UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL
IMMUNOBIOLOGIE DU VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL HUMAIN
PAR
ANGÉLIQUE MBIGUINO
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE ET IMMUNOLOGIE
F ACULTÉ DE MÉDECINE
THESE PRÉSENTÉE À LA F ACULTÉ DES ÉTUDES SUPÉRIEURES
EN VUE DE L'OBTENTION DU GRADE
DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)
EN VIROLOGIE
SEPTEMBRE 1991
© ANGÉLIQUE MBIGUINO 1991

---

Université de Montréal
Faculté des études supérieures
Cette thèse intitulée:
Immunobiologie du virus respiratoire
syilcytial humain
présentée par:
,
Angélique Mbiguino
a été évaluée par un jury composé des personnes suivantes:
. fR.AIJCoiS
eOUTLie
(?1!.6$IDEIJ7)
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J-1EIJE 2ES
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These acceptee le
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---

AVERTISSEMENT
Les tennes virus RS ou RSV désignent tous les deux , le virus respiratoire
syncytial. Le terme RSVH indique qu'il s'agit d'une souche humaine de
RSV par opposition à la souche animale Oe RSV bovin).
Donc dans la revue de littérature, nous utiliserons l'abreviation de l'auteur.
Dans le reste du texte, les tennes RS ou RSV seront utilisés parce que dans
certaines illustrations, le mot RS convient mieux que RSV (à cause du
manque d'espace).

---

SOMMAIRE
Le développement d'un vaccin efficace contre le virus respiratoire
syncytial (RSV), agent responsable d'affections sévères des voies
respiratoires
inférieures
chez
les
nourrissons,
est
l'une
des
recommandations de l'Organisation Mondiale de la Santé. Mais, avant d'en
arriver là, il est nécessaire de comprendre les phénomènes qui
interviennent au cours de la maladie, notamment, les mécanismes
immunologiques, qui à notre avis semblent les plus importants.
En effet, étant donné qu'il n'y a pas de protection chez le nourrisson
en dépit de la présence d'anticorps, et que l'infection expérimentale chez
l'animal soit fatale malgré l'activation de cellules cytotoxiques, une des
hypothèses avancées est que les protéines de l'enveloppe virale, surtout la
protéine de fusion F, étant endommagées au cours de l'inactivation du
virus, ne jouent plus aucun rôle dans l'induction de la protection. Une
autre hypothèse est que certaines fonctions des cellules du système
immunocompétent seraient affectées lors de l'infection de celles-ci par le
RSV.
La démarche de notre recherche intitulée: "lmmunobiologie du virus
respiratoire syncytial humain", a consisté à infecter les cellules
mononucléées du sang périphérique et à vérifier s'il y a réplication virale
ou non.
Nous avons aussi évalué l'intégrité des mécanismes effecteurs
(activité NK, activité cytotoxique), ainsi que la production de lymphokines

---

III
et monokines, induits par le RSV, ou par ses protéines de surface. Enfin,
nous avons testé l'induction de cellules suppressives, nécessaires à la
régulation de la réponse immune, par le RSV infectieux et
par ses
glycoprotéines de surface. L'accomplissement de tous ces travaux, nécessite
avant tout, d'obtenir de bonnes préparations de virus purifié, d'où nos
travaux sur la purification du RSV, sur différents gradients.
Dans une première étape, nous avons démontré que, la purification
partielle en gradient de saccharose, demeure pour le moment, le milieu qui
préserve le mieux, l'infectivité du virus. Par la suite, nos résultats laissent
entrevoir que, les cellules mononucléées du sang périphérique sont
infectables par le RSV, et qu'il y a production d'interférons, suite à
l'infection.
En ce qui concerne les mécanismes effecteurs, nous avons pu constater
que, l'activité NK peut augmenter ou diminuer selon la souche. Il y a
activation de cellules cytotoxiques, aussi bien par le virus infectieux que par
ses glycoprotéines, et qu'en plus, celles-ci sont reconnues comme cibles par
les cellules cytotoxiques. Au cours de notre travail, nous avons démontré
qu'il y a induction de cellules suppressives, par le RSV infectieux et ses
deux glycoprotéines, et noté qu'une différence réside, au nivau de la
production d'interféron gamma, d'interleukine 1 et d'interleukine 2. Ces
substances, sont inhibées en présence de cellules suppressives induites par le
RSV infectieux.
Enfin, nous avons constaté que, les protéines libres
provenant de l'enveloppe virale, jouent un rôle important dans la

---

IV
stimulation des mécanismes immunologiques, lors d'une infection
expérimentale.
À partir de nos résultats, nous tirons les conclusions suivantes:
- L'infection par le RSV, affecte les fonctions de certaines cellules du
système immunologique; le virus est donc immunosuppresseur.
- Cette immunosuppression, peut-être le résultat d'un effet direct du virus
sur les cellules infectées, ou une action via certaines substances, comme
l'interféron gamma, l'interleukine 1 ou 2.
- Les cellules suppressives induites par le RSV infectieux, exercent une
régulation négative sur les mécanismes effecteurs, notamment les cellules
cytotoxiques, ce qui explique qu'en présence de ces cellules, le virus est
éliminé de l'organe-cible (les poumons), mais que paradoxalement, on
observe des nécroses fatales au niveau de ce même organe.
- Ces données supplémentaires, ouvrent la voie vers le développement d'un
vaccin sous-unitaire, qui ne contiendrait que les glycoprotéines de
l'enveloppe du RSV, et qui serait possiblement efficace et permettrait ainsi
de résoudre, les problèmes des vaccins développés jusqu'à maintenant.

---

TABLE DES MATIERES
SOMMAIRE
II
TABLE DES MATIERES
v
LISTE DES TABLEAUX
xi
LISTE DES FIGURES
XIll
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS
xvi
DÉDICACE
xix
REMERCIEMENTS
xxi
IN1RODUCfION
1
CHAPITRE 1: REVUE BmLIOORAPHIQUE
3
1.1 LE VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL
4
1.1.1 Isolement et nomenclature
4
1.1.2 Morphologie et taxonomie
4
1.1.3 Propriétés du virus
6
1.1.3.1 Propriétés physico-chimiques
6
1.1.3.2 Purification du virus
8
1.1.3.3 Organisation du génome viraL
9
1.1.3.4 Nature nombre et fonctions des polypeptides
l0
1.1.3.5 Propriétés biologiques
13
1.1.3.5.1 Comportement en culture cellulaire
.13
1.1.3.5.2 Particules défectives interférantes
16
1.1.3.5.3 Infections persistantes
17
1.1.3.5.4 Recherche d'une activité hémaggluti-
nante, hémadsorbante et neuramini-
dase
18
1.1.3.5.5 Susceptibilité des animaux au RSV
18
1.1.3.6 Propriétés antigéniques
20
1.1.3.6.1 Structure antigénique
20

---

VI
1.1.3.6.2 Variations antigéniques
21
1.1.4 Épidémiologie
23
1.1.5 Immunologie
29
1.1.5.1 Immunité humorale
30
1.1.5.1.1 Production d'anticorps sériques
30
1.1.5.1.2 Production d'anticorps locaux
32
1.1.5.1.3 Rôle des anticorps materne1s
.33
1.1.5.1.3.1 Anticorps acquis par voie
transp1acentaire
33
1.1.5.1.3.2 Anticorps acquis par le lait
et le colostrum
35
1.1.5.1.3.3 Anticorps acquis par
transfert passif
35
1.1.5.2 Immunité cellulaire
.36
1.1.5.2.1 Transformation des lymphocytes
36
1.1.5.2.2. Activité cytotoxique
37
1.1.5.2.2.1 Activité cytotoxique
naturelle (NK)
37
1.1.5.2.2.2 Activité cytotoxique induite
par les cellules T (CTL) .....38
1.1.5.2.2.3 Activité cytotoxique
dépendante des anticorps
(ADCC)
39
1.1.5.2.3 Action des cellules suppressives
.40
1.1.5.3 Production des lymphokines
et monokines
41
1.1.5.3.1
Production d'interféron
.41
1.1.5.3.2 Production d'interleukine 1 (lL-1)
.42
1.1.5.3.3 Production d'interleukine 2 (lL-2)
.42
1.1.6 Pathogénèse de la maladie
.43
1.1.6.1 Rôle des anticorps sériques dans la pathogénèse
du RSV
44
1.1.6.2 Rôle de l'hypersensibilité
.47
1.1.6.3 Rôle des IgE dans la pathogénèse
.48
1.1.6.4 Rôle des IgG4 dans la pathogénèse
.49
1.1.6.5 Rôle des cellules cytotoxiques dans la
pathogénèse
50
1.1.6.6 Immunosuppression
50
1.1.6.7 Rôle du complément dans la pathogénèse
52

---

Vll
1.1.6.8 Rôle des facteurs non-immunologiques
52
1.1.7 Prophylaxie
53
1.1.7.1 us vaccins
53
1.1.7.2 L'immunothérapie
56
1.1.7.3 us substances antivirales
56
CHAPITRE 2: MATÉRIEL ET MÉTHODES
59
2.1 TECHNIQUES VIROLOGIQUES
60
2.1.1 Milieux de culture
60
2.1.2
Culture cellulaire
60
2.1.3 Souche virale
61
2.1.4 Production du virus
62
2.1.4.1
Banque virale
62
2.1.5 Concentration virale
63
2.1.5.1 Concentration au polyéthylène glycol 6000
63
2.1.5.2 Concentration sur coussin de saccharose
63
2.1.6 Mesure de l'infectivité
64
2.1.7 Purification du virus en gradient de densité
65
2.1.7.1 Purification en gradient de saccharose
65
2.1.7.2 Purification en gradient de Renografin
66
2.1.7.3 Purification en gradient de Percoll™
(polyvinyl pyrollidone)
66
2.1.7.4 Purification en gradient de métrizamide
67
2.1.8 Purification des glycoprotéines virales par
chromatographie
67
2.1.8.1 Chromatographie d'affinité
68
2.1.8.2 Identification des glycoprotéines par
"Dot Blot"
69
2.1.8.3
Immunoblot.
70
2.1.8.4 Filtration moléculaire sur gel de sephacryl
S-200
71
2.1.8.5 Dosage des protéines
71
2.1.9 Analyse des protéines par électrophorèse sur gel de
po1yacrylamide (PAGE)
72
2.1.9.1 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
73
2.1.9.2 Coloration au nitrate d'argent..
73

---

VIll
2.2 TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES ET
IMMUNOENZYMATIQUES
73
2.2.1 Milieu de culture des lymphocytes
73
2.2.2 Séparation des lymphocytes du sang périphérique
74
2.2.3 Purification des lymphocytes CD3+
75
2.2.4 Obtention des lymphocytes B
76
2.2.5 Purification des lymphocytes CD4+ et CD8+
76
2.2.6 Culture des monocytes et des macrophages
77
2.2.7 Test de stimulation des lymphocytes
78
2.2.8 Infection des cellules de lignées établies
79
2.2.9 Infection des lymphocytes frais
80
2.2.1 0 Infection des monocytes et macrophages
81
2.2.11 Test de viabilité des cellules infectées
81
2.2.12 Test d'immunofluorescence
82
2.2.12.1 Immunofluorescence indirecte de
membrane
82
2.2.12.2 Immunofluorescence directe de membrane
83
2.2.12.3 Immunofluorescence indirecte interne
83
2.2.13 Mesure de l'activité NK (Natural Killer)
84
2.2.14 Activité cytotoxique dépendante des
anticorps (ADCC)
86
2.2.15 Induction de cellules T cytotoxiques (CfL)
87
2.2.16 Induction de cellules suppressives
89
2.2.16.1 Effet des cellules suppressives sur l'activité
NK
90
2.2.17 Techniques de dosage de l'interféron
91
2.2.17.1 Dosage de l'interféron totaL
91
2.2.17.2 Dosage de l'interféron gamma
92
2.2.18 Dosage de l'interleukine 1 et 2
93
2.2.19 Analyses statistiques
93
CHAPITRE 3: RÉSULTATS
94
3.1 PRODUCTION VIRALE
95
3.2 CONCENTRATION VIRALE
95
3.3 PURIFICATION VIRALE
95
3.4 PURIFICATION DES GLYCOPROTÉINES VIRALES PAR
e:tIFtO~TOGFtJ\\J?~
101

---

IX
3.5 TEST DE STIMULATION DES LYMPHOCYTES
104
3.6 PRODUCfION DU VIRUS PAR LES CELLULES MONONUCLÉÉES
107
3.6.1
Par les lignées établies
107
3.6.2 Par les cellules mononucléées fraiches d'adultes
107
3.6.3
Persistance virale
116
3.7 TEST DE VIABILITÉ DES CELLULES INFECTÉEs ....•.......•............ 120
3.8 TEST D'IMMUNOFLUORESCENCE
120
3.9 PRODUCTION D'INTERFÉRON
123
3.9.1 Production d'interféron total
123
3.9.2 Production d'interféron gamma
127
3.10 MESUREDEL'ACfIVrrÉNK
131
3.11 ACTIVITÉ CYTOTOXIQUE DÉPENDANTE DES ANTICORPS
136
3.12 ACTIVATION DE CELLULES CYTOTOXIQUES
136
3.13 INDUCTION DE CELLULES SUPPRESSIVES
138
3.13.1 Induction de cellules suppressives par le RSV
infectieux ou par le RSV inactivé
138
3.13.2 Effet des cellules suppressives induites par le RSV
infectieux ou inactivé sur l'activité mitogénique
de la PHA
140
3.13.3 Effet des cellules suppressives induites par le RSV
infectieux sur la production d'interféron gamma,
d'IL-1 et d'IL-2
142
3.13.4 Induction de cellules suppressives par les 2 glyco-
protéines et leur effet sur la production d'IFN- )( d'IL-1
et d'IL-2
144
3.13.5 Effet des cellules suppressives induites par le RSV
infectieux, inactivé ou par ses glycoprotéines sur
l'activité NK
146
CHAPITRE 4: DISCUSSION
152
4.1. PRODUCfION, CONCENTRATION ET PURIFICATION DU RSV
153
4.1.1. Étude de la production du RSV sur billes de gélatine
153
4.1.2. Obtention de virus après concentration
154
4.1.3. Purification virale en gradient de densité
155
4.2. PURIFICATION DES GLYCOPROTÉINES DE
L'ENVELOPPE DU RSV
156

---

Xll
TABLEAU XIII:
Induction des cellules suppressives par les 2
glycoprotéines et leur effet sur la
production d'interféron gamma, d'interleukine 1
et d'interleukine 2
145

---

LISTE DES FIGURES
FIGURE 1:
Affections respiratoires dues aux virus grippaux A et B,
aux virus parainfluenzae, au virus RS, mois par mois,
dans l'hémisphère nord
27
FIGURE 2:
Purification du RSV en gradient discontinu de
saccharose
98
FIGURE 3:
Purification du RSV en gradient continu de
saccharose
99
FIGURE 4:
Purification des glycoprotéines de l'enveloppe du RSV
par chromatographie d'affinité
103
FIGURE 5:
Titre du RSV dans les lignées établies
109
FIGURE 6:
Titre du RSV des cellules mononucléées du sang
périphérique
110
FIGURE 7: Titre du RSVpar les lymphocytes CD3+ ou
les lymphocytes B
111
FIGURE 8:
Titre du RSV par les lymphocytes CD4+ et CD8+
112
FIGURE 9:
Titre du RSV par les monocytes et macrophages
113
FIGURE 10: Titre du RSV par les PBL lavés ou non
114
FIGURE Il: Titre du RSV par les lymphocytes CD3+ lavés ou non... 115
FIGURE 12: Infection persistante à RSV dans les cellules
mononucléées
117
FIGURE 13: Infection persistante à RSV dans les cellules
mononucléées
118
FIGURE 14: Test de viabilité des PBL infectés par le RSV
119

---

XIV
FIGURE 15: Test d'immunofluorescence des PBL infectés par
leRSV
121
FIGURE 16: Test d'immunofluorescence des PBL infectés par
le RSV
122
FIGURE 17: Production d'interféron total par les PBL et les
lymphocytes CD3+ infectés par le RSV
124
FIGURE 18: Production d'interféron total par les CD4+ et CD8+
infectés, par le RSV
125
FIGURE 19: Production d'interféron total par les PBL infectés par
le RSV avec une m.o.i. de 0,1
126
FIGURE 20: Production d'interféron gamma par les PBL et les
lymphocytes CD3+ infectés par le RSV
128
FIGURE 21: Production d'interféron gamma par des PBL infectés
par le RSV avec une m.o.i. de 0,1
129
FIGURE 22: Production d'interféron gamma par les lymphocytes
CD4+ et CD8+ infectés par le RSV
130
FIGURE 23: Activité NK induite par le RSV dans les lymphocytes
d'adultes et de sang de cordon
134
FIGURE 24: Activité NK des lymphocytes d'adultes induite par les 2
glycoprotéines de surface du RSV
135
FIGURE 25: Activation des cellules cytotoxiques par le RSV
ou par ses glycoprotéines de surface G et F.
137
FIGURE 26: Effets des cellules suppressives induites par le RSV
sur l'activité NK
147
FIGURE 27: Effets des cellules suppressives induites par le RSV
sur l'activité NK
148

---

XVll
LT
Lymphocytes transformation pour transformation des
lymphocytes
M
Molaire
ME
Microscope électronique
MEM
Milieu mininal essentiel
mL
Mililitre
m.o.l
Multiplicity of infection pour multiplicité d'infection
Microgramme
Microlitre
Natural Killer
ng
Nanogramme
nm
Nanomètre
NP-40
Nonidet P-40
NTE
150 mM NaCI, 50mM Tris, ImM EDTA, pH 7,5
PBL
Peripheral blood lymphocytes pour lymphocytes du sang
périphérique
PBMC
Peripheral blood mononuclear cells pour cellules mononuclées
du sang périphérique
PBS
Phosphate buffer saline
PEG
Polyéthylène glycol
PG
Prostaglandines
PGE2
Prostaglandines E2
PRA
Phytohémagglutinine
p.l.
Post-infection
P.M.
Poids moléculaire

---

XVlll
PMSF
Fluorure de phénylméthylsulfonyle
PWM
Pokeweed mitogen
RIA
Radioimmuno assay
r.p.m.
Révolutions par minutes
RSV
Virus respiratoire syncytial
RSVH
Virus respiratoire syncytial humain
SFV
Sérum de veau foetal
Tc
T cytotoxiques
Th
T helpers
TNF
Tumor necrosis factor
ts
Thermosensibles
Ts
T suppresseurs
UFS
Unités formants syncytia
UI
Unités internationales
UV
Ultra-violets

---

À mes ftls, Rudy-Ashley
Loïc-Alfred

---

À LA MÉMOIRE DE:
mon grand-père
Joseph Mbiguino
ma grand-mère
Germaine Owongwayilé
mes oncles
Paulin Ewillo
Alexis Obame
mes tantes
Marie Mpemba
Georgina Obame Omanda
mes frères
RelVé Mbouron
Joseph Mbiguino

---

xxi i
Que le Docteur Caroline Alfieri, chercheur au laboratoire de
virologie au Centre de Recherche Pédiatrique de l'Hôpital Ste-Justine soit
remerciée pour ses précieux conseils.
Je remercie le Docteur Jean-Marie Leclerc, de la clinique
d'hématologie spéciale ainsi que son personnel pour avoir fait les
prélèvements de sang.
Je remercie Mesdames Louise Robillard, du laboratoire de
diagnostique en virologie et Marie Blagdan du laboratoire de Microbiologie
et Immunologie, Hôpital Ste-Justine.
Je suis très reconnaissante envers le personnel du laboratoire
d'immunovirologie de l'Hôpital Ste-Justine, particulièrement envers
Meriem Khyatti, Syra Kasparian et Irina Stéphanescu.
J'exprime ma profonde reconnaissance à mon père Edouard
Mbiguino, à ma mère Valentine Azéva, à ma tante Soeur Agnès-Marie, à
mes
oncles
Joseph
Ompendoguelet,
Marcel
Ogouma,
Eugène
Nkombényondo, Sébastien Anotho, Martin Anotho, Honoré Igowa, à mes
cousins le Docteur Olivier Brahime et Flavien Reteno, dont l'aide et
l'encouragement m'ont permis de poursuivre mes études.
À mon époux, pour les sacrifices et les encouragements au cours de
toutes ces années, je dédie cette thèse.
À mon beau-frère Pierre Eteno, à ma belle-mère Albertine
Mwamboumba, pour leur soutien et leur encouragement.

---

xxii i
Je remercie Mgr Fernand Anguilet, Archevêque de Libreville, ainsi
que les soeurs de la congrégation de l'Immaculée Conception pour l'aide
précieuse apportée au cours de ce travail.
Je ne saurais terminer sans mentionner les noms de mes amis
Florence Sebag, Élisabeth Stra1heim, Marie-Thérèse et Fémi Aina, Évelyne
et Frantz Raphaël, Christian Renamy, Marc Ropivia, Monique et Emmanuel
Ofoué, qui ont toujours été derrière moi, dans les moments les plus
critiques.
Je remercie l'Ambassade du Gabon et particulièrement les
conseillers Mathias Koundi et Faustin Biyo'o, dont la compréhension m'a
permis de poursuivre ces études.
Je remercie le gouvernement gabonais pour le support fmancier
sans lequel beaucoup d'entre nous ne pourraient poursuivre leurs études.
Mes remerciements s'adressent également à messieurs Edouard
Messan et Alfred Mouagaya, pour avoir effectué les corrections de cette
thèse.
Enfm j'exprime ma reconnaissance, à tous ceux qui de près ou de
loin ont contribué à l'achèvement de ce travail

---

INTRODUCTION
Le RSV humain est un virus qui cause une infection banale chez les
adultes, à moins que ceux-ci soient immunocompromis. Cependant, chez
les bébés, l'infection due au RSV est un problème sérieux, qui nécessite des
études approfondies et le développement d'un vaccin efficace, capable de
protéger cette population cible.
L'étude du RSV humain est un sujet complexe car les travaux faits
jusqu'à présent sont très souvent contradictoires, et effectués sur des
modèles divers, ce qui rend la compréhension de la pathologie de la
maladie très difficile. L'étude de l'infection causée par le RSV, est d'un
grand intérêt encore aujourd'hui, car les phénomènes immunologiques
impliquées dans cette affection demeurent encore obscurs. D'abord, les
maladies les plus sévères, causées par le virus, surviennent durant les 6
premiers mois de la vie, alors que les anticorps neutralisants obtenus de la
mère, sont encore à un taux élevé (Chanock, et al., 1976; Gardner et al.,
1970). Les enfants plus âgés et les adultes, ont des affections moins graves
lors d'une réinfection. De plus, l'expérience de la vaccination avec le virus
inactivé au formol, a démontré que, les anticorps neutralisants et fiXant le
complément, qui avaient été stimulés par ce vaccin, ne jouent aucun rôle
dans la protection, et pourraient plutôt être impliqués dans la pathogénèse
(Chin et al., 1969; Fulginiti et al., 1969; Kapikianet al., 1969; Kim et al.,
1969). TI Ya aussi le fait que, les anticorps provenant probablement de la
mère, augmentent la réplication virale (Krilov et al., 1989; Gimenez et. al.,

---

2
1989). D'autre part, il Y a l'action néfaste des IgE qui pourrait entraîner
une réaction d'hypersensibilité.
Au vu de toutes ces données, nous soupçonnons qu'il y a
probablement une altération de la fonction de certaines cellules. Ainsi,
notre hypothèse de recherche, a été de vérifier le rôle de l'immunité
cellulaire dans la protection.
Notre travail a consisté premièrement, à démontrer la susceptibilité
des cellules du système immunologique au virus.
Dans une seconde étape, il nous a fallu comparer l'activité
cytotoxique, non spécifique (NK) et spécifique (CfL), induite suite à une
infection, par le virus ou par contact avec les protéines de l'enveloppe
virale. Nous avons ensuite vérifié l'induction de cellules suppressives, par
le virus infectieux et par les protéines de l'enveloppe virale.

---

CHAPITRE 1
REVUE
BmLIOGRAPHIQUE

---

4
1.1
LE VIRUS RESPIRATOIRE SYNCYTIAL
1.1.1
Isolement et nomenclature
Le virus respiratoire syncytial (RSV) fut isolé pour la première
fois, à partir d'un écouvillonnage de gorge d'un chimpanzé souffrant de
maladie des voies respiratoires supérieures, par Morris et al., (1956) et fut
appelé "Chimpanzee coryza agent" (CCA). Cet agent transmissible cause un
effet cytopathique caractéristique en culture de tissu.
Une année plus tard, 2 souches humaines, Long et Snyder, furent
isolées sur cellules KB, (carcinome humain) à partir d'un écouvillon de
gorge d'enfants, ayant une affection des voies respiratoires inférieures
(Chanock et al., 1957). Ces deux souches sont, par l'effet cytopathique en
culture de tissu et par leurs propriétés antigéniques, similaires au CCA.
Les souches Long et Snyder, ont la caractéristique de produire de
grands syncytia dans les cellules KB, ce qui emmena Chanock et Finberg
(1957) à les regrouper sous le nom de "virus respiratoire syncytial".
1.1.2
Morphologie et taxonomie
Au microscope électronique, le RSV se présente sous forme de
particules très pléomorphes, sphériques ou filamenteuses (Amstrong et aL.,
1962, Berthiaume et al., 1974; Joncas et al., 1969; Kalica et al., 1973;

---

5
Norrby et al., 1970). Le diamètre des particules varie entre 80 et 500 nm.
Le virus possède une enveloppe bordée de péplomères, de 12 nm de long,
qui renferme une nucléocapside hélicoïdale ou encore, comme le désigne
Zakstelskaya et collaborateurs (1967), en forme de hareng "herring bone
pattern". Le diamètre de la nucléocapside est de 13,5 nm et le pas d'hélice
de 6,5 nm (Bachi et Howe, 1973; Eckert et al., 1965, Berthiaume et al.,
1974; Ito et al., 1973; Joncas et al., 1969; Zakstelskaya et al., 1967)
Le virus respiratoire syncytial fut classé au départ dans le genre
Paramyxovirus, à cause de sa similitude de taille et de forme avec les autres
membres de ce genre. Cependant, des différences existent, dans le diamètre
de la nucléocapside, qui est de 17,5 nm, le pas d'hélice de 5 nm et la
longueur des péplomères de 8 nm chez les Paramyxovirus (Berthiaume et
al., 1974; Joncas et al., 1969; Kingsbury et al., 1978; Zastelskaya et
Shendervoch, 1970). Ainsi, le RSV humain, bovin ainsi que le virus de la
pneumonie de la souris sont classés dans le genre Pneumovirus (Kingsbury
et al., 1978). Ce genre appartient à la famille des Paramyxoviridae, dans
laquelle est aussi classé les genres Paramyxovirus et Morbillivirus.
L'agent étiologique de la rhinotrachéité du dindon (turkey
rhinotracheitis virus), a été proposé récemment comme membre possible du
genre Pneumovirus (Caranagh et Barrett, 1988; Chambers et al., 1990;
Collins et Gough, 1988; Ling et Pringle, 1988).
En plus des différences dans la taille de la nucléocapside et des
projections de surface, entre le genre Pneumo virus
et les genres

---

6
Paramyxovirus et Morbillivirus, le genre Pneumovirus ne possède pas de
neuraminidase. Chez le RSV, l'hémagglutinine est absente, alors qu'elle est
présente chez tous les membres du genre Paramyxovirus , ainsi que chez le
virus de la rougeole, membre du genre Morbillivirus.
1.1.3
Propriétés du virus
1.1.3.1
Propriétés physico-chimiques
Le RSV a une densité de flottaison moyenne de 1,21 g/cm3. En
effet, lors de la purification de ce virus en gradient de saccharose, il migre
à des densités variant entre 1,16 et 1,26 g/cm3 (Chanock et al., 1957; Coates
et al., 1966; Femie et Gerin,1980; Lambert et al., 1980; Levine, 1977;
Trépanier et al., 1981; Ueba, 1978, Wunner et Pringle, 1976). En gradient
de chlorure de césium, la densité du RSV est entre 1,19 et 1,32 g/cm3
(Bloth et Norrby, 1966; Coates et al., 1966; lnaba et al., 1973). en gradient
de métrizamide elle est de 1,16 à 1,20 g/cm3 (Wunner et Pringle, 1976).
Outre les études sur les conditions d'équilibre du RSV, en gradient
de densité, d'autres propriétés physico-chimiques ont été étudiées, et sont
résumées dans le tableau I.

---

7
TABLEAU 1: PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DU RSV.
Stabilité
Sensibilité
Références
ChâDîPs gravitationnels élevéS
Chanock et âl., 1957
Obtention d'un culot par ultra-
Wunner et Pringle, 1976
centrifugation de sumageants de
culture
Chloroforme
Bennett et Hamre, 1962
Déoxycholade de sodium
Bloth et Norrby, 1966
Ether
Chanock et al., 1957
Trypsine 0,25%
Inaba et al., 1963
pH 7,5
pH3
Hambling, 1964
Hamparian et al., 1963
-5oo C à -8oo C
550 C, 5 min
Beemetal.,196O
370 C, 24 heures
Hambling, 1964
Wulff et al., 1964 b.
250 C, 48 heures
40 C, 7 jours
Congélation rapide
Congélation lente
Beem et al., 1960
Gel-dégel
Hambling, 1964
Jo~ 1962
Lait écrémé à 20%
Bennett et Hamre, 1962
Glycérine à 50%
Law et Hull, 1968
Sérum de poulet
Wulff et al., 1964 b.
Saccharose 44,5%
NaO,MgS04
Fernie et Gerin, 1980
Na2S04
Reschteiner, 1969
Phosphate de sodium,
Yamamoto, 1969
glucose, sorbitol, glace
sèche
Mg02
Tai et al., 1974
Milieu de transport avec
Lyophylisation
Klein et al., 1975
bentonite
Wulff et al., 1964 b.
Stabilité: l'infectivité du virus n'est pas affecté.
Sensibilité: l'infectivité du virus diminue ou est complètement abolie.

---

8
1.1.3.2
Purification du virus
Les tentatives antérieures, pour l'obtention de quantités importantes
de virus purifiés, ont été sans succès, à cause de l'extrême labilité du RSV.
Pour cela, le RSV ne peut être soumis à des procédures complètes de
purification (Forsyth et al. 1966; Levine, 1977; Wunner et al., 1975;
Wunner et Pringle 1976).
Une purification en gradient de saccharose ne peut être obtenue, si le
virus a été concentré par ultracentrifugation, sans entraîner une perte
d'infectivité considérable (Wunner et Pringle, 1976).
De plus, après 2
cycles de centrifugation en gradient de saccharose, les pertes d'infectivité,
vont jusqu'à 80% (Trépanier et al., 1981, Ueba, 1978). La purification du
virus en gradient de métrizamide a des résultats peu précis, indiquant, par
des données non publiées, que l'infectivité du virus n'est pas affectée par le
métrizamide (Wunner et Pringle, 1976).
Ces résultats indiquent donc, qu'il n'existe pas encore de milieux de
purification adéquats pour le RSV. Ainsi, une tentative de purification du
virus dans d'autres gradients, serait nécessaire, ce qui explique nos travaux
sur les différentes techniques de purification.
D'autre part, la concentration du virus par obtention d'un culot, a
pour effet de l'inactiver (Wunner et Pringle, 1976). A cause du fait que,

---

9
les particules du RSV ont tendance à s'aggréger, l'infectivité de celui-ci
n'est retrouvée que si, après précipitation du virus au PEG on resuspend le
culot à son volume initial (Senterfit et Baldridge, 1974; Ueba, 1978;
Wunner et Pringle, 1976). Une concentration du RSV avec un rendement
infectieux de
48, 49, 75 et 90% est faite par précipitation au sulfate
d'ammonium, au polyéthylène glycol, par ultrafiltration ou par
concentration sur coussin de saccharose en présence de MgS04 1 M,
respectivement (Femie et Gerin, 1980; Senterfit et Balbridge, 1974;
Trépanier et al., 1981).
Cependant, le PEG, bien qu'ayant un faible
rendement concentre moins de protéines cellulaires, que le sulfate
d'ammonium ou l'ultrafiltration (Trépanier et al., 1981). La précipitation
au PEG ou le coussin de saccharose, seraient donc les méthodes de choix
pour la concentration du virus.
1.1.3.3
Organisation du génome viral
Le génome du RSV est constitué d'une molécule d'ARN
monocaténaire.
Son poids moléculaire est d'environ 5 X 106 daltons
(Huang et Wertz, 1982). Au moins 93% de l'ARN du virion a une polarité
négative (non-messager) (Huang et Wertz, 1982; Lambert et al., 1980;
Wunner et al., 1975). Le génome viral contient 10 gènes distincts, codant
chacun pour une protéine donnée (Huang et al., 1984, 1985). Les séquences
de 9 de ces gènes à l'exception du gène L ont été jusqu'ici complètement

---

10
détenninées (Collins et al., 1984a, b, c; Collins et Wertz, 1983; Elango et
Venkatesan, 1983; Satake et al., 1984; Satake et Venkatesan, 1984;
Venkatesan et al.,1983a, b; Wertz et al., 1985). L'ordre des gènes tel que
déduit par l'analyse d'ARN polycistroniques est le suivant: 3' NS 1-NS2-NP-
P-M-NS3-G-F-M2-L 5' (Collins et al.,1984 b; Collins et Wertz, 1983,
1985 a; Dickens et al.,1984).
Le génome du RSV contient un seul
promoteur précédant le gène NS1 (Dickens et al., 1984).
1.1.3.4
Nature, nombre et fonction des polypeptides
Dès les débuts des travaux sur les protéines du RSV, il n'existait pas
d'unanimité sur le nombre et la taille de ces protéines. Une des causes de
cela est la difficulté de produire et de purifier ce virus.
Ainsi, après
analyse et comparaison du profil électrophorétique et de la cartographie
peptidique avec les résultats obtenus par les techniques de clônage
moléculaire, de séquence des nucléotides, d'hybridation et de traduction
(Collins et al., 1984; Collins et Wertz, 1983; Elango et Venkatesan, 1983;
Satake et al., 1984; Satake et Venkatesan, 1984, Venkatesan et al., 1983 a,
b), entre 6 et 10 protéines ont été décrites. Ces travaux sont resumés dans le
tableau II. D'après ces travaux, nous retiendrons que le RSV possède au
moins 8 protéines de structure, dont 2 glycosylées.
Les deux autres
protéines sont non structurales. Les caractéristiques de ces polypeptides sont
résumées dans le tableau ill.

---

TABLEAU II:
RÉsuMÉ DES TRAVAUX SUR LES PROTÉINES DE STRUCTURE DU VIRUS
RESPIRATOIRE SYNCYTIAL.
Wunner
Cash et al
Levine (1977)
Peepleset
Berstein et
Pringle et al
et Pringle (1976) (1977)
Levine (1979)
Hruska (1981)
(1981)
2001
200
160
GP2 79
GP90
GP92
73
GP48
GP48
GP56
GP49
GP50
GP48
GP42
GP42
44
44
44
41
41
41
38
38
32
32
32
35
32
27
27
28
28
28
27
25
25
25
25
25
GP22
22
21
GP 17
10
10
Nom1rede
protéines
1
7
6-8
7
7-8
8
7
Nom1rede
glycoprotéines
1
1-2
1-2
3
2-3
3
1
1: Les tailles sont exprimées en kilodaItons
2: Glycoprotéines

---

TABLEAU TI:
(suite)
Dubovi (1982)
Femieel
Trépanier
Larnbertel
Walsh
Huang et al. (1983)
Gerin (1982)
et al. (1983)
Pons (1983)
Hroska (1983
200
180
L
140
GP86
GP84
GP90
GP89
GP90
G
68
67
50
GP66
GP68
GP48
GPSO
F
4S
40
42
42
44
N
GP43
36
37
34
34
33
F
33
27
28
28
28
27
M
22
24
24
IS
12
13
10
Noml:rede
1
9
10
9
8
8
7
protéines
Noml:rede
1
1
2
2
2
2
2
glycoprotéines

---

12
TABLEAUill:
CARACTÉRISTIQUES DES PROTÉINES DU
RSV.
Protéines
Réfél'ences
L
P.M., 2001{, polymérase, présente dans la
McIntoshet
nucléocapside.
Chanock, 1985.
G
P.M., 84 - 90 K glycosylée. nombreux liens 0,
Collins et Wenz, 1985; Levine
extrémité bydrophobe, protéine de surface de
et al., 1987; MCIntosh et
l'enveloppe virale
Chanock. 1985.
F
P.M., 68-701{, fusion des cellules infectées,
Walsh et Hruska, 1983b;
protéine de surface de l'enveloppe virale, clivage de
MCIntosh et Chanock, 1985.
Po- Fl(48K) et F2 (20K)
N
P.M., 42-441{, nucléoprotéine, étroitement lié à
MCIntosh et Chanock. 1985.
l'ARN génomique
P
P.M., 32-35 1{, JXésente dans la nucléocapside,
MCIntosh et Chanock, 1985.
phosphŒyIiée et relativement acide
Satake et al., 1984.
M
P.M., 27-28K associée à la matrice
Collins et al.• 1984c,
Collins et Wenz, 1985;
MCIntosh et Chanock. 1985.
M2
P.M., 22 1{, Basique et hydrophyle localisée dans
Collins et al, 1984; Satake et
l'enveloppe virale, sert de lien entre la
Venkatesan. 1984; Roudegde et
nuc1éocapside et la membl3ne.
al., 1987 a.
NSI
P.M•• (15,6 K), non structurale, enCŒe appeléelC,
Venkatesan et al., 1983 b.
legèrement acide, fonction inconnue.
Venkatesan et al., 1983 b.
NS2
P.M., (14.7K), non structurale, encore appelée lB
fonction inconnue basique.
NS3
P.M., encore appelée SR ou 1 A, protéine
Collins et Wenz, 1985;
transmembranaire, retrouvée sous 2 fonnes
Olmsted et Collins 1989.
(glycosy1ée ou non) noyau fortement
hydrophobe

---

13
1.1.3.5
Propriétés biologiques
1.1.3.5.1
Comportement en culture cellulaire
Le virus respiratoire syncytia1 humain a été isolé au début sur
cellules "Chang" de foie humain (Morris et al., 1956), et cellules "KB" de
carcinome humain (Chanock et al., 1957). Les études subséquentes ont
montré que plusieurs systèmes cellulaires sont sensibles au RSV. En effet,
les cellules diploïdes fœtales humaines (He1-1 et WI-38) sont très
appropriées pour l'isolement du virus (Anderson et Beem, 1966).
Bromberg et al., (1984) recommandent l'inoculation immédiate plutôt que
tardive de sécrétions nasopharyngées sur cellules HEp-2. La combinaison
de fibroblastes de poumons (WI-38 ou MRC-5) avec des cellules primaires
de singe (RhMK) et des cellules HEp-2 a amélioré le rendement du RSV
(Arens et al., 1986).
Le virus se cultive et se reproduit très bien sur
cellules HEp-2, Hela, Vero, LLCMK2, BSC-1, CV-l, ainsi que sur des
cellules primaires de rein de singe (Bennett et Hamre, 1962; McIntosh et
Chanock, 1985; Pons et al., 1983; Wulf et al., 1964 b). Cependant, les
cellules HEp-2 en phase active de croissance ont un rendement supérieur
aux mêmes cellules en phase stationnaire (Pons et al., 1983). Cette lignée
cellulaire reste de loin la meilleure en ce qui concerne la production virale.
En dehors des tapis cellules, il a été démontré que le RSV peut
infecter les monocytes-macrophages, ainsi que les lymphocytes (Domurat et
al., 1985, Gimenez et al., 1989; Krilov et al., 1989; Midulla et al., 1989;
Panuska et al., 1990). Les études démontrant l'infection cellulaire, ont été

---

14
faites par immunofluorescence dans la plupart des cas. L'organe-cible est le
poumon, car le virus cause des maladies pulmonaires, très sévères et
souvent fatales (Hall et al.,1986; Milner et al., 1985), mais, une extension
extrapulmonaire a été déjà démontrée, par l'isolement du virus à partir de
myocarde de personnes immunodéficientes (Fischaut et al., 1980), ainsi que
de la rate et des reins d'animaux infectés avec le RSV (Wong et al., 1985).
Un article récent rapporte l'isolement du RSV, à partir du foie d'un enfant
souffrant d'atrésie extrahépatique biliaire chronique (Nadal et al., 1990).
Ces dernières données pourraient être la preuve d'une virémie lors d'une
infection par le RSV.
Les études faites sur le cycle de multiplication ont montré que le
VIruS respiratoire syncytial s'adsorbe très lentement à la surface des
cellules. En effet, 50 à 60% des particules virales sont adsorbées entre 30
minutes et 2 heures, mais il faut plus de 10 heures pour que 96% des
particules soient adsorbées (Bennett et Hamre, 1962; Levine et Hamilton,
1969; Richman et Tauraso, 1971). La période d'éclipse est de 10 à 12
heures (Jordan, 1962; Levine et al., 1977). La latence dure 12 à 16 heures
(Jordan, 1962). Pendant une partie de cette période, il y a synthèse des
antigènes viraux (Levine et al., 1977). La production de virions matures
commence vers la IDe et 14e heure et se continue dépendamment de l'indice
de multiplicité (m.o.i.). Au cours de cette période, le virus est produit,
mais plus de 90% des particules virales reste associé aux cellules (Bennett et
Hamre, 1962; Jordan, 1962; Lambert et al.,1980; Levine et Hamilton,
1969; Richman et Tauraso,1971; Wunner et al., 1975). En principe, pour

---

1 5
une m.o.i. de 1, la produciton virale est à son maximum au bout de 24
heures post-infection, alors qu'avec une m.o.i. inférieure à 1, le titre
infectieux est maximal 72 heures après l'infection (Kisch et al., 1962).
Du point de vue de la morphogénèse, il a été démontré qu'environ
12 heures après l'infection apparaissent des corps d'inclusions éosinophiles,
intracytoplasmiques ou périnucléaires (Armstrong et al., 1962; Berthiaume
et al., 1974; Kalica et al., 1973; Norrby et al., 1970). Ces inclusions sont
constituées de matériel électro-dense d'aspect amorphe ou granulaire
(Armstrong et al., 1962; Berthiaume et al., 1974).
Elles contiennent
probablement les nucléocapsides et les phosphoprotéines, d'après l'étude de
réactivité avec les anticorps monoclonaux dirigés contre ces 2 types de
protéines (Cote et al., 1981; Stott et al., 1984). La maturation des particules
virales par bourgeonnement, a lieu lorsque ces inclusions se trouvent au
voisinage de la membrane cytoplasmique de la cellule-hôte ou des vésicules
présentes dans le cytoplasme.
TI y a aussi apparition des franges de
péplomères (Bachi, 1988; Bachi et Howe, 1973; Berthiaume et al., 1974;
Norrby et al., 1970).
Le virus respiratoire syncytial produit en culture de cellules, un
effet cytopathique caractérisé par un arrondissement des cellules, suivit
d'une fusion de celles-ci pour former des cellules géantes multinucléées,
appelées syncytia
(Chanock et al., 1957; Rowe et Michaels, 1960).
Le
titre du virus est déterminé par le dénombrement de foyers de cellules
fluorescentes (Schieble et al., 1967) ou en comptant les
syncytia

---

16
visuellement (Coates et al., 1966) ou encore à l'aide d'un microscope
(Trépanier et al., 1980). Cette dernière technique se fait sur microplaques
et pennet de titrer plusieurs échantillons à la fois et de faire la lecture des
résultats, au bout de 3 jours p.i., après coloration au violet de crystal. Une
technique d' immunoperoxidase a été adaptée récemment, et permet
d'évaluer le titre viral en moins de 36 heures p.i. (Cannon, 1987; Bélanger
et al., 1988 a).
1.1.3.5.2
Particules défectives interférantes
Les particules défectives interférantes (DI) sont produites après des
passages multiples in vitro du RSV non dilué (Treuhaft, 1983, 1984;
Treuhaft et Boom, 1982). Ces particules protègent les cellules de l'effet
cytopathique par interférence avec la réplication du virus standard. Avec
l'apparition des particules DI, il Y a réduction de la production de virus
infectieux, bien que les antigènes viraux soient exprimés à la surface des
cellules.
La production d'interféron augmente et il peut y avoir
établissement d'infections persistantes. La génération des particules DI in
vivo n'a pas encore été rapportée. Cependant, certains chercheurs (comme
Treuhaft, 1983), pensent qu'un tel phénomène in vivo pourrait avoir un
effet sur l'infection, soit en l'augmentant, soit en l'atténuant. De même, les
antigènes exprimés à la surface des cellules protégées pourraient servir de

---

17
cibles pour les mécanismes effecteurs (NK, ADCC, CTL, etc.) qui
interviennent dans la lutte contre l'infection.
1.1.3.5.3
Infections persistantes
Les infections persistantes sont un phénomène issu de l'infection avec
des mutants thermosensibles (ts) (Pringle et al., 1978; Simpson et Iinuma,
1975), de la culture de cellules ayant survécu à la lyse par le virus sauvage
(Peeples et Levine, 1981; Simpson et Iinuma, 1975) ou aussi de l'infection
par des particules DI (cf 1.1.3.5.2). L'information virale est transférée
d'une cellule à l'autre, lors de la division des cellules infectées de façon
persistante. Ces cellules sont résistantes à la surinfection avec le virus
standard, produisent de petites plages et expriment les antigènes viraux à
leur surface (Peeples et Levine, 1981; Pringle et al., 1978; Simpson et
Iinuma, 1975). Des infections persistantes ont été établies in vitro sur des
cellules humaines (Baldridge et Senterfit, 1976), sur des cellules de souris
(Femie et al., 1981), ainsi que sur des cellules de singe (Mills et al., 1980,
1981; Pringle et al., 1978). Leur existence in vivo pourrait avoir le même
rôle que celui des cellules produisant des particules DI sur les mécanismes
effecteUrs (cf 1.1.3.5.2).

---

18
1.1.3.5.4
Recherche d'une activité hémagglutinante. hémadsorbante et
neuraminidase.
L'activité hémagglutinante et hémadsorbante a été recherchée par
analogie avec les autres membres de la famille des Paramyxoviridae et des
Orthomyxoviridae, où cette activité est retrouvée dans la plus grosse des
glycoprotéines de surface, la HA ou RN. La démonstration de ces activités
chez le RSV est demeurée vaine jusqu'à maintenant (Beem et al., 1960;
Chanock et al., 1957; Richman et al., 1971).
L'activité neuraminidase
retrouvée chez les Orthomyxovirus, et chez certains membres des
Paramyxovirus comme le virus Sendai, n'existe pas chez le RSV (Choppin
et Scheid, 1980).
1.1.3.5.5
Susceptibilité des animaux au RSV
On sait que plusieurs espèces animales sont infectables par le RSV.
Parmi celles-ci, il yale chimpanzé, le boeuf et le veau (Chanock et al.,
1957; Kimman et al., 1988, 1989; Kingsbury et al., 1978; Morris et al.,
1956; Prince et Porter, 1976). Des anticorps fixant le complément ont été
détectés chez le chien (Lundgren et al., 1969), et chez le mouton
(Berthiaume et al., 1973). Kalter et Heberling, (1971) ont démontré que,

---

1 9
l' orang-outang, le rhésus, le patas, le lagotrix, possèdent des anticorps anti-
RSV.
Ce virus cause des infections respiratoires chez le bétail (Inaba et
al., 1972; Paccaud et Jacquier, 1970,; Scott et al., 1980). La chèvre est
infectée par un virus ressemblant au RSV bovin et humain (Lehmkuhl et al.,
1980; Smith et al., 1980).
Le besoin d'un modèle animal, dont la pathologie du RSV ressemble
à celle de l 'homme, a donné lieu à plusieurs essais d'infections
expérimentales chez les animaux. Ainsi, l'inoculation intranasale du RSV, à
certaines espèces animales a montré que, le cobaye, le furet, le chinchilla,
le marmouset, le vison, le lapin, le rat, ne développent pas de maladie, mais
produisent des anticorps fixant le complément et neutralisants (Adams,
1970, Chanock et al., 1957; Coates et Chanock, 1962; Coates et al., 1968;
Prince et Porter, 1976; Taylor et al., 1984 b). La souris est sensible au
RSV (Coates et Chanock, 1962; Scott et al., 1986; Taylor et al.,1984 b),
mais ne développe de signes pathologiques que lorsque l'inoculum utilisé
contient un titre élevé de virus (Graham et al., 1988).
Le singe-
écureuil adulte, le singe rhésus nouveau-né, le singe cébus nourrisson,
infectés,
sécrètent
du virus, mais ne font pas de maladie (Belshe et
al.,1977; Hemming et al., 1988).
Enfin,
le
hamster
et
l'agneau
sont sensibles au RSV
(Lehmkuhl et Cutlip, 1979; Skovikova et al., 1983;
Wright et al., 1970). Parmi tous les animaux testés, le nourrisson furet, la
souris et le rat du coton sont de bons modèles pour la compréhension de la

---

20
pathologie du RSV, car leur affection ressemble à celle de l 'homme, à
savoir, la présence de lésions, bronchiolites et pneumonies (Dreizin et al.,
1971; Prince et al., 1978; Prince et Porter, 1976).
1.1.3.6
Propriétés antigéniques
1.1.3.6.1
Structure antigénique
Dès le début des travaux sur le RSV, la présence d'un antigène fIXant
la complément est rapportée (Chanock et al., 1957). Plus tard, 2 antigènes
A et B, ayant des densités différentes en gradient de chlorure de césium
(CICs) sont signalés (Coates et al., 1966). Ces 2 antigènes stimulent la
production d'anticorps fIXant le complément. L'antigène A provoque en
plus, l'apparition d'anticorps neutralisants.
L'antigène A est associé à
l'enveloppe virale et l'antigène B à la nucléocapside. La présence d'un
troisième antigène est aussi rapportée (ForsYth et al., 1966). Cependant, les
travaux de biologie moléculaire ont pennis de démontrer que le RSV
possède plusieurs antigènes de structure (Collins et al., 1984 b, 1985, 1986;
Collins et Wertz, 1983, 1985; Dickens et al., 1984). Et, il est probable que
les antigènes de surface de l'enveloppe du virus ne soient pas les seuls à
stimuler les mécanismes immunologiques (McIntosh et Chanock, 1985).

---

21
1.1.3.6.2
Variations antigéniques
L'utilisation d' antisérums humains a démontré que le RSV possèdait
un seul sérotype (Coates et al., 1963, Wulf et al., 1964 a). Cependant, des
différences parmi les isolats ont été observées par neutralisation à l'aide de
sérums immuns (Beem, 1967; Coates et Chanock, 1962; Coates et al., 1963,
1966, Doggett et Taylor-Robinson, 1965; Hierholzer et Hirch, 1979), par le
profil électrophorétique des protéines virales (Cash et al., 1977), par la
réactivité avec les anticorps monoclonaux (Gimenez et al., 1984; Ward et
al., 1984) et par la carte peptidique (Ward et al., 1984).
Les techniques de radioimmunoprécipitation, d'immunofluorescence
et d'ELISA, en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre plusieurs
protéines, dont celles de l'enveloppe ainsi que les techniques d'hybridation
moléculaire, ont permis de distinguer 2 sous-groupes antigéniques majeurs
1 et 2 ou A et B (Anderson et al., 1985; Mufson et al., 1985; Sullender et
al.,1990). De plus, l'existence d'un troisième groupe a été notée (Anderson
et al., 1985), ainsi que la présence de souches n'appartenant à aucun groupe
et dites "intermédiaires", (Hendry et al., 1986).
Lors d'une épidémie, les souches des 2 sous-groupes se retrouvent
couramment, avec une prédominance des souches du sous-groupe A (Monto
et Ohmit, 1990; Mufson et al., 1988; Tsutsumi et al., 1988). Les infections

---

22
causées par les souches du sous-groupe A sont plus sévères que celles dues
aux souches du sous-groupe B (McConnochie et al., 1990). Ces 2 sous-
groupes sont rencontrés à travers le monde (Anderson et al., 1985 Akerlind
et Norrby, 1986; Gimenez et al., 1986; Hendry et al., 1986; Morgan et al.,
1987; Mufson et al., 1985, 1988; Storch et Park, 1987; Tsutsumi et al.,
1988).
Les différences antigéniques majeures observées parmi les 2 sous-
groupes résident dans la protéine G, mais, des variations de souches existent
aussi au niveau de la protéine F, de la nucléoprotéine, de la phosphoprotéine
et de la protéine M (Anderson et al., 1985, 1986; Bangham et Askonas,
1986; Gimenez et al., 1986; Hendry et al., 1986; Johnson et Collins, 1988;
Johnson et al., 1987; Mufson et al., 1985; Norrby et al., 1986). Ces
différences concernent à la fois la séquence des nucléotides, des acides
aminés (Baybutt et Pringle, 1987; Collins et al., 1984 c; Johnson et Collins
1988; Johnson et al., 1987) et les épitopes (Anderson et al., 1985, 1986;
Johnson et al., 1987; Mufson et al., 1985).
Les techniques d'immunofluorescence, d'inhibition compétitive ainsi
que le pattern de neutralisation par des anticorps monoclonaux dirigés
contre la protéine de fusion F, de souches cliniques de RSV ainsi que de
souches mutantes resistantes à des anticorps monoclonaux ont révélé entre 2
à 3 épitopes sur la nucléoprotéine, 3 à 6 épitopes sur la protéine G et 1 à 16
épitopes sur la protéine F, (Anderson et al., 1985, 1986; Beeler et van

---

23
Wyke Coelingh, 1989; Trudel et al., 1987; Tsutsumi et al., 1987; Walsh et
al., 1986, 1987 a).
Certains épitopes sur la protéine F sont soit des épitopes de
neutralisation, soit d'inhibition de la fusion des cellules infectées. Panni les
souches du même sous-groupe, il existe des variations antigéniques
(Akerlind et Norrby, 1986; Morgan et al., 1987).
TI a été d'ailleurs
démontré que les souches du sous-groupe B peuvent être subdivisées en 2
sous-groupes B1 et B2, dont la différence se situe au niveau de l'épitope G2
de la protéine G (Akerlind et al., 1988). Une hétérogénéité génomique a
été détectée parmi les isolats du sous-groupe A (Storch et al., 1989). Ces
variations sont un critère dont on doit tenir compte du point de vue
clinique, épidémiologique et prophylaxique.
1.1.4 Épidémiologie
Panni les 5 familles de virus qui causent des maladies respiratoires
chez l'homme (Tableau IV), le virus respiratoire syncytial est le plus
important agent pathogène des enfants en bas âge (Glezen et Denny, 1973;
Kim et al., 1973; Lennette, 1981; Parrott et al., 1973). TI est la cause des
plus importantes épidémies de bronchiolites et de pneumonies, surtout chez
les nourrissons et les jeunes enfants (Beem et al.,1960; Chanock et al., 1961;
Chanock et Parrott, 1965; Elliott, 1979; Kapikian et al., 1961; Lennette,

---

24
1981; Tyrell, 1965). De plus, les enfants qui guérissent de ces bronchiolites
ont tendance à faire de l'asthme récurrente plus tard dans leur vie
(McIntosh, 1976; Webb et al., 1985).
Les épidémies surviennent régulièrement chaque année. Dans les
zones tempérées, elles s'étendent de novembre à avril dans l'hémisphère
nord, avec un pic au mois de février (figure 1) (Kim et al., 1973; Mufson et
al., 1973). Dans l'hémisphère sud, les épidémies ont lieu entre le mois
d'avril et septembre.
Dans les régions tropicales et sub-tropicales, les
épidémies ont lieu pendant la saison chaude et pluvieuse (Florman et
Mclaren, 1988; McKay et al., 1988).
Les infections sont très graves chez les enfants de moins de 5 ans,
notamment ceux entre 6 semaines à 6 mois, avec un pic de fréquence à l'âge
de 2 mois.
Le taux d'hospitalisation est en moyenne de 9 0/00 et la
mortalité de 0,5 à 2,5% (Clark et al., 1978; Coates et Chanock, 1964;
Elliott, 1979; Garden, 1973; Glezen et al.,1981; Kim et al., 1973; Lennette,
1981; Orstavik et al., 1980; Parrott et al., 1973). La proportion d'enfants
possédant des anticorps neutralisants augmente avec l'âge, ainsi 80% des
enfants de moins de 4 ans ont déjà été en contact avec le virus (Beem et al.,
1964; Chanock et Finberg, 1957; Hambling, 1964).
Bien que le risque d'infection soit excessivement élevé chez les
nourrissons et plus les jeunes enfants (Chanock et al., 1976; Hall et al.,
1979; Krasinsky, 1985), les adolescents, les adultes et les personnes âgées en
sont aussi victimes (Agius et al., 1990; Crane et al.,1981; Finger et al.,

---

25
1987; Fransen et al., 1967; Grist et al., 1967; Hamre et Procknow, 1961;
Johnson et al., 1961; Levenson et Kantor, 1987; Mathur et al., 1980; Milder
et al., 1979; Spelman et Stanley, 1983; Vikerfors et al., 1987). Des données
récentes ont fait mention du rôle croissant de l'infection à RSV chez les
adultes et principalement les personnes âgées (Garvie et Gray, 1980;
Sorvillo et al., 1984). L'infection chez les adultes est caractérisée par une
affection des voies respiratoires supérieures, une bronchite et de l'asthme
dans certains cas (Gardner, 1973).

---

26
TABLEAU IV:
VIRUS DU SYSTEME RESPIRATOIRE CHEZ
L'HOMME.
Famille
Genre
Types et groupes
Orthomyxoviridae
lnfluenzavirus
Influenzavirus
types A, B et C
Paramyxoviridae
Paramyxovirus
Parainfluenzavirus
Type 1-4
Pneumovirus
Virus respiratoire
syncytial (RSV)
Picomaviridae
Rhinovirus
111 sérotypes
Entérovirus
Coxackievirus,
groupe A, 23 types
groupe B, 6 types
Echovirus, 31 types
Entérovirus, 4 types
Coronaviridae
Coronavirus
3 types
Adénoviridae
Mastadénovirus
36 sérotypes
D'après Lennette H.W, Bull. Wld Hlth. Org. 52, 305-324, 1981.

---

27
FIGURE 1:
AFFECTIONS RESPIRATOIRES DUES AUX VIRUS
GRIPPAUX A ET B, AUX VIRUS PARAINFLUENZAE,
AU VIRUS RS, MOIS PAR
MOIS, DANS L'HEMISPHERE
NORD
10000 . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - .
9000
8000
l
7000
J
.. 6000
"4>
;;
C
CI
0;;;
5
.. 5000
'tl
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E
o
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VIRUS RS
3000
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2000
VIRUS
i
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PARAINFlUENZAE ,,-.......
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J A S
0
N D
J
F M
A M
J
Moi,
Oîv'1S, série de rapports techniques, nO 642, 1980.

---

28
Les nourrissons, les enfants et les adultes immunocompromis (Crane
et al., 1981; Englund et al., 1988; Fishaut et al., 1980; Hall et al., 1986;
Jarvis et al., 1983; Kasupski et Leers, 1983; Milder et al., 1979; Milner et
al.,1985), les nourrissons ayant des maladies cardiaques congénitales
(MacDonald, et al., 1982), les enfants suivant une chimiothérapie
anticancéreuse (Hall et al., 1988), les adultes transplantés cardiaques ou
ayant reçus une greffe de la moëlle osseuse (Martin et al., 1988; Sinnott et
al., 1988), sont des sujets à risque, dont l'infection est souvent une
bronchiolite ou une pneumonie parfois fatale.
Le RSV est hautement contagieux et se propage très bien dans les
groupes d'enfants, les familles et les hôpitaux (Hall et al., 1975, 1976;
Henderson et al., 1979). La voie d'infection la plus propice est le nez et les
yeux, la bouche étant moins sensible (Hall et al., 1981). La réinfection est
commune chez les enfants et les adultes, et joue un rôle important dans la
diffusion du virus (Beem, 1967; Freymuth et al., 1980; Johnson et al.,
1962; Henderson et al., 1979). Des études ont montré que 33 à 93%
d'individus possédait des anticorps fixant le complément, prouvant la
fréquence des réinfections. La présence de ces anticorps est le signe d'une
infection récente, car ils ne restent pas longtemps dans l'organisme,
contrairement aux anticorps neutralisants (Doggett, 1965; Hambling, 1964).
Le risque de primo-infection chez les nourrissons et les jeunes enfants est de

---

29
98%, la possibilité d'une seconde et d'un troisième infection de 75 et 65%
respectivement (Henderson et al., 1979).
Au vue de tout ceci, une protection des nourrissons et des personnes
à risque est nécessaire.
1.1.5 Immunologie
Plusieurs observations ont, à la suite des problèmes observés jusqu'à
maintenant (atteintes sévères chez les nourrissons agés de moins de six mois)
suggéré le rôle des facteurs immunologiques, dans la pathogénèse du RSV
(Chanock et al.,1976; McIntosh et Fishaut, 1980). Ainsi, plusieurs théories
ont été énoncées à ce sujet.
La première, est qu'il se produit dans les poumons, une interaction
entre les anticorps développés lors de la vaccination, et les antigènes lors de
l'infection naturelle chez les nourrissons dépourvus d'IgA sécrétoires
(réaction de type ID) (Chanock et al., 1970).
La seconde théorie est en faveur d'une pré-sensibilisation des
lymphocytes circulants, lors d'un premier contact avec le virus (Gardner et
al., 1970).

---

30
La troisième indique qu'il y aurait participation de l'immunité à
médiation cellulaire, notamment les lymphocytes dérivés du thymus (Kim et
al., 1976).
Une autre est basée sur les leçons et observations tirées des essais de
vaccination avec le RSV, qui n'ont pas induit de titres d'anticorps adéquats
contre certaines protéines spécifiques du RSV, comme la protéine F de
fusion.
Les nourrissons pourraient aussi, avoir perdu sélectivement les
anticorps maternels anti-F.
TI serait donc nécessaire d'examiner chaque volet de l'immunité,
suite à l'infection par le RSV.
1.1.5.1
Immunité humoral~
1.1.5.1.1
Production d'anticotps sériques
Après la primo-infection, il y a production d'anticorps, dont le taux
semble diminuer au cours de l'année suivant l'infection (Welliver et al.,
1980 a). De hauts titres d'anticorps sont ensuite produits lors d'infections
subséquentes, et persistent longtemps (Henderson et al., 1979; Welliver et
al.,1980 a).
Les anticorps produits sont neutralisants et fixent le
complément (Chanock et al., 1970; Fulginiti et al., 1969; Kim et al., 1969;

---

3 1
Parrott et al., 1973; Routledge et al., 1988).
Les immunoglobulines
produites sont de type IgM, IgA et IgG (Kaul et al., 1981; Meurman et al.,
1984; Murphy et al., 1986 b; Nandapalan et al., 1984, 1986; Watt et al.,
1986; Wagner et al., 1986; Welliver et al., 1980 a).
Des études plus approfondies ont démontré que, les anticorps
produits à la suite d'une infection par le RSV humain réagissent avec toutes
les protéines de structures du virus (Gimenez et al., 1987; Ward et al.,
1983), et principalement avec les protéines de l'enveloppe (G et F) (Levine
et al., 1988; Murphy et al., 1986 b; Routledge et al., 1988; Ward et al.,
1983; Watt et al., 1986).
Des anticorps anti-idiotypiques ont été induits. Ils réagissent avec la
protéine G, et neutralisent le RSV (pa1emo et al., 1990). On observe aussi
des réactions croisées, avec les souches des sous groupes A et B (Palomo et
al., 1990). Mais, en dépit du fait qu'on détecte des anticorps, leur rôle dans
la résistance est sujet à controverses (Bruhn et Yeager, 1977; Chanock et
al., 1976; Gardner et al., 1970; Parrott et al., 1973).
De plus, ni les
anticorps, neutralisants, ni ceux fixant le complément, ne semblent avoir de
relation, aussi bien avec la sévérité de la maladie que la résistance à
l'infection. D'ailleurs, l'expérience de la vaccination avec le virus inactivé
au formol a démontré que, bien que ce vaccin ait stimulé la production de
taux significatifs d'anticorps neutralisants et fixant le complément, il ne
confère aucune protection chez les sujets vaccinés (Fulginiti et al., 1969;
Kapikian et al., 1969; Kim et al., 1969).

---

32
1.1.5.1.2
Production d'anticorps locaux
En cas d'infection par le RSV, l'organe-cible est le poumon, mais les
voies nasales sont les premières infectées; cependant, bien que l'immunité
dans les voies nasales soit de moins longue durée que celle dans les
poumons, elle n'en est pas moins importante. De plus, elle augmente à la
suite des infections et de l'âge (Henderson et al., 1979; Kim et al., 1969;
Scott et Gardner, 1970, 1974). Ces anticorps sont aussi de type IgA, IgG et
IgM (Anderson et al., 1990; Kaul et al., 1981; Homsleth et al., 1984;
McIntosh et al., 1978, 1979; Welliver et al., 1980 a). On peut les retrouver
attachés aux cellules de l'épithélium respiratoire, avec une prédominance
des IgA (Gardner et McQuillin, 1978; Kaul et al., 1982 a; McIntosh et al.,
1979), ainsi que dans les tissus lymphoïdes des muqueuses (Okamoto et al.,
1988). Les anticorps neutralisants locaux semblent prévenir l'infection des
voies respiratoires supérieures (Mills et al., 1971).
De plus, le rôle
protecteur des anticorps locaux a été démontré chez le bétail (Mohanty et
al., 1976).
Malgré toutes ces données, la protection conférée par les anticorps
sécrétoires est insuffisante, sinon absente chez les nourrissons. D'ailleurs, il
existe encore beaucoup de controverses. Kim et al. (1971) trouvent, par
exemple, qu'une majorité de bébés de moins de 6 mois démontrent une

---

33
activité neutralisante dans leurs sécrétions nasales après une infection, alors
que McIntosh et al. (1978) concluent plutôt qu'après l'infection naturelle au
RSV, l'activité neutralisante dans les sécrétions nasales varie beaucoup, et
que souvent, chez les nourrissons ces anticOIps sécrétoires ne neutralisent
pas le virus in vitro.
Alors que Mills et al. (1971) parlent de l'effet des
anticorps locaux dans l'immunité, Kaul et al. (1981) déduisent que ces
anticorps jouent un rôle mineur dans la guérison.
1.1.5.1.3
Rôle des anticorps maternels
1.1.5.1.3.1
Anticorps aCQuis par voie transplacentaire
Les anticorps acquis par voie transplacentaire protègent dans une
certaine mesure contre les maladies pulmonaires (Frank et al., 1982; Glezen
et al., 1981; Lamprecht et al.,1976; Ogilvie et al., 1981; Wong et Ogra,
1986).
Cette protection correspond probablement au moment où les
anticorps maternels sont à leur taux le plus élevé (Ogilvie et al.,1981;
Parrott et al., 1973). Ainsi, on observe des cas de bronchiolites et de
pneumonies modérées chez les nourrissons âgés de moins de 3 mois, et chez
lesquels le taux d'anticorps maternels est très élevé (Hall et al., 1979;
Neligan et al., 1970).
La sévérité de la pneumonie est inversement
proportionnelle aux taux d'anticorps neutralisants préexistants (Glezen et
al., 1981; Lamprecht et al., 1976).
Chez ces enfants ayant un taux

---

34
d'anticorps maternels élevé, la quantité et la durée de production du virus
sont réduites.
De plus, il y a une relation entre le taux d'anticorps
neutralisants à la naissance, et l'âge au moment de la primo-infection. Mais,
bien que les observations mentionnées suggèrent que les anticorps maternels
protègent des infections, la corrélation entre le taux de ces anticorps et la
protection est encore incertain, et d'ailleurs, des maladies plus sévères
surviennent alors que les enfants possèdent encore un taux modéré
d'anticorps maternels (Scott et Taylor, 1985).

---

35
1.1.5.1.3.2
Anticoms acquis par le lait et le colostrum
Concernant toujours le rôle des anticorps maternels dans la
protection contre le RSV, des études ont cité les effets bénéfiques des
anticorps du lait maternel sur l'infection.
D'après certains auteurs, la
maladie est moins sévère chez les enfants nourris au sein (Berman et al.,
1983; Downham et al., 1976; Evans-Joneset al., 1978; Fishaut et al., 1981;
Glezen et Denny, 1973; Mito et al., 1984; Pullan et al., 1980; Toms et al.,
1980). Un effet similaire a été observé chez l'animal expérimental (peri et
al., 1982; Prince et al., 1983; Suffin et al., 1977, 1979). Mais, l'évidence
de toutes ces observations n'est pas encore établie car, d'autres travaux font
mention d'un rôle protecteur plutôt incertain (Nandapalan et al., 1987;
Taylor et al., 1982).
1.1.5.1.3.3
Anticotps aCQuis par transfert passif
L'administration d'un sérum contenant un titre élevé d'anticorps
neutralisants, par voie orale ou intrapéritonéale, au furet nourrisson, ne
le protège pas contre une infection subséquente (Suffm et al., 1979). Chez
le rat du coton par contre, le transfert passif de sérum immun entraîne une
protection presque complète de la réplication virale dans les poumons
(Prince et al., 1983, 1985 a et b). De même, une protection des poumons

---

36
est observée chez le rat du coton et la souns, après transfert passif
d'anticorps monoclonaux dirigés contre les 2 protéines de l'enveloppe du
virus (Taylor et al., 1984 a; Walsh et al., 1984 a). Mais, dans tous ces cas,
ces anticorps n'empêchent pas la réplication virale au niveau de l'épithélium
nasal. Bien que certains auteurs aient parlé de protection, le mécanisme
n'est pas encore clair et, il est possible que la protection ne soit pas due à la
neutralisation (Scott et Taylor, 1985).
1.1.5.2
Immunité cellulaire
1.1.5.2.1
Transfonnation des lymphocytes
Après une infection naturelle, expérimentale ou une vaccination, on
peut observer un phénomène de
transformation des lymphocytes en
présence d'antigènes RSV, chez 40% d'adultes et
70 % de nourrissons
(Cranage et Gardner, 1980; Femald et al., 1983; Kim et al., 1976; Mito et
al., 1984; Schauf et al., 1979; Scott et al., 1978, 1981, 1984; Welliver et
al., 1979). Une transfonnation des lymphocytes est aussi observée chez le
singe-hibou ainsi que chez la souris (Anderson et al., 1990; Koff et al.,
1983). Cette réponse LT est détectable 3 jours p.i. et précède la réponse
cytotoxique
(CTL)
(Anderson
et al.,
1990).
Une réponse
lymphoproliférative a lieu avec les lymphocytes du sang de cordon et

---

37
semble être induite par les cellules T (Scott et al., 1978; Mito et al., 1984).
Cependant, les observations sont divergentes en ce qui concerne la relation
entre la réactivité lymphocytaire et le type d'affection causé par le RSV.
En effet, alors que Scott et al., (1978) ne notent aucune différence entre la
réponse lymphocytaire et les cas de bronchiolites, de pneumonies et
d'asthme, Welliver et al., (1979) trouvent au contraire une réponse immune
plus forte en cas de bronchiolites ou d'asthme qu'en cas de pneumonies ou
d'affection des voies respiratoires supérieures.
1.1.5.2.2
Activité cytotoxique
1.1.5.2.2.1
Activité cytotoxique naturelle (NK)
L'activité NK n'a pas vraiment été étudiée, sauf par quelques
auteurs qui notent une activité cytotoxique non spécifique du virus (non
MHC restreinte), à la fin de la réplication virale. Ceci a été observé chez le
rat du coton (Kumagai et al., 1985; Sun et al., 1983 a et b) ou alors lors de
l'infection expérimentale de la souris (Anderson et al., 1990).

---

38
1.1.5.2.2.2
Activité cytotoxique induite par les cellules T (CfL)
Bien que les rapports sur l'immunité à médiation cellulaire aient été
longtemps axés sur la réponse lymphoproliférative suite à l'infection par le
RSV, on sait maintenant, grâce à plusieurs études qu'il y a activation de
cellules cytotoxiques.
La présence des CfL a été démontrée chez la souris (Anderson et
al., 1990; Bangham et al., 1985; Cannon et Bangham et al." 1989; Cannon
et al., 1987; Nicholas et al., 1990; Openshaw et al., 1990; Taylor et al.,
1985), et chez l'homme (Bangham et McMichael, 1986; Isaacs et al., 1987).
Ces cellules cytotoxiques sont MHC restreintes (Bangham et al., 1985;
Bangham et McMichael, 1986; Bangham et al., 1986; Nicholas et al., 1900;
Taylor et al., 1985), du phénotype CD8+ surtout, mais aussi CD4+
(Bangham et McMichael, 1986; Nicholas et al., 1990), et spécifiques du
virus ou de certaines de ces protéines notamment les glycoprotéines de la
nucléocapside (Bangham et Askonas, 1986; Bangham et al., 1985, 1986;
Cannon et Bangham, 1989; Openshaw et al., 1990; Pemberton et al.,
1987).
TI a été démontré qu'il existe des réactions de cytotoxité croisées,
générées après infection par voie intranasale avec le virus vivant (Cannon
et Bangham, 1989).
De plus, ces cellules sont produites chez les
nourrissons âgés de plus de 6 mois et souffrant d'une bronchiolite de

---

39
gravité moyenne, mais non sévère (Bangham, 1986; Chiba et al., 1989;
Isaacs et al., 1987). D'après certains auteurs, cette induction de cellules
cytotoxiques correspond à la disparition du virus dans les poumons (Taylor
et al., 1985).
1.1.5.2.2.3
Actiyité cytotoxique dépendante des anticoms (ADCC)
Une cytotoxicité dépendante des anticorps spécifiques du RSV, a été
démontrée à l'aide des lymphocytes du sang périphérique (pBL "peripheral
blood lymphocytes"), avec le sérum, le colostrum et les sécrétions
nasopharyngées chez l'homme (Cranage et al., 1981; Kaul et al., 1982;
Meguro et al.,
1979; Scott et al.,
1977). Une activité similaire a été
observée dans le sérum et les PBL du singe-hibou (Koff et al., 1983).
L'ADCC semble médiée par les IgG (Meguro et al., 1979). fi n'existe pas
de relation entre les anticorps ADCC et les anticorps neutralisants chez
l'homme.
En effet, après la primo-infection, les anticorps ADCC
augmentent et déclinent plus rapidement que ceux neutralisants. De plus,
les anticorps neutralisants peuvent être détectés en absence d'anticorps
ADCC. Le titre d'anticorps ADCC n'augmente pas avec les infections
comme c'est le cas des anticorps neutralisants (Meguro et al., 1979). Bien
qu'une telle activité ait été démontrée, sa relation avec la disparition du
virus est inconnue et son rôle reste encore à déterminer (Kaul et al., 1982;
Meguro et al., 1979; Scott et al., 1977).

---

40
1.1.5.2.3
Action des cellules sunnressives
Au cours de l'infection, les lymphocytes T helpers (Th, de
phénotype CD4+) sont activés et ont pour fonction d'induire la réponse
immune, qui par la suite, est modérée ou supprimée, par les lymphocytes T
suppresseurs ( Ts, de phénotype CD8+), après leur induction. L'ampleur de
la réponse immunitaire, dépend des proportions des cellules favorisantes Th
et des cellules suppressives Ts (Girard et Hirth, 1989). Dans le cas du
RSV, mentionné par Welliver et al. , (1984), cette régulation de la réponse
immune est absente, car on note une transfonnation des lymphocytes, ainsi
qu'une production d'IgE exagérées, conjointement avec un faible nombre
de T suppresseurs, chez les patients souffrant de bronchiolites (Welliver et
al. , 1984). Donc, l'immunosuppression serait ici, ce défaut de la fonction
régulatrice des lymphocytes T suppresseurs. Car, plusieurs travaux ont
démontré que, la production d'IgE est régulée par ces cellules. (Buckley et
al. 1982; Fiser et Buckley, 1979; Katz, 1980; Katz et al., 1980).

---

41
1.1.5.3
Production des lymphokines et monokines
1.1.5.3.1
fuWuetion d'interféron
Les travaux faits jusqu'ici ont porté sur la détection de l'interféron,
en tant que substance anti-virale. TI s'agit possiblement de l'interféron
alpha, mais les informations sur ce sujet ne semblent pas concorder.
En effet, la première contradiction , est que le RSV est sensible à
l'effet de l'interféron (Corbitt, 1971; Gardner et al., 1970; Hill et al.,
1969; Moehhring et Forsyth, 1971). Par ailleurs, l'interféron ne semble
pas avoir d'effet inhibiteur sur la production virale (Hanada et al., 1986).
L'autre contradiction serait que
le RSV est un faible inducteur
d'interféron (Chomnaitree et al., 1981; McIntosh, 1978; Mito et al., 1984;
Roy et al.,
1967; Roberts, 1982), contrairement à ce que soulignent
d'autres chercheurs (Anderson et al., 1990; Chiba et al., 1987; Hanada et
al., 1986; Moehring et FOfSyth, 1971). Le rôle de cette substance varie
énormément.
En effet, l'interféron semble stimuler l'activité NK
(Anderson et al.,
1990), il aurait aussi une activité anti-virale (lsaacs,
1989). On parle d'une suppression de l'hypersensibilité retardée due à une
forte production d'interféron alpha chez les enfants nourris au sein (Chiba
et al.,
1987).
Une étude a démontré que l'interféron gamma pouvait
inhiber l'infection des monocytes par le RSV. Cette inhibition peut se faire

---

42
aussi en combinant l'interféron gamma au TNF, produit par le RSV in vitro
après stimulation des monocytes avec des lipopolysaccharides (LPS)
(Midulla et al., 1989).
La sensibilité du virus à l'IFN fait de cette substance un candidat
idéal pour la thérapie anti-RSV (Isaacs, 1989).
1.1:5.3.2
Production d'interleukine 1 (lL-l)
Très peu d'études ont porté sur l'interleukine 1. Cependant, il a été
démontré que le RSV pouvait induire sa production, mais que, la présence
de cette monokine était masquée par la production concomitante d'un
inhibiteur de l'IL-l dans le milieu de culture (McCarthy et al.,
1989;
Roberts et al.,
1986). L'inhibition de la production d'IL-l a été aussi
mentionnée par Wainberg et al., (1988).
1.1.5.3.3
Production d'interleukine 2 (lL-2)
D'après une étude sur l'activation des cellules Th (helper) mémoires
par le RSV vivant et recombinant, on sait qu'il induit la production d'IL-2
(Openshaw et al., 1988).

---

43
1.1.6
Pathogénèse de la maladie
Une partie de la gravité de l'infection est due au fait que le RSV
semble avoir une prédilection pour les cellules des voies respiratoires
supérieures (cellules de l'épithélium bronchiolaire) des nourrissons, comme
le dit bien Potner et al., (1980). De plus, la moindre inflammation des
bronchioles dont la lumière est déjà restreinte en raison du jeune âge,
suffirait à expliquer la sévérité de la maladie chez les nourrissons. Mais,
c'est de loin la meilleure explication de la pathogénèse.
Des facteurs
immunologiques semblent aussi y être impliqués. En effet, l'infection est
plus sévère (bronchiolites et pneumonies) au moment où les anticorps
maternels sont encore présents. De plus, il y a un phénomène d'aggravation
de la maladie si une infection naturelle survient à la suite de l'immunisation
avec un vaccin fait à partir du virus inactivé au formol; ceci en dépit d'une
forte production d'anticorps sériques contre les diverses protéines du RSV.
Outre la participation soupçonnée des anticorps dans la pathologie
due au RSV, le rôle de l'immunité à médiation cellulaire et des réactions
d'hypersensibilité,
ne sont pas à négliger.
Ainsi, dans les prochaines
sections nous discuterons de ces aspects.

---

44
1.1.6.1
Rôle des anticoms sériques dans la pathogénèse du RSV
Les anticorps maternels acquis par voie transplacentaire ne sont pas
efficaces en cas d'infection du nourrisson (Beem, 1967; Cranage et
Gardner, 1980; Femald et al., 1983; Glezen et al., 1981; Lamprecht et al.,
1976; Parrott et al., 1973; Ogilvie et al., 1981). On note au contraire une
suppression de la réponse anti-RSV en leur présence (Bruhn et Yeager,
1977; Levine et al., 1988; Murphy et al., 1986 b; Schauff et al., 1979), et
plus précisément, la réponse contre les 2 glycoprotéines de surface du
virus, et ceci aussi bien chez le nourrisson humain que chez le veau
(Murphy et al., 1986 b; Kimman et al., 1987).
Cette immunosuppression peut aussi être induite par les anticorps
transférés par voie passive (Buynak et al., 1978; Murphy et al., 1988, 1989;
Prince et al., 1979, 1982).
L'âge semble jouer un rôle important dans la réponse anti-RSV, et
par conséquent dans la pathogénèse, car des études ont démontré qu'il y
avait une augmentation de la production des IgG et IgA chez les bébés âgés
de plus de 6 mois (parrott et al., 1961; Scott et al., 1978, 1984; Welliver et
al., 1980 a).
La pathologie observée après la vaccination avec le virus inactivé au
formol est l'objet de plusieurs interprétations. TI semble dans certains cas

---

45
qu'il y ait induction d'anticorps neutralisants, sans protection (Chin et al.,
1969; Fulginiti et al., 1969; Kapikian et al., 1969; Kim et al., 1969).
Dans d'autres cas, il y aurait plutôt production d'anticorps fixant le
complément, mais pas de protection lors d'une infection subséquente
(Fulginiti et al., 1969; Kim et al., 1973). Une autre explication possible
est la production d'anticorps dépoulVUs d'activité neutralisante, ce qui laisse
sous-entendre que l'inactivation au formol détruirait les épitopes de
neutralisation sur les protéines virales, stimulant ainsi la production
d'anticorps dont la majorité est dirigée contre des épitopes non
neutralisants. De tels anticorps ne serviraient pas à la neutralisation (étant
non neutralisants), mais se lieraient plutôt aux antigènes viraux pour
fonner des complexes immuns dans les poumons. Ces complexes seraient
donc responsables des affections pulmonaires observées chez les sujets
vaccinés (Murphy et Walsh, 1988; Murphy et al., 1986 c). Un phénomène
semblable a été observé avec le vaccin contre le virus de la rougeole, où le
formol inactive la protéine de fusion (Fulginiti et al., 1967, Norrby et
Gollman 1975).
Le phénomène d'aggravation de la maladie a été observé, chez le rat
du coton infecté par le RSV vivant par voie intranasale, après immunisation
avec le virus inactivé au fonnol (prince et al., 1986).
Bien que, la sélection d'épitopes non-neutralisants semble mise en
cause ici, plusieurs autres phénomènes peuvent être noté, car, un effet
similaire d'augmentation de la pathologie pulmonaire a été observé chez le

---

46
rat du coton et la souris, immunisés cette fois avec un vaccin recombinant
exprimant les protéines individuelles du virus et ensuite infectées
naturellement (prince et al., 1986; Scott et al., 1987). La réponse anti-F
et G est semblable à celle des animaux non vaccinés, mais infectés
naturellement. Cependant, le taux d'anticorps neutralisants est beaucoup
plus faible (prince et al., 1986).
Une autre hypothèse est que, les anticorps puissent augmenter
l'infectivité du RSV, par formation de complexes anticorps-virus qui
s'attachent ensuite par la fraction Fc aux récepteurs cellulaires.
Ce
phénomène démontré récemment chez le RSV (Krilov et al.,
1989;
Gimenez et al., 1989), avait déjà été prouvé chez d'autres virus comme le
virus de la dengue et les fiavivirus (Hallstead et D'Rourke, 1977; Peiris et
Porterfield, 1979).
Malgré tout ce qui a été énoncé plus haut, le problème de la
pathologie du RSV reste entier, car il a été rapporté que des bonchiolites
peuvent survenir en absence d'anticorps sériques, et que les nourrissons
ayant des taux d'anticorps transplacentaires élevés, avaient des formes plus
sévères d'affection, comparés à ceux qui ne possèdent pas d'anticorps
(Glezen et al., 1981; Lamprecht et al., 1976).

---

47
1.1.6.2
Rôle de l'hypersensibilité à médiation cellulaire
L'immunité à médiation cellulaire et plus précisément, la réponse
lymphoproliférative semble contribuer à la pathogénèse de la maladie
causée par le RSV.
D'après certains chercheurs, l'infection par le RSV entraînerait une
réponse lymphoproliférative exagérée, caractéristique des formes sévères
de la maladie (Kim et al., 1976; Mito et a/., 1984; Scott et a/., 1978;
Welliver et al., 1979).
Le fait que cette réponse à médiation cellulaire exagérée ait lieu
surtout chez les nourrissons de moins de 6 mois, et qu'il y ait détection de
cellules sensibilisées dans le sang du cordon, fait penser à une sensibilisation
intra-utérine des lymphocytes foetaux par les antigènes du virus (Kim et
al.,
1976), ou par le transfert par voie transplacentaire de médiateurs
solubles du CM! (Scott et al., 1984).
Une autre explication serait qu'il y ait altération des mécanismes
immunorégulateurs (Welliver et a/., 1979).
TI Y a aussi la possibilité de l'effet mitogène des antigènes, sur les
lymphocytes du sang du cordon, ou la présence de lymphocytes maternels
dans le sang du cordon.

---

48
Tout se passe comme dans le cas de la rougeole où la persistance de
la réaction à médiation cellulaire, en cas d'infection congénitale, augmente
la sévérité de la maladie (Gallagher et al., 1981; Scott et al., 1984).
Une réaction d'hypersensibilité, causée probablement par une pré-
sensibilisation des lymphocytes, suite à la vaccination avec le RSV inactivé
au formol, a été obselVée chez l'animal et chez l'homme (Kim et al., 1976;
Piedra et al., 1989; Prince et al., 1986).
1.1.6.3
RQku1es I&lidans la pathogénèse
Les infections sévères dues au RSV, surtout en cas de bronchiolites,
sont associées à une forte production d'IgE (Bui et al., 1987; Welliver et
al., 1980 b, 1981, 1985). Selon certains auteurs, ces immunoglobulines
jouent un rôle dans la pathogénèse de la maladie, aussi bien chez l'homme
que chez l'animal, avec un titre d'anticorps plus élevé chez les patients
asthmatiques, que chez ceux ayant une infection des voies respiratoires
supérieures ou une pneumonie asthmatique (Bui et al., 1987; Bohlender et
al., 1982; E1azhary et al., 1980; Frey, 1983; Pirie et al., 1981 a et b; Smith
et al., 1975; Stewart et Gershwin, 1989; Thomas et Scott, 1981; Welliver et
al., 1981).
Cette production anormale d'IgE, semble être le résultat d'un
mécanisme immunorégulateur déficient (Welliver et al., 1980 b), ce qui

---

49
explique que les enfants prédisposés génétiquement à l'asthme, auront une
réponse IgE plus importante (McIntosh et al., 1973; Rooney et Williams,
1971).
La pathologie ne semble pas résulter uniquement d'une pré-
sensibilisation par le virus, d'autres mécanismes peuvent y être associés.
En effet, la production d'IgE est suivie d'une libération d'histamines
(Welliver et al., 1981), bien que quantitativement non proportionnelle à la
sévérité de la maladie. Ceci suggère que les IgE pourraient faire libérer en
plus, d'autres substances comme les leucotriènes, les prostaglandines ou les
thromboxanes, qui obstruraient les voies respiratoires, contribuant ainsi à
la pathologie (Welliver, 1988).
1.1.6.4
Rôle des I&Q4..dans la patbogénèse
Une augmentation de la production d'IgG4, immunoglobulines
capables de provoquer une réaction anaphylactique, pourrait contribuer au
bronchospasme causé par l'infection par le RSV (Scott et Taylor, 1985).
La présence de ces anticorps a été démontrée dans le sérum de nourrissons
infectés par le RSV (Bui et al., 1982). La protéine de surface G du RSV est
l'inducteur de ce type d'immunoglobuline, car cette protéine, ayant
principalement des liens 0 réagirait comme un antigène polysaccharidique
qui produirait en majorité des IgG2 et IgG4 (Ward et al., 1983).

---

50
Le rôle de ces immunoglobulines, aussi bien que leur production ne
semblent pas clairs, car, alors que Bui et ses collaborateurs parlent de
détecter des IgG4 chez le nourrisson infecté, Ward et al., (1983) parlent
d'une incapacité pour le nourrisson de produire une réponse IgG2 et IgG4.
1.1.6.5
Rôle des cellules cytotoxiques dans la pathogénèse
Lors de l'infection par le RSV, il Y a une forte concentration de
CTL dans les poumons. Cependant, il a été démontré chez la souris que
ces cellules, en éliminant le virus augmentent la pathologie dans les
poumons (Cannon et al., 1988). Donc ces cellules ne jouent pas toujours un
rôle bénéfique et par conséquent, ce paradoxe demande à être élucidé.
1.1.6.6
Immunosuppression
En cas d'infection par le RSV, une immunosuppression est observée
à plusieurs niveaux. Il semble qu'il y ait une inhibition de la production de
l'IL-l (McCarthy et al., 1989; Roberts et al.,
1986; Wainberg et al.,
1988).
Or, cette monokine est importante, dans la stimulation des
lymphocytes CD4+, à produire d'une part, l'interféron gamma, (substance
immunorégulatrice), et d'autre part l'IL-2. De même, un effet suppresseur

---

51
transitoire a été observé au niveau de l'induction de la production
d'interféron alpha par le virus (Isaacs, 1989).
Cette suppression est
prononcée chez les enfants nourris au sein et pourrait bien être causée par
les anticorps maternels (Chiba et al., 1987).
Concernant la réponse lymphoproliférative, 2 phénomènes peuvent
se produire. D'un côté on peut avoir une suppression de cette réponse chez
les enfants nourris au sein (Mito et al., 1984) et de l'autre, une absence de
t
la fonction régulatrice des cellules T, entraînant ainsi, une CM! exagérée
(Welliver et al., 1979).
L'induction des CTL semble supprimée chez les nourrissons en cas
de bronchiolites sévères (!saacs et al., 1987), ainsi que chez les nourrissons
âgés de moins de 5 mois, faisant encore penser ici à l'effet suppresseur des
anticorps maternels (Bangham, 1986; Chiba et 01., 1989), ou plutôt à une
immaturité immunologique (Murphy et al., 1986 b). Cette immaturité
immunologique, semble être la cause de l'absence de LT au cours des
premières infections et qui augmente ensuite graduellement avec les
réinfections (Fernald et al., 1983; Welliver et 01., 1979). L'analyse de tous
ces résultats montre que, des études sur l'induction des cellules suppressives
sont nécessaires.

---

52
1.1.6.7
Rôle du complément dans la pathogénèse
Le complément en présence de complexe antigène-anticorps peut
provoquer une réaction d'hypersensibilité de type II, qui serait responsable
des nécroses pulmonaires observées lors des infections dues au RSV (Kaul
et al., 1982 a; Kimman et Westernbrink, 1990; McIntosh et al., 1979).
D'autre part, les complexes antigène-anticorps,
activent in vitro le
métabolisme oxidatif, ainsi que celui de l'acide arachidonique dans les
neutrophiles (Faden et al., 1983).
1.1.6.8
Rôle des facteurs non-immunologiques
Outre le fait que la bronchiolite peut être un problème de maturité
des voies respiratoires, encore très étroites chez le bébé âgé de 2 à 6 mois,
et très vite obstruées lors d'une infection (Hogg et al., 1970; Scott et
Taylor, 1985), il y a donc la probabilité de facteurs additionnels, viraux et
non viraux dans la pathologie du RSV (Piedra et al., 1989).

---

53
1.1.7
Prophylaxie
1.1.7.1
Les vaccins
La production d'un vaccin efficace contre le RSV, est un but
important à atteindre, à cause de l'âge des personnes le plus sévèrement et
fréquemment atteintes (enfants de moins de 6 mois), et la tendance du virus
à infecter les voies respiratoires inférieures.
Plusieurs types de vaccins ont été développés et testés. TI s'agit de
vaccins faits à partir de virus inactivé, de virus vivant atténué, de virus
modifié, mais aucun d'entre eux n'a été accepté.
Le premier vaccin, composé de virus inactivé au formol, fut
développé et administré par voie parentérale chez des enfants âgés de 2 à 10
ans. Ce vaccin, bien que produisant des anticorps neutralisants circulants,
et fixant le complément, chez les sujets séronégatifs, ne protège pas lors
d'une infection naturelle subséquente, mais entraîne une fonne plus sévère
de maladie (Chanock et al., 1970; Chin et al., 1969; Fulginiti et al., 1969;
Kapikian et al., 1969; Kim et al., 1969).
Récemment, l'expérience de
vaccination avec le vaccin à virus inactivé au fonnol, fut refaite chez le rat
du coton, qui a manifesté une augmentation de la pathologie pulmonaire
lorsqu'il fut infecté à nouveau par voie intranasale par le RSV (Prince et
al., 1986).

---

54
Le développement d'un vaccin atténué, composé de virus adapté à
faible température (260 C), fut sans succès, car il cause une infection
inapparente chez les sujets séropositifs et une maladie chez les nourrissons
séronégatifs (Friedwald et al., 1968; Kim et al., 1971; Parrott et aI., 1975).
D'autres vaccins faits à partir de mutants thermosensibles (ts) furent
retenus (Chanock et al., 1977; Gharpure et al., 1969; Jackson et Muldoon,
1972; McIntosh et al., 1974; Wright et al., 1970, 1971). Mais, même si le
virus s'avérait atténué, lorsque les vaccins furent testés chez les primates ou
chez les adultes (Kim et al., 1973; Richardson et al., 1978), ils causent une
rhinorrhée ou des otites chez les enfants séronégatifs (Belshe et aI., 1978;
Tyeryar et al., 1978). D'autres part, des révertants ont été notés après
utilisation de ces mutants (Belshe et al., 1978; Hodes et aI., 1974; Tyeryat et
al., 1978), de même qu'une perte du phénotype ts due à la suratténuation
(prince et aI., 1979; Wright et aI., 1982). Un autre type de vaccin fait à
partir d'un virus atténué par passages multiples et administré par voie
parentérale s'avérait prometteur (BuYnak et al.,
1978, 1979), mais fut
controversé (Belshe et al., 1982). TI Y a d'autre part, avec ce type de
vaccins à virus atténué, le danger d'établissement d'infections persistantes
(peeples et Levine, 1981; Pringle et al., 1978).
La purification par immunoaffmité des glycoprotéines F et G du
RSV, a permis la production d'un vaccin sous-unitaire, dont l'utilisation
chez l'animal entraîne une protection complète des poumons et seulement
une protection partielle des voies nasales (Walsh et al., 1987 b).

---

55
Un autre vaccin sous-unitaire fait de complexes immunostimulants
(ISCOMs), contenant les protéines du virus, produit un taux d'anticorps
neutralisants supérieur à celui produit par le virus entier (TrudeI et al.,
1989).
La technologie de l'ADN recombinant a donné lieu au
développement de vaccins recombinants (virus de la vaccine ou
bacculovirus), et exprimants les composants externes du virus (les
glycoprotéines de l'enveloppe F et G). Après immunisation, la réplication
virale est réduite dans les poumons de l'animal infecté expérimental, et le
taux d'anticorps neutralisants élevé (BalI et al., 1986; Elango et al., 1986;
Johnson et al., 1987; Olmsted et al., 1986, 1988; Scott et al., 1986; Walsh et
al., 1987 b, Wathen et al., 1989; Wertzet al., 1987). Cependant, on observe
quelques fois une augmentation de la pathologie pulmonaire (Scott et al.,
1987).
Bien qu'on ait parlé dans les 3 derniers paragraphes de vaccins qui
apparemment fonctionnent, ceci n'est pas encore bien évident, car, ils sont
encore à un stade expérimental chez l'animal. D'autre part, l'idéal serait un
vaccin capable de protéger autant de l'infection par le virus des voies
respiratoires supérieures et inférieures. Cependant, ce n'est pas le cas de
celui de Walsh et al. (l987b). D'autre part, une immunisation complète
implique l'inhibition totale de la réplication virale, ce qui ne se produit pas
dans le cas de vaccins faits à partir de virus recombinants. Enfin, malgré
tous ces travaux il s'avère que des études sur l'immunité à médiation

---

56
cellulaire doivent être faites. Ceci apporterait des informations
complémentaires et peut-être éluciderait les questions de protection
incomplètes ou absentes, soulevées ci-dessus.
1.1.7.2
L'immunothérapie
L'injection par VOle parentérale d'immunoglobulines ou le
traitement topique avec les mêmes immunoglobulines, réduit de façon
significative l'excrétion virale (Hemming et al., 1985, 1987, 1988; Prince et
al., 1985 b, 1987).
Des études ont montré que, l'usage d'un vaccin anti-idiotypique que
recevait la mère, entraînait le transfert d'anticorps anti-idiotypiques via le
lait maternel chez le nourrisson, cette approche est une étape vers le
développement d'une immunoprophylaxie lors de
la petite enfance
(Okamoto et al., 1989).
1.1.7.3
Les substances antivirales
Plusieurs substances ont été étudiées en rapport avec leur effet sur
la réplication du RSV. Parmi elles, il y a la rimantadine et l'amantadine, le
bis (5-amino-2-benzimidazol) méthane, l'IFN et le TNF (Berstein et al.,

---

57
1979; Douglas, 1979; Dubovi et al., 1980; Lennette, 1981; Midulla et al.,
1989).
La papaverine et la pyrazofurine ont été testés in vitro et in vivo.
Tous les deux inhibent la réplication virale, mais il existe encore des
problèmes de toxicité (Wyde et al., 1989).
Un peptide synthétisé selon le modèle de la sous-unité F1 de la
protéine de fusion, s'est révélé inefficace dans l'inhibition de la réplication
virale (Lobl et al., 1988).
Enfin, la ribavirine a une activité anti-RSV prometteuse (Isaacs,
1987). En effet, il a été démontré que cette substance, administrée par voie
intrapéritonéale, et par aérosols, réduisait l'excrétion virale dans les
sécrétions nasales (Hruska et al., 1982), la production d'IgE in vitro, ainsi
que la production de médiateurs de l'inflammation
(Snell, 1990).
La
ribavirine a ensuite été évaluéé chez l'homme (Hall et al., 1983 b), ainsi que
chez les nourrissons (Hall et al.,1983 a). Le traitement à la ribavirine
semble
efficace
chez
les
nourrissons
souffrant
de
maladies
cardiopulmonaires (Hall et al., 1985). À côté des effets bénéfiques de la
ribavirine, il existe quelques problèmes, comme le fait qu'elle soit
relativement insoluble et qu'il faille utiliser des nébulisateurs pour
l'administrer. L'usage de la ribavirine nécessite une certaine attention, car
des effets adverses peuvent survenir lors de son usage (Welliver, 1988).
D'abord,
parce que le mécanisme antiviral de cette drogue est encore
inconnu, même si l'on sait qu'elle interfère avec la synthèse des ARN

---

58
messagers viraux, ainsi que l'ARN polymérase dans le cas du virus
influenza A. La ribavirine est tératogène et embryolétale chez certaines
espèces. Ce produit peut causer des lésions cardiaques lorsque administré à
fortes doses.
Elle est mutagène pour les cellules de mammifères, et
tumorigène chez le rat. La ribavirine cause une immunosuppression chez
les animaux de laboratoire et certaines concentrations de la drogue bloquent
chez les humains et la souris, l'induction de la réponse anticorps primaire et
secondaire (Peavy et al., 1981; Power et al., 1982).
TI existe une
suppression induite par la ribavirine au niveau de la production d'IgA et
IgE (Rosner et al., 1987). Cet effet pourrait être un problème dans le cas
des IgA mais un avantage en ce qui concerne les IgE (Taber et al., 1983).

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CHAPITRE 2
MATÉRIEL ET MÉTHODES

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60
2.1
TECHNIQUES VIROLOGIQUES
2.1.1 Milieux de culture
Le milieu de croissance est constitué d'un mélange de 1:1 de milieux
MEM (Earle) et de 199 (Hank's) (Gibco, Grand Island, N.Y., U.S.A.),
additionné de 5% de sérum fétal de veau (SFV) (Gibco) et de 100
unités/mL de pénicilline G (Ayerst, Canada), 10 mg/mL de sulfate de
gentamycine (Schering, Pointe-Claire) et de 0,25 mg/mL de fungizone
(Squibb). Le milieu de maintient est du MEM (Earle) contenant 2% de
SFV et 50 mg/mL de sulfate de gentamycine.
2.1.2
Culture cellulaire
Le virus est cultivé sur des cellules HEp-2 (cellules de carcinome de
larynx humain) obtenues de l'ATCC (American Type Culture Collection,
Rockeville, MD., USA). Les cellules trypsinées (trypsine 0,05% et EDTA
dissodique 0,02%) sont ensemencées dans des flacons de polystyrène de 75
ou de 150 cm2 (Coming Glass Works, Coming, N.Y. USA), à des
concentrations de 50 à100 000 cellules/mL, pour le maintien des cellules et
la production de petites quantités de virus.
Pour obtenir de grosses

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61
quantités de virus, les cellules sont cultivées sur des billes de gélatine
(Ventregel TM, Ventrex Laboratories, Bioventures Group, Portland, USA),
selon la technique suivante: les cellules trypsinées sont resuspendues dans
du milieu de culture contenant 1 à 5% de SFV. Deux grammes de billes de
gélatine sont hydratés selon la procédure décrite par le manufacturier et
placés dans une bouteille à rotation horizontale de 2 litres (Wheaton Magna
Flex). Les billes sont stérilisées par autoclavage pendant 15 minutes à 115°
C. Après refroidissement à la température de la pièce, le milieu est enlevé
aseptiquement et les billes sont lavées 2 fois avec du milieu de culture
stérile. La suspension cellulaire est ensuite ajoutée à une concentration de
2 à la x 107 cellules par gramme de Ventregel. Le milieu de culture est
ramené à 500 mL et la bouteille placée sur un appareil à rotation à 37°C.
Le processus d'adhésion des cellules sur les billes se fait en laissant
sédimenter les cellules pendant 30 minutes et en faisant ensuite une rotation
de 2 minutes à 42 r.p.m. La procédure est ainsi répétée pendant au moins
4 heures.
Après ce temps, on fait une rotation continuelle jusqu'au
moment de l'inoculation avec le virus.
2.1.3
Souche virale
La souche Long du virus respiratoire syncytial humain (ATCC VR-
26. lot #140), obtenue de l'American TyPe Culture Collection (Rockville,
MO, USA) a été utilisée au cours de notre travail.

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62
2.1.4 Production du virus
Des feuillets cellulaires sur flacon ou sur billes de gélatine, sous-
confluents sont infectés avec une suspension virale avec un indice de
multiplicité de 1. Pour ce faire, le milieu de culture est décanté et les
cellules inoculées. Après une incubation de 2 heures à 37° C, sur une
plaque basculante ou sous agitation discontinue (pour les cellules sur billes
de gélatine), le milieu de croissance est ajouté et l'incubation se poursuit
jusqu'à 28 ou 32 heures post-infection à 37°C.
2.1.4.1
Banque virale
Pour la production de virus, un lot de semence a été préparé sur des
cellules HEp-2. Le surnageant infectieux a été recueilli aux environs de 30
heures post-infection, clarifié et réparti dans des cryotubes Nunc
(Burlington, Ont., Canada) à raison de 2mL/tube. Les tubes sont congelés
par immersion dans de l'azote liquide à -198°C et conservés ensuite à
-80°C.

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63
2.1.5 Concentration virale
2.1.5.1
Concentration au polyéthylène glycol 6000
Le surnageant viral est d'abord clarifié par centrifugation à basse
vitesse (3000 r.p.m. pendant 30 minutes à 4 oC, centrifugeuse Beckman,
model TJ-6).
Le virus est ensuite précipité par addition de 10% de
polyéthylène glycol 6000 (PEG) à 50% (WN) (Carbowax, Fisher
Scientific, Montréal, Canada), pendant 2 heures à 4°C, sous agitation
magnétique.
Le virus précipité est récupéré dans un culot après
centrifugation, à 3000 r.p.m. pendant 30 minutes à 4°C. Les culots obtenus
sont resuspendus et placés dans des tubes et congelés.
2.1.5.2
Concentration sur coussin de saccharose
La concentration sur coussin de saccharose a été faite selon la
technique de Fernie et Gerin (1980). Brièvement, le surnageant viral est
ajusté avec 0,1 M de MgS04 et 50 mM d'HEPES, pH 7,5. Le mélange est
placé sur un coussin de 1,15 ou 1,45 M de saccharose, dans un tampon
MHN (l M MgS04; 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCI) et centrifugé à

---

64
7500 r.p.m. pendant 4 heures à 4°C (Damon IEC B-20 A centrifuge). Le
virus est récolté et son infectivité déterminée par titrage.
2.1.6 Mesure de l'infectivité
Le titre du virus est évalué par la microméthode (Trépanier et al.,
1980), en utilisant des microcabarets de 96 puits (Nunc, Burlington, Ont.,
Canada). Une série de dilutions 1/5 ou 1/10 sont effectuées, 0,025 mL de
ces dilutions sont déposés sur le feuillet cellulaire contenu dans les puits du
microcabaret. Le plateau est ensuite incubé à 37°C, en atmosphère de 5%
de C02 pendant 3 à 4 jours. Au bout de ces 3 ou 4 jours, le méthyle
cellulose (Fisher) est enlevé par succion, le feuillet cellulaire est fixé et
coloré au violet de crystal 0,1 %, contenant 0,11 M d'acide citrique dans du
PBS (140 mM NaCI, 30 mM KCI, 100 mM Na2HP04, 15 mM K H2P04,
pH 7,2). Les syncytia sont énumérés à l'aide d'un microscope inversé. Le
titre viral est déterminé d'après la méthode de Payment et Pavilanis (1980).

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65
2.1. 7 Purification du virus en gradient de densité
2.1.7.1
Purification en gradient de saccharose
Le virus précipité au PEG 50% est resuspendu et placé sur un
gradient discontinu de saccharose (30-45 et 60%, VN) dans un tampon
NTE (150 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,5) et ensuite
centrifugé à 35 000 r.p.m, pendant 90 minutes à 4°C, rotor SW-41
(ultracentrifugeuse Beckman, model L5-65). La bande virale obtenue, est
diluée 1:2 et purifiée sur un gradient continu de saccharose 30-60%
pendant 18 heures à 4°C à
35 000 r.p.m., rotor SW-41. Les fractions
sont recueillies par le bas des tubes, et celles contenant le virus sont
détectées à l'aide d'un réfractomètre et la densité optique déterminée par
lecture au spectrophotomètre. Les fractions correspondant à une densité
entre 1,18 et 1,20 g/cm3 sont conservées à -80°C.

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66
2.1.7.2
Purification en gradient de Renografin
L'échantillon viral précipité au PEG est placé sur gradient
discontinu de 30 et 60% de Renografin (E.R. Squib and Sons, New York,
N.Y.) et centrifugé à 35 000 r.p.m. pendant 90 minutes à 4°C, rotor SW-
41. La bande de matériel dense est récoltée, diluée et purifiée sur gradient
linéaire 30-60% (VN) de Renografin, pendant 18 heures. Les fractions
sont analysées par titrage biologique. Leur densité est déterminée d'après
la fonnu1e:~ =3,4683N24-3,6267 (Grdina et al., 1974).
2.1.7.3
Purification en gradient de Percoll™ (polyvinyl pyrollidone)
Le précipité est resuspendu dans un tampon et placé au-dessus de 12
mL de Percoll (Pharmacia) (densité de départ 1,105 g/cm3 ).
La
centrifugation se fait à 35 000 r.p.m. pendant 25 minutes dans un rotor
type 50.2, à 4°C.
Les fractions sont collectées par capillarité et leur
densité, détenninée grâce à des marqueurs. La bande opale de matériel est
conservée à -80°C.
La présence du virus est évaluée par titrage et par
microscopie électronique.

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67
2.1.7.4
Purification en gradient de métrizamide
La purification du virus est effectuée dans un gradient linéaire 15 à
45% (W/V) de métrizamide. La centrifugation se fait pendant 18 heures à
35 000 r.p.m., rotor SW-41, à 4°C. Les fractions contenant le virus sont
détectées par titrage biologique et par microscopie électronique.
La
densité est calculée d'après la fonnule:(=3,453n20-3,601
(Rickwood et
Bernie, 1975).
2.1.8
Purification des glycoprotéines virales par
chromatographie
La purification par chromatographie s'est faite d'après les
techniques utilisées pour la purification des glycoprotéines du virus de la
rougeole (Casali et al., 1981 b) et du RSV (Lambert et Pons, 1983; Walsh
et al., 1984), avec quelques modifications.

---

68
2.1.8.1
Chromatographie d'affmité
La chromatographie d'affmité a été effectuée en utilisant un gel
composé de lectines de germe de blé couplées à des macrobilles de
Sepharose (6B) (Wheat Germ Lectin-Sepharose 6MB) ou de lectines de
lentille couplées à des billes de Sepharose 4B (Lentil Lectin-Sepharose 4B)
(Phannacia Fine Chemicals).
Le virus purifié sur un gradient discontinu de saccharose est dialysé
toute la nuit contre le tampon de chromatographie sans détergent.
Les
fractions dialysées sont solubilisées à l'aide d'un tampon (0,01 M Tris-HCI
pH 7,2; 0,3 M NaCI; 2% NP-40 (Nonidet P-40), 5 mM PMSF (fluorure de
Phénylméthylsulphonyle), (Sigma) et de 5U/mL d'aprotinine (Sigma),
pendant 1 heure à la température de la pièce ou toute la nuit à 4°C.
Une quantité d'environ 20 mL de lectines est placée dans une
colonne de 20 cm, qui est ensuite équilibrée avec 50 mL de tampon. (Tris-
NaCl) (0,01 M Tris-HCI, pH 7,2; 0,3 M NaCI; 2% NP-40). La colonne est
ensuite lavée avec le même tampon contenant 0,1 % de NP-40, avec un
débit de 15 mlIheure
Les protéines solubilisées sont diluées et, des quantités d'environ 5
mL sont mélangées au gel contenu dans la colonne en faisant basculer la
colonne continuellement pendant 1 heure à la température de la pIèce.
Après ce temps, les protéines sont adsorbées aux lectines. La colonne est

---

69
alors placée sur un support et on laisse couler le tampon par le bas. Cette
opération est répétée jusqu'à ce que l'on ait fait passer toutes les protéines
solubilisées. La colonne est ensuite lavée. Un échange est fait avec du
Tris-NaCI contenant 1 mM de B-octylglucoside. L'élution des protéines est
ensuite faite avec un tampon Tris NaCI, 1 mM B-octylglucoside et 0,2 M de
o<-Methyl-D Mannoside (Sigma), avec un débit de 15 mL/heure pour les
lectines de lentilles ou 0,5 M de N-acetyl-D-glucosamine pour les lectines
de germe de blé.
2.1.8.2
Identification des glycoprotéines par "Dot blot"
Une quantité de 0,1 mL des protéines éluées est appliquée sur une
feuille de nitrocellulose de 0,45 Jlm, préalablement lavée avec un tampon
TBS-T (0,050 M Tris; pH 7,4; 0,15 M NaCI; 0,1 % Tween 20) et placée
dans un appareil à filtration de 96 puits ("Manifold" Bethesda Research
Laboratories). Dans les puits non utilisés, on met une solution de 3% de
gélatine. Après une incubation de 30 minutes à 1 heure à la température de
la pièce, pour permettre aux échantillons de s'adsorber sur le papier de
nitrocellulose, le vide est appliqué jusqu'à ce que le papier de nitrocellulose
soit complètement sec. Les fractions contenant les glycoprotéines virales
sont révélées par immunoperoxydase (immunoblot), à l'aide d'un anticorps
polyclonal (pour les fractions obtenues après l'utilisation des lectines de
germe de blé, et d'anticorps monoclonaux de souris B23, B151 et 44-R

---

70
(anti-G et anti-F respectivement) pour les fractions issues de l'utilisation
des lectines de lentilles. Les anticorps monoclonaux B 23 (anti-G) et B 151
(anti-F) nous ont été offerts par Dr E. Norrby de Suède, alors que
l'anticorps monoclonal 44-R (anti-F bovin) nous a été donné par Dr.
Elazhary, St-Hyacinthe, Canada).
2.1.8.3
La feuille de nitrocellulose sur laquelle a été appliqué les fractions
est trempée pendant 30 minutes dans une solution d'albumine bovine 1,5%
(fraction V) (Sigma Chemical Company, St-Louis, MO USA), faite dans un
tampon TBS (0,050 M Tris; pH 7,4; 0,15 M NaCI), afm de bloquer les sites
non spécifiques. On fait ensuite un contact avec l'anticorps monoclonal
dilué 1/300 dans du TBS-T pendant 1 heure à la température de la pièce.
Après 3 lavages de 10 minutes chaque avec du TBS-T, la feuille de
nitrocellulose est mise en contact avec un conjugué de chèvre anti-
immunoglobulines de souris (Cappel, Malvern, P.A.; U.S.A) couplé à la
peroxydase (horse-radish peroxydase) dilué 1/1000 pendant 1 heure à la
température ambiante.
On lave la feuille à nouveau 3 fois pendant 10
minutes avec du TBS-T, et l'on aplique du DAB (3-3'-Diaminobenzidine
hydrochloride) 0,5 mg/mL (Sigma), auquel on aura ajouté 0,1% de
peroxyde d'hydrogène 30%.

---

71
2.1.8.4
Filtration moléculaire sur le gel de Sephacryl S-200
Une colonne de chromatographie de type K 26 est équilibrée à
l'aide d'un tampon Tris-NaCI contenant 0,001 M B-octylglucoside. Les
échantillons positifs après le Bio-dot sont mélangés et appliqués sur le gel
avec un débit de 2,5 mL/heure. Les fractions contenant les glycoprotéines
sont détectées par lecture au spectrophotomètre à 280 nm et confirmées par
"Dot-blot" et "immunoblot", et ensuite dialysées contre un tampon PBS.
2.1.8.5
Dosage des protéines
La quantité de protéines obtenues est déterminée d'après la trousse
de Sigma (protein Assay Ki4 Sigma Diagnostics, St-Louis, MO USA), qui
est une technique modifiée de la microtechnique de Lowry (Lowry et aI.,
1951).

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72
2.1.9
Analyse des protéines par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide (PAGE)
2.1.9.1
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
La pureté des protéines obtenues après la chromatographie est
vérifiée par électrophorèse, d'après la technique modifiée de Laemmli
(1970). Le gel est ensuite coloré au bleu de coomassie ou fIXé pendant 20
minutes dans une solution de 12% d'acide acétique, 50% de méthanol et de
l'eau, en vue de la coloration au nitrate d'argent. Une autre partie du gel
contenant les mêmes échantillons séparés dans les mêmes conditions par
électrophorèse est immédiatement transféré sur une feuille de
nitrocellulose par la technique du Western Blot (Towbin et al.• 1979). Les
protéines sont identifiées par immunoperoxidase à l'aide d'un antisérum
spécifique, telle que décrite dans la section immunoblot.

---

73
2.1.9.2
Coloration au nitrate d'argent
Le gel fixé est coloré d'après une trousse de Bio-Rad, afin de
détecter les échantillons dont la quantité de protéines est faible.
2.2
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
ET
IMMUNOENZYMATIQUES
2.2.1
Milieu de culture des lymphocytes
Le milieu de culture utilisé est du RPMI 1640 (Gibco, Grand
Island, NY), contenant 100 unités/mL de pénicilline G (Ayerst), 10 Jlg/mL
de sulfate de gentamicine (Schering) et 0,25 mg/mL de fungizone (Squibb)
et supplémenté de 10% de sérum fœtal de veau (Gibco). Ce milieu est
communément appelé RPMI-10.

---

74
2.2.2 Séparation des lymphocytes du sang périphérique
Le sang périphérique de 5 donneurs séropositifs (déterminés par les
techniques de neutralisation et d'ELISA), est récolté par ponction veineuse
dans des tubes héparinés de 10 mL (Vacutainer, Becton/Dickinson,
Company, Canada), et séparé par centrifugation sur gradient de Ficoll-
Hypaque (Boyum, 1968) d'après la procédure suivante: dans des tubes
Falcon de polystyrène de 13 mL contenant 5 mL de Ficoll-Hypaque
(Pharmacia et Winthrop, respectivement), on met par-dessus 5 mL de sang
hépariné. Les tubes sont ensuite centrifugés à 1 800 r.p.m. pendant 20
minutes à 20° C (Centrifugeuse Beckman, model TJ-6).
Après la
centrifugation, les globules rouges, plus denses se retrouvent au fond du
tube, le plasma au-dessus, tandis que la couche de cellules mononucléées se
situe à l'interphase. La couche de cellules mononucléées est récupérée. On
effectue ensuite 2 lavages de 10 minutes à 1 000 r.p.m. à 20° C avec 50 mL
de RPMI-10. Les cellules sont resuspendues dans du milieu de culture et
colorées avec une solution de Turk (50% acide acétique et 50% d'eau
distillée), comptées à 1'hémacytomètre et placées dans des boîtes de Pétri
(Nunc) à raison de 3 X 106 cellules par mL.
Les cellules ainsi
ensemmencées sont incubées à 37° C en atmosphère de 5% de C02 pendant
2 heures, pour permettre aux monocytes d'adhérer à la surface de la boîte
de Pétri.
Les lymphocytes, qui constituent la couche de cellules non

---

75
adhérentes sont récoltés en décantant le milieu de culture, afm d'effectuer
la séparation des sous-populations lymphocytaires.
2.2.3 Purification des lymphocytes CD3+
Les lymphocytes CD3+ sont obtenus par adsorption des cellules non
adhérantes sur une colonne de fibres de nylon Fenwal Leukopak (Fenwal
Laboratories, Morton Grove, minois) d'après la technique de Greaves et
al., (1976), et élution de celles-ci. En résumé, le nylon est lavé avec une
solution d'HCI 0,2 N pendant 2 heures, rincé avec l'eau distillée et laissé à
sécher. Il est ensuite immergé dans du PBS afm de le débarrasser des
bulles d'air, puis remis à nouveau à sécher. Des quantités de 300 à 600 mg
sont placées dans une seringue de polypropylène de 5 ou 10 mL, au niveau
2,5 ou 5 mL respectivement.
La seringue est ensuite couverte par un
capuchon de papier d'aluminium et stérilisée au gaz. Pour l'adsorption et
l'élution des cellules, le nylon contenu dans la seringue est imprégné de
milieu RPMI-IO et incubé à 37°C pendant 30 minutes. Une quantité de 5 X
107 dans 1 mL ou 10 X 107 lymphocytes dans 2 mL est placée dans une
colonne de 5 ou 10 mL respectivement. On laisse pénétrer les cellules
lentement dans la colonne, puis on l'incube à 37° C pendant 30 minutes.
Les cellules CD3+ sont ensuite éluées et recueillies dans un tube en faisant
passer 10 mL de RPMI-IO à travers la colonne à raison d'une goutte par
seconde. Le test d'immunofluorescence à l'aide d'un anticorps monoclonal

---

76
(OKT 3, Ortho Diagnostic System USA) , dirigé contre les marqueurs de
surface des CD3+ indique un degré de pureté de 95%.
2.2.4 Obtention des lymphocytes B
Une fois que l'on a élué les cellules CD3+ de la colonne de nylon,
les lymphocytes B sont obtenus en appliquant une pression sur la laine de
nylon d'un coup sec à l'aide du piston de la seringue. Les cellules sont
recueillies dans une boîte de Pétri et ensuite comptées.
Un test
d'immunofluorescence est effectué à l'aide d'un anticorps monoclonal OKB
7 (Ortho) dirigé contre les marqueurs de surface des lymphocytes B pour
s'assurer de la pureté des cellules.
2.2.5 Purification des lymphocytes CD4+ et CD8+
Pour cela, on place la suspension de CD3+ préalablement comptée
dans 2 tubes de 50 mL. Les tubes sont ensuite centrifugés pendant 10
minutes à 1 000 r.p.m. à 20° C. Sur le culot de cellules on place une
quantité d'anticorps monoclonaux OKT4 ou OKT8 (Ortho Diagnostic
System, USA), selon que l'on veut obtenir des CD8+ ou CD4+
respectivement, à raison de 1 JlL d'anticorps monoclonaux par 1 X 106
lymphocytes. Les tubes sont agités délicatement et incubés à 37° C, 5%

---

77
C02 pendant 30 minutes. Du complément de lapin est alors ajouté à raison
de 50 J.1L par 1 X 10 6 cellules et les tubes incubés à 37° C dans un bain-
marie avec agitation pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite lavées 2
fois avec du milieu de culture et comptées. La pureté des sous-populations
cellulaires d'environ 95%, est déterminée par énumération des cellules
positives par immunofiuorescence, d'après la technique décrite par
Welliver et al., (1984), en utilisant les anticorps monoclonaux OKT4 ou
OKT8 (ortho), dirigés contre les marqueurs de surface des lymphocytes
CD4+ ou CD8+ respectivement.
2.2.6 Culture des monocytes et des macrophages
Une fois les cellules non adhérantes (lymphocytes) récoltées (cf
2.2.2), les boîtes de Pétri sont lavées 3 fois avec du milieu MEM. Les
cellules fraîchement adhérées sont des monocytes et peuvent être utilisées
immédiatement dans des tests impliquant ce type de cellules. Sinon, une
quantité de 2 mL de MEM contenant 30% de sérum autologue est ajoutée à
chaque boîte de Pétri et la culture est incubée à 37° C, 5% de C02 pendant
1 semaine afm d'obtenir les macrophages. Les cellules sont lavées avec du
MEM et nourries avec 2 mL de MEM, 30% de sérum autologue 3 fois au
cours de la semaine.

---

78
2.2.7
Test de stimulation des lymphocytes
Les PBMC séparés sur Ficoll-Hypaque sont ajustés à 1 X 106
cellules/mL. Une quantité de 0,1 mL de la suspension cellulaire est placée
dans chaque puit d'un microcabaret de 96 puits à fond plat (Nunc,
Burlington, Canada). L'expérience se fait en triplicata. Dans les puits
contrôle on rajoute 0,1 mL de milieu RPMI-I0, alors que dans les autres
puits
on
place
0,1
mL
de
mitogènes
comme
la
PHA-P
(phytohémagglutinine, Difco, Détroit), la Con A (Concanavaline A, Sigma,
USA), le PWM (Pokeweed Mitogen, Gibco) à différentes concentrations;
du virus vivant ou inactivé à différentes multiplicité d'infection ou
dilutions. Les plateaux sont incubés à 37° C avec 5% de C02 pendant 72
heures, puis, 20 JlL de thymidine tritiée (New England Nuclear), diluée
1/20 (l JlCi/puit) est ajoutée pendant les dernières heures et la plaque
incubée pendant 4 heures à 37° Cet 5% de C02. Les cellules marquées
sont ensuite récoltées dans un flitre (Skatron) et le décompte détenniné à
l'aide d'un compteur Bêta (Beckman).

---

79
2.2.8 Infection des cellules de lignées établies
Ce test s'est fait avec 5 lignées cellulaires maintenues en culture, à
savoir, les cellules K562 (cellules null provenant de leucémie myéloïde
chronique); les cellules Raji et BJA-B (lymphocytes B isolés d'un
lymphome de Burkitt); les cellules 1301 et Molt-4 (cellules de type null,
pour les 1301 et, lymphocytes T, pour les Molt-4; obtenues à partir de
leucémies lymphoblastoïdes aigües). Les cellules Raji possèdent le génome
du virus Epstein-Barr (EBV), alors que les 4 autres types de cellules ne le
possèdent pas. Les cellules qui sont maintenues en culture sont lavées et
comptées. Une quantité de 3 à 4 X 106 cellules est placée dans des tubes de
10 mL et centrifugée et le culot resuspendu dans une suspension virale avec
une m.o.i. de 1,5 ou 10. Le tout est incubé pendant 2 heures à 37° C, 5%
C02. Les cellules sont ensuite lavées, le culot resuspendu dans du milieu
RPMI-10 et incubé à nouveau à 37° C, 5% de C02 pendant plusieurs jours.
Une portion de ces cellules est stimulée avec des mitogènes comme la PHA,
la Con A, le PWM, 3 jours avant ou après l'infection avec le virus. On fait
un témoin de cellules non infectées que l'on cultive avec du RPMI-10
seulement. Un échantillon est prélevé tous les 2 jours et les cellules sont
ensuite nourries.

---

80
2.2.9
Infection des lymphocytes frais
Une quantité de 3 à 4 X 106 cellules est placée dans des tubes de 10
mL, centrifugée et le culot resuspendu dans l'inoculum viral à la
multiplicité d'infection de 1, 5 ou 10. Après une incubation de 2 heures à
37° C, C02, les cellules sont lavées et resuspendues dans du milieu de
culture. Les tubes contenant les cellules sont placés à 37° C en atmosphère
de C02 pendant 15 jours. Cette opération se fait en duplicata. Un aliquot
du surnageant d'un des tubes sera prélevé comme tel, tous les jours en vue
de la détection du virus, de l'interleukin 1 et 2 (IL-l et IL-2) et de
l'interféron
total ou gamma et conservé à-70° C.
La quantité de
surnageant prise est remplacée avec du RPMI-10 frais. L'autre tube de
lymphocytes infectés est centrifugé et le surnageant récolté au complet
pour les tests mentionnés ci-haut.
Les cellules sont ensuite lavées et
réincubées avec du milieu de culture frais. La récolte des surnageants se
fait ainsi pendant 15 jours.
Quand une stimulation avant ou après
l'infection des lymphocytes avec le virus a lieu, on incube la même quantité
de cellules (3 à 4 x 106), en présence de mitogènes ou de virus pendant 3
jours. Après ce temps, les cellules sont alors infectées avec le virus ou
stimulées et la récolte des sumageants à titrer se fait à partir du premier
jour post-infection (p.L) ou post-stimulation. Un témoin cellules, incubées
avec du RPMI-I0, ainsi qu'un témoin cellules HEp-2 infectées avec le
virus, dans les mêmes conditions que les lymphocytes, sont prévus. Des

---

81
échantillons de ces tubes témoins sont aussi prélevés tous les jours pour le
dosage de l'IFN, l'IL-l et l'IL-2 ainsi que pour le titrage viral.
2.2.10
Infection des monocytes et macrophages
Les cellules adhérantes à la surface de la boîte de Pétri sont
infectées avec du RSV, avec un m.o.i. de 1. Elles sont ensuite incubées à
370 C en atmosphère de 5% de C02 pendant 2 heures. Après ce temps,
les cellules sont lavées et nourries avec du milieu de culture.
Des
échantillons sont prélevés tous les jours pour le titrage du virus et le dosage
de l'IL-l et conservés à -700 C.
2.2.11
Test de viabilité des cellules infectées
Le pourcentage des cellules vivantes, par rapport à celles qui sont
mortes est détenniné par le décompte, après coloration au trypan bleu, des
cellules prélévées toutes les 4 heures et ensuite tous les jours. On prévoit un
tube témoin contenant la même quantité de cellules non infectées que l'on
comptera en même temps que les autres.

---

82
2.2.12
Test d'immunoOuorescence
2.2.12.1
Immunofluorescence indirecte de membrane
Une quantité de 1 X 106 cellules est placée dans un tube de 5 mL,
centrifugée et le culot resuspendu et placé dans un tube de 1 mL (Kimble),
maintenu dans de la glace. Les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS
froid et resuspendu dans 0,2 mL d'anticorps monoclonaux dirigés contre
les protéines G et F ou polyclonaux, dilués If20, provenant d'enfants ayant
une infection à RS
. Après une incubation d' 1 heure dans de la glace, les
cellules sont à nouveau lavées 3 fois avec du PBS.
Elles sont ensuite
incubées pendant 45 minutes avec 0,2 mL de conjugué de chèvre anti-
immunoglobulines humaines ou de souris, à la fluorescéine (Ortho), dilué
1/10. On lave ensuite 3 fois avec du PBS et le culot est resuspendu avec
une goutte de PBS-glycérol (1:1). Une goutte de cette suspension cellulaire
est montée entre lame et lamelle et observée au microscope Zeiss à UV
(Axioscope). Un témoin cellules HEp-2 infectées avec le virus est traité de
la même façon. On prévoit aussi un témoin cellules infectées ou non que
l'on incubera seulement avec le conjugué.

---

83
2.2.12.2
Immunofluorescence directe de membrane
Cette technique s'est faite sur des cellules en utilisant un anticorps
monoclonal de souris couplé à la fluoréscéine (Whittaker, Maryland). En
résumé, 1 X 106 de cellules infectées ou non sont lavées et incubées avec
36 JlL d'anticorps couplé pendant 30 minutes à 4° C. Les cellules sont
ensuite lavées et resuspendues dans du PBS-glycérol (1:1), une goutte est
montée en lame et lamelle et observée au microscope
Zeiss à UV
(Axioscope).
2.2.12.3
Immunofluorescence indirecte interne
Pour cela, les cellules sont lavées comme précédemment, le culot
resuspendu et une goutte déposée sur une lame et ensuite étalée à l'aide
d'une aiguille.
La lame est séchée, fixée à l'acétone froid (-20° C) et
colorée comme pour les tests d'immunofluorescence de membrane décrits
précédemment. Le tout et monté entre lame et lamelle avec une goutte de
PBS-glycérol (9: 1) et observé au microscope Zeiss à UV (Axioscope).

---

84
2.2.13
Mesure de l'activité NK (Natural Killer)
Le test de l'activité NK a été effectué en utilisant comme cellule-
cibles des K56Z et des cellules HEp-Z, infectées ou non par le RSV. Les
effecteurs utilisés sont des PBL frais d'adultes ou de sang de cordon
infectés ou non. Les cellule-cibles sont comptêes, lavées, resuspendues au
vortex et une partie est infectée avec du virus ou incubée avec les
glycoprotéines virales. L'autre partie de cellules non infectée est incubée
en même temps que celles qui le sont. Après 1 heure d'incubation, à 37° C
en atmosphère de 5% de COZ, les cellules sont lavées, resuspendues au
vortex et marquées au chromate de sodium -51 (Na51 Crz04) (New
England Nudear, Boston, MA), à raison de 0,1 mL (100 J.lCi) par million
de cellules, pendant 1 heure à 37° C, COZ avec agitation légère toutes les
15 minutes.
Les cellules sont ensuite lavées 4 fois avec du RPMI-10,
comptées à nouveau et ajustées afin d'obtenir une concentration finale de 1
x 105 cellules par mL. Une quantité de 0,1 mL de la suspension cellulaire
est placée dans chaque puit d'un microcabaret à fond conique. On ajoute
ensuite 0,05 mL d'une suspension de PBL frais incubée ou non avec les
glycoprotéines ou infectée ou non avec le virus et dont la concentration
finale est de 4 x 106
cellules par mL, pour un ratio de E/T
(effecteurs/cibles) de ZO:1.
On prévoit
les 6 premiers puits comme
témoins et qui ne contiendront que des cellules-cibles marquées au 51 Cr et
0,05 mL de milieu RPMI-10. Le test se fait en triplicata et les plaques sont

---

85
incubées à 37°C en atmosphère de 5% de C02 pendant 16 heures. Les
plaques sont ensuite centrifugées à 4° C à 900 r.p.m. (centrifugeuse
Beckman, modèle TI-6), pendant 5 minutes. Les 6 premiers puits témoins
ne contenant que les cellules-cibles marquées au 51Cr et le RPMI-10
constitueront le minimum (3 puits) et le maximum (3 autres puits) de
libération du 51Cr, les puits contenant les cellules-cibles et les effecteurs
étant le test. Après la centrifugation, à 4°C, dans les puits constituant le
minimum, ainsi que dans les puits du test, on prélève 0,1 mL
de
surnageant, qui est ensuite placé dans des tubes Kimble, alors que les
cellules sont resuspendues dans les puits constituant le maximum et 0,1 mL
de cette suspension cellulaire est prélevé comme précédemment. Les tubes
sont comptés dans un compteur gamma (LKB, modèle 1272, clinigamma).
Le calcul de l'activité NK, détenniné par le pourcentage de lyse des
cellules-cibles et donc de libération du chrome se fait comme suit:
T-S
Activité NK =
_
X 100
M-S
où T est le pourcentage de libération du chrome 51 causée par les
effecteurs en lysant les cellules-cibles; S est le pourcentage de lyse
spontannée des cellules-cibles ou minimum; M constitue le maximum de
libération de chrome.

---

86
2.2.14
Attivité tytotoxique
dépendante
des antitorps
(ADCC)
Ce test est effectué en utilisant comme cibles des cellules Raji
infectées ou non avec le RSV. Les cibles infectées ou non sont marquées au
chromate de sodium comme pour le test NIC Les cellules Raji sont ensuite
lavées, comptées et ajustées à 105 cellules/mL et 0,1 mL de la suspension
est placé dans chaque puit d'un microcabaret de 96 puits à fond conique.
Les PBL frais, servant d'effecteurs
sont ajustés à 4 X 106 cellules/mL et,
0,05 mL de la suspension est ajoutée aux puits contenant les cibles (ratio
20:1). Une quantité de 0,05 mL de sérum positif dilué 1/10 est placé
ensuite dans les puits du test. Le test se fait en triplicata et on prévoit 6
puits ne contenant que des cellules-cibles, marquées au 51Cr, mais auxquels
on ne met pas de sérum , pour le maximum et le minimum de libération
du chrome 51. La plaque est ensuite incubée à 37° C, 5% C02 pendant 16
heures, après quoi, on récolte les échantillons exactement comme pour le
test NK.

---

87
2.2.15
Activation des cellules T cytotoxiques (CTL)
Les PBL frais comptés sont divisés en 3 parties qui constituent les
cellules stimulatrices, les cellules réceptrices, ainsi que des PBL qui
resteront non infectés. Les cellules stimulatrices sont infectées avec du
RSV avec une m.o.i. de 1 pendant 1 heure, ou incubées avec les
glycoprotéines de surface du virus à des concentrations de 10 ou 20 ng par
1 X 105 cellules, dépendamment du donneur. Les cellules réceptrices sont
des PBL non infectés ni incubés avec les glycoprotéines. Après l'infection,
les cellules stimulatrices sont lavées et mises en contact avec les cellules
réceptrices dans des ratios (stimulatrices/réceptrices) de 50:1, 20:1, 10:1,
2: 1 et 1: 1.
Les cellules sont alors incubées à 37° C, 5 % de C02 et
nourries avec du RPMI-10 auquel on a ajouté 5mM de 2-mercaptoéthanol
tous les 3 jours.
Le reste des cellules stimulatrices est incubé, nourri
comme les autres, ensuite inactivé aux U.V. et utilisé pour restimuler les
CTL avec les mêmes ratios que plus haut une semaine après. Le tout est
réincubé à 37° C, 5% de C02 et nourri tous les 3 jours. Un aliquot est
prélevé tous les jours pour la détection d'IL-2 et d'interféron gamma. Sept
jours après la restimulation, le test de cytotoxicité est effectué dans un
système autologue en utilisant comme cellules effectrices une partie des
CTL générés et comme cibles des PBL infectés ou non, ou incubés avec les
glycoprotéines virales et marqués au chromate de sodium -51. Le taux de
cytotoxicité est calculé selon la formule du test NK. On prévoit un témoin

---

88
K562 afin de s'assurer que cette activité n'est pas NK. L'autre partie des
CTL est analysée par FACS.

---

89
2.2.16
Induction de cellules suppressives
Un test de stimulation des lymphocytes est fait avec différentes
dilutions de virus vivant, inactivé ou de protéines virales afm de connaître
la dilution optimale qui entraîne une prolifération des cellules.
L'expérience a été faite ici dans un système autologue. Après le test de
stimulation, des PBMC frais sont mis en contact avec les antigènes ,qui sont
ici le RSV infectieux, inactivé ou les glycoprotéines, dans des conditions
optimales (c'est-à--dire en utilisant la dose réponse maximale) ou d'excès
d'antigènes (c'est-à-dire en utilisant 3 à 5 fois la dose réponse maximale).
Les cellules sont alors cultivées dans du milieu RPMI-IO et incubées à 370
C en atmosphère de 5% de C02. Sept jours après, une partie des cellules
est lavée et traitée à la mitomycine C à raison de 25 JlL par 1 X 10 6
cellules d'une solution de 2 mg/mL pendant 30 minutes. Les cellules sont
lavées à nouveau et lOO 000 cellules sont incubées avec la même quantité de
PBMC frais en présence de différentes concentrations d'antigènes pendant
5 jours. Des témoins PBMC frais avec PHA, PBMC avec PHA et dilution
optimale d'antigènes , PBMC avec dilution optimale d'antigènes sont
prévus. Des échantillons sont prélevés le dernier jour pour le dosage de
l'IFN- ~, l'll..-l et 1'll..-2. Vingt (20) J.1L de 3H-thymidine (1 JlCi/puit) est
placé dans chaque puit et la plaque est incubée pendant 4 heures. Le taux
de cellules ayant incorporé la thymidine est déterminé à l'aide d'un

---

90
compteur Bêta.
Le pourcentage de suppression est calculé d'après la
fonnule:
c.p.m. en présence de suppresseurs
100 -
Xl00)
( c.p.m. en absence de suppresseurs
2.2.16.1
Effet des cellllles sQP.Pressives sur l'activité NK
La partie de cellules suppressive non traitée à la mitomycine C, où
le surnageant de culture est mélangé avec des PBMC frais, dans les
proportions 1:1. Une partie de ces cellules est utilisée comme effecteurs
dans un test d'activité NK le jour même. L'autre partie du mélange est
incubée pendant 24 heures à 370 C, 5% C02 et est ensuite utilisée comme
effecteurs dans un test NK. Les cibles utilisées sont les K562.

---

91
2.2.17
Techniques de dosage de l'interféron
2.2.17.1
Dosage de l'interféron total
Dans des microplaques de 96 puits à fond plat, on effectue une série
de dilutions 1:2 avec 0,1 mL d'échantillon à titrer ou d'interféron standard
et 0,1 mL de milieu MEM-199, 10% SFV. Chaque échantillon est titré en
triplicata.
On prévoit 3 puits de témoins cellules et 3 autres puits de
témoins viros. On ajoute ensuite dans chaque puit 0,1 mL d'une suspension
de cellules HEL (fibroblastes de poumon embryonnaire humain) ajustée à 4
X 105 cellules/mL. La microplaque est incubée à 37° C pendant 24 à 48
heures ou jusqu'à la confluence du feuillet cellulaire. La plaque est alors
renversée sur une compresse stérile afm d'enlever le surnageant et, une
quantité de 100 doses de virus sindbis contenues dans 25 JlL est ajoutée à
chaque puit sauf dans les puits témoins cellules. Dans chaque puit on ajoute
0,2 mL de milieu MEM sans sérum.
La plaque est ensuite scellée et
incubée à 37° C pendant 72 heures. Le titre est déterminé après coloration
du feuillet cellulaire au naphtol-blue-black et lecture au spectrophotomètre.
Le principe de cette coloration est que les cellules protégées par
l'interféron ne sont pas infectées par le virus et vont retenir le colorant.

---

92
2.2.17.2
Dosage de l'interféron gamma
Le dosage de l'interféron gamma (IFN- CS') a été fait à l'aide d'une
trousse de RIA (Centocor, Malvem, P.A., USA).

---

93
2.2.18
Dosage de l'interleukine 1 et 2
Le dosage de l'interleukine 1 (IL-1) a été fait à l'aide d'une trousse
ELISA (Endogen, Boston, MA, USA); celui de l'interleukine 2 (IL-2) à
l'aide d'une trousse ELISA (Collaborative Research Incorporated, Bedford,
MA, USA).
2.2.19
Analyses statistiques
Un test de distribution t, de Student (Dixon et Massey, 1969) a été
effectué pour déterminer les significations statistiques de nos données.
Ainsi, cette analyse a consisté à comparer les moyennes de chaque test
individuel avec son témoin, donc une comparaison des moyennes de 2
échantillons.

---

CHAPITRE 3
RÉSULTATS

---

95
3.1
PRODUCTION VIRALE
La production du virus dans des flacons de polystyrène de 150 cm2
donne un titre appréciable, 107 UFS/mL, alors que, avec le Ventregel, le
titre viral est entre 108 et 1010 UFS/mL.
3.2
CONCENTRATION VIRALE
La concentration du virus sur coussin de saccharose (1,15 et 1,45
M) a un rendement de 93 à 100% respectivement (tableau V). Avec le PEG
6000, comme autre milieu de concentration, le rendement est de 80%.
3.3
PURIFICATION VIRALE
Le rendement
tel que mesuré par spectrophotométrie, après
purification sur gradient, est illustré dans les figures 2 et 3.
Après
purification sur gradient de saccharose, les fractions dont la densité est
entre 1,17 et 1,20 g/cm3 contiennent 90 et 57% de virus infectieux, dans le
cas de gradient discontinu et continu de saccharose respectivement (tableau
VI). La différence dans le rendement à la suite du premier et du second

---

96
cycle de purification peut aussi être observée par la diminution de la D.O.
(figure 2 et 3).
La purification du virus en gradient de Renografin (tableau VI)
donne 1 ou 2 bandes. Mais l'examen des fractions correspondantes au
microscope électronique (EM) ne démontre aucune présence de virion
intact Aucune particule virale n'est obtenue après purification du virus en
gradient de Percoll, en dépit de l'observation de bandes après la
centrifugation.

---

97
TABLEAU V:
CONCENTRATION DU RSV SUR COUSSIN DE
SACCHAROSE
ET
PRÉCIPITATION
AU
POLYÉTHYLENE GLYCOL (pEG) 6000.
Échantillons
Volume (mL)
UFS total X 1010 Rendements (%)
Surnageant
500
30
100
PEG
10±0
24,15±0,21
80,5±0,71 •
•
Saccharose 1,15M
4O±0,71
28,09±0,1
93,4±0
110,25± 1,06•
Saccharose 1,45M
45 ±1,41
33,07±0,32
,
UFS: Unités formant syncytia
PEG: Polyéthylène glycol; les différences sont significatives pour
pS 0,01. Le titre est exprimé en loglO du nombre d'unités formant syncytia.

---

98
FIGURE 2:
PURIFICATION DU RSV EN GRADIENT
DISCONTINU DE SACCHAROSE.
1,0
e
=
c:>
QCl
0,8
N
'<
~
0,6
~
CI
-E-<~ 0,4
0
~
E-<
0,2
-
tIJ
Z
~
Q
0,0
0
5
10
15
20
FRACTIONS (0,5 mL)
En abcisse on a les fractions récoltées et en ordonnée, la densité optique.

---

99
FIGURE 3: PURIFICATION DU RSV EN GRADIENT CONTINU DE
SACCHAROSE
0,30 - r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ,
0,25
e
I:l
Cl
00
0,20
N
-<
l';I;1
;:J
~
0,15
1-4
t:
0
'l';I;1
E-c
0,10
1-4
fi:!
Z
l';I;1
l:l
0,05
0,00 L~!:;:!~:::!::::!:~--r_---=;!::!::=t:::::L._.....-___J
5
10
15
20
°
FRACTIONS (0,5 mL)
En abcisse on a les fractions récoltées et en ordonnée, la densité optique.

---

TABLEAU VI:
PURIFICATION DU RSV SUR GRADIENT DE SACCHAROSE, RENOGRAFIN, PERCOLL ET
MÉTRlZAMIDE
Méthode
UFS/mL
UFS totalXloS'
Volume (mL)
Densité (g/cm3)
Rendement(%)
PEG
7 X loS
35
5
1001
Gradient discontinu
6XloS
31,5 ± 2,12
5,25±O,35
1,17 - 1,20
9O±6,1
~
(30,45 et 60%) de saccharose.
Gradient cootinu (30-60%) de
6X loS
19,85±O,21
3,3±O,42
1,18-1,20
56,7±3 ~
~harose.
Gradient discontinu
0
•
••
1,16 - 1,23
0
(30, et 60%) de renografin
Gradient cootinu
0
•
••
1,04 - 1,39
0
(30, et 60%) de renografin
Gmdient de percoll
0
•
••
1,084 - 1,096
0
Gradient cootinu (15-45%) de
0
•
••
••
0
métrizamide
1. Nous considérons l'échantillon précipité au PEG comme représentant 100% de rendement
Toutes les fractions ont été titrées et examinées au microscope électronique (ME)
• AuclBle activité virale détectée
•• Le volume ou la densité des fractions ne peuvent être détectés
UFS: Unité formant syncytia
PEG: Polyéthylène glycol
Les différences sont significatives pour p S 0,01.
o
o

---

101
L'examen au microscope électronique,
des fractions récoltées à
partir du gradient de métrizamide,
ne montre aucune particule virale
intacte.
Ces fractions n'ont aucune infectivité lorsqu'elles sont titrées.
D'ailleurs, un contact métrizamide-virus de 30 minutes à 1 heure, réduit le
titre viral de 2 logarithmes.
3.4
PURIFICATION DES GLYCOPROTÉINES VIRALES PAR
CHROMATOGRAPHIE
La purification par chromatographie d'affinité, en utilisant des
lectines de lentille, nous a permis d'obtenir les 2 glycoprotéines de surface
du RSV humain. Les fractions positives ont été détectées simultanément,
par dot-blot et spectrophotométrie.
Après électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en conditions non-réductrices, suivie du transfert sur feuille
de nitrocellulose et détection par immunoperoxydase, on note la présence
d'une protéine de
90 000 et de deux autres de 150 000 et de 70 000
Daltons, qui sont la protéine G et celle de fusion, sous ses deux formes
(dimérique et monomérique). La forme dimérique (150 000 Daltons) de la
protéine de fusion, est obtenue par chomatographie d'affinité,
après
l'utilisation des lectines de germe de blé
. La forme monomérique de la
protéine de fusion, est la plus fréquemment rencontrée dans les conditions
non réductrices de purification. La protéine de 150 000 Da est plutôt rare.
Le profil électrophorétique de ces polypeptides est montré dans la figure 4.

---

102
La séparation sur colonne de Sephacryl S-200, des fractions obtenues avec
les lectines de lentille, ne nous a permis que de résoudre la protéine de
fusion. Seules ces protéines sont retrouvées après coloration du gel au
nitrate d'argent.

---

103
FIGURE 4:
PURIFICATION
DES
GLYCOPROTÉINES
DE
L'ENVELOPPE DU RSV PAR CHROMATOGRAPHIE
D'AFFINITÉ
St
C
RSV
G
F
F
1
'1
Il
\\
1
1
\\
,
i
92,5 -
-
1
1
i'
66,2 -
1
,
11
, .
1
1
1
45 -
1
•
: ~ :
21,3 -
i ! 1
•
1
14,4 -
,
,
J
2
3
4
5
6
1: Standards; 2: Contrôle cellules non infectées; 3: Virus entier solubilisé; 4: Glycoprotéine G de 90.000
Da.; 5: forme dimérique de la protéine de fusion F; 6: protéine de fusion F de 70.000 Da (forme
monomérique).

---

104
3.5
TEST DE STIMULATION DES LYMPHOCYTES
Les résultats de ce test, montrent que la PHA 1:100, le PWM 1:25
sont les dilutions optimales utilisées au cours de notre travail, car l'index
de stimulation est respectivement de 39 et 14. Aussi, d'après des données
non illustrées ici,
la m.o.L à utiliser dans le cas d'une stimulation de
lymphocytes est de 3 pour le RSV inactivé et de 1 pour le RSV infectieux.
La stimulation avec la Con A est nulle. D'autre part, avec le virus, la
stimulation des lymphocytes s'annule, au fur et à mesure que la m.o.i.
augmente (données non-illustrées).
Les tests de stimulation, illustrés dans les tableaux VII et VITI
montrent, dans le cas du virus vivant ou inactivé, la dilution optimale
utilisée, et dans le cas des glycoprotéines, la concentration optimale.
Dans le cas du tableau VIT, la dilution optimale est de 1:20, pour le
RSV infectieux et de 1:80 pour le RSV inactivé. En ce qui concerne les
glycoprotéines, une quantité de 10 ng du mélange des 2 glycoprotéines est
nécessaire pour une stimulation maximale, alors que, pour la protéine de
fusion seule, il faut 40 ng (tableau VITI)

---

105
TABLEAU VII:
TEST DE STIMULATIaN DE LYMPHOCYTES
FRAIS AVEC LE RSV INFECTIEUX OU
INACTIVÉ.
Virus ou mitogènes
CPM
IS
RPMI
•
603±90
PRA (1:100)
21948±1908
36,40
RS 1:2,5
274±17
0,45
RS1:5
7071±638
11,72
RS 1:10
5988±927
9,93
RS 1:20
8828±1099 •
14,64
RS 1:40
7365±173
12,21
RS 1:80
4512±382
7,48
RS 1:160
3124±298
5,18
RS 1:320
3056±227
5,07
~ 1:2,5
627±12
1,04
&81:5
323±48
0,54
:a5 1:10
191±30
0,32
~1:20
266±68
0,44
&05' 1:40
2111±269
3,50
a51:80
3022±769
5,01
&8 1:160
2656±567
4,40
I?t5 1:320
2241±158
3,71
RS: RSV, ~: RSV inacùvé; CPM: coups par minute; IS: index de stimulaùon: rapport entre les CPM
des cellules sùumulées avec la PHA ou le virus et les CPM du témoin cellules non traitées (RPMI) ; PHA:
phytohémaggluùnine, les différences sont significatives pour p~O,Ol, entre chaque test et le témoin cellules
non traitées. Les CPM représentent les moyennes de trois expériences et les déviations standards.

---

106
TABLEAU VIII:
TEST DE STIMULATION DE LYMPHOCYTES
FRAIS AVEC LES DEUX GLYCOPROTÉINES DU
RSV
F
F+G
Protéine ou
CPM
IS
CPM
IS
mitogène
RPMI
641± 45-
641± 45-
PRA (l:I00)
22470±1976
35,05
22470±1976
35,05
lOng
3984±347
6,2
6493±464-
10,13
20ng
7949±560
12,40
3057±241
4,77
40ng
8848±1768-
13,80
3062±300
4,78
80ng
5611±649
8,75
4797±398
7,48
160ng
5455±1046
8,51
ng: nanogramme; F: protéine de fusion; F + G: protéine de fusion F et la glycoprotéine G.
PRA: phytohémagglutinine, CPM: coups par minute; IS: index de stimulation. La protéine G seule n'est
pas présente ici, parce qu'elle n'a pas été résolue après chromatographie sur gel; les différences sont
significatives pour p~O,OI entre chaque test et le témoin cellules non traités (RPMI). La stimulation des
protéines aux concentrations inférieures à 10 ng n'a pas été illustrée dans ce tableau car ces valeurs sont très
négligeables. Le test a été fait en triplicata sauf en ce qui concerne la protéine de fusion seule à la
concentration 10 ng qui a été effectué seulement 2 fois.

---

107
3.6
PRODUCTION DE VIRUS PAR LES CELLULES MONONUCLÉÉES
3.6.1 Les lignées établies
Dans la figure 5, on remarque que les 4 lignées de cellules
produisent du virus avec un maximum le jour 2. Le titre viral varie entre
102,4 et 102,7 UFS/mL. La production virale diminue ensuite le jour 4 et
6. La diminution de la production virale est beaucoup plus rapide avec les
lignées 1301 et Raji.
3.6.2 Par les cellules mononucIéées fraîches d'adultes
Les résultats des figures 6 à 9, nous montrent que la population
totale des cellules mononucléées, à savoir les CD3+, les CD4+, les CD8+,
les monocytes et les macrophages peuvent être infectés par le RSV et
produisent du virus suite à cela. Le pic de production maximale se situe au
jour 1 p.i. Les pics au jour 1 sont entre 102,7 et 103,8 UFS/mL.
Les
CD3+ sont la population de cellules mononucléées produisant le plus de
virus (figure 6). fi Y a ensuite une diminution graduelle de la production
de virus pour s'annuler vers le jours 6 (figures 6, 7 et 8).
Pour les
monocytes et les macrophages, la production virale se termine au jour 3

---

108
après l'infection (figure 9). Lorsque certaines de ces cellules' infectées sont
lavées tous les jours, on remarque qu'il y a toujours
production virale
(figure 10 et Il) et qui dans le cas de la figure 10 est supérieure au jour 2
p.i. De plus, les PBL non lavés produisent du virus plus longtemps. Des
résultats similaires sont obtenues avec les lymphocytes du sang de cordon.
Le tube contenant le virus qui a selVi à infecter les cellules, a été incubé
dans les mêmes conditions que les cellules infectées et ensuite récolté tous
les jours puis titré sans révéler de trace de syncytia. Le virus inactivé ne
provoque pas la fusion des cellules puisque, le virus irradié aux u.v. a été
titré afin de s'assurer de son inactivation complète, avant
le test de
stimulation des lymphocytes ,et n'a pas produit de syncytia.

---

109
FIGURE 5: 1ITRE DU RSV DANS LES LIGNÉES ÉTABLIES
3
EJ KS62
, ,
• 1301
,,',
,
• R.aji
13 Molt4
, ,
,
2
','
, ,
,~,
','
, ,
,
....J
",
E
, ,
......
,',
,
(1)
u..
','
::>
' ,
,
, ,
,
1
' ,
,
, ,
,
, ,
,',
,
, ,
,~,
','
','
, ,
,',
,',
0
2
4
6
JOURS
En abcisse. le oomble de jours d'iDcubatiœ; en ordamée le titre obtenu. Chaque colonne représente un type
cellulaire; Cette expérience a ~ faire 4 fois; la m.oj utilisée est de 1; UFS: unités fonnant syncytia. Les
barres indiquent les d6viations standards; les titms sont exprimés en Jogaridunes de 10, des unités formant
syncytia

---

110
FIGURE 6: TITRE DU RSV PAR LES CELLULES MONONUCLÉÉES
DU SANG PÉRIPHÉRIQUE.
4..,......---------------------,
3
1
o~--,..._-__- -.......- _ - -__- - o _ - _ _ < l - - - - 1
o
2
4
6
8
JOURS
En abcisse le nombre de joms d'incubation; en ordonnée, le titre. UFS: unités fŒlllant syncytia; la m.o.i
utilisée est de 1; cette exp&ience a ~ faite 3 fois, avec S dooneurs. Les barres indiquent les déviations
standards; les titres ~t eXIXim6s en logaritIuJa de 10, des unités formant syncytia.

---

1 1 1
FIGURE 7:
TITRE DU RSV PAR LYMPHOCYTES CD3+ OU LES
LYMPHOCYTES B
S"'T"""------------------------.
•
lymphocytes CD3 +
•
lymphocytes B
4
3
2
1
0 ...-
__-~---.--r---......--
....-
.....-~----,r-----1
o
2
4
6
8
10
JOURS
En abcisse le nombre de jours d'incubation; en ordonnée, le titre. UFS: unités fŒDl3Ilt syncytia; la m.o.i
utilisée est de 1; oeae exp&ience a ~ faite 3 fois, avec S donneurs. Les barres indiquent les déviations
standards; les titres sont expim6s en logarithmes de 10, des unités formant syncytia.

---

112
FIGURE 8:
TITRE DU RSV PAR LES LYMPHOCYTES CD4+ CD8+
4
.. lymphocytesCDS •
.. lymphocytesCD4 •
3
..J
El
-e:t.l~j;;) 2
1
O....- - - -.......- - - - - -__--~--~-.......r------I.
o
2
4
6
8
JOURS
En abcisse, le IlOIDŒe de jours d'incubation; en ordonnée, le titre. UFS: unités formant syncytia; la m.oj
utilisée est de 1; eeu.e expmenee a ~ faite 3 fois, avec S donnews. Les barres indiquent les déviations
standards; les titres sœt expimés en logarithmes de 10, des unités formant syncytia.

---

113
FIGURE 9: TITRE
DU
RSV
PAR
LES
MONOCYTES
ET
MACROPHAGES
4..,.------------------------.
•
monocytes
•
naaopbages
3
1
0 ......-
.......- -.......- - + - -....- ....- -.....- .....----.,
o
2
4
6
8
JOURS
En abcisse, le DOIDb'e de jours d'incubation; al ordonnée, le titre. UFS: unités formant syncytia; la m.o.i
utilisée est de 1; cette expérience a ~ faite 3 fois, avec 5 donneurs. Les barres indiquent les déviations
standards; les titres soot expimés en logarithmes de 10, des unités fonnant syncytia.

---

114
FIGURE 10:
TITRE DU RSV PAR LES PBL LAVÉS OU NON
5 "T"""------------------------,
•
PBL + RS (lav6s)
~
PBL+RS
4
2
1
O-o--__-...,...---r-......-~>_-o_-_o_-_o_-"""T'"-__1
o
2
4
6
8
10
JOURS
En abcisse. le nombre- de jours d'incubation; en ordonnée. le titre; les cercles pleins représentent les PBL
infectés et lavés tous les jours et les cercles vides. les PBL infectés. mais laissés comme tels durant le
temps d'incubation. La m.oj utilisée est de 1; UFS: unités formant syocytia; cette expérience a été faite 3
fois avec 5 donneurs. Les bIIms indiquent les déviations standan:ls; les termes RS ou RSV désignent le virus
respiratoire syncytial; les tiares sont expimés en logarithmes de 10. des unités formant syncytia

---

115
FIGURE Il:
TITRE DU RSV PAR LES LYMPHOCYTES CD3+
LAVÉS OU NON
5-r--------------------------,
~
CD~ + RS (lavés)
•
cm+ +RS
4
2
1
0 ...---p--.---_-_....----4....-
...-
......t---_---.----!
o
2
4
6
8
10
JOURS
En abcisse, le DOIIlbœ de jours d'incub8tion; en ordonnée, le titre; les carrés vides re}X'ésentent les
lymphocyteS CD3+ infectés et Ia~ tous les jours et les losanges vides, les CD3+ infectés, et laissés
comme tels pendant la-durée d'iDcubadoo. L'exp&ience a été faite 3 fois avec 5 donneurs;La rn.o.i utilisée
est de 1; UFS: unités formant syncytia. Les bams indiquent les déviations standards; les tennes RS ou RSV
désignent le virus respiratoire syncytial; les titres sont exprimés en logarithmes de 10, des unités formant
syncytia

---

116
3.6.3 Persistance virale
Il s'agit ici
de lymphocytes totaux provenant de 3 donneurs
séropositifs différents des 5 premiers, chez lesquels on peut observer une
production virale continue (figure 12). Dans ce schéma, on note un pic au
jour 1, comme dans les cas précédents, suivi d'une persistance virale allant
jusqu'à 10 jours. Dans la figure 13 par contre, il n'y a pas de production
de virus durant les premiers jours, et le pic se situe entre le 10e et le 13e
jour après l'infection. On observe ensuite, une diminution brutale de la
production virale à partir du jour 14. Ces cellules peuvent se remettre à
produire du virus à un moment donné, puisqu'un titre de 102,1 UFS/mL a
été obtenu sur un échantillon prélevé au jour 24 p.i.

---

117
FIGURE 12:
INFECTION PERSISTANTE A RSV DANS LES
CELLULES MONONUCLÉÉES.
S~----------------------t
4
2
1
0+----,r--~-~----.r----r--~___r-"""T""-~___r-____1
o
2
4
6
8
10
12
JOURS
En abcisse,le nombre de jours d'incubation; en ordonnée, le titre obtenU; UFS: unités formant syncytia; la
m.o.i utilisée est de 1; cette expérience a été faite 3 fois, avec 2 donneurs. Les barres indiquent les
déviations standards; les titres sont exprimés en logarithmes de 10, des unités formant syncytia.

---

118
FIGURE 13:
INFECTION PERSISTANTE A
RSV DANS LES
CELLULES MONONUCLÉÉES.
4 ........- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . . ,
,
0+-
,............,.r-----
------1
o
10
20
JOURS
En abcisse, le nombre de jours d'incubation; en ordonnée, le titre obtenu; UFS: unités formant syncytia; la
rn.o.ï utilisée est de 1; cette expérience a été faite 3 fois, avec 1 donneur. Les barres indiquent les déviations
standards; les titres sont exprimés en logarithmes de 10, des unités formant syncytia.

---

119
FIGURE 14: TEST DE VIABILITÉ DES PBL INFEcTÉs PAR LE
RSV.
100
90
80
~
5 70
1-;
=
-<
60
5=
{;!il
50
Cl
~
40
30
20
10
0
0
50
100
ISO
HEURES
En abcisse, le temps d'incubation; en ordonnée, le pourcentage de viabilité; la m.oJ utilisée est de 1; cette
expérience a été faite 3 fois, avec 5 donneurs; La viabilité des cellules non infectées, est en moyenne de
95%, dmant toute la durée de l'expérience. Les barres indiquent les déviations standards.

---

120
3.7
TEST DE VIABILITÉ DES CELLULES INFECTÉES
D'après les résultats obtenus avec le décompte des PBL infectés
après leur coloration au trypan bleu, une forte proportion de cellules
demeure viable après l'infection. En effet, il reste encore 80% de cellules
vivantes au bout de 6 jours (144 heures) p.i. (figure 14) et 16 jours après, il
y a encore 78% de cellules viables. La viabilité des cellules non infectées
est en moyenne de 95% pendant la durée de l'expérience.
3.8
TEST D'IMMUNOFLUORESCENCE
Les tests d' immunofluorescence de membrane, ou interne indiquent
que les cellules PBL infectées par le RSV humain expriment les antigènes
viraux à partir de 8 heures après l'infection (figure 15). Le maximum
d'expression d'antigènes se situe à 16 heures post-infection, avec un taux de
25%.
La figure 16 montre des cellules
fluorescentes ou positives
provenant de lymphocytes infectés (photo a, b, c, d, e) ou de cellules HEp-2
infectées (photo f), en comparaison avec des lymphocytes non infectés
(photo g). La fluorescence est caractérisée par la présence d'un contour ou
de tâches blanches (photos a, b, c, d, e et f) par rapport à leur témoin
négatif qui ne présente pas ces caractéristiques. On peut voir que certaines
cellules expriment très peu d'antigènes à leur surface (photo b, c, d, e).

---

121
FIGURE 15: TEST
D'IMMUNOFLUORESCENCE
DES
PBL
INFECTÉS PAR LE RSV.
50
fi)
~E 40
fi)
0
l:l-o
fi)
~
,.,J
30
:5
,.,J
f;I;'l
t.J
f;I;'l
l:l
20
~
10
O+--"""T"-.....,r---~-~----y"--r--...-----r----,r---t
o
20
40
60
80
100
HEURES
En abcisse; le temps d'incubation post-infection et en ordonnée, le pourcentage de cellules positives.
L'expérience a été faite 3 fois avec 5 donneurs.

---

122
FIGURE 16: TEST
D'IMMUNOFLUORESCENCE
DES
PBL
INFECfÉs PAR LE RSV.
Les photos a,h,c,d,e, illustrent des lymphocytes infectés, présentant des antigènes à leur surface; La photo f
représente des cellules HEp-2 infectées. La photo g montre le témoin cellules non infectées. Les 5
premières photos sont des lymphocytes infectés, dont la taille en général a augmenté, et qui montrent des
tâches caractéristiques de la fluorescence. La 6e photo illustre des cellules HEp-2
fluorescentes.

---

123
3.9
PRODUCTION D'INTERFÉRON
3.9.1 Production d'interféron total
Si l'on compare la population totale des cellules mononucléées du
sang périphérique, à savoir les PBL avec les CD3+, CD4+ et CD8+ (figure
17 et 18) on remarque que la production d'interféron est maximale au jour
2 post-infection. Les CD4+ et les CD3+ sont les cellules qui produisent le
plus d'IFN. Les PBL et les CD8+ en produisent moins que les 2 premières
populations. On note aussi que, lorsque les cellules infectées sont lavées
tous les jours, la production d'IFN est diminuée de moitié au jour 2 p.i.
(figure 19).

---

124
FIGURE 17: PRODUCTION D'INTERFÉRON TOTAL PAR LES PBL
ET LES LYMPHOCYTES CD3+, INFECTÉS PAR LE
RSV.
700
•
PBL+RS
600
~
CD3++RS
.J
500
El
....
....
;:l
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
JOURS
Les carrés pleins représentent des PBL et les carrés vides, les lymphocytes CD3+, infectés avec une rn.ol de
1; UI: unités internationales; l'expérience a été faite 3 fois, avec 5 donneurs, les barres indiquent les
déviations standards; les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial

---

125
FIGURE 18: PRODUCTION D'INTERFÉRON TOTAL PAR LES
LYMPHOCYTES CD4+.ET CD8+, INFEcTÉs PAR LE
RSV.
700
III
CD4++RS
600
•
CDS·+RS
500
....J
E
.......
-
::J
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
JOURS
Les carrés représentent des lymphocytes CD4+ infectés et les losanges pleins. des lymphocytes CD8+
infectés; UI: unités internationales; l'expbience a été faite 3 fois. avec 5 donneurs. les barres indiquent les
déviations standards; les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.

---

126
FIGURE 19:
PRODUCI10N D'INTERFÉRON TOTAL PAR LES PBL
INFECfÉS PAR LE RSV, AVEC UNE M.O.! DE 0,1
3OO-r-------------------------,
~
PBL + RS lavés
•
PBL + RS non lavés
200
100
o~__-....--.....____T-~4~;:::::::::t=::::;~+_
_____1
o
1
2
3
4
5
6
JOURS
Les cercles vides représentent des PBL infectés, et lavés tous les jours; Les tel'Cles pleins, montrent les PBL
infectés mains non lavés pendant la durée d'incubation; UI: Unités internationales; l'expérience a étét faite
3 fois avec 5 donneurs; les barres indiquent les déviations standards; Les tennes RS ou RSV désignent le
virus respiratoire syncytial.

---

127
3.9.2 Production d'interféron gamma
En ce qui concerne la production d'interféron gamma, son pic se
situe lui aussi au jour 2 p.i., et ce pour toutes les populations cellulaires.
Cependant, ici se sont les PBL qui en produisent le plus (figure 20). La
production d'interféron gamma est une fois de plus diminuée quand les
cellules sont lavées tous les jours, par rapport à celles qui ne le sont pas
(figure 21), et ceci, indépendamment de la m.o.i. Les CD8+ produisent
moins d'interféron gamma que les CD4+ (figure 22).

---

128
FIGURE 20:
PRODUCflON D'INTERFÉRON GAMMA PAR LES PBL
ET LES LYMPHOCYTES CD3+, INFECTÉs PAR LE RSV
3oo-r----------------------...,
200
100
0 4 - - -......---r--.......--..,.-----.;o----.;~~----r--"""'I
o
2
4
6
8
JOURS
Les cercles pleins représentent les PBL infectés et les cedees vides, les lymphocytes CD3+; ID: unités
internationales; l'expérience a été faite 3 fois avec 5 donneurs; les barres indiquent les déviations standards;
les tennes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.

---

129
FIGURE 21:
PRODUCITON D'INTERFÉRON GAMMA PAR DES PBL
INFECfÉS PAR LE RSV AVEC UNE M.O.I DE 0,1
100--------------------.....
~
PBL+RS
•
PBL+ RS (lavés)
80
60
40
20
o.!L_...........----.-----r----.......-t=:::::::::t:=::..\\.___r---l
o
1
2
3
4
5
6
JOURS
Les cercles pleins représentent les PBL infectés et lavés tous les jours, alors que les cercles vides. les PBL
infectés et non lavés pendant la durée de l'incubation;UI: unités internationales; l'expérience a été faite 3
fois, avec 5 donneurs; les barres indiquent les déviations standards; les termes RS ou RSV désignent le virus
respiratoire syncytial.

---

130
FIGURE 22:
PRODUCTION D'INTERFÉRON GAMMA PAR LES
LYMPHOCYTES CD4+ ET CD8+ INFEcTÉs PAR LE
RSV
2OO-r-------------------------,
0 4 - - _ - . . . . . - -__-~-~___,r_____,r__
..........~..........~~1____r---I
o
1
2
3
4
5
6
JOURS
Les cercles vides représentent les lymphocytes C04+ et les cercles pleins. les lymphocytes CD8+: UI :
unités internationales; l'ex.,mence a été faite 3 fois avec 5 donneurs; les barres indiquent les déviations
standards; les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial

---

131
3.10
MESURE DE L'ACTIVITÉ NK
Le tableau IX représente l'activité NK, lorsque les lymphocytes sont
infectés par le RSV. On note une diminution de cette activité, avec les
lymphocytes infectés avec une souche virulente de RSV, (c'est-à-dire une
souche donnant un effet cytopathique dans les 24 heures suivant
l'inoculation sur des cellules HEp-2). Cette diminution de l'activité NK se
ressent jusqu'au jour 6 après l'infection et ce, autant contre les cellules
cibles infectées ou non. Par contre, elle ne s'annule pas complètement, car,
c'est l'activité CTL qui commence. Cette activité est nulle avec les cellules
Raji, indiquant ainsi que ce n'est pas une activité K (killer) ; elle est aussi
nulle avec les PBL.
Par contre, lorsque la souche utilisée est moins virulente, l'activité
NK est augmentée et ce indépendamment de ce que la cellule soit infectée
ou non par le RSVH, sauf pour le K 562 - RS (figure 23)
L'étude de l'activité NK induite par les 2 glycoprotéines purifiées de
l'enveloppe virale, révèle une augmentation de cette activité (figure 24),
excepté contre les cibles HEp-2 - protéines. L'activité PBL seule, contre les
cibles K 562 - protéines et HEp-2- protéines, est supérieure à celle des
mêmes lignées cibles non mises en contact avec les deux glycoprotéines.Il
n'existe en général pas de différence marquée entre cette cytotoxicité,

---

132
lorsque les effecteurs sont incubés avec les 2 glycoprotéines mélangées et la
protéine de fusion ou infectées avec le RSV.

---

133
TABLEAU IX:
ACfIVITÉ NI{ DES LYMPHOCYTES D'ADULTES
INFECfÉS PARLE RSV
o
1
3
6
PBL
PBL+RS
PBL+RS
PBL+RS
PBL+RS
K562
34+10
25±6
17+8
19±9
18+7
K562+RS
33±9
23±9
19±9
20±8
19+8
RAll
0
0
0,6±O,01
3,2±O,1
0
RAll+RS
0
0
1,4±O,02
1,6±O,02
0
HEp-2
35±6
23+8
20±7
19±7
17+6
HEp-2+RS
34+8
24+7
19±9
19±8
22±8
PBL
0
0
ND
ND
ND
PBL+RS
0
0
ND
ND
ND
ND:Non détenniné; les cellules infectées portent le mot RS; les jours 0,1,3 et 6 constituent le temps
d'infection des cellules effectrices, avant de faire le test NK. Ce test a été fait en utilisant lD1e souche
vimlante; les différences sont significatives pour ~,Ol, entre chacune des quatre dernières colonnes et
celles constituant le contrôle PBL. Les tennes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.
L'expérience a été faite 3 fois, avec S donneurs. Les valeurs indiquent les moyennes plus les déviations
standards.

---

134
FIGURE 23:
ACTIVITÉ NK INDUITE PAR LE RSV DANS LES
LYMPHOCYTES D'ADULTES ET DU SANG DE
CORDON
50
~
;J
Ci
.....
~
40
.....
U
~
c..
r.n
~
r.n
30
>-
..J
~
Q
~
20
10
o
1
2
3
4
K562
K562-RS
HEp-2
HEp-2-RS
CELLULES CIBLES
Chaque colonne représente des cellules effectrices, infectées ou non, mises en contact avec des cellules-cibles
(en abcisse), pour le test NK; l'expérience a été faite 3 fois, avec 5 donneurs; CBL: lymphocytes du sang de
cordon; PBL: lymphocytes du sang périphériques d'adultes; la souche virale utilisée ici est moins virulente;
la mention RS indique que les cellules sont infectées; les différences sont significatives pour p~O,Ol, entre
chaque test (CBL-RS ou PBL-RS) et leurs témoins respectifs (CBL ou PBL)
; les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire
syncytial; les barres indiquent les déviations standards

---

135
FIGURE 24:
ACTIVITÉ NI{ DES LYMPHOCYTES D'ADULTES
INDUITE PAR LES DEUX GLYCOPROTÉINES DE
SURFACE DU RSV
80
•
• PaL
fJ PBL-FtG
ËI PaL-F
IJ PBL-RS
60
~
;:J
CI
rs
tJ
~
l:lo.
~
40
~
~
~
~
Q
~
20
o
KS62
KS62-RSV
KS62-PROfEINES
HEp-2
HEp-2-RSV
HEp-2-PROfEINES
CELLULES CIBLES
Chaque colonne représente des cellules effectrices infectées par le RSV, ou incubées avec les glycoprotéines
F et G, mises en contact avec des cellules-cibles (en abcisse), pour le test NK.; PBL-F+G: lymphocytes
incubées avec le mélange des deux glycoprotéines F et G; PBL-F: lymphocytes incubés avec la
glycoprotéine F; l'expmenee a été faite 3 fois, avec 5 donneurs; la mention RS indiquent que les cellules
ont été infectées; les différences sont significatives pour pSO,Ol,lorsque chaque colonne (qui constitue un
test) est comparée, avec son témoin (pBL non infectés); les barres indiquent les déviations standards.

---

136
3.11
ACTIVITÉ CYTOTOXIQUE DÉPENDANTE DES ANTICORPS
Cette activité s'est révélé faible Il,5%
3.12
ACTIVATION DES CELLULES CYTOTOXIQUES
D'après les résultats de la figure 25, on voit qu'il y a activation de
cellules cytotoxiques, aussi bien avec le RSV infectieux qu'avec les 2
glycoprotéines. Les ratios sont 1:1 et 10:1 respectivement. li y a une
cytotoxicité faible (10%) avec les ratios 10:1, 20: 1, avec le virus vivant et
2: 1 avec les protéines. On remarque aussi que l'activité cytotoxique des
CfL induites par les glycoprotéines est supérieure à celle des CfL induites
par le RSV infectieux.
La production d'interleukine 2 au jour du test de cytotoxicité est
nulle. TI y a cependant une production d'interféron gamma (48,4 et 42
UI/mL) lorsque les CTL sont induits par le RSV vivant et par les protéines
respectivement. Cette production d'IFN est doublée lorsqu'il y a absence
d'activation
de CTL comme avec les ratios 10:1 et 20:1, en ce qui
concerne le virus et le ratio 2: 1, en ce qui concerne les glycoprotéines
(données non illustrées). L'analyse de ces cellules par FACS révèle qu'il y
a 53,5% et 53% de CD4+, ainsi que 27,5 et 25% de CD8+ après
induction
des CTL avec le RSV ou les protéines respectivement.

---

137
FIGURE 25: ACTIVATION DES CELLULES
CYTOTOXIQUES PAR
LE RSV OU LES GLYCOPROTÉINES G ET F
120
• RS 1:1
[]J protéines 10:1
100
Il PBL
w
;J
CI
....
•
•
~
80
....
U
'W
~
CIl
•
w
CIl
60
•
~
W
•
Q
~
40
20
o
K562
PBL-RS
PBL-protéines
CELLULES CIBLES
Chaque colonne représente des cellules effectrices, qui sont des PBL stimulés, dans un rapport 1: 1 ou 10: 1
(cellules stimulatrices: cellules réceptitrices), avec des PBL infectés avec le virus ou incubés avec les
glycoprotéines de surface du RSV. Un témoin PBL maintenu en culture est aussi utilisé. Les cellules sont
mises en contact avec des cellules-cibles (en abcisse), pour le test de cytotoxicité. L'expérience a été faite 3
fois, avec 5 donneurs; les différences sont significatives pour p:5:0,OI, en ce qui concerne les deux derniers
blocs de colonne, lorsque les colonnes (RS 1: 1 ou protéines 10:1), sont comparés individuellement avec leur
témoin PBL; les barres représentent les déviations standards; les termes RS ou RSV désignent le virus
respiratoire syncytial.

---

138
3.13. INDUCTION DE CELLULES SUPPRESSIVES
3.13.1
Induction de cellules suppressives par le RSV infectieux
ou le RSV inactivé
Les résultats du tableau X montrent qu'il y a induction de cellules
suppressives, comme on peut le voir par le pourcentage de suppression, en
comparant les témoins cellules avec mitogènes, cellules avec le virus ou les
cellules maintenues en culture avec du RPMI-10, pendant la durée du test .
Une suppression étant effective lorsque le pourcentage est de plus de 50%,
il est évident dans ce tableau qu'elle est beaucoup plus marquée avec le RSV
infectieux et ce, qu'on ajoute des antigènes ou pas dans les puits du test de
stimulation.
Dans le cas des cellules
induites par le RSV inactivé, la
suppression ne s'observe qu'en présence de RSV infectieux en conditions
optimales. Il n'est pas nécessaire de faire le test en conditions d'excès
d'antigènes pour cela.

---

139
TABLEAUX: INDUCTION DES CELLULES SUPPRESSIVES PAR LE
RSV INFECTIEUX OU INACTIVÉ
%
CPM
IS
SUPR.
PBL frais + RPMI
•
1254±lOS
PBL frais + PHA (1:100)
18557±2482
14.80
PBL frais + RS opt
7123 ±632
5.68
PBL frais + PBL cult
1165 ±20
0.93
7
PBL frais + PBL cult + RS opt
989±194
0.79
21
PBL frais + PBL cult + RS opt
1799±306
1.43
0
PBL frais + PBL RS opt
435±5l
0,35
65
PBL frais + PBL RS opt + RS opt
350 ±56·
0,28
72
PBL frais + PBL RS excès
007 ±34
0.48
52
PBL frais + PBL RS excès + RS opt
463 ±45
0.37
63
PBL frais + PBL RS opt + .RS opt
450 ±88·
0,36
64
PBL frais + PBL RS excès + RS opt
550 ±40
0.44
56
PBL frais + PBL.RS opt
626 ±56
0.50
50
PBL frais + PBL.RS opt + RS opt
478 ±81·
0.38
62
PBL frais + PBL RS excès
1027 ±91
0.82
18
PBL frais + PBL R5 excès +RS opt
402±55·
0,32
68
PBL frais + PBL.,RS opt +,RS opt
1384 ±l00
1.10
0
PBL frais + PBL R$ excès +.RS opt
2557 ±544
2.04
0
PBL frais RPMI: témoin cellules non traitées; PBL frais + PHA: témoin positif indiquant la stimulation
maximale des lymphocytes; RS cpt: témoin virus; PBL RS ope cellules "suppressives" induites avec du
RSV infectieux en conditions optimales d'antigènes; PBL RS excès: cellules "suppressives" induites avec du
RSV infectieux en condition d'excès d'antigènes; PBL RS ope cellules "supressives" induites avec du RSV
inactivé en conditions optimales d'antigènes; PBL R$ inactivé excès: cellules "suppressives" induites avec
du RSV inactivé en conditions d'excès d'antigènes; CPM: coups par minute; IS: index de stimulation. La
dose réponse (opt): dilution 1:20 de virus infectieux. R5tinactiv~opt:ditlution 1:80 de virus inactivé. La
condition d'excès d'antigènes représente entre 2 a 3 fois la dose reponse; les différences sont significatives
pour ~.01. entre chaque ligne et le témoin cellules non traité (pBL frais RPMI); les tennes RS ou RSV
désignent le virus respiratoire syncytial

---

140
3.13.2
Effet des cellules suppressives
induites par le RSV
infectieux ou inactivé sur l'activité mitogénique de
la PUA
Les cellules suppresslVes
induites par le RSV entraînent une
diminution de l'action de la PRA, si l'on compare les index de stimulation
(Tableau XI).
Cet effet est beaucoup plus marqué lorsque le test de
suppression se fait en présence de RSV infectieux (73% et 65%
respectivement).

---

TABLEAU XI: EFFET DES CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES PAR LE RSV INFECTIEUX OU
INACTIVÉ SUR L'ACTIVITÉ MITOGÉNIQUE DE LA PRA
%
CPM
IS
SUPP.
PBL frais + RPMI
1254 ±
-
108
PBL frais + PHA (1:100)
18557 ±
2492
14,80
PBL frais + RS cpt
7123±
632
5,68
PBL frais + PHA + RS opt
214 ±
21-
0,17
83
PBL frais + PHA +.RS opt
4941 ±
642
3,94
o
PBL frais + PBL RS opt + PHA
869 ±
39
0,69
31
PBL frais + PBL RS opt + PHA + RS opt
333 ±
58-
0,27
73
PBL frais + PBL RS opt + PHA + RS opt
716±
72
0,57
43
PBL frais + PBL BS' opt + PHA
3438 ±
493
2,74
o
PBL frais + PBL RS opt + PHA + RS opt
435 ±
47-
0,35
65
PBL frais + PBL RS opt + PHA +.RS opt
1196±
155
0,95
5
PBL frais + PBL RS excès + PHA
1347 ±
o
1,07
o
PBL frais + PBL RS excès + PHA + RS opt
1822 ±
322
1,45
o
PBL frais + PBL RS excès + PHA + RS opt
4456±
684
3,55
o
PBL frais + PBL.RS excès + PHA
4390±
382
3,50
o
PBL frais + PBL RS excès + PHA + RS opt
1514 ±
73
1,21
o
PBL frais + PBL RS excès + PHA + RS opt
1947 ±
234
1,55
o
Le test d'induction des cellules supressives et leur mise en evidence a été fait comme dans le tableau X. Cependant, dans certains puits du test de
stimulation des lymphocytes, nous avons ajouté de la PHA, afm de voir si ces cellules ont un effet sur son action. On a prévu un témoin cellules non
traitées (ligne 1); un témoin PBL + PHA (ligne 2); un témoin virus (ligne 3); un témoin PHA et virus (ligne 4 et ligne 5); CPM : coups par minute; IS
: index de stimulation; les différences sont significatives pour p S 0,01, lorsqu'on compare chaque test avec le témoin PBL non stimulés (pBL frais +.
RPMI); Les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.
À

---

142
3.13.3 Effet des cellules suppressives
induites par le RSV
infectieux sur la production d'interféron gamma, d'IL-l
et d'IL-2
La présence des cellules suppresslves obtenues avec le RSV
infectieux ont un effet négatif sur la production d'interféron gamma, d'IL-l
et d'IL-2 (Tableau XII). L'inhibition de la production d'IL-l et IL-2 avait
déjà été observée avec des PBMC infectés simplement avec le virus. On
note cette suppression même en absence de certaines populations de cellules
comme les macrophages, les CD8+, les lymphocytes B.
L'addition
d'antigène ou pas dans le puit du test de stimulation ne semble pas
influencer ces résultats.

---

TABLEAU xn:
EFFET DES CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES PAR LE RSV INFECTIEUX SUR
LA
PRODUCTION
D'INTERFÉRON
GAMMA,
D'INTERLEUKINE
1 ET
D'INTERLEUKINE 2
%
CPM
IS
SUPPR
IFN -y IL· 1
IL - 2
PBL frais + RPMI
2136±
175-
0,20
60
0
PBL frais + PHA (1:100)
138059 ±
23135
64,6
950,00
70
60
PBL frais + RS opt
3345±
523
1,6
105,00
80
0
PBL frais + PBL cult
2020±
36
0,94
6
0,67
70
0
PBL frais + PBL RS opt + PHA
4134±
138
1,93
0
109,00
70
14
PBL frais + PBL RS opt + PHA + RS opt
855±
167
0,4
60
15,00
60
0
PBL frais + PBL RS opt + RS opt
320±
25- 0,15
85
0,80
70
0
CPM : coups par minute; IS: index de stimulation; IFN -y: interféron gamma; fi.. - 1 et fi.. - 2: interleukine 1 et 2. La génération et
la mise en evidence des cellules suppressives, sont faits comme dans les tableaux X et XI; Suppr.: suppression; Les différences sont
significatives pour p S 0,01, lorsqu'on compare chaque test avec le témoin PBL non stimulés (pBL frais + RPMI).
.t..
VJ

---

144
3.13.4 Induction
de
cellules
suppressives
par
les
2
glycoprotéines
et
leur
effet
sur
la
production
d'interféron gamma,d'IL-l et d'IL-2
On remarque aussi qu'il y a induction de cellules suppressives avec
les glycoprotéines. Cependant, celles-ci ne semblent pas agir négativement
sur la production de l'interféron gamma, ni de l'IL-l (Tableau XIII).
L'IL-2 demeure non détectable et ce, même avec les PBMC frais, incubées
avec les protéines.

---

TABLEAU Xill: INDUCTION DE CELLULES SUPPRESSIVES PAR LES 2 GLYCOPROTÉINES ET
LEUR
EFFET
SUR
LA
PRODUCTION
D'INTERFÉRON
GAMMA
D'INTERLEUKINE 1 ET D'INTERLEUKINE 2
%
CPM
IS
SUPP.
IFN-o
IL-1
IL-1
•
PBL frais +RPMI
2696±122
0,25
80
0
PBL frais +PHA 1:100
110978±loo54
41,2
898
90
10
PBL frais + prot opt
132OO±1000
4,90
200
150
10
PBL frais + PBL cult
252S±151
0,94
6
0,98
90
0
PBL frais + PBL prot opt + prot opt
273±64·
0,10
90
103
150
0
PBL frais + PBL prot opt + PHA
1361±64
0,50
50
264
150
10
PBL frais + PBL prot opt+ PHA+prot opt
1049±180
0,40
60
250
190
10
La procédure d'induction et de mise en évidence des cellules suppressives est la même que pour les tableaux X à XII, à la différence que, les cellules
suppressives ont été activées ici avec les glycoprotéines virales.Supp:suppression; les témoins sont les mêmes, mais cette fois , nous avons ajouté un
témoin PBL frais+ protéines en conditions optimales (prot opt). La dose utilisée est lOng, pour les protéines opt; les différences sont significatives pour
pS 0,01 si l'on compare chaque ligne et le témoin cellules non traitées (pBL frais + RPMI); les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire
syncytial.
~
lJ1

---

146
3.13.5 Effet des cellules suppressives induites par le RSV
infectieux,
inactivé
ou
par
ses
glycoprotéines
sur
l'activité NK
Les résultats de la figure 26 montrent , qu'il Y a une diminution de
l'activité NK, avec les cellules suppressives induites par le RSV infectieux
(si l'on compare cette activité avec celle des PBL en culture), et il suffit
pour cela que le test se fasse en conditions optimales d'antigènes comme on
l'a vu dans le tableau X.
Étant donné qu'il n'y a presque pas de cellules suppressives induites
avec le RSV inactivé d'après le tableau X, il s'avère dans la figure 26 que
la présence de ces cellules n'affecte pas l'activité NK, tout comme la
présence d'indométhacine, qui est un inhibiteur de la synthèse des
prostaglandines, qui elles agissent sur la production d'IFN. L'addition
d'indométhacine diminue donc l'activité suppressive du RSV.
On observe le même phénomène, même en incubant les cellules
suppressives avec les PBL frais pendant 24 heures avant de faire le test NK
(figure 27).
Lorsque ce test est fait, avec des PBL frais incubés avec le
surnageant provenant du test d'induction de ces cellules, on ne voit en
général pas de diminution de l'activité NK, sauf avec le surnageant
provenant des cellules induites par les protéines (figures 28 et 29).

---

147
FIGURE 26:
EFFETS DES CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES
PAR LE RSV SUR L'ACTIVITÉ NK
70
• PBLfrais
0 PBL-RS opt
0 PBLculture
• PBL-RSexcès
60
. . PBL-RS opt
~ PBL-RS opt + Indo
l';z;'l
•
El PBL-RS excès
lm PBL-~ opt +1ndo
~
CI
50
fi:
,..;
u
'l';z;1
I:l.
tI.l
40
l';z;'l
tI.l
><
...:l
l';z;'l
30
~
l;li!
20
10
0
CELLULES CIBLES (K562)
Chaque colonne représente des cellules suppressives. mises en contact avec des PBL frais. dans un rapport
1:1 et qui ont servi d'effecteurs pour le test NK; la souche virale utilisée est moins virulente; l'expérience a
été faite 3 fois. avec 5 donneurs; RS: virus infectieux; :as: virus inactivé; Indo: indométhacine; les
diférences sont significatives pour pg),O l, lorsqu'on compare un test où l'on a observé une diminution de
l'activité NK, avec le témoin PBL frais (exemple colonne 2 et 3); les barres indiquent les déviations
standards; les tennes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.

---

148
FIGURE 27:
EFFETS DES CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES
PAR LE RSV SUR L'ACTIVITÉ NK
80
•
PBLfraiJ
o PBLcukure
•
PBL-RS cpt.
a PBL-RSCllœ.
~
C PBL-1l5 cpt.
~
60
§
•
PBL-UCllœ.
El PBL-RS cpt. +1Ddo
Il PBL-M cpt. +1Ddo
~
~
[J PBL-RS Cllœ. +1Ddo
c:I:l
CI PBL-a5 Cllœ. +Indo
~
c:I:l
40
i>'"
...:l
~
c:::l
~
20
0 + - - - - - - -
CELLULES CIBLES (1'561)
Chaque colonne représente des cellules suppressives, mises en contact avce des PBL frais, dans un rapport
1:1 pendant 24H, et qui ont servi d'effecteurs pour le test NK; la souche virale utilisée est moins virulente;
l'expérience a été faite 3 fois, avec 5 donneurs; RS: virus infectieux; RS': virus inactivé; les différences sont
significatives polU' pg>,Ol, lorsqu'on compare un test où l'on obstne une diminution de l'activité NK, avec
le témoin PBL frais. Les barres indiquent les déviations standards; les tennes RS ou RSV désignent le virus
respiratoire syncytial.

---

149
Les cellules suppressives obtenues avec les glycoprotéines virales, n'ont
aucun effet inhibiteur de l'activité NK, car cette activité est similaire à celle
des PBL maintenus en culture.
L'addition d'indométhacine augmente
encore cette activité (figure 29).

---

150
FIGURE 28:
EFFETS DU SURNAGEANT DE CULTURE DES
CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES PAR LE RSV
SUR L'ACTIVITÉ NK
60
• PBLfrais
[] PBLcuiture
50
13 PBL-RS opt.
~ PBL-RS excès
~
;;l
0
PBL-RS opt.
CI
s:
40
• PBL-~excès
.....
U
~
Cl-.
tI.l
~
tI.l
30
~
~
Cl
~
20
10
0 - + - - - - - - - -
K562
CELLULES CIBLES
Le surnageant de culture, a été mélangé avec du milieu de culture, dans un rapport 1:1; des PBL frais on été
incubés avec ce milieu, pendant 24H, et ont servi d'effecteurs pour le test NK; la souche virale utilisée est
moins virulente; l'expérience a été faite 3 fois, avec 5 donneurs; RS: virus infectieux; ~ virus inactivé;
Les barres indiquent les déviations standards; les termes RS ou RSV désignent le virus respiratoire syncytial.

---

151
FIGURE 29:
EFFETS DES CELLULES SUPPRESSIVES INDUITES
PAR LES GLYCOPROTÉINES G ET F DU RSV SUR
L'ACfIVITÉ NK
100
• PBLfrais
[J SNGf-PBL-prot. opt
1:3 PBLculnue
•
SNGf-PBL-prot excès
CI PBL-prot. opl.
D PBL-prot opt+:Jndo
80
ra PBL-prot. excès
œ PBL-prot. excès +1ndo
f;I;'l
;J
CI
§
•
60
~
l:l.
tI.l
f;I;'l
tI.l
>0
..::l
40
f;I;'l
Q
~
20
0 - + - - - - - -
CELLULE CIBLE (K562)
Chaque colonne représente des cellules suppressives ou le surnageant (SNOT) de culture. mis en contact
avec des PBL frais. et qui ont servi d'effecteurs pour le test NI(; l'expérience a été faite 3 fois. avec 5
donneurs;
; Ioda: indométhacine; Opt: optimal; les diférences sont
significatives polU' pg>.OI.lorsqu'on compare un test où 1'00 observe une diminution de l'activité NI(. avec
le témoin PBL frais. Les barres indiquent les déviations standards;

---

CHAPITRE 4
DISCUSSION

---

153
4.1.
PRODUCTION, CONCENTRATION ET PURIFICATION DU RSV
4.1.1. Étude de la production du RSV sur billes de gélatine
Avant d'entreprendre l'étude comparative
des procédures de
purification et de concentration du RSV, la possession de bonnes quantités
de virus était nécessaire. Ainsi, la culture des cellules sur billes de gélatine,
nous a permis d'obtenir des titres viraux appréciables (108 UFS/ml,
Tableaux
IV et V).
Les systèmes de culture de cellules sur billes
(Cytodex, Ventregel, Ventreplas, etc.) offrent l'avantage de cultiver un
grand nombre de cellules dans un petit volume, entraînant ainsi, la
production de grandes quantités de virus, qui par la suite serviront à la
purification des protéines. Le virus respiratoire sYficytial,
avait déjà été
produit sur billes, et spécifiquement sur Cytodex, mais pas sur Ventregel
(Microcarrier cell culture, Pharmacia, 1981). Mais .la matrice Ventregel
est différente parce que ses billes sont composées de gélatine au lieu d'être
des billes de DEAE-sephadex chargées (Cytodex 1 et 2), ou comme dans le
cas de Cytodex 3, des billes dont la surface est recouverte de collagène
dénaturé. Le collagène dénaturé ou la gélatine, sont propices à une
croissance et fonction maximale des cellules adhérées, et par conséquent,
une production maximale de virus. De plus, les billes de gélatine ont
l'avantage d'être digérées complètement par la collagénase, permettant ainsi
une récolte facile des cellules. Pour l'obtention des particules virales,
surtout celles du RSV, qui restent en majorité associées à la membrane

---

154
cellulaire, la congélation et la décongélation, des cellules infectées ainsi
récoltées, est la méthode de choix.
4.1.2 Obtention de virus après concentration
Le rendement supérieur à 100%, obtenu après concentration du
virus sur coussin de saccharose 1,45 M peut s'expliquer par la forte densité
du coussin, qui permet ainsi, la concentration de toutes les particules
virales, par l'effet de l'EDTA sur les aggégats de virus, lorsque celui-ci est
ajouté à l'échantillon avant le titrage et fmalement par le MgS04 contenu
dans le milieu. Ces données corroborent celles de Rechsteiner (1969) et
Yamamoto (1969), qui trouvent que les sels inorganiques, comme le
magnésium, préservent l'infectivité du virus. Le fait de resuspendre le
culot dans son volume inital, et d'ajouter de 1'EDTA (concentration finale 1
mM), à l'échantillon à titrer avant de faire les dilutions, contribue à
augmenter le titre viral, comme on peut le voir dans le tableau V. La
dissolution des aggrégats avant le titrage, rend les sites d'attachement
accessibles, pour l'adsorption du virus aux récepteurs cellulaires. Cette
approche est plus utile pour les échantillons précipités au PEG, que pour
ceux concentrés sur coussin. Ces résultats concordent avec ceux de Senterfit
et Baldridge (1974), Wunner et Pringle (1976), Ueba (1978) et Trépanier
(1982) qui trouvent que l'infection du RSV est retrouvée quand le culot est
resuspendu à son volume initial.

---

155
Nous avons remarqué que, l'EDTA n'interfère pas avec l'action du
MgS04. Ceci est probablement dû à la petite quantité d'EDTA présente
dans le milieu par, rapport à celle du MgS04, ainsi, il ne peut pas capter
les ions Mg++ de façon efficace.
D'après nos résultats, qui visaient ici, à retenir la meilleure
procédure de concentration du virus,
le
coussin de saccharose a un
rendement supérieur à la précipitation au PEG. Mais le PEG convient
mieux, lorsqu'on a de grands volumes à concentrer.
4.1.3
Purification virale en. gradient de densité
Les bandes obtenues avec les gradients de Percoll et de Renografin
n'ont aucune activité virale, donc les particules virales ne sont pas intactes.
L'examen au microscope électronique des préparations obtenues en
gradient de métrizamide, révèle la présence de particules endommagées, ce
qui explique l'absence d'effet cytopathique en culture de tissu.
Le
métrizamide doit inactiver le RSV, puisqu'une diminution du titre virale de
2 log est observée après une courte incubation du virus dans ce milieu; ceci
explique pourquoi, on ne peut obtenir d'activité, après une centrifugation
de 18 heures. Ces expériences indiquent qu'un cycle de purification en
gradient de saccharose, entraîne une perte de matériel infectieux de 10%
seulement. Cependant, 2 cycles de centrifugation résultent en une perte

---

156
d'infectivité aux environs de 40%. Ainsi ces résultats indiquent clairement
qu'un seul cycle de purification est recommandé, pour des travaux qui
requièrent beaucoup de virus.
Des études sur la concentration et la purification du RSV avaient
été entreprises et
rapportées
auparavant.
Lors de notre étude , nous
confirmons certains de ces travaux, mais notre approche à permis de
comparer différentes méthodes, afin d'évaluer leurs avantages et leurs
inconvénients, en vue d'améliorer le rendement du virus.
4.2.
PURIFICATION DES GLYCOPROTÉINES DE L'ENVELOPPE DU
RSV
La chromatographie d'affinité à l'aide des lectines, est une méthode
efficace pour l'obtention des protéines glycosylées, lorsqu'on ne possède pas
assez d'anticorps monoclonaux, pour monter une colonne d'immunoaffinité.
Dans notre cas, cela a été facilité par le fait que nous n'avions que deux
glycoprotéines à purifier, sinon cela aurait été fastidieux à cause du fait
que, les lectines captent toutes les protéines glycosylées et le tout est élué en
même temps, ce qui nécessite ensuite une séparation des protéines éluées
selon leur poids moléculaire, par filtration sur gel, comme le gel de
Sephacryl etc.
Lors de notre travail, seule la protéine de fusion (celle de 70 000
Da), a pu être résolue sur gel de Sephacryl. Nous n'avons pas retrouvé la

---

157
glycoprotéine G (90 000 Da). Elle a probablement été dégradée pour une
raison que nous ignorons. Nous excluons le fait qu'elle ait migré lentement
et soit par conséquent retardée dans le gel, car de nombreux lavages de la
colonne ont été effectués, sans succès.
La fonne dimérique de la protéine de fusion (celle de 150000 Da)
n'a pas pu être obtenue après filtration sur gel de Sephacryl S-2OO. Une
des explications possibles de cela est que, ces fonnes de haut poids
moléculaire, semblent être instables à certaines conditions et peuvent être
clivées lors de la purification.
La coloration du gel au nitrate d'argent (données non illustrées)
démontrent que ces préparations sont pures, car on ne voit aucune bande
indésirable.
TI s'agit là aussi de protéines structurales du virus, car le
témoin cellules non infectées ne montre pas de bande protéique.
Ces travaux nous indiquent que les 2 glycoprotéines de l'enveloppe
virale du RSV, peuvent être purifiées par chromatographie d'aftmité en
utilisant les lectines de lentille.

---

158
4.3
INFECTION DES CELLULES MONONUCLÉÉES PAR LE VIRUS
RESPIRATOIRE
SYNCYTIAL HUMAIN
4.3.1.
Production virale par les lignées établies
Concernant l'infection par le virus des lignées de cellules
mononucluéées, nous constatons que les lignées établies nulles, c'est-à-dire,
lymphocytes n'ayant le phénotype ni T ni B (K562 et 1301), ainsi que, les
lymphocytes T (Molt-4) et B (Raji) peuvent être infectées par le virus
respiratoire syncytial (figure 5). Le fait de posséder le génome du virus
Epstein-Barr (EBV), comme les cellules Raji n'a aucune influence sur la
surinfection virale.
Cette propriété (l'infection par le virus), sera utile lors des tests sur
les mécanismes effecteurs ou l'expression d'antigènes sera requise.
4.3.2. Production virale par les cellules fraîches
Concernant toujours la susceptibilité des cellules monocucléées au
virus, il n'y a pas eu jusqu'ici de preuves de réplication du RSV dans ces
cellules, par production de syncytia, ni sans conditions favorisantes. En

---

159
effet, il a été démontré jusqu'ici que le RSV pouvait infecter les cellules
mononucléées, à savoir, les monocytes-macrophages, ainsi que les
lymphocytes frais (Chiba et al., 1989; Domurat et al., 1985; Krilov et al.,
1987; Midulla et al., 1989). Mais, ces travaux ont été faits en majorité par
immunofiuorescence et sans différenciation de la sous-population
lymphocytaire.
Des études ont ensuite montré que le RSV pouvait se
répliquer, avec un titre similaire ou plus élevé que celui que nous avons
obtenu, dans 3 lignées de monocytes-macrophages différentes, mais, la
production virale était augmentée dans ces cas par la présence d'anticorps
anti-RSV (Gimenez et al., 1989; Krilov et al., 1989). li Y a donc eu, dans
ces cas, des conditions favorisant la réplication virale.
L'étude présente montre que toutes les populations de cellules
mononucléées, c'est-à-dire les CD3+, les CD4+ et les CD8+, les
lymphocytes B, les monocytes et les macrophages sont infectées par le RSV,
sans conditions prédisposant les cellules à l'infection (figures 6 à 9). La
production virale est réelle car les PBL lavés tous les jours, et réincubés
avec du RPMI-10 frais, produisent autant de virus que leurs équivalents
non lavés (figures 10 et Il); ce qui veut dire que le titre viral obtenu, n'est
pas du tout dû aux résidus de l'inoculum viral, mais est plutôt le résultat de
sa réplication dans les cellules.
li faut écarter la possibilité pour ces
cellules de résultats faussement positifs, dûs au fait que la protéine de fusion
libre, puisse causer la fonnation de syncytia car, les temoins virus inactivé
par traitement aux U.V. ou par incubation prolongée à 37° C , ne
produisent pas de syncytia. TI reste une seule possibilité, c'est que le faible

---

160
pourcentage de monocytes-macrophages contaminants, puisse suffire à
produire des particules virales.
La production de virus par les monocytes-macrophages est
,beaucoup plus longue que celle obtenue par les autres populations
cellulaires, car le titre virale reste au-dessus de 103 UFS/mL, 2 jours après
1'ÏJ1jfection.
Le faible titre viral obtenu en général, avec les cellules
mononucléées ÏJ1jfectées par le RSV,
peut-être dû à la présence d'une
substance, probablement l'IFN, qui agit sur les particules virales. Hanada
et al., (1986) avait déjà démontré chez la souris, que la production de virus
était augmentée en présence d'anticorps anti-IFN.
La production virale par les cellules mononucléées, avait déjà été
démontrée avec plusieurs autres virus comme celui de la varicelle (Arbeit
et al., 1982), le virus herpès simplex (Daniels et al., 1978), le virus de la
rougeole (Huddlestone et al., 1980; Joseph et al.,
1975), le virus
respiratoire syncytial bovin (Toth et Hesse, 1983), le virus de la rubéole
(Van der Logt et al., 1980), le cytomégalovirus (Rinaldo et al., 1978;
Rodgers et al., 1985). Mais certains cas nécessitent la stimulation des
cellules par des mitogènes (Huddlestone et al., 1980; Lucas et al., 1978;
Sullivan et al., 1975), ce qui n'est pas le cas pour le RSV humain, dont la
stimulation des cellules n'a pas d'effet sur l'ÏJ1jfection virale.

---

161
On sait que l'infection par le virus, des cellules mononucléées,
notamment les macrophages, peut avoir plusieurs formes, allant de
l'infection inapparente, à la persistance ou à la fonne lytique; elle peut aussi
résulter en la réplication abortive ou complète (Mogensen, 1984; Oldstone,
1989).
Dans notre travail, il s'agit d'une infection inapparente
(puisqu'aucun changement de l'aspect des cellules n'est observé). De plus,
on observe ici, que les macrophages d'adultes sont sensibles au RSV,
contrairement à ce qui a été dit pour d'autres infections virales, où les
macrophages de nouveau-né, étaient plus sensibles aux virus que ceux
d'adultes (Daniels et al., 1978; Johnson, 1964).
4.3.3.
Le phénomène de la persistance virale
Cette observation peut s'expliquer de plusieurs manières. D'une
part, par la longue survie des cellules après l'infection, conjointement à une
faible expression des antigènes à leur surface (figure 12, 13 et 15),
qui
fait que ces cellules, n'étant pas infectées en même temps, ni lysées par le
virus, causent probablement une infection continuelle, et par conséquent,
une production virale continue.
Une autre alternative est qu'il puisse y avoir infection de certaines
cellules, comme les macrophages, sans expression d'antigènes ni production

---

162
de virus pendant un moment.
La persistance virale peut aussi être la
conséquence de l'infection des macrophages,
protégeant le virus de la
destruction par les cellules effectrices.
Les lentivirus échappent aux
mécanismes immuns de cette manière (Narayan et al., 1982).
Cette production virale prolongée, avait aussi été décrite in vivo
(Hall, 1977) chez des nourrissons atteints de maladie congénitale cardiaque
et infectés par le RSV, par Panuska et al., (1990) dans des macrophages
alvéolaires humains infectés in vitro et où il y a production de virus jusqu'à
25 jours p.i. D'autre part, il a été démontré que le RSV pouvait infecter de
façon persistante, des lignées de lymphocytes B (Bangham et McMichael,
1986).
Cette persistance virale semble être mise en évidence dans la
maladie de Paget, une affection chronique des os, où l'on a démontré la
présence d'antigènes du RSV, ainsi que des inclusions nucléaires
ressemblant à des nucléocapsides de paramyxovirus ou de pneumovirus
(Mills et al., 1980, 1981).
Donc, nous avons pu démontré, dans ce travail que le RSV, peut
aUSSI infecter les cellules in vitro, pendant longtemps. Et, comme ce
phénomène in vivo
a toujours été accompagné de cas de maladies
chroniques (Mills et al., 1980, 1981; Panuska et al., 1990), donc des cas
qui supposent une faiblesse immunologique; ce phénomène reflèterait ici
. ,
.
aUSSI, une nnmunosuppreSSlOn.

---

163
4.3.4. Viabilité des cellules mononucléées infectées par le RSV
D'après les résultats du test de viabilité, le RSV humain ne semble
pas avoir un effet toxique sur les cellules mononucléées (figure 14), car
nous avons encore un pourcentage de viabilité de plus de 95%, 18 heures
p.i. De plus, l'infection de ces cellules par le vitus ne semble pas les tuer,
car nous observons encore 78% de cellules viables 2 semaines p.i. Mais
ceci doit être pris avec réserve, car il se peut que les quelques cellules
infectées meurent et soient remplacées par les autres cellules qui se
multiplient. TI n'en demeure pas moins que, le faible titre viral ne semble
pas être lié à une destruction des cellules infectées. Bien qu'une viabilité des
cellules mononucléées simjlaire ait déjà été notée (Domurat et al., 1985;
Panuska et aL, 1990), une vérification de l'absence de l'effet toxique du
virus sur les cellules qu'il infecte, était nécessaire afin de trouver une
explication au faible titre obtenu.

---

164
4.3.5.
Expression
des
antigènes
viraux,
par
les
cellules
infectées
Le faible pourcentage de cellules infectées (25%), exprimant les
antigènes viraux (figure 15), constitue une autre explication au faible titre
viral obtenu (102,7 à 103,8 UFS/mL), et de la viabilité, en comparaison
avec les cellules témoins HEp-2, infectées avec le même inoculum et qui au
bout du même temps, donne un titre viral de 106 -107 UFS/mL. Bangham
et McMichael (1986); Domurat et aI., (1985) avaient déjà signalé un aussi
faible pourcentage d'expression des antigènes (15 à 20% respectivement).
Les antigènes à la surface des cellules sont détectés à partir de 8 heures p.i.
avec un pic à 16 heures, contrairement à ce que trouvent Domurat et al.,
(1985) dont l'expression des antigènes n'est détecté que 24 heures après
l'infection, avec un pic 3 ou 4 jours après. On détecte aussi les antigènes
viraux par immunofiuorescence interne, ce qui confirme bien l'infection
virale, car, une preuve d'expression interne et externe d'antigènes, par les
cellules, infectées,
démontre bien la réplication virale.
4.4
PRODUCTION D'INTERFÉRON
Nos résultats démontrent que le RSV induit la production d'IFN, car
le pic de production de celui-ci succède à celui de l'expression des antigènes

---

165
VIraux. La corrélation qUI existe~ entre 1~ élimination de 1~IFN
extracellulaire~ quand les cellules infectées sont lavées tous les jours et
1~ augmentation du titre viral~
démontre bien que~ 1~IFN produit a une
activité anti-virale.
Ceci confirme les données de plusieurs auteurs~
quelques années auparavant (Bell et al., 1983; Corbitt~ 1971; Gardner et al.,
1970; Hill et al., 1969; Moehring et Forsyth~ 1971). Le fait que cette
substance soit détectée au début de l'infection (2 jours p.i)~ signifie que sa
production et à travers cela~ celle de l'interféron gamma~ qui est inhibée~ en
présence de cellules suppressives induites par le RSV infectieux~ est encore
produite normalement en ce moment. Donc~ l'absence de production
d'interféron~ dépend de l'activation des cellules suppressives. Nous ne
pouvons émettre d'opinions sur la production d'interféron~ ~ car cette
substance n'a pas été testée au cours de notre travail. L'interféron gamma
semble avoir un rôle ici dont nous discuterons plus tard.
2.4.5. ACTIVITÉ CYTOTOXIQUE INDUITE PAR LE RSV.
4.5.1
Étude de l'activité NK.
Le phénomène de diminution de l'activité NK (tableau IX)~ lorsque
les cellules effectrices sont incubées 2 à 4 heures avec le virus~ avant

---

166
d'effectuer le test NK, prouve que le RSV a un effet direct sur cette
activité, du genre de celui qu'on observe avec le virus de la rougeole
(Casali et al., 1984), puisque quelques heures suffisent pour l'affecter. Ceci
dépend évidemment de la virulence de la souche.
Cet effet direct sur
l'activité NK, est un phénomène indépendant de la présence d'IFN, puisque
dans les 2 cas on détecte ce dernier. Ces résultats suggèrent qu'en cas
d'infection in vivo, la souche virale est un facteur détenninant, dans la
poursuite ou l'abrogation de l'infection, après l'action des cellules NK. La
suppression de l'activité NK est un phénomène commun à plusieurs virus,
dont le CMV (Rice et al., 1984; Schrier et al., 1986) et le virus de la
rougeole (Casali et al., 1984). Les phénomènes de l'augmentation ou de la
diminution de l'activité NK, liés à la virulence de la souche (figure 23 et
24), réflètent possiblement ce qui se passe, en cas d'une infection in vivo et
, pourraient expliquer, pourquoi certains nourrissons ont des affections de
sévérité moyennes, alors que d'autres ont des bronchiolites sévères.
L'augmentation de la cytotoxicité, lorsque les cellules-cibles K562
sont incubées avec le mélange des 2 glycoprotéines (figure 24), suggére
qu'au moins une de ces protéines, est reconnue comme cible par les cellules
NK. Ceci démontre que, les protéines libres induisent mieux l'activité NK
que les mêmes protéines associées au virus.
L'absence de cette cytotoxicité avec les cellules-cibles HEp-2
incubées avec les protéines, voudrait probablement dire que ces
glycoprotéines, dont l'affinité pour les membranes est grande peuvent

---

167
favoriser l'adsorption des cellules NK, à la surface des cellules-cibles HEp-
2, sans augmenter leur lyse. Un cas similaire a été déjà observé avec le
virus Sendai (Welsh et Hallenbeck, 1980). Il peut aussi s'agir, d'un simple
manque d'adsorption des glycoprotéines, sur les cellules HEp-2.
L'augmentaiton de la cytotoxicité observée avec les protéines purifiées avait
déjà été démontrée avec les glycoprotéines purifiées de plusieurs autres
virus (Alsheikhly et al., 1983; Casali et al., 1981 a; Harfast et al., 1980),
mais, aucune étude de ce genre n'avait été faite avec les glycoprotéines du
RSV.
La cytotoxicité NK, due à l'infection par le RSV, n'avait pas encore
été étudiée chez l'homme.
Chez l'animal, quelques travaux ont noté
l'existence d'une activité cytotoxique, non spécifique du virus et non MHC
restreinte (Anderson et al .,1990; Kumagai et al , 1985; Sun et al 1983 a et
b).
L'étude présente, tout en nous fournissant une des explications
possibles de la pathologie du RSV (une activité NK qui diminue), nous
oriente vers une des solutions possibles de ce problème: l'utilisation des
protéines de renveloppe virale, pour stimuler cette activité, lorsqu'elle est
affectée par la réplication du RSV.

---

168
4.5.2
Induction
de
l'activité
cytotoxique
dépendante
des
anticorps
L'activité cytotoxique dépendante, des anticorps (AOCC), avait déjà
été démontrée dans les poumons d'animaux infectés par le RSV (Koff et al.,
1983; Kumagai et al., 1985; Sun et al., 1983 b), dans les sécrétions du
système respiratoire et nasopharyngées chez l'homme (Cranage et al., 1981;
Kaul et al., 1982 b), ainsi qu'en utilisant comme cellules-cibles des cellules
HeLa ou HEp-2 infectées par le RSV (Meguro et al., 1979; Scott et al.,
1977). Dans notre étude cette activité est faible. Ceci peut être dû
à la
courte durée de la demie-vie des anticorps AOCC anti-RSV (Meguro et al.,
1979), car, les sérums que nous avons utilisés à cet effet provenaient
d'échantillons prélevés longtemps auparavant, ce qui fait que leur activité
avait diminué, en dépit de la conservation de ceux-ci au congélateur. Ces
sérums provenaient de convalescents, il n'y a donc aucun doute que les
anticorps AOCC n'étaient plus présents, car s'ils atteignent leur pic au bout
de 10 jours p.i., et régressent ensuite, alors que les anticorps neutralisants
atteignent le leur au bout de 20 à 30 jours p.i., ils auraient atteint une
concentration négligeable dans les sérums de patients en phase de
convalescence. Ce phénomène est aussi noté dans le cas du virus de la
rougeole, où les anticorps ADCC sont prédominants pendant la phase
éruptive et diminuent par la suite (Whittle et Werblinska, 1980).

---

169
Ces résultats indiquent que la détection de l'activité ADCC, doit être
effectuée, en utilisant des sérums prélevés pendant la phase aigüe de la
maladie.
4.5.3 Activation des cellules cytotoxiques
Dans le but d'effectuer une étude comparative de l'induction de
CIL par le RSV infectieux et par ses glycoproteines de surface, en vue du
développement d'un vaccin sous-unitaire, nous avons pu démontrer que
l'activité cytotoxique, obselVée dans cette expérience, est l'effet des CTL,
puisque ces cellules agissent faiblement sur les K562, indiquant ainsi que ce
n'est pas une activité NK. D'autre part, ces CIL sont spécifiques du virus.
TI s'agit ici d'une cytotoxicité MHC restreinte, car elle fonctionne très bien
dans un système autologue, comme c'est le cas avec les CTL classiques
(Zinkemagel et Doherty, 1974, 1979).
L'augmentation de la libération de 51Cr, lorsque les PBL sont
infectés avec le virus ou incubés avec les glycoprotéines virales libres,
démontre aussi, qu'au moins un des polypeptides de surface du virus, est
reconnu comme cible par les CIL, ce qui est en faveur d'un vaccin sous-
unitaire, qui comprendrait, les protéines sous leur forme libre.
Ceci
corrobore les affirmations selon lesquelles, les glycoprotéines sont en

---

170
général les structures reconnues par les CTL (Finberg et al., 1982; Rouse et
al., 1988).
Bien que ces résultats concordent avec les travaux antérieurs sur les
Tc activés par le RSV, qui démontrent que la protéine Fest reconue comme
cible (Cannon et Bangham, 1989; Nicholas et al., 1990; Pemberton et al.,
1987), ils apportent un fait nouveau, qui est la stimulation de ce mécanisme
par des protéines libres, et qui donnent une réponse cytotoxique semblable
à celle du virus entier. L'induction de cellules T cytotoxiques spécifiques
du RSV avait fait l'objet de plusieurs travaux chez l'homme (Bangham et
McMichael, 1986; Bangham et al., 1986; Chiba et al., 1989; Isaacs et al.,
1987); chez l'animal (Bangham et al., 1985, 1986; Cannon et Bangham,
1989; Cannon et al., 1988; Nicholas et al., 1988, 1990; Openshaw et al.,
1990; Sun et al., 1983 a et b; Taylor et al., 1984 b, 1985). De plus, les
CTL sont importants dans l'élimination du virus
chez 1'hôte infecté,
(Byme et Oldstone, 1984; Cannon et al., 1987; Lin et Askonas, 1981;
Mackenzie et al., 1989; Sethi et al., 1983; Yap et al., 1978).
D'après nos données, il ne semble pas y avoir d'anomalies dans le
processus d'activation de ces cellules, puis qu'on les détecte dans le cas du
RSV infectieux et de ses glycoprotéines. Cependant, le fait que lors d'une
infection par le RSV, on détecte des CfL dans le cas d'infections moyennes
et non dans les fonnes sévères (Chiba et al., 1989; Isaacs et al., 1987), et
que, paradoxalement, tout en détruisant le virus dans l'organisme, elles
puissent augmenter la pathologie (Cannon et al., 1988), laisse supposer qu'il

---

17 1
y a immunosuppression. Cette suppression est probablement médiée par le
RSV infectieux, car un article récent (Munoz et al., 1991) vient de
démontrer que, les CIL induits par des protéines exprimées par un virus
RS recombinant, éliminent le virus des poumons sans augmentation de la
pathologie. Donc, une étude sur les mécanismes régulateurs s'impose.
L'action paradoxale des CIL n'est pas un phénomène nouveau, car il a déjà
été rapportée,
dans le cas d'infection de la souris par le virus de la
chorioméningite lymphocytaire, où l'élimination du virus dans l'organisme
cause une méningite fatale chez cet animal (Buchmeier et al., 1980;
Oldstone et al., 1986).

---

172
Le fait que l'on retrouve beaucoup de CD4+ après analyse au FACS,
peut vouloir dire qu'il Ya induction de Th, celles-ci serviraient à activer les
CfL, comme l'a démontré Openshaw et al., (1988). TI ne s'agit pas d'une
cytotoxicité CD4+, car nous n'avons fait que 2 stimulations in vitro, alors
qu'il en faut plusieurs avant d'induire des CTL CD4+· Toutefois, pour le
confirmer, il aurait fallu faire en parallèlle, un test de cytotoxicité, en
utilisant des cibles exprimant les antigènes du CMH de classe 1 et TI, afin de
savoir le phénotype des effecteurs, car, les CTL CD4+ reconnaissent les
antigènes majeurs d 'histocompatibilité de classe TI, alors que les CfL CD8+
reconnaissent ceux de classe 1 (Zinkernagel et Doherty, 1974; Morrisson et
al., 1986).
L'immunosuppression peut être le résultat d'une régulation
négative, via des facteurs comme l'interféron gamma, l'interleukine 1 ou
l'interleukine 2. La modulation par ces substances, est importante pour la
réponse CTL, car en son absence, la réponse CTL peut être
immunopathologique, et si cette modulation est exagérée, l'action des CTL
est faible (Rouse et Horohov, 1986).
En effet, l'IFN ayant un rôle
immunorégulateur et anti-viral (De Mayer et al., 1981; Virelizier et al.,
1977; Yamada et al., 1986), il se pourrait fort bien que celui-ci n'agisse
plus, pour empêcher la propagation de l'infection aux cellules saines et
prévenir leur destruction, par les effecteurs NK ou CTL. Si un processus
semblable se produit dans le cas des CTL, il y aura de plus en plus de

---

173
cellules infectées, et les CTL continueront à les reconnaître et à les lyser,
d'où les nécroses tissulaires et aggravation de la maladie.
Aussi, comme l'IFN sert à activer les récepteurs de l'IL-2 (Johnson
et Farrar, 1983), et que, l'IL-1 aide les Th à produire de l'IL-2, alors, s'il
n'y a pas assez de production d'IFN et d'IL-l, et surtout s'il y a inhibition
complète, il n'y aura par conséquent pas d'IL-2 de produite.
Cette
lymphokine est un facteur de prolifération lors de l'activation des CTL.
Or, l'absence de détection de cette dernière, au cours de notre étude, ne
veut pas dire qu'elle n'ait pas été produite, mais plutôt que sa production ait
été supprimée à un moment donné,
probablement plus tard, après la
génération des CTL, sinon on ne détecterait pas de cytotoxicité.
Ceci
prouve encore que le processus d'élimination des cellules infectées est
déclenché, mais pas régulé. La production d'IL-1 n'a pas été testée, dans
cette expérience, mais il se pourrait que sa production aussi ait été inhibée.
4.6
STIMULATION MITOGÉNIQUE pES LYMPHOCYTES PAR LE
RSV OU PAR SES GLYCOPROTEINES.
Dans le but d'obtenir une dose réponse d'antigènes, afin d'assurer
une activation adéquate des cellules NK, CTL ou suppressives, le test de
stimulation démontre bien que le RSV inactivé active moins les cellules que
le virus infectieux. Dans le tableau VIII on voit que les glycoprotéines
purifiées sont mitogènes, comme cela avait déjà été prouvé avec les
glycoprotéines du virus de la rougeole (Rose et al., 1984). D'ailleurs, le

---

174
taux de stimulation optimal des glycoprotéines purifiées, presque similaire à
celui du RSV infectieux (tableaux VII et VIII), laisse supposer que cette
activité, est due aux protéines de surface du virus. Ces structures peuvent
être altérées, lors de l'inactivation aux rayons ultra violets, d'où la faible
réaction par rapport au virus vivant ou aux glycoprotéines.
4.7
INDUCTION DES CELLULES SUPPRESSIVES PAR LE RSV OU
PAR SES GLYCOPROTÉINES.
Afin de démontrer l'induction des cellules suppresslves, et de,
vérifier leur rôle dans la modulation de la réponse immune, l'observation
de suppression dans les tableaux X, XI et XII démontre bien la présence,
des cellules suppressives dans tous les cas. La différence réside cependant,
dans la fonction de celles-ci.
La suppression, beaucoup plus marquée
lorsqu'on rajoute dans le puit du test de stimulation, une quantité optimale
de RSV infectieux pro~ve que, soit le RSV exerce une activité suppressive
directe sur les cellules immunocompétentes, soit qu'il y a activation de
nouvelles cellules suppressives dont l'effet vient s'ajouter à celui de celles
déjà présentes. En effet, une suppression est déjà observée 3 jours après le
test d'induction de ces cellules (données non présentées) et est aussi efficace
qu'après une induction de 7 jours comme dans les résultats illustrés.

---

175
Le rôle immunosuppresseur du virus lui-même, est illustré par la
comparaison du pourcentage de suppression,
quand on ne rajoute pas
d'antigènes lors du test de stimulation, par rapport à son équivalent, avec
antigène (tableau X, lignes 7 et 8), ou alors en regardant la suppression de
la réponse des lymphocytes à la PHA en présence de RSV infectieux
(tableau XI ligne 4). Les cellules suppressives ne suppriment l'action de la
PRA qu'en présence d'antigènes (tableau XI, lignes 6 et 7; tableau XII ligne
5 et 6), ce qui veut dire que les cellules
induites n'exercent pas de
régulation négative sur l'action de la PHA, mais que le virus lui a un effet
unmunosuppresseur.
Ces résultats démontrent, que le RSV active les lymphocytes T,
suppresseurs. De plus, le RSV exerce un effet immunosuppresseur sur
l'activité mitogénique de la PHA, ce que
ne font
pas les cellules
suppressives induites. La diminution de la réponse à la PHA pourrait être
due ici, non pas à l'altération des fonctions des macrophages, incapables de
produire de l'IL-l, monokine importante dans l'induction de la réponse
lymphoproliférative (Roberts et al., 1986; Roberts et Steigbigel, 1978;
Scala et Oppenheim, 1983), mais probablement à l'inhibition de la
production de celle-ci, par l'infection virale directement ou par
l'introduction de l'inhibiteur de l'IL-l, déjà décrit (Roberts et al., 1986;
Wainberg et al., 1988). La diminution de la réponse aux mitogènes est
commune à plusieurs virus, tous immunosuppresseurs, comme le virus de
la rougeole, le virus influenza, le CMV et le LDV (Finkel et Dent, 1973;

---

176
Isakov et al., 1982; Roberts et Steigbigel, 1978). Dans certains cas, cette
diminution de la réponse aux mitogènes n'affecte pas la fonction des
monocytes-macrophages (Roberts, 1982). Nos travaux confirment ceux de
Roberts (1982) et ceux de Manzella et Roberts (1980) selon lesquels le RSV
affecterait la réponse des cellules T à la PHA, ce qui renforce notre
affirmation sur le rôle immunosuppresseur du RSV. Le RSV inactivé aux
U.V. n'est pas un bon inducteur de cellules suppressives (tableau X, lignes
13, 15 et 18), à moins d'ajouter du RSV infectieux,
dans le test de
stimulation des lymphocytes (tableau X, ligne 14) , on note encore ici,
l'effet immunossuppresseur du RSV. Le RSV inactivé ne supprime pas
non plus l'effet de la PHA (tableau XI, ligne 5).
L'activation, la prolifération et la différenciation des lymphocytes
T, dépendent non seulement de la stimulation par un antigène (Alcover et
al., 1987), mais aussi de signaux issus de cellules accessoires (Lutz et Fitch,
1979; Wagner et al., 1972), il est donc évident que les substances comme
l'IL-l, l'IL-2 et l'IFN jouent un rôle dans l'activation des cellules
suppressives. D'ailleurs, nous avons détecté ces lymphokines et monokines
lors de l'induction des cellules suppressives par les glycoprotéines du RSV
(tableau XITI). Cependant, l'inhibition de la production de ces substances,
lors de l'activation des cellules suppressives par RSV infectieux,
conjointement avec la présence de ces cellules, montre bien que cette
inhibition a lieu après l'induction de celles-ci, car, si les macrophages sont
requis dans l'induction des Ts (Kawasaki et al., 1986; Kuchroo et al., 1989;
Nakamura et al., 1982, 1986; Ptak et al., 1978), ce ne sont donc pas leurs

---

177
fonctions qUI sont compromIses, smon il n'y aurait pas de cellules
suppressives détectables.
Le phénomène est le même pour l'interféron
gamma et l'IL-2, qui sont 2 facteurs qui activent aussi les Ts (Aune, 1987;
Elmasry et al., 1986, 1987; Kadish et al., 1980).
Les cellules suppressives étant nécessaires dans la régulation de la
réponse immune (Asherson et al., 1985; Dorf et Benacerraf, 1984;
Germain et Benacerraf, 1981; Girard et Hirth, 1989; Green et al., 1983).
Un manque de régulation de la part de ces cellules, ne pourrait résulter
qu'en une immunosuppression.
Il est possible que la production
d'interféron gamma, d'IL-l et d'IL-2 ait été régulée négativement. Cette
régulation négative peut se manifester, par l'inhibition de la production des
lymphokines et monokines que nous avons noté dans cette étude sur
l'activation des cellules Ts, par le RSV infectieux, et se fait probablement
par le biais de lymphocytes T activés ou d'un facteur inhibiteur, tel que déjà
démontré (Colizzi et al., 1984; Kramer et Koszinowski, 1982; Lombardi et
al , 1985). Dans le cas de l'IL-l, il s'agirait de la substance inhibitrice déjà
citée plus haut (Roberts et al., 1986; Wainberg et al., 1988).
La suppression de la production d'interféron gamma, observée lors
de l'induction des cellules suppressives par le RSV infectieux, peut avoir
un effet direct sur l'aggravation de la maladie, comme cela a été le cas du
virus de la rougeole où , la réactivation et les infections secondaires
semblent dues à une suppression de la production d'interféron gamma
(Becford et al., 1985;Miller, 1964; Morley 1969).

---

178
Les résultats des figures 26, 27, 28 et 29 confrrment encore le fait
que les cellules suppressives induites par le RSV infectieux exercent un
effet négatif sur la régulation de la réponse immune, puisqu'on observe une
diminution de l'activité NK, par les cellules suppressives obtenues avec le
virus vivant, ce qui n'est pas le cas avec le virus inactivé, ni les
glycoprotéines.
Cette diminution de l'activité NK pourrait être attribuable à l'effet
des prostaglandines, puisque l'addition d'indométhacine (inhibiteur de la
synthèse des prostaglandines) n'a aucun effet négatif sur l'activité NK, mais
l'augmente bien au contraire (figure 26 et 27). Cependant, l'action des
prostaglandines n'est pas toujours négative, puisqu'on remarque qu'il y a
aussi augmentation de la réponse cytotoxique (NK) en présence
d'indométhacine avec les cellules suppressives induites avec les
glycoprotéines (figure 29).
Ceci veut dire que la synthèse des
prostaglandines peut avoir un effet partiel, car il a été démontré que les PG
notamment, les PGE2 jouent un rôle dans l'induction des cellules
suppressives, en augmentant les récepteurs de l'interféron gamma (Elmasry
et al., 1987).

---

CONCLUSION
Les travaux effectués au cours de cette recherche, nous ont permis
de tirer les conclusions suivantes .
L'utilisation des billes de gélatine est une bonne méthode pour
l'obtention de grandes quantités virales.
De plus, la technique de
récupération du virus (congélation et décongélation des billes), permet de
récolter la majorité des particules virales, qui dans le cas du RSV, restent
associées à la membrane cellulaire.
Pour la concentration du RSV, virus très fragile et qui ne peut pas
supporter les forces gravitationnelles élevées, la précipitation des particules
au polyéthylène glycol et leur concentration sur coussin de saccharose 1,15
ou 1,45 M, aident le virus à amortir les chocs qu'il pourrait subir lors de la
centrifugation. Néanmoins, pour la concentration de grandes quantités de
virus, le polyéthylène glycol est la technique de choix.
Les tentatives de purification du RSV en gradient de Percoll,
Rénografin et métrizamide, en comparaison avec le saccharose, indiquent
que le dernier gradient préserve mieux l'infectivité du virus, à condition
que l'on effectue un seul cycle de purification.
Les travaux de purification par chromatographie d'affinité
indiquent que, les deux glycoprotéines F et G de l'enveloppe du RSV,
peuvent être purifiées en utilisant des lectines de lentille.

---

180
Les résultats sur la production virale par les cellules mononucléées,
prouvent clairement que le RSV est capable d'infecter toutes les populations
de ces cellules, donc les CD3+, les CD4+, les CD8+, les lymphocytes B, les
monocytes et les macrophages.
Cette condition a lieu, sans traitement
prédisposant les cellules à la réplication du virus comme la pré-stimulation
de celles-ci, à l'aide des mitogènes ou encore le traitement avec un anticorps
anti-RSV, etc.. Ces résultats nous indiquent en plus que, l'infection par le
RSV des cellules du système immunocompétent, peut résulter en une
altération des fonctions de celles-ci. D'autre part, nous avons démontré que
le RSV persiste dans les cellules qu'il infecte, ce qui est l'indication d'une
unmunosuppresslOn.
Au cours de notre travail, nous avons noté que la fonction des
cellules NK dépend de la virulence de la souche. Le RSV dans certains cas
abolit cette activité; il y a donc immunosuppression. Ceci peut expliquer
les différences observées, lors d'une infection naturelle par le RSV (d'un
côté,
des nourrissons ayant des affections de sévérité moyenne, et
de
l'autre,
ceux ayant des formes très sévères de maladie, comme les
bronchiolites).
Les résultats sur l'activité NK, tout en apportant une explication du
point de vue pathologique, nous donnent une information sur la capacité des
glycoprotéines de l'enveloppe du RSV, à augmenter la cytotoxicité NK.

---

181
Ceci constitue une donnée d'envergure pour le développement d'un vaccin
sous-unitaire.
L'étude sur l'activation des cellules cytotoxiques apporte deux faits
nouveaux.
D'une part, ces travaux nous permettent de comprendre le
phénomène de l'aggravation de la maladie observé avec les CTL, induits
par le RSV infectieux, qui est certainement le résultat d'une régulation
négative, directe ou à travers les facteurs comme l'IFN-Y, l'IL-l et l'IL-2,
régulation normalement orchestrée par les cellules suppressives.
D'autre
part, l'induction de ces cellules par les glycoprotéines libres est effective
d'après nos travaux. Cette donnée est importante dans le développement
d'un vaccin sous-unitaire.
Selon le test d'induction des cellules suppressives, seules celles
induites par les deux glycoprotéines de l'enveloppe virale, exercent leur
véritable fonction régulatrice. Si nous pouvons nous permettre l'usage de
ces deux expressions: les cellules suppressives activées par les deux
glycoprotéines virales, seraient les cellules "immunorégulatrices", alors que
celles
induites
par
le
RSV,
seraient
plutôt
des
cellules
"immunosuppressives". Ainsi, si un manque de régulation par les cellules
suppressives induites par le RSV a lieu in vivo, cela expliquerait pourquoi
dans certains cas d'infection due au RSV, il y a une production exagérée
d'IgE, donc pathologie par hypersensibilité.
La détection d'interféron, au début de l'infection virale et l'absence
de détection de celui-ci, en présence de cellules suppressives induites par le

---

182
RSV, indique que cette fonction est suprimée par les cellules suppressives
activées par le RSV infectieux. Donc l' immunosuppression, ici, s'exerce
au niveau de la capacité des cellules appropriées à produire de l'interféron.
Pour des raisons d'éthique, il ne nous a pas été possible de faire ce
travail, en utilisant des lymphocytes de nourrissons affectés, ni de bébés
séronégatifs. Mais, la nécessité de vérifier certains mécanismes comme par
exemple, la mesure de l'activité NK, l'induction de cellules cytotoxiques et
suppressives, sur les lymphocytes de nourrissons infectés s'impose. Il serait
aussi intéressant de déterminer en même temps le sous-groupe de la souche
infectante ou de tester ces activités in vitro avec des souches de différents
sous-groupes afin de voir si l'on arrive aux mêmes conclusions.
Pour
terminer,
nous
dirons
que
le
RSV
est un
VIrUS
immunosuppresseur, et qu'un vaccin fait à partir de virus entier, infectieux
ou inactivé ne pourrait combler le besoin de lutter contre cette affection.
La solution à ce problème viendrait certainement du développement d'un
vaccin sous-unitaire, qui ne contiendrait que les protéines de surface de ce
VIruS.

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ANNEXE

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JO/lmal of'vïm/n.ciwl Met/rat!s.] 1(1991) 161-' 70
161
~) IlJlJ 1 Elsevier Sciencc Publishcrs B. Y. (13iol11edical Division)
ADONIS 0 168851 091000832
YIRMET 01108
Purification of human respiratory syncytial
virus: superiority of sucrose gradient over
percoll, renografin, and metrizamide gradients
Ângélique Mbiguillo allu José MCllczcs
Lahoratory of Immunovirology. Departm('111 of Microhiolof(Y & Imm/lnology. Universiry of
MOIlIreal, .and Pediatrie Research Center. Ste-Justine Hospital. Molllreal. Quehec. Ca/lada
(Accepted 21 Scptember 1990)
Summary
Amethod was devised for producing and purifying human respiratory syncytial
virus (HRSV) preparations.with high titers. Previous attempts to obtain substantial
amounts of purified human respiratory syncytial virus have been unsuccessful due to
the extreme lability of this virus, its close association with the host ccII membrane,
and its tendency to aggregate during concentration procedures. We describe a
comparative study of various purification media as weil as a novel approach for
obtaining high titers of HRSV. Virus was produced in HEp-2 ceUs grown on
gelatin beads and concentrated either by precipitation with polyethylene glycol
or by centrifugation over a sucrose cushion, the latter yielding 100% recovery.
These procedures employed EDTA to disaggregat~ the virus and MgS04 as a
virus stabilizing agent. Attempts to purify HRSV over percoll, renografin and
metrizamide gradients lead to loss of infectivity. Sucrose was found to represent
the best purification medium with a yield of up to 60%.
Rcspiratory syncytial virus; Gclatin bcad; Concentration; Purification
Introduction
The human respiratory syncytial virus (HRSV), first isolated in 1957 (Chanock
et al., 1957), belongs to the Paramyxoviridae family, genus Pneumovirus. This
virus causes serious respiratory diseases, particularly in infants. Attempts to
Correspondenee to: 1. Menezes, Laboratory of Immunovirology, Ste-Justine Hospital, 3175 Côte Ste-
Catherine. Montreal, Quebec. Canada H3T lC5.
OI61<-1<510191/$U3.5U

---

162
purify HRSV were unsuccessful because virtually ail the particles produced
remain associated with the host cell membrane thus preventing the harvesting
of sunicient working material. Anothcr difliculty was the extreme lability of
the virus, a feature which by itselr makes it dirticlIlt to slIhjcct HRSV to a
complete purification procedure (Forsyth et al., 1966; Wunner et al., 1975;
Wunner et Pringle, 1976; Levine, 1977). For example, purification by isopycnic
centrifugation on a sucrose gradient of a sample of HRSV concentrated by ultra-
centrifugation 'ed to a loss of infectivity of up to 99% (Wunner and Pringle.
[976). Likewise, a sample of HRSV that was precipitated with polyethylene
glycol (PEG) and banded twice in sucrose resulted in a loss of infectivity of
up to 80% (Ueba, [978; Trépanier ct al., 198 [). Wunner and Pringle (1976)
indicated that infectivity was not afTected by metrizamide. Howevcr, it was found
that concentration of virus by pelleting led to a substantial loss of viral titer
(Wunner and Pring[e, 1976). On the other hand. after precipitation of the virus
hy l'EG. infcctivity was recovered whcl1 the pellet was resuspcndcd in its initial
volume (Senterlit and Baldridgc, [1)74; Wunncr and Pring[e, [<)76; Ucba, [97H;
Trépanier, 1982).
We therefore carried out a comparative study of HRSV purification for which
the virus was cultured by infecting HEp-2 cells grown on gelatin beads. The latter
method offers the advantage of increasing the surface area for cell growth while
lowering cost and permitting recovery of virus with an appreciable titer. Different
media for virus purification and concentration were examined in an effort to avoid
resuspension of virus. The media used for purification were Percoll, renografin,
and metrizamide, tested simultaneously with sucrose. Ali offered the advantage
of low viscosity and osmotic pressure. Our results indicate that, among these
media, sucrose is the most suitable for the purification of HRSV.
Materials and M~thods
Ccll.~ al/d \\'irliS production
HEp-2 cellS (Human larynx carcinoma) wcrc grown in cqual parts of Eaglc's
minimal essentia[ medium and medium 199 (EMEM- [99) supp[cmcntcd with 25
Il.g/ml of gentamicin and 5% fetal bovine serum (FBS). Cells were grown on
gelatin beads (VentregeI™, Ventrex Laboratories, Bioventures Group, Portland,
U.S.A.). Two grams of Ventregel were hydrated according to the procedure given
by the manufacturer, sterilized. washed and placed in a horizontal roller boule
of 2 liters. The beads were sterilized by autoclaving for 15 min at 115°C at
liquid pressure. After cooling to room temperature, the medium was removed
aseptically and the Ventregel washed twice with sterile culture medium. HEp-2
cells were trypsinized and resuspended in culture medium containing 5% FBS.
The cell suspension was adjusted to a concentration of 2 to 10 X 107 cells per
g of Ventregel, the culture medium made up to 500 ml and the bOUle placed
on a roller apparatus at 3rc. The cells were allowed to settle for 30 min,

---

161
then rotated for 2 min at 42 rpm and allowed to seule again for 30 min. The
procedure was repeated for at least 4 h, aner which the beads were allowed to
rotate continuously. Cell growth was monitored daily untilthe desired confluency
was obtaincd. For inlCclion, the beads were allowed to scille. the supernatant
was then removed and the inoculum was added. Arter an incubation of 2 h. fresh
medium was added and the culture was reincubated on the rotator at 42 rpm until
generalized cytopathic effect was observed. Virus was harvested both from the
supcrnatant and from the beads. The lauer were subjected to numerous cycles
of freeze-thawing. They were then centrifuged and the resulting supernatant was
added to the original which was then stored at -80°e.
The Long strain of HRSV (American Type Culture Collection, Rockville. MD,
U.S.A.) was used. Subconfluent HEp-2 eclls were inoculated with HRSV at a
multiplicity of infection of 1. The virus was harvested 24 h postinfection (p.i.).
Virils cOlln'lI/ra/iol/
The procedure for virus precipItation with PEG (Fig. 1) was as described
previously (Trépanier et al., 1981). Briefly, the tissue culture f1uid was clarified
at 3200 g. for 20 min. Fifty percent (W{V) PEG 6000 was added to a final
concentration of 10% (V{V). The particles were then precipitated for 90 min at
4°C with moderate stirring. followed by centrifugation at low speed for 20 min.
The resulting pellet was snap-frozen by immersion in liquid nitrogen (- 198°C)
and stored at -80°e.
Concentration on a sucrose cushion (Fig. 1) was performed according to the
method of Fernie and Gerin (1980). The viral supernatant was adjusted to 0.1 M
MgS04 and 50 mM Hepes (pH 7.5). The mixture was layered on LIS and 1.45
M sucrose cushiolls in MHN buffer (1 M MgS04 : 50 mM Hepes, pH 7.5: 150
mM NaCI), and centrifuged at 7500 rpm for 4 h (Damon JEC B-20A centrifuge).
The virus was collected and infectivity titrated for syncytia-forrning units (SFU).
Virus [Jurification
Perm" (pâl.vl'il/yl pymllidont!) ~radien/
Ail stcps in our purification protocols wcre carricd out at 4°C. and are outlined
in Fig. 1. PEG-concentrated virus was laycred over Percoll (starting dcnsity 1.105
g/cm') and centrifuged at 35000 rpm for 25 min in a Beckman type 50.2 rotor.
Fractions were collected and their density determined with density markers, The
dense visible material banding at a given density was collected between 1.108 and
I.:n g/cm' and kcpt at -SO°e. Electron microscopy (EM) was used to visualize
viral particles and viability was determined by SFU titration.
Renografin gradient
The PEG-concentrated sam pie was layered on a discontinuous (30/60%)
renografin density -gradient and centrifuged in a Beckman SW-41 rotor for 90
min at 35000 rpm. The opaque band was recovered by side puncture, diluted 1:2

---

164
Supernalanl trom lntecled HEp-2 cells
1 3200g, 20min
~ Supern.t.nt.dlu"ed
Preelpll.llon .t 4'C,
0.& M
to 0,1101 "'gSO,
moder... IUrrlng,
'F
.nd SOmM HEPES,pH1.S,
90 min,
'.
1 .1 S
1SOOg, 4 hr
centrifugation, 20 min
low,p ••d
orl.4SM
Banding male rial
kepl al ·BO'C
Pellet
-----~---I
1 " " ,
Supernatant
Plaque IiIration
Oiluted 1:20 in NTE
discarded
and layered on
1 1
1
1
Percoll
oisbon"nuous
Oiscontinuous
Conlinuous
gradient
renogratln
sucrose
metrizamide
gradient
gradient
gradient
1
1
1
1
Spin JSK,
Spin 3SK,
Spin JSK,
type 50.2.
SW·4t,
90
2S min
min
§ SpinJSK,
JO% SW-4t
.-
gO min.
&0%
~
USW-41,18hr
1S·4S%
~JO%"':':&0%DUuled1:2 1Diluled1:2
ConUnuou, r.nogr.nn
ContJnuous lucraS.
gr.dlenl
1 gndlenl
1
Spin JSK,
,
DI"y... NTE
USW~I,18nr
JO-_
DI.ly. ., NTE
1
1
1 U
s~.p~~,~~Khr
JO._
DI.IV
, NTE
Dialy.e,
NTE
1
1
1
1
1
PI~qUe
Pleque
PI.que
Eloi
Eloi
EM
PI. que
Eloi
Tltretlon
Tltrotlon
TUr.tion
Tltr.Uan
Fig.!. L>iagram of Ihe procedures employetl in Ihe cOllœl1lration antl purilicalÎolI of IIRSV. NTE:
NaCI. Tris. EDTA; EM: electron microscopy.
and purified on a continuous (30-60%) renografin gradient for 18 h. Collected
fractions were analyzed by SFU titration and electron microscopy. Their density
was detennined according to the fonnula: p = 3.4683N24 - 3.6267 (Grdina et
al., 1974>. where p is density and N is the refractive index.
Metrizamide· g,:adient
The viral sample. concentrated as described above. was purified on a linear

---

1(,5
TABLE')
Concentration or HRSV on a sucrose cushion and by prc<:ipilalion wilh polyethylene glycol <rEG) 6000
Samples
Volume (ml)
Total SFU x 1010
Recovery (%)
Cullure supemalanl
500
30
100
PEG
10 ± 0
24.15±O.21
80.5 ± 0.71
Sucrose 1.15 M
40 ± 0.71
28.lJ9 ± 0.1
93A ± ()
Sucrose 1.45 M
45 ± lAI
33.07 ± 0.32
110.25 ± 1.06
(15-45%) (W[V) metrizamide gradient for 18 h at 35000 rpm in an SW-41 rotor.
Those fractions. within a density range of J .14 and 1.20 g/cm~ according to the
forlllula: Il = 3.451N:!(I - J.601 (Rickwood and Birnic. 1(75) wcrc lilmtcd and
cxunlincd by EM.
Sucrose Rradient .
The sucrose gradient procedure foJ/owed was essentiaJ/y as described by Ueba
(1l)7H). Sriclly, PEG-precipitated virus was puri lied by two successive sucrose
density gradients made in NTE (150 mM Nae\\, 50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA,
pH 7.5) buffer. The virus was first layered on a discontinuous 30, 45 and 60%
(W[V) sucrose gradient and centrifuged for 90 min at 35000 rpm in an SW-41
rotor. The visible band between 30 and 45% was collected. diluted 1:2 and then
purified on a continuous 3Q-{jO% sucrose gradient for 18 h at 35000 rpm in a
SWAI rotor. Fractions were analyzed by spectrophotometry and SFU titration.
Results
The use of Ventregel was found to increase the viral titer to 10R SFU pel'
ml. i.e. by a factor of 2 logs compared to the liter obtained when cells were
cultured in polystyrene ftasks. The concentration of the virus on a cushion of
sucrose (LI 5 and J.45 M) gave a recovery of 93 and J 10% respectiveJy, as
shown in Table 1. The use of PEG a1so produced a good yield ŒO%) even if
inferior to that oblained by centrifugation over a sucrose cushion. Sest recovery
in this case was obtained when PEG-precipitated samples were tirst resuspended
in their initial volume and supplemented with EDTA before proceeding to the
diluliol\\s (rcsulLs 1101 shown).
Figs. 2 and 3 show the values for recovery of HRSV as measured by spcc-
trophotometry. Vpon banding. it was found that those fractions with densities
corresponding to 1.17-1.20 glcm3 contained 90% of the virus in the case of the
discontinuous gradient and 57% for the continuous gradient (Table 2). The dif-
ference in recovery following the first and second sucrase gradient can also be
seen by the drop in üD (0.85 and 0.21, respectively) (Figs. 2 and 3).
Purification of the virus on renografin gradients yielded 1 or sometimes 2
bands. EM examination of the fractions did not show evidence of the presence of
intact viral particles. Likewise, no virus was recovered following percoll gradient
purification despite the observation of visible bands.

---

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5
10
15
20
FRACTIONS (0.5 ml)
Fig. 2. PEG-concentrated RSV was diluted 1:20 in NTE buffer and purified on a discontinuous sucrose
gradient. Fractions were analysed by measuring the optical density at 280 nm.
EM examination of the fractions collected from metrizamide gradienls also
failed to show intact yiral particles. These fraclions exhibited no infectivity when
tilrated. Our experiments revealed that exposure of virus to metrizamide for a
period of 30 min to 1 h reduced the viral titer by 2 logs.
Uiscussion
The present study deals primarily with a comparative analysis aimed at defin-
ing a suitable procedure for the purification of HRSV. However, it is noteworthy
that the method of culturing the cells that we also used provided the high virus
tilers which are reported (i.e. Tables 1 and 2). Like other microcarrier systems
(Cytodex, Ventreplas, etc.), Ventregel offers the advantage that a large number of
ceUs can be cultured in small volumes, thereby allowing the production of large
quantities of virus. Respiratory syncytial virus. like numerous other viruses. has
already been produced in a microcarrier system, specifically Cytodex (Micro-
carrier cell culture, Pharrnacia, 1981). We chose to use Ventregel matrix which

---

167
0 . 3 0 ; - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . . . . ,
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ml)
Fig. 3. The peak fractions oblained following purification on a discontinuous sucrose gradient were
pooled. diluted 1:2 in NTE and layered on a continuous sucrose gradient. Analysis of the fractions was
performed by spectrophotometry at 280 nm.
is different from Cytode,x in that these beads are composed of gelatin instead
of charged DEAE-Sephadex (Cytodex 1 and 2) or as in the case of Cytodex
3 whcrc the surface layer conrains denalllrcd collagcn. Denatured collagen or
gelatin make ideal surfaces for maximum growth and function of thc attachcd
ceUs. Consequently, maximal viral yields are attainable. Gelatin beads olTer the
advantage of being amenable to complete digestion by collagenase. Hence, cells
grown on gclatin bcads can be easily harvcsted. lI' viral particles alone must bc
recovered, then freeze-thawing is the mcthou of choice.
The recovery of up to 100%, obtained al'ter concentration of the virus on a
1.45 M sucrose cushion, may be explained by the high density of the cushion
allowing the concentration of ail viral particles, by the effect of EDTA on virus
aggregates when added to the sampie before titration, and finally by the MgS04
contained in the medium. These data contirm those of Rechsteiner (1969) and
Yamamoto (1969) who found that inorganic salts such as magnesium preserve
virus infectivity. Resuspension of the pellct in its initial volume and addition of
EDTA (final concentration: l mM) to the sample to be titrated before making
dilutions contributed to the increase in the viral titer, as can be seen in Table 1.

---

0-
:le
TABLE 2
Purification of HRSV on sucrose, renogratin. percoll and metrizamide gradients
Method
SFU/ml
Total SFU
Volume (ml)
Density (g/cm')
Recovery (%)
(x IOM)
PEG
7 x I(t
35
5
-
100"
Discont inuous (30. 45 and 6lJCk) sucrose densilY gradient 6 x 1O~
31.5 ± 2.12
5.25 ± 0.35
1.17-1.20
90 ± 6.1
Continuous (30-60%) sucrose density gradient
6 x IO~
19.H5 ± 0.21
3.3 ± 0.42
1.18-1.20
56.7 ± 3
Disconlinuous (30 and 60%) Rcnogralin density gradient 0
*
**
1.16-1.23
0
Continuous (3~0%) Renografin densilY gradient
0
*
**
1.04-1.39
0
Percoll density gradient
0
*
**
1.084-1.096
0
Continuous (15--45%) Melrizamide densily gradient
0
*
**
**
0
'Hcre we considered PEG-precipilaled s:lInpk as represenling a recovery of 100'7c.
Ail fractions were lilratcd. and examined by DL
* No "iral activily was detecled.
** No \\'olumc or density of the fraction could be dClermined.

---

169
The prior dissolution of the aggregates makes attachment sites accessible for virus
adsorption to cell receptors. This approach is more useful with PEG-precipitated
than with cushion-concentrated samples. This result is in accord with the findings
of Senterfit and Baldridge (\\974), Wunner and Pringle (1976), Ueba (1978) and
Trépanier (1982), who found that the infectivity of HRSV was recovered when
the pellet was resuspended in its initial volume.
.
lt was noted that EDTA did not interfere with the action of MgS04. This was
probably due to the small quantity of EDTA (1 mM) present in the medium
compared with that of MgS04 ; thus, it could not effectively chelate Mg ions.
Bands collected on percoll and renografin gradients did not yield any viral
activity, and it was concluded that the virus was not intact.
Electron microscopie exalllination of virus preparation ohtained afler metriza-
Illide gradient purification revealcd the presencc of damaged particles, which was
consistent with the -'ack of viral activity in tissue culture. Proof that metrizamide
inactivated RSV was obtained by observing that a decrease in viral titer after
a short incubation with metrizamide was suflicient for a reduction in virus titer
by a factor of 2 logs. This explains why we could not recover any activity after
centrifugation for 18 h.
The experiments indicate that one cycle of purification over sucrose gradients
resulted in a 10% reduction in yield; two cycles, however, resulted in over 40%
reduction (Figs. 2 and 3, Table 3). Thus, these results clearly indicate that one
cycle of purification is recommended where high yields of infectious virus are
required.
ln conclusion, the data indicate that Percoll, renografin, and metrizamide are
not suitable for the purification of HRSV, because the virus is inactivated. The
results also show that sucrose gradients made in NTE buffer presently represent
the best media for preserving viral infectivity.
The precipitation of virus with PEG or by centrifugation over a sucrose cushion
are good methods for concentrating HRSV. Moreover, the microcarrier cell
culture system is suitable for producing large quantities of virus such as HRSV.
Acknowledgements
Angélique Mbiguino has a studentship from the Government of Gabon. We
thank Dr Carolina Alfieri for hclpful suggestions and commcntsabout the
manuscript and Ms Liliane Gallant for typing. We are grateful to the Governmcnt
of Gabon and the Faculty of Graduate Studies of the University of Montreal for
support.
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Curriculum Vitae
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Communications:
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Purification of human respiratory syncytial
virus: superiority of sucrose gradient over
percoll, renografin and metrizamide gradients.
J. Virol. Methods lL 161-170, 1991.
Angélique Mbiguino and José Menezes.
Infection of mononuclear cells by human
respiratory syncytial virus. (en préparation).
Angélique Mbiguino and José Menezes.
Cellular cytotoxic activity against human
respiratory syncytial virus. (en préparation)
Angélique Mbiguino and José Menezes.
Generation of suppressor cells by human
respiratory syncytial virus. (en préparation)
Angélique Mbiguino, Pierre Payment et Michel Trudel.
Purification des glycoprotéines du virus
respiratoire syncytial humain par
chromatographie d'affinité. Cinquante-troisième
Congrès de l'ACFAS, Chicoutimi, 1985.
Angélique Mbiguino, Pierre Payment et Michel Trudel.
Purification du virus respiratoire syncytial
humain par centrifugatÜJn en gradient de
densité; comparaison du saccharose, percoll et
nycodenz.. Cinquante-deuxième congrès de l'ACFAS,
Québec, 1984
Thèse de maîtrise en Microbiologie médicale.
Morphologie des phages de lysotypie de Vibrio
~ et Yibrio El Tor.
Faculté de médecine, Université Laval, (1982)

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H.W. Ackennann, S.S. Kasatiya, T. Kawata, T. Koga,
J.V. Lee, A. Mbiguino, F.S. Newman, J.F. Vieu, A.
Zachary.
Classification of Y..ilJ.citl. bacteriophages.
Intervirology 22, 61-71, 1984.
H.W. Ackennann, A.L. Furniss, S.S. Kasatiya, J.V.
Lee, A. Mbiguino, F.S. Newman, K. Takeya, J.F. Vieu.
Morphology of Vibrio cholerae Typing phages.
AnD. Viral (lnst Pasteur) 134 Ba 387-404, 1983.
H.W. Ackennann et A. Mbiguino.
Identité morphologique du coliphage T5 et du
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Cinquantième (50) Congrès de l'ACFAS, Montréal,
1982.
H.W. Ackermann et A. Mbiguino.
Morphologie des phages de lysotypie de Yibrio
dulJerae et Yibrio El Tor. Congrès de la CSM,
Ottawa, 1981.
A. Mbiguino, H.W. Acketmann et J.F. Vieu.
Étude au microscope électronique des
bactériphages de Vibrio cholerae et du biotype
"El.IJH:!!.. Colloque international de microbiologie
tropicale, Dakar, 1980.
A fait un stage post-doctoral en biologie moléculaire
pendant deux ans au Département de biochimie, Faculté
de Médecine (Université de Montréal)
Publications et
Communications:
M. Dehbi, A. Mbiguino, M. Beauchemin, G. Chatelain et
A. Bédard. Transcriptional activation of the
CEF-4 cytokine genes by pp60 V-SRC. (en
préparation)

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1
!
t
A. Bédard, M. Dehbi, A. Mbiguino, L. Gonneville et M.
1
Beauchemin.
Transcriptional activation of the CEF-4
1
cytokine genes by pp60 V-SRC.
Cinquième
conférence Est-Canadienne sur le développement du
cancer, Montréal.
M. Dehbi, M. Beauchemin, A. Mbiguino et P.A. Bédard.
Trascriptional activation of the CEF-419E3 gene
in RSV-transformed cells. Seventh annual meeting
on oncogenes,juin 1991, New Yorlc
A. Bédard, M. Dehbi, A. Mbiguino, L. Gonneville et M.
Beauchemin.
Contrôle moléculaire du cycle cellulaire.
Quatrième entretiens du centre Jacques-Cartier, Colloque
no.18, janvier 1991, Lyon.
1
!
1
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