l-'NIVERSITE AIX - MARSEILLE I I
FACULTE DE PHARMACIE DE MARSEILLE
CCNI'RIBUTICIN A L'ETUDE DE L'ACTVITE ANTIPARASITAIRE DE ~ ~IPES
ACTIFS EXTRAITS DE BIDENS PIlDSA L.
THESE
Présentée et soutenue publiquement devant la
FACULTE DE PHARMACIE DE MARSEILLE
" '\\",
Le 21 avril 1983
,
, 1., . . j
par
---~
MATHIEU NIlOUNGA
né le 17 septembre 1953
MAITRE ES - SCIENCES
Pour obtenir le grade de
!
OCCTEUR DE 3è CYCLE
1j
.Spécialité : MICROBIOLCGIE
Option Anti - parasi taires
J
1
,
Exam:l.na.teurs de la ~se :
M.
P. T~ - DAVID
Professeur
Président
M.
G. BAUNSARD
Professeur
M.
G. DUMENJL
Professeur
Assesseurs
M.
M. QUIUCI
Professeur
M.
A. BABADJAM.IAN
Maître - Assistant
Travail effectué dans les laboratoires de Parasicologie et de Matière Médicale
1
de la FACULTE de PHARMACIE de MARSEILLE
.(~C:1. ~r

---

UNIVERSITE D'AIX - MARSEIllE
FACULTE DE PHARMACIE DE MARSEILLE
~ISTRATION
Doyen: J. P. CANO
Assesseurs: C. BRIAND - P. TIMON-DAVID
Attaché Principal, Responsable des Services Administratifs : C. AVENI
PROFESSEURS HONORAL"ES : F. MERCIER, M. MOURGUE, F. PELISSIER
PROFESSEURS :
Biologie Humaine
1<1.
LANZA
Biophysique
A. CREVAT
Botanique et Cryptogamie
P. REGLI
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Bromatologie Diététique et Analyse appliquée à l'Expertise
A. GAYTE-SORBIER
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11AITRES-ASSISTANTS
Biologie EumaL~e
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P. ETZENSPERGER
3iophysique
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Botaniqœ et C%"'lPtogamie
Y. BUFE"ARD
E. FER.~RI
M. GOODARD
M. D. STEINMETZ
Bromatologie Diététique et Analyse appliquée à l ' Exper-
C. AIRAUDO
tise
c.'1imie Analytique
C. ARFI
M. BOROONNEAU
B. DCKJULIN
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T. POGNET
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Chi.mie Thérapeutique, Droit et Economie de la Phar.na.cie
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Microbiologie, Hygiène Microbienne et Immunologie
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Microbiologie, Hygiène, Parasitologie et Zoologie
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A. CUGNARDE'Y
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Matière Médicale.
M. LALI.EMAND
D. LEM:lRDANT
Phazma.codynéUllie
S. DESSAIGNE
A.M. SCOTTO DI ~
Physique Phar:naceutique et Mathématiques.
M. SAR.'<AZIN
TOxicocinétique et Pharmacocinétique
J. CATALIN
TOcicologie Générale et Biotoxicologie
A. OL~
M. ESTADIEU
•
0
:)
0

---

A la mém:>ire de roon père
A ma mère
A mes frères et soeurs
A tous ceux qui me sont chers

---

A la Méooire du Professeur P. BERNARD
,t
j

---

A notre Président de Thèse
foUlsieur le Professeur P. TllIDN-DAVID
En nous dcnnant accès à votre laboratoire, vous nous avez fait
agréablement découvrir l'importance de la parasitologie.
Vos qualités humaines, votre compréhension et votre rigueur
ont grandement facilité l'élaboration de ce travail.
Nous tenons à vous exprimer notre profonde reconnaissance et
notre respectueux attachement.
A foUlsieur le Professeur G. BALANSARD
Nous vous exprimons notre profonde reconnaissance pour le cha-
leureux accueil que nous avons trouvé dans votre laboratoire et
pour les marques de sympathie et de bienveillance que vous nous
avez toujours témoignées.
Votre disponibilité, vos encouragements nous ont permis d'aimer
ce vaste domaine qu'est la chimie végétale.
Soyez assuré de nos sincères remerciements.
A foUlsieurs le Professeur G. OlItlENIL
Vous nous faîtes un grand honneur
en acceptant de faire partie
de notre jury de thèse.
Nous vous en remercions et nous vous prions de trouver ici le
témoignage de notre profonde gratitude .
.../ ...

---

A ltkJnsieur le Professeur M. QUILler
Nous vous remercions d'avoir bien voulu accepter de juger ce
travai l malgré les charges mul tiples qui vous incombent.
Soyez assuré d.e notre profond respect.
A ltkJnsieur le Docteur A. BABADJAMIAN
Nous avons pu apprécier le grand intérêt que vous portez à ce
travail.
Votre gentillesse et votre enthousiasme ont contribué grandement
à l'élaboration de ce travail.
Soyez assuré de notre respectueuse gratitude.
,
1
1
1
!
~

---

A lblsieur le Professeur C. GREBUS Doyen H:>noraire
Qui nous a accueilli avec une extrême bienveillance
Qu 1 il trolue ici l'expression de notre respectueuse considération.
A Maderoiselle le Professeur A. CREltUEUX
Avec tot.:.t notre respect et notre reconnaissance.
A Maderoiselle M.. ~
Durant notre séjour au laboratoire, votre aide efficace et
votre conseils ont énormément contribué à l'aboutissement de
ce travail.
Qu 1 il r.ous soit permis de vous exprimer notre affectueuse
amitié.
A Madaœ le Docteur F. DEll1AS
Votre aide nous a été particulièrement utile.
Nous vous exprimor:s ici notre profonde et reconr.aissante
amitié.
A lblsieur le Docteur M.-J. JULIEN
Par vos judicieux conseils et votre borne huneur,
vous nous avez permis de mener à bien ce travail.
Nous sarrnes très heureux de pouvoir vous exprimer ici nos sin-
cères et respectueux remerciements .
.../ ...

---

A fot:lnsieur N. HAlJ..E
Du Huséun d' Histoire Naturelle de Paris.
A Messieurs P. DEIPINO ET G. 00UDClN
Pour leur collaboration technique de tous les jours.
A tout le personnel des laboratoires de :
Matière Médicale
Microbiologie
Parasitologie
L'Université n'entend donner aucune approbation ni improbation
aux opinions émises dans les Thèses. Ces opinions doivent être
considérées carne propres à lecrs auteurs.

---

SOM MAI R E
Pages
INTRODUCTION
CHAPITRE l
ETUDE BOTANIQUE
LE GENRE BIDENS
1
* LES ESPECES du GENRE BIDENS
2
* BIDENS PILOSA
12
1.- VARIETES et SYNCNYMES
12
II.- DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE
des VARIETES de BIDENS PILOSA
19
111.- ECHANTILLONS du MUSEUK D'HISTOIRE
NATURELLE de PARIS
21
IV.- DESCRIPTION de BIDENS PILOSA L.
23
V.- USAGE en MEDECINE TRADITIONNELLE
24
VI.- HABITAT et ECOLOGIE
26
CHAPITRE II
,
,
l ' '.i:
"
TRAVAUX ANTERIEURS
1.- ETUDE CHIMIQUE
27
A.- Les CAROTENOIDES
,
28
""
B.- Les PHYTOSTEflOLS
30
C.- Les POLYACETYLENES
31
D.- Les DERIVES PHENOLIQUES
38
II.- ETUeE PHARMACOLOGIQUE
45
- ACTIVITE ANTIMICROBIE~NE
DES PRODUITS
ISOLES DE BIDENS PILOSA.

---

Pages
- TRAVAUX PERSONNELS
- CHAPITRE III
ETUDE CHIMIQUE ET PHARMACOLOGIQUE
1.- DROGUE et EXTRAITS ETUDIES
47
A- EXTRACTION par le METHANOL 80 %
47
B- ESSAI de FRACTIONNEMENT de la FRACTION
SOLUBLE dans le METHANOL
48
C- METHODES de CONTROLE des DIFFERENTES
FRACTIONS
49
II.- RECHERCHES CHIMIQUES PRELIMINAIRES
51
111.- ESSAIS PHARMACOLOGIQUES PRELIMINAIRES
54
A- MATERIELS et METHODES
54
la Détermination de l'activité anthel-
minthique in vitro
54
2 a Déterminé,tion de l' acti vi té amoebicide
in vitro
56
3 0 Activité trichomonacide in vitro
58
B- RESULTATS DE~ E~SAIS PREI,IMINAIRES
60
IV.- ETUDE DE LA FRACTION SOLUBLE NHLOH
64
A- FRACTIONNE~ENT sur COLONNE de GEL de SILICE
64
B- ESSAI de PURIFICATION du PRODUIT N
65
V.- ETuDE de ia FRACTION RESIDUELLE ETHER
67
A- FRACTIONNEMENT sur COLONNE de GEL de SILICE
67
B- PURIFICATION du PRODUIT A
70
C- ,PURIFICATION du PRODUIT C
71
VI.- CARACTERES PHYSICO-CIIIMIQUES et
IDENTIFICATION des FRODUITS A et N
72
A- CARACTERES PHYSICO-CHIMIQUES de la
SUBSTANCE A
72
B- CARACTERES PHYSICO-CHIMIQUES de la
SUBSTANCE N
73

---

Pages
C- IDENTIFICATION SPECTRALE
73
1° App&reils d'étu~e physico-c~imique
73
2° Ider.tification spectrale de la
substance A
74
3° Identification spectrale de la
substance N
78
VII.- ETUDE PHARMACOLOGIQUES DES PRCDUITS PURIFIES
8C
A- ESSAI IN VITRO
81
1° Activité anthel~in~~ioue vis à vis
d' Hymer,olepis nana var. fraterna
81
2° Activité anthelminthique sur
Fasciola hepatica
82
3° Activité amoet.icide in vitro
85
4° Activité tric~omonacide in vitro
85
5° Analyse des résultats des essais in vitro
85
B- ESSAI IN VIVO
87
* Activité anthelminthique in vivo
1°_ Essai sur souris blancre parasitée
par Hymenolepis nana var.fraterna
87
2°_ Essai sur sOüris blancre parasitée
par Syphacia obvelata
88
3°_ Interprétation des résultats
89
* Evaluation èe l'activité antim~larique
in vivo
90
- CHAPITRE IV
CULTURE IN VITRO DU PLASMODIUM FALCIPARUM
.l- I. BIOLOGIE du PLASMODIUM FALCIPARUM
93
II. HISTORIQUE sur la CULTURE des PLASMODJDES
99
III. TRAVAUX FERSONNELS
102
A- PREPARATION du MILIEU de CULTURE
102
B- LE E,ANG non INFECTE
10-<

---

Pages
C- ENTRETIEN de la SOUCHE
106
D- ASPECT et EVOLUTION de la CULTURE
107
E- CONSE8VATION de la SOUCHE ée PLASMODIUM
FALCIPARUM
108
1° le cryoprotecteur
109
2° Préparation du parasite en vue de
la congélatiorc
109
3° Décongélation et mise en culture
109
4° Evoluation èe la culture
110
F- APPLICATIONS
110
1° Sensibilité de la souche au sulfate
de chloroquine
110
2° Activité des substances et fractions
isolées de Bidens pilosa
115
3° Effet de l'éthanol sur la croissance
du Plasmodium falciparum
118
- CONCLUSION GENERALE
121
- BIBLIOGRAPHIE
126

---

l N T R 0 DUC T ION
Les pays d'Afrique Noire,
en raison de la nature
du sol et du climat possèdent une flore très riche et de nombreuses
espèces végétales y ont toujours été utilisées dans le traitement
des maladies diverses.
Depuis quelques années,
des études ethnobota-
niques tentent d'établir les catalogues des plantes médicinales
utilisées dans certains pays notamment au Congo, Côte d'Ivoire,
Madagascar .... Cependant,
les divers renseignements recueillis au-
près des guérisseurs et féticheurs gardent un certain caractère
aléatoire.
En effet,
l'usage des plantes en Afrique Noire reste
le plus souvent lié à des pratiques médico-magiques et les dé-
tenteurs des secrets sur les plantes donnent aux enqueteurs des
informations parfois incomplètes et même fausses.
Aussi est-il
indispensable d'entreprendre des études chimiques et pharmacolo-
giques de ces plantes pour justifier d'une manière sCientifique
leur usage.
Bidens pilosa L., plante qui fait l'objet de
ce travail est très répandue au Congo et utilisée en médecine tra-
ditionnelle dans de nombreux pays dans le traitement des maladies
parasitaires, des cephalgies,
de la coqueluche etc ...
.../ ...

---

Notre premier chapitre est consacré à l'étude
botanique et à l'usage en médecine traditionnelle de cette plante.
Nous avons répertorié les espèces du genre Bidens,
les variétés
de Bidens pilosa et leur répartition géographique.
Dans un second chapitre, nous faisons l'histo-
rique des travaux ( chimiques et pharmacologiques ) relatifs à
Bidens pilosa et aux autres espèces du même genre.
Après ces rappels qui nous ont paru nécessaires
pour poser le sujet, nous avons entrepris de définir la démarche
à suivre pour l'étude antiparasitaire de cette plante. Après une
description de la drogue et des extraits étudiés, nous abordons
successivement les essais préliminaires qui permettent d'orienter
nos recherches avec l'étude de la purification de trois principes
chimiques obtenus à partir des extraits de départ. Nous avons en-
suite évalué l'activité pharmacologique antiparasitaire de ces trois
substances.
Dans une dernière partie, nous reprenons les
modalités de la culture in vitro du Plasmodium falciparum per-
mettant d'avoir un outil d'évaluation
d'activité antipaludique
expérimentale.

---

l
1
1
1
CHAPITRE l
E T U D E
BOT ANI QUE

---

-
1 -
L E
G E N R E
B IDE N S
Le genre Bidens,
famille des composées
(synan-
thérées),
sous-famille des Radiées
(Corymbifères),
tribu des Hé-
lianthées, comprend plus de deux cents espèces dont certaines
comptent plus d'une dizaine de variétés
(Bidens pilosa a treize
variétés) .
Nous nous sommes largement inspirés de l'ou-
vrage d'Earl Edward Sherff datant de 1937 et qui constitue à no-
tre avis,
le travail le plus poussé mené jusqu'alors sur ce genre.
ê4
) •
Ce sont des plantes annuelles ou vivaces
que
l'on rencontre dans toutes les parties du monde,
sous tous les
climats. Les feuilles simples ou composées sont toujours opposées.
Les capitules hétérogames possèdent à la périphérie des fleurs
ligulées à trois dents alors que les fleurs centrales sont tubu-
leuses. Le nombre de lobes des fleurs ligulées peut atteindre la
dizaine.
La forme des akènes est l'un des caractères
essentiels qui permet de distinguer les espèces les unes des au-
tres. Ces akènes sont munis d'arêtes portant des barbelures inver-
sées.

---

-
2 -
ESPECES
D U
G E N R E
B IDE N S
(64 )
1 -
Eidens Ahnnei Sherff, Eot. Gaz. 76
: 165 - 1923
2 -
Bidens po1ycepha1a Schz. Bip. Flora 39 ~ 360 - 1856
,
3 -
Bidens de1toidea J. W. Moore, Bishop Mus. Bull. 102
!i
46 - 1933
j.
4 -
Bidens Jardinii Schz Bip.
Flora 39 : 360 - 1856
!
1
,
,
5 -
B. Bipontina Sherff Bot. Gaz 85 : 10 - 1928
,
1
\\1
6 -
B. co11ina Deg.
et Sherff ex Sherff Bot Gaz.
96
144 - 1934
7 -
B. Beckiana
( F. Brown)
Sherff. Comb. nov.
1
,
,1
8 -
B. cordifolia Schz.
Bip.
Flora 39
: 361 -
1856 ;
!
Sherff. Bot. Gaz. 85 : 24 - 1928
9 -
B. hivoana Deg.
et Sherff ex Sherff Bot. Gaz.
96
: 143 -
1934
10 -
B. hendersonesis Sherff,
Bishop Mus. Oecas.
Paps.
12
:
nO 19
: 6 - 1937
11 -
B. Lantanoides A. Gray,
Pro. Amer. Acad. 5
128 - 1861 ;
1
Sherff Bot. Gaz.
85
: 24 -
1928
1
12 -
B. mooreensis M.
L. Grant Sp. Nov.
!
13 -
B. austra1is Spreng. Syst. 3 : 453 - 1826
!
14
B.
raiateensis J. W. Moore Bish. Mus. Bull. 102
47 - 1923
1
15
E. Mathewsii Sherff Bot. Gaz. 81
34 - 1926
~
16 -
B. aoraiensis M.
L. Grant Sp. nov.
1
17 -
E. Henryi Sherff, Bot. Gaz.
76 : 164 - 1923
:
i
i
18 - B . glabatra
(Gray) Sherff, Bot. Gaz. 88 : 292 - 1929
1
19 -
B. orofenensis M. L. Grant ex Sherff, Bishop.
Mus. Occas.
!
Paps 12 n° 19
: 4 - 1937
1
i,
... / ...
!
,

---

-
3 -
20
B. hawaiensis Gray, Proc. Amer. Acad. 5 : 128 - 1861
21 - B. distans Sherff Bot. Gaz. 89 : 362 - 1930
22
B. Degeneri Sherff Bot. Gaz. 85 : 3 - 1928
23 -
B. asyrnetrica ( Lève ) Sherff Bot. Gaz. 81
42 - 1926
Bot. Gaz.
85
25 - 1928
24 -
B.
cervicata Sherff Bot. Gaz. 70 : 99 - 1920
1
,
25 -
B. graci10ides Sherff Bot. Gaz.
76 : 159 - 1923
1
26 -
B. ctenophy11a Sherff Bot. Gaz. 85 : 5 - 1928
!~i
27 -
8B.
glandu1ifera M. L. Grant, Sp. Nov.
,
28 -
B. marcrocarpa
( Gray
1
1
sherff, Bot. Gaz. 70 : 97 - 1920
!
29
B. magnidisca Deg. et Sherff ex sherff Bot. Gaz. 93
f
216 - 1932
i
1
30 -
B. micranthoides Sherff Bot. Gaz.
70 : 100 - 1920
1
t
t
31 -
B. Asp1enioides Sherff Bot. Gaz.
70 : 101 - 1920
1
32 - B. pu1.che11 a ( Less. ) Schz. Bip. Flora 39 : 362 - 1856
f
sherff Gaz. 85
:
25 - 1928
i
1
33 -
B. uapensis
( F. Brown ) Sherff comb. nov
34 - B. Popu1ifo1ia Sherff Bot. Gaz. 86 : 438 - 1928
1
35 - B. Skottsbergii Sherff Bot. Gaz. 91 : 311 - 1931
!.1
36 -
B. obtusi1oba sherff, Bot. Gaz. 88 : 289 - 1929
t
37 -
B.
sandvicensis Less. Linnaea 6 : 508 - 1831
1
fff
38
B. conjuncta Sherff Bot. Gaz.
76 : 162 - 1923
39 -
B. Wiebkei Sherff Bot. Gaz.
86 : 435 - 1928
40
B. fecunda Deg. et Sherff ex Sherff Bot. Gaz. 93
,
217 - 1932
tl
41 -
B. coartata Sherff Bot. Gaz.
86 - 1928
1
42 -
B. Sa1icoides Sherff Bot. Gaz.
86 : 437 - 1928
1
r.
1
43 -
B. Forbesii sherff Bot. Gaz.
70 : 103 - 1920
1
... / ...

---

1
- 4 -
44 -
B.
tort a Sherff Bot. Gaz.
70 : 105
1920
1
45 -
B.
fulvescens Sherff Bot. Gaz. 86
!,
435 - 1928
,
r
46 -
B. Campylotheca schz. Bip. Flora 39
: 359
1856
Î
47 -
B. nematocera Sherff Amer. Journ. Bot. 22
705 - 1935
1
,
~
48 -
B. valida Sherff Bot. Gaz.
70 : 102 - 1920
1
!
49 -
B. Stokesii Sherff Bot. Gaz.
70
101 -
1920
!
,
50 -
B. amplectens Sherff Bot. Gaz.
70 : 99 - 1920
51 -
B. waimeana Sherff Bot. Gaz.
76 : 164 - 1923
52
B. micrantha Gaud. Voy.
Freycinet Bot. 1926
53 -
B. Menziesii
( Gray) Sherff. Bot. Gaz. 70 : 98 - 1920
1
54 -
B. waianensis Sherff Bot. Gaz.
70 : 104 - 1920
i
1
55 -
B. Hillebrandiana ( Dr. del. Cast.
) Deg ex Sherff
1
i
Bot. Gaz.
85
: 6 - 1928
56 -
B. mauiensis
( Gray)
Sherff Bot. Gaz.
70 : 98 - 1920
57 -
B. molokaiensis
( Hillebr.
) Sherff Bot. Gaz.
70 : 97 -
1920
58
B. cuneata Sherff Bot. Gaz.
70 : 102 -
1920
59 -
B. Saint-Johniana Sherff Bish. Mus. Becas. Paps. 12 n°
19
12 - 1937
!
60 -
B. Cosmoides
( Gray)
Sherff Bot. Gaz.
70 : 98 - 1920
!1
61 -
B.
clarendonensis Britt. Bull. Torr. Bot. Club.
39 : 9 - 1912
1
62 -
B. monticola Poepp. et Endl. Nov. Gen.
et Sp. 3 : 49 - 1845
1
63 -
B. reptans
( L.
) G. Donin Sweet Hort. Brit. ed. 3 :
1
360 -
1839
i
1
64 -
B. incisa ( Ker) G. Don in sweet, Hort. Brit.
eâ. 3
,
360 - 1839
65 -
B.
squarrosa H. B. K. Nov. Gen.
et Sp. 4 : 187
( 238
.. 1820
1
66
B. Rubifolia H.
B. K. Nov. Gen.
et Sp.
186
(
237
- 1820
f,
67 -
B.
simplicifolia C. H. Wright Kew. Bull. 1906 : 5
r
... / ...
1
i
1

---

-
5 -
68 -
B. Vincaefolia Karst et Schz. Bip ex Sherff Bot. Gaz. 59
303 -
1915
69 -
B. Gent~Ji Sherff Bot. Gaz. 97 : 608 - 1936
70 -
B. urophylla
Sherff. Bot. Gaz.
81
: 32 - 1926
71 -
B.
segetum Mart.
ex Colla Herb. Pedem.
3 : 307 - 1834
72 -
B. Shrevei Britton, Bull. Torr. Bot. Club.
37 : 359 - 1910
73 -
B. Holwayi Blake et sherff ex Sherff Bot. Gaz.
64
: 39 - 1917
74 -
B. graveolens Mart. Isis 1824
596 - 1920
75 -
B.
fistulosa Schz. Bip ex Baker in Mart. FI. Bras.
6 pt. 3
247 - 1884
76 -
B. Bidentoides
( Nutt.
) Britt. Bull. Torr. Bot. Club 20
281 - 1873
77 -
B. Eatonii Fern. Rhodora 5
: 92 -
1903
78 -
B. aristosa
( Michx ) Britt. Bull. Torr. Bot. Club 20
28r - 1893
79 -
B. polylepis Blake, Froc. Biol. Soc. Wash.
35
: 78 - 1922
80 -
B. coronata
( L.
) Britt. Bull. Torr. Bot. Club.
20 :
281 -
1893
81 -
B. mitis
( Michx ) Sherff Bot. Gaz.
81
: 43 - 1926
82 -
B. Oerstediana
( Benth.
ex. Oerst ) Sherff Bot. Gaz. 80
385 - 1925
83 -
B. discoidea
( Torr et Gray 1 Britt. Bull. Torr. Bot. Club 20
281 - 1893
84 -
B.
frondosa L. 5:p. Pl.
:
832 - 1753
85 -
B. vulgata Greene, Pittonia : 72 - 1899
86 -
B. comosa ( Gray ) Wieg.
Bull. Torr.
Bot. Club.
24
436 - 189
87 -
B. connata Muhl in Willd Sp. Pl. 3 : 1718 - 1804
88
B. heterodoxa Fern. et st John, Rhodora 17 : 23 - 1915
... / ...

---

1
1
-
6 -
i~.
89 -
B. tripartita L. Sp.
Pl.
831 - 1753
i
Î
90 -
B. radiata Thuill. Fl. Par. ed. 2 : 422 - 1799
f
~
,
91 - B.
amplissima Greene,
pottonia 4 : 268 - 1901
92
B. cernua L. Sp. Pl. 832 -
1753
93 - B.
laevis
( L.
) B. S. P. prelim. Cat. N.Y.
29 - 1888
1
!!
,
l
94 - B. hyperborea Greene Pittonia : 4
: 257 - 1901
,,.
95 - B. diversa Sherff, Bot. Gaz.
76
159 - 1923
1
96 - B. Schaffneri
( Gray)
Sherff Bot. Gaz. 56 : 493 - 1918
97 - B. Ferulaefolia
Jacq.
) D.C. prodr. 5 : 603 - 1836
98 - B. coreocarpoides Sherff Bot. Gaz.
97
185 -
1935
1
,
1
,
,
99
B. Townsendii Sherff Bot. Gaz. 89 : 363 - 1930
l
100 - B. aurea
( Ait)
Sherff Bot. Gaz. 59
: 313 - 1915
1
101 - B. integrifolia Brandegee, univ. Calif. publ. Bot. 4
1
279 -
1912
102 - B. acuticaulis Sherff Bot. Gaz. 59
: 301 - 1915
103 - B. oligacarpa Sherff Bot. Gaz. 92
206 - 1931
104 .... B. amphicarpa Sherff Bot. Gaz. 88
290 - 1929
105 - B.
oligantha Brandegee,
Zo~ 5
224 -
1905
106 - B. Andrei Sherff Bot. Gaz.
61
495 -
1916
1·
107 - B. Anthriscoides DC. prodr. 5
600 - 1836 Cf Sherff
l,
Bot. Gaz. 61
: 501 - 1916
1
1
108 - B. Chrysanthemifolia
H.
B. K.
) Sherff Bot. Gaz. 61
!.
l
501 -
1916
1
109
B. mollifolia sherff Bot. Gaz. 64
:
21 - 1917
fl
110 - B. Abadiae DC. prodr. 5 : 601 - 1836
1
111 - B. Brandegeei sherff Bot. Gaz.
64
: 38 - 1917
1
112
B. aequisquama
( Fern)
Sherff Bot. Gaz. 64
: 26 - 1917
1
l
113
B. Bigelovii A. Gray in Torr. Bot. Mex.
Bound 91
1858
... / ...

---

- 7 -
114 - B.
leptocephala Sherff Bot. Gaz.
64
22 -
1917
115 -
B. bipinnata L.
Sp.
Pl.
832 -
1753
116 - B. cylindrica Sherff Bot. Gaz. 81 : 28 - 1926
117 - B. cornuta Sherff Bot. Gaz.
64
:
22
- 1917
118 - B. tenuisecta Gray Pl. Fendler 86 - 1849
119 - B. Straminoides Sherff Amer. Journ. Bot. 22 : 706 - 1935
120 - B. paupercula Sherff Bot. Gaz. 76
158 - 1923
121 - B. heterosperma Gray Pl. Wright 2
90 - 1853
122 - B. exigua Sherff Bot. Gaz. 70 : 89 - 1920
123 - B. parviflora Wi11d. Enum. Hart. Berol. 848 : 1809
124 - B.
Lemmonii Gray Syn.
Fl.
N. Amer.
1 pt.
2 :
297 -
1884
1
125 - B. capil1ifolia Sherff Bot. Gaz.
64
: 24 -
1917
126 - B. biternata
Laur.
Merr.
et Sherff in Sherff, Bot. Gaz.
1
88
293 -
1929
1
127 - B. Engleri O.
E.
Schulz, Bot. Jahrb.
50, suppl.
186 -
1914
128 - B.
tenera O.
E.
Schulz Bot. Jahrb. 50 suppl.
186
129 -
B. duranginensis Sherff Bot. Gaz.
70 : 90 -
Pl.
11 -
1920
130 - B. pseudocosmos sherff Bot. Gaz. 76 : 151 - 1923
131 - B. pseudolausensis Sherff Bot. Gaz. 64
:
26 - 1917
132 - B. pilosa L. sp. Pl. 832 - 1753
133 - B. subalternans DC. Prodre 5 : 600 - 1836
134
B. domingensis O.
E. Schulz in Urban,
Symb.
Anti11.
7
429 - 1912
135 - B. Malmei Sherff. Bot. Gaz. 89 : 364 - 1930
136
B. Cynapiifolia H. B. K.
Nov. Gen.
et Sp.
Pl. 4
185
235
1820
1
137 - B.
riparia H.
B.
K.
Nov. Gen.
et sp.
4
:
185
( 236 ) 1820
1
,~.
~
138 - B.
Sambucifolia Cav.
Icon et Descr.
3 : 15 -
1795
... / ...

---

-
8 -
l,
~
fr
f-
139 - B. Gardneri Baker in Mart.
Fl. Bras.
6 : 246 -
1884
I
140
B.
flagellaris Baker in Mart. Fl. Brasil 3 : 248 - 1884
141
B. nudata Brandeg. zoë 1 : 309 - 1890
142
B. brasiliensis Sherff Bot. Gaz. 81
: 49 - 1926
1
1
143 - B. Riedelii Bakffir in Mart.
Fl. Bras.
6, 3 : 246 - 1884
1
144 - B. Chodati Hassl. Repert. Sp. Nov.
12 : 369 -
1913
!1
145
B. pringlei Grenm.
Proc.
Amer. Acad. 41
263 - 1905
1
!
146 - B. angustissima H. B. D.
Nov. Gen. et Sp. 4 : 183
( 233
1
1820
1
147 - B. Anthemoides
( DC.
) Sherff Bot. Gaz.
56
493 - 1913
1
148 - B. andicola H. B. K. Nov. Gen. Sp. 4
: 186
237
1820
149 - B. macrophylla Sherff Bot. Gaz. 90
390 - 1930
!
150 - B. triplinervia H. B. K. Nov. Gen.
Sp. 4
182 - 1820"1-
151 - B. acrifolia Sherff Bot. Gaz. 94
591 - 1933
1
152 - B. insolita Sherff
Bot. Gaz. 97
607 - 1936
153 - B. canescens Bertol. Fl. Guat.
(Nov. Comm.
Act. Sc.' Bonon. 4 '
1
l
431 -
1840
1
154 - B.
serrulata
( poir.
~ Desf. Tabl. Ecol. Bot. Ed. 2
~
130 -
1815 ; cat. Hort. Par. Ed.
3 : 186 - 1826
f
1
155 - B. Geraniifolia Brandegee univ. ~alif. Pub. Bot. 6
1
76 - 1914
156 - B. chiapensis Brandegee, Univ. Calif. Pub. Bot.
6 : 76 -
1914
157 - B. Ostruthioides ( DC.
schz. Bip.
in Seem. Bot. voy.
Herald 308 - 1852 - 1857
1
158
B. bicolor Greenm.
Proc. Amer. Acad.
39 : 114 - 1903
!
159
B. Holstii
( o. Hoffm.
sherff. Bot. Gaz.
76
79 - 1923
!
160 - B. Kamerunensis Sherff Bot. Gaz. 76 : 148 - 1924
!
161
B. Gratii ( 01iv.
) sherff Bot. Gaz.
59
309 - 1915
... / ...
1
ti

---

1
,
-
9 -
1
162 - B. Uhligii Sherff Bull. Jard. Bot. Brux. 13
: 286 -
1935
1
!
163 - B.
s~eppia ( Steetz ) Sherff Bot. Gaz. 76
82 - 1923
1
164 - B. rufovenosa Sherff Bot. Gaz.
59 : 301 - 1915
1
165 - B. asperata
( Hutch et Dalz ) Sherff Bot. Gaz.
93
1
!
220 - 1932
1
,
n
i
166 - B. rubra De Wild.
Repert.
Sp. Nov.
13
: 203 - 1914
1
167 - B. urceolata De Wild. Ann. Mus. Congo IV : 167 -
1903
168 - B.
leptolepis Sherff Bot. Gaz.
76 : 85
1923
1
169 - B. taitensis Sherff Bot. Gaz. 90 : 396 - 1930
!
170 - B. Fisheri ( O. Hoffm. \\ Sherff Bot. Gaz. 76
158 - 1923
!
ln - B. Schimperi Schz. Bip. ex 1l'1alp. Repert. 6
168 - 1846
1
1
Sherff Bot. Gaz.
81 pl.
3 - 1926
1
172 - B. Onisciformis Sherff Bot. Gaz. 96
144 - 1934
173 - B. Hoffmannii Sherff Sherff Bot. Gaz. 76 : 146 - 1923
174 - B. Kirkii ( 01iv. et Hiern ) Sherff. Bot. Gaz. 56 :
309 - 1915
175 - B. musoziana Sherff Bot. Gaz. 86 : 445 - 1928
176 - B. Mossii: sherff Bot. Gaz. 92
202 - 1931
1
1
177 - B. Whytei Sherff Bot. Gaz.
76
145 - 1923
.
178 - B. gracilior ( O. Hoffm ) Sherff Bot. Gaz. 76
84 - 1923
1
179 - B. microcarpa Sherff Bot. Gaz. 76 : 84 - 1923
,
180 - B. paulstris Sherff Bot. Gaz. 76 : 148 - 1923
~'
181 - B. Schlechteri Sherff Bot. Gaz. 76 : 146 - 1923
182
B. Kivuensis Sherff Bot. Gaz. 96
145 - 1934
1
183 - B. Mildbraedtii Sherff Bot. Gaz. 91 : 308 - 1931
f
184 - B. Bequaertii De Wilde Repert. Sp. Nov. 13
:
204 - 1914
1
185 - B. Hildebrandtii O. Hoffm. Bot. Jahrb. 20 : 234 - 1894
1
t,
186
B. magnifolia sherff Bot. Gaz.
90 : 390
1930
f
... / ...
r1i
1
1

---

-
10 -
187 - B. Taylori
( S.
L. Moore l Sherff Bot. Gaz. 59 : 309 - 1915
188 - B. Elliotii
( S. L. Moore) Sherff Bot. Gaz.
59 : 309 - 1915
189 - B. Phalangiphylla Sherff Bot. Gaz.
76 : 152 -
1923
190 - B.
insecta
( S.
L. Moore) Sherff Bot. Gaz.
59
309
1915
191 - B. robustior S. L. Moore,
Journ. Linn. Soc.
35
349
1902
192 - B. ambiqua S. L. Moore,
Journ. Linn. Soc. 37
: 322 - 1906
193 - B. ugandensis
( S. L. Moore)
Sherff Bot. Gaz. 59 : 309 - 1915
194 - B. cinerea Sherff Bot. Gaz.
59 : 302 - 1915
195- B. crocea Welw.
ex. O. Hoffm. Bol.
soc. Broteriana 10
177 - 1892
196 - B. lineariloba Oliver, Trans. Linn. soc. 29: 99 -
1873
197 - B. flabellata O. Hoffm. in H. Baum, Kuhene Sambesi Exped.
419 -
1903
198 - B. Baumii
( O. Hoffm.
) Sherff Bot. Gaz.
59 : 309 - 1915
199 - B. ruandensis sherff Bull. Jard; Bot. Brux. 13
: 285 - 1935
200 - B. Moorei Sherff Bot. Gaz.
81
: 25 - 1926
201 - B. andongensis Hiern, Cat. Wielw. Afr. Pl. 1 : 588 - 1898
202 - B. Buchneri
( Klatt ) Sherff, Bot. Gaz. 76
158 - 1923
203 - B.
somaliensis sherff Bot. Gaz.
90 :
395 - 1930
1
204 ~ B. Seretii ( De Wild ) Sherff Bot. Gaz. 76
162 - 1923
205 - B. grandis Sherff Bot. Gaz. 59 : 309 - 1915
l
206
B. coriacea
( O. Hoffm.
) Sherff Bot. Gaz.
81
52 - 1926
1
207 - B. Brucei sherff Bot. Gaz. 97 : 606 - 1936
O. Hoffm.
) Sherff Bot. Gaz.
208 - B. crataegifolia
76
158 -
1923
B. Kilimandscharica
( O. Hoffm.
) Bot. Gaz.
209
59
309 - 1915
210 - B.
rhodesiana Sherff Bot. Gaz. 91
: 309 - 1931
211 - B. ukambensis S. L. Moore,
Journ. Linn. Soc.
35
1902
t
212 - B. volkensii O. Hoffm.
in Engler.
pflonzenw
Ost.
Afr. C : 415 - 1895
1
1
... / ...
l

---

-
11 -
213 - B.
lineata Sherff Bot. Gaz.
76 : 84 -
1923
214 - B. Aspilioides
( Baker
Sherff Bot. Gaz.
94
: 590 - 1930
215 - B. Schweinfurthii Sherff Bot. Gaz. 59
309 -
1915
216 - B. nyikensis Sherff Bot. Gaz.
81
: 50 -
1926
217
B. Rogersii Sherff Bot. Gaz.
81 : 52 -
1926
218
B. chaetodonta Sherff. Bot. Gaz.
90 : 387 -
1930
219 - B. Rueppellii
( Schz. Bip.
1 sherff Bot. Gaz.
90
389 -
1930
220
B. vatkei Sherff Bot. Gaz.
90
388
1930
221 - B.
rota ta sherff Bot. Gaz.
90
391 - 1930
222 - B. articulata Sherff Bot. Gaz.
94
591 -
1933
223 - B. Cirsioides Sherff Bot. Gaz. 90
393 -
1930
224 - B.
chaetophylla sherff Amer. Journ.
Bot. 22
: 705 - 1935
225 - B. Dielsii Sherff Bot. Gaz. 90 : 388 - 1930
226 - B.
superba Sherff Amer.
Journ. Bot.
22
707 -
1935
227 - B. Neumannii Sherff Bot. Gaz.
90 : 394 - 1930
228 - B. ternata
( Chiov.
) Sherff Bot. Gaz.
90 : 391 - 1930
229 - B.
setigera
( Sch~. Bip.
) sherff Bot. Gaz.
90 : 390 -
1930
.
f!
230 - B. setigeroides Sherff Bot. Gaz.
91
: 310 -
1931
f
t
231 - B. phelloptera Sherff Bot. Gaz.
92
:
204 - 1931
1
232 - B. praecox sherff Bot. Gaz.
92
: 450 - 1931
l
1
233
B. stuhlmanii
( O. Hoffm.
\\ Sherff, Bot. Gaz.
76
158 -
1923
1
1
(
!
1
,
1
t

---

-
12 -
B IDE N S
P T LOS A
l
- VARIETES ET SYNONYMES (64 )
- Ceratocephalus pilosus
( L.
) Rich. Cat. Jard. Médic.
91
- Bidens reflexa Link,
Enum. Hort. Berol.
2 : 306 - 1822
- B.
adhaerescens WeIl. FI.
Flum.
348,
8 pl.
88 1727
- B. californica DC. Prodr. 5 : 599 -
1836
- B. decussata Pav.
ex DC. Loc. Cit.
B. pilosa var. b. discoidea Schz. Bip.
in Baker - Webb
et Bertelot, Hist. Canar.
Isles III,
2,
pt.
2 : 242 -
1836
1850
- B. ciliata Hoffmgg. ex Fisch.
et Mey.
Ind. Sem. Hort.
Petrop. 6 : 46 -
1839
- B. hirsuta Nutt. Trans. Amer.
Phil.
Soc.
II,
7
369 - 1841
- B.
leucantha f. discoidea Schz. Bip. in Krauss,
Beitr. FI.
Cap. Natal.
77 -
1846
- B.
leucantha f.
discoidea subf. Krauss Schz. Bip. Loc. cit.
-
B.
leucantha var pilosa
( L.
) Griseb. Cat.155 -
1866
- Kerneria pilosa
( L.
) Lowe Man.
FI. Madeina 1 : 474 -
1868
- K.
pilosa var
discoidea
( schz. Bip.
1
Lowe,
Loc. Cit.
- B.
pilosa var.
l pilosa proper ( L.
) J. D. Hook.
FI. Brit.
Ind.
3
309 -
1881
- B. montaubanii Phil. Anal. Mus. Nac. Chile. Bot.
1891
: 49 - 1891
- B. pilosa var.
discodea
f.
) 1.
subsimplicifolia
( f .
1
2.
ternata,
( f .
) 3. pinnata, and
( f .
) 4 subiter-
... / ...

---

- 13 -
nata O. Duntze Rev. Gen.
1
:
322 -
1891
-
B. pilosa subvar.
~. discodia (Schz. Bip.) Pitard in
Pitard et proust,
îles Canar. FI. Archipel.
226 -
1908
-
B.
pilosa f.
subsimplicifolia O. Ktze and f.
Subbiter-
nata O. Ktze ex O.
E. Schz in urban,
Symb. Antill.
7 : 133 -
1911
-
B. pilosa var. discodea f.
ternata O.
Ktze and f.
punnata O. Ktze ex O.
E.
Schulz,
op.
cit. 134
~~~~~~_Ei19~~_~~E~_ffi~_~~~9E_i~1~L_êb~Eff~_§9!~_Q~~~_§Q_l_~§1_:_!2~~
Coreopsis leucorrhiza Lowr.
FI. Coch.
ed.
1 508 -
1790
Coreopsis leucorrhiza Lowr.
op.
cit.
ed.
2.
622 -
1793
Bidens hispida H.
B. K. Nov. Gen.
et Sp.
4 : 186
(237)
-
1820
Kerneria dubia Casso Dict.
sei. Nat.
24
: 398 -
1822
Bidens sundaica Blume,
Bijdr.
913 -
1826
B. sundaica var. minor Blume. op.
cit.
914
B.
leucorhiza
(Lowr) DC.
Prodr. 5
: 605 -
1836
B. leucantha var sundaica
(BI.)
Hasskarl,
Cat.
Pl. Hort.
Bog. 100 -
1844
B; andicola var.
~. wedd. Chlor. And.
1
70 -
1855
ex synon. H.
B. K.
B. sundaica BI.
ex.
Ind. Kew.
1 : 301 -
1895
B. aurantiaca colenso,
Trans. New Zeal.
Inst.
27
388 -
1893
B. africana Klatt,
Bull. Herb.
Boiss.
4
: 464 -
1896
B. pilosa var. brevifolia Hieron.
Bot.
Jahrb.
29
:
48 -
1900
B. pilosa var. dubia
(Cass.)
O.
E. Schulz in Urnan Symb.
Antill.
7
: 135 -
1911

---

-
14 -
90 : 394 - 1930
---------------
~~~~~~_E~!~~~_~~E~_t~_E~~~~!~_ê~b~~_~!E~_!~_~~~~E_~~ee_~!
~~E!b~!~!~_~i~!~_g~~~E~_!!!~_~::_i_~±~_:_!ê~~_:_!ê~Q
• Coreopsis leueanthenia L. Amoen. Aead. 4 : 291 - 175
• Coreopsis eoronata L.
sp.
Pl. ed.
2.
2
1281
• Coreopsis leueantha ~. op. eit. 1282
• Kernenia tetragona Moeneh, Meth. 595 - 1794
• Bidens leueantha
( L.
) Willd.
sp. Pl. 3 : 1719 -
1804
• Kerneria leueantha
( L.
) Casso Diet. Sei. Nat.
24 :
398 -
1822
• B. abortiva Sehum. & Thann. Beskr. Guin. Pl.
155
381 ) 1827
• B. adhaereseens Well. Fl.
Flum. 348,
8,
pl.
88 -
1827
• B. striata sweet Brit. Fl. Gard ser. 1 3, pl.
237 -
1828
• B. oxyodonta DC. prodr.
5 : 600 -
1836
• B. pilosa f.
radiata Sehz.
Bip. in Krauss, Beitr.
Fl. Cap. Natal.
77 - 1846
• B. pilosa var.
leueantha
L.
) Harv. Fl. Cap.
3
133 -
1865
• Kerneria pilosa var. radiata
( Sehz. Bip.
Lowe,
Man. Fl. Madeira 1 : 474 -
1868
• B. pilosa var.
leueantha f.
subsimplieifolia f~ ter-
nata,
f.
pilosior, and f.
subbiternata O. Ktze Rev.
Gen.
1
: 322 -
1891
... / ...

---

-
15 -
· Acocotli quauhuahuacensis Hernandez ex Mat. Med.oMex.
2
154 -
1898
• B. pilosa var humilis Walp. ex Reiche,
Fl. Chile 4
102 -
1905
• B.
leucanthema
( L.
) Krause in sturm, Fl. Deutsch. ed.
2 -
13
159 -
1905
B. pilosa subvar. radiata
( Schz.
Bip.
) Pi tard ex Pi tard
& proust, Iles Canar. Fl. de Archipel : 226 -" 1908
B. Wallichii var.
albiflora Max.
ex Matsum.
Ind. Pl. Jap.
2,
pt.
2 : 631 -
1912
• B. pi~osa var. albiflora Max. in Somoku Dzusetsu, ed. Ma.
Kino ( Iconogr.
Pl. Nippon)
15
: pl.
58 -
1912
Bidens pilosa var.y . radiata f.
1. indivisa Sherff, Bot. Gaz.
88
-----------------------------------------------------------------
297 -
1929
Bidens pilas a var. y • radiata f.
2 Dondiaefolia
( Less.
) Sherff
----------------------------------------------------------------
Bot. Gaz.
97
:
607 - 1936
-------------------------
·
Coreopsis alba L. Sp. Pl.
ed.
1 -
2
908 -
1753
ed.
2 - 2
1282 -
1763
Bidens Dondiaefolia Less.
Linnaea 5
: 155 -
1830 .
B. alba
( L.
j
DC. prodr.
5 : 605 -
1836
B. pilosa var.
alba
( L.
j
O.
E. schz. urb.
symb. Antill.
7
136 -
1911
Bidens oilosa var. Y • radiata f.
3 decumbens
( Greenm ~
Sherff
-------~----------------------------------------------
--------
Bot. Gaz.
97
: 607 - 1936
-------------------------
Bidens dec~~ens Greenm.
Proc.
Amer.
Acad. 34
576 - 1899
.../ ...

---

-
16 -
Bidens pilosa var.
8. bimucronata (Turcz ) O. E. Schulz in
-----------------------------------------------------------
QE~~~~_~~~~_6~!~!!~_1_~_!2ê_=_!~!!
Bidens caracas ana DC. Prodr. 5 : 600 -
1836
B. bimucronata Turcz.
Bull. Soc. Nat. Mosc~ 24
184 - 1851
Walp.
Ann. Bot.
Syst. 5 :
224 -
1858
Acocotli quauhauhaucensis Hernandez ex Mat. Med. Mex.
2
154 -
1898
Bot. Gaz. 81
: 41 -
1926
Bidens odorata Cav.
Icon.
1 : 9 and pl.
13 -
1791
coreopsis Ferulaefolia var.
odoratissima
Cav.
ex Pers.
Pers.
syn. Pl.
2 : 477 -
1807
Coreopsis odoratissima Cav. ex Pers.
10c. cit.
Coreopsis odorata
( Cav.
1 Poir.
in Lam. & Poir. Encycl.
Suppl.
2 : 350 -
1811
. Cosmos tenellus H. B. K. Nov. Gen.
et SP. 4
188 ( 230 )
1820
coreopsis multifida DC.
Prodr. 5 : 573 -
1836
coreapsis multifida var. mutica DC.
lac. cit.
B. Daucifolia DC. op. cit.
601
B. Perulaefolia var.
adoratissima
( Cav.
ex Pers.
) DC.
op.
cit. 603
B. Caucalidea DC. op. cit. 604
B. Bonplandii Schz. Bip.
in Seem.
Bot. voy.
Herald 308
1852 -
1837
B.
inermis Wats. Proc.
Amer. Acad.
23
: 278 -
1888
B. Deamii Sherff, Bot. Gaz. 56 : 490 - 1913
... / ...

---

-
17 -
B.
ramosissima Sherff op. cit. 491
B. barrancae Jones,
Extracts Contr. West. Bot. 18
82 -
1893
Bidens pilosa var.€
. alausensis
( H. B. K.
) Sherff, Bot. Gaz.
81 :
-------------------------------------------------------------------
35 -
1926
---------
· Bidens alausensis H. B. K. Nov. Gen. et Sp. 4 184
( 235 )
1820
• B. valparadisisaca Colla, Mem. Acad. Torin.
38
12 pl.
24
1835
B. chilensis DC. Prodr.
5 : 603 -
1836
B. diversifolia Willd.
ex DC. op. cit. 602 -
1836
B. valparadisea Colla ex Phillippi Cat. Pl. Chil. 155 - 1881
Bot. Gaz.
81
: 36 - 1926
· Bidens scandicina H. B. K. Nov. Gen. et Sp.
4
181
( 235 ) -
1820
1 -
1928
--------
· Bidens chilensis var Apiifolia DC. prodr.
5
604 - 1836
· Cosmos pilosus H.
3. K. Nov. Gen.
et Sp. 4
189
( 241 1
1820
Bidens exaristata DC. Prodr. 5
: 600 -
1836
Bidens brachycarpa DC.
loc. cit.
.../ ...

---

-
18 -
· B.
rosea Schz. Bip.
in Seemann,
Bot. Voy. Herald 308
1852 -
1857
· B.
rosea var calcicola Green~. proc. Amer. Acad. 41
264 -
1905
. B.
pilosa var. brachycarpa
( DC.
1 O.E. Schulz in Urban,
Symb.
Antill.
7
: 138 -
1911
· B. orendaniae Jones,
Extracts Contr. West. Bot. 18
82 -
1933
379 -
1925
----------

---

-
19 -
II - DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DES VARIETES DE B.
PILOSA ( 64 )
Bidens pilosa L. So.
Pl. 832 -
1753
Toutes les régions tropicales et subtropicales
Amérique centrale et latine: Mexique,
Californie jusqu'en
Argentine, Uruguay et Chili.
Tout le continent africain,
Asie du Sud-Est,
Australie, Nou-
velle-zélande,
Iles du Pacifique,
de L'Atlantique et de
l'Océan Indien.
Bidens pilosa var.
8. minor (BL.) Sherff,
Bot. Gaz.
80
387 -
1925
Même distribution que B. pilosa L.,
notam-
ment : Amérique Centrale
et Latine,
Afrique Tropicale et
subtropicale,
Asie du Sud-Est,
Japon,
Formose, Ceylan,
Aus-
tralie,
Nouvelle Zélande,
Iles des océans Atlantique,
Indien
et pacifique.
Bidens oilosa var. Y.
radiata Schz.
Bip. in Baker Webb et Berthelot
11
Hist. Canar.
III,
2
:
242 -
1836 -
1850
U.S.A.,
Amérique latine et centrale, Cuba,
Haïti,
Porto-Rico,
Jamaïque,
Egypte,
Tunisie,
Soudan, Zimbabwe,
corée,
Chine,
îles Canaries.
Bidens oilosa var. Y.
radiata f.
1.
indursa Sherff,
Bot. Gaz.
88 : 297 -
1929
Jamaïque,
Saint Domingue, Trinidad •
.../ ...

---

- 20 -
Bidens pilosa v~r.y
radiata f.
2. Dondiaefolia
(Less.)
Sherff,
Bot. Gaz.
97 : 607 - 1936
Mexique : Vera Cruz
Bidens oilosa var. Y
radiata f.
3 decumbens
(Greenm.)
Sherff,
30t. Gaz. 97 : 607 - 1936
Mexique : Tamaulepas
Bidens pilosa var.
8. bimucronata (Turcz) O.E. Schulz in urban,
Symb. ~ntill. 7 : 138 -
1911
Mexique, Jamaïque,
saint-Domingue, Trinidad,
venezuela.
Bidens oilosa var.
8. bimucronata f. 1. odorata (Cav.) Sherff
Bot. Gaz.
81
: 41 -
1926
Mexique : Guatemala
Bidens pilosa var.f
. alausensis
(H.B.K.)
Sherff, Bot. Gaz.
81 : 35 -
1926
Colombie,
Equateur,
pérou, Chili, Bolivie,
Iles Galapagos.
Bidens oilosa var.f
. alausensis f.
1. Scandicina
(H.B.K.) Sherff,
Bot. Gaz.
81 : 36 - 1926
Equateur,
pérou,
Bolivie
.../ ...

---

-
21 -
Bidens pilosa var.~
Apiifolia
(DC.) Sherff,
Bot. Gaz.
85
l
-
1928
Chili.
Bidens pilosa var. ~
calcicola
(Greenm.)
Sherff. Bot. Gaz.
80 : 377 -
1925
Mexique, Guatemala, Costa Rica, Colombie
Bidens pilosa var. ~
calcicola f.
1. dissecta Sherff.
Bot. Gaz.
80 : 379 -
1925
Mexique Guatemala
III - ECHANTILLONS DU MUSEUM D'HISTOIRE NATURELLE DE PARIS
Nous av OrE répertorié les échantillons du Muséum.
Tous proviennent de l'Afrique noire: Tropicale et Equatoriale.
Pays d'origine de ces échantillons:
Angola,
Cap-vert, Centrafrique, Congo, Cameroun,
Afrique du Sud, Côte d'Ivoire, Ethio9ie, Gabon, Guinée,Bissau,
Libéria, Mozambique, Niger, Ouganda,
sénégal, Tchad, Togo,
Zaïre.
Quelques échantillons du Muséum d'Histoire Naturelle
Récolteur
nO de Récolte
ville ou localité
Année
sch imper
1427
Ethiopie
Djeladjeranne
1840
Hens
286
Congo
Lutete
1888
.../ ...

---

- 22 -
Récolteur
nO de Récolte _~~L~
Ville
Année
---------
-------------
------
-----
Localité
--------
Schweinfurth
2 395
CENTRA -
Sebira Ghattoes 1866
FRIQUE
Gilles
24
GABON
Libreville
1970
Jardin
?
SENEGAL
?
1848
Fotius
1 813
TCHAD
Onoko
1969
Bos
2 175
LIBERIA
zorgor-Gbarnga
1966
Mpom
445
CJ...MEROUN
Yaounde Kribi
1961
Cremers
906
NIGER
Niamey Gao
1968
Menezes
3 452
ANGOLA
Huila-Curaca
1970
vanderijst
33 271
ZAIRE
Inkisi
1932
Chevalier
14 716
GUINEE
Kouria-Ymbo
1905
Leeuwenberg
1 869
CûTE
Angededou
1939
D'IVOIRE
Espirito Santo
2 208
GUINEE
Brandaa Fula
1945
BISSAU
Cunda
Me.houxe
50
TOGO
Abahoum
1930
Chevalier
45 281
CAP-VERT
San-Antonio
1934
surcouf
53
MOZAMBIQUE
Zambèze
1927
Dieterlen
10
AFRIQUE
?
1911
DU SUD
Diimer
843
OUGANDA
?
1921
Bouquet
50
CONGO
Voula
1964
Chevalier
27 284
CONGO
Brazzaville
1912
Boudet
2 798
CLJTE
Bouaké
1965
D' IVOIRE
... / ...

---

-
23 -
IV - Description de Bidens oilosa L.
La description de cette espèce porte essen-
tiellement sur des échantillons de plante dont nous avons
obtenu la croissance au laboratoire à partir des akènes pro-
venant du congo (jardins potagers et vergers de Brazzaville).
C'est une plante herbacée,
annuelle, poussant
dans les régions tropicales et subtropicales. Sa hauteur
moyenne est de C,5 m, mais dans des conditions de culture
idéales, elle peut atteindre lm. La tige
(0,5 à l
cm de dia-
mètre)
à une forme carrée dans sa partie inférieure. Les
feuilles opposées, composées,
sont à trois folioles
(5 à
la cm de long sur 2 à 5 cm de large). Cependant, certaines
feuilles ont cinq folioles. Dans les deux cas,
la foliole
terminale est la plus grande. Ces folioles sont lancéolées,
aigues au sommet et dentées en scie. Le pétiole mesure 5 cm
de long en moyenne.
Les capi.tules jaunes, axillaires ou terminaux,
solitaires, par deux ou par trois sont hémisphériques et
portés par des pédoncules. Les bractées extérieures
(0,3 a
0,5 cm de long)
sont pubescentes. Les fleurs extérieures du
capitule sont ligulées à trois dents et ses lobes de couleur
blanche sont au nombre de 5 à 6. Chaque capitule donne une
quarantaine d'akènes.
Les akènes de Bidens oilosa sont très fins
(1 cm de long en moyenne).
Ils sont tétragoniques,
les faces
légèrement concaves.
Ils portent des fines stries longitu-
dinales et se terminent par des arêtes munies de barbelures
.. ·1· ..

---

-
24 -
inversées qui ne sont visibles qu'à la loupe ou au micros-
cope. D'une manière générale,
les akènes périphériques sont
plus courts
(0,5 cm de long)
que les akènes qui sont au cen-
tre
(1 cm de long). Le nombre d'arêtes est de trois mais on
peut avoir des akènes à deux arêtes.
v - USAGES EN MEDECINE TRADITIONNELLE
1) Connaissances bibliographiques
Bidens pilosa L.
est une plante utilisée en
médecine traditionnelle dans des nombreux pays d'Afrique et
d'Asie.
CONGO: D'après Bouquet
15
),
la plante entière est
prescrite sous forme de décocté contre les affections grip-
pales avec céphalés,
les fièvres d'origines diverses,
les
douleurs intercostales et la coqueluche.
Le jus de la plante est utilisé contre les
otites,
les ophtalmies et les caries dentaires ;
les feuil-
les écrasées puis roulées en suppositoires sont employées
centre les hémorroïdes.
COTE D'IVOIRE:
(17, 38
cette plante est utilisée contre
les affections bronchiques et intestinales
: coliques, diar-
rhées, dysenteries. Elle serait .cicatrisante et prescrite
centre les morsures de serpent.
GABON:
( 7 3
: Le jus extrait de la tige et des feuil-
les s'emploi contre les filaires de l'oeil et pour cicatri-
ser les plaies.
MADAGASCAR
23
) Les feuilles fraîches,
pilées sont
appliquées sur les plaies.
... / ...

---

-
25 -
NOUVELLE CALEDONIE :
( 55 )
Bidens pilosa est utilisé
pour ses propriétés anti-inflammatoires,
anti-diarrhéiques,
anti-dysentériques et pectorales.
ASIE DU SUD-EST: Cambodge,
Laos,
Viet-Nam. ( 51)
Les boutons floraux pilés et mélangés à l'al-
cool servent au lavage de la bouche pour calmer les maux de
dents.
Les feuilles pilées sont placées en emplâtres
sur les paupières contre les affections des yeux.
AFRIQUE DE L'EST - AFRIQUE AUSTRALE
t 40 )
Dans un récent ouvrage, Kokwaro a décrit ~
dens pilosa comme une plante antipaludique : les racines
étant mâchées ou prises en décoctions.
Les feuilles sont écrasées,
la décoction uti-
lisée contre le mal de ventre,
la dysentérie,
la coqueluche
et comme médicament antiflômmatoire. Elle est aussi utili-
sée contre la conjonctivite.
2)
Enquête
personnelle
Les habitants du Sud du Congo utilisent cette
plante essentiellement dans le traitement des fièvres d'ori-
gin$diverses. Les tiges,
les feuilles et les fleurs bouil-
lies sont prises sous forme de décocté et de bains de vapeur.
Les feuilles écrasées servent à frictionner
les côtes en cas de douleurs intercostales.
. ../ ...

---

-
26 -
VI - HABITAT ET ECOLOGIE
Très courante au Congo et en Afrique tropicale
et subtropicale,
B. pilosa peuple particulièrement les en-
droits soumis à l'activité humaine:
jardins potagers,
champs
en jachère, dépots d'ordures.
Plante annuelle,
elle pousse en saison des
pluies et meurt en saison sèche. Cependant,
elle persiste
dans des endroits humides et à l'ombre.

---

---

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1
~
CHAPITRE II
:r R A V A U X
A N TER lEU R S
1
j

---

-
27 -
l - ETUDE CHIMIQUE
Bidens pilosa et ses diverses variétés ont
fait l'objet d'assez peu de travaux
chimiques. Ces
quelques travaux ont cependant montré la présence des dérivés
polyacétyléniques ( 7,
10 ) substances
isolées de nombreuses
espèces du même genre mais aussi d'autres genres de la tribu
des
Hélianthées,
très proches des Bidens, à savoir:
les gen-
res Coréopsis ( 10, 66,
67 l, Cosmos ( 8, 10 l, Dalhia ( 10,
22 l, etc .. ,
La présence des alcaloides reste sujette à
discussion. Dans un travail assez ancien, Arthur avait montré
l'absence
d' alcaloîdes sur des échantillons de Bornéo ( 2 l.
Ce résultat est en conformité avec des essais sur des échan-
tillons du Congo ( 16 l alors que ceux en provenance de
Madagascar ont donné des résultats positifs ( 23 li Dans tous
les cas,
les diverses réactions ou tests d'identification des
alcaloides ont donné des résultats contradictoires et aucune
étude poussée n'a jusqu'alors été faite en vue de l'extraction
et de la purification de ces alcaloides.
Par contre,
la présence des stérols signalée
dans une étude de l'ORSrOM ( 16, 23 l, s'est trouvé con-
... / ...

---

-
28 -
firmée par la purification de deux phytostérols
le 13-
sitostérol et le stigmastérol
De
nombreux travaux sur des espèces du mê-
me genre, notamment celles poussant en Europe et en Amérique
ont abouti à la caractérisation et l'identification de nom-
breux flavonoïdes et caroténoïdes.
Il faut enfin signaler une étude quantitative concernant
deux autres espèces
( 24 )
Bidens cernua L. et Bi-
dens radiata Thuill,
rapportant la présence des tanins
4,5 à 5,8 %, de l'acide ~scorbique: 121,7 à 139,3 mg % ,
des caroténoïdes
: 0,4 -
1,5 mg % , des flavonoïdes
: 0,5
à 2,8 % et des traces d'huiles essentielles.
Les pages ci-desssus rapportent les formules chimiques des
diverses substances ainsi que les tableaux comparatifs des
polyacétylènes et flavonoïdes isolés de quelques espèces du
genre Bidens.
A - CAROTENOIDES
Valladon et Mummery ( 72
)
ont effec-
tué une étude quantitative et qualitative des caroténoïdes
de Bidens ferulaefolia DC. qui a donné :
Caroténoïdes totaux
5,76 mg/g
ct Carotène
0, l
%
Trans époxycaroténe
0,8 %
{J carotène
5,5 %
.../ ...

---

- 29 -
Trans .monoépoxycarotène
52,5 %
Lutéine
28,3 01-
,0
Flavoxanthine
:
6,7 0'
"
Auroxanthine
6,1 %
De leur côté, Nestor O. Caffini et Collaborateurs.C 19.)
ont travaillé sur Bidens laevis
(L.
) B.S.P.
en effectuant
une étude quantitative des caroténoïdes qui a donné
Caroténoïdes totaux
1,21 mg/g
Carotènes
0,14 mg/g
Dihydroxycaroténoïdes
0,68 mg/g
Monohydroxycaroténoïdes
0,39 mg/g
... / ...

---

-
30 -
B - LES PHYTOSTEROLS
Dans une étude récente, une équipe chinoise a
isolé de la variété Bidens pilosa ,
var minor
, deux phy-
tostérols
: le stigmastérol et le
~sitostérol
21
CH H CH
Motif de base
: Stigmastane
3
3 l
Stigmastérol
Stigmasta
5 -
22 diène 3
Bol
HO
pSi tostérol
:
stigmasta
5ène 3 13 01
HO

---

-
31 -
C - LES POLYACETYLENES
Les polyines isolés de
nombreuses espèces du
genre Bidens ont tous un squelette carboné en C 13. La pré-
sence de nombreuses liaisons multiples: doubles et triples,
favorise des modifications qui conduisent à la formation des
cycles aromatiques, des thiophènes et des dérivés oxygénés
(
10
) .
Suivant le nombre de triples lBisons et la structure de la
molécule on peut distinguer :
-
des polyacétylènes aromatiques,
- des polyacétylènes de type tridéca pentayne
ene,
précurseurs de la pl Dlpart des thiophènes
(mono et di-
thi ophènes) ,
-
des polyines de type tridéca tétrayne diene,
tridéca triyne,
triène et trideca diyne trétraène. Toutes
ces structures de base sont des précurseurs d'alcools,
diols,
acétates et diacétates.
Ainsi,
à partir de quelques polyacétylènes, on a formation
de nombreux dérivés plus ou moins communs au genre Bidens
qui permettent d'établir un lien chimiotaxonomique avec les
genres coréopsis, Cosmos, Da1hia
10
)
. En effet,
chez de
nombreuses espèces de ces genres,
beaucoup de po-
lyines ont le même squelette carboné qui conduit à la for-
mation des mêmes polyacétylènes.
.../ ...

---

-
32 -
STRUCTURE DE QUELQUES POLYINES DU GENRE BIDENS
TRIDECA 3 - 5 -
7 - 9 - 11
PENTAYNE
1 ENE
HC=CH -
(C=Ck- CH =CH -CH R
2
2
R=H : TRIDECA 3 - 5 - 7 - 9 TRETRAYNE 1 - 11 DIENE
R=OH
OAc
H(HC-:-CH)2- CC =C )3- CH= CH-CH R
2
R= H : TRIDECA 5 - 7 - 9 TRIYNE 1 - 3 - 11 TRIENE
R=OH
OAc
,
H(HC=CH) -
(C=C ) -
CH =CH -CrLR
3
2
-2
R= H : TRIDECA 7 - 9 - DIYNE 1 - 3 - 5 - 11 TETRAENE
R=OH
OAc
Hétérciside
HO CH -
CH = CH - CC = Ch- CH 0 H
2
TRIDECA 4 - 6 - 8 - 10 TETRAYNE 2ENE
1-12
DIOL
130D
GLUCOPYRANOSIDE

---

-
33 -
n (C=c) -CH R
~
3
2
R=H : 1 PHENYLHEPTA 1 - 3 - 5 TRlYNE (P.H.T.)
R::OH
OAc
~C==C)--CH==CH--CH~R
\\-=::J \\
2
r-
0
R=H : 1 PHENYLHEPTA 1 - 3 DIYNE 5 ENE
R=OH
OAc
Thiophènes
_ _ _ _ 0=.
_
- Monothiophène
OH C-CH= CH-C=C-o-~C= C- CH=CH2
3
5
5 ( METHYL ) 2 BUTA ~YNE,
3ENE, 5 BUTA lYNE 3ENE 1 DIETHIENYL
- Di thiophènes
H C-HC= HC
3
5 PR~PENYL S' VINYL 2 - 2' DI THIENYL

---

-
34 -
5 METHYL
5'
BUTA
l - 3 - DIENYL 2 -
2'
DITHIENYL

---

- 35 -
C.1 - Distribution dans le genre Bidens
C.1.1 -
Bidens oi1osa L.
- Tridéca 3 - 5 - 7 - 9 - 11 - Penta~tne 1ème ( 7 )
- Tridéca 3 - 5 - 7 - 9 Tetrayne, l, 11 - Diène ( 7
- 1 Phény1hepta 1 - 3 - 5 Tr.iyne ( P.H.T. ) ( 7 )
- 1 Phény1hepta 1 - 3 Diyne 5ène ( 7 )
C.1.2 - Distribution dans les autres espèces
du Genre
- Tridéca 3 - 5 -
7 - 9 ~ 11 Pentayne 1ène
B. bipinata L.
( 9 )
B. da1hioides S: Wats
9
B
leucantbus L
9
)
t
ft
(
- Tridéca 3 -
5 -
7 -
9 tétrasne 1 - 11 diène
B. aurea
(Ait) Sherff ( 10 )
B. Connata Mueh1 ( 9 )
B. dalbioià es S. Wats
9
)
B. bipinata L.
(
9
)
B. feru1a"'fo1ia
(Jacq)
D.C. ( 6 , 34
)
BT
froodoSê
I.
(
56
B.
radiata TblliJ]
( 34
- Tridéca 5 -
7 -
9
triYne
l
-
3 -
11 triène
B.
feru1aefolia
(Jacq)
D.C.
( 6
...; ...

---

-
36 -
B.
fructe1ifo1ia
(D.C.)
Jaca. ( la )
- Tridéca 7 - 9 diy~ne 1 - 3 - 5 - 11 tétraène
B. feru1aefo1ia
(Jacq)
D. C. ( 6,
34 )
B. fructelifo1ia
(D.C.)
Jacq. ( la
B. radiata Thiu11
( 34 )
- Tridéca 4 -
6 - 8 -
la tétrayne
B. frondosa L. ( 49,
51, )55
)
2ène 1 - 12 Diol D Glucoside.
-
1 Phény1 hepta 1 -
3 - 5 triyne
B. dah1ioides S. Wars
( 9 )
B. feru1aefo1ia
(Jacq)
D.C.
( 3 4 )
B. fructe1ifo1ia
(D.C.)
Jacq
( la )
B. 1eucanthus L. ( 9
B. radiata Thiu11
34
-
1 Phény1 hepta 1 -
3 di~ne
B. dah1ioides S. w~ts
la
)
5ène
B. 1eucanthus L. ( la
.../ ...

---

-
37 -
-
5 Methy1 2 buta 1 yne 3ène,
5' buta 1 yne 3ène 1 diethieny1
B. Connata Mueh1
9
B.
dah1ioides S. Wats
( 9
)
-
5 Methy1 5'buta - 3 dieny1
B.feru1aefo1ia ( Jacq )
2,
2'
dithieny1
D.C.
( 10 )
B.
radiata Thui11
( 34 )
-
5 Propèny1 5'
viny1 2,
2'
dithieny1
B. Connata Mueh1
( 9 )
... / ...

---

- 38 -
D - DERIVES PHENOLIQUES
Une série d'études a été faite sur un cer-
tain nombre d'espèces en particulier:
Bidens aurea ( Ait
Sherff, B.ferulaefolia ( Jacq ) DC., B.
tripartita L.,
B.
frondosa L . . Ces travaux ont permis la purification des
nombreux aglycones
: aurones,
chalcones,
flavones,
flavonols,
flavanones,
des hétérosides et des dérivés de l'acide cinna-
mique.
Les aurones
OH
HO
OH
R
a
R=H
Sulphurétine
R=OH
: Aureusidine
Les chalcones
R
HO
a R= H Butéine
R=OH: Okanine

---

-
39 -
Les flavones
HO
OH
R=H
Apigénine
OH
0
R =OH
Lut~oline
R
HO
OH
R=H Kaempférol
. OH a
ouercétine
Les flavanones
-------~------
OH
HO
OH
Butine: 7 - 3' -
4'
trihydroxy flavanone
OH
OH
HO
OH Isookanine
7 , 8 , 3 ' , 4 '
t~trahYàroxy flavanone
a

---

---

---

---

-
40 -
Les Coumarines
HO
R
R=H : Ombelliférone
R:: OC H : scopolétine
3
Î'
.- ?
o
i
/1
HO
H=C~-O
Acide Chlorogènique
(HCLCH
3 2/
O=C-O
OC~
l'
( -
2 acétoxy 2 méthyl propionyl oxy ) Eugenol
isobu tyrate

---

- 41 -
DISTRIBUTION DES DERIVES PHENOLIQUES DANS LE GENRE BIDENS
=========================================================
Les aurones et leurs dérivés
- Sulphurétine
B. tripartita L.
( 63
B.
frondosa L.
56 )
B. ferulaefolia
(Jacq. )
De.
28
B. cernua L.
14
- Sulphuretine 6 glucoside
B. frondosa L.
( 56
)
( Sulphuréine)
B. ferulaefolia
(Jacq)
D • e.
28
B.
dernua L. ( 14 )
- Maritimétine
( 6 -
7 -
B. ferulaefolia
(Jacg)
3' -
4'
tétrahydroxy-
aurone )
B.
frondosa L.
56
)
Les chillcones et leurs dérivés
- Butéine
B. frondosa L.
( 56 :
B. ferulaefoJ j a
(,Tacq)
.../ ...

---

-
42 -
- Butéine 4 Glucoside
B.
frondosa L.
( 56 )
B. ferulaefolia
(Jacq)
DC.
(
28
)
- Okanine
B. frondosa L.
( 56 )
B. ferulaefolia
(Jacg)
DC.
(
28
)
- Okanine 4 Glucoside
B. frondosa L.
( 56 )
B. ferulaefolia Jacg.
DC. ( 28
)
- Butéine 7 0
D Glucoside
B. trioartita L. ( 60 )
- 2 -
4 - 3' -
4' Tétra-
B. trioartita L.
( 60 )
hydrochalcone
Les Flavones et leurs dérivés
- Lutéoline
B. ferulaefolia
(Jacg)
DC.
( 28 )
B. frondosa L. ( 56
B. trioartita
3, 59
- Lutéoline 7 Glucoside
B. ferulaefolia
(Jaçql
DC.
(28
B. triparti ta L.
(3, 59 )
.../ ...

---

- 43 -
- Lutéoline 7 rhamnogluco-
B.
ferulae~olia (Jacq)
side
DC. ( 28 )
- Apigénine
B. ferulaefolia
(Jacq)
DC.
( 28 )
- Apigénine 7 glucoside
B.
ferulaefolia
(Jacq)
DC.
( 28 )
Les Flavonols
- Quercetine
B.
cernua L. (14 )
Les Flavanones et leurs dérivés
- Butine
B. tripartita L. ( 60, 63
- Butine 7 Glucoside
B. trioartita ( 0,,60 )
- Isookanine
B. cernua L. ( 14 )
B. ferulaefolia
(Jacg)
DC.
(28 )
- Isookanine 7 Glucoside
B. tripartita L. ( 62
B. cer~ua L. ( 14 )
Coumarines
- 6 - 7 - Dihydroxycoumarine
B. trioartita L.
( 61
)
- Scopolétine
B. trioartita L.
( 61
)
... / ...

---

-
44 -
- Ombelliférone
B.
tripartita L. ( 61
Acides phénols
- Acide chlorogènique
B.
Frondosa L.
( 56 )
Dérivé de l'Eugenol
-
l'
( 2 acétoxy -
2 methyl
B. aurea
(Ait) Sherff.
( Il
)
propionyl ) eugenol isobu-
tyrate.

---

-
45 -
II - ETUDE PHARMACOLOGIQUE
Dans une mono~raphie parue en 1968, HARTWELL a
repertorié Bidens pilosa L. ainsi que Bidens graveolens Mart ,
Bidens tripartlta L. comme des plantes à activité anticancéreuse
(
29
). Signalons que selon Guerra et Goyas,
Bidens leu-
canthus Wild peut réduire la glycémie et la glycosurie ( 2 7
).
Des études récentes ont montré que l'administra-
tion à des rats, pendant une à deux semaines, de nourriture mé-
langée de feuilles de Bidens pilosa, provoque une multiplication
des cellules épithéliales de l'oesophage chez ces animaux
(
46
).
Ces travaux tendent d'établir une corrélation entre cette mul-
tiplication anormale des cellules et la fréquence élevée des
cancers de l'oesophage observée chez les habitants des Transkei,
populations d'Afrique Australe qui consomment couramment cette
plante.
ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES PRODUITS ISOLES DE BIDENS PILOSA
-------------------------------------------~----------
-------
Les polyacétylènes présentent en général une forte
activité biologique (
)
; ceux isolés du genre Bidens, de
Bidens pilosa en particulier n'échappent pas à cette constatation.
Il faut cependant, considérer cette activité sous
deux aspects ; du fait de la présence des liaisons multiples
dans ces molécules
( doubles et triples liaisons ), ces subs-
tances sont phototoxiques en présence d'une lumière ultravio-
lette ( 1 - 75 ).
La tridéca 1 -
Il - diène 3 -
5 -
7 -
9 tétrayne,
la tridéca lène 3 -
5 -
7 -
9 -
Il pentayne et la phényl hepta
1 - 3 - 5 triy~O
l p.H.T. ) sont trois substances purifiées de
Bidens Pilosa dont on a"mis en évidence l'activité phototoxique
.. . 1· ..

---

- 46 -
sur de no~reux microorganismes : bactéries gram+ et gram ,
levures, champignons mycéliens,
fibroQlastes etc •••
(
75
Pans un travail datant de 1958, Bondarenko et
Collaborateurs~, ne font aucune mention des conditions expéri-
mentales, ce qui laisse supposer qu'ils ont travaillé en l'ab-
sence de toute source lumineuse photosensibilisatrice
13
J •
Récemment, on a montré l'action léthàle de la
P.H.T. sur les cercaires de Trichobilharzia et d'Echinostomidés
à des concentrations de l'ordre de 0,3 p.p.m. ceci, indifférem-
ment en présence ou en absence de lumière
1J.V.
( :0:6
Purifiée pour la première fois en 1958 à partir
de Coreopsis qrandifolia
67
J, ensuite en 1961 à partir de
Bidens radiata (
34
), la P.H.T. fait actuellement l'objet
de nombreux travaux. Contrairement aux autres photosensibilisa-
teurs connus
( les furocoumarines qui agissent en établissant
des ponts entres les deux chaînes de l'A.D.N.
), l'importance de
la P.H.T.
réside dans le fait qu'elle ne forme pas ces ponts et
que son action semble impliquer la production de radicaux libres
en prés ence d' U. V. ( 1 ).
Parmi les nombreuse espèces étudiées qui ren-
ferment cette substance, Bidens pilosa renferme une quantité
relativement importante de phénylheptatriyne. Les feuilles fraî-
ches en contiennent de 400 à 600 ~g/g. ( 75 )
X
Ces auteurs sont les premiers à avoir mis en évidence l'ac-
tivité antimicrobienne de la phénylheptatriine.

---

TRAVAUX
PERSONNELS

---

CHAPITRE
III
E T U D E
CHI M l QUE
E T
P H A R MAC 0 -
LOG l QUE

---

-
47 -
l
- DROGUE ET EXTRAITS ETUDIES
La plante entière est récoltée et séchée à
l'abir du soleil. Elle est ensuite stockée dans des sacs en toile
pour éviter l'hydratation. Avant son utilisation, nous procédons
à un triage afin d'écarter les tiges et les racines pour ne con-
server que les feuilles,
les boutons floraux et les akènes. Le
tout est broyé de manière à obtenir une poudre.
500 g de poudre sont imbibés avec du Me OH
80 % et mis dans une colonne en verre ( capacité 2 litres J. Celle-
ci est ensuite remplie avec le même solvant en prenant soin ~e
bien tasser la poudre. On laisse macérer 24 à 48 heures, puis on
recueille goutte à goutte 2 à 2,5 l
de liqueur hydroalcoolique.
La liqueur obtenue est concentrée à l'évaporateur rotatif ( Rota-
vapor l, sous pression réduite jusqu'à l'élimination totale du mé-
thanol. On obtient une phase aqueuse qui est laissée au réfrigé-
rateur 24 à 48 h.
On sépare par filtration deux fractions
- une fraction insoluble dans l'eau,
soluble dans le
MeOH, pâteuse
elle est reprise par du méthanol et séchée au Ro-
tavapor.
.. .f ...

---

- 48 -
- une fraction soluble dans l'eau qui sera lyophilisée.
Pour 500 g de poudre. on obtient environ 10 g
de fraction soluble MeOH soit un rendement de 2 %.
B - ESSAI DE FRACTIONNEMENT DE LA FRACTION SOLUBLE DANS LE
------------------------------------------------------
METHANOL
5 g de cette fraction sont épuisés par 2 x 50 ml
d'éther éthylique. Cette fraction sol. MeOH n'est pas totalement
soluble dans l'éther.
La phase soluble éther est extraite dans une
ampoule à décantation avec de l'ammoniaque (NH 0H) 5 % :
4
3 x 50 ml.
La phase étherée est ensuite extraite avec
3 x 50 ml de KOH N.
La fraction étherée résiduelle est lavée avec
3 x 20 ml d'eau distillée et séchée.
Les deux phases basiques et aqueuses sont à
leur tour acidifiées avec HCl 2N jusqu'à pH 1 à 2. On extrait
avec l'éther éthylique et on sèche.
Pour 5 g de sol. MeOH. on obtient
0.5 g de fraction insoluble éther
1 g de fraction soluble NH 0H
4
0,3 g de fraction soluble KOH
2.5 g de fraction résiduelle étherée
R.E.
.../ ...

---

-
49 -
C - METHODES DE CONTROLE DES DIFFERENTES FRACTIONS
----------------------------------------------
Tout au long de notre travail, nous avons uti-
lisé la chromatographie sur couche mince
(C.C.M.)
comme mé-
thode de contrôle des différentes fractions.
Les supports
sont des plaques de gel de silice GF 254 Merck.
Pour le développement, quatre systèmes de
solvants sont
utilisés.
système nO l
Benzène
100
MeOH :
12
Système nO 2
Benzène
système nO 3
Ether de pétrole
75
Benzène
25
système nO 4
Ether de pétrole.
Avant la révélation par le réactif chimique qui est l'acide
sulfurique concentré,
les plaques sont observées SO'IS U.V.
(ultra-violet) à 254 nm pour la mise en évidence des produits
conjugués ou arômatiques et à 366 nm pour les substances
fluorescentes.
Après pulvérisation du réactif,
les plaques
scnt chauffées quelques minutes à l'étuve
(105°C) .
.../ ...

---

- 50 -
La poursuite de ce travail portera essentiel-
lement sur les deux fractions les plus actives : sol. NH 0H
4
et R.E. ; la fraction insoluble éther éthylique est peu ac-
tive et la fraction soluble H 0 inactive.
2
Nous avons été amenés à utiliser le méthanol
pur, l'éthanol pur et l'acétone comme solvants de lixiviation.
Ils permettent d'obtenir un rendement de la fraction insoluble
H 0 nettement supérieur.
2
Avec le méthanol pur, Rd sol. MeOH =
4 %
Avec l'éthanol pur, Rd sol. EtOH
= 4,2 %
Avec l'acétone, Rd sol. Acétone
= 4.5 %
Malgré sa forte activité anthelminthique, la fraction sol. KOH
ne fera l'objet d'aucune étude particulière; sa quantité est
relativement faible et un contrôle chromatographique permet de
retrouver, mais en quantité moins importante, les mêmes tâches
présentes dans la fraction sol. NH 0H.
4
L'utilisation de la potasse (KOH), correspond donc à un épui-
sement des substances pouvant être extraites avec la solution
ammoniacale.
.../ ...

---

S e l l E M A
D E
FRA C T ION N E MEN T
ISOl.
MeOIl,
Sol.
EtOIl,
Sol.
Acetonel
i
Ether éthylique
1
'SOlUble étherj.
~ insoluble étherl
i
3 x NII 011 5 %
4
solution aqqlèus"I~~solllb1eéther11
ï
i
soluble: NII 0/l
4
1)
acidification
_
pH l
à 2
13 x KOII N
2)
éther 6thylü.uc
solution aqueuse
~
sol uh lE
~~i so.1uble KOII '
i
soluble éther
NlIllOII
1) Acidification
résiduel
:
R. E.,
)_pH l
à 2
2)
éther l!ithylique
soluble
KOII
Figure 1

---

-
51 -
II - RECHERCHES CHIMIQUES PRELIMINAIRES
REACTION A LA CYANIDINE
C'est une réaction colorée qui permet de met-
tre en évidence les dérivés flavoniques.
Quelques mg d'extraits sont additionnés de
2 ml de méthanol contenant 0,5 ml de HCl concentré et quel-
ques copeaux de magnésium.
Une coloration rouge cerise caractérise les
flavonols,
une réaction mauve ou violette,
les flavanones.
REACTION DES PHENOLS
Cette réaction permet de mettre en évidence
les composés phénoliques.
On ajoute à l ml d'une solution d'environ l %
d'extrait dans l'eau,
une goutte de Fe C1
à 5 %.
3
Une réaction positive se traduit par une co-
loration verte ou bleue,
ou par un précipité noir.
REACTION DE STIASNY
C'est une réaction de précipitation qui permet
de rechercher les tanins condensés.
Réactif
Formol 40 % : l volume
H Cl r:oncentré
l
volume.
. ../ ...

---

-
52 -
2 g de poudre ou 200 mg d'extrait aqueux sont
mis au contact avec 180 ml d'eau distillée à 80°C pendant
deux heures.
On filtre et le résidu lavé à l'eau chaude jus-
qu'à l'obtention d'un volume final de 200 ml. 100 ml de fil-
trat, correspondant à Ig de poudre, sont précipités par 50 ml
de réactif de Stiasny. Après 24 h de repos,
le précipité est
recueilli sur un filtre taré, puis lavé jusqu'à l'élimination
de l'acide.
Le filtrat obtenu est additionné de FeC1 3
pour mettre en évidence la présence éventuelle des tanins
galliques.
Le précipité est séché à l'étuve à 100° C
pendant 24 h et pesé.
~EACTIONS DES ALCALOIDES
Réactif de Bouchardat :
2 ml d'une solution d'extrait à 10 %
environ dans l'eau sont additionnés d'une goutte de HCl con-
centré et trois gouttes de réactif de Bouchardat. Une pré-
cipitation signifie la présence d'alcaloïdes mais aussi de
certaines bas es
aminées
et certaines bases puriques.
~~:::~!:g_~::_12:;::::~::~~~:;:! : trois gouttes d'iodobismuthite de
potassium sont ajoutées à 2 ml d'une solution d'ex~ra1t à
10 % dans l'eau ainsi qu'une goutte de HCL concentré.
Un précipité est le signe de la présence des
alcaloïdes.
.../ ...

---

-
53 -
REACTION DES STEROLS ET DES POLYTERPENES
~~~s~!~~_~~_§~~~~~~~! : une petite quantité d'extrait sec
reprise par 2 ml de chloroforme est agitée avec un volume
égal d'acide sulfurique concentré. La phase chloroformique
se colore en bleu,
rouge, violet,
lorsque l'extrait contient
des stérols ou des terpènes.
INDICE DE MOUSSE
En milieu aqueux dilué,
si un extrait pré-
sente, par agitation une mousse très nette et persistante
après 15 minutes de repos,
cela signe la présence des sa-
ponosides.
RESULTATS
voir tableau l )
+
ré2ction positive
réaction négative
.../ ...

---

POUDRE
SOLUBLE
SOLUBLE
INSOLUBLE
SOLUBLE
R.E.
H2 0
ACETONE
ETHER
NH 0H
4
RECHERCHE DES DERIVES
+
-
~
-
-
PHENOLIQUES 1 - FeCl]
REACTION DE STIASNY
- Tanins condensés
+
+
~
-
~
-
- Tanins galliques
-
-
~
-
-
-
RECHERCHE DES DERIVES FLAVO~
+
:
NIQUES : - Cyanidine
-
~
-
-
,
-
REACTION DES ALCALOIDES :
,
-
Réaction de Bouchardat
..
-
~
-
-
..
- Réaction de Dragendorf
-
-
-
-
REACTION DES STEROLS ET DES
POLYTERPENES :
- Réaction de Salkowsky
~
-
~
-
,
REACTION DES SAPONOSIDES
-
Indice de MOUSSE
±
-
-
-
-
'l'aLlcau 1

---

-
54 -
ilI - ESSAIS PHl\\RMi',(X)LCGIQUES PRELlMINAIRES
A -
l'-1.ATERIEL ~ METHODES
La méthodologie adoptée consiste'
à suivre Ir ac-
tivité antiparasitaire d'un certRin nombre de fractions jusqu'à l ' i -
ôentification des substances responsables de cette activité.
Il est
donc nécessaire de lier les extractions chimiques ainsi que les pu-
rifications aux tests antiparasitaires in vitro.
Trois parasites ont été utilisés dans ces es-
sais préliminaires : un helminthe : ~enolepis nana var. fraterna,
deux protozoaires: Entamoeba histolytica et Trichomonas vaginalis.
PRINCIPES DES TESTS IN VITRO
Ces tests sont effectués en milieu monophasique
liq-.lide.
Pour les protozoaires,
on introduit des dilu-
tions croissantes de la fraction ou du produit à tester dans une sé-
rie de tubes contenant le milieu de culture.
Pour les helminthes,
le
produit ou la fraction sont introduits dans un récipient à fond plat
et à bords rodés,
contenant le milieu de survie et 3 à 4 helminthes.
1 - DETERMINAT ION DE L'ACTIVITE ANTHELMINTHIQUE IN VITRO
Pour ces essais préliminaires, nous avons choisi
.../ ...

---

-
55 -
la technique de sen et Hawking
(58
;
le parasite est~-
nolepis nana var fraterna,
cestode de la famille des Hyménole-
pididés dont l'hôte est la souris.
L'entretien de la souche se fait par transmission
régulière des oeufs mâtures tous les 15 à 20 jours. Pour cela,
les souris infestées sont sacrifiées; après dissection,
l'in-·
testin grêle est prélevé, disséqué et les vers sont placés dans
le milieu de survie porté à 37° C. La composition de ce milieu
est la suivante :
peptone : 10 g
extrait de l~
: 5 q
eau distillée: q.s.p. 1000 ml
Le pH est ~justé à 8,5 et le milieu stérilisé à 110°C /30 mn.
Avant l'emploi,
on ajoute 2000 unités/ ml de pénicilline et
l mg/ml de streptomycine.
Les anneaux postérieurs sont introduits dans un
peti~ mortier contenant de l'eau physiologique et écràsés dé-
licatement, afin d'en extraire les oeufs.
On les met en suspen-
sion dans l'eau physiologique et on les dénombre de façon à fai-
re ingérer à des souris de trois semaines, 0,3 ml d'une suspen-
ion finale contenant 500 à 2000 oeufs.
15 à 20 jours plus tard,
on recherche dans les
fèces de ces souris,
la présence des oeufs d'Hymenolepis,
cel-
les dont les fèces présentent des oeufs sont sacrifiées. On pré-
lève les vers comme précédemment décrit. Notons que certaines
de ces souris peuvent être utilisées pour des tests in vivo.
Nous avons pu observer que dans une souris intensément parasitée
( hébergeant plus de 10 ve]~s ), les Hyménolepis sent générale-
...; ...

---

-
56 -
ment petits
( 0,5 cm ), alors que chez les souris faiblement
parasitées
( l
à 3 vers ) ceux-ci sont de grande taille ( 5 cm
et même plus "
Pour effectuer les essais in vitro,
3 à 4 vers
de taille moyenne
( 2 cm environ ) sont placés dans des réci-
pients à bords rodés et fond plat, stériles, contenant 10 ml de
milieu de survie, dans lequel on a introduit des concentrations
croissantes du produit à tester 24 h après incubation à 37 0 C,
on contrôle sous la loupe binoculaire la viabilité des vers.
Pour chaque essai nous gardons deux boites témoins.
2 - DETERMINATION DE L'ACTIVITE AMOEBICIDE IN VITRO
Entamoeba histolytica est chez l'homme,
l'amibe
responsable de l'amibiase. C'est un protozoaire dont on obtient
facilement la multiplication in vitro.
On utilise le milieu
"Marmi te" décrit par Jones
(68
).
S:~~E~~~~~~~_~'::_~~!~::'::_~~~:!::IE~::::"
solution saline pH : 7,2
- phosphate dissodique Na HP0
: 7,4 g
2
4
- phosphate monopotassique KH P0
: 1,125 g
2
4
- cblorure de sodium Nacl
: 20 g
-
eau distillée: q.s.p.
2750 ml
Ajuster le pH à 7,2 et stériliser à 110 0
C/30 mn.
milieu "Marmite"
- solution saline stérile: 8,5 ml
- solution "Marmite"
: extrait de levure à l %
stérile : l
ml
.../ ...

---

-
57 -
-
sér~~ de poulain: 0,5 ml
- une pointe de spatule d'amidon de riz stérile.
Ce milieu est réparti aseptiquement à raison de 10 ml par tube.
Ces tubes . sont
ensemencés avec 0,25 à 0,3 ml d'un inoculum
contenant les amibes 48 h après incubation à 37° C, une goutte
du milieu est prélevé et on contrôle la présence d'amibes au
microscope: objectif 10. La survie du parasite est environ de
dix jours. Ce milieu est d'une préparation simple et permet une
lecture facile et un temps de survie du parasite relativement
long.
Entretien de la souche :
L'entretien d'une souche d'Entamoeba histolytica
peut se faire sur un milieu diphasique constitué par du sérum
coagulé additionné d'une ampoule de liquide de Ringer ( 5 ml
J.
Au laboratoire,
nous avons adopté le milieu
"Marmite" pour l'entretien de la souche.
a1 Recherche de la concentration minimale inhibitrice ( C.M.I.
J
au déoart de la culture
Les tubes contenant le milieu de culture sont
ensemencés avec 0,25 à 0,3 mlà'un inoculum contenant ~O 000
amibes /
ml. On ajoute dans chaque tube des doses croissantes
du produit ou de la fracti.on à tes ter. Pour chaque concentra-
tion, on utilise'quatre tubes et on laisse incuber 48 heures
à 37° C.
b) Détermination de la concentration léthale ( C. L.
) en 48 h
On ensemence les tubes contenant le milieu de
... / ...

---

-
58 -
culture comme précédemment décrit. Après 48 h d'incubation,
on ajoute des doses croissantes du produit à tester. La lecture
a lieu 48 h aprÈs incubation à 37° C.
c) Contrôle d'activité
On effectue une rétroculture à partir des tubes
où d.l Y a eu disparition des amibes. Pour cela,
on prélève 1 ml
du milieu de culture dans lequel les amibes ne se sont pas dé-
veloppées et on l'introduit dans 10 ml de milieu "Marmite".
Après 48 h d'incubation,
on vérifie l'absence d'amibes.
3 - ACTIVITE TRICHOMONACIDE IN VITRO
Milieu de culture:
-----------------
Nous avons utilisé le bouillon V.L. qui assure
une excellente multiplication de Trichomonas vaginalis.
Composition du bouillon V.L.
- peptone bactériologique : 10 9
- extrait de levure
5 9
extrait de viande
2 g
- glucose : 5 9
- chlorhydrate de cystéine
0,3 9
- chlorure de sodium : 5 9
- phosphate monopotassique
5 g
- phosphate dipotassique
8 9
- eau distillée: q.s.p.
1000 ml
Ajuster le pH 7,2 et stériliser à 110° C /
30 mn. Le milieu
... / ...

---

-
59 -
de culture complet se compose pour chaque tube de
8 ml de bouillon V.L.
l ml de sérum de poulain:
l ml de sérum de Ringer
Le Darasite flagellé peut ètre maintenu en survie 6 à 7 jours,
temps largement suffisant pour effectuer les deux types d'essais
in vitro:
- l'inhibition au départ de la culture pour la détermina-
tion de la C.M.I.
- et l'action léthale sur une culture de 48 h pour la C.L.
Le contrôle d'activité s'effectue également par
la technique des rétroculture~
L'entretien de la souche s'effectue comme pour
Entamoeba histolytica dans le milieu de l'Institut Pasteur
sérum coagulé additionné d'une ~mpoule de Ringer sérum .
.../ ...

---

-
60 -
B - RESULTATS DES ESSAIS PRELIMINAIRES
1 ,",. ~~!!2'gL~!I~h~k!!!4:!2!:h.!~l::~~*l!;:!;2'4:l!.,.~.:.tl~~llQk~124:2
nana var. fraterna
---~-~------------
TABLEAU 2 :
FRACTIONS .
CONCENTRATIONS EN ,ug/ml
TESTEES
1000
500.
250
1.00
50
25
la
5
Sol. HeOR
- .,. - -
.,.
"" -
...
"" "" ""
- -- - + + + + + + + +
Sol. H 0
2
+ + + + + +
+ ~ +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + ,
Insol.
- - - - - - .,. - .,. + + + + + + + + + + + + + + .;
éther
Sol.NH OH
- - - .,. - - - - - - - - - ...
4
- - - .,.
+ + +
+ + ,
Sol. KOH
- .,. - - - - - - - - .,. .,. - - - - - - + + + + + ..
IR·E.
- - - - ... - - - - - - .,. - - - - - - + + + + + .;
.
-Légende
- vers tués
+ vers vivants
Fraction soluble H 0
------------------2-
TABLEAU
3 :
CONCENTRATIONS
INHIBITION AU
RETROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
EN ,uq/rnl
DEPART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
CULTURE
DE 48 H.
1000
+ +
a
+ +
a
750
+ +
a
+ +
a
500
+ +
a
+ +
a
250
+ +
a
a
a
200
+ +
a
a
a
100
+ +
a
a
a
50
+ +
a
a
a
+ : amibes vivantes
a
test non effectué
.../ ...

---

1f
-
61 -
i
La fraction soluble
H 0 est inactive sur les amibes.
2
1
t~act1cn_~Q~le_~eQH
Tableau 4 :
,
CONCENTRATIONS
INHIBITION AU
RETROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
1
EN ,ug/ml
DEPART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
1
CUL.TURE
DE 48 H
1
1000
- ...
......
- -
- -
750
- -
-~
- -
- -
sad
- -
+ +
+ +
+ +
250
+ +
+ +
+ +
+ +
200
+ +
+ +
a
a
100
+ +
+ +
a
a
50
+ +
+ +
a
a
-
: amibes tuées
C.M.I. = 750 ,ug/ml
Fraction soluble NH OH
------------------ 4-~
Tableau 5 :
CONCENTRATIONS
INHIBITION AU
RETROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
EN ,ug/ml
DEPART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
CULTURE
DE 48 H
1000
- -
- -
+ +
a
750
- -
+ +
+ +
a
500 ,
+ +
+ +
+ +
a
250
+ +
+ +
a
0
200
+ +
a
a
a
100
+ +
a
o.
a
50
+ +
a
0
a
C.M.I. :> 1 mg/ml
f t · /
• • •
1
\\
1

---

-
62 -
fraction résiduelle éther
--------------------~-~~-
Tableau 6 :
CONCENTRATIONS
INHIBITION AU
RETROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
EN Ilg/ml
DEJ;'ART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
CUL:!'URE.
DE. 48 li
lGOO
- -
..- -
- ..-
- -
750
- -
..- -
- -
- .,.
500
- -
- -
- -
- -
250
- -
+ +
+ +
+ +
200
+ +
+ +
+ +
+ +
100
+ +
+ +
+ +
+ +
50
+ +
+ +
+ +
+ +
C.M.I. = 500 pg/ml
J ~ Activ1.tf trlchcm::naclde.
Fraction soluble NH OH
-------------------4--
TABLEAU 7
CONCENTRATIONS
INHIBITION AU
RETROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
EN Ilg/ml
DEPART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
CULTURE
DE 48 H
1000
- -
+ +
+ +
+ +
750
+ +
+ +
+ +
a
500
+ +
+ +
+ +
a
250
+ +
+ +
a
a
200
+ +
+ +
a
a
100
+ +
+ +
a
a
50
+ +
+ .;-
0
a
-
: T~chomonas tués ;
+ ; Trichomonas vivants
a
Test non effectué
C.H. r.) l mg/ml
. . ·1 ...

---

-
63 -
~~sç~1Qn~!~~~sY~11~_~~~~
. Tableau 8 :
CONCENTRAT IONS
INHIBITION AU
RET ROCULTURE
ACTION SUR
RETRO-
EN ~g/ml
DEPART DE LA
UNE CULTURE
CULTURE
CULTURE
DE 4.8 H
1000
-
~
- -
- -
- -
750
- -
- -
+ +
+ +
500
- -
+ +
+ +
+ +
250
+ +
+ +
+ +
0
200
+ +
+ +
+ +
0
100
+ +
+ +
... +
0
50
+ +
+ +
+ +
0
C.M,I. = l mg/ml
INTERPRETATION DES RESULTATS
La poudre de Bidens pilosa renferme des principes
actifs qui se retrouvent, aprè~ extraction par une solution hydro-
alcoolique dans la phase alcoolique ( fraction soluble MeOH ).
Le fractionnement de cette phase permet d'obtenir trois fractions
fraction soluble NH 40H, fraction soluble KOH, fraction résiduelle
éther qui présentent chacune une certaine activité antiparasitaire
in vitro.

---

-
64 -
IV - ETUDE DE LA FRACTION SOLUBLE NH 0H
4
Un controle chromatographique montre la pré-
sence d'un nombre relativement réduit de taches.
Pour ce contrôle chromatographique, nous avons
utilisé le système nO l
: Benzène 100, MeOH 12 et nous avons
noté qu'une tache était particulièrement intense.
A -
FRACTIONNEMENT SUR COLONNE DE GEL DE SILICE
3 g de sol. NH 0H sont passés sur une colon-
4
ne de gel de silice Kieselgel 60 Merck ( 75 g environ J. L'é-
lution est réalisée avec des mélanges d'éther de pétrole et
de dichlorométhane. On recueille des fractions de 150 à 200 ml.
Ether de pétrole
Dichlorométhane
Fractions
%
% J
70
30
1,2,3,4
60
40
5,6
55
45
7,8,9,
10
Dans la plupart des cas,
les fractions 4 à
10 renferment la tâche dont nous avons fait mention ci-dessus.
Nous appellerons N,
le produit correspondant à cette tâche de
Rf ~ 0,56.
Toutes les fractions contenant N sont réu-
nies. Après concentrations,
on laisse évaporer le solvant.Oo re
... / ...

---

-
65 -
cueille 1,2 g de fraction impure.
E -
ESSAI DE PURIFICATION DU PRODUIT N
----------------------------------
1,2 g de fraction impure sont fractionnés
sur une colonne de gel de silice Kieselgel 60
( 30 g
J.
Comme précédemment,
on utilise comme sclvants d'élution,
des mélanges d'éther de pétrole et de dichlorométhane.
On
recueille des fractions de 100 à 150 ml.
Ether de pétrole
( % J
Dichlorométhane
( % J
Fractions
75
25
l
-
2 -
3 -
4
70
30
5 - 6 - 7
Les fractions 2 à 4
(voir chromatogramme correspondant),
.montrent la présence d'une tâche unique: N. La réunion de
ces fractions,
suivie de la concentration et de l'évapora-
tion du solvant donne un produit pâteux qui ne cristallise
dans aucun solvant.
Pour 3 g de fraction soluble MR 0 H ,
nous avons recueilli
4
750 mg de produit N.
Remarque
La purification du produit N ne pose
pas
de
difficultés majeures. L'utilisation du dichlorométhane n'est
pas exclusive.
On peut aussi utiliser le benzène qui,
dans les mêmes proportions, permet une bonne élution de ce
produi t.
.../ ...
,

---

- 66 -
Le nombre de fractions recueillies est fonc-
tion du volume de chacune de ces fractions et peut donc va-
rier d'une purification à une autre;
l'élément déterminant
étant la présence dans les fractions recueillies d'une tâche
unique caractérisant le produit N.

---

C.C.M. DES FAACI'IONS ISOT.EES LORS DE rA pURn'ICATION DU ProDUIT N SUR
CDWNNE DE GEL DE SILICE
1.
Rf
_
0,9
0,8
OC>C)
0,7
0,6
~@®~@l~~
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
o
•
1
•
2
•
3
•
4
•
5
•
6
•
7-.
fracticns
~ : Tache corresponàant au produit N
Systàœ de migration : Benzène 100
M=Oli
12
Révélateur : ~ro4· concentré
Figure 2

---

-
67 -
v - ETUDE DE LA FRACTION RESIDUELLE ETHER
Cette fraction est la plus importante quanti-
tativement et contient un nombre (important
de tâches qu'il
est impossible de mettre en évidence avec un seul système de
solvants.
En rai son,' 4e la prés ence d'une quanti té notable
de chlorophylle, nous procédons dans une manipulation préli-
minaire à sa fixation sur du charbon actif. Pour cela 10 g
de R.E.
sont pris avec 200 ml de dichlorométhane. On ajoute
2 g de charbon actif pH 7 :
la solution est homogénéisée par
agitation et passée sur du papier filtre.
Le filtrat est con-
centré au Rotavapor.
Il nous semble important de faire remarquer
que l'utilisation du dichlorométhane n'est pas fortuite:
le MeOH,
l'éthanol et l'acétone ne solubilisent toutes les
substances présentes dans cette fraction,
c'est le cas de la
substance ,que nous appelerons C très peu soluble dans ces
trois solvants.
A -
FRACTIONNEMENT SUR COLONNE DE GEL DE SILICE
-------------------------------------------
Le résidu est placé au sommet d'une colonne
de gel de silice Kieselgel 60. L'élution est réalisée avec
des mélanges d'éther de pétrole et de benzène d'une part et
d'autre part de benzène et d'acétate d'éthyle .
.../ ...

---

- 68 -
Ether de pétrole
Benzène
Acétate
Fractions
( % )
( % )
d'éthyle
( % )
,
1
J
90
10
l
1
70
30
2
j
1
60
40
3
1
50
50
4
25
75
5
100
6
7
8
9 - 10
75
25
11 -
12
Les deux ou trois premières fractions recueil-
lies présentent en chromatographie sur couche mince, une tâ-
1
!
che intense absorbant dans lV.V.
et fluorescente. Après éva-
j
poration du solvant d'élution,
on remarque la formation des
cristaux. Le produit correspondant à cette tâche principale
\\
est désigné par la lettre A.
1
Les valeurs des Rf en fonction du solvant de
i
1
1
développement sont consignées dans le tableau suivant.
1
,
.../ ...

---

- 69 -
:
Solvant de migration
:
Rf de la tâche
:correspondant à A
.
Système n° 2 : Benzène
:
0,92
:
:.
système n° 3 : Ether de pétro~
le :
75
;
Benzène :
25
:
0,78
:
:
:
système n° 4 :
:
:
Ether de pétrole
:
0,33
:
:
Les dernières fractions obtenues avec l'élu-
tion du benzène et de l'acétate d'éthyle montre la présence
d'une substance, qui,
après évaporation du solvant,
cristal-
lise en fine aiguilles, malgré la chlorophylle qui l'accom-
pagne. Ces cristaux sont très peu solubles dans le méthanol,
l'éthanol et l'acétone.
En chromatographie sur couche mince,
ce pro-
duit qui cristallise,
donne une tâche intense et
de
couleur
violette après révélation par H so
concentré et présentant
2
4
un Rf de 0,08 dans le système n°
2 (Benzène).
Le composé correspondant à cette tâche prin-
cipale est désigné par la lettre C.
.../ ...

---

-
70 -
B -PURIFICATION DU PRODUIT A
La fraction contenant le produit A est par-
tiellement soluble dans l'acétone,
l'éthanol et le méthanol.
Par filtration,
on sépare une phase soluble jaune ou orangée_
e~ une phase insoluble, floconneuse. Le produit A se retrouve
au niveau du filtrat.
Nous avons choisi l'acètone qui donne
le meilleur résultat pour ce fractionnement.
Le composé insoluble dans l'acétone à froid,
est solubilisé dans ce même solvant à chaud et reprécipité
par refroidissement.
Il est soluble dans l'éther de pétrole
et la C.C.M. utilisant ce même solvant, montre une tâche au
niveau du front du solvant,
révélée après pulvérisation de
l'acide sulfurique concentré et passage à l'étuve à 110°C.
Ce composé ne possède pas d'activité anti-
parasitaire.
Cette purification est réalisée par chroma-
tographie sur colonne de 1,5 cm de diamètre,
contenant 6 à
8 g de gel de silice Kieselgel 60. On recueille des fractions
de 20 ml environ. Les deux premières fractions montrent la
présence de la tâche correspondant au produit A.
Ce produit A cristallise dans l'éther de
pétrole.
... / ...

---

C.C.M. DE lA FPJ\\CI'ION A IMPURE
Ether de pétrole 75
Ether de pétrole
Benzène
25
0,9
<:El
0,9
0,8
0
0,7
0..........
,
0,6
..•-....'
0,5
0,4
fI)
0,3
0
0,2
=respondant au
(/ffJJ) : Tache
,.....,
.-'
uitA
prod
.::)
0,1
-
C )
0 - _.
.
0
-
Rf
Rf
0,9
··0
1--
•
.
.
.
.Q.
1
2
3
•
4
5 •
6
- 7
0 -
Rf
C.C.M. DES I:1U\\Cl'IONS ISOLEES toRS DE lA PURIFICATION DU PRODUIT A
solvant d'élution : éther de pétrole
solvant de migration: éther de pétrole
Figure 4

---

-
71 -
Û -PURIFICATION DU PRODUIT C
La purification du produit C (Rf = 0,73 dans
Benzène 100 MeOH 12)
se fait sur gel de silice. L'obtention
du produit pur, nécessite dans la plupart des cas trois pas-
sages successifs sur des colonnes de gel de silice Kieselgel
60.
Le solvant d'élution est benzène
95 %,
éther de pétrole : 5 %'
Après réunion,
concentration et évaporation
des fractions présentant la tâche correspondant au produit
C,
on obtient dans tous les cas un produit qui cristallise
en fines aiguilles.
La cristallisation de cette substance C,
se
produit dans tous les solvants dans lesquels elle est solu-
ble, en particulier
l'acétate d'éthyle,
le dichlorométhane,
le benzène,
l'éther éthylique.

---

C.C.M. DE lA fRACl'ION C IMPURE
Een2ène : 100
senzène
I~E
· 12
·
.
l
c::>
1
0
~,9
• 0,9
.
\\---.
'"'---
..
~
0,6
,
.
0,6
•
.... _-"
0,7
•
0,7
0,6
0,6
0,5
0,5
0,4
0,4
-
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
cp>Ztp
....
a
•
•
...Q....
Rf
Rf
•
: TSc:he corresp:lIldant au produit C
Figure S

---

C. C.M. DES FRACTIONS ISOLEES WRS D'UN ESSAI DE romFlCATION'DU ProDUIT C
SUR COLONNE DE GEL DE SJLIŒ
Ç,..2
0,9- ~
Q
,
}
...._.
,--....
, _ _
.
0,8 • ~
61
• ..~.. tiUb:1JiIt
0,7- ~
0,6 • 1.
0,5_ -
0,4 • 1"
C,3 • - .
,
0,2 -
0, l •
~
.
••
••
••
•
•
•
•
• •
C
l
2
3
4
5
6
Rf
iIrq;lure
Fractions recueillies
- Tcutes les fractions 5alt éluées avec Benzèr-e
95 % + Ether de pétrole
5 %
- Solvant de. migration
Eenzène
100
MeOH : 12
• tâchecorrespondantauproduitC
Figure 6

---

-
72 -
VI -CARACTERES PHYSICO-CHIMIQUES ET IDENTIFICATION DES PRODUITS
A ET N
A -ÇSE~Ç!~~§_~gX§IÇQ~gINIQQ~§_Q~_~~_êQ~ê!~~Ç~_~
La substance A se présente sous forme de cris-
taux jaune orange.
Solubilité
-
Insoluble dans l'eau
Soluble dans le méthanol, l'acétone, l'acétate
d'éthyle, le dichlorométhane,
l'éther éthylique,
le cyclohexane,
l'hexane, l'éther de pétrole.
Identification sur C.C.M.:
_ Support : Gel de silice GF 254 Merck
Solvants de migration :
système n· l
benzène
système n· 2
benzène 25
( v.
)
éther de pétrole ( v.
)
·
système n· 3
éther de pétr?le.
- Révélateurs
· ultraviolet à 253 nm ;
la tâche correspon-
dante de couleur violette devient jaune après exposition
aux U.V.
• pulvérisation de l'acide sulfurique con-
centré et passage à l'étuve à 110·C.
Le Rf de la tâche dans les trois solvants de mi-
gration est respectivement de 0 , 92 -
0,78 - 0,33 .
.../ ...

---

- 73 -
c'est un produit blanchâtre de nature pâteuse.
Il ne cristallise dans aucun solvant organique.
Solubili té :
-
Insoluble dans l'eau,
-
Peu soluble dans
le méthanol,
-
Soluble dans l'étllanol,
l'acétone, le dichlo-
rométhane, l'éther éthylique, le benzène,
l'éther de pétrole.
Identification sur C.C.M :
Support : gel de silice GF 254 Merck
- Solvant de migration :
• benzène : 100 ( v,
méthanol:
12
( v.
- Révélateur: pulvérisation de l'acide sulfu-
rique concentré et passage à l'étuve à 110°C.
Le produit N donne une tâche jaune de Rf 0,56.
C -IDENTIFICATION SPECTRALE
------------------------
1 -Appareils d'étude physico-chimique
-
Le spectre d'absorption ultra-violette a été
enregistré sur un spectromètre Beckman Acta III. Le sol-
vant est l'éther de pétrole.
... / ...

---

-
74 -
- Les spectres infrarouges sont enregistrés sur un spectromètre
Perkin Elmer modèle 125 sur des pastilles de KEr.
- Les spectres R.M.N. ( résonance magnétique nucléaire
du proton
ont été effectués à 60 mégahertz avec un spectomètre Varian E.M. 360 de sol-
vant le crx:a
avec ccmne référence interne le'T.M.S. à l %.
3
- Le spectre R.M.N. du carbone 13 a été réalisé sur un spectranètre
Varian Fr 80 A. Le solvant est le CDC1
avec ccmne référence le T.M.S.
3
- Enfin, les spectres de masse ont été effectués à l'aide d'un
spectrographe AEI modèle MS 50.
2 - Identification spectrale de la substance A
~E~ct~_~tr~:::~ol~! :
Le point de départ de ce travail d'identification est le spectre
électronique superposable à celui de la phényl l - heptatriyne l - 3 - 5
( 66, 67, 75 ). Par ailleurs, i l présente des maxima d'absorption identiques
à ceux de la phényl l - octatriyne 1 - 3 - 5 ( 66, 67 ) ainsi qu'à ceux de
la phényl 7 - heptatriyne 2 - 4 - 6 01 - l ( 7 ). Cependant, le spectre de
A présente trois bandes d'absorption supplémentaires non encore mentionnées .
.. . f ...

---

SPECTRE u. v. DU PRODUIT A
DO
2
'251
.
..trat on = 2 /Lg/IIÙ
2'B
-
1
~.
214
J
~
lOS
'22~
291
3'31
iJJ
/
Y5
,
~ 0\\V '-.J \\..J \\
!I(n m)
3f?()
200
~O
Figure 7

---

- 75 -
À max du produit A et de ;La /?Mnyl~eptatri~
< ,(
PRODUIT A
PHENYL HEPTATRIY:NE ; Li.ttératu.re
( éther de pétrole )
(
)
(
#5
)
66, 67
hexane
éther de pétrole
331 run
330,9 run
331,5 nm
309 run
309,7 nm
310
run
291 mn
290,8 run
291
nm
275 run
273,5 nm
274
run
259 nm
259
run
259
nm
251 run
250,4 nm
250,2 run
246 nm
238"run
238
run
238
run
223 nm
214 run
Bandes d'absorption infrarouge de A
~1
cm
INTENSITES
ATTRIBUTIONS
3050
faible
vC-H arômatique
2220
fort
vC =C
2180
faible
J
.
1595
faible
} Relatifs au cycle benzénique
1490
fort
755
fort
} Déformation hors du plan des
685
fort
hydrogènes du cycle monosubs-
titué.
Ce spectre infrarouge ne contient aucune a~sorp­
tion caractéristique d'une fonction alcool primaire dans
... / ...

---

-
76 -
1
la région 3500 - 3100 èm-
et autour de 1000 cm- 1 mais
-1
confirme la présence d'un cycle arômatique
3050 cm
-1
-1
1595 cm
,
1490 cm
) monosubstitué
( 755 cm-l,
685,cm- 1 )
et d'une OU plusieurs triples liaisons acétyléniques di-
-1
substituées
( 2220 cm-l,
2180 cm
, absence de bande au-
1
tour de 3100 cm-
)
( 5 )
La position de ces bandes acétyléniques ne sem-
ble pas révéler une conjugaison éventuelle des triples liai-
sons entre elles ou avec le cycle benzénique mais ne con-
tredit pas une telle hypothèse puique l'absence d'effet
bathochrome a déjà été observée dans le cas des acides ou
esters conjugués R -
( C SC) n COOR avec n
1
( 5 )
Par contre,
l'intensité anormalement forte que nous ob-
1
servons pour la bande à 2200 cm-
est en faveur d'une con-
jugaison des triples liaisons avec le cycle aromatique. ( 76
La confirmation de la structure phényl 1 - hep-
tatriyhe 1 -
3 -
5 de notre composé est apportée par la
spectrographie de masse ou la R.M.N.
de proton et de car-
bone 13.
§E~s:~~!uà!L!!!!:!§§~
Le spectre de masse présente un pic moléculaire
M+ à ID = 164 ; les intensités relatives des pics M, M + 1
e
et M + 2 sont compatibles avec la formule C
H . Le pic
13 8
métas table à ~ = 116,1 est significatif de la filiation
~ = 164-_.~ ~ = 138 par perte d'unecrmolécule d'acétylène
soit au niveau du cycle benzénique
(
18
),
soit au ni-
m m
veau de la chaine latérale. Les pics à e = 87, e = 63,
... / ...

---

SPECTRE I.R. DE LA SUDSTANCE A
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l.
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1000
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J
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1
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i
. 1
1
SPECTRE I.R.
DE LA SUBSTANCE A
Figure 8

---

Pic métastable à ~ = 116,1
164
1"'/0
'00
C13HB
)
90
1
BO
1
70
131:3
1
60
)
50
1
40
)
30
07
)
20
l
10
mie
o
-- -
20
30
40
50
o
70
BQ
90
00
110
120
13
SPECTRE DE HASSE DE LA PHENYL 1 -
HEPTRATRIYNE 1 -
3 -
5
(SUBSTANCE A )
Figure 9
_,o.
_y, __ ",_,_,
__ •
, , _ - c - ' " ' ~ _
~ _ .

---

SPECTRE R.M.N. DE PROTON DE LA PHENYL 1
HEPTATRIYNE 1
3 - 5
Figure 10
+
5TAIH OF SWEEP
- H _
END OfSWEEP
~ZI'"!.~I'"'~"'II"
4011'/'", 20ppm
20Hz/cm 10ppm
lun 5
4Hz/cm
2ppm
2Hz/cm
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g:
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U>
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z
i
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7
6
5
4
3
2
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SPECTRUM AMPl,A'.u~~_
_
Illm
SWEEP TlME_L
"AMPLE
~~\\~
REMAn.(S: 1'CA JJ rdiü.t
OPERATOR.M~~~'!:L
_
{fû./';'" "fA-
P', ~l.)-_...aI1
,
FILTER __
·_I
,__"_,_ ..c
SWEEP WIOTH~
ppll' or Hz
DATE .JJ.1;lJlLt.---
Rf POWER ~_I)s'
InG
END OF SWEEP 0
pptn or Hz
SOLVENTe '-4> Cl1 .
eu ~~.~"_~.".:.~:~~
SPECTRUM Nr, _._ .
_
,

---

-
77 -
m
e =
39 sont attribuables respectivement à :
+
C +
CH
= C = C = C = C = C = CH
, CH = C = CH - C
2
CH +
CH
=
C
10
Il indique la présence de deux types de protons
S protons ar6matiques li = 7,2 ppm et
3 protons d'un groupe méthyle e5
= 1,9 ppm
Cette constatation est accord avec une structure phénylheptatriyne,
Le spectre RMN de 13C montre outre un signal relatif
à un groupe méthyle lié à un carbone d'hydribidation sp
ô= 4,6 ppml
31
J et quatre signaux relatifs à un cycle benzénique mono-
substitué (e5 = 132,9 -
129,6 -
128,5 -
121,1 ppm J, six ,signaux dont
les g~is~ements et les intensités sont relatifs à six carbones
acétyléniques
12, 32 J.
8
5
4
3
2
1
C =: C -C=:C -CaC-CH3
PHENYL l
HEPTATRIYNE
1 - 3 - 5
nO de Carbone
1
2
à 7
8
9
10
11
e5 en
4,6
59,1 - 65,1 - 67,6
121,1 132,9 128,5
129,6
ppm
74,7 - 75,4 - 78,5

---

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... ...
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-..'-~._~
.
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~
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SPECTRE RMN DE CARBONE 13 DE LA PHENYL 1 HEPTATRIYNE 1 -
3- 5
fT·80A
SPECTRUM NO•.rfl'P?
OPERATOR ".....R.f...
..... DATE ~ / üitl
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NUCLEUS ...~_~c. .... fnEQuENCY. ~o.o _.
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SYtHlltsl2.En SETlINO . .J 1.1 So 31~! ,
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ACQUISITION
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1
SPECmAL WIOTlIISWL .13000... __.HL
"0. Of TRAI'I's'IENI'S INT) 6lJUOO
ACQUISlHûN liME IATL. D, *,1'
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PULSE WIDTlIIPWI
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f"ULSE DElAY IPOL.
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VAfA POINTS IDPl
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TRAHSMITTER OffSET HO) ......)4: ..
IIIGIt flfLD ...... r ..lOW fiElD ..
RECEI\\I(fi ,GAIN mG)
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DECOUPLER MODE lDM 1.
"~ ....
DECOUPLEit OffSET 1001.
ta.
HOISE "AUDWIOTII lliOI ...... _.1..
Uil
ACQUISITION MODE (AM)
,
DISPLAY
SENS. EWIANCEMENT Isn JJ .1., .. latle,
WlQrtI Of PI.OT (WI-'L.
SûLb.
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,
1
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Figure 11

---

-
78 -
3 -
Identification spectrale de la substance N
TABLEAU DES RESULTATS
1er
2ème
3ème
moyenne
essai
essaI
essai
C %
75,73
75,44
75,63
75,6
x ;
16,12
H %
12,53
12,42
12,39
12,44
Y ;
31,8
1
o %
11,95
z ;
1,9
1
Les résultats de la microanalyse et la position du pic molé-
culaire dans le spectre de masse de N permettant de déduire la
formule brute C16H3202 à partir des formules suivantes
C % x r~
pour Cx Hy Oz
x
;
1200
H % x M
Y
;
100
o % x M
z
;
1600
avec C %,
H %,
0 % et M étant respectivement la composition en
carbone, hydrogène, oxygène et la masse moléculaire de la substance
étudiée.
Le spectre infrarouge est caractéristique d'un acide gras
- ( - 1
-1
sature
OH c.a.3000 cm
large et intense, CO 1710 cm
large et
Intense).
La structure compatible avec ces résultats est celle de
l'acide palmitique ( 54 ).

---

SPECTRE T.R. DE LA SUBSTANCE N
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3,5
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5
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25
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.._\\
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-1
.",
1·-------,
1
Figure 12

---

-
79 -
La fragmentation en spectrométrie de masse est en parfait accord
avec cette hypothèse. Le spectre consiste,
en effet, en deux
séries de pics résultants de la rupture de chaque liaison carbone-
carbone avec rétention de charge soit sur un fragment oxygéné de
formule générale
:
45,
59,
73,
87,
101,
115,
129
143,
157,
171,
185,
199,
213,
227
soit sur un fragment de formule générale
:
l+
C
H
m
n
2n + l
~ 43, 57,
71,
85,
99,
(65)
e

---

SPECTRE DE MASSE DE L'ACIDE PAUIITIQUE
0
43
100 ,0;:
73
90
41
Ba
70
57
55
60
50l
99
1
40
71
30
129
20
B5
os
la
5':
B7
l,III
01
n5
1
143
,
1
Il,11
Il
1.11 ,111,,",
157
.1
,1 1
1.,1
li 1111111 Il
01,,''''
,
" •. 1
.
30
40
50
60
70
bO
90
100
110
120
130
140
150
160
10
,%
sc
BO
70
60
50
40
30
20
213
la
15ï
171
11]5
143
1
1
159
~~I~:-'-:~W;-:;i:::-~...l.-..",--!-~:--~~....::.-.tL,...-~~~.....J.L...
_ _ ~/,
140
150
160
170
1BO
lsa
200
210
2~0
250
260
Figure 13

---

- 80 -
VII - ETUDE PHARMACOLCGIQUE DES PRODUITS PURIFIES
Les propriétés antiparasi taires in vitro des trois
produits isolés de Bidens pilosa ont été évaluées sur Entamoeba histoly -
tica, Trichanonas vaginalis, Hymenolepis nana var fraterna et Fasciola
hepatica. Par ailleurs, la prlénylheptatriyne ( produit A ) fera l'objet
d'une étude sur le Plasmoàium falciparum en cul ture in vitro.
L'étude de l'activité antiparasitaire in vivo a été
réalisée sur Hyménolepis nana, SyPhacia obvelata et Plasmodium berghei .
.../ ...

---

-
81 -
A -
ESSAIS IN VITHO
Les test in vitro sur Hymenolepis nana var fra-
terna,
Trichomonas vaginalis,
Entamoeba histolytica ont été ef-
fectués suivant la méthodologie décrite dans les essais préli-
minaires.
1 .
Activité anthelminthigue vis vis d'Hymenolepis nana var
fraterna
Hésu1tats
Tableau 9
PRODUITS ESSAYES
CONCENTRATION LETHALE
Phénylheptatriine
( Produit A )
-
10 !-tg/ml
Acide palmitique
250 ,ug/ml
Produit C
100 ,ug/ml
Niclosamide
0,3 ,ug/ml
2,5 ,ug/ml
Mépacrine
.../ ...

---

- 82 -
2 .
Activité anthelminthique sur Fasciola heDatica
Fasciola hepatica ou grande douve du foie est
un hôte habituel des canaux hépatico-biliaires des bovins et
ovins.
Pour ce test in vitro,
nous avons appliqué la
technique préconisée par Notteghein et Collaborateurs
(4g
),
reprise au laboratoire par Julien
( 37 '
Le parasite est mi= ~cins un milieu de survie dont
la composition est la suivante
- Milieu 199 ( Bio-Mérieux ) en solution concen-
trée : 50 ml
- solution de Na H C0
à 5 %
20 ml
3
- Glucose à 30 %
0,5 ml
- Eau distillée : q.s.p. 500 ml
Le pH est ajusté à, 8,2 -
8,5 avec une solution de NaOH
0,1 N
-
pénicilline : 100 000 unités
- streptomycine :
25 mg
Avant son utilisation,
on ajoute 100 ml de sérum de poulain
et 1 ml d'hématies de mouton.
~~~~~~~~_E~~~~~~~~~= :
Les douves sont récoltées à partir des foies pa-
rasités de bovins,
très peu de temps après l'abattage des ani-
maux ( 30 mn à 1 h ' .
A la température ambiante du laboratoire,
les foies sont disséqués en coupant les lobes hépatiques. Les
... / ...

---

-
83 -
douves sont récoltées à l'aide des pinceaux. Les trématodes se
retrouvent à la surface des lobes hépatiques et en abondance à
l'intérieur des canaux biliaires et hépatiques. Par pression,
sur les canaux sort un liquide noirâtre visqueux dans lequel
baignent les douves.
On les retrouve également au niveau des
concrétions plus ou moins pierreuses qui se sont formées dans
les canaux hépatiques.
Ces douves sont placées à 37° C dans un bécher
stérile contenant le milieu de survie.
Elles sont lavées par
décantation et agitation douce.
On les répartit ensuite dans
des boîtes en verre,
stériles et à bords rodés,
contenant le
milieu de survie,
à raison de trois douves par boîte.
Il est nécessaire de vérifi.er à la loupe bino-
culaire l'état morphologique général et la mobilité des douves.
Celles qui sont abîmées ou immobiles sont rejetées.
Les parasites retenus survivent plus de trois
jours. On ajoute dans les boîtes contenant les douves viables,
des quantités croissantes du produit à tester.
La lecture des résultats se fait à la loupe,
24 heures après incubation à 37° C.
... / ...

---

-
84 -
Résultats
Tableau 10
PRODUITS ESSAYES
CONCENTRATION LETHALE :
C.L.
Phénylheptatriine :
50 #9/ml
Produit A
Aclde palmitique
250 ,u9/ml
Produit C
750,u9/m1
-------------------- ----------------------
Iodo 3 - hydroxy 4
Nitro 5 -
benzoni-
100 ,ug/ml
trile : Nitroxil

---

- 85 -
3 • Activité amoebicide in vi tro
,
Résultats
~~--~~~-~
T.abl eau Il
Produi:.ts
Phénylhep-
Aêide
Produit C
Métronidazole
essayés
tatr.iyne
palmi tique
C.M.I. en
/lg/ml
50 ,ug/ml
l mg/ml
750 ,ug/ml
1,5 ,ug/ml
C.L. en
/lg/ml
1;00 pg/ml
l mg/ml
l mg/ml
5 ug/ml
4 • Activité trichomortacide
Résultats
.--'"!!"'------
Tableau 12
:t-roduits
Phénylhep-
Acide
Produit C
Mé tronidazole
èssayés
tatriyne
palmi tique·
C.M. I. en
/lg/ml
100 ,ug/ml
250 pg/ml
l
mg/ml
la ,ug/ml.
C.L. en
/lg/ml
200 ,ug/ml
500 pg/ml.
l
mg/ml.
25 pg/ml
5. Analyse des résultats des essais in vitro
Des trois produits isolés de Bidens pilosa, seule
la phénylheptatriyne ( produit A ) présente une activité in-
téressante ; N et C sont peu actifs.
La phénylheptatriyne a une activité taenicide in
vitro ( vis-~-vis d'Hyménolépis ), significative par rapport
au témoin mépracrine, mais relativement moindre par rapport
~ la niclosamide.
Son activité douvicide est comparable ~ celle du
nitroxil (douvenix ), substance utilisée en médecine vétéri-
.../ ...

---

- 86 -
naire..
". l'égard des l(rotozoatres : Entamoeba histoly-
tica et Trichomonas vaginalts, la phénylheptatriyne a une
activité vingt fois moindre que la métronidazole.

---

-
87 -
B - E S S A I S
l
N
V l
V 0
ACTIVITE ANTHELMINTHIQUE IN VIVO
l
Essai sur souris blanche parasitée par Hymenolepis nana
var.
fraterna
L'activité des trois produits isolés de Bidens pilosa a été
étudiée.
L'infestation des souris se fait selon la mé-
thodologie décrite dans les essais préliminaires. On utilise
un lot de souris parasitées par dose de produit essayé et un
lot de souris témoins pour chaque série de test.
La vérification de l'infestation c'est-à-dire
la présence des oeufs dans les fèces des souris es~ faite à
partir du 15ème jour.
Les souris parasitées sont laissées à jeun pen-
dant 24 heures,
ensuite traitées pendant 4 jours par l'admi-
nistration d'une dose quotidienne. Six jours après le début
du traitement,
les souris sont laissées à jeun 24 heures;
le
7ème jour,
elles sont sacrifiées et l'intestin grêle préle-
vé.
On recherche la présence des vers. On détermine le pour-
centage de souris totalement déparasitées par la formule:
n x 100
n
nombre de souris totalement déparasitées
N
N
nombre de souris traitées .
.../ ...

---

-
88 -
Résultats
---------
Tableau 13
Produits . Doses en
Nombre de souris
Nombre de souris
Pourcentage
essayés
mg/Kg
traitées
dé)?arasitées
de déparasi-
tation
Mépacrine
220
la
la
100 %
Niclosa""-
mide
200
la
la
100 %
Phénylhep-
500
la
2
20 %
tatriyne
-1
produit c
500
la
a
a %
Acide
500
la
a
a %
pàmitique
2 • Essai sur souris blanche parasitée par Syphacia obvelata
Syphacia obvelata est un nématode qui mesure 1,2 à 5,8 mm
x 0,4 mm selon le sexe; les mâles étant plus petits que les
femelles. Son habitat se situe dans le coecum et le colon de
la souris blanche. Il s'agit d'un Oxyuridé de la souris dont
la biologie est tr~s proche des Oxyuridés humains.
L'infestation des souris se fait par contact avec des
souris blanches intensément parasitées. On vérifie dans les
selles la présence des oeufs.
Le traitement se fait suivant la méthodologie décrite
pour Hymenolepis nana.
.... / .....

---

- 89 -
On dét~rmine le ~ourcentage des souris complète-
ment déparasttées.
Tableau 14
l?roduits
Doses en
Nombre de souris
Nombre de souris
Pourcentage
essayés
mg/Kg
traité3s
déparasitées
de déparasi-
tation
Sulfate
~e pipéra-
200
10
9
90 %
Une
l?Mnylhep-
500
10
0
0 %
t:atriyne
Adele
500
10
0
o %
pàmitique
Produit C
500
10
0
0 %
3 • rnterorétation des résultats
Les trois produits isolés de Bidens pilosa n'ont
pas d'activité anthelminthique significative .
.../ ...

---

-
90 -
EVALUATION de L' ACTIVITE ANTIMALARIQUE in VIVO
L'étude de l'activité antimalarique in vivo se fait sur des souris blanches infes-
tées avec le Plasmodium Berghei.
Le Plasmodium berghei est le premier hématozoaire décowert chez les ronget:rs
Muridés (25,39). La relative facilité d'entretien et de multiplication chez les
animaux courants de laboratoire : souris et rats blancs, hamster font de ce para-
site un matériel de choix pour la recherche des nowelles drogues antipaludiques.
Principe d'étude d'évaluation de l'activité antimalarique in vivo
Une substance a une activité antipaludique in vivo lorsqu'en même temps: elle
provoque une réduction de la parasi témie et une prolongation de la survie des
souris traitées.
Méthodologie
Si la plupart des auteurs utilisent le tes" en quatre jours (4 days test)
qui permet de rechercher les DE 50 et DE 90 au bout de 4 jours de trai tement des
souris parasitées (53,74), nous suivrons l'évolution de la parasitémie des souris
jusqu'à leur mort ou guérison éventuelle. Cette méthodologie utilisée par PETERS (52 )
pour l'étude dela résistance du Plasmodium Berghei à la chloroquine, permet
d'établir une relation étroite entre l'évolution de la parasitémie et la survie des
souris traitées.
Conduite de l'expérience:
Les souris blanches pesant 20 ,;, 2 g sont infectées par voie intropéri tonéale
avec 50;u1 de sang contenant environ 20 % d'hématies parasitées (2 à2.5 a:o,,(globules
rouges). ChaqUE lot comprend 10 sOl'~is et un lot témoin est constitué pour chaque
série de test.
Les produits sont mis en suspension dar.s l'eau distillée stérile. L'administration
se fait par voie orale
le tr-ai tement des souris comnence. le jour de l'infestation
et se poursuit pendant 5 jours par l' administration d'une dose quotidienne à chaque
souris. L'examen des frottis se fait à partir- du troisième jour. On détermine en
fin d'expér-ience le pourcentage d'hématies parasitées.

---

- 91 -
Activité des produits isolés de Bidens pilosa
Evolution moyenne de la parasitémie
% d' hématies parasitées
Tableau 15
,
i
DElAI
POORCENTAGE
EVOLUTICl'l DE LA PARASITE10lIE DES SOURIS TRAITEES
,
;
DE
DE
( groupe de 10 souris )
icœrROLE
PARASITE10lIE
1
DES
SOURIS
1
,
'l.'EM)INS
CHLœHYDRAIlE
PHENYIREPTATRIYNE
ACIDE PAlMITlÇUE
PRODUIT C
,
DE
500 r-I}/KG
500 r-I}/KG
500 r-I}/KG
i
~ININE
!
120 lo1:i/KG
,
i
P+
2jours
3,5 %
'0+
3
"
0,5 %
2,3 %
2,7 %
2,6 %
'0 +
4
"
18
%
0,1 %
2,5 %
2,8 %
4
%
'0 +
5
"
25
%
0
%
13,5 %
15
%
10
%
'0+
7
"
45
%+++
0
32
%+
40
%+
30
%
'0+
8
Il
60
%11111
°
56
%++ + +
50
% + + +
49
%+ + +
'0+
9
"
++
0,3 %
65
%+++
60
%+++
55
%+ + +
'0 + 10
Il
1,5 %
+ +
68
%+
65
11* + +
'0+11
Il
9
%
++
+
'0 + 12
Il
29
%
'0 + 14
Il
35
%+ + +
'0 + 15
Il
52
%+
'0 + 16
Il
62
%+ + +
'0 + 17
Il
+ + +
PCUOCENTAGE
DE
100 %
100 %
100 %
100 %
100 %
KJRl'ALITE
Le signe + in::li.que qu'une souris du lot est IIDrte.
L'évolution de la parasi témie des souris traitées avec les 3 produits isolés
de 8idens pilosa n' est pas significativement différente de la parasitémie des
souris ténDins.

---

-
92 -
Le chlorhydrate de quinine, à 120 mg/kg provoque une diminution très nette
de la parasitémie et une légère survie des souris traitées par rapport aux témoins.
Ce ralentissement ou diminuticn de la parasitémie des souris traitées avec la
quinine s'accompagne de la présence de nanbreux parasi tes anomaux de sang de ces
souris, observés aisément sur les frottis.
Les trois produits isolés de Bidens pilosa (phenylheptatriyne. acide palmitique.
produit C) ne semblent pas avoir une action inhibitrice sur la IIRlltiplication du
Plasmodium Berghei.

---

CHAPITRE IV
CUL T URE
l N
VIT R 0
D U
PLA S M 0 DIU M
F ALe l PAR U M

---

- 93 -
l - BIOLOGIE DU PLASMODIUM FALCIPARUM
Les agents du paludisme humain appartiennent
à quatre espèces du genre Plasmodium, sporozoaire de l'ordre des
Hémosporidés et de la famille des Plasmodidés.
Ce sont :
les
Plasmodium falciparum,
malariae, vivax et ovale. La première étant
la plus pathogène et sévissant toute l'année dans les pays tropicaux.
Le cycle complet du Plasmodium nécessite 2 hôtes
- un hôte vertébré
l'homme
(quelquefois le singe)
pour
ces quatre espèces chez qui la multiplication du parasite est
asexuée,
- un hôte invertébré
l'anophèle femelle où une partie
du cycle est sexuée.
1. Développement du Plasmodium falciparum chez l'hôte invertébré
rI existe plusieurs espèces d'anophèles capa-
bles de transmettre le paludisme à Plasmodium falciparum.
Citons
:
Anaohèles albimanus, maculipennis, labranchiae,
gambiae,
funestus,
.../ ...

---

-
94 -
maculatus, minimus etc ...
Le sang puisé chez l'hôte infesté
(homme)
con-
tenant des gamètocytes pénètre dans l'appareil digestif du
moustique. Les parasites qui ne sont pas différenciés en aa-
mètocytes
(macrogamètocytes et microgamètocytes)
sont détruits
par la digestion. Ce sont les trophozoltes,
schizontes et
corps en rosace. Les macrogamètocytes et microgamètocytes
vont se transformer par réduction chromatique,
en macrogamètes
(gamètes femelles)
et microgamè-ces
(gamètes mâles).
Les gamètocytes du Plasmodium falciparum ont
une forme caractéristique en faucille.
Après union des gamètes
mâle et femelle,
on a formation d'un oeuf mobile. L'évolution
de ce dernier se poursuit dans les cellules
épithéliales de
l'estomac OÙ i l se transforme en ookinète. Cet oeuf fusiforme
va traverser la paroi gastrique
(bordure en brosse)
pour s'en-
kyster sur la membrane interne de la paroi et donner un oocyste.
Cet oocyste perd sa forme fusiforme et se différencie. Après
la méiose,
il donne naissance à une multitude de sporozoïtes
qui vont migrer dans les glandes salivaires en attendant d'être
injectés à un hôte vertébré. La durée de l'évolution chez le
moustique dépend de la température; à 25° C, elle est de
12 jours environ.
2. Développement chez l'homme
La schizogonie ou développement du parasite
chez l'hôte vertébré comprend un stade exoérythrocytaire en-
core appelé stade pré-érythrocytaire suivi d'un stade éry-
.../ ...

---

- 95 -
throcytaire.
a) Phase exoérythrocytaire : Après une piqûre infectieuse
de l'anophèle,
les sporozoïtes
(la um de long en moyenne),
disparaissent rapidement de la circulation sanguine pour
amorcer la schizogonie dans les cellules hépatiques.
Les schi-
zontes vont subir une série de trensformations : division de
la masse chromatique,
augmentation des dimensions des cellu-
les parasitées. Les masses chromatiques s'entourent de cy-
toplasme et d'une membrane cytoplasmique constituant ainsi
des éléments parasitaires appelés mérozoïtes. Ces derniers
seront libérés dans la circulation sanguine et iront envahir
les hématies. Ainsi commence la seconde phase du développe-
ment du parasite chez l'homme
phase érythrocytaire qui se
produit au bout de sept jours après contage. Contrairement
aux trois autres espèces infestant l'homme,
on n'a pas de
réinfestation des hépatocytes par des mérozoïtes.
b)
Phase érythrocytaire : C'est la phase la plus étu-
diée car l'observation du parasite se fait aisément.
Elle
conditionne les signes cliniques. Les différentes formes évo-
lutives du parasite dans le sang peuvent être facilement ca-
ractérisées après coloration par le May-GrUnwald~iemsa (M.G.G.)
L'hématie qui vient d'être parasitée garde sa
forme et ses dimensions. La première forme parasitaire ap-
pelée trophozoïte va former un anneau avec un cytoplasme bleu,
un noyau en chàton rouge et au centre, une vacuole incolore.
Le parasite grossit, modifie la forme et les dimensions de
la cellule support. La chromatine se divise en plusieurs mas-
.../ ...

---

-
96 -
ses;
le parasite est alors appelé schizonte. Chaque fragment de
chromatine va s'entourer de cytoplasme pour donner un mérozoite.
Le corps en rosace correspond à l'ensemble des mérozo\\tes encore
entourés par la membrane de l'hématie.
Le corps en rosace va li-
bérer les mérozo~tes qui, à leur tour, parasiteront d'autres hé-
maties. La libération des mérozo\\tes dans le sang s'accompagne de
la production ultérieure des gamètocytes.
Ils proviennent de la
différenciation des trophozoïtes. Le cycle érythrocytaire dure
48 heures environ.
La présence du parasite dans le sang dé-
clenche l'apparition des signes cliniques.
L'accès fébrile cor-
respondant à l'éclatement des corps en rosace et la libération
des mérozo\\tes se caractérise par des poussées fébriles quoti-
diennes ou survenant toutes les 48 heures.
Le Plasmodium falciparum est l'espèce la
.plus dangereuse pour l'homme car il a un facteur de multiplica-
tion très élevé;
il s'en suit chez le patient une anémie très
importante.
Le paludisme à Plasmodium falciparum,
lorsqu'il n'est pas traité,
occasionne deux graves complications
l'accès pernicieux et la fièvre bilieuse hémoglobinurique pouvant
entrainer la mort.
L'accès pernitieux est la conséquence du
pouvoir de multiplication très important du Plasmodium falciparum
les hématies parasitées ont tendance à s'accoler à
la paroi des
capillaires sanguins et à s'agglutiner entre elles. On a un ra-
lentissement de la circulation sanguine et apparition
... /'"

---

-
97 -
des thromboses multiples dans les organes profonds en par-
ticulier dans les centres nerveux. Cela amène une hyperther-
mie, une adynamie et des signes neurologiques.
La fièvre hémoglobinurique,
souvent mortelle
se caractérise par une température élevée, une anémie sévè-
re, des vomissements bilieux et la présence d'hémoglobine
dans les urines. Cette complication atteint les sujets in-
suffisamment traités.

---

PHASE ASEXUEE DANS LES CELLULES HEPATIQUES
PHASE ASEXUEE DANS LE SANG
oQC'~
'J!(j
0°0 0
schizonte
jeune
/
Mérozo~te
~cellule
1
G.R.
'{HéPatique
HOTE VERTEBRE
:
HOMME
8
HOTE INVERTEBRE
:
ANOPHELE
sporoz.oïtes
Oocyste
Mioroga'
~
"------- "'''''
~.
r;.Y<---
PHASE ASEXUEE DANS LES GLANDES SALIVAIRES
PHASE SEXUEE DANS L'I NTESTIN
Figure 14

---

-
98 -
OBJET DU TRAVAIL
Depuis cinq à six ans, de nombreux laboratoires
dans le monde se sont spécialisés dans la culture in vitro
du Plasmodium falciparum .. Cette culture trouve de nombreuses
applications,
en particulier pour :
-
l'étude de l'ultrastructure du Plasmodium,
-
l'observation de la gamètocytogénèse et la gamèto-
génèse,
-
l'étude de la résistance aux drogues généralement uti-
lisées en chimiothérapie humaine
(résistance à la chlo-
roquine) ,
-
l'étude des problèmes immunologiques liés au dévelop-
pement du parasite.
Pour notre part, nous nous proposons de mettre
en culture, une souche de Plasmodium falciparum afin d'effec-
tuer une série d'essais in vitro pour tester l'activité phar-
macologique éventuelle de substances chimiques de synthèse
ou d'origine végétale.

---

- 99 -
II - HISTORIQUE SUR LA CULTURE DES PLASMODIDES
Les premiers essais de culture in vitro du
Plasmodium falciparœrr datent de 1912
(
2~
). En 1976,
Jensen et Trager d'une part (
69
), Haynes et collaborateurs
d'autre part (
30
),
exposent les techniques de la culture
continue du Plasmodium falciparum au stade érythrocytaire.
Si depuis,
tous les travaux portant sur les
parasites responsables du paludisme chez l'homme exploitent
cette espèce et cette technique,
i l faut noter qu'il est pos-
sible d'obtenir la culture in vitro du Plasmodium vivax ou
malariae
42
),
ainsi que la multiplication d'autres es-
pèces au stade sporogonique sur des cellules d'anophèles en
culture (
57
). De même, la multiplication du parasite au
stade exoérythrocytaire est possible sur des cellules de cer-
veau d'embryon de dindon pouvant être facilement infestées par
les Plasmodium fallax et lophurae (,4"
44). On peut égaleme~t
obtenir l'infestation in vitro d'hépatocytes de Thamnomys ga-
zellae ou de rat en culture par des sporozoïtes de Plasmodium
yoelii
(41, 45).
Pour de nombreuses raisons,
la culture du
stade érythrocytaire de Plasmodium falciparum
est la plus
exploitée.
PRINCIPE DE LA METHODE ET CONDITIONS DE CULTURE
-----------------------------------------------
La culture continue du Plasmodium falciparurn
au stade érythrocytaire fait appel à la technique de dilution
.../ ...

---

-
100 -
qui permet la croissance et la multiplication du parasite au
sein d'une couche de globules rouges,
recouverte par le mi-
lieu de culture. Cette technique nécessite:
- un environnement relativement pauvre en oxygène et
une tension en dioxyde de carbone
(COZ)
assez élevée,
-
la dilution du sang parasité avec des hématies non
infectées afin de réduire la parasitémie de départ entre
0,1 et O,Z %,
- un renouvellement
ou un apport régulier d'hématies
fralches,
-
la présence d'un bon tampon,
non toxique pour les
hématies et le parasite permettant la stabilité du pH.
En
raison de la grande production de lactate par le parasite
33
),
le changement de milieu et la présence de ce tam-
pon permettent d'éviter la chute du pH qui doit être main-
tenu entre 7,30 et 7,45,
- enfin,
le milieu de culture doit être obligatoirement
supplémenté avec le sérum humain.
Deux techniques permettent d'assurer les
mêmes conditions de culture.
1. Technique en flux continu
( 30, 44, 69 )
Cette méthode de culture consiste à assurer
un écoulement lent et permanent du milieu sur une couche de
globules sanguins et n'exige pas de surveillance quotidienne;
une connexion à une bouteille de gaz stérile alimente l'en-
ceinte de culture en mélange gazeux dont la composition est
.../ ...

---

- 101 -
la moyenne
Cü :7 à 8 %
2
O
2 à 5 %
2
N
88 à 90 %
2
2. Technique en boite de Pétri en anaérobiose
(35, 44 )
Cette technique simple, nécessite le reno~-vellement manuel
quotidien du milieu de cul ture. La cul ture se fait dans des boites de Pétri
de 35 à 60 nm de diamètre, boites qui seront introduites dans une jarre à
anaérobiose contenant une bougie afin de maintenir l'atmosphère pauvre en
oxygène.
3. Milieux de cul ture
Deux milieux permettent la culture in vi tro du Plasmodium
falciparum
le milieu R.P.M.I.
1640 ( 35, 47, 69 ) et le milieu 199 ( 30 ).

---

-
102 -
III - TRAVAUX PERSONNELS
Nous nous proposons de mettre en application
la technique de culture en boîte de pétri en utilisant le
milieu R.P.M.I.
1640.
La culture in vitro du Plasmodium falciparum
·nécessite des conditions d'aseptie très rigoureuses. Le mi-
lieu de culture est particulièrement riche et propice à la
prolifération des germes de toute nature. Rappelons qu'il
comprend les 20 acides aminés essentiels,
Il vitamines, de
nombreux sels minéraux, du glucose, du sang et du sénLm.
Malgré la présence dans le milieu d'un antibiotique:
la
gentamycine,
il est indispensable de travailler dans une en-
ceinte stérile. Toutes les manipulations seront exécutées sous
une hôte à flux laminaire horizontal
(LaminarAir Flow Class
100 Model NB 48 F). Les prélèvements du milieu, du sang et
du sérum seront facilités par l'utilisation d'un appareil·
de pipetage automatique
Pipetus
(Pipet Aid).
En plus de
toutes ces précautions,
le milieu de culture est systémati-
quement filtré sur membrane millipore (0,45 um), après cha-
que manipulation comme l'addition de bicarbonate ou l'ajus-
tement du pH.
Le milieu R.P.M.I.
1640 (Grand Island biolo-
gical compagny)
est commercialisé sous forme lycphilisée dans
des sachets de 10,4 g.
.../ ...

---

d
-
103 -
Le contenu du sachet est dissous dans 900 ml
d'eau distillée stérile pour préparation injectable.
Après
solubilisation,
on ajoute 5,95 g de tampon H.E.P.E.S
: acide
N
Hydroxyéthyle pipérazine N'2 éthane sulfonique
(Sigma)
2
équivalent à 25 mM.
Le volume est porté 960 ml avec de l'eau
distillée stérile. Une ampoule de gentamycine (10 mg)
est
ajoutée. Après filtration sur millipore (0,45 ~m), on répar-
t i t le milieu dans des flacons de 250 ou 500 ml. Le pH du mi-
lieu est alors de 6,75 ~ 0,02. La conservation se fait à
+ 4 0 C pendant un mois environ.
Avant l'utilisation,
le milieu est d'abord
supplémenté avec du bicarbonate de sodium: NaHC0
(Prolabo).
3
pour 100 ml de milieu,
on ajoute 200 mg de NaHC0
(équivalent
3
à 0,2 %). On ajuste le pH à 7,35 environ avec une solution
de NaOH .
Le milieu que nous appelerons à ce stade de la
préparation, RP est stérilisé par filtration sur millipore
et conservé à + 4 0 C cinq à sept jours. Il sert essentielle-
ment au rinçage des hématies non infestées.
Le milieu complet
Pour la culture du parasite ou le rinçage des
hématies parasitées,
le milieu RP doit être supplémenté avec
du sérum humain A+.
Le sang du groupe A+ prélevé sans anticoagu-
lant nous est fourni par le centre de transfusion sanguine
de Marseille. Le flacon de 500 ml, contenant en moyenne
300 ml de sang est laissé à + 4 0 C,
24 à 48 h afin de favo-
.../ ...

---

- 104 -
riser la formation d'un caillot de sang assez consistant.
Le sérum est prélevé et centrifugé dans des tubes stériles
de 50 ml à 2000 tours/minute pendant 10 minutes.
Il est en-
suite réparti dans des tubes à centrifuger à usage unique
stériles à raison de 8 à 9 ml par tube et conservé à-20° C.
Lorsqu'il s'agit de l'entretien de la souche,
nous utiliserons le milieu RP supplémenté par 10 % de H.S.
(humain sérum). Cependant, pendant les deux ou trois premiers
jours suivant la mise en culture d'une souche préalablement
congelée,
on utilise un milieu renfermant 15 ~b de H.S.
La quantité de milieu RP -
10 S préparé sera
juste suffisante pour deux ou trois jours d'entretien de la
souche. Le milieu RP ou RP -
10 S s'alcalinise facilement à
partir du quatrième jour lorsqu'il est laissé à la chambre
froide
(+ 4° cl.
( RP - 10 S = milieu RP contenant 10 % de
sérum humain.)
B - ~SAN~NON INFECTE
D'une manière générale,
le sang utilisé pour
la culture de Plasmodium falciparum doit être compatible avec
le sérum humain utilisé pour supplémenter le milieu R.P. Dans
notre expérimentation,
le sang sera donc du groupe A+ et col-
lecté sous anticoagulant C.P.D.
(acide citrique,
citrate de
sodium,
phosphate monosodique, glucose anhydre).
Il peut être
utilisé deux semaines après sa date de péremption. Pour fa-
ciliter le prélèvement au fur et à mesure des besoins,
le
contenu de la poche est transvasé dans des flacons de 100
.../ ...

---

-
105 -
à 250 ml. L~ consery~t~on se ~a~t à t
4 Q C,
Ce s~ng est centr,i;fuge ClAAs Cles tu!;>es à usage
uniq,ue ( Falcon ) à teI!\\/?ér~ture W\\b~ante à. 2 000 tours /?~r mi~
nute /?endant 7 à 10 minutes afin de sé/?~r~ les éléments figurés
Clu sang. Le surnageant a~si q,ue la couche de globules blancs
sont /?rélevés avec des pi/?ettes Pasteur stériles. Le culot de
globules rouges est mis en sus/?ension dans un volume égal de
RF. On procède ensuite au rinçage des hématies trois fois, en
centrifugeant comme il est indiqué ci-dessus.
Enfin, le culot de cellules est définitivement
mis en suspension dans un volume égal de RP - 10 s.
Origine de la souche
La souclle de Plasmodium falciparum FCC2 que nous
utilisons a été isolée le 30.09.80 /?ar le Dr Douvy ( I.M.S.S.T.A
du Pharo à Marseille) qui en a assuré la culture, à partir d'un
européen en provenance du Niger et n'ayant pas subi de traitement
avec les antimalariques connus. Il s'agit donc d'une souche sau-
vage non chloroquinorésistante.
Nous en avons effectué une subculture à partir
d'une boIte de Pétri de 60 mm de diamètre contenant environ
1 % d'hématies parasitées. Le protocole décrit a été suivi pour
l'entretien de la souche au laboratoire.
.../ ...

---

-
106 -
C - ENrnETIEN DE LA SOUCHE
Le contenu de la boite de pétri est centri-
fugé à 1800 tours/minute pendant sept à huit minutes. Le
surnageant est rejeté et le culot d'hématies parasitées re-
pris dans un égal volume de RP -
la S. Des frottis sont réa-
lisés afin d'évaluer la parasitémie de la culture en décomp-
tant au moins 2000 hématies.
Le sang est ensuite dilué avec
des hématies neuves de façon à réduire le pourcentage de
globules rouges parasités à 0,5 % environ. On prépare des
dilutions qui vont servir à la culture proprement dite. Pour
cela,
l
ml de sang dilué est introduit dans un tube à cen-
trifuger stérile contenant 5 ml de RP -
la S. Cette suspen-
sion est déposée à raison de 1,5 ou 4,5 ml dans des boites
de pétri de 35 ou 60 millimètres de diamètre. Ces boîtes sont
placées dans la jarre à anaérobiose puis on réalise une at-
mosphère réduite en oxygène nécessaire à la croissance du
parasite. L'incubation se fait à 37° C.
Régénération quotidienne du milieu de culture
La multiplication du parasite nécessite un
changement régulier du milieu de culture,
au moins une fois
toutes les 24 h. Les boites sont retirées de là jarre et
laissées au repos un quart d'heure environ,
afin de permettre
la reformation du tapis cellulaire désorganisé par la sortie
des boîtes de la clôche. Après avoir incliné la boite,
on
enlève le milieu de cultu~e avec une pipette Pasteur stérile •
.../ ...

---

-
107 -
Des frottis de contrôle sont raits pour déterminer le pour-
centage d'hématies parasitées;
1,5 ou 4,5 ml de RP -
la S
sont ajoutés respectivement dans les boîtes de 35 ou 60 mm.
On replace ces dernières dans la jarre et on incube à 37° C
comme précédemment.
D - ASPECT ET EVOLUT ION DE LA CUITURE
D' une I;lanière générale,
les globules rouges
forment après quelques minutes d'incubation à 37° C, une
couche cell~laire très nette au fond de la boîte de Pétri.
En partant d'une Parasitémie de 0,5 % envi-
ron,
la culture peut atteindre en trois jours, une parasi-
témie de 4 à 5 %. En cinq à six jours,
le pourcentage d'hé_
maties parasitées dépasse généralement la % et la culture
peut facilement dégénérer.
Lorsqu'une culture 'est laissée à l'étuve pen-
dant 48 h sans changement de milieu,
le parasite dégénère
inéluctablement.
Il est donc nécessaire pour l'entretien de
la souche, de partir d'une culture très diluée. Au départ,
il est préférable d'avoir une parasitèmie de 0,5 % au maxi-
mum 1 ensuite,
il faut apporter des hématies fraîches tous
les trois ou quatre jours suivant l'évolution de la culture.
Cette culture représente un matériel de choix
pour l'étude et l'observation des formes évolutives érythro-
cytaires du Plasmodium falciparum à l'exception des gamèto-
cytes qui nécessitent des conditions assez particulières
( 20)
.../ ...

---

1
1
j
1
- •
~, •..
.,
1
j
1
1
1
1
,

---

-
108 -
Après fixation par le méthanol,
les frottis
sont directement colorés avec le giemsa. Les différentes
formes évolutives observées sont
~~_~~~E~~~~!!~ : Le parasite à l'intérieur de l'hématie
a un contour très net ;
le noyau est toujours rouge,
le cy-
toplasme bleu et la vacuole incolore. Le trophozoIte peut
présenter deux noyaux. On remarque la présence de nombreuses
hématies polyparasitées ;
nous appelerons Tn = l, l'hématie
renfermant un seul trophozo'ite, Tn + 2, le globule rouge in-
festé par plusieurs parasites.
le schizonte
( 8chz.
)
: Le parasite n'a plus de contour
précis et occupe fréquemment la totalité de l'hématie. La
chromatine se divise en plusieurs fragments. Cette forme très
caractéristique, distincte du trophozo'ite évolue en ~~~E~
~~_~~~~~=, dernier stade de l'évolution du parasite en cul-
ture. Après éclatement du corps en rosace,
on observe sur le
frottis,
des amas de pigments,
refringents.
Notons enfin, que dans ces conditions d'ex-
périmentation,
les différentes formes évolutives du parasi-
te, présentent des dimensions nettement supérieures aux di-
mensions du même parasite rencontré chez un malade.
E - CONSERVATION DE LA SOUCHE DE
R.AS/oI)DIlM FALCIPARUM
La culture in vitro du Plasmodium falciparum
permet d'obtenir le parasite en abondance.
Il est donc in-
dispensable de rechercher les moyens de le conserver pour
le remettre en culture au gré des besoins. Nous avons appli-
.../ ...

---

-
109 -
qué la technique préconisée par Jensen et collaborateurs
( 44 ).
Elle consiste à conserver le parasite dans
un cryoprotecteur par congélation directe dans l'azote li-
quide (- 196 0 clou l'alcool maintenu à très basse tempéra-
ture.
1. Le cryoprotecteur :
solution l
: mannitol à 4,2 % dans Na Cl 0,9 %
----------
ê~!~!!~~_!!~~!~_~~_~~~EE~!~~!~~E: On ajoute 70 ml de gly-
cérol à 180 ml de la solution I. On stérilise par filtration
sur millipore (0,45 ~).
2.
préparation du parasite en vue de la congélation:
Le contenu des boites de pétri renfermant 3 à 5 % de globules
rouges parasités est centrifugé à 1800 tours/minute pendant
7 à la minutes ;
le surnageant est rejeté et le culot repris
par un volume égal de cryoprotecteur.
On laisse reposer 5 à
la minutes à température ambiante. On répartit ensuite dans des
tubes à congélation stériles
(capacité: 2 ml)
à raison de
0,5 à 0,8 ml par tube. Ces tubes sont directement plongés
dans l'azote liquide.
3. Décongélation et mise en culture
Les tubes sortis de l'azote liquide sont plongés directement
dans un bain marie à 37 0 C. Le contenu est centrifugé à
1500 tours/minute pendant 5 minutes ;
le surnageant est éli-
miné et le culot remis en suspension dans un volume éga:. de
.../ ...

---

-
110 -
solution de Na Cl à 3,5 % stérile. On centrifuge de nouveau
et on répète l'opération en rinçant le culot d'hématies pa-
rasitées avec le milieu de culture complet: RP - 10 S.
En
fin de rinçage,
les cellules sont remises~nsuspension dans
un volume égal de RP -
15 S.
4.
Evolution de la culture
L'application de cette technique donne des résultats varia-
bles.
En effet,
on assiste à un éclatement des globules rou-
ges lors de la centrifugation, notamment ceux qui sont para-
~tés. Il s'ensuit une très faible parasitèmie de départ, ce
qui permet un démarrage très lent de la culture.
F .. APPLICATIONS
1. Sensibilité de la souche au sulfate de chloroguine
Il est nécessaire lorsqu'on a réussi la culture in vitro d'une
souche donnée de Plasmodium falciparum, d'étudier sa sensi-
bilité à la chloroquine. On a remarqué dans certains cas que
la culture continue de ce parasite peut induire une résistance
à la chloroquine (
36
).
Notre but étant la mise au point d'une métho-
dologie permettant de tester des substances chimiques de syn-
thèse ou d'origine végétale,
il est indispensable de commen-
cer ce travail par un produit de référence. Nous appliquerons
la méthodologie préconisée par Trager et collaborateurs
(70)
.../ ...

---

-
111 -
43,6 mg de sulfate de chloroquine
(Spécia)
sont dissous dans la ml de RPMI
(milieu sans bicarbonate).
Cette solution est diluée au centième (1 ml + 99 ml de RPM
sans bicarbonate). La solution ainsi diluée est filtrée sur
millipore (0,45 um). On procède ensuite à~a préparation des
différentes dilutions qui vont contenir des quantités décrois-
santes de nivaquine.
Concentration Cl
: On prend 0,1 ml de la solution stérile
et on ajoute 19,9 ml de RP -
la s.
Concentration C : La concentration Cl est diluée au demi
2
5 ml de Cl + 5 ml de RP -
la s.
Concentration C : La concentràtion Cl est diluée au cinquième
3
2 ml de Cl + 8 ml de RP - la s
Concentration C
: Dilution de Cl au dixième :
l ml de Cl
4
+ 9 ml de RP -
la s.
On a donc
Cl ~ 0,5 nmole/ml
(0,218 ,ag/ml)
C
~
0,25 nrnole/ml
(0,109 /lg/ml)
2
C
~
0, l
nmole/ml
(0,0436,ag/ml)
3
C
~
0,05 nrnole/ml
(0, 0218 ,ag/ml) .
4
1.2. Conduite de l'exDérience
----------------~-------
La culture du parasite se fait dans des boi-
tes de pétri de 35 mm de diamètre. La technique a été lé-
.../ ...

---

-
112 -
gèrement modifiée pour faciliter les opérations. L'expérience
commence 24 h après la mise en culture, au moment du change-
ment de milieu.
On détermine la parasitèmie de départ dans
trois boites témoins.
Il est préférable au début du test, que
cette parasitémie soit très inférieure à 1 % pour éviter une
multiplication .trop rapide du parasite.
Pour mieux expliquer l'opération, nous pren-
drons l'exemple de la concentration Cl.
Lors du changement de milieu, on choisit trois
boites au hasard et on ajoute dans chacune de ces boites,
1,5 ml de cette concentration Cl.
On incube à 37° C. Vingt
quatre heures après, on change de nouveau le milieu de cul-
ture en ajoutant 1,5 ml de la concentration Cl.
On incube
de nouveau à 37° C pendant 24 h.
Le principe est donc de laisser le produit
au contact du parasite durant 48 h. Le même protocole sera
exécuté successivement pour toutes; les concentrations.
1.3. Résultats
La lecture des résultats se fait 48 h après
par l'examen des frottis et le calcul du taux de
parasitémie,
le pourcentage d'hématies parasitées correspond
à la moyenne des trois boites ayant reçu la même concentra-
tion en sulfate de chloroquine.
.../ ...

---

- 113-
Témoins
-------
Tn = 1
Tn~ 2
Sch
C.R.
n
N
Taux de parasi-
témie en pourcen-
tage ~n %
Essai 1
102
18
70
3
193
5500
3,5
Essai 2
96
14
49
1
160
4500
3,55
Essai 3
80
10
48
2
140
4000
3,5
Concentration C
: 0,5 nmolejml
---------------1---------------
Tn = 1
Tn~ 2
Sch
C.R. n
N
%
Essai 1
7
0
2
0
9
2700
0,3
Essai 2
8
0
0
0
8
2600
0,3
Essai 3
5
1
3
0
9
3000
0,3
~~~~~~!~~!!~~_C2 .:._Q!.~2_~~~~~~~~
Tn = 1
Tn ~ 2
Sch
C.R. n
N
%
Essai 1
28
0
0
0
28 4400
0,6
Essai 2
2
5
10
0
17 3000
0,5
Essai 3
8
1
7
0
16 3000
0,5
~~~=~~!~~!!~~_C3 ~_Q!L~~~~~~~~
Tn = 1
T~ 2
Sch
C.R. n
N
%
Essai 1
59
4
12
0
65 3000
2,1
Essai 2
41
12
9
0
62 3700
1,6
Essai 3
50
9
14
6
73 4000
1,8
Tn = 1
Tn) 2
Sch
C.R. n
N
%
Essai 1
55
11
19
0
85 2700
3
Essai 2
98
18
30
0
146 4800
3
Essai 3
64
20
46
0
130 4200
3
... j •..

---

-
114 -
concentration en sulfate de
Pourcentage de G.R.
chloroquine : nmole/ml
parasités
0,5 nmole/ml
0,3
----------------------------- --------------------
0,25 nmole/ml
0,53
~-------------------------------------------------
0,1
nmole/ml
1,82
~-----------------------------~-------------------
0,05 nmole/ml
3
f---------------------.--------- f--------------------
Témoins :
(0 nmole/ml)
3,5
Ces résultats peuvent être interprétés par
une courbe qui est la relation graphique entre les pourcen-
tages de globules rouges parasités par rapport au témoin en
fonction des concentrations en sulfate de chloroquine.
Elle
permet de déterminer les concentrations inhibitrices de la
culture :
C.I.
et C.I.
50
gO
C.I.
= concentration qui inhibe 50 % des parasites
50
C.I.
= concentration qui inhibe gO % des parasites.
gO
Pour la souche étudiée
la C. 1. 50 = 0,105 nmole/
ml
la C. 1. gO = 0,437 nmole/
ml
Cette exploitation des résultats nous semble
plus complète que la simple analyse ou comparaison des pour-
centages d'hématies parasitées pour chaque concentration
.../ ...

---

ETUDE IN VITRO DE LA SENSIBILITE A LA CHLOROQUINE DU PLASMODIUM
FALCIPARUM
Parasitémie
(% d'hématies parasitées)
4
3
= 0,105 nmole/ml
2
(0,0457 pg/ml)
1
= 0,437 nmole/ml
lO,19 ,.,.gJml)
°
0,
t.
,
,
c'oncentration:
en
nmoles/ml
Figure 15

---

-
115 -
testée.
Dans un travail récent, LE ~
et collabora-
teurs ont fait la même interprétation des résultats en utili-
sant non pas des boites de pétri comme enceintes de culture,
mais des cupules multiples pour culture cellulaire
( 4 3
).
Ces courbes,
lorsqu'elles sont établies pour
différentes substances chimiques, permettent d'avoir des va-
leurs comparables
(C.I.
).
SO
2 - Activité des substances et fractions isolées de Bidens Pilosa
Rappelons que la culture de cette souche de
Plasmodium falciparum,
s'inscrit dans un travail d'ensemble
portant sur l'étude de l'activité antiparasitaire de cette
plante.
2. L
Activité de la phénylheptatriyne
C'est un polyacétylène qui présente un spectre
d'activité assez large sur les parasites.
Il est donc intéres-
sant de rechercher une év~ntuelle activité antipaludique in
vitro.
préparation des dilutions
20 mg de produit A sont dissous dans 0,1 ml
d'éthanol pur,
le tout est porté à 20 ml de RPM~ (solution
mère :
Img/ml).
0,3 ml de la solution mère + 19,7 ml de
CQD~~D~~ê~~QD_Cl
RP -
10 S
.../ ...

---

- 116 -
Concentration C
0.2 ml de la solution mère + 19.8 ml de RP-10S
-------------- 2-
Q~~~~~~~~~~~~-Q3­ dilution de la concentration C au demi
2
. ,
Q~~~~~~~~~~2~-Q4­
dilution de la concentration C
au cinqu~eme
2
Q~~~~~~E~~~~~-Q5-
dilution au dixième de la concentration C2
On a
C
=
1
15 l'g/ml
C2 = 10 ,ug/ml
C
=
5 ,ug/ml
3
C
=
2 l'g/ml
4
C
=
1 ,ug/ml
5
Résultats
Témoins
-------
Tn = 1 Tn) 2
Sch
C. R.
n
N
Parasitémie (%)
Essai 1
114
22
35
2
173
3500
1,,9
Essai 2
110
25
40
0
175
3500
5
Essai 3
90
28
32
2
152
3000
5
Tn = 1 Tn~ 2
Sch
C.R.
n
N
Parasitémie (%)
Essai 1
21
4
0
0
25
5000
0,5
Essai 2
22
6
0
0
28
5000
0.56
Essai 3
18
2
0
0
20
5000
0,4
Q2~~~~~~~~~~~_Q2_=_lQ_~L~!
Tn = 1 Tn~ 2
Sch
C.R.
n
N
Parasitémie (% )
Essai 1
31
2
15
0
48
5000
0,96
Essai 2
13
1
9
0
23
3000
0.65
Essai 3
28
3
9
0
40
4000
1
... / ...

---

- 117 -
Q~~~~~!~~!!~~_Q3_=_2_f.~L~~
Tn = 1 Tn~ 2
Seh
C.R.
n
N
Parasitémie (% )
Essai 1
52
10
20
2
84 4500
1 ,86
Essai 2
46
4
26
0
76 4000
1 ,9
Essai 3
65
7
22
0
94 5000
1 .88
Q~~~~~!~~!!~~_C4_=_~_~gL~~
Tn = 1 Tn,> 2
Seh
C.R.
n
N
Parasitémie (% )
Essai 1
117
12
23
0
152 5000
3
Essai 2
60
8
30
0
98 4000
2,45
Essai 3
105
17
34
2
158 5000
3,1
Q~~~~~!~~!~~~_Q5_=_1_~gL~~
Tn = 1 Tn> 2
Seh
C.R.
n
N
Paras.i témie ( %)
Essai 1
130
31
26
2
189 4500
4.2
Essai 2
98
17
18
3
136 3500
3,8
Essai 3
117
21
29
3
170 4000
4.2
CONCENTRATIONS EN
POURCENTAGE D'HEMATIES
PRODUIT A ( ~g/ml)
PARASITES (MOYENNE)
15
0.48
10
0.87
5
1 .88
2
2.85
1
4,06
Témoin
4,96
... / ...

---

ACTIVITE IN VITRO DE LA PHENYLHEPTATRIYNE ~R LE PLASMODIUM
FALCIPARUM
Parasitémie
(% d'hématies parasitées)
s
4
3
C.I SO = 3,1 ,11g/m1
2
1
= lS
,ug/m1
~i--..~
o
1
Figure 16

---

...; 118 -
Cette substance A prés ente une certaine a::tivité sur la cul ture du
Plasmodium falciparum, en effet
C.I'
substance A
3,1 pg/ml
50
- - - - - - - - - - : - - - - - - - - : 67,8
C.1.
sulfate de chloroquine
0,0457 l'g/ml
50
C.I.go substance A
15 pg/ml
- - - - - - :
78
C. 1. 90 sulfate de chloroquine
0,19 ,ug/ml
la chloroquine a une activité environ 70 fois plus forte que la substance A.
la phénylheptatriyne est le seul produit isolé de Bidens pilosa qui inhibe
la mul tiplication in vitro du Plasmodium falciparum. Les autres produits ob-
tenus et fractions ont été essayés, mais se sont avérés inactifs.
3 - Effet de l'éthanol sur la croissance du Plasnodium falcipa:cun
Le produit A
(phénylheptatriyne) ainsi que toutes
les substances et fractions testées insolubles en solution aqueuse ( milieu
RPMI ), ils ont été préalablement solubilisés dans l'éthanol. Il est donc
indispensable de savoir les limites de son utilisation dans les essais in
vitro.
Nous avons testé l'éthanol à deux concentrations pour
connaitre l'effet sur la croissance du Plasmodiumfalciparum.
Préparatio~ de~~ilutio~
On réalise d'abord une dilution au 1/100 : 0,1 ml
d'éthanol absolu + 9,9 ml de RPMI ( milieu sans bicarbonate ) .
... / ...

---

-
119 -
~ère
__
" ' : : ' ~ " l " " _ o : " " " dilution
' : : '
- ~ _
testée
~
- ~ ~ . ~
0,2 ml de la dilution au 1/100 + 19,8 ml de
RP "" la S.
concentration en éthanol : ~ x 1~0 = 1/10 000
( 1 pour la 000 ml ).
0,4 ml de la dilution au 1/100 + 19,6 ml de
RP -
la S.
Concentration en éthanol
1/5 000
( 1 pour 5 000 ml )
RESULTATS
Témoins:
---~-..-
Tn = 1
Tn,> 2
Sch~· C .. R.
n.
N
%
essai 1
169
44
72
7
292
4 000 7,3
essai 2
181
26
69
4
280
4 000
7
essai 3
173
48
97
8
326
4 500 7,2
Ethanol : 1 pour la 000 ml
Tn = 1
Tn ~ 2 Sch
C.R.
n.
N
%
essai 1
115
36
53
la
2143000
7,1
essai 2
183
26
66
14
289 4 000
7,2
essai 3
175
37
97
6
315 4 500
7
, .. / ...

---

- 120 -
Eth.anol. ; l
pour 5 000 ml.
Tn = -l
Tn
2
Sch
C.R.
n
N
%
essai 1
108
34
74
1
217 3 500 6,2
essai 2
115
28
64
a
207 3 500 5,9
essai 3
135
38
79
2
254 4 000 6,3
L'éthanol présente une action inh.ibitrice certai-
ne sur la croissance du parasite; en effet, à partir d'une con-
centration de 1 pour 5 000 ml on a une réduction d'environ la %
de la parasitémie par rapport aux témoins. Il est donc néces-
saire d'utiliser l'éthanol comme solvant de nos produits à des
concentrations inférieures à l pour 5 000 ml afin qu'il n'y ait
aucune interférence possible dans l'interprétation de nos ré-
sultats.

---

CONCLUSION
GENERALE

---

-
121
-
Bidens pilosa est une plante utilisée en Afrique Noire notan-
rœnt pour ses propriétés antiparasi taires. I.e but de notre travail a été
de rechercher dans qùelle mesure cet usage peut trouver une justification.
Nous avons entrepris dans un premier terrps une étude botanique
en répertoriant les espèces dU genre Bidens, les variétés de Bi<iens pilosa
éntmérées par Sherff et l'usage en médecine traditionnelle. cette étude nous
a amené à examiner les échantillons de Bidens pilosa dU Muséun d'Histoire
Naturelle de Paris.
Dans une seconde partie, nous avons fait le point sur les subs-
tances chimiques déjà isolées ou purifiées et sur leur activité phannacolo-
gique. Toutes les espèces de Bidens renferment de nanbreux dérivés polyacé-
tyléniques. Bidens pilosa renferme en outre des phytostérols : f3 sitostérol
et stil?l/lBStérol. Un certain ru:tri:>re de dérivés flavoniques et phénoliques ont
été caractérisés ou isolés de quelques espèces autres que Bidens pilosa.
la troisième partie expose notre contribution à l'étude chimi-
que et phannacologique antiparasi taire de Bidens pllosa.
.../ ...

---

- 122 -
L'extrait méthan:llique obtenu par lixiviation de la poudre de
feuilles, fleurs et akènes avec le MeOH 80 %, repris avec l'éther éthylique
1
a été successivement traité par NH 0H 5 % et KOH N. Pour notre étl.xle chimi-
4
que, nous avons retenu la phase soluble aJm:lniaque et la fraction résicluel-
le soluble éther.
La purification des trois principes chimiques a été réalisée
par chranatographie sur gel de silice. A partir de la phase soluble amno-
niaque, nous avons isolé le produi t N. tandis que les produits A et C ont
été purifiés à partir de la fraction soluble éther.
L'analyse élémentaire de la substance N, ses spectres infra-
rouge et de masse, nous ont permis d'identifier N à l'acide pa1rni tique.
Le point de départ de l'étude de l'identification du produi t A
a été son spectre ul tra-violet qui se confond avec celui de la phénylhepta-
triyne et ses dérivés. La confirnation de cette structure phényl l - hepta-
triyne 1 - 3 - 5 a été obtenue grâce aux spectres loR., R.M.N. de proton et
de caroone 13 et le spectre de masse.
Produi t en quanti té iIrI>ortante dans l' extrai t de départ : so-
luble méthanol, majoritaire dans la phase soluble amx:Jniaque, l'acide pal-
mitique n'a, à notre connaissance, été signalé dans auc~ autre espèce du
genre Bidens. Par contre, la phénylheptatriyne ( P.H.T. ) est un polyacé-
... / ...

---

-
123 -
tylène déjà décrit et carmm aux espèces du genre Bidens. Notre étude nous a
permis d'attribuer les glissements du spectre R.M.N. de l3C et les pics du
spectre de masse.
Dans un premier tenps, nous avens évalué l'activité antiparasi-
taire in vitro des différents extraits sur un cestocle : Hymenolepis nana var
fratema.
un rtlizopode : Entarroeba histolytica. un flagellé uro-géni tal :
Trichc:rronas vap;inalis. En raison de leur activité, la phase soluble amoonïa-
que et la fraction résiduelle soluble éther ont été retenues pour une étude
plus poussée notarment par les essais des produits isolés de ces extraits.
L' activité in vitro des produits purifiés a été évaluée sur ces
trois parasi tes et sur un quatrième : Fasciola hepatica ( trématode ). Parmi
les trois substances, seule la phénylheptatriyne présente une activité anthel-
minthique assez significative ; après 24 heures, la C.L. ( concentration lé-
thale ) est respectivement de 10 et 50 ,ug/ml sur Bymenolepis et Fasciola. Son
activité protozoocide est environ vingt fois rroindre que le métronidazole.
sur Entaooeba C.M.I. = 50 ,uiJml, C.L. = 100 ,ug/ml
sur Trichcm:x1as C.M.I. = 100 ,ug/ml ; C.L. = 200 ,ug/ml
Les essais in vivo effectués sur HymenolepiS nana, Syphacia ob-
velata ( nematode ). Plasoodiun berghei ( sporozoaire ) n'ont pas pennis d'ob-
server d'activi té anthelminthique et antirnalarique significative .
.../ ...

---

-
124 -
CULTURE IN VI'1'H) III PI.ASKDItIt FAl.CIPAIllM
L'application de la récente techrûque de cul ture continue ( in
vitro J du Plasoodiun falciparun nous a permis d'obtenir un matériel adéquat
pour l'étude et l'observation des différentes fonœs évolutives érythrocy-
taires de ces parasites : trcphozoites ( Tn = l • Tn~2 J. schizcntes ( SCh J.
corps en rosace ( C.R. J. L'abondance du matériel nous a incité à conserver la
souche dans un cryoprotecteur par congélation directe dans l'azote liquide.
L'étude de la sensibilité de cette souche à la chloroqu:ne a per-
mis de calculer les C.I.
et C.I.
: concentration inhibitrice qui réduit de
50
90
50 à 90 % le pourcentage de parasitémie ( % d'hématies parasitées J par r-..p-
port à la cul ture télroin. Ce paramètre ( concentration inhibitrice J permet
d'avoir, lorsqu'on effectue un screening d'une série chimique. des va:eurs
cCllJlarables pour ces produits. Ainsi, la P.H.T. ( prenylheptatriyne J, seul
produit isolé de Bidens pilosa présentant une action inhibitrice sur :a cul-
ture de Plasnodiun falcipazun. a une activité environ 70 fois rroindre que le
sulfate de chloroquine.

---

\\
- 125 -
L'usage de Bidens pilosa pour ses propriétés pharmacologiques
antiparasitaires ne peut, à notre avis, être justifié d'une manière ration-
nelle pour deux raisons principales :
- Cette plante est utilisée sous forme de décocté ; or, la frac-
tion soluble eau provenant de l'extraction hydroalcoolique de la poudre de
feuilles, fleurs et akènes s'est avérée inactive sur les parasites.
- Les essais in vivo que nous avons réalisés, n'ont pas permis
de confirmer une activité antiparasitaire suffisamment efficace et satisfai-
sante pour justifier l'emploi de cette plante en médecine traditionnelle.
Lu et approtNé,
Lu et approtNé,
Le Président du Jury
Lelloyen
Professeur P. TIMJN-DAVID
Professeur J.P. CANO

---

-
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1
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Tiraqe effectué Q,ar le Service de Aepfoqragnie
de ja
Fo\\CUL Te ·je PHARMACie
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,
Bidens pilosa L. est une plante utilisée en médecine
traditionnelle en Afrique Noire dans le traitement des infec-
tions gastro-intestinales d'origine parasitaire et du palu-
disme.
L'étude chimique de cette plante a permis la purification
de l'acide palmitique, de la phénylheptatriyne et d'une
substance C non encore identifiée.
Les essais pharmacologiques ont permis d'observer une
activité antiparasitaire in vitro de la phénylheptatriyne sur
Hymenolepis nana.var fraterna,
Fasciola hepatica, Entamoeba
histolytica, Trichomonas vaginalis et plasmodium falciparum
en culture.
Ces essais ne semblent pas confirmer l'usage en médecine~:
traditionnelle de ~stte plante.
~I
1
MOTS CLES
Bidens pilosa L.
Acide palmitique
Phénylheptatriyne
Hymenolepis nana var. fraterna
Fasciola hepatica
Entamoeba histolytica
Trichomonas vaqinalis
Plasmodium falciparum
(
1-

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