UNIVERSITE DE MONTPELLIER 1
FACUL TE DE PHARMACIE
U.E.R. DES SCIENCES PHARMA-
CEUTIQUES INDUSTRIELLES
METABOLISME CUTANE D'UN MEDICAMENT ANTI-HERPETIQUE,
LA IODo-5-DESOXY-2'-CYTIDlNE (IDC)
ETUDE IN VITRO CHEZ LA SOURIS, LE RAT
ET L'ESPECE HUMAINE
THESE
présentée à la Faculté de Pharmacie de MONTPELLIER
en vue d'obtenir
le Grade de Docteur d'Etat ès Sciences Pharmaceu.tiques
par
Bernard MBATCHI
Diplômé d'état de docteur en pharmacie
Diplômé de l'Institut de Pharmacie Industrielle de Montpellier ([PIM)
D.E.S.S. des sciences pharmaceutiques industrielles
Certificat d'études pharmaceutiques spécialisées de santé publique (CEPS)
Attaché de l'Institut d'Hématologie (Coagulation-cytologie), Montpellier
publiquement soutenue le Il octobre 1984 devant la Commission d'Examen
JURY:
Président :
J. L
CHANAL,
Professeur
Assesseurs :
R.
MARIGNAN,
Professeur
J. P.
BALI,
Professeur
D.
SINCHOLLE,
Docteur ès Sciences pharmaceutiques
A.
BOULANGER,
Docteur en Médecine

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~IVE~SITE DE MONTPELLIER I
FACULTE DE PHARMACIE
HONORARIAT
Professeur M. MOUSSERON
M. DOLIQUE
M. JAULMES
M. SUSPLUGAS
M. GRANGER
M• RICHARD, Ancien Recteur
. EMERITAT
Professeur SASON, Président honoraire de l'Université
DOYEN : Monsieur le Professeur ORZALESI
INSTITUT DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
DIRECTEUR : Monsieur le Professeur CHANAL
INSTITUT DES SCIENCES APPLIQUEES A LA PROTECTION DE L'HOMME
DIRECTEUR : Madame le Professeur BRUN
INSTITUT EUROPEEN DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES INDUSTRIELLES
DIRECTEUR : Monsieur le Professeur DEuONCA
PROFESSEURS
M.
ANDARY Claude
Botanique et Cryptogamie
M.
A'I'l'ISSO Michel
Bactériologie et Biologie cellulaire
Mlle BARDET Lucette
Physique industrielle pharmaceutique
M.
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Biochimie
M.
BASTIDE Jean-Marie
Immunologie, Virologie, Parasitologie
Mme
BASTIDE Madeleine
Immunologie
M.
BERLAN Jacques
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M.
BONNE Pierre
Physiologie
M.
BONTOUX Jean
Hydrologie et Hygiène

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M.
BOUCARD Maurice, Doyen Honoraire
Pharmacodynamie
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Chimie analytique
M.
CABANIS Jean-Claude
Chimie analytique
M.
CASTEL Jean
Chimie thérapeutique
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CHANAL Jean-Louis
Biophysique
M.
CHAPAT Jean-Pierre
Chimie Organique Pharmaceutique
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Technique Pharmaceutique industrielle i
M.
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Pharmacodynamie
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FOURASTE Isabelle
Pharmacognosie
M.
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Biophysique
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GRAS Georges
Toxicologie
Mlle HAMELLE Geneviêve
Toxicologie
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BOGUET Robert
Biochimie
M.
JACOB Maurice
Pharmacie Galénique
M.
LALAURIE Marc
Anatomie, Physiologie humaine
Mlle MANDROU Bernadette
Chimie analytique et Bromatologie
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Physique
Mlle MASSE Jacqueline
Chimie générale et minérale
M.
MESTRES Robert
Chimie appliquée à l'expertise
M.
ORZALESI Henri, Doyen
Chimie thérapeutique
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Immunologie
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PELLECUER Jacques
Pharmacognosie
M.
PRIVAT Guy
Botanique et Cryptogamie
M.
PUECH André
Pharmacie Galénique
M.
RAMBAUD André
Hydrologie et Hygiêne"
M.
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Chimie organique Pharmaceutique
M.
SERRANO Jean-Jacques
Pharmacodynamie
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SIMEON DE BUOCHBERG Michêle
Bactériologie
Mlle SOLERE Maryse
Biochimie
Mme
SOULIE Berthe
Bactériologie
Mme
VAILHE Evelyne
Législation et Déontologie Pharmaceu-
tique
MAITRES-ASSISTANTS
M.
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Chimie Générale et Minérale
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ALLEGRI NI Jeanine
Zoologie Parasitologie
Mlle ARNAVIEILHE BONY
Biochimie
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Pharmacie Chimique
M.
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Physique Pharmaceutique

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M.
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Physique
M.
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Pharmacie Chimique
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Chimie analytique et Toxicologie
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Chimie analytique et Toxicologie
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Physique Pharmaceutique
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Immunologie, Virologie, Parasitologie
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Chimie Appliquée à l'Expertise
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CHARLOT Colette
Chimie Analytique et Toxicologie
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Pharmacie Chimique
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Pharmacie Galénique
Mlle ENJALBERT Françoise
Botanique
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Chimie Analytique
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Physique industrielle Pharmaceutique
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FRANCOIS Claude
Chimie Analytique et Toxicologie
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FRANCOIS Colette
Contrôle Pharmacodynamique des Médi-
ments
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FULCRAND Pierre
Pharmacie Chimique
Mlle GALEN Marie-Louise
Pharmacie Galénique Industrielle
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GRIGNON Henri
Hygiène
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GRIMMOMPREZ Louis
Biochimie
Mlle GUENOUN Françoise
Pharmacie Galénique et Déontologie
Mme
GUIBAL Jacqueline
Immunologie, Virologie
Mme
GUIBERT Marie-Sophie
Physique
Mme
ILLES Suzanne
Chimie Analytique et Bromatologie
Mme
JAN l cor Marguerite
Physiologie Pharmaceutique et Histolog
M.
JOACHIM Joseph
Pharmacie Galénique
Mme
JOACHIM Gisèle
Pharmacotechnique
M.
LASSERRE Yves
Pharmacie Galénique
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LIUKIUS Martine
Pharmacodynamie
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Biophysique
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MALLIE Michèle
Immunologie
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MAURY Luc
Physique industrielle Pharmaceutique
M.
MILHAVET Jean-Claude
Chimie organique
M.
MOOAT Guy
Physiologie
Mme
MONLEAUD Jacqueline
~harmacie Galénique
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PASSET Jeanne
Pharmacie Industrielle
Mme
PICor Bernadette
Hydrologie et Hygiène

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M.
PROM Thuch
Biochimie
Mme
RAMBAUD Joëlle
Chimie Minérale
-Chimie théorique - chimie physique
Mme REMY HEINTZ Nicole
Biochimie
Mme RICHARD Anne
Botanique
M.
ROBBE Yves
Chimie Organique Pharmaceutique
M.
ROUSSEL Jean-Louis
Botanique
MIe SABLAYROLLES Claire
Chimie Organique Pharmaceutique
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Microbiologie
M.
SUSPLUGAS Paul
Pharmacognosie
M.
TEP Yutthay
Chimie Analytique et Toxicologie
Mme TEP Aline
Toxicologie
M. - TEROL Alain
Chimie Générale et Minérale
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TEULADE Jean-Claude
Chimie Organique
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UCCELLI Gérard
Pharmacodynamie
MIe VIE Marie-Thérèse
Physique Pharmaceutique
Mme ZUCCARELLI Monique
Bactériologie, Zoologie.

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A
JOSEPHINE
GJr.a.rld- Pèlte LI BALMONI
Mon a66ecUon
Ma pe~~e
SASSE-FANIE
MES
PARENTS
Cet ..i.~tant
Ce c.âli.n
de bonheuJr.
MES AMIS
Mon J.>ouveI'ÛJL

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J'exprime toute ma gratitude à Me6~ie~ Paul et
B~d CHAUVIN pour m'avoir donné Z'occasion de découvrir
~ recherche appZiquée.
Qu'iZs me fassent Z'honneur d'accepter ce
remerciement.

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A MuûeuJr..6
l.L. CHANAL
V.
SINCHOLLE
R.
MARIGNAN
l. P. BALI
Madame
A.
BOULANGER
Ce travail, m'a été confié à la fin de l'hiver 1981 par
les Labo~o~U CHAUVIN-BLACHE et a été effectué pour un tiers
dans le Laboratoire de Biophysique de la Faculté de Pharmacie de
Mbntpellier, et pour le reste au sein des Laboratoires CHAUVIN-
BLACHE.
Le PJt06U.6eWL CHANAL m'a ouvert les portes du Laboratoire
de Biophysique,
me fait un grand honneur en présidant ce Jury de tMse.
Je veux lui exprimer ce jour toute ma gratitude pour ses
compétences, sa sympathie, son exhortation permanente à la réussite.
Les mots demeurant quelquefois avares, ma sensibilité reste juge.
M. SINCHOLLE, en me proposant le présent sujet, m'a fait
confiance.
J'esp~re ne pas l'avoir trahie et je veux ici lui signifier
mon remerciement le plus sinc~re et, s'il le permet, mes amitiés.
Tout au cours de mes travaux, son dynamisme, l'efficacité de ses
compétences, mais aussi son doigté dans la relation humaine, ont
constitué à mon endroit, au sein des Laboratoires, un réconfort
tr~s puissant.

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Le PJto6e,Me.UIl. MARIGNAN me fait également grand honneU1'
en prenant place à ce Jury.
L'étendue de ses connaissances, ses indications discrètes
comme son sourire, ont souvent été à mon égard d'une grande valeU1'.
Je veux ici exprimer ma reconnaissance au PJto6e,Me.UIl. BALI
de qui j'ai souvent profité du conseil avisé.
Sa gentillesse, tout comme ses compétences en enzymologie,
ont toujOU1'S suscité en moi une grande admiration.
Ce document lui est également dédié.
Le Vocte.UIl. BOULANGER, Chef de Clinique de Dermatologie,
me fait un grand honneur en acceptant de juger ce travail. Et c'est
avec le sourire aux lèvres qu'elle me reçut dans son Service.
Qu'eUe soit assurée en retoU1' de m::l sympathie et de mon
remerciement sincère.

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A VOU6 toU6, CHAUVIN-BLACHE, qui m'avez entouré pendant
trois ans.
La réussite de ce travail est aussi la vMre. Et je me
tourne vers :
C~tian FONTAINE a participé à l'étude de résorption
percutanée de l' IDC chez le rat.
Q;u'il soit encore aujourd'hui assuré de mon amitié.
c'est grélce
à JectYJ.-Pa..6ca1. CONVUZORGUES que j'ai pu me
procurer les échantillons de peau humaine.
Ma reconnaissance s'ajoute ici à notre relation amicale.
Manie-Jo~é BALMEFREZOL m'a apporté son concours pour la
• réalisation des contr~les analytiques.
Q;u'elle soit assurée de ma pensée sincère.
Mudamu Anne-Manie MILHAUV,
M.i.chèle BONNET et
MaJttine EYSSAVE ont oeuvré pour documenter ce travail.
Mon souvenir reste posé sur elles pour leur disponibilité
et leur sympathie.
Beaucoup ne trouveront pas leur nom transcrit ici.
Pourtant, ma pensée les édaire autant.

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Je voudrais remercier égaLement Madame CASSANAS
du Laboratoire de Physique IndustrieLLe pour son aide précieuse
dans L'anaLyse statistique.
Je n'oubLierai pas ici Le personneL du Laboratoire
de Biophysique qui, Lui aussi à sa manière, a su m'entourer.

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1 - La MALADIE de l' HERPES

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La iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IDC) est une substance
médicamenteuse des Labo~o~e6 Phakmaceutique6 CHAUVIN-BLACHE,
active dans le traitement des infections herpétiques oculaire,
cutanée et muqueuse.
Comme la iodo-5-désoxy-2'-uridine (IDU) dont elle dérive
directement, l'IDC est un analogue structural de la thymidine et
son mode d'action pharmacobiochimique antiviral est celui des
nucléosides pyrimidiques de synthèse (antipyrimidines).
Il s'agit d'une interaction drogue-virus (enzymes induites)
intracellulaire au niveau des sites assiégés par le virus herpétique,
sites qualitativement modifiés par l'activité de l'infection (lésion,
inflammation, •.• ), et cette interaction est susceptible d'influencer
la biodisponibilité des agents topiques médicamenteux.
Cependant, devant une inconnue, la nature et éventuellement
le degré de l'intervention du site (ici~ la peau) dans le devenir du
médicament et après avoir abordé l'évaluation de la résorption
percutanée de l'IDC chez le rat sans poil atrichis, nous avons
envisagé de déterminer in vitro le rdle des enzymes cutanées (cytidine
désaminase, uridine nucléosidase) dans le métabolisme de l'IDC chez
deux modèles animaux, la souris hairless, le rat atrichis, et chez
l'espèce humaine.
un certain parallèle dans des conditions identiques est
établi avec la biotransformation de l'IDC au niveau rénal chez la
souris.

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---

l
A - L'HERPESVIRUS SIMPLEX (HSV) OU VIRUS DE L'INFECTION HEPETIQUE
HUMAINE
1 - Généralités sur l'herpesvirus
Appartenant à la famille des Herpesvirus ou Herpesviradae,
l'HSV partage avec les autres membres des caractères communs de grou-
pe. En effet :
- les virus du groupe herpès ont tous les mêmes caractères struc-
turaux :
génome à ADN dans un nucléole central.
capside icosaédrique à 162 capsomères (12 pentons, 150 luxons,
5 capsomères par arrête) •
enveloppe, ou n Peplos n, dérivée des membranes de la cellule
hôte, d'où la grande thermolabilité de ces virus, leur inactiva-
tion par l'éther et leur distinction des adénovirus.
- tous se multiplient dans le noyau où ils donnent une inclusion.
- ils ont une tendance marquée à l'infection chronique latente et
à l'effet cytopathogène localisé.
Cependant, des infections généralisées graves sont possibles chez
le nouveau-né et le sujet immunologiquement déprimé.
Quatre virus de groupe herpè~
sont connus pathogènes chez
l'homme:
- l'herpesvirus hominis ou virus de l'herpès simplex (HSV) dont il
existe deux types antigéniques
l'herpèsevirus varicellae ou virus de la varicelle et du zona.
- l'herpèsvirus cytomegaliae ou cytomégalovirus ou virus de la ma-
ladie des inclusions cyto-mégaliques.
- le virus d'Epstein-Barr rencontré dans les subcultures de tumeur
de Burkitt étroitement associé aux cellules.
C'est aussi l'agent de la monocluéiose infectieuse.
D'autres herpèsvirus animaux sont interressants à connaitre
- l'herpèsvirus simiae ou virus B du singe, agent chez le singe d'une
affection vésiculeuse buccale bénigne. Innoculé accidentellement à

---

2
l'homme, il détermine une encéphalite aigüe ou une myélite ascen-
dante mortelle.
- deux herpesvirus animaux sont rencontrés dans deux maladies pro-
lifératives malignes : le virus de la maladie de Marek, ou neuro-
lymphomatose aviaire, èt l'herpesvirus du carcinome rénal de la
grenouille léopard (Rana pipiens) ou tumeur Lucké.
Ces virus sont étroitement associés à la cellule.
- l'herpesvirus Saimiri, virus latent du singe-écureuil dans les
conditions naturelles, détermine les lymphomes malins par inno-
culation expérimentale au singe-hibou et au marmouset.

---

3
2 - L'herpesvirus simplex
2.1 Caractères du virus
6
Le génome est un ADN bicaténaire de 100 x 10
daltons,
soit 17 000 paires de bases, capable
de coder pour 200 polypep-
tides. Le GC % en est très élevé (68 à 70 % contre 42 % pour l'ADN
de la cellule hôte) •
L'enveloppe virale est formée de trois feuillets conte-
nant lipides, polyamines et glycoprotéines (cinq glycoprotéines
spécifiques du virus HSV ont été décrites (gC, cB, cA, gE, gO) et
ce, quelque soit le type ontigénique du virus ; elles sont impli-
quées dans la spécificité immunologique).
L'enveloppe virale conditionne l'absorption du virus sur
les cellules. En effet, le virion isolé est incapable de croître et
de se multiplier - sa pénétration dans une cellule dont il détourne
l'acide nucléIque est indispensable -.
La conservation du pouvoir infectieux n'est assuré qu'à
très basse température (-70° C) .
2.2 Modèles d'étude expérimentale de l'infection herpétique
La percée de plus en plus grande des herpesvirus dans
beaucoup de pays du monde, a suscité en réponse, une avancée
très soutenue dans la recherche des thérapeutiques.
La nécessité de disposer de modèles d'études valables
est une réalité fondamentale au plan du screening des substances
antiherpétiques. Et bien que l'homme soit le seul hôte naturel,
un certain nombre d'animaux sont connus (1, 44) sensibles à l'her-
pes virus hominis (ou HSV):
- le lapin: l'inoculation de la cornée donne une kératoconjonc-
tivite parfois suivie d'encéphalite. Celle-ci peut-être provoquée
également par inoculation cérébrale ou instillation nasale.
L'injection intraveineuse peut déterminer une myélite ainsi que
l'injection intradermique ou la sacrification cutanée habituel-
lement suivie d'une éruption vésiculeuse.

---

4
- le cobaye, le hamster et la singe sont sensibles au virus. ILs
peuvent servir efficacement dans l'étude de l'infection latente
au niveau du ganglion; l'induction se faisant par inoculation
latente du virus dans la patte.
- les souriceaux nouveaux-nés sont particulièrement sensibles et
développent une encéphalite quelle que soit la voie d'inoculation.
- l'oeuf de poule embryonné est très sensible au virus. L'inocu-
lation sur la membrane chorio-allantoide (MCA) donne de petites
vésicules blanchâtres de 0,2 à 1,5 mm de diamètre.
- la souris hairless est un des derniers modèles décrits (44)pour
l'étude de l'infection herpétique in vivo; son aspect glabre ofirallt
quelques avantages supplémentaires. Ce modèle s'est montré par ail-
leurs utile pour l'étude de l'infection génitale à HSV (type 2).
Pourtant pour des raisons de convenance, de nombreuses
études de screening continuent de préférer la culture de cellules;
le modèle in vivo ne pouvant alors intervenir qu'à l'issue des
travaux
in vitro.
Les cellules utilisées sont de types var1e s ; cultures
primaires ou lignées continues, d'origine humaine ou animale.
- d'origine humaine;
lignée continue de cellules épithélioides
Kh, Hela, Hlf, Hff,
.,
Bef, Hele 1 etc . . .
souches diploides de cellules fibroblastiques = WI 38, Hdf.
cultures primaires de cellules de thyroide OU d'amnios humains.
- d'origine animale:
cultures primaires et certaines lignées continues de cellules
rénales de singe (lignée continue MA 104, vero, CV , BSC) .
l
. cultures primaires et certaines lignées continues de cellules
rénales de lapin (lignée continue RK 13, SIRe) .
. cellules fibroblastiques de souris (ex. MEF), d'embryon de poule,
cellules BHK 21.
2.3 Cycle de multiplication et extension cellulaire
Pendant la phase d'initiation, le virus s'attache par son
enveloppe àla membrane cellulaire probablement au niveau d'un ré-
cepteur selon un phénomène passif. Après digestion de l'enveloppe
virale et de la membrane cytoplasmique, la nucléocapside ainsi li-
bérée pénètre activement (protéine de transport) dans le cytoplasme
où se fait la décapsidation. Le nucléoside central correspondant
au génome est libéré et va déterminer la replication.

---

5
La replication proprement dite répond au schéma habituel
chez les virus à ADN.
Dans le noyau, il y a transcription des plus précoces
et précoces ARN messagers (1ère à 6ème heure), suivie de la tra-
duction dans le cytoplasme de protéines correspondantes à rôle
enzymatique: une DNase,une ARN-polymérase dépendante d'ADN, une
thymidine kinase. Alors commence dans le noyau la replication de
l'ADN viral (2ème à Sème heure) suivie d'une autre synthèse (3ème
à
10ème heure) d'ARN et de protéines (protéines structurales dont
celles des spicules de l'enveloppe virale). Ces protéines de struc-
tures traduites dans le cytoplasme sont transférées dans le noyau
où se fait l'encapsidation de l'ADN du virus. Le rendement de cette
étape qui exige de l'arginine est faible; environ 20 % seulement
de l'ADN viral synthétisé est encapsidé (9).
L'enveloppe s'acquiert essentiellement par bourgeonne-
ment de la lamelle interne de la membrane nucléaire bien que par-
ticipent aussi la membrane cytoplasmique ou celle des organelles
intracytoplasmiques (cf. schéma 1).
Le virion enveloppé et chargé en glycoprotéines nouvelles
(enveloppe), se trouve alors dans la zone périnucléaire du réti-
lum endoplasmique.
La libération des virions se fait après cheminement à
travers le
cytoplasme dans les dérivés du réticulum endoplasmique.
Ainsi les virions peuvent rester longtemps intracellulaires et
peuvent être transmis directement à d'autres cellules en présence
d'anticorps dans le milieu extracellulaire (extension de l'infection).
Deux types essentiels d'extension ont été décrits par
Notkin6 en 1974 (10)
- le type l ou extension extracellulaire n'existe qu'après la lyse
de la cellule infectée libérant des virions qui peuvent être neu-
tralisés par les anticorps.
- dans le type II (extension intercellulaire, avec ou sans fusion
cellulaire), les virus intracellulaires sont transmis sans être
accessibles aux anticorps.
Cependant Notkin6 a suggéré l'existence d'un troisième
type d'extension virale dans lequel le génome du virus est inté-
gré au génome cellulaire et transmis aux cellules filles
2.4 L'effet cytopathogène (E.e.p.).
Les caractéristiques de l'E.C.P. du HSV sont identiques
aussi bien au cours de l'infection in vitro (culture de cellules)
qu'in vivo (maladie).
chez l'homme, l'infection herpétique cutanéo-muqueuse
(par exemple) caractérisée par l'altération bal Ionisante de Unna
[11) montre une désintégration épidermique (dégénérescence spéci-
ale des cellules épithéliales) aboutissant à la formation d'une
cavité intra-malpighienne. Les altérations cellulaires (ECP) sont

---

6
'I~
l
SCHEMA
l
Schématisation de la séquence d'évènements au cours de la replication
de HSV dans les cellules.
l
• E.
= Immediate Early

---

7
surtout visibles dans les cellules qui flottent dans le liquide
des vésicules récentes non encore surinfectées.
A l'état frais en culture de cellules" in vitro",
c'est l'apparition de foyers de cellules arrondies et éventuel-
lement de sincytia.
L'examen microscopique après coloration montre des
altérations nucléaires :
- une inclusion nucléaire initialement basophile et Feulgen po-
sitive devenant, après le départ des capsides hors du noya~Feulgen
négative et éosinophile.
une disparition du nucléole.
- un nucléoplasme qui n'est plus qu'une masse éosinophile homo-
gène, "vitreuse ".
Ces inclusions nucléaires se retrouvent donc également
" in vivo " dans les frottis de vésiculef, et éventuellement les
examens histologiques d'organes infectés. Les cellules cependant
à noyau monstrueux irrégulier, parfois lobé, peuvent quelque fois
être plurinuclées ou même anuclées.
Selon la technique de lecture utilisée (coloration au
papanicolaou + microscopie photonique, microscopie électronique ou
immuno-électronique,
••• ) d'autres éléments de l'ECP peuvent
être observés tels que la présence de dépots granulaires, les mo-
difications ou l'apparition de structures membranaires ou lamel-
laires intracytoplasmiques etc ...
(9).
2.5 Caractères antigéniques du HSV.
L'HSV comporte deux sérotypes (HSV
et HSV ) ayant une
2
fraction antigénique commune et qui diffèrenf tant par leurs ca-
ractères physico-chimiquffique biologiques et antigéniques.
Le type 2 montre :
- une fraction antigénique absente chez l' autI e.
- un GC % de l'ADN égal à 69 (67 pour HSV 1).
une labilité thermique particulièrement élevée, ce qui explique
sa production à des titres infectieux moindresen culture de cel-
lules " in vitro " .
Seul le type 2 donne :
de grands syncitia en culture de cellules.
- de grandes plages sur fibroblastes embryonnaires de poulet.
- de grandes vésicules sur MCA.

---

8
Le type 2 est particulièrement neurotope chez les afii-
maux de laboratoire.
Antigéniquement, le typage du virus simplex est possible
grâce au développement des techniques sensibles immuno-enzymatiques
ou radio-immunologiques
(cf. § B.3 p.
20
).
Chez l'homme, l'existence de deux types antigéniques
du HSV se traduit par des aspects physiopathologiques différents
qui permettent de penser que le type du virus est approprié au site.
En effet, HSV
a été souvent retrouvé à l'état latent dans les gan-
I
glions trigémaux tandis que HSV
latent, présente une fréquence
2
nette dans les ganglions sacrés.
C'est ainsi que HSV I occasionera beaucoup plus souvent
des atteintes au dessus de la ceinture
(oro-faciales et oculaires)
et HSV
des atteintes au-dessous de la ceinture
(infection géni-
4
tale)
Les différences génétiques entre souches de virus her-
pétiques peuvent déterminer la virulence, le type clinique et la
gravité de l'infection, font observer V~nell et Coli.
(18) à l'étude
d'une souche HSVI' Colin et Qoli.
(43) à propos de 80 cas d'herpès
oculaire ont rapporté que s ' i l n'apparaIt pas de relation entre le
type du virus infectant et l'âge du patient, i l en existe une entre
la souche virale et le type clinique de l'infection. En effet, 70 %
des blépharites herpétiques comme 83 % des kératites superficielles
sont dues à HSV _
; les auteurs n'ayant pas isolé de souche HSV _
1 1
2 2
dans ces atteintes.
La meilleure exhibition des caractères antigéniques du
HSV a lieu au cours de la stimulation de la réponse immunitaire
chez le sujet infecté.
Cette stimulation est possible grâce aux protéInes specl-
fiques du virus. Une cinquantaine environ de polypeptides ont été
décrits dont la moitié est constituée
de protéines non structurales
comprenant des enzymes spécifiques
(thymidine kinase, ADN polymérase,
désoxy-ribonucléase).
(45
53, 25,35J.
,
Mais
la spécificité antigénique du virus herpétique est
liée aux glycoprotéines incorporées dans l'enveloppe virale. Ainsi,
la glycoprotéine E (gEl néo-antigène de surface, serait en fait un
récepteur pour l'extrêmité Fc des immunoglobulines et pourrait jouer
un rôle dans l'ADCC (cf. § 2.1
, p.
13 ).

---

9
B - L'INFECTION HERPET1QUE
1. Manifestations cliniaues de l'infection heroétiaue
Il est possible de ranger les manifestations cliniques
de la maladie herpétique en fonction du sérotype en cause (HSVI
ou HSV ) et du caractère initial ou récurrent de l'infection.
2
1.1 Selon le caractère ini tial ou récurrent de l'infection
Dans l'infection initiale, la guérison apparente s'asso-
cie à une mise en réserve du virus dans certains tissus de l'orga-
nisme et elle confère une immunité générale. On distingue (75,77)
- l'infection initiale primaire : " Primary first infection" :
C'est la primo-infection proprement dite. Elle correspond au pre-
mier épisode chez un malade jamais contaminé au préalable par le
virus de l'herpès simplex quelque soit son type; la maladie est
habituellement très bruyante et il n'y a pas d'anticorps dans le
sérum précoce.
- l'infection initiale non primaire :" Non
Primary First Infection "
Le sujet se plaignant pour la prmière fois présente une sérologie
positive. Il y a donc malgré la présence d'anticorps circulants,
réinfection endogène.
L'infection initiale primaire ou non. primaire peut admet-
tre des épisodes secondaires ou infections récurrentes.
- dans l'infection récurrente ou secondaire, la maladie est déclen-
chée par des stimuli variés non spécifiques (voir plus loin) qui
vont réactiver le virus resté à l'état de latence. La récurrence
peut comporter plu~ieurs épisodes par année pour HSV
ou par mois
I
pour HSV , entrecoupés par des périodes plus ou moins longues de
2
quiescence de la maladie.
Latence et réactivation de l'infection herpétique
Si les stimuli pouvant rallumer l'infection sont connus,
les modes de latence et de réactivation du virus n'ont pas encore
recueilli une théorie mécanistique établie. Néanmoins, il est
connu que le site profond de latence est un ganglion sensitif spécifique du
type antigénique de HSVI ; le ganglion tri géminaI ou ganglion

---

10
de Gasser pour HSV1 , le ganglion sacré pour HSV .
2
L'infection latente se caractérise par
[17, 58
l:
-
une non détection du virus infectieux dans les homogénats gan-
glionnaires. En effet, i l n'est possible d'isoler le virus que par
culture organotypique ou coculture des cellules du ganglion.
-
une négativité des réactions d'immunofluorescence.
Au plan moléculaire un certain nombre d'observations
ont été faites au cours de la phase latente de l'infection her-
pétique
-
réduction du nombre d'équivalents g~nomiques viraux dans les
cellules ganglionnaires
(12)
transcription incomplête
(30 %)
des ARNm viraux
(13).
- méthylation de l'ADN viral. Il semble que la méthylation soit
un processus général de l'expression des gènes.
- présence dans les souches de virus latents d'une TK active
cette TK serait impliquée dans la latence
(14).
Toutes ces observations suggèrent d'une part que pour
espérer une recherche biologique positive, l'intégrité des cellules
doit être respectée
(16)
1
et d'autre part que dans les ganglions
humains infectés par HSV, i l se produit pendant la phase de la-
tence, une transcription spécifique et surtout incomplête du géno-
me viral.
La revivescence est provoquée par des stimuli divers
pouvant être une infection bactérienne ou virale, une parasitose
(paludisme), un syndrôme d'intoxication
(SNC en particulier), l'ex-
position aux UV, les menstruations, les rapports sexuels, les conflits
affectifs, un traitement immuno-suppresseur.
c'est ainsi que l'infection herpétique latente consti-
tue dans certains cas
(immuno-dépression par exemple, cf. B.4 p24
un danger grave pour le sujet porteur,. La réactivation du virus
se produira malgré le taux élevé d'anticorps sériques chez le sujet
non immuno-déprimé ; les virus par voie axonale centrifuge vont
alors atteindre les sites anato~iques de la primo-infection.
Cependant l'immunité est nécessaire pour vaincre l'in-
fection aigüe et des hypothèses sous forme de modèles ont été
avancées sur le rôle de l'immunité dans l'installation de l'in-
fection herpétique latente.
Parmi les nombreux modèles proposés dans la littéra-
ture, deux méritent d'être évoqués ici, le modèle nO 3 D'Open6haw
e.:t c.oU.
(12), et le modèle de KlUYl. ( 151, même si nous ne leur
consacrons que quelques lignes.

---

11
Openshaw et coll. considèrent dans ce modèle que les
cellules ganglionnaires ordinairement non-permissives pour la
repli cation de HSV sont susceptibles de le devenir sous l'action
d'un signal que pourrait exercer l'infection virale ou le syn-
drôme associé. La replication virale est alors possible dans les
cellules ganglionnaires. Le rôle de l'immunité serait de conte-
nir l'infection épithéliale; ce qui a comme conséquence d'inhi-
ber le signal et d'établir un blocage de la transcription virale.
La réactivation éventuelle du virus latent serait induite après
l'émission d'un autre signal par un quelconque stimulus capable
de lever ce blocage.
Cependant Klein, tout en admettant la non-permissi-
vité des cellules ganglionnaires, propose un autre modèle basé
d'une part sur l'existence d'un flux continu centripète à parir
du site de la primo-infection, ce qui va provoquer une infection
productive, et d'autre part sur l'apparition d'une neurectomie.
Là encore, l'intervention des défenses immunologiques
va limiter la replication virale dans les tissus cutanéo-muqueux,
et de ce fait, le flux axonal deviendrait discontinu. L'inac-
tivation des virions au niveau neuronique par les enzymes cellu-
laires aboutirait à des quantités assez faibles de virus latents.
1.2 Selon le sérotype en cause
Les manifestations pathologiques du HSV peuvent être
classées de la manière suivante
- les primo-infections au virus type 1 :
Elles induisent une latence dans 90 % des cas et comprennent
• la gingivo-stomatite ulcéro-membraneuse de l'enfant en bas âge
(1/2 à 5 ans). Plus rare chez l'adulte, elle peut évoluer en sep-
ticémie herpétique mortelle.
· l'angine herpétique est à différencier de l 'herpangine , due elle,
au virus coxsakie A.
· l'herpès cutanéo-muqueux, péri-oro-nasal. Associé à un eczéma,
il correspond au syndrôme de Kapo~i-J~b~g, eczéma herpéticum
généralisé et souvent mortel .
. le panaris herpétique. Herpès le plus commun, c'est le bouquet
d'herpès, amas de vésicules confluant en une phlyctène polynucléaire.
• la kérato-conjonctivite herpétique aigüe. Elle serait dUe à plu-
sieurs souches de HSV
de virulence variable, déterminant ainsi,
1
des aspects cliniques distincts :
* conjonctivite folliculaire herpétique,
* kératite superficielle épithéliale herpétique,
* uvéite antérieure primitive herpétique.

---

12
Ces lésions cornéennes sont directement liées à la des-
truction cellulaires par l'effet cytopathogène du virus en repli-
cation.
i l existe d'autresmanifestations plus graves:
herpès généralisé,
encéphalite herpétique à tous les âges
(cf. § B.4,p. 24).
-
les primo-infections au virus type 2 :
manifestations localisées : herpès génitaux, maladies herpé-
tiques du nouveau-né par contamination lors de la naissance
ou
infection herpétique périnatale,
maladie herpétique généralisée avec hépatite,
méningo-encéphalite néo-natale.
-
les herpès secondaires
(récurrents)
dus au type 1
ou 2 :
herpès de sortie ou n bouton de fièvre n. C'est l'herpès labial
récurrent.
herpès typel
récidivant au niveau de la face, du doigt .
. herpès oculaire récidivant dans les atteintes multiples corres-
pondent à des altérations tissulaires provoquées par la réponse
de l'hôte vis-à-vis des antigènes viraux, en particulier les néo-
antigènes à la surface des cellules infectées. Ainsi,
* dans la kératite disciforme la lésion est due à des
phénomènes immuno-pathologiques.
* dans la kératite stromale avec nécrose, divers méca-
nismes y sont associés :
-
la replication virale intra-st~omale,
-
la réaction immunologique cellulaire et humorale,
-
l'action des collagénases locales provenant des
cellules épithéliales, des polynucléaires, des
macrophages ou de kératocytes altérés.
* l'uvéite antérieure secondaire à l'atteinte cornéenne.
Elle est due soit à la propagation virale, soit aux 2
mécanismes à la fois .
. herpès récidivant des régions fessières ou génitales, générale-
ment lié au type 2.
-
les herpès extensifs chez les sujets sous corticothérapie ou
immuno-suppresseurs, ou chez les immuno-déprimés. Ils peuvent
être déclenchés aussi bien par une primo-infection que par une
réinfection endogène par réactivation d'un virus latent (cf. § B.4,p.24).

---

13
2 - Rôle de l'immunologie dans l'infection herpéti4u~
Le rôle de l'immunologie dans l'infection herpétique
semble avoir un côté excitant du fait de la survenue fréquente de
réinfections endogènes malgrè la présence d'anticorps neutralisants.
Bien qu'à des degrés divers, la plupart des mécanismes
de la réponse immune sont capables d'intervenir dans l'infection
herpétique.
2. l Immuni té anti-herpétique non spécifique
Elle intervient immédiatement après le début de l'in-
fection initiale aux phases de l'invasion, de la multiplication
et de l'extension virales, sans sensibilisation préalable. Cette
résistance non spécifique de l'hôte à divers agents pathogènes
est déterminée génétiquement et implique le rôle de cellules
diverses (cellules phagocytaires, cellules à activité cytotoxique,
leucocytes) et de certaines substances de sécrétion cellulaire
comme l'interféron.
Rôle du terrain
La place du terrain vis-à-vis du virus herpétique a
été démontrée chez la souri s
[r 9, 20) et serait déterminée chez
l'homme par certains gènes du système majeur d'histocompatibi-
lité dénommé HLA (Hum~l
Leukocyte Antigen). Il est par ailleurs
admis
(231 chez les animaux, que les femelles possèdent, au moins
dans l'infection herpétique oculaire, une immunité non spécifi-
que plus efficace que les mâles.
Rôle des macrophages
Parmi les cellules phagocytaires impliquées dans la ré-
ponses non spécifiques, les macrophages jouent un rôle important
contre HSV {38,24 ,22,23,281. Les mécanismes d'action ne sont pas
encore acquis de manière définitive, il semble cependant qu'ils
feraient intervenir entre autres, l'interféron produit par les ma-
crophages.
Des activateurs divers de macrophages (22,28) utilisés
dans certaines expériences ont d'ailleurs de multiples autres
effets ; le corynebactérium parvum par exemple est un inducteur
d'interféron et également un activateur de cellules. Ces activa-
teurs macrophagiques (modulateurs immunologiques), administrés
à l'animal avant ou au cours de l'infection par recrutement au
niveau de la moelle osseuse de cellules macrophagiques hyper-
actives.

---

14
Le virus herpétique lui même est capable, in vivo, d'ac-
tiver les macrophages (24). Les macrophages humains ont un pouvoir
cytotoxique spontané en l'absence d'anticorps vis-à-vis de fibro-
b1asteshumains infectés avec HSV. Cette cytotoxicité spontanée selon
certains auteurs
(26,38) est augmentée par pré-incubation des macro-
phages avec de l'interféron
Mais tout en jouant un rôle certain dans la résistance
aux infections virales,
les macrophages peuvent paradoxalement
être quelque fois impliqués dans la dissémination de l'infection
virale
(28) ; ils sont susceptibles d'être eux-mêmes infectés
par les virus,
lesquels vont s'y rep1iquer.
Ainsi de nombreux travaux ont donc établi le rôle des
macrophages dans l'immunité non spécifique contre l'infection
herpéttque. Cependant, en accord avec Le HOANG (26), des points
d'ombre subsistent encore du fait de la difficulté d'obtenir
des préparations de macrophages exemptes d'autres cellules phago-
cytaires et à l'abri de toute cause d'activation artificielle.
Cellules NK
D'autres cellules de découverte récente et décrites
(32,
33) jusque là comme cellules effectri>cres dirigées contre les cel-
lules tumorales peuvent également participer à la réponse non spé-
cifique à l'infection herpétique: les" Natural Killer Cells "
(NK)
ou cellules tueuses naturelles. Il s'agirait de cellules ana-
logues aux précurseurs de cellules T ou de macrophages, capables
de lyser certains types de cellules tumorales sans nécessiter une
pré-immunisation. Ainsi, elles peuvent tuer de manière similaire
les cellules infectées par le virus, porteuses de néo-antigènes
viraux (21). Elles peuvent être également in situ, activées par
l'interféron induit par l'infection virale
(29,31,34), et leur
rôle dans la résistance à l'infection herpétique humaine a été
étudié par Lopez en 1983 (381.
Cellules K et AOCC
A côté des cellules NK, un autre type de cellules tueuses,
les cellules K, déterminent une cytotoxicité à médiation cellu-
laire, elle, dépendant d'anticorps: c'est l'ADCC,
" Antibody De-
pendent Cellular cytotoxicity ";
Par ce mécanisme, la cellule cible est lysée en présence
d'anticorps spécifiques dirigés contre la cible, lesquels inter-
viennent grâce à leur récepteur F •
c
L'ADCC ainsi, n'interviendra pas au cours de la phase
précoce des infections primaires mais,
jouera par contre un rôle
chez le sujet déjà sensibilisé. Il ne constitue pas un mécanisme
de défense non spécifique au sens strict.
Système interféron
La réponse tmmune non spécifique, nous l'avons annoncé,
fait intervenir par ailleurs des produits de sécrétions cellulaires,

---

15
les interférons ou système interféron (INF).
Ce sont des substances humorales à activité antivirale
(entre autres fonctions biologiques), produites par des cellules
variées après stimulation par un virus, par un mitogène, anti-
gène ou organisme, et déterminant le phénomène d'interférence
virale (41. Ainsi, ces substances capables d'inhiber la division
des cellules et d'augmenter certaines fonctions de cellules effec-
trices vont également exercer leurs effet au niveau de la surface
cellulaire (39).
Synthétisé précocement, en quelques heures après l'in-
fection et plusieurs jours après l'apparition des anticorps circu-
lants, l'interféron joue un rôle majeur dans la primo-infection
virale et son action n'est pas spécifique du virus (26).
Le système interféron comporte trois classes majeures
établies sur la base de leur origine, moléculairement et biolo-
giquement différentes (146, 42,43)
- INF a
leucocytaire
induits par les virus
- INF S , fibroblastique
- INF Y
immun, produit dans les cultures de lymphocytes après
stimulation antigénique spécifique ou mitogénique.
La réponse antivirale par l'interféron a été établie
pour l'instant comme étant un mécanisme à deux phases
(~6).
- phase l ou phase de production de l'interfér~n déclenchée par
la pénétration du virus dans la cellule. Cet INF est expulsé de
la cellule.
- phase II : établissement au niveau d'autres cellules récepti-
ves d'INF d'un état réfractaire aux virus grâce à l'induction dans ces cellu-
les de lIa production d'enzymes capableSde prévenir la transcrip-
tion, la translation de virus éventuels ou l'assemblage de nouvel-
les particules virales infectieuses.
L'interféron jouerait donc un rôle non négligeable dans
le contrôle de l'infection herpétique
[30,41,21 l 1 Levin etHahn
(36) ont d'ailleurs observé
que chez des sujets malades présen-
tant des déficiences congénitales en interféron, l'infection vi-
rale était d'une extrêmesévérité et même fatale. Par ailleurs,
SCHNIPPER et eott. (40) ont démontré que l'infection ~xpérimen­
tale de cellules épidermiques humaines avec HSV (1 ou 2) induit
la production d'interféron, tandis que l'usage d'un virus inac-
tivé par les UV n'entraine ni
la replication virale, ni la
production d'INF.
Lymphocytes et granulocytes
Au cours de l'infection herpétique primaire, seuls les
lymphocytes semblent essentiels de part la production de l'inter-
féron précoce (21).

---

16
Les polynucléaires, outre leur rôle phagocytaire, peu-
vent intervenir dans les mécanismes analogues à l'ADCC, mécanismes
tardifs par rapport à la phase précoce de l'infection primaire.
2.2 ~mmunité anti-herpétique spécifique
Grâce à ses facteurs spécifiques, elles s'installe de
manière tardive par rapport à l'infection primaire et contribue
à la résistance contre la réinfection par le même agent infecti-
eux ou par un agent doté d'antigènes semblables (26).
Malheureusement viv-à-vis de HSV, l'immunité spécifique
ne permet pas d'empêcher la latence du virus et de prévenir ainsi
la survenue des épisodes récurrents.
Les protéines spécifiques du HSV (cf. § A.2.5, p.
7)
comme les phénomènes de surface cellulaire sont les principaux
inducteurs de l'immunité spécifique anti-HSV.
Les phénomènes de surface cellulaire sont des modifi-
cations de la membrane plasmique que subissent des cellules infec-
tées par HSV {9} ; celles'ci sont liées à l'apparition à la sur-
face de la cellule, 4 heures après l'infection,de néo-antigènes
spécifiques du virus herpétique et détectables avant la fin de la
replication virale. Ces cellules vont ainsi être la cible de nom-
breux effecteurs tels les anticorps ~totoxiques + complément,
les cellules T cytotoxiques, les cellules K (AnCC), les cellules NK.
2.2.1 Réponse immunitaire à médiation
cellulaire
Les effecteurs intervenant sont essentiellement les
lymphocytes immuns qui vont inhiber l'extension extracellulaire
de l'infection (cf. A.2.3 p, 5 ).
Ces lymphocytes dans leur fonction de surveillance à
travers tout l'organisme vont détecter les antigènes viraux, en
particulier les néo-antigènes à la surface (associés ou non aux
antigènes natifs) des cellules infectées.
La réaction immunitaire aboutit à la destruction des
cellules infectées avec réaction inflammatoire et libération de
virus. Ces virus peuvent à leur tour soit infecter d'autres cel-
lules (extension type I), soit être neutralisés par des anticorps
circulants.
In vitro, l'activation des lymphocytes immuns avec un
antigène herpétique (HSV) spécifique correspondant (64) est asso-
ciée à des phénomènes variés tels que :
- développement de lymphocytes T spécifiques cytotoxiques (41,54),
- prolifération clonale de lymphocytes T immuns ou transformation
lymphoblastique en présence de l'antigène (46,49,59),
- production de lymphokines par les lymphocytesT sensibilisés et
mis en contact avec un antigène spécifique herpétique (48 1 :
MlF, lymphotoxine, interféron a et autres facteurs activant les

---

17
macrophages; MAF, CF, LIF etc •••
In vivo, certains de ces phénomènes ont lieu ; ainsi
les lymphokines augmentent la réponse spécifique et permettent
le recrutement de mécanismes additionnels de défense non spé-
cifiques (49
Mais alors comment expliquer la survivance in situ du
HSV et les réinfections endogènes qu'il occasionne?
IWASAKA et coti. (50) ont tenté de répondre à cette
question. Selon eux, l'apparition de lésions herpétiques récur-
rentes est associée à une induction des cellules suppresseurs et
des facteurs suppresseurs solubles, tous inhibant la réponse
lymphoproliférative et ce, d'après leurs investigations, seule-
ment, au moment de la réactivation de la maladie.
O'REILLY et coti. (49) pour leur part, ont observé
également un effondrement transitoire de la production de lym-
phokines, notamment la LMIF (leukocyte migration inhibitory
facteur) et l'INF,débutant juste à l'apparition de la première
vésicule de l'éruption récurrente.
Ces observations qui incontestablement attendent d'être
soutenues par d'autres, peuvent d'ores et déjà expliquer la sé-
vérité exceptionnelle de l'infection chez les sujets en déplé-
tion de cellules lymphoïdes thymodépendants ou du système réticulo-
endothéliales (thérapeutiques immuno-suppressives dans les cas
de greffes, de cancers, etc ••. ).
Réponse immunitaire humorale
Elle a été largement documentée par Holg~ K~chn~ (27).
D'une manière globale, l'immunité humorale semble tenir
un rôle peu déterminant vis-à-vis du HSV du fait de nombreux
épisodes, récurrents, au cours desquels il y a présence de taux
élevés d'anticorps sériques dirigés pourtant contre les antigènes
herpétiques. Les antigènes sont thymo-dépendants. En effet, la
production d'anticorps antiherpétiques par les cellules B néces-
site la coopération de cellules T helpers (SI).
Parmi ces immunoglobines, les Ig M sont les anticorps
initiaux de la phase infectieuse aigüe et peuvent avoir chez le
nouveau-né une valeur d'orientation vers une infection herpéti-
que acquise périnatale. Par contre, les Ig G,produi~de la réponse
humorale secondaire, peuvent être passivement transmises par la
mère.
Les Ig A sécrétoires dans l'infection herpétique comme
dans les infections virales de manière générale, constituent un
des éléments principaux de la réponse humorale au niveau des portes
d'entrée muqueuses. Dans l'infection oculaire, ils auraient un
rôle protecteur vis-à-vis d'une surinfection exogène avec le même
virus, mais jouent un rôle mineur au cours des réinfections endogènes.

---

18
Par ailleurs, au niveau d'un oeil inflammatoire, des
Ig G sériques ni neutralisants, ni lytiques en présence de com-
plément, vont transsuder à partir du plasma et peuvent empêcher,
au niveau des culs-de-sac conjonctivaux et de l'épithélium cornéen,
la neutralisation des virus par les Ig A sécrétoires (52)
; les
Ig G favorisent ainsi la persistance virale.
Les infections à HSV (1 ou 2) occasionnent la produ-
tion de deux catégories d'anticorps, soit strictement spécifiques
du type viral, soit dirigés contre les antigènes communs aux deux
types. Dans les infections herpétiques primaires, inversément aux
réinfections endogènes, les anticorps sont dirigés contre les anti-
gènes d'enveloppe plutôt que contre les antigènes de capside
(27).
c'est là un élément supplémentaire pour tenter d'expliquer la récur-
rence de l'infection herpétique.
De manière globale, nous pouvons retenir que les méca-
nismes immunitaires non spécifiques jouent un rôle essentiel
dans
l'infection herpétique primaire notamment aux phases précoces
de l'invasion, de la multiplication et de l'extension virale. Ils
influencent de manière importante le devenir de l'infection virale.
Leur action de manière secondaire, est renforcée par les mécanis-
mes immunitaires spécifiques pour aboutir à la guérison. A l'inverse,
lors d'une réinfection herpétique, les réponses immunitaires
spécifiques sont activées beaucoup plus rapidement et jouent un
rôle plus important de défense. Cependant, il est connu que l'im-
portance respective de l'immunité humorale et de l'immunité cellu-
laire au sein de la réponse spécifique antiviral est en grande
partie déterminée par le mode d'extension du virus
(53).
Si l'on considère la sévérité des infections à HSV,
au niveau de certains organes (oeil, cerveau, utérus gravide)
la
rupture des barrières anatomiques, l'inhibition de la réaction
inflammatoire (corticoides, immuno-suppresseurs, radiation ioni-
santes) sont autant de facteurs qui réduisent l'immunité non spé-
cifique, tandis que des substances comme les endotoxines bacté-
riennes, les mycobactéries, les corynebactérie anaérobies ou cer-
tains polynucléosides synthétiques sont susceptibles de la stimuler.
Au cours des infections récurrentes, il se produit pro-
bablement une diminution des défenses immunitaires non spécifiques
et des défenses spécifiques cellulaires. Par ailleurs, l'on peut
s'interroger, tout au moins à partir des observations au niveau
de l'oeil, .si les proportions relatives d'Ig A et d'Ig G n'exer-
ceraient pas un effet modulateur sur l'évolution de la maladie et
l'éradication du virus herpétique.

---

19
3 - Diagnostic biologique de l'infection herpétique
Le diagnostic biologique constitue un précieux outil
d'appréciation de la morbidité liée aux infections herpétiques
(55). Le développement de thérapeutiques chimiques efficaces
contre les infections cutanéo-muqueuses et viscérales ont susci-
té un besoin plus grand d'un diagnostic biologique rapide et spé-
cifique de l'infection à HSV. Celui-ci a connu des progrès cer-
tains sous l'éclairage de l'immunologie mais l'insuffisance,sou-
vent, des informations recueillies notamment lors des épisodes
infectieux récurrents confère encore à l'isolement du virus une
signification déterminante.
Quatre axes peuvent ëtre notés :
- l'examen direct (histologique ou cytologique)
- l'isolement du virus
- le typage du virus
- la détection et le titrage des anticorps HSV
L'examen direct
Il consiste à rechercher des inclusions nucléaires et
des syncitia, entre autres altérations cellulaires, dans des frot-
tis de lésions cutanéo-muqueuses, oculaires ou exceptionnellement
de biopsie cérébrale, après coloration au papanicolaou, ou à l'hé-
matéine-éosine par exemple.
Cependant, le diagnostic cytologique n'a qu'une valeur
d'orientation 1 peu spécifique et peu sensible, il nécessite une
expérience suffisante pour la lecture et l'interprétation de
l'E.C.P .. Mais malgré les avantages (manipulation facile, maté-
riels ordinaires, rapidité etc •.• ), de l'examen direct, on lui pré-
fère dans la mesure du possible, l'isolement du virus.
Isolement du virus
La recherche du virus par cette méthode est facile à
condition de prélever des lésions fraiches et d'inoculer sans
délai ce virus thermolabile à des cultures cellulaires en milieu
de survie. L'effet cytopathogène est souvent obtenu en 48 heures.
Seulement, les résultats ne permettent pas de départager les types
de virus responsables de l'E.C.P ••

---

20
Typage des HSV
De nombreux tests comme la réactionclassique de fixation
du complément utilisent des antigènes disponibles dans le commerce.
Ils sont malheureusement peu sélectifs. Aujourd'hui, un certain
nombre d'autres tests permettent de distinguer HSV
et HSV
à des
Z
degrés divers par rapport à l'isolement du virus ;let parm~ eux
(56,57,60,6 ,62,67)
- la neutralisation de l'anticorps
l'hémagglution passive
- l'hémagglution indirecte
- l'immunofluorescence directe
- l'immunoperoxidase indirecte
Mais si toutes ces techniques en elles-mêmes sont pra-
tiquées dans les laboratoires spécialists avec grande maîtrise,
les antisérums utilisés comme les antigènes viraux découlent d'un
contexte génétique étroit entre les deux sous types HSV. Ceci
laissent subsister des réactions croisées, et le typage sérolo-
gique exhaustif est ainsi souvent difficile à réaliser.
Cependant la possibilité récente de produire des anti-
corps monoclonaux 163,65,66,68) vis-à-vis de certains antigènes
(gC, gD et d'autres protéines) spécifiques du type viral confère
au typage des HSV une valeur réelle surtout si les résultats
sont croisés avec ceux obtenus par la méthode de l'enzyme de res-
triction de l'ADN viral (69~ 193). Cette technique utilise la diges-
tion de l'ADN viral par une endonucléase d'origine bactérienne;
l'ADN viral étant marqué par voie biologique, la détection se fait
par autoradiographie après électrophorèse sur gel d'agarose.
Détection et titrage des anticorps HSV
Ce diagnostic sérologique a une grande valeur en épidé-
miologie dans la surveillance des infections passées ou en cours ;
une ascension du taux des anti-HSV,.si.on examine un sérum précoce
et un deuxième sérum tardif témoigne d'une primo-infection, tandis
qu'un taux d'anticorps HSV élevé d'emblée et variant peu, est
signe de réinfection endogène. Les anticorps impliqués ici sont les
anticorps neutralisants circulants.
Néanmoins le diagnostic sérologique conserve encore un
intérêt de diagnostic virologique : détection de la présence des
virus ou de leurs antigènes dans les prélèvements. Le titrage des
anticorps peut être indispensable dans l'établissement du diagnos-
tic clinique de certaines formes profondes d'herpès oculaire ou
lors d'une suspicion d'infection herpétique cérébrale.
Dans le premier cas, le rapport des titres d'anti-HSV
dans le sérum et dans l'humeur aqueuse (coefficient de charge en

---

21
immuno globines de l'humeur aqueuse)
(,Or"
correspond ordinaire-
mant à l'unité; son élévation signerait une infection herpétique.
Au cours de l'encéphalite herpétique un rapport anti-
corps HSV sériques / anti-HSV dans le LCR inférieur à 20, à va-
leur d'orientation vers ce diagnostic sous réserves d'autres élé-
ments (intégrité de la barrière hémato-méningée) •
Parmi les techniques sérologiques utilisées
(56,55,43),
on peut citer
- la fixation du complément, déjà vue peu sélective,
- la neutralisation en culture cellulaire ; la préparation virale
est exposée aux anticorps spécifiques dits neutralisants, le ré-
sultat est la réduction du nombre de particules virales capables
de produire une infection,
- la technique ELISA, Il Enzyme Linked Immunosorbent Assay Il ou
technique immuno-enzymatique sur support solide. Beaucoup plus
sensible que les deux précédentes, elle permet de détecter Ig M
et Ig G anti HSV mais la sélectivité est nulle.
- l'immuno-fluorescence indirecte (IFI), l'ADCC ou le dosage
radio-immunologique (DRI) sont autant d'autres techniques utili-
sées pour détecter et doser des anticorps dirigés contre des
antigènes de l'enveloppe.
Notons qu'il est possible parle DRI, de doser soit les anticorps
d'enveloppe, soit de la capside, soit excrétés.
Toutes ces techniques présentent un intérêt limité
du fait de nombreuses interférences tels les Il récepteurs Fc Il
des cellules infectées ou d'autres protéines d'enveloppes.
D'autres techniques impliquant les lymphocytes T ont
été ~nvisagées pour le diagnostic clinique de l'infection her-
pétique. Elles permettent d'évaluer in vitro l'immunité cellu-
laire vis-à-vis du HSV et notamment [26)
:
- la réponse lymphoproliférative spécifique : par le test de
transformation lymphoblastique (TTL), on évalue in vitro la pro-
lifératio~lonale de lymphocytes T sensibilisés lors d'une ré-
exposition à l'antigène spécifique. En effet, seuls les lympho-
cytes immuns sont capables de donner lieu à des tests positifs,
et il existe une bonne corrélation entre l'état sérologique des
individus et leur réponse au TTL (46,49,591. Cette réponse pro-
liférative est une fonction des lymphocytes T mais nécessite la
présence de macrophages.
- la production spécifique de lymphokines par les lymphocytes
sensibilisés en présence de l'antigène herpétique.
Elle peut être quantifiée in vitro par exemple par le test d'inhi-
bition de la migration des macrophages; l'inhibition produite
est proportionnelle à la quantité de MlF produite.

---

22
Malheureusement les résultats sont encore contradic-
toires selon les équipes, estime Le Hoang
(26), en raison de
l'absence de standardisations et peut-être aussi de la possibi-
lité de nombreuses réactions croisées. Elles ne recueillent pour
l'instant qu'un intérêt très limité.

---

23
4 Epidémiologie des infections
herpétiques
4.I Morbidité liée aux HSV
Aujourd'hui les ~irus de l'herpès ont tendance à se
manifester plus fréquemment dans le monde et plus particuliè-
rement dans les pays industrialisés (5~.
En effet, l'infection herpétique oculaire, de type l ,
représente la cause essentielle de cessité en Europe, place te-
nue par le trachome dans les autres régions du globe (11).
Aus U.S.A., chaque année, un demi-million de cas nou-
veaux d'herpès de type 2, à localisation génitale, ont été enre-
gistrés (55,131, tandis que 80000 personnes environ ont été
atteintes dans la seule année 1983 en Allemagne (81).
La France manque de statistiques à ce sujet (Maladie
Sexuellement Transmissible, MST, non soumise à la déclaration
obligatoire), mais un phénomène croissant a été révélé au cours
de deux colloques, d'une séance de la Société de Médecine de Pa-
ris et d'une conférence de presse de l'INSERM (81'.
HSV
représente un tiers des affections sexuellement
l
transmissibles vues en consultation (
hommes, femmes, nouveaux-
nés) et l'incidence de l'herpès génital est actuellement une des
plus élevée des MST au U.S.A., Japon et Grande-Bretagne (15)
;
le type l devenant de plus en plus associé dans ces pays à l'in-
fection génitale primaire apparente. Dans ce dernier pays, on
estime un
~2 million de cas nouveaux de MST chaque année dont
12 000 cas d'herpès diagnostiqués (16).
Tout en présentant ici quelq~es observations suscep-
tibles de constituer une explication à l'accroissement des quel-
ques indicateurs de santé (incidence, prévalence), nous avons
volontairement choisi de rappèlèr dans le présent chapitre, plu-
tôt que dans celui des manifestations pathologiques, les symp-
tômes de morbidité liés à HSV au niveau cutané (HSV ) et géni-
I
tal (HSV ) au cours de l'infection primaire apparente et chez
2
certains groupes à haut risque tels les nouveaux-nés de mères
herpétiques et les sujets en état d'immuno-dépression.
L'herpès cutanéo-muqueux (de type 1), est une maladie
souvent bénigne qui récidive d'une façon décourageante. Il se
caractérise par l'apparition de vésicules sur le visage (le plus
souvent aux lèvres), par une certaine insensibilité et unelegère

---

24
infiltration oedemateuse de ·lagro"seur d'i1n. p.o:i;s, J;'O'Jge d'aspect et dure.
C'est au moment de la première apparition·que ces" boutons"
sont les plus douloureux. On observe sur le nodule rougi, un
amas de vési0ules serrées, translucides, de la grosseur
d'une
tête d'aiguille à celle d'un grain de riz, soit quatre à huit
unités. En quelques heures, le contenu aqueux des vésicules se
transforme en pus, puis celles-ci sèchent, des croûtes brûnatres
apparaissent et tombent au bout de quelques jours.
Dans la maladie génitale de l'herpès, autant l'infec-
tion primaire apparente est plus sévère, autant la li'ymptoma tologie
gie est plus aigue chez la femme que chez l'homme [12,11)
: dou-
leur, prurit, dysurie, pertes vaginales ou urétrales, adénopathie
inguinale sensible, sont les symptômes dominant.s. A la fièvre,
la mal de tête, le malaise et les myalgies des deux premiers jours,
succèdent les signes systémiques dont le point culminant s'ins-
talle au 4ème jour après les premières lésions génitales doulou-
reuses. La sévérité des symptômes locaux croit pendant les 10
premiers jours de la maladie pour décroître au cours de la semaine
suivante pendant que pointe une adénopathie inguinale sensible,
dernier signe à disparaître. Des lésions ulcérantes bilatérales
dans les deux sexes peuvent persister 4 à 15 jours avant de s'en-
croûter puis se réépithélialiser.
D'après COREY et eoit.
(15), le virus au cours de cette
infection primaire est présent dans l'urêtre (82 % des cas) ou
le col (88 % des cas) et quelquefois le pharynx (I3 % des cas).
l'élimination virale asymptomatique peut durer deux mois après
les manifestations cliniques.
4.2 Dangers liés aux HSV chez les groupes à haut risque
Femmes enceintes et nouveaux-nés
43 % des infections herpétiques étant
asymptomatiques
le dépistage clinique et la recherche du virus herpétique s'im-
posent chez la femme à haut risque
(= antécédents d'herpès géni-
tal pendant ou en dehors de la grossesse, partenaire(s) atteint(s)
d'herpès génital.
Au cours de l'infection génitale, de nombreuses compli-
cations pouvant aller de la méningite ~ptique aux infections
mycosiques secondaires confèrent à la maladie herpétique une pré-
occupatim de santé publique.
Mais le danger essentiel lié à l'herpès génital est
le risque d'infection périnatal du nouveau-né. La transmission
u virus, possible in utéro par virémie lors d'une primo-infec-
tion [1), a lieu principalement par contamination lors du pas-
sage de l'enfant dans les voies génitales infectées (11,18),
moins fréquemment à partir d'une infection cutanéo-muqueuse de la

---

25
mère, oU rarement encore par transfert" infanto-infantile "
Par l'intermédiaire du personnel soignant.
La transmission au foetus d'anticorps maternels ne
confère qu'une immunité peu réelle et très discutée (j,77,79)
cependant le passage transplacentaire de HSV est possible en cas
de primo-infection maternelle, mais rare et aboutit plus souvent
à une mort foetale qu'à des malformations.
Le risque de contamination à la naissance est de 60 %
en cas de primo-infection de mère à terme et d'accouchement par
voie basse ; ce risque est augmenté si les membranes sont rompues
depuis plus de 4 heures 77,76,80,81), voir encore élevé de 25 à
30 % en cas d'herpès récidivant à terme.
En néonatologie, les infections herpétiques occupent
une place particulière du fait de leur gravité.
Tandis que l'incidence de l'infection périnatale à HSV
est faible (0,032 %), l'infection viscérale disséminée (80 à 90 %
de décés) et l'infection du système nerveux central (50 % de décés)
sont la cause de taux élevés de mortalité néonatale, et on note
une forte incidence de séquelles significatives parmi les sur-
vivants (50 %)
(81,80,77,821 ; l'encéphalite herpétique demeurant
la forme la plus invalidante des encéphalopathies virales primi-
tives (17). Les antiviraux dans ce cas, n'apportent une amélio-
ration que si le traitement a débuté avant l'apparition des trou-
bles de la conscience; d'où l'intérêt d'un diagnostic précoce
(biopsie temporale, dosage des anticorps anti-HSV dans le L.C.R.).
Sujets à l'état d'immuno-dépression
Chez le sujet immunologiquement affaibli, le danger
provient des récurrences, liées à un virus latent, pouvant sur-
gir dans les débuts de tumeurs malignes, dans les cas de trans-
plantation d'organes (26,27,77J, de thérapeutiques immuno-sup-
pressives dont l'emploi de corticoides (dose> 20 mg/jour), dans
les cas de déficiences immunitaires congénitales ou acquises.
La maladie se caractérise par une longue période d'essai-
mage du virus et de grandes lésions doulQureùses pouvant provo-
quer des nécroses superficielles. Les récurrences peuvent Se pro-
duire sur les lésions encore vives (contamination contigue à la
lésion initiale) et l'auto-inoculation ou la dissémination cuta-
née entretient l'extension de la maladie.
En cas d'infections oculaires et du S.N.C., les lésions
viscérales disséminées peuvent comporter des atteintes pulmonaires
et hépatiques (84,85), mais ceci est plutôt rencontré chez les nou-
veaux-nés lors de brftlures et d'eczémas sévères.

---

26
4.3 Relation HSV
et cancer
2
En ce qui concerne le lien HSV
et cancer du col utérin,
2
nous savons aujourd'hui qu'un certain nombre de virus herpétiques
présentent un potentiel oncogénique et que le virus paraît une con-
dition nécessaire mais non suffisante au développement de cer-
taines tumeurs bien qu'expérimentalement, HSV
inoculé à doses
2
sublétales au hamster nouveau-né peut déterminer des sarcomes.
PARK et MAC NAB (86) ont injecté chez le rat Hooded
~~~, dans une tumeur induite par des cellules transformées
grâce à une portion d'ADN provenant de HSV , un virus intertype,
1
HSV2. Après culture les auteurs ont observé la production d'un
virus dont l'ADN' analysé,
(enzyme de restrictioru corresponà
a~~soit au virus injecté (30 plaques sur 32), soit au virus
transformant (2 plaques sur 32) •
Ces résultats confirment bien ceux obtenus antérieu-
rement par les mêmes auteurs (86):
- HSV peut induire la transformation de cellules normales en
cellules tumorales
- le génome entier peut être retenu sous une forme latente ou
non replicante dans des cellules transformées par HSV.
Par ailleurs, une revue scientifique diffusée par
l'Association pour le Développement de la Recherche contre le
Cancer (87) rapporte qu'aux U.S.A. des chercheurs de la Faculté
de Médecine de Pensylvanie ont isolé un antigène spécifique du
virus type 2 de l'herpès chez 80 % des femmes atteinte d'un
cancer du col de l'utérus.
D'autres travaux (88,89) cependant font
'état d'une
corrélation clinique entre HSV et cancer du col, mais encore
faille-t-il établir une relation de cause à effet.
Il semble toutefois que l'information génétique du
virus herpétique serait contenue dans les cellules cancéreuses.
Quelques études signalées dans la littérature (87) indiquent
que le virus herpétique composé d'environ 80 gènes, n'agirait
sur la cellule cancéreuse qu'au niveau d'un gène (ou de quel-
ques uns) qui reste à identifier. Dans ce cas le virus interv~n­
drait
indirectement et ne serait qu'une des causes de la maladie.
Ainsi, le développement d'une affection virale en cancer
dépend vraissemblablement du potentiel immunitaire de chaque in-
dividu. Et loin de nourrir une psychose qui a secoué les Etats-
Unis et une partie de l'Europe, ces cinq dernières années, les
infections à HSV constituent de nos jours une important question
de santé publique.

---

27
L'association de plus en plus fréquente du HSVI à
l'infection herpétique génitale notamment dans les pays anglo-
saxons pourrait admettre comme explication à l'origine, la prati-
que dans ces pays, de contacts oro-génitaux plus nombreux (77).
Mais même si une telle observation semble imprimer à l'épidé-
miologie des maladies herpétiques une distribution géographique
plus limitée, la faiblesse des statistiques au niveau mondial
tout comme les décalages de niveau dans la rigueur des diverses
législations des pays en matière de déclaration des Maladies
Sexuellement Transmissibles, ne doivent laisser subsister aucune
illusion sur la réelle montée à travers les continents de la
morbidité liée aux herpèsvirus simplex 1 et 2.
Il faut modùler cependant ce propos en admettant que
l'augmentation des sujets immunologiquement affaiblis dans les
populations actuelles des pays industrialisés (55,17 ), tout
comme la disponibilité de méthodes de diagnostic de plus en plus
pointues ont sûrement contribué à une meilleure appréciation de
l'épidémiologie des infections à HSV.
Par ailleurs, le risque sérieux d'infection néonatale
par contamination maternelle, l'éventuel pouvoir oncogène du HSV2
au niveau du col utérin et même la large informantion ayant
quelquefois dérapée en psychose sont autant de facteurs, et non
des moindres, qui ont probablement pu inciter de nombreux plai-
gnants à consulter un médecin •
•

---

---

29
C. POSSIBILITES THERAPEUTIQUES
1. Introduction
La prévalence élevée, comme nous venons de le constater
sur le plan épidémiologique, des manifestations pathologiques liées
aux HSV dans beaucoup de régions du monde, a suscité depuis quelque
temps la plus grande mobilisation des efforts dans des secteurs
divers de la recherche sur le médicament. c'est ainsi qu'à ce jour,
il existe trois orientations dans le traitement de l'herpès:
- les m4diaaments antivirauz,
constitués de composés variés de synthèse ;
ils sont actifs sur la replication du virus herpétique.
- les immuno-stimu~ts,
ils renforcent le système immunitaire de l'individu;
ces molécules permettent de lutter efficacement contre le virus.
Parmi eux: l'Isoprénosine.
- certaines pr4paration d'interféron,
Ces substances renforcent la résistance cellulaire au virus,
mais les difficultés liées à l'obtention de préparations purifiées
n'empëchent pas de fonder des espoirs certains dans la lutte
contre l'infection herpétique.
Nous n'évoquerons ici que quelques données relatives au
premier groupe, en mettant l'accent sur les deux molécules au centre
de ce propos: la iodo-5-désoxy-2'-uridine (IOU) et de son analogue
aminé, la
iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IOC).
-
Les m4diaaments antivirauz
Les médicaments antiviraux peuvent ëtre répartis en deux
groupes (90)
:

---

30
• Les substances influençant le métabolisme des acides
nucléiques. Parmi celles disponibles dans le commerce, citons:
- les dérivés ou analogues des nucléosides, des
pyrimidiques ou puriques
Pyrimidiques
La iodo-S-désoxy-2'-uridine (idoxuridine) ou IDU
La iodo-S-désoxy-2'-cytidine (iododésoxycytidine) ou IOC
La trifluorométhyl-S-désoxy-2'-thymidine
(trifluorothymidine) ou TFT
La (E)-S-(2 bromovinyl)-2'-désoxy-uridine
La (E)-(bromo-2-vinyl)-S-désoxy-2'-uridine
(bromovinyluridine) ou BVDU
La cytosine arabinoside (cytarabine) ou ARA-C
Puriques
La 9-D-arabinafuranosyladénine
L'arabino-D-furanosyl-9-adénine 1 adénine arabinoside
(vidarabine) ou ARA-A
La 9-2-hydroxy éthoxy méthyl guanine
La hydro-9-éthoxy-2-méthyl guanine 1 acycloguanosine
(acyclovir) ou ACV
- les composés non nucléosidiques
Le phosphonacétate
(PAA)
Le phosphonoformate (FPA)
• Les substances actives par blocage de la pénétration du
virus dans la cellule hôte :
Ici se situe la Tromantadine.
D'autres molécules nouvellement synthétisées, en cours
d'expérimentation ou même déjà commercialisées, ont été recensées (11]
et peuvent facilement venir compléter cette liste, principalement au
niveau du premier groupe.

---

31
La plupart des analogues des purines et des pyrymidines
sont en réalité des antimétabolites capables d'inhiber la synthèse,
des acides nucléiques notamment (ADN). Au niveau du virus, ces agents
empêchent la replication de l'ADN viral, par inhibition des voies
métaboliques des purines ou des pyrimidines, ou par inhibition de la
polymérase virale qui allonge le ruban d'acide nucléique. Dans d'autres
cas, le faux métabolite inséré dans l'acide nucléique viral bloque la
poursuite de sa synthèse ou altère sa fonction. Ces agents peuvent
malheureusement provoquer les mêmes perturbations au niveau des
constituants normaux de la cellule hôte (toxicité cellulaire). Aussi,
l'usage clinique de tels composés dépend de leur index thérapeutique
(90) ou rapport existant entre la dose efficace sur le virus et la
dose toxique sur les tissus de l'hôte.
C'est ainsi que, dans le monde, de nombreux travaux
(781 à 794) ont été consacrés à la compréhension de la physiopathologie
et à la maîtrise des infections à HSV.
Le but poursuivi dans la recherche de nouveaux médicaments
est l'obtention de nouvelles molécules qui inhibent spécifiquement les
enzymes codées par le génome du virus tout en respectant les enzymes
analogues propres à l'hôte.
•
2. Dérivés pyrimidiques de synthèse à action antiherpétique
2.1. Rappel historique
Les dérivés pyrimidiques de synthèse ont d'abord été étudiés
comme agents potentiels dans la chimiothérapie des cancers, notamment
des proliférations malignes de cellules sanguines.
C'est HITCHINGS, en 1945, (91) qui a trouvé, au cours
d'études systématiques, des activités biologiques d'une série de
dérivés puriques et pyrimidiques, que les analogues de la thymine,
dans laquelle le radical méthyl (CH3) a été remplacé par un halogène
(fluor, chlore, brome, iode) inhibent la reproduction du lacto-bacille.

---

32
Les relations physico-chimiques entre ces pyrimidines halogénées
et la thymidine, qui est un constituant normal de l'ADN, sont telles
que les dérivés halogénés analogues prennent la place de la thymidine
en tant que substrat métabolique et sont incorporés dans l'ADN
bactérien à la place de la thymidine.
En fait, ce qu'il est intéressant d'étudier sont les
conséquences biologiques qui résultent des substitutions sur la
molécule de thymidine. Ces modifications sont au nombre de deux.
Pour la iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IOC), dans laquelle l'oxygène du
carbone 14 du radical pyrimidique de l'IDU est remplacé par un
groupement amine (NH2). Notons que la présence du désoxyribose dans
la molécule est pratiquement obligatoire pour être incorporée dans
l'ADN, car la thymine, ribonucléoside, l'iodouracile et son ribo-
nucléoside, ne sont que de très mauvais précurseurs pour la synthèse
d'ADN dans les cellules de mammifères (92). Ainsi, le ribonucléoside
du iodo-5-uracile n'a pas d'activité sur la kératite herpétique
alors que l'IDU et l'IOC sont très efficaces.
Après HITCHINGS, en 1945, c'est THOMPSON et Coll.
(931
en 1949, qui étudient l'activité du bromo-5-uracile. Ces auteurs
passent en revue le potentiel inhibiteur de différentes bases
pyrimidiques et puriques sur des bactéries. Les résultats sont à
l'origine d'un travail de VISSER et Coll.
(94), en 1952, qui montrent
que certains analogues de ribonucléosides (chloro-5-uridine) inhibent
la replication du virus de l'encéphalite chez la souris, sur des
cultures de cellules cérébrales.
Peu de temps après que la désoxy-uridine ait été disponible
sur le marché, les désoxy-ribonucléosides halogénés (fluor, chlore,
brome, iode) furent à leur tour synthétisés. Pour l'IDU, c'est PRUSOFF
le premier qui a proposé la structure du produit en 1959 (95), SMITH
et Coll. (96), en 1960, trouvent que le BrDU inhibe la replication
du polyoma virus dans les cellules embryonnaires de souris. HERMANN
(91~ en 1961, trouve que BrDU et IDU inhibent la repli cation du virus
de l'herpès simplex en culture cellulaire.
Les propriétés antiherpétiques de l'IDU vont dès lors être
étudiées de manière approfondie, alors que déjà l'utilisation théra-
peutique en cancérologie avait révélé une disparition rapide de l'IDU
dans les milieux biologiques.
Une nouvelle préoccupation ayant été suscitée, les
tentatives des chercheurs pour obtenir un composé aux propriétés
biologiques identiques à celles de l'IDU, mais avec un degré moindre
de catabolisme, une stabilité à la chaleur plus grande et une meilleure
solubilité, trouvèrent un aboutissement, en 1961, lorsque CHANG et WELCH
(99) synthétisèrent l'IDC dans le cadre d'un programme de recherche
contre le cancer, aux U.S.A.

---

33
Iodo-S-désoxy-2'-uridine (IDU)
Un des premiers faits qui rend l'IOU important encore
aujourd'hui est la démonstration que les produits à base de nucléosides
ont non seulement une activité antivirale, mais sont actifs dans des
infections à virus déjà établies. Au contraire, la plupart des produits
antiviraux non pyrimidiques, comme l'interféron, ne sont actifs que
s'ils sont administrés à titre prophylactique. Ceci est très important
pour les phases initiales d'une épidémie ou lorsque l'on veut contenir
l'éclatement d'une infection virale contagieuse.
L'IOU est principalement actif sur les virus à ADN (HSV,
pseudorage, variole, adénovirus, polyoma). Seul Colombia-SK est affecté
en tant que virus à ARN ainsi que le virus du Sarcome de Pous, virus à
ARN oncogène.
De façon générale, on croit que la replication des virus
oncogènes à ARN implique un ADN intermédiaire qui est formé à partir
de l'ARN viral par une ADN polymérase aux ordres de l'ARN rétro-
transcriptase, présente dans le virion oncogénique à ARN. Cet ARN formé
est ensuite intégré dans l'ADN de la cellule hôte et peut être transcrit
dans l'ARN messager du virus qui est ensuite transféré dans les
polypepti.des viraux.
L'incorporation de l'IOU dans l'AON est probablement
responsable de l'inhibition de la replication des virus oncogènes à
ARN et des virus à ADN. La synthèse d'ADN nécessaire pour la replication
du virus du Sarcome de Pous (à ARN) intervient dans les phases précoces
de la reproduction du virus. Ceci explique pourquoi l'IOU est inhibiteur
de ce virus seulement lorsqu'il est utilisé au moment de l'infection des
cellules.
L'efficacité de l'IOU dans la kératite herpétique chez le
lapin et chez l'homme a été documentée par KAUFMAN et CoU., en 1962,
(700, a,b,Q), juste après le rapport de HERMANN en 1961 1707}, indiquant
que IOU et BrDU, mais pas la bromo-S-uridine, inhibaient la replication
d'HSV in vitro.
Les expériences animales sont confirmées par PERKINS et CoU.,
en 1962 (704), qui mettent en évidence la nécessité du radical pentose
de l'IOU puisque le iodo-S-uracile ribonucléoside est inactif. Cependant,
MAICHUK et CoU., en 1973 (703), montrent que la bromo-S-uridine possède
une activité inhibitrice sur HSV. Il avait été montré antérieurement,
par HANNA, en 1966 (704), que la base libre, le iodo-S-uracile, était
inactive sur la replication du virus de l'herpès et qu'elle n'affectait
pas la synthèse de l'ADN. On ne sait pas pourquoi BrOU serait actif et
lU ne le serait pas. BREITMAN, en 1966 (705), GOrrO, en 1969 (706) et
COOPER, en 1972 (701), ont montré que l'incorporation de la thymine

---

34
et du bromouracile dans l'ADN, peut être nettement augmentée si on
fournit au système une source de désoxy-ribose-I-phosphate. Ainsi,
le bromouracile per Be ou dérivé de la bromouridine après phosphorolyse,
peut être converti en désoxy-ribonucléoside (BrOU), très actif sur le
virus.
L'utilisation de l'IOU dans les thérapeutiques des infections
à HSV de l'épithélium cornéen, qui est une des principales causes de
cécité dans les pays industrialisés et aux U.S.A. en particulier,
a été établie de façon indiscutable et approuvée par FOOV ~ VRUGS
Admi~~on IF.V.A.) dans cette indication.
JUEL-JENSEN, en 1973 (708), a passé en revue l'intérêt
clinique de l'IOU et noté des résultats bénéfiques dans les kératites
herpétiques, le panaris herpétique, l'herpès génital, l'herpès cutané,
le zona, la variole, quand le composé est utilisé en solution concentrée
dans le diméthylsulfoxyde (OMSO).
Par contre, on manque de preuves cliniques de l'intérêt de
l'IOU dans l'encéphalite humaine herpétique par insuffisance de rigueur
méthodologique.
iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IDC)
Synthétisé en 1961, à partir de 1962, de nombreux
travaux Il in vitro ", pharmacologiques et cliniques, ont été
consacrés à l'IOC (99,709,770). En regard des considérations
théoriques qui prévoyaient la fin des problèmes rencontrés
avec l'IOU, l'utilisation de l'IOC comme anti-tumoral par voie
générale et hon locale a été plutôt décevante. A cela deux rai-
sons essentielles :
- la présence, chez l'homme, d'un système désaminasique (760,72j très
actif pour lequel l'IOC est un bon substrat: il y a donc
formation d'IOU ;
- la relative faible affinité de l'IOC pour la désoxycitidine
kinase. En effet, peu d'IOC est transformé en IDCMP qui, lui,
n'est pas attaqué par la désaminase.
Mais si l'intérêt de l'IDe se trouve ici limité
dans des cellules non infectées par HSV comme anti-tumoral
par voie générale, celui-ci se voit renforcé comme agent anti-
viral puissant.

---

35
En effet, l'IDC, comme l'IDU, inhibe nettement la
repli cation de HSV en culture, et esc~également actif dans la
kératite herpétique expérimentale. MENVEZ et MARTENET, en
1972 (Ill), montrent que l'IDC est plus actif que l'IDU dans la
kératite herpétique stromale profonde du lapin. Les résultats
à la fois cliniques et histo-pathologiques, si extrapolables
à
l'homme, sont d'une importance très grande puisque l'IDU
n'agit pas sur la kératite profonde, de même que dans l'encé-
phalite herpétique.
Aujourd'hui, l'IOC est utiliséesous forme de pommade
dermique dans le traitement de l'herpès cutanéo-muqueux.et sous forme
de collyre et pommade dans le traitement des infections herpétiques oculaires.
2.2 Principe d'action anti-herpétique des nucléosides pyrimi-
diques halogénés (IDe - IDU)
2.2.1. La iodo-5-désoxy-2'-uridine (IDU)
Les nucléosides pyrimidiques halogénés, dont le plus
connu est la iodo-5-désoxy-2'-uridine (IDU) , sont des composés
de synthèse ayant une structure chimique très voisine des nuclé-
osides pyrimidiques spécifiques de l'ADN. Ils en sont les ana-
logues non métaboliques qui, incorporés à leur place dans l'ADN
viral lors de la repli cation , empêchent la replication ultéri-
eure ou donnent des particules non infectieuses.
Ainsi, l'IDU pouvant être phosphorylée par la thymi-
dine kinase (TK) interfère dans la synthèse et l'utilisation
de la thymidine (THY)
; l'adjonction de thymidine à l'IDU dimi-
nue son efficacité. De plus, l'IDU bloque l'ADN polymérase
et d'autre enzymes virales. Par ailleurs, le génome viral est capa-
ble de coder une thymidine kinase susceptible d'accepter plusieurs
substrats.

---

36
2.2.2 La iodo-5-désoxy-2'-cytidine
C'est cette propriété biologique du virus de l'herpès
simplex qui donne tout son intérêt à l'utilisation de la
iodo-
5-désoxy-2'-cytidine
(IDC).
L'IOC est préférentiellement phosphorylée par la TK
spécifique du virus plutôt que par la TK de la cellule non in-
fectée
(92J. Tout se passe comme si le virus utilise facile-
ment un faux substrat pour sa replication, ce qui le conduit
à
sa perte. La cellule normale ne reconnaissant pas ce subs-
trat, ne l'utilise pas pour la synthèse de l'acide nucléique
nécessaire à sa reproduction.
En 1970, HAY et Qoti.
(772), ont mis en évidence
qu'une seule et même protéine était responsable de l'activité
de TK et OK, et qu'un seul site était impliqué.
Des travaux plus récents de CHEN et PRUSOFF, en 1978
(773), ont même montré que cette enzyme est aussi douée d'une
activité désoxythimidilate kinase.
Les travaux de VOBERSSEN et Qoti., en 1976 (774), et
ceux de JERKOFSKM et Qoti. en 1977 (775), ont montré que l'IDC
était un bon substrat pour le virus du zona, par un mécanisme
voisin de celui invoqué pour l'herpès.
Sur ce plan de l'encombrement stérique, i l n'existe
qu'une petite différence entre la thymidine et l'IDU puisque
la taille de l'atome d'iode définie par le rayon de VAN VER
WALLS est de 215 pm et le groupe CH
de 200 pm. Cependant,
la configuration électronique du ractical pyrimidique est modi-
fiée par l'halogène
(iode)
et peut produire deux types d'effets
un effet électronégatif, inducteur, qui repousse les électrons
loin du carbone sur lequel est fixé l'iode. Le deuxième effet,
moins important, est dû au fait que l'atome d'halogène a une
paire d'électrons non partagés qui peut initier un effet de ré-
sonnance dans le noyau pyrimidique en augmentant la densité
électronique. L'effet inducteur est le plus important et res-
ponsable de la labilisation du proton sur l'azote 3 de l'IDU
qui est plus dissocié que la thymidine)
pH physiologique.
Dans ces conditions, l'IDU est en grande partie sous forme
énol.
Notons que la plupart des auteurs tels que PRUSOFF
eL cot!. (92) s'accordent pour dire que le fondement de l'ac-
tivité antivirale de l'IDU ne correspond pas à un impact por-
tant spécialement sur une seule fonction du virus telle que
l'absorption à la surface cellulaire au niveau d'un récepteur,
le transport.dans la cellule, la décapsidation ou l'incorpo-
ration dans l'ADN, etc .•. Ils pensent plutôt que l'activité
anti-virale est basée surune~nce quantitative de l'activité
thymidine kinase présente dans la cellule infectée par rapport
à la cellule non infectée par le virus.
Les souches de virus dont les gènes ne codent pas
de synthèse de thymidine kinase sont totalement résistantes
à l'IDU lorsqu'elles poussent dans une cellule qui, elle aussi
ne peut pas produire de TK.

---

37
2.3 Avantages IDC/IDU -Activité-toxicité
2.3.1 ID U
Si la iodo-S-désoxy-2'-uridine (IDU) est très connue
pour ses propriétés anti-herpét~ques, son haut degrés d'analo-
gie vis-à-vis de la THY fait qu'elle est incorporée dans l'ADN
du virus, aussi bien que dans l'ADN de la cellule hôte.
Ceci démontre pour l'IDU (ainsi que pour d'autres com-
posés plus récents : ARA-A, TFT, ACV) une certaine toxicité
chez les cellules non infectées: quoiqu'il existe déjà une sour-
ce de sélectivité pour l'IDU par le fait que, dans les cellules
infectées par HSV, appara!t une augmentation nette de l'acti-
vité thymidine kinase.
Par voie générale, CALABRESI et eoll., en 1961(116),
ont réalisé des études cliniques avec des doses importantes
(de l'ordre de 50 mg/kg) et ont rencontré des problèmes de myé-
losuppression. LERNER et BAILEY, en 1972 (117), ont trouvé que
chez les malades, chez lesquels on suspectait une encéphalite
à HSV, traités par perfusion lente d'IDU (4mg/min.), le taux
d'élimination et de catabolisme était très important. Cepen-
dant, des quantités d'IDU (2,36 mM) sont retrouvées dans le
fluide cérébro-spinal d'un malade perfusé à l'IDU (SOmg/min.).
Ces auteurs indiquent que la concentration minimale inhibitri-
ce de l'IDU pour les isolats frais de HSV
est comprise entre
1
18 et 70 uM.
Il existe incontestablement un besoin de disposer
d'agents antiviraux moins toxiques lorsqu'on les utilise par
voie systémique. La question alors appara!t logiquement :
Peut-il exister un antiviral qui ne soit pas toxique?
( 1961.
Pour bien approcher une réponse à cette question, il
est nécessaire d'examiner les bases biochimiques de l'activité
de l'IDU, ainsi que le mécanisme de l'inhibition des cellules
non infectées.
Effets biochimiques
L'IDU ou ses dérivés phophorylés interviennent
clairement à trois niveaux:
(92)
. Inhibition compétitive de plusieurs enzymes impliquées dans
la syhthèse d'ADN (thymidine kinase, thymidilate kinase et
ADN polymérase) .
. Inhibition allostérique ou de rétro-contrôle par le triphos-
phate d'IDU sur les enzYmes de régulation (TK, désoxycytidi-
late désaminase et ribonucléoside-diphosphate réductase).

---

38
• Altération de l'expression génique suite à l'incorpo~ation
de l'IDU dans l'ADN.
Les deux types d'inhibition enzymatique sont compé-
titifs et rapidement
réversibles, alors que l'incorporation
dans l'ADN ne l'est pas.
c'est pourquoi, l'on pense que c'est l'incorpora-
tion dans l'ADN qui est responsable de la toxicité et de l'ac-
tivité antivirale de l'IDU.
2.3.2 IDe
En 1973, COOPER est à l'origine d'une découverte
très importante en mettant en évidence que l'IDe est phos-
phorylé par une TK induite par le virus, alors que cette enzy-
me, produite par la cellule non infectée, ne reconnaît pas
l'IDC comme substrat. Ces travaux introduisent pour la pre-
mière fois la notion de spécificité thérapeutique
de l'herpès
par l'IDC.
On a montré
également que lorsque l'IDe est phos-
phoryléepar l'enzyme virale en IDCMP, il devient un excellent
substrat pour la désoxytidilate désaminase (cf. § C.2.2.p.34
).
Ainsi, puisque l'IDC n'est pas phosphorylé dans les
tissus normaux, sauf dans les cellules infectées par H5V, on
devrait alors obtenir une thérapeutique anti-virale pratique-
ment dépourvue de toxicité et extrêmement sélective, si seule-
ment la non ou faible désamination dans ces tissus avant phos-
phorylation pouvait être scientifiquement établie.
Les bases de l'activité anti-virale sélective de
l'IDe résident donc dans les propriétés de la désoxycytidine
kinase présente dans la cellule infectée par HSV, car on sait
maintenant que l'infection des cellules par HSV entraîne une
induction d'unce~innmmbre d'enzymes codées par le virus dont TK,
DK et ADN polymérase (cf. § C2.2) .

---

39
D - CONCLUSION
Nous pouvons distinguer dans la replication du virus,
plusieurs passages métaboliques : absorption sur la membrane
cellulaire et pénétration cellulaire du virus, transcription et
translation de messages, production et modification de protéines,
synthèse d'ADN, assemblage des particules, enveloppement et re-
largage dans le milieu extérieur des virions.
Chacun de ces passages peut théoriquement faire
l'objet d'une intervention thérapeutique.
Les progrès récents de la biologie moléculaire, appli-
quée aux interactions virus-cellule permettent de distinguer
deux phases suivant que l'infection est active ou latente.
1°) la phase active ou lytique
L'expression coordonnée du génome viral aboutit à
la production de trois groupe de protéines virales contrôlées
par les gènes ~, Bety. (145) des cinq gènes
qui sont décrits
seul un est nécessaire à la replication du virus. Les fonc-
tions associées aux gènes B incluent la mort de la cellule
hôte, l'arrêt de l'expression des gènes~, et la synthèse
d'enzymes virales.
Les gènes y sont associés à l'inhibition de l'ex-
pression de quelques gènes B et la synthèse de protéines de
structure de virus, comprenant les glycoprotéines sinsérées
dans la membrane de la cellule hôte.
De façon idéale, on peut dire que ce sont les fonc-
tions métaboliques spécifiques du virus (différents de celles
de la cellule hôte) qu'il faudrait bien connaftre pour déve-
lopper des thérapeutiques efficaces et peu toxiques.
En ce qui nous concerne, deux points attirent notre
attention
a) la synthèse au cours de cette phase lytique de protéines
virales dont un certain nombre d'entre elles, à activité
enzymatique, intéressent le métabolisme de l'ADN. Parmi les
plus essentielles : une thymidine kinase, une thymidine mono-
phosphate kinase, une désoxyadénosine monophosphate kinase,
une ADN polymérase, une désoxy-ribonucléase.

---

40
En général, ces enzymes diffèrent, par leurs carac-
téristiques, des enzymes correspondantes trouvées dans les
cellules non infectées et suggèrent qu'elles sont codées par
le génome viral. En effet, en ce qui concerne la thymidine
kinase (TK), l'infection par HSV de cellules TK (dépourvues
de TK) induit la production de cette enzyme, et il existe des
mutants viraux qui sont TK.
b) la synthèse de l'ADN viral.
Il est essentiel, pour un matériel génétique, de faire
des copies exactes de lui-même.
L'ADN est formé par la polymérisation d'éléments
de base, les nucléotides. Ceux-ci sont constitués par une molé-
cule d'acide phosphorique, un sucre (le désoxy-ribose), une
base purique (adénine, guanine) ou pyrimidique (cytosine,
thymidine) .
Les nucléosides s'unissent entre eux pour former une
double chaîne hélicoidale : à une molécule d'adénine corres-
pond une molécule de thymidine, à une molécule de guanine cor-
respond une molécule de cytosine.
Un ADN ne diffère d'un autre que par les proportions
dans lesquelles y figurent les quatre bases et par l'ordre
dans lequel elle sont rangées. Ainsi, l'ADN du virus herpé-
tique contient un pourcentage élevé de guanine et de cytosine
(63 % et 73 % respectivement). Ceci permet de séparer l'ADN
viral de l'ADN cellulaire. Lors de la replication de l'ADN,
il se produit une rupture de l'hélice suivie de la formation
de molécules identiques, avec la même configuration des bases.
Précisons que la thymine,
base
spécifique de l'ADN,
est chimiquement voisine de l'uracil~base pyrimidique spéci-
fique de l' ARN.
2°) dans l'infection latente à HSV
Nous savons qu'il existe des différences de nature
moléculaire dans le génome viral. Après infection oculaire
chez la souris, HSV persiste dans les gangiions trigéminaux
dans un stade latent et n'est recouvrable que par explanta-
tion.
Le HSV latent constitue, comme il est établi, l'agent
potentiel déterminant les réinfections endogènes et ce, malgrè
une avalanche complexe des effecteurs immunologiques.

---

41
La compréhension espérée des raisons à la base de la
mise en réserve dans certains cas du virus à l'état quiescent:
ne pourra que déboucher sur la maîtrise de toute la morbidité liée
aux poussées herpétiques recurrentes comme des risques encourus
en néo-natologie ou dans les cas d'immuno-dépression.
Cependant, au cours de ces deux phases de l'infec-
tion herpétique et de manière plus radicale au cours de la pre-
mière, nous pouvons d'ores et déjà envisager notre propos
comme au' centre d'une triologie impliquant ipso facto trois
types d'interactions:
l
HSV
Tissus cutané
(infection)
(terrain)
IOC
(thérapeutique)
•
L'obtention de garanties thérapeutiques encore plus
larges dépend probablement de la compréhension aussi précise
que se peut de chacun de ces types d'interactions.
Dans l'étude expérimentale qui va suivre, nous allons
tenter d'explorer les interactions de type III
du schéma ci-
dessus
pouvant intervenir entre la iodo-5-désoxy-2'-cytidine
(IDC, molécule antiherpétique, et le milieu cellulaire cutané
dans le sens
peau-IDC : les interactions lOC-peau rele-
vant plus directement de la toxicologie.

---

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Il - ETUDE de la RESORPTION PERCUTANEE
de la IODO-5-DESOXY-Z'-CYTIDINE
à PARTIR du GEL "CUTERPES"

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45
A - LA PEAU i STRUCTURE ET CONDITIONS D'ABSORPTION DES
SUBSTANCES CHIMIQUES
La peau des mammifères est un tissu
constitué de
deux couches différentes issues de deux feuillets embryon-
naires distincts.
L'épiderme, le
plus mince et le plus externe,
d'origine ectodermique et de nature épithéliale, joue un
rôle essentiel lors de la pénétration dans l'organisme des
substances diverses exogènes comme dans les transformations
bioch~miques qui ont lieu dans la peau.
Au derme, plus interne et plus épais, on rattache
l'hypoderme, tous deux de nature conjonctive dérivent du mé-
soderme.
La peau présente par ailleurs des structures annexes
ou annexes épidermiques (glandes sudorales, glandes sébacées,
phanères). Ils dérivent embryologiquement des cellules de l'é-
piderme mais sont logés en grande partie dans le derme et
l'hypoderme. Ces annexes épidermiques comptent pour une part
réelle dans les processus d'absorption ou de biotransforma-
tion précédemmant évoqués au niveau de la peau.
Epiderme et derme s'articulent suivant une surface
hérissée de saillies plus ou moins coniques ; la jonction
dermo-épidermique. Celle-cièstd~,grand intérêt quand on consi-
dèxe que la nutrition de l'épiderme se fait à partir de derme,
lequel par sa vascularisation va permettre la résorption des
substances diffusant dans l'épiderme.
La peau, chez l'homme, présente des variations d'é-
paisseur suivant la localisation anatomique ; et celles-ci
sont déterminées par l'épaisseur de l'épiderme notamment de
la couche superficielle de kératine.

---

46
1 - Structure de la peau
Epithélivm malpighien kératinisé, l'épiderffie est
composé de plusieurs assises de cellules ou kératocytes dont
l~s aspects morphologiques varient au tur et mesure de leur
progression vers la surface de la peau et de leur maturation
cornée ; la kératinisation ne s'achevant que dans la zone
toute superficielle.
La couche la plus profonde, génératrice, couche
basale ou strat um germinatum, est formée d'une seule rangée
de cellules cylindriques à gros noyau foncé, disposées en palis-
sade perpendiculairement à la surface du derme.
c'est à ce niveau que se trouvent principalement
localisées les cellules de MASSuN ou mélanocytes dont certes
l'activité mais essentiellement les caractéristiques de leurs
grains de sécrétions, grains de mélanine ou mélanosomes, dé-
terminent la différence pigmentaire entre peau noire et peau
blanche
(7441.
Au stratum germinatum succède le stratum spinosum,
corps muqueux de malpighi comportant plusieurs assises stra-
tifiées de cellules maintenues entre elles par des tono-
fibrilles.
La couche granuleuse ou ~~um g~nulo~um comprend
deux à quatre rangées de cellules applaties, à noyau disloqué
ou dissout, contenant des grains de kérato-hyaline. Elle est
absente sur les muqueuses normales
(sauf kératinisation patho-
logique)
et dispar1t dans les défauts de maturation cornée
(parakétose du psoriasique) •
La couche suivante, le stratum luaidum, mal définie,
sauf aux endroits où la peau est épaisse (épiderme palmaire ou
plantaire)
est constituée de cellules translucides remplies
d'éléidine, produit supposé de transformation de la kérato-
hyaline.
Dans le stratum aorneum, =ouche la plus superfici-
elle, l'éléidine est convertie en kératine, substance non vi-
vante continuellement évacuée par la peau. Les cellules, à
maturation complête, sans noyau , et tassées les unes sur les
autres, forment des lamelles superposées, desséchées qui per-
dent ensuite leur cohésion et s'exfolient. La cellule cornée,
cellule morte calleuse, constitue ainsi, l'ultime terme d'une
longue migration
(25 à 30 jours)
de la cellule épithéliale
depuis la couche germinative selon un processus de transfor-
mation séquentielle avec production d'une protéine résistante,
la kératine. Ce phénomène contistue la kératinisation.

---

47
Nous pouvons noter avec intérêt que les cellules
basales extrêmement actives sur le plan métabolique sont ad-
jacentes au derme qui renferme l'unique réseau d'irrigation
de la peau et de ce fait, bénéficient d'une tension d'oxygène
plus élevée que dans les autres couches de l'épiderme.
Le mécanisme par lequel s'exerce le contrôle de la
prolifération et de la différentiation des cellules, demeure
encore à préciser. Quelques travaux (122) suggèrenL que des
substances comme les acides nucléiques cycliques, les prosta-
glandines et les polyamines dont le métabolisme est perturbé
dans le psoriasis peuvent de façon combinée exercer un effet
limi tant sur la prolifération épidermique normale. A ces fac-
teurs pourrait s'ajouter un autre, le facteur de croissance de l'é-
piderme (EGF : Epidermal Growth Factor)
(119,122), un polyep-
tide de PM 6400 isolée de la glande sous-maxillaire de la sou-
ris mâle et dont le rôle a été démontré in v~tro sur des cel-
lules épidermiques humaines en culture.
L'épiderme est rattaché au derme par la jonction
dermo-épidermique. Cette zone, élaborée conjointement par les
fibroblastes et les kératinocytes, ne possède pas de vérita-
ble membrane de séparation. Elle est traversée par les annexes
de l'épiderme et formée de quatre éléments qui sont en allant
vers le derme: la membrane plasmique de la cellule basale,
la lamina lucida, la lamina densa, les fibrilles d'ancrage
de structure collagène mélangées à des fibrilles élastiques.
1.2 Le derme
Le derme, couche la plus épaisse de la peau sur la-
quelle repose l'épiderme, est composé de fibres protéiques
surtout de collagène et d'élastine, enrobées dans une subs-
tance fondamentale amorphe essentiellement constituée de gly-
cosamino-glycanes (mucopolysaccharides acides) .
Les cellules conjonctives proprement dites, en petit
nombre dans les conditions normales, sont des fibroblastes
impliqués dans la biosynthèse de protéines fibreuses et de subs-
tances telles que l'acide
hyaluronique
les sulfates de chon-
droitine et les mucopolysaccharides.
Le derme contient d'autres cellules, des histio-
cytes, des macrophages, quelques lymphocytes et mastocytes,
des cellules graisseuses, et enfin des cellules associées aux
vaisseaux sanguins et aux nerfs de la peau. Il comporte deux
couches :
- le derme superficiel, derme papillaire, relativement riche
en cellules et en capillaires,

---

•
48
- le derme réticulaire comprenant à la fois derme moyen et derme
profond dans lequel on note un feutrage de faisceaux collagène.
Le tissu dermique est relié au tissu cellulaire sous-
cutané par l'hypoderme, couche adipeuse cloisonnée par des tra-
vées conjonctivo-élastiques, L'hypoderme contient les racines
des follicules pileux, les glandes sudoripares et, est parcouru
par des vaisseaux plus volumineux que ceux du derme.
1.3 Les annexes de la peau
annexes épidermiques
Les annexes épidermiques que nous rappelons brièvement
dans ce chapître comprennent : les follicules pileux, les glandes
sébacées, les glandes sudorales, les phanères. Ces derniers de
moindre importance dans notre propos, ne seront pas évoqués.
- les glandes sudorales eccrines et apocrines :
Elles correspondent à une origine, à des localisations
et à des fonctions différentes. Ce sont de simples glandes tubu-
laires, environ 3 millions sur tout le corps, comportant chacune
une partie sécrétrice et un tube sécréteur .
. les glandes éccrines, les plus nombreuses, se trouvent sur l'en-
semble du tégument et sont particulièrement abondantes aux paumes
et aux plantes, aux aisselles, au front ~t à la poitrine. Leur
partie sécrétrice ou peloton sudoripare, est situé dans le derme
profond et l'hypoderme. Le canal excréteur de ces glandes, ou ca-
nal sudorifére, suit un trajet sinueux à travers le derme, tra-
verse en spirale l'épiderme et s'abouche à la surface par un pore.
. Les glandes apocrines : anatomiquement et embryologiquement liées
aux glandes sébacées et aux poils, elles sont particulièrement
fréquentes dans les zones ano-g~nito-périnéale, inguinale, axil-
laire et mammelonnaire 1 mais en petit nombre, avec des varia-
tions individuelles, sur le cuir chevelu, le visage, les faces
antérieures et latérales du tronc. Ce qui les différencie des
glandes eccrines, c'est le plus grand diamètre de leur lumière
et le caractère éosinophile de leur assise bordante. Aussi elLes
sont enroulées et tubulaires et leur tube excréteur s'ouvre en
général dans un foL1.icule pilo-sébacé. Il n.'ya donc pas de pore
apocrine.
Comme les glandes sébacées, elles vident leurs sécré-
tions directement dans le canal pilaire 1 ces sécrétions ensui-
te parviennent à la surface de l'épiderme avec le sébum des
glandes sébacées.

---

49
- les glandes sébacées
Bien souvent annexées aux poils (appareil ou folli-
cule pilosébacé), les glandes sébacées sont habituellement for-
mées dans le tiers supérieur du follicule pileux au cours de
son développement et siègent dans le derme moyen.
Réparties sur la plus grande partie du corps, exception
faite à la lèvre inférieure, aux paumes et aux plantes, on les
retrouve surtout au niveau du visage (nez et joues), du crâQe,
du front, des aisselles ; toutes ces parties du corps qui ont
tendance à devenir huileuse. Le follicule pilosébacé est géné-
ralement le siège de lésions d'acné ou de phénomènes inflamma-
toires pouvant aboutir à une métaplasie malpighienne.
Les glandes sébacées synthétisent et ex~ètent des subs-
tances lipidiques caractéristiques qui entrent avec celles pro-
duites par l'épide.rme dans la composition des lipides de surface
de la peau. Ces lipides sont composés d'acides gras, de trigly-
dérides, de squalènes, de stérols estérifiés et libres, de cires
et divers lipides saturés (123,122, 71
1. Ce sont des glandes
(holocrines) dont les sécrétions sont directement fonction de la
taille et de l'activité.
L'activité des glandes sébacées, sensibles aux fluc-
tuations de l'apport calorique est, de m~me que leur taille, sous
contrôle hormonal particulièrement androgène (121,123). Ce con-
trôle agirait au moins à deux niveaUX : la mitose et la synthèse
intracellula~re.
Trois types différents de cellules composent la glande
sébacée :
- les cellules périphériques riches en ribosomes et situées près
de la membrane basale,
- les cellules pleinement différenciées, actives dans la synthè-
se et le stockage des gouttelettes de sébum,
- les cellules pleinement différenciées contenant des vacuoles
qui peuvent §tre libérées pendant la rupture des cellules.
L'activité normale des glandes sébacées admet comme
stade ultime la nécrose des cellules avec expulsion des débris
cellulaires et de sébum par contraction du muscle arrecteur an-
nexé au follicule pileux.
La peau est ainsi un organe vivant, composé de struc-
tures variées embryologiquement et histologiquement.
Largement irrigé (artères, veines, capillaires surtout
et fentes lymphatiques), le derme est considéré comme un réser-
voir de substances pour la nutrition de l'épiderme, et notamment,
de l'épiderme basal biologiquement actif (771.

---

50
Riche en eau de par le derme, suffisamment poreux de
par les annexes épidermiques,
la peau est aussi dorée d'un réseau
nerveux comprenant d'une part, des nerfs cérébro-spinaux,centri-
pètes et sensitifs qui assurent les fonctions sensorielles, et
d'autre part, des filets sympathiques, centrifuges, vasomoteurs,
et sécrétoires.
Il est ainsi aisé d'imaginer le rôle que pourrait jouer
un tel système dans l'infectionlatente ou récurrente à HSV à par-
t i r d'un site de primo-infection cutané.
Par ailleurs, du fait que l'organisme humain baigne
en permanence dans un environnement chimiquement chargé,
la
peau, en plus de la sollicitation dont elle est l'objet aux plans
cosmétologique et thérapeutique, constitue une des voies de régu-
lation des échanges entre les milieux intérieur et extérieur.
Avant de présenter l'étude de la résorption percutanée
de l'IDe chez le rat nu atrichi, allons-nous de manière succinte,
rappeler quelques données sur les conditions d'absorption des
substances médicamenteuses à travers la peau.

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51
2 - Conditions d'absorption percutanée des substances chimiques
2.1 Mécanismes intervenant dans l'absorption percutanée
La peau est une membrane épaisse, nous venons de le voir,
de structure complexe.
La plupart des molécules appliquées â la surface cutanée
doivent d'abord franchir le stratum corneum et sa couche lipidi-
que superficielle. Ensuite, elles doivent franchir l'épiderme
vivant, le derme papillaire avant de se résorber à travers les
parois capillaires ou les canaux lymphatiques.
Au cours de la phase de pénétration percutanée, trois
phénomènes interviennent; le rôle de " barriêre " de l'épider-
me et son .. effet réservoir .. , la diffusion dans l'épiderme.
La barrière principale â l'absorption percutânée des
molécules est constituée par les cellules cornées de l'épiderme,
cellules non vivantes dont le complexe kératine-phospholipides
joue un rôle majeur dans la régularisation des entrées et sorties
de substances chimiques (724). Ainsi, la couche lipidique super-
ficielle opposerait une résistance moindre au passage de l'eau
et d'autres composés chimiques.
Après pénétration et diffusion dans le stratum corneum,
les molécules chimiques sont alors âbsorbées â travers la peau
selon un processus de diffusion passive à vitesse constante. Mais
initialement, un temps de latence est nécessaire â l'imprégnation
du stratum corneum et â l'établissement d'un gradient de diffu-
sion (s.chéma II).
QI
'QI
-e
SCHEMA II
o
UJ
.0
'"
QI
.-i
'"
Profil d'absorption au cours
-I-l
o
-I-l
du temps d'une molécule
diffusant â travers la peau
humaine intacte.
T
temps de latence
Temps
T

---

52
A l'équilibre de diffusion, lorsque l'apport de subs-
tance pénétrante au niveau de l'épiderme, est égal aux pertes
par passage dans les structur~s dermiques, la diffusion est ré-
glée par la loi de Fiek.
dQ
Kp.S (Cl - C2)
<ft
avec
dQ
==
quantité de substance absorbée par unité
dt
de temps
Kp
constante de perméabilité :
S
==
surface d'application:
Cl - C2
==
différence de concentration de la sub-
tance de part et d'autre de la membrane.
La constante de perméabilité Kp, peut s'écrire (équa-
tion 2)
Km
Dm
Kp
==
e
avec
Km
coefficient de partage de la substance entre
la membrane et le véhicule :
Dm
==
coefficient de diffusion de la substance au
sein de la membrane :
e
==
épaisseur de la membrane.
Mais si la couche cornée de l'épiderme constitue la
barrière limitante de l'absorption des substances liposolubles
et au moins légèrement hydrosolubles, quelques auteurs cités par IV-
SONl124 )attribuent un certain rôle à la jonction dermo-épider-
mique (notamment la partie haute du derme papillaire) et parlent
méme de seconde barrière.
2.2 Les voies de pénétration percutanée
Pour une molécule chimique appliquée sur la peau, il y
a trois voies potentielles de pénétration à travers le stratum
corneum (12.4 J
a)
les régions folliculaires pilo-sébacées (voie transfollilaire),
b)
les conduits sudoripares (voie sudorale),
c)la matrice du stratum corneum (voie trans-épidermique).
Les glandE5 eccrines et condui 15 sudoriparE5 d' après IVSON
(12.4) puentdans la pénétration percùtanée, un rôle peu signifi-
catif. De ce fait, l'absorption percutanée de substances chimiques
s'opere essentiellement au niveau de la matrice cornéenne et via
les follicules pilosébacés. L'importance relative du rôle de l'une
et l'autre voie dans le processus d'absorption percutanée est dif-
ficile à établir et dépend des proprietés physicochimiques de la
molécule pénétrante.

---

53
Cependant il est bien admis que la voie transfolliculaire
est la seule à intervenir dans la phase précoce de la pénétration
de la couche cornée, pendant le délai de latence.
A l'équilibre de diffusion, l'absorption est principale-
ment trans-épidermique, au travers et entre les cellules cornées.
Celle-ci est lente même pour les petites molécules hydrosolubles,
écrit IVSON. A l'état hydraté, le stratum corneum se présente com-
me une phase semi-solide dense, dans laquelle des électrolytes de
faible
poids moléculaire se dissolvent en cré~t
de fortes in-
téractions chimiques.
Par voie folliculaire, les médicaments appliquës à la
surface de la peau, atteignent les orifices des glandes sudoripa-
res et directement l'épiblél~um stratifié et squameux des folli-
cules pilosébacés. Absorbés par les espaces microscopiques entre le
tronc pilaire et la paroi folliculaire, ils vont accéder dans les
zones situées sous la barrière membranaire.
1.2.3 Facteurs influançant l'absorption percutanée
De nombreux facteurs peuvent influencer la pénétration
percutanée des médicaments. Ces facteurs d'ordre physiologique,
ne seront pas discutés ici, et l'on peut citer: l'état (intact
ou lésé), l'âge, la surface traitée, le site anatomique considéré,
les variations inter-espèces animales, la température (120), le
degré d'hydratation de la peau, d'une part; les propriétés re-
latives à la préparation ou substance pénétrante (véhicule, pH,
concentration, coefficient de partage etc ••• ) d'autre part.
Lèétat lésé ou inflammé de la peau par exemple est sus-
ceptible de modifier l'absorption percutanée. Cet effet, expli-
cable par un " shunt surajouté" d'après IVSON consécutif soit à
une disparition partielle ou totale de la barrière cornéenne,
soit à une disparition histologique des structures épidermiques
peut être observé
dans des états pathologiques tels que l'eczé-
ma, les dermatoses exfoliatives dont l'herpès cutanéo-muqueux.
Le délai de latence dans ces cas peut être raccourci de manière
significative voire annulé. Alors le compcrr~ement de l'agent
pénétrant dans les liquides qui imbibent ces lésions ainsi que la
traversée du reste des constituants de l'épiderme vont dépendre
principalement des caractères de solubilité propres à la subs-
tance; d'où l'intérêt que l'on peut attribuer au coefficient
de partage lipide/eau.
En résumé, comme le rappelle WEPIERRE en accord avec
ROTHMAN, l'absorption percutanée d'une substance apparaît comme
la somme de deux phénomènes qui sont
d'une par~ une pénétration
des molécules du milieu extérieur au sein de la peau entière,
d'autre part une résorption depuis les structures cutanées par la
circulation sanguine ou lymphatique (j<~rp.ma III) •

---

54
Principe actif
•
vehicule
Préparation
Pénétration
diffusion dans la
LIBERATION
-~
couche cornée
P
E
.}
Oiffus:Lon dans les
E
stuctures
épidermiques et
ABSORPTION
A
dermiques
U
t
I;>ISTRIBUTION
0
Résorption
METABOLISME
EXCRETION
SCHEMA
III
Représentation schématique des conditions
d'absorption d'un médicament appliqué sur
la peau •
E = épiderme 1 0 = derme
Par rapport à ce schéma, nous allons présenter ici l'é-
tude expérimentale de la résorption percutanée de la iodo-S-déso-
xy-2'-cytidine (IOC) chez le rat à partir du gel" CUTERPES "
l'absorption à travers la peau entière ayant été étudiée in vi-
tro chez le rat et chez l'homme par WEPIERRE
Une partie de nos résultats ensemble avec ceux de WE-
PIERRE ont été l'objet d'une publication (126).
L'étude du métabolisme cutané de l'IOC, constitue le
sujet de la partie III de ce présent ouvrage.

---

55
B. ETUDE de la RESORPTION PERCUTANEE de la IODO-5-DESOXY-2'-CYTIDINE
â partlr du GEL COTERPES
L'étude de la résorption percutanée de la iodo-S-désoxy-
2'-cytidine chez le rat mâle sans poil et de sa biodisponibilité
comporte plusieurs volets :
- Etude de la résorption, de la distribution et de l'élimination
de l'12SIDC chez le rat mâle sans poil, après administration
orale
- Etude de la cinétique sanguine, de la distribution et de l'élimination
de l'12SIDC chez le rat mâle sans poil, après administration
intraveineuse ;
- Etude de la résorption percutanée de l'125IDC dans le gel CUTERPES
chez le rat male sans poil à peau normale ;
- Etude de la résorption percutanée de l'12SIDC dans le gel CUTERPES
chez le rat mâle sans poil à peau lésée.
Ces différents volets ont été envisagés non seulement dans
le but d'apprécier le comportement de l'IDC in vivo chez le rat
(résorption sanguine, distribution, élimination) après administration
générale ou locale, mais aussi et surtout d'établir sa biodisponibilité
relative dans des conditions se rapprochant de celles d'une peau
herpétique. C'est la raison pour laquelle l'administration locale
se fera avec du CUTERPES sous sa forme commerciale.

---

56
1. Matériels et Méthodes
1.1. Modèle du rat sans poil
Le modèle utilisé dans notre protocole expérimental est le
rat sans poil de souche atrichis fourni par le Centre de Recherche et
d'Elevage IFFA-CREDO (St-Germain-sur-I-Arbresle, France).
Les raisons du choix de ce modèle, évoquées lors de nos
précédents travaux (120)
, trouvent à leur base le souci de disposer
d'un matériel se rapprochant de la peau humaine.
En effet, 0,1 à 1 % seulement de la surface totale cutanée
chez l'homme (IVSON, 1915 - 124), est occupé par les glandes sudoripares
et les follicules pileux, et nous savons la part de rôle que sont
susceptibles de tenir ces annexes épidermiques dans le processus global
d'absorption percutanée de substances exogènes.
Ainsi, bien que plus coateux, nous avons préféré au rat
ordinaire avec poil (Wistar par exemple) le rat génétiquement glabre,
souche ne faisant intervenir aucune nécessité de rasage ni de dépilation
aux conséquences bien connues (1201.
L'activité pilo-sébacée étant sous contrOle androgène
nous avons choisi de nous placer, en utilisant le rat mâle, dans le cas
d'une physiologie optimale à l'état normal.
1.2. Molécule marquée: 125IDC
1.2.1. Caraat~ristiques
La molécule marquée a été fournie par New England Nuclear
(N.E.N.) avec les caractéristiques suivantes
Produit en solution dans l'éthanol à 50° (2,5 ml)
N° de catalogue
NEW 9994
N° ordre N.E.N.
24 68 33 140
N° de lot
350.296
Concentration
399,4 ~Ci/ml
Activité spécifique
776,5 ~Ci/mmole
Activité totale
1000
~Ci

---

57
1.2.2. Caraat~reB de soZubiZité
L'IOC est soluble dans l'eau, la solution à 2 g pour 100 ml
à 00o-100°C, est limpide.
1.2.3. Coeffiaients de partage
Lorsqu'une molécule en solution dans un excipient est placée
au contact de la peau, elle se répartit entre les deux phases selon un
coefficient de partage qui traduit l'affinité de la substance pour son
véhicule et pour le tégument (couche cornée) •
Les coefficients de partage, couche cornée humaine/véhicule
et myristate d'isopropyle/véhicule de l'IDC, ont été déterminés par
WEPIERRE et Colt. (121) ; les résultats sont consignés dans le tableau
COEFFICIENT de PARTAGE
Couche cornée humaine/véhicule
Myristate d'isopropyle/véhicule
Valeur
1,75 ± 0,76
Valeur = 0,105 ± 0,005
n (*) = 10
n = 5
(*)
Nombre de déterminations expérimentales.
Pour notre part, nous avons vérifié le comportement de l'IOC
en partage octanol/eau.
Le coefficient de partage K est déterminé à 37°C sous
agitation mécanique pendant 1 heure dans un bain-marie, d'un mélange
à partie égale d'une solution tamponnée d'IDC à 25 mg pour 100 ml de
tampon phosphate pH 7,4, saturé en octanol, et d'une solution d'octanol
saturée en tampon.
Un volume aliquote défini est transvasé dans une ampoule à
décanter et la densité optique est alors mesurée au spectrophotomètre
(PYE UNlCAM SP.8-100 UV/VIS) par échantillonnage à partir de la phase
aqueuse tamponnée.

---

58
Une droite de calibration préalablement construite
(concentrations en produit versus 0.0.) permet par interpolation
de lire la concentration du produit dans la phase aqueuse et après
calcul d'en connaître la quantité (02).
K
03
=
~
03
=
01 - 02 = Quantité d'IOC passée dans l'octanol
02
=
Quantité d'IOC restante dans le tampon
01
=
Quantité initiale d'IOC soumise à partage
Bien que nous n'ayons effectué que deux déterminations
expérimentales, le résultat obtenu (0,136 ± 0,010) est suffisamment
proche de celui obtenu par WEPIERRE (0,105 ± 0,005) compte tenu de
l'emploi de l'octanol dans un cas et du myristate d'isopropyle dans
l'autre.
1.3. Protocole expérimental général
Des rats mâles sans poil, de poids variant entre 250 et
300 g, fournis par le Centre d'Elevage IFFA-CREDD (St-Germain-sur-
l'Arbresle, France), sont mis en cage à métabolisme 24 heures avant
traitement, et à jeun 12 heures avant le début de l'expérience.
Ils peuvent cependant boire à volonté.
La solution de travail est obtenue par dilution isotopique
convenable à chaque voie d'administration (Cf.§B.2.1. page 55 et
§B.3.1. page 60), le volume final faisant 10,0 ml pour la voie orale
et 5,0 ml pour la voie intraveineuse.
Au temps zéro, un volume déterminé de solution ainsi préparée
équivalant à une dose radioactive de la microcuries est administré par
voie orale ou par voie intraveineuse.
Des prélèvements de sang veineux sont effectués à des temps
différents suivant un rythme déterminé dans le but d'établir la
cinétique sanguine du produit marqué.
D'autres prélèvements sont effectués et vont servir à l'étude
de l'élimination (urines, fèces) ou de la distribution (glande thyrolde)
du produit marqué et/ou de ses métabolites.

---

59
Les prélèvements de sang recueillis par section terminale
de la queue sont immédiatement pesés dans des pots packards tarés
(balance de précision SARTORIUS).
Du fait que le radioélément utilisé pour le marquage émet
un rayonnement gamma, les urines et les fèces recueillies sont
directement soumises au comptage dans des pots packard sans traitement
préalable.
Toutes les opérations ont été réalisées parallèlement à des
témoins, animaux n'ayant reçu à la place de la solution marquée que du
sérum physiologique.
La détermination de la radioactivité au niveau du sang, des
organes et produits d'excrétion, a été effectuée à l'aide d'un spectro-
mètre à scintillation
y
(PACKARD TRI-CARB 3255).
1.4. Expression des résultats
Les résultats sont exprimés en coups par minute et par
milligramme de sang (CPM.mg- 1) et concernent dans les divers tableaux
(Cf. résultats) des animaux pris individuellement.
•
Les moyennes sont associées à l'écart type.
L'activité moyenne administrée par animal est de
6
4,4.10
CPM.

---

60
2. Etude de la résorption, de ladistribùdonet de l'élimination de
1'I25IDC chez le rat mâle sans pOli, après adminlstratlon orale
2.1. Protocole expérimental
Les animaux utilisés repondent aux caractéristiques décrites
dans le protocole expérimental général, paragraphe B.1.3. précédent.
La solution de travail est obtenue par dilution isotopique
de l'IOC de manière suivante:
IDe non marquée
48,00 mg
Solution d'IDe N.E.N. marquée
0,20 ml
Eau distillée q.s.p.
10,00 ml
Au temps zéro, un volume de 1 ml de solution ainsi préparée
équivalant à une dose radioactive de 10 microcuries, est administré par
voie orale •
•
Des prélèvements de sang veineux sont effectués à différp.nts
temps (Cf. Tableau
l
) dans le but d'établir la cinétique sanguine
du produit marqué, et leur poids est immédiatement déterminé par pesage
dans des pots packard tarés (Balance de précision SARTORIUS).
L'étude de l'élimination du produit marqué et/ou de ses
métabolites est menée par fractions de 24 heures jusqu'au temps 72 heures
en prélevant donc à trois moments (24 h, 48 h, 72 hl, les urines, les
fèces et de la glande thyroïde.
Cette dernière est prélevée après sacrifice de l'animal par
section de la carotide; ce mode permet à l'animal d'être vidé de son sang.
Toutes les opérations ont été réalisées parallèlement à des
témoins, animaux n'ayant reçu à la place de la solution marquée que du
sérum physiologique.
La détermination de la radioactivité au niveau du sang, des
organes et produits d'excrétion, a été effectuée à l'aide d'un spectro-
photomètre à scintillation y
(PACKARD TRI-CARB 3255).

---

61
2.2. Résultats et discussion
2.2.1. Cinétique sanguine
Les résultats sont expr~mes en coups par minute et par
milligramme de sang (CPM/mg). Ils concernent cinq animaux pris
individuellement et les valeurs correspondantes, ainsi que les
moyennes et écarts types, sont rassemblés dans le Tableau
l
L'activité moyenne administrée par animal est de :
4,4 x 106 CPM.
La radioactivité sanguine est maximum environ 5 h à 6 h
aprês administration avec une valeur qui représente 0,3 % de la
dose administrée par ml de sang. Au-delà de ce maximum, la
décroissance de la radioactivité est assez nette et la demi-vie de
la phase d'élimination est de l'ordre de 12 heures.
TABLEAU
1
Cinétique sanguine chez le rat male sans poil
après administration orale d'125IDC
Radioactivité par rat = CPM/mg de sang
Temps
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
M± cr
15 mn
7,10
2,70
4,40
1,60
1,20
3,40 ± 2,40
45 mn
3,20
2,90
3,50
3,80
3,00
3,30 ± 0,40
1 h 00
3,60
3,60
3,30
6,00
3,30
3,90 ± 1,10
1 h 30
4,70
7,10
3,80
9,40
7,00
6,40 ± 2,20
2 h 30
4,90
5,60
5,60
10,70
6,00
6,60 ± 2,30
3 h 00
5,70
7,70
9,70
9,70
8,20
8,20±1,60
4 h 30
9,30
18,50
12,30
9,90
7,00
11,40 ± 4,40
5 h 00
11,00
14,50
10,80
18,50
15,70
14,10 ± 3,30
6 h 30
11,90
24,10
13,60
8,70
7,20
13,10 ± 6,60
7 h 00
9,90
17,60
13,30
9,20
6,50
11 ,30 ± 4,30
24 h 00
6,00
5,10
4,10
0,80
1,00
3,40 ± 2,40
48 h 00
1,10
1,10
1,90
0,20
0,20
0,90 ± 0,70

---

52
CP"/~9 san9
GRAPHIQUE
16
CIHETIQUE DAHS LE SANG APRES AD"IHISTRATIDH ORALE
1
1
1
1
1
39
35
49
59
55
TEMPS' (h, ~n )

---

63
2.2.2. Distribution de Z'125IDC et de ses métaboZites
Cette étude a été entreprise uniquement au niveau de la
thyrolde, susceptible de fixer d'une façon importante l'iode 125,
aux temps de 24 h, 48 h et 72 h.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau ci-après
et exprimés en pourcentage de radioactivité par organe prélevé
par rapport â la dose initiale administrée ; ils concernent cinq
animaux pour chaque temps.
TABLEAU lA
Temps
%radioactivité
M± (]
par thyroïde
1,30
1,20
1,26 ± 0,135
24 h
1,20
1, la
1,50
1,50
0,60
48 h
1 ,la
1,16 ± 0,361
1,60
1, 00
0,15
0,14
72 h
0,14
0,25 ± 0,018
0,48
0,33
Les valeurs observées montrent une fixation notable de
la radioactivité au niveau de la thyroide aussi bien pour les temps
de 24 h et 48 h que pour celui de 72 h.
Pour le temps de 24 h, la valeur moyenne se situe à
1,25 % de la dose administrée, alors qu'elle est de 1,06 % au temps
de 48 h et de 0,25 % au temps de 72 h.

---

64
2.2.3. Elimination de l,125IDC et de ses m~tabolites
Cette étude a été entreprise jusqu'au temps de 72 h en
collectant les urines et les fèces par fraction de 24 h.~
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau
et sont exprimés en pourcentage de radioactivité par rapport à la
dose initiale administrée.
L'élimination urinaire est la plus importante, puisqu'elle
atteint 60 % de la dose administrée au temps 72 h 1 elle se produit
surtout dans les premières 24 h avec une valeur moyenne de 47,5 %.
L'élimination fécale est nettement plus faible et ne
représente que 7,4 % de la dose administrée au temps 72 h. Au temps
24 h, la valeur moyenne est de 3,5 %.

---

TABLEAU lQ
Elimination urinaire et fécale après administration orale d'125 IDe
chez le rat mâle sans poil
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
Temps
- -
Urines
Fèces
Urines
Fèces
urines
Fèces
Urines
Fèces
Urines
Fèces
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
o - 24 h
49,50
5,00
35,00
2,20
52,20
5,00
52,70
3,00
47,80
2,10
24 - 48 h
li)
7,00
0,60
6,60
0,90
6,60
2,00
11,90
0,70
10,30
0,50
<D
48 - 72 h
2,40
6,80
9,20
4,20
2,40
3,70
2,30
0,20
3,50
0,20
%total à
58,90
12,40
50,80
7,30
61,20
10,70
66,90
3,90
61,60
2,80
72 h
Elimination
totale par rat
71,30 %
58,10 %
71,90 %
70,80 %
64;40 %
à 72 h
Elimination urinaire
Elimination fécale
-
M± (} = 59,90 ± 5,90 %
M± (} = 7,40 ± 4,20 %

---

66
3. Etude de la cinétique, de la distribution et de l'élimination de
,i125IOC chez le rat mâle sans pOll, après admlnlstratlon lntraveineuse
3.1. Protocole expérimental
Les animaux utilisés sont des rats mâles sans poil dont les
caractéristiques et les conditions de détention sont décrites dans le
protocole général, paragraphe B.l.3.
La solution de travail est obtenue par dilution isotopique
de l'IOC de manière à obtenir une activité de la microcuries dans
0,50 ml.
IOC non marquée
48,00 mg
Solution d'IOC N.E.N. marquée
0,20 ml
Eau distillée q.s.p.
5,00 ml
Au temps zéro, 0,50 ml de solution ainsi préparée est
administré par voie I.V. dans la veine du pénis.
Des prélèvements de sang veineux sont effectués à différents
temps (Cf. Tableau
I I ) dans le but d'établir la cinétique sanguine
du produit marqué.
Par fractions de temps de 24 h jusqu'au temps de 72 h,
l'étude de l'élimination du produit marqué et/ou de ses métabolites
est conduite en prélevant les urines et les fèces ainsi que la glande
thyroide une fois les animaux sacrifiés par section carotidienne.
Ces prélèvements issus d'animaux traités comme d'animaux
témoins sont soumis au comptage dans un spectrophotomètre à
scintillation y ; les prélèvements de sang ayant été au préalable
pesés dans des pots tarés.

---

67
3.2. Résultats et discussion
3.2.1. Cin~tique sanguine
Ces résultats sont exprimés en coups par minute et par
milligramme de sang (CPM!mg). Ils concernent cinq animaux pris
individuellement et les valeurs corresponsantes ainsi que les
moyennes et écarts types sont rassemblés dans le Tableau
II
L'activité moyenne par animal est de 4,4 x lOG CPM.
La décroissance de la radioactivité sanguine est assez
lente dans la première phase (distribution) où l'on passe de 0,2 %
de radioactivité par ml de sang au temps de 5 minutes à 0,14 % au
temps de 1 h.30. Au-delà de ce temps, on remarque une deuxième phase
d'élimination plus lente avec une demi-vie de l'ordre de 13 h.
TABLEAU
II
Cinétique sanguine chez le rat mâle sans poil
aprês administration intraveineuse d'125IDC
Temps
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
M ± cr
5 mn
8,10
10,GO
9,39 ± 1,80
10 mn
10,20
7,90
9,00±1,GO
20 mn
9,80
G,30
8,00 ± 2,50
30 mn
7,80
7,20
7,00
G,90
G,10
7,00 ± O,GO
1 h
8,10
8,10
7,70
G,50
4,80
7,00 ± 2,00
1 h 30
G,OO
G,20
G,GO
G,30
5,30
G,10±0,50
2 h
7,90
7,00
7,GO
G,30
5,50
G,90 ± 1,00
3 h
G,10
G,GO
9,10
5,80
5,00
G,50±l,50
4 h 30
G,OO
9,90
7,00
3,30
4,10
5,30 ± 1,40
5 h
5,40
5,30
G,20
3,GO
4,00
4,90±1,10
6 h
4,80
5,10
5,70
3,80
3,20
4,50 ± 1,00
24 h
2,90
3,20
2,50
O,GO
0,40
1,90 ± 1,30
48 h
0,90
0,90
0,30
0,10
0,10
0,50 ± 0,40

---

68
CINETIQUE SANGUIHE CHEZ LE RAT ~ALE SANS POILS APRES AD~INISTRATIOH
IHTRAUEIHEUSE D'I.D.C Iode 12S
see
Ieee
CINETIQUE ,AN'VINE ch.z 1. RAT HALE SAHS POIL
APRES ADMIHISTR. ORALE et IHTRAVE!H. D'IDC 12S

---

69
3.2.2. Distribution de Z1125IDC et de ses métabolites
Cette étude a été réalisée, comme pour la voie orale,
uniquement au niveau de la glande thyroïde, organe cible pour
l'iode 125, et cela, pour les temps de 48 h et 72 h.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau
III
et exprimés en pourcentage de radioactivité par organe par rapport
à la dose initiale administrée ; ils concernent cinq animaux pour
chaque temps.
TABLEAU
III
Temps
%radioactivité
M± cr
par thyroïde
1,67
1,53
±
48 h
2,77
1,85
0,485
1,41
1,89
0,17
0,19
72h
0,21
0,20 ± 0,030
0,17
0,25
On retrouve une fixation notable de radioactivité pour
les deux temps avec une valeur moyenne de 1,85 % de la dose
administrée au temps de 48 h et de 0,20 % au temps de 72 h.

---

70
3.2.3. EZimination de Z,125IDC et de ses métaboZites
Cette étude a été limitée au temps de 72 h en collectant
les urines et les fèces par fractions de 24 h.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau
IV
et sont exprimés en pourcentage de radioactivité par rapport à la
dose initiale administrée.
L'élimination urinaire est la plus importante et se produit
surtout dans les premières 24 h
la valeur moyenne pour ce temps est
de 62,8 %. Au temps de 72 h, on retrouve 69,1 % de la radioactivité
au niveau urinaire.
L'élimination fécale est faible puisqu'elle ne représente
que 3,7 % de la dose au temps de 72 h ; elle provient d'une élimination
biliaire du composé marqué et de ses métabolites relativement peu
importante.

---

TABLEAU
IV
Elimination urinaire et fécale après administration intraveineuse d'125 IDe
chez le rat mâle sans poil
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Rat 4
Rat 5
Temps
Urines
Fèces
Urines
Fèces
Ur_ines
Fèces
Urines
Fèces
Urines
Fèces
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
o - 24 h
63,90
0,40
49,50
0,70
70,90
0,20
64,80
0,70
64,80
0,50
...-1
r--
24 - 48 h
0,20
4,00
4,60
0,20
5,50
0,20
4,50
0,20
4,70
2,40
48 - 72 h
7,00
2,20
0,90
1,10
1,30
4,40
1,20
0,00 %
1,90
1,20
% total à
71,10
6,60
55,00
2,00
77,70
4,80
70,50
0,90
71,40
4,10
72 h
•
Elimination
totale par rat
77,70 %
57,00 %
82,50 %
71,40 %
75,50 %
à 72 h
Elimination urinaire
Elimination fécale
-
M± cr = 69,10 ± 8,40 %
M± cr = 3,70 ± 2,30 %

---

72
4. Etude de la résorption percutanée de l'IDC dans le gel CUTERPES
chez le rat mâle sans pOll à peau normale
4.1. Protocole expérimental
Deux méthodes ont été utilisées qui diffèrent essentiellement
par la présence ou l'absence d'une anesthésie préalable à l'éthyluréthane
et l'utilisation d'un pansement occlusif sur la surface enduite de gel,
chez l'animal vigile.
- Méthode utilisant l'animal endormi
- - - - - - - - - - - - - - - - -
Trois rats mâles, sans poil, anesthésiés à l'éthyluréthane
par voie I.P. à 1,20 g/kg, sont déposés ensuite en de cubitus ventral
dans des cages à métabolisme. Ainsi la pommade peut être appliquée sur
la peau du dos, sans aucune possibilité de contact.
Le gel marqué est préparé extemporanément selon la
composition :
CUTERPES commercial (gel)
1,8 g
Solution IDe N.E.N. marquée
0,2 ml
L'ensemble est soigneusement mélangé de façon à obtenir une
préparation convenable dont on peut contrôler l'homogénéité et l'activité
en réalisant des prélèvements en différents endroits du mélange.
Une surface de 12 cm2 est déterminée sur la peau du dos de
l'animal et, à l'aide d'une spatule préalablement tarée, 250 mg environ
de gel marqué y sont finement et de façon régulière, étalés. En repesant
la spatule après application, il est aisé de connaïtre la quantité exacte
de gel déposée.
Vingt-quatre heures après l'application, les urines sont
recueillies, le sang (1 ml) est extrait par ponction cardiaque et la
glande thyrolde prélevée juste après sacrifice de l'animal par section
carotidienne.
Pour deux des animaux ainsi vidés de leur sang et séparés de
leur thyroïde, la peau est délicatement retirée. L'animal est dépecé et
broyé entièrement au mortier-pilon en bronze (Cf. schéma) dans de l'azote
liquide en évitant les pertes.
La détermination de la radioactivité est identique à celle
décrite dans le protocole général (§ B.l.3.).

---

73
La technique est identique à celle utilisée pour l'animal
anesthésié, avec comme seule différence que l'animal étant vigile, la
surface enduite de gel (dans ce cas, 6 cm2), est recouverte à l'aide
d'un pansement occlusif: compresse de gaze isolée de la préparation
pâteuse par une pellicule souple plastique, le tout maintenu sur
l'animal par un ruban de sparadrap.
La suite du protocole reste identique à celle décrite pour
l'animal endormi.
Le gel marqué est alors appliqué sur la portion de peau
lésée (12 cm2) à l'aide d'une spatule préalablement tarée, le dépôt de
250 mg environ de préparation marquée est réalisé de façon aussi fine
que régulière.
Vingt-quatre heures après l'application, les animaux sont
sacrifiés et on opère de manière rigoureusement identique à celle pour
la peau normale, tant pour les prélèvements urinaires, sanguins et de
glandes thyroïdes que pour le comptage de la radioactivité. Pour chaque
animal, la radioactivité est déterminée au niveau du corps entier
débarrassé de la peau, du sang et de la glande thyroïde.
4.2. Résultats et discussion
4.2.1. Méthode utilisant l'animal endormi
Les résultats concernant deux lots de trois rats sont
rassemblés dans le Tableau
V
et sont exprimés au niveau des urines,
de la thyroïde et de l'animal entier en pourcentage de radioactivité
par rapport à l'activité déposée sur la peau, et au niveau du sang en
pourcentage de radioactivité par ml de sang.

---

74
TABLEAU
V
Passage percutané de l'125IDC dans CUTERPES GEL
24 h après application
sur rat mâle sans poil endormi à peau intacte
Surface
6 cm2 de peau
12 cm2 de peau
de dépôt
Rat
N° 1
N° 2
N° 3
N° 4
N° 5
N° 6
Urines
0,050
0,060
0,110
0,080
0,100
0,070
Sang
0,001
0,001
0,001
0,009
0,013
0,009
(1 ml)
Thyroïde
0,020
0,010
0,010
0,020
0,020
0,020
Ani ma l
0,310
0,430
entier
4.2.2. M~thod2 utiZisant l'animal vigiZe
Les résultats concernant six rats avec une surface
d'application de 6 cm 2 sont rassemblés dans le Tableau
VI
et sont exprimés au niveau des urines, des fèces et de la thyroïde
en pourcentage de radioactivité par rapport à l'activité déposée
sur la peau, et au niveau du sang en pourcentage de radioactivité
par ml de sang.

---

75
TABLEAU
VI
Passage percutané de l'125IDC dans CUTERPES GEL
24 h après application sur rat mâle sans poil vigile
(Surface d'application: 6 cm2)
Rat
N° 1
N° 2
N° 3
N° 4
N° 5
N° 6
M± cr
Urines
0,104
0,144
0,186
0,156
0,067
0,069
0,121
± 0,050
Fèces
0,030
0,010
0,020
0,010
0,050
0,070
0,030
± 0,020
Sang
0,003
0,001
0,00102
0,0015
(1 ml)
± 0,0009
Thyroïde 0,023
0,032
0,021
0,025
0,015
0,019
0,020
± 0,005
4.2.3. Discussion
4.2.3.1. La comparaison des résultats entre les deux méthodes
permet tout d'abord de montrer que:
- Les écarts observés sont peu importants, la méthode
pour l'animal vigile donnant des valeurs moyennes toujours supérieures,
soit: 0,121 % dans les urines, 0,0015 % pour le sang et 0,020 % pour
la thyroide, alors que les valeurs moyennes respectives pour l'animal
anesthésié et la même surface corporelle utilisée (6 cm 2) sont de
0,070 % dans les urines, 0,0010 % pour le sang et 0,010 % pour la
thyroide.
- Sur l'animal anesthésié, après dépôt de 12 cm2 de peau,
les valeurs moyennes respectives sont pratiquement doublées au niveau
des urines (0,121 %) et la thyroide (0,020 %) par rapport à celles
correspondant à la surface de dépôt de 6 cm2 ; au niveau de l'animal
entier, on retrouve 0,43 % de la radioactivité déposée contre 0,31 %
pour une surface de 6 cm2 .

---

76
- La méthode utilisant l'animal vigile conduit à des
résultats un peu supérieurs à ceux de la méthode concernant l'animal
anesthésié et la pénétration cutanée de 1'125IDC dépend directement
de la surface cutanée sur laquelle se fait le dépôt.
4.2.3.2. La comparaison des résultats de passage percutané de 1'125 I DC
dans le gel CUTERPES chez le rat mâle sans poil, à ceux obtenus chez
le même animal après administration orale de 1'125IDC permet de montrer
~e
:
-
Le passage percutané de 1'125IDC est faible. Au temps de
24 h, les valeurs retrouvées au niveau des urines (0,121 %) chez l'animal
vigile (surface d'application 6 cm2) sont 100 fois plus faibles en
moyenne que les valeurs obtenues pour le même temps après administration
orale d'125IDC et qui sont respectivement de 47,5 % au niveau des urines,
0,075 % par ml de sang et 1,26 % au niveau de la thyroïde.
-
Le pourcentage de radioactivité retrouvé au temps de 24 h
chez l'animal entier après dépôt de gel CUTERPES marqué et qui est de
0,30 %, alors qu'il est de 42,6 % après administration orale, confirme
bien cette hypothèse.
- Si l'on admet, à partir des résultats obtenus après
administration intraveineuse d'125IDC chez le rat mâle sans poil, que
la biodisponibilité de 1'125IDC est voisine de 90 % après administration
orale, on peut conclure que la biodisponibilité relative de 1'125IDC
dans le gel CUTERPES est nettement inférieure à 1 %.

---

77
5. Etude de la résorption percutanée de l'125IDC dans le gel CUTERPES
chez le rat mâle sans po,l à peau lésee
5.1. Protocole expérimental
L'expérimentation est conduite ici par la méthode de l'animal
anesthésié sur une surface lésée de 12 cm2 retenue pour des commodités
techniques. Le gel d'rOC marqué utilisé est préparé comme décrit dans le
paragraphe B.4.1.
Trois rats mâles sans poil sont anesthésiés à l'éthyluréthane
(1,20 g!kg), par voie intrapéritonéale et déposés ensuite en decubitus
ventral dans des cages à métabolisme après que des lésions de la peau
aient été crées d'après la méthode suivante:
Applications successives et uniques sur la peau du dos de rat
sans poil de morceaux de ruban adhésif, large de 5 cm, afin d'enlever la
couche cornée, jusqu'à obtention d'une peau lisse brillante laissant
apparaître les premiers capillaires. La dé lamination cornéenne est
convenable au bout de dix applications et arrachages vifs. A ce stade,
la peau devient rougeâtre et luisant et le ruban adhésif n'y adhére plus.
Après élimination d'une surface lésée de 12 cm2 sur la peau,
et à l'aide d'une spatule préalablement tarée, 250 mg environ de gel
marqué y sont finement et de façon régulière,étalés. En repesant la
spatule après application, il est aisé de connaître avec exactitude la
quantité de gel déposée.
Au bout de 24 h après l'application, les animaux sont sacrifiés
après prélèvement de 1 ml de sang par ponction cardiaque, les urines
recueillies dans des pots pour cage à métabolisme et la thyroîde extraite
tous ces échantillons sont introduits dans des pots Packard pour
scintillation en vue de la mesure ~e la radioactivité.
Pour un seul des animaux, vidé de son sang par section de la
carotide (sacrifice), la peau est soigneusement retirée. L'animal séparé
de sa glande thyrolde est dépecé et broyé entièrement au mortier-pilon
en bronze (Cf. schéma IV
) dans de l'azote liquide en évitant les pertes.
La détermination de la radioactivité est effectuée de façon
identique à celle utilisée dans l'étude par voie orale ou intraveineuse.

---

78
5.2. Résultats et discussion
5.2.1. Résultats
Les résultats concernant trois rats sont rassemblés dans
le Tableau
VII
et sont exprimés au ni veau des urines, de la thyroide
et de l'animal entier en pourcentage de radioactivité par rapport à
l'activité déposée sur la peau, et au niveau du sang en pourcentage de
radioactivité par ml de sang.
TABLEAU VII
Passage percutané de l'125IDC dans CUTERPES GEL
24 h après application sur rat sans poil anesthésié
à peau lésée (12 cm2 de peau)
Rat
N° 1
N° 2
N° 3
R ± cr
Urines
15,200
20,900
14,500
16,900
± 3,500
Sang (1 ml)
0,034
0,040
0,040
0,038
± 0,003
Thyroïde
1,000
1,000
1,000
1,000
Animal entier
22,100
5.2.2. Discussion
Les résultats obtenus montrent que, dans ce cas, le passage
est important comme en témoignent les valeurs élevées obtenues au
niveau des urines (16,5 %), de la glande thyroide (1 %), du sang (0,038%)
par ml et enfin de l'animal entier (22,1 %) au temps de 24 h.
La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus pour le même
temps après administration orale d'125IDC permet de conclure à une
biodisponibilité relative de 40 %.

---

79
C. CONCLUSION
L'objectif de notre travail était de vérifier la résorption
cutanée de la iodo-5-désoxy-2'-cytidine, principe actif du gel CUTERPES.
Pour y parvenir, nous avons d'abord étudié la résorption,
la distribution et l'élimination de l'IDC après administration orale
et intraveineuse chez le rat mâle sans poil de souche atrichis.
Nous avons pu établir que la demi-vie du produit était
d'environ 12 h par la voie orale et voisine de 13 h lorsque
l'administration est faite par voie intraveineuse.
Puis, nous avons étudié la résorption cutanée de l'IOC à
partir du gel CUTERPES à la fois chez l'animal à peau intacte et chez
l'animal présentant des lésions cutanées.
Les résultats que nous avons obtenus s'accordent pour
montrer que lorsque la peau est intacte, la résorption de l'IDC après
24 h est inférieure à 1 % de la quantité déposée. Lorsque la peau est
lésée, le passage transcutané de l'IOC est plus important; cependant,
la résorption cutanée demeure environ 2,5 fois moins importante que
la résorption observée par voie orale. Dans ces conditions, la quantité
d'IOC qui traverse la barrière cutanée chez le rat à partir du gel
CUTERPES, peut ëtre évaluée, sur une période de 24 h, à 3 ~g h- 1.cm2- 1 •

---

---

ID - ETUDE IN VITRO du METABOLISME CUTANE
de la IOD0-5-DESOXY-2'-CYTlDINE
CHEZ la SOURIS, le RAT et l' ESPECE HUMAINE
•

---

---

83
A - INTRODUCTION
1 - Voies métaboliques générales des nucléosides pyrimidiques.
La iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IDC) médicament
antiher-
pétique et objet de notre étude, est un nucléoside pyrimidique
halogéné. Nous avons choisi de ce fait, de présenter au début de cet-
te étude de biotransformation cutanée, les voies métaboliques
possibles essentielles de nucléosides pyrimidiques chez les mam-
mifères.
Les voiesanaboliques des nucléosides notamment des nuclé-
osides-phosphates, correspondent essentiellement à la synthèse
des précurseurs des acides nucléiques, synthèse pouvant se faire
soit selon la voie de novo, soit selon la voie de récupération
ceci étant déterminé par la capacité du tissu concerné à utiliser
l'un ou l'autre de ces processus.
Les voies cataboliques des nucléosides pyrimidiques
découlent pour la plupart de la dégradation des triphosphates
et comprennent entre autres les interconversions entre nucléo-
sides ; elles correspondent en général à un processus de récu-
pération.
1.1 Synthèse des nucléosides-phosphates (nucléotides) pyrimidiques.
1.1.1 nucléotides pyrimidiques à ribose.
Pour des raisons de condensation et de clarté, ces voies
de synthèse sont résumées dans le schéma
IV; les enzymes inter-
venant
dans ce schéma sont :
à l'étape 1 : l'aspartate carbamoyl-transférase ou transcaba.myl-
lase. Cette étape est activée par l'ATP et peut être rétro inhibée
par le dCTP, le CTP, le CMP.
à l'étape 2 : la dihydro-orotase;
la rétroinhibition est exercée par les produits des étapes sui-
vantes de cette voie œ synthèse, tels que l' orotate, l' UMP, le
dUMP, la cytidine etc ...
à l'étape 3 : la dihydro-orotate déshydrogénase dont l'action
oxydante nécessite la présence de coenzymes tels que
FAD et
FMN. La réaction est inhibée par le 5-méthylorotate.
à l'étape 4 : le ribose phosphate sous sa forme activée du PRPP
est couplé à l'orotate grâce à l'action de l'orotate-P-ribosyl-
transférase puis de la pyrimidine ribo-nucléoside pyrophospho-
rylase.

---

84
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---

85
La réaction est inhibée par le dihydro orotate, 6-azauridine,
le S-azaorotate.
à l'étape 5 : l'orotidylate formé
(OMP)
sous l'action de l'oro-
tidine-S'-P décarboxylase est convertie en uridylate
(UMP).
à l'étape 6 : fait intervenir la cytidilate kinase en présence
d'ATP et de magnes1um. La réaction est réversible chez les mammi-
fères grâce à l'action d'une nucléoside diphosphatase.
à l'étape 7
l'uridine-S-diphosphate est activé en UTP par la
nucléoside diphosphate kinase avant d'être incorporé dans l'ADN.
à l'étape 8 : les précurseurs activés sont polymérisés par l'ARN
polymérase ou ARN nucléotidyltransférase, cette étape activée
par la présence de GTP, ATP, CTP, Mg++, fait intervenir chez les
microorganismes tels que les virus ou chez les cellules infectées
par les phages une replicase induite.
à l'étape 9 : l'UTP, chez les mammifères (comme chez les virus)
peut être interconverti en cytidine-S'-triphosphate en présence
d'ATP par la CTP synthétase.La réaction exige une source de L-
glutamine ou d'ammoniaque et peut être dans certaine conditions
rétro inhibée par le CTP ou inhibée par l'ATP, le GTP.
à l'étape 10 : le CTP formé à l'étape précedente va ensuite être
polymérisé
(ARN-polymérase) et alors servir dans la fabrication
de l'ARN.
1.1.2 Synthèse des nucléotides pyrimidiques à désoxyribose :
Ces nucléotides comme le montre le schéma
vont être
synthétisés à partir du CDP ou de l'UDP grâce au système THIO-
REDOXINE (schéma ci-dessous)
+
+
NADPH + H
.
NADP
~
(THIOREDOXINE REDUCTASE - NADP -
""")r- SYSTEME THIOREDOXINE
~/'
FAD, cobamide CoE
THIOREDOXINE-(SH)2
d ATP
ATP
THIOREDOXINE-S 2
)~=:-:=_:-:~=:=:=:-==_=A_~_T_P_--<f
~'d
UDP
UDP
OU
ou
CDP
d UCP
A pa1±irde l'UDP, i l y a réduction en 2'
sur le ribose
par perte d'un oxygène, grâce à l'action de la ribonucléoside
diphosphate réductase et production de l'UDP ; la réaction est
inhibée par l'hydroxyurée.

---

86
Le dUDP est soit phosphorylé en dUTP qui est ensuiœ deux
fois phosphorolysé en dUMP par la désoxy-UTP-phosphatase, soit
directement phosphorolysé en dUMP par la nucléosie diphosphatase.
La thymidylate synthétase va alors assurer la méthyla-
tion du dUMP en thymidylate
(dTMP). Ce nucléotide de la thymi-
dine est ensuite activé par deux phosphorylations successives
avant d'être pris en charge par l'ADN nucléotidyltransférase
dans la fabrication de l'ADN.
La thymidylate synthétase exige l'intervention du
5,10-méthylène-THF en présence de Mg++ et peut être inhibée par le
5-fluoro-dUMP, le 5-trifluor-méthyl dUMP. L'action des kinases
nécessite la présence d'ATP et de Mg++.
7,8
DIHYDROFOLATE
THYMIDYLATE
THYMIDYLATE
SYNTHETASE
5,10
METHYLENE-THF
++
Mg
dURIDYLATE
La réduction du CDP au niveau du sucre par la ribonu-
cléoside diphosphate réductase produit le dCDP lequel va être
activé en dCTP avant de servir dans la synthèse de l'ADN.
Le dCDP au lieu d'être activé peut subir une phospho-
rolyse en dCMP pour être ensuite converti par désamination (deo-
xycytidylate désaminase)
en dUMP. Les étapes suivantes sont
décrites ci-dessus.
1.2 Voies du catabolisme des nucléosides pyrimidiques.
1.2.1 catabolisme des nucléosides pyrimidiques à ribose:
Ce catabolisme admet deux points de départ essentiels
-
l'uridine-5'-phosphate
(UMP)
issue de l'étape 5 du schéma V de
synthèse ou de l'UDP par réversibilité des réactions menant à
l'ARN;

---

SC.\\l~MI\\
~\\-J\\
d'apl\\6 (\\91)
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...
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Cytidine
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CTP-5
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5'-phosphate
5'-diphosphate
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triphosphate
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Cytidine
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Uridine
Uridine
Uridine-5
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1 2'-déoxyuridine
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5'-diphosphate
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......
triphosphate
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---

88
- le cytidine-S'-phosphate (CMP) provenant de CTP par phospho-
rolyse. Le CTP découle soit de l'étape 9 du schéma de synthèse,
soit de la dépolymérisation de chaines de précurseurs dans la
voie de synthèse de l'ARN.
Ainsi, ces 2 précurseurs sont résumés dans le schéma'IA
1°) A partir du cytidylate (CMP) il y a libération d'un acide
phosphorique sous l'action de la S'-nucléotidase et obtention de
la cytidine.
Remarque :
Cette réaction chez les mammifères est possible dans l'autre sens
en présence d'ATP grâce à l'existence d'une kinase
(uridine ki-
nase) sensible à l'effet inhibiteur du Mg++, de l'UTP ou rétro-
inhibiteur du CTP.
La cytidine produite est un substrat pour deux enzymes
la cytidine désaminase et la nucléosidase.
La cytidine désaminase est une amino-hydrolase ; son
action correspond à une désamination oxydative de la cytidine
en uridine, tandis que la nucléosidase, hydrolase agissant par
coupure du nucléoside au niveau de la liaison Ci - Ni' assure
une Ci - Ni hydrolyse et libère la cytosine, base qu~ peut être
à son tour convertie en uracile par la cytosine désaminase.
2°) A partir de l'uridylate (UMP) par action une fois encore de
la S'-nuclé~dase, il y a production d'uridine.
Remarque :
comme la cytidine, l'uridine est un bon substrat pour l'uridine
kinase en présence d'ATP.
L'uridine, qu'elle provienne de la cytidine ou de
l'uridylate, subit une ci - Ni hydrolyse (uridine nucléosidase)
en uracile.
Chez les mammifères, l'uracile est réduite en dihydro-
uracile (D.H.U) en présence de NADP (uracile-hydrogénase), avant
que ne s'ouvre le cycle sous l'action de la dihydropyrimidinase
A partir du 3-uréido propionate résultant
il y aura (il en faut
2 molécules) production de B-alanine sous l'action de la 3-uréido-
propionase et libération de CO , NE , H
2
3
20 résidus d'une molécule
d'urée.
La production de B-alanine à partir de l'uracile est
également probable chez les microorganismes ; le processus exige
au départ du NADH. Cependant chez ces mêmes microorganismes, en
présence d'un accepteur d'hydrogène, l'uracile déhydrogénase
peut oxyder l'uracile en barbiturate avant d'être scindé (barbi-
turase) en malonate et urée.

---

d-cytidine-5'
, d-cytidine-5'
d-cytidine-5'
phosphate
('
di phosphate
0(
~
triphosphate
.<"
..
~
1
~.A.
~
1
l
,
1
~ •
·oV
()
•
d-cytidine
Thymidine-5'
Thymi di ne- 5'
Thymi di ne- 5'
E"'"
~
Rr
.#
phosphate
di phosphate
triphosphate
'"
- ~
(J)
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lr
Thymi di ne
<
"> .... Thymi ne ~
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c=:>
Di hydro- <c::>
c=:>~ 3-uréi do-
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- - - · - ; ; 7 1 1
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9 3-ami no-
II'"
•
thymi ne
isobutyrate
isobutyrate
,- .. _----
r-- - - - - - - ---~
d-uri di ne- 5'
d-uridine-5'
<'
.:>
d-uridine-5'
phosphate
di phosphate
triphosphate
~CH EM A ''l'~
)
J}a fâs. (irO

---

90
1.2.2 Catabolisme des nucléosides pyrimidiques à désoxyribose.
Les voies cataboliques physiologiques des nucléosiques
pyrimidiques à désoxyribose chez les mammifères se rapportent
essentiellement à la thymidine;
la conversion du désoxy-2'-
cytidylate en désoxy-2'-cytidine par action de la S'-nucléotidase
ne faisant suite à aucune autre étape.
La thymidine découle du thymidilate
(TMP)
par déphos-
phorylation, cette réaction qui fait intervenir la S'-nucléoti-
dase est également possible dans l'autre sens sous l'action de
la thymidine kinase en présence d'ATP et de Mg++.
La thymidine est dégradée par la thymidine nucléosi-
dase
(C'l - Ni hydrolyse) en thymine.
Remarque
:
la thymine en présence de 2'-désoxyribose-l-phosphate et grâce
à l'intervention de la thymidine phosphorylase peut servir à la
synthèse de la thymidine.
Chez les mammifères, les étapes cataboliques à partir
de la thymine,
font appel strictement aux mêmes enzymes qu'à
partir de l'uracile: i l y aurait ainsi, réduction de la thymine
en déhydrothymine
(uracile hydrogénase, NADP)
suivie de l'ouver-
ture du cycle
(dihydropyrimidinase). Le 3-uréido-isobutyrate
résultant est scindé et hydrolysé par la 3-uréido propionase en
3-amino-isobutyrate avec libération d'eau, de CO 2 et NH3 . Seule
la dernière étape de ce processus est irréversible.
Chez les microorganismes, comme avec l'uracile, en
présence d'un accepteur d'hydrogène, la thymine peut être oxy-
dée en S-méthyl-barbiturate.
La iodo-S-désoxy-2'-cytidine est un nucléoside à désoxy-
ribose halogéné en 5 sur le noyau pyrimidique. La description
des voies métaboliques des nucléosides pyrimidiques fait appa-
raître au niveau des composés à désoxyribose
(schéma VI~.
qu'il n'a été décrit aucune voie physiologique chez les mammi-
fères assurant la conversion de la désoxy-2'-cytidine en désoxy-
2'-uridine.
Cependant au cours d'un certain nombre d!étud~in vitro
(150 a 157) il a été décrit que cette conversion est possible et
fait intervenir la pyrimidine nucléoside désaminase (92,151f ;
cytidine désaminase pour les uns
(152,157) ou désoxycytidine
désaminase pour les autres
(159).
D'après CREASEV (151), il s'agit d'une même enzyme ca-
pable d'assurer la désamination d'une large gamme de dérivés
nucléosidiques de la cytosine ; elle serait non spécifique de la
cytidine.

---

91
2 - Peau et activité enzymatique
De tous temps considérée comme enveloppe simple et
souple de protection, la peau fait depuis relativement peu, et les
travaux demeurent à ce jour épars, l'objet d'une réelle attention
d'un point de vue métabolique.
Cet intérêt tardif apparaIt d'ailleurs étonnant surtout
quand on fait remarquer que la peau correspond à l'organe le plus
étendu de l'organisme humain avec 2 m2 de surface corporelle et
3 à 4 kg de poids environ (162,149,163,1231. Elle joue un rôle
essentiel dans la régulation des entrées et sorties des substances
dissoutes ou en suspension dans les fluides divers de l'environ-
nement et apparait de plus largement sollicitée à des fins de
thérapie comme d'esthétique.
Dans de nombreuses cultures (en Afrique, en Asie, en Eu-
rope, etc •.. ), en médecine 'traditionnelle (substances naturelles)
comme en médecine moderne (substances de synthèse), en acupunc-
ture comme en pratique thermale la peau deme~e un
terrain pré-
cieusement sollicité, un organe plein de réactivité. Son état
traduit une expression globale de la fraîcheur et de la santé
physique de l'organisme.
Ainsi, du fait de son extrime stimulation chimique ou
biologique, la peau, tissu vivant, est capable de présenter une
réponse métabolique modulatrice, qu'elle soit de nature ortho-
ergique ou allergique. Elle peut donc moduler l'activité~~bio­
chimique, pharmacologique ou toxique des substances présentes
à sa surface.
La peau est un organe aux fonctions multiples ; celles-
ci, rappelées par RONGONE (123) comprennent: la régulation de la
température du corps, la protection contre l'environnement, la
régulation partielle de la perte et de la rétention d'eau, le
stockage temporaire du glucose lorsque le taux sanguin en ce sucre
est élevé. En plus de ces rôles physiologiques, de nombreuses
propriétés biochimiques sont associées à la peau : formation
de mélanine dont la régulation est assurée par une hormone sti-
mulant les mélanocytes (la mélanocyte stimulating hormone) ,
stimulation par l'épinéphrine des glandes sudoripares, synthèse
des protéines, régulation par les androgènes de la production
par les glandes sébacées de sébum.
2.1 La peau
tissu à métabolisme endogène
Ainsi, la peau présente de nombreuses activités méta-
boliques impliquant de nombreuses enzymes (123,122)

---

92
- Enzymes du métabolisme des oses comme celles intervenant dans
le shunt des hexoses monophosphates
(ex.
: glucose-6-phosphoglu-
curonate déshydrogénase), les enzymes de synthèse ou de dégrada-
tion du glycogène (glycogène synthétase, héxokinase, UDPG synthé-
ta se , phosphorylase,
a amylase,
... ), la peau utilise le glyco-
gène aussi bien que le glucose comme source d'énergie.
- Enzymes du métabolisme des lipides
Ces enzymes participent activement dans la sécrétion des lipides
de surface. Ceux-ci \\164,123]
sont composés d'acides gras, de tri-
glycérides, de squalène, de stérols estérifiés et libres, d'al-
canes. On note également la présence d'acides hydroxylés d'esters
d'alcool gras, de prostaglandines.
- Enzymes du métabolisme des protéines
La synthèse de ces protéines est attribuée à plusieurs consti-
tuants présents dans la peau tels que l'ARN ribosomal,
l'ARN messager, le pool des amino acides, les sources d'énergie.
les enzymes cytoplasmiques (amino acyl-t-RNA synthétase)
et un
porteur d'amino acides activés tel que l'ARN de transfert.
- Complexes hormonaux (stérordes)
impliqués dans la sécrétion des
stérols :
La thyroxine, les androgènes et la glande hypophyse joue un rôle
dans la sécrétion du sébum.
D'après les travaux de EBLING en 1974 (121), le contrôle hormo-
nal (androgènes) des glandes sébacées agit au moins à deux niveaux
la mitose et la synthèse intracellulaire, niveaux qui sont aussi
les sites d'action des an ti-androgènes lorsqu'ils abaissent la
production du sébum.
Les oestrogènes cependant, n'auraient aucun effet sur la mitose
et exerceraient leurs effets biologiques au niveau de la syn-
thèse intercellulaire.
2.2 La peau, tissu à activité métabolique vis-à-vis des substances
exogènes.
2.2.1 Procédés généraux d'étude in vitro du métabolisme cutané
des xénobiotiques.
La peau humaine est capable de métaboliser une variété
de médicaments et d'autres composés (149). Comme pour la peau
d'animal, les nombreuses voies métaboliques ont été recherchées
par de nombreuses procédures, celles-ci impliquent l'utilisation
- des fragments de tissu issus de découpage de peau entière
(SCRAP)
- des homogénats d'épiderme et de derme
(163,165,166) ou de peau
entière
(149).
La couche cornée, l'épiderme et le derme peuvent être
isolés par des méthodes physiques
(chaleur, froid, vide), chimi-

---

93
ques (vésicants) ou enzymatiques (digestion par la collagénase
la protéase, la trypsine ou l'élastase)
(767). L'utilisation
d'un microtome permet également d'obtenir des couches tangentiel-
les de la surface cutanée qui correspondent plus ou moins aux
différentes assises de la peau
(725).
D'autres procédés mécaniques anciens et moins courants
existent tels
que la technique de VAN SCOTT (765).
La préparation des homogénats de peau entière utilise
un broyage préalable suivi d'une homogénéisation. Cette dernière
peut mettre en jeu, plusieurs types d'appareils: polytron, homo-
généisateur à pilon en téflon et homogénéisateur TEN BROECK, ho-
mogénéisateur BOhler, appareil à ultrasons.
Des fractions subcellulaires (microsomes, cytosol)
peuvent être obtenues à partir des rnomogénats tissulaires par une
ultracentrifugation différentielle.
- des cellules épidermiques en culture (768).
- des cellules isolées cutanées (768,767,725).
Plusie~
techniques, de nature enzymatiques pour la
plupart, ont été utilisées pour la séparation de cellules de la
peau à des fins diverses : culture de tissu, étude de la distri-
bution localisée des produits appliqués à la surface de la peau
par stripping : délamination des cellules cornées par arrachage
successifs à l'aide d'un ruban adhésif: cependant, relativement
peu de techniques l'ont été dans le but d'étudier le métabolisme
des xénobiotiques • Ainsi, est-il possible à présent de séparer
les cellules épidermiques en cellules sébacées, en cellules basales
et en cellules différenciées.
Une des techniques des plus adaptées
est décrite par WILTON
(768)
et date de 1983. Améliorant celle de
GOLVENHERSH et eoll. publiée en 1982àle utilise après digestion
de la peau par la trypsine un gradient de centrifugation dans de
la métrizamide et du percoll. Elle obtient trois fractions enri-
chies en types différents de cellules.
Pour =es procédés utilisant des cellules isolées ou en
culture, le maintien d'une bonne viabilité des cellules est indis-
pensable. De plus, du fait que l'on se trouve dans un environ-
nement histochimique modifié ; ceci peut avoir quelque influence
sur le métabolisme in vitro ces substrats étudiés.
A cOté de ces procédés généraux, il a été rapporté par
ailleurs, un procédé d'étude du métabolisme cutané par perfusion
de peau de chien isolée.l98)
Beaucoup de travaux restent attendus afin de conforter
le rôle métabolique de l'organe qu'est la peau mais surtout de
mieux cerner l'étendue de ce rôle.

---

94
En effet, les systèmes métaboliques les plus étudiés
au niveau cutané, sont d'une part, ceux utilisant comme substrats
les stéroïdes pour lesquels la peau constitue une cible et d'autre
part, les systèmes intervenant dans l'hydrolyse des hydrocarbures
aromatiques polycycliqu~à cause de leur potentialité
tumorigène
par activation métabolique. Nous présentons ici, à partir de données
recensées par quelques auteurs dont WEPIERRE en 1983 (162), des
exemples de syscènks ü~tervenant dans la biotransformation de subs-
tances chimiques au niveau de la peau. Nous aborderons ensuite
la distribution de ces enzymes dans le tissu cutané, dans l'état ac-
tuel de nos connaissances avant d'évoquer brièvement les conséquen-
ces dans les études de toxicologie percutanée.
2.2.2 les systèmes enzymatiques cutanés dans la biotransforma-
tion des substances chimiques.
- Les enzymes du métabolisme des stéroïdes :
Les principaux systèmes démontrés au niveau cutané
sont les hydroxystéroïdes déshydrogénases, catalysant la con-
version d'un groupement hydroxylé en groupement cétonique, et la
5-a réductase présidant à la réaction dans le sens cétone-hydro-
xyle
Ces enzymes sont regroupées dans le tableau n~VII.
La S-a-réductase dont l'activité est assoc~ee avec la
fraction microsoma~
des structures cutanées, conduit à la ré-
duction des stéroïdes présentant le groupement 3-céto-~ 4 ; i l
y a production de dérivés 5-a -dihydrogénés avec la testostérone,
la progestérone, l'hydrocortisone et la cortisone.
La 5- Ct -réduction permet l'activation métabolique de
la testostérone qui n'agit sur la peau (glandes sébacées, appa-
reil pilaire), qu'à l'état de déhydrotestostérone.
-
les oxydases microsomales à fonction mixte.
Ces systèmes enzymatiques nécessitant la présence de
cytochrome P-450 et de cytochrome P-450-réductase, sont très
importants au niveau du foie.
Ils permettent l'hydroxylation de
très nombreux substrats lipophiles
(substances endogènes, médi-
camenteuses ou chimiques de l'environnement). Ils présentent un
caractère particulier, celui d'ëtre inductibles ; leur synthèse
est provoquée par la présence du substrat.
L'activité oxydative de ces enzymes peut aussi conduire
à la formation de métabolites actifs, qui sont souvent des muta-
gènes, des carcinogÈnes ou des agents cytotoxiques
(169).
L'arylhydrocarbure-hydroxylase
(AHH)
est le système
d'oxydation microsomal le plus étudié au niveau cutané. Il ad-
met comme substrat, de nombreux hydrocarbures aromatiques poly-
cycliques et notamment le Benz (al
pyrène dont le métabolite

---

95
essentiel le BaP-7,8-diol 1170,171,172) est considéré comme
procarcinogène au niveau de la peau.
L'AHH demeure un système d'oxydation parfaitement in-
ductible dans la peau. BICKERS et Qoli.(171) l'ont démontré
chez la souris et le rat, avec une préparation de microsomes cuta-
nées, après application sur la peau de deux types d'inducteurs
les Biphényls polychlorés et le méthyl-3-cholanthrène.
D'autres systèmes chez la souris Ng (mutation sponta-
née survenue chez des souris NMRI) ont été démontrés actifs au
niveau cutané (170)
; et c'est le cas de la 7-éthoxycoumarine
déethylase, la cytochrome C-réductase, l'aminopyrine N-déméthy-
lase, la benzo (a) pyrène hydroxylase.
A titre comparatif avec le foie, en considérant les
activités de l'aryl-hydrocarbure-hydro~ase(EC.1.14.14.2 ; AHH)
et de l'époxyde hydratase (EC.4.2.1.63 ; EH) calculées chez
l'homme par RAWLINS, SHUSTER, CHAPMAN et Qoli.
(163)
, la
peau exhibe pour ces deux enzymes respectives, 0,2 % et 0,5 %
seulement de la capacité métabolique du foie.
PANNATIER en 1980, pour sa part (149) ayant testé 1'0-
désalkylation cutanée et hépatique des alkylaryléthers chez la
souris avance que l'activité enzymatique cutanée représente 2 %
de l'activité hépatique.
POHL, PHILPOT et FOurS en 1976 (173), chez la souris,
situent l'activité cutanée des mono-oxy~énases cytochrome P-450
dépendantes dans une fourchette allant de 2 à 6 % de l'activité
du tissu hépatique ; activité fortement inductible par le dimé-
thyl-benzanthracène, le benzopyrène ou la dibenzo-p-dioxine.
- les systèmes d'hydrolyse :
De nombreuses hydrolases subsistent à la surface de la
peau après kératinisation. Ces hydrolases dans l'épiderme sont
localisées dans les lysosomes. Parmi les substrats étudiés et rap-
portés dans la littérature (162), on peut citer les esters de cor-
ticoides (valérate de difluocortolone) l'acide acétylsalicylique et
ses analogues, le 5-valérate de vidarabine (176), le triacétate
de dithranol.
D'après WEPIERRE (162), ces divers esters peuvent être
considérés comme des prodrogues qui sont, soit mieux absorbés
parce que lipophiles (esters de corticoides), soit moins toxiques
pour la peau. C'est pourquoi du fait que des antisolaires sont
combinés à divers vecteurs pour les rendre plus substantifs, et
en accord avec WEPIERRE, il serait
intéressant de connaître le
devenir de tels produits.
- les systèmes de conjugaison
Les réactions de conjugaison au niveau cutané ont été
démontrées pour un petit nombre de produits. Les principales
réactions mises en évidence sont présentées dans le tableau VI1
d'après des données recensées par RAWLINS et Qoli.
(163) et WEPI-
ERRE (162).

---

96
TABLEAU
VII
Exemples de réactions de fonctionnalisation rencontrées
au niveau cutané chez l'homme.
Réaction
Enz1llles
Substrat
HYDROXYLATION
MONOOXYGENASES
cortisol
cytochrome p-450
Testostérone
dépendantes
3-4 Benzopyrène
a)
7-12 diméthylanthracène
aniline
7 éthoxycoumarine
DESALKYLATION
-
IDEM--
aminopyrine
Epixide hydratase
b)
HYDROGENATION
Styrène oxide
5- a -
réductase
cortisol
Progestérone, Testosérone,
Hydro-Cortisone
Esters de corticoides*
AC-acetyl-salycilique
Esters ac-cromoglycique
5-valérate de vidarabine
c)
HYDROLYSE
Hydrolases
Triacétate de dithramol
formation des
Benz
(a)
pyrène
glucuronides
UDPG-Transférase
O-amino phénol
formation des
dihydroandrostérone
sulfates
sulfotransférase
t:, 5-androstène 313 -1713
diol
méthylation d'un
hydroxyle
COMT
Noradrénaline
liaison au
glutathion
Styrène glycol
a)
Réactions d'oxydation
b)
Réactions de réduction
c)
Réactions d'hydrolyse
d)
Réactions de conjugaison
~) exemples: Difluocortolone valérate Bétaméthasome malérate.

---

97
2.2.3 Distribution des enzymes du métabolisme cutané.
L'activité enzymatique de la peau, varie considérablement
en fonction du site anatomique et de la structure cutanée envisagée.
Le rôle du site a été démontré par des études autoradio-
graphiques et histochimiques menées avec des canëérogènes chimiques
1168) .
D'après les constatations de VUBE et ~oLt. en 1975 (174)
chez le rat et de WILSON et WALKER en 1969 chez l'homme (175), l'ac-
tivité de la 5- a -réductase est faible dans la puplart des régions
du corps, sauf celles dont le développement est sous controle an-
drogène.
Le rôle des couches et annexes de la peau a été traité
par PANNATIER en 1980 (149) et encore récemment par WEPIERRE en
1983 (162] selon
HAVGRAFT
la couche cornée présente une activi-
té enzymatique résiduelle faible
(185), et qui pourrait refléter
l'activité métabolique des assises de Malpighi dont elle est issue
mais sans effet métabolique réel sur les substances chimiques appli-
quées au niveau cutané
(162). L'activité enzymàti~ue de la flore
microbienne est très faible et peut être négligée également dans l'ac-
tivité métabolique de la peau; l'incubation de peau de cadavre
avec du décanoate de nandrolone n'entraine par la flore microbienne,
qu'une dégradation négligeable de l'ester de stérolde.
Dans la conversion cutanée de l'oestradiol en oestrone,
l'épiderme apparalt plus actif que le derme 1177), tandis que les
études effectuées sur l'activité de l'AHH, dans les différents ho-
mogénats cutanées (178), après fractionnement grossier, attribuent
une activité élevée dans les couches superficielles du derme, moyen-
ne dans l'épiderme et très faible dans les couches dermiques pro-
fondes.
L'activité arylhydroxylasique de la peau, chez l'homme,
est retrouvée à 96,5 % au niveau de l'épiderme d'après CHAPMAN et
~oLt. (lm.
L'activité estérasique de la peau, chez la souris sans
poil, est plus importante dans l'épiderme que dans le derme
l'inverse serait observé pour l'activité désaminasique d'après les
résultats par YU et ~oll. en 1980 (176).
La plupart des enzymes sont localisées dans les cellules
vivantes et il n'est pas certain qu'elles interviennent ~outes,
dans le métabolisme, puisque les enzymes lysosomiales de l'épiderme
sont normalement inactives et libérées uniquement au moment de la
kératinisation [1621.
c'est ainsi que l'intense activité manifestée par les
couches superficielles du derme pourrait être en relation avec la
localisation à ce niveau des glandes sébacées et des canaux pilài-
res (cf. § II A.1.2). En effet, l'étude du métabolisme des stéroï-
des par BAILLIE et ~oLt. (179) grâce à des méthodes histologiques
démontre que l'activité de la 17- 8 -désydrogénase est localisée
dans les glandes sébacées. De même, TAKAYASU et ~oLt. en 1980 (180)
rapportent que l'activité 5- a -réductase est également la plus éle-

---

98
vée dans les glandes apocrines et sébacées, un peu plus réduite
dans les follicules pileux et faible dans l'épiderme.
Toutes ces données montrent clairement qu'en fait d'ac-
tivité métabolique cutanée, il existe au delà des différences entre
espèces et au sein d'une même espèce, de grandes variations indivi-
duelles selon le site et selon les structures de la peau. Le rap-
port poids épiderme / poids derme varie de 1:3 dans le prépuce à
1:11 dans la partie abdominale (149)
; ce rapport selon la réaction
enzymatique en cause et les cellules cutanées impliquées, pourrait
expliquer le rôle du site dans le métabolisme cutané des substances
exogènes.
Et si l'on considère que les préparations dermiques conti-
ennent 3 à 5 % d'épiderme
(149), l'on comprend alors, la nécessité
d'une technique très pointue de séparation des couches et dépen-
dances de la peau lors d'une étude différentielle de l'activité
métabolique cutanée.
2.2.4 métabolisme cutanée et toxicité locale
Les monoxygénases microsomales sont capables d'activer une
grande variété de composèsen métabolites actifs susceptibles de
se lier à des macromolécuJes
di verses à l'intérieur des cellules.
Ce processus peut tenir une certaine part dans l'antigénicité, la
cytotoxicité et la carcinogénic:i.tét 163) .
Les lésions de la peau sont une des réactions secondaires
les plus courantes liées aux médicaments. Elles ont probablement
une origine immunologique ; la liaison covalente des métabolites
formés à l'intérieur de la peau pourrait produire des haptènes et
constituer une cause de cytotoxicité.
Chez l'homme comme chez l'animal, un certain nombre de
cancers cutanés sont induits par des hydrocarbures aromatiques
polycliniques par activation métabolique (181,182)
; les activi-
tés de l'AHH et de l'EH tenant un rôle important dans l'activation
et la dètoxificàicrl
de ces composés. Il est, par conséquent, pro-
bable que dans la peau humaine, les activités de l'AHH et de l'EH
comme celle de la glutathione transférase en présence du glutathion
soient des déterminants importants dans les cancers de la peau par
exposition aux goudrons et huiles (163).
Les hydrocarbures aromatiques polycliques cependant agi-
raient comme co-carcinogènes avec les rayons ultraviolets ; ce qui
laisse supposer que l'AHH et l'EH jouent un rôle plus grand dans
la pathogénésie des cancers de la peau (163).
Le métabolisme cutané, cependant, ne doit pas être sure~­
timé affirme WEPIERRE (162). En effet, selon les données actuelles
par WESTER et NOONAN en 1980 (183), le métabolisme cutané ne repré-
sente environ que 1 % du métabolisme hépatique (voir tableau
VIII)
Ce dernier est donc négligeable et le produit absorbé par voie
cutanée ne sera pas quantitativement biotransformé par la peau.
Le métabolisme dans ces conditions étant surtout hépatique,
sa nature sera qualitativement identique,quelleq\\E soit la voie d'ad-
ministration y compris percutanée ; les différences seront unique-
ment d'ordre cinétique et dépend.rort: des caractéristiques de l'ab-

---

99
sorption par les voies percutanées.
TABLEAU
VIII
Importance du métabolisme cutané dans la biotransforma-
tion des substances chimiques (d'après WESTER et NOO-
NAN, 1980)
Caractères
FOIE
Peau
POIDS
4000 g
3000 g
3
-1
3
-1
Débit Sanguin
160 cm
min
100 cm
min
Activité Enzymatique
100
2
Métabolisme
> 99 %
< 1 %
Il est ainsi, estime WEPIERRE, lorsque les études de
toxicité percutanée d'un produit (exemple cosmétique), présentent
des difficultés de réalisation pratique importante (forme, condi-
tions d'application), possible à partir de données toxicologiques
systémiques, de prédire un risque toxicologique par voie percutanée
à condition de réaliser quelques mesures pharmaco-cinétiques.
2.2.5 le métabolisme cutané,
un reflet du métabolisme systémique
du médicament?
Les études de métabolisme des médicaments chez l'homme
comme l'ont écrit, en 1980, RAWLINS et Qotf.
(163), sont souvent
limitées par la nécessité de préserver la santé et d'assurer la
sécurité des volontaires malades et sains concernés.
Les études in vitro à partir de biopsies, bien que tech-
niquement réalisables, ne sont souvent possibles que lors de prélè-
vements de tissu à des fins exploratoires.
Les investigations in vivo impliquent une étude soigneuse
du taux de métabolisme grâce à des composés " modèles " administrés
par voie orale ou parentérale et sont limitées par la toxicité du
composé en cause ou de ses métabolites. Bien que plusieurs substrats
" modèles" tels que l'isoniazide, l'antipyrine, la sulphadimidine,
l'acétanilide ou le paracétamol, peuvent être utilisés en toute sécu-
rité, ceux-ci ne permettent pas toujours d'établir une prédiction
de l'activité de toutes les enzymes. C'est ainsi par exemple, que des
composés convenables et utilisables comme tests de l'activité de
l'EH ou de la glutathione transférase sont trop toxiques pour l'ad-
ministration à l'homme.

---

100
La peau cependant, est un organe superficiel; facilement
prélevable par biopsie ou par technique de Il suscion blister ". Elle pour-
rait de ce fait, constituer in vitro un tissu Il modèle Il d'étude du
métabolisme des médicaments dans les organes peu accessibles chez
l'homme. Et même si la nature du métabolisme cutané selon WEPIERRE
(162) est dans la plupart des cas, qualitativement semblable par
voie percutanée et par voie parentérale ou orale, RAWLINS et ~ott.
pour leur part, pensent que l'extrapolation du métabolisme cutané
à celui dans les autres organes demeure quelque peu incertaine car,
cela voudrait supposer au préalable, que les enzymes cutanées du
métabolisme des médicaments sont semblable et se situent dans un
même context génétique et d'environnement que celles dans le foie
et les autres tissus.
Il n'empêche cependant que chez l'homme, un profil méta-
bolique systémique extrapolé à partir du métabolisme cutané de façon
intraspécifique, pourrait présenter plus de valeur prédictive, tout
au moins qualitativement que dans le cas de l'emploi d'un organe
semblable provenant d'un modèle animal,.
L'intérêt de la peau comme organe Il modèle Il d'étude du
métabolisme systémique pourrait déjà admettre comme justification
chez l'homme, l'observation de porphyries cutanées et plus couram-
ment chez l'adulte la porphyrie cutanée tardive à la suite d'expo-
sition à la lumière solaire. La maladie résulte d'un trouble méta-
bolique favorisé par une hépatite chronique (porphyrie hépatique)
dont l'une des caractéristiques biologiques est l'excrétton uri-
naire d'uroporphyrine de types l et II. Elle est parfois révélée
par la prise d'oestrogènes (146).
La place de la peau comme Il écran solaire Il et l'interfé-
rence de cette fonction dans l'activation métabolique apparait
aujourd'hui un des pôles de la recherche biologique. En effet, un
certain nombre de travaux publiés ces trois dern~ères années sur la
photopharmacologie du chlordiazépoxide (Librium
) en relation avec
sa phototoxicité par BAKRI et ~ott. (1~4)établissent la réduction
de la fonction N ~ 0 de ce composé sous l'effet des U.V. ; ce qui
4
signerait la présence de liaisons covalentes du chlordiazépoxide
dans l'organisme, liaisons confirf~es chez le rat, grâce à l'utili-
sation de la molécule marquée au
C-. Ces résultats, affirment
les auteurs, ne se limitent pas au niveau de la peau. L'oxaziridine
qui se formerait dans la peau (organe directement exposé aux U.V.)
serait donc capable de traverser les membranes biologiques et de se
lier à d'autres organes plus profonds.

---

101
3 - Biotransformation in vitro des nucléosides pyrimidiques substitués
données blbliographlques et but de notre étude.
3.1 Données bibliographiques sur la biotransformation in vitro des
nucléosides pyrimidiques substitués.
Les nucléosides pyrimidiques substitués, et essentielle-
ment ici ceux de la cytosine et de l'uracile, ont fait l'objet d'un
certain nombre d'investigations biochimiques à cause de leur inté-
rêt en thérapeutique
découlant de leur analogie à la thymidine, nu-
cléoside spécifique de l'ADN.
Ainsi, il a été démontré que les dérivés 5-halogénés de
la désoxy-2'-uridine (F DU, BrOU, IDU) peuvent découler, dans certains
tissus,de leurs correspondants 5-halogénés de la désoxy-2'-cytidine
(FOC, BrOC, IDC) par transformation enzymatique. Ceci a été établi
par de nombreux auteurs (750 a 751) dans le cadre d'un vaste program-
me de recherche sur la chimiothérapie anticancéreuse ; ces nucléosi-
des 5-halogénés ayant été démontrés utiles, en plus de leur action
antimétabolite, pour leur pouvoir à augmenter la sensibilité aux
rayons X des cellules en croissance rapide.
En synthétisant les dérivés 5-halogénés de la désoxy-2'-
cytidine, les chercheurs (CHANG et WELCH paA exemple) ont espéré
(92, 756) obtenir des composés d'une plus grande stabilité métaboli-
que, c'est à dire, des composés se comportant comme des faux donneurs
de désoxyribose et susceptibles d'être convertis dans la cellule en
dérivés 5-halogénés du désoxy-2'-cytidine-5'-phosphate (ex. IDCMP)
;
lesquels se prêteraient ensuite à une désamination par la désoxyti-
dilate désaminase en dérivés 5-halogénés du désoxy-2'-uridine-5'-
phosphate (ex. IDUMP).
Le point de départ des investigations sur l'existence
d'une pyrimidine nucléoside désaminase
fut la constatation par les cancérologues d'une disparition rapide
du
cytosine arabinoside (C-ara), administré
aux malades
en I.V. lors des études de taux sanguins des médicaments (760). Les
cliniciens avaient alors supposé que le médicament était transformé
probablement en un métabolite quelconque inactif. Cette hypothèse
fut par la suite démontrée grâce à des incubations de C-ara dans des
homogénats de foie humain : Le C-ara était œétabolisé dans ces con-
ditions en un produit inactif, l'uracil arabinoside (U-ara), et la
réaction implique une désamination.
Depuis ,un certain nombre de nucléosides à intérêt théra-
peutique en cancérologie ou en virologie, ont été testés comme subs-
trats de la nucléoside désaminase tissulaire ; la présence de cette
enzyme chez l'homme pouvant constituer un obstacle thérapeutique.

---

102
La préoccupation
immédiate a donc été de rechercher un
modèle animal proche de l'homme, en ce qui concerne l'activité et
la distribution de l'enzyme. C'est ainsi, que CAMIENER ~ SMITH
en
(760) ont testé 4 tissus d'organes de 11 espèces anima-
les. Chez l'homme seuls le foie et le rein, ont été testés.
Les résultats obtenus par les auteurs, montrent que chez
l'homme, l'activité de la pyrimidine nucléoside désaminase, aussi
bien vis-à-vis
-
C-ara que de la cytidine comme substrats, est
de loin supérieure dans le foie, bien qu'elle reste élevée au niveau
rénal: en une demi-heure, ils observent 100 % de C-ara biotrans-
formée,
tandis que la biotransformation n'atteint que 46 % en 2 heures
au niveau rénal.
Chez la souris SWISS et le rat WISTAR, contrairement aux
observations chez l'homme,
le foie ne manifeste qu'une très faible
activité désaminasique, que ça soit vis-à-vis du C-ara que,
vis-
à-vis de la cytidine
; la désamination par le tissu rénal de rat
étant également faible.
Ainsi des 11 espèces animales testées,
3 seulement ont
été retenues comme présentant une activité de la pyrimidine nucléo-
side désaminase élevée
(souris, cobaye, porc)
et ce essentiellement
au niveau d'un seul et ~me organe, le rein.
Les résultats obtenus par ces auteurs vont dans le même
sens que ceux observés auparavant par CREASEY en 7963 (92).
Cet auteur a développé des études de métabolisme ~n vitro
de la iodo-S-désoxy-2'-cytidine chez la souris, à partir d'une nuclé-
oside désaminase purifiée de rein, après avoir déterminé, comme pré-
senté dans le tableau
I X , l'aptitude de 9 tissus d'organes
provenant de 4 espèces dont l'homme, à transformer l'IDe. Cette trans-
formation est illustrée par le schéma suivant :
NH
OH
OH
2
1
1
1
C
C
C
-l
l
l
~ ........
()-
N"~ ......... C-
N
C
1
11
.>
">-
1 IIc
C17~ ./
O-=~/
HO
N
-~~
HO H2C /o~1
HO °'1/° 1
I~~I
~
C
H
I\\:-t
H
H
OH
OH

---

103
IOC
------=:>~
IDU
----'>~
lU
----~~~URACILE + l -
désamination
C' -N'
hydrolyse
déshalogénation
1
1
oxydative
(enzymatique ?)
(nucléosidase)
( nucléoside désami
désaminase)
TABLEAU
IX
Résultats exprimés en 10-9 moles de substrat décomposé
par 100 mg de tissu en 1 heure à 37° c.
TISSUS
RAT
SOURIS
LAPIN
HOMME
cerveau
19
45
14
sang
0
12
0
15
Moëlle osseuse
15
Foie
0
225
0
Rein
2
2733
5
Iléon
291
1680
111
130
Rate
12
81
203
Testicules
18
41
2
Thymus
0
2

---

104
3.2 But de notre étude:
La iodo-5-désoxy-2'-cytidine
(IDC)
est un composé chimi-
que de synthèse
(99) dont la structure pyrimidique rappelle celle
de la thymidine. Elle en est donc un analogue non métabolique et,
est utilisée dans le traitement des maladies provoquées par le virus
de l'herpès simplex comme antipyrimidine de synthèse: son incorpo-
ration sélective à la place de la thYmidine dans l'ADN viral lors de
la replication, aboutit à l'obtention d'un faux génome par inhibition
des enzymes de synthèse de l'ADN viral
(cf. § I.C.2.2 p.
3'
).
Cependant d'autres nucléosides pyrimidiques substitués
comme la iodo-5-désoxy-2'-uridine (IDU), présentent également une
action antiherpétique mais moins sélective
(cf § I.C.2.3 p. 35
)
et sont susceptibles d'interférer sur le métabolisme normal des cellu-
les non infectées.
La spécialité antiherpétique,auterpes
pommade dermique
des laboratoires CHAUVIN BLACHE, contient de l'IDC comme principe
actif.
L'absence dans les travaux antérieurs de données biochi-
miques sur l'IOC au niveau cutané, comme on peut le contas ter dans le
paragraphe pré~édent (tableau
IX
) nous a conduit à envisa-
ger l'étude du devenir de ce médicament dans la peau, chez l'animal
et chez l'homme.
Par ailleurs, le paragraphe III.A.2.2 sur l'activité mé-
tabolique de la peau vis-à-vis des substances exogènes fait qppa-
raitre (tableau
VII
page
96), l'absence des nucléosides parmi
les substrats étudiés.
Il ressort également de ce méme paragraphe, comme dans la
synthèse par HARRI VANIO en 1980 (1611 sur le rôle du métabolisme
extrahépatique
que, du fait de sa forte densité enzymatique et de
l'importance biologique de son rôle, le foie constitue la référence
en ce qui concerne l'évaluation du métabolisme systémique.
Cependant les nucléosides en général, correspondent à des
substances biologiques dont les perturbations métaboliques peuvent
se traduire par un dysfonctionnement de la physiologie rénale, tel
le cas chez les goutteux.
En outre les résultats obtenus par CREASEY, à propos de
l'activité de la nucléoside désaminase dans les homogénats de tissus
animaux, suggèrent clairement que le rein constitue, dans l'état
actuel, des données chez l'animal, la source la plus active de cette
enzyme 11581 •

---

105
De plus, du fait que l'absorption d'un médicament, dans
le corps humain, est influencé par sa solubilité dans les lipides,
son excrétion est rendue plus facile par sa polarité.
Ainsi, dans notre étude, nous avons choisi d'établir dans
des mêmes conditions expérimentales, un parallèle entre deux orga-
nes extrahépatiques, l'un jouant un rôle physiologique à la fois
dans la pénétration et l'élimination (la peau), l'autre essentielle-
ment dans l'élimination (le rein)
; ce dernier demeurant en sus,
la référence pour l'activité de la nucléoside désaminase.
En effet, la pyrimidine nucléosid~ésaminase définie
par CREASEY et les autres chercheurs cités ci-dessus, a été réper-
toriée par la commission
de " nomenclature des enzymes sous le
code: "E.c.3.5.4.5, cytidine aminohydrolase "
(758), l'uridine
nucléosidase ayant été, elle, dénomriiée : " E.c.3.2.2.3, uridine
ribohydrolase "
Ces enzymes ont été étudiées à pH compris entre 7 et
7,5 en milieu phosphate ou t r i s ; les renseignements complémen-
taires sont disponibles~~référence (158) de ce présent docu-
ment.

---

106
B. MISE au POINT des CONDITIONS ANALYTIQUES
1. Contrôles analytiques du ou des produit (s)
1.1. Propriétés physiques
1.1.1. Caractères organoZeptiques
IOC
Poudre microcristalline incolore, inodore.
mu
Poudre cristalline blanche, sans saveur ni odeur.
1.1.2. Critères d'identification
1.1.2.1.
Point de fusion
Déterminé au moyen d'un appareil utilisant un bain de
paraffine.
Le bain est préchauffé à 160°c environ.
Insérer le microtube
capillaire (fermé à une extrêmité) contenant la substance finement
pulvérisée.
Déterminer le point de fusion par élévation de la température
du bain de 2°C . min- 1 •
Relever la température de fusion (fusion franche) de la
substance.
Valeurs
IOC
= 183 ± 2°C
IDU
= 186 ± 2°C

---

107
1.1.2.2.
Ce spectre montre un maximum d'absorption à 292 ± 2 nm
et un minimum à 219 ± 2 nm pour l'IOC. Pour l'IDU, maximum 286 ± 2 nm
et minimum 215 ± 2 nm.
Il a été enregistré à partir d'une solution à 1 mg pour
100 ml dans l'eau à l'aide d'un spectrophotomètre UNI CAM utilisant une
cellule en quartz de 1 cm contre une solution aqueuse de référence.
Balayage entre 400 et 200 nm. Pleine échelle 0,5 de 0.0., 1 nm/sec,
10 sec/cm.
Spectre
Cf. Annexe
1.1.2.3.
Solubilité
IOC
Soluble dans l'eau, la solution à 2 g pour 100 ml
à 90 o -100°C, est limpide.
IDU
Soluble dans l'eau chaude ne dépassant pas 80°c
de température. Solubilité
< à 1 g pour 100 ml.
1.1.2.4.
Appareil: Spectromètre I.R. BECKMAN. Acculab 4.
1 mg de substance finement pulvérisée est incorporé à 300 mg
de bromure de potassium. Le mélange est comprimé en pastille sous une
pression de 12 tonnes.
Le spectre est enregistré sur une étendue de longueurs d'onde
de 2500 nm à 1600 nm au moins.
La position et l'intensité relative des bandes pour les deux
substances (IOC et IDU) correspondent bien aux spectres de référence.
Les spectres obtenus sont consignés en Annexes.
1.1.2.5.
Appareil : Spectromètre VARIAN. EM 360 A.
La substance pulvérisée (quelques mg) est dissoute dans 500 mg
de DMSO (diméthylsulfoxide).

---

108
Le pic du TMS
(tétraméthylsilane) est utilisé comme
référence.
Le spectre est enregistré à 60 MHz et l'identification
des groupements hydroxyls et amines est obtenue par inhibition au D20.
Après attributions et comparaison aux spectres de référence,
les spectres obtenus sont bien caractéristiques des produits
(Annexes
1.1.2.6.
Appareil : 2091 GAS CHROMATOGRAPH-MASS SPECTROMETER LKB
Ordinateur digital RL02. Imprimante PRINTONIX.
Conditions
Température
:
190°C
Potentiel d'ionisation:
70 eV
Injection par entrée directe des poudres.
Les Annexes
à
présentent respectivement pour chacun
des produits l'enregistrement du courant ionique, le spectre global
de masse,
le spectre normalisé et les abondances relatives;
l'existence
des masses
(pics) moléculaires dans ces spectres confirme bien l'identité
des produi ts .
Cependant,
le nombre élevé de pics fragments et la faible
abondance relative des pics moléculaires traduisent d'une manière nette
la susceptibilité de ces produits à la fragmentation.
1.1.3. critères de puret~
1.1.3.1.
Perte à la dessiccation (Pour l'IOC)
- - - - - - - - - - - -
Doit être inférieure à 3 p.
100 quand elle est déterminée
sous vide en présence d'acide sulfurique.
Peut être aussi déterminée par dessiccation à l'étuve:
Une quantité exactement connue autour de 1 g est introduite
dans une cupule en porcelaine préalablement desséchée, à poids constant
et tarée. L'ensemble, placé à l'étuve à 105°C pendant au moins 3 heures,
est desséché jusqu'à poids constant.

---

109
La formule suivante permet de déterminer la perte à la
dessiccation :
Perte (%)
100
Poids de la substance en mg au départ.
Poids de la substance desséchée.
1.1.3.2.
~o~v~iE. E.0!a!o!.r~ ~p~c!.f!.q~e : {a}~5 , ~e_l~I~
Dans une fiole de 25 ml, introduire une quantité exactement
pesée de 250 mg de substance et compléter jusqu'au trait de jauge avec
de l'eau distillée à 25°C. Déterminer ainsi à la même température la
rotation optique dans un tube de 2 dm à la lampe à sodium.
Par la formule suivante, i l est aisé de calculer la rotation
spécifique {a}25
o
a • 25
P.2
a
• 12.5
=
en
{%}
P
a
= Angle de rotation de la solution à étudier en degrés
angulaires.
P = Poids de la substance en g.
Valeur IOC
= 37,5 %.
1.1.3.3.
Ce contrôle a été réalisé sur couche mince de gel de silice
fluorescent à 254 nm en pratiquant trois chromatographies à l'aide de
trois solvants différents :

---

110
1. Butanol, eau, acide acétique
6/2/2
2. Butanol, méthanol, eau
'"
6/4/1
3 . Méthanol, ammoniaque à 50 %
9,5/0,5
Dans les trois cas, la tache due au produit ne doit être
accompagnée d'aucune tache secondaire liée à la présence d'impuretés.
Rf1
IDC
'"
0,62
Rf 1 IDll
0,80
Rf2
IOC
'"
0,74
Rf2
IDll
'"
0,89
Rf 3 IOC
0,83
Rf3
IDll
0,92
Quantité déposée
la Ill.
Temps de développement :
Système 1
1 h.45
Système 2
'"
h.
Système 3
40 mn.
1.2. Dosage de l'IDe
Dans une fiole de 100 ml, introduire une quantité exactement
pesée de produit égale à 25 mg (cr '" ± 0,001 mg), compléter à 100 ml à
l'aide d'une solution 0,1 N d'acide chlorhydrique à une température de
20°C.
Après mélange, réaliser une dilution au 1/20ème de cette
solution (5,0 ml à compléter à 100 ml avec HCl 0,1 N). On obtient ainsi
la solution de travail.
Déterminer le maximum d'extinction de cette solution dans des
cellules à quartz à 290 nm contre une solution de référence d'HCl 0,1 N.
1 %
Soit A l'extinction spécifique (E
) de la substance dans
1 cm
l'acide chlorhydrique à 290 nm.

---

111
Calculer la quantité (x) de la substance d'après la
formule suivante :
[max . 1000 . 100 . 100
x =
A • 5 • P
107
{%}
x =
5 A
[max
= Maximum d'extinction (densité optique) de la
solution à doser à 290 nm.
P
= Poids de la substance en mg.
Valeur trouvée
la valeur expérimentale doit être
comprise entre 98 et 102 %.
X
= 100,05 %.

---

112
2. Chromatographie en Phase Liquide Haute Performance (H.P.L.C.)
des nucleosldes substitués
2.1. H.P.L.C.
Instrument d'analyse des dérivés d'acides nucléiques
dans les échantillons biologiques
Les nucléotides, nucléosides et bases, constituants
essentiels des acides nucléiques et cofacteurs enzymatiques intervenant
dans les fonctions propres de la cellule, des tissus et des organes,
occupent aujourd'hui une place plus grande encore dans les troubles du
métabolisme des purines et pyrimidines. Ils apparaissent ainsi comme
des témoins de la dégradation des acides nucléiques et des traceurs
biologiques dans certains types de cancer. Certains, lorsqu'ils sont
modifiés, peuvent être utilisés en thérapeutique cancéreuse et virale
comme des antimétabolites.
Leur séparation dans les liquides biologiques, leur
identification et leur dosage ont, de ce fait, suscité un grand intérêt
et font intervenir essentiellement les techniques de chromatographie
liquide.
Les études de pionnier par COHN qui sépara les acides
nucléiques par chromatographie d'échange d'ions, par ANVERSON qui
développa un procédé automatisé de "monitorage" et par FELTON, HORVATH
et Coti. qui recherchèrent les paramètres afférents à l'efficacité de
la colonne, marquèrent le début d'une ère nouvelle dans la science de
la chromatographie (728).
L'introduction, dans les six dernières décennies, des
colonnes en acier inoxydable remplies de matériau pelliculaire capable
de résister à des pressions allant jusqu'à 4000 p.s.I (280 bars),
combinés à la tendance de la pompe à forcer la phase mobile dans la
colonne chromatographique, a rendu possible la séparation rapide des
mélanges complexes.
Le développement des matériaux de remplissage utilisant des
microparticules, en 1973, posa une nouvelle borne milIaire dans
l'histoire de la chromatographie. L'efficacité de la colonne a été
augmentée pendant que le seuil de capacité a été maintenu.
Le développement de l'H.P.L.C. a facilité l'isolement et la
quantification des constituants des acides nucléiques dans les liquides
biologiques et tissus; les séparations, qui auparavant nécessitaient

---

113
plusieurs heures par les méthodes de colonnes ouvertes, peuvent être
accomplies rapidement en utilisant l'H.P.L.C. Avec les systèmes de
détection "on line", la caractérisation aussi bien que la quantification
des substances en solution est possible.
Pourtant, depuis quelques années, des essais ont été envisagés
dans le domaine de la chromatographie en phase gazeuse (C.P.G.), seule
{129, 132
1 ou couplée à la chromatographie liquide
, ou encore
à la spectrométrie ou fragmentographie de masse (140,
130, 131, 133, 135)
Mais la C.P.G., couplée ou non à d'autres modes chromatographiques, ne
constitue pas un moyen pratique pour l'analyse des dérivés des acides
nucléiques.
La vaporisation des composés devant résister pendant celle-ci
à des températures de four élevées est une donnée fondamentale. Une
certaine perte accentuée par des taux faibles de certains nucléosides
et bases (études métaboliques dans les échantillons) rend cette technique
moins appropriée.
En effet, malgré la possibilité offerte par de nombreuses
réactions de dérivatisation (acétylation, acétonation, méthylation,
silylation, etc.) d'améliorer la volatilité des solutés en C.P.G., et
voire leur polarité, les nucléosides et nucléotides restent des substances
difficiles du fait de leur thermolabilité et de leur hydrolyse facile
(exemple des dérivés triméthylsilyls {135J. Et si la réaction de
perméthylation procure une satisfaction relative (réaction facile et
composés résultant de poids moléculaire peu élevé), les réactions de
silylation et d'acétylation aboutissent le plus souvent à des composés
de haut poids moléculaire et peu volatils. HAN COCK (129J d'une part,
et le duo YUKIKO SASAKI-TAKESHI HASHIZUME (132), reprenant PARKER et
SWEELEY,rapportent la difficulté d'analyser en G,L.C. les dérivés de la
cytidine et guanosine après silylation (triméthylsilyls), acétylation,
méthylation ou acétonation.
D'autre part, dans notre Laboratoire, HANAFIAH WANGSAATMAVJA
(141), ayant utilisé la 5-iodo-2'-déoxyuridine comme étalon interne après
perméthylation, a pu constater une certaine instabilité du composé à la
conservation. Ceci rejoint les remarques de HAN COCK et COLEMAN (135)
sur l'hydrolyse des dérivés triméthylsilyls des nucléotides monophosphorylés
de l'uridine et de l'adénosine.
D'autres couplages à la C.P.G. ont été réalisés, toujours dans
le souci d'analyser les dérivés des acides nucléiques. Ainsi TERUYOSHI
MARUNNAKA et YUHIKIKO UMENO, pour séparer la 5-fluorouracile et les bases
pyrimidiques dans le plasma, ont utilisé la C.P.G. couplée à la fragmen-
tographie de mase par ionisation chimique (GC - CI - MF) (140)
, puis à la
fragmentographie et à la spectrométrie de masse par impact d'électron
(GC - El - MP et GC - El - SM).

---

114
Enfin, après N-O-perméthylation, Von MINVEN et Me CLOSKEV (135)
ont tenté d'appliquer la désorption de champ (FI) à l'analyse des
nucléosides et nucléotides.
Mais aucune de ces techniques de vaporisation classique,
ni même celle de désorption de champ n'ont été aisément applicables
aux nucléosides et bases. Les premières pêchant par volatilité faible
des composés de dérivatisation sans doute due à la présence de
nombreuses fonctions hydroxyls et amines : la seconde pose un problème
de sensibilité (737). En plus, pour la désorption de champ, il est
évident que le faible degré de fragmentation constitue une perte réelle
du point de vue de l'information structurelle par rapport aux méthodes
par ionisation.
Les chromatographies liquides d'échange d'ions et de partage
restent les plus utilisées pour l'analyse des nucléotides, nucléosides
et bases.
Ainsi, les trois modes majeurs employés pour la chromatographie
des dérivés des acides nucléiques sont :
- l'échange d'ions (cationique ou anionique),
- la polarité de phase inversée,
- la formation de paires d'ions.
Pour notre part, nous avons retenu la chromatographie sur
colonne à polarité de phase inversée parce que convenable à beaucoup
de substances nucléosidiques.
2.2. Facteurs intervenant dans la chromatographie sur colonne
à polarité de phase inversée
Comme la formation de paires d'ions, la polarité de phase
inversée constitue un mode chromatographique de type partage. Le
processus de partage correspond à une chromatographique liquide-liquide
(C.L.L.) et la séparation est fondée sur des différences de solubilité
des molécules à séparer dans la phase liquide qui imprègne ou qui est
greffée sur un solide (support) convenable par une liaison chimique
covalente.
Le coefficient de distribution d'un soluté S entre les deux
phases est appelé "coefficient de partage".
K =

---

115
Cs et CM désignent respectivement les concentrations du
soluté dans la phase stationnaire S et dans la phase mobile M.
Le facteur de capacité K' est égal au rapport des quantités
de soluté S dans les deux phases
K'S
= K
Vs
= Volume de phase stationnaire contenue dans la
colonne.
VM
= Volume total de la phase mobile contenue dans la
colonne.
Avant de passer à l'optimisation du système chromatographique
utilisé, rappelons succinctement les facteurs majeurs intervenant dans
la chromatographie sur colonne à polarité de phase inversée et dont la
maitrise détermine la réussite de la mise au point des conditions
analytiques.
2.2.1. Le pH
rI peut affecter la polarité des solutés plus fortement que
la polarité de la phase mobile et des phases stationnaires (142J.
Le pH de l'éluant joue un rôle majeur car il détermine le
degré de dissociation d'une substance en solution. La protonation des
groupements basiques des substances en solution produit une augmentation
de la polarité et, par conséquent, une diminution des temps de rétention.
Le pH de la phase mobile n'influence que les valeurs de K' des solutés
ayant un pK situé dans la zone de modification de pH ; et dans la mesure
où la plupart des composés ont des pK différents, ce paramètre peut être
particulièrement utilisé en modifiant la sélectivité.

---

116
2.2.2. La polarité de la phase mobile
Une augmentation de la concentration en méthanol de la phase
mobile fait décroître les temps de rétention dans la chromatographie
sur colonne à polarité de phase inversée p.114. Cette concentration en
méthanol n'ayant visiblement pas d'effet sur la sélectivité, ceci
indique probablement que le méthanol ne modifie pas le type mais
plutôt l'intensité de l'interaction entre les composés en solution
et la phase stationnaire. Il entre en compétition avec les substances
dissoutes pour l'occupation des groupements octyls.
Ainsi, le méthanol ne modifiant que les valeurs de K'
(facteurs de capacité de la colonne) sans toucher à la sélectivité,
une décroissance de la concentration en méthanol dans le mélange
éluant ne doit pas améliorer la résolution des solutés de faible
sélectivité, mais doit déboucher sur un temps d'analyse plus long.
2.2.3. Conoentration en ions tampon, pouvoir hydrophobe des ions
tampon, mélange d'ions tampon
La concentration en ions tampon exerce seulement des effets
mineurs sur les facteurs de capacité de la colonne et la sélectivité
( 1421 •
Le pouvoir hydrophobe d'un ion tampon exerce des effets
mineurs sur les facteurs de capacité de la colonne et la sélectivité
des solutés de charge opposée. Par contre, il a des effets moindres
sur la rétention des solutés non chargés ou de même charge que les
ions tampon.
L'emploi d'un mélange d'ions tampon de pouvoirs hydrophobes
différents équivaut à celui d'un ion tampon de pouvoir hydrophobe
intermédiaire.
2.3. Optimisation du système
2.3.1. Appareillage
Chromatographe : SPECTRAPHYSICS 3500 à double pompe.
Détecteur : LC UV PYE UNICAM.
Enregistreur-Intégrateur: SP 4100.
Colonne : RP 8 MERCK -
7 pm (diamètre des particules)
250 mm (longueur)
4,00 mm (diamètre interne)

---

117
2.3.2. Conditions
Phase mobile : Eau-Méthanol (95/5)
ou Tampon phosphate-Méthanol (95/5)
pH 7,2.
Longueur d'onde de détection: 280 nm (fixe).
Atténuation
64.
Sensibilité
0,04.
Défilement du papier (CS)
: 0,5 cm • min- 1 .
Débit constant : 30 x 0,04 ml
Volume d'injection: 10 Ul.
Durée maximale d'analyse: 22 min.
2.3.3. Paramètres ahromatographiques
Ils ont été calculés à partir d'un mélange éluant Méthanol-
Eau (95/5) sur une colonne RP 8 ayant déjà servi trois semaines, et
d'après les expressions mathématiques des grandeurs fondamentales que
nous rappelons ci-dessous :
K'2
a
=
kil
RS
= 1/4 . (a - 1)
. (Neff) 1/2
a
5,54
2
(tR - ta)
Neff =
ô2
t 2R
oZ
= - -
N
(tR)2
N
= 5,54
ô2
L
H
= N

---

118
tRo
= Temps nécessaire pour l'apparition dans l'effluent
d'un composé non retenu sur la colonne.
tRi
= Temps de rétention relatif d'un composé;
temps d'élution au maximum du pic mesuré à partir
de l'injection.
K';
= Facteur de capacité.
a
= Facteur de sélectivité.
Il caractérise la distance séparant les sommets de
deux pics consécutifs; et j.
W;
= Largeur du pic; à la base.
Distance entre les points d'intersections des tangentes
d'inflexion avec la ligne de base.
ô;
= Largeur du pic; à mi-hauteur.
N
=
Nombre de plateaux théoriques contenus dans une colonne,
pour un soluté donné.
•
H
= Hauteur équivalente pour un plateau théorique (HEPT).
a 2
= Efficacité de la colonne.
Neff
= Nombre de plateaux efficaces de la colonne.
Permet d'apprécier de manière plus concrète la véritable
efficacité de séparation de la colonne.
Rs
= Résolution entre deux pics; et j.
tRo
= 50 sec.
vR
=
O
1,66 ml.
K'IDC = 11
K'IDU = 8,84

---

119
a
= 1,24
RS
= 3,31
N
=
5912 pour 250 mm de colonne
soit 23648 • m- 1
H
= 0,014
a 2
= 0,065
Neff
=
4682
2. J. 4. Choix du méZange éZuant
La séparation des nucléotides, des nucléosides et des bases
peut être réalisée au moyen de différents systèmes utilisant pour la
plupart des mélanges binaires ou ternaires comme phases mobiles.
Mais si certains d'entre eux, comme le mélange eau/acétonitrile/
acide acétique (94/5/1) permettent une séparation satisfaisante des
composés en milieu aqueux, les chromatogrammes obtenus avec les milieux
•
biologiques ne présentent pas une résolution complète des pics .
Dans notre étude de métabolites de la iodo-S-désoxy-2'-
cytidine (IDC) dans les extraits cutanés ou rénaux, il a été nécessaire
d'obtenir un chromatogramme permettant de distinguer la présence de
substances endogènes (provenant de l'hydrolyse des acides nucléiques)
de celle de métabolites issus d'une conversion enzymatique de l'IOC.
Il a donc été impératif de trouver un compromis entre cet
objectif et les réalités physico-chimiques des diverses substances
en jeu.
En effet, sur une colonne RP 8, le noyau 0-2 déoxyribose est
plus solidement retenu que le noyau O-ribose, probablement à cause de
la plus haute électronégativité de la fonction OH (6raph"I!~3).
Le processus d'élution des nucléotides, nucléosides et bases
étant une fonction du degré de protonation du groupement P04 (~Qfh~~3),
les molécules portant le plus de P04 sont éluées plus tôt que les autres.
Mettant à profit ces considérations physico-chimiques, l'emploi
d'une solution tampon phosphate pH 7,2 nous permet d'obtenir une rétention
plus importante des nucléosides exogènes (IOC, IOU) ; les nucléosides de
l'uracile apparaissant en général avant ceux de la cytosine C&rqrn -1'1"4) •

---

120
L'emploi du méthanol améliore l'élution des composés sans
altérer la résolution ; on obtient ainsi des temps de rétention un
peu moins longs. Mais si les processus d'élution des nucléotides de
la cytosine et de l'uracile sont semblables, la séparation des tri-
et diphosphates est remarquablement difficile malgré les modifications
de composition de la phase mobile.
2.3.5. Mode d'é~ution
L'utilisation d'un gradient de pH ou d'un gradient de
molarité, ou même d'un gradient à la fois de pH et de molarité, exige
un temps et des volumes de tampon plus importants pour la réalisation
de l'équilibre entre les analyses et la programmation du gradient si
l'on veut obtenir une résolution optimale.
Le souhait ayant été d'élaborer des conditions pratiques
rapides et efficaces, le mode isocratique d'élution a été retenu
pour notre étude comme convenable et satisfaisant.
Ce mode d'élution, comme les conditions décrites précédemment,
nous permettent ainsi de séparer nucléosides pyrimidiques et nucléosides
puriques; ces dernières, jusqu'au temps 20 mn, n'apparaissant pas sur
notre chromatogramme (Graphique n':4 ).

---

121
A'"
L:~c
S
~
<
1
1
1
C~
, . .
p .
;~
;
E:

---

-
122
~~;~~~~~~~~~~=~~~i:~Yt~l~'d~i~n~e~=:,~==:~.~5~~F_==========Ur
Désoxycyti di ne
Uri di ne
'-:.,.58
?
5. <3
Désoxyuridine
Iodouraci le
Iodocytosine
Iodouridine
] &' J~
. ,
, 8
IOdocytl Cl ne
l l . ~
Graphique n° 4
1 7 : De: 2.t.
Iodo-5-désoxy-2'-uridine
=~~~~:::-1<!.+1
1~. :l1
Iodo-5-désoxy-2'-cytidine
Graphique n° 5

---

123
3. Traitement des échantillons biologiques
3.1. Constitution des échantillons biologiques
Ce paragraphe est détaillé dans la partie expérimentale
proprement dite de l'étude du métabolisme cutané in vitro de l'IDC.
Les échantillons biologiques sont obtenus néanmoins d'après le
schéma ci-après :
r--1 Prélèvement tissus (Peau abdomen, dos) J
Séparation des parties adipeuses et musculaires
---- de la peau
+ capillaires
H Rinçage dans milieu d'homOgénéisation/
H Essorage sur papier absorbantl
H Hachage 1
H Homogénéisation 1
H Introduction substrat - Incubation 37°C B.M.-'
H Extraction des produits (Précipitation des protéines)l
H Chromatographie sur couche mincel
y Chromatographie 1iQuide haute pressionl
Schéma
VI l

---

124
3.2. Extraction des substances par précipitation des protéines
Les composés impliqués dans notre étude étant solubles en
faible quantité dans l'eau et encore moins dans les solvants
organiques non miscibles à l'eau, notre seule possibilité de les
récupérer a été la précipitation des graisses, des protéines et des
acides nucléiques des milieux tissulaires.
Les protéines en cause, dans la mesure où elles sont
solubles dans les milieux aqueux biologiques, correspondent à des
structures globulaires possédant de nombreuses fonctions polaires.
La solubilité dans l'eau des protéines est due essentiellement
aux radicaux qui ont de l'affinité pour l'eau (fonctions carboxyliques,
aminées, alcooliques). Cette solubilité, dépendante du pH et qui
détermine le degré d'ionisation des groupements fonctionnels, est
minimale au point isoélectrique.
Au pHi' la charge globale de la molécule étant nulle, les
forces de répulsion entre molécules passent alors par un minimum.
Pour la majorité des protéines, le pHi est en zone légèrement acide.
La solubilité dépend aussi de la concentration saline du
milieu et elle est modifiée par l'addition de solvants organiques
miscibles à l'eau. La plupart des solvants organiques sont des agents
précipitants, certains à haute constante diélectrique sont des solvants
tels le diméthylsulfoxyde, le formamide, l'acide chloracétique. La
diminution de la solubilité des protéines peut être obtenue par l'addition
de sels (sulfate d'ammonium, mélanges de phosphates alcalins) à forte
concentration, de solvants tels l'alcool, l'acétone, ou de sels de
métaux lourds.
En effet, à faible concentration, la solubilité des protéines
s'accroît en même temps que la concentration saline du fait de
l'accroissement de la polarité du solvant. Par contre, à forte concen-
tration, les ions du milieu en excès par rapport aux fonctions ioniques
de la molécule de protéine entrent en compétition avec celles-ci pour
l'eau et entraînent une déshydratation des protéines.
L'alcool et l'acétone, du fait de leur constante diélectrique
très faible, au contraire de celle de l'eau, isolent très peu les
groupes polaires (-COOH, -NH 2 , -OH) les uns des autres et sont ainsi
des agents précipitants. Utilisés à O°C ou en dessous, ils précipitent
les protéines sans les dénaturer. D'autres moyens peuvent être utilisés
pour précipiter les protéines tels l'emploi de l'urée, des agents
mécaniques et les rayons ultraviolets.

---

-
125
En ayant opté pour un milieu liquide réactif pour
l'élimination des protéines de nos échantillons afin d'en extraire
les composés, ce réactif, pour être bon, d'après
ZAKARIA et BROWN
(128), doit pouvoir:
1. Lyser la cellule,
2. Précipiter les protéines pour bloquer le
déroulement de l'action enzymatique
(catabolisme) ,
3. Permettre une bonne récupération des composés,
4. Permettre un environnement neutre
pour le stockage des dits composés.
Les solutions acides (acide perchlorique, acide trichloracé-
tique) sont communément utilisées pour extraire les nucléotides,
nucléosides et bases des cellules vivantes (homogénats de tissu), alors
que des possibilités de filtration sur colonne de gel boraté ou d'ultra-
centrifugation à travers des cônes de membrane existent dans le cas des
liquides biologiques.
L'acide trichloracétique est celui qui a été retenu dans notre
mode d'extraction. Il permet, en plus des points cités plus haut, de
précipiter abondamment les acides nucléiques et d'extraire les
nucléotides, nucléosides et bases à partir des homogénats entiers de
tissu mieux que l'acide perchlorique. Cependant, l'acide trichloracétique
interfère dans la séparation chromatographique notamment en couche mince
et doit être déplacé. Ces constatations, faites au cours de notre étude,
sont confirmées dans les travaux de BOLS et MOSS ER (143).
Et pour éviter l'emploi de grands volumes d'acide lors du
traitement des échantillons, nous avons utilisé une solution acide
méthanolique à 10 % d'acide trichloracétique contenant 50 % de méthanol
pour 50 % d'eau. Ces proportions de mélange permettent en outre de
réduire la durée d'évaporation à sec des extraits neutralisés au
rotavapor à 50°C et d'obtenir une concentration acide moyenne (10 % au
lieu de 20 % pour les homogénats entiers)
; ce qui met les molécules
à extraire à l'abri de toute hyqrolyse.
Cette étape d'évaporation à sec au rotavapor des surnageants
de centrifugation reste la plus longue de l'expérimentation. Certes,
l'emploi du méthanol a permis d'améliorer ce temps, mais il faut tout
de même compter 1 h.30 environ à 50°C pour évaporer un volume de 30 ml
d'extrait neutralisé. Le déplacement de l'acide trichloracétique dans
les extraits se fait par neutralisation au moyen de l'hydroxyde de
potassium 10 N. Le précipité de trichloracétate de potassium se forme à
partir du pH 5 (entraînant quelques restes de protéines) et se stabilise
autour du pH 7 et à froid (entre 0° et 4°C) .

---

126
Extraction par précipitation des protéines
1 Milieu après incubation S.M·I
+ Solution MeOH-Eau (50/50) de CC13COOH la %
+ centrifugation 3000 t.min- 1 , la mn
Surnageant l
+ KOR la N (Neutralisation)
Passage 1 h à + 4°C
+
+ Centrifugation 3000 t.min- 1
Surnageant II
+ Evaporation à sec (Rotavapor 50°C)
+ Reprise par 2,5 ml d'H 20
So l uti on aqueuse concentrée 1
+ Filtration sur minisart 0,22 ~m
So l uti on fil trée 1
Schéma VIII

---

-
127
Par centrifugation à 1500 t.min- 1, le sel est éliminé de
l'échantillon avant passage au rotavapor. Les résidus d'évaporation
sont repris par 2 à 4 ml d'eau distillée, puis filtrés sur membrane
de 0,22 ~m(minisart) avant d'être analysés par H.P.L.C. sur colonne
à polarité de phase inversée.
3.3. Rendement d'extraction
Le rendement d'extraction a été établi par rapport à des
solutions aqueuses d'IDU et d'IOC à 0,1 mg.ml- 1 à partir d'une droite
de calibration.
Des quantités croissantes de substances (IOC, IDU),
identiques à celles du calibrage, sont incorporées dans des tubes
à un homogénat témoin de rein de rat atrichis, préalablement dénaturé
à GOoC B.M. pendant 10 minutes.
Puis, dans chaque tube, un volume de solution méthanolique
d'acide trichloracétique (10 %) est immédiatement ajouté (temps zéro).
Les échantillons ainsi constitués, traités conformément au
paragraphe 3.2.,sont analysés par H.P~L.C. selon le critère de la
hauteur des pics.
Les résultats sont consignés dans le Tableau
X,
et
les graphiques nO G et nO 7.
3.4. Identification des composés
L'identification des composés est réalisée par cochromato-
graphie en présence de témoins. Des homogénats de tissus témoins,
traités dans des conditions identiques à celles des échantillons
étudiés, sont chromatographiés dans un premier temps. On dispose ainsi
d'un chromatogramme témoin. Les échantillons traités sont ensuite
chromatographiés à leur tour et chaque pic supplémentaire par rapport
au chromatogramme témoin est confirmé en rajoutant à la prise injectée
un certain volume de standard (composé pur à temps de rétention
préalablement déterminé). L'identité d'un pic au standard se traduit
par une augmentation de la hauteur du pic de l'échantillon.

---

128
ette méthode de cochromatographie offre l'avantage, lors
de l'iden
fication des composés, d'utiliser à la fois les temps de
rétention
elatifs, comparés à des standards séparément chromato-
graphiés,
t la coélution du composé de l'échantillon avec son
identique
tan dard , d'où l'augmentation d'amplitude du pic.
n plus de la co chromatographie des composés, nous avons
confirmé
attribution de chaque pic jugé intéressant en tirant,
en cours
analyse chromatographique des échantillons, son spectre
d'absorpt
n en U.V. ; ceci grâce à l'usage d'un système micro-
informati
détecteur-intégrateur-calculateur (PYE UNICAM PU 4021).
Le détect
r, à qui l'on demande de garder en mémoire le spectre U.V.
correspon
nt à un pic quelconque désiré, va permettre, à la suite du
chromatog
mme, à l'enregistreur de le tracer. L'on peut ainsi
directeme
confronter standard et composé de l'échantillon.
ar ailleurs, si la chromatographie sur couche mince (C.C.M.)
est quelq
fois peu pratique dans le cas de faibles quantités de
métabolit
, elle reste utile dans bien des cas. Les taches correspondant
à des Rf
cherchés peuvent être, après grattage sur la plaque de C.C.M.
et extrac
on, analysées par introduction directe dans un spectromètre
de masse.
alheureusement, la thermolabilité de nos composés ne nous a
pas permi
d'utiliser cette astuce.
e couplage chromatographie en phase liquide-spectrométrie de
masse (C.
- S.M.) demeurant encore d'application délicate, il reste
cependant
ossible d'utiliser le couplage chromatographie en phase gazeuse-
spectromé
ie de masse (C.G. - S.M.). Cette dernière méthode exigeant,
une fois
core, des substances thermostables et volatiles, des opérations
supplémen
ires (réactions de dérivatisation) auraient dû être nécessaires.
ne illustration est donnée
après la page 131, graphiques
na 8, 9 e
10 , nous présentons les spectres U.V. de trois standards
(lU,
IDU
IDC) tirés en tête de pics du chromatogramme (K), tandis
qU'à la p
e
,les spectres d'absorption en U.v. présentés correspondent
aux pics
à 6 du chromatogramme les précédant (P) et obtenu après analyse
d'un homo
nat de peau de rat incubé durant 24 heures à 37°C en présence
d'lOC et
ai té conformément au paragraphe B.3.2. avant chromatographie.
a confrontation des chromatogrammes K et P ainsi que des
spectres
b, c et l , S e t 6 par exemple, permet de confirmer les
résultats
e la co chromatographie : les trois pics de l'exemple ici
choisi pe
ent prendre l'identité suivante:
a
= 1 = lU
lodo-S-uracile
b
= 5
lDU
Iodo-S-désoxy-2'-uridine
c
= 6
IDC
lodo-S-désoxy-2'-cytidine
Ceci conc
dant bien avec l'information au préalable obtenue par couche
mince, l'
peu alors, avec beaucoup de quiétude, envisager la quantifi-
cation de
composés.

---

TABLEAU
X
Extraction de l 'IDC et de l 'IDU à partir d'un milieu tissulaire homogénéisé
Droite de calibration et rendement
Quantité Q (~g) de produit.
IDC ou IDU.
50
40
30
20
10
incorporée à l'homogénat inactivé
0>
N
Quantité Q' (~g)
IDC
44
31,24
28,60
16,50
8,55
r i
retrouvée
après extraction
IDU
40,26
34,32
23,98
16,72
8,36
Rendement
IDC
88,00
78,10
95,33
82,50
85,80
d'extraction
(%)
IDU
80,52
85,80 .
79,93
83,60
83,60
Les valeurs, dans ce tableau, correspondent à des moyennes à partir d'injections chromatographiques en double.
Les écarts types, très faibles, ne sont pas transcrits ici.

---

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---

135
3.5. Quantification des substances
Plusieurs méthodes sont applicables pour la quantification
des composés au cours d'une analyse par H.P.L.C. La sélection d'une
méthode quantitative se fait en relation avec la composition des
échantillons et la reproductibilité attendue.
Ayant utilisé un appareillage équipé d'un intégrateur-
calculateur, nous avons employé, pour des raisons de commodité
pratique, le dosage par la méthode de l'étalon externe.
Méthode de l'étalon externe
Pour une analyse n'exigeant pas la quantification de tous
les composants et lorsque les injections sont précises et les
conditions chromatographiques stables, la méthode de l'étalon externe
s'avère une des plus adaptées.
Chaque pic de l'échantillon d'analyse est comparé avec le
même pic dans l'échantillon de calibrage. La quantité de chaque
composant dans l'échantillon de calibrage est connue et un rapport
entre ce composant et l'échantillon d'analyse peut être calculé,
donnant ainsi la quantité du composant dans l'échantillon d'analyse.
Cette méthode, préférable pour la détection d'éléments à
l'état de traces, est également très appréciée lors de l'utilisation
d'injecteurs automatiques, à cause de la très bonne reproductibilité
des quantités injectées.
- Calibrage pour chaque composant i
aire i
Fri
=
Ci
Fri
Facteur de réponse pour le composant i
Ai re i
Aire du composant i
Ci
Concentration pour le composant i

---

l~
- Analyse pour chaque composant i
aire i
Cone ;
= Frl
Cone i
Concentration calculée pour le composant ;
Aire i
Aire du pic du composant i
1. Il est possible, dans le calcul de eone i, d'introduire
un facteur multiplicateur!
dont l'emploi est falcutatif.
a
2. Du fait que des droites de calibration ont été chaque
fois tracées pour vérifier le rendement d'extraction, nous avons
en outre pratiqué la méthode manuelle de dosage par hauteur de pic
les quantités des composés dosés étant lues par interpolation.
Les résultats obtenus par les deux modes d'évaluation sont
extrëmement proches, l'une et l'autre des méthodes ayant été appliquées
sur le même chromatogramme, donc dans des conditions identiques.
L'emploi de ces deux modes à la fois d'évaluation permet,
d'une part de contrôler la fidélité de l'intégration automatique, et
d'autre part de minimiser les fluctuations éventuelles liées à
l'imprécision des mesures d'amplitude sur les faibles quantités de
composé.
La méthode par intégration automatique cependant, demeure
plus aisée, moins consommatrice de temps et plus pointue pour les
faibles quantités.

---

137
4. Conclusion
De l'ensemble des données consignées dans ce document,
il ressort que les nucléosides halogénés de synthèse que sont
l'IDC et l'IDU sont bien des molécules de faible solubilité dans
l'eau et dans les solvants organiques non miscibles à l'eau.
Elles conduisent donc nécessairement, pour leur extraction
des homogénats tissulaires, à l'usage de la précipitation des
constituants moléculaires des milieux biologiques. Ce procédé comporte
plusieurs étapes et peut accroitre les risques de perte de rendement.
Leurs points de fusion et spectres de masse confirment leur
thermolabilité et leur forte tendance à la fragmentation thermique ;
ce qui les prédestine à une analyse par chromatographie en phase
liquide, notamment par H.P.L.C.
(Chromatographie en Phase Liquide de
Haute Performance) du fait de son pouvoir de résolution élevé, de sa
bonne sensibilité et des temps d'analyse relativement courts.

---

138
1. Modèles animaux
L'étude in vitro du métabolisme cutané de l'IDC est
menée chez deux modèles animaux (la souris hairless, le rat
atrichis)
et à partir de la peau humaine ; les deux modèles
animaux sont des souches mutantes choisies sans poil.
1.1 La souris hairless.
Souche mutante glabre, elle correspond à
la mutation
hairless survenue à l'Institut Pasteur en 1982. Ces souris homo-
zygotes pour hairless naissent avec des poils qu'elles perdent
à la première mue. Ces poils ne repoussent plus jamais mais i l
fait remarquer une hypertrophie de la peau et des glandes sé-
bacées.
La mutation hairless est différente de la mutation
nude, elle aussi glabre mais en plus athymique
(147).
1.2 Le rat atrichis.
Souche mutante glabre,
ce rat nait avec un pelage clair-
semé qui tombe à l'age de 3 semaines. A partir de la quatrième
semaine, les poils rares frisés au-dessus de la tête disparais-
sent et réapparaissent de manière cyclique
(148).
1.3 La peau de l'homme.
Le développement important de la pharmacologie aussi
bien fonctionnelle que biochimique, exige des investigations
expérimentales de plus en plus aigûes, et qui traduisent de la ma-
nière la plus fidèle possible les mécani~mes physiologiques ou
enzymatiques.
Et bien que le modèle animal soit le plus acceptable
et maniable tant an ni"ea n éthique qu' expérimental, rien ne peut
rester mieux fidèle à la réalité que l'aperçu des mécanismes
élaborés à partir des cas humains.

---

139
Malheureusement chaque individu humain n'est identique
qu'à lui-même et encore subsiste une certaine proportion d'aléas
qu'il convient de limiter par une rigueur méthodologique et une
interprétation réaliste et prudente des données expérimentales.
Dans cette étude qui vise à élucider in vitro les mé-
canismes enzymatiques cutanés pouvant intervenir dans la bio-
transformation de l'IDC, substance antiherpétique de synthèse,
nous tentons de constituer un aperçu pharmaco-biochimique à par-
tir de fragments cutanés excisés chez l'individu humain à l'oc-
casion d'interventions de chirurgie esthétique.
1.4 Choix des modèZes.
La rencontre de variations biologiques interspécifi-
ques voire intra-spécifiques incite de nos jours le pharmaco-
logue à multiplier les modèles d'études tant dans des conditions
in vitro qu'in vivo; ceci dans l'espoir de décrire la réalité
la plus proche de celle de l'espèce humaine.
Par ailleurs, les paragraphes sur la structure normale
de la peau et les conditions d'absorption percutanée des subs-
tances chimiques montrent bien le rôle déterminant des facteurs
tels les annexes épidermiques, les sécrétions de surface, l'in-
tégrité histologique etc ... de la peau dans la pénétration dans
l'organisme des xénobiotiques.
•
c'est ainsi que nous avons retenu pour l'étude de la
résorption percutanée de l'IDC, une espèce génétique glabre
le rat atrichis.
Dans un souci d'uniformité dans la méthodologie nous
avons observé les mêmes considérations en ce qui concerne le
modèle d'étude du métabolisme de l'IDC.
La nécessité d'une part de travailler contre une source
enzymatique à activité désaminasique cqnnuevis-à-vis de l'IOC,
le rein de souris (cf. tableau IX
p. 103), et d'autre part le
souci de multiplier les modèles sont autant de raisons qui nous
ont décidés à envisager comme autre espèce, une espèce glabre:
la souris hairless.
L'activité des annexes telles les glandes sébacées
comptant pour une part non négligeable dans le métabolisme cu-
tané endogène et se trouvant sous dépendance androgène, nous
utiliserons dans les études de la résorption percutanée comme
du métabolisme cutané de l'IDC des animaux mâles.
En ce qui concerne l'espèce humaine, la plus grande
sollicitation par le sexe féminin de l'acte de chirurgie esthé-
tique est l'unique raison à l'emploi de fragments de peau issus
de sujets féminins.

---

140
2 - Matériels et méthode générale d'étude in vitro du métabo-
lisme cutanê de l'IDC
2.1 Origine des animaux.
Les souris hairless de 7 semaines nous ont été fournies
par le centre de sélection et l'élevage des animaux de labora-
toires
(C.S.E.AL)
du CNRS-ORLEANS, FRANCE.
Les rats atrichis de 6 semaines environ proviennent
du centre d'élevage IFFA-CREDO, St.-GERMAIN sur l'ARBRESLE,
FRANCE.
Après réception, les animaux sont maintenus une semaine
en contention dans des cages à métabolisme et nourris .. ad Zi-
bitum .. pendant une semaine dans une pièce d'animalerie à 20° C,
50 à 60 % d'hygrométrie.
2.2 ORIGINE DE LA PEAU HUMAINE.
La peau humaine a été récupérée de la clinique de chi-
rurgie esthétique Ctémentville MONTPELLIER grâçe à l'amabilité
du VI{.. J0.6ette CONTE.
Il s'agit de fragments de peau excisés chez des sujets
féminins en bonne santé apparente, admises en consultation pour
ptose mammaire et d'âge variant entre 20 et 46 ans.
Les prélèvements sont effe~tués en salle de bloc opé-
ratoire sous anesthésie générale. Les fragments de peau prélevés
au dessous du sein et normalementde&inés à étre détruits sont
recueillis et placés aussitôt dans de la glace pilée puis immé-
diatement transportés au laboratoire dans une poche plastique
stérile.
2.3 Dispositif de traitement des organes
La peau est un tissu conjonctif fibreux, particulière-
ment élastique et résistant au broyage par les techniques habi-
tuelles.
Cette résistance est croissante en fonction de l'épais-
seur de la peau utilisée, celle-ci variable elle même d'un endroit
à l'autre du corps et d'une espèce à l'autre.

---

141
Ainsi, la peau de souris hairless mince et moins élas-
tique sera plus facile à broyer que la peau de rat atrichis ou
de l'espèce humaine.
Par ailleurs, l'absence sur le marché de dispositifs
_ppropriés au broyage et à l'homogénéisation d~ la peau nous a
conduiT à utiliser de~ dispositifs en série pour obtenir un ho-
mogénat satisfais~nt.
Ces dispositifs oui entrent dans le Tableau VI
de notre schéma VIIpag€l23 concernent ,-.ré<::is"ment la préparation
des homogénats cutanés et comportent" :
hachage :
- une oaire de ciseaux
- un mini-har.hoir KRUB à dOllbles couteaux rotatifs, 3 vitesses
homogénéisation :
- un homonénéisateur POTTER à vitesse variable maxi 1 500 tours-mm-l
- un broyeur nisnerseur GAR~LAR à vitesse variable, maxi 1 500
tours-mm-l
Le rein étant un organe facile à broyer, le passaoe
au mini-hachoir KRUB lors de la préparation des homogénats rénaux
est juaé inutile et supprimé.
Remarque :
La multiplication, du fait de ces dispositifs en ser~e,
des effets mécaniques exercés sur les tissus au cours de la pré-
paration des homoqénats constitue une source de développement
de chaleur et pourrait comporter un certain risque de dénatura-
tion de l'enzyme.
Cependant, dans nos conditions de travail (bac de
qlace et chambre froide à + 4° C), ce risque est estimé minime.
2.4 Composition des milieux liquides de travail
Ces milieux liquides dits de travail sont des solutions
de composition définie compatibles à la vie des organelles et
facteurs cellulaires. Leur emploi est une des caractéristiques
des études biologiques in vitro.
Dans notre présente étude, ces solutions sont de 3
types :
- la solution de survie et de rinçage des organes prélevés (éta-
pes II et IV du schéma VII §B3.1)
- la solution d'homogénéisation (étape IX)
- la solution substrat (étape XI) .
Les compositions respectives de ces milieux liquides
sont consignés dans le tableau ci-après :

---

142
TABLEAU XI
Solutions de travail
Milieu liquide aqueux
composition
Solution de rinçage
sucrose isotonique
0,25
M
(solution 1)
Solution d'homogénéisation
sucrose isotonique
0,25
M
(solution 2)
Tris
0,25
M
HCl 0,2 N q.s.p. pH 7,20
MgC1
0,002 M
2
Solution substrat
solution aqueuse d'IDC à
-1
(solution 3)
2 000 pg.ml_ l
soit 5,665 uM.ml
Remarque :
Les solutions de travail dans ce paragraphe excluent
celles utilisées dans le traitement et l'analyse des échantillons
biologiques ; ces dernières faisant partie du contexte analytique.
2.5 Préparation des homogénats entiers cutanés de souris et de
rat.
L'étude du métabolisme cutané de l'IDC chez la souris
et le rat est réalisée chez 3 lots randomnisés de la souris hair-
less et de 2 lots de 4 rats atrichis.
Dans tous les lots, les animaux doivent être en bon
état physique apparent et le poids moyen par lot tourne autour de
18 grammes pour les souris hairless et 210
grammes pour les
rats atrichis.
Les animaux une fois sacrifiés par dislocation cervi-
cale (149), la peau est rapidement prélevée au niveau du dos et
du flanc de l'abdomen et plongée dans la solution de rinçage
(Tableau
XI
, solution 1) maintenue à + 4° C dans un bac
de glace pilée. Les instruments de dissection de même que les mi-
lieux liquides sont au préalable refroidis et conservés à + 4° C.
Après extraction soigneuse des parties adipeuses, mus-
culaires et des capillaires sanguins notamment chez le rat, les
échantillons sont rincés dans du sucrose en solution puis essorés
sur papier absorbant.
Une quantité prec~se et suffisante de peau est déter-
minée par pesage de telle façon que lors de l'incubation, chaque
tube en contienne 250 milligrammes.

---

143
La peau dans un bocal plongeant dans de la glace pilée
est alors découpée en petits fragments en chambre froide à + 4 0 C
avant d'être figée à -
18 0 C pendant 20 minutes. Au bout de ce
temps, elle est soumise au hâchage en chambre froide à l'aide d'un
mini-hâchoir (cf. § C.2.3, P.140
) durant 120 secondes. Le tissu
ainsi hâché présente un aspect fibreux et a tendance à se ramas-
ser en boule. Démêlé à l'aide de coups de ciseaux, il est alors
broyé à 1 500 tours-minute-l.
Le tissu dans de la glace pilée, le broyage a lieu
dans du milieu d'homogénéisation définie au paragraphe précé-
dent, de volume équivalent au poids du tissu.
La soupe ainsi obtenue (broyat) sans fragment cutané
dans le cas de la peau de souris est centrifugée à faible vitesse
1 750 g dans un appareil réfrigéré à + 4 0 C (mini-fuge 2 Heraeus
Christ)
pendant 10 min.
Remarque
Dans le cas de la peau de rat, le broyat obtenu présente
quelques rares grumeaux persistants de tissu qu'on élimine après
centrifugation.
Le broyat centrifugé est recouvert d'un anneau superfi-
ciel de graisse blanchâtre qu'il est aisé de retirer à l'aide
d'une spatule de verre.
Le surnageant recueilli est homogénéisé durant 120 se-
condes au POTTER, dans un cylindre de verre à une vitesse de rota-
tion du piston de 1 500 tours-minute-l.
L'homogénat entier obtenu est de nouveau centrifugé
durant la minutes à 2 000 g sous réfrigération (+4 0 C) avant d'être
utilisé dans l'étude métabolique comme source d'enzymes.
2.6 Préparation de l'homogénat entier cutané humain.
La préparation de l'homogénat entier de peau humaine
est une des manipulations les plus difficiles. En effet, le fait de
ne pas toujours prévoir à l'àvance le jour et l'heure exacts du
déroulement des actes chirugicaux, nous a souvent laissé dans un
état de relative impréparation en ce qui concerne la préparation
de l'homogénat.
Ainsi, le moment variable de récolte des prélèvements,
tantôt la matinée, tantôt le soir en fin de semaine, nous a sou-
vent obligé de soumettre les prélèvements à des temps de congé-
lation de durée variable, avant qu'ils ne soient traités. La con-
gélation est obtenue en coulant sur la poche plastique fermée
contenant l'organe de la neige carbonique sous pression; l'or-
gane ainsi figé est conservé à -18 0 C.

---

144
Far ailleurs,
la peau humaine est un tissu résistant
au broyage, particulièrement élastique et à derme épais. Lors du
broyage, elle se laisse facilement prendre en boule malgré les
étapes préalables de découpage, de lacérage et de hâchage.
Pour minimiser cet inconvénient pouvant constituer un
certain risque d'irreproductibilité du degré d'extraction de
l'enzyme, nous avons dû soumettre les fragments cutanés humains
à deux fois 20 minutes de congélation pour les figer. Par ailleurs,
nous avons tenu d'observer la plus grande rigueur dans l'exécution
des temps et mouvements du protocole expérimental.
Traitement des prélèvements de peau humaine
Les fragments de peau humaine frais ou décongelés sont
d'abord débarrassés de leur amas de graisse et de fibres conjonc-
tives à
l'aide d'un scalpel à lame neuve. Cette étape demande
une certaine patience et est réalisée en chambre froide à + 4 0 C.
La peau ensuite plongée dans du sucrose en solution 0,25 M est
maintenue à + 4 0 C et rincée jusqu'à l'élimination de toute trace
de sang. Essorés sur papier absorbant, pesés et débités en frag-
ments plus petits, les fragments de peau rincés et essorés une der-
nière fois,
sont figés 20 minutes à ~ 18 0 C et hâchés durant 180
secondes er. chambre froide
(mini-hâchoir, cf. C.2.3 p. 140 ). Le
hâchis ainsi obtenu est de suite placé 20 minutes dans le congé-
lateur
(- 18 0 Cl.
Un volume de solution froide
(+ 4 0 Cl
d'homogénéisa-
tion égale à deux fois le poids initial du tissu, est ajouté à
la préparation refroidie dans de la glace,
l'ensemble est soumislO min.
à broyage
(broyeur disperseur cf. §C.2.3 p. 140 1 à la vitesse de
1 500 tours-minute-l. Le broyat constitué est décanté pour élimi-
ner les rares petits fragments persistants puis centrifugés 10 min.à
1 750 g dans un appareil réfrigéré à + 4 0 C (minifuge 2 Heraeus
Christ) .
On peut alors affiner au POTTER (cf. § C.2.3 p. 140
1 à
1 500 tours-minute-l,
l'homogénéisation du surnageant de centri-
fugation recueilli, débarrassé de son anneau blanchâtre super-
ciciel de graisse.
Comme pour la souris et le rat, l'homogénat entier
cutané humain subit une dernière centrifugation à 2 000 g durant
10 minutes sous réfrigération ; le surnageant final ainsi obtenu
constitue la solution d'enzymes.

---

145
D. ESSAIS PRELIMINAIRES à l'ETUDE IN VITRO du METABOLISME de l 'IDC
chez la SOORIS RAIRLESS, le RAt ATRICHIS et l'ESPECE HUMAINE
1. Biotransformation in vitro chez la souris de l'IDC
Influence du pA d'lncubatlon et de la temperature
La biotransformation de l'IOC marqué aux isotopes radioactifs
par des cellules rénales de souris est rapportée dans la littérature à
partir d'un modèle de souris Swiss (153) , et a également été confirmée
par des procédés utilisant un homogénat et une enzyme purifiée (151).
L'étude présentée ici de l'influence du pH d'incubation et de
la température sur la biotransformation in vitro de l'IOC est menée à
partir d'un homogénat rénal de souris hairless, après que nous ayons
vérifié dans les mêmes conditions expérimentales que la souche Swiss
présente bien l'activité désaminas4que décrite dans la littérature.
1.1. Préparation de l'homogénat entier rénal de souris
Les animaux sacrifiés par dislocation cervicale, les reins
sont aussitôt prélevés et plongés dans le milieu de survie, sucrose
0,25 M à + 4°C de température.
Soigneusement nettoyés et débarrassés de leur capsule
surrénale, rincés, essorés, pesés, ils sont découpés en petits morceaux
de façon à vider le bassinet, puis rincés de nouveau dans du sucrose.
Dans la glace pilée, les morceaux de reins sont alors soumis
à l'action du broyeur-disperseur (c.2.3. page 140) en milieu tris-HCl
(0,05 M pH 7,20) - MgC1
(0,002 M) de volume équivalent au poids
2
initial des organes.
Le broyat est centrifugé 5 minutes à 1750 g sous réfrigération
à + 4°C ; le surnageant obtenu, après élimination à la spatule de verre
de l'anneau blanchâtre superficiel de graisse, est homogénéisé au Potter.
L'homogénat entier ainsi obtenu, après une nouvelle centrifu-
gation à + 4°C pendant 10 minutes 2000 g, est alors prêt à l'emploi.

---

146
1.2. Détermination de la zone optimum de pH d'activité
de la cytidine désaminase rénale de souris
La plupart des enzymes présentent un pH optimum caracté-
ristique, auquel leur activité atteint une valeur maximum. Au-dessus
ou au-dessous de ce pH, l'activité de l'enzyme diminue. Cependant,
des facteurs nombreux et complexes peuvent intervenir dans la relation
entre le pH et l'activité enzymatique. Le comportement acidobasique de
l'enzyme étant un des éléments déterminants, la courbe d'activité en
fonction du pH varie avec la concentration en substrat.
Pour notre part, nous avons simplement cherché à déterminer
à une concentration donnée un intervalle de pH dans lequel la réaction
in vitro de désamination de l'IOC par un homogénat tissulaire entier
pourrait atteindre des activités proches des valeurs maximales.
Protocole expérimental
La réaction de désamination de l'IOC à 37°C, bain-marie, par
l'homogénat entier rénal de souris est mesurée au bout de 90 minutes à
trois points de pH différents; 6,00 - 7,20 - 9,00.
La réaction pour chaque point est réalisée en dOuble par
incubation de 2,832 ~moles d'IOC en présence d'une quantité identique
d'enzyme.
L'introduction du substrat dans le milieu d'incubation est
pratiquée par injection au centre de l'homogénat. à l'aide d'une
micropipette de précision convenable. Les tubes à incuber, bouchés,
sont agités par retournement avant d'être" placés sur portoir au
bain-marie.
Ci-dessous, la composition du milieu d'incubation pour
chaque pH
Tube
1
2
3
4
Solution enzyme a (ml)
0,250
0,250
0,250
0,000
Solution d'IDeb
(ml)
0,000
0,500
0,500
0,500
Solution tampon C
(ml)
4,750
4,250
4,250
4,500
a
=
Homogénat 2000 g à 1000 g de tissu par ml
b
=
Solution aqueuse d'IOC à 2000 ~g.ml-l
C
=
Solution tris-HCl, MgC1
(Cf. paragraphe C.2.4. page 141 •
2

---

147
Les tubes 1 et 4 correspondent à des tubes témoins
(témoin enzyme sans substrat et témoin substrat sans enzyme).
Au bout de 90 minutes d'incubation, la réaction enzymatique
est bloquée par rajout d'une solution méthanol-eau d'acide trichlora-
cétique à 10 %. Les échantillons sont traités conformément au protocole
décrit dans le paragraphe 0.1.1. page 125, puis analysés par H.P.L.C.
(§ B. 3 •4. et § B. 3 . 5. page 127 et 135 ) .
Résultats
Les résultats consignés dans le Tableau
XII
ci-après,
sont exprimés en microgrammes (~g) et micromoles (~M) d'IDU pour
0,250 g de tissu rénal de souris.
TABLEAU
XII
1DU Métabolite
~g
~M
pH
6,00
344,00
0,972
± 5,00
± 0,014
pH
7,20
522,00
1,475
± 3,50
± 0,010
pH
9,00
106,125
0,300
± 7,25
± 0,021
Les valeurs contenues dans ce tableau correspondent chacune
à la moyenne des deux valeurs expérimentales associée à l'écart type;
les incubations ayant été réalisées en double

---

148
Discussion
L'examen des résultats, comme le montre le graphique nO Il ,
fait apparaître que l'activité optimale de l'enzyme rénale se situe
dans la zone de pH comprise entre 6,00 et 8,00 dans les conditions
d'incubation définies dans le protocole expérimental, le point
culminant se tenant à pH 7 environ.
Dans la suite des essais préliminaires et dans l'étude
métabolique proprement dite, nous nous placerons dans cette zone
pour suivre la biotransformation de l'IDC.
1.3. Détermination de l'effet de la température sur l'activité
in vitro de la cytidine désaminase rénale de souris
La vitesse de la plupart des réactions enzymatiques augmente
avec la température dans l'intervalle de température où l'enzyme reste
stable et conserve sa pleine activité. Aussi, pour beaucoup d'entre
elles, leur QI0 varie d'une enzyme à une autre selon l'énergie d'acti-
vation de la réaction catalysée.
Dans le présent paragraphe, l'effet de la température sur la
réaction de désamination de l'IDe est testé de deux manières différentes
en utilisant comme source enzymatique un homogénat rénal de souris
hairless.
Protocole expérimental
Dans un premier cas, 2000 ~g d'IDC sont incubés en présence
de 100 mg de tissu rénal durant 2 h et 4 h dans des bains-marie réglés
à
15°e, 25°C, 37°C et 42°C.
Dans un second cas, nous avons cherché à établir la courbe
d'inactivation thermique de l'enzyme. L'homogénat entier rénal de
souris (100 mg) est au préalable chauffé durant 10 minutes à 60°C,
80°C et 100°C dans un bain-marie avant d'être utilisé.
L'homogénat de rein de souris est préparé comme décrit
précédemment (paragraphe D.l.2. page146). L'incubation est réalisée
parallèlement à des témoins (enzyme et substrat) et le volume total
du milieu réactionnel final dans chaque tube est de 15 ml. Les essais
sont faits en double.

---

149
Graphique n° 11
ACTIUITE de li CYT. DESAft[NASE RENALE de SOURIS: EFFET du pH
8
2
4
6
8
18
12
14
pH
v0:: Vitesse d'apparition du métabolite (IDU) exprimée en IJmoles
d'IDU produit par tube d'incubation (5 ml) pendant 90 minutes
et par 250 mg de tissu à pH x.

---

TABLEAU
XIII
Effet de la température d'incubation sur la désamination in vitro au niveau rénal
de l 'IDC chez la souris
Valeurs expérimentales en ~moles d'IOC résiduelle (IOCr) ou de métabolite (IOU) par 100 mg de tissu rénal.
Incubation de 5,665 ~moles d'IOC à 37'C 1 tris pH 7,20, durant 2 h et 4 h.
Température
4°C
15°C
25°C
37°C
42°C
5,520
3,768
1,552
0,619
IOCr _
5,495
3,674
1,516
0,439
-
M±S.D.
5,51 ±0,012
0
3,721 ± 0,047
1,534 ± 0,018
0,529 ± 0,090
#
0
U)
....
2 h
0,671
2,247
IOU
-
#
0
0,663
2,183
M±S.D.
0,667 ± 0,004
2,215 ± 0,032
3,017 ± 0,194
3,828 ± 0, 175
5,483
3,326
1,134
0,515
IOCr _
5,412
3,080
1,020
0,363
---- M±S.O. 5,488 ± 0,038
3,203 ± 0,123
1,077 ± 0,057
0,439 ± 0,076
#
0
4 h
0,924
2,949
4,486
3,277
IOU
-
#
0
0,878
2,851
4,058
2,927
M±S.D.
0,901 ± 0,023
2,900 ± 0,049
4,272 ± 0,214
3,102 ± 0,175

---

151
Graphique nO 12
ACTIUITE de I~ CYT.DESANINASE REN.de SOURIS:EFFET de I~ TENP
Vo : Vitesse d'apparition du métabolite (JOU) ou de disparition du
substrat (IDC) exprimée en IJmoles de produit produit ou trans-
formé pendant 2 heures ou Il heures par 100 mg de t issu rénal
dans le milieu d'incubation (5 ml).
Evolution de la disparition d'IDC dans le milieu réactionnel
respectivement pendant 2 heures et Il heures d'incubation.
Evolution de la production d'IDU dans le milieu réactionnel
respectivement pendant 2 heures et 1+ heures d'incubation
(5 ml).

---

TABLEAU
XIV
Dénaturation thermique de l'activité de la désaminase rénale de souris
vis-à-vis de l'IDe
Valeurs expérimentales en ~moles d'IOC résiduelle (IOCr) ou de métabolites (IDU, lU) par 100 mg de tissu rénal.
Incubation de 2,832 ~moles d'IOC à 37°C; tris pH 7,20 ; 1 h.
Température d'exposition
de
l'enzyme
4°C
GOoe
80°C
100° e
avant incubation
C\\J
If)
..-!
0,440
0,683
2,085
2,632
IOCr
-
0,324
0,664
2,020
2,568
M± S.D.
0,382 ± 0,058
0,673
± 0,010
2,052 ± 0,032
2,600 ± 0,032
2,310
1,935
0,044
IDU
-
2,138
1,921
0,041
14 ± S.D.
2,224 ± 0,086
1,928 ± 0,007
0,042 ± 0,002
#- 0
0,073
lU
0,051
M± S.D.
0,062 ± 0,011
#
0
#
0
# 0

---

153
Graphique n° 13
CYT.DESA"INASE REM.de SOURIS:DENATURATION THER"IQUE
U3.
o
3.
2.
Z.
1.
1.
C3
1
1
8
28
48
68
S8
le8
128
148
TE"PERAT.(O 'C)d'EXPOSITION PREALABLE de l'EHZY"E
Activité enzymatique résiduelle exprimée sous forme de vitesse,
en ~moles de métabolite (!DU ou lU) produit ou de substrat
ODC) transformé pendant
1 heure dans un milieu réactionnel
contenant 100 mg de tissu pré-exposé en bain-marie à la tempé-
rature T.
Courbes
respectives
de
ralentissement
de
la
production
d'IDU et d'lU en fonction de la température de pré-exposition
de l'enzyme.
C z : Courbe d'accroissement de la quantité de substrat non transformé
en fonct ion de la températ ure de pré-exposit ion de l'enzyme.

---

154
Après blocage de la réaction enzymatique en temps voulu
par rajout d'acide trichloracétique en solution la % méthanol-eau
(50/50), les substances sont, par la même occasion, extraites par
précipitation des protéines et analysées par H.P.L.C. après
neutralisation des solutions par la potasse 10 N.
Résultats
Les résultats exprimés en micromoles d'IDU métabolite
par 100 mg de tissu sont consignés dans les Tableaux XIII
et XIV.
Nous faisons remarquer que lors de ces essais préliminaires,
nous n' avons pas systématiquement recher·ché des conditions de
saturation en substrat. C'est la raison pour laquelle ici nous avons
testé deux quantités différentes de substrat, 2000 ~g et 1000 ~g,
dans le milieu réactionnel, soit 5,665.10-6 M et 2,832.10-6 M.
Les valeurs contenues dans ces tableaux correspondent
chacune à la moyenne tirée des essais en double et associée à l'écart
type arithmétique.
Discussion
L'observation des résultats présentés dans le Tableau
montre, que ce soit au bout de 2 h ou de 4 h, que la température
d'incubation exerce un effet accélérateur sur la vitesse de
désamination de l'IOC in vitro par l'homogénat entier rénal de
souris et ce, dans une gamme de température allant de 15°c à 45°C.
Par ailleurs, la courbe d'inactivation (Graphique n O l3)
indique que l'enzyme intervenant dans la réaction de désamination
de l'IOC conserve son activité jusqu'à une température de 60°c
au-delà de laquelle intervient une dénaturation rapide ; et c'est
bien là une des caractéristiques de la catalyse enzymatique.

---

155
2. Biotransformation rénale ou cutanée in vitro de l'IDC
chez la sourlS halrless, le rat atrlchlS et l'espêce humaine
Dêtermlnation de la quantltê utlle de tlSSU
L'influence du rapport des concentrations enzyme/substrat
sur la vitesse de réaction est un des aspects propres à la catalyse
enzymatique. En effet, les réactions faisant intervenir les enzymes
comme catalyseurs se distinguent des réactions chimiques classiques
par le fait que ces premières admettent le phénomène de saturation
de l'enzyme par le substrat.
La vitesse de réaction est proportionnelle à des
concentrations du substrat lorsque cette dernière est très basse
(réaction de premier ordre) .
Lorsque la concentration du substrat augmente par rapport
à la concentration de l'enzyme, la vitesse ne s'accroit pas dans
les mêmes proportions 1 la réaction est alors d'ordre mixte.
Aux fortes concentrations de substrat, la vitesse devient
constante, indépendante de cette concentration, la réaction est
d'ordre zéro; l'enzyme est alors saturée par son substrat.
Dans le présent paragraphe, nous ne nous intéressons pas à
l'évolution des activités enzymatiques en fonction de la concentration
du substrat, mais plutôt à celle en fonction de la concentration de
l'enzyme. Ceci est une autre manière de caractériser la réaction
enzymatique.
La détermination de la quantité utile de tissu à l'étude
in vitro de biotransformation de l'IOC est menée chez les trois
modèles retenus : souris hairless, rat atrichis et espèce humaine.

---

156
2.1. Détermination chez la souris hairless et le rat atrichis
de la quantité de tissu rénal ou cutané utile à l'étude
in vitro de la désamination de l'IDe
2.1.1. Tissu rénal
Protocole expérimental
Pour la souris hairless, l'essai est mené à partir de
deux lots randomisés de 6 animaux correspondant chacun à un poids
moyen de 18,30 ± 1,20 g et de 18,55 ± 1,35 g.
Des quantités croissantes d'homogénat entier de rein de
souris hairless (10 2 mg, 2.10 2 mg, 5.10 3 mg, 2.10 3 mg), préparé
conformément au paragraphe D.l.l. page 125, sont incubées avec une
quantité fixe d'IOC (5,665 ~M) dans un volume final de 10 ml.
L'ajustement à ce volume dans tous les tubes est possible grâce à
la solution tampon tris-HCl, MgC12 (Cf. solution 3, paragraphe c.2.4.,
page 141) .
Dans le cas du rat atrichis, l'étude porte sur un seul lot
de 4 animaux et de poids moyen 210,85 ± 3,40 g. ~
Les quantités de tissu rénal de rat atrichis testées sont
identiques à celles retenues pour la souris hairless ; la quantité
de substrat étant maintenue à 2.103 ~g pour les deux espèces,
l'incubation est réalisée en double dans un bain-marie à 37°C durant
60 minutes. Le contenu des tubes est ensuite traité par la solution
d'acide trichloracétique 10 % (Cf. § B.3.2. page 124) , les substances
sont analysées et quantifiées par chromatographie liquide haute
performance (Cf. § B.3.4. et § B.3.5. page 127 ex 135).
Résultats - Discussion
Les résultats, exprimés en micromoles (souris) ou nanomoles
(rat), sont consignés respectivement dans les Tableaux
XV
et XVI
Sur les graphiques n014,15et16,Vsont représentées les courbes
correspondantes chez la souris hairless et le rat atrichis.
L'observation des valeurs présentées dans le Tableau XV
et graphique nO 14 fait apparaitre de façon nette que la production
de métabolite en fonction de la quantité de tissu rénal chez la souris
hairless suit une progression linéaire jusqu'à la concentration de
500 mg de tissu par tube d'incubation.

---

157
Chez le rat atrichis au niveau rénal, cette linéarité
couvre toute la zone de concentrations de tissu testée d'après
l'observation graphique et se trouve confirmée par la signification
de la régression.
Nous pouvons donc retenir qu'en utilisant une quantité de
tissu rénal située dans la fourchette de la à 500 mg chez les deux
espèces, nous nous trouvons à coup sUr dans la zone optimale de
linéarité. Par ailleurs, du fait de l'activité importante du rein
de souris, 100 mg de tissu pourraient constituer une quantité idéale
pour la suite de l'étude si l'on veut espérer une saturation de
l'enzyme au cours de l'étude de Km.

---

TABLEAU
XV
Détermination chez la souris hairless male de la quantité de tissu rénal
utile à l'étude in vitro de la désamination de l'IDC
Résultats * expérimentaux en ~moles de métabolites (IDU, lU)
Incubation à 37°C, tris-HCI pH 7,20 0,05 M ; 1 h, de 5,665 ~M soit 2.103 ~g d'IDe
Tissu (mg)
50
200
500
1000
2000
co
l!l
....
0,696
1,390
2,841
3,695
4,300
IDU _
0,674
1,350
2,793
3,629
4,240
-"M ±5.D.
0,685 ± 0,011
1,370 ± 0,020
2,817 ± 0,024
3,662 ± 0,033
4,270 ± 0,030
lU
0,032
0,066
0,231
0,514
0,712
0,026
0,052
0,215
0,494
0,688
M±5.0.
0,029 ± 0,003
0,059 ± 0,007
0,224 ± 0,009
0,504 ± 0,010
0,700 ± 0,012
* Les valeurs expérimentales, dans ce tableau, proviennent d'un lot unique
chaque essai ayant été
effectué en double.

---

-
-
- - - - - - - - - - - -
159
Graphique n° 14
DESA"INATION RENALE IN UITRO de l'IDC chez SOURIS HAIRLESS '
Déter.ination de la quantité utile de tissu; Uo = F(Q).
8
588
1888
1599
v0: Vitesse d'apparition du métabolite (IDU ou lU) exprimée en
-1
j.Jmoles.h
par tube d'incubation et
pour chaque quantité de
tissu testée.
Cl
courbe de production du métabolite 1 = IDU.
C
Courbe de production du métabolite 2 = lU.
2

---

TABLEAU
XVI
Détermination chez le rat nu atrichis mâle de la quantité de tissu rénal
utile à l'étude in vitro de la désamination de l'IDC
Résultats en nanomoles d'IDU : incubation à 37°C: 20 minutes de 0,708 ~moles d'IOC
Tissu (mg)
120
240
480
720
960
0
<D
.-<
28,661
IDU
16,162
49,885
65,204
81,700
....---
14,912
27,837
48,985
64,740
80,900
M± S.O. 15,537 ± 0,625
28,249 ± 0,412
49,435 ± 0,450
64,972 ± 0,232
81,300 ±0,400
Droite de régression
y
=
0,07727
X + 8,9543
n = 10
r 2 = 0,996
Constantes
50
t
Signification
a = 0,077
0,0003
44,63
P < 0,001
b = 8,954
0,280

---

161
Graphique nO 15
DESAMINATION RENALE lM UITRO da l'IDe chaz RAT ATRICHIS :
O~ter_ination de la quantit~ utile de tissu; Uo = Fig).
8
288
488
688
888
1888
1288
1488
1688
TISSU REHAL: 1 -9 )
Va : Vitesse
d'apparition
du
métabolite
(JOU
ou lU) exprimée
en
~moles.h-1 par tube d'incubation et pour chaque quantité de
tissu testée.

---

162
2.1.2. Tissu cutané
Protocole expérimental
La détermination de la quantité utile de tissu cutané à
l'étude in vitro de biotransformation de l'IDC est effectuée chez
la souris hairless à partir de deux lots randomisés
de 6 animaux
de poids moyen 18,30 ± 1,20 g (Lot 1) et 18,55 ± 1,35 g (Lot 2).
Chez le rat atrichis, la peau est prélevée du même lot
précédent de 4 animaux ayant servi à la préparation de l'homogénat
rénal et de poids moyen 210 ± 3,40 g.
Les animaux sacrifiés par dislocation cervicale, la peau
du dos et du flanc est rapidement extraite à la suite des reins et
conservée dans du sucrose 0,25 M préalablement refroidi puis placé
avec l'organe à -
18°C le temps de préparer l'homogénat rénal.
Au moment de constituer l'homogénat cutané, la peau est traitée
comme il a été décrit au paragraphe C.2.5. page142
Les homogénats entiers cutanés de souris hairless et de
rat atrichis sont ensuite incubés dans des proportions croissantes
en présence de 2.10 3 ~g de substrat IDe. Les quantités de tissu
cutané testées correspondent aux valeurs 10 2 , 5.10 2 , 2.10 3 et
3.10 3 mg pour la souris hairless.
Pour le rat atrichis, nous avons testé une ser~e de valeurs
plus fortes que celles ci-dessus (10 3 , 1,5.10 3 , 3.10 3 , 4.10 3 , 5.10 3 )
du fait qu'apparemment au niveau rénal, l'homogénat de souris a révélé
une activité enzymatique plus élevée que celle du même tissu chez le
rat atrichis.
Les échantilions en double sont incubés dans un bain-marie
à
37°C pendant 60 minutes, la réaction est bloquée par rajout d'un
volume d'acide trichloracétique 10 % (solution méthanol-eau 50/50)
équivalent au volume utilisé de l'homogénat cutané. Le traitement des
échantillons, l'analyse et la quantification des substances par H.P.L.C.
se font comme décrit aux paragraphes B.3.2. page 124, B.3.4 page127.et
B. 3.5. page 13 5.) .

---

163
Résultats - Discussion
Les résultats sont consignés dans les Tableaux
Les valeurs, dans ces tableaux, sont exprimées en ~moles de
métabolite pour la souris et en nanomoles pour le rat.
Sur les deux graphiques, l'échelle des ordonnées (Va)
est exprimée en nanomoles de métabolites.h- 1 par tube d'incubation
et pour chaque quantité de tissu testée.
L'analyse des résultats montre clairement qu'aussi bien
chez la souris hairless que chez le rat atrichis, la zone commune
de linéarité peut être considérée comme comprise entre la et 500 mg
de tissu cutané.
Nous retiendrons 250 mg de tissu pour la suite de l'étude
du métabolisme cutané chez ces deux espèces, l'activité désaminasique
de la peau étant visiblement moins importante que celle du rein.
La quantification du métabolite 2 (lU) de l'IDC, effectuée
ici tant au niveau
rénal que cutané chez la souris hairless, n'entre
cependant pas dans notre souci majeur; l'objectif dans ce paragraphe
étant de déterminer la quantité de tissu rénal ou cutané permettant
de contrôler de la meilleure manière l'étape 1 de désamination au
cours de la bioconversion in vitro de l'IDe.

---

TABLEAU XVII
Détermination chez la souris hairless mâle de la quantité de tissu cutané
utile à l'étude in vitro de la désamination de l'IDC
Résultats en pmoles de métabolites (IDU, lU).
Incubation à 37°C, tris-HCI pH 7,20 0,05 M ; 1 h, de 5,665 umoles d'IDe
Tissu (mg)
100
500
2000
3000
<:t
<J:)
0,020
0,085
0,269
0,328
r i
IDU
0,015
0,060
0,138
0,200
M± S.D.
0,017 ± 0,002
0,072 ± 0,002
0,203 ± 0,065
0,264 ± 0,064
ru
0,050
0,082
0,095
0,131
0,030
0,050
0,062
0,092
M± S.D.
0,040 ± 0,010
0,066 ± 0,016
0,078 ± 0,016
0,111 ± 0,019
* Les valeurs expérimentales, dans ce tableau, proviennent de 2 lots distincts et correspondent chacune à
la moyenne des essais en double.
Une moyenne M globale est ensuite calculée et associée à la déviation standard.

---

165
Graphique n° 16
DESA"INATIDN CUTANEE IN UlTRa dA l 'IDC cho. SOURIS HAIRLESS ,
Oéter~ination de la quantité utile de tissu; Vo = F(Q).
9
599
1999
1599
2989
2599
3989
3599
TISSU CUTANE
( ~9)
Vit esse
d' apparit ion
du
mét abolite
(mu ou lU) exprimée en
-1
nanomoles.h
par tube
d'incubation et
pour
chaque quantité
de tissu testée.
courbe de production du métabolite 1 = [DU.
Courbe de production du métabolite 2 = lU.

---

TABLEAU
XVIII
Détermination chez le rat nu mâle atrichis
de la quantité de tissu cutané utile à l'étude in vitro de la désamination de l'IDC
Résultats en nanomoles d'IDU
Incubation à 37°C,
1 h.3ü de 1,416]Jmoles d'IOC

---

167
Graphique n° 17
DESA"IHATIOH CUTAHEE IN VITRO de l'IDC chez RAT ATRICHIS'
D4ter~ination de la Quantit4 utile de tissu i Vo = F(9).
1888
Z8BB
3888
Vitesse
d'apparition
du
mét abolit e (JOU ou lU) exprimée en
-1
nanomoles.h
par tube d'incubation et pour chaque quantité
de tissu testée.

---

168
2.2. Détermination de la quantité de tissu cutané utile
à l'étude in vitro de la biotransformation de l'IDe
chez l'espece humaine
Protocole expérimental
La détermination de la quantité de tissu cutané humain
utile à l'étude in vitro de la biotransformation de l'IDC est
réalisée sur des homogénats entiers préparés à partir de prélèvements
de peau provenant de trois sujets de sexe féminin.
Les fragments de peau frais ou décongelés sont nettoyés
dans du sucrose 0,2S M après extraction des parties adipeuses et
musculaires. La préparation de l'homogénat cutané est réalisée
d'après le protocole décrit au paragraphe C.2.6. page143 et contient
O,SO g de tissu par ml.
Pour la détermination de la quantité utile de tissu, des
quantités croissantes d'enzyme tissulaire sont testées par incubation
60 minutes au bain-marie à 37°C avec une quantité croissante de
substrat IDC, solution à 2.10 3
g.ml- 1 , soit S,66S
M.ml- 1 .
•
La composition du milieu d'incubation par tube (S ml) est
donnée dans le tableau suivant, les essais sont réalisés en double
et chez trois sujets distinctement.
Tubes
1
2
3
4
5
6
Tissu cutané
O,OS
0,10
O,SO
1,00
l,Sa
2,00
(ml)
IDC substrat
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
(ml)
Tampon
3,9S
3,90
3,SO
3,00
2,SO
3,00
tris-HC1, Mg C1 2
(ml)

---

169
A l'expiration du délai d'incubation, la réaction enzymatique
est aussitôt stoppée par rajout de 0,50 ml d'une solution froide
méthanol-eau (Sa/50) d'acide trichloracétique la %.
Le traitement des échantillons en vue de l'extraction des
composés est réalisé d'après le mode opératoire décrit au paragraphe
B.3.2. page 124.
L'analyse et la quantification des substances sont faites par
H.P.L.C.
(paragraphes B.3.4. page 127 et B.3.5. page.135)
; les résultats
sont présentés dans le Tableau
XIX
et schématisés sur le graphique nO
Résultats - Discussion
Les valeurs expérimentales de Va consignées dans le Tableau
semblent, à l'observation directe, évoluer de façon linéaire dans la
zone des concentrations de tissu considérée. Cette tendance, plus
évidente sur la représentation graphique, est encore confirmée par
l'étude de régression linéaire menée à partir des résultats obtenus
chez les trois sujets, la valeur de t prenant une liaison significative
au risque de ~ < 0,001, pour l'étape 1.
Afin de pouvoir établir pour l'ensemble du modèle humain
si possible une valeur unique de tissu cutané, moyenne à partir des
trois sujets, de la quantité utile à l'étude in vitro de la
désamination de l'IDe, une comparaison des trois régressions linéaires
a été envisagée afin de déterminer si les différences observées entre
elles sont significatives, et si tel est le cas, d'en déterminer
l'importance.
Sans donner ici non plus le détail des calculs, nous présentons
cependant dans le Tableau les données essentielles tirées de l'analyse
de covariance.

---

TABLEAU
XIX
Détermination de la quantité de tissu cutané utile à l'étude in vitro de la désamination de l'IDC
chez l'espèce humaine
, Valeurs expérimentales à partir de 3 sujets pris individuellement et exprimées en ~moles de métabolites
(IOC,IU).
Incubation de 5,665 ~moles d'IOC à 37°C; tris pH 7,20 ; 1 heure
Tissu (mg)
25
50
250
500
750
1000
-
Peau n° 1
0,107 ± 0,002
0,186 ± 0,005
0,850 ± 0,010
1 , 326 ± 0, 0 15
2 , 900 ± 0,006
3,400 ± 0,005
0
81 Peau n° 2 0,053 ± 0,004 0,093 ± 0,007
0,541 ± 0,006
0,700 ± 0,010
1,040±0,024
1,650 ± 0,045
r--
.....
Peau n° 3
0,166±0,002
0,216±0,028
0,474 ± 0,008
-
1,581 ± 0,012
2,291 ± 0,030
Moyenne
0,108±0,046
0,165±0,055
0,621±0,163
1,013 ± 0,313
1,840±0,781
2,447 ± 0,723
Régression
2
y
= 0,0024
X
+
0,010
r
= 0,995
n
= 6
t
= 28,28
P < 0,001
Peau n° 1
0,020 ± 0,005
0,033 ± 0,002
0,158±0,008
0,377 ± 0,001
0,471 ± 0,005
1,085 ± 0,003
~I Peau n° 2
0,036 ± 0,003
0,047 ± 0,002
0,052 ± 0,011
0,077 ± 0,009
0,109 ± 0,008
0,204 ± 0,010
Peau n° 3
0, 196 ± 0,001
0,203±0,023
0,232 ± 0,032
-
0,285 ± 0,004
Moyenne
0,084
0,159
0,094
0,078
0,147
0,076
0,227
0,150
0,288
0,147
0,644
0,440

---

171
E. EXPRESSION de l'ACTIVITE ENZYMATIQUE
,
Comme il a été rappelé par PANNATIER (1491, les résultats
des études de biotransformation in vitpo sont habituellement exprimés
en ~moles (~M) ou en nanomoles (nM) de produit formé par g de tissu
frais ou par mg de protéines microsomales et par unité de temps.
ceci dans la mesure où il est clairement défini que la réaction est
linéaire dans le laps de temps considéré pour la détermination
expérimentale de l'activité enzymatique.
Cependant, la peau est un tissu extrêmement lipidique et
bien que rapporter la quantité de métabolite, en unités molaires, à
des mg de protéines microsomales ou cytosoliques permet une meilleure
reproductibilité, nous avons estimé qu'en ce qui concerne l'activité
enzymatique cutanée du fait, d'une part des difficultés d'obtenir un
homogénat absolu principalement de la peau de rat ou humaine, et
d'autre part de la grande variabilité possible du taux de protéines
cutanées selon la localisation du site étudié et selon les individus,
une expression rapportée au g ou mg de tissu serait plus appropriée
parce que plus réaliste.
Nos résultats, par conséquent, sont exprimés en ~moles de
métabolites par 100 mg de tissu; l'expression en activité spécifique
n'intervient que dans l'essai de localisation cellulaire de l'enzyme
(Cf. paragraphe III.F.? page 207).
Cet essai étant mené chez la souris hairless au niveau rénal,
le dosage des protéines microsomales et cytosoliques a été réalisé
d'après la méthode colorimétrique de LOWRY ~ Coll.
(134) dont nous
donnons ici le principe.
Dosage des protéines selon LOWRY
Principe
Cette méthode est basée sur la formation d'un complexe coloré
entre le réactif alcalin cuivre-phénol et les restes tyrosines et
tryptophane protéiniques. La formation de ce complexe est directement
proportionnelle à la concentration en protéines dans une zone de 50 à
200 ~~ par ml.

---

172
La détermination quantitative des protéines rénales dans
le surnageant 100000 g, est conduite par comparaison à un standard,
l'albumine sérique bovine (ASB ou BSA).
Réactifs
Ces solutions sont énumérées ci-dessous et ne doivent pas
être préparées trop longtemps à l'avance.
- Solution 1 N d'hydroxyde de sodium.
- Réactif cuivré (pour 10 ml)
Solution 1 % de CuSO ••.•.•.•...••....••.•.•••• 0,1 ml
Solution 2 % de tartrate double de Na et de K•• 0,1 ml
Solution 5,S % (ou 2 % si anhydre)
de Na2C03, 10 H20 ..•••••••••••.••.•.....•.••.• 10,OOml
- Réactif de Folin-Ciocalteu : Solution 1 N.
Prise d'essai
- Solution de protéines
20 ~l
- Solution 1 N de soude
100 ~l
- Réactif cuivré
1000 ~l (préparation extemporané
Mode opératoire
Dans un tube à essais, 100 ~l de solution normale de soude et
1 ml de réactif cuivré sont ajoutés à chacune des dilutions de BSA (ou
de l'échantillon tissulaire). Après une brève agitation suivie d'un
repos de 10 minutes à température ambiante, 100 ~l de Folin 1 N sont
rajoutés l le mélange est obtenu immédiatement par agitation au Vortex.
Les tubes sont ensuite placés à l'obscurité durant 30 minutes.
La densité optique est mesurée au spectrophotomètre
(SP-S 100 UV/VIS UNICAM) à 750 nm pour les valeurs comprises entre
5 et 25 ~g de protéines et à 500 nm pour les valeurs au-delà de 25 ~g.
Une droite de calibration est ensuite construite à partir
des résultats obtenus.

---

173
Graphique n° 18
D~SAMINATION CUTAN~~ IN UITRO de l'IDC chez 1'~SP.~UMAIN~'
3.
OéterRination de la quantité utile de tissu; Uo = F(Q).
Uo
2.
2
1
1
8
288
Vitesse
d'apparition
du
métabolite (mu ou lU) exprimée en
-1
j..imoles.h
par tube d'incubation et pour chaque quantité de t is-
su testée.
courbe de production du métabolite 1 = mu.
Courbe de production du métabolit e 2 = lU.

---

174
Graphique n° 19
DOSACE DES PROTEINES par METHODE dQ LOYRY ,
.,.it. d' ,.Ii.,.ti." • 0.0 • F(".B.~
~
y: 9.99323387 X+ 9.89637498
r2.8.99~
/
8
25
58
75
188
125
158
175
2ge
225
258
ASB~icroG./~1
DOSACE do~ PROTEINES ~.r METHODE do LOYRY ,
Droite' da rdgre"ion y:.x+b ,et, y:ax forc4e par l'origine.
y : 8.88323387 X+ 8.88637498
Y' : 8.88323 X - 8.8898819
8
58
75
188
125
158
175
288
225
258
Asa
~icroG.I~1

---

175
Discussion
L'analyse des résultats obtenus avec la protéine de
référence CBSA) rapportés dans le Tableau
XX
et représentés
par la figure nO 19 , fait apparaître de façon nette que dans la
zone expérimentée la formation du complexe est directement
proportionnelle à la concentration en protéines. L'hypothèse nulle
pour l'ordonnée à l'origine étant acceptée, l'équation de cette
portion de droite est donnée par l'expression:
y
=
0,00323
x
+
0,00638

---

176
Construction de la droite de calibration
TABL EAU
XX
Densité optique de la BSA en fonction de la quantité
Dilutions (]J9. ml - 1)
0.0.
M
S.D.
0,034
0,037
12,50
0,025
0,034
0,005
0,036
0,040
0,084
0,093
25,00
0,063
0,078
0,014
0,060
0,092
0,189
0,175
50,00
0,237
0,184
0,025
0,155
0,164
0,337
0,354
100,00
0,362
0,346
0,009
0,340
0,340
0,507
0,541
200,00
0,744
0,643
0,040
0,595
0,827
Régression li néai re
y = a.x + b
r 2 = 0,998
n = 25
SD
Si gnifi cati on
a = 0,00323
0,001
t
=
107,131
b = 0,00637
0,021
P
NS
Régression forcée par l'origine
y = a.x
r 2 = 1
n = 25
SD
Si gn; fi cati on
a = 0,00323
0,001
t
4,79
p
<
0,001

---

177
F. METABOLISME RENAL IN VITRO de l'IDC
chez la SOORIS RAIRLESS et le RAT ATRICHIS
1. In troduct ion
La biotransformation in vitro ou in vivo des composés
halogénés de la désoxy-2'-cytidine est rapportée dans la littératur,
(154, 151, etc.. ) .
KRISS et Coti. (153) , par ailleurs, ont suivi la
distribution et le devenir de l'IOC au niveau des tissus chez la
souris et le rat à l'aide d'un traceur radioactif, le tritium,
à la suite de la parution des travaux de CRAMER et Coti.
(156) sur
des cellules de plusieurs organes de rat.
Toutes ces études ont montré que le rein présente une
activité métabolique importante vis-à-vis de l'IOC. Et c'est CREASE
qui, par la suite [151) , a réalisé chez la souris Swiss au niveau
rénal une purification de l'enzyme responsable, une nucléoside
désaminase susceptible de désaminer une large gamme de dérivés de
la cytosine.
Dans le présent paragraphe, nous tentons de vérifier chez
deux modèles sans poil, la souris hairless et le rat atrichis,
l'activité désaminasique de l'homogénat entier de rein avant d'ent~
r.
chez ces mêmes espèces, l'étude de l'activité enzymatique cutanée
dans la biotransformation in vitro de la iodo-5-désoxy-2'-cytidine.
substance à action antiherpétique.

---

178
2. Matériels et Méthode
Le métabolisme rénal in vitro de l'IDC est étudié chez la
souris hairless et le rat atrichis, espèces génétiques glabres.
Pour ce faire, nous avons tenté d'établir la cinétique de
désamination rénale et la détermination du Km et Vmax apparents.
Ensuite, nous avons mené une étude d'inhibition compétitive par la
cytidine de la désamination de l'IOC.
Enfin, nous avons cherché à définir,par un essai, la
localisation de l'enzyme rénale.
2.1. Animaux
L'étude est menée sur trois lots randomisés de 10 souris
mâles hairless, poids moyen par lot respectif: 18,15 ± 1,20 g -
18,50 ± 1,10 g -
18,30 ± 1,75 g, en provenance du Centre de Sélection
et d'Elevage des Animaux de Laboratoire (C.S.E.A.L.) du C.N.R.S. -
Orléans, France.
Chez le rat atrichis, l'étude est menée sur deux lots
randomisés de 6 animaux, poids moyen par lot respectif: 208 ± 2,25 g
et 211,20 ± 2,70 g, en provenance du Centre d'Elevage IFFA-CREDO -
St-Germain-sur-l'Arbresle, France.
Après réception, les animaux sont maintenus en contention
dans des cages à métabolisme et nourris ad libitum pendant une semaine
dans une pièce d'animalerie à 20°C, 50 à 60 % d'hygrométrie.
2.2. Produits et Réactifs Chimiques
Produits chimiques
Les poudres de iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IOC), de iodo-5-
désoxy-2'-uridine (IDU), de iodo-5-uracile (lU) sont des produits
Sigma et nous ont été fournies par OSI - Marseille, France, ou OSI -
Paris, France.

---

179
A réception, bien que ces produits soient dament étiquetés,
nous avons jugé non superflu de réaliser une série de contrôles
analytiques applicables en routine à toute matière première chimique :
essais d'identification, de pureté, etc.
(Cf. Chapitre B.l, page 106).
Ces produits, pendant toute la durée de l'étude, ont été tenus au
réfrigérateur (+ 4°C).
Toutes les pesées de poudres et réactifs sont réalisées à
la balance de précision (METTLER H 35 AR) •
Réactifs chimiques
Les poudres cristallines de sucrose et de chlorure de
magnésium ou microcristalline de tris (hydroxy-méthyl)-aminométhane,
comme les solutions d'acide chlorhydrique et de tampon phosphate
pH 7,20 prêt à l'emploi (ampoules titrisol), sont des produits MERCK
et nous ont été fournis par BAECKEROOT - Montpellier, France.
La conservation de ces produits a été faite d'après les
spécifications commerciales.
2.3. Dispositif de traitement des organes
et instruments analytiques
Le dispositif de broyage et d'homogénéisation est décrit
dans le paragraphe c.2.3. page 140.
L'analyse des échantillons biologiques (identification et
dosage des composés) a été réalisée par Chromatographie Liquide
Haute Performance. L'appareillage, les instruments et les conditions
sont présentés page
2.4. Préparation de l'homogénat entier rénal
Le protocole expérimental suivi reste identique pour la
souris hairless comme pour le rat atrichis.

---

180
Les animaux sont sacrifiés par dislocation cervicale,
les reins sont aussitôt prélevés et trempés dans le milieu de survie,
sucrose 0,25 M à + 4°C de température.
Soigneusement nettoyés et débarrassés de leur capsule
surrénale, ils sont découpés en petits cubes de façon à vider le
bassinet. Puis, rincés de nouveau dans du sucrose, les cubes de rein
sont alors broyés (Cf. paragraphe C.2.3. page140) en milieu tris-HCl
(0,05 M pH 7,20 - MgC12 (0,002 M) de volume équivalent au poids initial
des organes.
Le broyat est centrifugé 5 minutes à 1750 g à + 4°C dans un
appareil réfrigéré (MINI-FUGE 2 HERAEUS CHRIST)
; le surnageant, après
élimination à la spatule de verre de l'anneau blanchatre superficiel
de graisse, est homogénéisé au Potter.
Une nouvelle centrifugation de 10 minutes à 2000 g à + 4°C
est effectuée et l'homogénat entier est ainsi prêt à l'emploi •
•

---

181
3. Cinétique de désamination in vitro au niveau rénal de l'IDC
chez la sourlS halrless mâle
3.1. Protocole expérimental
L'étude cinétique in vitro de désamination de l'IDe au
niveau rénal est menée en utilisant l'homogénat entier rénal
préparé suivant le mode opératoire rappelé dans le paragraphe F.2.4.
page 179 ..
Elle concerne trois lots de souris mâles hairless aux
caractéristiques définies et précédemment rappelées au paragraphe
F.2.1. page
L'incubation de l'enzyme rénale avec le substrat
(5,665 vmoles) a lieu dans des tubes à essais bouchés dans un bain-
marie à 37°C sous agitation permanente, penaant des durées variables
5, 15, 30, 60 minutes, 2, 3, 18, 24 heures.
Les essais sont faits en double et utilisent 100 mg de
tissu rénal dans un volume final de la ml. Les échantillons, au terme
de l'incubation, sont aussitôt déféqués à l'aide de 200 VI d'une
solution refroidie d'acide; mélange méthanol-eau (50/50) contenant
la % d'acide trichloracétique.
Le traitement intégral des échantillons et l'analyse
chromatographique sont présentés dans le paragraphe III.B.3. page123
L'analyse chromatographique pour chaque essai comporte
deux injections, et il n'intervient dans les calculs que la moyenne
arithmétique des deux valeurs.
3.2. Cinétique chez la souris mAle hairless
résultats
Les résultats, présentés dans le Tableau XXI
et le
graphique nO 20
, sont exprimés en micromoles de métabolites (IDU, lU)
par 100 mg de tissu rénal. Le pourcentage de désamination, calculé
dans ce tableau, traduit la désamination globale du substrat : quantité
totale d'IDe transformée en métabolites par rapport à la quantité
initiale incubée. Ce pourcentage est obtenu grâce à l'expression simple
suivante:

---

182
Pool de métabolites
x
100
Substrat incubé
les quantités de métabolites et de substrat incubé étant exprimées
en une même uni té .
Ce mode de détermination de la désamination globale est
justifié par le fait qu'au cours de l'analyse chromatographique des
échantillons d'incubation, nous n'avons noté aucune présence d'iodo-
cytosine métabolite ou de tout autre métabolite.
Cette observation, déjà faite par CREASEY (757) et d'autres
[153, 154, 786), vient donc soutenir la conclusion, par ces mêmes
auteurs, que la iodo-5-uracile, au cours de la catalyse enzymatique
de l'IOC au niveau rénal chez la souris, découle exclusivement d'une
hydrolyse de l'IOU, elle-même naissant de la désamination du substrat
(étape 1 de la catalyse).
De plus, la chafne de conversion IOC .... IDU .... lU ayant lieu
de mole à mole et la dés halogénation chimique des trois composés
étant faible aux divers temps d'incubation, nous pouvons retenir ici
que le pool de métabolites résultant de la biotransformation de l'IOC
comprend essentiellement deux substances: l'IOU et l'lU.
3.3. Discussion
L'examen visuel des résultats montre que la désamination de
l'IOC au niveau rénal chez la souris hairless dans des conditions
in vitro est importante.
Une heure après le début de l'incubation, la moitié déjà du
substrat se retrouve à l'état métabolite et ce, principalement au
niveau de la première étape de la bioconversion de l'IDC.
A partir de la 6 ème heure d'incubation, la courbe de production
du métabolite 1 (IOU) accuse une décroissance au profit de l'étape 2,
laquelle semble atteindre un palier 18 heures après.
L'explication pourrait être de type "réaction de Michaelis" :
Les quantités croissantes d'IOU naissant de l'étape 1 satureraient de
mieux en mieux la nucléosidase. La vitesse de réaction ainsi augmente,
puis se stabilise lorsque la source endogène de substrat (réaction 1)
tend à tarir.

---

183
Ce mécanisme réactionnel à deux cascades et de type mole-
mole rend toute sa rigueur au mode de calcul ici retenu (relation
page 153) sans lequel l'effondrement de la production d'IDU se
traduirait par une diminution, voire une annihilation, inexpliquée
au-delà des 6 heures de la désamination (à la suite étape 1) tandis
que se poursuit irrésistiblement la consommation (non représentée ici)
du substrat.
En réalité, le pourcentage de désamination calculé selon le
mode rappelé plus haut n'exprime que la bioconversion de l'IDC aux
étapes 1 et 2 admises comme les plus essentielles.
Il nous faut cependant mentionner qu'au cours de l'analyse
chromatographique, certains tubes ont révélé la présence d'un composé
non identifié (composé X). Ce pic d'amplitude limitée apparaït dans
les premiers temps de la cinétique au niveau rénal à l'endroit de la
désoxy-2'-cytidine, OC (Cf. ordre d'élutions des composés standard:
diagramme nO 6 page 5bi~, pour ensuite occuper la position de la
désoxy-2'-uridine (DU) avant de disparaïtre de tout chromatogramme.
Dans tous les cas, d'après les spectres U.V., on pourrait attribuer
l'identité du composé X à de la OC ou de la DU s'il n'y avait un léger
décalage du maximum. Nous pensons tout de même qu'il pourrait s'agir
de la DC qui découlerait très rapidement de l'IOC par action d'une
déiodinase rénale, peu active cependant. Cette OC serait convertie par
la suite en DU sous l'action de la cytidine désaminase avant de se
retrouver convertie en uracile par la nucléosidase.
L'importance de ce composé, malgré les multiples stades
métaboliques qui lui pourraient être attribuables, reste limitée.
De plus, sa présence à tous les temps de la cinétique n'étant pas
toujours exprimée, nous avons décidé de le considérer comme un
métabolite mineur.
Une autre manière certainement plus directe de n'obtenir
qu'au stade 1 toute la désamination de l'IOC aurait été l'emploi d'un
inhibiteur de la nucléosidase.
Cette astuce, non envisagée ici, sera exécutée et communiquée
bientôt.

---

TABLEAU XXI
Cinétique de désamination in vitro de l'IDC au niveau rénal chez la souris mâle hairless
Résultats en umoles de métabolites (IOU, lU) et en pourcentage de désamination par 100 mg de tissu.
Incubation de 5,665 umoles d'IDe à 37°c; tris-HCl pH 7,20.
Temps
0,05
0,15
0,30
1,00
4,00
6,00
18,00
24,00
(h, mn)
"'!"
0,920
1,625
1,700
3,550
3,995
-
1,447
al
.....
mu
0,670
1,170
1,610
1,990
2,184
2,668
1,104
0,815
0,890
1,556
2,147
2,660
2,912
3,557
1,472
0,890
-M
"
0,827
1,450
1,819
2,734
3,030
3,113
1,341
0,853
±S.D. =
0, 111
0,200
0,234
0,638
0,744
0,444
0,167
0,037
ru
0,250
0,125
0,200
0,700
0,817
-
3,464
0,017
0,053
0,129
0,180
0,712
1,207
2,800
3,110
0,024
0,071
0,173
0,241
0,950
1,610
3,735
4,426
-
M
=
0,097
0,084
0,168
0,374
0,827
1,409
3,333
3,168
±S. D. =
0,108
0,030
0,029
0,232
0,097
0,201
0,392
0,890
DESAMINATION
16,30
27,07
35,07
54,86
68,08
79,82
82,50
70,97
(%)
s.0.=6,72
S.0.=12,33
S.0.=14,88
S.D.=22,48
S.D.=21,88
S.D.=16,22
S.0.=16,94
S.D.=27,36

---

185
Graphiques n° 20 (a) et 20 (b)
algTaAH~F.1N U1Tag ~~ J 'JD(,(jn6tjQu~ ~~ 6t~Q~~ l 1 2
4.
ou ~iYeow ~~nol chez 10 ~ouri~ N~l~ hoirl~$$,
Acv
3.
3.
2.
2.
1.
1.
BIOTRANSF.IN UITRO dA )'IDC'Cin4tiquA dA~ 4t'PA~ 1 L 2
4.
au niveau rénal chez la souris ~ale hairless.
Acv
3.
3.
2
2.
1.
1.
e
2ee
499
6ee
aee
Ieee
1299
14ee
16ee
TE"PS ' "n
ACV
Activités enzymatiques
exprimées
en
\\Jmoles
de
métabolite
produit par 100 mg de t issu rénal à 37° C au temps t dans
le milieu réact ionnel
Ml:
Courbe de product ion du mét abolit e
= mu
M2
Courbe de production du métabolite 2 = lU

---

186
Graphique n° 20 (c)
CINETIQUE de DES~"IN~TIDN ~u NIUE~U REN~L de l'IDC chez J~
12~
SOURIS H~IRL. '(~)du pool de ~ETABOLITES (Etapes 1&2)
(%)1
!eel
8~1€e-j y-"/"
1
1
40-t/
2a{
~~---rl--'-I--'I--TI--rl----,---TI--'1
e
2ee
4ee
6ee
aee
le8e
128e
1488
1689
TE"PS' ~n

---

187
4. Détermination des Km et Vmax apparents de
biotransformation rénale in vitro de l'IDC
chez la sourlS halrless et le rat atrlchls mâles
4.1. Protocole expérimental
Le protocole expérimental utilise un homogénat entier
rénal de souris mâle hairless ou de rat mâle atrichis, obtenu suivant
le mode de préparation rappelé dans le paragraphe F.2.4. page 179 , et
provenant des mêmes lots d'animaux (trois de souris et deux de rats)
que la solution d'enzyme impliquée dans l'étude cinétique.
Les caractéristiques des animaux sont décrites dans le
paragraphe F. 2 .1., page 178 .
Dans ce protocole, l'enzyme rénale constante (100 mg) est
incubée avec des quantités croissantes de substrat (voir tableau de
résultats) dans un volume final d'incubation de 10 millilitres. Le
substrat est déposé au centre de l'enzyme grâce à une micropipette
de précision ; le tube est ensuite agité par retournement lent.
L'incubation des essais est faite en double dans un bain-
marie à 37°C sous agitation permanente, durant 60 minutes. Au bout de
ce temps, la réaction est arrêtée par rajout de 200 microlitres de
solution refroidie méthanol-eau (50/50) d'acide chlorhydrique 10 %
ce qui assure également la défécation du milieu biologique.
Les échantillons sont ensuite entièrement traités et analysés
par H.P.L.C. conformément aux textes des paragraphes
pages
Les injections chromatographiques sont faites en double pour
chaque échantillon et la moyenne uniquement est utilisée dans les
calculs.

---

188
4.2. Km et vmax apparents au niveau rénal chez la souris hairless
Les résultats expérimentaux de Va ainsi que les valeurs
calculées de Km et Vmax apparents sont consignés dans les Tableaux XXII
etA,B,c.sur les graphiques n021a et n021 b , sont représentées les
valeurs de l/va en fonction de lis, ceci permettant de calculer Km
et Vmax apparents, associés à leur erreur.
Nous ne détaillerons pas ici, volontairement, le calcul
d'erreurs sur les valeurs de Vmax et Km. Ce calcul, cependant, peut
être établi (149) selon le principe de propagation des erreurs à
partir de l'équation:
y
=
ax
+
b
sous la forme
1
Km
1
1
+
Va
Vma x
s
Vmax
1
b
=
Vma x
ou encore
Vmax
1
=
b
Le calcul d'erreur sur Vmax et Km, par conséquent, devient
possible d'après les expressions
•~
2
f!. Vmax
= Vmax
f!. b
b2
et
Km
=
Km
+
f!. Vmax 2
Vrnax2

---

TABLEAU XXII
A. Valeurs expérimentales de Vo au niveau rénal chez la souris hairless à 37°C
tris-Hel pH 7,20 ; 1 heure
~term1nation des Km et Vmax apparents
étude par lot
Lot 1
Métabolite 1 = IDU
Métabolite 2 = lU
Si)
V j)
M 1)
S.D.
Vo
M
S.D.
0
0,710
0,405
0,061
0,402
± 0,003
0,056
± 0,005
0,399
0,051
1,416
0,872
0,114
0,865
± 0,007
0,100
± 0,014
0,858
0,086
en
li)
0,190
M
2,832
1,682
1,666
± 0,016
0,185
± 0,005
-1,650
0,180
5,665
2,911
0,349
2,906
± 0,005
0,336
± 0,013
2,895
0,323
11,328
3,484
0,404
3,468
± 0,016
0,388
± 0,026
3,452
0,362
/= 0,997
n = 10
r 2 = 0,999
n = 10
Constantes
S.D.
t
Signification
Constantes
S.D.
t
Signification
a
'"
1,694
0,019
.
51,563
p < 0,001
a '"
1,514
1,819
89,391
p<
0,001
b
'" 0,049
0,000
b '" 0,065
0,027
..
Km
= 34,571 • 10-6 H
AKm
0,390
Km
.. 9,194 • 10-6 H
AKm
.. 11 ,688
..
Vmax = 20,408 • 10-6 H.h- 1
I:J. Vmax ..
0,000
Vmax = 0,775 • 10-6 M.h- l
I:J. vmax
0,322
i)
.. Substrat S exprimé en pmoles par tube d'incubation (X ml).
Le tube d'incubation contient 100 mg de tissu rénal.
j)
.. Vo est exprimée en pmoles/h/l00 mg de tissu rénal.
1)
.. M représente la moyenne des essais d'incubation en double, associée à l'écart type artthméttque ,
ceci traduit les variations entre les différents tubes d'incubation.

---

TABLEAU
XXII
B. Valeurs expérimentales de Vo au niveau rénal chez la souris hairless à 31°C
tris-HCl pH 7,20 ; 1 heure
Détermination des Km et vmax apparents : étude par lot
Lot 1
Métabolite 1 = JOU
Métabolite 2 = lU
- -
-
S
Vo
fv1
S.D.
Vo
M
,-,
S.D.
-
0,218
0,028
0.710
0,226
± 0,008
0,024
± 0,004
0,234
0,020
1,416
0,441
0,060
0,433
± 0,008
0,049
± 0,011
0
0,425
0,038
C1l
.....
1,114
0,088
2,832
1,097
± 0,017
0,085
± 0,003
1,080
0,082
0,125
5.665
1,764
1,733
± 0,031
0,121
± 0,004
1,702
0,117
0,253
11.328
3,158
3,155
± 0,003
0,242
± 0,011
3,152
0,231
22,657
2,841
0,325
2,834
± 0,007
0,320
± Ot005
2,827
0,315
2
r
= 0,997
n = 12
r 2 = 0,998
n = 12
Constantes
S.D.
t
Signification
Constantes
S. D.
t
Si gnï fi cati on
a
= 3,092
0,148
a
=27,766
8,128
57,65
P < 0,001
70,64
P < 0,001
b = 0,052
0,048
b
= 2,043
0,675
Km
= 59,461 • 10-6 M
âKm
=
54,961
Km
= 13,589 • 10-6 M
âKm
= 5,999
Vmax = 19,230 • 10-6 M.h- 1 àVmax
=
17,751
Vmax =
0,490 • 10-6 M.h- 1
âvmax
= 0,162

---

TABLEAU XXII
C. Valeurs expérimentales de Vo au niveau rénal chez la souris hairless à 37°C;
tris-HCl pH 7,20 ; 1 heure
Détermination des Km et vmax apparents : étude par lot
Lot 3
Métabolite 1 = 10U
Métabolite 2 : lU
S
Vo
M
S.O.
Vo
M
S.O.
-
0,710
0,289
0,291
± 0,002
0,025
0,023
± 0,002
0,293
0,021
1,416
0,581
0,054
0,578
± 0,003
0,0535
± 0,0005
r i
0,575
0,053
0>
r i
0,950
0,995
± 0,045
0,084
2,832
0,083
± 0,001
1,040
0,082
5,665
2,629
0,106
2,750
± 0,121
0,103
± 0,003
2,870
0,100
11,328
3,230
0,260
3,365
± 0,135
0,246
± 0,014
3,500
0,232
22,657
4,495
0,487
4,712
±O,022
0,453
± 0,034
4,928
0,419
r 2 = 0,999
n = 10
r 2 = 0,992
n = 10
Constantes
S.O.
t
Signification
Constantes
S.O.
t
Signification
a
= 2,389
0,003
a
= 28,691
3,533
99,95
P < 0,001
35,214
P < 0,001
b
= 0,069
0,023
b =
1,754
0,498
- -
Km
= 34,623 • 10-6 M
llKm
=
11,541
Km
= 16,358 • 10-6 M
llKm
=
5,063
V
=14493.10-6 Mh-1
llV'max
=
4,831
Vmax =
0,570 . 10-6 M.h-1
llvmax
=
0,162
m a x '
.

---

1'i-
Graphique n° 21 a
6
• 10
M
14,493
+
6
1
19,230
(II
al
V /
1
• 10
M
r-I
\\11/ / /
1
6
. 10
M
20,408
1
6
.
34,571
. / 59,461' 10
M
1/5

---

193
Graphique nO 21 b
1
1
0,490
0,570
1
0,775
1
9,194
1
16,36
/

---

194
L'analyse par lot des résultats montre qu'au niveau rénal
chez la souris mâle hairless, la désamination in vit~ de l'IOC est
importante et est bien enzymatique.
Dans les lots 1 et 3, une même quantité de substrat est
nécessaire pour obtenir, après une heure d'incubation, la moitié de
la quantité maximale de métabolite produite à l'étape 1 de la bio-
conversion de l'rOC. Seul le lot 2, sur ce point,
exhibe
une
valeur,
quelque peu supérieure t,;mdis que la: Vmax apparente demeure
voisine de celle du lot 1-
Pour ce qui est de l'étape 2, les constantes cinétiques de
la réaction présentent des valeurs de même ordre de grandeur entre
elles et même proches si l'on tient compte du fait que nous ne nous
trouvons peut-être pas dans des condi tions de saturation de l'enzyme
impliquée.
Un test d'homogénéité des lots est réalisé ci-dessous et
l'on peut espérer poser une appréciation plus globale des résultats.
Test d'homogénéité des résultats au niveau rénal
entre les différents lots : analyse de covariance
L'analyse de covariance a pour objectif d'examiner si les
différences observées entre les régressions Ilné~ire~
sont
significatives, et si tel est le cas, d'en déterminer l'importance.
Du fait que les droites de régression linéaires peuvent
varier par leur pente, leur ordonnée à l'origine ou encore leur
variance résiduelle, l'approche la plus commode (149) est de comparer
d'abord les variances résiduelles puis les pentes et finalement les
ordonnées à l'origine.
L'analyse de covariance que nous présentons ici a été
exécutée sur la base d'un programme de micro-ordinateur du Laboratoire
de Physique Industrielle à la Faculté de Pharmacie de Montpellier
nous n'en donnerons pas, par conséquent, de calcul détaillé.
Le test fait apparaître une hétérogénéité des variances
résiduelles exprimée par la valeur de F pour les trois lots étudiés.
Par ailleurs, la différence entre les trois pentes étant significative
(non parallélisme accepté) et les ordonnées à l'origine différentes,
les trois lots de souris hairless ne peuvent être considérés comme
homogènes du point de vue de la bioconversion de l'rOC au niveau rénal.

---

**************************************************************************
*
VARIATION
*
X
*
XY
*
y
* DDL
*
*
FACTEUR
*
0.1)248
*
-1).1045
*
~). 7252
* 2
*
*
RESIDUELLE
*
3.8816
*
9.4281
*
24.2599
* 14
*
*
TOTALE
*
3.9064
*
9..3236
*
24.9851
* 16
*
-------------------------------------------------------------------------
*
F
*
0.0447
*
*
0.2093
*
**************************************************************************
ANALYSE DE COVARIANCE
*********************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES *
DDL
*
VARIANCE
*
F
*
*
FACTEUR
*
1.371850
*
2
*
1).685927 *
6.556810
*
*
RESIDUELLE
*
1.359970
* 13
*
(1.11)4613 *
*
*
TOTALE
*
2.731821)
* 15
*
1).182122 *
*
*********************************************************************
TABLEAU GENERAL
***************************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES *
DDL
*
VARIANCE
*
F
*
*
REG LIN MOY
*
22.899901)
*
1
*
22.899900 *1858.950001)
*
*
FACTEUR
*
1. 371850
2
0.685927 *
55.68170,)
s
*
*
*
*
NDN-PARALLE
*
1.224460
2
1).612231 *
49.6993
s
*
*
*
*
NON /1
ECART/DROITE
*
0. 1355ü6
* 11
*
0.1)12.319 *
*
*
TOTALE
*
2.731820
*
15
*
0.182122 *
*
****************************************************************************
COEFFICIENT DE REGRESSION B= 2.4289
GROUPE
YM (1)
~M ( l )
YAM (!)
.975
.5466
.831381
2
1.48233
.462833
1. 54217
.,.
....
1.17433
.462833
1.23417
MOYENNE GEN.
1.22441
.487471
1.20258
VOULEZ-VOUS REVOIR LES RESULTATS~ 0
AVEZ-VOUS BRANCHE L'IMPRIMANTE (0 OU N)~ 0
APPUYEZ SUR LA TOUCHE -PRINT ON-?
TITRE DE L'ANALYSE? "'C
Break in 765
Ok

---

196
Par conséquent, nous retiendrons un seul des trois lots
pour caractériser la bioconversion de l'IDC au niveau rénal chez
la souris; l'ensemble des constantes cinétiques étant regroupé
dans le Tableau XXIII.
Ces valeurs, notamment celle de Km moyen à l'étape 1,
confirment les conclusions par CREASEY en 1963 (151) selon lesquelles
le rein de souris constitue une source três active de cytidine
désaminase. Cependant, en travaillant avec une enzyme rénale de souris
Swiss purifiée et dans des conditions de détection radioactive (1 125 ),
CREASEY obtient une valeur de Km (5,5.10-4M) environ 10 fois supérieure
à la valeur la plus forte (0,60.10-4M) iœi déterminée par H.P.L.C. chez
la souris hairless avec un homogénat entier rénal (surnageant 2000 g) •
Nous avons vérifié par ailleurs, dans les mêmes conditions,
l'activité désaminasique rénale de souris Swiss ; les résultats obtenus
sont bien concordants avec ceux obtenus chez la souris hairless.
Ainsi, nous retiendrons pour la suite de nos travaux, le
modêle souris hairless au niveau rénal comme une source référentielle
de l'activité de la cytidine désaminase vis-à-vis de l'IOC.
TABLEAU XXIII
Constantes cinétiques moyennes de bioconversion in vitro
de l'IDC au niveau rénal chez la souris mAle hairless
Surnageant 2000 g ; tris-HCl pH 7,20 ; 37°C, 1 heure
Etape
1
Etape 2
Km
Vmax
Pente
Km
Vmax
Pente
Lot 1
0,35
0,21
1,66
0,09
0,008
11,25
Lot 2
0,60
0,19
3,15
0,14
0,005
.28,00
Lot 3
0,35
0,15
2,33
0,16
0,006
26,66
.
-4
-4
-1
Dans ce tableau Km est exprimé en 10
M et Vmax en 10
M.h
La pente est déterminée d'après la représentation de LineWeaver
et Burk.

---

197
4.3. Km et \\'max apparents au niveau rénal chez le rat nu m~le atrichis
Les résultats sont consignés dans le Tableau XXIV_: et sont
exprimés en nanomoles de métabolite par 100 mg de tissu, ceci à cause
des valeurs plus faibles chez le rat atrichis.
La valeur de \\lna:x ici, chez le rat atrichis au ni veau rénal,
indique que l'activité désaminasique observée est environ lë3 fois
plus faible que celle obtenue chez la souris hairless avec le même
tissu dans des conditions identiques.
Par ailleurs, on peut remarquer que l'activité de l'enzyme
catalysant l'étape 2 de la bioconversion de l'IOC appara!t plus faible
que celle de l'étape de désamination.

---

TABLEAU
XXIV
Km et Vmax apparents de biotransformation rênale in vitro de l'IDC
chez le rat nu mâle atrichis
Résultats en nanomoles de métabolites (IDU, lU) par 100 mg de tissu.
Incubation 1 h à 37°C, tris-HCI pH 7,20 0,05 M
Mêtabolite 1 = IDU
Mêtabolite 2 = lU
- -
-
Si)
V j)
Ml}
5.0.
Vo
M
5.0.
0
-
5,125
lX)
0,142
1,102
0,989
± 0,113
5,000
± 0,125
(J)
0,876
4,875
r i
0,283
2,090
9,458
1,978
± 0,112
9,375
± 0,083
1,866
9,292
1,416
7,147
19,500
6,78
± 0,367
19,375
± 0,125
6,413
19,250
2,832
8,884
21,104
8,757
± 0,127
20,834
± 0,730
8,630
20,104
r 2 =
0,999
n = 8
r 2 = 0,996
n = 8
Constantes
5.0.
t
Si gnifi cati on
Constantes
5.0.
t
Signification
a
= 0-,.135
0,024
a
= 1,484
0,001
77,420
P < 0,001
38,652
P < 0,001
b
= 0,053
0,013
b
= 0,882
0,001
-6
Km
= 2,547.10
M
1
t,Km
= 0,475
1,683 • 10-6 M
l
t,Km
0,002
Km
=
=
-9
-
9
-
V
1,065
t, Vmax
0,001
max = 18,868 • 10
M.h·
t, Vrnax
=
Vmax = 1,134 • 10-
M.h
=

---

199
....
....
/
oen
3:
N
N
....
..~ ....
W
....
o
....
0\\
..
3:
C ....
"""
....
N
co
....
..~co•....o'il
3:

---

200
5. Inhibition par la cytidine de la désamination rénale in vitro
de l'lOt chez la sourlS mâte halrless
5.1. Protocole expérimental
Le protocole ici utilise deux lots de 6 souris mâles hairless
de poids moyen par lot 19,15 ± 1,70 g et 18,95 ± 2,25 g.
L'étude de l'inhibition de la première étape de biotransfor-
mati on rénale in vitro de l'IDe chez la souris mâle hairless est réalisée
sur l'homogénat entier rénal 2000 g, préparé suivant le mode opératoire
rappelé dans le paragraphe F.2.4. page18D .J
• Dans des tubes à essais en double, une quantité de 100 mg
d'enzyme rénal est incubée pendant 60 minutes sous agitation permanente
dans un bain-marie à 37°C, avec des quantités croissantes de compétiteur
(indiquées dans le tableau de résultats) pour une quantité fixe de
substrat IDe (5,664 micromoles)
; le volume final d'incubation étant de
la millilitres. Les échantillons au terme de l'incubation, sont traités
par 200 microlitres d'acide trichloracétique refroidi en solution la %
dans un mélange 50/50 méthanol-eau.
La suite du traitement et l'analyse des échantillons sont
effectuées comme décrit dans les paragraphes B.3.4. et B.3.5. page 127 et
135
;
les valeurs en double découlant de l'analyse chromatographique,
sont utilisées dans les calculs sous la forme de leur moyenne arithmétique
5.2. Résultats - Discussion
Les résultats, consignés dans le Tableau XXV
et représentés
dans le graphique nO 23 , sont exprimés en micromoles de métabolites
pour 100 g de tissu rénal. L'analyse statistique des résultats expérimenta
dans les deux lots ayant montré (test de covariance non significatif et
parallélisme accepté) que ces lots peuvent être considérés comme homogènes
Les constantes d'inhibition sont ainsi calculées à partir d'un lot unique,
moyen.

---

201
Dans le tableau de valeurs :
i} C
Dose de cytidine incubée dans le milieu, en 10-6M pour une
quantité fixe de substrat 5,665.10-6M.
Vitesse d'augmentation du substrat résiduel ou de diminution
du métabolite exprimée en
moles de produit (IOC, IDU ou lU)
par tube d'incubation et par heure.
Chaque valeur de Vo correspond à la moyenne issue des essais
en double dans chacun des deux lots.
l}
Valeur moyenne de Vo calculée à partir du lot unique moyen,
associée à la déviation 'standard.
Les valeurs faibles de la dispersion prouve bien l'homogénéité,
à l'examen visuel, des deux lots.
La valeur de r
(0,997) traduisant une bonne corrélation, comme
le prouve la signification de la régression au risque a =
, la
constante Ki d'inhibition de l'étape 1 est calculée d'aprês l'équation:
y
= - 0,0792
x + 1,8630
au point y = 1,4625. Ainsi Ki = 5,056.10-6M.
Cette valeur, une fois encore, est différente de celle donnée
par WANG (3,0.10- 4M) dans le cas d'une cytidine désaminase purifiée et
indiquée dans la littérature (1581.
De plus, WANG a utilisé une source enzymatique bactérienne
(E. coli). Dans ces conditions, tout parallêle demeure difficile au
plan quantitatif entre ces résultats.
Malgré tout, la symétrie graphique entre la courbe traduisant
l'augmentation du substrat résiduel et celle objectivant le ralentissement
de la production du métabOlite ne jette aucun doute sur la qualité de
l'inhibition observée.
L'équation de régression ci-dessus est calculée en considérant
uniquement la partie linéaire de la courbe d'inhibition.

---

202
Graphique n° 23 (a et b)
DES~"IN~TIDN REN~E IN UITRO d8 l'IDC Ch82 SOURIS H~IRLESS:
ui'
INHIBITIOH par la CYTIDIHE ; Uo =F(Cp)
4.
Sr-+
4.
3.
3.
2.
2.
:~~:
1
1
1
1
1
8
2
4
~:
6
8
18
12
14
16
18
Cp
INHIBITION p~ la CYTIDINE d. la DESAMINQT.REN~LE d. l'IDC
5.
chez SOURIS HAIRLESS: déter~ination du Ki
Uo4.
4.
3.
3.
2.
2.
1.
1.
8
2
4
6
Vitesses d'inhibition
de l'enzyme exprimées en Ilmoles de
métabolite
(IDU ou lU) produit
ou de substrat
(IDC) non
transformé en 1 heure dans le milieu réactionnel par 100 mg
de tissu
rénal en présence d'une dose Cp de eytidine.
.inhibit eur •
Sr
Courbe
d'accroissement
des quantités de substrat
résiduel
(IDC)
Courbe
de
décroissance
de
la
production
de
métabolite
1 = IDU
Courbe
de
décroissance
de
la
production
du
métabolite
2 = lU
Cp :
Doses
croissantes
d'inhibiteur (cytidine)
dans
le
milieu
réactionnel

---

TABLEAU
XXV
. Inhibition par la cytidine de la désamination in vitro de l'IDC :
Valeurs expérimentales de Vo au niveau rénal chez la souris male hairless
Détermination de Ki : Incubation à 37°C tris-HCl pH 7,20, 1 h., de 5,665 pmoles d'IDe
Résultats en pmoles de métabolites
Substrat résiduel : IDC
Métabolite 1 : IDU
Métabolite 2 : lU
- -
Ci)
-
vOjl
Ml) ± S.D.
Vo
M± S.D.
Vo
M± S.D.
0,000
1,714
2,834
0,186
1,823 ± 0,109
2,925 ± 0,091
0,197 ± 0,011
1,932
3,015
0,208
1,037
2,304
2,086
0,043
2,416 ± 0,112
2,316 ± 0,230
0,046 ± 0,003
2,528
2,546
0,049
1,689
0,036
(")
2,074
3,084
2,980 ± 0,105
1,838 ± 0,149
0,039± 0,002
0
2,875
1,987
0,041
N
3,112
3,267
1,545
0,029
3,324 ± 0,057
1,662 ± 0,116
0,032 ± 0,002
3,380
1,778
0,034
4,150
3,615
1,397
0,012
3,724 ± 0,109
1,531 ± 0,133
0,019 ± 0,006
3,832
1,664
0,025
6,224
4,030
1,249
0,013
3,965 ± 0,065
1,356 ± 0,106
0,015 ± 0,001
3,900
1,462
0,016
8,298
4,135
1,047
0,012
4,138 ± 0,002
1,140 ± 0,092
0,013 ± 0,001
4,140
1,232
0,014
12,448
4,347
0,837
4,390 ± 0,043
0,911 ± 0,074
4,432
0,985
16,597
4,452
0,510
4,508 ± 0,056
0,556 ± 0,045
4,564
0,600
r 2 = 0,995
n = 18
Constantes
S.O.
t
a = - 0,0792
0,003
56,4
b =
1,8630
0,071
P < 0,001
Ki
=
5,056
± 0,062 •
10-6 M

---

- - - - - - - - - - - - - - _ . _ - - - - -
204
6. Caractérisation du mécanisme impliqué dans l'inhibition
~ar d'autres nucleosldes pyrlmldlques de la desamlnatlon
~n vitro de l'IDC par le tlSSU renal de sourlS halrless
exemple de la cytldlne et de la dêsoxycytldlne (OC)
6.1. Protocole expérimental
L'étude ici utilise un seul lot de souris males, poids
moyen 22,10 ± D,aD g, et maintenu dans les mêmes conditions de
détention que décrites dans le paragraphe c.2.1., page 140.
Le prélèvement des organes, la préparation de l'homogénat
sont identiques aux protocoles précédents. L'incubation est faite
en double à 37°C: une concentration fixe d'inhibiteur est incubée
avec des concentrations croissantes de substrat (IDC) pour une même
quantité d'enzyme. On teste ainsi deux doses distinctes d'inhibiteur.
Le dosage est effectué par H.P.L.C. après traitement des échantillons
(protocoles précédents) •
•
6.2. Résultats - Discussion
Les résultats sont exprimés dans le
Tableau,XXVIII
et graphiques nO 24 a et b.
Ces résultats montrent, d'après la représentation graphique,
que le mécanisme impliqué dans l' inhibi tion de la cytidine désaminase
de rein de souris est compétitif.
La valeur de Ki n'a pas été calculée dans ce paragraphe du
fait d'une difficulté technique à l'H.P.L.C. ; les échantillons de la
réaction non inhibée n'ayant pas été analysés. Néanmoins, la valeur de
Ki déterminée au chapitre précédent donne une approximation suffisante.
La cytidine désaminase, en admettant la cytidine
et
désoxycytidine comme autres substrats, est bien une pyrimidine
nucléoside désaminase.

---

TABLEAU XXVI
Inhibition compétitive par la cytidine de la biotransformation in vitro
de l'IOC au niveau rénal chez la souris
Résultats exprimés en pmoles de métabolite IOU par 100 mg de tissu
incubation 1 h. à 37°C 1 MgC12, tris-HCl pH 7,20
OESOXYCYTIOINE = 4,445 pM
OESOXYCYTIOINE = 22,222 pM
5i)
V J)
Ml)
5.0.
Vo
M
5.0.
0
1,416
0,153
0,212
10
0,148
0,005
0,207
0,005
0
0,143
0,202
C\\J
2,832
0,260
0,298
0,257
0,003
0,294
0,004
0,254
0,290
5,665
0,625
0,420
0,620
0,005
0,417
0,003
0,615
0,414
14,164
0,408
0,552
0,402
0,006
0,547
0,005
0,396
0,542
25,328
0,697
0,504
0,693
0,004
0,498
0,006
0,689
0,492
r 2 = 0,731
n = 5
r 2 =0,792
n = 5
Constantes
5.0.
t
Si gnifi cation
Constantes
5.0.
t
Signification
a = 0,017
0,00Q2
3,145
a .. 0,011
#
0
0,05< P<O, 02
4,25
O,Ol<P<O,OOl
b = 0,256'-
O,QB1
b = 0,281
#/6'

---

TABLEAU XXVII
Inhibition compétitive par la désoxycytidine de la biotransformation in vitro
de l'IOC au niveau rénal chez la souris
Résultats exprimés en ~moles de métabolites IDU par 100 mg de tissu
incubation 1 h. à 37°C ; MgCI2' tris-HCI pH 7,20
CYTIOINE
=
4,150 ~M
CYTIOINE = 20,746 ~M
Si)
Voj)
MI)
S.O.
Voj)
M
S.O.
-
1,416
0,990
0,410
0,983
0,007
0,402
0,008
0,976
0,394
10
0
N
1,639
0,778
2,832
1,629
0,010
0,769
0,009
1,619
0,760
5,665
2,973
1,433
2,967
0,006
1,423
0,010
2,961
1,413
14,164
4,529
3,085
4,501
0,028
3,077
0,008
4,473
3,069
25,328
5,407
3,899
5,372
0,035
3,885
0,014
5,337
3,871
r 2 = 0,946
n = 5
r 2 = 0,974
n = 5
Constantes
S.O.
t
Signification
Constantes
S.O.
t
Signification
a
= 0,177
#
a
18,02
p < 0,001
a
= 0,147
#
0
37;46
p< 0,001
b
= 1,345
# 0
b
= 0,456
#
0

---

207
],. Essai
cytidine désaminase
c ez
7..1. Protocole expérimental
Le protocole pour l'essai de localisation de l'enzyme
chez la souris au niveau rénal utilise un seul lot de 6 souris
males hairless d'un poids moyen 18,20 ± 1,10 g placé dans les
mêmes conditions de détention que pour les autres études.
(Voir
paragraphe
E
page 171) •
La source initiale d'enzyme est l'homogénat entier rénal,
surnageant de centrifugation 2000 g (Paragraphe F.2.4. page 179),
lequel va servir à la préparation des fractions cytosolique et
microsomale.
Ces fractions sont obtenues à + 4°C par ultracentrifugation
différentielle (Ultracentrifugeuse KONTRON TGA-SO) à 100 000 g pendant
60 minutes d'un volume d'homogénat entier rénal équivalent à 1000
milligrammes de tissu.
Le surnageant l recueilli est stocké à + 4°C ; le culot
microsomal est remis en suspension dans du tampon tris-HCI-MgCI2 et
ultracentrifugé de nouveau 60 minutes dans les mêmes conditions que
précédemment.
Les surnageants l et II réunis constituent la fraction
cytosolique et le culot d'ultracentrifugation, la fraction microsomale.
Ce culot est remis en suspension dans du tampon tris-HCI-MgCI2
de volume équivalent à celui de la fraction cytosolique avant d'être
utilisé.
L'incubation de l'enzyme microsomale ou cytosolique (100 micro-
litres) est réalisée dans un bain-marie sous agitation permanente à 37°C
pendant 60 minutes avec des quantités croissantes d'IDC indiquées dans
le tableau de résultats ; les essais sont réalisés en double. Le
traitement des échantillons et leur analyse par H.P.L.C. sont effectués
comme pour les autres études ; les valeurs en double découlant de
l'analyse chromatographique sont utilisées sous forme de moyenne
ari thmétique.

---

208
GRAPHIQUE .u,

---

209
7.2. Résultats - Discussion
Expression des résultats
Les résultats sont exprimés en ~moles de métabolite IDU
par mg de protéines.
Le dosage de protéines est réalisé conformément au
protocole décrit dans le paragraphe
E
page 171, et à partir du
même lot de souris ayant servi à l'étude biochimique. Les valeurs
des protéines obtenues sont respectivement de 13,158 ± 3,018 mg/g
de tissu dans la fraction microsomale, et de 63,212 ± 3,818 mg/g
de tissu dans le cytosol.
Discussion
Les résultats contenus dans le Tableau ~III et figurés
par le graphique nO 25
, font apparat tre à l'observation que,
bien que les valeurs de r 2 et de t au niveau microsomal gardent
une signification qui plaide suffisamment pour un caractère enzyma-
tique de la catalyse observée de l'-IOC, l' activi té de la cytidine
désaminase dans cette fraction atteint presque aussitôt la vitesse
maximale tandis qu'au niveau cytosolique l'on ne se si tue encore
que dans la portion linéaire de la courbe de Michaelis.
La très forte signification de la liaison (P < 0,001 0/00)
le prouve, l'activité de la cytidine désaminase rénale de souris se
trouverait localisée dans le cytosol 1 la faible activité rencontrée
au niveau microsomal proviendrait, malgré les rinçages du culot
d'ultra-centrifugation, d'une certaine contamination cytosolique
lors de la séparation des deux fractions. Le but, dans cette partie
de l'étude expérimentale, ayant été de situer la localisation
cellulaire de l'enzyme, nous n'avons pas envisagé de déterminer
Km et VInax apparents.
Par ailleurs, les vitesses de désamination ici observées
à partir des quatre concentrations de substrat considérées
font
appara!tre--que l' activi té enzymatique de la fraction cytosolique
apparaît plus élevée que celle de l'homogénat entier (surnageant
2000 g), peut-être à cause de la levée éventuelle d'un possible
effet inhibiteur exercé par un facteur quelconque d'origine
microsomale.
Une chose certaine est que la cytidine désaminase est une
enzyme à localisation cytosolique. La purification partielle
grossière (fraction cytosolique) ou poussée (fraction utilisée par
CREASEY) a pour effet de libérer l'activité de l'enzyme laquelle
peut passer d'un facteur de 1 (surnageant 2000 g) à 10 (fraction de
CREASEY) •

---

TABLEAU
XXVIII
Localisation cellulaire de la cytidine désaminase chez la souris hairless
Valeurs expérimentales de Va dans les fractions cytosolique et microsomale rénales
Résultats en pmoles de métabolite 1 (IDU) par mg de protéines
Incubation 1 h. à 37°C, tris-HCl pH 7,20
Fraction cytosolique
Fraction microsomale
Si)
Vaj )
Ml)
S.D.
Va
M
S.D.
--
0,165
0
1,416
0,028
.....
0,158
0,007
0,022
0,006
N
0,151
0,016
0,401
2,832
0,045
0,322
0,079
0,027
0,018
0,243
0,009
5,665
1,714
0,189
1,662
0,052
0,156
0,033
1,610
0,123
11,331
3,839
0,265
3,374
0,465
0,220
0,045
2,909
0,175
2
r
= 0,994
n
= 4
r 2
= 0,952
n
= 4
Constantes
t
Signification
Constantes
t
Signification
a
=
0,338
a
=
0,021
28,4
P
6,24
O,Ol<P < 0,001
b
< 0,001
=
0,415
b
=
0,007

---

211
U8
GRAPHIQUE ~S
3.~
3.~1
?..J
~,vl
~
2.~
/h
• - 1
1.:11
r
1
'j Y·'.3318' - ';!-;/
.~Aw ~I 1 1
?
01
~
1
1
~
,
6
8
18
!2
14
S

---

212
8. Détermination de Km et de Vmax apparents
au cours de la Ci 1- NI hydrolyse de J' lDU
chez la sour1S male hairless au nlveau renal
B.l. Protocole expérimental
L'étude est réalisée sur un homogénat rénal entier,
surnageant, 2000 g, provenant d'un lot de 6 souris mâles hairless
de poids moyen par lot 18,25 ± 1,80 g.
Les animaux sont sacrifiés par dislocation cervicale ;
les organes sont traités comme dans le paragraphe F.2.4. page171
L'incubation est réalisée dans des tubes à essais en double
d'une quantité croissante de substrat IDU (Cf. tableau de résultats)
pour une quantité constante de 100 mg de tissu rénal pendant 60 minutes
dans un bain-marie à 37°C sous agitation permanente. L'introduction du
substrat est effectuée à l'aide d'une micropipette de précision.
Les essais sont faits en double.
La réaction enzymatique, au bout de ce délai, est arrêtée
par introduction dans chaque échantillon de 200 microlitres d'acide
trichloracétique refroidi, en solution 10 % dans un mélange méthanol-
eau (50/50), et les tubes sont traités comme décrit dans le paragraphe
B• 3 • ,
page 123 •
L'analyse et la quantification sont faites par B.P.L.C.
(§ B. 3. page 123 ). Deux injections chromatographiques sont effectuées
par tube et seule la valeur moyenne entre dans le calcul des résultats.
8.2,. Résultats - Discussion
L'étude de la biotransformation de l'IDU en tant que substrat
initial par l'homogénat entier rénal de souris mâle hairless, a
essentiellement pour but de vérifier que la seconde étape rencontrée
au cours de la catalyse enzymatique de l'IDe admet bien, comme point
de départ, l'IDU naissante.

---

213
De plus, elle tente d'établir, dans de meilleures
conditions expérimentales (saturation de l'enzyme en substrat),
les valeurs de Km et de VIDax apparents au cours de l'hydrolyse
de l'IDU par la nucléosidase.
Les résultats présentés dans le. Tableau XIX
et
graphique nO 26 , montrent que si le métabolite essentiel identifié
aprês hydrolyse enzymatique de l'IDU au niveau C' 1 - Ni correspond
bien à de l'iodouracile, les valeurs de Km et de vmax obtenues sont
différentes de celles découlant de l'étape 2 de la biotransformation
de l'IOC.
Bien que toutes ces valeurs de Km expriment deux choses
distinctes (les unes, une quantité d'IOC ; les autres, d'IDU) et
demeurent de ce fait peu comparables directement, il apparaît de
maniêre nette, en ce qui concerne les vmax, que pour espérer atteindre
dans les deux cas des vitesses maximales identiques de la nucléosidase,
deux fois environ moins de substrat sont nécessaires lorsque l'on
part de l'IDU comme substrat initial.
Cette observation établit bien la C'l-Nl hydrolyde l'IDU
comme seconde étape de la bioconversion de l'IOC.

---

TABLEAU XIX
Km et Vmax apparents au niveau rénal de la C'l-N1 hydrolyse in vitro de l'IOU testée comme substrat
chez la souris male hairless
Valeurs expérimentales exprimées en ~moles de métabolite (lU) par 100 mg de tissu rénal.
Incubation à 37°C; tris pH 7,20 ; 1 heure
Si)
V j)
Ml)
S.O.
o
<t
0,706
0,094
0,080
± 0,014
.-l
0,065
N
1,413
0,130
0,118
± 0,012
0,105
2,825
0,181
0,172
± 0,009
0,163
5,650
0,215
O~234
± 0,018
0,252
11,300
0,269
0,316
± 0,047
0,363
r 2 = 0,993
n = 10
Constantes
S.O.
t
Signification
a = 6,960
3,287
33,6875
P < 0,001
b = 2,976
1,103
Km
=
2~338 • 1O-6M
t.~;Km ~
=
1,404
Vmax = 0,336 • 10-6M.h- 1
t. VInax
'"
0,125

---

215
Graphique n° 26
_1_ • 106 M
0,336
2,338

---

216
9. Conclusion à l'étude de biotransformation rénale in vitro
de j'IOC chez la sourlS halrless et le rat atrlchls mâles
L'étude au niveau rénal in vitro de la biotransformation
de la iodo-S-désoxy-2'-cytidine chez la souris hairless et le rat
atrichis, espèces génétiques glabres, fait appara!tre que la souris
constitue un bien meilleur modèle que le rat, l'enzyme de localisation
cytosolique étant susceptible de transformer en 1 heure, dans des
conditions in vitro, presque la moitié du substrat.
Au cours de la catalyse, l'IOC admet deux métabolites
principaux: la iodo-S-désoxy-2'-uridine (IDU) et la iodo-S-uracile
(lU), le premier naissant d'une désamination oxydative catalysée par
une hydrolase, la cytidine aminohydrolase dénommée EC.3.S.4.S.{158l
,
le second d' une hydrolyse du premier au niveau C' 1 - N1 grâce à
l'action d'une autre hydrolase, probablement l'uridine ribohydrolase
ou EC.3.2.2.3. Ces résultats, bien que dans des conditions différentes,
confirment bien les conclusions antérieures posées par d'autres auteurs
1151, 153, 154, 158, 159) et notamment par CREASEY et par CHANG.
L'essai d'incubation mené en présence de cytidine montre que
ce substrat exerce une forte inhibition de la biotransformation de
l' IOC in vitro probablement au niveau des deux étapes (1 et 2) de la
catalyse enzymatique puisque l'uridine pouvant découler de la désaminatiol
de la cytidine constitue un très bon substrat de l'enzyme 2 de conversion
de l'IDe.
Une différence importante d'activité de la cytidine désaminase
a été observée entre surnageant 2000 g et fraction cytosolique. Celle-ci
pourrait être en faveur d'une présence éventuelle dans la fraction
microsomale d'un facteur inhibiteur de type régulateur. Des essais vont
être menés prochainement dans ce sens pour clarifier ce point.

---

217
G. BIOTRANSFORMATIDN CUTANEE lN VITRO de l'IDC
chez laSOÛRIS MALE RAIRLESSetle RAT MALE ATRICHIS
1. Introducti on
Aprês avoir vérifié la nature et l'importance des réactions
catalytiques présidant à la biotransformation de la iodo-S-désoxy-2'-
cytidine chez la souris hairless et le rat atrichis au niveau rénal,
nous tentons, dans le présent volet, d' établir chez ces mêmes modêles
glabres dans quelles proportions la bioconversion cutanée de l'IOC,
dans les mêmes conditions, pourrait se rapprocher ou s'éloigner des
résultats obtenus avec le tissu rénal.
La plupart des travaux communiqués dans la littérature
ayant souvent rapporté l' activi té métabolique des organes étudiés à
celle du foie, nous avons choisi ici d'établir un parallêle entre
deux organes de non moindre importance : la peau et le rein.
La premiêre, externe et au contact de l'environnement, contrOle
l'équilibre du corps avec ce milieu l
le second, interne et filtrant,
rêgle l'hémodynamie et assure ainsi l'évacuation des déchets hors de
l'organisme.
Comme précédemment, nous avons envisagé, aprês étude
cinétique chez la souris hairless de la désamination de l ' IOC, une
détermination des constantes métaboliques chez les deux espêces
animales.
Un bref rappel des matériels et de la méthode utilisés est
donné conformément au paragraphe c.2 page 140 avant la présentation
des différents essais.

---

218
2. Matériels et Méthode
2.1. Animaux, Produits et Réactifs
Animaux
L'étude concerne, chez la souris mâle hairless, trois lots
randomisés de 10 animaux (sauf dans l'étude cinétique : un lot), de
poids moyen par lot 18,50 ± 1,30 g - 18,25 ± 2,20 g et 18,05 ± 1,84 g,
provenant du Centre de Sélection et d'Elevage des Animaux de Laboratoire
(C.S.E.A.L.) du C.N.R.S. - Orléans, France.
Chez le rat atrichis, l'étude concerne deux lots randomisés
de 4 animaux mâles, de poids moyen par lot 210,20 ± 3,40 g et 214,00 ±
1,45 g, fournis par le Centre d'Elevage IFFA-CREDO - St.Germain-sur-
l'Arbresle, France.
A réception, les animaux devant être en bon état physique
apparent, sont placés en contention dans des cages â métabolisme et
nourris ad ~ibitum pendant une semaine dans une pièce d'animalerie â
20°C, 50 â 60 , d'hygrométrie.
Produits et Réactifs
Les poudres de iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IDe), de iodo-5-
désoxy-2'-uridine (IDU), de iodo-5-uracile (lU) sont des produits
Sigma fournis par OSI - Marseille, France, ou OSI - Paris, France.
A réception, ces produits, bien que dOment étiquetés, sont
soumis â contrôle par exécution d'une série d'essais analytiques
applicables en routine â toute matière première chimique (Voir chapitre
B. 1., page 10(j).·
Les cristaux de sucrose, les poudres de chlorure de magnésium
et de tris-amino méthane, comme les solutions d'acide chlorhydrique et
de tampon phosphate pH 7,20 (ampoules titrisol), sont des produits MERCK
et nous ont été fournis par BAECKEROOT - Montpellier, France.
La conservation de ces produits et réactifs est faite selon
les spécifications commerciales.

---

219
2.2. Dispositifs de traitement de la peau
et instruments analytiques
L'appareillage de prélèvement, de broyage et d'homogénéisation
de la peau est prés~nté dans le paragraphe c.2.3. page 140.
L'analyse des échantillons biologiques (identification et
dosage des composés) est réalisée par Chromatographie Liquide Haute
Performance.
L'appareil, les autres instruments et les conditions
analytiques sont décrits dans le chapitre B.2, partie III de ce document).
2.3. Préparation des homogénats entiers cutanés
Les animaux une fois sacrifiés par dislocation cervicale, la
peau du dos et du flanc est rapidemenr prélevée et traitée comme décrit
de façon détaillée dans le paragraphe c.2.S. page1~2~.
1
L'homogénat entier cutané final obtenu (surnageant de
centrifugation 2000 g) constitue la solution d'enzyme.
La réaction de catalyse enzymatique de l'IDC par le tissu
cutané de souris hair1ess et de rat atrichis est suivie in vitro par
l'étude cinétique de biotransformation et par la détermination de Km
et de vmax apparents.
Un essai d'induction de l'activité enzymatique est tenté en
utilisant comme inducteur le méthyl-3-ch1oranthrène chez la souris
hair1ess.

---

220
.'
3. Etude cinétique de biotransformation cutanée in vitro
de l'IDC chez la sourlS mâle halrless
3.1. Protocole expérimental
Ce protocole est mené en utilisant un homogénat cutané
entier de souris hairless (surnageant de centrifugation 2000 g).
La réaction enzymatique est réalisée dans un bain-marie
A 37°C muni d'un système d'agitation permanente, pendant des temps
variables (Cf. tableau de résultats).
Dans des tubes à essais bouchés ,250 mg de tissu cutané
sont incubés en double en présence de 5,665 ~moles d'IOC incorporée
au centre de l'enzyme A l'aide d'une micropipette convenable de
précision.
Au bout de œhaque période d'incubation, la réaction est
arrêtée par introduction dans le tube A essais de 500
l de solution
refroidie d'acide trichloracétique 10 , en solution méthanol-eau
(50/50). Le tube est ensuite aussitôt placé à + 4°C pendant 30 minutes
avant de subir la suite du traitement (Cf. § B.3.2. page124).
L'analyse et la quantification des substances sont réalisées
par H.P.L.C.
(Chapitre B.3 page123 ) en double pour chaque échantillon,
mais seule la valeur moyenne arithmétique est prise en compte dans les
calculs.
3.2. Résul tats
Ces résultats (Tableau
XXX
) concernent un seul lot de
10 souris mâles hairless et sont exprimés en micromoles de métabolites
(IDU, lU) et en pourcentage de désamination de l'IDC pour 100 mg de
tissu cutané.

---

1
221
L'examen visuel des valeurs expérimentales (activités),
comme l'observation graphique directe, fait ressortir chez la souris
hair1ess au niveau cutané une activité désaminasique moins élevée
que celle exercée par la nuc1éosidase au cours de cette biotransfor-
mation in vitro de l'IDC et ce, 30 minutes après le début de
l'incubation.
Cette constatation, aussi notée au niveau rénal mais à
partir de la 6ème heure seulement, pourrait a priori difficilement
supporter l'explication déjà avancée, fondée sur une saturation de
mieux en mieux de l'enzyme 2, laquelle profiterait de l'augmentation
croissante de la production d'IDU.
Si cette hypothèse devait malgré tout être maintenue,
l'activité de la désaminase cutanée serait dans ce cas importante
d'emblée, ce qui activerait de façon intense l'étape 2 de la bio-
conversion du substrat. En effet, si l'IDU dosée à l'étape 1 n'est
pas résiduelle, alors se trouve posée toute la question sur l'importance
relative des deux réactions dans la biotransformation totale in vitro
comme in vivo
de l'IDC.
Une inhibition de l'étape 2, absente dans ce document, a été
envisagée pour tenter d'expliciter cet aspect; les résultats pourront
être communiqués ultérieurement.
Cependant, la relation
page 153
nous permettant tout de
même d'exprimer la désamination globale, nous pouvons noter qu'au
temps d'incubation 1 heure, le pourcentage cutané correspond au 15 ème
de la valeur (t) observée au niveau rénal chez le même modèle.
La biotransformation cutanée de l'IDC dans des conditions
in vitro chez la souris hair1ess peut ainsi être estimée faible,
comparativement au niveau rénal.

---

TABLEAU XXX
Cinétique de désamination in vitro au niveau cutané de l'IOC
chez la souris mâle hairless
Résultats en pmoles de métabolites (IOU, lU) et en pourcentage de désamination de l'IOC par 100 mg de tissu cutané.
Incubation à 37°C; tris pH 7,20
Temps
0,15
0,30
1,00
4,00
6,00
(h, mn)
(\\j
IDU
0,032
0,066
0,074
0,153
0,188
(\\j
(\\j
- -
0,023
0,054
0,059
0,142
0,172
-M
0,028
0~060
0,066
0,148
0,180
± 5.0.
0,028
0,06
0,013
0,005
0,008
0,045
0,060
0,156
0,420
0,400
lU
0,033
0,042
0,129
0,380
0,203
-M
0,039
0,051
0,142
0,400
0,389
± 5.0.
0,016
0,011
0,014
0,020
0,011
OE5AMINATION
1,182
1,959
3,672
9,673
10,014
(%)
5.0. = 0,529
5.0. = 0,476
5.0. = 0,476
5.0. = 0,441
5.0. = 0,335

---

223
Graphiques n° 27 a et b
RIQTRAN~FQRMATIQN CUTANEE IN UITRQ d. l'IDC :
Cin4tique chez la ,ouri, ~ale hairle"
.
1118
158
288
258
3118
358
488
TEIIPS : "n
CINETIQUE da DE~AMINATION CUTANEE IN UITRO d. l'IDC :
Pourcentage chez la souris ~ale hairless .
Acv, Ml' M : voir annotations pages
2

---

224
4. Détermination de Km et Vmax apparents
au niveau cutanê de blotransformation de l'IDe
chez la souris mâle halrless et le rat mâle atrichis
4 .. 10 Protocole expérimental
Dans cette étude, nous utilisons un homogénat entier cutané,
surnageant 2000 g de centrifugation, de souris male hairless ou de rat
mâle atrichis, provenant de trois lots pour la souris et de deux lots
pour le rat (Cf. § G.2.2. page 219).
L'incubation enzyme-substrat est effectuée à 37°C sous
agitation permanente pendant 60 minutes dans des tubes à essais bouchés,
en double, au bain-marie contenant 250 mg de tissu cutané en présence
de quantités croissantes de substrat IOC dans un volume total de 10 ml.
Le substrat est introduit à l"aide d'une micropipette
convenable de précision par injection au centre de l'enzyme; le tube
est alors mélangé par retournement lent.
Au terme de l'incubation, le volume de chaque tube est augmenté
de 500 ~l d'une solution refroidie méthanol-eau (50/50) d'acide tri-
chloracétique 10 , pour bloquer la réaction enzymatique. Les tubes sont
immédiatement placés à + 4°C pendant 30 minutes, puis le traitement des
échantillons est poursuivi comme décrit au paragraphe B.3 page123 ,.'
Analyse et quantification sont menées par H.P.L.C.
(paragraphes
B.3.4. et B.3.5., page127~èt;,135), en double pour chaque tube; seule la
valeur arithmétique moyenne est prise en considération dans les calculs.
4.2. Km et vmax apparents chez la souris mâle hairless au niveau cutané
Les résultats expérimentaux sont exprimés en ~moles de méta-
bolites (100, lU) pour 100 mg de tissu cutané , les valeurs de Km et de
vmax sont ensuite calculées sur l'ensemble des trois lots après compa-
raison statistique. En effet, la soumission des trois droites de
régression linéaire à une analyse de covariance simple à un critère n'a

---

225
révélé (Tableau
XXXII) aucune signification de la covariance. Le
parallélisme entre les droites étant accepté, les lots peuvent être
considérés comme homogènes. C'est ainsi que nous avons réuni les
résultats expérimentaux dans un pool commun en considérant pour chaque
lot la moyenne arithmétique issue des essais d'uneubation en double.
A partir de ce pool de résultats (TableauXXXI
), nous tirons
une régression moyenne dont l'étude de signification est ci-jointe
(Tableau
XXXI ).
Discussion
Il ressort des résultats consignés dans le Tableau
qu'il y aurait, sur la base de la valeur de r, corrélation entre
l'augmentation des valeurs de Vo et la variation de s.
De plus, le test de liaison exprimé ici par t, prend une
valeur significative avec un risque a bien inférieur à 1 0100.
La bioconversion cutanée in vitro de l'IDC chez la souris
mâle hairless est bien de type Michaelis-Menten.
Les valeurs de Km et de vmax apparents déterminées sont bien
différentes de celles obtenues au niveau rénal chez la même espèce
(paragraphe F.4 page '187). Et puisque l'on" admet, conformément aux
conclusions de l'analyse de covariance, qu'au niveau rénal les lots
étudiés de souris ne proviennent pas d'une même population, il reste
alo~s possible_1'avancer que la valeur de
Vmax
au niveau cutané
( S", 672 .1O-6M. h
) est de très loin inférieure aux valeurs observées au
niveau rénal au cours de cette étape 1 de bioconversion in vitro de
l'IOC.
La peau de souris mâle hairless en ce qui est de la
désamination de l'IOC, s'avère ainsi. largement,
moins active que
le rein chez le même modèle.

---

226
TABLEAU SOMME DES CARRES
**************************************************************************
*
VARIATION
*
X
*
XY
*
y
* DDL
*
'*'
FACTEUR
*
1). (H)I)('
*
1). 1)1)(11)
*
1). (11)1) 1
* 2
*
* RESIDUELLE
*
1).8699
*
@. 034)2
*
1).01)14
* 12
*
*
TOTALE
*
1).8699
*
1). 1)31)2
*
1).0015
* 14
*
-------------------------------------------------------------------------
*
F
*
0.(1)01)
*
*
0.5959
*
**************************************************************************
ANALYSE DE COVARIANCE
*********************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL
* VARIANCE
*
F
*
*
FACTEUR
*
1).000137
*
2
*
1). 1)('1)068 *
2. 2681)6\\)
*
*
RESIDUELLE
*
0.1)1)1)332
* 11
*
1). I)l)l)t)31) *
*
*
TOTALE
*
1).1)1)0469
*
13
*
1).1)1)1)1)36 *
*
*********************************************************************
TABLEAU GENERAL
***************************************************************************
.*
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL
* VARIANCE
*
F
*
* REG LIN MOY
*
\\). (1I)11)47
*
*
1).1)1)11)47 * 33.1)6551)1)
*
-------------------------------------------------------------------
*
FACTEUR
*
0.\\)1)1)137
*
..
NS
"
*
1). (1)01)68 *
2.162840
*-
* NON-PARALLE
*
O. (1)1)1)47
*
2
*
0.1)0l)1)24 *
0.7448
*
NS
* ECARTIDROITE
*
(1. (1)0285
*
9
*
1). ('(11)1)32 *
*
*
TOTALE
*
0.000469
* 13
*
0.0(1)1)36 *
*
****************************************************************************
COEFFICIENT DE REGRESSION B= .1)346886
GROUPE
YM (I)
XM (I)
YAM ( l )
1
.1)278
.2734
.0278
2
•1)2\\)4
.2734
.(21)4
.,.
.0242
.2734
.1)242
'-'
MOYENNE GEN.
.0241333
.2734
.0241333
VOULEZ-VOUS REVOIR LES RESULTATS? ·····C
Break in 1325

---

227
TABLEAU SOMME DES CARRES
**************************************************************************
*
VARIATION
*
X
*
XY
*
y
* DDL
*
*
FACTEUR
*
O. (1l3130
* -(1.0000
*
0.13010
* 2
*
* RESIDUELLE *
0.8699
*
13.0486
*
0.0031
* 12
*
*
TOTALE
*
0.8699
*
0.0486
*
13.0041
* 14
*
*
F
*
0.0000
*
*
1.9757
*
**************************************************************************
ANALYSE DE COVARIANCE
*********************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL
* VARIANCE
*
F
*
*
FACTEUR
*
0. 0010(18
*
2
*
0.000504 *
15.917300
*
*
RESIDUELLE
*
0.OÜ0348
* 11
*
O. ÜÜOl332 *
*
*
TOTALE
*
ü.üü1356
* 13
*
0.0ü01ü4 *
*
*********************************************************************
TABLEAU GENERAL
***************************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL
* VARIANCE
*
F
*
* REG LIN MOY *
(l. 002713
*
*
0.002713 *
71.85631)0
*
FACTEUR
*
0.001008
li-
2
*
0.000504 * 13.349413('
*$
* NON-PARALLE *
O. OÜO~309
*
2
*
0.000004 *
13.1127
* NS
* ECART/DROITE *
0.000340
*
9
*
O. I;H3131338 *
*
*
TOTALE
*
0.001356
* 13
*
0.000104 *
*
****************************************************************************
COEFFICIENT DE REGRESSION B= .0558487
GROUPE
YM (I)
XM (I)
YAM(I)
.0222
.2734
.0222
2
.ü152
.2734
.0152
~
. j
.035
.2734
.035
MOYENNE GEN.
.0241333
.2734
.0241333
VOULEZ-VOUS REVOIR LES RESULTATS?·'C

---

228
Graphique n° 28
1
10 6 M
0,072
1
2,419

---

229
Graphique n° 29
1
6
- - , l O M
3,703

---

TABL EAU XXXI
Km et Vmax apparents au niveau cutané de biotransformation in vitro de l'IOC
chez la souris male hairless
Résultats expérimentaux en nanomoles de métabolites (IDU, lU) par 100 mg de tissu cutané •
. Incubation à 37°C J tris-HCl pH 7,35
Métabolite 1 = IOU
Métabolite 2 = lU
Si}
v j}
o
M
± S.O.
Vo
R
± S.O.
21,876
21,150
o
1,416
35,450
28,142
8,017
* 22,408
20,520
l,57
l')
N
27,100
18,000
30,000
48,949
2,832
28,300
34,084
9,24
* 105,000
58,60
13,547
43,950
21,850
38,892
66,125
5,665
59,912
46,00
12,41
75,942
* 134,200
19,312
39,200
27,500
54,120
68,900
11,328
85,984
64,751
18,821
* 155,900
90,170
11,825
54,150
45,250
67,315
87,335
22,657
109,888
79,518
28,66
* 164,892
105,800
10,080
61,350
65,174
'* Valeurs provenant d'un même lot et re~etées
dans les calculs
rl
= 0,965
n = 10
rZ
= 0~970
n = 10
Constantes
S.O.
t
Slgniflcatlon
Constantes
5.0.
t
signiflcation
a =
0,034
0,009
14,85
P < 0,001
a =
0,066
0,013
b = 0,014
0,003
b .. 0,00027 0,015
16,083
P < 0,001
km
= 2,419 • 10-6 M
AKm
=
0,824
Km
= 244,45 • 10-6 M
A Km
= 13580,556
Vmax = 71,633. 10-9 M.h- 1
Avmax = 15,35
Vmax = 3703,70. 10-9 M.h- 1 Avmax = 205,761

---

231
4.3. Km et vmax apparents chez le rat nu mAle atrichis au niveau cutané
Les résultats expérimentaux sont exprimés en nanomoles
d'IOU métabolite par 100 mg de tissu, les faibles quantités d'lU
détectées ne nous ayant pas permis de quantifier ce composé.
Les valeurs de Km et vmax sont calculées après comparaison
statistique des deux lots considérés par analyse de variance simple
â un critère de classification.
La différence entre les deux lots, comme le montrent par
ailleurs (Tableau XXXIV) les valeurs excessivement proches de Vo en
tous points de la gamme de concentrations de S, étant non significative
au risque a inférieur â 1 0/00, ces souris peuvent être considérées
comme provenant d'une même population.
Nous avons par conséquent ici déterminé Km et Vmax à partir
d'~~ lot unique en constituant un pool commun des valeurs moyennes de
Vo obtcnues dans chaque lot, les dispersions respectives étant si faibles.
Un test de signification de la liaison a ensuite été effectué
après 'établissement d'une régression entre Vo et S â l'intérieur de ce
lot unique.
La valeur forte du coefficient de corrélation r, peu différente
de 1 comme celle de t, s'accorde à dire que la liaison est significative
à
< 1 0/00.
Ainsi, si l'on se réfère cette fois-ci à l'activité de la
cytidine désaminase de peau de souris (0,072.l0-6M.h- l ), la conclusion
évidente :st q~i l'act~vité désaminasique,de la peau de rat atrichis
(0,001.10 6M.h
) atte~nt seulement le 70eme de celle chez la souris
au niveau cutané dans nos conditions d'étude expérimentales et sur la
base des valeurs de Vmax.

---

TABLEAU XXXIV
Km et Vmax apparents de dêsamination cutanêe in vitro de l'IOC
chez le rat nu mâle
Résultats en nanomoles d'IDU par 100 mg de tissu.
Incubation à 37°C ; tris-HCI 0,05 M pH 7,20 ; 1 heure
si)
voj)
Ml)
S.O.
-
-
-
0,566
0,286
0,275
± 0,010
0,265
C\\J
(Y')
0,523
C\\J
1,416
0,501
± 0,021
0,480
2,832
0,673
0,654
± 0,018
0,636
5,665
0,827
0,802
± 0,025
0,777
11,331
1,016
0,999
± 0,017
0,982
14,164
1,044
1,024
± 0,020
1,004
r 2 = 0,999
n
= 12
Constantes
S.O.
t
Signification
a
'"
1,545
0,096
9,995
P < 0,001
b
=
0,917
0,036
- -
Km
= 1,684 • 10-6 M
l
li Km
= 0,124
Vmax =
9
-
1,090 • 10-
M.h
li vmax
=
0,043

---

233
. Graphi que no 30
tt-i)
~"o
1
• 106 M
----
0,0011
1

---

234
4.4. Conclusion à l'étude de la biotransformation cutanée
in ~tro del'IDCche~la souris m~le hairless
et chez le rat mAle atrichis
L'étude au niveau cutané de la biotransformation in vitro
de l'IOC chez la souris hairless et le rat atrichis montre que le
profil métabolique obtenu demeure qualitativement identique à celui
observé avec le tissu rénal : il y a transformation enzymatique de
l'IOC en IDU et lU.
Chez la souris hairless, le pourcentage de conversion
in vitro de l'IOC par la peau au bout d'une heure n'atteint que le
ls ème de la quant.ité observée avec le rein, l'activité de la
nucléosidase cutanée au-delà de ce temps devenant cependant de
plus en plus grande.
Comme au niveau rénal, le rat atrichis s'avère ici encore
moins métabolisant que la souris hairless, la valeur de Vmax
(0,001.10-6M.h- l ) demeurant nettement inférieur à Vmax chez la souris
(0,072.l0-6M.h-l) dans les conditions expérimentales précédemment définies
Par ailleurs, nous avons noté peu d'iodouracile produit
avec le tissu cutané (surnageant 2000 g) de rat atrichis. Ceci
pourrait vouloir dire que l'activité nucléosidasique cutanée faible
chez cette espèce serait liée soit à de moindres teneurs du tissu en
enzyme, soit à la faible production d'IDU substrat, métabolite de
l'étape 1.
Et si on attribue, chez la souris, au Km déterminé à
l'étape 2 de la bioconversion de l'IOC in vitro, une valeur
significative, alors le tissu cutané de souris hairless contiendrait
une nucléosidase beaucoup plus active que le tissu rénal, à moins
qu'il s'agisse là d'une forme moléculaire différente de l'enzyme.
Nous ferons remarquer qu'au sujet de l'adénosine désaminase
chez l'espèce humaine, un certain nombre de travaux (165, 166)
rapportent l'existence de trois formes moléculaires cutanées et
exhibant, vis-à-vis de l'adénosine, des valeurs de Km bien distinctes.

---

235
5. Essai d'induction par le méthyl-3-cholanthrène
de l'activltedela cytldlne dê~aminase au nlveau cutané
chez la sourlS mâlehairless
L'essai d'induction du métabolisme cutané de l'IOC par
le méthyl-3-cholanthrène est ici entrepris pour encore tenter de
mieux appréhender la qualité de l'activité des systèmes enzymatiques
cutanés intervenant.
Bien que le rein de souris ait été retenu comme la source
de référence de la cytidine désaminase, nous n'avons pas envisagé à
ce niveau une étude d'induction du métabolisme de l'IOC. En effet,
la différence entre les monooxygénases existant de façon quantitative
et/ou qualitative entre les systèmes hépatiques et extrahépatiques
(161) se retrouve également entre les organes extrahépatiques eux-mêmes.
Le tissu rénal pourrait à cet égard ne pas constituer une
valeur référentielle. Et comme le rapporte PANNATIER (149) d'après les
travaux de FEUER et Coll., après pré-traitement par certains inducteurs,
notamment le phénobarbital et le méthyl-3-cholanthrène, l'activité
d'enzymes telles que l'aminopyrine déméthylase, l'aniline hydroxylase,
la 3-coumarine
•
hydroxylase ou l'hexobarbital-oxydase, n'est pas stimulée
de façon significative qu'au niveau du tissu hépatique, mais pas du tout
dans les autres organes considérés (cerveau, rein, intestin, cortex
surrénal) •
Peu d'enzymes ont été testées comme systèmes inductibles au
niveau cutané. Chez le rat, l'activité cutanée de l'arylhydrocarbon-
hydroxylase est inductible par une simple application locale de biphényls
polychlorés. D'autres composés, les aromatiques polycycliques ou les
benzoflavones, sont des inducteurs de l'arylhydrocarbon-hydroxylase
cutané (Cf. Paragraphe A.2.2. page 97).
Dans le présent essai, nous tentons pour notre part de
rechercher au niveau cutané chez la souris hairless, l'existence d'une
possibilité éventuelle d'induire l'activité de la cytidine désaminase
(cytidine aminohydrolase) en utilisant le méthyl-3-cholanthrène.

---

236
5.1. Protocole expérimental
L'essai d'induction de l'activité de la cytidine désaminase
de peau de souris est ici mené chez un lot de 6 souris hairless mâles
de poids moyen 19,40 ± 1,65 g.
La source d'enzyme est constituée par l'homogénat entier
cutané, surnageant de centrifugation 2000 g, obtenu suivant les
opérations décri tes dans le paragraphe C. 2.5. page 1-.t,Z-. -'1 lA <L
L'administration de l'inducteur est effectuée par voie
locale, la voie d'administration tenant un certain rôle dans la
régulation de l'induction. Le méthyl-3-cholanthrène dissous dans
l'acétone, est appliqué sur le dos et les flancs de la souris,
parties devant plus tard servir à la préparation de l'homogénat
cutané.
Pendant quatre jours, l'administration est obtenue par
badigeonnage le matin à 9 h.30, à deux lots distincts de 4 souris
mâles hairless
chacun, d'une solution d'inducteur de concentration
différente (149). L'un des deux lots (Lot 3) reçoit une dose de
méthyl-3-cholanthrène équivalant à 100 mg/kg/jour dans 1 ml d'acétone,
l'autre (Lot 4) reçoit le dixième de la dose administrée au lot 3.
Dans les deux cas, 250 microlitres sont administrés sur chaque flanc
et 500 microlitres sur le dos.
Le lot 2, également de 4 souris, étant traité uniquement à
l"acétone, le lot 1 (4 souris) non traité constitue le lot témoin,
tous ces animaux répondant au départ aux caractéristiques générales
décrites dans le paragraphe C.2.5. page .J,~ 1'1~
Après traitement, les prélèvements de peau ne sont effectués
que le cinquième jour.

---

237
5.2. Résultats - Discussion
Les résultats consignés dans le Tableau XXXVI sont exprimés
en nanomoles de métabolites 1 et 2 (IDU, lU) par 100 mg de tissu
cutané.
L'observation directe des valeurs de Vo pour les deux doses
de substrat testées fait apparaître des chiffres peu différents entre
les quatre lots étudiés.
L'usage de l'acétone d'une part, mais aussi le traitement
par le méthyl-3-cholanthrêne à 100 mg/kg/jour comme à 10 mg/kg/jour,
ne semblent pas avoir d'effet quelconque notable sur les systèmes
enzymatiques cutanés impliqués dans la bioconversion de l'IOC, ceci
tout au moins dans les conditions d'application ici retenues de
l'inhibiteur.
Cette constatation semble concorder avec un certain nombre
d'indications bibliographiques selon lesquelles (149) la peau
constitue un organe métabolique extrahépatique en général peu
inductible au vu néanmoins des rares travaux communiqués à ce jour,
exception faite de la récente publication par BICKERS, MUKHTAR et
YANG (111) de l'induction, par le BPC (biphényl-polychloré) associé
au M3C, de la formati<:ln chez la souris C 57 BL 16 N susceptible aux
tumeurs et chez le rat nouveau-né Sprague-Dawley résistant aux tumeurs,
du métabolite procarcinogêne du benz{a}pyrêne (BaP), le BaP-7,S diol.

---

TABLEAU XXXVI
Essai d'induction par le méthyl-3-cholanthrène de l'activité de la cytidine désaminase au niveau cutané
chez la souris mâle hairless
Résultats en nanomoles de métabolites (IDU, lU) par 100 mg de tissu.
IncUbation 1 heure à 37°C; tris-HCl pH 7,20 0,005 M de doses différentes d'IDC
Lot 1
Lot 2
Lot 3
Lot 4
Métabolites
o *
r
--
V
S.O.
Vo
M
S.O.
Vo
M
S.O.
Vo
M
S.O.
!DU
40,565
_,38,983
34,068
32,769
42,938
41,469
42,825
41,469
al
- -
37,401
f
1,582
31,469
± 1,300
40,00
± 1,469
40,113
± 1,356
C'J
N
a)
ru
12,250
10,417
10,200
8,750
16,250
14,034
19,567
17,367
8,584
± 1,833
7,300
± 1,45
11,817
± 2,217
15,166
± 2,200
- -
!DU
47,175
45,198
44,226
42,768,
50,961
49,156
50,848
49,153
-
43,220
1,978
41,310
1,458
47,156
1,806
47,458
1,695
b)
ru
14,834
13,200
15,334
13,000
18,334
18,100
26,666
25,700
11,567
1,634
10,667
2,334
17,867
0,234
24,734
0,966
a)
IncUbation de 5,665 ~moles de sUbstrat (IDC)
b)
IncUbation de 11,30 ~moles de sUbstrat (IDC)
*
Quantité de métabolite. h- l
. 100 mg- l de tissu par tUbe d'incUbation
** Valeur moyenne de l'incUbation à doUble

---

239
H. BIOTRANSFORMATION CUTANEE IN VITRO de l'IDC
chez l'ESPECE HUMAINE
1. Introducti on
L'étude du métabolisme de l'rOC, tant au niveau rénal
que cutané, chez la souris male hairless et chez le rat sans poil
atrichis, a révélé des résultats expérimentaux quantitativement
différents chez les deux espèces et entre les deux organes.
Ceci étant, nous avons envisagé une étude in vitro chez
l'espèce humaine, tout au moins au niveau cutané, espèce cible de
la thérapie antiherpétique par les nucléosides.
Nous avons donc cherché à =llecter des prélèvements de
peau vivante provenant de sujets en bonne santé physique apparente
et consultant librement en chirurgie pour raisons de bien-être
esthétique.
Au cours de cette étude de biotransformation cutanée
in vitro de l'rOC chez l'espèce humaine, nous allons successivement
envisager après 1'1aspect cinétique, la détermination de Km et de
vmax apparents et l'inhibition par la désoxy-cytidine.
L'étude de Km et de vmax apparents, placée à la fin de
ce chapitre et qui utilise comme substrat, de l'rDU, présente
l'intérët d'explorer la deuxième étape de la biotransformation
cutanée de l'roc dans des conditions de saturation en substrat
chez l'espèce humaine.

---

240
2. Matériels et Méthodes
2.1. Prélèvements cutanés et produits réactifs
Les prélèvements de peau utilisés dans cette étude ont
été récupérés auprès de la Clinique de Chirurgie Esthétique
Clémentville à Montpellier, grâce à l'amabilité de son équipe
dirigée par le Voc.teUIL J. COMTE.'
Les caractéristiques des sujets donneurs et les conditions
de prélèvement comme de transport au Laboratoire sont décrits dans
le paragraphe C.2.2. page HO .
Les produits et réactifs chimiques sont identiques à ceux
impliqués dans l'étude chez la souris hairless et le rat atrichis
(paragraphe G.2.1. page218).
,
2.2. Dispositifs de traitement de la peau
et instruments analytiques
L'appareillage de broyage et d'homogénéisation est décrit
dans le paragraphe C.2.3. page 140, tandis que dans le chapitre B.3
page 12~ sont présentés l'appareil et les instruments annexes de
chromatographie.
2.3. Préparation de l'homogénat entier cutané humain
Les prélèvements de peau humaine frais ou décongelés
sont traités suivant le protocole décrit dans le paragraphe C:2.6.
page 14J,; le stade terminal est l'obtention du surnageant 2000 g de
centrifugation, solution d'enzyme qui va être utilisée dans la
réaction enzymatique. Un millilitre de cette solution correspond
à 250 mg de tissu cutané.

---

o
241
3. Cinéti~ue de désamination cutanée in vitro de l'IDC
chez 1 espèce humalne
3.1. Protocole expérimental
La source d'enzyme cutanée étant le surnageant 2000 g,
la réaction enzymatique consiste en l'incubation à 37°C dans un
bain-marie sous agitation permanente de 5,665 ~moles d'IOC en
présence de 250 mg de tissu cutané pendant 5, 15, 30, 60 minutes,
2, 4, 6, 12, 18, 24 heures.
Le substrat est introduit au centre de l'enzyme par
injection à l'aide d'une micropipette de précision Eppendorf de
volume convenable, et le contenu du tube est mélangé par
retournement lent.
L'étude cinétique est menée distinctement sur 5 homogénats
entiers cutanés correspondant à 5 sujets ; les essais sont réalisés
en double, le volume d'incubation atteint 10,00 ml en ajoutant du
tampon tris-HC1, MgC12, pH 7,20.
Au bout de chaque temps de la cinétique, l'incubation est
arrêtée par introduction dans le tube à essais de 500 microlitres
d'une solution méthanolique refroidie d'acide trichloracétique 10 %
mélange méthanol-eau (50/50).
Le tube est alors placé à + 4°C pendant 30 minutes et les
opérations de traitement sont poursuivies conformément au paragraphe
B.3.1. page 123.
Le contenu des échantillons est analysé comme le dosage
des composés effectué par H.P.L.C.
{paragraphes B.3.4. et B.3.5.
page.. 127)...,
•
1

---

- "
242
3.2. Résultats
Les résultats expérimentaux (Tableau XXXVII) sont exprimés
par peau de sujet humain en micromoles de métabolites (IDU, lU) pour
100 mg de tissu cutané dans les conditions opératoires du paragraphe
H.3.!. page 241.
Un pourcentage de désamination de l'IDe est ensuite calculé
pour rendre compte de la biotransformation globale du substrat.
Ce pourcentage est obtenu d'après l'expression donnée à la
page 153.
3.3. Discussion
L'étude cinétique de la biotransformation cutanée in vitro
de l'IDe est menée chez 5 sujets. Elle fait apparattre que la peau,
chez l'espèce humaine, possède, comme chez la souris et le rat, une
activité désaminasique et nucléosidasique vis-à-vis des nucléosides
pyrimidiques tels la iodo-5-2'-désoxycytidine.
Les tableaux ~!!Iet , comme les représentations graphiques
qui Les soutiennent, montrent qu'aussi bien pour l'étape 1 de désami-
nation que pour l'étape 2 d'hydrolyse de l'IDe, la capacité métabolique
de la peau varie d'un individu à l'autre pour un même site cutané
(peau de la base du sein). Cette variabilité entre les sujets s'inscrit,
pour les cinq considérés ici, dans une échelle allant de 2 à 7 pour
le temps d'incubation 1 heure, ou de 7 à 21 lorsque l'on considère le
temps 6 heures (Voir Tableau xxxvmpage247 - tableau des pourcentages).
Chez tous les sujets cependant et jusqu'au temps 6 heures,
l'activité désaminasique apparatt supérieure à celle de la nucléosidase.
Cette dernière (sujets 3 et 5) ne s'accélère qu'à partir de la 10ème
heure environ, appauvrissant alors le pool d'IDU naissant de l'étape 1,
ce qUi se traduit par un affaissement virtuel de l"activité de la
désaminase. Ainsi, l'on pourrait peut-être admettre maintenant que
l'hypothèse émise au niveau rénal et cutané chez la souris hairless à
ce sujet soit encore de mise.

---

243
Dans les conditions de notre étude et pour les 5 sujets
considérés, l'activité désaminasique globale au temps d'incubation
1 heure chez l'espèce humaine représente 3,5 à 12,5 , de l'activité
désaminasique rénale totale de souris. En d'autres termes, la
bioconversion in vitro de l'IOC au temps d'incubation 1 heure est
de 8 à 29 fois inférieure à celle occasionnée par la source enzymatique
animale connue la plus active, le rein de souris.
CAMIENER et SMITH (1601 en 1965, ont observé en utilisant
comme substrat la cytosine arabinoside, que chez l'espèce humaine, le
rein était doué d'une activité désaminasique importante. Mais l'absence
de données en ce qui concerne l'LOC chez cette espèce ne nous permet
pas ici d'établir un parallèle peau/rein intraspécifique. Cependant,
il ne demeure pas de doute que l'activité cutanée (versus rénal) de
la cytidine désaminase, dans un tel cas de figure, pourrait para!tre
encore plus faible.

---

TAB LEAU XXXVII
Cinétique de désamination au niveau cutané in vitPO de l'IDC
chez l'espèce humaine
Résultats en ~moles de métabolites (IDU, lU) par 100 mg de tissu cutané.
Incubation de 5,665 ~moles d'IDC à 37°C; tris pH 7,20
Temps (h, mn)
0,05
0,15
0,30
1,00
2,00
4,00
6,00
12,00
18,00
24,00
Peau-n° 1
0,048
0,061
0,128
0,190
0,306
0,412
0,540
± 0,004
± 0,001
± 0,007
± 0,008
± 0,011
±0,010
± 0,010
"t
0,015
0,039
-
0,212
0,288
0,298
0,443
0,604
1 ,225
1 ,470
"t
C\\I
Peau n° 2
±0,002
± 0,002
± 0,006
± 0,015
± 0,012
± 0,008
± 0,003
± 0,013
±0,032
:1
0,062
0,089
0,160
0,250
0,364
0,534
0,667
1,065
0,359
Peau n° 3
-
CI
±0,002
± 0,004
± 0,007
± 0,008
± 0,008
±0,010
± 0,011
±0,018
±
± 0,006
....
Peau n° 4
0,007
0,017
-
0,090
0,236
0,278
0,334
-
0,657
0,760
± 0,004
± 0,009
± 0,009
± 0,008
±0,016
±0,022
± 0,012
± 0,010
Peau n° 5
0,027
0,038
0,068
0.118
0,165
0,225
0,303
-
0,623
0,840
±0,003
± 0,006.
± 0,004
± 0,009
±0,005
± 0,003
±0,003
± 0,006
± 0,015
Peau n° 1
0,008
0,012
0,014
0,020
0,038
0,066
0,096
± 0,003
± 0,002
± 0,003
± 0,003
± 0,005
± 0,002
± 0,007
Peau n° 2
0,005
0,006
-
0,015
0,029
0,050
0,085
0,094
0,120
0,136
± 0,002
±0,003
± 0,006
± 0,006
± 0,007
±0,003
± 0,002
± 0,006
±0,010
~I Peau n° 3 0,034 0,096 0,102 0,127 0,209 0,282 0,514
1,212
-
1,910
± 0,005
±0,002
±0,022
± 0,013
± 0,008
± 0,010
± 0,002
± 0,021
± 0,014
Peau n° 4
0,005
0,007
-
0,018
0,040
0,051
0,058
-
0,270
0,415
± 0,003
± 0,003
± 0,002
± 0,003
± 0,004
±0,007
± 0,008
± 0,005
Peau n° 5
0,019
0,040
0,043
0,045
0,059
0,077
0,157
-
0,640
0,924
±0,002
± 0,004
± 0,003
± 0,003
± 0,001
± 0,008
± 0,003
± 0,007
±0,005

---

245
Graphiques n° 30 a et b
DESANIMATIOM CUTANEE lM UITRO de l'IDe che% l' ESP.HUMAIHE:
1.
Cin4tique des activit4s ,4tape 1.chez ~ sujets f4.înins.
Acv
1.
288
488
688
888
1888
1288
1488
1688
TEIIPS : lin
Il5:SAIlIHATlOH CUTAIl'i de l'IDe chu l'ESP.Il1IIl4lIIŒ:
2.
Cin4tique des activit4s, 4tipe 2 • chez ~ sujets f~inins~
Acv
1.
1.
1.
L"
1.
Acv : voir annot at ions page
l, 2, 3, 4, 5 : courbe cinétique chez les sujets respeCtifs.

---

246
Graphiques nO 31 a et b
DESAKINATION CUTANEE IN UITRO de l'IDC chez l'ESP.HUKAINE,
Cin4tique des activitts,4tape l, chez 5 sujets f~~inins.
8
DESAKINATION CUTANEE IN UITRQ de l'IDC chez l'ESP.HUKAINE:
Cn4tique des activit~s,4tape 2,chez 5 sujets f4~inins.
8
58
188
158
288
258
388
358
488
TEIII'S : "n

---

TABLEAU XXXVIII
Cinétique de désamination au niveau cutané in'vitro de l'IDC
chez l'espèce humaine
Pourcentage (%> de désamination par 100 mg de tissu cutané
Temps (h, mn)
0,05
0,15
0,30
1,00
2,00 '
4,00
6,00
12,00
18,00
24,00
Peau nO 1
0,99
1,28
2,50
3,70
6,07
8,43
11,22
ro-
<t
± 0,012
± 0,05
± 0,17
± 0,19
± 0,28
± 0,21
± 0,30
N
Peau n° 2
0,35
0,79
-
4,00
5,59
6,14
9,32
12,32
23,74
28,34
± 0,07
± 0,08
± 0,21
± 0,37
± 0,33
± 0,19
± 0,08
± 0,33
± 0,74
Peau n° 3
1,69
3,26
4,62
6,65
10,11
14,40
20,84
40,19
-
40,05
± 0,12
± 0,10
± 0,51
± 0,37
± 0,45
± 0,35
± 0,22
± 0,68
± 0,35
Peau n° 4
0,21
0,42
-
1,90
4,87
5,80
6,92
-
16,36
20,74
± 0,12
± 0,21
± 0,19
± 0,19
± 0,35
± 0,51
± 0,35
± 0,26
Peau nO 5
0,81
1,37
1,96
2,87
3,95
5,33
8,12
-
22,29
31,13
± 0,08
± 0,17
± 0,17
± 0,21
± 0,10
± 0,19
± 0,10
± 0,22
± 0,35

---

248
Graphique nO 32 a
DESA"INATION CUTANEE IN UITRO dl l'IDC chlz l'ESP.HU"AIHE:
Cinétiques des (~) chez 5 sujets fé.inins .
8
Z88
488
688
888
1888
1288
1488
TEIlPS : "n

---

249
Graphique nO 32 b
ŒSAIIINATIOH CUTANEE IN UITRO d. l' IOC chu )' ESP. HUIIllIHE:
22.
Cin4tique du (:c) chez 5 sujets Ftlllinins .
m28.
17.
15.
12.
18.
7.
5.
2.
1
1
1
1
1
1
188
158
288
258
388
358
488
TEIIPS:1fn

---

250
4. Détermination de Km et de Vrnax ap~arents
au niveau cutanê de blotransforma 10n in vitpo de l'IDC
chez l'espece humalne
4.1. Protocole expérimental
Km et VInax apparents de biotransformation de l'IOC sont
déterminés au niveau cutané chez l'espèce humaine par incubation
à 37°C sous agitation permanente dans un bain-marie de 250 mg de
tissu cutané en présence de quantités croissantes d'IOC (Cf. Tableau
de résultats).
L'introduction de substrat est réalisée par injection au
centre de la solution à l'aide d'une micropipette de précision
Eppendorf convenable.
Le volume total d'incubation atteint la ml en ajustant
avec du tampon tris-HCl, MgC12' pH 7,20.
Les tubes sont incubés, bouchés durant 60 minutes , AU bout
de ce temps, la réaction est bloquée par rajout de 500 ~l de solution
méthanol-eau (50/50) d'acide trichloracétique la , refroidie. Le
milieu ainsi déféqué est placé à + 4°C pendant 30 minutes ; le
traitement est ensuite poursuivi d'après la description du protocole
exposé dans le paragraphe B.3.2. page124.
L'analyse et le dosage des substances sont effectués par
H.P.L.C.
(Voir paragraphes B.3.4. et B.3.s. page127).
Les injections chromatographiques sont faites en double.
Pour chaque échantillon, seule la valeur moyenne arithmétique est
utilisée dans les calculs.
4.2. Résultats
Les métabolites quantifiés sont exprimés en ~moles pour
100 mg de tissu cutané dans les conditions opératoires ci-dessus ;
les valeurs expérimentales de Va sont consignées dans les Tableaux
XXXIX A et B.

---

TABLEAU XXXIX
Km et Vmax apparents de biotransformation cutanée in vitro de l'IDC
chez l'espèce humaine
Incubation à 37°C, tris pH 7,20
~ : Métabolite 1 (IOU)
: Valeurs expérimentales de Vo en fonction du substrat
Si)
0,708
1,416
2,832
5,665
11,331
16,997
22,662
28,328
r 2 - n
V j
o ) (1)
0,075
0,196
0,199
0,360
-
0,432
-
0,565
r 2 =0,973
± 0,002
±0,001
± 0,002
± 0,006
± 0,003
± 0,009
n = 12
r i
III
N
r 2 =0,940
Vo
( 2)
0,086
0,112
0,133
0,164
0,251
0,266
0,330
0,368
± 0,008
± 0,001
± 0,004
± 0,005
± 0,003
± 0,001
± 0,007
± 0,002
n = 16
Vo
(3)
0,097
0,217
0,240
0,268
0,371
0,383
0,457
-
r 2 =0,972
± 0,003
± 0,00
± 0,001
± 0,004
± 0,002
± 0,003
± 0,006
n = 14
Vo
(4)
0,039
0,103
0,143
0,199
0,236
-
0,270
-
r 2 =0,977
± 0,004
± 0,010
± 0,005
± 0,006
± 0,002
± 0,001
n = 12
Vo
(5)
0,054
0,116
0,175
0,286
0,285
0,297
-
0,344
r 2 = 0,991
± 0,006
± 0,002
± 0,004
± 0,005
± 0,002
± 0,003
± 0,004
n = 14
i)
S = Quantité de substrat à dose croissante dans 10 ml de milieu d'incubation.
j)
Vo = Vitesse d'apparition du métabolite (IOU) exprimée en ~moles • h- 1 par 100 mg de tissu cutané.

---

TABLEAU XXXIX
Km et Vrnax apparents de biotransformation cutanée in vitro de l'lOG
chez l'espèce humaine
Incubation à 37°C; tris pH 7,20
B : Métabolite 2 (lU)
: Valeurs expérimentales de Vo en fonction du substrat
S
0,708
1,416
2,832
5,665
11,331
16,997
22,662
28,328
r 2 - n
C\\I
V
C\\I
o (1)
0,024
0,040
0,068
0,078
-
0,086
-
0,100
r 2= 0,995
l!l
± 0,003
± 0,003
± 0,002
± 0,001
± 0,005
± 0,001
n = 6
Vo (2)
0,013
0,017
0,019
0,033
0,102
0,186
0,208
r 2 = 0,889
< 0,004
± 0,002
±0,003
± 0,001
± 0,003
± 0,005
± 0,004
± 0,005
n =7
Vo (3)
0,039
0,045
0,064
0,098
0,129
0,131
0,169
-
r 2= 0,942
± 0,002
± 0,002
± 0,001
± 0,006
± 0,007
± 0,004
± 0,005
±
n =7
Vo (4)
0,002
0,024
0,034
0,043
0,055
-
0,072
-
r 2=0,813
± 0,001
± 0,001
± 0,003
± 0,002
± 0,002
± 0,009
n = 6
Vo (5)
0-,008
0,021
0,027
0,034
0,043
-
0,056
-
r 2=0,975
± 0,002
± 0,001
± 0,003
± 0,003
± 0,002
±0,003
n = 6

---

1
TABLEAU xxxx
A
(Suite)
Détermination de Km et Vmax apparents au cours de l'étape 1 de biotransformation cutanée in vitro de l'IDC
CONSTANTES
CINETIQUES
a
b
t
Signification
Km
à.Km.
V~x
àVmax
( 1)
7,882
1,452
18,984
P < 0,001
5,422
0,305
0,688
'# 0,1
C"l
III
N
(2)
6,214
3,725
14,810
P < 0,001
1,688
0,367
0,268
0,004
(3)
5,387
2,145
20,410
P < 0,001
2,511
0,179
0,466
0,005
(4)
15,556
2,007
20,611
P < 0,001
7,758
2,597
0,498
0,111
(5)
11,096
2,105
36,352
P < 0,001
5,271
1,647
0,475
0,090
Km
apparent moyen
= 4,526. 10-6M
à Km
=
2,192
à vmax
Vmax
apparente moyenne = 0,479 • 10-6M
li- 1
=
0,133

---

TABLEAU XXXX
B
(Suite)
Détermination de Km et Vmax apparents au cours de l'étape 2 de biotransformation cutanée in vitro de l'IDC
CONSTANTES
CINETIQUES
a
b
t
Si gnifi cati on
Km
à Km
Vmax
à:Vmax
( 1)
22,892
8,844
28,213
P < 0,001
2,588
'<t
0,759
0,113
0,002
III
N
(2)
105,019
12,176
6,328
P < 0,001
8,625
3,178
0,082
< 0
( 3)
14,953
7,672
9,011
P < 0,001
1,902
0,240
0,130
0;009
(4)
336,617
43,062
4,170
0,02<p<0,01
7,817
43,180
0,023
0,123
(5 )
74,021
12,412
12,490
P < 0,001
5,963
4;752
0,080
0,042
Km
apparent
moyen
5,379
1O-6M
à Km
=
2,709
Vmax apparente moyenne
0,085
1O-6M • h- 1
à VInax
=
0,036

---

255
Graphique n° 33
1
0,268
1
3 =
106 M
0,466
1
106 M
4 = 0,498
1
106 M
5 = 0,475
1
,688
1
Ys
5,422

---

256
Graphique n° 34
1
1
106 M
=
0,113
. 1
106 M
2 =
0,082
1
106 M
3 =
4)1
0,130
1
106 M
4 =
0,023
1
106 M
5 = - - -
0,080
1
l'
-
::;:
106 M
2,588
1
6
2' = -
10
M
8,625
1
6
3' -
10
M
1,902
1
4' -
106 M
7,817
1
6
S' -
. 10
M
5,963

---

_ 257
4.3. Discussion
Les valeurs de Km et Vmax dans le Tableau XXXX sont
calculées pour chacun des 5 sujets, l'analyse de covariance simple
étant significative et le non parallélisme accepté.
Cette conclusion statistique confère ainsi une signification
à la variabilité des valeurs de Km observée au niveau cutané chez les
5 sujets considérés dans l'étude de désamination in vitro de l'IDC.
6
-6 L'échelle des valeurs de Km variant de 1,688.10- M à
7,758.10
M, nous avons admis de déterminer, pour simplifier
l'argumentation et établir des comparaisons éventuelles, une valeur
centrale dans cette échelle de variabilité: la médiane 5,271.10-6M.
Il en sera de même pour la Vmax.
Ainsi, comparativement à Vmax médiane observée chez la
souris hair1ess au niveau rénal (19.10-6M.h-1 ), il apparaît que
l'activité désaminasique de la peau humaine (0,479.10-6M.h-1 ) pour
les 5 sujets étudiés pourrait être définie comme étant 38 fois
moins élevée.
Mais il pourrait être également concevable de considérer
que la peau des 5 sujets étudiés provient d'un groupe hétérogène
défini par une moyenne arithmétique laquelle, vu le petit effectif
du groupe, ne traduit aucune réalité de la population d'où est issu
ce groupe.
Sous cet autre angle, nous avons estimé, et ne serait-ce
qu'à titre indicatif, de calculer un Km moyen et une Vmax moyenne
de biotransformation de l'IDC pour chacune des étapes 1 et 2. Les
valeurs trouvées sont présentées dans les Tableaux XXXX A et B.
A ce moment-là, selon la valeur de Vmax que l'on considère
chez la souris au niveau rénal (étape 1) 19 - 21 ou 15 10-6M.h-1 ,
6
l'activité désaminasique de la peau humaine (0,479.10- M.h-1 ) repré-
sente le 31ème, le 38ème, ou le 43ème de l'activité de notre modèle
de référence.
Ainsi, quel que soit le raisonnement choisi, l'activité de
la nucléoside désaminase (cytidine désaminase) est variable chez
l'homme d'un sujet à l'autre. De plus, celle-ci demeure d'intensité
limitée.

---

258
PEAU
HUMAINE
METABOLITE
1
!DU
3.5ü8
.059
3.367
.035
2.906
TABLEAU SOMME DES CARRES
**************************************************************************
VARIATION
*
x
XY
y
* DDL
*
*
FACTEUR
*
0.0508
*
~). 7869
* 88.522ü
* 4
*
* RESIDUELLE
*
7.4282
* 67.4703
* 747.5880
* 29
*
*
TOTALE
*
7.4790
* 68.2571
* 836.1100
* 33
*
*
F
*
0.0496
*
*
0.8585
*
**************************************************************************
ANALYSE DE COVARIANCE
*********************************************************************
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL
* VARIANCE
*
F
FACTEUR
* 78.404900
*
4
* 19.601200 *
4.07282\\)
RESIDUELLE
* 134.7550130
* 28
*
4.812691} *
*
TOTALE
* 213.160000
* 32
*
6.661260 *
*
*********************************************************************
TABLEAU GENERAL
*~*f*******************************t,***.*************
**********************
VARIATION
* SOMME DES CARRES * DDL * VARIANCE *
F
* REG LIN MOY * 612.832000
1
* 612.832000 * 420.913000
*
FACTEUR
* 78.404900
*
4
* 19.601200 *
13. 4627(H)
s
*
* NON-PARALLE * 99. 81230~3
*
4
* 24.953100 * 17.1386
• ~l)W Il
*
* S
ECART IDROITE
* 34.943100
* 24
*
1.45596(1 *
*
1
*
TOTALE
* 213.160000
* 32
*
6.661260 *
*
*****************************************************~**********************
COEFFICIENT DE REGRESSION B= 9.083
GROUPE
YM (I)
XM ( l )
YAM (Il
1
5. ~J5333
.456833
4.66
2
5.9575
.359125
6.45166
3
4.32957
.405429
4.4(1315
4
9.21783
.463167
8.76698
5
6.58986
.404143
6.67512
MOYENNE GEN.
6.16832
.413529
6.19138
VOULEZ-VOUS REVOIR LES RESULTATS? AC
Br-eak in 1325

---

259
PEAU
HUMAINE
METABOLITE
2
= IU
TABLEAU SOMME DES CARRES
**************************************************************************
*
VARIATION
*
X
*
XY
*
y
* DDL
*
*
FACTEUR
* 707.5000
*
6.2456
*
1.8896
'* 2
*
*
RESIDUELLE
*ï.23131)40.0l)0l)
*5518.71(1)
* 15.0852
* 14
*
*
TOTALE
*ï.2313750.l)1)00
*5524.9501)
* 16.9748
* 16
*
*
F
*
0.0021
*
*
0.8768
*
**************************************************************************
ANALYSE DE COVARIANCE
*********************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES *
DDL
*
VARIANCE
*
F
*
..,
*
FACTEUR
*
1.863851)
*
6.316290
"-
*
0.931925 *
*
*
RESIDUELLE
*
1.918060
* 13
*
1).147543 *
*
*
TOTALE
*
3.781910
*
15
*
0.252127 *
*
*********************************************************************
TABLEAU GENERAL
***************************************************************************
*
VARIATION
* SOMME DES CARRES *
DDL
*
VARIANCE
*
F
*
*
REG LIN MOY
*
13.167100
*
1
*
13.167100 * 420.884000
*
..,
*
FACTEUR
*
1.863850
*
91
"-
*
1).931925 * 29.7888(1)
*
*
NoN-PARALLE
*
1.573930
*
2
*
0.786965 * 25.1551
*
S . ~ON Il
}
* ECART IDRoITE
*
0.344129
*
11
*
1).031284 *
*
------------------------------------------------------------------------
*
TOTALE
*
3.781910
*
15
*
0.252127 *
*
****************************************************************************
COEFFICIENT DE REGRESSION B= 2.38591E-03
GROUPE
YM (1)
XM (1)
YAM(I)
-----------------------------~------------------------
------------
1
1. 4615
429.167
1. 45156
2
.6795
429.167
.669559
3
.9456
415
.969459
MOYENNE GEN.
1.03376
425
VOULEZ-VOUS REVOIR LES RESULTATS? AC
Break in 1,"''''

---

260
5.
e l'IDC
Toujours dans le but de mieux comprendre la nature des
systèmes biochimiques impliqués dans la catalyse enzymatique de
l'IDe, nous avons, après l'emploi de la cytidine comme inhibiteur
chez la souris hairless au niveau rénal, opéré in vitro une
inhibition cette fois de la bioconversion de l'IDe par la De au
niveau cutané chez l'espèce humaine.
5.1. Protocole expérimental
Ce protocole utilise également comme source enzymatique
le surnageant 2000 g préparé suivant les opérations détaillées
dans le paragraphe C.2.6. page 143.
Dans des tubes â essais â 37°C sous agitation permanente
et dans un bain-marie, sont incubés pendant 60 minutes, 5,665 ~moles
de substrat IDe, avec 250 mg de tissu cutané en présence de quantités
croissantes d'inhibiteur (De), 0,555 - 1,111 - 2,222 - 6,667 et
13,335 ~moles.
L'injection du substrat est réalisée à l'aide d'une pipette
de précision Eppendorf convenable au centre de la solution d'enzyme.
Les tubes en double sont bouchés et le milieu est mélangé par retour-
nement lent avant d'être mis â incuber.
Au bout de la durée de la réaction, 500 ~l de solution
méthanol-eau (50/50) refroidie d'acide trichloracétique 10 % sont
rajoutés au milieu ; le tube est alors placé 30 minutes à + 4°C
avant de subir la suite des opérations (Voir paragraphe
Après extraction, les substances sont analysées et dosées
par H.P.L.C. selon la méthode de l'étalon externe (Voir paragrapheB.4-B.!
page 127 ) grâce â l'usage d'un intégrateur-calculateur (SPECTRA PHYSICS
4100).

---

261
5.2. Résultats - Discussion
Les résultats expérimentaux sont consignés dans le
Tableau
XXXXI •
Les constantes cinétiques d'inhibition sont calculées à
partir de l'IOU métabolite, la solution d'enzyme utilisée provenant
d'un même homogénat entier de peau humaine que celle utilisée pour
la détermination de Km chez le sujet 5.
Dans ce Tableau :
i) C
=
Quantité d'inhibiteur dans le milieu d'incubation,
j) Va
=
Vitesse exprimée en pmo1es.h- 1 de disparition de substrat
ou d'apparition du métabolite, par 100 mg de tissu cutané.
l)M±SO = Valeur moyenne des deux essais d'incubation en double
associée à l'écart type arithmétique.
L'observation directe des valeurs de Vo représentées sur
le graphique n°
, ainsi que la prise en compte de la signification
du test de liaison exprimé par t, permettent d'apprécier la linéarité
de l' inhibi tion.
L'étude d'inhibition par la désoxy-2'-cytidine (OC) apporte
ici non seulement une preuve supplémentaire au caractère enzymatique
de la bioconversion cutanée de l'IOC chez l'espèce humaine, mais aussi
au fa! t que l'enzyme impliquée n'admet pas que l' IOC ou la cytidine
comme substrats.
Nous n'avions pas ici retenu de doser certains composés
comme la désoxy-2'-uridine (DU), métabolite découlant de la désamination
de la OC utilisée comme inhibiteur. Cependant, il ne subsiste aucun
doute sur la nature compétitive, signalée dans la littérature (151, 151)
de l'inhibition exercée par la OC de la désamination de l'IOC.
4
La valeur de Ki
(O,05965.10- M) obten~e avec la OC et
suffisamment proche de celle du Km (0,05271.10- M) de désamination
de l'IOC chez le même sujet, indique que l'enzyme présenterait le
même degré d'affinité à l'endroit de ces deux désoxyribonuc1éosides
pyrimidiques.

---

TABLEAU
XXXXI
Inhibition par la OC de la désamination cutanée in vitro de l'IOC
chez l'espèce humaine
Résultats expérimentaux en ~moles d'IDU par 100 mg de tissu cutané
Incubation de 5,665 ~moles d'LOC à 37°C 1 tris-HCl pH 7,20 0,005 MIl heure
Substrat résiduel (IDC)
Métabolite (IOU)
Ci)
voj)
MI )± S. O.
Vo
M± 5.0.
--
3,570
0,380
0,000
3,596 ± 0,026
0,389 ± 0,009
C\\J
3,622
0,398
ID
C\\J
0,555
4,721
0,309
4,660 ± 0,061
0,329 ± 0,020
4,599
0,349
1,111
4,854
0,292
4,802 ± 0,052
0,310 ± 0,018
4,750
0,328
2,222
5,125
0,245
5,075 ± 0,050
0,253 ± 0,008
5,025
0,261
6,667
5,259
0,141
5,202 ± 0,056
0,148 ± 0,007
5,146
0,155
13,335
5,281
0,039
5,234 ± 0,047
0,043 ± 0,004
5,187
0,047
r 2 = 0,969
n = 12
Constantes
5.0.
t
Signification
a = - 0,024
17,68
P < 0,001
b =
0,341
Ki
= 5,965. 1O-6M
S.D.
= 0,369

---

263
Graphique nO 35 a
DESANINAT.CUTANEE IN UITRD de l'IDC che2 l'ESP.HUMAIHE :
Inhibition coapétitiye par la désoxycytidine <DC); UO =F<Cp)
......._------~-----Sr---lC
14
Va ; Sr j Ml; Cp : annotations pages

---

264
Graphique nO 35 b
DESA"IHATIOH CUTANEE IH UITRO de l'IDC chez l' ESP.HU~IHE :
Inhibition co~p.titiYe par la d.soxycytidine ; Uo a F(Cp) .
•
8
Cp
v0 ; Cp : voir annot at ions page
La droite de régression ci-dessus correspond a la décroissance du
métabolite Ml (IDU)

---

265
6. Dêterminatien de Km et de Vrnax apparents
au nl veau cutané de laC' 1 - NI hydre lyse de l' IDU
chez l'espèce hurna1ne
La biotransformation de l'IOC par les homogénats rénaux
ou cutanés admet deux métabolites essentiels: l'IDU et l'lU, le
second découlant du premier par action d'une nucléosidase. Et c'est
pour vérifier chez l'espèce humaine cette étape 2 de la métabolisation
de l'IOC que nous avons envisagé d'utiliser l'IDU comme substrat dans
des quantités beaucoup plus saturantes que celles résultant de la
désamination de l'IOC.
6.1. Protocole expérimental
Le protocole est en tous points identique â celui suivi
dans la détermination de Km et de vmax apparents de biotransformation
de l'IOC.
Dans des tubes â essais, en double, des doses croissantes
d'IDU de 25.10 - 5.10 2 - 103 - 2.10 3 - 3.10 3 - 4.10 3 ~g sont incubées
avec 200 mg de tissu cutané dans un volume final de 10 ml, pendant
60 minutes â 37°C sous agitation permanente.
Le traitement des échantillons, l'analyse et la quantification
des substances sont effectués comme dans l'étude présentée dans les
paragraphes B.3.4. et B.3.5. page 12~.
;
Les injections chromatographiques sont effectuées en double
et seule la valeur moyenne est prise en compte dans les calculs.
6.2. Résultats - Discussion
Les résultats se rapportent ici â des homogénats entiers
cutanés provenant de 2 des 5 sujets impliqués dans l'étude métabolique
de l'IOC.

---

TABLEAU XXXXII
C'l-Nl hydrolyse cutanée de la iodo-5-désoxy-2'-uridine chez l'espèce humaine
Résultats expérimentaux en ~moles de métabolite (lU) par 100 mg de tissu cutané.
Km et Vmax apparents à 37°C; tris pH 7,20 1 1 heure
i)
PEAU N° 2
PEAU N° 3
S
1)
V j
o )
M
S.D.
Vo
M
S.D.
-
0, 706
~: ~~;
0,057
± 0 ,005
~:~;~
0,085
± 0,006
~
1,413
~:~~~
0,094
± 0,006
g;~~~
0,114
± 0,005
0,130
0,160
+
2,825
0,126
0,128
±0,002
0,158
0,159
_0,001
0,203
+
0,251
+
5,650
0,197
0,200
- 0,003
0,243
0,247
_ 0,004
-
0,304
8,475
0,290
0,297
± 0,007
0,470
+
0,328
+
11,30
0,456
0,463
- 0,007
0,310
0,319
_ 0,009
r 2 = 0,984
n = 10
r 2 = 0,976
n = 12
Constantes
S.D.
t
Signification
Constantes
S.D.
t
Signification
a = 10,750
1,688
22,267
P
0,001
a = 6,557
0,576
20,166
P
0,001
b =
2,739
0,227
b = 6,006
0,076
Km
= 3,924.10-6 M
llKm
= 0,664
Km
= 2,111.10-6 M
li Km
-
= 0,187
Vmax = 0,365 • 10-6 M. h- 1
llV!Dax
= 0,030
Vmax
= 0,321 • 10-6 M.h4 llvmax , = 0,004

---

267
Graphique n° 36
1
0.321
1
0,365
1
2,111

---

268
Les valeurs expérimentales sont présentées dans le
Tableau XXXXII :
i) S
= Quantité de substrat à dose croissante dans 10 ml de
milieu d'incubation.
j) Va
Vitesse d'apparition du métabolite (lU)
exprimée en
moles.h- 1 par 100 mg de tissu cutané.
1) M
= MOyenne des deux valeurs expérimentales issues des essais
d'incubation en double, et associée à l'écart type
ari thmétique.
L'examen des résultats contenus dans le Tableau XXXXII fait
ressortir que la variation de Vo en fonction de S évolue suivant une
linéarité significative d'après les valeurs de r, et qu'en outre, la
liaison entre ces deux variables est fortement significative au .
risque
a = 1 0/00.
Par ailleurs, les valeurs calculées de Km pour les homogénats
ici considérés laissent de nouveau apparaltre l'existence de variations
individuelles en ce qui concerne l'activité métabolique cutanée chez
l'espèce humaine pour les réactions ici en cause.
Cependant, on peut remarquer en ce qui concerne la peau
des sujets 3, que l'activité de la nucléosidase traduite par la
valeur de Vmax 0,365 et O,321.10-6M.h- l ) demeure assez proche
de celle observée chez la souris au niveau rénal O,336.10-~.h-l,
la peau n02, elle, paraissant plus active.
Sous réserve des travaux ultérieurs utilisant un plus grand
nombre de sujets, la peau humaine semble manifester une activité
nucléosidasique appréciable. Et si une telle tendance s'avérait un jour
confirmée, alors on pourrait réfléchir sur le rôle biologique d'un tel
système enzymatique au niveau cutané.
Comme la souris hairless, l'enzyme responsable de cette
hydrolyse de l'IDU pourrait bien être l'uridine nucléosidase, enzyme
dont l'activité et la spécificité seraient variables selon la source
utilisée.
Ainsi l'uridine nucléosidase de Phasedus radiatus est hautement
spécifique et inactive vis-à-vis de la désoxyuridine, de la cytidine,
comme de bien d'autres nucléosides pyrimidiques et puriques (149).
Par contre, d'origine microorganique (levures), cette enzyme pourrait
présenter quelque affinité vis-à-vis de la désoxyuridine et probablement
de l'IDU en plus de son substrat naturel, l'uridine (1491.

---

269
Et si l'on admet que l'enzyme impliquée dans la C'l - N1
hydrolyse de l'IDU, tant au niveau rénal chez la souris qu'au niveau
cutané chez la souris comme chez l'espèce humaine, correspond à
l'uridine nucléosidase, alors ces deux organes chez ces deux modèles
en constituent également une source, bien que peu active.
Une incubation de contrôle conduite en présence de
streptomycine et d'un antifongique (FungizoneR) a confirmé l'origine
bien tissulaire de l'activité de la nucléosidase ici observée tant
au niveau rénal que cutané chez la souris ou l'espèce humaine.

---

TABLEAU XXXXIII
Récapitulatif des constantes cinétiques
de biotransformation de l'IDe dans les deux organes étudiés
chez la souris hairless, le rat atrichis et l'homme
Les valeurs sont exprimées en 10-6M
REl N
P EAU
Etape 1
Etape 2
Etape 1
Etape 2
-
Km
Vmax"*
Km
Vmax
Km
Vmax
Km
Vmax
0
l '
N
35
20,5
9,2
0,8
SOURIS
35
19,25
14
0,5
2,42
0,072
244,5
3,703
60
15
16
0,6
RAT
2,6
18,9
1,7
1,14
1,7
0,0011
'-
5,422
0,688
2,588
0,113
1,688
0,268
8,625
0,082
HOMME
-
-
-
-
2,511
0,466
1,902
0,130
7,758
0,498
7,817
0,023
5,271
0,475
5,963
0,080
"* Vrnax est expri~en 10-6M.h- 1

---

271
6.3. Conclusion à l'étude de biotransformation cutanée de l'IDe
dans la peau humaine
L'étude de biotransformation in vitro de l'IOC dans la
peau humaine fait apparaltre que l'activité de la cytidine
désaminase est soumise à des variations individuelles, ceci tout
au moins pour les cinq prélèvements cutanés analysés.
Ce résultat appara1t tout de même peu surprenant pour
un tissu tel que la peau, dont l'activité métabolique sur la base
d'autres enzymes (AHH par exemple) est décrite comme variable en
fonction de la localisation anatomique.
De plus, nous avons utilisé ici des sujets d'âge variant
entre 20 et 46 ans, sujets dont l'activité désaminasique cutanée
pourrait être génétiquement variable, mais dont également la durée
de contact de la peau avec les divers facteurs de l'environnement
appara!t également différente. Certes, la peau semble peu inductible
dans les conditions d'étude ici présentées, mais l'un ne peut
préjuger de ce qui pourrait se passer en cas de stimulation plus
longue.
Cependant, dans la présente étude, les résultats montrent
que chez la souris, le rein constitue une source très active de
cytidine désaminase. Le taux de désamination cutanée est faible et
représente au temps 1 h. 7 "', tissu cutané versus tissu rénal, soit
3,6 '" d'IOC initiale désaminée.
Chez l'espèce humaine, le pourcentage de désamination de
l'IOC est variable d'un sujet à l'autre et fluctue entre 1,9 et 6,6 '"
pour le même temps. Ces chiffres, environ trois plus élevés chez
l'espèce humaine au niveau cutané, demeurent cependant de loin .
inférieurs aux pourcentages de désamination rénale de l'IDC chez la
souris (51,2 'Il). Ils corroborent également les valeurs du Km et de
la vmax apparents moyens déterminées par incubation 1 h. à 37°C de
l'IDe en Erésence de 100 mg de tissu cutané (4,902.10-6M et
0,469.10- M.h- 1).
.
En conclusion, l'étude fait appara!tre que le pourcentage
de désamination de l'IDe par la cellule cutanée humaine, non infectée,
ne dépasse pas 7 '" après 1 h. Les constantes cinétiques obtenues
laissent penser que dans la cellule infectée, l'incorporation plus
rapide du substrat dans l'ADN viral sous l'action des enzymes induites
par le virus lui-même, occasionnerait une désamination de l'IDe encore
plus faible.

---

---

273
1. CONCLUSION GENERALE
L '4tude du m~tabo Usme autan~ de l'antihe1'p~tique IDC
chez la souris~ le rat et l 'homme fait apparatt1'e que l'activiU
dAsarrrinasique est diff~1'ente non seulement d'une esp~ce à une
aut1'e~ rrrzis ~gaZement à l'inUrieur d'une mtJme esp~ce~ voi1'e
d'un mbme orogane.
Le 1'ein de souris paratt un bien mei Ueur modUe pour .
L' ~tude de l'activiU de la cytidine d~sarrrinase.
Cette enzyme à localisation cytosolique existe ~ga"Lement
dans la peau de souris et humaine. Son activit~ est t~~s faible
chez "Le rat tant au niveau ~~nal que autaM.
Par aiUeurs~ l'~tude de biodisponibiUU p~~senUe
dans ce doaument a ~~v~U un faible passage du ~dicament IDC et
de ses métaboUges. Le médicament~ apNS appUcation sur la peau~
demeU1'e donc stock~ dans ce tissu.
D'aut1'e part~ la faible capaaiU de la peau à d~sarrrine~
l ' 1DC par rappo~ au 1'ein laisse pense~ que ce médicament à
distribution locaLe pourrait constitue~ un meiUeur substrat pour
la dAso:r:yaytidine kinase induite pa~ le vi!'U8 ; ce qui est en
faveur d'un e:r:ceUent indice tM~apeutique.

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275
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Pression
Méthanol
Phase mobile binaire: MeOH/H20
observée
Débit constant
: 2 ml/mn
(bars)
Pression f (l) mélange.
370
350
330
310
290
270
250
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230
210
190
170
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317
TABLE
DES
MATIERES
1. la MALADIE de l'HERPES
A - L'HERPES VIRUS SIMPLEX OU VIRUS DE L'INFECTION HERPETIQUE
HUMAINE
.
1
1. GENERALITES SUR LES HERPESVIRUS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . .
1
2. L'HERPESVIRUS SIMPLEX (HSV)
3
2.1. caractère du virus
2.2. modèles d'étude
expérimentale de l'infection herpétique
3
2.3. cycle de multiplication . . . . • . • . . . • . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . .
4
2.4. effet cytopathogène (E.C.P.) . . . . . . . . . . . . • . . • . . • . . . . . . . .
5
2.5. caractères antigéniques du HSV . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . • . . . .
7
B - L'INFECTION HERPETIQUE HUMAINE
.
9
1. MANIFESTATIONS CLINIQUES DE L'INFECTION HERPETIQUE .....•.
9
2. ROLE DE L'IMMUNOLOGIE DANS L'INFECTION HERPETIQUE
13
2.1. immunité antiherpétique non spécifique
.
13
2.2. immunité antiherpétique spécifique
.
16
3. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'INFECTION HERPETIQUE .......•..
19

---

318
4. EPIDEMIOLOGIE DES INFECTIONS HERPETIQUES
23
4.1. morbidité liée aux HSV
23
4.2. dangers liés aux HSV chez les sujets à haut risque.......
24
4.3. relation HSV et cancer...................................
26
C - POSSIBILITES THERAPEUTIQUES FACE A L'INFECTION HERPETIQUE
29
HUMAINE
1. INTRODUCTION
·.....
29
2. LES OERIVES PYRIMIDIQUES DE SYNTHESE A ACTION ANTIHERPETIQUE
31
2.1.
rappel historique........................................
31
2.2. principe d'action des nuclèosides pyrimidiques IOC-IDU
35
2.3. avantages IDC/ICU = activité/toxicité
37
o - CONCLUSION................................................
39

---

319
II - ETUDE de la RESORPTION PERCUTANEE de la IODO-5-DESOXY-
2'-CYTIDINE à partir du GEL CUTERPES
A - LA PEAU; STRUCTURE ET CONDITIONS D'ABSORPTION DES SUBSTANCES
CHIMIQUES
.
45
1. STRUCTURE DE LA PEAU
.
46
1.1. épiderme
.
46
1.2. derme
47
1.3. annexes épidermiques
.
48
2. CONDITIONS D'ABSORPTION PERCUTANEE DES SUBSTANCES CHIMIQUES
51
2.1. mécanismes intervenant dans l'absorption percutanée
.
51
2.2. voies de pénétration percutanée
.
52
2.3.
facteurs influençant l'absorption percutanée
.
53
B - ETUDE DE LA RESORPTION PERCUTANEE DE LA IODO-5-DESOXY-
2'-CYTIDINE A PARTIR DU GEL CUTERPES
.
55
1. MATERIELS ET METHODES
56
1.1.
modèle du rat sans poil
.
56
1. 2.
molécule marquée
56
1.2.1. caractéristiques de la molécule marquée
.
56
1.2.2. caractères de solubilité
.
57
1.2.3. coefficients de partage
.
57
1.3.
protocole expérimental général
.
58
1.4.
expression des résultats
.
59

---

320
2. ETUDE DE RESORPTION DE LA DISTRIBUTION ET DE L'ELIMINATION
DE L'IDC CHEZ LE RAT MALE SANS POIL, APRES ADMINISTRATION
l NTRAVE l NEUSE
60
2.1.
protocole expérimental
.
60
2.2.
résultats et discussion
.
61
2.2.1. cinétique sanguine
.
61
2.2.2. distribution de 1,125 IDC et de ses métabolites
..
63
223
'1"
t·
d
1125
é '
. . . e l.ml.na l.on
e '
IDC et de ses m taboll. tes .......
64
3. ETUDE1~~ LA CINETIQUE, DE LA DISTRIBUTION ET DE L'ELIMINATION
DE L'
IDC CHEZ LE RAT MALE SANS POIL APRES ADMINISTRATION
INTRAVEINEUSE...............................
66
3. l .
proto col e expé r imental
66
3.2.
résultats et discussions
67
3.2.1. cinétique sanguine...................................
67
3.2.2. distribution de 1,125 IDC et de ses métabolites
69
3.2.3. élimination de 1,125 IDC et de ses métabolites
70
4. ETUDE DE LA RESORPTION PERCUTANEE DE L,125 IDC DANS LE GEL
"CUTERPES" CHEZ LE RAT MALE SANS POIL A PEAU NORMALE
.
72
4 .1.
protocole expérimental
.
72
4.2.
résultats et discussion
.
73
4.2.1. méthode utilisant l'animal endormi
.
73
4.2.2. méthode utilisant l'animal vigile
.
73
4.2.3. discussion
75
5. ETUDE DE LA RESORPTION PERCUTANEE DE L,125 IDC DANS LE GEL
"CUTERPES" CHEZ LE RAT SANS POIL A PEAU LESEE
.
77
5.1. protocole
77
5.2. résul tats et discussion
.
78
C - CONCLUSIONS
•••••.••....•••.•.••••••.••.•••.•.••.••••.•.•
79

---

321
III - ETUDE IN VITRO du METABOLISME CUTANE de la IoDo-5-DESoXY-
2'-CYTIDINE (IDC) chez la SOURIS HAIRLESS, le RAT ATRICHIS
et l'ESPECE HUMAINE
A - INTRODUCTION
83
1. VOIES METABOLIQUES GENERALES DES NUCLEOSIDES PYRIMIDIQUES ...
83
1.1.
synthèse des nucléosides-phosphates (nucléotides) pyrimidiques 83
1.1.1.
synthèse des nucléotides pyrimidiques à ribose ..........
83
1.1.2.
synthèse des nucléotides pyrimidiques à désoxyribose •...
85
1. 2.
voies de catabolisme des nucléosides pyrimidiques . ......
86
1.2.1.
catabolisme des nucléosides pyrimidiques à ribose .......
86
1. 2.2.
catabolisme des nucléosides pyrimidiques à désoxyribose.
90
2. PEAU ET ACTIVITE ENZYMATIQUE
91
2.1.
la peau: tissu à métabolisme endogène
.
91
2.2.
la peau, tissu à activité métabolique vis-à-vis des
substances exogènes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . .
92
2.2.1. procédés généraux d'étude in vitro du métabolisme cutané
des xénobiotiques
, . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
92
2.2.2.
les systèmes enzymatiques cutanés dans la biotransforma-
tion des substances chimiques...........................
94
2.2.3.
distribution des enzymes du métabolisme cutané..........
97
2.2.4. métabolisme cutané et toxicité locale
98
2.2.5.
le métabolisme cutané, un reflet du métabolisme systémique
du médicament...........................................
99
3.
BIOTRANSFORMATION IN VITRO DES NUCLEOSIDES PYRIMIDIQUES
SUBSTITUES, DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ET BUT DE NOTRE ETUDE
101
3.1.
données bibliographiques sur la biotransformation in vitro
des nucléosides pyrimidiques substitués..
101
3.2.
but de notre étude········................................
104

---

322
B - MISE AU POINT DES CONDITIONS ANALYTIQUES
106
1.
CONTROLES ANALYTIQUES
106
• • • • • • • • •
'
• • • • • • • • • •
"
•
0 . • • • • • • • • • •
.:
• • • •
1.1.
propriétés physiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . .
106
1.1.1.
caractères organoleptiques . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . .
106
1.1.2.
critères d'identification
..
106
1.1. 2.1.
point de
f u s i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
106
1.1.2.2.
spectre U.V.
107
1.1.2.3.
solubilité
101
1.1.2.4.
spectre I . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
107
1.1.2.5.
spectre R.M.N.
107
1.1. 2.6.
spectre de m a s s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
108
1.1.3.
ci'i tères de pureté
.
108
1.1.3.1.
perte de
la dessication de l'IDC
108
1.1.3.2.
pouvoir rotatoire spécifique de l'IDC
109
1.1.3.3.
contrôle de la chromatographie sur couche mince
109
1. 2.
dosage de la substance
(roC)
.
110
2.CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
(HPLC)
DES NUCLEOSIDES SUBSTITUES
(IDC,IDU)
112
2.1.
HPLC
:
instrument d'analyse des dérivés d'acides nucléiques
dans les échantillons biologiques
. . • . . . . . . . . . . . . . • . . . . .
112
2.2.
facteurs
intervenants dans
la chromatographie sur colonne
à polarité de phases inversée
.
114
2.2.1.
le pH
115
2.2.2.
la polarité de la phase m o b i l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
116
2.2.3.
concentration en ions tampon,
pouvoir hydrophobe des ions
tampon,
mélange d'ions tampon
116
2.3.
optimisation du système chromatographique
.
116
2.3.1.
l'appareillage
116
2.3.2.
conditions
117
2.3.3.
paramètres chromatographiques
117
2.3.4.
choix du mélange éluant
: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
119
2.3.5.
mode d'élution
120

---

323
3. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES . . . . . . . . . • . . . . . . . . .
123
3.1.
constitution des échantillons
123
3.2.
extraction des substances par précipitation des protéines
124
3.3.
rendement d ' e x t r a c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
127
3.4.
identification des composés..............................
127
3.5. quantification des substances
135
4. CONCLUSION................................................
137

---

324
C - MODELES (SOURIS, RAT, PEAU HUMAINE) ET PROTOCOLE GENERAL
D'ETUDE IN VITRO DU METABOLISME DE L'IDC
.
138
1. MOOELES DE LA SOURIS HAIRLESS, OU RAT ATRICHIS ET OE LA PEAU
HUMAINE . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
138
1.1. la souris hairless
..
138
1.2. le rat atrichis
..
138
1.3. la peau humaine
.
138
1.4. choix des modèles
..
139
2. MATERIELS ET METHODES GENERALES D'ETUOE IN VITRO DU METABOLISME
CUTANE DE L' IOC
.
140
2.1. origine des animaux
140
2.2. origine de la peau humaine..................................
140
2.3. dispositif de traitement des organes..
140
2.4. composition des milieux liquide de travail
141
2.5. préparation des homogènats entiers cutanés de souris et de
r a t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
142
2.6. préparation de l' homogénat entier cutané humain.............
143
o - ESSAIS PRELIMINAIRES A L'ETUDE IN VITRO DU METABOLISME DE
L'IDC CHEZ LA SOURIS HAIRLESS, LE RAT ATRICHIS ET L'ESPECE
HUMAINE
145
1. BIOTRANSFORMATION IN VITRO CHEZ LA SOURIS DE L'IDC : INFLUENCE
DU PH D'INCUBATION ET DE LA TEMPERATURE
145
1.1. préparation de l'homogénat entier rénal de souris
145
1.2. détermination de la zone optimum de pH d'activité de la
cytidine désaminase rénale de souris
146
1.3. détermination de l'effet de la température sur l'activité
in vitrode la cytidine désaminase rénale de souris ..... •....
148

---

325
2. BIOTRANSFORMATION RENALE OU CUTANES IN VITRO DE L'IDC CHEZ
LA SOURIS HAIRLESS, LE RAT ATRICHIS ET L'ESPECE HUMAINE:
DETERMINATION DE LA QUANTITE UTILE DE TISSU
155
2.1.
détermination chez la souris hairless et le rat atrichis
de la quantité de tissu rénal ou cutané utile à l'étude
in vitro
de la désamination de l'IDC
.
156
2.1.1. tissu rénal........................
156
2.1.2. tissu cutané
162
2.2.
détermination de la quantité de tissu cutané utile à l'étude
in vitro de la biotransformation de l'IDC chez l'espèce
humaine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
168
E - EXPRESSION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
171
F - METABOLISME RENAL IN VITRO DE L'IDC
177
1. INTRODUCTION................................................
177
2. MATERIELS ET METHODE.........................................
178
2.1. animaux
178
2.2. produits et réaction chimiques
178
2.3. dispositif de traitement des organes et instruments
analytiques............
..
179
2.4. préparation de l'homogénat entier rénal....................
179
3. CINETIQUE DE DESAMINASE IN VITRO AU NIVEAU RENAL DE L'IDC CHEZ
LA SOURIS HAIRLESS MALE......................................
181
3.1. protocole expérimental....................................
181
3.2. cinétique chez la souris mâle hairless : résultats.........
181
3.3. discussion
182

---

326
4.
DETERMINATION DES KM ET VMAX APPARTENTS DE BIOTRANSFORMATION
RENAL IN VITRO DE L'IDC CHEZ LA SDURIS HAIRLESS ET LE RAT
ATRICHIS MALE..............................................
187
4.1. protocole expérimental
187
4.2. km et Vmax apparents au niveau rénal chez la souris hairless
188
4.3. km et Vmax apparents au niveau rénal chez le rat nu mâle
atrichis
197
5. INHIBITION PAR LA CYTIDINE DE LA DESAMINATION RENALE IN VITRO
DE L'ICD CHEZ LA SOURIS MALE HAIRLESS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • .
200
5.1. protocole expérimental
200
5.2. résultats - discussion
200
6. CARACTERISATIDN du MECANISME IMPLIQUE dans l'INHIBITION par
d'AUTRES NUCLEOSIDES PYRIMIDIQUES de la DESAMINATION IN VITRO
de l'IDC par le TISSU RENAL de SOURIS HAIRLESS : EXEMPLE
de la CYTIDINE et de la DESOXYCYTIDINE (IDC)
• . . . . . . . . . . . . . .
204
6.1. protocole expérimental
6.2. résultats - discussion
204
7. ESSAI DE LOCALISATION DE L'ENZYME (CYTIDINE DESAMINASE) CHEZ
LA SOURIS MALE HAIRLESS . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . .
207
7.1. protocole expérimental
2D7
7.2. résultats - discussion
209
8. DETERMINATION DE KM ET DE VMAX APPARENTS AU COURS DE LA C'l-
N l HYDROLYSE DE L'IDU CHEZ LA SOURIS MALE HAIRLESS AU NIVEAU
RENAL . • • . • • . • • . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
212
- - -
8.1. protocole expérimental
212
8.2. résultats - discussion
212
9. CONCLUSION A L'ETUDE DE BIDTRANSFORMATION RENALE IN VITRO
DE L'IDC CHEZ LA SOURIS HAIRLESS ET LE RAT ATRICHIS MALE ...
216

---

327
G - BIOTRANSFORMATION CUTANEE IN VITRO
DE L'IDC CHEZ LA SOURIS
MALE HAIRLESS ET LE RAT MALE ATRICHIS ..
217
~/
1. INTRDDUCT-IDN
2. MATERIELS ET METHODE.........................................
218
2.1. animaux, produits et réactifs..............................
218
2.2. dispositifs de traitement de la peau et instruments
analytiques................................................
219
2.3. préparation des homogénats entiers cutanés..
219
3. ETUDE CINETIQUE DE BIDTRANSFDRMATIDN CUTANEE IN VITRO DE
l'IDC CHEZ LA SOURIS MALE HAIRLESS............................
220
3.1. protocole expérimental.....................................
220
3.2. résultats
220
4. DETERMINATION DE KM ET VMAX APPARENTS AU NIVEAU CUTANE DE
BIDTRANSFDRMATIDN DE L'IDC CHEZ LA SOURIS MALE HAIRLESS ET
LE RAT MALE ATRICHIS
224
4.1. protocole expérimental............................
224
4.2. km et Vmax apparents chez la souris mâle hairless au niveau
cutané
227
4.3. km et Vmax apparents chez le rat nu mâle atrichis au niveau
c u t a n é . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
231
4.4. conclusion à l'étude de la biotransformation cutanéein vitro
de l'IDC chez la souris mâle hairless et chez le rat mâle
atrichis
234
5. ESSAI D'INTRODUCTION PAR LE METHYL-3-CHDLANTHRENE DE L'ACTIVITE
DE LA CYTIDINE DESAMINASE AU NIVEAU CUTANE CHEZ LA SOURIS MALE
HAIRLESS
235
5.1. protocole expérimental
236
5.2. résultats - discussion
237

---

---

)
~- -
Vu et permis d'imprimer
Montpellier,
le •••••.•••••••••••••••••••
piLe Président de l'Université de Montpellier l,
Le Vice-Président
Doyen -
H. ORZALESI

---

MBATCHI Behvw./td
UfuveJv~dé de. MONTPELLIER l
Fac.u.tté de PhaJunac.Ü
7984
RESUME
La iodo-5-désoxy-2'-cytidine (IDC)
est une substance
antiherpéti 'lue des Laho ICa toi res CHA UVIN- BLACIIE. Nucl éosi de de
synthèse analogue de la thymidine,
son mode d'action pharmaco-
biochimique est celui des antipyrimidines.
Cependant,
l'inter-
vention éventuelle du terrain,
ici la peau,
dans le devenir d'un
médicament tonique est souvent une inconnue dans l'appréciation
de sa biodisponibilité.
Ainsi,
aprGs étude in m:v(1 de la résorption percutanée
de l'IDe chez le rat sans poil,
nous présentons dans ce document,
en parallèle avec la biotransformation rénale chez la souris,
le
rôle in vitro des enzymes cutanées (cytidine désaminase,
uridine
nucléosidase) du métabolisme de l'IDC chez deux modèles animaux,
la souris hairless,
le rat atrichis, et chez l'espèce humaine.
MOTS CLES
Iodo-5-désoxy-2'-cytidine
(IDC).
Arl tiherpéti que.
Métabolisme cutané.
Cytidine désaminase.

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