MUSEUM NATI ONAl
UNIVERSITE
D'HISTOIRe NATUREllE
PIERRE ET MARIE CURIE
DE PARIS
PARIS VI
THESE
POUR l'OBTENTION DU GRADE DE
DOCTEUR ES SCIENCES PHYSIQUES
PRÉSENTÉE PAR
AUGUSTIN BERE
SOUTENUE lE 17 OCTOBRE 1938
JURY
IIR . C,
HElENE
PRESIDENT
MR, J . ~I , lEHN
MME T,
MONTENAY-GARESTIER
MR, B,
VALEUR
EXAMINATEURS
MR, P ,
VIGNY
MR, C.M, GARY-BOBO

---

j
Je
voueirais
témoignror
toute
ma
reconnaissance
à Monsieur \\.:13ude
HEl.ENE,
Profe:;;seut'
au
Huséum
National
,j'Histoire
Nat;ul'elle,
Membre
de
l' insti Lut,
qui a bien voulu m'ar;cueillir dans son labCJr",t".oire pour me fwit'e
acquérir
une
grande
[o)'matiun
scicmtifir:jue.
Cc
travLlil
101t
be;}ucoup
à
Sil
gl'ande culture scientifique trè,s rigoureuse.
J<2
suis reconnaissant envers Monsieur Jroan-Mar'ic LEHN,
PI'o[esseur
à l'UniverSité Louis Pasteur de Strasbourg,
Prix r~obel, d'avoir' ilCcepter' de
juger cc t1'8vail,
mais aussi
d'avoit'
aimablGmcnt mis à nlél disposition tous
les pruduits dont j'avais besoin.
Je
)'emercie également Monsieur'
Piel're
VIGNY,
Pl'ofe.sseur à l'Uni-
versi té
Piel're et r-lar i e Curie
(PARIS
VI),
V.ons ieur'
f3erDèlrd
VAl.EUR,
pr'ofes-
~eur au Conscr'vatoire
National
des
Arts
et
M~tier~, Monsieur Claude M.
GARY-BOBO,
PI'ofcsseur
à
l'Unîver'sité
rier",:;
et
r1ari8
Curie
(PARIS
VI),
d'avoir a~cepté de JUGer ce travail.
Madam8
Th~r8se 1-1ONTENIIY-GM,ESTIER, 1'1aftre de
CO:lférences,
Sous-
Directeur' au Muséum National d'Hist"~ire Natur~lle a pOl'té SUl' ce travail lJlle,.
aU.entlon toute particulière. ·]e lui témoign(~ t(1ute mél rl:;conn"is:ô;ance.
Mons ieur'
Michel
ROUGEE,
Maître
de Confércnee0,
Sous-Dircctc;ur'
au
Muséum National d'Histoire Naturelle m'a permis de m'iniLier aux techniqu8s
de fluorescenCt dynamique. Je le remeroir: vivement.
Les pl'oduits IJtilisés au cours de ce travail ont été synthétisés à
L'Inst~tut
Le
Dd
de
l'Université
Louis
Pasteur
de
Strasbolwg
par
A.J.
BLACKER, J.
JAZWINSKI
et
F.X.
T..nLH~LM. Qu'ils
trouvent
ici
l'txpression de
mes remtrciements.
Les oligonucléotides ont été synthétisés au Cc;ntrc dC;! Biophysiquc
l'toléculaire d'Or"li~iHl.'> dans le laboriltoiJ'(: de Chimie dirigé pC3.r 110nsieur N.T.
THUONG.
Qu'il
trouve
ici
ainsi
que mesdemoLselles U.
i\\.SSELINE et
V.
ROIG,
l 'cxprcssi0n de mes remel'ciements.
Mad,~mois<211e M.
TAKASUGI,
Monsieur
L.
Pt::I~ROUAULT m'ont
aid~
~
réaliser
ctrt,aim!s
expériences
d'~crites dans ce trilvail.
Qu'ils
en
soient
l'emcrci€s.
Les membr'~s du laboratoire, MesdalTiC3 N. LORSAU, C. VEV[:R-BIZET, S.
SAlS(JN-BEHl'10ARAS,
Mesdemoiselles
M.
CHEVRIEh,
C.
CliAVANï,
Messieurs
R.V.
BENSASSON, D.
BRAULT, C. CAZENil,VE, M.
DELLINGER, J,C. FR.!lNCOJS, T. LE D(lAN,
P.
RII1NASSE, E. HICHARD, J.S. SUN, J.J.
TOULME, P. VERSPIERSN, m'ont appor'té
à des
titres
divers
un
encouragement
':lui
m'a beaucoup soutenu au
cours de
mon séjour. ·]t leur' térn'Jigne mon amitié.
J<2
voudrais
rtmer'eier
tl'ès
particulièrelTl8nt Mesdam.;.. s
C. .4LVAREZ,
H.
P.c.RTHF:NAY
et
Ma,1emoisE:lle
I-1ESMACQUE
q~li
onl~
dacl.ylogr'é'.[lhié
le
manlJ:~\\.Tit avec beaucoup de patierlce, mais aussi avec beaucoup de symp[Jthi·~ ;.,
:TIon égard.
Je remE:rcie enfin Ma.dame TL
Vr,Sf-:l qui m'a appcrt..6 un concours pour
Ja
recherche
des
références
bibliographiques,
r-1onsieLJr
Ci.
DF;LGADoJ
qui
2
8ssuré les
tirages
photographiques
et
r-1onsieur'
J.L.
MEHGNY
qui m'.1. ai(ié 3.
parfaire ce do('ument.

---

jJ
A
!'licnèle
Violette et Stéphanie
Darli~le
et Palll
Le u'mps de l'absence ...

---

1 1 1
SOM MAI R E
INTRODUCTION GENERALE
IléCérences bibl iographiques
5
MATERIEL ET METHODES
PI1INC 1 PES ET BASES THEORIQU~S
8
1
EQUATIONS fONDAMl':NT!ll)~;S EN SPECTROSCOPIE D' ~8S0RPTION
ET D'EMISSION MOLECULAIRE
10
1. Equations fondamentales
10
2.
Application de la nuoresc~nc,:
'"
3. Polarisatiorl de fluorescel1ce
16
II
-
DICHROrSME LINEAIRE
19
III -
REACTIONS DE PHOTOOXIDATlON DES ACIDES NUCLEIQUES
1
PHOTOSENSIBILISEES PAR DES COLORANTS
• . • • .
22
1
IV
-
TOPOLD~ΠDE L'ADN SURF.:NR,)ULE
)0
1
v
- MISE EN OEUVRE EXPERIMENTALE
))
1. r\\bsorption
))
2.
Fluol'esc~nce
3!1
1
3. l",éthodes biochimiques
)9
1
Référ'en'Jes bibliographlqucG
1
1
1
1

---

1 V
CHAPITRE 1
PROPIUETES SPECI'ROSCOPIQUl::S DU CHLORURE DE N,N'-DIM[ITHYL-
2,7-DIAZAPYR~NIUM (MDA p 2+) E'f DE 2,2-[METHYLENF:-DI-(1,~­
PHEln LEU ~r~ETJ-IY LEll [-OH L) ] -6 l S- (7 -N -M~;TmI -2 ,7 -
J
DrAZAPYRENTU1~:1 (BIS-DAP'I+)
. . . . . . . . . . . . . .
50
l
- .:;8S0R!''fION L'r EiilSSION DU r~DAp2+ ET DU BIS-DI!P~~
5D
1. Pl'oprLét.;is d'absorptlon
50
2. Pl'opritStés d'émission de fluorescence
57
II
INHIBITION DE LA FLUORESCENCE DU r-1DAP2+ ET DU BIS-D!lP~+
PAR LES HALœENUllES
6J
r. InhirJLtion de lB fluorescence .statique
6J
2.
Inhibition dynélmique de la fluor'esceoce
65
lIT - lNTER ACT l'JN DU 1~,[!r,p2+ ET DU BIS-DApJj+ AVEC LES
MQNr:lNUCLEOT IDES
72
1. F.wd~ (,0 aLJ50rption
72
2.
Etud~ en fluor'33cence statique
].
Etude en fluorescerJce dynamique
Références bibl i.]graphiqiws
83
CHAP ITRE Il
INTŒJl.cnON i)U MDAp2+ ET DU BlS-DfIP4+ AVEC LES flCIOES
NUCLUQUES
l
-
I::TUDfi: ~:N ABSORpT lUN
85
1.
Inl:eJ'ëJl:tion avec les Bcictes nucléiques
en "'i.mple hrin
. . . . . .
85
2.
IrJteréll,tion élvec le3 acides nucl~iqlJ~s en
doub18 brin
91
11
E1U[IE EN F'LUORESCI\\NCE
99
1.
MDAP2+
99
2.
bis-[)f\\.p 11+
1()2
1

---

1/
III -
FLUORESCENCE DYNMHQUE
103
a) Pùlyd(G--C)-polyd{G-C)
103
b) ADN (Je>
thymus de Ife,qll
10 :1
(;)
Polyd(A-T>-ro1yd(A-T)
1D5
d)
Foly(dJ\\)-poly(dT)
105
IV
DEN.''lTURATlO~j 'l'HERfHmJE DES ACIDF.:S NUCU:IQUE:) F.:N
PllESENCS DIj t'-1DAP2+
107
DénaLurati,m suivie en absorption
10'(
2. Fluol'escenr::e
109
',J
DICHROIS1'1E LINEA HlE DES COl'lPLEXES ACIDE:'> NUCLEIQUES-
t'1DAP2 1 /
ôLS-DIIPJ.j+
118
VI
DF.:TORSION DlI L' J\\[lf) SURENIlOUL~ DE pHR322 PAil LE tI,DJH'.2'
ET LE BIS-Di\\pJj+
• . . . . •
123
Référ'ences bibliographiques
129
CHAPITRE III
; DEGRADATION PHGTOCHIMIQUE DF.:S AClDES NUCLEIQUES PAR LE
MDAI-'2+ ET LE 8IS-DAP~+
: NUCLEASES J\\RTlFICIELLES
132
INTRODUCTION
l
DEGRADATION D'OLIG()NiJCLEOTIDES PAR LE f1DAP2"
ET LE
bfS-DllPJ.j+
135
1. Pr'ofil d·:;! la dégr'a.dation
136
2.
Produi ts de dégr'adation
139
3. Efricdcité de dégr~dation
Jl.
Cirlétique d~ dégradation
I l
-
DEGRADATION DU 27MERF:-AS PAh L'OLIGOTliY~lIDYLATE
Ta-MDAP2+
• • . . • • • . • . . • . •
•
•
•
.
1.'i"!
1.
Pr'ofil ri'; dégr,gdi1tLon du ,nmèl'e-AS par Tc.-MDAp2+
2. Cillétil]lle de dégractatlc'rl
153
3. Effet de la çûf]centratL'Jn '2n Ts-MDAP2+
15'1
11. Efr.;\\; dE) la cOllcentration
ionique
163

---

VT
CONCLUSION
167
néfé~en~es bibliogr'Dp~iques
168
CONCLUSION GENERALE
170

---

rNTRODUCTI ON

---

L'expression
des
gènes
ClilnS
une
C81lU18
dépend
à la
fois
de
sa
fonction,
de sa dit'férenciation,
mais aussi de son état physiologique. Cette
expression différentielle des gènes est
soumise
à une régulFltion en fonc-
tion des besoins CG11ulail'(,s et de l'environnement.
LE: premier mécanlsme de
régulation qui ait été découvert port:e sur 1,~ métabolisme du l8Ct i)SC chez le
colibacille. Ce mécanismf; comme ceux qui furent d8couVeJ'ts par la suite chez
d'autl'e:3
pl'ocaryote~ ou chez
le:3
eUkiJf'}'otes
fait
interventr
une
pr-otéine
régu latr ice.
D'une
[açOfI
généra le
les
proté ines
régu latr iees _ inter'v iennent
en se fixant sur une partie r2connue ,je l'acide nucléiquf~ ~oit au niveau de
l'ADN pour activer ou pour inhiber la transcription dL, gène en AfIN messager,
soit Sur
le pré-ARIJ messagel'
pour'
contrôler
son épissélge en IIRN messager",
soit
enfin
0111
niveau
de
l'MN
messager
pour
moduler
sa
trélc1uction
en
protétne.
Cette
r'égulation
repose
~:::lSentie lIement
sur
Lê!
reconnaissance
spécifiqu,~ d'une séquence donnée de l '3C ide nucléique par' la protéine régu-
latrice. Cettc t'econnaîssance met en Jeu:
- des interactions non spéciftq'c'(33
; des liaisons éle~tr'(Jstatiqucs
s'ét3.blissent
8nl~re les phosphate,,,; du squelette phospJ,o,Uester de l'aci.de
nucléique et les résidus dçs acides amillés basiques d'? la protéine;

---

des
inter'actions
.'3péc ifiques
notamment
d~s liaisons hydrogène
avec
lés bases nuclGiques.
(jes
intel':3.ctions d 'empi JemS'nt cl,-::;
noyaux aroma-
Liques cles acides aminés a'.ec ceux
des bases et enfin une réconnai.'3sance rie
la structu)'e :)econdail'e de l'dcicie llucléique par
la structure terti;;irc d0
la protéine (1-9).
La découverte de la t'Ggulation de la tr'aduction par des ARN cour'ts
ou MN éinti-sens montre qU';
les acides
nucléiques peuvent
intervenir comme
agents réguléiteur.:l de l'expr'2ssion génétique.
(10-1~). Ce mécanism= de régu-
lation a aW..'3i été mis en évidence lors de la réplication de cert.qLns
plas-
mides
(15).
La
réc:onnaissance
d'un,:;
séquence
de
l'ARN
messJ.gel'
par
l'MN
éinti-sens
répose
sur
la
,:omplémGntarité
des
paires
de
bases
par
des
liaisons
hydrogène
qUi
assul'ent
une
grande
spécificit·j
~
l'interaction.
Cette l'econnaissance dépend ,je L; longueur de l'oligonucléotide (~71.
La
possibilité de
)'6guler l'expression des
~ènes d'une f2~on sc§-
lecti'/G par
des oligonucl'i5otides
constitue dOllC' une (lutl'e stratégie et liI"!e
approche
fondamtontal~
intéressante
dans
la mesure
où la synthèse
de
ceS
olifj'onucléotides l'eut ~tl'e r'éalîsée par voi':! enzymatique (16, 17, ~3) ou par
voie chimique (18-'-'3,
4Il).
La synthèse chimique pet'm·~t de nombl'eusi::S modifications des 01130-
nucléotides qui
les rendent résistants aux endonucléases. En incorporant des
éi:1omèr~,c; (l ries nucléosides à la place des anomères 8 naturels (2~-27) ou en
introduisant d~s rnéthylphosphonates à la plaC:8 de3 pho~phat€s par
exemple,
on accl'oît ell:; manière
considérable
la résistance aux
nucléases
des
oligo-
nucléotides medifiés.
De plus
cett(; dernière mocjification augmc:=nte
la per'-
méabilité membranaire des oligophosphonates ainsi obtenus (28, 29).
La stabilité du
complexe
très
spécifique
formé
entre
l'oligonu-
cl~otid", et sa cible e3t for1:ément accru"! par
l'inter'C:ilation
d'un
agent
int,,,)'calant couplé par liaison covalente à l 'oligonucléotide. Cette nouvedlc
famillS'
df)
molécuh~3
a
été développée
par 1,;
Professeur
Claude Hélène au
labol'at,1ire . de
13 tOp,ilyS ique
du
Muséum
Nat ion::! L
d' Hi.s to ir'e
I~a turelle
en
collFlboration avc~c l'équipe du
Dr.
NglJyen
'f.
Thuong au
Centr~ rie Biophy-
sique Moléculail'e (CNRS) .3 Orléans (29-33,
,'14).

---

:3
C"'S Ilouvell~s
ma lécules
IIjNIE J sGnt capablc;;o, '1' i.nl', lt)ét'
l.~ traduc-
Lion
(j'un
Mn~ rn~ssag8r 2.1J,5.'jL
bien
in
vitro
qUI;;!
in
vivo
(23,
3!.J,
iJ6).
La
fiX8.tion
d'un oligonuclJo'';'lde couplé
~ un éJg(~nt
intercalant
(ON'BI)
;jur
sa
cible complémentaire reste
cepenoéJ:lt soumis(~ ~l lB.
lOl
c1'action de mass~ ct
une
expression
résiduelJe
du
g80lo:-cible
se;'éJ.
toujOUt'5
ob.'3er'vée.
Afin
de
f'endre l'inhibition
irréversLble,
il
a
été
C<)llplé
à
ce::J
oligonucléo-
tides
(Jes
ClgenLs
chimiques
susceptiole,s
de
créer
des
dommages
.sur l'élcide
nucléique
cible.
Ces composés
cllimiques
in(juisent des
dommages .sur l'acide
nucléique cible soit par activ<:ltion c!limiquc,
DOit par activation photonique
(27,35,
36).
Couplé
à
des
oligonucléotides,
l'EDTA
en
présence
de
Fe3+,
l 'orthophénanthroline
en
pré.'Jence
de
Cu 2 +
provoqur~:1t
une
coupure
de
la
chaîne
phosphodiestcr'
de
l'acide
nuclôiqu€
cibli2.
L'amorçage
de
12
réaction
est
~ffectuée pa,~
l'af1f1ition
d'un
réducteur.
(27-3::>,
~5).
La
réaction de coupure de la ciblc
est due à la production des radicaux hydro-
xyles
OH·
dan.s
le
mi lieu.
Le
tr'dnsfert
d'un
électron du cation métallique
vers
l'oxygène
moléculaire
est
Et J'origine
d'u:1e
succession
de
réactions
conduis;:mt à la pro(.1uction du radici-ll hydr'JKYle (réactions de renton).
Lc.s
dér'ivés possérJ.'lnt
un groupement
azide,
la pr'oflavine et
les
porphyrines couplés de façon cov:Ollerlte
à des oligonuc16otides provoquent la
formation
de
ront;lg€S
€ntre
l 'oligonucléotide
et
sa
cible
complémentaire
sous
Lrradi,;ti.on.
Le
traitement
de
CC;]
complexes
par 1(1 pipéridine. génère
des C'oupW'es d€
la cil)l(; ail r1Jvsnu des pontages (36-39).
Les intercal,lJlts des acid"s IlLlcléi.ques sont gt5'néralemcnt des molti-
cules aromatiques, pl.:mes et (;hargées. Di"er'ses ~ooléculc-~, de ce type ont été
utilisées
cornille
ëigent
irlter'C2.1ant lié à l'oligonucl~atide
l'<:lcridine,
la
2-méthoxy, 6-chlOl'O, 9-Clminoélcridine,
ILl proflavine
(Il~. 16).
C'est dans ce cadl'e que nous nous sommes
intéressés aux nouve1l8S
molécu.1es déri',rées dll
p)Tène
qui
()nt
r$t6
synthéti.sées
dans
le
laboratoire
du
Pr'ofesseur
Jean
)-lal'ie
Le)~~ il l'Institut Le Bel de l'Université Louis
Pastc=ur
de
L'étude
de
ces
molécules,
le
N,N' -d iméthy 1-2,7 -d iaz apyrèn~
(MD1\\p2 +)
et
son
dimère
le
bis-DApll+
(c f.
figu...·88 du chClpitre maLéri81 c=t méthodes)
et (.1e
leur'
inter'action élvee
les
acides nucléiques fait l'objet de ce tr8vail.

---

4
Nous avons étudié les propriétris phy,-iicoc~limiqlJes de ces nouv(;;ll,?s
molé~'lles élinsi que
les propr'iJtés
photocl1imiques qui
leur èonfèr'·~n\\.;
des
caract6r'istique::; d"'endonucléases" lorsqu'elle:,; sonl~ r;'Juplécs à deS oligonu-
Gl~,)tid€s.
Le chapitre
l
résume
l""ssenti",l des
j)!'opr'iétés spectr rjs20piques
ries deux compos~s libres et en pJ'ésenc~ de cel'tains Inhiblteur'3 ,ie fluores-
cence
étudi~es
par'
spectroscopie
ri'absorption
el
d'émission.
Les
il1teraçlions avee 18s rnononuc14otides sont 3.us:,i abOl'c!ées dans cctte paJ'tic.
Le
chapitre II tl'81\\.;e des
inter3ctions de ces molécules avec
les
<lcides
nucléiques
en
simple
et
eTl
d<Juble
br'in
étu,jié'2':'
par
l"~s
mêmes
mr3"thodes. Les l'ésuJtats du dichroïsme linéaire nous ont pel'mis de déter'miner
l'angle moyen que fait la. mO}8cule d8 MD.I\\p2 t
élV<2C l'axe r1J: la doütlle hélice
des acides nucléiques.
Ce résultat ~-'st; un .lrgurr.ent fa'/orable 8. l'intercala-
tion
de
cette molécule
entre le~J paire."] de
bêlses.
Il est également montré
par voie
biochimique que ces nouvelles mo12cules
détof'dent
l'ADN suren-
l'oulé à la manièl'e de cer'l;ain~ i:1ter'calants
(ilS:.
La dégradJ.tion
de~ acides nucJéiques par ceE; cornpos8s libres et
coupl·is
à
un
octathymidylat;e
est
étudi6e
da.n~ le chapitre
III
par
des
méthOdes l'Jiochinuques. Les rJsultat.s
rnontrent que l'hybrLLlatioll de l'octa-
thymiclylate
pl'otègc
la séquencp.
complémentaire c~ble et ql.1e les dommages
causé", sur la cible s 'observ0nt de chaque côtl de ceLt.e zone de protection.
Les :'ésultats obtenus montp(~nt que dans n··)s condi tians expél'imentales il se
[orme toujour~ une
proporLion importaTlte dc triple hélice.
Couplées à des
oligollucléotides,
ces
nOUVelle.'.;
molécules
se
comportent
comme
àes
lP en do-
nucléases" spéeif~ques d'une OJéquence détel'miné<? de l'ilDN.

---

5
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MATERIEL ET METHODES
!

---

R
PRINCl PE's ET BA;::,ES nlEiJRIQUES
JÎU
Cüllrs
de
(:e
trd'/élil,
nous
avons
lltili.'";é
essentiellement
des
méthodes
,c;pectl'oscopiques
pOut'
suivr'e
les
interactions
entre
les
d0ides
nucléiqu03 et .Les colorants
:
- ab.sm'ptiofl moléculail"::'
-
fluore.<;cenr;r~ statique et dynamique
di2hroIsme lin~0ire
1
Nous
"Vl)ns
ég,:üernent
LiU 1 isé
les
leclmi~ues ~18ctrophorétiques
1
pOUl' séparer l'?s difr4~'ents topoisom€:J>'ôs
ou [Jlélsmide pi3R 322 en fonction du
taux de ~ourenr'oulr;m(,nt et de
la cr.ar'G'::' Dette de chaque tO[JIJisomèrc. Enfin,
1
nous
;(:sumolis
r1!1.ns
ce
Cl1apitr,,,
les
ha..':.ies
t~Jécwiques
des
mé[~;lf\\ismes
des
:,éar;tions d'oxydation des ,J'.:'ides nucl~iques i=lnoto3e:1sit-i lisées par les c010-
:eants qui ont él~é Illili~é.s.
1
1
1
1

---

9
Etats singulets
Etats triplets
52
t
Couversion
1
iucerne
T
~
•
52
5
-1
...
Relaxac:ion
û.
vibrac:ionnelle
~
T
on
Convers ion
1
~
i
lncerne
-...
1,
'i'i
1
..--
~
~ §S
Conversion
on
im:et"système
......
1
e;
Relaxacion
0
UJ
-
Conversion
vi br<itionnelle
~
"-
~
1
inc:ersyscè.me
~Z
UJ
0
1
"~
1
c>
~
;;'
:>
'"
1
Relaxac:ion
'"0
vibrô.c:ionnelle
l
"-
~
0
>,
,
-T
-"- -
,
1
•
Figure 1
DiOlgl'cHrlme
de
Jablonski
et
transi ti,)rls
mises
cn
jeu
lors
de
l'excitation d'une molécule organique.

---

10
l
-
EQUATIONS
FDNDAMENTilLES
[/J
SPECTROSCQl'] E
D' AE',SOl1PTlDN
ET
Dr EMISSION
MOLECULAIRE
1. Equations fone!amentélles
Les mo16culè'S,
à 1 'CXcCDtion de l 'oXygèni~ moléculaire, scnt en 30-
Jutian
fJ
la
température
ambiar..te
dans
ti ta t
fondumental
singulet
L'absorption ,j'une radiation lumineuse fait
passer la molécul~~ de son état
fondnmental
singulet
Sa
à
un
ét.)t
exci I;é
singulet
Sn
dans
un
t0rnp3
de
l'ordre de
10- 15 secon,je.
L,q
désacth'atLon
cle
l'état excité Sn vers l'état
Cond<imentnl
50
s'~rrcctue ,~uivant plusieurs
rnécanisme.s
représentés
par
l~~
diagrarnme de
Jablorlski (figIJ!'e 11.
La
(!ifférenc!~ d'énE;!'Gie
entre
,jeux
niveaux
eX'2ités
Sn
et
S,,-l
(n)
1) étant faibl€,
la ConveJ'si,)rl inr,el'n8 d'un 8tat Sn (n :" 1) à l'état Sl
s'effectue très :"apl,)ement <:,t conduit la rnolécul': au niveau vibrationnnei le
plus tV.lS san~ érni.ssion de j)hol~OIl avec une c:onstante de Vît2SS8 de l'o)'dre dé:'
La
désactiv3.tiol1
de
l'état
oSl
'fers l'état So s',,,Cfectue b':2UCOUP
plus lentement,
1-3 difrér'end: d'énergie entt"2 CÇS deux ·?Lats étant beaucoup
plus
gr3.nde.
Plu,s~eul'3 mécanisl~t:s de désactiv::.tion de l'~Lat Sl
entrent
a10[','3 en oompétition.
[1)
Une
dé:3flctiviltiorl
:1,)n
b)
L'émission d'un pllOton
r
lIe
de. }'état 5,
.\\
l'étaL So avec une constante de viLess
()+9 s-l
: c'est: le
phénomène de t'l uorescence.
c) Le
celui
de
l''::tat
singlll~~L ~or'respondant
'me
convel's10:1
intersystème
peut.
d<§peupler
l'état Sl
pour
peup};;:'
l'i§Lat
Tl
avec une consL,"nLe kcis' L'état,
trip].et p<:'ut alors
st:' désacLiver'
de
façon
non
)',jcjiativr: 3,',-::(' un8
constantr"

---

11
KOH de
r l'o",~"e
'
do
"
10+ 0 "'-' l'J--1
" , - 1
~: c: ' e,s!;
1 e
"
phenomeno de
.la
1
pllOsp.lorC=3CCrlCe.
L' absorpt ion de la lumi~;'r~ par UIK solut ion
'~ui t
la
loi
dè 888r'-
Lam'D8rt
;
U10
cC.L
( 1 )
où - la et l !'eprésentent l'illtensit6 lumineuse incidente et émer-
gent(~.
- A est l'ahso)'bance de la solution.
- ,
est
le
ooefficient
décadique
(1'extinction
molaire
- C 83\\_ la conccontr'ation (lu sc-luté en rno];'JJ'ité.
l
(~st le tP.jet opti 'lue (cm).
Si
18bS est lé! qUDntiLé de lumièr'e absorl)ée p:lr unité de temps et
par
unité
de
volume,
lB
GoncentraLion
des
molécllHs
8xcitées
à l'état S1
[C*J peut ~'écrire à. tout moment:
d
[e' ]
~.
,I,~
(2 )
r.. l
l'~ 'J
dt
où
Vlr'squc
la
solution
est
sOUlllise
à
une
excl.t,aLion
·:;ontinue,
on
admetqu'à l'état statioIlnélire ,18 varia.tion (je la conC8ntratiün des moJlf~ules
ex~itées en fon~ti0n du temps i:::st nulle:
d[e']
-------
Ù
dt
ct 'où
,
I
,
abs
k·
le' J
en

---

12
Par
':èQntr'G,
lor'sqlW
Iii
solution
8St
soumi~;f.: ~ une
illlJrllinatLon
tlléol'iQucment
infinililent
bl'ève,
le
nom~)('e de mol·1cule:, de l'état .'3, qui. 3'0
désactivent v',~rs l'état So par' le::J clifrérents mécanismes représcntl':.s su:' h~
diagramme de Jablonski ;JuiL
1.-"1
r'elatlon suivante:
d[e']
"i [e']
dt
( 4 )
L'intégr"ation de l'équation (4) conduit à
t
[c' J
[CO']exp (- ----)
(5 )
TF
L'intensits
de
fluorescence
obsc)'v~e après
l'excitation
décroit
alor~ de façon exponentielle:
t
r ( tJ
kF le']
-
, 1
kF [CU
exp (- ----)
(6 )
'F
On
appell,:~
temps
de' vi",
radiatif,
1iJ '"
l/klè,
le
temps
de vie ne
fluOl'escence
théorique
(j'une
molécule
dont
1'2
seul
mode
de
dés8c:tivation
serait l'émission d'un photon de f'luorescence.
Tb' est
le
temps de
vie de
flUor'escence de
l'état singulet 31'
Il
tient
compte
de
t(Jus
les
mécanhrnes
rOsf3ibles
de
désactivêition
de
l ''''iL-,t
ln
Le
ren~~ernent
quantique
de
fluorescence est
alor'8 défini
r;omrn€
1e
.~8p[)ort du nombre de: [)hotons de
rluo:'escerlce émi.s sur
le
nombre
total
de
photons absorbés par liJ In,~,lé,:::llie.

---

IJ
[( L)
dt
'F
'0
D'après
la
loi
d8
Beer-Lélmbe:rë.,
1;j.
concent.:'ation
d·.o5
molécules
excitées [co*J
est éGale à .la qua:ltité de
lumièr'€
absorbée (Io -1)
el~ l'on
peut a101'5 écrire:
L' intensit~
toti:t1e
1e
[] uorescence
Cone t ion
dl)
temps
devient
t
la
(1
-
10-cCl)
•
. exp (- ----)
( 10)
'F
Lorsque l'ilbsorbance de la solution 8St faible,
à grande
dilution
A
cCl ( 0,(15), la relation (10) pelJt s'~crlr'e :
fi t)
2,3 C l[e] "u
tF
t
oxp (- ----)
'F
'F
Dans
une
solution (;Onteniirlt plusieu~'s espÈ<CfO:3
e,:cit-§es,
la.
fluo-
t'escence observée I~st léJ somme de la [J UOreSCl2ilCe (Je ohaque esp~ce i
rI
~iF
F (t)
L 2,3 ci01[eiJ la ------ exp (-
( 12 )
1=1
Tir
Si l 'Ofl intègre cette )'elation en Conc1;ion du t~~JpS, on obtient
n
F
2,3 1 ~ [i [CiJ ,~iF
i = 1

---

14
Pour
IlW"
excitatiOil
br'è,/8,
l'an<ily;se
du
déclin
de
i'luor,-;:scence
doit
en
principe
pel'm8ttr'c
l'identification
du
nombre
d'expèces
fJuore,'3-
cerltes pr'~sentes dans la 3011Jt1on (r81atlO[1 12).
2.
fl.pplications de la fluoresçence
La
moléculf'
exci téa
reste
d,ms
son
étRl
singulet
S,
pendant
un
temps relati':ament
long par rappol't au temps d'excitation.
Du)'ant ce temps,
0utre
1.03
dif[l~t'enb
mécanismes
de
(lésactivation
déjà
cités
dans
le
diagramme
ct,::,
Ja~lon,')v.i,
la
molécule
peut
'{air son érnissiun d,-~ fluor'escencc
modifiée pal' d'a'Jtres phénomènes:
-
L'el1viron:l';ment du milieu:
12 relaxation de
la cage du solVClnt
autour du moment Go? tr'Rnsil'î.on de la molscule exc'ltée peut ejéplaccf'
l',smis-
sion de rIucresccnce vers de plus féJibl8s ,~nergi8s.
-
[,8
molécule
excit~e peut transférer son éneJ'giE: ',rers d'autr'es
molécules
prC:;,:Jent;;s
dans
la
solution
C8
phénomène
peut
condllir'e
à
des
r'éactiom:. photocl1imiq1le.s et/ou fi
une: désactiv,lLion non J'adi~tive du c~lJ'omo­
p!lOre. On parle alors d'extinlêtiol1 de fluorescence par' transfert d'éneJ'gie.
-
Le tr3nsfert d'énergie peut 4galcmcnt se [)r'oduire '/o2r's J 'oxyg8n~
moléculair'e
vi<'l
l'état
triplet
du
chr'omophof'e
POUf'
g·?"nér'er
de
L 'oxygèn~
singulet
qui
est
à
l'origine
de
nomhreuses
T'éactions
è.'oxy(latio~l
des
compo.sé.s organ i que,..,.
-
l.Jne
inU:racti,:)n
~30Lt (18
l'ét~t fondamental 50 soit de
l'état
excir,ô 5,
avec un inhibiteur' dG
fluorescence peut conduir-€
à une inhibition
d€
la
f,luo~'escence du chromopho;''2
U;'l
inhibiteur
de
rluQI'escence
l~st une
substance qui n'absorbe pas l~ lumi8r'e à l~l lOllgueur' d'onde d'excitation [lu
chroniophoT'e,
mais qui éteillt la fluor0scenc~ de ce dernior,
Plusiew's méca-
nismes pelJVerlt expliquer' ~Gtt,~ intlibition suivant les deux sch6T(laS r'éacLion-
ne!::; s'li'èiilt.S
a)
Inhibition sLatique
L'i:1hibiLeul' de fluon'scenc€
notA Q inteloagit à l'état fonùa:nental

---

15
avec
18
CIH'om')phol'e
pour'
\\1(;[lner
un
comp10xc
(AQ)
qui
n'émet
plus
de fluo-
rcsr::,:ncc.
F. + Q
AQ
( 1U)
La fluorl:lscence mesurée r'C3te toujours pro[Jor'tlonnelle 8 la concentl'3tir)n de
l'espèce
librE:
A.
Si.
(J.
~3t la rraction de J\\ complexé avec l'inhibiteur Q
(IIQ) , ::,dcJ!'s
:
F
K ( 1 - a)
[Aja
Fa
K [AJo
\\~t
.
1"0- FI P
c'l.ll-(t
Ki Qj 00
F,)/F
1 ~ K[Q ]
( 15 )
La con.st;:}nte K mesur6e d panù' de la variation de l'intensité de
fluo('esc:ell'::e E.'n fonction
ii8
la
concentration en
inhitlit8LIr' Q repl'ésente la
cùnstante d'<'!quilibre
r]8 la r'éar::Cion
de complexation à
l'état
fondamentRol.
Lfintensité de
rluorescenC8 diminue mais le temps d·ô! vie reste inchangé.
b) Inhibition dynamique
Si
le complexe avec
l'inhibiteur 0'(; forme
avec le chromophore ~
l'état
excité,
la
désactivation
de
ce
c'Jmplexe entre alors
en
compétition
avec le_'3 autres m')des de \\1é:Jactivation dE: l'état 51'
A* + Q
A ~ Q
3i
kQ est la const:mte cinétique dl" désac:tivatlon de A* ilèlr Q, alors l"
tempo; de vie de fluoreSC8nce dE: l'étal; ,:xcité 1; val'ie suivant la relation
Ile
k,.- + ,.s",.
' k '
,
k,
[cl
"
'"
-c 1 S
1,.'
'-1
, '
[, J
i<Q '0
~
( 16)
où
'0
8st
le
temps
dr;
vi,;,
dL'
fluorescence
du
CI1l'omophor'8
e:1
l'absencc de

---

1G
l'inhibitéur Q et kQ es!., J.'j consLante dl::'. vitesse mesur'anl, l'fJCC8S~,ibilité du
chrolDop:lOJ'e 8xci té à l ' inhiblte1.Jl'.
Le
pl'oduit k Q 10 r;s\\~ 2.ppeJé cono;tante de
Ster n-Valmer.
[,'8xLinction
de
la
fluon"scence se traduit a101'3 par Un )"accour-
cissemr;nt O'J ter~ps
de v je.
Cette extincl: ion croi t quand la concentration et:.
in)jUnteut'
augmente
ct
devi02nt
très
importante
quand
le
temps
di:'
Vi8
de
l'espèce libl'e est long.
3. Polarisation stBtlque
Dans uw~ soluti.on fluide isotropé, les m0ments dipolaires de tra.n-
+
-,
sition d'absol'pLion ]la et d'émission !Je des mo16culés sont orienl;~s de façon
statiStlque
comme
les
rnoléclJlf'S
elles-mêmes.
La
pr'obabilité
d'absorption
- f + . - , , - f
d'un photon pour une
transition donnée est pl'oportiiJnnelle à .: lla.K )"- ou K
8sL le vecteur unilaire du champ électriqllE: de l'ondé:'
incidente.
Lorsque la
solution est excitée pa, une lumière polarlsée,
la distr'illution des molécu-
les excitées devient anisotrope
(1,2~'. C'e",t le phénomène de la photosélec-
tian.
Les
mCJments
de
transi tian en absorption
Il'-a font
un angle
8
avôcc
les
+
moments de transition en émission lit,. Pour unE: lumj~re polaris6e
verticale-
ment
le
l'appar'\\;
de
polarisation
est
donnér:
j)éJ!'
l'équation
de
Perrin
et
~lablonski <3,6)
p
(3 cos 2 El
- 1 )/(cot,2 B +
3)
(17J
On mesure l'anisotropie stati.que par' la :'elaLion
3 cos 2 El - l
r
( 18 )
5
ou
r
( -'--
( 19 )
3
p
Des équaUons
(17)
cL
(1,'.j) ,
On d~duit
l'inten'a]]e de viiriati.c1n de r
el ,je
p ,

---

17
EXCl,TATION
~ \\'E~T[CALE
l
-<.
échanLlllùll
I",,~
F.XC ITAl ION
HlJRI'l.ONTAU:
+
échantillon
,/
~c
Fi illJrc~
2.('h~rna POU)' la rn~~3lH'e dG l ' LJJl l soLI'op l'~ de f1uOI';,;:",(;<::'I1(;(:.
t·1C
~lgnii'ie
mli!IOCfll'OrHéJLeul' •
•
(1\\f'J + 2 IVI!> j'cpl'é:;erlte l'int~J1sjl;é toL81e tH: rl~liJl'8Sr;~rW0•
.
hJU!'
c:oi'('ig01'
l'(Jr[et lie le, '.iépol;}l'l.'3i.lti')11 inLr'cdlli!:c par' les
m')1l0Cill'<.);II':1l-dIT'S,
li!V est
rempli1cé'?
[Ja\\'
1:;1\\1'',' où
G C2""
un facl,eul'
de cor't'er;-
LLan défini
pal':
G co
IflV/lll1l
lH11 et JIIV d,~:ste:rleIlL lc'~' in;;0nsil~é~3 dG ['luo-
"C'lC,:II('~ lCJI'.s(jli':
1('
r:oL-lr'i."r':llr'
811
cX";il.:'Li')f1
est
plac\\.~ h',wiz()[ltélLcrTlOJlt
,:'L
(~f:llli '';1 ôillL'.i:3ion ,>:,Jl~ pliH>-'i J'e:='pecLiveJnE:I1L SOll~ 2t l'hOI'ilé')lli..'Ji·:;, soiL ,'1 liJ
','d'LicélI0.

---

18
2
<;
• ,-
, ,
;;,
et
p
,
S
]
2
Dan~) lil [1ratiqIJ'~, l'anlsotropie statique de flua:-'escence
r el le
rapport de polarisiüion p sont mesuré::; par
les r~lations ~lllivantes
IVV - IVH
r
(20c)
------------
,
"vv
2 IVH
l'v'V -
IVH
P
------------
,
t vv
IVH
Dans
ces
fo)'mules,
Ivv et IVH rqwésentent r,;s~ectivernent les
intpnsités de
fluorescence
mesur~es lorsqu'2 le polaT'ls8ur' à l'~missioll est
parallèle ou pc:'pe~diculairl~ <lU POlëll'i:3élteUJ' à l'excital,ion en posilion ver-
ticale (rigur~ 2).
LCJ polarisation d'une molécule en solution rigide est
Lndépe)ld:~nte
du
temps,
mais èn
solution
la
polAr'is2tiOll
varie
en
fOnction
de
nombreux
pariJ.mètres.
Jl.vant
d'émGttre un
pilOt on
de
fluore,':lcence,
1.:1 Ilh)léculG excitée
peut ~trc soumi:H1 à diver'ses c')nLtaintes qui
provoquent
une
dépolar'isatio:-\\
de l'émi,,>5ion :
- mouvemt~n t brownien
déformations rotationnelles et vibrationnell"~s
triJnsferts d'8Iler'gie à
iJne .'J.utre molécule Ct: môme natUf'e,
mais
c'ûssédant une ol'ienLation différEmte ou à une ITIoléclJl'? de nature
difféf'.:;nte.
1
1
1
1
1
1

---

Il
- DICHROISME LINE:AIRE
Lorsqu'une
soluboi\\
d'acidi25
nucléi'lué:s
est
soumLSG
2
l'ê.ction
d'une
force
extér'ieure
fa'-lorîsanl;
une
ori8nl;atiùn
p1'~fârentiell~ (je
ces
m3cr'ùmolécul~s,
(champ
élecl;rique,
ror'ce
hydrodynamirjlw),
les
,nolécules
Lenden t à ;;;' or ienter avec le gr'al1d axe d,") 13 double hé J ice parallèlement au
champ
de
13
force
Gxtét' i~urs
(7 -1 Q).
Ln
di ff;§l'ence
(}' absc'J'fJtLon
d'un""
lumièr8 polarLs.§e soit paY'allè,le:ntmt (Ail) soit
perpendiculairement U.J) au
CheU)) de
lE]
force
impos€'Ô'
pennet de
définir le
dichl"oIsme linéoil'e DA
(À)
et le dichroI:::rIle linéaiJ'e l'éduit M/f, 0).
(21 )
6A/A (À) = 3/2 (3 C05 2 a - 11 f(E)
(22)
f..
CÀ)
l'eprésente l'absorpU_on isotrc,pr:- rje
la solution non soumise
a l'Dctlon du champ (j'or'ientélLion.
f(E:)
est une fonction qui
définit le pourcerltage de l "Jrientation
des mac~'omolécule.'3 ·:~n foncl;ion de l' int>:'rlsité du ch:=.mp d'orientation. Cette
foncti,)n
tend
vers
l'unitci lorsque
ID
valeLlr'
du champ d'oril'mlation aug-
mente,
toutes les molécules s'orientant
par'allèlement aLJ champ ct", la
force
cxU~rne. (11-1'1,76-78).
Cl représente l'angle formé entre le moment dipol~~ire de tran.si tian
d'absorption
d~s bases
nucléi(jl1es
et
l'axe
de
la
double
h021ice
qui
est
paraUèle au cllamp d'orientation.
L..a
valeur'
théorique
limi te
du
tiichr'oIsme
1 inéairE:
réduit
est
de
-1,50
ce qui
corr'G.3pond à UlIC valeur de
l'angle Cl
de
90 G •
Délns ces condi.-
tians,
1,3 moment dipolaire de transition d'absorpLiorl qui
est
contenu
dans
le plan des basc.s,
féli!; un "ngle de 90° ë<vec l'axe de la double hélice (17).
E:xpérimenl,al(~merlt, pou."
la
for'me:3
de
1'ADN,
les
r'ésu,ltats
des
mt';sur'es
du
dichroïsme
linéaire
réduit dOl1nen~. Ul] angle dc 73°
:;: 2 qui e::Jt
a:,sez diff.2r'ent de 1" valeur rJe 83° +" 1 obl~E:nu pal' Inesul'es c~'isL"!llogrëlphique5
sur des fibres d'I\\DN (13,18.
'19).

---

Po 111'
l1es
8ci(les
nucléi<]lW~J de ;1[lUt poids mol<ku1aire,
r(F)
tend
errectivement vers 1 dans le cas Ol.l
la
for cc extérieure
est un champ élec--
tl"ique
(11-17).
Lorsque
la
force
extérieure
est
une
for'ce
hydrodynamique
(cellu!.!:!
de
Couett';)
le
l'acteur
d'orient;:oLiorl
t'I:!ste
très
f,lible
(23,
2.1.!,
76,'171.
il ppl i ca 1;. i on
Lorsque
de
petites
molécules
aromatiques
chargées
inter'agissent
avec les <-Jcides nucl~iQlles, deux
types de complexes peuvent être caractéri-
sé::.
: un compll:!xe extel'ne de natu)'(~ élt::cl,rostaLique entre 1,;,9 phosphal,es et
les charges porté,;s par les molécules aromat.iques et un complexe d' intcrea-
lation de la molécule (,ntre deux paires
de bases 6. l'intérieur de la double
hé1.ice.
Même
si
la
m,')lécule
possède
un
plan
de
symétrie,
l ' intcr'c<tlation
dan:, un endronnement
asymétr'ique,
induit un dichroïsme linéai.re. La m·~sure
de ce
dichroIsm~ induit p~rmet de connaître l'angle Que fait le plan de la
molécule avec l'axe de la double hélice et permet rjonc de distinguer théori-
qucment un complexe 'ë!xternc ct 'un
cornrlexe d' inLel'calatior,.
le dichroïsme liné<lire r'éduit du colorant qui absorbe en dehors de
la zone d'absor'ption d~s bases est alors:
M (chromophore)
3
------------- (1)
A
2
3i
1',)11
adlnet
qlJe
les
bases
de 90°
pa~"
rapport à l'axe de l'~lélice (16,19-23)
dans
la
20ne d'absorption des ba~es (260 nro) est
J
3
1
( 260)
[() cos 2 (90) - l)J
fiE)
f (E)
A
2
2
Pour s'affr,wchir
du
f1.cti~ur d',yi"-!ntation [(E) Qui dépend beau-
1
coup de l'intensité el. d~ 1<\\ natlJr'G de la fOt'c'3 ~;.:Lérieur·e (j'orientation, 1-2
pal'al'amètre A'
a
été dél'ini
il :'elie le diclJrolsme
réduit dans
la bande
1
d'absorption
du
C010:'élrlt
à celui
observé
d<tn:'i
la
band~ d'absorptIon des
b,1.fll~S nucl8.iques.
1
1

---

21
Le ]I&l'amètr'e At pcr'tnet d,= calculer' l 'cingle li que f;;lit le mom,=nt de
LI'.:lllsition
d'ilbsorption
du
colorant
avec
le
gl'ilTH]
axe
de
l'tlélice
d'?
l'acide nucléic]l18.
(20-~;2, '(8).
~A 1 A (À) (colorant)
,\\ '
1 -
3 00;)2 0
(231
Cos 0
[1/3 (1
- At )Jl/2
(2~ )
repré:.;ente
le
dichr'oIsm'2
linéaire
réduit du complexe d<1113
la
zone d' absorpt ion du color';:mt.
!J.A//i. (2GO)
est
le
dichroîslne
linéaire réduit des
bases nucléiqu~s à 260
nm.
AT
varie de -
2 8. + 1 lorsqu'? l'angle 0 varie de 0 ~ 90 D •
La
figUl'C
3
rCfH'ésente
L.J
variation
dll
['appr)rt
A'
entre
le
dichroîsm~ linéaire
réduit
dans
la
bande
(j'"bsol'ption
du
chr'omophore
et.
celui
mesurE': dans
la bande
d'at>;~orption des bas.:;s nuc1éiques (260 nm) en
fonction rh; l'angle 8.
~I-r---r--I---'-r--,--~,
• l ,0
"
-I,U
'(~J
Figure 3 :
'1iil'iation du rapport-
A'
'-'ntr'-' l
d"
_
Y
la
l\\Jnde
d'absorpti~n du "h;o el" lchro(Lsme linéaire réduit dans
,i,!ns
la
b
j
d' b "
'-
moplOrc
visible)
et
celui
mesuré
'an l
l
élll( e
,3
sorpLion
des
bases
nucléique8
(260
nml
g e e que f
L l
en
fonctlon
de
[ •
'ct
Â
al'
e plan du chromopho~'e ave" l'axe de la
-
a(è~ G nucl\\.dque.
-
-
dùuble hélice dG

---

?2
III - REACTIONS
DE
PHOTOOXIDJ\\TION
DES
ACIDES
NUCLEIQUES
PHOTOSENSIlJILISE~S
PAR DES COLORANTS
Dans les l'éaction,' de photooxidati0n d(;s acides nucléique:s ou des
boses nucléiques pêl!'" les photosensibilisateurs, on odmet génél'alement Que le
photosensibilisateur
intervient
comme
une
entité
~éactive dans
30n
état
triplet ou dans :::on ét,l.t singulet (25,26). Deux grand", méCêcnislnes
découlent
de ces réactions photosensibil1sées.
Le
pr'océssUS du
type
l
est
caract~risé par une intcrélction pri-
maire du substrat ovec J'état excité
triplet et/ou :singulet dl: photoscnsi-
bilisar,eur',
Ces
réélctions
conduisent
SI
la
formation
d~
rar1icau%
""oit
por
trélJ1sfcrt d'électron soit
par
tl'3.nsf~,rt d'atome d 'hydrogèn'2.
Les
réldicaux
fOI'rnés i:lteragisscnt avec l'oxygène moléculairc ct conduise:1t ~.i. 12 formation
(Je
comrosés
d' :")Xygénat ion.
Parmi
les
réact ions
de
photoo.>: idat ion
p8r
les
r'adicaux, on peut di5tinguer d'un',;, façon gE5nérale quatr'c types ds mécanismes
réactionnels
-
Dans les milieux: polilir'es,
la formation d'un comr1exe 2 tran5-
t'ert de charge avec l ' 0XY gène molécula ire condui t à la
fo,'rnat ion de l'an ion
supe:'ox l'de 02" - "
-
Le photo:,ensibilisateur à l'état ex<,ité peul
interagir direcLe-
m'-Jnt avec
l~s boses nucléiques en c.:éd,lnt ou en
acceptant un électrr)n dons
UnE: réaction d' oxydo-réduction. Le rad ical :m ion forlllé réag i t
avec l'oxygène
moléculaire pour produire .l'aniOII superoxyde 02"-'
p' , D •
p.- ,
8" '
+
réactions
•
°2 .
p
-
+
O')
+
ré",:tions

---

23
-
L'interacti,)n
(lu
photo~3en~ibilisateur excité ê.VCc' le
substrat
peut se trarjuire par le trilllsfert ,j'uri atome d'hydrogèn'3.
P*+DH"PH"
S·
,
Oz
IWO"
.,
P + SDDr!
PH'
-
Enfin
le
phot,)sensibilis8tew' J. l'état
excité Sl./tlit une di:Jso-
ciation intramoléculaire al:ec
formation
dl'l radicaux qui
'lont
réagir SUl' le
substrat et finalement c'onduil"e à 12 réilotion d'oxyddtLon,
pi!
_.
p"
ü?
P + 0' ------
oxydation
Lorsque
l'anion
super-oxyde
OZ' -
est
formé
dans
le
milieu,
plu-
sieurs schém'1S de réacti.ons d'oxydal.ion pemcent avoir lieu pal'mi lesquels on
peut eiter
:
- une ré(joti0n de dismuté)tion engendr'ant de
l'eélU oxygénée. Cette
l'é'1etion quoique exergonir~ue t'st très lente en milieu neutre,
(79, BO).
,
Oz' -
• Oz .- ~ °2
0 7
-
"2
ZH+
Z02"-
,
~
°2
HZOZ
- en pré:ience de certains cilti.ons métalliques,
l'anioll
supct'oxyde
peut
perdre ..,,~n -:Slectron ,ians I1n,~ r'êaction d 'oxydo-réduction,
con-.1uisant à
ta formation [lu ri'ld'ical hydroxyle OH' suivant la l'é.3.ctlon de Haber et 'o'ieiss,

---

a
a
Il
Il
~N~NH
a~{~~NH
a
~~+NANHt-<JN+N~NH2
Il
AcO~'7 0
AcQ'
OH
N=CNH
\\.-1
< 1 1
1
1
N
NA NH2 AcO
AcO
Aca y
J
Aca
OZI'Lg)
\\
0
\\
Il
0
\\~y:~
H,N
o;...a~
ACO~~
Aca
ri.gure 4A : Produits
d'oxydatlon
du
3',
5'-di-O-acét,1-2'-dé~oxyguanosine
par l'oxygène singulet d'après Sddet J. et collaborateurs (26).
288
counts
1
310
331
J
Figure
4B
Principal
produit
de
phot.ocxydation
du
3',
5'-di.-O-acétyL-Z'-
déoxyguanoslne résultant des réactions photochimiques du type I.
Spectre de masse d'après Cadet J. et collaborateurs (26).

---

- un atome d'hydrogène p"::ut ~trc Jrraché à un sllb.str'at pour' Cormer
l 'hydropcfiroxyde H02' qui se disrnute pow' fOr'ilIer l'eau oxygénée
rll1
02'-
rr
+ H02'
H02'
HO.:;"
H202
02
la
formation
de
ces
espf::ces
réactives
dans
le
milieu
conduit à
des r'éactions d'oxydation d,,::.',) bases nucléLques et 8 lé1 coupure de la chaîne
phosphodiester des J.cLdes nucléiques.
(26),
Dans
le processus du
type I l ,
l,! photosenSlbilisateur réagit dans
.son état
tl'iplet
avec l'oxygène moléculaire dans son état
fondamental
pour
donner de l'oxygène singulet
l'oxygène
0ingulet,
une
Cois
for'mé,
peul se
désactiver 011 dOnner'
lieu à des l'é8ctions d'oxydatlon :
->?02+ hv
(émissiorl à 12'{O )Im]
->
302 + cha leur (non )'adiative)
Q
-t
302 + Q
( inhibition)
, A
->
Aü 2
(photooxyda tian)
L'impor'tance et
Je r'endement
dcs
ré.Jetions
de
photooxidation
dé-
pend ~1e 18 nature du photosensibllisateur'
(26). L~3 produits de photooxida-
twn
d'un même
subslt'at
sont
différents
suivant
le
mécanisme
mis
'2f\\
jeu.
Ainsi
l'L)Xydation de
la 3',
5 1 -di-0-ac;[tyl-2'-désoxyguanosine par l'oxygène
~31ngul~t conduit.
principalE:mE:nt
~
la
formation
de
l'acide
ti-U' ,5'-di-O-
acétyl-.?'-désoxY-S-D-érytllropentofuranosyll
(;yanuriquE:
8t
,~ la 9-(3' ,5'-d1-
O-ac~ ty 1-2) -dé:JOxy-C -D-éry thopen L' ofuranosy 1) ~ -,8 -d ihydJ'o-!I-hydr'oxy-8-oxogua-
nine U'igul'e ~I). Dan5
la photo·jégr'adëltion du même produit
pM'
le
mécanisme
du
type
l,
les
proeJuiLs
obtenllS
sont
1f:,~
anomè)'ec,
.1
er
B
du
3' .5'-di-O-acétyl-2'-désoxy-D-érythropcëlcoful'anose. (2["
81).
La
photoe,xydi1tion des bases pyrimidiques [ait
inte)'v':'lIir
un méca-
nisme e1u type l
par
Lransfcrt d'élee;tl'on du noyau pyrimidique vers le
pho-

---

2(,
X=OH,R=CHJ
X=NH2,R=H
Fif!;ure
SA
figure 5
RCirrctions
du
radical
cation
du
noyau
pyrimidique
',Jroduit.
pa;'
photosen31blli9atiort
avec
la
m6rtadione,
d'après
Ca.det
J.
et:.
collabol'aCeurs (26).

---

HO
Figur~ 6
Déprotonation
du radIcal cation de
la
thymidine,
l:e rad"lcal ca··
tlan est produit par un transfert d'électron du noyau pyr-im1dJ.qu(·~
vers le photosensibillsateur dans son ~tat triplet (o'a(l"ès Cadet
J.
et collaborateurs (26)).
1
1
teH'
Base
o~as~
0lÇf~
~
R02"
0,
-RD:--QL-
-
a
0-0
a o'
a
1
1
1
\\
O~/>-o-
1
6cH'
1
OH-
OC~~H
~: 0,
OH
•
• H
•
OH
ft
1
a
a
a a
Q = P - ( J
1
1
1
Figure 7
IJn
des
m8cêlnismes
pos3ibles
de
formation
de
sites
labil.:s
en
milieu alcalin 3ur
le.'3 acides nucléiques par suite de l'3.bstrac-
;:;ion ct,,; l'hydrogène sur le carbc.ne C (2') du désoxyribo3~ d'3.près
C2de t
J _ et C') llabora teur' s
(26).

---

28
t030nsit) i li.'3at;eut'
dans
l'étal,
tr'iplet
(26-27).
Le
radic~l cation du noyau
pyrimidique
peul.
s'llydratrJl'
selon
le
sr:::héma
de
la
figur'€
5
ou
per'drc
un
pr'otan
suivant
ce lu i
la
figuI'€
fi
(2(-30).
Ces
deux
schémas T'C'pr'é-
SI?nl;ellt le cleveni)' du radical catio!] de la thymine produit pa)" p~10tosensibi­
lisation
avec
léi
mé!"1-3Hone.
Cc
photo~j8nsibilisatew' n'induit pas de r'éac-
tions
,Il~ niveau d;::s bases pur'iques mais I~ssentiellement au niveau d,?'3 bases
pyrimidiques
(2,'). Les l'adicaux forrnés au niV8JU du SUCI"~ peuvent conduire ~
une coupure de la ChZlîll~ en mil jeu basique suivant le mécanisme de la figun~
1.
L'action
,1e
l'oxyg::'ne
::Jingulet
délJ1S
Ip.s
réactions de plïotooxyda-
tian peut êtl'G aisément di.stinguéf~ dl2:> autres proces~w:'i. ~'our cel'l iJ surfit
de
séparer'
L:J
Sc)lution
Cont8nant
le
substral
du
photosensibiJ lSi-Jteur'
ri:,é
SUI" une pl8.que par une mince couC!le d'air
(31).
Dans ces condi tions le temp::J
de './ie d~ L'oxygène .'?,ingulet étant de ~O ," 50 ms à 1;-, pr'ession d'une
atmos-
phère,
l ' c)I,ygène
singulet. pr'odui t
par
j rrad ia l', ion
du
photose11sibilisateur
fixé sur la pla~ue pouL diffusel' jusqur~ li-J soJlltion
cont.erlilnt l€
substr'~t,
la l'éaction d'oxydation ~e ptoduis,Jnt à la sur'face de cette soluti,)n.
Ainsi
plusiGurs
substral:s
ou
dcèS
concentrations
diffél'entes
d'Un
même
substr'at
peU'lenL être étudié~;J di-Jns lé! même expél'ience.Il suffit p("lJr cela de dispo-
ser d'uni" cellule pr'ésontant plusieurs compartiml2nts sGpal'és de f2.,;cm éL'i\\-
che.
Cette
méthodologie
pel'met
de
distLnguer
les
méc,lnisrnes
du
type
l
et
ceux
faisant
inter'venir
l'oxygrone
singulet,
Le
rose
bengale,
le
bleu
de
méthylène ont ainsi <2té utilisé:, a~'ec succès pOlW oxyder la guanine;. l 'his-
tidine et le tryptopr,ane
(31). L'utilisaUon de l'ADN circulaire du pldsmide
pf3R322 a
per'mis
de
monl:I'S'I'
que
l 'oxysènG
singulet
formait
des
produits de
phütDoxydation
labtles
en
mili0u
lJa:sique
(32).
La
mutagénicité
de;
l'ADiJ
irradié en présence de l. 'oxygène singulet généré par la méthode dl" Hidden et
Wang condui t
le plus souvent 8 une transver'sion G ... T suggérant ainsi que la
guanine est la ciblt> privilégiée de l'oxygène .singulet.
(33, ,~:n.
Lorsque
le photosensibilisaV~uT' ir.ctllit la [O)';]I<,tion d'url complexe
physiqu8 stable avec les ù':êidr;s nucléiques ('~'e:st à dire int8!'(]<11é enl:.r'€
125
p,:iir"s
de
bases
aL.
fixé
(jans
l'un
des
sillcns
rie
l'ADN),
l~S
r'é8.ctiolls
photosel)sibilisé8d peU'Ierlt faire
intel"Vcnir soit J 'ét~t triple!:., soit l'état
singulet
du
phol;osensibilisatcur.
L'lrlter;lction pe:'tur'be l'él:~t sirlgulet du
phr,tos,?nsibilisat>-:ur fixé aff(?ctarlt ,,1nsi ses pl'opriétés d'émission de fluo-
rcscence.
De~,
ligand~ rixés
(jans
le
petit
sillon
d..
l'J1.DN
comme
le
II',

---

29
6-diamirw-2-phenylindole
(DJl.rI)
ùnl~ g6né)'alement lelJI' fluoresoence cX"lltée
(3~-36). La fluol'ésccnce
des
inter'c''.1,'Hlts
est soit
exaltée par
tout.e.S
les
pélires (je bases
(Bromur<.' d r~l;hidium) soit inhihée au voisiné1.g~ des paires de
bases G-C (êlcrlcline,
bleu
de méthyli-one)
(3','-)1',),
Peu
de molécul<:ls ont leur
[lllor'€SCence
oor:lpHd,emenL
étcinls à 18 fois par les pai:'es de base.'.> I\\-T ct
G-C. Les delJX seuls exenlples CO)111U5 SO)ll;. le tryptorh~ne (~2-~~) et le catiorl
10-méthylacridinilJm (~5).
Dans cel;u; thèse,
nous démont.rons qu'une nouvelle famille dE: molé-
cules
dérivées
clu
dia3é1pyrèn[~
voienl:
leur
fluor'escence
totalement
éteint>?
par
toub;;,
le3
bases
nucléiquE;S.
Cette
inrlH~ition totale de
leul'
fluores-
cence pour'rai t êtrü attribuée à une réaction du type l [)8r transfert ct 'élec-
cran de$ bases vel'S l'étéJt singulet ,1e3 diazapyrènes.
Ge plus ces molécules
photos>=nsibiliscnt 18 coupure de la chaîne phosphodiester lies acides nucléi-
ques 8n milieu llcutre.
Ces :lOuvelles molécules,
Gouplécs à des oligr)nucléo-
tides dirigés
(;oncre 'mü séquence
(.\\111e
de
l'ADN,
~,el)v"'nt eonstitu8r une
nouvell~ famiUe
d'endonucléas83
perm8tlant
de
couper
1.:>.
chaine
phosplw-
diester de l, 'acide nucléique par activation photoni.Que.

---

IV - TOPOLOGIE DE L'ADN SUiî.ENROUL,~
1.
Concept de bas~ - Définition
Une
mol.?cule
d'ADN
est
const-ituée
d,::
deux
chaine;]
linéail'es qui
.s'enroulent l'une ;)utour
de
l'autre a,/ec une (lf'ientation
CS'--\\. 3') antipa-
rallèle.
La
périodicitÉ:
de
l'hélic,:,
ainsi
fûrmée
esL
caractérisée
par
le
nombre de
pail'es de
bases dans
un
tour d'héHce (soit entre 9,5 et 11 sui-
vant la struclUre de l' ADN con~idéré).
L01'SqUC
les deux brins de chaque ('.h".tne sont fermés,
ln. 1I1()l8cule
d'ADN devient
cirr~ulaire. Le cer',-~le
formé
pal'
les
deux
brins
peut
alors,
sous des contrainLes exter'nes,
se surenroul,::r sur lui-même fOl'mant ainsi des
3upertours à b
manière d'une vrille. La plupart des plasmirJes bactél'iens se
présentent
ainsi
dans
les
conditions
physiologi<..lues
ou
sous
l'action
,je
colorants pouvant favoriser ou défavor'fser cetLe superstructure (l.J6-sü). Les
trois
paramètr~s qui pel-mettent Je caractériser' une
telle
superstJ'uctur'e
sont :
Le
noml)re
top01ogi que
L
Le
nombre
topologique
définit
le
nombçe (Je
fois
qu'un
brin
travers".':
le
plan dans
18qud
est
placé
l'auLre
brin(~7-52). Si
Jans un
flDN circtJlaLre non
est Iii valeur
du
nombre
topOlogique et si
L est
la nouvelle
ADH
5uren-
l'c,ulé,
la différenc,? entre
le sens du
surenroulemerlt. ~L =
Si
6L
< 0, on '-ht que l'ADN
surenI'oulé.
Si
61..
)
0,
l'ADN est positivement
sUI'enroulé.
Le
nombl'€:
topolc-
gique d'un ADN est néceSS8irement un nombre entl€t'.
- Le nombre de Laurs d' hélice T ; T '" tU:1 où N \\~s[.. le nombre total
de paires ,je bases et h le nombre dt-? paires cie ba::oes par [..our d'hélice.

---

31
- Le taux d,~ supGrlow'
(W)
: Il repr6sente l,:; rlombre d'enlac'O'm,:--nLs
de la double hélice sur elle-même.
(53,
511).
Les
trois
par8rnètres
utilisés
pOUl'
sar'actérisc~' l'ADN circulaire
sont reliés entre <2UX par
la relatiO;l 5uivante
(52-55)
:
L
oC
W + T
La périodicité hélicoïdale (je .J'IIDN a pu être m,~sul'éG par- l'action
de
nuc:léases
sur
de
l'ADN
adsorbé
sur
des
surfaces
solides
(56-59).
La
valeur
obtenue
est;
v01510e
de
10,5
piJlr'es
de
bases
ce
qui
correspond
au
nomb~',:
cie paire~ de base:'>
d'un tour d'hélice dans la forme B de l 'fIDN.
Le
sut'enroulernent de
l'ADN
,1ans
la
c811ule
est
contrôlé par
une
clas.se d'enzymes af;pe lées gyr;:;ses ou topoisomérases.
Les tr)poisoméréls,~s
Il
qui
sureJ1roulcnt
négati.vèment
l'ADN
dépendent
dc
l't,TP
~t
de
Mg 2+
(50,60,61).
Les
lopoisomérases nu
type
1 par
contre,
relaxent l'fliJN
suren-
roulé en ADN non 5u!'enr'üulé.
Cette ré2ction ne consomme pas d'énergie, !Tuis
utilise
l'én<?I'gie
emmag8sinée
dans
183
superlours.
C~S enzyrnes coupent
un
brin
de
l'ADN,
font
tourne!'
un brin
l'un
.1ulour
d,,"
l'aut!'e puis
lient les
eXLrémités coupét:s
(62).
Le
surenr')ulement de l'ADN Cûr'respond donc à
une
forme
de
stoc:k3ge
de
l'énergie
perlllettant
de
relaxer
les
chaînes
aux
fourches de réplication
(63).
2. Application
L'action
d'agenls
inlel'calants
peut
induire
la
!'elaxation
d'une
molécule d'ADN
slll'enroulée.
Dans
ces
COn(jilions,
on obtient des
rwlécules
,j'ADN
qui
ne
diffèrent
entr'8
elles
Llue
par
le
nombre
de
supertour's.
ces
différentes
molécules
sont
dppelées
des
topoisomères.
C<'cS
différents
topo-
isorn~res v·;uvent être 'lÎsualisés pdr mic!'o3cOP8 électr'onique, NI sépa)-és par
é lt~c tropho:'èsE: da<l~' un ge l (l' agaros e b id t men t iünm~ 1 pn présence ri' 1)11 in Lei-
calant.
Oans
une? pr'8ll1ière
étape,
1.' ADN
.sut'tnrou16
est
l'elaxé
pal'
la
VJpO-
isomérase
l
pour
cng'.?ndrer
les
diff,5rents
Lopoi30mères.
L'échantillon
~.'3t
a10r.'3
soumis
(J
une
électrl'L'horèse
dans
la
181'12
dirnension.
Lef,
différents
topoisomèrc:s sont séparé">
en foncl,ion de
leur nornbre de sUÇJ8rtours.
Le gel

---

est ensuile incubé dans un
Lampon ~.:lntenant l'intercalant puis Llne deuxième
électrophorèse est réô.liséc: perpendiculairement D la premièl'e dimension. Les
diffé"rentes
tacrles ob:Jervées SU)' le gel correspondent à des molécules d'ADN
qui ':;ïr'1'81'ent les unes des autres par
leur'
t.aux de
sLH't"nroulemenL.
Pendomt
l'incubatüm,
la fixation de l'intet'caldJ1t induit une décroissance du nombre
de $upertours, de sortr: que les rnol(icules qui étaient sw'enrouJées négative-
ment dr:viennent de i~oins en moins sUi'cnroulée3 ct celles qui étaient sur'2n-
roulé<!5
positivement iJagnent des supertours positifs et migr'ent alors
plus
v i te.
Doms
la
première
dimension,
les
topoisomèreé.'
comportant
le m!2me
nombre de supertours, qu' ils so ien L posi ti t's ou négat ifs, migrent de la même
raçon.
Une
taohe
donné\\O'
PE:ut ..... epr8"senter
alJ~,ji bien un topobornère avec n
supertoUl's
positifs
ou
négatifs.
D8ilS
la
première
dimension,
l'es
deux
topoiZ,otL1ères
ne 58r'ont pas résolus. SUPPOSOrl5 que la rixéltion d'une concen-
trat ion
donnée
de
l ' intercedant
t'8sse
per'dre
3
super'tours
négatifs,
le
topoisomère
q'Ji
avait
trois
supertour's
négntit's
devil:mt
relaché
et
migre
moins
vite que (;elui
qui
,wait trois
supertoUl's positifs puisqu'il possède
maintenant six supertour's positifs.

---

33
iJ - MISE EN OEUVRE EXPERIMENTALE
1. Ab3Gr'ption
Les spectr'es
d'~lbsOI'ption sont enr';~gi3trés .sur un spectr'ophotomè-
1~I'e du type UVIKON 520 ou UVIKC'N 860.
L'échantillon
est;
maintenu
à unr~
température consL~nte par un cryosLélt à cü'culation
(HUBER HS110). Les cel-
lules de mesure en quartz suprasil ü:1t des
tr<:Jj(jts
Optîqu8r.
var'iant de 2 à
10 mm et des volumes util~s de ÙOG )]1 à ? ml. LéS spectres sont enr'8gistrés
ave(~ une cuve témoirl en r~[~rence. h basse ternpér'atul"e (allLour de ODC), un
courant d'azote gazeux est dirigé SUl' la
face de chaque ,:::eJlule pour éviter"
la formation de buée sur les p:;l.l'ols. La vjte:3se de d~filement chaLoie est de
50 nm/mn et le spectre est enr~~gistré doms le dOtnéli;le df; 600 ioJ 300 mn après
avoir
fait
un ztfr0 à 600 nm,
régioll
où
les
coloz'ants a1n51
que
leurs
cam-
p.leXéS avec les acides nllcléiques n'absorbent pas.
Les
titra t ions
son t
E: Hec tuéc3
en
aj out an t
dans
la
Cé Il ule
de
meSl,lr8
('ontenant
le
co lorant,
de
peti ts
.'olutne3
d'une
sall)t ion
concentl'ée
des mononuc:léotides ou de polynucléotid'~S. Le. cellule de r'éfér<2nce Oonti8nt
toujours le tampon. ApI-ès ch "que <lddition,
l'em'eglstrement est différé (1e 5
minutes
afin
d'atteindre
l'équilibl'E: de température. Les spectrcs d'absorp-
tion sont corrigés de la dilution.
Dissociation
tllermique des
complexes sui 'lie ~n absorp~ion. Chaque
cou ri Je de dissociation
thel'miqu8 coorér:3.tive est caractérisée par'
une tem-
pél'atur<2 Tm pour laquelle la moitié de la double hélic:e ou d'J complexe acide
nuclé1que-colOl"ant est diSSociée.
Les courbes de dénatur'ation thermique des
oligonucléoLidéS
libres ou complexés aux colorants sont enregistrées à plu-
sieurs
longueurs
d'onde.
Le
spectropflotomètre
UVIKON
;)20
est
équipé
d'Un
systèlTe
(le
programmation
p~rmettant de
sLJil'l-e
l'absorbéHlce
de
plusieur's
échantillons il dir'férentes
longueurs
d'onde en
fonction
d",
18
t.::-mpératurc.
L'arjsorbance
du
colorant
est
enregistrG"e
dans
1.:1
l'E5gion
lj5ü
nm-JC1C' nm,
,égion dans
laquelle
les
polynlJcléotidf:S
n'absorbent ras
<2~ parallèlement
dans l'U'.,' où Les dcux composés absorbent fOI'ternen~.
La
vitesse
de montéE:
et
de
descente
en
température
est
fix<?G
a

---

34
D,' "C/mn.
fi.
cclt'2 '[itess~, les erTeurs systématiques darl3 la dG'termination
de
la
Lemp4r'ature de
demi.-dissociation Tm
sont
réduites.
Les
variatiCln.ô, de
r:oncentrat ion rar éVA.poration aux tempél'aLl.wes élevées sont négligeatd,:,s et
l'éibsorbance de c'naque soJuti,)n e~,t vérifiée ar/'l's crlaque ,~ycle ~ 2DoC.
La
p",ntG de
l,"
courbe de
fusion
'Ost
r'eliéc à l'enth3.1pie (611) de
la dissociation par'
la reléltion suivante
(6li)
da
Illl ~ 6f\\T 2
m
(----)
dT
T =
Tm
où Tm est la températur'~ de demi-clbsoci6.tion,
et Ct t'errésente la fraction
de complexe dissocié.
La
vClriation rjlj Tm est r",liée à la conCGntration en oligonucléo-
tides par la relation de D,mIle
(65).
!JS
2,3 R
log
( 2li)
dans
laquelle Cm r'eprésente 18 concentl'ation en
oligonucléotide
libl'e à
la
u:mrératUl'G de demi-dissociatir)rl Tm.
2. Fluorescence
2.1. FluOl't?scencG statique
Les
spectres
ri 'excita.tion
et
d'émission d.s
f'luorescenCt;
ont
été
enregisL:rés SUI' un spectroCluorimètre SPEX,
FluoroloG FlTll.
lin dispositif
pel'met la correcl;ion ,1es flucl;uations de
la lampe jans le tl;>mps (Xr§non
!60
\\o,latts),
des
tt'ansmi.':>sions
des
rnonochrolnaL:eur's
d'excitation
eC
des divers
dioptres.
La
mlOdamine
101,
placée
devant
lm
[l\\1.otomlll~iplicateuT' (le réfé-
rence,
délivre 11
tout
im,Lant
un :3ignëtl référence
propOt'tionnel à l'inLen-
si té de la la;llpe. Le Fluorolog F11"11
est muni de troiS monoC)lrorn:1teurs dis-
posés en T par rappol't au faisc'3au d'excitaL:ion.
CettE: disposition permet de
{,

---

35
falr~
des
mesur-es
dfO' polaris:1tion OLi d'anisotropie
d,~ !'lIJOi'eSCence rapides
et
précises.
Le
monochromal:ew'
~ l'e\\citation, gr'a'lé à 1200 traits/mm est
blazé
à
250
nm.
Les
deux
monochromi\\teurs
à
l'émission
gl'a-""b
à
1200
traits/mm sont blazis à 500 nrJI.
Le
spectrorluol"irnèt~'e est aussi
équipé
(l'un
mlJdule
de
contrôle
(j'acquisi.tion et de traitemi::nl '1(')5 spectr'es comprenant;
deux
ensembles
de
détectilJn
3.vec
des
photomultiplicateurs
du
type n 923
(RESEARCI-l
INC.)
reft'oidis
tllerm,),Hcctriquement par effet
Peltier
et qui enr'egistl'ant 10 signal de fLuo!'"!::scence.
un
microor,jinateur'
D!1
lB
permet
de
piloter
les. différentes
un i tés du spectrofL uor imètr'8 d'url>': Pdr't, d'accumuler et d,~ trai ter les spec-
tres sur de:, disquetl:es, d'aut,'>? f)ilt't.
Les échantillons 3ü nt en génér'Ell CC'tltenus dans des cuves en quartz
suprasil
analogues
à celles
utilisées
en
absorptiorl,
d€
trajet
optique
vari:3.nt de 2 à 10 mm eL. di:: \\/olum€
utilc de J60 III h l ml. La température des
cellules
est
maintenue
const~tnte p<'lr
un
SUPPOf't
th>?rmostaté.
Un
cour,tnt
,~d'azotc
gazeux est
utilisé pour en 1'2 '/<2['
toute buéc
sur' la pal'oi dcs cel-
lules à basse tempér'8ture. Des bande.,; passantes des lTionochromateurs de 0,2 à
2
nm et
une
vitp-sse ,ie défïlement
des monocl11'omateul'S de 0,2 à 0,5
nmlsê:-
conde ont été général(~menl; utilis28s pour les cnn:gHtl'ements.
* Les rend€ments
qU8.ntiques
de
f1 um'escence Q ont été
J6t€rminés
pa.r comparai.~Jùn avec un produi t
de réfé,n,mce
I~ dont 112 rendement quantique
est connu pt en utiLis,;lnt la relation SlJivante (66)
Q
Les
t€r'rnes
A et
Q désignant.
l'especl;ivement,
l'absOl'bance
de
la
solution
il la
longueur
d'onde
d'excitation
et
l'intégrale
du
spectre
de
fluol'esc€nce.
1.. ' indicc
~' s,, t'apporte dU
produi t
uti.lisé
comme
référence
dont
le
t·,:ndernent
qllant.i"wC
est
connu.
L'absorb2nCG
de
la
solution
2
la
lOIlgI.:"e")\\" d'and!; d'excitation "st lOiJjiJlJrs i.nrérieul~:à 0,05 urlit2 d'Eibsorban-
ce pOlJr' rnlnimin8r l'Bffet de filtr'e
int€t'ne.

---

31)
La
9-aminoilcr' ici ine
dans
le
tam;:Jon cacoJy late
de
so,j l',lm
10 mi-1 8
pH7, a été utilisé ccmme ~t'odult ùe rérér'ènce (67, (8).
x Le3
titrations
isotllennes E!n émission de
fluorcscenc~: sont ef-
fectuées de la même manière qU'cn absorptioCl
: de petites quantité:::; de rrono-
nucléotide,'3 ou cIe
polynuc16otides sont ajoutées à une solution contelv.nl
le
eolOl'ant. Lorsque la tcmpél'atur.,) est stabilisée après 5 minutes, l'inten,'3ité
de fluOr'escenee au maximum d'émission,
ou le spectre d'6mission de fluores-
cence sont:. enr'egistrés.
La
longueut'
d'onde
d'excitation est
tOI)jours
choi.sie
8 un poinl:.
isobec:,titll1e déterminé d'après
]es s~'ecLr'es d'absorption.
Tous
les speetrGs
d'excitation et ~1'émjssion de fluorescence sont corrigés de la dilution.
* La dissociation thermique des complexes est sui vie en émission
de fluOre,'3CènCe
en excitant
toujours en un pOLnt
isobestique détermin<5 par
les t,itrations isothermes en ilbsorption et en suivant la var'iation de l'in-
tensit05 d'émission de
fluor'escenc8 du colorant. La vitesse de montée ou
de
descente efl Lempérature (ost toujours de 0, 1 ~C/lnn.
La dJrivée
d,? la
courb2
Ir = f(T) pé:rmet de déterminer l.q ternpératw'e de demi-dissoci"'tion Tm_
* La mesure de l'anisotropie statique a 4té faite sur le 8rectro-
fluorimètrt' en utilisant:. d,os polari~eu('s dl) type Glan Thomson tl'anspar'ents
dans l'ultraviolet. La disposition en T des rnonochrorn(Jteurs permet un enr€-
gistrt'ment automatiqut' de l'anisotropie. A l'émission,
les deux polariseurs
sont
croisés
tandis qu'à
l'excitation le
polariseur est or'ienté alternati-
vement
à
la
vel'ticalc
et
à l 'll0rizontale
par
le
module
de
conll'ôl'ô
et
d'acquisition
d'O.3
données.
L'unité de
calelJ]
détermine automatiquement
le
facteul' ci., correction G = IHViIHH.
et les spectres cie
polarisation en exci-
tation ou en émission pGuvent être ensuit~ enregistrés.
-If
Luminescence B basse LempéralUl'c
Un
dispositif
constitué
d'un
Dewar'
dc
section
céH'rée
r'empU
d'az:ot'~ liquide permet d'obtenir'
la
luminescence
tol:.all~ d'un échantill'.Jn à
7'( K.
L'échantillon est
placé dans
un
tul)e en quartz supl'asLl de 3 mm de
diamètre qui
p.10nge
dans
le
Dewar.
Le sohant
utilisé d,Jns ces
con,iitions
est en général un mélange d'éthyHneglycol t't de tarllpon ou de glycérol et de

---

37
Lampon.
La méthode utilisée pour obt~njr' le .speetr'(:! de ;:>hospho:'esccncc <;on-
sistl2 à
utiliser' un syst;ème de fenêtl'es tou:":Lflntes reglées de !;e11e mélnière
que
la
fer,être
à
.1 '~mis.sion
soi t
ouvel'te,
'~lland celle à l'excitéltion
est
[eemée.
Dans ces conditions .seule la lUminescenc(~ cE:lr'acté:'ÎsJe par' un temps
de vie long est observ8e (supér'Leur à 1 ms).
Lorsque les fenêtres sont r)uverte~~ simull;anéiTI~nt ~ ,1 'excit:ltion et
à l'émission la luminescence tot::de 8St observée.
2.2.
Fluorescence dynamique
a. Hesur'E: de temps de.' 'lie de fl.uorescencE:
L'appi:JreLl de m'2.'3UY'E: du temps de vie de fluol'escence construit pa~'
EDINBURGH
INSTRW·1r:NTS
modè.l G
199M
est
Url
spectrofl uar' imè tre
impuls ionne1
utilisant la m€thode
du photoé18ctron unique
(69).
-l'excitation lumineuse est pl'oduite par la décharge n'un con den-
'3ateUJ'
<ôntre
d8UX
~lectrodl:::3
plongées
dans
un
g,l:~ sou:::;
p"essiiJn
réduite
(Azote, Hydrogène ou deut8rium).
18
photon
de
fl'Jorescence
émis
par'
la
solution
irradiée
est
recueilli
à
angle
(!roit
sur
la
car.hode
d'un
photomuHiplicatew' 2251.jB re-
fr'oi~i à - 30°(: par eff8t Peltier.
-
le signal pradui t pal' ce photoélectl'on SU!' l'anode est envoyé ,1.
un convertisseur
tGmps-ampl i tude
(TAC)
et eonsti tue 18 signal
"stop"
enre-
gi~,tré par un annlyscur Tilulticfl.naux (KCA). Le si.gnal "start" est fOUl'ni par
l'éclair de 18 li;mpe pêJr l'interméniail-~ d'url photomultiplicat8ur
de
réri5-
rl2'ncc.
Le
rôle
du
TAC
est
a.1ol's
de
déli',rer
à l'analyseur' multicanaux
un
signal propol'tlonnel au temp~, qui SépéH'e les cJE:UX signauX "start'I et ".stop".
Le
HCA inct"'émenti: alors d'une unité le nomt)"e d'évènements déjà enregistrés
(jans le canal dont l'ac!resse COl'J'cspond au <3ignal délivré [Jar le TAC. Le TAC
est r'éinitiali3é pa)'
l'éclair'
de
la
lampc pOUl'
un nouveau cycle.
Lc ncm~\\r'e
d'évènements enrr::gi:str'é.s dans
chaque canal du MCA ail bout d'lm
temps donné
représenti: la probabilité POil!' qlJ8 l'é:nissiofl d'url [)hoton de l'luorescence se
fasse au temps cOITesponcJi-mt à l'adress€
cie chaque canal
,l.près le début
du
flash.
Le déclin obtenu repl'éssnr;e la pl'obab'.lité d'émis~ion de f1u')rescence
li!" l'échantillon Gn
fonc\\".ion du temp:s.

---

38
- le d~c,Lirl de fll10rcsccllce ilinsi que le pr'ofjl de la lampe selJle
(obtenu avec UfW 31)11JLioli diffusante d·" ludox)
sont
trarlsférés sur un mini-
or,jjnateur PDP-1173 (GETEK) et ffi,.§mOI'isés :~ur' (ies disquettes pOIJr' une analyse
ultfrieUl'e.
la oourbe enr'egistl'4e sur l'analyseur multicaniJuJ:: ne repré31-;nte
pas
le vr'ai dÉ:clirl de
fJuorcsc,=nCG 18 l'échantillon étl:,jLé.
Ceci
est
dû au
fait
que le
fLa~,~h de LI lamp.:' n'est pas i~lstantal1é mais îJr~3(mte un": durée
dont la largeur' est d'environ de l,5
os.
Cette courbe t'Ct)
est dO:1C un pro-
duit
d,~ convolution du pl'ofil de la lampe g(t) el. du déclin théoriqlle de
fluo~escellce de l'échantilloll F(t).
t
r (t)
f
g( tl
F( t-xldx
g(t)
-If
f(t)
(25 )
o
L'analyse consis!;e à Pl'oposer' un mGdèle de déclin
mono ou mu1ti-
exponentiel et 8 ajuster If::S dl[férent~ paramètres intervenant
pour obtGnir
le meilleur aju"tement
possible
entre la courbe calcul{(~
F' (L)
par n~eon-
volution et
la courbG'
expérimentale
f(t;).
Le
critè,'e (1'aju:;;tement
des
deux
courbes est un test classique par rninirnisation dlJ X~2 r"éduit.
510
i f · _ y , 2
.
l
l '
X 2
r
l
(26 )
N
j = 1
y ,
Yi
représente
les
valeurs
(les
poirlts
expérimentaux,
Fi,
celle
des
points
cédculés et N le nOI;lbre de degr'és de liberté.
f..e
nombre
d~ d'~gr'é~ de liberté l~' =
n -
nT
où n est
le
nOlljore de
points
considér'és
:
'510
c;maux r'er~lJei11ant l'émission 1e fluore:ocence
da:ls
le MCA et m le nombre de paramètr'es à ;::ljuster dans le modèl~ choisi. Pour un
écll;::lntillon dont la distl'ibut;ior) des probabilités obéit; ~ une statistique de
Poisson,
comme c'est le cas en émission dG' fluOl'escencc,
la ·"'Ileur théorique
duX 2
r
=1.
Le p)'ogr'amme ·je calc;ul syntllétise la colwbe de déclin dé
fllloreO'.-
cence F'et) et ICI C''Jmpcll"e à la courbe ~xpérim8ntalc f(tl. ["tte démarche est
la 01us rapi<:1(' et permet Url meil1.eur ajustement des di.ft'érents par'ilmètre:3 du
mod81e
plutôt
que
la
r1éman::he
jlTver~e qui
consisterai L à
déconvcluer
12.
"courbe expérim'3ntale par' rapport au prcfi l
de lél. lampe
(70).

---

39
Les P('Ggl'<lmTra:o, uti.lsés perrnettent d'ajuster les courbe3 expér'imen-
tales de déclin de flUl)r'~3c'~nce à des courbes t!,!§o;,iques du typo
n
t
f ( t)
L ui exp (----) + ao
( 27)
, i
il?_, repr'ésente le bruit de fond.
il
peut
preneJre
les
valeur's
1,
2
ou
3 sui '{ant
que
le
déclin
est
analysé avec Url mo6~le mono, bi ou triexponentiel.
Le
programme
i tèrr~ en il.jusLélnt les différentes valeurs des para-
m~t,'c:3 du modèle
choisi
"iWli
que
le
déplacement
de
la
lampe
(0)
pour
0btenir
la
valeur minim.:lle
du
X 2
r
.
l.es
différent:3
paramètres
ajustés
sont;
les
temps
de
vie
de
fluorescence
(Ti),
leurs poi,js r'espectifs llormalisés
(ai),
le bruit de fond
(a o ), et le déplaC8ment de la lampe (D).
bi
ei
(28)
n
,c Ci
i = 1
On défini t le temps de '{ ie moyen <1) par
n
n
n
<,>
~ api
L r-~ il i 1 1 bi
(29 )
i '" 1
i = 1
i = '1
Pour
qu'une
arlalysc
soit
statistiquement
signific3L:.ive
pour
un
modèle à un,
deux ou tr'ois t,"mps de vie,
le nombre minimum d'évènements dans
le canal maximÇll doit être ,:tU moins de 5000, 8000 et 12000 l'espectivement.
3. f1étllodes biochirrliques
a. Mar'qua[Se des ollgonucléotides
Les
difféJ'ents oligrmuc L,~otide5 ont éLé marqués ~
leur' extrémi té
5'. Ce marquage est réalisé en incubant un échantillon d'oligoJ)u(:16otide
(10

---

picomoles)
avec.:
la
polynuc16ol:.idyl-kiluse du
pilage
T4
durant
30 minutes à
3cr~c dl présence de l'ATP marqué au pl1ospl1ore 32 en fJo:-3i.Uon
'(
(32p y ATP)
dans
le
tampon
suivant
50
mM
Tr'is-r1Cl,
10
mM
r--lgC12'
5
mrl DTT,
0,1
mM
spermine, 0, \\, rn~4 EDTA »\\1 1,1).
L'8chantillon est a101's
traité pDr Un r<lélimg8 phénol-alcool iso<l-
mylique
(1V/2V)
puis
précipité
dans
70%
d'éth,mol.
Après
séchage
i l
est
repris dans un tampon 10 mM cacodylate pH 7.
b.
F.:lectrophorèse sur gel dénaturcmt
L'irradi.Jtion
des
échantillon:J
est
f<-lite à l'aide
d'un
banc; op-
tique équipé d'une
lampe ?J.
vapeur' de
mer'cure
de
200 Wéltts
basse
pressio;,\\.
Une pb_Que rJ.e
verre et un filtre aqUE!UX perlilettent d 'éJimin'~r les rayonne-
ments
de
courtes
longueurs
d'onde
(À
(
300
nm:.
Le
banc
est
équipé d'un
pOl'te-cuve thermost[ltable permetLant de
m.qintenir constante la
tempér;].l;ur'e
dur'ant:. 1-0 temps d' il"rad iil tion.
Les échantillons irradi9s en pr'ésenee de.,; dif,férents photosensibi-
\\,bePo~
li sa teurs
son t
prée i il i té.s
dans
70%
j 'c§"thano 1,.."."..59~n ten an t.~!{~~3t'1
d' acéta te
d'ammonium ,;t 5 lJg de t-hNA, séchés,
0111.'3 reÇ!r.l'.~/dans ;:'0 ]Jl d)"
U. Ce volUme
.
(~( fJJ8P1J~O
~
est alors fractionnné en deux par'ties.
; . -
ll~ "
;;
....
1.... ni
1
- 10 )lI sont d0 nouveélU séch<5s r:,t r;ipr'lS cdaw, l'e 010 ant dt: CI1a1'-
\\~~,,6~·," -n lIon
.
ge puis chargés sur un g,=l dénaturant..
Ce ge
';'<.~e le~,.u res dil'cct03
produites
sur
l 'oligonuc14otide
par
les
P:'1oto~ :1S~~
eUl'::'
0:1
mi lieu
neutre.
10
)ll
sont
repris
dan::;
11 pi.Jér·idine,
incubés
10
minutes
.J
90°C puis lyophilis8S 3. 581;,
Le culot est
lavé deux fois avec 2001-11 d'eau.
séché et
repris
dans
le
colorant
de
ehal'ge de
Maxam-Gilbert
(71).
Ce
gel
révèl.::.: les produit:.s de photooxidation labill?s en mi lieu basique.
Le~~ gels dénaturiints (20 % Dcrylamide,
O,S % bis-élcryJ.q;nide,
'( 11
urée)
sont soumis à une électrophor'èse :"1aute tenston dans un tampon TEP. (90
mM Tris,
90 mt-l acide !)Qi"'ique,
2 mB
EuTA
pendant
deux
heur'es
à
!IO
W<ltLl
const<lnts. Les gels sont ensuit(~ autoradio~1:"'aphié3 sur des film~, FUJI (X-Riij
Film) ÈI -
7üoC avec lln éCl'at"'l é',mplific.qLeur (KC'iJA~J pendant 12 à
125 heures
suivant la quanCité de radioactivité f.nitialeme:"lt chargée.
l'

---

[.'inten~ité de
chaque
bande
est
estimée
soit
en
découp3nt
les
différentes
bandes
sur
le
gel
cL
en
comptant
la
t'adioactivité
présente
(compteur LKB) soi t en d0n:J i tométran t les films ilvec url densi tomè Lre à las8r
LKI3-2222-020.
c. Préparation du ~Jlasmidc pBR 3<-'2
Le
plasmIde
pBR
322
a
été
préparé
à
partir
d'une
souche
d'Escher1chla coll
Hl; 101. Ln purification e:~L r<581isée pal' ultracentl'ifu-
gation dons
un gréidient de chlorure de césium
saturé en bromure d'éthidium
(72).
Le
bromul'e
d'éthldlum est
ensuite retiré de
l'échantillon par
une
extr3ction
exhaustive 3.
,1 ':1.1coo]
isoarnyJique
(0
fois)
puis
p31'
(Iialyse
(5
fois)
contre un
Lampon
10 mM Tris,
2 mi'-! EDTA.
Dans ces conditions,
on ob-
tient
uniquement
de
l'ADN
du
plasmid·~ sur·:nroulé sans contamination avec
l'ADN hacLér'ien.
d. Gels d'agarose
Pour obtenir
les différent~ topoisomè,res du plasmide pBI1 322,
20
lJg de
l'ADN du
plasmide sont
incubés pendant 1 heure il 37°C avec
10 unités
de
la
topoisomérase
l
(AMSRSriflM)
dans
un
r,ampon
3::;
mM
Tris
pH
.13,
5
mM
MgC12'
5 m~ spermidine,
5 mM DTT,
'12 ml1 I<Cl,
0,0"\\% BSA. L'échantillon est
traité pal' un mélange
phénol-alcool
isoamylique (lVI2V),
èt
précIpité dans
70% d'éthanol.
3 \\Ig de
l'ADN du plA.slllide sont r8pris darlS un coltw3nt
: (60
% glycér'ol,
0,1
% bleu de bromophénol),
puis
chargés
sur
un
Bel
d'agarose
0,8%. Le gel d'agarose est soumis à une électrophor~se pendant 12 heures à
2 Volts/Cin dans un t3moon bOl'<1te larllrlnniaque 50 mr-1 pH '( ,5.
Après la premièl'e migration,
le gel est incubé à l'obscurité dans
de,lX litres de ta.mpon contenant
le lig3nd :3 étudier pend3nt
12 heures.
Une
dcuxièmè électrophOl'èse orientée per'pendiculairement à la première est alors
réalisée dans le tampon d'incubation contenant le ligand à 2 Volts/cm
pen-
dnnt
15
heures,
L(.
gel est finalement
inCillJé dans
un-~ solution 10-6 M (I~
!womur<2 d'·ithidiurn et photogl'aphié sous i.llL:minaUon ultr'aviolette,
1
1

---

4. l1dlériel
Le
chlol'uJ'<2
(1e
N,N'-2,7-rilméthy1d.iazapYI'énilJm
(MDAP2+),
et
2 ,~' [lIIé tllY 1ène- di - ( l , 4 -~.dlén'y l ènem6 thy 1ène- d if1 ) J -b i s- (7 -~I-mé thy 1- 2,7 -diaz 8-
j):irénium)
(bi;;-Dld,llj) ont É't'5 ;;yrIUI2ti.sé3 au labo;'éltoire ,ju r't'ofesseur Je;:m
HLl.rie j,EHtI
;1
l'Institut
LE
BF:I,
,je;
l'Universit&
LO"is
Past8l.H'
~
;:;t,rcisbour-g
(ï3),
13
f'igLwoJ
(J
repl'éscnte
les
fOI'mlJle,;
cilimi.ques
des
deux composé",.
Les
soJutLol1:'; iiqueus,,"s de ees pro(luiLS sont oons8n·ées all r'éfr'igérat':,ur 3. + Il''C
et à l 'OL.:Jcu/'ité. Nous ,-lVfJI1S vé)'ifio lew' con:oen·a.tion en meSlll'ant périooi-
CllJcm~nl leurs SP8ctl'L',':> ,j'at<,or'ption el; d''Oxe:itation de f1ufJl'eSc.:ence 8. ,jjfré-
Le
i)r(;lnlll'f~
d'ét~lidium
est
un
prodlJit
COl1l1jj,,,/'cial
MEllCK.
La
9-[Jminoact'iiJ\\;le est également un [wüdui t (-n:HCK qui a (~té pur'ifié pow chroma-
togl'élphie
SUt' eouciw IIlince
(3i.1ico Gel
60 F25lj) d,Lns url mélange d'é>thiHlol-
toluène
(lV/IV).
'tau.'>
le!]
solvants
ol'géHliQues
Ulilisés
sont
des
pr'o(jull:~, Fluka ou
,~1FJ':;CK d,> '--Iual i té "UVFI.SOL". Nous avon::i '''8r i f 12 l ' abserlCe ri' i Inpuretcis f luores-
i;enLe'3 élvclnt 1el11' utili.sation.
Les
rn')Jl(Inu,=:léotj,jes
et
les
polynucléoLirjes
sont
des
pr'oJlJits
PL
Biochemicals.
Les
oligonucléotidcG ci rJlf'.s
:
2'1lnère-As,
27mère-Ts,
('ni; ét~
syn-
thétlsés ~ Or12ans par' l'équip'~ du Dr. N.T. Thu'Jng (U. FIsseline, '\\'. Roig, r·l.
Chasslgno)l),
puis
pUI'ifi{,:o;
pé!r'
HPLC
ct
élcctroplh1rèse sur gel d'acr'ylamlde
('{il,
75, 1\\2, (;3).
1,(;8
octathYlilidylatcs
8-Te-M[l{\\p2~ et a-MDAP;!+-TB GriL été obtenus
]);:;;'
j;,
synt'nèse d'un octatrlYlllidylaLe par lé1 méthode des pho.sphlJtriesters en
solution.
Le (~olJpLage du 1'1DAP2+ pClt" un br'as p8ntaméthylè~ne s'effectue "Jn 3'
h-"'''11I1"
,'hl,"J~,,': <1" Il.rl'··dlmÜI,yl-2''I-rJL1·,';'p,'''~,,[u,,,
(1,1
'.'L
~~
2,,'- [11,,"Lhy le"<}-~ l - ( 1• lr-r,II~"i Pn('mé Lily lène-oJ ly 1}, b h -1 (- II-~."U",1-
?,7-(II'lz,1I'yr'6r1IWI)
(i~i.
-

---

Les
séquence3
nucl€otidi'lues
des
différents
oligonllcléotide~ ont été vél'i-
fiés sur E'JO'l par
la m~thod~, de Maxam-Gilb0rt.
(71).
2'rmère- As ;
(5') f
G h G T GAG 'r A A A A h A A A T GAG T G C C A h
(3')
27m'3 r'e- Ts :
CS') 'j' T G G CAC T C A T T T T T T T '[ ACT c: ACT C fl
(3')
32mèr'e- A6 :
(5"
T e e T GAT A A A G GAG GAG ~ T G h A C Â Â ~ A A A T G A (3')
32mère- T6 :
(5') T CA T T T T TTC TTC
AT eTC C T c e T T T A T C fl. G G il..
(3']
( dA) 10
(5')
OH A JI A Il Il fI A A JI l\\p (3')
(dA)8
'
(5')
OH A l, JI A A A A Ay (3')
( dT) 8
'
(S')
OH T T T T T T T Tp
(3')
a
"
':S')
OH T T TT T T T T -
P -
S -
(CH2)4
-
CH;:: -
MDAp2+
"o
a
"
TT T 'r 'r 'r '[' T (3')
"
ù

---

La
cOJ1,::cntratir)n
de
tous
les
produits
uLi i hés
a
été
déter'minéc
cl1aque fois piO' absorptiun ultraviolette ')U visibl€l
8n utilts'l.nL; 185 coeffi-
cients d'extinction mo13ir',~ qui figur'enL dc-ws le table'l.LJ I.
TABLEAU l
'~-::--T
Espèces (pif
7, T
cmaxxl0 3
(nrn)
(W 1 em- 1 )
1
AMP
259
15,11
GMP
252
1 J;r
CMP
2'{1
13,0
n·-jP
26'(
9,6
dAMP
259
15,2
dGI'lP
25,,'
"],1
dCr-lf'
271
1 3,0
dTMP
267
),6
poly( rA)
257
9,11
poly(dG)
253
10,1
poJj( dC)
27"
';', lj
p,üy(dA.)
257
8,6
poly(dT)
26"
3,52
po1yd (A. -T) -poly<j (A - T)
262
6,6
puly(dA)-po1y(dT)
2;;0
6,0
. ,
poly(rA)-poJy(dT)
2GO
0 "
polyd ( G- C) -po 1yo ( G-C)
255
",
7, "
pol y( d G) -pol j( di:)
253
il
ADN ttlymLJS de ~eau
260
5,5
27mère -A.S
250
9,0
.?7mère-To
9,0
o
260
32mère- A6
260
9 , Cl
32mèr€l-T ô
2(,0
9,0
(dJ'l) 10
2:',7
10, lj
( dA ) 8
25 '(
10,3
( dTi,
,
265
9,6
B-TS-~~DAP'- +
"20
12,65
(l -r-1O Ap2+ -1':~
"20
12,65
HDAP2!-
~
lj 18
15,8
l"Jis-DAP!.I+
Il 1':l ,S
25,2
Bromure d'éthidium
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1
t
1
1
1

---

[
[
1
1
1
CHAPITRE 1
1
PROPRIÉTÉS SPECTROSCOPIQUES DU CHLORURE DE
1
N,N'-DIMÉTHYL-2,7-DIAZAPYRENIUM (MDAp2+)
ET DE 2,2 é rMÉTHYLÉNE-DI (1,4-PHÉNYLÈNEMÉTHYLÈNE-DIYL)]
1
BIS-(7-N-MÉTHYL-2,7-DIAZAPYRÉNIUM) (Bls- DAp4+)
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

50
1
1. PROPRIETES
SPECTROSc.:OPIQUJ~S D'ABSORPTION ET D'EMISSION DU MDAP2' F.:T DU
BIS-DAp/J+
1. Propl'iétés d'absol'ption
1
Les deux composés
le 11DAp2+ et son dimère,
le bis-DIlP4+, absQ:'-
bent dRns le visible et dans l'u1Lraviolet. Les spectres d'absor'ption de ces
1
d'~Llx' compû~,é~J sont. c.:'lractél'i ..,éG j:l3)' tJ'oîs bande:.; d'al)sorption eentl'ées l'e,'';-
pectivem"~nt à Zlj1 nm, 3311,5 nm el 417.5 nm j.)our le MDAP2+, 250 nm, 33'{ !lm et
1
420 nm pOUl' le bis-DAP4'" (figur'e 1.1).
1
Les deux colorants ne co;npol'tent pas dans leur stl'uctw'e chimique
de groupements pOll'lant êt."e protonés ou déprotonés en fonction du pH.
C'est
1
ainsi Que leur spectre (1'ab.sol'pLion moléclJl:aire ne change pa~ lorsque l~ pH
varie de D à 8. En milieu 1;1'€~13 basique, les spectr'es d'absorption moléculai-
1
l'e évoluent en foncLion du
temps el l'on observe une précipitation des deux
pl'oduits.
1
Le;~ deux Lr'8nsitions situées dans le '.'isible et le proche ultl'a-
'.'iolet présentent
une struct,w'e vibr'oniQue bien résolue.
Les maxima de
ces
1
llandes vibl'CH\\iques sont dépl,'3.cé5 de deux tl:lrlomètl'<2s environ vel's les grandes
longueul's
(j'onde
dans
le
bi2,-DAP~" par l'apport ,JU monomère le MDAP2+. La
1
1
1

---

1
51
1
1
1
1
1
l
1
1
1
1
•uc
1
•.c ,0,84
o
1
•.0•
1
lJ
1
220
~90
360
430
500
À(nm)
1
1
Spl;ctr'es d'absorption molécul3.il'~ du "'IDAP2'" (,~) o::t. dlJ bis-Dl\\pll-i-
(8) dans
le tampon cacodylate 10 mM <1 pH '{ et 3 21)°C.
1
1
1
1

---

52
figure
I.1
:'epl'ésenLe
les spect~·"s d'êbso!'pti0r m01écdairc des dcux compo-
sés dons le tampon cacocylate HI mM à pH 7 eL à 20°(.
La
dlffér0nce
d'énergie
obse:'vée
entr'e
l.~s
bandes
vtbroniques
"entr'ées rcspr.,cti VGrn,;1l l: ~. :11 { ,S IlIli (=39:·0 cm- 1 ), 3'Jl.\\ !lI\\] (25360 C\\\\1-1), 31 2 nm
:21î880 cm- 1 ), soit cnvi:"on 1500 cm- 1 correspond à l'énergie de vibraLion des
liaisons C-C
du nOyClu
éromatiqLe
dans
le
plan
de
LI
rnolécule
1.1).
Cette
même
c1i.Cférence d'énel'gie s'obsc:'ve sur' la deuXième bande çentT'(ie êul;our de
33JJ nm.
Lê
mesu;,e
de
la
polarisation de
fluoresc8m;e à
!)D3SC tempéT'atuT'e
ln Kl 'J.insi QJe du di(;hr'oîsr~t: magnÉtique: ,.::ir'cul-3Îi'e du p:,'l'(one et du
2, c,'-dL:I:':dpjTèlle
<ri
permis
'.1'aLtribuer'
aux
di[fér'entC's
b-1ndes
du
spectre
d'absOt'ption molécula 1 J'e,
los dlfférentes
t!'ansi tions éJ l:ctroniQues corres-
f:0nda.:1Le.<o.
La
figure
1.2 l'I'fH'é5'mte
les
formuleS
chimiques
du
pyrpnr-
élVPC
les deux Dxes d'or'ientation de
b
molécule
(A),
du 2,7 diaz8pyrène
(B),
du
l",DAP2'
te)
ct du bis-Dru,ll'
<Di. La ::.>ubstitution de;, ~::''3.rbones (2 et
C7 pa~'
(ks
atomos ei'azot-,o danG la molécu1,~ de !Jyr'ène donne
un
nOyau
diazapyrène
qlJi cQn.<;ervc l,?s mêmes èlxes rie s\\'mét1'1(~
~2).
La rigL;~'e 1.3.1\\ r(;pl'ésente le spectre de pola,isation de fluores-
Genee du MLiI\\p2+
:2,91j
10- 6 M)
(I"ns
le rrélange
tampon cdc!J,jylate-gly(~érol .3
-
20 DC et
li::!
figure
1.3.R
illustre
los
spectre,'}
de
dichl'oî.smt:
rlldgJléti(jue
circulilire,
de
pol:il'iséJ\\:.ion
d'e:{citClticn
,j~ fJuore~,cen2e et les spectres
d'excitation de rluorcsc€nce
du pyrène ainsi
que du 2,7-dii:\\zapyrène obtenus
1
8 uôsse
t'2mpEôratul'e
(77 K). Cette figtJl'8 est tirée de l'érUcle d", THl1LS'~fWP
E.W.,
DCMNING J.h'.,
MICHL .1.
paru
da.ns
Ch.;mical
Phys.Î.c.'3
(1977) 23,307-319
1
(2).
L63 :'ésulti:\\ts
de
cet
ar'tlcle
ITiontrent l'existencp. rie
qUéltr'e
transi-
tions éleGtroniqu'2s
~,-n* des ét,l::'s singu18ts exdtés du pyrène èt c1'è qu~l-
ques diazapyrènes.
La
comparaison des
sj::ectres
1
d'absorption
moHieulaire et
d'eX01Ldtl'::;J)
de
fluUI,t~"jce;)ue dl] MDM·-2'
et
du
Dl.s-DAPIj-
àUX
spectres
de~
figUl'CS 1.3 nous a P0rmLs d'assigner aux dif'f2N2ntes r;3{J(Jes d'f.lbsorption les
1
transitior.s électroniques corTespùn(lanV~s ;
1
- La tt'~nsit\\on Lb :
1
J'
ddll::i
le
.oyrènê'
(26900
cm-Tl.
Elle
S8
d<iplace
V81'S
les
grandes
longueuT's
d'onde
.sur
les
speetl'es
,j '2bSOl'pLlon
des
riil'rér'2nls
ciaZ8p}'~','nes
2S200
crn- 1
pOUl'
lE'
1
1
1

---

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rOl'mule.s
chii~i cue~ dé'tei.oooées ::u D'n'i:ne (1'I~c L;:O$ d'2UX <lxes de
~;':métri-2 (1e la ·;TIol.02cule (A."), GU 2,7"-diàZa[ly,'è:18 1:5), (lu "ID/,;::2-
(2) el; du bis-DAP~- ([').
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lhe v~l"ç (J[ -lg" nll ' l''f RI 1'11,' nlcllhted '"l<lll, l!o"WIl
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r1yctirol il -
20°C.

---

55
-
La Lri:msi tian L.a
:
Cc:tt,~ 3e,~onde t,j'élnsition se i;rouve à 29600 cm- 1 dilflS le pyrène.
Elle est:. polal'isé~ pan111èlem,::nt ?:t l'axe z.
La substitution des carbones G2
et
C'(
par
les
aZ8te:3
dans
les diazapyrr.,nes ne P~'ovOQLle pas un déplacement
important (Je cette
ti'ansition
d'ln.'3
12
série
Qui
nous
cancer'ne.
Ainsi
elle
reste
centrér:
;,
29600
cm- 1 dans
le
2,,{-diazapyrène,
à 29900 cm- 1 dans le
MDAp2+ et à 29670 dans le bis-DAP~+.
- La
tl'ansition Bb :
Centr'ée <1. 36200 cm- 1 dan!) le PYI'ène,
r;l}e se trouve très déplacée
vers lei courtes longueurs d'ondr: dans les diazapyrènes.
Elll~ est pola:'isée
suivan~ l'axe y et est sltuée ~ 39100 cm-\\ dans le 2,7-diazapyr0ne. à
40500
cm- 1 dans }'2 MDP,p2+ et il ~OOOO cm- 1 d,lflS le biS-DlI.Pl.j·.
- La transi Lion Ba
:
Cette tr:'Hlsition,
fOI'tement fJoL~risfe sGlon l'axe::: dans le pyrène
à
111100
cm- 1 ,
est
déplacée
vers
les
cour'tes
longueurs
d 'oo(ie
dans
le
2,7-diC'.2apyrène.
Elle
se
d.jplacG
encor"
plus
,·el'S
les
courtes
longueurs
d'onde dans le MDAP2+ ainsi que de.ns lè bis-DAI'!.J 1 autour' de liB7BO cm- 1 • Elle
est masquée pal' la trallsitlon Sb.
La
riéterrnination d03
coefficients décadique:3 d'extinction molaire
El été raLle comm,,, suit:
500 mg de chaque prO(luLt sont
séc~,,?s à l'étuve en
pr'ésence de
P?Ü5
ju,<;qu'à
l'obtention d'un
poids
con5t::lIlt.
A par'tir
de
ces
produits
secs,
,jc~
petites
qUElntitfs
sont
pesé'3s
entr"3
mg
et
5l1ü
wg
et
dissoutes soit dflnS du tampon cacodylate 10 mH à pH 7 soi t cJil'8ctement dans
de l'eau bidistillée. I~es spectres d'absorption moléculaire sont alors erlre-
gistrés ,'ians une cuve de quarVz suprasil de 1 cm de parcour's optique contre
du tampon ou (1e l'eau da:ls la cellule de référence.
Le~ dilutions effectuées au
11 lOe ,
au
1I100 e
03t
au
1/1000 e
mon-
t"ent que l'absorbiH1Ce des deux
oomposi§s
sui t
la
loi
dE: Geer-Lambef't.
Les
phé.'lOl:lène,'j
d'agr'égation
ou
d'autoa<5socia'cion
ne
sont
donc
!~èlS obst=rvable;-,
d8ns lél gamme de: concenLr'ê1tion.s Que nous avon.s utilisée.
1

---

A partir' de ~'abso~b~nc~ de ctlaque pl'oduit,
les cceffici~llt5 d~CR­
jl'lllf''>
:J';;xtincti()n
molJ.ü,'è
ont
~té
détel'illir!~:5 el!
utilis8nt
la
r'e12tion
sui vante ;
J\\.
H.
\\'
( 1 î
m.
l
où
m
masse de l'échan:illon
~1
ITlaSSe molaire du pr'oduit
\\'
volllme:' de 12 solution.
Les
coefficients
décadique3
d'extinction
molaire d0termlné,s
dans
le tampoll cac;ody,late 10 mM,
à pH 7 et il. 2ü a C sont Id~ntic!w?s à ceux obtonu3
en cHssolvant directeme1t les produit;s dans cie l'eau bidistillée. Le tabJeF.l.u
l,A résu;ne les
~C'ngueurs d'onde des maxima d'absorpLon et le.': C'oef~icü:nt~
d'extinction molalt'€
ccwresponCiHlts,
I~- ~1DAP2+
bis-DAp!j+
, . (M-l .c.:r1I-1)
1
.\\
( nJ!)
.\\
(nrn)
c (W 1 • cm- 1 )
1
Lin.5
ls800
~20
25200
393,5
8200
395
13300
375
2600
37Li
)1900
33"
35000
33G ,5
(6')00
318,5
22000
:-;21
J..i3UIjIj
305
8000
30,!
19000
2~1 j
3J..iOU
295
1J/300
2%,5
66000
250
125000
1
TAPLEAU l.tl.
1
Carao\\:.érist iqU05 spectralp.'3
du I1DAp2+ et
du bis-DAp4+
,jans le
tarnp.")n caco-
dylatô; 10 mM à pH 7 ~t à 20°C.
1
1
1

---

57
soluticns
con c c n I~ :·é ''2S
dos
doux
~wodlJi t<:,
sont
cons~~'vées
l'Dbri
d~ IF.!
lumière
à
...
!.j°C.
Dans
ces
conditions,
aur:'\\Jne
variation
de
l'ab.:::;or'·Dan~;e n'est observée même sur une l,)ngue périod~ (3 mois)
2.
Propri~tr2S d'émi::;sion de fluorescenc8 statique
a.) Spect!'es d'exL:itation et d'émission de fluol'eseence
Le spectl'c d'émi.'3sion de fluorescence c.l'un composé pOl'té
sur
une
échelle
en
nombre d'ond~ est
tfléor'iquement
l'image
du spectre d'abso:'ption
dé
la
transition électronique:' Sa -1
S1'
Les s))<;c:tr,"s d'émission de fluore::;-'
cenee du MDl\\.p2-r ainsi
que du tLs-DAP~-r sont en effet symétriques des spec-
tres
de
la
pr'emièl'e
llande d'aborpLion.Les
figures
I.!.j
el
1.5
représentent
les spectres d'émission et d'excitatiorl de t'l.uorescencc du MDl\\.p2+ ainsi Que
du bis-DAf'ij-r dans le tampon e8cc)dylate 10 m!-l à pH 7 Cl: ,), 20°C.
Lê: spectl'c d'émission du MDAp2-r e.'Jt
très résolu el pl'é:3-2nte trois
pl"ineip;3.lI~S bandes vibrooiques à !.j23 nm, 1150 nIT. et 475 mil. Le même t.ype de
spectre "st observé pou, le Us-DAP!.j-r o',ec un déplacement de3 banrJes vibro-
niqueô de i~ nm cnvirürl vers les grandes longueurs d'onde s':Jit à ,'i27 nm, lJ55
nm
et
à
lJ80
nm,
LD.
dit'!'él'ence
d 'éne:'~je
entre
ces
diffét'ent(2S
banc1és
du
spectre d'timission de
fluorescence
(;;; 1300 'cm- 1 )
cOl'I'espond 7i l'énergie de
la vibr'ation active en élbsorption (voir' ci-dessus).
Les
spectres
d'excital.ion
de
fluOl'(;:"cence
pr·ésentent
les
mêmes
m9.xima que le::; sp.:ctres d'absorption.
:~<2S mêmes spectl'es sont obtenus 101's-
que
L'on observe la fluorescence
"dl] côté L'leu"
(!.j20 nm)
ou "du côt,§ rouge"
(i18!)
nm) du spectr'e d'C§mission de fluor'escence. Dans ces I:'onditions, l'émis-
sion
de
fluorcscencç
observéE:: sc' i t
dans
le
tampon
cac,)dylélte ,'YJi t
dans
de
l'eau COI'l'Gspond à celle d'une sêule entité chimique.
Dans les solvants visqueux eomm~~ le glycérol ou l'ét'nylè-ne-glycol,
les
deux
Il'ê\\nsitions
c1ans
le
pl'ocl1'-" L'llr"Glviolel
sent;
déplacées
vers
les
grandes
l·~ngueul's d'onde.
Li]
CI'ansition
cen1:J'éc
,),
417,5
nm dans
l'eélU
ou
,jans .le ta.npon cacodylêlte se déplaçe 3. lQO,5 nm, et celle si.tuée à 334 nlll se

---

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1O,---,-------~-------"'l
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•
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u
•
•
u
a
o
•
c•
'DO
500
600
fi;;;ur~ I,llfl
Spectres d'excita~lon et d'~mission de 1'luor"esce;\\ce du MOAP2-
dan:3 le tampol1 cacodylate
iO rM1 à pH -; ~L à ~oac,

---

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375
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"~.
o
400
500
. 1: II
S0(·'~tl'e~
,j r exc i lat ion
et
d'émissiol,
dl~
fluorescence
l)l.'3-[)!I?i~~ ,l a j,5 le tampon cacodylate 10 m\\-\\ cl pl~ Î à 20"[.
.,

---

60
déplace à 33'1 nm rour les solution:'.; du t'-lDAP?+.
["es mêwo.5 déplacem'2nts sont
übser'vés pour le bis-Df\\P!i+ clans le glycérCll ou .1'éthylènr=-glycol. Parallèle-
ment à ce déplé1f~emenL des sP(:Ct~'8S d'al)sorption moléculair'c. on obser've un
déplacemènt
des
spectr'es
d'émission
de
fluorescencè
VGrs
leG
griJndes
lon-
gueurs d'onde de l 'ol'dre de 3 nrn.
[';;:n::>
le
tampon
cacodylate,
un dépL;cement des spectres d'excitél-
tion
et
d'émission
de
fluor'e3cen(~e se produit également vcrs
les
s-randes
longueurs d'onde
lorsque
la
tempc§r'atul'€
'{ar'ie de
-SoC rl + 20°C. Au deH de
cette
tempér'ature,
seule 1JI1C diminuti.on dé
l'intensité de
fluLw€scence
est
obsel'vée vraisemblablem,:=nt duc: à une allgmentat.ion de la con5tante d0 d~sao­
tivation non radiative.
A tl'ès basse temp&r;jt1ln,
(77 K),
le specLre d'excitation de fluo-
['escence du t1D.4p2+ se déplace par contl'8 vers les CiolwLes longlleurs d'ond·"J.
Le maximum de la pre:nière l)ande à l 't':xsitation commE: à l'émission se trouve
alors
à
~10 nm.
Dans
ces
conditions,
la
mol1§cule
est
immobilisée et.
l'on
peut déterminer la position de la
transition 0 .. O. Le spectre d'émission de
fluorescence ('este toujours sl;ructur'é avec de:3
bandes 'Iibroniqucs d ~10 nm,
li2':i ntn,
lili3 nm et 465 nm.
bi R8ndement quantique de fluorescence
Le"
rendemenLs
quanti'lues
de
Duorescence
du
t1DAp2+
et
du
lllS-DAP~+ ont été mesurés par' l'appo:'t au rendement quanLique de la 9-amino-
acridine prise comme pl'oduit de l'éférence (3). Le specl;("2 d'absorption molé-
culair'8 élirlsi que le spectre d'émission dE::: fluorescence de la 9-aminoacridj-
ne recouvrent: les mêmes dom;, ines
de
longueur d'onde que ceux des deux
com-
pOS2S.
Pour'
des
solutions
ayant
la
mêm'3
absorbanC8
~ la longueur' d'onde
d'excitat;ion, le r'appol't Je l'intégrale du sr~'ctre d'émission de fluorescen-
ce par l'apP01't à celle de la 9-aminoaclridine permet de déduire Le t'endement
quantique
de
flu'JrescencG.
L'éJbsorbance
de
char:jLJe
solution
à
la.
10ngu'"2ur
d'on.j8
d'cxcitat1t:Hl
est
toujours
inférieUJ'e
à
0,')5
pour mi:1irniSGr 1 'l'J'fet
d'éor;'~ interne.

---

61
l),ms
ces
(;')nditiOllS,
nous
"Ivons
r'etrlJuvé
les
mômes
',ra12ul's
,lCt3
rend(;l!]cnls
ljui:ullüjue:.;
de
fluor'cscence
quelle
Que
soit
lit
longueur'
d'onde
d'exciti'ition si l'on '~orrige les mesures de l'absorb<Jnce ~ la lonsucur d'on-
dG C01'I'ssporldantc.
Le
t3bl.;;uu
I.B,
résum~ les
valeut's
de::> rc:n,jèlnents
Quanti!:J.ues de
fluor'e.'Jcence des tr0is compo:'Oés dan,'3 le.':; tanpons uti Usés.
T:~O"l~ 9_A_A
M_D_A_P_2_'
b_i_S_-_Û_'_P_JI_"_ _
H20à~,H"'"1,0
1
0,96
O,Sl
O,0~3
T::impon caclJd '.lIa te
10 mM
0,96
0,76
O,ol.J~
pH="(,O
Tampon cacodyla.te
10 f7lM,
tJaCl
100 mM
0,1.10
>J,026
pH = ;,0
Tampon caccdylAte
10 mM,N8 CIOl.j 2 M
0,96
0,85
0,070
pl, '= 7,0
_ _ _ _ _ _ _ _ L -
_
TABLEAI) I.[)
f'endements
quantiqU\\?S de
flu,Y'escence
Lie
la
9AA,
dJ MDAp2+
et du bis-DAPl.J+
tans difFérents tampons 21 20°C.
Le r8ndement quanticue de la 9-a.min~lacridine
(9AA.)
i:\\
été pris comme r,sférer.:::e,
(~J FILlOr'~S(~p.nc(" résoluE dans 10 tclllp:J
L,~s courbes représerltal1t le d<~cli.n de fluore3csT1c0 du MDr,p2 i
seul
peuvent être
Elju.'3té",.'3 à
un
seul
temp~ de vie quelle que soil; L3. longueur
d'onde d'émission.
A la tcmpér'atul'e 8nbiantE: (20 Ù C)
la f'luorescenee observ6c
r;)rTe.::,[)owl
0.Pt't:'lÎn'3m0nt
~
l 'érnÎ3::;!on
(;e
l'~tdl I·~l<'xé.
Le
t~mps
d,~
l'ie
je
l 'état
f~a[]ck-Condon est be(lu':èoup tr::J:) COUl't pou." êtr'e mesuré à 20°C. L.e
t0mps de '/ie de l'état "elax6 mesl~ré cans de l'e,,-u DJ dans le tampon cocady-
la te
10 mM à pH 7 et à 20°C est 02 10,80 -. 'J.20 ns P,)Ul" le HIH,.p2+.

---

62
Dans
18S mêrn'2s conditions exp~r'imentélles ,18 tampon et de tem[)~~'ô.­
Lure,
le
déclin
de
LLuOl'ê:'sccrlc',?
du
t'is-DAF,I: ..
ne peut être analysé (l''f(::C un
mod~lè à un seul étaL; cOITespondant à un seul bomps de vi~. Tl
faut
fair'e
inte)'venir
U11
modèle à tr'ois <"t.'J1;5 pou" C)b:;fènir un éljuslement
sat:,is[ai[",ant
dLI déclirl dG rll.loresc~nce
:
une
comp')sante
longue
dont
te
t~!TJpS
Je
vie
est
de
10,70 i
0,20 ns. Sa COfltribution à la fluorescerlcG totale est de 62 %'
-
Ijn
Lfèmps moyen de 3,70 +- 0,10 ns qui contribue pour 2> % seu,le-
merlt à
l'~nlission
totale.
- enfin ur) tenlps tr'ès court de 0,15 ; 0,05 n3 dont la contr'lbLltion
de
30 :t
à
la
fl',Jo~~escence i,~otale ,:=st plus
importT1nte
Que
ce) le
du
temps
moyGn.
Le
bis-DAP~ + présente cer'tainement plusieul's corlfol'ma.tîons en
solution en r'aison de la fl~xibilité partielle du bras de liaison entre les
deux cycles. Le temps de vie long,
identique à CGlui du MDII.P 2 +, eE:t dû à une
conformation ail l~s dC'ux cycles sont tr(;:J éloignés l'un de l'autre (confor-
mation
" ouve )"te").
Le
I~emrs le plus COllrt doi t cor'r'~spondre il une conforma-
tion où les deux cycles sont empilés l'un
sur l ';lUtl'€
et
le
temps
intermé-
rii:3.ire
à une
troisième
forme
où
les
deux
cycles
interagissent SDns
être
complèt<:'mcnt
empilés.
Les
m831H'eS
de
R~HJ ont
montré
que
le5
deux
/loyaux
aromatiques sont
pé1l"tîE:llement "~mpilés l'un .,,;ur l'autre (1.)).

---

63
II. INliTBITION
OE
LA
FLUORESCENU~ DU MuAp2-'- ET DU Bl:3-DAP1.J+ PAR LES IONS
HflLOGF;NURES ET J.,~S IONS PHOSPHf.TF:S
1. Inhibition (Je la fluor'esceTlcC:' statique
Le~ anions halogérllH'es ((1-, Br-, 1-) éteignent la fluoresc,:,ncc du
ro1I.JAp2+
0insi
que ce.l.l<2 du bis- OAp 1.J-t.
Aucun déplacement Il'23 spectres d'émis-
sion
de
fluorl~scen(;e n'est obscr'vé et
les
maxima
des
différentGs
bandes
'fibt'oniques
I"t~stent centrés ala mêmes longueul'.s d'oll(le Que; celles observées
sur 1e spectre d'émission du r~I\\DP2+ ou du liLs-DÎIP!.j-i en l'2bserlce de concen-
tr;üions élevées ,jes anions.
L' inhibi tion
08
la
l'luorescence
des
compcsés
ot'ganiques
par
les
ions halogénures not8rnment ] cs
ions t't'ùmures ,~L les
ions
iodUl'es est
inter-
pl'étée
comme ',m
effet d'8tome
lourd
\\5,
3). CE;t eff2t peut êtr'l'
décrit
par un couplage spin-ol'bite de l'état excité du cht'omoph01'8 dvec les orbit;:j-
les vacantes des atomes lourds qui pl'ovoque une ,jés,l.ctivBtion supplémentaire
de l'état ex[~it~ du chromop)lor'e.
La. fiSupe
l.b représcmte la variation l'dative de l'intensité de
fluot'escence du MDllp2+ en présenc~ de concentrations Cl'OiS5antes en (;1-. Br'-
et
1-
ct
rie
HPO~2-.
L'inhibit;ion
rie
la
fluclt'escence
du
MDA p2+
augmente
lor'squ'on passe des ions chlorures aux ions bromures et enf ir] aux ions iodu-
)'E:S.
Cette?
extinction
de
la.
fluon,scence
du
chromcphore
résulte
bien
d'Un
effet d '2.tome lourd
O\\l
le
couplage spin-orbite est
favori"é
lorsqUe? le nu--
mél'O atomique Z de l'a tomE: augrllente
(9-',1).
Par
contre,
en
pr'ésence ,:iu pe?rchlor'ate de
sodium.
Dn observe
uniè
légère
3ugmcnt2./-.ion du rendement
quantique de
fluorescence du
MDiIP2-t
(voir
tableau
I.B).
Les
ions CIO~-, en rempla.;:ant les
ions cr dans le voisin~ge
du ~mAP2+, sl1pprimenl~ l' inhibiticn d'O!
nuorescence dllE' à ces der'niel's.
Les
ions CLO~- sont '?n effeL des inhibiteurs (le fluorescence moirFs efficac<2s que
les ions chlorul'es.
Les
ions
phosphates
2teignent
aussi
La
fluü)'8scence
du ~"1DAp2+ et
du
bis-Dt,pi)-t.
Cette
inhitJition
de
la
fllJoresc'2Dce
pDr
lEls
ions
phosphates
est beaucoup plus faible qUi, celle obsel'vé'? en présence des halogénut'es

---

A
--- ------
- -------- --
----.----
------
2
3[[]
4
2
10
F
1
Fa
B
0,5
c
° °
0,1
0,2
0,4
IV!
;igt..:j'~ [Ji'''dJ',rot~Ot:::;r''~~al,i'!~sdcl'~Llr.er~sic2 .:','2 n~:cre::;c,,'lC9 é/F
r~u >101'."">
o
·!~1
:;~"~,;enc:,~
c:e ,ji.Cr'ér'':''nt5
'.nhl'Ji;;'2l1,~:' 2:-::::2,''1':'5
:.".n.'O
l'_~
t':!;II,-JO,1
(;2.00;.1,·12I:e
,,~, !1l1'i ~. [li: ~,' 2, A 20°C. La cü;l'~en":"2t.10rl ,'ll;,;i2Le e:', L:r;I\\p2~ '0'3,
rie
J't')
:<
10-'] ;-1.
La
Lcn;;ueur d'on(1r~ ,~r,:x,:L':.,:J.t.~c',J est d8 ~';S nm 21. l''5~~i<;sL0n
e~1. reeL'"iIlie ,'iU ;;"·::':'U:1Uin ,Je L'<émèS.'3i.On ,le é'l_uor'~sce:;ce sc:;,; 2. 1'23 nl~.
-,) KI
; c;.
,1<'.C1:
,:.])
n"2d~Q,I!.
1

---

65
La
v,wiat.ion
relative
de
J' intl<:lsi tci
rip
rluor'escen0e
des
deux
compos6s
en
fonction
de
lé!
concent/'aticln
en
halogénur'es
n'est
pas
une
droite.
IJ
semble donc coexi.'3ter
plusieurs mécanismes de dé.sactivation d8.'3
d'?ux produits pdr les ir)~libitetH':o ext(~rnes
une
Inhd)i tion à l'état fonda-
mental mais aussi un;:;
ùilübiti.on avei~ l'état excité dt's deux cnromophorcs.
2.
Inhibition dynamique (Je la fluor'escGnce_
Le
temps
de
vic;
du
MDAp2'"
diminue
lorsqU!:':
la
concentration
en
inhiDitcur
externe
augmente.
I,e
déclin
de
fluoresc:enCf?
ne
peut
cependant
i2tre ajusté avec un .seul temps de vie sauf en pr6sence ries ions phosphates.
Lcs ions phospl"lates étr:ignent d'unG façon moins drastique la fllloJ'cscsncc du
MDflp2 ....
La diminution du rapport 1'~/T (table:lu I.e: montre qu'une partie de
l'inhibition de la fluor-escence du chrOmOphOJ'8
~st duc à 1" forma.tion d'Un
complexe à
l'état
fondament-'11
donL
le
r·:;ndcment quantique de fluorescence
est très faible par T'apport au ~hromoph,}J'e libre.
,
~--r-
l
[KPOjj2~J U'Il
2
;r
,Cns)
,
X
<PFIT'10 7 (ns- li
1
0
0,81
10,80
1 , 12
1,50
9,95 '10-3
0,72
1
9,)0
1 , 18
7 , )-12
5,83 10- 2
0,60
8,90
1 ,28
b,n
9,52 10-2
0,56
tl,60
1 ,00
6,51
0,182
O,~9
8,3e'
1 ,05
5,90
°,"'·n
-~-'-'
O,lJ3
7 ,'~ rJ
1 ,24
5 , 114
TABLEII.U I,C
Var-iatiO:l
du
tièmps
de
vie
ct
(lu
rend,~ment
quantique
de
n uorescence du
MDflP2 1
en t'onction d.~ la ,,"oncentratlon en ions phosphates. L~ conc~ntr~tion
en MI:flP':>'" est de 1 ,00 10- 5 M ct la températul'e de 20°[.

---

66
LOI
va:"iation
relDtive
de
temps
de
'lie
de
rluorescenr;r=
r=n
fonction
cie
la
concentr2.Uon en
[1{PÜlI2-]
1 0 11
=
f
[l-iPD!1 2 -J
permet
d'estimel'
la
constante
cinétique
L]'aeccssibilit6
kq du chl'or:lophor'e excité aux 10ns H?OI12-. C:eUe
constante déduite dcs
"'<:lIeurs du
tableau
Le.
est de 5,6
107 M-l s -',. Cette
valeur très faible conf ir'mC' que le pro'jessus d' inhitl i. Lion de la fluo:'e.'3ci::nce
du ,'~rJAP2+ n'est pas entièrement cont:'ôlé p8.r' la rhffusi,)n.
La
dil~inution du tçmp3 de vie (je fluorescence du MiJAr 2 + en pré-
scnce
des
anions
c r ,
r- et 8r'- ne peut )10n plus être expli'lu~c par' un
mécanisme
de
rié.'33.ctîvation
3împle.
Le
déclin
de
[luO\\'8sCence
du MDAp2+
en
présence de ces halogénures ne pellt être ajusté de faç0n satisfaisante qu'e,'1
faisant
intervenir au moin.", r:Jeux temps d"" vie.
-
un
tcmp~, long qui décI'C\\Ît avec la concentration en
inhit)il,~urs
externes.
-
un temps court dont
la contribution à 1<\\ fluol'esc~n--::e
totale est
faible rendant sa déterrnination peu précise, Cornpte tenu de la forte
inhibi-
tion
de
la
fluore~3Cencc du M[)AP2+ pa. le!'.:- halogénure::;, ce deuxième temps
peut-êtr'8 attribué .soit à des impuretés l'ésidue1l8s, soit 1, la photodégrada-
tion du MDi\\p2+ au CDurs dè l'analyse.
En
I~ffet, l'inhibition de la fluc'I'es-
cen--::r; étant forte,
il
faut
beaucoup
de
temps pOUl'
élcC]lJér'ir
expérirJli~ntale­
ment la courbe de déclin de fluor'es<;ence,
De plus,
en pr03encc de traces de
dOnnf>UI'S d'électrons,
(amines, alGD(;ls),
le MDAp2+ peUL. [crmel' sous irTadia-
tion le radical ~ation MDAp+', Ce radical cation est produit pal' irra1jiation
d'une solution dé.<:>8rff'ée de t1,DAp2+ et pl'ésenl.e U!1è bande d'absopl'tion inten:oe
vers .~75 rHn.
Lorsque
l'on
[("dt
barboter
de l 'oxyg:':ne
dan:3
la
solution on
l'égénèr'e l·~ r"-mAp2+. Ce radical eation peut-êtr'e alJssi pr'c,ctuit par une r'éduc-
tian électt'ochimique (12-16),
Son spectre de résonance"'param<-ignétique a été
caractérisé par Bruhirl (1975)
(17).
Dans nos conditions expérimentales où )10U~ tr',1vaillons en ç'I'02sence
d'oxygène,
la
concentration de (~ette forme r6duit~ ser'ê] donc dr§pendante de
1<\\ concentration en 02 et du telll::J:J d'ir'radiation.
Au déllUL l1è
l.~_ titration ,
le déclin esl~ (]tJtenu '2n moins de 1,Q mn tandis qu'en fin dG titr:o.tion lorsque
l'émis:oion
est
tl'è5
faible,
il
faut
enVl,on
2
heUl'es
pOUf'
accumuler
la
courbe de d6clin.

---

67
POLIr
des
solutions parfflil:emerlt
dégagée.""
l'analyse C::U déclin
de
fluorcscc:nce avec un s~LJl
temps de vie n'est [1<'1.::0 satîsfaLsante. I l apparaît
lüujour':,: un
t8mp~ l,rès court
(à
la
limite de
lA t'ésolutlon de
l'appareil)
dont la conLribution 3. la fluorescence tatille est tûUjOUl'S très faihle.
Dans
C'2S condi.tion~3,
il sembh~ que ce Lemps cor'l"esponde à. un produit de la d~gra­
dation dlj MDAp2+.
L'en.'-"'mble
des
résultats
de
fluorescence
,',;tatiQue
et:
dynami.Que
montre qu'il existe en pl'é3é11CE: des halogènurcs plusieur;; types de complexes
aussi bien ;wec
l'état fondamental qu'avec l'éu,t excité ,lU cht'omophore.
- Un complexe à l'état fondamental dont la cont:-ibution à la f1uo-
reSCence d,:.>i t
être nulle
surtout 8n [1rés~ncc des ions bromures et ic>dtlt'es
où l'extinction d0 18 fluor~scf~nce Gst totale. Aux félihles concentrations e:l
inhibiteul's, ;::ia contr'ibution t'este toujours
t1'ès faible.
- Un complexe collisionnel à l'état excité qlJi
induit.- une diminu-
tion du temps (18 vie de fluor8.'iCenCe du MDJ\\p2+.
Etant donné l'·?xiste<lce ,j'au
moins 'jeu;(
mécanismes d'inhit1ition,
l'analyse simple de la variation de l'intensité de flufwescencc et du temps
de vie peut être faite suivant Ir: schéma cint':tique ci-dessous (18-2\\).
k'e
.,\\
Q
f\\Q"
k_
t
e
r
ki
Cc
k f(~
k i C J
Kg
,\\
Q
,\\Q

---

6G
Selon
·.::e
schéma,
l'inhibit'?L1r'
peut
l'ésgir
à
l'él~at
fondamentel
POU)' donner
un com;::Jlel<'O
AQ
avec
une
const,ante (j'équilibre Kg.
L'inhibiteur'
peu\\:, aussi réagir avec l'état excite du chromo)Jhor'\\'! pour donnel' un c'Jmplexe
AQ*
a',ec un~ constante rJ'éqlTilibl'0 Ke . Le chrom,"Jph01'€
l'. (~t le complexe AQ
absorbent à la
longueul" d'onde d',?,:citation avec l'es~1E:ctivement un ,~oefff-
oien!; d'extinction molaire c et EC'
3cd'='rl
le
sch6mo;
cinétique
pr'oposé
cio-dessus,
la
variation
OP
l ' intensité
Ij(~ fluorescpnce du chrornophore en fcnction de Iii concentration
en inhibitéur Q pellt €tl'e
mise sous 18 forme suivante:
f'
(2 )
:;>l.J
les
temps de vic cie fll1or'escence
et
1e,'3 rendements
quanticW'!s
de fluo-
rescence <:lu
(~hromophore libt'€:
A*
('Ci,q,l)
et du
~:omplexe flQ* l10 C ,qoC:', sont
donnés pa~ les relationS suivances
:
1/(kf1ki)
l/(k
C
f C+k i
)
Fa
et
F sont
les
intensités
de
fll,J01'eSC(?nce
mcsur'ées
cn
.l'absence
et
en
présence de l ' inhibilf;'ur Q.
R
qoc/q,j èst le l'appor't des n:ndcments quantiques de fluor'e.scence.
02.:1S
~e3 ,,"i)mplexes avec l.-? \\@;'F<>, aucune variation de l'absor-
bance n'est obser'vable en pré;Jence des inhibiteur's,
de telle sorte que l'on
peut consi1~rcl' que E est tre.os pcu différent de Ec:,
De plus,
les spectres
d'émission
de
fluorescence
restent
parfaitement
homothétiques
en
présence
(les différents inhibilëLl~'S. On observe simpLement une diminution de l'intcn-
si té di? t'luo,esc€:nc,.:.
Dans
LA ;nodèle Pl'0.00,')'::: ,.::L-cl!-,';sus,
on doit ()bse~'I,'er expérimentale~
ment
deux
\\;em!'~3 (j,:
vie
qui
varient
ave~
la
concentration
cn
jnhibiteul'S
suivant le3 relations ci-d€'ssous
(Hl, 20)
:

---

69
(J)
2
,'.
où
(5 )
' 0
b
1-
k_
(6 )
p
T o(~
c
(7)
L ' 2nalyse des résultats ,je flUOre~0f'n('p statique suivant le méca
nisme ~ropo.'3É e:i-dessus donne les valeurs J'ésumées dans le I,ableau 1.D.
- - , - r -
- r - - I
c
'"
K
' 0
fi
k, e
e
Kg
1
(no5)
(ns)
I
1
1
.'
(M-l
5-1)
":\\
1
,5
(l-J- 1
1W 1 )
[ Cl - ]
10,00
2,80
O,2lJ
J
10 10
J,6
10 9
. 8
· 30
[Br- ]
.
10,30
• 0, 1
• ()
" 1010 2
j()8
20
• 30
[ 1 -
10, ,gO
• 0, 1
• 0
"," 1010 1 1,6 108 . 275 • 75
'(
,
TABLEAU J. D
An2tlyse
de
l'inhibitLon
de
la
rI uore.o,ç,mce
du
par'
les
anions
halogénures suivant un modèle à dGUX éitats.
Les
valeurs
(lu
IrlDleau
I.D.
montrent.;
que
le
mücèJe ,'3. deux état-s
pOUl' e:nlique:' l'inhiDitLon de
lé
fluorescE:nce du MDAp2+
p,3.r l[;5 10n5 h?tlo-
génur'e~ n'est pas to~alement S;'Jti3CaisOlnt
ear' dans 10 cas :le;:;
iar.::J br0rnJr.;l5
~t ioriut'cS,
1:;
[llwrescence est
totalenent éteinl;e Dour des
concentrations
I;r'ès élev8es (autour de 1 M). I l .semble donc se former aux "ort88 con('pn~_ra-

---

70
tians el bromUl'ê~ 8t en iOO\\.l:'83 un ill.Jtre
type d,~ complexe liant le l'E:nd2mcnt.
quantique de fluorescence est nul.
La
var'iation relatl\\'C':. du
temps
long
en
fonctiCIl
de
la concentrél-
tior'. en
inhibitew' donne de::; valeLws (ie 13. constante cinétiqu2 d'acce3Sibi-
lité
(k+ e ) du MDAP2+ 8xcitC: par 183 ions halogéllUres différentes de celles
obtenues en fluorescence 0taUque.
~,o x lOG
2,e' x 1010
2,6 x lOlO
Ces
différ'ences
m.)ntrcnt,
qlJe
l'inbibition
de
la
flu,::wescence
du
MDAP2+ par
les anions h81ogénut'8S
est be::tucoup p'<us comp1e;:.;e~, que Ile l'in-
dique le schéma cinétiqu,~ pr'oposé d-dessus :
i l
se
fortn€
sûrement,
un
cOlnplex.~ avec
l'état
fondamenté'tl
du
MDAP2+.
Ce
complexe
ne
possède
pas
url':';
absof'bance
diffénonte
de
c,~lui du
r-mAP2+
libl'e
puisqu'aucune
v,1:'iati011
de
l'absorbélnce
ne
s',:)bsel've SUI'
les
deux pr-emières bandes d'absorpLîo;l
(1.J17,5 nrn et 33~ nm). Le r'endement quan-
tique de
ct: complexe doît, êtr"E:
Lr'ès r.:üble puisque
l'intensité de fluores·-
ce~\\ce d;~cro'ît rapidement en fon(;tion de la concentrat~on en in~ibiteurs :
i l sc for':ne aussi
des complexes à ]. 'ét;at r;xcité pUlsque le Lemps
de
vie
de
fluor'cscence
di.millue
qUélnd
la
con-Jentration
'=rl
inhibiteur
aug-
mente.
L"oxtinction
totale
dl;
LA
fluotesccnce
(iu
t1DAp2+
i2n
rrésence de
molail'e en ions iodur'es
indîque qu'il ne se fel'me pas un seul
com;üexe mais
plusieur's liant le ,jernier a un renliement quanLique nlJ1.
La cl ifficult,~ li 'ana-
JY3er ce sy,'>t~me esL i tlustréc par la variatlOrI du tanps de vis c1~ nUO~"2S­
cence du MDM,2+ en f,r'és€!tlce
de Kl résumée dans II? tablcilu I.E.

---

71
-
1--11
1
f (,> ~,)
[KI]
(M)
- -
~
1
;.:2
1
T1 (n~)
r 2 (ns)
( ns)
10 7 (ns- 1 )
'1
1
1
"
J---f----+------
1
0
0,81
10,80
100
0,99
7,50
1
8,Cl
10- 4
0,5?
8,,)t)
lno
1 ,20
7,05
1 ,60
10-3
0,45
6,72
97 ,6
0,96
1 ,05
5,8ï
'( ,67
2, "
2.40
10-3
0,36
5 ""'-;
" ,
96,"
0,99
1 , 16
4,78
7,53
:1,00
10-3
0,2G
4,3 11
Y3,4
O.71J
6,6
1.03
3,28
7,93
,
,
7,97
10-3
0, 15
3,12
87,3
1,390
1 -L, 7
0,98
2,69
5,58
1 , 19
10- 2
0,1 0
2,57
61 ,8
1 ,60
38,2
1 ,07
2,09
4,78
1,59
10- 2
o,O~I
1 ,El 3
B't ,6
0,74
12, 4
1 ,'16
1 ,5:;
/1 ,52
1 ,89
1()-2
o,OG
1 ,58
82,3
0 , 6'
1,2
1
1 ,ï 2
Î , 2 ~
",5"
2,76
10- 2
0,04
1 ,26
76,2
0,60
1 ,51.J
1,00
I.J , 01)
1
0
1
1
1
TABLEÂU I.E
!~flalY5e du déc! in de t'luorescene:e du MllAp2+ en foncrion de la conoen[;ratLon
fOn KI à 20 D C. Lé:! concentr'éJt;iQrl en MDAp2-1- est de 6 10-6 11.

---

72
I l l . INTEHAc:TION DU HDAp2 1 ET DU BIS-DÎ\\P~'
lIVE LES MONONUCLFOTJDES
1. Etude en absorption
L~~ Li trations ont été ré81isées da:'!3
le tampon cacodylate 10 mM
pH 7 et. à 20 Oc en l'absence de s€ 1. Les t i Lf'at ions de ces composés par les
mononuc:léot.:.ides font apPowilître SUI' l·~urs sflc;cLr'€:,;
d'ab:,;ûl'ption trois carac-
téristiques communes
un
déplClcement
du specLr'e
d'absorption des deux
composés
vers'
les grandes longueurs d'onde
: c:e ,jéplDt;ement est plu3 important en présence
des b<lses puriques.
Ainsi dans les
titrations (lu i'-1DJl.p2'
par les désoxymono-
nucléotides, on observe un déplacement du spectre vers le J'ouge de 1.5 nm en
pr',isence du
dGMP,
2,5
mn
avec
le
dATP,
1 nm av,:c
le (leMP et le dTMP.
Les
mêmas déplace\\ll~ril':~ sont ob.s~rvés en prés0nce du bis-DAr il • (tableaux I.r et
1. J ) .
- un liypo,:;:hromisme dans le,.; dl?uX prernières band83 d'absor'ption des
deux
composés.
Cet hypochromisme
est
plus
important.
en
présence
des bases
puriques.
-
l'existence
de
points
isobestiqul;s
SU!'
les spectres
d'absorp-
tion
; ces points isobestiques sont bien définis en présence des bases puri-
ques.
La figure 1.7 représente
Les spectt'es d'absorption du MDAPZ" titré
pa:' le dG;1P. En même temps que l'on obS€I":e
une diminution de l'absorbance à
1117,5 nm,
plusieurs
points
isobcstiques appar'aissent.
En
présence du
dGMP
sept~
points
i.sobestiquc~ sont
visitd(~s sur
les
specLI'p.s
d'absorption
à
~23,5 nm, ~05,5 nm, ~OO,5 nm. 380 nm, 367,5 nm, 338 nm et 31~ nm.
L'existence
Ij'un si
grnnn nombl'8 de points isobestLqu€s
(iémontre
l~-\\ présence d'Url seul
tYl)e dE complexe à l'étaL: fondament<lL dont le spectre
j'allsorption est différ'cnt (je celui nu composé libre.
Le;;
I.LtratiOllS (111 bis-DAI)}I-l
par les Quatre
mOJlonucléotides font
apparaître les mêmes phénomènes specL:l'oscopiques,
La figure
1.8 représente
les spectres d'absor'ption du bis-DAP~" ti tré par le GMP.

---

7J
0.210
•uc•.0
o
350
375
400
425
~(llll1)
SPèCI:,'é.:.:;
"-~'absol';:JtiQn inolécuL:ii,'8 du :1DAP';:~ ::.;.,~r''; (Jar ~~ dGl-\\P
da;;.:;
le _ tampon
cacody12t",e
la
1n,'1
'--'
~I-I
7
::-t
4'
~'o°C.
La
conC'2nti'2ti.on
en
~1~)AP';' "'S1 'Je l,'", x 10-5," ec _'"_~_
. ,,'
~
- ,
'-
.,
-
,·::t; t':>.'''2:lC3
sge~;cres
du
t,aut
'/81'S
le
bas
cor:"'::sllon::Jenr;
aux
"·3-leur',:;
."IH"é'_:1tc23
:Iu
iè:.:JIXWt;
PlO
(pilosprlate
sur'
colorant).
1)
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iô
32
~9; 65
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il]
i30
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i!l6.
0,35~
_
•uc•.0
o
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•
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o
350
375
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j '
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Dlp ic -
il
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~lf,uro::
,8
.~;:J~~!:.L'es'
;:(l;,)or',J ~0:1 rrIOle,;u_al;'e é,U :J15-,
"L,'"
,',~,)'
'::1
,;réso?nce
-le
quentités
c;'oissantes
en
G'I?
dàlio;
le
t21n',Jçn
cacodj'12te
le mt'j, piJ 1 à 2rJ~C. Les dit't'éi"ents 5peot,es du nDU[ 'IC:'~' ~'" ~GS
corrssponë1ent aux L<leurs ;::'~ll'la.nces GU ~'appo"t
jJ/D
0
:7,3
1 ) , ) ;
23.3
31
38,8;
ul~,5
5:1,3: 6' ~1' 69,8.

---

1
0
1
_~~.~~.===:.O==~.O
•
===::'. 2
A
. ,
-
~--oO-_-'_'---~o-~
aO-
_
""
Ao
3
•
•
4
0.5
o
200
400
600
800
plo
Figure 1.9 : -·/Griaxi.on
relative
de
l'absorbance
ou
:~1DAP2~ (I.n :< iQ-5 !.i)
sui '; ie à ~ 1 ï, 5 mm en présence des quatre désoxymcrlonucléot ides,
dans le tampon cacodylate
10 mM,
pH 7 à 20°C.
1. dn1P
; 2. dC1~P ; 3. dl\\I'11'
; 11. dGL1P.
A
1
A o
1
0,8
2
?lgU:'€
1.10
i/ariaticn
['elacive
de
lrdlJ~Jüroanc8 du bLS-ClApii" (1,30 x 10-5
1'1)
suivie il !120 ,'lm 8[: prés(lnce ::les quat"e ;o10nOnucl-2otieJes.
'1.
"!':W
2.
Gl?
;
..
.aJ1P
;
li
G1"lP,

---

15
Le!:',
Y."3.:'iations
rclative~, !je
l'al)sorb2nl~e mesurée 3 ~17,S nm et
~20 nm re:wccti vement avec le MDAf,2+ eL le
bis-Dt,?~'" en présence des qU<ltre
mononur:'léotides sonL ref)r',5.sentées sur les f igur'es 1.9 et 1. ',0.
Aux
for'te::')
concentrations
en
rnononucléotldL:s
la
vBl'iattùn
de;
l 'absor))ancG attE)int un pl2.Leau à par'::ir' duquel on pEcut estimer lé pOUl'cen-
tag8 d'r',YP~jd"ll'omisrne.
Les
car'actôristiQue~l spectrales du MDAp2+ et rju bJs-DAPIj+ ti trés
par les mOJlonucléotides sont r'cg,"oupés dans les tableaux I.H et 1.1.
L.a
variation
de
l'absorbance en
fonction de
la
concentr8tion en
nucléotirjes per'rnet d'estimer la const3.nte d'assO(Ji·ïtion à l'ét.at fondamental
en utilisant l'équation (8) oi-d~ssous.
K
MDAp2+ + N
complexe
K
bis-DAP~+ ... N
co:nplexe
(8 )
K
absorbancG initiale
absorbanc:~ de 18 solution [lU cours de la tltration
absorbélI1Ce lirnil;e ,3. concentr'éltion saturante i?n nucléotirjes
[N]
concE'ntration en nucléotides
K
COllstante d'éQuilibr'8.
Les
constantes
d'équilibrE;
calculées
pOUl'
le
MDAP2'"
et
1,"
bis-DAP4 t
SOllt regroupées d~n3 le t.able8U I.~.

---

76
M[)flP2+
lli.s-D!l.I'~t
K iw 1 )
K (W 1 )
dAMP
@80
AMI'
2200
dGMP
~80
CMP
2980
dCMP
110
CMP
6 JI0
dTMP
120
TMP
3'0
TABLE!<U l.F
Constantes
ct 'i1:>sociation du MOflP2+
et du bls-DAPIj+
avec
les mononuc.léotides
dans l(~ Lampon célcodyli1'~"~ 10 mM il pH 7 el, à. 20°C. Les constantes ct 'associa-
tion ont été déLet'mlnées J partir de la variation de l'absorbance du MDPA2+
à 1j17,5 nm et du bis-DAPIj+ à 420 nm en présence des quatre mononuc14tides.
2. Fluorescence st2tique
Les
ql1utre
rnononuc18otides
6teignent
la
flUOI'<2ScenC8
des
deux
composés MDAp2+ et bis-DAp4+.
Les
spectres
d'excital~iol1 ete
fluorescence
restent
semblables
à
ceux ,des composés libres quand la concentration en mononucléotides augmente.
Les maxima d'excitation l'estent respectivement à 417,5 nm et 33~,5 nm pow'
le MDAP2+,
~2Cl nm et 336,5 nm pour le bis-I)AP~"'. Le:o spectl'es d'excitation
de fluorescence sont
invariants en
position lorsque l'émission est suivie
aux coul'Les longueUl's d'onde,
du côté bleu
de l 'émission (~20 nrn) de
même
qu'aux grandes longueur:.> d'onde,
du côté r'ouge de l'émissi<)n
(~50 nm). Tout
se
passe
donc
comme
si
la
fluorescence
observée étai t
due
uniquement aux
molécules
libt'es.
La
fluorescence
d~s
complexes
est
donc
Pl'At i 'luement
éteinte.
Les G[JccLr'es d'émission de fluore3cence nf2 sllbi.<,~~8nt
8UCUll dépl2.-
cement
et
les
maxima
T'estent
à 1123
nrn
;:Jour
le
MDAP2+,
1127
nm
pour
le
bis-DflP4+.
Pour de très f0rtes concentrations
en nucléotides,
les 3pectl'es
d'émissiOIl
de::;
complex0s
avec
lc
lJis-Dflp11+
se
(lépli1cent
de
~27 nrn ve:'s
423 nm cor'r'espondant au max i mum d '~mi~s ion (lu ITPnOmèl'e.
1

---

·77
10
~
•
A
0
~
•
u
"•u••-00 5-•"••-•"•-"
0
400
475
550
À (nm)
figur<;;
1.li
:
Sp~ct;-,es d'c?:nission de fluol'escencc du ,'.IDAp2~ (T,50 x 10-'..1 Hl
en
.:)["ésenc~ ('U df'U'II' dans le t:ampcll cacodylate 10 rni1, pH '{ .i
20"C.
l,a
longueur
d'on.Je,\\:"o.';;I;
ur,
poLne
isob';stiou~ ,jét:erminé en abscr'f.il:ion.
L,;s dirr(;rGnts spc:ct::·,~s ccr':'esporld~ne .a.ux valeur.'; sui.':antes (ju tap~ot: P;D
A
0;
B : 208 ; C
T32; Q
11882,
10
~
•,;
rI
~
•u
"
•u••-00 i\\A
5
-•"••
•
~fr~0\\\\\\\\
"•
!
~ ~
-"
0
"'
~~.- -
400
500
600 À(nm)
fi.gure
1.12 :
::>0'=Ct.'8
d'émission
(je
r.luoro;scc:lCe
du
l;[.<;-U[\\pll.
(1,3ù
x
10-:)
;1)
::11:,.-5
par'
1,;
G1P
CËIlS
1,;
t.'li'IPO[j
(::J';oo:f~,"I;" 18 ::10'-1, ::JH ï à
2C"'C.
r...<ê.
longuteur
C'O!l'le
c'e;{CÜi1tLOIl
(!JrJO,S
!lm)
e:;~ '.1., POlnt i,5cJo'=st:lque
oéCe;(;Jl:l'.ê en ab5ù:'otioll.
[,CS dit'[~r'e;;ts SD8ccres cu ;;2\\:(. :et":; le Das cor,'es-
pOIlG€:,t
aux
-'aleui5 3ui':a"ces GU ;'20pOit PlO
O·
i-3,7
3",'.3
56;
ïll, ï
;
112eei,'J9.5.

---

78
O.B
0.6
04
02
o
o
500
1000
1500
2000
plo
?+
Figure'. J.
13:
V:Iri.1tion relative ùe l'illtensit,: dé fluol"est:l:IICe c111 Hlli\\I'-
(7,50 x 10-(i M)
en [H"é"cm.:e des diUércnL:s nWf]rlllllcléotides
dam;
le t<lmpon cacodylate
10 11~\\1 ;.. pli 7 ct .1 2û"C. L'émis~ion ùe. fluorescence
est recueillie à 423 nm tandis 'lue l'excitation (~~t tOlljours un point i50-
bcStl'1\\.Je dlit'~rII1il1é en <Ibsorpti.oll.
1 ; dTMr,
2
: clOU',
J
: dt01P,
!~ : dGHP.
F
F o
0.8
0.6
0.4
0.2
2
1
Ol-_---,~---::':-:=-----:-'-,---------'------'-----,-J
o
100
200
300
400
500
plo
Figure_-"lc.-,'C"4
: Variation relative de l'intensité de f1\\lor~sc"nce du bis- DAp 4+
(1,30 x 10-51'1) en rrésence des différents lllononucléotides
d;1I1S 1'12 tampon c.ncodyl:ILe 10 m;"i 21 pl! 7 et: il zoue. L'cxciull.Ît'Tl est [(lll.iollrs
Uil
[l1)Lnt
iSllbestîquc ct
l'(:IllÎssiol1 de I:lllOT<?,SCCI1CIO (Ost
rCI:uc.il1i"
GU
Il!;l:Uru\\l111
d'émissilill.
soit b 427 11111.
1 : CHP.
2
: MW,
J : C~ll). il
nif'.

---

79
l.es figul'es r.ll
et 1.12 l·r~l'r.:;.'3I~nLent r"::~.specLiyelw~nt
les spectr'es
d'émission de fluorescence (iu MDAp2 ' titl'(~ par le dl\\MP et (iu bis-DAP~+ titré
par le GM?
En
titration
isotherme,
l'excitation
est
toUjOUl'S choisie.) une
longueur
d'onde
i sobes ti que
déterminée
sur
les
spectres
d' absorpt ion.
On
surr>ose
ici,
comme on
le
verra
en
nUores\\)~nce dYMlmi.que,
qut' le rendement
quantiquf: du
cOr.Jplexe est
très
faIble.
Les
figures
l.i3 et
1.11.1
~'eprésen­
tent les variations de l'intensité de fluorescence du MDAp2+ et du bis-DAP~+
en pl'é.sence des différent:> mononllcléctides dans le tampon cacodylate 10 mM à
pH
? et à 2DoC.
La
représentation de
la variation de fluorescence suivant
l'équation
(2)
per'met
une estimation des cOl1stantes d'association à l'état
fondamèn!;a l
enLI'e les deux compœé:3 l:t les mononucléotides.
t1DAp2'
bis-DAPlj+
Kg (W 1 )
Kg (W )
'
dAt-1P
G·15
AMP
1970
dGHP
660
GMP
!970
dCMP
205
CHf'
560
dTMP
135
TMP
~90
TABLEAU l.G
Constantes d'association du MDAp2+
et du
bis-DAP~+ avec les quatre mononu-
cléotides,
Les valeurs des
constantes d'association mesuf'ées en fluorescence
dUfèr'ent
un reu de celles obtenu\\:s
pa:'
absorption.
Les
faibles
variations
Ol)sc.'""vé~s IJn abSol'ption inrjuisent une erreur trè.'3 impor'tante sur la déLermi-
na t ion
des cons ;:;an tes
d'association.
Les valeurs
obtenues
en
fllJoresCence
sont donc plus Gorrcctes.

---

3. Fluorescence dynamique
Le
déclin
de
rluor'8E.Ju02J1Ce
(lu
MDAP2'
d,lns
le
\\"IIr.pon
eacol1ylate à
2üoC peut êL:re ajusté avec un seul temps de vic de fluorescence de
10,8 ns.
En présence des différents mononucléotides, on obser'Ve une diminution de ce
temps de vic. Le déclin ne pellt plus alors 61.::'(; ,ljUStu uvee un s8ul tE:rTipS de
vie : il ffluL: fa ire intervenir un deuxième temps lorsque la concentration en
nucléotides augmente.
Ceci
explique Que la désactivation du MDAp2 1 par les
mononucléotidcs fasse intel'venil' nu moLn:.> deux nl'"?2anism8s
-
une
désacLivatiotl de
l'état excité qui
se
Ll"aduit par UJl rac-
coure issemen t <lu temps de v ie de .1 'é 1.;" t ~xc Hé,
- une inhibition à l'état fondamental: la constante d'associatio~
du HDAp2+ avec l.es bases l'este relativement faible I,,·oir· l,:!s J'ésulLats obte-
nus en fluorescence st<ltiquc),
i.l
s'ensuit que la proportion du complexe à
l'état
fondamental
t'este
faible.
De
plus son
rendement
quantique
de [1uo-
re ..,cence est petit par ruppot't À. celui du MDi\\p2+ libre.
Le temps inférieur à la nanoscconde contribue pour très peu (envi-
ron 5 %) à lu fluoresc8nee
totale.
Il pùut être <lttribué comme nous .l'avons
déjà
vu
avec
les h<llogénures à des produits de dégradation du MDAp2+ ou
[]
des complexes aV'2C l'état exoi té du t'lDAp2+ da~s lesquels intE:rviennent plu-
,
sieurs molécules de mononucléotides.
L'analyse
de
la
variation
du
temp ..,
de
"/le
de
fluorescence
de
l'étût exciLé permet cepend;:mt une estimati,)n des constant CD d'acee.'3Sibilit(,
du
MDAp2+
par
les
mononueléotidE:s.
Ct:!
temps
v31'ie
suivant
l'équation
de
Stern-Valmer.
La pente des droites permet d'estimer
la valeur
d~ la cons-
tante de
'Ji.tesse d'inhibition dn ~1DAP2+ p"r les mononucléotides. Le3 r,~sul­
tats sont rE:BI'oupés ci-dessous.
,

---

81
'0
(ns)
k'e '0 (W 1 )
k'e (Wlçl)
AMP
10,80
8~
7,78 10 9
GMiJ
10,80
103
9,5 11 10 9
CMP
10,80
~~
8,70 10 9
TMP
',O,SO
53
~, 91
Il)9
TABLEAU I.H
:
Constantes
cinétiques
d'inhibition
de
la
fluorescence
du
MDAp2+
à l'état
excîté
par
les
mononucléotides.
Ces cons-
t.antes sont déduites des variations relatives du
t'3rnpS
long
en fonction de 1<1 conc8nl;r'èltion en nuclé,)tides
COnel usiorl
La
fluorescence
du
MDAp2+
est
totalement
éteinte
pal'
les
ions
bromures ':!t iodures. CetLe extinction to\\.ale suppos(: un nécanisme plus c':Jm-
plexe·qu€
celui que nous avons proposé.
Il doit certo.inement se fOI"mer ?UK
fortes
concentrations
en
inhibiteurs
des
complexes
dont
les
r'endements
qU:JnLiques de flU01'(!:'H..:ence sont nuls.
L'inhibition
de
la
fluorescence
du
HDAP2+
par'
18S
nucléotides
n'est pas nue ,1 la présence des phosphates qui ont un cff,~l
inhibil'ôul' trè."
faible
jusqu'à
une
concentration de
10- 2
M (cf.
tableau
I.C)
mais
à
une
interaction du compo:'lé avec lcs bases nucléiques. Cette
inhibi tion est plus
fOI'te en présence de::; bases plll'iques.
l..a
présence d'un deuxi.?me
temps àont
la contribution b. la fluo-
l'escence- toti31::. est
fi3ible
montre que la désactivation rie l'état
excité du
MDA1'2+ fair.
i'ltervenil'
plusiellr's
tYP8S de complexes.
En
pl'ésence des bases
puriques,
la fluoresc~nce de ces complexes est totalemenl éteinte.

---

82
-----
..
..
Ap2'
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""'. ~" IlUI.r~· ~s< cOIl3La"L~ ~l ~;:ile ~ \\.3 10-5 ~:. L~ p...,t·"~"~~8"
,j'h;po~h"o"'~s,,~ en ~3(11ll4 ~ lr~"
r<,,-~" C~II~cn~n"",.'~" "'lnc~"cl~~'l~''" (. 10-2 l'.) lorsque l·"b...or~ano~ ~ "',.5 "'" ~orrl~~c de h ~il·)~lo" ~lld"l un
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11
2Ü·C.
t.~
cm".~nln,l1"n en bls-[)AP~' est. de 1,8 10-511. Le pou~c.nt.ll" d'hypocILrOOlI""ln .... l, e~tlmé Il ~r~s rort.
cO"p.enl~.U~n on <>:Jnon\\l"l"o~l~~s (= 10-2 11) lor~que l'absopbanc~ ~ b20 "'" c<,"rlg~e de la dl1utlo~ a"nln~ un plate"u.

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---

CHAP ITRE 11
2
INTERACTIDNS DU MDAp + ET DU BIS-DAP~+
AVEC LES ACIDES NUCLÉIQUES

---

85
1. F-TUoE EN ABSORPTION
1. Interaction avec les acides nucléiques en simple brin
Les
titratiOllS
du MDJ\\p2-> et du lds-DApij+
par les polynucLéotides
en simple br in comme en double br in sont caractérisées par trois
types de
r.lodifications
spectroscopiques.
Ces
modifications
sont
du
même
type
que
celles observé~s, lorsque de
petl tes
molécules chargées se fixent sur Ime
matr'ice polyanlonique (1-4).
un
déplacement
du spectre
d'élhso~'ption des deux composé.s vers
les
grandes
longueurs
d'onde.
Ce
déplacement
varie
avec
1é't
nature
et
la
st.:'uc.:ture
du
pOlynucléotide.
Ainsi,
le plus faible
déplacement.
est observé
dans la titraLion du MOf\\.p2+ pal' le poly(dA)
: ce déplacement est de 1,5 nm.
Pal'
contre,
dan::-,
la
titl'ation du
bls-DJil'il+
p,3.r
le [)oly(ri\\),
Le déplacement
du
spectre
d'absorption
vers
les
grandes
longueurs
d'onde
atteint
11
nm.
Qualitativement,
les phénomènes observés sur les spectres n'élbsorption SOrlt
analogues à ceux ohsel'v6s lors de~, titrations de (:e::; deu):
composés
p<lr
les
monorlLJcléot ides.

---

86
--------
, IIYI'0"'II'Om1~m~
• ~1T.5 m
MOAr 2 •
, OH l'''.1
'"
J. ~
31",5
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'125
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,ri ~.5
'"
rolld(C-C)-1'011~1(;'Ç)
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""
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J02
"
~.
,
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l~ l~ml'~" ca~odylaLc \\0 '"~. Il.Cl IUO mM ,. pH 1 1'l ~ 21)·~.
1
1

---

87
- un hypochromi.'5me dans le~ d~ux pr'emières bandes
des
deux
com-
posés
11
cst plus imporLallt pour les polynucléoLide::; çontenanL les bases
puriques que pou:" ceux contenant les bases pyrimidiques, ce phénomène a déjà
été
observé
avec
le3
mononucléol:tdes.
L'hypocl1J'omi""m~ duns
la
première
barlde d'absot'ptlon (417,5 nln) du MDAp2+ atteint 60 ~ dal15 la titratiOll avec
le poly(rA) ct 70 % dans la titration du bis-DAp4+ avec le poly(r'A).
Les car'actéristiques spectr'ales des deux colorants en présence des
diffdrents polynucléotides SQtlt ['agl'oupées dalls les Lable~ux Il.~ et Il.B.
poly{dA)
La
fixati0rl
nu MDAP?+ SUt'
12' poly(dA)
i"lriuit Lill hypocrlrornisrne dc
55 % dans
la première
bande d'absorption
du
ligand
(~17,5 nm).
Le spectre
d'absorption
se
déplace
vel'S
l~s
grandes
longueurs
d'onde
d~
1,5
nm
(41"/,5
nm -Jo
419 nm).
Quatre points
isobestiqucs apparaissent rc~'rectivement
à
~2~ nm, 383 nm, 3~0 nm et 3D3 nm.
poly(r'A)
L'hypochromisme sur la première bande d'absorption atteint 60 % en
pl'ésencc du MIlAP2+ et '1D % en présence du bis-DAP!I+.
Les spectres d'aboorp-
tion du MDAP2+ et du bis-DAP~+ se déplacent l'espectivement de 6 nm et 11 nI;!
vers
les
gr<Jndes
longuew's
d'onde,
Dans
l'l1n et
l'uuLr"~ cas,
les spectres
.
d'absorption
présentent.
plusieurs
points
isobcstiQues.
Lé!
multiplicité
de
ces
points
isobestiQues
doimontrc
l'exist.ence
à
l'état
fondamental
d'Un
seul
type
de
complexe
entr'e
chacun
des
deux
ligands avec
les
polynucléo-
tides.
Les
principuux
points
isobestiQues
observés
sur
le
spectre
d1absorption des deux ligands sont situés respectivement à 1123 nm,
~06,5 nm,
)99,5
nm.
384,5
nm,
338,5 11111,
32( nm et ]24
~25 nm,
~ 1D ,5 :lm,
IWO,5 nm,
388,5
nm,
342 nm.
331
nm,
327
<lm
et
304
nm
pour
le
biS-Dr,pl\\+ .
1
1
1
1

---

88
Ln
rigure
II.1
:--,eprésente
les
spectres
d'ëibso:'ption du
tit/'é avec
le poly(rA).
poly(dT)
L'hypochromisme
obser'vé
sur
les
spectres
d'absorption
du
I-1DAP2+
titré par l~ flo1y(dT)
est plus faible que pour] es autres homopolynucléoti-
d8S.
Il est d'environ
20 %.
Plusleul's points
isobestiques sont situés ,'e5-
pecLivement à 42\\
nm,
405,5 nm,
397 nm,
381
nro,
375 nll\\,
365,5 nm,
337 nm.
327 nrn,
322,5 nm et 312,5 nm.
Le déplacement des spectres d'absOI'ption vers
les
g:'andes
langueUI'S
d\\ond(~ est
de
2,5
nm,
Cette
valew'
Sr~
situe
entre
celle observée ,H'ec le pOly(dA)
(1,5 nm)
et avec le poly(rA)
(6 nm).
poly(rG)
'L..'hypochrornisllIe de.,;; tipectres d'abs01'ption du bis-DJ',pll-r <.:omplexé au
poly(rG)
(40
$)
est
moins
important
que
lorsque
ce
de:'n ier
est
complexé
avec le P01Y(l'A)
(70 %). Les spectres se déplacent de 7 nm vers les grandes
longueurs d'onde et plusieuf's points
iso~estiqucs sont otJs,~rv6s r'espective-
ment à !.l2/1,5 nm,
~10,5 nm, 399 nm, 388.5 nm, 3/11 nm, 330 nm, 326 nm, 31~ nm,
310,~ nm et 305,5 nm. La figure II,2 r-eprésente les spectr'es d'absorption du
~is-DAp/1+ titr0 par le poly(rG),
Le
maximum d'absorption du bis-DAp4+
complexé au pOly(rC)
se
dé-
plac~ de
419,5
nm
à
1120,5
nm
et
l'hypochromi."me
de
la
première
bande
d'ab50f'ption atteint
36 1"
lei
comme délns
les autres
cas,
plusieurs points
isobestiques
apparaissent
sur
les
spectres
d'absorption
respecti V~ment
à
/12/1,5 nm,
111 ,'lOIn,
3/11
[lm,
332 nm,
326 nm et 317 mn,
Le MDAP2+
est
le
bis-DAP~~ se fiXent sur' les polynucléotides
en
simple br'in.
Cette fixation provoque un déplacement du sp8ctre d'absorption
des
cjeux
composés
ver's
les
grandes
longueurs
d'onde
et
un
hypoc:hr'omisme
important est obser'vé sur les deux p:'"'emièr'es transitions, La variation rela-

---

89
0,2
•
1
u
"•D
!\\
0
•D
•
~ 1
0,1
,!
o 3oLo------.:::='------~40;;;0--~="""--~500 À (Il m )
~~ II.1 : Spf.?ctre:J <1';I1J~Qrption (1\\1 MDAP2+ (S,'(O X 10-6 t~) tilr'é par t.~
l'olY(I'A) dan~ le tanlporl c.'lcodylilt'l 10 mM À l'fi 7 et à 20°C. Le:;
dlfférenL8
spectres
(du haut
vers
Le bas
fi 1117.5 nm) cOrt'eSponoellL aux va-
leurs suIvantes du rapport J'ID:
0 ; 9,6
; 20
; 110
: 59,8
; 79,8
. 99,7
;
120 et 160.
0.45
•u
"
•
D
o
•D•
0,22
,=fi·
~
~
o28LO,-------...:::~------:4~2;0~§........---~550 À ( Il m )
-
. ,
~. (7 O'
10- 6 H)
ttLr~ [1i1I'
Figure II.2
: .spectres
d'ab:JOf'j)uon
du
bIS-DIlP
. 1.>
x
_,
Il? )h)ly(rG) [j,lns
le t,ullPOIi cacodylate
101;)1'1,
N;I,:lll)O mt1 él
pH
-f et à 20"C.
Les
différcnL~ 3[lectr'es (tu haut.. vel's 1,> 11119 ,'1 111'),5 ni') COI'-
respond0nt <LUX valeurs suivantes d li
r,lppOr' L P/D
0
: ; O r
, :
) ·
.
1
;
1.5
:
2
:
2,5 ; 3.5 ; ~.5 et. S.S.

---

A
Ao
1
\\
0,8 _
0,6 _
2
~ :"0-
•
0,4
0
50
\\00
150
200
r/D
Figur·~ 11.3
Val'i,ltion
l'eliJ.l.lv~ d'O! l'aLJ~ol'banr:c du HDi\\P:!t ((,,0 X 10-(' t1)
rn83urée à 1117,5 nm en pré::;ence des dl rrér'en1.5 poLynu<: 16otitlc.'l
en simple brin dans le tampon cacodylate la m1·I, pH '( ?1 20°C.
1
poly(d1')
2
poly(r'A)
J
roly(c1P,)
A 1
'Cl,
Ao
<>,
,
0,
\\
b. ,,
0,8
~
, ,
'1,
\\
,
\\
'q,
' ....0
1
0,6
\\
-'Q --.c..
__ --0-------
--0-'
-----o~-
~
~ \\
2
\\,
0,4
\\, '''-__.0--.--0----0----<>--.-.-------.-.-<)
3
o
5
10
15
20
25
p/D
f\\gUI'~ 11.1)
V"riéltion
l'elativ(~ do l'ao:Jül'banc.! llu bis-flApil' (G,·.') X 10-(,
~1) nl~sur~c à 1)20 nm en prp.3ence des dlfférfC'lls pOJynuclüOLid'l:l
dans le tampon cacodylate \\0 mH, NaCI
100 ml·1 pli 'r' à 20°C:
l : poly{rC) ; ~ : poly(rG) : l : poly(r·A).

---

9 ]
Liv0
de
l 'at)3or'banc'~ mesul'é,; SUI'
lé]
pr'emière
[)éUlàr.;
d'''3.b::;orption
des
deux
ligands es t représent.ée sUr' les [igUl'es l T. 3. et II ,1.1. Enf in on ovse:-,ve plu-
sieurs points isob8sLiques !:lUI' le:::; :'Jpectl'c-", d'absorption. L'existence de ce
grand n0mbr'e de points
isobestiqlJes montre que dans
la gamme de concent;'a-
tians en polynucléotides utilisée,
un sé:ul type de complexe est for'mé.
2. Interaction aveo les acides nucléiques en double brin
Les acides nucléiques en doubl'~ brin utilisés pour les titr-ations
du MDAp2 t
el
du
bis-DAP4+
sont
l'ADN
de thymus de veau,
le pOlyd(A-T)-
polyd(A-'[),
le
palyd(G-C)-polyd(G-C),
le
poly(dA)-poly(dT)
et
le
poly(rA)-poly(dT).
Les spectres d'absorption des deux colorants subi.ssent un déplace-
ment
vers
les
grondes
longU(;llrs d'onde,
ce déplacement
est d'autant
plllS
important que le pourcentage en paire de bases (G-C) augmente.
L'~l::pochromisme observé sur les deux premières bandes d'absorption
est plus important ,'1'1(;(;
le polydCG-C)-polyd(G-Cl
qu'avec les autT'es
poly-
nucléotides.
Enfin,
comme dans les t..itrations avec les polynucléotides en sim-
pl~
br in,
plus i eurs
points
isobes t; i.ques
appcwaissenL
sur
les
spectres
d'absorption.
ADN de thymus de veau
Les titrations avec le MDAP2+ ont été réalisées à faible concen-
traUon
ionique dHns le tampon
cacodylate
lU mM à pH 7 et à
20°C tandis
1
qu'elles ont été faiteS 8 haute concentraUon ionique avec le bis- Dflp 4+. En
erfet, à faiDle l'orce ionique, le bls-DApll+ provoque la form,ltion d'agrégat..s
1
qui précipitent. Les t..itrations ont donc été réalisées dans le tampon ca co-
dyl8te 10 m1'-l, NaCl 100 m~'l à pH '/ et à 20 oC.
1
1
1
1

---

92
Le
méiximum
de
l'ahsorption
du
~1DrlP2+ sc déplac{~ de ~17,5 nrn à
425,5
nm
tandis
que
(;cllJi
du
bis-Uf\\.p11+
se
eJéplacc
de
~19,5 nm à ~2'T nm.
L'hypochromisme observé dans la première bande d'absot'ption est de 62 :l pour
le MUf\\.p2+ ç:t 67 % pOUr' li~ t~is-[)Ap4+.
PlusiE)Ul'~ paLnts i;;;OD(;stiqU8::; appal'aL~­
sent sur les 5pectres d'absorption. Les longueurs d'onde de ces points iso-
bestiques
sont
déplacées
d'environ
2 nm ver's
les é/:randes
longu~urs d'onde
dans les complexes avec le bLs-DI\\p4 1 par' l'apPol't à ceux avec le
r1UAp2+.
polyd(G-C)-polyd(G-C)
Le déplacement du spectre d'absorption vers le::; gl'ûndes longueurs
d'onde est
de 7 nm dans
les
deux
cas
et
l'hypochromtsme
de
67
% avec
le
1'1Dflp2+ et
66 ',t ûvec le bis-D!l.P~+. Le maximum du spectre .1 imit:e du complexe
bis-DAP~+-polyd(G-C)-polyd(G-C)se situe en un point isobestique (426,5 nm).
Les
longueurs
d'onde
des
ûutres
points
isobestiques
sont
les
mêmes
que
celles mesurées en présence d'ADN de thymus (le veau.
polydCA-T)-polydCA-T)
L' hypochromi sme
es t
vois inde ce lu i
obser' vé
lor's de la l i tra tion
des
~eux composés par le polyd(G-C)-pOlyd(G-C) soit 5~ $ en
présence
du
MDAp2+ et 62 $ en présence du bis- DAp 4,. Les spectres d'absorption du MDAp2+
se déplacent
vers les grandes longueurs d'onde de 6,5
nm.
Les
points
1so-
bestiques
apparaissent
aux
longueur'."',
(j ")llde
suivantes
423,5
nm,
,'106 nm,
396,5 nm,
383 nm,
372 nm,
339,5 nm et 300 nm.
l'tU début de la
titration du
bis-DAp4+ par le pOlyd(A-T)-p01yd(A-T) on observe des points isobestiques
à
425,5
nm,
407.5
nm,
1102 nm,
385,5
nm,
342
nm,
296
nm
pour'
des
rappor'ts
phosphates
/
llgands
inférieurs
à 10. Au delà de ce rapport les spectres
d'absorption:;e
(Iéplacent
vel'~
l,~s
grandes
10ngucUI'3
d'onde.
Le
maximuili
d'absorption du bis-DAF'~+ dans les com~lexes se situe alors à ~23,5 nm.
poly(dA)-poly(dT)
En
absorption,
on
ohse:'ve
les
mêmes
variations
spectral'9s
du
MDAP2+
et
du
bis-DAp!l~ que e:elles obLenues l,)rs de:3 tLI;rations av·:')c les

---

93
1 ,2 li
•
u
c
•n
l"
0
•
1
n•
:11
0,63
1
'1
300
Vlgur'c II.5
: SpecLr'es
d'é1b:;()r'ption ,1u
MDi\\P~+
(J,S'!
X IO-:i t·;)
l.ILr'é
IHII'
18
polyd(i\\-T)-polyd(A-T)
d1in~ le t<:rmporl cacodylate \\0 ml-! 11 pH 'f
et.
il
20°C.
Les
difrér'0nt.s
3peet.r'es
eorre:;rono1ent
(du
)lauL
vers
le
bu.';
fi
11l"1,~; nm) illJX valeur's suivante.'l du r'ilpporl l'Ill
0 ;
1.;C;
2 , 3 ;
3,')
;
Il,(,
~;,8;
cL C,l,
0,<16
•u
c
•n
o
•n
•
0,23 _
r
o
300
430
550
h (nm)
Figul'c 11.6
::;pect.r'cs
d'':lkiol'ption
du bb-DM,II'
(6.~[l x 10-(' ~1) t.it1'é par'
le polyd(G-C)-polyd(G-C) délns le t.ampon e.lcodyl.aLù 10 mM,
t~é1Cl
100 mt1 ;1 pli '( et à 20°(;.
Les difrér'r:!nt.'l spec:tr'es
eorresr,orH1'~1l1. (,1e hnut en
ons il
'n9,5 11m)
au",
val,>UI's
suivanLes du
rarror'L
PlI)
,
0
;
0,119
;
0.9"
1,II~j ; 1,'.!3 ; ;:,.I\\;~ ; ;:,0(1 ; 3,3'1 ; 3,8',' et JI,:13.

---

1
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........
•
4
a a
25
50
75
100
plo
Figure II. Sb is
"
. ,
2+
Viln:lt~Qn relatlve de 1 absorbance dl] l-IDAP
0,5 10-5 N) mesurée ~ 417,5 nm en présence
du floly(dA)-poly(dT)
(1)
; du polydCA-T)-polyd(A-T)
(2)
; du nolyd(r,-C)-polyd(r,-C)
(4)
ct de l'ADN de
thYlIllLS
dQ Vl'ml
(3).
'L'lmpon cilcodylatc 10 m"',
pH 7 ZI. 20"C.
Figure Tf .6bis
. .
l '
d
1 \\ b
b
.
4+
Varultlon re .<ltlve
e
il
sor ancc du hl.s-DAP
suivic ."i. 420 nm dans
le tampon cilcodvlatc
10 111~',
NiJCl
Ion rnH J
l'II 7 et;1 20"r..
(1)
[l0i y d(A-T)-
polyd(A-T),
(2) ADN dl'
thymllB
de \\'E:<l\\l,
(3) polyd(r,-C)-polyd(r,-C).

---

95
aut!"'es polynucléotides. L'hypocllromisme est néanmoi;ls moins ImrJOrtant : 3'{ :l
pOut'
le
MD,1P2 1
et
Illj
% pour
le
bis-DAP~". Le dépla'~':ln8nt des spectrE:3
d'absor'ption
'1crs
les gr?ndes
longueurs d'onde
est
le
même
pour
les
deux
composés (3,5
nm).
Il
est moînfJ
împort;:lnt que pour 1€5
autres polynucléoti-
dC.'J.
(ln
obSel"/€
encore plusieurs
points
isob'2stiques
1.J23 nm,
~05 nm,
400
nm,
382 nm,
375 nm,
367,5 nm,
333 nm,
321J ,5 nm,
300,5 nrn sur les spectres
d'absorption dlJ bis-DAI,!II.
La
figure
Il.5
représenLe
les
spectres
d '~b30rptic'n <lu MDAp2+
titré par le polyd(A-T)-polyd(II-T) d3.ns le ta.mpon cacodylate 10 mt", pH 7
et
à
2üoC.
Les
spectres
d'absorption
du
bis-DAp.ll+
en
présence
du
polyd(G-Cl-polyc1(G-C) sont iIlu.<,;tré,:', :>Ilr la figw'e Il.G,
Les
tableilUX
II./\\
et
11.13.
résument
l'ent)omble
des
var'iaLions
specLroscopiQue~ du MDAp2+ et du bis-[)lIp4+ com;Jlexés aux dirrérents polynu-
cléotides.
La variation relatlve de l'ab~orbance du MDAp2+ mesurée à 411,5 nm
en présence des polynucléotide::; en double brin est r'crJl'ésenLée su:" la figure
Il.5 bis,
et eelle du l)is-DIIP4+ à 420 nrn SU)' la figure Il.6 bis.
Pal'mi les différents modèles propos€:J
pour <ll~éllyser' de [2.<;.'on Quan-
ti tati'le
la
[ixéltion
de
petites
molécules
sur
des
mac!'omolécules,
celui
proposé par Mc Chee et Von Hippel se distingue par la simplioité de sa for-
mulation mathématique.
(5,6). Ce modèle
décrit la fixation de ligands
sur
une
matr ice
;nac)'omolécula ire homogène
et
linéaire.
de
longueu,
inf inie
en
terme d'équilibrc thm'modynamiqIJ8 i"J l'<lide ,je I;rois pa1'iJmr~I,I'es ;
n,
la taille du site àe fixation du l i.gand,
K,
lF!
constante d'affinité
intrinsèque de
Cixati.on du ligand sur
un si te isolé
Id,
le degré dl! ooopérativlté 8ntre les ligands.
Sui'lRrlt la val.eu)' de Id,
IR t"lxatioll des ligands est dite coopéro-
tiv(> 51 w )
1 et anLi-coopérative si hl < 1. Lorsque w '= 1, 11 n'existe aucu-
ne interaction entre les ligands fixés.

---

Les équations formulées par' Mc Chee et:. Von Hi ppel sont
- pour une flxation non coopé:'ative (w
1 )
n-1
v/Lf" K(l-nv)
.
[(l-nv) 1 I-(n-l)v]
( 1 )
pour une fixation coopéréltive (w .,. 1)
v
- [(2w-l )(l-nv)+v-H]-'1 n-1
K(l-nv)
------------------1
[1-(n+l)v~nJ
[2(w-l)(1-nv)]
_
où
R
[[1-(n-l)vJ2+~ wv(1-nv)]1/2
v
représente
la
densité
de
fixation
v
[ligands
fixés]
1
[matrice]
Lf (,sL la concentr'ation en lig2nds libres.
La variation de
ltal)sortoan,;c du MDI'lP2+
(1118
nm ou 331j Ilm) en pt'é-
senee
des
différents
polynucléotides
a
été
analysée
suivant
ce
modèle
à
l'aide
d'un
programme
d 'ajust,~ment de moindres
e-'lrrés
mis <lU point pa."' le
Dr.
Gérard Lancelot ail Centre de
Biophysique !101é<..:ulaire à
Orléanz.
Le
ta-
bleau
ci-dessous rassemble
les
paramèLres
ther'modynamiaues
des différentes
fixations.
~~
n
ADN de thymus de veau
2,5 105
6,8
0,5
po lyd (C--C) -polyd (G- C)
1 ,1
101)
6
0,3
polyd(A-T)-j)olyd(I'l-T)
1 , " 105
6
0,9
poly(dl'l)-poly(dT)
6,0 103
5,5
3,5
poly(dT)
~ ! 3 103
6
- - - - -
TABLEAU II,C
Paramètres de la fixation du MDl'lp2~ SUt' les acides nucléiques dar1s le tampa:l
cacodylate 10 mM
à pH 7 et à 2ü r C.

---

97
La
fixation
du ,"1DAp2+
est be::wcQup plus l'orte sur
les acides lllJ-
r::léiques en double brin qu'en simple llri'1.
La
fixiJtion
est plus
importante
sur' le polyd(G-C)-rolyd(G-C) que sur le polyd(A-T)-ro1yd(A-r).
La valeUr' de Il var ie entr'e 6 et 7 phosphates aussi
bien sur
les
simples bl'in."I que .'3ur les doubles
brins.
Lu valeur de west inférieul'e à 1
pOLlO'
les
acides
nucléiques
en
double
brin
sauf
pOUl'
le
poly(dA)-poly(dT).
Ceci
démontri~ que la fixation du MD111,2 t est anticoopér:Jtivc. La tailH du
site,
voisine de 3 pai~'es de bases est la ':aleur généralement trouvée lors
de la fixation de certains colol'ants sur les :,ci1e3 nucléiques ('(-9).
Le
cas
du
poly(dAJ-poly(dT)
est
différent
de
celui
des
autres
polynucléotide~ en eJouble hélice. La str-uctUl'€
de ce duplex est bien polJ'ti-
culièr-e et
il
a
été
proposé
que
les
deux
chaines
n'adoptent
pclS
la
même
conformation,
le
nombre
de
paire~ de
bases
par
tou!'
d'rlélice
10,1
étant
inférieur
à ce que l'on trouve dans les autres formes d'acides nucléiques
(10,5
paires de 1]:"IS8S pOT
tOUI'
d'hélic€)
(10-14).
Des résultats
cristallo-
graphiques récents
montrent
que des
liaisons
hydrogènes
dites
"bifurquées"
se
fm'ment
entre deux
paires
de
bélses
,~-T successives (15). Cette particu-
larité explique que le poly(dA)-poly(dT) n'ait pas une structure favorable à
l'inter'calation d'où une constatll~e (l'équilibre [llus faible.
La fixatLon d'un
ligand provoque une modification de stt'ucture qui
favorise ensuite la fixa-
tion
d<lns
les sites
voisin~. 11 en résulte une coopérativité positive (w >
1)
contr<l irelllent aux autres polynucléotides en double br in.
Ce
comportement
a été aussi
trouvé
lors de
la fixation de la dnunomycine et de l'iodure de
propidium sur le poly(dA)-poly(e]T) (16,
17).
Les
constélntes
de
fixation
du
bis-0l\\p4~ sont plus éli;vées que
celle du MOAP2', de plus cette fLxation
est aussi forte SUI' les polynucléo-
tides
en
simple
brIn
qur~ sur
le:;
duplex
(tableau
11.0).
La
fixélt~on
est
anticoopérative et la taille de fixation (6 < n < 7) est la même que pour le
t'lDAp2+.
Ceci
:'l'expliquerait
si
un
seul
rJoyall
diazapyrène
inter0.git
:wec
l' ae ide nue 1éique tandis Que l ' autl'e moi t ié interag i t avec une autre mOlécu-
le.
Ce système de fixation
intet'caténail'e
provoque lé! formation d'agrégBts
observés à faible force ionLque et dans les déplacements anormaux du plasmi-

---

9R
de
pBR
322
dans
les
g~ls d'électr'op:lO:--èse (voir 1", der;,ièr'e pH:'tie de ce
chap i tre).
l--:-or1)
n
'"
ADN de thymllS do veau
1 , J 10 6
'(
0,9
polyd(G-C)-polyd(C-C)
2,3 10 7
5,5
0,3
polyd(A-T)-polyd(A-T)
3,0 10 5
6,
0,7
poly( rG)
3,3 107
6,6
0, '(
poly(r"::)
1 ,0 ](17
6,5
0,3
TABLE:AU Il.D
Constantes de fixation du bis-DAP~+ sur les acides nucléiques à 2üoC dans le
tampon cacodylate la mM, NaCl, 100 mM à pli 1 et ~ 20 c C.

---

99
I I . ETUDF.; EN FLUORESCI::NCE
Nous <wons vu au chapitre l
que
toutes les bases nucléiques étei-
gnent
la
rluor'escence du MDAP2;
ainsi
que celle du bü'-DAPL:t.
11 en e,n de::
même pour les oligonucléotides en simple ou en double brin. Cette extinction
de
f'luore5cencc est
pratiquement
totale avec l'ADN dt'
thYl1lu.,> de veau et le
polyd(G-C)-polyd(G-C).
Avec
les
aut:oes
polynucléolide5
l ' irL:-Jibition
de
18
fl'..lor'escence ezt
très grande car (~n fin de ti tl'atioll la f'luorc8C8nce
résI-
duelle est
toujours inférieure à
% de la fluorescence
initiale et ce
dès
que le rapport phos[JhaLe sur ligand att.eint 100 à faible J'oree ionique.
1. MDAp2+
Les spectres d'excitation et d'émission de fluol'escence du MDAP2·
en présence du poly(dA)-poly(dT) sont r8préserltés sur 18 figUl'e
TI.7.
Les
mêmes
types
de
spectres
sont
obl-enus
avec
les
aul-res
polynucléotldes
et
l'ADN de thymuf> ne veau. Le maxirnulll d'émission du MDAP2+ est situé à 1123 nm.
Au cours dcs titrations avec les différents polynucléotides, l'intensité (je
fluorescence niminue
sans déplacement du maximllm
d'émission. Tout se passe
donc comme si la fluorescence obser'lée n'était.. due qu'à la molécule llbre.
La
variation
relatL':e
de
l'Lntensité
de
fluorescence mesurée
au
maximum
de chaque bande
viul'oniqu"
est
la mêmE:,
L'inhibition
est
d'autant
pIus forte que le
polynucléotide est riche en guanine.
Les
polynucléotides
erl double brill sont pltlS efficaces pOllr ~teiJI(lre cettE: flIJOI'eScence. La fi-
gure Il.B représente la variat..[on :'elative de l'intensité de fluor'escence du
MDAp2+
me:Jurée
,1
423
nm
en
pr'és,omce
de
l 'ADN
(I(~
thymus
de
veau,
du
polyd(G-C)-polyd(G-C), du polyd(A-T)-polyd(A-T) et du poly(dA)-poly(dT),
On
obset've qu'à forte conl;enLr.J.L\\on en [,olynucléotides toutes les <:ourbr~s ten-
dent
vers une valeur l'ésiduelle très faible du rapport
F/FO,
sauf dans les
complexes
avec
l!~ poly(dA)-poly(dT)
oll
la
fluorescence
résirJu'211e
r'este
relativement importante.
Les spectres d'excitation de fluorescence du MDAP2+ sont eux aussi
bien résolu:) erl présence dc,') polynucléotides. Lé:3 maxima cI1I't'gi<.trés sur ces
s;:Jectt'es correspondent aux maxima observés SUt' les spectr-:s d'abSOI'[,tion du
t-'lDAr 2 '
lLr)I'\\:.
L.a
pl'emièl'e
transition So
.,
S1
a SOli maximum à
1~1'{,5 nm et
;

---

100
10
~
.;
,;
~
•
0\\
0
c•0
10.\\
"
•
"0,
5 -
-
1
•
Il
u
~
-
••
",A~Jr;\\
"c•
~ \\
c
I~V~
o
390
ri'~ .-
495
600
~(nm)
Figl!..C!...-II."IA
: Spectr'es d'6mi:'ision de fluOI'Gscencc de t-lDAF'2+
(6.13 X 10- 6 1.1)
en présence du p,)ly(nl\\)-poly(dT) (j,1.n~; 1" tampoll ';'<1codylate \\0
ml-l à
pH '{
el, à 2üoC,
Les
dirI'érent.s spectl'e:,
(du 11aut "'er~ le bas) corre,,-
pOfldent aux valeurs SUiV<1Jltes du l"ar'port PlO: 0 ; 9,6 ; 28,!1 ; 08,7 ct 279.
Ln
longueur'
d'onde d'excitF.ltiCln est un point
isobestique (jJtcl'miné SU:' les
spectres d' absor'pt ion ()82 nm).
10
~
~
,;
/\\
~
~
1 \\
"
c
~
"..~
"0
~
5
-~
"..,-
Il
/f\\1
"
c•c
1
350
400
450 ~(nm)
Figure IL7LJ
: Spectr'G3
d'8xcitation
de
nUor'ese~n(;e du r'1DAP2' (6,1.3 x 10-6
I·l)
en
présence
du
poly(dA)-pflly(dT).
l"éJ
longU\\:\\H"
<l'ami",
(i'(~mission c::;L de 110:;0 !lm. Les l.:ondiLion:l expér'imentalc:J ~ont
les mêmes que celles de la figur'e Il.7A.

---

101
o.u
F
l' 0
0.6
o
1··ilklll·'~_~!..:..Q
Var\\n\\.iOll
rel,lLiv,~ d8 1 t int'21l:'l\\t6 d<.: rlll"'l"';(.;<.:I1"(~
,lu
r'lll,W-"
meslll',~e ~ 1123 Ilnl ,jans 1(: l.ampOI\\ cLlt:udyl<ltc 10
In:1 plI "f il ;:O"L:
ell IJI',§~ènçe <J!:s ilci,ks nucléiques en double br·ill.
l.n
LOllgllCUI' (J'on,je d'c~ci­
\\'''lion
llst
LOUjOllf'S
Uil
point
isc,besl,ir;ue
d()I.'Jf'rnjJ1,~
SUI'
les
:';lil~~I.I'e;,
Il' ,\\1;S'..lf')' Lion,
1
polyd(G-C)-polyd(C-C):
1,\\ COIlCenl.. rilLion l'ln ~mfllj2t os 1.. ", 'f • i 0 1O--G 1·1 t;\\..
la longueuf' cJ'ondc d',~xciLil1..iCJIl esl. <le 3I1 n'll.
,
é'
.dm (I,~ lI1YIlIliS (10 '/I;~il"
;
la COllcentr'I1..Îon en /·II.JfII,2'
,~~ L lié!
, .5:3 \\O-~i
!(l
longuelJl' d'onde d'exci\\-tltion est (Jr~ 1100 I1rn.
" el.
3
r;,)lyrIU.-T)-poJyl!(A-T);
1:J (;O!lecntf'a!.inTl 1;", r1IJ!\\I'ZI
e~; l
," ". li(J 1() -(j Il d.
lél
longucur' c1'onue cJ'excitation est dc 31J0 Ilr.!.
11_
poJ .... (uA)-poly(dT)
III
concent.I'i'H.. ic'Tl
en l·milP;:'-
l'l.
ri"
{), 1')
1()-I]
;·1 pL
LI
IOlle'lClJ[" d'onde d'cX(;il.aLion coSt de Ji"? 11111.
111
~
(\\
"0
-•0
1 \\
"•0
••
1(\\\\/\\
", ,
0
i!r \\(\\\\
•u
Il \\V:\\\\
••
•"•
~/'\\l
"
IL-~A~_-
/
~~--
/
~~-=::::-
U
1
400
500
6~O
À (llm)
~P",~I.I'e5 d'I"~l'Ii",,;siolt lh,
rIUo,'e;:;l:Cllce
'~II
l,i;'j-]l/d,llt
(;~.{ll
X
1,)-11
1-1)
';il
)11'8:;(;IICC
<lu
!!ol.,.;l((;--C)-I,,)lyrll,{,I;i
d;LII~j l,' 1.:'"11")f]
(;<II:(,II)'I<lle 10 ,nt'l,
j'laG!
\\(JO mn f, pli '1 el ,\\
20"l;,
1,'lS dirrp.l·e:lt~ SpC,~lf'Wl dOl
11<111\\.
Vef',";
l "
l!ilS
COI','c'jpOnd(:lll.
,lUX
V;,U~IIl':; 'lIliv"'irl.i~:J tllJ i':JprH,l',1
1'/1)
(l
0,;'')
:
0,')
1,12 cl.
5,')(J,
Li!
l')ngUlJIH'
,l'andr;
d"~x(ll.'j\\.i()fl (1IOr),',)
,,:;1.
IIll
p'1irll.
i:,{)Il"'~,l.i'l\\I"_

---

IO~
deux lJ~ndes vibr'onique3 Ù 39 1) :lm et 3'r5 mil. La trélnsil.ion 31
-. 52 présen.te
un maximum à
33~,5 nm et trois bandes vibronl1llles à 319 nnl, 305.5 nm et 293
nm.
Aucun ctéplacemellL du sp8ctr'e d'excltfltion n'est obscrv~ 8lor'S Que
les spectr'es d'a~sor'ption se modifient
considér-abl-:!ment
(voir
les
spectr-e.'3
d'absorption r-ept'éSenLés sur la
figure II.4).
lei aus~d tout indique que la
fluorescence
recueillie
l;sL
'?sô',cntiellern>mt
due
a
l'émi.'}sion
du
MDAp2+
libre.
Les spectres d' lè'XC i taLion de fl uorescence sont ident iques lorsque
l'on observe la
f'luoresc<~nce (lu côté des fait)ll~s longueur::; d'onde (420 nm)
ou du côté des BI'andes
longueurs d'onde
(475 nm)
du spectre d'émission.
Ce
résultat
est
en
aeeor'd
avec
les
variations
de
l'intensité
d'émission
de
fluorescenc(~ en lwésene:e (1es difréretlLs polynucléotides et conflrme que la
fluo~escence mesurée est due pour' une grande part au color'ant libre.
2. bis-DAp4+
Comme
dans
le
l'as
du r;]<Jnomère,
la
fluorescence
du
bis-OAP4-'-
est
6teinte p~r tous les polynucléotides et l'ADN de Lhymus de Vei-iU.
Les
spectres
d'émission
de
fluo..-escence
du
bis- OAp 4---
présentent
égal,O!menL une st;r'llcture vlbronique bien
r'ésolUE:;
avec des
mil.xima à
42'(
n'm,
450 nm et un épaulement à 480 nm. En présE:;nce des diff~r(~nts polynucléotides
on observe une diminution de l'intensité de fluorescence à 1127 nm.
En pré-
sence de
l'ADN et du polyd{G~C)-polyd(G-C) la diminution d':O! l'intensité de
fluoresence à 112"( nm '~3t suivie aux fortes concentJ'nLions en phosplMtes
pa~'
une lnver'sion de l'intensité des bandes vibroniQues.
La bande centr'ée à ~50
nm se déplace vers 445 nm et devient la plus
lntense tandis que celle ce:1:-
tréc
à
42'(
nm ~e déplace progl'essivGfnenL V'3r's
!123
nm.
Néanmoins aux
très
fortes
concentrations
en
polyej(G-C)-polyd(G-C)
ou
en
f\\.DN,
la
rluœ'escence
totale du ccmplexe de','ient pr'atiQueme:1t nulle.
La figure 11.9 !'epr'ésento les sp~ctr8A d'émission dl~ fluor'r~scence
du bls-DAP4+ titré par le polïd(G-C)-polyd(G-C).

---

1()3
ILl. FLUORESCENCE DYNAMIQUE
Le
déclin
de
fluorescence
du
MDAp2+
est
monoexponentiel
et
le
temps de vie de
10,8 ns. Délns les C'Jmp18Xes <1'>'e"
183 ncides nucléiques,
le
déclin de fluorescence ne peut plus êtr'e ajusté à un seul temps de vie sauf
dans
les
comp.Lexes
avec
le
polyd(G-C)-polyd(G-C).
POur'
tous
18S
autres
acides nucléiques en simple
comme en double brin,
il faut faif'e intervelli.r
au moins un (!euxième temps de vie pour obtenir un ajustement satisfaisant du
déclin de fluorescence.
a) polyd(G-C)-polyd(G-C)
Quelle
Que
soit
la
longueur d'onde d'émission à laquelle on re-
cueille la
fluorescence,
O~ ob.serve toujours
Url
seul
temps de
vie dont
ICI
valeur moyenne est de 9,8 ns. Ce temps peut être attribué au MDAP2' fixé de
fô.lçon électro~tatiQue avec les phosphate:; du polynucléotide. Le raccourcis-
sement
du
temps de
vie
(10,8
ns à 9,3 ns)
cor'respond à une
inhibition par'
les phosphates.
Le
tableau ci-dessous résume
les résultats d'une
tltration
du MDAP2+ par le polyd(G-C)-polyd(G-C).
[polyd(G-C)-polyd(G-C)]
( M)
f' / [J
T ( n:l)
X2
F/Fo
0
0
10,00
l , 1~
lj,06
10-5
6,5,
9,81
1 , 1 6
0,2515
6,90
10-5
Il ,3
9,83
0.99
0,OB36
2,71
10-.ll
~7
9,01
l ,OB
0,006
5,03
1(1-lj
'jll
9,8 :"'i
l ,03
0,0026
7,0~
lO-lj
1~ 1
9,81
1,07
0,0023
1 ,035 10-3
23~,5
9,7~
l ,03
0,0022
TABLEAU ll.E ;
Analyse
du déclin
de
fluorescence du MDII.p2+
(6,25 10-6 M)
en
présence de
Quanl.ités croissantes de polydCG-C)-p,')lyd(G-C) (Ians Je tampon cacodylate
10
mM,
à pH 'r et à
20°C.
La
longueur
d'onde
d'excitation
est
de
335
nm et
l'émission est recueillie à 423 nm.

---

104
L'en5emble
des
l'ésultats
contenus dans
le
tableau ci-dessus,
de
mJme que la '.'élri:tLion dE;
l' intensi té de fluol'8scence du I\\.jDflP2~ t,n présence
du polyd(G-C)-polyd(G-Cl, montre que la fluorescence de ce composé est. tota-
lement
éteinte par les bases G-C
à l'exception d'une tres faible fraction
«
1 %) prol)ablemcnt fixée de faç'on externe pt'è:5 des p~lospllate.':l.
[
b) ADN de thymus de veau
[
Dans les complexes formés avec l'ADN, le déclin de fluorescence du
MDl'lp2+ IIC p,out plus être .1justé avec un seul
temps de vie.
Nou~', avons tenlA
d'ajuster le déclin avec .'3uccessivcmcnt deux et tl'ois temps de vie sans une
1
améliOT'ation significative de la valeur du X2 ,
Dans ces conditions,
le mo-
dèle
à d'~llx temps de vie nous a semblé le plus satisfaisant pour décrire
[
l'extinction de fluorescence du MDAp2+ pal' l'ADN de thymus de veau.
1
PID
x2
1
1
1
1
TABLEAU II .F
1
Analyse du déclin de fluoreBcence du MDAP2+ complexé avec l'ADN de thymus de
veau ,:!ans le tampon cacodylate 10 mM pH 7 à 20°C Ca) cL dans le tampon caço-
dylate la mM, NaCl
100 mM pH '13 20°C (b).
1
1
l,'exisLerlce
d'au
iIlOi:ls
deu=-:
Lemps
de
vie
montr'e
que
l"
I~DAp2+
complexé dans l'ADN n'est pas totalement éteint.
Les deux
temps de vie
co/'-
1
r'e:>poncJent sans doute au MDl'lp2+ fL<é de faç'on externe,
l'un au voisi.:lage des
pail'8s (G-C)
(8,8113)
et l'aut/'e
(11,20
ris)
élU voisinage des paires de b;J.~es
(A-T)
mais
non
inter-calé.
Ce
temps
de
l\\,20
ns
peut
êt,j'e
attribué
à
des
1
1
1

---

105
molt§culCG (je
MDJl.p2'
9itll~es ilLI vol$inagr~ des Ilair'es (A-'I') mais lion inte:'-
calées puisqu<:: nous avons vu précéd~mment que l.q fluo;'escence du MDflP2+ 2~t
totalement éLeinte ~u voisinage des paires de b.qses (G-C).
c)
polyd(A-T)-polyd(A-T)
Ici
aLl~~i, le d~clin lie fluorescence du MDAI,2+ ne pcut plU5 ôtre
ajusté avec un seul
temps de vie mais avec au moins deux
temps:
un temps
court de l'or'dre de 3,20 ns , un temps long de 9,90 n5.
P/D
11(ns)
[MOAP2+] = ~,91 10-6 (M)
3, ,'20
9,85
~(j
1,07
0,006
[POlyd(h-T)-polydlh-T)]-l ,il'l 10-3 (M)
TABLEAU II .C :
Analyse
du
décUn
ne
fluoresccncl~ du I-mflP2+ com;:.l·~xé avec le polyd(A-T)-
polyd(A-T) dans le tampon cacodylate 10 mM à [JH 7 et à 20°C.
1
d)
poly(dA)-poly(dT)
Nous
retrouvons
ic i
aussi.
le
même
type de
déclin que nous avons
1
déjà observé en présence du polyc!(A-T)-pr)lyd(A-T), à -",avait' Url déc:lin
pou-
vant
être
ajust8"
avec
deux
temps
de
vie
de
11,65 ns cor~'espondant à
des
molécules dc
t1DAp2+
en
interaetion avee
les
bases
mais non intel'e;:,lées
et
1
9,90 ns correspondant au MDAp2+ rixé de façon électrostatique externe.
1
plO
Tl (ns)
1
108
4,05
51
9.90
119
1,10" 0,26
1
[poly(dA)-P01Y(dT)] = 2,11
10-3 (~~
___
1
'1'!dII,EÂU Tl. Il
Analyse du déclin de fluor'escence du HDAp2+ en présence du poly(dA)-poly(dT)
d;:,ns le tampon cacodylate
10 mM 8 pH 7 et à 20°C.
1
1
1

---

106
L.e_'3
.. ésult[lts
de
f'l1..lOrescr:n;::e si,aUqUfè et
dynamique montrent
que
la fllJore~'~',';nce du t'--1DAp2" 8~)t él~einte par- le::; acicies rl1lcléiques. Celtr: inhi-
bition de la flu,wescencc !;st totale au voi~,in,l.ge d~s pDir-es de bas~s (G-C).
Au vOÎ:Jinage
Ijes pëlires
de base::.~ {I-'j' l'inhi~ition de la flu0rescence n'est
pas totale mais tr-ès impor-tante puisqu' '~n fluorC;SC0ncc st,l.tique la fluores-
cè:1ce résiduelle l?sl
inrérieur'G à
% cie la flwlT'escence initiale.
Beaucoup
de lig:::tnds qul
i1lter'agissent avec 1'0'3 <lcide" Ilu,~léiques vl)ient leur [luores--
cence éteinte au
voisin;,g/)
des paires
(C-C)
; c 'Cé;t le
cas
d'?
la 9-amino-
aCr'jjine, de la proflavil1,:> (je la 3-aminD;"c~'idine. D'aut.res eomml~ llacridi'ne
ol'3ng8,
le bromure d'2thidium,
011 le 3-diméthylamincacridine ont leur fluo-
rescen,?c
exaltée ou
T'8stent
insensibl\\~s quel
que
",oit le sit8 de ftxation.
Seul le cation lG-méLhylacr'iliiniulll voit ::';0. fluorescence pratiquement éteinte
quel que soit le site de
fixation.
Le MDAp2'
se comporte donc comme ce dér-
nier colorant et peut donc êtr~ plucé d0ns la classe III de la cl~ssificati­
<Jn des intercalants propo.sE'ie p<1,r KUBùTA
(9).
t
Conclusion
1
En
prosGnr;e
du
polyd(C-C)-polydCG-C).
lé]
t'luoresC:8nce
dl.!
t-1DAP2+
est
totalement éteinte. L'analyse du déclin de
fluorcscence donne un
temps
1
dc
l,'ordre de ? ,90 ns qui
peut être nttriblJE'; au MDAP2+ ftxé dc façon élec-
trostatique avp.c les phosphates.
1
En
pr'ésc;nce
des
alJtres
polYnucl~otides el de l' JI.DN (le
thymus
de
1
"eau, l'analyse \\ju déclin dG .t'luor8scence montr-e l'existence d'au moins deux
Lemps
1
-
un
temps
long
(entre 8,80 ns el 9,9 n~',) dont lél \\:alcur moyenne
se rapproche du temp.s trouvé s-n prés'Jnc:e du polyd(G-C)-polyd(G-C'J.
Ce temps
1
peut alol':3 être Cltlribué aux molécules d8 i-1DAp2+ qui
intèl'agissent a"ee les
phosphA.tos
1
un
temps
cour' t
qui
V ,lT i 8
en tre
3.20
ns
détriS
le
1
[Jolyd(A-1')-polyd(A-T) el 4,65 ns dans le poly(d.l\\)-poly(dT). Ce temps de \\'ic
correspond
2
des
molécule3
rixées
,je
raçon 12}: l;er'ne ma is
qui
interagissent
r
avec le~ baseH A-T.
1
1

---

107
IV. DENli')'URflTlON THERMIQUE DES ACIDES NUCLEIQUES EN PR~SENCE DU MDAp2+
La dén<lturation
ther'mique des acides nucléiques en présence ou
en
l'élbsence du ~mll.p2+ 3. été ::;u1v1e en meSUl'ant l'allso;,bance [jans l'ultravLolet
11 260 !lm,
ctolnéJine
,j'2bs01'ption des
1)8585 cL
du MD[\\p2+.
rr!8is ;:lussi à 1118 nrn
où seul 18 colornnt libre ou complexé absorbe.
Nous <lvons
également
déterminé
les
courbes de
rusion
en
suivant
uniquement 1" v<;riation de la fluo;csccnce du chr'omophor'€
cOlllplexé avec les
acides nucléiques. Au CQUt'S de la montée en L8mpérature,
l'émission du colo-
rant
est
suivie à
la
fois à
la
10l1gueur d'onde
de son
maximum
d'émission
(~23 nm)
mais
<lU.'351
à plus grande longeur d'onde
(1.J5ü
nm).
Les
dsultats
obtenus h ces deux langueurs ct 'onde sant tous identiques.
1. lJénaturation d~s acides nucléiques sui 'lie en allsarption
La dénaturation des acides nucléi~ues est réalisée dans le tampon
l
cacodylate
10
mM.
A cette
concentration
en
tampon,
la
fusion
des
acides
nucl~iques s'effectue LiV<lnt 10(1 Oc Sililf pour le [Jolyd(G~C)-po.lyd(G-r:) (jui a
1
une
tempél'ature
dc
demi-dissociation
très
éJevée
(T
;;;
95°Cl.
Le
tableau
ci-dessous donne les valeur's des
températures de demi-dissociation (Tm) des
1
différents acides nuclélQucs que nOllS élvons utilisés,
1
1
ADN (je thymus do veau
1,00 1O-JI
68
poly(dA)-poly(dT)
1,0910- 11
50
polyd(A-T)-polyd(A-T)
1,10 10- 11
~2 ,5
1
poly(rA)-poly(dT)
1,05 10- 4
47.5
poly(dG)-poly(dC)
1,57 10- 4
'{6
pol yd (G- C) - poL_Y_d_(_G_-C__
) _ _~_'"_'_0_-_U
<_9_5_ _
i
TABLEAU Il ,1
:
1
Tempéri1ture de demi-dis50ciation des acides nucléiques en double brin déter-
rnirlée
en
SUiV~lOt l'absol",JanC8 à 2~0 nm dans le tampon caco(:iylate 10 mM à
1
pH '1.
Ces résultats sont directement c0mpat'ahles à ceux obtenus \\~n fluo~'es­
cence dans le même
tampon et aux mJmes concentr'ations en acides nucléiques.
1
1
1

---

IOR
ro1yd(A-T)-polyd(A-Tj
La
t0mpéf.atul'C
de
dc<nj-dissociation
du
polyd(A-T}-polyd(fI-T!
en
présence
du nlJf,p;;l+ mesurée
à Ill?, !lm (zone :J','lbsorption du ligand) est plu:'>
élevé~~ d'environ 5~c que celle déterminée en ~,Ui',i:mt .1 'absorbancc à 260 !lm.
Cette difrér"'ence de
températ1lre peut-être aLtribuée à une fixation du c010-
t'ant sur les sim[11~3 brins au COUl'S de la déndturation de la double hélice.
Cepencla:lt,
pour
un
rapport
PID
=.
8.3.
qui
corrç~rond ~ une molécule de
MDAp2 t
pour qlJiltre paires de ba0€,
clone pr'oche de
1-1. valeur de n déter'minée
p<Jr
l'équation de MC' Gheoc 8t
Von Hippel
(j
.:
n
< 3.5 paires de bases) la
température de demi-dissociation en pr'atiqucment la même lorsque l'on suit
l'absorb~nce à 260 !lm ou à ~18 nm.
L'augmenl..iltion du Tm dd polyd(A-T)-polyd(A-Tl est nette
lorsque
la
concentration en t'1DAp2+
augmente.
Cette augmentation du 'l'Ill corresporl,j à une
sr.abilisatlon
de
la
doubl<2
hélice.
Le
tableau
II.J
J'ésume
les
résultats
obtenLl5 dans
le
tampon cacodylate
mM 8. pH
'! en suivant 1.) variation de
l'absorr~ance du polynuc14otid.:ô' seul à 260 nm,
du
complexe
polynucléolide-
ligand El 260 nm et à ~18 nm. L'a concentr'ati':m en
po.lyd(A-T)-polyd(A-T) est
constante et égale à 2,50 10-~-!M en phosphates.
--
lMDAp2+- J ( M)
PlO
Tm ( 0 C)
Tm (OC)
( "60 nm)
I1nS nm)
0
25.3
3,0 10-6
83,3
?~
- ,
?3.5
1
7,5 10-6
33, 3
30
37.1
1 ,5 10-5
16,7
38
112,G
3,0 10-5
3,3
!J6
117. 'r
-~------
- - - -
1
TABLEAU I1.J
TempéraLure de demi-dLssociation du polydC.:;-T)-polyd(A-Tl
en fonction de la
concentl'ati'Jn en MDAP2+ dan~~ le tampon <'Flcodylflte 1 m1'13. pH 'r. La concentr'a-
tion initiale '~n pOlyd(1\\-T)-polYd(I\\-T) est de 2,50 1O-~ en phos;:Jrlates.
1
--10
1
1

---

109
2.
Fluort'.'3éenC8
l.a
f1Uot'8éic'?rlCe
du
MD/\\P2+
déc)'oit
linéair'ement
8v,?c
la
tempéra-
ture.
Cette d,~croissance du r'endE'ment quanL\\(~u'? de fluor'escence '?n fOnction
d'? la tempér"élture est attribuée à une ::',llgmentation de l2 -::on.'3tantl: de désac~
tivatîon non r,qdiaLiv'?
l.a dénélturation
th'::t'mique des
c:omp18x8:'i
acides
nu-,
déiques
MDflP2+
peut
d0n'~ être suivie en mesu)'dnl la fluorescence du
MD~"p2+ Jibl'e au fUI' et à 'lleSLH'e que celul-ci se dissocie de l'acicle nuc102i-
que.
l.a longueur d'onde d'exL;ltation des solutions contenant les acides
nucléiques et le l'm.~p2+ est toujours un point iso'D8stique déterminé sur les
S])U~tl'e" d'absorption de façon à Ct' que l 'CIl puisse négligcr la varintion de:
l'absO)'b,'>nce du ligand
au VJW'S cje la rjénaturatton.
Ln dis[Josition en T du
spectr'ofluodmètre permet une acquisition simultanée d-:- l ' intensit2 dc fluo-
1'eSCenCI2 ;'J
plusir;urs longueurs
d'onde
(i.J23
nm et
1J50 nm). La courbe r'epré-
sentant la variation rje l ' intensit,~ rie flwwescence t'n fonction de la tempé-
rature est directement aCQuLse SUl' UW? disquctt.: et des progr'ammes de trai-
tement
per~ttent de dé-ri'/er
cette
courbe:
pOUl'
ootcnir'
la
t'?mpérature
de
demi-di5S0c.:iéltion.
IJes
Tm obtenus 50it en suiVant la fÎuorescence ~ ~23 nm
soi t 8 )150 nm son t
i [1en t iqu8S.
a)
poly(dI1)-~oly(rjT)
1
tél
figur'e
11.10
repr~sente les courb8S de
fl1sior]
du
poly(dA)-
polY(lJT) pour plusieur's con[)onLréJtjc)n >?n 1'1Df\\.p2+ d.Jns le tamplJn cacodylate 10
1
ml"! à pH ?' On constate que la to:mpérilture <Je demi-dissociation augmente i'.vec
la ClJn,~entr'atLon en MD~.p2+ : cp.tte aUB"rlIentation
d'environ 11°C ,] sa.turation
1
d'?s sites de fixatioll
est
tl'è.'S importante eL
démontre que
la
fixation
du
HDAP2+
sl;abilis.:' 1(1
struC'tlil'e
du
poly(dA)-poly(dTL
Le
tabl;::au
ci-dessous
1
donrlA le5 r'~Sllltats 'Jbterlus à pélt'tif' da~5 courbes de la figl11'e Ll.IO.
1
1
1
1

---

[·'igur0 II.l0ft.
: [;ourbes
d()
rj.]rwLural~ion
tlWI'miquE:-
du poly(rjl\\)-poly(dT)
(1,0
x 10- 11 M) ~rl !Jf'Jscnco du MDAP2+ dans l~ t~nlp0rl ()f1codylatc 10
1II1·1.?!
pli
'/.
La
longuolJl'
c1'ond<)
d'exciL:.at.ion
(382
nrn)
8~;t un point isobes-
l.iQue,
'2 1; l'émj'isil)n est l'ct'lJeill li-; à 1123 !lm en foncLion (~e 1:1 tpmpéral.ur·'.?
l,a
COtlcc:rlt.r'.'II:[r)fl
en
MDAp2<
8St
dc
:i)
1,[JI]
10-7
11
;
b)
.3,67
10-'[
l'~ ; 'è)
1,73 10- 1) H <.;t d)
1,90 10- 5 I-L
abc
d
10 r-~~~~~~"----r-r~--~--~I
•
lM 1\\
v
c
•v•
\\1 1
1
1
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1
•,o
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1 \\11,
\\
Il
1\\
5
l'III . 1
, l,
l '
•
c
•
liill 1
c
L~_~d...))LI-...l.\\,jL-\\-,-,-I-::,:,,.......-'\\.~~
o
_ _~ 1
40
60
80
FigW'8 L~IOB : Courbes dél'ivées de cf'lle.s de 111 figure 11.10J~ ct. p0rmf'LlanL
de d<'it.:'èl'miner la temp6riHul'c de dcmi-dhsociélLion.

---

11 1
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..;.,:.. ..... - · / 1
1
20
50
80
FigUI'8 Il.11/1: COlll'lles
d..
j6l1rJturél,tiotl
th~'r:nique de::;
comp.Jexes
polyd(,\\-'j'l-
- -
po.LyrJU,-T)-f1DAP 2 -t dans:i-c Lam;:lon célcorlyléLe
10 m~1.3 pH ','. Ce.:;
COlll'L>8:, repl'<?3ent~nt l'émission de flu::JrcscŒtlce riu liga:ld en fr:Jt1ct~0n rte 1<1
t,:,mt'ér8[;IJre.
Lil
concentrélt':on
en polyd(fl-T)-polyd(A-T) est c:)tlstar.Le el de
10- 1 ,'1 en
jlll')SP[Fit~S. La C:lneentl'C1\\.i.nll efl i1DAP2+ est r'~.3p("ctiv':ôlrJel:l de a:
l.j,n
10-"( 1'1
; b
;
8,36
10-'( 1'1
; c
:
2,15
10- 6 M ;
d
: 11,3610- 6 1'1 Pt. e
:
13,00 10- Ô 1'1.
abc d
e
10
~
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0
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u
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c
~
-
(B)
c
- - - - -
20
50
BO T(" C)
1
1
Fi.gure.~~
1
1

---

1 12
[MIJ/'tP2+ ]
U1)
PlO
T ( .le)
m
(4;~3 nm)
5C
1 ,8 1
10-7
)
5 :12
53,8
8,67 10- '7
116, 3
511 , ~
--
1 ,Tl 1û- 6
58,3
55,8
1 • 9() 10-5
5.3
61 ,3
TABLEAU II .K
Tempel'atur'e
de;!
demi-dissociation
du
poly( dfl.)~poly( dT j
(1,008
10-l!
t-j)
en
présence
du
MDAp2+
dans
le
tampon
c8codylate
10
rnM.
Le
Tm
du
poly( dA) -pOly( dT)
seul Çj
été
déterminé en su i van L l'absorbance de
la
salu-
tion à 260 nm.
Le Tm des complexes est déterminé en suivant la f1 'clOrescencl;
du MDfI.p2+,
soi L à 423 nm, soi t à 450 nm.
b)
pOlyd(A-T)-polyd(A-T)
Le tableau Il.L résume les Va18U)'S des tetllpératur'~s de demi-di.3so-
ciation
du
polyd(J\\-T)-polyd(A-T>
complexé avec
le
~1DIW2+. Au voisi:lage dl)
rapport
PiD
=
6 C3 paires di': b8ses) l'augmentation du Tm est plus
grande
que celle obser'vée ilvec le poly(d{I.)-poly(dT).
Lfè polyd(A-T)-polyd(A-T)
pas-
sGde une structure qui
favorise l ' .Lnter'calation 1.!1.:3 colOI',n,ts pm' rapport à
la structure du poly(d/l)-poly(dT)
(10-1 11,
18-19).
La
stabilisation
de
la
structure
du
poly(dA)-poly(dT)
peut-être
1
due
~~.ê.sentiellement à la diminution de la répuli:.ion de3 charges n;§"gatives
ceux-ci
sont
en
interaction
avec
le.':>
1
des
phosphates
10l'sqLJe
chal'ges
posi-
ti ves
du
~1DAp2'+. Lc;s
figures
11
représentent.
les
Courb~s de
fusion
du
polj'd(.4-'f)-polYd(.4~T) complex[~ ;,.!u MD ...;p2 1 ]ül'sque l'L,n suit la flUOf'8sce.nc'2
1
du ligand en
fonction d~ la température.
1
1
1
1

---

i IJ
"TABLEAU Il.L
Températur,~ de demi-dissociation du j)oIyd(A-'[')-poI::/dr:A-T)
I~ 10-!.j M) Cri
présence du MDAp2+ dans le tampon ca00dy1at8 10 mM à pH '( en suivant l'émU;-
sion de
fluorescence du MD{l.p2'
à !.j23 nm.
Le lm du polynu,~léotidc sC\\ll est
déterminé par abs1wpt ion.
CI
p,)lyd(G-C)-polyd(G-C)
.... u
début
.ie
ce
chélpitre,
nous
'.l'IDriS
vu
que
la
fluore5cence
du
MDAP2+ est
totalement éteinte en pl"ésence du polyd(G-C)-pç.lyd(G-C).
D'autre
part, ln températur~ de fusion du rolyd(G-C)-polyd(G-C) dans le tampon caco-
dylate 10 mM est t.rès élcv<ic,
de sorte que les l'ésultats obtenus en pr'ésence
du
MDPJl,2+ restent très qualitë.tifs.
Néanmoins ces résultats mettent claire-
ment en évidence une stabiliséJtion de la structure du polyd(G-C)-polyd(G-C).
Le tableau ci-dessous don:l,," quelque", valeurs ,ilJ Tm ciu polyd!G-:~)-polYd(G-C)
(~ 10-'1 11) ,=n prése:lCc du MDAP2', toujClJ~'S dans le t2.m~,ün cacodylate 10 mM.
1
1
1

---

10
il
/
~
"
0
!
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c
1;1
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\\
c
1/ (1\\)
\\
•
,
-
\\
C
-,;//
\\,
0
,
'.,
20
60
100T(oC)
Figure II. 12 : Cour'be de dénaturation thermique du comp18xe !\\DN ct,;; thymus de
v['~u-MDAp2+ dans
le
tampon
cacodylate
1(.
mM
à
pH
7.
La
cOrlcentr'at.ion en ADN est (j<;; 9,81
10-5 M en phosphates et celle du MDAp2+ est
de 9,33
10- 7 M.
La cour'be
(ai
repl'ésente l'émission du ligand suivie à Ij23
rHll en fonction de la température ·et la cOurbe (b) est la dérivt'e première de
la courbe (a).

---

1 1.')
---~--~---------
1'/ D
Tm (0 C)
(423 nm)
-
95°C
2,39 10-7
450
97
3,00 1a- 1
360
98,4
9,80 10-6
10,3
> 100
1 ,97 10<;
5,1
)
100
,-----
TABLE/lU 11 .M
T;;:mpérature de fusion du polyd(r;-C)-polyd(G-C) dan:s
le tampon cé-ICC)(lylate 10
mH en
pl'ése:v~e de t1DAp2+. Le Tm du polynucléotide seul a été déterminé par
absorption.
tl)
ADN de tl1Ymus de veé-lu
La
figul"e
II.12
f'eprésente
h~s
C'ourbes
de
fusion
de
l'ADN
de
thymus de.eau en présence de 9,33 10- 7 M
en 1'1Dflp2+ dan:; l~ tampon cacody-
late
10 mM.
L'émission
de
fluorescence du composé
est
mesuré à
423
nm
et
l'excita.tion est un point iso\\)estique déterminé en élbs01'ption. Sur la cOUl'be
(a) qui repr'ésente la fuO'>ion de l'ADN, non seulement la transition s'effec-
tue
SUl'
un domaine de
température
trÈ'3 grand,
mais on observe
alJssi
plu-
sieurs
transitions.
Le
r,:':lbleau
ci-dessous r'assemble
les valeur's
de3
diffé-
rents Tm d·"" l'ADN complexé ilvec le t-1DAp2+. La concentl'ation en ADN est cons-
tante et éga18 1 9,81
10-5 en phosphate.
La
déIlélturaL~on
thermique
de
l'ADN
de
thymus
d8
,'eau
(.'12 'j,
G-C)
sl;ivie
en
absol'ption
fait
apparait:'e
une
seu.le
transition.
La
largl?ur
d,,"
cetle
tr8nsiti,)n
(Cn'/iron
15°C)
est
tr8.'O, i}l'aneje Gl)mparée z.. celle
observÉI2
sur les':;Oùrbes (je fusion
dC's polynuf'léotides (de 2 à 5 OC).
La température
de
fusion
Tm
est
sensitJle
à
ta
composition
en
base
d'un
élcide
nucl.!iique
donné.
Les fluctuûtions en pourcent3ge de paires
de
ba~,e.'O, (G-C;
le
lOng de
la. molécule
induisent rJ'?s
vaJ'iations
locale.')
du Tm'
Il
s'ensuit que la fu-
1
1
1

---

11(,
sion ,je }'f\\\\)N n'obéit pas ,l:!
un modèlc ~imple dc deux ét.2.l.9 'iiscr'ets (joublE:
brin-simple brin.
La fusio:1
se produit.
de
façon
pl'ogressive des
régions
à
faible
teneur'
en
(G-C)
ver's
les
zones
(je
t.eneur
croissant.e
en
paires
de
bases
(G-C),
Erl incorpOt'dnt. des
hOr.]l)logues dc bnses qui
possèdent un
DOu-
voir
d'cmpil~,menl; Dlus
faible
(lue
1<1
pair.el~G-C),
dans
un !lDN,
Reich E,
~t
collaborat.eur's ont montré que 1'0:1 pouvait. met.t.re en é,'idence par absorption
deux transitions dans l 'f\\DtJ où l'on a ... emplacé les paires de bases (G-C) pa"
les paires (I-Cl
(22).
(MDAP2+]
(H)
I~
~-
68
10-7
1 ,98
~98
76,3
82,2
Be
,
2,3': 10-7
~ 1 ~
{(9 , 1
3J,5
87,7
1
5,13 10- 7
19 1
79,9
85,5
90,3
9,33 10-7
105
80,B
87,3
92,5
3, '15 10-6
1
26
82,7
8B
<.j 11 ,5
L
1
TABLEAU II .N
Température
de
demi-dissociation
de
11 ADN
de
t.tlymus
de
veau
(~2 % G-C)
1
complexé avec le MDAp2+ dans le tampon cacodylate 10 mM. La concentration en
ADN est de 9,81
10-5 M en phosphat.es,
Le Tm de
l'ADN seul a
été déterminé
par absorption.
1
1
L'existence des fluctuations en pouroent.age de paires de bases G-C
est. ainsi mis en évidence sur les courbes de dénaturat.ion t.hermique de l'ADN
d,:
thyml,s
de
ve:w en pr,§scr:cc du M[)!\\p2 1 •
Lél
t'lllorescence qui
es!; beaucoup
1
plus sensible que
l'absorption
permet
de
rjuiv/'e
les
variations
locales
de
l'envir'onn€.7Ient
du chromophore lié II l'ADN. Ainsi on peut suivre ir-tdirecte-
1
ment les fluctua.tions loc;J,l,~s dE- ID composit.ion en paires de bases
(fI-T) de
l'f\\DN <JyanL
fixé.te
chronlop!lcwe.Sul·
l<'l
figure
11.12,
Iii
cour't,,=
(a)
montre
1
1
1
1

---

\\17
plusieurs points de tran31tion qUi peuvent refléter la distribution statis-
tique du pourcentage de paires de bas;;
(G-C)
le
long de
l'ftDN,
tandis
que
Sllr les
figur~s II.lüA tô't
II.11
un,," seule t.ransition est observée en pré-
sence des polynucléotides èn double brin.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

J 1S
v. DII=HROISI-1E LI1H~ATRE DES Cül'lPLEXES ACIDES NUCLEIQUES - MOAp2+ ET 81S-
DAP~+
Le dicrH'oïsme linéaire est défini ;:'<:11' la relation suivante
(3)
c;,i;
A Il r'ep:'és'2nte l'absorbance de la salut i'ln pOUl' une lumièr'e pola-
l'isée
pa1'allèl~m'2nt au
C!;é'lmp
de
la
t'oree
d'orientation
(ohamp
~lectr'ique, champ llydrodynamique).
Al
représr::nt>= l'ahsorbance de
la solution pOUt' une lumi81'2 pola-
risée perpendiculalr'emcnt au champ d'orientation.
Le dichroïs:ne linéaire réduit M.lfI. 0) est 1<2 dichroIsme linéair'e
ra[Jport~ à l 'Oik30rbance totale d2 la solution pour chaque longueur d'onde.
Le
dichroïsme
liné"air<2
de5
complexes
du
MllAp2 t
et
du
tJis-DAP4+
avec les a.cià'Os nucléiques (~st néga~if dans les bandes d'absorption des deux
compo;Jés (300 nm-"i50 nrn). Il en est de même d8.ns le domaine d'absorption des
baSéS nucléir.jues (26D nm).
Le
rooment
de
tl'dllSi tion
en
absorption
à
260
nm
d,oS
bases
nucléiques es~ contenu dans
Je plem des
bases.
NOIJS
avons
vu
p:'~cédemment
(chapitre
1)
que
les
deux !1loments
de
transitiOn en
absorption
C33 JI nm et
in 7,5 nrn) du HOI'lp2+ sont également dans Je plan de la molécule et perpendi-
culJires
l'une
à l'autr<2.
On
doit
donc
s'attendr'e
à ce que
1<2
3igne
du
dichroISln2
linéaire
des
complexes
avec
l'ADN
soit
le
même
que
celui
de
l'ADN tout seul dans l'hypot,\\"'Ièse où l'on postule une intercalation du noyau
aroma t iq ue des li gan ds
entre le3 pa ires de bases.
L' .'1ppliciJ.t ion
d' U:1
champ
d'or ientat ion
(or ientat ion
pal'
écoule-
ment,
orientation
par un champ él'?~trique), a pour effet d',wienter' l'axe
de L'lléli<:~e de l'acide nucléique parallèlement au cllamp. Il s'e;lsuit que le
plan
de
ba8es
et
(j,os
colorants
interc2té~, devient
perpendicu,laire
a
ce
cl,amp.
Si
l'on choisit
des condltlons où toutes les molécules de MDAp2+ ou
du bis-DApllt sont fixées sur les aoide::; nucléiguf<!3,
la mesure du
diçhroïsme
linéaire réduit per'met aloJ'0 d'estimel' l'angle que fait
le moment de transi-
1

---

119
tion
.:::n
,]050('1'1;10.'1
de
ch:~que t('''lr;~J.i tion ove0 l'axe pr'incipal de la dOllble
hélice.
Dans le
cas du MDAp2+ où
l,ô.'3
deux moment.') de
transition I?n élbso('p-
tlan contenus dans
le
plan
de
lél
molécule
sont
ps,rpcon.1iC:1llaires .l'une
péH'
f'é1PPOl't
à l'autr'e,
la
détel'Inination
d;::
l'angle
qui
fait
chaque
transition
ClyeC
l'axe
de
1<1 double
hESllce,
dolt
pe('mettl'~~ une
e:~UmatiQn de l'élngle
moyen qUE: fait le pléJn de la molécule aYGc; la double J1élice.
(cos 2 8 - 1; f
(E)
( 'I )
A
2
Lc
degré
(j'ori8ntation
(les
moléculË"s dépend
du
facteur'
f(E)
qui
lui
aU.'3si
dépend
de 1" nature
et
de
l'intensité
de la
force
d'orientation
(23-29).
D,-ms
les
même.'3
conditions
de
trélvail,
on
s'arrréinl~hit du facteul'
[(El
en comparant 1ir'ectemcnt l,: dichroïsme linéaire réduit
rnC'.sUl'É dans les
bandes d'absof'ption :.lu chromophore J celui mesuré dans le tlomairw ct 'absorp-
tion des base~ nucléiques (30).
Si
on élccepte
que
l'angle Cl;
entre le 111an des bases et l'a,xe
de
l'hélice e.'!t peu différent d.o 90° alOI'S
hA/A (1) col,)r'a/lt
A'
---~---------------
!;.A/A (260 mil) ADN
3 cos 2 11 - 1
3 cos 2 e - 1
3 cos 2 (90) - l,
1 - 3 oos2 e
(5 )
Le r<1pport du dichroTsme linéaire
réduit
au
maximum
,j'absorption
des complexes
(~2[ nm et 337 nm) par' rappar't à e01ui de l'ADN ÈJ 260 nm per'-
met
alors
une
estiméltion de
l'angle
O.
L'équation
(5)
montre que pour
une
transi tian donné8 du oIIrOmophcr~), la val ('ur' d,ô A' doi t être constante.
La figur0 11.13 repl'ésente le é.ipeetre d'absorptLon du complexe ADN
de
thymus (j(~ veau MDAp2+ lA), du spectre de dichJ'oïsrne linéaire du complexe
(8) et du specl-r'e de cjlr:rJrolsme linéaire ré,juiL de complexe (C).
,,

---

120
,
•
..,
"0
"
",
.
•
,
",
figur'C' II.!]: Spectr'cs d'absorption
(A),
du
dichroIsm·.:
lin~.qirc (0) et uu
1
dichroIsme lin<5,lirc réduit
(C)
du complexe I~Dii (j ..
Lhymu:J
de
V(~~U
11
(],70 10-
M) ct Liu MDAI'2~ (2,0 10-5 M) dan~ le tampoll cacull;iate 1 mM,
rial:l
1 mM, EDTA (1,2 m~l ~ p}1 'l et à 20~C. SUI' la flgur'e II.13 (B) la Cour'llS 1
[
cOI'I','sjJond
à l'ADN seul,
la. courbe 2 au complexe.
L"l courbe]
est la même
que
la cour\\lO 2 mais avec
urie
6ehelle agrandie
Cà droite). StJr la fIgure
Il.1] (C), la cO\\Jr'be avec 18s !'ollds claIrs correSpOlllj au I"appor't P/D ~ 95 et
c\\:11c avec le;, rond" noi.J'~ à un p/D ,. 18,5. L'orienL]tion dû.') 1',lOlé';IJlc.'l Qst
1
due h lm l'lliIllli-J Il.Y(Jr'odYllamlquc dalu une cellllle de Couetto:'.

---

12 1
Dans
la ;:œ1c; d'absot'pl-ion des b;,s(~s
(220-300 nm),
le di(~hr0îsme
linËiair'e
t'éduit
augmente
en
fonction
d8
1·.
<:'oncentration en
t1DAp2-1-.
l:ett8
augm'?ntaUon dl; dichrolsm8 linéaire est ObSI?l'vée sur tous les acides llucl8i-
ques
en
pr.Jsen('e
du IWf,p2<
ai,lsi
que
d') bis-DAp 11+.
L'':J~0r'oissement du
di-
chroîsme
linéaire des acide:s nucJéiqUi?3 dans lél bandc d'absorption des bases
peut
êtl'e
8Ltribué
fi
Lme
meilleure
orientation
de
l'axe
de
l'hélice
à la
suitp de
la fixAtion du
ligand.
[,a
fixation
,iu
lig;:U1d augmente
la rigi(l,lt~
du dUplf:x
qui
s',)riente
éllm's plus
facilement
suivant
le d1ilmp
hydrodyrla-
mique.
(a)
--,
~------
,..
[MD!\\p2+J
( M)
PlO
61\\1 fI
t,AI l.
MIA
A'
(260 nml
I3liO Tlm)
(~26 nml
0 110 )lm)
( 1126 nml
- - - - - -
3,90 10-('
95
- 2,07
1 r:"
,0,
, ,85
0,76
0,89
7,90 10- 6
47
- 2,03
1,70
- , ,83
0,84
0,90
2,00 Hr S
18 , S
- 2,25
-
:2 • lj JI
- 2,15
1,08
0,96
3,~0 Î 1)-5
9,5
- ::' ,59
- ;: , 1j!j
- 2,28
0,9 11
0,88
, 7,90 11)-6 1
47
, ,68
- l,59
- 1,5S
0,95
0.92
1
-----l
( b 1
bis-DAp!j+
( M)
PlO
MI A
M/A
M/A
1
( 2GO nlll)
( 311 0 nm)
( lj26 nm'
.'
A'
(3110 nml
( lj 26 nm)
1
3,08 10-6
100
J,77
- 1 ,62
-
1 ,88
0, ~3
0,50
6,1 6 l(l-6
50
- 4,23
- 1,69
- 1 ,89
0,40
0, ~5
, ,54 10- 5
20
-
~, 38
- 1 ,7 11
- 2,00
0, lia
O. "6
TABLEAU 11.0
Dicl,f'oIsme linéCJlr'e récluit d28 c:Jmplexes
ADt~ de thymus d(~ v'.:.1U
(~2 % G-C) avec
l~ I1Dflp2+ et:. le bis-DAPlj+. L8 ccnceJltrat~on en ADN est:. de 3,70 10- il J-1 en pré-
3'JnCC du MDAP2+
(a)
el, d~ 3,08 10-~ M avec 1.:: bis-DAPlj+. Tous 10S complexes sont
préparr5s
dans
le
tampon
cacùdylate
1 mM,
NaGl
t
mM,
EDTA
0,2
mt-1
3 pH
7
et
à
20 D C.
Dan:", l~ tablenu II.O (a;, à la ligne comportant un astérisqu~, le complexe
aV~e le t,mAr;~+ est réa l isé <ians l~ tampon cacodylate Î mM, NaCl 10 mM, EDTA 0,.2
<nM afin de détr2rminer l ' inflUenc<ë' rJe la concenLration en sel.

---

123
Vl.
DETl'HSlüN DL'; L'ADN SLJln:NIiOULI~ DU pElI;j22 PAil LE MDM,2' ~T LE 151S-D!\\p!I+
L,)
LopolsomO::r'il~~';
l
catalysf:'
1:1
coupur'~
et
la
fer'meture
de l ' fiON
;;1H'enroul.é
sùit positivement saiL
négativeIn8l1L.
(lu
COUl'5
Je
ceL acte
Célt'J-
lytique, elle génè..-e une famille de topoisomèr-es Qui différent
les uns des
autres par leur
nomb~e de super tours (31-35).
Les
colorants
qui
s'interca1cnt
dans
la
double
hélice
de
l'fiON,
rr'O\\'oQuent
un
allongement
du
pas de
l 'nélice et
une ct iminuLion de l'angle
<jcs
paires
de
bases
<36-39).
Pout'
un
ADN circulaire
suren,'oulé
cette
uétorsiùn (je:,
paires df~ bases provoque une diminuti.on du l~allx de surenrou-
lcment Qui peut-être visualisée sur un gel d'électl'ophorèse.
L(~s figures 11.111,15 et Hj représentent des gels (j'électrophorèse
Q deux dimensions
de
l'i\\orj du
pléi3mide pBR322 en pl'ésetlC8 dl1 MDAp2-',
L'!\\Drj
du plasmide pBH3?2 est trùi té une heure à 37 Oc avec la topoisomérase l pour
relaxer le nombre dc supertours négatifs. On obtient une solution contenant
une
famille
de
topoi.'K,mères
dont
le
nombre de
supertow'5 négatifs diminue
rar l'apport. ,"lU nomtlre initial de super'tours du PBH322 qui est de -33 (40),
Dans
la
pJ'emière
ct i mens iOll
de
l ' é lectr ophorèse,
les
no lécu les
d'ADN sont s6par'écs en foncti.on de
1'~ur nomhr'e topologique donc en fonction
de la valeur
absolue {tu nombre de
supertours,
Les moléculc:s ayant
un
taux
l
a.bsolu de SUr'enroulement élevé migrent plus vite.
Le sur'enroulement réduit
la taille de
La moléoule d'ADN et
facilite son passage à travers
les par'es
1
du g'21 d'agetl'ose.
Dans la deuxième dimension,
la migration électl'ophor'étique se fait
1
perpendtculairement à
la première.
Le gel est auparavant
incubé pendant 12
Ileures rhns
un Lampon (;ontenant soit le r.fDli p2-l
soit le hls-Dlip4+. La
f'ixa-
tion des ligands sur les molécules d'ADN provoqLJ€
IJne dimin\\ltion
du nombre
1
de supertours.
Les molécules
d'ADN qui possédaIent dans la première dimen-
s ion des 5upertour's positifs verront
leur nombr'e de supertolJ:'s augmenter' et
1
migreront rdl):> vLte.
l.f~S rnolécules '-lui aV31':!llt Lies 5upertours négatifs ver'-
1
l'ont cc nombrc (jiminuer' p.n valeur absolue et migreront
moins vite que
les
précédentes (40).
1
,

---

124
2
•
+
1
+
•
1!_,\\1~, G{;l
d'{;ler:\\.-('ophorè",c
bhlirn;!IlS10I1IJel
df'
l'r,D~i
du
,Il i éL';;lIi,J\\..'
t 1 gur'f
-::-
_
fl~\\Kj?,' (3 II~) en pl'(;.:;en~c dJ ~1f)l\\r.2+ ': l ,72 '{ 1'J- ô 1'1:1 ,Jans 1.'
t,'-!mpon
!lOr,lte 50 ~lt'1 il pH "( ,5 et :'1 la
tempél,,]tw'(, ;<rntlianle.
Les
dJff,~I'CCltJ
l')I)oi301~('I'(:3 du pl,lsmiôe lr2iLf'S par le LOi)ni.'301~61'i1::J'"
l
sont-,
.séparé'; (L'Il;'
Id
prf>mif',re
?lcctr'oph,)rèrw
(du
h<'lI;t
V"W5
le
0;",:'
C'!l
r{)lletl(~n '!II
ll()lnb!'('
?bsolu d,~ leUI'3 :,upert;cJlJr.s jl2lJdf'llt
12 hcur(:s sou:) Ilr10
ten.siol] conO;V111Le lle
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v01\\.')
l'il"
cm.
I.e
ll'll
Cest
Ulsujt,(;
jnCUD:~ pendant 1,~ ~18U)'"'~ dan;; le t:OI'lfl0f'
IJar'at" eonlcn:,nr,
1,72
x
IO-ô il de M)M,+2 Ilt:ndi'lnL U'le nui!.. "1 1 'ollsi,w'it.ii.
1.(1
deuxif;me
miS:''-lLio!l
,~lecLrOr·horétiqu"" \\'''''~''i>d\\d\\;::'l\\''lr'; ~
1:1
I-'r'~.'''lj~r'''::
lOf:
fiJud\\,;;'
,jl'oiV))
83~ r,~8lisée dans le Lampon '~OllLen,l!lt 1.0 M:),~p2' (l,'!?~'
10-[' II,)
reml.'I!JL
lb rte'j:',,"'" i',O..\\" url'::
[,)n"i"n ':;Orl',I;.lnLG <1<' ;:> \\olts pa"
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co)]riil;ion5
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S'JIll',
1n:;
m§mf'3
'~IF,
cellr2:3
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-, cO
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"(
J\\
[,odiN]
::: \\IU
!bi.S-Df\\f)II+ J = ~ , .)
>;
1 ' ,
U
:
ll'dHJJ = ::: IJ1';;
t.li..'o-n{\\I,JII J " JI,] x l(l- b l',

---

1
, '] c
l "" r)
A caus"
donc de cette différence de m'Jbilité électt'ophorétique les
molécul023
d'A.DN
,su:'ènroulé':e::J
soit
positivement
30il;
négativem,'nL
peuvent
être .'.:éparé(;s 1,)rsqu'8.l1,~.'} ont fix,§ un intcr'Céllant. Elles se t'etrouvent dans
LB ~leuxième
dirnel1sic'l1 de chaque
côLé
de
l'ar"c
et
chaque
tach"~ correspond à
une
molécule
ayant
un
nombl'e
de
supel'toU/'S
bien
(jéfini.
Les
molécules
surenroulées
positivement
se
trou'/ent
sur
le
côté
droit
de
l'BI'C
et
les
sur enroulées nég-'ttiv\\-lment sC' tr'ûuvenL:. sur le côté gaLlC~1C.', lorsque la migr.=;.-
tion dans la dtuxi0me 1imol1sion a lieu de la
git'Jche
':el's
la dt'oite
(Figure
II,1li).
l
Lél
figur8
Il.l ~
représente
un
gel
bIdimensionnel
du
plasmide
pBR322 ayant complexé le MDAP",-'t.
Dan~i la pr'emière dimension (dL:. haut vers IG
bas)
les diCférents
topoisorn~rl2s d'un 6chantillon de 5 pg (j'ADN traité par
la topoisomérase
l
sOnt sépi.lrés en
Conction d02 leUr nombre absolu de super-
tOlJl'S.
~co gel est ensuite incubé ,jiH1S un tampon d~~ borate d'ammonium 50 m:'" à
pH 7.5
cont€nant
1,P_
10- 6 M en MDAp2-'- pendant 12 heures.
Dans la ()Duxième
dimension (de gauch-o:' à droite)
les différent.'3
topoisomères qui
ont fixÉ:
le
MDA.p2+
Inigrent
du
c,3té
droit
dco
l',ll'c
pour
les
supcl'l:.ours
positifs
et
du
côté gauche pour les SUDertours né~atifs.
b.
BrOmUI"e ,j'6thjdium (BET)
La
figut'e
11.1:5
repn~s"'nte le
gel
bidimerl:3ionnel
du
plasmiJE:
pBR322
(3,6
IJg)
en
pl'É:s2nce dc
3.7
10- 8 M en bror'Jun': d'éthidium "lui
est un
des intercalants les IllieLlx caractérisés
(37-~O).
Dans
la df'uxième dimcnsic'll.
on obsel've seulem'?nL la partie gauche
cie l'arc ce qui signifie qu'à la tempér'2tur'€
de l'expérience
(20 D C)
l'ér::jui-
libre
thermodynamique n'a
PélS
favorisé
ld
fOl'mation dco mol~cules
ayant
des
51JpE:I'tOUI'S positifs
(~O-~3).
l

---

La
c()ln~lar'cli30n (jes figur~:3 Il, H
el"
Il. 15 démontre cla irement que
si
le bl'omUf'c d'éthi-iium dé;ouJe l.'liUN surerwoulé par
i:1tercalation,
il
est
vraisûmbl.:lblû quo
le
MDAP2+
agit
aussi
comin>')
un
intercdlant.
CûS
résultatS
sont
en
ac~ord avec ceux o:>t;enus
par
dicllioï.':lm,=
linéaire.
Tuus
sont
en
faveur' d'une intercalation du ('-1DAP':::+ dans l'ÙNJ.
Plusieurs agenV, sont aussi connus pOUf' dérouler' l'ADN
surenroulé
comme les f·olvo:mts ol't!;iwiques ou 1:'1 températul'e (~1, ~5). Nous avons vérifié
qu,= d"lnS nos condt ions expéri m'-?n té< les li! détors ion dt) l'ADN ét8. i L uniqllemen t
due à la
fixation
dL~':: ligands. La figure Il.16 (A) représent;e un gcd bidi-
mensionnel de;> 3,0 ).lg de pBR322 en préscncû de 2,50 10- 9 ('-1 en bis-DAPJ.J.
Dans
Ip.s conditions de concentration en coloranL,
la quantité en bis-Dfl.PJ.J+ fixée
n ',:::st pas suffisante pour' provoquer' une pcrt~ de sUper'tours négatifS, alors
tous le3
topoisomèr'e.:; lIlig~'enL de
la même
faç"Jn (jans 1:'1 première (ô!t la deu-
xième dim,:::nsion ût se retrouvent sur la diagonal(, du g'21.
c.
bis-DAPJ.j+
Les
gels
bidimensionnels
de pEiR322
':::n présence du bis-DAp4+ sont
repl'rfsenté~ sur les figLlrûs II.16 CA el; E). Dans !il deuxU~me dimension,
la
1
migratic>n
des
différents
topoLsom.'2res
.ô,a
Lüt
d'une
façon
anor'male.
Cette
migration anormale est causée par :
[
-
l'effet
d'2
crlarge
du colorant
(lJ
chargûs posit.ives)
qui retdi'-
dent toutes les ITDlécules dans ln deuxième dimension,
-
les
photocoupllf'ûS
sur
Url
brin
de
l'ADN:
chaque fois
qu'il
se
produit
une
coupur'e
sur
un
brin,
1'ADN
se
dér'oule
POUl'
donner
une
forme
relaéhée
(ouvel'te ût circlJl:'1ire).
Dans ces conditions tous les I~opoisomères
qui
auront
subi
un
seul
dommage
se
conVerLi~j8ent sous
for' me
relachée
et
migrf;nt
de
la
même
façon
dans
la
deuxi:?lTle
électrophorèse.
Les
produits
de
ces
dornméJges
photocllimiques
sont
si tués
SUI'
une
verticale
(lêlns
la
figur'8
11.16 (BI.
-
la bis-interoalatiorl
:
la
figlJre
11.16 (B)
mO!ltre à la fois la
formation d'un arc,
l'<JffeL des phùtodomm8.ges et l'effet de la ~)is-interea­
lation.
C8tte
bis-intercéJlaLion
pl'ùvoque
une migration anol'male
d'?s diffé--
.... ents topoisomères comme l'indique léJ partie
droite dc~ la figue Il.16 lB).

---

r
128
Le.:. ,'ésultaL3 ~',ont en "ccOl'd avec ceux obtenus en dichl'olsrne li-
né,lire.
Ils
montrent
que:
pOUl'
une
bis-intercalation
ou
Llne
interaction
intercaténai:'e,
lé! fOJ"mation de pontages
imlvn;r~ rj~s c0ntr'2intes à la .'3tr'UC-
l
turc de l'ADN et modifie les propl'iétAs hydrodyna.-ni.'1ues de la molécule.
i
1

---

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---

CHAPITRE III
DÉGRADATION PHOTOCHIMIQUE DES ACIDES NUCLÉIQUES PAR
LE MDAP2+ ET LE Bls-DAPq+ : NUCLÉAS ES ARTIFICIELLES

---

1NTRODUCTlON
Certaines molécules
organiqu~s libres ou complexées à des cations
mc§talliques ont la prorriét~ d' induiJ'8 une dégréldation i,I'2versible du sque-
lett'::
phCSp[lOdiesl:>:::r
,jGS
acides
nucléiques.
D'autres
molécul'os par'
contre
alkylent les bases nucléiques et les l't:'ndent labiles en milieu
êllc"l.lin (1).
Enfin,
certaine.s
m018[èules
SI)I1S
l'Gfft:t
d'un~
radlation
lumin(~U3e se
fixent
dG façon
covalente aux
a,::i,IGs nucléique:s.
Parmi cd les-ci
les fw'o-
coumarin(::s,
les
porphyrines
Gt
des
molécules portant
un
ont
été
ut:ilisées
pOUl'
sensibiliser
1 a
do?l,>r'adation
des
acdes
nuclc2iques
(2-6).
réduc-
teur,
11ydrolyse
la
crlaine
phosphMiester
des
êlcides
nucléiques
(7-9).
La
dégt'adation ,"st beaucoup plu::: efficace .:oUt' le double br'in que sur le simple
br',rl
(10).
C'2tt'.O t'éaction ,1
é1vé utilisée pour faire l'étude ct" 1a st.ructu-
re s,"cond.'lire
des prmw)reur'S
de
l'opéron lactose
(11,12). Si on lie un
oLigonucléotide à cet agent '~himiqIJ'3met-lt. actlvable,
l'crlsemble
se
C0!nporte
alors
comme
U!W
nucléase
élrtifici'dl<:>
pOLl/'
la
cible
compléme(ltair€
de
l 'oligonuclc2otide
('J,
13-15).
"
"

---

133
Le
complexe EO'f.I\\-Fer' possède également en mi li~u n~\\Jtr'e une acti-
vité nucléasique.
Il a été montr·~ que l'EDT!\\ couplé de fa,;,on covalente à un
oligonllcléotide
induisaiL
dps
coupur'es
SU!' Ulle séQIH::nct: complémentélire,
en
pl'6sence 1'un ['éducteur' qui déclenche la l'éJction Chimtqu8 (9,
15).
Les
pOl'phyrines
rerr'iques
dégradent
aussi
Je
squelette
phospho-
diestel'
des aClrJes
nucléiques.
Couplées à des
oligonucléotides,
elles
in-
duisent
des pOrlt2lges S\\J1' les cibles complémentaires.
Le traitement de
ces
pontages en milieu b2lsique co~duit ~ une coupure de la chaîne complémentaire
cible (3,
'5, 1G).
La proflavine ct les po:'phyrines
(non métallées) sont capable.'.3 de
former'
des
Liaisons
covéllentC~l Jvec les u,'lses nucléiques sous
ir:'adÎ<1Lion
lumineuse.
I l
en
est
de
même
de
dérivés
azido
comme
l'azidophellélcyl
ou
l'azidoproflavine.
Lorsque
ces
groupements
photoactifs
sont
attachés
de
façon
covalente à l'extrémité d'un oligolllldéoti,je les réactions de photo-
pontage sont ciblées sur' la séquence comj)lémentail'€
de l 'ollgonucléotide (5,
1 l.J ) •
Dans
ces
différents
types
de
r'éilr.ti.ons,
le
signal
qui
initie
la
~'éaction est de natur'e soit chimique (l'addition d'un réducteur dans le cas
des
complexes orthophénanthroline-r.uivre,
ED'fA-Fe
ou
porphyrine-Fe),
soit
une \\,xcitation lumineuse dans le cnG de la pr'oflavitle ou des porphyrin8s.
Dans ce chapitr~, nous montrons que le MDAp2+ et le bls-DAP~f sous
irr'é1diatlon
lutTiineusl2
(\\
)
300
Ilm)
pr'ovoqu8nt des
coupures
du squelette
phosphodiester'
des acides
nucléiques,
Les
coupures
ont
un
rendement
plus
impol'tant
au
niveau
des
guanines
et
beaucoup
plus
faible
au
niveau
des
autres
base.'i
rluclé ique.'J,
Le
trai tem'2nt~
0n
mi 1 ieu
alcal in
des
3C ides
nucLéiques
irradiés
en
présence (le
ces
deux
composés met en évidence une
augmentation du pourcentage
de coupures au
niveau
de
tous
les
sites
pal'
rapport au pourcentage observé en milieu neutre.
En plus done des coupures
directes induites en milieu neut!'e,
les deux
composés favori.sent aussi des
photodommages sur toute::; les bases nucléiques. Ce sont ces dommages qui sont
rév6lés par' un traltement en milleu bélSiqu~.

---

IJ4
Lor'sQue
.l'on
in'ad ie
.1' Am:
SUI'enrQul.§
du
plasmLd8
pGR
322
(,11
présenC0
du
MDAp2'
ou
(iu
bis-Dl\\?~t,
on
obser,'.:
SUI'
un
g(;l
d'élgar'ose,
l'appal'ltion
de
1<:1
ful'me
linéair'e
de
l'ADN
''J0rrco8pond<~!nt à
li,
~OlJpure
simultanée des
deux !lrins,
et
d'une
fOl'llle
circIJlaire o~ seul IJn tl,'in él été
c:Jupé.
Ces
COUpur'Cs
phol;o3ensibtlisées des
acides
nucléiques
par
les
dellX
compoz,és ont été mises en évi.dence ra:' f3lacker' 1\\..J .• Joz\\·:insU J., Lehn a .1-1.
et Wilhelm en 1986 (li-18).

---

1. DEGRADATION D'OLIGONUCLEOTIDES PAR LE MDAp2+ ET LE BlS-DAP~+
La dégr'ad8.tion photochimique ete::; acides nucléiques en simple et en
double brin pa:' le r·lDAp2+ ec le bjs-DAP~+ a été esse:1tiellement étudLée sur
des oligonuc16otide:3 de séquence connue. Ce sont de" oligonucléotidC':J
C:Or',S-
Li tués de 27 nucléotides contenant une séquence AB ou Te eL qui seront dési-
gnés par la suite par 27mèJ'e-AB Oll 27mère-Te.
(cf. matériel 0t méthodes pour
lil séquenc'2).
L'extrémité 5'
de
l'oligonucJéotjde a été marquée radioactivement
pa:' voie enzymatique avec
la polynucléotide kinase riu phage T~ en pl'ésence
d'ATP
[r
32pJ.
Les produits
de
dégradation
sont. ensuite séparés selon
leur taille par électrophorèse SUI'
un gel de polY<lcJ'ylélm~dc. Pour une con~
centratîol1 c:onst<mte en 27mère-AB,
des concenLration.s croissanLes de MDI'.p2+
et
de
bls-DA?~+ sont ajoutées dans le t<Jmpon cacodylate 10 m1'l à pH '(. Les
solutions sont ir'I'~ldiée;:; <lvec une liunpe ]HlO rje 200 Watts perH1élnt 30 Illinutes
à 20°C.
Un filtre
constitué
d'une
cuve de verre remplie d'cau esL utilisé
pour absorber toutes Jes radiations de longueur d'onde inrél'ieure à 300 nm.
APl'ès
il't'nciintion,
les
échantilLons
sont
pl'écipités
par
de
l'éthanol
en
présence de l ug de tARN. Cette ét.ape est nécessaire car elle permet d'éli-
miner les deux pl'oduits qui
provoquent
une
trainée au
cour's de l'éLectro-
phorèse.
Le
pJ'écipité
est
alors
r'epr'is ;:lvec
20
III
d'eau et fra(~l;lonné en
deux parties.
Le premiei' aUquet
esL lyophilisé et r'epris directement dans
le colorant de charge, puis c:néll'gé sur un gcl. Les coupur~~ qui apparaissent
sur J 'auter'8.diogramme de Cl: gel
:JonL des coupures qui
se sont produites en
mllieu
neutre,
La
deuxième
fraction
est
tl'aitée avec
100 pl
de pipéridine
1 M 10 minutes à 90°C.
Elle est.
cOTll?elée,
lyophili.'3ée et
rincée dl.:llX
foi.~
avec
200
]..JI
d'eau
avant
d'êcre
reprise à
son
tour
dans
le
coloJ'ant
de
ch8.r'ge, et chat'gée sur un gel de polyacrylamide. L'autol'8.diogramme de ce gel
l'évèle les ()()UpUr'i~s induiLcs "n mi 1ieu neutre plus ()elles qui apparaissent
après tl'ai tement en mi lieu basi Que.
Ces coupUt'es sont dues essent iellement
aux dommaBe3 causés sur les bases nlJcléique~,
Ln lI!igréltion électrophorétique s'effectue à puissance constante de
IW Watts
penda.nt
L)'ois heur'es dans
le tampon
1 TBE
(Tr'is 90 m:-l,
horate 90
mM,
~iJTf\\.
mM).
IJCS
gels
sont
t~llsuite autoradiographiés à -70°C
sur
des
films Fuji
(X-Ray)
pendant 12 à ~e heur'es suivant la Qua:ltité de radioacti-
viLé chargée.

---

136
1. Profil de la dégradation
l,,q
Ciglwe III.1A t'efll'83enl~e .l':"lutor'adiogr'amrne d'utl gel "neutre" du
27rnère-As
irradié
en
présence de quanti Lés croissantes de MDAp2+ da riS
le
t.ampon cncodylate
ID rnH pH 7 eL à 20°C. Les puits 9 et
10 sont les témoins
irl'aHi,],>
et
non
ir'l'adiés.
Lorsque
lA.
concentr'ation
eOl
HÎJAP2+
auglnente
du
pull;:, tJ ver", le puits 1 les coupure:J 30nL plus intenses au niveau
de toutes
les
bases.
L'efficacité
des
coupures
est
plus
impœ'tante
au
niveau
des
gua:1ines aussi
bien en milieu neutre '1u'après
traitement en milieu basique
(figul'c JJr .2A).
L'analyse
Quantitative
des
densitogl'ammes
pm'met
de
détermine:'
l'efficacité de coupure au niveau de chaque base:
-
Les gllcHlines du côté 5'
(G6 ct G8) sont touchées de la même ma-
nière soit enyiron 1,5 % de dégradation en milielJ neutre,
Après traitement
en milieu basique (figure 111.2A) ce pou)'centé\\g~ augmente b 'f%, environ.
Les guanines du côté 3'
(GI9,
G2ü et G23) ont un pourcentage de
dégradation
(~ à 5:0 plus élevé que du C:ôté 5'. Lorsque les échantillons
sont Lr'aités en milieu bél..",ique POU)' rtGvéler les dOlllrrJél.ges subl~, par l~s Ilases
on retrouve les mêmes pourc8ntages de dégradation.
-
Les él.dénines
contigues
dans
la
séquence AB
sont
peu dégradées
m2is avec la mêm8 et'flc.1.c:ité en lIIilieu neutre et en milieu basique (pourcen-
tage de coupure de l'ordre de
%). Les adénines sit.\\Jées entre deux gUnnines
sont par contre plus touchée~ (A7 et A20) surtout en milieu neutre.
-
Les thymines situées du côté 5'
(T5 et T9)
sont moins touchées
(0,7 %) que celles situées du côté 3' en milieu neutre. En milieu basique le
pourcentage :'edevient le même.
- fJes cy tosines ne !lont pDS bC:ë1uCOUP touchées aus:..> i bien en mi 1 ieu
neutr'e qu'en milieu basiqLle.
Les
figures
III.1B
et
II1.2B f'eprés~ntent les profils
d'un den-

---

137
3'
A
A
CCGTGAlAAAA ... • •
A
A
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A
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-fil, JlI,
. ll\\;~
..\\J!II... ,:'«~,.,.,J
G
-
,
T
e'
,
Figure ULlA: fllIt?radiograrnrne
d'un
gel
"neutre"
du
2"(mère-AIJ
(1,35
x
10-1
M en phosphates)
irradié 30 minutes cn fonction de
ln
el)l\\ccnl:ration en MDAp2+ dans le tampon cacodylal:e 10 mM à pl! ., et à ZooC.
Le~ différelll:s pult3 contIennent respectivement les concentrations suivanl:es
en MDflp2+
: 1 : 2,77 x 10-6 M i Z :' Z,o~ x 10-6 Mi 3 : 1,36 x 10- 6 M ; Il :
6,,(9
x
1Q-7-M
5
1,T!
x
10-7 M
6
1,3'(
x-l0- 9 M i
'f
:
6,86 x
10-9
M
1.\\:
2,'!"! x 10- 6 M ~ témoin non irradié
9 :
témoin ;alls MDfII,2'
irTadié
1 0 : témoin sans MDAp2+ non irradié.
•uc•.Q
o
•.Q•
l",
.."" \\""".
/\\
"
"
o
110
220
distance
de
migration (mm)
( tgur'e
III. tA
montrant
Fieure l11.1D
Den!li togramme
du
puits
n03
de
la
1 '.,rrJcar.:lté de coupure au niveau de ehaquc base.

---

138
- -1,1
",
'.
1$84
Ys
,
$3&.-
-
•
l'i(iul'c 111 ..":'11
: !lutOt'udiogl'amllle
d'un
gel
de
séquenee
du
2ïrnèr'e-!llI
(2,7~ x
10-7
11
lm
phosphates)
ir'I'OC] ié
30
InînutCG
Cil
IlI'é.'jcnce
du
1"lIl1'1I,;;1
PUiél I.r'iliL:é lU rninul.e" par'
la plpérld1ne 1 molaire.
l.,'Lrrac\\iaLion est;
ri'lite 01"1113 le Lampon cacOllylaLe la mM à pH 7 8[; à 2üoC.
l..a COl1cenlr"t;loll ~Il
1"lDf\\1'2! est l'cspecLivernen[; de
:
1 :
2,78 x 10-5 t'-1
; 2
:
2,08 x 10-') M ;
3
I,YI)(
lù-S M ; JI
:
S,60 x IO-DM ; 5 ; 5,% X lO-C-tJ, ; 6 : 3.13 x 10- 6 M
7 : 1,110 x 10- 6 ~1; 11 : ",,.rlJ x 10-5 M-CtélllVlll avec MDi\\p2+-noIJ irradié)
9
1
télllUil1 "ans Milfd-,2
i;:-r'adié
;
10 :
t6moll1 san,'] HDi\\p2+ non irr"Htié.
"
l' 1
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1
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Il
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220
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de
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IJf;Il."1il:lJgl"}!IlWl
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[Juil::>
nO'{
<Je
la
r' i 17, lIl' (~
1 11. 2f\\
1I1011Lt'allL
l 'F'r'fl(~;]('il6 lk~ (~()UpU1'e au nlve;lU d~ cJl.1que b;l.'le,

---

sitogramme
du
puits
n03
du
gel
Ilneutr'e"
et
du
puits
nO'(
du
gel
dit
Le profll d~ dégradation des 01igonucléotidc8 pE1r le bis-DApil-l- cst
le même que celui obsen'é en pr'éscnce du HDAp2 1
Aux mêmes concentri1tion~, en
•
color'ants,
le bis-DAP~+ est plus efficace que le l-lDAP2+. Lcs guanines sont
toujcUl's les b:3.ses les plus t'Juchées .
.?.
f'r'oduits d~ clégr'adéltion
Les produits de lEI r'éaction ne coupures du 27m'~r'~-As par le MDAp2'
et
le
bi.s-DAP~-I- en milieu neutrc migr'ent
SUl'
un
gel
dénaturant au même
nh'eelu qu.:: les produits
de dégradation de la réaction chimique
CG
-1-
A)
de
Milxam Gi U1er'l;..
Un peut dOliC conclw'r; 'lLl~ ces pr'oduits ont leul's extrémi tés
sous forme 3' phosphomonoes tel'S (19).
Pal' contre les échanti.llons traités i~n mili.eu b<J.siQuc (pipéridine
molaif'e,
la
minutes
à 90 D C)
présentent
un
dédoublement
des
bandes
des
pr'odui ta
df'
(1égr'adati011.
Les
bandes
1"''''
plus
intense.')
migrent
comme
les
pr'oduits de 1<J. réaction de Maxam Gilber'l;.. Il apparait cependant une deuxième
bande moins intense Qui migr'e plus lentement que la bande principale. Sur la
figur'8 III.2A ces bandes sont netLern.::nt visillies au niveau de
l'adénine 3,
de la guanine ~, dc la thymine 5, de lel guanine 6. de l'adénine 7 et de la
guanine U et mêrnr~ au niv'~au (j8 1:>
thymine 9.
Les mêmes
bande., secondaires
deVI'aient appar-aitre au niveau de toute5 l~s ba~es j lcur' visuali.sation est
simplement
limitée par
la
limite de résolution du gel.
Il
existe donc
en
milieu
b:l.sique
des
produits
secondaire,)
de la
r',1aetion,
soit; (les
produits
d'ouverture des cycles puriques en milieu basique, soiL des produits déphos-
phorylés à leur extr'émi ti~ 3'.
L'identification des
produits de dégradation dans le cas du com-
plexe
orLhoph6nill1thr'olinc
cuivJ't<
a
pel'mis
?:J
David
Sigman
dc
proposer'
un
Inécanisme POlJ:- li( coupure du Sque18tte phospllodiester des acidcs nucléiques.
Ce mécanism.:- postule une attaque nu sucn~ par' IJIl rEl'!.icill hydroxyle condui-
sant
al.!
départ
de
la
l)asl2
et
à
la
coupurc
du
squelette
phosphodiester
(20,21).

---

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un~no.,n
} rOI~Qn (l()qrn~M
5-MF
Par le schéma (a), on aboutit à un oligo 3' phosphate mal'qué en S'
tandis que par le
sclléma
(b)
on
ûllLienL
un 01 igümwléotick i.Jyant
en
3 1
un
phosptlOglycolate
qui
migre
différemment
du
pr'écédenL.
I.~ phosphoglycolate
dispar'aft en millelJ basique.
). EffIcacité de coupur'e
],e:;;
figures
IV.3,
II
el
5
illustrent
le
pOlwcenLage
de
coupure
induite
SIH'
le
2'{mère-Aa
pal'
le
M[)Ap2~ ainsi que le bis-j)Apl!~ 00 lIIilieu
neutre et apr'ès traitement en milieu basique. La concentration du 27mère-AB,
du 27mère-T(J
ou du
duplex
est d,~ 2,'rO
10-'( M Cil phospllate .1ëlns LOIJtes
les
expériences, Les pOlll'Centages de coupure ont
été calculés en découpanL
les
bandL~s du gel corl'c~,pondiHlt au 27mèt'e lIon dégl'adé cL :WX [H'oduits de
c::ou-
puré,
Un t.1moin ne contenanL pas dc photosensibilisaLr;ur Ct allssi éLé
irl'ildié
]0 minutes à 2ûoC pOUl' 3t:l'vil' d,~ l'JCél'ence allx CQUpUJ't:s non ~;pé,~i!,jque:3, Lc
I).::urcentage
de
oJégr'adation
<lu
Lémoill
esL
LOUjOlws
int'éri8Ut' à
3 'J, cc
qui
corresponoJ dans nos expét'iencc:3 au t)ruit de t'ont!,

---

a. MOi\\p2+
L<,
fi~ur'8
111.3
l'epr'é:3ente
les
pour'c,:nLages
de
dégradéltlon
du
27mèl'e-AB
et
du
27mère~T8 sensibilisés par le MOi\\p2+. En milieu n~lltre on
obtlent jusqu'à SO ;; dl': coupure
CUl' Chél(fue oligonucléotiue.
La
légère au@:-
menl-ation d-=s coupures
(,;o
60 %)
SUI' lc 27m01'e-TB est dUiJ essentiellement à
la pr8senCJ€
dcs deux guanincs du côté 5'
de l 'oligotlucl'~ot;icle. L'efficacité
de
coupur'e
étant
plus
gl'allde
élU
niVCélU
des
guanill<2s,
chaque
fois
qu'une
coupure? sc prod.uit à leur nivcau,
on
perd
la
radioactivité
de
telle sorte
que l'on ne voit plus les coupures pl'oduites au niveau des autf'cs sites.
Le tra i temcn t des échan tillons en mil i eu has i que augmen te le pour-
centage de dégradation qui atteint pratiquement
90 % SUI' les deux oHgonu-
cléotides.
La différence dG 1.J0
% observée cn[;t'e le pOlJ1'Centa~e de d'~grada­
tion
en
milieu
"basique"
ct
"ncutre"
t'eprésente
les dommage~ (Dhotooxy<la-
tion)
photochimiques subis par 1 es bases au cours de l'irradiation.
I l y a
donc
pratiquement
aut,lIlt
de
coupures
<lirectes
du
squelette
phosphodiester
qu'il y a d'oxydation de bases.
25
% de coupures sont observ(~es diH1S les mêmes conditions sur le
duplex en milieu neutr'e.
i\\pr'ès traite:nent
par' la pipéridine ce pourcentage
double
pour les même:;
r'ai~ons
que
ci-d'~ssus. La fjgur'€
111.5 pré5ente
les
efficaci tés de coupure du duplex pi.Jr le MOAp2'.
b. bis-DI>.pll+
La
dégradation
du
2','IlI~I'e~T8 ~t dl', duplex pm' le bls- DAp1.J+ est
représentée sur les figures
111.4 et 111.5. Sur le simple brin,
le pourcen-
tag~ de dégradation cn Illili,~u Il€Utl'8
est d0 SO % il est Lr'ès voisin de celui
observé
avec
le
MDAp2+.
Sur'
le
duplex
(figure
111.5),
la
dégradation est
bealJCOUp plllS importarll:e qu'~veo lc MOAp2+, do plu:; ce pourCCt1tage est at.-
teint pour de plus faibles concentrations en bis-OAP.!j ....
Le
traiter.Jent des
échantillons
irradiés
en
milieu
basique
donne
pratIquement le même t·ésultat
: 90 à 95 % de dégl"adatiol1 sur lc simple 81'in
et sur le duplex.

---

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lf1.3
I::l'ric'I~'i',..i c..Ie délW<.Jd;ILlon [Je::. olicc>t1uL!'l<JLldC:3 pal' le
1·\\[;!U,,"2<
ct.
le
bis-DApll<
en
miliet]
ncull'e
et
<IPl'è~:s Lr'i:J.itc~nwnt (1~3
.~c::llaflLlllon:J en nlllicu basique. La (;Onr:C:rlLI'dLioll Cil oljgonu,;I~OLidl?'J cst d'~
;:.70 x
10-,' \\-1 on plIOSflh;lt".
Le
tcmpD d' irr'iHil .• LlolJ ilst (1," ]0 lil,inuLe~ (l,m:; le
\\.:illnYOIl
cacodyl;)l:,e
10
mH pH
7
à 20°C.
Les
pourcl!nt"BcS
ont
éloi
calculés
il
partir
nu comptage (le
la
rndioactiviLé des
I.'an'k:l (Ii'.'~ :?!' In'::I'(~"
inL'I';Lf'3 "l.
,j.::]
Ill'udl! i t:.J <10 d(:i!~r,\\d.1I,i<Jll.
<'ïwlr'c-l'Iu
~i[)J\\p2t en mil ieu neuLl'e
2
27nlère-'\\fl + l'iDIiJ,2+ traité p;>r 1 M pipél'idinc
3
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t'I[)J\\p2'
en mil t<.;ll neuLr'"
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27I11èJ',~~T8 pilJ' le LJis-[)i\\r
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llii Ij,!u ncu\\.l'c (1)
P.t apl'ès Li'dilelll"nL der. 6ch<lnl.lllol1rl pdl' 111
PipÛ"Ldine
l
mol~lir'e (2). 1,l!~3 ,:ol1oiLiorlêl '!>:pél'lmenLili.!.'l :loni.
(;~lle:J de la figur'c Il.).

---

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IBis-D:'IP
1.
['ïgur," JI1.5
: Efficaci.té
de
dégl'3daUon
du
2'(
mèr'e
rll.ljJl,"x
(;:"rmère-Aa-27mère-T8)
(2,80
x
10-'r
M en
pl108pllal,ps)
!;dl'
le
l'HiAP2'
ct
LQ
l)i.'J-ll~,[)JI+-.
Les
conditions
expér'imenl,ales
sonL
.1c~J 111\\)mc,c. 'lw~
(;<~lle~ (1e 13 flgurc U1.3.
2'(mère dllplex +- t'1Dfl.p2+ en milieu neutr'e
j
2'rtr1~rc (IlJpl~X + t·1rJi'\\p2+ traité par la pipérid lne
J
27trArc dllplex
blS-DAPll+ cn milieu neutre
;
7ï
2'/ln'"'['8 <lurip-o::
bi.s-DAP!.J+
traité par 1<1 pipérirJine.

---

JI.
Cinéti que de d~gradation des oligonucléotides
l.a fleure 111.6 r~pr~sente la cinétique de Ijégl·~[lat.ioll du 2"
m~re
duplex
par
le MDl\\p2+ en mili'2u
neutre .;::t [Iprès
traitement (jes fchantillon5
par la pipéri.dine.
Dans ces con,jitions, au bout d'une ~H"ure !j'irradiation on
obtient
un
platroau
rlui
corrEspon(j
à 30 :t de coupur'es en mi l i.AU neutre et
70 % ell milieu basique. Les )joints cort'esponnant ."'lU temps t
=
0
;'e[wéscntent
en
f{Jit
les
eoupœ'es
provoquées
pal'
l'abSOI'pl.ion
de
l2.
lumi.èl'e
naturelle
pendant la durée de l'expérience,
Ces coupures sont tr'È:s
faible5 en milieu
neutre,
mais 1/èviennent toujOU)'.s
impo:'tantes quand l'éch3nti11on est traité
par la pipéridinc,
l.e
puit!5
rl°8
de
la
figure
IJI.2A mon!;re
le
profil
de
dégrEldatic'n par l'arJsorpti.on de .hl
lumière rFlturclle
(la trainée noire sur
l'ensemble du [,',lits
corr'espowj sans doute à une élimination seulement
par-
tielle [lu f1DAp U+ lJtllisé à forte concerltration).
La
figllre
111,"(
repr~sente les
cinétiques
(1e
coupure
du
duplex
bis-DAP~+. En milieu lIeutre, la dégr-adation 8St tot.ale au iJout de
deux
heures
d'il'radiation.
L'efficaci'c..é
rJe
rjégl'3 11ation
du
duplex
pal'
le
bis-D!lP~+ est plus importante que celle du ~1DAp2+, On Il'Jtera sur 12 figure
111.7 que l'~chantillon 110n ir'radié IJrésente des coupurcs en miliell rl8utre
qui
sont
considél'ablement
ampLifiées
en
milieu
basique.
Ce
résultat
e.'3t
vr'aisemblablcment dû à l'aetion de la lumii'::re ambiante. La comparaison 2vec
la figure 111.6 montre que les dommages des bases sont plus importants avec
1e bis-DAP~+ qu'avec le MDAP2+.
Con..;lusiOIl
LAS
nouvelles molécules MlJAp2+ et bis-DAp U+ qui se fixent sur les
acide3 nucléique"" en simpl;:; et en doue·le hr'in sont cap3bJes de sensibi liser
une dégradation des êlCid8S
nucléi.,~ues lo('~,que l'on ÎI'I"adie le mélanp;e avec
des radiations de longueur's
d'onde
supérieUl'es il 300 nm
('If),
Les
c:ouIlU;'QS
du
:squelett'Ô'
phospho!jiester
l!~s
aci.des
nucléiques
sont
directem€nt
ob~er-
'lables en mil ieu
neul;re.
D,"
plus
(1es
photoàommages
indui ts
au
ni ve,:lU
des
bases sont révélé,~ par tl'aitemcnt ell mi lieu al(;alin.
Le
bis-DhP~+ est plus
efficace comme photos'2n.'3ib11is;Jt~ur
qlle le ],mAP2+ en ['aiSr)O de sa plus fortE:
affinité pOUl' les aci:les nlJc1.hques.
1

---

1
1"5
100
Z
2
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1
Cl
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0
l
0
60
120
180 '1'0111['.'; (1I1Il)
Cllle:lLi'pw
dl)
dép;I':ldCltion
du
27m81'(,
dLlp18X
(8,'':(1
:.:
IU·· f
1·\\ ~II
1)~lCi~;I)ll:lIJ':J)
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1
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2
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Ul
Cl
010
,
,
~'
o
o
60
120
180
Temps(mn)
CjW~Li(IW] (j,~ dr5gl'dd:lticjll du 27IllÈ~r'G duplex {/J,IIQ x 10-( t-1 en
i>IIi)';I_,lnl,;,:-,:1
l "it"
1<:
lJi,.-IlJ\\p il+
((J,JIO
x
10-0 H)
déJrl~3 le l,lInpOll
;:"''l)dyl,Il:'3
11) ml1 l'~I",';~
2UoC.
Illi 1 j'cl]
r,,:utl'c'
: ,11'i'èc; ',r'(lllpll"-:IIl: 'ü,;~ ~~~Il(ln;;illr)n.r: IFlI' la pipéi'ldine.

---

146
En
milielJ
neutre,
les
coupures sont
plu.'?,
intenses
au
niveau
des
guanines
mais
d'auLl'E~s
liaisons
phosphodi8sters
sonl,
également
coupées,
nota[rJllenL 8U Jli,'cau de;; adénines dans les séquences GAG.
Par' contre, peu de
(wupures
sont
obsf'::"{'~es au !li v8au
de
" :J~quence A8· Ce résultat semble
i:ld Lcluer
que
la fixation du MDAp2 i
dépencj de la séqueneG des bases. En mi -
lieu
basique
les
dommages
produits
<lU
niveau
des
bases
Sonl:
révélés.
La
guanine est de
loin
la
base 13 plus modifiée,
prob3blement par photooxyùa-
tion.
1

---

1~ 7
II. DEGR~!\\TJON DU 27MEHE-AS PAR L'OLlGOTHYMIDYL.H['; TS-l1Diip2 i
Dans le but de pouvoir utiliser ces nouvelles m,')l.§culcs pour cou-
pt2r de façon sélBctive les acid-=s nU(;.Léiques,
le MDAp2+ a été couplé pa:' un
bras
pentamethyJènc
3.
un
oligothyrnidylat'2
(Te)
pal'
l'intermédiaire
d'une
liaison phosphothloestet'
en
position 3'.
Le 2'1mère-Ae possède une séquence
A8
complémentaLrc de l'oligunucléotide ainsi synthétisé. La compl ...~mentarité
de
ces
deux
séqut2nces
(lait
permettre
de
localiser'
le
MDAp2+
sur
un
site
unique au
niveau du 27mère-JI.3.
l'ensl~ml)l~ mimeHlt une nw~léa3c artificielle
activable par une irJ'i:JdiBtion lumineust2.
La figure IIl.8 p:'ésente l'autoradiogramme ,ju gel obtenu en mLlieu
neutre
avec
le 27mèr'e-il.e
ir'radié en
présence dt2
"~oIlC0ntrationf,
oroissantes
en Te-MDAI'2+.
Des coupures sont ob,<Jervées au niveau des guanin,;s si Luées du
côté 3' de la séquene,; Ae métis leur intensi.t;f ne dépend pas de la concentr'a-
tion en TB-MDAp2+.
Par contre une coupu"e au niveau du nucléotide T1S ",ppa-
l'élit
Quand
la
coneentréltion
dè
Ta-MDAP2+
augmente,
,Son
amplitudt2
atteint
10 % du 27mère à une conccntr'ation ·1," S,li x 10-6 M (tableau lILA). En même
temps appal'élissel1t deux bandeS corr83pondant à des espèces qui migl'ent plus
lent:ment que le 27mère
(tableau III.B).
La figul'e
III.9A présente le den-
sitogramrne du gel cOl'rc~ponctant à 1-3 concentration ~,li x 10-6 M en T8-MDfIP2+
et la figw';o III.9B montre la variation des coupurE:s au niV'C,au des
nucléo-
tides Tle, G19 et GB en fonction d~ la concentration en Te-MDAP2+.
Par analogie avec leS résultats obtenus avec ct 'autres gl'OlJ[1ements
photoactifs
(proflavine,
azidophénacyl,
8.zidoproflavir1è,
porphyrines),
les
espèces qui migrent plus lentement que le 27mère peuvent être identifiées à
des
produits
de
pont3.gè de
Te-MDAp2+
sur le 27mèrt2 induits pal' l'irradia-
tion.
LorsQu~ Les échanti llons du 2ïmère-,'..8 sont trdit6s la minutéS à
90°C par la pipéridine
molain-o,
le pl'ofil de (iégrac1éltion
devient ctiffé-
l'cnt
de
ce,lui
observé
cn
milieu
neutl'8.
La
figure
III. 10/1
l'eprésente
un
autoradiogramme du
27mère-AB
Lrradi\\~ e:î présence du TB-r1DAP2+ et traité par
la pipér i(j ine.

---

14R
3
A
A
SC
T X
~
A
A
-
~A
.:1,
A
..
A
A
T
G ~
A
G -
~
,
T
5
?jglJt'e 111.8
;
f\\uCoradiogr'amme
d'un
gel de séquence du 27Iilère~l\\[; irr'ad'lé en
fonction
,:l"
li!
<;o(\\ccnt!'f\\Linn
en
Tl1,-I1D,i\\p2'
'J<tnc:
L8
Lam!'on
lèilcodyla I:C 10 m~l.
NaCl 250 mM .1 pH 7 et à 0 oc. Le tE:mpG d' i [TEH! ta t iL)1l ('S C dr,
30
miJJUle3.
Lcl
'"0n::i"ntl'iltic,(\\
en
27
rrère-Ae
COll:
CF'
10-::
~1 ièt
CCLE~ dit
'1"B-mlAI'2+
est-.
respccl.ivemcnt
de 0,13
;
0,27
;
0,011
0,81
1,uD;
I,U9
2,7
l't
S,li
\\lX
d<l
puit:;
1
AU
plliu,
8.
Le
puits']
00nsciLll(l
Je
t2mOU]
::''tm~r'<;-f\\rJ irrJd jé 30 mn 5fl'1:J TI:J-MI),~r:>.
3
•
0
""" 2
0
"
1
",
1 -
1
zoo
1
100
distzn:e
d"
rnÎçf<l\\i)n (ml~')
[)cn~it()Srallm(' du puits nOB ,:lu gl'l \\1(' lil rLgurc: 111.8 mon-
1
trant
l'clTicé'lcilci
d,"
l]ùupUre
d"
cha'1liC
b:J:~e dll 27~lè:'e-AB
['al' TS -r·mAp2 •.
1

---

z
1 0
0
-f-
<l;
0
<l;
'"0'"0
010
5
G 19
- - - - - - - "'()- - - - - - - - - - - - - .-0-- - _.
0
o
o
2
4
Fielll'c 1l1.lJfl
POUl'Ct~IlLélge de coupure du 27mèl'p.-AB pal' Ta-110M2 1 éll1
llive311
de Id I;U<Hljrl()
GA,
CIl)
I~t de 1.1 thyminç TlIL Lr:l" ,»tHlltll)I13
~xp01·illl"nLnlr.;, sont cclle:,; (ip 1;\\ riglJ['(~ 1Il .•9.

---

150
"
'c'
" .-~
fClD....
-
~ ........ __. ",.".."~
., ...~.:..~....-
.. )
fwtoradiogrammc·
d'un
gel
ct,::
-'Jéquence \\lu
,'lJn,\\rc-f't3
1)'1'30 L,'
en
fonction
de
la conr~<2ntr'<ltion (ê[) TS-rmAP2+
Les
ée:h'"ln-
tillons
:;;ont
trait8s
10 minutes
à 9U"C
p;;r
1'1.
pipéririinp.
1
M.
Le"
conditions
c'xpéJ'imentdlcD
sOITL,~r,ll<::,; (ie
li!
figur'p 111.8.
2
•vc•"'
o
;;
1
•
1
0,41~
1
20
100
200
distance
de
migration (mm)
Figur'c Ill.l0El
: L'ê'nsi togramrnc du r'uit,s nOB rju gel de 1" figTTl'e IOrl rnont.J"TTlt
l'efficacité
de
Coup'llre
des
basps
dll
?",Imèl'c-i\\8
p,H'
T[J-MDfd,2+ .

---

151
,.,,
[TB-MDII.p2"'] _10 6 (M!
0,13
0,2"
\\) ,~) Ij
0,81
1,08
1 ,8J
2,7
% coupur '" 'T Hs
1) ,82
o,8J
'J
").~
L , '.10
1 ,f3)1
2,50
J,60
6 "
,0
10, n
% coupure G19
2.,'3f.
~ ,0 Ij
}~ ,96
1j,20
11,30
J,"J
Jj , 2
):, Z!.j
% cou~ure 0,9
o ,~'9
l ,O:~
0,79
() ,82
0,71
",78
0,83
0,72
TABLEAU l TT. .fl
:
Pourcentage d(~ COUpUt'€!
de tr'oîs bases du 27rnÈ:re-Jis (10-8 (~ en extrémi tés) oo:rl
présencG d8 quantité cr'odS:lnte de T8-I~DAF,2+- dans le tampon cacodylate 10 m,'1
NaCl 250 [riM à pH 7 et à DoC. Lr; temps d'irradiation est de 30
minuLes.
0,27
0,81
1,08
1,89
2,1
% pontage l
0,72
0, '( 9
1 , JJ
1 , 117
1 ,75
2,09
2,63
% pontage LI
0,72
[) ,90
1 ,62
1 ,85
2,07
2,85
J,25
TABLEAU Ill.P,
Pourcentage de pontagGs induits ;sur le 27rnère-AB par' le T8-r1DAP2+ en
milieu
neutre. Les cond i t ions expér i men ta l <;s son t. ] es mômes Que celles de l,a figure
111.8.
Cette figure montre Que :
- la coupur'e maximum sc produit au niveau de la thymine 18
;
dc~s
coupures
importantes
sont
obser'/ées
au
ni veau
des
trois
guanines (Gllj. G21. et G23) du r::)té 3'
;
- la région AS
est protégée saur l'aMninu
17
qui
est p8J'tielle-
ment coupée ;
les
trois
guanines
du
côté
J'
(G~,
G6
et
Ga)
sont
également
toucrlées sans que l'on r)')Sèl'Ve une 01lgmentaLion des c'.Jupurcs par
rapport à celles observées en milHu neutre.

---

152
le MDAp2+ 6tant f'lXé dLI c5té 3' de l'oligothymirjylate les coupures
sont attendues du côtê2 5' du 27mère dans le cas d'un appariement antiparal-
lèle. La bélse la
plus proch': du site de COUpLll'e est cl.1ors la tlo,ymine Tg-
En milieu neutre, les coupures sur cette base sont très faibles et
l'on retrouvG l,~ même l'ésûlL:at 2prè,s 3yoLr traitA les échantUlc'ns en milieu
basir:]ue.
Le
tableau
Ill.C ci-dessüu3 donne le pcurcentage des coupur'3s des
g!.lanines GB, G19 E:t des thymines Tg et T17-
[TS-l1DAP2-+J.106
( M)
0,1 3
0,27
0,5 11
0,31
1 ,05
I,S9
? , 7
:), ~
% coupure GS
6 ,6
~ ,11
5,0
5,7
, , 1
2,5
3, 1
3,2
,, çoupure Tg
1 ,9
1 ,3
1 , ,
1 , !1
1 , ,
1 , ,
[1,g
0,9
% '~Ol.lpUrc T18
1,7
1 ,6
2,6
3,'
6,2
5
7 ,7
9.3
1 coupure G19
6 ,6
6,6
8 ,
,-
7,5
1[1 ,7
6, ,
6,7
5,5
TABLE!\\U III .C
PourcentagE; de coupures au nive:,u ~les guanines CS, G19 des thymines T9' T18
du 27mèrr:=-As irr'adié en pr'éscmcc de l'oligonuel';'otide TS-MDAP2+. Les
condi-
tions
expc§rimentales
sont
les
mômes
que
eelles
de
la
figur'e
III.S.
Les
écha~tillons (lnt été traités par la pip~r'idine 1 molaire pendant 10 minLltes
à. 90 Oc avant d'être chargés SLH' le gel de séquence.
La comparalsc)rl des t<ibleaux III.A et III.C montre Que
-
les
<èoupures
sur'
la
guaninG
19
du
27mère
r'estent
constantes
quand la concentrAtion en T8-~~D!\\P2+ augmente aussi bien en milieu "neutre"
(Jj
Xl qu'en milieu "basique" cr %). L'augmentation des coupures après
trai-
t;:~l1lent en milieu basique montre que le:=; bases qui ont subi des photodommages
sont labil~s en milieu
alcalin.
Il y a donc un enricJüssemenl; des eoupur'es
SUl'
cettt? base lor.:'ique l',)n traite les échantillons par la pipéridlne 1 M ;
1
,
,
,,,
1
j
j,

---

[53
La guonine 8 qui
n'étaiL pas touchée en milieu neutre voit ses
coupures enrichtes après traitement en milieu basique. Cependant le taux de
coupures diminue lorsque la concentl'atlon en TS-MDAP2+ augrn~nte.
La nispari-
tion nf!S pont,lgcs n8 G~rntJle none pa.'; cnrichir L~eLte CoupU)'e ;
la
thymine
Tg
est
très
faiblement
révélée
en
milieu
basique
alol's qu'elle ne l'étai t pas en mi ll(~u neutre;
la
thymtne l'la
qui
est
la plus touchée en milieu netltl'e l'est
aussi
après
t ri'l i tement
en
mil i eu
bas i que.
La
di spari t i on
des
pon ti'lges
se
tr'aduit
essentiellement
par
un
cnl'icl11ssement
des
CCiJ[lul'es
au
nIveau
de
cette base.
2. Cinétique de dégradation du 27mèr'c-AB par le TB-MDAP2 1
Une concentration de
1,6
10-6 M de 27mère-As
est
incubée avec la
même
concentration
en
Ta-MDflP2+
à
zéro
degl'é
pendant
rj,~ux l1eure,; d,ms le
tampon cacodylat!l 10 mM, NaCl 250 mt'-1 à pH '7 pour former le duplex, Le duplex
est ensuite irradié à zéro degré.
Les échantillons sont
prélevés en fonc-
tion
du
temps d'irradiation et
analysés
SUI'
Ull
gel
de
séquence
en milieu
neutrf~, ou apt'ès traitcm~nt en milieu basique.
Les figures 111.11 et IIl.12 ~'eprésentent respectl vement les auto-
r'adiogramm~s des
gels
de
séquence
de
la
dégri,dation
du.
27lnère-Ae
pa:--
le
Ta-MDflP2+ en mili.eu neutl'e et 2près tr,litement des échantillons par la pipé-
ridine 1 M.
Les conditions d'hybr'id,qLion du TS-MDAP2+ sur le 2'7mère-As:
(une
concentration en sel
de
~.?50 mM NaCl et
une
concentration équimolair'e
des
deux
oligonucléotides)
ne sont pas favorables
à la formation d'une triple
rlél1ce. Par conséquent les coupure,'3 obse~'vées sur le 27mèr'e-Ae
indiqucnt la
localisation <lu sroupement activable
(MDAP2+)
et l'orientation nu
t'Win TS
StH' la séquence complémentaire
A8.
1
1
1

---

f'i[';iJl'8
I l l . l l t l '
Ci:l<i"UqI18
dc
dé[;r':I(Jauon
dl!
2lmÔt"2-'~_lJ (\\,'.i c;,;,: H',-r, ;,1 t-m
xLrÉrnites)
P<3I'
le '1'B-i1iJ,I,pZ>
r1,~',() < \\ <,-(, (\\ ""
'>;':l''''~r''il.';,,)
dans
le
Vir;lr0r\\
célc)(lylat\\è
1(1
ml-l,
lüel ::'')ll 1I1~1 .'i
l'II
cI'
,_'1.
J
C,ù:,.
i;ct
é1U\\~[)r'dd \\C'i;l'2.m\\n," rGvt:1F' lCf; COU;'i,II'l.:\\ d tl'ec;L"s ]1['v"
duites en Milieu Ilcutr'ù,
o
."
•
(;,slanc,'
de
mlgraloon (m",)
Ih~(\\:-'iL(]G,·"r['II'~ du [Ui!..'; fJo~; (30 liIjll'II.,'o rj'II'/'adi.';!,iolli du
E':.
de
];1
figul'C
III.II!.
'1(1;][1i'"1.
',"('l'l::ii,-i\\.~. oh' ,,,,l''IMI''c
,111
::"/lnÙI"c-i1(] ;lll n i l'I~éW de ch"'llle I)"oi"'.

---

\\ 5 5
.....~
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27rn;'T'~-/\\i;
(1,~J7
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10-6 M)
(1(~!\\I'{ldJ par' le T8-r1J)r,~';~' (1 ,6B x
10-(' ~1) Lll ïOI)c-
Lion uu
tr.:lnl):"; .1' irTadiaLion
:
tEim~'on cacodyJaL,;
',(1
II1M,
N,lCl
100 ml,) à
l'Ii 'r
"\\:
à
OUC.
Ce
gel
repr'éscnlC'
le:.;
fc011[)1lr'0;';
:"<2'<'':'lc:,;;;
i1dr
" I l
LI'cdLellli:Jll.
,I,,~;
ic\\v:mtillons par' 1(l \\lLo~ridin~
l
~.f
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0
0
• 0,0
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0,45 L.
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5
100
F'igW'8 111.',:';8:
D"f]sitogl'aI1J1J1';
,iu
puiL:.;
Il''')
(30
rnj"Llle,c;
,]'ir'l' 1l11,11IOn)
dlj
c
!;el
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la
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1II.12!\\
r1(';'~lClllt. l'errici'l',ité <1<.;
C(lU~llH'(·
ri'i 2'(rnÈTv-fll3 ,:111 il i l'eau de 011<1'111,'
IJil:~,~.

---

1')6
Les
coupures
les
rlus
iI1tenS(~5 sont
observees
du
côté
3'
du
27m8re-As
et portent e3::JcnLiellern~'nt SUI' les glHnines G19,
G~21
(~t G23' La
U"Jymine
'J'18
et
l'adénine Al7 sont aussi
révélées avec
une inten:J"ltt? plus
faible
que
Les guanines.
Du eGté 5'
s8ules
les guanines G~, G6 et G8 sont
l'€vOées.
En
mi lieu
n'2utJ'e,
toutes
les
coupures
aUl3mentent en fcnction du
temps
d'irradiation
aussi
bi8n
du
côté
3'
que du
côté
5'
du
27mèl'e.
Les
coupures
1'2~; plus
intenses
se .situent
toujours dlJ côtES 3'
au -niveau de la
~l)anine G19 et de la thYlnine 118.
Lorsque
le~ échantill,)ns ::Jont
traités
en milieu
basique,
on ob-
serve
une
augmentation
dl)
pourcentage
de
coupure
par
l'apport
au
mil leu
neutre.
Du çôté 5'
de la cibl€
l'intensit,~ des band88 de la gU3nine G8 aug-
mente toujours en fonction du temps,
par conLre du
côté 3'
les
COUpur'es au
niveau de la thymine 118 et G19 restent relativemGnt constéJJ1tes. Le tableau
ci-dessous résume les pourcùntag€s
de coupures au niveau des troü: bases Ga.
TiS et G19'
,
temps (mn)
15
la
15
20
JO
~!
noutre
0.95
1 ,90
2, JI
3,3
3.9
G8
pip4ridine
2,99
S,liS
7,9"
8.15
8 >71
n€u tre
2,70
'
o. ~,
1J,5
5.5
G,0
T 8
'
PiPéri~ 2."0
1
3."9
3,7 il
J, ,29
3,81
5,70
9.8
12.0
n e n t r d
13 •J
1~ ~
- ,.~
G19
[lipéridine
18 ,83
2Ji,112
22, 1~
19 •JO
12,60
TABLEAU IIl.D
Cinétique de cOupure des bas8~', GS, 118 et. G19 du 2'{mèl'G-A8
par
ll:J-MDAP2+
en milieu l1'2utr'e et après
Lraitcment par li!
pipéridine.
Ces
poul'c:entages
ont ~té calcul~s par densitornétrif' d"2s autoradiosrammes de~ gels des f'igllres
111.11 et 111.12.

---

157
3. Effet de la concentratiO:1 en Ta-HùAp2+
L"~nergie Libre d'élssociatlon du T,g-I-lDIIP2+ SUI' sa séquence cible
est la somme des énergies libre~ des
inter'actions suivantes (21-2~)
l'énergie
libre (le
l'appariem,:ont de
la
séqucnc,= T.f]
sur la sé-
quence !Î8 complém'~ntaiI'e,
- l'énergie de l'interaction du bras pentaméthylène
l'énergie d'interél~ti~n du MDAp2" a'/eè le duplex aii1si formé.
En première appl'oximation, on peut donc éCf'iI'e que:
( 1 )
De cette
relation,
on
peut
estimer
la
constante
d'équilibr'e
du
sy~t'=!me à une tempéJ'8tllr'e donnée pal' ln l'(~latlon suivante:
KaN' Kg • KI
(2 )
La constante d'équilibre du système peut êt:"'e déterminée en
sui-
'Iant la
dénaturation
thermique
du
complexe
ainsi
formé
en fonction
de
la
température.
La
tempéJ'ature de demi-dissociation du duplex est r-eliée à la
e0ne~ntration de l'oligorlucléotid,," librc à la tempél'aature Tm pa:' li-l r'ela-
tion de Damle (25)
:
/',$
2,3 R
+ ------- log Cm
;\\H
La constante d'équLLibl'e entl'e l'oligonuc16otide Til et le poly(rA)
est
de
1,9
10 7 M-l
à 2'13
K et de
2,3
10 11
Wl
lor'sque l'oligonucléotide
por'te un intercalant en l 'oeew'r'cnee l'acridine (21-24).
La
constante d'association de
l 'oligonlleléotide
TS-MDAP2+
5lH' la
séquence comp14mentaire est certainement du même Ol'dl'e de gr-andeur que celle
du TS-Acl'.
1
1
1

---

A
A"
U, !I
0, 0
o 7
2
l
11L.IJ(\\
TiLI"II,j'JII
du
TI.l-MDAP2+'
par
l'üllgünU()l{~ütlrJ," (dfl)]O dalls
Jo! t,-'~ll'Oll cacodylate 10 mM, N8Cl 100 wH 8 pif 7 cL à ')OC. 1,;1
<':'JllCf~rllriltlüll
initiale
Oll
Tü-t·1l)AP?+ est de G,[111 x 10-6 /-1
c.'l, la variatIon de l'absorbaneo ost suIvIe':-'
11201lm.
F
r= <'
", 0
",n
0, ·1
1]
7.
20
.-,-
2+
1Po,
J 1 U1IJAt'
1
L
"
Figul".' J11.138
'JïLJ'iltlon
ciu
'f8-MOAP2+
par
le
poly(rA)
suivie
on
émissIon
Ile [lu(wcsoençe.
Le
r'appor't
F/fo l'epcésurlte l'intensité de
flU')1'9.'H:encû iiI) 1'[l-11LI J'P?+ seul <.Jt en pr'éson<::e du poly(rA). La eOllcentrat1on
du
T[j-r",üAP;>'
ü'-JL
de
3,32 .'<
lO- G M,
la longueur' d'onde drex(~lLat1on est de
3'75 nlll r:1. l ',1mis:.JlOIl tc:JL l'ocuelllLe à 1123 nm.

---

]59
La
figul'e
11l.13A
n~pr'ésente la
variation
de
l'absorbance
du
TS-MDAp2 t
mesurée à ~20 nm en
fOllct..ion de la conce:ltration en
(elA) 10 à 5 Oc
dans un t,:lInrh)n contenant
100 m~l NaCL.
Il
.semble se
formel'
deux
eomplexc.s
:
l'un
3'/CC
une
stoechiométrie
de
deux
T,g
[Jar'
(dA)10.
l'autre
avec
une
stoec!liométrie 1:1.
La
titration
(lu
T8-MDAp2~ par le poly(rA) dans les m02mes condi-
tions de température et do; force
ionique montre qu'il se forme seulement un
complexe 1/1.
La figure 1l1.131~ montr'e la val'iaUon de l'lnt,~nsit6 de fluo-
rescence du TS-11DI\\P?+ en fonction
de
La concentration Cil poly(rl\\). L'inten-
si té de
fluorescence diminue
jusqu'à
un
l'appor't;
[PO~-] / [1-1DAp2+] = 8 qui
correspond à un complexe 1/1.
Elle rcst..e ensuite stable jusqu'à un rappor't
20 puis cf'oit au den. En etTet, au début de la titration, 1" concentration
en
ligands
Cri
l'occurrence
le
Te-MDAp2+,
est
en
gros
excès,
et
r::'2ux-ci
s'agrègent sur la matrice, puLs ils se redistribuent au fur et à mesure que
la
eonr::enLr'ation
en
matriC<3
augmente.
La
fixation
du
Ta-l-lDAP2+
sur'
le
poly(rA)
étant
une
association
coopérati 'le ,
le
signal
speotroscopique
du
ligand
(MDAP2+)
utilisé pour suivre .1'associaUon varie lui
aussi
au cours
de léJ titration o::n fonction de la denslt(~ de
fixation
(26).
Les d8uX type:::;
de complexes ont des absorbances différentes.
Ce phénomène eX;lliquc la lé-
gère augmentation observée de l'intensité de fluorescence pour' des rapports"
[POJ.j-] /
lMDAP2+J ::>upérieut's ~I 20,
Pour distinguer
les
différentes structures
qui
peuvent 3e fOt"mer
entre
le
Ta-MDAP2+
et
le
2?mèr'e-As,
(double
ou
triple
hélice)
nous ,,"vons
suivi
lêl
dégradation
du
2?mère-Aa
en
fonction
de
la
concentration
en
Ta-;~DAP2+. La figure lIl.lllA représente l'autoradiogramm~ d'un gel de sé-
quenco::
du
27mère-AB
irradié
en
prés(mce
de
concentrations
croi:1:o,antes
en
Tti-MDAp2+.
La
concentration
en
27mère-Aa
(1,6
10-6
M en
extrémités)
est
constante dans toutes les expériences.
Dans le puits A,
la concentration en
Ta-MDAP2+ est de
1,6
10- 7 M soit 10 fois plus faible que celle de la cible
complémentaire.
Dans
le puits
8,
eUe
est
égêlle à
celle
de
18
cible
et
enfin dans le puits C, elle est 10 fois plus grande que r::elle du 27mère-Aa_
Dans l(~s puits
1\\ et. 13,
la concenl;ral;ion de l 'oligothymidylatG Gt
l'absence de sel ne doivent pas favoriser la for'mation d'une triple hélice.
Dans ces conditions
si l'appariement entre le 27mère-Aa et le Ta-MD~p2+
se
t'ait de façon antLparallèle. alors les COuput"es sont attendues du côté 5' et
1
1

---

i"igul-e "Ji[~: etc!
lIe
sé>qul:'nce
du 27m:'ire-Ae r;l\\
mL Lieu "\\leutre".
L1 con-
cCIltrarillll I~n 27~~TC-~e
est
,I~ l,57 .
la
~1 JilllH
tOIlS
les puLts.
Les
lluits
,\\,
13 ct C ne conticnnent
l'as de .<ôel ct
la cqllcen-
+
l:t:"ilti,ln dl T8-~mi\\l'L
e,<1!:
de
:
putt.'; A
1 ,67
1()-]
pui t,: 1\\
1, G7
1n-() "
pnits C
[ , G7
10- 5 "
N
1.?s Plli.ts D,E III JI con-_ G
Cli2_11nent chal:11I)
1,67.l0
N
Cl~ T -Hl),W 2+ E~t 100 11l~1,
S
----
2J() nÙ'1,
500 1I1~1 de t'inCl,
TC'SpCC ci 1,,'('lllen L:.
Les puiu-.:
1,2,3,4 et
:,
,,:ollticllllent lil même c<:n-
c'.~ntr;ltion el] 'l'R-~ll1AI'?+
([ ,(,]. 10- 5 ~1) cl: 0,1
0,25, 0,5
; 0,75 el:
! mM
- .,-
CIl
NaCl, r,~spcctiveIIICI1L:.
"
~1~LDJ~LeJ
Fi~ure 1\\ 1.141) : Aut(',<l-
Jiogro"'Hrnnl2. du p;cl de
•
séqu~lt:e ùu 27~è:e-i\\R. tes
conrhtlons cxperlnlentalcs
sont illelltiqucs ~ cI~lles
._._'-'.
(le la fj)~urc 111.14A. I.C5
échantillons Ollt ét6
trilltC's 10 minutes [i lj(J"C
par lil rir~rLJine 1 ~I.
- ---'__D
-
~.- -----
-----~

---

; - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ,
2
~
u
c
C"
.0
"0
~
.0
G
1
\\,
u,~
100
200
distance
de
migration (mrn)
Fï gUI'8 II 1. 15/\\
Dens i togramme
du
puits
13
de
10
rigur'e
UI,Il<A
donnant
l'effIca.cité
de
coupures
oU
ni ve;:HJ
de
d1<l<"jlle
bas~
du
2'/m.}r'c- Ae·
2
~
~
u
C
Q
D
1
"
0
~
D
G
1
1
1
1
u,~
100
200
1
distance
de
migration (mm)
1
Figul'e III .15B
Densi tog,'amme
du
pu i ts
G
de
la
ri gure
III. 1~ R donnan t
l 'eff ic;)c i té
de
coupur'es
;Hl
ni veClU
de
chaque
base
du
2'rmèl'c-'~H
1
.
1

---

162
les bases touchées seraient la thymi.nt' Tg, la guanine Gd, l'aljéninc A7 ~t la
guanin€
GG.
Manifc.stement,
SUI"
léS
puiL.s
fl.
et
B de
la
figure
llr.l~ les
bas'2:o
l~::" plus touchées sont j (Os tl'ois gU<înin>?s du côté 3'
du 2'{ rrI81"t?-Ae.
Dans
le puits
C,
où la concentration en T5-1",O 1d"J2 + (?st 10 fois plus grande
que la (;ihlé,
les pour~entages de coupures sont respectivement de 2 % pour
la
guanine?
Ge,
3
% p01Jr
la
thymine
T1S
et
10
% pour la guanine G1g. La
thymine Tg
du côté S'
n'est
pas du tout révélée quelle qUi>. soit la concen-
tr'ation en 'fS-MDAp2+.
U:pr:ndallt c'est la base qui devail êtl'e 1:'1 pl.us
tou-
ch~e dans le cas d'un appariement antip:-Jr'allèle du TS-MDf\\p2+ sur la séquence
complémentaire. L~ TB-r1DAP2+ semble donc s'apparier parallèlement au 27mère-
.11.8 ou al')r's fa'l0riser la formation de triple hélice.
L01'.SQlJe les échantillons sont traités en milieu basique,
les
cou-
pures élugmentent du côté 5'
du 27m;or'e-As. La figure Ill.l!lB réprésente l'~u­
tOl'adiosri1mme
du
gel
de
s6quo>n,:e
du
27m'2re-AB
ir'radié
en
pré~,ence du
T8-MD[\\p2+
lorsque
les échantillcn:3
sont
traiU~s par la. pipéridine 1 M. La
disparition des pontages s',:ffectue essentiellement au profit d'une éice:umu-
lation
des
coupur'es
sur les
trois guanines
(Glj,
G6
et GS)
du côté 5'
du
27mÈ:re-f\\s.
La
[~gure
III.15
représente
le",
d(:nsitog,rammes des
puits
B des
Cigures
III.lljA
et 8.
Cette figure
permet
de
visualiser
l'intensité
de
coupur'e au niveau de chaque base.
Au
cours
Je
l'irradiéltion,
h'
TS-t1DAP2+
peul
s'aulodégrader'
et
libérer ainsi
dans
le milieu
de
petits
fragments
d'oligothymidylate
et
du
MDfl.p2+ libre.
Ce~ petits fr'agments ou le MDf\\p2+ li~)re en se fixant sur le
27mère-AB pourraÎ.(:nt être à l '<?rigine des COUpUI"eS obser'vées du côté 3'
,j~
la cible.
Pour cela le 1!3-110AP2+ a été marqué ell 5'
et nous aVOIiS véri.fié
que les produits marqués cGrr'espondaient bien à un Te-MDf\\p2+ Qui migre l:omme
un oligo Tl0.
La réduction du
nombre de charges et la présence du color'ant
retar'dent
18 migr'atton de .1 'oligonucléotide
sUt' un gel
de
po.lY<3crylami,je.
Lorsquo le TS-MDAP2+ eDt irr'adié,
on observe une dégradati.on de
l 'oligonu-
e:léctidc av1O:C "'l.prar'itiùn de fragments plus c:our'Ls.
En intl'odlJ1Sant dans le milieu l'éaclionnel un
produit servant de
piége pour le MDfLP2+, on peut alors masquer les coupures non
spécifiques et
ne faire apparaitre que les .:::ou;,ures spécifiques dues ,lU T8-MDf\\P2~ apparié
sur
la
cible
complémentai)~e.
Pour
cela,
un
grand
excès
de
polyd(G-C)-f)olyd(G-C) a été ajouté dans le miliçu réacttonnel pour' piéger Il?

---

r-lDl\\P2+-
libre
dont la constante de
fixaLion sur ce polynucléotide (1,0
10 6
M-l) est très élevée.
La figure IlI.16 représente l'outoréldiogramme d'un gel df~ séquence
du 27rnèr'e-As
(1,6
10- 6 M)
irradié en ~!'ésence du Ti:1-t~DAP:;:+
(puits A, 8
cl
C) et en présence d'un excc;s en po.lyd(G-C)-rolyd(G-C)
(puits D, E et F).
Les puits Po.,
B et
C contiennL:nt respecti',r..:mcnt
1,68 10- 6 11 ; .:J,!.)
10-6 M et
1,68 10-5 M eil '['8-11DAP2+.
La conc(;ntration en sel est de 100 mM.
Les
gUélnines
d8
chaque
CÔu!
de
la
séq',JCrlce
AB
sont
touché~s. Par c,)nt're
l'al.i<2nine 1117 et la thymine T1B du côt6 3'
(',u 27mèrc sont plus touchées que
l'adénine Ali) ct l~ thymine T9 du côté S'.
Les pui ts
D,
E et
F contiennent
1,6B
3,!.)
10-6 M et 1,6B
10 - C
-'
M
respec t'1 vemen t
en
'[8-',""AP2'
'J'!
e t
l ,30
( en
phosrhate)
de
polYI.He.-t:)-polydZG-C). Le profil de coupure oDser'/é sur ces
trois puits est
le même que celui obser'vé sur les [luits P., B ct C. Ce r'ésuHat démontre que
l'addition du polyd(G-C)-polyd(G-C) pour' piége:' les prOl.iuit~, de dégradation
du T8-r~Dli.p2-f- ne modifis pas le profil de d€gradation
du 27mère-li.B. Les cou-
pures les plus importantes
sont
toujOUT's
dl) CQte? 3'
dB
la
séquenr.e AB
du
27mère et n0 sont Jonc PélS dues ~t du I-lDli.P2-t libre ou à de courts oli'g'Jnu-
cléotides portant toujours le MDli.p2+.
Lorsque
les
échantillon::;
sont
traités
en milieu basique,
on ob-
serve un-= dispariti.on des pontages et une augmentation de la dégr8.dation du
27mère
du
côr;é 5'.
Les guaniI1r?s Cl),
CG
et GB
sont
révélées avec
beaucoup
plus d'intensité.
La
thymine Tg
et
l'adsnine hW qui
sont 8bsentes sur 10.
figure III.16 sont m,intenant révélées. LJ figure UT.17 repr'ésente l 'auto-
radiogl'arnrrl8 du gel de séquence du
27mère-AB'
Les conditions expét'irnentales
sont les mêmes que celles de la figure
111.16,
et les échantillons rmt éti§
trait~s 10 minutes h 90 Os par la pipérirjine 1 M.
!.).
Effet de la cüncentl'ation ioni que
La format ion d'une tr' iple li.;'; l icc est fa'tor i sée par' une augrol'ntél-
1
tion
de 18
force
ionique par la présenc~ de certaines polyamines comme la
spermine
et
aussi
par
certains
polyols
(8thylèneglycol)
qui
r&duisent
la
1
1
1

---

...'
- .-
Figure 16
ripurc 17
!l.Jsur'~~ : f\\UtOI'3'liogr'(-lllime
(lu
g<;1
ci"
;,';qll,"llèC
du
27Inèl'e-'~8 (1,60
;{
1c\\-('
Î'1.1
il'radi(~
en
fOI\\ctiorl
(k~
La
conccn[;I';'tLlotl
'="1
TO-MDJ\\P;:"l
sC~LJl (rults J\\. [J, Cl ct €Il
rH'';~oCIiCe (J'un C:«'.23
de
polyd(G-C)-
pCJlyrj(G-C)
rj;]n~ le laI1Ip'.')l C'éH:odyl<:lt': 1(1 rnH, NaCl 10(1 mt-l, 1,117 à (1°C.
l'ui.t:'l f,
:
lT8-r~L1flp?+ j '"' 1 J) x HrC, M
Plll\\:~ [):
T8-MLlnr~+J = S,~I x 10-~ t-\\
PUIts C:
T3-I1Dfll-"~~
=
1,1.> x 1u- 5 1'1
Le:.:;
puil:,>
l.',
E
ct
F
'"'ol~tic>ntlr;i1t
r'>'3pu:LlveinO:::ri\\
1';3
mêtll'23
,;onccll[;l'aLions 8n TI:l-r-1[)!lp:~f que Jo2.": JjulLS fi, I3 [·t C, rie 1)1,)3 i.Ls ~'Üi\\t\\enncnt,
1,30 x
ID-II H cl·? polYlhG-()-po!yd{C-C).
Figure I l l . 1ï
Le:.>
condili<)J),',.
r=Xj)(killlcnta18S
~30nt
"~C'llcs
de
la
f'igUl'C
111.1G.
LC~3 éCfléllltil10ns sonL tl'rtiLés 10 mirllJtc,,", ,'1 9üoc p,cH'
]a l)ip0r'i\\jill~ 1 M.

---

répulsiorl de~ charges négati':es des phosphates (27-32). Lorsque
la concen-
trat~on en NaCl augmente, l'intensité et la spécificité des coupures, pro~
duites par Je TB-î1011.p2 f
sur
le 27mère en
milieu
neutre du côté 3'
dc la
!',équence c.)mplémentéJ ii'e, élugmenLerlt.
La
figure
IIl.ll.JA montre l'effet de la concentration ionique sur
l·~ pr'ofil dr: dégradaLion du 27mèr{~-AB.
-
Les pUi ts D,
E et F contiennent 1,6 10-6 H '~:l 27 m02re AB et 1,6
10-6 ,"1 en TB-~1DAP2+. La concentr'aLion en sel est l'espectivemr:nt de 100 mt1,
250 mM et 500 m.M.
A faible force
ionique,
le3 bases
l,~s plu::> touchées sont
toutes du côté 3'
de la séquence 11.8. Lorsque la concenLration en NaCl aug-
mente,
les coupur'es apparaissent des deux côtés de la séquence A8. Ces cou-
pur(~s ne peuvent être interprétées que par la formaLion d'une tr'ip1e hélice.
Il apparaît en outre (les pr'oduits de pontage en quantLté croissante.
Dans
les puits
1 à
5,
\\a concentt'ation en TS-MDAP2+
est 10 fois
supérieul'e ;,.
celle du
2'(mère-As.
La
concentration çn
NaCl var'ie de
100 mM
dans le puits 1 à \\ M dans le puits 5.
Le profil de dégradation observé met
encore Gn évidence des coupures de c;"1aque côté de la séquence AB,
Dans ces
conditions, et eommG démontré précédemmt"nt, ces r6:JultRI~S prouvent la forma-
tion d'une Lr'iple hélicc entr'e la séquence AB du 27 mèt'e et de Ta-11DAP2+.
Le
Lrclitement
des
échantillons
par
la
pîpéridine
M (figure
rll.l~13) augm8nte l'intensité de coupure au niveau de toutes Les I)as~s mais
SUI'touL du côté 5'
de
la séquence AB.
L.e tableau ci-dessOUS donne le pour-
centage de coupures de trois bases prises de chaque côté de la séquence AB.
Ci~S pourCGntag8s ont été calcull~~ à
partir" des densltogramrnes des figures
1l1.1~A et B. On observi~ un enrichissement des couput'es sur les guanines
(;8
et G'9'
par contre le pourcentage t'este relativement constant au niveau de
la thymine T18.
1
Les coupures obse~vées sur cette biJ3e sont donc des coupul'es spé-
1
cifiques et tendent à montrer que le TB-MOAP2+ s'or'iente de façon pai'allèle
à ln
séquenl:c
AS
du
2'Tmère.
L":;)nrichiss~:nenL des coupures au tllV0.:lU des
trois
guanines
de
chaque
côté
de
la
séquence
AB
peut
être
atLribué à la
1
formation d'une triple hélice.
CeLte t:,iple hélice
se
forme
même à
faible
force ionique puisqu'à 100 mm NaCl (puits ï) on obser've déjà
3 % de coupure
1
1
1

---

q
166
sur la guanine Ge.
et 8,5 % sur 1~1 guanine G"19 en mllielJ neutre. Le traite-
, 1
, ,
ment en milieu bél.siqu~ rait passer' ce pourcentage de 9 % à ':1 1, respective-
ment.
fI
partir' de
25ü m~1 en NaCl 1e=. ~(lupures sont ,je même ordre
de gran-
deur de Chi-1C]Ue côt6 de la séquence fIS: sail; 8 % en mili'2u Ileutr'e et 16 % Gn
milieu basique pOUl' la gUéllline CE"
9,3 % en milieu neutre et 13,5 % en mi-
lieu basique pouf' la guanine G19 de cl"1Bque ~ôLé de la séquence f,S-
- - -
~
-~
-
-~-
1
[TS-t1D.4Pé"J ~ 1 ,6 10- 6 11
[TS~I·1D!ip2' ] ~ l ,6 10-5 M
1
[NaClJ
100 m;'1
250 mM
500 ml'+:: 25u mM
500 m"
700 mM
1000 mOl
1
1
neutre
1 , °2
l ,98
~3'2 8,03 lU 3,58 8,62
Cs
li,
\\
,,
1
pipéridine
1
~ , ~ 1
5,73
7,26
1
8,65
1) ,'{Ci
17 ,05
1ô ,02
1 ~ ,Sl
neutr'S
3.6s
5.86
6.96
6
10.50
15 • ~ Il
16.92
''"7 J')
l ' J ' -
T18
pipéridine
5,93
5.39
6,07
7,98
9 ,16
8,35
8,02
9 ,2l.J
neu tI" e
10,20
8 , 1~
6 • ~5
3,5
10,92
S.87
8,69
8,81
1
Gp1
pipéridine
17, "9
1 3.78
11 .20
1l.J ,02
16,20
13.!18
1 2.97
" .92
TABLEr"u III.E
PQurc:entages
de
dégradation
(ju
21
mère
!il:)
par
'l'8--MDAP2-t
mNlurés
sU)"
les
bases Ge. T1S.
et G19
é'n fonction .je la cllcentr<ltion en NaCl. L.i. concentra-
tion en 27 mère A8 est égale à 1,6 10- 6 M.
1
1
1
1

---

Conel us 1on
TS-MDI'I P2+ semble toujour'3 former
lUlè triple hélicc 8VéC le 271n"'re~
AS et cc aussi bien à faible qu'à h8ute concentr-ation en N2Cl. L'irrarJiation
des complexes induit:
~ des coupureS en milieu
nWltre du côt02 3' du 27mè('e-i\\:j Gues au TS
apP8)' lé
Diwallèlement.
Ce
dernier'
8st
alo/'s
apparié
par
des
1i8ison5
Hoogsteen
;
-
des
Dontage5
du
Ts-t·mAP2+
sur'
lél
cible
complém,.ôntaire
deux
types 1e
pont.::!ge
corresl:)Ondent
à
l'2.l:.l:.ache;n,~nt d'un et ne deux '\\'e sur
le
27mère-As
-
des
réactions
d'oxydation ,jcs
guanines du
côté 51
: ces r'éac-
tians ne conduisent p~s 2 des coupures importantes en m\\lLeu neutre, mais le
trai ter1'lmt
en
mi..1.ieu
basique
met
,,::la~rement en
,~\\'idc:nce des
r::oupUT'es
au
niveau 1e ces guanines. Les produits d'cxydation du 2'imère-As peuvent migrer
en milieu neutr'<2 soit comme le 27mère
intact ou être
inclus
'181\\3 les pro-
rjuits de ponL3ge
-
les
produits (\\.-e
pontûge
traités
en milieu
basique donnent
des
fragments
plus
courts
que le 27mère,
d'J
27mère
intaot
ou
des
pr'(11IJits
de
27mère altér~s mais migrant de la même façon.
Dans oette ifltI21'prétation,
les deux molJcules de MDI'IP2+- sont cer-
tai.nemer,t dans des environnements différents puisqu'ils sont li.és à des
TS
qui
n'ont
pas
le même mode de liaison hydr,.)g~ne avec la séquence A.g.
Bien
que la séquence soit identique sur cinq bases de chaque côté de la séqut?rl'::~
AS,
la
structuT'i::
esL dissymétr'ique et
doIt
favoriser
une
Lnter'action pluS
forte de la molécule de M[lflP2+- du côté 3'. La guani'le étant meilleur donneur
d'électro,", qU8 la
thymine,
les r'éacqcns dc coupures dU squelett." pho3pho-
diester
sont
très
pronorlcées élU niveiJu de cette base des deux côtés d8 la
séquence AS.

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---

CONCLUSION GENERALE

---

170
Le MDflP2+ et le t'is-DlIP 1.J+, molécules dél'ivJcs du
noyau pyrène, se
l~évèlent avoiJ' des car'actéristique,'i spectl'ides trÈ:s int.4,.~ssantcs.
-
Les spc::'ctl'es d'absOl'ption di:Jf\\s le procll'j ultraviolet pr'ésent8nt
deux bandes bien sép,wécs très l'ésC'lues en ban,jes vibroniques peur le MDAP2+
et POut' Je bis-DII.P!.j+. Les )'ésultélts de polarisation de [l uoresçencc montr'Ont
que ces deux
lransiti.on.'3
contenues
dans
le pléln du
noyau diélzapyrène
sont
perpendiculaires l'une à 1 'autn~.
-
Les spcctre~, <j'émission de fluor'e:~çence sont aussi très résolus
et
sont
l'image mÎx'oir
('L\\.l
8pectre
d'excitation
el;
d'absorption
d3ns
la
pt'(~mi ère tr'ansi tian. Ils sont légèr'=men t dép 1acés vers 1e:3 grandes longueur's
d 'on<je pour le bis-DJ\\P1.J+.
-
Le r€ndement
<luanti,~ue de fluorescence du MDIIP2+ dans It':'s solu-
tions
aqueuses
est
très
élevé
(0,81),
b€aucoup
plus
élevé
Que
celui
du
dimère bis-DAP!.j+.
Le
fluo['cscence
de ce", doux molécules est
totalement éteLr\\.te par
les
ions bromur'CS et
j(Jc\\ures pal' effet
d'atome
l(Jurd.
EIl'=
est
également
éteinte par
les
bases nucléiques.
Cette
inhibition de
la flUor'escence
des
deux compos'Ss,
plus effi.cace en présence de
bc"lses pU1'iques
que
de
bases

---

J 7!
fJyr'imidiques,
peut
être
attribu~e à une inter'i.!ction d'empilement du noyau
diazClpyrènc avec celui
(ies bases,
E:mpilc·m~mt plus féJvor'able dans le ca~ d2S
bases
pul'iques
que
pYl'imi ,1 i'1ue,c; ,
en
plus
08
l'inhibitic1n
collisiom1811e
limitée par ln diffusion.
Ces
nouvelle::; molécules intE:l'aBisscnt avec les
acides nucléiques
en simple et double brin.
Ces
inter8ctions modifient
profondément les pro-
priétés spf:ctroscopiques des deu:< composés.
-
Le
déplacemenL des spectres d'absCl'ption vel'S les grandes lon-
gueur.s d'onde s'accompagne d'un hypochromïsme
important sur lC's
r1r:'ux
pr'e-
tni~r'es bandes d'absol'pLiorl.
- L'émission de fluorescence e:.>t totalemE~nt
intlibée par' les acides
nucléiques en simple ou en dounle
brin.
CetLe
inhibition est d'autant
plus
forte que le po.lynu,~léotide cst:. plus riche en paire", d(l bases G-C, mais les
paires de bases A-T ét€ignent
aussi Cétt,E: fluor'escenc(l.
Les
color<ints
qui
s'inte~'calent dans la (10Ublf~ hélice dc.'} acid'3s
nucléi'1ues
ont
la
propriét:.é
de
dérouler'
l'ADN
surêlJl'oulé.
Les
résultaL3
électrophol"étiques
d'2montrent
que
le
~-1DAp2+ se comporLe aussi commE: un
intercalant car
il déroule l'ADN surenroulé.
De
plus
les
résultats
du di-
chro"î.sme
liné~~ire montrent:. que le pUn du noyau dLazapyrène fait un
angle
moyen de 80° avec l'axe de la double hélice dcs acides nucléiques.
La fixa-
tion du ~1Di\\P2+ sur le poly(dAJ-poly(dT) est. coopérative tandis qu'elle est
ant:.icoopératî ve <iVec les outr;~s pCllynucléotides en double brin.
Cette rjif-
férence
dc
compot'tement:. est aussi
une çlJ'opriété des molciculeé3 qui s'intel'-
calent
d,"ns
la
double
hélice.
L'ensemble
de
ces
résultats
constitue
un
faisceau d'arguments en faveur d'une interaction par intercalation du noyau
diazapyrène avec les acides nucléiques.
Lorsque
18S acid,~s nucléiques sont
irradiés
0. > 301} nm) en pré-
sence de ces d\\~ux composr?s. on obslJrve ,'3. la fois
une
coupure
du squelett(l
phosphodiester E:t une 0xycl<-ttîon des bases nucléiques. LéI gU8nine est de loin
la
base
la
plus
touclléE:.
Un
des
mécanismes
possibles
de
l'oxydation
des
1
bases par le MDAp2+ et le bis-DAp4+ est le transfert d'Un électl'on des bases
VI~('S le noyau diéJe-apYI'ène pour génél'er un radical c8tion MDAP+-. Ce radi,'~al
cation Deut:. réagir' SOiL directemenl; SUl' l,?~, bases, soit avec l'oxygène molé-
1

---

172
culaire
pOUl'
génél'~r
l'anLL,n
super'o:.:yde
°2- 0
L'évolution
de
C:ot
anion
•
superoxyJe conduit à la production dans le milieu du l'adiC<11 hydroxyle OH".
Ce
radical
en
èirrach8nt
un
atome
d'hydrogène 31H' le
carbone ': 12 du Sucre
conclu!t à une coupure du squ(,olette phoGphodicstet' df~S acid('s nucléic~\\Jt:3.
Ces molécul:05 sont donc d,~s Llgc:nts de coupurt: puissants des acides
nucléiques.
Couplé
de
Caçon
co'.'aLente
sur
\\l;)
oligonucléot\\àe
l'ensemble
(oligonucléotide-MDAp2+)
se
C'ompO!'"'te comme
une
l'enàonu(~léase "t'[;ificielle"
sur un 3cidé nuoléiQue cible com;Jlémentaire de l 'oligoTlucl&otidc.
Nous
('[vans
montré
que
dans
le
système
utilisé
pour
suLvrc les
propriétés
photochimiques
de
ces moléc1.11es
(27m8re-,!\\8 ITG-tmAp2+),
l'olig,o-
thymidylate couplé
au MDAp2+ sembl~
tOUjOllr'3
favoriser la formation d'une
triple hélice a.vec l 'oligonllcléotide comportant 27 IlllCléotidcs eL
conl;enant
une séqul?nce de G adénin~~ contigues.
Une d<2gradation de l 'acide nucli~ique
ciblé est alors obset'Vée de chaque côté de la séquence AS protégée de même
qU8.
la
[or'(!1.;'ltion
de
pontagcs
correspon~1ant à
Ja
fixa,tian
covahnte
d'un
octathymid)'lat-ël puis de deux O"Lll' le 2'( Inère-As. Ce COmpoJ'temcnt est vrais€(!1,-
blablement
dû à
une
très
grande énergie d'empilement du
noyau diazapyrène
avec le~3 base.s de chaque côté de lB. mini-double hé] ice favorisant''''(linsi la
formai;ion de triple héliceo
. /(;>'~ '''l''~~,,,,,,?
;;
('I!:IP1_1~O...
~
'" l
'
~
-
C~s molécules qUI dégradent les aCIdes nUCltiqùes constItuent do c
comme les porphYrines de nouvelles substance::; capables ~~.:.~pké€!)In§~t~v.c0T/
·ts
virus par
lr'radli'l.tion avec une lumière de longue'jr d 'o~~o5)~\\. à 300
~
,rli(.""""o!,~
nm.
Ds
IJlus,
le MDAP'- + couplé dE' façon covalente 3 un oli
~.Lde, se
cçmporte comme une endonucléase sur l'3cid,: nucléique cible. L'ensemble pt'ut
donc ainsi
constituer' un nouvel outil, permettant d'inhiber de façoon sélec-
tive l'expr'ession
d'un
gène
indésirable
ou
de
bloqué'r'
la
réplic3ticHI
des
virus.
1
1
1

---