-5). Après 20 minutes
1
.)
à 37°C les absorptions sont mesurées à 585 nm.
1
e) Dosage du KDO.
1
Le KDO est dosé dans le LPS et dans le PS après hydrolyse par l'acétate
d'ammonium 0,025 M pH 4,6 pendant 30 minutes à 100°C (78).
1
e-1) Dosage du KDO par l'acide thiobarbiturique.
1
Nous avons utilisé la méthode d'Osborn (76) modifiée par Weissbach (79)
PUlS Karkhanis
(80).
1
A 200 1-11 des hydrolysats contenant 5 à 50 nmoles de KDO sont ajoutés
1 250 \\.lI d'acide periodique (HI0 ) 0,04 Mdans l'acide chlorhydrique 0,125 N.
4
Après 20 minutes à tEmpérature mnbiante, 250 1-11 d'une solution d'acétate
1 de sodium à 2,6 %dans l'acide chlorhydrique 0,5 N sont additionnés. Le
milieu réactionnel est agité pendant quelques minutes à température mnbiante.
Après l'addition de 500 \\.lI de TBA 0,6 %, les produits sont chauffés 15 minutes
1 à 100°C et DTImédiatement additionnés de 1 ml de DMSO. L'absorption est lue
à 548 nm.
1
e-2) Dosage du ](DO avec le semicarbazide (81).
1
A 1 ml des hydrolysats contenant 0,8ornole de KDO est additionné 1 ml
1 du réactif suivant: 200 mg de chlorhydrate de semicarbazide , 300 mg d'acétate
de sodium
3H20 dans 20 ml d'H 0. Après incubation 15 minutes à 30°C, le
2
milieu réactionnel est dilué à 5 ml avec de l'eau distillée, l'absorption est
1 lue à 250 nm.
1
1
1
1
- 27 -
1
1
f) Dosage du phosphore.
1
Nous avons utilisé la méthode de Lowry et al. (82). A un volume de 100 ~l
des échantillons et des solutions témoins contenant 10 à 50 nrnoles de phosphore,
1
on ajoute 100 ~l d'une solution contenant
acide sulfurique concentré
30,6 ml
acide perchlorique à 70 %
6,7 ml
1
- eau
q.s.p.
100 ml
'1
Le mélange réactionnel est porté pendant 1 heure à 100°C puis 2 heures
à 165°C. Après refroidissement, on ajoute 1 ml de réactif préparé extempora-
nément à partir de 9 ml d'une solution A et 1 ml d'une solution B.
1
•
La solution A comprend
1
- 1 ml d'acétate de sodium M
- 1 ml de moly1xlate d' annnonium à 2,5 %
1
- 7 ml d'eau distillée
1
La solution B est une solution d'acide ascorbique à 10 %. On porte à 38°C
pendant 90 minutes et l'absorption est lue à 700 nrn.
1
g) Dosage des groupements aminés libres (83).
1
Les échantillons contenant 25 nrnoles de composé aminé sont repris par
100 ~l d'eau. On ajoute 25 ~l de tétraborate de potassium à 5 % (pH 9,2) et
1
10 ~l d'une solution alcoolique de DNFB 0,1 M. La réaction s'effectue pendant
30 minutes à 60°C à l'obscurité. On ajoute alors 800 ~l d'HCI 4 N et l'absorp-
1
tion est lue à 420 nrn. Une solution d'éthanolamine témoin a été traitée dans
les mÊmes conditions.
1
2) Analyse des sucres réduits et acétylés par chromatographie en
1
phase gazeuse.
a) Préparation des acétates d'alditols (84).
1
Les échantillons de LPS et de PS (1 à 5 mg) sont hydrolysés par HCI 0,1 N
1
pendant 48 heures à 100°C. Les hydrolysats sont neutralisés par l'amberlite IRA 410.
1
1
1
- 28 -
1
Les sucres obtenus sont réduits par une solution de borohydrure de sodium
1 (5 mg/ml) une nuit à température ambiante. Après traitement par le Dowex
50 X 2 jusqu'à pH 4 et concentration, on élimine l'acide borique libéré sous
1 forme de borate de méthyle par 3 distillations successives en présence de
méthanol. Les alditols obtenus sont acétylés par 1 ml du mélange pyridine-
1 anhydride acétique (1 :1, v/v) pendant 20 minutes à 100°C puis séchés.
b) Analyse des acétates d'alditols par chromatographie gazeuse.
1
Les sucres réduits et acétylés sont repris par le chloroforme et
1 analysés par chromatographie en phase vapeur à 170°C sur une colonne de
verre (200 x 0,3 cm) contenant 3 %de ECNSS~ sur chromosorb G (80-100 mesh).
1 Le xylose est utilisé comme standard interne. Le chromatographe est un
appareil Intersmat 120 FB à ionisation de flamme.
1 E - Techniques diverses.
1
1) Acétylation du LPS.
1
10 mg de LPS sont traités par 2 ml du mélange pyridine-anhydride acé-
tique (1:1, v/v) en présence de diméthylaminopyridine pendant 20 minutes à
1 100°C. Le produit acétylé est purifié par dialyse et lyophilisé (85).
1
2) Méthylation du LPS acétylé et du polysaccharide.
Le LPS acétylé et le polysaccharide sont méthylés selon la méthode
1 de Hakornori (86). 5 à 10 mg mis en solution dans 1 ml de DMSO sont traités
par l'hydrure de sodium en solution dans le DMSO. On laisse reposer une
1 nuit sous atmosphère d'azote. Puis on ajoute 1 ml d'iodure de méthyle. Les
échantillons sont alors soumis pendant 1 heure aux ultra-sons, puis le
1 mélange réactionnel est dialysé. Les produits méthylés sont purifiés par
passage sur une colonne de Sephadex LH-20 avec le solvant chloroforme-métha-
1 nol Cl :2, v/v).
1
Les produits méthylés sont hydrolysés par l'acide formique à 90 %
pendant une heure à 100°C puis par l'acide sulfurique 0,25 N pendant 16 heures
à 100°C. Les hydrolysats sont neutralisés par addition de carbonate de baryum.
1
1
1
1
- 29 -
1
1
1 Les sucres méthylés sont réduits en alditols par le borodeutérure de sodiL@
(30 mg) en présence d'eau lourde pendant une nuit à température ambiante.
1
Les alditols obtenus sont acétylés par 2 ml du mélange pyridine-anhy-
dride d'acétique (1:1, v/v) pendant 20 minutes à 100°C puis séchés et repris
1 par le chloroforme.
1
3) Déphosphorylation du polysaccharide.
1
Le polysaccharide (SO mg) est déphosphorylé par 2 ml d'acide fluorhy-
dr~e à 54 %à 4°C pendant 5 jours. Après lyophilisation le produit est
purifié sur colonne de Sephadex G 15 avec élution par le solvant pyridine-
1 acide acétique-eau (10:4:1000, v/v/v).
1
4) Réductions du polysaccharide déphosphorylé.
1
a) Réduction par NaBH
du polysaccharide déphosphorylé.
1
1
20 mg de polysaccharide déphosphorylé sont réduits par une solution de
NaBH
(50 mg/5 ml) pendant une nuit à température ambiante. Après traitement
4
par le Dowex 50 X 2 jusqu'à pH 4, l'acide borique est éliminé sous forme
1 de borate de méthyle par distillation en présence de méthanol.
1
b) Réduction par LiAlH
du polysaccharide déphosphorylé, réduit et
1
méthylé.
1
Le polysaccharide déphosphorylé et réduit par NaBH
est méthylé selon
4
1 Hakomori. Il est ensuite réduit par LiAlH . Après dissolution dans le mélange
4
éther-dichlorométhane (3:1, v/v) et addition de 60 mg d'hydrure de lithium
et d'aluminium, le milieu réactionnel est laissé sous reflux à 60°C pendant
1 14 heures. L'excès de réactif est alors détruit par addition de quelques
gouttes d'eau. Le précipité formé est dissous par addition de H S0
2 ~.
2
4
1 Le produit réduit est extrait à l'éther.
1
1
1
1
1
- 30 -
1
5) Oxydations périodiques.
1
a) Oxydation totale des LPS.
1
10 mg de LPS sont oxydés par 10 ml de métaperiodate de sodium 0,05 M
1 pendant 48 heures à 4°C et à l'obscurité. L'excès de periodate est détruit par
1 ml d'éthylène glycol. Les groupements aldéhydiques formés sont réduits
par addition de borohydrure de sodium 0,05 M pendant une nuit à 4°C. Le
1 lipopolysaccharide oxydé et réduit est purifié par dialyse et lyophilisé.
1
b) Dégradation de Smith du PS (87).
1
100 mg de polysaccharide sont oxydés par du métaperiodate de sodium puis
réduits par NaBH
dans les mêmes conditions que pOtlr le LPS. Le produit
4
1 purifié et lyophilisé est ensuite soumis à une hydrolyse par HCl 0,5 N à 37°C
pendant 7 heures. Dans ces conditions, les liaisons osidiques des oses quI
1 ont résisté à l'oxydation periodique ne sont pas hydrolysées. L'hydrolysat
est purifié sur une colonne de Sephadex G 15 avec le solvant pyridine-acide
acétique-eau (10:4:1000, v/v/v) (52). Dans les fractions de 3 ml les grou-
1 pements réducteurs sont dosés par la méthode au phénol-acide sulfurique (71).
1
6) Hydrolyse enzymatique.
1
dans 100 ~l d'une
1
1
1
7) Analyse des oses phosphorylés.
1
Le polysaccharide est hydrolysé par HCl N pendant 2 heures à 100°C.
L'hydrolysat est analysé sur papier à pH 5,4 dans le solvant pyridine-eau-
1 acide acétique (2,5:1000:9, v/v/v).
1
1
1
1
- 31 -
1
1
Les bandes dont la mobilité électrophorétique est voisine de celle du
glucose-6-phosphate utilisé comme témoin sont découpées et éluées. Les éluats
1 sont soumis à l'action de la phosphatase alcaline dans le tampon Tris 0,2 M
pH 8,2 pendant 1 heure à 37°e.
1
Les oses déphosphorylés ainsi obtenus sont analysés par chromatographie
gazeuse sous forme d'acétates d'alditols.
1
8) Analyse des acides gras du lipide A.
1
Le lipide A est soumlS à une hydrolyse par Hel 4 N, 5 h à 100 0 e (88).
,1 Les acides gras libérés sont extraits par le chloroforme et méthylés par le
diazométhane gazeux préparé extemporanément, à partir de N-méthyl-N-nitroso-
p-toluène sulfonamide (89). Les esters méthyliques sont repris par le chlo-
1 roforme et analysés par chromatographie en phase gazeuse à 1600e, sur une
colonne (200 x 0,3 cm) de DEGS 10 %sur chromosorb W (80/100 mesh DMeS).
1 F - Spectrométrie de masse.
1
Pour la spectrométrie de masse des mélanges de sucres acétylés et partiel-
1 lement méthylés, le chromatographe en phase gazeuse est couplé à un spectro-
mètre de masse (Appareil Firu1igan). Les spectres de masse sont effectués à une
température d'injection de 210 0 e, pour un potentiel d'ionisation de 82 eV, avec
1 un courant d'ionisation de 0,5 mA et une température de la source d'ionisation
de 70 0 e.
1 G Dosages spectrophotométriques.
1
Les dosages colorimétriques et les dosages en U.V. sont faits à l'aide
1 d'un spectrophotomètre Beckmann model 2~ à double faisceau.
1
1
-1
1
1
.....,
1
- 32 -
1
1ROISUHE PARTIE
RESULTATS
1
1
L'analyse nrumunologique des souches mutantes thermosensibles isolées
à partir des souches parentes CR 34 et CR 341de E. ~O~ K 12 (10), a été
1 effectuée par Bruneteau et al. (9). L'antisérum E. ~O~ K 12 CR 34 donne une
réaction positive avec le lipopolysaccharide homologue: titre d'aggluti-
nation 1/2560. L'inhibition de cette agglutination a été étudiée avec les
1 lipopolysaccharides provenant de différents mutants cultivés à 30°C et
à 40°C. Les quantités minimales provoquant l'inhibition sont indiquées dans
1 le tableau 5 .
1 Tableau 5 . Inhibition de l'hérnagglutination passive par les lipopolysac-
charides de mutants cultivés à 30°C et à 40°C vis-à-vis du système hémag-
1 glutinant E. ~O~ K 12 CR 34.
Souche bactérienne
Quantités minimales de lipopolysaccharides
1
inhibant l'hémagglutination
à 30°C
à 40°C
1
)Jg/ml
1 CR 34
2
CR 34 T 46
8
8
CR 34 T 26
10
6
1 CR 34 T 83
> 200
> 200
CR 341
20
10
1 CR 341 T 18
20
6
CR 341 T 9
20
10
1 CR 341 T 11
20
20
1
Les souches CR 341, T 46, T 26, T 18, T 9 et T 11 cultivées à 30°C et
à 40°C donnent une inhibition avec le sérum anti E. ~O~ K 12 CR 34 à des
1 taux inférieurs ou égaux à 20 )Jg/ml. Seul le mutant T 83 ne donne aucune
inhibition avec l'antisérurn CR 34 à une concentration de 200 )Jg/ml.
Il
1 est donc certain que le lipopolysaccharide de ce mutant présente des dif-
férences structurales avec celui de la souche sauvage. Ces différences res-
1 ponsables d~ la spécificité irnrnunologique de T 83, peuvent se situer au
1
1
1
- 33 -
1
1 niveau de la séquence polysaccharidique du noyau) au niveau des groupements
phosphates présents dans la région interne du noyau ou au niveau de la
1 région KOO. Nous avons donc étudié la structure du noyau polysaccharidique
en recherchant la présence d'esters phosphoriques puis la région KOO.
1 Nous avons complété cette étude par l'analyse du lipide A
Chapitre l - Analyse du lipopolysaccharide et du polysaccharide du mutant
1 T 83 de E. ~oti K12 cultivé à 30°C et à 40°C.
1 A - Isolement du lipopolysaccharide.
1
Le lipopolysaccharide du mutant thermosensible T 83 de E. ~oti K 12
CR 34 cultivé à 30°C et à 40°C est préparé selon la méthode de Galanos.
1 Il représente 3,1 %du poids sec des bactéries cultivées à 30°C et 2,9 %
du poids sec des bactéries cultivées à 40°C. L'absence des acides nucléiques
dans les préparations obtenues a été démontrée par spectrophotométrie
1 ultraviolette.
1 B - Composition du lipopolysaccharide.
1
1) Analyse qualitative.
1
L'analyse des oses présents dans le LPS est effectuée par chromatographie
gazeuse des acétates d'alditols (84). Les chromatogrammes obtenus sont repré-
sentés sur les figures 4 et Set les temps de rétention sont indiqués dans
1 le tableau 6. On constate la présence de galactose (pic B), de glucose (pic C)
et de L-glycéro-D-mannoheptose (pic E). Le pic D, t
= 3,37 est un produit
R
1 de dégradation du t-glycéro-D-mannoheptose formé durant l'hydrolyse acide
du LPS.
1
Sucres
Pics
T *
R
1
Xylose
A
1
Galactose
B
2,24
1
Glucose
C
2,59
X
D
3,37
1
Heptose
E
6,33
Tableau 6. Temps de
rétention des acétates d'alditols à la chromatographie
1 en phase gazeuse. TR*: temps de rétention rapporté au penta-O-acétyl-xylitol.
1
~ ',.~
1
..,.
..
LPS T 83 30°
- 34 -
~L·
1
A
«=
:0-
-
1
~
CI:>
c-
CD
e·
c:
~
1
-=
c:
CI
~
o:=c
1
c
1
1
E
1
....
lemps - -
1
1:1" T 83 40°
A
1· 'o. 5.
1
CI:>
.==:
1
-~=c-
a:>
=
1
c::
.."
""C:I
c:
CI
~
c:::e:
1
c
1
1
E
1
1
Cl.'l!lD
Jemps--
~I· 4 et 5. Analyse des lipopolysaccharides de T 83 Qlltivé. d 3aoe et à 40°C
en chromatographie gazeuse des acétates cl' il lclitols.
1
1
- 35 -
1
La configuration D du galactose et du glucose est montrée par des
1 méthodes enzymatiques
- le D-glucose est dosé par la glucose-oxydase et le D-galactose par
1 la galactose-oxydase.
1
2) Analyse quantitative.
Les résultats du dosage des oses, de la glucosarnine et du phosphore
1 sont indiqués dans le tableau 7.
1 Tableau 7. Dosages enzymatiques et colorimétriques des constituants du LPS
de T 83 cultivé à 30°C et à 40°C.
1
Origine
Glucose %
Galactose
Heptose
KDO
Glucosarnine
P
1 LPS T 83 à 30° 6,5(3)
2 ,2 (1 )
19,7(7,6)
18,6(6,5)
7,9 (3 ,6)
3,5
LPS T 83 à 40°
6,8(2,4)
2,9(1)
19,7(5,9)
22,6 rJ,'j)
9,16(3,2)
3,04
1
Les résultats sont exprimés en %du poids sec et en rapports molaires
par rapport au galactose.
1
C - Préparation du lipide A et du polysaccharide.
1
Le LPS est traité par l'acide acétique à 1 %pendant 45 minutes à 100°C,
1 il est scindé en deux fractions: l'une est constituée d'un polysaccharide
ou PS, l'autre fraction est lipidique, c'est le lipide A représentant environ
70 %du composé initial. Il y a également libération de KOO comme le montre
1 le schéma suivant :
Polysaccharide - KOO f (KDO~-KDO - lipide A
1
Acid~ acétique 1 %
Polysaccharide - KDO + n(KOO) libre + KOO - lipide A
1
Le polysaccharide brut est purifié par chromatographie sur colonne de
Sephadex G 15. La figure
6 représente le diagramme obtenu après élution.
1
La fraction PS (K
= 0,21) représente le polysaccharide Pur. La fraction
D
1 F (K = 0,78) est essentiellement constituée de KDO. Elle sera analysée dans
D
le chapitre III.
1
1
1
1
- 36 -
1
1
1
1
1
PS
j"
1 Ee
Il)
~
1 ~'C'C
G>
1 ~
F
.sr
ë.
1 0'G>.'t:
1 (/)r:Q)"C
1
1
1
1
1
"---" .
1
....,.---volume d"élution (ml)--
1 Fig. 6. Diagramme d'élution d~ PS du mutmlt T 83 d'E. ~O~ K 12
1
sur Sephadex G 15.
1
1
1
- 37 -
1
1
1) Analyse du lipide A.
Le lipide A contient du phosphore, de la glucosamine, du KDO dosés par
1 colorlinétrie (tableau Sa) et des acides gras.
1
P
gluNH2
KDO
~0
1
cul tures à 30 DC
2, 1
6,3
10,8
cul tures à 40°C
2,5
5,6
9,5
1 Tableau Sa. .~alyse du lipide Adu LPS après culture à 30°C et à 40°C.
1
Après hydrolyse acide du lipide A par 3 ml d'acide chlorhydrique 4 N
1 pendant 5 heures à 100°, les acides gras sont extraits par le chloroforme.
Ils sont ensuite méthylés par le diazométhane (89) et analysés par chromato-
graphie en phase gazeuse. Les figures 7 et 8 représentent les chromatogrammes
1 obtenus. Les pics 1, 2 et 4 correspondent aux esters méthyliques des acides
gras possédant respectivement 1t, 14 et 16 atomes de carbone, le pic 5
1 correspond à l'ester méthylique de l'acide B-hydroxymyristique. Ils sont iden-
tifiés par comparaison avec le chromatogramme en phase gazeuse d'un mélange
1 d'esters méthyliques témoins. La composition en ac~de~ gras qe,chaque LPS
~
"
,!\\(V'
e.k~ ,loi ~ 'A ~t 1\\ .
est donnee dans le tableau 8 b.
.1).'"
r.,...L ":> "A ... r'
.
1 i,
1
Les acides laurique, myristique, palmitique et S-hydroxymyristique sont
présents lorsque les cultures sont effectuées à 30°C ou à 40°C mais on note
1 quelques variations dans le taux de ces acides. Le taux de l'acide laurique
est plus faible à 40°C et parallèlement, le pourcentage des autres acides
1 gras augmente à cette température de croissance.
1
1
1
1
1
!.I
~
Fig. 7. Chromatogramme des acides gras méthylés par le diazométhane et analysés
en chromatographie gazeuse.
[ :3 0 "- c J
CD
-"';::~GD
L-
CD
=
=
ftlI
~
C
Q
...1::1
oC
2
5
----~-.--------------
C7l
'''')
Fig. 8. ChrornatogréDnme des acides gras méthylés par le di azanéthémc et
analysés en chromatographie gazeuse.
l4 0 c ]
0
-:0-
2
II
1
l'~
a;
"-
1
ca
--
7"<
c:
C)
-=
cc
.~
/ f
v~
r
5
4
---------------------------------- - --
'1
- 40 -
1
Tableau Sb. Composition en acides gras du LPS de T 83 cultivé à 30°C et
1 à 40°C.
1 Origine
Pics
TR
%
A.G. identifié
1
0,53
62,4
C 12
0
1
2
1 ,00
13,9
C 14
0
T 83 30°
3
1 ,73
0,8
1
4
1 ,93
1,7
C 16
0
5
7 ,10
21
C l4
OH
1
1
0,53
47,72
C 12
0
2
1 ,00
16,92
C 14
0
1 T 83 40°
3
1,73
2, 1
4
1 ,93
4,70
C l6
0
1
5
7 , 13
28,5
C 14
OH
1
2) Analyse du polysaccharide.
1
L'analyse qualitative des sucres présents dans le polysaccharide est
effectuée par chranatographie gazeuse des acétates d' alditols. Les figures
1 9 et 10 représentent les diagrammes obtenus. Les sucres présents sont
le glucose (pic C, TR = 2,59), le galactose (pic B, TR = 2,24) et le L-
1 glycéro-D-mannoheptose (pic E, T = 6,33). Les résultats de l'analyse ~lan
R
titative des sucres et du phosphore sont donnés dans le tableau
9 .
1 Tableau 9. Analyse quantitative des constituants du polysaccharide de T 83
cultivé à 30°C et à 40°C.
1
Glucose
Galactose
Heptose
KDO
Glucosamine
P
1 PS T 83 30° 19,6(2,6) 7,6 Cl )
29,9(3,4)
7,9(0,78)
0,l7(0,02)
4,4
1 PS T 83 40° 19,1O(2,3) 8,25(1)
0,22(0,02)
4,55
Les résultats sont exprimés en ~0 du poids
par
1 rapport au galactose.
1
1
,1
1
- 41 -
PS T 83
30°
~.
CD
.=:
-..,:ci;
1
"-
Q;)
=
=
..,
-=
1
c
A
=
CI
-=
ce
1
1
B
E
1
1
1
-
Jemps-
1
1
t T R:i 40°
Q;)
:>
Fig. 10.
-..,
1
a:;
"-
Q;)
=
=
1
ta
-=
=
CI
-=
ce
A
1
c
1
1
E
---_._~
-.....r----Temps-
9 et 10. Analyse des polysaccharides de T 83 cultivé
à 30°C et à 40°[.
Chromatogrammes des acétates d'alditols des PS.
1
- 42 -
1
Q - Méthylation du lipopolysaccharide.
1
Les LPS sont d'abord acétylés, puis méthylés selon la méthode de Hakomori
(86). Les produits méthylés sont hydrolysés par l'acide formique à 100°C pendant
1 ; heure: , puis par l'acide sulfurique 0,25 N pendant 16 heures à 100°C. Après
neutralisation par le carbonate de baryum, les sucres méthylés sont réduits
1 par le borodeutérure de sodium, puis acétylés. Les acétates d'alditols par-
tiellement méthylés sont analysés par chromatographie gazeuse. Les chromato-
1 grammes obtenus sont représentés sur les figures 11 et 12
Les différents composés ont été identifiés d'après leur temps de réten-
1 tion par rapport au 2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucitol. Le tableau 10 indique
les résultats obtenus.
1
Tableau 10.
Temps de rétention par rapport au 2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucitol des
1 différents composés du LPS partiellement méthylés.
1
Pic
T
Nature du composé
R
A
1,00
1,S-di-O-acétyl-2,3,4,6-tétra-O-métpyl glucitol
1
B
1,09
1,4-di-O-acétyl-2,3,5,6-tétra-O-méthyl galactitol
C
1,28
1,5-di-O-acétyl-2,3,4,6-tétra-O-méthyl galactitol
D
1,90
1 ,2,5-tri-O-acétyl-3,4,6-tri-O-méthyl glucitol
1
E
2,02
1,4-di-O-acétyl-2,3,5,6,7-penta-O-méthyl heptitol
F
2, 16
1,5-di-O-acétyl-2,3,4,6,7-penta-O-méthyl heptitol
1
Les mêmes sucres sont identifiés dans le lipopolysaccharide méthylé
1 du mutant T 83 de E. ~O~ cultivé à 30°C et à 40°C. On note la présence
de 2,3,4,6-tétra-O-méthyl galactopyranose (pic C) et en quantité plus faible
1 celle de 2,3,5,6-tétra-O-méthyl galactofuranose (pic B). Le galactose sous
les 2 formes est en position terminale sur la chaîne du polysaccharide.
1
Le 2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucose (pic A) existe toujours en proportion
1 assez faible, il provient vraisemblablement des chaînes polysaccharidiques incom-
plètes. On constate également la présence de 2,3,4,6,7-penta-O-méthyl heptopy-
ranose (pic F) et de 2,3,5,6,7-penta-O-méthyl heptofUranose (pic E) corres-
1 pondant respectivement aux formes pyranique et furanique du L-glycéro-D-
mannoheptose non substitué.
1
1
1
1LPS T 83 30° Me
- 43 - X
c
1Fig. 11.
1
cg
1
:00-
-C'O:IQ;r:..
A
1
cg
0
=
c:
C'O:I
-=
c:
Q
1
-=
...,z::
1
~
1
l'
.
J
-1
'IIII!i
Te mps-
G
1LPS T 83 40° Me
Fig. 12.
1v
1
A
1
B 0
1
B
1
1
CG
Temps-
11 et 12. Analyse en chromatographie gazeuse des acétates cl' aidi tois des
Iipopolysaccharides partiellement méthyIés.
- 44 -
tl
E - Conclusions.
[1
L'étude de la composition du LPS de la souche thermosensible T 83 de
E. co~ K 12 cultivée à 30°C et à 40°C a montré qu'il n'existe pas de dif-
férence qualitative lorsque la bactérie est cultivée à la température opti-
il
male de 30't ou à la température non permissive de 40't.. Le glucose, le galac-
tose et l'heptose sont présents dans des proportions sensiblement identiques,
seul le taux du KDO et de la glucosamine est plus élevé à 40°C. Dans les
2 cas, la glucosamine est localisée dans le lipide A. L'analyse après méthy-
lat ion du lipopolysaccharide de T 83 cultivé à 30°C et à 40°C a montré la
[1
présence des mÊmes oses méthylés, seules les formes furaniques du galactose
et de l'heptose deviennent plus importantes dans le lipopolysaccharide du
Il
mutant cultivé à 40°C. L'enchaînement des oses dans la chaîne polysacchari-
dique est le même aux deux températures, nous avons déterminé cet enchaî-
1 nement et précisé la structure du noyau du mutant T 83.
Chapitre II - Structure du noyau polysaccharidique du mutant thermosensible
T 83 de E. co~.
Il
Dans la première partie, nous avons montré que le noyau polysaccharidique
ne renferme pas de glucosamine. Les sucres présents sont le galactose, le
II glucose, le L-glycéro-D-mannoheptose et le KDO dans les rapports molaires
voisins de 1 :3:3:1 (Tableau 9), il renferme de plus, 4 %de phosphore.
fi
La structure du polysaccharide a été démontrée par analyse des produits
1 obtenus après déphosphorylation et méthylation, action de l'a-D-galactosidase
sur le polysaccharide déphosphorylé et par dégradation avec le periodate
de sodium.
A - Identification des oses phosphorylés.
Le polysaccharide est hydrolysé par HCl N 2 heures à 100°C et l'hydrolysat
est analysé par électrophorèse à haut voltage sur papier. Après rêù' lation par
le nitrate d'argent en milieu alcalin on observe la présence d'une tache migrant
Il vers la cathode dont la mobilité électrophorétique est voisine de celle du
[1
il
li
1
- 47 -
1
1
1
1
1
1
1
1
~
c
--
"'
~
c...
1
~
=
c::
"'
"'=
1
c::
Q
A
-=
0«
B
1
E
1
0
- 1 - - - - - - - - - - -1
......
:remps--
1 Fig. 14. Analyse du polysaccharide déphosphorylé de T 83 cultivé à 30°C par
chromatographie en phase gazeuse.
1
1
1
1
1
1
- 48 -
1
On constate que le traitement à l'acide fluorhydrique a éliminé les
1
groupements phosphates mais n'a pas modifié la composition glucidique du
polysaccharide. Aucun des oses n'est donc lié à la chaîne oligosidique du
1
noyau par l'intermédiaire d'une liaison phosphodiester.
1
2) Méthylation du polysaccharide déphosphorylé.
1
La méthylation est effectuée selon la méthode de Hakomori (86). Les oses
méthylés obtenus après hydrolyse sulfurique du polysaccharide déphosphorylé
et méthylé sont analysés par chromatographie gazeuse des acétates d'alditols
1
couplée à la spectrométrie de masse.
1
a) Principes généraux.
1
Chizhov ~t al. (90) ont montré qu'il fallait faire une distinction entre
les fragments primaires dus à la coupure entre deux atomes de carbone et les
1
fragments secondaires formés à partir des précédents par éliminations simples
ou consécutives d'acide acétique: 60
,de cétène: 42 , de méthanol: 32
ou
de formaldéhyde: 30 .
1
Bjorndal U al. (91) ont montré que la coupure entre les carbones des
1
structures (1) et (2) se produit de préférence à la structure (3) .
1
1
Lft!--
1
0 - CH
tH - 0 - COCH
3
lfL- 0 - CH3
3
rf--
1
,
0 - CH
CH - 0 - COCH
CH - 0 - COCH
3
3
3
1
1
1
1
(1 )
(2)
(3 )
1
b) Résultat de la méthylation.
1
La figure
15
représente le chromatogramme obtenu. Les temps de réten-
tion et les spectres de masse permettent d'identifier les différents acétates
1
d'alditols. Le tableau
12
indique les fragments primaires observés par
spectrométrie de masse.
1
1
1
1
1
l'
- 49 -
1
93uepuoqV
1
1
c:::e
1
CCl
1
1
1
'-.J
'J
1
1
GJ
'f,
ë3
N
=.r;
1
ü
'f;
1
1 ~
=-
E
ü
~
ü
1
1
1
=
(J
'f;
À
1
1
1
1
1
1
---------------------
Tableau 12.
Telllps de rétention et pics de fragmentation des acétates d'alditols méthylés exprimés par rapport
au l, 5-di-O-acétyl- 2,3,4, 6-tét ra -O-llléthy19 Lucitol .
Fragments primaires mie
Pics
t R
45
89
118
161
162
189
190
205
206
233
234
249
Nature de l'ose méthyLé
correspondant
A
1.0
+
+
+
+
+
2,3,4,6-tétra-O-méthyLgLucose
(spectre 1)
B
1.27
+
+
+
+
+
2,3,4,6-tétra-O~éthylgalactose (spectre 2)
C
2.04
+
+
T
+
+
3,4,6-tri-O-méthylglucose
(spectre 3)
+
+
+
+
2,4,6-tri-O-méthylglucose
0
2.25
+
+
+
+
+
+
+
2,3,5,6,7-penta-O~éthylheptose (spectre 4)
E
2.39
+
+
+
+
+
+
+
+
2,3,4,6,7-penta-O~éthyLheptose (spectre 5)
F
2.58
+
+
+
+
+
2,3,4-tri-O-méthylglucose
(spectre 6)
G
4.95
+
+
+
+
+
2,4,6,7-tétra-O-méthylheptose
(spectre 7)
Il
5.52
+
+
+
2, 4--di -O-méthylglucose
(spectre 8)
l
10.95
+
+
2,4,6-tri-O-méthylheptose
(spectre 9)
V1
<:)
1
1110
HCO DAc
- S1 -
1
1
ll.'
Hy
_~CH~2or
1
162
H3 CO CH
20
-
-
-
Ht OCH~IGf
1
- L - - - t - - - -
5
HC
DAc
-- - - +- - - -
1
H C
DCH
45
2
3
1
1
1
1
Spectre du 1 ,S-di-O-acétyl-2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucitol (pic A)
1
1
1
Spectre n02
1
1
1
2 0
1
'~pcdre Ju 1,S-cii-O-acétyl-2,::i,4,1l-tetra-O-méthyl galactitol CPH': '-J)
1
1
- 52 -
1
S
o~
pectre n .)
10
HCO DAc
1
1
HC DAc'
1
190H3 CO tH - -HIS
- - - + - - i 6 f
ru
HC DCH3
1
- - 1 - - - -
50-]
HCDA
1
--~- -
J
~C DCH ~
3
1
1
2110
1
Spectre du 1 ,2,5-tri-ü-acétyl-~,4,6-tri-O-méthyl glucitol et du
1
1,~ ,5-tri-O-acétyl-2,4 ,6-tri-O-méthyl glucitol (pic C)
1
1
Spect re nO _,
HyO DAc
1
118
H3 CD CH
- - -
---1- - -
1
162
H3 CD CH
- - - - - 1 - - -
He DAc
5
- - -H1
1
DCH - 133
- - - -1 - _3_ af
1
H CO CH
3
- - - - 1 - - - - -
H C DCH
45
2
3
1
1
1
Spectre du 1,4-di-O-acétyl-2,3,5,6,7-penta-O-méthyl heptitol (pic D)
1
1
r -
-
JJ
-
1
Spectre nOS
1
1
5
1
1
1
1
1
1,S-di-O-acétyl-2,3,4,6,7-pen.ta-O-méthyl heptitol (pic E)
1
1
1
15
1
1
1
1
1
1,S,6-tri-O-acétyl-2,3,4-tri-O-méthyl glucitol tpic ~)
1
---------------------
Spectre
0
11
7
HyO OAc
118..
_H3CO~H_
10
_ AcO~ _-
lli. _
_H~OCH3 _10Ç
_ _ ~OAc
350
H CO CH
-
TJ"
3
50
-
-HJ;OCH- - 45"
3
350
1 ,3,S-tri-O-;J(.:étyl-2,4,b,7-tétra-O-méthyl hcptitol
(pic C)
:Jl
.j:o.
---------------------
SPL'L-tl"C
Il')~
__ H~D DAc
118
Hy OCH3- m
_Ac~-rH _ ~
10
2.JL _ _~?_OC~3_lBg-
HÇ DAc
H t DAc
2
5
300
1,::;,S,h-tétl"eJ-O-;lcétyl-2,4-c!i-O--lJlétl1yl glm-itol
(pic Il)
lF1
VI
1
- 56 -
1
1
1
1
1
1
1
1
50
1
1
1
2 0
1
1
1
1,3,S,7-tètra-O-ac6tyl-2,4,6-tri-O-méthyl heptitol
(pic T)
1
1
1
1
1
Il
1
- 57 -
1
1
L'examen du chromatogranme obtenu à partir du polysaccharide déphosphorylé
1
montre que le galactose se retrouve sous forme de dérivé 2,3,4,6-tétra-O-
méthylé (pic B) correspondant à une position terminale de cet ose dans la
1
chaîne polysaccharidique. Le glucose se retrouve sous f01TIe de 2,3,4,6-
tétra-O~éthylglucose (pic A), de 3,4,6-tri-O-méthylglucose (pic C), et de
2,4-di-O-méthylglucose (pic H) correspondant respectivement à un glucose
1
terminal, à un glucose 2-monosubstitué et à un glucose 3,6-disubstitué.
1
Le pic F correspondant au 2,3,4-tri-O-méthylglucose n'existe qu'en
faible quantité. Les heptoses donnent deux penta-O~éthylheptoses, l'un
1
furanique (pic D) et l'aurre pyranique (pic E), ce qui indique qu'une partie
de l'heptose occupe une position terminale dans la reglon interne du noyau.
1
On note aussi la présence d'un 2,4,6,7-tétra-O-méthylheptose (pic G) et d'un
2,4,6-tri-O-méthylheptose.
1
C - Action de l'a-D-galactosidase d'~r~~g~tt~ nig~ sur le PS déphosphorylé.
1
1) Analyse du polysaccharide hydrolysé.
1
Le polysaccharide déphosphorylé de T 83 cultivé à 30°C est traité par
l'a-D-galactosidase d'A~r~g~~ nig~, dans le tampon acétate de sodium
1
pH 4,4 0,2 M 2 heures à 37°C. Le mélange réactionnel est alors analysé par
chromatographie sur papier avec le solvant butanol-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v).
On observe une seule tache qui se révèle au nitrate d'argent en milieu alcalin
1
et qui correspond au galactose. L'hydrolysat est alors soumis à une chromato-
graphie sur Sephadex G 15.
1
La fraction chromatographique principale contient un mélange du polysac-
1
charide ayant subi l'action de l'a-D-galactosidase et du polysaccharide résiduel.
La composition de cette fraction en glucose (20,2 %) et galactose (5,5 %)
1
comparée à la composition du polysaccharide déphosphorylé initial indique
que 30 % environ de galactose a été libéré. Ce pourcentage ne varie pas après
1
une action prolongée de l'enzyme sur le polysaccharide. Par ailleurs, la 5-D-
galactosidase est sans effet sur le polysaccharide ce qui démontre la nature a
de la liaison osidique du galactose.
1
1
1
1
- 58 -
1
2) Méthylation du polysaccharide hydrolysé.
1
La méthylation est effectuée selon la méthode de Hakomori. Les oses
1 méthylés obtenus après hydrolyse du produit méthylé sont réduits et acétylés,
puis analysés par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.
Le chranatogramme obtenu est représenté sur la figure
16.
1,
On observe la présence des mêmes pics que sur le chromatogramme obtenu
1 à partir du polysaccharide déphosphorylé (Fig. 15) mais dans des proportions
différentes. Les spectres de masse montrent qu'ils correspondent aux mêmes
1 dérivés méthylés. Les variations observées dans les oses méthylés obtenus
par méthylation du polysaccharide déphosphorylé avant et après traitement
1 par l'a-D-galactosidasesont donnés dans le tableau 13
Tableau 13. Variations des oses méthylés après action de l'a-D-galactosidase.
1
Pics
Nature du composé
Variations observées
1
A
2,3,4,6-tétra-O-méthylglucose
o
B
2,3,4,6-tétra-O-méthylgalactose
- 30 p.cent : disparition du galactose
1 C 3,4,6-tri-O~éthylglucoseet
+ 32 p.cent
: apparition du 2,4,6-tri-
2,4,6-tri-O-méthylglucose
O-méthylglucose
1 D
2,3,5,6,7-penta-O~éthylheptose
Variation inférieure à 10 p.cent
E
2,3,4,6,7-penta-O-méthylheptose
"
"
"
F
2,3, 4-tri -O-méthylglucose
"
"
"
1 G 2,4,6,7-tétra-O-méthylheptose
"
"
"
H
2,4-di-O~éthylglucose
- 32 p.cent : disparition du 2,4-di-
1
O-méthylglucose
l
2,4,6-tri-O-méthylheptose
Variation inférieure à 10 p.cent
1
On constate une diminution du taux de 2,3,4,6-tétra-O-méthylgalactose
1
(pic B) et de 2,4-di-O-méthylglucose (pic H) et une augmentation de l'intensité
du pic C. Ce pic correspond aux temps de rétention du 1,2,5-tri-O-acétyl-3,4,6-
tri-O~éthylglucitol et du 1,3,5-tri-O-acétyl-2,4,6-tri-O-méthylglucitol qui
1 sont pratiquement identiques. Le spectre de masse (spectre n03) présente des
pics à mie = 45, 161, 190, 205, 234, correspondant aux fragmentations d'un
1 1,2,5-tri-O-acétyl-3,4,6-tri-O-méthylhexitol et un pic important à mie = 118
1
1
1
A
Ol
en
CI:I
--"'CI:IL.
CI:I
~
s:::::
"'
--s:::::e....IC:lce
c
B
o
E
G
H
F
~l----
-
Temps---
Fig.
16. J\\nalyse IXlr chrom:ltographie g:1Zcllse du polysaccharide Jéphosphorylé,traité
par l'a-D-galactosidase et mêthylé.
,.....
',,.
;1:",
---------------------
1
- 60 -
1
1
correspondant au fragment ICH(OCH3)-CHD-OCOCH31+ caractéristique d'un 1 ;3;5-
tri-O-acétyl-2,4,6-tri-O-méthylhexitol. L'augmentation du pic C est donc due
1 à l'apparition du 2,4,6-tri-O~éthylglucose dont l'acétate d'alditol n'est
pas séparé par chromatographie de celui du 3,4,6-tri-O-méthylglucose préexistant,
mais qui est identifié par spectrométrie de masse. La diminution du taux de
1
2,4-di-O-méthylglucose et l'apparition de 2,4,6-tri-O~éthylglucose après action
de l'a-D-galactosidase indiquent que le galactose est lié en a-1,6 à une molé-
1
cule de glucose du polysaccharide.
1 D - Dégradation de Smith du polysaccharide.
1
Analyse de l'oligoside S.
Le polysaccharide est oxydé par une solution de métaperiodate de sodium
1 0,05 M, réduit par NaBH 0,05 Mpuis hydrolysé par HCl 0,5 N 7 heures
4
à 37°C.
L'hydrolysat est purifié par chromatographie sur colonne de Sephadex G 15 avec
1 le solvant pyridine-acide acétique-eau (5:2:500, v/v/v). On obtient une
fraction principale qui correspond à l'oligoside S (Fractions 20 à 40) (Fig. 17a).
1
Les dernières fractions sont réunies et analysées. Elles contiennent
1 essentiellement le glycérol identifié par chromatographie sur papier. Ce dernier
provient des molécules de galactose, glucose et heptose qui ont été oxydées
(Figure 17b).
1
1) Analyse qualitative et quantitative de l'oligoside S.
1
La composItIon de l'oligoside S est déterminée par analyse des acétates
1 d'alditols en chromatographie gazeuse après hydrolyse et réduction. Le chromato-
gramme obtenu est représenté sur la figure
18 .
1
Le pic A est le penta-acétyl xylitol témoin. On constate la présence des
Il
dérivés du mannose (pic B : T
= 1,83), du glucose (pic C : T = 2,40), du L-
R
R
glycéro-D~annoheptose
(pic E : T
= 5,86) et du produit de dégradation (pic D).
R
Le dosage colorimétrique des constituants de l'oligoside S indique des quan-
1 tités sensiblement équimoléculaires de glucose (0,68), de mannose (0,49) et
d'heptose (0,57). Il renferme par ailleurs, 4,5 %de phosphore.
1
1
1
1
- 61 -
1
1
1
1
oligos ide
S
/
1 \\
1
glycérol
1
1
1
Il
1
/
\\.,_..............
1
1
1
1
1
1
1
1
I~~f
1
,
2
10
20
4,0
6,0
n° des fractions
1
Fig.
l7a. Diagramme d'élution de l'oligoside S sur G 15.
1
1
1
1
1
- 62 -
x
Gal
Hep
1
ta1 ,6 Il ,7
12
13
13
13
15
0 0
Glc ~> Glc ~> Glc ~Hep ~ Hep ~KDJ- (KDO) -KDO -+ Llplde A
1'4
/4
14
n
1
P P P
1
Hydrolyse acétique
(CH COOH 1 %, 1 h, 100 D C)
3
J
1
Gal
Hep
1a1,6
~1,7
Glc
1
J-l-L Glc ~ Glc ~ Hep ~ Hep ~ KOO
14
14
14
P P P
1
+ (KDO)n + KOO -+ Lipide A
1
1 - NaI04
2 - NaBH4
1
Gal (oxydé)
Hep (oxydé)
1
al, 6
/
1, 7
~.9~
1
12
i
13
13
o'P\\
Glc ~
Glc~Glc~Hep~Hep~KDO
(oxydé)
(oxydé)
Î
Î
1 oxydé
14
14
4
1
P P P
1
Smith
~ Dégradation de
Glycérol
1
(produit d'oxydation
+ Glc 2-J Hep _1_,~ Man -+ KOO oxydé
de Glc, Gal et Hep)
r
i
Î
1
~
P
Pj
--~v
oligoside S
1
~ 1 - Hydrolyse (HCI N, 2 h,
~ 2 - Phosphatase alcaline
1
Glc, Hep, Man
1
1
Figure 17 b.
Dégradation de Smith du polysaccharide.
1
1
1
- 63 -
Q:l
>
ca
A
-
G
B
Q:l
"-
G:I
=
c:
ca
-=
c:::
0
-=
c:e
D
L\\nal vse de l' oligoside S par chranatographie gazeuse des acétates d' aJd i tols.
l'
- 64 -
1
1
2) Structure de l'oligoside S.
Les résultats des méthylations précédentes montrent que, dans l'oligo-
1
side S, le mannose provient d'une molécule d'heptose monosubstituée en 3,
qui après méthylation du polysaccharide déphosphorylé donne le 2,4,6,7-tétra-
1
O-méthylheptose (pic G, Fig. 15). La molécule d'heptose qui a résisté à l'oxy-
dation periodique provient d'une molécule d'heptose disubstituée en 3 et en 7
1
qui donne le 2,4,6-tri-O-méthylheptose (pic 1, Fig. 15) après méthylation
du polysaccharide déphosphorylé.
1
Par ailleurs, l'obtention d'un dérivé d'un triholoside composé de glucose,
1
mannose et heptose après dégradation de Smith du polysaccharide montre que le
glucose voisin de l'heptose dans la chaîne polysaccharidique du noyau résiste
à l'oxydation periodique. Parmi les oses phosphorylés présents dans le poly-
1
saccharide initial, nous avons identifié un glucose phosphate et un heptose
phosphate. Dans l'oligoside S, nous identifions en plus un mannose phosphate.
1
Deux molécules d'heptose et une molécule de glucose de la chaîne polysaccha-
ridique sont donc phosphorylées comme dans le cas du lipopolysaccharide de la
1
souche sauvage CR 34 (4).
I -
1
Méthylation et réduction par LiAlH
du polysaccharide déphosphorylé et
4
réduit.
1
Le polysaccharide contient une molécule de KDO ; nous avons précisé la
liaison heptose-KDO. Le polysaccharide déphosphorylé est réduit par NaBH ,
4
1
il est ensuite méthylé selon la méthode de Hakomori puis réduit par LiAlH .
4
Après hydrolyse acide, les sucres méthylés sont réduits en alditols, acétylés
1
et les acétates d'alditols sont analysés par chromatographie en phase gazeuse
couplée à la spectrométrie de masse (Fig. 19). Le chromatogramme obtenu présente,
1
à côté des pics caractéristiques du PS déphosphorylé (fig. 15) correspondant
aux dérivés du glucose, du galactose et de l'heptose, un dérivé du KDO qui
a été identifié par son spectre de masse représenté sur la figure
20. Les
1 fragments primaires à mie = 45,89, 117, 133, 291 et 335 correspondent aux
ions suivants :
1
1
:1
1
1
C~OH
1
HCOH
- 6S -
1
R-
1
1
KD0
1
l
Réduction (NaBH )
4
1
1
H
1
1
1
1
1
1
1
l - Hydrolyse
2. - NaBH4
1
R Me +
Hept itol Me +
1
Acétylation
1
1
Acétates d'alditols de RMe
AcO
+
et Hep Me
1
OCH 3
1
Fjg. 19. Détermination de la haison heptose-KIX).
1
- - - - - - - - - - - - - - -
?H2OAc - - - - - -
1
CH OCH
UJ ____/
3
_____
yH2
115
~H DCH~ .
- - - -
- - - -
I/r
--rH DAc
lOlh
,
-
-
-
-
-
-
-133
291
CH DCH
___ -+_-...:.3 ___
.1~ 3
,
89
335
rH DC~ H3
- - - -CH DCH - -
45
AO/
1
1
2
3
1
1
50
'2 'JI
ACt
~L..-L-t(.U~-+iJltI~llllll,-JI~'I~"iIllIllllIlJJlIll'L.J'''l'
1
Il'iI'l ,''1,1111
1
1
I l ,
IdU lia 1 ~1
III"P"'I' '1 11111"'"
,
W;
u~o
2 0 ~~I
'/f
l le
t
1
1
,
l
'1.
1
i
1
1 ,II..
, " , ' ,
, ' , " ,
1
1
"
,II""
" "
r r
Fig. 20. Spectre cie masse clu 1 ,5-cli-O-acétyl-2,4,6,7 ,8-penta-O-méthyl-3-désoxyoctitol.
0'
0'
><
1
1
- 67 -
1
CH
= 0+ - CH_
CH = 0+ - CH
CH
- 0 - CO - CH
2
.'l
3
3
1
~H
- CH
~2=
- 0
0+ - CH
2
mie = 45
3
3
mie = 89
mie
117
1
+
CH = 0
- CH
CH
- 0 - CO - CH
CH
=' 00 - CO - CH
1
1
3
1
2
3
1
2
'
3
CH-O-CH
CH - 0 - CH
CH = 0 - CH
bl2 0 ~3
1
3
1
3
CH)
fH2
1
CH - 0 - CH
tH -- o - CH
mie
133
1
3
~H
3
CH - 0 - CO - CH.,
- 0 - CO - CH
1
+
..)
1
3
1
CH = 0
- CH.,
yH - 0 - CH.,
..)
..)
CH
0+
CH
mie = 291
3
1
mie
334 :,~')
1
Les fragments secondaires sont observés à mie = 275 (335-60), 231 (291-
60),201 (275-32-42),185 (291-32-32-42), 167 (291-32-32-60),143 (175-32), 101
1
(175-32-42). Ces fragments proviennent du 1 ,5-di-0-acétyl-2,4,6,7.~penta-0
méthyl-3-désoxyoctitol. Ce résult'at montre que dans la chaîne polysaccharidique
du LPS le L-glycéro-D-mannoheptose est lié au carbone 5 du KDO.
1
F - Structure de la chaîne polysaccharidique du LPS isolé du mutant T 83
1
de E. coü.
1
L'ensemble de nos résultats schématisés sur la figure 22, nous permet
de proposer pour le noyau polysaccharidique de la souche ITIutante thermosensible
1
T 83 de E. coü K 12, la structure suivante
Gal
Hep (III)
1
Œ
'I )1,6
11'7
(III)
2 (II)
~
1
Glc
/') Glc _----'---'3~>Glc ~Hep ~ Hep ~ KDO
l tell) tel)
1
Figure 21. Structure du noyau polysaccharidique de T 83.
1
1
1
- - -~-,\\,-
- - -
f"'Iglll e L.L.. t\\Jlny5e 1-
eu
-[
noyau po
-.-
)'si'i"'ccl'iarw l.que l-)S'-~I-
eiTlJ',
i"S"OTè e li
-
-
-
lI1ut:lI1ttTï.ennosensibJe T
-
83 de E. - c.oL<-
-
K 12.
Gal 7,6 %
CIe
glycérol
Glc 19,6 %
Gal
+
I-1ep29,9 %
Glc-P
Hep-P
Gle -+ Hep -+ Man -+ KDO oxydé
t
t
r
p p p
(t.)
oligoside S
Hydrolyse acide
Il
Hydrolyse acide
Dégradation de Smith
HCl 0,1 N 48 h 100°C
HCl N 2 h 100°C
HCl 0,5 N 7 h 37°C
"
Gal
Hep
~
Jal,6 J 1,7
1,2Gl
1,3_
1,3
1,5
Gl
rl
1,3 H
H
KDO
c~ C~j:~f~~1:~
p p p
/
~
l-Déphosphorylation (HF 4°C 72 h)
1-Déphosphorylation (HF 4°C 72 h)
1-Déphosphorylation (rW 4°C 72 h)
2-Méthylation (Hakmlori)
2-Hydrolyse enzymatique (a-D-galactosidase
2-NaBH4
3-Méthylation (Hakomori)
(3\\ /
3-MéthYlan~~J (Hakcmorij
~1114
Déri vés cleutériés du
Variations observées
Dérivés deuterlês du
2,3,4, 6-tét r~-O-Me-Glc
o
2,3,4,6-tétra-O~~e-Glc
2,3,4,6-tétr:l-O-Me-Gal
30 %
disparition du galactose
2,3,4,6-tétra-O-Me-Gal
3,4,6 -tri-O-Me-Glc
+ 32 %
apparition du 2,4,6-tri-O-méthyl-
~'1'â
, ,
-tri-O,~e-GIc
2,4,6
glucose
2 3 5 6 7
, , , ,
-pcnta-O-Me-Hep
2,3,5,6,7 -penta-O-Me-Hep
2,3,4,6,7
2,3,4,6,7
variations inférieures à 10 %
2,3, 4-tri -( )-Me-Glc
2 , 3 , 4-tri-O-Me-Glc
~~
00
2,4,6,7-tétra-O-Me-Hep
2,4,6,7, 8-penta-O-Me?désoxyocti to.
2 ,4-di -O-Me'-(; Le
- 32 % : disparition du 2,4-cli-O-Me-Glc
2,4,6,7-tétra-O-Me-Hepx
1
2,4, 6-tri -( H1e-Hep
vari ations inférieures à 10 %
2,4 -d i -O-:-Me-Glc
2,4,6-trl-O,~e-Hep
1
1
- 69 -
1
Les résultats obtenus après méthylation, hydrolyse enzymatique et dégra-
1 dation de Smith ont permis de préciser l'enchaînement des molécules de
glucose l, d'heptose et de galactose. La position des molécules de Glc II et
1 III, de KOO a également été démontrée par les résultats de la méthylation.
1
Les groupements phosphates sont situés sur une molécule de glucose et
sur deux molécules d'heptose. Leur position sur ces oses n'a pas été déter-
minée mais étant donné l'analogie entre la structure de la région interne
1 du noyau du mutant T 83 et de la souche sauvage CR 34, il est vraisemblable
que les groupements phosphates estérifient dans les deux lipopolysaccharides
1 l'hydroxyle 4 du glucose et des heptoses (4).
1 Chapitre III - Analyse comparative de la structure des LPS isolés de la
souche mutante T 83 et de la souche parente CR 34.
1
Nous analyserons comparativement les trois parties du lipopolysaccharide
le lipide A, la région KDO et le noyau polysaccharidique.
1
Le lipide A et le noyau de la souche sauvage CR 34 ont été étudiés
1 par Blache (4).
1 A - Analyse du lipide A.
1
Le tableau 1 4 résume les résultats obtenus.
Tableau 14. Composition du lipide A de la souche sauvage CR 34 (4) et de la
1 souche mutante T 83,cultivéeà 30°C et à 40°C.
1
g lucosarnine
P
% KOO
Acides gras
C
C
C
12
14
16
(18
SOH
1 CR 34
6,3
2,2
7, 1
33,9
28,2
5,9
1,8
30
T 83 (30°)
6,3
2, 1
10,8
62,4
13,9
1 , 7
21 , 1
:1 T 83 (40°)
5,6
2,5
9,5
47,72
16,92
4,7
28,5
1:,1
Le lipide A a une composItIon très voisine dans les delŒ souches. On
note la présence de glucosarnine, de phosphore, d'acide 2-céto-3-désoxyocto-
1 nique et des acides laurique, myristique et S-hydroxymyristique. On note
1
1
1
- 70 -
1 cependant, un taux plus élevé d'acide lauri~le dans la souche mutante
cultivée à 30°C et également un taux plus élevé de KOO.
1
~ - Analyse de la région KOO.
1
Le lipopolysaccharide de la souche sauvage CR 34 contient 31.8 %
1 d'acide 2-céto-3-désoxyoctonique, le lipopolysaccharide de la scuche mutante
thermosensible T 83 en contient 18,6 % lorsqu'elle est cultivée à 30°C et
22,6 %lorsqu'elle est cultivée à 40°C. Ces valeurs sont obtenues par dosage
1 avec la méthode au semicarbazide qui donne la totalité du KDO. Nous avons
également dosé le KOO selon la méthode de Osborn et ai. dans laquelle le
1 cétose est oxydé par le periodate de sodium. Il y a formation de l'acide
3-fonnyl-pyruvique qui se canbine avec l'acide 2-thiobarbiturique pour donner
1 une coloration rose. Cette réaction n'a lieu que si les fonctions OH des
carbones 4 et 5 ne sont pas substituées.
1
COOH
COOH
HOOC
OH
1
~
1
/ /
1
1
C
CO
s
1
,0 ~f-======::::27
~
+
GI)
1
H01~
12
/
'"
CHO
H
COH
1
HOQ-!
1
1
Acide
R
3-formylpyrivuque
1
i'n-j-CO
Co--NH
\\-)
/ '
/ "
~
S C
"""c
CH-CH
CR
CH
C
1
'--...
/ /
~
/
NJ-j-CO
CO-NH
1
(coloration rose)
1
Pour libérer le KOO présent dans le lipopolysaccharide, une hydrolyse
par l'acétate d'ammonium 0,025 M pendant 30 minutes à 1000( est effectuée.
-1
Elle ne scinde que les liaisons cétosidiques et seules ·les molécules de KOO (1)
et (III) sont libérées (fig. 23). Les valeurs obtenues avec la méthode d'Osborn
sont donc plus faibles qu'avec la méthode au semicarbazide . Les ré~lltats
1 obtenus avec les deux méthodes sont indiqués dans le tableau 15. On cons-
1
1
1
1
- 71 -
1 tate que les polysaccharides (PS) des souches CR 34 et T 83 renferment
1 sensiblement la même quantité de KOO (7 à 8 %).
Tableau 15. Détermination du KDO présent dans le lipopolysaccharide des
1 souches sauvage CR 34 et mutante T 83 de E. c.oü K 12.
1
CR 34
T 83 (30°)
T 83 (40°)
Méthode au semicarbazide
1
LPS
31 .8
18.6
22.6
PS
7 . 1
7.9
6.8
1
Lipide A
7. 1
1(1.8
9.5
Méthode d'Osborn
1
LPS
18.8
14.30
18.40
1
1
L'identification du 1 ,5-di-O-acétyl-2,4,6,7,8-penta-O~éthyl-désoxyoctitol
après méthylation du polysaccharïde déphosphorylé et réduit a montré que la
première molécule de KOO était liée à l'heptose par une liaison 1 ~ 5
1 (chapitre II). D'autre part, lorsque l'on traite le lipopolysaccharide par
l'acide acétique on obtient à côté du polysaccharide et du lipide A, une
1 fraction relativement abondante, f, recueillie par chromatographie sur Sepha-
dex G 15 (figure 6) (chapitre I). Nous avons analysé cette fraction f.
1
La fraction f est purifiée par chromatographie sur colonne de Sephadex
1 G 10. Sur les fractions recueillies on dose les groupements réducteurs (71).
les groupements -NH
par la méthode des
2
DNP~érivés (83), le phosphore selon
la méthode de Lowry (82) et le KOO selon la méthode au semicarbazide de MacGee
1 et Doudoroff (81). Les figures 24 et 25 représentent les diagranunes d'élu-
tion A et B obtenus respectivement avec la souche sauvage CR 34 et avec la
1 souche mutante T 83. Trois fractions 1, 2 et 3 sont obtenues. Les fractions
1 et 2 n'existent qu'en faible quantité. La fraction 1 contient tous les sucres
1 du noyau identifiés par chromatographie gazeuse des acétates d'alditols (84).
C'est le polysaccharide résiduel. La fraction 2 est analysée par chromatogra-
1 phie sur papier. Elle renferme des traces de produits aminés en mélange avec
du KDO libre. La fraction 3 est chromatographiquement la plus importante. Elle est
analysée par chromatographie sur papier dans les solvants butanol-acide acé-
1 tique-eau (65:10:25, v/v/v) (solvant A), butanol-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v)
1
1
- 72 -
1
1
1
E
c
1
LC)
~
.q
.phosphore
1
·ro
t.
+semicarbazide
1
0>
A
o :-..n-l
l j bres
7
; j
:r
Dgrpts réducteurs
1
~
(phénol-sul furique)
0-
0
1
'0>
~
fi)
c:
1
tlJ
1::J
1
1
1
1
1
50
1
1
1
3
'(
1
1
Fig. 24. Iliélgramme d'élution de la fraction F de CR 34 (A) sur Sephadex G ln.
1
1
1
1
1
1
- 73 -
1
1
1
. phosphore
1
+san icarbaz. ide
~0".-
oNH
libres
..,
7
Q.
Dgrpts réducteurs
1 o
(phénol-su 1 Eu rique)
B
1
1
1
1
1
1
1
1
o
1c;>
20
40
50
1
1
1
1
n" des· fractions
1
..".~_..:..1_~) :.<E<:_~2_~> 't<:l(,...----=c3----3>iIlO-'~
1
Pig. 25. Diagramme d'élution cie la fraction F (figure 6) de T 83 (B)
1
su r Sephaclex G 10.
1
1
1
1
- 74 -
1
1 (solvant B), et par électrophorèse sur papier dans le tampon pyridine-acide
acétique-eau (25:9:1000, v/v/v). Après révélation par le nitrate d'argent
1 en milieu alcalin on observe par chromatographie la présence de quatre taches
(a), (b), Cc), Cd) dont les RF sont donnés dans le tableau 16.
1
Tableau 16.
Analyse de la fraction 3 par chromatographie sur papier dans
1 le solvant A : butanol-acide acétique-eau (65:10:25, v/v/v) et dans le solvant
B : butanul-pyridine-eau (6:4:3, v/v/v).
1
Solvant A
Solvant B
1
RF/Glu
Témoins
1
\\<DO
0,52
0, 16
galactose
0,80
0,89
1
mannose
1 ,32
1 , 16
rhamnose
2,24
1 ,66
1 Fraction 3 (CR 34 et T 83)
a
0,55
0, 17
1
b
0,80
0,84
c
1,81
0,21
1
d
2,46
1 ,92
1
Les composés des taches (c) et (d) n'existent qu'en faible quantité.
Ils n'ont pas été identifiés. On note cependant que le RF de la tache (d)
1 est assez voisin de celui du rhamnose. L'ose correspondant est peut-être
le 3-0-méthylmannose déjà identifié dans les lipopolysaccharides de Kf~b~~elfa
1 et de E. eo~ (92).
1
Les taches (a) et (b) ont respectivement les mêmes RF que le KOO et le
galactose témoins. Le galactose est vraisemblablement le galactofuranose présent
1 dans le lipopolysaccharide initial (3,4) libéré en partie lors de lth~'drolyse
acétique. Par ailleurs, 1 'hydrolyse acétique scindant plus spécialement les
liaisons cétosidiques, la libération en quantité importante de KOO libre
1
1
1
1
1
- 75 -
1
(tache a) indique que dans les deux souches, le noyau polysaccharidique est
1
rattaché à la fraction lipidique du LPS par l'intermédiaire d'une ou de plusi~lrs
molécules de KDO.
1
L'électrophorèse sur papier d'un hydrolysat sulfurique du lipide A obtenu
après traitement acétique du lipopolvsaccharide oxydé par le periodate révèle
1 la présence d'une tache de même mobilité électrophorétique que le KOO témo:in. La pré-
sence de KOO est également démontrée par la réaction colorée que donne l'hydro-
1
lysat sulfurique avec l'acide thiobarbiturique après oxydation par le periodate
de sodium. Par conséquent, la molécule de KDO présente dans le lipide A (Ta-
1 bleau 15) n'a pas été oxydée par le periodate, elle est donc disubstituée en
ï ou 8 et en 4 ou 5. Par analogie avec les Sa1mon~lta (68) et E. co~ B (6)
1 on peut proposer, pour la région KOO du LPS de la souche sauvage CR 34 et
mutante T 83 de E. co~ K 12, la structure suivante:
1
1
Hep-O
1
1
COOH
1
0 - lipide A
1
1
HO
HOCH
1
1
CH20H in
1 Figure 23. Structure de la région KOO du LPS des souches sauvage CR 34 et
mutante T 83 de E. co~ K 12.
1
1
1
1
1
- 76 -
1
Dans les Salmonella et dans E. ~o~ B, la molécule de KOO (III) est
1 substituée en 7 ou 8 par la phosphoryléthanolarnine. Dans les deux souches
sauvage CR 34 et mutante T 83, nous avons recherché s'il existait un substi-
1 tuant sur la molécule de KDO (III). La figure 26 résume l'ensemble des
opérations effectuées. Le lipopolysaccharide est oxydé par le métaperiodate
de sodium puis réduit par NaBH
1
4 . Il est ensuite hydrolysé par l'acide acétique
à 1 % à 37°C pendant 5 heures. Dans ces conditions seules les liaisons acé-
tali~les sont coupées. On obtient un précipité d'un polysaccharide renfer-
1 mant du glucose, du mannose, de l'heptose et du KOO. Le surnageant est lyo-
philisé pu1S analysé pour rechercher la présence de glycérol ou d'érythritol
1 provenant de l'oxydation de la molécule de KOO (III) (figure 27). Une acétylation
est effectuée avant et après hydrolyse par HCl 0,1 N à 100°C pendant 48 heures.
1 L'identification des acétates est effectuée par chromatographie gazeuse. Seul
le glycérol est présent. L'ensemble de ces résultats indique que la molécule
1 de KOO (III) n'est pas substituée. Dans les deux souches sauvage et mutante,
la région KOO paraît être identique. (figure 23).
1 C - Analyse du noyau polysaccharidigue.
1
Dans les deux souches sauvage et mutante, le noyau contient les mêmes
sucres : glucose, galactose, L-glycéro-D-mannoheptose et KOO dans des propor-
Il
tions identiques: Gal: 1, G:c : 3, Hep: 3, KOO : 1.
1
Par ailleurs on retrouve le même enchaînement représenté sur la figure
22 .
~1ais S1 l'on compare les dérivés méthylés du polysaccharide de la souche
parente CR 34 (4) et du mutant T 83, on observe une différence au nIveau du
1 2,3,4-tri-O-méthylglucose qui est pratiquement inexistant dans la souche T 83.
Ce résultat s'explique par la dispar ition d'un substituant présent dans le
1 lipopolysaccharide de la souche CR 34, le glucose devenant terminal dans la
chaîne polysaccharidique du mutant T 83. On observe, en effet, une augmen-
1 tation du taux de 2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucose dans le polysaccharide
méthylé de la souche T 83 (Tableau 17).
1
1
1
1
1
1
- 77 -
Gal
Hep
1
7
~ t 0.1,6 11,7
Gl
l,,", Gl
1,.) Gl
1,3 H
1,3 H
1,5 KIlO
KDO
T··d
A
c ~
c
c ----'" ep~ ep ---=;0
_ _
___lpl e
1
1
t
4
i
I
4
Î 4
( II)
)
p p p
KDO
(III)
1
1
jl-NaI04
2-NaBH4
Gal(oxydé) Hep(oxydé)
1
!
1
o.l,6
1,7
1 7
1
1,3
1
1:)
0
0
. ·d
Glc~G c~
c~Hep~Hep~KO ~KO ~Llpl e A
(oxydé) (oxydé)
1
t
(oxydé)
(II)
CI)
r4 14 r
Jo
4
oxydé
(III)
1
p p p
oxydé
1
CH COOH
3
1 %37°C 5 h
1
o
COOH
glycérol
1
~.-
1 3
1 ~
1 5
(produ i t d'oxydation
+ HOH 2CJ
+ GIc ~Hep~-\\1an ~KDO __KDO---+Lipide A
de Glc, Gal, Hep
î
i
t
oxydé
et KDO CI II))
(produit d'oxydation P P P
1
de KOO III)
(L III)
1
1
Figure 26. Recherche de la présence d'un substituant sur la molécule
1
latérale de KOO.
1
1
1
1
1
1
1
- 77 -
Oxydation du KOO (I II)
1
1
1
KOO substitué
KOO non substitué
(III)
(II 1)
1
ŒZOH
,
x-O-
1
COüH
OH
COOI-I
1
0 _
(III)
(III!
1
NaI04
1
]'NaI04
NaBI-I
NaBH
4
4
1
I H
ZO
°
COOI-I
X-O-CH
°~ .----cOOI-I
+
~/
1
+
C
1
HCOH
/
1
OI-ICH--
Z
HCHOI-I
~
1
glycérol
érytritol
1
Figure 27.
Les deux possibilités pour l'oxydation de la molécule de KOO (III)
1
par le métaperiodate de sodium.
1
1
1
1
1
1
1
- 79 -
1
1 Tableau 17. Analyse comparative du taux des oses méthylés présents dans
le polysaccharide des souches sauvage CR 34 et mutante T 83 de E. coü K 12.
1
Rapport molaire
1
CR 34
T 83
2,3,4,6-tétra-O-méthyl galactose
1
2,3,4,6-tétra-O-méthyl glucose
0,6
0,9
2,3,4-tri-O~éthyl glucose
0,3
0,07
1
1 D - Conclusion.
L'analyse comparative des lipopolysaccharides des souches sauvage CR 34
1 et mutante T 83 a mis en évidence une identité de structure au niveau de la
séquence polysaccharidique du noyau, de la présence de groupements phosphates
1 et de la nature de la région KDO.
1
Les différences observée5 dans les propriétés immunologiques (9) résultent
de la présence dans la souche sauvage d'un substituant, non encore déterminé,
1 fixé sur le glucose terminal de la chaîne polysaccharidique. Le mutant T 83
est donc un mutant R de la souche parente CR 34 possédant un lipopolysac-
Il
charide à chaîne plus courte.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
- 80 -
1
CONCLUS IONS
1
1
Au cours de ce travail, nous avons d'une part, analysé le lipopolysac-
charide de la souche mutante thermosensible T 83 cultivée à 30°C et à 40°C,
1 d'autre part, recherché des différences structurales dans les LPS de la
souche mutante et de la souche parente pouvant expliquer les différences
1 de spécificité Dnmunologique.
1
La souche thermosensible T 83 possède une mutation DNA A conduisant à
l'arrêt de l'initiation de la réplication du DNA lorsque la culture est ef-
fectuée à 40°C. Le RNA et les protéines continuent à être synthétisés mais
1 il n'y a plus formation de septum et les cellules deviennent filamenteuses.
On constate des altérations dans les protéines mEmbranaires (16,17) mais aucune
1 différence avec la souche sauvage n'est observée dans la composition phos-
pholipidique (15).
1
Nos résultats montrent que le lipopolysaccharide n'est pas modifié
1 lorsque la souche est cultivée à 40°C, température à laquelle se manifeste
la mutation. La nature du lipopolysaccharide est donc indépendante de la
température à laquelle est effectuée la culture et la mutation conduisant
1 à la modification du LPS est différente de la mutation DNA A.
1
Il existe par contre, des différences lorsque l'on compare les lipopoly-
saccharides de la souche T 83 et de la souche parente CR 34. La structure
1 du squelette polysaccharidique et de la région KOO est identique dans les
deux cas mais il existe dans la souche parente un substituant fixé sur le
1 glucose terminal non réducteur, substituant qui est absent dans le mutant T 83.
C'est vraisemblablement ce substituant qui est responsable de la spécifi-
cité immunologique de la souche sauvage et des autres mutants thermosensibles
1 étudiés précédemment (9).
1
1
1
1
1
1
- 81 -
1
Les études effectuées avec des souches variées de E. ~oti K 12 ont
1 montré une grande homogénéité dans la nature des LPS et Prehm a proposé
un motif commun à tous ces LPS, caractéristique du type K 12 (65). Ce motif
correspond à la séquenc~ suivante :
1
Gal
Hep
1
lCt1,6 / \\1,7
1
\\\\
1
Glc.24 G1C~G1C~He:1,3:>~ep~KDO
1
Les LPS de type K 12 se différencient par la nature du substituant
1 variable, fixé sur le glucose terminal. La souche T 83 correspond à un
mutant R renfermant le LPS fondamental du type K 12. C'est la première
fois que ce LPS est caractérisé dans une souche d'E. ~oti K 12.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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