DEPARTEMENT DE PHYTOLOGIE
FACULTE DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE
ET DE L'ALIMENTATION
THESE
PRESENTEE
A L'ECOLE DES GRADUES
DE L'UNIVERSITE LAVAL
POUR L'OBTENTION
DU GRADE DE MAITRE ES
PAR
GUMEDZOE MAWUENA YAWOVI
DIPLOME (Ir.) DE LA FACULTE DES
DE L'ETAT A GEMBLOUX
CARACTERISATION D'ISOLATS DU VIRUS DE LA.
MOSAïqUE DE LA TOMATE (ToMV) ISOLES AU QUEBEC
AOUT 1982
A me.-6 pMe.n.t.6
A mort. é.pou.ôe.
A me.-6 é.ducate.~~
REMERCIEMENTS
Monsieur le professeur Alain Asselin a bien voulu m'accepter
au sein de son unité de recherche
pour la réalisation de cette thèse et
je tiens à lui exprimer ma profonde et sincère gratitude.
Il a suivi,
au jour le jour, l'évolution de mes recherches et sans ses remarques et
ses critiques constantes, ce travail n'aurait jamais pu être couronné
de succès.
J'aimerais exprimer ma reconnaissance à tous les professeurs
du Département de phytologie qui m'ont fait bénéficier de leur enseigne-
ment ou de leurs conseils judicieux.
Je suis très reconnaissant à monsieur Jean Grenier, pour
son aide technique efficace.
Mes sincères remerciements s'adressent à
messieurs Alain Ménard et Tommy Jensen pour leur collaboration technique.
J'assure de ma reconnaissance mademoiselle Suzanne Desjardins
pour sa contribution précieuse dans l'examen de nos échantillons au
microscope électronique.
Monsieur André Roy a réalisé le dosage des acides aminés de
la protéine de la capside de nos isolats, je lui exprime ma sincère
reconnaissance.
Il m'est impossible de citer individuellement le personnel
administratif et technique, les étudiants gradués du Département et mes
camarades de laboratoire qui, de près ou de loin, ont contribué à ce
travail.
Je leur adresse à tous, mes chaleureux remerciements, pour
l'aide amicale et l'appui moral qu'ils m'ont apportés.
i
ii
Le présent travail est effectué dans le cadre de la formation
prévue dans le protocole d'accord du projet Sy~tèm~ c~aux (TOGO)
3-P-77/00S0, projet financé par le Centre de recherches pour le dévelop-
pement international (CRDI).
Que les autorités de cet organisme veuil-
lent bien trouver ici l'expression de ma profonde gratitude.
RESUME
Nous avons étudié une trentaine d'isolats du virus de la
mosa1que de la tomate (ToMV) collectés à travers la province de Québec.
Les résultats de nos études au niveau:
- biologique (symptomatologie sur plantes indicatrices);
- physico-chimique (mobilité électrophorétique des virions);
- biochimique (composition en acides aminés de la protéine
de la capside de cinq des isolats),
nous permettent de dégager les conclusions suivantes:
1)
le virus de la mosaïque de la tomate est présent chez
la plupart des producteurs de tomate de serre;
2)
les isolats testés diffèrent par les symptômes qu'ils
peuvent induire sur Nicotiana tabacum cv. Turkish Samsun et sur
Lycopersicon eseulentum cv. Vendor;
3)
cependant, les profils électrophorétiques des virions
en gels d'agarose à faible concentration dans des tampons Tris-acétate-
EDTA et phosphate à pH 7,0 ne présentent pas de différence marquée;
4)
la composition en acides aminés de la protéine de la
capside de cinq des isolats présente des variations mineures, en accord
avec celles signalées dans la littérature.
iii
TABLE DES MATIERES
Page
REMERCIEMENTS "ç
i
0
"
•
CI
• •
"
•
CI
• • •
0
• • • • • • • •
"
• • • • •
CI
• •
CI
•
•
•
•
•
•
•
•
• •
•
•
•
•
•
•
RE5LIME " ••
iii
Cl
"
•
CI
• •
"
CI
• • • • • •
CI
CI
• • • •
"
CI
• •
CI
•
CI
CI
• •
CI
• • • • • • • •
CI
0
•
CI
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
TABLE DES MATIERES
iv
LISTE DES TABLEAUX
viii
LISTE DES FIGLIRES •••••.••••. CI ••••• e ••••••••• " • • • • • • • • • • • • • • • • •
lX
LISTE DES ABREVIATIONS .•..........•.•..•.....••••..•..••......
x
II\\JTRODUCTIDI\\J ."
l
CI
"
•
"
•
"
•
"
• • •
CI
• • • • • • •
"
• •
e • • • • • • • • • • • CI •
"
• •
"
•
•
•
•
•
•
•
•
CHAPITRE l -
CARACTERISTIQUES DU VIRUS DE LA
MOSAïqUE DE LA TOMATE ...•..•...•.••.•..••.••....
3
1.1
Générali tés
0
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
3
1.1.1
Histor ique ~
.
3
1.1.2
Synonymes
II'
• • • • • • • •
4
1.1.3
Distr ibution géograprf~•............ _
5
_\\.
li -c
-1//T"'~
c\\~
.~
, . .
.
., c.;
(Il
1.2
Caractel'J.stJ.ques blologJ!qu
Co' •••••••~••••••••••
5
::
"'-'-'1
\\ :;
-
-'''':·-11
) , . .
1. 2.1
Sources d 1 inoculu~ .....~ •.. ~'.. ••......•
5
1.2.2
Modes de transmi~~~. ~ o{: •••.••••••
9
1. 2.3
Symptomatologie.et qâ~'
de plantes senslbles .• ~.~ ..•...•.•.......
10
1.2.4
Classification des isolats,
souches et mutants du ToMV
suivant les systèmes de
Pelham et de McRitchie ...••.•..•.•.•.....
12
lV
v
Page
1.3
Caractéristiques physico-chimiques
duT aM V
12
0
CI
0
0
CI
CI
CI
•
CI
•
•
CI
Ci'
•
"
• • • • •
CI
•
•
•
•
Cl
•
CI
•
•
e 0
C
CI
CI
• • • •
Cl
CI
CI
1.3.1
Morphologie
12
CI
• • • • • • •
Cl
•
Cl
CI
•
Cl
CI
• •
l1li
CI
•
CI
CI
Cl
•
C
1.3.2
Propriétés physico-chimiques
du virion ....
14
CI
• • • • • • • • • • •
o • • • • • • • • • • • • o . e .
1.3.3
structure Cl" •••••••••••••••
14
l1li
• • • • • • • • • • • • • • •
1.3.4
Propriétés antigéniques du
virion
0
0........
16
1.3.5
Mobilité électrophorétique des
virions du ToMV ....
18
0
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
0
1.4
Propriétés biochimiques des principaux
constituants du virion . .
20
0
" . . . . . . .
1.4.1
Protéine de la capside
20
1.4.2
Acide nucléique ou ARN du ToMV
.
20
CHAPITRE 2 -
MATERIELS ET METHODES
24
201
Origine des isolats
25
2.2
Production des plants (de tabac et
de tomate)
ClO
O..............................
25
2.3
Obtention des isolats ••.••••••...•..•.••.•.•••••.
28
2.4
Multiplication du virus .•••.••••••...•..•••••....
30
2.5
Extraction et purification du virus
30
2.6
Etude électrophorétique des isolats
en gels d' agarose
31
CI
•
•
•
•
2.6.1
Conditions d'électrophorèse .•.•••.••....••
31
2.6.2
Préparation des échantillons
pour l'électrophorèse
.
32
2.6.3
Coloration des gels et leur
conservation ......•.. v
e.......
33
2.6.3.1
Coloration au bromure
d'éthidium
33
G
G
• •
G
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
2.6.3.2
Coloration au bleu de
Coomassie R-250 .•.•••.••..••..••.
33
2.7
Elution des bandes de monomères
séparées dans un gel d'agarose ••..•....••.••.••••
34
vi.
Page
2.7.1
Candi tians dl élution ••••••••.•••••••.••.••
34
2.7.2
Inoculation des éluats aux
2.8
Electrophorèse comparée des isolats
avant et après l'élution du contenu
des bandes des gels d'agarose ••••••••.••••••••••.
34
2.9
Composition en acides aminés de la
protéine de la capside de quelques
isolats
35
CI
CI
CI
•
Il
• •
CI
CI
• • • •
"
2.9.1
Extraction de la protéine de
lac ap s ide .
35
CI
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
CI
•
•
•
2.9.2
Hydrolyse acide
des protéines
virales
c
o...................
35
2.9.3
Dosage des acides aminés ••••••••••••••••••
36
2.10
Etude de quelques caractéristiques
de l'ARN du ToMV
0
0.....................
37
2.10.1
Isolement de l'ARN ••••••••••.•••••••••.••
37
2.10.2
Migration électrophorétique
de l' ARN ..
38
CI
• • •
ClI
• • • • • • • • • • •
CI
•
•
•
•
•
•
..
•
..
..
•
..
•
•
2.11
Observation au microscope électronique
de coupes dans une feuille de tomate
virosée et d'extraits purifiés de virus
38
2.1l.1
Réalisation des coupes dans du
tissu foliaire de tomate virosée
38
2.11.2
Observation des extraits purifiés
de virus au microscope électroni-
qu e
39
0
CI
•
CHPAITRE 3 -
RESULTATS ET DISCUSSION ••••••••.•••••••••••••.•.•
40
3.1
Symptomatologie comparée des isolats ••••.••••••••
40
3.1.1
Nicotiana tabacum cv. Xanthi n.c. .•••.•.••
40
3.1.2
Nicotiana sylvestris ••••..•.•.•...•.•••.•.
42
3.1.3
Nicotiana tabacum cv. Turkish Samsun .•••••
43
3.1.4
Lycopersicon esculentum cv. Vendor •...•.••
45
3.2
Purification des isolats .•....•..•.•..••.••••.•.•
49
3.3
Profils électrophorétiques des isolats
duT oMV
50
CI
lIjI
CI
..
vii
Page
3.4
Composition en acides aminés de la
protéine de la capside des isolats
55
CONCLUSIONS oooe.eQ"e"ClClClQ •• OOOQOGCleIilO ••• OCloeOClOClOO."QOOQOOGClOClOO
59
BIBLIOGRAPHIE
62
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU
Page
1.1.3.a
Distribution géographique de souches et
d'isolats du ToMV dans quelques pays •.•••••.•••••
6
1.1.3.b
Présence du ToMV dans différentes
provinces du Canada ... ~ ... Q......................
8
1.2.4
Classification des isolats, souches et
mutants du ToMV suivant les systèmes de
Pelham, de McRitchie et Alexander ..•.•.•.•.•.•..•
13
1.3.5
Principales propriétés physico-chimiques
du virion du ToMV
.
21
2.1
Origine, nombre et dénominations des
isolats testés
26
1;1
• • • • • • • • •
3.4.a
Composition en acides aminés comparée
des cinq isolats étudiés et de souches
du ToMV de la littérature (a, b et c) •••.•••..•.•
57
3.4.b
Comparaison par paires des cinq isolats
étudiés et de deux souches (D et Y-TAMV)
du ToMV ••• " ••• Cl..................................
58
viii
LISTE DES FIGURES
Figure
Page
2.1
Carte de situation des localités d'origine
des isolats étudiés ....
27
0
• • • • • • • • • • • • •
0 8
• • • • • • • • • • • •
2.2
081 2)
Etapes de la production des plants
de tabac •••••••• 0 ••••••••••••••••••••••••••••• e ••••
29
3.1.1
Lésions locales nécrotiques produites par
l'isolat HV7 sur une feuille de Nicotiana
tabaeum cv. Xanthi n.c., trois jours après
l'inoculation
~
o
v.................
41
3.1. 2
Lésions locales nécrotiques induites par
l'isolat HV2 sur une feuille de Nicotiana
sylvestris, trois jours après l'inoculation
43
3.1.3
Symptôme de mosaYque verte induit par
l'isolat "11", sur N. tabacum cv. Turkish
Samsun, 12 jours après l'inoculation .••••••••••••••
45
3.1.4 (1)
Symptôme de mosaïque verte sur une foliole
de tomate (Lycopersicon eseulentum cv.
Vendor), suite à l'inoculation de cette
plante par l'isolat 11 .•••.•••••••••••••.•.••••••.•
47
3.1.4 (2)
Microphotographie d'une coupe dans une
foliole de tomate Vlrosee
.
48
3.3 0)
Profils électrophorétiques de quelques
isolats du ToMV en gel d'agarose 1% (co-
loration au bromure d'éthidium) .••.••.•••••••••••.•
51
3.3 (2')
Profils électrophorétiques de quelques
isolats du ToMV en gel d'agarose 1% (co-
loration au bleu de Coomassie R-25D) ..•••••••••••.•
51
Profils électrophorétiques comparés de
quelques isolats viraux obtenus à partir
des gel s élués .....
53
a
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
ix
LISTE DES ABREVIATIONS
AA
acide aminé
ADN
acide désoxyribonucléique
ALA
alanine
ARG
arginine
ARN
acide ribonucléique
Cc
souche Qowpe~ du TMV (ou souche niébé, ou haricot)
CMV
QUQumb~ mo~aiQ ~~~ - virus de la mosaïque du concombre
CYS
cystéine
D
souche Dahlemense du ToMV
d
dalton
0.0.
densité optique
EDTA ou
NazEDTA
éthylène diamine tétraacétate de sodium
ELISA
enzyme-~nked ~muno~o~bent ~~ay - titrage avec une enzyme
liée à un immunosorbant
GLY
glycine
GLU
glutamate
G-TAMV
g~een-tob~QQoatye~Qalmo~aiQ v~~ - souche atypique du
virus de la mosaîque du tabac induisant de la mosaïque
verte
HAc
acide acétique
HClconc.
acide chlorhydrique concentré
HIS
histidine
HR
li
holm~ ~~bg~~~ - souche du virus de la mosalque du tabac
qui infecte le plantain
ILEU
isoleucine
Kd
kilodalton
LEU
leucine
LYS
lysine
MET
méthionine
x
xi
NaCl
chlorure de sodium
l'.JaH 2P0 4
phosphate de sodium monobasique
l'.JaOH
hydroxyde de sodium
Na2HP04
phosphate de sodium dibasique
NPK
engrais de type azote-phosphate-potassium
OD
optical density - densité optique
PEG-6000
polyéthylène glycol - 6000 (6 000 à 7 000 de poids molécu-
laire)
PHE
phénylalanine
PM
poids moléculaire
PPD ou PSV
particule partiellement décapsidée ou p~tially ~tk~pp~d
v-Uttv.'l
PVX
potato v-Ut~ X - virus X de la pomme de terre
SDS
~odium dod~Qyl ~ul6aX~ - dodécyl sulfate de sodium
SER
sérine
SSME
~enolog~Qaliy ~p~Q~6~Q ~l~Qtkon m~~o~QoPy - méthode sérolo-
gique spécifique à la microscopie électronique
S20, W
coefficient de sédimentation à 200 C dans de l'eau, exprimé
en unités Svedberg
THR
thréonine
TMV
tobacco mo~aiQ v-Uttv.'l - virus de la mosaïque du tabac
ToMV
tomaXo mo~aiQ v-Ut~ - virus de la mosaique de la tomate
TRIS
Tris (hydroxyméthyl) aminoéthane
TRP
tryptophane
TYR
tyrosine
USERIA
ultka ~~~~tiv~ ~ad~o ~muno ~~ay - méthode sérologique ultra
sensible de titrage avec des substrats radioactifs
UV
ultra-violet
Ul, U2, U4, ce sont des souches du virus de la mosaïque du tabac (TMV).
US, U6 et
Les souches Ul, U4 et U7 sont des souches du TMV appartenant
U7
au groupe du tabac.
Les souches U2 et US appartiennent au
groupe II.
La souche U6 est monotypique.
VAL
valine
Y-TAMV
y~llow - tomaXo ~P~Qal mo~aiQ v-Ut~ - souche atypi~ue du
virus de la mosaïque de la tomate induisant une mosalque
jaune
INTRODUCTION
Les virus végétaux sont des nucléoprotéines infectieuses qui
ne peuvent se multiplier que dans des cellules végétales vivantes où ils sont
introduits par suite de blessures cicatrisantes (mécaniques ou très sou-
vent dues à des organismes vecteurs).
Leur génome, généralement consti-
tué diacide ribonucléique (ARN), est encapsidé dans une structure protéi-
que.
En un mot, un phytovirus est essentiellement de l'information
génétique protégée par une ou quelques protéines de la capside.
Etant
donné sa constitution, il est donc normal d'imaginer qu'un virus puisse
changer ses caractères génétiques sous certaines conditions (c'est-à-dire
muter).
Il est ainsi possible de trouver, dans la nature, différents
isolats d'un même virus ayant une constitution génétique et un pouvoir
pathogénique différents.
Ces changements génétiques (ou mutations natu-
relles) se produisent spontanément sans que l'on puisse identifier clai-
rement les facteurs responsables.
De telles variations du comportement
de certains isolats par rapport à la souche commune du virus de la
mosaYque du tabac (TMV) ont été signalées dans la littérature (60, 76,_
107). En effet, la probabilité d'obtenir une mutation spontanée chez le
TMV est élevée et, si celle-ci est viable, elle peut donner naissance à
une nouvelle souche (148).
Parmi les 25 groupes d'affinité de virus
végétaux caractérisés jusqu'à ce jour, les Tobamovirus dont le représen-
tant type est le TMV, comptent probablement le plus grand nombre de sou-
ches naturelles (environ une trentaine).
Ces dernières sont classées
en plusieurs sous-groupes qui partagent certaines caractéristiques telles
que la symptomatologie, la composition en acides aminés de la protéine
de la capside (159) ou l'homologie de l'ARN viral (162).
Le sous-groupe
tomate ou virus de la mosaïque de la tomate (ToMV) est celui qui fait
l'objet de nos études.
Ce dernier est responsable de la maladie virale
2
la plus importante de la tomate (Lycopersicon esculentum Mill.).
En
effet, l'interaction parasitaire ToMV-tomate peut entraîner des consé-
quences physiologiques assez sérieuses pour les plants infectés, condui-
sant souvent à des pertes de production variant de 5 à 50% et parfois
plus (2, 14, 17, 39, 107, 109).
En 1980, des pertes de rendement dues à ce
virus dans certaines parcelles se chiffraient à 38% chez des producteurs
de tomates de plein champ en Californie (USA) (2).
Au Canada, entre 1976
et 1977, plus de 7 000 plants virosés ont été dénombrés dans des serres
de tomates à Calgary (67).
Le virus en cause est présent au Québec chez
la plupart des producteurs de tomates en serre, après l'analyse des
échantillons que nous avons reçus des différentes régions productrices
de tomates de serre de la province.
Le virus de la
"
mosaique de la tomate est très stable, infec-
tieux et parfois difficile à éliminer dans les établissements serricoles
fortement infestés.
De plus, le virus démontre une grande variabilité
dans l'expression de ses symptômes sur la plupart des plantes sensibles
qu'il infecte de façon systémique.
Ainsi plusieurs isolats du ToMV ont
été identifiés de par le monde, et leur nombre et leur variabilité rendent
nécessaires une identification et une caractérisation de plus en plus
précises.
Notre objectif, au cours du présent travail, est donc d'étu-
dier les principales caractéristiques des isolats de ce virus collectés
à travers la province de Québec.
De telles études de caractérisation
d'isolats viraux qui apportent des informations précieuses non seulement
au phytopathologiste mais aussi au sélectionneur et au producteur, peu-
vent se situer à différents niveaux (biologique, physico-chimique et
biochimique).
Avant d'aborder les chapitres consacrés aux experlences réali-
sées et aux résultats obtenus, examinons d'abord les principales proprié-
tés de ce virus à la lumière de la littérature actuelle.
CHAPITRE 1
CARACTERISTIQUES DU VIRUS DE LA MOSAïqUE DE LA TOMATE
1.1
Généralités
1.1.1
Historigue
La mosaïque de la tomate n'est pas une maladie récente.
Son
origine remonte probablement au début de la culture de cette plante.
D'aprés Orton et McKinney (124), les premiéres descriptions des symptô-
mes de cette infection furent faites par Lodeman en 1892.
La maladie a
été signalée en 1916 au Canada par Howitt et Stone (72).
Au Québec, les
premiers travaux sur ce virus datent de 1923 et ont été réalisés par
Dickson et Vanterpool (44, 167).
Si la mosaïque de la tomate constitue, à l'heure actuelle,
un probléme majeur pour les phytopathologistes, c'est à cause des réduc-
tions importantes de rendements que ce virus peut entraîner seul ou en
association avec d'autres parasites (PVX, CMV, etc.) (2, 6, 10, 26, 44,
91, 167).
Les moyens mis en oeuvre pour l'enrayer n'ont pas aussi tou-
jours donné les résultats escomptés.
Le virus de la mosaique de la
tomate a été longtemps confondu avec la souche commune du virus de la
3
4
mosaïque du tabac, à cause de la similitude de certains de leurs symptômes
sur quelques plantes sensibles infectées systémiquement (135).
Ces divers
symptômes sont largement influencés par les conditions environnementales,
l'âge, la nature du cultivar et l'état nutritionnel des plants, ainsi que
par la souche virale, la quantité de virus et la période de l'infection
(20).
Cette variabilité au niveau des symptômes a conduit divers auteurs
à décrire d'innombrables isolats et parfois à désigner le même virus sous
différentes appellations.
Il existe donc divers synonymes pour le virus
u
de la mosalque de la tomate.
1.1.2
Synonymes
I~ous reproduisons ici quelques synonymes souvent rencontrés
dans la littérature pour dénommer les membres du sous-groupe du virus de
la mosaYque de la tomate:
1)
la souche tomate du virus de la mosaïque du tabac (20,135);
2)
virus l de la tomate (ou Lycopersicon virus 1) (149);
3)
la souche commune ou souche faible du virus de la mosaYque
de la tomate (70);
4)
le virus de la mosaïque de la tomate (70);
5)
le virus de la mosaïque aucuba de la tomate (ou Y-TAMV)
(25);
6)
la souche Dahlemense (Ill).
Ces différents synonymes ne sont que le reflet de la complexi-
té du travail lorsque l'on veut décrire les différents isolats du ToMV
répertoriés de par le monde en se référant uniquement aux symptômes.
Si
utiles que puissent être ces regroupements d'isolats viraux à partir de
critères symptomatologiques, il faut les utiliser avec beaucoup de cir-
conspection, et surtout ils doivent être considérés comme des classifi-
cations provisoires et à usage strictement local (135).
Comme l'impor-
tance des symptômes est liée à une série de facteurs du milieu, il serait
plus justifié de recourir à d'autres critères (biologiques, physico-
5
chimiques et biochimiques) pour des études comparatives d'isolats de ré-
gions diverses ou de différents pays.
1.1.3
Distribution géographique
"
La présence du virus de la mosaique de la tomate est signalée
sur les cinq continents partout où cette solanacée est cultivée (tableau
1.1.3.a).
Au Canada, le virus a été rapporté dans presque toutes les
provinces (tableau 1.1.3.b), en particulier au Québec où il est commun
dans presque toutes les régions productrices de tomates comme en témoigne
la répartition des isolats que nous avons testés (tableau 2.1).
La pré-
sence du ToMV dans différents sites écologiques traduit la plasticité de
ce virus et aussi sa capacité de produire différents isolats.
1.2
Caractéristiques biologigues
1.2.1
Sources d'inoculum
1)
!:.e~ ~e!!!.e~c~s_C.g.r~i!le~)• Une controverse perdure quant à
la localisation du virus au niveau de la graine.
Le virus est-il limité
aux téguments?
Peut-il atteindre l'endosperme ou même l'embryon?
Des
recherches menées en Australie sur 2 000 graines de tomate situent le
virus au seul niveau du tégument (40).
D'autres auteurs signalent la
présence de particules virales du ToMV dans la gangue mucilagineuse en-
tourant le tégument, mais également à l'intérieur de l'endosperme (154).
On estime qu'environ la moitié des graines provenant de tomates infectées
portent des particules du ToMV, et cette proportion varie suivant le cul-
tivar, le moment de l'infection, la position des fleurs et la méthode de
nettoyage ou de désinfection des graines (17, 19, 20, 62, 64, 136).
Le
taux de contamination des graines commerciales peut atteindre 0,1% et
parfois plus (20, 105).
Des particules virales peuvent demeurer longtemps
sur les graines, des mois, voire des années.
Sont-elles pour autant
viables?
Certains auteurs ont suggéré que des substances toxiques anti-
virales pourraient être secrétées par les graines mais sans preuve for-
melle (137).
La localisation du virus au niveau de l'embryon n'a pas été
prouvée non plus (20).
6
TABLEAU 1.1.3.a:
Distribution géographique de souches et d'isolats du
ToMV dans quelques pays
Souches ou isolats
Région géographique
Références
du ToMV
SAF
Afrique du Sud
169
Dahlemense (0)
Allemagne fédérale
111 (a)
(b)
Allemagne (Rép. démocratique)
141
PTA
Argentine
169
Aus-II (Australian II)
Australie
169
(b)
Belgique
161
(b)
Brésil
95
(b)
Cambodge
16
(b)
Canada
(Cf. tableau
L1.3.b)
(b)
Chili
5
(b)
Colombie
75
(b)
Corée
13
(b)
Côte d'Ivoire
168
(b)
Cuba
133
(b)
Danemark
9
(b)
Egypte
3
Y-TAMV
Etats-Unis
114 (a)
CV60
Etats-Unis
169
CV61
Etats-Unis
169
AC-9
Etats-Unis
169
HD
Etats-Unis
169
SJ (=San Joaquin)
Etats-Unis
169
VEN (Ventura)
Etats-Unis
169
FN-ToMV
Etats-Unis
104
(b)
Finlande
96
(b)
France
113
(b)
Grande-Bretagne
48~49
(b)
Grèce
155
L/DH
Hongrie
102 (a)
(b)
Inde
134
7
TABLEAU 1.1.3.a (suite)
Souches ou isolats
Région géographique
Références
du ToMV
(b)
Irlande
100
(b)
Italie
31, 32
(b)
Japon
83, 122, 169
(b)
Liban
101
(b)
Maroc
97
(b)
Mexique
112
(b)
Nigéria
88
(b)
Nouvelle-Zélande
118
DUT-I (Dutch I)
Pays-Bas
169
YLGP (= Ye11o\\JI Leaf GP)
Pays-Bas
169
(b)
Pays-Bas
135
(b)
Pérou
45
PTV
Philippines
169
(b)
Pologne
11
(b)
Roumanie
77
(b)
Sénégal
156
(b)
Soudan
l
(b)
Suisse
14
(b)
Turquie
160
(b)
Union-Soviétique
58
(b)
Vénézuéla
91
(b)
Vietnam
16
(b)
Yougoslavie
78
REMARqUES:
1) Cette liste de pays où du ToMV a été signalé n'est pas
exhaustive, elle traduit la plasticité de ce virus et sa
capacité à produire différents isolats dans divers sites
écologiques.
2) Les
références bibliographiques ne se rapportent pas aux
premières descriptions du virus, sauf celles marquées (a).
3) (b) se réfère à une collection d'isolats du ToMV non
dénommés.
8
TABLEAU 1.1.3.b:
Présence du ToMV dans dif-
férentes provinces du Canada
Provinces
Références
Alberta
35~ 67
Colombie-Britannique
157
Ile du Prince-Edouard
34
Manitoba
36
Nouveau-Brunswick
142, 147
Nouvelle-Ecosse
38
Ontario
4, 38, 50
Québec
38~ 162
Saskatchewan
35
Terre-Neuve
36
Yukon
34
2)
b.e~ .9.é~.rl-.s_d~ E.l.ê.n!.e~ ln.f.eE.t~e~ S..f~ul-.lle~,_tl-.g~s_e!. .E.a-
~i.!le~)
constituent des moyens sars de contamination des tomates saines
avec du ToMV (4, 46, 89, 90, 104).
3)
~Y~J.!lfe~éY~Y~3~~~~~~~~~~~~~~
(4, 18, 22, 89, 93, 104).
Une autre source d'inoculum beaucoup plus insi-
dieuse est l'excrétion de particules virales par des racines de plantes
virosées dans la rhizosphère.
Ces virions excrétés, polluent d'abord le
sol.
Puis ils parviennent au niveau des feuilles saines par la projec-
tion de gouttelettes d'eau (~p~h~ng) lors de l'arrosage ou encore par
les feuilles de la strate basale qui entrent en contact avec le sol.
Leur survie tant sur la feuille que dans le sol dépend des facteurs de
l'environnement et des pratiques culturales (90, 104).
Généralement, il
ne faut que quelques plantules infectées pour assurer le démarrage rapide
d'une épiphytie virale dans une production de tomates (46, 104).
9
4)
~~~~YJE~~io~~~~~~~~~~~y~~~~g~~
ic~s_d~ .s.ul.t~r~s_h.ldE.o.e.o~i.9.u~s_d~ !.o~ale~)_c~nla~i.!2é~s'y~r_d~s'y~r!.i.sul.e~
~i.E.al.e~ iu_T~~, constituent des foyers primaires de départ d'une épiphytie-
virale (4).
5)
!:.e~.e.l~n!.e~.E.é~e.E.v~i.E.s, qui sont généralement des mauvai-
ses herbes, appartiennent le plus souvent aux Solanacées, Chénopodiacées
et Amaranthacées.
Un seul cas a été bien étudié, il s'agit de Physalis
subglabrata Mack. & Bush qui serait une source d'inoculum pour la conta-
mination de tomates de plein champ en Intiana (20, 56).
Le ToMV a été aussi
isolé à partir de plants de Physalis alkekengi L. atteints de mosaïque (11).
6)
.!:.e~ ~êle~e.!2t~,_l~s_o~t~}~ ~r.§.t~i.E.e~ ~t_l~s_i.!2s1r~m~nls
ii~e.E.s.z.. ~tllls~s'y~u~e.!2t_êlr~ ~u~sl .s0.!2t~mln~s (21).
Les graines infestées, les débris végétaux et le sol contami-
né constituent donc de loin les sources les plus importantes de l'inocu-
lum viral.
A partir de ces foyers primaires, le virus peut être amené au
contact des plantes saines pal' l'une des modalités suivantes.
1.2.2
Modes de transmission
1)
lr~n~mis~i~n_m~c.§.niq~e. Le virus de la mosaïque de la
tomate est facilement transmis de façon mécanique.
Il s'agit du mode de
transmission le plus important.
Celui-ci est assuré soit pal' contact ou
frottement entre les organes végétaux infectés et ceux de plants sains
(racines, feuilles, etc.), soit pal' suite d'opérations culturales diverses
(repiquage, transplantation, pincement, taille, tuteurage, etc.) (90, 104).
2)
Ir~n~mls~i~n'y~r_d~s_i.!2s~cle~. La question de la trans-
mission du ToMV pal' des insectes est très controversée et les quelques
l'ares études qui existent ne nous permettent pas de nous prononcer avec
certitude.
Il n'existe pas d'insectes vecteurs capables de transmettre le
ToMV dans la nature.
Cependant, certains auteurs signalent la transmission
possible du virus pal' des pucerons et des sauterelles (15).
En effet, il
a été l'apporté des cas réussis de transmission expérimentale du virus pal'
certains insectes.
Ainsi, le puceron Myzus persicae Sulz. peut transmettre
10
le ToMV dans certaines conditions mais â un taux relativement faible
(15 y 99).
3)
..!.r~n~mis~i~ny~r_l~ .9.r~f.fa.9.e_e!. .E.aE..la_c~sE.u!.e. Le virus
de la mosaique de la tomate peut également être transmis par le greffage
si des porte-greffes et/ou des greffons sont infectés (20, 135).
La
transmission du ToMV par la cuscute (Cuscuta subinclusa Dur. & Hilg.) a
été aussi rapportée (139).
4)
Autres modes de transmission.
Des oiseaux et des mammi-
fères peuvent aussi transporter des particules virales du ToMV sur leur
plumage ou leur pelage et contribuer ainsi â leur dissémination, mais
cette contribution est moins importante que les autres déjâ mentionnées.
Une fois le virus introduit dans la plante sensible et si les conditions
de l'environnement sont favorables y différents types de symptômes peuvent
être observés.
1.2.3
Symptomatologie et gamme de plantes sensibles
Le virus de la mosaïque de la tomate peut infecter plusieurs
espèces végétales et induire une gamme de symptômes caractéristiques.
Ces derniers peuvent être regroupés en deux catégories principales dans
le cas d'un cultivar de tomate sensible infecté systémiquement.
1)
~~!.ô~e~
"
~e_m~s~igu~. Sur les feuilles s'observe une
mosaique verte plus ou moins foncée, avec parfois une déformation des
jeunes feuilles (surtout en été).
Des énations peuvent se former dans
certains cas.
En hiver, les plants croissent peu et les feuilles peuvent
prendre une forme fusiforme et très étroite (feuille de fougère).
Cer-
.' ;\\.
tains isolats provoquent un allongement de 4~'feuille évoquant très for-
t- /
tement un lacet.
Les plants de tomate atte1nts de,la mosaique en lacet
j21~v,
sont fortement rabougris et deviennent pr~~quemenr-ïmPtO?UctifS. quel-
ques isolats provoquent sur le système foll~~~",~a{&'s'c3.iqueâ taches
",",'/<
,,,{:(;j'7
jaunes ou mosa~que aucuba, qui se caractérise'p~FI~~moucheturejaune
brillant ou jaune-vert (70).
I l
2)
~~lô~e~~é~r~tlq~e~.
Des symptômes nécrotiques sont
également observés sur les tiges, les pétioles et/ou les fruits (67, 90,
104, 135).
Ces derniers peuvent aussi connaître un brunissement interne
(17, 67, 135, 155).
Les symptômes ainsi mentionnés varient en intensité
et en importance suivant la souche virale, la durée et le moment de
l'infection, la quantité de virus, le cultivar, la sensibilité et l'âge
des plants ainsi que les conditions de l'environnement (température, inten-
sité lumineuse, durée du jour, éléments nutritifs dans le sol et l'état
hydrique de ce dernier) (30, 51, 132).
De plus, il se produit chez les plantes virosées d'importan-
tes modifications des processus physiologiques (120, 132, 146).
Celles-
ci peuvent se traduire par une sévère diminution de la croissance des
plants et du développement racina ire (37).
La photosynthèse qui, au début
de l'infection virale augmente légèrement, diminue par la suite, tandis
que la transpiration suit le mouvement inverse (37).
En plus de la tomate, d'autres espèces végétales peuvent être
infectées par du ToMV, dont certaines permettent de caractériser diffé-
rents isolats de ce virus et de les distinguer d'autres Tobamovirus appa-
rentés.
Parmi ces plantes indicatrices se trouvent plusieurs tabacs:
Nicotiana sylvestris L., Nicotiana tabacum L. cv. White Burley lignée
Dutch A, et Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi n.c., qui fournissent des lé-
sions locales et N. tabacum cv. Turkish Samsun qui est infecté systémi-
quement (70).
A la suite de l'infection virale par ToMV, il est noté chez
la plupart des plantes sensibles à ce virus, la formation d'inclusions
cellulaires paracristallines ou cristallines de formes diverses (78, 170).
Parmi ces dernières, les plus caractéristiques et pouvant être utilisées
comme critères de diagnostic sont les cristaux hexagonaux formés généra-
lement dans les cellules épidermiques de plants de tabac ou de tomate.
En utilisant judicieusement les informations fournies par les
u
u
symptômes externes (mosalque verte, mosalque aucuba ou lésions locales) et
internes (inclusions cristallines hexagonales), il est possible de carac-
tériser et de séparer différents isolats du ToMV, de ceux de la souche
commune du TMV par exemple (78, 135).
On peut aussi tirer parti du
lZ
comportement. différentiel des isolats de ce virus, sur une gamme de varié-
tés de tomates possédant différents gènes de résistance pour classer ceux-
ci dans divers groupes (groupes de Pelham, groupes de McRitchie) (110,
lZ7, lZ8).
1.2.4
Classification des isolats, souches et mutants du ToMV
suivant les systèmes de Pelham et de McRitchie (tableau 1.2.4)
Les isolats du ToMV sont classés en cinq groupes (ou groupes
de Pelham) suivant leur capacité à produire ou non des symptômes sur des
lignées isogéniques de tomates résistantes ou tolérantes (tomate du type
Craigella) (127, lZ8).
Ainsi, le groupe 0, qui compte les isolats les
plus fréquents, ne provoque pas de symptômes sur les variétés de tomate
possédant le gène Tm.
Par contre, les groupes l, Z, 1.Z et Z2 ou Za
induisent des symptômes sur des plants de tomates possédant respective-
ment les gènes Tm-l, Tm-Z, Tm-l et Tm-2 et Tm-Z 2 •
La plupart des isolats
naturels du ToMV appartiennent aux groupes 0 et l de Pelham (70).
McRitchie et Alexander (110) ont aussi utilisé différentes sélections ou
lignées de tomates pour regrouper les isolats et souches du ToMV dans
cinq catégories dénommées OHIO, l, II, III, IV et V.
Ces catégories ainsi
définies ont plus une valeur pour le sélectionneur que pour le phytopa-
thologiste.
Celles-ci d'ailleurs ne coïncident pas toujours avec des
groupes déterminés par la sérologie (ou sérotypes) ou par la symptomatolo-
gie sur des plantes indicatrices.
De la prudence est donc nécessaire dans
l'interprétation de telles classifications.
1.3
Caractéristigues physico-chimigues du ToMV
Nous allons considérer les propriétés physico-chimiques connues
des souches Dahlemense et Y-TAMV du ToMV.
Ces isolats sont les mieux ca-
ractérisés à l'heure actuelle (70, 75, 81, 92, 117, 151, 169, 174).
1.3.1
Morphologie
Observées au microscope électronique, les particules virales
du ToMV se révèlent être des bâtonnets rigides d'une longueur moyenne de
300 nm, d'un diamètre moyen de 18 nm.
L'acide ribonucléique (ARN) à
.,,
TABLEAU 1.2.4:
Classification des isolats, souches et mutants du ToMV suivant les
systèmes de Pelham, de McRitchie et Alexander.
Sources: Références (57, 70, 110, 127, 128)
Groupes de
Symptômes
Gènes
Observations
McRitchie
Pelham
(Ohio)
o
1 + II
Tm
Souches fréquentes (Ohio 1 et II)
Souches assez fréquentes (Ohio
l
III
+
Tm-l
III, Dahlemense, MII-16, ••• )
2
IV
+
Tm-l
Ohio IV, Chiba 2, 3 et 4
Tm-l
1.2
V
+
Ohio V
et Tm-2
22
+
Tm-2 2
Souches assez rares
1-'
VI
14
simple brin positif d'environ 6 400 nucléotides est intercalé entre les
sous-unités protéiques formant la capside, à raison de trois nucléotides
par sous-unité (27).
L'ensemble de la capside est composée de 2 130 sous-
unités protéiques identiques (27, 66, 70) qui confèrent une très grande
stabilité au virus, grâce aux liaisons pko~é~ne-p~o~é~ne d'une part et
p~o~é~e-ARN d'autre part (66).
1.3.2
Propriétés physico-chimigues du virion
Le virion ou particule virale du TMV a une masse particulaire
d'environ 40 x 10 6 daltons (d), la capside comptant pour 95% de ce poids.
Le ToMV est un virus extrêmement infectieux.
En effet, une suspension
constituée d'une part d'extrait viral dilué dans cinq millions de parts
d'eau demeure encore infectieuse.
Cependant, l'extrait viral perd rapi-
dement son pouvoir infectieux lorsque exposé à la température de 85 à 900 C
pendant dix minutes;
et il en est de même lorsque la dilution de la sus-
pension virale dépasse 10- 6 (69).
Mais l'infectivité de cette dernière
persiste des mois à la température du laboratoire et plusieurs années
lorsqu'elle est maintenue à la température de 0 à -20 C.
Non seulement les traitements thermiques ont des effets délé-
tères sur l'infectivité du virus, mais aussi certains traitements chimi-
ques.
Ainsi le ToMV est particulièrement sensible à l'élévation du pH.
Aux pH alcalins le virus se décapside plus ou moins rapidement (62, 68, 140).
1.3.3
Structure
Les données récentes de la diffraction aux rayons-X ont permis
d'établir la structure tridimensionnelle de la protéine de la capside en-
tourant l'ARN de la souche Dahlemense (28).
Ces études démontrent qu'il
n'existe pratiquement pas de différences majeures entre la structure du
ToMV et celle de la souche commune du TMV (12).
Il a été noté une modifi-
cation mineure au niveau de l'hélice de la souche Dahlemense qui possède
une structure régulièrement déformée (28).
Environ 49 sous-unités pro-
téiques identiques sont nécessaires pour constituer trois tours d'hélice
consécutifs (soit 16 1/3 de sous-unités par tour), et l'acide nucléique se
trouve intercalé entre ces sous-unités.
Ces dernières ont des acides
15
aminés basiques (ex.: arginine) qui occupent des positions privilégiées~
leur permettant de neutraliser les groupes phosphatés de chacun des trois
nucléotides avec lesquels ils vont interagir.
Les structures secondaire
et tertiaire de la capside permettent la formation d'une cage carboxylique
assurant ainsi l'existence:
1)
de liens entre les groupes phosphatés de l'ARN et certains
acides aminés (principalement l'arginine et la lysine);
2)
d'interactions hydrophobiques entre les bases nucléoti-
diques et certains acides aminés~ et
3)
de ponts hydrogènes entre les sucres et certains acides
aminés qui, dans l'ensemble~ stabilisent la structure du virus (71).
Au sein d'une telle structure, il existe des régions bien
conservées à cause de leur fonction biologique évidente (165).
Deux ré-
gions privilégiées ont été ainsi identifiées dans la séquence des acides
aminés de la sous-unité protéique (65~ 165).
Celles-ci comportent prin-
cipalement des acides aminés polaires.
Ces régions sont:
1)
la région 87-94 + Phe-Asp-Thr-Arg-Asn-Arg-ILe-Ile;
2)
la région 113-122 + Arg-Val-Asp-Asp-Ala-Thr-Val-Ala-ILe-
Arg
Les séquences mentionnées seraient responsables de l'interaction p~oté~ne
ARN par l'établissement de liaisons ioniques entre l'arginine et les phos-
phates des nucléotides et par des liaisons hydrogènes entre l'acide aspar-
tique ou la thréonine et la base des nucléotides.
De plus, les acides
aminés apolaires qui sont moins variables sont situés préférentiellement
à l'intérieur de la chaîne polypeptidique, et les acides aminés polaires
qui sont plus variables sont situés à la surface de la capside (115, 165).
Il est important de noter l'influence d'une telle distribution des acides
aminés sur la mobilité électrophorétique du virion.
Enfin, parmi les
acides aminés situés à l'extrémité carboxylique de la protéine de la
capside (-X-Ser-Gly-Pro-Ala-Ser.), la sérine semble jouer un rôle impor-
tant dans les propriétés a~tigéniques du virus (165, 174).
16
1.3.4
Propriétés antigénigues du virion
Dans beaucoup de cas, lorsqu'un virus végétal est injecté
dans le système circulatoire d'un animal à sang chaud (lapin, cobaye,
etc.), la protéine de la capside se comporte comme un antigène et induit
la formation d'anticorps spécifiques.
La découverte du caractère anti-
génique des virus végétaux a permis le développement d'une méthode d'iden-
tification de ceux-ci par diverses techniques sérologiques.
La base de
la réaction sérologique est la combinaison entre l'anticorps protéique et
les particules d'antigène formant un complexe insoluble.
Parmi les principales techniques utilisées pour mettre en
évidence la réaction antigène-anticorps, citons celles qui sont utilisées
ou sont susceptibles de l'être dans la caractérisation des isolats ou
souches du ToMV.
1)
!iélh~d~ ~e_ micE.o.:p.E.@E,iE.ilaii~n.
La réaction de précipi ta-
tion peut avoir lieu dans un tube, sur une lame, dans une boîte de pétri,
etc.
Les tests sérologiques, selon cette méthode, sont généralement
effectués sous huile de paraffine d'après la technique décrite par Van
Slogteren et reprise par d'autres (158, 164, 166, 168).
Cette technique
est parfois utilisée dans l'identification d'isolats du ToMV (23, 168).
2)
!iélh~d~ _d~ la_d~u~l~ ~i.!:.r~s.!.oI!. ~a~s_l~a.9.aE.. La méthode
de la double diffusion la plus utilisée pour détecter le ToMV est celle dite
de Ouchterlony (125).
Dans cette technique, le virus (antigène) et l'anti-
sérum (anticorps) sont déposés dans différents puits perforés dans un
gel d'agar (ou d'agarose) dans lequel ils diffusent.
La présence du
virus est révélée par l'apparition en un ou trois jours d'une ligne de
précipitation blanchâtre ou grisâtre dans l'agar séparant les deux consti-
tuants, ce qui indique la rencontre antigène-anticorps.
Plusieurs lignes
de précipitation peuvent parfois être observées (80).
La technique de la
double diffusion dans l'agar ou l'agarose est très souvent utilisée pour
identifier différents isolats du ToMV (29, 104, 168, 169).
3)
!i~~~~3~~~Y~E.~~~~~~l~~~~~~Y~
io~ fL1.S6::fnEJ!!!e.~L:0~e.Q.-1.n1!!!.u!2:.o::~ ..o~b5l:..I1:!.-~:2.a!i).
Il existe maintenant
différentes variantes de cette technique sérologique décrite en 1977 par
17
Clark et Adams (33), et la plus utilisée par les virologistes est celle
du
double
~~ndw~Qh.
Elle consiste à coupler le virus à des anticorps
spécifiques qui eux-mêmes sont adsorbés sur les parois de microcuvettes
de polystyrène.
Les particules virales ainsi fixées réagissent ensuite
avec d'autres anticorps spécifiques liés chimiquement à une enzyme (ex.:
phosphatase alcaline).
Après des lavages appropriés, les complexes
anticorps-antigènes sont détectés par colorimétrie après addition d'un
substrat utilisable par l'enzyme.
Cette variante possède une grande
spécificité et pourrait être utilisée pour différencier des isolats du
ToMV qui ont des propriétés antigéniques très voisines.
4)
!ié!.h~d~ ~éE.ol.o.9.i.9.u~ §J~c.ifl~e_à_l.§. !!liE.r~sE.0E.i~ ~l~.c!.r~
.!li.9.u~ i.o~ .2.StlE_=_S~~f~~Q~:~e~,-SEe.'s:'~i~'s:'ff~QS!t~VLJvI:!:.C:!:..o:lQ0J!i). Cette
méthode décrite par Derrick en 1973 (43) pour les virus végétaux consiste
à faire adsorber sur une grille de microscope électronique, des protéines
de l'antisérum (y-globulines) pour permettre de trapper l'antigène (ou
suspension virale).
Les grilles, lavées pour éliminer les sels et les
contaminants, sont observées au microscope électronique.
La sensibilité
de la méthode dépasse souvent celle des techniques immunoenzymatiques.
Cette technique pourrait être utilisée par exemple pour détecter des iso-
lats du ToMV dans des lots de graines de tomate.
5)
~u!.r~s_t~c.b.nl~e~ ~éE.ol0.9.i.9.u~s.
Parmi les nouvelles
techniques sérologiques susceptibles d'intéresser le virologiste des
plantes, signalons celles des anticorps monoclonaux (ou hybridomes)
(82) et celles utilisant des substrats radioactifs (ex.: USER lA = U~~
Se.~~ve. Rad~o lmmuno ~~ay) (106).
Dans un avenir très rapproché, ces
nouvelles méthodes sérologiques pourront servir sans doute à opérer une
meilleure classification des nombreux isolats du ToMV, identifiés et
isolés de par le monde.
Une telle classification en sérotypes bien dis-
tincts s'impose en vue d'établir des relations valables et reproductibles
entre les propriétés sérologiques de ces isolats et leurs caractéristi-
ques physico-chimiques et biochimiques.
Mentionnons enfin qu'il existe une relation étroite entre les
propriétés chimiques de la protéine de la capside et les caractéristiques
antigéniques des virions d'une souche virale.
Ainsi, Wang et Knight
(169) dans leurs études sur différents isolats du ToMV de provenances
diverses ont montré que:
18
1)
les lignes de précipitation observées sont coalescentes y
ce qui suggère l'existence d'un site antigénique (ou épitope) commun
entre les isolats testés;
2)
une similitude peut exister entre leurs propriétés chimi-
ques et sérologiques.
Il est prouvé aujourd'hui qu'il y a entre trois et cinq épi-
topes différents répartis à la surface de la capside du TMV (probablement
du ToMV aussi) (116, 165).
Certains de ces épi topes occupent une posi-
tion interne (donc sans influence directe sur les propriétés antigéniques
du virion).
D'autres sont localisés à la surface du virion, et deux de
ceux-ci sont situés aux extrémités (aminée et carboxylique) de la chaîne
polypeptidique (116).
Ils sont responsables de la stimulation de la pro-
duction d'anticorps qui reconnaissent aussi bien le virion que les sous-
unités protéiques dépolymérisées.
S'il y a un changement dans la séquen-
ce des acides aminés de la protéine de la capside dans les sites accessi-
bles aux anticorps, ceci peut altérer de façon significative non seule-
ment les propriétés sérologiques mais probablement aussi les caractéris-
tiques électrophorétiques de la souche virale (115).
1.3.5
Mobilité électrophorétigue des virions du ToMV
L'électrophorèse est une technique de séparation physico-
chimique qui met en oeuvre la migration de particules électriquement
chargées sous l'influence d'un champ électrique généralement uniforme.
De nombreux travaux ont été publiés sur les propriétés élec-
trophorétiques du virus de la mosaique du tabac et de ses variantes (61,
85, 144).
Les premières études sur le sujet ont permis:
1)
d'établir la similitude entre les courbes de la mobilité
électrophorétique en fonction du pH des souches Dahlemense et Ul (85,
144);
2)
de démontrer la proportionnalité entre la mobilité élec-
trophorétique et la charge nette par unité de surface;
19
3)
d'estimer la mobilité électrophorétique de la souche
Dahlemense â -0,97 x lO-~ cm 2 volt- 1 sec- 1 (â pH 7~O et avec une force
ionique de 0,075) (86);
4)
d'affirmer que le virion intact et la particule virale
reconstituée in vitro (sans l'ARN) de la souche Dahlemense possèdent la
même mobilité électrophorétique (86).
L'ARN
nia donc pas d'influence
sur la mobilité électrophorétique du virion.
Ce sont les charges â la surface des particules virales qui
déterminent la mobilité électrophorétique.
Ces charges proviennent de
l'ionisation de groupements acides et basiques de certains acides aminés
(ex.: arginine et lysine).
La charge globale nette de la particule virale
dépend de l'acidité du milieu, il est donc essentiel d'opérer â un pH
donné et de maintenir ce pH constant pendant toute la durée de l'électro-
phorèse.
Cette dernière exigence dépend beaucoup du tampon d'électropho-
rèse et des limites de stabilité du virus â étudier.
Lors de l'électro-
phorèse de virions du ToMV, il faut aussi tenir compte du tampon et du
milieu de migration, celui-ci doit être si possible électriquement neutre.
Différents milieux sont utilisés pour satisfaire ces exigences dont les
plus courants sont les gels de polyacrylamide et d'agarose.
Les gels de
polyacrylamide ont d'abord été utilisés pour caractériser des virus_végé-
taux icosaédriques (119, 143), puis par la suite des virus en bâtonnets.
Wolf et Casper (175) ont montré, en 1971, qu'il est possible d'utiliser
des gels mixtes polyacrylamide (2,7 â 2,9%) - agarose (0,5%), pour étudier
les propriétés électrophorétiques des virions des virus en bâtonnets.
Beaucoup d'auteurs utilisent â l'heure actuelle soit des gels de poly-
acrylamide soit des gels mixtes polyacrylamide-agarose dans l'étude
électrophorétique des virus végétaux, en particulier le ToMV.
Ainsi, les
gels de polyacrylamide de 2,7 â 2,9% et d'agarose 1% avec un tampon Tris-
acétate-EDTA (pH 6 ou 7) ont été utilisés avec succès pour séparer divers
types de particules virales du groupe des Tobamovirus (7, 8).
L'utilisa-
tion des gels d'agarose â faible concentration (0,5 â 1%) dans l'étude
des propriétés électrophorétiques des virions de diverses souches des Toba-
movirus, dont le
ToMV, est beaucoup plus récente.
Les premières études
sur le sujet ont débuté dans ce laboratoire (7, 8), pour ce qui concerne
20
les virus végétaux, tandis qu'en virologie bactérienne, ces types de
gels sont utilisés couramment pour caractériser des virions de bactério-
phages (145).
Les principales propriétés physico-chimiques du virion du
ToMV sont résumées au tableau 1.3.5.
1.4
Propriétés biochimigues des principaux constituants du virion
1.4.1
Protéine de la capside
La protéine de la capside de tous les isolats connus du ToMV
est constituée de 158 résidus d'acides aminés (159, 169).
La séquence
de la chaîne polypeptidique est connue pour quelques souches telles que
Dahlemense et Y-TAMV (159, 174).
Le poids moléculaire de la protéine
de la capside de la souche Dahlemense est de 17 640 d (70, 174).
De
plus, la protéine de la capside du ToMV peut être enlevée partiellement
ou totalement de l'ARN en utilisant différents agents décapsidants, en
particulier des tampons à pH alcalin (140).
La glycine se révèle à ce
titre, être un excellent agent de décapsidation alcaline (68).
La dé cap-
sidation partielle est progressive et est initiée préférentiellement, sinon
exclusivement, à une extrémité (extrémité 5') de la particule virale.
Un
tel processus de décapsidation se dénomme une décapsidation séquentielle
et polaire (152).
Des particules virales du ToMV et de la souche commune
du TMV, soumises à la décapsidation partielle donnent lieu in vitro, à
la formation d'une série de nucléoprotéin~s~pt~eJlement décapsidées
/0'v
"r\\
de diverses longueurs (130, Dl, 171). IE:es/Ôernièt~s'i\\appeléespCVttic.ule.-o
pCVttie.Ue.me.nt dé.c.a.p~idé.e.-o (= P. P•D.) (f~ {~s.~ .':: PCVttia.Uy Sbtippe.d
V~~) peuvent être regroupées en diff~ntes classes ~68, 171). La dé-
capsidation totale par contre libère co\\~;lÀell]enL-.J:j(\\R~~/des interactions
, ' ,
c f
qu'il a avec la capside et il est ainsi p~~~î~~afétudier les caracté-
ristiques biochimiques de l'acide nucléique libéré.
1.4.2
Acide nucléigue ou ARN du ToMV
L'acide ribonucléique (ou ARN) du ToMV est un ARN à simple
brin positif, représentant 5% du poids du virion, soit d'un poids
TABLEAU 1.3.5~
Principales propriétés physico-chimiques du virion du ToMV
Propriétés
Références
Dilution limite de la sève infectée
lo-ltà 10- 6
168 ~ 20 ~ 70
Température d'inactivation
90-950 C
168~ 20~ 70
Durée de conservation de l'extrait viral
purifié à -20oC
> 4 ans
168
Rendement de la purification
760 mg/kg feuilles
168
Sensibilité aux pH alcalins
oui
140~ 152
Caractéristiques du spectre d'absorption de
llextrait:
Amax/Amin
1~10 (D.O.)
70
A260/A2BO
1~19 - 1,20 (D.O.)
Taille
300 x lB nm
70
Densité de flottaison du ToMV > à celle de Ul
oui
70
Point isoélectrique
4~50 - 4~64
70
Coefficient de sédimentation (S20, W)
177 - 190 S
70
Mobilité électrophorétique (pH 7,0~ force
ionique 0,75)
-0,97
70
Sérologie - immunogénéicité
assez immunogène
l
l
70
- titre
-
4 000
16 000
Poids moléculaire (PM)
40 x 10 6 d
70
N
~
22
moléculaire de 2 x 10 6 daltons.
L'extrémité 5' de l'ARN possède une
structure coiffe (cap) comportant un nucléotide renversé et modifié du
type m7 GS 'ppps'Gp (87, 177).
L'extrémité 3' peut être aminoacylée par
l'histidine (138).
La digestion complète de l'ARN du ToMV par la ribo-
nucléase Tl génère un oligonucléotide d'environ 73 nucléotides appelé
fragment oméga (84).
Ce fragment est contigu à l'extrémité 5' et est
dépourvu de G.
L'ARN du ToMV comme celui de Ul est formé d'environ 6 430 nu-
cléotides, et comporte différentes régions.
A partir de l'extrémité 5'
de l'ARN vers son extrémité 3', les portions suivantes peuvent être suc-
cessivement reconnues:
1)
la coiffe (ou cap) (87);
2)
un fragment de 71 à 73 nucléotides dépourvu de bases G
et appelé fragment oméga (84, 87);
3)
le gène codant pour deux protéines (de 160 et 117 Kd),
qui partagent une même portion de séquence.
La plus grosse des deux est
synthétisée lorsque le ribosome ne lit pas le codon d'arrêt (129);
4)
le gène 12 qui code pour une protéine de 30 Kd dont le
rôle exact n'est pas encore connu (73, 94);
5)
à la fin du gène 12 , se trouve le site d'encapsidation
(24, 55, 123);
6)
le gène de la protéine de la capside (74) et enfin,
7)
l'extrémité 3' qui peut être aminoacylée (138).
La plupart des auteurs supposent que l'ARN du TMV contient
l'information génétique suffisante pour assurer la synthèse d'au moins
quatre produits de gène (73, 94).
Le site d'encapsidation de l'ARN du
ToMV a été déterminé par reconstitution séquentielle du virion en utili-
sant des protéines virales de différentes souches, suivie de l'analyse
de la répartition de ces protéines par la sérologie spécifique en
microscopie électronique.
Ainsi, le site d'encapsidation se trouve à
environ 800 nucléotides à partir de l'extrémité 3' (54, 55, 123).
Ce
23
site est donc interne, et l'encapsidation se fait de façon bidirection-
nelle (de 3' vers 5' rapidement, et de 5' vers 3' beaucoup plus lentement).
La séquence des nucléotides de l'ARN du ToMV n'est pas con-
nue.
Des études d'hybridation moléculaire avec des ADN complémentaires
à différents ARN des Tobamovirus ont révélé l'existence de régions
d'homologie plus ou moins importantes entre la souche Dahlemense et les
souches virales suivantes:
Ul, U2, U5 et U6 (126, 163).
CHAPITRE 2
MATERIELS ET METHODES
Nos études de caractérisation des isolats du ToMV porteront
sur:
1)
la symptomatologie comparée de ceux-ci à l'aide d'une
gamme de plantes indicatrices (tabacs et tomate);
2)
leurs propriétés physico-chimiques:
mobilité électropho-
rétique des virions;
3)
les propriétés biochimiques de quelques-uns de ces iso-
lats:
composition en acides aminés de la protéine de la capside, et
4)
l'examen au microscope électronique de leurs virions.
Toutes les solutions et tous les tampons utilisés au cours
de nos expériences sont préparés à partir d'eau distillée et déminérali-
sée de conductivité inférieure à deux ~hmos.
Les centrifugations de
20 000 g et moins sont réalisées à l'aide d'une centrifugeuse
Intek~onaf IEC-B-20A utilisant les rotors du type 870 ou 872.
Les
centrifugations de
20 000 g et plus sont effectuées à l'aide d'une
25
ultracentrifugeuse Beckman L2-50 équipée d'un rotor R-30 ou SW-27<
Les
différentes étapes de l'extraction du virus se déroulent à froid (agita-
tion et conservation des extraits viraux sur de la glace).
Toutes les expériences concernant l'aspect symptomatologique
ont été menées en serre. Et après chaque série d'essais, une désinfection
complète de celle-ci est opérée avec une solution à 10% (p/v) de trisodium
orthophosphate.
2.1
Origine des isolats
"
Les isolats du virus de la mosaique de la tomate (ToMV) pro-
viennent de différentes régions productrices de tomates de serre de la
province de Québec.
Le tableau 2.1
et la figure 2.1 indiquent les loca-
lités d'origine des isolats étudiés.
2.2
Production des plants (de tabac et de tomate)
Trois cultivars de tabac et une variété de tomate ont été
utilisés au cours de nos essais;
ce sont respectivement Nicotiana
tabacum cv. Xanthi n.c., Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum cv.
Turkish Samsun et Lycopersicon esculentum cv. Vendor.
Le terreau,
composé de perlite, de vermiculite, de mousse de tourbe et de terre noire
suivant les proportions 1:1:1:3, est stérilisé à la vapeur (30 minutes
pour 0,36 m3 ).
A ce mélange s'ajoutent de la chaux hydratée (600 g/0,90
m3 de terreau) et du Super Phosphate 20% (525 9/0,90 m3 de terreau).
Les graines sont semées dans une caissette de 30 cm x 30 cm x
6 cm et le terreau est maintenu assez humide.
Trois semaines et un mois
après le semis, respectivement pour les tabacs et la tomate, les plantules
sont transférées individuellement dans de petits contenants de 5 cm x
5 cm x 5 cm, en prenant soin de ne pas abîmer le système racinaire.
Deux
semaines plus tard, les jeunes plants sont transplantés dans des pots en
plastique de 10 cm de diamètre par 10 cm de hauteur.
Les caissettes et
les pots sont arrosés hebdomadairement avec un mélange 20:20:20 de NPK
à raison de 6 g/L.
26
TABLEAU 2.1:
Origine, nombre et dénominations des isolats testés
Régions
Nombre
Dénominations
Localités
agricoles
d'isolats
provisoires
Beauce
03
5
2, 3, 5, 6, 9
Cap Saint-Ignace
02
1
12
Montréal
07
4
HV8, HV9, HVIo, HV11
Nicolet
04
3
4, 7, 8
13, 14, 15, 16, 17,
Québec
02
7
Rl, TSl
Sainte-Clothilde
07
1
HV5
Saint-Damase
06
3
HV6, HV7, 18
Saint-Jacques
10
1
HV2
Sainte-Julie
06
1
1
Saint-Laurent-de-
09
1
HV4
Gonzague
Saint-Louis-de-France
11
1
10
Saint-Rémi
07
1
11
Saint-Roch-sur-
06
2
HV1, HV3
Richelieu
~
---1
9
L._
.......
-'--
,
....... -,
"
)
\\
""
"
'-
"
" ...
'.
...
'.
",.
\\.
,
" ....
6) L'Est de Montréal
Régions agricoles:
7) Sud-ouest de Montréal
1) Bas Saint-Laurent, Gaspésie, Iles-de-la-Madeleine
8) Région adricole de l'Outaouais
2) Rives nord et sud du Saint-Laurent
9) Le Nord-O~est québécois
3) Beauce, Dorchester, Mégantic, Frontenac
10) Rive Nor~ du fleuve Saint-Laurent
4) Nicolet
11) La Mauric!ie
5) Les Cantons de l'Est
12) Saguenay :- Lac Saint-Jean
N
--.,J
Figure 2.1:
Carte de situation des localités d'origine des isolats
28
Les conditions ambiantes des serres sont les suivantes:
la
température est d'environ 280 C le jour et de 21°C la nuit, toutefois du-
rant les périodes chaudes (été), des élévations sporadiques de la tempéra-
ture (30 à 35 0 C) peuvent être enregistrées.
Les serres sont équipées d'une
série de tubes fluorescents (type Gro-Lux WS, Sylvania) qui fournissent un
éclairage d'appoint de 221 ~E m- z sec- 1 (= 17 000 lumen/m Z ) afin d'assu-
rer une photopériode de 16 heures.
La protection des plants est assurée par une fumigat40n hebdo-
madaire en utilisant en alternance de la Nicotine fumigène (14,8 g de
matière active pour 300 m3 ) et du Sulfotep (Il g de matière active pour
traiter 283,2 m3 ), vendus sous les noms commerciaux respectifs de Plant-Fume
N~Qotine et Piant-Fume # 103 (Plant Product Co.). Les figures 2.2(1) et 2.2(2)
illustrent les différentes étapes de la production des plants de tabac.
2.3
Obtention des isolats
De jeunes plants de N~Qo~na tabaQum cv. Xanthi n.c. (au
stade cinq à sept feuilles) et N~Qo~na ~yiv~tk~ (huit à dix feuilles)
sont utilisés à cet effet.
Des rondelles d'environ 0,5 cm de diamètre
sont prélevées sur les feuilles des tomates malades et sont broyées sur
des spatules de verre dans une goutte de tampon phosphate (Na zHP0 4 /NaH 2 P0 4 )
D,lM est ajoutée à pH 7,4.
Une pincée de Célite 545 (Fisher) est ajoutée
à l'extrait avant l'inoculation.
Cette dernière est réalisée à l'aide de
spatules de verre qui permettent de frotter légèrement la surface foliaire
supérieure des tabacs.
Après cette opération (généralement une à deux
minutes après), les plants sont lavés avec de l'eau courante, et sont con-
servés sous éclairage continu pendant deux à trois jours, le temps néces-
saire pour l'apparition des lésions locales.
Cette opération est répétée
pour chaque isolat, en prenant toutes les mesures hygiéniques nécessaires
pour éviter la contamination d'une inoculation à l'autre.
Chaque isolat
est normalement inoculé à un seul plant de N~Qo~na tabaQum cv. Xanthi
n.c.
Le transfert des lésions locales à d'autres plants de N~Qo~na
tabaQum cv. Xanthi n.c. se réalise le troisième jour après l'inoculation
en suivant la même procédure que celle décrite précédemment.
Cette opéra-
tion est répétée deux à trois fois avant de les inoculer définitivement à
des plantules de N~Qo~na ~yiv~tk~.
Sur ce dernier plant aussi, nos
isolats ont été obtenus par deux à trois passages successifs.
Figure 2.2 (1):
Etapes de la production des plants de ~~bac
A)
Semis
B)
Repiquage des plantules dans une caissette
C)
Transplantation des tabacs dans des pots
en plastique de 10 cm x 10 cm
.~
Figure 2.2 (2):
Etapes de la production des plants de tabac
D)
Nicotiana tabacum cv. Xanthi
E)
Nicotiana sylvestris
F)
Nicotiana
tabacum cv. Turkish Samsun
/
30
2.4
Multiplication du virus
Parmi les lésions locales obtenues sur N~cotiana ~ylv~~~,
celles qui sont bien individualisées et représentatives de l'ensemble des
lésions, sont transférées à de jeunes plants de N~cotiana tab~cum cv.
Turkish Samsun de huit à dix feuilles (une lésion locale par plant).
Ce
dernier cultivar de tabac produit des symptômes systémiques lorsque inoculé
avec du ToMV.
Environ dix jours après l'inoculation, les plants qui mon-
trent de la mosaique ou de la marbrure sont utilisés pour inoculer d'autres
tabacs N~coti~na tab~cum cv. Turkish Samsun, ceci afin d'assurer la multi-
plication massive de nos isolats.
Des plants de cinq à sept feuilles de
Lycop~~~con ~culentum cv. Vend or ont été également utilisés pour les
mêmes fins.
2.5
Extraction et purification du virus
Deux à trois semaines après l'inoculation de N~coti~na tab~cum
cv. Turkish Samsun et de Lycop~~~con ~culentum cv. Vendor suit l'extrac-
tion du virus à partir des feuilles de ces plantes.
la méthode d'extrac-
tion est la même pour tous les isolats indépendamment du matériel végétal
(tabac ou tomate).
les feuilles infectées sont collectées et congelées à
-20oC jusqu'au moment de l'extraction.
la méthode de purification utili-
sée est celle décrite par Gooding et Hebert (63) avec de légères modifica-
tions.
le matériel végétal congelé est d'abord émietté et une quantité
appropriée du tampon d'extraction y est ajoutée.
Ce dernier est constitué
de:
1)
tampon phosphate 0,05M à pH 7,4 (2 ml/g de tissu
foliaire);
2)
0,1% (v/v) de 2-mercaptoéthanol (ajouté au moment du
broyage).
le tout est broyé à froid dans un homogénéisateur (Waring Blendor 18-3
type SJT) d'une capacité de un litre.
le broyat est filtré au travers
de quatre couches de mousseline.
Au filtrat, constamment agité, du
n-butanol est lentement ajouté à raison de 9,3 ml par 100 ml d'extrait.
31
l'agitation est poursuivie après l'additiGn du n-butanol pendant 45 minutes
encore, et la suspension est ensuite centrifugée pendant 30 minutes à
15 000 g (rotor 872).
le surnageant est récupéré délicatement, et à celui-
ci est additionné du polyéthylène glycol 6000 (PEG 6000) (4 gr pour 100 ml
de surnageant), et une fois la dissolution de ce dernier produit assurée,
le tout est laissé au repos pendant 30 minutes.
Après une deuxième cen-
trifugation de 30 minutes à 15 000 g, le culot est récupéré et resuspendu
dans du tampon phosphate O,OlM à raison de 20 ml du tampon pour 100 ml
d'extrait initial.
Cette nouvelle suspension est centrifugée 15 minutes
à 15 000 g.
le surnageant est repris et 4 g de PEG 6000 plus 4 gr de NaCl
y sont ajoutés pour 100 ml de suspension clarifiée.
la suspension bien
dissoute est conservée à froid pendant 45 minutes environ.
Une nouvelle
centrifugation de 15 minutes à 13 000 g s'en suit.
le culot est remis en
suspension dans du tampon phosphate O,OlM à pH 7,0 (2 ml du tampon pour
100 ml d'extrait initial).
Après une courte centrifugation de cinq minu-
tes à 13 500 g, 1% du Triton X-IOO est ajouté au surnageant.
Une agitation
r
d'au moins 45 minutes précède l'addition d'une solution de saccharose à 20%
(5 ml de cette solution pour 10 ml de suspension virale).
Une ultracentri-
fugation de 80 000 g pendant 100 minutes est ensuite réalisée.
Au culot
est additionnée de l'eau stérilisée, et après dissolution, suit une cen-
triFugation de 20 minutes à 13 500 g.
le surnageant est récupéré.
les
différents extraits viraux sont conservés à 40 C au réfrigérateur, après y
avoir ajouté une goutte de toluène et une goutte de formol.
la quantité
de virus extraite est évaluée par un dosage spectrophotométrique à 260 nm
et à 280 nm (Spectronic 2000, Bausch et lomb).
Sachant que l mg de virus
par ml correspond à 3 O.D. (O.D. = densité optique) à 260 nm.
le rapport
des absorbances à 260 et à 280 (A280/A260) est aussi calculé.
2.6
Etude électrophorétigue des isolats en gels d'agarose
2.6.1
Conditions d'électrophorèse
les gels d'agarose utilisés au cours de nos expériences ont
une concentration de 1% (p/v) et l'électrophorèse se fait à l'horizontale.
la composition de tels gels est la suivante:
60 ml d'eau et 0,9 g
d'aga-
rose (Bio-Rad, Standard low-mr) sont passés à l'autoclave pendant 15
32
minutes à la température de 1150 C environ.
A la sortie de l'autoclave, à
la suspension d'agarose sont ajoutés 30 ~L du tampon d'électrophorèse 3X.
Lorsque la température de la solution atteint environ 500 C,
cette dernière
est versée sur une plaque de verre de 16 cm x 20 cm x 0,2 cm dont les
côtés sont scellés avec du ruban adhésif de vinyle
Une matrice de bak~t~
pour former des puits a été préalablement installée à 3 mm au-dessus de la
plaque de verre et à environ 4 cm d'une de ses extrémités.
On laisse le
gel d'agarose se solidifier à la température de la pièce pendant une heure
avant de l'utiliser.
Le gel et son support de verre sont déposés sur un
appareil à électrophorèse en plastique (pf~xig~) fabriqué dans notre labo-
ratoire.
Le tampon d'électrophorèse (lX) habituellement utilisé est celui
de Loenig (98) constitué de 40 mM de Tris-20mM d'acétate de sodium et lmM
d'EDTA, et son pH est ajusté à 7,0 avec de l'acide acétiq~e (HAc).
De
bons résultats ont été aussi obtenus en ajustant le pH avec de l'acide
chlorhydrique concentré (HClconc.).
Les deux compartiments de l'appareil d'électrophorèse sont rem-
plis avec le tampon lX.
L'électrophorèse se déroule à la température de
la pièce à un voltage constant de 40 volts pendant 16 heures.
2.6.2
Préparation des échantillons pour l'électrophorèse
Des volumes variables d'extrait viral sont dissous dans une
quantité appropriée d'eau pour atteindre un volume final de 45 microlitres
(~L) par puits.
Les concentrations des extraits purifiés mis sur gels
varient de 0,65 à 1,3 ~g de virus par ~L de suspension virale.
Les échan-
tillons ainsi préparés sont généralement conservés au réfrigérateur avant
leur dépôt dans les puits du gel.
L'échantillon est directement déposé
dans le fond du puits, suivi par une pré-électrophorèse de 20 à 30 minutes
à 40 volts pour permettre aux particules virales de bien pénétrer dans le
gel.
Ensuite les puits sont complètement scellés avec une solution
d'agarose 1% (plv).
33
2.6.3
Coloration des gels et leur conservation
2.6.3.1
Coloration au bromure d'éthidium
Les gels d'agarose sont plongés dans une solution fraîche de
bromure d'éthidium (2 ~g/mL) (Bio-Rad, grade électrophorèse) et maintenus
à l'obscurité sans agitation pendant une heure.
Ensuite, ils sont décolo-
rés dans l'eau pendant cinq à dix minutes.
La visualisation des bandes se
fait à la lumière ultraviolette à l'aide d'un transilluminateur (modèle
C-61, Ultraviolet Products Co., San Gabriel, Californie, U.S.A.).
Les
photographies des gels sont prises à l'aide d'un appareil polaroid
(Polaroid MP3) avec un film positif/négatif du type 55 de la même compa-
gnie.
2.6.3.2
Coloration au bleu de Coomassie R-250
Les gels sont immergés pendant une heure dans une solution de
coloration constituée à:
1)
50% de méthanol (v/v)
2)
0,2% (p/v) de bleu de Coomassie R-250, et
3)
10% (v/v) d'acide acétique glacial, ajouté au moment de
l'utilisation.
La décoloration des gels est obtenue en utilisant une solution
dont la composition est identique à celle utilisée pour la coloration sans
le bleu de Coomassie.
L'opération de décoloration dure de six à dix heures
avec plusieurs changements fréquents du décolorant.
Une fois les gels
décolorés, ils sont conservés dans une solution d'acide acétique glacial
7% (v/v).
Les bandes sont généralement observées au-dessus d'une source
lumineuse.
34
2.7
Elution des bandes de monomères séparées dans un gel d'agarose
2.7.1
Conditions d'élution
Les gels dont les bandes vont être éluées ont été préparés de
façon identique à ceux décrits aux sections 2.6.1 et 2.6.2.
Après la colo-
ration au bromure d'éthidium (section 2.6.3.1), les gels sont visualisés
au transilluminateur (modèle C-62) pour localiser correctement les bandes
de monomères.
Des rondelles correspondant aux bandes de monomères sont
délimitées dans le gel à l'aide d'un emporte-pièce.
Chacune de ces rondel-
les d'agarose est d'abord transférée sur du parafilm (partie stérile) et
ensuite hâchée finement avec un scalpel stérile.
Les morceaux d'agarose
sont transférés dans une colonne de plastique stérile de ID mL du type
EQonoQoionne (Bio-Rad).
Le tout est centrifugé à 8 500 g (rotor 870) pen-
dant dix minutes.
Après la centrifugation, l'extrémité de la colonne est
coupée et le jus obtenu (ou éluat) est récupéré dans un tube du type
Eppendo~6 de 1,5 mL.
L'éluat est conservé à 40 C.
Le reste du gel est
coloré au bleu de Coomassie R-25D, ce qui permet de vérifier la qualité de
l'élution du contenu des bandes.
2.7.2
Inoculation des éluats aux plants de tabac
Les éluats provenant des bandes de monomères sont inoculés à
des plantules de Nicotiana tabacum cv. Xanthi n.c. et de N. sylvestris à
raison de 50 ~L par plant dans chaque cas.
Après deux transferts succes-
sifs sur N. sylvestris, les lésions locales obtenues sont transférées à
de jeunes plants de N. tabacum cv. Turkish Samsun.
Le virus est purifié
à partir de ces derniers plants.
2.8
Electrophorèse comparée des isolats avant et après l'élution du
contenu des bandes des gels d'aqarose
Les isolats viraux obtenus à partir des gels élués ont été com-
parés quant à leur mobilité électrophorétique dans les mêmes conditions de
gel d'agarose (section 2.6.1).
35
2.9
Composition en acides aminés de la protéine de la capside de
quelques isolats
2.9.1
Extraction de la protéine de la capside
la protéine de la capside est extraite en dégradant l'extrait
viral purifié avec de l'acide acétique suivant la méthode décrite par
Fraenkel-Conrat (53) en y incluant de légères modifications.
A deux volu-
mes d'acide acétique glacial très froid (sur la glace) est ajouté un volume
d'extrait purifié du virus.
le tout est agité lentement pendant 10 à 15
minutes, puis centrifugé dix minutes à 13 500 g.
Au surnageant obtenu
sont ajoutés trois volumes d'eau.
la solution de protéines est ensuite
dialysée à froid pendant 24 heures contre de l'eau distillée déminéralisée
stérile, incluant de fréquents changements de l'eau.
les sacs à dialyse
(Spectrapor R type 8-670A, MW 6000-8000) sont préalablement lavés à l'eau
et à l'EDlA.
A la fin de la dialyse (24 à 48 heures), il se forme un pré-
cipité blanchâtre.
Ce dernier est récupéré et est centrifugé à 80 000 g
pendant une heure.
le culot obtenu est dissout dans 10 ml d'eau à pH 8,0
(ajusté avec NaOH).
Puis une ultracentrifugation identique à la première
est effectuée et le surnageant est conservé.
la quantité de protéine de
la capside obtenue est évaluée par dosage spectrophotométrique en assumant
que l mg de protéine par ml correspond à 1,27 0.0. à 282 nm.
2.9.2
Hydrolyse acide des protéines virales
la procédure d'hydrolyse acide des protéines, se déroule sui-
vant les étapes suivantes:
1)
l ml d'acide chlorhydrique (HCl, 6N en concentration
finale) est ajouté à 10 mg de protéines virales contenues dans un tube à
hydrolyse;
2)
après avoir introduit par barbotage, dans le tube à
hydrolyse un jet d'azote, on le ferme soigneusement;
3)
le tube est chauffé à 1100C pendant 72 heures;
4)
généralement à la fin de l'étape (3), il apparaît un pré-
cipité plus ou moins brunâtre.
le tout est filtré sur du papier Whatman
36
-~ _No l, et le filtrat est transféré dans un ballon à évaporer;
5)
l'excès d'acide chlorhydrique est éliminé par évaporation
à sec à 490 [ dans un bain-marie (évaporateur type Rotavapor R
B~hl);
6)
le résidu obtenu dans le ballon est repris avec de l'eau
distillée stérile;
7)
l'opération de l'étape (5) est répétée;
8)
le résidu obtenu cette fois-ci est repris avec un tampon
citrate (citrate de sodium 0,2N, pH 2.2);
9)
la solution est enfin filtrée sur du papier millipore
(0,22 w) et le filtrat est conservé.
2.9.3
Dosage des acides aminés
Les échantillons à analyser sont d'abord injectés dans une
capsule d'une capacité de 5 à 80 WL, à l'aide de pipettes ajustables
(Pippetman).
Une solution standard sert à calibrer l'appareil.
Des quan-
tités variables de protéines (3 Wg à 20 Wg) correspondant à des volumes
de 25 à 30 WL sont injectées dans les capsules qui sont ensuite introdui-
tes dans l'analyseur.
~ composition en acides aminés des protéines de
la capside des cinq isolats choisis est déterminée sur l'analyseur auto-
matique LKB 4400.
Un calculateur monocanal et une imprimante fournissent
les données chiffrées à partir du chromatogramme sous la forme du temps
de rétention, de surfaces des pics, de facteurs de calcul et d'unités de
concentration.
A partir du chromatogramme et des concentrations, la quan-
tité de chaque acide aminé est déterminée en moles par sous-unité protéi-
que à partir des relations suivantes:
(1)
N
- (II.J
+ Y)
x
AA
TRP
=
(2)
P
N
= X· (AA)
37
où
Nt
nombre total des nanomoles (concentration)
NAm
concentration d'ammoniaque
NAA
nombre total d'acides aminés dans chaque sous-unité protéique
(pour le ToMV = 158)
N
nombre de résidus de tryptophane dans une sous-unité protéique
TRP
Y
nombre de résidus de tout autre acide aminé non dosé
N
nombre de résidus de chaque acide aminé contenu dans une mole
de protéine
(AA)
concentration de chaque acide aminé
(en nanomoles).
Le nombre de résidus du tryptophane est estimé par mesure spectrophoto-
métrique suivant la méthode de Spies et Chambers (150).
A une suspension
virale contenant 10 à 50 mg du virus est ajouté du NaOH pour une concen-
tration finale de D,IN.
L'absorbance de cette suspension est déterminée
(Spectronic 2000 Bausch et Lamb) à 294,4 nm et à 280,0 nm.
A partir des
relations (1) et (2) ci-dessous, le rapport molaire tyrosine/tryptophane
est calculé:
mM(TYR)
= 0,592 x A294,4 - 0,263 x A280
(1)
mM(TRP)
= 0,263 x A280 - 0,170 x A294,4
(2)
Des données obtenues de l'analyseur automatique pour la tyrosine, on en
déduit la concentration en tryptophane à partir du rapport molaire.
La
cystéine n'est pas directement dosée, mais elle est obtenue par différence
en tenant compte des données du chromatogramme.
2.10
Etude de quelques caractéristiques de l'ARN du ToMV
2.10.1
Isolement de l'ARN
Toutes les étapes de la technique d'extraction doivent être
réalisées à froid, et le port de gants en plastique stériles est indis-
pensable.
Les tubes servant à la centrifugation ou à l'ultracentrifuga-
tian sont habituellement siliconisés.
A l'équivalent d'environ 10 mg du virus, est ajouté 1/20
de volume du dodécyl sulfate de sodium (SOS 20%) (v/v) et le mélange est
38
chauffé à 75-80oC pendant 30 à 45 secondes, ce qui rend le liquide limpi-
de.
Un volume du phénol saturé à l'eau est ajouté, et la suspension est
agitée pendant cinq minutes avant d'être centrifugée à 8 500 g.
le phénol
a été préalablement distillé et il contient 0,1% (v/v) du 2-mercaptoéthanol.
Après la centrifugation, la phase aqueuse est prélevée et elle est de
nouveau mélangée à un volume du phénol saturé à l'eau et recentrifugée.
A la nouvelle phase aqueuse résultante sont ajoutés, 2,5 volumes d'étha-
nol 99% très froid (à -200 C) et 1/10 du volume d'acétate de sodium 2M,
pH 5,0.
Ce dernier mélange est incubé pendant 18 heures à -20oC avant
d'être centrifugé à 13 500 g pendant dix minutes.
le culot est asséché
sous un jet doux d'azote, puis resuspendu dans de l'eau stérile.
l'ARN
est dosé en sachant que l mg d'ARN par ml correspond à 25 0.0. à 260 nm.
les solutions d'ARN sont conservées à -80oC avant d'être utilisées plus
tard.
2.10.2
Migration électrophorétigue de l'ARN
l'étude électrophorétique des ARN extraits a été effectuée
dans un gel d'agarose 1% en utilisant un tampon borate (40mM) - EDTA
(lmM) à pH 8,0.
les conditions d'électrophorèse sont les mêmes que
celles décrites précédemment (section 2.6.1), mais le voltage maintenu
constant est de 30 volts, pour une durée de 16 heures.
Après l'électro-
phorèse, les gels sont colorés au bromure d'éthidium (10 ~g/ml).
les
bandes ont été révélées à l'aide d'un transilluminateur U.V. (modèle
C-61).
la mobilité électrophorétique des acides nucléiques est étudiée
aussi dans un gel d'agarose 1% en conditions dénaturantes suivant la
méthode décrite par McMaster et al. (108).
2.11
Observation au mlcroscope électronigue de coupes dans une feuille
de tomate virosée et d'extraits purifiés de virus
2.11.1
Réalisation des coupes dans du tissu foliaire de tomate
virosée
Une foliole d'un plant virosé est fixée avec de la glutaral-
déhyde 1% (v/v) dans du tampon cacodylate à pH 7,4, pendant six heures à
39
la température de 4°C.
Après cette opération suivent trois lavages de 30
minutes dans du tampon cacodylate à pH 7,4 à 40 C.
La seconde fixation
est réalisée avec du
tétroxyde
d'osmium 1% pendant trois heures à 4°C.
Après cette fixation, deux lavages de 30 minutes chacun sont réalisés
avec de l'eau à la température de la pièce.
Et suivent alors diverses
séries de déshydratations, d'abord une première série de 30 minutes cha-
cune dans différentes solutions d'alcool à 25%, 50%, 75% et 90%.
Quatre
autres déshydratations de 15 minutes chacune sont réalisées dans l'alcool
à 100%.
Tout le cycle de déshydratation se déroule à la température de
la pièce.
L'enrobage est effectué avec de l'Epon 812 (résine époxyque)
et des coupes ultrafines sont réalisées au microtome.
Celles-ci sont
colorées dans de l'acétate d'uranyle à 1,5% (v/v) pendant une à deux minu-
tes puis dans du citrate de plomb (1,4 g/lOO mL) pendant deux minutes.
Les coupes sont ensuite observées à l'aide d'un microscope électronique
du type Siemens 101.
2.11.2
Observation des extraits purifiés du virus au microscope
électronigue
Un volume d'environ 5 ~L d'extrait purifié du virus (ou
parfois d'échantillons élués de gels) est déposé sur un support de toile
de cuivre (ou grille) de 400 mesh, recouverte de ButVaA 0,75%.
Après
deux minutes, la grille est épongée puis asséchée à l'air.
La colora-
tion négative est réalisée en déposant sur la grille, une goutte de 5 ~L
de 1% (p/v) d'acide phosphotungstique à pH 7,0 pendant 35 secondes.
La
grille, épongée, est asséchée à l'air.
Les préparations sont examinéss à un grossissement de
40 OOOX, à l'aide d'un microscope à transmission Siemens 101.
Différen-
tes sections des préparations sont photographiées et les épreuves photo-
graphiques finales représentent un agrandissement supplémentaire de 2,7
ou 3,6X.
Les mesures finales des dimensions des particules virales sont
réalisées directement sur les photographies.
Les virions du TMV sont
généralement utilisés comme unité de mesure de référence, en prenant pour
acquis que la particule virale a des dimensions de 18 nm x 300 nm (176).
CHAPITRE 3
RESULTATS ET DISCUSSION
3.1
Symptomatologie comparée des isolats
3.1.1
Nicotiana tabacum cv. Xanthi n.c.
Tous les isolats ont produit des lésions locales sur cette
plante indicatrice.
Ces lésions nécrotiques sont très variables en
taille et sont souvent de couleur grisâtre.
Généralement trois groupes
de lésions locales ont été dénombrés, et se répartissent en lésions:
1)
petites ayant moins de l mm de diamètre;
2)
moyennes de 2 mm de diamètre environ, et
3)
de grande taille, de 3 mm et plus de diamètre.
Les trois catégories de lésions locales peuvent être obser-
vées sur la même feuille en nombre variable (figure 3.1.1).
40
41
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Figure 3.1.1:
Lésions locales nécrotiques produites sur une feuille
de Nicotiana'tabacum cv. Xanti, trois jours après
l'inoculation (isolat HV7).
LE:S- feuilles ont été saupoudrées avec de la Célite 545.
L'inoculation a été faite avec une spatule de verre sté-
rilisée.
Les plants sont conservés sous éclairage conti-
nu pendant 72 heures après l'inoculation.
(Les chiffres au bas de la photographie donnent une idée
de la taille des lésions)
42
3.1.2
Nicotiana sylvestris
Les isolats testés ont induit des lésions locales brunes de
forme variable sur ce tabac (figure 3.1.2).
Trois catégories de lésions
nécrotiques peuvent être définies suivant leur taille:
1)
de petites lésions d'environ 0,5 mm de diamètre;
2)
des moyennes de l mm de diamètre environ, et
3)
de grandes lésions nécrotiques de 2 mm et plus de diamètre.
En plus de cette variabilité dans la taille des lésions loca-
les, il a été noté pour certains isolats, l'existence d'une mosaïque
verte ou jaune sur les feuilles non inoculées.
Si nous considérons qu'un
isolat peut être constitué de plusieurs souches virales en mélange, ces
cas peuvent s'expliquer aisément.
Compte tenu de ces faits, plusieurs
passages successifs sur N. sylvestris ont été nécessaires au cours de nos
expériences d'isolement pour favoriser la multiplication du ToM V par rap-
port à d'autres souches systémiques du TMV.
Cette variabilité dans la
taille des lésions locales d'isolats du ToMV a été remarquée par diffé-
rents chercheurs (29, 121, 153).
En effet, en 1974, Takahashi (153),
signale que la taille des lésions locales varie suivant le site d'inocu-
lation, l'âge et la position de la feuille inoculée.
Cassels (29), en
1977 dans une étude similaire, a noté que les lésions présentent une
variation dans leur forme et leur taille, et que les jeunes feuilles
produisent des lésions locales beaucoup plus variables que les vieilles
feuilles.
Le même auteur a également essayé d'établir une relation entre
la taille des lésions locales et la sévérité des symptômes provoqués par
celles-ci sur certaines plantes indicatrices.
Il a indiqué aussi qu'il
est possible de séparer des souches virulentes du ToMV de celles peu
virulentes, utilisées dans des essais de prémunition, en se basant uni-
quement sur la taille des lésions locales qu'elles induisent sur des
plantes indicatrices.
Nos observations préliminaires supportent partiellement cer-
taines des conclusions avancées par ces auteurs.
En effet, une varia-
bilité dans la taille des lésions nécrotiques suivant l'âge des feuilles
a été observée au cours de nos essais.
Aucune étude systématique n'a
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Figure '3'.1.2 Lésions locales nécrotiques induites par l'isolat HV2 sur une
feuille de Niaotia'na- sy.lvestri$. _.
trois jours après l'inoculation.
Lès conditions d'inoculation sont identiques à celles décrites à
la figure 3.1.1.
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CIo)
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r~ ,~
44
cependant été menée dans notre cas, nous ne pouvons donc pas affirmer
qu'il est possible de distinguer entre des souches virulentes et peu
virulentes du ToMV en utilisant le seul critère de la variabilité de la
taille des lésions locales.
La question mériterait une étude plus dé-
taillée.
Cependant, cette observation nous a conduit à ne choisir parmi
les lésions locales produites sur les tabacs que celles qui sont repré-
sentatives de l'ensemble des lésions nécrotiques.
3.1.3
Ni coti ana tabacum cv. Turkish Samsun
Tous les isolats étudiés ont induit des symptômes de mosaïque
verte, plus ou moins sévères sur cette plante (figure 3.1.3).
Cependant,
quelques caractéristiques symptomatologiques différencient les isolats
et nous permettent de distinguer les grands groupes suivants.
Le groupe
(1) rassemble les isolats HV2 et HV6 qui induisent de la mosaïque verte,
faible à moyenne, souvent sans symptôme nécrotique sur les feuilles de
la strate basale.
Dans le groupe (II), se retrouvent les isolats HV1,
HV3, HV7, HV8, HV9, HVll, l, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17,
Il
Rl et TS1, dont les symptômes systémiques consistent en une mosaique verte,
faible à moyenne, en plus des symptômes nécrotiques plus ou moins sévères
sur les feuilles des strates basale et moyenne.
Le groupe (III) est celui
Il
des isolats, HV4, HV5, 7, Il, 16 et 18, qui induisent une mosaique verte,
moyenne à forte, accompagnée d'une déformation des feuilles apicales.
Le
groupe (IV) comporte le seul isolat HVIO qui présente surtout une marbrure
généralisée.
La présence de symptômes nécrotiques induits par certains
isolats du ToMV sur le limbe de cultivars du tabac, en été ou en hiver,
a été observée par Rast (135) et ce phénomène a été confirmé au cours de
nos essais en serre.
En effet, les isolats, surtout ceux du groupe (II)
présentent des symptômes nécrotiques sur les feuilles du tabac Turkish
Samsun, en hiver pour certains isolats, et en été pour d'autres.
Ces
taches nécrotiques connaissent une progression lente de la strate
foliaire basale vers la moyenne.
Les causes d'une telle symptomatologie
variable avec la saison ne sont pas clairement établies.
~
o
Figure 3.1.3:
Symptômes de mosa~que verte induits par l'isolat "11" sur Nicotiana
tabacum cv. Turkish Samsun, 19 jours après l'inoculation.
Les feuilles ont été saupoudrées avec de la Célite 545.
L'inocula-
tion a été réalisée avec une spatule de verre stérilisée.
Les
pla~ts ont été maintenus en condition de phûtopériode de 16 heures
~
U1
46
3.1.4
Lycopersicon esculentum cv. Vendor
Les symptômes foliaires observés consistent essentiellement
en une mosaïque verte d'intensité variable suivant les isolats en cause
(figure 3.1.4-1).
Les premiers symptômes de l'infection se révèlent par
l'apparition d'une marbrure plus ou moins diffuse, puis après deux à
trois semaines, apparaît de la mosaïque verte, et dans certains cas, un
liseré des nervures fort prononcé.
Parfois aussi les feuilles apicales
se déforment (légèrement gaufrées), et les vieilles feuilles peuvent
jaunir.
Certains isolats n'induisent pas de symptômes foliaires, mais
le virus s'y multiplie abondamment.
En effet, lorsque des extraits de
ces plants, apparemment sains, sont utilisés pour inoculer des plantules
de tabac (N. tabacum cv. Xanthi n.c. et N. sylvestris) , de fortes quanti-
tés de lésions locales sont obtenues.
De plus, une coupe faite dans le
tissu foliaire de plants de tomate moyennement infectés, révèle après un
examen au microscope électronique que les cellules sont gorgées de
particules virales (figure 3.1.4-2).
Comme cela a été fait pour les autres plantes indicatrices,
nos isolats peuvent être regroupés en trois grandes catégories suivant
les symptômes qu'ils induisent sur ce cultivar de tomate:
1)
le groupe (1) est caractérisé par l'absence de mosaïque
foliaire visible.
Il rassemble les isolats suivants: HV1, HV2, HV6, HV8,
HV9, l, 12, 15 et 16;
"
2)
les isolats du groupe (II) produisent de la mosaique
verte faible avec parfois un liseré des nervures.
Ce sont les isolats
HV7, HVll, 2, 5, 7, 8, 13, 14, 17, Rl et T51;
3)
la catégorie (III) regroupe tous ceux qui induisent une
"
mosaique verte sévère avec un liseré des nervures accompagné de déforma-
tions des feuilles apicales et parfois d'un retard dans la production .
des fleùrs.
Ce sont les isolats:
HV3, HV4, HV5, HVIO, 3, 4, 6, 9, 10,
11 et 18.
Nous n'avons pas observé au cours de nos différentes séries d'expériences
en serre (durée moyenne d'un mois), l'apparition de symptômes nécrotiques
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Figure 3.1.4 (1):
Syw.ptômes de mosalque verte sur une folIole de tomate (Lycoper-
sicon esculentum cv. Vendor), suite à l'inoculation de cette
plante par l'isolat "Il".
La photographie a été prise 19 jours apr~s l'infection artifi-
cielle.
Les conditions du traitement sont les mêmes que celles
de la figure 3.1.3
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i·
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o
1
-"- ~.
Figure 3.1.4 (2):
Microphotographie d'une coupe transversale dans une
/
foliole de tomate virosée observée au microscope
électronique (Siemens 101). grossissement 40 OOOX
V: particules virales
.~
c:»
/i
49
sur cette variété de tomate.
Le cultivar de tomate Vendor possède le gène
Tm~l (un des trois gènes de résistance au TMV) (57), alors nos isoiats peu-
vent être répartis dans deux groupes de Pelham, les groupes 0 et 1.
Cette information est fort utile pour le sélectionneur et aussi pour le
producteur.
Tous les deux doivent chercher à obtenir et à utiliser des
variétés résistantes possédant au moins deux des trois gènes de résistance
identifiés (Tm-l, Tm-2 et Tm-2 2 ).
La variabilité mise en évidence au sein de nos isolats du
ToMV
peut être aussi utilisée pour des études de prémunition.
En effet,
différents isolats identifiés (HV1, HV2, 15 et 16) sont stables et très
infectieux, et sont donc susceptibles de servir de souches protectrices
dans une expérience de prémunition.
Cependant, nous devons exprimer
quelques réserves concernant cette méthode de lutte contre les maladies
virales.
Nos réticences pour l'utilisation d'un tel moyen de lutte au
Québec s'expliquent.
La prémunition utilisée comme une méthode de con-
trdle des viroses de la tomate de serre est relativement dangereuse.
Il
a été démontré dans certains pays européens où cette pratique est très
courante (20, 47, 52, 135), que les souches peu virulentes n'assurent
qu'une compétition faible ou peu efficace à l'égard des autres souches
du ToMV qui sont soit issues de mutation, soit provenant de contamina-
tions diverses (52, 103).
Ces nouvelles souches virales peuvent se mul-
tiplier plus vite que la souche protectrice et constituer ainsi des pro-
blèmes plus graves pour le serriculteur.
3.2
Purification des isolats
Tous les isolats du ToMV ont été extraits et purifiés à par-
tir de N. tabacum cv. Turkish Samsun.
Les rendements moyens de purifica-
tion de nos différents isolats sont de l'ordre de 760 mg de virus par
kilogramme de feuilles (poids frais), avec des extrêmes de 200 et l 600
mg de virus par kilogramme de feuilles.
Les rapports des densités opti-
ques à 280 nm et à 260 nm (A280/A260) sont de l'ordre de 1,20, avec des
extrêmes de 1,10 et 1,21.
Il est préférable d'extraire le virus à partir
des plants de tabac (N. tabacum cv. Turkish Samsun) plutôt qu'à partir
de tomate.
Les extraits viraux issus de tissus de plants de tomates sont
généralement plus contaminés par des constituants cellulaires et la
so
quantité de virus obtenue est plus faible.
Ceci confirme des résultats
déjà obtenus par d'autres auteurs (70, 168).
Une amélioration de la
technique d'extraction du virus s'impose afin de minimiser certains phé-
nomènes particuliers observés au cours de nos expériences comme l'agréga-
tion des virions.
Ce but pourrait probablement être atteint en apportant
de légères modifications aux conditions actuelles de purification du virus
ou au tampon d'extraction (pH, concentration en sels ou autres).
3.3
Profils électrophorétigues des isolats du ToMV
Asselin
et al.
(7, 8)
sont les premiers à démontrer qu'il
est possible de caractériser et de constituer des groupes de migration
distincts de diverses souches des Tobamovirus en évaluant leurs mobilités
électrophorétiques dans des gels d'agarose à faible concentration.
Ainsi, par l'électrophorèse en gels d'agarose, ils ont pu séparer et
différencier diverses souches du virus de la mosa~que du tabac (TMV)
(Ul, U2, U4, US, U6, U7, HR, Cc, ••• ) et diverses souches et isolats du
ToMV.
Les résultats des études comparatives des profils électropho-
rétiques des souches Ul, U2 et des isolats du ToMV testés au cours de nos
expériences arrivent aux mêmes conclusions.
En parallèle à cette étude
de comparaison des mobilités électrophorétiques de nos isolats révélées
par la coloration au bleu de Coomassie R-2S0, il est possible aussi de
différencier, sous certaines conditions, divers sous-groupes des Tobamo-
virus par leur affinité pour le bromure d'éthidium (colorant sélectif
pour les acides nucléiques).
Les mécanismes assurant cette propriété
sélective ne sont pas complètement élucidés.
Cependant, il est maintenant
établi que la souche commune du TMV (soit Ul) possède une faible affinité
pour le bromure d'éthidium (68), et cette observation a été confirmée au
cours de nos essais.
La souche U2 du TMV et tous les isolats du ToMV
étudiés, prennent d'une façon importante ce colorant (figure 3.3-1). Un
examen de la figure 3.3-2 permet de regrouper les différentes souches du
TMV (Ul et U2) et les isolats du ToMV testés en trois catégories bien
distinctes en utilisant comme critère leurs mobilités électrophorétiques:
Figure 3.3 (1):
Profils électrophorétiquesde quelques isolats du ToMV en
gel d'agarose 1%
Les conditions d'électrophorèse sont les suivantes:
a) tampon Tris-acétate-EDTA (à pH 7,0 ajusté avec HAc.)
b) voltage: 40 volts (soit ~ 30 mA/gél)
c) durée: 16 heures
d) coloration au bromure d'éthidium pendant une heure
e) les bandes sont révélées à l'UV
De gauche à droite, les échantillons du gel sont:
1: Ul
4: HV2
7:
9
10: U2
2: U2
5: HV3
8: 16
3: ToMV
6: HV9
9: Ul
11: ToMV
Remarques:
1) Les bandes de Ul ne sont pas visibles sur
cette photographie, car cette souche du
TMV n'est pas sensible au colorant utilisé
2) Ul, U2 et ToMV constituent des échantillons
standards
Figure 3.3 (2):
Profils électrophorétiques de quelques isolats du ToMV en
gel d'agarosel%
Les conditions d'électrophorèse sont identiques à celles
de la figure 3.3 (1).
La coloration a été réalisée avec
du bleu de Coomassie R-250 (pendant une heure).
De gauche
à droite, les échantillons du gel sont:
1: Ul
5: HV3
9:
4
13:
9
2: U2
6: HV4
10: 11
14: Ul
3: ToMV
7: HV7
11: 14
15: U2
4: HV2
8: HV9
12: 16
16: Tor--'lV
-.
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16
,
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1
52
1)
la première comprend la souche U2 et les souches apparen-
tées (US, G-TAMV)i
2)
la deuxième est celle de Ul et des souches apparentées
(U4, U7), et enfin
3)
la troisième renferme les isolats de la souche tomate du
TMV (comprenant aussi Y-TAMV).
Le patron de migration caractéristique
en gels d'agarose à faible concen-
tration (1%) des membres de cette dernière catégorie est constitué d'un
certain nombre de bandes identifiées à la figure 3.3 (2).
Parmi ces der-
nières, deux (a) et (b), d'intensité comparable apparaissent régulière-
ment.
Lorsque celles-ci sont examinées au microscope électronique après
l'élution, la première bande (a) inférieure révèle surtout des virions
intacts (ou monomères), tandis que la seconde (b) est constituée essen-
tiellement de l'agrégation de deux virions intacts (ou dimères).
En plus
de ces deux bandes majeures, d'autres bandes mineures sont parfois obser-
vées au-dessus de celle de (b), ce sont des trimères (c).
Parfois aussi
d'autres séries de bandes mineures sont visibles en-dessous de celle des
monomères;
elles sont constituées de particules partiellement décapsi-
dées (ou PPD) de diverses classes.
Dans certains cas, deux autres bandes
apparaissent entre celles des monomères et celles des dimères.
Elles
deviennent beaucoup plus importantes lorsque survient une décapsîdation
partielle, et elles semblent être constituées d'agrégats de virions
intacts et de PPD de diverses classes (68).
La figure3.3 (3) indique les
profils électrophorétiques de quelques isolats viraux obtenus à partir
des gels élués (sections 2.7.2 et 2.8).
Trois types différents de tampon d'électrophorèse ont été
aussi étudiés;
ce sont les tampons:
1)
Borate-EDTA (40mM d'acide borique et 0,25mM d'EDTA à pH
8,0 ajusté avec NaOH)i
2)
Tris-acétate-EDTA (40mM de Tris, 20mM d'acétate de sodium
et lmM de Na 2 EDTA à pH 7,0 ajusté avec HAc ou Hel);
53
Figure 3.3
Profils électrophorétiques de quelques isolats du ToMV
en gel d'agarose 1% (avant et après l'élution du conte-
nu des bandes)
Les conditions d'électrophorèse sont les mêmes que
celles de la figure 3.3 (2).
Les échantillons du gel
sont:
1: HV3 av
4: HV7 ap
2: HV3 ap
5: RI av
3: HV7 av
6: RI ap
Remarques:
1) HV3 av (isolat "parent")
2) HV3 ap ("éluat": isolat obtenu après
l'élution du contenu des bandes de HV3 av)
54
3)
Phosphate (phosphate de sodium monobasique/phosphate de
sodium dibasique, 10mM à pH 7,0 ajusté avec NaOH).
Dans ce dernier cas, une pompe péristaltique a été utilisée pour mainte-
nir la concentration en sels plus ou moins constante dans les deux cuvet-
tes au cours de l'électrophorèse.
Le tampon Borate-EDTA à pH 8,0 a
entraîné la décapsidation partielle de la plupart de nos isolats, il a
donc été abandonné.
Par contre, celui avec Tris-acétate-EDTA à pH 7,0,
ajusté avec HAc, s'est révélé le meilleur tampon d'électrophorèse jusqu'à
présent.
S'il est possible de difféiencier et de constituer des grou-
pes de migration distincts en gels d'agarose pour diverses souches
du
TMV, dans le cas des isolats du ToMV étudiés, il ne nous a pas été possi-
ble de mettre en évidence des différences notoires entre ces isolats
suivant leurs mobilités électrophorétiques, du moins dans nos conditions.
Cependant, l'électrophorèse en gels d'agarose demeure un
outil important pour la caractérisation de ces isolats à cause de:
1)
la simplicité de la technique;
2)
la facilité avec laquelle l'élution du contenu des bandes
peut être effectuée;
3)
la possibilité de séparer les souches tabac et tomate
du TMV, puisque les deux types peuvent se retrouver chez un même plant
de tomate virosée.
Il est évident donc que les gels d'agarose à faible concen-
tration possèdent des avantages ·indéniables dans la caractérisation des
virions des isolats du' ToMV, mais comment expliquer l'absence de diffé-
rences marquées dans les profils électrophorétiques?
Dans l'état actuel
de nos connaissances sur ces isolats, il ne sera question que d'hypothè-
ses pour expliquer cette uniformité dans les mobilités électrophorétiques.
La première est que la plupart des isolats du ToMV proviennent d'un seul
genre (Lycopersicon) et donc n'ont pas subi une pression de sélection
aussi forte que celle subie par exemple par des souches du TMV isolées
d'orchidées appartenant à différents genres voire différentes familles
55
végétales (79).
Les isolats du ToMV étant bien adaptés à la tomate, ne
semblent pas montrer de différences majeures dans les propriétés chimi-
ques et biochimiques de la protéine de leur capside.
La deuxième possibilité est le fait que les producteurs
s'approvisionnent aux mêmes sources.
Ils utilisent donc probablement
les mêmes cultivars et il n'est pas surprenant que, la sélection natu-
relle aidant, les isolats les mieux adaptés à ces variétés aient survécu.
La troisième hypothèse est liée aux caractéristiques biochi-
miques du virion, en particulier à la charge nette totale de la protéine
de la capside de ces isolats.
Sengbush (144) a démontré que des échanges
d'acides aminés entraînant un changement dans le nombre total des groupes
acides et basiques d'une protéine peuvent ne pas influencer nécessaire-
ment la mobilité électrophorétique de celle-ci.
Ainsi, il se peut que
des variations dans le nombre des groupes acides ou basiques ionisables
des acides aminés de la protéine de la capside des isolats du ToMV aient
lieu, mais celles-ci n'influencent pas leurs profils électrophorétiques.
Les hypothèses avancées pourraient donc expliquer l'unifor-
mité électrophorétique des souches tomates étudiées.
3.4
Composition en acides aminés de la protéine de la capside des
isolats
Wang et Knight (169) ont étudié la composition en acides
aminés de la protéine de la capside de 13 isolats du ToMV provenant de
tomates virosées collectées dans différentes localités du monde.
Ils
ont montré que, malgré la dispersion géographique de ces isolats, il
n'existe pratiquement pas de différence
dans la composition en acides
aminés de leur protéine de la capside.
Dawson
et
al.
(41,
42), ainsi que d'autres chercheurs (159, 169), ont étudié la teneur en
acides aminés de la protéine de la capside de différents isolats du
ToMV.
Ils arrivent tous à la conclusion qu'aucune différence marquée
n'est décelable entre ces isolats du ToMV, même lorsque les échantillons
proviennent de régions géographiques très éloignées.
56
Dans notre cas, les isolats étudiés proviennent de différen-
tes régions productrices de tomates de serre du Québec.
Les résultats du
dosage exprimés en nombre de résidus d'acides aminés par sous-unité pro-
téique sont repris au tableau 3.4.a.
L'examen de ce tableau nous amène
à faire les observations suivantes:
1)
tous les isolats ont 158 résidus d'acides aminés et aucun
de ceux-ci ne renferme de l'histidine;
2)
les proportions trouvées pour la plupart des acides aminés
demeurent relativement constantes d'un isolat à l'autre;
3)
de légères variations sont cependant notées entre les
isolats étudiés, en particulier la présence de deux résidus de Méthionine
et l'absence de Cystéine chez les isolats suivants:
HV2, HV7 et Rl;
4)
parmi les résultats du tableau 3.4.a, seul
Rl compte
trois résidus de Lysine dans la composition en acides aminés de la
protéine de sa capside.
Cependant, ce résultat devra être confirmé avant
de se prononcer sur le statut particulier de cet isolat;
5)
les variations constatées dans le nombre total pour cha-
que acide aminé ne dépasse pas deux unités.
La comparaison de nos isolats entre eux et avec des souches
du ToMV, D et Y-TAMV dont la composition en acides aminés est connue,
fournit les résultats consignés au tableau 3.4.b.
Chaque chiffre repré-
sente le nombre de fois qu'une différence est constatée dans la composi-
tion en acides aminés de chaque paire d'isolats.
Cette étude comparative
sommaire permet de classer les cinq isolats étudiés dans trois groupes
distincts:
1)
le premier groupe comprend HV2 qui est différent des
autres;
2)
le deuxième groupe est composé de HV3, HV7 et Rl;
3)
l'isolat 11 constitue une autre entité.
De plus, HV3
est celui qui possède la composition en acides aminés la plus proche des
souches D et Y-TAMV.
57
TABLEAU 3.4.a:
Composition en acides amlnes comparée des cinq isolats
étudiés et de souches du ToMV de la littérature (a
b et
f
c)
Isolats du
ToMV
ToMV (32)
D
Y-TAMV
HV2
HV3
HV7
11
RI
(a)
(b)
(c)
AA
ASP
18
19
19
19
20
18, 17-19
17
18
THR
15
15
15
15
15
16, 14-17
17
17
SER
14
14
13
13
13
15, 13-16
16
15
GLU
20
20
20
19
20
19, 18-21
19
19
PRO
8
8
8
8
8
8,
7-10
8
8
GLY
7
7
7
7
7
6, 7
6
6
ALA
11
11
12
12
11
11, 12
11
11
VAL
14
15
15
15
15
15, 14-18
15
15
MET
2
1
2
1
2
1
1
1
ILEU
6
7
7
8
7
7,
6- 8
7
7
LEU
13
14
13
13
13
13, 12-14
13
13
TYR
7
4
5
4
4
5,
4- 6
5
5
PHE
8
8
8
8
8
8,
7-10
8
8
LYS
2
2
2
2
3
2
2
2
ARG
9
9
9
10
9
9,
8-10
9
9
CYS
0
1
0
1
0
l, 0
1
1
TRP
4
3
3
3
3
3
3
3
Remarques:
1)
La colonne (a) fournit des chiffres moyens (avec des
extrêmes) de la composition en acides aminés de 32 iso-
lats du ToMV (référence 59).
2)
(b) = composition en acides aminés de la souche
Dah1emense (D) (références 70, 173, 174)
3)
(c) = composition en acides aminés de la souche
Y-TAMV (références 159, 169)
58
TABLEAU 3.4.b:
Comparaison par paires des cinq isolats étudiés .. et de
deux souches (0 et Y-TAMV) du ToMV
. -
..- --
HV2
HV3
HV7
11
Rl
-0
Y-TAMV- -
~_.-
HV2
0
9
7
11
7
11
10
.
..
~
AVJ
9
0
6
6
4
-7
7
HV7
7
6
0
6
4
8
7
11
11
6
6
0
8
8
8
Rl
7
4
4
8
0
9
9
0
11
7
8
8
9
0
2
Y-TAi"1V
10
7
7
8
9
2
0
En conclusion, la composition en acides aminés de quelques-
uns des isolats étudiés présente des variations mineures qui demeurent
en accord avec celles signalées dans la littérature (41, 42, 159, 169).
Ces résultats préliminaires constituent un jalon important dans la con-
naissance des propriétés physico-chimiques de ces isolats, pouvant être
reliées en particulier à leurs propriétés sérologiques.
Les mêmes hypothèses émises au paragraphe 3.3 peuvent être
reprises ici pour expliquer la concordance presque parfaite des résultats
du dosage des acides aminés des différents isolats.
CONCLUSIONS
Cette étude de caractérisation d'isolats du ToMV reposait
sur un certain nombre d'interrogations qui suivent.
D'abord, peut-on
rencontrer des isolats du type tabac en plus de ceux du type tomate
dans nos échantillons?
Existe-t-il une variabilité importante au sein
des isolats du ToMV collectés au Québec?
Peut-on exploiter uné- telle
diversité génétique pour identifier des souches virales avirulentes et
stables à utiliser dans une étude de prémunition?
Peut-on établir une
relation entre la quantité de virus et les symptômes observés sur cer-
taines plantes indicatrices?
Est-il possible de définir des groupes
physico-chimiques ou biochimiques bien distincts au sein d'une telle
collection d'isolats viraux?
Les résultats de nos expériences ont permis d'apporter des
éléments de réponse à ces questions et nous pouvons donc dégager les
conclusions suivantes:
1)
la plupart des serres à tomates du Québec sont contami-
nées par des isolats du type tomate du TMV.
Les isolats du type tabac
semblent beaucoup moins fréquents
pour ne pas dire absents;
2)
tous les isolats ont produit des lésions locales varia-
bles en taille sur les tabacs N. tabacum cv. Xanthi et N. sylvestris;
3)
il existe une variabilité au niveau des isolats quant à
l'expression de leurs symptômes avec le cultivar de tomate Vendor
(Lycopersicon esculentum cv. Vendor) et avec le tabac Turkish Samsun;
59
60
4)
certains des isolats sont stables et induisent des symp-
tômes assez faibles sur la tomate, ceux-ci pourraient donc être utilisés
dans des études de prémunition;
5)
il n'existe pas de relation directe entre la quantité de
virus et les symptômes.
En effet, les isolats du ToMV qui provoquent des
symptômes relativement faibles sur la tomate sont très infectieux et se
multiplient abondamment dans cette plante;
6)
le cultivar de tomate Vendor, très utilisé dans la pro-
vince par les serriculteurs, possède le gène Tm-l.
Nos isolats peuvent
donc se répartir dans deux groupes de Pelham, les groupes ° et 1;
7)
il n'existe pas de différences majeures entre les profils
électrophorétiques des isolats testés.
Ces derniers migrent tous au
niveau de la souche tomate typique;
8)
cependant, leurs mobilités électrophorétiques diffèrent
de celles des souches tabac (Ul et U2) du TMV.
Nous disposons là d'un
moyen simple et rapide pour identifier et différencier les divers groupes
de souches des Tobamovirus pouvant infecter les tomates;
9)
les résultats de nos expériences démontrent clairement
que l'électrophorèse en gels d'agarose demeure un outil important pour
la caractérisation de groupes d'isolats à cause de:
- la simplicité de la technique
- la facilité avec laquelle l'élution du contenu des
bandes peut être effectuée
- la possibilité de séparer les souches du type tabac
et tomate du TMV, lorsqu'elles se retrouvent toutes
les deux dans un même plant de tomate virosée.
Parmi les tampons d'électrophorèse testés, deux se sont révé-
lés très intéressants, ce sont:
- le tampon phosphate, 10mM à pH 7,0, et
- le second est constitué de Tris (40mM) - acétate de
sodium (20mM) - EDTA (lmM) à pH 7,0 ajusté avec HAc;
61
10)
la composition en acides aminés de clnq des isolats
étudiés présente des variations mineures qui demeurent en accord avec
celles signalées par d'autres auteurs dans la littérature (41, 42, 70,
159, 169).
De plus, HV3 est, des isolats testés, celui qui a la compo-
sition en acides aminés la plus proche des souches D et Y-TAMV du virus
de la mosaïque de la tomate.
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. .
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GIK 7P4.
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, ,
Eightcen strains or isolates of T~1\\' \\k,'ere compared and
, "
· grouped according ta viral R~A T· fingerprint analys:s.
I
· clectrophoretic mobility of virions in agarose and acryla'm-
i ide gels, in \\';Iro alkali dccapsidation ~ensjti\\'ity. formation
i~f partiaUy stripped \\:irus particles. ~nd arnino acid composi-
~l\\~ii
i tlon of theco3t proteln. The follo\\vsng groups are suggested:
; U lt U•• U, (VI group); U;9 Cl'A ~1 V., l!~ (t:~ group); 'r0 ~i V
1
f (si x is 0 1a tes) and YTA M \\' (t 0 mat 0 gr() u p J: Il R (3 j S0 J3 tes. ~
. \\'
. from Si/cne
1
.t;;'J.) (JI R group): Ut- (monotYrc)~ (.~ (monotypoe)..
· Il isshown tha! J1R.,"rol..1V~and C~ isoJates~re \\;cryscnsitivc
\\
: to a.lkaJi sfripping. \\/iral RNA T fingerprints shov.' t'T,roor
J
~ difference.s y.°ithin sorne: groups especially \\\\!ith the UI BrJd U1
· groups. Isolates of HR and Totv1V appcar more \\."2-riabIc.
: J-he significance of these rcsult~ will be discusscd in the light, .
iof the putatiye origin and c~otuti(ln of tohZ1mO\\·ir~s_..·~:· ~ .', . ':~
J.. -. "~
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.
.tI._c -"irus de lanlosaïquc (le -la tunulfc au
Québec. t'i1. GUlncdzo~ &:1 A. I\\s~~'lin, F a-
cuité des sciences, d~ )'agricultur~ Cl d~ I"ali·
nl~nl~ltion, Dép~rteInenl de
phyh)ll)gi~.
Université
.Laval,
Sainlc:-Fov
(Quéh~\\.·)
GIK 7P4.
; Le virus de la 111nsaïquc d~ la l()rn:.lt~
<TofvlV) est respons'lblc·<.1t: la ll1ala-di~-~\\'iralè----'
la' pl~s grave de la lonlat~ (L.vcopersicol1 (.1>.,.
c~/èI1tÙI11). Cette .'-virose est présente ~u
-!
Q-u,;bcc CJ-lt~Z )":l nllln~rt ,t~..: nr{"\\/~r.,"1_", .. r~· IL.
i
' -
'-r
t..
J'" - -- ... _ . . .
.........
J.- ...-I ... -.. ... ,. ......... -.1
. . . . . .
c~lte plante. Nous avons analysé une .lr~n
laIne d'isolats .de.ce virus, cüllecl~s à lra\\·c.:~:\\
la. province, chez différ~nts s~rrjcultcurs. I)~
119S . éludes t
- nous
pouvons
dégager _!~S
conclusions 5uiv41nlcs: 1) les isolats (jij·
f t:1ren l par lcu'r synlptôlllato}ogie sur J~ Nico-
riùna labacum cv. l"urkish Sansun Cl sur k:
Lycopc:rsicoJJ escu/enlu/n cv. Vendar; 2) il
n'existe pas de différence marquée cntre leur
nl0bilité électrophoréliquecn gel d'agarose:
3) la coolposilion en acides anlinés -d~quel
ques-uns des isolats' présente des varÂations
rllineures_qui demeurent en accord avec cc]-
l~s signalées dans la littérature. La significa-
-(ion dt:s résultats sera discu lée.
,-
.
~_._--_ .. ~
-1-
au
...~~~ Jr••