1
1
UNI VER S l TE DE REl MS
1
Année 1974-1975
1
THE S E
1
présentée
1
A LA FACULTE
DE
PHARMACIE
1
pour l'obtention du titre de
1
1
1
y ALA FIDÈLE
1
1
Pharmacien
1
EïUDE DES CARACTÈRES DE RÉSISTANCE
AUX ANTIBIOTIQUES DE
1
QUELQUES SOUCHES DE BACTÉRIES A RËACTION DE GRAM NÉGATIVE
1
Soutenue le 1er Octobre 1975
1
JURY
1
1/,. ~L
AUROUSS EAU
Président
1
!
jJ1 J.
LEVY
~
•
Examinateurs
~.J. DUCHENNE
1
1
1
I~·,1:i
l J i\\ .l VIII ~) 1 TE
llf
III 1MS
il '
-----===============
1 i
FACULTE DE PHARMACIE
Doyen, Directeur de l'U.E.R •....•.....•.•....•••
M.
J. LE MEN
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tvlme M. C. LEVY
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Chef des services Administratifs
M.
E. LAVIGNE
Bibliothécaire
Mme J. PITHPIS
~r "
"
1
1
1
A MON EPOUSE ET A NOTRE CHERE FILLE,
EN HONNEUR POSTHUME
A
MON PERE ET A MA MERE,
1
' \\ .
A MES FRERES
ET
SOEURS,
1
A MES MAITRES:
MONSIEUR LE PROFESSEUR AUROUSSEAU QUI A ACCEPTI
DE
PRESIDER
CE
JURY,
MONSIEUR LE PROFESSEUR LEVY
QUI ME FAIT L'HONI
NEUR DE JUGER CE TRAVAIL,
MONSIEUR LE PROFESSEUR DUC HENNE , EN TEMOIGNA-
GE
DE MA PROFONDE RECONNAISSANCE QUI M'A ACCUEILLI
DANS SON LABORATOIRE,
MADAME C. CHOISY MAITRE DE CONFERE~CE AGREGE
1
POUR SA COLLABORATION APPORTEE DANS CE TRAVAIL.
1
AVANT -
PROPOS.
1
Le travail qui fait l'objet du présent mémoire a été accomrl
au Laboratoire de Bactériologie, Virologie et Immuno~ogie de la Faculté 1
de Pharmacie de Reims, dirigé par Monsieur le Professeur J.
DUCHENNE.
C'est
\\
pour moi un agréable devoir de lui exprimer ici ma très vive
1
recon
naissance
pour m'avoir accueilli dans son Service, initié à la recher-
che dans u~ domaine aussi important que la Bactériologie et pour le matél
riel qu'il a mis, avec confiance~ à ma disposition.
Je ne saurai oublier Monsieur Le Professeur M. AUROUSSEAU
1
qui non seulement il y a quelques années a accepté de compléter nos
connaissances dans son service,
en Pharmacodynamie, pour m'aider à mieul
travailler dans mon pays, mais accepter àvec sympathie de présider ce
jury.
Ma gratitude s'adresse également à Monsieur le Professeur
1
LEVY qui apporte sa caution à mes efforts en acceptant de juger ce tra-
vail.
1
1
1
Qu~ Madame C. CHOISY trouve lCl l'expression de mes remerciemer
sincères pour m'avoir suivi avec une patience toujours r.enouvelée,
tout au long de ce travail,
pour ses conseils
judicieux,
ses criti-
ques constructives,
pour la part qu'elle a
prise dans l'amélioratior
des résultats et enfin pour avoir réviser mon manuscrit
malgré son
travail.
Mes Maîtres
ont su habilement choisir un sujet
dont
on connaî~
l'importance dans la
pratique hospitalière.En Afrique,
continent en
,
i
plein essor d'urbnnisation,
la consommation en antibiotiques augmen~
d'nnnée en année.
Déjà,
en 1969,
des cas de r6sistance
plasmldique
avaient été signalés à Douala au Cameroun et Dakar au Sénégal par
l'Institut Pasteur.
J'aurai donc l'occasion de continuer ces humble~
1
1
travaux qui en fin
de compte constituent un point de départ.
:~
Je réserve mes
derniers remerciements à Madame J.
PITHOIS et
au Personnel de
la bibliothèque pour la collaboration active à la
recherche bibliographique de ce travail,
au
personnel du Service
de Bactériologie de la
Faculté qui a
contribué à la pr.éparation des
milieux de culture utilisés dans ce travail.
\\\\
1
;
}
1
1
/
1
1
1
1
1
L'invention doit être partout,
jusque
1
dans les plus humbles
recherches de faits,
jusque dans l'expérience
la plus simple.
1
Là où i l n'y a pas un effort personnel et même original, i l
n'
y a même pas un commencement de science.
1
Henri BERGSON.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
...~.
1
1
l N T R 0 DUC T ION
1
i\\'
L'emploi massif d'antibiotiques, en médecine et dans
d'autres domaines,
au cours des vingt dernières années,
a for-
tement contribué, au sein de la population bactérienne,
à la
sélection de micro-organismes antibiorésistants. Aussi, con-
naît-on,
à présent,
des souches
de bactéries qui résistent à
tout antibiotique d'usage courant en clinique.
La contribution la plus efficace du Biologiste,à l'étu-
de de cet important problème de la thérapeutique moderne,
est,
incontestablement,
de prévenir ou du moins de prévoir certaines
résistances acquises en étudiant leur mécanisme.
C'est à ce genre de travail, indispensable en épidé-
1
1
miologie,
que Monsieur
Le Professeur DUCHENNE et Madame CHOI-
1
f
SY nous ont initié pour ,nous aider à mieux travailler dans
notre pays.
Nous avon~,ainsi,tenté,dans le présent travail,
d'ex-
pliquer le mécanisme de la résistance observée chez des bacté-
ries,isolées,au cours de diverses infections,à l'Hôpital de
Montfermeil.
1
Les antibiogrammes et sulfamidogrammes de ces souches,
1
en majorité des entérobactéries, montraient leur résistance aux
antibiotiques courants: Ampicilline, Streptomycine,
Kanamycine,
Chloramphénic~l, mais aussi aux Tét~acyclines et aux sulfamides
1
dont les concentrations minimales inhibitrices étaient
les plus
élevées(256 et 128 mcg/ml).
1. ·
Depuis les célèbres travaux des auteurs Japonais,
OCHIAI
1
et Coll.
en 1959, on admet que la résistance transférable joue
un rôle important en clinique, mais la résistance par mutation
est rare.
1
1
1
1
1
C'est ainsi,
qu'à la lueur des travaux des différents
1
auteurs,
notre travail fut orienté,dès le début,vers la recher-
1
che du transfert de la résistance observée par conjugaison bacté-
rienne.
Utilisant les entérobactéries de notre collection de labo-
ratoire destinées aux travaux pratiques des Etudiants,
nos
premiersl
essais furent vains et même décourageants.
D'autre part,
la méthodo
logie du transfert de la résistance par conjugaison bactérienne est 1
en fait empirique, comme le soulignait d'ailleurs Y.A.
CHABBERT(59
N
IJCJ~
• •
h
té
..
tA
..
d
è
ous sommes a~ns~
eur
s
tres
ct a
es probl mes.
1
Une souche réceptrice doit répondre à certaines conditions.
Comme signalé par divers auteurs,
Eschérichia coli K12 F-(sans fac-I
,
'
teur sexuel)est de loin la meilleure souche réceptrice(
5.9
) •
1
Nous avons ainsi pu transférer facilement la résistance de 1
certaines souches(Proteus et Enterobacter)
à Eschérichia coli K12.
Par contre,
les essais de
transfert à partir du pyocyanique ou aero·
manas,
tant en milieu liquide
que sur membrane de cellophane,
ont
été tous sans succès.
1
1
etl
Les conjugués obtenus étaient analysés par antibiogramme
\\
par la technique ses répliques à l'aide des tampomde velours.
1
1
1
Affirmer l'existence
des plasmides,par l'étude par conju-
\\
1
gaison seul~ peut paraître illusoire,à l'heure actue~le,car depuis
\\!
,
douze années;
l'étude des facteurs
de résistance a connu.
des
pro-
grès:
ultracentrifugation ~éparant l'ADN plasmidique de l'ADN chro-I
mosomique,
par gradient de densité;
guérison des bactéries de leurs
plasmides par des substances chimiques.
Nous n'avons pas pu réaliser
toutes ces techniques par manque de matériel.
Il est cependant accell
table de corroborer les résultats obtenus par conjugaison par la
1
guérison des bactéries de leur plasmide.
Pour certains auteurs
d'ailleurs,
la guérison d'une bactérie de sa résistahce par un agen~
1
chimique,
traduit la situation extrachromosomique de la
résistance
observée(
46
)0
Un autie fait
nous rassuie:
la perte de cer-
tains caractères observés,
au bout de quatre années de conservation l
.1
Ces caractères
qui ont ainsi disparu en bloc,
traduisent incontes-
tablement la situation extrachromosomique de la résistance
que
nous avons observée.
les fréquences
de cure que nous avons obtenues ,avec le
bro-
mure d'éthidium sont encourageantes, malgré la toxicit~ cellulaire
de ce produit.
Mais certaines souches dans ce travail,
non seulement n'on~
pas pu transf~rer leur résistance par conjugaison, mais elles n'on:
pas été aussi guéries de leur résistance par le bromure d'éthidium.
Cela montre que la
résistance est un phénomène complexe et comme II
dit CHABBERT,
une
bactérie peut résister à un seul antibiotique
par plusieurs modes de résistance différents(35
)0
En ce qui concerne la cinétique du transfert,
i l semble
qu'au bout de
trente minutes,
la
résistance peut être tr«nsférée e'
elle peut s'exprimer phénotypiquement.
Au terme de
notre modeste travail,
i l nous est agréable de
de remercier encore
nos maîtres pour leur dévouement,
leur patience
et l'expérience qu'ils ont su nous transmettre.
Dans l'exposÉ',de
notre travail,
nous avons adopté le plan de la page suivànte:
1
~
l '
1
PLAN
DE
LA
THESE.
i
1
'i1
- : -
]
1
PREMIERE
PARTIE
RAPPELS SUR LA RESISTANCE BACTERIENNE AUX ANTIBIOTIqUES.
1
PRESENTATION DU MATERIEL D'ETUDE. ESSAIS
DE SENSIBILITE.
1
Chapitre I. Notion de résistance aux antibiotiques.
Résistance naturelle
1
Résistance acquise: chromosomique,
extrachromosomiqu,
ChapitreII. Origine et répartition des souches;
Identification.
1
Essais de sensibilité:
antibiogrammes
sulfamidogrammes
an l
lO lques,1
- calcul des CMI des
t "b"
t"
des sulfamides.
1
Résultats: -fr~quences des caractères étudiés.
-antibiotypes des souches.
Entretien des souches résistantes.
1
DEUXIEME
PARTIE.
ESSAIS DE CONJUGAISON EN MILIEU LIqUIDE ET SUR CELLOFHANE.
1
ESSAIS DE GUERISON DES BACTERIES DE LEUR RESISTANCE PAR LE BPO- 1
MURE D'ETHIDIUM -
ESSAIS DE GUERISON SPONTANEE DES CARACTERES.
CALCUL DES FREqUENCES DE TRANSFERT- ESSAIS DE DETERMINATION DU
1
NOMBRE DE PLASMIDES EN FONCTiON DES CONCENTRATIONSDE CURE.
introduction.
1
Rappels sur la conjugaison bactérienne et les facteurs R.
Rappels sur les m~canismes d'inactivation des antibiotiquel
par les facteurs R.
Chapitre I.
1
Essais de transfert par conjugaison en milieu liquide.
t
t
- nécessité d'un milieu riche.
t
~
1
-
techni~ue de conjugaison.
J
analyse des cOnjUgUés:technique._1
1
1
J1
1
1
Essais de transfert sur membrane de cellophAne.
Techni~ue de Y.A.
CHABBERT
Variante du montage de la techniyue.
Chapitre II.
·\\
.~
Essais de guérison des bactéries de leur rF-sistance par le
r;
~
bromure d'éthidium.
"
t
Rappels sur le mFcanisme d'action du
l~
"1
bromure d'éthidium.
t','.
~
Méthodologie •
Chapitre III.
Essais : ~ur~la~guérison
spontanée des caractères observés.
Chapitre IV •
Résultats obtenus pour chaque souche:
essais d'interpr~ta
tion sur la nature de la résistance de chaque souche en
partant de l'ensemble de tous ces résultats.
Critioue des
techniques utilisées.
a)- résultats des germes bêtagalactosidase moins: (lac-
1- Proteus -mirabilis
-:rettgeri
-morgani
Hypothèse sur la natu:re de la résistance de ces
souches. Conclusion sur les Proteus.
2 -
Pseudomonas
aeruginosa
-
sans pigment n02
sans pigment nO]
b)- résultats des
germes bêtagalactosidase plus:(lac+
1
1
Klebsiella et Aeromonas
1
2
Ente:robacter.
[ 0 n c lus ion
g é n ~ r a,l e sur l'e nsem b l e des rés u l ta t s:
hy Il 0 t h è ses u r l e
mF-canisme biochimi~ue de quelques antibiotiques étudiés .
. . ./ ...
1
1
Chapitre V.
1
Analyse des conjugués obtenus:
répliques
et antibiogrammes
1
calcul des CMI.
~tude des caractères biochimiques aval
et après conjugaison.
1
Essais de détermination de la fréquence
de
transfert.
Résultats.
1
Essais sur le nombre de plasmides en fonction
des doses de
cure.
1
Conclusions -
Bibliographie.
1
\\ ,
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
•
1
1 r
1
1
1
1
1
1
PREMIERE
PARTIE
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1
1 1
1
1
1
i
1
1
1
1
1
l
1
~ 1
1
1
PRE MIE R E
PAR T l E.
1
CHA PIT REl.
1
CONCEPTION ACTUELLE
SUR LA
RESISTANCE
BACTERIENNE AUX ANTIBIOTIQUE1I
1
Avant de commencer notre travail expérimental,
nous allons,
dans ce premier chapitre,résumer brièvement les notions acquises par
1
divers auteurs sur la résistance bactérienne aux antibiotiques.
Ces
rappels bactériologiques
porteront sur les trois points suivants:
1
l
-
Notion de résistance bactérienne aux antibiotiques.
1
II - La résistance naturelle aux antibiotioues~
1
III - L~ résistance acquise aux antibiotigues:
1
d'origine chromosomique.
;~
:.
1
i
-
d'origine extrachromosomique.
1
1
1
1
1
.1
1
1
1
1
1
1
1- NOTION DE RESISTANCE BACTERIENNE
AUX ANTIBIOTIDUES.
Dans son rapport technique(1961,
n0210),
l'Organisation Mondiale
de la Santé(OMS),
définit la résistance bactérienne comme étant 12 poss~
bilité de supporter une concentration plus
élevée que la concentra-
tion qu'il est possible d'atteindre in vivo.
Dien entendu,
les cliniciens savent que de multiples causes
peuvent,in vivo,compromettre l'efficacité thérapeutique antibiotique,
en particulier les barrières tissulaires limitant la diffusion de la
drogue jusqu'au foyer infectieux.
Au laboratoire,
le biologiste ne considère
que les résistances
démontrables in vitro.
A l'heure actuelle,
i l est devenu classique
d'opposer la résistance acquise et la résistance naturelle.
2- LA RESISTANCE
NATURELLE.
C'est un caractère constant et stable des espèces bactériennes
les rendant inaccessible à l'action d'un ou plusieurs antibiotiq~es.
Nous savons ainsi, par exemple,que la pénicilline G est naturellement
inéfficace sur le bacille tuberculeux.
Dès la mise sur le marché d'un
nouvel antibiotique,
on connaît généralement son spectre d'activité.
Cela permet ainsi,théoriquement,
en dehors de tout antibiogramme,
de
1 li
prévoir l'efficacité
ou l'inéfficacité de tel ou tel antibiotique, si
un diagnostic bactériologique précis a
été établi.
1 1
1
1
3- LA RESISTANCE ACQUISE.
1
Problème essentiel de la thérapeutique moderne,
la résistênce
1
acquise affecte des souches bactériennes appartenant à des espèces
1 1 classiq~ement sensibles. Le plus souvent p elle concerne plusieurs
antibiotiques à la fois,
jusqu'à sept même(
48
).
1
La résistance acquise de nombreuses souches a
évolué au cours
du temps.
Tout le monde sait,
par exemple,
que 95% des staphylocoques
1
étaient sensibles ~ la pénicilline en 1945.
Depuis les travaux de
CHABBERT en France et MARY BARDER en Angleterre,
on" sait que ce taux
1
1
3 1
1
<
~ !
1
i .
a spectaculairement baissée
55
).
D'autres espèces bactérien-
~ .
nes sont en pleine évolution et son fréquemment rencontrées dans
les infections nosocomiales(Proteus et pyocyanique par exemple).
1
On peut donc dire à
l'heure actuelle qu'il est illusoire de faire
1
confiance au "spectre d'activité des antibiotiques".
L'antibiog~am-
me même,
bien que rendant d'éno~mes services dans les urgencs clini-
ques,
n'est qu'une
simple indication.
1
Le rôle du
biologiste face au problème de la résistance
1
bactérienne acquise est de prévenir ou au moins de prévoir certai-
nes résistances acquises en étudiant leur mécanisme.
Dans les pages
1
qui vont suivre,
nous allons résumer brièvement les mécanismes
permettant d'expliquer l'apparition des résistances acquises.
1
A -
LA RESISTANCE
ACQUISE D'ORIGINE
CHROMOSOMIqUE.1
a)- Caractéristiques de ce phénomène.
1
La résistance acquise d'origine chromosomique intervient
1
à la suite d'une mutation.
Sa mise en évidence est facile
a~ 1a-
boratoire et permet de reproduire les caractères classiques de
1
l'évènement mutationnel.
Ces faits ont été bien décrits
par Y.A.
CHABBERT in l'Antibiogramme(
55
).
Nous allons nous contenter,
ici,
d'en donner un résumé.
1
Î)- La résistance d'une bactérie à un antibiotique donné
1
est un caractère nouveau acquis par mutation et ce caractère se
maintient héréditairement dans la descendance de cett~ bactérie.
1
2)- Cette mutation est un fait de hasard comme toute muta-
1
tion,
peu fréquent,
1/10 7 ,
et ne portant que sur un 'seul caractère.
3)- Si cette mutation apparait au cours d'un traitement par
1
l'antibiotique auquel le mutant est devenu résistant,
cet antibio-
tique
jouera le rôle d'agent de sélection,
épargnant la descendance
1
du mutant et détruisant les bactéries sensibles.
1
1
4)- Au niveau moléculaire,
on admet
que la mutation entraî-
ne un changement de site de l'antibiotique qui ne
peut s'y
fixer.
On a précisément étudié ce phénomène dans le cas de la streptomycine.
b)- La mutation est insuffisante pour expliquer tous les
cas de résistance
b~ctérienne.
On a longtemps considéré la mutation comme le mode essentiel
de l'acquisition des résistances mais en fait elle ne peut expliquer
tous les cas observés en clinique.
La mutation,d'autre part,
fait appel
à
deux étapes
peu
compatibles avec la réalité des évènements.
1°_ La mutation est relativement rare et ne peut conférer
qu'une résistance par famille d'antibiotiques,
la possibilité de
mutations multiples entraînant une résistance à
trois ou quatre
familles
en même
temps est rare,
voire même nulle.
2°_ La sélection est d'autre part 'un phénomène lent,
exigeani
beaucoup de temps pour qu'une population bactérienne se reconstitue
à partir d'un seul mutant,
de plus dans bien des cas,
on voit appa-
raître
des résistances à plusieurs antibiotiques alors
qu'un seul
antibiotique a
été prescrit ou même
en dehors de
tout traitement
antibactérien qui
puisse jouer le rôle d'agent de sélection.
c)- Les transferts oénétigues,
le transduction sont 2USS~
1
des mécanismes de la résistance chromosomique.
1
Ces
deux
phénomènes ont aussi semblé,
un
temps,
capables
d'expliquer certaines des discordances observées.
On a
en effet dé-
montré qu'une bactérie sensible pouvait acquérir un fragment de
1
chromosome codant par exemple une résistance
à
un antibiotique
par transduction,
c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un bactério-
1
phage.
1
1
1
5
1
1
Les évènements se passent de
la façon suivante:
le Vlrus
1
bactérien parasitant une bactérie résistante à l'antiiJiotique V2
provoquer
sa lyse;
i l peut entraîner,
lié
~ son propre génome un
1
fragment de chromosome bactérien.
Le
bactériophage transducteur
parasitant
une bactérie sensible lui transmet le fragment ainsi
1
emprunté.
Un phage transportant ainsi
un fragment de chromosome est
dit tempéré
car i l ne provoque
pas la lyse de la bactérie parasi-
1
1
tée qui conservera ainsi la séquence
transduite avec la possibili-
té
de la transmettre à ses descendants.
Ce phénomène est lui aussi rare et ne peut expliquer tous
1
les cas de résistance observés.
Les circonstances permettant la
transduction
sont vraisemblablement
peu fréquentes.
1
d)- La résistance chromosomique
En clini~ue.
1
Les résistances chromosomiques du bacille tuberculeux sont
1
connues car i l fut un temps où elles inquiétaient les cliniciens.
1
Dans d'autres infections traitées par la streptomycine,
on cbser-
vait aussi des cas de résistance chromosomique.
Quand la valeur de
la concentration minimale inhibitrice dens ce cas de
résistance
1
était élevée d'emblée,
on l'appelait résistance en un seul échelon.
Quand la valeur de la concentration minimale inhibitrice s'élevait
1
palier par palier,
on l'appelait résistance en plusieurs échelons,
observée généralement avec la
pénicilline.
.1
Les résistances chromosomiques
sont très ra~es cn clinique
CHABBERT les considère comme une curiosité de laboratoire( 55
).
1
e)- L'association d'antibiotioues
oermet de vaincre certains
cas de résistance chromosomique.
1
Les mécanismes chromosomiques de la résistance aux antibioti)
ques et surtout le système mutation/sélection ont cependant une
para 1
de
simple:
l'association de deux antibiotiques actifs sur la bacté-
rie.
Dans ce cas,
l'un des antibiotiques détruit les
éventuels mu-
tants résistants
à l'autre antibiotique et réciproquement •.•
1
•
Le
système devrait être efficace puisque
la
probabilité de doubles
mutants est très faible.
Cette règle a
permis d'atteindre le bacil-
le tuberculeux dont la résistance chromosomique a
dangereusement
menacé la santé de l'homme.
Par contre,
cette règle
est presque
inefficace avec des
bactéries comme le pyocyanique,
les enté~obac
téries et les germes communs pyogènes.
En conclusion,
la résistance par mutation est rare en
clinique.
Si elle s'installe,
on a
plus de chance de la vaincre
par une assoèiation bien faite d'antibiotiques.
La résistance
d'origine chromosomique par mutation apparaît ainsi comme le dit
CHABBERT comme une simple curiosité de laboratoire.
Il
n'en est pas
de même de la résistance d'origine extrachromosomique que nous
allons examiner dans les pages suivantes.
1
1 11
1 tf1
1
1
1
1
1
"~1 .
1
~ ,
'.
1
B -
LA RESISTANCE ACnUISE D'ORIGINE EXTRA-CHRm~O-
SOMIqUE.
1
1
a)- Rappel historique.
1
De la fin de
la deuxième guerre mondiale à l'année 1958,
le Japon a connu de nombreuses épidémies de dysentérie
à
Shigella. La sulfamidothérapie et l'antibiothérapie
permirent
1
de juguler les premières épidémies qui s'étaient déclenchées.
Mais à partir de 1955, ces épidémies devinrent graves car un
1
grand nombre de bactéries résistaient à plusieurs antibiotiques
et aux sulfamides classiquement actifs sur ces bactéries' 248
Devant ces faits,
OCHIAI émit ét vérifia l'hypothèse
~u:unl
bactérie pouvait acquérir en bloc, simultanément plusieurs res~s
tances et que ce phénomène se propageait dans une population
bactérienne comme une maladie infectieuse et contagieuse(
140
1
( 24 8 ) •
b)- Les caractères de la résist2nce extra-chrO~Dscmicue.
1
bac~éri0109istl
Il Y a à peine une douzaine d'années que les
étudient le phénomène de la résistance extra-chro~osomique. Des
1
faits intéressants ont été accumulés grâce aux travaux de l'école
j a po nais e 0 CHI Al ( 1 4 0 , 1 4 2 ), I:J ATMM BE (
197
),
MITSUHASCHI( 133
i
de l'école anglaise( ANDERSON et Coll.( 20, 21
),
et de nombreux 1
auteurs Français pour ne citer que Y.A. CHABEERT(
59,60
),
D.
BOUHANCHAUD(
47
).
Il est établi 21-'heureactuelle:
1
1
- La résistance extrachromosomique apparaît simultanément
pour plusieurs antibiotiques(4,
6 familles et même plus)(
SE
)1
Elle apparaît en quelques heures in vivo chez un sujet
dont la souche était parfaitement sensible.
1
- La résistance peut apparaitre en l'absence de tout traitel
ment antibiqtique.
1
-
In vitro le phénom~ne ne peut être reproduit qu'en introduisant
dans la culture sensible une culture résistante,
ce qui démontre
la contagiosité de ce phénomène.
-
In vitro on démontre que le contact direct
entre bactéries sensi-
bles et bactéries résistantes est indispensable
à la transmission
de la résistance. Les filtrats
ne sont pas actifs,
ce qui élimine
le rôle
éventuel d'un mécanisme de transduction.
2°_ Depuis l'année 1963.
-
Les premiers faits
observés avant
l'année 1963,
avaient permis
de rapprocher le phénomène des observations faites
par JACCE et
WOLLMANN
auparavant
sur la conjugaison bactérienne,
en 1956. Ces
deux auteurs français
furent les premiers à
proposer le concept
d'épisomes
à la suite des travaux qu'ils avaient faits
sur divers
mécanismes de transferts génétiques.
Plusieurs types d'unitÉs
génétiques définies comme étant des épisomes ont été découvertes:
bactériophages tempérés,
le facteur de sexualité F(mis
pour fertili-
té),
les colicines.
C'est la similitude en de nombreux points Entré
le facteur F et les facteurs
de résistance transférable qui a per-
mis
de
bien étudier ces facteurs.
On admet ainsi:
-
Le mécanisme de transfert des résistances est spécifique,
i l né-
cessite une conjugaison bactérienne mais est indépendant du facteur
sexuel F.
-
L'élément transféré n'est pas un morceau de
chromosome mais un
filament d'ADN,
extrachromosomique bicaténaire,
circulaire comme
le chromosome bactérien mais beaucoup plus
petit:
c'est un plasmi-
de(64,48,248
).
-
Sur ce filament d'AD~, des zones successives
constituent des
loci correspondants aux différentes résistances
transférables:
Ce sont des facteurs
de résistance ou facteurs
R,
dont la PY§sence
dans la cellule entraîne généralement la
production d'enzymes capa-
bles de détruire l'antibiotique correspondant (183
184
)(. 248 2L1 0)
~
"
. , . 1 .
1
~.
1
'
1
-
Un facteur de rRsistance ou plasmide comprend précis~ment
des
qènes de réplication et des
qènes
transfert ou RTF et des gènes de
1
",
"résistance aux antibiotiques{ 48,248
).
On peut ainsi écrire que
5 '
y.
RTF + Marqueur de résistance
constituent un facteur R.
Voir
1
figure n01
à la page 10.
-
Certains agents chimiques peuvent débarrasser les bactéries de
1
leurs plasmides:
exemples:
1
acridine orange(248, 46,96).
acriflavine(248,96)
bromure d'éthidium
et d'autres
produits 1
que nous aurons l'occasion de voir dans la partie expérimentale de
notre travail!96,
248).
1
-
Les facteurs de résistance peuvent se perdre spontanément au cours 1
du temps de vie de la bactérie qui les héberge.
La perte des plasmi-
des est analogue à des
phénomène de ségrégation au niveau du chromo-
sorne.
1
-
On peut éqalement observer des recombinaisons des
facteurs
R
aboutissant à
un accroissement du nombre des résistances.
1
-
On a enfin mis en évidence des
incompatibilités
entre facteurs
R
et autres plasmides(par exemple facteurs
R incompatibles avec les
1
facteurs de fertilité
F).
1
-
Si le mécanisme de
transmission des résistances
est spécifique
de ce phénomène,
et si chaque séquence d'ADN BSt spécifique de la
1
résistance à
un antibiotique donné,
la possibilité de
transmission
n'est au contraire pas limitée
à
des bactéries de même espèce,
et
1
on peut observer de façon courante des transferts entre colibacilles
et salmonella,
entre colibacilles et vibrions~ 248,
19,
70,119)
1
3°_ ~éthodologie de mise en évidence des factsurs R.
------
1
-
Depuis la découverte des facteursR,
des
progrès ont été faits
dans l'étude des facteurs
de résistance:
1
-
Isolement par 'voie
physique (ul tracent:;:-i fugation)
de l'ADN plasmidique.
,- Mais aussi les
techniques classiques de
".
'..1-.
genel.J..qLl8
1
microbienre comme la conjugaison
ou la transduction.
~Jous y revien-
drons.
I
~ Gènes de réplication et de transfert ~ Génes de résistance GntiblotiqUo
(Iacteur de transfert des fonctions de
(déterminants de r)
(
.:.
résistanca.(FTR}
.'
facleurR
1
d1romosome t
tube de conjugaison
processus sexuel
1
Cellule porteuse
Unlo."1 III uno auIDl cellula
du facteur R
Ro;>!lCtltlon et trenafert cu fa.etour R
Après le transfert, rupturo (b
b
tube de conjug<:ison.
c!0UX cellulee cor,tenant Glen
chacullo \\s facteur R
1
1 ,g':~)Sl;ucturedu facte}!r R :les deux porions peuvent se dissocier, àcertaines c~nditions.'b) Diagramme illustrant la struc-
rt COllJuguec du facteur R. ~
•
,
1
1
1
1
1
1
"
1
../j .....,
, .
PRE r--1 1ER E
PAR
T l
E(~uite).
CHA
P I T R E
II.
ETUDE
EXPERIMENTALE
DES
SOUCHES.
Nous venons
de faire,
dans
ces.premières pages,
un bref rappel
permettant de situer le problème de la résistance
bactérienne
aux
antibiotiques.
Avant d'aborder l'explication du m~canisme de la résis-
tance
qui a
été observée
en
clinique chez nos souches,
nous
allons
.~
d'abord r~partir les souches selon leur origine, faire leur identifica-{:
tion biochimique mais
surtout effectuer des essais de sensibilitB
in
vitro.
Nous verrons ainsi les
trois
points suivants:
l
-
Oriqine et
répartition des souches.
II· -
Identification
biochimique des
soucheso
,,...
. ,
III
-
Essais de sensibilité;
antibioGrammes
e~ SU-LTFimlOOCr?:'l-
mes,
calcLl des
concentrations minimales
inhibitrices
des antibiotiaues
et
sulfamides.
, ')
l ,_
1- ORIGINE ET REPARTITION DES SOUCHES.
· f;
"
Comme dans
tout laboratoire de biologie médicale,
le
~.
-',
Service de Mr Le Pr DUCHENNE(H~~ital de Montfermeil) isole depuis
~"':
de nombreuses années des souches bactériennes résistantes aux
antibiotiques.
Les vingt souches que nous
étudions dans le pré-
sent travail font
partie du lot isolé
en Novembre
1971,
au cours
de diverses infections nosocomiales.
En majorité des Entérocacté-
ries,
ces souches provenaient de milieux
pathologiques variés
comme le montre le tableau suivant n01.
Tableau n01
,
Origine et répartition des souches.
Souches
Produits pathologiques
TC-:êil
Genre
Urines
Pus
Selles
SEmg
.
1
1
nterobacter
4
~.
!
-
-
-
...;
\\
1
1
1
~lebsiella
1
2
,
2
-
-
-
i
1
1
Proteus
9
\\
-
-
1
1
1 0
i
1
1
1
1
1
,
1
1
i
1
!
Pseudomonas
2
1
3
-
1
1
!
1
1
1
1
.
reromonas
1
-
-
1
-
!
i
1
l
1
1
;
i
.
,
1
!
20
1
Faial
16
2
1
1
1
1
1
\\
!.
Une souche de Citrobacter et une souche de
Proteus ont éti
1
écartées du lot du fait
de leur sensibilité aux antibiotiques étu-
diés.
1
1
1
,
,
, ~
1
1
1
II -
IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE
DES
SOUCHES.
Introduction:
Le biologiste dispose
généralement des m8thodes
1
sérologiques et biochimiques pour identifier les bactéries.
Les méthodes biochimiques classiques d'identification des
bactéries
1
sont codifiées par L. LE MINOR(
).
Il faut cependant
1 21
2dme~tre
que ces méthodes classiques sont encombrantes et par le nombre de
1
tubes
utilisés et par la préparation des
différents milieux.
Le
t8~~S
au bout duquel i l faut réunir tous les caract~res étudiés est relati-
1
vement long surtout pour l'urge~ce clinique.
~ous avons utilis2 ces
méthodes, mais aussi les microgaleries API
SYSTEM 20 ENTERDBACTERIA-
CEAE distribuées par l'Institut
Pasteur de
Paris.
Ces
1
mic~o921e~i~s
1
couramment utilisées depuis
un certain nomb~e d'années sont pratiques
à de
nombreux points de vue:
simplicité,
rapidité,
mais surtout
possibilité de lire une vingtaine de caract~res en tr~s peu de temps.
Nous avons
utilisé ces galeries
dont les résultats sont facilement
1
reproductibles et fid~les, identiques à
ceux obtenus par les méthQccs
classiques~figurE n02 page 14).
1
Le mode opér2toi~e
pour l'utilisation des miCrGgé~E'
rles est joint à l'emballage.
Nous l'avons SU~Vl. Les ~ésul-c2ts
•
.l-
ou ... 8- I
nus figurent dans les tableaux
n02
et nO]
pages
1 3
e.lc
1 5
Tableau n02,
Répa~tition des souches selon la prése~ce 1
et l'absence de la bêta -galactosidase
et de l'cxyoas8 o
Cxvdase
Bêta -
galactosidase
1 Aeromonas
:.;-
2 Klebsi-ella
1
positive
~ Enterobacter
10 Proteus
1
Bêta-galactosidase
3 Pseudomonas
négative
1
1
1
1
1
1
<
. ,
p:....
··--r·'·
'",,-./
' ' - - '
Figure n02 -
Recherche des caractères chimi~ues
(milieu de Kligler)
t
,~1_, 1
1
Tableau na 3, Répartition des souches par espèce.
1
roteus na 1, 2, 10
Proteus mirabilis
=
1
roteus na 3, 8
Proteus rettgeri
=
rote us na 4, 5, 6,
1
7, 9
Proteus morgani
=
1
eromonas
Aeromonas shigelloides
=
1
lebsiella n 0 1 , 2
Klebsiella pneumoniee
=
1
nterobacter na 1 , 2
=
Enterobacter aerogenes
1
nterobacter n 0 3,
=
Enterobacter cloaceae
1
.~fyl'
seudomonas n 0 1
Pseudomonas
=
eeroginosa
1
seudomonas n 0 2, 3
=
sans pigment
1
ara colon
=
Paracolon aerobacter.
1
1
1
1
1
1
1
1
"<~
1
;......,1.,_ ..•
16
En conclusion:
L'échantillonage que nous avons étudié est trop petit
pour parler de résultats statistiques valables.
Mais,
au vu de la
. littérature médicale on peut dire qu'il y a parallélisme avec les
souches isolées depuis un certains nombre d'années.
Ainsi les Proteus
considérés hier comme des bactéries rares en ~linique pr§dominent
à l'heure actuelle dans de nombreuses infections nosocomiales.
Un autre point· que l'on peut signaler en considérant
nos souches, c'est l'origine urinaire de la majorité des bactéries
résistantes.
Cela s'explique par la pression de s§lection exerc§e
par les antibiotiques
qui atteignent des
concentrations élevées
dans les urines.
· ..~
"";
Iii
(,"
.:.~
!Th
tfJ
!it~
i'J
~(
';'.
:~5:
..
.'
",:-
te
1 y
..
"';i\\'
·;f.·,~ {'lé:
,
!;'
.t:'
:;: i",.
1
~; "
1
111- EPREUVES DE SENSIBILITE: ANTIBIOTYPES DES SOUCHES.
1
Introduction:
i
1
L'exploration de la sensibilité d'une bacté-
r~e aux antibiotiques comporte des essais à l'antibiogramme et
1
surtout la recherche de la concentration minimale inhibitrice
(CMI)
ou taux inhibiteur qui a toute son importance en clinique.
1
Nous avons réaliSÉ ces essais par la méthode des disques selon
CHABBERT pour l'antibiogramme,par la microméthode de SCAVIZZI et
Coll.
pour le calcul des CMI.
1
1
a)- Les antibiogrammes et sulfamidogrammes.
1
Il est bien entendu superflu
de décrire la
méthode des disques de Y.A. CHABBERT généralement utilisée dans
tout laboratoire de biologie clinique. D'autre part, les labora-
1
toires fournisseurs de disques joignent à l'emballage la méthodo-
logie à suivre. Le milieu et les disques utilisés dans notre tra-
1
vail ont été fournis par les Laboratoires BD MERIEUX.
On ne doit cependant pas oublier que la métho-I
de des disques a été établie au prix de nombreux travaux. En effet,
déjà en 1887, CARRE étudiait la diffusion des antibactériens dans
1
la gélose. Ces travaux ont été p~r la suite continués par DOEH~E
en 1889, GRATIA en 1925, FLEMING en 1929, HEATLEY en 1941
et 1944'1
Le père de l'antibiogramme est en fait GARROD qui le premier utili-
sa la technique des cupules en gélos~ en 1944. Mai~ la méthode des
disques est due à MORLEY en 1945.
1
Divers auteurs comme CHAEEERT ont amélioré
la méthode des disques qui en France est connue sous son nom.
1
L'Organisation Mondiale de la Santé et des bactériologistes comme
KIRBY, BAUER ont contribué à la réglémentation sur la préparation
1
des milieux de base pour l'antibiogramme afin de standardiser cette
t e c h n i que. E, n' e f f et, d a 1;1 sun ,t est des e ns i b i l i t é, lem i lie u ut i lis él
le pH,
l'inoculum, le temps de lecture,
le proo6dé de lecture,
sont autant d'éléments qui ont chacun sa valeur, son importance.
1
1
Le milieu
utilisé a
été le
milieu de
MUELLER-HINTDN dont
la formule
est la suivante:
Infusion de viande de boeuf dégraissé ••••• 300,
OOg
Hydrolysat acide de caséine •••••••••••••••
17, 50g
Amidon s o l u b l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1, 50g
Agar agar soluble •••••••••••••••••••••••••
17, 50g
Eau distillée •••••••••••••••••••••••••••• 1000
ml
Mis au
point en 1941
par MUrLLER et HINTON,
ce milieu était
initialement destiné à l'isolement des méningocoques et gonocoques,
mais de
plus en
~lus, on s'est aperçu qu'il donne
les meilleurs
résultats
pour les antibiogrammes et sulfamidogrammes.
Les disques ont été choisis en fonction des
germes,
en te-
nant compte de leur résistance naturelle,
des
spectres
théoriques
des antibiotiques.
Ils sont mentionnés dans
le
tableau suivant:
Tableau n04
,
Disques choisis pour les antibiogrammes.
1°
Familles
Antibiotiques
Disques choisis
Symboles
Bêtalactamines
Ampicillines
A
-----------------------------------------------------
Streptomycines
S
Kanamycine
K
Aminosides
1
Gentamycine
G
1
-----------------------------------------------------
Antibiotiques à
structure d'acides
Chloramphénicol
C
aminés
----------------------------------------------------- -------------
Tétracyclines
Dé~éthylchlorté
(résistance croisée).
.' tracyclines
T
1
2°
Sulfamides
Sulfathiazol
Su
(résistance croisée)
1
b)- Calcul des concentrations minimales inhibitr.ices.
1
1
Introduction:
1
La concentration minimale inhibitrice ou taux
inhibiteur d'un antibiotique ou sulfamide ou encore taux de sensi-
bilité d'une souche bactérienne
1
est une valeur très importante en
clinique.
Si sa valeur e~t basse, dans la majorité des casl
on peut atteindre le germe in vivo. Mais si sa valeur est élevée,
l'échec thérapeutique est presque certain.
Il est donc interessant 1
de calculer cette valeur.
Les résultats obtenus par antibiogramme
ne sont qu'une simple indication.
1
Méthodologie de calcul des CMI:
Pour l'urgence clinique,
c'est généralement la 1
méthode utilisant la courbe de conco~dance établie par Y.A.
CHABBERi
en fonction des diamètres obtenus par antibiogramme que l'on u t i l i s l
Mais cette méthode n'est pas valable pour des molécules d'antibibti-1
ques diffusant mal dans la gélosel55)
La microméthode de SCAVIZZI et Coll.
est avanta
geuse à ce point de vue et convient à un
travail de recherche.
pourl
nos souches anaérobies et aéro-anaérobies,
nous avons utilisé cette
méthode(
169
). Le Pseudomonas,
aérobie strict a ~é étudié par
la méthode de Y.A. CHABBERT.
La microméthode de SCAVIZZI et Coll.
1
est en plus fidèle,
facilement reproduc~ible.
1
Les résultats des essais de sensibilité sont donnés dans les
pages suivantes:
1
1
1
1
1
1
18
';;--1
ft"'uQCG- :iP.sVUCQ ,i14i4tZi§ii!i, lA$!,=.acQX '-,
~?~- _.-
_ _ _ _ _ _
'."~. '-,,-.-....,,'. .... ..... -- .."..''--" '."
- ~ _ ,
-..~.
"
- u
.,
•• ~ _. •
_
_
. _ .
~"
Figure nO 3 -
Calcul des [MI; Technique de SCAVIZZI
et [011. in 169.
1
1
1
RESULTATS
DES
ESSAIS DE SENSIBILITE.
1
1
1°_Quand on étudie la sensibilité des bactéries,
i l est intéres-
sant d'établir les antibiotypes des souches. Le mot antibiotype veut
dire séquence ou ensemble des caractères exprimés par une bactérie.
1
En épidémiologie,
i l est indispensable d'établir les antibiotypes des
souches résistantes.
1
1
Si l'on examine le tableau nO 4
page
20
" on voit que le
groupement complet des résistances aux cinq familles d'agents chimio- 1
thérapiques utilisés
c'est-à-dire:
aminosides(S,
K,
G,)
bêta lactamines(A)
'- tétracyclines (T)
1
groupe du chloramphénicol(C)
-
sulfamides(Su),
se trouve:·
'1
17 fois sur 20,
soit 7 fois sur 10 chez les Proteus,
2 fois sur 2
chez les Klebsiella, 4 fois sur 4 chez les Enterobacter,
1 fois chez
1
Aeromonas,
3 fois chez les Pseudomonas sur trois.
Si l'on examine dans le même tableau n04,
la fréquence de
1
chaque caractère, on voit:
1
-
G(Gentamycine)
est présent 3 fois sur 20,
donc
1
absent 17 fois.
Cet antibiotique a mieux agit que les autres.
-
T(Tétracycline)
et Su(sulfamide)
sont présents 20
fois sur 20.
1
Ils sont aussi toujours associés.
-
A(ampicilline),
S(Streptomycine), C(Chloramphénicol) 1
sont présents successivement 19, 18,
18 fois sur 20.
A est toujours
associé à C.
1
1
1
1
1
.-~."
"n:
•.:§
;~"~
:;"~
.',
7;'''
"
2°_
Si l'on compare les aminosides étudiées,
i l n'
y a
pas
de résistance
croisée absolue;
S(Streptomycine) apparaît
six fois
seule sans les autres aminosides ni K ni G.
3°_
Les [MI
les plus élevées sont obtenues avec les sulfa-
mides et les Tétracyclines,
comme le montre le tableau nO
6 page22.
Tableau nO 4,
Fréquences des différents antibiotypes des
souches sauvages
et fréquence de chaque caractères •
.
.
.
.
.
li)
~
"IJ
E
+'
.a
Q)
:J
0
ri
Antibiotypes
0
Q)
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~
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C
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::.:::
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0
1-
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-
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1
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1
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-
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1
A
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T
Su
1
-
-
-
-
1
G
T
Su
1
-
-
-
-
1
Total
19
1 8
1 2
3
1 8
20
20
10
2
4
3
1
20
1 ....
:~:-;1"'~
/
/
1
1
•
' /
A = Ampicilline, S = Streptomycine, K = Kanamycine,~Œ = Oh+oramphÉ
J
1
"-,~ ,
nicol,
T = Té tracycline, Su = sul famides.
Prot.
= Pro~'eüd'! Klebs'; =
1
\\.~~" ',~
.-~/.. 102'-");})
Klebsiella,
Ente = Enterobacter,
Pseud.
=. Pseudomonas 01~~~YAeromOQaE
1
I~~~
I l~)""-:-_.A
1 \\
21 1
Tableau nO 5,
Les antibiotypes des souches.
1
1
Souches
A n t
~ b ~. 0 t Y P e s
A
S
K
G
c
1
T
Su
1
Proteus n01
G
T
Su
2
A
S
G
C
T
Su
1
3
A
S
T
Su
4
A
,~
C
T
Su
5
1
A
S
K
C
T
Su
6
A
S
K
C
T
Su
7
A
1
S
C
T
Su
8
A
C
T
Su
9
A
S
C
T
Su
1
10
A
S
C
T
Su
1
Pseudomonas
n01
A
S
K
G
c
T
Su
2
A
S
K
c
T
Su
1
3
A
S
K
c
T
Su
1
Aeromonas
A
S
K
c
T
Su
1
KLebsiella nO
1
A
S
K
c
T
Su
1
2
A
S
K
c
T
Su
Enterobacter
1
A
S
K
C
T
Su
2
1
A
S
K
C
T
Su
3
A
S
K
C-
T
Su
Para colon
A
S
K
C
T
Su
1
1
'"
1
1
1
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L'
ENTRETIEN
nfS
SDLJCHtS.
Tout au
long de
nos travaux,
les souches ont
~t~ TE~:
qu~es toutes les quinzain~s en touches sur de la g~lose nutritive
et bouillon ordinaire.
Ces milieux dont les formules
sont donr~~s
ci -
dessous
ont
~t~ prépar~s selon la technique d~crite par
CASSAGNE
~n Technique de base Institut Pasteur 1961.
Formule
du
bouillon.
i
Extrait de
viande Liebig • • . . . . . . . . . . . . . . . . 5g
Peptone
209
Chlorure de
sodium .."
5g
Eau distill~e qsp
1000ml
Formule de
la
g~lose.
Gélose
1 3g
Bouillon nutritif(ci-haut)
500ml
1
1
DEUXIEME
PAR T l
E.
1
Cette deuxième partie va nous permettre de chercher la natu1l
de la résistance que nous venons d'observer. Comme nous l'avons vu
dans la litt~rature, depuis une douzaine d'années, des résultats
intéressants ont été accumulés dans l'étude des plasmides(64,48).
1
Certains de ces résultats sont acquis mais d'a ut r e s son t l' 0 b j e. t d ~
controverses entre les différentes ~coles( 48). Avant d'aborder noil
travail expérimental, i l est intéressant de rappelier brièvement
ces notions acquises par divers auteurs:
méthodologie d'étude des
1
plasmides, m~canisme d'action des 2plés~id~6u~ssur les antibioti-
ques.
Cette deuxième partie comprend:
1
Introduction: quelques rappels sur la conjugaison des
facteurs R.
1
Chapitre l
-
ConjugAison:
milieu liquide.
1
cellophane
Chapitre II
Essais de guérison par l'éthidium.
1
Chapitre III -
Essais de guérison spontanée.
1
Chapitre IV
Résultats par souche en tenant compte de
l'ensemble de tous les essais.
1
Conclusion générale sur ces essais: mécanisll
biochimique.
l
·.,'
Chapitre V
Analyse des conjugués,
fréquences de trans- 1
fert,
essais sur le nombre de plasmides.
1
1
1
1
1
l ~nR ODUC TION:
a)- Rappels sur le transfert des facteurs R par conjugaison.
La découverte de
LEDERBERG et TATUM,
en 1946, la conjugaison
bactérienne/trouve son application la plus intéressante dans l'étude
du transfert de la résistance aux antibiotiques.
Il est généralement admis que les
plasmides ou facteurs R se
rapprochent tant du point de vue génétique que du point de vue fonc-
tionnel du facteur sexuel F d'éschérichia
coli(
91,78
).
Les facteurs R induisent la conjugaison
qui ressemble en tout
point
à celle induite par le facteur sexuel F.
Dans les généralités
que
nous avons vues dans la première
partie,
nous avons défini'
et
donné
les propriétés des facteurs
R.
Une de leu~ propriétés, condi-
tion sine qua non de leur existence,
est leur autonomie de réplica-
tion.
On peut ainsi résumer schématiquement la cinétique de la conju-
gaison de la façon suivante:
la cellule donatrice résistante por-
teuse
du facteur R s'unit à une cellule réceptrice non
porteuse de
facteurs
R,
sensible,
par un tube de conjugaison comme le montre la
figure 4
page
26
• Le facteur
R se réplique de manière autono-
me et est transmis à la cellule réceptrice.
Après le transfert,
rupture du tube de conjugaison,
deux cellules por~euses de facteurs R
commJe le montre la figure n01
page
10.
b)- Problèmes
méthodologiques
dans le trarisfert in vitro par
conjugaison.
1
La première technique de transfert
par conjugaison fut décri-
te en 1961
par WATANABE et FUKASAWA(
197
). Depuis leur public~~
tion,
divers auteurs ont imité cette technique!
18,59, 119
).
Ce qui ressort de la littérature c'est la grande
part d'empirisme
dans la technique:
la mpthodologie varie d'auteur à
auteur et Y.A.
CHABBERT déplorait cet empirisme(
59'
).
/{; 1
1
Bactérie résistante hébergeant un ou plusieurs plasmides.
1
1
1
Chromosome bactérien.
1
Plasmide ou facteur R
1
Copie de plasmide en
cours de transfert.
1
Tube de connexipn.
1
1
Plasmide acquis
1
1
1
Bactérie sensible acquerant la résistance.
"
'.
1
'.
;'"
Figure
4 -
Schéma très simplifié représen-
tant
la thèse la plus couramment admise sur le transfert pli
conjugaison des facteurs cytoplasmiques.
1
1
1
1
1
J~ ..",.
1
1
27
. ,
.,
c)- Autres techniques d'étude des facteurs R.
Résultats obtenus •
.;
Outre la conjugaison bactérienne et la transduction, on peut
étudier les facteurs R par des méthodes physiques comme l'ultracen-
trifugation. Cette technique sépare par gradient de densité, l'ADN
chromosomique de l'ADN plasmidique(
175,48).
Ces techniques ont permis de connaitre des points intéres-
sants concernant les plasmides:
1°_ le poids moléculaire des plasmides varie entre 30 à
2°_ ADLER et Coll. ont pu isoler des plasmides à partir
des"minicells" ( 4, 5
).
3°_ encore plus intéressant, COHEN et Coll.ont pu mettre
-....
en évidence
les différentes formes sous lesquelles on peut trou-
ver
l'ADN plasmidiqure: forme l, forme II, caténanes( 66,"67).
4°_ on a pu établir les cartes de certains facteurs R:
le facteur R 222 par WATANABE, la pénicillinase P 258 par NOVICK
et EOUANCHAUD( 48,137,213
l.
5° enfin, d'autres résultats, apparemment contradictoires
ont été acquis par les deux écoles, japonaise et anglaise: certains
points sont partiellement expliqués. EOUANCHAUD résume ces résul-
tats in
48
Le mécanisme biochimique d'action des plasmides a été
étudié pour plusieurs antibiotiques. Nous allons tenter de résumer
ces faits dans les pages qui vont suivre.
1
1
1
•
f . .,
:~.;.';
1 je',
,.'.
..';
MECANISME D'ACTION DES PLASMIDES SUR LES MOLECULES
! :.',
DES ANTIBIOTIQUES.
il
Ji'1:
Que la résistance s'installe par mutation ou par trans-
IlIl
fert,
la bactérie acquiert la propriété d'élabo~er des enzymes
Il
qui vont inactiver la molécule d'antibiotique.
Comme le montre
ill'
la figure
nO
5 page
29
, on connai t
sur certaines molécules
ii
les points précis d'action des enzymes élaborés par les bacté-
II
l'
ries résistantes.
Nous résumons brièvement certains résulaats
l!
acquis par divers auteurs.
1
il
il
1°_ Cas des Sulfamides et des tétracyclines.
1
H
L'existence d'une résistance transmissible à ces produits
a été observée lors des premières épidémies de dysentérie qui
ont permis de découvrir la résistance transférable ( 197,.. '248
).
1
j,
Le mécanisme biochimique de leur action est peu connu.
On pense
seulement que les bactéries hébergeant des facteurs R e~ résis-
1
i
tantes à ces produits sont imperméables à leur pénét~ation
1
173, 249,
147
) .
':1
li
2°_ Cas des pénicillines et des céphalosporines.
1
1
1
1
D'après DATTA, à une exception près,
la résistance aux
pénicillines et aux céphalosporines est due à des bêta-lactama-
1
ses qyi
inactivent ces antibiotiques en scindant le cycle bêta-I
lactame(
75,249). L'ampicilline
et la carbénicilline sont
'
.
aussi inactivées par le même mécanisme'
~ )
249,177
.
..
1
30 -
Cas du chloramphénicol' 173,
249
) .
1
La résistance transférable à cet antibiotique fut décou-
verte pour la première fois au Japon( 197,249
).
Actuellement
1
on la rencontre couramment dans de nombreux pays. L'action des
1
facteurs R'
sur la molécule du chloramphénicol est assurée par
t l
la transacétylase qui acétyle les groupes hydroxyles de la molé-
cule comme le montre la figure 5 page
29
1
1
2 "
Q CH,
ACONH-j-("
.
ACONH n:~CH'
.
.LL
C H , -
N
CH.
0'
COOH
0 ' 'o~
COOH
A.lnacllvalion de la pénicilline
a.lnactlvatlon de la céphaIosporInct
"
":·1",
.'.....
1
1
1
1
1
30
1
1
1
4°_ Cas des aminoglycosides.
1
La streptomycine,
la néomycine,
la kanamycine sont
inactivées par les enzymes phosphorylants communément présents
chez les bacilles pyocyaniques.
On connaît aussi des enzymes
1
qui inactivent la gentamycine. Les antibiotiques modifiés sont
inactifs parce qu'ils ne peuvent plus se lier aux ribosomes
1
d'après YAMADA et Coll.(
249
).
Le tableau n08 suivant
présente les différents enzymes inactivant les aminoglycosides.
1
1
Tableau 8:
Inactivation enzymatique des
aminoglycosides.
in 249
Enzyme
Mécanisme d'inactivation
Mode de
résistance
1
Streptomycine phospho
Phosphorylation du cycle
1
Streptomyci-
transférase
L-glucosamine
ne
1
Streptomycine adényla-
Adénylation du cycle
1
Streptomycine
te synthétase
L-glucosamine
Spectinomyci-
ne.
1
Kanamycine-acétyle
Acétylation du cycle
Kanamycine A
~ )j
~ "
f,'
.
;-;~
~.
transférase
D-glucosamine
(faible résis-I
~,
tance aux au-
tres sUbstratsl
Néomycine/Kanamycine
Phosphorylation de la
Néomycine
D-glucosaminè
Kanamycine
1
phospho-transférase
1
Paromomycine
Gentamycine-adénylate
Adénylation du cycle
Gentamycine
synthétase
glucosamine.
Kanamycine
1
Gentamycine-acétyle
Adénylation du cycle
Gentamycine
1
transférase
désoxystreptamine
1
1
31
5°_ Cas des macrolides,
des lincosamides.
Les macrolidesCérythromycine,
triacétyl-oléando8ycine)
et les lincosamidesClincomycine et clindamycine sont inacti-
vées
par un enzyme de méthylation
qui modifie les ribosomes
bactériens de manière que l'érythromycine
et la lincomycine
ne peuvent plus s'y lier et ne
peuvent plus exercer leur
action inhibitrice d'après LAI
et WEI5BLUM(
249
).
6°_ Par contre,
pas de facteurs
R pour les aoents
antimicrobiens suivants:
acide nalidixique,
nitrofuranes,
ri famycines.
On adme t
que le::. .rés is ta nc e:
à ce s
produi ts
survient après un traitement prolongé par mutation.
En conclusion,
tous ces mécanismes montrent que la
résistance bactérienne peut un jour causer un problème sérieu>
et engage le praticien à manier les antibiotiques avec discer-
nement,
notamment en pratique générale •
., .
:,~
Dans les pages qui vont suivre,
nous allons tenter
d'expliquer la résistance obse~vée chez nos souches.
~~
~t:
1
1
1
1
1
32
1
1
1
CHA PIT R E l .
ESSAIS DE TRANSFERT DE LA RESISTANCE EN MILIEU LIqUIDE ET SUR
1
MEMBRA~E
DE CELLOPHANE.
1
1 - ESSAIS DE TRANSFERT DE LA RESISTANCE PAR CONJUGAISON EN
1
MILIEU LIqUIDE.
1
1- Principe de la méthode:
1
1
La technique utilisée est basée sur le principe suivant:
Les bactéries donatrices(résistantes)
et les bactéries
réceptri-
ces(sensibles)
sont mélangées in vitro en phase exponentielle termina-I
le.
Après dix huit
1
heures de contact,
à une température convenable,
-,
le mélange est dilué et ensuite étalé sur les milieux contenant le ou
. ..j
<
les antibactériens à
étudier.
1
2- Matériel;
1
a)- Le matériel comporte essentiellement:
1
des boites de Pétri de 10 cm d~ diamètre en plastique ou en verre.
}
-
un milieu solide gélosé convenable;
nous avons utilisé la gélose
1
• 1
lactosée au bromocrésol pourpre dont la formule sera donnée plus
loin.
1
-
des solutions d'antibiotiques
-
de l'eau stérile pour les dilutions.
1
des pipettes de 1 et 10ml
-
des carrés de velours de 15 X 15 cm
-
des tampons de velours en bois
1
-
des souches donatrices et réceptrices en bouillon de 18 heures.
1
1
1
33
b)- Obtention des
tampons
de velours.
Nous les avons fabriqués
nous-mêmes,
en
utilisant du bois.
Il suffit
pour nos boîtes de
Pétri utilisées,
de
tailler dans du bois un cylin·
dre
de 2 cm de haut sur 8 cm de di:arr:'.~:~;r,~.• ,Fixer. au centre un-manche
en bois de 10 cm de long sur 2 de diam~tre~ Ces'dimensions permetten
une fois
le tampon recouvert de son velours,
de
transporter aisément
les
bactéries sans frottement
sur les
parois de
la boîte de Pétri.
c)- Choix et stérilisation du velours.
Il faut choisir ilies velours
non colorés
car les colorants industrie:
genre aniline sont toxiques
pour les
bactéries.
Pour les dimensions
de nos
tampons,
nous avons
découpé
des. carrÉs de velours
de 15 X 15
cm.
Les velours ont été fixés
au tampon
par des bracelets en eaou-
tchouc.
La meilleure stérilisation des
velours
n'a été obtenue qu'à
l'autoclave à 120°C pedabt
trente minutes.
Nous
les avons stérilisé,
' "i
aux rayons ultraviolets mais ce
procédé n'a
pas
été efficace.
d)- Le milieu gélosé
utilisé:
gélose
lectosée au bromocrésol
pourpre.
Sa formule
est celle donnée par CASSAGNE
in Technique de
base
, ',~~,
Institut Pasteur 1961.
. ;
1
Peptone pancréatique de viande
5 B • • . • • . . . . . . . 20g
Gélose
;
20g
1
Eau distillée • • • • • . . • • . . . . . . . . . . . . . • . . . . . • .
1000ml
Ajuster le pH avec NaoH à 7,3.
Précipiter ce mélange à 120°C à l'au-
1
toclave pendant trente minutes
et ensuite
au liquide bouillant,
ajouter:
Lactose
10g
1
Eromocrésol pourpre . • • . . • . . • • . . • • • • • . . . • . • . • . . • 0,025g
Réparti à raison de
18 ml en
tubes
de
20 X 2COmm,
pour des
raisons
:;;
techniques.
Ce milieu a
été stérilisé à 110°C et conservé à l'abri
j
de la lumière.
./'.,., 1
1
1
e)- Le milieu liquide du mélange des souches.
1
Un milieu liquide pour le transfert de la résistance
doit répondre à certaines conditions: rich~sse en source de~~ar-I
b 0 ne no t amme nt. En effet,
"'Wl~o~;;;bii}l,ti;fif%Q,':,J.:;r-&$ie,~;b,·~-l:;,·~wste··
Ur'i
.,.,!,,..~i~~J'Il,~~~~~.,
UnwmiJdteu~nauv. te, '4commêJrirli:8
'iol.
-1~s 01u.ti:on4Js a l-i~n,e~Jàl';\\~9?p'~1:l!;;;lO 00 .~t.~be:s\\",c0 l:ld'i:-I
~)~~~: al.~~ .s.,~,.i~ ~~..I\\n:~.Pi">;wt';.œrpi~;:t....."...~...'~ .~~..~. ·"~,4J~;\\,".'t\\'ol;~.:_'1't~"'·~·:"~·N{"'~~:f~~\\~I~J'>'''$~.'~i~.;.;:, <.:~)}.w;4\\- ;~~.r~il:,R~~t~~~j~j.1~SWj~tj}~}'':!''e~I;(r...~'
tions anaérobies ne conviennent pas au transfert.
Ces observatio
avaient été faites très tôt en 1961 par EGAWA et Coll.(
82,2d~
Ils avaient montré que le transfert de la résistance nécessite
une certaine énergie qui est fournie par phosphorylation oxyda ti-
ve.
1
Nos essais en solution saline à 9 p.
1 000 ne donnèrent
aucun résultat interprétable. Nous avons utilisé le milieu
1
bouillon coeur'cervelle des Laboratoires BD MERIEUX. La formule
de ce milieu est la suivante:
1
,
1
'f'
Infusion de coeur de veau ..••••• 200g
'.t
Infusion de coeur de boeuf ••...• 250g
;
Peptone(gélysate) • . . . . . . . . . . . . . . . 10g
1
Chlorure de sddium . . . . • . . . . . . . . . . . 5g
Phosphate disodique . . . • . . . . . . . . . . • 2,5g
1
Glucose
~
29
1
Ce milieu, livré en poudre a été dissous à raison de
37 9 par litre d'eau distillée, réparti en tubes de 20 X 200 mm'I
à raison de 10 ml par tube et stérilisé 20 minutes à 120 0 C à
l'autoclave. Quand il n'a pas été utilisé le jour même de sa pré-
paration, ce milieu a été d'abord porté au bain -marie bouillantl
pendant vingt minutes.
1
1
1
1
1
f)- Les antibiotigues utilisés.
Quand on effectue un essai,
i l faut
utiliser les formes
injectables car les comprimés,
les dragées contenant des exci-
pients ne sont pas valables. , _ , '
.~.
, ,
'\\;
Antibiotigues
Laboratoires
Kanamycine A
Bristol(France)
Streptomycine(Sulfate)
Diamant(France)
Gentamycine C
Unilabo(France)
Ampicilline
Delagrange(France)
Chloramphénicol
Roger Bellon(France)
Tétracyclines
Pfizer-Clin
(France)
Sulfamides
<
''.,
f..~
.. ');
Solumédine
Spécia(France).
)"
j
~,,
.~
g)- Les souches réceptrices.
~
1
On ne peut pas prendre n'importe quelle souche commerécE
trice.
Nous avons,
dans un premier temps
utilisé diverses Entér
1
bactéries de notre collection de Laboratoire mais les résultats
étaient vains.
1
Nous
savons qu'une souche doit être notamment F-,
c'est-
dire sans,facteur sexuel car la présence
de ce facteur peut dirr
1
nuer considérablement la fréquence de transfert'
248~197
).
Nous avons utilisé des souches de Colibacille de l'Institut Pa~
teur,
rendues résistantes à
l'acide nalidixi~ue et à l'azoture
1
de sodium(azide)
pour des raisons techniques,
sur gradient de
SZYBALSKI(
176
).
1
1
-,
1 "<'Ç,
1
3)- Méthode.
1
Notre méthode comporte 5 temps essentiels:
1
-
Technique de culture.
Les conditions de conjugaison.
-
la sélection des clones tran·~",il.~~"
-~~:~\\iir,I}'~"~~Q,~~~_~~E&~~~:iO~~~.îI.~~i1S~_~~~
1
-
L'analyse des conjugués.
1
a)- Technigue de culture.
1
Les souches résistantes{donatrices) et.la souche de COlil
bacille sensible aux antibiotiques{réceptrice),
ont été mises à
incuber dans 10 ml de bouillon coeur cervelle à l'étuve à 37°C
1
pendant 18 heures. La tempéràture de 37°C convient à toutes les
souches à étudier et au colibacille. Les tubes dans lesquels se 1
faisaient les mélanges avaient pour dimensions 20 X 200mm. Cette
incubation se faisait sans agitation.
1
Apr~s ces 18 heures, les cultures étaient diluées ensui-
1
te au 1/50 en bouillon coeur cerve~le dont la stérilité était
contrôlée une nuit à
37°C.
Pour diluer ainsi une culture au 1/50~
1
0,2 ml de la culture était ajoumé à 9,8 ml de bouillon stérile.
Ces cultures dilUées ont été ensuite incubées exacte-
ment six heures à
37°C,
à l'étuue.
Dans ces conditions,
apr~s cel
délai de six heures,
les cultures 'sont en phase exponentielle
1
terminale. A ce moment,
on peut compter le nombre de bactéries
donatrices qu'on va mélanger à la culture réc~ptr{ce. Nous avons1
fait ces numérations en inclusion en gélose et en surface. Le
nombre de bactéries donatrices ainsi obtenG: permet de calculer
la fréquence de transfert par rapport au donneur( 48,175
).
1
1
1
1
; f
b)- Les conditions de conjugaison.
Nous nous sommes inspirés des conditions décrites par
WATANAEE et FUKASAWA(
197
).
Les cultures, préc éd emm~'9tt4~~'1~)-,~}~.~,~:,»e8f~bouil)_on'd e's']~~-R'qshe
dOl)a;trice~i.,e:t'réceptrice,. ont été mélangées ,dans lefr,:.rapport de
1/5, cela veut dire que 1 ml de la sou'che donatrice et 5 ml de
la souche réceptrice étaient mélangés. Le mélange a été ensuite
incubé 18 heures à 37°[ à l'étuve,sans agitation.
On comprend aisément pourquoi on peut ainsi mettre moin
de bactéries donatrices~ En effet, le facteur R qui se répliquE
indépendemment du chromosome et d'une manière rapide peut se
répandre de manière épidémique.
c)- La sélection des clones transférés.
Quand on étudie le transfert de la résistance aux antibi
tiques par conjugaison, i l faut disposer de marqueurs fid~les
pour distinguer la souche réceptrice de la souche donatrice.
Deux catégories de marqueurs sont généralement employées
-
Un marqueur biochimique comme l~ fermentation de lactose;
WATANAEE avait dans sa première technique utilisé ce marqueur
t 9-7 ;'.
) •
La résistance chromosomique de la souche réceptrice à un pro
duit chimique auquel la bactérie donatrice doit être sensible
pour être éliminée
lors de la sélection.
Pour notre part,
nous avons utilisé ces deux méthodes,
selon les cas.
Nous avons procédé ainsi:
1°_
Cas où la fermentation du lactose a été utilisée
Nous avons utilisé ce cas pour les souches de Proteus et
de Pseudomonas qui sont ~outes bêta-galactosidase négative. Not
",;-
colibacille utilisé comme souche réceptrice fermente le lactose
en moins de 24 heures.
··,·1
,~ { 1
1
1
Bien entendu,
pour obtenir des résultats interprétables,
i l faut
prendre soin
de diluer convenablement le mélange des souches
1
donatrice et réceptrice.
Nous avons fait des dilutions à
10- 7
8
9
10
10-
10-
,
10-
et 0,1 Oml ont été inoculés sur le milieugélosl
et ensemencé par étalement au rateau.
Dans cette technique,·;
i l
1
faut travailler de manière à
obtenir un nombre total maximum de
200 bactéries car au-dessus
de ce nombre,
toute la gélose est dé~
colorée et la distinction des souches s'avère difficile.
1
2°_ Cas où la résistance chromosomigue de ln souche
récel
ptrice à un produit a
été utilisée comme margueur.
1
Deux mutants rendus résistants l'un l'azoture de
sodium
à 250 mcg/ml et l'autre à
l'acide nalidixique à
50 mcg/ml,
ont
été utilisés.
1
En incorporant l ' azid.e de sodium ou l'acide nalidiXiqUel
selon le cas,
à la gélose à laquelle est incorporé l'antibioti-
que à
étudier,
seules les bactéries réceptrices ayant acquis le
caractère étudié se dévéloppent, mais les bactéries donatrices
1
et les réceptrices n'ayant pas acquis le caractère sont tillées.
Dans
notre essai,
le mélange des souches a
~.été dilué
1
6
de 10 en 10 jusqu'à 10- •
Un volume de O,10ml des dilutions à
10- 3 et 10-6 cèt été inoculé
sur les bottes contenant les
1
produits à étudier et étalé au rateau.
1
Les témoins indispensables.
Les souches donatrices et réceptrices seules
étaient
1
aussi diluées et ensemencées sur les milieux contenant l ' a n t i b i l
tique à
étudier,
à titre de
témoins.
La souche réceptrice seule
doit obligatoirement être sensible car dans le cas contraire,
l'essai n'a aucune valeur.
1
1
1
1
d)- La préparation des boîtes:
incorporation doc antit:c'
gues à la oélose.
1°_ Les solutions-mères des antibiotigues.
Un exemple de solution-mère:
En mettant une poudre de Streptomycine sans excipient à
raison de
gramme dans de l'eau distillée q.s.p 10 ml,
on a
unE
solution titrant 100 000 microgrammes par millilitre.
Dans tous
les cas,
nous avons respecté les titres indiqués par les laborat
res fournisseurs des antibiotiques.
2°_ L'incorpo~ation des solutions d'antibiotiques à 12
gélose.
Les dilutions étaient d'abord faites
en eau distillée sté·
rile mais les dilutions finales étaient obtenues directement
dans de la gélose fondue au bain-marie et refroidie à 4S -
SooC
c'est-à-dire grossièrement la température à
laquelle on tient un
tube sans se brûler.
Exemples de dilution en gélose.
J.
:,
-
Ampicilline à
200 mcg/ml
+
gélose fondue
Concentration
finale
1
2 ml
18 ml
20 mcg/ml
d'ampicilline.
1
1
-Ampicilline 200mcg/ml
+
Azide de Na
+ gélose
Concentration
fondue
finale
1
2ml
16 ml
d'ampicillinc
1 '1·~:1
. ,<
1~ '~'1l~,L,
1
40 1
1
1
Sur le même modèle,
les concentrations finales suivantes ont
été utilisées:
1
1
Antibiotigues
Concentrations en mcg/ml
1
Ampicilline
20·
Streptomycine
12,50
1
Kanamycine
20
Chloramphénicol
20
1
Tétracycline
20
Solumédine
20
1
1
e)- Analyse des conjugués obtenus.
1
Les colonies ont été répérées selon le marqueur ~tiliSI'
et numérées.
Cinq colonies ont été ensuite prélevées et ~ncu-
bées en bouillon coeur cervelle pour faire des essais de senSi-.
bilité:
par antibiogramme par la méthode des disques;
-
par la méthode des répliques qui consiste à transporil
ter des bactéries à l'aide d'un tampon de velours,
d'une boîte 1
sans antibiotique sur des milieux contenant les antibiotiques
à étudier.
Pour bien réussir une.réplique,
brosser les poils du
1
velours avant stérilisation,
partir d'une boîte contenant des 1
colonies ~ien séparées,par exemple en diluant le mélange à
8
10- et inoculant 0,10 ml de cette dilution, on obtient des
colonies bien séparées.
1
1
La souche réceptrice seule, c'est-à-dire non mé12ngée
a été incubée dans les mêmes conditions.
Ses antibiogrammes et
répliques ont été aussi réalisés à titre dè témoins.
Enfin,
nouS avons aussi examiné les caractères biochimil
ques des~conjugués avant et après mélange.
1
.~
·'1'
Souche
.',
i
donatrice ré-
(
Souche réceptrice
sensible
sistante
îO- Incubation
bouillon riche.
( 1 8 heu re s )
11°_ Dilution en
bouillon riche au
1/100 et incubation
6heures(phase exponr
tielle terminale).
111°_ Mélange: 1/4.
Conjugaison.
Contact 18 heures.
\\ 1
\\ 1
\\ ,
1
1
Témoin de ré-
Témoin de
sistance.
.
sensibilité
(donatrice
V
avant mélange.
(réce trice)
IV. Sélection des
Mél nge
clones, analyse des
conjugués.
-sur sélecteurs
-
antibiogramme
-témoin sans antibio~
-sur milieux
sur sélecteurs
tique.
sélecteurs
(ne doit pas
pousser)
-antibiogrammes -sur 1 colonie du
conjugué: antibiogram-
me et répliques
( 1 )
( 3 )
Comparer:
(2)
et (3~
(3)
et (1)
1
ïABLEAU ~b.Schéma adopté pour la mise en évidence du
I l
tra9sfert de la résistance.
J
1 1
1 .,
,~
l >'.,l'
L~>
I<:L" 1."!
1
"<.
1
1
Il - ESSAIS DE TRANSFERT DE LA RESISTANCE DES SOUCHES A ESCHERI-
CHIA COLI SUR MEMBRANE DE CELLOPHANE.
1
1
Dans ces essais, nous avons utilisé la méthode décrite par 1
CHABBERT pour le montage des tambours, mais en fait ce montage
;~.
• J
.'.
peut être effectué d'une manière plus simple. Nous décrirons ces 1
deux montages.
1
: ,~ .
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
~
.
11- ESSAIS DE TRANSFERT DE LA nESISTANCf. DES SOUCHES
A ESCHERICHIA COLI SUR MEMBRANE DE CELLOPHANE.
1- Introduction:
La technique de transfert sur membran!
de cellophane a été d'abord utilisée par CHAEEERT pour étudie:
la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Actuellement,
cette technique est de plus en plus employée pour réaliser le
transfert de la résistance bactérienne aux antibiotiques. En
effet, la cellophane est une membrane hémiperméable;
posée SUj
la gélose, elle permet d'obtenir un dévéloppement plus impor-
tant que'en
milieu liquide. Dans ces conditions, il est plus
facile d'observer un transfert de la résistance, même si la
fréquence de transfert est très basse.
,
2- Matériel:
1 11~
nous avons utilisé:
1 \\1j
1
des carrés de 'cellophane pour confiture
vendue dans le commerce(0,03mm d'épaisseur
1 ~l1
type 400N) de 150 X 150 mm, livrée avec des
11
bracelets de caoutchouc.
- des cylindres en pyrex de 6 cm de diamètre
1
1
sur 4 cm de hauteur, ouverts aux deux extrÉ-
l
mités.
1
des cristallisoirs en pyrex de 10 cm de diam
tre sur 8 de hauteur.
1
-
de la gélose de MUELLER et HINTON.
- des bouillons de 18 heures des souches dona-
1
trices et réceptrices.
1
•1tj
4 4
1
.~
1
1
'.
3- Méthode:
AI - Montage selon CHABBERT.
~
1
. ) - Préparation des tambours de cellophane.
1
Nous avons trempé la cellophane quelques secon-
des dans de l'eau bouillante. Aussitôt sortie de l'eau bouil11l
te, la cellophane a été tendue sur le cylindre en pyrex,
au
1
moyen d'un bracelet de caoutchouc. Le tambourin ainsi formé
est posé dans le cristallisoir, la cellophane reposant sur un
carré de papier filtre légèrement imbibé d'eau. L'ensemble a 11
enveloppé de papier filtre sulfurisé avec H S0
N/10,
et
•
2
4
stérilisé à 125°C à l'autoclave pendant 30 minutes.
1
b)- Technique de culture:
La gélose de MULLER et HINTON a i~té
fondue 1
et coulée à raison de 10 ml dans le fond du cristallisoir,
d'une manière stérile.
Après solidification, le tambour de,
1
cellophane a été déposé sur de la gélose.
Nous conseillons dei
déposer la cellophane en une seule fois sans la bouger pour
éviter des poches d'air qui ne favmrisent2spas le contact de
la cellophane avec la gélose.
1
A partir des bouillons de 18 heures des souche
1
donatrices et réceptrices,
O,SOml de chaque culture ont été
prélevés, mélangés directement su~ la cellophane et étalés au1
rateau. Le tout a été incubé à 37°C pendant 18 heures.
c)~ Sélection des clones transférés à E.col"
Après incubation, la culture a été reprise
p a l
0,50 ml d'eau distillée stérile. L'ensemble des bactéries a
'
récupéré à l'aide d'un rateau,
transféré dans un tube stérile.
1
à l'a~de d'une pipette ~térile. La purée de bactéries ainsi
obtenue a été utilisée pour la sélection des clones éventuellé
ment
transférés exactement comme nous av.ons procédé pour le1l
essais en milieu liquide.
Les m@mes marqueurs ont ~été utilise
L'anal~se des conjugués a été faite aussi comme dans les ess1
en mil~eu.liquide.
\\
1
45
El -
Variante du mont~ge.
Au lieu de faire le mont~ge comme décrit précedemment,
nous
avons cherché encore à rendre ce montage plus rapide et plus simpj
Il suffit de découper,
pour des boîtes de Pétri de
10 Cm des cercl
de cellophane de
11
cm de diamétre.
Après stérilisation de la cel]
phcne ainsi découpée(mettre à l'autoclave dans du papier filtre
imbibé d'eau et emballer dans du papier sulfurisé),on la dépose
ensuite sur 1. gélose coulée en boîte de
Pétri.
On ensemmence enSL
te comme pr~cédemment. Pour éviter des poches d'air sous la cello-
phane,
on l'étend en utilisant un rateau.
le bouillon des cultures
permet d'étendre facilement la cellophane.
La purée de bactéries
obtenue le lend~main est aussi dense que celle obtenue en utilisan
le montage de CHAEEERT.
1
1
1
1
1
1 '.1·4
j
1 ~~
.~
..~'~
1
1
CHAPITRE
II.
1
ESSAIS DE GUERISON DES BACTERIES DE LEUR RESISTANCE
PAR LE
BROMURE1
D'ETHIDIUM.
1
Après les ess.is de transfert par conjigaison,
nous avons
1
cherché à éliminer 1. résistance observée chez nos souches par le
traitement par l'éthidium. D'après BOUANCHAUD et Coll.( 46
),
la
";1
1
. ,
guérison d'une bactérie de sa résistance après traitement par un
,.. ~.
agent curant,
traduit 1. situation extrachromosomique de la résis-
1
tance observée. Ce traitement par l'éthidium nous a permis ainsi
corroborer les résult.ts obtenus par la conjugaison bactérienne.
ï.' ':
Dans les pages qu~ vont suivre, nous ferons d'abord un
1
rappel historique et ensuite nous décrirons la méthode utilisée
pour mettre en évidence l'action du brDmure d'éthidïum.
1
1
1- Rappels historiques.
11- Le bromure d'éthidium: son mécanisme d'action.
,
1
111- Méthodologie.
1
1
,.',
1
1
1
1
1
•
Il(
l
-
Rappels
historiques:
L'action des substances chimiques sur les
éléments cytoplasmique
a été en fait signalée depuis 1949 par EPHRUSI,
HOTTINGER et CHEMINES
(83).
Faisant agir de l'acriflavine sur la levure,
ces auteurs obte-
naient des mutants "petite colonie".
","
Mais ce fut WATANABE et FUKASAWA en 1961
qui les
premiers ont
essayé d'appliquer les propriétés de l'acridine et de l'acriflavine
sur les éléments cytoplasmiques aux facteurs de résistance( 198 ).
Depuis,
de nombreux a~teurs ont cDnfirmé leurs travaux et de
"~\\
nombreuses substances,
ayant les mêmes propriétés,ont été étudiées.
On:p~ut citer les plus étudiées:
-
Le bromure d'éthidium que nous avons délibérément choisi
d'étudier dans ce travail.
-
Les antipaludéens:
-
quinacrine,
quinine,
chloraquine.
-La berbérine,
la spermine,
la p.
rosaline,
le bleu de méth
lène,
les phénantridines autres que le bromure d'éthidium, les rifamp
-
,
cines; cette liste
n'étant pas limitative(
96).
II
-
Le bromure d'éthidiu~, son mécan{sme d'action.
Le bromure d'éthidium est le 2,7-diamino,
10~éthyl
9 -
phényl
phénanthridium bromide,
comme le montre la figure
6 page
Le produit que nous avons utilisé a été fourni
par les
établissements
PICHANCOURT à
Tourcoing.
C'est une
poudre rouge très hygroscopi~ue.
C'est pour cela que nous l'avons conservée dans dessicateur pour évi-
ter l'humidité.
C'est un corps très soluble dans l'alcool éthylique,
l'eau,
le bouillon de culture que nous avons
utilisé.
Son poids moléc
laire est de
394,3.
Nous avons exprimé les dilution en poids à cause
du caract~re hygroscopique de ce produit •
.~.
-1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
· J
1
J!
1
Figure -
6.
1
1
1
1
;/
J
1
i
1
,
1
"
1
T
1
\\
1
\\
Mécanisme d'action du bromure d'éthidium:
1
1
~
On s . i t que le bromure d'éthidium est un dérivé de la Phénantric
ne dont de nombreux autres dérivés sont utilisés comme
trypanocides.
De nombreuses
hypothèses ont été émises sur leur mécanisme d'action:
inhibition de la synthèse des acides nucléiques,
inhibition de l'ADN -
polymérase.Depuis 1966, c'est l'hypothèse de WARING qui est générale-
ment admise(
46,
96
).
D'après cet auteur,
l'éthidium se fixe en se
mettant en sandwich entre deux bases de la double hélice de la molécuJ
d'ADN.
Cette intercalation se fait le long .de
la molécule de telle
sorte que la réplication ne peut plus se produire.
Il y a aussi des me
difications dans
la structure hélicoïdale de la molécule.
Cette explic
tion s'étend à l'action de diverses substances sur les plasmides: c'eE
1
le cas de la berbérine selon KREY et Coll.(
118
)0
1
1
III -
Méthodologie •
\\
• ) -
Matériel:
t
Le matériel comporte essentiellement le bouil
\\
9
Ion de culture coeur cervelle utilisé précédemment pour les conjugaisc
et des
velours et leur support,
stérilisés comme
précédemment
lors dro
l'analyse des conjugués obtenus.
La solution de
bromure d'éthidium en
bouillon pour réaliser la gamme des concentrations o
b)
-
Principe de la méthode:
La méthode que nous avons
utilisée dérive de
celle décrite par HAHN et Col1.(96),
EOUANCHAUD et Coll.( 46
),
STDLE
RU et Coll.(
175-).
On ensemence ainsi une série de
tubes à essai~
de bouillon nutritif additionné de bromure d'éthidium à concentration~
sol
]
1
1
\\
\\
1
i
1
1
__
....... '-'
"-,-.--~..,...----~--~,....-~-
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Figure -
7 -
montrant une partie de la gamme de
concentrations décroissantes en bromure' d' éthidium.· Ainsi,
l ' essal
de guérison ~tait fait sur les bactéries du tube contenant le brol
mure d'éthidium immédiatement inférieur à
la concentration minima
inhibitrice{inhibant toute culture visible)~
1
1
1
1
i' , .
51
décroissantes,
avec
une culture de 18 heures,
de manière à avoir ur
4
concentration terminale de
10
bactéries
par millilitre de milieu.
1
Le tube témoin ne contient pas de bromure d'éthidium.
Les tubes sor
1
·1
ensuite incubés à 37°C pendant 18 heures.
1
Les bactéries
qui se sont multipliées dans le tube contenant
le bromure d'éthidium immédiatement inférieur à la concentration
minimale inhibitrice(
inhibant toute culture visible)(96, 46,
175),
sont ensemmencées sur la
gélose lactosée de manière à obtenir des
1
colonies bien séparées les
unes des autres.
Ces colonies sont enSL
[
1
te répliquées sur le milieu contenant
le
ou les sélecteurs à étu-
i
dier et sur le m~me milieu sans antibiotique. La numération des co-
lonies permet de calculer la fréquence de cure(
96, 46,
175).
1
,
Méthode:
La gamme de dilutions de bromure d'éthidium était la suivantE
[
. t
!
50
,
100
,
150
,
200
,
250
,
300 ,
350
,
400
,
450
,
•••••••
1000
microgrammes par millilitre.
3
4
Pour obtenir un inoculwm titrant entre 10
et 10
bactéries
~
par millilitre de milieu,
nous avons procédé de la façon suivante:
à partir des bouillons de 18 heures, deux dilutions successives ont
d'abord réalisées à raison de 0,05 ml dans 10 ml d'eau distillée
1
puis 0,05 ml de cette suspension dans ,10 ml d'eau distillée encore,
4
ce qui donne une dilution d'environ
0,25.10- • C'est cette suspen-
sion qui a été distribuée à
raison de 0,05 ml dans chaque tube
de
la gamme.
Pour obtenir des colonies séparées,
nous avons
ensemmencé
6
0,05 ml à la dilution de
10-
en eau distillée stérile.
A partir
de la boîte -
mère,
les répliques ont été faites sur milieu
témoin
sans antibiotique et sur milieux contenant le ou les antibiotiques.
~j! 1
1
1
CHAPITRE
III.
1
ESSAIS
SUR
LA RECHERCHE DE LA .SEGREGATION SPONTANEE DES
1
CARACTERES DE LA RESISTANCE OBSERVEE.
1
D~ns ce ch~pitre, nous avons cherch~ à voir si leS' caractèrel-
de
r~sist~nce observ6e pouvaient se perdre spontanément. En effe
on sait à
l'heure actuelle que les facteurs
de r~sistance peuvent
1
se perdre spontanément au cours du temps de vie de la bactérie
qui les h6berge(
175, 48).
1
Nous
nous sommes inspir~s de la technique décrite par G.H.
STOLERU et Coll. in 175.
1
Méthode:
1
1
i
La souche r6sistante 6tait cultiv~e en bouillon coeur cervell
pendant
18 heures.
Cette culture est ensuite dilu~é, ensemencéel
1
sur de l~ g610se lactosée au bromocr~sol pourpre. A partir de
cette culture en g610se,
cinq colonies étaient repiqu~es en boui:1
J
Ion et incubées 18 heures. Cette dernière culture était ainsi
diluée et ensemenc6e sur de la gélose lactosée de manière à obtejl
1!
nir des colonies bien s6parées. Ces colonies ont ét6 ensuite répi
1!
qu~es
1
sur de la gélose lactosée additionnée de l'antibiotique à
!;
étudier,
comme nous l'avons fait
précédemment pour l'analyse des
conjugués obtenus,
puis répliqu~s sur un milieu témoin sans anti-
biotique.
Après une nuit d'incubation,.on repère par rapport à
I
li
boîte-mère et à
la boîte témoin les colonies disparues.
Ces colon
colonies disparues sont celles qui ont eu une perte spontan6e dei
caractères de résistance.
1
1
1
1
CHAPITRE
IV.
RESULTATS
OBTENUS
PAR
LES TECHNIQUES
PRECEDEMMENT DECRITES.
Nous allons,
dans les pages qui vont suivre,
présenter
les résultats obtenus par les techniques que nous venons de décri
re. Au préalable,
nous critiquerons ces techniques elles-mêmes.
Ensuite,
nous donnerons,
germe par germe,
les résultats des conjü
gaisons
entre chaque
germe et le colibacille,
de la cure
par le
bromure d'éthidium
et aussi de la ségrégation spontanée des care
tères de la résistance observée.
Après chaque résultat,
nous
émettrons une
hypothèse sur la nature de la résistance étudiée.
Par contre,
la discussion sur le mécanisme biochimique,
en fonc-
tion des antibiotiques,n'aura lieu qu'à la fin de la
présentation
de tous les résultats.
1 -
CRITIQUES DES TECHNIQUES UTILISEES.
Dans toutes
les conjugaisons en milieu liquide,
nous av on
9
mélangé des cultures
titrant près de 4.10
bactéries par millili-
tre,
dans la proportion de
1 volum~ de la bactérie donatrice pour
4 volumes de la bactérie réceptrice.
Dans ces conditions,
les
3
lectures des résultats à
la dilution de
10-
s'avéraient très dif·
1
ficiles à cause de
la trop
grande densité de colonies sur le mi-
lieu lactosé,
quel que soit d'ailleurs le marqueur utilisé.
Nous
1
6
avons ainsi travaillé souvent à la dilution de 1U-
• 'A c~tte dilu·
1 i1
tion,. nous avons
aussi
parfois fait varier le volume de la suspen·
.!
sion bactérienne
inoculé sur le milieu lactosé,
à cause du
trop
1
grand nombr~' de colonies. Le maximum du volume de la suspension
inoculé était de
0,1oml
et le minimum de 0,02ml à
O,oSml,
sur
1
chacune des quatre
boîtes de P~tri utilisées par essai.
Les
techn
ques étaient dans
l'ensemble facilement reproductibles.
1
1
1
·"1
~..f
1
~
~
1
1
1
i
Dans plusieurs essais faits
sur membrane
de cellophane,
la
pur~e
1
de
germes obtenue ~tait très dense, le plus souvent accompagn~e 1
de morceaux de cellophane emport~s lors du pr~lèvement. La pur~e
1
obtenue ~tait le plus souvent lav~e deux fois en s~rum Physiolo~1
que
st~rile
en la centrifugeant doucement avant de faire
les
!1
dilutions.
Que le montage soit fait,
pour la membrane de cello- 1
phane,
selon la technique d~crite par CHABBERT,
ou qu'on la dé-
pose directement sur la
gélose
comme nous l'avons fajt,
les
ré-
1
sultats étaient les mêmes.
I
Quant aux marqueurs
utilisés(fermentation de lactose et
résistance chromosomique de la souche
réceptrice à
l'azoture de l
sodium ou à l'acide nalidixiqu~), nous pouvons dire d'emblée
que la technique utilisant
un mutant est très ~légante, méthodel
d'ailleurs très utilisée en France.
1.
1
1
II
-
RESULTATS OBTENUS AVEC DIFFERENTES SOUCHES.
1
Comme nous l'avons
dit plus haut,
les résultats nlétaien~
considérés comme valables
que quand les
t~moins répondaient aux
conditions suivantes:
avant conjugaison,
la souche réceptrice
1
devait être sensible aux antibiotiques
étudiés comme le montre
la
figure 8 de la page suivante(essais
par antibiogramme mais
1
aussi sur milieu contenant la drogue
à
étudier),
mais la souche
donatrice devait être résistance avant comme après conjugaison. 1
Pour plus de clarté dans l'exposé,
nous avons adppté
le
plan suivant pour
pr~senter nos résultats:
1
1) -
Résultats des
germes bêtagalactosidase -
•
1
A -
Les Proteus;
B -
Les
Pseudomonas.
II)
-
Résultats des
germes bêtagalactosidase + •
1
A -
Aeromonas
;
B -
Les
Klebsiella;
C -
Les Enterobacter.
,i
III)
-
Discussion sur le m~canisme biochimigue de la r~sifl
tance ~tudi~e, en fonctioQ des antibiotiques utilisés.
1
1
j
1
1.. !
Figure na
B -
Escherichia coli K12:
sensibilité
auX antibiotiques avant conjugaison •
.'
1
1
Avant d~ donner ces résultats,
il y a lieu de faire un
rappel sur la sensibilité des germes à r~action de GRAM négative
1
en gén~ral. Le tabl~au nOSc de la page 57 donne un aperçu sur
cette sensibilité car certaines résistances non transférées
J
à
-
E.coli K12 peuvent être simplement et pourquoi- pas des r~sistance_
naturelles.
1
1
1
1
1
1
1
.-
1
1
1
1
1
1
i1,
1
1
1
l
{
1
57
-----------_.
--1
Tableau Sc- SENSIBILITE DES GERMES GRAM NEGATIF AUX ANTIBIOTIQUES
In Feuillets du Praticien.
Novembre II.
196q. T.34 N°ll
Cocci Gram -
Entérobactériacées
Neisseria
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(1)
1
1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1 - - 1 - - 1
1
Sulfamides
++
++
+
±
+
o
o
o
1
J
1--1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1 - - 1 - - 1
1
Pénicillines G
++
++
o
o
++
o
o
+
o
++ 1 ++
o
~
1
1 1 1 1=1=1
1' 1 1 1 1
Pénicillines M 1 + +
1 + +
0
±
+
0
±
+ +
1 + +
:
:
~ Pénicillines A
++
++
+
+
+
o
o
o
o
o
++
++
++
<li
1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1--1--1
1
1 - - 1 - - 1
1
'0 1 Cephalo-
c:l
sporine C
++
++
±
+
+
o
++
++ 1 ++
Carbénicilline
++
+
+
±
o
++
±
+
+
1
1
1--1
1 - - 1 - - 1 - - \\ - - 1 - ' - 1
1 - - 1 - - \\
1
1--1--1
1
'"
Strepto - Kana
+
++
+ et 1 0 et 1 + et 1 0 et
+ BO % R
o et
++
+
++
++
++
++
++
±
++
++
et
CIl
==
++
+
~ 1 - - - - - 1
1--1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1--1--1
1
1 - - 1 - - 1
1
:g Néomycine
~ Framycétine
~
1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1 - - 1 - - 1
1
Gentamycine
++
++
++
++ 1 ++ 1 ++
+
++
++
1
1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
J
1 - - 1 - - 1
1
: Chloramphénicol
++
+ +
1+ + (5 % R) 1 + +
±
o
+
o
90 % R 0
o
++
++
++
++ 1 ++
++
1
1
1--1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1 - - 1 - - 1
1
Tétracyclines
+
++ 1+
(15% R)I
+
o
o
+
o
o (70 % R)
o
+
+
+
+
++
++
1
f
1--1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1_ _ 1_ _ 1
1
Macrolides
+
++
o
o
o
o
o
o
o
±
o
:::
++
++
1
1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1_ _ 1_ _ 1_ _ 1
1_ _ 1_ _ 1
[
1_ _ 1_ _ 1
1
Polypeptides
o
o
++
+
o
++
o
++
o
(15 %
R)
+
o
o
+
o
1 - - - - - - - 1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
\\ - - 1 - - 1
1
Négram
++
±
+
+
++
±
+
1
1
1 - - 1
1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1 - - 1
1 - - 1 - - 1
1
1 - - I - - j
1
Furadoine
+
±
o
+
o
o
o
,
- -
p + S p + S
.
l-I~I-I-I-I
. 1-1- 1
1--1-)1-1
b, .... _
.. ,
\\Associatlons
~ht+.s..1~ + ~ ".., 's> rrn """~;............".,...,,.,,>,,;,-=~.n~ ..-t._.SJk~.=-=-•.JS.....-+_CblL.I......
- - - _..
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' , '
',~
- - - - - - -
1
5B
à l
,i
1
',''),
~ ,'.
1
A -
RESULTATS OBTENUS AVEC LES SOUCHES DE
PROTEUS.
$ 1
"
'..
1
Il nous paraît rationnel de diviser ces
résultats en trois
.
groupes:
ceux obtenus avec les P.
mirabilis,
les P.
rettgeri et
'
.
enfin les P.
morgani.
1
1 -
Cas des Proteus mirabilis.
1
Ces souches ont ~t~ désignées dans la premi~re partie par
1
Proteus nO
1, 2,
10.
"
"
-
Les essais de
transfert
à Ecoli K12.
1
Les
tableaux nO
10,
12 et
14 montrent les résultats nu~.§riqul
-----.
des sélections faites
avec les différents antibiotiques.
Les n01
1
et 2 n'ont à aucun moment transmis
un seul des caractères qu'ils
portent.
Par contre,
le Proteus n010 a:
pu
transmettre deux de
ses caractères à E.coli K12.
Nous avons ainsi la séquence
SC
été
transmise.
Nous
nous sommes demandés si certains caract~res étaient trarl
f~rés à un niveau plus faible. les essais à des concentrations ini
rieures
n'ont rien donné de positif.
1
-
Les cures par le bromure d'éthidium.
1
Les concentrations minimales inhibitrices de toute culture
visible:;
à l'oeil nu étaient de 400 mcg/ml
pour le premier germe
1
mais de 500 mcg/ml pour les nO
2 et 10.
Nous avons examiné 490
colonies(Proteus n01)et 531
colonies(germe ~o2)
fi
5 ans e f f e t
n 0 ta b l
Pour le
Proteus nO
10,
nous avons
pu supprimer
les caractères A,
S et C.
1
La
perte spontanée des caractères de
résistance.
1
Sur les 650 colonies examinées pour le
Proteus n01
et 531
1
pour le
Proteus nO
2,
aucune
perte n'a été constatée.
Dans le cas
du
Proteus nO
10,
950 coloniés au
total ont été répliquées.
La per~,
1
des car.ctères S et C a '::été constatée dans
10 colonies mais celle
de A dans 6 èolon~es.
1
1
Une telle perte
qui
a
une
fr~que9ce voisine de 10-
n'est pas If
8
fait d'une mutation réverse qui
généralement est de
10- 7 à 10-
•
Hypothèse sur la nature de la résistance de ces souch~
1 0 _
Dans le cas des
Tétracyclines,
on sait qu'en cliniqUE
et in vitro,
ces antibiotiques
sont généralement sans effet sur
les Proteus mirabilis.
Il existe donc avant tout une résistance
intrinsèque des proteus mirabilis à ces produits.
Dans notre cas
't· ,
.~ '.
, .
où la résistance à
ces produits n'a été ni
transférée ni supprimi
~i : .
<
i l est probable que cette
résistance soit naturelle ou d'origine
~ ,
chromosomique. Remarquons
que dans
bien des cas,
la résistance à
ces produits peut être aussi
extrachromosomique(
231)
chez les
Proteus mirabilis.
2 0 _
Dans le cas du Chloramphénicol,
on sait que générale-
ment cet antibiotique atteint le
1/4 d'une population de
Proteus
mirabilis. Le Proteus n 0 10 a
pu
transférer ce caractère à E.coli
K12.
Dans le cas des
Proteus
nO
et 2,
i l peut s'agir d'une
~ési
tance extrachromosomique qui
n'a
pas été
transférée ou simplement
d'une r~sistance naturelle.
3 0 _
Nous retenons cette deuxième
hypothèse
pour l'ampicil
në vis-à-vis des Proteus n 0 2 et 10.
Pour ce dernier germe,
la
résistanceàl'ampicilline est probablement d'origine extrachromosc
mique si l'on considère les résult~t~ de la cure par l'éthidium.
1
En effet la suppression d'un caractère par un agent curant signi-
fie sa situation extrachromosomique(
46) •
. .:.
1
4 0 _
Les raisonnements
faits
aux 2 0
et ]0 sont valables
dans le cas.de la
r~sistance aux sulfamides.
1
et 2 ont été les rares souches
1
avec quelques pyocyaniques à
résister à la
gentamycine dans notre
travail.
Nous
n'avons
pas pu transférer ce caractère à
E.coli
K12
1
Nous savons que jusqu'en 1971,
date d'isolement de
nos souches,
i l était encore rare
de
parler de
résistance'transférable à
la
gentamycine(S7,
231).
1
1
1
1
En conclusion, sur trois souches de Proteus mirabilis,
une seule a pu transférer quelques uns de ses caractères.
On peutl
aussi faire
remarquer qu'une bactérie peut être guérie d'un carac-
tère donné mais ce carctère n'est pas forcément transférable comml
le cas de l'ampicilline dans le proteus nO
10.
Les tableaux des pages qui vont suivre rendent compte
résultats obtenus.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
61
- Marqueurs:
Fermentation lactose
Résistance(Azide ou Acide
Nalidixique).
Colonies:
Lac-
Lac+
Colanies survïvéill1ltes:
Antibioti-
:;'
ques:
T
1 30 -170~
néant
néiilnt
109 -168~;~
-
-~
-
-*
90
-200*
-
-.
-
-~
100 -159*
-
-)t
-
-~
Total
429 -697~
-~
-
-lIE
-
Su
140 -179)t
-*
-~
-
-
125 -190.
-
+ lIE
-
-lIE
1 30 -180~
-
-li!
-
-lIE
'.
105 -185)l
-
-lIE X
-
-lIE
Tgtal
500 -734.
-
-lt
-
-~
G
70 -100)1(
-
-li!
-
-lIE
50 -105lt
-
-~
-
,
-.
46 -1 o9
-
-~.:
lIE
-
-~x
_.
65 -90 lIE
-lIE
-
-lIE
Total
231
-4 (i)4lrlEX
-
-lIE X
-
-lIE
Tableau nO
10 -
Conjugaisons en milieu liquide et su:
membrane de cellophane:
Proteus nO 1
X E . ' coli K 12 0 , Les colones
ayant une ii1stéri~que donnent les résultats obtenus sur membrane de
cellophane.
.. -- - - - - - - - - - -- - ------
Nombre
de
colonies
examinées de
Colonies sensibles
%
ph6notype G T Su
1
G
T
Su
G
T
Su
490
650.
- -ll
- -lie
-
-lIE
-
- l l
- -lf
- - l t
Tableau nO
11
-
Action du bromure d'éthidium,
gu~rison spontanée sur le Proteus n D 1
lIE
=
r6sultats
de
la
perte spontanée.
~ (:~~~~~~1:~;~ ',F'
6~~6
~-79~·
K
y~~~~~~~~------~ _._~~~~._~
1
bJ
1
Marqueurs:
Fermentation lactose
Résistance(Azide ou
acide nalidixique)
1
': '-
Colonies
1
Lac -
Lac+
colonies survivant~:
1
Antibiotiques:
1
if·
A
84
-li-
- 120~
néant - néant)(
néant - néant!
. ~ .
..,
99 - 143)(
-
-
-
-
. (
':
"~"
88 - 109)(
-
-
-
-
1
.'r
90 - 1301(
-
-
-
-
-
-
-
Total
361
-
1
- 502)(
-
-
-
-
s
:;
1
S
77 - 190)(
-
-
-
-
~
95 - 158
1
•
-
-
-
-
89 - 173~
-
-
-
-
~
102 - 143.x
-
-
-
-
1
.,; .
Total
363 - 664 )(
-
-
-
-'
-
.. '. .'
1
G
102 - 146>l
-
-
-
-
73 - 175.x
-
-
-
-
98 - 180)(
-,
-
-
-
1
108 - 158.
-
-
-
-
Total
381 - 659lil
-
-
-
-
1
..
C
90 - 150
-
-
-
-
1
63 - 132
-
-
-
-
88 - 102
-
-
-
-
1
90 - 109
-
-
-
-
Total
331
"
- 493
-
-
-
-
1
[
• • • /
• • 0
,
1
Marqueurs:
Fermentation lactose
R1Ssistance(Azide ou <a ci·
de nalidixique)
1
Colonies
L.c-
Lac+
Colonies survivantes
1
Antibiotiques:
1
T
75 - 132lE
n1Sant - n1Sant.
n1Sant - néa ri
84 - 101.
-
-
-
-
90 - 1241(
-
-
-
- 1
88 - 130~
-
-
~,
,
-
-
.,~
"
Tot.l
337 - 487_
-
-
-
- 1
Su
97 - 107)IE
-
-
-
-
88 - 132.
1
-
-
-
-
90 - 108.
-
-
-
-
79 - 132.
-
-
-
- 1
Tot.il
394 - 479*
-
-
-
-
1
.;
-(.'"
1
X E.coli K12. 1
Tableau nO
12 -
Conjugaisons Proteus n02
li!
= résultats sur cellophane.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Colonies examinées de
Colonies sensibles
"la
phénotype A S G C Te Su
1
A
T
S
G
C
Su
1
A
T
S
G
C
Su
215
195~
néant
néant
200
178~
néant
néant
222
15811t
néant
néant
Tot 637
531~
Tableau n 0 13 -
Action du bromure d'éthidium (CMI
de la culture 500 mcg/ml).
et guérison spontanée(~) sur le Proteus n 0 2.
@$~',jWàiji"'_"_""'".;"!!....~i!j_I" ('!"'#hU "'?"''''?"f' ~r'''''''''Î'!!ii!I!Î' ,'§!IRq....";;..""..""'.....,,"'-..!Ilj!u:èër>·...
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Marqueurs:
Fermentation lactose
Résistance
(Azide ou
•
ael
de nalidixique)
-
-
Colonies
Lac-
Lac+
Colonies survivantesl
Antibiotiques
1
"
S
85
- 150*
50
- 82*
50 -
110*
, , '
:
80
- 103)f
60
- 50>1:'
62 -
108)f
,
1
75
- 180*
54
- 85*
82 -
90*
69
- 102*
70
- 6oli(
85 -
95*
1
Total
309
- 535*
234
-277*
289 -
403lE
C
82
- 108lE
93
- 88lE
84 - 11 1*
67
- 18oll(
73
- 63lE
75
1
- 102*
50
- 160*
60
- 75*
80 -
101lE
63
- 105*
80
- 9oli(
70 -
90*
1
Total
262 - 553*
306
-316lE
309 - 404li(
A
85
- 112l1(
néant néantlE
néant
néantll(
1
75
- 150*
-
-
-
-
30
- 18oll(
-
-
-
-
1
85
- 99l1(
-
-
-
-
Total
275
- 541 ~
-
-
-
-
Su
60
153*
1
-
-
-
-
-
.' t
80
- 108lE
-
-
-
-
99
- 89l1(
1
-
-
-
-
75
- 107*
-
-
-
-
Total
314
- 457*
-
, -
-
-
1
T
90
- 102~
-
-
'-
-
-
87
- 170*
-
-
-
-
1
70
- 15oll(
-
-
-
-
67
- 88*
-
-
-
-
1
Total
314
- 51 oli(
-
-
-
-
1
1
Tableau nO 14 -
Conjugaisons entre Proteus nO
10 et E;eOli
K 1 2;
l
)f = résultats obtenus sur membrane de eell~
phane.
1
1
1
olonies examinées de
phénotype
Colonies sensibles
%
A S C T Su
!
A
S
C
T
Su
A
S
C
T
Su
20B
73
86
80
-
-
35%
40
31
-
-
950.
6.
8.
10.
-
-
0,6
0,7
1
Tableau nO
15 -
Action du bromure d'étidium,
guerison sponta-
née sur la souche nO
10:
~'~M:tt~:::::i::= !Ji L~M"""'; ""......,...... ISlj~~è.pf2.:N:'resp
1
*9'
i
t
.,..,............-..:
# 5o.ef:s2 "'.'" oeJ "" h !
"........~êrrt'=ee'z.....,.
. ' -
hm"
ev ter_
.:.!
,. ~ .~ .,
-
-
- -
-
1
1
2 -
Cas des
ProteDs morgani.
1
Ces Proteus,
les plus nombreux du lot étudié portaient
moyenne cinq caractères chacun.
Nous les
avons représentés dans la
première partie de ce travail par les numéros 4,
5,
6,
7,
,
et 9
1
Essais de transfert des caractères de r~sistance à
E.
coli K12.
1
Les Proteus na 4,
n 0 5 ont transféré à E.
coli K12 les
1
caractères A,
C,
S,
Su, Soit les séquences A S Su et A C Su.
1
_Les figures 7 et 8 pages
70
et
71
rendent compte de l ' ana-
lyse des conjugués obtenus.
Nous avons par contre été déçus par la non transférabili~
de
la résistance à partir des Proteus na
6, 7,
;:. et 9,
hébergeant
au moins chacun cinq caractères.
Même les essais à un niveau Plusl
bas
n'ont pas été concluants,
et même sur membrane de cellophane.
1
-
L'action du bromure d'éthidium.
Pour ces souches,
la concentration minimale inhibitrice
1
de toute culture visible à l'oeil nu a
été relativement plus élevé'
600 mcg/ml pour les souches na
6,
7~
,
9;
300 mcg/ml pour le n041
mais 230 mcg/ml pour le n 0 5.
Les fréquences
obtenues avec la souch
1
na 4 'sont relativement _basses:
17 pour A,
28 pour S et 20 pour Su
-
La ségrégation spontanée --des caractères de résistance
1
Le tableau n'
17 montre les résultats obtenus avec le
Proteus na 4.
Les fréquences
obtenues 1,7
, 2 et -1 ,5 expriment
bien qu'il ne s'agit pas d'une mutation réverse 4
Ici aussi,
i l
été surprenant de constater que les proteus na
6,
7,
et 9 n'ont
pas donné de résultats significatifs.
l
1
1
1
1
[. )
Hypothèse sur la nature de la r~sistance observ~e.
En pratique,
très
peu d'antibiotiques atteignent les Proteus
morgani,
à l'exception de
la gentamycine.
A un degr~ moindre,
la
carb~nicilline et la Kanamycirie peuvent atteindre ces germes in
·~.
vivo et in vitro.
La non transf6rabilit6 de tous ces caractères
est vraisemblablement due à
la r6sistance qui est d'origine
naturelle,
c'est-à-dire intrinsèqu~.
Dans les
pages
qui vont suivre,
nous donnerons à
titre
d'exemple les r6sultats obtenus avec le
proteus nO
4.
Les résul-
tats obtenus avec les
Proteus nO
6, 7,
;~, 9 sont semblables à cel
obtenus pr6cedemment avec les Proteus nO
1 et 2~
puisque aucun
caractère n'a
été transmis.
!
1
1
1
1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
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Figure nO 3 - Analyse du conjugué obtenu avec le Proteus N? 4, par antibiogramme.
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,
S- MILIEU CONTENAllT ©
4 - aom 'OHT~lWIr G)
Cf CARAC.TfRf N'A PAS ETE' TI\\M'S141S iii.
LA BACTERIE ~VENVC RESISTANTE
SIlUtMf aOHATRIΠy EST 5EIlSI81li.
,:c;;,'<o,~;:;t:;,"i:~~~~'-::~:!'
·~Î-:t-~;fr~:~~~_":;;S~.;p.:;.:..'t.-.c,;;
Figure
no~e -
Analyse
du conjugué obtenu avec
le
Proteus
n 0 4
par la méthode
des
répliques
à
l'aide
des
tampons
de
velours.
·~9,.·..<·-
, ~
;C/i
0,",,-'_- .
"-'-~- ·_~_-.n::""':;""~"'4~•..:..~:'
~'~,;iJ
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,'. _··'·;·::'~lU~~t~t;;'~;,1i.'t:''':~,":~.H;:''i.·~/·.
1,1
1
Fermentation lactose
Résistance(Azide ou aCI'
de nalidixique)
Lac-
léilC+
Colonies survivantel
t;:'
',Antibiotiques:
"-
.~ :
A
83
140)1;
46
80lE
39
53*
40
1D1lE
40
75~
42
39*
63 -
83~
54
82*
72
112*
88
150)1;
56
86*
57
98)1;
Total
274
474 *
196- 323lE
210
302)1;
S
68
11 b~
84 - 78*
49
53)1;
52 -
98)1;
45 - 76*
56
79*
59
1o4lE
70
89*
39
68l(
82
1D6~
58
70*
62
90)1;
...
1
Total
31 1
420*
257
313*
206
290*
Su
80 -
90*
29 -
72*
41
84)1;
49
102*
23
90*
62
70*
"~
88
99lE
54
97*
32
84)1;
63 -
120*
47 -
89)1;
39
67>t:
Total
280
411 )1;
144
348*
1 74
305*
c
82
116*
néant- néant*
néant - néant*
17
130~
90 - 200*
85 - 89*
, !
80 -
109*
414 - 644*
-
T
68 - 123)1;
50 -
89)1;
48
104*
70 - 150)1;
Tableau n016 _ Conjugaisons P~oteus n04 X E.coli K12.
* = Résultats obtenus sur cellophane.'
Nombre de colonies examinées de
Colonies sensibles
%
phénotype
A S C T Su
A
T
S
C
Su
1
A
T
S
C .
Su
190
36
-
60
- 40
15 B
28
-
30
- 31
1 89
30
-
62
-
37,
Total: 537
94
-152
-108
1 7
28
20
450lt
8
10
7
1 , 7
2
1 , 5
Tableau nO
17 -
Résultats de l'action de l'éthidium(CMI
300mcg/ml)
et guérison spontanée sur le proteus nO 4
::l'~' ..."~ ,.
..'
..,:AI
" .. •~;::';;~'~""kl.~ ",~:~~",ol_';"~j.f,.•,;:.,,':-"'G'3.::::';',,'" -'~ •' ..''''''
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~
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"
... ~~~-:'~ .. "
; - : . '
1
•
' . . .
~
-- ......... ~ - - -
---------------------
:;
Nombre de colonies examinées 1
Nombre
de colonies sensibles
% de guérison
de
phénotype A S K C T Su.
A
S
K
C
T
Su
1
A
S
K
C
T
Su
104
44
0':
0
34
0
39
120
54
0
0
40
0
51
106
40
0
0
30
0
3D
200
70
0
0
61
0
50
Total
520
121 B
0
0
165
0
190
1
42
-
-
32
-
37
Tableau n018 -
Action du bromure d'éthidium sur le; Proteus n05
,.• ',,;. ..::.~~,:;:_:..:..;:..,_3.,....".~....~•.,~:...-~.•~k!...~,....:'_'s~·_~
~".<..~~- ..; .
.,,-'
' ( "
• 't~,,~; '!.
"~'~:l,.*\\-:~,; .~.,. ').;' ":..
I~
-
Cas des
Proteus
rettgeri.
Nous les
avons repr6sent6s dans la
première partie
par les
num~ros 3 et 8 et leurs ph~notypes 6taient pour le nO
3
A S T Su
et pour le n08
ACT Su.
Il nous
paraî~ inutile de donner les r6-
sultats numériques détaillés
car aucun caractère n'a
6té
transfe
ré à partir de
ces souches à E.coli K12.
Les résultats
sont les
mêmes que ceux obtenus avec les
Proteus nO
et 2 qui
n'ont pas
transmis leurs caractères.
La
guérisnn par le bromure
d'6thidium
n'
apas 6t6 obtenue comme
pour les autres souches.
La concentra-
tion minimale inhibitrice de
toute culture visible 6tait de 600
mcg/ml pour le nO
3 mais de
300 mcg/ml pour le nOS.
i;
1
1
1
CONCLUSION CONCERNANT LES ESSAIS SUR LES PROTEUS.
1
Des dix Proteus que nous avons 6tudi6s,
trois souches ont 1
pu transmettre leurs caractères à E.coli
K12.
La guérison
par
le bromure d'6thidium et la gu6rison spontan6e à des fr6qUenceSI
relativement 6lev6es,
confirment
l'existence extrachromosomi-
que de la résistance qui été transférée.
1
Pour les caractères non
transférés
à
E.
coli K12,
i l
1
s'agit probablement de
plasmides qui
n'ont
pas été transférés
ou simplement de résistance naturelle si l'on considère les
spectres d'activité des antibiotiques
étudiés.
Le
tableau nO
1
19 résume les résultats obtenus avec les
Proteus,
page77.
,.
;-
,r
1
1
"
,
'.\\ .;
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
77
Souches
Antibiotype
Caractères transférés
Guéri
r
a c. • coli K12
[r'·~ l
mcg/ml
Proteus nO
G
T
Su
néant
400
Proteus nO
A
S
G
C
T
Su
SOO
Proteus nO
A
S
T
Su
600
Proteus nO
A
S
C
T
Su
A
S
Su
300 (+ )
1.
Proteus nO
A
S
K
C
T
Su
A
C Su
230 (+ )
Proteus nO
A
S
K
C
T
Su
600
.i~~
..
1
,,\\
Proteus nO
A
S
C
T
Su
600
•
e
.~
!
Proteus nO
A
C
T
Su
300
,. .'
•>
Proteus nO
A
S
C
T
Su
600
Proteus nO 1
A
5
C
T
Su
S C·
SOO (+ )
. ~.'-.
"
". ~
. , ~ -..
Tableau nO
19- Résultats des conjugaisons et de 12
cure par l'éthidium obtenus avec les souches de
Proteus.
(+)
~ guérison et perte spontanée obtenues.
~.
'.
•
<~ ''::'''.
1
1
B -
RESULTATS
DETENUS AVEC LES PSEUDOMONAS.
1
-
Les
essais de
transfert.
1
1
Des
trois
souches
de
Pseudomonas que nous
avons
étudiées,
aucune n'a
pu
transf~rer ses caractères de r~sistance à E.coli K12,
malgr~ les nombreux caractères de r~sistance h~berg~s par ces sou-
ches.
1
-
Les essais de
Guérison
et de
perte sDontanée.
1
Aucun des trois
Pseudomonas n'a
perdu ses caractères
sous
l'effet de l'éthidium.
Nous n'avons observ~ de guérison spontanée
1
après
un étude sur 970 colonies pour le P.
aeruginosa
et
940 et
890 pour les deux autres souches.
1
1
-
Hypothèse sur la nature de la r~sistance observée.
J
Ces
résultats
nous surprennent peu.
En effet,
au vu
de
la
littérature,
nous
savons
que
très
peu d'auteurs
ont
obtenu des
tran~
ferts
à
partir des
Pseudomonas.
CHABBERT in
231
insiste sur le
1
fait
que ces
transfertSsont généralement infructueux.
Sur sept sou-
ches qu'il avait étudiées,
CHABEERT n'avait obtenu qu'un seul trans-1
fert.
Si l'on considère d'autre
part la sensibilité
des
Pseudomon2s
aux antibiotiques
en général,
seules la gentamycine
et la carbénici1l
line atteignent ces
bactéries.
Aussi,
on peut ici
penser que
la
l . j ·
résistance
observée aux
sulfamides,
à
l'ampicilline,
1
au
chloramphé-
nicol,
streptomycine et
kanamycine
est naturelle.
La
résistance à
la
gentamycine observée chez la souche
nO
1 c'est-à-dire
le
pyocya- 1
nique peut être'd'origine chromosomique
car en
1971,
i l était très
rare de
parler de
résistance à
la gentamycine,
transférable
chez
de
nombreuses
bactéries.
Le
tableau nO
20 page
79
résume
ce
que
1
nous avons observé.
1
1
1
r..
7L:
. /
·1
\\
,
d
.
Il nous a paru inutile de donner les résultats numériques
des conjugaisons qui sont semblables à ceux obtenus avec les Pro-
teus nO
1 et 2,qui n'ont pas transmis leur résistance à E.coli K~
:;~
l~;~';'
Souche
Antibiotype
Transfert à
cr~ 1 de l ' é-
E. coli.
thidium.
Pseudomonas n01
A S K G C T Su
néant
(-)500 mcg/m2-
Pseudomonas n02
A S K
C
T Su
(-)250 mcg/ml
Pseudomonas nO]
A S K
C T Su
(-)300 mcg/ml
1"
'
.
:~: l
l'~ ";
'')
-;',
"
,
.. - ~- .
Tableau nO
20 -
Conjugaisons Pseudomonas X [.col
(-) = guérison non obtenue.
1
J
1
1 ,f:'
1 l:~.'
"
1 "{
1
1 ~,
~-
1 /'i'~J".,.i;
1;'
,'f!'
.-: ...t
1
'.'
"1-: ..
{1' •
, "
UL: 1
1
1
II - RESlJL TATS DES GERMES POSSEililNT ur'JE B;:--,L: r:"1 rr-cc-
DASE.
J k
1 '-c"', r,L I,~ ;1
1
Pour ces souches,
comme
nous l'avons dit plus
haut,
1
le marqueur a
été la résistance de la souche
réceptrice à l'azo-
ture de sodium ou à l'acide nalidixique.
Nous
avons groupé
les résultats des Aeromonas et Kle-I
bsiella car ces souches n'ont donné
aucun résultat satisfaisant.
1
A - E - RESULTATS OBTENUS AVEC LES SGUCHES DE
AEROMDNAS et KLEB5IELLA.
1
Aucune de ces souches ne
nous a
donné de
résultat-
1
satisfaisant ni
par les conjugaison ni
par l'action de l'éthidium.
Sur les milieux sélecteurs,
i l n'yavait aucune colonie.
1
Hvpothèse sur la nature de ces
résistances.
1
Nous ne sommes pas très surpris des
résultats obtenus
avec la souche de Aeromonas.
Ce
germe:
est relativement peu fré-
"
1
J;'
!:;
quent en médecine humaine et très
peu d'auteurs ont obtenu des
~''.
résultats satifaisants à partir de ces
bactéries(
152).
1
Par contre,
nous sommes surpris des
résultats obtenus
avec les
Klebsiella.
Fr~quentes en clinique humainEi ces souches
1
transmettent facilement leur résistance à E.
coli K12.
Rappelons
1
aussi que
nous
n'avons étudi~ que deux de ces souches.
Si nous
pouvons
émettre l'hypothèse d'une
résistance
1
naturelle
pour-l'ampicilline qui généralement n'atteint pas les
Klebsiella,
i l est probable que les caractères
5,
K,
C,
T. Su
1
appartiennent à
un ou des
plasmides qui
n'ont
pas été
transférés.
On peut aussi se demander pourquoi la
cure par l'éthidium n'
a
rien donné.
Le tableau n021
présente les
résult~ts obtenus.
1
Souche
Antibiotype
Transfert à E.coli
r
'
.
lOueTlson
U'lI
é th i d i L
Aeromonas
A S K C T Su
néant
SOO mcg/".
Klebsiella
A S K C T Su
( -)
2 3 0 mc 9 / r-.
Klebsiella
A S K C T Su
(-)
250 mcg/r:-
Tableau nO
21
-
Conjugaisons Aeromonas ou
Klebsiella
X
E.coli K12.
(-) = guérison non obtenue.
.
,
1
1
c - RESULTATS OBTENUS AVEC LES SOUCHES
ENTERDEACTER.
1
-
Transf~rabilité.
1
Meilleurs résultats dans l'ensemble qu'avec les autres
souchesl
1
que nous avons
étudiées.
L'enterobacter n01
a
pu
transmettre les
caractères S et C et l'enterobacter n02 les caractères A,
S,
K,
C,
Su,
et le
paracolon
aerobacter le" caractère:
C.
1
-
Essai de guérison.
1
Nous
pouvons dire
qu'elle aété facilement
obtenue
pour les
enterobacter
nO
et 2.
Nous avons aussi constaté chez l'enterobal
ter nO
1 qu'un caractère non
transmis
peut être guéri.
Les CMI
en 1
bromure d'éthidium
n'étaient pas les
mêmes:
230 mcg/ml pour les
nO
1 et 2 mais
500 mcg/ml pour l'enterobacter n03
et
250 mcg/ml
pour le paracolon aerobacter.
1
-
La perte des caractères a
été obtenue
comme le montrent les
tableaux nO
23,
25,
26.
1
1
1
1
1
L
1
1
1
. ~~
.,
"
:f " ..
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
i'
····1
1
Figure nO
11
Guérison de l'enterobacter nO
du
caractère C.
1
1
1
1
1
1
-)
1
- - - - -- - - - - - - - - - -- - -- -
_olonies examinées de
nombre de colonies sensibles
%
bhénotype A S K C T Su
guérison,
1
A
K
C
T
S
Su
1
A
K
C
T
S
Su
1
1rn 8
80
60
77
0
86
90
200
150 1 1 0 140
0
165
170
Total 308
1
230 170 217
0
251
260
1
72
55
67
0
70
82
106
*
109
*
102
*
Total 417
*
Colonies sensibles à l'ensem-
3 *.
bles des produits = 9
Tableau nO
23 -
Action de l'éthidium et perte spontanée(*)
chez
l'enterobacter nO
1
.,
,-"'."
., ,'.'
'.~'
,- -~,.:.: <, •
;;":i.';';~,l:~Ji!i"""'~:;;,,,,, ."-,',;.;;.~.~./:.:",~~J!<,.~,,,...,L;.~-4,-;;is:J;;;:~-"
!~..'~i':._'~' :1if~~.~
'":
'/,~ -';t-j~~
_, .,~~~~~~l!:~~~~?~~~i~f~~:~7;'~:~~.;(· ~. ':r>';:',~;~'~~~~~~?~"T~\\~rf'~~~"~~~'>'~ .
c: c
~1arqueur:
Résistance(Azide
ou
Acide
n21idixicue).
Antibiotiques
Nombre
de
colonies
surviv2ntes
A
54
64*
52
75*
45
112*
70
66*
Total
221
314 ~
1
5
42
32*
1
57
120*
59
90*
60
75*
1
"
"
:
21:8
317*
"
',1.,
:~;
"
1
"
K
62
70*
.~:,
49
84 *
1
56
67*
1
50
89*
'!'/l~("
'~'i
~tr
Total
217
...
~
300*
~.
- ",
",.
c
45
82*
1
"
"
~r.
.
,
:
32
67*
;;7
"~:"
"
1O.'i:
':
: ..
56
112*
1
~;.
"
,
j
(
.,
""C:.
"
39
102*
b
:
,
"
:
·L
Total
172
363*
1
J"
f
'(',
Su
60
100*
56
80*
'.
1
c'
70
70*
80
50>'<
.) t,
266
'~
300*
1
,"
T
néant
néant~
1
!J
<
1
'f
:~:
Tableau
na
24
Énterobacter n 0 2 X [.coli Kî2
4~.
(*) = rÉsultats sur membr2ne de cellophanE
""
1
1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Nombre de colonies examinées de
Nombre de colonies sensibles
'ta de guérison
phénoj:ype
A S K C T Su
1
A
K
C
T
S
Su
1 A
K
C
T
S
Su
Total des 4 boîtes de
gélose = Ll8D
1
200
190
240
0
1 60
215
142
39
50 0
37
49
280*
Nom b r e d e bac t ~ rie s sen s i b l f~
2){
S
~ l'ensemble des produits=
7*
Tableau 25 -
Action de l'éthidium et perte spontanée des caractères chez
enterobacter nO
2.
(*) = perte spontanée.
r'1arqueu!' :
Résistance(Azide ou acide nnlidixique).
Antibiotiques
Nombre de colonies survivan~es
C
85
125*
78
102*
BD
1 1 7}(
74
8[j*
Total
317
388*
A,S,K,T,Su.
néant
néant*
Tableau nO
26 -
Paracolon aerobac-ter X [.coli K12.
(~) = résultats sur membrane de cello-
phane.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 V -
GE~ERALE
OETE~Usl
CONCLUSION
fT DISCUSSION DES RESULTATS
PAR CONJUGAISON BACTERIENNE, GUERISON PAR LE BROMURE
D'ETHIDIUM ET SEGREGATION SPONTANEE DES CARACTERES.
1
1
1 ° - Le tableau n06, dans la première partie de ce travail, p2~
résume
les
résultats
obtenus
pour nos
vingt souches quant à la
1
CMI de quelques antibiotiques. D'autre part, la représentation
1
graphique(tableau n07)
de
ces
résultats
montre
que la
plupart
des
souches ont un niveau assez bas de
rtsistance 2 la Streptomy-
cine,
à
la Kanamycine,
à l'ampici~line et au chloramph~nicol, cel
qui
est un argument en faveur
d'une
origine
extrachromosoGique
de
la
résistance.
La
plupart des
souches
sont sensibl? à
la gent o
mycine.
Par cantre,
le
plus
haut niveau(relatif)
de résistance
21
la
tétracycline est en faveur
d'une
résistance d'origine chromosc
mique.
1
el
2°
-
L'analyse des conjugués
obtenus
faite
par ant{biogramme
par la méthode des
répliques
comme le montrent les figures
9 et
10 d'une
part,
la guérison des
bactéries
hébergeant ces caractè-I
res
transférés par le bromure d'éthidium,
la fréquence
relative-
ment
élevée de
la
guérison spontanée de
ces caractères d'autre
part,
sont en faveur
de
la situation extrachromosomique de
la
1
· ''or
résistance étudi~e. D'après certains auteurs,
la guérison d'une
f
j'
. .~.,
::
bactérie d'un caractère
par un
produit
chimique montre la situa-I
\\.
tian
extrachromosomique de ce caractère'
4 6 ) .
JO _ Les techniques utilisées ont permis d(obtenir les
1
suivants:
six souches
parmi les
vingt
qui
ont é~é étudiées
ont
été
capables de transférer certains
de
leurs
gènes de
résistance
Le
tableau 27 de la
page suivante
résume
ces faits.
Les
ente~o- 1
bacter ont le plus .transmis. leurs caractères de
:r.ésistance"75~:.),
suivis
par les
Proteus(30%).
Par contre
l~ souche d'Aeromonas, -
souches de
Pseudomonas n'ont transmis
aucun de
leurs car 2 ct2Tes·1
Nous
sommes surpris du manque
de
transfert
de la
r~sistance ~
partir de nos souches de
Klebsiella.
1
1
1
"
_._-
'r-'
Souches
Nombre
Nombre
de
Pourcent~ge
étudiées
de
souches
tréJnsferts
de
transfert
Oxydase
Bêta-
obtenus
galactosidase
-
+
Enterobacter
4
3
75%
-
-
Proteus
10
3
30%
' .
+
Pseudomonas
3
.'
0
-
0%
+
+
Aeromonas
1
0
0%
.
-
+
Klebsiella
2
0
Do!10
Tableau
nO
21
-
Pourcentages
des
transferts
obtenus
~ partir des souches
sauvages.
.:.;.'.
'l.".,.,:.t~~~,;··~~~~~tI~~1:~~~~!~~&k~-r~%~",~.'." r'.!"
,.'.~.~ '. ".i";~ ,,~r~ .
a = = -
....
- --
- - - -
1
1
1
Les
transferts
ohtenus sont
group~s dans le tableau n02B.
1
1
Souches
Antibiotypes
Séquences
tT2r,sl
férées.
Enterobacter n01
A 5 K [
T Su
1
S
[
Enterobacter n02
A S K [
T Su
A
S K C Su
Paracolon aer.
A S K [
T Su
c
1
Proteus
n04
A S
[
T Su
A
S
Su
Proteus
nOS
A S K [
T Su
A
r
e-
Su
1
"
Proteus
n01D
A 5
C T Su
S
C
..
1
1
Tableau nO
28 -
Séquences
de
caractères transfé-
rées à partir des
souches sauvages
à
E.coli
K12'1
\\"
,""
1
1
.,:'- J
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4°_
Aucun Pseudomonas,
aucun Aeromonas,
aucune de nos Klcbsiel-
les n'ont pu transférer leurs gènes de r~sistance par conjugaison
1
avec la souche r~ceptrice E.coli K12.
Mais ces résultats n'excluent
en aucune manière la présence de
plasmides de résistance chez les sou-
1
ches
qui n'ont pas pu transférer leurs gènes de r~sistance. Il existe
en effet des plasmides non transférables par eux - mêmes, mais Lrans-
f~rables par d'autres proc~dés comme la transduction, facteur de trans·
1
fert associé,
conjugaison avec une souche HFr que nous n'avons pu réa-
liser par manque de matériel.
On ne peut aussi exclure l'éventualité de résistance intTin
1
sèque chez ces souches,
en considérant les spectres d'activité théoTi-
ques des antibiotiques étudiés~ comme le montre le tableau Bc page 57
5° -
Nous avons vu dans la partie bibliographique de notre expo-
sé que ies facteurs R responsables de la résistance transférable por-
tent l'information génétique permettant l'élaboration d'enzymes qui
~
inactivent les antibiotiques.
[es faits sont représentés dans la figu-
re n05 et le tableau n 0 8.
Parmi les
antibiotiques que nous avons étu-
diés,
nous examinerons les mécanismes d'inactivation:
de la streptomy-
cine,
de la Kanamycine,
du chloramphénicol,
des sulfamides,
de l'ampi-
cilline~ à la lueur des traveaux des différents auteurs.
-
[as de la streptomvcinej
Une adénylation permet l'inactivation de la stTeptomycine en affectan~
; '
i,
.
le groupement hydToxyl en [3,
du N -
méthyl -
glucosamine.
[e mode
': \\ '
. ~\\'
d'inactivation fut mis en ~vidence par UMEZAWA et [011. (î83, 184),
,:. 'il·'
par TA KAS AliJ A e t e 0 11 . ( 1 7 9 ),
y M~ ADA
e t e 0 Il.
c i t Rs i n
2 2 9 •
Un deuxième mécanisme d'inactivation de la streptomycine,
par phosphc-
lation,
fut d~crit par OZANNE et [oil.(148). Le site diaction de l'en-
zyme est le même" que cel~i de l'adénylase(14B), soit:
.. ..
Ç7" ,L;c~nylation ou phcs-
o ~.~ ~=.....mn...,.' phorylation.
1
1
1
-Cas d~ la Kanamycine.
1
DKAMDTD et SUZUKI cités ln 229 avaient les premiers émis l'hypot~ès~
d'une acétylation de la kanamycine A(rappelons
qu'il existe les ~?nl
mycine A, B et C, mais la A est la seule utilisée en thérepeutiou:.-;)
qui fut confirmée par DKANISHI et Coll.
et par UMEZAWA(1 t 6,
153).
Cette aCÉtylation agit sur le groupement aminé du 6 ami no -
6 deoxyl
glucose de la Kanamycine A comme le montre la figure
S,
page
25
Une phosphorylation permet aUSSl l'inactivation de la KanamYCine(îCI
Cette
phosphorylation agit sur le
groupement
hydroxyl en [3 du 6
no -
6 deoxyglucose de la Kanamycine A.
C. H~ N li 2. ~ Acétylation.
1
1
1
OR~
,
1
Phosphorylation
•
1
\\
1
H
1
1
Adénylation
1
Inactivation de la Kanamycine(voir formule com- 1
pIète figure S page
29
1
1
1
·. ff
1
1
Cas du Chloramph~nicol.
L'action des
facteurs
R sur
la mol~cule du Chloramph~nicol a
été aussi démontrée.
L'enzyme est
une
transacétylase qui ac~tyle le~
groupes
hydroxyles de
la mo16cule{voir molécule complète figure
5
page
29
IV H c..O Co. ti cO. 7-
\\
.. . .. ,
cH
c. H - C. l4 a:.
f
1
OH
OH
'" 7
Acétylation.
Inactivation du Chloramphénicol.
Quant aux sulfamides.
bien
que la
résistance transférable
à
ces
produits ait
été découverte
depuis,
le mécanisme biochimique est
peu
élucidé.
On
émet
encore l'hypothèse
d'une
imperméabilité de
la
bactérie à la drogue
hébergeant le
facteur R.
En conclusion,
la résistance
que
nous avons
pu
transférer a
les mêmes séquences couramment rencontrées
en France{166.
168,
152).
La sensibilité de
nos
souches
à la
gentamycine se
justifie par le
fait
qu'en 1971,
la résistance à
ce
prodùit était encore
rare con-
trairement à ce que montre
la
presse
médicale à l'heure actuelle
(229,230,
231,135,
136
) .Les mécanismes
démontrés
par divers
auteurs
1
ont sans doute
été mis
en
jeu pour
inactiver nos
antibiotiques
~tu
diés,
par les bactéries.
Dans les
cas
de
non transfert,
la résista~,
naturelle n'est
pas aussi à
négliger.
1
1 ,"
,
1
1 ~:t .~l-
I
1
1
1
1
CHAPI TRE
V.
1
ANALYSE DES CONJUGUES OBTENUS- CALCULS DES FREQUENCES DE TPf',[i<=,-
FERT.
ESSAIS SUR LtINTERRlJPTIOr-.; DE l_A CONJUGAISDN. ESSP,IS DE
1
GUERISDN A DIFFERENTES CONCENTRATIDNS DE LA GAM~E
D'ETHIDIUM.
l
-
ANALYSE DES CONJUGUES oBTENUS o
1
L'analyse des conjugués obtenus a ét~ conduite de la façon sUi-1
vante:
1
1°
-
Nous avons étudié les caractères transférés à E.coli K12
comme le montrent les figures nO
9 et 10.
par antibiogramme et par la
méthode des répliques à l'aide des tampons de velours~ voir pages70
1
et 71.
2°
-
Les concentrations minimales inhibitrices des antibiotiqUel
auxquels ces souches étaient devenues résistantes avaient été déte~mi
nées par la technique de SCAVIZZI et Coll.(
169, 163). Les résultats
obtenus figurent dans le tableau nO 29 de la page suivante. On peut yi
faire remarquer qu'une :'résistance
transférée se situe soit au même
niveau soit à un niveau inférieur.
1
3° -
les caractères biochimiques ont §t6 à nouveau examinés
sur les galeries API SYSTEM et selon les techniques décrites par L.
1
LE MINoR in 121; nous n'avons observé aucune modification de ces caral
tères.
1
1
1
!
, ,
1
1
1
1
1
- -
96
1
1
Bactérie donatrice
[.M.I.
[onjugu~ obtenu
[.rJ\\. 1.
1
Enterobacter n02
A
16
E.coli K12
A = 16
1
A 5 K T S Su
S = 64
A K C S Su
S = 32
Su= 64
Su= 64
c
1
= 64
[
= 64
T = 64
K = 16
Enterobacter n01
A = 16
E.
coli K12
1
A S K T S Su
S = 64
'S C
S = 32
Su= 1 28
1
C = 64
C = 64
K = 64
T == 32
1
Paracolon aerobact
A = 32
E • coli K1 2
A 5 C T Su
S = 64
r
C = 64
[
[
64
T
256
1
Su= 128
,-
Proteus nO 4
A = 32
E.coli K12
A = 16
1
A S C T Su
-c = 64
A S Su
T
256
S = 64
S = 1 6
Su= 128
Su= 32
Proteus nOS
A = 1 6
E.
coli K12
A S K [
T Su
K = 64
ACSu
A = 16
C = 64
C = 64
T
256
S = 64
Su=128
Tableau nO
29 -
[
M l
des souches donatrices et
des souches réceptrices.
1
·',
•.1
1
,-' !
1
11- ESSAIS DE
nEl
MINATIO\\IJ DE LA FREOUENCE
1
a)
-
Int
JdU'
1
1
Quand
F.tudi
;s r~sistances transf~rables. la notion de fr~-
quence
d,
11
.'a
e
" , "> " 0 t ion i mp 0 r tan te.
0 n a p p e Il e
he bit u e
ment
fr~
~n[
r
1sfert le rapport du
nombre de bact~ries r~ce~
.,~ ,
trices
(
=: n u,
S
',tantes au nombre
de
bactéries donatrices
prés,l
tes
dan~~
ml
~lume d'inoculum(175. 168).
1
b)
-
M6'\\;hC1rlo~rie.
1
La
technir;ue
:Jrécédemment d~crite pour les conj ugaisons bacté-
riennes
en bau: .lon a
été
utilis~e mais en limitant le contact des 1
bactéries donfrices
et r~ceptrices è 30 minutes.
Cette foi'
-
ci,
nous fait la
s~lection des clones à di fférentesl
3
4
5
6
dilutions
10-
10-
,
10-
,
10-
• 10- 7 •
cL -
~__,--~ ..i. du nombre de bactéries donatrices.
.1
Nous
nou,,::
sommes inspirés de la
technique décrite
1
in
168.
Quarld
la culture 0~: la bactérie donatrice ~tait arrivée en phase exponen-
tielle
termi~ale, avant mélange, elle a été diluée de 10 en 10
8
6
jusqu'à 10-
O.
10ml ou 0.02 ou 0.05 ml
des dilutions
à 10-
1
7
8
10-
•
10-
étaien~ ensemenc~s, sur de la g~lose lactos§e additionn~e1
de l'un des
antibiotiques auxquels
c~tte souches
~tait résistante
(168).
Parallèlement,
des numérations
étaient faites
en inclusion,
1
pour comparer les résultats.
Le nombre de
colonies obtenues permet-
tait de
calculer la fréquence
de
transfert
pour chaque facteur ce
1
résistance
par rapport
au donneur au bout de ces trente minutes.
le tableau nO
30
présente les différents résultats
obtenus.
1
1
1
1
~j [:
pi
1\\1
1:
~';\\lid·i.'
f
.li ,!
11 .~
Ex.mol. ri. celcul:
si le nombre de bactfri." .vant 1. m~l.n-1
gc est deN ( bac t ~ rie s don i'.l tri ces) et S l
a p r è s
J (J min u t P. S
d p
con t" ct If
la s~lection
sur un milj~u contenant lA drofJue 1: ~tl)dier donnF. un
;1
1
;
nombre NI
de bact~ries r~ceptrices, la fréquence est alors donn~e
il;
par le rapport:
NI
N
Ainsi la fr~quence rour Je ci'.lractère C chez Enterohacter
11\\
2
'f
n02 était obtenue N = 2,2 1U~bactéries par ml et NI = 6,6 10
~
2
-7
6,6 10
=
3.1 0
.!
la fréquence =
9
2,2 10
Pour IIEnterobacter n02. nous avons obtenu:
Numération avant mélange
Sélection après Jomn
9
3
N =
2,2 10
Iml
fl.
5.7 10
3
K
2
1 0
2
C
6,6 10
2
5
9,5 10 2
Su
9.0 1 0
Pour l'Enterobacter n01
2
5
6 , 0 10 4
C
1,0 1er
Pour Paracolon aerob.
8
2
N=3.710
C
7,1.10
Pour le Proteus n04
•
8
2
N ::>' 2.2 1 0
A
7,2.10
2
5
,9.0.10 2
Su
1 1
• 1 0
1
1
1
POLIr
IF. nToteus nO :-i:
4
1
A
c: .
-'
10
2
C
6,1.10
1
2
Su
2 , 1 1 0
1
Pour le proteus n010:
1
1
1
c
5,0.10
Su
7,01U'
1
1
Nous regroupons tous les rapports~ dans le tableau n030
I\\J
sur cette même page.
1
"
.
A
.
K
C
.
T
.
S
l Su
..
7
"
Enterobacter nO 1
0
0
6. 10
0
1.10- 5
0
A K C T S Su
1
1
Enterobacter n02
-6
2. 1 0
h.10- 6
3. 1 0- 7
0
5.10- 7 1 4.10 -7 ..
A K [
T S Su
1
1
•
Paracolon aerob.
0
0
2.10- 6
0
0
0
1
!,.
A K C T S Su
1
6 -
1
Proteus n04
3.10- 6
0
0
0
4 . 1 0- 7
5 10
1
.
-
A C T S S'u
7
Proteus n05
5.10- 5
c-.
0
6.'0-
0
0
1
2.,1
A K C T S Su
1
Proteus nO 10
0
0
5.10- 7
0
7.10- 7
0
"
A [
T S Su
1
·1
i
1
Tableau nO
30 -
Fréquence de transfert rour c~aq~e C2T2C1
tère.
1
..~
1
."
.>,
l l l
-
ES S AJ sni J NTf RRlJ PTI [J N DE U\\ C[) f': J lJ GAI 5 [H! t~. T): ~-:=- F P Frn s
INTERVALLES nE TEMPS.
ES 5 AIS DE GLJ ERIS 0 N DES BA [ TEli lES
ADE S CLH,] [ UH R.i\\ TI Ci ..
DIFFERENTES ET TRES RAPPROCHEES
DE LA
GAMME
DE
BROMU-
RE
D'ETHIDIUM.
Introduction:
En réalisant ces deux essais,
nous avons cher-
ché à atteindre le but suivant:
le nombre de plasmides portés par le~
bactéries qui ont pu transférer leurs caractères de
résistance.
NetrE
hypothèse a été la suivante:
1° -
En interrompant le phénomène de la conjugaison dens le
temps,
nous avons cherché à déterminer le moment exact o~ un caractè-
re peut s'exprimer.
Si
un caractère chez une bactérie multirésistantE
peut s'exprimer dans le temps indépendemment des autres
ca~actères,
i l a des chances d'être
porté pôr un
plasmide différent.
2°
-
En faisant
des essais de guérison à
des concentrations
très rapprochées et différentes de la gemme de
bromure d'éthidillum,
nous avons cherché à voir si un caractère pouvait,
chez une bactérie
multirésistante,
être éliminé à
une concentration différente de cellf
qui élimine l'ensemble
des caractères.
Un tel caractère a
des chance~
d\\être porté par un plasmide différent.
Méthode:
a)
-
Techniaue d'interruption: La technique que
nous avens uti-
lisée est relativement simple.
Certains auteurs comme WATANABE et
FUKASAWA in
193 avaient déjà montré que le transfert de
la multiré-
sistanee par cônj~gaison peut être interrompu par agitation brutale
du mélange
des bactéries donatrices et récept~ices, ce
qui montre
bien d'ailleurs
la nécessité d'un contact entre les
bactéries.
Ces mêmes auteurs avaient remarqué aussi qu'une
très
grande dilution
du mélange des deux cultures réduit considérablement les chances de
conjugaison bactérienne.
Pour diminuer encore davantage les chances
1 U 1
1
1
1
de conjugaison,
nous avons fait
nos dilutions du m~lange en sclu-
tion saline
à 9 pour mille.
En effet,
un milieu pauvre,
1
si':ns source
de carbone ne favorise pas le ph~nomène de conjugaison bact~rienne
1
qui nécessite pour sa réalisation de l'énergie fournie
per pnosphori
lation oxyc:lative(EGA\\oIA 1961
in 82).
Les interruptionsse feisaient a-
près15~Notre agitation était manuelle, dès la sortie du tube de l'~tuve
et le mélange était aussitôt dilué à 1/100 c'est-à-dire 0,1
ml du
1
mélange dans 9,9 ml de solution saline. Cette dilution était ensuite
6
agitée et les dilutions étaient faites
jusqu'à 10-
comme nous l'a-
1
vons fait lors des sélections après les incubations de 18 heures,
lors des conjugaisons en bouillon.
Les sélections étaient faites
6
sur les dilutions à 1/100,
1/1000
1/100000 et à 10- .
1
b)
-
Les essais de guérison étaient faits à des concentrations
1
inférieures à la concentration minimale inhibitrice de toute cultu-
re visible à l'oeil nu. La gamme était ainsi plus serrée selon la
1
progression suivante:
75 mcg/ml,
100,
125,
150,
175,200 etc . . . .
1
Résultats:
1
L'interruption de la conjugaison, toutes les quinze minutes,
la
guérison à différentes concentrations ne nous ont pas peT~is de
. d~ssocier les plsamides. Ou bien la guérison était obtenue pour tousl
. les caractères ou rien du tout.
L'interruption ne permettait d'oeseT
ver l'expression phénotypique des caractères qu'après trente minutesi
ou quarante mais pas un temps inférieur.
Pourtant certains auteurs
ont obervé des transfert dès le mélange
J
des souches(
248).
Pour le paracolon aerobacter ~ui n.'a transmis qu'un seul caractè
rE,
nous pouvons affirmer l'existence d'un seul pla.smide.
POUT
les
autres souches,
nous ne pouvons nous prononcer car des plasmides
1
différents peuvent être guéris à
une même concentration en bromure
d'éthidium. Même si on resserr~ la gamme davantage, il est c:liffiCil,1
d'obtenir un résultats
satisfaisant.
Bien sûr nous savons qu'il
existe une
li"'
m~thode plus é16gante qui est basée sur la ~adioactivitél
Nous n'avons pas pu la réaliser par manque de matériel.
1
1
1
1C2
RESUME
ET
CONCLUSIONS
GENERALES.
1 -
Devant l'importance,
sans cesse croissante, des infections
bactériennes rebelles ou difficilement jugulées par la thérapeutique,
nous avons voulu nous initier à l'étude des mécanismes d'apparition
de la résistance bactérienne aux antibiotiques,
chose indispensable
en épid~miologie.
II -
Après un bref rappel sur les différentes cat~gories de résistan-
ce,
c'est -
à -
dire naturelle et acquise soit d'origine chromosomique'i
soit d'origine extrachromosomique,
nous avons identifié et réparti nos
souches selon leur origine.
Cette répartition montrait l'origine urinai·
re de la majorité des souches qui s'explique par la pression de sélec-
tlon exercée par les antibiotiques qui atteignent des concentrations
très élevées dans les urines.
III -
Les essais de sensibilité par l'antibiogramme par la méthode ~esl
disques de CHABBERT et le calcul des concentrations minimales inhibitri:
ces des antibiotiques et sulfamides par la microméthode de SCAVIZZI
et
coll. montraient des valeurs relativement élevées pour les tétracycli-
nes i256 mcg/ml) et pour les sulfamides 128 mcg/ml mais par contre des
1·::',-
J"
valeurs très basses pour la gentamycine qui a été très active sur la
.
'f
,":;
majorijé
des souches étudiées.
La plupart des souches hébergeaient
1
au maximum cinq caractères de résistance.
IV -
Pour expliquer le mécanisme de la r~sistance ainsi observ~e, nous
nous sommes d'abord demandés si cette résistance était d'origine extra-
chromosomique.
Nous avons tenté de transférér
cette résistance par
1
conjugaison bactérienne car on sait que les facteurs de résistance ou
plasmides ou facteurs R sont transférables par conjugaison.
Pour corro-
1
borer les résultats obtenus par conjugaison,
nous avons exploité la
propriété des facteurs R d'être éliminés par l'effet de certains pro-
1
duits comme le bromure d'éthidium que nous avons délibérément utilisé.
Nous avons aussi exploité la propri~té des facteurs R de se perdre spon
tanément au cours du temps.
1
1
i~1
t
1 l l . J
1
1
1
1
v - Ces techniques ont permis de réunir les résultats suivants:
1
1~) - Six souches bactériennes sur vingt souches étudiées ont
transmis au moins
un caractère de résistance.
.\\1
2°)
-
La résistance acquise,
analysée par antibiogramme et par
la m~thode des '~~pl~ques, se situait soit au m~me niveau soit
~
à un niveau inférieur
chez (.Coli K12.
r
il'I
. i
3') -
biochim~1
Les conjugués n'ont perdu aucun de leurs caractères
ques.
~I
,/
"
.~
4°)
-
La concentration minimale inhibitrice en bromure d'éthidium '
S
1
de
toute culture visible à l'oeil nu des souches oscillait entre
250 et 500 mcg/ml.
5°)
-
La fréquence
de
guérison par le
bromure d'éthidium se si-
tuait entre 32 et 82%.
1
1
~
fréquence
de la perte spontanée
oscillant entre 10-
est différente de la fréquence
de mutation
réverse dans
1
un cas de résistance chromosomique.
où la fréquence
est de l'or-
.
-7
dre
de
10
•
'~'
1
VI
-
Le caractère de
résistance aux tétracyclines(T)
est remarquable,1
par rapport aux autres
par une CMI
à un niveau
plus
élevé(sup.
à
256 mcg/ml).
Or ce caractère semble correspondre,
d'après nos
essais
à un gène chromosom~q~e(non transférable et non guéri),
ce
qui est en accord
avec l'observation générale
que le niveau
1
de résistanée dû à
un gène chromosomique
est plus élevé
que celui
conféré par un
gène extra -
chromosomique.
1
1
VII
-
Nous n'avons pas trouvé de plasmide
autotransférable
chez
les souches du
genre
Pseudomonas et Aeromonas,
bien
que les nive-
aux de
ré 9 istance de ces germes aux antibiotiques soit r~lative- 1
ment
peu élev~B, comparables à ceux des facteurs transferables~
1
1
1
Nos résultats sont en accord
dans ce domaine avec les observations
publiées par d'autres auteurs(231,
152).
VIII
-
Nous avons tenté d'interrompre les conjugaison à différents
moments après le mélange des souches donatrices et réceptrices
pour
pour voir s~ les caractères étaient transférés séparément à E.
coli
K12,
mais i l nous a
semblé
que
ces caractères ont été transférés en
bloc,
appartenant à un même
plasmide sans doute.
Les essais de
guéri-
son à différentes concentrations en bromure d'éthidium ne
nous
ont
pa,
aussi
permis de guérir la bactérie de ces caractères séparés.
Il nous
semble que ces caractères appartiennent à des plasmides
uniques.
-'"..
1 't
1
·1
1
1
E l E LlO 5 R A PHI E
1
A
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d
"
t"
f
C14
"
'd
b
' L
-
an
~ncorpora ~on 0
am~no
ac~
s
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1 91 •
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, ,
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Z
L
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:'~I'
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87 -
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1
1
1
TABLE
DES
MATIERES.
: -
1
p.ages
1
Avant - Propos
Introduction
1
PREMIERE PARTIE:
,"
1
Rappels sur la r6sistance bact6rienne aux abtibi~tiqu~~
.
,
'
PrEsentation du mat6riel d'Etude. Essais de sensibilitE:.
CHAPITRE 1: Rappels sur la r6sistance bact6r~enne aux
aux antibiotiques.
0
1
Notion de résistance aux antibiotiques
R6sistance naturelle
2
R6sistance acquise •••••••••.••••••.• 2
10
1
CHAPITRE II: Origine et répartition des souches.12
j
1
Identification ••.•••••...•••....•. 13-1.6
Epreuves ,de sensibilité •••••••...•.•... 17-25
1
DEUXIEME PARTIE:
1
Introduction: rappel~ sur la conjugaison des facteurs,R.
page 25
CHAPITRE 1 : Conjugaison en milieu liquide •...•• 32
1
Con j u gai s b n .sur ce 110 p han e ••......•.... 4 3
1
CHAPITRE II: Essais de guérison des bactéries par
le bromure d'6thidium ••........ ~ ......• 46-51
. '
1
CHAPITRE III: Recherche sur la perte des caract~res
~2~
n
•
,
(, \\\\
1
CHAPITRE IV
R6sul t'a t s
; 5~n
7/}!
CON CLUS ION 5
.. (1;;8 2
1
BIBLIOGRAPHIE ••.•••••••.••.••••.••..• ". . . . • . • . . . • . . • ~ 105
1
1
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:l VANT··PROPOS
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les t echni que·s:·('il9S .pl ùs déli:ç
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pratiqu6es ~ l'Un{t$ C'l'lü l êra ou dansd.' au{res L.ab'
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ont su nous ouvrir- lC?uJ's por~es. Je ·dois encorf.!~'Qu
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part actiue cie m.on. a.li1~ le Docteu.r f. GEIZER dan.s la"'rea
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ciéc!:: c:cc ',:3. J'aim.erais cependant rapp'2Zer au
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Z 'U,;,U5 C.',c)?i:'a cie
l.'Institr..!f Pasteur de PaTia'.:'"
....... >.:.
dan.s Cf: Se: 1,<ce fut tr,:s enrichissant. à to'ut po'i
ren.o~weLcr· ,~ /loi1.siclC fi'. GUILLOU tout. mes .remerCf<t
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sa COllt[U):.~t~O:l appréc:able. Le pér'son.ne,l du L~l2:9
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la Sm7.t6, ilessieurs ~. OKER;[NO~~t D. i1If~;
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l it~notj"c recherche bibl iographique.
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