~ d'ordre:
THESE
présentée
A
L'UNIVERSITE
LOUIS
PASTEUR
DE
STRASBOURG
pour obtenir
LE GRADE
DE
DOCTEUR
ES
SCIENCES
par
,
,
.,
, "
Martin
DIATEWA
BIOGENESE
ET
ETUDE
DES
PROPRIETES
DE LA
PHENYLALANYL-
tRNA SYNTHETASE
DES MITOCHONDRIES
DE LA LEVURE Saccharomyces cerevisiae
Soutenue le 12 JUILLET 1982 de-..ant la Commission d'Examen
MM.
J. P.
EBEL
Président
A.J.C.
STAHL
Y.
BOULANGER
Examinateurs
J. P.
WALLER
P.
REMY
~
.YERSI1t LOUIS PASTEUR
~DITIOII AVRIL 1982
STRASIOUAI 1
LISTE DES PROFESSEURS, MAITRES DE CONFeRENCES
DIRECTEURS ET MAITRES DE RECHERCHE CNRS ET INSERM
Pnlsident
Professeur
F.MARCOUX
Vice-Présidents
Professeur
C.GODBILLON
Professeur
H.DURANTON
Pmidents honoraires
Professeurs
G.OURISSQN . P.KARLI
Secrétaire Général
Monsieur
G.KIEHL
U.E.R.
DES
SCIEICES
M~DICALES
U.f.R. l1li sa-. Médial.
Directeur
Mere DORNER
U.f.R. Il. . . . . Biem6dicll.
Directeur
J.a SCHWARTZ
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E.FORSTER
G.GR[INER
C".GRQ'S
A.JUNG
P.MANOf.L
H.M[TZGEA.
P.MULLER
A.ROHMER
If.
HNLEGANS· J,sEROR· J.5TAHL· J.VEDRINE . P.VINTEMBEAGER
J.WARTER
G.WINC~LER
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E.GROSSHANS
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J.MEHL
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S.METZ
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L.HOLLENDl!:R
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R.MINCK
BKltr iol. Virot.lmmuftOl ....
A.MTZENSGI ,IIrGI!JI
Analom .. P.th-.o,iQU.
J.L.IMBS
Pharm.colo'llit
G.MORAND
ChirurgIe thot'KiQU.
P. •VER
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A.BLOCH
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L.ISRAEL
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R.RENAUD
Gynecol09i• .t ODsteCriQU.
R.BOCKEL
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P.REVILLE
EndOCrinOl.Mtt'Dot ••t NutrU
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Chir.Gtn:·H6g.L.P.""" COlm.'
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Th.KAMMERER
Clin.P,ychM'riqu.
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NeurophY·~09I.
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B.KELLER
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J.V.RUCH
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Biocl'limie
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G.SAVA
Chirurvi. ,.ntui.
J.CMAMBRON
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Neurologie
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BIOChimi.
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F.MAACOUX
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Radiologi.
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J.P.WEILL
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P.SAUVAGE
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ChirUrtie In'.nlil.
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J.M.LANG
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J.P.SCHIEBER
PhySiolOl"
J.".DUP(.YRON
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D.MAITROT
Neurochirurgi.
G.SCHLAEDER
I.EISENMANN
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J.L.MANDEL
Biochimi.
J.L.SCHLI ENGE R
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J.FL.AMENT
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J.MARESCAUX
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H.SICK
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Directeur
Gérerd SCHIFFMANN
SciI_ PIlySiques Il CItÙllïques
Sc._
Directeur
Henri BENOIT
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Directeur
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Geneviève LEBEURIER
Scie_ da COIlljlme-t et de l'Erwironnement
Directeur
Bruna WILL
E_ d'AjI"iation des H.uts Polymères
Directeur
Mannd LAMBLA
Ecol••Itiollllt Sup6rieure de Chimie
Otrecteur
Mere DAIRE
Dbsemtoin
Directeur
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PIlysi.,. du Glabe
Directeur
Raland SCHLICH
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Directeur
Gilbert SUTTER
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J.H.WEIL
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Biochimi.
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Chimi•
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R.MONTlGNY· ~opny.,qu. ,"t.
E.PETERSCHMITT· G'OphYliqu. int.
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Chi mi.
A.KOVACS
PhYlicœn.n..-cromolkul.ir.
ASKOULIOS
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Virologie
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A.J.p.MfvEFl
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Chimie o'geniqu.
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J.MERl
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G.KAUFMANN
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J.CHEVALLIER
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E.MARCHAL
PnytiCOCh.mol ••t m.cromol.
J.C.THIERRV
Ch.mie
I.FRANÇOlS
PhYICoeh.nlKlomOIeCU"'''.
R.MORAND
pnYI."uel.el corpulCulair.
K.TRAORE
Pnyl.cOCh .•tam ..t iOftlQu.
E.II'R"'NTA
Phy1tCCKnfmie ""O,,"ullir.
D.MORAS
Cnimi.
P.WAGNEFl
PhYI.nuel.et corpuKu..i,.
J.M.ll'A.I!OT
~.ca~.œ"""
Tn.t.IlULLER
PhYI.nucl .•' c.orelulCul.ir.
G.WAL TER
Phy•. nucl .• 1 corpulCul,ajr.
I."RITIQ
VirO'OI~
G.MUNSCHV
Pl'lYliQu.
F,.WE8ER
G.olotie
'V .0........0"1'
Phys,icocl\\.m.c,'Oft\\Ol!tCul.ir.
M.NAUCIEI-·8LOCM
PhYllqU. des SOlic:lft
J.P.WENIGER
ZOOlot
J.~.o.l!:R_"
PhyLlIMI;lAC COIIputcul.'N
A.NICOLAIEFF
V jrologie "el)6t.l.
J.WITZ
'•
Biolov<oe cettu..;,.
R.o.'EGe:
IfOCI'imie
H.PAQlJET
GtOlogi.
~.WOLFF
Cnimie
~QRA""'I"
.......-
PhySiCOCh.t'IWCt'Offt016cu"ir.
-..-1_-
M.PATV
...., ..........,.
~!~~.~:.~~~~~~,~-
J.P·ZIELINGl!:R
,
....
~':~,~_........ n.'--
UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG
UIllU d'Eaae.lgnement et de Recherche
Mise à jour le 15 !Dan 1982.
dea Scienc.... PhU!Daceutique8
LISTE DU PERSONNEL ENSEIGNANT
Directeur: M. P.MÉTAIS.
Directeurs-adjoints: MM. Ph.POINDRON - A.STAMM.
Secritllire : M. R. BRUDER.
•
Doyens Mnoraires ; MM. P.DUQUENOIS - M.HASSELMANN - G.DIRHEIMER.
Professeurs honoraires: MM. LP.EBEL - G.GAZET DU CHATELIER - P.CORDIER - P.JAEGER.
Professeurs :
Assistants titulaires
MM. R.ANTON
Pharmocog nosif:
Mme F.BINDLER
Chimie analytique
R.CARBIENER
Botanique
Mlle M.J.BOUCHET
Chimie organique
Ci.DIRHEIMER
Toxicologie
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A.BOURGUIGNAT Biochimie
Ci.FÉRARD
Biochimie oppliquée
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Toxicologie
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Pharmacie galénique
D.GÉRARD
Biophysique
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Chimie analytique
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Chimie analytique
Mme M.KETZ
Chimie organique
L.JUNG
Chimie thérapeutique
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Pharmacognos ie
J.C.KOFFEL
Chimie thérapeutique
Mme C.PIGAULT
Physique
H.LAMI
Mathématiques
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R.SCHLEIFFER
Physiologie
Y.LANDRY
Pharmocolog ie
Mme M. TRÉMOLlÈRES
Botanique
C.L.APP
Chimie générole et minérale
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Chimie analytique et Bramatol.
Assistants délégués
G.L.AUSTRIAT
Physique
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ToxicolQQie
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Immunologie
M.
G.GRIMM
Chimie analytique
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Pharmacagnosie
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A.HENNEQUIN
Physique
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Parasitologie
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Toxicologie
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Virologie
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Bactériologie
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Chimie analytique
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Chimie anaiytique
A MES PARENTS
A E. M. GIESEN
A TOUS LES MI ENS
Le~ tltava.ux. 6a.üa.nt l'objet de c.ette thè.6e ont été ltéa.-
l~~é~ au laboltato~lte de B~oc.h~m~e de l'U.E.R. de~ Sc.~enc.e~
Phaltmac.e~que~ de l'Un~velt~~é Lou~~ Pa~teult de Stlta~boultg ~ou~
la d~ltec.t~on de Mon~~eult le Plto6e~~eult Andlté J.C. Stahl. Qu'~l
veuille tltouvelt ~c.~ l'ex.plte~~~on de notlte plto6onde ltec.onna~~~a.nc.e
poult l'ac.c.ue~l, le~ gltande~ ~n~t~~~ve et l~beltté qu'~l nou~ a.
l~~~ée~
dultant la ltéal~~a.t~on de c.e~ tlta.vaux, et POUlt le temp~
qu'~l nou~ a. c.on~ac.lté.
Nou~ ltemeltc.~on~
Mon~~eult le Plto6e~~eult J.P.
Ebel de l'
Un~velt~~té Lou~~ Pa~teult de Stlta~boultg , M~mblte de l'Ac.a.dém~e
de~ Sc.~enc.e~, de nou~ avo~lt 6~t l'honneult de plté~~delt c.e jUlty.
Nou~ ltemeltc.~on~ v~vement Mon~~eult le Plto6e~~eult
J.P. Wallelt de l'Ec.ole Polytec.hn~que de Pala~~eau d'a.vo~lt a.c.c.ep-
té de jugelt c'e tlta.va.~l.
Nou~ tenon~ a explt~melt notlte plto6onde gltat~tude a Mon~~eult
le Plto6e~~eult Y.
Boulangelt de l'Un~velt~~té Lou~~ Pa.~teult de
Stlta~boultg qu~ nou~ a a.c.c.eu~ll~ dan~ ~on laboltato~lte POUlt y étu-
d~elt, en c.ollaboltat~on avec. lu~-même, l'olt~g~ne génét~que de~
~o~-un~té~ de~ phénylalanyl-tRNA ~ynthéta~e~ m~toc.hondlt~a.le et
c.ytopla~m~que de levulte pa.lt vo~e b~oc.h~m~que,
et qu~ a. b~en
voulu ac.c.eptelt de ~~égelt dan~ notlte jUlty de thè~e.
No~ ltemeltc.~ement~ ~'a.dlte~~ent a Mon~~eult P. Rémy, Ma.2tlte
de ltec.heltc.he au CNRS, POUlt le don de la phénylala.nyl-tRNA ~ynthé
ta.~e c.ytopla~m~que de levulte ut~l~~ée au c.oult~ de c.ette étude,
et POUlt avo~lt a.c.c.epté de 6a~lte pa.ltt~e de notlte jUlty de thè~e.
No~ ltemeltc.~ement~ vont a Mon~~eult le Plto6e~~eult J. Malglta.~
de l'Un~velt~~té Lou~~ Pa.~teult de Stlta.~boultg et a Mon~~eult Ac.~elt
du Centlte de Tlta.n~6u~~on Sa.ngu~ne de S.tlt~~boultg POUlt leult c.olla.-
bolta.t~on dan~ l'~mmun~~a.t~on du la.p~n.
Nou~ ltemeltc.~on~
éga.lement la. Fonda.t~on POUlt la. Rec.heltc.he
Méd~c.a.le POUlt l'a.~de 6~na.nc.~èlte qu'elle nou~ a. a.c.c.oltdéc r-ou~
ac.hevelt c'e tlta.va.~l.
En6in, nOu6 t~non~ à ~eme~eie~ tou~ no~ ami~ du tabo-
~a~oi~e pou~ teu~ ambianee t~è~ ~ympathique du~ant ta ~éat~~a
tion de ee t~avait; no~ ~eme~eiement~ pa~tieutie~~ à J.L. Taite
pou~ ~a eottabo~ation dan~ ta pu~i6ieation de~ p~éeu~~eu~~ de
ta phénytatanyt-tRNA ~ynthéta~e mitoehond~iate de tevu~e, et à
not~e compagnon de ~oute,
Mademoi~ette
K. Witm.
TABLE
DES
MATIERES
Pa.g e~
INTRODUCTION . . .
1
PREMIERE PARTIE :
ASPECTS MOLECULAIRES DE LA PHENYL-
ALANYL-~RNA SYNTHETASE DES MITOCHON-
DRIES DE LEVURE.
CHAPI HE l
PURIFICATION DE LA PHENYLALANYL-tRNA
SYNTHETASE DES MITOCHONDRIES DE LE-
VURE
10
I.METHODES . . . . .
11
I. I.I~otemen~ de~ m~~oQhond~~e~
Il
I. 1. 1. Cut~u~e de~ tevu~e.6 . . .
Il
I.l.2.T~a.n~6o~ma.~on de~ Qettute~ de tevu~e en
p~o~opta~~e~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
I. 1.3.I~otemen~ de~ m~~oQhond~~e~ . . . . . . . . . . . . .
17
17
I.3.Pu~6~Qa.~on
de ta. phényta.ta.nyt-~RNA ~yn~hé~a.~e
de~ m~~oQhond~~e~
de tevu~e . . . . . . . . . .
19
I.3.1.Dé~e~m~na.~on
de t'aQ~v~~é de ta. phénytatanyt-
~RNA ~yn~hé~a.~e de~ m~~OQhond~~e~ de tevu~e . .
19
I.3.2.Dé~e~m~na.~~on
de ta. QonQe~~a.~on de~ p~o~é~ne~
20
I.3.3.EteQ~Mpho~è.~e
~u~ get de potyaQ~yta.m~de . . . . . .
20
I.3.4.Dé~e~m~na.~~on
de~ a.m~noa.Q~de~
N-~e~m~na.ux
pa~
ta mUhode de~ dé~vé~ dan~yté~ . . . . . . . . . . .
20
I.3.5.P~oQédu~e
de pu~~6~Qa~on de ta. phényta.ta.nyt-
~RNA ~yn~hé~a.~e de~ m~~oQhond~~e~ de tevu~e . . . . ,
21
I.3.6.Pu~e~é de ta. phényta.ta.nyt-~RNA ~yn~hé~a.~e de~
m~~oQhond~~e~ de tevu~e
31
II.RESULTATS ET DISCUSSION
31
Pa.g e.<'l
CHAPITRE II
STRUCTURE POLYMERIQUE VE LA PHENYLALANYL-
tRNA SYNTHETASE VES MITOCHONVRIES VE
LEVURE
34
1. METHOVES . .
35
1. 1.Eh~ma.tion de. ta. maA<'le. motécuta.i~e. de. ta. phényta.ta.-
nyt-tRNA hynthétahe. mitochond~ia.te. na.~ve. . . . . .
35
1. 1. I.Ete.ct~opho~è<'le. hU~ ge.t de. potya.c~yta.mide.
35
1. 1.2.Ch~oma.tog~a.phie. hu~ Sépha.de.x G-200 .
38
I.2.Eh~ma~on de. ta. ma.~~e. motécuta.i~e. de.<'l di66é~e.nth
con4tituan~
de. ta. phényta.tanyt-tRNA hynthéta.<'le.
de.~ mitochond~ie.<'l de. te.vu~e. . . . . . . . . .
38
1.2. I.Ete.ct~opho~è<'le. <'lU~ ge.t de. potya.c~yta.mide.
e.n
p~é<'le.nce. de. SVS e.t d'U~ée. • • • • • • • • •
38
II.RESULTATS ET VISCUSSION
44
CHAPITRE III
ORIGINE GENETIQUE VES CONSTITUANTS VES
PHENYLALANYL-tRNA SYNTHETASES MITOCHON-
VRIALE ET CYTOPLASMIQUE VE LEVURE . . .
46
1. METHOVES .
47
1. I.App~oche. biochimique.
47
1. 1. I.I<'lote.me.nt de.<'l hO~ -unité<'lCl e.t S de. ta. phényta.ta.nyt-
tRNA <'lynthéta.he. de.<'l mitochond~ie.<'l
de. te.vu~e. . . . .
47
I.l.2.Véte.~mination
de. ta. compohition e.n acide.h a.miné<'l
48
I.2.App~oche. immunologique. .
48
I.2.1.P~océdé d'immunüa.tion du tapin
48
I.2.2.P~i6ica.tion
de.h a.ntico~p<'l
. . . . . . . . . . . . . .
49
I.2.3.Etude. de.<'l déte.~mina.nt<'l
a.ntigénique.<'l de.<'l phénylala.nyl-
tRNA <'lynthéta.he.h mitochond~ia.le. e.t cytopla.hmique. de.
le.vu~e. pa.~ la. méthode. ELISA.
. . . . . . . . . . . .
50
Pa.g e.~
Il.RESULTATS ET VISCUSSION • • • • • •
50
Il. 1. Pltlpa.lta..türr. de.~ ~oU-6 -un'<".té-6cx e..t B de. ta. phérr.yta.ta.rr.yt-
.tRNA -6yrr..thé.ta.-6e. de.-6 m.<...tochorr.dlt.<..e.-6 de. te.VUlte. • • • ••
50
Il.2.Re.che.ltche. de.-6 ~'<"m.<..ta.It'<".té-6
-6.tltuc.tUlta.te.-6 • • . • • • • . •
53
III .CONCLUSION
57
VEUXIEME PARTIE:
BIOSYNTHESE ET TRANSPORT VE LA
PHENYLALANYL-.tRNA SYNTHETASE MITO-
CHONVRIALE VE LEVURE
58
I . METHOVES
• •
59
I. 1 • CltOÙ-6a.rr.ce. de.-6 ce.ttute.-6
• • • • • • • • • • • • • • • . .
59
I.2.Pltlpa.lta..t.<..orr. de. ta. 6lta.c.t'<"orr. cy.tO-6ot'<"que.
S9
I.3.Pltépa.lta..t'<"on de. ta. 6lta.c.t.<..on m.<...tO-6ot.<..que.
59
1.4. Immunopltéc'<"p'<".ta..t.<..orr. de.-6 potype.p.t'<"de.-6 pltécult-6e.ult-6
60
I.5.PuJt.<..6'<"ca..t'<"orr. de.-6 pltécult-6e.ult-6 de. ta. phényta.ta.rr.yt-
.tRNA -6yrr..thé.ta.-6e. m.<...tochorr.dlt.<..a.te. de. te.VUlte.
60
1.5. I.Pltépa.lta..t.<..on de. t''<''mmurr.oa.d-6oltba.rr..t
60
1.5.2.Pult'<"~'<"ca..t'<"orr.
de.-6 pltécult-6e.ult-6 • •
61
I.6.Corr.ve.It-6'<"orr. de.-6 pltécult-6e.ult-6 e.n plto.té'<"rr.e.-6 ma..tulte.-6 • •
62
1.6. I.Pltépa.lta..t.<..orr. de.-6 me.mblta.ne.-6 m.<...tochondlt'<"a.te.-6 .to.ta.te.-6
62
I.6.2.Corr.ve.It-6'<"orr. de.-6 pltécult-6e.ult-6 e.n plto.té.<..rr.e.-6 ma..tulte.~
•
62
1.7.Ete.c.tJtopholtè~e.
~ult ge.t de. potya.cltyta.m'<"de. e.rr. plté-6e.nce.
de. SVS • • •
• • • ••
• • •
• • • • •
63
I.8.F'<"rr.ge.ltplt'<"n.t-6 .tltyp~.<..que.-6
de.-6 pltécult-6e.ult-6 e..t -6 0 u-6 -u n'<".t é-6
ma..tulte.-6 de. ta. phényta.ta.rr.yt-.tRNA ~yn.thé.ta.-6e. m.<...tochon-
dlt'<"a.te. de. te.VUlte. • . • • • . • • • • • • •
64
Page~
II.RESULTATS ET VISCUSSION
.
. . 64
II. 1. M.i.6 e en évidenc.e de~ pJtéc.uJt~ euJt~ dan~ le
c.yto pla~ me •
• • •
•
• • •
64
II.2.PuJti6ic.ation de~ pJtéc.uJt~euJt~ de la phénylalanyl-
tRNA ~ynthéta~e mitoc.hondJtiale de levuJte . . .
69
II.3.MatuJtation de~ pJtéc.uJt~euJt~ de la phénylalanyl-
tRNA ~ynthéta~e mitoc.hondJtiale de levuJte . . .
71
III.CONCLUSION . . .
75
IV.PERSPECTIVES V'AVENIR
75
TROISIEME PARTIE:
ETUVE VE QUELQUES PROPRIETES
CINETIQUES VE LA PHENVLALANVL-tRNA
SVNTHETASE VES MITOCHONVRIES VE
LEVURE
CHAPITRE l
ROLE VES GROUPEMENTS SULFHVVRILES VE LA
PHENVLALANVL-tRNA SVNTHETASE MITOCHON-
VRIALE VANS LA REACTION V'AMINOACVLA-
nON
77
1. METHOVES . . .
78
I. I.PJtépaJta.tion du tRNA mitoc.hondJtial . . . • . .
78
1.2. Inac..tivation de l'enzyme paJt le p-hydJtoxymeJtc.uJtiben-
zoate et l'iodoac.étate .
.
. . . . 78
I.3.VéteJtmina.tion de l'ac.tivité enzymatique
79
1.4. Analy~ e c.iné.tique . . . . .
79
II.RESULTATS ET VISCUSSION . . . .
. . . 80
II. ,. Inhibi.tion de l'enzyme paJt le p-hydJtoxymeJtc.uJtiben-
zoate et l'iodoac.étate
.
80
II.2.Ac.t~on du dith~hJtéitol et du 2-meJtc.aptoéthanol ~uJt
1
l'inh~bition de l'enzyme due au p-hydJtoxyme~c.u~~ben-
zoate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
Pag e.~
II.3.E~ude. de p~o~e.e~on de. l'e.nzyme. pa~ ~e.~ d~66é~e.n~~
~ub~~~a~~ eon~e. l'~nh~b~~on due. au p-hyd~oxyme.~-
eutib e.nz oa~e . . . . . . . . . . . . . . . .
80
III.CONCLUSION
85
CHAPITRE II :
INACTIVATION THERMIQUE ET ETUVE VES
PROPRIETES CINETIQUES VE LA PHENYLALA-
NYL-~RNA SYNTHETASE MITOCHONVRIALE VE
LEVURE
.
88
I.METHOVES • . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 89
I.l.Te.ehn~que. pou~ l'é~ude. de. la déna~u~a~~on ~he.~m~que. . .
89
90
1. 3. Anai.y~ e. e~né~~q ue. . . .
. .
90
II.RESULTATS ET VISCUSSION .
90
II.l.E66e.~ de. la ~e.mpé~a~u~e. ~u~ la ~~ab~l~~é e.~ la
~~ae~~on d'am~noaeyla~on de. l'e.nzyme. . . .
90
II.2.E66e.~ p~o~e.e~e.u~ de.~ ~ub~~~a~~ ~u~ l'~nae~~va~~on
de. l' e.nzyme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
RESUME ET CONCLUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,
101
BIBLIOGRAPHIE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
108
PUB LI CATI ONS
C~ ~4avail a donné li~u aux publica~ion~ ~uivan~~~
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PU4i6ica~ion and ~ubuni~ ~~4UC~U4~ 06 mi~ochond4ial ph~nyl
alanyl-~RNA ~yn~h~~a~~
~40m y~a~~
Bioch~m.
Biophy~.
R~~.
Commun., 94,
189-198
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Bio~yn~h~~i~ and ~4an~p04~ 06 y~a~~ mi~ochond4ial ph~nylala
nyl-~RNA ~yn~he~a~~
Nucl~ic Acid~ R~~.,
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Ob~~n~ion d~ p40~opla~~~~ d~ l~vu4~ à l'aide de di66é4en~e~
p4épa4a~ion~ de ~uc hépa~0-panc4éa~ique d'Helix poma~ia
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~ubuni~~ ~o ~h~i4 cy~opla~mic
coun~e4pa4~~:
i~ola~ion and
de~e4mina~ion 06 amino acid compo~i~ion~
Biochem. Biophy~. Re~. Commun., 106,520-525
- DI~7éW~, ~. and S7~HL. ~.J.C. (1983)
~iiochond~iae ph~nyeaeanye-iRN~ ~ynfheia~~ t~om y~a~i: to~maiion
ot ~nzyme-~ug~i~ai~ compe~x~~ ~hown gy h~ai O~ SH ~~aqeni inac-
iivaiion
Biochimü,
65,
355 - 360
- DI~7[UI~, ~.,
7~I7[, J.L. and S7~HL, ~.J.c. (1986)
Pu~iticaiion ot cyiopea~mic p~ecu~~o~~ ot yea~i miiochond~iae
phlmyeaeanye -iRN~ ~ynil1eia/)~ .6u{Junii~
Bioch~m. Bioph!/~. R~~. Commun., 137, 1119 - 1124
ABREVIATIONS
PheRS
phlnylalanyl-tRNA 6ynthlta6e
mt
mitochond~ial
ct
cytopla6mique
60uche de levu~e dont le mtVNA e6t de type
6auvage.
60uche "petite" 6an6 mtVNA.
p-
6ouche6 de levu~e dont le mtVNA po~te de6
dliltion6 au niveau, 60it de6 gène6 de6 tRNA,
60it de6 gène6 de6 ~RNA.
6yn
6ouche6 de levu~e dont le mtVNA po~te de6
mutation6 ponctuelle6 au niveau de6 gène6 de6
tRNA ou de6 ~RNA.
PMSF
phlnylmlthyl6ul6onljl6luo~ide
T~i6
T~i6-(hyd~oxymlthylJ-aminométhane
TEMEV
N,N,N' ,N'-tlt~amlthylène diamine
EVTA
acide éthylène diamine tét~aacétique (6el
di60diquel
TCA
acide t~ichlo~acétique
VEAE-cellulo6e:
dilthylaminoéthyl-cellulo6e
l
INTRODUCTION
GENERALE
Les mitochondries, centrales énergétiques de la levure,
sont des organites cytoplasmiques entourés de deux membranes,
la membrane externe lisse et la membrane interne formant des
crêtes.
L'intérieur de ces organites, semi-liquide, est appelé
matrice
(figure 0-1). Ces phases cytoplasmiques, pourvues
d'une continuité mitochondriale car se divisant à partir de
phases préexistantes,
sont douées d'une continuité génétique
mitochondriale dont le support héréditaire est le DNA mito-
chondrial
(mt DNA).
Les molécules de mt DNA de SacchaAomyce~ ce~ev~~~ae, bica-
7
ténaires et circulaires, mesurent 25 pm de long, soit 5.10
daltons
(Hollenberg et coll.,
1970
; Petes et coll.,
1973
Locker et coll.,
1974 ; Sanders et coll.,
1976). Elles ne
codent que pour une dizaine de protéines
(Borst et Grivell,
1978).
Le reste des protéines d'origine nucléaire est synthé-
tisé sur les ribosomes cytoplasmiques, puis transféré dans les
mitochondries.
Trois approches : génétique, biochimique et
immunochimique,
nous ont apporté la lumière sur les protéine~ codées par le
mt DNA de la levure Saccha~omyce~ ce~ev~~~ae.
L'outil génétique par l'emploi des mu~ants cytoplasmiques,
syn-,
p
pOet mit-
(pour des revues: Gillham,
1978 ;
Tzagoloff et coll.,
1979)
a permis de caractériser les produits
de l'expression du matériel génétique mitochondrial. L'utili-
sation conjointe de ces mutants et des fragments du mt DNA
issus des enzymes de restriction a favorisé l'établissement
d'une carte de quelques gènes du mt DNA
(figure 0-11).
L'association, d'une part de l'approche biochimique par les
expériences de traduction des mRNA mitochondriaux ou cytoplas-
miques dans les systèmes acellulaires
(pour une revue : Poyton,
Inn. membf.ne
Criltae
Longitudinal section
spoc.
:rft
Matrik --no4
Enl.rg.ment of •
Inn... membrane
crilta showing F 1
Crist•• --I.i.~"'..l
k nobs on inn.r side
Int... membrane ---i~;:=~
of inn" membrene
spac.
Outer--+
membrane
Crou section
Figure 0- l
Diagramlllatic "Icha. allllÔlachandrial .IIVe"'..,
( (j/LLHAN. 1978)
R"lnCIiO!! EN~
Eo:oRI
t Il
H.ol
lai
80lllHl 1.1
H.f1d Il 101
H"o 1
(.1
)(bo 1
(AI
SolI
t"'l
PSI 1
ft)
o UNITs
25
50
75
1
1
1
1
1
o K8P
19
38
57
50,11
Pst 1
,
ElAlRI 1
t
1 4
1
2
(9111
50011 "il8l
3
T6
Hpal
4
1
5 161,
2
1
3
171
:,
80mHl
4
1
1
r
3
r
2
1 5
HlI1dm
3
(5)1:
4
(611
1
1
'2
1 3
HhoI
31
5 1 7 191
1
(11)1 1 6 1 4 (Kj 1
2
1 8 1 3
Xbol
3
r
2
1
1
161 5 l '
4
1 3
FIgure 0- n : PhyMcol and v.,.tic JftOp af mlDNA of S. cereo;isia. as determined by reJtriction fragment onolYJiJ of ..,DNA
from IItOrker.retoining P- Mutonh and by hybridizotion of comp~mentary RNA probe, mode on p .. mtONA ta p+ mtONA.
The frov",ent ",op unih ore fhouMInch of bos.e pain (KBPI, Qnd the RNA is gio;en in unih. Gene deJivnonons ore aJ fol·
~.,: 21S artd US ore larve and tIl'lall mitochondriol rRNAl, reapectio;ely, C and E ore RIBI and R~83 venes, re,pecti'lelYj
01 and 011 ore OUI and Oll:l, P il PAR1 i OXIr, OXI2, and OXI3 ore three cytochrome oaida,e geneJ; COB embroceJ
IWO cytochroMe b Venel; "'Îtochondrial tRNAI mop in three leparate regions. (CowteJY of Dr. M. Robinowitz.)
( GlLLHAM . 1978 )
4
1980)
et d'utilisation des inhibiteurs de la synthèse des
protéines mitochondriales et cytoplasmiques
(pour des revues
Schatz et Mason,
1974 ; Tzagoloff et coll.,
1979 ; Kroon et
De Jong,
1979), et d'autre part de l'approche immunochimique
(pour une revue: Cabral et Schatz, 1979),
a permis de mettre
en évidence les produits d'origine mitochondriale.
Le système de synthèse protéique mitochondrial de la levure
est formé pour sa plus grande partie des protéines d'origine
nucléaire telles la RNA polymérase
(Scraag,
1976), les facteurs
d'élongation
(Parisi et Cella,
1971),
les protéines riboso-
males à l'exception de la protéine Var
(Schmitt, 1971 et 1972
Groot,
1974
Groot et coll.,
1979), et les aminoacyl-tRNA
synthétases
Bogulowski
et coll.,
1974 ; Schneller et coll.
1976a) .
Les aminoacyl-tRNA synthétases
(aRS)
sont des enzymes cata-
lysant la fixation des acides aminés sur leurs tRNA spécifi-
ques
(figure O-IIIa).
Les acides aminés fixés sur les tRNA
sont ensuite transportés au niveau des ribosomes pour leur in-
corporation dans les protéines
(figure O-IIIb_d).
L'identification des aminoacyl-tRNA synthétases mitochon-
driales de divers organismes a été abordée, d'une part par la
comparaison des comportements chromatographiques et des pro-
priétés d'aminoacylation des enzymes mitochohdriales et
cytoplasmiques, et d'autre part par l'étude de leurs détermi-
nants antigéniques
(Barnett et coll.,
1967
; Buck et Nass,
1968
et 1969 ; Kislev et coll.,
1972 ; Guillemaut,
1973
;
Chiu et Suyama,
1973 et 1975 ; Jeanin et coll.,
1976 ; Lynch
et Attardi,
1976 ; Beauchamp et coll.,
1977 ; Schneller et
coll.,
1976a,b et 1978 : Charezinski et Borkowski, 1978
Sinclair et coll.,
1981). L'utilisation des propriétés d'amino-
acylation et des comportements chromatographiques n'a pu
résoudre le cas de certaines aminoacyl-tRNA synthétases mito-
chondriales que l'on ne
peut distinguer de leurs homologues
+ AMP
(0 )
inilialion de la chaine polypcplidique. En prbence d'un facleur prol~ique F., la particule 30 S
du ribosome forme un complexe 'vec l'ARN meuager au niveau du oOOon AUG, Ce complexe
en pr~.ence <.le <.I<ux facleur. prOl~ique. F, cl F, el du GT!' acccpte le F·Mel.IARN, l'e",emule
fonnanl un complexe <.l'inilialion. La derni'rc ~lape correspond à l'addition au complexe de la
particule 50 S, Le F·Mel.tARN, .e lrouvanl en position P, r~agira. comme dan. l'~lonsation.
nec J'aminoacide apporl~ au .ile A par le tARN cOlTCSpondantau .econd codon du meuager
"'1
~..<:c:
... ,
\\
(c)
tlong.lion d<s chain<. polypcpliùique., Après la formalion de la li.ison pcp:idique, la ch.ine
...nonKée sc: n:trüu\\'c ,ur le sile Aj elle cU ensuite lransrêr~e de Ge site sur le' site Pen mtmc temps
que '" pruduit UII" lran;lOCalion de l'AR:-.' messager et l'expul.ion du tARN libre
UAG
~UM + RF·l
DU
---?
+ 1 (d)
",
~UGA + RF·2
",
UM
".
Libération du polypeptide en préserce
d'un des
triplets
de
terminaison
et
du
facteur
RF -1
ou
RF - 2
Flgure 0 - .m
mécanisme
schématique
de
la
biosynthèse des protélhes
(Cas
des Procaryotes, similaire à celui des Eucaryotes )
O'a{ris
CHAPEVILLE
et al., 1974a,b
6
cytoplasmiques
(Guillemaut, 1973
; Suyama et Hamada, 1978 ;
Bogulowski et coll.,
1974 ; Felter et coll., 1981). L'absence
de mutants nucléaires et de structures chimiques pour ce
dernier cas des aminoacyl-tRNA synthétases ne permet pas de
conclure sur leur parenté structurale. L'origine nucléaire
des protéines localisées dans les membranes et la matrice mi-
tochondriales ou chloroplastiques de divers organismes a
conduit bon nombre de chercheurs à élucider leurs mécanismes
de synthèse et transfert dans les mitochondries ou chloro-
plastes.
Les résultats obtenus jusqu'à présent sont en faveur
de deux mécanismes :
-
synthèse des protéines dans le cytoplasme sous forme de
précurseurs, puis transfert dans les mitochondries ou chlo-
roplastes selon un processus "post-traductionnel"
(figure O-IV)
(pour des revues: Chua and Schmidt,
1979
Blobel et coll.,
1979 ; Neupert et Schatz, 1981)
- couplage de la synthèse des protéines se faisant sur les
ribosomes cytoplasmiques liés au niveau des membranes mito-
chondriales ou chloroplastiques avec leur transfert. Ce
mécanisme est similaire au processus de "traduction vecto-
rielle" observé dans le cas des protéines sécrétées chez
les Mammifères
(figure O-V)
(Blobel et Dobberstein,
1975a,
b
; Chua et Schmidt, 1979 ; Blobel et coll., 1979
Sevarino
et Poyton,
1980
; Harwood, 1980
; Ades et Butow, 1981a,b).
Contrairement à l'importance jouée par les aminoacyl-tRNA
synthétases mitochondriales dans la synthèse protéique, peu
de travaux ont été consacrés à leur biogénèse. Ainsi, avons-
nous apporté notre contribution à ce problème en étudiant la
phénylalanyl-tRNA synthétase des mitochondries de la levure
Saeeha~omyee~ ee~evi~iae, enzyme localisée dans la matrice.
Les travaux préliminaires
(Schneller et coll., 1976a,b)
entrepris sur la phénylalanyl-tRNA synthétase mitochondriale
ont été consacrés :
Signol ptp.ia.
Signol pep. id...
RibcKomf receptor
SÏ!!nal roc.p.o.
Figlre O-:Ir : Sd,~matic illustra. ion of thr si!!,na! hypolhesis for th~ tran.loca.ion of
.ecr~.ory prolcin. acro" Ih~ REH membren...
Variou. . .ar.' of th~ t ...n.lation of • mit:".'&' for a 't"er~.ory prol~in on 8
mt"mbranr-hound potysome ar~ indicated. The poly.ome eonlain. six ribosom~s.
The firs. 'v"" ribo.ome. near .he 5' end of mR:"A ar~ not y~1 hound to th~
m~mbr3ne.Th" nasecnl chain i. indic.ted 10 ,::ro,,' in a tunnel in the lar,::~ ribosomal
subunil. The sirnal peplide ponion is indicaled "
e zig-zal:\\!ed linr at lhe
amino-Ierminus of Ihe n,"cenl chain (.....t"cond and thire! rih<••om~) or d~a\\"~d
from Ihe na"'l'nl chain and located in Ihe mt"n,hrane (.ce membrane hetw,,~n
ribosome 3 and 4). Th. siJ.:nal-pcptiu.s~Sil" of the n..cent chain is indicated by
an up\\\\'uu poimin\\! arrow h..d cl)nnccled 10 a dashcd line. RibusomcoreC('plor and
si,::nai-receptor acti"ity ar" represenled arbitrarily by two differenl inl~gr1ll
mnnbram proleins. Alternatively, these two acti,-ities could be r~prescnt~d as rwo
scparal~ domains on on~ jnl~Rral m"mbran~ prol~in
SR
.,.0
C
'OH
Figure 0 - m :.l1ypolhetical modd forthe post-translaliona' translocalion of a prol~in across
1 mt'mhrant:'.
The prolcin 10 h.. tr1lnslocated comains a si"nal sequ~nce, indicaled here as a
cro..-harrrd reJ.:ion on lhe ar..ino-terrninal of the polypeplide chain. The prolein
is fold"d (indic.ted by dot,) hUI lhe siRn.1 .equence is ~xpmed and free to interacl
-wilh Ihe signal r~c~plot5 (SR). This inl~raction is indicated to result in the
a~re~atjon of the si/!nal rrceplors in th~ pl3ne of lhe m~mbrane to form a pore.
Althoui!h not indicaTed in Ihis simple model, il i. conceivahle thal the signa'
Il'quenct:' for po~t·tran~I::Hional translocation p(l!r.~~"'es t\\A;Q distinct domains. }:ioth
of th,,* domain. cou Id he analogous to the t..·o ...parate siles which have h«"
in"oked for co-<tanslational Iranslocalion: one, which could b~ the analogue of the
translocalion domain of the signal ""quence of nascenl pr~oecretor}" proleins, and
anolh~r one which cou Id b~ Ihe analogue of a sile on the large ribosomal subunit
(e.I!' a ponion of a ribosomal prot"in). B~' further analogy to co-translational
translocation, Ihe
l'A'o putative domains of the
signal o~Quence for post-
translational Iranslocation could be reco,::nized by two distinct receptoro, each
of them r~pr....ented by a specific membrane prote in.
Translocation is indicaled arhirrarily 10 procerd carboxyl-Ierrninal firsl. SiRnal
Jlfplidase (51') would c1ea.... when translocation is complete or nearly complete.
Cleavage could he cou pied to disa..embly of Ihe pore by laierai diffusion of the
r""eptors in the plane of the membrane.
(Q'a{Y'ès BLOBEL and coti., 1979 )
s
1)
à sa caractérisation:
-
par
la capacité de charger spécifiquement le mt tRNAPhe
après chromatographie sur colonne d'hydroxylapatite d'un
extrait brut contenant à la fois les protéines mitosoliques
et cytosoliques, et d'un extrait pourvu uniquement de
protéines mitosoliques
-
par voie immunologique grâce aux anticorps préparés à partir
d'un extrait brut mitosolique contenant toutes les aminoacyl-
tRNA synthétases mitochondriales
;
2)
à la détermination de son origine génétique:
enzyme codée par
le DNA nucléaire car présente dans les
mitochondries du mutant
p 0
de levure.
La première partie de notre travail porte sur
la purifica-
tion,
la structure polymérique de la phénylalanyl-tRNA synthé-
ta se mitochondriale, et sur
l'origine génétique des différents
constituants des phénylalanyl-tRNA synthétases mitochondriale
(mt Phe RS)
et cytoplasmique
(ct Phe RS)
de levure.
La deuxième partie traite de la biosynthèse et du transport
de la mt Phe RS.
La troisième partie est consacrée a
l'étude de quelques
propriétés cinétiques de la mt Phe RS.
11
L'existence d'une ct Phe RS d'origine également nucléaire nous
a
incité à purifier
la mt Phe RS avant d'aborder
toute étude sur
cette dernière.
I. METHODES
I.
1.
ISOLEMENT DES MITOCHONDRIES
Afin d'obtenir une mt Phe RS exempte de toutes traces de
de son homologue cytoplasmique,
nous avons préféré l'extraire
a partir des mitochondries.
Deux méthodes sont couramment utilisées pour
la préparation
des mitochondries de levure
-
obtention des mitochondries après broyage des cellules de
levure en présence de billes de verre
(Utter et coll.,
1958
Wintersberger et Tuppy,
1965
Mattoon et Balcavage,
1967
Schatz,
1967 ; Stahl,
1969 ; Deters et coll.,
1976
;
Labbe et Chambon,
1977
; Pena et coll.,
1977)
-
isolement des mitochondries après lyse hypotonique des
protoplastes de levure.
Les protoplastes sont obtenus après
digestion de la paroi cellulaire de levure par
les enzymes,
soit d'origine microbienne,
soit du suc digestif d'escargot
(pour des revues:
Phaff,
1971 ; Kuo et Yamamoto,
1975).
Le rendement et l'intégrité des mitochondries obtenues a
partir de ces différentes méthodes nous ont amené à opter pour
/
la méthode de lyse des protoplastes.
I.
1.1. Cultu~e de la levu~e SaeehaAomyee~ ee~ev~~~ae
La souche de levure Saeeha~omyee~ ee~ev~~~ae IL 8-8C
p +
de génotype nucléaire
0<.
TrYl his l et de génotype mitoch0!1drial
12
C~21 E~14 of (Collection du Professeur P. Slonimski), utilisée
pour la préparation de la mt Phe RS,
est cultivée sur le milieu
suivant
Glucose
(Merck)
.
l g/l
Galactose
(Prolabo)
. la g/l
Yeast extract
(Difco Laboratoires)
.
la g/l
Bacto-peptone
(Difco Laboratoires)
.
la g/l
la l de milieu de culture dans un fermenteur
"Microferm 114
New-Brunswick",
préalablement stérilisés à l'autoclave sous
une atmosphère pendant 30 min,
sont ensemencés avec la levure
provenant d'une préculture de l
l
incubée à + 28 oC pendant
24 h.
La préculture est réalisée sur le même milieu, mais
additionné de 5.10 5 U.l. de benzylpénicillinate de sodium
(Laboratoires Spécia, France).
L'agitation du fermenteur est
fixée à 400 tours/min,
le débit d'air à 16 l/mn et la tempéra-
ture à + 28 oC. La culture est arrêtée en fin de phase exponen-
tielle comme le montre la figure 1.1.
Les cellules sont recueil-
lies par centrifugation pendant la min à 700 x g et à 4 oC,
lavées trois fois à l'eau distillée préalablement refroidie à
+ 4 oC. Les cellules ainsi obtenues
sont aussitôt soumises a
l'action des enzymes du suc hépato-pancréatique d'Helix
pomatia
pour leur conversion en protoplastes.
1.1.2. T~an46o~mation de4 cellule4 de levu~e e~ p~otopla4te4
La paroi cellulaire de levure est formée de 3 couches
(fi-
gure 1-2a)
(pour des revues:
Phaff, 1971
Matile et coll.,
1969
Hunter et Rose,
1971)
-
une couche externe riche en mannanes, chitines, complexes
mannanes-protéine,
lipides;
-
une couche intermédiaire riche en glucanes,
lipides
-
une couche interne ou membrane plasmique renfermant des
lipides, protéines et polysaccharides.
Récolte
14
cellules
10
6
2
4
8
12
16
Temps
(h)
FIgure l -1 : Cinétique
de
prolifération :Je
Saccharomy'ces
cerevislae
ILB-BC r
1: 2-mercaptoéthanol
membrane
Plasmique
2: hélicase
cytoplasme
cytoplasme
Protopla stes
Structure sché~tiquE! de 1a paroi cf!llulatrE!
de lenn (MAT/LE E!t al,1969)
H : ",annane s ; G : glllcanes
Prof: proféine.
P: phosphatE!. S: soufrE!
.
,
figurE! 1- 2 : conversion des levures en pr%plas/es
La présence de plusieurs polymères d'oses et d'osamines,
et des ponts disulfures dans la paroi cellulaire complique la
digestion de cette dernière par les enzymes lytiques, et donc
la formation des protoplastes. L'obtention des mitochondries
en très bon état nécessite une durée de préparation des pro-
toplastes n'excédant pas 2 h 30. Ceci est réalisé grâce à
l'action conjointe des préparations enzymatiques
(Helicases)
du suc hépato-pancréatique d'He!~~ pomat~a enrichies en glu-
canases, mannanases, chitinases
(Anderson et Millbank,
1966),
et de la rupture des ponts disulfures assurant le maintien
de la structure de la paroi cellulaire avant l'incubation
des cellules avec les préparations enzymatiques
(figure I-2a,
b)
Swihla et coll.,
1961 ; Burger et coll.,
1961 ; ùuell et
coll.,
1964
; Davies et Elvin,
1964
; Bacon et coll.,
1965 ;
Sornmers et Lewis,
1971).
Dans le but d'obtenir des mitochondries de très bonne
qualité,
nous avons testé quelques préparations enzymatiques
(Hélicases) du suc hépato-pancréatique d'He!~~ pomat~a.
Préparation des protoplastes :
Elle a été faite selon une méthode dérivée de la technique
de Petzuch
(1971).
400 g de cellules de levure sont mis en
suspension dans 800 ml d'une solution préparée extemporanément
de 25 mM d'EDTA, 0,64 M de 2-mercaptoéthanol, pH 7,4.
La sus-
pension est soumise à une agitation
magnétique pendant 30
min
à + 30 oC. Les cellules sont recueillies par centrifugation à
700 x g pendant 10 min à + 4 oC,
lavées trois fois au tampon
permettant le maintien des protoplastes
(K2 HP04 150 mM,
acide
citrique 50 mM, Sorbitol 1,08 M , pH 5,8). Les cellules sont
remises en suspension dans le même tampon. Après avoir ramené
la température de la suspension à + 30 oC au bain-marie, la
préparation enzymatique:
suc d'He!~~ pomat~a brut ou hélicase
lyophilisée ou cytohélicase
(Réactifs IBF,
France)
est addition-
née.
Le mélange, maintenu
sous agitation constante, est
incubé à + 30 oC à l'étuve.
La formation des protoplastes est
suivie par la lecture de l'absorbance à 600 nm après
E
c
8
G
et
1,0
0,5
Temps (h)
Figure 1 - 3 : Action lytique de différentes préparations enzymatiques
du
suc hépato-panaéatique d'Hélix P-Qmatia
sur la paroi
cel/ulaÙ'e
de Sacchqromy'ces cerevisiae IL 8 - 8C p.
t:.
6
Hél/case, 6 ml
(Lat A, 357 • code
2059)
0---0 Héltcase lyophilisée. 6 g
(réf. 3695 )
...
Â
CytohélicaS/!. 10 ml
(réf. 1.9701 )
•
•
Il
1Sml
/1
• •
Il
20 ml
"
dilution au 1/200e du mélange d'incubation avec de l'eau
distillée. Cette dilution conduit à une lyse hypotonique des
protoplastes. Les résultats obtenus avec les différentes pré-
parations enzymatiques sont représentés sur la figure 1-3.
La figure 1-3 montre que les meilleurs
résultats sont ob-
tenus avec 20 ml de cytohélicase, produit contenant en parti-
culier la B-l,3-D-glucanase dont le titre est de 700 U.1./ml.
10 ml,
15 ml et 20 ml de cytohélicase permettent, respectivement,
la transformation de 67 %,
80 % et 88 % de cellules de levure
en protoplastes en 2 h. Pour le même temps, 6 ml d'hélicase
brute
(code 2059) ou 6 g d'hélicase lyophilisée
(code 3695)
conduisent respectivement à 40 % et 75 % de protoplastes.
Après incubation des cellules de levure avec 20 ml de cyto-
hélicase,
la suspension est centrifugée à 7000 x g pendant
15 min à + 4 oC.
Le surnageant est conservé à - 20 oC. L'addi-
tion de 10 ml de cytohélicase fraîche au surnageant conservé à
-
20 oC permet de retraiter un nouveau lot de 400 g de cellu-
les avec un rendement de 85 % de protoplastes en 2 h.
Le culot
obtenu après centrifugation a 7000xg est lavé 3 fois au
tampon
isotonique aux protoplastes.
Les protoplastes ainsi recueillis
sont ensuite soumis à une lyse hypotonique pour l'obtention
des mitochondries.
1.1.3. I~otement de~ mitochond~ie~
Il a été fait selon la technique de Faye et al.
(1974)
(Figure 1-4).
1.2. PURIFICATION VES MITOCHONVRIES
Elle a été faite par centrifugation en gradient discontinu
de saccharose selon la technique de Accoceberry et Stahl
(1972) .
Le gradient est constitué par la superposition de trois
couches de 50 %,
36 % et 20 % de saccharose dans le tampon
PROTOPLASTES
1- Protoplastes de 100g de levure homogénéisés dans tamponl400mt!
isotonique aux mitochondries:
Tris - HCL 60 mM, pH 7,5, [OTA 2 mM
sorbitol D,m, BSA 2/1
2 - Broyage des protoplastes dans mixer 1Waring Blendor}: 2 x 15 sec
3 - centrifugation: 120Dx g. 10 min
CULOT:
SURNAGEANT
débris de protoplastes
centrifugation: 1200xg ,ID min
+ cellules non converties
CULOT
SURNAGEANT
centrifugation: 16000xg. 20 mm
SURNAGEANT:
CULOT
1- Homogénéisation
dans
tampon
1CYTOSOL J
Tris-HCL 5DmM,pH7,5.EDTA ImM
sorbitol 0,5 M
2- Centrifugation: 1200xg. 10 min
CULOT
SURNAGEANT
centrifugation: 16DOOxg,20 mm
SURNAGEANT
CULOT
1- Homogénéisation dans
tampon sorbitol 0,5 M
2- centnlugatlon: 18000xg, 20 min
1expérience
répétée
3 foiS )
SURNAGEANT
CULOT
1 MITOCHONDRIES
Figure 1- 4
Procédé
d'Isolement
des
mitochondries
1 Toutes les opérations
sont effectuées
à +4'C )
19
Tris-HCl 50 mM, pH 7,2, contenant 2 mM d'EDTA,
l g/l de BSA
(figure 1-5).
MI tochondrie s
dans
0,5 loi sorbitol
20.r s,accharose ~
centrifugution : Spinco L5-•
36 -l" saa:harose-+
50 Beckman, 22000 rpm,
60 min. rotor SW 27
50< sa"hM'OSI ~
figure I- 5:
Procede
de
purification
des
mitochondries
(Tl1Utes
le s opér.1tions
sonf effectuées à
+4'C)
Après centrifugation, les mitochondries sont recueillies à
l'aide d'une pipette Pasteur, diluées au quart dans du sorbitol
0,5 M, et centr ifugées à 18 000 x 9 pendant 20 min à + 4 oC.
I.3. PURIFICATION VE LA mt Phe RS
I.3.1. Vtte~mLnatLon de l'actLvLtt de la mt Phi RS
La présence de la mt Phe RS au cours des différentes étapes
de purification a été suivie par la réaction d'aminoacylation.
Le milieu réactionnel contient pour 0,1 ml : l
,~ole d'ATP
(Sigma), 1,5 pmoles de MgC12,
2,5 ~moles de Tris-HCl
(pH 8),
0,75 pmole de 2-mercaptoéthanol, 4 unités de A260 nID d'extrait
brut de tRNA (Boehringer, Mannheim, RFA),
5 nmoles de
L-~I!]Phe (Activité spécifique: 33 Ci/mmole, C. E. A., Saclay,
France), la ug de BSA, et une quantité variable de protéine
enzymatique. Les dilutions de l'enzyme sont faites dans le-·tamp::m
20
Tris-HCl 25 mM,
pH 8, contenant la mM de 2-mercaptoéthanol,
0,1 mg/ml de BSA. Après 15 min d'incubation à + 35 oC pour le
test des fractions chromatographiques ou l
à 5 min pour la
mesure des activités spécifiques,
80 pl de milieu réactionnel
sont déposés sur un disque de papier Whatman 3 MM
(diamètre
25 mm).
Les disques,
immergés dans une solution de TCA à 5 %
pendant la min à + 4°C, sont lavés 3 fois au TCA à 5 %, puis
2 fois a
l'éthanol 95 °
froid.
Les disques sont ensuite
séchés à l'étuve.
La radioactivité du
@H]Phe-tRNAPhe formé
est comptée dans un scintillateur
(Pakard, TRI-CARB)
à l'aide d'un liquide de scintillation (5 ml par flacon) cons-
titué de 4 g d'omnifluor
(NEN,
RFA)
par
litre de toluène.
L'unité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme
catalysant la formation d'une nmole de Phe-tRNA Phe par min
dans les conditions expérimentales.
L'activité spécifique est définie par le nombre d'unités
enzymatiques par mg de protéines.
1.3.2. Véte~minat~on de la coneent~at~on de~ p~oté~ne~
Elle a été faite selon la technique colorimétrique de
Lowry et al.
(1951)
avec la BSA comme standard.
Les électrophorèses en absence d'urée et SDS ont été réali-
sées selon la technique de Jovin et al.
(1964)
avec des gels
de 5 % en acrylamide dans le sytème Tris-glycine, pH 8,5.
1.3.4. Véte~m~nat~on de~ am~noac~de~ N-te~m~naux pa~ la méthode
de~ dé~~vé~ dan~ylé~
Elle a été faite selon la technique de Gray et Hart1ey
( 1963).
21
Une nmole de mt Phe RS oxydée ou non est dissoute dans
20 ~l d'une solution de bicarbonate de soude 0,2 M. Après
évaporation à sec,
20 ~l d'un mélange préparé extemporanément
(1:1)
de chlorure de dansyle à 10 mg/ml dans l'acétone et
d'eau distillée sont ajoutés.
Le tube en pyrex
(1 x 12 cm)
contenant la solution est incubé pendant 2 h à + 37 oC. Au
terme de ce temps, on rajoute 20 ~l du mélange ci-dessus, puis
on réincube à + 37 oC. Après disparition de la couleur jaune,
la solution est évaporée à sec, puis l'échantillon hydrolysé
par 300 ~l d'acide chlorhydrique 6 N pendant 24 h à 105 oC.
L'hydrolysat est séché, puis repris par 2 x 100 ~l d'acétate
d'éthyle saturé d'eau.
La nouvelle solution est séchée et
l'échantillon repris par 10 ~l d'éthanol à 95 °
Une aliquote
de l'échantillon est déposée sur un des côtés des feuilles
plastiques
(5 x 5 cm)
recouvertesd'une couche de polyamide
(F 1700, Schleicher, et Schül, RFA). De l'autre côté et au
même endroit on applique une aliquote de DNS-aminoacides
témoins.
Une chromatographie est réalisée dans l'acide formique 1,5 %
(v/v)
dans la premlere dimension, puis successivement dans
benzène/acide acétique
(10:1),
acétate d'éthyle/acide acétique/
méthanol
(20:1:1)
dans la deuxième dimension perpendiculaire
a
la première.
de pUkl6lcatlon de la mt Phe RS
Toutes les étapes d'extraction et de purification de la mt
Phe RS ont été effectuées à + 4°C.
Préparation de l'extrait brut:
Elle a été faite suivant la méthode d'Accoceberry et al.
(1973).
Les mitochondries purifiées correspondant à 400 g de cellu-
les humides sont homogénéisées au Patter pendant 45 min d~ns
22
un tampon hypotonique aux mitochondries,
Tris-HCl 10 mM,
pH
8,5, contenant 60 mM de KC1,
20 mM de MgC1 2 . L'ATP est ensuite
additionné à une concentration de l mM.
La suspension est
soumise sous agitation pendant 15 min. Au terme de ce temps,
10 ml de la suspension sont soumis à l'action des ultra-sons
pendant 2 min
(Ultra Turrax, position 120).
Le 2-mercapto-
éthanol et le PM5F sont alors additionnés à une concentration
de 10 mM et l mM,
respectivement,
à la suspension. Cette
dernière est centrifugée à 105 OOOx g pendant 2 h 30, et le
surnageant ainsi obtenu est appelé extrait brut.
Précipitation au sulfate d'ammonium:
L'extrait brut, porté à 70 % de saturation en sulfate
d'ammonium,
est maintenu sous agitation constante pendant
toute la nuit.
Le précipité obtenu après centrifugation à
58000x g pendant 45 min est dissous dans le tampon Tris-HCl
10 mM,
pH 7,4, contenant 15 mM de MgC12,
10 % de glycérol,
0,1 mM
de P~6F,
10
mM de 2-mercaptoéthanol,
et dialysé contre le
même tampon.
Chromatographie sur DEAE-cellulose
:
Le dialysat
(405 mg de protéines),appliqùé sur une colonne
(2,4 x 42 cm)
de DEAE-cellulose
(DE-ll, Whatman, Balston)
préalablement équilibrée avec le tampon Tris-HCl 10 mM, pH 7,4,
contenant 10 mM de 2-mercaptoéthanol, 15 ~~ de MgC12,
10 % de
glycérol,
0,1 mM de PM5F,
est élué avec le même tampon.
Les
fractions de 3 ml sont recueillies avec un débit de 42 ml/ho
Chromatographie sur Hydroxylapatite
(pH 7,4)
Les fractions DEAE-cellulose
(30 ml)
sont concentrées par
ultrafiltration
(Amicon PM-IO)
et dialysées contre le tampon
phosphate de potassium 25 mM,
pH 7,4,
contenant 15 % de glycé-
rol,
0,1 mM de PM5F,
10 mM de 2-mercaptoéthanol.
Le dialysat
,.-.-.16
6
•·0..~
E
e
Q,
c
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0
1
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tz'1
~
\\
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0
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1
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4
\\
1
0
\\
1
\\
1
2
\\0\\
- 0 - - 0 - - 0 - - - 0 - -
"
60
120
180
Fraction number
figure I-7 : chromatographie de la fraction sulfate d'ammonium
sur
DEAE - cellulose
.......
activité
de 1a
mt PheRS
1cpm)
0-0
A
nm
lBO
B
1
10
lA\\'o
1
\\
0.4
,.......
\\
:s
*
'--"
0
.--,
1\\
1I0'f'
1
~
0
5
0
~o.5
1
1
1
0
1
0
/
_ tJ/l
1
15
30
45
60
Fraction number
Figure 1-8: élution de la fraction
DEAE-cellulose sur
colonne
d· hydroxylapatite (pH 7, 4 ) par gradient de phosphate
de potassium
_
actIVIté de
la
mt PheRS (cpm )
0-0 A280nm
----..
concentration en
phosphate
E
.... 0
O.S c
o \\
o
1
\\
CD
1
0
C'/
o
\\
et
1
\\
1
0,
1
0 - 0
o
.........
_CY
0 - 0 - _ 0 --0
o
3
20
40
Fraction number
FIgure 1- 9;
rechromotogrophie
du
pic A
sur colonne
d'hydroxylapatite IpH 7, t,)
___ activité
de
la
mt PheRS
Icpm)
0-0
A28D nm
.......... concentrafton
en phosphate
26
est appliqué sur une colonne
(1,6 x 5 cm) d'Hydroxylapatite
(HA-ultrogel,
18F, Clichy, France)
préalablement équilibrée
avec le m~me tampon. La colonne est éluée par un simple gra-
dient linéaire en phosphate de potassium
(pH 7,4)
allant de
25 mM à 400 mM
(2 x 60 ml).
Les fractions de l
ml sont
recueillies avec un débit de 12 ml/ho
Chromatographie sur Hydroxylapatite
(pH 8)
Les fractions Hydroxylapatite-pH 7,4
(la ml)
sont dialysées
contre le tampon phosphate de potassium 25 mM,pH 8, contenant
15 % de glycérol,
la mM de 2-mercaptoéthanol,
0,1 mM de PMSF,
puis chargées sur une colonne
(1 x 3 cm)
d'Hydroxylapatite
équilibrée avec le même tampon.
L'élution est faite par un
gradient linéaire
(2 x 20 ml)
en phosphate de potassium
(pH 8)
allant de 25 mM à 400 mM.
Les fractions de l ml sont recueillies
avec un débit de 9 ml/ho
Chromatographie sur AH-Sépharose 48
(avec
(NH4)2 S04)
Les fractions Hydroxylapatite-pH 8
(7 ml), portées a 2,3 M
de saturation en sulfate d'ammonium, puis ajustées à pH 7,2
avec la potasse,
sont maintenues sous agitation constante
pendant l
h.
La fraction sulfate d'ammonium est ensuite appli-
quée sur une colonne
(1,6 x 7 cm)
de AH-Sépharose 48
(Pharmacia,
Uppsala)
équilibrée avec le tampon phosphate de potassium 20 ~
pH 7,2, contenant la % de glycérol,
2,3 M de
(NH4)2S04,
lQ mM
de 2-mercaptoéthanol,
0,1 mM de PMSF.
L'élution est faite avec
un gradient linéaire décroissant en sulfate d'ammonium allant
de 2,3 M à 0,42 M dans le même tampon.
Les fractions de 2 ml
sont recueillies avec un débit de 7 ml/ho
Chromatographie sur AH-Sépharose 48
(sans
(NH4)2S04)
Les fractions actives
(la ml)
sont dialysées contre le
tampon phosphate de
potassium 20 mM, pH 7,4, contenant la %
de glycérol,
la mM de 2-mercaptoéthanol, 0,1 mM de PMSF.
~16
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0
0
20
60
100
Fraction nU!1'ber
Figlll"l l ·10: èlution
de
la
fraction 8 sur
colonne
d' hydroxylapatlte IpH 8)
par gradient
de
phosphate
de
potassium
.... activité
de
la
ml PheRS
(Cpm'
0-0 A280 nm
...... concentration
en
phosphate
,.....
0.4
n
?O 16
~
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o
~O-O-O-O-O_O-
o
6
40
120
200
280
Fraction number
FiglJ{"
1- 11 : élution de
fa
fraction
hydroxylapatite (pH 8) sur
'olonne
de
AH- sépharose 48
par
gradient
décroissant
de
(NH ); sa,
4
~
oletivlté
de
la
mt PheRS
(epm)
0-0
A1BO nm
o.~
o
/o
/
rO.05
2.5
/ D
- 0 - 0 - 0 - 0
a
20
40
F rection number-
Agure 1-12
(hrOm3fographie
de
la
fraction
AH-sépharose 48 + (NH,'2S0r.
sur
colonne
de
AH - sé pharose
,8
sans
(NH, J; SOI.
_ _
t3cfivifé
de
la
mt PheRS
( cpm)
0 - 0
A280 nm
-
Figure 1-13: 6lectrophorèae de la mt
PheRS
de
levure
lur gel de polyacrylamide dMs
un tampon Tris- glycine. pH 8,5
(d'.... Jo"tn et coll.• 1964 )
31
Le dialysat est appliqué sur une colonne
(1,6 x 7 cm)
de AH-
Sépharose 4B équilibrée et éluée avec le même tampon.
Les
fractions de 2 ml sont recueillies avec un débit de 7 ml/ho
Concentration et conservation de la mt Phe RS
:
Les fractions actives ainsi obtenues sont concentrées par
ultrafiltration
(Amicon PM-10), puis dialysées contre le
tampon phosphate de potassium 20 mM, pH 7,4, contenant 50 %
de glycérol,
10 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,1 mM de PMSF. Le
dialysat est conservé à -
20 oC.
1.3.6. Pu~eté de ta mt Phe RS
Trois techniques ont permis de tester l'homogénéité de la
préparation enzymatique
-
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en absence d'urée
et de SOS
(figure 1-13)
présence d'une seule bande;
- détermination des aminoacides N-terminaux : mise en évidence
d'un seul résidu: Glu:
superposition de l'activité enzymatique et du pic protéique
sur
la colonne de Sépharose 4B
(figure 1-12).
II. RESULTATS ET DISCUSSION
856 mg de protéines représentant la fraction mitosolique ou
extrait brut sont obtenus à partir de 400 g de cellules humides.
L'activation de la mt Phe RS observée à l'étape sulfate d'am-
monium peut être due à l'élimination d'une substance inhibant
l'activité de l'enzyme
(tableau 1). La mt Phe RS sort dans
le premier pic non retenu sur la colonne de DEAE-cellulose
(figure 1-7). Un second pic peut être élué avec 60 mM en RC1.
Deux pics, A et B, contenant la mt Phe RS,sont observés a la
sortie de la première colonne d'Hydroxylapatite
Tableau 1-1
Purification de la mt Phe kS de levure.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~----------
PROTEINES
ACTIVITE TOTALE
ACTIVITE SPECIFIQUE
RENDEMENT
FRACTIONS
(mg)
(nmole/min)
(nmole/min/mq prot.)
( %)
Extrait brut
855,60
876
1
100
(NH 4) 2S0 4
404,60
1 229
3
140
DEAE-cellulose
106,40
791
7
90
N
".,.,
Hydroxylapatite
(pH 7, 4)
15,60
552
35
63
Hydroxylapat ite
(pH 8)
6,44
388
60
44
AH-Sépharose + (NH4)2S04
1,92
323
170
37
AH-Sépharose sans
(NH 4 )2 S0 4
0,40
154
385
17
33
(figure 1-8). Le pic A ne renferme pas une isoenzyme de la
mt Phe RS car la rechromatographie de ce pic sur la même
colonne laisse apparaître une enzyme ayant le même comporte-
ment chromatographique que la mt Phe RS du pic B (figure 1-9).
Le pic A est dû
à une surcharge de la colonne. Sur les deux
colonnes d'Hydroxylapatite
(figure 1-7, 10)
la mt Phe RS est
éluée à 100 mM en phosphate de potassium.
Des comportements chromatographiques différents peuvent
être observés sur la colonne de Sépharose 4B équilibrée avec
2,3 M en
(NH4)2S04 entre les mt et ct Phe RS de levure. En
effet,
la mt Phe RS est éluée à 0,95 M en
(NH4)2S04 et la ct
Phe RS à 1,83 M (Von der Haar, 1976).
La seconde chromatographie sur Sépharose 4B
(figure 1-12)
conduit à une enzyme pure sortant dans le premier pic non
retenu sur la colonne.
La méthode de purification de la mt Phe RS que nous avons
mise au point dans ce travail permet d'obtenir 400 ~g d'enzyme
à partir de 400 9 de cellules humides avec un rendement de
17 % et un enrichissement de 385 fois
(tableau 1). L'enzyme
apparaît homogène au vu des tests analytiques utilisés.
35
La nature polymérique de la mt Phe RS de levure a été
abordée, d'une part à partir de la masse moléculaire de l'en-
zyme native déterminée par électrophorèse sur gel en absence
d'agents dénaturants ou par chromatographie sur Séphadex G-
200, et d'autre part à partir des masses moléculaires des
différents constituants de la mt Phe RS obtenues par élect~o
phorèse sur gel en présence de SOS et d'urée.
1. METHODES
1.1. ESTIMATION DE LA MASSE MOLECULAIRE DE LA mt Phe RS NATIVE
1.r.1. Eleet~opho~l~e ~u~ gel de poly~e~yl~mlde
Principe:
La mobilité d'une protéine globulaire supposée sphérique et
placée dans un champ électrique est définie par la relation
Q
k
q
u =
=
f
f
où q
=
charge nette de la protéine
k
=
constante dépendant du pH et de la force ionique du
milieu
f
=
facteur dépendant de la forme de la protéine et de ses
interactions avec le milieu.
Si pour des expériences réalisées sur des gels de porosité
variable on se place aux mêmes pH,
force
ionique,
température,
temps de migration, et intensité,
la mobilité électrophorétique
d'une protéine supposée globulaire est fonction de sa taille.
Empiriquement, divers auteurs ont pu établir des relations per-
mettant d'estimer la masse moléculaire des protéines globulaires
36
en fonction de leur coefficient de friction ou de retardement
avec le support solide. Nous avons choisi deux méthodes de
représentation pour déterminer la masse moléculaire de la mt
Phe RS native.
Estimation de la masse moléculaire selon Thorun et Mehl
(1968)
A partir de deux concentrations en acrylamide, Tl et TZ'
choisies judicieusement, Thorun et Mehl ont pu établir une
relation linéaire entre la masse moléculaire de la protéine et
le coefficient de friction, F.
F
= cd Mr
+
e
où c, d et e
= constantes
Mr
= masse moléculaire relative
F
= coefficient de friction = Uz avec Uz = mobilité
Ul
électrophorétique de la protéine dans un gel
(TZ) à faible concentration en acrylamide,
Ul = mobilité électrophorétique dans un gel
(Tl) à forte concentration en acrylamide
Estimation de la masse moléculaire selon Hedrick et Smith
(1968)
Par rapport aux auteurs précédents, Hedrick et Smith élimi-
nent l'influence du temps de migration et l'intensité en déter-
minant la migration relative
(Rm) de la protéine par rapport à
une molécule marqueur telle le bleu de bromophénol. Une rela-
tion linéaire entre le logarithme de la migration relative et
le degré de réticulation du gel a pu être établie :
log Rm
=
a x
+
b
où x
= degré de réticulation
a
=
pente de la droite
b
= constante.
37
Dans le cas des protéines globulaires,
la pente
(0 )
est
liée à la masse moléculaire de la particule par la relation
o
=
cd Mr
+
e
ou c, d et e
= constantes
Mr
= masse moléculaire relative.
Du point de vue pratique, on établit d'abord des courbes
d'étalonnage avec des protéines marqueurs de masses molécu-
laires connueS
(BSA : 67000 ; catalase de foie de boeuf
236000).
Connaissant,
soit le coefficient de friction,
soit
la pente
0
de la protéine inconnue, on peut se reporter sur la
courbe étalon et estimer sa masse moléculaire.
Procédé
expérimental
L'électrophorèse est réalisée dans un tampon Tris-glycine
0,1 M ajusté à pH 8,3 avec l'acide chlorhydrique.
Les protéines,
dissoutes ou diluées dans le tampon Tris-glycine 0,1 M,
pH 8,3, glycérol 10 %,
sont déposées sur des gels de migration
polymérisés dans des tubes de 10 cm de longueur et 0,6 cm de
diamètre.
La composition finale des gels de migration est:
Tris 37,5 mM-
glycine 37,5 mM
(pH 8,3),
TEMED 0,04 %,
persulfate d'ammonium
0,04 %, concentrations variables en acrylamide--bis-acrylamide
(de 4 % à 7 %).
Les concentrations en acrylamide ont été pré-
parées à partir des solutions mères de 30 % (Plv)
d'acrylamide
et 0,8 % (Plv) de bis-acrylamide.
Les électrophorèses ont été
réalisées sous une intensité de 4 mA par
tube à + 4 oC. Après
arrêt des expériences,
les gels sont plongés pendant 2 h dans
une solution isopropanol/acide acétique/eau
(25:10:65), puis
colorés au bleu de Coomassie
selon la méthode de Ames et
Mikaido (1976).
La décoloration électrophorétique sous une
intensité de 5 mA par tube est faite dans une solution d'acide
acétique à 7 % (v/v).
38
Principe:
De nombreux travaux sur la détermination de la masse molé-
culaire des protéines sur gel de dextrane ont pu montrer qu'il
existe une relation entre la masse moléculaire des protéines
globulaires et leur volume d'élution.
Du point de vue pratique, on étalonne d'abord la colonne
de Séphadex G-200 avec des protéines marqueurs de masses molé-
culaires connues,
puis estime la masse moléculaire recherchée
de la protéine à partir du volume d'élution qui est fonction de
sa taille et des caractéristiques de la colonne
(Andrews,
1964).
Procédé
expérimental
Les protéines dissoutes dans le tampon phosphate de potassium
25 mM, pH 7,4, contenant 20 mM de 2-rnercaptoéthanol,
60 !fu·l de
NaCl,
la % de glycérol sont chromatographiées sur une colonne
de Séphadex G-200
(1,6 x 42 cm)
préalablement équilibrée avec
le même tampon.
La colonne a été au préalable calibrée avec les
protéines marqueurs: BSA, B -galactosidase d'E~~he~~~h~a ~o!~
(130 000) , ct Phe RS de levure gentiment donnée par le Docteur
P.
Rémy
et purifiée selon la méthode de Kern et al.
(1977),
de masse moléculaire 276 000
(Schmidt et al.,
1971).
1.2. ESTIMATION OE LA MASSE MOLECULAIRE OES OIFFERENTS CONSTITUANTS
OE LA mt Phe RS OE LEVURE
1.2.1. Ue~uophMè~e ~u~ gU de po.eya~~!f.eam~de en p~é.~en~e de~
agent~ dé.natu~ant~, SOS et u~ée
Principe:
Le SOS, par sa chaîne hydrophobe, va contracter des liaisons
avec la partie hydrophobe des protéines.
Il en résulte la
39
formation de micelles chargés négativement. Sous l'action d'un
champ électrique,
la migration de ces macromolécules sur des
gels de polyacrylamide sera fonction de leur taille. Ainsi,
le
gel de polyacrylamide en présence de SOS est similaire à un
tamis moléculaire.
En 1967, Shapiro et al.
ont pu montrer que la migration
relative
(x) des protéines traitées par une solution de SOS a
l
% et de 2-mercaptoéthanol à l
% dépend de leurs masses
moléculaires sur des gels de polyacrylamide contenant 0,1 %
de SOS.
log Mr
=
bx
+ log K
ou Mr
= masse moléculaire relative
b
= pente de la droite
K
= constante
x
= migration relative de la protéine par rapport a une
molécule marqueur,
le bleu de bromophénol.
Procédé
expérimental
La technique de Fairbanks et al.
(1971)
a été utilisée.
Les échantillons sont dissous dans 100 pl de tampon Tris-HCl
10 mM
(pH 8), contenant l
mM d'EOTA,
l
% de SOS,
l
% de
mercaptoéthanol,
10 % de glycérol, puis incubés à + 100 oC
pendant 5 min. D'autres échantillons ont été traités en presence
de SOS l
% et Urée 4 M.
La composition finale des gels de séparation dans des tubes
de 10 cm de longueur et 0,6 cm de diamètre e s t :
7,5 % en
acrylamide, 0,04 % en TEMEO,
0,04 % en persulfate d'ammonium,
0,1 % en SOS,
2 mM en EOTA,
40 mM en Tris-acétate
(pH 7,4).
L'intensité du courant est fixée à 4 mA/tube. Après arrêt des
expériences,
les coloration et décoloration sont effectuées
comme ci-dessus.
15
10
5
0,5
1,5
2,5
masse moléculaire (.105 )
Figure 1 - 14
Estimation de Id m<1SSe moléculaire
de
la
mt PheR5
selon HEDRICK and SMITH (1968)
(électrophorèse)
B5A , : monomère de la sérum albumine bovine
B5A
: dimère
JI
1
B5A3
: trimère
"
mt PheRS
2,5
!
1
O ' - - - - - r - - - - r - - - . , - - - - r - - - - - , - - - - - - - - '
0,5
1,5
2,5
5
masse moléculaire (x 10 )
Figure 1- 15
: Estimation de la masse molécu/aire
de
la
mt PheRS
selon
THORUN and MEHL (/9681
( é/ectroprorèse)
BSA 1 : monomère de
la
sérum albumine bovine
BSA
: dimère
Il
2
BSA3
: trimère
Il
--&CIl.~
J
~
5.5
"
<J
..o~CIl
o
4.5
40
80
120
Elution yolume (ml)
0.2
E
c
o
<Xl
1
N
o
ct
0.1
60
120
Elution
volume
(ml)
Figurl 1- 16
Détermù"lation de ~ masse moléculaire de la mt l'heRS
sur gel de detrane 1séphadex
G- 200 )
0-0 A28D nm
.....
activité
de la ct PheRS
. . . . activité
de
/0
mtPheRS
1 ; cf PheRS
2 : n galacfosidase
3
BSA
- 1
>.
1
..-...;;
(1
E
l•
•
>
-....-III0:
0.6
0.4
0.2
4.2
4.4
4.6
4.8
log (mole cular weight)
Figure 1 - 17
: Détermination de la masse moléculaire des
différentes
sous -unités
de
la
mt PheRS
sur
gel
de
polyacrylamide en
présence
de
SOS
et
d'urée
1 : myoglobine.
2: chymotrypsinogène
3
ovalbumine.
4: 8SA
ce
et n : sous - unités
de
la
mt PheRS
44
II.
RESULTATS ET DISCUSSION
Les deux méthodes utilisées pour la détermination de la
masse moléculaire de la mt Phe RS native donnent une valeur
compr ise entre 260 000
et 270 000 . Les résultats obtenus à
partir de l'électrophorèse en absence d'agents dénaturants,
SOS et urée
(figures 1-14,
15), et de la méthode par filtration
sur Séphadex G-200
(figure 1-16)
sont rassemblés dans le
tableau 1-2.
Masse
Représentations
Méthodes
moléculaire
utilisées
265 000 + 13 000
Thorun et Mehl
Electrophorèse en absence
-
d'urée et SOS
267000 + 11 000
Hedrick et S:nith
-
Séphadex G-200
266 000 + 10 000
-
Tableau 1-2
masse moléculaire de la mt Phe RS native.
Après dissociation de la mt Phe RS, deux polypeptides de
masses moléculaires respectives,
72000
.:!: 2 000 et 57 000
+
2 000
ont pu être carac térisés par électrophorèse sur gel
(figure 1-17). En accord avec la masse moléculaire de la mt Phe
RS native, ces résultats permettent de conclure que la mt Phe
RS a une structure tétramérique de type a
B2' avec a = 72 000
2
et B = 57000.
Cette structure tétramérique a également été
observée dans le cas des Phe ES d'autres origines
(Tableau
1-3).
1.J5
Masses moléculaires
Origine
Auteurs
Enzyme native
Sous-unités
a = 94 000
Fayat et al. (1974 )
E4Chek~~h~a ~ol~
266 000
8 = 39 000
Hanke et al. (1974)
a = 75 000
Foie de rat
288 000
Tscherne et al. (1973
8 = 69 000
a = 67 200
Réticulocytes de lapin
248 400
Tanaka et al. (1976)
e = 57 000
a = 63 000
238 000
Fasiolo et al. (1970)
8 = 56 000
a = 75 000
276 000
Schmidt et al. (1971)
e = 63 000
Levure
a = 77 000
286 000
Lanks et al. (1973)
8 = 66 000
a = 74 000
274 000
Fasiolo et al. (1974)
e = 63 000
a = 80 000
Genne de blé
260 000
.Car ias et Julien (1976)
e = 50 000
a= 72 000
Archambault de Vencay
Placenta humain
254 000
e= 55 000
et al. (1978)
a=
Lupbul-6 luteu-6
75 000
Barciszewski et al.
268 000
e= 59 000
(1979)
V~o-6oph~a melanoga-6tek
200 000
--
Christopher et al. (1971)
Ba.c.iU.u.-6 -6teM othekmoph~u.-6
221 000
--
Grosjean et al. (1975)
Tableau 1-3
Structures polymériques des Phe RS d'origine dtrerse.
47
La structure quaternaire
~2 B2 et l'origine nucléaire des
ct et mt Phe RS de levure nous ont conduit à rechercher une
éventuelle parenté structurale entre les différentes sous-
unités constituant les deux enzymes.
Deux approches,
l'une
biochimique et l'autre immunologique, ont été utilisées pour
résoudre ce problème.
1. METHODES
1.1. APPROCHE BIOCHIMIQUE
1.1. 1. I~olement de~ ~ou~-un~té~ Q
et B de la mt Phe RS
Réduction et carboxyméthylation
:
Elles ont été faites à partir de la technique de Crestfield
et al.
(1963)
que nous avons modifiée de la manière suivante:
La mt Phe RS
(3 mg), dialysée contre 20 mM de bicarbonate
d'ammonium et lyophilisée,
est dissoute dans 3 ml de tampon
Tris-Hcl 0,5 M,
pH 8,4,contenant 2 mM d'EDTA,
7 M de chlorure
de guanidine,
0,175 M de 2-mercaptoéthanol.
La réduction est
faite sous azote pendant 2 h à + 50 oC. Au terme de ce temps,
0,2 M d'acide iodoacétique dans le tampon Tris-HCl 0,5 M,
pH 8,4,
est additionné à la solution. La réaction d'alkylation
est réalisée à + 25 oC pendant 40 min à l'obscurité.
La réaction
est ensuite arrêtée par addition de 2-mercaptoéthanol 0,175 M.
L'échantillon est dialysé toute la nuit contre le tampon phos-
phate de potassium 10 mM,
pH 7,4, contenant 20 mM de 2-mercapto-
éthanol,
l mM d'EDTA,
6 M d'urée
(tampon de dialyse),
à + 4 ~C
et à l'obscurité.
Chromatographie sur DEAE-cellulose :
Le dialysat est appliqué sur une colonne
(1 x 8 cm)
de
48
DEAE-cellulose (DE-52, Whatman, Balston) équilibrée avec
le
tampon de dialyse. L'élution est faite par un gradient linéaire
(2 x 15 ml) de Kcl dans le même tampon. Les fractions de l ml
sont recueillies avec un débit de 12 ml/h (figure 1-18).
La pureté et la taille des sous-unités à partir des diffé-
rentes fractions chromatographiques ont été examinées par élec-
trophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS selon
la technique de Fairbanks et al.
(1971).
1.1.2. DéteAm~nat~on de ta compo~~t~on en ac~de~ am~né~
Les fractions A et B de la chromatogràphie sur DEAE-
cellulose sont dialysées contre une solution d'acide acétique à
0,5 %,
puis lyophilisées. Les échantillons sont hydrolysés,
sous azote,
par une solution
de HCl 6 N contenant 0,5 % (v/v)
de thiodiglycol et un cristal de phénol pendant 24 h à 110 oC.
Les hydrolysats sont ensuite analysés à l'aide d'un analyseur
automatique d'acides aminés Durrum D500. Le contenu en Cys et
Met est déterminé après oxydation performique (Moore, 1963).
La détermination du contenu en Trp est faite selon la méthode
de Liu et Chang (1971).
1.2. APPROCHE IMMUNOLOGIQUE
l.t.l. PAocédé d'~~mun~~at~on du ldp~n
0,3 mg de mt Phe RS dans 0,5 ml de tampon phosphate de
potassium 20 mM, pH 7,4, contenant la mM de 2-mercaptoéthanol,
50 % de glycérol est mélangé avec 50 ~l d'adjuvant complet de
Freund, puis injecté dans les coussinets plantaires d'un lapin
"New Zealand". Le 14e jour, 0,5 mg de mt Phe RS est injecté par
voie intraveineuse au niveau de l'oreille; le 35e jour, 0,3
mg de mt Phe RS mélangé avec 50 ~l d'adjuvant complet de Freund
est injecté par voie sous-cutanée le long de la colonne verté-
brale
; le 4ge jour, 0,3 mg de mt Phe RS par voie intraveineuse
au niveau de l'oreille. Après détermination du titre en anti-
corps au 60e jour, le sang est prélevé par ponction cardiaque.
49
Fractionnement au sulfate d'ammonium
Le sérum
(30 ml)
obtenu après 3 centrifugations répétées
de 30 min à 600 x g est porté à 33 % de saturation en sulfate
d'ammonium à + 4 oC. Après ajustement du pH à 7,6 avec la
potasse,
la suspension est maintenue sous agitation constante
pendant 3 h à + 4 oC, puis centrifugée à 10000 x g pendant
30 min à + 4 oC.
Le culot est dissous dans un volume fin~l de
30 ml de tampon phosphate de potassium 40 mM,
pH 7,3, NaCl
150 mM.
La suspension est de nouveau portée à 33 % de satu-
ration en sulfate d'ammonium, maintenue sous agitation cons-
tante pendant 3 h, puis centrifugée comme précédemment
(l'ex-
périence est répétée 2 fois).
Le culot ainsi obtenu est dissous
dans le tampon phosphate
de potassium 20 mM, pH 7, puis
dialysé contre le même tampon.
Chromatographie sur DEAE-cellulose :
Le dialysat
(200 mg de protéines)
est appliqué sur une
colonne
(1,6 x 10 cm) de DEAE-cellulose
(DE-52)
préalablement
équilibrée avec le tampon phosphate de potassium 20 mM, pH 7.
Les immunoglobulines G sont éluées de la colonne avec le
même tampon.
Les fractions de 2~ sont recueillies avec un
débit de 15 ml/ho
Les fractions non retenues sur la colonne
(IgG)
sont rassemblées,
puis portées à 50 % de saturation en
sulfate d'ammonium.
Le culot obtenu après centrifugation à
10 OOOx g est dissous dans un volume minimum de tampon Tris-
HCl 20 mM,
pH 7,4,
azide de sodium 0,02 %, puis dialysé contre
le même tampon. Après dialyse,
la concentration des IgG
déterminée par la méthode de Lowry et al.
(1951)
est de 11,13
mg/ml.
Le volume total est de 10 ml.
50
1.2.3. Etude de~ déte~m~nant~ ant~gén~que~ de~ ct et mt Phe RS
pa~ la méthode ELISA lenzyme-l~n~ed ~mmuno~o~bent a~~ayJ
La méthode de Engvall et Perlmann
(1972)
a été utilisée.
10 ~g de ct Phe RS ou mt Phe RS ou sous-unités mt ~ et mt
~ sont dissous dans 300 ~l de tampon carbonate de sodium 50
mM,
pH 9,6,puis fixés toute la nuit à + 4 oC sur une plaque
de microtitration
(microtiter cooke, Poly Labo). Après trois
lavages des plaques de 5 min au tampon phosphate de potassium
40 mM, pH 7,4, contenant 150 mM de NaCl,
0,05 % de Tween-20
(tampon PBS-tween), plusieurs dilutions d'anticorps anti-mt
Phe RS dans 300 ~l du même tampon sont ajoutées dans les
godets, puis la plaque incubée à + 37 oC pendant 2 h. Au terme
de ce temps,
la plaque est lavée 3 fois au tampon PBS-tween,
puis l'antiglobuline de mouton anti-lapin conjugée à la phos-
phatase alcaline d'E~chek~ch~a cof~, diluée au 1/100 dans le
tampon PBS-tween, s t ajoutée au complexe ct ou mt Phe RS--IgG.
La plaque est de nouveau incubée à + 37 oC pendant 2 h. Après
lavage au PBS-tween,
300~1 du substrat p-nitrophénylphosphate
à l mg/ml dans le tampon carbonate de sodium 0,1 M, pH 9,8,
sont additionnés dans les différents godets,
puis la plaque
incubée pendant 45 min à + 37 oC. Après arrêt de la réaction
enzymatique par addition de 50 ~l de NaOH 2N,
le milieu des
différents godets est dilué au 1/3 et l'absorbance lue au spec-
trophotomètre à 400 nm.
II.
RESULTATS ET DISCUSSION
II.1.
PREPARATIONS VES SOUS-UNITES a ET ~ VE LA mt Phe RS
Afin de rechercher d'éventuelles similarités structurales
entre les différentes sous-unités des mt et ct Phe RS,
nous
avons développé une technique d'isolement des sous-unités de
la mt Phe RS
(figure 1-18). Comme révélées par l'électroph~rèse
A
B
0.25·
•
E
c::
.
0
fD
"
C
il .\\
0.4-,..
.
.", """""
i
~---!,
~
-
r:il
Y
-- U
./"
L::J
f--+---\\----------..-'~
0 -'-
•
-
\\.......
\\
r-.
.......-.-.- . .-.-.
-
~-II-.
.
10
20
30
40
Fraction
number
Figure l -18
: élution
des
différentes sous - unité s
de
la
mt PheRS
sur colonne
de
OEAE-cellulose
en presence d"urée 611
-
A280nm
A
B
Figure 1 -19
: schéma des électrophorèses (7,5 Z acry/amide + 0,1 /. SDS J des
fractions
A et B de la chromatographie sur DEAE - cellulose
..
sous - UNI TES DES PheRS
DNS~acides amines
AUTEURS
non identifiable
oc
mt
ce travail
(]
Glu
oc
Pro
Robbe-Saul
et al.
et
(1977 J
(]
non identifiable
Tableau 1-4 : acides aminés
N- terminaux
des différentes
sous - unités
des
PheRS
de
levure
rable 1 -5: Amino ù.cid compositions of yeast mitochondrial and
cytoplù.smic native Phe-tRNA synthetase and their
subunits.
Ami no
Native
Mean for
mt-Ô
mt-a
mt-B
mt-2(a+B)
ct-Cl
ct-6
ct-2 (0.+5)
Native
acid
mt-PheRS
ct-PheRS
(\\)
ct-PheRS
Cys
7
4
22
22
22
0.00
I l
2
26
25
Asx
81
66
294
294
294
0.00 1
73
62
270
284
Thr
32
30
124
120
122
1. 63
t
30
29
112
128
S~l:"
29
35
128
1')-;
125
2. ~o
::0)
29
DE
1>-
1
_ 0
.
G'.....'I.-
87
56
28;:;
242
264
8 ,"
.
7ï
70
29';
2Sl..!
Pro
32
29
122
122
122
c·.~; 1 ='0
"ri
_ L
1
104
le-:>
Gly
71
39
no
t
200
210
4.ï[
1
34
30
128
134
Ala
54
46
200
212
206
2.90
41
28
138
142
val
38
35
146
170
158
7,30
34
25
118
120
Met
13
4
34
34
34
0.00
10
12
44
45
Ile
29
29
116
134
125
6.96
36
27
126
126
Leu
51
51
206
222
214
3.67
60
62
244
236
Tyr
14
11
50
54
52
3.77
20
16
72
68
Phe
19
19
76
80
78
2.53
30
28
116
114
Trp
8
1
18
16
17
5.71
5
7
24
24
His
10
9
38
32
35
8.23
14
13
54
56
Lys
61
48
218
226
222
1. 78
47
40
174
176
Arg
24
21
90
90
90
0.00
27
20
94
90
Total
618
533
2388
2392
2390
617
522
2278
2296
~101eè:ular
72000
58000
260000
260000
260000
70000
60000
260000
260000
Weight
.
Reference
Robbe -Saut et al. (1977 1
1
Values are expressed as amino acid residues per
mole.
mt - A z experimental error calculated from the
amino acid compositions of mt Phe RS and mt
2
(a+ 8) •
53
sur gel de polyacrylamide en présence de SOS,
la fraction A
non retenue sur la colonne de OEAE-cellulose correspond à la
sous-unité
B et la fraction B à la sous-unité
a (figure 1-19).
Aucune contamination des différentes fractions par l'une ou
l'autre des sous-unités n'a pu être décelée dans les diffé-
rents électrophorégrammes. L'analyse des acides aminés N-
terminaux par la méthode des dérivés dansylés a révélé la pré-
sence du résidu Glu pour la sous-unité
B. Aucun acide aminé
N-terminal n'a pu être détecté pour
la sous-unité a
(tableau
1-4) .
II.2. RECHERCHE DES SIMILARITES STRUCTURALES
La question des similarités structurales entre les diffé-
rentes sous-unités des Phe RS de levure a été abordée par
la
cowparaison de leurs compositions en acides aminés et l'étude
de leurs déterminants antigéniques.
Comme le montre le tableau 1-5,
le contenu en certains
acides aminés est similaire dans les différentes sous-unités
Ile et Asx dans les sous-~nités S,Pro dans les sous-unités a
,
et Thr, Arg dans les sous-unités a
et B. Par contre des diffé-
rences significatives sont observées pour tous les autres acides
aminés.
La composition en acides aminés de la mt Phe RS native
est en très bon accord, dans les limites de l'erreur experlmen-
tale,
à celle calculée à partir des différerites sous-unités la
composant.
Par la méthode des dérivés dansylés, des différences dans les
extrémités N-terminales des sous-unités des deux enzymes ont
pu être décelées
(tableau 1-4).
L'étude des déterminants antigéniques, comme illustrée par
la figure 1-2~ montre une stricte spécificité des anticorps
anti-mt Phe RS vis-à-vis de la mt Phe RS native et de ses deux
sous-unités,
a
et 6.
Par contre l'enzyme cytoplasmique n'est pas
~ +Mtl.mtPh8RS
~g-anti.mt PheRS
~_.,ti.mtPheRS+ Ac-E ----... ~-anti-mtPheRs-Ac-E
~_.nti.mtPheRS-Ac-E -+ S
tAg-anti-mt PheRS-Ac-ES
(3)
~-anti.mtPheRS-Ac-ES ---... ~g-anti-mtPheRS-Ac-E + P
(4 )
_ quMef Ag non ,.connu par anti-mt PheRS, P: 0 => équations 1 )(. 3
• quMd
Ag reconnu
par anti-mt PheRS , p: formé, possibilité
de
le do..r à ~: 400 nm ::;> équations 1 -+ 4
F9I" 1· 20: Principe de
la
méthode
ELISA
}
pI4IqIIe
de
Po/vsIV,ene
Ag: mt PhaRS ; ct Ph eRS ; ml oc
: mt 8 .
Mti - mt PheRS :
Iract ion
IgG
ant i - mt PheRS
AC-! =antiglobulines de mouton
anti-Illpin
conjuguées
il
la
phosphata.e
alcaline
&: paranitropMnylphosphate
P =p.rMil rophènolate
1
•
E
c
o
o
"Of
<
0.5
~o ~5
Xo
Dilution
of
IgG
Figure 1-21
: Test ELISA
lenzyme-linked
immusorbent assayJ
~ 10 fig de mt PheRS pure fixée par godet de
la
plaque de microtitration
___ sous-unité oe
de la mt PheRS
(10 IIg)
....-... sous-unttéfJ de la mtPheRS
I10I19}
0- -0
et PheRS (10119)
57
reconnue par ces anticorps.
Les résultats identiques ont été
obtenus au laboratoire par Schneller et al.
(1976b)
en
utilisant l'effet inhibiteur des anticorps anti-mt Phe RS et
anti-ct Phe RS sur la réaction d'aminoacylation catalysée
par
les Phe RS de levure.
III. CONCLUSION
Les différences observées dans les compositions en acides
aminés entre les sous-unités des mt et ct Phe RS de levure,
et dans la nature de leurs sites antigéniques nous permettent
de conclure que ces sous-unités sont codées par des gènes
nucléaires différents.
59
L'origine nucléaire de la mt Phe RS soulève la question de
ses mécanismes de synthèse dans le cytoplasme et de transfert
dans les mitochondries de la levure Saccha~omyce~ ce~ev~~~ae.
Pour aborder ce problème nous avons eu recours à l'approche
immunochimique.
1. METHODES
1.1. CROISSANCE VES CELLULES
Les cellules récoltées au milieu de la phase exponentielle,
A600nm = 9,5 (figure 1-1), sont incubées pendant 30 min à
+ 30 oC, soit en présence de cycloheximide à une concentration
de 100 Ug/ml, soit en présence de 0,1 mM de carbonylcyanide
m-chlorophénylhydrazone~lors de la purification des précurseurs,
avant leur conversion en protoplastes.
1.2. PREPARATION VE LA FRACTION CYTOSOLIQUE
Le cytosol obtenu après lyse hypotonique des protoplastes
(figure 1-4) est centrifugé à 105000 x g pendant 2 h 30, puis
porté à 70 % de saturation en sulfate d'ammonium. Après ajus-
tement du pH a 7,4 avec la potasse, la suspension est laissée
sous agitation constante à + 4 oC pendant toute la nuit en
présence de diisopropylfluorophosphate l mM. Le précipité est
recueilli par centrifugation à 58000 x g pendant l h à + 4 oC,
dissous dans le tampon Tris-HCI 50 mM, pH 7,4, contenant 5 mM
d'EDTA,
l mM de diisopropylfluorophosphate, puis dialysé contre
le même tampon.
1.3. PREPARATION VE LA FRACTION MITOSOLIQUE
L'extrait brut mitochondrial, dépourvu de 2-mercaptoéthanol
et préparé comme décrit précédemment, est porté à 70 % de
60
saturation en sulfate d'ammonium.
Le précipité résultant est
traité comme ci-dessus.
1.4. IMMUNOPRECIPITATION DES POLYPEPTIDES PRECURSEURS
40 mg ou 400 mg de protéines mitosoliques ou cytosoliques,
respectivement,
sont mélangés avec un volume équivalent de
tampon Tris-HCl 50 mM,
pH 7,4,
contenant 300 mM de NaCl,
5 mM
d'EDTA,
l mM de diisopropylfluorophosphate.
0,8 mg d'anticorps
anti-mt Phe RS est additionné à chacune des fractions et le
mélange est incubé à + 4 oC pendant 16 h.
Les immunoprécipités
sont recueillis par centrifugation à 15000 x g pendant 30 min,
puis lavés 5 fois au
tampon Tris-HCl 50 mM,
pH 7,4,
contenant
5 mM d'EDTA,
l
mM de diisopropylfluorophosphate.
1.5. PURIFICATION DES PRECURSEURS DE LA mt Phe RS
1.5.1. Pképakat~on de i'~mmunoad~okbant
L'immunoadsorbant formé par les IgG anti-mt Phe RS
insolubi-
lisées par
la glutaraldéhyde a été préparé selon la technique
de Avrameas et al.
(1969).
AUX 12,5 mg d'IgG anti-mt Phe RS dialysés contre le tampon
phosphate de potassium 0,1 M,
pH 7,4,
est ajouté 0,1 ml d'une
solution de glutaraldéhyde à 25 %. Une polymérisation instan-
tanée se produit.
Le gel ainsi formé est incubé à + 25 oC pen-
dant 3 h pour compléter
l'insolubilisation des IgG.
Les pro-
téines insolubilisées sont dispersées dans 10 ml de tampon
phosphate de potassium 0,2 M,
pH 7,4,
puis homogénéisées au
Pot ter .
La suspension est centr ifugée à 12000 x 9 pendant
10 min.
Le culot ainsi obtenu est retraité 3 fois comme ci-
dessus.
Le dernier culot est de nouveau incubé pendant
l
h à
+ 25
oC dans le tampon Tris-HCl 0,1 M,
pH 7,4.
Après centrifu-
gation,
le culot est lavé 3 fois au
tampon d'élution acide
acétique 0,2 M-glycine 0,1 M-HCl, pH 2,5, puis 3 fois au
tampon
61
phosphate de potassium 40 mM,
pH 7,4, NaCl 150 mM.
Immunoprécipitation des précurseurs
Après homogénéisation au Potter de l'immunoadsorbant dans le
tampon phosphate de potassium 40 mM, pH 7,4, contenant 150 mM
de NaCl,
5 mM d'EDTA,
l mM de PMSF,
400 mg de protéines cyto-
soliques obtenus comme décrit ci-dessus sont ajoutés à la
suspension.
Après 16 h d'incubation à + 4 oC,
le complexe im-
munoadsorbant-précurseurs est récolté par centrifugation a
12 OOOx g pendant 10 min.
Le complexe est homogénéisé au Potter
dans le tampon ci-dessus,
puis centrifugé
(rexpérience est
répétée 5 fois).
Après lavage,
les précurseurs sont élués par
le tampon acide acétique 0,2 M-glycine 0,1 M-HC1, pH 2,5.
L'éluat est rendu 20 mM en 2-mercaptoéthanol,
l mM en PMSF.
Il
est de nouveau centrifugé à 12000 x g pendant 30 min de manière
à éliminer l'immunoadsorbant entraîné, puis lyophilisé.
Chromatographie sur Séphadex G-200
:
3 mg de lyophilisat, obtenus après quatre expériences d'im-
munoprécipitation, sont dissous dans le tampon phosphate de
potassium 20 mM,
pH 7,4, contenant 20 mM de2-mercaptoéthanol,
0,1 M de NaCl.
La solution est centrifugée à 12000 x g pendant
30 min.,
puis le surnageant chromatographié sur une colo~ne de
Séphadex G-200
(1,6 x 42 cm)
équilibrée et éluée avec le
tampon ci-dessus. L'éluat contenant les précurseurs est dialysé
contre le tampon acide acétique 0,2M-glycine 0,1 M- HC1,
pH
2,5,
puis lyophilisé.
Chromatographie sur DEAE-cellulose
:
Après réduction et carboxyméthylation des 3 mg de précurseurs
comme décrit dans le chapitre III,
la solution protéique est
appliquée sur une colonne de DEAE-cellulose en présence d'urée
6 M (chapitre III).
Les différentes fractions des précurseurs
62
sur colonne de DEAE-cellulose montrent le même comportement
chromatographique que les sous-unités matures
(figure 1-18).
La fraction A a été traitée et chromatographiée une deuxième
fois pour s'assurer qu'aucune fraction B contaminante n'est
présente. Les fractions purifiées sont représentées sur la
fig ure 11-5.
1.6. CONVERSION VES PRECURSEURS EN PROTEINES MATURES
1.6. 1.
P~épa~at~on de~ memb~ane~ m~~ochond~~a!e~ tota!e~
Après lyse hypotonique des mitochondries obtenues à partir
des cellules récoltées au milieu de la phase exponentielle et
non traitées aux inhibiteurs de l'oxydation phosphorylante, la
suspension est centrifugée à 15000 x g pendant 30 min. Le
culot est homogénéisé au Potter dans 10 volumes de tampon Tris-
HCl 50 mM, pH 7,4, contenant 25 mM d'EDTA, 0,5 M de RCl, puis
incubé à + 4 oC pendant toute la nuit sous agitation douce.
Le culot obtenu après centrifugation est de nouveau traité dans
le même tampon, mais contenant l M de RCI. La suspension est
maintenue sous agitation douce à + 4 oC pendant l h. Le dernier
culot est lavé 4 fois au tampon Tris-HCl 25 mM,
pH 7,4, glycérol
10 %.
L'immunoprécipité cytosollque, préparé directement à partir
du cytosol, est dissous dans la soude 0,2 N, puis un volume
équivalent de HCl 0,2 N est ajouté.
La suspension ainsi obtenue
est mélangée avec un volume égal de tampon Tris-HCl 0,2 M,
pH 8,4, contenant 12 M d'urée,
10 mM d'EDTA,
5 % de 2-mercapto-
éthanol,
puis chauffée à + 100 oC pendant 15 min. L'échantillon
est ensuite dialysé à + 4 oC contre le tampon Tris-HCl 25 ~~,
63
pH 7,4, contenant 10 % de glycérol, 10 mM de 2-mercaptoétha-
nol. Le dialysat est appelé fraction-précurseur.
1,5 mg de la fraction-précurseur dans 2,5 ml de tampon Tris-
Hel 25 mM, pH 7,4, contenant 10 % de glycérol, 10 mM de
2-mercaptoéthanol ou 2,5 ml de tampon
(témoin) ,sont incubés
avec 25 mg de protéines de la préparation des membranes mito-
chondriales totales pendant l h à + 30 oC. Au ~erme de ce
temps,
les suspensions sont centrifugées à 15 OOO,x g pendant
30 min.
Les surnageants et un témoin de la fraction-précurseur
non incubé à + 30 oC avec la fraction membranaire sont dialysés
contre 20 mM de NH4 Heo3' puis lyophilisés.
Les 1yophilisats
sont ensuite dissous dans le tampon Tris-HCl 25 mM, pH 7,4,
contenant 10 mM de 2-mercaptoéthanol. L'activité d'aminoacy-
lat ion des différents lyophilisats est testée.
1.1. ELECTROPHORESE SUR GEL OE POLYACRYLAMI0E EN PRESENCE OE SOS
Les immunoprécipités préparés à partir du cytosol sont
dissous dans le tampon Tris-HCl 20 ~~,
pH 8, contenant 2 mM
d'EDTA,
2 % de 2-mercaptoéthanol, 2 % àe SDS,
20 % de glycérol,
puis chauffés à + 100 oC pendant 5 min.
Les échantillons sont
ensuite dilués av~c un volume égal d'eau distillée.
Les électrophorèses en gel de 10 % d'acrylamide ou sur
gradient linéaire en gel de' polyacrylamide allant de 12,5 a
5 % en présence de glycérol 10 % ont été réalisées sur des
plaques verticales (épaisseur: 0,1 cm,
largeur: 15 cm,
Longueur:
12 cm) selon la technique de Fairbanks et al.
(1971).
Les plaques sont soumises à une électrophorèse pendant 4 h à
160 vo
· ,
Fig. ][-1 : électr~orèse sur gel de 10 %acrylamide
en presence
de SDS
1: immunoprécité cytosolique
2 : immunoprécipité
mitosollque
3 : mt PheRS purifiée
4: aSA
"
l.g. FINGERPRINTS TRYPSIQUES VES PRECURSEURS ET SOUS-UNITES VE
LA mi Phe RS
Après fixation et coloration des protéines,
les morceaux
des gels contenant les précurseurs et les sous-unités matures
de la mt Phe RS sont lavés successivement avec les solutions
isopropanol/acide acétique/eau
(25:10:651, isopropanol
25 %,
et méthanol 10 %. Après lyophilisation, une digestion
trypsique
est effectuée ~n ~~LU dans les gels selon la techni-
que Co
EIder et al.
(1977).
Les éluats,
après lyophilisation,
sont dissous dans une solution d'acide acétique à 20 %,
puis
centrifugés et lyophilisés. Les lyophilisats sont dissous dans
20 ~l d'une solution diacide acétique/acide formique/eau
(8:2:90). Les échantillons
(10 ~l) sont appliqués sur des
plaques de cellulose (Polygram cell 400 ; 20 x 20 cm).
Les pla-
ques sont soumises à une électrophorèse dans le tampon acide
acétique/acide formique pendant l h 30 à 400 volts et à + 4 oC.
Après séchage des plaques, une chromatographie est réalisée
dans la direction perpendiculaire à l'électrophorèse dans le
tampon pyridine/n-butanol/acide acétique/eau
(12:15:3:12).
La
révélation des peptides trypsiques est faite avec la ninhydrine
à 0,3 % en solution dans l'éthanol 95 °
contenant 3 % de col-
lidinp~ 10 % d'acide acétique .
II.
RE~
.TS ET DISCUSSION
II.1. MISE EN EVIVENCE DES PRECURSEURS VANS LE CYTOPLASME
Comme le montrent les figures 11-1 et 11-2, deux polypeptides
de masses moléculaires relativement plus grêndes que les sous-
unités matures de la mt Phe R5 sont précipités à partir
du
cytoplasme par
les anticorps anti-mt Phe RS.
Sur le gel de 10 % en acrylamide
(figure 11-1), il est dif-
ficile de détecter une différence de mobilité électrophoré~ique
- - - - - - - - - - - - = - - - - - - - - - - - -- -
1
2
P-74
m-72
P-61
rn-57
Fig. j[ - 2 : électrophorèse (gradient linéaire en
acrylamide + 0, 1% SOS) des :
1: immunoprécipite
cytosoliQue
2:
Il
mitosoliQue
65
entre la sous-unité mt a mature et son précurseur. Pour ré-
soudre ce problème, nous avons utilisé un gradient linéaire
en acrylamide allant de 12,5 à 5 % (figure 11-2). Dans ce
système, on peut observer une différence dans la mobilité élec-
trophorétique indiquant des masses moléculaires de 72 000 et
74 000 pour
la sous-unité mt
~ mature et son précurseur, respec-
tivement. Par contre pour la sous-unité mt S et son précurseur,
des différ~ces dans les -m~~iii"tés électropholîlétriques sont
déjà observées dans les gels de la % en acrylamide. Sur la fi-
gure 117l~3, une.-·petite bande de mass-e moléculair'e égale à
114 000
est observée.
En accord avec la masse moléculaire de la
sous-unité mature 3, cette bande corr~spond à son dimère. La
bande disparaît quand les électrophorèses sont réalisées en
présence, d!une part, d'urée 4 ~ et de SOS 0,1 % dans les gels
de sép?ration et, d'autre part,' de 2-mercaptoéthanol 20 ffil\\1 dans
le tampon de migration. Des. dimères de BSA sont également
observés sur la figure 11-1,4.
Afin de s'assurer que les polypeptides de masses moléculaires
élevées sont bien les précurseurs des différentes sous-unités
de la mt Phe RS,
nous avons réalisé des fingerprints trypsiques
~n ~~tu dans les morceaux de gel contenant les différents poly-
peptides.
Les résultats sont représentés sur la. figure 11-3.
Aucune différence sign~ficative ne peut ~tre' observée dans la
migration des peptides ~trypsiques élués des gels entre chacun
des précurseurs et sa sous-unité mature. Ces résultats suggèrent
que les sous-unités matures de la mt Phe RS dérivent des pré-
curseurs immunoprécipités du cytoplasme par
les anticorps anti-
mt Phe RS.
Les précurseurs de la mt Phe RS lllustrés sur les figures
11-
üt 11-2 ont été obtenus à partir des cellules traitées
uniquement avec la cycloheximi:J;, (voir "Méthode"). On peut en
déduire gue ces ~récurseurs s'accumulent à des concentrations
notables ~n v~vo dans le cytoplasme.
p-74
m-72
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EL E C TROPHOAE SIS
Figurt JI .. 3
flngerprints
frypsiQues des précurseurs
et sous-unJfés
ma/ures
de
/a
ml PheRS
'p,7~ :préwrseur
de
la sous-urJJfé 0.:
:m-72 ',sous-unite mature oc
p·67 :
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~8°
Q
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c
8°~
0
•
•
1
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-
1 1 •
ELEe TROPHORE SIS
FigurE! JI - 3:
'-,ngerprinls
Irypsiques des precurseurs
el sous-urulés
md/ures
de
la
ml Pl1pRS
p . 7~ : préeurs eur
de
la
sous - undè 0<:
,m· 72 : sous - unitê mal ure oc
p·6J
:
(J ;
m· 57 :
-II
II.
(J
CytosoJ
0- 70 % saturation en
(NH
)2 S04
4
Immunoadsorbant
[19G anti- ml PheRS -
glutarardéhyde ]
Séphadex
G- 200
DEAE-celluloie + urée 6M
figvre n - 4
Procedé œ purdicalJ'ofl des
précurseurs
de Id ml PheRS
69
II.2. PURIFICATION DES PRECURSEURS DE LA mt Ph~ RS
La localisation des extensions terminales dans les polypep-
tides précurseurs nous a incité à développer une technique de
purification de ces précurseurs.
Afin d'avoir suffisamment de matériel, nous avons au préa-
lable traité les cellules en présence d'un découplant de
l'oxydation phosphorylante,
le ~arbonylcyanide m-chlorophényl-
hydrazone~ permettant de renforcer l'accumulation des précur-
seurs dans le cytoplasme. En effet, le passage des précurseurs
aussi bien dans les mitochondries que dans les chloroplastes
nécessite de l'énergie
(Nelson et ·Schatz, 1979 : Grossman et
al., 1980 ; Mor i et al.,
1981). Ainsi,
toute substance permet-
tant l'inhibition de la synthèse de l'ATP mitochondrial favori-
serait l'accumulation des protéines mitochondriales synthétisées
sur les ribosomes cytoplasmiques.
La technique de purification des précurseurs de la mt Phe
RS comprend 4 étapes comme résumée sur la figure 11-4. Un point
intéressant est le même comportement chromatographique des.
polypeptides précurseurs et des sous-unités matures de la mt
Phe RS sur la colonne de DSAE-cellulose en présence d'urée 6M
(f igure
1-18).
L'obtention des précurseurs purs
(figure 11~5) nous a permis
de voir que les extensions observées dans les polypeptides
précurseurs sont situées du côté ~-terminal. Après oxydation
performique des polypeptides précurseurs, nous avons détecté
par la m~thode des dérivés dansylés des résidus DNS-Met 3°2-
Ces résultats sont comparables a ceux rapportés dans la
littérature pour d'autres p~éGurseurs des protéines mitochon-
driales ou chloroplastiques.
P-74-'
Fig.][ -5 : électrophorèse (10 %acrylamide ... 0,1 %SOS)
des fractions A et B des précurseurs de
la mt PheRS
éluées de la colonne de
DEAE -cellulose en présence d'urée 6M
72
l'activité ~e la mt Phe RS
(figure 11-6).
Le manque d'activité
enzymatique des précurseurs non traités par les membranes mi-
tochondriales n'est pas dû a une éventuelle inactivation ther-
mique lors de l'incubation a + 30
oC car aucune activité des
précurseurs n'est observée avec ceux conservés à + 4 oC.
La
contamination des membranes mitochondriales par
la mt Phe RS
mature ne permet pas d'expliquer l'augmentation de l'activité
des précurseurs après traitement avec la préparation des mem-
branes mitochondriales totales.
La contamination des membranes
mitochondriales de levure par d'autres enzymes matricielles a
également été observée par Gasser et al.
(1982). Comme l'ont
observé Mori et al.
(1981),
le traitement par le KCl ne semble
pas être suffisant pour éliminer complètement les enzymes ma-
tricielles séquestrées dans les fractions membranaires.
Le clivage des extensions terminales des précurseurs de la
mt Phe RS conduisant à l'apparition de l'activité enzymatique
serait dû à une "signal peptidase"
mitochondriale de levure.
Un mécanisme analogue a été démontré récemment à l'aide d'une
fraction de membranes mitochondriales par Sakakibara et al.
(1980), Kraus et al.
(1981)
pour la glutamate oxaloacétate
aminotransférase et l'ornithine transcarbamoylase mitochon-
driales de foie de rat,
respectivement.
L'absence d'activité d'aminoacylation de la fraction pré-
curseur nous a également conduit à examiner l'état structural
des polypeptides précurseurs.
La chromatographie sur
colonne
de Séphadex G-200 des précurseurs obtenus après précipitation
par les immunoadsorbants glutaraldéhyde-1gG anti-mt Phe RS,
non alkylés à l'iodoacétate, et préalablement dialysés contre
le tampon phosphate de potassium 20 mM,
pH 7,4, contenant
20 mM de 2-mercaptoéthanol,
60 mM de NaCl, montre que les
précurseurs ont un volume d'élution similaire à celui du mono-
mère de la sérum albumine bovine
(figure 11-7). Ceci nous
amène à la conclusion que les précurseurs de la mt Phe RS sont
à l'état dissocié dans le cytoplasme, et qu'il existe une
relation entre la structure monomérique des précurseurs et
l'absence d'activité d'aminoacylation.
7l
II.3. MATURATION DES PRECURSEURS DE LA mt Phe RS PAR LA PREPARA-
TION DES MEMBRANES MITOCHONDRIALES TOTALES
Il a été démontré depuis bien des années que certaines
enzymes protéolytiques sont synthétisées sous forme de précur-
seurs devenant actifs après clivage d'un fragQent polypeptidi-
que
(pour une revue: Kay,
1980).
L'existence d'une extension N-terminale dans les précur-
seurs nous a
incité à rechercher une éventuelle relation de
structure-activité entre ce peptide supplémentaire,
"peptide
signal"
ou "peptide leader",
et l'activité de la mt Phe RS.
Outre l'identification d'une "signal peptidase"
dans la
matrice des mitochondries de foie de rat et de levure
(Boehni
et al.,
1980
; Mori et al.,
1980), une ou des "signal pepti-
dase(s)"
a ou ont été localisée(s)
dans la fraction des mem-
branes mitochondriales totales
(espace intermembranaire ou
membrane interne)
des mitochondries de foie de rat
(Mori et al.,
1980
; Sakakibara et al.,
1981
; Kraus et al.,
1981). Dans
les fractions des membranes mitochondriales totales de levure
et plus particulièrement dans l'espace intermembranaire, une
activité "signal peptidasique" a été décelée par Gasser et al.
(1982)
ces auteurs pensent que cette dernière est une acti-
vité contaminante de celle localisée dans la matrice mitochon-
driale.
Nous avons utilisé l'actIvité "signal peptidasique"
localisée dans la fraction des membranes mitochondriales to-
tales pour résoudre le problème de structure-activité.
Afin d'éviter
toute contamination des membranes mitochon-
driales par les aminoacyl-tRNA synthétases mitochondriales,
nous les avons traitées avec des tampons contenant du KCl
(voir
"Méthode").
L'incubation de la fraction précurseur avec la pré-
paration des membranes mitochondriales totales entraîne le
clivage des extensions terminales comme observé après électro-
phorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Ce cli-
vage du peptide "signal"
s'accompagne d'une restauration de
-ED.
U
-ct2tr:..11000
..E
1
D
.=
D-
500
I
~
~
5
10
15
20
Time(mi n .)
flgUf"e JI - 6
Relafton
de structure - actIVIté
entre
le
"peptide
signaI"
et
l'ac t/vlfé
de
la
mt PIleRS
. - . : actIVIté
de
!a
fractIon -précurseur
non
Incubée
avec
la
préparcdlon
des
membranes
mlfochondrlales
totales - (f00 ~g
de
protéines)
~. -0 : surnageant (témoin) après
centrifugation
des
membranes
mlfo-
chondnales
non
Incubées
avec
la
fraction -précurseur
(f00 fJg
de
protéines
l,ées
aux
membranes
mlfochondnales
et
détachées
durant
l'incubation
à
+ 30"[
pendant
60
min)
____
:
surnageant
après
centrifugation
du
mélange
membranes
mlfochondnales
+ fraction - précurseur (TOO ~g de
protéines)
E
c
0
CD
N
4
'\\
0.8
1 •
. \\
•
0.4
•
\\•
(1)
(2)
•
(3)
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0.2
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'D
\\.
d
1
..... 0'/...
,
.........
.-.-.-.-&-.-.-.-.~.
0-0
- .
20
40
60
Fraction number
Figure JI: - 7
estimation des masses motécutali'es des potypeptides précurseurs de ta
mt PheRS
sur cotonne de Séphadex [j - 200
(1 x 42 cm)
1 : mt PheRS mature. 2: (] - gatactosidase d' Escherichia
coi;
1
3: BSA
0--0: A
nm
•
. : potypeptides précurseurs
2BO
75
L'analyse de tous ces résultats nous a permis d'émettre
l'hypothèse d'une régulation de l'activité des aminoacyl-tRNA
synthétases mitochondriales par les extensions terminales
portées par les précurseurs en plus de leur rôle dans le trans-
fert des protéines.
In v~vo, ces extensions participeraient à
la compartimentation des aminoacyl-tRNA synthétases en empê-
chant les enzymes mitochondriales d'être actives dans le cyto-
plasme.
III. CONCLUSION
La mt Phe RS est synthétisée sur les ribosomes cytoplasmi-
ques non liés au niveau des membranes mitochondriales,
sous
forme de précurseurs,
puis transférée dans les mitochondries
où ont lieu les processus de sa maturation.
IV.
PERSPECTIVES D'AVENIR
Les polypeptides précurseurs purifiés permettront,
après
détermination de leurs séquences N-terminales, d'étudier
les
interactions entre les peptides "signaux" et les récepteurs
membranaires des mitochondries de levure
(voir
introduction,
figure Q-IV).
73
1. INTRODUCTION
Yeast mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase is a tetrameric
enzyme (1) distinct of its cytoplasmic counterpart (2,3). Its amino acid
composition shows 22 cysteine residues (M. Diatewa, Y. Boulanger, A.J.C.
Stahl, unpublished). Sulfhydryl groups reactivity in catalysis has been
demonstrated for phenylalanyl-tRNA synthetase from other sources (4-7).
In this report, we have studied the participation of cysteinyl groups
of yeast mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase in the tRNA acylation
reaction. Using iodoacetate and p-hydroxymercuribenzoate as modifying
reagents, two classes of sulfhydryl groups with different reactivities can
be noticed. Only the most reactive class of sulfhydryl groups is required
for catalytic activity. The thiol groups of this class are located in or
near the substrate site as revealed by substrates-induced protection of the
enzyme against p-hydroxymercuribenzoate inactivation. Inhibition can be
reverted by 2-mercaptoethanol or dithiothreitol.
2. MATE RIALS AND METHODS
2.1. Preparation of yeast mitochondrial tRNA and phenylalanyl-tRNA
synthetase
The unfractionated mitochondrial tRNA was extracted from yeast by
the procedure of Schneller et al.
(8). The pure mitochondrial Phe-tRNA
synthetase of yeast was isolated according to (1).
2.2. Inactivation studies of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase by
iodoacetate and p-hydroxymercuribenzoate
The yeast purified mitochondrial Phe-tRNA synthetase was thoroughly
dialyzed against 35 mM Tris-Hel buffer, pH 8, containing 15 % (v/v)
glycerol, under nitrogen. 26 ~g of enzyme were incubated with various
73
concentrations of p-hydroxymercuribenzoate or iodoacetate (Na salt, from
Sigma Chemical Company) in 0.16 ml of 35 mM Tris-HCl buffer, pH 8,
containing 15 \\ glycerol at + 30°c. After variable incubation time
intervals, 20 ~l aliquots were removed for enzyme assay. For the study
of substrates-induced protection, the enzyme was previously incubated
with substrates at + 30°C for 5 min, and then sUlfhydryl reagent was
added. No loss of enzyme activity was observed after 15 min incubation
of the enzyme in the buffer without p-hydroxymercuribenzoate or iodo-
acetate.
2.3. Enzyme assay
The mitochondrial Phe-tRNA synthetase activity was measured as
described in (1) with following modifications: the 0.1 ml reaction
mixture contained 2 ~moles
M9C1 , 3.5 ~moles Tris-HCl (pH 8), 1 A
2
260
unit of total mitochondrial tRNA, 0.5 ~mole
KCl and 17 ~g of bovine
serum albumin. The reaction was performed at + 33°C for 10 min in the
absence of sulfhydryl compounds.
2.4. Kinetic analysis
Mitochondrial Phe-tRNA synthetase inactivation as a function of
p-hydroxymercuribenzoate concentrations was analyzed by the method of
Ray and Koshland (9). The inhibition kinetics could be represented by the
following equation :
where k
and k
are the pseudo-first-order rate constants of the two
1
2
classes of sulfhydryl groups; A and A
are the enzyme activities, at a
o
given time and at zero time ; F represents the fraction of activity still
presents in the partially reactive enzyme-inhibitor complex.
30
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Inactivation of mitochondrial Phe-tRNA synthetase by p-hydroxymercu-
ribenzoate and iodoacetate
In order to study the possible contribu~ion of sulfhydryl groups
of the enzyme, p-hydroxymercuribenzoate and iodoacetate are used as
inhibiting reagents. Graphic analysis of the enzyme inactivation on
selliilog paper (figure 1) shows biphasic kinetics. These data indicate
the existence of two classes of sulfhydryl groups in the inhibitory
process. As shown in figure 2, the inactivation reaction of the enzyme
as a function of the p-hydroxymercuribenzoate concentrations follows
second-order kinetics. Second-order rate constants of the two classes of
sulfhydryl groups, obtained from the slopes of the graphs represented in
-1 -1
-1 -1
figure 2, are 375 sec
M
and 4 sec
M
, respectively. As revealed in
figure 1, iodoacetate is a less effective inhibitor than p-hydroxymercu-
ribenzoate.
3.2. Reversion of inactivation by sulfhydryl compounds
To deraonstrate that only cysteine residues,are alkylated in the
experimental conditions of enzyme inactivation, we have reverted the
p-hydroxymercuribenzoate action by 2-mercaptoethanol and dithiothreitol.
Figure 3 shows that the sulfhydryl compounds abolish p-hydroxymercuri-
benzoate inhibition. The enzyme activity is restored up to 100 , with
dithiothreitol and up to 77 % with 2-mercaptoethanol. These results
indicate that cysteine residues alone participate in the inhibitory
process.
3.3. Protection of enzyme activity against p-hydroxymercuribenzoate-
inhibition by substrates
7'0
localize the sulfhydryl groups either in the catalytic or in the
100
80
~
- -.-
-.--
-
0\\0
60
' - '
>
..> 40
....ft!
ft!
::1
'0
20
III
QI
œ
10
o
5
10
15
Time (min.)
FIGURE 1
Inactivation of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase by iodo-
acetate
(lAC) and p-hydroxymercuribenzoate
(pHMB).
rot PheRS
(6.25 ~M) was incubated with
. - - - - . lAc
(156.25 ~M),
~
pHMB
(62. 5 ~M),
0 - - - 0
pHMB
(93.75 ~M), ,..,o----ro pHMB
(156.25 ~M).
...
2
f
---
... ~
f
0-
CJ
I.E
"Jill
E
"i(')
---
t';)
..
Il
C
IV
..
"è''''
III
C
0
U
QJ
..IV.... 1
QJ
"..01..III.!::...1
0
"::1QJIII
Cl.
= 4 sec-1
-1
k 2
M
-~--
a
50
100
FIGURE 2
Effect of p-hydroxymercuribenzoate concentrations on the inacti-
vation kinetics of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase.
The pseudo-first-order rate constants were calculated from the graphs of
figure 1 by the wethod of Ray and Koshland (10). The second rate constants
of the different thiol groups were obtained from the slopes of monophasic
graphs.
R-SH
100 •
-~-.~--.---II
1
".
80 .
-.-
1
1
_ 4 - -
- ---.
1
. /
1
~ 60 •
/
o~
1
~
1
'-"
1 (
>-
40
..
1 /
>
..
/ /
101
1/
" 20
"
/;
:2
~
•
III
a:
~J
10
.
.
.
.
0
5
10
15
20
25
Time
( min.)
FIGURE 3
Influence of 2-mercaptoethanol and dithiothreitol on the inacti-
vation of mitochondrial Phe-tRNA synthetase due to p-hydroxymer-
curibenzoate
(pHMBl.
mt PheRS
(6.25 ~M). After five minutes of inactivation bypHMB (
o----a
156.25 ~M), 1.72 mM of 2-mercaptoethanol (
A- - - A
or dithiothreitol
. - - - .
) were added in the inactivation mixture. 20 ~l aliquots were
removed for enzyme assay after variable incubation time intervals.
>
..-...ca-ca=~
Wl
2 0 .
al
a:
10
,
o
5
10
15
Time
(min.)
FIGURE 4
Efféct of substrates on the mitochondrial Phe-tRNA synthetase-
inactivation due to p~hydroxymercuribenzoate.
mt PheRS
(6.25 ~M) were previously incubated for 5 min with
0 - - - - 0
total
mt tRNA
(3.44 mg/ml),
0----0
Phe + ~TP
(37.5 ~M + 6.25 mM),
~----~
Phe
(37.5 ~M)
_ ____.
M9C1
+ ATP
(6.25 mM + 6.25 mM),
1
2
(6.25 mM), x----x ATP
(6.25 mM). At zero time, pHMB
(62.5 ~M) was added to
the mixture. Control reaction : o~--~o pHMB + mt PheRS
(62.5 ~M + 6.25 ~M).
85
substrate site, we have used the substrates-induced protection against
p-hydroxynlercuribenzoate inactivation as an approach. Figure 4 shows
that the most reactive class of sulfhydryl groups is required in tRNA
aminoacylation activity of the enzyme. On the contrary, the less reactive
class of thiol
groups is not involved in the acylation reaction because
i t exhibits the same rate constants in the presence or in the absence
of substrates.
Addition of Phe or MgCl
or ATP alone shows that the protection
2
afforded by ATP and Phe together or ATP and MgCl
together is due te
2
conformational changes in the enzyme. Such conformational changes have
been observed with histidinyl-tRNA synthetase (10), Tryptophanyl-tRNA
synthe ta se
(11) and isoleucyl-tRNA synthe ta se
(12) of ~~=~~:~=~~~_=~!~.
Differences in protection due to the substrates can be noticed
between yeast cytoplasmic (4) and mitochondrial Phe-tRNA synthetases.
No protection can be observed toward p-hydroxymercuribenzoate-inhibition
ef mitochondrial enzyme with ATP alone, whereas ATP alone partially
protects the cytoplasmic enzyme. The best protection is afforded by Phe
for the cytoplasmic enzyme, and by mt tRNA for the mitochondrial enzyme.
Phe-induced protection of mitochondrial enzyme is more efficient when
associated with ATP' whereas the protection by Phe and ATP together is
similar te that of Phe alone in the case of cytoplasmic enzyme.
4. CONCLUSION
The data of substrates-induced protection enable us to conclude that the
most reactive class of sulfhydryl groups belongs to or is located near the
substrate site of the enzyme. The reversion of p-hydroxymercuribenzoate-
inhibition by sulfhydryl compounds suggests that the sulfhydryl groups are
essential for the catalytic activity. Conformational changes of the enzyme
induced by the substrates could explain the masking effect of the most
reactive class of sulfhydryl groups, becoming then less reactive against
p-hydroxymercuribenzoate action.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by the Centre National de la Recherche Scienti-
fique and by the Délégation Générale à la Recherche Scientifique et Techni-
que.
REFERENCES
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89
ABSTRACT
Beat denaturation of yeast mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase is
examined by measuring aminoacylation capacity. Each substrate protects the
enzyme against thermal inactivation even in the absence of other substrates.
Best protection is obtained with the three substrates, Phe, ATP and mt tRNA,
toqether. Magnesium chloride reduces heat inactivation of the enzyme. Results
of substrates-induced protection against heat denaturation of the enzyme
suggest an aminoacylation mechanism proceeding in two steps with a random
fixation of Phe and ATP in the first step, like the mechanism of the
cytoplasmic homologous enzyme.
INTRODUCTION
The aminoacyl-tRNA synthetases catalyze the tRNA acylation reaction ei-
ther in one step or in twc successive steps : the amino acid activation and
the transfer of activated amino acid to the specific tRNA (1, 2). The infor-
mation on the binding of substrates to the enzyme can be obtained by means of
heat inactivation experiments (3, 4). This approach has been widely applied in
the case of aminoacyl-tRNA synthetases.
In this report, we have determined the dissociation constants of the
various substrates of yeast mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase using
the kinetics of heat inactivation. We have compared the dissociation constants
to the apparent Km values of the respective substrates. An aminoacylation
mechanism is discussed according to the protective effect of substrates
against heat inactivation of the enzyme.
MATERIALS AND METHODS
Yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase was purified according to (5).
The preparation of yeast mitochondr~~l tRNA was performed as described in
(6). The content of mitochondrial tRNA
e, determined by the kinetic method
in the presence of an excess of enzyme, represents 5 per cent.
Technique for heat inactivation
5 ~g enzyme were incubated at + 50°C in 100 Wl of 35 mM Tris-HCI buffer,
pB B, containing la mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mg/ml BSA. After variable
90
incubation time intervals, 10 ~l aliquots were removed and diluted in 40 ~l
of the seme buffer, previously cooled at + 4°C. 10 ~l of this dilution were
used for the determination of enzyme activity. For substrate protection
studies, enzyme and substrates together were previously incubated at + 4°C
for 20 min.
Enzyme assay
The assays of enzymatic activity were performed as described in (5) with
following modifications: the 0.1 ml reaction mixture contained 2 ~oles
MgC12' 3.5 ~moles Tris-HCl (pH 8), 1 A260 unit of total mitochondrial tRNA,
0.5 ~le
KCl and 10 ~g bovine serum albumin. The reaction was carried
out at + 33°C.
K1netic analysis
The estimate of Km values was performed by the Lineweaver-Burk plot (7).
The reaction mixtures contained 0.17 nM yeast Phe-tRNA synthetase. Incubation
time of 5 min was selected for the linear reaction rates. The substrates
concentrations used for the Km values estimate varied from 2 ~M to 30 ~M
D~Phe, 5 mM to 20 mM ATP, and 0.2 ~M to 2.0 ~M mt tRNA. MgC12/ATP ratio was
2 for each ATP concentration used.
The heat inactivation of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase follows a
first-order kinetic represented by the equation
ki
log A IAo = -- t
+
2
t
2.3
where At and Ao are the enzyme activities at a given time, t, and at zero
time ; ki represents the inactivation constant. The method of Südi (4) was
used te estimate the dissociation constants for each substrate.
RE5ULT5 AND DISCUSSION
Effect of temperature on the stability and the aminoacylation reaction of
yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase
As shown in figure l, yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase activity is
highly decreased when the enzyme is preincubated at + 50°c. The 1055 of
enzyme activity above the optimal temperature of aminoacylation reaction
(figure 2) can be explained by the destruction of quaternary and tertiary
structures of the enzyme, according to the results of figure 1.
Protective effect of substrates on heat denaturation of the enzyme
Figure 3 shows that yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase can be
protected by magnesiuru chloride against inactivation at + 50°C. This
protective effect has already been reported for yeast cytoplasmic (8) and
E8cheriohia ooLi (9) Phe-tRNA synthetases.
The protection induced by each substrate on the enzyme denaturation can be
observed in the figures 4, S, 6. The results indicate the formation of
enzyme-substrate complexes, and show that each substrate binds to the enzyme
in the absence of other substrates. The best protection is obtained
100+-------~
-0\\0-)..-.->.--u050-g
~IIIQ)
CI'
10
30
50
Temperature (OC)
Figure l
Influence of temperature on the stability of yeast mitochondrial
Phe-tR~A synthetase.
Enzynle was preincubated for 5 min
at different temperatures
before enzyme activity measurements.
~
E
Q.
~
-<
z
4000
a:
....
....E,
CD
.&:
Q.
1
::t
,('1)
2000
30
60
Temperature
(oC)
figure 2
Influence of temperature on the aminoacylation reaction catalyzed
by the enzyme.
The reaction mixtures were previously incubated for 10 min at
different temperatures and th en 0.17 nM enzyme was added.
2
o
~
Cen
o
- 1
2
4
lime (min)
Figure 3
MgCIz-induced protection against heat denaturation of the enzyme.
•
•
5)JQ enzyme alone;
enzyme + 3 mM MgCIZ (0- -
-0),
+ 5 001'1 (0---0), + 10 m~11"1gC12 (A---A).
2
o
~
ce
0')
o
-
1
1
3
lime (min)
Figure 4
ATP-induced protection against heat inactivation of the enzyme.
•
• 5 ~g enzyme + 3 mM MgC1Z ; enzyme + MgC1Z + 3 mM ATP
( 0 - - 0 ) , + 5 ml1 ATP ( . - - . ) , + 10 mM ATP ( 6 - _te.).
-cE 20
--~.:;:T"""
o
0.1
0.2
V[Phe]
1
(fJM- )
figure 5
Dissociation constant for Phe estimated from its protective effect
on heat inactivation of the enzyme.
5 J-lrJ enzyme + 3 rnM MCJCI Z + Phe-varYlng concentrations.
20-
-c:.-E-
10-
1
o
1
0.02
1/ [mt tRNAheJ
figure 6
mt trlNAPhe dissociation constant estimated from its protective
effect on heat inactivation of the enzyme.
5 pq enzynle + mt tHNAPhe-varying concentrations + 10 mM MgCIZ'
Substrates
None
0.322
10 fJM Phe
0.218
+ 0.104
5 ml~ ATP
0.241
+ 0.081
10 ~M Phe + 5 mil ATP
0.161
+ 0.161
0.55 A260 uni t ml tRNA
0.253
+ 0.069
10 f.I~l Phe + 5 m!"1 ATP + 0.55 A260 unit mt tRNA
0.128
+ 0.194
Table
l
Cornbinéltion effect of substrates on the heat inactivation of
enzyme.
~ki represents the protection induced by the substrates.
Dissociation
Substrat es
Km values
constànts
L-Phe + 3 mM MqC12
3.12 x 10-5 M
1.47 x 10-5 M
L-Phe + 10 ml'1 l'1gC 12 + 10 mM ATP
3.12 x 10-5 M
+ 1 unit A260 mt tRNA
mt tRNAPhe
3.21 x 10-7 1'1
mt tRNAPhe + 10 ml-l rlqC12
3.21 x 10-7 M
0.51 x 10-7 M
mt tRNAPhe + 10 ml'1 f'1C}CIZ + ID mf'1 ATP
-7
3.21 x 10
M
+ 10 I-lM Phe
ATP al one or with other substra~ together
--
1.64 x 10-3 M
Table II
Cou,parison of dissociation constants and Km values of the three
slJbstrates of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase.
when the enzyme is incubated with aU three substrates together (table 1).
The protection induced by ATP alone or in combination with other substrates
does not allow the true estimate of its dissociation constant, due to the
weak divergence of monophasic graphs-slopes.
Phe
As reported in table II, the dissociation constants of Phe and mt tRNA
are respectively 2.1 and 6.4-fold greater than their corresponding Km values •
.
Theses differences could be due to a small alteration of the enzyme structure
in the experimental conditions.
The protection afforded by each substrate alone suggests that the
aminoacylation roechanism of yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase proceeds
in two discrete steps, the amino acid activation step and the transfer step.
The results of thermal stability of the enzyme due to ATP and Phe together or
alone (table Il indicate a random fixation of these substrates in the first
step. Such a mechanism has also been demonstrated for yeast cytoplasmic (10)
and Escherichia coli (11) Phe-tRNA synthetases.
Although the kinetic studies at steady-state are the best procedure to
determine the order of substrate addition , the results obtained in this work
with measure of substrates-induced protection against heat inactivation of
yeast mitochondrial Phe-tRNA synthetase are in favour of a similar
mechanism to that of yeast cytoplasmic homologous enzyme (10):
~ Ph.RS.ATP~h'
.J";
~~
j::"S'
.. PheRS. AMP",Phe
ATP.Ph. ~
PheRS. Phe
he
tRNt
AMP
p~.
\\
Phe
PheRS. AMPNPhe 04
... PheRS. AMPNPhe. tRNA~
Ph eRS + Phe- tRNA
( 2)
(1 )
_mino
_cid activation
step
( 2 )
transI"
slep
Acknowlœdgements
This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifi-
que and by the Délégation Générale à la Recherche Scientifique et Te~hnique.
100
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4812.
102
RES UME
E T
CON C LUS ION
Les résultats exposes dans ce travail sont consacres aux
aspects moléculaires,
à la biosynthèse, au transport, et à
l'étude de quelques propriétés cinétiques de la phénylalanyl-
tRNA synthétase des mitochondries de la levure Sacchakomyce~
cekev~~~ae.
/. ASPECTS MOLECULAIRES DE LA mt Phe RS
La première partie de ce travail porte sur
la purification,
la structure polymérique de la mt Phe RS,
et
sur l'origine
génétique des différents constituants des Phe RS mitochondriale
et cytoplasmique de levure.
Purification de la mt Phe RS
Afin d'éviter
toute contamination de la mt Phe RS par son
homologue cytoplasmique,
nous avons préparé l'enzyme mito-
chondriale à partir des mitochondries obtenues après lyse hypo-
tonique des protoplastes de levure.
Le procédé de purification de la mt Phe RS que nous avons
mis au point comprend six étapes:
précipitation au sulfate
d'ammonium, chromatographie sur DEAE-cellulose, deux chromato-
graphies sur hydroxylapatite,
et deux chromatographIes sur
Sépharose 48.
Le rendement obtenu est de 17 % avec un
103
enrichissement de 385 fois.
L'enzyme apparaît homogène au vu
des différents tests analytiques utilisés : chromatographique,
électrophorétique,
et d'identification de l'aminoacide N-
terminal
(présence d'un résidu Glu).
Structure polymérique de la mt Phe RS
La masse moléculaire de la mt Phe RS native déterminée par
Séphadex G-200 et par électrophorèse en absence d'agents
dénaturants varie entre 260000
et 270000.
Après traitement
de l'enzyme en présence de SOS l
% et 2-mercaptoéthanol l
%,
deux bandes de masses moléculaires respectives,
57000
et
72000,
peuvent être observées sur les électrophorégrammes.
Ces résultats permettent de proposer une structure quaternaire
de type a2 6 2 pour la mt Phe RS.
Origine génétique des différents constituants des Phe RS de
levure
L'existence d'une Phe RS cytoplasmique d'origine également
nucléaire nous a conduit à rechercher une éventuelle parenté
structurale entre les différents constituants des Phe RS de
levure. Deux approches ont été utilisées,
l'approche biochimi-
que et l'approche immunologique.
Dans un premier
temps,
nous avons préparé des anticorps
anti-mt Phe RS chez un lapin,
puis dans un deuxième temps,
nous avons isolé les différentes sous-unités constituant la
mt Phe RS.
Le procédé d'isolement comprend:
-
une étape de réduction de la mt Phe RS à + 50 oC pendant 2 h
en présence de chlorure de guanidine et de 2-mercaptoétha-
nol,
suivIe d'une alkylation à l'iodoacétate i
-
une chromatographie sur DEAE-cellulose en présence d'urée.
A partir des Phe RS mitochol1driale et cytoplasmique natives,
et des sous-unités isolées de la Phe RS mitochondrlale, nous
avons abordé l'étude des déterminants antigéniques par la
104
méthode ELISA
(enzyme-linked
immunosorbent assay).
Seules la
Phe RS mitochondriale native et ses différentes sous-unités
réagissent avec les anticorps anti-mt Phe RS.
L'étude de la similarité structurale entre les différentes
sous-unités des Phe RS de levure a été entreprise par compa-
raison de leurs compositions en acides aminés.
Des différences
significatives ont été observées.
L'analyse des acides aminés
N-terminaux a également révélé des différences dans leurs
extrémités.
Les différences observées dans les compositions en acides
aminés entre les sous-unités des mt et ct Phe RS,
et dans la
nature de leurs sites antigéniques,
nous permettent de con-
clure que ces sous-unités sont codées par des gènes nucléaires
différents.
2. 810SYNTHESE ET TRANSPORT DE LA mt Phe RS
Cette étude a été abordée par voie immunochimique.
A partir du cytoplasme des cellules déréprimées de levure
récoltées au milieu de la phase exponentielle,
nous avons pu
précipiter avec les anticorps anti-mt Phe RS deux polypeptides
de masses moléculaires relativement plus gràndes que les
sous-unités matures.
Les masses moléculaires déterminées sur
gel de polyacrylamide en présence de SDS sont de l'ordre de
61000
pour
le précurseur de la sous-unité de 57000 , et de
74000
pour celui de 72000.
La parenté structurale entre
chaque précurseur et sa sous-unité mature a été abordée par
comparaison de leurs cartes trypsiques.
Aucune différence
significative n'a pu être décelée.
Afin de localiser
les extensions terminales dans les poly-
peptides précurseurs,
nous avons développé une technique de
purification de ces précurseurs. Cette technique comprend quatre
étapes:
une précipitatIon des protéines cytoplasmiques au
lOS
sulfate d'ammonium, une chromatographie d'immunoaffinité dont
le support est un immunoqdsorbant formé d'un réseau de
glutaraldéhyde-IgG anti-mt Phe RS, une chromatographie sur
Séphadex G-200, et une chromatographie sur DEAE-cellulose en
présence d'urée après alkylation des précurseurs à l'iodoacé-
tate comme pour les sous-unités matures. Les précurseurs sur
colonne de DEAE-cellulose ont le même comportement chromato-
graphique que les sous-unités matures. Après oxydation perfor-
mique des deux précurseurs purifiés, l'analyse des extrémités
N-terminales par la méthode des dérivés dansylés nous a
révélé la présence de la méthionine dans les deux polypeptides
précurseurs. Les sous-unités matures ont l'une le résidu Glu
et l'autre un acide aminé non identifiable. Ces résultats
montrent que les extensions terminales se trouvent du côté
N-terminal comme ceux rapportés dans la littérature pour
d'autres
précurseurs des protéines mitochondriales.
L'absence d'activité enzymatique
des polypeptides précur-
seurs nous a amené à étudier un éventuel rôle des extensions
N-terminales en plus de celui du transfert des protéines dans
les organelles. Après incubation des précurseurs, non alkylés
à l'iodoacétate, avec une préparation de membranes mitochon-
driales totales ohtenue à partir des cellules de levure non
traitées aux inhibiteurs de l'oxydation phosphorylante, une
activité enzymatique a pu être décelée. Cette apparition d'ac-
tivité s'acco!~pagne d'un clivagé des extensions N-terminales
pouvant être dG à une "leader peptidase" localisée, soit dans
la membrane interne, soit dans l'espace intermembranaire. Les
précurseurs non alkylés ont un volume d'âution semblable à
celui des monomères de la sérum albumine bovine lors de la
chromatographie sur Séphadex G-200. L'état dissocié des poly-
peptides précurseurs révélé par les résultats de la filtration
sur gel de dextrane permet d'expliquer leur absence d'activité
enzymatique. L'analyse de tous ces résultats nous a permis
d'émettre une hypothèse de régulation de l'activité des amino-
acyl-tRNA synthétases mitochondriales par les extensions
105
terminales en plus de leur rôle dans le transfert des pro-
téines.
In v~vo, ces extensions participeraient à la compar-
timentation des aminoacyl-tRNA synthétases en empêchant les
enzymes mitochondriales d'être actives dans le cytoplasme.
En conclusion,
la mt Phe RS est synthétisée sous forme de
précurseurs dans le cytoplasme,
puis transférée dans les mi-
tochondries de levure où ont lieu les processus de sa matura-
tion.
3. ETUVE VES PROPRIETES CINETIQUES
Deux points ont été abordés dans cette dernière partie
Rôle des groupements sulfhydriles dans la réaction d'aminoacy-
lation de la mt Phe RS
Utilisant l'iodoacétate et le p-hydroxymercuribenzoate,
deux sortes de groupes sulfhydriles avec des réactivités diffé-
rentes ont pu être décelées.
L'inhibition par
le p-hydroxymer-
curibenzoate peut être levée,
soit par
le dithiothréitol,
soit
par le 2-mercaptoéthanol.
Les résultats des études de protec-
tion de l'enzyme par
les différents substrats contre l'inhibi-
tion due au p-hydroxymercuribenzoate révèlent que seuls les
groupements thiols les plus réactifs participent à la réaction
d'aminoacylation. Ces mêmes résultats permettent de localiser
les groupements thiols les plus réactifs dans ou près des sites
de fixation des substrats.
Inactivation thermique et étude des constantes de dissociation
des différents substrats de la mt Phe RS
La mt Phe RS portée à + 50
oC se dénature très rapidement.
Les différents substrats protègent l'enzyme contre l'inactiva-
tion thermique.
La comhinaison de divers substrats améliore
la protection de l'enzyme contre la dénaturation thermiqu~.
107
Les constantes de protection ou de dissociation estimées pour
chaque substrat à partir de la technique d'inactivation ther-
mique sont de 3,12 .
10- 5 M pour la L-Phe et de 3,21
• 10- 7 M
pour le mt tRNAPhe.
L'effet protecteur dû à l'ATP seul ou en
association avec le mt tRNA et la L-Phe ne nous a pas permis
de calculer sa constante de protection ou de dissociation.
Les constantes de Michaelis obtenues a partir de la réaction
d'aminoacylation sont de 1,47
.
10- 5 M pour
la L-Phe,
0,51
• 10- 7 M pour
le mt
tRNAPhe,
et de 1,64 .
10- 3 M pour
l'ATP.
Un mécanisme d'aminoacylation de la rot Phe RS similaire à
celui des Phe RS cytoplasmique de levure et d'E~eh~~~eh~a eol~
a été proposé en accord avec les résultats de protection de
la mt Phe RS par ses différents substrats contre la dénatura-
tion thermique: mécanisme se faisant en deux étapes,
l'étape
d'activation et l'étape de transfert de l'aminoacide activé
sur
le mt tRNAPhe
;
la fixation de l'ATP et de la L-Phe dans
la première étape se ferait selon un mécanisme d'association
au hasard.
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) 0 (
'.:'"
RESUME
, "
La ~hénylalanyl-tRNA
synthétase mitochondriale de,levure,
:' distincte ,'immunologlquement et structuralement de son homologue
... , )
'cytoplasmique, a été purifiée à homogénélté en six étapes.
Lps
cpmposltionsen acides aminés des sous-unltés de l'enzyme pré-
e
sentant une structure
quaternaire de type
QZ 6 2 ont éte déter-
minées. L'enzyme est synthétl"sée ~ous forme de précurseur.s,.dans
lé cytopla~me, puis transférée dans les mitochondrles où ont
..
,lleu
les prOCessus de sa maturatlon.
Utilisant l'lodoacétate
et le p-hydroxymercurlbenzoate, deux classes de-groupes svlf-
•
1"
•
hydrlles ont été décelées. Seuls les groupem~n~s thiols, les
r·"p.lus ,t~.act1f,s. participent à la réaction d'aminoacylàti~'~ Là,
déna~~ation thermique et les propr iétés catalytiq\\.fe~ }le i'en-
"
zyme ont ete étudiées. Un mécanisme d'aminoacylation de la .
,;pn~nYlalanYl-tRNA synthétase mitochondriale ~imilaire à celui
de son homologue cytoplasmique a été proposé ~n accord avec
.
les, iésu l tatsde."protect!on de l'enzyme mitochondr laIe par, ses
différentss~stratscontre la dénaturation thermique.
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