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1
UNIVERSITE RENE DESCARTES DE PARIS
Unité d'Enseignement et de Recherche de Biologie Humaine et Expérimentale
Année 1988-1989
Série n°
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A l'Unité d'Enseignement et de Recherche
de Biologie Humaine et Expérimentale
de l'Université René Descartes de Paris
pour l'obtention du grade de
DOCTEUR D'ETAT ès SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
Frédéric LOKO
ETUDE D'UNE FORME MOLECULAIRE INTERMEDIAIRE
D'HEXOSAMINIDASE (HEXI) DU SERUM HUMAIN:
ISOLEMENT ET PROPRIETES, DONNEES PHYSIOPATHOLOGIQUES
Soutenue le : 22 juin 1989
Jury:
M. le Professeur F. PERCHERON, Président
Mme le Professeur E. BAR, Examinateur
M.le Professeur R. BOURBOUZE, Examinateur
M. le Professeur J.L. VILDE
M. le Docteur R. GIBEY

---

Ce travail est dédié à la mémoire de mon père disparu trop tôt.

---

A ma fille Armelle, en espérant qu'elle fera également preuve de té-
nacité pour le travail.
A tous les miens.

---

AVANT-PROPOS
Je tiens à exprimer ma respectuel;Jse reconnaissance à Monsieur le
Professeur François PERCHERON pour m'avoir accueilli dans son labora-
toire et pour m'avoir encouragé à poursuivre ce travail. Il me fait l'honneur
de présider ce jury. Je garderai en exemple ses qualités d'enseignant et de
chercheur.
Je remercie Madame le Professeur Edith BAR pour ses conseils
dans la rédaction de cette thèse, pour avoir si spontanément porté intérêt à
mes résultats et accepté de prendre place dans mon jury.
A Monsieur le Professeur Richard BOURBOUZE, je tiens à adresser
plus que des remerciements. Je lui exprime ma plus sincère reconnais-
sance pour avoir accepté de diriger ce travail, et m'avoir soutenu dans
maintes circonstances. J'apprécie ses qualités humaines, sa grande com-
pétence et son sens critique.
J'adresse tous mes remerciements à Monsieur le Professeur Jean-
Louis VILDE pour l'aide apportée au cours de la réalisation de ce travail
ainsi que pour avoir accepté d'être membre de ce jury.
Je remercie Monsieur le Docteur Roger GIBEY pour avoir porté inté-
rêt à ce travail et accepté de participer à ce jury.

---

Je remercie les enseignants, chercheurs et doctorants du Labora-
toire de Biochimie de la Faculté de Pharmacie, en particulier Daniel ROSIe
pour sa disponibilité et ses conseils.

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PLAN
Pages
IN"rRODUCTION
1
CHAPITRE 1: MATERIEL ET METHODES
8
CHAPITRE Il : HEXOSAMINIDASES INTERMEDIAIRES DANS LES
TISSUS ET LIQUIDES BIOLOGIQUES
22
1
CHAPITRE III : CHOIX DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES POUR
L'ISOLEMENT ET LA PURIFICATION DE L'HEXOSAMINIDASE
INTERMEDIAIRE SERIQUE (HEXI)
35
CHAPITRE IV: CHOIX D'UN PROTOCOLE DE PURIFICATION DE
HEXI SERIQUE
46
CHAPITRE V : ISOLEMENT ET PURIFICATION DE HEXI SERIQUE ....... 65
CHAPITRE VI : PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET CINETIQUES DE
HEXI SERIQUE
75
CHAPITRE VII : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES AUTRES
FORMES MOLECULAIRES D'HEXOSAMINIDASES SERIQUES (HEX AS
ET HEXP)
93
CHAPITRE VIII : RECHERCHE D'UN APPORT DES MONOCYTES
MACROPHAGES A L'ACTIVITE HEXOSAMINIDASE DU SERUM
113
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
134
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
143
TABLE DES MATIERES
156
LISTE DES FIGURES
162
LISTE DES TABLEAUX
167
LISTE DES ABREViATIONS
169

---

INTRODUCTION
Les B-N-Acétylhexosaminidases (EC 3.2.1.52), ou hexosaminidases, sont
des glycohydrolases Iysosomiales retrouvées dans tous les tissus et li-
quides biologiques étudiés chez l'homme.
Depuis l'identification par Robinson et Stirling en 1968 (1) de deux formes
tissulaires séparables par électrophorèse, une forme acide A et une forme
basique B, puis la mise en évidence de l'absence de la forme A dans la
maladie de Tay-Sachs (2, 3), ces enzymes ont été le support de nom-
.
.
breuses investigations.
Depuis deux décennies,
l'intérêt porté aux
hexosaminidases repose sur leur utilisation comme enzyme Iysosomiale
type pour l'étude des modifications post-transcriptionnelles ("processing")
de ces glycoprotéines et leur sécrétion ou ségrégation dans les lysosomes
au niveau cellulaire, et sur leur rôle potentiel d'enzymes marqueurs dans
diverses pathologies .....Des revues générales rendent compte de cet intérêt
soutenu pour les hexosaminidases (4, 5).
Présentement, l'approche moléculaire des hexosaminidases est en cours
(6, 7, 8) et renforcée par l'isolement du cDNA des précurseurs des chaînes
polypeptidiques (9, 10).
Les hexosaminidases hydrolysent les liaisons glycosidiques engageant un
résidu N-acétyl-B-D-glucosamine (GleNAc) et N-acétyl-B-D-galactosamine
(GaINAc) en position terminale non réductrice des glycolipides, gly-
coprotéines et glycosaminoglycannes, ainsi que les substrats synthétiques
dérivés du paranitrophénol et de la méthyl-4-umbelliferone. Aussi, dans la

---

2
littérature, les hexosaminidases sont-elles souvent retrouvées sous la dé-
nomination de N-acétyl-B-D-glucosaminidase (NAG) en raison de leur plus
grande activité catalytique envers les substrats synthétiques comprenant
un résidu GlcNAc. Cependant, ces enzymes présentent une affinité appa-
rente plus élevée pour les substrats synthétiques à résidus GalNAc et le
ganglioside GM2, substrat naturel de référence, est un galactolipide. Aussi,
dans la suite de ce texte, nous utiliserons la dénomination hexosaminidase
(HEX) tout en nous conformant à l'appellation des auteurs lors de citations
de la littérature.
Les deux formes moléculaires majeures d'HEX, ou isoenzymes A et B,
mises en évidence pour la première fois par Robinson et Stirling à partir de
la rate humaine (1), ont été retrouvées dans tous les tissus et liquides
biologiques étudiés (foie, rein, cerveau, placenta, sérum, urine, larmes,
salive, ,etc.). En raison de sa facile accessibilité, le tissu placentaire
constitue la source la plus connue pour l'isolement de cette enzyme
(11,12,13).
HEX-A placentaire est composée de deux sous-unités ; une sous unité a,
correspondant à une seule chaîne polypeptidique, et une sous-unité B
(comprenant deux peptides, Ba et Bb, issus du clivage d'un précurseur)
reliées entre elles par des ponts disulfures ; sa structure est a (BaBb).
L'HEX-B placentaire comprend deux sous-unités B, 2(BaBb). Les deux
formes d'HEX sont glycosylées (8).
En plus des formes majeures A et B, des formes mineures d'HEX tissu-
laires ont été retrouvées. Deux formes, 11 et 12, de charge intermédiaire
entre A et B de par leur comportement électrophorétique et chromatogra-
phique sur DEAE-Cellulose représentent une petite proportion de l'activité
totale des tissus normaux (5). L'une de ces formes intermédiaires, 12,
augmente considérablement dans les lymphocytes de sujets atteints de
leucémie aiguë Iymphoblastique commune (cALL), caractéristique qui
semble la différencier des autres formes de leucémies (14).

---

3
Ces formes mineures intermédiaires d'HEX tissulaires sont également fai-
blement représentées dans le sérum et l'urine. Leur représentativité peut
s'amplifier dans certaines conditions pathologiques (15,16,17), et dans le
sérum maternel où une forme intermédiaire HEX-P devient la forme sérique
majeure au cours de la grossesse (18).
La relation structurale de ces formes intermédiaires avec HEX-A et HEX-B
est restée longtemps inaccessible en raison de leur faible abondance dans
les tissus et liquides biologiques. Ainsi HEX-P fut pendant longtemps la
seule forme intermédiaire obtenue purifiée et montrée sur la base de don-
nées immunologiques composée uniquement de chaînes B (19).
HEX 12, la forme intermédiaire la plus abondante du placenta, a été isolée
en 1984 et son analyse polypeptidique révèle la présence de chaînes a, Ba
et Bb (20).
Récemment, la forme 12 a été purifiée du foie humain, et en électrophorèse
sur gel de polyacrylamide-SDS, se révèle constituée à la fois de sous-uni-
tés a et B (21). Ainsi la forme P sérique semble s'individualiser des formes
intermédiaires 12 placentaire et hépatique. En revanche, sur la base de cri-
tères chromatographiques et de quelques propriétés physico-chimiques, P
est généralement assimilée à la forme 12 sérique (15,22,23). A ce jour, la
forme 1 sérique n'a pas été à notre connaissance caractérisée au-delà de
sa position sur le profil d'élution chromatographique.
Ces quelques données concernant les formes intermédiaires d'HEX soulè-
vent le problème général de la source cellulaire et du processus de trans-
fert des enzymes Iysosomiales vers les liquides biologiques et notamment
le sérum.
Les enzymes Iysosomiales sont synthétisées sous forme de polypeptides
précurseurs glycosylés de plus haute taille moléculaire que les chaînes
matures par le Reticulum Endoplasmique Rugueux. Ces formes précur-

---

4
seurs néosynthétisées subissent des modifications post-transcriptionnelles
qui portent à la fois sur les parties peptidiques et g!ycanniques. La matura-
tion complète des enzymes Iysosomiales s'effectue après leur séparation
de la voie sécrétée au niveau du Golgi au cours de leur ségrégation dans
les lysosomes (5,24,25) (Figure 1).
Dans les cellules en culture une petite fraction (5 à 20%) des enzymes Iy-
sosomiales nouvellement synthétisées échappe à la ségrégation dans les
lysosomes et est sécrétée dans le milieu où les formes précurseurs
s'accumulent (26).
Ainsi, les fibroblastes et d'autres types de cellules (endothéliales, muscu-
laires lisses, lymphocytes, hépatocytes) ne sécrètent pas d'enzymes ma-
tures ; les macrophages en revanche sont connus pour sécréter des en-
zymes Iysosomiales matures après activation (24).
Les
atteintes
cellulaires
(lyse,
modifications
de
la
perméabilité
membranaire) peuvent en outre constituer une source possible d'enzymes
Iysosomiales sous forme mature pour le sérum.
Les sources cellulaires et les processus sous-jacents à l'alimentation dLJ
sérum en enzymes Iysosomiales restent à établir. Cependant, par analogie
avec les modèles de cellules en culture, l'activité HEX sérique est
considérée comme représentative de la fraction des enzymes Iysosomiales
nouvellement synthétisée qui échappe à la ségrégation
dans les
lysosomes (27). Ainsi la forme HEX-A sérique, ou HEX-As , qui présente
des chaînes a
et B de plus haute taille moléculaire que les chaînes
matures, et une charge globale (pl) plus acide que les formes A tissulaires,
est-elle assimilée à la forme précurseur polysialylée de la forme
Iysosomiale (5).

---

5
RE
LYSOSOME
'-'-\\Y '-'-\\9 ~
: ."... :~:
p.
.p
--=~~DoI~~~==~~~~=\\
GOLGI
f
ACIDIFIED
•COMPARTMENT
t
t
Plasma Me-rrb"one
Figure 1 : Schéma du routage intracellulaire des enzymes Iysosomiales (d'après Kornfeld
~ : Les enzymes Iysosomiales et les glycoprotéines de sécrétion sont synthétisées dans
le réticulum endoplasmique rugueux (RER) et glycolysées par l'intermédiaire d'un
DoIichol-P-P-oIigosaccharide (Dol). Dans le RER. les peptides ·signal" (WIIIIIIIIII/') sont
éliminés. Les protéines sont transloquées au Golgi où les oIigosaccharides des
glycoprotéines de sécrétion subiront une maturation de type complexe,
et les
oIigosaccharides des enzymes Iysosomiales seront phosphorylés. La plupart des enzymes
Iysosomiales se fixent sur les récepteurs à mannose 6 phosphate (MPRs) .MM et sont
transloquées dans un compartiment prélysosomial acide, où le ligand se dissocie. Les
récepteurs retournent au Golgi ou à la surface de la cellule. Les enzymes sont stockées
dans
les
lysosomes
où
elles
subissent
un dernier clivage
peptidique
et
une
déphosphorylation. Une petite fraction des enzymes Iysosomiales ne se lie pas aux
récepteurs et ceux-ci sont sécrétés comme les glycoprotéines de sécrétion. ( - » . Ces
enzymes peLNent se fIXer sur les MPRs de surface et être Internalisées dans le
comPartiment prélysosomial.
•
N acétyl glucosamine
o
Mannose
Â
Glucose
•
Galactose
•
Acide siaHque

---

6
Au cours de ces dernières années, l'attention s'est concentrée sur la varia-
tion des formes intermédiaires d'HEX de l'urine (17,28,30) et du sérum
(16,23,29) en association avec divers processus pathologiques (14). Une
augmentation notable des formes intermédiaires d'HEX sérique a ainsi été
rapportée pour des pathologies aussi différenciées que le diabète, les at-
teintes hépatiques,
certains types de métastases osseuses et de
leucémies. Aussi, la tentation de certains auteurs de conférer à HEX-12
notamment le rôle d'enzyme marqueur pour une pathologie donnée,
semble problématique. De plus, il faut rappeler l'importance de HEX-P
dans le sérum maternel au cours de la grossesse, et que jusqu'à ce jour
aucune propriété différenciant P de 12 n'a pu être relevée.
L'isolement et la caractérisation des formes intermédiaires 1de l'HEX sé-
rique s'impose en préalable à toute extrapolation sur leur rôle marqueur
potentiel en pathologie.
Au cours de ce travail, une approche séparative et analytique différente de
la chromatographie sur DEAE-Cellulose habituellement pratiquée ne per-
met d'identifier qu'une seule forme intermédiaire d'HEX sérique. Cette
forme HEX-I ne correspond en fait qu'à la seule forme moléculaire pré-
sente avec HEX-As au sein de tous les échantillons de sérums normaux ou
pathologiques étudiés.
La première partie est consacrée à la littérature concernant les formes
d'HEX intermédiaires décrites dans les tissus et liquides biologiques.
La seconde partie de ce travail est consacrée à la sélection d'une popula-
tion de sujets présentant une activité sérique élevée à forte représentativité
en HEX-1. Ainsi, des échantillons de sérum de transplantés ont été utilisés.
La troisième partie décrit les diverses techniques mises en oeuvre pour le
choix d'un protocole de purification et notamment le comportement para-
doxal de l'activité HEX sérique envers des supports d'affinité.

---

7
La quatrième partie correspond à l'isolement et la purification partielle de
HEX-I sérique dont quelques propriétés physico-chimiques et cinétiques
sont décrites dans une cinquième partie.
La sixième partie rassemble l'isolement et l'étude des autres formes molé-
culaires d'HEX sérique, HEX As et HEX-P.
Enfin une dernière partie est consacrée à la recherche d'un apport des
monocytes-macrophages à l'activité HEX sérique.

---

Chapitre 1
MATERIEL ET METHODES
1. PRELEVEMENT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONS
BIOLOGIQUES
1.1. Recueil et conservation des échantillons de sérum
Les échantillons de sérum proviennent de sujets sains, donneurs de sang
dans un centre de transfusion sanguine, de sujets insuffisants rénaux et
transplantés rénaux, et de sujets en situations pathologiques (Service des
Urgences).
Les échantillons de sérum de femmes en cours de grossesse (Service de
Maternité) correspondent au troisième trimestre de grossesse.
Après recueil du sang par ponction veineuse sur tube sec (sans anti-
coagulant), les sérums sont conservés à - sooe avant leur utilisation.
1.2. Traitement des échantillons tissulaires
Les échantillons tissulaires de rein et de foie humains ont été prélevés
après décès et conservés congelés à - sooe avant traitement. Un placenta
a été recueilli directement en salle d'accouchement après la délivrance
puis traité immédiatement.

---

9
1.2.1. Préparation d'un extrait de rein
Le fragment de tissu de rein humain est broyé au Polytron dans du tampon
phosphate 0,05 M pH 7,0 NaCI 0,2 M Triton X 1000,1% (10% PV).
Le broyat est centrifugé 15 mn à 8000 tours/mn, le culot remis en sus-
pension dans le tampon puis soniqué et centrifugé. Les surnageants sont
réunis et conservés à - 20°C après addition de PMSF (Phényl-méthyl-sulfo-
nylfluorid) 0,0002 M (inhibiteur des protéases),
avant analyse par
électrofocalisation.
1.2.2. Préparation d'un extrait hépatique
Le fragment hépatique est broyé à l'Ultraturax dans du tampon PBS ~ 7,4
(10% PV). Le broyat est centrifugé 15 mn à 8000 tours/mn et le sur-
nageant, après dilution au 1/1 De par le tampon PBS, est analysé par élec-
trofocalisation.
1.2.3. Traitement du placenta
Le placenta est lavé avec du NaCI 0,15 M puis découpé et broyé au Poly-
tron dans NaCI 0,15 M (10% PV), PMSF 0,0002 M. Le broyat est centrifugé
15 mn à 8000 tours/mn et les protéines précipitées par du sulfate
d'ammonium à 80% de saturation. Après une nuit à 4°C, la préparation est
centrifugée pendant 25 mn à 8000 tours/mn. Le culot est remis en sus-
pension dans du NaCI 0,15 M puis dialysé contre de l'eau distillée. Le bain
de dialyse est renouvelé quatre fois sur une période de 48 havant
équilibrage contre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 pendant une nuit à
4°C.
Cet extrait protéique a été utilisé pour la purification partielle de l'activité
HEX placentaire à l'aide de deux étapes chromatographiques : chromato-
graphie sur Concanavaline A Sépharose et chromatographie sur hydroxy-
apatite dans les conditions expérimentales décrites plus loin.

---

10
2. METHODES ANALYTIQUES .
2.1. Détermination de l'activité Hexosaminidase (HEX)
L'activité des échantillons de sérum (0,1 ml d'une dilution au 1/20e par du
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0) est estimée à l'aide du méthyl-4-umbel-
liféryl-N-acétyl-B-D glucosaminide (Sigma), O,S mM, sérum albumine
bovine (Pentex) 0,2 mg/rnl en solution dans du tampon citrate de sodium
0,1 M pH 4,6 (O,S ml).
Après incubation de 1 h à 37° C, la réaction est arrêtée par 2,S ml de
tampon glycine soude 0,1 M pH 10,8.
L'activité des différentes étapes de purification de HEXI sérique est déter-
minée sur D,OS ml de fractions à l'aide de méthyl-4-umbellytéryl-N-acétyl-B-
D-glucosaminide 2,S mM, sérum albumine bovine 1 mg/ml en solution
dans du tampon citrate de sodium 0,1 M pH 4,6 (O,2S ml). Après des
temps d'incubation à 37° C, variables selon les étapes de la purification, la
réaction est arrêtée par 2,8 ml de tampon glycine soude 0,1 M pH 10,8.
La quantité de méthyl-4-umbelliférone libérée est estimée par fluorimétrie
(excitation à 368 nm et émission à 448 nm) par comparaison avec une
solution de sulfate de quinine 4 mg/!.
~ \\1.": ·1,
~t>-~~_
La solution de sulfate de quinine 4 mg/ljg_~ns de l'acide.su;fUrique 0,1 N a
été préalablement calibrée à partir d'u.H~ ~~taldn~ge de O,2S à
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e met y -4-
umbelliférone libérée par heure et par litre pour les échantillons de sérum
et en unités correspondant à 1 nMde méthyl-4-umbelliférone libérée par
heure et rapportées au taux de protéines pour les différentes étapes de
purification de HEX-I sérique.

---

I l
2.2. Dosage des protéines
Pour suivre la purification de HEX-l sérique, le dosage des protéines a été
pratiqué selon la méthode au réactif BCA et selon la méthode à la fluores-.
camine pour la dernière étape de purification.
2.2.1. Méthode au réactif BCA (Pearce Chemical Company)
Cette méthode au BCA (Acide Bicinchoninique) est basée sur la réaction
du biuret et permet à partir d'échantillons de 0,1 ml l'estimation de 5 à
100 J,Lg de protéines. La sérum albumine bovine (Pentex) a été utilisée
comme protéine de référence pour l'étalonnage.
2.2.2. Méthode à la f1uorescamine
La méthode à la fluorescamine selon Udenfried S. et coll. (31) a été prati-
quée avec le réactif FluramR (Roche). Cette méthode permet à partir d'un
aliquot d'échantillon, l'estimation de 0,001 à 100 I-'g de protéines par ml.
La sérum albumine bovine (Pentex) a été utilisée comme protéine de réfé-
rence pour l'étalonnage.
3. METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
En l'absence d'indications contraires, toutes les chromatographies ont été
pratiquées à 4° C et les échantillons ont été préalablement équilibrés avec
le tampon d'équilibrage de la colonne par passage sur colonne de Sépha-
dex PD 10 (Pharmacia).
3.1. Chromatographie d'échange d'ions
La chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Séphacel a été utilisée
comme étape préparative pour séparer les différentes formes moléculaires
de l'activité HEX sérique.

---

12
Les échangeurs DEAE Trisacryl et DEAE Cellulose ont été utilisés à titre de
comparaison pour la mise en évidence d'une influence possible de la
matrice sur la séparation.
3.1.1. Chromatographie sur DEAE Séphacel
Deux colonnes (19,5 x 2,3 cm) et (9,4 x 1,5 cm) de DEAE Séphacel (Phar-
macia, France) ont été utilisées.
Le gel est équilibré avec du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0. Après dépôt
de l'échantillon et lavage de la colonne avec le tampon d'équilibrage, on
applique un gradient linéaire de NaCI 0-0,5 M, respectivement de 500 ml et
400 ml pour chaque type de colonne. Après le gradient, la colonne est dé-
chargée avec du NaCI 1 M puis rééquilibrée pour une nouvelle séparation.
3.1.2. Chromatographie sur DEAE Trisacryl
La chromatographie sur colonne (8 x 1,8 cm) de DEAE Trisacryl (IBF) a été
réalisée avec deux systèmes tampons: tampon phosphate 0,01 M pH 7,0
et tampon Tris-HCI 0,05 M pH 8,6.
Après dépôt de l'échantillon et lavage de la colonne avec le tampon
d'équilibrage, on applique un gradient linéaire en NaCI 0-0,3 M (300 ml).
3.1.3. Chromatographie sur DEAE Cellulose
Une colonne (3,2 x 1 cm) de DEAE Cellulose (Whatman) a été équilibrée
avec du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 et un gradient linéaire en NaCI
0-0,3 M (200 ml) dans le tampon a été utilisé.

---

13
3.2. Chromatographie d'affinité
3.2.1. Chromatographie sur gels d'affinités spécifiques
Deux supports d'affinités spécifiques des hexosaminidases ont été testés.
Le para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48 a
été préparé selon la méthode de Lisman (32). Un support commercial, le
3,3'-diaminodipropylamine- 1 thio-N-acétyl-D-glucosamine Gel (E.Y. Labs)
a été également utilisé.
3.2.1.1. Préparation du pa ra-amino-phényl-N-acétyl-B-O-galactosami-
nide Sépharose CH 48
Le gel est préparé suivant le protocole suivant:
Le ligand est obtenu par réduction du para nitrophényl-N-acétyl-B-D-galac-
tosaminide (PNP Gal NAc) couplé au Sépharose en présence de chlorhy-
drate de carbodiimide à pH 5,5.
27 mg de Na2S204 sont ajoutés à 40 mg de PNP Gal NAc en solution
dans 5 ml de NaHC03 0,5 M ; la réduction s'effectue sous agitation vigou-
reuse pendant 3 h.
.
Le contrôle de la réduction est effectué par addition de 1 ml de NaOH 0,1 N
à 0,1 ml du produit de la réaction, et chauffage à l'étuve: '100° C pendant
1 h.
Le PNP Gal NAc présente une coloration jaune alors que le produit réduit
reste incolore.
Pour préparer le gel, 2,5 g de Sépharose CH 48 sont mis en suspension
dans NaCI 0,5 M (10 ml). Le gel est lavé avec du NaCI 0,5 M (500 ml) sur
verre fritté n° 3 puis à l'eau distillée.

---

14
Le couplage s'effectue par mélange du gel et du ligand dans une fiole à
scintillation ; le pH du milieu est ajusté à 5,5 avec HCI N. Le pH se stabilise
environ après 1 h 30 et le mélange est laissé sous agitation pendant 36 h.
Ce support d'affinité a été utilisé en colonnes (5 x 1,5 cm) et (4,5 x 1,2 cm)
en tampons phosphate 0,05 M pH 6,2, 6,8 et 7,4 renfermant du NaCI
0,15 M et avec un débit de 4 ml/h ou 24 ml/ho
Après pénétration de l'échantillon, la colonne est lavée avec le tampon
d'équilibrage puis un gradient linéaire en N-acétyl-glucosamine 0-0,1 M
(20 ml) est appliqué .
Le gel est ensuite déchargé avec du NaCI 1M puis rééquilibré.
3.2.1.2. Interaction de l'HEX placentaire et du para-aminophényl-N-
acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48
Le para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48 a
été préalablement testé à l'aide d'une fraction HEX placentaire de forte
activité et partiellement purifiée après deux étapes chromatographiques
des protéines d'un broyat de placenta, précipitées par du sulfate
d'ammonium.
La fraction placentaire (5 ml) est déposée sur une colonne (1,5 x 5 cm) de
para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48 préala-
blement équilibrée avec du tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 NaCI 0,15 M.
Après pénétration de l'échantillon, la colonne est lavée avec le tampon
d'équilibrage, puis un gradient linéaire en N acétylglucosamine 0-0,1 M est
appliqué.
La colonne est ensuite déchargée avec du NaCI1 M. L'élution est pratiquée
avec un débit de 24 ml/h.

---

15
3.2.1.3. Essai d'un support commercial, le "3.3' diaminodipropylamine
1 thio-N-acétyl-D-glucosamine Gel".
Le support comprend comme ligand un thioglycoside (inhibiteur compétitif
des glycosidases). Le gel est utilisé en colonne (6,3 x 1 cm) et préalable-
ment équilibré avec du tampon phosphate 0,01 M pH 6,0, puis élué avec
du tampon citrate 0,01 M pH 4,6 et une solution de N acétylglucosamine
0,1 M.
La colonne est ensuite rééquilibrée avec le tampon de départ. L'élution est
pratiquée avec un débit de 24 ml/h et un recueil des fractions sous un vo-
lume de 2,4 ml.
3.2.2. Chromatographie d'affinité sur lectines immobilisées
Les hexosaminidases sont des enzymes Iysosomiales de nature glyco-
protéique et sont donc susceptibles d'être fixées par les lectines immobili-
sées, puis éluées spécifiquement par un compétiteur.
3.2.2.1. Concanavaline A Sépharose 48 (Con A Sépharose) (Pharma-
cia)
La chromatograptlie sur colonne de Con A Sépharose a été utilisée
comme étape de purification de l'HEX placentaire et de l'HEX-I sérique
dans les conditions suivantes.
Deux colonnes de Con A Sépharose ont été utilisées (13 x 6,25 cm) pour la
purification de l'HEX placentaire et (3,18 x 1 cm) pour HEX-1. Le gel est
équilibré avec du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 NaCI 0,2 M, azoture de
sodium 0,02 %, puis lavé après dépôt de l'échantillon par le tampon. Après
lavage de la colonne, les fractions fixées par le gel sont éluées par une so-
lution 0,5 M d'Q méthyl mannoside.

---

16
Ces chromatographies ont été pratiquées à température ambiante avec un
débit de 20 ml/h.
3.2.2.2. Lectine de Ricin RCA 120 (Sigma)
Une colonne de lectine de Ricin insolubilisée par couplage à de l'agarose
est équilibrée avec du tampon phosphate 0,01 M pH 6,0 NaCI 0,15 M,
azoture de sodium 0,02%. Après dépôt de l'échantillon et lavage, la co-
lonne est éluée avec une solution de D( +) galactoseO,1 M avec un débit
de 10 ml/h et à température ambiante.
Cette colonne d'affinité a été utilisée avec la Con A Sépharose pour l'étude
comparative des structures glycanniques d,es différentes formes d'HEX sé-
riques.
3.3. Chromatographie d'adsorption sur colonne d'hydroxyapatite
La chromatographie sur hydroxyapatite a été utilisée comme seconde
étape de purification partielle de l'activité HEX placentaire.
Une colonne (13 x 6,25 cm) d'hydroxyapatite est équilibrée avec du tam-
pon phosphate 0,01 M pH 6,0 à un débit de 150 ml/h. Après pénétration
de l'échantillon (éluat Con A Sépharose de l'extrait placentaire) et lavage
de la colonne avec le tampon d'équilibrage, il est procédé à une élution par
paliers à l'aide de tampon phosphate 0,75 M pH6,0 puis du même tampon
amené à une concentration 1M en KC!.
3.4. Chromatographie de filtration moléculaire sur colonne de
Superose™ 12 (FPLC)
Le système "Fast Protein Liquid Chromatography" de Pharmacia (FPLC) a
été utilisé comme dernière étape de purification de HEX-I sérique et pour
déterminer les masses moléculaires relatives des différentes formes molé-
culaires d'HEX étudiées.

---

17
Le système comprend une colonne de Superose™ 12 dont le domaine de
fractionnement linéaire est de 1000 à 300.000 daltons, un système
d'injection des échantillons et une pompe d'alimentation pour l'injection.
La colonne est équilibrée par un tampon phosphate 0,01 M pH 7,0, NaCI
0,2 M, azoture de sodium 0,02%, préalablement dégazé.
Les échantillons sont filtrés sur filtre Millipore Millex G. V. puis injectés sur la
colonne sous un faible volume (0,1 ml). L'élution s'effectue avec le tampon
phosphate.
La chromatographie est réalisée sous une pression de 2 à 3 bars avec un
débit de 0,25 ml/mn et un recueil de fractions de 0,5 ml.
3.5. Chromatofocalisation
3.5.1. Chromatofocalisation sur gel PBE™ 94
La chromatofocalisation est réalisée sur une colonne (13,2 x 1,2 cm) de
PBE™ 94 (Pharmacia) équilibrée par un tampon imidazole HCI 0,025 M
pH 7,4 Triton X 100 0,1 %. Les échantillons de sérum sont préalablement
équilibrés par passage sur colonne de Séphadex PD 10.
Après dépôt et adsorption des échantillons, la colonne est lavée par le
tampon imidazole puis l'élution se poursuit à l'aide d'une solution de poly-
buffer PB 74 (Pharmacia) diluée six fois et ajustée à pH 3,8 par HCI 0,1 N.
La solution de polybuffer PB 74 ajustée à 3,8 et amenée à une concentra-
tion de 0,1% en Triton X 100 assure un gradient de pH de 7,4 à 3,8 pour un
volume total de 200 ml.
Après la réalisation du gradient de pH, la colonne est déchargée à l'aide
d'une solution de NaCI 1 M. Les fractions recueillies sont utilisées pour la
mesure du pH et de l'activité HEX.

---

18
La chromatographie est réalisée avec un débit de 30 ml/h et un recueil de
fractions de 0,5 ml. Les suspensions de gel et les tampons utilisés sont
préalablement dégazés.
3.5.2. Chromatofocalisation sur colonne Mono P (FPLC)
Le système "Fast Protein Liquid Chromatography" de Pharmacia (FPLC) a
été utilisé. Le système comprend une colonne Mono P HR 5/20 (4 ml), (le
gel de la Mono P est un échangeur anionique faible qui sépare les
molécules en fonction de leur pl), un système d'injection des échantillons
et une pompe d'alimentation pour injection. La colonne est équilibrée par
un tampon Bis Tris - acide iminodiacétique 0,025 M pH 7,4.
Les échantillons sont équilibrés par passage sur colonne de Séphadex
PD 10 contre le tampon puis filtrés sur filtre Millipore Millex G.V. et injectés
sur la colonne sous un faible volume (0,1 ml).
L'élution s'effectue par du polybuffer 74 - acide iminodiacétique pH 4,0 qui
assure un gradient de pH de 7,4 à 4,0 pour un volume total de 40 ml.
Le pH de l'éluat est mesuré et enregistré à la sortie de la colonne par un
détecteur d'ions et de pH (IBF). Les solutions tampons sont préalablement
dégazées.
La chromatofocalisation est réalisée avec un débit de 30 ml/h et un recueil
de fractions de 0,5 ml pour le repérage de l'activité HEX.

---

19
4. METHODES ELECTROPHORETlàuES
4.1. Electrophorèse sur plaques de gel de polyacrylamide
L'électrophorèse sur plaques (80 x 60 x 0,75 mm) de gel de polyacrylamide
a été réalisée à l'aide du système Bio-Rad (Mini Protean " Stab Cell) en
conditions non dénaturantes.
Le gel de séparation (7,5% en acrylamide) est surmonté d'un gel de
concentration (4%) et la migration s'effectue en tampon Tris-Glycine 0,3%
pH 8,3 à 160 V et 50 mA pendant 45 mn.
Après électrophorèse, les protéines sont révélées par la méthode au nitrate
d'argent (Dupont Silver Stain Detection System). La plupart des protéines
peuvent être visualisées par cette méthode en moins de 2 h à une
concentration de 0,05 ng/mm2.
La révélation de l'activité HEX s'effectue par incubation de la plaque en
présence du substrat naphtol-AS-BI-N-acétyl-B-D-glucosaminide (Serva).
Celle-ci comprend une incubation de 1 h 30 à 3rc dans le réactif suivant
préparé extemporanément:
- Naphtol-AS-BI-N-acétyl-B-D-glucosaminide (0,26 mmol/I)
20 mg
- Méthyl cellosolve
1 ml
Après dissolution, on ajoute:
- Tampon citrate pH 4,6
20 ml
- Sel de diazonium fast gamet (Sigma)
20 mg
Après agitation, le mélange est filtré sur papier Whatman n° 3.
Après incubation, la réaction est arrêtée par immersion dans l'acide trichlo-
racétique (10% p.v).

---

20
Une bande pourpre apparaît au niveau de l'activité enzymatique sur un
fond de gel coloré en jaune.
Après coloration, le gel est conservé dans de l'eau.
4.2. Electrofocalisation
L'électrofocalisation a été effectuée sur plaques de gel de polyacrylamide
sur appareillage L.K.S. Multiphor 2117.
Le dépôt s'effectue à l'aide de rectangles de papier Whatman n° 3
(5 x 10 mm) inhibés de l'échantillon de telle sorte que la quantité de pro-
téines déposée soit de l'ordre de 5 I1g. Les papiers sont appliqués sur le
gel du côté de l'anode.
Les gels sont à 5% en polyacrylarnide et 2,4% en ampholines et permettent
de réaliser un gradient de pH compris entre 3,5 et 9,5.
Un échantillon d'une solution d'hémoglobine A1 est déposé du côté ca-
thodique de la plaque comme témoin interne de la focalisation.
Le contact entre les électrodes de l'appareil et le gel est établi au moyen de
deux bandes de papier imprégnées d'une solution molaire d'acide phos-
phorique pour l'anode et d'une solution molaire de squde pour la cathode.
.~~~
. d~\\NEetj;
Une tension de 200 Volts est appliquée a4é~~~ff~indre progressi-
vement 1000 Volts au bout de 45 mn. peb~'~éurii~~tion (1 h), une
G.
puissance de 25 Watts est maintenue.
\\::,,'-.)
fil
' \\ .<
Q'b 17
'~,
'-;,~f
Après électrofocalisation une fraction du gel e·sK(jé.cOb~ sur toute sa lar-
geur en segments de 0,5 cm à l'aide d'un scalpel. Les fragments de gel
sont introduits dans les tubes à hémolyse renfermant 1 ml d'eau distillée, et
conservés à + 4°C le temps de la diffusion des ampholines (12 h). Le pH
de chaque tube est ensuite mesuré au pHmètre.

---

21
La fraction de gel destinée à la révélation des protéines est plongée dans
une solution de fixation : Méthanol (150 ml) - Acide sulfosalicylique
(17,25 g) - Acide trichloracétique (57,5 g) - Eau distillée (350 ml). Ce traite-
ment permet à la fois de précipiter les protéines dans le gel et d'éliminer les
ampholines qui sont susceptibles de fixer le colorant.
La coloration est réalisée à l'aide du bleu de Coomassie R250 (0,115 g)
dans 100 ml d'une solution de décoloration : éthanol (500 ml) - acide acé-
tique (160 ml) - eau distillée (QSP 2000 ml).
Les bandes protéiques apparaissent en bleu. Des lavages sont effectués
avec la solution de décoloration jusqu'à décoloration du fond du gel. La
plaque est ensuite desséchée par immersiqn dans une solution de déco-
loration contenant 10% de glycérol, puis séchée et recouverte d'un film de
cellophane assurant sa conservation.
Le fragment'de gel destiné à la révélation de l'activité HEX est découpé en
segments de 0,5 cm à l'aide d'un scalpel. Les fragments de gel sont intro-
duits dans les tubes à hémolyse renfermant 0,4 ml de tampon citrate 0,1 M
pH 4,6 et conservés à + 4°C pendant 12 h.
L'activité HEX est testée ensuite dans chaque tube après addition de
0,1 ml d'une solution de méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-glucosaminide
2,5 mM, sérum albumine 1 mg/ml.

---

Chapitre Il
HEXOSAMINIDASES INTERMEDIAIRES DANS LES
TISSUS ET LIQUIDES BIOLOGIQUES
Depuis la première mise en évidence par Robinson et Stirling en 1968 (1)
de deux formes de N-acétyl-B-D-glucosaminidases tissulaires séparables
par électrophorèse, une forme A (acide) et B (basique), ce type d'enzyme
a donné lieu à de nombreuses investigations.
Ces deux formes moléculaires de N-acétyl-B-D-glucosaminidases ont été
retrouvées en proportions variables dans tous les tissus et liquides biolo-
giques chez l'homme, accompagnées ou non de formes intermédiaires.
D'une manière générale, la variabilité et la faible représentativité de ces
formes intermédiaires ont jusqu'à ce jour limité leur étude.
Les principales données de la littérature signalant la présence ou l'absence
de
formes
intermédiaires
de
N-acétyl-B-D-glucosaminidases
ou
d'hexosaminidases au sein de divers tissus ou liquides biologiques sont
chronologiquement regroupées dans le tableau 1.

---

23
Tableau 1
Formes moléculaires d'hexosaminidases dans les tissus
et liquides biologiques
Références
Origine
Formes isoenzymatiques
Méthodes de
de l'activité HEX
séparation
(3)
Cerveau
HEX-A
pl = 5,0
Electrofocal isation
HEX-B
pl = 7,3
HEX-A
Electrophorèse
HEX-B
sur gel d'amidon
(33)
Cerveau
HEX-A
DEAE Cellulose
au moins 2 HEX-I
(pH 6,0)
HEX-B
HEX-A
Electrophorèse
Sérum de femme
HEX-P
sur gel d'amidon
(18)
en cours de
grossesse
HEX-A
DEAE Cellulose
HEX-P
(pH 7,0)
HEX-A
Electrophorèse
HEX-I (traces)
sur gel d'amidon
(15)
Sérum
HEX-A
DEAE Cellulose
HEXI
+ 1
(pH 7,0)
1
2
HEX-B
Sérum
HEX-A
DEAE Cellulose
(34)
Foie
HEX I~ + '2
(pH 6,0)
Cerveau
HEX-

---

24
Références
Origine
Formes isoenzymatiques
Méthodes de
de l'activité HEX
séparation
HEX-A
Foie
HEX I~ + 12
HEX-
-
HEX-A
Urine normale
HEX ~ + 12 (traces)
HEX-
(35)
DEAE Cellulose
Urine
HEX-A
(pH 7,0)
pathologique
HEX ~ + 12
(atteinte
HEX-
rénale)
HEX-A
Sérum
HEX ~ + 12
HEX-
HEX-A
Rein
HEX I~ + 12
HEX-
HEX-A
Foie
HEX-B
(35)
HEX-A
Electrophorèse
Urine
HEX-B (traces)
sur Cellogel
Sérum de femme
HEX-A
en cours de
HEX-P
grossesse
HEX-B (traces)
(19)
Sérum de femme
HEX-A
DEAE Cellulose
en cours de
HEX-P
(pH 6,0)
grossesse
HEX-B
A
pl = 5,2 - 5,3
Electrophorèse
P biphasique
pl = 6,3 - 6,7
sur gel d'amidon
B
pl = 7,6 - 7,7
et Electrofocalisation

---

25
Références
Origine
Formes isoenzymatiques
Méthodes de
de l'activité HEX
séparation
HEX-A
DEAE Cellulose
Sérum
HEX-I
(pH 6,0)
HEX-B
HEX-A
pl = 4,97 ± 0,06
3 HEX-I
pl = 5,41 ± 0,10
Sérum
pl = 6,32 ± 0,06
Electrofocalisation
(36)
pl = 6,7
HEX-B
pl = 7,14 ± 0,16
HEX-A
pl = 4,95 ± 0,05
Sérum de femme
3 HEX-I
pl = 6,60 ± 0,15
en cours de
pl = 6,23 ± 0,10
Electrofocalisation
grossesse
pl = 5,41 ± 0,08
HEX-B
pl = 7,02 ± 0,08
HEX-A
DEAE Cellulose
Foie
HEX-I
(ph 7,0)
l
HEX-B
(37)
HEX-A
DEAE Cellulose
Rein
HEX-I
+
(?)
(pH 7,0)
l
12
HEX-B
(38)
Sérum de fem-
HEX-A
DEAE Cellulose
mes soumises
HEX-I
(pH 7,0)
ou non à un
HEX-B
traitement par
contraceptifs
stéroïdiens
HEX-A
Rein
HEX-I
+ 1 (traces)
l
2
HEX-B
(17)
DEAE Cellulose
HEX-A
(pH 6,8)
Urine
HEX-I
+ 1
l
2
(traces inconstantes)
HEX-B
Sérum de femme
HEX-A
pl ~ 4,2-4,8
Electrofocalisation
(23)
en cours de
HEX-I/P
pl = 4,9-6,8
grossesse
HEX-B
pl = 6,9

---

26
Références
Origine
Formes isoenzymatiques
Méthodes de
de l'activité HEX
séparation
HEX-A
pl = 4,4-4,9
(29)
Sérum
HEX-I
pl = 5,0
Electrofocalisation
HEX-B
pl = 6,7-7,0
HEX-A
DEAE Sépharose
(39)
Placenta
HEX-1
+ 1
(pH 6,0)
1
2
HEX-B
HEX-A
DEAE Sépharose
(5)
Placenta
HEX-1
+
(pH 6,0)
1
0 + 12
HEX-B
(16)
HEX-A
DEAE Cellulose
Rein adulte
HEX-1
+ 1
(pH 7,0)
1
2
HEX-B
HEX-A
Rein enfant
HEX-1
+ 1
1
2
HEX-B
Urine normale
HEX-A
(adulte et
HEX-1
+ 1 (traces)
1
2
enfant)
HEX-B
(21 )
HEX-A
DEAE Cellulose
Foie
HEX-~
(pH 6,0)
HEX-
HEX-A
Rein
HEX-~
HEX-
HEX-A
Placenta
HEX-~ (traces)
HEX-
HEX-A
Cerveau
HEX-~
HEX-
Ce
tableau
met
en
évidence
une
certaine
variabilité
du
profil
isoenzymatique de l'activité HEX, singulièrement en ce qui concerne les
formes intermédiaires, et ceci en fonction de la méthodologie utilisée et des
tissus ou liquides biologiques étudiés.

---

27
1. HEXOSAMINIDASES INTERMEDIAIRES TISSULAIRES
1.1. Le cerveau
Par électrofocalisation (3) ou électrophorèse sur gel d'amidon (33), deux
formes majeures HEX-A (pl = 5,0) et HEX-B (pl = 7,3) ont été signalées
dans les extraits tissulaires de cerveau.
A ces deux formes majeures s'ajoutent deux formes intermédiaires 11 et 12
(33,34) identifiées par chromatographie sur DEAE Cellulose en tampon
phosphate 0,01 M pH 6,0, éluées au début du gradient linéaire en NaCI 0-
0,3 M avant HEX-A. HEX-B n'est pas retenue par l'échangeur dans les
mêmes conditions expérimentales.
Dewji (21) ne signale qu'une forme 12, Il faut souligner toutefois que le pic
d'activité HEX non fixé par l'échangeur, assimilé à HEX-B présente un
aspect biphasique. La position d'élution du second sommet de ce pic (en
fin de lavage par le tampon d'équilibrage et début de gradient) pourrait
l'assimiler à la forme 11, des autres auteurs.
1.2. Le foie
Des formes intermédiaires d'HEX ont été obtenues par DEAE Cellulose en
tampon phosphate 0,01 M pH 6,0 ou 7,0.
Les deux formes majeures HEX-A et HEX-B sont séparées par un pic
HEX-I (21, 37) ou deux pics 11 + 12 (34,35). Le pH du tampon d'élution
influe peu sur le profil de séparation.
Il est à souligner que la forme HEX-I hépatique est la seule forme d'HEX
intermédiaire tissulaire
qui a été isolée et purifiée
avec la forme
intermédiaire placentaire (5, 39).

---

28
Dewji et coll. (21) ont purifié HEX-12 isolée d'un extrait hépatique par DEAE
Cellulose. Les propriétés physicochimiques de cette forme intermédiaire 12
tendent à lui conférer une plus grande analogie avec la forme A qu'avec la
forme B.
1.3. le placenta
Les résultats obtenus par différents auteurs par chromatographie sur
DEAE Sépharose ou Cellulose en tampon phosphate 0,01 M pH 6,0
rapportent deus formes majeures A et B et des formes intermédiaires dans
le placenta:
- HEX-1 1 et HEX-12 (39) séparées par chromatographie et ultérieurement
caractérisées par électrophorèse sur gel d'amidon en tubes où elles
correspondent à deux bandes bien distinctes.
- HEX-1 1, HEX-D et HEX-12 (5) dont certaines propriétés physicochimiques
ont été étudiées.
- HEX-12 très peu représentée (21) ; mais HEX-B non fixée par l'échangeur
présente un profil d'élution biphasique.
1.4. Le rein
L'activité HEX rénale par chromatographie sur DEAE Cellulose en tampon
,
phosphate 0,01 M pH 6,0 ou 7,0 montre deux formes majeures A et B
séparées par une forme HEX-I (17, 21) ou deux formes HEX 11 + '2 (16,
35, 37) intermédiaires.

---

29
2. HEXOSAMINIDASES INTERMEDIAIRES DES LlaUIDES
BIOLOGlaUES
2.1. Le sérum
Deux formes HEX-A et HEX-B et une (36, 38) ou deux formes d'HEX
intermédiaires
(15,
34,
35)
sont
signalées
dans
le
sérum
par
chromatographie sur DEAE Cellulose en tampon phosphate 0,01 M pH 6,0
ou 7,0.
L'analyse par les méthodes électrophorétiques est plus hétérogène:
- Lowden et coll. (36) par électrofocalisation retrouvent les deux formes
HEX-A et HEX-B, mais la fraction intermédiaire assimilable à HEX-I se
subdivise en trois entités.
- Alhadeff et coll. (29) identifient trois formes HEX-A, HEX-I et HEX-B par
électrofocalisation.
- Hultberg et coll. (23) par électrofocalisation ne signalent que deux formes
sériques HEX-A et HEX-1.
- Price et Dance (15) par électrophorèse sur gel d'amidon, confirment
l'identité des quatre formes HEX-B, HEX-1 1 + 12 et HEX-A de la séparation
chromatographique.
Le sérum de femme en cours de grossesse constitue un cas particulier.
Quelque soit la méthodologie utilisée, le sérum de femme en cours de
grossesse se caractérise par la présence d'une forme majeure HEX-P de
position d'élution chromatographique et de migration électrophorétique
assimilable à HEX-12.
Cette forme HEX-P s'accompagne d'HEX-A (18, 23) ou d'HEX-A et HEX-B
(19,35,36).

---

30
2.2. L'urine
Par chromatographie sur DEAE Cellulose en tampon phosphate 0,01 M
pH 7,0, deux formes majeures A et B et deux formes intermédiaires HEX-11
+ 12 à l'état de traces sont retrouvées dans l'urine (16, 17,35)..
Il est à souligner que l'électrophorèse sur Cellogel ne reproduit pas la
séparation
chromatographique
puisque
seule
HEX-A est retrouvée
accompagnée de HEX-B à l'état de traces par Ellis et coll. (35).
De nombreuses études rapportent une augmentation de l'amplitude des
formes HEX-B et HEX-I dans les urines pathologiques: antibiothérapie
néphrotoxique, atteinte tubulaire rénale, transplantation rénale (revues
dans 40, 41). Dans la majorité des cas, la séparation des formes d'HEX
urinaires a été pratiquée par chromatographie sur DEAE Cellulose.
3. SEPARATION DES FORMES D'HEXOSAMINIDASES
INTERMEDIAIRES ET METHODOLOGIE
Dans les tissus, par DEAE Cellulose ou DEAE Sépharose en tampon
phosphate 0,01 M pH 6,0 ou 7,0, une (17, 21,37), deux (16, 33, 34, 35, 37,
39) ou trois formes intermédiaires (5) ont été séparées des formes
majeures HEX-A et HEX-B.
On note donc une grande variabilité des profils chromatographiques
isoenzymatiques concernant HEX-I dans les extraits tissulaires.
Ces formes intermédiaires ne sont pas toujours retrouvées à l'aide des
méthodes électrophorétiques (3, 33, 35).
Cette variabilité se retrouve dans les liquides biologiques. Dans le sérum,
les méthodes électrophorétiques semblent confirmer la présence d'HEX-I
et P des séparations chromatographiques (15, 23).
· ..r ',--
.•

---

31
En revanche, la presque totalité des données de la littérature concernant
des formes
d'HEX intermédiaires urinaires relèvent des méthodes
chromatographiques, le support utilisé étant le DEAE Cellulose.
Des données antérieures obtenues dans notre laboratoire à l'aide d'un
autre type d'échangeur, le DEAE Trisacryl en tampon phosphate 0,01 M
pH 7,0,
concernant
des
urines
normales
ou
pathologiques,
ne
reproduisent que partiellement les séparations signalées dans la littérature.
L'urine normale ne présente avec ce support chromatographique que la
forme HEX-A, accompagnée ou non d'HEX-B de faible représentativité.
Cette forme HEX-B augmente dans les urines pathologiques.
Ces
données
chromatograhiques
ont
été
confirmées
par
électrofocalisation sur plaques de gel de polyacrylamide (40).
Le suivi de transplantations rénales chez l'homme n'indique qu'une
excrétion transitoire pendant la période post-opératoire d'une forme
urinaire intermédiaire. Celle-ci est confirmée par électrofocalisation et reste
toujours de très faible amplitude, comparativement aux formes A et B (41).
Il est donc apparu que la nature de l'échangeur utilisé pourrait influer sur la
séparation chromatographique de l'activité HEX des tissus et liquides
biologiques, notamment en ce qui concerne HEX-1.
Dans ces conditions, nous avons opté pour l'électrofocalisation sur
plaques de gel de polyacrylamide comme méthode de référence pour le
profil isoenzymatique du sérum et de quelques extraits tissulaires humains.
En effet, cette méthodologie permet une séparation des protéines,
uniquement en fonction de leur charge globale (pl) et n'est pas susceptible
de générer des interactions non spécifiques entre les protéines et un
support comme les matrices chromatographiques.

---

32
La
figure
2
reproduit
les
profils
isoenzymatiques
obtenus
par
électrofocalisation d'extraits tissulaires placentaire, hépatique et rénal. Si
l'importance relative de chaque forme isoenzymatique varie en fonction de
l'extrait tissulaire, les formes HEX-A (pl = 5,5 ± 0,2) et HEX-B (pl = 7,4 ±
0,1) sont accompagnées d'une seule forme intermédiaire HEX-I qui
focalise pour un pH de 6,3 ± 0,4 (n = 3).
En ce qui concerne le sérum de Banque du Sang, l'électrofocalisation ne
révèle que deux formes isoenzymatiques : HEX-A (pl = 5,1) et une
seconde forme qui focalise pour un pH de 6,2 et assimilable à la forme
HEX-I tissulaire (Figure 3A).
Pour le sérum de femme en cours "de grossesse (Figure 3B), un profil
isoenzymatique identique est retrouvé avec une forte amplitude de la forme
intermédiaire HEX-P qui focalise pour un même pH (6,3) que la forme
HEX-I sérique.
L'électrofocalisation sur plaques de gel de polyacrylamide confirme la
présence d'une formed'HEX intermédiaire à la fois dans les tissus et le
sérum. Néanmoins, cette approche méthodologique ne révèle qu'une
seule forme intermédiaire en contradiction avec de nombreuses données
de la littérature basées sur les méthodes chromatographiques.

---

33
IF
pH
HEXB
10
40
HEXA
6
A
20
2
0
5
10
15
N° des fractions
HEXA
100
9
6
B
50
3
o
5
10
15
N° des fractions
9
HEXA
140
6
c
100
3
60
N~ des fractions
o
5
10
15
Figure 2 : Profils isoenzymatiques de l'activité HEX obtenus par
électrofocalisation d'extraits placentaire (A), hépatique (B), rénal (C).

---

34
IF
pH
HEXA S (pl=5.1)
9
150
8
7
100
6
(pl=6.2)
A
5
4
50
3
5
10
15
N° des fractions
pH
9
300
8
HEXA s (pI=5.0)
7
B
6
200
5
4
100
3
5
10
1:i
N° des fractions
Figure 3 : Profil isoenzymatique de "activité HEX sérique (A), et d'un
sérum de femme en cours de grossesse (8) par éleetrofocalisation.

---

Chapitre III
CHOIX DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES POUR
L'ISOLEMENT ET LA PURIFICATION DE
L'HEXOSAMINIDASE INTERMEDIAIRE SERIQUE HEXI
Une augmentation de l'activité HEX sérique a été signalée au cours de la
grossesse (19, 36) et dans divers états pathologiques: diabète (42, 44),
hyperthyroïdie (43), certains cancers (16), atteintes hépatiques (5, 23,46).
Selon les données de la littérature HEX-l et HEX-P (chez les femmes en
cours de grossesse) sont dans la plupart des cas la cause principale de
l'augmentation de l'activité HEX sérique totale.
L'isolement et la purification de HEX-I à partir du sérum humain nécessite
au préalable la sélection d'une population présentant une activité HEX sé-
rique élevée à forte représentativité en HEX-1.
Dans ce but, nous avons pratiqué le dosage de l'activité HEX sérique sur
des échantillons correspondant aux populations de sujets bien individuali-
sées sur le plan physiopathologique, et accessibles dans un service hos-
pitalier d'accueil (laboratoire de biochimie de l'hôpital la Pitié). De plus, le
profil isoenzymatique représentatif de chaque population a été précisé.
Des échantillons de sérum de donneurs d'une "Banque du Sang" ont été
considérés comme représentatifs d'une population non pathologique de
référence.
Le diabète et les atteintes hépatiques ont été signalés, associés à une acti-
vité HEX sérique élevée. Nous avons donc envisagé des échantillons sé-
riques, correspondant à ces pathologies, mais les sujets testés atteints de

---

36
cirrhoses n'ont pas présenté une activité HEX significativement élevée par
rapport à la population de référence.
Le suivi de transplantations rénales à l'aide du dosage différentiel des
isoenzymes de l'HEX urinaire a été pratiqué ces dernières années dans
notre laboratoire (40, 41). Aucune donnée de la littérature concernant
l'activité HEX sérique des sujets transplantés n'étant disponible, nous
avons sélectionné cette population ainsi que celle d'insuffisants rénaux.
Des échantillons de sérum de femmes en cours de grossesse ont consti-
tué une population à forte activité HEX sérique.
La figure 4 regroupe l'ensemble des données obtenues à partir des échan-
tillons testés et le tableau 2 la moyenne d'activité HEX sérique pour chaque
population de sujets. Les proportions de chaque forme isoenzymatique
déterminées par calcul de la surface des pics en électrofocalisation sont
représentatives de chaque population de sujets (échantillons cumulés).
Groupe A - Donneurs "Banque du Sang" :
La figure 4 montre une faible dispersion des données avec une activité
moyenne de 359 ± 50 /.LM/h/I (n = 37) comparable aux activités HEX
sériques de sujets normaux trouvées dans la littérature (47, 48). Par élec-
trofocalisation, HEX-A est la forme majeure (> 80%) et HEX-I faiblement
représentée « 20%) (Figure 5A).
Groupe B - Sujets diabétiques
Les données obtenues recoupent celles de la littérature puisque les
échantillons testés présentent une moyenne d'activité augmentée :
540 ± 103 /.LM/h/I (n = 32), imputable semble-t-il à une augmentation
relative de HEX-I (Figure 5B).

---

37
ACTIVITE HEX SERIQUE
IlM/h/1
2DDD
••
•
•
•
•
•
•
15GC
•
•
••
•
•••••
•
•••
•
••
•••••
lDD
••
•••
• •
•
• ••
••
• ••••
••••••
••
•
•
•••••
•
•••
•
•••
.....
•
••
• •••••
•
•
••••••
...,..
••
1
..........\\
••••
•••••••••••••
• ••••••••••
•
5DD
•
--.tt'i""
••
•••••••••• ••
••• ••••••••••
•
••
••
• ••••••••••••••••••
•
•
...!: ..
••
•••••••••••••••••
•••••••••••••
.....
•
•••••••••••••••
•
••
•• ,', ,',1•••
••••
•
••
•••••••
•••••••••••
•••••
• ••••
•
• •••••
.."...
• •
.. '!(.
..., .
..
.
"1:: •• ,
•••
A
B
c
o
E
Figure 4 : Comparaison des valeurs d'activité HEX sérique obtenues dans
quelques populations de sujets examinés:
A - Donneurs (Banque du Sang)
B - Diabétiques
C - Transplantés rénaux
D - Insuffisants rénaux
E - Femmes en cours de grossesse

---

38
pH
IF
HEXA
8
S (p 1:: 5. 1)
7
100
6
A
5
4
50
3
HEXI (pI=6.4)
5
10
15
N" des fractions
pH
IF
HEXA s (pI=4. 7)
9
60
8
7
B
6
40
5
HEXI (pI::6.0)
20
4
3
1
5
10
N° des fractions
Figure 5 : Profils isoenzymatiques par électrofocalisation, représentatifs de
chaque population étudiée (échantillons cumulés) : sujets donneurs
"Banque du Sang" (A), sujets diabétiques (B).

---

'39
Groupe C - Transplantés rénaux
Les transplantés rénaux présentent une activité HEX sérique élevée avec
une moyenne de 520 ± 181 J.LM/h/I (n = 234). Quelques échantillons au
sein de cette population présentent une activité HEX ~ 1000 J.LM/h/I,
rejoignant ainsi les très fortes activités habituellement constatées chez les
femmes au cours du troisième trimestre de grossesse. De plus les pmfils
isoenzymatiques montrent une augmentation notable de HEX-I (Figure 6).
Groupe D - Insuffisants rénaux
Les échantillons testés correspondent à des sujets présentant un,e créati-
ninémie ~ 250 J.LM/1. L'activité moyenne de cette population de sujets, 184
± 43 J.LM/h/I (n = 33), est notablement inférieure à celle de la population
de référence. Une faible dispersion des données est à souligner ainsi
qu'une forte représentativité de HEX-I (Figure 7).
Cette faible activité HEX sérique chez les insuffisants rénaux non ultérieu-
rement signalée dans la littérature, a été confirmée et publiée au cours de
notre travail par Scapa et coll. (45) et reste à ce jour non expliquée.
Groupe E - Femmes en cours de grossesse
Les échantillons de femmes au cours du troisième trimestre de grossesse
présentent une grande dispersion des données et de fortes activités,
1110 ± 552 J.LM/h/I (n = 37), conformes en ceci aux données de la
littérature. De même, le profil isoenzymatique de ces échantillons confirme
la prééminence de la forme intermédiaire HEX-P (Figure 3B).

---

40
HEXA S .(pJ=5.1 )
IF
pH
cr
,(;,0'
~ 98
10C
0'
7
....0
0""0
6
_0'
HEXI (pI=6.2)
0'
•
5
;/0
\\
4
0
/
•
50
0
•
/
•
•
•
\\
.,.J
••
\\ . .-e-e -e-..-e
+
5
10
5
N° des fractions
Figure 6 : Profil isoenzymatique (électrofocalisation) représentatif des su-
jets transplantés rénaux à activité HEX sérique élevée (> 500/.LM/h/I).

---

41
HEXA s (pl =4.7)
laD
pH
9
8
7
50
6
5
4
3
10
15
N° des fractions
Figure 7 : Profil isoenzymatique par électrofocalisation représentatif des
sujets insuffisants rénaux (créatinine ~ 250 #lM/I).

---

42
L'isolement et la purification de HEX-I sérique a été entreprise à partir
d'échantillons de la population de transplantés rénaux puisque ceux-ci
présentent une forte proportion d'échantillons à activité HEX élevée. En
outre, l'électrofocalisation révèle une augmentation de l'amplitude de la
forme HEX-1.
Les échantillons de sérum réunis ultérieurement pour l'isolement de HEX-I
présentent une activité > 500 J.LM/h/I soit > X + 2 SEM des sérums des
sujets non pathologiques.
La forte activité HEX sérique décelée chez les transplantés rénaux, ne peut
être expliquée et ne peut être rapportée qu'à l'état clinique complexe de
ces sujets.
En particulier aucune corrélation significative (r = 0,18) ne peut être établie
entre l'activité HEX sérique d'échantillons d'intervalles compris entre 224 et
1299 J.LM/h/I et les créatininémies correspondantes de 72 à 617 J.LM/I reflet
de l'état fonctionnel du greffon (n = 43) (Figure 8).
De même, aucune corrélation significative (r = 0,24) ne peut être établie
pour ces mêmes échantillons entre l'activité HEX sérique et le recul par
rapport à la transplantation (1 à 155 mois) (n = 43) (Figure 9).
Une corrélation significative aurait pu être rapportée à l'évolution de la cor-
ticothérapie après transplantation. Une diminution de l'excrétion urinaire de
l'HEX parallèlement à la diminution de la corticothérapie en fonction du
temps chez ces sujets a en effet été signalée (49). De plus, une augmenta-
tion de l'activité HEX sérique imputable principalement à la forme intermé-
diaire a été rapportée aux effets des contraceptifs oraux stéroïdiens (38).

---

43
ACTIVITE HEX SERIQUE
/lM/hi'
•
1000
•
•
• •
•
•
•
•
500
•• •
• • •
••••
•
•
•
•
•
••
•
• •
•
y =.0.41X + 594
r=0.1S
200
400
600
CREATININEMIE
/lM/1
Figure 8 : Absence de corrélation significative entre l'activité HEX sérique
et la créatininémie de 43 échantillons d'une population de transplantés
rénaux.

---

45
Tableau 2
Moyenne des valeurs de l'activité HEX sérique déterminée dans
quelques populations de sujets examinés (exprimée en J,LM/h/I) et
représentativité de chaque forme isoenzymatique
(électrofocalisation)
Echantillons
X
SEM
n
HEX-A
HEX-I
(%)
(%)
A - Donneurs "Banque du Sang"
359
50
37
> 80
< 20
B - Diabétiques
540
103
32
64
36
C - Transplantés rénaux
520
181
234
56
44
D - Insuffisants rénaux
184
43
33
50
50
E - Femmes enceintes
1110
552
37
23
77
x = moyenne
SEM = erreur standard de la moyenne
n = nombre de sujets de chaque population

---

Chapitre IV
CHOIX D'UN PROTOCOLE DE PURIFICATION
DE HEXI SERIQUE
La richesse en protéines du sérum justifie le recours à une méthode
d'isolement de l'activité HEX sérique en préalable à la séparation de HEX-I
des autres formes isoenzymatiques par les méthodes chromatographiques
traditionnelles.
La recherche d'un support d'affinité a donc été envisagée afin d'isoler sé-
lectivement l'activité HEX du sérum. Une chromatographie d'échange
d'ions (type DEAE) devant permettre ensuite la séparation des isoenzymes
de l'HEX sérique.
1. RECHERCHE D'LIN SUPPORT D'AFFINITE POUR L'ISOLEMENT DE
L'ACTIVITE HEX SERIQUE
1.1. Le 3,3'-diaminodipropylamine-1 thio-N-acétyl-D-glucosamine Gel
Nous avons d'abord envisagé d'utiliser un support d'affinité commercial, le
"3,3'-diaminodipropylamine-1
thio-N-acétyl-D-glucosamine
Gel"
(E.Y.
Labs).
Ce support comprend comme ligand un thioglycoside (inhibiteur compétitif
des glycosidases), type de ligand utilisé par Sandhoff et coll. (50) pour la
purification de HEX-A et HEX-B à partir d'extraits hépatiques. Il est à souli-
gner toutefois que ces auteurs ont préparé un dérivé galacto, le 6-amino-
hexyl-2-acétamido, 2-déoxy-1 thio-B-D-galactopyranoside, et non le dérivé
gluco du support commercial.

---

47
Dans les conditions expérimentales décrites dans Matériel et méthodes, la
majeure partie de l'activité HEX déposée accompagne les protéines sé·
riques non fixées par le support. La fraction de l'activité HEX fixée par le
support d'affinité, au plus 30% de l'activité déposée, est éluée par le com-
pétiteur.
Il est à souligner qu'à titre de comparaison, un essai pratiqué dans les
mêmes conditions avec un extrait placentaire conduit au même type
d'interaction.
Le faible rendement de.ce support commercial nous a incité à préparer le
support d'affinité utilisé par Lisman et coll. (32) pour l'isolement de l'activité
HEX placentaire.
1.2.
Le
gel
de
para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide
Sepharose CH 48
Un gel de para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH
48 a été préparé dans les conditions décrites dans Matériel et méthodes,
et préalablement testé à l'aide d'une fraction HEX placentaire partiellement
purifiée. Le tampon de travail est le tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 NaCI
0,15 M.
1.2.1. Interaction de l'HEX placentaire et du support d'affinité
Une faible fraction de l'activité initiale est décelée au niveau de la fraction
protéique non retenue par le support, et la presque totalité de l'activité HEX
placentaire déposée
est éluée
au
sein
du
gradient de N-acétyl-
glucosamine (GleNac) 0-0,1 M. Aucune activité résiduelle n'est décelable
par décharge à "aide de NaCI 1M (Figure 10).

---

•
48
•
A 4~Onrn
Gl cNAc lM
a.l
0.05
0.5
(O-O.IM) GleNAc
NaCll/1
~o-O-o
0
...0..0-0 ... /
lU
lJ
3U
N° des fract 1<Jns
Figure 10 : Profil d'élution de l'activité HEX placentaire obtenu par
chromatographie
d'affir.ité
sur
para-amino-phényl-N-acétyl-B-O-
galaetosaminide Sépharose CH 4B.

---

49
Un profil d'élution identique est obtenu par recyclage, et cette étape chro-
matographique s'effectue avec un taux de récupération de aO% de l'activité
HEX. Ce rendement est en réalité légèrement sous-estimé, compte tenu de
l'inhibition de l'activité HEX par le GlcNac.
Le para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48 pré-
paré s'est donc révélé un support d'affinité approprié pour l'HEX placen-
taire, puisque celle-ci est quantitativement fixée et éluée par un compéti-
teur. Son utilisation a donc été envisagée pour l'isolement de l'activité HEX
sérique.
1.2.2. Interaction de l'HEX sérique et du support d'affinité
Un premier essai a été réalisé dans les mêmes conditions expérimentales
que pour le placenta avec du sérum préalablement équilibré avec du tam-
pon phosphate 0,05 M pH 7,4 NaCI 0,15 M.
L'activité HEX sérique pour sa plus grande part n'est pas fixée par le sup-
port d'affinité, mais présente seulement un profil d'élution retardé par rap-
port aux protéines du sérum. Ce décalage peut être légèrement accentué
en utilisant ~n débit plus lent (4 ml/h) que celui adopté pour l'HEX placen-
taire (24 mljh). Une faible proportion de l'activité globale a été fixée puis
éluée au sein du gradient de N-acétyl-glucosamine 0-0,1 M.
L'influence du pH sur l'interaction entre le support d'affinité et l'HEX sé-
rique a été envisagée. En tampons phosphate 0,05 M pH 6,a et 6,2 NaCI
0,15 M, l'activité sérique n'est pas fixée par le support et suit le pic pro-
téique (Figure 11).
Ultérieurement, un essai pratiqué avec HEX-I sérique partiellement purifiée
a reproduit ce même type d'interaction.

---

50
IF
Sëpharose
CH
48
~OO-"""~~.-(Q)-.
~
.
n
NHCOCH)
r
\\
para_amino-phényl-N-aeétyl-B-D-galaetosaminide_Sépharose CH 4B
100
\\\\'\\o
50
( 0 - 0.1M ) GleNAC
LJ
•
50
100
150
Ve [",1)
Figure 11
Profil d'élution de l'activité HEX serique obtenu par
chromatographie
d'affinité
sur
para-amino-phényl-N-acétyl-B-D-
galactosaminide Sépharose CH 48.
/ / / / / / / / /
Absorbance à 280 nm
•
•
. Tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 NaCI 0,15 M
D
0
Tampon phosphate 0,05 M pH 6,8 NaCI 0,15 M
o
0
Tampon phosphate D,OS M pH 6,2 NaCI 0,15 M

---

51
1.3. Supports d'affinité non "spécifiques"
Des supports d'affinité non "spécifiques" de l'activité HEX ont été envisa-
gés pour éliminer la sérum albumine, protéine majeure du sérum.
Ces supports (Con A Sépharose et Blue Sépharose) n'ont pas été retenus
comme première étape chromatographique de purification en raison des
faibles rendements obtenus.
Un support d'affinité approprié à l'isolement de l'activité HEX à partir du sé-
rum dans des conditions satisfaisantes n'a pu être sélectionné. A cet
égard, soulignons le comportement différent de l'activité HEX sérique et de
l'activité HEX placentaire vis-à-vis du para-aminophényl-N-acétyl-B-D-
galactosaminide Sépharose CH 4B.
La méthode classique de séparation des isoenzymes de l'activité HEX des
tissus et liquides biologiques par chromatographie sur échange d'ions a
donc été réutilisée.
2. SEPARATION DES ISOENZVMES DE L'HEX SERIQUE SUR
ECHANGEUR D'IONS TYPE DEAE
2.1. Echangeur DEAE Trisacryl
2.1.1. DEAE Trisacryl, tampon phosphate 0,01 M pH 7,0
Les isoenzymes de l'HEX urinaire ont été séparées par Bourbouze et coll.
(40) par chromatographie sur colonne de DEAE Trisacryl équilibrée avec
du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0. Dans ces conditions, HEX-B n'est
pas fixée par l'échangeur et HEX-A est éluée par un gradient linéaire en
NaCI 0-0,3 M.
Un échantillon de sérum préalablement équilibré par du tampon phosphate
0,'01 M pH 7,0 et chromatographié dans les mêmes conditions expéri-
mentales, permet de séparer trois fractions à activité HEX (Figure 12) :

---

t
52
IF
HEXA S
30
~u
)u
lu
HaCl1M
0,3
O.Z
10
o. ,
(
o
10
20
30
40
HO des frac t,ions
Figure 12 : Profil d'élution de l'activité HEX serique obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Ttisacryl en tampon
phosphate 0,01 M pH 7,0.
o
0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)

---

53
Une fraction non fixée assimilable à HEX-B, une fraction HEX-I éluée pré-
cocement au sein du gradient (0,02 M en NaCl) et une fraction HEX-A
éluée pour une concentration de 0,1 M en NaCI. Ce profil d'élution
chromatographique est à confronter aux profils isoenzymatiques de l'HEX
sérique obtenus par électrofocalisation (Figures 5A, 5B, 6, 7).
L'électrofocalisation ne révèle que deux formes d'HEX sérique: HEX-A et
HEX-1.
En outre, d'une expérimentation à l'autre, nous avons constaté des varia-
tions d'amplitude du pic d'activité HEX non fixé et du pic d'activité HEX
élué au début du gradient de NaCI.
La confrontation des données électrophorétiques et chromatographiques
nous incite à envisager une fixation aléatoire de HEX-I sur le DEAE Trisa-
cryl, résultante de sa très faible interaction avec l'échangeur, dans les
conditions de pH. et de force ionique utilisées.
Ces résultats recoupent les constatations de Mahuran (5) concernant la
variabilité des formes d'HEX intermédiaires sériques relevées dans la litté-
rature.
En effet selon les auteurs (15, 34, 35, 36), par chromatographie sur DEAE
Cellulose en tampon phosphate 0,01 M pH 6,0 ou 7,0 sont signalées:
- une forme HEX-B non fixée,
- une ou deux formes HEX-I éluées en début de gradient de NaCI,
- une forme HEX-A.
En outre, l'amplitude relative des formes B et 11 + 12 présente une grande
variabilité. Mahuran (5) relève ainsi dans la littérature des proportions de
HEX-B de 3 à 28% suivant les auteurs.

---

54
Mahuran s'interroge sur la validité des pH 6,0 et 7,0 habituellement utilisés
en chromatographie sur DEAE Cellulose pour la séparation des formes in-
termédiaires. Il en conclut qu'un tampon d'équilibrage de pH > 7 serait
sans doute plus approprié. Effectivement, nos données montrent que
HEX-I sérique focalise pour un pH de 6,30 ± 0,25 (n = 12). D'où un faible
état d'ionisation à pH 6,0 ou 7,0.
2.1.2. DEAE Trisélcryl tampon Tris, HCI 0,05 M pH 8,6
Une séparation sur DEAE Trisacryl en tampon Tris, HCI 0,05 M pH 8,6 a
été pratiquée. Dans ces conditions, la figure 13 montre deux pics d'activité
HEX (HEX-I et HEX-A) élués par un gradient en NaCI 0-0,3 M. Ce profil
d'élution et notamment l'absence d'un pic d'activité assimilable à la forme
HEX-B est cohér~nt avec les profils d'électrofocalisation.
En revanche, ces résultats sont contradictoires avec les données de la lit-
térature concernant la séparation de l'HEX sérique par DEAE Cellulose. Il
nous a donc paru intéressant de réaliser une séparation sur DEAE Cellu-
lose dans les conditions décrites dans la littérature (15, 34, 35, 36).
2.2. Echangeur DEAE Cellulose
Les isoenzymes de \\'HEX sérique ont été séparées sur DEAE Cellulose en
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0. Dans ces conditions, le profil obtenu
diffère de celui signalé dans la littérature. La figure 13 montre un pmfil
proche de celui obtenu à pH 8,6 sur DEAE Trisacryl, avec deux fractions,
HEX-I et HEX-A, éluées respectivement à 0,103 M et 0,146 M en NaCI (Ta-
bleau 3).

---

55
A'BOnrTl
IF
"'EXI
100
2
so
llaCll,..
~0.3G.20.1o
10
20
30
40
so
60
Il'' de~ frac; l ;on~
Figure 13 : Profil d'élution de l'activité HEX senque obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Trisacryl en tampon Tris. HCI
O,05M pH 8,6.
o
0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)

---

56
Les profils ohtenus par chromatographie sur DEAE Trisacryl montrent
l'influence du pH sur la séparation des différentes formes isoenzymatiques
de l'HEX sérique (interaction ionique avec le groupement DEAE). En outre,
une interaction protéine-matrice peut être évoquée, si l'on considère les
profils isoenzymatiques différents et la position d'élution de la forme HEX-A
sérique à pH identique (pH 7,0) par chromatographie sur DEAE Trisacryl
(0,100 M) et DEAE Cellulose (0,146 M).
Afin de tester une interaction éventuelle, autre que ionique sur échangeur
de type DEAE, nous avons expérimenté un autre type d'échangeur acces-
sible commercialement: le DEAE Séphacel.
2.3. Echangeur DEAE Séphacel
La séparation chromatographique a été réalisée en tampon phosphate
0,01 M pH 7,0 (Figure 15). Deux pics d'activité HEX sérique ont été bien
séparés par un gradient linéaire en NaCI 0-0,5 M. Hex-I et HEX-A sont
éluées respectivement pour des concentrations de 0,09 M et 0,15 M en
NaCI.
De plus, avec cet échangeur, le pic HEX-I est suffisamment décalé de la
sérum albumine pour envisager une élimination efficace de ce contaminant
par recyclage.
Par électrofocalisation, la fraction HEX-I séparée. par DEAE Séphacel foca-
lise à pH 6,4 (16).

---

57
IF'
100
HEXA S
.-tEXI
Na Cl1 M
75
0.5
50
0.3
(Q-a.5M) NaCl
a. ,
25
a
5
10
15
20
Ne des fractions
Figure 14
Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Cellulose, en tampon
phosphate 0,01 M pH 7.0.
A 280nron
IF
80
NaCl tM
0.5
O. i
40
0.2
40
60
N° des fraclions
Figure 15 : Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Séphacel en tampon
phosphate 0,01M pH 7,0
o
-0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)

---

58
3. INFLUENCE DE LA MATRICE DES ECHANGEURS TYPE DEAE SUR
LA SEPARATION DES ISOENZVMES DE L'HEX SERIQUE ET URI-
NAIRE
Les données chromatographiques obtenues sur échangeurs de type
DEAE à partir d'échantillons de sérum suggèrent une interaction entre les
isoenzymes de l'HEX sérique et la matrice de l'échangeur. Interaction qui
vient se superposer à l'interaction de type ionique proprement dite. Celle-ci
se reflète par une séparation non identique et une position d'élution de
HEX-I et de HEX-A différente au sein du gradient selon l'échangeur utilisé
(tableau 3). La faible rétention des formes d'HEX sérique sur DEAE Trisa-
cryl recoupe les indications du fournisseur qui présente cet écha'ngeur
comme
dépourvu
d'interactions
autres
que
ioniques,
c'est-à-dire
d'interactions non spécifiques, de type hydrophobe notamment.
Cette influence du support chromatographique sur la séparation des
formes d'HEX sérique a été retrouvée avec des échantillons urinaires où
les formes d'HEX présentées sont de type tissulaire (35).
La figure 17 représente les profils isoenzymatiques d'un échantillon d'urine
obtenus par chromatographie sur les trois types d'échangeurs : DEAE
Cellulose (Figure 17), DEAE Trisacryl (Figure 178) et DEAE Séphacel (Fi-
gure 17C). L'échantillon urinaire pathologique utilisé pour ces essais pro-
vient d'un sujet atteint d'un adénocarcinome d'extension rénale probable,
et traité par des antitumoraux. Cet échantillon urinaire reflète une atteinte
tubulaire et correspond à une forte enzymurie (3797 nM/h par mg de
créatinine urinaire).

---

59
IF
HEX 1 ( Pl =6 . 4 )
pH
80
50
6
3
5
N ces
ractions
Figure 16 : Profil d'électrofocalisation du pic d'activité HEXI élué en début
de gradient sur DEAE Séphacel.

---

IF
60
HEXA
150
100
NaC11 M
0.3
0.2 A
10.1o
IF
HEXB
HEXA
40
NaC11M
0.3
J.2
(O-O.3M) NaCl
B
11).1o
IF
NaCl 1M
50
fc.10
10
Figure 17 : Profils d'élution de l'activité HEX d'un même échantillon
urinaire obtenus par chromatographie d'échange d'ions en tampon
phosphate 0,01 M pH7,0.
A - DEAE Cellulose
B - DEAE Trisacryl
C - DEAE Séphacel

---

61
Un pic d'activité assimilable à HEX-B n'est pas fixé sur échangeur DEAE
Cellulose. IHEX-1 1", HEX-12" et HEX-A sont éluées pour des concentrations
respectives de 0,035M, 0,08M et 0, 19M en NaCI.
Sur DEAE Trisacryl, deux pics d'activité sont séparés: HEX-B non fixée et
HEX-A éluée à 0,12 M en NaCI.
La chromatographie sur DEAE Séphacel montre aussi deux pics d'activité:
HEX-I (ou B) et HEX-A fixées sur l'échangeur et éluées respectivement à
0,06 M et 0,17 M en NaCI.
Ces résultats sont regroupés dans le tableau 4.
Par électrofocalisation, l'activité HEX non fixée sur DEAE Trisacryl et la
fraction éluée en début de gradient sur DEAE Séphacel focalisent d'une
manière identique en un seul pic au sein du gradient de pH, à pH 7,4 (Fi-
gure 18A et B). Ces deux pics d'élution correspondent donc à la forme
HEX-B tissulaire.
Ainsi, en contradiction avec les profils trouvés dans la littérature avec le
DEAE Cellulose (16), l'activité HEX urinaire comprend deux formes HEX-A
et HEX-B, HEX-I n'étant apparemment pas représentée d'une manière si-
gnificative dans l'urine, confirmant en ceci les données antérieures de
Bourbouze et coll. (40, 41). Là encore, le tableau 4 confirme la plus forte
interaction des échangeurs DEAE Cellulose et Séphacel envers les formes
d'HEX comparativement au DEAE Trisacryl.

---

62
IF
pH
100
8
A
6
50
4
5
10
t 15
N° des fractions
HEXB (pI=7.4)
~
pH
20
8
B
10
6
4
5
10
15
W des fractions
Figure 18 : Profil d'électrofocalisation de l'activité HEX non fixée sur DEAE
Trisacryl de la figure 178 (A) et de l'activité HEX éluée en début de gradient
sur DEAE Séphacel de la figure 17C (8).

---

63
En conclusion, la confrontation des séparations obtenues sur échangeurs
de type DEAE avec les profils d'électrofocalisation permet d'envisager
l'absence d'une forme HEX-B sérique significative, et la présence d'une
seule forme HEX-I dont l'isolement de HEX-A se révèle le plus satisfaisant
sur DEAE Séphacel.
La séparation sur DEAE Séphacel de l'activité HEX urinaire montre égaIe-
ment un pic d'activité élué avant HEX-A et identifié à HEX-B par électrofo-
calisation. Cependant ces deux pics d'activité sont élués pour des
molarités en NaCI différentes, respectivement de 0,060 et 0,090 M pour la
forme urinaire et la forme sérique.
Le profil d'élution de l'activité HEX sérique sur DEAE Séphacel est cohé-
rent avec le profil d'électrofocalisation, tant en ce qui concerne les formes
isoenzymatiques que leur amplitude relative. Avec ce support. HEX-I est
obtenu avec un bon rendement, bien isolé de HEX-A et de la sérum albu-
mine, et le DEAE Séphacel a été retenu comme échangeur pour un proto-
cole de purification.

---

64
Position d'élution dans le gradient de NaCI (en Mil)
Echangeur
"HEX-B"
HEX-I
HEX-A
DEAE Trisacryl
tampon phosphate
non fixé
0,020
0,100
0,01 M pH 7,0
DEAE Trisacryl
tampon Tris 0,05 M pH 8,6
-
0,070
0,110
DEAE Cellulose
tampon phosphate
-
0,103
0,146
0,01 M pH 7,0
DEAE Séphacel
tampon phosphate
-
0,090
0,150
0,01 M pH 7,0
Tableau 3:
Interaction des formes d'hexosaminidases sériques avec les échangeurs
anioniques.
Position d'élution dans le gradient de NaCI (en Mil)
Echangeur
HEX-B
"HEX-I "
"HEX-1 "
HEX-A
1
2
DEAE Cellulose
tampon phosphate
non fixé
0,035
0,080
0,190
0,01 M pH 7,0
DEAE Trisacryl
tampon phosphate
non fixé
-
-
0,120
0,01 M pH 7,0
DEAE Séphacel
tampon phosphate
0,060
0,170
0,01 M pH 7,0
Tableau 4:
Interaction des formes d'hexosaminidases urinaires avec les échangeurs
anioniques.

---

Chapitre V
ISOLEMENT ET PURIFICATION DE HEXI SERIQUE
Des échantillons' de sérum sélectionnés et conservés à - 80°C (sérum de
transplantés rénaux à activité > 500 JLM/h/I) sont réunis pour un volume
de 20 ml pour chaque tournée de purification.
20 ml de sérum sont dialysés 48 h contre du tampon phosphate 0,01 M pH
7,0, puis divisés en deux lots équivalents pour la première étape chroma-
tographique.
1. CHROMATOGRAPHIE SUR DEAE SEPHACEL
La moitié de chaque dialysat issu de 20 ml de sérum est déposée sur une
colonne de DEAE Séphacel (19,5 x 2,3 cm), équilibrée avec du tampon
phosphate 0,01 M pH 7,0.
Le profil d'élution lors de cette étape chromatographique, à une échelle
préparative, correspond à celui de la figure 15.
La totalité de l'activité HEX sérique est fixée par l'échangeur et éluée par un
gradient linéaire en NaCI 0-0,5 M (500 ml).
Les fractions correspondant au pic d'activité HEX-I élué en début de gra-
dient sont réunies et dialysées contre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0
pendant 48 h.

---

66
Les dialysats de deux colonnes de DEAE Séphacel correspondant à
l'isolement de HEX-I des 20 ml de sérum de départ sont réunis et concen-
trés par ultrafiltration (cellules Amicon). Les dialysats concentrés sont re-
cyclés par chromatographie sur une deuxième colonne de DEAE Séphacel
(9,4 x 1,5 cm) équilibrée en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0. Pour cette
deuxième étape chromatographique sur DEAE Séphacel un gradient li-
néaire 0-0,5 M (400 ml) en NaCI ést utilisé. L'activité HEX-I est éluée en un
seul pic au sein du gradient (Figure 19). Le pic HEX-I est dialysé contre du
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 et concentré par ultrafiltration.
HEXI
IF
150
E
c
Na C11 M
0
CZ)
C'l
0.5
cf .....
100
2
ura
0.4
z:
~
LI).
0
1
0
0.2
50
o
20
30
N° des·fractions
Figure 19 : Profil d'éJution de HEX-I par recyclage sur DEAE Séphacel en
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
o
0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)

---

67
Cette première étape de la purification de HEX-I impliquant deux chroma-
tographies successives sur DEAE Séphacel permet le traitement d'une
quantité relativement importante de sérum et de parfaire l'isolement de
HEX-I, de HEX-A et de la sérum albumine. Le recyclage des fractions
HEX-I des deux premières colonnes préparatives sur une colonne plus
réduite et un gradient d'élution plus performant (d'un volume supérieur à
vingt fois le volume du gel) permet une augmentation de l'activité
spécifique de HEX-I d'un facteur de 1,6 avec un rendement de 72%.
2. CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE SUR CON A SEPHAROSE
La chromatographie d'affinité sur gel de Con A Sépharose a été sélection-
née comme deuxième étape de purification avec pour objectif principal de
parfaire la séparation de HEX-I de la sérum albumine.
La fraction HEX-I de l'étape précédente est déposée sur une colonne de
Con A Sépharose équilibrée avec du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0
NaCI 0,2 M.
Une importante fraction protéique n'est pas fixée par la colonne. Une acti-
vité HEX est décelée à ce niveau. Après lavage de la colonne par le tam-
pon d'équilibrage, HEX-I est éluée par une solution d'a-méthyl mannoside
O,5M.
La figure 20 reproduit le profil d'élution de l'activité HEX sur la colonne de
Con A Sépharose. Ce profil d'élution nécessite deux remarques:

---

68
~
A2BOnm
:;
IF
ro,
...
::l'"
'<
Qi
::l
::l
0
150
60
Ln
a.
ro
0
lJ1
3:
100
40
!
50
20
5
10
15
20
W' des fracti
Figure 20 : Profil d'élution de HEX-I après DEAE Séphacel, sur colonne de
Con A Sépharose.
o
-0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)
Les hexosaminidases sont des enzymes Iysosomiales de nature glyco-
protéique donc affines de la Con A. Cependant, il a été constaté une pro-
portion de HEX-I sérique non retenue par la lectine lors de cette étape
chromatographique. De même, il a été signalé lors du protocole de purifi-
cation de HEX-12 à partir du foie humain qu'une fraction de cette isoen-
zyme n'était pas retenue sur une colonne de Con A Sépharose (21).
Le pic HEX-I élué par l'Q·méthyl mannoside représenté sur la figure 20
correspond à "activité HEX déterminée en sortie de colonne et en pré-
sence d'a-méthyl mannoside. Dans ces conditions l'activité HEX est
notablement inhibée (70%) et la figure 20 ne reproduit que l'activité HEX-I
résiduelle.

---

69
La fraction HEX-I éluée de la colonne de Con A Sépharose est dialysée
contre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0. Le bilan de cette étape chro-
matographique (tableau 5) a été effectué à partir de ce dialysat.
Tableau 5
Tableau de purification de HEX-I sérique
Volume
HEX-I
HEX-I
Protéines
Rendement
Facteur
ml
U totales
U/mg de
mg
%
de purifi-
protéines
cation
Sérum
20
16506
10
1600
100
1
Dialysat
22,5
14065
11
1 278
85
1,1
du sérum
DEAE
Séphacel
(80 ml)
53
10176
65
156
62
6,5
Tampon
phosphate
0,01M pH7
DEAE
Séphacel
(17 ml)
52
8320
106
78
50
10,6
Tampon
phosphate
0,01M pH7
Con A
Sépharose
Tampon
33
2737
553
4,95
17
55
phosphate
0,01M pH7
NaCI0,2M
FPLC
Superose 112
Tampon
1
1 408
2095
0,67
9
209
phosphate
0,01M pH7
NaCI0,2M

---

70
3. CHROMATOGRAPHIE DE FILTRATION MOLECULAIRE SUR
SUPEROSETM 12 (f'PLC)
Le dialysat de l'étape précédente est concentré par ultrafiltration puis sur
ultragaine (Schleicher et Schüll) à un volume de 1 ml. Cette concentration
est imposée par les faibles volumes injectables sur la colonne de Super-
ose™ 12 (0,25 ml).
La figure 21 reproduit l'élution de HEX-I en un pic symétrique au sein du
domaine de fractionnement de la colonne de Superose, décalé par rapport
à un important pic protéique. Les fractions réunies à activité HEX de cette
étape chromatographique correspondent à la préparation enzymatique
d'HEX-I sérique obtenue la plus purifiée.
IF
A280nm
100
0.004
50
0.002
Va
Vt
25
40
60
temps de rétention
(mn)
Figure 21 : Profil d'élution de HEX-I par chromatographie de filtration mo-
léculaire sur gel de Superose™ 12 (FPLC).
o
0
A280nm
...- - - . .
IF (activité HEX)

---

71
4. FRACTION HEX-I SERIQUE PARTIELLEMENT PURIFIEE
En l'absence d'un support d'affinité spécifique pour l'isolement de l'activité
HEX du sérum, HEX-I a été isolée et obtenue partiellement purifiée après
quatre étapes chromatographiques.
Le tableau 5 regroupe les données des différentes étapes de la purification.
HEX-I a été obtenue avec une activité spécifique de 2095 nM/h par mg de
protéines et purifiée 209 fois avec un rendement final de 9%. Le facteur de
purification et le rendement ont été déterminés à partir de l'activité
HEX-I initiale du sérum sachant que celle-ci représentait 47% de l'activité
HEX sérique totale dans les échantillons cumulés pour un volume de 20 ml
de sérum.
Par électrophorèse en gel
de polyacrylamide,
en
conditions non
dénaturantes, la fraction HEX-\\ obtenue le plus purifiée révèle plusieurs
bandes protéiques. Une bande protéique de bonne intensité présente la
même distance de migration que la bande d'activité HEX révélée par
incubation d'une partie de la plaque de gel dans une solution de naphtol
ASSI N-acétyl-B-D-glucosaminide (Figure 22).

---

72
Vl
rD
:J
VI
Cl.
il
~
Q>
Mo
.....
_
HEXI
_
o
:J
Figure 22 : Electrophorèse sur plaques de gel de polyacrylamide en
conditions non dénaturantes.
A1 : Révélation des protéines du gel par le nitrate d'argent
A2 : Révélation de l'activité HEX par incubation en présence du naphtol
ASBI N-acétyl-B-D-glucosaminide (Serva).

---

73
5. DISCUSSION
La forme HEX-I sérique n'a pu être obtenue à l'état homogène. La fraction
HEX-I la plus purifiée montre par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
la persistance de contaminants protéiques. Cette purification partielle ne
peut entièrement rendre compte nous semble-t-il de la relative faible
activité spécifique de HEX-I de 2095 nM/h par mg de protéines et d'un
facteur de purification modeste en regard de la richesse en protéines du
sérum.
Ainsi, la forme HEX-12 hépatique a été obtenue à l'état homogène (21)
avec une activité spécifique de 6120. 103 nM /h par mg de protéines et
purifiée plus de 10 000 fois. Des données similaires sont retrouvées en ce
qui concerne les formes A et B d'HEX hépatique (21) et les différentes
formes moléculaires d'HEX placentaire (39).
En revanche, la forme A sérique (HEX-As) a été obtenue à l'état homogène
et purifiée 195 fois pour une activité spécifique de 4680 nM/h par mg de
protéines (51), et la forme P sérique (HEX-P) purifiée, présente une activité
spécifique de 4 391 nM/h par mg de protéines avec un facteur de purifica-
tion d'environ 600 (19).
La confrontation de nos résultats avec les données de la littérature se limite
aux travaux où le substrat MUGlcNAc a été utilisé pour le dosage des
activités enzymatiques. Nos résultats sont comparables aux données de la
littérature se rapportant aux formes d'HEX du sérum qui se caractérisent
par
de
faibles
activités
catalytiques
comparativement
aux
formes
tissulaires. Celles-ci diffèrent systématiquement d'un facteur de 103.
Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliciter la faible activité
catalytique des formes d'HEX circulantes comparativement aux enzymes
tissulaires :

---

74
- '_es formes d'HEX circulantes seraient des enzymes issues d'un
processus spécifique de sécrétion et/ou des formes précurseurs des
enzymes Iysosomiales, de plus faible activité catalytique que les formes
matures Iysosomiales.
- Les enzymes sériques seraient des formes moléculaires "dénaturées"
éliminées par la cellule lors de l'exocytose Iysosomiale.
Quoi qu'il en soit, la faible activité catalytique des enzymes sériques sous-
tend des différences conformationnelles qui peu~ent rendre compte de la
faible affinité constatée de l'activité HEX sérique pour le para-amino-
phényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 48, par contraste
avec l'HEX tissulaire placentaire.

---

Chapitre VI
PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES
ET CINETIQUES DE HEXI SERIQUE
Les propriétés physico-chimiques et cinétiques de HEX-/ sérique ont été
étudiées à partir de la fraction isolée par chromatographie sur Con A Sé-
pharose. Cette étape ne correspond pas à la fraction enzymatique obtenue
la plus purifiée. Cependant, à ce stade, HEX-I est bien isolée de HEX-As'
Ce stade de la purification permet l'obtention de fractions enzymatiques en
quantités suffisantes pour les différentes expérimentations. En revanche,
l'étude de l'interaction entre HEX-I et les lectines a été pratiquée avec la
fraction de l'étape précédant la chromatographie sur Con A Sépharose.
1. PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES DE HEX-I SERIQUE
1.1. Thermostabilité
La thermostabilité de HEX-I a été étudiée après préincubation à SO°C pen-
dant des temps variables (0 à 90 mn). Après refroidissement l'activité en-
zymatique résiduelle est déterminée dans les conditions habituelles et ex-
primée en pourcentage de l'activité initiale (Figure 23).
L'activité HEX-I sérique se révèle thermostable à 50° G, avec seulement
une perte d'activité peu significative de 6% après 90 mn d'incubation.

---

76
100
70
Q)
....ttl 50
...,
s::
.....
'Q)
...,
..... 30
>
...,u
ttl
- 20
Q)
"<K
10
5
10
20
30
45
60
90
mn
Figure 23: Thermostabilité à 50° C de HEX-I sérique.
1.2. Détermination de la masse moléculaire relative (Mr)
La colonne de Superose™ 12 (FPLC) de la der~ière étape de purification
de HEX-f a été étalonnée à l'aide de solutions à 2 mg/ml de protéines de
masses moléculaires relatives suivantes : Chymotrypsinogène (25.000) -
Ovalbumine (45.000) - Aldolase (158.000) - Catalase (240.000) et Ferritine
(481.000) (52).
Le volume vide de la colonne (Vo) a été évalué à partir du temps de réten-
tion de la thyroglobuline de Mr 669.000, c'est-à-dire exclue du domaine de
fractionnement (1.000 à 300.000) du Superose™ 12. Le volume total de la
colonne (Vt) a été estimé à partir du temps de rétention de la vitamine 612
de Mr 1350.

---

77
Les temps de rétention de HEX-I des différentes étapes finales de la purifi-
cation sur SuperoseTM 12 permettent de lui attribuer une Mr de 210.000.
La forme HEX-A urinaire (HEX-Au) de type Iysosomial isolée par chroma-
tographie d'échange d'ions, présente dans les mêmes conditions expéri-
mentales une élution plus retardée correspondant à une Mr de 95.000 (Fi-
gure 24).
Kav
1.0
~
HEXAu
HEXI
Y=-0.2848X + 1.8255
r=O.95
O. 1
4
4.5
5
5.5
6
6.4
LogPM
Figure 24 : Détermination de la masse moléculaire relative (Mr) de HEX-I
sérique et HEX-A urinaire par chromatographie de filtration moléculaire sur
SuperoseTM 12 (FPLC).
Etalonnage de la colonne avec des protéines de référence :
(1) Chymotrypsinogène (25.000), (2) Ovalbumine (45.000), (3) Aldolase
(158.000), (4) Catalase (240.000), (5) Ferritine (481.000).

---

78
1.3.1. Etude de la copule glycannique
Une approche de la structure glycannique de HEX-I sérique a été entre-
prise par l'intermédiaire de l'étude de l'interaction de l'enzyme avec deux
lectines, la Concanavaline A (Con A) et la lectine de Ricin (RCA 120 Sigma)
couplées au Sépharose.
1.3.1. Spécificité des lectines utilisées (53, 54, 55)
La Con A n'interagit pas avec les glycopeptides des glycoprotéines de type
complexe (oligosaccharides tri ou tetraantennés). La Con A interagit fai-
blement avec les oligosaccharides biantennés élués par de faibles
concentrations d'un compétiteur spécifique, l'Q-méthyl mannoside (0,01 M).
Les structures glycanniques de type hybride et oligo mannosidique, phos-
phorylées ou non, interagissent fortement avec la Con A, et leur élution né-
cessite de fortes concentrations en Q-méthyl mannoside (O,5M) (Figure 25).
L'agglutinine 1de la lectine de Ricin est affine des structures glycanniques
incluant des résidus de galactose libres et substitués par des résidus
d'acide sialique en position Cs plutôt qu'en position C3 ; c'est-à-dire des
structures de type complexe ou hybride (Figure 25).

---

79
Ne uAe
NeuAe
N,uAe
l '" 2,~ (6)
l 01 2,~ (6)
~ ~ 2,~ (6)
Gal
Gal
Gal
1
•
~ j 1,4
U 1,4
.11 1,4
GleNAc
GleNAc
GleNAc
~
III 1,2
~ 1,2 / '_ ' ~4
--,
r- Mon- - - -
Man
~~~,6
I
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1
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1
1
GleNAe- FuC
L
- - -
-~-
--l
_Ain - A
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Mon
Mon
Gal
111 1,4
~~I,2
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GleNAc
GleNAc
Mon
Mon
Mon
Mon
Mon
~~ 1,2
~ I,~ ~ 1,,:-
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-
Mon
Mon
1
r Man -
-
-
Mon
~~',6
~~~,6
Mon •
1 GleNAc
1
Mon
,
1,4l
,
1,4
II 1,4
1
GleNAc
1
GleNAc
~ 11 1,4
1
lj 1,4
1
GleNA.c
GleNAc
-1
L
-1-
-------1-
- Ain-
-A.,,·
a
e
Figure 25 : Oligosaccharides des glycoprotéines des cellules de mammi-
fères d'après Jürgen Roth (55).
A - Type complexe (triantenné)
B - Type oligomannosidique
C - Type hybride

---

80
1.3.2. Protocole expérimental
L'étude de l'interaction HEX-I - Con A Sépharose a été pratiquée en
tubes dans des conditions bien standardisées pour établir le bilan de
l'activité enzymatique non fixée et des activités éluées respectivement à
des concentrations de 0,01 Met 0,5 M en a-méthylmannoside.
Dans un tube à hémolyse, 1 ml de la fraction HEX-I (éluat de la deuxième
colonne de DEAE Séphacel) est ajouté à 2 ml d'une suspension à 50% en
gel de Con A Sépharose, en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 NaCI 0,2 M,
azoture de sodium 0,02%. Le milieu est soumis à une agitation continue
sur appareil rotatif à température ambiante pendant 15 mn. La suspension
est centrifugée et le surnageant prélevé. Le gel est remis en suspension
dans 2 ml de tampon et soumis à agitation pendant 5 mn. Après centrifu-
gation les deux surnageants sont réunis (fraction non affine de la Con A).
L'activité HEX fixée par la Con A est éluée à l'aide de deux paliers de
concentrations en a-méthylmannoside selon le même protocole expé-
rimentai : 0,01 M à température ambiante et 0,5 M en enceinte thermosta-
tée à 3rc.
Les surnageants, 0,01 M et 0,5 M en a-méthylmannoside, sont passés sur
une colonne PD 10 équilibrée par le tampon initial pour éliminer l'a-
méthylmannoside, inhibiteur de l'activité HEX.
L'activité HEX est évaluée dans les conditions habituelles pour les trois
fractions. Le bilan est déterminé en tenant compte des corrections de vo-
lumes et exprimé pour chaque fraction en pourcentage de l'activité totale
récupérée
L'interaction de HEX-I avec la lectine de Ricin a été étudiée par chromato-
graphie sur la lectine immobilisée en enceinte close en raison de la toxicité

---

81
de cette lectine, dans les conditions expérimentales décrites dans le cha-
pitre Matériel et méthodes.
Après dépôt de l'échantillon, la colonne est éluée par le tampon phosphate
0,01 M pH 6,0 NaCI 0,15 M azoture de sodium 0,02 % (10 volumes de gel)
puis par une solution 0,1 M de galactose dans le même tampon. L'activité
HEX est testée dans chaque tube (recueil de fractions de 1 ml). " a été vé-
ri'fié que le galactose à la concentration utilisée n'interférait pas avec
l'activité enzymatique.
Les pourcentages d'activité HEX non fixée et éluée de la lectine ont été
déterminés à partir de la surface des pics des profils d'élution (trois expé-
rimentations) .
1.3.3. Interaction de HEX-I avec la Con A et la lectine de Ricin
Le tableau 6 regroupe les données obtenues avec la Con A. La totalité de
HEX-I interagit avec la Con A, mais 24% de l'activité ultérieurement éluée
présente une faible affinité pour la lectine puisque éluée par l'ct-méthyl
mannoside à une concentration de 0,01 M. A noter également un taux de
récupération de 96%.
Tableau 6
Interaction de HEX-I sérique avec la Concanavaline A
Concanavaline A
Taux de
récupération
Non fixée
ct-méthylmannoside
0,01 M
0,5M
HEX-I
sérique
1%
24%
75%
96%

---

82
Ces résultats impliquent la présence de chaînes oligosaccharidiques de
type complexe (biantenné) et sont cohérents avec les données de
l'interaction de HEX·I avec la lectine de Ricin.
La figure 26 montre l'jnteraction de HEX·' avec la lectine de Ricin. La
majeure partie de l'activité HEX déposée est retrouvée au niveau de la
fraction non fixée par la lectine.
IF .
20
15
Cl
+
---G')CI
CI
n
.-+
0
Vl
10
(l)
Cl
3:
l
5.
40
N° des fractions
10
20
30
Figure 26 : Profil d'élution de "activité HEX-I par chromatographie sur
lectine de Ricin.

---

83
Néanmoins, le profil d'élution du pic correspondant signale une interaction
de type réversible à ce niveau puisque, malgré un lavage prolongé avec le
tampon d'équilibrage, on constate une activité résiduelle qui persiste. 17%
de l'activité HEX-I interagit spécifiquement avec la lectine de Ricin et est
élué par du galactose 0,1 M.
Il est à noter que le taux de récupération (80%) est ici plus faible qu'avec la
Con A (Tableau 7).
Tableau 7
Interaction de HEX-I sérique avec la lectine de Ricin
Lectine de Ricin
Taux de
récupération
Non fixée
D + Galactose
0,1 M
HEX-I
sérique
83%
17%
80%
1.4. Approche de la structure sous-unitaire de HEX·I sérique
Deux formes majeures d'hexosaminidases, A et B, sont présentes dans les
tissus chez l'homme. La différence de charge de ces deux formes repose
sur
une
structure
sous-unitaire
bien
différenciée.
HEX-A
est
un
hétéropolymère de sous-unité ex et de sous-unités B (Ba et Bb). HEX-B est
un homopolymère de sous-unités B (2 x Ba Bb). Les sous-unités ex et B sont
de masses moléculaires différentes et codées par des gènes distincts (4,
11,13).
La structure sous-unitaire de HEX-I ne peut être mise en évidence par
analyse en électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS puisque
l'enzyme n'a pu être obtenue à l'état homogène. Néanmoins une approche
de la structure sous-unitaire de HEX-I a pu être mise en oeuvre à l'aide du

---

84
méthyl-4-umbelliféryl-B-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate
(don
du
Dr
T. Beccari).
Le
substrat naturel
de
l'hexosaminidase
comprend
de
nombreux
glycolipides tel que le ganglioside GM2. 1\\ a été démontré que la
dégradation du GM2 (non hydrosoluble) est médiée par une protéine
spécifique de faible masse moléculaire appelée "activator". Le complexe
GM2 - protéine activatrice constitue le véritable substrat hydrosoluble qui
présente une spécificité de chaînes Q (56) (Figure 27).
r '
\\~f\\ ~lcNAc
. - .__. .
oc."
/
~\\NAc
~6S ~-~~~j'i
Ac1.GM2~
.erIVE HEl( A· GIlII2 ACTI.....TOI'l·Clol 2
~
CO"I>LEl(
G1117 llC T,-'TOfl . G1117
CCM"\\.U
14"~"S1S ~ <>"2 ANO
RE COL NE FUT lQtj OF
P'IIOT EINS
Figure 27 : Activité catalytique des sous-unités Q et B de HEX-A envers
des substrats synthétiques et naturels d'après Conzelmann et coll. (56).

---

85
Ainsi HEX-A mais non HEX-B présente une activité non seulement envers
les gangliosides, les protéoglycannes sulfatés mais aussi les substrats
synthétiques : para-amino-phényl-B-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate (57)
et méthyl-4-umbelliféryl-B-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate (32, 58).
L'activité de HEX-I et de la forme HEX-A urinaire (HEX-Au) a été
déterminée envers le MUGlcNAc et le MUGlcNAc-6-S dans les conditions
décrites par Beccari (22). Le tableau 8 montre les résultats obtenus. Pour
HEX-I l'hydrolyse du MUGlcNAc-6-S pendant 1 h d'incubation à 3r C est
très faible bien que significative sur le plan expérimental (intensité de
fluorescence
de
l'essai
correspondant
à
trois
fois
l'intensité
de
fluorescence du témoin-substrat correspondant).
Tableau 8
Activité (en nM/h) de HEX-I sérique et de HEX-A urinaire envers les
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosaminide
- méthyl-4-um.belliféryl-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate
MUGlcNAc
MUGlcNAc-6-S
MUGlcNAc-6-S
MUGlcNAc
HEX-I
sérique
144
0,1
0,0007
(? Ba Bb)
HEX-Au
610
23
0,037
( Ba Bb)
Cependant, par comparaison avec les données obtenues avec HEX-Au,
l'activité de HEX-I envers le substrat sulfaté peut être envisagée comme
négligeable et par là même inciter à envisager .l'absence de sous-unités a
pour HEX-1.
1.5. Détermination du point isoélectrique
L'électrofocalisation sur plaques de gel de polyacrylamide réalisée à partir
d'échantillons de sérum, et des différentes étapes de la purification, montre
que HEX-I focalise au sein du gradient pour un pH de 6,30 ± 0,25 (n =

---

86
12). Au cours de toutes ces expérimentations l'activité HEX-I focalise en un
seul pic.
De nombreuses données de la littérature signalent, par séparation
chromatographique, deux formes d'HEX intermédiaires dans le sérum (11
et '2), Ainsi, par chromatofocalisation sur gel PBE™ 94 effectuée à partir
d'échantillons de sérum,
nous avons constaté au cours d'études
préliminaires (59) un pic biphasique de HEX-I, pour des pH de 5,6 et 6,1 au
sein du gradient, et pouvant correspondre à deux formes intermédiaires '1
et 12 (Figure 28).
IF
HEXA S
80
A
pH
8
0 - 0 - 0 - 0
•
'0_ 0
7
60
- 0...... 0 ~O
6
-..)-0
- 0 - 0
•
- 0 _
5
40
HEXl 1
HEXI2
•
0, o\\
•
0 - 0 - 0 - 0
4
1'1
/
•
3
20
.
/
\\
,...._---J \\.-...,
,
•
•,
., 'e
...
10
20
30
40
N° des fractions
Figure 28 : Profil d'élution de "activité HEX d'un échantillon de sérum par
chromatofocalisation sur PBETM94.

---

87
La méthode de séquençage des gels pour le repérage de l'activité
enzymatique après
électrofocalisation
peut
ne
pas
permettre une
séparation suffisamment fine pour l'identification de formes ne différant que
de quelques dixièmes d'unités pH.
L'homogénéité du pic d'électrofocalisation de HEX-I a cependant été
confirmée par chromatofocalisation sur Mono P (Pharmacia) FPLC. Cette
méthode permet un enregistrement en continu du gradient de pH ; un
recueil de fractions de 0,5 ml assure un pouvoir séparateur de 0,1 unité pH
(Figure 29).
IF
100
pH
\\
7
\\
50
6
5
4
5
10
15
N° des fractions
Figure 29: Chromatofocalisation de HEX-I sur Mono P (Pharmacia) FPLC.

---

88
Dans ces conditions expérimentales HEX-I est éluée en un pic symétrique
pour un pH de 5,7 au sein du gradient.
L'homogénéité du pic constatée tant par électrofocalisation qu'au cours
des séparations chromatographiques se trouve confirmée. Le pl apparent
de HEX-I par chromatofocalisation sur Mono P (pl = 5,7) est plus acide
que le pl déterminé par électrofocalisation (pl = 6,3 ± 0,25) (n = 12). Ce
décalage, ainsi que le pic biphasique de HEX-I par chromatofocalisation
sur PBETM94 peuvent être rapportés à des interactions de type
hydrophobe entre l'enzyme et les supports chromatographiques. Ces
interactions de type hydrophobe sont minimisées par le support de
MonoP, mais très importantes dans le cas du PBETM94. En effet, des
travaux antérieurs dans notre laboratoire ont montré qu'en absence de
Triton X100 0,1% dans le gradient de pH, la forme HEX-I tubulaire rénale
est éluée au sein du gradient à pH 5,0 et la forme HEX-A (pl = 5,2 - 5,4 par
électrofocalisation) n'est toujours pas él~ée à pH 4,0, pH de la fin du
gradient. HEX-A reste fixée sur le support chromatographique et son
élution nécessite du NaCI 0,1 M (60).
2. PROPRIETES CATALYTIQUES DE HEX-I SERIQUE
2.1. pH optimum
Le pH optimum de HEX-I a été déterminé par incubation en présence de
MUGlcNAc dans des solutions de tampon citrate 0,1 M pH 3,3 à 6,5 (de
0,2 en 0,2 unité pH).
HEX-I présente un pH optimum de 4,8 (Figure 30) qui se superpose
rigoureusement à la courbe de pH optimum de HEX-As'

---

89
IF
40
30
20
10
3
3.9
4.8
6. 1
pH
Figure 30: pH optimum de HEX-I et HEX-A sériques.
o
0
'HEX-I sérique
•
• HEX'"A sérique
2.2.
Détermination
des
paramètres
cinétiques
pour
quelques
substrats
Les paramètres cinétiques de HEX-I ont été déterminés à l'aide des
substrats suivants:
- Méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-glucosaminide (MUGlcNAc), pour des
concentrations dans le milieu réactionnel de 0,28 mM à 3,33 mM.
- Méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-galactosaminide
(MUGaINAc)
de
0,10 mM à 1,66 mM.

---

90
- 3-crésol-sulfone-phtaleine-N-acétyl-B-D-gluccs8minide
de
0,30 mM
à
1,80 mM.
Les cinétiques observées sont de type michaëlien pour les trois substrats
et la figure 31
rassemble les droites calculées à partir des points
expérimentaux selon la représentation de Lineweaver et Burk. Les valeurs
des constantes de Michaëlis (Km) et des vitesses maximales (Vm) sont
rassemblées dans le tableau 9.
Tableau 9
Paramètres cinétiques de HEX-I sérique, envers quelques substrats
Substrat
Km (mM)
Vm (nMjh)
Vm/Km
MUGlcNAc
0,53
571
1063
MUGalNAC
0,09
142
1 510
3 crésol sulfone
0,26
133
511
phtaléine GleNAc
Les Km obtenus sont différents pour les trois substrats: 0,54 mM avec le
MUGlcNAc, 0,09 mM avec le MUGaINAc, 0,26 mM avec le 3-crésol-sul-
fane-phtaléine GleNAc ; et les valeurs de Vm sont respectivement de 571,
142 et 133 nM/h.
HEX-I n'ayant pas été obtenue à l'état homogène, la constante Kcat pour
ces substrats reste inaccessible. Cependant, ces études cinétiques ont été
réalisées avec la même fraction enzymatique, donc à des concentrations
en HEX-I équivalentes. Dans ces conditions, la comparaison des Vm
montre une plus forte activité catalytique de HEX-I pour le MUGlcNAc. En
revanche les Km obtenus reflètent une plus forte affinité apparente de
HEX-I pour le MUGaINAc.

---

91
ltY
0.0251
.,.
.'
0.0177
A
-I/Km
o
f. 2048
2.4390
l/S
'IV
..'
..-
...•"
0.0690
.
..,
0.0555
._.~
., ... ..
..
B
1/Vm .'
-IIKm
o
I/V
..-'"
",
0.0116
...•
..•...
--
1.0096
.-'
w'·
c
l/Vm
.,'
.-
-l/K:n
o
1. 11
2.22
liS
Figure 31 : Détermination des paramètres cinétiques (Vm et Km) de HEX-I
vis-à-vis
du
MUGlcNAc(A),
MUGaINAc(S),
O-crésol-sulfone-phtaleine
GlcNAc(C).

---

92
Le rapport Vm/Km, meilleur reflet de la spécificité catalytique d'une
enzyme laisse apparaître également une spécificité plus élevée pour le
MUGaINAc.
3. DISCUSSION
L'étude des propriétés physicochimiques de la fraction HEX-I isolée du
sérum
confirme
la
présence
d'une
seule
forme
intermédiaire
d'hexosaminidase sérique. Celle-ci se caractérise par sa thermostabilité à
50°C, une masse moléculaire relative plus élevée que la forme HEX-A
urinaire, et une structure glycoprotéique hétérogène comprenant des
chaînes
glycanniques
complexes
biantennées
et
hybrides
ou
oligomannosidiques. .
La structure sous-unitaire de HEX-I ne semble pas comprendre de chaînes
de type cr.
Les données cinétiques pour la MUGlcNAc ne différencient pas HEX-I
sérique des formes tissulaires hépatique (21) et placentaire (39) qui
présentent un pH optimum de 4,4 - 4,8 et un Km compris entre 0,5 et 1mM
pour ce substrat.
HEX-I présente une plus grande activité catalytique pour MUGlcNAc mais
en revanche une affinité apparente (Km) et une spécificité catalytique
(Vm/Km) plus élevée pour MUGaINAc.

---

Chapitre VII
ISOLEMENT ET CARACTERISATION
DES AUTRES FORMES MOLECULAIRES
D'HEXOSAMINIDASES SERIQUES (HEXAS ET HEXP)
La forme moléculaire majeure d'hexosaminidase antérieurem,ent isolée et
caractérisée dans le sérum humain est la forme A dite HEXAS pour la diffé-
rencier des formes A tissulaires étant donné son caractère légèrement plus
acide (5, 18).
Par chromatographie d'échange d'ions et électrofocalisation d'échantillons
de sérum, nous avons également constaté la forte représentativité de cette
forme HEXAS comparativement à la forme HEX-1. En revanche, les échan-
tillons de sérum de femmes en cours de grossesse (troisième trimestre)
ont montré la prépondérance d'une forme intermédiaire dite HEX-P. Cette
forme HEX-P est généralement assimilée à la forme HEX-12 dans la littéra-
ture (18, 19,23).
Après la purification partielle et l'étude des propriétés de HEX-I, il nous est
apparu nécessaire d'entreprendre une étude comparative des formes sé-
riques HEXAS et HEX-P en complément des données obtenues pour
HEX-1.
Il nous fallait en effet d'une part, confirmer l'identité moléculaire propre de
HEX-I par rapport à HEXAS' et d'autre part, en raison de quelques don-
nées contradictoires de la littérature, confirmer ou infirmer à l'aide de notre
propre approche méthodologique, la relation des formes HEX-I et HEX-P.
En outre, la forme HEX-A urinaire a été utilisée comme forme tissulaire de
référence pour certaines propriétés physicochimiques.

---

94
1. ISOLEMENT DE HEX-P ET DE HEXAS
1.1. HEX-P sérique
Les échantillons de sérum de femmes en cours de grossesse (troisième
trimestre), conservés à - 80°C sont sélectionnés (activités enzymatiques ~
500 J.LM/h/I) et réunis par fractions de 15 ml pour une séparation
chromatographique.
Chaque lot est fractionné et équilibré par passage sur colonne PD 10 en
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 puis déposé sur une colonne de DEAE
Séphacel (19,5 x 2,3 cm) équilibrée avec le même tampon. Le profil
d'élution obtenu, èorrespond à celui de la figure 32A. La totalité de l'activité
HEX sérique est fixée par l'échangeur et éluée par un gradient 0-0,5 M en
NaCI (500 ml). Les fractions correspondant au pic HEX-P éluées en début
de gradient (0,09 M en NaCI) sont réunies et dialysées contre du tampon
phosphate 0,01 M pH 7,0 pendant 48 h. Les dialysats de deux colonnes de
DEAE Séphacel sont réunis et concentrés par ultrafiltration (cellules
Amicon).
Ces fractions sont recyclées par chromatographie sur une seconde co-
lonne de DEAE Séphacel (9,4 x 1,5 cm), équilibrée en tampon phosphate
0,01 M pH 7,0. HEX-P est éluée en un seul pic au sein du gradient 0-0,5 M
NaCI (400 ml) (Figure 328). Ces fractions correspondant à HEX-P sont ré-
unies et dialysées contre du tampon phosphate 0,01 M pH 7,0 pendant
48 h.

---

95
IF
A280nrn
150
HEXP
NaCl tM
A
1)0
0.4
0.2
(0-0.5M) NaCl
o
10
20
30
40
N° des fractions
IF
A280nrn
NaCl tM
0.4
8
0.2
20
(0-0.5r~) NaCl
~-~!
,
10
20
30
40
N°des fractions
Figure 32:
A- Profil d'élution de l'activité HEX du sérum de femme en
cours de grossesse (3e trimestre) obtenu par chromatographie d'échange
d'ions sur DEAE Séphacel en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
B- Recyclage sur DEAE Séphacel de HEX·P isolée du sérum.
o
0
A280nm
•
•
IF (activité HEX)

---

96
Le profil par électrofocalisation de l'activité HEX du lot de sérum utilisé
montre deux formes HEXAS et HEX-P qui focalisent pour des pH respectifs
de 5,3 et 6,6 (Figure 33A). Après isolement par chromatographie sur DEAE
Séphacel, HEX-P focalise en un seul pic pour un pH de 6,6 (Figure 33B).
La fraction HEX-P isolée présente une activité spécifique de 169 nM/h par
mg de protéines.
1.2. HEXAS
La forme HEXAS a été isolée parallèlement à la purification de HEX-I à par-
tir de sérums de transplantés rénaux.
Le pic d'activité HEXAS' élué après HEX-I dans le gradient lors de la pre-
mière étape chromatographique sur DEAE Séphacel a été recyclé sur une
seconde colonne de DEAE Séphace/ dans les mêmes conditions que
HEX-I et HEX-P. A la suite de cette seconde chromatographie, HEXAS est
éluée en un seul pic au sein du gradient (0,18 M en NaCl) (Figure 34A). Les
fractions correspondant à HEXAS sont réunies et dialysées contre du
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
Par électrofocalisation, HEXAS focalise en un pic pour un pH de 5,1 (Figure
34B).
La fraction HEXAS isolée présente une activité spécifique de 120 nM/h par
mg de protéines.

---

97
IF
pH
150
HEXP
/
9
HEXA s
7
100
A
5
50
3
r=1
5
10
15
N° des fractions
IF
80
HEXP
pH
60
9
7
40
B
5
20
3
5
10
15
N° des fractions
Figure 33 : A- Profil par éleetrofocalisation de sérum de femmes en cours
de grossesse (échantillons cumulés).
8- Profil par éleetrofocalisation de HEX-P après recyclage sur DEAE Sé-
phacel.

---

98
IF
A2BOnm
Na Cll M
0.5
100
\\~ 0·4
A
02
50
(O-0.5M) NaCl
0
V"'~V
ft
ft
10
20
30
40
50
60
70
N° des fractions
pH
IF
7
80
B
5
40
J
+
o
N0 des fractions
Figure 34 : A· Profil d'élution de HEX-A isolée du sérum par recyclage sur
DEAE Séphacel en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
v
9
A 280 nm
~
., IF (activité HEX)
B· Profil par électrofocalisation de HEXAS après recyclage sur DEAE Sé-
phaceL

---

99
2. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET CINETIQUES DE HEXAS
ET HEX-P
2.1. Propriétés physico-chimiques
2.1.1. Thermostabllité
L'étude de la thermostabilité est effectuée après préincubation des diffé-
rentes formes enzymatiques à 5Q°C pendant des temps variables (0 à 90
mn). L'activité enzymatique résiduelle est alors déterminée par incubation
en présence de MUGlcNAc, dans les conditions habituelles.
HEXAS et HEX-P se différencient par leur thermostabilité à 5Q°C (Figure
35). HEX-P est thermostable à 50°C avec une perte d'activité peu signi'fica-
tive de 1% après 90 mn d'incubation. HEXAS est thermolabile et ne
conserve que 7% d'activité résiduelle après le même temps de préincuba-
tion à 5Q°C.
100 l-----All.--
------------------.~-------
...
QJ
~
ra
.~
50
...,
.~
C
'QJ
...,
.~
30
>
...,ura 20
-
QJ
-0
~
10
10
30
45
60
90
mn
Figure 35 : Thermostabilité à 5Q°C de HEX-P et HEXAS
•
• HEX-P
•
•
HEXAS

---

100
2.1.2. Détermination de la masse moléculaire relative (Mr)
Les masses moléculaires relatives (Mr) de HEX-P et HEXAS ont été esti-
mées par chromatographie de filtration moléculaire sur une colonne de
Superose™ 12 (FPLC) dans les mêmes conditions que décrites précé-
demment.
HEX-P et HEXAS présentent des temps de rétention correspondant à des
Mr respectives de 160.000 et 145.000. Comme HEX-I, ces deux formes sé-
riques montrent une taille moléculaire apparente plus élevée que la forme
HEX-A urinaire (Mr 95.000) par filtration moléculaire (Figure 36).
Kav
1.0
HEXAu
0.7
( 1)
HEXAs
Y=-0.2848X + 1.8255
HEXP
r=O.95
0.5
O. 1
LogPM
4
4.5
5
5.5
6
6.4
Figure 36 : Détermination de la masse moléculaire relative (Mr) de HEX-P,
HEX-A sérique et HEX-A urinaire par chromatographie de filtration molécu-
laire sur Superose™
12 (FPLC).
Etalonnage de la colonne avec des protéines de référence : (1) Chymo-
trypsinogène (25.000), (2) Ovalbumine (45.000), (3) Aldolase (158.000), (4)
Catalase (240.000), (5) Ferritine (481.000).

---

101
Il a été antérieurement signalé que par filtration moléculaire sur gel de Sé-
phadex, HEXAS présentait une taille moléculaire supérieure à HEX-A hépa-
tique (34), et HEX-P une Mr estimée à 150.000 (19).
2.1.3. Etude de la copule glycannique de HEX-P et HEXAS
L'interaction de HEX-P et HEXAS avec la Con A et la lectine de Ricin, cou-
plées au Sépharose, a été étudiée suivant le protocole expérimental décrit
pour HEX-I sérique.
Le tableau 10 regroupe l'ensemble des données de l'interaction de HEX-P
et HEXAS avec la Con A. Ce tableau inclut également des données cor-
respondant à l'interaction de la forme HEX-A urinaire (HEX-Au), forme Iy-
sosomiale tissulaire.
Tableau 10
Interaction des formes HEX sériques (AS et P)
et urinaire (Au) avec la Concanavaline A.
Formes enzymatiques
CanA
Taux de
récupération
a-méthyl mannoside
%
Non fixée
0,01 M
O,5M
HEX-P
2
28
70
90
HEXA
3
15
82
84
S
HEX-Au
3
5
92
73
Les trois formes enzymatiques étudiées interagissent avec la lectine, mais
se différencient selon deux critères: la proportion de l'activité éluée par l'a-
méthyl mannoside 0,01 M et le taux de récupération.
Les données obtenues pour HEX-P avec la Con A sont très comparables à
celles de HEX-I (tableau 6).
En revanche, contrairement à HEX-I, HEX-P ne présente aucune affinité
pour la lectine de Ricin (Figure 37).

---

102
IF
IF
6C
3e
\\
A
i
B
40
2G
':'
..,
..
.,
\\ l:l+
C'>
'"
C'>
;-
'"
-'"..,
..
0
0
r:>
'"~
~
~
%
10
:i
20
,
J ·1
5
10
20
30
40
5
10
20
30
40
IF
5:
'?
E'
-'"..,
..0
C
'"t:l
!2
:i
iD
•
l
H·
!~
5
10
iO
JO
N' des fractions
Figure 37 : Interaction de HEX-A urinaire (A) HEX-A sérique (8) et HEX-P
(C) avec la lectine de Ricin.

---

103
L'interaction de HEXAS avec la Con A (tableau 10) et la lectine de Ricin
(Figure 37, tableau 11) est cohérente et traduit une hétérogénéité de
structure glycannique.
Tableau 11
Interaction des formes HEX sériques (AS et P)
et urinaire (Au) avec la lectine de Ricin
Formes enzymatiques
Lectine de Ricin
Taux de
récupération
Non fixée
D + Gal
%
0,1 M
HEX-P
100
0
97
HEXA
88
12
62
S
HEX-Au
100
0
82
HEX-Au montre une forte affinité pour la Con A et une absence
d'interaction avec la lectine de Ricin, reflet d'une structure de type
oligomannosidique stricte.
2.1.4. Approche de la structure sous-unitaire de HEX-P et HEXAS
L'activité de chaque forme enzymatique envers le MUGlcNAc et le
MUGlcNAc-6-S a été déterminée dans les conditions décrites par Beccari
(22).
L'hydrolyse du MUGlcNAc-6-S par HEX-P peut être considérée comme
peu significative. Les données obtenues avec HEXAS sont comparables
aux données antérieures concernant HEX-A urinaire (tableau 8).
La confrontation des activités relatives pour les deux substrats de HEX-P et
HEXAS nous incite à envisager comme pour HEX-I l'absence de sous-
unités cr pour HEX-P.

---

104
2.1.5. Détermination du point isoélectrique
Le point isoélectrique de HEX-P a été déterminé par éleetrofocalisation sur
plaques de gel de polyacrylamide à partir d'échantillons de sérum de
femmes en cours de grossesse, ou de HEX-P isolée par chromatographie
sur DEAE Séphacel. HEX-P focalise au sein du gradient de pH en un seul
pic pour un pH de 6,40 ± 0,35 (n = 8).
Par chromatofocalisation sur Mono P (FPLC), HEX-P focalise en un seul
pic pour un pH apparent de 5,5 (Figure 38). Ce décalage des pl apparents
selon la méthode utilisée a été antérieurement signalé et discuté pour
HEX-1.
Pour HEXAS' l'électrofocalisation sur plaques de gel de polyacrylamide,
réalisée à partir d'échantillons de sérum (Banque du Sang, transplantés
rénaux,
insuffisants rénaux, diabétiques) ou de HEXAS isolée par
chromatographie sur DEAE Séphacel, montre que cette forme majeure
d'hexosaminidase sérique focalise au sein du gradient de pH pour un pH
de 5,0 ± 0,23 (n = 16).
Par
chromatofocalisation
sur
gel
PBE™
94
effectuée
à
partir
d'échantillons de sérum, HEXAS focalise en un seul pic pour un pH de 4,7
(Figure 28).

---

105
pH
IF
4.5
50
5.5
40
30
6.5
20
Collecte
10
7.5
,
i 4
fa i1942
i&iiF $
1
'f
'
10
20
30
40
50
N° des fractions
Figure 38 : Profil d'élution de HEX-P par chromatofocalisation sur MonoP
(FPLC).
O~---D gradient de pH (7,5-4.0)
•
•
IF (activité HEX)

---

106
2.2. Propriétés catalytiques de HEX-P et HEXAS
2.2.1. pH optimum
Les pH optima de HEX-P et HEXAS ont été déterminés par incubation en
présence de MUGlcNAc en tampon citrate 0,1 M pH 3,3 à 6,5 (de 0,2 en
0,2 unité pH).
HEX-P présente un pH optimum de 4,4 et HEXAS un pH optimum de 4,8.
La figure 39 montre ce léger décalage du pH optimum de HEX-P par
rapport à HEXAS.
IF
40
30
20
10
1
3.9
4.8
6.1
pH
Figure 39 : pH optimum de HEX-P et HEXAS
o
0
HEX-P
•
•
HEXAS

---

107
Dans les mêmes conditions expérimentales, les activités en fonction du pH
de HEX-I et HEXAS montraient des profils rigoureusement superposables
avec un pH optimum commun de 4,8 (Figure 30).
2.2.2.
Détermination des paramètres cinétiques pour quelques
substrats
Les trois substrats MUGlcNAc, MUGalNAc et le 3-crésol-sulfone-phtaleine
GlcNAc ont été utilisés dans les conditions décrites pour HEX-I pour la
détermination des paramètres cinétiques de HEX-P et HEXAS'
Les valeurs de Km et Vm sont regroupées dans le tableau 13. HEX-P
présente des Km respectifs de 0,63 mM pour MUGlcNAc, 0,07 mM pour
MUGalNAc et 0,33 mM pour le 3-crésol-sulfone-phtaleine GlcNAc. HEX-P
présente une plus forte affinité apparente pour MUGalNAc et une activité
catalytique supérieure pour MUGlcNAc. En revanche,
la spécificité
catalytique (Vm/Km) de HEX-P est très voisine pour les trois substrats
(Figure 40).
Les Km obtenus pour HEXAS sont respectivement de 0,79 mM pour
MUGlcNAc, 0,09 mM pour MUGalNAc et 0,43 mM pour le 3-crésol-sulfone-
phtaleine GlcNAc (Figure 41). HEXAS présente également uné plus forte
affinité pour MUGalNAc et une plus forte activité catalytique pour
MUGlcNAc. HEXAS montre une spécificité catalytique (Vm/Km) plus
accentuée pour MUGalNAc que pour les deux autres substrats.
HEXAS a été isolée et caractérisée à partir du plasma humain dès 1974
(51). Envers MUGlcNAc et MUGalNAc, les Km trouvés sont très voisins de
nos propres données, ainsi que l'importance relative des spécificités
catalytiques pour les deux substrats en faveur du MUGaINAc.

---

108
I/V
0.0178
0.0125
A
9
I/Vm
-l/Kin
0
1.2048
2.4390
I/S
I/V
0.0370 ~
9
..'
•
....
0.0270
..".
..".
l/Vm
9·9
, .
8
-1/K.':I
o
3.60
7.20
liS
I/V
0.0137
•. 9
c
0.0107
. ' 9
..
9. ..
l/Vm
- 1/,.11
o
1.11
2.22
Figure 40 : Détermination des paramètres cinétiques (Km et Vm) de HEX-
P vis-à-vis du MUGlcNAc (A), MUGalNAc (B), O-crésol sulfone phtaleine
GleNAc (C).

---

109
I/V
0.0054
0.0035
A
./
/ e
.. "
I/Vm
••
./
-I/Km
a
1.204a
2.44
Ils
1/V
,..
0.0250 f
.fI, .- ---
..-
0.020a
••••
I/Vm..' •••
.'
B
,.'
.. ..'
'
-I/Km
a
3.60
7.20
Ils
I/V
0.0035
0.0029
c
I/Vm,/
; /
.;-
; '
/
, ' /
Ils
-I/Km
o
1.11
2.n
Ils
Figure 41 : Détermination des paramètres cinétiques (Vm et Km) de HEX-
A sérique vis-à-vis du MUGlcNAc (A), MUGalNAc (B), Q-crésol-sulfone-
phtaleine GleNAc (C).

---

110
Tableau 12
Activité (en nM/h) de HEXAS et HEX-P envers les:
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosarninide
- méthyl-4-urnbelliférul-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate
Formes enzymatiques
MUGlcNAc
MUGlcNAc-6-S
MUGlcNAc-6-S
MUGlcNAc
HEX-P
974
0,5
0,0005
( ? Ba Bb)
HEXA~
173
5,2
0,030
(Ba
)
Tableau 13
Paramètres cinétiques de HEXAS et HEX-P
envers quelques substrats
Formes
Substrat
Km (mM)
Vm (nM/h)
Vm/Km
enzymatiques
MUGlcNAc
0,63
990
1 571
HEX-P
MUGalNAc
0,07
122
1 743
3-crésol-sulfone
0,33
480
1 454
-phtaleine GleNAc
MUGlcNAc
0,79
493
624
HEXA
MUGalNAc
S
0,09
145
1 611
3-crésol-sulfone
0,43
141
328
-phtaleine GleNAc

---

111
3. DISCUSSION
Les formes HEXAS et HEX-P sériques ont été isolées et caractérisées sur
le plan physicochimique et cinétique.
Les résultats obtenus pour HEXAS recoupent les données antérieures de
la littérature : thermosensibilité à SocC, présence de sous-unités a, une
structure glycannique de type complexe, un pl plus acide et une taille
moléculaire plus élevée que la forme HEX-A tissulaire correspondante (34).
Certaines des caractéristiques (taille moléculaire, interaction avec la Con A)
qui différencient HEXAS de son homologue tissulaire, en l'occurrence la
forme HEX-A urinaire, ont été retrouvées avec la forme HEX-P et déjà
signalées pour HEX-1. HEX-P se signale néanmoins par une absence
d'interaction avec la lectine de Ricin,. en contradiction apparente avec les
résultats obtenus avec la Con A.
L'agglutinine 1de Ricin utilisée présente une plus grande affinité pour les
séquences glycanniques incluant des résidus galactose substitués par des
acides sialiques en position C6 plutôt qu'en C3 (S3). Ainsi, comme il a été
constaté antérieurement pour HEX-I, une fraction notable de HEX-P éluée
par une "faible concentration en a-méthyl mannoside (0,01 M) et un taux
élevé de récupération de la lectine signalent la présence de structures
glycanniques autres que oligomannosidiques. L'absence d'interaction de
HEX-P avec la lectine de Ricin pourrait être imputable à des liaisons sialyles
différentes des chaînes complexes biantennées.
HEX-P se différencie de HEXAS par sa thermostabilité à SOCC et son
absence d'activité significative envers le MUGlcNAc-6-S. Ces deux
propriétés ont déjà été signalées pour HEX-I et caractérisent également les
formes HEX-B tissulaires.
Les données cinétiques obtenues à partir de substrats synthétiques ne
différencient pas d'une manière significative les formes HEXAS et HEX-P

---

112
entre elles d'une part, et de HEX-I d'autre part. Celles-ci correspondent à
une plus grande activité catalytique pour MUGlcNAc et une affinité
apparente (Km) plus élevée pour MUGaINAc. Il faut remarquer toutefois
une absence prononcée de spécificité catalytique (Vm/Km) particulière
pour les trois substrats utilisés en ce qui concerne HEX-P.

---

Chapitre VIII
RECHERCHE D'UN APPORT DES
MONOCYfES-MACROPHAGES A L'ACTIVITE
HEXOSAMINIDASE DU SERUM
Nous avons été amenés à constater que des échantillons de sérum de su-
jets ayant subi une transplantation rénale présentaient une forte activité
HEX sérique avec une forte représentativité de HEX-1. D'où le choix de ce
matériel biologique pour l'isolement et la purification de HEX-I sérique.
Dans la littérature, les fortes activités HEX sérique accompagnées d'une
augmentation de l'amplitude des formes intermédiaires (1 et P) sont princi-
palement rapportées aux atteintes hépatiques et à la grossesse. Hultberg
et Isaksson ont proposé en 1983 un processus commun pour expliquer
ces observations: l'augmentation de l'activité HEX sérique et la modifica-
tion du profil isoenzymatique pourraient être rapportées à une activation
antigénique des macrophages (23). Antérieurement ces auteurs avaient
envisagé une diminution de la clairance de HEX sérique par les cellules
non parenchymateuses du foie au cours de la grossesse et des atteintes
hépatiques. L'augmentation du taux de HEX sérique et de ses formes in-
termédiaires était ainsi rapportée à une diminution de la fonction du sys-
tème réticulo-endothélial (61).
Récemment,
les mêmes auteurs ont
confirmé à l'aide d'une expérimentation chez le rat cirrhotique, l'implication
de cellules d'origine hépatique dans l'augmentation de l'HEX sérique (62).
Ainsi une augmentation de l'HEX sérique pourrait provenir d'une diminu-
tion de la clairance hépatique de cette enzyme et/ou d'une sécrétion ac-
crue dans le secteur plasmatique d'enzymes Iysosomiales.

---

114
Les macrophages tissulaires ou résidents sont directement dérivés des
monocytes qui ont quitté le territoire vasculaire pour rejoindre certains tis-
sus et s'y différencier morphologiquement et fonctionnellement (63).
Le foie des mammifères comprend principalement des cellules parenchy-
mateuses (hépatocytes) et des cellules du système phagocytaire mononu-
cléé (cellules de Küpffer). Environ 35% des cellules hépatiques sont des
cellules non parenchymateuses représentant 5 à 10% de la masse tissu-
laire (64).
De nombreux composés tels que les Iipopolysaccharides bactériens, les
peptidoglycannes de parois cellulaires et, plus notablement un dérivé des
lymphocytes T qui a été identifié à l'interféron ,augmentent la capacité
des macrophages à produire des radicaux oxygénés en réponse à des
stimuli membranaires. Cette capacité est bien corrélée avec l'augmentation
de
l'action
microbicide
dirigée
contre
de
nombreuses
bactéries
pathogènes, des champignons et protozoaires, phénomène connu sous
l'appellation d'activation des macrophages (72, 77).
Les macrophages tissulaires interviennent au cours des réactions inflam-
matoires et immunologiques par la production et la sécrétion de nom-
breuses substances biologiquement actives ; parmi celles-ci, les enzymes
hydrolytiques stockées dans les lysosomes comme l'hexosaminidase (65,
68).
Afin de confirmer ou d'infirmer l'hypothèse d'une contribution possible des
macrophages tissulaires à l'activité HEX du sérum au cours des réactions
inflammatoires et immunologiques, un modèle cellulaire a été utilisé. Les
macrophages humains dérivés des monocytes ont été cultivés en pré-
sence de zymosan et d'interféron (IFN--y) humain recombinant. L'activité
HEX et les profils isoenzymatiques ont été déterminés sur les lysats cellu-
laires et les milieux de culture.

---

115
1. CULTURE DES MACROPHAGES HUMAINS DERIVES DES
MONOCYTES
Les monocytes du sang humain périphérique ont été obtenus par ponction
veineuse chez des adultes sains. La fraction cellulaire mononucléée est
obtenue par centrifugation à 4000 tjmn pendant 30 mn à 20°C sur une
solution de Ficoll-diatrizoate de sodium (Ficoll-Paque, Pharmacia).
L'interface comprenant les cellules mononucléées (lymphocytes et mono-
cytes) et les plaquettes est prélevée et diluée (1 :1) dans du milieu 199 à
base Hank's (Diagnostics Pasteur). Les cellules mononucléées sont récu-
pérées dans le culot après centrifugation à 4000 t/mn pendant 10 mn à
4°C
et
les
plaquettes
résiduelles
éliminées
par
recentrifugations
successives dans les mêmes conditions.
Après remise en suspension des cellules dans du milieu 199, le comptage
des cellules est effectué au microscope sur un hématimètre de Malassez et
la numération différentielle des monocytes est effectuée par la coloration
des estérases.
La suspension cellulaire est alors réajustée avec du milieu 199 pour obtenir
une concentration finale de 1 x 106 monocytes par ml de milieu.
La culture des monocytes est réalisée dans des chambres de culture en
plastique stériles à deux compartiments (Lab-Tek, Miles). 1 ml de la sus-
pension cellulaire homogénéisée (1 x 106 monocytes) est déposée dans
chaque puits; après 3 h d'incubation à 37°C sous 5% de CO2, les milieux
et les cellules non adhérentes de chaque puits sont retirés par aspiration
du surnageant et rinçage avec du milieu 199.
Les cultures adhérentes, correspondant aux monocytes, sont incubées à
37°C sous 5% de CO2 dans du milieu nutritif composé de milieu 199 addi-
tionné de 10% de sérum humain normal (1 ml/puits). Ce milieu est changé
à nouveau à J1, J2 et J4 de la culture.

---

116
Dès J5 on obtient une couche homogène monocellulaire de macrophages
bien développés. Les macrophages dérivés des monocytes sanguins ainsi
obtenus sont considérés comme largement représentatifs des macro-
phages tissulaires ou résidents et peuvent être utilisés comme modèle
cellulaire in vitro (7B).
2. TRAITEMENT DES ECHANTILLONS
Après prélèvement des surnageants, la couche cellulaire est lysée par
contact pendant 1 h avec 1 ml de tampon phosphate 0,01 M pH 7,0, O,15M
NaCl, 0,5% Triton X 100, 0,005 M EDTA puis rinçage avec 1 ml de la même
solution.
Les surnageants de 24 h ou 72 h (1 ml) et les lysats cellulaires (2 ml) sont
conservés à - BO°C.
L'activité HEX est mesurée sur 0,05 ml des surnageants et lysats cellulaires
par incubation avec du méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-glucosaminide
2 mM (Sigma) en tampon citrate 0,1 M pH 4,6 additionné de 1 mg/ml de
sérum albumine bovine (0,2 ml), pour un temps d'incubation de 15 mn à
37°C. Le dosage de l'activité HEX a été pratiqué en triple exemplaire pour
chaque échantillon.
Le dosage des protéines par la méthode à la fluorescamine a été utilisé
comme reflet de la masse cellulaire.
L'activité HEX des surnageants et lysats cellulaires exprimée en nM/h a été
rapportée
au
taux
de
protéines
en
mg
de
la
couche
cellulaire
correspondante.
Les profils isoenzymatiques de l'activité H~X ont été déterminés par élec-
trofocalisation, suivant le protocole habituel après passage préalable des

---

117
échantillons sur colonne PD 10 (Pharmacia) et concentration dans des
cellules Amicon B15.
3. ACTIVITE HEX SECRETEE ET INTRACELLULAIRE DES
MACROPHAGES
Les puits ont révélé une activité HEX sécrétée variable suivant les don-
neurs et pour un même donneur d'une expérimentation à une autre (Figure
42).
Activités HEX
(nM/h)
300
n=5
n=7
n=4
200
T
i
1
n=5
l
n=3
T
I
J.
~
100
JLV22/5
CP17/04 JLV10/04
CP3/04
JLV27/03
Figure 42 : Activités HEX des milieux de culture J5-J7 de monocytes-ma-
crophages issus de prélèvements et donneurs différents.

---

118
Cette variabilité des cultures de macrophages issus des monocytes hu-
mains a été antérieurement signalée dans la littérature (66).
D'autre part, l'apport initial en activité HEX du sérum humain dans les mi-
lieux de culture n'est ni constant, ni négligeable. Cet apport a été estimé à
29% de l'activité HEX des surnageants 24 h de J4 à J5 (Figure 43), ce qui
correspond à l'activité résiduelle constatée d'un échantillon de milieu té·
moin maintenu pendant24 h à 37°C.
Activités HEX
500
(nM/h)
n=7
.
300
n=6
T
100
1
milipux
surnageants
témoins
J -J
4
S
Figure 43: Activités HEX des surnageants de culture J4-J5 de monocytes-
macrophages et activités HEX de milieux de culture témoins.

---

119
Le profil isoenzymatique par chromatographie d'échange d'ions sur DEAE
Trisacryl en tampon pt'lOsphate 0,01 M pH 7,0 de l'activité HEX montre une
importante fraction HEX ne présentant pas d'interaction avec l'échangeur
et dont le profil d'élution dans les conditions expérimentales utilisées per-
met de l'assimiler à la forme HEX-B tissulaire. Un second pic d'activité as-
similable à HEX-A est élué par le gradient de NaC!.
Les données des figures 43, 44 rendent compte d'une sécrétion d'activité
HEX dans les milieux de culture par les macrophages, activité de sécrétion
remarquable par l'amplitude de la forme HEX-B puisque celle-ci ne peut
être apportée par le sérum des milieux. Il nous est apparu cependant sou-
haitable d'éliminer l'interférence de l'activité enzymatique apportée par le.
sérum des milieux de culture.
IF
200
HEXA
HEXB
100
Na C11 M
•
\\
0.3
0.2
O. 1
a
20
30
40
N° des fractions
Figure 44 : Profil isoenzymatique de l'activité HEX des milieux de culture
J4-J5 de monocytes-macrophages par chromatographie sur DEAE Trisa-
cry!.

---

120
Des cultures ont été pratiquées après dénaturation de l'activité HEX sé-
rique par traitement à 56° C pendant 30 mn (sérum décomplémenté).
L'emploi de sérum décomplémenté a été testé à divers stades de
l'évolution de la culture des monocytes macrophages. Les cultures obte-
nues présentent une moins grande densité de cellules qui sont "tourmen-
tées", moins étalées et adhérentes, et de ce fait tendent à se détacher lors
des changements successifs de milieu.
Le tableau 14 rassemble les activités HEX sécrétées et cellulaires à J7
dans différentes conditions de culture.
Tableau 14
Activités HEX sécrétées et intracellulaires
des macrophages dans différentes conditions de culture.
Activité HEX (nM/h par puits)
selon les conditions de culture
Echantillons
Sérum non
Sérum
Sérum non
décomplémenté
décomplémenté
décomplémenté
JO -> J7
Jo -> J7
JO -> J6 puis
décomplémenté
J6 -> J7
SUrnageants
142
50 ± 13
74 ± 1
24 h J6 -> J7
n = 1
n=6
n = 2
Lysats
577
144 ± 73
485 ± 75
cellulaires J7
n = 1
n=6
n = 3
Activités spécifiques
(nM/h par mg de protéines)
Lysats
cellulaires J7
5948
5864 ± 1569
10365 ± 1 296
L'utilisation de sérum décomplémenté de JO à J7 affecte parallèlement
l'activité HEX intracellulaire et sécrétée. En revanche, l'activité spécifique
HEX intracellulaire n'est pas modifiée en fonction des différentes modalités
de culture. La baisse d'activité intracellulaire et sécrétée en présence de
sérum décomplémenté semble attribuable à la diminution du nombre de
cellules, ce qui corrobore l'observation de la morphologie des cultures.

---

121
Les données du tableau 14 suggèrent l'utilisation du sérum natif jusqu'au
stade le plus tardif de la culture. Ultérieurement, la décomplémentation du
sérum ne sera utilisée que pour les changements de milieux à J4 ou J6
pour l'étude de l'activité HEX sécrétée de J4 à J5 ou de J6 à J7.
Le taux des activités HEX intracellulaires et sécrétées des macrophages
.issus des monocytes humains (tableau 14) est comparable à celui signalé
pour les macrophages péritonéaux de souris (69). Ainsi la proportion
d'activité sécrétée en 24 h, correspondant à 5-15% de l'activité HEX totale
de la culture contraste avec la faible activité sécrétée signalée pour les
monocytes (70, 78).
La
maturation
des
monocytes
en
macrophages
est
rapide
et
s'accompagne d'une augmentation de l'activité spécifique des enzymes
Iysosomiales, dont l'HEX, pour atteindre un maximum au septième jour.
Puisque les monocytes ne prolifèrent pas in vitro, cette augmentation de
l'activité spécifique observée correspond à une augmentation cellulaire des
enzymes Iysosomiales (78).
Le
profil
isoenzymatique
par
électrofocalisation
de
l'activité
HEX
intracellulaire à J5 (Figure 45) montre la présence des formes A, 1et B qui
focalisent respectivement pour des pH de 5,1, 6,0 et 7,2 (n = 5). Ce profil
est représentatif des formes matures Iysosomiales d'HEX et se signale par
une forte représentativité de HEX-B. Une forte représentativité de HEX-B a
également été mise en évidence chez les monocytes par contraste avec
les autres cellules circulantes : granulocytes, lymphocytes et plaquettes
(71).

---

122
HEXB (7.2)
IF
3D
HEXA
(5.1)
Figure 45 : Profils isoenzymatiques de "activité HEX intracellulair~ (A) et
sécrétée (B) obtenus par électrofocalisation.

---

123
Le profil isoenzymatique par électrofocalisation de l'activité HEX sécrétée
pendant 24 h de J4 à J5 (milieu sérum décomplémenté). (Figure 45B) est
cohérent avec le profil obtenu par chromatographie sur DEAE Trisacryl
(Figure 44). L'électrofocalisation montre une plus grande amplitude de la
forme HEX-B comparativement à HEX-A. Le profil de la figure 44 intégrait
l'activité HEX-A sérique d'où un rapport des pics correspondant à HEX-A
et B légèrement différent.
Les deux approches méthodologiques confirment l'importance de la
sécrétion de la forme HEX-B par le macrophage.
Cette cohérence constatée entre les deux approches méthodologiques
justifie l'utilisation ultérieure de l'électrofocalisation comme méthode plus
appropriée au traitement de nombreux échantillons, et ceci malgré la
complexité des échantillons à analyser. En effet, les surnageants des
milieux de culture présentent une forte teneur en protéines (10% de sérum)
et nécessitent une concentration préalable en raison des faibles activités
sécrétées. Par ailleurs les lysats cellulaires sont obtenus en milieu Triton
X100 0,5%. Ces facteurs non propices à une bonne électrofocalisation ont
néanmoins permis d'obtenir d'une manière reproductible des profils
isoenzymatiques représentatifs.
Lesfo~mes HEX-A et B sécrétées focalisent au sein du gradient pour des
pH identiques à ceux des formes cellulaires correspondantes.
4. MACROPHAGES CULTIVES EN PRESENCE DE ZVMOSAN
Les macrophages ont été cultivés en présence de zymosan (0,05 à 0,2
mg/ml) de J6 à J7 de la culture. L'activité HEX des surnageants de 24 h
(J6-J7) et des lysats cellulaires (J7) a été déterminée parallèlement à des
cultures témoins issues du même donneur n'ayant pas subi une
stimulation par le zymosan. En raison de la variabilité des cultures de
macrophages antérieurement signalée, les résultats ont été exprimés en
pourcentage par rapport à la culture témoin de chaque expérimentation.

---

124
La tableau 15 reproduit l'incidence de la concentration en zymosan sur
l'activité HEX intracellulaire (I.C.) et sécrétée dans le milieu extracellulaire
(E.C.). La stimulation par le zymosan est dose dépendante, et se traduit
par une augmentation. de l'activité HEX sécrétée de 134 à 325%
comparativement au témoin n'ayant pas subi l'action duzymosan.
Corrélativement, on constate une diminution de l'activité intracellulaire. La
figure 46 illustre l'augmentation de la proportion d'HEX sécrétée au sein
des cultures de macrophages en présence de concentrations croissantes
de zymosan pendant 24 h.
Tableau 15
Activité
HEX
intracellulaire
(IC)
et
sécrétée
dans
le
milieu
extra cellulaire (Ee) des macrophages cultivés en présence de
zymosan de J6 à J7 de la culture.
Zymosan
(activité HEX avec zymosan
/activité HEX sans zymosan). 100
mg/ml
EC (J6 - J7)
IC (J7)
0.05
134 ± 6
71 ± 7
0.1
166 ± 38
40 ± 3
0.2
325 ± 36
47 ± 27
n=g
n=g
Une stimulation de 2 à 5 fois de la sécrétion des enzymes Iysosomiales sur
une période de 24 h par contact avec divers agents inflammatoires dont le
zymosan a été constatée avec les macrophages péritonéaux (65) et les
macrophages issus de monocytes humains (66).

---

125
35
Cl)
'<lJ
+.J
'<lJ
25
~
U
'<lJ
If)
X
w
::c
15
'<lJ
+.J
'r-
>
+.J
u
l1:l
~
5
\\!
0
50
100
200
~g/ml
Figure 46 : Influence de la concentration en zymosan sur le pourcentage
sécrété de l'activité HEX des cultures de monocytes-macrophages.
Les profils isoenzymatiques par électrofocalisation des activités HEX
sécrétées (E.C.) et intracellulaires (I.C.) ne sont pas modifiés. HEX-A et
HEX-B sécrétées et cellulaires focalisent respectivement pour des pH de
5,38 ± 0,1 et 7,5 ± 0,2 (n = 6). Les données du tableau 15 et les profils
isoenzymatiques semblent refléter une décharge Iysosomiale dans le milieu
de culture, induite par le zymosan. Cette décharge lysosomiale est mise en
évidence lors d'une autre série d'expérimentations oliles macrophages ne
sont stimulés que pendant 1 h à J6 à des concentrations deO,05 et 0,2
mg/ml en zymosan. L'activité HEX est déterminée sur les surnageants 1 h
à J6 puis sur les surnageants J6-J7 après stimulation par le zymosan
(E.C.), et les lysats cellulaires à J7 (I.C.).
Le tableau 17 montre une stimulation importante de la sécrétion d'HEX
uniquement pendant la période de contact avec le zymosan (1 h à J6). Au
contact du zymosan, les cellules sécrètent 85% de l'activité sécrétée en
24 h par les cellules témoins. Les cellules ayant eu un contact avec le

---

126
zymosan présentent ultérieurement des activités intracellulaires (J7) et
sécrétées (J6-J7) diminuées. Le dosage des protéines reflète néanmoins
une masse cellulaire voisine des puits traités ou non, d'où une diminution
de l'activité spécifique de l'HEX intracellulaire des cellules ayant subi
l'action du zymosan. Tout se passe comme si après 24 h, les cellules
n'avaient pas encore reconstitué leur stock Iysosomial d'activité HEX.
Tableau 17
Activité HEX intracellulaire (C) et sécrétée dans le milieu
extracellulaire (EC) des macrophages cultivés en présence
de zymosan 1 h à J6 de la culture
Zymosan
Activité HEX nM/h par mg
Protéines
n
1 h à J6
de protéines
mg
mg/ml
I.C.
E.C.
E.C.
I.C.
1 h J6
J6 -> J7
J7
0
0
978 ± 44
6860 ± 262
0,145 ± 0,01
6
0,050
570 ± 80
512 ± 68
5649 ± 236
0,160 ± 0,01
12
0,200
648 ± 43
534 ± 100
5184 ± 149
0,168 ± 0,07
12
Le profil des activités HEX sécrétées pendant le temps de contact avec le
zymosan et pendant les 24 h suivant la période de stimulation est identique
à celui constaté avec les cellules témoins (Figures 47A, B, C).
Par une autre approche (électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et
révélation par immunoprécipitation), Imort et coll., après action du
zymosan ne signalent la présence que de chaînes matures
et B dans les
lTIilieux de culture de macrophages issus de monocytes. Les auteurs en
concluent que l'importante quantité d'HEX sécrétée en présence de
zymosan provient du stock intracellulaire des enzymes Iysosomiales. Le
zymosan semble induire la fusion avec la membrane plasmique d'une
classe de lysosomes riches en formes enzymatiques matures (70).

---

127
IF
j
t-IEXA (5. 3)
A
HEXB (7.4)
t-IEXA /5.3)
B
~ pH
B I1/ t
HEX
7
C
5
1ù
Figure 47 : Profil isoenzymatique par électrofocalisation des activités HEX
sécrétées par les macrophages pendant et après contact avec le
zymosan:
A- J6 (1 h) 0,050 mg/ml de zymosan
B- J6 (1 h) 0,200 mg/ml de zymosan
C- J6-J7 après 1 h avec 0,050 mg de zymosan à J6

---

128
Nos résultats obtenus à partir de formes d'HEX sécrétées et intracellulaires
matures sont cohérents avec les données de Imort et coll. et nous
permettent de conclure à la sécrétion par les macrophages stimulés ou
non par le zymosan, uniquement des formes d'HEX Iysosomiales matures.
En ce qui concerne notre objectif, nous soulignons l'absence de sécrétion
de HEX-I bi~n que cette forme soit présente au niveau intracellulaire.
5. MACROPHAGES CULTIVES EN PRESENCE D'IFN-'Y
L'interféron (IFN-'Y) est un immunostimulant capable d'augmenter le
métabolisme et l'activité antimicrobienne des macrophages (77). Le
mécanisme précis de l'activation des cellules phagocytaires par "IFN-'Y
n'est pas connu. De même, les conséquences de l'activation par l'IFN-'Y
sur les produits de sécrétion des monocytes et des macrophages restent
pour une large part méconnues.
Au cours de la culture in vitro des macrophages humains dérivés des mo-
nocytes, il existe une diminution spontanée et progressive de la capacité
oxydative et de "activité antimicrobienne qui peut être prévenue ou restau-
rée par le traitement in vitro des cellules avec l'IFN-'Y (73, 74). Les modifica-
tions morphologiques (augmentation de taille) et fonctionnelles (augmen-
tation de l'activité microbicide et tumoricide) des cellules du système mo-
nocyte-macrophage sous l'action de l'IFN-'Y sont accompagnées de modi-
fications biochimiques (augmentation du métabolisme oxydatif, du contenu
en enzymes Iysosomiales, de la production de monokines, etc.) qui ont été
étudiées essentiellement sur des cellules d'origine animale.
L'IFN-'Y humain recombinant (RU 42 369 - Roussel Uclaf) a été testé sur
des macrophages humains infectés par L. pneumophila par l'équipe du Pr
J.C. Wilde (INSERM U13, Hôpital Claude Bernard Paris). L'IFN-'Y humain
recombinant est capable de réduire la multiplication intracellulaire de L.
pneumophila dans les macrophages humains. Cet effet est observé avec
des concentrations supérieures à 125 UIml et nécessite un temps
d'incubation prolongé (75).

---

129
Un même protocole expérimental a été utilisé afin de tester l'action de
\\'IFN--y sur la production et la sécrétion de l'activité HEX par le monocyte-
macrophage.
Des macrophages ont été cultivés pendant 72 h en présence de
concentrations croissantes en IFN--y (31 à 1000 U/ml) de J4 à J7 de la
culture. L'activité HEX a été déterminée sur les milieux de culture
correspondant
au
temps
de
contact
avec
l'IFN--yaux
diverses
concentrations (activité HEX E.C. J4-J7). Le temps de contact prolongé
nécessaire avec l'IFN--y (72 h) a imposé l'utilisation de sérum non
décomplémenté dans les milieux de culture. Dans ces conditions, les
activités HEX E'.C. correspondent aux activités des surnageants, déduites
des activités propres de milieux témoins maintenus dans les mêmes
conditions que les cultures. L'activité cellulaire (I.C.) a été déterminée à J7.
Le tableau 16 montre que les macrophages cultivés en présence
d'IFN--y de J4 à J7 de la culture présentent une activité HEX sécrétée
légèrement plus faible que celle de cultures témoins non stimulées par
l'IFN--y. Cette absence de stimulation de la sécrétion d'HEX par l'IFN--y
s'accompagne d'une activité HEX intracellulaire accrue (180 à 185%). Les
activités HEX intracellulaires et sécrétées sont indépendantes de la dose
d'IFN--y utilisée.

---

130
Tableau 16
Activité
HEX
intracellulaire
(IC)
et
sécrétée' dans
le
milieu
extracellulaire (EC) des macrophages cultivés en présence d'IFN--y de
J4 à J7 de la culture.
IFN--y
(activité HEX avec IFN--y
lactivité HEX sans IFN--y). 100
Ulml
EC (J4 - J7)
IC (J7)
31
91 ± 9
180 ± 34
250
85 ± 17
185 ± 90
1000
84 ± 1
182 ± 25
n=9
n=9
L'analyse par électrofocalisation des activités HEX intracellulaires et sé-
crétées indique que la stimulation par l'IFN--y induit chez les macrophages
la production et sécrétion de formes isoenzymatiques A et B de l'HEX plus
acides que les formes Iysosomiales (pl respectivement de 4,6 ± 0,2 et 7,1
± 0,2 n = 5). La figure 48A reproduit le profil isoenzymatique de l'activité
HEX intracellulaire avec ce déplacement des formes A et B vers les zones
plus acides du gradient de pH, comparativement aux profils antérieurs. Il
est à remarquer que la forme HEX-I ne subit pas ce déplacement et foca-
lise au pH de 6,0-6,2, constamment observé lors des profils antérieurs.
Dans les conditions imposées pour la stimulation par l'IFN--y, le profil
isoenzymatique de l'activité HEX sécrétée se révèle d'interprétation plus
complexe. La figure 48B est à analyser comme la résulta~te de la juxtapo-
sition de l'activité HEX sécrétée par les macrophages au contact de l'IFN--y
et de l'activité HEX sérique apportée par les milieux de culture, et ceci en
proportions sensiblement équivalentes. Le profil symétrique du pic HEX-A
révèle la sécrétion en présence d'IFN--y d'HEX-A plus acide que la forme
Iysosomiale et "mature" par le macrophage. La forme HEX-A du milieu de
culture issu du macrophage s'assimile ainsi à la forme HEX-A sérique, de
type "sécrété". La forme HEX-I semble devoir être imputable à l'apport sé-
rique des milieux de culture, tandis que la forme HEX-B sécrétée focalise
pour un pH plus acide que les formes HEX-B intracellulaires matures.

---

131
IF
HEXA (4.6)
30
HEXB (6.8)
A
HEXI (6.2)
10
\\
HEXB (6.8)
30
pH
HEXA (4.4)
B
15
5
10
15
N° des fractions
Figure 48 : Profil par électrofocalisation de "activité HEX intracellulaire J7
(A), et des milieux de culture J4 - J7 des monocytes-macrophages cultivés
de J4-J7 en présence de 250 Ulml d'IFN-l.

---

132
La stimulation
par l'IFN--y de la biosynthèse de l'HEX au
niveau
intràcellulaire
s'accompagne
d'une
modification
de
son
profil
isoenzymatique par électrofocalisation. Les formes isoenzymatiques A et B
plus acides que les formes Iysosomiales cellulaires pourraient refléter une
accumulation de formes néosynthétisées précurseurs phosphorylés et/ou
polysialylés de A et B. En effet, le schéma aujourd'hui classique des
modifications post transcriptionnelles des enzymes Iysosomiales et
notamment de l'HEX élucidées à partir des cultures de fibroblastes, a été
également décrit pour des cathepsines ~hez les macrophages péritonéaux
de rat (76).
Par ailleurs, des modifications dans la glycosylation des protéines
intracellulaires et membranaires ont été récemment démontrées après
activation des macrophages par le thioglycolate. Ainsi, une élévation de la
teneur en acide sialique de deux ou trois fois a-t-elle été constatée chez les
macrophages activés comparativement aux macrophages résidents (79).
6. DISCUSSION
Une contribution à l'élévation de l'activité HEX sérique et l'origine des
formes 1 et P ont été suggérées par activation des macrophages
hépatiques (ou cellules de Kûpffer) lors des atteintes hépatiques et de la
grossesse (23, 61).
Les résultats obtenus par stimulation in vitro de macrophages issus de
monocytes humains par le zymosan et l'IFN--y ne tendent pas à conforter
l'hypothèse d'une contribution notable de la part des macrophages au
cours des réactions inflammatoires et immunologiques à l'activité HEX
sérique.
Une importante augmentation de la sécrétion d'HEX est constatée par
contact avec le zymosan. Cependant, les monocytes macrophages en
culture n'élaborent apparemment aucune des formes enzymatiques
HEXAS et IjP sériques. Les formes HEX-A et B sécrétées, d'origine

---

133
Iysosomiale, sont des formes matures oligomannosidiques et vouées à
une clairance hépatique rapide.
La stimulation par J'IFN--y induit une accumulation intracellulaire d'HEX. Les
formes d'HEX néosynthétisées se retrouvent dans les milieux de culture, et
la forme HEX-A sécrétée par stimulation par l'IFN--y semble pouvoir être
assimilée à la forme HEXAS selon les données de l'électrofocalisation.
Quelle que soit la concentration d'IFN--y utilisée, le taux de sécrétion d'HEX
des monocytes macrophages traités par l'IFN-r reste légèrement inférieur
à celui des cellules témoins. Là encore il paraît peu probable que les
macrophages stimulés par l'IFN-r puissent contribuer d'une manière
notable à l'augmentation de l'activité HEX sérique.
Au cours de toutes les expérimentations pratiquées avec les monocytes
macrophages, HEX-I, bien que présente au niveau intracellulaire, n'est
jamais représentée dans les milieux de culture.

---

DISCUSSION GENERALE
ET CONCLUSION
Une forme moléculaire d'hexosaminidase dite intermédiaire, HEX-I, a été
isolée du sérum et notamment séparée de la forme majeure HEXAS après
deux chromatographies consécutives sur DEAE Sephacel. Des contami-
nants de nature non glycoprotéique, albumine principalement, sont ensuite
séparés de la fraction HEX-I par chromatographie sur Con A Sépharose, et
une ultime étape de filtration moléculaire sur colonne de Superose™ 12
(FPLC) conduit à la fra~tion HEX-I obtenue la plus purifiée.
HEX-I présente une activité spécifique de 2095 nM/h par mg de protéines
et est purifiée 209 fois avec un rendement final de 9%. L'électrophorèse sur
gel de polyacrylamide montre la persistance de contaminants protéiques
au niveau de la fraction HEX-/ obtenue la plus puri'fiée ; celle-ci révèle une
seule bande d'activité sur le Naphtol ASBI GlcNAc en correspondance
avec une des bandes protéiques.
Par contraste avec les formes tissulaires, HEX-I comme les autres formes
d'HEX circulantes (AS et P) se caractérise par une faible activité catalytique
et une absence d'interaction spécifique avec les supports d'affinité testés
(3,3'-diaminodipropylamine-thio-N-acétyl-D-glucosamine
Gel
et
para-
aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose CH 4B).
L'électrofocalisation sur plaques de gel de polyacrylamide des échantillons
de sérum et des différentes étapes de la purification n'ont toujours montré
qu'une seule forme intermédiaire d'HEX, bien que deux formes 11 et 12
soient généralement relevées dans la littérature. La chromatofocalisation

---

135
sur colonne MonoP (FPLC) confirme la présence d'une seule espèce mo-
léculaire
qui
présente
une
position
d'élution
en
chromatographie
d'échange d'ions et un pl (5,7 ou 6,3 selon la méthodologie) très proche
des formes 12 sérique et tissulaire décrites dans la littérature.
Outre la différence de charge, HEX-I se différencie de HEXAS par sa ther-
mostabilité à 50°C et une structure moléculaire ne comprenant apparem-
ment que des chaînes de type B, déduite d'une absence d'activité signifi-
cative envers un substrat sulfaté (MUGlcNAc-6-S) qui présente une spécifi-
cité de chaînes Ct (56). Ces résultats sont à confronter à ceux obtenus pour
la forme 12 hépatique récemment purifiée et qui se révèle très proche de la
forme A de ce tissu (21).
HEX-I sérique est donc bien individualisée de la forme HEXAS et ne semble
pas devoir être assimilée à une forme intermédiaire tissulaire.
Ces caractéristiques ont été retrouvées avec une autre forme intermédiaire
sérique HEX-P qui devient majoritaire au cours de la grossesse.
HEX-P a été antérieurement purifiée (19) et effectivement considérée sur la
base de critères immunologiques comme un homopolymère de chaînes B,
ce qui là encore différencie cette forme circulante de la forme 12 placentaire
constituée de chaînes Ct, Ba et Bb (20).
La détermination de la masse moléculaire relative (Mr) par filtration sur co-
lonne de SuperoseTM 12 des différentes formes d'HEX circulantes, paral-
lèlement à une forme tissulaire de référence (HEX-A urinaire), surprend par
l'hétérogénéité des données obtenues. Des Mr de 145.000, 160.000 et
210.000 ont été respectivement attribuées à HEXAS' P et l, comparative- '
ment à 95.000 pour HEXA urinaire.
La taille moléculaire apparente élevée de HEX-l est néanmoins validée par
la cohérence des autres résultats avec les données de la littérature.

---

136
Le5.' Mr des formes matures d'HEX tissulaires habituellement retrouvées
par chromatographie de filtration sur gel varient de 100.000 à 140.000 (5),
et HEXAS est éluée plus précocement d'une colonne de Sephadex G750
que la forme A hépatique (34). Par filtration sur colonne de Sephadex G200
HEX-P présente une Mr de 155.000-160.000, notablement plus élevée que
les formes A et B placentaires (100.000-103.000) dans les mêmes condi-
tions expérimentales (19).
En outre, les Mr des chaînes polypeptidiques a et B matures et précur-
seurs par électrophorèse sur gel·de polyacrylamide SDS conduisent à une
extrapolation de 112.000 et 130.000 respectivement pour les formes d'HEX
Iysosomiales et sécrétées (26, 80). Les ~r des formes matures et précur-
seurs de HEX-A déduites des cDNA des chaînes polypeptidiques corres-
pondantes seraient de 100.000 et 120.000 respectivement (6).
/1 n'en demeure pas moins que la chromatographie de filtration moléculaire
ne permet qu'une approche de la masse moléculaire, dépendante d'une
conformation globulaire voisine de celle des protéines utilisées pour la
droite d'étalonnage. La possibilité d'une conformation non strictement glo-
bulaire n'est pas à exclure pour des glycoprotéines, et nos données ne
nous permettent de conclure qu'à un encombrement stérique important
qui confère à HEX-I une Mr apparente élevée de 210.000.
Outre cette taille moléculaire apparente élevée, HEX-I se caractérise éga-
Iement par sa glycosylation. L'étude de l'interaction de HEX-I avec la
Con A et la lectine de Ricin révèle des chaînes glycanniques de type
complexe biantennées affines de la lectine de Ricin, et qui interagissent
faiblement avec la Con A. Un taux élevé de récupération de la Con A tend à
indiquer
une
prééminence
de
chaînes
hybrides
plutôt
que
oligomannosidiques en raison de la très forte interaction connue de ces
dernières avec la lectine.
Les études d'interaction avec la Con A ont été pratiquées en tube et à la
température du laboratoire, plus propice à une interaction avec la lectine

---

137
que la température de + 4°C imposée p·ar l'étape chromatographique de
purification sur Con A Sépharose.
Cette étape a montré une fraction non négligeable de HEX-I déposée non
fixée par le support d'affinité. Cette étape qui se traduit par un faible ren-
dement de 35% reflète l'absence ou la réversibilité de l'interaction d'une
partie notable de l'activité HEX-I avec la Con A dans des conditions expé-
rimentales.
Le même schéma d'interaction avec la Con A est retrouvé avec HEX-P.
L'absence d'interaction de HEX·P en revanche avec la lectine de Ricin
pourrait être rapportée à une microhétérogénéité dans le. type de liaison
des résidus sialyles des chaînes complexes biantennées.
HEX-I et P apparaissent plus riches en chaînes complexes que HEXAS' et
ces formes circulantes se différencient de la forme tissulaire de référence
HEX-A urinaire qui montre une forte affinité pour la Con A et une absence
d'interaction avec la lectine de Ricin.
Si l'on se réfère là encore au modèle cellulaire, il a été démontré que les
formes d'HEX sécrétées comprennent préférentiellement des glycannes de
type complexe et/ou hybride phosphorylés et sialylés, associés aux pré-
curseurs polypeptidiques, et les formes d'HEX intracellulaires une préémi-
nence de chaînes oligomannosidiques associées aux chaînes matures (5,
25).
L'hétérogénéité des chaînes glycanniques au niveau moléculaire des
formes d'HEX circulantes que traduisent nos résultats avec les lectines, a
été mise en évidence également récemment au niveau des chaînes ma-
tures d'HEX placentaire. Deux glycopeptides majeurs affines de la Con A
ont été localisés sur la chaîne Bb et un glycopeptide non affine de la Con A
sur la ~haÎne Ba, associés dans la sous-unité B à la fois de HEX-A et B pla-
centaires. Un seul glycopeptide majeur affine de la Con A a été trouvé as-
socié avec la sous-unité Q de HEX-A placentaire (8).

---

138
Ces quelques propriétés physicochimiques incitent à envisager HEX-I
comme un homopolymère de chaînes B dont la taille moléculaire apparente
élevée et la teneur en glycannes de type complexe tend à l'assimiler à une
forme sécrétée.
HEX-I sérique ne présente pas d'analogie avec les formes intermédiaires
tissulaires qui ont été caractérisées, et pourrait ainsi représenter la forme
circulante de HEX-B, au même titre que HEXAS est envisagée comme la
forme circulante, sécrétée, de HEX-A tissulaire (5).' Rappelons que par
électrofocalisation, méthode analytique de référence, il n'a pu être décelé
de forme B sérique dans tous les échantillons étudiés.
En se fondant sur le déplacement de leur pic d'élution chromatographique
après traitement par la neuraminidase, Mahuran a également proposé
d'envisager les formes HEX-12 et HEX-P comme des pré-isoenzymes
HEX-B hautement sialylés (5).
Aucun critère significatif ne nous permet d'envisager HEX-P comme une
espèce moléculaire différente de HEX-1. Ces deux formes sont thermo-
stables à 50°C, ne comprennent apparemment que des chaînes B et se
différencient par leur taille moléculaire apparente et glycosylation de la
forme HEXAS et des HEX tiss~laires.
Le comportement différentiel de HEX-I et P vis-à-vis de la lectine de Ricin,
explicité par une liaison différente des résidus sialyles, peut rendre compte
de quelques particularités' physico-chimiques et cinétiques constatées
entre les deux formes. Une structure tridimensionnelle non identique des
chaînes glycanniques de par un positionnement différent des acides sia-
liques peut être responsable d'une différence d'encombrement stérique et
de répartition spatiale des charges apportées par les acides sialiques. D'où
des masses moléculaires relatives (Mr) distinctes et le léger décalage
constaté dans les pl de HEX-I et HEX-P par électrofocalisation sur plaques
de polyacrylamide ou colonne MonoP.

---

139
Une légère différence de structure tridimensionnelle peut se répercuter au
niveau de la conformation des sites actifs et rendre compte des propriétés
cinétiques non rigoureusement identiques; léger décalage du pH optimum
et spécificité catalytique (Vm/Km) moins prononcée de HEX-P pour le
MUGaINAc.
Cette microhétérogénéité de glycosylation entre les deux formes intermé-
diaires peut être fondée sur leur origine, supposée pluricellulaire pour
HEX-I et foetale pour HEX-P, impliquant une différence de spécificité des
sialyltransférases cellulaires.
Il nous faut ainsi maintenant envisager l'origine de l'activité HEX sérique
afin de tenter de comprèndre la signification de l'augmentation des formes
intermédiaires HEX-I/P dans certaines situations physicochimiques. Les
HEX sériques apparaissent COlTlme le résultat de la concentration des
formes les plus sialylées sécrétées par différents types cellulaires (5).
Les formes d'HEX peu sialylées, ainsi des formes Iysosomiales matures
oligomannosidiques susceptibles d'être désialylées après lyse cellulaire ou
exocytose Iysosomiale, seront rapidement éliminées de la circulation san-
guine par clairance hépatique. Ainsi la demi-vie des glycoprotéines dans la
circulation du rat perfusé a-t-elle été mesurée et correspond à 100 mn pour
le type complexe, 15 mn pour le type hybride et moins de 1 mn pour le
type oligomannosidique (81).
Une augmentation de l'activité HEX sérique doit donc être recherchée vers
les processus qui tendent à stimuler l'expression et la sécrétion des glyco-
protéines de type complexe hautement sialylées.
L'activation antigénique des macrophages hépatiques (cellules de Küpffer)
a été envisagée pour rendre compte d'une augmentation de l'activité HEX
sérique, et notamment de la représentativité des formes 1 et P, lors
d'atteintes hépatiques et au cours de la grossesse (23, 61). Nos données

---

140
expérimentales obtenues à partir de macrophages issus de monocytes
cultivés en présence de zymosan et d'IFN-l humain recombinant ne véri-
fient pas cette hypothèse d'un apport à l'activité HtEX sérique des macro-
phages activés au cours des réactions inflammatoires et immunologiques.
La sécrétion d'activité HEX par les macrophages activés ou non par le zy-
mosan correspond par électrofocalisation à la sécrétion des formes A et B
Iysosomiales vouées à une clairance hépatique rapide. La stimulation par
l'IFN-l semble induire la néosynthèse de formes d'HEX plus acides; mais
HEX-I, bien que représentée au niveau intracellulaire, n'a jamais été retrou-
vée dans les milieux de culture au cours de toutes les expérimentations
pratiquées avec les monocytes-macrophages.
Des données récentes ont précisé les modifications de glycosylation de
nombreuses protéines, dans le sens d'une diminution des chaînes oligo-
mannosidiques et d'une augmentation des chaînes complexes, lors de
processus tumoraux et au cours de la croissance et de la régénération
cellulaire.
La modification de l'activité HEX lymphocytaire dans certains types de leu-
cémies s'accompagnant d'un pic d'HEX intermédiaire en électrofocalisa-
tion (82) ou par ctlromatographie sur DEAE Cellulose (83) a pu être expli-
citée. L'action des endoglycosidases et la chromatographie sur Con A Sé-
pharose révèlent une plus grande teneur en glycopeptides à chaînes oligo-
saccharidiques complexes hypersialylées des formes d'HEX lymphocy-
taires comparativement à celles des fibroblastes (84). Il est peu probable
que ces modifications de glycosylation des HEX, à l'inverse des glycopro-
téines de membranes de surface, aient une implication fonctionnelle. Les
enzymes Iysosomiales, comme toutes les glycoprotéines, transitent par
l'appareil de Golgi et sont des substrats potentiels des glycosyltransfé-
rases modifiées des cellules transformées.
Une plus haute proportion de glycopeptides de type complexe, spéciale-
ment biantennés, a été révélée à partir du foie de rat au cours de la crois-

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141
sance cellulaire liée au développement ou à la régénération du tissu hépa-
tique. L'étude comparée du foie de rat pendant la période foetale et post-
natale suggère que ces modifications de glycosylation pourraient être re-
présentatives de la croissance normale des cellules hépatiques (85).
C'est dans ce contexte qu'une augmentation de l'activité HEX sérique
pourrait être envisagée. Une proportion accrue d'HEX de structure com-
plexe biantennée échappant à la ségrégation Iysosomiale et soumise dans
la circulation sanguine à une moindre clairance hépatique, serait liée à la
croissance cellulaire due au développement du tissu embryonnaire
(HEX-P) ou à la régénération du tissu hépatique (HEX-I). Au cours de ce
processus, les deux formes sériques AS et I/P sont augmentées, même si
proportionnellement les formes intermédiaires sont plus amplifiées. Nous
avons constaté avec les monocytes-macrophages que les profils d'activité
HEX sécrétée etcellulaire pouvaient ne pas être superposables.
La sélection d'une population de sujets ayant subi une transplantation ré-
nale présentant une activité HEX sérique élevée à forte représentativité en
HEX-I peut aussi se justifier de par une hypertrophie compensatrice du
greffon. Ainsi, une enzymurie plus élevée a été constatée chez des sujets
donneurs ayant subi une néphrectomie unilatérale comparativement à des
sujets témoins. Le taux élevé des enzymes urinaires, dont l'HEX, a été relié
à une augmentation du métabolisme des cellules tubulaires après né-
phrectomie en réponse à une hyperfiltration compensatrice (86).
Une contribution non négligeable des tissus à l'activité HEX sérique en
complément des cellules circulantes et bordantes peut ainsi être suggérée,
de la part du rein en particulier, puisqu'inversement les sujets insuffisants
rénaux ont montré une activité HEX sérique diminuée.
En conclusion, les propriétés physicochimiques et cinétiques de la forme
intermédiaire sérique HEX-I obtenue partiellement purifiée nous incitent à
l'envisager comme la forme sécrétée de HEX-B tissulaire. HEX-I et HEX-P
(forme intermédiaire sérique majeure au cours de la grossesse), appa-

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142
raissent comme une même identité moléculaire ; les quelques différences
constatées dans les propriétés de HEX-P peuvent correspondre à une
spécificité tissulaire d'origine.
L'amplification dans le sérum des pics d'activité de ces deux formes inter-
médiaires semble devoir être rapportée à un processus de croissance cel-
lulaire lié à la transformation maligne, au développement et à la régénéra-
tion tissulaire.

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Postnatal changes in N-linked oligosaccharides of glycoproteins in rat liver.
Biochem. J., 1988, 253, 59-66.
86. TAPSON J.S., HODSON AW., MARSHALL S.M., WILKINSON R.
Urinary enzyme excretion after donor nephrectomy.
Nephron, 1988, 48,126-131.

---

TABLE DES MATIERES
PLAN
INTRODUCTION
CHAPITRE 1: MATERIEL ET METHODES
1. Prélèvement et traitement des échantillons biologiques
1.1. Recueil et conservation des échantillons de sérum
1.2. Traitement des échantillons tissulaires
1.2.1. Préparation d'un extrait de rein
1.2.2. Préparation d'un extrait hépatique
1.2.3. Traitement du placenta
2. Méthodes analytiques
2.1. Détermination de l'activité hexosaminidase (HEX)
2.2. Dosage des protéines
2.2.1. Méthode au réactif BCA
2.2.2. Méthode à la fluorescamine
3. Méthodes chromatographiques
3.1. Chromatographie d'échange d'ions
3.1.1. Chromatographie sur DEAE Séphacel
3.1 :2. Chromatographie sur DEAE Trisacryl
3.1.3. Chromatographie sur DEAE Cellulose

---

157
3.2. Chromatographie d'affinité
3.2.1. Chromatographie sur gels d'affinités spécifiques
3.2.1.1. Préparation du para-aminophényl-N-acétyl-B-
D-galactosaminide Sépharose CH 4B.
3.2.1.2. Interaction de l'HEX placentaire et du para-
aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide Sépharose
CH4B.
3.2.1.3. Essai d'un support commercial le "3,3'-
diaminodipropylamine-thio-N-acétyl-D-glucosamine
Gel"
3.2.2. Chromatographie d'affinité sur lectines immobilisées
3.2.2.1. Concanavaline A Sépharose (Con A
Sépharose)
3.2.2.2. Lectine de Ricin
3.3. Chromatographie d'adsorption sur hydroxy-apatite
3.4. Chromatographie de filtration moléculaire sur colonne de
Superose™ 12 (FPLC)
3.5. Chromatofocalisation
3.5.1. Chromatofocalisation sur gel PBETM94
3.5.2. Chromatofocalisation sur colonne MonoP (FPLC)
4. Méthodes électrophorétiques
4.1. Electrophorèse sur plaques de gel de polyacrylamide
4.2. Electrofocalisation
CHAPITRE Il : HEXOSAMINIDASES INTERMEDIAIRES DANS LES
TISSUS ET LlaUIDES BIOLOGlaUES
1. Hexosaminidases intermédiaires tissulaires
1.1. Le cerveau
1.2. Le foie
1.3. Le placenta
1.4. Le rein

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158
2. Hexosaminidases intermédiaires des liquides biologiques
2.1. Le sérum
2.2. L'urine
3. Séparation des formes d'hexosaminidases intermédiaires et
méthodologie
CHAPITRE III : CHOIX DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES POUR
L'ISOLEMENT ET LA PURIFICATION DE HEXI SERIQUE
CHAPITRE IV : CHOIX D'UN PROTOCOLE DE PURIFICATION DE HEXI
SERIQUE
1. Recherche d'un support d'affinité pour l'isolement de l'activité HEX
sérique
1.1. Le 3,3'-diaminodipropylamine-1 thio-N-acétyl-D-glucosamine
gel
1.2. Le gel de para-aminophényl-N-acétyl-B-D-galactosaminide
Sépharose CH 48
1.2.1. Interaction de l'HEX placentaire et du support d'affinité
1.2.2. Interaction de l'HEX sérique et du support d'affinité
1.3. Supports d'affinités non spécifiques
2. Séparation des isoenzymes de l'HEX sérique sur échangeur d'ions
type DEAE
2.1. Echangeur DEAE Trisacryl
2.1.1. DEAE Trisacryl, tampon phosphate 0,01 M pH 7,0
2.1.2. DEAE Trisacryl, tampon Tris, HCI 0,05 M pH 8,6
2.2. Ec;:hangeur DEAE Cellulose
2.3. Echangeur DEAE Séphacel
3. Influence de la matrice des échangeurs type DEAE sur la sépara-
tion des Isoenzymes de l'HEX sérique et urinaire

---

159
CHAPITRE V : ISOLEMENT ET PURIFICATION DE HEXI SERIQUE
1. Chromatographie sur DEAE Séphacel
2. Chromatographie d'affinité sur Con A Sépharose
3. Chromatographie de filtration moléculaire sur SuperoseTM 12
(FPLC)
4. Fraction HEXI sérique partiellement purifiée
5. Discussion
CHAPITRE VI : PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES ET CINETIQUES
DE HEXI SERIQUE
1. Propriétés physicochimiques de HEXI sérique
1.1. Thermostabilité
1.2. Détermination de la masse moléculaire relative (Mr)
1.3. Etude de la copule glycannique
1.3.1. Spécificité des lectines utilisées (2,3,4)
1.3.2. Protocole expérimental
1.3.3. Interaction de HEX-I avec la Con A et la lectine de Ricin
1.4. Approche de la structure sous-unitaire de HEX-I sérique
1.5. Détermination du point isoélectrique
2. Propriétés catalytiques de HEX-I sérique
2.1. pH optimum
2.2. Détermination des paramètres cinétiques pour quelques
substrats
3. Discussion

---

160
CHAPITRE VII : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES AUTRES
FORMES MOLECULAIRES D'HEXOSAMiNIDASES SERIQUES (HEXAS
ET HEX-P)
1. Isolement de HEX-P et HEXAS
1.1. HEX-P sérique
1.2. HEXAS
2. Propriétés physicochimiques et cinétiques de HEXAS et HEX-P
2.1. Propriétés physicochimiques
2.1.1. Thermostabilité
2.1.2. Détermination de la masse moléculaire relative (Mr)
2.1.3. Etude de la copule glycannique de HEX-P et HEXAS
2.1.4. Approche de la structure sous-unitaire de HEX-P et
HEXAS
2.1.5. Détermination du point isoélectrique
2.2. Propriétés catalytiques de HEX-P et HEXAS
2.2.1. pH optimum
2.2.2. Détermination des paramètres cinétiques pour
quelq~es substrats
3. Discussion
CHAPITRE VIII : RECHERCHE D'UN APPORT DES MONOCyrES-
MACROPHAGES A L'ACTIVITE HEXOSAMINIDASE DU SERUM
1. Culture des macrophages humains dérivés des monocytes
2. Traitement des échantillons
3. Activité HEX sécrétée et intracellulaire des macrophages
4. Macrophages cultivés en présence de zymosan

---

161
5. Macrophages cultivés en présence d'IFN--y
6. Discussion
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS

---

· 1
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
Figure 1 : Schéma du routage intracellulaire enzymes Iysosomiales
(d'après Kornfeld S.) : Les enzymes Iysosomiales et les glycoprotéines de
sécrétion sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique rugueux
(RER) et glycolysées par l'intermédiaire d'un Dolichol-P-P-oligosaccharide
(Dol). Dans le RER, les peptides "signal" ('////'I//////t.l sont éliminés. Les pro-
téines sont transloquées au Golgi où les oligosaccharides des glycopro-
téines de sécrétion subiront une maturation de type complexe, et les oligo-
saccharides des enzymes Iysosomiales seront phosphorylés. La plupart
des enzymes Iysosomiales se fixent sur les récepteurs à mannose 6 phos-
phate (MPRs)
7
7. et sont transloquées dans un compartiment prélyso-
somial acide, où le ligand se dissocie. Les récepteurs retournent au Golgi
ou à lasurface de la cellule. Les enzymes sont stockées dans les lyso-
somes où ellesm subissent un dernier clivage peptidique et une déphos-
phorylation. Une petite fraction des enzymes Iysosomiales ne se lie pas
aux récepteurs et ceux-ci sont sécrétés comme les glycoprotéines de sé-
crétion. (------ ». Ces enzymes peuvent se fixer sur les MPRs de surface et
être internalisées dans le compartiment prélysosomial.
CHAPITRE Il
Figure 2 : Profils isoenzymatiques de l'activité HEX obtenue par
électrofocalisation d'extraits placentaire (A), hépatique (8), rénal (C).

---

163
Figure 3 : Profil isoenzymatique de l'activité HEX sérique (A), et d'un
sérum de femme en cours de grossesse (B) par électrofocalisation.
CHAPITRE III
Figure 4 : Comparaison des valeurs d'activité HEX sérique obtenues dans
quelques populations de sujets examinés:
Figure 5 : Profils isoenzymatiques par électrofocalisation, représentatifs de
chaque population étudiée (échantillons cumulés) : sujets donneurs
"Banque du Sang" (A), sujets diabétiques (B).
Figure 6 : Profil isoenzymatique (électrofocalisation) représentatif des su-
jets transplantés rénaux à activité HEX sérique élevée (:::: 500 J-LM/h/I).
Figure 7 : Pro1'il isoenzymatique par électrofocalisation représentatif des
sujets insuffisants rénaux (créatinine:::: 250 J-LM/I).
Figure 8 : Absence de corrélation significative entre l'activité HEX sérique
et la créatininémie de 43 échantillons d'une population de transplantés
rénaux.
Figure 9 : Absence de corrélation significative entre l'activité HEX sérique
et le recul en mois par rapport à la transplantation de 43 échantillons d'une
population de transplantés rénaux.
CHAPITRE IV
Figure 10 : Profil d'élution de l'activité HEX placentaire obtenu par
chromatographie
d'affinité
sur
para-amino-phényl-N-acétyl-B-D-
galactosaminide Sépharose CH 4B.
Figure 11
: Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatographie
d'affinité
sur
para-amino-phényl-N-acétyl-B-D-
galactosaminide Sépharose CH 4B.
Figure 12 : Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Trisacryl en tampon
phosphate 0,01 M pH 7,0.

---

164
Figure 13 : Profil d'élution de l'activité HEX senque obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Trisacryl en tampon Tris, HCI
O,05M pH 8,6.
Figure 14 : Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatographie d'échange d'ions sur DEAE Cellulose, en tampon
phosphate 0,01 M pH 7.0.
Figure 15 : Profil d'élution de l'activité HEX sérique obtenu par
chromatograptlie d'échange d'ions sur DEAE Séphacel en tampon
phosphate 0,01 M pH 7,0
Figure 16 : Profil d'électrofocalisation du pic d'activité HEXI élué en début
de gradient sur DEAE Séphacel.
Figure 17 : Profils d'élution de l'activité HEX d'un même échantillon
urinaire obtenus par chromatographie d'échange d'ions en tampon
phosphate O,01M pH7,0.
Figure 18 : Profil d'électrofocalisation de l'activité HEX non fixée sur DEAE
Trisacryl de la figure 178 (A) et de l'activité HEX éluée en début de gradient
sur DEAE Séphacel de la figure 17C (8).
CHAPITRE V
Figure 19 : Profil d'élution de HEX-I par recyclage sur DEAE Séphacel en
tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
Figure 20: Profil d'élution de HEX-/ après DEAE Séphacel, sur colonne de
Con A Sépharose.
Figure 21 : Profil d'élution de HEX-I par chromatographie de filtration mo-
léculaire sur gel de Superose™ 12 (FPLC).
Figure 22 : Electrophorèse sur plaques de gel de polyacrylamide en
conditions non dénaturantes.
CHAPITRE VI
Figure 23: Thermostabilité à 50° C de HEX-I sérique.

---

165
Figure 27 : Activité catalytique des sous-unités ct et B de HEX-A envers
des substrats synthétiques et naturels d'après Conzelmann et coll. (56).
Figure 28 : Profil d'élution de l'activité HEX d'un échantillon de sérum par
chromatofocalisation sur PBETM94.
Figure 29 : Chromatofocalisation de HEX-I sur Mono P (Pharmacia) FPLC.
Figure 30 : pH optimum de HEX-I et HEX-A sériques.
Figure 31 : Détermination des paramètres cinétiques (Vm et Km) de HEX-I
vis-à-vis du MUGlcNAc(A), MUGaINAc(B), a-crésol sulfone phtaleine
GlcNAc(C).
CHAPITRE VII
Figure 32:
A- Profil d'élution de l'activité HEX du sérum de femme en
cours de grossesse (3e trimestre) obtenu par chromatographie d'échange
d'ions sur DEAE Séphacel en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
Figure 33 : A- Profil par électrofocalisation de sérum de femme en cours
de grossesse (échantillons cumulés).
Figure 34 : A- Profil d'élution de HEX-A isolée du sérum par recyclage sur
DEAE Séphacel en tampon phosphate 0,01 M pH 7,0.
Figure 35 : Thermostabilité à 50°C de HEX-P et HEXAS
Figure 36 : Détermination de la masse moléculaire relative (Mr) de HEX-P,
EX-A sérique et HEX-A urinaire par chromatographie de filtration molécu-
laire sur Superose™ 12 (FPLC).
Figure 37 : Interaction de HEX-A urinaire (A) HEX-A sérique (B) et HEX-P
(C) avec la lectine de Ricin.
Figure 38 : Profil d'élution de HEX-P par chromatofocalisation sur MonoP
(FPLC).
Figure 39 : pH optimum de HEX-P et HEXAS
Figure 40 : Détermination des paramètres cinétiques (Km et Vm) de HEX-
P vis-à-vis du MUGlcNAc (A), MUGalNAc (B), a-crésol sulfone phtaleine
GlcNAc (C).
Figure 41 : Détermination des paramètres cinétiques (Vm et Km) de HEX-
A sérique vis-à-vis du MUGlcNAc (A), MUGalNAc (B), a-crésol sulfone
phtaleine GlcNAc (C).

---

166
CHAPITRE VIII
Figure 42 : Activités HEX des milieux de culture J5-J7 de monocytes-ma-
crophages issus de prélèvements et donneurs différents.
Figure 43 : Activités HEX des surnageants de culture J4-J5 de monocytes-
macrophages et activités HEX de milieux de culture témoins.
Figure 44 : Profil isoenzymatique de l'activité HEX des milieux de culture
J4-J5 de monocytes-macrophages par chromatographie sur DEAE Trisa-
cry!.
Figure 45 : Profils isoenzymatiques de l'activité HEX intracellulaire (A) et
sécrétée (8) obtenus par électrofocalisation.
Figure 46 : Influence de la concentration en zymosan sur le pourcentage
sécrété de l'activité HEX des cultures de monocytes-macrophages.
Figure 47 : Profil isoenzymatique par électrofocalisation des activités HEX
sécrétées par les macrophages pendant et après contact avec le
zymosan:
Figure 48 : Profil par électrofocalisation de l'activité HEX intracellulaire J7
(A), et des milieux de culture J4 - J7 des monocytes-macrophages cultivés
de J4-J7 en présence de 250 Ulml d'IFN--y.

---

LISTE DES TABLEAUX
CHAPITRE Il
1. Formes moléculaires d'hexosaminidases dans les tissus et liquides bio-
logiques.
CHAPITRE III
2. Moyenne des valeurs de l'activité HEX sérique déterminée dans
quelques populations de sujets examinés (exprimée en J-LM/h/I) et
représentativité de chaque forme isoenzymatique (électrofocalisation).
CHAPITRE IV
3. Interaction des formes d'hexosaminidases sériques avec les échangeurs
anioniques.
4. Interaction des formes d'hexosaminidases urinaires avec les échan-
geurs anioniques.
CHAPITRE V
5. Tableau de purification de HEX-I sérique.
CHAPITRE VI
6. Interaction de HEX-I sérique avec la Concanavaline A
7. Interaction de HEX-I sérique avec la lectine de Ricin

---

1
168
8. Activité (en nM/h) de HEX-I sérique et de HEX-A urinaire envers les:
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosaminide
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate
9. Paramètres cinétiques de HEX-I sérique, envers quelques substrats
synthétiques.
CHAPITRE VII
10. Interaction des formes HEX sériques (AS et P) et urinaire (Au) avec la
Concanavaline A.
11. Interaction des formes HEX sériques (AS et P) et urinaire (Au) avec la
lectine de Ricin.
12. Activité (en nM/h) de HEXAS et HEX-P envers les:
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosaminide
- méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-glucosaminide-6-sulfate
13. Paramètres cinétiques de HEXAS et HEX-P envers quelques substrats
synthétiques.
CHAPITRE VIII
14. Activités HEX sécrétées et intracellulaires des macrophages dans diffé-
rentes conditions de culture.
15. Activité HEX intracellulaire (IC) et sécrétée dans le mili71::J~2êlt~l~re
(EC) des macrophages cultivés en présence de zymosê'~"8e<ffiàJ7'dé:Îa
·'if'
'
~ 7\\
culture.
ç)' '::. !~ M
. ~,;\\
-J"
~12
~.,
16. Activité HEX intracellulaire (IC) et sécrétée dans le rBili~u extracellulaire.;;)
,
\\
1
)
(EC) des macrophages cultivés en présence d'IFN--y de\\J-4 à'J7AeJa/,," ,:
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culture.
": '1;>''helltS~Çl;5/
.:..~~_.~~."
17. Activité HEX intracellulaire (IC) et sécrétée dans le milieu extracellulaire
(EC) des macrophages cultivés en présence de zymosan 1 h à J6 de la
culture.
Les activités HEX IC et EC ont été rapportées à la masse cellulaire des
puits correspondants exprimée en mg de protéines.

---

LISTE DES ABREVIATIONS
HEX
Hexosaminidase
HEX-I
Forme d'hexosaminidase intermédiaire, relativement
aux formes majeures HEX-A (acide) et HEX-B
(basique).
HEX-P
Forme d'hexosaminidase majeure au cours de la
grossesse (Pregnancy).
HEXAs
Hexosaminidase A sérique
HEXAu
Hexosaminidase A urinaire
MUGlcNAc
Méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-glucosaminide
MUGalNAc
Méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-galactosam'inide
MUGlcNAC-6-S
Méthyl-4-umbelliféryl-N-acétyl-B-D-glusaminide-6-
sulfate
GleNAc
N-acétyl-B-D-glucosamine
GalNAc
N-acétyl-B-D-galactosamine
DEAE
Diéthyl-amino-éthyl-
Con A
Concanavaline A
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography
Mr
Masse moléculaire relative
I.C
Intracellulaire
E.C
Extracellulaire

---

· _ .,..J~,/,r-
_. ..".
~
2
\\ .... '
:",
RESUME
-t''7'
Les B··j\\J-acétyl-hexosaminidases
(E.C. 3.2.1.52) ou hexosaminidases
(HEX) sont des hydrolases lysosomiales des tissus et liquides biologiques
chez l'Homme.
Deux formes moléculaires majeures HEX-A et HEX-B sont présentes dans
tous les tissus, accompagnées de formes mineures intermédiaires HEX-1.
Dans le sérum, des variations d'amplitude des formes intermédiaires'(HEX
11 et 12) ont été constatées lors de divers processus pathologiques et au
cours CIe la grossesse (HEX-P).
L'isolement et la caractérisation des formes intermédiaires sériques HEX 1
et P a été entreprise afin de tenter de préciser leur identité moléculaire, leur
origine cellulaire, et leur rôle de marqueur potentiel en pathologie.
Une seule forme moléculaire HEX-I a été identifiée au sein des sérums
normaux et pa.thologiques et obtenue partiellement purifiée après quatre
étapes chromatographiques. Cette forme enzymatique circulante est ther~
mostable à 50°C, ne comprend que des chaînes polypeptidiques de type B
et des chaînes glycanniques de type complexe biantenné ; HEX-/ serique
se différencie ainsi des formes d'HEX tissulaires. En revanche, aucun des
paramètres physico-chimiques et cinétiques étudiés ne permet d'envisager
les formes HEX-I et HEX-P comme des entités moléculaires distinctes.
Des macrophages humains dérivés de monocytes ont été cultivés en pré-
sence de zymosan et d'interféron (IFN--y) humain recombinant. L'analyse
des profils isoenzymatiques des activités HEX intracellulaires et sécrétées
ne permet pas de conclure à un apport possible des macrophages tissu-
laires à l'activité HEX sérique au cours des réactions inflammatoires et im-
munblogiques.
.
L'amplification dans le sérum des formes HEX-I et HEX-P semble devoir
être rapportée à un processus de croissance cellulaire (transformation ma-
ligne, développement et régénération tissulaire) et à une faible clairance
hépatique de ces enzymes circulantes de nature glycoprotéique complexe.
DISCIPLINE: SCIENCES BIOLOGIQUES: BIOCHIMIE
Mots-Clés:
- N-acétyl-B-D-glucosaminidase
- Hexosaminidase
- Formes moléculaires intermédiaires (1 et P)
- Sérum humain
- Monocytes-macrophages'
ADRESSE DE L'AUTEUR:
Frédéric LOKO
4, avenue de l'Observatoire
Laboratoire de Chimie 'Biologique
. .

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