FACULTË DE MËDECINE SAINT·ANTOINE
UNIVERSITË PARIS VI
-,
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THESE
'.'''-.: I!~rnz~r""""
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pour l'obtention du
DIPLOME D'ETUDES ET DE RECHERCHE EN BIOLOGIE HUMAINE
Spécialité: IMMUNO-HËMATOLOGIE et IMMUNO-GËNËTlQUE HUMAINES
L'ENSEIGNEMENT DE L'IMMUNOLOGIE ET
DE LA TRANSFUSION SANGUINE
EN AFRIQUE NOIRE OCCIDENTALE:
UN PROGRAMME ET DES MÉTHODES
Présentée et mutenue publiquement lJ Paris,le 15 Avri/1985
par
SECLONDE Comlan Hospice
Sous la Direction de Monsieur le Professeur Charles SALMON
DACTYL PAINT ·135 AUE DE VAUGIRARD -75015 PARIS· 783 3309

---

A notre Ma~tre, le Professeur Charles SALMON
Vous avez inspiré ce sujet tout à fait original et conduit
méthodiquement les travaux jusqu'à
sa réalisation complète.
Il ne fait plus de doute aujourd'hui qu'un avenir transfusion-
nel: meilleur du Continent Africain, réside dans la mise sur pied d'un
système de fomzation approprié correspondant aux besoins spécifiques
de ce continent.
Pour avoir inspiré ce sujet, vous êtes l'un des promoteurs
de cet avenir.
Cher Ma~tre, permet-tez que nous vous en remerciions
sincèrement et veuillez recevoir notre profond hommage.

---

Aux MerrVres du JU1."!J,.
M:r.l.gré vos mul.tipl.es chapges quotidiennes, vous avea accepté
de participer au jugement de ce travail. original..
Ce faisant, vous apportez directement votre contribution
au déüel.oppement: de "L' Inmunoloqùe et de "La Transfusion Sanguine en
Afrique Noire et partiiauldèrement: au Bénin.
Pe~ettea-nous de vous présenter nos sincères remerciements.

---

La réal-isat-ion de ce travail, a été faciLitée par 1, 'aide de
certaines personnes qui ont bien vouLu d'une part, nous accepter dans
Leur service pour y travaiLLer, et d'autre part, apporter des correc-
tions aux techniques que nous avons rédigées.
Nous pensons ainsi au Docteur Geneviève MOUGEOT, Chef du
Laboratoire de ParasitoLogie de 1, 'hôpital, Saint-Antoine ;
au Docteur Gittes AVENARD, Chef du Service Central, d'AnaLyses CNTS-
Production (Orsay) ; au Docteur Jean LEBLANC, Chef du Département
Assurance qual/ité et produits diagnostiques CNTS-Production (Orsay) ;
à lbdame COUROUCE et à M::zdame BENAMON, Chefs des Laboratoires d'Hépatite
Vira Le CNTS-Cabane L.
Nous pensons éqal.emeni: à ftbdemoiseHe Suzanne LANSET,
à MademoiseUe Véronique BROD et au pereonnel: du Secrétariat avec qui
nous avons constamment travaiLLé tout au Long de notre séjour dans Le
Service du Professeur SALMON.
Nous pensons enfin à tous ceux qui ont, à queLque niveau que
ce soit, apporté Leur contribution à La »éal.ieat-ion de ce tiravail: ainsi
qu'à ceux qui ont participé à notre formation.
A toutes ces personnes, nous présentons nos sincères
remerciements et nous Les associons dans un même hommage.

---

COMPOSITION-DU-JURY
Président :
Charles SALMON
Professeur d'Immunologie à
l'Université Pierre et Marie cux-ie Paris VI,
Direateur Général du CNXS-Institut Raris
Autres merribres :
Jaaques RUFFIE,
Professeur au col.lèqe de France,
Président du Conseil d'Administration du CNTS (Raris)
M:zra GENTILINI,
Professeur à la Faculté de Médeaine de Paris,
Titulaire de Chaire de Santé dans le monde,
Chef du Service de Parasitologie à l'Hôpital Salpêtrière
(Paris)
Claude ROPARTZ,
Professeur dé Génétique à l'Université de Rouen
Direateur du Centre Régional de Transfusion Sanguine
(Rouen)
Dr JUBANI LEIKOLA,
Ma-ttre de Conférence â'Tmmmoloqie à l'Université
d'HELSINKI,
Directeur du Progranrnede Sang à la Ligue des
Soaiétés de la Croi:r: Rouge et du Croissant Rouge
(Genève)

---

1.
SOMt1A 1RE
AVANT-PROPOS
1NTRODUCTI ON
5
1. - LES BUTS A ATTEINDRE
.
7
1. En Immunologie Générale
.
8
2. En Immuno-Hématologie .............•.....•....................
8
3. En Transfusion Sanguine .......•..............................
10
11.- ~lETHODES ET TECHNIQUES SH1PLES APPROPRI EES ..•...................
12
1. En Immunolog i e Généra le ............•.........................
13
2. En Immuno-Hématologie
.
15
- Constitution de panels
dlhématies-tests
.
15
- Production de réactifs anticorps de groupage ABO
.
17
- Le problème du réâctif anti-D
.
18
- Production de l 'antiglobuline humaine polyvalente
.
18
3. En Transfusion Sanguine
.
20
- Recrutement des donneurs de sang .•.........................
20
Préparation de quelques composants sanguins dans les
Centres Provinciaux de Transfusion Sanguine .....•..........
21
II I. - CONDITIONS OPTmALES DE REUSSITE
~j-1Y:~" " ,
".'
:s.~'-.y.--;-.~.- •.. '
. 24
1. Rôle du Laboratoire Central dl Immunologift/~~ ge TransfuSion
',,-----1, "" "-
'
.
1 - , , '
S
r ,
angulne .......................•...... ~.~
~ ....•.......
25
2. Données de l a formation .......•...........'·.~.-~..u_~ -e,:...........
27
* D
'
th ~
.
'n!~rn~..,.."t(~·
27
onnees
eorl ques
~".~~;.
.
- Immunologie Générale
28
- Immuno-Hématologie érythrocytaire
28
- Transfusion Sanguine ..........•........................... 29
- Ana lyse du programme
29
* Données de la formation pratique
36

---

2.
Pages
- Travaux pratiques d'Immunologie Générale
.
37
Opsonisation phagocytose ..............•............
37
41
· Précipitation en milieu gélifié ....••......•••.....
(Imnmodttfus i on d' Ouchterl ony)
· Précipitation en milieu gélifié. Technique
d' él ectro'imnunod iffus ion ...•••.•.••••••••••••••••..
44
· Agglutination spontanée et agglutination passive .••
48
· Agglutination artificielle •••••••••.•••••••••.•••••
51
· Inhibition de l'hémagglutination passive •••.•••..••
54
• Immunofluorescence indirecte: identification d'un
anticorps anti-schistosome .•••..•••••.••••••••••.••
58
- Travaux pratiques d'Immuno-Hématologie ••••••••••••••••••
62
Formation Universitaire - ••••••...••.••.•.•••••••••• ....
64
• Analyse des Principes,gestes et réactifs utilisés
en Inmuno-Héma tol agie
-. .. .. .. ..
..
..
65
.. Groupages ABD normaux
69
· Groupages ABO et difficultés, groupes rares •.......
71
.. Groupage Rhésus
76
,It ..
.. ..
..
· Le test de Coombs ..........•..••••••.••..•.•....•..
79
· Recherche de substances solubles ABH dans la salive.
83
· Recherche d'anticorps irréguliers et tests de
compatibil ités
86
· Etude des anémies hémolytiques auto-immunes IgG
90
· Etude des anémies hémolytiques auto-immunes de
type C
94
Formation Continue -
• Le phénotype plus élargi •.••.••••••••••..•••••••...
99
· Contrôle de qualité des réactifs •••••.•••••.••••.•. 102
• Lapolyagglutinabilité érythrocytaire T ••••••.••.•••
106
- Les Enseignements Dirigés
111
• Questions classiques
112
.. Questions jeux
.
134
.. Phrases à compléter
.
136
.. Vrai ou Faux
..
137

---

3.
Pages
• Invnuno-Hématologie ..•.......••••.•••..•..•.•.•.•.• 140
• Transfusion Sanguine ..•..•....•.••.•.••.••••••••.• 143
IV.- COMMENTAIRE .................................................. 147
CONCLUSION •.••••.••••.•..••• ~ •••••••••••...•••••••••••••.••••••.•• 151
BIBLIOGRAPHIE ·..
. 153
~
A N N E X E
-1-
- Technique de diagnostic sérologique des parasitoses •••••.•••••••
-2-
- Technique de dépistage de l 1 antigène HBs •••••.•••••••••••••••••• -34-
- Technique de production des réactifs de groupage ABO •••••••••••• -49-
- Technique de production de l'antiglobuline polyvalente ••••••.•.• ~60-
- Technique de préparation de quelques produits sanguins .•••.••..• -79-

---

4.
AVANT-PROPOS
Il s'agit dans ce travail de concevoir un programme pratique
exploitable dans notre pays, le Bénin. Le texte proposé au jury pourrait
ainsi paraître simple; mais tel est l'objectif demandé par le Directeur
de thèse. Cet objectif s'exprime comme suit:
"Que pouvons-nous entreprendre a notre retour au Bénin, qui
puisse être immédiatement réalisable à peu de frais, pour faire fructifier
l'expérience personnelle acquise au cours de notre propre formation 1"
Nous n'avons donc retenu dans ce programme que ce qui pourrait
être effectivement réalisé a court terme. Il en est de même pour ce qui
concerne les enseignements dirigés
a propos desquels nous nous sommes
bien entendu, fortement inspiré
des habitudes du service où nous avons
reçu notre formation.
Nous avons effectivement expérimenté ces enseignements au cours
d'un bref séjour au Bénin au Collège Polytechnique Universitaire
d'Abomey-Calavi.
Ainsi, cette thèse constitue l'élaboration d'un projet réaliste
de développement de l'enseignement de l'Immunologie et de la Transfusion
Sanguine dans un pays d'Afrique Noire.

---

5.
INTRODUCTION
Le développement d'une discipline donnée dans un pays, passe
obligatoirement par une bonne formation des hommes, formation appropriée
à cette discipline et spécifiquement adaptée aux besoins de ce pays
(66, 92).
Cette vérité évidente n'est pas encore totalement appliquée sur
le Continent Aficain en général, et en particulier au Bénin, dans les
domaines de l'Immunologie et de la Transfusion Sanguine.
C'est pour cette raison que notre Maître, le Professeur SALMON,
qui a souvent plaidé pour un meilleur enseignement de l'Immunologie et
particulièrement de la Transfusion Sanguine (111) à travers le monde, nous
a demandé de réfléchir aux méthodes simples et efficaces à mettre en pra-
tique, pour promouvoir au Bénin, une formation universitaire et une forma-
tion continue de qualité dans ces deux domaines.
En effet, après nos études effectuées avec succès à l'Université
Pierre et Marie Curie à Paris VI en Transfusion Sanguine (Diplôme Univer-
sitaire de Transfusion Sanguine), en Immunologie générale (Certificat
d'Etudes Supérieures dl Immunologie Générale), en Immuno-Hématologie et
Immuno-Génétique Humaines (Attestation d'Etudes Approfondies dl Immuno-
Hématologie et d'Immuno-Génétique Humaines), nous nous sommes inscrit au
Diplôme dl Etudes et de Recherche en Biologie Humaine (3ème cycle de
Biologie Humaine).
Là, nous avons été admis au laboratoire d'enseignement du
Professeur SALMON et nous sommes ainsi passé de l'autre côté de la bar-
rière, pour participer activement à la préparation des travaux pratiques
et à la conduite des enseignements dirigés.
Alors que la vie d'Etudiant apparaît très simple et consiste
seulement à recevoir les cours déjà extrêmement travaillés et des travaux

---

6.
pratiques parfois trop préparés, celle de formateur apparaît beaucoup plus
complexe. Elle consiste à :
* Concevoir des cours théoriques à partir d'un ensemble de ren-
seignements parfois discordants
* monter des travaux pratiques présentant une utilité réelle, et
à effectuer à l'avance les expériences appropriées;
* prendre en charge des individus pour les conduire à l'acquisi-
tion d'une assimilation correcte de la matière enseignée, et cela à partir
des enseignements dirigés.
Tout cela exige du formateur, d'une part, un savoir-faire incon-
testable, ainsi qu'une expression claire et simple à la portée des per-
sonnes en formation ; et d'autre part, un véritable esprit de synthèse
traduisant une parfaite maîtrise de la discipline enseignée.
Nous nous sommes exercé à ce métier pendant deux ans dans le
service du Professeur SALMON après nos études universitaires. (lest cette
expérience que nous voudrions mettre à profit à la fois aux côtés du corps
médical et du corps enseignant de notre pays, d'une part, en formant des
techniciens et des étudiants en médecine, et d'autre part, en apportant
notre contribution à la réalisation de certains travaux de laboratoire
ayant un but diagnostic.
Comment peut s'opérer concrètement cette mise à profit de notre
formation? C'est ce que nous tenterons de dégager tout au long de ce
travail, en examinant successivement:
* Les buts qu'il convient d'atteindre au Bénin en Immunologie
Générale, en Immuno-Hémato10gie et en Transfusion Sanguine
* Les méthodes et techniques appropriées
* Les conditions optimales de réussite.

---

7.
1,- LES BUTS A ATTEINDRE

---

8.
1.1. EN IMMUNOLOGIE GENERALE
Depuis quelques années, l'Immunologie Générale devient une dis-
cipline biologique fondamentale qui apporte de précieuses données expli-
quant éloquemment divers phénomènes pathologiques chez l'homme.
S'agissant des maladies infectieuses, surtout les maladies
parasitaires et virales, l'Immunologie Générale permet encore, grâce à
de récentes acquisitions techniques, d'apprécier le stade d'évolution des
infections et d'orienter ainsi les cliniciens vers une thérapeutique
curative et/ou prophylactique efficaces.
Ces différentes données de très grande importance, sont genera-
lement obtenues à partir de tests sérologiques simples, dont le principe
consiste à exploiter dans un but diagnostic, la spécificité de la liaison
antigène-anticorps.
Dans le cas particulier de notre pays aux possibilités écono-
miques très limitées, et où sévissent différentes parasitoses ainsi que
l'hépatite à virus B, la mise au point de méthodes immunologiques de
diagnostic de ces différentes affections serait d'une grande utilité.
La formation que nous avons reçue nous permet alors d'élaborer
une stratégie et des techniques simples qui pourraient être mises en pra-
tique dans notre pays, pour diagnostiquer les principales parasitoses
locales et dépister régulièrement l 'hépatite à virus B chez les donneurs
de sang, à partir d'un matériel relativement simple.
Cette stratégie et ces techniques sont portées à l'annexe de ce document.
1.2. EN IMMUNO-HEMATOLOGIE
Les examens immuno-hétamologiques correctement effect~és tant
en nombre qu'en qualité, constituent la base de la sécurité immunologique
des transfusions dans un pays. Cela implique la disponibilité d'un person-
nel qualifié et d'un minimum de réactifs appropriés.

---

9.
Or, ~ l'heure actuelle dans notre pays, le groupage ABO qui
représente le seul examen immuno-hématologique largement effectué, est
encore trop souvent limité au seul Beth-Vincent (détermination des anti-
gènes érythrocytaires). Cela constitue une grave entorse à la règle de
détermination correcte des groupes ABD, cette détermination devant norma-
lement être faite par une épreuve globulaire ou Beth-Vincent et par une
épreuve sérique ou Simonin.
Un autre aspect tout aussi important en Immuno-Hématologie,
concerne la compréhension et l'exécution correctes du test de Coombs.
En effet ce test est fréquemment effectué en Immuno-Hématologie pour
diagnostiquer les incompatibilités foeto-maternelles et les anémies hémo-
lytiques immunologiques. Sa mauvaise exécution peut être à l'origine
d'erreurs de diagnostic particulièrement graves, si par exemple une allo-
immunisation foeto-maternelle est méconnue. Ce test est actuellement peu
effectué dans notre pays.
Le troisième aspect
également important en Immuno-Hématologie,
se rapporte à la recherche des anticorps irréguliers. Cette recherche per-
met dt identifier précisément le ou les anticorps responsables des maladies
hémolytiques néo-natales par incompatibilité foeto-maternelle et des
accidents retardés de la transfusion. Cette recherche n'est pas encore
effectuée dans notre pays.
Il résulte de ce qui précède que, les buts qui doivent être
atteints par notre pays sont de trois ordres et peuvent être formulés
COIl11le suit :
* application rigoureuse des techniques correctes de groupages
ABO et Rh standard dans tous les laboratoires d'Immuno-
Hématologie i
* exécution correcte du test de Coombs dans les laboratoires de
Cotonou et de Porto-Novo suivant une technicité rigoureuse i
* exécution correcte de la recherche d'anticorps irréguliers.
Pour atteindre facilement ces différents buts, il faudra d'une
part, constituer un panel d'hématies appropriées à partir de donneurs

---

la.
de sang locaux, et d'autre part, préparer localement dans un laboratoire
agréé par l'Etat Béninois, les réactifs de groupage ABD et le réactif
antiglobuline humaine polyspécifique.
La formation que nous avons reçue nous permet encore ici d'indi-
quer des méthodes et techniques simples surtout peu onéreuses, pour cons-
tituer le panel d'hématies et préparer les réactifs ci-dessus précisés.
Les techniques simples à appliquer pour produire localement les réactifs
de groupage ABD et le réactif antiglobuline humaine po1yvalente sont.
portées à· l'annexe du présent document.
1.3. EN TRANSFUSION SANGUINE
La Transfusion Sanguine représente l'une des applications pra-
tiques de l'Immunologie et de l'Immuno-Hématologie réalisable un peu
partout dans le monde.
Bien que cette réalisation de la transfusion soit simple, elle
comporte néanmoins d'énormes risques.
A l'heure actuelle, son niveau est très bas dans notre pays et
se situe aux alentours de 3 prélèvements annuels pour 1 000 habitants.
En raison des
principaux aspects soulignés ci-dessus, les
buts que notre pays doit s'efforcer d'atteindre dans ce domaine sont de
deux ordres
* d'une part, recruter le maximum de donneurs bénévoles de sang
* d'autre part, garantir la sécurité des transfusions.
Pour atteindre efficacement ces deux principaux buts, notre for-
mation nous permet d'avancer trois grandes propositions pouvant sensibi-
liser significativement une bonne partie de la population Béninoise au don
du sang. Elle nous permet également d'élaborer un programme d'enseignement
dont l'exécution devra servir à donner aux techniciens ainsi qu'aux utili-
sateurs du sang, les connaissances de base appropriées. Ces propositions
seront exposées dans les parties II et III de ce travail.

---

11.
Ainsi, nous venons de définir successivement les buts que notre
pays devrait s'efforcer d'atteindre en Immunologie Générale, en Immuno-
Hématologie et en Transfusion Sanguine.
Nous allons maintenant envisager les méthodes et techniques
simples qui pourraient être mises en application dans notre pays, pour
atteindre sans grands moyens les buts précédemment définis et, accéder à
une meilleure qualité dans les prestations de service propres à l'Immuno-
logie et à la Transfusion Sanguine.

---

12.
II. - METHODES ET TECHNIQUES SIMPLES APPROPRIEES

---

13.
ILL EN IMMUNOLOGIE GENERALE
Les parasites et les virus, en particulier le virus de l'hépa-
tite B ont une incidence considérable sur la santé et sur l'économie de
notre pays. Ils diminuent très significativement la vitalité et la produc-
tivité de la population active. Cependant, on n'est pas encore en mesure
d'appliquer localement, les tests sérologiques appropriés qui permettraient
un diagnostic spécifique.
Rappelons qu'en parasitologie, ces tests sérologiques sont très
utiles dans la plupart des cas et irremplaçables (43) dans trois situa-
tions qui sont
• la phase larvaire des helminthiases (exemple
les bilhar-
zioses) ;
• les localisations viscérales au cours des amibiases et des
mycoses profondes
• et lors d'impasses parasitaires, c'est-à-dire, toute situation
dans laquelle un parasite ne peut effectuer son développement
complet chez l'hôte (exemple: séjour de Toxocara canis, para-
site habituel du chien chez l'homme).
En ce qui concerne l'hépatite virale B, les tests sérologiques
permettent non seulement de dépister les porteurs sains du virus B, mais
aussi de diagnostiquer la forme aiguë de la maladie et d'étudier son évo-
lution au cours du temps.
Compte tenu de l'efficacité de ces tests sérologiques pour le
diagnostic des parasitoses et de l'hépatite B, nous voudrions communiquer
quelques techniques simples qui pourraient être réalisées au Bénin.
Ces techniques que nous avons sélectionnées, adaptées aux condi-
tions du Bénin et effectuées dans différents laboratoires du Centre Natio-
nal de Transfusion Sanguine, ainsi qu'au laboratoire de parasitologie de
l'hôpital Saint-Antoine à Paris, sont présentées à l'annexe de ce travail.

---

14.
Leur mise en pratique dès l'acquisition d'un microscope à fluo-
rescence, permettrait de diagnostiquer cinq grandes parasitoses locales
en toutes circonstances. Il s'agit des bilharzioses, de l'onchocercose,
de la toxoplasmose, des amibiases viscérales et des mycoses profondes.
Un tel effort constituera un grand pas vers le contrôle de ces affections.
Quant au paludisme dont le diagnostic immunologique échappe
encore à ces premiers tests sérologiques, seule la recherche d'antigène
plasmodial dans le sang circulant, pourrait favoriser son identification
même en présence d'une très faible parasitémie. Ce nouveau test sera
publié sous peu.
En ce qui concerne l 'hépatite virale B, bien qu'à l'heure
actuelle le débat soit ouvert sur l'opportunité du dépistage systématique
ou non de l'antigène HBs chez les donneurs de sang en zone d'endémie
(137), la mise en pratique des tests sérologiques (immuno-diffusion,
électro-immunodiffusion et inhibition de l'hémagglutination) que nous
présentons à l'annexe de ce travail, permettrait:
* d'apprécier la prévalence de cette affection dans la popula-
tion Béninoise
* de destiner tout au moins aux nouveaux-nés, à la pédiatrie et
aux malades particulièrement affaiblis, des unités de sang
dépourvues d'antigène HBs.
Au total, nous venons de parler des méthodes et techniques
simples appropriées pour effectuer régulièrement dans notre pays, d'une
part, le diagnostic sérologique de certaines grandes parasitoses locales,
et d'autre part, le diagnostic immunologique des diverses formes de
l' hépatite B.
Dans la suite de ce travail, nous allons aborder les techniques
simples qui pourraient être appliquées pour produire localement certains
réactifs de première nécessité utilisés en Immuno-Hématologie.

---

15.
II.2. EN IMMUNO-HEMATOLOGIE
La réalisation des trois principaux objectifs fixés au point
1.2 de ce travail, ~st étroitement liée A l'acquisition de certains réac-
tifs de première nécessité.
Sans ces réactifs, on ne peut ni faire un groupage correct, ni
diagnostiquer les maladies hémolytiques néo-natales par incompatibilité
foeto-maternelle et les accidents transfusionnels retardés.
Déjà, l'acquisition de ces réactifs constitue à l'heure actuelle,
un problème sérieux pour notre pays, compte tenu de leur coût régulièrement
croissant. C'est pourquoi, nous voudrions, d'une part, indiquer ici la
méthode très simple A mettre en pratique pour constituer localement, le
fichier de donneurs réguliers de panels d'hématies, et d'autre part,
annexer au présent travail, les techniques simples à mettre en pratique
pour produire au Bénin les réactifs ABO et l'antiglobuline poly~alente.
Comme précédemment, ces techniques ont été sélectionnées et
adaptées aux conditions de notre pays.
En ce qui concerne le problème des réactifs anti-Rhésus, en
particulier le réactif anti-D, nous le discuterons A part. Mais auparavant,
voici les méthodes A mettre en pratique pour constituer dans notre pays
les panels d'hématies appropriées.
II.2.1. Constitution de panels d'hématies-tests (123)
Un centre de Transfusion Sanguine sans panel d'hématies-tests
appropriées, constitués A partir de donneurs de sang nationaux, ne peut
rien découvrir d'authentique, notamment en ce qui concerne les anticorps
irréguliers d'allo-immunisation responsables de maladies hémolyti9ues
néo-natales et/ou d'accidents transfusionnels retardés. Cela signifie que
ce centre de Transfusion ne connaîtra pas du tout ou connaîtra très peu,

---

16.
l'ordre d'immunogénicité des principaux antigènes de groupes sanguins
dans la population.
Dans le cas particulier du Bénin t on pourrait réussir à consti-
tuer un fichier de donneurs volontaires et réguliers de pane1s t en expli-
quant sous diverses formes et à plusieurs reprises t non seulement au per-
sonnel du Centre National de Transfusion Sanguine et à sa fami11e t au
personnel en service dans les locaux du Ministère de la Santé t au person-
nel du Centre National Hospital ier et Universitaire mais aussi aux familles
dans lesquelles ont été identifiés des cas de maladies hémolytiques néo-
nata1es t l'importance d'un panel pour l'efficacité des traitements à base
de sang.
Ainsi t pourrait-on dans un premier tempst déterminer les anti-
gènes de groupes sanguins reconnus immunogènes chez le sujet noir. Il
s'agit des antigènes Rhésus t Lewis t Ut P1t Ke11 t Kidd ••••
Par cette première démarche t on pourrait disposer d'un panel de
50 hématies congelées en permanence et convenablement réparties en 5
groupes de 10 hématies.
Chaque groupe de 10 hématies représentera le panel d'identifica-
tion dans lequel 2 ou 4 hématies au p1us t devront constituer le panel de
dépistage d'anticorps irréguliers.
Selon un rythme qui sera localement définit le panel de dépis-
tage pourrait être distribué aux Centres Provinciaux de Transfusion
Sanguine. Seul le Centre National de Transfusion Sanguine pourrait utili-
ser dans un premier temps, le panel de dépistage et le panel d'identifi-
cation. L'utilisation de ces deux types de panel pendant un certain tempst
permettra d'établir la liste complète ainsi que l'ordre d'immunogénicité
des principaux antigènes de groupes sanguins érythrocytaires ayant une
importance en transfusion, et d'adapter les panels définitifs aux fré-
quences antigéniques locales.
Quant au panel de référence, il sera plus tard constitué à
partir des mêmes donneurs t lorsque les recherches effectuées ou les moyens
financiers permettront de se procurer les réactifs anticorps spécifiques
aux autres systèmes de groupes sanguins. Parallèlement à ces travaux

---

17.
concernant la constitution de panels d'hématies- tests appropriées, il
convient d'entreprendre la production des réactifs anticorps de groupage
ABO et du réactif antig10bu1ine po1yspécifique.
II.2.2. Production des réactifs anticorps de groupage ABO
(42, 59, 69, 91, 106, 109, 122)
Les techniques approprlees qui pourraient permettre la produc-
tion locale de ces réactifs, sont portées à l'annexe du présent travail.
A notre avis, compte tenu des titres faibles en anticorps ABO généralement
constatés chez les donneurs non immunisés, on pourrait dans le cas parti-
culier de notre pays, et en raison des doses appréciables de vaccins
DTTAB inoculés aux soldats, entreprendre un travail de dépistage systé-
matique des militaires ayant des anticorps ABO de haut titre.
Ainsi, par l'application des techniques de production de ces
anticorps que nous joignons en annexe à ce travail, on pourrait dans un
délai assez bref, préparer les réactifs de groupage ABO pour la consom-
mation nationale.
Toutefois, compte tenu des besoins toujours croissants de ces
réactifs et surtout de la diminution progressive du nombre de donneurs
volontaires, on devra envisager dans un second temps, deux éventualités
• soit signer des accords de coopération avec les Centres de
Transfusion Sanguine producteurs de réactifs anticorps
monoclonaux, à cet égard, un accord bilatéral de coopération
technique avec le Centre National de Transfusion Sanguine
de Paris serait souhaitable ; -
• soit produire ces réactifs monoclonaux ABO et même anti-D en
Afrique Noire dans un cadre plus général (Conseil de l'Entente
ou Communauté Economique des Etats de l'Afrique de l'Ouest).

---

18.
II.2.3. Le problème du réactif anti-D
Jusqu'à ces dernières années, la production du réactif anti-D
relève de l'immunisation accidentelle et surtout volontaire de sujets
humains Rh- (négatif).
Depuis deux ans, pour des raisons d'éthique et surtout en raison
de la diminution très significative du nombre de donneurs acceptant encore
l' immunisation volo~taire, la préparation du réactif anti-D s'effectue
par la technique d'infestation des lymphoblastes humains au moyen du
virus d'Epstein-Barr (EBV).
Pour ce qui concerne le cas particulier du Bénin, déjà l'absence
de panels d'hématies-tests appropriés, fait qu'aucun contrôle immuno-
logique pré ou post-transfusionnel autre que les groupages ABO et Rh
standard n'est encore possible.
Il en résulte que pour les nombreux polytransfusés et les femmes
multipares, aucune sécurité immunologique des transfusions ultérieures
n'est pour le moment véritablement garantie. Dans ces conditions et sur-
tout pour des raisons d'éthique, il ne paraît pas opportun d'entreprendre
au Bénin, des immunisations volontaires en vue de produire des réactifs
de groupage.
A notre avis, la solution d'avenir pour faire face à nos besoins
en ces réactifs, ne peut être recherchée qu1au niveau de la signature
d'accords bilatéraux de coopération avec des centres producteurs d'anti-
corps monoclonaux anti-D, ou la création d'un Centre Régional Africain
de production de ces anticorps monoclonaux en Afrique Noire.
II.2.4. Production de l'antiglobuline humaine polyvalente
(47, 48, 144)
Le réactif antigl obul ine humaine est un hétérc-ant icorps <l'origine
animale, produit soit à partir du lapin, du mouton ou de la chèvre.
En Immuno-Hématologie, ce réactif est d'une grande importance, car il

---

19.
permet de nombreuses possibilités comme le diagnostic des diverses anémies
hémolytiques immunologiques, et l'identification des anticorps irréguliers
généralement incriminés dans les accidents transfusionnels retardés et
dans les maladies hémolytiques néo-natales par incompatibilité foeto-
maternelle.
En un mot, c'est le réactif qui permettra d'établir la liste
des antigènes de groupes sanguins érythrocytaires effectivement immuno-
gènes dans la population Béninoise. C'est également le réactif qui permet-
tra de garantir la sécurité immunologique des transfusions, surtout chez
les polytransfusés comme les drépanocytaires et les thalassémiques dont
le nombre n'est pas négligeable dans la population Béninoise.
Ce réactif est actuellement vendu très cher à notre pays. C'est
pourquoi, nous annexons à ce travail, la technique simple et appropriée
dont la mise en pratique au Bénin, permettrait de le produire sur place
pour la consommation nationale.
Compte tenu des ressources animales nationales disponibles, la
technique que nous avons retenue et adaptée aux conditions du ~énin est
celle qui utilise la chèvre et le zymozan. Nous avons retenu cette tech-
nique de l'OMS pour trois raisons:
• les chèvres existent et coûtent moins cher dans notre pays ;
• l'immunisation de la chèvre par le sérum humain total pourrait
provoquer chez cet animal, la synthèse d'anticorps anti-
albumine et anti-transferrine qui généreraient l·obtention
d'un réactif antiglobuline valable;
• le zymozan préincubé avec du sérum humain frais active le
composant C3 du complément par la voie alterne (144).
Le C3b résultant de cette activation est rapidement scindé
en C3d et en C3c qui se déposent sur les particules de zymozan,
et qui, après injection de ce zymozan à une chèvre, immunisent
cette derni ère.
.
Ainsi, pourrait-on, tout en contournant les difficultés concer-
nant la préparation de C3 et de C3d purifiés, produire localement une
antiglobuline polyvalente ayant une bonne activité anti-Complément.

---

20.
Au total, nous venons de présenter les différentes méthodes et
techniques simples appropriées pouvant permettre de réaliser au Bénin les
trois objectifs définis au point 1.2.
Nous allons maintenant envisager la transfusion sanguine pour
indiquer comment on pourrait préparer très simplement quelques produits
sanguins à usage thérapeutique. -
11.3.
EN TRANSFUSION SANGUINE
Fonder tout un organisme national d'approvisionnement en sang
humain sur la base de dons bénévoles et volontaires, constitue de nos jours,
un risque qui ne peut être surmonté qu'au prix d'une campagne active de
sensibilisation de la population, et d'une utilisation optimale des unités
de sang collectées.
En ce qui concerne notre pays, la mise en pratique des méthodes
de recrutement que nous indiquons ci-dessous, ainsi que l'appliçation des
techniques mentionnées ci-après pour la préparation de quelques produits
sanguins, pourrait apporter une amélioration sensible à la transfusion
sanguine nationale.
II.3.1. Recrutement des donneurs de sang (17, 22, 50,71,72, 73)
Trois actions fondamentales nous semblent nécessaires pour
accroître significativement le nombre de donneurs bénévoles de sang :
1°) Création d'un comité national composé de gens spécialement
formés pour le recrutement des donneurs de sang-bénévoles et volontaires.
A notre avis, cette tâche pourrait être e~~ment cQnfiée à la Croix-
Rouge Nationale.
I-~ (. '_ "''..::_ \\
2°) Edition d'une brochure à'~è~x~~~veau~~-direction de
' . f t
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t:..;-- ?
l'école Béninoise, brochure dont le contenu ~era:rt .~e;gné aussi bien
' . . . .
. 0
. . " , .
dans les écoles de base que dans les lycées et-èours secondaires.

---

21.
Dans cette brochure, seront clairement présentés :
· les composants du sang et leur rôle ;
· les aspects médicaux du don du sang ;
· l 1 importance de la transfusion sa~~uine dans le programme
national de santé.
3°) Expédition simultanée par les PTT et les Banques, des
bulletins de salaire et d'une note circulaire du Centre National de
Transfusion Sanguine, aux Agents Permanents de l'Etat pour les informer
· des besoins nationaux en sang et en produits sanguins ;
du nombre d'unités de sang collectées et de leur utilisation
· du nombre d'unités de sang à pourvoir.
Après avoir apporté ces informations à chaque Agent Permanent
de l'Etat, cette même note circulaire expliquera que le sang dont a besoin
un malade, ne peut venir que d'un autre homme sain, et invitera ce dernier
à offrir un peu de son sang dans l'établissement de Tranfusion Sanguine
le plus proche.
Mais les unités de sang ainsi collectées devraient être utilisées
dans un souci d'économie et d'efficacité. Dans cette perspective, la
méthode que nous indiquons ci-dessous, et les techniques de préparation
de quelques produits sanguins que nous exposons à l'annexe de ce travail,
pourraient être d'une grande utilité.
II.3.2. Préparation de quelques composants sanguins dans les
Centres Provinciaux de Transfusion Sanguine
(5, 6, 7, 82)
Les composants du sang qui peuvent être préparés dans les Centres
Provinciaux de Transfusion Sanguine dépourvus de congélateurs et surtout
de centrifugeuses réfrigérées, sont les concentrés de globules rouges et
le plasma liquide conservé.
Pour préparer localement ces deux composants sanguins, le sang
doit être prélevé en don ordinaire dans les doubles sacs plastiques conte-
/ '
nant du COP-adénine. Ces sacs plastiques seront déposés dans un réfrigé-
rateur à +4°C pendânt 24 heures, et maintenus en position debout par un
support quelconque.

---

22.
Les globules rouges vont alors sédimenter et le plasma surnageant
pourra être transvasé stérilement dans le second sac plastique. En effec-
tuant manuellement deux noeuds adjacents bien serrés au milieu de la tubu-
lure de transfert, cette tubulure de transfert pourra être sectionnée
entre les deux noeuds pour isoler les deux sacs. Dès la libération des
deux sacs plastiques, on pourrait renforcer la sécurité en effectuant un
second noeud bien serré à la base de chacun d'eux. Ainsi,obtient-on le sac
de concentré de globules rouges utilisable dans les 35 jours qui suivent
pour traiter efficacement les malades en anoxie tissulaire.
Quant au sac de plasma, il possède encore une activité d'environ
3D à 40 % en facteur VIII (82). Il pourrait être utilisé dans toutes les
situations d'hypovo1émie et même éventuellement en l'absence de cryo-
précipité, dans des cas d'accidents secondaires de l'hémophilie A maté-
rialisés par des hémarthroses.
Nous voudrions également souligner que, même en l'absence de
doubles sacs plastiques, le sang total prélevé dans des flacons d'ACD
ne devrait plus être utilisé sous cette forme pour traiter les patients
en anoxie tissulaire sans hypovo1émie. En effet, il suffit de:faire reposer
le flacon de sang sens dessus dessous pendant quelques heures avant l'acte
transfusionne1 proprement dit. On verra alors les globules rouges sédimen-
ter et la transfusion peut être arrêtée juste à la limite du plasma
surnageant.
Les plasmas ainsi recueillis pourraient être poo1és par groupe
ABO et clarifiés par centrifugation.
A ce niveau, il serait souhaitable que notre pays le Bénin,
conclue des accords de coopération technique avec des Centres de fraction-
nement étrangers, afin que de tels plasmas puissent y être envoyés pour
être fractionnés en albumine et en immunoglobulines standard.
Les produits de fractionnement ainsi obtenus, viendraient
compléter le matériel thérapeutique mis à la disposition du corps médical
national. Il est cependant indispensable de souligner que toutes les
manipulations précédemment indiquées doivent être rigoureusement entourées
d'asepsie, pour éviter toute souillure des composants sanguins localement
préparés.

---

23.
Au total, à partir d'un matériel relativement simple composé de
réfrigérateurs assurant une température de +4°C, de poches plastiques
doubles contenant du CPD-adénine, et/ou de flacons d'ACD et de bons
accords de coopération technique, il serait possible de mettre à la dispo-
sition des cliniciens, une gamme de produits sanguins à usage thérapeu-
tique comprenant: les concentrés de globules rouges, le plasma liquide
conservé, l'albumine et les immunoglobulines standard.
Cet arsenal de produits sanguins contribuera à améliorer les
soins apportés à la population Béninoise.
Par ailleurs, les méthodes de préparation de ces différents
produits seraient plus aisées, et les produits sanguins obtenus auraient
une meilleure qualité- si lion pouvait acquérir dans un établissement de
référence, une centrifugeuse réfrigérée, un congélateur de très basse
température (-SOOe ou -BO°C) et des poches plastiques triples.
Dans ce dernier cas, les techniques pouvant être utilisées
pour préparer localement divers produits sanguins, sont indiquées à
11annexe de ce travail (5, 6, 7).
Ces produits sanguins qui pourraient être localement préparés
sont: les concentrés de globules rouges, le plasma frais, le plasma
liquide conservé et le cryoprécipité unitaire.
Ainsi, nous venons de terminer la revue des différentes méthodes
et techniques simples appropriées susceptibles dlêtre efficacement
utilisées dans notre pays.
Nous allons maintenant envisager les conditions optimales à
remplir, pour réussir pleinement la réalisation effective des objectifs
précédemment définis au point 1 de ce travail.

---

24.
111.- LES CONDITIONS OPTIMALES DE REUSSITE
(60) 77) 104) 123) 129)

---

25.
La réalisation concrète dans notre pays des différentes tech-
niques simples présentées plus haut et à 1 1 annexe du présent travail,
exige la création d'un laboratoire central d'immunologie et de transfu-
sion sanguine. Ce laboratoire devrait être dirigé par une direction tech-
nique compétente, capable de concevoir un plan de développement approprié.
Les rôles que doit jouer un tel laboratoire sont très divers.
IlL1. ROLE DU LABORATOIRE CENTRAL D'IMMUNOLOGIE
ET DE TRANSFUSION SANGUINE
Le Laboratoire Central ainsi créé, devra avant tout, élaborer
un programme d'activités en Immunologie Générale, en Immuno-Hématologie
et en Transfusion Sanguine.
- En Immunologie Générale, le programme d'activités visera en
priorité à entreprendre :
* la préparation des réactifs nécessaires pour le dépistage
de l'antigène HBs chez les donneurs de sang, ou tout au
moins sur les unités de sang destinées aux nouveaux-nés,
à la pédiatrie et aux malades très affaiblis.
* la préparation selon les priorités nationales, des suspen-
sions parasitaires indispensables pour le diagnotic
sérologique des grandes parasitoses locales.
- Dans le cadre de l'Immuno-Hématologie, le Laboratoire Central
devra prioritairement rédiger à l'intention de tous les laboratoires
d'Immuno-Hématologie de la périphérie, les techniques de groupage ABO et
Rh standard, ainsi que la technique du test de compatibilité ultime au
1it du malade.
D'autres techniques concernant le test de Coombs et 1a recherche
d'anticorps irréguliers seront élaborées, cette fois-ci à l'intention
des Centres Provinciaux de Transfusion Sanguine.
------~---
- - -

---

26.
En vue de permettre l'exécution de ces différentes techniques,
le Laboratoire Central devra entreprendre, d'une part, des campagnes de
sensibilisation intensive et régulière pour la constitution des différents
panels d'hématies, et d'autre part, la préparation des réactifs de grou-
page ABO, puis du réactif antiglobuline polyvalente.
Enfin, la définition des normes minimales et l'élaboration des
techniques de contrôle des réactifs à utiliser sur le territoire national,
relèvent également de la compétence de ce Laboratoire Central.
Dans le cadre de la Transfusion Sanguine, le Laboratoire Central
devra également définir les normes des divers produits sanguins à utiliser
en thérapeutique, les précautions à prendre pour assurer l'efficacité et
la sécurité des transfusions. Dans la mesure du possible, le Laboratoire
Central peut proposer aux Autorités du Ministère de la Santé, les accords
à conclure avec les Centres de fractionnement plas~tique étrangers.
Parallèlement à toutes ces activités, la direction du Laboratoire
Central devra entreprendre la formation des techniciens et des étudiants
en médecine suivant un programme correspondant aux buts définis à la partie
l de ce travail.
Pour permettre à ce Laboratoire Central de remplir efficacement
toutes ces missions, un minimum d'équipement en dehors de la verrerie
est indispensable. Cet équipement doit comprendre (104) :
- un microscope à fluorescence et ses divers accessoires
(40 000 FF) ;
- un générateur de courant électrique, une cuve à électropho-
rèse, des plaques de verre, des pipettes Ependorf de 25 ul,
50 ~l et 100 ul, et deux emporte-pièces munis l'un des
couteaux de 4 mm de diamètre, et l'autre des couteaux de 6 mm
de diamètre (20 000 FF) ;
- deux congélateurs pouvant atteindre des températures très
basses (-50°C ou -80°C) (40 000 FF)
- une centrifugeuse réfrigérée fonctionnelle (109 400 FF)
- une ou deux centrifugeuses de table (3 700 FF l'unité)
- un ou deux réfrigérateurs (6 000 FF) ;

---

27.
- une centrifugeuse avec différentes couronnes et différents
plots ou pots (10 700 FF) ;
- un distillateur d'eau (8 200 FF)
- le matériel pour filtration clarifiante et filtration
stérilisante (5 400 FF) ;
- et des stocks initiaux de différents réactifs.
A l'exception des stocks initiaux de réactifs, le coût total de cet équi-
pement est actuellement estimé à 246 700 FF soit 12 335 000 F CFA HT.
En ce qui concerne la formation des techniciens et étudiants
en médecine, l'acquisition d'un matériel audio-visuel comprenant un magné-
toscope, un appareil téléviseur, une caméra, deux spots et vingt cassettes
vierges pourrait être envisagée.
Au total, la création d'un Laboratoire Central d'Immunologie
et de Transfusion Sanguine véritablement-actif sur le territoire national,
sera la clé de la réussite dans ces deux disciplines dont l'importance ne
cesse de s'agrandir.
Mais, pour apporter notre contribution à ce Laboratoire Central
dans son rôle de formation
des techniciens et des étudiants, nous vou-
drions proposer ici, un programme d'enseignement en rapport avec les buts
définis plus haut, et indiquer la méthode qui pourrait être suivie pour
assurer efficacement cette formation.
111.2. DONNEES DE LA FORMATION
111.2.1. Données de la formation théorique
En raison des buts définis à la partie l d'une part, des méthodes
et techniques simples exposées à la partie II et à l'annexe d'autre part,
il apparaît indispensable d'introduire dans la formation universitaire
au Bénin, l'enseignement de l'Immunologie et de la Transfusion Sanguine
selon un programme approprié.

---

28.
Ce programme pourrait comprendre 17 chapitres répartis dans
l'Immunologie Générale, l'Immuno-Hématologie et la Transfusion Sanguine.
Cinq chapitres apparaissent nécessaires pour donner aux étudiants
et aux stagiaires en formation, les connaissances de base pouvant garantir
plus tard, une nleilleure activité professionnelle. Ces chapitres peuvent
être intitulés comme suit
* Les agents de l'immunité: les molécules et les cellules
(1, 2, 8, 30, 31, 32, 42, 49, 52,80, 83, 93, 94, 95, 97,
103, 114, 125, 132, 133) ;
* Les interactions cellulaires et les régulations génétiques
dans la réponse immunitaire (1, 19, 89, 116) ;
* Les réactions antigène-anticorps et leurs applications
(20, 32, 40, 61, 95, 105, 130) ;
* Immunologie des maladies infectieuses (23, 24, 26, 33, 34, 38,
39, 53, 66, 87, 90, 96) ;
* Les surprises de l'immunité (33, 55, 62, 63, 64, 99, 125, 131,
134, 138, 140, 141, 142, 143).
L'étude de 8 chapitres s'impose ici pour couvrir les différents
aspects souhaités. Ces chapitres sont les suivants:
* Approche génétique des groupes sanguins (117)
* Les principes et techniques de base utilisés en imnluno-héma-
tologie érythrocytaire (78, 108, 109) ;
* Le système ABD et ses associés Hh-Sese et Lele (107; 108)
* Le système Rhésus (125) ;

---

29.
* Les autres systèmes de groupes sanguins : Ke11 Duffy, et
Kidd d'une part, MNSs et P d'autre part (27, 118, 127) ;
* L'allo-immunisation chez l'homme (89, 116) ;
* Les po1yagg1utinabi1ités érythrocytaires (119, 126)
* La recherche de paternité (120, 124).
Quatre chapitres permettent de donner aux étudiants et aux
techniciens en formation, le maximum de données devant garantir la sécurité
des transfusions. Ces chapitres sont intitulés comme suit :
* Les principes et les bases imrnuno1ogiques de la transfusion
(57,121) ;
* Les produits sanguins à usage thérapeutique et leurs indica-
tions (45, 54, 12) ;
* Les risques de la transfusion sanguine (21, 56, 1Z1) ,
* Etude du code d'éthique de la Société Internationale de
Transfusion pour le don du sang et la Transfusion Sanguine (3).
Dans la présentation de chaque chapitre indiqué ci-dessus, la
priorité sera accordée à l'exposé clair et simple sur les connaissances
de base, et sur les données ayant un intérêt pratique.
Les éléments concernant la recherche scientifique ne paraissent
pas pour le moment nécessaires ; ces éléments pouvant être apportés plus
tard, lors des cours de perfectionnement.
Quant aux chapitres qui se rapportent aux techniques de base,
ils doivent être particulièrement détaillés, pour montrer toutes les diffi-
cultés pratiques et les moyens de les contourner ou de les surmonter.

---

30.
CD Ainsi, en Immunologie Générale, lorsqu'on aborde l'exposé
sur 1I1es agents de l'immunité", les molécules qui seront principalement
présentées sont les antigènes, les anticorps et le complément.
L'exposé sur les cellules de l'immunité sera essentiellement axé
sur la présentation claire d'expériences très simples montrant l'origine
et les rôles des lymphocytes B, des lymphocytes T et des macrophages.
Quant aux cellules accessoires (polynucléaires, cellules Ket cellules NK)
leur existence sera seulement soulignée.
- Abordant 1I1es interactions cellulaires et les régulations
génétiques dans la réponse tmnuni ta ire" l'exposé sera présenté en deux
volets.
Dans la première partie, le formateur devra montrer clairement
la coopération entre macrophages et lymphocytes T he1per, et la coopéra-
tion entre lymphocytes Thel per et lymphocytes B dans 1a réponde tmnun i-
taire humorale.
Dans la seconde partie, le formateur démontrera l'existence du
gène Ir. Puis il se référera aux expériences de Biozzi (19) pour définir
les notions de bons et mauvais producteurs d'anticorps.
- L'exposé concernant 1I1es réactions antigène-anticorps et leurs
app1ications ll doit être particulièrement détaillé, notamment les réactions
de précipitation en milieu gélifié (immunodiffusion d'Ouchter1ony et
é1ectroin~unodiffusion) (40), l'agglutination, l'hémagg1utination passive,
l'inhibition de l'hémagg1utination (105, 130) et la réaction d'immuno-
fluorescence "indirecte (61).
Les principes et les techniques de réalisation de ces diffé-
rentes réactions doivent être clairement exposés.
Les difficultés souvent rencontrées au cours de l'exécution de
ces différentes réactions doivent être analysées. Il s'agit surtout du
phénomène de zone qui donne des réactions faussement négatives en é1ectro-
immunodiffusion, et de l'inhibition possible de l'antig1obu1ine humaine
au cours de l'exécution du test de Coombs.

---

31.
- Abordant Ill' immunologie des maladies tnfect ieuses", le forma-
teur pourrait d'une manière générale, présenter les divers mécanismes
possibles de défense immuno10gique contre ces maladies. Ensuite il pourra
étudier l'immunologie parasitaire (23, 32), puis l'immunologie de l'hépa-
tite à virus B (33, 34).
- Enfin dans le cadre de l'exposé sur 1I1es surprises de l' immu-
nité ll , le premier souci du formateur sera de montrer que l'immunité ne
signifie pas toujours protection.
Ainsi, en présentant les mécanismes de survenue de l'asthme,
de l'accident transfusionne1 retardé, du rejet d'allo-greffe, de la glomé-
ru10néphrite, de l'anémie hémolytique auto-immune, des tumeurs et le phé-
nomène de la gestation, le formateur démontrera aisément que l'immunité
comporte des accidents (hypersensibi1 ités), des revers (auto-immunité)
et des manques (tolérance et facilitation).
Au total, les données théoriques exposées tout au long de ces
cinq chapitres, jointes aux données de travaux pratiques exposées ci-
dessous, apporteraient aux techniciens et aux étudiants en formation, les
connaissances immuno10giques de base, qui leur confèreront une compétence
professionnelle à la mesure des buts d'Immunologie Générale précédemment
définis.
® En Immuno-Hémato1 ogie, 1e chapitre concernant "l 'approche
génétique des groupes sanguins" présente un grand intérêt théorique.
Grâce à ce chapitre, le formateur- pourra dès le départ, donner les défini-
tions précises des différents concepts de génétique couramment employés
dans l'étude des groupes sanguins.
Pour plus de commodité et de facilité d'assimilation, ces
concepts pourraient être présentés en trois grands groupes :
* Termes de génétique propres à 1a multip1 ication, à la di stri-
bution du matériel génétique, et au maintien de l'espèce, ainsi qu'au fonc-
tionnement du matériel génétique ;

---

32.
* Termes spécifiques à la génétique formelle
* Termes d'immunogénétique.
- L'étude du chapitre intitulé: "Principes et techniques de
base en tnmunc-héma to'loq ie érythrocytaire" présente un intérêt pratique
capital, car elle permet au formateur de décrire en détail, les techniques
couramment utilisées en routine.
Ainsi, au cours de l'exposé de ce chapitre, une large part doit
être particulièrement accordée aux techniques concernant, les groupages
ABD et Rh standard, le test de Coombs, la recherche d'anticorps irrégu-
liers et les tests de compatibilité.
Les témoins auto, a110 et AB qui permettent de comprendre
l'origine de toute discordance entre le Beth Vincent et le Simonin, doivent
être clairement présentés.
Le témoin albumine absolument nécessaire dans tout groupage
Rh standard, et les erreurs de manipulations à éviter dans l'exécution
du test de Coombs, doivent être également mis en relief.
Enfin, il importe d'insister particulièrement sur l'importance
du test de compatibilité ultime au lit du malade, tout en précisant
qu'il doit être toujours effectué entre le sérum du receveur et les
globules rouges du sang à transfuser. Le formateur pourra également men-
tionner la variante de ce test qui conssite à contrôler les antigènes ABD
du donneur et du receveur, par l'épreuve du Beth Vincent.
- L'exposé sur "le système ABD et ses associés Hh-Sese et Le1e"
doit être essentiellement centré sur les aspects immunologiqlJes ayant une
importance en transfusion. Ces aspects invnuno10giques concernent
* les phénotypes ABD courants (Al, A2, B, D, AB) ;
* les anticorps du système ABD ;
* la double population ;
* les phénotypes Lewis érythrocytaires et les anticorps anti-
Lewis.

---

33.
Quelques aspects de génétique formelle pourraient être claire-
ment présentés à l laide d'arbres généalogiques simples et informatifs,
pour montrer les particularités dont la méconnaissance pourrait entraîner
des exclusions erronées de paternité. Ces particularités concernent:
le phénotype Bombay, llexceptionnel cis AB et la génétique du système Lewis.
- Le système Rhésus doit être entièrement détaillé en raison des
particularités décrites chez des sujets africains (OIV C_ chez Madame NOU.
de Côte d'Ivoire, rGrG chez un étudiant du Bénin, RN au Mali et au Sénégal).
La référence bibliographique indiquée (125) apporte tous les détails
appropriés.
~ Llexposé sur le chapitre intitulé "Les autres groupes sanguins"
peut être axé sur la présentation des aspects immunologiques liés aux
antigènes et aux anticorps courant dans chaque système de groupes sanguins.
Ces premiers renseignements pourraient être complétés par les
aspects génétiques particuliers à certains systèmes. Ainsi,à l'aide d'arbres
généalogiques très simples et informatifs, le formateur montrera le mode de
ségrégation des gènes Kell, Kpa et Js a, et l'existence de gènes silencieux
dans le système Ouffy, particulièrement fréquent dans la population noire.
- L'exposé sur "l val l o-fmsun tsat ton chez l'homme", notamment
l'allo-immunisation transfusionnelle, doit être particulièrement détaillé
pour mettre l'accent sur les conséquences néfastes pouvant résulter des
transfusions réalisés sans précautions appropriées chez les sujets de
sexe féminin.
Cet exposé devra être complété par la présentation de l'allo-
immunisation foeto-materne~le aux antigènes érythrocytaires et plaquet-
taires (89, 116) pour montrer les différentes situations pouvant engendrer
la maladie hémolytique du nouveau-né et les thrombopénies néo-natales.
- L'exposé sur "les polyagglutinabilités érythrocytaires" doit
être principalement axé sur la présentation des polyagglutinabilités T,
Tn et B acquis.
L'intérêt de cet exposé est de faire comprendre les mécanismes

---

34.
de survenue de ces po1yagg1utinabi1ités, de souligner les difficultés
de groupage qu'elles entraînent lorsque ces groupages sont effecutés par
les anticorps po1yc10naux, et de préciser les lectines spécifiques qui
en permettent le diagnostic. Le fait que ces difficultés de groupage sont
évitées par 1luti1isation des anticorps monoclonaux pourrait être souligné.
- Enfin, 11exposé sur "1a recherche de paternité" est pour le
moment dlordre informatif, car il contribuera à faire comprendre qui une
expertise de paternité ne peut être uniquement basée sur les seules déter-
minations des groupes ABD et/ou Rh standard.
Au total les diverses données exposées tout au long des 8 der-
niers chapitres, jointes aux données de travaux pratiques exposées ci-
dessous, confèreront aux techniciens et aux étudiants à former, une compé-
tence professionnelle à la mesure des buts dlimmuno-hémato10gie précédem-
ment définis.
€)
En transfusion sanguine, les deux premiers chapttres inscrits
au programme permettent de montrer aux étudiants et aux techniciens, com-
ment et avec quel produit sanguin on doit transfuser un malade.
Le troisième chapitre permet dlexposer tous les risques possibles
qui peuvent résulter dlune transfusion sanguine.
Pour y parvenir avec méthode, le formateur pourra présenter
dlune part les risques immuno10giques tout en précisant les précautions
permettant de les éviter ; et dlautre part, les risques non immuno10giques,
tout en mentionnant les règles de leur prévention.
Le dernier chapitre de ce programme de transfusion présente une
importance à deux dimensions :
* dlun côté, il permet au formateur dlexposer les règles morales
et médicales mondialement observées à 11égard de la personne humaine du
donneur et du receveur; cela donne à cet exposé la valeur dlune' séance
de sensibilisation des techniciens et étudiants au don bénévole et volon-
taire du sang.

---

35.
* de l'autre côté, il permet de présenter la transfusion san-
guine nationale.
Ainsi, les données exposées tout au long de ces quatre chapitres
apporteront aux étudiants et aux techniciens en formation, les connais-
sances de base correspondant aux buts précédemment définis en 1.3.
Au total, le programme d'enseignement théorique que nous venons
de présenter est élaboré à partir des éléments d'appréciation étroitement
liés aux besoins de notre pays.
Son exécution correcte à l'université de Cotonou apporterait
aux étudiants, une formation théorique de base très complète en Immunologie
Générale, en Immuno-Hématologie et en Transfusion Sanguine.
Mais, selon notre propre expérience, une formation théorique
aussi complète soit-elle, non soutenue par des travaux pratiques et des
enseignements dirigés bien conduits, est tout à fait insuffisante.
En effet, c'est au cours des travaux pratiques du Diplôme
Universitaire de Transfusion Sanguine, d'Immunologie Générale et de
l'Attestation d'Etudes Approfondies d'Immuno-Hématologie et d'Immuno-
Génétique Humaines, que nous avons appris à manipuler. De plus,ces travaux
pratiques nous ont permis d'acquérir une assimilation correcte d'un grand
nombre de données théoriques.
En conséquence, nous pensons que l'organisation de travaux pra-
tiques d'Immunologie Générale et d'Immuno-Hématologie bien conduits, à
l'Université de Cotonou, représente une tâche indispensable pour d'une
part, apprendre aux étudiants à bien travailler en pratique, et d'autre
part, les amener à acquérir une bonne assimilation des données théoriques.
Quant aux enseignements dirigés, ils nous apparaissent encore
plus indispensables, car nous n'avons nous-même réellement assimilé les
données les plus fondamentales non traitées en travaux pratiques, qu'au
cours des conversations en enseignements dirigés, avec les Enseignants.
Un enseignement dirigé bien préparé tant par l'Enseignant que
par l'Enseigné a une valeur inestimable. Nous avons expérimenté ces deux

---

36.
aspects, d'une part, pendant notre propre formation en qua1 ité dlétudiant,
et d'autre part, lorsque nous sommes passé de 11autre côté de la barrière.
Nous allons donc aborder successivement 1lorganisation, ~
11Université de Cotonou, d'une part des travaux pratiques dl Immunologie
Générale et dl Immuno-Hémato1ogie, et dlautre part des enseignements dirigés.
IIL2.2. Données de la formation pratique
L'organisation des travaux pratiques dans le cadre dlune forma-
tion scientifique ou professionnel1~ représente une tâche de très grande
importance, car il est absolument indispensable dlassurer une formation
technique de meilleure qualité, pour garantir 11efficacité des prestations
de service.
Dans le cas particulier du Bénin aux moyens matériels limités,
et où les objectifs à atteindre dans un premier temps en Immunologie
Générale et en Immuno-Hémato1ogie sont très simples, nous avonS sélectionné
des travaux pratiques qui permettront d'enseigner les techniques de base
propres à ces deux matières.
Pour que cet enseignement revête toute la qualité appropriée,
nous avons rédigé les modes précis de préparation et de déroulement des
divers travaux pratiques sélectionnés.
Ainsi, sont successivement présentés ci-dessous les textes
concernant 7 séances de travaux pratiques dl Immunologie Générale et 12
séances de travaux pratiques dl Immuno-Hématologie.

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37.
TRAVAUX PRATIQUES n'IMMUNOLOGIE GENERALE

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38.
TRAVAUX PRATIQUES N° l
Titre
OPSONISATION - PHAGOCYTOSE (112)
Le but de cette séance est de montrer aux étudiants ou aux sta-
giaires, ce qu'est concrètement la phagocytose.
Cette étude sera faite suivant une technique réalisable en un
temps. L'exemple choisi est de réalisation très simple; il s'agit de la
phagocytose par les polynucléaires neutrophiles d'hématies de groupe A
sensibilisées par une IgG anti-A.
Préparation de la séance
* ~~tériel
Distribuer par paillasse:
- un microscope ou si possible deux
- un paquet de lames porte-objet
- une pissette d'eau distillée
- un flacon de May Grünwald ;
- un flacon de Giemsa
- un carton de tubes à hémolyse ou tubes de Kahn.
Distribuer par étudiant ou stagiaire
- un portoir ;
- deux béchers
- une pipette Pasteur avec tétine.
Régler l'étuve à 37°C ou dans le cas échéant, le bain-marie à 37°C.
* Echantillons de sang à examiner
Distribuer par étudiant ou stagiaire, un tube contenant ~u sang
prélevé chez un sujet de groupe A. Ce sang doit être prélevé sur du citrate
de soude à 10 %, à raison d'un volume de citrate pour 12 volumes de sang.
Une heure et demie avant le début de la séance, incliner à 45°
chaque tube de sang.

---

39.
* Réactifs anticorps et autres
Les réactifs anticorps à utiliser sont essentiellement 1lanti-A
naturel et 1'anti-A immun.
Ainsi, il convient de distribuer par paillasse:
- un tube contenant du sérum provenant de sujet 0 ou B,
ne possédant pas d'anticorps anti-A immuns.
- un tube contenant du sérum provenant de sujets 0 ou B possédant
des anticorps anti-A immuns. De tels sujets peuvent être trouvés
parmi les donneurs de sang ayant reçu du vaccin antitétanique
ou des femmes de groupe 0 ou B ayant un ou des enfants de
groupe A.
Il importe aussi de distribuer par paillasse, un tube contenant du
sérum AB qui servira à effectuer la réaction témoin.
Déroulement de la séance
Le formateur pourra introduire cette séance par le rappel de la
définition et de la description de la phagocytose. Puis, évoquant la
défense naturelle, il indiquera l 1 importance de la phagocytose dans ce
type d'immunité.
Après ces premiers rappels, le formateur envisagera l'opsonisation
dont il donnera la définition, les conditions de sa réalisation et le
rôle dans la défense de notre organisme contre les agents pathogènes.
Ensuite, le formateur abordera la phase pratique de la séance,
où il apportera toutes les précisions sur les manipulations pratiques
à exécuter.
Ainsi, les étudiants ou stagiaires pourront successivement
- aspirer la couche leucocytaire avec des globules rouges
auto1ogues, le tout en suspension dans le propre plasma du
sujet ;
- faire la réaction d'opsonisation et de phagocytose en un temps,
en faisant agir les divers sérums à étudier sur le mélange
leucocytes-globules rouges précédemment aspiré ;

---

40.
- confectionner chacun un fin frottis à partir de sa préparation
- colorer le frottis confectionné au ~lay Grünwald Giemsa ;
- et observer le frottis coloré au microscope avec l'objectif à
i I11TIers i on.
Cette observation permettra aux étudiants ou aux stagiaires d'exa-
miner le phénomène de la phagocytose et de déterminer le pourcentage de
phagocytose, soit en comptant le nombre de phagocytes pour cent leucocytes,
soit en comptant le nombre de globules rouges phagocytés par cent leuco-
cytes.
Au total, cette séance n'a pas réellement un intérêt diagnostique,
mais elle présente un grand intérêt didactique. Très simple à organiser
et à réaliser, elle permet de comparer l'activité opsonique des anticorps
naturels anti-A par rapport à celle des anticorps immuns anti-A.

---

41.
TRAVAUX PRATIQUES N° 2
Titre
PRECIPITATION EN MILIEU GELIFIE (IMMUNODIFFUSION DOUBLE
D'OUCHTERLONY)
(35, 41).
Le but de cette séance est de montrer aux étudiants ou aux sta-
giaires, le moyen d'effectuer le dépistage systématique de l'antigène HBs
ou (Ag HBs) dans les Etablissements de Transfusion Sanguine, à partir d'un
matériel relativement simple.
Préparation de la séance
* Matériel
- Préparer à pH 7,6 le tampon Prince dont la formule est indiquée
ci-après :
chlorure de Sodium
0,1 M
tris
0,01 M
EDTA
0,001 M
- Faire fondre dans de l'eau distillée portée à+80°C sur plaque
électrique ou sur réchaud à gaz, de l'agarose dans la proportion de 2g
pour 100 ml d'eau distillée.
Après fusion complète de llagarose (1 heure de chauffage à +80°C),
ajouter du merceptyl à 1 % préparé extemporanément (1 g de poudre de
merceptyl pour 100 ml d1eau distillée). La solution de merceptyl est
ajoutée dans la proportion de 1 ml pour 100 ml d1agarose fondue.
L1agarose ainsi préparée peut être conservée à +4°C dans des
tubes à essai et utilisée au moment voulu après chauffage.
- Mélanger 8,6 ml d1agarose fondue à 20 ml de tampon Prince
préalablement chauffé, et couler ce mélange sur 6 lames de microscope
disposées sur un portoir placé lui-même sur une table à niveau.
- Couler ainsi autant de lames que d1étudiants ou de stagiaires
prévus pour 1a séance.

---

42.
- Après 30 mn, placer les lames de gélose en chambre humide pendant
au moins deux heures avant la séance.
Apprêter le complément de matériel indiqué ci-après
une boite de lames de microscope
· un emporte-pièce muni de sept couteaux de 4 mm de diamètre
dont six forment un hexagone et le septième occupe une position
centrale ;
des pipettes Pasteur et des tétines
• le matériel pour la lecture;
des pipettes de 10 ml graduées
· et enfin mettre à chauffer de l'agarose et du tampon Prince.
* Echantillons de sérums à analyser
Distribuer par paillasse, six échantillons de sérum provenant de
donneurs différents dont trois sont antigène HBs positif, deux antigène
HBs négatif et un positif en anticorps anti-HBs.
* Réactifs antigène
Distribuer par paillasse, d'une part le sérum pur d'un donneur
possédant l'antigène HBs à un faible titre (3), et d'autre part, le sérum
pur d'un autre donneur possédant l'antigène HBs à un titre plus élevé (8).
* Réactifs anticorps
Distribuer par paillasse le sérum pur d'un donneur possédant
l'anticorps anti-HBs à un faible titre (5), et d'autre part, le sérum pur
d'un autre donneur possédant llanticorps anti-HBs à un titre plus
élevé (10).
Si lion ne peut obtenir des sérums de titres élevés en antigène
ou en anticorps comme indiqué ci-dessus, on pourra utiliser face aux
réactifs antigène et/ou anticorps de faibles titres disponibles, chaque
sérum à étudier, au pur (1/1) et dilué au 1/10 en saline.

---

43.
Déroulement de la séance :
Le formateur pourra introduire la séance en rappelant la définition
de la réaction antigène-anticorps et ses manifestations visibles.
Puis slintéressant particulièrement à la précipitation, il devra
rappeler brièvement, d'une part le ring-test et son importance, et d'autre
part, llexpérience de Heidelberg et Kendall pour indiquer les trois zones
définissant la courbe de précipitation.
Abordant la précipitation en milieu gélifié, le formateur en
donnera les caractères généraux, avant de dégager pour une analyse plus
approfondie, l limmunodiffusion double d'Ouchterlony qui fait l'objet de
cette séance.
Dans la phase pratique de la séance, après avoir lui-même exécuté
en exemple quelques gestes, le formateur devra conduire les étudiants
ou stagiaires à :
- couler de la gélose fondue sur quelques lames;
- pratiquer les puits sur les lames de gélose déjà apprêtées ;
- et remplir correctement les puits pratiqués avec les sérums
appropriés.
Enfin le formateur fera lire par les étudiants ou stagiaires,
à titre d'exercice des réactions d'immunodiffusion double dlOuchterlony
précédemment effectuées.
Au total, par l lorganisation de cette séance de travaux pratiques,
le formateur aura appris aux étudiants ou aux stagiaires, la technique
pour dépister à partir d'un matériel relativement simple,llantigène HBs
et l'anticorps anti-HBs dans les Etablissements de Transfusion Sanguine
du territoire national.
Ainsi, avec cette technique très simple, on peut espérer écarter
du don du sang 60 à 70 % des porteurs du virus B de l'hépatite.

---

44.
TRAVAUX PRATIQUES N° 3
Titre
PRECIPITATION EN MILIEU GELIFIE, TECHNIQUE D'ELECTRO-IMMUNO-
DIFFUSION
Dans la gamme des réactions d'immuno-précipitation en milieu géli-
fié, après l'étude de la technique d'immunodiffusion réalisable par tout
laboratoire, il convient d'organiser une séance de travaux pratiques sur
la technique d'électro-immunodiffusion qui est beaucoup plus sensible que
l'immunodiffusion et qui ne peut être réalisée que par des laboratoires
beaucoup plus équipés.
Ainsi, au cours de cette séance, le formateur devra également
appliquer la technique d'électro-immunodiffusion à la recherche de l'anti-
gène HBs et de l'anticorps anti-HBs.
Préparation de la séance
* Matériel
- Préparer à pH 8,6, le tampon Véronal acétate (TVA) dont la
formule est indiquée ci-dessous
véronal sodique
24,428 g
acétate de sodium 3H2D
19,428 g
acide chlorhydrique ih-
270 ml
eau distillée
3 litres.
- Faire fondre dans un bain-marie à +80°C, de l'agarose dans la
proportion de 2 9 de poudre dans 100 ml d'eau distillée.
- Mélanger 17 ml d'agarose fondue à 34 ml de tampon (TVA) préala-
blement chauffé, et couler ce mélange sur une plaque de verre de dimension
14 cm x 18 cm x 2 mm disposée sur une table à niveau.
Couler ainsi, une ou deux plaques pour la séance de travaux pratiques.

---

45.
- Après 30 mn, placer la plaque ou les plaques de gélose en chambre
humide pendant au moins deux heures avant la séance.
- Apprêter le complément de matériel ci-après indiqué:
quelques plaques de verre de dimensions 14 cm x 18 cm x 2 mm
un emporte-pièce muni de couteaux de 4 mm de diamètre
· une cuve pour immuno-électrophorèse et un générateur de
courant ;
· des pipettes Pasteur et des tétines ;
· le matériel pour la lecture ;
· et enfin, mettre à chauffer de l'agarose fondue et du tampon
TVA.
* Echantillons de sérums à analyser
Distribuer par paillasse, 7 échantillons de sérums cOQprenant
- un sérum normalement positif en antigène HBs ;
- un sérum fortement positif en antigène HBs et donnant un phéno-
mène de zone avec le réactif anticorps de faible titre ;
- un sérum faiblement positif en antigène HBs et ne donnant un arc
de précipitation qu'après une nuit de diffusion en chambre
humide ;
- un sérum dont la positivité en antigène HBs est juste limite
- un sérum possédant l'anticorps anti-HBs ;
- un sérum négatif en antigène HBs et en anticorps anti-HBs ;
- et si possible un sérum contenant l'anticorps ou l'antigène
de parvovirus B19.
* Réactifs antigène
Distribuer par paillasse, un sérum humain provenant d'un donneur
possédant l'antigène HBs à un faible titre (3 ou 4).
Dans la mesure du possible, distribuer également le sérum d'un
donneur possédant l'antigène du parvovirus B19.

---

46.
Distribuer par paillasse :
- un sérum humain provenant d'un donneur possédant l'anticorps
anti-HBs de titre égal à 2 ou 3 ;
- un sérum humain provenant d'un donneur possédant l'anticorps
anti-HBs de titre plus élevé (8).
Si l'on ne dispose pas de sérum humain possédant l'anticorps
anti-HBs de titre élevé, on pourra concentrer sur du lyphogel (10 grains
de lyphogel dans 1 ml de sérum), le sérum contenant l'anticorps de faible
titre pour obtenir finalement un réactif anticorps de titre élevé.
- Enfin, et si possible, distribuer également le sérum d'un donneur
possédant l'anticorps anti-parvovirus 819·
Déroulement de la séance
Après avoir rappelé le principe de la technique d'électro-immuno-
diffusion, et souligné les difficultés pratiques rencontrées lors de son
exécution, le formateur donnera toutes l es "indications techni ques pour
couler l'agarose fondue sur une plaque, et perforer les puits sur la ou
les plaques de gélose déjà apprêtées pour la séance de travaux pratiques.
Ainsi, après avoir lui-même exécuté en exemple quelques gestes
bien précis, le formateur devra conduire les étudiants ou stagiaires à
- couler l'agarose fondue sur quelques plaques de verre;
- perforer les puits sur les plaques de gélose apprêtées pour la
séance ;
et remplir les puits perforés avec les sérums appropriés.
En ce qui concerne ce dernier point, chaque étudiant ou stagiaire
devra s'exercer à remplir correctement sur la ou les plaques perforées,
les puits avec les sérums et les réactifs distribués par paillasse.
Enfin, pendant que la migration est mise en route, le formateur
fera lire aux étudiants ou aux stagiaires à titre d'exercice, des réactions
d'électro-immunodiffusion antérieurement effectuées.

---

47.
Au total, 1'organisation de ces deux séances de travaux pratiques
sur les réactions de précipitations aura permis au formateur de montrer
aux étudiants et surtout aux stagiaires, l'intérêt pratique que l'on peut
tirer de l'utilisation des réactions d'immunoprécipitation, à partir d'un
matériel relativement simple et peu coûteux. En effet, par l'utilisation
systématique de ces deux tests au Bénin, on pourrait écarter du don du
sang, 60 à 70 %des porteurs de virus Bde l'hépatite dans les postes de
transfusion, et 75 à 80 % des porteurs de ce même virus dans les Centres
Provinciaux de Transfusion Sanguine alimentés en électricité.

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48.
TRAVAUX PRATIQUES N° 4
Titre
LI AGGLUTINATION SPONTANEE ET L'AGGLUTINATION PASSIVE
(12,15,32,130,135).
L'agglutination des globules rouges est la technique de base
de l'Immuno-Hématologie. Elle est également utilisée en Immunologie Géné-
rale pour établir le diagnostic sérologique de certaines affections bacté-
riennes, parasitaires ou virales.
L'organisation des séances de travaux pratiques se rapportant à
l'agglutination, permettra au formateur, d'apprendre aux étudiants ou aux
stagiaires, la technique d'exécution correcte de ce type de réaction
antigène-anticorps, ainsi que la méthode d'interprétation des résultats
obtenus.
Ainsi, seront réalisés au cours de cette séance, l'agglutination
spontanée active basée sur le groupage ABO, et l'agglutination passive
basée sur l'immunologie parasitaire.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel indiqué pour chaque étudiant ou stagiaire aux
pages 65 et 66.
De plus, disposer par paillasse, une centrifugeuse de table et
un carton contenant des tubes à hémolyse ou tubes de Kahn.
Distribuer si possible par paillasse, une microplaque à fond en U
ou en V.
* Echantillons de sang et de sérums à analyser
Distribuer par étudiant ou stagiaire :
- deux échantillons de sang total prélevés chez des donneurs de
groupes A et B ; ces échantillons serviront à démontrer l'agglu-
tination spontanée ;

---

49.
- un échantillon de sérum de sujet atteint d'onchocercose ;
- un échantillon de sérum de sujet atteint de bilharziose;
- un échantillon de sérum de sujet sain ;
Ces trois sérums seront utilisés pour démontrer l'agglutination
passive des globules humains sensibilisés par l'antigène de filaire.
* Réactifs cellulaires
Prévoir par paillasse
- un tube contenant une suspension à 0,2 %en tampon TAP albumine,
des globules rouges humains a sensibilisés par l'antigène de
filaire d'Onchocerca volvulus (voir protocole tndjqué
l'annexe).
à
* Réactifs anticorps et autres
Prévoir par paillasse:
- un flacon de réactif anti-A et un flacon de réactif anti-B.
Déroulement de la séance
Après avoir rappelé les deux principales étapes
de l'agglutina-
tion immunologique des globules rouges, les substances capables de provo-
quer l'agglutination non spécifique des hématies, ainsi que les mécanismes
impliqués dans la réaction d'agglutination érythrocytaire, le formateur
analysera le principe de l'agglutination spontanée des globules rouges
en C1Na à 9 %0'
Puis, dans le premier temps de la phase pratique, le formateur
donnera aux étudiants ou aux stagiaires, toutes les indications pratiques
pour laver les échantillons de globules rouges A et B et les mettre en
suspension à 10 %en saline.
Ensuite,les étudiants ou stagiaires réaliseront l'agglutination
spontanée, en faisant agir sur plaque d'opaline, une goutte de chaque
suspension globulaire avec une goutte de réactif anticorps.

---

50.
Ainsi, en deux ou trois minutes, ces étudiants ou stagiaires pour-
ront voir apparaître l'agglutination et suivre sa cinétique jusqu'à l'in-
tensité maximale.
Dans une seconde phase, et sur indications techniques du formateur,
les étudiants ou stagiaires devront diluer les trois sérums à analyser de
demi en demi jusqu'à la dilution 1/4096, avant d'effectuer la réaction
d'hémagglutination passive.
Dans l'interprétation des résultats obtenus, le formateur mettra
en relief les manifestations de la réaction croisée, puis le seuil de
spécificité.
Au total, en organisant cette séance de travaux pratiques, la
mission du formateur est d'éduquer les étudiants ou stagiaires à effectuer
et interpréter correctement la réaction d'agglutination spontanée et
passive dans un but diagnostique.

---

51.
TRAVAUX PRATIQUES N° 5
Titre
AGGLUTINATION ARTIFICIELLE
(108, 130)
Le but de cette séance est d'apprendre aux étudiants ou aux
stagiaires, à utiliser pratiquement des artifices, pour provoquer une
hémagglutination spécifique qui ne pourrait être obtenue par la seule fixa-
tion de l'anticorps sur les hématies normales.
Trois techniques d'agglutination artificielle peuvent être ensei-
gnées dans le cadre de cette séance.
Il s'agit de la techni que en mi lieu macromo l ëcul aire, de la
technique utilisant les hématies traitées par enzyme et de la technique
utilisant le sérum antiglobuline humaine.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel indiqué aux pages 65 et 66 pour chaque
étudiant ou stagiaire. De plus, disposer par paillasse un rhésucope, une
centrifugeuse et un carton contenant des tubes à hémolyse ou tubes de
Kahn.
Régler l'étuve et/ou le bain-marie à 37°C.
* Echantillons de sang à analyser
Distribuer par étudiant ou stagiaire
- un échantillon de sang Rh+ (positif)
- un échantillon de sang Rh- (négatif)
- un échantillon de sang D faible ou DU ;
- un échantillon de globules rouges dce/dce sensibilisés par
l'anticorps anti-c
suivant le protocole ci-après:
(A un volume de culot globulaire dce/dce lavé 3 fois en saline, ajouter
1 à 2 volumes d'anti~ albumineux, et incuber le mélange ainsi obtenu à
37°C pendant 45 mn).

---

52.
* Réactifs sériques et autres
Prévoir par paillasse:
- un flacon d'anti-D albumineux
- un flacon d'albumine bovine témoin
- un flacon d'antig1obu1ine polyvalente
- et un flacon de papaïne.
Déroulement de la séance :
Le formateur pourra introduire la séance par le rappel de la
définition de l'agglutination, de l'agglutination spontanée et de l'agglu-
tination passive.
Puis, il abordera l'agglutination artificielle qu'il devra définir
et analyser à partir de l'étude du potentiel zéta.
Dans la phase pratique de la séance, il rappellera la composition
de l'anti-D, avant de faire exécuter dans un premier temps par les étu-
diants ou stagiaires, la détermination de l'antigène Rh standard sur les
quatre échantillons de sang distribués. Cette détermination sera effectuée
sur Rhésuscope.
Dans l'interprétation des résultats obtenus, le formateur devra
faire ressortir l'importance du témoin albumine, en se basant sur les résul-
tats du groupage Rh concernant l'échantillon de globules rouges dOe/dOe
sensibilisés in vitro par l'anti-c.
Ensuite, la séance sera poursuivie par la recherche du 0 faible ou
Du, d'une part, au moyen du test deCoombs indirect effectué sur les échan-
tillons de sang Rh-et 0 faible distribués, et d'autre part, après traite-
ment de ces mêmes échantillons de sang par la papaïne.
Les résultats obtenus à la suite de la recherche du 0 faible se-
ront comparés à ceux du groupage Rh standard précédemment effectué, pour
faire ressortir l'intérêt pratique de l'utilisation de ces artifices.
Au total, l'organisation de cette séance aura permis aux étudiants

---

53.
ou aux stagiaires de pratiquer trois différentes techniques d'agglutina-
tion artificielle et de constater concrètement que l'agglutination est
bien une manifestation visible de la réaction antigène-anticorps, et non
la réaction antigène-anticorps elle-même.

---

54.
TRAVAUX PRATIQUES N° 6
Titre
INHIBITION DE L'HEMAGGLUTINATIGN PASSIVE
(13, 14, 15)
Dans le cadre de l'enseignement de la pratique des réactions
d'hémagglutination, il importe après la présentation de l'agglutination
spontanée et de l'agglutination artificielle, d'envisager l'inhibition
de l'hémagglutination passive également utilisée à des fins diagnostiques.
Ainsi, le formateur pourra organiser la présente séance de travaux
pratiques, en appliquant la réaction d'inhibition de l 'hémagglutination
passive à la recherche de l'antigène HBs dans le sérum des donneurs de
sang.
Préparation de la séance
* Matériel
!l Préparer les différents tampons dont les formules sont indiquées
ci-dessous :
. I~~QQ~_~UQ~Qb~~~_~~li~~_~_Q~_Zlg
- solution de NaH2P0 0,2 M
4
115 ml
- solution de Na 2HP0 0,2 M
385 ml
4
- Nacl
17 g
- eau distillée q.s.p.
2000 rr~
. I~~QQ~_I~~_~l~~~i~~
- Tampon phosphate saline
1000 ml
- polyvinyl pyrrolidone
(specia)
25 mg
- Tween 80
0,05 ml
Avant chaque utilisation, ajouter à 100 ml de ce tampon,
1,66 ml de solution à 30 % d'albumine bovine.

---

55 .
. I~~eQQ_~~~t_~_e~_Zl~
- Solution de MgC1
5 ml
2
M
- Solution de CaCl
5 ml
l
0,3 M
- Hcl N
34,6 ml
- Véronal sodée
10,190 g
- Nacl
83 g
- eau distillée q.s.p.
2000 ml
~ Préparer les globules rouges sensibilisés selon le protocole
ci -après :
- Prélever chez les donneurs de sang, les hématies 0 sur EDTA ;
- Laver 6 fois ces hématies en tampon Mayer dilué au 1/5 extem-
poranément ;
- Ramener le culot globulaire obtenu A une hématocrite de 55 %
- Réaliser le couplage de l'antigène HBs purifié aux globules
rouges ainsi lavés, en ajoutant à un volume de culot globulaire~
un volume d'antigène HBs et un volume de solution C1 3Cr faite
extemporanément en tampon Mayer au 1/5 ;
- Agiter manuellement ou mécaniquement pendant 15 mn le mélange
- Laver 5 fois les globules rouges traités en tampon Mayer au
1/5 ;
- Reprendre le culot globulaire dans 10 fois sonvolume en tampon
de conservation à pH 7 ;
- Juste avant l'emploi, rediluer la suspension globulaire en
tampon TAP au 1/30.
~ Utiliser les globules rouges humains sensibilisés, pour effec-
tuer le titrage de l'anticorps anti-HBs contenu dans le sérum d'un donneur,
par la méthode de dilutions sérielles de raison 2. Les dilutions successives
de ce sérum doivent être faites en tampon TAP albumine au moyen.de pipettes
Pasteur calibrées à 25 gouttes par ml ou si possible au moyen de Pipettes
Ependorf de 25 ~l.

---

56.
A partir du titrage ainsi effectué, on retiendra pour la réaction
d'inhibition de l'hémagglutination passive, la dilution 4 fois inférieure
au titre déterminé.
21 Apprêter le matériel complémentaire ci-après
une plaque de microtitration par paillasse
- une pipette Ependorf avec cônes plastiques adaptés ou des
pipettes Pasteur calibrées à 25 gouttes par ml ;
- des tubes à hémolyse et des portoirs.
* Echantillons de sérums à analyser
Distribuer par paillasse, 6 échantillons de sérums provenant de
donneurs différents et trouvés positif normal, positif limite et négatif
en antigène HBs par la technique d'électro-immunodiffusion.
* Réactifs anticorps
Le réactif anticorps à distribuer par paillasse, est le sérum
de donneur précédemment titré. La dilution d'utilisation de ce sérum
est celle qui correspond à la dilution 4 fois inférieure au titre déter-
miné.
* Réactif antigène
Distribuer par paillasse, une suspension de glogules rouges hu-
mains 0 précédemment sensibilisés par l'antigène HBs.
La suspension de globules rouges sensibilisés distribuée doit
être rediluée au 1/30 en tampon TAP albumine avant utilisation.
Déroulement de la séance:
La séance peut être introduite par le rappel du principe de la
réaction d'inhibition, puis par la description de la technique Rroprement
dite de la réaction d'inhibition de l'hémagglutination passive.
A partir de cette description faite par le formateur, les étudiants

---

57.
ou stagiaires devront d'abord diluer en tampon TAP albumine, d'une part,
les hématies humaines sensibilisées au 1/30, et d'autre part, les sérums
à analyser au 1/10.
Ainsi,chaque sérum à étudier sera testé au pur (1/1) et dilué
au 1/10.
Ensuite, chaque étudiant ou stagiaire devra effectuer la recherche
de l'antigène HBs sur les différents sérums distribués- par paillasse,
en utilisant horizontalement une seule rangée de godets de la micro-
plaque.
Enfin, pendant que les différentes réactions mises en route sont
en incubation, le formateur devra entraîner les étudiants ou stagiaires
à lire et interpréter correctement la réaction d'inhibition de l'hémagglu-
tination
à partir d'exemples de réactions déjà effectués avant la séance.
Au total, par l'organisation de cette troisième séance de travaux
pratiques sur la réaction d'agglutination, le formateur aura appris aux
étudiants ou aux stagiaires, les différentes facettes sous lesquelles,
cette réaction peut être utilisée en pratique pour des fins diagnostiques.

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58.
TRAVAUX PRATIQUES N° 7
Titre
IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE
IDENTIFICATION D'LIN ANTICORPS
ANTISCHISTOSOME
(61, 65)
Cette séance a pour but de montrer aux étudiants ou aux stagiaires,
l'intérêt diagnostique des réactions antigène-anticorps utilisant un mar-
quage.
Pour atteindre ce but, le formateur pourra étudier en exemple,
l'immunologie d'une maladie parasitaire locale (les bilharzioses) par
la technique d'immunofluorescence indirecte.
Préparation de la séance
* Matériel
a) Préparer les solutions suivantes conformément aux formules
indiquées ci-dessous:
- chlorure de sodium
17 9
- phosphate de sodium mono-
sodique
0,6 g
- phosphate de sodium disso-
dique
5,5 g
- eau distillée à Ph 7,2
2000 ml
. §l~s~riŒ~_~~~QQŒŒ~~
- glycérine
1 partie
- tampon phosphate à pH 7,2
9 parties
. Solution de bleu Evans
----------------------
Dissoudre un gralTD11e de bleu Evans dans 100 ml de tampon
phosphate à pH 7,2. Cette solution est conservable à +4°C pendant 15
jours. Au moment de l'emploi, elle doit être rediluée en tampon phosphate

---

59.
à pH 7,2 dans la proportion de 1 ml de solution-mère de bleu Evans pour
99 ml de tampon.
b) Apprêter le compl ément de matériel sui vant :
- lames de microscope et lamelles. Sur chacune de ces lames
seront gravés dans le sens de la longueur 3 petits cercles
de diamètre égal à celui de la petite pièce de 1 F CFA;
- pipettes Pasteur et tétines, (chaque pipette Pasteur doit
être calibrée à 25 gouttes par ml) ;
- acétone ;
- graveurs ;
- tubes à hémolyse et portoirs ;
2 bacs pour les lavages successifs
- un bac à coloration ;
matériel pour réaliser la chambre humide
- un ou deux microscopes ordinaires ou des loupes.
c) Apprêter le microscope à fluorescence avec tout son équipement,
et régler l'étuve à 37°C.
* Echantillons de sérum à tester
Distribuer par paillasse :
- un échantillon de sérum
provenant de sujet bilharzien ;
- un échanti~lon de sérum prélevé chez un sujet victime de
l'onchocercose ;
et un échantillon de sérum provenant de sujet sain.
* Réactif antigène
Distribuer par paillasse, 2 à 3 petits bocaux contenant de l'eau
de source, ou de l'eau du robinet vieillie riche en furcocercaires émises
par des mollusques du genre Biomphalaria. Dans chaque petit bocal seront
laissés le ou les mollusques ayant émis ces larves parasitaires.
* Réactif anticorps
Prévoir pour la séance, un ou deux flacons d'antiglobuline polyva-

---

60.
lente marquée à la fluorescéine et dont la spécificité a été préalablement
contrôlée à la dilution efficace.
Déroulement de la séance
La séance peut être introduite par le rappel du principe de la
réaction d'immunofluorescence indirecte, de ses avantages et de ses uti-
lisations en biologie humaine.
Puis, après la description du microscope à fluorescence et de la
technique d'exécution de la réaction d'immunofluorescence indirecte, le
formateur devra amener successivement les étudiants ou stagiaires à :
- examiner les mollusques Biomphalaria ;
- observer à la loupe les furcocercaires dans les petits bocaux
ou au microscope entre lame et lamelle
- réaliser la suspension de furcocercaires appropriée pour la
réaction d'immunofluorescence indirecte;
- étaler une goutte de suspension de furcocercaires devant servir
de support antigènique ;
- réaliser au 1/20, 1/40, 1/80 les dilutions des différents
sérums à étudier ;
- effectuer complètement la réaction d'immunofluorescence indi-
recte sur chacune de ces dilutions.
Pendant les périodes dl incubation absolument nécessaires dans
l 1 exécution de la réaction d'immunofluorescence indirect, le formateur
devra faire examiner par chaque étudiant ou stagiaire, le microscope
à fluorescence et son équipement. Il devra également leur faire observer
des exemples de réactions d'immunofluorescence positives, faiblement
positives, douteuses et négatives, antérieurement effectuées.
Enfin, la séance sera terminée par la lecture des réactions
effectuées et l 1 interprétation des résultats obtenus, tout en indiquant
les manifestations des réactions croisées ainsi que le seuil de spécifi-
cité.

---

61.
Au total, par 1'organisationdecette séance de travaux pratiques
sur llimmunofluorescence indirecte, le formateur aura ainsi fait le tour
des techniques immunologiques simples pouvant être exécutées en
République Populaire du Bénin dans un but diagnostique.
Nous allons dans la suite de ce travail, envisager les bases pra-
tiques propres à 1'immuno-hématologie, bases pratiques qui doivent être
aussi maîtrisées par les techniciens.

---

62.
TRAVAUX PRATIQUES n'IMMUNO-HEMATOLOGIE

---

63.
En raison du programme de développement de la Transfusion
Sanguine actuellement en cours en République Populaire du Bénin- (création
de 5 Centres Provinciaux de Transfusion Sanguine
et de 21 postes de
Transfusion Sanguine), et en vue d'uniformiser les techniques et méthodes
de travail dans tout le pays, les travaux pratiques d'enseignement de
l'Immuno-Hématologie pourraient être organisés dans deux cadres de
formation: le cadre universitaire et le cadre de la formation continue.
Dans le cadre universitaire, neuf séances de travaux pratiques
suffisent pour enseigner aux étudiants en techniques de laboratoire
médical et en médecine, les techniques de base de l 1 Immuno-Hématologie.
Quant au cadre de la formation continue, en plus des travaux
pratiques prévus pour la formation universitaire, trois séances supplé-
mentaires nous paraissent absolument nécessaires pour mieux armer les
techniciens déjà en activité dans les établissements de Transfusion
Sanguine.
Ces séances supplémentaires concernent, le phénotypage plus
élargi, le contrôle des réactifs et les polyagglutinabilités érythrocy-
taires.
Voyons donc successivement les modes de préparation et de dérou-
lement des diverses séances de travaux pratiques prévues pour la formation
universitaire et pour la formation continue.

---

64.
FORMATION UNIVERSITAIRE

---

65.
TRAVAUX PRATIQUES N° l (130)
Titre
ANALYSE DES PRINCIPES, GESTES ET REACTIFS UTILISES
EN IMMUNO-HE~~TOLOGIE
Le but de cette séance est de présenter aux étudiants ou aux
stagiaires, les principes suivis, les gestes élémentaires souvent exécutés
et les réactifs couramment utilisés en Immuno-Hématologie.
Pour y parvenir le plus concrètement possible, il importe
d'apprêter tout le matériel utile dans un laboratoire d'Immuno-Hématologie.
Préparation de la séance
De toute évidence, avant chaque séance de travaux pratiques, il
importe de connaître le nombre d'étudiants ou de stagiaires effectivement
présents.
Dans le cas particulier de cette première séance, il convient de
préparer la salle de travaux pratiques en apprêtant le matériel qui peut
être utilisé dans un laboratoire d'Immuno-Hématologie.
Ainsi,mettra-t-on à la place réservée à chaque étudiant ou
stagiaire
- un lot de cellulose ou de compresses d'environ 2 cm d'épaisseur
et dont le rôle est de permettre le séchage de la pipette
Pasteur ;
- deux béchers de 250 ml servant ~ contenir les eaux de lavage et
de rinçage de la pipette Pasteur;
- un cristallisoir ou un troisième bécher plus grand dont le rôle
est de recevoir les eaux de lavage et de rinçage de la pipette
Pasteur.
- une pipette Pasteur munie de tétine. Le bout effilé de cette
pipette Pasteur doit être régulièrement sectionné et la zone
d'insertion pipette-tétine doit être serrée par un élastique
pour assurer une étanchéité absolue ;

---

66.
un litre d'eau physiologique à 9 %0 par paire d'étudiants ou de
stagiaires ;
L'eau physiologique est utilisée en Immuno-Hématologie pour laver
les globules rouges et réaliser les différentes dilutions des
sérums ou des globules rouges.
- un crayon feutre par paire d'étudiants ou de stagiaires pour
identifier les tubes d'échantillons et les tubes de réactions
- un portoir en bois, en métal ou en plastique servant à poser les
tubes ;
- une plaque d'opaline utilisée pour effectuer les groupages
sanguins ;
- une pissette remplie d'eau physiologique à 9 %0 qui sera utilisée
lors des lavages de globules rouges ;
On disposera par paillasse:
- une centrifugeuse de table
- un microscope mono ou binoculaire
un rhésuscope servant à déterminer les groupes Rh
- une boîte de lames porte-objet ;
- un carton de tubes à hémolyse ou de tubes de Kahn
- un carton de microtubes si possible.
Les microtubes sont utilisés dans le groupage Rh et lors de la
recherche d'agglutinies irrégulières par la technique à 22°C en
saline;
- un chronomètre qui sera utilisé pour la mesure de l'avidité
d'un anticorps pour son antigène;
un compte-minutes dont le rôle est de servir au chronométrage
des réactions mises en route.
Le matériel lourd utilisé dans un laboratoire d'Immuno-Hématologie,
et qu'il convient de présenter aux étudiants ou aux stagiaires dans le
cadre de cette séance de travaux pratiques doit comprendre
- une étuve réglable à 37°C ;
- un bain-marie à température réglable sur 37°C et 56°C

---

67.
Ce dernier appareil permet d'incuber les réactions et d'effectuer
les tests d'élution.
- un Poupinel, appareil non absolument nécessaire dans un labora-
toire d'Immuno-Hématologie, mais il convient de l'obtenir pour
réaliser localement les stérilisations souhaitées.
- un réfrigérateur dont l'importance est capitale dans un labora-
toire d'Immuno-Hématologie, car il sert à conserver les réactifs
anticorps ou cellulaires en cours d'utilisation;
- un pH-mètre utilisé pour ajuster le pH de certaines solutions
localement préparées ;
- un congélateur servant à conserver pour une longue durée, les
stocks de réactifs anticorps et cellulaires
- une balance pouvant être utilisée pour peser les produits chi-
miques dans les limites de 0,1 g à 300 g.
Les réactifs qulil convient d'apprêter pour présenter aux étudiants
ou aux stagiaires dans le cadre de cette séance sont
- des réactifs sériques d'origine humaine ;
(exemple : réactifs anticorps du système ABD, du système Rhésus,
si possible du système Lewis, et le sérum AB)
- des réactifs sériques d'origine animale ;
(exemple: réactifs antiglobulines humaines, réactifs anti-M
anti-N, etc ••. ) ;
- des réactifs d'origine végétale
(exemple: lectines de Dolichos biflorus et d'Ulex europaeus)
- des réactifs cellulaires d'origine humaine, notamment les
suspensions à 5 %et 10 %en saline de globules rouges tests A1,
A2, B et 0 ;
- des enzymes protéolytiques, en particulier des flacons de papaïne.

---

68.
Déroulement de la séance
En introduction à cette premlere séance, il convient de rappeler
la définition de l 1 Immuno-Hématologie et son but, avant de souligner que
tout laboratoire peut faire une Immuno-Hématologie d'excellente qualité
à partir d'un matériel relativement simple.
Ensuite, le formateur pourra présenter le matériel ci-dessus
apprêté, tout en précisant l 1 intérêt de chaque composant.
Les principes et gestes élémentaires que le forn~teur devra ana-
lyser, exécuter et faire exécuter par les étudiants ou stagiaires sont:
- comment s'installer confortablement à la paillasse;
- comment se servir correctement de la pipette Pasteur
- comment étaler et lire correctement une agglutination
- quels témoins utiliser et quand les utiliser.
Pour apprendre aux étudiants ou aux stagiaires à distribuer dans
les différents tubes, une même quantité d'anticorps ou d'antigène, il
convient de les éduquer à maintenir la pipette Pasteur en position verti-
cale pendant toute la durée de la distribution.
Le dernier point à envisager pour clore cette première séance
concerne le conditionnement des réactifs couramment utilisés en Immuno-
Hématologie.
A cet effet, le formateur devra preClser l'origine, la nature, la
spécificité et les différents modes de conservation des divers réactifs.
Il s'agit des réactifs sériques (anticorps, sérum AB, albumine bovine),
des réactifs cellulaires (globules rouges - tests) et des enzymes protéo-
lytiques (flacons de papaïne).
A titre d'exemples concrets, le formateur présentera aux étudiants
ou aux stagiaires, des flacons de réactifs sériques d'origines humaine,
animale et végétale, ainsi que des réactifs cellulaires et flacons
d'enzymes protéolytiques qulil aura apprêtés.
Au total, l'étudiant ou le stagiaire ayant attentivement SU1Vl
cette première séance de travaux pratiques, devrait pouvoir s'installer
correctement à une paillasse de groupage et utiliser sans fautes une
pipette Pasteur.

---

69.
TRAVAUX PRATIQUES N°2
Titre
GROUPAGES ABO NORMAUX
(78, 108, 130)
Le but de cette séance est d'apprendre aux étudiants ou aux sta-
giaires, la technique de groupage ABO correcte à partir des échantillons
de sang normaux.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédemment indiqué pour chaque étudiant ou
stagiaire et celui prévu par paillasse, excepté les rhésuscopes, les
boîtes de lames porte-objet, les cartons de microtubes, les chronomètres
et les compte-minutes.
* Echantillons à analyser
Distribuer par étudiant ou stagiaire, environ 7 échantillons de
sang total prélevés chez des donneurs normaux de phénotypes A1, A2' 0,
B et AB. Les échantillons AB peuvent être de phénotype A1B et/ou A2B.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse, des culots de globules rouges tests
A1, A2 et B lavés 3 fois en eau physiologique.
Les étudiants ou stagiaires réaliseront eux-mêmes, les suspensions
salines à 10 % de ces globules rouges-tests.
* Réactifs anticorps
Prévoir par paire d'étudiants ou de stagiaires, une boîte de
réactifs anti-A, anti-B et anti-A+B, et par paillasse, un flacon d'anti-
A1, ainsi qu1un flacon d'anti-H.
Les réactifs anti-A, anti-B et anti A+B nécessaires pour ces
travaux pratiques pourraient être localement préparés par la technique
indiquée à l'annexe de ce travail.

---

70.
Déroulement de la séance :
Cette séance peut être introduite par un exposé sur la méthode
de groupage ASO et les règles administratives pouvant codifier ce groupage
au Bénin. Les règles sérologiques et la concordance entre _l'épreuve glo~u­
laire et l'épreuve sérique qui caractérisent le groupage ABO seront égale-
lement rappelées.
Ensuite. le formateur devra rapporter les données précises concer-
nant la technique du groupage ABO sur plaque d'opaline.
Ces données techniques seront aussitôt mises en pratique par chaque
étudiant ou stagiaire pour effectuer le groupage des échantillons qui 1ui
sont distribués.
Les échantillons seront testés un par un. afin que soient contrô-
lées pour chaque étudiant ou stagiaire. la technique. la lecture et la
quantification des réactions d'agglutination érythrocytaire observées.
A partir des résultats corrects enregistrés. le formateur devra
insister sur l'obligation d'effectuer dans tout groupage ABO.les deux
épreuves globulaire et sérique.
Il devra à nouveau insister sur la concordance à observer entre
ces deux épreuves avant la délivrance d'un résultat de groupage.
Enfin. il convient d'envisager la pratique de la détermination des
phénotypes A, et A2• avant de faire réexaminer par les étudiants ou sta-
giaires. les mêmes échantillons par la technique en tubes.
Au total. l'étudiant ou le stagiaire ayant attentivement suivi
cette séance de travaux pratiques devrait pouvoir effectuer correctement
dans les deux techniques. un groupage ABO normal. et lire sans difficultés
les résultats obtenus.

---

71.
TRAVAUX PRATIQUES N° 3
Titre
GROUPAGE ABD: DIFFICULTES ET GROUPES RARES
(78, 108, 130)
Le but de cette séance est de présenter aux étudiants et aux sta-
g1alres quelques exemples concrets de discordance, de difficultés diverses
et si possible de groupes rares.
Ces discordances et difficultés ne sont pas naturellement si fré-
quentes pour satisfaire en temps voulu, les besoins de l'enseignement.
Il est donc nécessaire que le formateur sache les créer artifi-
ciellement in vitro en cas de besoin, pour les présenter aux étudiants
ou aux stagiaires lors de la formation pratique.
Plusieurs manifestations préparatoires sont donc nécessaires avant
le démarrage des travaux pratiques proprement dits, en cas d'absence de
malades ou de donneurs présentant concrètement ces difficultés, discor-
dances ou groupes rares.
En ce qui concerne particulièrement les groupes rares, leur créa-
tion artificielle nlest pas possible. Ils seront répertoriés au fur et à
mesure de leur découverte, et conservés au laboratoire de référence.
Préparation de la séance
en cas- d'absence de cas concrets,
de difficultés ou de discordances
* t'1atéri el
Apprêter le même matériel -que celui indiqué pour la séance
précédente.
Déposer dans 1létuve à 37°C, des pissettes remplies d'eau physio-
logique à 9 %0.

---

72.
* Réactifs cellulaires
Réaliser et distribuer à chaque étudiant ou stagiaire, des suspen-
sions à 10 %en saline de globules rouges-tests A1, A2, B, 01' 02' 03'
04' 05·
Le globule rouge A2 et l'un au moins des globules roUges °doivent
avoir le même phénotype Lewis.
* Réactifs anticorps et autres
Prévoir par paillasse, les réactifs anti-A, anti-B, anti A+B,
anti -A1 et anti-H, à raison d'un flacon par réactif. Prévoir également
par paillasse un flacon ou tube de sérum AB.
* Echantillons à étudier
Si au moment de l'organisation des travaux pratiques, des malades
ou des sujets présentant ces cas concrets de difficultés ou de discordances
sont disponibles, il faudra distribuer par étudiant ou stagiaire :
- un échantillon de sang de malade atteint du syndrôme des
agglutinines froides;
- un échanti 11 on de sang de sujet agammag1 obu1 inémique
- un échantillon de sang de sujet transfusé par du sang compatible
non isogroupe (par exemple sujet A ou B transfusé par du sang 0)
- un échantillon de sang de sujet ayant un anticorps irrégulier dans
son sérum.
En cas d'absence de l'un ou de l'ensemble des sujets présentant
ces différents cas sus-cités, les manipulations suivantes pourraient
être effectuées pour préparer artificiell ement in vitro, 1e ou 1es échan-
tillons de sang appropriés •
• Préparation artificielle d'un échantillon de sang pouvant remplacer
l'échantillon de sang de sujet atteint du syndrôme des agglutinines
froides
- Distribuer par tube, 2 à 3 ml de sérum de sujet adulte A ou B
ou 0, n'ayant pas d'anticorps irréguliers;
- Déposer à l'aide de la pipette Pasteur au fond de chaque tube
ayant reçu du sérum, 2 à 3 gouttes de globules rouges autologues prélevés

---

73.
sur anticoagulant
- Environ 5 à 10 mn avant le début des manipulations pratiques,
mettre dans les tubes de sang, une à deux gouttes d'un sérum contenant
un anti-I sélectionné ayant un fort titre (1024) par exemple;
- Placer les tubes de sang à +4°C pendant quelques mn (3 à 5 mn).
Llanti-I se fixe en partie sur les globules rouges, le reste étant encore
dans le sérum.
Dans llanalyse de cet échantillon, le formateur devra guider
llétudiant ou le stagiaire, afin que celui-ci découvre par lui-même, les
contrôles à effectuer et la méthode à utiliser pour trouver le phénotype
ABO correct de lléchantillon en étude •
. Préparation artificielle dlun échantillon de sang pouvant remplacer
lléchantillon de sang de sujet agan~globulinémique
- Distribuer par tube, 2 à 3 ml de sérum dlun sujet AB nlayant pas
dlanticorps irréguliers.
- Déposer dans les tubes ayant reçu du sérum AB, 2 ou 3 gouttes
de culot globulaire A ou B ou 0 lavé 3 fois en saline, les globules
rouges devant être prélevés sur anticoagulant .
. Préparation artificielle dlun échantillon de sang pouvant remplacer
lléchantillon de sang de sujet transfusé par du sang compatible non
isogroupe : (exemple choisi sujet A transfusé par 0)
- Réaliser un mélange globulaire comprenant 20 gouttes de culot
de globules rouges A1 lavés 3 fois en saline et 10 gouttes de culot de
globules rouges 0 lavés 3 fois en saline.
- Homogénéiser le mélange à la pipette Pasteur par plusieurs
aspirations suivies de plusieurs refoulements.
- Répartir par tube, 2 à 3 ml de sérum de sujet A nlayant pas
dlanticorps irréguliers.
- Déposer au fond de chaque tube ayant reçu du sérum, 2 à 3
gouttes du mélange globulaire réalisé.

---

74.
L'étude de cet échantillon a pour but de montrer à l'étudiant
ou au stagiaire, la double population. A cette occasion, le formateur
discutera les diverses causes d'une double population de globules
rouges.
Préparation d'un échantillon de sang contenant un anticorps irrégulier
Le réactif anticorps susceptible d'être mélangé in vitro avec le
sérum d'un donneur convenablement choisi, peut avoir la spécificité
anti-P 1, anti-Lewis, anti-M, ou anti-N.
Pour le cas particulier de l'Afrique Noire où les anticorps
anti-Lewis sont assez fréquents (13 % des Gabonais Le(a-b-) sont un anti-
Lewis, on pourrait facilement constituer ce type d'échantillon pour les
besoins de l'enseignement, en utilisant tel quel, un sérum de donneur
A Le(a-b-) ayant un anti-Lea.
Dans ce cas, il faudra
- répartir par tube 2 à 3 rr~ de ce sérum ;
déposer au fond de chaque tube ayant reçu du sérum, 2 ou 3
gouttes de globules rouges du même donneur ou d'un autre
donneur Le(a-b-).
Dans ces conditions, le globule rouge A2 et l'un au moins des
globules rouges 0 prévus pour l'épreuve sérique doivent être Le(a+).
Déroulement de la séance
Cette séance de travaux pratique représente la suite normale de
la séance précédente. Il convient donc de l'introduire par le rappel
des techniques exécutées au cours des groupages ABO normaux.
Un autre élément qui mérite d'être rappelé concerne la concordance
qui a été observée entre l'épreuve globulaire- et l'épreuve sérique de
tous les cas de groupages examinés.
Après ces rappels, le formateur pourra élargir le champ d'analyse
en abordant les cas d'exception où sont observés les discordances entre
les épreuves globulaire et sérique.

---

75.
Dans ce cadre, les échantillons de sang à tester seront examinés
un par un sur plaque d'opaline, afin que chaque étudiant ou stagiaire
apprenne à observer la difficulté, à la situer, à l'analyser par les
différents témoins et à l'interpréter correctement.
Les témoins à utiliser dans les discordances sont:
- le témoin auto dont la négativité indique l'absence d'aggluti-
nines froides ;
- le témoin AB dont la négativité donne toute garantie à l'épreuve
globulaire et indique l'absence de polyagglutinabilité érythro-
cytaire ;
- et le témoin allo dont la négativité rend interprètable l'épreuve
sérique et signe l'absence d'anticorps irréguliers agglutinants.
Les doubles populations seront lues macroscopiquement sur plaque
puis au microscope par chaque étudiant ou stagiaire, en référence à une
double population type (globules rouges A + globules rouges 0) que celui-
ci aura préparée extemporanément en mélangeant 2 gouttes de AZet 2
gouttes de O.
Les cas de double population seront repris par la technique en
tubes pour montrer aux étudiants ou aux stagiaires, l'inconvénient majeur
de cette dernière technique dans l 1 identification de ce phénomène.
Au total, le formateur devra faire ressortir au terme de ces deux
séances de travaux pratiques sur les groupages ABD, le caractère particu-
lier propre à chaque groupage, et par conséquent, la rigueur dont doit
faire preuve le biologiste dans l'analyse et l'interprétation des résul-
tats de chaque groupage. Il doit faire ressortir également l'importance
des témoins en cas de discordance entre l'épreuve globulaire et l 1 épreuve
sérique.

---

76.
TRAVAUX PRATIQUES N° 4
Titre
GROUPAGE RHESUS
(78, 108, 130)
Cette séance a pour but d'apprendre aux étudiants ou aux stagiaires,
à déterminer correctement les antigènes Rhésus, notamment l'antigène Rh
standard sur la base de réaction témoin appropriée, le témoin albumine.
Pour cela, plusieurs échantillons de sang sont nécessaires.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédemment indiqué pour chaque étudiant
ou stagiaire, et celui prévu par paillasse à l'exception des chronomètres.
* Echantillons de sang à examiner
Distribuer par étudiant ou stagiaire
- trois échantillons de sang Rh+ normal
- deux échantillons de sang Rh-
- un échantillon de sang prélevé chez un malade atteint
d'anémie hémolytique auto-immune de type IgG.
Si l'on ne dispose pas de tel malade sous la main au moment de
l'organisation de cette séance, on pourrait artificiellement préparer
in vitro un échantillon de sang pour simuler cette affection de la manière
suivante : à un volume de sang rr lavé 3 fois en eau physiologique,
ajouter un volume égal d'anti-c de titre au moins égal à 8, et incuber
le mélange à 37°C pendant 45 mn.
Répartir ce mélange dans les tubes à distribuer aux étudiants
ou aux stagiaires.
- Enfin et dans la mesure où les réactifs anti-Rh sont.disponibles,
on pourrait distribuer à chaque étudiant ou stagiaire, un échantillon de
sang à phénotyper dans le système Rhésus.

---

77.
* Réactifs
Prévoir par paillasse
- un flacon d'anti-D albumineux
un flacon d'albumine témoin
et dans la mesure du possible
- un flacon d'anti-D salin;
un flacon d'anti-D+C+E albumineux ;
un fl acon d' ant i -c al bumi neux
un flacon d'anti-E albumineux
un flacon d'anti-e albumineux
Déroulement de la séance
Cette séance de travaux pratiques pourra être introduite par un
bref rappel théorique sur la découverte du système Rhésus, sur la méthode
de détermination des antigènes Rhésus, et sur les règles administratives
codifiant actuellement cette détermination.
Il convient également de rappeler, la définition exacte de
l'agglutination artificielle et les facteurs qui l'influencent~ avant de
présenter la composition des réactifs utilisés pour la détermination des
antigènes Rhésus.
Le formateur pourra ensuite donner le schéma technique du groupage
Rhésus sur plaque chauffante.
Ce schéma technique sera aussitôt mis en pratique par chaque
étudiant ou stagiaire, d'abord sur les 3 échantillons Rh+ et les 2 échan-
tillons Rh-, puis dans un second temps sur l'échantillon de sang rr sen-
sibilisé in vitro par l'anti-c.
Les différents résultats obtenus seront enregistrés et largement
commentés, notamment ceux concernant l'échantillon de sang rr sensibilisé
par l'anti-c.
Dans ce cas particulier, le formateur devra mettre en relief
l'importance du témoin albumine, avant d'indiquer les manipulations à
exécuter pour faire une détermination exacte de l'antigène D.

---

78.
Puis, dans l'esprit des règles administratives en vigueur pour
le groupage Rhésus standard, le formateur fera réexaminer les mêmes
échantillons de sang par la technique en tube.
Ensuite, sur des indications techniques preclses que le formateur
aura données, les étudiants ou stagiaires effectueront chacun, un phéno-
typage Rhésus complet sur un échantillon de sang prévu à cet effet. Dans
ce cadre, il importe que le formateur souligne aux étudiants ou aux sta-
giaires, la nécessité d'observer rigoureusement la notice d'emploi qui
accompagne toujours un réactif.
A partir des résultats obtenus à la suite du phénotypage Rhésus,
le formateur devra amener les étudiants ou stagiaires, à déterminer les
génotypes possibles et les génotypes probables.
A titre d'entraînement, le même type d'exercice peut être étendu
à d'autres exemples théoriques jugés instructifs par le formateur.
Au total, l'étudiant ou le stagiaire qui a suivi attentivement
cette séance de travaux pratiques, devrait saisir l'importance du témoin
albumine dans toute épreuve de détermination de l'antigène 0.11 devrait
pouvoir effectuer correctement cette épreuve, ainsi que le phénotypage
Rhésus complet.

---

79.
TRAVAUX PRATIQUES N° 5
Titre
LE TEST DE COOMBS (78, 108, 109, 130)
Le test de Coombs est l'une des réactions les plus souples ou les
plus riches de possibilités en Immuno-Hématologie. Dans le cadre de cette
formation, il convient de lui consacrer une séance entière de travaux pra-
tiques pour montrer son importance dans le diagnostic des anémies hémoly-
tiques immunologiques, la recherche de certains antigènes de groupes
sanguins et la recherche des anticorps irréguliers. Plusieurs échantillons
de sang sont donc nécessaires.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédemment indiqué pour chaque étudiant
ou stagiaire, et celui prévu par paillasse, à l'exception des chronomètres
et des cartons de microtubes.
* Echantillons de sang à examiner
Distribuer par étudiant ou stagiaire
- deux échantillons de sang de sujet atteint d'anémie hémolytique
auto-immune de type IgG. Si l'on ne dispose pas de malade pré-
sentant cette affection, on pourrait préparer artificiellement
un échantillon de sang suivant le protocole indiqué à la page 76.
- un échantillon de sang de sujet atteint du syndrôme des aggluti-
nines froides. Si l'on ne dispose pas de malade présentant ce
type d'affection, on pourrait artificiellement préparer un échan-
tillon de sang en sensibilisant des globules rouges d'adulte 0
par un anti-I sélectionné comme il est indiqué aux pages 72 et 73.
- un échantillon de globules rouges D faible ou DU.
Par l'analyse de cet échantillon, le formateur montrera l'utilité
du test de Coombs dans la détermination de certains antigènes
de groupes sanguins.

---

80.
- un échantillon de sérum contenant un anticorps anti-Lea inactif
en saline à 22°C.
L'analyse de cet échantillon permettra au formateur de montrer
l'utilité du test de Coombs dans la recherche des anticorps
i rrégul i ers.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse
- une suspension à 5 % en saline de globules rouges rr ou Ror
sensibilisés par i 'anti-c pour contrôler l'activité anti-IgG de l'antiglo-
buline
- une suspension à 5 % en saline de globules rouges Le(a+) sensi-
bilisés par l'anti-Lea suivant le protocole ci-après
à un volume de culot globulaire Le(a+) lavé 3 fois en saline, ajouter un
volume égal de réactif anti-Lea non agglutinant ou plus simplement un
volume égal de sérum d'un donneur ou d'un malade, contenant un anti-Lea
puissant. Incuber le mélange à 37°C pendant 45 mn. Centrifuger, retirer
le surnageant et le remplacer par un volume égal du sérum AB frais et
incuber à nouveau pendant 20 mn. Ce sont les globules rouges ainsi traités
qui sont lavés 3 fois et remis en suspension à 5 % en saline. Ils per-
mettent de contrôler l'activité anti-Complément de l'antiglobuline.
- une suspension à 5 % en saline de globules rouges D faible
connu pour servir de témoin positif dans la recherche du D faible ;
une suspension à 5 % en saline de globules rouges Rh- pour servir
de témoin négatif dans la recherche du D faible;
- une suspension à 5 % en saline d'un panel composé de 2 ou 3
hématies convenablement choisies, pour effectuer le dépistage de l'anti-
corps irrégulier contenu dans le sérum à examiner. Ce dépistage sera
seulement effectué en saline à 22°C et par le test de Goombs indirect.
* Anticorps et autres
Distribuer par paillasse
- un flacon d'antiglobuline humaine polyvalente;
- un flacon d'antiglobuline humaine spécifique anti-IgG (s;
possible)

---

81.
- un flacon d'antiglobuline humaine spécifique anti complément
(si possible) ;
- un flacon de sérum AB stérile ;
et un flacon d'eau physiologique à 9 %0 accompagnée d'une
-
pipette spéciale.
Déroulement de la séance :
La séance peut être introduite par un bref rappel théorique se
rapportant à la définition du test de Coombs, aux deux types du test
de Coombs et à leurs usages en biologie humaine.
Il convient également de rappeler le mode de préparation des
différentes antiglobulines humaines, et de mettre en relief, la nature
immunologique de l'artifice utilisé pour obtenir l'agglutination érythro-
cytaire dans le test de Coombs.
Après ces importants rappels, le formateur pourra donner les
indications pratiques relatives à l'exécution correcte du test de Coombs
direct.
Ces indications pratiques seront aussitôt mises en application
par chaque étudiant ou stagiaire sur les quatre premiers échantillons
sus-indiqués, les deux premiers donnant un Coombs direct négatif, et les
deux derniers, un Coombs direct positif.
Les résultats de ces tests d'application du Coombs direct seront
lus par les étudiants ou stagiaires, en référence aux réactions témoins
qu'ils auront parallèlement effectuées.
Ces réactions témoins dont le formateur devra préciser les signi-
fications sont :
- le témoin utilisant les globules rouges sensibilisés par
l'anti-c;
- le témoin utilisant le sérum AB en remplacement de l'antiglo-
bul ine ;
- et le témoin utilisant l'eau physiologique en remplacement de
l'antiglobuline.

---

82.
Le second aspect technique qu'il convient d'envisager dans cette
séance de travaux pratiques, concerne l'utilisation du test de Coombs
pour la recherche de certains antigènes de groupes sanguins érythrocy-
taires.
A ce niveau, l'exemple simple à faire exécuter est la recherche
de l'antigène D faible sur l'échantillon prévu à cet effet ainsi que sur
des témoins positif
et négatif
appropriés.
Le dernier aspect technique qu'il convient d'aborder se rapporte
à l'utilisation du test de Coombs dans la recherche d'un anticorps
irrégulier.
Dans ce cadre, l'exemple simple à faire pratiquer est le dépis-
tage d'un anti-Lea sur un panel de 2 ou 3 hématies convenablement choisies
par le formateur.
Compte tenu de la technicité rigoureuse avec laquelle le test
de Coombs doit être effectué, le formateur devra recenser les différentes
erreurs techniques commises par les étudiants ou stagiaires, afin d'en
profiter pour signaler avec insistance, toutes les causes qui peuvent
être à l'origine d'une réaction de Coombs faussement négative.
Au total, l'étudiant ou le stagiaire qui aura suivi attentivement
cette séance de travaux pratiques, devrait saisir trois aspects fondamen-
taux qui sont :
- la simplicité de la réaction de Coombs ;
- la technicité rigoureuse à mettre en oeuvre pour garantir
un résultat correct ;
- et les différentes situations dans lesquelles la réaction de
Coombs est utilisée en Immuno-Hématologie.

---

83.
TRAVAUX PRATIQUES N° 6
Titre
RECHERCHE DE SUBSTANCES SOLUBLES ABH DANS LA SALIVE
(32, 130)
L'intérêt de cette recherche est essentiellement d'ordre scienti-
fique et génétique.
Signalons cependant que les substances ABH salivaires peuvent être
utilisées pour l'immunisation de sujets volontaires en vue de préparer des
réactifs de groupage.
Préparation de la séance
* Matériel
- Apprêter le matériel précédemment utilisé pour le groupage ABO.
Ajouter à ce matériel, les compte-minutes.
- Prévoir un réchaud électrique ou à gaz et une casserole ou un
grand bécher pour réaliser un bain-marie bouillant.
- Distribuer par étudiant ou stagiaire, un tube à essai vide et
propre.
* Echantillons à analyser
Chaque étudiant ou stagiaire analysera au cours de la séance de
travaux pratiques, sa propre salive qu'il aura recueillie dans un tube à
essai qui lui est distribué.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse
- un tube de globules rouges A2 lavés et mis en suspension à 5 %
dans l'eau physiologique à 9 %0 ;
- un tube de globules rouges B lavés et mis en suspensi0!l à 5 %
dans de l'eau physiologique à 9 %0
- un tube de globules rouges a lavés et mis en suspension à 5 % en
saline.

---

84.
* Anticorps
Distribuer également par paillasse
- un flacon d'anti-A ;
- un flacon d'anti-B ;
- et un flacon d'anti-H (lectine d'U1ex europaeus)
Déroulement de la séance
Cette séance peut être introduite par le rappel de certaines
données de base concernant
- la définition du phénotype secréteur et du phénotype non secré-
teur de substance ABH ;
- les relations génétiques et fonctionnelles existant entre ABD,
Lewis et Sese d'une part, Hh et Sese d'autre part;
- l'intérêt essentiellement scientifique et génétique des sub-
stances ABH salivaires.
Ensuite, il convient de présenter avec une grande clarté, le
principe de la recherche des substances ABH salivaires, principe qui repose
sur l'inhibition de l'anticorps homologue par le produit ABH présent dans
la salive.
Ce principe étant clairement présenté, le formateur pourra alors
donner les indications pratiques à mettre en oeuvre pour :
- prélever et traiter la salive;
- diluer la salive traitée et les réactifs anticorps à utiliser
- exécuter les deux temps de la recherche proprement dite des
substances ABH.
Ces indications techniques seront aussitôt mises en pratique par
chaque étudiant ou stagiaire sur sa propre salive qu'il aura recueillie
dans un tube à essai.
Les résultats de l'analyse seront lus en référence à la réaction
témoin (dans laquelle l'eau physiologique remplacera la salive) que le
stagiaire ou l'étudiant aura parallèlement effectuée.

---

85.
Au total, cette séance aura permis à chaque étudiant ou stagiaire
de connaître slil est ou non secréteur de substances ABH.
Elle aura également apporté des éclaircissements dlune part, sur
l'intérêt de cette recherche, et d'autre part, sur la différence existant
entre les secrétions de substances ABH et Lewis dans la salive.

---

86.
TRAVAUX PRATIQUES N° 7
Titre
RECHERCHE D'ANTICORPS IRREGULIERS ET TESTS DE COMPATIBILITE
(78, 108, 109, 130)
Le but de cette séance est d'apprendre aux étudiants et aux sta-
giaires, à rechercher et à identifier correctement un ou des anticorps
irréguliers présents chez la ferrlme enceinte, chez le malade avant toute
première transfusion ou chez le malade po1ytransfusé et après chaque
transfusion.
L'intérêt de cette séance est donc essentiellement pratique, car
elle permet de former des agents capables d'assurer efficacement la sécu-
rité immuno10gique des transfusions de globules rouges d'une part, et
d'identifier correctement la spécificité d'un allo-anticorps responsable
d'une maladie hémolytique néo-natale d'autre part.
Trois techniques seront particulièrement exécutées pendant cette
séance. Il s'agit de la technique en saline à 22°C, papaïne à 37°C et
du Coombs indirect.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel pour chaque étudiant ou stagiaire et celui
prévu
par paillasse, excepté les chronomètres.
* Echantillons de sang à examiner
Distribuer par étudiant ou stagiaire
- un sérum de malade contenant un anticorps irrégulier pré1ab1e-
ment identifié.
Si l'on ne dispose pas d'un tel malade on pourrait artificiellement
préparer un sérum contenant un anticorps irrégulier à partir du sérum d'un
donneur normal auquel on ajoute un réactif anticorps connu.

---

87.
Dans l'un ou l'autre cas, le sérum à examiner doit être présenté
aux étudiants ou aux stagiaires comme provenant d'un malade à transfuser.
- Il convient de distribuer à chaque étudiant ou stagiaire, un
tube de gl obul es rouges comme échant i 11 on de sang à transfuser.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse
- une suspension à 5 % en saline d'un panel de dépistage pour
rechercher l'anticorps présent dans le sérum en étude;
- une suspension à 5 % en saline du même panel traité par la
papa ;ne ;
- un panel d'identification de 10 hématies lavées 3 fois en
saline et laissées en culot.
* Anticorps et autres
Distribuer par paillasse
- un flacon d'antiglobuline polyvalente
- un flacon de papaïne.
Déroulement de la séance
Cette séance peut être introduite par le rappel de certaines
données concernant, les indications de la recherche d'anticorps irrégu-
liers et les principes fondamentaux assurant la sécurité ainsi que la
validité de cette recherche.
Ces principes fondamentaux se rapportent :
- à la
constitution des différents panels;
- à l'éventail de techniques dont l'association garantit le dépis-
tage et l'identification d'un grand nombre de spécificités
anticorps ;
- à l'application rigoureuse de la technique du Coombs indirect
- à la date de l'examen chez les polytransfusés

---

88.
- et aux deux principales méthodes statistiques pouvant valider
toutes les hypothèses avancées concernant une spécificité anti-
corps donnée.
Après cette série de rappels très importants, le formateur pourra
donner toutes les indications pratiques relatives aux trois techniques à
exécuter par les étudiants ou stagiaires. Il s'agit de la technique à 22°C
en saline, de la technique utilisant les hématies traitées par la papaïne
et de la technique utilisant la réaction de Coombs indirect.
A partir de ces données pratiques, chaque étudiant ou stagiaire
devra mettre en route dans un premier temps, les réactions de dépistage
dans les trois techniques sus-indiquées, en faisant agir le sérum X sur
les différentes suspensions du panel de dépistage distribuées.
Pendant l'incubation des réactions de dépistage, chaque étudiant
ou stagiaire traitera par la papaïne, le panel d'identification et les
hématies présentées comme hématies à transfuser, avant de mettre en route
d'une part, les réactions devant conduire à ~'identification de l'anti-
corps contenu dans le sérum X, et d'autre part les réactions de compati-
bilité au laboratoire entre le sérum X et les globules rouges à transfuser.
Ensuite, les différentes manipulations assurant la compatibilité
ultime au lit du malade seront effectuées. Dans ce cadre, la réaction
qu'il convient de faire effectuer par les étudiants ou stagiaires consis-
tera :
- à rechercher sur plaque d'opaline, un anticorps agglutinant
en faisant agir le sérum X sur les globules à transfuser.
Par cette réaction, on termine ainsi les manipulations pratiques
et chaque étudiant ou stagiaire devra ensuite procéder à la lecture
correcte des résultats obtenus, puis à la recherche de la spécificité
anticorps sur le panel d'identification.
Enfin le formateur devra indiquer aux étudiants ou aux stagiaires,
tous les renseignements devant permettre à ceux-ci de valider l~urs hypo-
thèses par la méthode exacte de Fisher.

---

89.
Au total, l'étudiant ou le stagiaire
à la fin de cette séance de
travaux pratiques, devrait connaître les conditions optimales de recherche
et d'identification des anticorps irréguliers.
Il devrait aussi pouvoir effectuer correctement, les différents
tests de compatibilité tant au laboratoire qu'au lit du malade.

---

90.
TRAVAUX PRATIQUES N° 8
Titre
ETUDE DES ANEMIES HEMOLYTIQUES AUTO-IMMUNES DE TYPE IgG
(AHAI IgG)
(109)
En général s l'étude Immuno-Hématologique des AHAI et particulière-
ment des AHAI de type IgG est très complexe.
Elle consiste après réalisation du test de Coombs direct, à éluer
l'auto-anticorps responsable de la maladie et à identifier sa spécificité
sur un panel Rh très particulier, comprenant des hématies Rh normal
des hématies en silence partiel et en silence total pour le Rh.
Dans le cas particulier de la formation que nous proposons s
l'objectif à atteindre dans un premier temps est très simple: pouvoir
diagnostiquer cette affection d'une parts et d'autre parts pouvoir assurer
la sécurité immunologique des transfusions à ces malades en cas de besoin.
Compte tenu de cet objectifs nous allons donc volontairement limi-
ter les manipulations aux tests de diagnostic (Coombs direct et élution)
puis aux tests d'absorption qui permettront d'identifier un éventuel anti-
corps irrégulier caché par l'auto-anticorps.
Si l'on ne dispose pas de malade présentant cette affection au
moment de l'organisation de ces travaux pratiques s on devra alors préparer
artificiellement un échantillon de sang en sensibilisant des hématies
o cIëe/cIëe par l' anti -ê', comme il est indiqué à l a page 76 •
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédemment indiqué pour chaque étudiant
ou stagiaire et celui prévu par paillasse à l'exception des chronomètres
et des cartons de microtubes.
Régler le bain-marie à 56°C et y déposer les plots des centri-
fugeuses. Toutefois s si l'on dispose de l'éthers le réglage du bain-marie

---

91.
à 56°C n'est plus nécessaire, car il sera préférable de faire l'élution
à l'éther.
* Echantillons à étudier
Distribuer par étudiant ou stagiaire un échantillon de sang de
sujet atteint d'anémie hémolytique auto-immune de type IgG.
Si l'on ne dispose pas d'un tel malade au moment de l'organisation
de ces travaux pratiques, on pourra alors sensibiliser in vitro des
hématies 0 dce/dce Le(a-) par un anti-c albumineux suivant la technique
indiquée à la page 76.
Dans ce dernier cas, après sensibilisation des hématies
o dce/dce Le(a-) par l'anti-c, on pourra remettre un volume de ces
hématies dans un volume égal de sérum d'un donneur ou d'un autre malade
contenant un anticorps anti-Lea.
De cette façon on constitue un échantillon de sang de "ma l ade
atteint d'anémie hémolytique auto-immune avec un anticorps irrégulier
dans le sérumtl • A défaut d'un malade présentant réellement cette affection,
c'est cet échantillon de sang qui sera distribué à chaque étudiant ou
stagiaire pour analyse.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse
- une suspension à 5 %en saline de globules rouges 0 dce/dce sen-
sibi l isés par l'anti-c. Ces globules rouges seront util isés pour contrôler
l'activité anti-IgG de llantiglobuline.
Afin de montrer aux étudiants ou aux stagiaires, la démarche
technique à suivre pour identifier un anticorps irrégulier chez un malade
atteint d'AHAI de type IgG, le formateur devra faire faire à ces ëtudiants
ou stagiaires tous les tests d'absorption.
Il devra donc rlistribuer également par paillasse :
- un culot de globules rouges 0 dce/dce Le(a-) lavé 3 fQis en
saline. Ce culot globulaire sera utilisé par les étudiants ou stagiaires
pour absorber l'auto-anticorps encore présent dans le sérum à étudier;

---

92.
- un culot de globules rouges a dce/dce Le(a+) lavé 3 fois en
saline;
- un culot de globules rouges a Dcë/DCë Le(a+) lavé 3 fois en
saline;
- un culot de globules rouges a DCe/DCe Le(a-) lavé 3 fois en
saline.
Les trois derniers globules rouges seront utilisés pour réaliser
les absorptions pouvant permettre d'identifier un éventuel anticorps
irrégulier caché par l'auto-anticorps.
Enfin, pour les besoins de l'enseignement d1une part, et pour
pouvoir identifier dans un premier temps les auto-anticorps anti-ë ou
anti-e en cas d'analyse d'échantillons de sang de malades, il convient de
disposer en permanence, d'un panel Rh de 5 hématies, comme il est indiqué
ci-dessous :
Au moment de l'organisation de ces travaux pratiques, ce panel
sera distribué par paillasse en suspension à 5 %en saline, et en suspen-
sion à 5 % en saline après l lavoir traité par la papaïne.
Ces deux suspensions de globules rouges seront utilisées pour
tester l 'éluat et le sérum à étudier.
* Réactifs anticorps et autres
Distribuer par paillasse:
- un flacon d'antiglobuline polyvalente
- un flacon de sérum AB ;
- un flacon d'eau physiologique stérile avec pipette spéciale
et dans la mesure du possible :
- un flacon d'antiglobuline spécifique anti-IgG
- un flacon d'antiglobuline spécifique anti-C ;
- un flacon d'éther.

---

93.
Déroulement de la séance
La séance peut être introduite par le rappel de la définition
des AHAI en général et des AHAI de type IgG en particulier.
Puis, abordant la phase pratique de la séance, le formateur fera
d'abord exécuter par les étudiants ou stagiaires, le test de Coombs direct
sur l'échantillon de sang à étudier.
Après lecture des résultats et commentaire approprié, le formateur
donnera toutes les précisions techniques pour permettre aux étudiants ou
stagiaires d'effectuer l 'élution à l'éther ou à la chaleur selon le maté-
riel disponible.
L'éluat obtenu sera ensuite testé sur le panel Rh de 5 hématies
normales et papaïnées.
Cette réaction permettra aux étudiants ou aux stagiaires d'iden-
tifier un auto-anticorps anti-c ou anti-e.
Dans un deuxième temps, le formateur donnera aux étudi.ants ou aux
stagiaires, toutes les précisions techniques pour réaliser les différentes
absorptions appropriées et identifier un éventuel anticorps irrégulier.
Ces précisions techniques seront aussitôt mises en pratique par
les étudiants ou stagiaires sur le sérum à étudier pour identifier
l'anti-Lea qui y est contenu.
Au total, par l'organisation de cette séance de travaux pratiques,
le formateur aura donné à l'étudiant ou au stagiaire, la méthode pratique
à adopter devant une AHAI de type IgG pour faire un diagnostic correct de
l'affection, orienter correctement le médecin dans ses investigations, et
garantir au malade une bonne sécurité immunologique des éventuelles
transfusions.

---

94.
TRAVAUX PRATIQUES N° 9
Titre
ETUDE DES AHA1 DE TYPE COMPLEMENT
(109)
Le but de cette seconde séance de travaux pratiques sur les AHA1,
en particulier sur les AHA1 de type complément, est d'abord didactique,
car elle permettra à l'étudiant ou au stagiaire de distinguer une AHA1
de type 19G d'une AHA1 de type complément.
Ensuite, telle que nous la présentons, cette séance permettra
à l'étudiant ou au stagiaire- de comprendre le mécanisme de survenue de
cette affection in vivo.
Mais, compte tenu du fait que l'anémie hémolytique acquise de
type complément révèle généralement une affection sous-jacente, c'est son
diagnostic qui est important. Nous allons volontairement limiter cette
étude pratique au diagnostic et au titrage de l'agglutinine froide du
sérum.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le même matériel que celui indiqué pour la séance précé-
dente.
Déposer dans l'étuve à 37°C, des pissettes d'eau physiologique
Régler le bain-marie à 56°C et y déposer les plots des centri-
fugeuses.
Prévoir par étudiant ou stagiaire :
- un tube contenant un culot de globules rouges 01+ normal lavés
3 fois en saline (10 gouttes de globules rouges 0 d'adulte)
- un autre tube contenant 2 à 3 ml de sérum autologue ..

---

95.
* Réactifs ce11ulaires
Distribuer par paillasse
- un tube contenant une suspension à 5 %en sa1ine de globules
rouges Le(a+) sensibilisés par un anti-Lea, conformément à la technique
indiquée à la page 80. Cette suspension servira à contrô1er l'activité
anti-complément de l'antiglobuline ;
- un tube contenant une suspension à 5 %en saline de globules
rouges 01+
- un tube contenant une suspension à 5 %en sa1ine de globules
rouges 01+ papaïnés ;
Ces hématies seront utilisées pour titrer l'anticorps anti-1
du sérum à étudier et de l'éluat.
- un tube contenant une suspension à 5 %en saline de globules
rouges Oic (cordon) ;
- un tube contenant une suspension à 5 % en saline de globules
rouges Oic (cordon) papaïnés.
Ces hématies de cordon seront utilisées pour rechercher dans
1'éluat et dans le sérum à étudier, la présence d'anti-i.
* Réactifs anticorps et autres
Distribuer par pai11asse :
- un flacon d'antiglobuline humaine polyvalente;
- un flacon de sérum AB ;
- un flacon d'eau physiologique stérile avec une pipette Pasteur
spéciale ;
- un tube contenant le sérum de malade sélectionné pour son
activité anti-1.
Dans la mesure du possible, distribuer par paillasse, un flacon
d'antiglobuline spécifique anti-1gG et un flacon d'antiglobuline humaine
spécifique anti-complément.

---

96.
Déroulement de la séance
Le formateur pourra introduire la séance en rappelant les centres
dl intérêt de l 1 étude immuno-hématologique des AHA1 en général et les
manipulations précédemment effectuées au cours de llétude des AHA1 de
type 19G.
Ensuite, le formateur abordera les AHA1 de type complément, en
rappelant la définition du test de Coombs direct de type complément, et en
précisant les conditions dans lesquelles sa positivité pourrait être prise
en considération.
Les spécificités des auto-anticorps de nature 19M ainsi que les
diverses hémo~ysines responsables des AHA1 de type complément peuvent être
rappelées.
Enfin l 1 importance des AHA1 de type complément pour le clinicien
ainsi que les diverses affections sous-jacentes qulelles révèlent seront
fortement soulignées.
Après tous ces rappels, le formateur abordera la phase ~ratique de
la séance.
Là, sur des indications techniques preclses que celui-ci aura
données, chaque étudiant ou stagiaire devra effectuer successivement:
la fixation in vitro à +4°C de llanti-1 sur les globules rouges
01+ qui lui sont distribués et observer llagglutination ;
- les lavages à 37°C jusqulà la disparition de llagglutination
(élution à 37°C) ;
- le test de Coombs direct avec si possible différentes anti-
globulines (antiglobuline polyvalente, antiglobuline anti-1gG
et antiglobuline anti-complément).
Ces trois événements séquentiels seront commentés par le formateur
pour faire comprendre aux étudiants ou aux stagiaires, le mécanisme de
survenue de cette affection in vivo.
Enfin, le formateur donnera les indications techniques pour per-
mettre à chaque étudiant ou stagiaire dleffectuer 1lélution de llanti-1

---

97.
à la chaleur (56°C), et de tester aussi bien l'éluat obtenu que le sérum
sur le panel OIic normal et papainé.
Au total, par l'organisation de ces deux séances de travaux pra-
tiques sur les Anémies Hémolytiques Auto-Immunes (AHAI), les étudiants ou
stagiaires pourraient distinguer facilement une AHAI de type IgG d'une AHAI
de type complément, effectuer correctement leur diagnostic immunologique,
orienter efficacement les cliniciens et assurer en cas de besoin, la sécurité
irnrnunologique des éventuelles transfusions qui serainet nécessaires à ces
malades.

---

98.
fORMATION CONTINUE

---

99.
TRAVAUX PRATIQUES N° 10
Titre
LE PHENOTYPAGE PLUS ELARGI (78, 108, 130)
Cette séance de travaux pratiques a pour but d'apprendre aux sta-
giaires à déterminer avec précision, les antigènes de groupes sanguins
érythrocytaires autres que ABH et Rh standard.
L'organisation de cette séance est subordonnée aux réactifs anti-
corps disponibles.
En supposant que les réactifs anticorps pouvant satisfaire le
médecin transfuseur sont disponibles, cette séance de travaux pratiques
pourrait être organisée suivant la méthode ci-après:
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédemment indiqué pour chaque étudiant
ou stagiaire et celui prévu par paillasse, excepté les chronomètres.
* Echantillons à examiner
Distribuer par stagiaire, un échantillon de globules rouges à
phénotyper en Rh, Kell, Lewis, Kidd et P.
Parmi les échantillons de globules à phénotyper, on pourra inclure
des hématies rr sensibilisées in vitro par l'anti-c conformément à la tech-
nique précisée à la page 51. Ce- type d'échantillon permettra de montrer aux
stagiaires, l'importance du Caornbs direct lors du phénotypage.
* Réactifs cellulaires
Dans la mesure du possible, le formateur pourra distribuer par
paillasse, des hématies contrôles hétérozygotes dans chaque système de
groupes sanguins érythrocytaires.

---

100.
* Réactifs anticorps et autres
Distribuer par paillasse:
- un flacon du réactif anticorps correspondant à chaque antigène
que lion désire déterminer s chaque réactif devant être utilisé
conformément à la notice d'emploi rédigée par son producteur;
- un flacon dlantiglobuline humaine polyvalente
- un flacon d'albumine bovine ou de sérum AB
- un flacon de papaïne en cas de nécessité.
Déroulement de la séance
Cette séance peut être introduite en rappelant les groupes sanguins
érythrocytaires (ABD et Rh standard) généralement déterminés chez les su-
jets normaux s les femmes enceintes et chez la plupart des malades.
Ensuite s le formateur pourra souligner toutes les circonstances
médicales et génétiques qui nécessitent la détermination d'un nombre plus
important dlantigènes de groupes sanguins s notamment les antigènes de
groupes sanguins définissant les systèmes immunogènes et/ou polymorphes.
Après ces rappels s le formateur pourra présenter les principes
généraux du phénotypage dans les divers systèmes s avant de donner les ren-
seignements techniques précis que chaque stagiaire mettra en pratiques pour
phénotyper l'échantillon de sang qui lui est distribué.
Aussi s dans le seul cadre de la formations le phénotypage Rhésus
peut-il être effectué en tube sur des hématies papaïnées en utilisant des
réactifs anti-Rhésus albumineux dilués en saline.
Toutefois s le formateur devra souligner avec insistances dlune
parts que les groupes sanguins doivent être déternlinés conformément à la
notice d'emploi qui accompagne toujours chaque réactifs et d'autre parts
que la lecture et l'interprétation des résultats du phénotypage.doivent se
faire en se référant aux réactions témoins effectuées sur des hématies
hétérozygotes appropriées.

---

101.
Abordant le cas particulier des sujets trouvés hétérozygotes pour
les antigènes dont la détermination fait appel à l'agglutination artifi-
cielle (Rh, Kell, Kidd etc ... ), le formateur devra souligner l'importance
du test de Coombs direct en pareille circonstance pour valider les résul-
tats du phénotypage.
Au total, le stagiaire qui a suivi attentivement cette séance
de travaux pratiques, devrait non seulement retenir les circonstances médi-
cales qui exigent un phénotypage complet des malades, mais aussi il devrait
pouvoir effectuer ce phénotypage et l'interpréter correctement.

---

102.
TRAVAUX PRATIQUES N° Il
Titre
CONTROLE DE QUALITE DES REACTIFS (108, 109)
Le but de cette séance est d'enseigner aux stagiaires, la pratique
du contrôle de qualité des réactifs anticorps couramment utilisés en
Immuno-Hématologie. Il s'agit des réactifs anti-A, anti-B, anti-A+B,
anti-D et du réactif antiglobuline humaine polyvalente.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel précédenvnent indiqué pour chaque étudiant ou
stagiaire et celui prévu par paillasse.
* Echantillons à analyser
Distribuer par stagiaire
- un réactif anticorps, anti-A ou anti-B ou anti-A+B
- un réactif anti-D ;
- et un réactif antiglobul ine humaine polyvalente.
* Réactifs cellulaires et autres
Distribuer par paillasse:
- trois tubes contenant respectivement une suspension à 5 %en
saline de globules rouges-tests A1, A2, et B ;
- cinq tubes contenant respectivement une suspension à 5 %en
saline de globules rouges prélevés chez cinq sujets normaux de
groupe o.
Ces cinq tubes peuvent être identifiés par 01' O2, 03, 04 et 05.
Si l'on n'a pas pu obtenir cinq donneurs différents de g:oupe 0,
on pourrait dans le cadre exclusif de l'enseignement, se contenter d'un
seul donneur de groupe 0, dont les globules seront répartis dans les 5
tubes ci-dessus indiqués.

---

'03.
Ces différentes suspensions globulaires seront utilisées pour
contrôler la qualité des réactifs de groupage ABD distribués.
- un tube contenant une suspension à 40 %en sérum AB de globules
rouges R,rpréalablement lavés trois fois en saline;
- un tube contenant une suspension à 40 %en sérum AB de globules
rouges rr préalabl ement lavés 3 foi s en saline ;
Ces deux dernières suspensions globulaires seront utilisées pour
contrôler la qualité du réactif anti-D distribué.
- un tube contenant une suspension à 5 %en saline de globules
rouges rr sensibilisés in vitro par l'anti-c conformément au
schéma technique indiqué à 1a page 51;
- un tube contenant une suspension à 5 % en saline de globules
a
rouges Le(a+) sensibilisés par un réactif anti-Le ou par un
sérum de donneur contenant un anti-Lea, comme il est précisé
à la page 80.
Ces deux dernières suspensions globulaires seront utilisées pour
contrôler la qualité du réactif antiglobu1ine polyvalente distribué.
- un flacon de sérum AB stérile pour permettre aux stagiaires de
vérifier l'état des globules rouges utilisés dans les tests de
contrôle.
- un flacon d'eau physiologique stérile pour effectuer les diffé-
rentes dilutions des divers réactifs à contrôler.
Déroulement de la séance
Cette séance peut être introduite par le rappel des notions d'a1lo,
d'hétéro et d'auto-anticorps.
Ensuite, le formateur pourra préciser les diverses sources pos-
sibles des réactifs utilisés en Immuno-Hémato1ogie, avant de donner les
principes de leur production.
Après ces rappels, le formateur abordera le contrôle des réactifs
anticorps en indiquant :

---

104.
- les règles générales de contrôle pouvant être localement appli-
quées à tout réactif anticorps
- les normes propres à chaque catégorie de réactif anticorps,
notamment aux réactifs anticorps du système ABa, anti-Rhésus et aux anti-
globulines.
Dans le cadre des règles générales de contrôle, le formateur devra
définir les méthodes de mesure ou de détermination des paramètres tels que
la spécificité, le titre, l'intensité et le score d'agglutination ainsi
que l'avidité.
En ce qui concerne les normes des réactifs, le formateur devra pré-
ciser les caractéristiques que doivent avoir chacun des réactifs indiqués
ci-dessus.
Il s'agit des réactifs anti-A, anti-B, anti-A+B, anti-D et du
réactif antiglobuline polyvalente.
Ainsi, après avoir donné tous les renseignements techniques concer-
nant les manipulations à exécuter, le formateur devra conduire les sta-
giaires à effectuer successivement le contrôle de qualité:
- des réactifs ABa ;
- du réactif anti-D ;
- et du réactif antiglobuline polyvalente
qui leur sont distribués.
Chaque stagiaire déterminera pour chacun des réactifs qui lui sont
distribués, la spécificité, le titre et le score d'agglutination.
En ce qui concerne particulièrement les réactifs ABa et le réactif
anti-D, chacun déterminera leur avidité.
Ainsi, chaque stagiaire comparera ses résultats aux renseignements
contenus dans la notice accompagnant chaque réactif. Le formateur en profi-
tera pour souligner les différentes erreurs de manipulations à éviter.
Pour clore cette séance, le formateur rappellera les conditions
de conservation des différents réactifs utilisés en Immuno-Hématologie et

---

105.
il insistera sur la nécessité de les contrôler avant de les utiliser.
De ce point de vue, le formateur pourra souligner l'importance d'un labo-
ratoire national de référence, dont le rôle est d'effectuer ce contrôle
pour tous les réactifs devant être utilisés dans le pays.

---

106.
TRAVAUX PRATIQUES N° 12
Titre
LA POLYAGGLUTINABILITE ERYTHROCYTAIRE T (108)
Le but de cette séance est de faire analyser par les stagiaires,
un exemple concret de polyagglutinabilité érythrocytaire qui traduit
une anomalie de membrane du globule rouge.
L'exemple concret de polyagglutinité érythrocytaire facilement
réalisable in vitro,
lorsqu'on ne dispose pas de malade présentant cette
affection est la polyagglutinabilité T.
Les manipulations préparatoires sont très simples.
Préparation de la séance
* Matériel
Apprêter le matériel indiqué pour chaque étudiant ou stagiaire
et celui prévu par paillasse à l'exception des cartons de microtubes,
des chronomètres et des compte-minutes.
Prévoir de la neuraminidase.
* Echantillons de sang à examiner
Distribuer par stagiaire un échantillon de sang de groupe 0 à ana-
lyser. Cet échantillon devra être préalablemènt traité de la ~nière sui-
vante: - prélever chez un donneur 0 normal, un échantillon de sang sur
anticoagulant ;
- centrifuger et décanter le plasma ;
- laver 3 fois en saline les hématies 0 ;
- diluer la neuraminidase à 10 %en saline
- à cinq gouttes de culot d'hématies 0 lavées, ajouter 25 gouttes
de neuraminidase diluée au 1/10e ;
- incuber le mélange à 37°C pendant 30 mn ;
- laver à nouveau trois fois en saline, les hématies traitées par
la neuraminidase.

---

107.
Avant de remettre ces hématies en suspension dans leur propre
plasma, il convient d'absorber au préalable ce plasma auto10gue par une
partie des hématies traitées par la neuraminidase. Cette absorption a
pour but de retirer de ce plasma llanti-T naturel qui y est contenu.
Une fois cette absorption effectuée, on pourra remettre en suspen-
sion dans le plasma autologue, le reste des glob~u1es rouges traités par
la neuraminidase et distribuer lléchanti110n de sang ainsi obtenu aux
stagiaires pour analyse.
* Réactifs cellulaires
Distribuer par paillasse, 3 tubes contenant respectivement une
suspension à 10 %en saline de globules rouges A1, A2 et B, puis 5 tubes
contenant respectivement une suspension à 10 %en saline de globules
rouges prélevés chez 5 donneurs différents de groupe O.
Les 5 derniers tubes doivent être identifiés par 01, 02' 03' 04
et °5,
Si 1Ion nia pu obtenir 5 donneurs 0, on pourrait dans le cadre
exclusif de la formation, utiliser les globules rouges dlun seul donneur
qulon répartirait dans les 5 tubes distribués par paillasse.
* Réactifs anticorps et autres
Distribuer par paillasse:
- une boite de réactifs anti-A, anti-B, anti-A+B ;
- quatre échantillons de sérums tous prélevés chez des donneurs
de groupe A
Ces sérums doivent être dépourvus dlanticorps
1B.
irréguliers et dlagglutinines froides. Ils doivent aussi avoir
un anti-T correct.
Dans la mesure du possible, prévoir par paillasse, quelques
gouttes de la lectine Arachis hypogea.

---

108.
Déroulement de la séance :
La séance peut être introduite par un rappel de la définition du
phénomène de polyagglutinabilitésérythrocytaires, avant une brève revue
des mécanismes de survenue des caractéristiques sérologiques des diffé-
rentes polyagglutinabilités érythrocytaires.
Puis, abordant la phase pratique de la séance, le formateur fera
exécuter par- les stagiaires, le groupage ABD sur l'échantillon de sang
distribué.
A partir des résultats de ce groupage qui devrait normalement
révéler une discordance entre l'épreuve globulaire et l'épreuve sérique,
le formateur guidera le stagiaire dans son analyse jusqu'à ce qulil dé-
couvre lui-même, l'origine de cette discordance.
Pour cela, le formateur devra faire rappeler par le stagiaire, les
témoins à effectuer en cas de discordance et la signification de chaque
témoin.
Dans la réalisation des différentes réactions témoins,chaque
stagiaire fera le témoin AB sur les 4 sérums AB distribués par paillasse.
Dans la mesure du possible, chaque stagiaire déterminera le type
de polyagglutinabilité en cause, à l'aide de la lectine d'Arachis hypogea.
Toutefois, le formateur pourra souligner l'existence des autres
lectines utilisées en cas de polyagglutinabilités érythrocytaires, et
indiquer leurs spécificités.
Pour clore cette séance, le formateur pourra rappeler les deux points
essentiels concernant :
- d'une part, l'intérêt scientifique et diagnostique que représente
la mise en évidence du phénomène de polyagglutinabilité sur un échantillon
de sang
- d'autre part, l'importance que présente pour les laboratoires
moyens, l'utilisation des anticorps monoclonaux en groupage de toutine.

---

109.
Ainsi, nous venons de présenter le programme détaillé de la Forma-
tion Pratique Universitaire et Continue en Immuno-Hématologie érythrocy-
taire.
L'exécution correcte de ce programme au Bénin devrait garantir des
prestations de service de meilleu~ qualité dans les établissements de
Transfusion Sanguine. Pour contribuer davantage à cette efficacité souhai-
tée, le formateur pourrait rappeler aux étudiants ou aux stagiaires, un
certain nombre de règles qui méritent d'être retenues.
Ces règles peuvent être formulées comme suit :
1) S'installer confortablement à la paillasse en ayant à portée
de main tout le matériel nécessaire;
2) Apprendre à se servir correctement de la pipette Pasteur ;
3) La pipette Pasteur doit être lavée, rincée, et séchée après
chaque usage ;
4) La pipette Pasteur ne doit jamais être posée sur la paillasse
5) Le bout effilé de la pipette Pasteur doit être toujours régu-
lier et la zone d'insertion pipette-tétine doit avoir une
étanchéité absolue ;
6) La cellulose ou la compresse doivent être fréquemment changées
7) Identifier immédiatement un tube qui vient de recevoir, un
réactif anticorps ou un réactif cellulaire, ou un échantillon
provenant d'un donneur ou d'un malade
8) Ne jamais faire moins de 3 lavages;
9) Un lavage de globules rouges est d'autant meilleur que le
volume d'eau physiologique utilisé est de 3 à 4 fois supérieur
au volume globulaire;
10) Contrôler toujours un réactif avant usage ;
11) Le réactif antiglobuline doit toujours être distribué avec une
pipette Pasteur spéciale ou avec un compte-gouttes spécial
12) Les réactifs cellulaires et réactifs anticorps en cours d'utili-
sation doivent être conservés à +4°C ;

---

110.
13) Les stocks de réactifs anticorps et cellulaires doivent être
répartis en petites fractions, et conservés à -20°C;
14) En dehors des cas d'agammaglobulinémie, toutes discordances
apparues au cours d'un groupage ABD, nécessitent la réalisa-
tion des témoins auto, allo et AB ;
15) Effectuer toujours suivant une technicité rigoureuse, les
tests à l'antiglobuline et lire les réactions par référence
aux témoins utilisant les globules rouges sensibilisés, le
sérum AB et l'eau physiologique
16) L'identification d'un anticorps irrégulier est subordonnée à
la qualité du panel utilisé, à la date de l'examen, et aux
résultats des calculs statistiques correctement effectués;
17) Dans tout test de phénotypage faisant appel à l'agglutination
artificielle des globules rouges du donneur ou du malade,
il faut systématiquement effectuer un Coombs direct sur les
globules rouges ;
18) Travailler toujours le plus proprement possible.
Ainsi. nous venons de présenter d'une part, les données concernant
la formation théorique et d'autre part, celles se rapportant à la forma-
tion pratique en Immunologie Générale et en Immuno-Hématologie.
Un point particulier retient pourtant notre attention et mérite
d'être approfondi. Il s'agit des enseignements dirigés, desquels dépend
toute l'assimilation que pourraient acquérir les étudiants sur les divers
cours exposés.

---

111.
III.2.3. Les enseignements dirigés
Les enseignements dirigés constituent une sorte de contrôle des
connaissances au cours duquel, l'étudiant engage une conversation libre
mais obligatoire, avec son professeur, à partir des questions que ce der-
nier aura clairement formulées.
Cette méthode demande du temps, mais elle est extrêmement efficace
et consolide l'ensemble des enseignements que l'étudiant a reçu. Elle per-
met à l'étudiant de se rendre compte par lui-même du niveau de compréhen-
sion auquel il est parvenu.
C'est pourquoi, nous considérons comme indispensable d'introduire
cette forme d'enseignement à l'Université de Cotonou.
Pour un bon déroulement des enseignements dirigés, l'ensemble
des étudiants doit être réparti en groupes de 15 personnes au maximum, et
les questions appropriées doivent leur être distribuées à l'avance afin
de leur permettre de se préparer à y répondre.
En réalité, dans le choix des questions, le professeur devra
s'orienter de manière à baliser l'ensemble du cours. De cette façon, tout
étudiant consciencieux qui tente de répondre correctement aux questions
posées, acquiert automatiquement sans s'en rendre compte une assimilation
correcte de l' ensemb1e du programme.
Nous avons ainsi préparé un certain nombre de questions. A titre
d'exemple, nous voudrions en présenter environ une cinquantaine concernant
l'Immunologie Générale avec leurs réponses et leur intérêt pédagogique.
Ces questions se présentent respectivement sous quatre formes que voici :
a) sous forme de questions classiques, ayant pour but d'amorcer
une discussion ;
b) sous forme de phrase à compléter par un mot, pour montrer que
l'étudiant a bien compris un concept ;
c) sous forme de jeu de mariage, dont le but est d'amener l'étu-
diant à associer des idées ;
d) sous forme d'un choix à effectuer entre plusieurs éventualités.

---

112.
Nous proposons ci-dessous, 31 questions classiques permettant
de discuter les principaux aspects de l'immunologie générale.
1 0 ) QUESTION: Quelles sont les différences essentielles
existant entre défense naturelle et défense immunitaire ?
REPONSE ATTENDUE
Défense Naturelle
Défense Immunitaire
. Elle est caractérisée par un
Elle est caractérisée par le mécanisme
mécanisme naturel de résistance qui
de :
est la phagocytose, par suite du
- cytotoxicité humorale par anticorps
chimiotactisme exercé par les
fixant le complément ;
germes sur les phagocytes, et par
- cytotoxicité cellulair~ exercée par
la toxicité cellulaire exercée
les lymphoaytes T cytotoxiques et par
par la cellule NK ;
les macrophaqee armés ;
- cytotoxicité par ADCC ;
- phagocytose par suite d'opsonisa-
tion (Fc des IgG)
Elle n'est pas spécifique;
Elle est spécifique ;
Elle n'est pas douée de
Elle est douée de mémoire ;
mémoire ;
• Elle se déclenche dès l'entrée
Elle se déclenche bien après l'entrée
de "l' étranger" dans l' orga-
de "l' étiranqer" dans l'organisme.
nisme.
INTERET PEDAGOGIQUE
Le but de cette question est d'amener l'étudiant à établir un
tableau récapitulatif des principales caractéristiques de l'immunité natu-
relle d'une part, et de la défense immunitaire d'autre part. Ayant un tel

---

113.
schéma en tête, l'étudiant pourra aisément se retrouver et assimiler sans
difficultés les différents aspects développés dans ce cours. Ainsi, en
20 ou 30 mn de conversation entre l'étudiant et son professeur, toute la
complexité de l'immunologie élémentaire pourrait être élucidée.
2°) QUESTION: Quelles sont les différentes molécules qui inter-
viennent d'une part dans la défense naturelle, et d'autre
part dans la défense immunitaire ?
REPONSE ATTENDUE
Défense Naturelle
Défense Immunologique
. Le lysozyme ;
• l'antigène ;
le complément ;
l'anticorps;
l'interféron.
le complément ,
. les interleukines.
3°) QUESTION: Quelles sont les cellules qui interviennent d'une
part dans la défense naturelle, d'autre part dans la défense
irrurrunologique ?
REPONSE ATTENDUE
Défense Naturelle
Défense Immunologique
le rrv.crophage ;
les lymphocytes T ;
le polynucléaire neutrophile ;
les lymphocytes B ;
la cellule NK.
les rrv.crophages ;
• les cellules K ;
les polynucléaires ;
les ce-llules NK.

---

114.
INTERET PEDAGOGIQUE
Les deux dernières questions présentent l'avantage de mettre en
regard l'un de l'autre sous forme d'un tableau comparatifs les caractéris-
tiques moléculaires et cellulaires des deux types de défense.
Ainsi s il devient évident pour l'étudiant de constater que la réponse
immunitaire ou défense immunitaire est une amplification de la défense
naturelle.
4°) QUESTION: Par quels mécanismes, le complément intervient-il
dans la défense de l'organisme humain contre "l'étranger" ?
REPONSE ATTENDUE
Le complément intervient dans la défense de l'organisme humain
contre l'étranger par deux voies d'activation qui sont:
- activation par la voie alterne au cours de la déf~nse natu-
relle j
- activation par la voie classique après la synthèse d'anticorps
spécifiques contre "l'étranger" et formation de complexes
irrurruns.
Dans l'un ou l'autre cas, si l'activation s'arrête à C3'
"l'étranger" va être opeoni.eé , puis phagocyté par les macrophages ou les
polynucléaires.
Si l'activation va jusqu'à C
"l'étranger" va être détruit par
9'
lyse de sa membrane.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question ouvre la discussion sur le complément et, le for-
mateur pourra rappeler la clé permettant une compréhension claire du cha-
pitre qui s'y rapporte. Cette clé comprend 3 parties
- les activation~ successives ;
- les divers sites d'inhibition possibles;
- les conséquences de l'activation et du déficit en complément.

---

115.
5°) QUESTION
Qu'est-ce qu'un antigène?
REPONSE ATTENDUE
On appeLLe antigène, toute substance étrangère qui, introduite
dans un organisme est capable d'induire une réponse immunitaire humorale
et/ou cellulaire.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question présente l'avantage d'attirer l'attention de
l'étudiant sur le fait qu'un antigène induit non seulement une réponse immu-
nitaire humorale, mais qu'il peut provoquer dans certains cas une réponse
immunitaire humorale et cellulaire.
A partir de cette définition, la discussion peut s'étendre aux
notions d'épitope ou de déterminant antigénique, d'immunogénicité, d'allo
et d'hétéro-antigènes et enfin à la notion de répertoire immunologique.
L'introduction du mot "étrangère" dans la définition. devrait
permettre d'introduire l'auto-immunité.
6°) QUESTION: Qu'est-ce qu'un anticorps?
REPONSE ATTENDUE
Un anticorps c'est une glycoprotéine synthétisée par un orga-
nisme, en réponse à un antigène qui lui est inoculé, cette glycoprotéine
pouvant en retour se fixer spécifiquement sur cet: antigène.. EUe caracté-
rise la réponse humorale.

---

116.
7°) QUESTION
Qu'est-ce qu'un anticorps monoclonal?
REPONSE ATTENDUE
Un anticorps monoclonal, c'est un anticorps synthétisé in vitro
par hybridome ou par immortalisation d'un clone de lymphoblastes humains
au moyen du virus -d'Epstein Barr (EBV).
8°) QUESTION : Quelles différences essentielles existe-t-il entre
un anticorps polyclonal conventionnel et un anticorps
.
monoclonal ?
REPONSE ATTENDUE
Anticorps polyclonal
Anticorps monoclonal
· souvent produit un vivo par
· souvent produit in vitro par hybri-
injection d'un antigène dans
dome ou par immortaUsatiorz. de lympho-
un organisme humain ou animal ;
blastes humains au moyen de l'EBV ;
· les molécules constitutives
· les molécules constitutives sont
sont différentes les unes des
toutes identiques ;
autres ;
· les molécules constitutives
· les molécules constitutives recon-
reconnaissent différents épitopes,
naissent le même épitope, ont le même
ont différents allotypes, dif-
allotype, le même idiotype, et la
férents idiotypes, différentes
même affinité ;
affinités ;
· ne permet pas d'effectuer une
· permet d'effectuer une recherche
recherche fondamentale fine ;
fondamentale fine.
· ne permet pas un traitement
· permet un traitement efficace des
efficace des cancers ;
cancers ;
· en laboratoire de groupage
· en laboratoire de groupage sanguin,
sanguin, il détecte la polyagglu-
les anticorps monoclonaux donnent un
tinabilité érythrocytaire.
résultat correct même en présence de
polyagglutinabilité érythrocytaire.

---

117.
INTERET PEDAGOGIQUE
L'ensemble des questions 6, 7 et 8 permet de discuter sur les
immunoglobulines en montrant d'une part, l'hétérogénéité qui caractérise
les anticorps polyclonaux conventionnels, et d'autre part, le caractère
homogène et l'importance des anticorps monoclonaux tant en recherche fonda-
mentale qu'en recherche appliquée.
9°) QUESTION: Quelle est l'origine des cellules de l'immunité?
Justifier votre réponse par deux expériences simples.
REPONSE ATTENDUE
Les cellules de l'immunité proviennent de la moelle osseuse
comme le prouvent les deux expériences suivantes :
a) une injection de moelle osseuse syngénique à une souris irra-
diée à dose léthale, restaure toutes les lignées cellulaires
sanguineB et repeuple les organes lymphoides ;
b ) une greffe de moelle à un enfant souffrant de déficit irrmu-
nitaire combiné sévère, restaure l'immunité chez cet enfant.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question permet de rappeler les cellules intervenant dans
l'immunité et d'ouvrir la discussion sur les déficits immunitaires.
10°) QUESTION: Définir respectivement les rô1es du macrophage,
du lymphocyte T et du lymphocyte B dans la réponse immuni-
taire humorale.

---

118.
REPONSE ATTENDUE
* Le maorophage oapte l'antigène, le digère, le prépare et le
présente à sa surfaoe, pour ensuite inviter par l'intermédiaire de l'inter-
leukine 1 qu'il seorète pour la oiroonstanoe, les lymphooytes T helper à
reconna-ître cet: antigène. Il n'y a que lui pour faire ae travail.
* Le lymphooyte T helper séleotionné par l'interleukine 1 d'ori-
gine maorophagique, reoonnatt oet antigène en,assooiation aveo les propres
antigènes HLA de olasse II du macrophage. De plus, le lymphooyte T helper
produit l'interleukine 2 qui va reoruter spécifiquement les lymphooytes B
portant l'immunoglobuline de surfaoe adaptée à l'antigène en oause. Ce
travail est spéoifique du lymphooyte T helper.
* Le lymphooyte B séleotionné par l'interleukine 2, va se trans-
former en plasmooyte pour produire les moléoules d'immunoglobulines appro-
priées, à raison de 2000 moléoules par seoonde.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question permet de montrer à l'étudiant, un exemple de
coopération entre plusieurs cellules différentes pour accomplir une
seule et même fonction, la production d'anticorps. L'étudiant doit alors
effectuer lui-même au tableau, le schéma de coopération cellulaire.
11 0) QUESTION : Râl.e du tmcrophaqe dans l' immunité ?
REPONSE ATTENDUE
Défense naturelle
Réponse immunitaire
. le maorophage ingère toute
. le maorophage oapte l'antigène,
eubetance étrangère et même les
le digère, le prépare et le présente
oellules opsonisées et les dé-
au lymphooyte T helper ;
truit qrâce aux sa os de lysozome
présents dans son oytoplasme ;

---

119.
Défense naturelle (suite)
Réponse immunitaire (suite)
. il produit le ClqJ le C2 J
. il secrète l'interleukine 1 qui
le C
le Bf et la prostaglan-
active le lymphocyte T helper ;
4,
dine.
. activé par le MAF produit par le
lymphocyte T hel.per , il devient une cellule
tueuse
qui tue directement toute Qel-
lule ét~ngère ou tout micro-organisme
pathogène.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question qui vient juste après la précédente, a pour but
de récapituler tout ce que fait le macrophage dans notre organisme et de
souligner qu'il le fait sans aucune spécificité.
12 0) QUESTION : Comparer lymphocytes T et lymphocyt~s B.
REPONSE ATTENDUE
Lymphocytes T
Points communs
Lymphocytes B
· maturat-ion dans le
· naissent tous les
· maturation dans la
thymus ;
deux dans la moe He
moelle osseuse ;
osseuse ;
· assurent l'immu-
· tous deux sont des
· assurent l'immunité
nité cellulaire ;
cellules nucléées ;
humoral-e ;
· ont des récepte~rs
· ils ont la meÎne mor-
ils donnent naissance
pour les globules
phologie ;
à la rosette EA et à la
rouges de mouton, et
rosette EAC ;
font donc la rosette
mouton ;
· sont activés par la
· ils exercent tous les
· ne sont pas activés par
PHA ou la Con A ;
deux, des fonctions de
les activateurs polyclo-
reconnaissance spéci-
naux PHA et Con A ;
fique ;

---

120.
Lyrrphocytes T
Points communs
Lyrrphocytes B
. montrent les molé-
. peuvent avoir une
. présence de molécules
cules HLA de classe
vie longue.
HLA de classe II au repos
II s'ils sont acti-
ou activés ;
vés.
. ont à leur surface des
immunoglobulines dites
immunoglobulines de sur-
face.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question aide l'étudiant à dresser un tableau récapitu-
latif des différentes caractéristiques des deux principales cellules de
l'immunité spécifique.
13°) QUESTION: Par quelles voies les microbes et les virus
'peuvent-ils pénétrer dans l'organisme humain? Quelles
sont les défenses avancées qu'ils rencontrent?
REPONSE ATTENDUE
Les voies possibles de pénétration des microbes et des virus
dans l'organisme humain sont : le naeophargnx , la peau, la voie veineuse
et le contact sexuel.
Les défenses avancées que les microbes et virus peuvent ren-
contrer sur ces différentes voies sont :
- les ganglions lymphatiques placés sur le trajet de la
lymphe ; ces ganglions assurent aussi la surveillance de la
peau ;
- la rate spécialisée dans l'épuration du sang;
- les amygdales et les plaques de Peyer, disséminées le long
de l'intestin;
- les nappes lymphoides des muqueuses digestives.

---

121.
INTERET PEDAGOGIQUE
Etant donné que cette question montre à l'étudiant, l'extraor-
dinaire organisation par la nature, de la surveillance immunologique de
l'organisme humain, elle réveillera du même coup la curiosité de llétu-
diant à connaître les mécanismes de survenue des maladies infectieuses.
14°) QUESTION: Quelles différences faites-vous entre la réac-
tion antigène-anticorps et l'agglutination ou la préci-
pitation ?
REPONSE ATTENDUE
La réaction antigène-anticorps est la fixation de l'anticorps
sur l'antigène, sans préjuger des conséquences de cette fixation.
Par contre, l'agglutination ou La précipitation constituent
les manifestations visibles de cette fixation de l'anticorps à l'antigène.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question introduit la discussion sur les techniques immu-
nologiques dont le but est de révéler par un artifice, les autres réactions
antigène-anticorps qui ne présentent pas de manifestations secondaires
visibles. On discutera sur les deux notions souvent confondues d'affinité
et dt avidité.
15 0) QUESTION : QueUes sont les deux caractéristiques fonda-
mentales de la réaction antigène-anticorps ? Expliquez-les.
REPONSE ATTENDUE
Les deux caractéristiques fondamentales de La réaction anti-
gène-anticorps sont La réversibilité et La spécificité.

---

122.
La réversibilité, c'est l'élution spontanée d'un anticorps
de son antigène. L'exemple suivant l'illustre parfaitement:
- on prend des hématies B Rh+ sensibilisées par un anti-D
(Coombs direct positif) ; on les met en contact aVec des héma-
ties A Rh+ non sensibilisées par l'anti-D (Coombs direct néga-
tif) .
- Après un certain temps d'incubation à 3?OC, on sépare les hé-
maties A Rh+ des hématies B Rh+ et, on constate que le Coombs
direct pratiqué sur les hématies A Rh+ est positif.
Conclusion, l'anti-D s'est élué des hématies B Rh+ pour se
fixer sur les hématies A Rh+.
La spécificité d'un anticorps donné, c'est le fait que cet
anticorps ne reconna~t que son antigène inducteur. Par exemple, un anti-D
reconna~t les hématies D positif et non les hématies D négatif.
INTERET PEDAGOGIQUE
A partir de cette question, on pourra parler aux étudiants des
usages qu'on fait de ces deux caractéristiques : ces usages sont l'élution
d'anticorps à partir des complexes antigène-anticorps et les diagnostics
sérologiques dans diverses affections.
16°) QUESTION: Qu'est-ce que la zone d'équivalence pour une
réaction antigène-anticorps ?
REPONSE ATTENDUE
La zone d'équivalence, c'est la zone dans laquelle les quanti-
tés d'antigène et d'anticorps mélangés, sont en proportions optimales pour
que soit formé le maximum de complexes irrmuns antigène-anticorps.

---

123.
INTERET PEDAGOGIQUE
La réponse à cette question montre à l'étudiant qu'une réaction
antigène-anticorps donnée doit se faire rigoureusement suivant une tech-
nique appropriée.
17°) QUESTION: Que signifient anticorps froid et anticorps
chaud?
REPONSE ATTENDUE
On dit qu'un anticorps est froid,
lorsque, sa fixation sur l'an-
tigène correspondant, dégage une grande quantité de chaleur, ou plus simple-
ment lorsque l'optimum thermique de sa fixation sur l'antigène correspondant
est compris entre +4 Oc et +22 "C,
A l'inverse, on dit qu'un anticorps est chaud, lorsque sa fixa-
tion sur l'antigène correspondant dégage très peu de chaleur ou plus simple-
ment lorsque l'optimum thermique de sa fixation sur l'antigène correspondant
est à 37°C. Ces anticorps sont généralement de nature IgG.
INTERET PEDAGOGIQUE
Le but de cette question est de permettre à l'étudiant de maî-
triser les données de base avant d'aborder l'étude de l'immuno-hématologie.
Elle permet également d'attirer l'attention de l'étudiant sur la
différence de comportement des anticorps en fonction de la température.
De plus,il s'agit d'un exemple simple qui permettra au formateur d'appli-
quer aux groupes sanguins les notions de thermodynamique qui sont souvent
difficiles à expliquer, car apparaissant comme trop abstraites.
Le formateur expliquera que les constantes d'association d'un
anticorps varient avec la température, ce qui représente l'étymologie du
mot : "thermo" pour température, "dynamique" pour variation.

---

124.
18°) QUESTION: Qu'est-ce que le potentiel Zéta ? Comment peut-
on le modifier ?
REPONSE ATTENDUE
Le potentiel Zéta, c'est la différence de potentiel qui maintient
une hématie en suspension dans une solution. Cette différence de potentiel
est le potentiel électrique entre le nuage de cations entourant l'hématie
et le milieu neutre.
La valeur du potentiel Zéta est donnée par la formule
)
=
On peut le modifier en faisant varier
- soit ~~ la charge électrique du globule rouge, en traitant
les hématies par les enzymes protéolytiques qui coupent à leur extrémité,
des glycoprotéines porteuses des charges électriques négatives:de l'hématie;
- soit D, la constante diélectrique du milieu en ajoutant à ce
milieu une substance macromoléculaire, comme l'albumine;
- soit~, la force ionique du milieu en augmentant la concentra-
tion saline du milieu de suspension.
INTERET PEDAGOGIQUE
LI intérêt de cette question est qulelle prépare 1létudiant à
comprendre aisément llagglutination artificielle. Celui-ci devra alors
trouver 3appl ications pour chacune des 3 notions:
cr (traitement par la
papaïne des· hématies), D (groupage Rh), IJ (le Coombs à basse force ionique).
On demandera alors aux étudiants dlexpliquer la différence
d'action de IJ dans la fixation et llagglutination ; ce qui aura pour inté-
rêt de mieux leur faire comprendre le test de Coombs.

---

125.
19°} QUESTION: Définir L'aggLutination artificieLLe et donner
trois méthodes pour L'obtenir.
REPONSE ATTENDUE
L'agglutination artificielle, c'est l'agglutination obtenue par
l: ' uti lisation d'un art i.fice .
On peut obtenir l'agglutination artificielle:
- par élévation de la constante diélectrique du miLieu
(addition d'albumine au miLieu) ;
- en diminuant la charge électrique du globule rouge
(traitement des hématies par une enzyme protéolytique)
- en utilisant un at'tifice inmunol.oqique (réalisation du test de
Cootrbe ) •
!tIT ERET PEDAGOG l QU E
Cette question complète la précédente. Elle prépare l'étudiant
aux techniques de base couramment utilisées en Immuno-Hématologie.
20°} QUESTION: QueLs sont les principes et l'utilité de la
réaction d'immunoflu~rescencè in~irecte ?
REPONSE ATTENDUE
Le principe de la réaction d'immunofluorescence consiste à recher-
cher dans un sérum de malade, un anticorps spécifique par le test de Coombs
indirect en utilisant une antiglobuline marquée au moyen de la fluorescéine
ou de la rhodamine.
Cette réaction est souvent utilisée en parasitoLogie pour des
fins diagnostiques.

---

126.
INTERET PEDAGOGIQUE
Le but de cette question est d'attirer l'attention de l'étudiant
sur la variété des techniques utilisées en Immunologie, notamment les tech-
niques utilisant un marquage.
21°) QUESTION: QueLs sont Les différents types d'immunité connus
en parasitoLogie ?
REPONSE ATTENDUE
On distingue 4 types d'immunité en parasitoLogie. Ces types
d'immunité sont :
1) L'immunité stériLisante, c'est-à-dire L'immunité qui entraine
La disparition du parasite et empêche La réinfection du sujet. Exempl-e
unique: La Leishmaniose cutanée chez L'homme;
2) L'absence d'immunité apparente, c'est Le cas Le pLus fréquent.
Exempl.e : trypanosomiase africaine.
3) L'immunité non stériLisante ou immunité dite de prémunition,
c'est-à-dire une immunité qui confère une résistance partieLLe à La réinfec-
tian tant que persiste un parasitisme modéré dans L'organisme du sujet.
exempLe: paludieme , schistosomiase.
4) L'immunité concomitante propre aux schistosomiases, qui
consiste en une résistance active contre Les formes d'invasion (schistoso-
muLes) mais inactive contre Les vers aduLtes.
22°) QUESTION: Cites 5 mécanismes de survie du parasite chez
L'hôte.
REPONSE ATTENDUE
Les 5 mécanismes de survie du parasite dans L'organisme de L'hôte
sont :

---

127.
- la rapidité de multiplication du parasite ;
- l'acquisition des antigènes de l'hôte par le parasite.
- la variation antigénique du parasite ;
- l'altération de la réponse irrununitaire de l'hôte par le
parasite ;
- la dynamique de membrane du parasite.
INTERET PEDAGOGIQUE
Ces deux questions ont pour but de faire comprendre à l'étudiant
la complexité des mécanismes de défense contre les parasites, et par consé-
quent ouvrent la discussion sur les difficultés actuellement rencontrées
pour préparer les vaccins contre les affections parasitaires.
23°) QUESTION: Donner les différents marqueurs sert.ques du
virus B. Lesquels doivent être régulièrement recherchés dans
les Etablissements de Transfusion Sanguine ?
REPONSE ATTENDUE
Il Y a 6 marqueurs sériques du virus B. Comprenant 3 antigènes
et 3 anticorps. Les antigènes sont :
- antigène HBe : sa mise en évidence dans le sérum d'un sujet
signe ~ replication active du virus. Le sujet
fait alors une hépatite B aiguë.
- antigène HBc
il est souvent mis en évidence dans les cel-
lules hépatiques.
- antigène HBs : on le met en évidence dans le sérum de sujet
malade faisant une hépatite B aiguë" ou chronique
ou dans le sérum de sujet apparettmeni: sain.
Les anticorps sont :
- anti-HBe
sa mise en évidence dans le sérum d'un sujet est
le témoin d'une évolution favorable de l' hépatite -
que fait ce sujet.

---

128.
- anti-HBc
sa mise en évidence dans le sérum d'un sujet n'a
aucun sens sur l'évolution de l'hépatite que
fait ce sujet.
- anti-HBs
: sa mise en évidence dans le sérum d'un sujet
signifie que ce sujet a acquis soit après une
hépatite, soit après un vaccin, la résistance
contre l'hépatite B et ne fera plus cette maladie.
Parmi ces différents marqueurs du virus B, seuls l'antigène HBs
et l'anticorps anti-HBs doivent être très souvent recherchés dans les sérums
de donneurs de sang.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question a pour avantage de présenter un schéma clair et
simple de l'immunologie de l'hépatite B et d'attirer l'attention de l'étu-
diant sur l'un des aspects du travail immunologique à effectuer dans un
centre de transfusion.
24°) QUESTION: Est-ce qu'un sujet immunisé contre une substance
étrangère (molécule, cellule ou germe) peut être victime
d'une complication due à cette immunisation ?
REPONSE ATTENDUE
Oui, un sujet immunisé contre une substance étrangère (molécule,
cellule ou germe) peut très bien être victime d'une complication parfois
très grave, due à cette immunisation.
Cette complication peut être un accident irrunédiat de l.t ùmtunité ,
c'est l'anaphylaxie. Exemple: crise d'asthme aigu.
Elle peut survenir après un certain temps; c'est l'hypersensi-
bilité retardée. Exemples : les ql.omérul.onéphx-i.tee extira-membrana-iree et
le rejet des allo-greffes.

---

129.
Elle peut revêtir l'aspect d'une véritable auto-destruction.
c'est l'auto-immunité par réaction croisée. Exemple: l'anémie hémolytique
auto-immune liée à la mononucléose infectieuse.
INTERET PEDAGOGIQUE
En répondant correctement à cette question, l'étudiant s'aperce-
vra que l'immunité comporte tout aussi bien la protection que des risques
parfois très graves. Ainsi, cette question ouvre la discussion sur les
hypersensibilités et l'auto-immunité.
25°) QUESTION: Définir les étapes de l'hypersensibilité
irrmédiate.
REPONSE ATTENDUE
La survenue de l'hypersensibilité immédiate comprend trois
étapes :
- injection antigénique sensibilisante. le sujet ne présente
aucune manifestation clinique ;
- formation d'anticorps IgE en grande quantité ;
- injection antigénique déclenchante ; le sujet présente alors
tous les symptômes cliniques et biologiques appropriés.
INTERET PEDAGOGIQUE
La réponse à cette question permet à l'étudiant d'avoir en tête
un schéma clair et simple des mécanismes de l'anaphylaxie.

---

130.
26°) QUESTION: Citer quatre manifestations pathologiques chez
l'homme relevant de l'hypersensibilité immédiate.
REPONSE ATTENDUE
Asthme allergique, urticaire, allergie alimentaire et allergie
médicamenteuse.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question a pour but d'indiquer à l'étudiant, les cas con-
crets d'anaphylaxie souvent rencontrés dans la population, et le comporte-
ment à adopter pour éviter leur répétition.
27°) QUESTION: La M.H.N.N. par allo-immunisation foeto-mater-
nelle est un exemple de réaction immunitaire défavorable.
Enumérez les étapes de sa survenue.
REPONSE ATTENDUE
a) A la première grossesse incompatible, passage des hématies
foetales dans la circulation maternelle;
b ) forrrr:ztion par la mère d'anticorps anti-hématies foetales
porteuses de l'antigène paternel absent chez la mère;
c) seconde grossesse incompatible avec à nouveau passage d'héma-
ties foetales- incompatibles dans la circulation maternelle ;
d) réactivation des anticorps anti-hématies foetales chez la
mère ;
e) traversée placentaire des anticorps maternels vers la circula-
tion foetale ;
f) destruction des hématies foetales par les anticorps maternels
et déclenchement de la maladie.

---

131.
INTERET PEDAGOGIQUE
En répondant ainsi à cette question, llétudiant aura en tête un
schéma clair et simple sur la M.H.N.N.
Du même coup, cette question permet de discuter le polymorphisme
et ses conséquences concernant la reproduction, la transfusion sanguine et
les greffes.
On insistera sur 11 intérêt du test de Coombs chez le nouveau-né
pour le diagnostic. On en profitera pour comparer M.H.N.N. Rh et
M.H.N.N. ABO.
28 0 ) QUESTION : Citer deux exemples de maladies auto-irrurrunes chez
l'homme qui peuvent être considérées comme des accidents et
dire pourquoi ?
REPONSE ATTENDUE
1) Anémie hémolytique auto-immune de la mononucléose infectieuse
2) Anémie hémolytique survenant au cours d'une infection à myco-
plasme. Les auto-anticorps responsables sont des anti-I de
nature IgM.
Ces maladiee auto-immunes sont probablement dues au phénomène de
La réaction croisée.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question permet à llétudiant de constater les conséquences
des réactions croisées en Immunologie. Ainsi, elle ouvre la discussion dlunE
part,sur les différents types de réactions croisées,et d'autre part, sur
llauto-immunité accidentelle.

---

132.
29°) QUESTION: Cit e» deux exemples de maladies auto-immunes
obtenues chez l'homme paro des médicaments et diroe pouroquoi.
REPONSE ATTENDUE
1) Anémie hémolytique à auto-anticorps IgG due à la Méthyl Dopa;
2) Lupus éroythémateux disséminé avec auto-anticoY'ps dû à la
D pénicillamine.
Dans ces deux cas. ce n'est plus une roéaction crooisée qui est
en cause. ma~s c'est une peroturobation causée dans le système immunitairoe
paro ces médicaments.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question attire l'attention de l'étudiant sur les risques
possibles pouvant accompagner l'utilisation de certaines drogues, et ouvre
ainsi la discussion sur l'auto-immunité iatrogène : modèle expérimental
chez l'homme qui montre la complexité des phénomènes d'auto-immunité.
30°) QUESTION: Citero troois maladies humaines où l'on observe un
grand nombre dï auiio-antricorpe et dive pourquoi.
REPONSE ATTENDUE
- le lupus étythérrr:zteux disséminé (LED) ;
- l'anémie hémolytique à auto-anticoY'ps IgG chauds;
- la polyarothroite rohumatoide, à un degroé moindre.
L'effloroescence d'anticorps obtenue dans ces différoentes rrr:zladies
auto-immunes, et même controe les antigènes ra~es, peut êtroe expliquée paro
un déséquilibroe entroe les lymphocytes T supproesseurs et les lymphocytes B.
Ce déséquilibroe s'exproime paro un déficit des lymphocytes T supproesseurs
pa~ roapporot aux lymphocytes T auxiliairoes. Ainsi les lymphocytes B ne sont
plus contrôlée,

---

133.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question présente l'avantage de partir des cas concrets
de maladies humaines, pour discuter l'auto-immunité vraie ou l'auto-immu-
nité maladie. Ainsi à partir de trois questions, (28), (29) et (30) correc-
tement formulées, toute l'auto-immunité est schématiquement discutée.
31°) QUESTION: Citer quatre grandes situations non génétiques
où La réponse immunitaire est prise en défaut.
REPONSE ATTENDUE
- La gestation ;
- Le nouveau-né ;
- Le SIDA;
- Les affections parasitaires.
INTERET PEDAGOGIQUE
Cette question présente l'avantage d'ouvrir la discussion sur
les notions de tolérance, de facilitation et de déficits immunitaires.
Nous venons ainsi de parcourir toute l'Immunologie Générale, à
travers quelques questions classiques, entraînant des discussions sur les
principaux aspects. Nous allons maintenant proposer d'autres types de ques-
tions très simples sous forme de jeu ou de mots à compléter dans une
phrase ou de choix à faire parmi plusieurs possibilités.

---

134.
INTERET PEDAGOGIQUE
Sous cette forme, nous proposons 7 questions ayant pour but
d'entraîner l'étudiant qui a étudié son cours, à associer correctement
deux idées parmi plusieurs qui lui sont proposées. Ainsi, sous forme d'un
jeu de mariage, l'étudiant sera amené à chercher des renseignements com-
plémentaires de base, pour clarifier les points qui lui paraissent encore
obscurs.
Marier les lettres aux chiffres ; chaque chiffre doit trouver
une lettre. La polygamie n'est pas autorisée. Attention au mariage précoce.
32 0) QUESTION :
REPONSE ATTENDUE
l i Clq
AI IgE
lC
21 molécule
BI épi tope
2E
31 interféron
cl CH
3D
2
41 antigène
DI virus
4B
51 mastocyte
El idiotype
5A
33°) QUESTION:
REPONSE ATTENDUE
l i Hypervariable
AI site anticorps
lE
21 isotype
BI C5a
2C
31 Fab
Cl Kappa
3A
41 anaphulatoeine
DI hétéroantigène
4B
51 vaccin
El VL
5D
34 0) QUESTION :
REPONSE ATTENDUE
l i bourse de
Althymo-indépendant
lB
Pabr-i.eius:
21 polysaccharide
Bloiseau
2A
31 vie longue
C/histamine
3E
41 basophi le
DIADCC
4C
51 cel.l.ul:e K
ElZymphocyte mémoire
5D

---

135.
35 0) QUESTION :
REPONSE ATTENDUE
l/lymphocyte B
A/récepteur IgE
lC
2/basophile
B/rrucrophage
2A
J/lymphocyte T
C/anticorps
JE
4/Interleukine 1
D/immunité cellulaire
4B
5/thymus
E/rosette mouton
5D
36°) QUESTION:
REPONSE ATTENDUE
l/technique
A/agglutination
lD
d'Ouchterlony
artificielle
2/B acquis
B/réaction croisée
2B
J/fluorescéine
C/réaction antigène-
JE
anticorps
41spécificité et
D/immunoprécipitation
4C
réversibilité
5/potentiel zéta
E/corps fluorescent
5A
J'10) QUESTION:
REPONSE ATTENDUE
1/IL
A/destruction des para-
lC
2
sites par ADCC
2/éosinophi les
B/rejet d'allogreffe
2A
J/HSR
C/lymphocyte T helper
JB
4/méthyl dopa
D/anémie hémolytique
4D
iatrogène
5/hémolyse intra-
F/C
5E
9
vasculaire
J8°) QUESTION:
REPONSE ATTENDUE
l/anticorps faci-
AI anaphylaxie
lD
litants
2/IgE
B/IgG
2A
J/anticorps chauds
C/auto-immunité vraie
JB
4/LED
D/adjuvant incomplet
4C
de Freund
5/Tolérance immuno-
Elfoetus
5E
logique

---

136.
II.2.3.3. ~Qt~_~_~Q~el~t~t_~~~~_~~~_e~t~~~
(Chaque mot à trouver doit comprendre autant de lettres que de
points indiqués).
INTERET PEDAGOGIQUE
Nous proposons sous cette forme, 10 questions dont le but est de
contrôler si l'étudiant a bien compris certains concepts et s li1 peut les
utiliser correctement tant en conversation orale qulà l'écrit.
Phrase à compléter : mots à trouver :
39°) QUESTION: La réponse immunitaire est ?PfÇJfJQ~f et
QQVç~ .Qç.r~çf:1Ql~~, alors que la défense naturelle n'est rien
de- tau t eela ,
40°) QUESTION: Les lymphocytes B ont un récepteur poùr le ~ç
des IgG.
41 0) QUESTION : Une réaction antigène-anticorps enbraîne l'acti-
vation du ÇQ~~~~~~~1 par la voie Ç~~~~{Qij~.
42°) QUESTION: Le MACROPHAGE capte l'antigène le prépare et le
.
.
.
PRES~rEaux lymphocytes T HELPER.
........
.
.
43°) QUESTION: L'interleukine 2 est produite par les LYMPHOCYTES
...........
T AUXILIAIRES .
.............
44°) QUESTION: Le MACROPHAGE activé par le ~~f devient une
.
.
~
véritable cellule tueuse.

---

137.
45°) QUESTION: Un antigène qui déclenche une réaction anaphy-
lactique s'appelle un ~~~~~~~~~.
46°) QUESTION: Dans les Q~f!Çn~.lt:\\f1V~n~l~~S.acquisou hérédi-
taires, la réponse immunitaire ne fonctionne pas.
47°) QUESTION: Le test immunologique qui permet de faire le
diagnostic d'une anémie hémolytique auto-immune est le test
de COOMBS DIRECT .
.............
48°) QUESTION: La réaction antigène-anticorps est ~~X~~~~~~~
et ~~~Ç!f!QV~.
Un dernier type de question que nous proposons en enseignements
dirigés, concerne les questions à répondre par vrai ou faux.
Son intérêt pédagogique consiste à entraîner l'étudiant à réagir
vite et juste à la lecture ou à l'écoute d'un document traitant de l'immu-
nologie.
Pour cela, en demandant à l'étudiant de répondre à une question
soit par vrai ou faux, soit en effectuant un choix entre plusieurs éven-
tualités qui lui sont proposées, on l'oblige à préciser davantage ses
connaissances. Il arrive ainsi à un niveau d'assimilation élevé.
Nous proposons ci-dessous dans ce style 6 questions.
II.2.3.4. Vrai ou Faux
------------
Répondre par vrai ou faux aux questions ci-après

---

138.
49 0) QUESTION " Le C! ou le C3d déclenche :
REPONSE ATTENDUE
- La lyse cellulai~e
FAUX
- l'opsonisation
VRAI
- la phagocytose
VRAI
- La fixation de l'IgE
FAUX
- le Coombs di~ect positif
VRAI
50°) QUESTION
Les lymphocytes T sont des lymphocytes :
REPONSE ATTENDUE
- de l'immunité humo~le
FAUX
- éduqués dans la moelle
FAUX
- éduqués dans le thymus
VRAI
- p~oducteu~s d'IL2
VRAI
- po~teu~s d'IgS
FAUX
- précureeure des plasmocytes
FAUX
51°) QUESTION: L'anticorps anti-HBs est le témoin:
REPONSE ATTENDUE :
- d'une hépatite B aiguë"
FAUX
- d'une hépatite B guérie
VRAI
- d'une vaccination efficace cont~e
VRAI
l'hépatite B
- d'une hépatite A guérie
FAUX
- du SIDA guéri
FAUX
- de l'hépatite non A non B gué~ie
FAUX
52 0) QUESTION : La gestation est l'exemple :
REPONSE ATTENDUE :
- d'une semi-allog~effe ~éussie pa~
VRAI
La natu~e
- d'une g~effe xénogénique
FAUX

---

139.
53°) QUESTION: L'interruption volontaire de grossesse peut
entnxriner :
REPONSE ATTENDUE :
- une allo-immunisation de la mère aux
VRAI
antigènes de groupes sanguins du globule
rouge
- une allo-immunisation de la mère aux
VRAI
antigènes plaquettaires du foetus
- une allo-immunisation aux antigènes de
VRAI
groupes sanguins très rares
54°) QUESTION: La coopération cellulaire dans la réponse
immunitaire cellulaire s'exerce entre:
REPONSE ATTENDUE
- les tmcrophaqes et le lymphocyte T hel.per
VRAI
- le macrophage et le lymphocyte B
FAUX
- les lymphocytes T helper et le lymphocyte T
VRAI
cytotoxique
Nous venons de présenter quelques questions d'enseignements
dirigés et leurs réponses dans le cadre de l'immunologie générale.
Ces questions sont posées sous quatre formes
- questions classiques ouvrant la discussion sur des points
parti cul iers ;
- questions permettant d'associer des idées;
- questions amenant l'étudiant à compléter une phrase par le
mot qu'il faut;
- et enfin questions amenant l'étudiant à faire un juste choix
entre plusieurs éventualités qui lui sont proposées.

---

140.
Les mêmes types de questions peuvent être posées tant en Immuno-
Hématologie qu'en Transfusion Sanguine.
A titre d'exemples nous présentons ci-dessous deux questions
classiques dans chaque spécialité pour leur intérêt pédagogique et pra-
tique.
IMMUNO-HEMATOLOGIE
1) QUESTION: Un sujet 0 R1R
Le t a-r ) U- est transfusé pal' du sang
1
o 1'1' Le(a+) U+. Quels anticorps peut-il faire ?
REPONSE ATTENDUE :
a
Ce sujet peut faire un anti~ + un anti-Le
+ un anti-U.
INTERET DE LA QUESTION :
Cette question introduit la discussion sur le polymorphisme dans
notre espèce et llallo-immunisation inter-humaine qui en découle.
Sur le plan pratiques elle permet de montrer à l 1 étudiant que s
la conception qui consiste à considérer les sujets 0 Rh- s comme donneurs
universels, doit être abandonnée pour des raisons dlefficacité transfusion-
nelle dlune part, et dléconomie des unités de sang Rh- dlautre part.
2) QUESTION: VOUS groupez un nouveau-né et vous trouvez les
résuLtats suivants :
anti-B
anti-A
anti-A+B
B
++
Que pensez-vous de ces résuLtats ?

---

141.
REPONSE ATTENDUE :
Le problème est un exemple de cas réel vécu~ ma~s pas très
fréquent et par eureroî:t, diffici le à résoudre.
Il importe que le Formateur le pose sous forme de jeu en
se prêtant à toutes sortes de questions venant des Etudvants ou
e taqi ai.ree , questions auxquelles il pourra répondre par oui ou par
non.
Voici quelques exemples de ces questions .
1) Obtient-on le même résultat avec un autre lot de réactif
anti-A ?
non
2) Obtient-on le même résultat avec les Globules rouges
lavés du nouveau-né ?
oui
3) La fixation-élution d'anti-A sur les Globules rouges du
nouveau-né est-elle positive ?
non
4) Le test de COOTlÙJS Direct effectué sur les Globules rouges
du nouveau-né est-il positif?
oui
5) L' élution directe fai te à partir des Globu les rouges du
nouveau-né a-t-elle donné quelque chose?
oui
un anti-D retrouvé chez la mère.

---

142.
6) La H.A.l. effectuée SUl' le eérunr-tieet: anti-A utilisé
a-t-elle donné un résultat positif?
non : elle est négative avec un panel
ordinaire d'une part, et avec un panel privé d'autre part.
7) La m~re du nouveau-né n'aurait-elle pas des allotypes
d'immunoglobulines particuliers?
possible
8) Le sérum anti-A utilisé contient-il des anticorps anti-
allotypes d'immunoglobulines?
oui : en fait, ce sérum contient un
1
anti-Gm
et les immunoglobulines anti-D de la mère avaient
1
l'allotype Gm •
C'est cela qui explique l'agglutination érythrocytaire isolée
provoquée par le réactif an ti-A .
INTERET· DE LA QUESTION
Cette question présente l'avantage de montrer à l'étudiant,
un exemple de difficulté rare mais possible, qui peut être rencontrée lors
d'un groupage ABO.
Sur le plan pratique, elle pennet à l'enseignant de guider
l'étudiant afin que celui-ci découvre lui-même la démarche à suivre jus-
qu'à la solution du problème posé.
C'est là une excellente méthode de préparation des étudiants
pour aborder avec un esprit tout à fait éveillé, les groupages sanguins
érythrocytaires.

---

143.
TRANSFUSION SANGUINE
1°) QUESTION: Corrunent transfuser efficacement un sujet dPépa-
nocytaire ?
REPONSE ATTENDUE :
Le drépanocytaire est un sujet qui fait souvent des poussées
hémolytiques. Il est donc potentiellement candidat à des transfusions
répétées. Il faudrait alors :
déterminer ses antigènes Rhésus, Lewis, U et Kidd avant toute
première transfusion ;
respecter strictement son phénotype érythrocytaire à chaque
transfusion ;
s'il avait reçu antérieurement des transfusions sans être
phénotypé, continuer à le transfuser avec des unités de sang
o 1'1' Le(a-) U- Jk(a-) ;
organiser dans tous les cas, une recherche d'antièorps irrégu-
liers 8 à 12 jours après chaque transfusion ou chaque série
de transfusions ;
transfuser ces mal-ades en priorité par du culot globulaire ;
enfin, ouvrir pour chaque malade, un carnet dans lequel seront
inscrits tous les renseignements concernant les différentes
transfusions effectuées.
INTERET :
Cette question présente l'avantage d'ouvrir la discussion sur la
stratégie transfusionnelle à adopter pour traiter ces malades qui sont
relativement nombreux dans la population Béninoise, et surtout sur la si-
gnification même de la transfusion des produits sanguins localement dispo-
nibles et de leurs indications.

---

144.
2°) QUESTION: A quels risques possibles est exposé un malade
qui reçoit une transfusion de sang ?
REPONSE ATTENDUE .
Le malade qui reçoit une transfusion de sang peut être victime
d'un risque immédiat ou d'un risque à court terme, ou d'un risque à long
terme.
Parmi les risques immédiats ou risques à court terme, on peut
citer :
les accidents immunologiques par incompatibilités ABO ; exemple
sujet 0 transfusé par A ou B ;
. les accidents immunologiques par allo-immunisation anti-pro-
téine : exemple : sujet déficitaire en IgA avec un anti-IgA
et transfusé par du sang contenant IgA.
les accidents bactériologiques par injection de sang contaminé
par des germes gram négatif ;
les accidents de surcharge volémique provoquant un oedème aigu
du poumon (OAP) , par erreur d'appréciation des besoins du
malade en volume des composants à injecter ;
les accidents métaboliques dus à l'injection d'une grande quan-
tité de citrate qui peut ent-ra-îne» des perturbations dans l' équi-
libre électrolytique chez le malade ;
et les transfusions inefficaces qui sont généralement dues à un
conflit antigène-anticorps de faible intensité ou à la perfusion
de cellules ayant perdu presque la totalité de leurs propriétés
fonctionnelles.
En ce qui concerne les risques à long terme, on peut mentionner :
. l'allo-immunisation ou la réactivation post-transfusionnelle
de type humoral, oaraatëx-ieée par la synthèse d'anticorps contre
un ou des antigènes de groupes sanguins étrangers au receveur ;
la transmission de maladies parasitaires (filarioses, paludisme)
et virales (Hépatite B, Hépatite non A, non B, SIDA) ;

---

145.
risque de surcharge métabolique dont le plus représentatif
est l'hémochromatose secondaire à l'accumulation de fer dans
l'organisme;
. la réaction du greffon contre l'hôte par perfusion au malade
immunodéprimé, de lymphocytes T actifs.
INTERET
Cette question présente les deux avantages pédagogique et pra-
tique de montrer à 1'étudiant~ les différents types de risques accompagnant
toute transfusion, et d'ouvrir la discussion sur leur prévention et la sé-
curité des transfusions en général.
Ainsi~ comme pour l'Immunologie Générale, les différentes ques-
tions qui pourraient être posées aussi bien en Immuno-Hématologie qu'en
Transfusion Sanguine, auront pour but
* d'entraîner l'étudiant à identifier correctement un problème
* de structurer normalement la réponse appropriée;
* et d'acquérir ainsi une bonne assimilation des données
exposées.
Cela n'est pas évident, car de la part de l'étudiant, il demande
du temps et un double effort pour étudier les cours et préparer à l'avance
les réponses aux questions.
Du c6té de l'enseignant, cet effort est encore plus considérable.
Il concerne non seulement sa propre assimilation de la matière à enseigner,
mais aussi, le choix de la méthode d'enseignement, le choix des questions
pour les enseignements dirigés, la conduite de ces enseignements dirigés
et l'organisation des travaux pratiques.
Nous avons personnellement vécu ces deux expériences pendant
trois ans (un an à l'Université Pierre et Marie Curie pour notre propre
formation, et deux ans dans le service du Professeur SALMON pour notre
préparation à l'enseignement).

---

146.
Les premiers résultats concernant l'application effectuée à
l'Université de Cotonou sur notre apprentissage à l'enseignement sont
consignés dans le commentaire présenté ci-après.

---

147.
IV. - COMMENTAIRE

---

148.
Nous voudrions, en débutant ces commentaires placer notre sujet
de thèse dans son vrai contexte.
En effet, nous venons d'être formé dans un système très sophis-
tiqué ayant tout l'équipement moderne approprié. Mais, dans un bref avenir,
nous allons retourner dans notre pays d'origine où, les possibilités écono-
miques sont très limitées, et où les ~aboratoires sont très souvent sous-
équipés. Dans le meilleur des cas, lorsqu'un laboratoire dispose d'un équi-
pement moyen, il est toujours sous-approvisionné en réactifs de première
nécessité.
Face à cette situation, conment pourrions-nous nous consacrer à un
sujet de recherche d'intérêt purement scientifique qui ne peut être mis en
pratique dans notre pays dès notre retour ?
Nous serions dans ce cas inefficace, d'où l'opportunité de ce
sujet de thèse de DERBH dont le grand avantage est d'être immédiatement
exploitable dès la fin de notre formation.
La démarche suivie lors de nos travaux a consisté à définir les
besoins actuels et prioritaires de notre pays, puis à sélectionner les
méthodes et techniques simples exigeant le moins de matériel onéreux, et
pouvant être mis en pratique sur place. Enfin, nous avons examiné les diffé-
rentes conditions qui peuvent favoriser la réussite dans les buts définis.
c'est ainsi qu'en atalysant ces différentes conditions, la forma-
tion de techniciens qualifiés pouvant animer un Laboratoire Central
d'Immunologie et de Transfusion Sanguine s'est révélée prioritaire, car
sans hommes valables, on ne peut parler de développement.
En vue de démarrer cette formation, nous nous sommes rendu au
Bénin avec le programme présenté ci-dessus, et nous avons inauguré pendant
un mois, l'enseignement de-l' Inmunol oq ie Générale au Collège Polytechnique
Universitaire de Cotonou au profit des étudiants en Techniques de Labora-
toire Médical.

---

149.
La méthode que nous avons utilisée, a consisté à donner des cours
théoriques suivis d'enseignements dirigés intensifs, à partir des questions
formulées pour leur intérêt pédagogique et pratique.
L'évaluation de cet essai à la fin de notre bref seJour au Bénin,
a donné 73 % de réussite et une moyenne de classe égale à 11,72 sur 20 chez
des étudiants qui venaient d'avoir leur premier contact avec l' Inmunol oqte
Générale.
Ces résultats n'ont pu être obtenus que grâce aux enseignements
dirigés intensifs, tels que nous avons appris à les pratiquer à Paris,
méthode que les étudiants ont fortement appréciée et dont ils ont souhaité
l'extension aux autres matières qui leur sont enseignées.
La répétition étant la clé de tout enseignement efficace, nous
espérons avec beaucoup d'optimisme, de meilleurs résultats lorsque nous
reprendrons service au Collège Polytechnique Universitaire dès la fin de
notre formation.
Quant aux techniques de laboratoire, notamment les techniques
d'immunof1uorescence indirecte, de préparation des suspensions parasitaires,
de préparation des hématies sensibilisées à l'antigène HBs par le chlorure
de chrome, de dépistage de l'antigène HBs et de l'anticorps anti-HBs par les
techniques de précipitation mentionnées dans ce travail, nos essais réalisés
dans différents laboratoires du Centre National de Transfusion Sanguine et
de 1'Hôpital Saint-Antoine à Paris, avec l'équipement minimum défini ci-
dessus, ont donné de très bons résultats.
Nos espoirs de réussite dans ce domaine sont encore ici au beau
fixe, car, si même les anticorps du système ABD préparés par les techniques
indiquées dans ce document montraient un titre faible, ces anticorps pour-
raient être valablement utilisés pour la formation des techniciens et
étudiants.
Un autre point que nous voudrions preclser dans ces commentaires
concerne le dépistage de la syphilis sur les unités de sang destinées aux
malades. En effet, le Tréponème responsable de cette maladie étant très
fragile à +4°C, ce dépistage n'est nullement nécessaire sur les unités de
sang conservées à cette température pendant 24 à 72 heures (137).- Un tel
dépistage peut donc être effectué seulement sur du sang à transfuser immédia-
tement après le prélèvement.

---

150.
Compte tenu du nombre réduit de ces transfusions, nous n'avons
pas jugé nécessaire d'aborder dans ce travail, les tests de dépistage de
cette maladie.
Le dernier point de ces commentaires concerne l'acquisition de
l'équipement minimum défini plus haut. Ce problème est d'importance, car
il s'agit de faire un choix entre deux éventualités qui sont:
* soit acheter chaque année plus de réactif et de matériel
consommable au détriment de l'équipement lourd;
* soit envisager la constitution rapide de l'équipement minimum
défini plus haut et démarrer les travaux présentés dans cette
thèse.
La seconde éventualité apparaît à nos yeux plus prometteuse
d'avenir, car elle permettra de résister à la crise économique et d'atteindre
au même moment des objectifs tout à fait valables.
Nous voudrions terminer ces commentaires en insistant à nouveau
sur le problème de la formation qui représente la clé des "bonnes pratiques"
en Immunologie et en Transfusion Sanguine.
Cette formation doit se dérouler suivant une méthode vivante,
comprenant des cours intensifs destinés à faire converser les étudiants
et techniciens sur les chapitres présentés. Cette conversation est indispen-
sable, car elle permet de contrôler le niveau de compréhension auquel est
parvenu l'étudiant. Ces cours théoriques et enseignements dirigés, doivent
être complétés par l'organisation de travaux pratiques bien sélectionnés
et correctement montés.
Au total, par la réalisation de ce travai1,nous nous sommes
familiarisé en ce qui concerne l'enseignement du premier niveau d'Immunologie
et de Transfusion Sanguinet avec tout ce qui peut être fait dans les cou-
lisses et devant les étudiants.
De plus, nous pouvons également avec l'équipement minimum précé-
demment indiqué, mettre au point toutes les séquences des manipulations à
effectuer, pour atteindre les objectifs définis plus haut.

---

151.
CONCLUSION

---

152.
Le sujet de thèse que nous avons traité est un sujet original
qui présente une grande importance pour notre pays et pour toute l'Afrique
Noire. C'est un sujet riche d'enseignement, car il nous a permis de montrer
que des objectifs tout à fait valables, peuvent être atteints en Immunologie
et surtout en Immuno-Hémato1ogie, à partir de quelques bons principes et
de peu de moyens matériels.
Le problème essentiel est seulement de savoir s'organiser, de
savoir et d'aimer travailler; ce qui permettra de constituer avec le
temps, les réactifs nécessaires pour s'auto-entretenir.
Dans le domaine de la transfusion sanguine, l'utilisation des
poches plastiques serait très utile et même indispensable pour notre pays,
car les services que rendent ces sacs plastiques sont inestimables par
rapport à leur coût. Pendant longtemps encore, ces sacs plastiques seront
achetés à l'étranger. Mais, notre pays pourra facilement se les procurer
si dès maintenant un effort est fait pour réunir les éléments de l'équipe-
ment minimum défini plus haut et créer un Laboratoire Central d'Immunologie
et de Transfusion sanguine.
Ce Laboratoire Central ainsi créé, donnera tout l'élan néces-
saire à la réalisation des objectifs définis dans ce travail en assurant
une formation de qua1 ité aux techniciens et aux étudiants en médecine,
au contact même des réalités locales. ~

---

153.
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---

- 1 -
A N N E X E

---

- 2 -
~
DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE
DES PRINCIPALES PARASITOSES

---

- 3 -
A notre avis, le problème essentiel qu'il convient de résoudre,
pour instituer au Bénin, la réalisation régulière du séro-diagnostic
des principales parasitoses locales, concerne l 1 obtention des antigènes
parasitaires.
Clest pour cette raison que nous avons jugé utile de recourir
aux techniques simples facilement réalisables avec des suspensions para-
sitaires.
Ces techniques concernent l 'immunofluorescence indirecte et
des tests propres à certaines parasitoses.
Pour des raisons de commodité, nous allons dans un premier
temps, présenter le schéma technique de la réaction d'immunofluorescence
indirecte applicable à un grand nombre de maladies parasitaires.
Quant aux protocoles d'exécution des autres techniques simples
que nous avons sélectionnées, ils seront précisés lorsque nous aborderons
les diverses parasitoses locales.

---

- 4 -
1. REALISATION TECHNIQUE DE LA REACTION
DIIMMUNOFLUORESCENCE
INDIRECTE

---

- 5 -
Le seul appareil coûteux de cette technique est le microscope
équipé d'un dispositif pour la fluorescence.
Compte tenu des possibilités économiques limitées de notre pays,
toutes nos préparations antigéniques seront effectuées à partir de suspen-
sions parasitaires, ce qui permettra de différer l'achat d'un cryostat à
congélation.
1.1.
Préparation des lames
Nous décrirons ultérieurement au chapitre concernant chaque
parasitose, la préparation de la suspension parasitaire appropriée.
Mais, il convient de souligner que toutes les lames seront pré-
parées de manière identique conformément au protoco1 e ci-après :
1. A l'aide d'une petite pièce de 1 F CFA, tracer trois cercles
sur une lame porte-objet dans le sens de la longueur, à l'aide
d'un graveur;
2. Nettoyer et dégraisser soigneusement les lames gravées ;
3. Déposer au centre de chaque cercle, une goutte de la suspen-
sion antigénique ;
4. La goutte s'étale d'elle-même ou le cas échéant, l'étaler
sur un diamètre d'environ 6 mm.
5. Laisser sécher, et conserver au congélateur à -20°C ou
à -70°C. Les lames ainsi préparées seront utilisées au fur
et à mesure des besoins.

---

- 6 -
1.2. Exécution de la Réaction d'inrnunofluorescence indirecte
1. Sortir les préparations du congélateur, les identifier avec
un graveur.
2. Fixer les étalements pendant 10 mn dans un bain d'acétone si
nécessaire à la température du laboratoire ou à +4°C.
3. Diluer en tampon phosphate, les sérums témoins et les sérums
à étudier,
a) Pour le dépistage on utilisera les dilutions suivantes
. 1/20, 1/40 et 1/80 dans les cas d'helminthiases;
• 1/100, 1/20D et 1/400 dans les cas des potozooses et
des mycoses.
Ces dilutions peuvent être modifiées selon les expériences
local es.
b) Pour l'étude quantitative, les sérums trouvés positifs
au dépistage et le sérum témoin sont portés en tampon
phosphate à pH 7,2 à des dilutions géométriques plus
fortes de raison 2.
4. Distribuer convenablement les gouttes des différentes dilu-
tions de sérums sur les étalements parasitaires préalablement
numérotés.
Dans le cas du dépistage, on utilisera une lame pour le témoin
positif, une lame pour le témoin négatif et une lame par sérum
à édutier.
5. Incuber pendant 30 mn, toutes les lames à l'étuve à 37°C et
en chambre humide.
6. Laver deux fois les lames par trempage dans deux bains diffé-
rents de tampon phosphate à pH 7,2 •.
-
Chaque lavage dure 5 mn. Egoutter et sécher.

---

- 7 -
La mise en contact du conjugué fluorescent et du bleu Evans peut
s'effectuer soit en un temps soit en deux temps. Nous préférons
la mise en contact en deux temps, car la concentration du bleu
Evans peut changer suivant la parasitose.
7. Recouvrir chaque étalement d'une goutte de conjugué fluores-
cent polyvalent anti-IgGAM ou spécifique anti-IgG ou anti-
IgM préalablement porté en tampon phosphate à ph 7,2 à sa
dilution d'emploi.
Rappelons que la dilution d'emploi du conjugué fluorescent est
de 1/50e pour les helminthiases et de 1/100e pour les autres
parasitoses.
8. Incuber à nouveau les préparations pendant 30 mn à l'étuve à
37°C et en chambre humide.
9. Laver les préparations comme indiqué au n° 6 mais non séchées.
10. Plonger pendant 10 mn, les lames dans une solution de bleu
Evans à 1 %diluée en tampon phosphate à pH 7,2. La dilution
d'emploi de la solution de bleu Evans est de 1/200 pour les
étalements d'amibes de cultures et de 1/10 000 pour les
- autres parasites.
11. Laver à nouveau les lames comme indiqué au n° 6.
12. Déposer sur chaque étalement, une goutte de glycérine tam-
ponnée et le recouvrir avec une lamelle.
1.3. Lecture et Interprétation
Examiner les préparations au microscope équipé pour la fluo-
rescence.
Si l'examen doit être retardé, conserver les lames à l'obscu-
r i té ,

---

- 8-
La lecture des préparations s'effectue en prenant comme éléments
de référence, les réactions des lames témoins positif et négatif.
Les réactions sur les lames témoin positif doivent présenter une
nette fluorescence jaune-vert des parasites. Cette fluorescence doit couvrir
tout le pa ras ite.
Les réactions des lames témoin négatif doivent être rouge-
sombre. Aucune fluorescence jaune-vert ne doit être observée.
En ce qui concerne les sérums en étude, les réactions franche-
ment positives sont matérialisées par une nette fluorescence jaune-vert
des éléments parasitaires utilisés.
Les réactions faiblement positives montrent une fluorescence
jaune-vert à la périphérie, le centre du parasite restant rouge-sombre.
Les sérums négatifs donnent une réaction montrant un aspect
rouge-sombre.
Dans une étude quantitative, le titre d'un sérum est donné par
la plus forte dilution de ce sérum qui montre encore une fluorescence
jaune-vert à la périphérie des éléments parasitaires.
Enfin, lorsqu'un sérum en dilution donne des réactions douteuses
sur plusieurs dilutions successives, la première de ces dilutions est con-
sidérée comme positive et les suivantes comme négatives.
Les formules du tampon phosphate, de la glycérine tamponnée et
de la solution du bleu Evans utilisés dans la réalisation de la réaction
d'immunofluorescence indirecte sont:
Tampon phosphate à pH 7,2
- chlorure de sodium : 17 g
- phosphate de sodium monosodique : 0,6 g
- phosphate de sodium dissodique : 5,5 g
- eau distillée : 2 000 ml
Glycérine tamponnée
-
glycérine
9 parties
tampon phosphate à pH 7,2
1 partie

---

- 9 -
Solution de Bleu Evans
Dissoudre 1 g de Bleu Evans dans 100 ml de Tampon phosphate à
pH 7,2. Cette solution-mère se conserve à +4°C au maximum pendant 15 jours.
Au moment de l'emploi, diluer 1 ml de cette solution-mère dans
99 ml de tampon phosphate à pH 7,2.
Nous venons d'indiquer le schéma technique de la réaction
d'immunofluorescence indirecte réalisable en République Populaire du Bénin.
Nous allons maintenant envisager les différents diagnostics sérologiques
pour un certain nombre de parasitoses locales.
D'après les renseignements que nous avons obtenus localement,
les diagnostics sérologiques des parasitoses suivantes semblent priori-
taires. Il s'agit des diagnostics sérologiques:
• des bilharzioses à Schistosoma mansoni et à Schistosoma
haematobium ;
des filarioses et surtout de l'onchocercose
• du paludi sme ;
de l'amibiase à Entamoeba histolytica
de la toxoplasmose
• et de la Candidose à Candida albicans.
Nous n'envisagerons pas dans ce travail, les diagnostics immu-
nologiques des helminthiases intestinales comme l'ascaridiose et l'anky-
lostomiase qui sont pourtant très fréquentes au Bénin.
Les raisons de notre attitude découlent du fait que
- les examens parasitologiques directs à la période d'état
permettent un diagnostic aisé de ces parasitoses ;
- les nématodes responsables de ces affections donnent de nom-
breuses réactions croisées avec d'autres vers.

---

- 10 -
II. HELMINTHIASES

---

- 11 -
ILL Les BILHARZIOSES.
(25,67,85,98)
Les bilharzioses intestinales et urinaires humaines sont des
affections parasitaires qui sévissent en République Populaire du Bénin.
Dans le Sud du pays, elles sont localisées en priorité dans les
villages lacustres de Ganvié (Province de l'Atlantique), de Hêtin-Sota
et des Agu~gu~s (Province de l'Ouémé).
Ces deux Schistosomiases majeures sont causées par Schistosoma
mansoni pour les bilharzioses intestinales et Schistosoma haematobilJm pour
les bilharzioses urinaires.
Le seul procédé actuellement utilisé au Bénin pour établir le
diagnostic biologique de ces affections, est l'examen parasitologique des
selles et des urines.
Les tests sérologiques seraient donc un appoint complémentaire
précieux pour l'établissement de ces diagnostics.
Ces tests sont nécessaires pour découvrir précocement ces affec-
tions, contrôler l'efficacité d'un traitement institué, et apprécier par
des enquêtes séro-épidémologiques, l'étendue de ces parasitoses sur le ter-
ritoire national.
Deux tests sérologiques simples exigeant peu de moyens, pour-
raient être réalisés au Bénin.
Ce sont le test d'Immunofluorescence indirecte dont le protocole
d'exécution est précédelTlJlent indiqué, et le test de Vogel Minning.
Pour ces deux réactions, nous utiliserons comme support antigé-
nique, des furcocercaires récoltées sur place au début, puis par la suite,
nous pourrons en collaboration avec les parasitologistes locaux, entretenir
au laboratoire une souche de Schistosoma mansoni.

---

- 12 -
II.1.1. ~r~E~r~!iQ~_9~~_~~~E~~~iQ~~_9~_f~r~Q~~r~~ir~~_~Q~r_l~_r~~li~~!iQ~
9~_1~_r~~~!iQ~_9~_YQg~1_~i~~i~g
Il est possible de récolter dans les marais ou dans les villages
lacustres sus-cités~ des mollusques du genre Biomphalaria~ ce qui permettra
d'effectuer les réactions exclusivement sur des furcocercaires de
Schistosoma mansoni.
A partir de cette récolte, le protocole indiqué ci-après peut
être suivi.
1. Tester individuellement ces mollusques en mettant chacun
d'eux dans 5 ml d'eau de source ou d1eau de robinet vieillie.
2. Exposer pendant deux heures, ces mollusques au soleil ou à
une lumière vive. Les mollusques parasités émettent des
furcocercaires.
3. Rechercher ces furcocercaires en examinant une goutte de
la suspension au microscope ou mieux à la loupe.
4. Afin de concentrer ces parasites, rassembler dan~ une éprou-
vette tous les échantillons d'eau contenant des furcocer-
caires.
5. Masquer avec un papier opaque, le fond de l'éprouvette
excepté la partie supérieure sur 2 à 3 cm.
6. Exposer à nouveau l'éprouvette à la lumière solaire ou à
la lumière vive~ jusqu'à ce que toutes les furcocercaires
soient rassemblées à la surface de l'eau.
7. Recueillir les furcocercaires en surface avec une pipette
Pasteur.
Ces larves vont servir de support antigénique pour la réalisa-
tion du test de Vogel Minning et/ou du test d'Immunofluorescence indirecte.
1. Réaliser à partir des furcocercaires vivantes, une suspension
contenant environ 10 larves vivantes par goutte de liquide.

---

- 13 -
2. A l'aide d'une bougie chauffée ou de paraffine, délimiter
sur une lame porte-objet, un carré de 20 mm de côté.
3. Déposer dans la cavité ainsi formée, une goutte de suspension
de furcocercaires précédemment réalisée, ainsi qu'une goutte
de sérum à étudier. Le sérum à étudier est préalablement dé-
comp1émenté. IL peut être dilué jusqu'à 1/40.
4. Recouvrir la préparation d'une lamelle et la laisser à la
température du laboratoire.
5. Observer la préparation toutes les 15 mn au microscope pen-
dant 3 heures, puis à intervalles plus espacés pendant 24
heures.
6. Au bout de 24 heures, lire la réaction au microscope à faible
grossissement.
Dans un sérum normal chauffé, les furcocercaires sont encore
vivantes au bout de 24 heures. Leur queue est encore souple, allongée et
très mobile.
Par contre dans un sérum immun brut, la furcocercaire réagit
assez rapidement dans les cinq premières minutes et semble se fixer à la
lame. Ses mouvements sont encore rapides.
Vers la quinzième ou la vingtième minute, apparaît tout autour
de la cercaire, une très mince membrane hyaline qui s'épaissit peu- à peu.
Cette membrane commence son décollement au niveau de la queue et en- même
temps elle se plisse.
Ce phénomène gagne de proche en proche le corps de la cercaire.
Au bout de 2 à 3 heures, la cercaire est encore faiblement
mobile, elle est rétractée au niveau de la partie caudale à l'intérieur
d'une membrane sinueuse rigide limitée par un double contour.
Au bout de 24 heures plus tard, la furcocercaire est morte ou
ill11lObilisée.
Dans les réactions faiblement positives, il ne se forme qu'une
membrane d'épaisseur variable au niveau du corps.

---

- 14 -
Les réactions sont notées + + + +, lorsque l'épaisseur de la mem-
brane est supérieure à 7 ~ et accompagnée d'un décollement.
Elle est notée + + +, lorsque l'épaisseur est supérieure à 7 ~
sans décollement, + + lorsque l'épaisseur est de l'ordre de 2 à 3 ~ et +,
lorsque l'épaisseur est inférieure à 2 ~.
II.1.4. ~r~~~r~~iQ~_Q~_l~_~~~Q~~~iQ~_Q~_f~r~Q~~r~~ir~~_~Q~r_l~
r~~li~~~iQ~_Q~_~~~~_Q~!~~~Qfl~Qr~~~~Q~~_i~Qir~~t~(16, 98)
1. Rassembler dans un tube à hémolyse le reste des furcocer-
caires non utilisées pour la réaction de Vogel Minning.
2. Placer ces furcocercaires à +4°C. A cette température, les
larves descendent au fond du tube à hémolyse.
3. Décanter à l'aide d'une pipette Pasteur, le surnageant jusqu'à
réaliser la suspension adéquate pour la réalisation de la
réaction d'Immunofluorescence indirecte.
4. Faire des étalements d'environ 6 mm de diamètre avec cette
suspension de furcocercaires.
5. Laisser sécher les lames à la température du laboratoire
pendant 30 mn.
Ces lames peuvent être conservées
- à +4°C pendant 24 heures ;
- à -20°C au congélateur pendant quelques mois
- ou encore à -70°C au congélateur pendant une durée plus
longue.
6. Réaliser au moment voulu, la réaction d'immunofluorescence
indirecte sur ces lames.
Le titre des anticorps fluorescents est souvent fortement élevé
dans les bilharzioses intestinales et dans les bilharzioses urinaires.

---

- 15 -
Après un traitement efficace, le titre des anticorps fluores-
cents slélève entre le premier et le troisième mois suivant la cure pour
les deux types de bilharzioses.
Cette élévation du titre des anticorps peut atteindre 4 fois la
valeur du titre initial avant le traitement.
Le titre des anticorps ne revient A sa valeur initiale que vers
."
.". - . . . . .
. . -
le 8e mois pour les bilharzioses A Schistosoma mansoni, et vers le 5e mois
..
. ..
- .. -
pour les bilharzioses A Schistosoma haematobium.
Enfin, un traitement non efficace, n1entraine aucune modifica-
tion du titre des anticorps fluorescents.
En conclusion, la sérologie des bilharzioses peut être commencée
dans un premier temps au Bénin, par la réalisation de la réaction de Vogel
Minning qui ne nécessite aucun matériel onéreux, et qui de plus, permet de
dépister les affections débutantes.
Ce test sera plus tard complété par la réaction d'i~TIunofluo­
rescence indirecte sur les furcocercaires de Schistosoma mansoni dès
llacquisition du microscope A fluorescence.
II.2. LES FILARIOSES
(16, 25, 98).
Les quatre filarioses pathogènes pour l 1homme, A savoir
l 1onchocercose, la filariose lymphatique, la loase et la
dranunculose,
coexistent en République Populaire du Bénin.
Parmi elles, l 1onchocercose est la plus préoccupante.
Nous n1envisagerons par conséquent dans ce travail que le diag-
nostic sérologique de cette affection.
Dans le pays, les zones privilégiées de localisation de cette
parasitose, sont les régions frontalières avec le TOGO et surtout avec la
HAUTE-VOLTA (BOURKINAFASO).

---

- 16 -
Le diagnostic biologique de cette affection y est actuellement
fait par la recherche des microfilaires dans une biopsie cutanée exsangue.
Bien qu'il soit spécifique, ce test parasitologique est parfois
en défaut, d'où l'importance des tests sérologiques qui peuvent ainsi com-
pléter efficacement les investigations diagnostiques.
Le test sérologique que nous pourrons effectuer pour l'instant
au Bénin, est une réaction d'hémagglutination passive.
En effet, nous ne pouvons espérer dans un premier temps disposer
d'un cryostat qui nous permettrait de réaliser les coupes à la congélation
sur des adultes d'Onchocerca volvulus, pour effectuer les tests d'immuno-
fluorescence indirecte.
Pour la réaction d'hémagglutination, les nodules onchocerquiens
seront obtenus, à partir de leur ablation chez les sujets parasités, et
cela, en collaboration avec les services de chirurgie.
A partir de ces nodules, les filaires d'Onchocerca volvulus
seront prélevés afin de préparer l'antigène spécifique conformément au
protocole ci-après i
1. Prélever les filaires d'Onchocerca volvulus à partir de
nodules onchocerquiens ;
2. Laver soigneusement 3 fois en eau physiologique froide à
+4°C les filaires prélevés ;
3. Sécher isolément mais rapidement chaque filaire sur papier
filtre
4. Couper les filaires en petits fragments ;
5. Ajouter aux fragments de filaires, une très petite quantité
de mélange d'eau physiologique et d'eau distillée suivant les
besoins. Ce mélange est composé d'un volume d'eau physiolo-
gique et d'un volume égal d'eau distillée;
6. Broyer mécaniquement dans un mortier placé dans un bain
réfrigéré composé de sel et de glace, les fragments de
filaires ;

---

- 17 -
7. Après réduction des fragments de filaires en bouillie, mettre
la bouillie dans un tube, et centrifuger à 10 000 tours par
minute pendant une heure à +4°C, dans une centrifugeuse
réfri gérée ;
8. Mettre le surnageant dans des boudins de dialyse
9. Dialyser pendant 24 heures, ce surnageant contre de l'eau
distillée tamponnée à pH 7.
Le dialysat obtenu au bout des 24 heures, représente l'antigène
de filaire d'Onchocerca volvulus recherché.
Il est utilisé pour sensibiliser les hématies humaines o.
1. Prélever sur EDTA, les hématies humaines 0 ;
2. Laver 6 fois ces hématies en Tampon t~yer dilué extempora-
nément au 1/5 -;
3. Ajuster le culot globulaire à une hématocrite de 55 %
4. A un volume de culot globulaire, ajouter un volume
d'antigène d'Onchocerca volvulus et un volume de chlorure
de chrome (C1 3Cr).
La solution de C1 3Crest extemporanément diluée au 1/5 en
Tampon Mayer.
5. Agiter pendant 15 mn manuellement ou mécaniquement.
6. Laver 5 fois les hématies en Tampon Mayer dilué au 1/5.
7. Reprendre le culot globulaire dans 10 fois son volume en
Tampon de conservation à pH 7.
8. La suspension globulaire ainsi obtenue peut être conservée
pendant un mois à +4°C.
9. Au moment de l'emploi, cette suspension est rediluée en
Tampon TAP au 1/30.

---

- 18 -
II.2.3. Réaction d'Hémagglutination Passive
1. Diluer le sérum à examiner et les sérums témoins positif et
négatif de demi en demi en Tampon TAP albumine.
2. Déposer une goutte de chaque dilution, à l'aide d'une pipette
Pasteur calibrée à 25 gouttes par millilitre, dans chaque
puits de la microplaque.
3. Ajouter avec la même pipette, une goutte de la suspension
g1ob u1aire à 0,2 %.
4. Agiter légèrement la plaque et la laisser en chambre humide
pendant 30 mn.
5. Incliner la plaque à 60°C sur un portoir spécial.
6. Lire la réaction au bout de 5 à 10 mn.
L'absence d'anticorps est signalée par une coulée rectiligne
le long du puits (V).
En présence d'anticorps, le culot d'hématies reste au fond du
puits (V).
Mais, en raison des riches communautés antigéniques existant
entre les différents groupes de filaires d'une part, et entre les filaires
et les autres parasites d'autre part, une expérience locale sera nécessaire.
Cette expérience sera faite parallèlement sur des sujets sains,
des sujets atteints de diverses parasitoses et des sujets onchocerquiens
connus, pour établir le seuil de spécificité.
Au total,l 1 Immunofluorescence indirecte serait encore ici la
meilleure technique sérologique pour diagnostiquer l'onchocercose.
Mais, en attendant l'acquisition d'un cryostat pouvant permettre
- . . . -
-
la confection de coupes fines d'Onchocerca volvulus nécessaires.à la réali-
sation du test dl Immunofluorescence indirecte, la réaction d'hémagglutina-
tion passive aidera à diagnostiquer l'onchocercose dans les cas où l'examen
parasitologique est en défaut.

---

- '9 -
III.
PROTOZOOSES

---

- 20 -
111.1. LE PALUDISME
(76s 86 s 98s 100)
La République Populaire du Bénin comme tous les pays d'Afrique
Noire est une zone de forte-endémicité palustre.
L'espèce plasmodiale la plus fréquemment en cause est
Plasmodium falciparum.
Le diagnostic biologique de cette parasitose y est actuellement
fait par l'examen de la goutte épaisse ou du frottis sanguin coloré au
May-GRUNWALD GIEMSA.
La méthode de concentration sur ficoll des hématies parasitées
par Plasmodium (79)s méthode qui améliore sensiblement le diagnostic
parasitologique de cette affection y est inconnue et nlest donc pas pra-
tiquée.
Ainsi s certains cas de paludismes notamment les cas de rechute
qui sont les plus fréquents et dans lesquels la parasitémie est souvent
très faibles ne sont pas biologiquement diagnostiqués.
Reste la méthode sérologique de diagnostic qui consiste à re-
chercher par immunofluorescence indirectes les anticorps spécifiques anti-
Plasmodium.
Cette méthode qui présente un grand intérêt diagnostique dans les
pays exempts de paludismes montre par contres un intérêt diagnostique très
peu important dans les pays d'endémie palustre.
En effets dans ces pays de forte endémicité palustres les anti-
corps antiPlasmodium sont déjà amenés à des titres élevés par les re-
infestations et les nombreux accès antér;eurs s si bien que lËs infestations
ultérieures par Plasmodiums ne provoquent que de légères modifications du
titre des anticorps fluorescents.
Dans les pays de forte endémicité palustres l'intérêt diagnos-
tique de cette méthode sérologique est donc limité au dépistage du paludisme
chez les tous jeunes enfants de moins de trois ans s et chez les çoopérants
europénes dont l'organisme est encore neuf vis à vis de l'infestation par
Plasmodium.

---

- 21 -
Toutefois, cette méthode présente dans ces mêmes pays, un grand
intérêt pour les études épidémologiques, car elle permet d'évaluer la pré-
valence du paludisme dans une région et de vérifier l'efficacité des
mesures prophylactiques mises en oeuvre.
Dans un avenir proche, une autre technique immunologique sera
mise au point dans le Service du Professeur J.P. SOULIER au Centre National
de Transfusion Sanguine à Paris. Cette nouvelle technique dont le principe
consiste à mettre en évidence, les hématies parasitées par Plasmodium
falciparum et/ou l'antigène plasmodial soluble dans le plasma à l'aide
d'anticorps monoclonaux fluorescents, permettra de diagnostiquer avec une
plus grande efficacité, le paludisme en Afrique Noire même si la parasi-
témie est très faible.
En attendant la publication de cette nouvelle technique, nous
réaliserons la technique d'immunofluorescence indirecte avec surtout comme
but les études épidémologiques du paludisme.
111.1.1. ~~~~~r~!iQ~_9~_!~~~!ig~~~_e!~~~Q9i~!_~Q~r_!~_r~~!i~~!iQ~_Q~_!~~!
9~i~~~Qf!~Q~~~~~~~~_i~9ir~~!~ (98)
1. Prélever 5 à 10 ml de sang sur héparine ou sur EDTA chez un
sujet dont la parasitémie a été vérifiée sur frottis sanguin.
2. Noter bien le volume initial du Prélèvement.
3. Laver 6 fois l'échantillon en Tampon phosphate à pH 7,2.
4. Reprendre le culot avec du tampon phosphate à pH 7,2 pour
atteindre le volume initial.
5. Confectionner avec cette suspension parasitaire, des étale-
ments minces ou des microgouttes épaisses sur des lames de
microscope.
Les microgouttes seront confectionnées sur des lames portant les
cercles précédemment gravés à l'aide du diamant.
6. Pratiquer sur ces préparations, la réaction d'immunofluo-
rescence indirecte suivant la technique indiquée précédemment.

---

- 22 -
Dans l'ensemble les hématies parasitées par Plasmodium montrent
une légère fluorescence jaune-vert.
- -
Les parasites et les ~ranulations endoérythrocytaires montent
une fluorescence jaune-vert intense.
Ces différentes fluorescences peuvent s'observer encore à des
dilutions très élevées du sérum en étude, ce qui témoigne de la présence
de l'anticorps spécifique antiPlasmodium dans ce sérum.
Lorsque le sérum étudié ne contient pas l'anticorps anti-
Plasmodium, aucune fluorescence jaune-vert n'est observée, et la prépara-
tion apparaît
rouge-sombre à ces dilutions.
Après un traitement prophylactique efficace à l'échelle d'une
région ou d'un pays, on constate une baisse très sensible du titre des
anticorps fluorescents antiPlasmodium au bout de quelques mois.
Un traitement non efficace n'entraine aucune baisse du titre
de ces anticorps.
Au total, la détection des anticorps antiPlasmodium par la
réaction d'immunofluorescence indirecte, présente beaucoup plus en Afrique,
un intérêt épidémiologique qu'un intérêt diagnostique.
111.2. L'AMIBIASE
(53,98)
L'amibiase intestinale aiguë est une parasitose fréquente en
République Populaire du Bénin, comme dans tous les pays où l'hygiène
n'est pas suffisamment développée.
Elle affecte une bonne partie de la population, surtout les
enfants d'âge scolaire.
Le procédé actuellement utilisé pour diagnostiquer cette affec-
tion, est l'examen parasitologique des selles.

---

- 23 -
En ce qui concerne les amibiases extra-intestinales~ en parti-
culier les localisations amibiennes hépatiques ou pulmonaires~ aucun procé-
dé immunologique de diagnostic n1est encore utilisé.
Le diagnostic de ces amibiases viscérales~ repose donc sur des
données cliniques.
Nous nous proposons alors de réaliser localement, une réaction
d'immunofluorescence indirecte pour la détection des anticorps anti-
amibiens circulants, permettant ainsi le diagnostic biologique des amibiases
métastatiques.
111.2.1. ~r~e~r~~iQ~_~~_1~~~~i9~~~_~~i~i~~_eQ~r_l~_r~~li~~!iQQ_9~_1~
réaction d'immunofluorescence indirecte
1. Isoler une souche dl Entamoeba histolytica à partir d'un prélè-
vement de selles d1un malade atteint de dysenterie amibienne~
ou dans la mesure du possible, utl l i ser une souche entretenue
au laboratoire.
2. Mettre cette souche en culture sur milieu approprié pour
protozoaire- (milieu de 111nstitut Pasteur par exemple).
Cette culture peut être faite en collaboration avec les para-
sitologistes locaux.
3. A partir d1un tube très riche en trophozoites, recueillir au
5e jour de culture, la phase figurée à la jonction de la phase
solide et de la phase liquide.
Eliminer au maximum, l a phase liquide contenant des débris
organiques solides ou d~ssous.
4. Dissoudre ce prélèvement dans 10 ml de tampon phosphate à
pH 7,2, et centrifuger pendant une à deux minutes à
1 500 tours/mn.
5. Dissoudre le culot obtenu dans une à deux gouttes de tampon
phosphate à pH 7,2. A ce stade deux éventualités peuvent se
présenter :

---

- 24 -
soit l'amidon n'est pas aggloméré, on obtient un mélange
laiteux, le tube est à jeter ;
. soit l'amidon est aggloméré en amas de 0,1 à 1 mm et
donnant un aspect de lait caillé. Dans ce cas, redissoudre
doucement avec 10 ml de tampon phosphate à pH 7,2, sans
détruire les amas déjà formés.
6. Laisser reposer quelques minutes.
Les diverses impuretés réunies dans les agrégats sédimentent
en "flocons de neige" et les amibes restent en suspension
dans le surnageant.
7. Centrifuger le surnageant si nécessaire. Le culot de centri-
fugation obtenu est remis en suspension dans les mêmes condi-
tions que précédemment.
8. Répéter 3 ou 4 fois ces mêmes opérations pour éliminer le
maximum d'amidon.
9. A la fin, centrifuger une dernière fois et réali~er en
Tampon phosphate à pH 7,2, une concentration de l'ordre de
100 000 amibes par millilitres ou 200 à 300 amibes par goutte.
10. Répartir immédiatement cette suspension d'amibes sur des
lames de microscope précédemment apprêtées pour la réaction
d'immunofluorescence indirecte, à raison d'une goutte par
cercle.
11. Etaler la goutte de suspension d'amibes sur un diamètre de
6 mm et laisser sécher les préparations à la température du
laboratoire.
12. Les lames ainsi préparées peuvent être conservées à +4°C
pendant quelques jours, à -20°C pendant 2 à 3 mois et plu-
sieurs mois à -70°C.
13. Réaliser au moment voulu, la réaction d'immunofluorescence
indirecte sur ces lames, conformément à la technique
précédemment décrite.

---

- 25 -
En cas d'amibiases viscérales (hépatique, pulmonaire ou autres
localisations métastatiques), la réaction est positive avec un titre au
moins égal à 800.
Notre expérience locale dans ce domaine pourra nous amener à
modifier ce titre.
En cas d'amibiase aiguë intestinale, la réaction peut être néga-
tive, ou faiblement positive avec un titre ne dépassant pas 400.
Chez les anciens amibiens, la réaction peut être négative ou
faiblement positive avec des titres séquellaires d'anticorps.
Chez les porteurs sains des formes minuta ou de kystes
d'Entamoeba histolytica, la réaction est généralement négative.
Les traitements efficaces anti-amibiens diminuent les titres
d'anticorps fluorescents dès le 20e jour après le début du traitement.
A partir du second mois, après le traitement efficace, la séro-
logie se maintient à un taux sensiblement constant et bas qui ne se néga-
tive qu'après un recul d'un an.
Au total, la mise au point en République Populaire du Bénin
de la réaction d'immunofluorescence indirect~ permettra- de rechercher les
anticorps anti-amibiens et de diasgnostiquer avec précision, les amibiases
métastatiques. Quant à l'amibiase aiguë intestinale, seule l'expérience
vécue localement nous permettra de définir l 1 importance du test d'immuno-
fluorescence indirecte dans l'établissement de son diagnostic biologique.
111.3. LA TOXOPLASMOSE
(53, 98).
Selon les diagnostics biologiques spécifiques établis en Côte
d'Ivoire par l'Institut Pasteur d'Abidjan suivant la technique dl Immuno-
fluorescence indirecte, la toxoplasmose a une fréquence sensiblément élevée
dans la zone géographique du Conseil de l'Entente, tant dans la population
infantile que chez les adultes. Cependant le diagnostic parasitologique de

---

- 26 -
cette affection étant difficile, il n'y a pas encore un test
sérologique
appliqué au Bénin pour l'identifier chez les enfants et chez les femmes
enceintes.
Rappelons brièvement que cette parasitose existe en gros sous
deux formes :
. la forme congénitale et la forme acquise.
La forme congénitale entraîne des foetopathies fréquemment
mortelles.
La forme acquise, généralement bénigne chez les adultes,
entraîne pourtant diverses complications dont les méningo-encéphalites
chez les enfants.
Il est donc temps de mettre au point en République Populaire du
Bénin, une technique immunologique qui permette un diagnostic efficace de
cette parasitose.
c'est à ce titre, que nous voudrions preclser dans ce travail,
le schéma technique qui pourrait être suivi pour préparer localement,
l'antigène de Toxoplasme gondii qui permettrait de réaliser le test
d'Immunofluorescence indirecte.
Ce test d'Immunofluorescence indirecte permettra non seulement
de diagnostiquer spécifiquement cette affection, mais aussi d'étudier son
évolution chez le sujet Béninois.
Dans les premiers instants, la souche de Toxoplasme gondii devant
servir à préparer l'antigène approprié, pourrait nous être adressée par un
laboratoire ami disposant de cette souche.
Le cas échéant, si nos moyens financiers nous le permettaient,
l'antigène de Toxoplasme gondii étant actuellement commercialisé tout prêt
à l'emploi, nous pourrions nous le procurer pour démarrer notre étude,
avant d'envisager la production locale de cet antigène.
En supposant que la souche de Toxoplasme gondii nous soit
adressée, le protocole suivant pourrait être suivi pour préparer l'antigène
approprié

---

- 27 -
1. En mettant à profit l'animalerie et le personnel de parasito-
logie du Département des Sciences Naturelles et de la Produc-
tion Animale du Collège Polytechnique Universitaire, on injec-
tera cette souche de Toxoplasme à des souris blanches par
voie intra-péritonéale ;
2. Le liquide d'ascite des animaux inoculés sera prélevé 72
heures après l 1 injection ;
3. Après avoir noté le volume Vdu liquide d'ascite prélevé,
on le mélangera à 5 volumes (SV) de Tampon phosphate à
pH 7,2 ;
4. Par centrifugation différentielle, les éléments non parasi-
taires seront éliminés, et après deux lavages ainsi réalisés,
on obtiendra un culot de Toxoplasmes gondii.
5. A partir de ce culot de Toxoplasmesgondii, on réalisera en
tampon phosphate à pH 7,2, une suspension de Toxoplasmes à
raison de 1 500 000 parasites par ml.
6. Par dépôt d'une goutte de cette suspension de Toxoplasme aux
f
centres des cercles gravés sur les lames précédemment apprê-
tées pour la réaction dl 1mmunofluorescence indirecte, on réa-
lisera des étalements d'environ 6 mm de diamètre.
7. Les préparations seront laissées sur la paillasse à la tempé-
rature du laboratoire pour séchage.
8. Les lames ainsi apprêtées peuvent être conservées soit à
+4°C pendant une semaine, soit à -20°C pendant trois mois,
soit enfin à -70°C pendant plus de trois mois.
9. Réaliser au moment voulu, le test dl 1mmunofluorescence indi-
recte sur ces lames, en utilisant les conjugués fluorescents
anti 19M et anti 196.
En cas de primo-invasion par Toxoplasme gondii, la réaction
d'1mmunofluorescence indirecte est généralement positive avec l'antiglo-
buline anti 19M marquée. Les titres de positivité atteignent au moins 50,

---

- 28 -
très souvent 400 et même au-delà.
Cette positivité qui témoigne une infestation récente, exige un
traitement adéquat et rapide chez la femme enceinte et chez le jeune enfant.
Lorsque la réaction est positive avec l'antiglobuline anti IgG
marquée à des titres compris entre 10rr et 400, il s'agit d'une Toxoplasmose
résiduelle. Le sujet concerné est déjà immunisé et aucun traitement n'est
nécessaire.
. .
Lorsque la réaction d'Immunofluorescence indirecte est positive
avec l'antiglobuline anti IgG marquée à un titre supérieur à 400, il s'agit
d'une Toxoplasmose en évolution. Un traitement est nécessaire chez la femme
enceinte, et un test de contrôle est indiqué sur un second prélèvement
effectué après trois semaines.
A titre indicatif, voici la courbe d'évolution des anticorps
fluorescents dans la Toxoplasmose et l'interprétation appropriée (page 29).
Enfin, par utilisation simultanée d'un sérum témoin positif de
titre en Unités Internationales (UI) connu, et de sérums trouvés positifs
au dépistage, on pourrait transformer en UI, les titres de ces derniers
sérums.
Exemple
Soit un sérum dont le titre par la méthode de dilutions succes-
sives est de 400 et celui en UI est égal à 100 UI.
Les dilutions des sérums à tester en dépistage pour avoir des
titres de 10 et de 300 ur sont données par les calculs suivants
• Pour 10 UI, il faut une dilution de
100
= 1/40
400 x 10
• Pour 300 UI, il faut une dilution de
100
= 1/1 200.
400 x 300
.
Au total, la mise au point de la réaction d'Immunofluorescence
indirecte et de la technique de préparation de l'antigène de Toxoplasme

---

- 29 -
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10 UI/ml
..... ::>
+
+
e
e
I
l . . . - -
-
Schéma de l'évolution des anticorps dans la toxoplasmose
(cf référence bibliographique n° 40) -

---

- 30 -
gondii, permettra de diagnostiquer la toxoplasmose et de connaître sa
prévalence dans notre pays. Elle permettra également de fournir aux gyné-
cologues accoucheurs et aux pédiatres, des renseignements biologiques
précieux concernant l'évolution de cette affection chez les femmes enceintes
et chez les enfants, renseignements biologiques qui leur font défaut actuel-
lement.

---

- 31 -
IV. MYCOSES

---

- 32 -
IV.1. CANDIDOSES A CANDIDA ALBICANS
(53, 98)
Le Candida a1bicans.est un champignon saprophyte normal de la
flore des muqueuses chez 11 homme. Il est responsable dlaffections oppor-
tunistes particulièrement graves, dont le diagnostic myco1ogique est par-
foi s difficile.
Dans ces conditions, clest seulement la détection des anticorps
anti Candida a1bicans qui permet dlaffirmer une localisation viscérale de
ce champignon.
La recherche de ces anticorps est facilement réalisable par la
technique dlimmunof1uorescence indirecte.
Ainsi, avons-nous retenu pour notre pays, cette technique pour
le diagnostic des Candi doses profondes.
Clest pourquoi, nous voulons communiquer dans ce travail, le
schéma technique qui pourrait être suivi pour préparer localement, 1lanti-
.
,
gène de Candida a1bicans nécessaire pour la réalisation du test dlimmuno-
fluorescence indirecte.
1. Identifier par culture sur milieu de Sabourand solide, une
souche de Candida a1bicans.
2. Après 48 heures de culture, mettre ces levures en suspension
dans de lleau distillée et effectuer 3 lavages (lavage des
levures en eau distillée).
3. Réaliser après ces lavages, une suspension dlenviron 2 500 000
levures par ml.
4. Déposer au centre de chaque cercle gravé sur les lames précé-
demment apprêtées pour la réaction dlimmunof1uorescence indi-
recte, une goutte de la suspension de levures et l'étaler sur
un diamètre dlenviron 6 mm.

---

- 33 -
5. Laisser sécher les préparations pendant 1 h 30 mn à la tempé-
rature du laboratoire.
6. Les préparations peuvent être conservées à -20°C au congéla-
teur pour une longue durée.
7. Réaliser sur ces préparations au moment voull,l,la réaction
d'immunofluorescence indirecte.
IV.1.2. Interprétation des résultats
Dans le cas des Candi doses superficielles (muguet buccal,
vaginites à Candida albicans, Candidoses cutanées ou ungéales), la réaction
d'immunofluorescence indirecte est négative ou faiblement positive avec
des titres d'anticorps atteignant rarement 100.
Dans les cas de Candidoses profondes, les anticorps fluorescents
atteignent des titres très élevés.
Après un traitement efficace, on assiste à une baisse du titre
des anticorps et la réaction d'invnunofluorescence indirecte peut se néga-
tiver au bout de 4 mois environ.
En conclusion, l'application de la réaction d'immunofluorescence
indirecte aux candidoses à Candida albicans, permettra une meilleure con-
naissance de la prévalence des candidoses profondes et démarrera l'Immuno-
logie fongique en République Populaire du Bénin.
Ainsi, nous venons d'indiquer la stratégie très simple qui pour-
rait être suivie pour intégrer dans le programme sanitaire Béninois, la
pratique de l'Immunologie parasitaire qui permettrait le diagnostic des
principales parasitoses locales.
Nous allons maintenant aborder la méthode à mettre en pratique
pour éviter l'hépatite B transmise par transfusion.

---

- 34 -
fjV
DEPISTAGE DE L'ANTIGENE HBs
ET DIAGNOSTIC DE L'HEPATITE AIGUË B
(13, 14, 15, 35, 36, 37, 41,
136, 137)

---

- 35 -
- METHODES ET TECHNIQUES SIMPLES
(35, 41)
1.
IMMUNODIFFUSION PAR LA METHODE D'QUCHTERLONY
L'lmmunodiffusion (ID) représente la technique la plus simple qui
exige le moins de moyens matériels.
Elle peut donc être pratiquée par tout laboratoire en attendant
d'acquérir le matériel approprié pour effectuer la technique de l'E1ectro-
Immunodiffusion (EID).
Bien qu'elle soit moins sensible que l'EID, sa réalisation systé-
matique sur les sérums de donneurs de sang, permettra de dépister 70 % des
porteurs du virus B.
Les manipulations pratiques Aexécuter pour sa réalisation sont
assez simples et sont mentionnées ci-dessous:
,
1. Couler un gel d'agarose à 2% en tampon Tris O,01M de ph 7,6
préconisé par Prince sur une série de lames de microscope
disposées sur un support approprié. Ce support peut être un
cadre plastique adapté pour 6 lames (modèle CNTS de Paris).
La formule de ce tampon est la suivante
C1Na 0,1M ; TRIS 0,01M et EDTA 0,001M.
2. Après 30 mn, placer les lames en chambre humide pendant deux
heures.
3. Pratiquer des puits dans la gélose avec un emporte-pièce muni
de 7 couteaux de 4 mm de diamètre.
4. Enlever l'excès de gel par aspiration à l'aide d'une trompe
à vide.

---

- 36 -
5. La disposition des puits par lame est la suivante
6. sur une même lame, remplir le puits c~ntral de gauche par le
réactif antigène (Ag) en utilisant une pipette Pasteur, et
le puits central de droite par le réactif (Ac).
7. Remplir les puits périphériques avec les sérums à étudier
non dilués.
8. Placer les lames sur un support en chambre humide.
Ainsi sur une même lame, six sérums de malades ou de donneurs
de sang subissent à la fois, une recherche d1antigène HBs et d1anticorps
anti HBs.
Une autre possibilité consiste à étudier les sérums de malades
ou de donneurs au pur (1/1) vis à vis de deux réactifs antigènes HBs et
de deux réactifs anticorps anti HBs de titres différents (un fort et un
faible) •
Dans cette dernière possibilité qui représente llidéal, 6 sérums
de donneurs ou de malades subissent à la fois sur une même lame de gélose,
une recherche d1antigène HBs ou d1anticorps anti HBs vis à vis de deux
réactifs de titres différents.
1.1. Lecture et Interprétation des résultats
La lecture des arcs de précipitation se fait à partir du
lendemain et pendant 4 jours.

---

- 37 -
Dans certains cas, les arcs de précipitation peuvent être
visibles soit après 5 heures pour les réactions très "intenses, soit après
18 heures pour les réactions normalement positives.
Les antigènes ou les anticorps faibles ne sont visibles qu'après
24 heures ou seulement après 48 heures.
Les antigènes ou les anticorps très faibles ne sont visibles
qu'entre le 3e jour et le 4e jour. Dans ce dernier cas deux éventualités
sont à envisager :
- s'il s'agit d'une recherche d'anticorps, il convient de re-
commencer l'épreuve par la même technique après concentration du sérum
concerné sur du 1yphoge1 (1 ml de sérum pour 10
grains de lyphoge1).
Il convient également de réaliser sur le sérum concentré, une
réaction d'identité en utilisant une gamme de réactifs antigènes de faibles
titres (1/3,1/4,1/6,1/8).
- s'il s'agit d'une recherche d'antigène, le sérum concentré doit
être étudié en Electro-Immunodiffusion vis à vis de deux réactifs anti-
corps de différents titres (un fort et un faible).
La technique d'Immunodiffusion par la méthode d'Ouchter1ony est
également très efficace pour rechercher en dépistage, l'antigène HBe et
l'anticorps anti HBe qui permettent de préciser l'évolution de l'hépatite B.
Les manipulations à mettre en oeuvre pour effectuer ce dépistage
sont également simples et sont précisées ci-dessous.
1 - Après avoir préparé le gel comme précédemment, le couler sur
une plaque de verre, dont un exemple est la plaque utilisée
au CNTS de Paris ayant pour dimensions 14 cm x 18 cm x 2 mm.
2 - Après 30 mn, placer la plaque en chambre humide pendant
2 heures.
3 - Perforer dans la gélose, les puits de 6 mm de diamètre.
Deux méthodes peuvent être utilisées pour pratiquer ces
puits. Nous n'exposerons dans ce travail que la méthode la
plus simple exigeant le moins de moyens matériels.

---

- 38 -
Elle consiste A tracer sur un papier ordinaire, le schéma en
grandeur-nature de la disposition des puits, et A pratiquer par transpa-
rence, les puits dans la gélose A l'aîde d'un simple couteau de 611111 de
diamètre.
L'excès de gélose est enlevé avec une trompe A vide et on
obtient la disposition représentée par·la figure ci-après
lnununodiffusion
AC2
Ac2
t
SM4 •
SMl
eO
SM8
SMS
A92 .
•••
•
9 2 .
. • SM6
.. • Acl.
~.
SM]
•
ACl
•••
•e. .-. ..- •••
••
••• .-.
•
•
• ••
•
• -·e
••• •••
••• •••
•
••• ••• •••
e·
••
•
Réactifs pour recherched'AgHBe et d'anti HBe
Agl = le AgHBe
Acl = le Ac anti HBe
Ag2 = 2e AgHBe
Ac2 = 2e Ac anti HBE
.
.
Les réactifs Ag sont des sérums
Les réactifs Ac sont des sérums de
de malade concentrés 5 fois avec
malade utilisés tels quels.
du lyphogel.

---

- 39 -
4 - Les puits ainsi pratiqués sont remplis à l'aide de pipettes
Pasteur conformément aux indications portées sur la figure
ci-dessus.
5 - Déposer la plaque en chambre humide.
Ainsi, 24 sérums de malades peuvent subir à la fois sur l'exemple
de la plaque de verre 14 cm x 18 cm x 2 mm, une recherche d'antigène HBe et
d'anticorps anti HBe qui donnent des indications précieuses sur l'évolution
de l'hépatite B.
Au total, l'application de cette technique simple d'Immunodiffu-
sion qui ne nécessite pratiquement pas un matériel coûteux, permettra en
République Populaire du Bénin:
de dépister 70 % des porteurs du virus B parmi les donneurs
de sang ;
• de diagnostiquer l'hépatite B aiguë et de préciser son évolu-
tion ;
r
• de commencer la constitution des stocks de réactifs antigènes
et anticorps pouvant être utilisés sur place.
Si par bonheur, nous entrions en possession du matériel appro-
prié pour effectuer l'Electro-immunodiffusion, les chances de dépistage
d'un pourcentage plus élevé d'antigène HBs seraient accrues.
Dans cette nouvelle situation, les manipulations à mettre en
oeuvre pour réaliser ce test d'Electro-imrnunodiffusion (EID) sont encore
simples et sont indiquées ci-dessous:
II. ELECTRO-IMMUNODIFFUSION (EID)
(36, 41)
Cette technique est plus sensible que la précédente,·car elle
permet de dépister 75 à 80 % des porteurs du virus B de 1'hépatite.

---

- 40 -
Outre sa sensibilité plus grande, cette technique présente
encore l 1avantage de rechercher simultanément chez le même sujet, llantigène
HBs et llanticorps anti HBs.
Son principe consiste à faire migrer sous un courant électrique,
llanticorps vers la cathode et llantigène vers llanode. La rencontre de ces
deux éléments forme une ligne de précipitation visible après une heure de
migration.
Les manipulations simples à exécuter pour réaliser cette tech-
nique sont
1. Couler un gel d1agarose à 2 %en Tampon Véronal Acétate (TVA)
O,05M ayant un pH 8,6 sur une plaque de verre dont un exemple
est la plaque utilisée au CNTS de Paris et ayant pour dimen-
sions 14 cm x 18 cm x 2 mm. La formule du tampon TVA est la
suivante :
- Véronal sodique
24,428 g
- Acétate de sodium
3H20
19,428 g
- Acide chlorhydrique
N
270 ml
- eau distillée
ln)
3000 ml.
Ce tampon est utilisé pour faire le gel et pour remplir les cuves
d1électrophorèse.
2. Après 30 mn, déposer la plaque pendant deux heures en chambre
humide.
3. Pratiquer dans la gélose à l'aide d1un emporte-pièce muni de
couteaux de 4 mm de diamètre, un ensemble de puits distants
de 10 mm de centre à centre. Le premier et le dernier puits
doivent être situés à 3 cm environ du bord de la plaque.
4. Enlever l'excès d'agarose à llaide d'une trompe à vide. La
disposition finale des puits en grandeur-nature se présente
comme suit :

---

- 41 -
20 sérums à examiner
pur (1/1)
20 sérums à examiner
!
Jl d;lués au 1/10
.. -i 0
0
0
0
0
0
o 0 0 000
G 0
0
0
0
0
0
o 0 0 000
3 0
0
0
0
0
0
o 0 0 000
".0 0
0
0
0
0
o 0 0 000
5 0
0
0
0
0
0
o 0 0 000
6 0
0
8 0 0 0 o 0 0 000
~ 0
0
0
0
0
o 0 0 000
S 0
0
0
0
0
0
o 0
0
0 0 0
9 0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
10
0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
Il
0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
I~ 0
o 0 0 0 0 o 0
0
0 0 0
.) 0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
14 0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
15
0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
.6
0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
'1 0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
ft
0
o 0 0 0 0 o 0 0 o 00
19 0
o 0 0 0 0 o 0
0
0
0 0
~o 0
o 0 0 0 0 o 0 0 000
Réactif
Réactif
Ag HBs
anti HBs

---

- 42 -
5. Diluer les sérums à étudier au 1/10. Chaque sérum à étudier
doit être testé au. pur (1/1) et au (1/10).
6. Remplir à l laide de pipettes Pasteur, les puits de réactifs
et de sérums à étudier conformément aux indications portées
sur la figure ci-dessus.
7. Déposer les plaques sur· les cuves à électrophorèse préalable-
ment remplies de tampon véronal acétate (TVA).
8. Etablir la liaison entre le tampon et la plaque à l laide de
papier Cofram bien épais pour éviter des pertes d'énergie.
Le papier Cofram doit reposer sur toute la longueur du gel
et sur une largeur de 2 cm.
9. Mettre le courant électrique et laisser migrer pendant une
heure sous une différence de potentiel de 7 volts par cm
mesurée aux deux extrémités de la plaque au niveau des ponts.
Pour l'exemple de plaque citée dans ce travail, la migration se
fait sous une différence de potentiel de 90 volts. ,
10. Lire immédiatement sur fond noir les arcs de précipitation
dès la fin de la migration, puis après une nuit de diffusion
en chambre humide.
Ainsi, sur une plaque de 14 cm x 18 cm x 2 mm, 40 sérums de
donneurs peuvent subir à la fois au pur (1/1) et au 1/10, une recherche
d'antigène HBs et dlanticorps anti HBs.
Une autre possibilité consiste à étudier les sérums des donneurs
au pur (1/1)· vis à vis de deux réactifs antigènes et de deux réactifs anti-
corps de titres différents (un fort et un faible).
cette dernière possibilité offre l'avantage d'étudier sur une
plaque de 14 cm x 18 cm x 2 mm, 80 sérums qui subissent à la fois une re-
cherche d'antigène HBs et d'anticorps anti HBs.

---

- 43 -
II.1. Lecture et Interprétation des résultats
La lecture des arcs de précipitation se fait juste à la fin de
la migration et après une nuit de diffusion en chambre humide.
Les principales difficultés qui peuvent être rencontrées dans
la pratique quotidienne de ce test d'EID sont: le phénomène de zones les
réactions très faibles ou douteuses et les réactions faussement positives
qui sont rares et qui peuvent avoir diverses origines s notamment l'antigène
spécifique du parvovirus 819 si le réactif anti HBs est également anti B19.
Le phénomène de zone représente la difficulté la plus importante
en EID. Il se présente comme suit :
(+) Ac
st·,
Ag
(-)
a)
0 1 0
0
-+arc de précipitation normal après
1 h de migration
Ac
SM
Ag
b)
0
0
0
-.possibilité de phénomène de zone
par suite d'un fort ta~x d'Ag HBs
dans le sérum du malade
Ac
Sr4
Ag
c)
a 0
0
..... phénomène de zone après 1 h de
migration
SM
Ag
d)
@
0
0
~ phénomène de zone après 18 h de
diffusion en chambre humide.
Ce phénomène se produit chaque fois que le sérum étudié contient
un très fort titre d'antigène HBs. L'arc de précipitation est alors très
proche du puits de l'anticorps et peut être flou. Si l'on n'observe pas
attentivement les lames s ce phénomène peut entraîner des faux négatifs.
Mais après une nuit de diffusions les arcs de précipitation au nombre de
deux occupent la position ci-dessus indiquée qui permet de repérer la
positivité.
De plus comme nous conseillons l'utilisation systématique de
sérums dilués au 1/10s nous pensons pouvoir rattraper les faux négatifs
avec le sérum dilué.

---

- 44 -
Dans le cas où certains laboratoires disposeraient d'une gamme de
réactifs anticorps de forts titres, ils pourraient lors du phénomène de zone
tester les sérums concernés vis à vis de ces réactifs anticorps. Ce dernier
procédé offre l'avantage de ne pas diluer les sérums à étudier.
Quant aux problèmes posés par les réactions très faibles ou
douteuses généralement observées après une nuit de diffusion en chambre
humide, ils sont résolus par l'utilisation d'une gamme de réa~tifs anticorps
de faibles titres (1/3, 1/4, 1/6).
Les faux positifs dus aux antigènes spécifiques du Parvovirus
B19 sont reconnus par un aspect caractéristique des arcs de précipitation.
Ces arcs se présentent comme suit :
(-)
Ac
SM
Ag
a)
010
o - arc de précipitation normal
Ac
SM
Ag
b)
o 0 o - arc de précipitation non spécifique
de llAg HBs et probablement dû à
l'antigène spécifique du Parvovirus
B19·
La lumière est faite sur ce phénomène en testant par la même
technique, le sérum concerné vis à vis d'un réactif anticorps spécifique
du Parvovirus B19.
Au total, l'Electro-immunodiffusion représente une technique
appréciable pour le dépistage systématique de l'antigène HBs et de l'anti-
corps anti HBs. Par sa capacité d'identifier 75 à 80 % des porteurs du
virus B de l'hépatite, elle augmentera en République Populaire du Bénin, les
chances de constituer une gamme plus étendue de stocks de réactifs antigènes
HBs et anticorps anti HBs plus que ne le permettrait la technique d'Immuno-
diffusion.
Toutefois, il convient dans les cas douteux de faire appel à
cette dernière technique pour effectuer les réactions de spécificité.
Une autre méthode qui peut être facilement mise en pratique en
-----~----

---

- 45 -
République Populaire du Bénin, se rapporte A l 'hémagglutination. Le pro-
blème est encore ici celui de la disponibilité des réactifs appropriés.
Par cette méthode, on pourrait dépister environ 90 % des porteurs
du virus B parmi les donneurs de sang. Les manipulations pour préparer
localement les réactifs demandent un équipement plus important dont une
centrifugeuse réfrigérée, des antigènes purifiés et des microplaques.
Ainsi, une fois par mois, on pourrait préparer pour la consomma-
tion locale, les hématies sensibilisées appropriées A partir d'antigène
HBs et/ou HBe purifiés obtenus A la suite de relations internationales
fructueuses.
Les manipulations A exécuter pour rechercher l'antigène HBs et
l'anticorps anti HBs par cette méthode d'Hémagglutination sont également
simples et sont indiquées ci-dessous.
III. HE~~GGLUTINATION
111.1. Préparation deshématies~ sensibilisées par l'antigène HBs purifié
(13, 14, 135)
1. Prélever sur EDTA, les hématies humaines de groupe 0 ;
2. Laver 6 fois ces hématies en tampon Mayer dilué extemporanément
au 1/5. La formule du tampon r~yer se présente comme suit:
- NaCl
8,3 g
- Vérona l sodé
10,190g
- HC1N
34,6 ml
- solution de Cac1
0,3M
5 ml
2
- solution de MgC1
5 ml
2 lM
- eau distillée
2000 ml
Agiter et ajuster le pH A 7,3.
3. Ajuster le culot globulaire A une hématocrite de 55 %

---

- 46 -
4. A un volume de culot globulaire, ajouter un volume d'antigène
HBs et un volume de chlorure de chrome (C1 3Cr).
La solution de C1
est extemporanément diluée au 1/5 en
3Cr
tampon Mayer ;
5. Agiter pendant 15 mn manuellement ou mécaniquement
6. Laver 5 fois les hématies en tampon Mayer dilué au 1/5
7. Reprendre le culot globulaire dans 10 fois son volume en
Tampon de conservation à pH 7 ;
8. La suspension globulaire ainsi obtenue peut être observée
pendant un mois à +4°C ;
9. Au moment de l'emploi, cette suspension globulaire est redi-
luée en tampon TAP au 1/30. La composition du tampon TAP est
la suivante:
- Tampon phosphate saline
1000 ml
- polyvinylpyrrolidone (Spécia)
25 mg
- Tween 80
0,05 ml
Avant chaque utilisation, ajouter à 100 ml de ce tampon,
1,66 ml d'albumine bovine à 30 %.
Le tampon phosphate saline est composé de
115 ml de NaH2P0 0,2M
4
- 385 ml de Na2HP0 0,2M;
4
- 17 g de NaCl ;
- 2000 ml d'eau distillée.
111.2. Dépistage et titrage de l'anticorps anti HBs par Hémagglutination
passive (13, 15)
1. Diluer de 1/2 en 1/2 les sérums témoins positif et négatif
ainsi que les sérums à étudier.
Cette dilution doit être effectuée en TAP albumine.

---

- 47 -
2. Déposer une goutte de chaque dilution à l'aide d'une pipette
Pasteur calibrée à 25 gouttes par ml dans chaque puits de la
microplaque.
3. Ajouter avec la même pipette, une goutte de la suspension
globulaire à 0,2 %.
4. Agiter légèrement la plaque, la recouvrir de parafilm et la
laisser à la température ambiante pendant 30 mn.
Si l'on ne dispose pas de parafilm, agiter légèrement la
plaque et la déposer en chambre humide pendant 30 mn.
5. Incliner la plaque à GO°C sur un portoir spécial et lire la
réaction au bout de 5 à 10 mn.
111.3. Interprétation
L'absence d'anticorps est signalée par une coulée rettiligne le
long du V.
En présence d'anticorps, le culot d'hématies reste au fond du
puits.
Le titre de l'anticorps est donné par la dernière dilution qui
agglutine les hématies.
III.4.- Recherche de l'antigène HBs par la technique d'inhibition de
l'hémagglutination
(13, 14)
Cette technique est plus sensible que l'EIO. Il convient de la
pratiquer seulement sur les sérums de donneurs ayant montré un résultat
négatif au dépistage de l'antigène HBs par l'EIO.
Le schéma technique d'exécution de cette réaction se présente
comme suit :

---

- 48 -
1. Répartir les sérums à étudier dans les puits de la micro-
plaque, à raison dlune goutte par puits
2. Ajouter à la goutte de sérum à étudier, une goutte de réactif
anticorps anti HBs.
3. Laisser reposer la mn à la température du laboratoire;
4. Ajouter au mélange, une goutte de la suspension de globules
rouges humains 0 sensibilisés et préalablement dilués au 1/30
en Tampon TAP.
5. Recouvrir la plaque de parafilm et laisser reposer pendant
45 mn à la température du laboratoire.
Si lion ne dispose pas de parafilm, laisser la plaque en
chambre humide pendant 45 mn.
6. Lire sur un plan incliné, ou laisser toute une nuit à +4°C
et lire le lendemain matin en inclinant la plaque.
III.5.Lecture et Interprétation des résultats
L'absence d'antigène HBs est signalée par une agglutination des
hématies. Le culot globulaire reste au fond du puits (V).
La présence d'antigène HBs est signalée par l'absence d'aggluti-
nation des hématies.
On observe une coulée le long du puits (V).
Ainsi, la mise au point en République Populaire du Bénin des
réactions d'immuno-précipitation et d'hémagglutination, permettra d'iden-
tifier environ 90 % des sujets ayant été en contact avec le virus B de
l'hépatite, et contribuera grandement à mettre à la disposition des malades,
des unités de sang majoritairement dépourvus de ce virus.

---

- 49 -
~
PRODUCTION DES REACTIFS DE GROUPAGE ABD
(42, 59, 69, 91, 106, 109, 122)

---

- 50 -
1.
DEPISTAGE DES SERUMS A HAUT TITRE. D'ANTICORPS ABO
1. Prélever aseptiquement chez le donneur, notamment chez le
nouveau donneur en phase de sélection, 10 à 20 ml de sang
total dans un tube en verre, sec, propre et stérile.
2. Boucher aussitôt le tube de sang et le placer à l'étuve à 37°(
pendant une heure.
3. Après coagulation et rétraction du caillot, centrifuger le
tube et transférer stérilement le sérum surnageant dans un
autre tube en verre, sec, propre et stérile.
4. Décomplémenter le sérum en plaçant le tube au bain-marie à
56°C, et en veillant que la température à l'intérieur du séruIT
soit effectivement portée à 56°C pendant 30 mn.
5. A 0,1 ml de sérum stérile et décomplémenté, ajouter 5,9 ml
de solution physiologique isotonique stérile. On obtient ainsi
une dilution de 1/60.
6. Sur une plaque d'opaline bien nettoyée et bien dégraissée,
faire agir respectivement, une goutte de sérum dilué avec une
goutte de suspension à 10 %en saline de globules rouges
Al, A2 et B. Lire les agglutinations dans les 2 à 3 mn.
7. Retenir :
- les sérums de sujets Aayant agglutiné les globules rouges B
les sérums de sujets B ayant agglutiné les globules rouges
Al et A2 ;
- les sérums de sujets 0 ayant agglutiné les globules rouges
Al, A2 et B.
Bien entendu, on écartera tout sérum donnant une agglutinatio'
non spécifique.
De tels sérums devront être étudiés à la recherche d'anticorp

---

- 51 -
anti Lewis (anti Lea, anti Leb ou anti Lex), d'anti P1,
ou même d'auto-anti l ou d'auto-anti P1.
C'est ainsi qu'on pourra amorcer la constitution d'une séro-
thèque à réactifs plus élaborée.
8. Sur les sérums ayant donné une agglutination spécifique des
globules rouges A ou B, ou A et B, effectuer aussi le dépis-
tage d'allo-anticorps irréguliers en saline à +4°C, en saline
à 18-22°C et en saline à +37°C, en utilisant trois hématies
phénotypées dans les systèmes Rhésus (D, C, c, Ee), Kell
(K, k, Jsa, Jsb),Lewis (Lea, Leb), P (P1), MNSsU,
Jk (Jka, Jkb).
-
9. Les sérums présentant un ou plusieurs anticorps irréguliers,
seront inclus dans la sérothèque à réactifs, après une identi-
fication plus fine de l'anticorps ou des anticorps irrégu-
liers qu'ils contiennent.
10. Sur chaque sérum retenu pour la préparation des réactifs ABO,
on devra effectuer le dépistage d'antigène HBs par une tech-
nique sensible localement pratiquée (14).
11. Rejeter tout sérum positif en antigène HBs.
II. ETUDE PLUS APPROFONDIE DES SERUMS RETENUS
II.1. Détermination de l'avidité sur plaque (59)
1. Mélanger convenablement sur plaque d'opaline, une goutte de
chaque sérum retenu avec une goutte de suspension.à 10 % en
saline de globules rouges A1 d'une part, et d'autre part,
une goutte du même sérum avec une goutte de suspension à 10 %
en saline de globules rouges A2•

---

- 52 -
2. Dès le début du mélange, déclencher un chronomètre pour déter-
miner le temps d'apparition des premiers agglutinats visibles.
On ne devra retenir que les sérums ayant visiblement agglu-
tiné les globules rouges A1 en 10 secondes et les globules
rouges A2 en 20 'secondes, -
1. Mélanger convenablement sur plaque d'opaline, une goutte de
chaque sérum retenu avec une goutte de suspension à 10 %
en saline de globules rouges B.
2. Dès le début du mélange, déclencher un chronomètre pour déter-
miner le temps d'apparition des premiers agglutinats claire-
ment visibles à l'oeil nu. On ne devra retenir que les sérums
ayant agglutiné les globules rouges B en 10 secondes.
1. Mélanger respectivement sur plaque d'opaline, une goutte de
chaque sérum retenu avec :
une goutte de suspension à 10 %en saline de globules
rouges A1 ;
- une goutte de suspension à 10 %en saline de globules
rouges A2 ;
- une goutte de suspension à 10 %en saline de globules
rouges B ;
- et si possible une goutte de suspension à 10 % en saline
de globules rouges Ax.
2. Dès le début du mélange, déclencher un chronomètre pour déter-
miner le temps d'apparition des premiers agglutinats claire-
ment visibles à l'oeil nu.

---

- 53 -
On ne devra retenir que les sérums ayant visiblement agglutiné
les globules rouges A1 en 10 secondes, les globules rouges A2
en 20 secondes, les globules rouges B en 10 secondes, et
dans la mesure du possible les globules rouges Ax disponibles
en 3 à 5 minutes.
II.2. Détermination de la force du ou des anticorps contenus dans les
sérums retenus
(44, 59)
1. Sur un portoir de 50 places, disposer de gauche à droite
- 10 tubes à hémolyse sur la première rangée ;
- 10 tubes à hémolyse sur la seconde rangée ;
- 6 tubes à hémolyse sur la troisième rangée ;
- 1 tube sur la quatrième rangée ;
- et 1 tube à hémolyse sur la cinquième rangée.
2. Identifier ces tubes à hémolyse de gauche à droite à partir
de 1/1 à 1/512 sur les deux premières rangées et de 1/1 à
1/32 sur la troisième rangée. Le tube de la rangée 4 et celui
de la rangée 5 seront identifiés par 1/1.
3. Mettre dans le premier tube de chaque rangée (tubes identifiés
par 1/1), une goutte de sérum pur non dilué.
4. Dans une autre série de 9 tubes disposés sur un autre portoir,
réaliser des dilutions sérielles de 1/2 en 1/2 jusqu1à
1/512, à partir de 4 gouttes d'eau physiologique et de 4
gouttes du sérum à étudier.
5. t4ettre dans les tubes appropriés, une goutte de chaque dilution.
6. Mettre dans chaque tube de la première rangée, une goutte de la
suspension à 5 %en saline de globules rouges A1•
7. Mettre dans chaque tube de la seconde rangée, une goutte de
la suspension à 5 % en saline de globules rouges A2'

---

- 54 -
8. Mettre dans chaque tube de la troisième rangée, une goutte
de la suspension à 5 %en saline de globules rouges A2B.
9. Mettre dans le tube de la quatrième rangée, une goutte de
la suspension à 5 %en saline de globules rouges B, et dans
le tube de la cinquième rangée, une goutte de la suspension
à 5 %en saline de globules rouges O.
10. Examiner parallèlement sur un second portoir, un réactif
anti A de contrôle.
11. Agiter les tubes et les incuber entre 18°C et 22°C pendant
1 h 30 mn à 2 heures.
12. Lire les résultats sur fond blanc et noter le titre du réac-
tif de contrôle et celui du sérum étudié.
Ainsi, le sérum anti A étudié ne sera jugé valable et retenu que
lorsqu'il aura montré un titre au moins égal à 64 vis à vis des
globules rouges A1 et A2, et un titre au moins égal à 8 vis à vis
des hématies A2B.
1. Sur un portoir de 50 places, disposer de gauche à droite,
10 tubes à hémolyse sur la première rangée,· 1 tube à hémolyse
sur la seconde rangée et 1 tube à hémolyse sur la troisième
rangée.
2. Identifier les tubes comme il est indiqué précédemment.
3. Mettre dans le premier tube de chaque rangée (tubes identi-
fiés par 1/1), une goutte de sérum pur non dilué.
4. Dans une autre série de 9 tubes disposés sur un autre portoir,
réaliser des dilutions sérielles de 1/2 en 1/2 jusqu'à
1/512, à partir de 3 gouttes d'eau physiologique et de 3
gouttes du sérum à étudier.

---

- 55 -
5. Mettre dans les tubes appropriés, une goutte de chaque
dilution.
6. Ajouter au contenu de chaque tube de la première rangée, une
goutte de la suspension à 5 %en saline de globules rouges B
puis, au contenu du tube de la seconde rangée, une goutte de
la suspension à 5% en saline de globules rouges A1 ; et au
contenu du tube de la troisième rangée, une goutte de la sus-
pension à 5% en saline de globules rouges O.
7. Examiner parallèlement un réactif anti B de contrôle.
8. Agiter les tubes et les incuber entre 18°C et 22°C pendant
1 h 30 mn à 2 heures.
9. Lire les agglutinats sur fond blanc et noter aussi bien le
titre du réactif anti B de contrôle que celui du sérum en
étude.
On ne retiendra que le sérum qui aura montré un titre au moins
égal à 64 vis à vis des globules rouges B.
1. Sur un portoir de 50 places, disposer de gauche à droite, trois
séries de 10 tubes sur les trois premières rangées, 6 tubes
sur la quatrième rangée et 1 tube sur la cinquième rangée.
2. Identifier les tubes comme il est indiqué précédemment.
3. Mettre dans le premier tube de gauche de chaque rangée (tubes
identifiés par 1/1), une goutte du sérum pur non dilué.
4. Dans une autre série de 9 tubes disposés sur un autre portoir,
réaliser des dilutions sérielles de 1/2 en 1/2 jusqu'à
1/512, à partir de 6 gouttes d'eau physiologique et de 6
gouttes du sérum à étudier.
5. Mettre dans les tubes appropriés, une goutte de chaque dilu-
tion.

---

- 56 -
6. Ajouter respectivement
- au contenu de chaque tube de la 1ère rangée, une goutte de
la suspension à 5 % de globules rouges A ;
1
- au contenu de chaque tube de la seconde rangée, une goutte
de la suspension à 5 % en saline de globules rouges A ;
2
- au contenu de chaque tube de la troisième rangée, une goutte
de la suspension à 5 % en saline de globules rouges B ;
- au contenu de chaque tube de la quatrième rangée, une
goutte de la suspension à 5 % en saline de globules rouges
Ax dans la mesure du possible ;
- et au contenu du tube de la cinqième rangée, une goutte de
la suspension à 5 % en saline de globules rouges O.
7. Agiter les tubes et les incuber entre 18°C et 22°C pendant
1 h 30 mn à 2 heures.
8. Lire les résultats sur fond blanc et noter les titres obtenus
On ne retiendra que les sérums anti A+B de sujets d ayant montré
un titre au moins égal à 64 vis à vis des globules rouges A , A
1
2
et B.
Les sérums ainsi retenus doivent agglutiner sur plaque dans les
3 à 5 minutes, les globules rouges Ax disponibles avec une inten-
sité allant de (+) à +.
A partir des différents titrages effectués, on devra déterminer
le score dlagglutination de chaque sérum étudié.
Ains.i , l es scores normaux à accepter sont :
• pour llanti A, 50 avec les globules A1 et 40 avec les globules
rouges A2 ;
• pour llanti B, 50 avec les globules rouges B.
En ce qui concerne llanti A+B, les caractéristiques indiquées
ci-dessus pour llanti A et pour llanti B demeurent valables.

---

- 57 -
Lorsque les sérums étudiés ont chacun satisfait les exigences
de spécificité, d'avidité, de titre et de score, on pourra les pooler par
groupe ABD, ce qui permettra d'obtenir :
- le pool de sérums provenant de sujets A ;
- le pool de sérums provenant de sujets B ;
- et le pool de sérums provenant de sujets D.
Sur chaque pool de sérums constitué, on devra en dernière ana-
lyse, effectuer un contrôle de qualité en vérifiant suivant les mêmes
techniques que précédemment, la spécificité, l'avidité et le titre de
l'anticorps.
Ainsi, l'exécution correcte de ces quelques techniques simples
en parallèle aux tests biologiques visant à sélectionner les donneurs,
permettra d'orienter certains de ces donneurs vers les prélèvements pour
la préparation de réactifs de groupage ABD.
Les opérations de préparation proprement dite de ces réactifs
peuvent être exécutées de la manière suivante
(59) :
1. Prélever aseptiquement en don ordinaire chez le aonneur
convenablement orienté, 300 à 400 cc de sang total dans un
récipient en verre sec, propre et stérile ;
2. Placer le récipient de sang à 37°C pendant une heure, et
ensuite pendant une nuit à +4°C ; le sang ainsi traité coa-
gule et le caillot se rétracte;
3. Centrifuger le récipient de sang à 2000 tours par minute
pendant 30 mn, et décanter stérilement le sérum surnageant
dans un autre récipient en verre sec, propre, et stérile
4. Effectuer systématiquement sur chaque sérum, une épreuve
sérique (Simonin) de contrôle;
5. Pooler dans un même récipient, tous les sérums provenant de
donneurs appartenant au même groupe ABD
6. Ajouter immédiatement et stérilement de l'azide de sodium
(N3Na) stérile au pool de sérums constitué, à la cose de
1 ml de solution-mère de N3Na pour 99 ml de sérum stérile.
La solution-mère de N3Na s'obtient en dissolvant 100 g de
poudre de N3Na dans un litre d'eau distillée stérile.

---

- 58 -
7. Augmenter l'avidité du pool de sérums constitué en ramenant
à 13 g/l, la concentration en NaC1, de ce pool;
exemple : pour un pool de sérums de 2,3 1, on devra ajouter
stérilement 9,2 g de NaC1, soit 30,66 ml d'une solution à
30 % de NaC1. Cette augmentation de sel au réactif provoque
une augmentation de la force ionique du milieu.
8. Dans la mesure du possible, ajouter stérilement les colorants,
soit 5 ml d'ériog1èucine par litre de sérums provenant de
sujets de groupe B, et 5 ml d'acrif1avine par litre de sérums
provenant de sujets de groupe A.
9. Effectuer une filtration c1arifiante avec des filtres de
1,2 U et 0,45 ~ d'une part,et d'autre part,une filtration
stérilisante avec des filtres de 0,22 ~.
10. Répartir stérilement en petits volumes (2 à 10 ml) dans les
flacons en verre neutre,propres, stériles et non colorés. les
réactifs préparés et déposer ces flacons dans un congélateur
à -20°C après les avoir correctement étiquetés ;
11. Sur quelques flacons de réactifs choisis au hasard dans le
le lot, effectuer le contrôle de la spécificité, de l'avidité
du titre et du score ;
12. Effectuer également sur ces flacons de réactifs choisis au
hasard, le contrôle de stérilité en déposant successivement
ces flacons à 37°C pendant 3 jours, puis à 18-22°C pendant
3 jours ;
13. l'apparition d'un aspect trouble dans les flacons signe une
souillure et doit conduire à rejeter tout le lot.
Au total, l'exécution correcte et méthodique de ces quelques
techniques simples en République Populaire du Bénin. permettra de prépare!
dans un premier temps en vue d'une consommation locale, les réactifs de
groupage ABD à partir des anticorps contenus dans le sérum de$ donneurs
de sang.

---

- 59 -
Nous venons d'exposer la technique de préparation des réactifs
de groupage ABD.
Nous allons passer à la présentation de la technique de produc-
tion de l'antiglobuline humaine polyvalente à partir des chèvres et du
zymozan ; technique proposée par l'OMS et que nous avons essayé d'adapter
aux conditions simples existant au Bénin.

---

- 60 -
CID
TECHN 1QUE DE PREPARAT 1ON
DE L'ANTIGLOBULINE HUMAINE POLYVALENTE
(47, 88, 144)

---

- 61 -
Le réactif antig1obu1ine po1yspécifique peut être préparé soit
par le mélange de deux réactifs antig1obu1ines spécifiques anti IgG et
anti Complément, soit en augmentant 11activité anticorps des deux spéci-
ficités chez le même animal.
Dans le cas particulier du Bénin, le Laboratoire Central
d'Immunologie et de Transufsion Sanguine pourrait préparer pour la consom-
mation locale, le réactif antig1obu1ine po1yspé~ifique par la seconde
méthode, à partir du zymozan et des chèvres, conformément aux protocoles
indiqués ci-après.
1. LE CHOIX DES ANIMAUX
Les chèvres à utiliser pour préparer ce réactif doivent
a) être saines
b) être neuves, c'est-à-dire, n'avoir été préalablement utilisées
pour la préparation d'aucun autre réactif anticorps;
c) avoir dans leur séum, un anti A - 1ike de très faible titre
vis à vis des globules rouges humains de groupe A ;
d) elles peuvent avoir reçu ou non des vaccins contre diverses
maladies.
Dans l'exécution d'un programme de préparation d'antig1obu1ine,
il convient dl immuniser à la fois deux chèvres.
II. PREPARATION DU ZYMOZAN
Le matériel d'immunisation doit être aseptiquement préparé
suivant1a séquence d'actes indiqués ci-dessous:

---

- 62 -
a) Peser 150 mg de zymozan pour une dose d'immunisation par
chèvre.et le mettre dans un récipient en verre stérile;
b) Ajouter 5 ml d'eau physiologique stérile
c) Placer le récipient au bain-marie à 100°C pendant 30 mn
d) Après stérilisation, centrifuger la suspension de zymozan
à 1000 tours/mn pendant 2 mn ;
e) Retirer le surnageant et laver 4 fois le zymozan dans du
tampon barbital sodé à pH 7,3. La composition de ce tampon
est la suivante :
- Diethyl malonylurée sodée: 20,6 g
dans un litre d'eau distillée.
Ajouter à 570 ml de cette solution, 430 ml d'une solution
de HCl ~ et ajuster le pH aux alentours de 7,3.
f) Remettre en suspension le zymozan lavé dans 5 ml de tampon
barbital sodé.
g) Prélever 5 ml de sang frais humain de groupe 0 et le laisser
coaguler pendant 20 mn à 37°C dans un récipient de verre;
h) Centrifuger le sang coagulé entre 2000 à 2500 tours/mn ;
i) Recueillir le sérum et centrifuger à nouveau ce sérum pour
le débarrasser entièrement des globules rouges
j) Mettre dans un récipient en verre stérile 1 ml de sérum et
20 ml de tampon barbital sodé ;
k) Ajouter les 5 ml de suspension de zymozan au mélange sérum-
tampon barbital et agiter bien ;
1) Placer le récipient au bain-marie à 37°C pendant 1 heure et
agiter de temps en temps ;
m) Laver 3 fois le zymozan en tampon stérile refroidi à +4°C.
Pour ce lavage, centrifuger chaque fois à 1000 tours/mn pen-
dant 2 mn ;

---

- 63 -
n) Après le dernier lavage, mettre en suspension le zymozan
dans 1,5 ml d'eau physiologique nonnal et stérile;
0) Ajouter 1,5 ml d'Adjuvant Complet de Freund et émulsifier par
agitation vigoureuse ;
p) Le zymozan ainsi préparé peut être soit immédiatement utilisé
pour immuniser la chèvre ou le mouton, soit conservé à -20°C.
III. PROTOCOLE D'IMMUNISATION
a) Injecter approximativement 0,75 ml d'émulsion de zymozan dans
chaque quartier de devant et chaque arrière-train de la chèvre
choisie.
b) Faire une seconde injection identique à la première après
6 semaines d'intervalle.
c) Faire une troisième injection identique à chacune des deux
premières six semaines après la seconde.
d) Six semaines après la troisième injection, mélanger chaque
aliquot (0,75 ml) de zymozan à 1 ml de préparation d'immuno-
globulines humaines à 16 % diluée au 1/80.
Injecter ce mélange à l'animal dans chaque quartier de devant
et dans chaque arrière-train. Cette dernière attitude a pour
but d'augmenter la force de l 'antiglobuline en activité
anti IgG.
IV. PROTOCOLE DE SAIGNH1Etn DE L'ANIMAL
Une semaine après la 4ème injection, prélever un échantillon de
sang à la veine jugulaire de l'animal pour tester les activités anti IgG
et anti Complément.

---

- 64 -
Si les premiers résultats obtenus se montrent satisfaisants,
on pourra prélever 500 ml de sang tous les mois par chèvre pendant tout
le temps où la puissance des anticorps serait à un niveau satisfaisant.
La démarche à suivre pour récolter le maximum de sérum valable est la
suivante
a) Prélever les 500 ml de sang dans un récipient en verre neuf,
sec, propre et stérile ,
b) Laisser coaguler le sang à 37°C pendant 60 mn et ensuite
à T4°C pendant une nuit ;
c) Décanter soigneusement le sérum après centrifugation à
2000 tours/mn pendant 60 mn et le transférer dans un autre
récipient en verre neuf, sec, propre et stérile;
d) Centrifuger à nouveau le sérum ainsi recueilli et séparer le,
sérum surnageant dans un troisième récipient en verre neuf,
sec, propre et stérile ;
e) Inactiver le complément en incubant le sérum au bain-marie
à 56°C pendant 30 mn. Cela veut dire qu'il faut effectivement
porter la température intérieure de sérum à 56°C pendant
30 R11 ;
f) Conserver à -20°C le sérum ainsi obtenu.
Ainsi, les 500 ml de sang prélevés chez la chèvre
àonnent environ 200 ml de sérum dont il faut absolument absorber
les hétéroagg1utinines, avant de tester les activités anti IgG et anti-
Complément.
les globules rouges appropriés pour effectuer cette absorption
des hétéroagg1utinines sont les hématies humaines de groupes 0, A1 et B.
Ces hématies sont préparées comme suit :

---

- 65 -
V. PREPARATION DES GLOBULES ROUGES POUR L'ABSORPTION DES HETEROAGGLU-
lININES
a) Prélever en don ordinaire, 400 à 450 ml de sang chez les
donneurs de groupes 0, A et B ;
1
b) Laver 9 fois en eau physiologique stérile, chaque unité de
sang ainsi prélevée. Pour chaque lavage, utiliser un volume
d'eau physiologique égal au double du volume globulaire, et
centrifuger le sac de sang pendant 30 mn à +4°C et à une
vitesse de 2000 à 2500 tours/mn.
c) A chaque lavage, l'eau physiologique surnageant doit être
complètement enlevée après la centrifugation.
d) D'un lavage à l'autre, remettre délicatement mais entièrement
toutes les hématies en suspension dans l'eau physiologique.
e) Réaliser un pool de culot globulaire en mélangeant volume à
volume les culots globulaires de groupes 0, A1 et B séparé-
ment lavés.
Bien homogénéiser le mélange ainsi constitué.
f) Répartir dans des récipients neufs, ce mélange entrois
fractions égales, le volume de chaque fraction étant approxi-
mativement égal au volume du sérum à absorber.
g) Déposer les différentes fractions de concentré globulaire à
+4°C.
VI. ABSORPTION DES HETEROAGGLUTININES
a) Refroidir le sérum décomplémenté à +4°C.
b) Ajouter le sérum décomplémenté et refroidi à la première frac-
tion de pool de concentré globulaire. Bien agiter et incuber

---

- 66 -
à +4°C pendant 1 heure tout en ayant soin d'agiter toutes
les 15 mn.
c) Centrifuger pendant 30 mn à +4°C et à une vitesse de 2000 à
2500 tours/mn.
d) Enlever le sérum' surnageant et l'ajouter à la seconde fraction
de pool de concentré globulaire. Bien mélanger et incuber à
+4°C pendant 60 rnn tout en agitant de temps en temps.
e) Centrifuger pendant 30 mn à +4°C et à une vitesse de 2000 à
2500 tours/mn.
f) Enlever le sérum surnageant et l'ajouter à la troisième
fraction de pool de concentré globulaire. Bien mélanger et
incuber à +4°C pendant 60 mn tout en agitant de temps en temps.
g) Centrifuger pendant 30 mn à +4°C et à une vitesse de 2000 à
2500 tours/mn.
h) Décanter soigneusement le sérum surnageant tout en: évitant de
prendre des globules rouges.
i) Centrifuger encore une fois le sérum ainsi décanté pendant
30 mn à +4°C et à une vitesse de 2000 à 2500 tours/mn pour le
débarrasser complètement de toute trace de globules rouges.
j) Prélever un échantillon du sérum ainsi traité pour divers
examens de contrôle et conserver le reste à -20°C.
L'échantillon de sérum ainsi prélevé sera utilisé pour contrôler
l'absorption effectuée, tester les activités anti IgG et anti Complément,
et déterminer enfin la dilution optimale d'utilisation du réactif anti-
globuline.

---

- 67 -
VI I. CONTROLE DE LI ABSORPTION. DES HETEROAGGLUTININES
a) Diluer le sérum antiglobuline absorbé au 1/2, 1/4, et 1/8
dans le diluant final,ici PBS ;
b) Porter à +4°C, 0,5 ml de chacune de ces dilutions et 0,5 ml
du sérum antiglbbuline absorbé et non dilué.
c) Préparer en plasmas autologues, des suspensions de 5 %de
globules rouges de groupes 0, A1 et B prélevés sur ACD ou CPD.
Mettre ces suspensions à +4°C.
d) Préparer deux séries de 12 tubes chacune et trois tubes pour
contrôle.
Ces tubes seront disposés comme suit
Fig. 1
,
Après 5 mn
Dilutions
à +4°C
de l'antiglobuline
GR A1 GR B GR 0
GR A1 GR B GR 0
Sérum AG absorbé et
non dilué
Sérum AG absorbé et
dilué au 1/2
Sérum AG absorbé et
dilué au 1/4
Sérum AG absorbé et
dilué au 1/8
Diluant seul
(contrôle)
NB : AG =antigZobuZine

---

- 68 -
e) Mettre dans les tubes appropriés 0,05 ml de suspensions glo-
bulaires conformément à la figure ci-dessus.
f) Mettre dans les tubes contrôles, 0,1 ml du diluant préalable-
ment refroidi à +4°C.
Centrifuger pendant 1 mnà 1000 tours/mn et lire macroscopi-
quement. Il ne devrait pas y avoir d'agglutination.
g) Laver 3 fois en tampon PBs refroidi à +4°C, les suspensions
globulaires réparties dans les deux séries de 12 tubes.
h) Ajouter au culot de globules rouges contenus dans chaque tube,
deux volumes de sérum antiglobuline absorbé pur ou d'iIué con-
formément aux indications de la figure 1, et bien agiter.
i) Centrifuger immédiatement une série de 12 tubes et lire
macroscopiquement. Il ne devrait pas y avoir d'agglutination.
j) Centrifuger la seconde série de 12 tubes après 5 mn d'incu-
bation à +4°C et lire macroscopiquement. Comme ~récédemment,
il ne devrait pas y avoir d'agglutination.
VIII. CONTROLE DE L'ACTIVITE ANTI IgG DU SERUM ANTIGLOBULINE ABSORBE
L'activité anti IgG du sérum antiglobuline est testée au moyen
de globules rouges 0 positif sensibilisés par un anti 0 de la manière
suivante :
VIII.1. Sensibilisation des globules rouges 0+ par l'anti 0
a) Prélever des globules rouges 0 positif chez un sujet Rhésus
positif de préférence hétérozygote (Od).
b) Laver une fois en tampon PBS, les hématies prélevées et
réaliser une suspension à 5 % de ces hématies en PBS.
c) Choisir un réactif anti 0 dont le titre est égal à 16 en
Coombs indirect. Si l'on ne dispose pas d'un réactif anti 0

---

- 69 -
donnant ce titre, on pourra diluer en PBS, un réactif anti D
plus fort jusqu~à obtenir le titre 16 en Coombs indirect.
d) Mélanger un volume de la suspension de globules rouges D+
à 5 % avec deux volumes du réactif anti 0 choisi ou dilué,
et incuber le mélange à 37°C pendant 45 mn.
e) Laver 3 fois les hématies en tampon PBS et réaliser de nouveau
une suspension à 5 % de ces mêmes hématies en PBS. La suspensior
dhémattes D+ senstbil i sées par l'antt Dest ainsi prête à 11 emploi
pour tester .1 1 activité anti IgGd:J sérum ant i ql obul ine absorbé,
f) Réaliser également à 5 % en PBS, une suspension des mêmes glo-
bules rouges 0+ mais non sensibf l i sés par 11anti O.
VIII.2. Contrôle proprement dit de 11activité anti IgG du sérum
antig10bu1ine absorbé
a) Réaliser une double dilution sérielle de demi en demi du
sérum anti globuline absorbé jusqulà 1/512.
b) t~langer 0,05 ml de la suspension à 5 % de globules rouges
sensibi1 isés avec 0,1 ml de chacune des dilutions du sérum
antiglobuline absorbé.
c) Mélanger 0,05 ml de la suspension à 5 % des mêmes globules
rouges non sensibilisés avec 0,1 ml de chacune des dilutions
du sérum antig10bu1ine absorbé.
d) Centrifuger tous les tubes pendant 1 l11l à 1000 tours/rm et
1ire 1es résul tats.
e) Des agglutinations macroscopiques doivent être observées au
moins dans les 5 premiers tubes contenant les hématies sensi-
bilisées par llanti O.
Par contre, aucune agglutination ne doit être observée dans
les tubes contenant des hématies non sensibilisées.

---

- 70 -
IX. CONTROLE DE L'ACTIVITEANTICOMPLEMENT DU SERUM ANTIGLOBULINE ABSORBE
L'activité anticomplément du sérum antiglobuline absorbé est
testée au moyen de globules rouges 0 d'adultes recouverts de complément
de la manière suivante :
IX.1. Sensibilisation des hématies 0 d'adultes par le Complément
a) Prélever des globules rouges de groupe 0 Le(a+) chez un adulte
sain, et laver 3 fois en PBS ces hématies.
b) A un volume de culot globulaire 0 Le(a+) lavé, ajouter un
volume égal de sérum d'un sujet Le(a-) ayant un anti Lea
non agglutinant. Incuber le mélange à 37°C pendant 45 mn.
Centrifuger, retirer le surnageant et le remplacer par un
volume égal de sérum AB frais sans anticorps irréguliers.
c) Incuber le mélange à nouveau pendant 20 mn à 37°C~
d) Laver 3 fois en PBS, les hématies 0 Le(a+) ainsi traitées.
e) Réaliser une suspension à 5 % en PBS des globules rouges
o Le(a+) ainsi traités. Ces globules rouges sont alors prêts
à l'emploi pour tester l'activité anti Complément du sérum
antiglobuline absorbé.
IX.2. Contrôle de l'activité anti Complément du sérum antiglobuline
a) Préparer trois séries de 10 tubes comme il est indiqué dans
la figure 2 ci-après:

---

- 71 -
Fig. 2
Dilutions du
sérum antiglo-
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16 1/32 1/64, 1/128 1/256 1/512
buline absorbé
. .
Globules rouges
recpuverts de
Complément C3d
. .
.
.
..
. .
.
.
Globules rouges
non. recouverts
de Complément
.
.
.
.
..
Globules rouges
conservés pen-
dant deux se-
maines à 4°C en
ACD ou en CPD
.
.
.
.
. .
. .
.
.
b) Diluer le sérum antiglobuline absorbé de demi en demi jusqu1à
la dilution 1/512 en tampon PBS.
c) Répartir 0,05 ml de la suspension à 5 % de globules rouges
recouverts de Complément (C3d) dans chacun des tubes de la
première série.
d) Répartir 0,05 ml de la suspension à 5 % en tampon PBS des
mêmes globules rouges non recouverts de complément dans chacun
des tubes de la seconde série.
e) Répartir dans chacun des tubes de la troisième série, 0,05 ml
de la suspension à 5 % en tampon PBS des mêmes globules rouges
prélevés sur ACD ou sur CPD et conservés à +4°C pendant deux
semaines. L1inclusion de cette troisième série de globules
rouges dans le test de contrôle permet de vérifier si le sérum
antiglobuline préparé contient une activité anti C
le C
4,
4
étant llùn des composants du complément capable de recouvrir
non spécifiquement les globules rouges pendant leur conserva-
tion.

---

- 72 -
f) Ajouter aux globules rouges contenus dans chaque tube, 0,1 ml
du sérum antiglobuline absorbé ou de ses dilutions comme il
est indiqué sur l a figure 2 ci -dessus.
g) Agiter bien et centrifuger tous les tubes à 1000 tours/mn
pendant une minute.
h) Lire macroscopiquement les réactions sur fond blanc.
Toutes les réactions doivent être négatives avec les globules
rouges non recouverts de complément.
Par contre, une réaction positive (agglutination des hématies)
doit être observée dans tous les tubes contenant des globules rouges re-
couverts de complément (C3d en particulier).
Lorsque tous ces contrôles effectués sur le sérum antiglobuline
absorbé, à savoir: contrôle de l'absorption et contrôle des activités
anti IgG et anti Complément ont donné des résultats satisfaisants, il
convient de déterminer la dilution optimale à laquelle sera utilisé le
réactif antiglobuline polyspécifique ainsi préparé.
x. DETEro~INATION DE LA DILUTION OPTIMALE DU SERUM ANTIGLOBULINE
POLYSPECIFIQUE
La détermination de la dilution optimale d'un sérum antiglo-
buline polyspécifique est essentiellement fondée sur son activité anti IgG
et effectu~e comme suit :
a) Réaliser en tampon PBS, des dilutions successives de demi en
demi jusqu'à 1/512 du sérum antiglobuline absorbé
b) Placer ces dilutions à +4°C jusqu'à l'emploi;
.
c) Réaliser en tampon PBS, des doubles dilutions directes de 1/1
à 1/16 d'un pool de sérums anti D incomplet dont le titre en
Coombs indirect ne dépasse pas 16 ;

---

- 73 -
d) Placer également ces dilutions à +4°C jusqu'à l'emploi;
e) Installer 6 rangées verticales de 12 tubes chacune conformé-
ment à la figure 3 représentée ci-dessous :
Fig. 3
~
ANTI D
du sérum
Ant.iglobul ine
SHt{ .
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
absorbé
AB
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
'1/256
1/512
<
Réactif antiglobuline
de référence
Diluant du sérum anti-
globuline absorbé
(PBS)

---

- 74 -
f) Préparer une suspension à 5 %en tampon PBS de globules
rouges ORh+ prélevés de préférence chez un sujet 0 positif
hétérozygote (Dd) et lavés 4 fois en PBS
g) Ajouter 1,2 ml de chaque dilution d'anti 0 À 0,6 ml de la
suspension globulaire qui vient d'être réalisée; par ailleurs,
à un volume de la suspension globulaire qui vient d'être réa-
lisée, ajouter deux volumes d'un sérum humain normal AB. Bien
agiter l'ensemble des tubes et incuber le tout à 37°C pendant
45 mn ;
h) Laver 4 fois les globules rouges en tampon pas après l'incuba-
tion, et les remettre à nouveau en suspension à 5 %dans du
pas ;
i) Répartir dans chaque tube approprié et conformément à la figure
3 présentée ci-dessus, 0,05 ml de la nouvelle suspension glo-
bulaire réalisée au point h ;
j) Distribuer ensuite dans chaque tube approprié et suivant la
figure 3 présentée ci-dessus, 0,1 ml de chaque dilution du
sérum antig10bu1ine absorbé, 0,1 ml du réactif antig10bu1ine
de référence et 0,1 ml du diluant du sérum antig10bu1ine
absorbé (PBS) ;
k) Agiter les tubes et centrifuger immédiatement pendant 1 mn à
1000 tours/mn ;
1) Secouer doucement les tubes et lire macroscopiquement les réac-
tions sur un fond blanc. Les réactions macroscopiquement néga-
tives doivent être observées au microscope ;
m) Noter l'intensité des réactions d'agglutination et établir le
score du sérum antig10bu1ine po1yspécifique absorbé.
Pour déterminer la dilution optimale d'utilisation du sérum anti-
globuline po1yspécifique absorbé, on devra recommencer les mêmes"manipu1a-
tions en utilisant cette fois, un anti Ke11 avec des globules rouges 0 ~ + k4
(voir Fig. 3).

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Ainsi la dilution optimale recherchée sera la plus forte dilu-
tion du sérum antiglobuline polyspécifique qui agglutine encore avec une
intensité égale à +++t les globtiles rouges sensibilisés par un .anti D
dont le titre est égal à 16 en Coombs indirect.
A cette dilution,
• les réactions observées doivent être comparables à celles du
réactif antig~obuline de référence;
• il ne doit pas y avoir de phénomène de zone ;
• et on ne doit pas observer de réaction d'agglutination avec
les globules rouges non sensibilisés.
Lorsque toutes ces conditions ont été vérifiées t on devra effec-
tuer sur le sérum antiglobuline polyspécifique absorbé et convenablement
dilué, un dernier contrôle de qualité en vérifiant sa spécificité et son
spectre d'activité de la manière suivante :
XI. CONTROLE DE QUALITE DU SERUM ANTIGLOBULINE POLYSPECIFIQUE
ABSORBE ET CONVENABLB~ENT DILUE
a) Prélever du sang sur ACD ou EDTA chez 10 donneurs répartis
comme suit : 3 de groupe Ot 3 de groupe At 2 de groupe B
et 2 de groupe AB.
Le sang destiné à ce panel ne devrait pas être prélevé plus
de trois jours auparavant.
b) Laver une fois en PBS les globules rouges prélevés.
c) Réaliser en PBS t une suspension à 5 %des globules rouges
ainsi lavés.
d) Ajouter à Ot05 ml de chaque suspension globulaire t Ot1 ml de
sérum AB frais ou de sérum autologue et bien agiter.

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e) Centrifuger pendant une minute à 1000 tours/mn.
f) Remettre les globules rouges en suspension par agitation
des tubes.
g) Incuber pendant 30 mn à 37°C.
h) Centrifuger pendant une minute à 1000 tours/mn.
i) Remettre les globules rouges en suspension par agitation
des tubes.
j) La ver 3 foi s les gl obul es rouges en PBS et décanter comp l ète-
ment le surnageant au dernier lavage.
k) Diluer au 1/1, 1/2, et 1/4, le sérum antiglobuline polyspéci-
fique préalablement porté à sa dilution optimale en tampon PBS.
1) Mettre sur les culots de globules rouges contenus dans les
tubes 0,1 R~ de dilution appropriée de l'antiglobuline poly-
spécifique.
m) Bien agiter pour remettre les globules rouges en suspension
dans la dilution de l'antiglobuline, et centrifuger pendant
une minute à 1000 tours/mn.
n) Lire macroscopiquement et microscopiquement les réactions.
Toutes les réactions doivent être négatives.
XII. ETUDE DU SPECTRE Dl\\CTIVITEDU SERUM ANTIGLOBULINE POLYSPECIFIQUE
Cette étude peut être simplement faite en utilisant d'une part,
les allo-anticorps anti D et anti Kell avec dans chaque cas des globules
hétérozygotes pour tester l'activité anti IgG, et d'autre part l'anti Lea
avec des globules rouges Le(a+) pour tester l'activité anti Complément.
En ce qui concerne l'étude de l'activité anti IgG, la sensibilisa-
tion des hématies appropriées dans chacun des cas sera faite ccnformément à la
technique suivante

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a) Laver une fois en PBS les globules rouges appropriés prélevés
chez des sujets hétérozygotes, et réaliser en PBS une suspen-
sion à 5 %de ces globules rouges.
b) Choisir les réactifs anti D et anti Ke11, dont le titre ne
dépasse pas 16 en Coombs indirect, et diluer chacun de ces
réactifs au 1/2, 1/4, 1/8 et 1/16 en PBS ;
c) Incuber à 37°C pendant 45 mn, 0,05 ml de la suspension globu-
laire à 5 %avec 0,1 ml de réactif anticorps approprié en
dilution;
d) Laver 3 fois les globules rouges en PBS ;
e) Au dernier lavage, retirer totalement le surnageant, il reste
alors au fond des tubes un culot de globules rouges ;
f) Diluer de demi en demi jusqu'à 1/128 le sérum antig1obu1ine
po1yspécifique en étude ;
g) Ajouter au culot de globules rouges restés au fon~ des tubes,
0,1 ml de l'antig1obu1ine ou de sa dilution appropriée et bien
mélanger ;
h) Centrifuger pendant une minute à 1000 tours/mn ;
i) Lire macroscopiquement et microscopiquement les réactions.
Noter les résultats des deux lectures et exprimer par des
croix l'intensité des réactions d'agglutination.
Ainsi, pour que l'activité anti IgG d'un sérum antig1obu1ine soit
jugée valable, les dilutions 1/8 et 1/16 rie ce sérum antig1obu1ine doivent
encore agglutiner faiblement :
• les globules rouges D positif hétérozygotes sensibilisés par un
anti 0 de titre 16 ;
• les globules rouges Ke11 positif hétérozygotes sensibilisés par
un anti Kel1 de titre 16.
Quant à l'activité anti complément, elle peut être testée en
utilisant les globules 0 Le(a+) sensibilisés par un réactif anti Lea ou un

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sérum de donneur Le(a-) contenant un anticorps anti Lea comme il a été
précédemment indiqué au point 9.1.
Ainsi, pour que l'activité anti complément du sérum antig1ogu1ine
préparé soit jugée valable, une réaction d'agglutination doit être observée
avec les globules Le(a+) sensibilisés par un anti Lea de titre 16, ou avec
les globules rouges Jk(a+ b+) sensibilisés par un anti Jka de titre 8.
Nous terminons ainsi la présentation des techniques qui pourraient
être mises en application pour produire dans notre pays, les réactifs de
première nécessité.
Nous allons maintenant envisager, celles pouvant permettre de pré-
parer sur place quelques produits sanguins.

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@ PREPARATION DE QUELQUES PRODUITS SANGUINS
PAR LE CENTRE DE REFERENCE
(5
6
7)
t
t

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- 80 -
1.
PREPARATION DU CONCENTRE GLOBULAIRE ET DU PLASMA FRAIS
_.
. .
.
A PARTIR DES DOUBLES SACS'PLASTIQUES
(5)
1. Choisir des pots ou adaptateurs avec ou sans cloison en
fonction du volume des poches.
2. Chasser le sang total resté à la base de la tubulure de
prélèvement.
3. Introduire convenablement les poches plastiques et les tubu-
lures dans les pots.
4. Pour chaque centrifugation, mettre en pot des unités de sang
de poids voisin.
5. Equilibrer sur une balance, les pots avec de l'eau ou avec
des plaques de carton découpées à cet effet.
6. Mettre les pots de même poids en face l'un de l'autre dans la
centrifugeuse.
7. Centrifuger à 3000 tours par minute pendant 21 minutes à la
température de 20°C au plus.
8. Sortir délicatement les sacs de sang en évitant de remettre les
globules rouges en suspension.
9. Mettre les sacs de sang sous pression de l'extracteur de plasma.
10. Libérer le dispositif obturant la tubulure de transfert au
niveau de la poche de sang.

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11. Transférer ainsi la totalité du plasma surnageant dans la
poche secondaire.
12. Clamper immédiatement la tubulure de transfert dès qu'on voit
monter un fi)et de globules rouges à la base de la tubulure.
13. Faire deux noeuds adjacents bien serrés au milieu de la tubu-
lure de transfert.
14. Couper stérilement la tubulure de transfert entre les deux
noeuds adjacents pour séparer les deux poches.
15. Faire aussitôt un second noeud de sécurité à la base de chaque
sac.
On obtient ainsi un sac de concentré globulaire prêt à l'emploi
pour traiter les malades en anoxie tissulaire. Sa durée de validité est de
21 jours à +4°C.
Le sac de plasma frais peut être soit congelé dans les 6 heures
,
qui suivent pour donner le plasma frais congelé ou PFC, soit utllisé imrné-
diatement pour traiter les déficiences hémostatiques dues à l'absence ou à
l'insuffisance de facteurs labiles de la Coagulation.
II. PREPARATION DU CONCENTRE GLOBULAIRE A PARTIR DES TRIPLES SACS
PLASTIQUES
(6)
A partir du sang total prélevé dans les triples sacs plastiques,
on procède comme il est indiqué plus haut du point 1 au point 12 inclus.
Puis, par l'ouverture du système seccable du sac n° 3, la solution
électrolytique SAG riche en adénine contenue dans ce sac est refoulée dans
le sac de concentré globulaire pour remettre en suspension les globules
rouges.
On fait ensuite deux séries de noeuds comme suit

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• d'une part, deux noeuds adjacents bien serrés au milieu de la
tubulure reliant le sac de globules rouges au sac n° 3 ;
. d'autre part, deux autres noeuds adjacents au milieu de la tu-
bulure de transfert reliant le sac de globules rouges au sac
n° 2 contenant le plasma.
On sectionne ensuite les deux tubulures sus-indiquées entre les
noeuds adjacents, et on libère le sac de concentré globulaire qui est prêt
à l'emploi pour traiter les malades en anoxie tissulaire. Sa durée de vali-
dité est de 35 jours à +4°C.
Le sac de plasma frais est immédiatement congelé à -20°C ou -30°C.
Il représente le plasma frais congelé ou PFC utilisable seulement après dé-
congelation pour toutes les indications du plasma frais.
III. PREPARATION DU CRYOPRECIPITE ET DU PLASMA DEPOURVU DE CRYOPROTEINES
(7)
On décongèle lentement à +4°C pendant 16 heures le plasma frais
précédemment congelé.
Puis, après avoir refroidi les pots à +4°C, on fait une mise à
pot correcte des sacs à la température de +4°C.
L'équilibrage des pots est ensuite rapidement fait à la tempéra-
ture ambiante soit avec des plaques de carton, soit avec l'eau préalable-
ment refroidie à +4°C.
Les pots sont introduits dans la centrifugeuse préalablement re-
froidie à +4°C, et on centrifuge à 3000 tours par minute pendant 21 minutes.
Les unités ainsi centrifugées sont complètement dép1asmatisées
à +4°C. Pour cela, on dépose les poches plastiques pleines sur une étagère
du réfrigérateur et on laisse s'écouler le plasma dépourvu de cryoprotéines
(POC) dans les poches vides posées sur une étagère inférieure.

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On strippe la tubulure de transfert vers le POC et on fait deux
noeuds adjacents bien serrés.
Les deux sacs sont enfin séparés par section de la tubulure de
transfert entre les deux noeuds.
Le Cryoprécipité ainsi obtenu est appelé cryoprécipité unitaire
et on peut l'utiliser pour traiter spécifiquement les hémophiles A.
Quant au POC, il peut être utilisé corrme substance de remplissage
dans les états d'hypovolémie, ou il peut être poolé avec d'autres unités
de même groupe ABO pour permettre la préparation de réactifs de groupage.

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