: /
·Etùde de l'aspect ionique de la vision sur un
modêle de membran~ biologique artiffcielle
par N'Soukpoé Kossi N'Suavi
'\\
, '
THESE PRESENTEE AU
DEPARTEMENT ,DE BIOPHYSIQUE
DE LA FACULTE DE MEDECINE DE
L'UNIVERSITE DE SHERBROOKE'
EN VUE DE t'OBTENTION D'UN
DOCTORAT ES SCIENCES (BIOPHYSIQUE)'
Approbation du jury
" '
Trois-Riviêres, QUé~ec, Canada, 1980.

---

i i
JWANT -PROPOS
Depu~s la découverte de la structuretrilaminaire de la membrane
biàlogique il ya de cela u'ne cinquantaine d'années, l'étude des proprié-
tés physiologiques de celle-ci et de~ mojens de la simuler en laboratoire
nl~nt cessé de susciter de plus en plus d'intêret.
Cela se comprend fort
~isémen~, 'non seulement a cause du rôle de la mem~rane dans les structu-
res excjtables comme le neurone, le mus~le et les photorécepteurs, mais
,auss'i â cause de son, importance dans les',mécanismes d'absorption,. de se-
crétion, d'excrétion, d'écha~ge de maté~iel d'une unité biologique! l'au-
tre et entre le milieu biologique et son, monde extérieur;
bref, toute la
régulation du mécanisme de la vie.
Et si l'histoire de la membrane re-
mon~e jusqu'aux coacervats des débuts de l'êre biotique selon les phy-
iiologistes"il existe ~ujourd(hui une école de pens~e, avec! sa tête,
1e professeur Gil bert Ling. qui se pose des 'ques ti ons, três séri euses' quant
! l'utilité même de cettè fameuse membrane biolo~ique qui ne serait presque
'"
rièn d,'aUtre qu'un artéfact d'interface ~
Je comprends alors la réaction
du professeur George Wald, l'un des "gr'ands hommes de la vision", lors-,
quiil compare la membrane biologique a la prose' et je traduis:
"L1histoi-
'1
.,'
re de l a membrane nous fa i t réagi r comme le personnage du Bourgeoi s Gen'-
,
,
tilhonjf!le de'Molière 'to~t ém~rveillé d'apprendre que le langage qu'il a tou- ----
"~.
jours parl é' était de ,1 a prose ... ;
toute notre vie. nous avons pa~l é de
,
"
membrane, ét aujour1'hui encore, la.membrane se retrouve au coeur des mer-
veilles ... JI;
Je suis sOr que nous passerons toutes nos vies a parler,enco-
re de'membrane avec non moins d'admiration de la chose biolo~ique que le
.
Bourg~ots Gentilhomme de la prose.

---

111
SOMMAIRE
Si la plupart des experts s'entendent pour dire que la vue contri-
bue pour 40 % a la connaissance tant du monde extérieur que de notre mon-
~e intérieur, ils tombent moins d'accord sur le mécanisme même du proces-
sus visue~.
Certes, quelques principes ont reçu l'appui des chercheurs,
,mais il en reste encore qui continuent d'alimenter de vives controver?es.
Oe ceux-ci, on peut citer notamment le processus de la' photo-transductign
visuelle.
Le but de ce travail justement est de tenter d'explorer le fon-
dement ionique ,de la transduction de l'énergie lumineuse en énergie élec-
trique, probablement le poin~ de, départ de la véritable stimulation visuel-
le au niveau de la membrane du photoréce~teur.
C'est ainsi que nous avons"
pour commencer, mis au point une méthode de préparation de membranes arti-
,
'ficielles a l'image de celle des disques dès bâ:tonnets, méthode fondée sur
-:
~.
, la technique des couches monomoléculaites., Ces me~brane~ artificielles,
évidemment i,ncorporées du pigment photorécepteur, la rhodopsinè, ont servi
a'l'étude de l'effet de la lumière sur leur perméabilité aux ions.
Le's
résultatS obtenus ont permis l'établissement d'un modèle pour le mécanisme
d'action des différents ions' d'jntérêt, à savoir: le potassium, le ,sodium
,
21". ' .
et le calcium, lors du phénomène visuel et.
le Ca..
serait un candidat
valable commè trans~etteur interhe dans le processus de la vision.
)
1

---

iv
ROiERCIEMENTS
Je tiens a exprimer toute ma reconnaissance envers le p~ofesseur
Roger Le6lanc du d~partement de chimie-biologie de l 'U~iversit~du Qu~­
bec a Trois-Rivières, pou~ toute la confiance qulil a investie en moi
lors de l'~laboration ainsi que tout le long de l'exécution' de ce pro-
jet sur les membranes' ar-yifi clelles, sans oubl i er ses tonseils et toutes
, les 'fac;:l i tés, techni ques et fi nanci ères qu 1 i 1 a mi ses d ma di spos i ti on
depuis, maintenant sept ans.
Je remercie fermement le docteur Jean-Pierre
Caillé pour son appui et ses judicie~ses suggestions et le docteur Clau-
de Gi'cquaudpour son aide appréciable lors dutravai.l de microscopie ·élec-
tronique~
Un .sincère merci' va ~galement à monsieur Gaston Gagné et tout
,
·le personnel d~ l~at~lier de mécanique, ainsi qu'aux technicien~ ~u dé-
partement de chimie-biologie de l'Université du Québec à Trois-Rivières
;' pOlN leur assistance technique.
Je dois' beaucoup' aussi ~ tous les profes-
.~.
seurs'du département de biophysique de l'Université de Sherbr~oke pour la
manifestation particiul ièrement aigu€!
de leur intérêt à ma formation aca-
démique.
~n mot de reconnaissance envers tous les membres de'.l 'équipe de
recherch~ du professe4r Leblanc pour la fraternelle am6iance et liesprit
de coopération qu'.ils ont su . créer et maintenir dans ·le groupe ..
Un merci
spécial va, à mademoiselle Manon Goulet pour la dac,tylographie de cette
, thèse:
' . t '
•
'. '

---

v
AVERTI SSEI'iEI'H
Tout le long de c€
texte nous avons utilisé le système interna-
_
tional d'unités." La virgule (,) est employée pour ,les nombres décimaux
au lieu du point (.).
:
( '
'"

---

vi
LISTE DES SYMBOLES ET ABREVIATIONS
'0
; A
aire mblécu1ai~e en monocouche (A2 molécule~l ou cm2 ~g-l)
,0
A
Angstr~m (l'O-JO m)'
. 0
l
A
-
air~ mol~culaire en monocouche~ au collapse (A2 molécule-
c
2
- 1)
ou cm
\\.19
Abs
absorbance
; a ' c -
acide
,02'
- 1 '
2
- 1
-
ai~e mol~culaire limite en monocouche (A . mo1~~ule
ou cm
\\.1g
)
, ° 2 .
-',
~- 'aire moléculaire enmonocouch~, ~ pression zéro (A molécule
2
-1)"
ou cm
\\.19
.
0
"
-1
2
<A>
,.. - . aire moléculaire expérimentale moyenne (A2 mol~cule
ou cm
\\-19- 1)
'exp j
0
-.
-1
2
- 1)
<A> th ~ . -
aire moléculaire théori que moyenne (A2 molécule
ou cm
\\.1g
r
. eor
/
ATP
,-
adénosine triphosphate:
. AtPas~-,. adénos ine tri phosphcltase
:.'
Cholest.-
cholest~rol
CNa
-
canaux sodiques
Co
temps de relaxation rotationnelle (\\-1s)
DEAE
diéthyl amino éthyl éther
d
densité (masse/volume)
,
i
E
poten,tiel d'équilibre du Ki- (mV)
.i
K
. '(
E
;potentiel membranaire (mV)
m
' ,
"
'
E ' , ." , ,,'
"
'
,patenti èl d'équilibre du Na i- (mV)
,Na
l:-
I
~G*
~ !
"
-'1
j
.
~'
variation de l'énergi.elibre de Gibbs (kca 1 mal')
, GMP
- l·guanos i ne manophospha te
c-GMP"
guanosine')" ,5'.-~onophosphate cyclique
, ,
... "
\\

---

vii
GTP
- guanosine triphosphate
GTPase
- guanosine triphosphatase
-2)
9
accélération de la gravité terrestre' ( m S
-' conductance potass i que
conductance sodiq0e
- variation d'enthalpie '(kcal mOl'- l )
~nergie lumineuse
Méta- l
- métarhodopsine-I
Méta- II .'
métarhodopsine-II:
- nombre d'Avogadro
,
. ,
N-rétinylidène-opsine
n .
fraction molaire du composé de rang .(,.
.{,.
P
poi d.s (g)
.PC
phosphatidylcholine
Pd. :'
coefficient de perméabilité ionique pour l 1 i on de rang )..
.{,.
.1
PE
-.phos ph at i.dyléthano 1am-j ne
',Pl
~ phospholfpide
. ..
"
"1
'·i
PNa
pompe sodi q'ue
. "PS .
phosphatidylsérine.
) R.
résistance (n)
*
...... Rh·
rhodops'i ne exci tée
:... 2
,; ,
'\\Rm
- résistance membranaire spécifique (n cm )
,
'
.~~
s
~urface mem~;a~a;re
2
(cm )
t
, l
- l .
.: -.,ô.s
-:- variation .d'entropie (cal mol-
de,9
)
..." -
"\\
. çS l
- premier ~tat excité 5ingule~
.' .'
ai

---

'V i i i
SES
- segment externe de bâtonnet
SIS
- segment' interne de bâtonnet
Tl
premi er état exci té tri plet
" t ,
- temps de demi-réaction (s ou min)
12
3 '
v
V,o 1ume (cm )
- chaleur
y
- tens; on s uperfi ci e11'e de 11 interface recouverte de monocouche'
(mN, m- l)'_
l
Yo
- tension superficielle de l'interface libre (mN m- )
·r·
g.
- constante diëlectriqu~
absorptivit~
3
l
l
E:498
molaire a 498 nm (dm
mol-
cm- )
nm
n
- indice de réfraction
<::x:>',
- viscosité moyenne (poise)
À
- .longueur d'onde (nm)
).1.
_. potentiel chimique'du composé de rang À.. dans un mélange
-<..
0
",
).1.
-:
potentiel chimique du composé de rang À.. pur
"
-<..
11
pression de surface (mN m- l )
TI
pression'de ,surface au collapse (mN m- 1)
C
<p,
- flux de 1 lion de rang À..
-<..
[:
]
(
-3)
toncehtration
mol dm
, /
- environ
j .
'1:
-
".i
'\\..

---

-.. 'îx
LISTE DES FIGURES
Figure
Processus dé la photoisom~risatibn de la
rhodops i ne
2
Figure 2
~B!tonnets etc6nes des vertébrés; cellules
de types Met. P
'.. ~
:
; 7
1
Figure 3
Circuits électrique et ionique du ~ou~ant
de fond des b~tonnets de vert@brës
&
Fi gure 4
Ultrastructure de la membrane discale
~
11
Figure 5
. Structure de la rhodopsine"et formation des
)
canauxdelibér~tion du' calcium par les
dîs'ques •.•.•...........•.........• ~ ..•........•........ 13
Fi gure ,6
Pla n de t ra vail .•.....•••............................. 15
Figure 7
Bain de Langmuir, vue de profil
~ 18
•
Figure 8
Bain de L~ngmuir, vue du système de balancier
19
Figure 9
Photographie du syst~me d'adsorption de bicouche
.
1· .d"
lpl
21
.1qU~ •••••.•••••••••••••••••••••••••••• ; ••••••.••••.,
{,
Figure 10
Sch~ma d~tai11~ du systè~e d'adsorption ~e·
bicouche
;
·
;
22
fi gure, 11
Montage de mesure de la résistance"membranaire
24
Figure 12
.Montage de niesure de la diffusion ionique
;
25
Fi gure -13
Courbe d'étalonnage du système de balancier du
'bai n de Langmui r ,"
:
'
'
'.. 35
Fi gure 14'
Illustration de la formation d'une, bicouche lipidi-'
que par la ~éthode de Langmuir-Blodgett
41
Figur~ 15
Illustration de la. formation' de la bicoushe lipidi-
que par la méthode combinée de Langmuir-Blodgett
et du contact horizontal
:
43
"
, Figure 16
Isothermes de pressi.on de surface de la rhodopsine .... 50
:
Fi gure 17
Micrographe de la rhodopsine purifiée
52
l
",\\ .
l'

---

x
"Fi gure 18:, :
Isothermes de pression de ~urface de la PE,
PC, PS et du 'cho1estéro1 .,;, ..... , .... , ...... ,. ,J,.",'. 57
" Fi gure 19
Isothermes de pression de surface du mélange.
PE-PC-PS .. ,. :., .', .. , , .. , . , .. , .... , , .'. , , , .. , , , •.. , , , . , ., 60
Figure 20
'Isothermes de pression de ~~rface du mélange
PE-PC-P$-cho1es'téro1
.'.,.",
62
Fi gure 21 .
Effet de· la lumière b1anche·sur l'iSotherme
de pression de su'rface de la rhodopsine
,
67
Figure 22
Isothermes de pression de surface de l'opsine '
68
Figure 23,
Courbes de diffusion ionique induite par la
,.
.1umiêre b1ao~he incandescente ~ 290 K .~ ..•.... ~ •...••. 79
". Figure 24
Courbes dé di,ffus i on i oni que induite par
la lumière monochromatique de 498 nm
.
.~ 276 K
:
~
,. 81
Fig~re ~5':
Schéma du mécanisme de la photo-transduction
dans 1es bâtonnets des vertébrés
,., .. ,
,.. 90
';' Fi 9Qre'2p
Structure schématique' de la PE, de la PS et de
"1a PC à .pH':;: 7, a .............................., .'. . . . '.. . , .94
Photo-transduction visuelle: modèle de Honig et
coll. ..:'. " ... , ..................•........ , . . . . . . . . . .. 106
~ :. "
I~ .
.-<;,
..:
. . .~, .
r
• .
<":'.
-
,
.,~'
'"'"
... ;
.'
'
...... '

---

..
x: i,'
, '
LISTE DES TABLEAUX
Tableau l i:
Autres matériels et produits chimiques
:
'
26
o2
Tableau 2:
Tableau comparatif des aires moléculaires (A )
des différentes classes de lipides utilisés
58
Tableau 3
Paramètres de monocouche des différent~
constituants membranaires étudiés
'
64
Ta6l~~J 4:: .Rapports d'adsorption pour' les processu~ de montée
" "
et du contact hori zontal
"
:. :; "
'.. 72
Tableau 5
.Rés i s ~,ance ê l,:c~r~que de différents sys tème,s _~em-
"
branalr,esartqflClels dans du KCl 0,1 mol dm
," ...... 75
,~
Tableau 6 .
'Ôiffusion du K+ i'nduite 'par'la gramicidi,r:te
a 290 K
'
~
0. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
76
Tableau ? .' Diffus i on photo-i nduï'te du ci+
78
Tableau'S.
Paramètres de la diffusion ionique photo-induite
84
:~
. ,
tableau 9 :
Tableau comparatif des taux dediffusi~n ionique
photo- i ndui te
,
;
'
, 87
:./
/

---

xii
TABLE DES/VlATI ERES
AVANT-PROPOS
;
:
:
.'
i i
SOMMA 1RE ..........................•........................ ;........ i i i
REMERCIEMENTS ..................•..........•.......................... iv
.AVERTISSEMENT· : ..•....•..•.••..•........•.•...•. ; ..•..•.............. v
LISTE DES SYMBOLES ET ABREVIATIONS •.•....•.•.•..•...•........ ~
vi
-
LISTE DES FIGURES............••.••••. '..~
".. i x
LISTE DES TABLEAUX .•.•...•.•...•.••••.••.•••••••..•..•............•.. xi
.TABLE .DES MATIERES .........
. xii
'
','
I - .
.I NTRODUCTI ON •.....: •.....•••.••...••••................•...........
A)
Aperçu général :du processus visuel
..•..•••.. :
:'
.
B)
But du travail ...•••••.•.•.•••.••.•.••.•............... ~ •.... 9
.C)
Le photorécepteur visuel: le bâtonnet des vertébrés •. ~...•. ·10
• J
0)
Plan de travail'
:
)4
II-
MATERIEL ET METHODES. EXPERIMENTALES ......•.•.•..........•.... 17
A)
Matériel
17 .
1)
Ba in de monocouche .: .....•.....•..•........•........... 17
2)
Appareil d'adsorption
'
20
3)
Support de ia membrane arti'ficielle
".'"
20
4)
Montage de mesure de la ré~istance membranaire ••.•... 23
"
5)
Montage de mesure dé la ·diffusi.on ionique t r a n s - '
\\
membranaire photo-induite
: .•... :
:
23
l'
t
6). Autres matériels et .produits chimiques ...........•.•... 26
1.
'B)
Méthodes expérimentales
:
.-;
29
1)
Extraction et purification de la rhodopsi~~
29
f

---

.:.
,
xiii
a)
Isolation des segments externes de bâtonnetS
29
b)
Extraction et purification 'de la rhodopsine
30
c)
Elimination du déters'if
,
31
2) ~Iicroscopie éll?ctronique de ,la rhodopsine
32
3) Monocouche ....•............ '
'
,
. 32
a)
Généra 1i tés
. 32
b)
Methodes
. 33
aY Isotherme de pres~ion de surface ~ •.....•...... 33
"
,
8)
Etude d'interactions in{ermolé-
cul a; re s
o' • • • • • • • . • • • , "
.
37
y)
Etude de l'effet de la lumière sur la
rhodops i ne en monocouche
',' .. ,
. 38
è)
Préparation de la membrane de 'bïcouche
llpldl,que
. 39
':i
,'.
'i)
Méthode de Langmuir-Blodgett
~
. 40
ii) Méthode combinée 'de Langmuir-Blodgett
et du contact hori zonta 1 .: '.'
'
. 42
\\
E)
Incorporation de la rhodopsine dans la
bicouche lipidique
:
' 44
4)
Mesure de l~ résistance membranaire
'..
5)
Mesure de la diffusion ioniqu~ photo-induite .'
.
6)
Effet de la gramicidine sur la perméabilité
ionique de la membrane de bicouche lipidique'
.
)
..
.
" 111- RESuLTATS
; ..•......................... ~
,
.
À),
Rhodopsine purifiée
~
-
'
.
. 1)
Caract~ristiques
~
.
2)
Conditions dë stabili.té
54
\\
.
',,-:,,'.
. ':'1"
)._" "

---

xiv
B) -Iriteractions intermolécu'laires dans des monocouches
de 1i.pi des
-
55
C)· Interactions lipides-rhodopsine en monocouche
66
0)_' La membrane àrtificielle .. ;
~
70,
"
cr
E)~ Diffusion ph6to-ind~ite a tra0ers les me~bfanes
) artificielles incorp~rées de rhodopsine ~
;
74
1,)
Effe'tde 1al umi ère i ncandes'cen te blanche
!
77
, ..,..'
"
.-
'r
'2}' Effet d~ l~ lu~iêre incandescente·a A ~607 nm
77
r.
3) Effet de 1a température
.'..~;
"
: ;,' 80
.. ~
,
4)
Effet de la lumière _moriochromatiqu.e A :: 498 nm
80
5)
Cin~ti~ue de la diffusion ionique photo-induite .:
~. 82
iv- .DISCUSS ION •...•.•...•.••••••••.••.•..•••..•••••••.•..••.••.••. 86
\\
v-
CONCLUSION
J02
,APPENDICES
1 ,
1..:.
Les autres propositions de mécanisme pour le processus
,
de transduction visue1,le ...•......... ;
104
1
·1
•
1
11-' Données numériques s~ppl~mentaires sur les segments
e'xternes de b~tonnet5
·
:
112
. i
.
.
.
,III':Oosage des phospholipides par la méthode modifié~. de'
'.,
F;sk.e~Subbàrow·
'...•;..•..•.. ~ .•••..•..•.........•.... .. ,
-;
115'
.'
. \\ .
/ '
" ,
'; ..
,BIBLIOGRAPHIE' .•..•••••-
; •...•• '......•. ; ' '; ..• '.' •••....• '.; 117
..",
.\\
,
' J .
"

---

.... ,',
CHApITRE l
INTRODUCTION
)
,\\,1.
, ,
\\

---

I -
INTRODUCTION
A)
Aperçu général du processus visuel
Le processus visuel est un complexe phénomène que d~clenche l'ab-
l'
sorption d'un photon par une ~olêcule de pigment visuel.
Dans le cas
de ia vision scotopique, comme dans celui de la visionphotopique, il se
produit'une isomérisation du ll-cis-rêttnal, chromophore lié à la protéi-
ne scotopsine et photopsine respectivement, par un lien de base de Schiff.
Suit alors une sêrie de réactions photophysiques et photochimiques au ter-
me de laquelle le rétinal, alors sous forme, tout-trans, se libère de la
protéin~ par l'hydrolyse de la mol~cule.
'.
"
la figure l montre le processus de la photoisomérisation par le~
que,l la rhodopsine excitée', passe par diffêrents isomères sous l'effet
de la chaleur, pour finir par se scinder en deux, libérant alors la pro-
téine, opsine,et le rétinal to~t~trans.
Sur cette chafne réactionnelle,
u~e étàpe ~evêt un intëtêt particulier, celle 00 ~e génère le courant
électr5que nécessaire' à l'excitation des axones ,du' nerf optique; onigllo-
re en'core laquelle et comment.
Rosenberg (l) a proposê la théorie de la
..:'
, "
1
photoco~du~tion, après avoir-Observé l~ génér~tion d'un photocourant!
\\-
"
"iravers du car6tène pià~ué en~re deux électrodes; photoç6Utant'~~od~it
par la création et l'accélération de trous positifs :dans l'e carotène par
,le rayonnement é l ectromagnét; que.
Cette 'é,tude n'! a malheureusement pas été
,
j
,
,
,
.
. '
~
'." •. ' t, " "
\\,.. :~;.;.:i':!i~~d'
.

---

1
/
;~:A
..
'.
. -
" .
1
1
'1
- 1
1
, .
·1
. :1
Figure
Processus de la photoisomérisation de la rhodopsine
!
Modèle de Mathews et coll; (12) remodelé (13-16).
- ",
~: .
. '
1
"'''' r . . •'
'1
i-

---

.. 2
.Temps écoulé (16)
aprê~ illumination! 293 K"(s)
Hypsorhodopsine (13)' "
". Rhodopsine (498 nm; à 298 K:
11-cis,
h\\l(540 nm) . 12-S-cis-rétina1) (14)
l
fJ LJ ( 4Jo·
.
. tllll).
hv(437 nm)
'/
Bathorhodopsine (543 nm; ) 78 K: ll-trans,
l2-S-cis-rétinal) (14)
R
b-
T > 133 K .
lumirhodopsine (497 ~m; à 223 K: l}-trans,
l2-S~trans.rétinal)
,"'";
j
nT>
l>
233 K
M~tarhodopsihe-I (478 nm; ~ 276 K)
. -4
10
:~,
(---~-----~--~ excitation
visuelle
+
•
~ ;H; T :> 258 K ..
Métarhodopsine-~I (380 nm: a 276 K).~ ~
. prodult secondalre (465 nm) ~ou hv ~
T > 268 K
,
Mêtarhodopsine-III (465 nm; à 276 K) (15)
l q2 .~,
= 288 :1<
> 7, r
liH+;·TpH
,
NR0440 nm.
"
N-rétinylidêne-opsine
.... {1
~~-~-~~-photodé~oloratio8
Rétinai tout-trans. (387 nm)
.
+.
opslne
Figure

---

,3-
r
étendu~ ~ur la rhodopsine, pas plus que sur les pfgments des cônes.
La théorie qui a surtout retenu 1iattention des chercheurs est celle
de la photoisomérisation (2).
Cette 'théorie met 'de l'avant un proces-
sLis au cours duquel l'i.somérisation pourrait procéder, soit par excita-·
tion directe; soit par photoisomérisation à partir des états singulets
($1) et triplets (Tl) (3, 4)~
Pourtant, la photoisomérisation en tant
que telle ne met pas en évidence la génération du stimulus électrique
visuel.
C'est pourquoi, plusieurs auteurs ont s~ggéré comme possible
"
.'
e~plication; un éventuel change~ent de la permé~bilité membranaire aux
ions ct l'instar du nerf (5, 6). lors du passage ,du rétiryal de la confor-
mation ll-cis a tout-trans,
Plusieurs travaux appuient'cette thêse (7-
11') ,
~Do~t~ le l1-c~s-rétinal,de l'état d'encombrement stérique qu'il'
,
i
était, passerait par isomérisation a un état plus relaxé et pîus ordonné,
, !
1
~
donc plus compact (17) .dans lequel la chafne polyénique serait plus faci-
lement entassable, pour éventuellement créer des pores. ou des canaux sé-
lectiyement accessibles a,certains. ions,
Le bien fondé de cette théorie
.
.
"'"
,
reste toutefois a vérifier expérimentalement.
Néapmoins, pour l'instant,
nous pouvons débuter a~ec les quelques faits ~ruciaux qui suivent:
1 'absorption d'un photon réduit de 3 %le courant de fond des
bâtonnets (18):
d6nc, 1 'excita~ibn-électronique d'une molécule de rhodop~
sine et d'une seule molécule est capable dé donner. une réponse mesurable
au niveau de la membrane-plasmatique;
"
x.;il,o:
'·f.
,
•
< • •
L
,
' .

---

les ~olécules de rhodopsine travaillent individuellement,
sans trans fert d' énergi e i riterne '( 19); toute ,l' énergi e -absorbée du
photon serait convertie en chaleur, vu
que la rhodopsine semble ne
pas fluorescer (20) cont~airement a l'observation de Guzzo ~t Pool (21);
..;
sous l'effet de l'illumination, le potentiel membranaire des
bât6nnèts passe de l'intervalle {-30 mV, - 40 mv] ~ des 'valeurs plus
négatives vois,ines de -60 mV (22-25):
'donc, l'absorption de l'énergie
1umiheuse fait passer le p6tentiel d'~né valeur a mi-chemin entre les
,
"
'potentiels d'équil'ibre du Na+(E
= + 30mV) et du K+ (E
: : - 70 mV)
Na
K
(10) à une valeur proche "de. E'K (22, 26-'28); e~ d'au~res te,~mes',lamem­
brane plasmatique des segments externes de bâtonnets serait, à la noir-,'
ceur, perm~ab1e au 'K+ et au'Na+ 'alors qu'a la lumiêre" la conductance
'
sodi~u~
,
1
est réduite (22-~4)t l~ conductance potassique demeurant intacte;
l'
-
par ailleurs, la suppre~sion du Na+ dans le milieu d'incubation
inhibe toute capacité de photo-réponse a la cellu1e photoréceptrice' (24,
29, 30).
.,
Si l 'absorptio~ d'un photon, produisant deschan~e~ents dans une
de~' 3'x 107 molécules de rhodopsine du bâtonnet de rat, réduit de 3 %'
. le courànt de fond (50 pA chez le rat) (18), alors l'effet total d'u~
',1
, "
. ,
.
,
1
photon corre,spo.ndrait au flo't de l'ordre de 10 7 charges électroniques !(31);
d'où' une ,amplification de liordre',de 10 7;
le gain "mo léculaire ll de la
6
lumière est aussi, du même ordre de grandeur (3 % x 3 x ,10 7~ 10 ) (32).,
,1
•
\\ -
'. ~' ..;.
.,:.

---

5
D'autres travaux ont appuyé cet effet d'amplification (31, 33) nécessai-
re pour él ever l' énergi e dl un photon au niveau de l' énergi e -requi se pour
l'e,xcitation de la membrane plasmatique. '
De:plu~, les disques ~tant structuralement (34), é1ectriquement
(18, 35) et osmotiquement (36) isolés de la membrane plasm~tique, un
système' ge communication ou de médiateur s'impose entre les deux struc~
turés (10,30,31, 37-40).
,Il en va de même des cônes et des bâton-
nets d'invertébrés (39,40), cellules du type P (figure 2) chez qui
.
't
,on observe parfois une importante distance entre les microvilli, porteurs
du pigment visuel 'et le siêge de l'excitation électrique (41).
Donc', le p~ocessus"V1sùèl prêsente un aspect ionique dont le mé-
çanisme :,fait appel ,a un systè~e de transmetteur et un système de gain.
.
,
,
~C'e~t a patti~'de cesdo~nees que Hagins (JO)' proposa,'pour le pro~essu~
. .,,. ~
"
v~;uel "l~'~~cah~sme l~ pl~s a~cepté aujourd'hüi. Noûs 'en r~sumoni le
mécaniSme commes ui t:·
Ala noirceur,. circule dans les bâtonnets (cellules du type M) et
cône's, (cellules du type P) de vertébrés (figure 2) un courant dépolari-
sant qui eritre p~r le ,segment e~terne, passe dan~ le ~ytoplasme, sdrt
,
,
par'la terminaison' nerveuse: et retourne au segment externe (31, 42-44)
dont ,la membrane est perméable au Na+ grâce a un réseau de canaux; au
nivea'u de la membrane plasmatiqUe du segment interne, une pompe Na-K
,àctionnée par l'ATPase permet l'entrée du K+ contre l'expulsion du Na+.'
"
•
\\.1
,'~.
,':
- ~~.~:-~~~: .

---

Ce courant de fond ainsi que les circuits électrique et ionique sont
représentés à la figure 3.' Sous l'effet de la lumière, un médiateur
serait libéré par les disques pour aller bloquer les canaux sodiques
de la membrane plasmatique du segment~xterne et.hypir~olariser celle-ci;
~Iest cette onde d'hyperpolarisation, née d'une réduction ,de gN
(22-24)
.
a
circulant du segment externe vers le segment interne qui.va stimuler
le nerf optique.
Chez'les bâtonnets d'invertéb~és .(cellules du type P)
(figure 2), le fonctionnement est diff~rent:
la membrane plasmatique
du segment externe est perméable au Kt et imperméable au 'Nat , ayant un
~otentiel trarismembranàire proche de E (45-48) jusqu'au moment de 1'é_.·
K
ciairage 00 se crée ~n co~rant de dépolarisation sodique gr!ce a une
augmen:tation ~~.gNa (45-'47,49).
Ce courànt circule le lon~·de la mem-
bra~e ~la~matique du segmeht èxt~r~e vers )e segment interne, e~ direc-
tion des· cellules ganglionnaires'; le système retourne ct l'équilibre au
moyen d'ul1e ponipe sensi,ble a la ouabaine (32, 50, 51).
Dans les deux
,systërrfës; ie transmetteur'semble être le Ca 2+ (,30, ~2, ,37,52).
,.
,
'}.
....
-:D'autres propositions de mécanisme
du processu~ visuel ~ur lesquel-
le$ nous donnons plus de détails en appendi~e (appendice I) font mainte-
. .
~,
.~ :
:',' ',nant l"·àbJet de beau'ccîup de 'contrb'verses:
.': '
La première fait état de dépl.acements dans· la distribution des'
~l~ctrons dans le rétin~l qui e~t stabilisée par une charge dans la'pro-
téine (53; 54);
"
,
.......6t ...
, '
:... - ..~~;:,.,,',

---

' , ' .
.' "
\\
'
.
"
,~
J
Fi gu re 2
Bâtonnets et cônes des vertébré~, cellGles
de types M et P ,
"
.1
.
"
! '. '
A -. 'N9U? présentons la structure des~âto~~~:sdes vertéq,r~$,.:A.. ":~"i "":~""
droi te. nous comparons' les structUresde.,'diif'êre'nts pho'toj:~'
. ,,"
'-'.
réc~pteurs vi sue l s.
~.
.,
B
'Structure du bâ,tonnet dl invertébré (ce 11 ùl e du type P)
,,'
.'~.' ,
:
•
:1'".'
.,.
..
,
.;
C - Structure du cône Cee 11 ul e du type P)
....;~
0 -
Structure du bâ tonne t de ve(tébré (ce 11 ule du ,type M)
Chez les' ceJlules du type P"la ,~embrane discàle est en continuité
avec' la membrane plasmatlque, alors.que chez les cellules' du type M, 'mem-
branès discales et plasmatique
sont séparê~s.
~ .
~' ~.' .
. ,

---

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Fi gure 2

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..
"
Figure 3 :
Circuits électrique et i~onique du courant de fond dès oâton-' ";- ,.. ;,
~
- .;
. .. ' ~.
. '.
'
.
•
" . ; ' . , '
" :
,.1 •
~ . .'
. net~ de vertébrés (37)
....
"
':. '.
...
;
"
."
A ~
A la noirceur, ~n coGrant de fond, ~e nature' sodiqu~, .entre
dans le segment externe du bâtonnet, traverse toute la cellu-
.',
. "
:' ,.
1e~ s~rt par 1a termi nai son nerveus"e et retourne au segment'"
externe pour fermer la boucle.
B
Le courant, de fond est'supprimé par-l'incidencede la,lumiè're ..
C -
Schéma ~eprésentant le circuit électrique (32) correspondarit
t
"
~u co~rant de fond.
Au niveau du SEB, Je Na
entre passive-
"
L
-,
ment dans la ce11ul~co~tre"~~e fui~e d~ Kt pendant qu'au ~i~
veau du corps cellulaire, le Nat est exp~1sé pa~ une pompe (P),
symbolisée par la roue orientée, contre une admission du Kt.
;
"j.
•
é
.'

---

8
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+
(A)
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SEB
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Ci lium,
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nerveuse
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SEB
Corps
Cellulaire
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1
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Figl:Jre 3
:
"
'1
l
', • •
~: . . .:':: ,; .'. .
';.'
'~_~:,:,;"7"J:..2:-:.

---

la seconde fait ~ppel à un transfert de proton par effet
tunnel (55);
et enfin, une troisième est fondée sur le contrôle du poten-
'·Hel de photoréception par. un cycle,de transformation enzyme-substrat,
~ savoir'la GMP cyclique et la GMP phosphodiestérase (56, 57).
Vodlàj ~n bref, 1'histoire du processus visuel et les principaux
",
,
.
'..
. l '
,-::-
.
. . " . . .
.. " .
. . ,
~
,':'
, ' .
" .
,
'
..
.' ~mécanism~~ pro~os~s jusqu'A cè jdur •. Chacuhe des thêse~' avant~es se dé-
o
'
d
•
i
_
•
.
1 ,~.
• •
"
,
- •
, , :
"
•
fend.
'.assez éloquemment comme nous aurons l'occasion dlen discuter plus
tard.
U incombe néanmoins au~ adeptes de l'une ou l'autre thèse la tâche:
(i)
de pr6uver que la lumiêre engendre une réponsé ou une réaction suffi-
sante' des '.espêces en cause.; et dan's un temps suffisamment court pour être
..
:~,:'PhYs i01 d'gi q~émen t à.cèeptabl e;':. CuJ de r,eridre 'compte du système de médi a-
.
'
,
'.
ti on et'de ga in; Cu)..'}
,d'expliquer le mécanisme de retour a l'état
d'équil~bre du systême de la photoréception.
!
,B).
But au tra'vail
Le but de ce·travail est d'approfondir l'aspect ionique du proces-
sus visuel sur une membra~e artificiell~.'. ~6ur ce faire, nous avons
'_ choisi·~~ travailler sur un modêle de membrane artificielle de grandes
':,~ ."
. : - .
l ' . :
",
:-
":, _ 1.
,_
._'.','
•
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~
' : , '
,
-
<,. 'dirnen.s i bris, capab 1ê de donner des répOnses rap,i dès, un modè 1e membrana i -
..
i
~~
'"~~
. re dan~!:lB:juel nous puissions étudi,er :les interactions intermoléculaires
l._.
, .éventue~lement imp11quées dans le changemènt de la perméabilité membranaire
....'.
::.':"."?: },.'
< . ; .
f - ::';;. :.
.j:
1
'
".,
p-
J..,""",,'~.
'

---

la
aux ions.' Nous avons donc entre~ris de travailler a la mise au point
.,
d'une méthode de préparation de membranes artificielles sur support po-
reux par la techni~ue des 'monocouches sur laquelle ~ous élaborerons en
détail plus loin.
Pour le moment,'il-semble oppo~tunde donner un aper-
çu général de la constitution de l'unité photoréceptrice de la vision
scotopique.
, 1 .
, 1
:)}.
. C)
. ,"i
Le photorécepteur visuel:
lie bittonnèt des vertébrés
- (
"
"
1
,. f
Le batonnet (Fig. 2-A et 3-6) se compose, essentielle~ent (58) d'une ter-
minals'on nerveuse, d'un segment, 1nterne, le éentre du métabolisme cellu-
laire, d'un cilium qui rel~e ~e dernier au seg~ent externe,'telui-ti
"
étant l'antenne p~otoréceptrice. Oans le se~ment externej se trouverrt
"
.
empil és lés u"ns s'ur 1es autres, que 1ques,deux mil li ers de petits, sacëu-
. les, les disqJ~s, dont la membrane renferme une 'couche monomoléculaire
de rhodop'sine' (59-63).
Ces disques provienn~nt d'invaginations de la'
me'mbran~ plasmatique et en .sont 'séparées par la suite (64, 65) pour en
.....
:
>',
l '
•
y
. 'fair'e des strùctùres i.solées U:ellules du typeM)'i,alors,que;ces invagi-
"
nations, demeurent rattachéés ~ là membrane plasmatique ~hez les cônes
pour en faire'les cellules du type P.' Les disques et la membrane plasma-
tique son~ séparés par une distancé d'au moins 100 ~ 200 nm (la, 18, 34).
):
..~
. &~f\\
'De~1' études sur lëidiff~actiori,~e~, neutrons (66) ont montré que la
rhodopsine ~raversela ~embrane.discale d'un bord a l'autre et qu'elle
., .
'; 1
,
,
l,
" "

---

1
. ,
.........
. '.
Figur~ 4:
Ultrastructure de la membrane discale
. . ..
, . '
.... ,
A
Structure du b~ionnet de vertébré compo~tànt des ~il~
\\
liers de disques dans le segment exte~ne.
'.
. : \\
B
Structure de la membrarye discale montrant les molécul'es
d~ rhodopsine
(Rh),
baignant dans la bicouche phospholi-
,
. ;
pidique. ,L'effet de la lumière estd'exçiter la rhodopsïn'e
pour fairelibérer aux disques un transmetteur qui'va,bloquer
les canaux ..sodiques de la membrane plasmatique comme l'i.ndi-
quent les flèches.
1
c
La 'rhodopsipe e~t en liberté de diffu~iqn rotatoire ~t
t
. ,
.latérale dans la,membrane discale.'
.'
..' .....
....,'.

---

11
A
8
.~3à6,LL"
externe-----
cytoplasme
1
1
~se
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CNe.
(principalement
Kcl
CNa =-
disque
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30 à 50 fL
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M i'tochondri es
cytoplasme
(KC\\ ),
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corps
synapt iq ue
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.{~~~:i.;'..<,.~-.,.,_:
. _'. . .t".
..t •

---

serait plus exposée au milieu cytoplasmique. qu'au milieu,iritradiscal·
(figure 4).
Tout récemment, ! l'aide des rayons-X et d~ la protéase
sublilisine, Dratz et coll. (67)· ont montr~ que la molécu1e de rhodop-
~sine tra~erse la bicouche lipidique àu moins cinq foi~ (figure 5) expo-
1 •
•
1
~
sant l',a chaînepolyp'eptidiqtle trois fois aux milieux aqueux; son carbo-
nyle ierminal touche au milieu {nterdiscal et sa terminaison aminée a~
milieu intradiscal.
Cette terminaison N serait liée de façon covalente
.:. ...... '~
à des r~sidus d'hydrate de ca~bone (69, 70) probablement au nombre de
.
,
.
"
-q9atorzè '(67) !l basé demannos'eet.' de'-N-acétyl 91 ucosami ne (71).
Il
.-~ '.
. ~" ..
,:--"en serait de même de la terminaison C près'dü n~einal, (72-75).
Ces
'jntradisca1 (69~ 76~ ,h~, 78) .
. La membrane di sca'l e es t composée d ".envi ron 50 % de prot~i ne dont
la r~odop~ine représenterait environ 85 % (79)~ et'50 ~,de lipides ré-
t!,
r.
partis comme suit:
46 %'dephosphatidyléthaho1amine (PE)~ 25 %de phos;-
phatldylcho1ine (PC), 15 % de'phos"PhatidYls~rinè, 17 % de cholestérol
etq~elques traces dl-acides gras iibres et de sphingomyél.ine (80). Se-
,
.
'. ~ ..
10n' Cr~i.n et coil. (8l,).~ les phospholipides sont.distribués de façon asy-
,
,
L; ,
.
:f '.
~
. '
f
métrjque dans la membrénèi. de l~ a-27 %de la PE sont localisés d~ns
,1 a. mpi ti é interne de 1a membrane';: contre 63 à 72 % dari:;~;' 1a moiti ~ exter- _
·rie; ~Vec6 a 14 % atc~ssibiesau~arqueur chimiq~e (le,sulfonate de tri-
':"riitrobenzëne) la PS se retrouve. ~ 25-35 % sur ,la face intradiscale contre
,
' .
.
25-il %~ur la face cytoplasmique.
Oe plus~ Crain et coll. (81) ont
"
-,r.! "?'
"démontré au l moyen ,du difl uorodi nitrobenzène que 72 ~~ 'dé"'l a PI sont en tre 1i és;
"':" .
- :~ .
. .~:. "' ."
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..~"._ .:f: ';"'"

---

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..
.~:
\\'
:!'- ",
:.
~:
.~
Figure 5 ,.
Structuré de la rhodopsine et formation des: canaux'd~ ,lt-
•
• 1~ ~••
bêrati6n du calcium par les disques
A
StructUre sommaire de la rhodopsine.
2
B et ,C
Fonna tlon des.' canaux de li bêrati,on du Ca +.
, ,
(Référence 68)
,"
,
./
, 1

---

13'
(A) '.
. '
SURFACE
CYTOPLASMIQUE
\\
MEMBRANE
ESPACE
INTRADIS.CAL
,
. ( B)
( C)
HOb
RESIDUS
NON-POLAIRES
j-
>,'
RESIDUS
POLAIRES
....".
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",
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---

.
.
~
~.
14
43 % de la PS liés avec la PE et 6 % ~e la quantité totale de PE ainsi
que 37 IOde la PS sont liés a des protéines membranaires.
,Donc la PE et la PS sont prépondérantes sur la face cytoplasmique
de la membrane discale.
Et com~e, embryologiquement parlant, la membra-'
'.
.
. ne discale est faite par des invaginations de la membrane plasmatique a
partir de la b?se du bâtonnet (64, 65)".1~~ distribution~ des phospho-
.
.
.',
,
~
,
1ipidè~ d,ans les deu~ structüfês~'-sont'llimagemiroir i (une de l'autre.
'" ,
En d'au~res termes, la PE et la PS qui dominent dans- la moitié externe
(cytopla;mique) de la'membrane discale, le sont dans' la moitié interne
, 1
.. (cytôplas~iciue) de la membràne:,pi.asmatïque:
.j
~
Ces informations seront f9rt utiles dans la préparation des-membra-
nes artificielles modèles et ç1ans' l'~'laboration d'un mécanisme dlaction
", :dè la' rh~dopsin'èd~ns 'le processus visùel:
Des 'dbnMes supplémentaires
,.',
\\
. sur la rhqdopsi~e et la cellule pho~oréceptrice sont présentêes dans
".
,,1 appèndi ce 1I.
·O)··.. Plan. de travail
..•• i
.i
En partarit des renseignements donnés ct-haut,,"nous avons tracé le
plan de travail présènté.a la figure 6.
:: D'abord, ·il s.' agit de'~~parer l es segments externes de bât6nnets
. (SES) des segments internes (SI.8).
Pui~,'la rhodopsine .e·xtraite des SEB
.
'
,
"
.
sera caract@risée en monocouche.
De la même façon, les principaux phos-
pholipides que lion 'retrouve dan~;les SEB, c'est-à-dire la PE, la PC et
,.
.,~"
., -
..,. ~
' , '
~~"
. .
,,~.
'-\\--~--'.'"
' .
'.~~~:~

---

".
15
"
Réti'nes
Bovines
(ou
yeux
bov.ins)
1 SE 8 l
1 SI B
1
1 Phospholipides 1
hho,estéroïl
:"
{,
1 Rh o'd 0 psi ne
l '
;--1
~ \\ ' "
Monocoué he
.
~,-
171" - A
Il Irradiation 1
'17T - ~
lntéract ions
1
•
1
..
• i.
'.
' ' ; ,
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....
,
"
".'.
,
1
Intéractions
1n t er mol écu 1air es
1
l "
I-----r-------------..:-..------::...---.---~---...,...----'
Membrane
Artificielle
1
1
'.
"
\\
:", ,.....--.;..;...;..--'-'
.,--.:,-
---11.;...-----------------------.
" ,
o i ff u si 0 n
Photo '"7 induit e
de
de K~
et
de
Ca 2t
J.
'
,"
.' .
Fi gure 6

---

16
la PS, ainsi que le cholest~rol seront e~~aussi caract~ri~~s en ~ono-
~ouche.
Une ~tude d'interactions intermoléculaires sera men~e sur
ces constituants lipidiques entre eu~, ainsi que sur le m~lange lipide-
rhodopsine dans 1e~rs rapports molaires respectifs in vivo~
'. ~
Une étape cruciale sera la mise au point d'uné méthode de prépa-
ration dela membrane artificielle p~r la technique des monocouches.
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Enfin, nous pourrons 'procéder ~"l'étude ~inétique de la diffusion
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ionique à travers la membrane incorporée de rhodopsine à 1laide de macro-
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~lectrodes spécifiques dans des' conditions d'llactivité" (noirceur) et de
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CHAPITRE II
MATERIEL ET METHODES EXPERIMENTALES
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II -
MATERIEL ET METHODES EXPERIMENTALES
A)
~latériel
1)
Bain de monocouche
L'appareil de base en monocouche est un bain de monocouche, du
type de Langmuir, modifié tel que d~crit par Hotchandani et coll. (82).
En bref, 11 se compose d'un bain en verre dé 30 cm de long sur 14,85
cm de'large et 5 cm de profondeur, sur lequel est monté
un système de
balancier pour la mesure de la pression de surface (figures 7 et 8).
L'intérieur du bain est tapissé de ruban de téflon.
Le système de ba-
lancier comprend:
un fi l de to'rs ion (figure 8, item 3) eri aci er inoxy-
dable~ solidaire en haut d'un miroir (figure 8, item 1) qui réfléchit
un fa)sceau lumineux sur un écran et d'un double bras de levier or-
thogonal: . un bras horizontal (figu·re 8, item a) qui sert à supporter
les pOids marqués lors de l'étalonnage du systême de mesure et un bras
verti~al(figure 8, item b) enfourché dans un flotteur de mica rattaché
aux parois du bain pa~ deux feuilles d'or (4 x 0,5 x 0,0061 cm) - les.
feu'lrles d"or peuvent être remplacées par des feuilles de téflon. -.
Une
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barrière mobile en verre (21,7 cm x 1,0 .cm x 0,6 cm) enveloppée de ru-
ban de téflon, actionnée par un moteur rotatif à vitesse variable grâce
'~ un rhéostat sert à compresser les molécules ~ la~surface du bain rempli
d'eau·.distillée ou d'une solution appropriée.
Le bain de mesure est mon-
té dans un autre bain d'éau thermostaté, et le tout est logé dans une
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Fi gure 7
Bain de. Langmuir; vue de profil

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Bain de Langmuir. vue du système de balancier

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7- Bain
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20
cage de p1exig1ass à l'épreuve de la poussière.
De plus, tout l'appa-
re~l de monocouche se trouve dans une salle de monocouche munie d'un
système de ventilation et de contrôle de température (~90,0 ± 0,5 K).
Et pour finir, la salle de monocduche é11e-même se situe dans un 1abo-
ratoire à air c1imatisê (288 ± 1 K).
Nous devons prendre toutes ces
précautions afin d'obtenir des isothermes de pression de surface repro-
duttib1és, une des mesures i~portantes en monocouche.
2')
Appareil' d'adsorption
I;j
,
Un moteur synchrone de 0;25 rpm (Cràmé'r, modê1e 117 P, r1eter~
"
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master, Montrêa1, Qué.) est uti1isê ,pour effectuer li transfert de
monocouche de l'interface air:-1iquide a l'interface air-soUde.
Il
trans~et a~ support s~lide,un mouvement de va-et-vient à travers l'ih-
terface air-liquide .•'
,t..
3)
Support d~ la mem~rane artificielle
Lé système d'adsorption (figure 9) utilisé pour la préparation
de la membrane artificielle se compose d'un disque poreux (figure 1ü-B)
en cellulose triacêtate (filtres Ge1man Metrice1, GA-8, 47 mm de dia-
,f
mêtrei ü,2 ~mde diamètre d~ pore, de Ge1man Instr., Montréal, Qué.) que
nous avons; fixé sur un b10è de téflon (figure 1ü-:A) par;un anneau ~g~le-
,f
~
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ment en téflon (figure 1Ü-C).
Le bloc de téflon es t percé d'un trou: sur'
le ~6té (figure 10-À, item b) et d'un autre au dos (figure lü-A, item a)
(tous deux d'un diamètre égal à 3 mm) pour 'le fixer. à l'appareil d'adsorp-
tion pendant les manoeuvres de momtée et de contact horizontal comme

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Figure 9
Photographie du système d'adsorption de bicouche lipidigue
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21
Figur~ 9

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Schéma détaillé du sy~iême d'adsorption de bicouche
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Bloc de téflon (pour ?uppprter1e disque poreux) pourvu d'un
trou (A-b), sur le côté pour le fix~r a l 'appareil 'd'adsorption
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Le trou (A-b) s'ouvre sur )a'Jac~ du 910c de téflon par l'ori-
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fice (A-c) qui sert de tuyau d' échappement à l!a i r. "
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Disque poreux ~ .
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C -
Annequ detéf10n.~ervantà fixer le disque poreux au bloc de:,
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1 'ouverture du, fond de
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de
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Systèm.e d'adsorpt,ion '~s~emq,lé, 1T10ntr~nt la face ~xposée (q-e)
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du disque poreux et l~ tige de fixation (D-d) d4 système
d'adsorption a l I~ppareil~',ad~orption.
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23
nous le, verrons dans l es m~thodes expérime'nt~ les.
Le trou du côté
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lj1gur~~lO-A, item b) s'ouvre s~~ la'jâce d~ b16t'de téflon par un
peti t conduit (fi gure l a-A, item c) de l mni'de dî amètre qui sert de
tuyau d'échappement â l'àir lors du contact horizontal.
L'anneau, lui,
,càmporte une entaille sur le ,rebord. laquelle est dirigée vers le bas
durant la manoeuvre de monté~"pour l~~sser s'écouler l'eau librement.
Ce"système permet de prêpare~\\ la bicouche sur une seule face du disque.
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4)
Montage de mesure,'de la r~sis~an~~"membranaire
La résistance membranaire a' ~t~ mesurée" avec un montage standard
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(figure 11) composé d 'pn~ SOurce de tension de, courant continu (fournie
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pa:) et d'un,multimètre digital (m6dêle l7~ OMM, Keithly Instr. ,Cleve-
(
land, Ohio).
La membraDe; supportée par le disque poreux; est insérée
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entre deUx compartiments de verre à"l'aide de joints de téflon comme ils
~e~~nf·d~crits dan~ là s~tti6n d~mohta~e demesufe de diff~siori ioniqUe.
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Le~ mesures de résistance nie~branaire sont prises en milieu de KCl 0;1
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;'ihdul te
Il se constitue d'un double compartiment de béchers taillés,
rel iés, par des joints de téflon.
L'étanchéité du système est assurée"
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,par de~ rondelles de éabutchouc' i:nsérêe~ dans l'es sillons des jo"irits"
·de téflon au contaèt des b~chèrs.'
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Figure 11
Montage de mesure de la résistance membranaire.
Le montage est co~poséd'une source de·courant continu~ d'une résistance
connue R, en série avec la membrane insérée dans 1~ système de double
c~mpartim~nt;'.ce dernier est serré èn étau entre des pinces, .comme 11;n-··
diquent les flèches.
L'électrom~tr~' s~rt. a mesurer la différence de.
potentiel aux bor~.esde f( lorsque' l:e,!i <ie!J~ éleçtrodes.s~nt introduites.
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cées de part et d'autre de la m~mbrane, dans les deux compartiments.
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ter toute fuite de cout~nt êlect~ique ou d'ions autour d~ la membrane.
La f,gu~e 12 donne un schéma du 'sYstême:.
Le compartiment numéro l
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Le 'poteritiel ionique se fues'urea:",a'ide d'un:pH mètre (modèle PHM 26,
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Copenhagen, Danemark) et-'d' él eci~'à'des':;~:pi~cHiq~èS à memb~ane échangeu-
" 5"d'idni ~iquide Po~'J"{f~t~n11,~~~\\~jf~'~'f"~'èchilh9,eür d'ion5solide '.
pour la Na, toutesprovenalit'dè:la cômpagnieOricin (Or-ion Res. Inc.~
,:'-, Cambrid~e~;\\>Mass. ).,.,;".;Les-~T~t:ttes{-;~ât~-~jèls- etPfdduits chimiques sont in-
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BDH Chem., Montréal,
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99 mol %; réactif A.C.S.
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Montréal, Qué.
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Réactif,A:c.S.
Fisher Sci. Co.,
Montréal,Oué.
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Sucrase
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Chô 1es téro 1
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St-Louis, Mo .
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TritonX-100
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Extra'fte' du foi~dè' boeuf
AppLSci. Lab., Inc.,
, State Co11ege, Pa.
PS
i' bfcl ",~; :.,: :: ,::! :'
ibid
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::1.;"-;
PC
'Extraite 'du:' cerveau de boeuf
ibid
Bi o-Beads. SM-2
Doit être lavé avant usage
Bio-Rad Lab., Richmond,
'Ca.
Bi6-Rad P~6tein Assay
ibid
Colonne de chromato-
45 cm de haut sur 1 cm de
O.H. Johns Sci.,
graphie
diamêtre intérieur
,Montréa'" Oué.
Colonne de chromato:,"::'"
Co10nn~. K-l~, réservoir R-15
pharmacia Fine
" '-.'
gH!phie
"-:,:;";, :>':'~',>;
"':.. >
, , " , Chem.; -Uppsala;.
:;...:~. ~..
",
Swedèn
Electrode Ag/AgCl
Fisher Sci~ Co;"
,',
Montréal, Oué'.
El~ctr6de spétifiqu~
,Echang~ur d'ions, état soli- ,
Ori on Res.. 1nc. ,
, dÊ~' Na+ ,
i ,
de; référence: élect'rode à
Cambridge, Mass.
·dolJb1e tube (tube interne rem-
0:'
pli de la solution Orion 90-01;
tu&e externe rempli de NH C1)
4
, ;
..~'.
,.~âiJ&~·~,:-,;::.:..;':,i~~tJ~~;~"';'Z&><"''''':'~~_:_'M''''';- ."""..". '
.
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:'MATERI ELS
PROVENANCE
Electrod~ spécifi-
Membrane échangeuse d'ions
Orion Res. Inc.,
que de K
"liquide; référence: électro-
Carnbr; dge, l"1ass.
:<: ,'('dê' à" tube' si mp'l è renipl i de
"
NaCl, ~ ,
Electrode spécifique
Membrane échangeuse d'ions
ibid
'de Ca 2+
' : , liqùide; référence: électro-
";,; ~~::'/::,:~~?:;~t~~~' '~~~Sl~~~~~~l ~v~~ Ag+
Homogénéi seur man~Ù ~,~:'r~!;,:;~'" '
" "
Pyrex ,Lab. Glass-
ware Corning, U.S.A.
Memb,r ané de diaJys e'<; ;~,\\hl~~~~~}:;;;; ,"
Millipore, Missis-
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sauga, Ont.
..~.' .:~: '.:):
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Papier fi l tré, enton~.' 'Porés; de 5 ~m ,'6,45 11m 'et de ;
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noir et support
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Spettrophot6m~tre~
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Variant Instr.,
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Hitachi Ltée, Tokyo
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Ultracentrifugeuse
IEC, mod~le B-60
Needham Hts, Mass.
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B)
Méthodes expér"jnlentales
,
.. ' . .. ~-' .
.",'"
.
. 1)
Extracti on et p~'rifi'd~tion .de 1a rhodops"j ne
"
Toutes l~s manip~la~io~s sont effectuées sous la lueur d'une lam-
"
.>~~ .'. t', ,-": ":..:. ~:\\t.:::i~.'· ';~<'.:'~~;- ., "'~:"'>~ ~< ~' -, ....
,
pe rouge 25 Wet .li' 277K~';:;sàuf "av; 5 contrai re.. La procédure débute par
..
'. :r
l' i sol ati on dessegl~ents.;e~.terries,de .' bâtonnets (SES).
.
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"
.. , .. ":' Les . SEB~sont"'lsolés\\'-soi t! 3 partir :dé' réti nes .bovi ries 'de 1a mai son
' :
l • .
Gè~rge. A. Horme l:(Mfnnes6ta:).;'·;sà;·t dl yeu'x:: prbYênaht d'a,battoi rs de la ré-
'-;...
gion de Trois-Riviêr~i'LDàns
ce d~rnier c~s; les .yeux 'sont disséqués en
:pratiquan~ u.rie.incfSiôn. la'téraié'dé,l'oeilqui p~rmet de lë vider pour.
•••••
' "
~ i
laisser la r:ét;ne:p~nd.rê··du nerf optique.
Celle-ci est 'tout simplement
,.
décolée de la chorofde et sépérée d~ nerf optique.
Les· SES sont alors
isolés par là méthode d~crit~ par Applebury (83):
-
un lo't de 50 réti nés 'dége 1ées sont moul ues: Jus.qu 1 à cons i s'tance
.,
,
, : pâteuse douce , puis suspendues dans 50 ml de 's'ol ut"j on froi de de . KCl 0, l
'"
. 3 .. ' ....,.... ,..' ,'.;
';.. '.
. '
. '-3
mol dm- dans'dû t~mpdnimidàzole 0,01 mol dm
, pH:l,O et homogénéisées
.~ . .'
.:
Y.l.~~.~> ~1.:· ,.',
"
dans un hdmogéné~seur mariùel.;
".
.
- '
\\-'
la 'sùspènsiclh est'centrifugée 15 min à 100 g;"
;
,
le surnag~ant épais de SES est recentrifugé 20 min à 27 000 g;
. '.
~'.::-' .. '.,;:...<~~" ..3' ·~"·~'::·.::;·~·;~r·":\\!"··;~:~·:~;':..:'~!;"·:"';'"~·: ,~"~ . .,~.f: . -:. ,.
.
,"
.-'
~ . ,
... ,~'.
• ;';> ,
>,~' le>ëûld't"e·s1::..:r.êcüeilli 'pour la 'premièrefl?ttaisàn;
. "
'l'e ''\\;ul ot h"6rnbgénéis'é' dans 50 ml. de sucro~e'40 % (P/P) dans du
tampon i~i d~Zdl e' a ,al' mo~ ..'~m -3,PH: 7,0 est centrifugé 20 min à 27 000 g;
.....
4"' . . •
,
};~:.:-.
~"M,"_O'\\~(" ',;;i~(;;i.i~}L.;.:,:..:;~;WJji~::·~:"·.·: ..
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~
" ,
....•... -
, 30
~ on décolé l~~matériel~flottant sur la paroi que l'on récupêre
..
-'
'
ainsi que la moitié supérieure du surnageant;
3
- la suspension est,'diluêe 1:4 ave'c du KCl 0,1 mol dm- , imida-
-3
,"
zole 0,01 mol dm ,pH: 7,0, .centrifugée 15 min à 27 000'9 pour sédimen-
ter l es SES ~
"'..
... :i,
'~"!:"
t { •
,
, j
~ i ,"
les SEB sont, ai6r's:'fsoi,~s, par ,là-,:méth6de, de Mcéonrie'll (84) com-
' .
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.:..;::{'~l:""':' ...,.', ~ ;:~"~ /. ,~'~.' ~.
..~,'"
me suit:
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,
'"
.~~,,"!: i•.~.:';:::~/~ l '"," ·~;.l~·...t~ , .. ,.-·r
Dans ~n tubel\\~i~diirit~ 'ori dê~6sé 6'~1 de sucrose 40 %, imid~-
zole 0,01 mol d~"'3';f;d "=:::f,~à2r~>6'ml :de,sùc'tos~ 20 %: imidazole 0,01
mol dm- 3,pH:' 7,0 (d'~'~f:08~)~':La\\'usperisiond~ SES dans du KCl 0,1 mol
.
-03'
' .. , .,,: ~..: . 1: ·ô':,.· ;;;:::",<.; . '~' '1 . . " ..... ,,'
' i
dm
, i~idazole est dépbséeau~dêssus du sucrose;
Après 2 heures·de
,
..
1,"
}"
t
. . .
". tentrifugàtion,lL51,505, 9 a '2U'K àvec un rotor .5B':'2B3, les SES, loca-'
iiSê~' vers le miii,~'u 'du' tubë s~~{:retirés' a l Îa1de' d'une pipette Pas~teur .
propre.
Le~ ~~B ~irisifsoléss~nt lavés 2 ou 3.foi~ i l'eau distillée,
pu·is conservés a 253.K,sous atmosphëre d'azote jusqu'a'u moment de leur
Ûtilisation.
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' , , ! ,
"
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,
.
,
. . .
,-o'
•
Les segmentsexte~nes"de 25 rétines sOlÎt s~spendus dans environ
l ml de Trit~n x-160 e~ ~ol~tion de 2 % (V/V) dans du tampo~ Tris-HCl
r
.
2 x~lÙ~Jmol dm- 3, pH: 7,2 00 ils sont solubilisés par agitatiori magnê-
,
,
,. ti que toute uh{ nun: ....'· La sbl ûti:on es t al br:s centrifugée l heure' à
' .
'
.
..
. ;
'
' , , '
.
, ,40 OOOg.
Le sUrnageant' alors c.lair de. rhodopsine est récupéré pour
être purifié.
A cèttefin,'nous "utilisons"une colonne de cellulose ëfnlo-
"'
nique Ectéola 'dlune' ha,ûteur 'd'elOcm et de 2 cm de di·;3mètre.
L'êlution.
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. ",,'
:
,~
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---

31
. , ... ~'..
1" : ••~.
se fait avec du TritoD x~ib6 2 %rlans du tampohTris-HCl 2 x 10-j mol
. ,-
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dm- 3 t pH: 7 t2't NaCl 10-:-,2;ITlÔ"l.d~-3 ..
~ ~ ~ ~Il'
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,
.
c)
El iminationdu.détersif
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:v~·.;';,:·::;;'}~ù:!:j~Ô';V,' ,'.; \\', "
J
,
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L"étapesuivanté::e~t~~'l:~élimi~n~tldn 'du détersif. C'est une opé-
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.
'.
.'
'::~"1':"::'~ <';t~:'1~:t1:'~;:;:~:; '~.:~ ~ .:.:..... - :.
ration simple de princ;pei'I!':?riiàiS:',extrêmenient délicate d'exécution;
J
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, ' . ' , ~ ~f .·.14:~~\\~·I:::;·~·~ii~"'·'
"c"} ,~,~~~~;' : .:' . _.-
'Comme la rhodopsïn~ est.ins·qlüblè d~\\nsJ'.eaut il s'agit de soustraire
~.
J.> .' ·.:,"._~··':~~_'·'.{;'~ij~/~~Y~ ..,· ...;,.:"~~~':.,.':~'.:'" .. :~:"'"
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le détersif de la sol'ut1ori':,'suffis'amment poUr que le'reste n'affecte
' .
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... ":':,.:.:·.~:;·S:4:!.·l·.t:·:·i~~~J·~ ,,~~j :-& .': J;;"
,"
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"
.
.
~pas 1es mesures, effe·ëtuées:. eh monocoLiche., (l~ détersif étant un agel'1t
'tensioactif) t .et pàs".tr,~p ·pB:~;.' Pf~ci~1'~è~' ia 'rhodopsine. Ainsi t,la
: . '
.
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~.. ;.: .': .,~:~ . :" (~~"::' ..~ l.;.;ll. " -, ,>: ~. : i',.'.··.~ :: :,';.
'
· solution est d'abord abondamment. diluée avec du tampon Tris-Hel t puis
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recohtentréeàvec: unemeinbran~·~a~ dialyse M'n; i pore éonn.ectée à un
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.
..
système a vi'de. > La .reconcenttàtion· de.' la solution est accompagnée
d'une éli~inatiori partielle du Triton X~lOO. ;La scil~tion concentrée
;':"est al'ors ajo~tée a du Bio-Beads SM-2 en raison de l ml de sol ution
pour 0,3 9 d~ l 'adsotbant lavé selon la méthodi de Holloway (85).
Eh
.
. "
~
:gên'éral, la"solUtiôr,'est traitée 'âuBiO~B"eads p~r inversion pendant' ,
2. heures'. ;,.L'élimi·nation du détèrsif est .. suivie en spectroscopi.e d'ab-
'~.t :'
;~•. ,"
' . : "'"
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4
:"s'orpdèin (À. ""'::"275:' '~ri1) 'et en ~onoc·oui:he.
Le traitement est "~rrêtê
'
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max··
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.
, ..
.
'
10rsqLi'appar:-att l'épaulement a 275-280 nm et que l'étalement de· la
,
,
·'quan t;tê de' 50 l ~ti on r,equis~ pour une expéri ence de inonocouche (,... l 00 ~ 1) ..
,
•
,
..... ";f, .~~-"
'
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,.
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"
,
•
•
he génére qu'une pr~;s'i~n' de surface négligeab,le « 1 'mN m- l ) ct une com~'
pression zéro.
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1;:i,~isk~i?!;~i~!.~~~$!C~'.: ,

---

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32
Une autfe m~thodé,ài~tê:aus~i utilisêei celle décrite par Zorn
,
".-' '.' .
':èt Futte'rman (86) qUiè6~~:~'~si/~'ex'traire le détersif avec du toluène:
~.' :: "1;
•
les ,segments' externes d~: ,b§tonnetslyophi li sés, sont suspendus dans
'.,> ~;t ~~. ;~ ~:"~ .
'.";.
'.
du toluèn~ a 277 Ki 'cen~ri*ug~§ j min â l
. .
. .
éoo g. L'op~ration, répétée
.
~
-
deux autres ,fois. donne·un ,dùîo'tde.rhodop~ine pratiquement insoluble
. .
.~/ ~', '~~:~{:" ~".:~~ .: ~
dans les solvants organiques"usl;Jëls tels que 'le di~thyl éther, llétha:-
';',:-f..
,;-' ..,'
nol, le n-hexane, l:è"toluène>yet,L'eau ~ moins d'y ajouter du détersif.
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Microscopie él'èètr'oniqué, -aé :la rhodopsine
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Dans le but deco-nna,ttre.les'dimerisions et la forme de l"a rhodop-
,
.'
.
•
~
1•. ,
, .
•
.'
• '
1
sine de rios ,prêpa~ations, ~oûs,avons procédé ~son observation directe
au microscope êlectron1que:Cmodêle Philips No~ 201; -Amsterdam, Pays-Bas).
Le pigment visûel, ,exempt .de,dête·tsif a: êtê coloré né,gativement avec
. èlé l ,'acéta te ~i ,'urariiulri~ .i'd~'n1 d~"'l' eaU:' (s'Jr des' 'g'rn ies' fo~mvar'-carbbne-,
traitée au plas~âgf~w) ef'-'6bs~:rv-é:, pa,r:tt~hsm;'s'si~-n"a~ec urie tens'iori de
. ':' ..'
"
,~,
~. t, '
J~).
•
'. , , "'60 'I;'V' '."
• ,•.' "i:
1\\..
3)
Monocouche
. "
~ . +_.l.~ 1~.
':, L'exp~~i'-erîèè de.l;homme face aux films de graisse à la su'rface de
.~ ,,~. ~·::.r:~'l:
.'
.,",,~",;:,- :,,·~~,_.. ?:i-i~! :.:·(")~f-;.. '.,."" ,:_':~
_
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_,,':l:',i~àij':'re'fliontè ~c:.1 a hàute':àhti qÎJ Hé .', '-En effe t,li àpâ i s emen t des
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".". ~
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~.~.".
.,'. r:·,,:_"".. " "
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.
vagues de l'?c~an' par de's' nappés d'huile était déjà con,nu des anciens.
Gaines (87)'relate que Plutarqué en avait déjà'fait iilentlon.
l"1ais l'une
"~' . " ~': -'
,
'de§ premiêres expérièn~e~ s~ientifique~ sur ce sujet n'a été effectu~e

---

33
q~len 1774 paf Fr~nki~n (BAi. Franklin avait répandu une cuillérée a
_ thé d'huile:~ur'ûn ;étan~{:'~l ihuile s'êtait répandue sur une surface
d'un demi-acre (2 sào '1l1z.)~"la, rendant ~ussi luisante qu'un miroir.
".
, . . . . .
l '
,
,
0
'l'épaisseur mesurée 'de' rà'couchê d"huile>~ta,it 'alo'rs de 25 A, soit de
la dimensi6n d'une molé~ul~: 'Le concept de couche monomol~~ulai~e avait
ainsi'vu le jour~:'\\1~i/s Cé'\\Âi~~~lt qüé"plJs t'ard que l'on commença' ~ faire
1'analysé therm~dYha~iqu~.(89).du'~hénomêne, et a ~~availlera la mise
,"
.
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'~, . '
....;;. '1.'. ;' 'J:
•
, " "
:.
~.
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au point des techn1q'ùes,'de'màriipulatlon des rTlOnocouéhes (90).
C1e$t èn
. ....... ~ ..;. .. ..
,1917 que LangmÙif:(9l:)of+)Ù:'l'~~ ,bas'es, véritables de la technique mo-
~.:'
~.,~ <:I_::>~~;~-·.r;~·>."+~~(~;~:.:;~~ ", :;'.. ,. "':'.,. .. ~:
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• .
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derne des monotoüèhes~
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;
,
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"
. ';~
" b)
Méthodes
--------
"
,,-
ci)
Isotherme de pression de surface
La méthode' se résume comme suit:
le c~mpos~ a étudter est étalé
go~tte a goutté ~u moyen d'urie sering~a micrométri~ue Hamilton a l'in-
terface air-liquide, entre le flotteur de mica et la barri:ère mobile (fi-
'gure7) aprês aV9i r scrupuleusement nettoyé la surface liquide au préa 1a-
'"
.
ble.
Quelques cinq minutes plus tard, les molécules sont compressées
'régU1iè~ement et 'constamment par la barrière mobile a une, vitesse de
,
0
, - ,
16
17.x 10
A2' min'"l, 'jusqU'à ce qu,telles formeht une mônocoUche plus ou
lTloins co'mpacte selon leurs propri~tés d'interface.' Tout le long de la
.
~ .
"
"çompression,le système dé balancier permet de mesurer l'évolution de la
pression de surface TI
de la monqcouche (rr =yo'- Y;~ Yo et y sont respec-
,tivement les tensions s.uP~rficielles dei' la sous-phase pure, i.e. derr;ière
r .
,
,
'

---

34 '
. '- '
: ":'~"';
' j
.
lé mon~touche),i l'laide' de
la courbe d~étalonnagé (fi~~re, 13).
C~ll~-ci est une fonction linéaire
~u poids par rapport A l'angle de 'torsion du fil.
Nous sommes alors en
mesure de porter en graphique cette pression de surface (rr) en fonction
~
-de l'aire moléculaire (Ar (i~ compos~: clest l'isotherme de pression de
, ' ,
. , .~
Dans des cohditions ~t p~opri~tês physico-chimiques précises de la
..'.
sous-phase, telles que la t~nsion, superficielle, le,pH, la force ionique
,-
et la ~e~p~rature, un comp6s~ -pur'~r~ierite un isotherme de pression de
~.-.
~ ~
~: ~'. ·.:·<;.\\1:·.,.(.\\~:.~:;};ii~>..I/;;~:::::;.:,~ ...-~ ';..~·}.6·:~;';-·.~.r~. ·.:..:..,t. ~'.:.- . ,.
; : ' . ( . ;
' .
•
.•
"l••
surfaéé qui1ui estpràpre~\\':':Cel1é~c'1'l'à1Sse:'voir en' général, trois ré-
gions (92): (-l.)
une dans'.lès basses préssions de surface c"orrespondant
a 1'état gaze~x du film mono~oléculaire, état de trê~ faibles interactions
intermoléculaires; (~) une région abrupte dans ies fortes pres~ions qui
témoigne de l'état solide 'du film ,"avec de fortes interactions et (Ui..)
,
,
entre les dèux; une~, zone interl11édiai're qlJi s'as~ocieavec 'l'état liquiçJe
les p~osrholipides naturel~, la rhodopsine et le cholestérol ~résentent
"des i~otherm~~ de ~r~ssi6n de ~urface qui n'ont pas une tégiori aussi abfup-,
te que dans le cas de ceux qui forment des films sQlides (comme, l'acide
arachidique) aux' forte~pres,~ioris de surface:, ~e s~nt des composés. qui
fo~ment pi u'tÔt des fi lms 1iq~i des, ,même aux fortes press ions, avec des
isothermes depressi6n de surface à l'allure évasée.
.
-'
, ,
~
.
.'
.'
. .'.....
~ .. '.-.. -

---

'~~"'..:;~. : .' , ..;; '.' .
:',.. "
Fi 9Üre 13
Courbe d'étalonnage du système de balancier du bain de
Langmui r' '
En absciss'è est po'rté l'angle.ide rotation imposê.~u fil de torsion pQur
ramener le' systêm'e ~ zêr~ 'par'sui te, de 19 :déviation'ëausée par de's poids
,
'
,
marqués accrochés successivemènt au bras de levier horizontal: (8-a) ~
'.
' .
-
.' ~
En nrdonnée sont portés les poids "marqués.
~P
,
La pente de cette droite (iîë) sert ~ calculer la sensibilité, 5 du balan.,.
ci er selon la fonnul e
,5
ôP . 9 x a
.1::
::
M
b
d
x"
00
980
N '-1
I11
~ =
9;:' :'
"
.....
.~';:- ~'. ..
c " .'-:":'-
' ,. -;: .~:'
...........
a = 6,50 cm
b = 7,30 cm,
d
1argeur effecti ve.,du"bain ,;~;,:: "
,
r ,
, '. ~ -' ~~:: '\\., /,;>,~?: ;'~::::~~,;.~'~,(i:~~~l~~'::; .~~~:~~~, ~~:~ ·~l~~· / .> .:. ..';'.. :',
-
- 1o'ngueu'r. :e.'du·:2flbtteü;r·:;:.t~ i ,:::{.la rge'u r, r~e11 e
~
.~
'.'; :,:/~'}'{' r~"J~~_~~~··}·/·~,:~.;'>'·r\\'·
' , '
.
= 13,70 cm
" '-1";
.. ~i
Nous obtenons
5 = Q,46.JTlN m, ,deg .. ,~"
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",:,:
. 'Figure 13
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36
"'}", .
1 . '
~,
'. " ~
Pour la plupart des 'composés, il existe une pression de surface
à laquelle les molécules s~, trouvent dans un entassement si serré que
la moindre compression add.i~lonne.lleengendre une dissolution partiel-
le du matériel dans la sous-phase' ou bien un chevauchement moléculaire.
'~,
.
. 1 , '
""
" ;
Alor~; toute cdmpressioh,suij~~quentede~eure sans effet sur la pression
de surface.
Ceci se traduit:it)a~ ,un affaissement de la courbe II-A.
Cet!'
te pression tritiq~e (II~),~~t:~i~e pression dl~ffaissemen~ ou pression
.
~
.,~.:.~
,,:.' ":~'i'.. i"'~~1": .....
~.
.
de "collapsetl selon latermfnolbgïë anglaise.
Les transferts de mono-
.~d6~h~; ur"ul~ff:,!~~~;r~îsj~:~i;l~'~:~::tt~~rj
u~des
5
Us Ù a
sou.' . de
"cette pression critïque tëut~,en, d,emeuràntdahs 'là région' abrupte de la
.~
~, ..,,',. " . ': , "
·· ·i~ï· <'
.
éourbe II:-A.
Clest' égalemènt dari~ cette co~dition de ,'film monomoléculai-
,
.
"
re cohérent qu'il faut'es'p,érer Rrépa rer des nieinbra'nes foneti onne 11 es .
.'.....~ '"
,"", ;•.::,~'~' ,~~~";:(::'::·~.i:,;ji:!~::·;~~r~;\\,~~,;':~ :'" - "
' ..
. '
..... ,
i :
', .. '
Pàur lè'trarïsfet~t'de'moné;cèjuched"unè intért'aèe' à l'aUtre, Lang.;.,
"
mu{r'(93) avait développé urie méthode dite d'adsorption, laquelle a été
"P~~l~ :~uite' ad~p;té'é par' Blo:d'~eÙ; (~4). de'puis 1935;. d'oG son appellation
dé ~éthode d'ad~orption de Lan~~uir~Blodgett.
Elle consiste, comme nous
. -
~.
.. '
"
,
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r
. "
"
,..
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_ J
:
'"• •,
~.
,..
(<"
"
" l~ veftons e~ détail plus loin~ ep une combinaison de sortie et de plon- ,
,
'~'~e ,dusuppor't ,dan's la soiJs-'~hâ~i, à travers la monocouche interfaciale.
On peut; de c~tte mihiêre, ~~tii~es bicouches et des multicouches d'aci~
'.~~.,; l'\\~'~ .>. ~,;_'t,j. ,';. :·d'.f~~·~.:j~\\;:·~·-·,';t~ -;..-\\"~ ~:::~~_.;~{ ..\\ ~~'.:.
. , .
,," ~
'.'
.'
"dés "gràs, dé pigmentS"èt·d'aütres màlécules amphipathiques'teiles que
; ,', : ~
:..
i 'iilustr~ le croquis schématiq~:~';de la figure 14, p. 4·1.
Une autre utilité de la courbe II-A rési~è dans le contrôle d~ la
"l' qua~ité et ~e la p~feié du produit en étude. En effet"un produit con-_
,
ta'miné ou impur và donner un isotherme de presslon de.surface"beaucoup plus,
,
~,
- -.'
,
._ ; '
1\\
""
~'... •
. . '
..
~
• {
. '
. ,'. { .
"'.:
:' :; '~

---

,:'
.!
.....;
.
.;'..,
37
évasé
que normalement:, avec parfois soit une zone de collapse Iilal
. définie, soit une pression dé collapse différente de celle du produit
' . , \\
pur.
Tout ceci dépendra dans une large mesure, du type d'interactions
entre le produit pur et ~és ,contaminants.
Ce qui nous conduit a l'étu-
de des interactions intermoléculaires .
. '.... ~.
;'
.... ',
s)
Etude d'interàctiotii inter~'olêcu1aires
.;, ' ',": : ,~,:,.;.t,,".·, ,
",: ~.~. ':. ~.'.~
...{. ,
.~. ·· ...·~:1
: : . ,.:.
":.;'~j.\\"":';;': ,": ,.
"',
...
Dans l'étUde d'iiiteract.icins interlllo1éculaires en monocouche, .le
paramêtre lé plus fréquém~ent ùt1li~ê e~t l'aire moléculaire limite
,
(A,t) ~ 's,âvoi r,l"ai f~.\\mâi~è~t~i:t~!;,obt~:nli~~:'p:àt<l~êxtr~poÙtior" de '1,~ por- '.
"
; ' .
/. )
'.
\\',,::"".:
.. :.. .: .
ti drî' ,aorupte de 'l' i so'thetme d~ press'fond~ surface sur l'axe de A.
Cette ai re 1imite est carattéri s'tiqùe de chaque composé pur ~
Oans
certains cas, 1 'anaiyse, de 1 "aire moléculaire ~ d'aùtres pressions peut
\\
aussi s'avérer três révélatrice.
1
1 . .
' . :
Si telle est la ~ituationpour un composé pur, qu'en sera-t-il
.;d:un mélange?
,Comment se'co~~ortent diffêrents composé~ lipidiques
,.:.
t
.
•
.,
i-
l 'un:~is-a-vis dé l'autfe, vis-a-vis de la rhodopsine, du d0 thromoph6re
, ,
ll-cis-rétinal ?
Vàil~ le genre' de questions auxquelles l'étude des
,'iriteractions i~termo1etul~ires tènte de répondre~
Pour l 'insta~t, nous
sommes en droit de croire qù'en.presence d'un mélange idéal dans les
:termes de monocouche, il y aura additivité arithmétique des aires"molé-
"Cl.Jlaires des ê()mpôsants, et evid.~mment non-additivité en cas de formation
d'associations ou de complexes.
Mais, l'additivité des aires moléçulaires
s'appfi.que aUssi .'aux rilélanges de ,compo'sés cor'nplêtement immiscibles.
C'est
pourquoi il .fàut àupfé,a'l~tile s'assu're"r de la miscibilité des· constituants
..
" .

---

,
.. "
.. ~,,'
38,
du rrié:lc:ing~·liarla r~\\11e des phases de Crisr (87).
La loi d"additivi"té
des aires mo1écu1~ires ~'écr{i.
"
.
m
,
< A.
>
= E
n, A.
[ 1 ]
-<",.·,ô!f1 •..
-<..
-<..
-i;= 1
dans laquelle < A,<.,.;;m >,:..es~~;~1~::ài_~,e 11l01écu1aire moyenne des composés de
•
. ' . r ' ,
' 1 '
.•
rang -i; â m; n. et A. sont l~,.,fr~,ctio,n molaire et1 1 aire moléculaire norma-
.
"
' , '
,-<..
.-<",'
i ,";~<;II',;;,::t~"".'·
le du composé du rang,.[, ê":';(
<.,....~. ,',
. ~:
"
.
. ~.
'. :, : ''j,~.tr ..);<~; ,t~~~':~"1~k::,:~~~"f~\\ :,'::.',;-,./::, '"
Cette étude a 'été mèrîéé" sur les mélanges ,(-i;) PE-PC-PS (1: 1: 1);
(Li.)
: ", <,
;::. ::\\. ::~ ~~~~!;~.:'~ '~:.', "
'>.
.
'
,f.
PE,;,pc-PS-cho1estéro1 ,(1 :,1 :l.':1)';':,,;(.U),L rho~'Opsii1é"phospholipide?
(1 ;2 ..3), sur.
.
! ;',~,
.
. .... .;
. ' •
:
,:Ii". '.1
'+;'\\, {~..... f';;~; j.. ~.ll ~. "':'.j:~ ~ ..~ -).': .~"~~,' :,:' '.'
,
.
.
...
du tamp6n t~is-HC1 2 X'10-~,~6i;'dm-3,:p~:7,2; T= 290 ± O,5.K., Les isother-
"; ~ ~~ ;:':...::. ;.: y; '.: ~'. ]~~:~,', t'".~, • . ~ ",' .• '
, mes obtenus
pou~ les ~~lariges ~'ront comparés aux courbes théoriques cor-
respondantesfondées sur la ~upposUion de mélanges idéaux.
\\
..
'
",
. ,,'
, . y)
Etude de .1'ê'ffetde la luriliè'resur là rhodopsine en monocouche
,-
'. Nous avons cherché à étudier T'effet de la lumière sur les monocou-
'
ches' derhodops1ne'eri 'te~mes d'eff~t sur les isothermes de pression de '~ur­
face, ou de' va'riation de 1 i aire'mo1écu1aire à la noirceurco'mparativement
à la 1umi~re.
C'est ainsi "que des' è'ourbes de pression de surface ont ~té
~'"
.
prises pour la, 'rhodopsin'e' inta'c:te et' la ~hodopsi~e photo1ysé.e.
Nous avons
, , aUssi prl s des courbes ,d 'éxpans,i o,f C~écompress i on) de1 a rhodàpSi'ne â1 a '
.'.'
"
noircéur'et aprè~ irradiation afiD.d,e déterminer la possibilité d~'forma-:
tiqn d'~9régats.d'~psine~ous l'effet de la lumière.
Les concentrations
••) r ••
. .~

---

.
..
~
,
"; " "' '.~~;. ".~, '",
39
. ':. ~,~
de rhodopsine sont déterminées ~ partir de la différence d'absor-
bance
à 498 nm avant ef'aprês photolyse, cons i dérant que E:
nm=40 60b
498
8)
Préparatib~ de la membrane de btcouche lipidique
..~ :.
;'; ..
Une membrane biologique',nat~relle est constituée essentiellement.>
, • . ,"-"
; , . .
,,':::
~".
. !
laire; les cha'tne~ hy'drocarbon~'e~; son't àlors diri~ées vers 1 1 intérieur
",' ':'~: ", . "':: ,>~t. ~'~\\'~>~;:,~~.: ..~~ ~":,.,. ~'.'
1
• •
de ~~ b~couthe.
Cette s~rüciu~~"l~miri~ite peut !tre obtenue de diverses
manières par la technique des monpcouches.
Takagi et coll,.: (96) ont mis au point une méthod~ selon laquelle
une bicouche lipidi9ue, teil~ .gue', décrite ci-dessus est ré~li'sée en
, ,
~escendant une pi~te de~téf'on ~ourvue d'un petit trou au travers d'une
monoèoùche lipidiquè' ~, iHit~ffac~ air-"liquidë. La piece de téflon pré-
,
;
,/"
\\
a1ab1èment rendue lipophile 'par un traitement spécial, adsorbe au passa-
ge; deux mon6couches, s01t ~~~-de chaqu~ cÔté, 1esdeux·se ~ejoignant .
.'
àu ~iveau du trou p~r Jeurs ~ueue~ hydrocafbonées~ Sept ans plus tard,
....
Mo~tal et Muellè'r (97)'ont P'ub1ié, une méthode identique ~ cene de Takagi
et coll. (96) avec la"seuledifrérenc'e que la pièce .de téflon reste immo-
(
l
't
. 1
.
-
bi1~ et la bicouchè est, formée en'éJevant le niveaU de la phase aqu~use
;"
su~~o~tant la monocouche jusq~'~ l'orifice pratiquée dans le téflon.
Ces
deux méthodes ont permis la fabrïcation de membranes artificielJes de dia-
.
. .'.
'
'"
mÈ!tre all'ant'de O,l'à:'O;S m~.·> Mais la préparation devient difficile 10rs-
que le di amêtres 1 ac<croît.
:.
'.
....
'. ,
.'~:, ,~~ '. ~ <;-~\\1·.<~;,«:~'~~~ .,....

---

...... ~
40
i)
Méthode de Langmuif~Blodgett
Dans le but d'obtenir une membrane artificielle de grandes dimen-
sions, nous avons, utilisé,la.tech~ique de Langmuir-Blodgett (93, 94).'
~.
';
. '
'
•
•
< "
J"
- "
~·:·~':~t', . .. '~.~.
..
~
Le support employé est lin diSqUe 'poreux ~ surfaces: hydrophiles , fait de
;
'
. . . . . . 1 ·
•
'cellu11ose triacétate,' ayant :~ri diamètre de 47 mm, des pores de 0,2 \\lm
et une épaisseur dé' 0,13 m~.:; La méth'cide de Langmuir-Blodgett consiste
.
.
à immerger le supportdàns'1~' s:ou~~-phase~ pUis a préparer la monocouche
'au;"dessu~' de'1a Phas~'aquèus'e;',':aiJnsi,.e~ retira~t 1~ support de' l'eau
'a,' 1laide de l ;apP,areil d'adsorpti~'n, lJn',~ monocouche est ad?orbée sur
,chà~ue face du suppOrt, puis une deuxiême,'en replongeant le support
dans 1a' sous -phase (fi gure, 1.4). ",Cette méthode a été appliquée aux phos~
.>'. : ".'.' ",: ~'" ':'"
.' ::;~l'~:
:,1...:~", ~'~..~.'~;~::~ >··~~:i·.)·::.<·/,,(~,-,~·. -.:. :~"v ';1;:' ',:.,'
' :
• • • • •
>
.
:-',': 'phôlipides PE,PC:êtPS'; àuéhôléstérôl, .de même qu'au méla~ge des qua-',
"
, " ire "l'ip"de~"', eta': "'I~~~~ctiid~~e: d~~ cad~ium"mais sans succès. Une seule
monocouche a plJ être adsorbée;lors, du processus de montée, laquelle
f
;.
se désorbe au cours du processus d.e, plongée subséquent ai ns i que nous
.~,
,"âiiàns en dis'cuter plüs làirl.::, '<.
,"
~
~.
Par contre, la bicouche se forme bien par la,méthode,que nous avons
convenu
d' appe 1er "méthode combi nÉ!,e de Langmui r-B l odgett ,et du contact
I~ -
·horizontal"'.' Cèlle-ci: a été' rendue 'possible grâce' au support spécial
.
. , . ....
d'adsorption en, bloc de téflo~ 'que nous avons" conçu et fabriqué à cette
fin (f1gures ,9 e~:,lO)., La, prÇlcédure est la, suivante:
"
_.~~..; ' .
.: 'l' ~

---

Fi gure 14
Illustration de la formationd1une bic6uche'lipidique par
la'méthode de Langmuir-Blodgett
"
'
, ~:
.
'.'
A
Formation' de la' monocouche à llinterface air-liquide
pendant
que lesuppo~t (no~ représenté ici) est immergé dans la sous-
phase.
Adsorption d1une.monocouche sur chaque ·face du support hydro~ "
phile lors du processus de montée.
"'J"
C -
Adsorption dl'une deuxième' monocouche sur chaque face du
support l~rs du processus de plongée.

---

41
. "
.',
','
.
',J'
~ ,
Flotteur
Barr/ere
mob i le
'.
( A )
".
"
.....
ri', ~ ",.:,
..
.... ,;
,
• f~.
<'.):•. "".
',<
J '
,!ame.:de
quartz
.'.
(surfaèe
hydrophl.le.)
( B )
(c )
·.··Adsorp~ ion lors
de
Adsorpt ion
10."3
de
lai montée
la
plongée
.
;'
,
,.
Figuré 14
~. "
~,
,"

---

42
ii}
Méthode combinée de Langmuir-B10dgett et du contact horizontal
.. '
Le di sque poreux (fi gu re ,1 0-8 ~ p. 22)
rincé dans du tampon~ est'
,mis',en place sur,le bloc de téflon (figure lü-A) auquel il est retenu
par l l anneau de téflon (fig~re 1ü-C); le tout assemblé (figure 10-D)
,est fixé à'l'appareil d'adsorptionet plongé dans la sous-phase (tampon
tri~s-HC1'2 X 10-3 mol dm-3~ pH:. r~2; T = .290~0 ± 0~5 K). Le processus 1
;'.de"iformationde 1a'bicouche est illustré par la fig~..lre 15.
Environ
>l~, ,l,
':-
.;."~....
~<\\':'
'~:;:':106:~lde:'là.
l
solution lipidique de concentration 0,4 mg ml-
sont étalés
4,'"
,"
"
"..
( ' -
- , '
,~6~:tte ~'joutte sur, la phase aqueuse au moyen d'une seri ngue,.mi crométri-
',: (f.i'gur~'\\r5,~A) met ~ncore 5 à 10 mi nutes à se re-stabil i ser . Al ors ~ à
l'.~ide. de~l'appareil d'adsorption~ le système d'adsorption est remont~
,.•'
,') ~
-'
1.,
_'
\\·:;"avec u~e' monocouche (fi gure 15-B) ~ mais sur la seul e.face ex.posée du
disque poreux.
Notoris que pendant que l 'adsorption procède~ nous compres-
sons '-a'monocouche à l'interface air-liq;y,ide'po'ur compenser la chute de
..
la press00n de surface occasionnée par le transfert de matériel de la
'su'rface'l'fquidea la surface solide.
Le rapport de l'aire ainsi balayée.
, ' .
<
• •"
. . .
~
~. ~t de la surfa~e recouverte du disque poreux mesure l'efficacité de l'ad-
, " .. sorpti on:
c'est le rapport d'adsorption.
Après 5 min de .. ' stabil'isation
' , . ) .
'..'
1
."...' "
~
de' la monocolJche ~ le système dl adsorpti on es t fixé horizontalement à
, !
,
"'1,' apparei ld 1 adsorpti on pour la manoeuvre du contact hori zonta 1 (figure
. '15-C).
La hauteur de l'apparei lest réglée de t~11e sorte que le système

---

....
.~'- ..
'f
, .~
, t
-r.
o • • ~
~~;:>.Ffgùre:~:"S::',::' Il'lustration 'de la formation de la bicouche lipi-
de Langmuir-Blodgett
:.~' ';,':~;;'[~?ij!:~ii~~ pf; 1améthode combinée
" "'<'
! • • '
;":"':~~:~7,,-e_t_d_u_,_c_o_n_t_a_c _t_h_o_'r_i_z_o_n_t_a_l
, '.
0',1'
. \\~.'
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Figure. 15
~
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..
....
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---

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. {
... -'
44
,
f.
~ " , .
, "",,
.,
.
,
,
" ,', Ci 1 adsofpliort de téflon vi enne touc~er exactement l a surface aqueuse
"
'~"I' ,
" , '
,
.•".~,~'~'•. '\\'~}.'.")i:";..~, .
":'. .'
,
;:':' .. ':' , lors "de:'sâ de'sc:ente complète. A ce moment, une~euxiême monocouche
\\:. ,>.
".".,: '\\.~:::<,,~L., :' '.'. ','
:';'e's't"'a'asib'rbée s-ur la' pre:mière' par interaction hydrophobe.
Le rapport
. ,.~ ,. ~ .. '" .. '; ~"",~ ;.'~;.. ,;,'!: ">.:"
.
>':'d"'~ds'ôrptionèst-t~ricore'calculé
'ô'
: ' .
une ','fois la rémontée effectuée, pour
,:'~' .'~. .:'. ~~~; .,~ll;:ï );:"::'j~L. ," . ','~~..< ' ..,
•
"
r'::s~:assûrèr',de'1'a formation de la bicouche.
Bien qu'un rappor,t dladsorp-
~ "
"
' :
l. \\
• "
•
'" ~ ',.. • ~
• " ,
h
' • ~
''->:::~'::;;,tÙ)~'i;dl'~,'l,OO\\::±0,05 n'ous indique la formation d'une bicouche, n'ous nous
.~
;;:\\'.:,~'. ,,':",:n,;~~:~à:~:~ôri'~:: d~li';p~ier 'cel1e-ci 'membrane arti fi cielle jusq.l~ 1aprês .en avoir
",;, :: )",'(;;~"i:;::'\\:Ü3 '.;;"'~::;'~> :,: \\. ,,'
:
,
,,>';{:t:rI~~Mt~fJe,s~::pa.ramètres microscopiqu'es ou électriques comme la résistance
" ::,f>;:/:~~t'·.:~~:<·'I~;~:>:'.\\ '; ','~.. J::"
'
.,:""":::~>é,~i~~iq~è~;~'.bÎi'la capacité. Mais avant de présenter la méthode de mesu-
-:":~'.'" . ;·::'~'·).'~::f :·:~':~;,'~'}:~:,~t~~~",}·'~:~'_~\\\\" ··..f:' .. ", ~~ ....
:~,
, ,
,(,;,:: re~' de<la frés istance membrana ire, nous croyons opportun d'élaborer:'sur
,,~. ':':~";~fi;::)',:~:(k;\\:,<;;(~;:,d~ ,:: ':;~,,',: 'i" , , '
'.' "'li/.-,fnco'r,po'ra,ti-bn;- de la rhodopsine dans la bicouche lipidique.
'~.
_t?~i"!rr~~f~;:2~~J3:'" , '....
;';;;,-,:;", e.);,;;;:Inèorporatlon de Ta rhodopsine dans la 'bicouche lipidique
~;.':.':
. ~:~' ;ÎL'X;;{ ,;,,:).>~
"
. '.',
. "
.',
. .~
!,
" ,
'
".,~,,;ita<~olut;:On;'de'.travâi1est préparée de la manière suivante: pour
,"::;:;,'dn\\.vo~:u~~,"'t·:~~,,~Olùtioh de rh~dops ine contenant x mg de rhodopsine,
'1
.',',' ,'6b'ü~.p0éT~to~s' d' I une- so l utïon lipidique de PE-PC- PS- cho le stérol (46: 25 :
" ,"'l3:'i~:èn';'poids sec dans de lléther éthylique) un volume' v renfermant'
2
'a'ùss:r·:x mg'de'lipide;
la solution lipidique est évaporée sous un jet
dl azote et 1e rés i du' 1i pi di que redi ssous avec de l'éthanol pur ayant
,',
.1,
'.
,
"
".,'"
.
:>,un> voluriie v3 tel que le mélange final obtenu par l'addition de la solu-
",,":~ti~n d~:~rhddopsine soit dans un milieu de 8 à la % d'éthanol. Cette
','., "':,teneù'r:en éthanol est inoffensive pour la rhodopsine.
La solution de
.
' , " ' "
-,'
". ~
... '~
;;'Ù~~~:if est ~réparée de cette manière pour respecter les rapports molaires
,
:.';
:,;; /~, -
de/ces d,ifférents constituants
",in situ"
selon le~ travaux de Shichi (80).
~
,.'

---

;. ", 1 -
45
,Nous avons utilisé cette solution pour préparer la bicouche de la même
man~ère que ;celle décrite antérieurement à savoir, la méthode combinée
,r
':"
'
' ' ; ' '
.'
'
, t
de Langmuir;-Blodgett et"du contact horizontal.
L'étalement de la mono-
couche,.. toutefois, a été effectué
en utilisant la technique de Trurnit
•
',.,1.:,,)
;1
.
(98), donc, en faisant couler doucement la solution, du sommet hémisphé-
,
' . ,
'~,
rique d'une tige de.verre (plantée dans la phase aqueuse) de 2 mm de dia7
. ' . '
'~-
,'" \\
.
"
,
. '.:
.
mètre. sur?, cm d~ long, s'élevant à 2 cm au-:odessus du niveau de la phase
, "
.t: l"." ,.
, ' : '
~
. : • Î
.:" ,;' . ,
:. "
\\
,~,"., •
aqueusf..
Çe;tte méthode permet ·d'éviter la perte de matériel dans la
, , ' , . .
, , ; , '
" ;
, l
-
.
s;pus,::phaselors de l'étalement, vu qu'il est en soluti,on aqueuse.
7 l ",' '.' ,1.., i -. ' .. ,.~.; ",', ,':
'
, ; ' . : . '~
' J
,
'1
,
'
, ! '
"
. '
•
',;': :'.
'. 'i;t j,'r. ,:' _::' .•.~;. ~ :.' '; .
. Le montage comprend une source de courant coritinu, un multimètre
,
'
l"
_"
di'gftai ;.,e.t::' un système de double compartiment (figure 11, p. 24).
La
. :
.t,",.t.,1/<.
':,:, . . . . J~
,',
',.'.~:.
" : '
'
•
membt.an~ .'est.'·'insérée avec son support de disque poreux entre les dE~ux
,
'
'.,J '~.,',
"'~ ,."(", " ,"1";'~
_",
~
,
.
: " ' .
.
" "
~
•
comp.a'rti~ents.,qui s'ont ensuite rempl is de KCl 0,1 mol dm-3 Pour une
. '., ','
~ ~ '.'" .
.
"
~ .
. ' . '
, )
.' ~
,
"
.
. '
meilJ~ure éfènchéité, les contacts de joints de téflon s6~t enduits de
~ .$""~ 1··'
~ .'
' / ' " ; : ' , : , . ' , : .
, ; ..........
•
.....
. grais~eMde.silicone.
Nous mesurons alors la résistance du systême dont
_. ". / •. t, ..t,
"
. "
1~
•
:
:
.'
•
sont. déduites les valeurs de la résistance standard placée en série
:'
,
avecl~:membràne,'et la résistance des électrodes, pour obtenir la ré-
. ~isi~ri~e ·memb~anaire.: Le· potentiel appliqué. aux;bornes du systême est
généralement de 1'ordre de 100 mV.
··Ir-.,
..
.. 5) ~.Mesure de la'diffusion ionique photo-induite
,'"
'.
~.
,
!.. ',t
,
~;
.

---

..' ~'
46
2
Ca +. ' Dans chaque' étude cinétique, Sml de la solution d'électrolyte
o,s"
3
mol dlll-
5 on't' ajoutés au, compartitnent-l et la diffusion est mesuré~~
, ..
. dans la compartiment-2 (figure 12, p. 25), les deux étant préalablement·
-J
• -3
' "
q:mp lis ,de; i.tampon:,:tri s"Hel 2 x, 10, ";"'mo "9m
• pH:, 7,2.
Notons que tou-
,
'
. '~,
' .
. .
, te~tlê(étapès.;:de·,"l ~;'tpréparati on de l a membrane ont··été franchi es sous
,'a"lueurd'une',)umière,rouge' jusqu'au moment de l'irrad.i,ation" alors
que nous i]luminonsla:membrane 3 mi,n après avoir ajou;é' lesS ml de
s!olutioll,d"é:l~c::tràlyte ..':.çette attente de 3 mina pour but de tester·
,~ " .
.......;1.
•
•
.. toute;;Iuit{p~ssible d'ions à travers,. le système, avant.de procéder à
• • •
>
t
1; ~."
, •~',
.
;
. '
.'
., ..:r,1 ~b.~~:;va.:.ton.: de,· J:.eff,et:d·e." l'~exci tati on 1umi neuse. Les :expér.i é~èes
on,t,été,,·faite's.en, trois'
.
,
. ,': .. ";:' ::::' :'.,
.•.. :. ','.' ,; ,:;"
.. ',
'.
"
'.,
.
. étap~s avec au:moins
trois mesure's à cha~'
<itqpe/p'à~h<:haque iion'. ,
.;
.'
'.
l
-. , '.','
.~ .
,Les"études.ont·d,'abord été effectuées â 290 K en irradiant lamem-
' .• ,,,
"
i"
·,.br~ri~:.avec,:·une,lampe,incandescente de 300 Wà travers une fenêtre de
,
' .
...
.
5:cnide d.iamètre' du·côté '9u compartiment-l, de sorte que le milieu.
. '
'
aqueu>,<-'de"\\c'e,lùi-C:Î;,;serve de filtre ther:mique.
la,source lumineuse est
."
\\.:::.
i.nstallée ç 60 cm de l'unité de mesure.
',Puts, pour, tester l' i nfl uence ct 1 un échauffement éventue l, uné au-
.'
,r '/.
tre ;'séri'e"'de'mesures a été 'effect~ée en i rradi antl a "membrane avec la
.. - .
~.',
.....
,','
',.
,.'
'
'même source mais cette fois-ci, à travers un filtre:rouge (Corning Co- (
.... ;-...
'lOurlFd\\e~~ iNo . 2-61 ~ Esco Products, Oa'k Ridge, N.J:)d'abso~ban-ce éga-
.' .1,·
\\~' .,.
' "i'
' .
~e ~~2.0 pour i ~ 607 nm.don~ laissant passer seulement À ~ 607 nm:
.'
'cette'bande chromatique est. inoffensive pour la rhodopsine.
<
••••
:
'
~'.,
'r ',!
., \\\\..
.~ ..'
"
;

---

, 47
. Le montage, étant au point, les expériences ont été 'poursuivies
e~ utilisant d~ la 'lumière monochromatique de 498 nm (À
de la rho-
max
13
2
dopsine) d'intensité 2 x 10
photons cm-
s-l obtenue grâce a un
monochromateur (H-2ü-IR, Am, I5A, Metuchen, New Jersey)· ce- qui nous
,
,
"
"
permettait d1avoir un état de photo~saturation presque instantanémerit puisque
13
les membranes renfermaien't "" 3,5 x 10
molécules de rhodopsine.
Cette t
dernière sérié de mesures a été faite à 276 K afin de minimiser la con-
-J~-' ""tr:(bùtion.possible du rétinal tout-trans à la perméabilité ionique de
.';1,.'
~,,;,I ,
.~.,
. , <,
1
' .
"
;
,
,:~'la,membranè '( 8,'51)., Cette précaution est nécessaire pour préveni r
:' '
une 1ib'ération importante de rétina) tout-trans par isomérisa1:'tàn ther-
, , '
"
,li
~,
mique de'Ta Métarhodopsine-IIà T )' 2~7 ~, co~me la transiti6n~
~
' ; 1 : "~ <
'
• •
•
Méta!.I.~~ Méta-II a un temps de demi-réaction de 160 min (99) à 277 K,
"
...','-
., ',.-
:Chaque type ct 1 expéri ence ayant été répété au moi ns troi s foi s pour
~.' ' ,
chaqueéspèce ionique"nous rapportons la, courbe moyenne pour chacun'
,
'
des cas qui"nolJs aura permis de calculer les coefficients de perméabil;i-
. ""
,
,
té ionique (Pd) a partir de la formule (100) qui suit '.
..
[2 ]
où' ep-<.
est le flux en nombre de particules -<. diffusées par seconde;
2
"S
est la surface membranair'e (cm );
a-<'l et a-<'2' l'activité de l lion de rang -<. dans les compartiments i
et 2"
,
"
, .
,\\'

---

48
Signalons enfin a titre d'information que tout le systême de
.acQ~par~iment5 est blindé avec du ruban adhésif noir pendant que l'illu-
mination..,~,~;.fait .à"travers la fenêtre pratiquée a l'une des extrémités',
',.,
dU"côtë du comparti ment-l. '.c es t vers ce coté-l a même que l a membrane
,',e
~. '...
.
"
. .
es t' ori en tée.
~h :
;
\\ ' '
Effect de la gr?micidine sur la perméabilité ionique de la membrane
.; ~, or
-
de.bitouche ,]ipidique
~" 1 • _1.
';i
" .. ,
"i' c,'
'.
~,
, "
L'effet de l'antibiotique gramicidine sur la perméabilité mem-
i
. ~
b,r~~;.~:~,~..~~,ét~ é:Udiée pour le K+. Comme dans les cas de mete de dif-
3
. fusion,photo-ind~ite, au temps Zéro,
sont ajou-
r
5 ml de KCl 0,5 mol dm-
,
tés a'ù',c9~'par;timent-l. Après une attente de 3 min (pour tester toute
fu~te )ton~~ue dansie système), 'nous ajoutons 1,0 ml d'une solution fraf-
. " "
. '
,~~e de gramicidine 0,8 mg ml- l dans du méthanol au compartiment-l et me-
,
"';. ',. ,
~. '
,
.
.:
..
" su.!,\\onsJ.'activité ionique du K+ dan~ le compartiment-2.
11 est impor-
"'1:;"":
:
l' •.,..,.
~ '-'.:/., ,~, "'.
._< .'", :.:.. - • • •
1: _ .
:. ';.
. tani d'~t~liser une solution frafche de gramicidine car, cet antibiotique
y'j'
,:,\\
.; :'~:.~•.~~.~..
,~' ".,
'
.
.
.
.
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sel11ble perdre rapjdement son activité ,biologique en solution,selon nos
propY;'es~. observati ons.
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RESULTATS
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1'.,
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.AY : Rhodopsine purifiée
1"1
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, 1 ' , 1 .
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'.~.' Le degré de pureté de la 'rhodop'sine est mesurÉ:!' par les rapports
,>,.,.
"
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1
,: :<:.l~·:·spË:~êtr:aux 'Abs 2o/B /Abs 498 m' Abs350nm/Abs498 nm mais celui qui est le'
," . ':' .::-. .:'::~~.'~ ..:~,;/.,,;:' .. ",:':. !
.~
nm.
n
,
.. ' ,".... plLisCouraniinent utilisé est le rapport spectral Abs 228 nm/Abs 49-8 nm qui
!i,}:f~~,~f:~jE~~Î~~:t~::~::s::b::::f:~ 1:o:;:::p:~:::::: ::n'r::ct::s~:~::eu:
t
t
,~ ..'·i;'r:p~~~t~P7~tra
n~égal~'
l Abs 278 nmlAbs 498
2,0 ± 0,2 .
Plus ce rapport
:;... :T: ·'.:·~j:t::.P~'ti( ~p1us la rhodopsine est considérée comme pure. Le plus petit
~.
. '
..~ '~~
.'
,
;::':\\'f';'~:'>' ~'~i:~:pport "S:PètN1 AbS ' /Abs498
pub 1i é' dans 1a 1ittéra ture scient;-
278
~.::.. " ': ,.; ".,'.')<','," .. i:
.nm
: nm:
.
{·· .. ·<...:,fique,est,de 1,6 (101).
Néanmoins, le rapport de 2,0 nous semble 1arge-
, . ~~ \\·\\'i.':'·~
. " .'; .;..~/;::_:.,\\ . ".h·, ,.' .~..
J
•
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.;m~ht; sa·tisiaisant si l'on considère que 1es.'traces de Triton X-100
,d:· ,'.
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'= 275: nm) contribuent à élever ce rapport.\\.
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::. r .' : .:'
l .
'D'ail'leurs le poids moléculaire de'J.a rhodopsine dans nos prépa-
,',
" . '
.
:rations a été évalué à 35 000 { 1 200 (102) en.accord avec la plupart
".:' .,i'
"
?: ..
i ••
. ;'des travàux~ récents',(103-111) comme présentés dans l'appendice 'rr.
,
<
"
•
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1.
.'
.
.
~
. ,"O'autre,pp,rt, les.courb,es ge pressign de su~facE; deJa rhodopsine nO\\:iS
"'~:·';"'·~;'·:':::do'~n~:nt<'~~s.ai·.res !l101écu1aires l"imites variant autour de 2: 400 ~2 '(fi9~-
\\
~',. ', .. 'J;'
,~. :.l.''''~·'"·· • ,,-:,~~."
'
"::'re .16"courbe-l) lorsque la concentration de la rhodopsine est calculée
.J'::;,..'. ,"
,
,'.
,
0
.'~ ";..,~.:<,, ;:':;;:rp'~~tir
2
de b.Abs
nm avant et après ~hoto1yse, et de 2 000 A (figure
498
,,': ..
·.~·;'l.6, courbe-2) lorsque la concentration est déterminée par dosage
,..
49
.'
,'.
>
' " ,
,/' '. '

---

,.
.1
. :.
..~
,J,
Figure 16
Isothermes de pression dé surface de la rhodopsine: "
-3
-3
:
, La sous-phase est un tampon Tris-HCl 2 x la
mol dm
; -
pH', : 7,2; T : 290 K.
Courbe-l . : "Obtenue en calculant la[ Rh] à l'aide du ,AAbs
n'm
,
.•. ~
498
Courbe-':
Obtenue en ca1cülant la [Rh] ~ l'aide du dosage protéinique.
. :.'
!t~'
~""
'"
..
"
'

---

.
50
,.
.~
. .
"40
",
','
3 2
\\ ;
l
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- 24
1
\\
E
\\
\\
z
\\
\\
E
.;
\\
-
. ' .'
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16
\\ '
\\
\\
\\
\\
\\
8
\\
\\
\\
\\
\\
'
\\
1
\\
\\
\\
\\
, \\
l ,
2,0 ,
"
v 2,4
O-t------r------=r-........&.:---r-_~-=~
o
1
2
3
4
-~.
°2
-1
A x
10
(A
molécule
)
Figure 16

---

' .
'1
51,
protéinique.' Ceci permet d'établir le diamêtre de la rhodopsine a
o
50;"4 :±: 1,2 A si -l'aire occupée à l'interface air-eau est circulaire.
Cette valeur est tout â fait conforme avec celles obtenues ailleurs,
.
0 ,o~
.,
à savoir .40~50 A (112), 46A (113).
Par contre, 'elle entre en con-
flitave~ l~Jsotherme"de pression de surface de la rhodopsine publié~
,": '
par Azuma et Takagi (114).
L'aire moléculaire limite minimale, (114), obtenue "
, 0
0
f
sùr de l'eau pure, éta-it de 4000 A2 , soit 71,3 A pour le diamètri de
."
'.
:~Ja:rho~opsine:
ce qui est nettement en dehors des valeurs rapportées
{
"
c51i-haUt'~ ,La microscopie électronique nous a permis d,'appuyer nos ré-,
"
:
"
'.
,; .
sultats.
Èn' effet, la' molécule derhàdopsine, telle que révélée"par
les miCrOgr~p~es;-seraitsphêrique aveé un di amêtre de 40 ± 7~ ' i gu-
: "
'.,,' ~ : l,;':; ~.:,
,'"
~,
, "
.' \\
J'
re·ln.:-'· Ajoutons qu'en utilisant de la rhodopsine,exempte d'opsinej1
.
.
.
.
"
~
,
'
.'
""
,~: .
.
purifi~e~~a~s de l'acide cholique par la méthode de précipitation au
"
.
".
. . . ' . .
,
.
sulfaté'd'ammonium (101)"
nous avons obtenuegalement une aire molécu-
'
O
,
~':
2
laire~imtte de 2 000 A
' . ' {
,
'
','
',Led9sag~ protéinique nous's~mp:}e donc plus juste car il mesure
1a 'quantité.-tota 1e de protei ne, rhodop~ ine, pour autant que la sol uti On
,
'
ne soi t pas. contami née par d'autres protéi n~s .
La méthode spectrophoto-
.métrt~~e
.
'. ~lie, mesure
la concentration
.
( .
,
~e rhodopsine encore in~acte,
c'est~à-di.re' non photolysée; '. ainsi les traces d'opsine"s lil y' en a, ne sont
pasdécèlé~s:'-Or, nous sommés à peu près sûrs qu'il y a toujours une'qyantité
de r~odopsine qui.s'isomërise au cO~rSdes;multiples opérations d"e purification,
,"
,
,laql.Jelle n'est pas "mesurée par spectrophotométrie et quï pourtant.contribue
.. -',
.
,
. '-'/ ~i'\\: <,:,:,t..;,. 'f.:!., ;~:~:>~··r~~'~·:~:...~ '; .",r.,>

---

,
'.
"
Figùre 17
. ;
""'';;
,
~., .
: '
"

---

53
à l'aire moléculaire limite mes,urée en monocouche.
C'est surtout ce
" l i ,
, ' ,
' : , '
"
O "
2
• '9:uj"e~p,liq,uerai~ l'écart entre,2 400 A (en uti,lisÇl.nt 6AbS4~8 nm) e.r
a
"
0
';:"':?,,900':,,A~ (en do.sant la rhodopsine' par le réactif IIBio-Rad Protei~ As-
\\~
~ay~).
Ainsi. po~~.des mesures se rapportant a la quantité réelle de
,
protéjn~, rhodopsine, la méthode du dosage protéiniq~e est, tout indi-
..'
'"
~ ..".
:.
"
"",
' .
qUée;
par con~~e, .pour des expériences sur l'activité visuelle, la
f
'm~thode de Mbs 498 nm serait le meilleur choix.
, \\ .'~~'~;:;~':~i: 1'~r' ~;;'
~ ~,
•. " ,..
:i:.
Noùspouvons évaluer l'activité de la rhodopsine par lé rapport
: ' ,
' , . , ~"", :"':'....,,
:., '," :.. ' .: "., .
, ··~:<,:>dès· céncentrati ons .obtenues, a p~rt5 r. des deux méthodes; . ce ·.que refl è.te
. , '
'. -,.~.
.
.
. '
.
. '
.
~
' .
le,:rapgort"des aires moléculaires limites correspondan~es, ~t
•
1 "
.'~L ~,\\_;.> 'ô ' ~ ,,'
"0"'
' .
' ( '
.
2
2
'ZjOO'.A /2,.400 A
. x,) 00: %,=.83,33 %.
Cette valeur d'act,iyité pourrait
'i·:.i~~~~')",d,e:'c,r,.itêr~ de pU,retê de 1a rhadapsine et peut-être même mieUx
.':.~~~. ~~~2-78:' nm/Abs498 nm" étant donné, que 'ce rappprt s,pectral:es t ~ujet
" ,
'.
"
"
··'\\~:'be.~',L~6yJvd:'i~terfér.ence dué:a l",abs()rptionde plus,ieurs·.détersifs et
.:'
l ' , "
...~ ':~' ,"
'-.
('~':., ,_:~"~ ".•.:?;-f,".' ,t"
~.
J<,
••
",
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' " ,
:, ·,fip,i qês'Jans "l'ultra-violet.
~ ':,:~ ,!,. v·J.:,
:.,.' .... ,,,.~
,~. ~
:;,
" . , . '
Pour 1 lélimination du détersif, en général, un traitement au 8io-
. ',.,
"<',
!
~•.'" '"', ,~
,
.' . ".
"
Beads SM-~ pend~nt 2 heures donne de trêsbons résultats.
Mais l 'exp~-
rjen~e'n!~st pas toujours reproduçtible.d'un essai~a l ~autre.
Il arri-
.
,
,-', .-
'\\
:,:'
.'
. ' .
' . ,
~
;' ~..:.
'
,
·>.. ;.'.:···v~(;~~uv~ntôc;qulapr~s ~."hell.res:d'a9so~ption.;,du Triton X."lOO sur du Bio-
"'1
'".
'.'
:
.,(, ."
;.,.
, .,.: -,,'
. '
: ' , - , .
~':'
.
' , ' l '
,
'
•
.
. ' .
J
·~.:·"'.".',:X,;:,.êeacls,SM~2,:soit,;qU'il en'rest~ e~cp.re beaucoup trop ,et alors, l'uti\\i-
";+'~.::~::.~:(~'~,~fqn;:ê;~.~'mp~o~ou~he'~s~imPossibl,e,:sO'it que le d~t~rsif.es·t trop éî'i~
.::1\\~.. ~.";, .. _,,, ,;'''",
.~,,~.~,-
"""'~." ..., , ' .
..,
.
.
"
,
.
.:; .. ,
miné: ~t,~lorsla rhodopsine tombe ..en suspension et devient três instable.
~"'; -:-.
i:
"
~~çet~~ difficulté a été.contournée en arrêtant le traitement au Bio-Beads
.
,
~
P·.'~'·a~':J?o\\Jt...q~.':?O.,min.piJiS"s~ivre,1.I,é}imination pasà p'as•. à chaque une ou
'" ,.' :':':. '::~,.-}~;,:'~iL:f.~;· . ,'J,,"
' ' ' ,
" .
. • .•
.~', " rt
' . ni. '.:"
•..•..•
", ".:_~ A./ r:.~· ,1 't'
~~~~C~'~~~~~.'W:~~~'.L-t-~~.~~·'B_.'';;:-~":'~W·i~~;,-~~"~,~~·~~",~.~~~.,.~",,,~~LJ~'.:'~~:"":.~==.:.-..-:~~----,:..-....:,---,,---,,--,----'-"----,--

---

54
deu'~; ~i riutÈ!'s " pa r s p'2'ctrophotométri e. Lorsqu' i l' se p'todu ft 'une 1égêre
C I , '
~". . -
.
•
'
précipitation, celle-ci est tout simplement éliminée par centrifugati6n
,~
a'40 000 g pendant 15 min. Donc," entre l'élimination comp'lète du déter-
'sif.:1â pÜrificati~n poussée de, la rhodopsine et la conservation de son
'à.cùv'itébïo1'ogique, il Y a tout un corilpromis à Jaire, compromis qui doit
1
fenir tompte'des conditions de stabilité du pigment visuel.
,
,
'
"~'
,
e "
••
" .
" 2)'"
Dans, des ,essa i s antéri eurs, nous avons, pu puri fi er 1a r~dops i ne
jusqu'a de,s rapports spectraux Abs
nm/Abs498 nm
278
= , ,6, non ~s avec le
Triton 'x-)OO "mais 'àvec l'Ammonyx i.Olequel ne s"élimine pas facilement.
C'iesit>poJ~quoinou~ avon's da adopter 1e Triton X-TaO. Nos expériences "
"
,
d ~éiim{natl on du Triton X- 100 ontf;urn i " eurs me; 11 eurs rende~ents sur
des',so lutions de 'rhodops i ne moi'ns bien dé1 i pi dées ,soit une teneur de 1 'or- , '
, ;
dre'~'ede'~imolécules de phosphol"ipide parmo1écul'e de rh'odopsine (vous
.
"
trouverez a l'appehdi ce' III la méthode modifiée de Fi ske-Subbarow (115)
<
'"
"pour 1~" dosage des phospho1 i pi qes).
Certes, nous pouvons éliminer defaço~'s~tisfaisante le triton
X-10D des",solutions"de rhodopsine hautement purifiées.
Mais, 1arhodop-
sin~:ai~si"~rop,délipidée~t ~~lativeme~t exempte ~e détergent, préc~~i­
te·fàtil~me'nt.Elle n'est stable que' pour une ou deux journées à 277 K.
Pârcontre:"~~eê des solutions partiellement dé1ipidées,' la t.hermostabili-
"
l
, .
~'.";
" ,
•
"
_
< ,
'
; ,
,
té dela rhodopsine est plus grahde tout en n'étant que de quelques jours
.
'
,(un~:,semair~'e'auplus)touJours à 277 oK. Tout se passe, exactement de telle
.
,
'
,-,-',

---

55
sorte a confiTmerl Ihypothêse de certains auteur~ (116-118) a l'effet
q~e l~~rhodopsine.a besoin, pour sa stabilité, d1un environnement compa-
•
rab1e.àce,lui,lIin sltu", lequel lui assure la présence suffisante de lon-
.,
.'
gues ,cha'fnes dl,acides gras comme dans. les phospholipides .
Les déters ifs
à longues,-cha'fnes hydrocarbonées jouent aussi le même rôle.
D'où,la dif-
. ficullé de conserver 1 lintégrité structurale ou la stabilité de la molécu-
t
l~ ~ntiêfement délipidée.et exempte de détersif.
Entre,les longues chaT-
".
.
::
'
, .'.
ries'hydrocarbonées de phospholipide ou de détersif, nous avons choisi les
~,:' :.. '::' ..../ ..;.:;,'......
. .
;
'
,
' . "
' .
,'.:
-premlères'pquY"'protéger 1 1 i ntégri té structural e é1e la rhocicips i ne, pui squè
"
"
les'~h6sphdli'p;des font partie de la membrane biologique,natUrelle.
•
..',
.
.$1
'/cUn 'aùtre' point qulil importe de relater ici est de ne
"
jamais conge-
" .... ~.
~
lèr,.);ûne'·solution de-rhodopsine don~ le détersif a été extrait:
la rh'odop-
slrîè:~préct'pite.Maïs alors, la rhodopsine 'précipitée ,accompagnée généra1e-
,ménf:d·lun"peu:cf'opsine, forme ,de~ agrégats pratiquement insolubles dans· les
», '/' ,
.
.
,
• . ,,-
"l,
~61'~:;nts<,'o'r~a.niqùes courants tels que .1e diéthyl éther, 1l éthano1, le n-hexa-
rie, le toluêne et ce après lyophilisation, et même en~,présenc'e de 'détersif.
, c ' "
".:',
B)
Interactions intermoléculaires .dans des monocauches de lfpides
:; .... Dans cette section, nous présentero.ps, primo, les interactions"mo1é-
culàires des différents composés lipidiques de la membrane entre eux, à
savoir laPE, la PC, la PS; secundo, lliriteraction entre ces phospho'lipides
et .le >.cholestéro1; tertio, l'effet du cholestérol; quarto, l,' interaction
de~ quatre lipides avec la rhodopsine dans des conditions de non-décolora-
I
tion ,du pigment visuel.
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56.
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··.,q~at're·~composés lipidiques. précités. Le calcul de leu~aires moléculaires
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',~: :'l\\~~'t~~:,;;'e~'ikcti'vesnous donne 6,2 cm2 llg-1 pour 1a PE, 5,9 cm2 llg-1' pour
,
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.
2
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:la. PC,:.'.5,4,.cm
llg
pour la PS et 7,9 cm
llg
pour le cholestérol.
Nous
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<,.avo~2,pretéré exprimer ces'valeurs à la fois en unités d'aire par unité
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1
2
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';"de"'~a~sè::eten A molécule- pour la simple raison que les poids molécu-
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"'::~)aiies;~dis<Ph;S:Pholipides ne sont pas connus avec précision et d.lailleurs,
.... "'. '.:.; t;::'F~:''';~
.'.: :':":, , ',., ,
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.' :.:.:·,.ces ,'composés' n '·ont pas toujours l a même structure chi mi qu~ rel ati vemen t aLl'x
.', ·,~·;:t~}·y·::·:~,~~ ...::,·/,: :>', . , ..,',
':
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..:o.:i:,èhaî'nes>:d'·~tides" gras, d'.un,ti·ssu à l'autre, et même d'une molés:ule à l'au-
.' ':: ':~:<::,('~!;~:; >:\\', ,:,'
,
' . :
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..\\:::'tye;)?,â~I;,;~~;:.m,êmet.issu~ ',Toutef~~s, des valeurs a)lant de 700 '800 ont été
, ,iôùvènt.Util;sée~\\dans "la l1ttérat'llre ëonime poids moléculaire.
Quant à nous
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..... ,: '.
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.'::·.e,t,:s~ron' nos: 'propres détermi nati ons, nous uti 1i serons une valeur moyenne d~
.....i .
. .... :": .. ,
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. :C'12l6/pb'~r,"c~âè~n:,des trois:,phospholipide's.
Ainsi', l'aire moléculaire l;'mite
':s"e~a:i~:;de 74,0 ~2 pour la phosphatidyléthanolamine, 70,5~2 pour la pho'S'pha"-
'~~.';,"
; :'
'~' , ';. " , .
.0 2
tidYlcholine et 64,5 A pour la Ph~sPhatidYlsé~in~,: Celle du cho1est~roi'
e~iae 50~7'~2 'Notons que chaqu~ tourbe représente Ja~oyenne d'au moins
... trois courbes obtenuès avec le même échantillon.
l'exactitude de ces valeurs
.
.
.'
....
est fonc~jOn de la précision des concentrations indiquées par les fournis~ .
"
'
seur~, et ,du degré dl évaporati on du solvant avant 1e prélèvement pour les ana-
:,lyses~ ~algrétout, nos" résultats sur l'lévaluati6n"des aires moléculaires
soiÎten'l~'ànacêord avec les valeurs ~btenues'dans d'autres laboratoif/(s (119-
,
.
~-
. '
.
·113), avec· toutefois des écarts plus ou moins importants s~lon l~ con~titJ-
tion de la sous-phase et le degrêd'insaturation des c'haînes diacides gras
des p~bspho1ipides (tableau 2).
Clest ainsi qye pa~ exemple, 1'ai~e moléculair~
....'.
; .

---

57
PS
Cholestérol
48
,32
G
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-
~
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8
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~\\_,': "',' •• ; Tableau 2 :
Tableau com(l'aratif des aires molécu'laires (A2 ) des différente~ classes~de lipides"utlllsêS
.';\\0.
~>,.
Les résultats des colorines '(a) son't·ti~és de la~référence1l9::.ceu~ des'c~'l~onn'es (q) de la-;
référence 120, ceux des colonnes (c) de la référence 121, ceux ,des colonnes' (d) de la .réfé-
rence 122 et ceux de la colonne (e)' de la référence 123.
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Nos résultats
Résultats d'autres laboratoirés
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PS
Cho1est.
PE
PC
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ChO'l es t,.
Paramètres
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(b)
(c)
. (d)
(d) ,
(d) " (b)
, (c)'
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143,4
167,3 '119,5
67,4
' 53,0
98,0
115,0
63,0
130,0157,0
120,0
47,0' 43,0
O m'N m
..
' .
.. ,
,
"
1
"
A10 mN 111-
84,8
97 ,1
72 ,9
52,0
47,060,0
85,0
50,0 ' 90,0
107,0
83,0
43,0
40,5
..
..
-
"
.'
A
-1
47,8
5.0,2'40,6
,
32 mN ni
46,2
41,0
48,0
63,0
43,0
64,0 - 76,0
,
550
40,0
-
'"
..
",
Al
74,1
70;5
,64,5
50,7
47,0
53,0~75~0 50,0
85,0
94,0
82,0
44,0
41,0
..
,
-,
'.~
U1
00,
(.._,

---

.i
.
"
,
59
o
0
limite de la PC qui est de 70,5 A2 dans notre cas, mesure 50,0 A2
pour la (1 ,2-distéaroyl )-3-PC à deux chaînes d'acides gras saturées,
0.
0 ' .
'
,
t
de 85,OA2 pour l,a (l-palmitoyl-2-linolénoyl)-3-PC, à une chaîne poly-
o2
insaturée,et de 94,0 A pour la (l,Z-dilinolénoyl )-3-PC a deux chaînes
poly-insaturées (123).
Ces valeurs sont indiquées aux 2g, 8g , 9g et lQg
"
colonnes du tableau 2.
Nous ignorons malheureusement la structure exacte
'.
'.
.
J
des phospholipides que nous avons utilisés.
Par ailleurs, l'aire molécu-
.
"
0
.
,
.
laire limite du cholestérol est de 44,0 A2 (121) sur du NaCl 10-2 mol dm~3~',
o
0
;~:
2
alors.qu'elleestde 41,OA
sur"de l'eau pure (123) et de 50,~,AZ sur du
tampon'Tris~HCl
3
3
Z x 10-
mol dm-
selon nos expérie~ces.
'.
,
;.
~
,S,ur la. figure 19 nous indiquons 11 isotherme de pression de surface
• :.;.' ~ .1"
. -
: ' .
théori,què'moyenobtenu pour les trois pho?pholipidesa partir de la rela-
. "',
"
. , ' .
.
tion~l,~ ~~ 3~ (co~rbe~~) et l'isotherme expérimerital obtenu d'une solution'
,équimolaire,des trois phospholipides,kourbe-2).
Vous remarquerez la 'Super-
,
,
p()sit.ioi\\':d~sdeuxcourbes aux, basses pressions de surface et le léger déca-
lage.aux fortes pressions de ·surface.
2
~l
Oz
.': L'aire mol~cula~:re limite théorique est de 5;83 cm
].1g
, soit 69,0 A,.
'molé·c·ule~l. contre une aire moléculaire expérimentale de 5,87 cm2 \\.Ig-l soit
" . oZ.:;'
'. "'-1""
,
,
70,OA··~olécul~.: Cet écart de,moins de 1 %étant dans le domaine des
:
' 1 ; ' ,
.
er~eurs 'expérimentales; nous enconcl urions que PE, PC, et PS constituent
,
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' "
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,
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un~él~n~e idéal, si nous nous fions à la superpositio~ des isothermes
expérimental' et théor~que en accord avec la loi d'additivité des aires
"'moléculaires (relation-l, p. 38).' Mais signalol'ls tout de suite q~e la
co'nformité,à la loi d'additivité aes aires moléculaires n'est ni le seul
;;.
...
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.CHAPITRE II r
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RESULTATS
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.
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.
~;~:~:r;.idii::·~.!Wddi'hvÜé·de·saires moléculai'res~" En fait, la loi d'addiitivité
~~;~.~~~'l~i~~';~~;~I~V~i~·~·~··'~'~··::;,:..·:,~r; .\\ :~ ,: ' :
" .
:,{;.•:·s:~;a·pp·Uq~ê,·.~:·~.cou.P sûr~aux composés non miscibles..
Toute déviation de
~(:~·;7;'.\\<r):~;)t~\\:~~:i_if"·r.:,~;~.:;' .. '>' ': .
~" .
.
;5:'.{ç·e;~t~~,~~J~oi.:e;!s:t. P1l.itOtsigne de miscibil ité des composés constituant le
.~:~"i':: ~,; ~. :).,·h~;~~::~ ~f .~i.;~,· <~.
.
1\\~ 'méJ.ang~',r·i:·,PJjur 'cjü1un mél.ar:Jgé soit·idéal, il faut que la loi d'additivité l
;J;,~:,~,'>~;~:;:;;!::;T(~~f'~': !:,:,:;-< ,.' ':.,:
\\~,Ji,:~·:~,'.appJ:~:.gùe';:majs· n"faut aussi que soit vérifiée .la relation du potentiel'
..
~.: ~~ + RT ln n.
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:·~~;-t/;r~J~:tfQn'<:,d~j'déalité,qui.rejoint la loi d'additivité des aires molécu-
(i:\\&tt·;.:~~~;\\·!:t($$.:~;·.\\:I'rd:~h.\\:"::. .
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~i'}~~A~'fr~s!!::>~~r,:;fa'u,t'également qiJe la pression d'affaissement (Il ) varie de
f~~f:-,iJ~:~~;f~~'f~:!g~~~'&,+:~j+';. ""'" .... :'
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c , .
i.10~~~~:;}Sl~,:i(p':9U~:::Y~:·~,:~ornp02é.J), .vers TIc (pour le composé 2) lorsque l a frac t ion
~~~.:r,;~;~,;?t~i~~~:2~~:~~ji::~~,::;'::~'" l '! :'., :;,.'.....
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.
r~:;~<1'1o,);~1.'~r~.;,D2";;":;.,'( pour l eco~posé 2) va ri e de zéro à un.
Etant donné que 'nos
t;.;~~·r~~;{.\\'~.:~~:.~tl~~~;':.~::,H~/I:~~<r~~~~-?·:: ,:
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;'f;:;~·?qu~tr.e:~composés l ipi di ques,.ont des press ions d 'affa i ssement très s imil ai-
.;:;'{~::;j~;:;f';~F,";~".:;;:~ ,'; ;p-<.'.:;:
/·:·;·,~r~s,:'i'n(jUs .rie·:pouvons dqnc util iser que la loi dl additi vi té.
Beaucoup
Wf::·F';,:r<~:~,,;;::(:;; ..;}·';;c:~· ."
>.::·..~,:.\\'plus':d':irifo:rmations
sont données à ce sujet au chapitre 6 de la référen-
~j,i~1;~~~i;r"(: '
,
·"I.:;;~~<:).~.i~~~~tJn:Jals.ant la: même analyse pour la flgure 20, nous constatons que
~:p~~);\\(~~ </;i/:' . ....'.
1:~:,·:;."'a,·:..c6urbe ..expérimentale des quatre composés lipidiques (courbe-2) présepte,
:;.:.~,.. ,...:,.... ~., ,\\_::,1.',: ,'" ~):
~
.
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.~ '.: une déviation négative par rapport à là courbe théorique moyenne (courbe-l ).
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2
- 1
.
2
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)..1g
,SOlt 66,5 A molécule
)
i :.'~:..::(~,>;~. ·)::'"~X~:\\:.~~"> ;~'; ~ ~°7>-",:~
. ,
\\;:~'·est:';.toütefofs
2
p'eu différente de l'aire expérimental.e,(6,35 cm
)..1g-1, soit
'~}:~<' ': ,.,..:.;, f:, .~,:~,~. ci' ...~.'.'. <;0; ,.
~
,
.
:~.:·:)':~5:}O;:::A~·::~àiéCule-l). Cependant, nous n~ pouvons laisser inaperçue la
:1t;;{;:;~i~?~:;,,\\ç'..• .
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Fi gute 20
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' . '

---

/
Figure 20
Isothermes de pression de surface du mélang~ PE-PC-PS-Çho~
lestérol
Les quatre lipides sont dans le rapport 1:1 :1:1 .La sous-
-3
' : " 3 ·
phase est un tampon Tris-Hel 2 x 10
mol dm
; 'pH:7,2;
T : 290 K,
. Notation:
0
courbe théorique en,supposant un mélange
i déa 1 (courbe-l)
courbe exp!rimentale du mélange (courbe-2)
. ,
p

---

; i
63
gràndé 'déviation dans la zone des, basses pressions de surface.
A pres- "
,
' , 0 '
2
"sion'zéro" l'Iaire moléculaire 'théorique est de 11,0 cm
)..lg-1 (112,5'A2 mo1é':'
"
' 0 '
"
~ire
2
expérimentale de~,O cm )..lg-l (92,0 A2 molécu~e~l),
'./
.
~.',".
soft, une déviation négative de 18 % de la courbe expérimentale par rapport,
"
.....
"
~ la courbe théorique.
Ces résultats nous conduisent a~la conclusion què
le cholestérol condense le film 1ipidique,aux faibles pressions de surîa-
",
.:
',ce alors que 1a:monocouche est dans son,étatle plus fluide.
L'effet
'~e condensation diminue vers les fortes pressions alors q~e la monocou~
, ' ,
~, che devient plus ~ompacte.
"
,
~.
;,:.
,......
..~
.. i,
',,',
Cètte,~na'yse fondée sur l'aire l11~lécu1aire l1mite, qu~ue fort
. "
./
::r~~élatr.i ce ,; a:'généra1 ementp1us. de si g'n:,i fi cati on lors qu 1 on a un film mono~
"~':;","
~':~(-'PI
.. ,....
: ' .
~
.~" ..
;'molêculairesolide.
Ici, nous avons affaire à un film liquide pour le mé':'
.
". ~
,
lange phospholipidique
et à un film "su b-so1ide" pour le mélange phospho-
,"
lipides-cholestérol, à cause de la présence du cholestérol qui, selon' les
'"
~obse~vations relatées plus haut, semble condenser ou,~ou~ ainsi dire,
,'solidifier le film.
Alors, il paraît p1I,Js opportun d'étudier l'interac:
tion intermoléculaire 'à une pression de surface"donnée que par l'aire
,~oléculair.e
-1
limite.
Ainsi nous 'choisissons la pression de 32 mN m , pres-
s fon à 1acjue 11 e les monocouches ,seroht adsorbées pour la préparation de
,
"
la membrane de bicou~he lipidique.
A 32 mN m- 1 (tableau 3), lia ire mo 1é~
,:;'
" , ..
0
2
cu'lair:e ,est de 4,2 cm
Ilg-l (42,0 A2 mo1écul~~1) sur ,la courbe th~orique;
,':;'".i, .,\\'
,. . .
, '
0 ' "
....
1
. 'O'ètdé3,,87 ~.m2 Jig-
(39,60 A2 mo1éc~ie-1) sur .1a;cour'be expérimentale "
,'p()~r'lè 'iné,la,ngePE-PC-PS-cho1estérol; ce",qui représente une déviation né-
..
'.
".
.
" ,
2
-1
.
'
,',.;gati,ve de 0;33 cm,llg
de la courbe expérimenta'le par rapport à la,
.• .1-.:.:
. i
::~:càurbeth,éoriqu~, soH u,n écart significatif .de·l,a %. Quant au mélange"
. '
j
~
. ,:: '".
'l'
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.
" ..
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'

---

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-'
\\
Figure 19
Isothermes de pression de surface du mélange PE-PC-PS
"
\\ .
Les trois lipides sont dans le rapport 1:1:,1.
La sous-
p~ase
<
est 'Un tampon Tris~HC1:2 x lO-3~ol dm~3; pH:7~2;
, ,
'
T": 290 K.
" ,:. <
..
- ' ,
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,
,
.",:.
"
Notation
o
courbe theori que' en supposant un ,mélahge
idéal (courbe-l)
courb'e expérimenta le du mél an.ge (courbe-2).~
"
,'J,
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PS
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3,50 .
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2,60
PE-PC-PS (1:1:1)
5,83;'"
47,0
c'; ,<A>'théor.
3.25
1
3.00
PE-PC-;PS (1: i: 1)
5,87·,;
':~. <À>exp'L
::1': 3~·7.5
47.0
2,80
7,9
'6,65
48.0'
6,40
t·
Cho 1es féro 1
~(
:' ~',
PE-PC~PS-cho1estéro1,
<A>théor.
6,35
4,20
48,0
4,07
( 1: l:J : 1)
-'" "
PE-PC-PS-eho1estérol'
<A>
'1
6,50.
3,,87
47,0
2~60
(1:1:1:1)
.exp .
Rhodopsine-phospholi~
. <A>exp 1.
. 3,21'
40~0 .
1,63
pides(1:2:3)
,
,
0'\\
+:>

---

65
-1
'PE-PC-PS~ à'32rnN.m
,la déviation devient,maintenant importante par
,
•
-
-,
'.,
"
~:. ~:,~: ~,
" " ' l ' . , - .~_
"
•
~,' "._. ."
"
';;">.:,
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-
- ,
~
.
..
"
.,'
-
compa,rafsonavec ~elle à laquelle avait conduit l'ana]'yse des aires m9-
' l
l'éculài"ré~;Jlimité~E:"En effet, ;lf'aire moléculaire expérimentale à 32 mN' m-'l
e'~f"d~·:~·,75';drl~·~9·-l contre 3,25' cnl )j'g-l pour-Paire théorique, ·donc-
Javec unEf,déviâtion .positive de 15,4 %.
e
.
.;/ ..
..:.
1
.:
. ' ,
':'Mis ensemble, ces résultats semblent indique~ que: J.t) dans le
mé,lange.:êdephospholip'ides, on ass,iste ,à un ,comportement idéal aux basses
,
. ' .
,,~,
'~ ,:et:moyennespressions de, surface; (..u..) au fur et à mesure que la pression
.monte;,les molécule? s'approchant de plus en plus les unes d:~s autres,
·i1,se;créer:-ait·uneattraction entre les molécules de même es~e pour
;'"former dès~~gglomérats homomoléculaires, des m.icro-domaines,lesquels
c"-,",. .
,
"
" .
"
,
'
•
favoriseraient la, formation d'interstices entre eux; 'ce qui, de façon
t
~spétul~tive,'pourr~it ~xpliquer 'la déviation positive des, fortes pressions
.de;,.surf~c~; (W}:.par contre ;en ,présence du cho1es térol qui dil ue dl avan-
ce, tout, le système dès le,départ en occupant les espaces intermoléculai:"
res ph6spholipidiques, une déviation négative est observée a~x basses
pressions'de surface, situation qui prévient la formation des micro-domai-
nes des hautes'pressions de surface.
En définitivé, le cholestérol agit
cqmme ciment'dans'le systëme"phospholip',idique, en accord avec plusieurs
travaux antérieurs '(119, 122,124-127).' Mais<d1autres' observations ont
iridiqué:que:lecholestér~l peut aussi 'flùidifier les films monomol~culai-
~
~.
~es solides d~' phospholipides (126, 127).
\\"
',"
~..
::.'.
l,.,

---

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,','
66
C)
InteractiQns, ,1 iptdes -rhodops i ne en monocGuche
à'
~'idéeant~rieurement conçue~était d'étudier les changements d'in-
teractiomintermo1écu1air~sousl'effet de la 1umiêre~ d'~n mélange lipi-
,'~
"
.
selon les rapports mo1a1es respectifs dans la
'membrane:':discale~soit50 % rhodopsine~ 23 % PE~ l2~5 % ~C~ 6~5 % PS e~
· ./.
8,0,% cho1estêrol~
Mais~ a cause de la position d~ compromis que nous
avons été contraints d'adopter pour conserver à .la rhodopsine son intégri-
~" té stnj'ctur'ale en ne la délipidant que partiellement (2-3 molécules de
phdsp~olipides par molécule de rhodopsine), no~s avons a1ors':fpté pour
:l'.ét'üde de l'effet de la lumière blanche sur la courbe de pr.ion de
"
",
'
'sutfaèe'd~ la solution 1ipo-protêinique, telle qIJe.'purifiêe~ à l'inter-
';' ') ':' .
'
,
f~~,e"air':eau (autrement, l'addition de lipides à la solution' dite de rho-
"do~~':inèaurait condui,t à l'observation d'interactions 1ipides-1ipo-rhodopsi-
ne et ~on pas d'interactions 1ipides-rhriaopsine)~ Les résultats sont
'., p~ésenté~ ~ux figures 21 et 22.
, .
.
.
,
Sur la fi,gure 21 , les courbes de pression de surface de la rhodops i ~
·
':, ','
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, " "
" " .
'.'.
,
O2
ne·, non photolysée, donnent une atremo1écu1aire )imite autour de 2 400 A 'mo-
' , '
" , - , .
. "
.
léçu1e·~1~.:~ 5%. NO\\Js remarquons que la première courbe de
-l'"~
d~compression
,
~
~
" '~t
"(o)riedjffère que de f~çon négligeable d~ la première courbe de compres-
.'
t
.
. ~
< <~-
,-
sion (+). toutes deuxob~enues sous l'éclairage d'une lueur rouge irnoffen-
l,
· \\";-
sJv~ pour la rhodopsine. ,Il faut noter cependant que la courbe de décom-
,!',
press ion' rejoi nt tardi vement 1 1 axe. des A probablement, à cause du temps de
f":"
..
" ,
: • .'.
~,,: ;;;:. 1 ~ .. ,,;,";;.
r"
l
.
'T';.··';:'è:r~t6ur;,âl'équi1ibre plus long comparé à la vite~sede décompression,
1 ~ ':'1 ~ ";:~~::." .'~;~j: -:',1'. . :~~"~~l; .;:'
:."
.c
",:<,\\pourtan.tdéjà très lente.
Ce point. ne peut être entièrement élucidé pour,
" ::' .., ,~:' :~ ".~,~~~!1r .. :., .~,,:, ",.',: ".',. '
~ 1~instant et ne présente pas d'intérêt réel pour la compréhension du
: Il'") ..
' t
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,"~.ti~{4~~i::~L2:; ': " ;..""

---

Fi gure 22
Isothermes de pression de surface de l'opsine
.'
-3
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La sous-phase est'un tampon Tris-Hel· 2 x·10. mol
,
-3
"
·dm
; pH:7,2; T '.= 299'··K.
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Notation .,
,
0
courbe de compression
..
~:. ",:,"
,:0
courbe de décompress,i on' .
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67
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Fi gure 21 .
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.: Fi gure2l
Effet de la lumière blanche sur llisotherme de pression
-" '
de surface de la rhodopsine
..~-'
10-3
-3
La sous-phase est un tampon Tri s -Hel 2 x
mol dm
,
.'. ..
pH:7,2; T : 290 K.
,
Notation
+
courbe de compression
",
,
0
co~rbe 'de decomp~ession
(')
courbe de recompression
!Y'
.
.. ,
'
1:.
courb.e de redecomp.res,s.i on après i rradi a- ...
,:;'
tion de 1a monocouche':avec !dè la 1umi ère ~
blanche pendant 2 min
Dur~e totale de l'éxperience : 100 min
".

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68
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2
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6
A
(
ma lécu le- I )
Figure 22
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" '

---

69
su'y.'tout, c'est'la'position relative de la courb'e de redécompression (p)
"etc'éllè ,d~ 'r'èc6mpre'ssiàn' (@):
alors 'que'la courbe de recomp'ression' (0)
Si es {mani fes tement é'èa rté'e des deux précéden tes, ce 11 e de 1a redécom-
~'tè~~i·~;,:·,(~r;";;'le'nf,les ,rejoindre.' Que peut-o~" d'abord dire de la cou'roe
, '
h.'
~ ;,'r'-' '
"
'
.
;
dë~:reco,rn'pr;é'sslon?' 'Pour une niêmè aire molécuia~ré';A-<., la pression ,de!
",'sü~fa~g::rr::;;ies:t:p"ùkgr~nde lors';de 'la recompressi'oR':(Q) que iors de la
,.' /c .,:,: "" ' : .:,-<-, . . '
, .'"
"
.;:, '
, . . .
,,': r.edécbmpres·s i o'n, ef!même pl us grande, que dans les cas antëri eurs .
Ce
.,~~( ':,.. ~:,1.<, '. ,'. ~'<~>'
',~.
",,' comportement "peut', ,à pri ori, êHe":;nterprété' comme une augmenta ti on de
~,..:.,...
.:~.
•
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'
'1. • :_
f.
';<lat~~~~:it'é:'de:'mol'êculé'à'la 'surface du bain lors de la récol:ession,
'
\\jd~;t,:~~Adiss\\)ciation.'dè' la' rhôdopsine en'àpsine et en rétinX, tout-
, :,J;'~/'.~,:~:": >.'~~',,(-',.: ',<~
',. "
"
"
f.r,ahs',:~s'6it'par"accumulation de traces de poussièr~:;'da~s 11 inter{ace
.
" . "
':av'ec..)e:temps.Cette dernière possi,bilité m'apparaît très ,improbable"
,
'
,
"
,'Yù'les~lconèfitioris;:de ~igueur' dans iesquelles nous travaillons, et
. . "
.~ . ,. .
~. " "
'
' , "
,. ,
,:~:,~ut;;~:~.:'~~oins .que ceci ne se réflè'te pas, sur les autres gr'aphiques.
"'urie dégradation, thermique partielle de la rhodopsine semble pour llinstant
..: pl~s :pi~aus i ble.
r
. :-j..:: ,.:
',~
.~ ~ '.,'~,
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· .;..
"
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',~t'~~;i'(~'lors,'~;~~~t exPliqu~rla\\dévi~ti9~ n~~gat;~e de la courbe
,d~,:q~e'décomp~'ession C~)" par .suit~de l' i'rradia~i;~' à'l a l~mière blanche
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, ,,', / ' ,
J,
, ; . -~ ~
• ,
•
'de' la moriotouche rècompressée (0) sinon. par la te~dance bien connue de
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, . '
,
•
:.l:opsin~ !s'agréger en phase aqueuse.
En effet, selon la figure ?2, .'
; .' -:_(,'~\\~.~.,.:~ :~;>.
. :,1..
'.<~
,.,": 'les courbes de compression (0) et' de décompre~sion (O)d'l1n éch~ntil-
::"_.,,,,":~:';~'~..."7,
";"
:~';I
.
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\\
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"
. '~16n de la m~mesolution de rhodopsine intentionnellement photolysée au
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.,' " pré'ài~bl;~' ~ontrent' une dévi a'ti on du même ordre: de grandeur que précédemment.
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70
'<!"~'"L:;~'éârt's'élève à p~èsde9 % à 32'mN rn-l, entre la courbe de compression,
'r':,,:;,~}'<"~:;""':'~ :~<:,"'"
, ,
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9' et"dé ',déconipress i on de 1a fi glJre 22, comme entre l es courbes, de recom-
,:;~ p';~~s!1"6;~,,~'t~e r~dé~o~p~essl0n 'de la fi'~ur~21. Retenon; donc que la
"~'!;"~.r.}~<'~'.,
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";\\>:::'~:~~'i~r~,'~'l~n'c~e'p~r'une'contra~tion comm~ ré~ultat de l'agrég~tion de
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. , " , '"':" , .'. ',: .
~t·:.·:1 jnN, in7>:~; (j 29) ,.aux, press i ons moyennes . Alors que 11 agréga ti on semble
:",,:<,,~~:,~,,~),);"::~:~~'~:>'~~,. 't~' , ;,,.1, ,,' ':':~' ,~) .;~
>.
êtrefa.vo~j,sée, parl1entassement serré aux fortes pres'sions "~e surface
~;" re~'p:~~js'i':~m, e11e, paraît veni r de l'entrée du, réti nal toÙt-'ans dans
" ( '
, ,: ~
"
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la mànotouche de:l;'opsine'dont il s'est,:l'ibéré (129).
, " ..:,;'
D)>
La membrane'.arti'ficieTle
, Nous a~ons éprouvé beaucQup de difficultés a préparer une bicouche
,- ~
, ,',
lipidique par la méthode classique d'adsorption, celle, de Langmuir-Blodgett.
-~
:'!,~
.
Lors de l a sorti e de,l a sous-phase (montée), le' di sque poreux adsorbe une
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:...
•
, . . . .
._, ~~ • l,"
' . : ; ' ;
,
,1",
: ,
~onocolJche ,sur chaque face tel qulen témoigne l~ rapport d'adsorption va-
l' ,,', I:,~"
;::
riant dans l';ntervallede tolérance' 1,0 ± 0,1.
M~is, lors, -de la Pllongée
,.
subséq'uente, la monocouch'e déjà adsorbée re tourne à 11 interface air-eau
f~;sant ~onter:la pression de surface.
Nous avons fait varier le pH de
la, s,qus-phase de 5,6 ~à 7,4 sans aucun effet.
l l, en a été de même du

---

71
. .
~
changement d2 la force ~o~iq~e de la sous-phase en utilisant du tampon
;
Tris-HÇl de concentrations allant de 10- 6 à 10- 1 mol dm- 3,
Par-dessus
.~.
. '
(
, tout, 1 1adsorptl on dl une bi couche dl arachlda te deçadmi um reconnu pour,
s'ori.habileté à former des mufticouches aisément a échoué.
Ces résultats
. ~.'
.
"
.
.
,~réunisnous ont irrésistiblement ~menés à la conclusion que 1'énergie 1i~'
~"':
. {' ",
. ,;', .,' '...
.,', i
'
, : . ' "
"
~~bre:d'~asorption de la premiêre ~ondcouche fofmée dans les condition~ men-
;.
,~.:;.
:', -';j;>.ll'~ . ~ .
'
•
.
:tibh~'ées;est trop faible pour vaincre l'énergie d:attraction des groupe-
':,;~~n~,k;'pdlaires à, 11interface air..'ea'u entre eux~' àinsi qu'avec l'eau' qui
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"
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~: );COQs:F"itLle 1a sou?·.:phase.,
' " , . "
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0,'.'
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'J,
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:<:, '<T'V:'"es't de,là'd'allleurs qu~':,l.'idéenous est' v'enue 9.~,t\\ter la,métho-
....
'.:
" ' 1 '
,
. " .
\\d~·,.dG,/h>rttact hori zonta1; (fi gure :15:) :dont a fai t mention Ga"ihes (87).
'.' ;/~:~~: ,<: , ...., ",~'.~ .
", . (. ",',' :__.'
".,,J. .
~. <.:
'" ..
,,'~':N.o:~s;'ayons ainsi pu contourner le:'problèm~ de désorption d~la pr~niière
monocouch~, et réussir la deuxièm~,acisorption.'Le' 'tab}eau 4 présente "','
J,"
'.:,
'::les rappo~ts d 'adsorpti on de di fférentès.· p~é'pàrations:.,' Les vaieurs' se
.
"
~
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situent en 1TI0yenne dans l'intervalle de validité.
Elles'sont de 0,9 à
,
.
.
.
:.~ ,
1,2 pour le proces~us'de monté~ (i .e., pour la première monocouche) et
\\
de 0,97 à 1,08 pour le processus du contact horizontal (i .e~, pour la
;les- bicouches-l~pidigues préparées avec'~es rapports dJ~dshrptib~ de
"
"
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Tableau 4:
Rapports d'adsorption pour lès processus de montée, etdu',côntact.horizontal ;'.: ' "':' '>.
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PROCESSUS D'ADSORPTION
. 'RAPPORTS, DI ADSORPTION, .,;:>:" ,;,.., '~.
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Cholestérol'
0,97 '" 1 ~08
1;03
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"".,
PE-PC-PS-cholestéro1 (46.0:25.0:11,d:1~.0)
l ,17 , " 1 ,17 , ": 0,97 ,
1,08,
l , 17 ,
1,07
,
.~.
"i_
1,.04·,
0,97,
1 ,04,
1,08
l'
PE-PC-PS-cholest.-rhodopsine (23,0:12,5:6,5:8,0:5a;0)
0,97,.
0,97,
1 ,08,
1,O~'
0,97"
0,99
Contact horizontal
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PE
'0 ,8q,
0;97
0,88 "
1
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PC
l" 17 ,
1 ,08: '
1 ,12'
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PS
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1,00
1 ,04
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I-
L
Cholestérol
1
1,13
,30éJ.~91
:, l,
~.;,"
f:-
PE-PC-PS-cho1estérol (46,0:25,0:1 3 ,0:16,0)
1,17,
0,97,
1 ,18,
0,97,
0,97,
1 ,00
,.~.
,
0,80,
0,95
,
,
~
PE-PC-PS-cho1est.- r hodopsine{23,0:12,5:6,5:8,0:50,0)
l ,17,
1,20,
1, 10,
1 ,20,
1 ,20
1, 17
.
-..,j
;.
N

---

, ....
"
.' ......'
, 73
1:...
.: .~ ..
,
,
molécules dansTlenvironnement immédiat de la plongée doivent s'incli-
d
'
'
neret s lécarter pour permettre l'entrée du disque poreux (si tuation'iqùi
éî()ignele~ cha1nes d'acides gras à 1':inter:face air-eau de celles de la
monol::ouche déj~ déposée, et par le fait 'même,'r,éduit llefficacité d'in-
tèracti o'~s . hydrophobes ); (,U.)
dans le cas du processus du contact hori-
zontal ,ies,'molécules de la première monocouche déposêe et celles de l}~in-
,
).
.'
',terfac~ ~ir-eau viennent directement en contact po~r alors permettre une
..
"
'adsorpiion efficace queue-à-queue.
Cette jnterprétation est ~'ailleurs
,:~'t:', '.:~/"
,:'~ , "'\\' '~'~ "
1·....
t3 ..
'~
apPuYé~ .par l'échec de la formation de bicouche sur le, support préalable- '
"~
o~
i
.~' ....
: : . '0
••
'
'.
•
. "
ment rendu hydrophobe avec du n-hexane :,1 e rapport moyen es1t-, de 0,6
,p~yr: le processus de montée et de 0,2 pour celui du contact
'. ' . "
,
~rizontal.
;i!.""'.
Qtie les rapports d'adsorptionsoient de 1 indiquent~ non seulement
la ,formation d'une bonne bicouèhe, mais aussi qu'il n'y a pas d'incurva-'
tiàn au niveau des pores du disque.
Malntenant, il faut garder dans
,
,
~"
l'esprit'que: prép~rer une bicouche lipidique 'est une chose; préparer
une membr~~e artificielle en est uneaut~ie. En effet, une bicouche lipi-
di que es t sa~s intérêt pour '11 étude des phenomènes bi Qmembranai res si elle
.
.,
i
ne présente pas le; caractères de bio'membranes.
C'est pourquoi il faut
caractériser cesbicouches par des paramètres électriques comme la ré-
sistance'membranaire et l'action de la gramicldine, spécifique des mem-
. '
<.
, branes' d'e,bicouche· lipi,dique.
~. , . }
"
, ... ,
•
1
.
;,
"
"
r "
2);
R~si~tarice éi~ctrique .\\
,l~ ,support poreux seul nloppo~e aucune ré~istance au courant élec-
:', , .' tr;;'q~~ ~l or~qulon i ui':app 1i que une tension' de 50 à 100 mV à travers deux
" : , , , '
, < ,
,
f . .
•
~, ".
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'....
..
,~' l
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,
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.
,,~ :::;ji;:·~iSlb:;:';':I~/<f~it~i~'i~,','"",: ,:,.",

---

74
électrodes Ag/AgCl remplies d'une solution saturêe de KC1.
Par contre,
~. àveclamembrane de bicouche lipidique, une résistance, différente de
..
,
'
2
celle des électrodes est mesutée.
Elle est de l'ordre de 105n cm
pou~ .
• de~ bicouches de phospholipides pures, ainsi que pour celles de mél~nges
~e pho~pholipides-cholestérol
(tableau 5).
"':"
, f
" .3)
Effet de la gramicidine
L'~ddition de la gramicidine provoque la diffusion du Kt a tra-
vers la membrane de bicouche lipidique (tàbleau 6),. une'autre preuve
;~
de la formation de celle-ci .Le taux de diffusion varie énorrnêment
".'
,
:J~
alUne expêrience a l'autre et croft'avec le temps,
Nous attr~ons ce
......
comportement a,: la variation du
•
•
',1
, t
•
ta~x d'incorporation de l'antibiotique
•
fla ~~iTlbra~e. 'Pbur ,cette même ràison, nous ni avons pas pu. ét~dler
l'effet de la concentration de gramicidine sur la diffusion'.
Ceci aurait
été p6ssible en i~~orporant l'antlbiotique directement à la membrane' .
lors de sa formation, mais nous aurions couru le risque de contaminer
dangereusement le bain de monocouche et pour longtemps, attendu que la
gramicidine
10
él9it même sous form~ de trace~(~
1'0-
mol dm- 3 ).
Cette
. observatio~, quelque sommaire qu'el{e soit, milite en faveur de la for-
-,'
",
"
mation d'une b6nne bico~che lipidique.
E)
Diffusion photo-induite a travers les membranes artificielles in,
corporées de' rhodopsine
c: .
Dans tous le~ cas étudiés, sauf un, celui dU K+ a 290 K en irradiant
avec la lumiêre incandescente blanche, l'effet de la lumiêre se traduit
. '.
* Hall, .J . E. .
Channels in black lipid films.
Dans Giebisch, G., Tosteson, D.C.
~t Ussing, H.H. (Eds.):
Membrane Transport in Biology, Vol. 1. Con-
. 'cept and 'Models.
Springer-Verlag, New York (1978), p. 475-532.

---

..
'
"
,.~; .~?
.o!O".
3
Tableau 5:
Résistance électrique de différents systèmes membranaires artificiels dans du KCloO,l mol
dm-
2
t
' ' ' ' - .
.'.~,
Résis'tance (g)
Résistànce spécifiguè (0 cm )
JI·.·•.".:·
. : .
.
; ~:- ::"-
.,
"
'.;, {'..
'>
., ·3
Résistance ,d'électrodes
4,50
x',10
,:.\\
.'
"
,
.
"'3*
, Di sque poreux .
' '
4,50' x
10
5
Bi couche de' PC-PC-PS-tho1es tér:o 1
8, l a x '103 :
0,55
x 10
3
5
Bicouche de PC
8,35
x 10
0,57
x 10
~
,.'
Bicouche d'arachidatede Cd
7,48
x 103,
0,44
x 105 .,
t,8,>.!
* Nous retrouvons. seulement la résistance des électrodes, le disque poreux n'opposant aucune
résistance au courant.
.t1JF».: ,;
x:;9:";;:;-
,....
~
"~
~ .:-
'-J
t;:'.;
ln
rf1
·d
,,..

---

76 '"
. .
Table'au 6
Di ffus ion du Kt induite
~.
pè~ la
2 ?on v
gra:m Cl ,-,1 r.e
'--''-'
"
ci
" ' 1
:t
4
10
105
10- 17
x 10-
a K+ x
M K+ x
~Kt X
(s)
(mol dm- 3)
(mol dm- 3)
( K+ s - l )
.,
.,
a
0, 1O
0,00
"
t-f
6
0, l °
0,00
0,00
"-: ...
~
-.
"
12
0,10
0,00'
0,00
>-
.- ~- .~.
~.
"'.
G*
18
0, l °
0,00
0,00
~
l ' "
•
'
"
.~. < .',
~
24
0,19
0,90
4,06
..
•!\\
30
0,44
2,50
11 ,29
","'\\,
~:,;,'<t,
~
'\\', -~
36
0,79
3,50
15,81
'l_'
42
1,28
4,90
22,13
48,
.2,9 7
7,90
.35,68
\\ ~
"
54
2,63
5,60
.25,29
60
.3,67
10,40
46,98
. ,
'
.
66
4,89
12,20
55,11
"
72
6,84
19,50
88,08
.> :
: ~ :,-
~', ~
i
"
./18
"
. , ..7,89.,
,10,50
47,43
.
'. ~ ~~. ~ .
,"
--.~
.. 84
9,36
14,70
66,40,
"
:\\
"
1
c :
, '90
11,00
16,40
74,08
- f;'·
, *.: Addition de' 1 ml de .gramicidine 1,084 llg/ml au compartiment-1
3
'::'conteriant'une solutlon de KC1 18,5 mmol dm
dans du tampon
Tris~HC12 x,10-3 mol dm- 3; pH .. 7,2.
, :
. \\' .. ~ '.,
-/ . '::
!, '.
,
: ' ,,;;;'
,r;
~ "',: r
. . '
, ; '-' ,
--'---'-_ _----"_'·--,-,:,J>,,-,,?;~=~·:,,-,.~',-"-;::~,-,-,;:;:',~:~,,~,~r· ,:i': ~ ';.Ls:::·~_~'~
'",';;'.-\\

---

77
par une augmentation de la perméabilité de la bic6uche lipidique incorpo-
d
rée de rhodopsine aux ions.
L'effet siest surtout fait sentir sur le Ca;2+.
,
Sur le tableau 7; nous indiquons la variation brute
photo-i ndui te de 11 ac-
ti vi té ionique du Ca 2+ comme exemple de réponse des électrodes s péc ifiq ues.
Vous y remarquerez que l'activité ionique mesurée dans le c6mpartiment-2
.'"
est dell'ordre de 10-4 rnol·dm- 3.
Pour les autres ions, l'activité mes~rée
"."
4ans te co~partiment se. situe entre 10~5 et 10-4 mol dm- 3, presqulau ~euil
,de.féponse linéaire des électrodes.
Dans ces derniers cas, une courbe
,
dl~ta16nnage' couvrant particuliêrement cette région a été utilisée .
..~-.."
1)
Effet de la lumiêre incandes~ente blanche
Comme déjà mentionné ci-avant, l 'irradiation de la membrane de bi-
couche lipidique"incorporée de ~hodopsine provoque une hausse de sa per-
o.
•
2
'méabilité aux ions Ca +, Na+ (figure 23}, avec un effet plus prononci
.
"2+
+
0
pour l~ Ca
,que pour le Na.
Nous nlavons pas observé d'effet de l'é-
clairage sur ,la diffusion du K+.
Par contre, alors qu'il y a absence
de fuite 'ionique a la noirceur pour'le Ca 2+ et le Na"lo à 290'K, le'K+ lui,
présente une diffusion de fuite appréciffble dans les mêmes conditions
que n:altêre'pas la lumiêre.
'.}'"
'." .' .
. ,1.,. 1 ~
•
2)
Effet de Ta iumiê~e incandescente a À ~ 607 nm :
, ",
La l umi ère d'une ampoul e' incandescente lai ssant passer des photops
de À ~ 607 nm ne manifeste aucune influence sur la perméabilité de la bi-
,,~ouche."lipidique
2
incorP9rée de rhodopsine vis-à-vis; de l'ion Ca + à 290 K
,
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•
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---

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\\
~.~,
.:A' -1
f
!l.
'
.'
/
.....
li.' ; . •
78
2
Tableau 7
Diffusion photo-induite du Ca +
2
a
2+
= activité ionique du Ca + mesurée dan~ le compartiment-2.
Ca
Lumière blanche, T = 290 K
Lumière monochromatique
i
(À = 498 nm) T = 276 K
... 1
,::>
aca2+x10't
</>2 *X10- 11
,,+
::>
><
-II
,txlO .
MCa2+x10
aCa2+x10
~aCa2+xlO
'</>Ga2+x,lO
Ca +
(s)
(mol dm- 3) ,. (mol dm- 3)
(Ca 2+ s-l)
( - 3
-3) (
2+ '-1)
mol dm
)
(mol dm
C a s ,
,
,
.
'
a
1,61
0,00
0,00
0,81
0,00
0,00
!
6
1,61
O~OO
0,00
0,81
0,00
0,00,
,
,12
1 ~61
0,00
0,00
0,81
'O-~oo
0,00
~~\\
hv
1 ,61
- 418
0,00
0,00
0,81
'Cato°
0,00
..
24
.1 ,61
0,00
0,00
1,28
4,69
21 ,20
..
,
"
30
2.12
5,09
23,00
1 ,91
6,37
28,80
,"
36
2,54
4,20
. 19,00
2,30
3.,83
17,30
.
42
'Z,70
1.60 .
7,20
2,43
1 ,28
5,70
A8
.3 ,04
3,41
15,40
2. ,43
0,00
0,00
, 54
3',23
. 1,90
8,60
2,49
0,60
2,70
.'
60
3,42
i ,99 '
9.00
2,54
0,50
2,30
"
,66,
,3,85
4,29
19,40
2,54
o,do
0,00
"
·72
4,33
,4,80
21 ,70
2,54 '
. 0,00
0,00
,
,
'-
,
,.
~aCa2+
x No x 75 ml
~t
x
1000 ml
75'~1
volume du comparfiment-2
000 ml·
1 dm3
No
nombre d'Avogadro

---

Figure 23
Courbes de diffusion ionigu~ induité par 'la lumière'
'.
blanche incandescente 8 290 K
Notation '.'
0
•
Calcium
0
Sodium
, r:
.- .
'f::.
Potassium
..
.
'h'J':
énergie lumineuse; la flèche indique
le début de l'irradiation
; .
p

---

ro
79
a
0
.X
20-r------~------------.
~
200-
..
Ca
.. ~
;
<l
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Z
W
~
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l--
0::
«
CL
~
0
U
. ,
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q
LU
~
.=-'
~.
-.
Cf)
Z
«
0
8
o 0
o
Cf)
Z
. ,
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Na
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4
..:
W
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CD
Q
0
.~
, "-:;.' 0
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o~:.=.....-;----...."__r_---:........~.--:....-.~.-~-___;~
o
~ 24-' ·-··;~·;:'·:'·~''''4e.·'
..
. ·12
hv
,.... .
..
fK ~ 0 QI. ( s) '. .'
Figure 23.
' 1 . '
..
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"
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...:.
" . '
• f
"
.
. ' .
'
. .
:.:i ,~.:.4,:, ?5' ~:.~:::'I
. '.:-~'
:
i".i.
_' r' _ . ~':, .,
.

---

..
Figure .24:
Courbes de diffusion ionique induite par la lumiêre
.
13
-2
-1
monochromatique de 498 ~m (2 x 10
photon cm.
s
) a 276 K
f,
'
'Notation
o
calcium
o
sodium
6
potassium
hv
énergie lumineuse; la flêche. indiq~e le dêbut de
llirradiation
, .

---

.
,~~............-.~.~--"-.,l.-..-.c.-'...--""""~",,,,,-,
..
• • t
• •
<
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."
t
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Hl
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D
~
0
Na
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0
~
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0
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9 91
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~
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0
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Ca
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Cl
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"
0
o
0
3
=
Cl
2
W
0:::
00
~
0
z
o
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0"
72
Figur'e 24
.
"'l"
.'
..
" ~.
'<,:~~?";:,:,~~",:~t:_, ,...\\,\\'~:',~~,~: ",';:",'~, .: ' .. _
' .. "
.......

---

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•
" , ' , ' : t , '
"
.~', -
•
..
l
~'r', '" ~" ,_
. 'C-i_:_~':!-:'~.,~~~04'~-:-;~~~;~~" ',~~_'uo~-
82
13
comportait génér,alement 3,4-3,6 x 10
molécules de rhodopsine pour une
2
;:" surface membranai re de 14 ,82 cm .Pour des fins de comparaison dl une ex-
,
'
péri e'nce, .àl' aut're ou d' un ion 8 .1.1 autre. nous avons c,onvenu de normal i-
,'s~~Je f;ux,'iordq'ue,'photo.induit
13
à 10
molécules :de rhodopsine.
Nous
po~von~,obse'rVèr 'l'es'p'rofï'ls',de diffù'slon photo-induitè par la lumière
mônoc,hràm:à'ti'q~e'
2
de 498 nm sur la flgure 24 pour la Ca +, le Na+ et le;lr
i<+ • La: q'Lai1t1 té':d 1 i ons diffusés ,es t une fonction linéaire du temps au
'débu't,des,mesures, pendant que le système est encore bien loin de l'état
,
.....
'
<
"
"
: ~~ ':'
..... ,
~; "diéquilibre'entre les cieux compartiments (d'où l'usage de la: pente initia-
.': <.: .>:1 :<~:,,: .~;', ,:'.: .["_"
>,...
.~ ~....
'le)., Précisons
que'la' concentration ionique dans le comparmm~nt-1,
(~a'~acitë;~~1'35nli ):est de1'o;dre 'd~:18,5 mm~l' dm~3 e't~e ~îieqUe'
.-".>i"'"
..
,:(,,:
,.~.~:'.~~:.
~"' •. "'.,
j.;l",",~
,'.'
[
.très 'peÙ toutle'long de, l'expérience'; alors que ce1,1~ du compartiment-2
(~apa'~i1:/d~ 75~m'1):'~/a jamais aiteint io-~ mol dm~3 à la fin des mesu-
·r
'
, ,~
: ~ ,
5)':' ,Cinétique de la diffusion ionique photo-'induite
..:.. '
! ,.Y....
: ;
"
'Les'résultats relatés jUsqu'ic·i 'sur le processus diffusionnel
no~s amênènt:a un certain' nombré de conclusions~'
l es membranes préparées 'par la méthode combl née de Langmui r-
Blodgett. et du contact 'horizontal sont irryperméables aUx ions Na+, K+l
2+
. '
et Ca
, en l'absence du r~tina1 tout-trans et de lumière capable
d'exciter la rhodopsine;
,. .
,

---

83 .
la présence du rétinal tout-trans augment~ la perméabilité
.; membranaire 'aux ions monovalents, au Kt surtout;
'llabsorption de la lumière blanche et de la lumière monochroma-
tique de' À :. .498 nm augmente la diffusion des tr:ois ions à travers la
membran~ de bicouche lipidique incorporée de rhodopsine, en dehors de ,
tput effetd'êchauffement du systême par la source lumine~se.
:' Ën 'ût,il i's'ant 1à pe.n~e i ni tia le des courbes de diffus ion vèrsus t,
' h
~,
. . . . , .
,.'
. . '
"
nous~sommes en mesure de calculer le coefficient de perméabilité (~d;) a
.
.oS\\.
""
+
. . . . .
.
,
}>1..
"l'laide 'de la relation [2'J (voir p. 47).
Les trois ions se r&~ent
,
~ans 1'ord~e . Pd 2+» Pd +
Ca
K >
PdNa+ .• C'est ainsi quia 276 K, avec
'.'
'la lumière monochromatique, le coefficient de permé'abilité est de
'2.30'x 10~4?cm's~1 pour le Ca2+, 1,74 ~ lo~5 cm s:-l pour le Kt et de
,1 ,00 ',x 10~5,; c~' s-l pou~ le Na+. A 290 K,' avec la 'lumière blanche,
Pd
2.+ =,' 1:','60 X 1Ô-~ cm s-l,~ Pd + = 3,60 x 10-5 cm s-l, Pd + = 3;02. x'
Ca
K
Na
,l0-5~':cm s-l :: ~~marquon~toutefois sur la figure 23 (courbe du bas) que.
,
'
<Ta 1uIllière semble ne 'rien changer à la courbe de diffusion du K+ par rap-'
.port àl"é~at d'avant irradiati~n. Il serait plus 'juste de s'abstenir
. ,
d~ parler de Pd. photo-induit pour'le K+ ici, ~t plutôt de fuite due
.... , , ' .
.{.
, "
au rétina1 tout-trans pré.sent dan's la; membrane avant 1 l illumination.
"
Le coeff;"cient rêe1'deperméabi1ité photo-induit serp' celui mesuré à ~
276 Ksoit 1~74 x 1ci~~'cm s-l.
;
'-".
'. +
Itfaut noter aussi (tableau 8) que le Pd
phpto-induit du K
i
."
. +
•
est peu différent de celui du Na.
La différence nettè réside entr~
"''''','

---

.,:
~ ..'
.;- .
<J'
.r:;:.
,.t:>~'
...:'
, .
Tableau, 8 :,' Paramètres de la diffusion ionique photo-induite
~ ';
~..:
J,?"-:
"
.•~.
r'-:
~~'~
.'
Espèces Ioniques
,
.. '
Lumière blanche, T =,290 K .
... Lum ère monochromati que
.. (À
498 nm), T = _ 76 '.K
.
"
' - l "
5"
,
.
k~
Pd. (cm 5
) x 10"
Nombre dl i ons diffusés
' Pd
- r
.5~ Nombre dl ions
..
-t ,
','
'
,L (cm s
) x 1a '"
_Rh *,-1 s-l
..
diffusés
Rh*-l ~-1 _
"
"
Na+
3 a
166
1. a
50'
"
..'
, ,
K+
f
1 .7 ","
.è 3,6
96
-
.,
c/+
,,16.0
'
-
888
23.0
1 277
..
,
.
-r
.....~
.
Coefficient de perméabilité à la noirceur.
/J""',9;; ..
""~~
",",
.d
"
co·
,r:::.

---

..
"
.
'
.
~ .... ',
.lo,'
"
1 , " ,
'
'
"
, , :
, 85
',": '
"
'
1,1"
1 . "
" . : ,
','.
. -'
. ~..
.. l~ ". ".
~le ;~i+ Cl lun côté et 1es deux ions .monovalents de 11 autre, avec' un
':~Pd~,à
2
peu' P~è~ S"fois plus grand pour le Ca + par rapport aux d~ux au-
';l
. tr~~ ion.s:~ la: l'uniière blanche à 290 K et: même 13 fois plus ~ la lu-
,m'i,ère !TIonoc,h~omùi~ûe:k 276:'K. Donë'i'isô'm~ri~ation'de la rhodopsine
s'e résulf~ :ei/u~l'augmentatioti c~~sidérable ~t sélective de la perméa-
:, ' ~il ~ t/me~brana ire a'u 'ca2+' par' rapport au Na+ et au K+.:, Cela se tra- .
.
.
,
,
d~{t"par'ûrie:'~iffù'sion:i'dnique[de stoechiométrie; .1 277 Ca2+ Rh*-l s-l~
'::96'K+ Rh~~l's;~l èt5D N~+'Rh*-l s-l'a 2'76 K avec la lumiêre monochroma-
'i,.dqûe:dl·~ne part ét de ~88 Ca2,+ Rh*·-.l s-l l66Na+ Rh*-l s-l à 290 K
, '
avec .la.1Umière blanche de 1 'autr~.
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CHAPITRE IV
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DISCUSSION
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~.IV
,DISCUSSION
le b,ut premier de ce travail est l'étude de l,'aspect ionique
":'
~u'proc~ssus:visuel. C'est donc ce qui' va ~ous préoc~uper d'abord
.'.. ~tJ e plus 'dan$ ce chapi tre .
P·uis.,·'nous élaborerons un peu sur les
.. . ~'.'
A
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, . '
,,'~t0de~"d'in~~tactions i~termoléculaires en monocouche pour finir par
t
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.
",
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,la.~dis.cussion sur la membrane artificielle et le problème' de :purifica-
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. ,
.~~. tion. de ,.1 a rhodops i ne.
,J.i
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. La molécule~ de pJgment visuel, la rhodopsine, réagit .à(Nabsorp-
, .-
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' .
..
..
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2+
.: 'li'té de: 1a m~lTIbrane au~ ions, én:pa!'t,iculier et surtout au Ca
, en rai-
+.
.
son'~~l
2
277 ions de Ca + par seconde, 96 K+ et 50 Na
par seconde.
Ces
.. ~ ~.
'observati o'ns appui ent très fortement d'autres. fa ites ai 11 eurs comme vous
pouvez le constater sur le tableau 9.
Nous y remarquerons cependant,
que probablement à cauie~dela 'difficultê d'isol~r intégralement les
di sql,Jes 'et les' SES,: ,'a: quan~ité dl i ons C~2+ 1i bérés pat rhodop-si ne exci-
'."
tée:y:arie"(~'diun à 1000 dans' les ~EB isolés p()ur .les cas les.·mieu·x con-
~t61és (13t-133) et'dans les disques i~dlés de SEB bovi~~ (134).
DJau-
2t
.,' t~:~s 'cas de diffusion du Ca
deSEB induite par la lumière sont aussi
".1.
rapportés,mais les donnéès.et les conditions expérimentales ne permettent
·'pas une interprétation ~rafment critique relitivement a 1 Ihyp6thèse du
2
Ca + (135-138).
Hubbe 11 et coll.(139) ont également observé llefflux
2
photo-induit du Ca + de.yésicuies incorpor'ées de l1hodopsine pré~lablement
chargé~s de llion radioactif.
Des mesures quantitatives, les seules du
86
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Tableau 9
Tableau compatatifdes ~a~x de diffusion:ionique pho~~~induite
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Ion
(
,Nos résu1 tats
Résu lta tt'd" 'autres'
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, i aboratol-res
i
mesuré
,
1
1
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Membilnès 'a'r'ti,'fi ci e11 e~'
'.
SEB'et dis'ques
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'.'
.' '-~
J',
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Na-t
166 N'a T Rh *-,1 s - t à 290 K
:.-~
". ~
Eff1~x r~pidè d~Na+: induit
!--
par 1a,1~miêre, ~t 1'additio~
,
l
50 N~T ~h*-ls-l'a 276 K
184 22
du'rétin~l tout-tran~ (8,51),
Nat Rh *-,1' ,'sur 'des 'vésic,u1es
f'
incorporée~
de SES
de rhodopsine (Si) a
1
27i:K
.
K+
Eff1ux'du 42 K+ photo-induite
des SE~i8,9, 51)
\\~
: ~..,
,;.
,
Ca 2-t
2
2
Eff1ux > 184 Ca + Rh*-l, de vési-
SES: 1 Ca -t/ 30 Rh*
( 132),
sicules incorporées de rhodopsine'
0,2-1,0 Ca 2+ Rh)~-l
( 135)
1
a 2971 K~52)..
~
2+..
~ '.'
10-1000 Ca 2+ Rh*-l
( 131)
l,
Eff1 UXl ns tantane de Ca
de ves 1 cU- .. '
'
2+
. *-1
les in~orporges~~e rhodo~sine, pré-! Olsques: 0,75 Ca
Rh
chargée~
[
..de 4, Ca (139)
....
(134)
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88
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.
genre' sur des membranes· artificielles vésiculaires, effectuées par
.,, ~
"
O'àrston et Montal (52') ont permis d'évaluer le taux d1efflux photo-
indui~
2
du Ca + à plùs de 184 ions par rhodopsine photolysée (Rh*) par
seC:o~de,et .de 184 ions pour le Na+. L.es valeurs que nous avons obte-
.'
~
,
2
nue's, 'en .sont di fférentes:
l a di ffus i on photo-i ndui te du Ca + dans nos
expér;~nces
2
est de l 277 Ca + Rh *-1 ,s-l contre 184. selon les auteurs
d!~;/.r~f~r~:Q~~(52).,;parcontre le taux: de diffusion 'du Na+·dans notre'
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' + ' * 1
' '~soi f e,de'50 contre '184 Na 'Rh - •
C'es 'd'j fféren',cespeuvent venir
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' 3
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".-
,; ,~~ dé:"N·~+',' et 2,~'5 ,mmell 'dm-:) de' ca2+, 'a'l ors ::quë dans n6's :e;péri ences ,le 0
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'... .
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'..,
.. '. ' "3 '
• ,.,'
",
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compart;ment-l'ava;t;unë~'concentration'del8,5mmol dm- pour chaqué
espèce ; on; que contr~zé~o dans 1e compartiment-2 au temps 'zéro.
N,OS
0
"
(~,
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'.
résultats seflib 1ent de plus démontr.er une pl us grande sél ecti vité des
"1
'
m~rnbr~nes ~;s:..a-vi~ du è~2+' "Par' ai'l1~urs' i'lss'o'~t'~n parfait accord'
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à fixer le taux de diffusion photo~induite d'un éventuel trarsmetteur
dans "le processus' vis'û~i'''â:~loJ ~~l'~~~le~' Rh *~,l s - r: pour satisfaire
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aux exigences de gain.
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précités; nous avons de~raisorîs, de";~'fatuer que lEi- p'rocessu~:s v'isuel pas-
.. se 'par, une' é'tape dl augmentati on dë ~iC~2+,au ni've'au de l'a 'membrane ,di sca 1e.
Com~~'~d~s l~~vons établi plus haut, tout modèle d~ processus visuel doit
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89
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pouvoi~ d'lune part, expliquer le mécanisme de communication entre
,la membrane discale (siège del'absorption de l'énergie lumineuse)
d
. "
~t la membrane p~asmatique (siège du dégagement de l 'énergie électri-
,que) et'd~autre parf, rendre compte du sy~tême de gain qui élève l'é-
,
.
- 1 ' :
",:nergied 1excitation photon.i;que (- 40 kcal mol' ) au niveau de l'éner-
, g';e d 'exci tati on él ectrique de toute 11 entité nerveuse opti que..
De
t
c~
2
point de vue, le Ca +'estun candidat de choix.
"li·
2
r,.
Ainsi, le Ca + stocké dans les disques ayant une activité de 1'or-
'a.
- 3 '
-3 "
dre de la
,mol dm
(14Q) pourrait agir 'comme transmetteur ·entre les
.
"
~
,
"
1.J
deux systèmes membranaires.
L'énergie d'excitation fumineus1;,~isoméri-'
"s:~;:la rhodopsine qui, à son,tour, provoquerait l'augmentation de'la
'permêabiltté ionique observée.
, >
... '
Le cl+ libéré par les disques diffuserait à travers le cytoplc3:~me
'jusqu'à la membrane plasmatique pour y bloquer ies~~anaux sodiques 1, ' hy-'
9
>.~:'
perpolarisant par le fait ~ême (30, 37, 52).
A la fin du processus vi-
2
" suel', ~lors ,que la concentration du' Ca + discale. a atteint un certain
se~i1, le c~2+ serait repompé par un processus ac~if pour restaurer' la
concentration discale de départ (figure 25).
Ce repompage s'~pèrerait
à l,l~ide d'ATP (141) oumieux de GTP puisque la GTP existe abonda'mment
. ,,> dans le mil ieu ,cytoplasmique.
De pl us, la GTPase·se trouve dans le ~
':segment externe et la lumière provoque,une dëstruction 'de la GTP avec
, une excellentesuperpositibn des spectres d'action et d'absorptio~,de
la rhodopsine (142, 143).
...
.~.
),1
"
•

---

.'. .
ï
Figure 25
Sch~ma du mécanisme de la photo-transduction dans.
. 1es· béitonnets des vert~brés
p

---

.... 1.•.•••
l
,., r,,"·.' :~ .
.., .....
90
,
d
Noirceur
Espace
intradiscal
E m -
- 40 mV,
SEB
Lum1'ère
K+ C.
V~""'\\0~7mel dm-:J
<::J
Na+
[Ca 2 +J _10- 8 mol
dm-~
Espace
interdiscal
E m .- - 60 mV
......
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:
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MJ.
. :
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SIB
,
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K+
métobo!ique
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Figure 25
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"1
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1
J,
Su~ la figuré 25, on note aussi qu'a la noirceur le Na' et le
'K+ diffJsent iibrement ! travers la ~embrane plasmatique lorsque la
2+'
. .'
'.
. •....' .
. . ' .
-8
-3
]
..
'
·.C Ca . J' cytoplasmique n'est que de l'ordre de 10
mol dm '. selon
't '~': .
' .
'
.:
-'-i
:,,-vos'hikamiet Hagins (37).
Sous l'effet de la lumière, les disques 1i-
J.~ .
.
"
2
. bèrent du'ca +' qui diffuse à travers le cytoplas~e augmentant la con- .
, .
.
.'..
,)
';.'
.
' . .
'1
.
]
~entrati6n ~n Ca2+ ~e celui-ci a lO~7'mol dm-3 (31) pour aller bloquer;
l , .
1
. ,
.', les canauxsodi<~uesg hyperpolarisant ainsi la m~mbrané plasmatique, tou-'
.
. . .
..... ' . ,
'.'
.
.
.'
:'. '!'. "
, ' , '
2-<-
J
'. jours perméable au K+.
Pendant ce 'temps la C Ca
]
discale descend,
, ,.
i. : .. : .'.. " • .'
. '
. . . . . ' . :
, ' . " ::. 4
- 3
.
~;
probablement ~usqulau seuil de la
mol dm
·et déclenche l 'actlon de
J'.
, " :,,1 a pompe, Cil1ci que" pour re~ taurer 1aconcentrati on ini'ti ~1{3u C/:
, dans i es di sques, et l
J'.,,;",\\.
~ cycl e es t prêt ct recommencer.. Joute cette sé-
.
t
' .
',.
.',
..... ,.J.
.'
. ~ .
r"
., rie d'opérations ne doit pas durer plus que quelques millisecondes (la).
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, "
" .
]
. .
...
, 1
'
.. ~:
•
' . :
1
" , . , '
•
M~canisme d'action de la rhodopsine
]
Maintena~t~" nou's, pouvons nous'poser:'la question
de quelle
J
.
.
'.
;
manière l 'excitation de la' rhodopsine favorise la diffusion massive-
'. "
1
,
'. "2+
J
: du Ca
à travers 1a membrane artificielle et par conséquent la mem-
bra,he discale?
.
]
~,
:.'
Montal et coll. (144, 145) avaient proposé la formation d"agré-
J
gats d'ops.ine formant;· une espèce de tunhel à travers la membrane. ,~
. ,
",
J'" ....
'Cette hypothèse "ad hoc" vint justifier le temps de délai de 100 s (144),
~bserve dans- le changement de la conductance de membranes de bicouche
2
J
li pi di que incorporées de rhodops i ne en pré~ence ,'d' ions Ca +, comme
]
".J,.)
.
. .
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_..J
. _ . '
_ _
.
.'
92
réponse 8 la lumière alors que t~ de photodéco10ration de la rbodopsine
'.
ct
a été évalué
à 3 s à 500 nm.
Nous manifestons quelques 'réserves à
i
l'égard de cette théorie. ,Certes, l'agrégation de la rhodopsine photo-
1ysé~ es t un phénomène bien connu en phase aqueuse (146, 147). Il res te
"
tout~fois a prouver. qu'~lle, peut se produire aussi dans le milieu lipidi-
qu:è metrlbr.anaire, premier· point .. '. Deuxième point, nous avons généra1eme4"lt
,'ob~ervéque:1es agrégai~ d'opsine sorit'diffici1es a défaire en ph~se
:'~qu~use;:'d'onc"cette théorie de la formation dé· canaux ioniques doit pré-
, ' . "
.. '
.
:.....
.~ ',,Voi'r 'l~'mécanisme' de retour de cès agrégats à l'état initial dàns le pro-
'
.
.
.'.
:' cessus de regénération de la rhodopsine.' Un dernier point, ~fis non le
1
: ' . .
•
~,,\\
"
,
'moindre:, il est généralement accepté que la ,rhodopsine agit îh-âividue1-
.;.:'
.
'.'
,.' .',.
..'.
.
. ,
.. ' , '
, ;le~e~t a l 'absorptian d'un ~hoton (18, 148) sans transfert ~Iénergi~
"{"'intermo1écu1aire (19) alors que le modèle de,Monta1 et coll. (144,145)
exigel '~~tiori concertée de plusieurs mo1écu1esexcitée~. Il faudrait
peut-êt~e~penser a'l'agrégation d'une mo1écu1~ d'opsine avec ~Iautres
.~.'"
. molécules de rhodopsine intactes:
mais tel ne semble pas' être le cas
dans la membranè,'~"in situ" '(149).
La situation étant telle quelle, ce
processus"coopératif devient'incertain ..
"
Nous nous inclinons p1utBt en faveur d'un processus unimo1écu1aire
9
(?8)~?ourquoi ? La rhodops i ne" c~ns,tituée de 50 % d'Iaci des ami nés hydro-
.:'
phi1es et de 50 % d'acides aminés hydrophobes '(78, '150)g traverse 1~
membrane discale d'un, bord à l'autre, avec aux antipodes l'une de l'autre,
ses ,terminaisons aminée et carbonyle exposées aux'mi1ieuxaqueux de part
eLd'aut're de la membrane (76, 77, i39).
D'autres études ont montré que
"
, , -
1
..
. ~., f.:.. 1. "

---

' . '
l ' .
"
.~..
':.'
. . . .'
1
l~ rhodopsine présente des résidus d'hydrates de carbone auxquels elle
>est liée de façon coval~nte du côté' intradiscal (66, 151, 152) et qu~el-
-
..- .
, , le est très hydratée du côté cytoplasmique (pôle hydrophile prj,ndpal)
. ... '
(66).
Ainsi, nous pouvons concevoir 'à travèrs .cette structure (figure 5,'p.
\\,13L1a possibilité de formation d'(j[l canal hydraté dans lequel le réti-
., .
. .
~
2
'" nal jouerait un rôle crucial.'Dan's le milieu intradiscal. le Ca + peut se rendr
'.,
'
"
a~roximité de la'~hodopsine, dans le voisinage des hydrates de carbone.
~ - Ainsi, par suite de l '~bsorption d'un photon~ ~e rétinal, passant de sa
, ~" forme dl encombrement s téri que à l a forme tout-trans, amorcerait 1a séri e
(J'
"
~
"
,,'de réactions condui.sant à la formation du canal hydraté à traJ(ers la'
~~.l..\\..
,
1 .
•
. . . . .
(
'
'.. protéinique opsinequelques millisecondes plus tard, à l'étapJde la
.,'
., transition ~1étarhodopsinè-I ---4 Métarhodopsine-II.
L'existence même et
,
,
. ,la formation de ce canal hydraté sont favorisées par la présence des 50%'
d'acides aminés hydrophiles (78,150) dans l'opsine.
Les autres 50%
. '. ~
diacides aminéshyçirophobes lui servent d'ancrage dans la bicouche iipi':"
~ique. ,Ce ~odê1e ~st appuyé par le grand
.
chang~m~nt 'de conformation de
.
'
. ,
.
:la'protéine, le' premier d'i'mportance observé dans le temps aux conditions
de température ~t de vitess~ de réaction physiologiques. En effet, la
,
"
'photoisomérisation de la rhodopsine. entraîne, un changement du pic à
•
•
1.,
•
. 278 nm (153);
la' transition Méta-I -.-> Méta-II s,laccompagne de lIHl: et
.
~
1
liS:!: de
+ 33 ± 1 kcal ~ol -1 ~t + 63 ±5 cal mo1- deg- l respectivement
avec lIG* allant de 14,84 à 13,84 kcal'~ol-l pour 293 K s T s 311,2 K~i54).
Mécani.sme d'action ionique au niveau de la membrane 'plasmatique
Le Ca2+ libéré par le canal, diffuserait à travers le cytoplasme
cellulaire jusqu'à la membrane plasm~tique 00 il se lierait à des sJtes
r
' ••

---

'Fi gure 26
Structure schématique de la PE, de la PS et de la
PC à pH = l',O
'..
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. .
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. :- ;' ." ..
'. "
'';J
. '. '
.,-
'.
' . " .
,~
PS
PC
Figure.26

---

95
. "
'"
+
. spécifiques pour bloquer le passage du Na, causant ainsi 1 l hyperpo1ari-
.'
~
sation de:~a membrane.
N6us avons beaucoup de taisons de croire que 1~
C 2.+
1. '
.
d
l
. a
se
le! des phospho1lpi e~ de façon te le a condenser la face cy-
.
.
2
topiàsmique'de la membrane plasmatique:. En effèt, le Ca + est connu
: . ,
" ,
p,our Sê! prop'('iétë de 'condenser les. monocouches de phospho li pi des (155-
;,1
.,"
.
'
,
, '157) et te dansl'ordre:
PS> PE > PC (157).
L'effet du Ca+, associft
~ l'~ccessibilité des charges nettes des phospholipides (voir structure
·:r
(1
•
.~ la figure 26) semble encore plus,impo~tant dans le cas des ~haTnes
l
d'·acidesgras ayant un 'bas degré d'insaturation (158).
Dans la liai-
2
2
son du Ca +avec les phospho li pi. des, le ca ,+ peut s' échanger",i0ntre des
l"'·
.
+
+
~ \\
ions monovalents comme le Na
et le, K , cornmec1est le cas p-\\..;,lJr des mo-
.;, .... nocouches de PC (159); ces ions ont,.eux un effet d'exp,ansion sur le
film phospholipidique (160).
On peut maintenant miser sur l'intetaction
discriminatoire de la PS à 'l'égard du Na+ et du K+ (161) comme moyen de
2
coordination de l'effet du Ca + lors de l'irradiation pour bloquer sé1ec-
tivement· les canaux Sodiques, laissant à la membrane, la chahce de s'hy-
perpol ariser, à· travers 1es canaux potass i ques .
.'
Si le Na+ et le K+ diffusent passivement au niveau de la membrane
plasmatique des segments externes de bâtonnets ,il en va tout autrement
~u niveau des segménts internes.
En effet, clest u~e pompe ATPase acti-
+
+
.
vée par le Na " sensible à la ouabafne ~ui y concentre le K contre l'ex-
,'pulsion dU,.Na+ (32,43,50,51).
Donc, ! la noirceur, le Na+ et le K+ se lteraient spécifiquement
~ des phospholipides, surtout la PC, fluidifiant la membrane pour
.;.: • • • • . "
•
. ' " "
'f
)j
,':.
' : :t.: L , .,".
~.'

---

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-,
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\\
,
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.
"
~__
_ . • •
~. • •
_....,.
.........
.. _ . . J . ._-',~~
--
. _ - ~ - - - - - - - - - - - -
96
,....
, -';
,
,-.'
ensuite
diffuser à travers celle-ci .. Par suite de l'incidence de
2
la lumière,~il ya isoméris,ation de la rhodopsine; le Ca + libéré
....
:' abondamment par les disques, diffuse â travers le milieu intracellu-
laire pour"~enir:se'lier à ,d'autres type; de phospholipides tels que
'"
t
\\
'",
,
'la PS et la PE~"condensant la membrane et du même coup,bloquant le"
','
,
" +.;
, -
"
2+
f
,
. " ,
,. 'passage du Na ;
lorsque 1a concentrati on interne du Ca
es t descen-;
",:)
i ... , .
,,., " ,due"àun certal~ \\eui 1, 1~ 'Ca2+ 'es t repompé acti vefnent;
presque pa-
.'
~ l~
...:
,
p,
rallèlerrient~'
2
i(se pro'di~irait uri~ ~chang~ entre le 'Ca + déjà lié sur la
,,' ~'
faceinterrie' d~"la mènibrane plasm~tique 'et le K+ lib~e dans ,.l_~ cytoplasme;>
.
,
';; ,l'ion divalent's'e'faisant plus rare dans'''ie milieu, et le cY~,le est de
'.'
'
~ ~,
2
'
. , " ' .
,
•
, ' "
i
I~"
"~-.J
.
. . . . .
' .
',>, :'retÇlur à 1"é'tat: it'litial... ·Le .. repompagedu Ca + serait actionné par un systême
\\..
'.
,
: 'GTP-GTPase (142,,'143)' ou'peut-être même par la phosphO'rylation de la
,
l
' .
, .~.
' .'
"
;
,.. rhodopsin~ et de;l'opsine 'enprés'ence d'ATP bu de GTP puisqu'une molé-
"
,
.1
,
.",
cule d'apsine peut lier de 10 â 40 ~roupements phosphates (162,163).-
'.
'Mai s un point demeure obscur:
le passage dù K+ en. dépit de 1a
.2
condensation de.;là.bi.couche 'pa~ le Ca +. 'Ce qui 'lai,5s'!: la place à
d'l'autres possibiHtés pour expliquer lè blocage'spécifique des canaux
, 2
'
sodiques.
Même la thèse d'une liàiso~ spécifique entre le Ca + et des
sites protéiniques (134, 144, 164,165) comporte la même faille.
Il
nlest d~ailleur~ pas exclu que le systême de sélectivité soit sépar~ du
i
·systè~e de' transport proprement dit.
Mais dans le cas de la validité
. , '
.
2
de l 'hypothèse de la liaison Ca +-phospholipides, le K+ peut sIen tirer a-
+
vec la petitesse de son rayon hydraté pqr rapport à celui du Na .
..
'
\\

---

\\
.-.
..
_
',;;
1
~._.:o:.--,"
- -,._'" --- - -
_
.'
...---... - - ----
97
~écan{sme
2
possible de couplage du Ca + et de la c·GMP
Noui aVons ~elaté plus haut que,l 'absorption ~e la lumiêre par la
2
cell ule photoréceptri ce aurait pour'effet de; libérer 'du 'Ca + pour hyper-
,,·,',:'polariser 'l~membrane 'celluliJi~è~ D'autres étu'des ont montré que cette
.' ~mêm2
4
énergie lumineus~ occas'ionnerait la disparition de l 'ordre de 5 x t-10
.' ....~,.
,
.
'.
.:
, 'molécules de guanosine 31 ,51":rTlOr,ophospha'te cyclique; ia 'c-GMP (166-170)
aVec un·t~ de~dé~roissanc~ :d~ ~125 ~s et un temps de dêlai d~ 50'ms: ce'
,
2
;1..'
,,\\'l,q~f, selon les auteurs, ferait de la c-GMP, un autre candidat comme trans-J'
"
~etteurl ntèrn'e ." t~ais' le 'Ca2+ suppr; me l'activité de, la '?Uanil! ate cycl ase
.. ';'{l7l), inhibant ainsila formation de la c-~~lP" (167).
Nous n;~Js; trou.vons
2
.•'alôrs devant'llalternativésu'ivante:
ou bien le 'Ca +"est le vérHable
.
'{
1
:.!
: ' transme'tteur':interne',< alors, la décroissànce de la c-GMP nlest qU"une
", "
,
,
j
,
, 'réaction para1lêl~ connexei ou bien c'est plutôt la c-GMP le ,véritable
(,',transmetteur~"et
2
'alors le'Ca +:est écarté.
Ma'is,vu que l'addition du
~ ;Ca2+-réduit non seulement.le courant de fond du bâtonnet{donc ~yperpola~
rise la membrane'plasmatique) mais aussi le niveau de la c-GMP (167), que
• son élimination faitm6nter le niveau de la c-GMP dans les S~B (J67~172)
,
,
et que la c-GMP, elle, est insensible a la lumiêre {169, 172), nous optons
.
2
,
"
: pour le Ca +
Nous proposons que la décroissance de la c-GMP soit subor-
,
,'2"
donnée à 1 'accumulation'du Ca + dans le cytoplasme, condition,née et contrô-
.,)ée par elle, suivant le mécanisme suivant: .à l'absorption de la 14~iêre,
2
le Ca + libéré va hyperpolariser la 'membrane plasmatique tout en inhibant
,
,
laf?rmation de la c-GMP; "puis la' c-GMPdiminue en concentration, conso'in-
mée par la réaction ~e formation de la Gip (GTP It-G~P phosphodiestérase
~
.
;;
2
c'-GMP + 2: P.), laquelle GTP servira 'dans le mécanislllede repompage du.ca +
-<..
.
' "
.,": ,,'.~.. "
O " ' . I . l l .
\\ " ' ; . '
::,
',;..
• _ L ' ,
~.

---

98
.•..
dans les disques en présence de GTPase.
(,
"'"
2
, Quant au mécanisme de libération du Ca + par les disques so,us
l l effetde la lumière tel que nous l lavons proposé t son bien-fondé
.'
.,!
~épend largement de, la position et du comportement spatial du rétinal
dans la membrane ainsi que du profil vérit~ble du changement conforma-~
.
,
ti onnel auquel 1a 1umi ère soumet la rhodopsine.
Des études de résonan-
',ce"de ~pi.n, ~lectronique (173) et de résonance Raman (174.- 178) nlont
, ,~: ,'ni~ntré; au~iùi'charigeme'n't dl état de l a base de Schi ff comme effet ,de la
1
:,
;
,;
,
transition rhodopsine~bathorhodopsine. Toutefois t on note d~tmportants
.."t
,
~:"~.
,', ,changements dàns l! interaction de la protéi ne avec le chromop~0re ,(179).
",",l'~1ais nous ignorons' l,';'m'p'ortance de ces changements dans la dlffusion
.. ,
ionique.
C'est pourquoi nous avons eff~ct~é quelques expériences préli-
mi nafres sur l e~'types 0 1 interacti on pouvant avoi r cours entre l es. di ffé-
. ~
.
~.
.
rents constituants principaux de la membrane discal~tsous l'influence
\\' ,
,de la lumièr~.
,
, .:. ~.
,
..
, '
Nous avons noté une certaine interaction moléculaire dans les mo-
nocouches de phospholipi'des et' de chol'estérol,'avec une déviation négati-
ve ~e là courbe théorique,dans le domain~ des basset pressions de sur-
j '
.;
face.
Don'c le: cholestérol sert à cond'ènser le film.
Evidemment, ceci
se passe indépendamment de to'u'te' influence de la lumière.
Par contrf=,
les ~élanges de lipides et de rhodopsine devraient nous révéler des
informations fort utiles t en comparant les courbes de pression de surface
, du mélange aux courbes théoriques' et à celles obtenues après photolyse
~'~ '-1~' • '
" ,
..
. :...;.J. ~:..... ''.' ,
1
• • '
•
'
•

---

' , '
.',
99
.1'.
de l~ rhodopsine.
Mais, les conditions actuelles de nos méthodes expé-
~riritentales ne· nous ont pas permis de sortir des résultats co'ncluants
, ,
pour'p1usieurs raisons:
iJ est actuellement três difficile de préparer des solutions
: \\.,
...'.
"~ de rhodop~ine abso1Mment pures, c'est-a-dire entiêrement dépourvues de
"'phospholipides et desol.vant, en l'occurrence le détersif.
,
' . '
"
... ' (u) la rhodopsine, protéine membranaire intrinsêque,ne peut
~,
'.
" j '
,être stable, et biologiquemen~,active en l'absence de lipides à, longues
.~
~ .. ".
chaînes d'a'cides gras o,u de détersifs possédant également de l~~Jlues
",k
chaînes hydrocarbonées (116-118).
,,'
, '
"
'
Par conséquent, nous avons da choisir, pour l~instant, une situa-
: tio~ de compromis, ~n délipidant partiellement la rhodopsine extraite·
..'
'
par le détersif Triton X-lOO qui sera éliminé quasi-entiêrement par la
.
~.
'
"
,~
' . ' r
suite~ T~issant une rhodopsine stabilisée par des restes de 1ipidès et
.
"
, . '
. . '
~
:
: ~ .
..
...
soluble ~n phase aqueuse ~race a des. traces de dêtersif.
Cette façon'
de procédet rious ~ permis d'évit~r l'usage de stabilis~teurs non membra-
.
~i "
haires comme le dithioérythritolet le mercapto-éthanol (180), mais ne
favorise pas ,une vérit~p1é étude d'intera~tions lipide~_rhodopsine.
l
Montal et Korenbrot (181) ont mis ~au point une t~chnique de prépa-'
,
.:\\:
ration de rhodopsine ou plutôt de complexe rhodopsine-lipide (lipoprotéi-
"
ne) en phase organique par neutralisation des charges avec des ions diva-
, '
2+
'
2+
lents comme le Mg
et surtout le Ca
.
Mais nous croyons que c'est déja

---

100
là une situation qu,inous éloigne de 'Iétat "in vivo" et des conditions
~ dl~tudes dfin~eractions intermoléculaires enmonocouche. Il 'faut en~ore
beaucoup de travail 9 un travail de lringue haleine pour résoudre le pro-
blêm~'de,la purification de-la rhodopsine, spécialement la rhodopsine
des vertébrés.
Il faut aussi encore beaucoup de trav~il po~r élucider les mécà-
nJsmes qui ont cours dans les membranes biologiques naturelle~ ainsi que
: \\
"
,
daŒles membranes artificielles pour percer le secret de leur ,mode d'ac-
.
~
-,
' .
tion~ans le phénomêne. d~ transport. Mais les techni~ues s~multiplient
,
.
~n,
"
.'.
'et se raffinent .. Des membranes artifi ci el" es cl oses et pl afj~;) de petites
"
avons rencontré un nombre considérable de difficultés dans la mise ~u
;
~
pDt~t'de la méthode de formation du modêle décrit dans ce' rapport.
Il
reste aussi .des points à ,améliorer comme la rêsistance membranaire,
d~autres à explorer plus à fond comme l '~ction de creuseurs' de pores
(e.g. gramicidine)~de transporteurs (e.g. vàlJnomycine).
Dans le cas qui
nOU$ concerne ici, la rhodopsine semble se ranger dans le groupe des creu-
seurs de pores ioniques comme la gra~icidine.
Pour ce qui est de la valeur de lê résistance ~embranaire que nous
,
avons obtenue (~ 105 n cm2), elle se com~are bien aux résultats da Miyamo-
~b et Thompson (182) et de Pagano et Thompson '(183); toutefois elle est inférieL
aux valeurs généralement obtenues pour des membranes artificielles, soit
106 - lOlO n cm2 (184-188) pendant qu'elles sonb de 103 - 10 5 n cm2 dans
·1 .
: ; '.
.
..
~
.. '
','

---

101
,les membranèbiologiques naturelles (189).
Nous ignorons encore la
cause de cet écaft.~ Il n'est pas impossible que le caractêre fluide des
",
monocouches de lipides a la base de la préparation des membranes de bi-
couche ~oit en cause.
On peut aussi se demander si la monocouche adsor-
bé~, sur un SUP'PQY;"t, solide garde la même structure qU'à l'interface air-
liquide.
Des recherches en interférométrie pourraient probablement éclai-
l'
rer ce 'point.
Un fait remarquable cepend'ant:
l'imperméabilité des bi,-
couches incorporées de rhodopsine aux ions à la noirceur;
ce qui témoi-
'"
~ne de la validité d'un tel modèle pour l'étude de l'aspect ionique de
•
J ~
la vi~'on et de la, pour l'étude des phénomênes de transport trans-membra-
.«
''''l"
naire en général.
~~
La possiblité d'incorporation de macromolécules dans la bicouthe
lipidique ouvre des voies sur l'étude des interactions lipides-macromo:'
lécule~ dans- la régulation du transport trans-membranaire.
,La membrane-
supportée, entant que telle, se prê~bien aux étude~de spectroscopie,
de photoconduction ainsi que de diffraction des neutrons et des rayons-X ..
.;'.
',;

---

....
'.d
, .,
..:'-
CHAPITRE-V
.CONCLUSION
;
"
,',' .
, <
.. ~ ;
- -,
'.~'
.'..
','
.-.,"

---

"
,
.,
V
CONCLUSION
d
",.'f
. " ~ !,f'
. ;'. '. ~
'"
Par la méthode combinée de Langmuir-Blodgett et du.contact horizon-
"~
.:.
",tal, ~6us~avo~s réussi! construire une membrane a~tificielle mod~le pré-
,
"
sentant des pro~riétés de perméabilité comparables A celles de la'membra-
, .
.
i
'
ne discale ,des photorécepteurs visuels.
Non seulement s~ ~ompare-t-elle
av'antageusement a'ux àutres types de membranes arti fi éi elles du poi nt de
....:
~ vu~ dei ~aractêrei ~lectriq~es~ mai~ aussi a-t-elle le privilêge des gran-
. ".~
'a des dimensibn5~' de la facilité de manipulation~ d'être. affranchie de la
"
.~.
~ontamihaÙ~npar des solvants non biol'ogiques. La p6ssibilit~, de con-
1 .
,
\\
'
,',
-J
; trale~ sa struct~r~ èt sa composition en fait un modèle dont le comporte-
m~nt est directement interprétable. Notre m~thode permet aussi la forma-
tion de membranes asymétriques.
En ce qui concerne le processus de ]a photo-transduction, il res-
, sort de ce trava~l, la preuve que, l'illumination desmembranes artificiel-
les incorporée~ de rhodopsine augmente la perméabilité aux ions, une per-
:- .
2
méabilité sélective au Ca 2+.
De plus, la diffusion photo-induite du Ca +
rencontre les conditions de temps et de stoechiométrie requises pour fai-
re de cet ion un candidat valable dans le processus· de la photo-transduc-
tion visuelle:
Remarquons tout de suite que cette affirmation repose sur
la condition que les faits observés sur ce modêle: artificiel soient trans-
posables sur le comportement "ii! situ".
A ce niveau, nous nous devons
d'être prudents pour affirmer quoi que ce soit concernant la membrane
discale des bâtonnets "in vivo".
102
;
. '
.

---

, "
,
_ . . . .~:
_...".6 _~_:-_.;:" _~~ ..:......--_ . .a- .'~
~__ ' - ; - :.~...... ~. _ _ . . _.
-W-;~_ ......... . . . : . . . - - , - .
",
103
Cependant, il n'en demeure pas moins que l'effet de la lumière
'" :;~r':o perméabi,Hté membranai re en présence de rbbdopsi ne soi t réel. i
.~o:: s~u1 fait,gênant réside dans le faible taux de diffusion photo-
"
.
"
\\m~ll.ite
lT
du Ca
, observé dans les segments externes de bâtonnets, et dis-
...; .
~u:~isolês jus~U'! ce jour.
Mais je crois que les succès obtenus avec
I!
les systèmes, de récombinaison doivent encourager la poursuitë des re-
. \\
"
cherches au niveau des systèmes sub-cellulaires et surtout "insitu"
2+
, ", 'ppur confi rmer. i de façon .défi ni ti ve " hypothèse· du Ca,
.
.'. .
{.
",
L'impl,ication possible, selon lesrecherches':Photobioch'1~~iquesdes
.,',
,,~.....
.
l;,.!'o
. " ,
dernières ànn~ès, de 'systèmes enzymatiques comportant la guan6~Jne 3,5-mono-
,
;
':I,'phosphate cyclique,'soit dans la phosphorylation de protéines, soit directe-
\\. ....
,
~ J
'ment dans le, contrôle de,laconductance de la membrane plasmatique, solt
,
,
:.
.
"
':
. , . '
,
"
, encore, en coopérationav~c le Ca~+ est fort intéressante.
Les éléments
l
"
"
•
,
"
•
,"
,<de base s'emblent réunis.
Il reste alors à conjuguer les efforts pour ren-
,,' dre plu's évident aux yeux. le processus, de là transduction visuelle.
La clef du problèmè nlest peut-être plus loin'~
:•• i : )
.:J. , '
i:"

---

..,
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• • • . • 1
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•
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.
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...•...
APPENDICEI
V
LES AUTRES PROPOSITIONS DE MECANISME POUR LE
PROCESSUS DE TRANSDUCTION VISUELLE
' ..
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"'~
..
- " 1
•
"'~'.:
"-
.•.. ,...
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• .,,'......~.' ...__ ._ _
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---

...
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i
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~_~ __ .•~_..: __ •
-.....~ __ :-_~:
:.~ =-.-r-'
-'-~- "='-'~-~._-.---::-
104
" APPENDICE l .
Les autres propositions 'de mécanisme
pour le processus
de transduction visuelle
Les pi,gments visuels sont des protéines comportant un chromophore,
'le ll-cis-rétinal, lié au groupement e:-aminé de la lysine de l'opsine
. ,(la protéine proprement dita du pigment visuel) de façon covalente d~ns
un lien de base, ,de Schiff.
L'absorption d'un photon par le pigment vi-
, suel amorce une série de réactions physico-chimiques conduisant à la gé-
" -
~
nération d'un s,ignal électrique nerveux.
r~ais la nature du processus pri-
... ,",
.
maire photochimique a la base de toute cette rêaction en chyfne nia cessé
,.'
~.'\\
,de soulever, des controverses.
~<b
'Il a dl abord ~té suggéré que 11 acte -priJTIair~ soi t 11 i soméri sati on
du chromophore, 'de sa forme ,ci s à sa forme tout-trans (190, 191).
Le
',plus puissant-,des arguments en faveur de ce mécanisme
est fondé sur le
faieque~ les données ,d'absorption à basses températures indiquent que!
"
'le pigm2nt artificiel, isorhodopsine(à base de 9-cis-rétinal), a le même
,.photoproduit' que la rhodopsine elle-même.
'.
Mais des, études, d'absorption dans le domaine de la pic'oseconde,
,
en'spectroscopie Ram~n~ et en enz~mologie ont apporté des faits nouveaux.,
'.f "
Ces étudès 'ont général ement tond,ui t âbeaucoup de di scordes parmi
les chercheurs dans ce domaine.
Le groupe de Rentzepis (20, 55, 192)
l , !

---

,
,
a observé l'absorption d'un intermédiaire de la rhodopsine (hypsorhodop-
sine) à la.température de lapièce, qui se 'forme en moins de
d
6 ps.
Il
•
a
alors été amené
~ la conclusion que cet intermédiaire, résultat de
,1 lacté primaire du processus visuel, se produit à l 'intérie~r d'un laps
de temps trop court pour faire intervenir' la photoisomérisation, alors
que Green et coll. (193) arrivèrent à des conclusions opposées.
De cekte
contradiction, des modè,les ont pu v6ir1e jour.
P~te,rs et coll. (55) ont
mis de l'avant le modèle de transfert d'un proton par effet tunnel ayant
~"lieu avant la,phot6isomérisation; Ils ont identifié leur intermédiaire
'. (hypso~hodopsine) comme étant un état excité singulet ~Sl} d'~:~"la
." . ( , '
'..
('
\\
.'" n(1; '1uj ~I; convertirait par la suite en bathorhodopsine.
" '\\)
Ce modèle sera invalid,épar Honiget coll. (194).
Ces auteurs. par
'suite d'un calcul basé sur la m'éc~nique newtonienne~ ont démontré que l'iso-
mérisation d'une molécule de la taille du rétinal peut steffectuer dans un
!
laps de temps de l ps, montrant ainsi que la photoisomérisation est ~n
pro-
cessus qui peut être plus rapide que la formation du "premier intermédiaire"
"
du groupe de Rentzepis (20~ 55. 192).
leur calcul est d'ailleurs appuye par
des mesures dans le domaine de la picoseconde: (195) qui ont donné un temps
de rotation extrêmement rapide, même pour de grosses molécules.
Rejetant
'alors le modèle de Peters et coll. (55), Honig et coll. (194) ont propo- '
s~leur' propre modèle selon lequel 1lisomérisation doit être précédé~ par
" u~~ séparation des charges au niveau du rétinal et son co~tre-ion (fi-
o
0
gure 27).
Pour un éloignement des tharges de 3 A (avant)! 5 A (après)
"
0
et de~ paramètres
diélectriques
E
=
1,0
pour' r
= 3 A.

---

Fi gure 27
Photo-transduction visuelle
modèle de Honig et coll. (194).
A -
Le ll~cis-retinal, chromophore de la rhodopsine, est dessinê avec sa
base de :Schiff,formant un pont
salin avec un contre-ion négatif.
La
paire de charges additionnelles près de la double liaison Cll~
C12
représente le(s)
groupement(s) qui régularise(nt) le maximum dlab-
, '
sorption d~ pigment.
L'évènement photochimique est l'isomérisation
autour de la doubl~ liaisori C~l= C
dans la rhodopsine (probable~
12
ment autour de la double liaison C = C
dans la bactériorhodopsi-
13
14
. ne); mais toute isomérisation dans quelque direction que ce soit
doit pro~uire une séparation de charge comme le montre cette étape
de la figu're.
'.
0"
\\')
B - ~Les valeurs pK de la base de Schiff et celles des autres groupements
R et R sur la' pro!êi~e sont f6rtement affectées par la photoisomé-
l
2
risation, à cause du bris du pont salin;:une charge (+) siest Jépla-
cée vers ~2 et R porte'une charge (-) nette.
l
~C et D - Processus possibles ~~·transfert de proton.
Par spéculation, il peut y avoir formation d'hypsorhodopsine si un
transfert de proton de la base de Schiff·était possible~

---

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Ahodlo!JshH~
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107
o
et E = 2,5 pour r = 5 A, ils ont évalué l'énergie stockée à 40 kcàl
-1
dmol
. "-pour lJne charge de 0,5 sur l'atome d'hydrogène.
Ce processus
de stockage d'énergie par séparation des charges serait le modèle de ·
transduction visuelle qui rende compte des déplacements vers le rouge
(bat~orhodopsine) de ,la base de Schiff :protonée (175,179) 'qu'est la
rhodopsine .
. ,
Comme déja mentionné dans la présente analyse, il y a ~lusieurs
raisons,qui justifient et même exigent l"existence,d'un médi~"t'eur entre
.
'~,
,
,
,
"
,
~
lesite de l'absorption de la lumière et le siège de "exciti.hÂon ner-
veuse, et d'un mécanisme de gain.
Plusieurs chercheurs ont un penchant
2
favorable a la candidature du Ca + comme médiateur (30, 32~ 37, 52, 136,
196, 197). Mais des études biochimiques des cinq dernières années font.re-
dresser un peu la balance du côté d'un mécanisme plutôt enzymatique. '
Les travaux de Woodr'uff et coll. (166, "67) et d'autres (168- 170)
ont montré que la photolyse d'une molé~ule de rhodopsine peut entrafner
4
la disparition de l 'ordre de 5 x 10
molécules de GMP cyclique (c-GMP);:
cë qui ,représente une importante amplification du signal lumineux.
De
, plus, la c-GMP pré~ente un demi-temps de décroissance de 125 ms et un temps
,
.
de délai de 50 ms;
la décroissance dé la concentration de la ~-GN~va-
rie suivant le logarithme de l'intensité de la lumière et sa restaura-
tion, qui prend de 30 à 60 s après la cessation de l'illumination,
est
fonction de l'intensité lumineuse, tout comme la restauration du poten-
tiel membranaire.
Tout ceci fait de la c-GMP un candidat tout aussi
, ,'.
i
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J,"
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... _......._~-_.~.- -_....-
'r .
108
",\\
2+
'
valable que le Ca
comme transmetteur' dans le 'processus de la photo-
,transducti 9n visuelle.
Ces observations semblent propres! la ~·GMP,
d
pui~que le~ niveaux'd'ATP sont insensibles a la lumière, et que la dimi-
nution de la concentration de la GMP linéaire due a la lumière est beau-
coup plus,faible par· 'rapport
~ celle de la c~GrlP (198).
Fait impor-
2
tant, le Ca + imite la lumière, en. réduisant la concentration de la CiGMP
•
,'(167).
Dlun autre point de vue, certains pensent que le? nucléotides cy-
~'
~ ! ,- cliques pourraient contrôler la perméabilité ioniqu~, en régularisa~t
...'1
'des liaisons covalentes de protéines surtout dans le cycle \\,..)PhoSPhory-
1ati on' e,t' de déphosphorylation (199).
C'est ainsi que, récemment, Palans
et coll .. (200) ont démontré l'existence.de deux protéines secondaires de
'~l
•
12 dao et 13 000 daltons~dans le~ SES ,de grenouille, dont là phospho-
rylation à la noirceur est réglée par la· c~GMP.
Ces:,protéines se déphos-
phorylent rapidement sous l'effet de l'illumination, et regagnent leur
2
phospbore, après'" la cessation de l'irradiation.
Ici ,aussi, le Ca + agit
comme la lumière en causant une déphosphory\\~tion rapide.
Mais on.igno-
re encore si ces protéines font partie de.la membrane discale ou de la
membrane plasmatique.
Notons-aus~iq~e,Lolley et coll: (201) ont observé
dans .les SEB bovins un système de déphosphorylation mettant, en jeu la
,c-GMP et une protéine de poids moléculaire 30 000, également de pro~venan-
ce inconnue.
Néanmoins, en confrontant ces données avec les études physiologi-
1
ques, nous sommes tentés de penser que 1a c-GMP et 1a phosphoryl ati on de

---

t ' '\\ .
109
'.' .
certaines protéines de nature encore inconnue joueraient un rôle dans
,
"
la régulation de la perméabilité de la membrane
d
pl~smatique.
Mais le
,'.
,"
.
2+
.
2;
1·
. Ca. est aussi ·très associé avec ces comportements.
Vu que le Ca
sup-
1
pri'me la perllléabil i té membranai re et 11 acti vité de la guanyl afe cyc) ase
1
i
• •
•
'
.
1 .
,(l71),. inhibe la formati,àn de la c·GMP '(167) et la,
phosphoryl.ation pro-
téiniqUeV~~ l~ c'-GMP (200) tout 'se
- ' .
p~sse alors
'.
c~mme si f'e~~et du ~a2+
'"
l
sur la perméabi1ité membranaire slexercerait par l lentremise de la c-GMP.
Il se pourra~ ta~~si .q'ue' le" Ca2+. tout en rédui s~nt la condu'ctance sodi-
1
~ue de la me~branep1asmat~q~~. inhibe'la ~~anYTat~ cyclase. donc arrê-
,
'
,
t'>'
te la forination de la c-GMP dont le niveau baisserait subs~quemment en
1
. ,
.
,
,A
'
entrant dans 1~ synthèse de la GTP i mp li quée dans le 'sys tè~ '" de 'repompage
\\.
,,'
,
..J
"
,2-1-
j '
du Ca
.
Soulignons aussi que les SEB renferment, pour ces réacti ons bi 0-."
chimiqüe's9tout le ~atêriel nécessaire comme la'c-G~~P'phosphodiestéra'se'
'dans la membrane discale et":" 'adénylate Cyclas~~'.-(202~Z04;). la GTPase dans
les SEB (198,205)..
Si les rapports exacts entre ces différentes màlécu-
l
,
lei ne sont p~s encore c~rrectement étab1is,i1 semble au moins très
"
. ' , "
probable que 1â'c-GMP phosphodiestérase soit le pr.incipa1 régu'lateurdu
..' '.
Î
niveau de la C-GMp'dans les SES.
J
·...1.
1·
1
Depuis la proposition du modèle de transfert de proton de Kropf (206).
~
les études se sont poursuivies sur le comportement du '~ien de la base
1
r :
de Schiff dans la rhodopsine.
Fransen et coll. (207) avaient appuyé ce
modèle comme une alternative à la photoisomérisation pour expliquer le
déplacement vers le rouge .de la bathorhodopsine et surtout rendre compte
de certaines bandes à 920. 877 et'856 cm- 1
Mais ces pics ne sont pas
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11'0
,i' '.
,
,
propres à la bathorhodopsine (175) et,sont observées'aussi dans les
"
, ,
d
spectres Ramande réson'ance de cri s tau~ de 11 ,:,"c'i s rét'i na1 (208).
Le { ,
modëie de' trânsfert de p~oton exige que la formation dè la bathorhodop-
_ '
>"
", '
sine ~a~se ~~r 'un tran~fert ~e proton de l'anneau benzénique,! l'opsine
l
(53, 54, 209)pu{s~ue le proton impliqué d~ns la base de Schiff ne· chari-
't'
ge'pas d'état 'lors de' la transï'tion rhodopsine::: , '> bathorhodopsine selon i
.
,
" ,les données de résonance Raman (174-:-178);
Mais ,', un' ~nalogue de rhodopsi..,.
, '
': ne» la 5~din rhodopsine;'dont le chr~mo'phore est'.demêthylé en position
-:0 .
,}~,;:.
,
" ,;: ,
.
'~' -'5 de l"~nneau'ben~éniquep donne un photo~r~duit batho~hrome".baptisé
,
.
.
.~
.
,la'5-dm b?'thorhodopsine '(210). Ainsi on p~~'t.obtenir ~ri prodl1~~~lt.batho­
\\,,)
, "
•
l"
~ , .
•
, ,c.hrome sans passer par un transfert du méthyl allyl ique, et donc 1e trans-
. ~,
, fe~t de proton nies t pas un prérequi s au processus de trans i ti on rhodop-' \\'
sine-bathorhodopsine.
Lewis {2ll) propose alors un modêle de mécanisme fondé sur des trans~
formations structurales photo-induites del ~opsine:'et du, rétinal qui
,~omportent entre autres choses, une translocation de proton dans la
~matric~ de la 'protéine, de la base de Schiff à un groupement aminé dlun
'1
acide aminé encora inconnu dans 1'opsine.
,Clest pour lui, le processus
',' "
primaire de la vision, plutôt que 1lisomérisation ll-ci5 ! tout-trans
(212) ou. un transfert de proton par effet tunnel (55).
Warshe11 (54)
,
, "
L
aussi est arrivé à une conclusion similaire par des tr~itements théori-
ques.
Tous ces modêles s'appliquent à èxpliquer le comportementbatho-
chrome de la rhodopsine, mais semblent négliger le problëme fondamental
qui est 1lexcitation visuelle proprement dite.
~
, • ,
..
l '

---

,
~' ," ',:"'-
," .. \\
-- -~.....'---...... _-"----~- ......-----~~--------- --~~---------_---:",--_."--~----- -,-~'
111
, Pour finir, mentionnons qu'on parle aussi de phbsphory1atiqn de
~la rhodopsin~ et de l 'opsine. En effet, la lu~iêre iemble contrôler ,
"
la phosphory1ation' de la rhodopsine et de l'opsine'(108, 162, 213-216).'
En pré.sence d'ATP ou de GTP, de" faibles' intensités 1um-ineuses provoquent
, , ~
l'incorporation de la a 40 molécule~ de phosphate a chaque molécule de
'rhodopsine ou d'opsine (162) dans les SEB isolés de grenouille.
Ce
'système d'amplification serait le, résultat d'interactions coopératives
~
,
dans le, pl'an de la m~mbrane di~cale (162).
~1ais le temps de réaction"
.,
,~ ,de la phosphory1ation est très long, soit de plusieurs secondes à quel-
.;"
,ques minutes;
de plus, on ignor~, si ce processus d'amp1i~ication se
;'
(,:1.
produit effectiveme'nt dans, la cellule vivante.
' :
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"
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, 1
" 1
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,

---

d
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,
"
. ,
APPENDICE II
,
l ,
DONNEES NUMERIQUES SUPPLEMENTAIRES SUR LES
SEGMENTS EXTERNES DE BATONNETS
, '
.. ,.. '
"

---

112
APPENDICE II
Données numerlques supplémentaires sur les segments
externes de bâtonnets
d
SES
dimensions
longueur: 50 ~m; diamètre: 6 um (217, 218)
diamètre: 5 ~m (219)
-
nombre de disques:
1 500 - 2 ·000 (217,22Q)
-
nombre de membranes (i nombre de disques) : . ~ 000 (220)
' !
2
-
aire' de base (diamètre de 5 ~m):
19,64 vm
(221)
-
surface d'un disque (diamètre de 6 ~m) : 28,27 ~m2- (221)
;
.
2
~
rapport
. surface discale/SEB: 84 900-113 200 ~m
(221)
3
rapport
disques/surface membrane plasmatique: 0(,86-1,14 x 10
t· '.
(0)'
.
vo 1ume· :
1 413 ~m3 (218)'
-
volume aqueux de l'espace intradiscal
1,4 x 10- 1 ~m3 (221)
9
nombre de molécules de rhodopsine/SEB:: 3,8 x 10
(222)
" ..
2,1 x
9
10
(223)
9
3,0 x 10 .. (224)
2
concentration de ta + dans le milieu intradiscal a la noirceur
Ca·lculée: .... 10-3 mol dm- 3 (37)
2
concentration de Ca + dans le ~ilieu interdiscal a la noirceur:
Calculé~:
8
3
IV 10-
0101 dm-
(37).
2
3
concentration de Ca + dans:les SEB
31 mmol dm-
(136)
.~ 10-3 mol dm-3 (140)
2
nombre minimal de Ca + libéré/molécule de rhodopsinephoto,hsée
22 (225)
Na+ entrant/molécule de rhodopsine/sèconde (à la noirceur)
]
Calculée:
1 (226)
-
inf1ux de Na+/SEB/s : 2,1 ~.109 (226)
.J
]

---

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~.
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_-1;',
113
}
"
nombre de bâton~ets/cmZ de rétine:
3,42 x 106, (Z'Z'l)
1
,
,
Z
J
% de bâtonnets Ilrouges"/cm
de tétine:
96% (Z18)
3
concehtration de ,rhodopsine
2~S ~moi dm- (227)
1
densité de surface des molécules de rhodci~sine
2~S x 1'0+4 crri-2
},
(2Z0)
-
temps de relaxation rotationnelle (Po) de la rhodopsine en f
}
solution de digitonine:
O,lS ~s (ZZ8)
-
temps de relaxation rotationne11e dans 1a rétine fraîche
J,
4,S ~s ~ 283 K;
ZO ~s â 293 K (229)
coefficieht de diffusion translationnelle de la ~~odopsine
1
J
.
-9
2
-1
,!I
3,9 ± 1,S x 10
cm
s, à 293 K (230 a;j'1)
'v
10 S
-
fréquence de collision des molécules de rhodopsine
_10 6 s-l
(230 a)
6
nombre de molécules de rhodopsine/di?que
1,41S x 10
(2'21)
o'
.
4
-
volume de la rhodopsine (si sphérique) :
2,1:2,8 x 10
A~ (221)
À
de la rhodopsine en milieu de digitoriine:
S02 nm (227)
max
déplacement de À
vers le rouge du pigment "in situ" : 8 nm (227)
max
-
rapport dichro~que "in'situ ll :
0./0./7:
6 (227)
dichrofsme cirèulaire de la rhodopsine
AC.O.=(E G - EO)/Emax
S x 10-4 a À = 490 nm, 6 x 10-4 ~ À = 340 nm(231)
-
fracti on de 1a surface réti ni enne occupée par l es SES' : 67% (221)
3
-
bir~fringence (à la lumiêre): 1,6 x 10- (232)
-
biréfringence intrinsèque 6n : + O,OOSO (220)
l
}..
-
viscosité de l'environnement de la rhodopsine (oc>
2 poises) .
(229)
,
~ \\'
-
molécules de phospholigides/molécule de rhodopsine dans la
membrane discale:
102 (86)
)
r
.
1.,
~ '""-~ _. . ~
;
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:.:~ •J •. ) ,

---

~,.
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,
~,
,
1 . ,
'APPENDICE III
DOSAGE DES PHOSPHOLIPIDES PAR LA METHODE MO-
.
.
DI FIEE DE FISKE-SUBBAROW
"',"
"
' . ' ,
· . ' ; , )

---

';
.:
]
114
J'"' ...' , .;..
- i
temps'de.renouve11ement des protéines par les SEB
8~5 semaines
( ,
--1
ct
(233)
-
poids. ~oléculaire de la rhodopsine:
35 000 (102. 103)
]
36 000 (79. 104)'
28000-40 000 (105-111, 234)
l (
--J
-
angle d'orientation du moment de transition dipolaire du 11-cis
.-,
rétinal dans la rhodopsine par rapport au plan de la membrane .
1
discale lIin situ":
160 (227)
li
J
à l'interface air-liquide:
150 (235) .
o
. 0
1
.J
-
rayon de la rhodopsine (si sphérique) : 23 A (113),20-25 A (li2)
"~
....T
point isoélectrique de la -rhodopsine a la noirceur
~J
rhodopsine bovine:
5~2-5,5i (146) .~-
(-,
'1
rhodopsine de grenouil1è:
4,47 (236))
\\"
.. ,;.,l
point isoélectrique de la rhodop'sine à la lumière
./'
j ,......
rhodopsin~ bovine: 5,3-5,67 (146)
rhodopsine de grenouille
4,57 (236).
l
\\
~1
-J
]
1
J
~l
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.. ,-
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"'_.J
•
-
- - -
+
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~.-
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1 ---,.
)
11:
' j
,1
"
APPENOICE III :
Dosage des phospholipides par la méthode modifiée de
J
j
~
'd
Fiske-Subbarow (115)
"1 ~
1.
' ~.J
fl
'}
Solution de coloration ,(solution M*):elle se compbse de:
,
Il
l volume'd)~cide ascorbique 10% dans de l"~au distillée et
. '1 '
déminéralisée;
- '~t de 6 volumes de solution de 0,42% de molybdate d'ammonium
dans du H S0
1 mol dm-3 .
2 4
'1
.-
.
. <)
..
~'"
~
?y-éjJo.rèition des échantillons et solutions standards "
"
t' .,
.
'\\
'.
.
préparer des solutions standards contenant de 10'..1 20 j.lg de
phosphore;
~. prélever des·échantillons tels a avoir de 250 a 500 ~g de
"
.
~hospholipides en tenant compte des indications du fabricant.'
1.
Procédure expérimentale
Les échantillons et les standards sont placés dans des ballons .de di-
gestion de Kjeldhal de 30 ml.
ajouter quatre gouttes de H2S04 concentré ~our minéraliser
l
!
le phosphore en chauffant doucement jusqul~ llapparition d'une
fumée blanche (....... 20 min):
les échantillons deviennent noirs,
carbonisési>
ajouter deux gouttes de 1-1 2°2' 30% dans de l'eau: les solutions
deviennent claires;
amener les solutions a un volume de 10 ml po~r les échantillons
et a 20 [111 pour les stê\\ndardsavec de l'eau distillée;
ll '
L> ' .". '.~... : -~

---

116 .
- prélever dans une éprouvette de ·10 ml, 0,6 ml de chaque solution
à laquelle est ajouté 1,4 0)1 de solution de coloration· r~;
i
- bien agiter pour mélanger et· boucher les tubes;
o
incuber pendant 20 .min â 4S C;
l~re rapidement 1 labs~rbance à 820 nm dans les 5 min qui suivent:
les colorations sont sta~les pendant 5 min •
..'
* La solution 1"1 remplace celle de Fiske-$ubbarow qui est à base diacide
1-amino- 2-naphtol-4-sulfonique, de sulfite de Na+ et de bisulfite'de
'Na+. ..
.
'"
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BI BLIOGRAPH l E
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---

',. ,
"
;.
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_. -_...... --- ""----.~_.
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