UNIVERSITE DE PROVENCE
AIX-MARSEILLE 1
THESE
présentée par
Aboubakar Sidiki OUATTARA
pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR - MENTION SCIENCES
(Biologie Cellulaire - Microbiologie)
CONTRIBUTION A L'ETUDE DES BACTERIES
REDUCTRICES DU FER ET DU SULFATE DANS
LES SOLS DE RIZIERE DE LA VALLEE DU KOU
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Soutenue le 29 Juin 1992 devant la Commi~Î<ffl"di'examen
MM
J-p
BELAICH
P
CAUMETTE
Rapporteur
TA
HANSEN
Rapporteur
J-L
GARCIA
S A
TRAORE

A mes parents

Ce travail a été réalisé principalement au Laboratoire de Microbiologie OR5TOM à
l'université de Provence, Marseille, FRANCE puis en partie au Laboratoire de Biochimie et
Microbiologie de l'Université de Ouagadougou, BURKINA FASO.
Je voudrais tout d'abord remercier Monsieur Alfred S. TRAORE, Professeur à
l'Université de Ouagadougou, pour la grande confiance qu'il a bien voulu m'accorder et lui
exprimer toute ma grattitude pour m'avoir encadré, conseillé et aidé tout au long de ma
formation
Je tiens à remercier également:
Monsieur Jean-Louis GARCIA, Directeur de recherche à l'ORSTOM, pour m'avoir
accueilli dans son laboratoire. Je lui exprime ma reconnaissance pour son aide et la confiance
qu'il m'a porté.
Monsieur Théo A. HANSEN, Professeur à l'Université de Groningen, Pays Bas,
d'abord pour m'avoir fait profiter de sa grande compétence et de son expérience en
biochimie des bactéries anaérobies, puis ensuite de l'honneur qu'il me fait en acceptant de
juger ce travail en tant que rapporteur.
Monsieur Pierre CAUMETTE, Professeur à l'Université de Bordeaux pour m'avoir
accordé le privilège de juger ce travail comme rapporteur.
Monsieur Jean Pierre BELAlCH, Professeur à l'Université de Provence, Marseille,
pour l'intérêt qu'il a bien voulu porter à ce travail en acceptant de faire partie de ce jury.

Je remercie très chaleuresement:
Monsieur Pierre Armand ROGER, Directeur de recherche à l'ORSTOM, pour le
soutien moral et les encouragements qu'il m'a apporté, ses commentaires et suggestions
constructifs et enfin, pour tout le mal qu'il s'est donné pour corriger les articles présentés
dans ce travail
Mademoiselle Nadine CUZIN, pour toute l'aide qu'elle a pu m'apporter lors de nos
expériences d'enzymologie, pour avoir fait les figures présentées puis la mise en page finale
de ce travail et enfin, pour son soutien et ses encouragements
Je remercie enfin:
les co-auteurs des articles présentés dans ce travail
tous ceux qui, par leurs assistance technique, leurs suggestions et commentaires, ont
contribué à la réalisation et à l'amélioration qualitative des articles présentés dans ce travail
les chercheurs, étudiants et stagiaires du Laboratoire ORSTOM de Marseille par leur
sympathie, leur encouragements et conseils m'ont aidé lors de ce travail
la direction et tout le personnel du Projet Agricole de la Vallée du Kou, mais plus
particulièrement Issiaka OUEDRAOGO et Zoumana OUATTARA, pour leur aide et leur
,
disponnibilité lors de la collecte des échantillons de sols
le personnel et l'ensemble des étudiants et stagiaires du Laboratoire de Biochimie et
Microbiologie de l'Université de Ouagadougou, pour leur collaboration, leur amitié et
surtout leur bonne humeur
toutes les amies et tous les amis qui m'ont aidé, soutenu et encouragé tout au long de
ce travail
le peuple Burkinabè, pour tous les sacrifices consentis pour assurer et faciliter ma
formation

SOMMAIRE

AVANT PROPOS
1
~1rFtOl)lJ<=1lIO~ 13113~I()(JRAPflI~lJI:
5
1. ~I:S I3A~RIES R!:l)lJ<=1lRICI:S l)lJ FER
8
2. US I3A~RœS S~FATO-R!:l)lJ<=1lRICI:S
Il
2. 1. Réduction des accepteurs d'électrons
13
2. 1. 1. Réduction du sulfate
13
2. 1. 2. Réduction d'autres accepteurs d'électrons
18
2. 2. Métabolisme des donneurs d'électrons
20
2. 2. 1. Métabolisme de l'hydrogène moléculaire
20
2. 2. 2. Métabolisme du formate
23
2. 2. 3. Métabolisme des alcools
23
2. 2. 3. 1. Métabolisme des alcools primaires monovalents
23
2.2.3.2. Métabolisme des polyols
25
2. 2. 3. 2. 1. I:thylène glycol et 1,2-propanediol
25
2. 2. 3. 2. 2. 1,3 propanediol
26
2. 2. 3. 2. 3. Glycérol
27
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2.2.4. MétabolIsme du lactate et du pyruvate
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2. 2. 5. Métabolisme des sucres
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2. 2. 8. Métabolisme du propionate
36
2. 2. 9. Métabolime du butyrate et des autres acides gras à longue chaîne
38
2. 2. 10. Métabolisme du malate, du fumarate etdu succinate
39
2. 2. 11. Métabolisme du furfuraL
39
2.2. 12. Métabolisme des composés aromatiques
39
2.2. 13. Métabolisme des alcanes
40

PRESENTATION DU SITE
41
TRAVAUX SUR PUBLICATIONS
45
Article 1: Etude des bactéries réductrices du fer et du sulfate dans les sols de rizière
de la Vallée du Kou (Burkina Faso)
47
Article 2: Characterization of sulfate-reducing bacteria isolated from Senegal
ricefields
59
Article 3: Characterization of Anaerovibrio burkinabensis sp. nov., a lactate
fermenting bacterium isolated from rice field soils
80
Article 4: Anaerobic degradation of 1-2 propanediol by a new Desulfovibrio strain
and Desulfovibrio alcoholovorans
89
DISCUSSION
109
CONCLUSIONS
116
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
120

AVANT PROPOS
1

Le riz est la troisième céréale mondiale si l'on considère la quantité produite (468
millions de tonnes par an en 1990), mais la première en ce qui concerne la consommation
alimentaire humaine. Il constitue la base du régime alimentaire de près de la moitié de la
population mondiale. Ce n'est généralement pas une culture de rente et moins de 5% de la
production mondiale est commercialisée sur le marché international. D'ici l'an 2020, une
augmentation de la production rizicole mondiale de 300 millions de tonnes (environ 60% de la
production actuelle) sera nécessaire pour assurer les besoins alimentaires de la population du
globe. Cet accroissement de production devra être obtenu principalement en augmentant les
rendements sur les surfaces cultivées car la majorité des agro-écosystèmes favorables à la
riziculture est déjà plantée en riz. L'intensification et l'optimisation des pratiques culturales
permettent d'espérer des rendements théoriques de 10-15 tonnes/ha. Mais un rendement moyen
réel de seulement 2,3 à 5 tonnes/ha est observé de par le monde. Plusieurs facteurs limitants
rendent impossible l'obtention de rendements optima. La toxicité de certains métabolites issus
des activités microbiennes comme les sulfures et les ions ferreux, peut être une cause non
négligeable de la baisse de rendement.
C'est en Asie que se situe l'essentiel des surfaces rizicoles du globe. La riziculture sur le
continent africain ne réprésente que 5 à 6% des surfaces rizicoles mondiales. A l'exception de la
Casamance au Sénégal qui possède une variété de riz très ancienne que l'on ne trouve nulle part
ailleurs, les autres cultivars de riz présents en Afrique ont été introduits et proviennent d'Asie.
La riziculture est pratiquée depuis des millénaires dans la plupart des pays de l'Afrique de
l'Ouest comme le Burkina Faso, la Côte d'Ivoire, le Mali, et le Sénégal.
Le Burkina Faso est un pays enclavé où la culture du riz se fait essentiellement dans les
bas-fonds à l'exception de quelques zones aménagées pratiquant une riziculture irriguée.
Comme la plupart des pays en développement, le riz est l'aliment de base de presque toute la
population Burkinabè. Les différents gouvernements successifs du Burkina Faso ont inscrit
l'autosuffisance alimentaire comme première priorité de leur politique de développement. C'est
ainsi que depuis de nombreuses années, les efforts des autorités sont orientés vers
l'accroissement de la productivité de l'agriculture d'une manière générale et de la riziculture en
2

particulier. Dans ce secteur, les données statistiques disponibles révèlent les caractéristiques
suivantes:
1) la production de riz non décortiqué qui était déjà au faible niveau de 45000 tonnes en 1981-
82 et de 44000 tonnes 1982-83, s'est abaissée à 38000 tonnes en 1986, alors que les quantités
nécessaires pour satisfaire les besoins de la consommation étaient estimées à environ 70000
tonnes de riz usiné;
2) la consommation de riz par an et par habitant varie entre 4 à 6 kg dans les zones rurales et 60
à 75 kg dans les zones urbaines, avec une moyenne de 8 kg (Rapport ADRAO, 1983);
3) les imponations de riz ont été de 104022 tonnes en 1985-86, correspondant à des sonies de
devises évaluées à plus de 4 milliards F CFA et augmentent d'années en années;
4) les rendements tendent à baisser d'une manière régulière et aujourd'hui on a pour cet élément
les données suivantes:
- riz pluvial: 0,5 à 0,7 t/ha pour des variétés ayant un potentiel de 3 à 4 t/ha,
- riz de bas-fonds: 1,0 à 1,5 t/ha avec des variétés ayant un potentiel de 6 à 7 t/ha,
- riz irrigué: 2,5 à 3,0t/ha pour des variétés ayant un potentiel de 8 t/ha;
5) les superficies cultivées en riz sont estimées à 42000 ha, alors que les surfaces irriguées
potentielles sont évaluées à plus de 165000 ha (Hébié, 1979; Sanon, 1985; Sawadogo, 1982).
Les baisses de rendement sont aggravées aujourd'hui par l'abandon de certaines terres
aménagées à cause d'une part, de la méconnaissance des techniques optimales d'exploitation, et
(j'autre part de la dégradation continuelle des sols de rizières et l'apparition de toxicité dues aux
sulfures et/ou au fer dans les sols. Par exemple, à la plaine aménagée de la Vallée du Kou
(située à 25 km au Nord-Ouest de Bobo Dioulasso) , environ 300 hectares ont été abandonnés
en 1986 à cause de la fone toxicité du fer. Dans le Sud-Ouest du pays, zone de riziculture par
excellence, les mêmes problèmes sont rapportés chaque année dans de nombreux sites
aménagés.
Aucune étude n'a abordé jusqu'à présent, l'aspect microbiologique du problème de
l'intoxication des plants de riz par les ions ferreux et les sulfures au Burkina Faso. Cette étude
constitue donc une première approche d'écologie microbienne des sols de rizière du Burkina
Faso et ses principaux objectifs sont les suivants:
3

- suivre l'évolution des populations de bactéries réductrices de fer et de sulfate dans les
sols de rizières tout au long du cycle cultural dans les zones où apparaissent des phénomènes de
toxicité due aux sulfures et aux ions ferreux;
- caractériser et étudier la physiologie des souches dominantes isolées de ces biotopes
afin de déterminer leur rôle dans ces problèmes de toxicité et comprendre leur mode d'action.
A ce niveau, l'étude physiologique a été étendue à certaines souches dominantes isolées de sols
de rizières du Sénégal afin de pouvoir faire une étude comparative.
Le travail a nécessité deux périodes de prospections d'au moins six mois chacune
couvrant deux cycles culturaux, en 1989 et 1990 au Burkina Faso.
Ce mémoire qui expose les principaux résultats de nos études comprend trois parties:
- une introduction bibliographique qui rappelle l'essentiel des connaissances actuelles sur la
systématique et la biochimie des bactéries réalisant la réduction dissimilatrice du fer et du
sulfate;
- une série de résultats et discussions présentés sous forme de travaux sur publications;
- une discussion et une conclusion générales
4

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
5

La rizière est un écosystème artificiel hétérogène dont l'équilibre est continuellement
perturbé par des pratiques culturales (irrigations, fertilisation, semis, etc.) et des phénomènes
naturels (pluies, changements de température, etc.). On y observe donc une extrème instabilité
et des fluctuations sur une courte période (cycle cultural) mais une certaine stabilité sur une
longue période. L'écosystème "rizière inondée" est constitué de cinq sous-systèmes principaux:
l'eau de submersion, le sol oxydé de surface, le sol réduit, le sous-sol, le plant de riz, sa
phyllosphère et sa rizhosphère (Fig. 1).
Biomasse
photosynthétique
aquatique
Eau de
Sol oxydé
Zone
submersion
photique
oxydée
Zone
aphotique
réduite
réduit
Sous-sol
ou oxydé
Figure 1: Schéma synthétique des principaux sous-systèmes d'une rizière submergée
(d'après Roger, 1991).
Bien que ces sous-systèmes puissent être différenciés macroscopiquement, ils sont plus ou
moins continus à cause de leurs interactions. Dans chaque sous-système, il y a des niveaux
inférieurs dans lesquels les communautés biotiques se dévéloppent plus ou moins séparément.
Les interactions entre les différents sous-systèmes constituent un phénomène clé dans les
6

processus régissant le flux d'énergie et l'échange de matière dans la rizière. Chaque sous-
système possède des caractéristiques chimiques et biochimiques particulières qui font que les
populations d'algues, de champignons et de bactéries qui s'y développent, lui sont spécifiques
(Ponnamperuma, 1972; Watanabe et Furusaka, 1980; Yoshida, 1975). Les activités des
microflores aIguales et bactériennes dans les rizières sont très fortement influencées par l'apport
de nutriments (sources de carbone, d'azote, de phosphate, de phosphore, type de source
d'énergie,etc.) et par les conditions physico-chimiques (potentiel rédox, température, pH,
salinité, etc.). L'apport de source de carbone et d'énergie nécessaire aux activités des
microorganismes est assurée par la décomposition des pailles et des chaumes, de celle de la
biomasse photosynthétique (algues, adventices) et par les exsudats racinaires ( Jacq, 1989).
Quand les conditions nécessaires à ces activités microbiennes sont réunies, celles-ci se
déroulent selon un ordre séquenciel allant des bactéries aérobies aux méthanogènes en fonction
de la quantité et de la nature de(s) l'accepteur(s) d'électrons disponible(s). Mais ces activités
peuvent parfois avoir lieu simultanément. Une très grande diversité de microorganismes
peuplent le biotope complexe qu'est la rizière. Il y a un recyclage continu de la matière
organique et minérale grâce à des processus biologiques et abiotiques.
Les accepteurs d'électrons dont les produits de réduction peuvent être toxiques pour les
plants de riz, sont le fer ferrique et le sulfate (Jacq et al., 1991). L'intoxication du riz serait due
à une pénétration des sulfures, et/ou des ions ferreux libres dans le système racinaire des
plantes ou à un dépôt de FeS sur les racines (Prade et al., 1990; Jacq et al., 1991). Les activités
des microflores réductrices du Fe(IIl) et du sulfate peuvent donc avoir des conséquences
économiques néfastes. Ceci a amené les microbiologistes à s'intéresser aux activités des
bactéries impliquées dans les différentes transformations de ces composés et de leur produits de
réduction dans le cycle biologique de la matière dans les rizières.
Une grande partie de la réduction du Fe(IIl) dans les rizières est dûe aux activités
bactériennes (Ponnamperuma, 1972; Watanabe et Furusaka, 1980; Prade, 1987). La réduction
du Fe(IIl) dans les rizières est souvent couplée à l'oxydation des substrats, probablement à
travers les systèmes de transport d'électrons des bactéries anaérobies facultatives ou strictes.
Une grande diversité de bactéries participent à la réduction du fer dans les rizières (Prade,
7

1987). Elles peuvent être aérobies ou des anaérobies facultatives comme cenains Pseudomonas,
Micrococcus, Bacillus, certaines Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae, ou des anaérobies
strictes comme cenains Clostridium, Desulfotomaculum, Desulfovibrio.
La sulfato-réduction est un phénomène très fréquemment observé dans les rizières; elle
serait responsable de 95 à 97% des sulfures produits dans ces biotopes. Les bactéries sulfato-
réductrices (BSR) sont très souvent présentes dans les sols de rizières où les sulfures produits
par leur activité peuvent être léthaux pour les plants de riz (Jacq, 1989; Watanabe et Furusaka,
1980). Les BSR sont localisées dans les horizons oxydés ou réduits des sols de rizières, dans
des microsites anoxiques (Durbin et Watanabe, 1980; Garcia et al., 1974; Jacq, 1989). Le
nombre de sulfato-réducteurs varie entre 101 à 103 bact./g de sol dans les rizières non
submergées et de 1()4 à 108 bact./g de sol sec, dans les rizières submergées (Garcia et al., 1974;
Jacq, 1989; Watanabe et Furusaka, 1980; Yoshida, 1975).
1. LES BACTERIES REDUCTRICES DU FER
La réduction dissimilatrice du fer ferrique [Fe(III)] est un processus au cours duquel les
bactéries tirent l'énergie nécessaire à leur croissance, de la réduction du Fe(III) couplée à
l'oxydation d'un donneur d'électrons avec production et accumulation de fer ferreux [Fe(II)]
dans le milieu. Elle peut être considérée comme une respiration où l'oxygène est remplacé par le
Fe(III). Le fer ferrique est l'un des accepteurs d'électrons le plus abondant dans la nature
(Ponnamperuma, 1972; Lovley, 1987). Cependant, sa réduction dissimilatrice est assez peu
étudiée probablement parce que l'on ne connait que très peu de microorganismes qui l'utilisent
comme mode obligé d'obtention et de conservation d'énergie. Dans les écosystèmes naturels, le
fer ferrique peut se présenter sous plusieurs aspects allant des formes solubles aux formes
cristallines. Plus les formes de fer sont cristallines, moins elles sont accessibles comme
accepteurs d'électrons pour les bactéries (Lovley et Phillips, 1986a,b; 1987a; Phillips et
Lovley, 1987). Une très grande diversité de microorganismes aérobies, anaérobies stricts ou
facultatifs peuvent réduire le fer en anaérobiose (Tableau 1). Cependant, dans la plupan des
cas, ce sont des bactéries ayant un métabolisme de type fermentaire n'utilisant pour la réduction
8

du fer, que seulement 0,03 à 0,13% des équivalents réducteurs générés lors de l'oxydation du
donneur d'électrons (Lovley, 1987; 1991; Prade, 1987). Quelques rares microorganismes
comme "Geobacter metallireductans", Desulfovibrio desulfuricans, Desulfotomaculum
nigrificans utilisent la réduction dissimilatrice du Fe(III) comme mode de conservation
d'énergie. Certaines bactéries telles que Shewanella putrefaciens (anciennement Alteromonas
putrefaciens), couplent la réduction du fer à l'oxydation de l'hydrogène ou du fonnate.
"Geobacter metallireductans" peut réaliser une oxydation complète des substrats qu'elle utilise:
acétate, propionate, butyrate, éthanol, toluène, benzoate, p-crésol, phénol, etc.
Toutefois, dans tous les cas connus jusqu'à présent, les bactéries réductrices de fer
peuvent également utiliser le nitrate comme accepteur d'électrons.
Les mécanismes moléculaires de la réduction du fer ne sont pas encore bien élucidés.
Parce que le nitrate peut inhiber la réduction du fer, certains auteurs ont émis l'hypothèse que la
réduction du fer se ferait grâce à la nitrate réductase (Munch et Ottow, 1983). Si ceci reste
possible dans certains cas, chez plusieurs bactéries dont "Geobacter metallireductans" ,
l'existence d'une ferriréductase différente de la nitrate réductase a été mis en évidence
(Champine et Goodwin, 1991). Les enzymes impliquées dans la réduction du fer, les
ferriréductases et probablement les cytochromes de type b, sont des protéines membranaires.
Aucune ferriréductase n'a pu être purifiée et caractérisée jusqu'à présent. La réduction du fer
met en jeu une chaîne de transporteur d'électrons, avec probablement le NAD+ comme
accepteur physiologique d'électrons ou de protons. La réduction du fer interviendrait entre le
transfert des électrons au niveau du succinate ou/et du cytochrome b mais avant le cytochrome c
(Dailey et Lascelles, 1977).
Chez "Geobacter metallireductans", la seule bactérie anaérobie stricte réductrice de fer
"obligée" connue à ce jour, les donneurs d'électrons sont oxydés en C02 via le cycle de l'acide
citrique. Les enzymes de la voie du monoxyde de carbone sont absentes chez cette bactérie qui
contient des cytochromes de type b (Champine et Goodwin, 1991; Gorby et Lovley, 1991).
9

Tableau 1 : Bactéries réductrices de fer
Organismes
Références
Actinomucor repens
Ottow et Von Klopotek, 1969
Aerobacter aerogenes
Ottow, 1970
Aerobacter sp.
Bromfield, 1954a
Alternaria tenuis
Ottow et Von Klopotek, 1969
Alteromonas putrefaciens
Semple et Westlake, 1987
Bacillus cereus
Ottow, 1970
Bacillus circulans
Bromfield, 1954a; Ottow, 1970; Troshanov, 1968
Bacillus mesentericus
Troshanov, 1968
Bacillus polymyxa
Roberts, 1947; Hamman et Ottow, 1974; Bromfield, 1954a
Bacillus pumilus
Ottow, 1970
Bacillus sp.
De Castro et Ehrlich, 1970
Bacillus subtiIis
Ottow et Glathe, 1971
Bacteroides hypermegas
Jones et al., 1984
Clostridium butyricum
Hamman et Ottow, 1974
Clostridium polymyxa
Troshanov, 1968
Clostridium saccharobutyricum
Hamman et Ottow, 1974
Clostridium sporogenes
Starkey et Halvorsen, 1927
DesuIfovibrio desulfuricans
Jones et al., 1984
Desulfotomaculum nigrificans
Jones et al.} 1984
Escherichia coli
Starkey et Halvorsen, 1927
Escherichia coli
Ottow, 1970
Fusarium oxysporum
Gunner et Alexander, 1964
Fusarium oxysporum
Ottow et Von Klopotek, 1969
Fusarium solani
Ottow et Von Klopotek, 1969
"Geobacter metallireductans"
Lovley et Phillips, 1988; Lovley et Lonergan, 1990
Paracolobactrum sp.
Bromfield, 1954a
Pseudomonas aeruginosa
Ottow, 1970
Pseudomonas denitrificans
Jones et al.} 1984
Pseudomonas liquefaciens
Troshanov, 1968
Pseudomonas sp.
Ottow et Glathe, 1971; Balashova et Zavarzin, 1980
Serratia marcescens
Ottow, 1970
Shewanella putrefaciens
Obuekwe et al., 1981; Myers et Nealson, 1990
SuIfolobus acidocaldarius
Brock et Gustafson, 1976
Thiobacillus thiooxidans
Brock et Gustafson, 1976; Kino et Usami, 1982
Thiobacillus ferrooxidans
Brock et Gustafson, 1976; Kino et U sami ,1982;
Sugio et al.} 1985
Vibrio sp.
Jones et al., 1983 et 1984
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10

2. LES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Les bactéries sulfato-réductrices (BSR) sont des microorganismes qui tirent l'énergie
nécessaire à leur croissance, de la réduction dissimilatrice du sulfate, couplée à l'oxydation d'un
substrat donneur d'électrons. La réduction dissimilatrice du sulfate est assimilable à une
respiration où l'oxygène est remplacé par le sulfate, d'où la terminologie "respiration sulfate".
Ce type de nutrition très spécifique nécéssite des conditions d'anaérobiose stricte et est
caractérisé par la présence d'enzymes constitutifs, l'accumulation de sulfures (H2S, SH-, S2-)
dans le milieu de croissance et l'existence de phosphorylations oxydatives liées au transport des
électrons.
Depuis l'obtention de la première culture pure en 1903, les techniques de culture et
d'isolement en anaérobiose stricte se sont beaucoup améliorées, surtout vers la fin des années
1970. Cela a permis la découverte de plusieurs nouveaux types de microorganismes sulfato-
réducteurs (Widdel, 1988), révélant ainsi que les BSR constituent un groupe très hétérogène
sur le plan morphologique et physiologique (spectre d'utilisation et métabolisme des substrats
carbonés, exigences en sels, etc.). La définition et une certaine hiérarchisation de nouveaux
critères taxonomiques se sont avérées nécessaires, ce qui a considérablement affiné la
classification de ces bactéries.
Les critères taxonomiques les plus importants pris en compte actuellement pour la
classification des BSR sont: la morphologie, la capacité à sporuler ou non, le type de sulfite
réductase présent (désulfoviridine, désulforubidine, désulfofuscidine, P-582), le type de
cytochrome présent (a, b, ou c), la biochimie de la nutrition carbonée et la teneur en Ge de
l'ADN bactérien. Sur la base de ces critères, de la séquence des ARN 16S et du taux
d'hybridation ADN/ADN, on subdivise l'ensemble des BSR en quinze genres regroupant 57
espèces. Certains genres regroupent plusieurs espèces, alors que d'autres n'en comprennent
pour l'instant qu'une seule (Tableau 2). On peut également distinguer deux types de BSR:
celles qui réalisent une oxydation incomplète de leur substrat carboné en acide gras (acétate,
propionate, butyrate, valérate), et celles qui oxydent complètement leur substrat en gaz
carbonique (C02).
Il

Tableau 2: Classification des bactéries sulfato-réductrices
OXYDATION INCOMPLETE
OXYDATION COMPLETE
DES SUBSTRATS ORGANIQUES
DES SUBSTRATS ORGANIQUES
Réf.
Réf.
Desulfobotulus
sapovorans
Desulfoarculus
baarsü
Desulfobulbus
elongatus
2
Desulfobacter
curvatus
20
propionicus
3
hydrogenophilus
20
latus
20
Desulfohalobium
retbaense
4
postgatei
21
Desulfomicrobium
apsheronum
5
Desulfobacterium
anilini
22
baculatum
5
autotrophicum
23
cathecholicum
24
Desulfomonile
tiedjei
6
indolicum
25
macestii
Desulfotomaculum
antarticum
1
niacini
26
guttoideum
7
ofeovorans
27
nigrificans
1
phenolicum
28
orientis
1
vacualatum
7
ruminis
1
Desulfococc us
biacutus
29
Desulfovibrio
africanus
1
multivorans
1
alcoholovorans
8
carbinolicus
9
Desulfonema
limicola
30
desulfuricans
1
magnum
30
fructosovorans
10
furfuralis
11
Desulfosarcina
variabilis
giganteus
12
gigas
1
Desulfotomaculum
acetoxidans
31
halophilus
13
geothermicum
32
fongus
14
kuznetsovii
33
pigra
1
sapomandens
34
salexigens
1
thermoacetoxidans
35
simplex
15
thermobenzoicum
36
sulfodismutans
16
termitidis
17
Archaeoglobus
fulgidus
37
vulgaris
1
profondus
38
Thermodesulfobacterium
commune
18
mobile
19
1: Widdel et Pfennig 1984, Widdel et Hansen 1992; 2: Samain et al. 1984; 3: Widdel et Pfennig 1982;
4: Ollivier et al. 1991; 5: Rozanova et Nazina 1988; 6: DeWeerd et al. 1990; 7: Widdel 1988; 8: Qatibi et al.
1991b; 9: Nanninga et Gottschal 1987; 10: Ollivier et al. 1988; 11: Folkerts et al. 1989;12: Esnault et al.
1988; 13: Cau mette et al. 1991; 14: Magot et al. 1992; 15: Zellner et al. 1985; 16: Baie et Pfennig 1987;
17: Trinkerl et al. 1990; 18: Zeikus el al. 1983, 19: Rozanova et Pivovarora 1988; 20: Widdel 1987; 21:
Widdel et Pfennig 1981a; 22: Schnell et al. 1989; 23: Brysch et al. 1987; 24: Szewzyk et Pfennig 1987; 25:
Baie et Widdel 1986a; 26: Imhoff-Stuckle et Pfennig 1983, Widdel et Hansen 1992; 27: Aeckersberg et al.
1991; 28: Baie et Widdel 1986b; 29: Platen et al. 1990; 30: Widdel et al. 1983; 31: Widdel et Pfennig 1977;
32: Daumas et al. 1988; 33: Nazina et al. 1988; 34: Cord-Ruwisch et Garcia 1985; 35: Min et Zinder 1990;
36: Tasalei el al. 1991; 37: Stetter 1988; 38: Burggraf el al. 1990.
12

2. 1. Réduction des accepteurs d'électrons
2. 1. 1. Réduction du sulfate
Dans les milieux de croissance des BSR, les sulfures sont les seuls produits finaux de la
réduction du sulfate. Cependant, la production de très faibles quantités de sulfite ou de
thiosulfate à partir du sulfate a été observée chez une souche de Desulfovibrio desulfuricans
(Fitz et cypionka, 1990; Vainshtein et al., 1980). Toutes les étapes de la réduction du sulfate
étant localisées dans le cytoplasme, ce composé doit nécessairement franchir la membrane
cytoplasmique. Le transport du sulfate à travers cette membrane est assuré par un processus
électrogénique chez Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobulbus propionicus et Desulfococcus
multivorans (Cypionka, 1987, 1989; Warthmann et Cypionka, 1990). Chez Desulfovibrio
desulfuricans et Desulfobulbus propionicus, le mécanisme de transport est un symport de type
H+-S042- utilisant au moins 3 H+ par molécule de sulfate transportée alors que chez
Desulfococcus multivorans, il s'agirait plutôt d'un symport de type Na+-S042- (Warthmann et
Cypionka, 1990). Le transport du sulfate par un système de symport H+-S042-, parce qu'il
nécessite la consommation d'au moins un H+ électrogéniquement produit, équivaudrait à la
perte de 0,33 mole d'ATP par mole de sulfate transporté si on suppose comme Thauer et Morris
(1984), qu'un ATP est synthétisée à partir du transport de 3 H+. Huit électrons sont nécessaires
à la réduction complète du sulfate en sulfure. La réaction se fait en plusieurs étapes et seuls les
mécanismes de la formation du sulfite sont actuellement connus. Le potentiel rédox très négatif
du couple S042-/HS03- (-516 mV) fait du sulfate un assez mauvais accepteur d'électrons
potentiel. Avant d'être réduit en sulfite, le sulfate est d'abord activé par une ATP sulfurylase, en
adénosine pyrophosphate (APS) et pyrophosphate (PPi). L'APS obtenu est ensuite converti en
sulfite et AMP par une APS réductase dissimilatrice; le potentiel rédox du couple APS/(HS03-
+ AMP) est de -60 mV et on pense que le potentiel réel dans la cellule est encore probablement
plus positif que cette valeur. Sur le plan thermodynamique, l'équilibre de la réaction catalysée
par l'ATP sulfurylase est très défavorable à la formation de l'APS et du pyrophosphate (~Go, =
+46,0 kJ/mole). L'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate inorganique (Pi) par une
pyrophosphatase, déplace le sens de la réaction et de ce fait favorise la formation de l'APS.
13

L'énergie libre de fonnation (L1Go') du sulfite à partir de l'APS est de -68,6 kJ/mole et celle de
l'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate inorganique est de -21,9 kJ/mole. Les réactions se
déroulent selon la séquence suivante:
APS + PPi
L1Go' =+ 46 kJ/mol
2 Pi
L1Go' =- 21,9 kJ/mol
APS +H
L1Go' = - 68,6 kJ/mol
2
--~>-~ HS03+ AMP + 2 Pi
L1GoI = - 44,5 kJ/mol
Des activités pyrophosphatases élevées ont été trouvées chez des espèces de
Desulfovibrio (Fauque et al., 1991), et Desulfobulbus (Kremer et Hansen, 1988), chez
Desulfotomaculum orientis (Thebrath et al., 1989) et Archeoglobus fulgidus (Dahl et al.,
1990), alors que celles trouvées chez les autres espèces de Desulfotomaculum étaient plus
faibles (Thebrath et al., 1989). Cependant, la théorie proposant une utilisation du
pyrophosphate dans des réactions de phosphorylations indirectes de l'ADP via la
pyrophosphate:acétate kinase (Liu et Peck, 1981) chez les espèces de Desulfotomaculum, a été
remise en question et est contredite par les résultats de Thebrath et al. (1989). Toutefois, une
utilisation du pyrophosphate à la place de l'ATP dans certaines phosphorylations pendant la
synthèse cellulaire est tout à fait possible (Thauer, 1989).
Des APS réductases dissimilatrices ont été purifiées ou mises en évidence chez des
souches de Desulfovibrio, Desulfobulbus propionicus, Thermodesulfobacterium mobile
(précédemment Desulfovibrio thermophilus), Archeoglobus fulgidus, Desulfobacter,
Desulfococcus et Desulfosarcina (Fauque et al., 1986; Kremer et al., 1988b; Speich et Trüper,
1988; Stille et Trüper, 1984). Ces enzymes sont des flavoprotéines cytoplasmiques dont les
donneurs d'électrons physiologiques, responsables de la régénération du groupement FAD lié
en FADH2, ne sont pas connus.
Le sulfite issu de la réduction du sulfate via l'APS, sera ensuite converti en sulfure. S'il
est clair que des sulfites réductases interviennent au cours de la réduction du sulfite en sulfure,
14

les mécanismes de ce processus sont encore un sujet de controverse. Sur la base d'expériences
de réduction réalisées in vitro avec un accepteur d'électrons artificiel, deux théories de
conversion du sulfite en sulfure ont été avancées:
- la première voie propose une réduction directe du sulfite en sulfure mettant en jeu six
électrons, sans formation d'intermédiaires (Fig. 2A);
- la deuxième voie propose une réduction via le trithionate et le thiosulfate avec plusieurs
boucles de recyclage partiel du sulfite (Fig. 2B). Ce schéma appelé "voie du trithionate", est
suggéré par la formation de trithionate, de thiosulfate et de sulfures à des pourcentages variables
selon les conditions expérimentales, lors des réactions de réduction du sulfite réalisée in vitro
avec des extraits cellulaires (Akagi, 1983; Kobayashi et al., 1972; Trudinger et Loughin,
1981).
S02-
4
t-::_ 2Pi
APS
So2-
4
t---
2[H]
AMP
~::~211
ATP
APS
r-
HSOi
2[H]
t
2[H] ,l
AMP
2ADP
t'---- ~ ATP
~O~
6[H]
,
_1
2ADP
HiS
Figure 2A
Figure 2B
Fig. 2: Voies hypothétiques de dégradation du sulfate et du sulfite chez les BSR:
A: Voie directe; B: Voie du trithionate
15

Des sulfites réductases dissimilatrices ont été purifiées et caractérisées chez toutes les
BSR. Ce sont des enzymes cytoplasmiques contenant un sirohème et des noyaux fer-soufre
(clusters [4Fe-4S]); elles ont toutes une structure a2~2 et un poids moléculaire compris entre
167 et 225 kDa. Elles diffèrent entre elles par des caractéristiques spectrales et moléculaires
spécifiques. On distingue quatre grands types de sulfite réductases: les désulfoviridines, les
désulforubidines, les désulfofuscidines et les P-582 (Fauque et al., 1991; LeGall et Fauque,
1988).
Trois arguments peuvent être avancés en faveur de la "voie du trithionate":
- des thiosulfates réductases ont été mises en évidence ou purifiées et caractérisées chez
des espèces des genres Desulfovibrio et Desulfotomaculum (Aketagawa et al., 1985; Badziong
et Thauer, 1980; Hatchikian, 1975; Fauque et al., 1991);
- la première enzyme utilisatrice de trithionate décrite ("enzyme productrice de
thiosulfate") requiert la présence de sulfite pour fonctionner et au fur et à mesure que la réaction
se déroule, le sulfite est régénéré; ceci rajouterait ainsi une boucle de régénération du sulfite
supplémentaire à la "voie du trithionate" (Kim et Akagi, 1985);
- la réduction du trithionate selon la voie hypothétique de la Fig. 2A a été mise en
évidence chez Desulfovibrio vulgaris par la découverte d'une protéine capable de réduire le
trithionate en thiosulfate; cette enzyme agi t en étroite association avec la désulfoviridine (Kim et
Akagi, 1985). La formation de trithionate fournirait ainsi un oxydant relativement plus fort
(Eo'= +225 mV) et de ce fait un accepteur favorable même pour un puissant donneur
d'électrons potentiel comme par exemple ceux provenant de la dé hydrogénation du succinate
(Eo'= +30 mV).
Cependant, il existe plusieurs autres arguments contre la "voie du trithionate"
(Chambers et Trudinger, 1975; Trudinger et Loughin, 1981):
- puisque le pourcentage des produits peut varier en fonction des conditions
expérimentales, les formations du trithionate et du thiosulfate devraient être considérées comme
des sous-réactions qui deviennent dominantes dans les expériences in vitro à cause par
exemple, des fortes concentrations de sulfite ajouté;
16

- des réactions du sulfite ou du bisulfite en excès avec des intermédiaires liés au
sirohème de la sulfite réductase sont également possibles (Trudinger et Loughin, 1981);
- il est possible que la formation d'intermédiaires libres soit due à des réactions
spontanées se produisant entre le sulfite et les sulfures issus de sa réduction; en effet, ces
composés sont connus pour réagir chimiquement entre eux pour donner du thiosulfate ou des
thionates, spécialement à pH acide (Hennisch, 1976). Si la sulfite réductase facilitait une telle
réaction, les sulfures produits ne s'accumuleraient pas mais seraient plutôt consommés et ceci
donnerait les oxoanions observés. La thiosulfate réductase et la trithionate réductase serviraient
alors pour utiliser leurs substrats respectifs dans le milieu ou pour les consommer en tant que
sous-produits de la réaction de la sulfite réductase.
- Les traces de thiosulfate formé lors des expériences de Fitz et Cypionka (1990) et de
Vainshtein et al. (1980), devraient être considérées comme des sous-produits issus de la
réaction inverse (catalysée par la sulfite réductase) entre le sulfite et les sulfures; les électrons
générés par cette réaction à bas potentiel rédox (-402 mV), pourraient être facilement
consommés par les autres processus de réduction; la production de faibles concentrations de
thiosulfate (5 à 100 ~M) à partir du sulfite avec des suspensions non proliférantes de
Desulfovibrio desulfuricans;
- au cours de la réduction assimilatrice du sulfate, la formation d'intermédiaires libres
n'a jamais été observée (Fauque et al., 1991; Peck et Lissolo, 1988; Trudinger et Loughin,
1981 ).
Pour le moment, il n'y a aucune preuve directe pouvant confirmer ou infirmer l'une ou
l'autre des deux voies hypothétiques.
Signalons enfin qu'un type particulier de catabolisme du pyrophosphate chez certaines
espèces de Desulfotomaculum a été proposé par Liu et Peck (1981): il serait utilisé avec l'acétate
comme
co-substrat,
pour
synthétiser
de
l'ATP
via
l'acétyl-phosphate.
Une
pyrophosphate:acétate kinase et une acétate kinase seraient impliquées dans ces réactions. En ce
qui concerne le catabolisme du sulfate, la différence entre certaines espèces de Desulftomaculum
(excepté D. orientis) et celles de Desulfovibrio residerait donc au niveau du système utilisé pour
déplacer l'équilibre de la réaction d'activation du sulfate dans le sens de la formation de l'APS;
17

alors que la consommation du pyrophosphate est réalisée par une pyrophophatase chez les
Desulfovibrio, ce serait plutôt une pyrophosphate:acétate kinase qui assurerait cette fonction
chez certaines espèces de Desulfotomaculum (Liu et Peck, 1981). Cette hypothèse serait
confortée par le fait que les activités pyrophosphatases mesurées chez ces espèces de
Desulfotomaculum ne sont pas significatives et par conséquent ne seraient pas suffisantes pour
supposer leur implication dans l'hydrolyse du PPi produit lors de l'activation du sulfate. Par
contre, ces espèces pourraient conserver l'énergie fournie lors de l'hydrolyse du PFi comme le
suggère leur capacité à utiliser le PPi comme source d'énergie pour la croissance (Liu et al.,
1982). Cependant, ce mécanisme est contredit par des résultats expérimentaux rapportant des
activités pyrophosphate:acétate kinase non significatives chez les espèces de Desulfotomaculum
(Thebrath et al., 1989). On pense que les activités pyrophosphate:acétate kinase élévées
observées par Liu et Peck (1981) pourraient être des artéfacts expérimentaux.
2. 1. 2. Réduction d'autres accepteurs d'électrons
J
La plupart des BSR peuvent utiliser le sulfite ou le thiosulfate comme accepteurs
d'électrons à la place du sulfate (Postgate, 1984a; Widdel, 1988). Cependant, certaines espèces
comme Desulfobotulus sapovorans ne peuvent pas utiliser le thiosulfate, et d'autres telles que
Desulfotomaculum acetoxidans, Desulfobacter latus et Desulfonema magnum ne peuvent pas
réduire le sulfite et le thiosulfate.
Le soufre élémentaire, le tétrathionate et la dithionite peuvent également servir
d'accepteurs d'électrons pour certaines BSR.
Le sulfite, le thiosulfate et la dithionite peuvent être dismutés en sulfate et sulfures par
Desulfovibrio sulfodismutans. Ainsi, cette souche est capable de tirer l'énergie nécessaire à sa
croissance grâce à un processus de fermentation de composés inorganiques. Une propriété
métabolique similaire mais de plus faible amplitude (magnitude) a été détectée chez
Desulfobacter curvatus, Desulfovibrio desulfuricans souche CSN et D. vulgaris souche
Marburg (Bak et Pfennig, 1987; Dilling et Cypionka, 1990). La dismutation du sulfite ou du
thiosulfate en sulfate et sulfures se déroule via les réactions inverses de la réduction
dissimilatrice du sulfate (Kramer et Cypionka, 1989) ce qui signifie que c'est l'ATP sulfurylase
18

et non pas l'ADP sulfurylase, qui est responsable de la fonnation du sulfate à partir de l'APS
chez ces espèces. La réaction de synthèse du pyrophosphate indispensable pour favoriser la
conversion de l'APS en sulfate et ATP, n'a pas été encore établie. Des équivalents réducteurs
sont générés de la transfonnation du sulfite en APS (Eo'= -60mV). La sensibilité de la réaction
de dismutation aux découpleurs indique qu'un "shift" de ces équivalents réducteurs par un
transport des électrons en sens contraire, semble nécessaire à l'étape de réduction conduisant
aux sulfures (Kramer et Cypionka, 1989).
Le nitrate et parfois le nitrite peuvent être utilisés comme accepteurs d'électrons par
Desulfovibrio desulfuricans, D. furfuralis, D. simplex, D. termitidis, Desulfobulbus
propionicus et Desulfobacterium catecholicum (Brauman et al., 1990; Folkerts et al., 1989;
McCready et al., 1983; Posgate, 1984a; Trinkerl et al., 1990; Widdel, 1988; Zellner et al.,
1989). Le nitrate et le nitrite sont réduits en ammonium.
Certaines espèces de Desulfovibrio peuvent utiliser le fumarate et le malate comme
accepteurs d'électrons; ces acides dicarboxyliques sont réduits en succinate (Postgate, 1984a;
Widdel, 1988). Le fumarate et le malate peuvent être dismutés en acétate et succinate par
quelques espèces de Desulfovibrio (Brauman et al., 1990; Postgate, 1984a; Ollivier et al.,
1988).
Le gaz carbonique peut être utilisé comme accepteur d'électrons par Desulfotomaculum
ruminis et D. orientis (Klemps et al., 1985).
Plusieurs BSR sont capables d'utiliser directement l'oxygène comme accepteur
d'électrons en condition de microaérophilie. Cette respiration aérobie peut être couplée à
l'oxydation de l'hydrogène, du fonnate, du lactate ou du pyruvate: aucune croissance cellulaire
n'est observée mais le processus peut permettre la synthèse d'ATP. Cette propriété métabolique
est marquée chez Desulfovibrio desulfuricans (souches CSN et Essex 6), et D. vulgaris souche
Marburg, mais elle est moins importante chez D. sulfodismutans, Desulfobacterium
autotrophicum, Desulfobulbus propionicus et Desulfococcus multivorans (Dilling et Cypionka,
1990).
19

2. 2. Métabolisme des donneurs d'électrons
Par rapport à un catabolisme de type purement fermentaire, l'oxydation des donneurs
d'électrons en présence d'un accepteur d'électrons exogène offre deux avantages:
- la réduction de l'accepteur d'électrons externe peut être associée à une chaîne de
transport d'électrons permettant ainsi une synthèse chimiosmotiq ue d'ATP. Chez les bactéries
utilisant les composés organiques comme seules sources d'énergie et de croissance en l'absence
de tout accepteur exogène d'électrons, la conservation de l'énergie se produit uniquement grâce
à des processus métaboliques particuliers comme par exemple ceux trouvés chez les bactéries
productrices de propionate (De Vries et al., 1973) ou chez les méthanogènes.
- en présence d'accepteur d'électrons, la phosphorylation au niveau du substrat est
beaucoup plus efficace que dans la seule fermentation qui gaspille une partie du substrat pour
éliminer des équivalents réducteurs. En outre, la phosphorylation au niveau du substrat est
possible même avec des composés non fermentescibles comme par exemple les acides gras.
2. 2. 1. Métabolisme de l'hydrogène moléculaire
Beaucoup de BSR peuvent utiliser l'hydrogène moléculaire comme substrat et doivent
de ce fait, être considérées comme des chimiolithotrophes facultatives. Pour ce mode de
conservation d'énergie, le matériel cellulaire doit être synthétisé soit à partir de l'acétate et du
COz pour les espèces chimiolithohétérotrophes, soit uniquement à partir du COz pour les
espèces chimiolithoautotrophes.
Des activités hydrogénases ont été mises en évidence chez les espèces des genres
Desulfovibrio (Fauque et al., 1988; 1991), Desulfobulbus (Samain et al., 1986; Kremer et
Hansen, 1988), Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfosarcï~a (Schauder et al., 1986) et
Desulfotomaculum (Cypionka et Dilling, 1986). Elles ont même été trouvées chez des espèces
de Desulfobacter incapables de croître sur Hz (Lien et Torsvik, 1990).
Les hydrogénases des BSR du genre Desulfovibrio o;;h.çté les plus étudiées (Fauque et
'~~~>'
al., 1988; 1991). Ce sont souvent des enzymes périplasmiques mais dans certains cas leur
activité a été localisée dans le cytoplasme (Cypionka et Dilling, 1986; Fauque et al., 1991; Fitz
20

et Cypionka, 1989). Ces hydrogénases sont subdivisées en trois groupes: les hydrogénases à
fer (hydrogénases [Fe]), les hydrogénases à nickel-fer (hydrogénases [NiFe]) et les
hydrogénases à nickel-fer-sélénium (hydrogénases [NiFeSe]). Ces trois types d'enzymes
diffèrent essentiellement au niveau de leurs activités catalytiques, leur structures moléculaires
(Fauque et al., 1988) et leur sensibilités au monoxyde de carbone, au monoxyde de nitrate, au
nitrite et à l'acétylène (He et al., 1989). Il peut exister plusieurs hydrogénases chez certaines
espèces; par exemple Desulfovibrio vulgaris souche Hildenborough possède les trois types
d'hydrogénase (Pecket al., 1987).
L'oxydation de l'hydrogène par des hydrogénases périplasmiques est supposée créer un
gradient de protons (force proton-motrice), par un processus de transfert vectoriel d'électrons;
dans ce système, les protons issus de l'hydrogène moléculaire restent dans le périplasme et
seuls les électrons sont transportés à travers la membrane jusqu'aux accepteurs cytoplasmiques
(Badziong et Thauer, 1980). La réduction, au niveau du cytoplasme, de ces accepteurs
physiologiques (ferrédoxine, flavodoxine et rubrédoxine) par l'hydrogénase fait intervenir un
cytochrome C3 périplasmique. Le mécanisme de transport des électrons via la membrane n'est
pas encore entièrement élucidé. La création d'un gradient de protons par simple séparation de
charge (transport vectoriel d'électrons) grâce à une hydrogénase périplasmique, devrait libérer
huit protons extracellulaires par mole de sulfate réduit. Puisque un au moins de ces protons
entre dans la cellule pendant le transport du sulfate (Cypionka, 1989), il ne devrait pas en rester
plus de sept pour la conservation d'énergie chimiosmotique, ce qui donnerait 2,33 moles
d'ATP par mole de sulfate réduit avec Hz- Mais puisque 2 moles d'ATP sont consommées pour
l'activation du sulfate, il ne resterait donc que 0,33 mole d'ATP pour les synthèses cellulaires.
Ceci est inférieur aux valeurs estimées à partir du rendement de croissance, qui suggèrent une
synthèse nette de 1,33 mole d'ATP par mole de sulfate (Nethe-Jaenchen et Thauer, 1984). Par
conséquent, un gradient de protons semble être généré en plus par le "pompage" des protons;
ainsi le rapport 3 H+/ATP utilisé dans les calculs est une estimation correcte. En effet, en
présence de Hz et de sulfate, un transfert de protons a été mesuré dans les cellules de
Desulfovibrio desulfuricans souche Essex 6 dont l'hydrogénase est pourtant cytoplasmique ou
tout au moins situé du côté cytoplasmique de la membrane (Fitz et Cypionka, 1989). Les autres
21

espèces de Desulfovibrio réalisent un transfert de protons en présence d'hydrogène et de nitrite
bien que l'hydrogénase et la nitrite réductase soient des enzymes périplasmiques (Barton et al.,
1983; Steenkamp et Peck, 1981); cela exclut donc la génération d'un gradient de protons par
simple flux vectoriel d'électrons à travers la membrane cytoplasmique. Enfin, la croissance
d'une bactérie Gram-positive, Desulfotomaculum orientis, sur H2 avec des rendements élévés,
démontre que la synthèse chimiosmotique d'ATP ne nécessite pas une hydrogénase
périplasmique (Cypionka et Pfennig, 1986). Par conséquent, le tranfert vectoriel d'électrons
semble être seulement un mécanisme supplémentaire de conservation d'énergie chez un certain
nombre de Desulfovibrio. Le mécanisme principal est manifestement un transport vectoriel de
protons, c'est-à-dire par des protéines d'oxydo-réduction pompes à protons ou des boucles de
type Mitchell (Fig. 3). Les ménaquinones seraient impliquées dans ce mécanisme.
périplasme
cytoplasme
Fig. 3: Modèles de génération de force proton-motrice pendant la croissance des espèces de
Desulfovibrio sur H2 et sulfate (d'après Widdel et Hansen, 1992).
SR : enzymes et autres composés impliqués dans la réduction du sulfate en H2S; H2 ase: hydrogénase.
22

2. 2. 2. Métabolisme du formate
La plupart des BSR peuvent utiliser le formate comme source d'énergie. LeGall et
Fauque (1988) ont suggéré que chez les Desulfovibrio, la conservation de l'énergie se ferait par
un mécanisme de transfert vectoriel d'électrons au cours duquel une formate déshydrogénase
serait impliquée dans la génération de la force proton-motrice. La formate déshydrogénase a été
découverte chez toutes les BSR, à l'exception des souches du genre Desulfobacter (Fauque et
al., 1991; LeGall et Fauque, 1988; Aeckersberg et al., 1991; Schauder et al., 1986; Spormann
et Thauer, 1988). Cette enzyme est une protéine périplasmique chez les Desulfovibrio (Odom et
Peck, 1981a; Fauque et al., 1991). Elle a été partiellement purifiée chez Desulfovibrio vulgaris
souche Miyazaki et, in vitro, le cytochrome c-553 purifié peut lui servir d'accepteur d'électrons
alors que le cytochrome C3 ne le peut pas (Yaghi, 1979). Chez Desulfovibrio gigas, la formate
déshydrogénase utiliserait le cytochrome C3 comme accepteur d'électrons (Riederer-Henderson
et Peck, 1986). Chez les espèces réalisant une oxydation complète de leur substrat, la formate
déshydrogénase est impliquée dans l'oxydation de l'acétyl-CoA via le monoxyde de carbone, et
son accepteur d'électrons physiologique est le NAD+. Desulfotomaculum acetoxidans pousse
faiblement et difficilement sur formate (Widdel et Pfennig, 1981b) malgré la présence de fortes
activités formate déshydrogénase (Spormann et Thauer, 1988). Ceci pourrait être dû à un
manque de système de transport approprié et à une localisation intracellulaire de la formate
déshydrogénase, ce qui semble fon probable chez cette bactérie Gram-positive.
2. 2. 3. Métabolisme des alcools
2. 2. 3. 1. Métabolisme des alcools primaires monovalents
A l'exception du méthanol, les alcools primaires monovalents peuvent être une source
d'énergie et de carbone pour la plupart des BSR. Il y a alors production dans les milieux de
croissance, soit de C02 dans le cas d'une oxydation corpplète, soit de l'acide gras
correspondant en cas d'oxydation incomplète.
Chez les espèces de Desulfovibrio et de Desulfomicrobium, la première étape du
catabolisme d'un alcool primaire est une déshydrogénation qui aboutit à la formation de
l'aldéhyde correspondant. Cette étape est catalysée par une alcool déshydrogénase dont
23

l'accepteur physiologique est le NAD+ (Kremer et al., 1988a; Malesset, 1982). Chez certains
Desulfovibrio, seule une aldéhyde déshydrogénase est impliquée dans la conversion de
l'aldéhyde formé en acide gras (Fig. 4A); l'accepteur physiologique de cette enzyme n'est pas
connu (Kremer et al., 1988). Cependant, chez une souche de Desulfomicrobium
(anciennement classée Desulfovibrio desulfuricans souche 9974), une CoA dépendante
aldéhyde déshydrogénase, une phosphate acétyltransférase et une acétate kinase interviennent
dans la transformation de l'aldéhyde en acide gras. Un ATP est synthétisé au cours de la
dégradation de l'alcool (Fig. 4B). L'accepteur physiologique de l'aldéhyde déshydrogénase
impliquée dans ce processus serait le NAD+ (Malesset, 1982). Il est probable qu'une autre
souche de la même espèce (anciennement classée Desulfovibrio desulfuricans souche Norway
4) et les souches de Desulfovibrio utilisatrices de choline dégradent les alcools primaires
monovalents selon une voie métabolique identique.
ETHANOL
~ NAD
t-NADH
ETHANOL
~NAD
ACETALDEHYDE
rHSCoA
~NADH
ACETALDEHYDE
t-
ACETYL-CoA
PPi ~
2[H]
t-HSCoA
ACETATE
ACETYL-P
~ ADP
t- ATP
ACEfATE
Figure 4A
Figure 4B
Fig. 4: Voies de dégradation de l'éthanol chez les souches de Desulfovibrio
(d'après Kremer et Hansen, 1988; Malesset, 1982).
24

Il a été démontré qu'en présence de sulfate, la dégradation de l'éthanol en acétate chez
Desulfobulbus propionicus a lieu selon la voie hypothétique de la figure 4B (Stams et al.,
1984). En absence de sulfate, cette souche fennente l'éthanol et le C02 en acétate et propionate.
L'acétate est fonné via l'acétyl-CoA et l'acétyl-phosphate. L'acétyl-CoA, le pyruvate, l'oxalo-
acétate, le malate, le fumarate, le succinate, le succinyl-CoA, le methylmalonyl-CoA, le
propionyl-CoA et le propionyl-phosphate sont les intennédiaires de la production du propionate
(Stams et al., 1984).
Le méthanol est utilisé par quelques espèces de Desulfovibrio (Ollivier et al., 1988;
Nanninga et Gottschalk, 1987). Les mécanismes d'oxydation du méthanol ne sont pas encore
connus.
2. 2. 3. 2. Métabolisme des polyols
2.2. 3. 2. 1. Ethylène glycol et 1,2-propanediol
L'utilisation du 1,2-propanediol comme substrat de croissance n'a été rapportée que
chez Desulfovibrio desulfuricans souche DG2 (Dwyer et Tiedje, 1986) et D. alcoholovorans
(Qatibi et al., 1991a, b). D. desulfuricans souche DG2 dégrade ce composé en propionate aussi
bien en culture pure en présence de sulfate qu'en coculture avec une méthanogène, en absence
de sulfate (Dwyer et Tiedje, 1986). En présence de sulfate, D. alcoholovorans catabolise le 1,2-
propanediol en un mélange d'acétate et de propionate; le rapport acétate/propionate dépend des
conditions de culture (Qatibi et al., 1991a, b). En absence de sulfate et en coculture avec une
méthanogène hydrogénophile, ce diol est converti en propionate exclusivement (Qatibi et
al.,1991a, b).
La plupart des espèces de Desulfovibrio oxydent l'éthylène glycol sans croissance, à
l'exception de D. carbinolicus qui peut l'utiliser comme source d'énergie et de croissance.
L'éthylène glycol est converti en acétate ou en acétaldéhyde par les Desulfovibrio. Aucune
donnée biochimique concernant la dégradation de l'éthylène glycol et du 1,2-propanediol chez
les BSR n'a été faite jusqu'à présent.
25

2. 2. 3. 2. 2. 1,3 propanediol
Quelques espèces de Desulfovibrio peuvent oxyder le 1,3-propanediol soit en acétate
comme par exemple Desulfovibrio souche OttPdl (Oppenberg et Schink, 1990) et D.
alcoholovorans (Qatibi et al.,1991a, b), soit en 3-hydroxypropionate comme par exemple D.
carbinolicus (Nanniga et Gottschalk, 1987), D .desulfuricans souche DG2 (Dwyer et Tiedje,
1986) et D .fructosovorans (Ollivier et al., 1988).
Une voie de dégradation du 1,3-propanediol en acétate dans laquelle le 3-
hydroxypropionate, le malonyl-semialdéhyde et l'acétaldéhyde seraient des intermédiaires a été
proposée par Oppenberg et Schink (1990) pour Desulfovibrio souche OttPdl (Fig. 5).
1,3 - PROPANEDIOL
t--2lHI
3 - HYDROXYPROPIONALDEHYDE
} - 2[H]
3 - HYDROXYPROPIONATE
t-- 2lHl
MALONYL SEMI-ALDEHYDE
}-C~
ACETALDEHYDE
CoASH~
t- 2[H]
ACETYL-CoA
'i
p.' t- CoASH
ACETYL-PHOSPHATE
ADP---{
~ATP
ACETATE
Fig. 5: Voie hypothétique de dégradation du 1,3 propanediol chez Desulfovibrio souche
OttPdl (d'après Oppenberg et Schink, 1990).
26

2. 2. 3. 2. 3. Glycérol
En présence de sulfate, plusieurs Desulfovibrio peuvent utiliser le glycérol comme
source de carbone et d'énergie. Il est oxydé en acétate par certains Desulfovibrio comme D.
desulfuricans, D. vulgaris et D. alcoholovorans (Kremer et Hansen, 1987; Postgate, 1984a;
Qatibi et al., 1991a et b; Widdel, 1988) ou en 3-hydoxypropionate par d'autres (N anninga et
Gottschalk, 1987; Ollivier et al., 1988). En absence de sulfate, la fermentation du glycérol par
D. carbinolicus et D. fructosovorans produit principalement du 3-hydroxypropionate et des
traces de 1,3-propanediol (Nanninga et Gottschalk, 1987; Ollivier et al., 1988). En coculture
avec une méthanogène, la dégradation du glycérol par D. carbinolicus et D. fructosovorans
donne du 3-hydroxypropionate et des traces de 1,3-propanediol (Qatibi, 1990).
En présence de sulfate, le glycérol est oxydé en acétate via le glycérol-phosphate, le
dihydroxyacétone-phosphate et une partie de la voie de la glycolyse chez deux souches marines
de Desulfovibrio (Kremer et Hansen, 1987; Fig. 6).
2. 2. 4. Métabolisme du lactate et du pyruvate
Le lactate et le pyruvate sont les substrats les plus communément utilisés par presque
toutes les BSR. Cependant Desulfoarculus baarsii (précédemment Desulfovibrio baarsii) ,
certaines espèces des genres Desulfobacterium et Desulfonema (Widdel et al., 1983),
Desulfotomaculum acetoxidans et la plupart des Desulfobacter (Widdel et Pfennig, 1981a,
1981 b, Widdel, 1987) ne peuvent pas utiliser le lactate.
Chez les espèces du genre Desulfovibrio, le lactate est catabolisé en acétate via le
pyruvate, l'acétyl-CoA et l'acétyl-phosphate (Ogata et Yagi, 1986). L'étape d'oxydation du
lactate en pyruvate est catalysée par une lactate déshydrogénase dont l'accepteur physiologique
n'est pas connu. Les activités lactate déshydrogénases ont été démontrées chez plusieurs
espèces Desulfovibrio (Peck et LeGall, 1982; Pankhania et al., 1988), chez une souche très
proche de Desulfomicrobium baculatum (précédemment Desulfovibrio desulfuricans 9974;
Stams et Hansen, 1982) et chez Archeoglobus fulgidus (Moller-Zinkhan et al., 1989). Jusqu'à
présent, aucune lactate déshydrogénase n'a pu être purifiée peut être parce que ce sont des
enzymes très sensibles à l'oxygène.
27

GLYCEROL
,t-:,
GLYCEROL 3-PHOSPHATE
~ 2[H]
DIHYDROXYACETONE PHOSPHATE
t
GLYCERALDEHYDEPHOSPHATE
Pi
-J- NAD
~NADH
1,3 - DIPHOSPt:~;ERATE
3-PHOSPHOGLYCERATE
~
2-PHOSPHOGLYCERATE
~
PHOSPHOENOLPYRUVATE
r-~;
PYRUVATE
i-
CoA
2[H]
ACETYL-CoA
Pi
y- ADP
~ATP
ACETATE
Fig. 6: Voie hypothétique de la dégradation du glycérol chez certaines espèces du genre
Desulfovibrio (d'après Kremer et Hansen, 1987).
28

Les activités lactate déshydrogénases peuvent être localisées dans la fraction membranaire
(Czechowski et Rossmoore, 1980) ou en partie dans la fraction cytoplasmique (Ogata et al.,
1981).
La décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA a pu être démontrée chez des
souches de Desulfovibrio desulfuricans, D. gigas, et D. vulgaris en utilisant la flavodoxine ou
la ferrédoxine comme accepteur d'électrons (Fauque et al., 1991; LeGall et Fauque, 1988;
Ogata et Yagi, 1986; Suh et Akagi, 1966). Ce même type de réaction a été mis en évidence chez
Archeoglobusfulgidus en utilisant le méthyl viologène comme
accepteur d'électrons (Moller-Zinkhan et al., 1989). L'acétyl-CoA est ensuite converti en
acétate via l'acétyl-phosphate par l'intermédiaire d'une phosphate acétyltransférase et d'une
acétate kinase (Brown et Akagi, 1966; Ogata et Yagi, 1986).
Un mécanisme de génération de force proton-motrice a été suggéré par Odom et Peck
(1981 b) pour expliquer la croissance des Desulfovibrio sur lactate et sulfate. Cette théorie
appelée modèle de recyclage de l'hydrogène, mettrait en jeu une production cytoplasmique
d'hydrogène provenant de l'oxydation du lactate en pyruvate et de celle du pyruvate en acétyl-
CoA; après diffusion dans la membrane cytoplasmique, l'hydrogène serait oxydé dans le
périplasme. Il y aurait création d'un gradient de protons dû à un transfert vectoriel d'électrons
du périplasme vers le cytoplasme, permettant la synthèse d'ATP. Il est maintenant considéré
comme très improbable que l'hydrogène libre soit vraiment un intermédiaire obligatoire dans le
catabolisme du lactate comme le suggère l'absence d'une forte inhibition de l'oxydation du
lactate par une atmosphère d'hydrogène. En effet, selon le modèle de recyclage de l'hydrogène,
on devrait s'attendre à une inhibition presque complète du catabolisme du lactate en présence
d'hydrogène pour des raisons thermodynamiques; or on n'observe qu'une inhibition partielle
(Lupton et al., 1984a; Pankhania et al., 1986). De plus, il existe des mutants de Desulfovibrio
qui ne peuvent pas pousser sur hydrogène plus sulfate mais peuvent oxyder le lactate en
présence de sulfate (Odom et Wall, 1987; Rousset et al. 1991), et d'autres BSR comme par
exemple Desulfobotulus sapovorans et Desulfococcus multivorans pouvant bien croître sur
lactate mais ne possédant pas d'hydrogénase. La formation d'hydrogène à partir du lactate serait
thermodynamiquement défavorable (Thauer et Morris, 1984). Il a été démontré que la
29

production d'hydrogène liée à l'oxydation du lactate en pyruvate est un processus qui
consomme de l'énergie (Pankhania et al., 1988). La mise en jeu d'une consommation d'énergie
fait que le recyclage de l'hydrogène en tant que mode de conservation de l'énergie est
invraisemblable. Enfin, il existe une régulation des activités hydrogénases chez Desulfobulbus
elongatus: elles sont réprimées en milieu lactate plus sulfate (Samain et al., 1986b; Samain,
1987). Cependant, le recyclage de l'hydrogène a été directement démontré lors de la croissance
de Desulfovibrio vulgaris sur pyruvate et sulfate (Peck et al., 1987). L'hydrogénase [NiFeSe]
localisée du côté interne de la membrane cytoplasmique, fonctionnerait comme hydrogénase
productrice d'hydrogène, l'hydrogénase [Fe] et l'hydrogénase [NiFe] agiraient comme
enzymes d'oxydation de l'hydrogène (Fauque et al., 1991; Rohde et al., 1990). Mais dans les
conditions naturelles, le recyclage de l'hydrogène à partir du pyruvate n'est probablement pas
une réaction importante. L'addition de pyruvate dans un milieu de croissance d'un
Desulfovibrio provoque, grâce à une réaction pyruvate:ferrédoxine oxydo-réductase, une brève
génération d'hydrogène qui est ensuite piégé principalement par les hydrogénases
périplasmiques. Dans les habitats naturels des BSR, le pyruvate n'est pas un produit libre
majoritaire des bactéries fermentaires ou des exsudats racinaires.
La production de traces d'hydrogène pendant la croissance de BSR sur lactate plus
sulfate (Lupton et al., 1984b), n'est une preuve ni pour le recyclage de l'hydrogène, ni pour un
mécanisme particulier contrôlant le niveau d'oxydo-réduction des transporteurs d'électrons
impliqués dans l'oxydation du lactate. Une explication possible serait qu'une partie des
équivalents réducteurs générés pendant la croissance sur lactate plus sulfate, est simplement
perdue via une hydrogénase constitutive; la pression partielle d'hydrogène reflèterait le degré de
déséquilibre entre les réactions productrices et consommatrices d'électrons (Widdel et Hansen,
1992). La capacité des Desulfovibrio à croître en l'absence de sulfate, en utilisant les
méthanogènes comme accepteurs d'électrons externes grâce à un transfert inter-espèce
d'hydrogène (Bryant et al., 1977; Traoré et al. 1983; Zellner et al., 1987; Zellner et Winter,
1987), permet d'avancer une autre explication possible. La conversion du lactate en acétate, H2
et C02 en absence de sulfate, semble être l'un des rôles écologiques des espèces du genre
Desulfovibrio (Bryant et al., 1977; Zellner et al., 1987; Zellner et Winter, 1987). En présence
30

de sulfate, le système producteur d'hydrogène (Pankhania et al., 1988) ne doit pas être
complètement supprimé ou réprimé et conduirait à la pene d'une infime partie des équivalents
réducteurs sous forme d'hydrogène (Widdel et Hansen, 1992). Une telle hypothèse semble en
accord avec le mode de régulation des activités hydrogénases qui sont réprimées sur milieu
lactate plus sulfate chez Desulfobulbus elongatus (Samain et al., 1986).
Le lactate et le pyruvate peuvent être fermentés par Desulfobulbus propionicus en acétate
et propionate. La formation de propionate se fait via une "voie du succinate" faisant intervenir
une méthyl-malonyl-CoA:pyruvate transcarboxylase (Stams et al., 1984). Cette voie est
similaire à celle utilisée par les espèces du genre Propionibacterium et Anaerovibrio lipolytica,
sauf que l'activation du succinate en succinyl-CoA n'est pas directement liée à la formation du
propionate à partir du propionyl-CoA.
2. 2. 5. Métabolisme des sucres
Seules quelques BSR peuvent utiliser les sucres tels que le fructose (Klemps et al.,
1985; Ollivier et al., 1988; Zellner et al., 1989) ou le glucose, saccharose, ribose, arabinose,
etc. (Joubert et Britz, 1987; Trinkerl et al., 1990).
2. 2. 6. Métabolisme des acides aminés
L'utilisation de la glycine, de l'alanine et de la sérine comme source d'énergie a été
observée chez certaines espèces de Desulfovibrio (Stams et al., 1985). L'alanine peut être
dégradée par Desulfotomaculum ruminis (Coleman, 1960) et le glutamate par plusieurs
Desulfobacterium (Bak et Widdel, 1986b; Brysch et al., 1987; Imhof-Stuckle et Pfennig, 1983;
Schnell et al., 1989; Szewzyk et Pfennig, 1987).
La première étape de l'oxydation de la L-alanine chez deux souches marines utilisatrices
d'amino-acides et chez Desulfotomaculum ruminis, est une conversion en pyruvate par une
déshydrogénase NAD+-dependante (Stams et Hansen, 1986).
La choline peut être oxydée en acétate ou fermentée en acétate, éthanol et triméthylamine
par Desulfovibrio desulfuricans. La dégradation de la choline en acétate procèderait via
l'acétaldéhyde, l'acétyl-CoA et l'acétyl-phosphate. L'aldéhyde/alcool déshydrogénase
31

responsable de la production d'éthanol lors de la fermentation de la choline serait une enzyme
NAD+ dépendante.
2. 2. 7. Métabolisme de l'acétate
L'oxydation des substrats organiques par les BSR peut être soit complète en donnant
uniquement du COl, soit incomplète, l'acétate étant le produit final le plus couramment
rencontré dans ce cas. La formation d'acétate est due à l'absence d'un mécanisme d'oxydation
de l'acétyl-CoA. Une oxydation complète du substrat en COl par les BSR acétogènes est
seulement possible avec les composés à un atome de carbone comme le formate et le méthanol
(Klemps et al., 1985; Nanninga et Gottschalk, 1987; Ollivier et al.,1988), ou avec les
composés à deux atomes de carbone plus oxydés que l'acétate, comme par exemple la glycine
(Stams et al., 1985) ou l'oxalate (postgate, 1983).
L'acétate est l'un des substrats les plus abondants dans les environnements anoxiques.
L'acétate et l'hydrogène seraient les principaux substrats des BSR dans les écosystèmes
naturels. Chez ces microorganismes, la présence d'une voie d'oxydation de l'acétyl-CoA est
habituellement associée à la capacité d'utiliser l'acétate comme substrat de croissance.
Cependant, les espèces des genres autres que Desulfobacter utilisent assez difficilement
l'acétate, et peuvent même en excréter dans certaines conditions.
La dégradation de l'acétate chez Desulfobacter postgatei et D. hydrogenophilus fait
intervenir tous les enzymes du cycle de Krebs ou cycle de l'acide citrique (Brandis-Heep et al.
1983; Gebhardt et al. 1983; Kroger et al. 1988; Schauder et al. 1987; Thauer 1988, 1989;
Thauer et al. 1989). Néanmoins, cette voie métabolique comporte des aspects inhabituels en
comparaison avec celle trouvée chez les mitochondries et les bactéries aérobies. L'acétate n'est
pas activé via l'acétate thiokinase (acétyl-CoA synthétase) ou l'acétate kinase et la phosphate
acétyltransférase, mais via la succinyl-CoA:acétate-CoA transférase (Fig 7A). La
déshydrogénation de l'isocitrate est catalysée par une enzyme NADP-dépendante comme chez la
plupart des eubactéries. La conversion de l'a-cétoglutarate en succinyl-CoA n'utilise pas le
NAD+ mais une ferrédoxine comme accepteur d'électrons.
32

ATP
Cirrate~
Oxaloacétate
Isocitrate
NADPH
Malate
Acétyl-CoA
H20~
2-0xoglutarate
Fumarate
k d[OXYdé]Fd[red]co
Succinyl-CoA
2
MK(Oxydé)
Fig. 7A: Voie hypothétique de la dégradation de l'acétate chez Desulfobacter postgatei
(d'après Thauer, 1988; Thauer et al., 1989).
L'accepteur d'hydrogène de l'oxydation du succinate en fumarate serait une ménaquinone et
non l'ubiquinone comme dans les mitochondries et la plupart des bactéries Gram-négatif. La
condensation de l'acétyl-CoA et l'oxalo-acétate en citrate chez Desulfobacter postgatei est une
réaction réversible associée à une synthèse d'ATP (Müller et al., 1987). Il y a ainsi une
conservation de l'énergie du thioester dans ce cas alors que dans les cycles de Krebs communs,
l'action de la citrate synthase gaspille cette énergie par l'hydrolyse du citryl-CoA transitoirement
formé. L'accepteur d'hydrogène de la malate déshydrogénase n'est ni le NAD+, ni le NADP+.
Comme l'activité de cette enzyme a été trouvée dans la fraction membranaire et a pu être inhibée
par un antagoniste de la ménaquinone, le 2-(n-heptyl)-4-hydroxyquinoline-N-oxyde (HQNO),
certains ont suggéré que l'accepteur serait une ménaquinone; cependant une telle hypothèse
n'est pas confirmée par les résultats des tests enzymatiques in vitro avec des substituants des
33

ménaquinones comme le naphthoquinone ou le diméthylnaphthoquinone (Moller-Zinkhan et
Thauer, 1988).
Chez les autres BSR qui réalisent une oxydation complète de leur substrats et qui
n'appartiennent pas au genre Desulfobacter, ni les activités de l'a-cétoglutarate déshydrogénase
ni celles des autres enzymes du cycle de l'acide citrique n'ont été détectées (Jansen et al., 1985;
Schauder et al., 1986). Chez Desulfotomaculum acetoxidans, on a pu montrer qu'un cycle de
l'acide citrique n'intervenait pas lors de la dégradation de l'aspartate et du glutamate. Par contre,
chez toutes les BSR n'ayant pas une a-cétoglutarate déshydrogénase, de fortes activités
monoxyde de carbone (CO) déshydrogénase ainsi que la capacité à former des traces de
méthane, ont été mises en évidence; ces activités CO déshydrogénases sont absentes chez les
Desulfobacter. Chez les espèces réalisant une oxydation complète et n'appartenant pas au genre
Desulfobacter, l'acétyl-CoA est l'intermédiaire clé de l'oxydation des donneurs d'électrons. Les
substrats sont dégradés via l'acétyl-CoA qui est ensuite clivé en un groupement monoxyde de
carbone et un groupement méthyl liés chacun à une protéine de transport; chacun de ces
groupements liés est ensuite oxydé en CO2 (Jansen et al., 1985; Schauder et al., 1986;
Spormann et Thauer, 1988; Fig. 7B). Le transporteur du groupement méthyl est le
tétrahydrofolate chez Desulfotomaculum acetoxidans (Spormann et Thauer, 1988). L'accepteur
de la méthylène tétrahydrofolate déshydrogénase et de la formate déshydrogénase, est le
NAD+. La conversion du formyl-tétrahydofolate en formate est couplée à une synthèse d'ATP.
Chez Desulfobacterium autotrophicum, le transporteur du groupement méthyl est le
tétrahydropteroyl-tétraglutamate, un analogue du tétrahydrofolate qui a quatre résidus glutamate
au lieu d'un seul (Lange et al. 1989). L'accepteur du groupement méthylène lié est le NADP+
(Schauder et al., 1989).
Une voie métabolique identique a été mise en évidence chez Desulfoarculus baarsii
(Jansen et al., 1985).
Chez Archeoglobus fulgidus, la voie de dégradation des substrats est similaire à celle
trouvée chez Desulfotomaculum
acetoxidans, Desulfobacterium
autotrophicum et
Desulfoarculus baarsü, avec toutefois quelques modifications (Fig. 7C).
34

Donneur d'électrons
Donneur d'électrons
organique
organique
t
o
o
"
"
CH) - C - SCoA " "
CH) - C - SCoA " "
/
/
[CO]
[CO]
CH -THP
)r.2un
CH =THP
2r- NAD(P)
,~ NAD(p)H
CH=THP
2[H]
2[H]
~CHO-THP
~CHO-THMP
rADP
,~ATP
HCCXY
~CHO-MF
~ADH (2[ll])
C0 2
Figure 7B
Figure 7C
Fig. 7: Voies hypothétiques de la dégradation de l'acétate chez Desulfotomaculum
acetoxxidans, Desulfobacterium spp. et Desulfoarculus baarsii (7B) et Archeoglobus fulgidus
(7C) (d'après Thauer, 1988; Thauer et al., 1989).
35

Cette
archéobactérie
possède,
à
l'instar
des
bactéries
méthanogènes,
la
tétrahydrométhanoptérine, le méthanofurane et d'importantes quantités de dérivé déazaflavine,
le facteur F420 (Burggraf et al., 1990; Stetter, 1988; Stetteret al., 1987). La
tétrahydrométhanoptérine est le transporteur du groupement méthyl, le facteur F420 est
l'accepteur d'électrons de la méthylène-tétrahydrométhanoptérine déshydrogénase (Moller-
Zinkhan et al., 1989) et l'accepteur du groupement formyl est le méthanofurane. Le formate
libre n'apparaissant pas pendant la formation du C02, le formyl-méthanofurane doit
probablement être déshydrogéné et clivé simultanément en CO2 et méthanofurane libre.
Apparemment, aucune phosphorylation au niveau du substrat n'intervient lors de cette étape
(Fig. 7C). La plupart des accepteurs d'électrons sont encore inconnus.
2. 2. 8. Métabolisme du propionate
Le propionate apparaît souvent comme produit de la fermentation de plusieurs composés
tels que les sucres, le glycérol et certains acides organiques. Il peut servir de source d'énergie et
de carbone pour plusieurs des BSR capables de réaliser une oxydation complète de leur
substrats et pour les espèces de Desulfobulbus qui l'oxydent incomplètement en acétate.
En présence de sulfate, le propionate est dégradé en acétate et CO2 via une "voie du
succinate" faisant intervenir une méthyl-malonyl-CoA:pyruvate transcarboxylase (Kremer et
Hansen, 1988). Le propionyl-CoA n'est pas formé directement à partir du succinyl-CoA
comme chez les Propionibacterium et Anaerovibrio lipolytica, mais du méthyl-malonyl-CoA
(Fig. 8). Le catabolisme du propionate en C02 par Desulfococcus multivorans se déroule via la
"voie du succinate" aussi (Stieb et Schink, 1989), mais contrairement aux Desulfobulbus, cette
souche peut oxyder le pyruvate transitoirement issu de la conversion des acides dicarboxyliques
au delà du niveau de l'acétate; l'acétyl-CoA est oxydé en C02 via la voie du monoxyde de
carbone/ groupement méthyl décrite chez Desulfotomaculum acetoxidans et Desulfotbacterium
autotrophicum.
36

Ethanol
Lactate
Prop~na~;,
~ADP
Propionyl-P
rHSCOA
2[HJ
2[H]
ADP
Propionyl-CoA
?SUCCinYI-CoA ~ATP
(
"-HSCOA
Méthyl-
malonyl-CoA
suc~ 2[1l]
[C0 ]-TC
2
Acétaldéhyde
~
.l )
L...-
Pyruvate
Oxaloacétate
Fumarate
r--HSCOA
~ 2[H],C02
Malate
.....-------",..".....---~ Acétyl-CoA
NADH
NAD
}-HSCOA
2[H]
Acétyl-P
r- ADP
~ATP
Acétate
Fig. 8: Voie hypothétique de l'oxydation du propionate, de l'éthanol et du lactate en acétate chez
Desulfobulbus propionicus (d'après Kremer et Hansen, 1988).
37

2. 2. 9. Métabolime du butyrate et des autres acides gras à longue chaîne
Le butyrate et les autres acides gras à longue chaîne peuvent être oxydés par plusieurs BSR
(Pfennig et Widdel, 1981 a, b; Widdel, 1988). L'oxydation incomplète des acides gras ayant un
nombre pair d'atomes de carbone aboutit à la formation d'acétate, tandis que celle des acides
gras ayant un nombre impair d'atomes de carbone produit de l'acétate et du propionate. Le
mécanisme principal de la dégradation des acides gras est une B-oxydation. Les équations de
dégradation peuvent s'écrire comme suit:
-
n
2-
n
-
CH - (CH
3
2)2n COO + -2- S04
+ -2 OH
-......,.>~ (n+1) CHf COO-
n
-
+ _OH
2
n
+ -H2 0
2
Dans le cas de l'oxydation des acides gras ayant un nombre de carbone impair, le
propionyl-CoA est transitoirement formé; comme il ne peut pas être métabolisé par les BSR
réalisant une oxydation incomplète, il est converti en propionate qui est alors excrété dans le
milieu de croissance. La plupart des BSR capable de réaliser une oxydation complète de leur
substrat, peuvent dégrader le résidu propionyl-CoA en C02 via la "voie du succinate".
L'équation de la dégradation complète devient alors:
2
4H-(CH 2)n- COO- + (3n + 1)S04 - + H20
_~>~ (4n+4)H-CO; + (3n + l)HS- + H+ + OH-
La dégradation de l'isobutyrate commence par une activation du substrat en isobutyryl-
CoA qui est ensuite converti grâce à une butyryl-CoA déshydrogénase et une enoyl-CoA
38

déshydratase en 3-hydroxy-isobutyryl-CoA. Ce composé est ensuite hydrolysé en acide libre
qui est ensuite oxydé en méthylmalonate semialdéhyde. Une déshydrogénation-CoA
dépendante du semialdéhyde et une décarboxylation conduisent au propionyl-CoA qui est
transformé en acétyl-CoA comme chez Desulfobulbus propionicus. L'acétyl-CoA est enfin
dégradé via la voie du monoxyde de carbone/groupement méthyl. La conversion du succinyl-
CoA en succinate est couplée à l'activation de l'isobutyrate en isobutyryl-CoA grâce à une
succinyl-CoA: acide-CoA transférase.
2. 2. 10. Métabolisme du malate, du fumarate et du succinate
Les acides dicarboxyliques sont des substrats assez couramment utilisés par les B5R
(Postgate, 1984a, b; Widdel, 1988). Ils sont souvent oxydés en acétate en présence de sulfate.
Le fumarate et le malate peuvent être dismutés en acétate et succinate en absence de sulfate.
,L'oxydation des acides dicarboxyliques fait intervenir une enzyme malique NADP+
dépendante qui requiert des ions divalents pour son activité et est stimulée par les ions K+
(Kremer et al. 1989).
2. 2. Il. Métabolisme du furfural
Le furfural peut être utilisé comme source d'énergie par Desulfovibrio furjuraiis et
Desulfovibrio sp. (Boopathy et Daniels, 1991; Folkerts et al., 1989).
Le succinic-semialdéhyde serait un intermédiaire de la dégradation du furfural en acétate; des
furfuryl-alcools et l'acide 2-furoïque s'accumulent transitoirement dans le milieu de culture. Les
mécanisme précis ne sont pas connus.
2. 2. 12. Métabolisme des composés aromatiques
Jusqu'à présent, seules les B5R réalisant une oxydation complète de leur substrats sont
capable d'utiliser les composés aromatiques comme source d'énergie. Les voies de dégradation
des substrats aromatiques ne sont pas encore connus.
39

2. 2. 13. Métabolisme des alcanes
Il n'y a pas de preuve directe d'oxydation du méthane par les BSR. Certaines espèces de
Desulfovibrio utilisent les alcanes à longue chaîne comme substrat de croissance (Durbin et
Watanabe, 1980; Widdel, 1988). Une BSR (provisoirement identifiée comme Desulfobacterium
oleovorans) capable d'oxyder complètement l'hexadécane, le 1-hexadiène, les alcools à longue
chaîne et les acides gras en CO2, a été récemment isolée (Aeckersberg et al., 1991). Cette
souche n'utilise ni le lactate, ni l'hydrogène.
Les mécanismes des premières étapes de l'oxydation de l'hexadécane ne sont pas encore
élucidés, mais on sait que le C02 est formé via le monoxyde de carbone.
40

PRESENTATION DU SITE
41

Le Burkina Faso est un pays continental situé au cœur de l'Afrique de l'Ouest entre les
latitudes 9°20' et 15°05' Nord et les longitudes 2°20' Est et 5°30' Ouest. Il couvre une superficie
de 274200 km2 et est limité au Sud par le Benin, le Togo, le Ghana et la Côte d'Ivoire, au Nord
et à l'Ouest par le Mali et à l'Est par le Niger (Fig. 1).
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Figure 1: Situation géographique du Burkina Faso.
La pointe de la flèche indique l'emplacement du périmètre agricole de la Vallée du Kou.
42

Le Burkina Faso est un pays essentiellement agricole: 90% de la population est rurale et
les recettes agricoles réprésentent plus du tiers du Produit Interieur Brut (PIB) et contribuent
pour près de 80% aux exponations totales du pays. Le climat y est sous l'influence de deux
grandes saisons: une saison sèche d'environ huit mois et une saison pluvieuse qui dure environ
quatre mois (mi-Mai à mi-Septembre). Les activités agricoles se situent en grande partie pendant
la saison pluvieuse et ont lieu pour l'essentiel, au Sud et au Sud-Ouest du pays. La quasi-
totalité des surfaces agricoles sont utilisées pour la culture de céréales dont les principales sont:
le maïs, le mil, le sorgho et le riz. Les surfaces rizicoles répresentent moins de 14% des
superficies couvenes par les cultures céréalières. Elles sont situées au Sud et au Sud-Ouest du
pays pour la plupart.
Situé à 25 km environ au Sud-Ouest de Bobo Dioulasso, le périmètre irrigué de la Vallée
du Kou est essentiellement utilisé pour la culture du riz. Une grande partie de la production du
riz provient de cette zone dont les sols sont relativement très feniles.
Les sols des rizières de la Vallée du Kou se caractérisent par un pH acide compris entre
3,75 et 5,5 ± 0,3 pour les sols non submergés et 6,5 et 7 quand les sols sous eau, des teneurs
en matières organiques et en carbone ainsi qu'un rappon C/N très variables mais plus élévés
que la moyenne des sols de rizière. La plupart des autres caractéristiques (teneurs en azote,
calcium, magnésium, potassium et sodium, capacité d'échange de cations) sont relativement
proches de celles observées dans la majorité des sols de rizières. Les sols de la Vallée du Kou
sont relativement riches en phosphore et fer (Tableau 1). La teneur en fer libre, facilement
utilisable par les bactéries, peut atteindre 5 % dans les sols sévèrement touchés et se manifeste
alors par l'apparition d'un film rouge d'oxyde de fer (voir photos ci-contre). La plupart des sols
sont très pauvres en sulfates (S042- ::;; 0,01 meq/lOO g sol sec).
La température moyenne des eaux oscille entre 23 et 35°C selon les saisons alors que
celle des sols varie entre 29 et 33 oc.
Nos études ont été faites sur quatres sols où apparaissaient des symptômes de toxicités
dues au fer ou/et aux sulfures.
43

Tableau 1: Principales caractéristiques des sols de rizières de la Vallée du Kou (Burkina Faso)
détenninées en 1990 et aimablement fournies par le Projet Agricole de la Vallée du Kou. Les
valeurs sont exprimées pour un sol sec.
Caractéristiques
Moyenne
Minimum
Maximum
Matière organique (%)
1,28
0
2,64
Carbone total (C %)
0,79
0,09
l,53
Azote total (N %)
0,06
0,02
0,17
C/N
13,65
1,65
30,83
pH (KCI)
4,34
3,42
5,25
Phosphore assimilable (ppm)
11,41
0,61
39,73
Phosphore total (ppm)
167,46
13
496
Fer libre (%)
0,56
0,07
1,18
C.E.C. total (MEQ/100gr)
4,38
2,04
7,2
Ca2+ (meq/100g)
1,74
0,68
3,17
Mg2+ (meq/lOOg)
0,67
0,09
1,79
K+ (meq/100g)
0,07
0,01
0,68
Na+ (meq/100g)
0,04
Om
0,83
% Argile plus limon
54
27
72
44

Photo 1: Vue d'ensemble d'un champ de riz de la Vallée du Kou (Burkina Faso)
Photo 2: Toxicité ferreuse primaire avec film d'oxyde de fer en surface.
Le plant a peu de talles et les feuilles les plus âgées sont jaunes.

Photo 3: Toxicité ferreuse primaire avec carence en zinc.
Les feuilles deviennent jaunes ou blanches.
Photo 4: Toxicité ferreuse secondaire avant floraison.

TRAVAUX SUR PUBLICATIüNS
45

Le premier de nos articles traitera de la dynamique des populations de bactéries
réductrices du fer et du sulfate dans les sols de rizière de la Vallée du Kou et de la
caractérisation de certaines d'entre elles.
Lors de la caractérisation des BSR isolées des sols de rizières de la Vallée du Kou, nous
avons étendu notre étude à certaines des BSR isolées des sols de rizière du Sénégal. Nous
rapporterons les résultats de l'étude taxonomique des bactéries sulfato-réductrices "dominantes"
isolées des sols de rizière du Sénégal dans le deuxième article.
Quant au troisième article, il rapportera la taxonomie d'une souche de bactéries
réductrices du fer isolées lors de nos études.
A cause des différences importantes apparues au niveau du métabolisme des diols entre
une des BSR isolées et Desulfovibrio alcoholovorans, nous avons étudié beaucoup plus en
détail la biochimie du catabolisme du 1,2-propanediol chez ces deux BSR. Les résultas et
discussions de cette étude de la dissimilation du 1,2-propanediol chez certaines espèces du
genre Desulfovibrio seront présentés dans le quatrième article.
46

Article 1
Etude des bactéries réductrices du fer et du sulfate dans les sols de
rizière de la Vallée du Kou (Burkina Faso)
47

ETUDE DES BACTERIES REDUCTRICES DU FER
ET DU SULFATE DANS LES SOLS DE RIZIERE
DE LA VALLEE DU KOU (BURKINA FASO)
Aboubakar S. OUATTARA
RESUME: Les groupes bactériens impliqués dans la réduction du fer et du sulfate ont été
quantifiés dans les sols de rizière de la Vallée du Kou au Burkina Faso. La réduction du fer
dans ces écosystèmes peut être couplée à l'oxydation du lactate, du propionate, de l'éthanol et
de l'acétate. Le nombre de bactéries réductrices de fer et utilisatrices de lactate ou d'éthanol
varie entre 106 et 108 bact./g sol sec. Les bactéries de ce type sont surtout des fermentaires et
des sulfata-réductrices. Le nombre des bactéries qui oxydent le propionate et l'acétate peut
atteindre 104 à 105 bact./g sol sec. La population de bactéries sulfato-réductrices (BSR)
utilisatrices de lactate ou d'éthanol est relativement importante (106 à 108 bact./g sol sec). A
l'inverse, celles qui peuvent oxyder l'acétate ou le propionate n'ont pas été détectées. La
caractérisation partielle des souches de BSR a montré qu'elles appartiennent toutes au genre
Desulfovibrio.
L'étude physiologique des bactéries réductrices de fer et de sulfate "dominantes" a
montré qu'elles sont bien adaptées aux conditions nutritionnelles et physico-chimiques des
écosystèmes d'où elles ont été isolées.
Mots clés: sulfato-réduction; réduction dissimilatrice du fer; Desulfovibrio; lactate;
acétate; propionate; sol de rizière; Numérations; Burkina Faso.
48

1. INTRODUCTION
Les sols de rizière sont des écosystèmes complexes où une grande partie du flux
d'électrons produits lors de la minéralisation de la matière organique, est utilisée pour la
réduction du fer et du sulfate. Les ions ferreux et les sulfures produits par ces processus de
réduction peuvent intoxiquer les plants de riz en pénétrant dans leur système racinaire (Prade et
al., 1990; Jacq et al., 1991). Une grande diversité de bactéries fermentaires, anaérobies strictes
ou facultatives utilisent une petite partie des électrons générés lors de l'oxydation de leur
substrat pour la réduction du fer dans les sols de rizières (Prade, 1987). A l'inverse, un groupe
nutritionnel de bactéries très spécialisées dans la réduction du sulfate ou du soufre, est impliqué
dans la toxicité due aux sulfures. Ces phénomènes de toxicité commencent à se manifester si le
rapport (nombre de bactéries productrices de sulfures)/(nombre de bactéries sulfo-oxydantes)
est supérieur à 1000 (Jacq et Roger, 1978). Une étude de la microflore sulfato-réductrice
impliquée dans ces processus, a montré que seules des espèces du genre Desulfovibrio
participent activement à la production de sulfures dans la majorité des sols de rizière du
Sénégal. Cependant quelques espèces appartenant au genre Desulfotomaculum sont également
présentes mais sous forme de spores inactives. Aucune BSR capable de réaliser une oxydation
complète du substrat de même que celles appartenant aux genres Desulfotomaculum ou
Desulfobulbus n'ont pu être isolées lors de ces études (Jacq, 1989). Au vu de ces résultats,
nous avons essayé de déterminer quels étaient les types de bactéries impliquées dans la toxicité
ferreuse et celle due aux sulfures dans les sols de rizières de la Vallée du Kou, au Burkina.
Les sols de la Vallée du Kou sont des sols acides et très riches en fer qui sont utilisés
pour la culture du riz. On y observe depuis quelques années, une intensification de
l'intoxication des plants de riz par les ions ferreux ou les sulfures. Des quantifications de
bactéries capables de coupler l'oxydation du lactate, de l'éthanol, de l'acétate et du propionate
avec la réduction du fer ou du sulfate dans certains sols de rizières de la Vallée du Kou ont été
réalisées pour déterminer les bactéries impliquées dans la toxicité ferreuse et celle due aux
sulfures.
49

Nous rapportons dans ce travail, la caractérisation partielle de cenaines souches
bactériennes "dominantes", réductrices de fer ou de sulfate, isolées de ces sols de rizière.
3. MATERIELS ET METHODES
3. 1. Echantillonnage, numérations, enrichissements et isolements
Les échantillons de sol ont été prélévés et stockés dans des récipients fermés
préalablement dégazés à l'argon ou à l'azote. Entre le transpon des champs jusqu'au
laboratoire, dans ces conditions d'anaérobiose et la réalisation des suspensions/dilutions pour
les numérations, il s'écoule environ huit à dix heures.
Environ 10 g de sols sont suspendus dans 100 ml d'une solution stérile contenant
MgC12 à 0,5% et Na2S à 0,025%, puis vigoureusement agités pour disperser les agrégats de
sols. La solution ainsi obtenue est considérée comme la suspension bactérienne mère. Après
homogénéisation au Vonex, 10 ml de la suspension mère sont utilisés pour inoculer 90 ml de
milieu de numération ne contenant ni donneur, ni accepteur d'électrons. Une série de dilutions
successives similaires à celle décrite précédemment, sont alors effectuées à partir de cette
suspension bactérienne pour obtenir les inocula des tubes de numération. Nous avons utilisé la
méthode du nombre le plus probable (MPN) à 3 tubes pour déterminer le nombre de bactéries
dans les sols de rizières. Ces numérations ont été faites en utilisant l'oxyhydroxyde de fer
ferrique (20 à 50 mM), le citrate de fer ferrique (20 mM) ou le sulfate (20 mM) comme
accepteurs d'électrons. Chaque accepteur d'électrons est testé avec chacun des donneurs
d'électrons suivants: l'acétate (20 mM), le propionate (20 mM), le butyrate (10 mM), l'éthanol
(20 mM) et le lactate (20 mM). La réduction de l'accepteur d'électrons est ensuite déterminée
après 3 à 5 semaines d'incubation à 30°e. Seules les dernières dilutions positives sont utilisées
pour des études plus détaillées.
Les enrichissements ont été réalisés à panir des dernières dilutions positives par quatre à
cinq transferts successifs dans un milieu de culture contenant le donneur et l'accepteur
d'électrons initialement présents dans la culture de numération. Les souches ont été isolées et
50

purifiées par la méthode des roll-tubes décrites par Hungate (1969). Des tentatives d'isolement
et de purification ont été faites par la méthode de la gélose profonde en utilisant 0,7 à 0,9%
d'agar noble dans le milieu de croissance (Pfennig et al., 1981).
3. 2. Milieux et conditions de cultures
La composition des milieux de culture a déjà été décrite auparavant (Ouattara et al.,
1992a,b).
3. 3. Méthodes analytiques
L'oxyhydroxyde de fer ferrique est synthétisé par neutralisation (pH 7,0) d'une solution
0,4 M de FeC13 avec du NaOH (Lovley et Phillips, 1986). Le précipité obtenu est ensuite lavé
plusieurs fois avec de l'eau distillée pour éliminer le NaCl fonné, puis mis à sécher à 60°C dans
une étuve. Il est ajouté dans les milieux de croissance pour avoir une concentration comprise
entre 20 et 50 mM.
Les concentrations de Fe(III) et Fe(II) sont déterminées selon la procédure décrite par
Lovley et Phillips (1986b), comme précédemment indiqué par Ouattara et al., (1992a).
Les sulfures sont dosés par la méthode de Cord-Ruwisch (1985).
Les acides gras et les acides organiques sont dosés par HPLC comme précédemment
indiqué par Ouattara et al., (1992a).
Le contenu en cytochromes, sulfite réductase et la teneur en GC de l'ADN bactérien
sont détenninés comme précédemment indiqué par Ouattara et al., (1992a,b).
51

4. RESULTATS ET DISCUSSIONS
4. 1. Réduction du fer
Le nombre de bactéries réductrices de Fe(III) utilisatrices de lactate évolue entre 3,5x 102 et
7,3x102 bactéries/g de sol sec quand la rizière n'est pas sous eau, pour atteindre 2x1D4 à 6x1ü7
bactéries/g de sol sec dans les sols de rizière submergés. Le maximum de densité bactérienne
est atteint en 21 jours, et ce nombre ne varie pas significativement jusqu'à la fin du cycle
cultural (Fig. 1). Les bactéries réductrices de fer utilisatrices d'autres substrats tels que l'acétate
et le propionate, ont été dénombrées en nombre plus faible mais le profil d'évolution de leur
densité est similaire à celui observé sur lactate ou éthanol (Fig. 1).
log(nbre de bact./g sol sec)
8 ~----CF====O:===O===:O=====ci;::::==:::O:==::::oJ
6
4
o
log (B.R.F. Laet.)
2
A
log (B.R.F. Acet.)

log (B.R.F. Propio.)
O-+-...........,..--'T--.-~..---..,......-.- ........--r--..........,~~~
o
20
40
60
80
100
120
140
Jours
Figure 1: Evolution du nombre de bactéries réductrices de fer et utilisatrices de
lactate, d'acétate ou de propionate dans les sols de rizière de la Vallée du Kou.
52

Plusieurs enrichissements stables de consortia bactériens capables de coupler la
réduction du fer à l'oxydation de l'acétate ou du propionate, ont été obtenus. Mais il ne nous a
pas été possible d'isoler des souches bactériennes utilisant ces deux substrats par les différentes
méthodes d'isolement en milieu gélosé, à cause de leur impossibilité à former des colonies dans
ces conditions de culture. Après la dernière étape d'enrichissement sur fer, des tentatives
d'isolement ont été effectuées en remplaçant ce composé par le nitrate. Quelques unes des
souches isolées dans ces conditions peuvent réduire le fer en culture pure; elles ont un temps de
division compris entre 5 et 8h à pH 7 et 35°C. Mais toutes les souches obtenues par ce procédé
sont exigentes en facteurs de croissance tels que l'extrait de levure ou la Biotrypcase. Leur
caractérisation complète est encore en cours.
Des cultures pures de bactéries réductrices de fer et utilisatrices de lactate ou d'éthanol
ont pu être obtenues. La caractérisation des souches a révélé qu'elles étaient soit des
fermentaires appartenant aux genres Anaerovibrio (Ouattara et al., 1992a) et Clostridium, soit
une bactérie sulfato-réductrice très proche de Desulfovibrio desulfuricans dont la description
sera donnée dans le chapitre suivant.
La présence de Clostridies comme bactéries réductrices facultatives de fer a déjà été
montrée dans les sols de rizière du Sénégal. Des espèces des genres Bacillus et Pseudomonas et
de la famille des Enterobacteriaceae étaient également impliquées dans la réduction du fer
couplée à l'oxydation de sucres dans ces biotopes (Prade, 1987).
Nos études montrent que des bactéries tirant l'énergie nécessaire à leur croissance de la
réduction dissimilatrice du fer, participent à la production d'ions ferreux dans les sols de
rizières. Les bactéries réductrices de fer joueraient alors le rôle d'acceptrices terminales
d'électrons dans les écosystèmes étudiés. Des résultats similaires ont été observés dans d'autres
biotopes riches en fer ferrique (Lovley et Phillips, 1987b).
53

4. 2. Réduction du sulfate
Le nombre de BSR utilisatrices de lactate ou d'éthanol varie entre 102 et 1()3 bactéries/g
de sol dans les rizières à sec et entre 105 et 108 bactéries/g de sol dans les rizières submergées.
La population de BSR augmente avec la submersion des sols et atteint une valeur d'équilibre
qui varie très peu (Fig. 2). Nos résultats diffèrent quelque peu de ceux de Jacq (1989) qui
rapportent des fluctuations du nombre de BSR selon les apports de substrats dûs aux exsudats
racinaires mais sont similaires à ceux observés dans plusieurs rizières de bas-fonds au Burkina
Faso (Dianou, 1989).
log(nbre de B8R/g sol sec)
9 - r - - - - - - - - - - - - - - - - - . ,
8
7
6
5
o
log(BSR) éthanol
4

log(BSR) lactate
3+-.....-......"""'T---r"~__,____r_.---r___y---,.___,r_-r-~
o
20
40
60
80
100
120
140
Jours
Figure 2: Evolution du nombre de BSR utilisatrices de lactate ou d'éthanol
dans les sols de rizière de la Vallée du Kou.
54

Nous n'avons pas pu détecter la présence de BSR utilisatrices d'acétate ou de propionate
lors de nos numérations. Un tel résultat pourrait s'expliquer par:
- la brièveté du temps d'incubation (3 à 5 semaines), si on considère qu'il faut en moyenne 6 à
12 semaines pour que la croissance des BSR oxydant l'acétate ou le propionate soit notable ou
significative (Bak et Pfennig, 1991; J0rgensen et Bak, 1991);
- l'utilisation de milieux sélectifs lors de nos études qui ne permettraient pas la croissance des
BSR oxydant l'acétate ou le propionate ;
- leur absence dans la rizière; en effet, cet écosystème est un biotope très pauvre en NaCl alors
qu'il faut au moins 3g/l de ce sel dans les milieux de croissance de toutes les BSR utilisatrices
d'acides gras (Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus ou Desulfonema) connues
actuellement pour qu'elles puissent croître.
Toutes les BSR "dominantes" isolées sur lactate ou éthanol, réalisent une oxydation
incomplète de leur substrat. Ces souches sont non sporulantes, qui se présentent sous forme de
bâtonnets mobiles, incurvés et contiennent de la désulfoviridine. Elles appartiennent toutes de
ce fait au genre Desulfovibrio. Les premières études de taxonomie montrent qu'une des souche
isolée, Desulfovibrio souche HDv est proche de D. alcoholovorans. Cependant elles diffèrent
entre elles au niveau du métabolisme des diols (Ouattara et al., 1992b). Les deux autres
souches, Desulfovibrio souche DDv et Desulfovibrio souche NDv se rapprochent sur le plan
nutritionnel de D. desulfuricans Essex 6 et de D. vulgaris (Tableau 1). La caractérisation
complète de ces souches est en cours. Ces résultats sont similaires à ceux trouvés dans les sols
de rizières du Sénégal où les BSR "dominantes" dénombrées appartiennent au genre
Desulfovibrio (Jacq, 1989).
Il est fort possible que les BSR capables d'oxyder les acides gras soient présents, en
faible nombre toutefois, dans les rizières où elles joueraient un rôle important dans la
détoxification du biotope. Mais leur faible taux de croissance et leurs exigences nutritionnelles
(NaCl, MgC12) font que leur implication dans les maladies physiologiques du riz paraît très
improbable.
55

Tableau 1: Comparaison des substrats donneurs ou accepteurs d'électrons utilisables par les
souches de Desulfovibrio isolées des sols de rizière de la Vallée du Kou, Desulfovibrio
desulfuricans et Desulfovibrio vulgaris.
souche DDv
souche NDv
Desulfovibrio
Desulfovibrio
desulfuricans
vulgaris
Donneurs
d'électrons
H2C02
+
+
+
+
Formate
+
+
+
+
Ethanol
+
+
+
+
Propanol-1
+
+
+
+
Butanol-1
+
+
+
+
Pentanol-1
+
+
+
+
Lactate
+
+
+
+
Pyruvate
+
+
+
+
Dihydroxyacétone
+
+
+
+
Glycérol
+
+
+
1-2 Propanediol
+
+
1-3 Propanediol
Fumarate
+
+
+
Malate
+
+
+
Choline
+
+
Accepteurs
d'électrons
Sulfate
+
+
+
+
Sulfite
+
+
+
+
Thiosulfate
+
+
+
+
Soufre élémentaire
nd
nd
+
Fumarate
nd
nd
+
Malate
nd
nd
+
Nitrate
+
+
Fe(III)
+
+
nd: non déterminé
56

Même dans les environnements pennenant la croissance de ce type de BSR, leur nombre est
toujours inférieur d'un facteur allant de 100 à 1000 à celui des BSR utilisatrices de lactate ou
d'hydrogène (Pfennig et Bak, 1991; Laanbroek et Pfennig, 1981; Caumette, 1986; Jli1rgensen et
Bak, 1991). Une autre hypothèse qui pourrait expliquer l'absence de BSR utilisatrices d'acétate
et de propionate, serait que la compétition pour ces substrats tournerait à l'avantage des
bactéries réductrices de fer dans ces biotopes riches en fer et assez pauvres en sulfate. Il a été
montré que certaines bactéries réductrices de fer peuvent avoir des affinités d'environ 25 fois
supérieures à celles de bactéries méthanogènes ou sulfato-réductrices (Lovley et al. 1989).
57

Références bibliographiques
Bak F, Pfennig N (1991) Sulfate-reducing bacteria in littoral sediment of Lake Constance.
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58

Article 2
Characterization of sulfate-reducing bacteria isolated from Senegal
ricefields
FEMS Microbiology Ecology (Sous Presse)
59

Characterization of sulfate-reducing bacteria
isolated from Senegal ricefields
Aboubakar S. OUATTARA and Vincent A. JACQ
Laboratoire de Microbiologie ORSTOM, Université de Provence, Marseille, France
Key Words: Sulfate-reduction; Desulfovibrio; Ricefields; Sulfide toxicity; Ecology.
Corresponding author: V.A. JACQ, Laboratoire de Microbiologie ORSTOM, case 87,
Université de Provence, 3, Place Victor Hugo, F-13331 Marseille Cedex 3, France.
Phone (33) 91.50.64.04 or 91.10.63.36
Fax
(33) 91.84.57.94
60

1. SUMMARY
Sulfate-reducing bacteria were enumerated in soils and water samples from Senegal
ricefields using lactate and sulfate as substrates. When rice plants were severely injured by
sulfides, maximum densities ranged from 107 to 109 bacteria.g- 1 of dry spermosphere or
rhizosphere sail. Seven non-sporulating, mesophilic strains were isolated. The strains had
motile curved cells and stained Gram-negative. Lactate, pyruvate, H2+C02, malate, fumarate,
or ethanol could serve as electron donors. Organic acids were incompletely oxidized to acetate.
Alcohols were degraded to the corresponding fatty acids. Sulfate, sulfite, or thiosulfate couId
serve as electron acceptors and were reduced to sulfide. Vitamins, yeast extract, Biotrypcase, or
additional NaCl were not required for growth. On the basis of morphological and physiological
properties, and the G+C mol % of the DNA, six isolates were identified as Desulfovibrio
vu/garis and one as Desulfovibrio desulfuricans. The comparison of their main physiological
properties with the physico-chemical properties of sampling sites indicated that they were better
adapted to conditions prevailing in the rice rhizosphere than to those prevailing in the bulk of
soil.
2. INTRODUCTION
Microbial reduction of sulfate is performed by the morphologically and physiologically
versatile dissimilatory sulfate-reducing bacteria, an heterogenous group of microorganisms
exhibiting a large nutrition al diversity {1-3}. As in any natural environment, the activity of
sulfate-reducers in ricefields depends upon redox potential, sulfate, temperature, salinity, pH,
and the availability of organic nutrients provided by rice exudates or derived from the
metabolism of heterotrophic fermentative bacteria. Although most rice soils in the world are S-
deficient, significant reduction of sulfate has been reported in a wide range of ricefields {4}.
Production of sulfides, at levels that cause rice injury, was observed in Asia {5,6}, U.S.A
{7 ,8}, and Senegal {9}. In lowland ricefields, strictly anaerobic bacteria, including sulfate-
reducers, becorne active when the soil becomes anoxic, because 02-consumption by facultative
anaerobes is not balanced by 02-diffusion from the floodwater and the oxidating power of rice
roots {1O-11}.
Sulfate-reducers are common in flooded soils {3, 12, 13}. They are present in oxidized
and reduced soil layers, as colonies located in Oz-depleted sites such as iron-clay aggregates
and organic debris {14,15}. They are also found in the rhizosphere and the spermosphere of
rice {9,13,16}. Reported densities in rice soils range from 103 to 105 cells.g- 1 dry soils in Asia
{12 }. Studies in Senegal ricefields showed the existence of a very active anaerobic microflora,
including methanogens {13}, sulfate-reducers {9, 13}, sulfur-reducers {17}, and ferric iron·
reducers {18} located in the soil and the vicinity of the roots. Pot experiments with seedlings
61

showed densities of sulfate-reducers ranging from 6x 101 to 7x 105 cells.g- 1 of soil in
rhizospheric samples {13}, and microplot experiments showed that in situ densities may reach
109 cells.g- 1 of soil {16}.
Although Desulfovibrio strains were suspected to be dominant in Asian ricefields {12},
there is only one report on the isolation of both sporulating and non-sporulating sulfate-reducers
{19}. Simultaneous enumeration of lactate-using sulfate-reducers and Thiobacilli {20},
suggested that the most numerous sulfate-reducers in the sperrnosphere and the rhizosphere,
and, because of their locations, the most potentially harrnful for the plant, were mostly non-
sporulating forrns. This work follows several applied studies of the conditions inducing sulfide
toxicity in Senegal ricefields {9, 11 ,16,21}. It reports on the isolation and characterization of
seven strains of Desulfovibrio. Physiological properties of these strains are discussed with
regard to their growth conditions in the sampling sites and the rice rhizosphere.
3. MATERIALS AND METHüDS
3. 1. Sampling sites
Surveys were done in 82 ricefields located in the delta of the Senegal River and the
Casamance, the two rice producing areas of Senegal. In situ soil temperature varied from 28°C
to 30°C at 5-10 cm depth under waterlogged conditions {21}. Soil pH ranged from 4.0 to 5.2
in newly rewetted soils and from 5.2 to 6.9 after four weeks of submersion {21}.
Four sites with high intensity of microbial reducing processes and marked detrimental
effects on rice growth, were choosen for detailed surveys during three rice cropping seasons
{11,18,21}. Soils were sampled at time intervals in the root vicinity (rhizosphere) and around
germinating seeds (sperrnosphere). Sites from which the strains were isolated were described in
previous papers {9, 16,18,21,22}. Their main characteristics are summarized in Table 1. These
soils differed widely in texture and salt content. A lower variability was observed for carbon
content and soil pH measured on newly rewetted soils. Senegal River delta soils became less
acidic than Casamance soils after 4 weeks of submersion. Despite a low organic matter content,
they were favourable to chemical and microbial reducing processes when waterlogged, because
of their high clay content {22,23}. Tilène 3 soil was a moderatly saline, acidic and sulfated soil
{16,23}. Pont-Gendarme 9 soil is highly sulfated and acidic, with a sulfuric horizon and
jarosite mottles, and 2%0 w/w mineraI sulfur in surface layer {23}. In the Casamance, Djibélor
soil, after 30 years of rice cultivation, lost sorne properties of the original mangrove soil: in soil
surface part of soluble sulfates was leached and pH became almost neutral, but jarosite mottles
were still encountered under the plough layer {22}. Loudia-Ouoloff soils were acidic
mangrove-type soils, in which the anaerobic bacterial process most potentially harmfull to rice
was Fe2+ production by ferric iron-reducers {22}.
62

Table 1 : Sorne isolation site and strain growth characteristics
Site characteristics
Sarnpling zone
Senegal River delta
Casamance
Soil
Tilène 3 Pont-Gendarme 9 Loudia-Qualoff
Djibelor4
Average temperawre COC) 1
29-31
28-32
28-30
26-28
pH (dry soil) 2
4.0-4.4
3.8-4.7
4.1-4.4
3.7-5.5
pH (soil solution) 3
6.1-6.5
5.6-6.2
4.3-6.4
4.2-6.8
S04 2 - (lO-2 M. kg- l ) 2
3.2-4.3
7.7-9.3
0.73-1.26
0.55-2.2
Na+ (10-2 M. kg- l ) 2
_9.0 4
4
n.d.
0.9-1.57
0.11-0.65
CI - (10-2 M. kg-1) 2
4
16.4
n.d.
9.0 -15.0
3.4-4.1
Oay contents (%) 2
55-58
59-65
15-36
16-31
Carbon (w %) 2
1.1-1.2
0.85-1.1
1.9-2.8
2.1
Strain growth characteristics
Strain
FO
F3
FI
F2W
F2X
F2Y
Gl
Tempernture range (oC)
16-42
16-46
16-43
20-43
16-44
20-45
20-48
Opùmum temperature
33-35
35-37
30-31
30-32
30-34
36-39
38-42
pH range
5.8-8.7 5.8-8.65
5.7-8.7
6.3-8.6 5.8-8.7 5.2-8.6
5.7-8.5
Optimum pH
6.8
6.85
6.9
7.0
6.95
6.75
6.9
NaCI range (g.l-l)
0-15
0-15
0-17
0-12
0-15
0-10
0-15
Optimum NaC1
5-7
5-10
10-15
3-7
7-14
1-7
1-7
1 At 10-15 cm depth, at sampling
2 At 0-10 cm depth, on dry soi1 before sowing or tr:lJlsplanéng of rice
3 At 10 cm depth, after 4 weeks of waterlogging
4 Moderately salted soil before frrst irrigaéon, then progessively desalting ; n.d. : not determined
Correcéon (lmeq.100g- l )=(1.l0-2 M. kg- l )
63

3.2. Field enumerations
In situ enumerations of sulfate-reducers were performed on 3,000 soil or water samples
(5-10 g) collected in fields exhibiting clear sulfide toxicity symptoms (Figure 1). Soil samples
were collected anoxically at 3 to 15 cm depth in the spermosphere or the rhizosphere of rice, as
described by Prade et al. (22}. Millipore filters were used for the enumeration procedure, as
described by Baldensperger and Mouraret {24} for Thiobacilli, and by Traoré and Jacq (17}
for sulfur-reducing bacteria. Samples were diluted in sterile 0.6% MgC1 2 solution,
homogenized by a rotary shaker, and immediately deposited on Millipore filters (HAWP 04700;
Millipore Corp., Bedford, Mass., USA, OA5~m, 6 filters/sample). Each filter was then placed
in a screw-cap tube (22ml; 125x16mm) containing 21 ml of Medium 1. Tubes were incubated
at 35°C until the appearance of a black FeS-precipitate on the filter. The time necessary for total
blackening of the filter was correlated with the initial numbers of viable cells {17}. Calibration
curves were established with pure cultures of sulfate-reducers.
Medium 1 was used for enumeration studies. Solution A: KH2P04, 0.5 g; MgS04'
7H20, 2.0 g; Na2S04·lOH20, 1.0 g; CaCI2·2H20, 0.1 g; modified Pfennig's element trace
solution (25}, (l ml); distilled water, 750 ml. Solution B: N~CI,1.0 g; 60% sodium lactate,
6 ml; FeS04(NH4h S04·6H20, 6.0 g; yeast extract (Difco) 1.0 g; distilled water, 235 ml.
Solution C: NaOH, 10 ml of OA3 M solution. Solutions A and C were autoclaved for 20 min at
120 oc. Medium 1 was prepared by mixing cooled solutions A and C to B, sterilized through
Millipore filters (OA5~m) and 21 ml of the final medium were aseptically dispensed into sterile
Kimax test-tubes containing 50 mg of finely ground FeS and 1 ml of water. The final pH was
7.0. During the last field experiment on Casamance (Loudia-Oualoft) a modification of Medium
1 was tested, in which yeast extract was replaced by 1 ml.l- 1 of OA % (w/v) biotin solution and
1 ml.I-l 0.02 % (w/v) vitamin B12 solution {17}. Modified media, with lactate replaced by Na-
acetate (l0 mM) or Na-palmitate (2 mM), were used to enumerate other types of sulfate-
reducing bacteria.
3. 3. Enrichment cultures
Enumeration tubes in which calculated numbers of sulfate-reducing bacteria were higher
than 108 cells.g- 1 of dry soil were kept for enrichment-cultures on various electron donors
(Figure 1). Higher in vitro densities were obtained on lactate, after four or five successive
transfers on the freshwater medium of Widdel and Pfennig {26}, supplemented with 1 ml of
trace-element solution SL7 {27} and reduced with 2ml of a 0.5 M Na2S solution (Medium 2).
General techniques for the cultivation of strict anaerobes (28-31) were used for media
preparations and during experiments. Substrates or vitamins were supplied from autoclaved or
filter-sterilized stock solutions.
64

Figure 1: Schematic representation of the isolation process
of studied strains
82 locations in 2 areas of Senegal
ENUMERATIONS on4 media
(3.000 soil and water samples)
1
1
1
1
Lactate
Modified
Acetate
Palmitate
Medium 1
lactate
Medium
Medium
Medium 1
Selection of enumeration-tubes containing
more trlan 108 sulfate-reducers g-' of soil (14 soils)
''--------"
504
70
58
Total: 568 tube:l 'with vibrioid cell:l, 505 tube:l 'with motile vibrio:l
Et\\IRI CHM ENTS
1,.....-----
Media 2
Selection of 30 tubes with
isolation
densities of sulfate-reducers
of major
(.":)..'s&-Ailim
> 10 9 cells ml-'
contaminant
.~~~A":lm
1
ISOLATIONS -1
1
1
on lactate
on pyruvate
on acetate
on propionate
1
2 slow-growing and sporulating
F2
sulfate-reducers
"-
~
1
Second purification
lost after 3 subculturings
(F2W~(F2Y)
65

3. 4. Isolation and purity control
Thirty fast-growing subcultures with a cell density higher than 109 were chosen for
isolation tests (Figure 1), using repeated deep agar (0.8 to 0.9 %) dilutions adapted from
Pfennig et al. {32}. Strain purity was checked in Medium 2 supplemented with 0.25% yeast
extract (Difco), 0.25% peptone, 0.25% Biotrypcase (BioMérieux, Craponne, France), 0.25%
nutrient broth, 0.25% glucose (or 0.25% fructose). Cultures were examined microscopically
for puritYafter three weeks of incubation at 35°C.
3.5. Growth studies
Unless otherwise indicated, experiments were conducted in Medium 2 with 20 mM
lactate and 20 mM sulfate, at 35°C and pH 7.2, and with 0.1 % NaCl. Growth was monitored
by measuring optical density at 580 nm with a Bausch and Lomb Spectronic 21
spectrophotometer. Total non-precipitated sulfides (H2S, S2-, and HS-) were measured
spectrophotometrically as colloical CuS {33}.
The pH range of growth was estimated in bicarbonate buffered mineraI Medium 2,
where pH was adjusted with sterile Na2C03, NaOH, or HCl solutions. The temperature range
for growth was tested from 16 ta 55°C. A possible salt requirement in addition to the
concentration used in Medium 2 was tested by adding NaCl concentrations ranging from 0.1 to
3 %.
Ability of strains to use various substrates as electron donor was tested in presence of
20 mM sulfate. When the growth failed, substrate oxidation ability was tested in presence of
vitamins {32} and 2 g. 1-1 of yeast extract. Sulfite, thiosulfate, elemental sulfur, nitrate,
fumarate, and malate were tested as electron acceptors in presence of 20 mM lactate.
3. 6. Analytical techniques
Organic acids, alcohols, and fatty acids were assayed by high-performance liquid
chromatography (HPLC): pump, Analprep 93 (Touzart et Matignon, Vitry-sur-Seine, France);
flow rate, 0.6 ml/min; injection loop 20 ~l; column ORH-801, 300x6.5 mm (Interaction
Chemicals Inc., Mountain View, CA, USA); eluent: H2S04 O.OlN; H+ ions exchange column,
8 ~m pore size; elution according to the pKa and/or the molecular weight for the non-ionic
compounds; column temperature, 35°C; detection, differential refractometer (Knauer, Berlin,
Germany); recorder, Chromatopak C-R3A (Shimadzu, Kyoto, Japan).
For cell pigment determination, 3 g of wet cells, suspended in 10 ml of 20 mM Tris-
HCl buffer (pH 7.6), were sonicated and the suspension was centrifuged at 30,000 g for 20
min. The resulting cell-free extract was centrifuged at 140,000 g for 2 h. The pellet was
resuspended in the previous buffer. Cytochromes were identified by recording air-oxidized and
dithionite-reduced spectra, as weIl as the redox difference spectra of the dithionite-reduced
66

minus air-oxidized of each fraction, using a Shimadzu UV 300 spectrophotometer (Shimadzu,
Kyoto, Japan).
Gram staining was done using a standard method with a coloration kit (Sigma Chemical
Co, St Louis, U.S.A). Escherichia coli and Micrococcus luteus were used as controls.
The guanine-plus-cytosine content of the DNA (G+C%) was determined at the German
Collection of Microorganisms (DSM), Braunschweig, Germany. DNA was isolated by
chromatography on hydroxyapatite {34}. The G+C % was determined by HPLC; non-
methylated Lambda virus DNA was used for calibration {35}.
4. RESULTS
4.1. Field results
Densities of lactate-utilizing sulfate-reducers were measured from sowing
(spermospherical samples: 0-14 days) ta harvest (rhizospherical samples : 15-110 or 120 days)
in the two Senegal River delta soils (Figure 2a). In the two Casamance soils, they were
enumerated before the first usefull rain (unplanted soil samples), and on rhizospherical
samples, from transplanting to harvest (Figure 2b). Higher densities were observed on the days
after seed germination, from transplanting to tillering, and at flowering.
4.2. Microscopical observations on enumeration and enrichment cultures
The enumeration-tubes choosed for enrichment-cultures (Figure 1) contained two
carbone sources, the electron donor (lactate, acetate, or palmitate) and yeast extract.
Microscopical observations showed mixed cultures of one or more motile sulfate-reducing
bacteria, and weakly motile or non-motile rods, sometimes observed in their sporulating stage.
Vibrio-shaped cells (differing by motility and sizes) were significantly dominant in more than
90% of the tubes observed during the hours following the blackening of filter, whatever the site
or the electron donor. Most of cultures (98 %) did not show a modification of cell forrns when
subcultured on Media 1 or 2. But vibrios died when subcultured 1 to 3 times on acetate or
palmitate-sulfate media. Four or five rapid subculturings on Medium 2 (free from yeast extract),
with lactate or with pyruvate reduced the relative number of sporulating bacteria (that might he
other sulfate-reducers or contaminants, such as anaerobic bacteria using the yeast extract).
Enrichment-tests on propionate, acetate, n- and iso-butyrate, n-benzoate, palmitate,
glucose and fructose failed, whereas those with propionate or palmitate progressively resulted
in the selection of two sporulating sulfate-reducing bacteria (slighly curved rods or oval cells
with round spores). They grew very slowly (2 to 6 months of incubation were necessary to
obtain cell densities around 105), and could not be subcultured for more than three transfers and
identified.
67

log SRB g-1 of soil
10 ~=======:::;::::====:::;------
---,
Tilène
Flowering
8
Pont Gendarme
Tillering
6
4
Harvest
1
1
Rhizospheri:al sam;::lles
'If
y
: - - - - - - - - - - - >
o
50
100
i50
Days after sowing
Fig. 2a: Lactate-utilising bacteria enumerated in the spermosphere and the rhizosphere
of direct-seeded rice in 2 fields of the Senegal River delta.
log Sr;3 9-1 of soil
10 ""'i"r========::::::;------::-------------,
ïillering
Dji:>élor
---0-
Lou:lia-Oualoff
8
Ficwering
Fi~ jaïn
Tra nsp lanti ng
ê
Dry soil
Harvest
4
Rhizosphere samples
2-;---....,....--.....,.---.....::;::------r---..-----r----.-----1
-200
·100
o
100
200
Days after transplanting
Fig. 2b: Lactate-utilising bacteria enumerated before transplanting and in the rhizosphere
of transplanted rice in 2 fields situated in Casamance/Senegal.
68

4.3. Isolation
Four strains (FO, F2, F3 and G 1) were isolated on lactate (15 mM) as electron donor,
while strain FI was obtained on pyruvate (15 mM). They developped after 3 to 9 days of
incubation at 35°C as brownish, lens-shaped colonies in deep agar tubes. Because the growth
characteristics of strain F2 were not constant, this strain was repurified on deep-agar lactate
medium, leading to the isolation of three strains (F2W, F2X, and F2Y).
4.4. Strain description
4.4.1.Morphology
The seven isolates were motile vibrios, 1-3 ~m in length and 0.5-0.8 ~m in width
(Table 2). They lost motility and became spirilloid in old cultures. Strain G 1 exhibited a slight
variability (both in size and motility) when cultured on lactate or pyruvate. Cells stained Gram-
negative and did not sporulate.
4.4.2. Physiology
Growth characteristics of the strains on Medium 2 are reported in Table 1. The range of
temperature for growth was 16-48°C, optima were between 30 to 42°C. The range of pH was
5.2-8.7, optimum pH were between 6.75-7.0. Strains could grow in Medium 2 whithout
addition al NaCl. But NaCI improved growth, with optima observed when added concentrations
varied from 1 to 5 g.I-l.
Data on electron donnors and acceptors are presented in Table 2. The strains were fast-
growing bacteria with minimum doubling times between 1.5 and 4 h on Medium 2 with lactate
or pyruvate. Lactate and pyruvate were incompletely oxidized to acetate, and growth occured
without addition of vitamin s, yeast extract, peptone, or Biotrypcase. Fumarate (except for strain
F2Y), malate, H2+C02, ethanol, propanol, and butanol (except for strains FO and FI) could
serve as electron donors only when vitamins and yeast extract were provided. Acetate was the
end product of fumarate and malate degradation. Alcohols were degraded to the corresponding
volatile fatty acids. Except strain G 1, aIl isolates could ferment pyruvate. Substrates tested and
not utilized are listed in Table 2.
Sulfate, sulfite, and thiosulfate were used as electron acceptors by aIl isolates (Table 2)
and sulfide was the product of reduction. No isolate was able to use elemental sulfur, fumarate,
malate, or nitrate as electron acceptor.
4.4.3. Cytochromes, pigments and DNA base composition
When reduced with sodium dithionite, the soluble extracts of aIl isolates exhibited
absorption bands characteristic of c-type cytochrome, with maxima at 419, 522, and 552 nm.
The oxidized extracts showed the cytochrome Soret peak at 408 nm. In addition, the spectra
showed a characteristic absorption band at 628 nm indicating the presence of desulfoviridin
{36,37}.
The G+C % varied from 56.3 to 62.8 ± 0.3 % (Table 2).
69

Table 2. Electron donors and acceptors, G+C mol %, pigments and morphology
Strain
FO
FI
F2W F2X F2Y F3
GI
D. vulgaris
D. desulfuricans
Electron don ors (in mM) on Medium 2
Lactate (15)1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Pyruvate (15) 1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Electron donors (in mM) oxidized on Medium 2, acetate (2mM) and vitamins added2
H2+C02 (2bars)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Fumarate (10)
+
+
+
+
+
+
+
+
Malate (10)
+
+
+
+
+
+
+
Ethanol (5)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Propanol (5)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Butanol (5)
+
+
+
+
+
nr 3
+
Glycerol (5)
(+)4,
(+)
(+)
(+)
+
nr
Serine (10)
(+)
(+)
(+)
+
+
Choline (5)
+
Carbon substrates (in mM) fermented in sulfate-free Medium 2 5
Pyruvate (15)
+
+
+
+
+
+
+
Malate (10)
+
Electron acceptors (in mM), lactate (20mM) as electron donor
Sulfate (20)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Sulfite (5)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Thiosulfate (IO)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ElementaI sulfur (10)
+
Nitrate (5)
+
Fumarate (10)
+
G+C mol % and pigments
G+C mol %
62.5±0.6 59.0 60.4±0.2
62.8
56.3
60.1
60.2
61.0
55.0
Cytoehromes
c
c
c
c
c
c
c
c
c
Desulfoviridin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Morphology
Form
vibrio
vibrio
vibrio
vibrio
vibrio
vibrio
short rod 6
vibrio
vibrio
Average length (J.un)
3-6
4-7
3-7
2-6
3-6
4-7
2-4 (4-6)
1.5-4
1.5-4
Average width (J.un)
0.5-0.8
0.5-1.0 0.4-0.7 0.5-0.8 0.5-0.8 0.5-0.7 0.6-0.8 (0.8-1.0)0.5-0.8
0.5-0.8
1 Without vitarnins or yeast extract
2 Substrates tested (mM), either in presence or absence of acetate or vitamins, and not supporting the growth of any of the
7 isolates: formate (10), oxalate (5), succinate (10), methanol (5), iso-propanol (5), iso-butanol (10), pentanol (10), acetate
(10), propionate (10), n- or iso-butyrate (10), 2-methylbutyrate (10), n-benzoate (10), valerate (5) palmitate (2), fructose
(15), glucose (10), xylose (5), ribose (5), and cysteine (10)
3 nr = not reported
.
4 ( +) Slow degradation without significant growth when yeast extract added (0.1 %)
5 No fennentative process observed, in sulfate medium without yeast extract on: lactate (15), succinate (10), fumarate (10),
oxalate (10), fructose (15), glucose (l0), and ethanol (10)
6 Size and motility were different on lactate or on pyruvate (data in brackets)
70

5. DISCUSSION
5.1. Taxonomy
The seven isolates are strictly anaerobic, mesophilic, Gram-negative, non-sporulating
sulfate-reducing bacteria. They perform incomplete oxidation of lactate and pyruvate to acetate
and C02. They are unable to oxidize acetate, propionate, butyrate, or palmitate. CeUs contain
c]-type cytochromes and desulfoviridin. Based on the above characteristics, they belong to
genus Desulfovibrio {1,3,36,38}. Morphological and physiological characteristics are similar
to those of D. desulfuricans or D. vulgaris {1,3}. The G+C % of strain F2Y (56.3%) is close
to that of D. desulfuricans (55 %) whereas the G+C % of the other six strains (59 to 62.8%) is
close to that of D. vulgaris (61 %). The six strains similar to D. vulgaris differ from the type
strain only by the use of glycerol (Table 2). Strain F2Y differs from D. desulfuricans by its
inability ta oxidize choline and to utilize elemental sulfur and nitrate as electron acceptors.
Likely, strain F2Y is a strain of D. desulfuricans and other isolates are strains of D. vulgaris.
5.2. Low variability of isolated strains
Results show a limited strain diversity (two species of non-sporulating sulfate-reducers)
whereas we surveyed the rhizosphere of at least a dozen of rice cultivars growing in soils
exhibiring a wide range of physico-chemical properties (Table 1) and situated at about 800 km
of distance. The dominance of non-sporulating sulfate-reducers was also reported by Bak and
Pfennig, in the sediment of Lake Constance, where fast-growing H2-and lactate-consumer
strains, were mostly found {39}.
However reported field enumerations and subsequent isolations might he insufficient to
conclude that rice spermosphere and rhizosphere are colonized only by the described fast-
growing, mesophilic, neutrophilic, and non-sporulating strains.
Populations of acetate-utilizing sulfate-reducers might be underestimated because of the
short incubation time required ta obtain positive results (blackening of the filter). Experiments
by J~rgensen and Bak {40} on agar media with marine sediments showed that 12 weeks of
incubation were necessary to obtain the maximum ceU numbers of acetate-using sulfate-
reducers, whereas 1-3 weeks was enough for the developpement of aU colonies of fast-
growing lactate- (or H2)-utilizing sulfate-reducing bacteria. When acetate- or palmitate-utilizing
sporulating sulfate-reducers were enumerated on modified Medium 1 (lactate replaced by 15mM
acetate, or 1mM palmitate), 2-4 weeks of incubation were needed to obtain the blackening of
the filters.
The low strain diversity recorded could also be attributed to low salt content of the
media used for enumeration, enrichment and isolation. In particular, fatty acid-oxidizing
sulfate-reducing bacteria (Desulfobacter or Desulfobacterium spp) require a relarively high level
of NaCl. Laanbroek and Pfennig {41}, comparing the anaerobic oxidarion of short-chain fatty
71

acids in freshwater and in marine sediments, established that acetate-oxidizing strains did not
grow in freshwater medium. They were isolated from brackish or marine sarnples only, and
their densities were significantly lower than those of Desulfovibrio desulfuricans.
Vitamins requirement couId have limited the growth of sorne strains. However, during
the last survey in Loudia Oualoff, the use of the modified Medium 1 (yeast extract replaced by
biotin and vitamin B 12), did not result in the growth of morphologically different sulfate-
reducers, as compared with samples collected during the preceeding cropping season. But it
reduced the relative number of non sulfate-reducing bacteria -- probably those able to use yeast
extract as carbon source-- and increased the number of vibrioid sulfate-reducers.
Acetate- or palmitate-utilizing sporulating sulfate-reducers, found as minor component
in less than 10% of fast-growing enumeration-tubes, were different from Desulfobacter
postgatei or Desulfotomaculum acetoxidans, as shown by the very slow growth observed on
the specific acetate-sulfate media established for these two species by Pfennig et al. {26,42}.
Enrichment-tests with various times of incubation, carbon sources, salt content, pH, and
vitamins content did not permit to isolate these species {21 }.
In a field experiment {lI, 18}, it was shown that densities of acetate- or palmitate-
utilizing sulfate-reducers, were 102 to 103 times less abundant than fast-growing lactate-
uti1izing sulfate-reducers on the root surface (Figures 3a and b). Because of their low
populations and very low growth rate, it was assumed that they were not significantly
implicated in rice plant intoxication. Other sulfate-reducers ressembling to Desulfobulbus (oval
or lemon shape), or Desulfonema (filamentous cells) were also observed as rare contaminants
( Il). Their isolation was not assayed: they could not be responsible of the damages on rice
because of their very low occurence in the rhizosphere.
Despite of possible methodological reservation, the dominance of non-sporulating
sulfate-reducers observed in this study, is consistent with a previous work reporting that the
detrimental effects of sulfides produced in ricefieds was due, whatever the soil and the cultivar,
to lactate-utilizing sulfate-reducers, and may be indirectly correlated with their number. Jacq
and Roger {20} determined that sulfide toxicity was the result of the antagonistic action of
sulfate-reducing, lactate-oxidizing bacteria versus sulfide-oxidizing bacteria. Major injuries to
and death of the rice plant occured only when the density of lactate-oxidizing sulfate-reducers,
enumerated on Medium 1, was at least 100 times higher than that of Thiobacillus denitrificans
in the same sample.
It was found that non sporulating sulfate-reducers were associated in the rhizosphere of
diseased rice plant with 02-consuming facultative ferric iron-reducing bacteria, including
Clostridia (11,21). We also found that major contaminants on lactate-sulfate were mainly
Clostridia. Clostridium aceticum was evidenced as the dominant species {21}. As it did not use
lactate, it was supposed that its presence did not significantly modify the composition of lactate-
72

log SRB g-1 of root
,,

Lactate
Cultivar
10
Il
Acetate
IR8
A
Palmitate
9
8
7
6
Harvest
5
0
20
40
60
80
100
120
Days after transplanting
Fig. 3a: Lactate-, acetate-, and palmitate-utilising bacteria enumerated on the rhizoplane
of transplanted IR8 rice in Loudia-Oualoff fields (Casamance/Senegal).
log SRB g-1 of root
11 - : - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ,

Lactate
10
Il
Acetate

Flowering
Palmitate
9
Cultivar
I-Kong-Pao
8
Tillering
7
6
5+----.-----,r--...,......---r'----..--.,..------,-----,...---...,......--!
o
20
40
60
100
Days after transplanting
Fig. 3b: Lactate-, acetate-, and palmitate-utilising bacteria enumerated on the rhizoplane
ofl-Kong-Pao transplanted rice in Loudia-Oualoff fields (Casamance/Senegal).
73

Medium 1 during a short incubation time.
5.3. Strains and their environment
Isolated strains grow in rice rhizosphere on the sma1l number of carbon substrates
(Table 2) that can be provided by germinating seed and root exudates {9,13,43}, or/and
resulting from the activity of heterotrophs. Lactate and pyruvate, exudated by rice roots or
germinating seeds are the main electron donors for a1l strains and can ensure their growth.
Experiments with hydroponic cultures of 1-2-week-old seedlings of IR8 rice {43} showed that
lactate + pyruvate comprised about 15% of excreted carbon compounds and only 25-30 % of
substrates were usable by most Desulfovibrio strains. Average exudation was estimated to be
3.2 Jlg of lactate and 2.1 Jlg of pyruvate day-l. seedling- 1. Fumarate and malate -- oxidized by
most of the studied strains only in presence of vitamins -- represented 8.3 and 1.2 Jlg.day-
1.seedling-1, respectively.
The surveys preceeding this study did not establish any minimum sulfate content in soils
that couId be required for the development of sulfide toxicity {21}. Such result may be partly
explained by high densities of Thiobacillus denitrificans in rice rhizosphere {4,20,26}, which
may contribute to a rapid turnover of reduced sulfur compounds, providing enough sulfates for
Desulfovibrio activities {21}. Brandi et al. {44) reported that Desulfovibrio spp were very
active in the sulfate-limited sediment of Lake Geneva.
Concentrations of NaCI used for growing isolates from brackish ricefields (5 to 15 g.l-
1) were similar to or higher than the concentrations in soil solution a1l0wing rice growth (1-2
g.l-l at sowing or transplanting stages to 5-6 g.l-1 at flowering). Plot experiments with saline
soil of Tilène 3 showed that salinity in the spermosphere and the rhizosphere decreased from
0.2 g.l-l at sowing stage to 0.09 g.l-l at flowering stage {l6}. Field surveys {21} also
showed that NaCI measured in situ under the plow layer with a permanent piezometer, did not
exceed 3-4 g.l_l. Therefore, it can be assumed that sulfate-reducers in the rhizosphere and
spermosphere grow at low sali nity level (0.2 to 3-4 g.l-1). Whereas laboratory results showed
that no isolates required additional NaCI for growth, the optimum NaCI range was significantly
higher than the concentration generally used for growing freshwater strains. This agree with the
hypothesis of a brackish origin of Desulfovibrio occuring in ricefields established on former
mangrove soils {21 ,22}. However, it does not explain why sporulating and completely
oxidizing sulfate-reducers usually occuring of the brackish environments were not encountered
in ricefields established on mangroves.
Isolates were neutrophilic, while they were isolated from soils having an initial pH
ranging from 3.6 to 6.25 after rewetting{ 13,21}. However, flooding results in an increase of
soil pH by 1.5 to 2.0 units during the 3-4 weeks following submersion {Il, 13,16,23}. A
survey in Senegal River delta showed that 95 % of rhizospheric pH were between 6.5 and 7.2,
and that the pH in blackened rhizosphere was 0.4 to 0.6 unit higher than in sulfide-free soil
74

{21}. Sulfate-reducers grow under neutral conditions when they are close to the roots:
optimum pH ranges established for the seven isolates coyer pH range measured in situ in rice
rhizosphere.
All strains were mesophilic. During the rice cultivation cycle in Senegal (July to
November), air temperature varied from 23-24°C (night) to 37-38°C (day), maximum water
temperature was generally 30- 32°C under the rice canopy, temperature at the soil surface
sometimes reached 45°C, and soil temperature at 15 cm depth remained around 28-30°C
{21 ,23 }. The temperature range of isolates covered temperatures that were measured in soil and
floodwater. ln situ measurements indicated that sulfate-reducers activity in the rice
spermosphere and rhizosphere developped around 30±2°C. This range is lower than that
recorded in vitro (Table 1). Upper temperature allowing growth (42-48°C) explain why sulfate-
reducing activity can be detrimental to germinating seeds at the soil surface (2-3 cm depth),
where temperature is not buffered, and why sulfate-reducers can also survive marked increases
in temperature in the floodwater.
6. CONCLUSIONS
Fields surveys showed the presence of high densities of fast-growing, lactate-using,
sulfate reducers in the rhizosphere of rice plant presenting sulfide toxicity symptoms. The seven
sulfate-reducing bacteria isolated from rice rhizosphere pertained to the Desulfovibrio group.
They are characterized by their ability to oxidize a low number of electron donors, which are
provided by rice exudates and incompletely oxidized. They are fast-growing strains, which may
explain why they could damage in a few days germinating seeds, seedlings and even maturing
plants at reproductive stage.
Their densities in sulfide-intoxicated rice rhizosphere and spermosphere, and in
enrichment cultures, were significantly higher than those of sporulating sulfate-reducers which
could not be identified. Therefore, described Desulfovibrio are to be considered as mostly
responsible for the developement of sulfide toxicity.
In the studied area, environ mental conditions in rice rhizosphere appear to be quite
similar in terms of available substrates, temperature, salinity and pH. Desulfovibrio seems to he
the genus best adapted to conditions prevailing in this environment.
The seven strains have been deposited with the D.S.M. under DSM numbers: 6617
(FO), 6618 (FI), 6619 (F2W), 6620 (F2X), 6621 (F2Y), 6622 (F3) and 6623 (G1).
75

ACKNOWLEDGEMENTS The authors thank J.-M. Chianea, C. Mimaudo, and E. Dupont for technical
assistance during laboratory experiments, and Dr.-Ing. K. Prade for technical assistance during field works.
Thanks are due to Dr. J.-L. Garcia for helpful discussions and Dr. P.A. Roger for valuable comments and
revising Ùle manuscript.
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79

Article 3
Characterization of Anaerovibrio burkinabensis sp. nov., a lactate
fermenting bacterium isolated from ri ce field soils
International Journal of Systematic Bacteriology (Sous Presse)
80

/)/' /~L~/'/ ~;fL,/ 'JS ~
JO~.~.-\\ME: ~~~~L'1:.9:f(f,t,:i) P'-\\~~'"sESS(3 6CTPL~: Wed Apr 1) 07:57:35 1992
br 1: -,Ol;te:tm4i1jSD/ljsb - ju/92,6681-10 /
,
1
AUTHOR:
SéE aUE~
PAGE
:J, -)
!STERNATIONAL JOURNAL 01' SVSTEMATlC B"CTERIOLOGV, July 199:, p. 000-000
Vol. 4:, No. 3
00:0·7il3!92030000·00S0:.00,O
Copyright ~ 1992, International Union of Microblological Socictics
Characterization of Anaerovibrio burkinabensis sp. nov., a Lactate-
Fermenting Bacterium Isolated from Rice Field Soils
ABOL'BAKAR S. OCATIAR.-\\,I ALFRED S. TRAORE': AND JEAN-LOCIS GARCIA 1.
Laboratoire de lvlicrobiologie ORS TO/vf, Universicé de Provence, 3 Place Victor Hugo, 1333] Marseille Céde.r: 3,
France, land Départemenc de Biochimie·Microbiologie l.S.N., Université de Ouagadougou,
Ouagadougou, Burkina Faso:
A strictly anaerobic. gram-negative bacterium was isolated from rice field soils by using lactate as a sole
carbon and energy source. The cells were non·spore·forming, motile, curved rads. Optimal gro\\Vth occurred
at 35°C and pH 6.8. No :"iaCI requirement \\Vas observed. Vitamins were required for growth. Our isola te.
strain B.BoT (T = type strain), fermentcd pyruvate, fumarate. malate, citrate. dihydroxyacetone, fructose,
1,:.propanediol, glutamate. and aspartate to acetate, propionate, succinate, and traces of hydrogen. Strain
B.B T
o
did oot use ribose or glycerol as an energy source, although glycerol degradation produced mainly
1.3-propanediol. Ferric iron was facultatively reduced. :'Iiitrate and sulfate were not reduced. Cytochrome b
was present. The guanine·plus.cytosine content of the 01'iA \\Vas 44.1 := 0.1 mol%. We propose that strain B.Bo
(= OS;\\1 6:83) should be the type strain of a ne\\V spccie~ in the gcnus A naerovibrio , Anaerovibrio bllrkinabensis.
In wetland ecosystems, SLlch as rice fields, the anaerobic
approximately ï .0. A Mechanobacceriwn sp. strain was
mine~<liiZJtion of organic matte:- is a key mechanism in
obtained from our labor:ltory collection.
nutrient ~ecycling, which involves severa! ':Jac:erial groupS.
:\\Iedia and culture conditions. We used the techniques for
Lactate is thought ta be an important inte~meàiary in .his
cu\\ti....ation of strict anaerobes desc:ibed by ~lacy et al. (2-:-)
process since this compound is produced both trom fermen-
throu!!hout this studv. Strains were !!rown on a basal me-
tation processes and as a ~ice root exudate. L.lctate is
diu:7l -containing (pe-r liter) 0.25 g of KH:PO., 0.30 g of
cor.sumed anaerobically by members of mor;Jhologic:.Jlly
:'-<MJCl, l g of :--iaCl, 0.50 g of KC!, DAO g of ~lgCl: . 6H:0,
diverse and nutritionall\\' hetero!!eneous ~rouos of bacteria.
0.16 g of CJ,Cl: . 2H:0, 0.001 g of resazurin, and 1 ml of 3
including many ferme;\\tative bac:eria. seve:al sulfur- and
trace element solution (17). The medium was boiied under a
sulfate-rc:ducing bac:eria (1::,21, ::; • ..:~, ":5), and sorne ferric
stream of O:-free N:, cooied tO room temperature, and
iron reducers (11, 18, ::, 261.
dispensed into Hungate tubes or serum bottles by using the
In sorne water-lo!!2ed rice field soils_ ferrous iron :Jnd
Hungate anaerobic technique (16) as modified by ~liller and
sul:ide, the end produc:s of me:J,bolism of ferric iron-
\\Vollin (::9) and Balch and Wolfe (2). After the medium was
reducing bacteria and sulfur- and sulfate-reducin!! bacteria,
autoclaved at 1l0·C for 40 min, NaHCO
respect~e!y,
J and Na:S were
are very toxic for ri ce Il '7a, 33a). -Riee fic:ld
added from heat-sterilized stock solutions to final concentra·
soiis rrom the Kou V;dlev in Burkina Faso iWest Africa) are
tions of 0.:5 and 0.0:'s':é, respectively. Just before inocula·
acidic and ri ch in iron. In an ;lttemot ta studv ferrous iron
tion, sucstrates and vitamins (1 ml per liter of culture
and sulfide toxicities in thc:se soils, bac!eri;l erlrichment
medium) \\Vere supplied from filrer·sterilized stock solutions.
cultures were grown \\Vith ferric citrat::: and sulfate as e!ec-
l"nless olherwise indic:lted, ail experiments were carried
tron acceptors and with various substr:ltes (ac::::ate, propi-
out at 35=C and pH 7.1 in a culture medium containing 52
onate, ethanol, lac:ate) as encrgy sources. Several lac:ate-
m~l lac:ate as the sole carbon and energy source. Growth
utilizing microorganisms (fermentative J,nd sulfate-reducing
\\I.'as monitored by measuring optical densiry at 530 nm with
bacteria) were isolated.
a Bausch & Lomb Spectronic 21 spectrophotometer. The pH
In this paper we describe the isolation and characteriz:J-
range for growth was estimated in a Tris·maleate buffer
tion of a lactate-fermenting, facultative!v iron·reducing bac-
medium, and the pH was adjusted with sterile NaOH solu-
terium that was obtained -from reduced rice field soils. rn
tions. The tempe:ature· range for growth was tested at
view of the morphology and the me:abolic properties of the
tempe ratures ranging from 13 to SO·C The salt requirement
isolate, we propose that this organism is a member of a new
was tested by growing the strain in the presence of 0 to 2':é
spe:.::ies of the genus A naerovibrio , Anaerovibrio burkin-
NaCl in media. Nutritional tests were carried out simulta·
abensis .
neouslv in four media. Medium 1 was a basal medium that
was s~DDlemented with growth factors (0.1':é veast extract
~l-\\.TÈRLU.S
rDifco Laboratories, Detroit. Mich.] and 0.1%' Biotrypcase
A..'m \\lETHûDS
[Biomérieux, Craponne, France], 3 mM sodium acetate (as a
Origin of straios. Al1aerol'ibrio lipoZvcica DSM 30ï4 and
carbon source), and a substrate at a concentration of 5, 10,
Jfechanospirillum IWl1garei DSM 364 were obtained from the
or 20 mM (as an energy source). Medium:: was the same as
German Culture Collection. Strain B.IB T
medium 1 except th.n rhe concentrations of the growth
n
(T = type strain)
was isolated from reduced layers (depth, lU to :5 cm) in four
factors were dec:eased to 0.01 %. Medium 3 was the same as
diffc:rent ri ce field soils in the Kou Vallev of Burkina Faso.
medium:: except that the growth factors were omitted. And
The in situ temperature was about 33·é, and the pH was
medium 4 was the same as medium:: except that aCet;!te was
omitted. In addition, 1,3-propanediol utilization was tested
in a coculture with a Methanobacterium sp. strain or lvfeth-
anospirilIlImhungacei. The vitamin requirement was studied
• Currcsponding author.
by Llsing the vitamin solutions of Balch et al. (1) and Pfennig
81

rOB;-';AME: IJSB-J'üL92 (6681) PAGE::; SESS: 3 OL"TPL"T.; Wed Apr 807:57:35 1992
brl.301/team41ijsb/ijsb- juI9:, 6681-10'7
b
OUATIARA ET AL.
i:-<T. J. SYST. B,\\CTEIUOL.
et aL (31), which were tcsted separ:Hely. The molar growth
RESl.'LTS
yield was determined in a :!-liter batch culture containing
medium 4 supplemented \\Vith :0 mM lactate, 10 m~1 fruc·
Isolati.on. Enumeration by using the most probable number
tose, or 10 mM glycerol phosphate in the p~esence of 0.1 %
methoet (three tubes per dilution) with lactate and ferric
yeast extract. In the determinations of growth yields when J citrate as the electron acceptors showed tha~ iron reduction
- Cl
glycerol phosphate was uscd, we correc:ed for growth Î' occurred at high dilutions (10-' to lO-~g' of wet sOil'·''). f~' r·
without an added energy source. Al! of the values given
. \\Vhen ferric iron reduction was observed. the highest posi. LPd ~CLl
bdow are the means of three determinations.
tive most probable number dilution was chosen fôr funher
Iron reduction was t'ested with lactate (10 mM) and ferric
studies. Cultures were enriched by subjecting them to at
citrate (10 mM). Fe(III) and Fe.(II) were quantified as de·
least five transfers on a medium containing lactate and ferric
scribed by Lovley and Phillips (24). Chemic:l1 reduction of
citrate. Microscopic observations showed that a motile,
Fe (III) by sulfide, chemical reduction of Fe(III) by succi·
nonsporulated vibrio was a major bacterial form in enrich-
nate. and chemical reduction of Fe(III) by any other com-
ment cultures. To determine whether ferric iron reduction
.' 1. pound in the medium w~ntified jn.....i..o.ucubted culture
was obligatory or facultative, Fe(III) citrate was omitted
from the culture medium; after five subcultures with laC~Jle
" l ' tUDes supplemcnted with~O.O.5Cé)Na:~mOm:VILsuCcin:l;"e.: and
in the absence of Fe(III) citrate, the enrichment cultures had
,
1 ml of an autoclaved culture ofmain B~BoT;~ctive!y.
the ability to reduce ferric iron, and we- observed the same
Fumarate (10 mM) was tested as an electron acceptor in the
1\\
motile, nonsporulated vibrio as the major bacterial form.
presence of H~ ~ CO: (SO:20. 1..5 x ID" P:l.). Nitrate (10
This showed that ferric iron reduction was facultative;
.
m\\1) :lnd sulfate (10 mM) were tested as electrons acceptors
X'
therefore. purifications were performed without Fe(III) cit·
in the presence of H:~ CO: (80:20, l.j x 105 Pa) or 10 m;"'1
... lactate.
rate. After 5 davs of incubation at 35'C, circular, lens-
shaped. ochre tci brown colonies appeared. The colonies
Isolation. Pure cultures were obtained by repeated appli-
\\vhich we picked reduc:d ferric iron in liquid medium. Two
cation of the roll tube method as described by Hungate (16).
strains (strains B.B/ and C~Co) were isolated from four
Strain puriry was checked by using :1 complex medium
àifferent rice field soils; because these two str:lÎns were verY
contuining 0.25% veast extmct. U.25% oeotone. U.:5% Bio-
trypcase.~
similar. strain B.BoT was chosen for further characterizj·
and 0.:5% glucose. The cuît~re was examined
tion.
microscopic:l.lIy after 3 weeks of incubation.
\\!orphology. The cells of strain B.B T
n were slightly cur'.:ed
CcII pigment determinatioll ..-\\bOlit 3 ::; of .:c!ls in 10 ml or'
raùs (0.5 bv 1.5 tO 3.0 èLm) and were highlv motile bv means
:0 m;"'! Tris hydrochloride butter (pl-! '7.b) was sonic:lt~d, and
of a single 'polar flagellum (Fig. 1). In old 'cultures. the ce Ils
the resulting suspension was centrifuged at :30.000 x g for 20
were spirilloid and not motile. The cells were gram negative.
min. The resulting ccli extr:l.ct \\Vas separated into the soluble
and spores were nCt observed.
ir~ction ~nd rhe panicuLJte fr:Jction by c::ntrifug:l.tion ~t
Physiology. Strain B.B T
o was a strictly anaerobic bacte-
1':0.000 x g for 1 h. The p:miculate frac~ion was the
rium. The optimum growth temperature was approximately
ultrac~ntrifugation peliet resuspended in the buffer described
:3j'C; no ~ro\\Vth was observed at temDeratures above 43°C
above. Cytochromes were ièentified by recording the redox
or b~lo\\V Ï3°c (Fig. :a). Strain B.B T
o grew optimally at pH
èiffere:lce soectra of the di~hion ite-reduced minus air-oxi-
6.S :.lOd gr:w at pH values ranging from 5.3 to 8.5 (Fig. 2b).
dized ponio'n of each fraction by using a Shim~dzu modei
","0 :-.iaCl requirement W:lS observed. Complete inhibition of
l'V 300 spectrophOtometer.
\\!rowth was observed Jt an NaCI concentrJtion of 1.2S: or
Transmission electron micrographs. Electron· micrographs
~;bove (Fig. lc).
. '
.
.
were obtained by using a JEOL model JE~I·1200 EX trans-
.
The growth rate determin;:lied at 35'C and pH 6.8 in a :1oi'<tl11" (
mission eiec~ron microscooe and ne:.:ati\\'e staininl: with 1~
medium contain::-.,; 1 g of NaCI per liter and :0 m:Vllac:ate
(wtJvol) sodium phosphot~ngstate. Gram staining was per-
\\Vas 004'7 h- 1•
formed by using a standard method and a color:nion kit
'\\
The molar growth yields determin~œd by using lactate. 0~i~:II""':
(Sigma Chernical Co., St. Louis, Mo.). EschericluD coii :lOd
glycerol phosphate. and fructose were i.: =1.5, 19.7 =2.0.
MicrococcLlS [weLlS were used :l.S con trois.
and 27.0 =1.8 g (dry weight) per mol, rcspectively.
Analytical techniques. Volatile fatry acids. organic acids.
Strain B.B T
o fermented citrate, fumamte. malate, lactate.
and alcohols were assayed by high-pe:iormance liquid chro·
pyruvate. dihydroxyacetone. fructose. 1.2-propanediol. as,
matography; the pump was an Analprep 93 pump (Touzurt et
panate, and glutamate. Yeast extract. Casamino Aciàs.
~Iatignon, Vitry sur Seine. France), the flo\\V rate WJS 0.6
peptone, and Biotrypcase sùpponed slight growth. Glycerol
ml/min, the volume of the injection loop was 20 èL1. the'
was slightly degraded with no increase in the turbidiry of the
column (300 by 6.5 mm) was a lype ORH-SOI column
culture medium. Glycerol 3-phosphate was readily de-'
(Interaction ChemicJls. Inc .• Mountain View, CatiL). the
graded. but very good growth (optical densiry, 0.9) occurred
column temoer;uure was 35°C. the detector was a differential
only when 0.1% yeast extract was provided; in the absence
refractometer (Knauer. Berlin, Germanv). and the recorder
of yeast extract, this substrate \\Vas not degraded.
was a Chromatopak C-R3A recorder ·(Shlmadzu. Kyoto.
Acetate and propionate in variable amounts and traces of
lapan).
hydrogen were produced from ail of the substrates degraded.
Hydrogen and me:han.: were measurcd by using gas
The following four compounds were detected as major
chromatogrJphic methods as describeù previously (1':J). Sul·
products: (i) acetate from citrate. pyruvate. and glutamate;
fide was me:lsured spectrophotometric:t1ly as colloidal CuS
(ii) propionate from lactate, dihydroxyacetone. fructose.
(5).
1.2·propanediol. and glycerol 3-phosphate; (iii) succinate
DNA extraction. DNA was isolated by chromatography on
from fumarate, malate, and aspartate; and (iv) 1,3·propane-
hydroxyapatite (4). The guanine-plus-cytosine (G'"-C) con-
diol from glycerol (Table 1). Small amouncs of lactate and
tent of the DNA was determined by using high-performance
succin:lte were detected when a sugar was degraded (Table
liquid chromatography; nonmethylated lambda virus Di\\:A
1). Propanol was a main product of 1.2·propanediol fermen·
was used for calibration 1:8).
t:ltion (Table 1). Carbon dioxide was produced. but since this
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IbrL301/team'+/ijsbiijsb - j u19:,'66S 1-10'7
AUTHOR:
SE= ~y
PAGE
~
VOL, 42, 1992
AfliAEROVlBRJO BURKINAllENSlS SP, NOV,
c
\\
'.
'"
....
FIG. 1. Electron photomic:~ograph of strain B~BoT. Bar = 1 ~m.
comDound was not auantified after !Howth of the slrJin, the
the presence of H:-CO: (80:10, 1.5 x lOs Pa), strain B.BoT
leveis of total carb~n recovery c~uid not be calculated.
convened 10 mM fumarate to 0.1 mM acetate, 2.3 mM
\\!Jlate and amino Jcid fermentJtion reauired acctate as a
propionate, and 7.5 mM succinate; in control culture tubes
carbon Source (Tabie 1). Ye~lst extract' was required ior
containing fumaratc and S.·CO. (80::0, 1.5 x HP Pa), the
growth on glycerol phosphate: yeast cxtrJct and Biotrypcase
concentr:ltions of acetate, ·propionate, and succinate were
were required for 1.2'propanediol utilization. The substrates Ci·LS. 2.4, and 5.1 m:-'1, resoectivelv.
chat did not SUPDOrt !.!rowth included H,-CO"
methanol,
In the presence of H:-CO: (80::0, 1.5 x 1O~ Pa), or lactate
et~anol, propanoL bu:7mol, pent:Jnol, 1,]·'propanediol, eth·
<lnd nitr:lte, nitrite and ammonia were nOt produced. In a
yle:1e glycol, sorbitol, m~lnnital, dulcitol, adonitol, g!yceral.
medium containing sulfate, H:·CO: (80::0, 1.5 x HP Pa), or
dehyde, ribose, xylose, arabinose, glucose, galactose, sor·
lactate, sulfide \\Vas not detected. The stoichiometrv of
bose, rhamnose, SUCiose,
lactose,
melibiose, raffinose.
lactate fermentation (3.3 mM acetate, 6.6 mM propio~ate,
starch, cellulose, amylose, pectin, formate, ace ta te, propi,
and 0.02 mM succinate) in the presence of nitrate or sulfate
onate, butyrate, succinate, male:Jte, choline, :Jlanine, cyste-
was the same as chat in control tubes without these corn·
ine, lysine, serine, rvrosine, and !!elatin.
pounds.
No growth occu;red in a culture medium t.hat lacked
No methane production was observed when strain B~BoT
vit;lmins or \\vhen the medium was supplemented with the
was cultured with :"fcrftanobacrerium sp. or ,'vfcrftanospiril-
vitamin solution of Pfennig et al. (31). However, substrate
l/lm /lLlngarei in medium containing 1,3-propaneàiol.
ferment:ltion was observed when the same medium was
. Pigments. In the soluble and the particulate fractions, the
suppleme:ned with the vitamin solution of Ealch et al. (1).
reduced spectra contained
the ch:lracteristic absorption
Growth was observed when both growth factors <lnd the
bands of rype b cytochromes with maxima at ~23, 525, and
vitamin solution of Pfennig et al. (31) were addcd to the
555 nm. The oxidiz:d extract had an absorption ma.ximum at
medium.
.
408 nm. The cvtochrome WOlS not reduced bv sodium ascor·
In the presence of lactate :Jnd ierric citrate. S ta 10 mM
bate, which indic;Jted that it had a low midpoint redox
Fe(II) was produced by strain E.E"T after H ta 30 h of
potential. Fumarate reoxidized the cytochrome (data not
growth; we observed formation of an important quaritiry of a
shown) .
. black precipitate (FeS) in the culture medium, and 10 m\\'l
Di'iA base composition. The G"""C content of the DNA was
lactate was converted to 5.8 mI\\:! ucetate and 4.2 m;vl
44.1 = 0.1 mol% (mean of three determinations).
propionate. During the same time, on~y 0.2 to OA m~1 Fe(Il)
\\Vas produced in culture tubes containing sulfide, succinate,
and 1 ml of an autodaved culture of strain B.EnT. When
DISCl.:SSION
culture tubes were autoclaved, the concentration of F:::(II)
produced was less than 0.5 m~L Cd!-free filtrates of activelv
Physiology. Strain B.B T
o is a strictly ~naerobic vibrio that
growing cultures of strain B~B"T did not produce F~(1IJ. In
uses lactate and a broad range of substrates, including
83

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IbrUOl/team4/ijsbiijsb-juI9:.6ô81-107
AUTHOR:
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10
20
30
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50
5
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a
Il
Temp (OC)
pH
0..3
C
!.. 0,2
•E
:l-
0.1
0.0 +----T'"""---~--......,~--......,---....,.......;=-
.......-....J
o
2

6

10
12
[NaCI)
(g/l)
FIG. ~
Effccts of tcmpcraturc (al. pH (bl, .md :"aCi concentration (c) on :hc growlh ':lte of strain B.80'l'·
organic acids, sug:lrs.
1.2-propanediol, and sorne amino
(l'rom the tri- and dic:J.rboxylic aciàs lested) and propanol
'\\I.:ids, as energy sources.
(l'rom l.:-propaneàiol) are additional main products. \\Ve
The fermentation e:ld products are acetate and propionate
deteCled traces of \\ac:ale and succinate l'rom sugar metabo-
in variable amounts. as weI! as lraces ai hydrogen. Succinale
lism.
T.-\\BLE 1. E:1d products of substratc fcrrncnt:lliuns by strain B.B./
Concn ImM) of the following ferment3tion products":
Substr3le
Ac~:~[e
P.op,onalc
Lac:ate
Suceinate
Prapanol
Hydragen
Citratc (20 mM)
3..l..J
6~0
O.l-OA
Fumar:llc (20 mM)
9.J
-kG
10.1
O.l-O.J
~Ialatc (20 mMt
10.:
1.6
12.8
O.l-O.J
Lactatc (20 mM)
6.7
13.3
O.l-O.J
?yruvatc (20 mM)
1J.~
5.::
d.1-O.J
DihydroxY:lcctone (10 mM)
'+.5
5.S
<0.05
<0.04
O.l-O.J
Fructose (10 mM)
:l.S
11.2
<0.05
<0.08
O.I-O.J
Glycerol (10 mM)<
<0.01
1.J
O.l-OA
1.:·Propanediol (20 mM)"
O.J
11.J
7.6
0.1-0.--
Aspart:llc (::0 mMY'
6.:
J.2
9.5
0.1-0.4
Giutamate (:0 mM)"
32.9
i.J
O.l-OA
.. D~la ....ere coTTeCled for conlral vaiue~.
• Acetate was rcqulred lar substrate utiliz~tion.
.
C
Glyccrol \\Vas <!egndcd [a 1.3·praJlanedioll~.5 mM). prapianale (1.~ m~ll. and tr~ce~ af acetatc and hydragen. but na growth \\Vas obscrved. ln [he presence
al 0.1':'0 yeast extract, glyeerol pnaspl"'tc (1~ mM) ....as realJily dcgradelJ wllh goolJ growth to propianate (1:.0 mM) and acct~te (1.5 mM\\.
84

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brl:301:team4/ijsbiijsb - ju!92.'6681-lOi
.AUTHOR:
SE: QUERY
PAGE.-J C
VOL.•1:, 199:
ANAEROVlBR10 BURKlNABENS1S S?
NOV.
e
The occurrence of succinate as an end product of metab·
22,14); obligatory ferric iron dissimilatory reduction coupled
olism suggests that propionate is formed via a dicarboxylic
with substrate oxidation can be carried out by facultatively
acid pathway (35). Degradation of reduced compounds, such
or strictly anaerobic bacteria (23, 15, 26).
as 1,2·propanediol, 1,3-propanediol, and glycerol, by strictly
Because of its facultative abiliry to reduce femc iron,
anaerobic bacteria requires an external e\\ectron acceptor (8,
strain B~BoT could contribute to ferrous iron toxicirv in rice
30, 36). This suggests that the yeast extract and biotrypcase
fields.
-
required for 1,2-propanediol fermentation act as elec~ron
. The optimal temperalUre, optimal pH, and optimal NaCI
acceotors (36). The members of several groups of bacteria
concentration determined by laboratory studies were very
prod~ce 1,3-propanediol and acids from glyc~rol fermenta·
similar to the in situ conditions observed in the rice field soils
. tion (10, 13, 38. 40-42). The mechanism oi 1,3-propanediol
of the Kou Valley (33°C, pH 7.0, and traces of NaCl),
formation from glycerol is conversion of the substrate (via
showing that strain B4BoT is well adapted to its site of
dehydralation) to 3·hydroxypropionaldehyde. which is then
isolation.
reduced to 1,3-propanediol (9, 10, 13, 38, 40-+1). Fermenta·
Taxonomy. As a gram-negative, strict!y anaerobic, non-
tion data have suggested that the use of glycerol as an
spore-forming, chemoorganotrophic organism that forms
indirect H acceptor (3-hydroxypropionaldehyde is the direct
ac::ate and propionate, strain B.BoT belongs to the family
H acceptor) through its conversion tO 1,3-propanediol does
Bacteroidaceae and should be compared with the genera
not generate ATP and I~ads to an irretrievable loss of
Anaerovibrio (34, 3i), Pectinaws (la), 'PropiOlli.spira l39),
substrate for generation of ATP and cell mate ria! (13, 4:).
and Selenomonas (3). Ali of these 2enera ferment numerous
The outstanding property of Anaerovibrio species is anaer-
substrates, including sugars and organic acids, to mainly
obic Jegradation of glYCt:rol to mainiy propionate (1 .. , 3", 3.5,
acetate and propionate (3, 10, :;.. , 37, 39). Identification of
37). Glvcerol is thought to be fermented via glvcerol kinase,
strain B B
4
oT as a member of the genus Pecrinaws. Propioni.
as repérted previously for propionic acid ba~teria (i, 3i).
spira, or Selenomonas is not possible because of the differ-
Our results for gJycerol degradation can be interpreted as
ences observed in the type of flagellation and the inabiliry of
dismutation of glycerol. The glycerol-3-phosphate fermenta-
strain B.BoT to ferment arabinose, galac~ose, glucose, and
tion pattern (exclusive of conversion to propionate,l is similar
mannitOl (Table 2). In contrast tO species belon!:!ing to the
to the fermentation patterns of propionic ac:d bacteria, such
genera Pecrinattls and Propionispira, strain B.B1( does not
as AIJaerovibrio and Propionibac!eriLlm species (6, i, 35,
ferment cellobiose (Table 2). Cnlike Sefenomonas spp.,
3i). The inabilicy to use glycerol but nct glycerol 3-phos-
strain B.B~T fermems fructose and does not use lactose and
Dhate and dihvdroxvacetone su!!!!ests that there mav be t\\VO
mannose (Table 1). The other sugars that are nO[ used bv
pathways for' anaeiobic glycerèf degradation, one 'path\\\\'ay
strain B.B T
o but are readily fermented by species belongin-g
whicn involves glycerol denydrJtJse and a second pathway
to the genera PeCrinatlLS, Propionispira, and Selenomonas
that is simiiar to the path\\\\'ays in propionic acid bacteria (35,
are listed in Tabie 1. When we consiàered (i) morphology
3i). Glycerol dismutation to l,3-propanediol instead of fer-
and the type of flagellation, (ii) the cytochrome content, (iii)
mentation to propionate may result from (i) the absence of
the abiliry to ferment dihydrox-yacetone, fructose, lactate,
\\!lvcerol kinase or the :nabilitv of \\!Ivcerol kinase to exnress
and glycerol phosphate, and (iv) the occ:.Hrence of the same
it~ potential, or (ii) a gre~lter ;ffinity- of glycerol dehyàr'atase
end products from these fermentations, strain B.B T
o
ap-
th an ~lvcerol kinase for the substrate.
peared to be more close!y re\\ated to the gcnus Anaerovihrio.
The ;bsenc: of 1,3-propanediol degradation may be due lO
However, in contrast ~ to the previously describe::J
a lack of enzymatic equipment th:lt is responsible of the-
Anaerovibrio spp., which readily ferment glycerol to mainly
degradation of this substrate rather than exc::ss e1ectron
propionate (6, 3.. , 37), strain B.BoT degrades glycerol with·
release.
out growth to 1,:;-pràpanediol (the main produc:), propion-
Serain B~BuT llsed fcrric iron as an electron acceptor.
ate, and traces of acetate and hydrogen; also, there is a
, . L"ciiization of Fe(II!) as a minor e!ec:ron sink is common in
,:<
difference of la to 13 mol'S"ë between the G-C contents of
a wide variery of fermentative bacteria (:~). We could not
strain B.B T
o
DNA and DNAs of species belonging to the
determine whether using Fe(III) as an ~lectron sink provided
genus Allaerovibrio (Table 2). Despite these differences, we
a slightly gre:ller ~nergy yield than fermentation alone.
suggest that strain B.B T
o should be assignedto the genus
About 50% of the fumarate provided as substrate was
Anaero'v'ibrio since wide divergences in DNA G.,.,C contents
convened to succinate (the end product of fumarate reduc·
have be::n described previously (for example, within the
tion) by strain B.B T
o (Table 1). This level increased to 75%
genera Desulfovibrio [42 to 68 mol%] and Clostridium [12 to
and the amount of ace,ate produced drastically decr:ased
55 mol% D. This assignment, which is based on morpholog-
when the isolate was grown with fumarate in the presence of-
ical and physiological characteristics, is not as indisputable
hydrogen. Ali of these data suggest that fumarate is used as
as an assignment based on DNA-DNA or DNA-RNA hy- .
an electron acceptor. the reduction of fumarate by the
bridization data, bur currently se:ms to be the most accept-
cytochromes of. strain B~BoT is con~istent with the use of
able alternative. If this assignment is confirmed by phyloge-
fumarate as an electron aCCeptor. Cvtochrome b has been
netic experiments, emendation of the description of the
shown to be involved in anaerobic" electron transport tO
genus Anaerovibrio conceming degradation of glycerol will
fumarate in Selenomonas nllnin~ntiLlm, A. lipolyrica, and
be necessary.
Veillonella alcalescens (6). The reoxidation of the cv-
A. lipolytica (14, 15) and Anaerovibrio glycerini (3i) are
toc~rome b of strain B.D T
u by fumarate suggests the pre"s.
the only [wo previously described species of the genus
ence of a cytochrome b·linked electron transport system to
Anaerovibrio. While A. glycerini is highly specialized to
fumarate.
ferment glycerol and its derivatives (3i), A. lipolyrica also
Nitrate and sulfate were not used as electron acceptors.
ferments in addition ta these substrates lactate, dihydroxy·
Ecology. Under anaerobic conditions, microbially reduc·
acetone (this study), fructose, and ribose (14, 15). Unlike the
ible iron is often the most abundant potentia] electron
other [WO species described previously, strain B.BoT fer-
acceptor for bacterial metabolism (32, 43). In anaerobiosis,
ments citrate, fumarnte, malate, pyruvate, and 1,Z-propane-
ferric iron can be redllced by sorne fermenting bacteria (11.
diol (Table 3). Strain B4BoT a1so has a higher DNA G-C
85

JOB~..lu\\IE: IJSB-JCL92 (6681) PAGE: 6 SESS:.3 OCTPCT: Wed Apr 8 Oï:5ï:.35 1992
b.L301/teJm4iijsbiijsb-ju19:.'6681-107
OUAITARA ET AL.
1!'o'T. J. SYST. BAC'TE:RloL.
TABLE 2. Comparison of strain B.B T
n
with sorne acetate- and propion:lle-producing genera oi the family Bacteroidaceae"
Characteristic
,,1 nacro~ -ibrio
p~ctinatu.s
Morphology
Cdl ~hape
Cur..·ed rods
Curved rods
Curved rads
CcII width (IJ,m)
0.5
0.5
0.7-0.8
CcII length (IJ,m)
1.5-3
1.:-3.6 tO 10
2-3:2
Multiple flagella
(-)
( -)
("-)
Flagellum location
Polar
Polar
Lateral
G.,.C content (mol';é)
·Kl
31-34
40
Fermentation of:
Arabinose
Cellobiose
FrucLOse
GalacLOse
Glueosc
LaeLOse
Maltose
~lannose
Raffinose
Rhamnose
Ribose
Sucrose
:'\\vlose
Adonitol
Glyeerol
~!:lnnitol
Lactate
Eseulin
.1
Sl.:~ tex: for rcfcrcnc:s. The .:hara~:c:'lStlcs in Ul'; :atll:': .If: ~(lmmon !() :h~ =urr~:1tl\\.' acsc:-ibct1 SOCCICS or strJ,rntSI of l::1ch ccnus. (-). IWO ûr more r.Jc::lla~
: -), lm!; :bg;;llum; IOleTal tui~. lat"::-;l!luù ln :11..: ,,:~:H;::" û: !h~ ..;:..lIlC;I .....,; .... IJ;,; 1I1 th~ ..:.::1: -:ï';;rm;,;ntc~; -'. n/Jt r.:rm';:11cC:; w. LÎl.::gr,J[i711ion wllhnUl gro,""th; v. v;,;iabic
tt.::::"ÏoH'::HCd b~' somc spccics or sUOSrCCI;';~l; ~R. nO! ;..:~()rt~J.
~o:1tenr (-"..U =0.1 mole,,) th:ln .-1. g!.\\·cerini 1.:':.: =1.0
description of this isolate below extends the range of sub-
molc:'c) andA. lipolylica (3l.5 =1.: molC"c). Therefor::. strain
st,ates whlch are tcoment:d by Anaerol'ibrio species.
B,BuT is a new rype of anaeroDlc baclerium that C:lnnot be
Descriplion
of
Anaerovibrio
bllrkinabensis
sp.
nov.
pbced in either of the previously de~cribed species. We
Anaerovibno bllrkinabensis (bur.ki.na.ben'sis. N. L. adj.
p·ropose that st:,ain BJBo is the type strain of a ne\\\\' species of
bllrkinabensis,
from
Burkinabe, inhabilanls of Burkina
the genus Anaerovlbrio, AllaerO~'ibrio bLirkinabensls. The
Faso. Wesl Afric:l). Curved. spiral-shaped ceUs that are 0.5
by 1.5 ta 3.0 IJ.m. \\·IOlile in young cultures. Gram negative
and non-spore forming.
TABLE 3. Diifer:;lt;ation of strain B,B r
n
(rom other species of
Strictly anaerobic chemoorganolroph. Cilrate, fumarate,
~hl.: gClll1S .~naf.!ro....ihrio"
m:llate, lact:lte, pyru\\":ll:, l.:-propanediol, dihydroxyace-
tOne, fructose, a~partat:. glutamate, glyc:rol phosphate,
ChJ:"actc::stic
LI. giycer:m
.'1. li!,OIyuca
StrJrn 8,13.. r
ye:lst extract, Biotrypc:lse, and Casamino acids ,Ire used as
F~rmentation of:
~nc:·gy sources. Acet:lte is required for fermentation of
Citrate
malate. l,:-propane!iiol, and amino acids, yeast extract is
fumarate
required for glycerol phosphate degradation, and yeast ex-
\\lalate
tr:lcr and Biotrypcase are required for l,:"propanediol utili·
Lactate
.;.
Pvruvate
zation. Succinate is the main product of malate, fumarate, or
Dihydru),:yacetone
aspartate fermentation, while acetate and propionate are the
Fructose
main products resulting from fermentations ofother sub-
Ribose
.;.
strates. Propanol is produced from LZ"propanediol. Glyc-·
l,:-Propanediol
.;.
erol is mainly degraded to l,3-propaneàiol. Traces of succi-
Giycerol
\\V
nate, lactate (in sugar fermentations), and hydrogen are also
Diolein
...
ND
produced .
Aspartate
Vitamins are required for growth. NaCl is not required.
Glutamate
Ferric iron is reduced. Sulfate and nitrate are not reduced.
y cast extract
Tcmp range (oC)
Cytochrome b is present. Substrates that do not support
l~:
35--15
F-43
Optimum temp (oC)
3i
38
35
growth include H:-CO:, methanol, ethanol, propanol, buta·
pH range
5.O-S.5
~. i-,.O
5.3-8.-1
nol, pentanol, l,:;-propanediol, ethylene glycol, sorbitol,
Optimum pH
6.5-'7.5
6.3
6.8
mannitol, dulcitol. adonilol, glyceraldehyde, ribose, xylose,
CYlOchromc(s)
h
a.h
h
ar:lbinose, glucose, galactose, sorbose, rhamnose, sucrose,
G"'C content (mol%)
34.3
31.5
.!ol.l
lactose, melibiose. raffinose, starch, cellulose, amylose,
" Sce text for references.
pectin, formate, acelate, propionate, butYTate, succinate,
" .... substr:llc fermenleù; -. substratc nO! krmenlcù; w. sunstratc ùe-
maleate, choline, alanine, cysteine, lysine, serine, tyrosine,
sradcd without growth; ND. not dctcrm;ncù.
and gelatin.
86

)B0iAME: IJSB-JUL92 (6681) PAGE: 7 SESS: 3 o LiTPL"T: Wed Apr 807:57:35 199:
.L'301/teJm4iijsbiijsb - jul92i6681-107
AUTHOR:
SE= jOUERY\\ 1
PAGE
~"
VOL ...2, 1992
rlNAEROVlBRIO BURKISABE,VSIS SP. NOV.
. g
The pH range for growth is 5.3 [08.'1: the optimum pH is
strict Jnaerobes. Merhods ~licrobiol. 3B:117-132.
around 6.8. The temperature range for growth is 13 ta ~3·C;
17, Imhol'f·Sluckle, O., and ~, Pfennig. 1983. Isolalion and charac-
[he optimum temperature is around 35'C. The NaCl range
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L'n1vc~silV of Provenc::.
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JOBNAME: IJSB-JULY2 (6681) PAGE: 8 SESS: 3 Ol.;"TPUT: Wed Apr 8 Oï:57:35 1992
'brl/301/tearn~!ijsbiijsb- ju 19:/6681-10ï
AUTHOR:
SE: QU;RY
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88

Article 4
Anaerobie degradation of 1-2 propanediol by a new Desulfovibrio
strain and Desuljovibrio alcoholovorans
. Archives of Microbiology (Sous Presse)
89

Anaerobie degradation of 1,2-propanediol by a new
Desulfovibrio strain and D. alcoholovorans
A.S. Ouattara!, N. Cuzin!, A.S. Traore2 and J-L Garcia!
1 ORSTOM, Laboratoire de Microbiologie, Université de Provence, 3 Place Victor Hugo,
F-13331 Marseille Cedex 3, France
2 Département de Biochimie, Faculté des Sciences, B.P. 7021, Université de Ouagadougou,
Burkina Faso
Offprint requests to : J-L. Garcia
90

Abstract. A sulfate-reducing bacterium, strain HDv, was isolated from the anoxic soil of a
ricefield using lactate as electron donor. Cells were Gram-negative, motile, nonsporulating
curved rods, with single polar flagella. Substrates were incompletely oxidized to acetate and
included glycerol, 1,2- and 1,3-propanediol. Sulfate, sulfite, thiosulfate, elemental sulfur,
fumarate, maleate, and malate were utilized as electron acceptors. Pyruvate, fumarate, maleate,
malate and dihydroxyacetone were fermented. Desulfoviridin and c-type cytochromes were
present. The DNA base composition was 66.6 ± 0.3 mol % G+C. The isolate was identified as
a Desulfovibrio sp.; its metabolic properties were somewhat different from those of previously
described Desulfovibrio species. Comparative biochemical study of 1,2-propanediol
dissimilation by the new isolate and Desulfovibrio alcoholovorans showed that NAD-dependent
dehydrogenases play a key role in the catabolism of this substrate. The hypothetical pathways
of 1,2-propanediol degradation by Desulfovibrio spp. are presented.
Key words : Sulfate reduction - Desulfovibrio - 1,2-propanediol degradation - alcohol and
aldehyde dehydrogenase - NADH dehydrogenase
Among sulfate-reducing bacteria, the "classical" Desulfovibrio species are known to
oxidize typical fermentation products such as hydrogen, ethanol or higher homologs, lactate,
pyruvate, and dicarboxylic acids (Hansen 1988; Widdel 1988). However, sorne Desulfovibrio
spp. can also grow on amino-acids (Postgate 1984; Stams et al. 1985), sugars (Ollivier et al.
1988), and reduced compounds such as glycerol and 1,3-propanediol (Kremer and Hansen
1987; Nanninga and Gottschal 1987; Oppenberg and Schink 1990; Qatibi et al. 1991b).
Biochemical studies of glycerol dissimilation in two marine Desulfovibrio strains, showed the
absence of a NAD(P)-dependent or independent glycerol dehydrogenase, suggesting that, in
these microorganisms, glycerol is degraded to acetate via
glycerol-3-phosphate,
dihydroxyacetone phosphate, and part of the glycolytic pathway (Kremer and Hansen 1987).
Oppenberg and Schink (1990) suggested a sequence for 1,3-propanediol oxidation to acetate
by Desulfovibrio strain OttPdl; a possible intermediate is malonyl semialdehyde. Recenùy, 1,2-
propanediol degradation by Desulfovibrio strains has been reported (Dwyer and Tiedje 1986;
Qatibi et al. 1991a,b). However, to our knowledge, no data are available on the biochemistry of
1,2-propanediol dissimilation in Desulfovibrio. The most cornmon pathway encountered in
anaerobic degradation of 1,2-propanediol by microorganisms involves, in a first step, the
conversion of the substrate to propionaldehyde by a dehydratase, followed by the subsequent
oxidation of this compound to propanol and propionate by a NAD-dependent aldehyde
dehydrogenase, a CoA-linked NAD-dependent aldehyde dehydrogenase, a phosphate
propionyltransferase, and propionate kinase (Toraya et al. 1979). However, degradation of
91

1,2-propanediol involving NAD-linked alcohol dehydrogenase has been reported for a mutant
of Escherichia coli cultivated anaerobically with fumarate as electron acceptor (Sridhara et al.
1969).
Studies on the implication of sulfate-reducing bacteria on sulfide toxicity observed in
many ricefields of the "Kou Valley" (Burkina Faso) included counting series of these
microorganisms using various substrates (acetate, propionate, ethanol, and lactate). The last
positive dilutions were retained for detailed studies. Several sulfate-reducing bacteria oxidizing
ethanol and lactate incompletely were isolated. Among them, two 1,2-propanediol oxidizers,
strains EDv and HDv, exhibited metabolic properties different from those of previously
described Desulfovibrio species. Because the two strains closely resembled, we report on the
characterization of strain HDv. Comparative studies of enzymes involved in the anaerobic
degradation of 1,2-propanediol by strain HDv and Desulfovibrio alcoholovorans and probable
pathways are presented.
Materials and methods
Origin of strains
Strain HDv was isolated from reduced layers (10 to 25 cm) of ricefield soils of the "Kou
Valley" in Burkina Faso. Lactate and sulfate were the substrates of enrichment cultures. The
temperature in situ averaged 33°C and the pH was near 7. Methanospirillum hungatei, DSM
864, was purchased from the German Collection of Microorganism, Braunschweig, Germany.
Desulfovibrio alcoholovorans DSM 5433 and Methanobacterium sp. were obtained from our
culture collection.
Media and culture conditions
The techniques for cultivation of strict anaerobes described by Macy et al. (1972) were
used throughout this study. Strains were grown on a basal medium containing (per liter) :
KH2P04, 0.25 g; NH4Cl, 0.30 g; NaCI, 1 g; KCI, 0.50 g; MgCI2. 6H20, DAO g;
CaCI2.2H20, 0.16 g; resazurin 0.001 g; and 1ml of a trace element solution (Imhoff-Stuckle
and Pfennig 1983). The medium was boiled under a stream of 02-free N2, cooled at room
temperature and dispensed into Hungate tubes or serum boules using Hungate's anaerobic
technique (1969) as modified by Miller and Wolin (1974) and Balch and Wolfe (1976). After
autoclaving (1lQ°C for 40 min), NaHC03 and Na2S.9H20 were added, from autoclaved stock
solutions ta final concentrations of 0.25% and 0.025%, respectively. Just before inoculation,
substrates were supplied from filter-sterilized stock solutions. Filter-sterilized solutions of
92

vitamins according to Balch et al. (1979) or Pfennig et al. (1981) were used to account for
vitamin requirements. Coculture experiments were realized as described in Qatibi et al. (1991a).
Unless otherwise indicated, aIl experiments were conducted at 37°C and pH 7.0 in a
culture medium containing 22 mM sulfate and 20 mM lactate. Growth was monitored by
measuring the optical density at 580 nm with a Shimadzu (Kyoto, Japan) UV 300
spectrophotometer. The pH range for growth was estimated in a Tris-maleate buffer medium.
The pH was adjusted with sterile NaOH solutions. The temperature range for growth was
tested from l3°C to 50°C. Studies for salt requirements were carried out in media containing
from 0 to 3% (w/v) NaCl.
Isolation
Pure cultures were obtained by repeated dilution, using the roll-tube method (Hungate
1969). Purity of isolates was checked in a medium containing 0.25% yeast extract (Difco
Laboratories, Detroit, MI, USA), 0.25% peptone (Difco), 0.25% Biotrypcase (Biomérieux,
Craponne, France), and 0.25% glucose. The culture was examined microscopically after three
weeks of incubation.
Cel! pigment determination and Gram staining
About 3 g of cells (wet weight) in 10 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) were
sonicated and centrifuged at 30,000 x g for 20 min. The cell-free supernatant was separated into
the soluble fraction and the particulate fraction by centrifugation at 140,000 x g for Ih. The
particulate fraction was resuspended in the previous buffer. Cytochromes were identified by
recording the redox difference spectrum (dithionite-reduced minus air-oxidized) of each fraction
using a Shimadzu UV 300 spectrophotometer.
Gram staining was performed using a standard method with a coloration kit (Sigma
Chemical Co, St Louis, MO, USA). Escherichia coli and Micrococcus luteus were used as
controls.
Enzyme assays
Cells grown on 20 mM lactate, 15 mM 1,2-propanediol, or a mixture of 15 mM 1,2-
propanediol and 5 mM glycerol, in the presence of 22 mM sulfate, were harvested at the end of
the exponential growth phase, washed three times with 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and
sonicated under a stream of N2. After centrifugation for 15min at 15,000 x g under N2, the
supernatant was tranferred into an oxygen-free serum boule supplemented with 0.5 mM
dithiotreito1.
93

Enzyme activities were measured spectrophotometrically according to the general
procedures of Kremer and Hansen (1987) and Kremer et al. (1988). NAD-dependent 1,2-
propanediol dehydrogenase (the forward reaction) was determined in 100 mM Tris-HCl (pH
9.0) containing 5 mM NAD and 10 mM 1,2-propanediol; the activity of the backward reaction
was assayed in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.2 mM NADH and 2 mM
glycolaldehyde instead of lactaldehyde, because the substrate for the physiological reduction to
1,2-propanediol is not available cornrnercially. Reactions were started with 1,2-propanediol or
glycolaldehyde and the formation or disappearence of NADH was recorded at 340 nm. NADP-
and NADPH-dependent dehydrogenase activities were recorded by the same procedure, except
that NAD was replaced by NADP and NADH by NADPH. Enzyme activities with glycerol,
1,3-propanediol, ethylene glycol, ethanol, and propanol as substrates were measured in the
direction of corresponding aldehydes by following the appearance of NADH at 340 nm as
described for 1,2-propanediol dehydrogenase. NAD(P)H-dependent acetaldehyde, and
propionaldehyde dehydrogenase were tested as described for glycolaldehyde. Following
enzyme activities were measured according to their respective authors: 1,2-propanediol
dehydratase (Toraya et al. 1977), lactate dehydrogenase (Stams and Hansen 1982), pyruvate
dehydrogenase (Odom and Peck 1981), NAD(P)- or dye-linked CoA-dependent
propionaldehyde dehydrogenase (Kremer et al. 1988), phosphate acetyltransferase, acetate
kinase, and propionate kinase (Oberlies et al. 1980), NADH and NADPH dehydrogenases
(Kremer and Hansen 1987). A unit is expressed as ~mole of product formed or substrate
consumed per minute (Ilmol.min-l). The protein content was determined by the method of
Sedmak and Grossberg (1977), using bovine serum albumin as standard. Each experiment was
carried out at least in duplicate. AlI chemicals used were of analytical grade.
Analytical techniques
Volatile fatty acids, organic acids, sugars and alcohols were assayed by high-
performance liquid chromatography (H.P.L.C.): pump, Analprep 93 (Touzart et Matignon,
Vitry sur Seine, France); flow rate, 0.6 ml/min; injection loop, 20 Ill; column, Interaction
ORH-801, 300 x 6.5 mm (Interaction Chemicals Inc., Mountain View, CA, USA); column
temperature, 30°C; detection, differential refractometer RID-6 A (Shimadzu, Kyoto, Japan);
recorder, Chromatopak C-R3A (Shimadzu, Kyoto, Japan).
Sulfide was measured spectrophotometrically as colloidal CuS. Methane was measured
by gas chromatography. The procedures used were as reported by Qatibi et al. (1991a).
94

DNA base composition
DNA was isolated by chromatography on hydroxyapatite (Cashion et al. 1977). The
guanine-plus-cytosine content of the DNA was determined by HPLC; non-methylated Lambda
virus DNA was used for calibration (Meshbah et al. 1989).
Results
Mo rphology
After 7 days of incubation at 35°C, strain HDv formed circular, lens-shaped colonies
that were light brown in colour. The isolate was a vibrioid rod, and highly motile by a single
polar flagellum. Cells occurred singly or in pairs and were 0.8-1.2 x 2.2-3.1 Jlm in size. In old
cultures, they became spiril10id and lost their motility. The cel1s stained Gram-negative. Spores
were not observed.
Physiology
Strain HDv was strictly anaerobic. The optimum growth temperature was 37° C; no
growth was observed above 42°C or below 13°C. Optimum growth was observed at pH 6.8 in
a range of 5.8 - 8.0. The isolate grew optimal1y in a medium without NaCl; growth was
completely inhibited at 1% NaCl .
No growth occurred in the absence of vitamins. Vitamins couId be replaced by yeast
extract. Sulfate, sulfite, thiosulfate, elemental sulfur, fumarate, maleate, malate served as
electron acceptors. Fumarate, maleate, and malate were reduced to succinate whereas the other
electron acceptors were reduced to sulfide. The isolate did not use nitrate or ferric iron as
electron acceptor. The compounds used as energy sources in the presence or absence of sulfate
and their respective end products are summarized in Table 1. We presumed that C02 was
produced from aIl degradations. No growth was observed on sugars, amino acids, and fatty
acids (Table 1). Growth with molecular hydrogen or formate required acetate as carbon source.
Malate was a transitory product during fumarate and maleate oxidation.
Studies of the degradation of reduced compounds in coculture with methanogenic
hydrogen scavengers showed that smaIl amounts of 3-hydroxypropionate were produced fram
glyceral degradation in addition to acetate. Such results differ from the exclusive production of
acetate from glycerol catabolism in the presence of sulfate (see footnote c of Table 1).
Furthermore, as compared to the results obtained in the presence of sulfate, strain HDv was
unable to use more than 2.1 mM and 3.0 mM of 1,2- and 1,3-propanediol, respectively in
syntrophic association with methanogens; however, the organic end product profile observed
95

Table 1: End products of substrates used as electron donors by strain HDv, in the presence or
absence of 22 mM sulfate. We presumed that C02 was produced from aIl degradations.
Substrate a
+ S042-
- S042-
Growth
End products
Growth
End products
H2+C02
+
n.r
n.r
Formate
+*
n.r
n.r
Ethanol
+
Acetate
n.r
1-Propanol
+
Propionate
n.r
1-Butanol
+
Butyrate
n.r
1-Pentanol
+
Valerate
n.r
Ethylene glycol
(+)
Glycolaldehyde
n.r
1,2-propanediol
+
Acetate
n.r
1,3-propanediol
+*
3-H.P b
n.r
Glycerol
+
Acetate C
n.r
DRA
+
Acetate
+
Acetate
Lactate
+
Acetate
n.r
Pyruvate
+
Acetate
+
Acetate
Fumarate
+
Acetate + succinate
+
Acetate + succinate
Maleate
+
Acetate + succinate
+
Acetate + succinate
Malate
+
Acetate + succinate
+
Acetate + succinate
Succinate
+*
Acetate
n.r
Legends: DHA, dihydroxyacetone; 3-H.P, 3-hydroxypropionate; +, substrate used as electron donor
with good growth; +*, substrate used as electron donor with weak growth (O.D ::; 0.07);
(+), substrate used as electron donor without growth; -, substrate not fennented; n.r, not recorded.
a Substrates were tested at concentrations of 10 or 20 mM.
b In addition of 3-hydroxypropionate, 0.2 to 0.5 mM of acetate were also detected.
c When the tenninal electron acceptor was Methanospirillum hungatei instead of sulfate, 12 mM of
glycerol were converted to 11.0 mM acctate and 0.8 mM 3-hydroxypropionate; when sulfate was
replaced by Methanobacterium sp., 10.8 mM acetate and 1.8 mM 3-hydroxypropionate were produced
from the degradation of 12 mM gl ycerol.
Substrates tested but not utilized by strain HDv were: acetate, propionate, butyrate, methanol, 2-
propanol, 2-butanol, benzoate, citrate, ribose, glyceraldehyde, arabinose, xylose, glucose, fructose,
galactose, sorbose, rhamnose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose, starch, cellulose, amylose, pectin,
choline, serine, glutamate, aspartate. alanine. glycine, proline, threonine. lysine. betaine, tyrosine.
valine, leucine, phenylalanine, isoleucine. cystein. gelatin.
96

from these substrate degradations was the same regardeless of the terminal electron acceptor.
Our results differed from those reported for 1,2-propanediol degradation by Desulfovibrio
alcoholovorans which yielded acetate and propionate when the terminal electron acceptor was
sulfate, and only propionate when the acceptor was Merhanospirillum hungarei (Qatibi et al.
1991a).
Pigments
The soluble fraction of strain HDv exhibited the characteristic absorption bands of c-
type cytochrome with maxima at 419, 523, and 553 nm. The oxidized extract showed the
cytochrome Soret peak at 408 nm. The cytochrome was not reduced by sodium ascorbate,
which indicated that it probably had a low midpoint redox potential. The spectrum showed a
strong absorption band at 628 nm and a weaker one at 582 nm, characteristic of desulfoviridin
(see Potsgate 1984; Widdel 1988).
DNA base composition
The guanine-plus-cytosine content of the DNA was 66.6 ± 0.3 mol % (average of three
determinations).
Enzymes involved in 1,2-propanediol degradation
Cell-free extracts of 1,2-propanediol-grown cells of the two strains tested contained significant
specific activities of lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, propionate kinase and
acetate kinase but relatively weak specific activities of phosphate acetyltransferase (Table 2).
However, whereas significant specific activity of 1,2-propanediol dehydrogenase was found in
the crude cell extract of strain HDv, we measured relatively weak activity in cell extract of
Desulfovibrio alcoholovorans grown on the same substrate [about one hundred fold lower as
compared to the one found in strain HDv (Table 2)].
Anempts to detect coenzyme B 12-dependent 1,2-propanediol dehydratase activity in cell-
free extracts of strain HDv grown on 1,2-propanediol, or 1,2-propanediol plus glycerol were
unsuccessful (Table 2). The dehydratase activity found in crude cell extracts of D.
alcoholovorans grown on 1,2-propanediol in the presence of sulfate was very low, about 0.015
unit.mg- 1 protein (Table 2). Such result is consistent with the small amounts of propionate
produced in the culture medium (l to 2 mM).
NAD-linked CoA-dependent propionaldehyde dehydrogenase activities were not
detected in the two strains tested. NADP-linked CoA-dependent propionaldehyde
dehydrogenase activities measured in the crude extracts of the two strains were not significant:
97

Table 2: Enzyme activities (llmol. min- l . mg- l protein) in cell-free extracts of cells of strain
HDv and Desulfovibrio alcoholovorans grown on 1,2-propanediol in the presence of sulfate
Enzyme
Specific activity
strain HDv
D .alcoholovorans
1,2-propanediol dehydratase
not detected
~ 0.017
Propionaldehyde dehydrogenasea
~ 0.0001
~ 0.001
Propionate kinase
1.88
2.08
1,2-propanediol dehydrogenase
1.88
0.016
Lactate dehydrogenase
0.32
1.92
Pyruvate dehydrogenase
4.07
1.04
Phosphate acetyltransferase
0.06
~ 0.015
Acetate kinase
1.60
1.20
NADH dehydrogenase
3.31
1.93
NADPH dehydrogenase
1.22
0.60
a CoA-dependent NAD-linked propionaldehyde dehydrogenase.
The electron acceptors used were: NAD+ for 1,2-propanediol and propionaldehyde, DCPIP
(Dichlorophenolindophenol ) for lactate, benzylviologen for pyruvate, and MTT [3-(4',5'-
dimethylthiazol-2-yl)-2,4-diphenyltetrazolium bromide] for NADH or NADPH dehydrogenase
activities, respectively. The references are indicated in the text.
Data are mean values of at least two determinations
98

~ 10-4 unit.mg- 1 protein for strain HDv and ~ 10-3 unit.mg-1 protein for D. alcoholovorans.
However, the presence of very active alcohol dehydrogenase may render difficult the detection
of such activity (see Kremer et al. 1988). We could observed significant dye-linked CoA-
dependent propionaldehyde dehydrogenase activities in cell extracts of the two Desulfovibrio
strains. With benzylviologen as electron acceptor, the specific activity of CoA-dependent
propionaldehyde dehydrogenase measured was 0.44 unit.mg- 1 protein for Desulfovibrio
alcoholovorans and 0.21 unit.mg- 1 protein for strain HDv.
In crude cell extracts of strain HDv, we observed high NAD-dependent dehydrogenase
activitiy with several aldehydes and alcohols including glycerol as substrate (Table 3).
However, the activities measured with polyols and glycolaldehyde were lower than those found
with ethanol or propanol and their corresponding aldehydes as substrates. Furthermore, the
NAD-dependent-glycerol dehydrogenase measured was higher with 1,2-propanediol plus
glycerol-grown cells than with 1,2-propanediol-grown cells.
In crude extracts of 1,2-propanediol-grown cells of D. alcoholovorans, only
propionaldehyde dehydrogenase activities were measured at values similar to those found in
strain HDv (Table 3). Ethanol or propanol dehydrogenases were significant but about ten fold
lower than those found in cell extract of strain HDv (Table 3). Specific dehydrogenase activities
with polyols as substrates measured in cells of D. alcoholovorans were below 0.03 unit.mg- 1
protein regardeless of the cultivation conditions. This represents 1% or less of the values found
in strain HDv (Table 3). The dehydrogenase activities measured in celI extracts of D.
alcoholovorans with polyols as substrates represented about 5 to 10% of those found when
substrate was ethanol or propanol, regardeless of the cultivation conditions; only 20 to 25% of
the activities measured with acetaldehyde or propionaldehyde as substrate were recovered when
they were replaced by glycolaldehyde (Table 3).
The following specific activities (unit mg- 1 protein) were found in cell-free extracts of
lactate-grown celIs of strain HDv: lactate dehydrogenase 0.794, pyruvate dehydrogenase
0.075, phosphate acetyltransferase ~ 0.01, acetate kinase 0.04, ethanol and propanol
dehydrogenase ~ 0.011, NADH dehydrogenase 0.278, and NADPH dehydrogenase 0.292.
NAD(P)-dependent dehydrogenase activities with polyols and aldehydes as substrates were not
detected in lactate-grown celIs.
High NADH and NADPH dehydrogenase activities were present in 1,2-propanediol-
and lactate-grown cells of strain HDv. However, the NADH dehydrogenase was about ten fold
higher during growth on 1,2-propanediol (Table 2) or a mixture of 1,2-propanediol plus
glycerol (data not shown) than during growth on lactate. Similarly, NADPH dehydrogenase
activity increased about 5 fold.
The NADH and NADPH dehydrogenase activities measured in D. alcoholovorans were
lower than those found in strain HDv. However, NADH dehydrogenase activities found in the
crude extracts of the two strains were al ways higher than NADPH dehydrogenase activities
99

Table 3: Specifie NAD-dependent dehydrogenase activity (~mol.min-1.mg-1 protein) with
different alcohols and aldehydes as substrates in crude cell-free extracts of Desulfovibrio strain
HDv and D. alcoholovorans grown on 1,2-propanediol or 1,2-propanediol plus glycerol in the
presence of sulfate.
1,2-propanediol
1,2-propanediol + glycerol
grown cells of
grown cells of
Strain HDv
D. alcoholovorans
Strain HDv
D. alcoholovorans
Substrate a
Ethanol
3.56
0.311
2.37
0.22
Acetaldehyde
6.95
1.05
5.03
0.41
Propanol
3.63
0.312
5.15
0.22
Propionaldehyde
1.37
1.02
1.77
0.38
Ethylene glycol
3.10
0.024
4.55
0.017
Gl ycolaldehyde
2.60
0.282
2.27
0.088
1,2-propanediol
1.88
0.016
2.04
0.022
1,3-propanediol
2.11
0.027
2.63
0.022
Glycerol
1.64
0.015
2.33
0.016
a The electron acceptor was NAD+ for a1cohols dehydrogenase activity assays (tested in a 100
mM Tris-HCl buffer, pH 9.0). The electron donor was NADH for aldehydes dehydrogenase
activity assays (tested in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5). About 1 to 5 % of the
dehydrogenase activities were recovered when NAD or NADH were replaced by NADP or
NADPH, respectively.
100

(Table 2).
NADP could replace partially NAD as electron acceptar of alcohol or aldehyde
dehydrogenases but only 1 to 5 % of the NAD-dependent dehydrogenase activity was
recovered. NADPH could replace partially NADH as electron donor, with similar low recovery
of dehydrogenase activity (data not shown).
Discussion
The classification of the new isolates of sulfate-reducing bacteria has been traditionally
established on the basis of chemical data such as the G+C content of genomic DNA, and the
presence of particular pigments, in addition ta phenotypic characters such as morphology and
nutrition physiology (Postgate 1984; Widdel 1988; Widdel and Pfennig 1984). Later, genetical
data such as 16S rRNA sequences, rRNA-DNA and DNA-DNA hybridizations were added to
improve the existing classification, generating new taxonomic affiliations (Devereux et al.
1989,1990; Fowleretal. 1986; Nazinaetal. 1987; WiddeI1988).
The new isolate, strain HDv, is a strictly anaerobic, Gram-negative, sulfate-reducing
bacterium. This mesophilic vibrio does not sporulate, is un able to oxidize acetate, propionate,
or butyrate, and performs an incomplete oxidation of pyruvate and lactate to acetate and C02.
Based on these characteristics, strain HDv can be related to genera Desulfovibrio and
Desulfomicrobium (Pfennig et al. 1981; Widdel 1988; Rozanova et al. 1988). Since
desulfoviridin is present in the soluble extract of the isolate in addition of c-type cytochrome, it
can be definitively affiliated to the genus Desulfovibrio (Widdel 1988). Morphological and
physiological characteristics of Desulfovibrio strain HDv are similar to those of the species D.
desulfuricans, and D. vulgaris (Widdel and Pfennig 1984), D. alcoholovorans (Qatibi et al.
1991b), D.fructosovorans (Ollivier et al. 1988), and D. carbinolicus (Nanninga and Gottschal
1987). Strain HDv differs from the Desulfovibrio species other than D .alcoholovorans, and D.
desulfuricans strain DG2, by its ability to use 1,2-propanediol as substrate. In contrast to D.
desulfuricans, strain HDv is unable to utilize choline or nitrate as energy source or electron
acceptar, respectively. The isolate differs from D. vulgaris by its ability ta ferment fumarate or
malate. The most distinctive characteristics between Desulfovibrio strain HDv, D. vulgaris, and
D. desulfuricans is that the G+C mol % of strain HDv's DNA is 5% and 10 % higher than
those reported for D. vulgaris and D. desulfuricans, respectively (Widdel 1988). Unlike D.
fructosovorans, the isolate does not use fructose. The differences between Desulfovibrio strain
HDv and D. carbinolicus are: (i) D. carbinolicus is nonmotile; (ii) in the presence of sulfate, D.
carbinolicus converts glycerol to 3-hydroxypropionate, and ethylene glycol to acetate, whereas
the new isolate oxidizes glycerol to acetate and degrades ethylene glycol to glycolaldehyde,
without growth. In contrast to D. fructosovorans and D. carbinolicus, strain HDv cannot
ferment glycerol and ethylene glycol. Desulfovibrio strain HDv can be distinguished from D.
101

alcoholovorans by their respective end products of the degradation of glycerol, 1,2- and 1,3-
propanediol in the presence of sulfate or in coculture with a methanogen. The main distinctive
properties between these Desulfovibrio spp. are the inability of strain HDv to produce
propionate from 1,2-propanediol degradation, whatever the tenninal electron acceptor and to
oxidize the 3-hydroxypropionate transitory fonned during 1,3-propanediol degradation.
Morever, D. alcoholovorans differs from strain HDv in being able to convert ethylene glycol to
acetate. Furthermore, in contrast to D.
alcoholovorans, the new isolate ferments
dihydroxyacetone and uses fumarate or malate as electron acceptor.
The occurence of 3-hydroxypropionate as addition al end product of glycerol degradation
only when methanogens were used as terminal electron acceptor, may be due to the inability of
these bacteria to decrease the hydrogen threshold concentration to values allowing substrate
oxidation to acetate exclusively. Previous coculture experiments indicated that the hydrogen
threshold concentration may be a key factor of the formation of end products more reduced than
acetate from fructose catabolism in D. fructosovorans (Cord-Ruwish et al. 1986), as weIl as
from 1,2- and 1,3-propanediol dissimilation in D. alcoholovorans (Qatibi et al. 1991a).
The reasons of the inability of Desulfovibrio strain HDv to use more than 2 to 3 mM of 1,2-
and 1,3-propanediol in syntrophic association with hydrogen-utilizing methanogens are not
known.
Preliminary studies of enzymes involved in 1,2-propanediol degradation by cells of
Desulfovibrio strain HDv and D. alcoholovorans grown on this substrate give first hints on its
degradative pathway by Desulfovibrio strains. Cell-free extract of Desulfovibrio strain HDv
contained sufficient activities of 1,2-propanediol dehydrogenase, lactate dehydrogenase,
pyruvate dehydrogenase, phosphate acetyltransferase, and acetate kinase to assume their
involvement in 1,2-propanediol catabolism. Hence, lactaldehyde, lactate, pyruvate, and acetyl
CoA would play a central role in such metabolic pathway (Fig.l). The high pyruvate
dehydrogenase activity suggests that it is not only involved in cell carbon assimilation but also
in the catabolism. Occurence of propionate and acetate as end products and the relatively low
1,2-propanediol dehydrogenase specific activities measured in D. alcoholovorans indicate that,
part of this substrate may be degraded via lactaldehyde and another pathway involving: a 1,2-
propanediol dehydratase, a CoA-dependent aldehyde dehydrogenase not linked to NAD, a
phosphate propionyl transferase, and a propionate kinase. The enzyme activities measured in D.
alcoholovorans are consistent with such a catabolic pathway that couId be somewhat similar to
those found in sorne genera of Enterobacteriaceae and Propionibacteriaceae (Toraya et al. 1979;
Ichikawa et al. 1985). The weak polyol dehydrogenase activity observed could explain the
relatively low specific growth rate reported by Qatibi et al. (l991a) for D. alcoholovorans
cultivated on 1,2-propanediol (0.09 h- 1) or 1,3-propanediol (0.086 h- 1) as compared to those
obtained with glycerol (0.22 h- 1). The high specific growth rate observed with glycerol as
102

substrate suggests that the first step of this compound degradation would be rather a
phosphorylation than a dehydrogenation.
The sequence of 1,2-propanediol degradation by D. alcoholovorans is summarized in Fig 1.
Part of this pathway can be also the one used by D. desulfuricans strain DG2 described by
Dwyer and Tiedje (1986), which produce exclusively propionate from 1,2-propanediol
dissimilation.
Energy substrates used by the most Desulfovibrio species are degraded via NAD-
independent enzymes (see Postgate 1984). However, a role for NAD(P)-dependent catabolic
enzymes was recently established in sorne sulfate-reducing bacteria (Stams et al. 1984, Kremer
and Hansen 1987, Kremer et al. 1988). In this study, we have also demonstrated that during
the growth of Desulfovibrio strain HDv on 1,2-propanediol or 1,2-propanediol and glycerol,
NAD-dependent dehydrogenases play a key role (Table 3). The role of these NAD(P)-
dependent dehydrogenases and NAD(P)H-dehydrogenases in alcohol degradation is discussed
in detail by Kremer and Hansen (1987), Kremer et al. (1988), and Kremer (1989). In contrast
to the results reported by Kremer and Hansen (1987), we report a high NAD-dependent
glycerol dehydrogenase activity during the growth of Desulfovibrio strain HDv on 1,2-
propanediol. The increase of the NAD-dependent glycerol dehydrogenase specifie activity in
1,2-propanediol plus glycerol-grown cells extracts (Table 3) suggests a possible.competition
between a glycerol kinase and a NAD-dependent dehydrogenase for initiation of glycerol
catabolism in Desulfovibrio strain HDv.
The NAD-dependent ethanol and propanol dehydrogenase activities measured in 1,2-
propanediol-grown cells of D. alcoholovorans are always higher than those of polyols, and
they decrease in presence of high concentration of polyols (Table 3). This relatively high
specificity for primary monovalent alcohols suggests the existence in D. alcoholovorans, of
only one type of alcohol dehydrogenase weakly active on polyols. The characteristics of this
enzyme will be similar to those of the component 1 of NAD-linked alcohol dehydrogenase
reported by Sridhara et al. (1969) in a mutant of Escherichia coli. In contras t, the NAD-
dependent dehydrogenase of Desulfovibrio strain HDv seems to be not specifie (Table 3).
Furthermore this (these) alcohol and aldehyde dehydrogenase(s) present in strain HDv is (are)
an inducible enzyme(s).
Propionate formation from 1,2-propanediol is a common metabolic property of species
of genera Lactobacillus (Schütz and RadIer 1984), Klebsiella, Citrobacter (Toraya et al. 1978;
1979), Acetobacterium (Eichler and Schink 1985), and Propionibacterium (Ichikawa et al.
1985) In these organisms, a coenzyme B12-dependent 1,2-propanediol dehydratase is involved
in 1,2-propanediol degradation. The lack of this common enzyme couId explain the inability of
strain HDv to use 1,2-propanediol in the absence of sulfate and to produce propionate in its
presence or in coculture with methanogenic bacteria. This is consistent with the quasi
stoichiometric conversion of 1,2-propanediol to acetate observed with strain HDv (Table 1).
103

H 20
~~----- CH3-CHOH-CH2OH
1
k-:- NAD
~HSCoA
+
t~NADH,H+
~2[H]
1
1
l
CH:3 - CHOH - CHO
CH3- CH2- CO- SCoA
~2~

1
1
1
CH3 - CHOH - COO-
1
1

: . - - - Pl
:~HSCoA
~2[HJ
1
1
1
CH
1
3- CO - COO-
1
Y
l---- HSCoA
CH3- CH2- CO-®
~C02,2[H]
CH3 - CO - SCoA
~P'
:,.....--- ADP
>f_H~COA
1
:~ATP
1
1
CH3L:~p
1
1
1
1
Y
r ATP
CH - CH
3
2- Coo-
CH3- COO-
Fig. 1 - Proposed pathways of 1,2-propanediol degradation by Desulfovibrio strain HDv and
D. alcoholovorans. Full lines: hypothetical pathway of strain HDv. Full and dotted lines:
hypothetical pathway of D. alcoholovorans. Dotted lines: hypothetical pathway of D.
desulfuricans srrain DG2 (not supported by enzymatic measurements).
104

The weak dehydratase activity observed in D. alcoholovorans could explain its inability to
ferment 1,2-propanediol (or ethylene glycol) in absence of external electron acceptor and the
slow growth in coculture experiments [specifie growth rate: 0.005 h- l (Qatibi et al. 1991a)]. An
intriguing question is why propanol is not produced in coculture experiments if very active
NADH-linked propionaldehyde dehydrogenase can be detected in vitro. In D. alcoholovorans,
the pathway of 1,2-propanediol degradation depends upon a competition between the
dehydratase and the dehydrogenase catalyzing the iniatial step of this substrate catabolism. The
mecanism of regulation of the shift toward the "dehydratation" or the "dehydrogenation"
pathway needs to be investigated.
Our results suggest that in the two Desulfovibrio strains tested, phosphate propionyltransferase
and propionate kinase may in fact be the same as phophate acetyltransferase and acetate kinase,
respectively.
On the account of all the differences mentioned above, it is unlikely that Desulfovibrio
strain HDv is a mutant or a subspecies of D. alcoholovorans. Hence, this isolate cannot be
ascribed to any Desulfovibrio species so far described. DNA-DNA hybridization experiments
between Desulfovibrio strain HDv and the most closely related Desulfovibrio species will be
performed soon to determine its taxonomie affiliation.
Strain HDv has been deposited in the German Collection of Microorganisms,
Braunschweig, FRG under the collection number DSM 6830.
Acknowledgements. The authors are indebted to T.A. Hansen and B. Ollivier for helpful discussion, to K.D.
Jahnke for the determination of the DNA base ratio, and to A.I. Qatibi for technical assistance and valuable
comments. Thanks are due to P.A. Roger for revising english and the manuscripl.
105

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108

DISCUSSION
109

1. Ecologie microbienne
1. 1. Bactéries réductrices du fer
Nous avons mis en évidence l'existence de trois principaux groupes de bactéries
pouvant être impliqués dans la réduction du fer dans les biotopes anoxiques des sols de rizière:
- les bactéries fermentaires des genres Anaerovibrio et Clostridium dont le nombre peut
atteindre 1()6 à 108 bactéries/g de sol sec;
- certaines BSR parmi lesquelles une souche de Desulfovibrio desulfuricans dont le nombre
peut atteindre 106 à 108 bactéries/g de sol sec;
- un ensemble de bactéries encore non caractérisées en culture pure, qui peuvent coupler
l'oxydation d'acides gras comme l'acétate ou le propionate, à la réduction dissimilatrice du fer;
elles peuvent être présentes dans les sols de rizière à raison de 1()4 à 105 bactéries/g de sol sec.
Les résultats des numérations indiquent qu'une partie importante de la réduction du fer
dans ces écosystèmes, peut être effectuée par des bactéries fermentaires à croissance rapide qui
utilisent une partie des équivalents réducteurs produits pendant l'oxydation de leurs substrats
organiques pour réduire le Fe(III). Cette utilisation facultative du fer comme accepteur
d'électron exogène devrait leur procurer, en cas de compétition pour un même substrat, un
avantage certain par rapport aux bactéries ne pouvant réaliser qu'une fermentation pure.
La présence d'une BSR réductrice de fer et utilisatrice d'hydrogène montre que dans ces
biotopes, la réduction dissimilatrice du Fe(III) peut être couplée à l'oxydation de ce substrat.
Vraisemblablement, l'essentiel de la production des ions ferreux dans les sols de rizière de la
Vallée du Kou, devrait être dû aux bactéries à croissance rapide de ce type, d'une part parce que
ce sont des biotopes riches en fer et d'autre part parce que l'hydrogène est l'un des substrats les
plus abondants dans les écosystèmes naturels. Cela semble en accord avec la présence des
souches de Desulfovibrio desulfuricans.
Le fait que nous n'ayons pas d'études avec des cultures pures de bactéries qui tirent
l'énergie nécessaire à leur croissance, de la réduction dissimilatrice du fer couplée à l'oxydation
des acides gras (acétate ou propionate) ne nous permet pas d'évaluer l'impact réel de ce type de
bactéries dans les sols de rizière.
110

Il est probable que les bactéries réductrices de fer soient les acceptrices finales
d'hydrogène et d'acétate dans les sols de rizière étudiés. Les travaux de Lovley et Phillips
r
(l987b) démontrent que dans les écosytèmes à fortes concentrations en Fe(III), sa réduction
peut inhiber la sulfata-réduction et la méthanogenèse à cause de la plus fone affinité des
bactéries réductrices de fer pour ces substrats. En culture pure, cenaines bactéries réductrices de
fer comme Alteromonas putrefaciens, ont une affinité pour l'hydrogène 25 fois supérieure à
celle de cultures pures de bactéries sulfato-réductrices ou méthanogènes (Lovley et al. 1989).
1. 2. Bactéries sulfato-réductrices
Dans la plupart des biotopes naturels, on peut distinguer deux groupes nutritionnels de
BSR selon leur capacité à réaliser une oxydation complète ou incomplète de leur substrat.
Généralement, les espèces qui oxydent complètement leurs substrats utilisent l'acétate et sont
incapables de croître sur Hz. Inversement, les espèces réalisant une oxydation incomplète de
leur substrat utilisent l'hydrogène ou le lactate et ne peuvent pas dégrader l'acétate.
Parce que les espèces des genres Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfomicrobium et
Desulfotomaculum sont les consommatrices potentielles d'hydrogène les plus couramment
rencontrées dans la nature (Bak et Pfennig, 1991; Laan broek et Pfennig, 1981), nous nous
attendions à trouver des bactéries de ces genres dans les écosystèmes étudiés. Mais nos
résultats indiquent la "prédominance" des espèces du genre Desulfovibrio dans les sols de
rizière de la Vallée du Kou. Des observations similaires ont été rapportées de sols de rizière de
bas-fonds du Burkina Faso (Dianou, 1989) et de divers biotopes anoxiques (Bak et Pfennig,
1991; Caumette, 1986; J0rgensen et Bak, 1991; Laanbroek et Pfennig, 1981). Les taux de
croissance généralement élévés des espèces de ce genre doivent leur conférer un avantage
décisif en cas de compétition pour le sulfate dans les milieux anoxiques. Quand la concentration
en sulfate n'est pas limitante, les espèces des autres genres peuvent coexister avec celles du
genre Desulfovibrio; mais en cas de limitation de sulfate comme c'est le cas dans les sols de
rizière de la Vallée du Kou, les espèces de Desulfovibrio consomment l'essentiel du sulfate
présent dans le milieu. L'incapacité des espèces des genres réalisant une oxydation complète du
substrat à fonctionner comme donnatrice ou acceptrice d'hydrogène dans les associations
syntrophiques, est aussi un handicap possible pour elles dans les biotopes pauvres en sulfate.
111

Une compétition pour l'acétate entre les bactéries réductrices de fer ou de soufre et les
BSR, pourrait également expliquer l'absence apparente de BSR appartenant aux genres autres
que Desulfovibrio.
La caractérisation des souches "dominantes" isolées de sols de rizière du Burkina Faso
ou du Sénégal, montre qu'elles appartiennent aux espèces Desulfovibrio desulfuricans et D.
vulgaris ou qu'elles sont proches de D. alcoholovorans (pour les sols du Burkina Faso
uniquement).
Enfin, il apparaît que toutes les souches "dominantes" isolées sur des milieux sélectifs
ont la capacité d'utiliser en culture pure, la plupart des substrats habituellement produits par les
exsudats racinaires (alcools, acides aminés, acides organiques) ou par les processus de
fennentations (diols, hydrogène). En outre, les conditions physico-chimiques pennettant leurs
croissances optimales sont très proches de celles des sols de rizière submergés. L'ensemble de
ces résultats indique une très bonne adaptation des souches aux conditions physico-chimiques
et nutritionnelles des écosystèmes d'où elles ont été isolées, leur appartenance à la microflore
régulière des sols de rizière et surtout leur implication probable dans les processus de toxicité
dûs aux ions ferreux et aux sulfures.
Parce qu'elles sont à la fois réductrices de fer et de sulfate, les souches de Desulfovibrio
desulfuricans devraient représenter les BSR les mieux adaptées à ces écosystèmes.
2. Taxonomie
Sur un plan fondamental, nos études ont confirmé que l'utilisation de critères
morphologiques, physiologiques et biochimiques (teneur en GC de l'ADN batérien, contenu en
pigments tels que les cytochromes, les sulfites réductases, etc.) peut souvent suffire pour
déterminer la position taxonomique d'une souche nouvellement isolée. Mais parfois,
l'utilisation de ces critères taxonomiques traditionnels aboutit à une classification discutable
comme par exemple dans le cas de la description de la bactérie fennentaire proposée comme
nouvelle espèce du genre Anaerovibrio, Anaerovibrio burkinabense. Tout comme Anaerovibrio
lipolytica etA. glycerini (les deux autres espèces de ce genre), la souche que nous avons isolée
oxyde le glycérol, le glycérol-phosphate, le lactate, le pyruvate et le fructose, mais diffère par sa
112

capacité à fermenter l'aspartate, le glutamate, le citrate, le fumarate, le malate et le 1,2-
propanediol. Contrairement aux espèces A. lipolytica et A. glycerini, la fermentation du
glycérol ne permet pas de croissance cellulaire chez cette souche et l'accumulation de 1,3-
propanediol dans le milieu de culture indique un catabolisme via une déshydratation. La teneur
en GC de l'ADN du nouvel isolat est de 10 à 13% supérieur à celui d'A. lipolytica et A.
glycerini. Cependant, nous avons estimé que les différences observées n'étaient pas suffisantes
pour classer cette souche dans un nouveau genre parce que le profil des produits de
fermentation de la plupart des substrats communs est le même que celui d'A. lipolytica et A.
glycerini. L'utilisation future de critères taxonomiques génétiques (hybridations ADN/ADN,
sequençage de l'ARN 16S) devrait permettre, soit de confirmer la classification présente auquel
cas un amendement du genre Anaerovibrio pour l'utilisation du glycérol sera nécessaire, soit de
proposer une reclassification.
De la même façon, l'utilisation de critères taxonomiques basés sur la morphologie, la
physiologie nutritionnelle et biochimique n'a pas permis une caractérisation au niveau de
l'espèce de Desulfovibrio sp. souche HDv. Cet isolat présente beaucoup de caractéritiques
communes avec D. alcoholovorans ou D. carbinolicus et quelques différences nutritionnelles
mineures notamment au niveau du métabolisme des diols.
3. Biochimie
Lors de l'étude de la dissimilation du 1,2-propanediol, nous avons mis en évidence dans
des extraits cellulaires de Desulfovibrio sp. souche HDv cultivé sur ce substrat, la présence de
fortes activités spécifiques de la 1,2-propanediol déshydrogénase, la lactate déshydrogénase, la
pyruvate déshydrogénase, la phosphate acétyltransférase et l'acétate kinase. Ces résultats
suggèrent que la dégradation du 1,2-propanediol chez cette souche passe par une conversion en
lactaldéhyde puis en lacate, grâce à deux déshydrogénations successives; le lactate est ensuite
métabolisé en acétate selon les voies classiques connues chez toutes les espèces de
Desulfovibrio. Toutes ces enzymes sont également présentes chez 'D. alcoholovorans avec
cependant des activités 1,2-propanediol déshydrogénase 100 fois plus faibles que celles
détectées chez Desulfovibrio sp. souche HDv. Les cellules de D. alcoholovorans contiennent
une faible activité 1,2-propanediol déshydratase contrairement à celles de Desulfovibrio sp.
113

souche HDv; le catabolisme du 1,2-propanediol avec l'aide de la déshydratase, conduit à la
formation de propionate et met en jeu une CoA-dépendante aldéhyde déshydrogénase, la
phosphate acétyltransférase et l'acétate kinase. Il existerait de ce fait, deux voies de catabolisme
du 1,2-propanediol chez D. alcoholovorans et une compétition entre la déshydratase et la
déshydrogénase pour initier la dégradation de ce substrat. Le pourcentage d'acétate ou de
propionate formé dépend de cette compétition entre ces deux enzymes pour le même substrat.
Cependant, il se pourrait que l'activité de la déshydratase soit régulée comme celle de la plupart
des enzymes de ce type connues actuellement (Toraya et al. 1978; Ichikawa et al. 1985); les
facteurs impliqués dans cette régulation sont inconnus. Les faibles activités des premières
enzymes cataboliques du 1,2-propanediol pourraient expliquer la lente dégradation de ce
substrat chez D. alcoholovorans.
L'absence de 1,2-propanediol déshydratase chez Desulfovibrio sp. souche HDv
constitue la différence essentielle entre les souches de BSR étudiées et explique l'impossibilité
pour cette bactérie d'utiliser le 1,2-propanediol en coculture et de convertir ce substrat en
propionate. Un tel résultat suggère que l'étape limitante du transfert inter-espèce d'hydrogène
vers les méthanogènes hydrogénotrophes se situerait au niveau de la première ou/et de la
deuxième étape(s) de déshydrogénation du diol, puisque les Desulfovibrio peuvent pousser en
syntrophie avec le lactate comme substrat ou quand la première étape du catabolisme est une
déshydratation (Qatibi et al., 1991a,b; Dwyer et Tiedje, 1986).
Les accepteurs physiologiques des alcool et aldéhyde désydrogénases trouvées chez ces
BSR sont le NAD+ ou le NADH et non pas le NADP+ ou le NADPH. Ceci est en accord avec
les activités NADH déshydrogénases plus élévées que les NADPH déshydrogénases que nous
avons mesurées. L'accepteur de l'aldéhyde déshydrogénase CoA-dépendante n'est pas encore
connu.
L'absence d'activités alcool et aldéhyde désydrogénases dans des extraits de cellules
cultivées sur lactate, montre que ce sont des enzymes inductibles chez les espèces de
Desulfovibrio. Des résultats similaires ont été démontrés lors de la dégradation de l'éthanol par
certaines espèces du genre Desulfovibrio (Kremer et al., 1988). Les alcools et aldéhyde
déshydrogénases présentes dans les cellules de Desulfovibrio sp. souche HDv cultivée sur 1,2-
114

propanediol sont également actives sur les alcools monovalents, le 1,3-propanediol, le glycérol
et les aldéhydes correspondants. Ceci montre qu'elles ne sont pas spécifiques et laisse présager
l'existence d'un ou de plusieurs types d'alcool/aldéhyde déshydrogénases. La non spécificité et
l'augmentation de ces activités déshydrogénases quand les cellules poussent sur un mélange
1,2-propanediol-glycérol, permet de supposer l'existence probable d'une compétition entre une
kinase et une déshydrogénase pour l'utilisation du glycérol dans ces conditions de culture.
115

CONCLUSIONS
116

Les travaux réalisés lors de cette étude se présentent sous deux aspects:
- une partie écologie microbienne en relation avec les phénomènes de toxicité dans les rizières,
- une partie plus fondamentale avec l'isolement, la caractérisation et l'étude physiologique de
souches bactériennes.
Sur le plan écologie microbienne, ce travail a permis d'identifier une panie de la
microflore impliquée dans les phénomènes de toxicité dûs aux ions ferreux et aux sulfures dans
les sols de rizière de la Vallée du Kou.
La réduction microbienne du fer qui produit l'essentiel des ions ferreux dans ces
écosystèmes, peut être réalisée par:
- des bactéries fermentaires des genres Anaerovibrio et Clostridium,
- des BSR, dont Desulfovibrio desulfuricans,
- un groupe de bactéries pouvant coupler la réduction du fer à l'oxydation de substrats
non fermentescibles comme les acides gras (acétate, propionate, etc.). Aucune bactérie de ce
type n'a pu être obtenue en culture pure et donc identifiée. Ces études montrent que la réduction
dissimilatrice du fer couplée à l'oxydation de l'acétate et du propionate, est un processus
imponant dans les sols de rizière et indiquent l'existence probable de bactéries réductrices de fer
"obligées" dans ce biotope.
Les BSR "dominantes" des sols de rizière de la Vallée du Kou appartiennent au genre
Desulfovibrio. Nos études n'ont pas permis de montrer l'existence de BSR appartenant à un
genre autre que Desulfovibrio. La caractérisation de ces souches "dominantes" a révélé qu'elles
sont proches de D. alcoholovorans, D. desulfuricans et D. vulgaris. Des résultats similaires ont
été également observés dans les sols de rizière du Sénégal.
Les taux de croissance élévés des souches de bactéries réductrices de fer ou/et de sulfate
isolées, et leur très bonne adaptation aux conditions nutritionnelles et physico-chimiques des
écosystèmes d'où elles proviennent, indiquent qu'elles peuvent être impliquées dans les
processus de toxicité dûs aux ions ferreux et aux sulfures.
117

Sur le plan fondamental, ce travail a pennis:
- la description d'une nouvelle espèce du genre Anaerovibrio, Anaerovibrio burkinabensis sp.
nov. La souche type de cette espèce a la particularité de dégrader difficilement et sans croissance
le glycérol en 1,3-propanediol et de fermenter le citrate, les acides dicarboxyliques, l'aspartate
et le glutamate, contrairement aux deux autres espèces jusqu'à présent décrites dans ce genre;
- la caractérisation d'une souche de Desulfovibrio qui, par son métabolisme particulier des
alcools, pourrait appartenir à une nouvelle espèce;
- d'apporter quelques éclaircissements sur les mécanismes de dissimilation du 1,2-propanediol
par les espèces du genre Desulfovibrio. Ce composé peut être dégradé selon deux voies
métaboliques:
- la "voie de la déshydratation" fait intervenir une alcool déshydratase, une aldéhyde
déshydrogénase (dont l'accepteur physiologique n'est pas connu), une phosphate
acétyltransférase et une acétate kinase; elle conduit à la formation de propionate;
- la deuxième, ou "voie de la déshydrogénation" met en jeu une alcool/aldéhyde
déshydrogénase NAD+ -dépendante et toutes les enzymes du catabolisme du lactate; elle aboutit
à la production d'acétate dans le milieu de culture.
Cependant, ce travail n'est qu'une contribution à une étude qui pour être plus complète,
pourrait se poursuivre sur le plan fondamental par:
- la purification et la caractérisation de(s) l'alcool/aldéhyde déshydrogénase(s) de
Desulfovibrio sp. souche HDv, afin de déterminer s'il y a un ou plusieurs types
d'alcool/aldéhyde déshydrogénases qui interviennent dans le métabolisme des alcools;
- l'étude de la biochimie de la réduction du fer afin de mieux comprendre le mode
d'action de la ferriréductase;
- des études génétiques (hybridation ADN/ADN et séquençage de l'ARN 16S) des
espèces du genre Anaerovibrio pour confirmer la classification proposée et établir la phylogénie
entre ces espèces et, par exemple celles des genres Selenomonas, Pectinatus,
Propionibacterium, etc. Une étude similaire pourrait être effectuée entre les souches de
Desulfovibrio isolées et les autres espèces de ce genre.
118

Sur le plan écologie microbienne, il serait intéressant de détenniner la présence et le rôle
possible dans ces écosystèmes, des bactéries capables de coupler l'oxydation des acides gras à
la réduction du sulfate ou du soufre élémentaire.
Il serait également indispensable de mettre au point un protocole pennettant l'isolement
en culture pure de bactéries tirant l'énergie nécessaire à leur croissance, de la réduction
dissimilatrice du fer couplée à l'oxydation de l'acétate, du propionate ou du butyrate.
Enfin, une étude plus vaste comprennant l'intervention d'agronomes, de pédologues et
de microbiologistes devrait être initiée pour essayer d'apponer des solutions concrètes à ces
phénomènes de toxicité dûe aux ions femeux et aux sulfures, dans les rizières.
119

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f'0 .
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STUDY OF THE DISSIMILATORY IRON- AND SULFATE-
REDUCING BACTERIA IN RICEFIELD SOILS OF THE
nVALLEE DU KOU n (BURKINA FASO)
ABSTRAcr
We report on the study of the dissimilatory iron- and sulfate-reducing bacteria
involved in ferrous iron and sulfide toxicities in many flooded ricefield soils of the "Vallée
du Kou" in Burkina Faso. Sulfate- and ferric- iron reducing bacteria were enumerated and
characterized for two consecutives rice growth cycles in four fields. These studies showed
that a heterogenous group of microorganisms including hydrogen-, acetate-, propionate-,
and lactate-oxidizing bacteria are involved in FeCHI) reduction in ricefield soils. Lactate
fermenting bacteria and lactate-utilizing sulfate reducers that could reduce ferric iron in pure
culture were isolated. A novel species of genus Anaerovibrio, Anaerovibrio burkinabensis
sp. nov., was described. The new isolate strain oxidizes citrate, fumarate, malate, aspanate,
glutamate, and 1,2-propanediol. Acetate and propionate are the main products of substrates
fermentations. Glycerol is fermented mainly to 1,3-propanediol but could not be used as
energy source.
The population of sulfate-reducing bacteria reached 106 to 108 bacteria/g dry soil in
submerged fields and was dominated by Desulfovibrio species. Similar results were
observed in Senegal ricefields. The Desulfovibrio spp. isolated were closely related to D.
alcoholovorans, D. desulfuricans, and D. vulgaris.
The mechanims of 1,2-propanediol dissimilation by Desulfovibrio species was
examined. Two hypothetic catabolic pathways of this substrate were presented: the
dehydratase pathway which leads to propionate formation, and the dehydrogenase pathway
which produces acetate. The alcohoValdehyde dehydrogenases involved in 1,2-propanediol
degradation are inducible enzymes that use NAD+ or NADH but not NADP+ or NADPH as
physiological protons and electrons acceptors.
Key words: Anaerovibrio; Desulfovibrio; Enumeration; Ricefield soils; Dissimilatory ferric
iron reduction; Dissimilatory sulfate reduction;
1,2-propanediol metabolism;
AlcohoValdehyde dehydrogenases; Fermentation; Acetate; Propionate; Lactate; sulfides;
ferrous ions; Burkina Faso.

JRIESlJMIE
/
' ... '
'Ce travail ~. cocr::erné >§,tude des ba.Gté:de~ réductrices du fer et du' sulfate (BSR)
ünplkruées dan"g les phéno'm?:n~s de.' toxici.î:é dût'; aux ions ferreux et a~x ~ :llfures dans les'
••
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5LI1s d~ rizière de la Vallée du Kou au Burl<-.-lna Faso. .
Le dénombrement et 18, carar~t,érisalj.on de ces b~ctéries tout au long d'il cycle 'cultural
(;.li :dz, .~, pennis de montrer ql(un groupe héûSrogène de microorganismes constitué de
'tac:i:éries pouvant coupler la réduction du fer à l'oxydation del'acé~ate; du prQpi~nateet du
):a.(;i:~.te, est Ù1).pliqué dans la réd.'J.ction du fer dam ces écosystèmes. Des bactéries capables de
:,,:tüu.i:r~' acti~eI?ent"le fe; en culture' pure rJot pu être isolées, Ct: san;: des bactéries
. 'fer.mentaiJ.·es appartenant a~x genres AnaerôvibtiiJ et Clostrid'ium~ dont le nom6re peut
attemdre 106 à "108 bactérl:::;/g de sol sec 'ainsi qu'une BSR proche de Dèsulfovibrio
',' desufr'uriçari."s. Une nouvelI;; e~pèce du genre Ana"erovibr-io a été décrite, Anaerovibrio
~~urkinribense, sp. nov.; elle oxyde ie ciiTate" le furnilla;:.-;, le malatè, l'aspRt'tate, kglutamate,
·
.
.
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"
'
\\
~t le l,?-prop~ediolet ferme!:.î:e difficilement le glyc~rol en 1,3··propanedioL L'acétate et le
.:~propinate sont les produ.its'majeurs des proceSSiJS de fç;ITnentation.
~
, -
~,..
,
Les bactéries dOfr.tlmntes de la microf1Œc suifr..to-réductrice appartiennent toutes au
· genre Desulfovibrio; leur nomb~~ peut att~in(he 106 à 108 bactéries/g de sol sec. Auç~ne
espèce d'un autre genre n'a pu êotre mise erl évidenr.~. Ces résultats sont similaires;"à ceux
observés 8.U Sénégal. Le~ souches de BSR l.solées SŒlt. proches de D: :ûcoho[Qvorans, D.
·qêsulf;,tricans Oj.l D. vulgaris, Les mécanismes de la (l.issimilation du J,,2-prop'anediol chez
les espèces du'gern:e Desulfovi.brio, ont ét~ étudiés et i'existence de df.:ux voies ca.taboliques
démontrée: la "voie de~fa déshydratation" qui aboutit à, la formation de propionateet la "voie
de la déshydrogé·nation"q1.ü produit de l'acétat~. Lçs alcool/aldéhyde d.éshydrogénases
,
\\ " . . . . , .
.
' .
impliquées dans le ):uétabolisme des aicools chez les ·espèces étudiées, sont des enzymes .
_iuductibles dom l'a~c~pteurd'électrons et de protons serait le NAT)+ ou le NADH et non le
NADP+ ou le NA.DPrt.
.
. .
Mots clés: Anaerovibrio; Desuifovibrio; Dénombrement; Sols de rizière; Réduction du fero .
~Sulfat-réduction; .Métabo1is~ne 'du 1,2-propanediol; Alcools/aldéhyde ~éshydrogénase~;;
Fêrmèmation;Ac~tate; Propionat~; Lactate; Sulfures;Ions ferreux; BurkinaFaso.
.
.
.