UNIVERSITE DE NANCY 1
U.E. R. PHYSIQUE· CHIMIE- 810lOG1E
THESE
présentée devant l'Universite de Nancy 1
pour obtenir le grade de
DOCTEUR
ES
SCIENCES
par
Tobias Kokou HEVOR
EfUDE DU CONVULSIVANT. LA METHIONINE SULFOXIMINE: TAUX DE NUCLEOfIDES
CYCLIQUES ET ACTIVITE DE LA FRUCTOSE-J.6-BIPHOSPHATASE DANS LE SYSfEME
NERVEUX CENTRAL DU RAT ET DE LA SOURIS.
Soutenue publiquement le
26 Juin
1980
Membres du Jury
Président
M.
J. GAVET
Examinateurs
MM.
R. NAQUET
J. MARK
C. ALAIS
F. STEPHAN

---

A mon père
A ma mère
A mes frères et soeurs
dont le précieux soutien matériel et moral ne m'a jamais manqué.

---

AVANT-PROPOS
========================
Le présent travail a été réalisé au Laboratoire de Physiologie Générale
de l'Université de Nancy I.
Monsieur le Professeur GAYET, Directeur de ce Laboratoire, m'a fait le
grand honneur de m'acceuillir dans son équipe. Il m'a proposé ce sujet de
.thèse et m'a suivi de près pendant sa réalisation. En dépit des réserves des
autorités administratives et syndicales et de leurs supports en milieu ensei-
gnant, il a réussi à m'assurer une aide matérielle lors de mes recherches. Que
le Professeur GAYET veuille trouver ici l'expression de ma profonde gratitude.
Monsieur le Professeur NAQUET, Directeur du Laboratoire de Physiologie
nerveuse du CNRS (Gif-sur-Yvette) a bien voulu apporter ses critiques à ce
travail et me faire profiter de sa compétence. Je lui suis très reconnaissant.
Que Monsieur le Professeur MARK, Directeur du Laboratoire de Biochimie à
la Faculté de Médecine de Strasbourg veuille accepter ma profonde reconnaissance.
Il a bien voulu examiner ce mémoire et me faire part de ses suggestions.
Monsieur le Professeur ALAIS, Directeur du Laboratoire de Biochimie appli-
quée à l'Université de Nancy l a accepté de faire partie de mon jury. Il avait
aimablement effectué
l'analyse des acides aminés sur l'autoanalyseur de son
Laboratoire. Je le remercie vivement ainsi que toute son équipe.
Monsieur le Professeur STEPHAN, Directeur du Laboratoire de Zoologie Géné-
rale à l'université de Nancy l
a accepté de juger ce travail et de me faire
part de ses critiques. Qu'il veuille trouver ici mes très sincères remerciements.
Je voudrais remercier la Fondation pour la Recherche Médicale et les Labo-
ratoires de Recherches SERVIER pour leurs aides matérielles ainsi que les Labo-
ratoires CIBA-GEIGY qui nous ont aimablement offert la métyrapone.
Je remercie vivement tous mes collègues de Laboratoire qui m'ont aidé direc-
tement ou indirectement. Je remercie également toute l'équipe du Professeur
GADAL dont l'aide et l'entrain m'ont été d'un précieux secours tout au long de
ce travail.

---

1
PLA N
G E N E R A L
1
i
Chapitres
Pages
1
1
Introduction générale.
1
II
Effet de la méthionine sulfoximine sur l'activité
de la fructose-1,6-biphosphatase et de la phospho-
fructokinase dans l lencéphale de la Souris.
26
III
Isolement et purification de la fructose-1,6-biphos-
phatase dans l'encéphale du Rat. Caractérisation bio-
·chimique. Action de la méthionine sulfoximine.
63
IV
Action de la méthionine sulfoximine sur la biosyn-
(
1
thèse et la régulation de la fructose-1,6-biphos-
phatase dans llencéphale du Rat.
100
f
V
Etude immunologique de la fructose-1,6-biphosphatase
1
du cortex cérébral du Rat. Effet de la méthionine sul-
foximine.
147
VI
Effets de la méthionine su.lfdximine sur le taux de
nucléotides cycliques dansl1encéphale du Rat et de
la Souris.
162
VII
Discussion générale.
186
VIII
Résumé et conclusion.
203
INDEX DES AUTEURS CITES
212

---

Chapitre l
INTRODUCTION GENERALE
Pages
1.1. METHIONINE SULFOXIMINE ET DIFFERENTS MODELES D'EPILEPSIE
EXPERIMENTALE
1
1.1.1. Méthionine sulfoximine
1
1.1. 2. Di fférents modè1es dl ëpil epsi e expérimenta1e
2
1.1.2.1. Stimulation électrique
2
1.1.2.2. Application de différents composés au niveau de
l'encéphale et méthodes physiques
3
1.1.2.2.1. Substances à action rapide
3
1.1.2.2.2. Traitements physiques
4
1.1.2.2.3. Substances à action tardive
5
1.1.2.3. Administration de diverses drogues par voie
'systémique
5
1.1.2.4. Hyperexcitabilité spontanée chez quelques espèces
animales
6
1.1.2.5. Autres modèles
7
1.1.3. Syndrome de l'épilepsie chez 1'Homme
7
1.1.4. Activité électrographique et convulsions
8
1.1.5. Aspects biochimiques des convulsions épileptiformes
10
1.2. METABOLISME ENERGETIQUE ET NUCLEOTIDES CYCLIQUES
Il
1.2.1. Métabolisme glucidique dans le système nerveux central
et voies métaboliques associées
12
1.2.1.1. Glycolyse et gluconéogénèse
12
1.2.1.1.1. La glycolyse
12
1.2.1.1.2. La gluconéogénèse
12
1.2.1.2. Cycle de Krebs
14
1.2.1.3. Shunt des pentoses
17
1.2.1.4. Synthèse du glycogène
17
1.2.3. Métabolisme des nucléotides cycliques
19
1.3. FRUCTOSE-1,6-BIPHOSPHATASE ET GLUCONEOGENESE
20
1.4. BUT DU TRAVAIL
21

---

Chapitre II
EFFET DE LA METHIONINE SULFOXIMINE SUR L'ACTIVITE DE LA FRUCTOSE-l,6-
BIPHOSPHATASE ET DE LA PHOSPHOFRUCTOKINASE DANS LI ENCEPHALE DE LA SOURIS.
Pag25
"Fructose-l,6-biphosphatase and phosphofructokinase
activities in the brain of mice submitted to methionine
sulfoximine." (Brain Research).
33
2.1. INTRODUCTION: IMPORTANCE DU GLUCOSE DANS LA PHYSIO-
LOGIE NERVEUSE.
39
2.1.1. Contrôle du métabolisme du glucose.
39
2.1.2. Le glucose, substrat énergétique principal
du cerveau.
40
2.1.3. Régulation de l'activité de la fructose-1,6-
biphosphatase et de la phosphofructokinase.
41
2.2. MATERIELS ET METHODES.
43
2.2.1. Matériels.
43
2.2.1.1. Animaux.
43
2.2.1.2. Réactifs.
43
2.2.2. Méthodes.
44
2.2.2.1. Etude de l'activité de la FDPase.
44
2.2.2.1.1. Purification partielle.
44
2.2.2.1.2. Evaluation de l'activité de la FDPase.
44
- Principe.
44
- Dosage.
45
2.2.2.2. Etude de l'activité de la PFKinase.
46
2.2.2.2.1. Préparation de l'extrait enzymatique.
46
2.2.2.2.2. Evaluation de l'activité de la PFKinase.
45
- Principe.
46
Dosaqe.
47
2.2.2.3. Evaluation du taux de protéines.
47
2.2.3. Comparaison statistique des résultats.
47

---

"Amphetamine-induced changes in body temperature and glycogen
content of the encephalon in the chicken." (Experientia)
24
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
26

---

2.3. RESULTATS.
·48
2~3.1. Le syndrome épileptiforme induit par la méthionine
sulfoxirnine.
48
2.3.2. Action de la méthionine sulfoximine sur l'activité
de la fructose-1,6-biphosphatase.
49
2.3.2.1. Activité de la fructose-1,6-biphosphatase
chez les animaux témoins.
49
2.3.2.2. Activité de la fructose-1,6-biphosphatase
chez les animaux traités par la méthionine sulfoximine.
51
2.3.2.2.1. Chronologie.
51
2.3.2.2.2. Doses.
51
2.3.3. Action de la méthionine sulfoximine sur l'activité
de la phosphofructokinase.
56
2.3.3.1. Activité de la phosphofructokinase chez les
animaux témoins.
56
2.3.3.2. Activité de la phosphofructokinase chez les
animaux traités par la méthionine sulfoximine.
60
2.4. DISCUSSION.
60
2.4.1. Distribution de la fructose-1,6-biphosphatase et
de la phosphofructokinase dans l'encéphale.
60
2.4.2. Le cycle fut"ile fructose-1,6-biphosphate -- fruc-
tose-6-phosphate.
61
2.4.3. Régulation du flux glycolytique et action de la
méthionine sulfoximine.
63
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
65

---

Chapitre III
ISOLEMENT ET PURIFICATION DE LA FRUCTOSE-l,6-BIPHOSPHATASE DANS L'ENCE-
PHALE DU RAT. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE. ACTION DE LA METHIONINE SUL-
FOXIMINE.
Pages
"Fructose-l,6-biphosphatase activity in the brain. of mice
and rats submitted ta the convulsant methionine sulfoximine."
(Biochemical Society Transactions).
70
3.1. INTRODUCTION.
72
3.1.1. Action indirecte de la méthionine sulfoximine sur
l'accumulation de glycogène.
72
3.1.2. Problèmes méthodologiques.
73
3.2. MATERIELS ET METHODES.
74
3.2.1. Matériels.
74
3.2.1.1. Animaux.
74
3.2.1.2. Réactifs
74
3.2.2. Méthodes.
75
3.2.2.1. Chromatographie d'affinité.
75
3.2.2.2. Electrophorèse sur gel de P9lyacrylamide.
75
3.2.2.2.1. Electrophorèse standard.
75
3.2.2.2.2. Electrophorèse en présence de dodécyl-
sulfate de sodium.
76
3.2.2.3. Evaluation des acides aminés.
76
3.2.2.4. Détermination du poids moléculaire.
77
3.2.2.5. Purification de la fructose-l,6-biphosphatase.
78
3.2.2.6. Activité enzymatique.
78
3.3. RESULTATS.
79
3.3.1. La fructose-l,6-biphosphatase purifiée.
79
3.3.1.1. Evolution de l'activité totale.
79

---

3.3.1.2. Evolution de l'activité spécifique.
79
3.3.2. Quelques caractéristiques biochimiques de la fructose-
1,6-biphosphatase du cortex cérébral de Rat.
86
3.3.2.1. Action du pH.
86
3.3.2.2. Action de quelques cofacteurs.
87
3.3.2.3. Composition en acides aminés.
87
3.3.2.4. Le poids moléculaire.
90
3.3.2.4.1. La détermination du poids moléculaire avec
le gel de polyacrylamide.
90
3.3.2.4.2. Détermination du poids moléculaire par la
composition en acides aminés.
91
3.3.3. Action de la méthionine sulfoximine sur la protéine-
enzyme de la fructose-1,6,biphosphatase.
95
3.3.3.1. Action de la méthionine sulfoximine sur le com-
portement du Rat Sprague-Dawley.
95
3.3.3.2. Méthionine sulfoximine et fructose-1,6-bi-
phosphatase.
95
3.3.3.3. Propriétés de la fructose-1,6-biphosphatase
après traitement à la méthionine sulfoximine.
96
3.4. DISCUSSION.
96
3.4.1. Particularité de la fructose-1,6-biphosphatase
cérébrale.
96
3.4.1.1. In fluence des cofacteurs.
97
3.4.1.2. Structure moléculaire de la fructose-1,6-biphos-
phatase.
97
3.4.2. Action de la méthionine sulfoximine.
101
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
103

---

Chapitre IV
ACTION DE LA METHIONINE SULFOXIMINE SUR LA BIOSYNTHESE ET LA REGULATION
DE LA FRUCTOSE-1,6-BIPHOSPHATASE DANS L'ENCEPHALE DE RAT.
Pages
4.1. INTRODUCTION
106
4.1.1. Biosynthèse de la fructose-1,6-biphosphatase.
106
4.1.2. Inhibition de la synthèse protéique.
107
4.1.3. Les métabolites intermédiaires.
107
4.2. MATERIELS ET METHODES.
108
4.2.1. Matériels.
108
4.2.1.1. Animaux.
108
4.2.1.2. Réactifs.
108
4.2.2. Méthodes.
109
4.2.2.1. Taux de synthèse de la fructose-1,6-
biphosphatase in vivo.
109
4.2.2.2. Etude des inhibiteurs de la synthèse
protéique et de la métyrapone.
112
4.2.2.3. Résistance à la chaleur et à la trypsine.
112
4.2.2.3.1. Résistance à la chaleur.
112
4.2.2.3.2. Résistance à la trypsine.
113
4.2.2.3. Taux des métabolites intermédiaires de la
voie glycolytique.
113
4.2.2.4.1. Préparation de l'extrait tissulaire.
113
4.2.2.4.2. Dosage des métabolites intermédiaireS.
114
4.3. RESULTATS.
115
4.3.1. Incorporation de la valine[114 c] dans la molé-
cule de fructose-1,6-biphosphatase.
115
4.3.2. Effets des inhibiteurs de la synthèse protéique
ct de la métyrapone sur l'activité de la fructose-1,6~bi-
phosphatase.
118

---

4.3.2.1. Action des inhibiteurs de la synthèse
.
protéique et de la métyrapone sur le syndrome épileptique
ind~it par la méthionine sulfoximine.
118
4.3.2.2. Action du cycloheximide sur l'induction
de la fructose-1,6-biphosphatase par la méthionine sul-
foximine.
119
4.3.2.2.1. Dose de 5 mg/kg de cycloheximide.
119
4.3.2.2.2. Dose de 20 mg/kg de cycloheximide.
122
4.3.2.3. Action de 1 'ac~inomycine D.
126
4.3.2.3.1. Dose de 100 ~g/kg d'actinomycine D.
126
4.3.2.3.2. Dose de 500 pg/kg d'actinomycine D.
126
4.3.2.4. Action de la métyrapone.
130
4.3.2.4.1. Dose unique de métyrapone.
130
4.3.2.4.2. Action de deux doses de métyrapone.
130
4.3.3. Action de la chaleur et de la trypsine sur l'acti-
vité de la fructose-1,6-biphosphatase.
131
4.3.3.1. Action de la chaleur.
134
4.3.3.2. Action de la trypsine.
139
4.3.4. Taux des métabolites intermédiaires liés au cycle
futile frlJctose-1,6-biphosphatase -
phosphofructokinase.
139
4.3.4.1. Pructose-1,6-biphosphate.
139
4.3.4.2. Dihydroxyacétone-3-phosphate et glycéral-
déhyde-3-phosphate.
139
4.4. DISCUSSION.
142
4.4.1. Biosynthèse de la frlJctose-1,6-biphosphatase.
142
4.4.1.1. Problèmes méthodologiques.
142
4.4.1.2. Régulation de la biosynthèse protéique.
143
4.4.2. Inhibiteurs de la synthèse protéique et métyrapone.
145
4.4.2.1. Actinomycine D et cycloheximide.
145
4.4.2.2. Métyrapone. Résistance à la chaleur et à la
trypsine.
147
4.4.3. Les métabolites intermédiaires.
147
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
149

---

Chapitre V
ETUDE IMMUNOLOGIQUE DE LA FRUCTOSE-l,6-BIPHOSPHATASE DU CORTEX CEREBRAL
DU RAT. EFFET DE LA METHIONINE SULFOXIMINE.
Pages
5.1. INTRODUCTION.
153
5.2. MATERIELS ET METHODES.
154
5.2.1. Matériels.
154
5.2.1.1. Animaux.
154
5.2.1.2. Réactifs.
154
5.2.2. Méthodes.
155
5.2.2.1. Préparation de la fructose-l,6-biphosphatase.
155
5.2.2.2. Préparation de l'antisérum.
155
5.2.2.3. Double diffusion d'OUCHTERLONY.
156
,-
5.2.2.4. Immunotitration.
156
5.2.2.5. Incorporation des acides aminés.
157
5.2.2.5.1. Simple marquage.
157
5.2.2.5.2. Double marquage.
157
5.3. RESULTATS.
158
5.3.1. Spécificité de l'antisérum.
158
5.3.2. Immunotitration.
158
5.3.3. Biosynthèse de la fructose-l,6-biphosphatase.
161
5.3.3.1. Incorporation de la valine [114CJ .
161
5.3.3.2. Incorporation de la valine [3~J et de la
valine [114C] .
161
5.4. DISCUSSION.
165
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
167

---

Chapitre VI
EFFETS DE LA METHIONINE SULFOXIMINE Slin LE TAUX DE NUCLEOTIDES CYCLIQUES
DANS L'ENCEPHALE DU RAT ET DE LA SOURIS.
Pages
"Effect of methionine sulfoximine on brain cyclic
nucleotide levels." (Neuropharmacology). Préliminaire.
168
"Cyclic nucleotides in the brain of mice and rats
submitted to the convulsant methionine sulfoximine."
171
(Biochemical Pharmacology).
6.1. INTRODUCTION.
177
6.2. MATERIELS ET METHODES.
178
6.2.1. Fixation des nucléotides cycliques.
178
6.2.2. Purification des nucléotides cycliques.
179
6.2.3. Dosage des nucléotides cycliques.
179
6.2.3.1. AMP cyclique.
179
6.2.3.1.1. Principe.
180
6.2.3.1.2. Dosage.
180
6.2.3.2. GMP cyclique.
180
6.2.3.2.1. Principe.
181
6.2.3.2.2. Dosage.
181
6.3. RESULTATS.
181
6.4. DISCUSSION.
185
6.4.1. Convulsions et nucléotides cycliques.
185
6.4.2. Métabolisme énergétique, neurotransmetteurs et
nucléotides cycliques.
185
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
187

---

Chapitre VII
DISCUSSION GENERALE
Pages
7.1. CRISES CONVULSIVES ET METHIONINE SULFOXIMINE
192
7.2. CONVULSIONS EPILEPTIFORMES ET ENERGETIQUE DANS LE SYSTEME
NERVEUX CENTRAL
195
7.3. ROLE DES NUCLEOTIDES CYCLIQUES
198
7.4. MECANISME POSSIBLE DES CONVULSIONS INDUITES PAR LA
METHIONINE SULFOXIMINE
199
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
204
Chapitre VIII
RESUME
209
CONCLUSION
214
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
216
INDEX BIBLIOGRAPHIQUES
218

---

Chapitre I
INTRODUCTION GENERALE

---

1
~
g
,
f
La méthionine sulfoximine (MSO) induit des convulsions chez plusieurs animaux
1
de laboratoire. Le caractère particulier des crises épileptiformes induites par
t
ce convulsivant permet d'étudier la genèse et les mécanismes de l 'hyperexcita-
t
bilité corticale. A l'heure actuelle, les phénomènes de l 'hyperexcitabilité
liés aux convulsions sont mal connus. Les études électrophysiologiques ont per-
mis de localiser des zones particulièrement sensibles dans certaines régions
du système nerveux central. Plusieurs autres travaux sont orientés vers la re-
cherche des voies métaboliques éventuellement impliquées dans cette hyperexcita-
bilité. Le métabolisme énergétique et le métabolisme des nucléotides cycliques
paraissent intéressants dans l'étude de la genèse des convulsions épileptiformes.
1.1. METHIONINE SULFOXIMINE ET DIFFERENTS MODELES D'EPILEPSIE EXPERIMENTALE
Méthionine sulfoximine
Méthionine
Structures moléculaires de la méthionine sulfoximine et de la méthionine.
La présence dans le régime alimentaire de certaines. protéines comme la zéine,
la caséine et la lactalbumine provoquaient chez différents animaux une toxicité
neurologique accentuée. On a montré que ce n'étaient pas les protéines elles-
mêmes qui étaient responsables de cette toxicité, mais le traitement par le
chlorure d'ammonium de la farine faisait apparaître un composé toxique (pro-
téines agénisées). Ce composé, la méthionine sulfoximine, a été isolé et iden-
tifié en 1950 (l, 2, 3).
1
1
Les crises convulsives induites par les protéines agenlsees ont été décrites
chez le Chien ( 4). Les manifestations semblent être fonction de la dose. On
observe une phase de troubles alimentaires avec vomissement et salivation

---

- 2 -
assocles à une ataxie et une paresle du train arrière. Dès le début de l'into-
xication ~u avec une dose faibl~, des troubles affectifs apparaisent avec une
frayeur prononcée. Il se retire dans un coin obscur ,sans réaction~ Lorsque
la quantité de protéines agénisées ingérées est relativement élevée(2,5 mg/kg)
il y a des cr i ses psychomotrices 'lui peuvent apparat.tre soit spontanément,
soit à la suite d'une émotion banale comme le bruit: l'animal exécute des
mouvements circulaires, la démarche est traînante et il perd tout contrôle. Dans
plusieurs cas, la dose de 3,5 mg/kg entraîne des convulsions généralisées res-
semblant à celles du grand mal: il y a des mouvements cloniques faciaux, un
tremblement, des spasmes toniques et des convulsions généralisées avec une in-
continence urinaire. La composante affective (frayeur) semble être constante dans
les crises épileptiformes déclenchées par les protéines agénisées ( 4). Dès
1950, plusieurs études ont été faites avec la MSO. Son action inhibitrice sur
la synthèse de la glutamine dans le cerveau avait été montrée (5).
1.1.2. giff~r~~!~_~Q~~1~~_~~~~il~~~i~_~~2~ri~~~!~1~.
1.1.2.1. La stimulation électrique.
Lorsqu'on applique une stimulation électrique dans une reglon de l'encéphale,
il se produit une activité paroxystique qui peut se poursuivre après l'arrêt
de la stimulation (6). Les caractéristiques du courant électrique utilisé et
de la zone stimulée ont une influence sur les post-decharges épileptiformes.
Lorsque les stimulations sont appliquées régulièrement, à intervalles suffisants
au niveau de certaines structures cérébrales, l'amygdale notamment et pour
une durée donnée pendant plusieurs jours avec des électrodes chroniques, l'on
peut assister à la transformation progressive d'une décharge focale en une
crise généralisée (7). Les post-décharges ont été amplement étudiées. Avec des
impulsions données (forme, amplitude, durée) toutes les structures des hémi-
sphères cérébraux répondent à une fréquence variant de 40 à 100 cycles/seconde
(c/s) avec un voltage de 2 à la V. Par contre, dans le cervelet, le seuil se
situe entre 20 et 30 V avec une fréquence de 100 à 300 c/s. De plus, les post-
décharges obtenues dans ce dernier cas sont variables et de courtes durées (8).
En se basant sur les études réalisées chez le Chat, le Singe et l 'Homme, plu-
sieurs structures encéphaliques ont été classées en fonction de leur sensibilité
( 9) : par ordre croissant, l 'hippocampe, le cortex moteur, l'amygdale, les no-
yaux caudés, le thalamus (partie antérieure du noyau), le lobe frontal et le
lobe occipital. Les décharges paroxystiques initialement localisées dans la ré-
gion de la stimulation, se propagent progressivement et, quelquefois, peuvent se

---

- 3 -
généraliser. Cette activité électrographique peut s'accompagner ou non de mani-
festaions motrices (Tableau 1).
La curarisation préalable de l'animal permet de séparer l'activité électrogra-
phique de l'activité motrice.
Activité électrographique
Activité motrice
- Phase d'activation asynchrone
(Décharges rapides de bas voltage, res-
semblant aux ondes d'éveil)
Phase tonique musculaire
- Phase de décharges synchrones ryth-
miques (grandes ondes de 20 à 30 c/s
décroissant progressivement
- Phase d'activité électrique clonique
Phase de myoclonies
(décharges paroxystiques 1 à 2 c/s)
- Phase de silence post-critique
- Phase de récupération
Récupération progressive
(réapparition d'ondes asynchrones
lentes)
Tableau 1 : Activité électrographique et motrice après stimulation du cortex
moteur chez le Chat. (Tiré de NAQUET et LANOIR,
9).
Pendant la stimulation électrique (3 c/s) de la partie antérieure du noyau thala-
mique,certains auteurs ont déclenché au niveau du cortex frontal des pointes-on-
des ressemblant à celles du petit mal. Ce
modèle était intéressant ·parce qulil
était comparable au petit mal de 1'Homme, mais depuis sa description, il n'a pu
être reproduit chez l'animal éveillé.
1.1.2.2. Application de différents composés au niveau de l'encéphale et
..............................................................
méthodes physiques.
1. 1.2.2. 1. ~~~~~~~~~~..~..~~~J.~~..:.~P.~~~.
- Pénicilline: Lorsqu'on dépose à la surface du cortex cérébral des cristaux
de pénicilline, un papier imprégné d'une solution de pénicilline (10, Il )ou
un gel saturé de cet antibiotique (12,13), on observe au bout de quelques mi-

---

- 4 -
nutes un foyer épileptogène dans la zone du dépôt avec une décharge de pointes
sporadiques. Les premières crises convulsives apparaissent environ 30 min après
l'application. Entre les périodes critiques, on observe des pointes de 6 à 30
c/s. Même lorsque le corps calleux est sectionné, l'activité électrographique
se répercute au niveau de l'hémisphère contralatéral. Avec une préparation chro-
nique chez le Chat, on a observé que lorsqu'une forme d'épilepsie géné-
ralisée ou focale se développe,c'est toujours dans les 24 h qui suivent l'injec-
tion intracorticale de la solution de pénicilline (9 ). Lorsque le mode d'implan-
tation permet d'éviter la diffusion de la pénicilline dans les structures sous-
jacentes, on a montré que, seuls, 1'hippocampe, la formation réticulée et l'a-
mygdale sont capables d'émettre une activité électrographique critique parmi
les structures sous corticales (9~ 14 ). Cependant, l'apparition de pointes à
point de départ réticulé a été critiquée (14).
- Strychnine: La strychnisation locale d'une partie du cortex cérébral provoque
l'apparition dans cette zone d'oscillations bioélectriques clairement distinctes
de celles de l'électrocorticogramme normal. Ces oscillations appelées lIondes stry-
chniquesll sedistinguent par leur voltage élevé (plus de 1 mV), leur apparition
soudaine et leur disparition rapide ( 9).
- Acide kaïnique : Un modèle récent a été réalisé par l'application d'acide
kaïnique dans l'amygdale du Rat (15). On obtient des manifestations électro-
graphiques et motrices épileptiformes comparables à ce que l'on observe lors
de la stimulation électrique de cette région. L'activité motrice est caracté-
risée par des mouvements de mastication, des myoclonies faciales, un tremblement
des membres et des chutes avec une salivation fréquente.
1.1.2.2.2. Traitements physiques
Deux minutes après la congélation d'une zone corticale, l'activité électrique
cesse complètement pour réapparaître 10 min plus tard avec une allure normale.
Vers la 35e min, une activité électrographique épileptiforme apparaît dans la
zone refroidie et se propage progressivement dans les zones souscorticales. Dans
plusieurs cas, l'animal meurt à la suite de convulsions généralisées. Lors-
qu'il survit, l'activité paroxystique persiste pendant 7 à 10 jours. Ce modèle
a été
perfectionné par la vaporisation de chlorure d'éthyle sur le cortex.
L'activité électrographique s'étend au cortex contralatéral 00 elle persiste
même après l'ablation de la zone congelée.

---

- 5 -
1.1.2.2.3. Substances à action tardive
Cobalt: L'application de poudre de cobalt à la surface d'une région du cor-
tex provoque une activité électrographique paroxystique chez le Rat (50% des
cas), le Chat (80%) et le Lapin. Chez le Rat, les crises se manifestent entre le
e
e
10
et le 20
jour après l'application tandis que chez le Chat, elles se mani-
festent après la 30e heure et disparaissent vers le 4e jour après l'application.
Sur le plan électrographique, les premières anomalies qui apparaissent sont
des ondes lentes continues dans la zone de l'application. Ces ondes sont rapide-
ment remplacées par des pointes. Certains auteurs considèrent que l'apparition
d'un foyer sur le cortex contralatéral est responsable de la généralisation se-
condaire des crises qui a lieu dans 25% des cas chez le Chat et rarement chez
le Rat. Chez ces deux espèces, l'apparition d'un état de mal épileptique est
rare. Comme pour tous les autres foyers, l lapplication sur la cortex moteur
provoque des crises jacksonniennes (9).
- Tungstène: L'introduction de petites quantités de gel diacide tungstique
dans l'amygdale ou dans l'hippocampe dorsal ou ventral entraîne une activité
électrographique et motrice épileptiforme 24 h après l'introduction et pen-
dant plusieurs jours.
- Crème d'alumine: L'application de crème d'alumine provoque une cicatrice
très localisée. L'application chronique au niveau du cortex sensori-moteur
du Singe d'une crème spéci9le à base d'alun et d'alumine provoque l'apparition
de crises jacksoniennes au bout d'une période de 1 à 3 mois. Ces crises durent
plusieurs mois avec une forte tendance à la généralisation secondaire. Selon
certains auteurs, le Cobaye et le Lapin ont des crises tout à fait différentes
de celles des Primates, tandis que le Chien et le Chat sont résistants à l'ap-
plication corticale de gel u'alumine. On a observé que de multiples injections
intracorticales au niveau du cortex visuel du Chat ne provoquent jamais de
crises épileptiformes spontanées, mais favorisent l'apparition de bouffées pa-
roxystiques de pointes-ondes à la suited'une stimulation' lumineuse intermitten-
te
ou d'injection de pentylènetétrazol. Mais, ces mêmes injections effectuées
dans le gyrus sigmoïde induisent des crises jacksoniennes spontanées dans plu-
sieurs cas ( 9).
1.1.2.3. Administration de diverses drogues par voie systémique .
• .. • • .. .. • • .. •
• .. .. • • • .. • •
• • • • .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .o." ..
- Le pentylènetétrazol : L'injection de pentylènetétrazol à un Chat initiale-
ment traité au flaxédil provoque une activité électrographique de type épilep-
tique qui s'installe avec la séquence suivante: 1) Augmentation de la fré-
quence et diminution de l'amplitude comme dans une réaction d'éveil; 2) Dimi-

---

- 6 -
nution de la fréquence; 3) Apparition de pointes et de bouffées d'ondes de
grande amplitude à la suite d'une stimulation sensorielle; 4) à partir d'un
seuil, l'activité précédente se transforme en activité de type tonico-c1onique;
5) Une phase de "silence" dont la durée semble proportionnelle à celle de la
phase tonique (16); 6) Réapparition d'une activité semblable à celle de la
phase 3). Chaque po1ypointe précédant immédiatement le début de la crise est
accompagnée par des myoc1onies généralisées à l'ensemble du corps. La phase
tonique é1ectrographique se traduit par une tétanisation musculaire. La téta7
nisation incomplète simulant un tremblement de même
que les pointes rythmi-
ques commencent à ralentir. Pendant la phase clonique, chaque pointe isolée
ou chaque po1ypointe-onde correspond à une myoc1onie tandis que chaque onde
lente est associée à une phase de décontraction et le dernier groupe de pointes-
ondes accompagne la dernière myoc1onie (9).
Chez le Chat, l'injection parentérale d'une dose élevée de pénicilline provoque
des manifestations é1ectrographiques et motrices ëpt l eptf formes (17). La strych-
nine en injection intraveineuse induit également des manifestations é1ectrogra-
phiques très caractéristiques accompagnées par des convulsions toniques (téta-
nie strychnique) (9 ).
- Parmi les autres molécules entraînant une hyperexcitabi1ité corticale, on peut
citer la bicucu11ine.En administration intraveineuse, elle induit des convulsions
de longue durée (18). L'a11y1g1ycine provoque chez les Rongeurs et le Babouin
des crises convulsives qui ont été décrites (19, 20, 21). Le stéréoisomère L
semble être plus actif que le D et leurs mécanismes d'action ne seraient pas
identiques (21, 22).
1.1.2.4. Hyperexcitabi1ité spontanée chez quelques espèces animales .
........... .... ............................................
- Les crises audiogènes : Chez certaines espèces comme la Souris, le Rat et le
Lapin, l'audition d'un bruit défini
entraîne une activité motrice anormale
juste après le bruit, l'animal bondit, puis court çà et là à une grande vitesse;
puis il s'arrête brusquement et est sujet à des convulsions cloniques générali-
sées. Ces convulsions s'arrêtent brusquement, l'animal restant immobile en phase
tonique. L'activité é1ectrographique ne semble pas caractéristique de l'épi-
lepsie tonico-c1onique. La phase clonique n'est pas toujours accompagnée d'ac-
tivité é1ectrographique paroxystique. Ce modèle parait ainsi discutable (9).
- L'épilepsie photosensible: Des Babouins de Casamance (Sénégal) de l'espèce

---

- 7 -
Papio papio répondent à des stimuli lumineux intermittents (25 c/s) par des
manifestations épileptiformes (60% des cas) (23, 24, 25). Les manifestations
motrices commencent par la face et peuvent gagner tout le corps dans certains
cas. Sur le plan électrographique, les stimulations se traduisent par des poin-
tes, des polypointes et des pointes-ondes soit isolées soit en rafales dont la
fréquence est indépendante de celle de la stimulation lumineuse avec une prédo-
minance dans la zone fronto-rolandique. Ces manifestations peuvent se poursuivre
après l'arrêt de la stimulation. L'implantation de cobalt dans la région fronto-
rolandique (et non dans la région occipitale) (26) ou 1lin jection de L-allyl-
glycine (21) renforce le syndrome induit par la stimulation. Ce modèle ressemble
étrangement tant du point de vue motrice qu'électrographique à l'épilepsie idio-
pathique photosensible observée chez l'Homme. Il a fait l'objet de nombreuses
études (27, 28, 29).
1.1.2.5. Autres modèles.
Plusieurs autres modèles d'épilepsie expérimentale ont été décrits. Certains
proviennent de troubles métaboliques
- La respiration d'oxygène hyperbar
chez l'Homme ou l'animal
- L'hypoglycémie insulinique entraîne des manifestations motrices et électro-
encéphalographiques épileptiformes qui sont supprimées par une administration
de glucose (30).
- Une hyperhydratation chez llanimal (31)
- Hypocalcémie par parathyroïdectomie
- Anoxie par ischémie (32)
D'autres modèles sont basés sur les troubles physiologiques comme ceux provo-
1
qués par une embolie gazeuse intracarotidienne. L'administration de 4 ou 5 ml
d'air dans la carotide du Singe se traduit par une perte de conscience avec
une hémiplégie, puis une récupération
suivie d'une normalisation avec une ap-
parition progressive de crises épileptiformes (33).
1
(
On peut enfin citer les modèles provenant de la stimulation des afférences sen-
sorielles surtout après sensibilisation par une injection préalable de stry-
1
chnine ou de pentétrazol à des doses subliminaires ( 9).
1.1.3. h~_?~~~~~~~_9~_1~~p!1~p?!~_~~~~_1~~~~~~.
Les manifestations électroencéphalographiques et motrices du syndrome épi lep-

---

- 8 -
tique chez l'Homme sont extrêmement variées. Plusieurs tentatives de classifi-
cation ont été faites(34). Les nombreuses manifestations ont été redéfinies par
GASTAUT (35). Dans l'épilepsie généralisée, l Ion trouve le grand mal et le
petit mal. Le grand mal est considéré aujourd'hui comme "1a crise épileptique
tonico-clonique" (35) : sur le plan moteur, cette crise est caractérisée par
un début rapide avec la chute du sujet. Immédiatement, survient une phase
de contractions toniques involontaires suivie d'une phase de contractions
cloniques généralisées. Le sujet perd connaissance. Pendant la crise, il y a une
apnée, une salivation et souvent une incontinence urinaire. L'électroencépha-
logramme est caractérisé par des décharges paroxystiques constituées de pointes
rythmiques de grande amplitude, bilatérales, symétriques et dont la fréquence est
de l'ordre de 15 c/s. Après la
crise
le tracé devient plat pendant quelques
instants ("silence électrique"). Les crises tonico-cloniques du grand mal sont
d'emblée généralisées mais les crises partielles peuvent se généraliser secon-
dairement (36). Dans la crise de petit mal, l'activité électrographique présente
des décharges bilatérales synchrones et symétriques de pointes-ondes rythmiques
à la fréquence de 3 c/s. Cette activité est associée à des absences. On peut ob-
server également des polypointes-ondes associées à des myoclonies. Celles~ci
sont caractérisées par des secousses musculaires violentes généralement symé-
triques.
En dehors de l'épilepsie généralisée, les crises épileptiques focales ont été
largement décrites (35, 36). Les décharges paroxystiques sont localisées dans
une région donnée du cortex entraînant des crises multiformes: les crises
somato-motrices dont la crise bravais-jacksonnienne constitue un exemple typique,
les crises psychiques s'exprimant quelquefois sous forme d'hallucinations, les
crises végétatives (digestives, cardiaques ou respiratoires).
1.1.4. ~f1jyj1~-~1~f1r9gr~pbj9~~_~!_f9~Y~1~j9~~.
La dépolarisation périodique des neurones dans le cerveau normal produit des
décharges asynchrones donnant une activité globale relativement faible. En
cas d'épilepsie, un groupe de neurones se déchargent de façon synchrones pro-
voquant une activité nettement plus ample et paroxystique que normalement et
qui peut se propager à d'autres neurones.
L'activité électrographique varie avec le modèle expérimental utilisé. L'acti-
vité obtenue après stimulation électrique a été déjà décrite (Tableau 1). La
figure 1 montre deux exemples d'activité électrographique épileptiforme.

---

- 9 -
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....e.
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E ~_ _ ~ _ ,__~........,.-.....-.__.
~ •..~ ..-
...... # ..._._-
Figure 1 : Electroencéphalogrammes dans les convulsions épileptiformes
a) Electroencéphalogrammes du cortex contralatéral du foyer épileptique (2)
et du cortex pariéto-occipital dans l'épilepsie induite par une application cor-
ticale de pénicilline (RAABE et coll.,) (12).
A : Pointes rythmiques; B : Décharges critiques; C
"Silence" post-cri-
tique.
b) Enregistrements effectués dans l'épilepsie induite par llapplication
intraamygdalienne diacide kaïnique (BEN-ARI et coll.,) (15).
Dans le modèle induit par l'application de pénicilline, llactivité paroxystique
est localisée au niveau du foyer (gyrus) 2 heures après "application(12). Après
l'application diacide ka;nique dans l'amygdale, on observe une activité électro-
graphique paroxystique également au niveau du foyer. Six minutes après, cette
activité gagne l'hippocampe puis l'amygdale contralatérale et enfin le cortex.
Il s'agit d'une épilepsie focale secondairement généralisée,

---

- 10 -
Dans un modèle induit par l'injection de MSO, l'activité électrographique a
été décrite par GASTAUT et coll.(4) chez le Chien: l'activité de base est
constituée par des ondes de faible voltage et de fréquence rapide. Cette acti-
vité augmente en amplitude en même temps que sa fréquence se ralentit. Entre les
crises, il y a des décharges paroxystiques sporadiques. Les crises, soit provo-
quées par un stimulus surtout auditif, soit spontanées (rarement), sont carac-
térisées par des décharges de pointes rythmiques surtout dans la région tempo-
roinsulaire d'un hémisphère puis des 2 hémisphères. Ensuite, parallèlement à
ces pointes rythmiques, on observe des ondes lentes généralisées sur les deux
hémisphères surtout au niveau des lobes frontal et occipital. Les stimulations
sensorielles provoquent de multiples décharges sous formes de pointes-ondes soit
localisées, soit généralisées (4 ).
Deux théories contradictoires tentent d'expliquer l'origine topographique des
cri ses él ectrographi ques qênêr-a li sées : la théori e Il centrencépha li que" admet
que les décharges paroxystiques naissent dans les structures profondes alors
que la théorie "corticale" situe l'origine des crises au niveau du cortex cé-
rébral. L'utilisation de la pénicilline par voie systémique ou en application
corticale, puis, récemment, la découverte de l'épilepsie photosensible chez Pa-
pia papia constituent des démonstrations expérimentales de la deuxième théorie
( 37) .
Les études biochimiques effectuées sur l'épilepsie sont relativement
réduites. Par implantation de cobalt chez le Rat, BROTCHI et coll. (14)
ont observé le développement de l'activité de plusieurs déshydrogénases.
Dans l'astrocyte normal, les activités de la glucose-6-phosphate déshy-
drogénase, de la glutamate déshydrogénase, de la lactate déshydrogénase
et de la succinate déshydrogénase sont relativement faibles .par rapport
à celle de l 'oligodendroglie et de la cellule nerveuse. Dans certaines
conditions, comme une lésion corticale, les astrocytes peuvent devenir
réactionnels avec appar i t ion de gliofibrilles. Dans l e icas de l épl l ep-
t
sie expérimentale induite par le cobalt, il y a une relation étroite
entre l'apparition des astrocytes activés et le phénomène de l'épilep-
sie focale. En suivant l'évolution de l'électroencéphalogramme, on a
observé que les astrocytes activés aoparaissent avant les crises epl-
leptiques. Ils apparaissent d'abord dans le foyer puis se propagent
pour atteindre le cortex contral.atéral. Ils ne semblent donc pas être
la conséquence des convulsions.Cependant, l'association des astrocytes

---

- 11 -
réactionnels activés avec les convulsions épileptiformes ne semblent pas être
un phénomène général. En effet, BROTCHI et coll. (39) ont montré que dans le
cas l'épilepsie obtenue par effet d'embrasement chez le Rat, il n'y a pas ap-
parition de ces astrocytes activés.
D'autres types d'études ont été effectuées en particulier le métabolisme
des ions associés à l'activité nerveuse. Par implantation de crème
d'alumine dans le cortex cérébral du Chat, on a mesuré le flux d'ions
K+ et Ca++ par une double électrode sensible aux ions (15). Pendant les
convulsions, il y a une augmentation considérable des ions K+ extracel-
lulaires et une diminution des ions Ca++ extracellulaires. Les déchar-
ges spontanées interictales
sont également accompagnées des mêmes
variations de flux ionique, mais avec une amplitude moindre. Il est
possible que ces flux d'ions soient impliqués dans la génèse des con-
vulsions épileptiques induites chez l'animal. Depuis longtemps, plusieurs
facteurs neurochimiques, en particulier le métabolisme du glutamate et
de l'ammoniaque ont été étudiés lors des convulsions épileptiformes (41).
Ces travaux ont montré l'implication de plusieurs voies métaboliques
dans la genèse des convulsions expérimentales.
1.2. METABOLISME ENERGETIQUE ET NUCLEOTIDES CYCLIQUES.
Lors des convulsions épileptiformes, la somme totale de l'énergie dépensée
atteint des valeurs remarquablement élevées par rapport à une activitr
normale. On observe une activité musculaire impresionnante. La variation
de l'électroencéphalogramme et les mesures de 1 'activité unitaire rendent
compte d'une activité neuronale accrue. Dans ces conditions, on peut se
demander si la fourniture d'énergie suffit à la dépense effectuée. Com~
ment sont alors régulées les voies métaboliques impliquées dans la four-
1
niture d'énergie?
.•

---

- 12 -
1.2.1. ~~_~~!~~Qli~~~_gl~~i2ig~~_2~_~~~!~~~_~~~~~~~_~~~!~~!_~!_!~~
~Qi~~_~~!~~Qlig~~~_~~~Q~i~~~·
On a montré depuis plusieurs années que le substrat énergétique princi-·
pal du cerveau est le glucose (42). Le système nerveux présente un mé-
tabolisme particulier du glucose.
1.2.1.1. Glycolyse et gluconéogénèse.
Le système nerveux central, relativement pauvre en glycogène et en glu-
cose utilise pourtant une quantité élevée de glucose (43).
Le glucose sanguin traverse la barrière sang-cerveau puis la membrane
plasmique. Il est phosphorylé par la glucokinase en glucose-6-phosnate.
1.2.1.1.1. La glycolyse .
........................
Une partie importante du glucose-6-phosphate sera dégradé par la voie
glycolytique d'Embden Meyerhof (Fig.2) puis par le cycle de Krebs (Fig.3).
Dans les conditions physiologiques normales, cette voie est celle uti-
lisée par le cerveau (441. La voie glycolytique subit une régulation
très poussée dans cet organe. Plusieurs enzymes de cette voie sont des
enzymes réversibles. Mais il existe deux étapes qui sont catalysées par
des enzymes irréversibles : la transformation du fructose-6-phosphate
en fructose-1,6-biphosphate par la phosphofructokinase et la transfor-
mation du phosphoénolpyruvate en pyruvate par la pyruvate kinase.
1.2.1.1.2. Gluconéogénèse.
Dans le foie, il y a une néoformation du glucose a partir du lactate
sous contrôle hormonal, en particulier l'insuline et le glucagon (45).
Trois étapes de cette gluconéogénèse sont également catalysées par des

---

- 13 -
Glucose
o
AT P
Hexo.,n,,,er
~ADP
Glucose B-phosphate
PhOSPhOgIUrOSe' 1l
·",me, ,'3 0
Fructose 6-phosphate
fb\\
\\!:!J
krnase
FATP
Phosphotructo-
ADP
Fructose 1.6-diphosphate
Aldolase
Triose phosphate
isomerase
Figure 2 : Glycolyse.
Les enzymes-clés catalysant les
réactions irréversibles sont notées a,
b, c.
a
Hexokinase
Phosphoenolpyruvate
b
Phosphofructokinase
o
rADP
Pyruvate r
c
Pyruvate kinase
~ kinase
ATP
Les enzymes homologues de la glu-
Pyruvate
conéogénèse :
al
Glucose-6-phosphatase
b'
Fructose-l,6-biphosphatase
Cl
Pyruvate carboxylase et phosphoéol-
pyruvate carboxykinase.

---

- 14 -
~
COO~
C
C H ; r J -
?H l
HO~C-COO- ~ TOo -
CD
tH
@
CHl
COO-
1 1
I _
1
COO-
C~COO
C=O
Il
1
Citrate
HC
CH
1
1
1
COO-
COO-
Oxaloacet8te
NADH ~®
coo-
COO-
lCH
l
l
H-C-OH
1
H-C-COO-
1
CH
1
l
H-C-OH
1
COO-
1
COO-
Mal8te
Isocitrate
@~COl + NADH
COO-
l
COO-
CH
l
Il
CHl
HC
1
CH
1
l
COO-
1
C=O
fumarate
1
COO-
FADH ~
?i .
g~~~:r:e
Q)
COO-
C-S-'CO
z
1
1
CHl
t H : - r - ® tH
X®
CHZ
CO
1
z
1
1
/
COO-
COO-
0
GTP
NA H
Succinate
Sucein,1
CoA
Figure 3 : Le cycle de Krebs.
Les enzymes catalysant les différentes réactions sont
1) Citrate synthétase
2) Aconitase
3) Aconitase
4) Isocitrate déshydrogénase
5) ~ cétoglutarate déshydrogénase
6) Succinyl CoA synthétase
7) Succinate déshydrogénase
8) Fumarase
9) Malate déshydrogénase

---

- 15 -
enz)jnes irréversibles : la transformation du pyruvate en oxaloacétate
par la pyruvate carboxylase suivie de la conversion de l loxaloacétate en
phosphoénolpyruvate par la phosphoénolpyruvate carboxykinase. la trans-
formation du fructose-1,6-biphosphate en fructose-6-phosphate par la fruc-
tose-1,6-biphosphatase et la transformation du glucose-6-phosphate
en glucose
par la glucose-6-phosphatase. En dehors de l'insuline
et du glucagon, les hormones surrénales notamment l 'adrénaline et les
corticostéroTdes influencent ce métabolisme dans le foie.
Pyruvate + CO
+ ATP + H
2
20 4
•
Oxaloacétate + ADP + Pi + 2 H+
Oxaloacétate + GTP.
•
Phosphoénolpyruvate + GDP + CO 2
Fructose-1,6-biphosphatase + H
---~.~ Fructose-6-phosphate + Pi
20
Glucose-6-phosphate + H
--~.~ Glucose + Pi
20
1.2.1.2. Cycle de Krebs.
Le glucose est dégradé jusqu'au stade du pyruvate dans le cytoplasme.
La suite de son ~tabolisme s'effectue dans la mitochondrie. Le pyru-
vate est décarboxylé en acétyl-Coenzyme A par la pyruvate décarboxylase
en présence de thiamine pyrophosphate. L'acétyl-Coenzyme A entre dans
une série de réactions cycliques au cours desquelles sont synthétisés
de l 'ATP et des nucéotides réduits (Fig.3).
Certains intermédiaires du cydle de Krebs servent de précurseurs à la
synthèse des acides aminés. C'est le cas de l '~-cétoglutara~ qui peut
être transformé en glutamate avec de l'ammoniaque. Le glutamate sert de
précurseur à la synthèse de plusieurs autres acides aminés. On sait éga~
lement que certains intermédiaires de la glycolyse sont utilisés pour la
synthèse d'autres acides aminés comme la sérine qui provient du 3-phos-
phoglycérate. Ainsi donc. le carbone du glucose prélevé par le cerveau
est rapidement incorporé dans les acides aminés. L'incorporation rapide
du carbone du glucose dans les acides aminés non essentiels est une ca-
ractéristique du métabolisme cérébral (46).
1

---

16 -
NAOPH + H~
NAOPH + H"
COI
erythro ....... PO.
rHO
HCOH
1
HCOH
~HIOPO::lHl
TPP
~g". tr1Il'l.'tol_
lf H' OH
CHO
1
<:=0
HCOH
[
1
HOCH
tH::I:ÛPOJH:r:
-+---J
HCOH
Ji)'ccraJdebyde- 3-PO.
1
HrOH
CHtOP01H 1
fnJet<JSe-6..PO.
Figure 4
Le cycle des pentoses-phosphates. En haut
voie oxydative
en bas
voie non oxydative.
Synthétase
Synthé ta se
~
b~
~
~
Synthétase
ph0sphatase
kinase
Synthéta se a
~ pp
UGDP
ATP -....... UTP
~
AOP
" ' "
GL YCOGDE
GLUCOSE-I-P
Pi
A.~.P.
cyc l ique
~
À
~ Phosphorylase a
Phosphorylase....
\\ ~ 0hosphorylase
phosphata se
Phosphorylase .t
(ki nase active
Phosphoryl~se ...
P~osphorylase
,; nas
phosphe te s
,
" . , , " na s
Phophoryl ase
; -
kinase inactive
Figure 5
Régulation du métabolisme du glycogène.

---

- 17 -
Dans les tissus où la gluconéogénèse a lieu, on comprend que le carbone
provenant des acides aminés et donc des protéines peut être réincorporé
dans le glucose.
1.2.1.3. Le shunt des pentoses.
En dehors de la voie d'Embden-Meyerhof, le glucose provenant du sang et
phosphorylé par la glucokinase peut être utilisé par la voie métabolique
des pentoses (Fig. 4) L'activité de cette voie est réduite dans le cer-
veau (47). Elle sert à la formation du ribose qui entre dans la synthèse
des nucléotides et à la formation du NADPH qui sera utilisé comme ré-
ducteur dans les synthèses cytoplasmiques comme celles des lipides.
1.2.1.4. ~a synthèse du glycogène..
La troisième voie métabolique suivie par le glucose provenant du sana
est la synthèse du glycogène (Fig.5).
L'uridine-diphosphate-glucose (UDP-glucose) est impliqué dans la synthèse
du glycogène (48). L'UDP-glucose en présence d'une amorce glycogénique
ou d'une chaînepolyglucosidique cède son glucose à cette matrice.
glycogène synthétase
UDP-glucose + (glucose)n-------------------------~. UDP + (glucose)(n + 1)
En dehors de la glycogène synthétase, la synthèse du polysaccharide
'::•.'.•.
requiert la présence d'une enzyme qui catalyse l'établissement des liai-
•
sons 1-6. C'est l'enzyme branchant. Certaines glycoprotéines pourraient
servir d'amorce à la synthèse du glycogène.
Le catabolisme du glycogène est catalysé par la phosphorylase
Phosphorylase
(glucose)(n + 1) ----------~.~ glucose-1-P + (glucose)n
La phosphorylase dégrade imcomplétement le glycogène. La rupture des
liaisons 1-6 se fait grâce à l'enzyme débranchant.

---

- 18 -
Epinephrine
,,
,
Adenylo~
Epinephrine
AdenylaLr.
,
,
cyclase
cyclase
,
,
,,,
Adenvl..
,
~ Adenyl Q-\\lL
...
cyclase
cYcit Se
.........--.-., Cyclic
ATP
AMP
,
,
,
,
~CYcliC
,
ATP
AMP
Protein
Protein ~
,
,,
kinase
kinase
,+
.
,,
Protein ~ Proteln
A
Phosphorylase ~ Phosphorylase
kinase
kinase
kinase
kinase
,
,
,
,
,
..,
,
Glycogen
B
~ Glycogen
synthetase
Phosphorylase ~ Phosphorylase
synthetase
(1)
b
a
(0)
Figure 6
Interconversion des différentes formes des enzymes du métabolisme du
glycogène.
EXIRACELLULAR
-----
;'
Adenosine ._._
/
Ph.•.•-Ph~;j.bo-.--;ll
...I-
j - -
tfan.'''a.~ .1
/--[.d.;,oiin~}•..<, -, .
1nosrne
l i
kina..
- ... 5 AM?
(
1
.. \\--
-
<:'
~
5'-AMp·
INTRACELLULAR
Figure 7
Régulation du métabolisme de l'AMP cyclique. (DALY et coll.,) (59).

---

- 19 -
Le taux de glycogène tissulaire est étroitement lié à l'activité de la
synthétase et de la phosphorylase. La glycogène synthétase existe sous
deux formes moléculaires: une forme active et une forme inactive. Le
passage de la forme active à la forme inactive se fait par phosphoryla-
tion de l 'apoenzyme SOU9 l'action de la glycogène synthétase kinase. Le
passage inverse se fait par déphosphorylRtion grâce à la glycogène syn-
thétase phosphatase (Fig.6).
La phosphorylase aussi existe sous une forme active et une forme inac-
tive. Mais, l'activation se fait par phosphorylation de l 'apoenzyme sous
l'action de la phosphorylase kinase. L'inactivation se fait par déphos-
phorylation sous l'action de la phosphorylase phosphatase. La phospho~
rylase kinase elle-même est activée par la phosphorylase kinase kinase
et inactivée par la phosphorylase kinase phosphatase (Fig.6)
La glycogène synthétase kinase et la glycogène phosphorylase kinase ki-
nase sont sous la dépendance étroite de la concentration tissulaire en
AMP cyclique (49,50). D'une façon générale les agents stimulants comme
l'adrénaline provoquent une glycogénolyse avec une augmentation du taux
dlAMP cyclique (49). Les agents sédatifs ou hypnotiques sont générale-
ment glycogéniques (51). Ces différents agents ont un impact particulier
au niveau du système nerveux central (52, 53, 54).
Ainsi donc, le métabolisme glucidique est étroitement associé à celui
des nucléotides cycliques. L'activité de l 'adénylate cyclase a une inci-
dence sur le taux tissulaire de glucides.
La synthèse d'AMP cyclique et du GMP cyclique s'effectue à partir de
leurs nucléotides triphosphates correspondants, l 'ATP et le GTP. Ces
réactions sont catalysées respectivement par l 'adénylate cyclase et le
guanylate cyclase.

---

- 20 -
L'adénylate cyclase est une enzyme exclusivement membranaire. En fait, il
existe plusieurs types d'adénylate cyclasesqui diffèrent les unes des autres
par leur sensibilité à différentes molécules (55). Un exemple typique
est l 'adénylate cyclase sensible à la noradrénaline, enzyme extrêmement
active dans le système nerveux central.
La guanylatecyclase est à la fois une enzyme cytoplasmique et particu-
laire (56). L'enzyme membranaire diffère de l'enzyme particulaire par
ses propriétés catalytiques.
La d~radation des nucléotides cycliques est catalysée par la phosphodi-
estérase. Il existe plusieurs types de phosphodiésterases. Par chroma-
tographie sur DEAE-cellulose, trois différents pics ont été identifiés.
Les propriétés catalytiques de ces formes diffèrent les unes des autres
(57, 58).
La régulation du métabolisme des nucléotides cycliques dans le système
nerveux central a été très étudiée (59, 60, 61). Leur participation à
la transmission synaptique est probable (62). Leur rôle dans le métabo-
lisme du glycogène (63) et dans la régulation de la synthèse protéique
(64) a été démontré.
En conclusion, le métabolisme glucidique est tributaire dans une large
mesure du métabolisme des nucléotides cycliques. L'activité des enzy-
mes glycolytiques ou gluconéogéniques est donc influencée par le taux
d'AMP cyclique et de GMP cyclique.
1.3. FRUCTOSE-1,6-BIPHOSPHATASE ET GLUCONEOGENESE.
Lors de la gluconéogénèse, la réaction catalysée par la fructose-1,6-
biphosphat~e (FDPase) joue un rôle important en ce sens qu'elle est
au carrefour des autres voies métaboliques. En effet, à partir de cette
étape, le glucose~-phosphate peut être transformé en glucose ou il peut

---

- 21 -
entrer dans la molécule de glycogène. Cette enzyme a fait l'objet de
très nombreuses études dans le foie (65, 66, 67). Dans de nombreuses
recherches actuelles, elle sert de modèle pour la phosphorylation pro-
téique (68). l'interaction enzyme-enzyme (69, 70), le clivage de molé-
cules enzymatiques (71) ou pour le recyclage de substrat (72, 73).
L'existence, dans le foie de Mammifère, d'une phosphorylase spécifique
catalysant la transformation du fructose-1,6-biphosphate en fructose-5-
phosphate a été décrite pour la première fois en 1943 par GOMORI (74).
Il réussit à séparer la FDPase des autres phosphatases. Jusque là, les
phosphatases étaient considérées comme des enzymes cataboliques et la
participation d'une telle enzyme à la gluconéogénèse soulevait des con-
troverses.
Une particularité de la FDPase est que l'inverse de sa réaction est ca-
tnlysê
par une autre enzyme irréversible, la phosphofructok i nase . Les deux
enzymes étant actives à la fois, elles const.i tuont un cycle "futile" avec
recyclage du glucose. Leur activité dépend de la demande d'énergie. Lorsqu'il
y a une forte consonmation de glucose, carme pendant l'activité musculaire,
l'activité de la phosphofructokinase est préderninante. l'ai s cette régulation
semble complexe lors des convulsions, en particulier durant celles induites
par l a ~iSO.
1.4. BUT DU TRAVAIL.
Dans la recherche des causes des convulsions épileptiformes, plusieurs
études ont été orientées vers le sang et le métabolisme systémique chez
l'Homme. Plusieurs paramètres, comme le métabolisme glucidique, le métabo-
lisme des protéines, l léquilibre acido-basique ainsi que l'activité endo-
crine de plusieurs glandes ont été étudiés. La circulation cérébrale et la
consommation d'oxygène paraissent normales entre les périodes convulsives
bien qu'une tendance à l 'hypoxie, à l 'hypoglycémie et à une tolérance
anormale des glucides ait été signalée (1). Cependant, des expériences
récentes ont montré que dans l'épilepsie photosensible chez Papio papio,
une hyperglycémie est associée aux crises tonico-cloniques bilatérales

---

- 22 -
alors que l'hypoglycémie ne semble pas agir sur la sensibilité des ani-
maux aux stimulations lumineuses (25). Ces recherches ont abouti à des
résultats divergents conflictuels. Il y avait une plus grande dispersion
de plusieurs paramètres homéostatiques chez les épileptiques que chez
les individus normaux. Les études neurologiques ont montré que les déchar-
ges épileptiques provenaient souvent d'un foyer localisé dans la substance
grise. Autour de ce foyer, on observait beaucoup de cellules gliales fi-
breuses. Ces observations ont fait penser à une origine biochimique de
la maladie (1). Actuellement, de nombreux chercheurs travaillent sur la
neurochimie de l'épilepsie. Plusieurs modèles sont utilisés: l'électrochoc,
des dépôts de pénicilline ou de métaux (cobalt, alumine), administration de
molécules comme le pentétrazol, la bicuculline ou la méthionine sulfoxi-
mine. Après une revue d'une série de modèles, WOLFE et ELLIOT (1) signalent
"The seizures induced by methionine sul foxim'i ne are of particular interest
to the neurochemist and neurophysiologist because of their resemblance to
human epilepsy and their ready reproductibility in a variety of experi-
mental animals." (sic). En effet, le syndrome induit par la MSO permet
d'étudier les phases préconvulsives, convulsives et postconvulsives, cha-
cune de ces phases ayant une durée relativement importante.
Comme nous l'avons signalé plus haut, on peut penser, a priori, que dans
le cas d'une augmentation de l'activité motrice et nerveuse, il y a une con-
sommation des réserves énergétiques pour faire face à la demande accrue d'éner-
gie. Effectivement, dans un travail préliminaire, nous avions induit une aug-
mentation de l'activité neuro-motrice par administration d'une molécule psy-
chotrope, le sulfate de D-amphétamine. Les résultats obtenus ont été décrits
par HEVOR and coll. (75). Ce travail montre une diminution de la concentra-
tion intracérébrale en glycogène associée à une hyperactivité motrice. Mais
dans le cas de la méthionine sulfoximine, qui induit à long terme une aug-
mentation de l'activité motrice, plusieurs auteurs ont rapporté une accumu-
lation intracérébrale considérable de glycogène (76, 77). Ce résultat para-
doxal suggère l'idée d'un métabolisme cérébral particulier chez les animaux
soumis à la MSO. La MSO induit chez la Souris une intense activité convulsive
qUl peut se rapprocher de l'activité induite chez le Rat par l'amphétamine,
bien que n'étant pas du même type (78). Pourtant, la 11S0 est glycogénique
alors que l'amphétamine est glycogénolytique. FOLBERGROVA (76) avait déjà
montré que la MSO n'avait pas d'action sur les enzymes du métabolisme du gly-
cogène dans le système nerveux central. Une accumulation intracérébrale de
glycogène à partir du glucose sanguin serait en rapport avec l'une des voies

---

- lJ -
du métabolisme glucidique du cerveau. Récemment, PHILLIPS et COXON (79) avaient
montré une incorporation de pyruvate, de glutamate et de bicarbonate dans le
glycogène des coupes de cortex cérébral. Cette observation suggère l'exis-
tence d'une voie gluconéogénique dans le cerveau. KREBS et WOOOFORO (80)
avaient signalé depuis longtemps qu'une telle voie n'exitait pas dans le cer-
veau. Comment expliquer alors l'incorporation du pyruvate dans le glycogène
cérébral?
Au moment 00 nous avions commencé ce travail, l'activité de la FOPase n'avait
pas été décrite dans le système nerveux central. Récemment, la conversion du
fructose-1,6-biphosphate en fructose-6-phosphate in vitro (81) indiquait la
présence très probable de la FOPase dans le tissu nerveux. Etant donné que
la méthionine sulfoximine induit une accumulation de glycogène par des méca-
nismes inconnus, nous avons pensé à l'intervention possible d'une gluconéogé-
nèse cérébrale éventuelle dans ces phénomènes. Nous avons donc entrepris la
recherche de l'activité de la FOPase dans le système nerveux et l'action de la
MSO sur cette enzyme. La gluconéogénèse pourrait avoir un rôle dans les crises
épileptiformes induites par cette molécule. Nous avons également étudié l'in-
fluence de la MSO sur le taux de nucléotides cycliques. En effet, en plus de
leur action sur le métabolisme glucidique, les nucléotides cycliques semblent
être impliqués dans la genèse des convulsions épileptiformes.

---

Separa tum EX PEl{( ENTrA 31, (,7+ (1 'H 5)
- 24 -
lIirkh"II"l'r Vorlau, Il,,,d (Schwriz)
Amphetamine-Induced Changes in Body Temperature and Glycogen Content of the
Encephalon in the Chicken 1
Thirty min af ter an i.p. injection of IJ-amphetamine,
EC>
5 mR/kg, the concentration of glycogcn in the mouse brain
Qi
dccreased by 30%; this deplet ion was closclv associated
~
0;
with an increasc in phosphorylaso a, and the subsequent
~
CI>
rnarked resynthcsis of the polysaccharide scemcd achicvcd
by the conversion of glycogen synthetasc J) to \\2,3. In
~
thcse conditions, the dcplct ion of glycogen may occur in
-E!'
glial cclls in responsc to the rclcasc of ca tcchola 111ines 4,5.
'"
CI>
ë5
On the other ha nd, injection of amphetamine in the rat,
E
the NMRI-strain mouse and the ra bbit prorluccd an
-=<=CI>C>
incrcase in body temperature, though in the C3H-strain
0
U
>0-
rnousc
no
change appeared 8-8.
Tho
possible
roll'
of
(3
dopamine in the amphetamine-induced hvpert hcrrnia was
0
15
30
45
60
75
90min
suggested 7,0,10. We may expect that sorne connection
lime
cxists betwecn cerebral glycogenolysis and body hypcr-
Fig.
1. Effe('l of u-umplu-t amiue sulphntc, .=i mg/kg. i njr-ru-d i.p..
thcrrnia, which is mediated by the lcvel of biogcnic amines
011
the gl~'c()gf'1J r(llltf'lIt of r-r-rcbral
hr-misphcn-s
(~
~), opti«
in the central ncrvous system. Since the effect of amphet-
lobes ('.'--ll) .uul ",'rd)('1!1I111 (e- e) of the 30-da\\"-old chirkr-n.
amine on the metaholism of glycogcn in the a via n brain
Each point is th" nu-an of 3 to 21 l'Xperillll'lIt, 1- S.E.~1. 'l'Ill' clifkr·
was nover investigated, we have pcrfor mcd a study on the
['IH'P5 bc twrv-n cOlltrol and ('Xlwfirll(,lltal an imal ... wcre <l:-...:..rs....e<i bv
glycogen content in the encephalon, and cnrrcla t ivclv on
r-test. • l'·
0.1l'i.
the body temperature, of the adult chicken subm ittcd to
th,' drug
Materiels and methods . 30-day-nld male and fcrnale
chickens (Gallus domesticuss from a Plymouth x Rhode
Island Red cross, wl'ighing about 500 g, wcre used. l'hl'
birds were allowed free access to food and watcr and wcre
kcpt in groups in breeding cages, at an environ mental
temperature of 21 ± 1°C and undcr diurnal light-clark
l'vele, until the start of the cxpcr iments. Body temperature
was rccorded , the chicken being placed in a rostra ining
apparatns at an environmental temperature of 21 ± 1°C,
in a Gilson polygraph equipped with a S.E. 21 type
rnodulus and a A-4062 type bridge by rncans of a thermistor
(Vellow Springs Instruments Co., Vellow Springs, Ohio)
inscrtcd 5 cm into the cloaca! cavity. n-ampln-taminc
15
30
60
75
sulphate,
dissolved
in
isotonie
sodium
rhlorick-,
was
injected i.p. in a volume of
1.0
ml; control annnals
rcceivcd Lü ml isotonie sodium chloride. Fm the ex pcr i-
Fig. 2. Efft'ct of n-uruphct auum- sulphu tr-, 7..~ Illg/kg, i njcrtr-d i.p.,
nu-nts on the estimation of brain glvcogcn. the hinls,
on t hr- glycog('n «on teut of t-t-rt-hr al ln-misphcrr-, (~ - ~), nptic lobe-,
which werc kept in individual cages at an r-nvironrncntal
(\\) --
,) and ccrd)('llulIl le-- el of the JO·,\\ay-nld r-hir-kr-n. F"ch
temperature of 21 ± 1°C, wcrc sacrif iccd at regular timc
point j ... t hr- 111(';111 nf ] to 21 r-xpr-rimc-nt-. 'r S.E.:\\1. .})
(LOS.
intr-rva ls hetween 15 and 90 min aft er the injection. Ali
the expcrimcnts wcre made in the morning, bct wccu
09.011 and Il.00 h; this period, in the circadian rhythm,
corresponds to a relat ively stable concentration of glyco-
gen in the normal adult mousc 2 and young chic ken brain U.
The birds wcre decapit atcd ami the-ir lu-ad was instan-
taneously immersed in Iiquid nitrogen; afterwards, it was
k('pt at --30 oC and the cerebral hemispheres, optic lobes
and cerehellum were dissected out ancl weiRhed whilst in
the frozen state. (~lycoRen was isolateli frol11 l'ach of the
3 l'ncepahlic tissues by a modification of the mcthod of
Le BARON 12, the estimation of glucosl' being made by a
glucosl' oxidase-peroxidase speetrophotomctric methol\\ 13.
The concentration of glycogen \\Vas exprl'ssed in ll-moles of
anh\\'droglucosyl units per g wct w"ight. of tissue.
Reslllt.>. The cOllcentration of Rlycogl'n in the cerebral
h,'mispheres, optic lobes and c('rehellul11 of the 30-clay-old
4050 ,~_~_--'
...L-_---'
, - 1
1_ _- - ' - - _ - - - '_ _
intact chic ken is respectin'Iy 1.35
1- 1!.l0, 1.47 ± 0.03
.
0
15
30
60
75
90min
and 2.44 ± O.OR ll-moles per g. 30 min after an injection of
2.-'; mg/kR D-amphctamine, an incfl'ase occurs in the
concentration of glycogen in the 3 encephalic tissues, the
Fi!!:. ]. :\\Ipiln c10acal tt'IIlJwrahln'''' of JO-oay-nld chkkf'll'" Îlljf'ctpd i.p.
perccntaRe of which is 37, 12 and 9 respectinly in the
with n""l1phetamille slllphatc, 2.'1 mg/kg le -el, S mg/kg (.
),
,·,'rebral helllisphere:-, optic lohes and cerebellum, and at
7.'1 mg/kg (. - . ) ,,"d 10 mg/kg (
('1 alld with -alill," (
-
1.
4-'; min th" values are thl' same as those evaluated in the
Earh point is the 111f';}Tl of 2 to (, {'xp('riIlH"llt~. • J'.
0.05;·· Il ~
control animaIs. Fignre 1 illustrates the evolutioll of the
()'01.

---

- 25 -
15.6. 1975
Specialia
concentration of brain glycogen, after an i.p. injection of
hyperthermia followed by a hypothermia ". At a low dose,
n-amphetarnine, 5 mg/kg. In the cerebral hemispheres,
amphetamine may induce a hypothermia by a direct
after an initial increase of 18% at 15 min, the glycogen
action on the therrnoregulatory structures in the anterior
content decreases by 73% at 30 min and finally it increases
hypothalamus, whereas the hyperthcrrnia recordcd at a
by 36% at 75 min. In the optic lobes, the concentration
high dose of the drug could be possihly correlated with
of the polysaccharide remains practically constant during
sorne peripheral events 17-19. If in the male albino mouse,
the first 30 min, then it increases by 19% at 70 min. In
sorne relation seemed to exist between cerebral glyco-
the cerebellum, the concentration of glycogen decreases
genolysis and body hyperthermia, after an i.p. injection of
regularly by 28% at 30 min, then it gradually rises to the
5 mg/kg n-amphctarnine ", wc have demonstrated that in
value estimated in the control chickens. Another series
male and fernale chickens the drug administered at the
of experiments was made with 7.5 mg/kg o-amphetamine
same dose
induced
a
cerebral
glycolysis
which
was
(Figure 2). In the 3 encephalic tissues analyzed, a rapid
associated with body hypothermia. Our results are in
fall occurs in the concentration of glycogen at 15 min
accordance with the previous observations proving that
after the injection of the drug, reaching 42% in the
the effect of
amphetamine
on
body temperature is
cerebral hemispheres and ccrebellum and 36% in the optic
dependent not only on the species but also on the strains
lobes. In the cerebral hemispheres, this depletion in the
of the animais used in the experiments 20.
concentration of glycogen is followed by its enhanced
resynthesis, since at 60 min the concentration of the
Résumé. L'injection i.p. de sulfate de o-amphétamine,
polysaccharide increases by 20%. After treatrnent with
à la dose de 2,5 à 10 mg/kg, chez le poulet âgé de 30 jours,
10 mg/kg n-amphetamine, the Iall in the concentration of
est suivie d'une diminution de la concentration en glyco-
glycogen in the 3 encephalic parts reaches a value which is
gène dans l'encéphale; cette diminution est particulère-
very close to that estimated with 7.5 mg/kg amphetamine;
ment importante dans les hémisphères cérébraux et le
however,
the
subsequent
resynthesis
of
glycogen
is
cervelet, mais elle l'est nettement moins dans les lobes
always faster.
optiques. La drogue provoque une hypothermie corporelle
The time course of the variation of body temperature of
qui n'excède pas 1°C.
the chicken after administration of
amphetamine is
represented in
Figure 3. o-amphetamine,
2.5
mg/kg,
T. K. HEVOR, P. R. LEHR and J. GAVET
induces a slight hypotherrnia at 15 min. But by increasing
the dose of the drug from 5 mg ta 10 mg/kg, there occurs a
Laboratoire de Physiologie Générale, Université de Nancy I,
gradually increasing hypothermia, the mean value of
c.a. No 140, F-54037 Nancy (France).
which does not exceed 1°C at 45 min after the injection of
27 [anuary 1975.
amphetamine.
Discussion. In the 30-day-old chicken, the concentra-
1 This work was supported by !(rants from the Centre National dl' la
tion of glycogen estimated in the cerebellum is about 81 %
Recherche Scientifique (E.R.A. No. 331) and from the Fondation
greater than that estimated in the cerebral hemispheres
pour la Recherche Médicale Française.
or the optic lobes. Although the rate of depletion of the
• D. A. HIJTCIlINS and K. J. ROGERS, Rr. J. Pharmac. J9, 9 (1970).
polysaccharide,
after the administration of
5 mg/kg
• S. R. NAIlOR'KI and K. J. HOGERS, J. Neurochem. 2J, 579 (1974).
n-amphetamine is approximately the sarne in the cerebral
• J. J. SCIlII.nKRAlIT and S. S. KETY, Science 1.56, 21 (1967).
hemispheres and the c erebellum, it does not significantly
• S. H. NAHOR'KI and K. J. HOGERS, J. Neurochern. 21, 1>79 (1973).
produce any change in the leve1 of glycogen in the optic
8 j. SCHEEL-KRÜ<:F:R and E. HA"ELAGER, Psvchopharmacologia
lobes. Since the depletion of glycogen induced by amphet-
J6, 189 (1974).
amine in the mamrnalian brain would he mediated by the
7 S. CACCIA, G. CECCHETTI, S. GARATTINI and A . .JORI, Br..J. Pharrnac.
release of central catecholarnines v w, it may be of interest
49,400 (1973).
to note that the highest amount of noradrenaline in the
8 A. HORITA and H.
F. HILL, in
The
Pharmacology 0/ Thermo-
chicken encephalon was found in the optic lobes
regulation. (Eds,
15.
The
E. SCHONRAUM and l'. LOMAX; S. Karger, Basel
relative stability of the store of glycogen in the optic lobes
1973), p. 417.
could be explained either by the low sensitivity of their
• C. MATSUMOTO and \\V. GRIFFIN, .J. Pharm, Pharrnac. 2J, 710
(1971).
catecholaminergic nerve endings towards amphetamine,
10 H. F. HILL and A. HORITA, j. Pharrn. Pharrnac. 2J, 715 (1971).
or by the slow rate of uptake of released catecholamine
transmitter by glial cells, th us affecting glycogenolysis in
11 C. EDWARDS and K. j. ROGltRs, J. Neurochern. 19,2759 (1972).
11 F. N. Lit BARON, Biochern. J. 61, 80 (1955).
these cells 5. But presumably, as was shown recently in the
11 H. U. BltRGMltYltR and E. BERNT, in
Methods
0/ Enzymatic
rat brain P, the localization of amphetamine, and possibly
Analysis (Ed. H. U. BERGMItYER; Academie Press, New York
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phalon differs. Consequently, if a threshold appears for
" D. A. HUTCHINS and 1\\. J. ROGERS, Br..J. Pharmac, '/8,19 (1973).
the cerebral glycogenolytic effect of amphetamine, this
rs K. KORAYASlIl and S. Ernusox , Devel, Psychobiol. J, 13 (1970).
threshold may reflect the heterogeneous distribution of
18 A. .lORI and S. CACCIA, J. Pharm, Pharmac, 26, 748 (1974).
the drug Î11 the brain.
17 D. O. MCCIJLLOUGH, J. N. MII.RERG and S. M. HORINSON, Br. J.
Amphetamine induces a hypothermie effect in the
Pharmae . ./0, 219 (1970).
18 G. L. GE'SA, G. A. CLAY and B. B. [{RODIE, Life Sei. 8, 13S (1969).
chicken organism. Su ch a hypothermic effect was also
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previouslv obtained in the male Swiss alhino mouse after
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an i.p. injection of 1 to 5 mg/kg n-amphetarnine, ad-
20 E. DOI.FINI, S. GARATTINI and L. VALZE1.Ll, Eur. .J. Pharrnac. ï,
ministration of a larger dose, as 10 mg/kg, resulted in a
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Chapitre II
EFFET DE LA METHIONINE SULFOXIMINE SUR L'ACTIVITE DE LA FRUCTOSE-l,6-BI-
PHOSPHATASE ET DE LA PHOSPHOFRUCTOKINASE DANS L'ENCEPHALE DE LA SOURIS.

---

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(Accepted January 18th, 1978)
The intracerebral accumulation of glucose and glycogen which occurs during the
period of seizures induced in the mouse by administration of methionine sulfoximine
(MSO), and which persists up to 72 h after injection of the convulsant--s-P, is prevented
by the s'rnultaneous injection ofmetyrapone, an inhibitor of II fJ-hydroxylasecatalysing
cortisol synthesis in the adrenal cortexl-ê. Thus, glucocorticoids would exert a control
in the metabolic pathways leading to the long-terrn accumulation of cerebral glucose
and glycogen induced by MSO, the storage of the polysaccharide occurring prorninent-
Iy within swollen astrocytes in the cerebral cortex and subcortical white matter!". ft
has been suggested- that the ultrastructural damages observed in the brain following
MSO administrations.! may weil be the primary cause of an activation of gluconeo-
genesis through regulation by glucorticorticoids. Brain has been considered as a non-
gluconeogenic organ owing to its relative lack of gluconeogenic enzymes, namely
glucose-ô-phosphatase (EC 3.1.3.9), fructose-I ,6-biphosphatase (EC 3.1.3.11) (FDPase)
and phosphoenolpyruvate cal boxykinase (EC 4.1.1.49)14. However, Phillips and Coxon
(see ref. 13) have shown in guinea pig brain slices that gluconeogenesis may proceed
from pyruvate and glutamate, with evidence for FDPase activity. Moreover, the un-
equivocal demonstration of FDPase in the rat brain was very recently given by Ma-
jumder and Eisenbergl", who purified the enzyme to 95~;'; homogeneity by standard
procedures, including adsorption toa phosphocellulosecolumn followed byelution with
substrate. Since the control points in glycolysis in the brain must occur at the hexokinase
(EC 2.7.1.1), and particularly at the phosphofructokinase (EC 2.7.1.11) (PFK) steps'',
the activation of gluconeogenesis or inhibition of glycolysis can be effected either by
stimulation of FDPase or inhibition of PFK. The effect of MSO administered to the
mouse, on the activity of these two enzymes seemed to be of interest, in order to show
whether the cerebral accumulation of glucose and glycogen, induced by the convulsant,
originates from an activation of gluconeogenesis.
Male Swiss mice (OFI strain) of 25-30 g body weight were used. MSO (t-rnethio-
nine-nt-sulfoxirnine, Sigma) (25-100 mg/kg body weight) dissolved in 0.2 ml ofO.9ï~
NaCl was injected intraperitoneally; control animais received the same volume of 0.9 ï~
NaCI. During the experiments the animaIs were placed in individual cages at 22 oc. The

---

TABLEr
Effcc: of A1S0 011 FDPase activity ill mal/se cerebral cortex, brain stem and cerebellum
The mice were sacrificed at indicated times after intraperitoneal injection of \\1S0 (100 mg' kg body weight). Results are expressed as Il mole fructose-1 ,6-
biphosphate hydrolysed/g tissue wet weight.rnin at 37C (mean vaiues v- S.E. M, for number of assays in parentheses). Statistically significant difference
between MSO-injected and control animals is indicated.
Time olier l'v( SO
Cerebral cortex
Brain stem
Cerebellum
administration (Il)
Contrais
MSO-illjecled
Controls
MSO-illjecled
Contrais
M S'Ovinjected
4
0,121::::: 0.017 (4)
0.228::::: 0.038**
(4)
0.050::::: 0.007 (4)
0.143::::: 0.054*
(4)
0.213:::':: 0.020 (4)
0.409::::: 0.100*** (4)
8
0.092 ::::: 0.023 (6)
0,316::::: 0.080**
(6)
0.044 -= 0.010 (6)
0.140:::,:: 0.025**
(6)
0.182 ::::: 0.068 (6)
0.445::::: 0,044* * * (6)
24
0.104:::':: 0.040 (6)
0.481::::: 0.056*** (6)
0.036 =-'= 0.010 (6)
0.384 ± 0.085*** (6)
0.228:::':: 0.092 (4)
0.517::::: 0.100*** (6)
48
0.072 :::':: 0.030 (4)
0.409:::':: 0.058*** (6)
0.044 ::::: 0.015 (4)
0.276:::: 0.062*** (6)
0,188:::':: 0.050 (6)
0.631::::: 0.092*** (6)
72
0.108::::: 0,025 (6)
0.281 ::::: 0.033*** (6)
0.044 :c: 0.015 (4)
0.099:::':: 0.010**
(6)
0.228 :::: 0.075 (4)
0.480::::: 0.073*** (6)
* P -: 0.05.
** P " 0.01.
*** P < 0,005.
CID
w
~

---

- 35 -
TABLE II
Effect ofan increasing dose ofMSO on FDPase activity in //IOI/se cerebral cortex, brain stem and cerebellum
The mice were sacrificed 24 h after intraperitoneal injection of MSO (25-100 mg/kg body weight).
Results are expressed as Ilmole fructose-I ,6-biphosphate hydrolysed/g tissue wet weight/rnin at 37 "C
(mean values ± S.E.M. for number of assays in parentheses). Statistically significant difference he-
tween MSO-injected and control animais is indicated.
Dose of MSO
Cerebral cortex
Brain stem
Cerebellum
(mg/kg body weight )
- _ . - - - --------~.
o
0.112 ± 0.030
(12)
0.043 ± 0.010
(12)
0.219 ± 0.033
(10)
25
0.181 ±0.060·
(3)
0.083 ± 0.026·
(3)
0.324 ± 0.090'"
(3)
50
0.214 ± 0.074··
(3)
0.114 ± 0.020"
(3)
0.385 ± 0.026"· (3)
100
0.481 ± 0.056··· (6)
0.384 ± 0.085"· (6)
0.517 ± 0.100·" (6)
• P < 0.05 .
. . P < 0.01.
. . . P < 0.005.
mice were sacrificed by decapitation at 4 h (preconvulsive period), 8 h (convulsive
period), 24, 48 and 72 h after administration of MSO. The brain was rapidly isolated,
then, for the estimation of FDPase, it was irnmersed in a medium containing 0.15 M
KCl and 5 mM cysteine hydrochloride, at 0 "C, and, for the estimation of PFK, it was
immersed in a medium containing 50 mMTris . HCl buffer, pH 8.0, 5 mM MgS04 and
1 mM EDTA, at 0 oc. Most of the cerebral cortex, the brain stem and cerebellum were
dissected out in these two media. The brain tissues from 4 mice were pooled for each
experiment. A preparation of FDPase, devoid of hexose-ô-phosphate and of glucose-
6-phosphatase and PFK activities, was made-". The estimation of FDPase activity was
performed at37°C inamediumcontainingO.1 MTris' HCl buffer, pH 7.5, 5 mM MgCI2,
0.5 mM NADP, 5 mM mercaptoethanol, 10 f-lg/ml of phosphoglucose isomerase,
5 f-lg/ml of glucose-ô-phosphate dehydrogenase and 75 p.M fructose-l ,6-biphosphate,
in a final volume of 1.5 ml. The reaction started by the addition of an aliquot of the
enzyme preparation (about 1.0 mg protein) and the optical density was recorded spec-
trophotometrically at 340 nm. FDPase activity was expressed as f-lmole fructose-I,6-
t
biphosphate hydrolysed per g cerebral tissue wet weight per min. A preparation of
PFK was made-v. The estimation of the enzyme activity was performed at 37 Co in a
1
solution containing 50 mM Tris' HCI buffer, pH 7.5, 5 mM MgS04, 5 mM KCI,
0.2 mM NADH, 1 mM phosphoenolpyruvate, 1 mM fructose-6-phosphate, 1 mM
ATP, 20 fig/ml of pyruvate kinase, 15 f-lg/ml oflactate dehydrogenase, in a final volume
of 1.5 ml. The auxiliary enzymes were freed of (NH 4hS04. The reaction started by the
addition of an aliquot of the enzyme preparation (about 12 f-lgprotein), and the optical
density was recorded spectrophotometrically at 340 nm. PFK activity was expressed
as f-lmole fructose-6-phosphate phosphorylated per g cerebral tissue wet weight per
min. Protein determination was made in an aliquot of each enzyme preparation-t.
Statistical comparisons were established using the Student's t-test.
The mean values of FDPase activity in the cerebral cortex, brain stem and cere-
bellum for control mice (Table 1) are close to those previously estimated in guinea pig 13

---

TABLE III
Effect of Jf50 on PFK activirv in mouse cerebral cortex. brain stem and cerebellum
The mice were sacrificed at indicated times al'ter intraperitoneal injection of MSO (100 mgkg body weight). Results are exr.ressed as {imole fructose-6-
phosphate phosphorylatedg tissue wet weight.rnin at 37 T (mean values =S.E.M. for number ofassays in parenrhesesr. Statistically significant difference
between MSO-injected and control animaIs is indicated.
Time atter A150
Cerebral cortex
Brain stem
Cerebellum
administration ( Il)
Controls
Af50-injected
Controls
.H50-injected
"Contrais
At 50-injecred
4
~1.71 == 3.52 (4)
22.52 = 2.89 (6)
16.83 = 2.53 (4)
[7.86 = 1.46 (4)
14.95 =2.17(5)
16.30 ± 1.68 (4)
8
20.70 = 3.43 (4)
~2.86 == 3.31 (4)
17.15 = 1.75 (4)
19.79 ::.:: ~.77 (4)
15.12 = 2.69 (4)
18.17 == 3.34 (4)
~4
21.60 = 3.40 (6)
26.96 = 3.17** (6)
18.03 == 2.50 (6)
24.38 = 5.19* (6)
15.00 = 3.00 (6)
22.43 =4.33 ** (6)
48
20.93 =2.41 (5)
22.83 = 3.51 (4)
16.74 == 3.99 (5)
19.20 = 2.39 (5)
16.29 = 2.77 (5)
17.11 = ~.02 (5)
* P < 0.05.
** P < 0.01.
@
W
0'1

---

- 37 -
and ratIO brain. After administration of MSO at a dose of 100 mg/kg body weight, a
statistically significant increase of the gluconeogenic enzyme activity occurs in the 3
brain regions studied (Table 1). This is first apparent during the preconvulsive period
at 4 h; the increases are maximal 24 or 48 h after injection with e1evation of FDPase
activity of up to 6-fold in the cerebral cortex, II-fold in the brain stem and 3-fold in the
cerebellum. This effect ofMSO on brain FDPase activity appears to be dose-dependent,
since 24 h after administration of the convulsant at an increasing dose of25-100 mg/kg
body weight, FDPase activity increases from 2- to 4-fold in the cerebral cortex, from
2- to 9-fold in the brain stem, and from 1.5- to 2-fold in the cerebellum (Table II). The
mean values of PFK activity in the cerebral cortex, brain stem and cerebellum for con-
trol mice (Table III) are either higher or lower than those previously determined re-
spectively in the meuse? and sheep" brain. In contrast, the data for PFK activity indicate
only a slight elevation (of about 50 I~) for this enzyme under conditions of maximal
response of FDPase, i.e. 24 h after intraperitoneal injection of MSO at a dose of 100
mg/kg body weight (Table Ill).
In conclusion, MSO administered to the mouse induces in the brain an increase
in activity of the key gluconeogenic enzyme FDPase, during the preconvulsive and the
convulsive periods, and also when the animais appeared normal. In the same experi-
mental conditions, the activity of the key glycolytic enzyme PFK does not change
significantly. Previous results from our laboratory had shown that the increase in
cerebral glycogen content, in the same experimental conditions, was of the same order
of magnitude for these 3 periods following administration of the convulsantt. Thus, the
ultrastructural damages occurring in the mouse brain following administration of
MS03,4 do enhance gluconeogenesis, probably in astrocytes, through an activation
and/or a de novo biosynthesis of FDPase.
This research was supported by grants from the Centre National de la Recherche
Scientifique (E.R.A. 331) and from the Fondation pour la Recherche Médicale Fran-
çaise.
1 Bérel, A., Lehr, P. R. and Gayet, J., Inhibition by rnetyrapone of convulsions and storage of brain
glycogen in mice induced by methionine sulfoximine (MSO), Brain Research, 128 (1977) 193-196.
2 Bérel, A., Lehr, P. R. and Gayet, J., Inhibition by metyrapone of convulsions and of accumulation
of brain glucose and glycogen in mice induced by methionine sulfoximine (MSO). In Proc, 6th Int .
Meet.Tnt . Soc. Neurochemistry ; Copenhagen 21-26 August 1977, Abstract No. 211.
3 DeRobertis, E., Studies on neurochemical changes in experimental epilepsy, Triangle, 10 (1971)
93-98.
4 DeRobertis, E., Sellinger, O. Z., DeLores Arnaiz, G. R., Alberici, M. and Zieher, L. M., Nerve
endings in methionine sulphoxirnine convulsant rats; a neurochemical and ultrastructural study,
J. Neurochem., 14 (1967) 81-89.
5 Folbergrova, J., Glycogen and glycogen phosphorylase in the cerebral cortex of mice under the
influence of methionine sulphoximine, J. Neurochem., 20 (1973) 547-557.
6 Folbergrova, J., Passonneau, J. V., Lowry, O. H. and Schulz, D. W., Glycogen, ammonia and re-
lated metabolites in the brain during seizures evoked by methionine sulphoximine, J. Neurochem.,
16 (1969) 191-203.
.
7 Lowry, O. H. and Passonneau, J. V., The relations between substrates and enzymes of glycolysis
in brain, J. biol. Chem., 239 (1964) 31--42.

---

- 38 -
8 Lowry, O. H. and Passonneau, J. V., Kinetic evidence for multiple binding sites on phosphofructo-
kinase, J. hiol. Chem., 241 (1966) 2268-2279.
9 Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X. and Schulz, D. W., Effect of ischemia on
known substrates and cofactors of the glycolytic pathway in brain, J. hiol. Chem., 239 (1964) 18-30.
10 Majumder, A. L. and Eisenberg, E., Jr., Unequivocal demonstration of fructose-I .ô-biphosphatase
in mammalian brain, Proc, nat, Acad. Sei. (Wash.), 74 (1977) 3222-3225.
Il Miller, G. L., Protein determination for large number of samples, Analyt . Chem., 31 (\\ 959) 964.
12 Phelps, C. G., An ultrastructural study of methionine sulphoximine-induced glycogen accumula-
tion in astrocytes of the mouse cerebral cortex, J. Neurocytol., 4 (1975) 479-490.
13 Phillips, M. E. and Coxon, R. V., Incorporation of isotopie carbon into cerebral glycogen from non-
glucose substrates, Biocliem. J., 146 (\\975) 185189.
14 Scrutton, M. C. and Utter, M. F., The regulation ofglycolysis and gluconeogenesis in animaltissues,
Ann. Rev, Biochem., 37 (\\968) 249-302.
15 Underwood, A. H. and Newsholme, E. A., Sorne properties of fructose-I,6-diphosphatase of rat
liver and their relation to the control of gluconeogencsis, Biochem. J., 95 (1965) 767-774.
16 Undcrwood, A. H. and .Newsholrne, E. A., Sorne properties of phosphofructokinase from kidncy
cortex and their relation to glucose metabolism, Biochem. J., 104 (1967) 296-299.

---

- 39 -
2.1. INTRODUCTION
IMPORTANCE DU GLUCOSE DANS LA PHYSIOLOGIE NERVEUSE.
!
Dans le système nerveux central. le métabolisme du glucose subit une
régulation très poussée. Un des premiers facteurs limitant est le pas-
sage du glucose du système vasculaire au tissu nerveux. BACHELARD (17)
1
souligne que la cellule endothéliale des capillaires cérébraux est pro-
fondément différente de celle des capillaires des organes périphériques.
En effet. par ses propriétés. elle constitue un élément important de
la barrière sang-cerveau. L'entrée du glucose dans le tissu nerveux est
un processus stéréospécifique et saturable. Les différents Km de péné-
tration du glucose dans le tissu nerveux sont tels que cette pénétration
ne semble pas être le facteur limitant primordial de l'utilisation du
glucose in vivo. Il existe des étapes enzymatiques jouant un rôle plus
important.
La régulation de la glycolyse se fait à des étapes-clés bien définies:
ce sont les étapes catalysées par l 'hexokinase. la phosphofructokinase
et la pyruvate-kinase. Dans les conditions physiologiques normales.
les capacités catalytiques maximales de ces enzymes ne sont pas atteintes.
Cette propriété permet au tissu nerveux de multiplier localement sa
consommation de glucose (X 100 quelquefois) lors de stimuli importants
comme la stimulation électrique in vivo ou in vitro. (17).
Pour étudier l'action de la MSO sur la gluconéogénèse. il serait intéres-
sant de choisir une étape enzymatique convenable qui permettra d'évaluer
l'importance de cette gluconéogénèse. Nous avions déjà mentionné les étapes-
clés de cette voie métabolique. La réaction catalysée par la glucose-6-
phosphatase est en relation directe avec le taux de glucose sanguin qui

---

- 40 -
peut influencer l'activité de cette enzyme (18). Les réactions catalysées
par la pyruvate carboxylase et la phosphoénolpyruvate carboxykinase sont
situées au début de la voie métabolique conduisant à la néoformation du
glucose à partir du lactate. Il est difficile de conclure qu'une activation
ou une inhibition de ces enzymes est en rapport avec le taux de glucose néo-
formé. Par contre, la réaction catalysée par la fructose-1,6-biphosphatase
est en relation directe avec la synthèse du glycogène. Cette étape paraît
intéressante pour l'étude des mécanismes d'action de la MSO, molécule glyco-
génique.
Comme nous l'avons montré précédemment, l'utilisation du glucose par
la voie glycolytique est profondément tributaire de l'activité de la
PFKinase et de la FDPase. On sait que chez le Mammifère adulte, 90% du
glucose consommé par le cerveau se fait par la voie glycolytique (18).
Cette propriété souligne l'importance de la FDPase et de la PFKinase
dans le métabolisme énergétique du cerveau. L'augmentation de l'activité
de la FDPase indique que le tissu considéré est engagé dans une voie
anabolique,
vraisemblablement avec une accumulation de glycogène. De
même, une activation de la PFKinase est le signe d'une glycolyse accen-
tuée.
Ainsi donc, il nous a paru intér~ssant de rechercher l'influence de la
MSO, molécule éminemment glycogénique, sur l'activité de la FDPase et
aussi de la PFKinase.
Comme nous l'avons mentionné précédemment, les manifestations électri-
ques et motrices de l'épilepsie doivent faire appel à une consommation
d'énergie inhabituelle. De ce point de vue, le métabolisme énergétique
du cerveau revêt une importance particulière dans les convulsions in-
duites par la MSO. On sait, depuis de nombreuses années, que le glucose
constitue le substrat énergétique principal du cerveau. BACHELARD (17)
souligne que dans l'organisme du Mammifère, le cerveau est l'organe qui
manifeste le plus de dépendance
vis à vis du glucose. Chez l'Homme
adulte, par exemple, le cerveau constitue 3% du poids corporel total,

---

- 41 -
mais il consomme 20% du glucose total et de l 'oxygène. Or les réserves
en glucose et en glycogène de cet organe sont faibles. Il n'est donc
pas surprenant que le cerveau soit étroitement tributaire de la four-
niture de glucose par le sang.
Par différentes approches expérimentales, on a montré que le glucose
était essentiellement dégradé par la voie glycolytique chez le Mammi-
fère adulte (18). Le shunt des pentoses n'a qu'une importance minime.
Par rapport aux autres organes,notamment le foie, le cerveau adulte
présente un métabolisme particulier du glucose. Le carbone du glucose
est massivement
et rapidement incorporé dans les acides aminés, alors
que dans le foie, ce carbone est recyclé dans la molécule de glucose.
Ainsi donc, le glucose consommé sert à la fourniture d'énergie et à la
synthèse des protides. Mais il semble que le glucose jouerait un autre
rôle dans le système nerveux central.
A partir des observations relatives à une déficience en glucose entraî-
nant le coma suivi d'une refourniture de glucose, il semblerait que ce
glucidesoit impliqué dans des mécanismes autres que la fourniture d'éner-
gie (17). Les données expérimentales sont encore réduites, mais on sait
que le cerveau peut suppléer provisoirement à un manque de glucose en
utilisant une autre source d'énergie. Les variations de l'électroencé-
phalogramme et du comportement interviennent à un moment où l'état éner-
gétique du cerveau n'est pas encore critique. On pense alors que le glu-
cose jouerait d'autres rôles. En particulier, il pourrait participer
à la transmission synaptique et il est possible qu'il existe des récep-
teurs au glucose dans le système nerveux central (17). Il est probable
que la MSO. qui modifie le métabolisme glucidique, altère considérable-
ment la physiologie du système nerveux central . Cependant, récemment, il
n'a pas été possible de mettre une corrélation entre le taux initial de
glucose et la sensibilité de Papio papio à la stimulation lumineuse inter-
mittente. Le syndrome induit par cette stimulation ne semble pas ~tre de
même nature que celui induit par une hypoglycémie sévère (53).
La régulation de l'activité de la PFKinase (19, 20, 21, 22, 23) et de la
FDPase (24, 25, 26, 27, 28) a fait l'objet de nombreuses études. Les

---

- 42 -
interactions entre ces deux enzymes lors de la glycolyse et de la gluco-
néogénèse ont été amplement décrites (29, 30, 31, 32). Ces études ont
porté sur le foie, le rein, le muscle et le cerveau du Mammifère et de
l'Oiseau et sur les microorganismes (33, 34, 35). Il ressort des ces
études, que la FDPase et la PFKinase subissent une régulation très pronon-
cée. La FDPase est fortement inhibée par l'AMP dans le foie, le rein, le
muscle. Le substrat lui-même, a fortes concentrations, exerce un effet
inhibiteur. Certains cations divalents comme le Zn 2+ et le Cu 2+ sont
2
également inhibiteurs. Par contre le Mg 2+ et le Mn +, a faibles concen-
trations, sont activateurs. L'histidine et l 'acétylcoenzyme A sont des
activateurs. La régulation de la PFKinase est bien connue dans les organes
précédemment cités, mais aussi dans le cerveau. L'ATP et le citrate sont
de puissants inhibiteurs. L'AMP, le fructose-l,6-biphosphate, le phosphate
inorganique et l'ammoniaque sont des activateurs. Une remarque intéressante
est que le fructose-6-phosphate active également la PFKinase (14, 19).
C'est donc une enzyme qui est activée a la fois par son substrat et le
produit de la réaction qu'elle catalyse. La PFKinase joue un rôle impor-
tant dans l'effet Pasteur.
On comprend donc que les activités de la FDPase et de la PFKinase soient
sujettes a des modifications importantes in vivo. En particulier, les
facteurs qui activent ou inhibent la consommation d'énergie auront un im-
pact important sur leur régulation. On peut donc penser que la MSO ait
une influence sur ces enzymes, et c'est dans ce but que nous avons étudier
l'influence de ce convulsivant sur l'activité de la FDPase et de la PFKi-
nase dans l'encéphale de la Souris.

---

- 43 -
2.2. MATERIELS ET METHODES
2.2.1. Matériels.
2.2.1.1. Animaux.
Les animaux utilisés pour l'étude de la fructose-1,6-biphosphatase et
de la phosphofructokinase sont des souris du genre Mus musculus de race
Swiss et de souche OF1. Les animaux proviennent d'un élevage local (IF-
FA CREDO, Arbresle). Avant l'expérimentation, ils sont maintenus dans le
laboratoire pendant un certain temps, par groupes de dix, dans des cages
standard. Ils sont nourris ad libitum avec un aliment à composition fixe.
Les conditions d'éclairement correspondent au cycle de la lumière natu-
relle, la température ambiante est maintenue entre 20 et 23°C.
2.2.1.2. Réactifs.
L-méthionine-DL-sulfoximine (MSO)
Sigma, St Louis, Mo
Phosphoglucose-isomérase
Glucose-6-phosphate déshydrogénase
Pyruvate kinase
Lactate déshydrogénase
Fructose-1,6-biphosphate
Frustose-6-phophate
Boehringer
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydé(NADP) Mannheim
Nicotinamide adénine dinucléotide réduit(NADH)
Adénosine triphosphate(ATP)
Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane(Tris)
Réactif de Folin-Ciocalteu
Merck, Darmstadt
SerUJI~lbumine bovine (Fraction IV)
Serva, Heidelberg

---

- 44 -
2.2.2. Méthodes.
2.2.2.1. Etude de l'activité de la fructose-1,6-biphosphatase.
2.2.2.1.1. Purification partielle de la fructose-1,6-biphos-
phatase.
Les principales étapes de 11 estimation de L' act tvi tê de la FDPase ont
déjà été décrites par HEVOR et GAYET (36). Cette méthode est une modi-
fication des méthodes couramment utilisées. Le tissu nerveux est homo-
généisé dans un milieu composé de chlorure de potassium à la concentra-
tion de 0,15M et de chlorhydrate de cystéine 5mM. Chaque région de l'en-
céphale est homogénéisée dans un appareil de Potter-Elvehjem à O°C.
L'homogénat est porté à 37°C pendant la min. au bain-marie; après re-
froidissement à 4°C, le pH est abaissé à 5 avec Hel N.Il est ensuite
centrifugé à 30 000 x g pendant 45 min. à 2-4°C dans une centrifugeuse
Spinco L 40. Le surnageant est rame ne a pH 7,5 avec KUH N. Lors d'une
telle préparation, les hexoses-monophosphates sont dégradés. La présence
éventuelle de fructose-6-phosphate et de glucose-6-phosphate pouvant para-
siter la réaction a été néanmoins recherchée.
L'extrait enzymatique est traité avec de llacide perchlorique à 6%. Le
mélange est centrifugé à 18 000 x g pendant 15 min. à 4°C. Le surnageant
est neutralisé avec
KOH 5N. Après élimination du perchlorate de po-
tassium, le surnageant est utilisé pour doser les hexoses-monophospha-
tes éventuels.
pha tase.
- Principe.
Llactivité de la FDPase a été m~sur~e dans les préparations de foie,
de rein et de muscle chez le Mammifère ou 110iseau (37,38,39). Deux mé-
thodes sont couramment utilisées, elles sont basées respectivement:

---

- 45 -
o
sur la formation de fructose-6-phosphate, en spectropAotométrie
o
sur la formation du phosphate inorganique
La détermination de l'activité de la FDPase basée sur la formation du
fructose-l,6-biphosphate semble être la plus convenable dans les préoa-
rations tissulaires brutes ou partiellement purifiées (38, 40). Le prin-
cipe du dosage est le suivant:
FDPase
Fructose-1,6-biphosphate ------~~~ Fructose-6-phOsphate + phosphate
inorganique
Phosphoglucose isomérase
Fructose-6-phosphate --------------------~~~ Glucose-6-phosphate
+ Glucose-6-phosphate déshydrogénase
Glucose-6-phosphate + NADP
~ 6-phosphogluconate +
NADPH + H+
La formation de NADPH + H+ est enregistrée au spectrophotomètre
BECKMAN
Acta III à 340 nm. Les enzymes auxiliaires, la phosphoglu-
cose-isomérase et la glucose-6-phosphate déshydrogénase sont en excès
de telle sorte que la formation de NADPH + H+ suive fidèlement
celle du
fructose-6-phosphate. Cette méthode est celle qui a été la
plus utilisée pendant cette étude.
La méthode de dosage du phosphate inorganique a été utilisée quelque-
fois. Le phosphate libéré est dosé par la réaction colorimétrique à
l 'heptamolybdate d'ammonium en milieu acide (41). De récentes techniques
enzymatiques de dosage du phosphate inorganique ont été décrites,mais
les enzymes auxiliaires utilisées les rendent peu commodes dans les
conditions expérimentales de notre étude (42).
- Dosage.
L'aspect pratique du dosage de la fructose-1,6-biphosphatase par les
enzymes auxiliaires a déjà été décrit par HEVOR et GAVET (36).
Pour le dosage du phosphate inorganique, la réaction enzymatique s'ef~

---

- 46 -
fectue dans du Tris-HCl 0,1 MpH 7,5, 5 mM de MgC1
5 mM de mercapto-
2,
éthanol, 75 ~M de fructose-1,6~biphosphate et de l'extrait enzymatique,
au bain-marie à 37°C pendant 15 ou 30 minutes suivant l'activité de
l'enzyme. La réaction est arrêtée par addition d'acide trichloracétique
à 125%. Les protéines sont éliminées et le phosphate inorganique est
dosé dans le surnageant. L'inconvénient majeur de la technique d'esti-
mation de l'activité de la FDPase par le dosage du phosphate inorganique
est son manque de spécificité. En effet, le phosphate inorganique libéré
par les autres phosphatases est également dosé. Ainsi, cette technique
est applicable dans le cas d'une purification de l'enzyme, en particu-
lier lorsqu'on atteint un degré de pureté relative (38).
2.2.2.2. Etude de l'activité de la phosphofructokinase.
2.2.2.2.1. Préparation de l'extrait enzymatique .
........................................................................
La PFKinase a été étudiée suivant les techniques déjà décrites (16,21).
Le tissu nerveux est homogénéisé dans un milieu contenant du Tris-HCl
50 mM pH 8, du MgS0
5 mM et de l 'EDTA 1 mM à O°C avec un homogénéiseur
4
de Potter-Elvehjem. L'homogénat est centrifugé à 30 000 x g pendant
45 minutes à 2-4°C. Le surnageant est prélevé pour l'estimation de l'ac-
tivité de la FPKinase.
2.2.2.2.2. Evaluation de l'activité de la phosphofructokinase .
....................
.
- Principe.
L'activité de la PFKinase est souvent mesurée avec des enzymes auxi-
liaires suivant deux principes (38,43) :
oclivage aldolique du fructose-1,6-biphosphate formé
oestimation de l'ADP formé
La technique permettant d'estimer l'ADP formé a été utilisé:

---

- 47 -
PFKinase
Fructose-6-phosphate + ATP ---------~.~ Fructose-1,6-biphosphate + ADP
Pyruvate kinase
ADP + Phosphoénolpyruvate ------------~.~ ATP + Pyruvate
Lactate déshydrogénase
Pyruvate + NADH + H+ ------------------lI.~ Lactate + NAD+
Les enzymes auxiliaires sont en excès; l'activité enzymatique est sui7
+
vie avec la disparition du NADH + H .
- Dosage.
Le dosage de la phosphofructokinase a été décrit par HEVOR et GAYET
(36)
Lors de l'étude de l'activité de la FDPase et de la PFKinase, la con-
centration en protéines de l'extrait tissulaire a été évaluée avec la
technique de LOWRY et coll. (44) mod ifi ëe.
2.2.2.3. Evaluation du taux de protéines.
La technique de dosage courante des protéines avec le réactif phénoli-
que de Folin-Ciocalteu , en présence du tartrate double de potassium
et de sodium a été utilisée (11). La courbe de référence est établie
avec une solution de serum albumine bovine.
Les résultats sont comparés avec le test t de Student, en utilisant

---

- 48 -
une machine Texas Instruments,modèle SR 52. Les probabilités de diffé-
rence significative sont indiquées sur les tableaux et les figures.
2.3. RESULTATS.
Après administration de la dose unique de 100 mg/kg de MSO par voie
intrapéritonéale. les animaux ont un comportement normal. semblable
à celui des animaux non traités. pendant les 4 heures qui suivent l'in-
e
e
e
jection. A partir de la 4
heure et jusqu'à la 7 ou 8
heure. les ani-
maux manisfestent une ataxie de plus en plus prononçée. Ils ont une po-
sition cataleptique. Immobiles.ils ne réagissent pratiquement pas aux
e
stimuli externes. Vers la 7 ou 8e heure. les convulsions toniques ap-
paraissent; l'animal est généralement couché sur le côté. les pattes
en l'air. Ces convulsions toniques sont suivies de convulsions cloni-
ques durant
3 à 5 secondes et sont caractérisées par des mouvements
rotatifs très désordonnés couplés avec des bonds répétés de l'animal
jusqu'au toit de la cage. Les secousses sont sponténées ou déclenchées
par un stimulus externe. en particulier le bruit. Elles sont suivies de
convulsions toniques. l'animal restant couché sur le côté et raide.
Le temps séparant les convulsions généralisées est très variable. allant
de la minute environ à plusieurs minutes. L'état de mal a une durée
variable. mais il atteint au moins une heure. Les convulsions généralisées
disparaissent peu à peu. l'animal étant toujours en hypertonie. Il re-
trouve sa posture normale. mais reste peu vigilant. Au bout de 24 heures
3près l'administration. l'animal a un comportement pratiquement iden-
tique à celui des animaux non traités. 48 heures après. aucun signe ne
I)ermet de le distinguer des autres animaux. Ce syndrome est semblable

---

- 49 -
â celui décrit par d'autres auteurs chez le Rat (45):
2.3.2. ~s!iQ~_Q~_!~_~~Q_~~~_!~~s!iYi!~_Q~_!~_f~~S!Q~~:!~§:ei~~Q~­
~~~!~~~.
2.3.2.1. Activité de la fructose-l,6-biphosphatase chez les
animaux témoins.
Avant l'estimation de l'activité de la FDPase, la présence de fructose-
6-phosphate ou de glucose-6-phosphate dans l'extrait enzymatique a été
recherché comme précédemment décrit. Le dosage est effectué de la même
façon que pour l'enzyme, mais les enzymes auxiliaires sont ajoutées de
façon séquentielle: la glucose-6-phosphate déshydrogénase pour évaluer
la concentration en glucose-6-phosphate, puis la phosphoglucose-isomé-
rase pour évaluer la concentration en fructose-6-phosphate. Aucune quan-
tité dosable de ces deux hexoses-monophosphates n'a été observée. Ce
résultat s'explique par la présence de la phosphoglucose-isomérase et
de la glucose-6-phosphate déshydrogénase dans le tissu nerveux (7,46,
47). Les hexoses-monophosphates sont rapidement détruits post-mortem
et pendant l'incubation â 37°C.
L'activité de la FDPase dans l'encéphale de la Souris traitée avec du NaCl
isotonique est de 0, 112 ± 0,030; 0,043 ± 0,010 et 0,219 ± 0,033 ~g de fruc-
tose-l,6-biphosphate par gramme de tissu frais par minute â 37°C respective-
ment dans le cortex cérébral, le tronc cérébral et le cervelet: Quelle que
soit la région de l'encéphale considérée l'activité de l'enzyme dans le tis-
su nerveux est beaucoup plus faible que celle du foie:
- dans le foie du Rat, l'activité est estimée â 15 ~moles de FDP/g de
tissu frais/min. Chez les autres vertébrés, l'activité varie de 6 â 37 ~moles
de FDP/g de tissu frais/min dans le foie (14).
- Dans le reindu Rat, cette activité est de 17 ~moles de FDP/g/min (14).
Il apparaît donc que la faible activité de la FDPase du cerveau rend cet
organe peu gluconéogénique par rapport aux autres organes.

---

- 50 -
***
0,4
-le- *
***
0,2
c
E
-CI) 0
ca
...
-
CORTEX CEREBRAL
;::,
CI)
***
.!
....
G)
0,4
"0
C)
-.....
0-
C
LL
0,2
..!!
0
E
a,
0
W
....1
TRONC
CEREBRAL
ct
~
0
***
~
w
~
0,6
>
**
~
***
U
ct
0,4
0,2
o I-_---L._
4
8
24
48
72
Heures
après injection
CERVELET
Figure 1 :Chronologie de l'action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur l'activité
de la FDPase dans l'encéphale de la Souris. Le nombre de détermi-
nations est compris entre 4 et 6. Les différences significatives
avec le test t de Student sont :
p<0,05 •
Témoi ns
1
r
p<O,Ol ••
Soumis à la MSO
~
p <0,001 •••

---

- 51 -
L'activité rapportée aux protéines totales de l'extrait enzymatique
est de 30 ± 1,22 ± 3 et 34 ± 4 nmoles/ mg de protéines/min respective-
ment dans le cortex cérébral, le tronc cérébral et le cervelet. Cette
activité est beaucoup plus homogène dans les différentes régions étu-
diées que'
2.3.2.2. Activité de la fructose-1,6-biphosphatase chez les
..................................................
animaux
s ourn i s à la MSO.
2.3.2.2.1. Chronologie .
......................
La MSO, administrée à la dose de 100 mg/kg par voie intrapéritonéale,
entraîne une augmentation considérable de l'activité de la FDPase dans
le cortex cérébral et le cervelet de la Souris (Tableau 1, figure
1):
l'évolution de l'activité totale a été déjà décrite par HEVOR et GAVET
(36). La MSO induit également une augmentation de l'activité rapportée
au mg de protéines totales (Tableau IV, figure 2): On remarque que
cette augmentation, bien que hautement significative ( Test t de Stu-
dent pour p<0,05), est moins importante que celle de l'activité to-
tale. Contrairement au cas de cette activité totale, la variabilité
suivant la région de l'encéphale étudiée est nettement plus atténuée.
Les valeurs obtenues dans le cortex cérébral sont plus importantes que
dans les autres régions étudiées
et 48 heures après l'administration
J24
de la MSO.
2.3.2.2.2. Doses.
Comme l'indique le tableau II et la figure 3, l'induction de l'activité
de la FDPase de l'encéphale de la Souris semble être dose-dépendante

---

- 52 -
Temps
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
après
i njecti on
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
(heures)
à l a ~1S0
à la MSO
à l a ~1S0
0,030
0,042
0,022
0,034
0,034
0,041
4
:!: 0,008
± 0,007
± 0,003 ± 0,010
± 0,004
+ 0,015
0,030
0,041
8
0,034
0,030
0,037
0,044
~ 0,009
± 0,013
± 0,003 ± 0,003
± 0,007
± 0,003
••
•••
0,033
24
0,042
0,025
0,052
0,033
0,055
:!: 0,004
± 0,006 ± 0,005
± 0,003
± 0,013
± 0,006
••
••
•••
48
0,033
0,070
0,033
0,060
0,035
0,060
± 0,006
± 0,008
± 0,006
± 0,012
± 0,005
± 0,012
•
•
72
0,032
0,039
0,028
0,038
0,031
0,044
± 0,006
± 0,005
± 0,004
± 0,004
± 0,006
± 0,005
Tableau IV
Chronologie de l'action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur
l'activité par mg de protéines de la FDPase dans l'encéphale
de la Souris. Le nombre de déterminations est compris entre
4 et 6.
/

---

••
••
- 53 -
0,06
0,04
0,02
0,04
0,02
0 ......-
.......
CERVELET
4
8
24
48
72
Heures après injection
Figure 2
Chronologie de l'action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur l'activité
par mg de protéines de la FDPase dans l'encéphale de la Souris.
p< 0, 05 •
[ l
Témo in s
p <0,01 ••
~
Soumis à la MSO
p < 0,001 •••

---

-54._ -
0,6
ACTIVITE TOTALE
pmole FDP/g de tissu frais/min
0,4
0,2
O'"----I........
.........
..L...-
....-.....~
ACTIVITE
,..mole FDP/mg prot.jrnln
0,04
0,02
O'------L
-l.-
--JL...--
...L---I~
o
25
50
100
DOSESde MSO (mg/kg)
Figure 3
Action de différentes doses de MSO sur l'activité totale (en h~ut)
et l'activité par mg de protéines (en bas) de la FDPase dans l'en-
céphale de la Souris. Le nombre de déterminations est compris entre
3 et 12 .
• - . Tronc cérébra l
 - -  Cervelet
. - . Cortex cérébra l

---

- 55 -
DOSES de t4S0
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
(mg/kg)
0,033
0,025
0,033
0
± 0,004
± 0,005
± 0,013
0,034
0,022
25
0,036
± 0,007
± 0,006
± 0,004
0,038
0,037
0,038
50
± 0,008
± 0,008
± 0,003
0,042
0,042
0,041
100
± 0,006
± 0,003
± 0,006
Tableau V
Action des différentes doses de MSO sur l'activité par mg de protéines
de la FDPase dans l'encéphale de la Souris, 24 heures après adminis-
tration de cette molécule. Le nombre de déterminations est compris
entre 3 et 12.

---

- 56 -
L'activité par mg de protéines totales reste relativement constante avec
l'augmentation de la dose de MSO (Tableau V, figure 3). Elle n'augmente
que très peu avec la dose.
2.3.3.1. Activité de la phosphofructokinase chez les animaux
témoins.
La PFKinase est une enzyme très active dans l'encéphale de la Souris.
L'activité totale est de 21,71
± 3,52; 16,83 ~ 2,53 et 14,95 ~ 2,17
~moles/g de tissu frais/min à 37°C respectivement dans le cortex cérébral,
le tronc cérébral et le cervelet. Cette enzyme a une activité relativement
homogène dans les trois structures étudiées. C'est le cervelet qui présente
la plus faible activité, contrairement au cas de la FDPase. La phosphofruc-
tokinase a été étudiée. Des valeurs de 6 à 33 ~moles/g de tissu frais/min
ont été obtenues par d'autres auteurs (14, 21). Il faut souligner que l'a:-
tivité de cette enyzme allostérique subit une régulation très poussée dans
le tissu nerveux et les valeurs obtenues sont très dépendantes des con-
ditions expérimentales (48). Dans tous les cas, l'activité de la PFKinase
est beaucoup plus importante que celle de la FDPase dans le système ner-
veux. Cette situation est contraire à ce que l'on observe dans le foie
où la PFKinase a une activité de 3,3 Jmoles/g de tissu frais/min à 37°C
chez le Rat. Dans le foie des autres vertébrés, les valeurs varient de 1
à 9,2 pmoles/g de tissu frais/min (14). Le système nerveux serait donc
un organe à prédominance glycolytique. L'activité par mg de protéines
totales est de 6,56 ± 0,96; 6,18 ± 0,80 et 5,10 ± 0,40jJmoles/mg de pro-
téines/minute respectivement dans le cortex cérébral, le tronc cérébral
et le cervelet de la Souris.

---

••
- 57 ;.
·5
E
---.!!~'-~en
CORTEX CEREBRAL
.!!
....CI)
•
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~
0
~
TRONC
CEREBRAL
w
~
>
••
-~
22
0
cr
8
24
Heures après
injection
CERVELET
Figure 4 : Chronologie de l'action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur l'activité
totale de la PFKinase dans l'encéphale de la Souris. Le nombre de
déterminations est compris entre 4 et 6. Les différences significatives
avec le test t de Student sont
p < 0,05 •
c=J Témoins
P< 0,01..
_
Soumis à la MSO

---

- 58 -
TEMPS
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
(heures)
Témoi ns
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
à la MSO
à l a t~SO
à la MSO
6,56
6,92
6,18
5,63
5,10
4,93
4
± 0,96
± 0,80
± 0,50
± 0,60
± 0,40
± 0,35
6,72
6,69
5,92
6,26
5,65
5,66
8
± 1,70
± 0,55
± 0,68
± 0,95
± 0,76
± 0,95
7,10
6,98
6,56
7,60
5,31
6,05
24
+ 1,56
± 1,15
± 1,07
± 1,10
± 0,83
± 0,99
•
6,61
6,19
5,97
6,63
5,21
6,00
48
± 0,63
± 0,46
+ 1,42
~ 0,45
± 0,30
± 0,65
Tableau VI
Chronologie de l'action de la t'1S0 (100 mg/kg i.p.) sur
l'activité par mg de protéines de la PFKinase dans l'en-
céphale de la Souris. Le nombre de déterminations est
compris entre 4 et 6.

---

- 59 -
e
.-E
-'0~0-
CORTEX CEREBRAL
C)
E
-Q.1co1u..
CI)
.!
o
E
~
W
:J
o
-
u..
-UW
Q.
TRONC CEREBRAL
Cf)
W
t-
->
-t-
U
cl
4
8
24
48 Heures
après injection
CERVELET
Figure 5 : Chronologie de l'action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur l'activité par
mg de protéines de la PFKinase dans l'encéphale de la Souris. Le nombre
de déterminations est compris entre 4 et 6. Les différences significa-
tives avec le test t de Student sont:
p < 0,05.
1.
1
Témoi ns
~
Soumis à la MSO

---

- 60 -
2.3.3.2. Activité de la phosphofructokinase chez les animaux
................................................................................................
soumis à la MSO.
Lorsque les animaux reçoivent une dose unique de 100 mg/kg de MSO par
voie intrapéritonéale, l'activité de la PFKinase ne varie pratiquement'
pas (36). On observe une très légère.augmentation dans le cortex cérébral
notamment (Tableau III, figure 4).
L'activité spécifique également ne varie pas dans toutes les régions
étudiées (Tableau VI, figure 5).
Il apparaît donc que la MSO n'a pas d'action sur l'activité de la phos-
phofructokinase du cortex cérébral, du tronc cérébral et du cervelet de
la Souris. Dans les mêmes conditions expérimentales, cette mol~cules induit
une activation prononcée de la FDPase de l'encéphale. La MSO provoque
ainsi une modification de l'équilibre existant entre les activités de
la FDPase et de la PFKinase.
2.4. DISCUSSION.
Les résultats précédents indiquent que, chez la Souris non traitée,
l'activité de la PFKinase (enzyme-clé glycolytique) est prédominante sur
l'activité de la FDPase (enzyme-clé gluconéogénique). Cette différence
d'activités indique que dans le tissu nerveux la voie glycolytique prédo-
,nine sur celle de la gluconéogénèse.
L'activité totale de la FDPase varie d'une région à l'autre. Le cervelet
semble être la région la plus gluconéogénique de toutes les régions étu-

---

- 61 -
diées, et le tronc cérébral offrant la plus faible activité. Il semble que
cette répartition soit le reflet d'une distribution hétérogène de la
protéine-enzyme même et non d'une variation de l'activité catalytique.
En effet, dans la préparation partiellement purifiée de la FDPase, l'ac-
tivité spécifique varie dans des proportions moindres que l'activité
totale. Le tronc cérébral semble avoir une sensibilité particulière à
l'action de la MSO. En effet, bien que présentant l'activité FDPasique
la plus faible, c'est dans cette région
de l'encéphale que l'augmentation
est la plus marquée. L'enzyme du cervelet, par contre, est nettement moins
sensible. La distribution de la PFKinase est différente de celle de la FDPase.
D'abord, elle est moins hétérogène. De plus, c'est le cortex cérébral qui
présente la plus forte activité et le cervelet la plus faible. Dans cette
dernière région, le cycle futile fructose-1,6-biphosphate - fructose-6-
phosphate doit avoir une certaine importance relative.
2.4.2. b~_~~~1~_f~~il~_fr~~~Q~~:11§:~!~bQ~~b~~~_~fr~~~Q~~:§:QbQ~:
Qb~~~·
Jusqu'à ces dernières années, un cycle futile fructose-1,6-biphosphate -
fructose-6-phosphate nia pas été décrit dans le cerveau. En effet, l'exis-
tence de la FDPase dans le tissu nerveux étant méconnue (18,24), il appa-
raissait que le fructose-1,6-biphosphate subissait simplement un clivage
aldolique et la glycolyse se poursuivait par les trioses-phosphates. Les
résultats précédents, ainsi que ceux obtenus par d'autres auteurs (10,
13) montrent que chez le Rat et la Souris, dans les conditions physiolo-
giques normales, la conversion du fructose-1,6-biphosphate en fructose-
6-phosphate a lieu. KATZ et ROGNSTAD (48) écrivent: IIWhen interconversion

---

- 62 -
of two compounds occurs by irreversible reactions, and the enzymes cata-
lysing theses reactions are both active, there is "futile cycling" with
dissipation of energy without a corresponding change in metabolites."
Si l'on se réfère à cette définition, on peut conclure que dans l'encé-
phale de la Souris normale, il existe un cycle futile fructose-l,6-bi-
phosphate - fructose-6-phosphate :
PFKinase
Fructose-6-phosphate + ATP ------~~~Fructose-l,6-biphosphate
+ ADP
FDPase
Fructose-l,6-biphosphate
-------t~~ Fructose-fi-phospha te + Pi
Somme
ATP - - - - - - -...~~ ADP + Pi
Avant d'affirmer llexistence d'un tel cycle dans le cerveau, il faudrait
démontrer que les deux enzymes impliquées dans ce cycle sont actives si-
multanément. L1activité de la PFKinase est une évidence. Une démonstra~
tion directe de l t act lvi tê simultanée de la FDPase in vivo, en utilisant
des radioisotopes nia pas encore été faite dans le cerveau comme dans
le foie (49,50,51). Mais, les résultats expérimentaux précédemment dé-
crits (13,52) suggèrent fortement l'activité simultanée de la FDPase et
de la PFKinase dans le tissu nerveux. Ainsi donc, on peut conclure en
l'existence d'un cycle futile dans llencéphale. Quel serait le rôle de
ce cycle futile?
Le cycle futile, comme dans les autres organes, doit jouer un rôle dans
la thermogénèse et dans la régulation métabolique (48).
- Sans changement dans la concentration des métabolites, les réac-
tions précédentes montrent qu'il y a une production de chaleur. Il est
très probable que cette chaleur serve au maintien de la température du
tissu. Mais l'importance de la chaleur produite est fonction de l'état
de l'équilibre existant entre la PFKinase et la FDPase (48). Dans le cer-

---

- 63 -
veau, la faible activité de cette enzyme laisse supposer que la chaleur
produite par ce cycle est relativement faible chez l'animal normal.
Le cycle futile pourrait avoir une plus grande importance dans
enzymes étant allostériques et subissant une régulation très poussée
par différents composés, leurs activités jouent un rôle primordial dans
la régulation du flux glycolytique. Une petite variation de l'activité
de 1'une de ces enzymes se traduit par une modification importante du
flux glycolytique et de l'état énergétique du tissu considéré. Le cycle
futile fructose-l,6-biphosphate - fructose-6-phosphate jouerait donc un
rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique cérébral.
L'action de la MSO sur l'une quelconque de ces enzymes doit se traduire
par une variation importante de l'état énergétique de l'encéphale.
La MSO induit une activation de la FDPase et n'a pratiquement pas d'ac-
tion sur la PFKinase. Dans le système nerveux central, la régulation de
la PFKinase est sens"ible aux mêmes effectueurs que dans le foie et les
autres organes. Par contre, le peu de travaux effectués sur la FDPase
du tissu nerveux ne permet pas une connaissance approfondie de sa régula-
tion. Comme nous le verrons dans la suite de ce travail, il est très peu
probable que la FDPase de l'encéphale subisse la même régulation
que
la FDPase des organes périphériques (10).
Au stade actuel de nos investigations, il est difficile d'entrevoir les
mécanismes par lesquels la MSO active la FDPase. Mais le manque d'effet
sur la PFKinase indique qu'il se produit un déséquilibre dans le cycle
futile. L'ampleur de l'activation de la FDPase

---

- 64 -
conéogenese (48). Il est très vraisemblable
que le nouvel état d'équi-
libre entraîne la production accélérée de fructose-6-phosphate qui sera
transformé ensuite,en glucose-1-phosphate. En effet. KATZ et ROGNSTAD
(48) soulignent que l'augmentation du recyclage dans un cycle futile
amplifie énormément le flux métabolique dans le sens de la réaction pré-
pondérante. C'est ainsi qu'une variation de 5% de l'activité des deux
,enzymes-clés se traduit par une augmentation du flux glycolytique de
20%. Dans le cas de nos ecpëri eices , l'activité de la FDPase augmente
de 3 à Il fois suivant la région considérée. Une telle augmentation
dOlt se tradulre sans doute par une gluconéogénèse considérablement
accrue. Alnsl donc. la méthionine sulfoximine aurait une action marquée
dans la réqul at ion du cycle FDPase-PFKinase. Cette action pri nci pa l e
s'accompagne probablement d'une action thermorégulatrice. En effet.
par les mécanlsmes décrits plus haut. l 'augmentatlon de l'activité de
la FDPase induite par la r1S0 doit s'accompagner d'une hydrolyse accrue
de l 'ATP et donc d'une production accrue de la chaleur dans l'encéphale.
Une mesure directe de la température du cerveau doit confirmer ou in-
flrmer cette lnterprétation.
Quel est le devernr du glucose-1-phosphate néoformé? Il est probable
que la gluconéogénèse soit suivie d'une accumulatlon de glycogène com-
me l'ont dêcr tt HEVOR et GAVET (36).
Le changement d'actlvité d'une protéine-enzyme peut être due à plusieurs
facteurs comme une variation dans le taux de synthèse ou de dégradation,
un cllvage lrr{versible de l'enzyme, une liaison covalente comme la phos-
,
phorylation, une l ra i son de cofacteurs (53). Les resultats précédents
semblent suggérer que l'induction de la FDPase par la MSO serait due à
une variation du taux de synthèse ou de dégradation. Nous avons alors
recherché l es effets de la r·1S0 sur l a quantité de protéi ne-enzyme dans
l'encéphale.

---

- 65 -
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. BEREL, A., LEHR, P.R. and GAYET, J., 1977
Inhibition by metyrapone of convulsions and storage of brain gly-
cogen in mice induced by methionine sulfoximine (MSO).
Brain Res., 128, 193-196.
2. BEREL, A., LEHR, P.R. and GAYET, J., 1977
Inhibition by metyrapone of convulsions and of accumulation of
brain glucose and glycogen in mice induced by methionine sulfoximine
(MSO).
in : Proc.
6th Int. Meet. Int. Soc. Neurochemistry, Copenhagen,
21-26 August 1977, Abstract N° 211.
3. DE ROBERTIS, E., 1971
Studies on neurochemical changes in experimental epilepsy.
Triangle, lQ, 93-98.
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Chapitre III
ISOLEMENT ET PURIFICATION DE LA FRUCTOSE-l,6-BIPHOSPHATASE DANS L'ENCEPHALE
DU RAT. CARACTERISATION BIOCHIMIQUE. ACTION DE LA METHIONINE SULFOXIMINE.

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- 70 -
BIOCHEMICAL SOCIETY TRANSACTIONS 576th MEETING, LONDON
Vol. 6
1029-1031
Fructose 1,6-Bisphosphatase Activity in the Brain of Mice and Rats
Submitted to the Convulsant Methionine Sulphoximine
TOBIAS HEVOR and JACQUES GAYET
Laboratoire de Physiologie générale, Université de Nancy l, 54037 Nancy, France
The intracerebral accumulation of glycogen that occurs during the period of seizures
induced in the moiëe by administration of t-methionine DL-sulphoximine, and that
persists up to 72h after intraperitoneal injection of the drug (Folbergrova et al., 1969;
Folbergrova, 1973), is prevented by the simultaneous injection of rnetyrapone, an
inhibitor of Il P-hydroxylase catalysing cortisol synthesis in the adrenal cortex
(Bérel et al., 1977), but is only partially prevented in adrenalectomized mice (A. Bérel-
Gosset, P. R. Lehr & J. Gayet, unpublished work), It has been suggested (Bérel et al.,
1977) that the ultrastructural damages observed in the brain after t-methionine DL-
sulphoximine administration (De Robertis, 1971) may weil be the prirnary cause of the
long-term accumulation of glycogen, within swollen astrocytes (Phelps, 1975), by an
activation of gluconeogenesis, probably throughregulation by glucocorticoids. Although
brain had been considered as a non-gluconeogenic organ (Scrutton & Utter, 1968), it has
been shown recently in guinea-pig brain slices that gluconeogenesis may proceed from
pyruvate and glutamate, with evidence of fructose 1,6-bisphosphatase (EC 3.1.3.11)
activity (Phillips & Coxon, 1975); moreover, the presence of this key gluconeogenic
enzyme in the rat brain was proved unequivocally (Majumder & Eisenberg, 1977).
Since the control point in glycolysis in the brain must occur particularly at the
phosphofructokinase (EC 2.7.1.11) step (Lowry et al., 1964), the activation of gluconeo-
genesis or inhibition of glycolysis can be effected either by stimulation of fructose
1,6-bisphosphatase or inhibition of phosphofructokinase. The effect of t-methionine
m-sulphoxlmine, administered to the male Swiss rnouse, on the activity of these two
enzymes in the cerebral cortex, brain stem, and cerebellum has been studied to show
whether the cerebral accumulation of glycogen induced by the convulsant originates
from an activation of gluconeogenesis. Fructose 1,6-bisphosphatase, devoid of hexose
6-phosphate and of glucose ô-phosphatase and phosphofructokinase activities, was
prepared from a brain-tissue homogenate as described by Underwood & Newsholme
(1965), and assayed with the cou pIed spectrophotometric method of Latzko & Gibbs
(1974); the activity of fructose 1,6-bisphosphatase was expressed as pmol of fructose
Lô-bisphosphate hydrolysedjmin per g of tissue wet wt. at 37°C. Phosphofructokinase
was prepared from a brain-tissue homogenate and was assayed spectrophotometrically
by an adaptation of the procedures of Newsholme et al. (1977); the activity of phospho-
fructokinase was expressed as /lmol of fructose 6-phosphate phosphorylated/min
per g of tissue wet wt. at 37°C. After intraperitoneal injection of t-methionine DL-
sulphoximine (100mgjkg body wt.), an increase of fructose 1,6-bisphosphatase activity
occurred in the three brain regions studied. This was first apparent during the pre-
convulsive period at 4h; the increases were maximal 24 or 48h after administration of
the drug, with elevation of fructose 1,6-bisphosphatase activity of up to 6-fold in the
cerebral cortex, l l-fold in the brain stem, and 3-fold in the cerebellurn, Previous results
from our laboratory had shown that the increase in cerebral glycogen content under
the same experimental conditions was of the same order of magnitude for these periods
after administration of the convulsant (Bérel et al., 1977). This effect of L-methionine
nt-sulphoximlne on brain fructose Lë-bisphosphatase appeared to be dose-dependent,
since 24h after administration of the drug at an increasing dose of 25-100mgjkg
body wt., fructose 1,6-bisphosphatase increased from 2- to 4-fold in the cerebral cortex,
from 2- to 9-fold in the brain stem, and from 1.5- to 2-fold in the cerebellum. In contrast,
the data for phosphofructokinase activity indicated only a slight e1evation (of about
50 %) for this enzyme under conditions of maximal response of fructose 1,6-bis-
phosphatase, i.e. 24h after administration of t.-methionine nt-sulphoxirnine (lOOmgjkg
body wt.),

---

- 71 -
Recently we have performed the isolation and purification of fructose 1,6-bisphos-
phatase from cerebral cortex isolated from male Sprague-Dawley rats by an adaptation
of the procedures of Traniello et al. (1971) and Majumder & Eisenberg (1977), including
five successive steps: (1) a centrifugation at lO000g for 20min of a homogenate of the
brain tissue; (2) a heating of the supernatant rapidly at 55°C for 20s, followed by a
rapid coolingat O°Cand a centrifugation at 1ooOOOg for 60min; (3) an acidification of the
supernatant to pH 5.0 with acetic acid, followed by a centrifugation at 60oo0g for 30min
and neutralization of the supernatant to pH 7; (4) adsorption of the neutralized extract
to a phosphocellulose P Il column, followed by elution with fructose 1,6-phosphate
and concentration of the fractions; (5) filtration of the concentrated enzyme preparation
through a Sephadex G-2oo column, and verification of the purity of the fractions by
absorbance measurements and polyacrylamide-gel dise electrophoresis in a standard
7% acrylamide gel (Davis, 1964). Fructose 1,6-bisphosphatase activity in the fractions
emerged as an unique peak, and the gels stained after electrophoresis with Coomassie
Brilliant Blue showed one protein band. Under these experimental conditions the
overall purification was 169-fold, with a yield of 35 %' When male Sprague-Dawley
rats were submitted to an intraperitoneal injection of L-methionine nt-sulphoximine
(Ioomg/kg body wt.), 24h later purified fructose 1,6-bisphosphatase in the cerebral
cortex increased about 2-fold, with a lesser elevation of its specifie activity. Under the
same experimental conditions the increase in the glycogen content of the cerebral cortex
was of the same order of magnitude as that of fructose l,6-bisphosphatase (A. Bérel-
Gosset, unpublished work).
The results thus obtained confirm that brain tissue injury induced by t-methionine
ut-sulphoximine administration does enhance gluconeogenesis, probably in astrocytes,
through an activation and/or biosynthesis de nopa oF the key enzyme fructose
1,6-bisphosphatase.
This research was supported by grants From the Centre National de la Recherche Scientifique
(no. E.R.A. )31) and From the Fondation pour la Recherche Médicale Française.
Bérel, A., Lehr, P. R. & Gayet , J. (1977) Brain Res. 128, 193-196
Davis, B. J. (1964) Ann. N. Y. Acad. Sei. 121,404-427
De Robertis, E. (1971) Triangle 10, 93-98
Folbergrova, J. (1973)J. Neurochem, 20. 547-557
Folbergrova, J., Passonneau, J. V.. Lowry, O. H. & Schultz, D. W. (1969) J. Neurochent. 16,
191-203
Larzko, E. & Gibbs, M. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.),
pp. 881-884, Academie Press, New York
Lowry. P. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X. & Schulz, D. W. (1964) 1. Biol. Chem.
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Majumder, A. L. & Eisenberg, E., Jr. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 3222-3225
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Scrurton , M. C. & Utter, M. F. (1968) Annu. Rev. Biochem. 37, 249-302
Traniello, S., Pontrernoli , S., Tashirna, Y. & Horecker, B. L. (1971) Arch. Biochem. Biophys.
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Underwood, A. H. & Newsholme, E. A. (1965) Biochem, J. 95, 767-774

---

- 72 -
3.1. INTRODUCTION
Plusieurs auteurs avaient tenté d'élucider les mécanismes par lesquels
la r·1S0 mdui t une accunulation de glycogène dans le systàne nerveux
central. In vivo, dans des conditions expérimentales où la r1S0 induit
une accunulation consldérable de glycogène, l'activité de la phospho-
rylase totale ne varie pas (4). Ce nlest que pendant les convulsions
qu'on observe une faible diminution passagère de la phosphorylase ac- '1
tive, dimlnution qui n'explique pas l 'accunulation de glycogène. FOL-
BERGROVA (4) invoque alors des mécanismes devant faire intervenir des
hormones. Cette hypothèses peut également être mise en rapport avec le
manque d'action de la MSO in vitro sur l'accumulation de glycogène. En
effet, dans les coupes de cortex cérébral de Souris, incubées en présence
de différentes concentrations de MSO, aucune variation de la teneur en gly-
cogène nia été observée (4). Une action directe de la molécule paraît
donc peu probable. L'action de la MSO sur le métabolisme glucidique doit
donc être une action indirecte. L'hypothèse d'une intervention hormonale
a été également suggérée par HEVOR et GAVET (15).
Comme nous l'avions souligné précédemment (15), l 'accunulation de gly-
cogène peut être en rapport avec les dommages ultrastructuraLD< provo-
qués par la MSO (10). On sait que dans les cas d'atteintes du tissu
nerveux, comme une blessure mécanique, une irradiation aux particules
0(, aux rayons X oU~lon observe une accunulation localisée de glyco-
gène,
en particulier
dans
les astrocytes
(16).
Il
est
possible
que
ce
soit
également le
cas
de
la
MSO.
L'accumulation
du
po-

---

- 73 -
lysaccharlde peut être un phénomène de réraratlon du tlssU lésé. Dans
les cas de réparation, la synth~se protéique peut être accélérée (17).
Les résultats obtenus précédemment montrent qu'une telle synthèse est pro-
bable dans l'encéphale des animaux soumis a la MSO. C'est pourquoi, une
étude de la concentration tissulaire en FDPase a été entreprise.
Les méthodes d'étude de la synthèse protéique dans le système nerveux
central font souvent l'objet de controverses (18,19). Après une criti-
que de toutes les techniques utilisées, DUNN (19) conclut qu'il est
très difficile d'estimer le taux de synthèse protéique dans le cerveau
in vivo avec autant de précision que dans les organes périphériques. Un
des problèmes majeurs est la présence de la barrière sang-cerveau qui
limlte la pénétration des précurseurs de façon différentielle dans le
parenchyme cérébral. Cette pénétration est d'autant plus complexe que
l'administration d'un précurseur donné peut freiner la pénétration d'un
autre acide aminé. De plus, une compartimentation très poussée du système
nerveux central empêche une imprégnation homogène par le précurseur. Ces
remarques suggèrent l'utilisation de plusieurs méthodes pour aborder le pro-
blème de la synthèse protéique cérébrale (18).
SCHIMKE et DOYLE (20) soulignent que le meilleur moyen de savoir si une in-
duction enzymatique est due à une synthèse protéique est d'isoler l'enzyme
et de voir si le tissu traité avec l'inducteur contient plus de protéine-
enzyme. Nous avons choisi cette méthode pour étudier l'action de la MSO
sur la protéine-enzyme de la FDPase. La FDPase du foie, du rein et du mus-
cle a été purifiée par plusieurs auteurs (21, 22, 23, 24). Les méthodes
utilisées par ces auteurs ont été adaptées pour isoler et purifier la FDP-
ase du cerveau (8). Certaines caractéristiques biochimiques de la FDPase
ont pu ainsi être déterminées.

---

- 74 -
3.2. MATERIELS ET METHODES.
3.2.1. Matériels.
3.2.1.1. Animaux.
La Souris avait été uti1iséeen raison de sa sensibilité particulière
à la ~lS0. Parmi tous les animaux utilisés, la Souris semblerait avoir
les convulsions épileptiformes les plus typiques. Cependant, l'isolement
de la FDPase nécessitant une quantité importante de tissu nerveux, un ani-
mal de plus grande taille paraissait plus convenable. Dans ce but, le Rat,
Rattus norvegicus, de souche
Sprague Daw1ey a été utilisé. Ce sont des
animaux mâles, pesant en moyenne 300 g. Ils sont fournis par un élevage
local (P. JANVIER, Le Genest) et sont gardés dans les mêmes conditions que
les souris.
3.2.1.2. Réactifs.
Phosphoce11u1ose P Il
Whatrnan,Maidstone
Eng 1and
Acry1ami de
N,N'méthy1ène-bisacry1amide
N,N-N' ,N' tétraméthy1 ène di ami ne (TEr1ED)
Persulfate d'ammonium
Serva,
Bleu brillant de Coomassie
Hei de 1berg
Sephadex
Pharmacia,
Kit de calibration des poids moléculaires des protéines Uppsala, Sweden

---

- 75 -
3.2.2. Méthodes.
3.2.2.1. Chromatographie sur Phosphocellulose.
La FDPase est lsolée par chromatographie sur Phosphocellulose. La chromato-
graphie est effectuée sur une colonne de dimension 1,6 x 30 cm. La résine
utilisée est une résine destinée aux échanges de cations, la phosphocellu-
lose P Il. La phosphocellulose commerciale renferme une quantité lmpor-
tante d'ammonium. Elle est recyclée suivant la technique de HAN et coll.
(25). Elle est trai tëe avec 15 volumes (plv) de Na OH 0,5 N pendant 30
mlnutes. On procède ensuite à un lavage à l'eau bidistillée jusqu'à
pH neutre. On ajoute 15 vo l unes d'HCl 0,25 rJ pendant 30 minutes . Un nou-
veau lavage est effectué jusqu'à pH neutre. La résine ainsi recyclée
est conservée dans du tampon acétate 0,2 r1 pH 6,3. Avant chranatographie,
elle est lavée à l'eau bidistillée, puis équilibrée avec du tampon acé-
tate 10 mM pH 5,7. Ensuite elle est introduite dans la colonne.
3.2.2.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Une électrophorèse analytique est effectuée avec les différentes frac-
tions protéiques.
3.2.2.2.1. Electrophorèse standard.
Clest une électrophorèse di scont i nue effectuée suivant la technique de
nAVIS (2) modlfiée (26, 27). Le gel de séparation est de 7% d'acrylamide
et le gel de préconcentration à 3%. Les gels sont coulés dans des tubes
de dimensions 0,6 x 6,5 cm. La polymérisation ne nécessite pas un éclai-
rage ultra-violet. Après polymérisation, 15 à 20 ug de protéines sont dé-
posés sur le gel. La migration se fait dans un appareil de Pleuger (Mo-
dèle Acrylophor, Belgique) à 4°C. Elle se fait à courant constant de 2
mA par tube.

---

- 76 -
Après migration, les gels sont colorés par le bleu brillant de Coomassie.
en solution dans de l'acide acétique méthanolique pendant une nuit. Ils
sont ensuite décolorés par électrophorèse dans un appareil de PLEUGER.
Les gels non colorés subissent quelquefois un scanning. Le gel est dans
un tube de quartz qui est introduit dans l'appareil à scanner BECKMANN
(Gel scanner). Ce dernier est monté dans le compartimnet à cuves d'un
spectrophotomètre Beckman Acta III. La longueur d'onde est fixée à 280
nm et le scanning se fait soit à 1,5 cm/min, soit à 6 cm/min. Les dif-
férents pics sont enregistrés; le début et la fin du gel sont nettement
marqués, permettant ainsi une bonne détermination des mobilités.
sodium.
L'étude du poids moléculaire a été effectué par électrophorèse discon-
tinue en présence de dodécylsulfate de sodium (SOS) suivant la méthode
de WEBER et OSBORN (28). Le gel-tampon et le gel d'électrode sont pré-
parés avec du SOS. Les protéines sont chauffées dans un tampon phosphate
10 mM, pH 7,contenant 0,5 Md'urée, 1% de mercaptoéthanol et 1% de SOS
La migration se fait à courant constant de 5 mA par tube.
Comme pour l'électrophorèse standard, les gels sont colorés au bleu de
Coomassie puis décolorés; on peut aussi enregistrer l'électrophorégramM
me avec le scanner. Un étalonnage est effectué avec un kit de calibration.
Clest un mélange de protéines de poids moléculaires connus.
3.2.2.3. Evaluation des acides aminés.
La composition en acides aminés de la FOPase a été déterminée par hydro-

---

- 77 -
lyse acide. Un échantillon de protéines électrophorétiquement pures est
hydrolysé en présence d'HCl 6 N. Les tubes, scellés sous vide poussé,
sont introduits dans un four Pasteur a 110°C pendant des temps varia-
bles. L'hydrolysat, après déssication, est repris dans un volume donné
dl HCl 0,1 N.
Le dosage des acides aminés est réalisé avec un autoanalyseur TECHNICON
(Modèle NC II P). Les acides sont séparés sur une colonne de résine
échangeuse de cations. L'élution se fait avec un gradient de pH. Les
acides aminés, séparés suivant leur pHi, sont dilués a la sortie, puis
colorés a la ninhydrine. La densité optique est lue a 405 nm. La nor-
leucine est utilisée comme étalon interne. L'a~pareil a été initialement
étalonné avec un mélange diacides aminés de. composition connue. Les dif-
férents pics sont enregistrés et leur surface est donnée par un inté-
grateur.
3.2.2.4. Détermination du poids moléculaire.
Les techniques actuelles de détermination du poids moléculaire des pro-
téines comportent chacune des insuffisances. Il est souhaitable de faire
cette détermination avec plusieurs méthodes. Nous avons choisi la mé-
thode de DELAAGE (29) en plus de la précédente.
Cette méthode utilise la composition en acides aminés d'un échantillon
d'une protéine pure. Le principe est le suivant:
- soit xi le nombre de pmole d'une espèce i d'acides aminé donnée
dans l'échantillon ( acide aspartique, thréonine, sérine .... )
- soit Ni le nombre de résidus de cet acide aminé i dans une mole
de protéine
- soit x le nombre de ~mole de protéine contenue dans l'échantillon
analysé.
Il est évident que x· = N.x
l
l
La valeur xi est déterminée lors de l'analyse des acides aminés et pour

---

- 78 -
chaque acide aminé. La valeur x est tout simplement le plus grand di-
viseur commun des x .. Il s~ffit de déterminer ce plus grand diviseur
,
commun et d'en déduire Ni et donc le poids moléculaire. Dans la pratique,
pour faciliter les calculs, DELAAGE (29) donne une méthode de détermina-
tion
du plus grand commun diviseur par récurrence. Ces calculs sont pro-
grammés sur machine (Ordinateur SEMS, modèle Mitra 15). Les données 'néces-
saires pour la machine sont la composition en acides aminés de l'échantil-
lon et le poids moléculaire de chaque acide aminé.
La limite principale de cette méthode est la pureté de l'échantillon.
La protéine doit avoir une pureté élevée pour que le poids moléculaire
ainsi déterminé soit exact. Nous avons procédé à une purification sup-
plémentaire. Après électrophorèse sur gel de polyacrylamide, la bande
majeure correspondant à la FDPase estdécoupée, en se servant d'un té-
moin qui a été coloré au bleu de Coomassie. Plusieurs gels sont découpés
et homogénéisés dans un appareil de Potter-Elvejem .L'homogénat est cen-
trifugé à 30 000 x g pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant est ultra-
centrifugé, puis lyophilisé. Le lyophilisat sera hydrolysé pour la dé-
termination du poids moléculaire.
3.2.2.5. Purification de la FDPase.
La FDPase de l'encéphale du Rat a été isolée et purifiée suivant les
méthodes de TRANIELLO et coll. (13) et de MAJUMOER et EISENBERG (8). Les
différentes étapes de la purification ont dèjà été décrites ( HEVOR
et GAVET, 15).
3.2.2.6. Activité enzymatique.
L'activité de la FDPase des différentes fractions ob~nues lors de la
purification est évaluée de la même façon qu'au Chapitre II. Lorsque

---

- 79 -
l'activité est faible, la fraction est concentrée par diafi1tration sur
membrane AMICON (Amicon Diaf10, PM la) avant les mesures.
3.3. RESULTATS.
Les différentes étapes de la purification sont rassemblées sur le ta-
bleau
J.
3.3.1.1. Evolution de l'activité totale.
L'activité totale diminue fortement avec les différents traitements.
Certains auteurs procèdent à un chauffage plus important de la fraction
brute (8). Un chauffage à 55°C pendant 3 minutes entraîne une très for-
te diminution de l'activité totale. Un chauffage rapide, suivant la
méthode de HAN et coll. (25) entraîne une diminution modérée de 24%
(Figure 1). Après acidification, il y a une autre perte de 22% d'acti-
vité par rapport à la fraction brute. A la fin de la purification, l'ac-
tivité restante constitue 34% de l'activité initiale.
3.3.1.2. Evolution de l'activité spécifique.
Dès les deux premières étapes de la purification (chauffage et acidifi-
cation), l'activité spécifique double pratiquement (Figure 1). L1étape
importante est la chromatographie d'affinité sur phosphoce11u10se. La
fraction acidifiée est chargée sur cette colonne et abondamment lavée
jusqu'à disparition des protéines. Lorsqu'on élue la FDPase avec une
solution de son substrat, on obtient un seul pic (figure 2). Cette chro-

---

- 80 -
Acti vité to-
Quantité de
Activité spé- % de récupé-
tale
protéines
cifique
ration
}Jmole/g/min
mg/g
jJmo 1e/mg de
prot./mi n
Fraction
brute
0,063
28,16
0,0023
100
Fracti on trai-
tée à 1a cha-
leur
0,048
14,33
0,0034
77
Fracti on aci-
difiée
0,034
7,50
0,0045
53
Fraction P-
cellulose
0,024
0,064
0,375
37
Fraction Se~
phadex
0,021
0,054
0,388
34
Tableau 1
Etapes de la purificatin de la FDPase dans le cortex cérébral du Rat.
Le pourcentage de récupération est calculé par rapport à l'activité
totale initiale (une expérience tirée d'une série de 3 expériences).

---

- 81 -
ACTIVITE TOTALE
jrmole F-6-P/g de tissu fra'is/min
0,12
0,08
0,04
0'---_--1-_
ACTIVITE SPECIFIQUE
JJmole F-6-P/mg prot./min
0,5
0,3
il
0,002
0'-_--'-_
Fa
FC
FA
P-cell
Seph
Figure 1 : Purification de la FDPase de l'encéphale du Rat. Les étapes sont:
FB
Fraction brute obtenue après homogénéisation et centrifugation
Fe : Fraction chauffée et centrifugée à haute gravité
FA : Fraction acidifiée
c===J
Témoins
P-cell : Fraction phosphocellulose
~
Soumis à la MSO
Seph : Fraction Sephadex

---

- 82 -
0.0.
(avant élution)
0.0.
(après élut ion)
0,10
2,0
1,0
0,01.--'- - - . . . . l . . - - - - - - - I - - - - - - - f
o
5
10
Â45
50
55
Elution
FRACTIONS
(Sm!)
Figure 2 : Chromatographie d'affinité de la FDPase sur phosphocellulose P Il. La
résine est recyclée suivant la méthode de HAN et coll. (25). Après la
charge de l'enzyme, la colonne est abondamment lavée avec du tampon
acétate 0,2 M,pH 5~8 contenant de l 'EDTA 0,1 mM. Après disparition des
protéines, la FDPase est éluée avec une solution de fructose-l,6-biphos-
phate dans du tampon acétate 0,2 M, pH 6,3 contenant 0,1 mM D'EDTA, à
la vitesse de 5 ml/heure.

---

- 83 -
1
2
A
B
Figure 3 : Electrophorèse sur gels de polyacrylamide.
A) Etapes de la purification de la FDPase. 1. Fraction brute.
2. Fraction chauffée. 3. Fraction acidifiée. 4. Fraction phos-
phocellulose. 5. Fraction Sephadex.
B) Protéines de calibration (1) et FDPase (2) (gels SDS). a = thy-
roglobuline (330 000); b = ferritine (220 000); c = albumine
(67 000); d = catalase (60 000); e = lactate déshydrogénase
(36 000); f = ferritine (composante de 18 000).

---

- 84 -
Figure 31 : Electrophorèse sur gel de ployacrylamide.
Etapes de la purification de la FDPase après administration de MSO
(100 mg/kg i.p.) aux animaux (gels standard).
1 - Fraction brute
4 - Fraction phosphocellulose
2 - Fraction chauffée
5 - Fraction Sephadex
3 - Fraction acidifiée

---

- 85 -
150
1
0.0. x 1000
100
50
OJ.-.,
--'-
~~---......I.----~----.l.-----~--
___
20
40
60
FRACTIONS (2,5ml)
Figure 4
Chromatographie de la FDPase sur colonne de Sephadex G 200. Le gel est
équilibré avec du tampon acétate 0,2 M, pH 6,4 contenant de l'EDTA
0,1 ml~. Les fractions phosphocellulose sont concnetrées sur membrane
Amicon PM 10 et chargées sur la colonne. L'élution se fait avec le tam-
pon d'équilibration à la vitesse de 2,5 ml/ho Les fractions de 2,5 ml
sont receuillies.

---

- 86 -
matographie purifie la FDPase de 169 fois par rapport à l'activité ini-
tiale. L'électrophorégramme indique la présence de deux bandes mineures
(figure 3). Ces bandes peuvent être éliminées soit par un lavage inten-
sif de la colonne de phosphocellulose avant l 'élution de l'enzyme, soit
par filtration sur'gel de Sephadex G 200. Par chromatographie sur gel
de Sephadex, après passage de protéines de plus petites tailles, la FD-
Pase émerge sous la forme d'un pic unique et symétrique (figure 4).
Cette symétrie indique qu'il s'agit vraisemblablement d'une seule et uni-
que protéine.
L'activité spécifique finale de 0,388 ~mole/mg de protéines/min est net-
tement plus fa"ible que celle obtenue par d'autres auteurs dans le foie
de Mammifère ou de l 'Oiseau (21,25). Le pouvoir catalytique de la FDPase
de l'encéphale est plus faible que celle du foie (8). Il est difficile
de-savoir si le procédé
d'isolement affecte ou non l'activité cataly-
tique de l'enzyme.
3.3.2. Ç~~lg~~~_ç~r~ç!~ri~!ig~~~_~iQçbi~ig~~~_~~_l~_fr~ç!Q~~:
! l§ :
~i~bQ~~b~!~~~_~~_çQr!~~_ç~r~~r~l_~~_~~!·
3.3.2.1. Action du pH.
L'activité de l'enzyme a été évaluée tout le long de la purification à
pH 7,5 et à pH 9,5. L'activité est maximale à pH 7,5. Lors des premiers
essais de purification, une estimation à pH 5 ne donne qu'une activité
résiduelle négligeable. A pH 9,5, l'activité obtenue est inférieure de
2,5 fois environ à l'activité à pH 7,5, aussi bien dans la fraction
pure que dans les fractions précédentes. Ce résultat diffère de celui
2
obtenu par MAJUMDER et EISENBERG (8) en absence de Mg +. La FUPase isolée
est donc une enzyme de type neutre. Dans le foie, une FDPase alcaline et une
FDPase neutre ont ètè isolèes avec un pH optimum de 7-7,5 et 9-9,2 réspec-
tivement (21). Dans nos expériences, le rapport de l'activité à pH 7,5
à l'activité à pH 9,5 reste constant tout le long de la purification.
Il n'y a donc pâs d'interconversion d'une forme neutre en une forme al-

---

- 87 -
caline comme on peut l'observer dans le foie, dans certaines conditions.
3.3.2.2. Action de quelques cofacteurs.
L'activité de la FDPase du cortex cérébral a été déterminée en présence
d'inhibiteurs et d'activiteurs de la FDPase du foie. La suppression des
ions Mg 2+ , cations indispensables pour l'enzyme du foie, ne modifie pas
l'activité de la FDPase cérébrale. Les ions Mn 2+ , ~ la concentration de
O,5lTIMn'ont également pas d'action. Le 5' AMP, puissant inhibiteur al-
lostérique de l'enzyme du foie n'a pas d'effet. Ces propriétés de l'en-
zyme cérébrale ont déjà
été observées par d'autres auteurs (8). Il est
possible que l'enzyme du cerveau ait une configuration différente de
l'enzyme du foie.
3.3.2.3. Composition en acides aminés.
Après isolement de l 'enzyme ,du gel de polyacrylamide, la FDPase a ur.e
pureté élevée qui permet la détermination de sa composition en acides
aminés (figure 5).
On sait que l 'hydrolyse des acides aminés augmente généralement avec le
temps et qu'une hydrolyse poussée peutentratner la dégradation de cer-
tains acides aminés. Chaque acide aminé a un temps d'hydrolyse propre.
Les hydrolyses ont été donc effectuées au bout de temps variables
(Tableau 2). Après un temps d'hydrolyse de 24 heures et de 48 heures,
le nombre de résidus acides aminés libérés est relativement constant
pour la plupart des acides aminés sauf la sérine, la cystéine, la mé-

---

- 88 -
-
-
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l
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Figure 5 : Spectre de l'analyse des acides aminés de la FDPase du cortex cérébral
du Rat, sur Autoanalyseur Technicon Ne II P avec les surfaces intégrées.

---

- 89 ~
Acides ami %acides
Nombre de
dans l' hy- ami nés dans Mo les diA.
Acides aminés dans l 'hydrolysat
drolysat
l 1 hydro ly-
A.. dans
6 H
24 ~
48 H
n~1
sat
40 000
Asp
56,569
54,416
55, 786
56,57
10,37
31,15
31
Thr
27,181
27,509
26,027
27,51
5,04
16,93
17
Ser
36,073
31,792
26,501
36,07
6,91
25,16
25
Glu
62,070
60,536
61,782
62,07
11 ,37
30,93
31
l-r-:
1
Pro
27,442
29,998
27,304
30,00
5,50
19,10
19
Gly
46,678
45,032
45,541
46,78
8,57
45,66
46
f--
Ala
45,598
45,088
45,888
45,89
8,41
37,75
38
-
1/2 Cys
6,060
-
-
6,06
1,11
3,70
4
Val
28,985
38,301
38,299
38,30
7,02
23,91
24
---
Met
10,664
6,310
2,102
10,66
1,95
5,24
5
Ileu
20.423
22,181
25,175
25,17
4.61
14,06
14
Leu
43,699
45,834
44,3~7
45,83
8,40
25,60
26
Tyl"
11,739
11 ,242
10,195
11,74
2,15
4,75
5
Phe
19,698
19,572
20,646
20,65
3,78
9,16
9
Lys
46,155
37,098
34,315
46,15
8,46
23,14
23
His
11 ,543
12,055
11,334
12,05
2,21
5,69
6
- -
Arg
22,621
18,571
24,218
24,22
4,44
10,19
10
- - --
-- r---
Try
-
-
-
-
-
-
NH
53,330
54,293
51,182
54,20
3
Tableau II
Composition en acides aminés de la FDPase du cortex cérébral du Rat.

---

- 90 -
thionine et le tryptophane. Une hydrolyse d'une courte durée de 6 heures
a été réalisée. On obtient alors 6 résidus de cystéine et le nombre de
résidus sérine et méthionine augmentent notablement. Par contre, aucun
résidu tryptophane n'a été détecté. On sait que le tryptophane présente
une sensibilité particulière à l'hydrolyse: le noyau indole est rapi-
dement détruit à 110°C en milieu acide. Une hydrolyse rapide de 6 heures
en milieu réducteur (sulfate ferreux à 0,1%) n'a donné aucun résultat.
Dans ces conditions, le nombre de résidus cystéine, acide aminé parti-
culièrement sensible, nia pas augmenté non plus.
Les différentes valeurs obtenues avec les différents temps sont compa-
rées et la valeur maximale est retenue. Dans la composition en acides
aminés, il semble y avoir une prédominance de résidus acides. L'acide
aspartique et l'acide glutamique constituent une forte proportion. Par-
mi les résidus basiques, la lysine prédomine avec 46 résidus. Les acides
aminés neutres notamment la glycine et l'alanine sont largement repré-
sentés. On remarque une importance relative de la 'va~line, acide aminé
essentiel chez le Rat.
3.3.2.4. Poids moléculaire.
Le poids moléculaire (PM) a été déterminé avec deux méthodes
le gel de polyacrylamide en présence de SDS
- la composition en acides aminés.
3.3.2.4.1. Détermination du PM avec le gel de polyacrylamide .
........
." .
Une calibration a été établie avec la méthode de WEBER et OSBORN (28).
Les protéines de référence
utilisées sont rassemblées dans le Tableau
suivant :

---

- 91 -
,
PM
Protéines
sous-uni tés
PM
Origine
---
Thyroglobuline
330 000
669 000
Thyroïde de porc
Ferritine
220 000
440 000
Rate de cheval
(18 500)
Catalase
60 000
232 000
Foie de boeuf
Lactate déshydrogénase
36 000
140 000
Coeur de boeuf
Albumine
67 000
67 000
Sérum de boeuf
Tableau III:Protéines utilisées pour la courbe de référence de
détermination du poids moléculaire.
Les résultats sont illustrés dans la Figure 3. Les mobilités sont déterminées
par scanning. La mobilité de la FDPase permet d'estimer le poids moléculaire
de la sous-unité de cette enzyme à 40 000 environ. L'électrophorèse en pré-
sence de SOS indique que les sous-unités sont identiques. Ces résultats sont
voisins de ceux déjà obtenus pour la FDPase de l '~ncéphale du Rat (8).
3.3.2.4.2. Détermination du PM par la composition en acides
aminés.
Pour la détermination du poids moléculaire, les valeurs maximales obte-
nues pour la composition en acides aminés ont été utilisées. Les calculs
sont effectués sur machine, en aveugle, à l'aide d'un programme préétabli.
La composition en acides aminés est recalculée accessoirement (fig.6).
Le poids moléculaire est estimé à 40 800. Cette valeur est très voisine
de celle qui a été déterminée par la méthode de WEBER et OSBORN (28).

---

ACIDE
X
p
1
510.57
133.10
1
2
27. ~I
Il ~.\\ u
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3
30.07
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Figure 6
Détermination du poids moléculaire de la FDPase du cortex cérébral du
Rat par l'analyse des acides aminés. La détermination des NI est effec-
tuée sur machine (Ordinateur SEMS Mitra 15).
A : Détermination globale - B
Détermination rapprochée dans la zone
du poids moléculaire trouvé en A.

---

- 93 -
Activité
Quantité
Activité
% de récu Act.pH 7,5
totale
de
spécifiqUE péra ti on
Act.pH 9,5
}Jmo~e/g/ protéine jJmole/mg
mln
mg/g
prot./min
Fraction brute
0,120
33,17
0,0036
100
2,38
Fracti on tra itée à
la chaleur
0,097
17,19
0,0056
81
2,35
Fraction acidifiée
0,061
8,90
0,0068
51
2,80
Fraction P-cellu-
lose
0,049
0,093
0,526
41
2,50
Tableau IV
Purification de la FDPase dans le cortex cérébral du Rat soumis à la
MSO (100 mg/kg i.p.). Le pourcentage de récupération est calculé
par rapport à l'activité totale initiale (une expérience tirée
d'une série de 3 expérience).

---

- 94 -
PROTEINES
mg/g de tissu frais
30
O'--_.....L_
FB
FA
Fe
P-cell
Seph
Figure 7 : Evolution des protéines lors de la purification de la FDPase du cortex
cérébral du Rat.
Témoins
Soumis à la MSO ~

---

- 95 -
3.3.3. ~~!iQ~_2~_l~_~~Q_~~~_l~_e~Q!~i~~:~~~~~~_2~_l~_f~~~!Q~~:!1§:
~iebQ~eb~!~~~·
3.3.3.1. Action de la MSO sur le comportement du Rat Sprague-
Dawley.
Les animaux sont traités avec une dose de IOn mg/kg de MSO en solution
dans du NaCl g%o. Le syndrome épileptiforme
suit à peu près la même
évolution que chez la Souris. Cependant, il y a une différence impor-
tante: les convulsions cloniques sont pratiquement inexistantes. Lors-
qu'on augmente la dose de MSO jusqu'à 300 mg/kg, ces convulsions clo-
niques prennent de plus en plus dlampleur. Mais elles n'ont jamais atteint
l 'intensit~ de celle~ l,bservées chez la Souris. Il y aurait donc une
différence de sensibilité génétique.
3.3.3.2.MSO et Fructose-l.6-biphosphatase.
Au bout d'une période de 24 heures correspondant à l'accumulation maxi-
male de glycogène, les animaux sont décapités et la FDPase est isolée et
purifiée comme précédemment. Les résultats sont rassemblésdans le tableau
4. La MSO induit une augmentation d'environ 100% de l'activité de la
FDPase. Cette augmentation s'observe tout au long de la purification.
L'activité spécifique augmente également mais dans des proportions moin-
dres, soit 36% environ.
L'évolution de la concentration tissulaire en protéines lors de la puri-
fication montre qulil y a peu de changement au bout des trois premières
étapes (fig.l). Par contre. après la chromatographie d'affinité. la quan-
tité de protéines est nettement plus importante dans les tissus des ani-
maux traités. On observe une valeur supérieure de 45% à celle des ani-
maux témoins.
Les résultats précédents prouvent que la MSO à une propriété d'induction

---

- 96 -
sur 1'activté de la FDPase dans l'encéphale du Rat.
3.3.3.3. Propriétés de la fructose-l,6-biphosphatase après trai-
.......................................................
tement à la MSO.
Les caractéristiques biochimiques de la FDPase après traitemènt des
animaux avec la MSO semblent être En tout p6int identiques a celles de
11enzyme des animaux témoins. La figure 3 montre une électrophorèse
standard sur gel de polyacrylamide effectuée lors de la purification
de 11enzyme des animaux traités. Elle est semblable à celle que nous
avions obtenu précédemment. Le pH optimum est de 7,5 comme précédem-
ment. Les ions Mg 2+,Mn 2+ de même que le 5 1AMP nlont pas d'action non
plus. La composition en acides aminés déterminée après une hydrolyse
de 24 heures est tout à fait semblable à celle que nous avons déjà
obtenue pour 11 enzyme des animaux témoins.
On peut donc conclure que le traitement des animaux par la MSO ne modi-
fie pas 1lapoenzyme de la FDPase du cortex cérébral du Ràt.
3.4. DISCUSSION.
La FDPase a été étudiée dans le foie et les autres organes périphériques.
Les résultats que nous avons obtenus, comparés avec ceux des autres

---

- 97 -
auteurs montrent que l'enzyme du cerveau diffère de celle des organes
périphériques par certaines propriétés.
3.4.1.1. Influence des cofacteurs.
2+
2+
Les ions Mg
et Mn
ne sont pas indispensables à l'activité de la
FDPase cérébrale, contrairement au c~s de la FDPase hépatique. De même,
le 5'AMP n'est pas un inhibiteur. Par la mesure des constantes de liai-
son, PONTREMOLI et coll. (21) ont montré qu'il existe au moins 4 sites
de liaison
par molécule de FDPase du foie. Le fructose-1,6-biphosphate,
2+
2+
le Mg
ou le Mn 2+ aurait chacun un site distinct. La liaison du Mn
au site n'intervient qu'en présence de fructose-1,6-biphosphate. La sé-
quence des réactions serait la suivante :
FDPase + F-1,6-P
FDPase - F-1 6-P
2
•
2
FDPase - F-1,6-P
+ Mn 2+_ FDPase + F-6-P + Pi + ~1n2+
2
Pour l'enzyme du cerveau, le complexe FDPase-F-1,6-P
n'aurait pas
2
.
2+
2+
besoin de Mn
ou de Mg
pour la trans forma t icn du substrat. D'autre
part, il est possible que la FDPase cérébrale ne soit pas allostérique
si le 5'AMP n'a aucun effet. Toutefois, il faudrait s'assurer que l'en-
zyme isolée n'a pas perdu ses propriétés lors de la purification. Dans
tous les cas, il semble que les propriétés de la FDPase du foie sont
liées à l'existence de certains résidus acides aminés (21) : la liaison
du fructose-1,6-biphosphate et de l 'AMP serait tributaire de deux sé-
quences d'acides aminés comportant chacune 4 résidus tyrosine. On sait
2+.
aussi qu'un résidu cystéine est impliqué dans la liaison du Mn
Les
différences dans la composition en acides aminés de l'enzyme du foie et
de l'enzyme du cortex cérébral sont peut-être à l'origine des diffé-
rences dans les propriétés catalytiques.
3.4.1.2. Structure moléculaire de la fructose-1,6-biphosphatase.
Le tableau 5 résume la composition en acides aminés de la FDPase de dif-

---

- 98 -
AC IDES AIU NES
FOIE
FOIE
CERVEAU
FDPase neutre
FDPase alcaline
Asp
135
128
124
thr
72
70
68
Ser
76
79
100
Glu
104
81
124
Pro
59
52
76
Gly
102
100
184
Ala
117
106
152
1/2 Cys
22
20
16
Val
100
104
96
Met
33
34
20
!leu
75
70
56
Leu
111
94
104
Tyr
46
52
20
Phe
36
40
36
Lys
120
117
92
His
24
14
24
Arg
54
34
40
Try
-
-
-
Tableau V
Composition en acides aminés de la FDPase de différentes sources. Les
compositions en acides aminés de la FDPase neutre et celle de la FDP-
ase alcaline ont été données par HORECKER et coll. (22).

---

- 99 -
férentes sources.
FDPase du cor-
FDPase neutre
FDPase alca-
Gr.oupes d'acides
tex cérébral
du foie
line du foie
aminés
Nombre de
Nombre de
Nombre de
résidus
%
résidus
%
résidus
%
-
Dicarboxylique
Asp + Glu
248
21
239
21
209
20
Dibasique: Lys +
Hist + Arg
156
13
198
17
165
16
Hydrophobe : Gly
+ Ala + Val + Ile
592
51
505
44
474
45
+ Leu
Soufrés : Cys +
Met
36
3
55
5
54
5
Aromatique
Tyr
+ Phe
56
5
82
7
92
9
Pro
76
7
59
5
52
5
Tableau VI: Proportions des groupes d'acides aminés dans la FDPase provenant
du cortex cérébral et du foie. Le nombre de résidus par grou-
pes d'acides aminés dans une mole est indiqué de même que
leurs pourcentage. Le tryptophane n'est pas pris en consi-
dération.
La composition de la FDPase neutre et alcaline a été donnée
par HORECKER et coll. (22).
On sait déjà que chez une même espèce, la composition en acides aminés
de la FDPase du muscle diffère de celle du foie (23). La FDPase du cor-
tex cérébral présente une richesse particulière en résidus acides. Les
acides aminés neutres notamment la glycine et l'alanine sont en nombre

---

- 100 -
beaucoup plus important que dans l'enzyme du foie et du muscle. Par
contre, la FDPase cérébrale a relativement peu d'acides aminés basiques.
Il est probable que cette différence de composition entraîne une diffé-
rence dans la conformation tertiaire et quaternaire,
donc sur la ca-
pacité catalytique de l'enzyme. Il est à noter que le poids moléculaire
obtenu pour la FDPase cérébrale est plus élevé que celui de la FDPase
du foie (22).
Lorsqu'on compare la FDPase neutre et la FDPase alcaline du foie, on
observe une différence de 92 résidus acides aminés. On sait
que dans le foie, la FDPase neutre peut être transformée en FDPase al-
caline sous l'action d'une enzyme protéolytique (22). Expérimentalement,
cette transformation a été réalisée avec la papaïne et la subtilisine.
Les lysosomes peuvent également la réaliser. Après trans~ormation, cha-
que sous-unité de l'enzyme perd un peptide de poids moléculaire 5 000-
6 000 à l'extrémité NH
terminale, avec une diminution parallèle de
2
leur poids moléculaire. La molécule ainsi transformée est insensible à
l'AMP. Le nombre de résidus total de la FDPase cérébrale est très voi-
sin de celui de la FDPase neutre hépatique. De plus les 2 enzymes ont le
~ême pH optimum. Ces remarques suggèrent fortement que la FDPase isolÉe du
cortex cérébral du Rat est de type neutre. Le manque d'action de l'AMP
est vraissemblement dû à une conformation différente de l'enzyme du cer-
veau. En effet, HORECKER et coll. (22) mentionnent que les liaisons aux
différents cofacteurs et les propriétés allostériques de l'enzyme du foie
sont dues aux interactions entre les sous-unités, c'est à dire à la
structure quaternaire. La FDPase du cerveau a vraisemblablement une autre
structure quaternaire. Ce fait serait à l'origine du faible pouvoir ca-
talytique de l'enzyme du cerveau, relativement à celui de l'enzyme du
foie. Dans le cerveau, la FDPase constitue 0,19% des protéines de la
fraction brute contre 0,36% dans le foie, rapporté par d'autres auteurs
(25). Cette différence est sans commune mesure avec l'activité spécifi-
que de 14,6 et 62jUmoles/mg de protéines/min respectivement dans le foie
ce Lapin et dans le muscle de Poulet (13, 23) contre u,39~mole/g/min dans
le cortex cérébral.
Nous n'avons pas obtenu de tryptophane lors de la détermination de la

---

- 101 -
composition en acides aminés. Dans la FDPase du muscle du Poulet, une
recherche intensive du tryptophane a révélé que cet acide aminé n'était
pas dosable dans l'hydrolysat (23). Dans le foie, un seul résidu tryp-
tophane a été dénombré par sous-unité (22). L'enzyme du cerveau aurait
également une quantité négligeable de tryptophane.
3.4.2. Action de la méthionine - sulfoximine.
Sous l'action de la MSO, l 'activité totale de la FDPase cérébrale double.
Par les mécanismes de régulation du flux glycolytique déjà décrits, une
telle activation de l 1 enzyme doit se traduire par une
gluconéogénèse
accrue etvraisemblablementuneaccumulation de glycogène; Des expériences
effectuées dans notre laboratoire avec le Rat Sprague - Dawley montrent
que dans les mêmes conditions expérimentales, la MSO induit une accumu-
lation de glycogène (BEREL, résultats non publiés). Le taux de glycogène
augmente de deux fois environ, tout comme l 'activité totale de la FDPase.
Ce parallélisme entrelaugmentation du taux de glycogène et l'activité
totale de la FDPase avait été observé chez la Souris. On peut donc pen-
ser que la gluconéogénèse est étroitement impliquée dans l'accumulation
de glycogène induite par la MSO.
Par quel mécanisme la MSO active-t-elle la FDPase? SZEPESI et FREELAND
(30) décrivent une méthode permettant d'estimer l 'induction enzymatique
par une synthèse accrue. En utilisant essentiellement l'activité totale,
ils écrivent:
k t = ln
Af - At
2
Af - Ai
Dans cette équation, k
constante de dégradation
2
Af = activité à la fin du traitement par l'inducteur
At = activité à un moment t donné
Ai = activité avant le traitement
Cette équation permet de calculer la 1/2 vie t1/2 = ln2/k2. Le taux de
synthèse initiale ou finale est estimé par k1 = k2 x A. Cette équation
montre concrètement qu'une augmentation de l'activité de l'enzyme est

---

- 102 -
l'expression d'une synthèse globale accrue de l'enzyme. On peut donc
dire que chez la Souris et le Rat, la MSO induit une synthèse accrue de
la FDPase. Cependant, cette équation a une limite très importante: l'ac-
tivité de l'enzyme ne doit pas changer au cours du traitement sous l'in-
fluence d'un activateur ou d'un inhibiteur. Ainsi donc, cette méthode
qui a été employée avec succès dans le foie ne semble pas applicable au
système nerveux central. En effet, bien que la FDPase du cerveau ne sem-
ble pas subir la même régulation que l'enzyme du foie, il est hasardeux
d'exclure une activation par un composé quelconque.
L'induction de la FDPase se produirait par deux phénomènes: il y aurait
une activation de la capacité catalytique de l'enzyme puisque l'activité
totale de l'enzyme augmente deux fois alors que la concentration en pro-
téines de la fraction purifiée n'augmente que de 41%. Cette activation
se produirait parallèlement à une synthèse globale accrue de la protéine-
enzyme
de la FDPase. Il y aurait une accélération de la synthèse de
l'enzyme ou un ralentissement de la dégradation ou les deux à la fois.
L'action de la MSO semble être une action sélective. En effet, la con-
centration en protéines des fractions brutes ne change pratiquement pas.
Par contre, dans la fraction phosphocellulose. le taux de protéines est
nettement plus important. Une telle sélectivité avait déjà été observée:
la MSO induit une augmentation significative de l'incorporation d'acides
aminés marqués dans des coupes de cortex cérébral (31). Ceci ne 'semble
pas être un phénomène général (32). L'incorporation d'acides aminés
marqués sera étudiés plus amplement.
Les résultats obtenus après l'action de la MSO montrent qu'il n'y a pas
de changement de la structure moléculaire de la MSO. L'enzyme est tou-
jours de type neutre avec un poids moléculaire semblable.

---

- 103 -
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---

Chapitre IV
ACTION DE LA METHIONINE SULFOXIMINE SUR LA BIOSYNTHESE ET LA REGULATION
DE LA FRUCTOSE-!,6-BIPHOSPHATASE DANS L'ENCEPHALE DU RAT.
1

---

- 106 -
4.1. INTRODUCTION
Les résultats exposés précédemment montrent que la MSO provoque une activa-
tion de la FDPase cérébrale en augmentant la Quantité de orotéine-enzyme
et en activant le pouvoir catalytique. Comme indiqué par BARONDES (1),
la méthode d'isolement est la plus sûre pour étudier ce phénomène. Ce-
pendant, elle a l'inconvénient majeur de manquer de précision. En effet,
la quantité d'une enzyme donnée dans le système nerveux est relativement
faible par rapport à l'ensemble des protéines et la purification en-
traîne encore des pertes. Dans ces conditions, il est nécessaire d'en~
visager la biosynthèse de la FDPase par une autre méthode. Nous avons
utilisé la méthode de l'incorporation d'acides aminés marqués dans la
molécule de FDPase. De plus, l'action de la MSO sur la quantité de pro-
téine-enzyme de la FDPase est une action globale. On ne sait pas si
elle est due à un ralentissement de la dégradation ou à une accéléra-
tion de la synthèse. Une telle méthode permet d'envisager les mécanismes
de l'action inductrice de la MSO sur la FDPase cérébrale.
L'action de la MSO sur la synthèse protéique totale avait été déjà étu-
diée. En utilisant la leucine[14Cl SELLINGER et coll. (2) ont observé
une augmentation de la synthèse protéique totale dans le cortex céré-
bral du jeune Rat de 7 jours. Chez le Rat de 18 jours, une heure après
administration de la MSO, il n'y a pas de différence significative.
Mais 3 heures après l'injection de MSO, il y a une diminution de la
synthèse protéique chez ce dernier animal. Par contre, en utilisant la
phénylalanine, ces auteurs ont observé que la ~1S0 n'a aucun effet

---

- 107 -
sur la synthèse protéique dans toutes les conditions étudiées. Ils ont
conclu que la MSO exerce un effet très sélectif sur la synthèse pro-
téique. Ces travaux ont été effectués pendant la période préconvulsive,
1 et 3 heures après administration de la MSO. De plus, les animaux
utilisés sont de jeunes animaux chez lesquels le métabolisme protéique
est en cours d'évolution et n'a pas atteint un état d'équilibre stable.
Comme l'accumulation de glycogène et l'activation prononcée de la
FDPase se produisent à une période postconvulsive, 24 heures après
l'administration de la ~SO, nous avons repris l'étude de la synthèse
protéique dans ces dernières conditions chez un animal adulte.
L'actinomycine et le cycloheximide sont souvent utilisés pour bloquer
la synthèse protéique. Ces inhibiteurs permettent de voir si l'aug-
mentation de l'activité d'une enzyme est le reflet d'une synthèse ac-
crue ou non (4,5). L'enzyme induite et l'enzyme non induite semblent
identiques sur le plan moléculaire. Cependant, la différence dans la
capacité catalytique semble indiquer une certaine différence de con-
formation. Nous avons donc étudié la résistance à la chaleur et la
dégradation par une protéase.
La métyrapone réduit considérablement l'accumulation de glycogène
induite par la MSO dans l'encéphale de Souris (6). On sait que la
métyrapone est un puissant inhibiteur de la stéroïde-11~hydroxylase.
Si l'accumulation du glycogène est le résultat d'une activation de la
gluconéogénèse, il est possible que la métyraDone agisse sur la syn-
thèse du glucose, à moins qu'elle n'inhibe sélectivement la glyco-
gène synthase. Nous avons donc associé la métyrapone à la MSO pour
tenter de répondre à ces différentes questions.
4.1.3. Les métabolites intermédiaires.
Comme nous l'avons exposé précédemment, les taux des métabolites inter-

---

- 108 -
médiaires peuvent réguler le flux glycolytique. Un excès ou un défaut
d'un métabolite donné peut favoriser la réaction de glycolyse ou de
gluconéogénèse. Les résultats précédents semblent indiquer que l'acti-
vation de la FDPase n'est pas le résultat de la seule augmentation de
la quantité de protéine-enzyme. Nous avons recherché l'implication éven-
tuelle des métabolites intermédiaires dans la régulation de l'activité
de la FDPase.
4.2. ,MATERI ELS ET METHODES
4.2.1. Matériels.
4.2.1.1. Animaux.
Comme dans les expériences précédentes, la FDPase a été isolée de l'encé-
phale du Rat de souche Sprague Dawley. Les expériences avec les inhbiteurs
de la synthèse protéique ont été realisées avec la Souris de souche OF 1.
4.2.1. 2. Réactifs.
Valine [114C]
37,5 mCi/mmole
Commissariat à l'énergie
Glucose [u 14c] étalon
atomique (CEA),Gif sur Yvette
Soluène
Packard Instrument, Illinois
Instagel
U.S.A.
Cycloheximide
Sigma, St Louis, MO
Inhibiteur de la trypsine
Métyrapone
Ciba Geigy, Suisse
1

---

- 109 -
A1do1ase du muscle de Lapin
G1ycérol-3-phosphate déshydrogénase du muscle de Lapin
Boehringer
Triose phosphate isomérase du muscle de Lapin
Trypsine
4.2.2. Méthodes.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l'étude de la synthèse pro-
téique dans le système nerveux central (7,8,9). Récemment, OUNLOR et
coll. (10) ont décrit une méthode qui paraît être convenable pour cette
étude, avec un risque minimum d'erreur.
4.2.2.1. Taux de synthèse de 1a fructose-1,6-biphosphatase
in vivo.
La méthode de REl TH et co11. (11) a été ut il i sée pour l'étude de 1a
synthèse de la FOPase dans le cortex cérébral. C'est une adaption de
la méthode de surcharge décrite par DUNLOP et coll. (10,12).
Le principe de cette méthode est la fourniture au cerveau d'une quan-
tité très importante de précurseurs acides aminés. On sait que l'une
des difficultés majeures dans l'estimation du taux de synthèse protéi-
que cérébrale est l'évaluation de l'activité spécifique pendant la pé-
riode d'incorporation des acides aminés (12). Dans cette méthode, une
fourniture massive de précurseurs permet de saturer et même
d"'in-
nonder" les différents pools d'acides aminés. De ce fait, la formation
de complexe ami no- acy1 -ARNt ne sera pas 1imitée par un défaut de pré-
curseurs.
Les animaux reçoivent une injection de MSu dissoute dans NaC1 0,9 %
à la dose de 100 mg/kg par voie intrapéritanéa1e. Les témoins reçoi-
vent une injection d'un volume équivalent de solution de NaC1.Ces injections
ont lieu 24 heures avant la d~capitation~ Les animaux traités avec la MSO

---

- 110 -
1
et les témoins reçoivent une injection de val ine [114 C] (15 IJmole~/g avec une
!
activité de 0,048 ~Ci/g) l, 2 et 3h avant la décapitation.La FDPase est iso-
1
1
lée-dans les mêmes conditions que celles préciséesauparavant.Une fraction
d'homogénat total est prélevée pour l'étude de l'incorporation dans les
protéines. La FDPase isolée et purifiée est concentrée par diafiltration
sur membrane Arnicon PM 10. La solution concentrée est lyophilysée. Le lyo-
philysat est humidifié dans un volume minimum d'eau distillée et on ajoute
1 ml de Soluène 100. Les flacons bien fermés sont introduits dans un bain-
marie à 60°C pendant 1 heure. Après refroidissement, on ajoute du mélange
scintillateur Instagel. Les échantillons sont laissés à l'obscurité et après
disparition de la chimioluminescence, la radioactivité est estimée dans un
spectromètre à scintillation en phase liquide (Beckman, LS 150). L'effica-
cité du comptage est déterminée en utilisant un étalon de toluène e4c] ou
de glucose [14C],puis les valeurs en cpm sont converties
en dpm.
Un échantillon d'homoqénat est traité par un volume égal d'acide tri-
chloracétique (TCA) à 10% (plv). Le mélange est centrifugé à 5 000 x g
pendant 15 min., à 2°C. Le sédiment est lavé 2 fois avec du TCA à 5%
puis transféré dans un flacon de comptage à scintillation où il subit
un traitement analogue à celui de la FDPase. La radioactivité est ainsi
déterminée dans les protéines totales, de même que dans la fraction acido-
soluble.
Un échantillon de plasma est traité par un volume égal de TCA à 10%.
La radioactivité est déterminée dans la fraction acido-soluble.
Le taux de valine est déterminé dans les différentes fractions. Les
échantillons de FDPase purifiée et de protéines totales sont hydrolysés
à 110°C pendant 20 heures. La concentration en valine de l 'hydrolysat
désséché est déterminéeavec un autoanalyseur d'acides aminés comme il a été
précédemment décrit.La standardisation interne est'faite àvec lanorleucihe.
La concentration en valine de la fraction acido-soluble de l 'homogénat

---

- 111 -
total et de la fraction acido-soluble du plasma est également déter-
minée
de la même façon.
Dans une série d'expériences séparées, le tissu nerveux est homogénéisé
dans 5 volumes d'acide sulfosalicylique â 3% (plv) suivant la méthode de
REITH et coll. (11). L'homogénat est centrifugé â 5 000 x gpendant 15
min J â 2°C. Le sédiment subit un traitement identique â celui de l 'ho-
mogénat précédent. Les résultats obtenus sont semblables dans les 2 cas
soit 515 nmoles de valine par mg de protéines pour l'homogénéisation
dans du KCl + NaHC0
et 428 nmoles/mg
par
traitement au TCA.
3
La radioactivité spécifique est déterminée 1, 2 et 3 heures après l'in-
jection de la valine [114CJ . La courbe de l'incorporation en fonction
du temps est tracée par régression linéaire. En estimant que la quasi-
totalité de la radioactivité protéique est liée â la valine, le taux de
synthèse est déterminé â partir de la pente de la courbe s~ivant l'équa-
tion de REITH et coll. (11). Lorsque l'on ne prend en considération
qu'un seul compartiment dans lequel se produit l'incorporation de la
valine, le taux d'incorporation suit la relation suivante:
dS B
-
= KS
- KSB
dt
A
SB : radioactivité spécifique de la valine protéique (dpm/nmole)
SA : radioactivité spécifique de la valine libre (dpm/nmole)
K : proportion de valine protéique remplacée par unité de temps.
La méthode ut"ilisée permettant de saturer tous les pools de valine, la quan-
tité de SA est constante pendant toute la durée de l'incorporation. La re-
lation s'écrit alors:
( II)
Pendant l'intervalle limité par l'instant 0 et l'instant t d'incorpora-
tion, l'équation (II) s'intègre comme suit :
SB
ln (1 - ---- ) = - Kt
SA
soit encore :
-Kt
SB = SA (1 - e
)
Dans cette équation, les quantités SB et SA sont mesurées. La quantité
t est l'unité de temps. Par régression linéaire, on obtient la radio-
,
activité incorporée par heure. On peut donc calculer aisément K, le
taux d'incorporation.

---

- 112 -
1
i
4.2.2.2. Etude des inhibiteurs de la synthèse protéique et de
i
la métyrapone.
Les animaux utilisés sont des souris de la même souche OF1. Les ani-
maux témoins reçoivent une injection intrapéritonéale d1ihhibiteurs de
la synthèse protéique (le cycloheximide et l 'actinomycine D) et de
métyrapone, en solution dans 0,2 ml de NaCl 9 %0. Les animaux trai-
tés reçoivent une injection de L-méthionine-DL-sulfoximine (MSO) en
même temps que les inhibiteurs et la métyrapone. Ils sont décapités gé-
néralement 24 heures après l'administration des molécules, période qui
correspond à l'activité maximale de la FDPase lorsque les animaux sont
traités avec la MSO seule (15). Quelques expériences ont été faites pen-
dant la période convulsive, soit 8 heures après l'injection. Après
décapitation, le cerveau est rapidement dégagé de la boite crânienne et
immergé dans un milieu contenant K~l 0,15 Met chlor'lyqrate de cystéine
5 mM à O°C. L'estimation de l'activité de la FDPase a été décrite auparavant.
Les principales étapes sont :
- Homogénéisation dans le milieu précédent
- Incubation à 37°C
- Centrifugation
- Dosage de la FDPase par la phosphoglucose isomérase et la
glucose-6-phosphate déshydrogénase. L'activité est exprimée en)Jmoles
de fructose-1,6-biphosphate hydrolysé par g de tissu frais ou par mg
de protéines par minute. Les protéines sont dosées comme précédemment.
4.2.2.3. Résistance à la chaleur et à la trypsine.
Le but de cette étude est de voir si la FDPase induite par la MSO est
identique à la FDPase présente
normalement dans l'encéphale des ani-
maux. S'il y a identité, ces deux enzymes doivent avoir la même résis-
tance à la chaleur et à la trypsine.
4.2.2.3.1. Résistance à la chaleur.
L'inactivation par la chaleur a été étudiée suivant la méthode de CIA-

---

- 113 -
RANELLO et AXELROD (16) et de Mc GINNIS et DE VELLIS (17). L'extrait en-
zymatique est préparé selon
le procedé
habituel
. Il est ensuite di-
visé en plusieurs fractions. Ces fractions sont chauffées dansun bain-
marie à 47°C pendant des temps variables. A la fin du chauffage, l'ex-
traitestrapidement refroidi jusqu'à O°C. Après centrifugation à 18 000
x g,à 4°C, pendant 15 min, l'activité de la FDPase est évaluée dans le
surnageant. La constante de stabilité à la chaleur est calculée en tra-
çant la courbe de l'activité résiduelle en fonction du temps de chauffage.
4.2.2.3.2. Résistance à la trypsine.
La résistance à la protéolyse est déterminée en utilisant la trypsine.
La solution enzymatique contenant la FDPase est ajoutée à volume égal à
un milieu contenant du Tris-HCl 100 mM, pH 8,2, de la trypsine la ~g/~(l.
Le mélange est incubé à 37°C pendant des temps variables. La réaction
est arrêtée par addition de la ug d'inhibiteur de la trypsine en solution
dans 50 ~l. L'estimation de l'activité de la FDPase non traitée à la tryp-
sine est effectuée dans le milieu habituel, mais contenant en plus la
même quantité de trypsine inhibée. Aucune différence n'a été observée
dans ce milieu. La constante de stabilité à la trypsine est calculée
comme dans le cas de l'inactivation à la chaleur.
4.2.2.4. Taux des métabolites intermédiaires de la voie glyco-
10
• •
10
• • • • • • • • • • • • • • •
10
•
10
,.
.
lytique.
4.2.2.4.1. Préparation de l'extrait tissulaire.
Les taux de fructose-1,6-biphosphate, de glycéraldéhyde-3-phosphate et
de dihydroxyacétone-3-phosphate ont été mesurés chez la Souris. La mé-
thode utilisée est une méthode enzymatique décrite par MI CHAL et BEUTLER
. Les animaux reçoivent une injection de MSO ou de NaCl comme précé-
demment. Après des temps variables de 4 à 48 heures, ils sont sacrifiés par
immersion dans de l'azote liquide. Cette immersion a toujours lieu entre

---

- 114 -
8 et 10 heures pour mlnlmlser les effets éventuels du rythme circadien.
Les animaux sont gardés a -30°C jusqu'a la dissection qui est faite en
état de congélation profonde. Le cortex cérébral, le tronc cérébral et
le cervelet sont séparés,selon la méthode de GLOWINSKI et IVERSEN (19).
Les différentes régions sont pesées, puis homogénéisées dans de l'acide
perchlorique a 6%. L'homogénat est centrifugé a 20 000 x g pendant 15
min, a 2°C. Le surnageant est neutralisé avec KOH SN. Un chauffage du
surnageant s'est avéré inutile (20). Le perchlorate de potassium est
éliminé après centrifugation a 3 000 x g pendant 30 min, à 4°C. Les mé-
tabolites intermédiaires sont dosés dans ce dernier extrait.
4.2.2.4.2. Dosage des métabolites intermédiaires.
L'évaluation de la concentration tissulaire en fructose-1,6-biphosphate
glycéraldéhyde-3-phosphate et dihydroxya0étone-3-phosphate est effectuée
avec des méthodes déjà décrites (18,20,21).
- Principe.
Le principe du dosage est le suivant
Aldolase
Fructose-1,6-biphosphate
~ Dihydroxyacétone-3-phosphate +
•
Glycéraldéhyde-3-phosphate
Triose phosphate
isomérase
Glycéraldéhyde-3-phosphate -----------.~ Dihydroxyacétone-3-phosphate
•
Glycérol-3-phosphate
+
déshydrogénase
2 Dihydroxyacétone-3-phosphate + NADH,H
~
2 glycérol-3-phosphate + NAD+
Le milieu de la réaction comprend du tampon Tris-HCl 100 mM, pH 7,5,
du NADH 0,015 mM, deI 'extrait tissulaire et des enzymes auxiliaires
dans un volume final de 3 ml. Les enzymes auxiliaires sont ajoutées
dans la séquence suivante :

---

- 115 -
· La glycérol-3-phosphate déshydrogénase (3,25 pg/ml) pour évaluer
le dihydroxyacétone-3-phosphate
· La triose phosphate isomérase (0,325 ~g/ml) pour évaluer la gly-
céraldéhyde-3-phosphate
· L'aldolase (6,5 ~g/ml) pour évaluer le fructose-1,6-biphosphate
(18). Les 0.0. sont lues au spectrophotomètre (BECKMAN, Acta III) à 340
nm. Les résultats sont exprimés en nanomole de métabolites par 9 de tissu
frais.
Toutes les comparaisons sont faites statistiquement avec le test t de
Student.
4.3. RESULTATS.
4.3.1. !Q~Qr~Qr~!iQQ_Q~_!~_~~!i~~_I1:~çl_Q~~~_!~_~Q!~~~!~_Q~_fr~~:
!Q~~:11~:~i~~Q~~~~!~~~·
Les résultats obtenus après administration d'une dose massive de valine
radioactive sont regroupés dans lestableau l et figure 1 . Les taux de
valine présents dans le plasma 1h, 2h, 3h après administration sont
respectivement de 7,5; 7,5 et 6,4 ~mole/ml chez les animaux témoins. Les
valeurs chez les animaux soumis à la MSO sont du même ordre de grandeur
(7,2; 7,3 et 6,0). Le taux plasmatique de valine chez l'animal non traité
à la valine est de 1,6 ~mole/ml. L'activité spécifique dans le plasma reste
très élevée et voisine de celle de la valine injectée, soit 6,4; 6,2 et 6,3
dpm/nmole de valine, 1h, 2h et 3h après administration respectivement.
Le taux de valine présent dans l'encéphale (fraction acido-soluble)
après administration de 15 ~moles/g de valine [1-14c]est de l'ordre de 1,1
~mole/g de tissu frais. Ces taux sont beaucoup plus élevés que la valeur de
0,12 ~mole de valine/g de tissu frais obtenue chez les animaux non traités
à la valine. L'activité spécifique reste élevée (6,4 dpm/nmole) repré-

---

- 116 -
Fraction
Protéines totales
FDPase isolée
!
acido-soluble
l
TelTops
(H. )
Témoins
Soumis
Témoins Soumis
Témoins Soumis
à la MSO
à 'la MSO
à la MSO
1
dpm/mg
7~82
7~60
22
25
27
60
1
nmoles Val
1~04
1~24
491
487
463
443
/mg
+ 28
± 52
+ 31
+ 30
-
dpm/mg
7~08
6~99
52
55
55
136~5
+
- 0~52 + 0~25
+ 10
± 13
+ 14
2
nmoles Val
1~ 10
1~ 10
491
487
463
443
/mg
± ()~52
+ 0,25
: 28
± 52
± 31
± 30
-
dpm/mg
6~87
7,03
65
78
70
190
3
nmoles Val
1 ~05
1 ~07
491
487
463
443
/mg
± 28
: 52
: 31
± 30
Tableau 1
Incorporation de la valine ~_14c]dans la FDPase~ les protéines totales
et la fraction acido-soluble du cortex cérébral du Rat. Les activités
sont exprimées en dpm/mg de tissu (fraction acido-soluble) et en dpm/
mg de protéines. Les concentrations sont exprimées en nmole de valine
par mg de tissu et en nmole par mg de protéines. Chaque valeur repré-
sente 1 à 3 déterminations avec 6 animaux par déterminations.

---

- 117 -
Activité spêcltlque
(dpm/rnq protêlnes)
150
100
50
1
2
3
Temps après l'injection (heure)
Figure 1: Incorporation de la valine [1-14C]dans la FDPase et dans les protéines
totales du cortex cérébral du Rat.
Témoins
Soumis à la MSO
6 - 6 -
FDPase
À
Â
0 - - 0
Protéines totales
.--.

---

- 118 -
sentant près de 80% de l'activité spécifique de la valine injectée. Il
apparaît donc que le pool de valine libre présent dans le cerveau est
"inondé" par la valine exogène.
L'incorporation de la valine [114 C] dans l'ensemble des protéines du
tissu nerveux ne change pas notablement après administration de la MSO
(Tabl. I Fig. 1
). Par contre, la radioactivité spécifique par mg de
fructose-1,6-biphosphatase isolée au bout des trois périodes étudiées
passe respectivement de 27, 55 et 70 dpm/mg d'enzyme à 60, 136,5 et
190 dpm/mg, soit une augmentation de 2 à 3 fois.
Le taux de synthèse apparent des protéines est calculé à partir des cour-
bes de la Fig.1. L'équation de REITH et coll. (11) précédemment décrite
a été utilisée. Les radioactivités spécifiques de la valine protéique
(SB) et de la valine libre (SA) ont été déterminées. Le taux de synthèse
(K) a été estimé à 0,64% de renouvellement par heure dans les protéines
totales chez les animaux témoins contre 0,76% chez les animaux traités.
Par contre, dans le cas de la FDPase isolée, ce taux passe de 0,72% par
heure chez les animaux témoins à 2,05% par heure chez les animaux trai-
tés soit une augmentation de 2,8 fois. Sur la base de cette augmentation
du taux de synthèse apparent, on peut conclure que la MSO augmente la
synthèse de la FDPase dans l'encéphale de Rat.
4.3.2. ~ff~!~_9~~_!Q~!~!!~~r~_9~_1~_~~Q!~~~~_erQ!~ig~~_~!_9~_l~
~~!~r~eQ~~_~~r_l~~~!i~!!~_9~_1~_fr~~!Q~~:1l§:~!e~Q~e~~!~~~.
4.3.2.1. Action des inhibiteurs de la synthèse protéique et de
.....................................................
la métyrapone sur le syndrome épileptique induit par la MSO.
Lorsque les animaux sont traités avec 5 et 20 mg/kg de cycloheximide,
100 et 500 ~g/kg d'actinomycine ou 100 mg/kg de métyrapone isolément,
leur comportement est semblable à celui des animaux n'ayant reçu aucun
traitement, aucun signe de toxicité nia été observé. On sait que la MSO,

---

- 119 -
à la dose de 100 mg/kg induit chez la Souris des convulsions épi-
leptiformes
7 à 8 heures après son injection, convulsions qui durent
au moins 1 heure (22,23). Lorsque la MSO (100 mg/kg) est associée avec
le
cycloheximide (5 mg/kg) l'apparition des convulsions est retardée
de 2 à 4 heures. Ces convulsions sont essentiellement de type clonique,
l'animal retrouvant sa posture après l'agitation. Les convulsions toni-
ques, lorsqu'elles apparaissent, sont de moindre durée que dans le cas
de la MSO seule. La durée des convulsions est voisine d'l heure. Par
contre l'actinomycine, en association avec la MSO, retarde à peine l'ap-
parition des convulsions (1 heure environ). Les convulsions sont de même
type que dans le cas de la MSO seule.
La métyrapone associée à la MSO entraîne également un retard dans l'ap-
parition des convulsions, dOlltla Juree varie de
2 à 4 heures. Lors-
qu'on pratique une deuxième injection de métyrapone 7 heures après la
première injection, les convulsions sont retardées de 5 heures environ.
Les convulsions cloniques sont nettement marquées, de même que les con-
vulsions toniques. La période des convulsions dure environ 1 heure.
4.3.2.2. Action du cycloheximide ~ur l'induction de la fructose-
.......................................................
1,6-biphosphatase par la MSO.
Le cycloheximide a été étudié aux doses de 5.et 20 mg/kg chez la Souris.
4.3.2.2.1. Dose de 5 mg/kg de cycloheximide.
Après administration de la dose de 5 mg/kg de cycloheximide et de 100
mg/kg de MSO, l'activité de la FDPase augmente de façon significative'
dans les trois régions étudiées (p<O,Ol; Fig.2). Elle augment de 4 fois
dans le cortex cérébral, de 6 fois dans le tronc cérébral et de 2 fois
dans le cervelet. Cette augmentation est assez voisine de celle obtenue
lorsque les animaux sont traités avec la MSO seule.
Il a été montré que le cycloheximide, 24 heures après son administration

---

- 120 -
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
à l a ~·1S0
à la MSO
à la MSO
Acti vité
0,111
0,283
0,046
0,133
0,134
0,289
totale
± 0,015
:t 0,071
:t 0,010
~ 0,040 ± 0,028 :t 0,041
)Jmol e/g/
8 H
min
Activité
spécifique
0,027
0,044
0,035
0,046
0,030
0,038
}Jmo le/mg
± 0,003 ± 0,011 ± 0,006 :t 0,009 ± 0,009 ± 0,008
de prot./
min
Acti vité
0,097
0,386
0,061
0,338
0,076
0,165
totale
± 0,020 :t 0,100 :t 0,010 :t 0,054 ± 0,021
± 0,047
jJmole/g/
24 H
min
Activité
0,020
0,069
0,020
0,049
0,018
0,031
spécifique :t 0,002 ± 0,017 :t 0,006 ~ 0,018 ± 0,006 ± 0,006
/-lmole/mg
de prot./
min
Tableau II : Action du cycloheximide (5 mg/kg i.p.) sur l'induction de la FDPase
dans l'encéphale de la Souris par la MSO, 8 et 24 heures après admi-
nistration du convulsivant. Le nombre de déterminations indépendantes
est de 3 par valeur .

---

~
li)
C
li) . -
+: E
- 121 -
a>Ù)
"C ëu
~.t:
a.
c
LL
~ 0,300
E
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~ 0,060
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~ 0,040
o
«
0,020
o'--"__~
CC
TC
Figure 2
Action du cycloheximide (5 mg/kg i.p.) sur l'induction de la FDPase
par la MSO dans l'encéphale de la Souris 24 heures après administrat-
tion du convulsivant.
o Témoins
~
Soumis à la MSO

---

- 122 -
induit une augmentation de 137% de la synthèse protéique dans le foie
après une inhibition de 6 à 16 heures, inhibition qui dépend de la dose
(25,26). Si ces phénomènes ont lieu dans le cerveau, on peut penser que
cette synthèse rapide peut alors interférer en réactivant à nouveau
l 'activité de la FDPase 24 heures après l 'administration des drogues.
En vue de vérifier cette éventualité, nous avons étudié l'activité de
la FDPase chez la Souris pendant la période convulsive, soit 8 heures
après administration du cycloheximide associé à la MSO. Les résultats
obtenus sont rassemblés dans le Tabl.II, Fig.3. Ces résultats montrent
que pendant la phase de forte inhibition de la synthèse protéique par
le cycloheximide (26), la MSO exerce toujours son acti~ité d'induction
sur la FDPase puisqu'on observe une activation de 2,5 fois dans le cor-
tex cérébral, de 3 fois dans le tronc cérébral et de 2 fois dans le cer-
velet. Ces proportions sont relativement proches de celles observées
lorsque les animaux sont traités avec la MSO seule. Ces résultats peu-
vent être le reflet de plusieurs phénomènes:
- La MSO augmente l'activité de la FDPase par activation de son
pouvoir catalytique;
- La MSO intervient dans la synthèse protéique à un autre niveau;
- La dose de cycloheximide est insuffisante pour inhiber effica-
cement la synthèse protéique.
Les résultats précédents montrent que la MSO active le pouvoir cata-
lytique de la FDPase, mais cette activation n'explique pas à elle seule
l'activité enzymatique globale enregistrée. Les deux dernières éven-
tualités ont été vérifiées avec une dose plus élevée de cycloheximide
et avec l 'actinomycine D.
4.3.2.2.2. Dose de 20 mg/kg de cycloheximide .
...........
.-:
.
Lorsque la MSO (100 mg/kg i.p.) est injectée en même temps que 20 mg/
kg de cycloheximide, on obtient une réduction notable de l'activation
induite par la MSO. L'au ~entation de l'activité de la FDPase n1est
plus que de 2,6, 4 et 1,3 fois respectiveemnt dans le cortex cérébral,
le tronc cérébral et le cervelet (Tabl .111, Fig.4). Ces valeurs sont

---

H
"
.5
- 123 -
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en en
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Ct
~ 0,300
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w
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0,100
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CC
CT
CV
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0)
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't 0,040
c
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E
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W
1-
>
1-
0,020
o
«
o~__-'--
CC
CT
CV
Figure 3 : Action du cycloheximide (5 mg/kg i.p.) sur l'induction de la FDPase par
la MSO dans l'encéphale de la Souris 8 heures après administration du
convulsivant.
1·
1
Témoi ns
~
Soumis à la MSO

---

- 124 -
1
1
!
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
1
J
1
Témoins Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
à la MSO
~ la MSO-
~ la MSO'
1
1
Activité
0~087
0.229
0.046
0.197
0.106
0.135
Î
totale
± 0.014 ± 0.043 ± 0.010 ± 0.073 1" 0.023 ± 0.049
!
)Jmo~ e/g/
!
mln
20
~.r
mg/kg!
~
t
Activité
1
0.023
0~054
0.025
0.049
0.029
0.029
spécifique
!
± 0.003
± 0.015
± 0.007
1: 0~008
± 0.008 ± 0.009
i
fmol e/mg
prot./min
1
!
1~1~,s;
Tableau III : Action du cycloheximide (20 mg/kg i.p.) sur l'induction de la FDPase
1
!
dans l'encéphale de Souris par la MSO. 24 heures après administration
1
du convulsivant. Le nombre de déterminations indépendantes est de 3 par
1
valeur.
!1
!
1
!
1
1
!!ij
i
1
1
i

---

:::J.E
~ E
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- 125 -
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w 0,200
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~ 0,100
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~ O
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E
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C)
E
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cu.
CIJ
ëE~
w
~
->
~ 0,020
o
et
O
...a-
CC
Figure 4 : Action du cycloheximide (20 mg/kg i.p.) sur l'induction de la FDPase
par la MSO dans l lencéphale de la Souris, 24 heures après administra-
tion du convulsivant.
c====J
Témoins
~
Soumis à la MSO

---

- 126 -
significativement inférieures à celles obtenues avec la MSO seule.
Le cycloheximide freine donc l'induction de la FDPase par la MSO.
4.3.2.3. Action de l vacti nomyc ine D.
Les résultats obtenus avec l'actinomycine D sont rassemblés dans le
Tableau IV., figures 5 et 6.
L'actinomycine D a été administrée à la dose de 100 ~g/kg, dose éloi-
gnée de la DL 50. Bien que n'ayant pratiquement pas d'action sur la
genèse des convulsions, cette dose d'inhibiteur entra' ne une nette diminution
de l'action stimulatrice de la MSO sur l'activité de la FDPase. Dans le
cortex cérébral, on n'observe plus qu'une augmentation de 2,2 fois de
l'activité de la FDPase, de 3,5 fois dans le tronc cérébral et de 2
fois dans le cervelet. Dans le cortex cérébral et le tronc cérébral,
ces proportions sont nettement moindre que celles observées lorsque les
animaux sont traités avec la MSO seule.Il est intéressant de remarquEr
que l'augmentation de l'activité spécifique est sensiblement parallèle
à celle de l'activité totale: 1,9 fois dans le cortex cérébral, 2 fois
dans le tronc cerebral et 1,6 fois dans le cervelet.
A la dose de 500 ~g/kg, l'atténuation de l'action inductrice de la MSO
sur la FDPase est presque identique dans le cortex cérébral, à peine plus
prononcée dans le tronc cérébral et le cervelet. Comme dans le cas de la
dose de 100 ~g/kg, il existe toujours un parallélisme entre l'activité to-
tale et l'activité spécifique de l'enzyme.
~:
1
1
1

---

- 127 -
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
à la MSO
à l a ~lS0
à la MSO
Activité
0,102
0,231
0,065
0,231
0,093
0,193
totale
± 0,025 +- 0,030 ± 0,008 ± 0,032 ± 0,030 ± 0,059
j.lmole/g/
100
min
pg/kg
Activité
0,016
0,031
0,013
0,028
0,013
0,021
spécifi que ± 0,003 ± 0,008 ± 0,005 ± 0,006 ± 0,005 ± 0,005
~mole/mg
prot./min
Acti vité
0,177
0,218
0,043
0,096
0,026
0,104
totale
± 0,021
± 0,067 ± 0,010 ± 0,011 ± 0,009 ± 0,020
500
~mole/g/
min
}lg/kg
Act i vité
0,014
0,029
0,009
0,015
0,004
0,015
spécifique ± 0,003 ± 0,006 ± 0,003 ~ 0,001 ± 0,001 ± 0,004
II.1mole/mg
prot./min
Tableau IV : Action de l'Actinomycine D sur l'induction de la FDPase par la MSO
dans l'encéphale de Souris, 24 heures après administration du convulsi-
vant. Le nombre de déterminations est de 3 par valeur.

---

Q,l .S
- 128 -
oc E
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c=
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-
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E
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W
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0,020
-~Uet:
0,010
cv
Figure 5 : Action de l'Actinomycine D (100 ~g/kg i.p.) sur l'induction de la FDP-
ase par la MSO dans l'encéphale de Souris, 24 heures après administra-
tion du convulsivant.
1
D Témoins
~ Soumis à la r'1S0.
1
1

---

G1.~
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- 129 -
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0,200
w
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1-
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C') . -
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C E
u.Q.
!!
0,030
o
E
a,
0,020
0,010
OL...-_ _........
cc
TC
CV
Figure 6 : Action de l 'Actinomycine 0 (500 ~g/kg i.p.) sur l'induction de la FDP-
ase par la MSO dans l'encéphale de la Souris, 24 heures après adminis-
tration du convulsivant.
c====J Témoins
~
Soumis à la MSO
'

---

- 130 -
1
!
Ces résultats montrent que la synthèse protéique est nécessaire à la sti-
1
mulation de l'activité de l~ FDPase induite par la MSO.On a montré depuis
t
longtemps que les corticostéroïdes (cortisol et son dérivé fluoré, le tri-
1
1
amcinolone) stimulent considérablement l'activité de la FDPase dans le
1
foie du Rat par biosynthèse de nova (27). Cette action est inhibée par
l,~
l 'actinomycine D qui empêche par voie de conséquence l'accumulation de
i
glycogène (3). Des études récentes ayant montré que la métyrapone, inhi-
1
biteur de la stéroide 11~hydroxylase, inhibe l'accumulation de glyco-
l:
[{-
gène induite par la tiSa (6), nous avons étudié l'action de cette drogue
~~
sur l'activité de la FDPase.
!rl~
4.3.2.4. Action de la métyrapone.
L'activité de la FDPase a été étudiée après administration d'une dose unique
ou de 2 doses de métyrapone.
4.3.2.4.1. Dose unique de métyrapone.
La métyrapone (100 mg/kg) est administrée aux animaux en association avec
la ~so 100 mg/kg. Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau
V. On observe une augmentation de 2,8 fois dans le cortex cérébral,
de 4 fois dans le tronc cérébral et de 1,9 fois dans le cervelet. Les
proportions de stimulation sont donc inférieures à celles observées dans
le cas de la t1S0 seule. Contrairement au cas de l'actinomycine D, les
variations de l'activité spécifique ne sont plus parallèles aux varia-
tions de l'activité totale.
En vue de remédier à l'action fugace de la métyrapone, une deuxième in-
jection est effectuée 7 heures après la première. Le Tableau V montre
que la proportion de stimulation de l'activité totale est réduite à

---

'- 131 -
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
Témoins
Soumis
TPl:o·; ns
Soumis
Témoins
Soumis
à la MSO
à la MSO
à la MSO
Acti vité
0,096
0,269
0,045
0,186
0,167
0,318
tota l e
± 0,040 + 0,063
± 0,015
± 0,070
± 0,042
: 0,078
)Jm~le/g/
1
mln
injection Activité
0,021
0,031
0,021
0,029
0,018
0,023
spécifique ± 0,008 : 0,005 ± 0,002 : 0,008 ± 0,004 ± 0,006
)Jmo le/mg
prot./min
Acti vité
0,096
0,188
0,043
0,196
0,162
0,253
totale
+
- 0,030
± 0,043 ± 0,012
± 0,039
± 0,047
± 0,053
2
jJmole/g/
mln
i njecti ons
Acti vité
0,016
0,023
0,012
0,087
0,015
0,017
spécifique ± 0,004 ± 0,023 : 0,002 ± 0,007 ± 0,003 : 0,006
}Jmo le/mg
prot. /mi n
Tableau V : Action de la métyrapone sur l'induction de la FDPase par la MSO dans
l'encéphale de la Souris, 24 heures après administration du convulsi-
vant. Le nombre de déterminations est de 3 par valeur.

---

- 132 -
1
.5
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CI)
CI)
1
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1
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~ 0,300
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0,030
li.
1)
~a,
w
0,020
~
-
>
--1-U~
cc
TC
cv
Figure 7
Action de la métyrapone (dose unique) sur l'induction de la FOPase par
la MSO dans l'encéphale de la Souris, 24 heures après administration
du convulsivant.
o
Témoins
~
Soumis à la MSO

---

CI,)
"0 c
cnE
- 133 -
a:-""U; 0300
c·- ,
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....
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w
0,200
...J
~~w1- 0,100
->-1-~ 0
-=-
..e0..=cnEE---a.0,030
cu,
CI,)
0
E
a,
w
0,020
1-
->
1-
o
«
0,010
cc
TC
CV
Figure 8 : Action de la métyrapone (deux doses) sur l'induction de la FDPase par
la MSO dans l'encéphale de la Souris, 24 heures après administration
du convulsivant.
D Témoins
~ Soumis à la MSO

---

- 134 -
1,9 dans le cortex cérébral et qu'il y a peu de changement dans les
autres régions étudiées. La métyrapone réduit donc l'induction de la
FDPase par la M90. Les résultats obtenus avec les inhibiteurs de la synthêse
protéique semblent indiquer que cette induction se produit par deux mé-
canismes impliquant d'une part la synthêse de nova de la protéine-enzyme
et d'autre part une stimulation de la capacité catalytique de la FDPase
préexistante. L'étude de la résistance à la trypsine et à la chaleur qui
sera effectuée doit permettre de vérifier si l 1 enzyme induite et l'enzyme
normale sont identiques.
4.3.3. ~Ç!iQD_9~_!~_çb~l~~r_~!_9~_l~_!r~~~iD~_~~r_l~~ç!i~i!~_9~_l~
fr~ç!Q~~:ll~:~i~bQ~~b~!~~~·
1
4.3.3.1. Action de la chaleur.
1
,
Lorsque l'induction d'une enzyme est le résultat d'une synthêse de nova
J
uniquement, l'enzyme induite et l'enzyme non induite ont la même résis-
tance à la chaleur (16,17). Dans ce cas, les courbes de l'activité enzy-
1
matique en fonction du temps d'exposition à une température donnée sont
t
parallêles pour les deux enzymes. Si l'induction a lieu par une stimu-
i
lation du pouvoir catalytique, un tel parallélisme n'a pas lieu.
1
1
1
1
La dégradation d'une protéine-enzyme par la chaleur étant une fonction
de premi~r ordre, on peut déterminer la 1/2 vie de cette protéine en
1
tracant le logarithme de l'activité en fonction du temps (16). On ob-
1
tient ainsi pour l 1 enzyme du cortex cérébral des animaux témoins une
j
1/2 vie de 5,9 ± 0,9 min. contre 10,8 ± 3,7 min. pour les animaux trai-
1
tés, à 47°( (Tabl.VI,Fig.9). La MSO renforce donc la résistance de la
ij
FDPase à la chaleur.
1
1i

---

- 135 -
TefTIps de
Témoins
Soumis à la ~1S0
tra itement
(minutes)
1
2
3
1
2
3
27
25
19
58
43
32
0
(3,30)
(3,22 )
( 2,94)
(4,06)
(3,76 )
(3,47 )
17
17
14
43
35
28
3
(2,83)
(2,83)
(2,64)
(3,76)
(3,55 )
(3,33)
11
13
9
32
28
24
6
(2,40)
(2,56)
(2,20)
(3,47)
(3,33)
(3,18 )
7
8
7
23
23
21
9
( 1,95)
(2,08)
(1,95)
(3,14)
(3,14 )
(3,04)
5
6
5
18
19
19
12
(1,61)
( 1,79)
( 1,61)
(2,89)
(2,94)
(2,94)
3
5
4
13
15
16
15
( 1, 10)
(1,61)
( 1, 38)
(2,56)
(2,71)
(2,77)
10
13
13
18
(2,30)
(2,56)
(2,56)
7
9
12
21
(l, 95)
(2,48)
(2,48)
Constante
de stabi-
0,144
0, III
0,106
0,099
0,063
0,042
lité
t 1/2
4,81
6,24
6,53
6,97
10,94
14,42
Moyenne
5,86 ± 0,92
10,78 :!: 3,73
t 1/2
Tableau VI
Résistance de la FDPase du cortex cérébral de Souris à la
chaleur chez les animaux témoins (NaCl) et les animaux trai-
tés avec la MSO (100 mg/kg i.p.). Dans chaque cas. 3 expé-
riences avec 3 déterminations par expérience ont été faites.
Les activités sont exprimées en nmoles/mg de protéines/min.
Les logarithmes (népériens) sont indiqués entre parenthèses.
La constante de résistance à la chaleur. K. est la pente de
la courbe. La 1/2 vie est tl/2 = (Log 2)/K (CIANARELLO et
AXELRDD. 16 ). T 1/2 est calculée pour chaque expérience et
la moyenne est calculée pour les témoins et les traités.

---

Ln Activité
- 136 -
4
3
2
1
!!
1
1
1
i
1
i
1
1
!
o
fi
12
18
Temps (min)
Figure 9 : Résistance de la FDPase du cortex cérébral de la Souris à la chaleur.
T 1/2 = (Log 2)/K, K étant la pente.
0 - 0 Témoins
. - . Soumi s à 1a MSO

---

- 137 -
Temps de
Témoins
Soumis à la MSO
traitement
(minutes)
1
2
3
1
2
3
33
32
29
43
40
39
0
(3,50)
(3,46)
(3,36)
(3,76)
(3,69)
(3,66)
25
21
22
30
32
32
5
(3,22)
(3,04)
(3,09)
(3,40)
(3,47)
(3,47)
19
17
16
26
25
26
10
(2,94)
(2,83)
(2,77)
(3,26)
(3,22)
(3,26)
15
13
11
'21
20
22
15
(2,70)
(2,56)
(2,40)
(3,04)
(3,00)
(3,09)
11
10
7
16
15
18
20
(2,39)
(2,30)
(1,95)
(2,77)
(2,71)
(2,89)
r =
0,9988
0,9933
0,9951
0,9978
0,9989
0,9996
k
- 0,0558
- 0,0280
- 0,0702
- 0,0480
- 0,0487
- 0,0382
=
t 1/2
12,42
12,38
9,87
14,44
14,22
18,14
Moyenne
11,56 ± 1,46
15,60 ± 2,20
t 1/2
Tableau VII
Résistance de la FDPase du cortex cérébral de la Souris à la trypsine
chez les animaux témoins (NaCl) et les animaux soumis à la MSO
(100 mg/kg i.p.) (Même légende qu'au tableau VI).

---

- 138 -
Ln Activité
4
2
1
O...----_-!oo--
.........
~------a.-__tl~
5
10
15
20
Temps(min)
Figure 10 : Résistance de la FDPase du cortex cérébral de la Souris à l'action de
la trypsine. T 1/2 = (Log 2}/K, K étant la pente.
0 - 0
Témoins
. - .
Soumi s à la MSO
1
1
1
l

---

- 139 -
4.3.3.2. Action de la trypsine.
La signification du test d'activité de la chaleur est également valable
pour une exposition a l'action dlune enzyme protéolytique. Les résultats
obtenus sont regroupés dans le Tableau VII et la Figure la.
La 1/2 vie de la FDPase est de Il,56 ! 1,46 min chez les animaux témoins
et de 15,6 ± 2,20 min
chez les animaux traités. Ces valeurs diffèrent
significativeemnt (p<0,05). L'enzyme induite et non induite ne sont
donc pas strictement identiques. La MSO semble "renforcer" la FDPase.
On remarque cependant que les 1/2 vie des animaux témoins et des ani-
maux traités ne sont pas très éloignées l lune de l'autre.
4.3.4. I~~~_9~~_~~!~~Qli!~~_i~!~r~~9i~ir~~_li~~_~~_~~~1~_fr~~!Q~~:
ll§:~ie~Q~e~~!~~~_~_e~Q~e~Qfr~~!Q~i~~~~·
Les concentrations en fructose-1,6-biphosphate, glycéraldéhyde-3-phos-
phate et dihydroxyacétone-3-phosphate ont été déterminées dans 3 régions
de l'encéphale de la Souris 4, 8, 24 et 48 heures après administration
de l a ~1S0.
4.3.4.1. Fructose-1,6-biphosphate.
Après administration d'une dose de 100 mg/kg i.p. de t50~ le taux de
fructose-1,6-biphosphate ne varie pas significativement dans toutes les
régions étudiées (Tabl.VIII). Les valeurs obtenues chez les animaux té-
moins sont très voisines de celles obtenues chez les animaux traités.
4.3.4.2. Dihydroxyacétone-3-phosphate et glycéraldéhyde-3-phos-
phate.
Comme dans le cas du fructose-1,6-biphosphate, la MSO n'affecte pas le
taux de dihydroxyacétone-3-phosphate dans le cortex cérébral, le tronc
cérébral et le cervelet de la Souris (Tabl. IX ).

---

- 140 -
Temps
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
~mole/g de tissu
jJmole/g de tissu
fJmole/g de tissu
. après
frais
frais
fr-a i s
injection
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
(heures)
à l a t~SO
à la MSO
à la MSO
0,144
0,137
0,106
0,113
0,155
0,130
4
± 0,029
± 0,014
± 0,025
~ 0,031
: 0,030
± 0,015
0,127
0,125
0,107
0,103
0,143
0,131
8
± 0,016
± 0,024
~ O,C20
± 0,019
~ 0,017
± 0,019
1
0,137
0,157
0,115
0,131
0,135
0,156
24
± 0,033
± 0,050
± 0,014
+ 0,024
± 0,016
± 0,034
-
1
i
0,130
0,128
0,103
0,111
0,146
0,144
48
± 0,022
± 0,016
± 0,023
± 0,013
± 0,024
± 0,018
1
1
r
1
l
tri
Tableau VIII: Action de la MSO (100 mg/kg i.p.) sur le taux de fructose-1,6-bi-
!
1
phosphate dans l'encéphale de la Souris. Chaque valeur représente une
i
moyenne de 3 déterminations indépendantes.
1
1
~~1i
1~.~!i·
:

---

- 141 -
Temps
Cortex cérébral
Tronc cérébral
Cervelet
A
après i n-
umole/g de tissu
umole/g de tissu
umole/g de tissu
frais
frais
frais
jection
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
(H)
à la MSO
à la MSO
à la MSO
0,047
4
0,048
0,042
0,042
0,055
0,049
1" 0,006
± 0,009
± 0,004
± 0,003
± 0,008
± 0,006
0,047
0,047
0,040
0,039
0,049
0,047
8
± 0,004
± 0,009
± 0,009
± 0,009
± 0,007
± 0,008
0,044
24
0,049
0,037
0,040
0,053
0,057
± 0,004
± 0,004
± 0,004
± 0,008
± 0,010
± 0,009
0,049
0,048
0,043
0,043
0,050
0,050
48
± 0,010
± 0,004
± 0,008
± 0,007
± 0,003
± 0,008
Temps après
Cortex cérébral
B
i njecti on
(heures)
Ta bleau 1X :
Témoins
Soumis à la
MSO
Ac tion de la MSO (100 mg/
kg i.p.) sur le taux de
0,0016
0,0016
gly céraldéhyde-3-phosphate
4
±0,0004
±0,0008
(B) et de dihydroxyacé-
to ne-3-phosphate (A) dans
l'e ncéphale de la Souris.
0,0014
0,0016
8
Cha que valeur représente
± 0,0004
±0,0001
une moyenne de 3 détermi-
nat ions indépendantes.
24
0,0013
0,0012
~ 0,0004
±0,0004
0,0011
0,0011
48
± 0,0001
~ 0,0003

---

- 142 -
La concentration tissulaire en glycéraldéhyde-3-phosphate est très faible.
Elle n'a pu être mesurée que dans le cortex cérébral. Il n'y a pas de
variation significative dans toutes les régions étudiées (Tabl.IX).
La MSO n'a donc pas d'effet sur le taux des métabolites intermédiaires
liés au cycle fructose-1.6-biphosphate - phosphofructokinase.
4.4. DISCUSSION
La MSO induit une biosynthèse de la FDPase dans le cortex du Rat 24
heures après administration de la drogue. Les inhibiteurs de la synthèse
protéique freinent
cette induction. La régulation de l'activité de
la FDPase ne semble pas être tributaire du taux de métabolites inter-
médiaires de la voie glycolytique.
4.4.1.1. Problèmes méthodologiques.
La validité de l 'estimation de la synthèse protéique dans le système
nerveux central dépend très étroitement de la méthode utilisée. Le
l
choi x de l 1 aci de ami né doit répondre à plus i eurs critères. Lorsqu' i l
s'agit de la biosynthèse d'une protéine donnée. il est indiqué d~ choi-
J
sir un acide aminé particulièrement abondant dans cette protéine (28).
1
i
L'analyse de la
composition en acides aminés de la
FDPase montre une
richesse relative en valine et en leucine. Parmi les acides aminés non
1
synthétisés par l'organisme du Rat. la valine et la leudne ont été sou-
vent utilisées pour l'étude de la synthèse protéique cérébrale (8. 29,
30). Ces acides aminés ont l'avantage de ne pas influencer notablement
1
i

---

- 143 -
la physiologie nerveuse comme la tyrosine
ou l'acide glutamique (31).
Le marquage sur le carbone Cl revêt une importance particulière. En effet,
lorsque l'acide aminé est métabolisè, le Cl se transforme en CU
qui est
Z
éliminé par le système respiratoire (32). Le marquage des autres carbones
peut sc traduire par l'incorporation de la radioactivité dans une autre
molécule qui pourra interferer avec les mesures.
Plusieurs auteurs ont étudié l'influence d'un acide aminé donné sur la
pénétration des autres acides aminés (33). Il semble que l'augmentation
du taux plasmatique d'un acide aminé donné se traduit par une baisse
du prélèvement par le cerveau des autres acides aminés qui empruntent
le même système de transport. Ainsi, l'augmentation de
concentration
en valine se traduit par une altération du prélèvement de leucine, d'iso-
leucine mais aussi de phénylalanine et de tyrosine. Il semblr néanmoins
que les pools intracérébraux des autres acides aminés ne soient pas nota-
blement réduits.
4.4.1.2. Régulation de la biosynthèse protéique.
Comme nous l'avions signalé orecedemment, l'étude de l'influence dela HSO
sur la synthese protéique dans le cerveau avait été déjà abordée. Chez le
jeune Rat en croissance, le taux d'incorporation varie suivant l'acide ami-
né uti li sé (2). Ces travaux ont été repri s récemment par SAt~UELS et coll.
(34, 35) chez la Souris adulte. La MSO a été utilisée
â. une dose rela-
t.ivonent f a i bl e (50 mg/kg)
qui ne pertube pas le comportement des sou-
ris 3ppartenant aux souches C57BL/6J. A cette dose, l'agent convulsivant in-
ni be la
glutarnylcysteine synthètase qui semble être impliquee dans les mé-
canismes de transport des acides aminés. Ces auteurs ont observé que la
MSO diminue le prélèvement par le cerveau de la valine. Parallèlement,
l'incorporation de la valine dans l'ensemble des protéines diminue de
17%. Dans ces expériences, l'activité spécifique de la valine protéique
n'a pas été déterminée et les auteurs ont estimé approximativement la
biosynthèse en assimilant le taux d'incorporation de l'acide aminé au

---

- 144 -
taux de synthèse apparent des protéines. Il semble néanmoins que dans
les 4 heures qui suivent l'injection de la MSO, il se produise une dimi-
nution de l'incorporation des acides aminés dans les protéines céré~
bra1es. Mais, 24 heures après administration du convu1sivant, nous avons
observé qu li1 n'y a pas de changement significatif dans le taux de syn-
thèse de l'ensemble des protéines. LAJTHA (36) signale que l'évaluation
du taux de synthèse de toutes les protéines du cerveau apporte peu dlé1é-
ments à la compréhension du métabolisme protéique~ en ce sens que la bio-
synthèse de chacune des protéines subit une régulation qui lui est propre.
Ainsi, il est difficile de tirer une conclusion ferme concernant l'action
de la MSO sur la synthèse de l'ensemble des protéines du cortex cérébra1.Né-
anmoins, il semble que dans un premier temps, la MSO puisse diminuer le
taux d'incorporation de la valine dans les protéines cérébrales (35). Plus
tardivement, longtemps après les convulsions, nos résultats montrent
que le taux de synthèse revient à sa valeur normale. Il est à noter que
la diminution du taux de synthèse apparent déterminé avec la valine est
relativement faible, de l'ordre de 17% (35).
Lorsqu'on isole une protéine donnée, on peut évaluer son taux de syn-
thèse avec une meilleure pr,écision. La MSO augmente le taux de synthèse
apparent de la FDPase corti cale sans changement de la biosynthèse de
1
1
t
1 e n s e m b 1 e d e s
protéines.
La MSO a donc une action sélective sur la
i
FDPase. Cette sélectivité d'action a été observée par d'autres auteurs.
En utilisant 1'hydrocortisone, Mc GINNIS et DEVELLIS (17) ont observé
que dans des cultures de cellules nerveuses de Rat, il y a une légère
1
i
diminution du taux de synthèse de l'ensemble des protéines alors que
i
i
le taux de synthèse de la glycéro1-phosphate déshydrogénase augmente
considérablement de 12 fois. SCHIt1KE et DOYLE (37) signalent des cas
1
analogues de sélectivité dlaction. Ils soulignent que lorsqu'on utilise
!t
un organe donné, il faut savoir que les réponses à un stimulus médica-
ft
menteux ou hormonal varient considérablement d'un tissu à un autre ou
!
d'une cellule à une autré. De ce fait/les protéines- enzymes sont attein-
tes très sélectivement. On peut donc penser que la MSO agit sélective-
J
ment sur un type donné de cellules, action qui se traduit par une induc-
1
ti on de 1a synthèse de 1a FDPase.
1
1
1

---

- 145 -
4.4.2.1. Actinomycine et cycloheximide.
L'utilisation des inhibiteurs de la synthèse protéique a permis d'ap-
profondir les mécanismes de l'induction de la FDPase par la MSO. n'une
façon générale, dans les phénomènes d'induction enzymatique, ces inhi-
biteurs permettent de faire la différence entre l'activation du pouvoir
o
o
' , - - - C
CH]
CH,
C
1
CH-HC
CH- HC,
CH,
N-CH,
CHI-N,
CH,
l ,....,......,
Oe-C
c=o
,CH,
CH)-N/
Sarcosi.,.
-c~-o
o=C'
o
H'C(f°~P'l .~O
o
'
H,C / H,C-éCH
HC.':"-CH~--CH
-CHVH
l-Proline
:"L
'
1
H c.....- N ,-,
o";c"
-'CH ',CH 1
CH, l
c=o
H CH
CH-HC"
a·Valine
CH-HC,
°
HN
CH,
CHI
NH
'C~co
o=c,
HC-HC-~
L-Threonine
----cH·.-~·C>-l
Cycloheximide
NH
CH,
CH, HN
'c=o
O=.C
"
/
/
.'\\l''~~,.-
"':~~'T,/N H ~
,
Phel1011aZOne
""r~
CH,
CH]
Acti nomyc i ne D
Mêtyrapone
Figure 11 : Structures moléculaires de l 'actinomycine D, du cyclohéximide
et de la métyrapone.
catalytique de l'enzyme et la synthèse
de nova.
Lors d'une acidose,
l'activité de la phosphoénol pyruvate carboxykinase rénale augmente
considérablement (38). Cette augmentation n'est ras antagonisée.par
l 'actinomycine ou l'éthionine. L'acidose entraîne donc l'activation
d'une enzyme qui existait déja mais qui êtait inactive. Par contre, lors
de l'intoxication au tétrachlorure de carbone il se ~roduit une aug-
~entation de l'activité de plusieurs enzymes de la voie qlycooénique,

---

- 146 -
la glucose-6-phosphatase, la FOPase et la phosphoénol pyruvate carbo-
xykinase (24); cette augmentation est antagonisée par le cycloheximide
et l 'actinomycine D. Il Y a donc une induction par la biosynthèse lors
de cette intoxication. Nos résultats montrent que les inhibiteurs de la
synthèse protéique antagonisent partiellement l'induction de l'activité
de la FDPdse cérébrale par la ~SO. Il apparaît donc qu'il y a une bio-
synthèse de nova de la FDPase. Mais l'induction qui persiste malgré
l'administration des inhibiteurs montre qu'il y a une activation du
pouvoir catalytique de l'enzyme déjà existante,.parallèlement à.l 'accéléra-
tion de la synthèse. Ces résultats sont en accord avec ceux que nous avions
obtenus après l'isolement de l'enzyme.
D'une façon générale, les inhibiteurs utilisés agissent au niveau de la
synthèse protéique: l'actinomycine n réa~it avec les chaînes d'ADN,
au niveau des bases guanine - cytidine. Il bloque ainsi l 'ARN p~lymé­
rase. Le cyclohexiMide bloque l'initiation et l'élongation des chaînes
polypeptidiques. On doit espérer que même une faible dose d'inhibiteurs
soit active, tout au moins partiellement. Tel semble être le cas de
r
1
l 'actinomycine D. Par contre, la dose de 5 mg/kg de cycloheximide est
l
pratiquement inactive. On peut se demander si ces composés agissent en
bloquant la synthèse des protéines. Il est difficile de répondre à cette
1
question si l'on sait que ces inhibiteurs bloquent en même temps les
1
enzymes impliquées dans les synthèses hormonales et donc, altèrent le
taux des hormones circulant comme les glucocortico~des (37).
Lorsqu'on soumet les animaux
à
la MSO seule, les proportions d'aug-
mentation au bout de 4 heures sont relativement proches de celles qu'on
obtient au bout de 24 heures avec l 'actinomycine D associée à la MSO.
Il est possible que l'activité accrue de la FDPase dans ces cas soit le
reflet de l'activation du pouvoir catalytique par la MSO. On peut pen-
ser qu'il y a une régulation aiguë rapide par augmentation de la vitesse
de catalyse de l'enzYMe. Cette régulation aiguë serait complétée plus
tard par une régulation chronique due à la biosynthèse de nova de la
FDPase, comme ce que l'on observe généralement.

---

- 147 -
4.4.2.2. Métyrapone. Résistance à la chaleur et à la trypsine.
La métyrapone est ,en particulier un puissant inhibiteur de la stéroTde-11-B
hydroxylase (JO). Ce compose freine l'induction de la FUPase par la M~O,
comme les inhibiteurs de la synthèse protéique. On sait qu'il réduit
également l'accumulation intracérébrale de glycogène induite par la
MSO. Ces résultats permettent de supposer deux mécanismes. D'abord,
les corticostéroTdes seraient impliqués dans l'action de la ~~SO. De
plus, il semble exister une relation entre la gluconéogénèse et l'accu-
mulation intracérébrale de glyco0ène puisque la métyrapone inhibe les
deux phénomènes.
L'enzyme induite par la MSO et l'enzyme normale ne semblent pas tout
à fait identiques. Les demi-vies de résistance à la chaleur et à la
trypsine ne sont pas identi~ues. Dans les deux cas, on remarque que
l'enzyme "induite est plus résistante que l'enzyme normale. La r'1S0 aurait
donc un pouvoir protecteur sur la molécule de la proté i ne-enzyme .
L'actinomycine D ne retarde pratiquement pas les convulsions provoquées
par la MSO mais il inhibe fortement l'induction de la FDPase par la r~s().
Le cycloheximide retarde ces convulsions mais il n'antagonise la FDPase
qu'à une dose relativement élevée. On peut en conclure que l'activation
de la gluconéogénèse et l'accumulation probable de glycogène qui s'en
suit ne sont pas en rapport direct avec la qenèse des convulsions. L'ac-
tion directe de la ~so dans les phénomènes d'induction paraît peu pro-
bable. In vitro, cette drogue est sans action sur le taux de glycogène
(22). Ce serait une action indirecte, peut-être à mettre en rapport avec
les domma~es ultrastructuraux causés par la drogue. Ces phénomènes se dé-
rouleraient dans les cellules gliales où l'accumulation de glycogène
se produit.
4.4.3. Les métabolites intermédiaires.
La nso n'a pas d'action sur la concentration en fructose-1,6-biphos-

---

- 148 -
phate, en glycéraldéhyde-3-phosphate et en dihydroxyacétone-3-phosphate
tissulaires. On a pu observer une variation du taux decertains métabo-
lites intermédiaires de la voie~ gluconéogénique lors d'une accélération
de la gluconéogénèse. Lors de l 'intoxication au tétrachlorùre de car-
bone, en même temps que les enzymes gluconéo9éniques du rein sont acti-
vées, on assiste à une augmentation du taux tissulaire de phosphoénol-
pyruvate, de 2-phosphoglycérate, de 3-phosphoglycérate et de glucose-6-
phosphate (24). ~~ais dans le foie où cette intoxication provoque un
ralentissement de la gluconéogénèse, on observe olutôt une augmentation
de la concentration en lactate, pyruvate et malate. Dans nos expériences,
les métabolites qui sont en rapport avec la FDPase et la PFKinase ne
subissent pas la même régulation. Il apparaît que les taux de ces méta-
bolites ne constituent pas un élément important de la régulation de
l 'activité de la FDPase et de la PFKinase dans le cerveau des animaux
traités avec la MSO. Clest la variation je l 'activité même de ces deux
enzymes qui accélère la gluconéogénèse. Cette remarque suppose que clest
l 'ensemble des enzymes de la gluconéogénèse qui subirait cette régulation.
1
,l
1
!i
1

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1
1
1
***
!i
f
f
J
J
1
~1
1
!t
1

---

Chapitre V
i
ETUDE IMMUNOLOGIQUE DE LA FRUCTOSE-I,6-BIPHOSPHATASE DU CORTEX CEREBRAL
!
DU RAT. EFFET DE LA METHIONINE SULFOXIMINE.
i•.
f
t1,
1
f
1
1
f
1

---

- 153 -
5.1. INTRODUCTION
L'étude de la FDPase dans le système nerveux central par les méthodes
précédentes a montré que la MSO induit une synthèse
de la protéine-
enzyme. Un approfondissement des mécanismes de l'induction nécessite
uhe étude au niveau moléculaire.
Les méthodes immunologiques ont connu un important développement de leurs
techniques qui permettent un isolement de l'enzyme avec une précision éle-
vée. Il est possible de fixer les immunoglobulines anti-enzymes à un support
tel que le Sépharose (1). Une chromatographie d'une préparation enzymatique
brute sur un tel support immunoadsorbant permet de retenir sélectiue-
ment les molécules d'enzymes qui seront éluées par la suite (2). Cette
1
méthode est une adaption de l 'immunoprécipitation classique. Etant don-
1
!
né que nous avons purifié la FDPase jusqu'à une homogénéité électropho-
1
rétique, de telles méthodes peuvent être utilisées avec une précision
1
remarquable.
i
Les résultats obtenus antérieurement avec la chromatographie d'affinité
montrent une augmentation de la quantité de protéine-enzyme sous l'ac-
1
tion de la MSO. L'incorporation de la valine [114C] reflète une synthèse
globale accentuée de l'enzyme. Cette synthèse est vraisemblablement le
!
résultat d'une synthèse accrue plutôt que le ralentissement de la dégra-
t
dation. En effet, la demi-vie d'une protéine est relativement longue.
t
Celle de la lactate déshydrogénase est de 6 jours et celle de la fructose-
r
birhosphate aldolase est de 4,9 jours dans le foie (3). Ainsi donc, on es-
!
t
time
généralement que lorsqu'on utilise un temps d'incorporation rapide
i
de quelques heures. 1e taux de synthèse apparent est l' i ndice de 1a
biosynthèse, sans interférence notable de la dégradation. La demi-vie
a pu être calculée à partir du taux de synthèse (4). Cependant, l'assi-

---

- 154 -
milation du taux d'incorporation à la biosynthèse comporte des risques.
Toutes les protéines n'ont pas une même demi-vie. Les valeurs sont très
disparate~ même si l'on considère les enzymes d'une même voie métabo-
lique. La demi-vie de la phosphoénolpyruvate carboxylase n'est que de
0.3 jour. celle de la glucose-6-phosphate déshydrogénase et de la glu-
cokinase de 1 jour contre les 4.9 jours de l'aldolase dans le foie (3).
Dans les cas de courtes demi-vies. la dégradation interfère avec la
synthèse lors de l'incorporation d'un acide aminé. Ainsi donc. l'utili-
sation d'une autre méthode s'avère nécessaire pour faire la part de la
synthèse et de la dégradation. Nous avons utilisé la méthode de double
marquage suivie par une séparation de la FDPase par immunologie (5.6).
Un sérum anti-FDPase a été préparé avec
l'enzyme purifiée (voir
références 7 et 8). La spécificité de l 'anti-sérum a été déterminée
par
la méthode de double diffusion d'OUCHTERLONY.
5.2. MATERIELS ET METHODES
5.2.1. Matériels.
5.2.1.1. Animaux.
La FDPase a été isolée chez le Rat de souche Sprague-Dawley comme au-
paravant. L'anti-sérum a été préparé avec le Lapin. Oryctolagus cunni-
culus de souche Néo-Zélandaise. Les lapins ont été achetés dans un éle-
vage local. Ils sont gardés dans le laboratoire pendant plusieurs jours
et sont nourris ad libitum.
5.2.1.2. Réactifs.
Adjuvant de Freund complet
Difco

---

- 155 -
Agar purum
Behringwerke, Marburg
Azocarmin G
Merck, Darmstadt
C.E.A.
Gif-sur-Yvette
5.2.2. Méthodes.
5.2.2.1. Préparation de la FDPase.
La FDPase est
isolée par chromatographie d'affinité comme auparavant.
Une série d'électrQphorèses est effectuée sur gel de polyacrylamide standard
dard à 7,5%. Un gel est coloré au bleu de Coomassie puis décoloré par
électrophorèse. Par comparaison, la partie contenant la FDPase est dé-
coupée, puis homogénéisée dans du NaCl gO/DO à 4°C. L'homoqénat est
centrifugé pendant une heure à 60 000 x g. Le surnageant est
utilisé
pour l'immunisation du Lapin.
1
1
5.2.2.2. Préparation de l'anti-sérum.
1
La FDPase purifiée est mélangée à volume égal avec de l'adjuvant de
Freund complet. Après émulsion, le mélange est injecté par voie sous-
1
f
cutanée aux lapins. Les injections sont réparties en 4 endroits dans
le dos de l'animal. Une quantité de 250 ~g de FDPase est utilisée. Deux
f1
semaines après la première injection, une injection d'immunisation a
1
!
été pratiquée dans les mêmes conditions que la première. Deux semaines

---

- 156 -
après la deuxième injection, le sang est prélevé par la veine marginale
de l'oreille. Après coagulation le sérum est séparé.
5.2.2.3. Double immunodiffusion d'OUCHTERLONY.
La technique d'OUCHTERLONY a été pratiquée sur une lame de microscope
recouverte de gel ose à 2%. Un puits central et cinq puits périphériques
sont pratiqués dans la gelose. Dans le puits central on effectue un dé··
pôt de l 1 anti gène. Dans l es puits péri phéri ques l 1 anti -sêrurn est déposé
soit à l'état pur, soit dilué. La diffusion s'effectue pendant 48 heures
environ à 4°C dans une chambre humide. Après précipitation, les lames
sont soigneusement rincées avec une solution de NaCl g%o pendant au
moins 24 heures. Elles sont ensuite séchées à la température ambiante
ou dans une étuve ventilée à 30°C. Elles sont colorées pendant 10 min
environ dans une solution méthanolique d'azocarmin à 0,4% (p/v) conte-
nant 10% (p/v) diacide acétique. La décoloration s'effectue dans une
solution méthanolique diacide acétique à 10%.
5.2.2.4. Immunotitration.
Les rats reçoivent une injection de NaCl g%o (témoins) ou de MSO à la
dose de 100 mg/kg i.p .. Ils sont sacrifiés 24 heures après. Le cerveau
est rapidement prélevé et immerqé dans un milieu contenant KCl 0,15 M
et
NaHC0
10 mM. Le cortex est séparé et homogénéisé dans 3 volumes
3
du milieu précédent et :entrifugé.Le pH du surnageant est ajusté à 7,4.
Des fractions de 0,5 ml d'extrait enzymatique sont réparties dans plu-
sieurs tubes. On ajoute aux tubes des volumes variables d'anti-sérum.
Les tubes sont mis au bain-marie à 37°C pendant gO min,puis à 4°C pendant
une nuit. La FDPase est dosée dans le surnageant de la même façon qulau-
paravant.

---

- 157 -
5.2.2.5. Incorporation des acides aminés.
5.2.2.5.1. Simple marquage.
L'étude de la biosynthèse a été effectuée avec la valine U14C] . Les
rats reçoivent une injection de NaCl 9%0 ou de MSO (100 ma/ka i.o.).
La valine est injectée à la dose de 15~moles/g de poids corporel avec
une activité de 0,048 ~Ci/g. Cette jnjection est pratiquée quelques
heures avant le sacrifice de l'animal. Le cortex cérébral est séparé
et l 'immunoprécipitation est effectuée dans les mêmes conditions qu'au-
paravant. Une fraction d'homogénat complet est prélevé pour la détermi-
nation de la synthèse des protéines totales cérébrales. Cette
fraction est traitée avec le TCA et la radioactivité est déterminée
comme auparavant. Après la centrifugation, l 'immunoprécipité est lavé
avec la solution d'homogénéisation contenant en plus de l'albumine 0,2%
et du NaCl 90 / 0 0 , Le mélange est centrifugé à 3 000 x g pendant 30 min.
à 4°C. Un deuxième lavage est effectué dans les mêmes conditions. La
radioactivité du dernier surnageant est nulle. Le sédiment final est
traité avec du Soluène 350 et la radioactivité est déterminée comme au-
paravant.
5.2.2.5.2. Double marquage.
L'étude de la synthèse et de la dégradation a été effectuée par une in-
jection de valine [3 HJet de valine [114CJ . La valine tritiée est in-
jectée aux animaux en même temps que la MSO. La dose de tritium est de
0,67 ~Ci/g d~4PJOidS corporel. Vingt deux heures après cette injection,
t
la valine r C est administrée à raison de 0,067 ~Ci/g de poids cor-
1
porel. La concentration en valine administrée est de 15 ~moles/g dans chaque
cas. Deux heures après la dernière injection, les animaux sont sacrifiés
le cerveau est rapidement disséqué. La FDPase est précipitée comme avant
avec de l 'antisérum et le précipité est lavé. Il est traité avec du So-
luène 350. La radioactivité en [3H] et en [14 CJ est déterminée avec la
~chnique du double marquage (9). Les canaux [3H] et [14C] sont préréglés

---

- 158 -
et l'efficacité de comptage est déterminée pour le[3 H] et le [l/1rcl Les
résultats sont exprimés en dpm/mg de protéines. La radioactivité des
deux isotopes est également déterminées dans une fraction de protéines
totales.
5.3.RESULTATS
Lorsqu'on utilise le sérum de préimmunisation recueilli ~près la pre-
mière injection de FDPase au lapin, il n'y a pas formation d'immunoprécipité.
Par contre, avec l 'antisérum complet, on observe une seule bande d'im-
munoprécipité (Fig.1). L'antisérum obtenu est monospécifique. Ce résul-
tat indi0ue que la FDPase préparée ne contient qu'un type de molécule.
5.3. 2. Immunotitration.
---------------
Les résultats obtenus avec l 'immunotitration sont rassemblés sur le
Tabl.I,Fig.2. Le point équivalent,correspondant au volume nécessaire
d'antisérum pour neutraliser la totalité de la FDPas~est déterminé par
extrapolation de la partie linéaire de la courbe. Une régression linéaire
est effectuée avec cette partie linéaire (Fi~.2).
Chez les animaux témoins le point équivalent obtenu est de O,14'ml pour
une activité de 2,18 nmoles/mg de protéines/min. Chez les animaux soumis
a la MSO, 24 heures après administration de la molécule, il faut 0,23
ml pour neutraliser une activité de 4,11 nmoles/mg de protéines/min.

---

- 159 -
Figure 1
Double immunodiffusion d'OUCHTERLONY avec l'anti-FDPase. La
FDPase a été préparée jusqu'à une pureté électrophorétique
à partir du cortex cérébral du Rat. L'enzyme est injectée
avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Après une
injection de rappel, le sang est prélevé et le sérum est sé-
paré. L'anti-sérum pur est déposé dans les 5 puits périphé-
riques et la FDPase dans le puits central, le volume déposé
est de 20 J.1l dans chaque cas. Après migration et-lavage, l'im-
munoprécipité est coloré à l'azocarmin; l'excès de colorant
est éliminé et les plaques sont photographiées.

---

- 160 -
Activité spécifique de la FDPase
nmoles/mg protéines/min.
Volume d1antisérum
(}Il)
Témoins
Soumis à la MSO
0
2,20
4,10
20
1,84
40
1,60
3,40
80
1,25
2,65
120
0,74
2,40
160
2,30
200
2,20
Tableau 1
Immunotitration de la FDPase du cortex cérébral du Rat.

---

- 161 -
Lorsqu'on fait le rapport des activités enzymatiques en l'absence d'an-
tisérum d'une part et des points équivalents d'autre part chez les ani-
maux témoins et les animaux soumis à la MSO,on obtient respectivement 1,89
·et 1,57. Il y a une différence de 20% qui indique que l'induction de la
FDPase n'est pas uniquement due à une' augmentation du
nombre de molé-
cules enzymatiques (2). Il y a une activation parallèle de la catalyse.
5.3.3.1. Incorporation de la valine [114C] .
Les résultats obtenus par simple marquage sont voisins de ceux que nous
avions déjà obtenus après isolement de l'enzyme (Tabl.II, Fig.3). Les
activités sont exprimées en dpm/g. Les concentrations en valine ont été
mesurées lors des expériences précédentes. La radioactivité spécifique
de la valine libre et de la valine protéique
avait également été dét~r­
minée.
La radioactivité de la fraction acido-soluble reste élevée pendant toute
la période d'incorporation. Lorsqu'on considère la radioactivité des
protéines totales, il n'y a pas de différence entre les animaux traités
et les témoins. Par régression linéaire, la radioactivité incorporée
est de 17 dpm/mg de protéines/heure chez les témoins contre 19 dpm/mg
chez les animaux soumis à la MSO. Par contre, dans la FDPase, on obtient
6,5 dpm/g de tissu/heure chez les témoins contre 9,5 dpm/g après adminis-
tration de la molécule. La MSO active donc sélectivement l'incorporation
de la valine dans la FDPase cérébrale.
5.3.3.2. Incorporation de la valine [3 H] et de la valine [114CJ.
Les résultats obtenus par le double marquage au[3 H] et au[14 C]sont ras·
semblés dans le Tableau II .

---

- 162 -
Activité nmoles FDP/mg prot.jmtn
4
•
3
2
o
40
ao
160
200
240
,...1 d'antlsêrurn
Figure 2 : Immunotitration de la FDPase du cortex cérébral du Rat. Un volume cons-
tant d'enzyme est incubé avec des volumes variables d'anti-sérum. L'ac-
tivité de la FDPase est déterminée dans le surnageant. Les points d1équi-
valence sont déterminés avec la partie linéaire de la courbe~ par régres-
sion linéaire.
0 - 0 Témoins
. - . Soumis à la MSO

---

1
- 163 -
t
f
Temps
Fraction ac i do-
Protéines totales
FOPase
(heures)
soluble
dpm/mg de protéines dpm/g de tissu
t
dpm/mg de tissu
1
A
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
Témoins
Soumis
1
à la MSO
à la MSO
à la MSO
1
7,30
7,28
20
18
6
9
1
;
2
7,12
6,80
40
43
10
16
1
3
6,75
6,54
53
56
19
28
Protéines totales dpm/mg prot
FOPase
dprn/g de tissu
B
Témoins
Soumi s à la MSO
Témoins
~oumis à la MSO
14C
56
52
17
28
3H
460
526
423
466
14C/3
0,12
0,10
0,04
0,06
H
Tableau II : Incorporation de la valine dans la FOPase.
A - incorporation de la valine [114C] dans les protéines totales et dans
la FOPase du cortex cérébral du Rat. Les activités sont exprimées en dpm/
9 de tissu pour la FOPase et en dpm/mg de protéines pour les protéines
totales. Chaque valeur représente une détermination avec 5 animaux pour
1 heure et 3 animaux pour 2 et 3 heures.
B - Oouble incorporation de la valine [114C] et de la valine [3H] dans les
protéines totales et dans la FOPase du cortex cérébral du Rat. Chaque va-
leur représente une détermination avec 5 animaux chacune.

---

- 164 -
Radioactivité
1500
(dpm 9 de tissu)
1000
500
Protéines
totales
o Témoins
• Soumis à la MSO
•
20
10
FDPase
o Témoins
• Soumis à la MSO
o"""--
+-
~-.,....,...._----~_
1
2
Heures
3
Figure 3 : Incorporation de la valine [114c] dans les protéines totales et dans la
FDPase du cortex cérébral du Rat.

---

- 165 -
Au bout de 24 heures d'incorporation de la valine [3 HJ, le taux de ra-
dioactivité est semblable dans les protéines totales des animaux témo}ns
et des animaux soumis à la MSO. Dans la FDPase éqalement, les valeurs sont
voisines.
Après deux heures d'incorporation de la valine [114C], les résultats
rappellent ceux obtenus avec le marquage simple. Les protéines totales
présentent une activité semblable chez les animaux traités et les té·
moins tout comme dans le cas du tritium. Par contre, l'activité de l'a
FDPase des animaux traités est plus élevée que celle des animaux té-
moins. On observe une augmentation de 65% par rapport aux témoins.
5.4. DISCUSSION
Les méthodes immunologiques ont per~is de confirmer les résultats anté-
rieurement obtenus. La monospécificité du sérum anti-fructose-1,6-bi-
phosphatase confirme les études réalisées avec l'éléctrophorèse sur gel
de polyacrylamide. L'enzyme induite et l'enzyme non induite sont iden-
tiques au point de vue moléculaire. En effet, sur une même lame, les
deux types d'enzymes réagisssent avec l 'antisérum préparé avec l'en-
zyme normale.
r
La concentration tissulaire d'une enzyme est la résultante de son taux
de synthèse et de son taux de dégradation.Une variation de cette concentra-
tion provient d'une variation du taux de synthèse ou de déqradation Oll np.s
deux à la fois. La technique de double marquage a été
utilisée avec
1
succès pour distinguer l'induction enzymatique par accélération de la
synthèse ou par ralentissement de la dégradation (2). L'administration
1
séquentielle de la forme tritiée d'un acide aminé suivie 24 à96 heures plus
~
tard de
l'administration de ce même acide a~iné marqué au [14CJ a
t
permis d'expliquer les mécanismes d'induction de la FDPase. Les résul-
r

---

- 166 -
tats obtenus montrent que la MSO exerce son influence sur la biosyn-
thèse de l'enzyme et non sur sa dégradation. Ces résultats confirment
que les inhibiteurs de la synthèse protéique inhibent effectivement la
biosynthèse de la FDPase. On peut donc conclure que l'activité de l'en-
zyme qui persiste après administration des inhibiteurs associés à la
MSO est le reflet d'une activation du pouvoir catalytique. Comme les ré-
sultats l'ont déja montré, cette action est spécifique.
Les courbes d'immunotitration permettent d'entrevoir les mécanismes mo-
léculaires de l'induction. Si l'enzyme était activée uniquement par aug-
mentation du pouvoir catalytique, il faudrait la même quantité de ~­
globulines pour neutraliser les activités FDPasiques différentes chez
les animaux traités et les témoins. Tel n'est pas le cas dans nos ex-
périences. Dans le cas d'une activation par augmentation du nombre de
molécules de FDPase exclusivement, la quantité de l-globulines est di-
rectement proportionnelle a l'activité enzymatique. Or le rapport des
points d'équivalence est différent du rapport des activités en absence
d'antisérum. Il y a donc une biosynthèse de nova associée a une acti-
vation du pouvoir catalytique de la FDPase sous l'action de la MSO.
Les phénomènes de phosphorylation protéique semblent être impliqués
dans la régulation de l'activité de certaines enzymes cérébrales (10).
Le métabolisme des nucléotides cycliques semble
être lié a ces phéno-
mènes. C'est pourquoi, nous avons étudié l'action de la MSO sur le taux de
nucléotides cycliques dans l'encéphale de la Souris.

---

- 167 -
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---

Chapitre VI
1
(
EFFETS DE LA METHIONINE SULFOXIMINE SUR LE TAUX DE NUCLEOTIDES CYCLIQUES
DANS L'ENCEPHALE DU RAT ET DE LA SOURIS.

---

- 168 -
\\ 1 !l'''f'lid/ll[(/, "l, '1/ \\.
\\ ,,1
1.'\\. ~'r, IO~t} Il' III ~ r
Pl'r~,llll'In Pre ...... lIt! !1l71} Pnutcd in <ill',I! Hutum
..Prél imlnalre"
EFFECT OF METHIONINE SULPHOXIMINE ON
BRAIN CYCLIC NUCLEOTIDE LEVELS
T, IIl'vOR and J. CiAYH
labor.uoire de Physiologie Générale. Hnivcrsitè de Nancy 1. CO. 140.
~40,17 Nancy. France
Methionine
sulphoximinc
adrninistcrcd
to
rats
80 C l'or 1 min. The content or cyclic nucleotides was
and mice induced an activation and l'roba hl)' a bio-
cstimatcd in this brain tissue l'l'action. Cyclic AM P
synthesis de 1/11/'0 of the key gluconcogenic enzyme
was rncusured by the competitive protein binding
Iructosc-Lô-biphosphatase (EC .l !.J.III in the cere-
assay (Gilrnun. 1970) rnodified (Weller, Rodnight and
bral cortex. hrain stem and ccrebcllurn. during the
Carrera.
19721. with
an adsorption or the
cyclic
preconvulsive and convulsive pcriods and also :Jt the
nucleotide on charcoul (Albano. Barries. Muudsley,
rime or recovcry l'rom scizurcs when the animais
Brown and Eikins, 1974; Tavey. Oldham and Whe-
appear normal (l-lcvor and Gayet, 1978a. h], These
tan. 1974). Cyclic CiM P was estimated hy the radioim-
data suggest thal the subsequent intracerebral ac-
munoassay (Steiner. Parker and Kipnis. 1972). The
cumulation or glycogcn which occurs, within swollen
matcrials l'or the cyclic nueleotide determinations
astrocytes, during the period or sei/ures induced by
were
purchased
l'rom
Ihe
Radiochernical
Centre.
administration of methionine sulphoxirninc. and per-
Amersham. Vailles were deterrnincd using standards
sists up to 72 hl' artel' injection or the convulsant (Fol-
or cyclic AMI' and cyclic GMP. Cyclic nucleotide
bergr ova.
Passonncau.
Lowry ami
Schulz,
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phosphodicstcruse (Boehr inger
Mannheim
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Meylan) hydrolysed 100"" of the reactive cyclic AMr
l'rom au activation of the gluconcogcnic p.nhwuy.
and cvclic GMP in cxtructs l'rom hrain tissue both
Sincc concentrations of adenosine Y,5'-cvclic mono-
l'rom control and
methionine sulphoximc-injcctcd
phosphate (cyclic AM Pl and guunosinc :rS-eyclic
mice, The mean yield or cycl ic-AM P and cyclic G MI'
rnonophosphatc (cyclic CiM l') within particulur brain
l'rom the biological surnples was 94"", bascd on the
regions appcar 10 be dependent upou the type of seiz-
recover y or known arnounts or standard cyclic AM P
ure activity induccd by central nervous system stiruu-
and cyclic G M Il added 10 tissue samples prim to pur-
lants or by elcctrushock (Lust, ('llldberl! and Passon-
iûcation,
neau. 1976: Ferrcndclli and Kinschcrf 1977: Lust,
Alter the intrupcruoucal inicction or methionine
Kupferberg,
Yonckawa.
Pcnr y,
Pussonncau
and
sulphoxirninc '100 mg/kg), no change in the cyclic
1
Wheatou, 197~). it sccrns relevant to the study or the
AMI' content was noticcablc in the rnouse cerebral
relationship bctwccn
neuronal
dcpolur i/ution and
cortex and in t he rat cerebral cortex. striaturn, hypo-
1
glial glycogeuesis. hoth induccd by methionine sul-
thalamus and ccrcbcllurn ton. during the convulsive
phoximinc, to 1'01101\\ the regional changes or the lcvcls
and postconvulsivc pcriods, rcspcctivcly about 8 and
or cyclic AMI' and cyc!«: (;MP in the mousc and l'al
24 hl' alter adrninistration or methionine sulphoxi-
brain.
mine. nllrinl! lhe prcconvulsive pcriod, 4 hl' artel' ad-
Male Swiss rnicc (O\\-\\
stmin) and
Wistar rats
ministralion or methionine sulphoxirninc, the concen-
[Iaboratory inhred strain] wcrc uscd throughout the
tration or cyclic <.,Ml' did not change significantly in
exper imcnts. i-Mcthiouinc-tu-sulphoximinc (Sigma.
the mou-e cerebral cortex. brain stem and cerebcllum
St louis. Mn) (lllO ml! kg) dissolvcd in 0.2 ml (micc]
(F ig. 1). From 4 10 7 hl' alter injection or the drug.
or \\.0 ml (rats) of O.'!"" NaCI was inicctcd intruperi-
whcn the animais exhibitcd an increasing syndrome or
toneally; Cllu lro l animais reccÎ\\"ed the same \\"olume or
ataxia. the wnccntration or eydie <.iMP was aug-
0.9"" NaCl.
rhe mice were l'l'Olen intact in li'IUid
mentcd hy 40"" in the hrain stem. When the micc
nitrogen and the rats Ilerc decapilaled and
lheir
I\\cre saeri/iced juSl afler the onsel or Ihe tirst spon-
heads instautanwusly immersnt in liquid nitrngen. at
taneoliS <:Ionic seizure. lhe Lydie GMP content ln the
dilTerent perinds rpllowinl! injeL'tion or IllL'lhionine
cerehr,i1 cortex and hrain stem re<lched respecti'dy X7
sulphoximinc. The l'Hl/en animais and hl'a,1s were
and X2 pmol'g tissue wet wl: Xhl' after administration
stored at -:10 C until the brain 1\\as 1"CllIllwd. The
or mcthionine sulphoximine. during the period L)r in-
1
chilled hrain reginns 1\\'Te dissected nut ill a rcrriger-
tense tonic and donic sei/lire aCli\\ily. the concen-
aled chamhcr and rapidly wcighed. [aeh hrain region
tration or cyelic GMP inereased arpHlximately hy 44
was homogeniled in b "'/lwI) or 10"" trichl"wacetic
and
100"" respectil'ely in thL" cerehral Cl1rtex and
add. and tlu: hnmo!!cn~llc was l'enlrirnged II~.O()O g.
hrain \\(cm. willlOut any change of Ihis concentratil1n
15 min) at 4 C. The sll['crnatant \\Ias \\\\ashed 5 times
in the rlTehcllumlFig. Il. At Ihe end or lhe pcriud ur
""ith 4 \\pl uf \\\\atcr-satlllated diL'lIl\\1 clher: diethyl
..ei/url' aeti\\ ity. about l) hl' after administrali"n ,,1'
L'lher rL'mainin!! in thl' ",llIlipn "as "\\<lI)('Iatc<l ;It
ml,tlllnl)ine slIlphl1ximil1e. the eyclic (,1\\11' eUI)(l'1l1 ln

---

-
Ib9 -
T. HEVOR and J GAYET
c
A
B
160
160
140
140
140r
...
••
120
120
120
'"
"=
<,
u,
~
100
100
100
l?
U
a
E
80
80
80
a,
70
60
60
40
40
OC
-r1Sl
-;C
,--,g
CC
cc
c
Fig. 1. Effect of methionine sulphoximine on cyclic GMP content in mouse cerebral cortex (CC), brain
stem (S) and cerebellum (C). The animais were sacrificed in the preconvulsive (A), convulsive (B) and
postconvulsive (C) periods, respectively about 4. 8 and 24 hr after an intraperitoneal injection of t.-rneth-
ioninc-Dl.-sulphoximine (100 mg/kg) dissolved in 0.2 ml of 0.9~~ NaCI; control animaIs reccived the
same volume of 0.9~·;, NaCI. Open columns represent control (saline-treated) and hatched columns
rcpresent methionine sulphoximine-trcatcd mice. The values are
the mean levels of cyclic GMP
expressed as picornoles/g tissue wet wt ± SD for 3~ 10 animais. Statistical comparisons are established
using Student's r-test: • P < 0.05 .. P < 0.005.
the brain stem was still 56"" higher than that deter-
(E.R.A. 331) and from the Fondation pour la Recherche
rnincd in the control mice. During the postconvulsive
Médicale.
period at the time of recovery from seizures, 24 hr
RF:FF.RENCF:S
alter injection of the convulsant, the concentration of
Albano, J D. M .. Barnes, G. D .. Maudsley, D. V.. Brown.
cyclic GMP in the rnouse brain stem was only in-
B. L. and Etkins, R. P. (1974). Factors affecting the satu-
ration assay of cyclic AM Pin biological systems. Ano/yt.
creascd by 27'\\ (Fig. 1).
Biochem. 60: 130 141.
It has been suggested that changes in cyclic GM P
Berel, A., Lehr. P. R. and Gayet. J (1977). Inhibition by
lcvels in ail regions of the brain directly reflcct alter-
metyrapone of convulsions and storage of brain gly-
ations in neuronal activity (Fcrrendclli, 197X). The ele-
cogen
in
micc
induced
by
methionine
sulfoximine
(MSO). Brain Res. 128: 193-196.
vated concentration of cyclic GMP observed in the
Ferrendelli, J. A. (1978). Distribution and regulation of cyc-
brain during seizure activity originatcs from depolari-
lie GMP in the central nervous system. In: Adl'<II1(eS ill
zation of neurons following the action of a specifie
Cydi( Nucleotide Research (George, W. J and Ignarro,
neurotransmitter. However, in the present results, it
L. J., Eds], Vol. 9, pp. 453464. Raven Press, New York.
seems unlikely that cyclic G MP levels incrcascd only
Ferrendelli, J
/1. and
Kinscherf, D. A. (1977). Cyclic
nucleotides in epileptic brain:
E!Tects of
pentylcnc-
in association with neuronal depolarization, since an
tetrazol on regional cyclic AMP and cyclic GMP levels
incrcase in cyclic GM P content occurred at the time
in tiro. Epilcpsia 18: 525531.
of recovery from methionine sulphoximine-induced
Folbergrova, J,
Passonneau, J V., Lowry, O. H. and
seizures. The cyclic GMP-mediated metabolic events
Schulz, D. W. (1969). Glycogen, ammonia and relatcd
metabolites
in the brain arc cornpartrnentalized and it is possible
in the brain during scizures evokcd by meth-
ionine sulphoxirnine. J. Ncuroclicm. 16: 191-203.
thar the increase of the level of the cyclic nucleotide
Gilman, A. G. (1970). A protein binding assay for adeno-
may develop simultancously in
neuronal and glial
sine 3': 5'-cyclic monophosphate. Prot. /la/n. Acad. Sei.
cells, during sorne periods following administration of
U.S.A. 67: 305 312.
the convulsant. The brain stem appears to be a region
Hevor, T. and Gayet, J. (1978a). Fructosc-Lô-biphospha-
tase and phosphofructokinase activities in the brain of
of rat and rnouse brain in which methionine sulphoxi-
mice submitted to methionine sulfoximine. Brain Re.'.
mine or its metabolitets) prirnarily exert their stimu-
150: 210215.
lating eflect on sorne specifie neuronal ce Ils, followed
Hcvor, T. and Gaye!' J. (1978b). Fructose- Lô-biphospha-
by an induction of gluconeogenesis in glial cells.
tase activity in the brain of mice and rats submittcd to
the convulsant methionine sulfoxirnine. Bioclicm. Soc.
Trans. 6: 1029 1031.
Lust, W. D., Goldberg, N. D. and Passonncau, J V. (1976).
Ackllmr!"dl/ements
This rcscarch was supported by grants
Cyclic nucleotides in mutine brain: the temporal rcla-
from
the Centre National de la Recherche Scientifique
tionship of changes induccd in adenosine 3',5' mono-

---

e- 170-
Effect of methionine sulphoxirnine on brain cyclic nucleotide levels
phosphate and guanosine 3',5' rnonophosphate following
Steiner. A. L.. Parker, C. W. and Kipnis, D. M. (1972).
maximal electroshock or decapitation. J. Neurochem. 26:
Radioimmunoassay
for
cyclic
nucleotides.
1. Prep-
5-10.
arations of antibodies and iodinated cyclic nucleotides.
us\\. W. D., Kupferberg. H. J.• Yonekawa, W. D.. Penry, 1.
J. biol. Chem. 247: 1106-1113.
K.. Passonneau, 1. V. and
Wheaton, A. B. (1978).
Tovey. K. c.. Oldham, K. G. and Whelan, 1. A. M. (1974).
rChangesinbrainmetabolitesinduced byconvulsantsor A simple assay for cyclic AMP in plasma and other
electroshock: effects of anticonvulsant agents. Mol. Phar-
biological samples using an improved competitive pro-
InOr. 14: 347-356.
tein binding system. Clin. Chim. Acta 56: 221-234.
Phelps, C. G. (1975). An ultrastruclural study of melh-
Weiler. M .. Rodnight, R. and Carrera, D. (1972). Deter-
ionine sulphoximine-induced glycogen accumulation in
mination of adenosine 3',5' cyclic monophosphate in
astrocytes of the mou se cerebral cortex. J. Neurocvtol. 4:
cerebral tissues
by saturation analysis.
Biochem.
J.
479-490.
129: 113-121.
1
1
1
!
1
~

---

- 171 -
Hiochemical Phurm.rcologv. Vol. 21'. pp. 1"117-3512
© l'clg.alllllll l'n.'"'' Ut! 11.)79 Printed in Great Brimin
CYCLIC NUCLEOTIDES IN THE BRAIN OF MICE AND
RATS SUBMITIED TO THE CONVULSANT, METHIONINE
SULFOXIMINE
TOBIAS K. HEVOR and JACQUES GAYET
Laboratoire de Physiologie Générale. Faculté des Sciences. Université de Nancy 1. 54037 Nancy.
France
(Received 30 March 1979; accepted 27 June 1979)
Abstract-s-Regional cyclic AMP and cyclic GMP levels were measured in the rat and mouse brain
following intraperitoneal injection of the convulsant me thionine sulfoximine (MSO). at a dose of
100 mg/kg body weight. No change in the cyclic AMP content is noticeable in the mouse cerebral cortex
and in the rat cerebral cortex, striatum, hypothalamus and cerebellum during the preconvulsive.
convulsive and postconvulsive periods following administration of MSO. The cyclic GMP content
increases in the mouse cerebral cortex and brain stem, but it does not change in the cerebellum, during
the period of MSO-induced seizure activity. At the time of recovery from seizures, the increase of
cyclic GMP content persists only in the brain stem. During the whole periconvulsive period cyclic GMP
level rises in the brain stem. Administered at a dose of 50 mg/kg body weight, MSO induces a relatively
reduced increase of cyclic GMP content in the brain stem only. Il is suggested that the increase of the
leve1 of cyclic GMP may develop simultaneously in neuronal and glial cells, primarily in the brain stem,
during sorne periods following administration of the convulsant MSO.
~
The mechanisms of the convulsant and glycogenic
Il has been claimed that the excessive neuronal
effects of methionine sulfoximine (MSO) in the cen-
discharge which occurs during seizure activity may.
f
tral nervous system are not yet elucidated [1-4].
by itself, lead to neuronal damage [4]. Since it has
MSO administered to mice and rats induced an
been postulated that the ultrastructural damages
f
activation and probably a biosynthesis de novo of
occurring in the mouse and rat brain following
the key gluconeogenic enzyme fructose-l,6-biphos-
administration of MSO [11-13] do enhance gluco-
i
phatase (EC 3.1.3.11), in the cerebral cortex, brain
neogenesis [l , 5, 6], probably in astrocytes, it seems
r
stem and cerebellum, during the preconvulsive and
relevant to the study of the relationship between
convulsive periods, and also on recovery from sei-
neuronal depolarization and glial glycogenesis to
zures at the time when the animais appear normal
follow the regional changes of the levels of cAMP
[5, 6]. These data suggest that the subsequent intra-
and cGMP in the mouse and rat brain.
1
cerebral accumulation of glycogen which occurs dur-
ing the period of seizures induced by administration
1
of MSO, and persists for up to 72 hr after injection
MATERIALS AND METHOOS
i
of the convulsant. results from an activation of the
gluconeogenic pathway. Since it has been shown
Male Swiss mice (OFI strain) of about 30 g body
1
that glycogen accumulates prominantly within swol-
weight and male Wistar rats (Iaboratory inbred
i
len astrocytes in the cerebral cortex and subcortical
strain) of about 300 g body weight were used
white matter [3], it is tempting to consider that the
throughout the experiments. MSO (t-methionine-
gluconeogenic pathway develops in astroglia from
ot-sulfoximine.
Sigma,
St.
Louis,
MO.)
(5~
a precursor which may be glutamate originating from
200 mg/kg body wt.) dissolved in 0.2 ml (mice) or
activated neurons and subsequently taken up by
1.0 ml (rats) of 0.9% NaCI was injected intraperi-
1
astroglia [3, 4]. Glutamate would be quantitatively
toneally; control animais received the sarne volume
available for gluconeogenesis since its conversion
of 0.9% NaCl. During the experiments the animais
1
into glutamine is prevented due to the inhibition of
were placed in individu al cages at 22°. The mice
glutamine synthetase acitivity by MSO [7. l'].
were frozen intact in Iiquid nitrogen and the rats
f
Recent data indicate that seizure activitv induced
were decapitated and their head instantaneously
by pentylenetetrazol affects adenosine 3': .'i'-cyclic
immersed in liquid nitrogen. at different periods of
monophosphate {cAMP} and guanosine Y Y -cyclic
seizure activity. The frozen animais and heads were
monophosphate (cGMP) levels differcntlv in the cer-
stored at - 30° until the brain was removed. The
ebral cortex, cerebcllum , striaturn , thalamus and
chilled cerebral cortex. striatum, hypothalamus.
hippocampus of rnice , and that regional changes of
brain stem and cerebellum were dissected out in a
cyclic nucleotide concentrations arc dependent upon
refrigerated cham ber and rapidly weighed. Each
r
the type of seizure activity [9]. Moreover, the regu-
brain region was homogenized in 6 vol. (w/v) of 10";'-
~
Jation of regional cAMP and cGMP levels appear
trichloroacetic acid , and the homogenate was cen-
to be independent of each other [10].
trifuged at 18.000g for 15 min at 4°. The supernatant
1
1

---

- 172 -
T. K. HEVOR and J. GAYET
Taille 1. Recovery of cAMP and cGMP and effect of cyclic nucleotide phosphodi-
esterase on assay for cAMP and cGMP
cAMP
Recovery
Tissue
(nmoles/g wet weight)
(%)
Cerebral cortex (control mouse)
1.66 ± 0.13
+ phosphodiesterase
0
+ 1.20 nmoles of cAMP
2.75 ± 0.12
96
Cerebral cortex (MSO-
injected mouse)
1.46 ± 0.10
+ phosphodiesterase
0
+ 1.20nmoles of cAMP
2.46 ± 0.14
92
cGMP
Recovery
(pmoles/g wet weight)
(%)
Cerebral cortex (control mouse)
77.15 ± 6.93
+ phosphodiesterase
0
+ ISO pmoles of cGMP
213.94 ± 7.51
94
Cerebral cortex (MSO-
injected rnouse)
110.10 ± 11.29
+ phosphodiesterase
0
+ 150 pmoles of cGMP
241.63 ± 13.77
93
Brain stem (control mouse)
43.42 ± 5.81
+ phosphodiesterase
0
+ 150 pmoles of cGMP
179.68 ± 8.64
93
Brain stem (MSO-injected
mouse)
105.65 ± 21.24
+ phosphodiesterase
0
+ ISO pmoles of cGMP
244.80 ± 27.64
96
Cerebellum (control mouse)
168.68 ± 8.89
+ phosphodiesterase
0
+ 150 pmoles of cGMP
296.52 ± 14.63
93
Cerebellum (MSO-
injected mouse)
180.31 ± 9.18
+ phosphodiesterase
0
+ ISO pm oies of cGMP
314.26 ± 7.52
95
For the recovery experiments 1.20 nmoles of cAMP and ISO pmoles of cGMP
were added to the tissue extracts. Equal volumes of tissue ex tracts with no added
cyc1ic nucleotide were used in parallel to determine the basal concentrations of
cAMP and cGMP. The MSO-injected mice were sacrificed in the convulsive period
about 8 hr after an intraperitoneal injection of MSO (100 mg/kg body wt) as described
in the text. Values are means ± S.D. for three anirnals,
was washed five times with 4 vol. of water-saturated
phosphodiesterase (Boehringer Mannheim France,
diethyl ether; diethyl ether remaining in the solution
Meylan) (10 /-lg per ml). The reaction was stopped
was evaporated at 800 for 1 min. The content of
by heating at 1000 for 2 min; the sampies were cen-
cyclic nucleotides was estimated in this brain tissue
trifuged and the resulting supernatants were used as
fraction. cAMP was measured by the Gilman com-
blanks. Cyclic nucleotide phosphodiesterase hydro-
petitive protein binding assay [14] modified [15], with
lyzed 100 per cent of the reactive cAMP and cGMP
an adsorption of the cyclic nucleotides on chareaal
in extracts from cerebral cortex, brain stem and
[16,17]. cGMP was estimated by the radioimmuno-
cerebellum from control and MSO-injected mice
assay described by Steiner et al. [18]. The materials
(Table 1). Statistical comparisons were established
for the cyclic nucleotide determinations were pur-
using Student's t test.
chased from the Radiochemical Centre, Amersham,
Buckinghamshire and they were checked for possible
RESULTS
interference from other nucleotides, divalent metal
ions and the non-dialysable compound reported by
Weiler et al. [15]. The standard curves were plotted
Effeet of MSO oh brain eye/ie AM?
with the standard cyclic nucleotides dissolved in 10%
The cAMP level determined in the control rat
trichloroacetic acid washed five times with water-
cerebral cortex, striatum, hypothalamus and cere-
saturated diethyl ether [16]. Blank values were car-
bellurn , appears to be relatively homogeneous (Table
ried on aliquots of the tissue extract incubated for
2). After intraperitoneal injection of MSO, at a dose
60 min at 370 in an equal volume of ](JOmM Tris-
of 100 mg/kg body weight, no change in the cAMP
HCI buffer , pH 7.5, containing cyclic nucleotide
content is noticeable in the mouse cerebral cortex

---

- 173 -
Effect of methionine sulfoximine on cyclic nucleotides in brain
8
Table 2. Effect of MSO on cAMP content in mouse cerebral cortex and rat cerebral
cortex. striatum, hypothalamus and cerebellum
cAMP (nmoles/g tissue wet weighl)
Tissue
Convulsive period
Postconvulsivc period
Cerebral cortex (mouse)
control
1.53 ± 0.10 (5)
MSO-injected
1.32 ± 0.07 (5)'
Cerehral cortex (rat)
control
0.94 ± 0.13 (4)
MSO-injected
1.11±0.05(4)
1.10 ± 0.02 (4)
Striatum (rat)
control
0.99 ± 0.14 (4)
MSO-injected
O.72±O.II
O.X3 ± O.D2 (4)
Hypothalamus (rat)
control
1.06 ± 0.04 (4)
MSO-injected
1.07 ± 0.02 (4)
1.01 ± 0.00 (4)
Cerehellum (rat)
control
0.81 ± 0.03 (4)
MSO-injected
0.92 ± 0.04 (4)t
O.H2 ± (l.OI (4)
1
The animaIs were sacrificed in the convulsive and postconvulsivc periods respec-
1
tively about 8 and 24 hr after intraperitoneal injection of MSO (JOO mg/kg hody wt. )
!
Results are cxpressed as nanomoles cAMP/g tissue wet weight (mean value ± S.D.
for number of animaIs in parentheses). Statistically significant differences between
1
MSO-injected and control animais are indicated.
, P < 0.05.
J
t P < O.O\\.
1
and in the four rat brain regions studied too, during
200 mg/kg body weight. From 4 to 7 hr after injection
1
the convulsive and postconvulsive periods (Table 2).
of MSO, when the animais exhibit an increasing
Even administered at a dose of 400 mg/kg body
syndrome of ataxia, the concentration of cGMP aug-
i
weight, MSO does not influence cAMP level in the
ments by 40 per cent in the brain stem (Table 3).
1
rat brain structures during the preconvulsive and
When the mice are killed just after the onset of the
convulsive periods.
first spontaneous clonic seizure, the cGMP content
in the cerebral cortex and brain stem reaches respec-
Effect of MSO on brain cyclic GMP
1
tively 87 and 82 pmoles/g tissue wet weight. Although
The cGMP content in cerebral cortex of control
these latter values are significantly higher th an those
J
mice is about 22 times smaller (Table 3) than that
determined in the control rnice , they do not reach
of cAMP (Table 2), and its regional distribution is
the values determined in the mouse brain during the
heterogeneous, the concentration in the cerebellum
period of intense seizure activity. During this intense
being two and three times higher than that in the
tonie and clonic seizure activity. approximately 8 hr
cerebral cortex and brain stem respectively (Table
after administration of MSO, the concentration of
3). During the preconvulsive period, 4 hr after
cGMP in the cerebral cortex and brain stem increases
administration of MSO (100 mg/kg body wt), the
respectively by 50 per cent and 137 per cent, without
concentration of cGMP does not change significantly
1
any change in the cerebellum (Table 3). At the end
in the three brain regions studied; 8 hr after admin-
of the period of seizure activity, about 9 hr after
f
istration of MSO. the animais being in the period
administration of MSO, the cGMP content in the
of intense tonie and clonic seizure activity, the con-
brain stem is still 56 per cent higher th an that
centration of cGMP increases approximately by 44
determined in the control mice (Table 3). The ani-
per cent and 100 per cent respectively in the cerebral
maIs submitted to MSO at a dose of 50 mg/kg body
1
cortex and brain stem, without any alteration of this
weight exhibit a slight syndrome of ataxia and no
1
concentration in the cerebellum (Table 3). During
seizure activity, and 8 hr after the administration of
the post-convulsive period at the time of recovery
the drug only the concentration of cGMP in the brain
from seizures, 24 hr after administration of MSO,
stem increases by 30 per cent (Table 4). When the
the concentration of cGMP in the brain stem is only
mice are killed 8 hr after an intraperitoneal injection
increased by 27 per cent (Table 3).
1
of MSO at a dose of 200 mg/kg body wt, the con-
ln order to investigate the possible relationship
centration of cGMP does not change in the cerebral
between the state of seizure activity induced by MSO
cortex and brain stem, but it decreases by 33 per
and the regional cGMP content in the mouse brain,
cent in the cerebellum (Table 4). The animaIs sub-
we have performed the estimation of the cyclic
mitted to this high dose of MSO exhibit either a
1
nucleotide, on the one hand during the periconvul-
strong syndrome of ataxia followed by an akinesia
sive period using MSO at a dose of 100 mg/kg body
or a seizure activity, but they ail die within 24 hr.
weight, and on the other hand during the convulsive
For the mice exhibiting a seizure activity, the cGMP
period using the drug at an increasing dose of 50--
content in the cerebral cortex. brain stem and cer-
Il l'
::1o;~.J
Il

---

CD
Table 3. Effect of MSO on cGMP content in mouse cerebral cortex, brain stem and cerebellum
Cerebral cortex
Brain stem
Cerebellum
Time after MSO
- -
administration (hr)
Controls
MSO-injected
Controls
MSO-injected
Controls
MSO-injected
:-i
;;<:
4
73.44 ± 12.81 (5)
70.94 ± 17.44
(6)
47.12 ± 6.86
(5)
-16.55 ± 7.23
(6)
153.80 ± 12.5R (3)
151.62 ± 14.30 (5)
4--7
70.71 ± 15.78 (8)
74.43 ±
8.88
(3)
48.18 ± 6.26 (10)
67.23 ± 15.45~
(4)
158.35 ± 9.52
(7)
151.41 ± Il.24 (3)
:I:
m
8
102.09 ± 15.09+
(5)
95.03 ± 29.66:::
(7)
165.65 ± 25.94 (7)
.;;;
;c
9
90.16 ± 16.62
(4)
74.96 ± 9.31:j:
(4)
155.79 ± 11.44 (4)
24
71.62 ± 14.67 (5)
67.30 ± 17.17
(la)
48.16 ± 6.73
(6)
61.11 ± 15.11* (la)
155.56 ± 12.37 (4)
148.84 ± 32.97 (6)
'"
::l
0.
' -
The anirnals were killed 4 hr (preconvulsive period). between 4 and 7 hr (period of increasing state of araxia), 8 hr (period of intense tonie and clonic seizure
Cl
activity), 9 hr (period of ending of seizure activity) and 24 hr (postconvulsive period) after intraperitoneal injection of MSO (100 mg/kg body weight). Results
»
are expressed as picomoles cGMP/g tissue wet weight (mean value ± S.D. for number of animais in parentheses). Statistically significant differences between
-<
~
MSO-injected and control animais are indicated.
* P < 0.05.
t P < O.Ol.
::: P < 0.005.
t-'
-....;
~

---

- 175 -
Effect of methionine sulfoximine on cyclic nucleotides in brain
8
Table 4. Ettect of an increasing dose of MSO on cGMP content in mouse cerebral cortex, brain stem
and cerebellum
Dose of MSO
(mg/kg body weight)
Cerebral cortex
Brain stem
Cerebellum
o
70.71 :!: 15.7H Ul)
48.IH ± 6.26
(10)
15R.J5 :!: 9.52
(7)
50
79.86 ± 10.64 (4)
62.49:!: 14.77* (4)
144.14:!: IH.90 (J)
100
106.40 ± IJ.42t (4)
IIJ.R9:!:25.lJt
(4)
170.72:!: 26.94 (4)
200
63.RJ ± 16.82 (R)
49.06 ± 9.46
(Hl
106.24 ± 15.25t (4)
The animais were killed Hhr after mtrapcritoneal injection of MSO (50-200 mg/kg hody,wt.).
Results are expressed as pmoles cGMP/g tissue wet weight (mean value:!: S. D. for nurnber o.fanirnals
in parentheses). Statistieally significant differences bctwcen MSO-JnJcctcd and control ammals are
indicated.
* P < 0.05.
t P < 0.005.
1
ebellum is respectively 81, 58 and 118 pmoles/g tissue
pentylenetetrazol, since with the latter the frequency
wet weight.
of clonic-type seizures is maximal approximately
15 min after its intraperitoneal injection [9], whereas
with MSO the state of long-lasting tonie seizures
DISCUSSION
1
with intermittent clonic seizures is maximal only
i
~
The possible role of cyclic nucleotides in specifie
about 7-8 hr after its intraperitoneal injection. Our
neuronal function is not c1early elucidated, and il
present results seem to be in agreement with recent
1
seems likely that the cyclic nucleotide-mediated
data showing that during all the phases of focal
metabolic events in the brain are compartmentalized
epileptic activity induced by penicillin in the cat
[19.20]. Recent experimental data have shown that
cerebral cortex, cGMP levels were significantly
1
the concentrations of cyclic nucleotides in the brain
higher in the epileptic focus than in corresponding
in vivo vary according to the lever of excitability.
contralateral cortex or the occipital cortex; cGMP
Both cAMP and cGMP levels in mouse brain in vivo
levels in the focus did not change [23], Il was con-
increase following electroconvulsive shock [21, 10]
c1uded from these data that alterations of cAMP
and administration of pentylenetetrazol [9]. The
level may not be essential for epileptogenesis.
1
results of our study do not demonstrate that MSO
At a dose of 50 mg/kg b. wt., MSO induces a
J
has such a widespread effect on both cAMP and
relatively low increase of cGMP content in the brain
cGMP levels in mouse and rat brain, During the
stem only, but at a dose of 200 mg/kg body weight ,
period of intense tonie and clonic seizure activity,
which appears to be lethal within 24 hr for ail the
which takes place approximately 1\\ hr after intraper-
1
animais thus treated, the drug induces a significant
itoneal injection of MSO. at a dose of 100 mg/kg
decrease in cerebellar cGMP level 8 hr after its
body wt , we failto detect any changes in the regional
administration, In this last experimental condition,
cAMP concentration. except for a slight decrease in
the mice exhibiting a severe syndrome of ataxia, the
the mouse cerehral cortex and the rat cerebellurn.
cerebellum seems to be specifically sensitive to MSO.
On
the
contrary.
the
concentration
of
cGMP
Although heing a convulsant drug. MSO induces an
increases in the mouse hrain stem during the period
accumulation of glycogen in the rodent brain [24. 2].
of the onset of the clonic seizures, particularly during
After administration of MSO. at a dose of 100 mg/kg
the period of tonic and clonic seizure activity, and
body wt, glycogcn content in the meuse cerehral
still remains elevated 24 hr after administration of
cortex rises by 65 per cent during the preconvulsive
MSO at the time of recovery from seizures, when
period and by 5lI per cent during the convulsive
the animais appeared normal. The content of cGMP
period, with a maximum of 470 per cent 24 hr later
in the cerebral cortex augments only during the
atthe tirne of recovcry from seizures [1]. This MSO-
period of intense seizure activity and it docs not
induced cerebral glycogenesis seems ta originate
change in the cerehellum. Il has previously hcen
from an activation of gluconeogcnic pathway, since
shown that seizures induced by convulsant drugs
the drug induces in the brain an increase in activity
elevate cerebellar cGMP levels [22]. and that this
and probably a hiosynthesis de /IOVO of the key
t
effect on cerebellar cGMP is antagonizcd by anti-
gluconeogenic enzyme fructosc-l , ô-biphospharase ,
convulsant [10]. Our present results are at variance
during the preconvulsive and convulsive periods and
with this previous data. since MSO-induced seizures
also at the time of recovery from seizures: this
i
have no influence on cerehellar cGMP content. The
enhanced gluconeogenesis seems ta be particularly
percentage of increase of cGMP concentration in the
located in the brain stem [5. 61. 11 has heen suggested
f
hrain stem and cerehral cortex during the period of
that changes in cGMP levels in ail regions of the
f
tonie and clonic seizure activity, is markedly lower
brain directly rellect alterations in neuronal activity
f
than that obtained in the varions brain areas du ring
[22]. The elevatcd concentration of cGMP observed
clonic seizures induced by pentylenctetrazol [91. The
in the orain during seizure activity originates from
f
chronology of developmcnt of seizure activity state
depolarization of ncurons following the action of a
IS different bctween micc submittcd tn !\\ISO and
specifie ncurotransmitte r. Il'l\\VC\\-Cf. in our present
1

---

- 176 -
T. K. HEVOR and J. GAYET
8results,asinthosepreviouslyobtainedbyRaabeet 6.T.HevorandJ.Gayet,Biochem.Soc. Trans.6,1029
al. [23] in focal penicillin epilepsy, it seems unlikely
(1978).
that cOMP levels increase onlv in association with
7. C. Lamar and O. Z. Sellinger, Biochem. Pharmac. 14,
neuronal depolarization, since an increase in cOMP
489 (1965).
8. J. Pace and E. E. McDermott, Nature, Lond. 169,415
content occurs at the time of recovery from MSO-
(1952).
induced seizures and in the postictal depression in
9. J. A. Ferrendelli and D. A. Kinscherf, Epilepsia 18,
focal penicillin epilepsy. At the present time no data
525 (1977).
allow us to explain how cOMP may play a well-
10. W. D. Lust, H. J. Kupferberg, W. D. Yonekawa, J.
defined effector role in the central nervous system,
K. Penry, J. V. Passonneau and A. B. Wheaton, Molec.
as was recently postulated [25]. The cO MP-mediated
Pharmac. 14,347 (1978).
rnetabolic events in the brain are compartmentalized
11. E. DeRobertis, Triangle 10, 93 (1971).
and it is not excluded that the increase of the level
12. E. DeRobertis, O. Z. Sellinger, G. R. DeLores Arnaiz,
of the cyclic nucleotide may develop simultaneously
M. Alberici and L. M. Zieher, J. Neurochem. 14. 81
(1967).
in neuronal and glial cens during sorne periods fol-
13. N. Rizzuto and N. K. Gonatas, 1. Neuropath. exp.
lowing administration of MSO. The brain stem
Neurol. 33,237 (1974).
appears to he a region of rat and mouse brain in
14. A. G. Gilman, Proc. natn. Acad. Sei. U.S.A. 67,305
which MSO or its metabolite(s) primarily exert their
(1970).
stimulating effect on sorne specifie neuronal cens,
15. M. Weiler, R. Rodnight and D. Carrera, Biochem. J.
followed by an induction of gluconeogenesis prob-
129, 113 (1972).
ably in glial cells.
16. J. D. M. Albano, G. D. Barnes, D. V. Maudsley, B.
L. Brown and R. P. Etkins, Analyt. Biochem. 60, 130
(1974).
17. K. C. Tovey, K. G. Oldham and J. A. M. Whelan,
Acknowledgements-«This research was supported by grants
Clin. chim. Acta 56, 221 (1974).
from the Centre National de la Recherche Scientifique
18. A. L. Steiner, C. W. Parker and D. M. Kipnis,1. biol.
(E.R.A. 331) and from the Fondation pour la Recherche
Chem. 247. 1106 (1972).
Médicale.
19. J. W. Daly, lnt. Rev. Neurobiol. 20, 105 (1977).
20. J. A. Nathanson, Physiol. Rev. 57, 157 (1977).
REFERENCES
21. W. D. Lust, N. D. Goldberg and J. V. Passonneau,
J. Neurochem. 26,5 (1976).
1. A. Bérel, P. R. Lehr and J. Gayet, Brain Res. 128,
22. J. A. Ferrendelli, in Advances in Cvclic Nucleotide
193 (1977).
Research (Eds. W. J. George and L. i. Ignarro), Vol.
2. J. Folbergrova, J. V. Passonneau, O. H. Lowry and
9, p. 453. Raven Press, New York (1978).
D. W. Schulz, J. Neurochem. 16, 191 (1969).
23. W. Raabe, S. Nicol, R. J. Gumnit and N. D. Goldberg,
3. C. G. Phelps, 1. Neurocytol. 4,479 (1975).
Brain Res. 144, 185 (1978).
4. B. K. Siesjô, Brain Energy Metabolism. Wiley, New
24. J. Folbergrova, J. Neurochem. 20,547 (1973).
York (1978).
25. N. D. Goldberg and M. K. Haddox, A. Rev. Biochem.
5. T. Hevor and J. Gayet, Brain Res. 150.210 (1978).
46,823 (1977).

---

:- 177 -
6.1. INTRODUCTION
Le rôle exact des nucléotides cycliques dans le système nerveux central
est encore mal connu. Ils pourraient participer à la transmission sy-
naptique, leur rôle dans la phosphorylation de certaines protéines
membranaires étant très probable (26.27). Il semble exister une rela-
tion très étroite entre les neurotransmettpu~s et les nucléotides cy-
cliques. On a montré que dans les coupes de cortex cérébral de Rat, la
noradrénaline augmente le taux d'AMPc et l 'acétylcholine auq~ente le
taux de GMPc (28). Le glutamate et l 'acide ~-aminobutyrique orovoquent
une augmentation du taux des deux nucléotides cycliques. D'une façon
générale. les phéno~ènes qui indüisent une augmentation extracellu-
laire du taux de neurotransmetteurs s'accompa~ent d'une augmentation
tr~nsitoire de la concentration en nucléotides cycliques. Lorsqu'on
pratique des lésions mécaniques dans le cortex cérébral de la Souris,
la concentrati on en M1Pc augmente de 7 foi s envi ron (29). Cette augmen-
tation est antagonisée par la chlorpromazine mais aussi par la théophyl-
line,alors que la réserpine n'a aucune action antagoniste. Dans dif-
férentes régions de l'encéphale du R~t. le stress provoqué par l'élec-
trochoc ou la contention entrai ne une accumulation en AMP cyclique (3e)
On peut constater que les rhér.omènes provoquant une variation du taux
de nucléotides cycliques ont également un impact sur le métabolisme
glucidique. Dans le foie de la Souris, l'administration du glucagon se
traduit par une augmentation du taux d'A~Pc et une inactivation de la
qlycoqène-synthé te se (31) Par contre, lorsque les souris reçoivent une in-
jection de glucose ou de prédnisolone, il y a une légère diminution du
taux d'AMPc (19% environ) qui s'accompagne d'une augmentation considé-
rabl~ de l'activité de la glycogène-synthétase (14 fois). Le rôle de
1 'ft~Pc dans l'activation et l 'inactivation d~s enzymes glycogéniques

---

- 178 -
par phosphorylation avait été déjà montré (32). Il semble donc inté-
ressant d"~tudier l'action de la MSO, molécule glycogéninue, sur la
teneur en nucléotides cycliques
de l'encéphale.
Plusieurs travaux récents ont montré l'implication des nuc l éot ides
cycliques dans les convulsions induites par certaines molécules co~­
me le pentétrazole (9) ou la pénicilline (23). HEVOR et GAYET (33,34)
ont suggéré l'intervention probable de 1"AMPc et du GMPc dans les con-
vulsions épileptiformes induites par la MSO.
6.2. ~1ATERIELS ET ~~ETHODES
Les matériels et les méthodes utilisées ont été décrits par HEVOR et
GAYET (33,34). Ouelques précisions complémentaires et la critique des
techniques seront abordées.
Parmi les métabolites cérébraux. l.e~ nucléotides font Parti de ceux qui
subissent unp al tération rapide avec l'ischémie. Plusieurs méthodes ont
été décrites pour minimiser cette altération:l 'irradiation avec des
microondes (36,37,38); la technique du Il fr-eeze-b l ovri nq" (39);la congé-
lation de l'animal entier (9). LUST et coll. (40) ont effectué une
étude comparative de plusieurs méthorles de fixation des nucléotides cy-
cliques dans le tissu nerveux. La méthode d'irradiation semble la plus
convenable, lorsque la puissance des microondes est suffisante. Cepen-
dant, ces auteurs ont observé que l'immersion de l'animal donne des
résultats tout à fait acceptables et c'est cette dernière méthode qui a été
adoptée dans leurs expériences ultérieures (10.21). Dans le cadre de

---

- 179 -
nos expériences, l'utilisation des microondes posait quelques problèmes.
Les appareils actuellement disponibles nécessitùnt une contention de
l'animal,
celle-ci ne semble pas convenable
nour nos expériences.
En effet, il ~erait impossible de savoir à quel moment précis les ani-
maux entrent en convulsions.
La méthode de dosage par radiocompétition
exige
une purification
préalable des nucléotides cycliques. On procède par une élimination
de toutes les protéines, celles-ci risquant d'interférer avec la liai-
son du nucléotide cyclique ou de les adsorber de façon non spécifique.
Certains auteurs ont proposé une purification supplémentaire par la chro-
matographie d'affinité (37).Ce type de chromatograohie entraine une perte
non négligeable de nucléotides cycliques et une correction doit être
apnortée sur les mesures effectuées·L'oG{ention d'un haut degré de
puretédela protéine de liaison des nucléotides cycliques permet d'évi-
ter cette deuxième étape de la purification et d'obtenir des résultats tout
à fait satisfaisants (17).
Plusieurs méthodes d'extraction des nucléotides cycliques ont été es-
sayées: l~omogénéisation a êté réalisée dans un milieu conten~Jlt de l'isobu-
tylméthylxanthine, dans de l'acide perchlorique ou de l'acide trichlora-
cétique. Ces différentes ~éthodes ont donné des ré,ultats comparables.
6.2.3.1. AMp cyclique.
La méthode de radiocompétition a été utilisée (14).

---

- 180 -
6.2.3.1.1. Princioe.
Le principe de cette méthode est la liaison hautement sélective et spécifi-
que de l 'AMP cyclique
à une protéine isolée du rein,ayant une affinité
élevée (14). On met en présence de cette protéine une quantitp rlpterminée
d',f!,J1Pc marqué au tritium dont la radioactivité est bien évaluêe.
En
absence d'une autre source d'M~Pc. le nucléotide cyclique radioactif
se fixe sur les sites de la protéine de liaison. La quantité d'AMPc
est largement pn excès et tous les sites sont occupés. En présence d'une
deuxième source d'M·1Pc, "Il y a une compétition entre cette dernière et
l'AMPc radioactif pour les sites de la protéine de liaison. Le nombre de
molécules d'A~~Pc radioactif fixées sur la protéine est inversement pro-
portionnel au nombre de molécules présentes dans lB deuxième source.
L'excès de nucléotides cycliques est éliminé et la radio~ctivité est
mesurée sur la protéine de liaison.
6.2.3.1.2. Dosage.
Dans la pratique, une courbe d'étalonnage est établie avec des dôses
croissantes d'ftMPc allant de 5 a 80 pmoles/ml. L'A~~P cyclique radio-
actif et l 'A~1P cyclique d'étalonnage sont mis ensemble en présence de
la protéine de liaison. Les tubes sont incubés à Qae pendant deux heures.
On ajoute une suspension de charbon pour éliminer l'.At1pc non lié à la
protéine. Cette dernière est récupérée après une brève centrifugation
et la radioactivité est évaluée après addition du scintillateur Ins-
tagel dans un spectromètre à scintillation. Les échantillons dont la
concentration en AMPc est inconnue sont dosés de la même façon que
l 'AMPc d'étalonnage. La teneur ~n ft~P cyclique est déduite de la courbe
de référence.
6.2.3.2. Gt1P cyc l ioue .
Le GMP cyclique est dosé par une méthode radioiT'1munologique (18).

---

1
- 181 -
1
6.2.3.2.1. Principe.
1
1
Le GMPc est transformé en 2'-O-succinyl GMP cyclique avec de l'anhy-
1
dride succinique. L.e succinyl Gt1Pc est fixé par conjugaison à l'hémo-
cyanine. La protéine liée au GHPc
sert à la préparation d'un anti-sé-
rum chez le Lapin. L'anti-serum est mis en présence d'une quantité fixe
de Gt1Pc radioactif et de Gr~pc d'une autre source comme dans le cas de
l'AMPc. Le Gt1Pc rad l oactif et non radioactif se fixent par compétition
sur l'anti-séruM. Ce dernier est ensuite séparé. La radioactivité fixée
est inversement proportionnelle à l~ concentration en GMPc de la deu~
xième source.
6.2.3.2.2. Dosage.
Le sérum anti-G~Pc est mis en présence d'une quantité fixe de G~Pc ra-
dioactif et de G~Pc non radioactif. Ce dernier rrovient de l'échantil-
lon à analyser ou des solutions d'étalonna~e. Après une incubation à aoc
pendant une heure 30 minutes, l 'anti-sérum est précipité
avec du sul-
fate d'ammonium. fprès dissolution dans de l'eau. la radioactivité est
déterminée. La concentration en GMPc des échantillons est déterminée
à partir de la courbe d'étalonnage.
6.3. RESULTATS
Les résultats obtenus ont été présentés par HEVOR et GAVET (33,34), Ces
résultats sont complétés par les figures 1. 2, 3, 4 et 5.

---

- 182 -
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PERIOOS RESPECTIVB..Y ABlJT 2.30 H Alil 4.30 H JlfŒR [NTfIAPERlTOf'fAl... INJEI:TIOO OF M9J (1Ol r-G'KG
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- 183 -
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- 184 -
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100 (8) IWJ 200 ffi (0 / KG IDlY IIfIGHD.
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---

- 185 -
6.4. DISCUSSION
Les relations possibles entre la genèse des convulsions et le taux de
nucléotides cycliques ont dpjà été discutées par HEVOR et G~YET (33,
34). La comparaison avec les autres agents convulsivants a été abordée.
6.4,2. ~étabolisme énergétique, neurotransmetteurs et nucléotides
----------------------------------------------------------
Plusieurs spéculations ont été faites sur le rôle des nucléotides cy-
cliques dans le système nerveux central (41,42). Leur rôle dans les
mécanismes de phosphorylation protéique paraît très probable (43,44
45). In vivo, on a observé que certaines amines biogènes comme l'adré-
naline et l 'histamine provoquent une augmentation rapide de la concen-
tration en AMPc dans les hémisphères cérébraux du Poulet (46).Certaines
hypothèses avaient attribué un rôle contradictoire ft l 'AMPc et au GMPc
dans le système nerveux central (49,50). L'AMP cyclique serait impli-
qué dans la transmission synaptique adrénergique et le GMP cyclique
dans la transmission cholinergique (22). Les travaux ultérieurs ont
montré que les agents qui affectent le taux d'acétylcholine, de nora-
drénaline,
de dûpamine ou d'autres neurotransmette1lrs peuvent provo-
quer aussi bien une variation du t~llX rl'A~Pc que du taux de G~Pc (51).
L'action de plusieurs drogues psychotropes sur l'augmentation post-
mortem du taux d'AMP cyclique~a été ~tudié (52). Parmi les molécules
psycholytiques. les phénothiazines comme la trifluopérazine. antagonise
cette augmentation alors que ses analogues comme la chlorpromazine et
la prométhazine
ont peu d'effet dans le cervelet du Rat in vivo. Les
drogues psychodysleptiques comme la psilocybine et le diéthylamide de
l'acide lysergique (LSD 25) augmentent l'accumulation d'AMPc in vitro. Ces

---

- 186 -
résultats montrent la compléxité de l'action des drogues sur le taux
de nucléotides cycliques dans le système nerveux central. Cette com~
pléxité serait en rapport avec les différents types de neurotransmet-
teurs des voies en cause. En effet, en utilisant différents acides
aminés, comme la glycine, llacide l-aminobutirique ou le glutamate,
on a observé une augmentation du taux de G~Pc dans les coupes de cer-
veau de Rat (53). Dans les mêmes conditions, le glutamate provoque une
augmentation considérable du taux d'A~Pc alors que la glycine et l'acide
laminobutyrique provoquent une diminution de ce dernier nuclPotide
cyclique. Il semble donc exister une relation entre l'origine des voies
nerveuses touchées par la molécule utilisée et un type donné de nucléo-
tide cyclique (54). Dans le cas de la MSO, il a été montré récemment
que cette drogue provoque une légère diminution de la concentration
cérébrale en tyrosine, dopamine et noradrénaline (55). Cette observation
semblerait
être en accord avec les variations du taux d'A~~Pc. Cepen-
~ant, il faut remarquer que dans le cas de nos expériences, les variations
du taux de nucléotides cycliques ne sont vraisemblablement pas dues a
llnction directe de la molécule de MSO.

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***

---

Chapitre VII
DISCUSSION GENERALE
1
r
1
1
1
1
~

---

- 192 -
Les résultats précédents seront discutés en considérant les modèles d'épi-
lepsie expérimentale, le métabolisme énergétique et le rôle des nucléo-
tides cycliques.
1
1
f
1
7.1. CRISES CONVULSIVES ET METHIONINE SULFOXIMINE.
1
Les crises épileptiformes ont été étudiées à l'aide de plusieurs modèles
f
~
expérimentaux. Parmi les modèles existants, il est difficile de conclure
qu'un type de modèle donné reproduit exactement le syndrome de l'épilep-
sie humaine sous toutes ses formes: chaque modèle se rapproche d'une forme
1
particulière des crises humaines. Le choix de la MSO a été orienté par un
t
certain nombre de critères. Un aspect important est que la méthode d'induc-
tion ne doit pas perturber le métabolisme glucidique. On sait que l'appli-
cation de métaux sur le cortex cérébral entraîne une nécrose localisée du
tissu nerveux. Or, lorsqu'on pratique une blessure dans le tissu nerveux,
il y a une accumulation de glycogène autour de la région lésée (1, 2). Ainsi
donc, ce modèle d'épilepsie se prête mal à notre étude puisqu'on ne peut
savoir si l'accumulation de glycogène est une conséquence de la nécrose du
tissu cérébral ou si elle est liée aux crises épileptiformes. C'est égale-
ment le cas de l'application intraamygdalienne d'acide kaïnique (3, 4).
Le pentétrazol est une molécule utilisée en clinique qui est également uti-
lisée pour induire des convulsions chez le Rat et la Souris. Chez ces es-
pèces, les convulsions sont de courtes durées et apparaissent après un dé-
lai relativement court après l'administration. Or, dans nos expériences,
nous recherchons une période préconvulsive de longue durée afin d'étudier
les variations métaboliques éventuelles pendant cette phase. Nous avons
choisi le modèle induit par la MSO. Dans ce modèle, les périodes précon-
vulsive et convulsive durent longtemps contrairement aux cas de l'acide-
3-mercaptopropionique et de la bicuculline (5). Les crises épileptiformes
induites par la MSO chez le Rat et la Souris peuvent, peut-être, se rappro-
cher du grand mal chez l 'Homme. En raison de la durée des périodes précon-
vulsive et convul~ive, de la survie des animaux après l'arrêt des convul-
sions, de la forme de ces convulsions, nous avons recherché l'effet de cette
molécule sur le métabolisme énergétique cérébral.

---

- 193 -
Les effets de la ~1S0 sur le métabolisme cérébral ont été relativement bien
étudiés. Son action inhibitrice sur la glutamine synthétase dans l'encé-
phale a été observée depuis longtemps. In vitro~ on a montré que la L-ami-
no-acide oxydase transforme la MSO en une suite de composés dont certains
seraient toxiques (Fig. 1) (7).
CH3
1
O=S=NH
1
R
CHz
H 0
1
1
..
Z
5
CHi
1
1
CHi
C=O
1
1
CHi
CO~
1
19
H-C-NH
.IV
1
3
ccJ:
:xnr
Figure 1 : Métabolisme de la MSO sous l'action de la L-amino-acide-oxydase. Les
principaux composés sont :
III
e(-ceto- y -sulfoximi nyl butyrate
V
méthane sulfoximide
VI
acide 2-imino-3-buténoïque
VIII: acide méthane sulfinique
X
vinylglyoxylate
(COOPER and coll.) (7).

---

- 194 -
Plusieurs travaux ont essayé d'établir une corrélation entre l'action
de la MSO sur le métabolisme de l'acide glutamique et l'action convul-
sivante de cette molécule. L'inhibition de la glutamine synthétase a
été très étudiée (8, 9). On sait également que la glutamyl cystéine synthé-
tase
est inhibée (la). Les travaux de MEISTER (11) ont élucidé un
certain nombre de points: il a montré que parmi les différents isomères
de la MSO, seule la L-méthionine-S-sulfoximine peut induire des convul-
sions, ce qui suggère l'idée d'une action moléculaire bien précise. In
vitro, à la suite de l'incubation de la glutamine synthétase ou de la~­
glutamyl cystéine synthétase en présence de MSO et d'ATP, il y formation
de méthionine sulfoximine phosphate. La méthionine sulfoximine phosphate
de synthèse inhibe fortement les deux enzymes. Dans le cer~eau, la MSO-phos-
phate formée est proportionnelle à la quantité de glutamine synthétase pré-
sente.
~H3
~H3
a
1
a = S = NH
a = S = N - Po;
C - a - PO-3
l
1
1
~H2
~H2
~H2
~H2
~H2
CH2
CHNH;
1
_
~HNH;
~HNH;
cao
cao
cao
Méthionine sulfoximine
Méthionine sulfoxi-
~-glutamyl phosphate
mine phosphate
Figure 2
Analogie de la MSO et de son dérivé phosphate avec la f-glu-
tamyl cystéine. Dans les conditions normales, le r-glutamyl
phosphate se lie à la glutamine synthétase. Puis l'ammoniaque
est ensuite fixée sur le y-glutamyl phosphate. Il se forme un
intermédiaire ammoniaque- l-glutamyl phosphate qui ressemble
à la MSO. L'inhibition de la glutamine synthétase est due à
la liaison de la MSO au site catalytique de l'enzyme à la
place de cet intermédiaire. Les phénomènes sont identiques
pour la ~-glutamYl cystéine synthétase (MEISTER, Il).

---

- 195 -
MEISTER (11) souligne que l'inhibition de la glutamine synthétase est
associée aux convulsions induites par la MSO, mais il n'a pas été pos-
sible de montrer que l'induction de ces convulsions est due au taux
tissulaire de glutamine synthétase, de glutamine, de glutamate ou d'am-
moniaque. D'autres auteurs pensent que l'action de la MSO sur l'acide
r-aminobutyrique (GABA) serait en rapprot avec les convulsions; en effet,
la MSO provoque une diminution importante du taux de GABA dans le cerveau
du Rat. Cette diminution est maximale 9 à 12 heures après l'administration
de la molécule. Mais le taux de GABA reste toujours faible après l'arrêt
des convulsions (12). STONE et JAVID (13) ont également montré l'implication
du GABA dans les crises épileptiformes. Ils ont montré que l'acide-3-mercap-
topropionique inhibe la glutamate déshydrogénase entraînant ainsi une dimi-
nution du taux de GABA. Or, l'injection du phosphate de pyridoxal, qui lève
l'inhibition de la glutamate déshydrogénase, n'empêche pas l'apparition des
convulsions. Dans ces conditions, le taux de GABA ne doit pas intervenir -
du moins directement - dans l'apparition des convulsions induites par le
3-mercaptopropionate.
Certains effets métaboliques de la MSO semblent présenter quelques par-
ticularités par rapport àceux1'autres convulsivants. D'abord, sa demi-vie
dans le cerveau est très élevée (13, 14). Alors que le pentétrazol, la
picrotoxine et l'isoniazide augmentent considérablement le taux intra-
cérébral de prostaglandines, la MSO a peu d'effet sur ce taux (15). De
plus le pentétrazol et l'électrochoc entra'nent une augmentation du taux
des acides gras libres tandis que la MSÙ ne présente pas cette propriété
(16). Cette dernière action est aussi paradoxale que l'accumulation de
glycogène à un moment 00 il y a une importante dépense énergétique.
7.2. CUI~VULSIONS EPILEPTIFORMES ET ENERGETIQUE DANS LE SYSTEME NERVEUX
CENTRAL.
Le rôle du glycogène dans le système nerveux central est mal connu.
Nous avions montré que chez le Rat et le Poulet, l 'administratio~ d'une
molécule stimulante entraîne une glycogénolyse importante (17). Ces ré-

---

- 196 -
sultats semblent indiquer que le glycogène jouerait un rôle de réserve
énergétique qui serait utilisée lors d'une activité cérébrale intense. Or,
paradoxalement, pendant les crises épileptiformes induites par la MSO, il
se produit une accumulation intracérébrale de glycogène. Il apparaît anor-
mal que le potentiel énergétique du tissu nerveux augmente quand il y à
une activité motrice et nerveuse intense. Les travaux de FOLBERGROVA (18)
ont souligné la particularité des convulsions induites par la MSO. L'in-
jection d'homocystéine provoque chez la Souris des convulsions après
une brève période de latence. Lors des convulsions, il y a une augmen-
tation de la phosphorylase active dans le cerveau avec une diminution
corrélative de glycogène. L'inhibition des convulsions par le phénobar-
bital ou la glycine empêche les variations de la glycogène phosphorylase
et du taux de glycogène.
Dans le cas des convulsions induites par la
MSO, la quantité de phosphorylase active n'augmente pas (19) mais il y
a une accumulation de glycogène (20). Les taux des autres métabolites
énergétiques ont été mesurés. Le taux de glucose augmente avant et pen-
dant les convulsions, celui de l'ATP et la phosphocréatine ne changent
pas, le lactate augmente. Par ischémie, le taux métabolique (26 ATP +
6Phosphocréatine + 6 Lactate) a été déterminé. Ce taux augmente de
20 % pendant les convulsions. L'inhibition de ces convulsions
par la méthionine empêche l'augmentation du taux de lactate mais pas
celui du glucose et du glycogène. Dans le cas des convulsions induites
par le pentétrazol ou l'électrochoc, il y a une augmentation du flux
glycolytique suivie par une production accrue de lactate dans le cer-
veau (21). La charge adénylate:
(ATP
+ 0,5
ADP)
/
(ATP
+
ADP
+ AMP)
baisse à la suite de plusieurs convulsions. Comme dans le cas
de 1 'homocystéine, le taux de glycogène diminue de même que le glucose
intracérébral. Plusieurs autres études ont montré une diminution du
potentiel énergétique cérébral lors des convulsions induites chez l'ani-
mal: la bicuculline induit une augmentation du taux de consommation
de glucose (22). Il apparaît donc que l'impact de la MSO sur le méta-
bolisme énergétique cérébral n'est pas du même type que celui de cert-
tains agents convulsivants. Les résultats de nos expériences montrent
que la MSO augmente considérablement l'activité de la FDPase dans l'en-
~CéPhaleduRatetdelaSouris. Ilyauneaugmentationdupouvoircata-
lytique et de la quantité de protéine-enzyme par synthèse de nova. La
FDPase étant la ~ernière enzyme irréversible de la gluconéogénèse avant

---

- 197 -
la formation du glucose-6-phosphate, on peut penser que la gluconéogé-
nèse induite par la MSO est en rapport avec l'accumulation de glycogène.
Le glucose néoformé peut être utilisé par plusieurs voies. L'accumula-
tion de glucose sous l'action de la t1S0 a été signalée (20). La forma-
tion de glucose à partir de la gluconéogénèse suppose une activité de
la glucose-6-phosphatase dans le cerveau. L'existence de cette enzyme
dans le cerveau avait été longtemps méconnue (23, 24). Par plusieurs
méthodes; on a montré que cette enzyme était active dans le tissu ner-
veux (25, 26). Dans le cortex cérébral, le tronc cérébral et le cerve-
let du Rat Sprague-Dawley, la glucose-6-phosphatase a été localisée
par histoenzymologie. En utilisant un tampon approprié, l 'actiyité de
l'enzyme, par une méthode spectrophotométrique est de 0,5 pmole/
mg de protéines/heure. Le glucose-6-phosphate néoformé peut donc être
transformé en glucose dans le tissu nerveux. Mais, il est peu probable
que tout le glucose-6-phosphate néoformé se transforme en glucose, fo~me
inhabituelle de stockage de glucide. Aucun travail n'a été effectué sur
la voie des pentoses-phosphates chez des animaux soumis à la MSO
mais l'importance de cette voie étant minime dans le ce Neau, la quan-
tité de glucose qu'elle utilise doit être relativement faible. La voie
( métabolique la plus probable pour le glucose-6-phosphate néoformé est
! la voie de la synthèse de glycogène. L'accumulation intracérébrale de
i
glycogène s'expliquerait par l'augmentation de la gluconéogénèse ob-
servée. La MSO n'a pas d'action sur la glycogène synthétase et la phos-
phorylase comme on pouvait l'espérer (19, 20). Il est possible que, dans
les conditions normales, le facteur l imitant de la synthèse de glyco-
gène soit le glucose-6-phosphate. La fourniture de ce substrat par la
gluconéogénèse pourrait favoriser une synthèse plus importante du poly-
saccharide. Une origine périphérique du glucose incorporé dans le gly-
cogène est difficile à démontrer. Cette éventualité est néanmoins faible
puisque les activités de la phosphorylase et de la s~nthétase ne sont
pas affectées.
L'existence de la gluconéogénèse dans le cerveau suppose l'existence
des autres enzymes-clés. L'existence de la pyruvate carboxylase a été
montrée depuis plusieurs années (27). La phosphoénolpyruvate carboxy-
kinase a une activité de 0,3jJmole/g de tissu frais/minute chez le Rat
(28). La dégradation des protéines cérébrales produit des acides aminés qui
peuvent entrer dans le cycle de Krebs. Ainsi donc, par l'intermédiaire de
ce cycle et de la gluconéogénèse, le carbone des protéines peut être incor-
poré dans le ~lycogène, comme lia signalé WOODBURY (29).

---

1
- 198 -
7.3. ROLE DES NUCLEOTIDES CYCLIQUES.
Il semble bien établi actuellement, que les nucléotides cycliques soient
impliqués dans les mécanismes des convulsions chez l'animal (30, 31). On
peut se demander si les variations de taux de ces nucléotides sont â l'ori-
gine des convulsions ou si elles en sont la conséquence. Lorsqu'on soumet
les animaux à un anticonvulsivant comme une benzodiazépine, les convulsions
n'ont pas lieu, de même que les variations du taux de nucléotides cycliques.
Mais,d'après nos résultats, la chronologie des variations du taux de GMPc
semble indiquer que les convulsions interviennent après ces variations. Nous
avons également observé que le tronc cérébral semble être une région par-
f
ticulièrement sensible: pendant la période précédent immédiatement les con-
vulsions, il apparaît déjà une augmentation du taux de GMPc dans cette ré-
gion; de plus, à la dose de 50 mg/kg de MSO qui ne provoque pas de convul-
sions, il se produit aussi une augmentation du taux de GMP cyclique dans la
1
même région. Le métabolisme et l'action des nucléotides cycliques dans
le système nerveux central seraient compartimentés (33). On sait qu'il
existe des interactions entre le cortex cérébral et le tronc cérébral
lors de certaines crises convulsives (34, 35). Toutefois, nos résultats
ne permettent pas de conclure sur l'origine anatomique des crises induites
par la MSO chez le Rat et la Souris.
Le rôle exact des nucléotides cycliques dans la genèse des convulsions est
difficile à expliquer. SANDERS et coll. (36) signalent que pendant les con-
vulsions induites par la MSO, l'ATP se lie à la glutamine synthétase, à d'au-
tres protéines et même à des organites cellulaires. Il serait ainsi "séques-
tré" et serait à l'abri de l'hydrolyse. C'est ainsi que le taux d'ATP ne
change pas avant et pendant les convulsions induites par la MSO (20). Dans
tous les cas, l'implication des nucléotides cycliques et de·l'ATP dans les
mécanismes de phosphorylation protéique semble être bien établie (37). L'ac-
tivation de la phosphorylase kinase kinase est bien connue. Le manque d'ac-
tion de la MSO sur le taux d'AMPc est en accord avec son incapacité à activer
1
cette kinase. Aucun travail sur la phosphorylation ou la déphosphorylation
f
de la FDPase dans le cerveau n'a été fait. Dans le foie, in vivo et in vitro
on a montré que la FDPase est phosphorylée par la protéine kinase dépendant
1
(
de l'AMPc, en présence d'ATP. Cette phosphorylation entraîne une activation
1
de l'enzyme gluconéogénique (38). L'existence d'un tel phénomène dans le
f
tissu nerveux est possible.
f

---

- 199 -
7.4. MECANISME POSSIBLE DES CONVULSIONS INDUITES PAR LA MSO.
Dans les conditions physiologiques normales, les cellules gliales, en
particulier les astrocytes, jouent un rôle tampon en absorbant le potas-
sium extracellulaire. On sait que la MSO provoque la formation de glio-
fibrilles notamment dans les astrocytes. Il semble que ces astrocytes
sont incapables d'éliminer l'excès de K+ extracellulaire. Le neurone
se trouve dans un milieu riche en K+ et son excitabilité augmente (39,
40). Plusieurs auteurs ont observé peu ou pas de changement dans les cel-
lules nerveuses: quelques gonflements de terminaisons synaptiques sont
signalées après des études ultrastructurales (41 ) ou morphométriques
(42). Cependant, ce mécanisme probable de la genèse des crises épilepti-
fl~mes induites par la MSO ne peut 2tre envisagé pour tous les modèles. En
effet, comme nous l'avons signalé dans l'effet d'embrasement chez le Chat,
les astrocytes réactionnels activés n'ont pas été observés.
Une conséquence importante de l'inhibition de la glutamine synthétase
par la MSO est l'accumulation considérable d'ammoniaque dans le tissu
nerveux. L'ammoniaque peut être à l'origine d'une altération du métabolisme
des cellules qui entraîne la formation des gliofibril1es. Il faut remarquer
cependant que la formation de gliofibrilles s'observe dans certains autres
cas d'épilepsie expérimentale comme l'application corticale de cobalt. Il
semble plutôt que la transformation de l'astrocyte est une réponse à des
stress de différentes natures comme une intoxication à l'ammoniaque. En
effet, on sait que les blessures mécaniques ou l'irridiation avec des ra-
yons ionisants entraînent une accumulation de glycogène. Les résultats
de nos expériences semblent montrer que cette accumulation est le résul-
tat d'une gluconéogénèse accélérée dans le tissu nerveux par activation
de la FDPase. Le précurseur de cette gluconéogénèse pourrait bien être le
glutamate comme le suggère PHELPS (43). L'inhibition de la glutamine syn-
thétase devrait s'accompagner d'une accumulation de glutamate. Or le taux
de glutamate diminue aussi (20). La quantité considérable de glutamate qui
devrait donc s'accumuler emprunte une autre voie métabolique qui est vrai-
semblablement celle de la gluconéogénèse. L'action stimulante du glutamate
sur la gluconéogénèse a été montrée dans le foie (44). In vitro, PASSONNEAU
et CRITES (45) ont montré que les cellules nerveuses tout comme les astro-

---

- 200 -
cytes sont capables d'accumuler du glycogène lorsque le milieu de culture
est riche en glucose. La régulation de ce métabolisme par 1'AMP cyclique
et l'isobuty1méthy1xanthine est semblable à celle qui a lieu dans le foie.
Mais, les cellules nerveuses accumulent moins de glycogène que les astro-
cytes. In vivo, l'accumulation de glycogène semble se limiter aux astro-
cytes (43), tout comme les changements u1trastructuraux (46, 47). Une
augmentation du nombre d'astrocytes a été signalée sans toutefois une
augmentation des figures mitotiques (47). Si la cellule nerveuse est nor-
malement capable d'accumuler du glycogène et qU'in vivo on n'observe pasune
telle accumulation, on peut penser que cette cellule utilise le glucose
qui a pénétré dans son cytoplasme. Effectivement, le neurone est l'élément
excitable du tissu nerveux; il est le siège d'une intense activité pendant
les convulsions. Nécessairement, il lui faut une source d'énergie. Comme
nous l'avons mentionné précédemment, la gluconéogénèse serait cette source
d'énergie. Or, l'accumulation de glycogène dans l'astrocyte semble indiquer
que la gluconéogénèse a lieu vraisemblablement dans cette cellule. Il faut
donc qu'il y ait un transfert de substrat entre le neurone et l'astrocyte.
Un tel transfert existe pour le potassium (39, 40). C'est également le
cas du glutamate. Dans les conditions physiologiques normales, ce glutamate
serait transformé en glutamine dans la cellule gliale. Or, sous l'action de
. la MSO, la glutamine synthétase est inhibée. Il est probable que dans ces
------
conditions, les astrocytes synthétisent du glucose et du glycogène à par-
tir du glutamate. Le glucose néoformé dans l'astrocyte pourrait passer dans
la cellule nerveuse pour servir de source d'énergie. Les études morphomé-
triques ont permis de découvrir ceraines structures qui pourraient être
la matérialisation des échanges astrocyte-neurone. Au niveau des contacts
entre le neurone et 1'astr9cyte en particulier dans la région synaptique,
il existe des citernes submembranaires
constituées par des disques de
reticu1um endoplasmique sans riJbosomes (48,49). L'imp1ication de ces
citernes submembranaires dans la régulation du flux de K+ avait été si~
gna1é depuis longtemps (50, 51). Le K+ rejeté dans 1lespace extrace11u-
1aire par le neurone lors de sa dépo1arisation serait capté par l'as~
trocyte puis restitué au neurone par les citernes submembranaires. Il
est possible que, par l 'intermédiaire de ces citernes, l'astrocyte capte
le glutamate issu du neurone et restitue à ce dernier du glucose syn-
thétisé de nova à partir du glutamate.

---

- 201 -
Les différentes considérations précédentes nous ont amené à émettre l 'hy-
pothèse illustrée par la figure 3 sur les échanges métaboliques liés aux
convulsions induites par la méthionine sulfoximine dans l'encéphale du Rat
et de la Souris. On sait que le glycogène cérébral a un turnover rapide,
phénomène qui ne semble pas être en accord avec son rôle de réserve énergé-
tique éventuelle. Il est possible que le glycogène de l 'astrocyte subisse
une dégradation rapide dans les conditions physiologiques normales pour
fournir du glucose au neurone. Celui-ci dégraderait le glucose, et le glu-
tamate issu de ce métabolisme serait restitué à l lastrocyte qui l'utilise-
rait pour resynthétiser du glycogène. Le glycogène cérébral, essentielle-
ment contenu dans les astrocytes, subirait ainsi un renouvellement rapide
dans les conditions normales. Ces phénomènes expliqueraient pourquoi il
n'apparaît pas une glycogénolyse rapide dans le cas d'une hypoglycémie mar-
quée. Dans ces cas, il y aurait une augmentation du turnover du glyco-
gène pour fournir de l'énergie supplémentaire, au lieu d'une glycolyse
qui ne doit intervenir qu'au moment où la gluconéogénèse n'arriverait plus
R fournir suffisammentde glucose pour satisfaire la demande. Ces phéno-
mènes ne doivent concerner qu'une partie du glucose si l Ion sait que la
majeure partie de ce glucide est dégradée en CO
et H
par le tissu ner-
2
20
veux.

---

- 202 -
QI
QI
li)
li)
:....:.--_...---.~~~ Glycolyse
ca
ca
ATP
-g. -u
u
u
-IICycle de KREBSII
-
1
~
>. >. w
c
c Z
ca
ca a
:J
:J
GMPc
1
e " a:
:l
w
Gluoose
Z
Glutamate
lt
CI ernes
]
submembranaires [
:1
_
PhOSPho~_t_io_n_?
~
1
5
K+
l
Glucose
Glutamate
NH4
1
t .-G6Pase
J~Iutamine
G6P . . : :~ Glycogène
Oxaloacétate
.•t
®
t Ph!sphorylase
F6P
FDP
t
•
te
AMPc
FDPase n ® . FDPase a
t~ 0
t
Protéine kinase?
ATP
t
Sang
Figure 3
Schéma de la compartimentation hypothétique du métabolisme du glucose
dans le cerveau du Rat et de la Souris soumis à la MSO. Les principaux
points sont :
1 - Le glutamate provenant de l'activité neuronique est cédé à l'astro-
cyte (PHELPS, II, 12) peut-être par les citernes submembranaires. Ce
glutamate peut stimuler le neurone (VAN GELDE~, VII, 53).
2
Par gluconéogénèse, le glutamate est transformé en G-6-P (MAJUr1DER
et EISENBERG, II, 10; HEVOR et GAVET, II, 36; III, 15).
3 - Sous l'action de la MSO, la FDPase normale (n) est stimulée (FDPase
a) par biosynthèse de nova et par activation (HEVOR et GAVET, II, 36;
III, 15). Cette activation est peut-être due à une phosphorylation
comme dans le foie (RIOU et coll., VII, 38).

---

- 203 -
4 - Une légère diminution du taux d'AMPc (HEVOR et GAVET, VI, 5; VI, 6)
se traduirait par une augmentation considérable de la concentra-
tion en glycogène (VAN DEN BERGHE, VI, 31).
5 - Le glucose formé par la G-6-Pase (STEPHENS et SANDBORN, VII, 25)
retourne au neurone peut-être par les citernes submembranaires.
6 - Une augmentation du taux de GMPc, à partir d'un seuil, serait im-
pliquée dans le déclenchement des convulsions en participant, peut-
être, à des mécanismes de phosphorylation protéiques membranaires.
Le K+ issu de l'activité neuronique s'accumule dans l'espace extra-
cellulaire, ne pouvant plus être absorbé par l'astrocyte. Il s'en-
suit une excitation plus élevée des neurones qui entretient les
convulsions.
Les convulsions, en augmentant la pression systémique, endommage la
barrière sang-cerveau (PETITO, VII, 52), le K+ extracellulaire pour-
ra ainsi s'élimineret entraîner une diminution progressive des con-
vulsions.
FDP
fructose-l,6biphosphate
F-6-P
fructose-6-phosphate
G-6-P
glucose-6-phosphate
G-6-Pase
glucose-6-phosphatase

---

l
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Chapitre VIII
RESUME ET CONCLUSION

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- 209 -
REsur·1E
La méthionine su1foximine (MSO) induit chez plusieurs animaux de labora-
toire des convulsions épileptiformes. Ce modèle a été utilisé pour la
recherche des mécanismes métaboliques liés aux convulsions.
Les premières recherches ont été orientées vers le métabolisme énergétique
périphérique mais n'ont pas réussi à éc1aicir la genèse des convulsions.
L'origine centrale de 1'épi1epsie a été montrée et les recherches ont été
orientées vers l'électrophysiologie et la biochimie du système nerveux cen-
tral. La neurochimie a apporté un certain nanbre d 'é1énents sur le déclen-
chement des crises.
Dans le modèle d'épilepsie induite par la MSO, plusieurs auteurs ont obser-
vé une inhibition de la glutamine synthétase avec une accumulation corré-
lative d'ammoniaque dans le tissu nerveux (1). D'autre part, il se pro-
duit une accumulation énorme de glycogène dans les astrocytes alors que
l'animal
exhibe
une activité motrice et nerveuse intense. Comme
l'activité de la glycogène synthétase et celle de la phosphory1ase ne
varient pas, il parait peu probable que le glucose incorporé dans le
glycogène soit d'origine périphérique. Récemment, PHILLIPS et COXON
(2) d'une part, MAJUMDER et EISENBERG (3) d'autre part, ont montré l'incor-
porati on de déri vés autres que 1e g1ucose dans 1e g1ycog ène cérébral. Or
il était admis jusqu'à une date récente, que la gluconéogénèse n'avait
pas lieu dans le système nerveux central, les travaux de KREBS et WOODFORD
(4) ayant abouti à une telle conclusion. Nous avons entrepris cette étude
pour tenter d'élucider les mécanismes qui sont à l'origine de l'accumu-
lation du glycogène dans le cerveau des animaux soumis à la MSO.
On sait que le métabolisme glucidique, en particulier la synthèse et la
dégradation du glycogène, est sous le contrôle de 1'AMP cyclique. D'autre
part, plusieurs auteurs ont montré l'implication des nucléotides cycli-
ques dans les convulsions épileptiformes chez différents animaux. La parti-
cipation de ces composés à la genèse des convulsions a été soupçonnée.
Les taux d'AMP cyclique et de GMP cyclique ont été déterminés afin de voir

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- 210 -
leur incidence éventuelle sur le métabolisme énergétique et sur la genèse
des convulsions.
Au moment où nous avons commencé ce travail, on considérait que la fruc-
tose-1,6-biphosphatase (FOPase) n'existait pas dans le système nerveux
central. Nous avons mis en évidence l'activité de cette enzyme dans le
cortex cérébral, le tronc cérébral et le cervelet de la Souris par une
méthode spectrophotométrique décrite par UNOERWOOO et NEWSHOLME (5). C'est
une méthode qui minimise les interférences dues à la présence de fruc-
tose-6-phosphate, de glucose-6-phosphate et de la glucose-6-phosphatase
endogènes. La MSO entraîne une augmentation très importante de l'activi-
té de la FOPase dans les trois régions étudiées. Cette augmentation est
maximale 24 heures après administration intrapéritonéale de la drogue,
période au bout de laquelle il y a une accumulation intracérébrale maximale
de glycogène. L'activité est statistiquement plus élevée pendant la pé-
riode préconvulsive (4 heures après l'injection) et persiste 72 heures
après l'injection.
L'activité de la phosphofructokinase (PFKinase) a été mesurée avec la
méthode d'UNOERWOOO et NEWSHOLME (6) modifiée. Oans les trois régions, il
n'y a pas de changement d'activité notable pendant les périodes précon-
vulsive, convulsive et post-convulsive. Sur le plan du comportement, la
MSO, à la dose de 100 mg/kg provoque chez la Souris des convulsions
tonico-cloniques 7 à 8 heures après l'administration. Les convulsions
cloniques sont particulièrement violentes et spectaculaires. L'animal
retrouve un comportement normal 24 heures après l'injection.
Ces résultats ont été décrits par HEVOR et GAVET (7) en considérant le
métabolisme énergétique de l'encéphale. L'augmentation de l'activité de
la FOPase suggérant une synthèse globale accrue de l'enzyme, celle-ci a
été isolée et purifiée.
La purification a été effectuée par la méthode décrite par MAJUMOER et
EISENBERG (8). Cette méthode consiste à détruire une enzyme
protéoly-
tique probablement lysosomale qui transforme la FOPase neutre en FOPase
alcaline par clivage de la protéine-enzyme. Les autres phosphatases sont
inactivées.Les étapes de la purification sont vérifiées par électropho-
rèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium
(SOS). Certains paramètres de l'enzyme purifiée ont été déterminés. La
composition en acides aminés a été évaluée par autoanalyseur. Le poids
moléculaire a été déterminé par deux méthodes différentes.

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- 211 -
La MSO induit une augmentation de la quantité de protéine-enzyme de la
FDPase. Le pouvoir catalytique aussi augmente. Ces expériences ont été
faites chez le Rat, 24 heures après administration d'une dose de MSO
de 100 mg/kg. Les électrophorégrammes, par IIscanningll, réalisés après
migration sur gel de polyacrylamide simple ou en présence de SDS mon-
trent une bande majeure correspondant à la FDPase. Lorsque la chromato-
graphie d'affinité est suivie par une filtration sur gel de Sephadex, il
reste une seule bande. L'emploi de certains inhibiteurs et activateurs de
la FDPase montrent que l'enzyme du foie et l'enzyme du cerveau ne présen-
tent pas les mêmes propriétés. La composition en acides aminés globale
est voisine de celle de la FDPase neutre du foie mais les proportions de
certains restes acides aminés ne sont pas les mêmes. Le poids moléculaire
de la sous-unité est estimé à 40 000.
Chez le Rat Sprague-Dawley traité avec la MSO, le syndrome épileptiforme
est assez voisin de celui de la Souris, mais les convulsions généralisées
n'ont pas été observées.
Les mécanismes probables de l'action de la MSO sur la quantité de la
FDPase dans l ~ncéphaleont été évoqués par HEVOR et GAVET (9) en consi-
dérant la gluconéogénèse astrocytaire.
(
La biosynthèse de l'enzyme a été étudiée dans le cortex cérébral du Rat
par une méthode radioisotopique décrite par DUNLOP et coll. (10). C'est
une méthode qui permet de saturer tous les pools du précurseur acide
aminé dans le tissu nerveux. L'enzyme a été isolée et le taux d'incorpo-
ration a été déterminé après une injection d'une dose massive de valine
(14C] La radioactivité spécifique de la valine a été déterminée et le
taux d'incorporation a été calculé à partir de l'équation de REITH et
coll. (11).
Afin de voir si l'augmentation de la quantité d'enzyme était l'expres-
sion d'une synthèse de nova ou d'un ralentissement de la dégradation, nous
avons utilisé les inhibiteurs de la synthèse protéique, l'actinomy-
cine D et le cyclohéximide. La métyrapone, un inhibiteur de la stéroide-
11p hydroxylase corticosurrénale, réduit l'accumulation intracérébrale
de glycogène. Son effet sur l'activité de la FDPase a été étudié. L'en-
zyme induite par la MSO et l'enzyme non induite ont été comparées par

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- 212 -
la méthode physique de résistance à la chaleur et par la résistance à
une enzyme protéolytique. La régulation de l'activité de la FDPase a été
étudiée par la détermination des métabolites intermédiaires liés au
cycle futile FDPase-PFKinase.
Le taux de synthèse apparent de l'ensemble des protéines du cortex céré-
bral du Rat a été évalué à 0,64 %de renouvellement par heure chez les
animaux témoins contre 0,76 %chez les animaux soumis à la MSO. Ce taux
est de 0,72 % pour la FDPase du cortex cérébral des témoins contre 2,05 %
après administration de la molécule.
Lorsque les animaux sont soumis à la MSO associée à l'actinomycine D,
leur comportement est semblable à celui des animaux n'ayant reçu qu'une
injection de MSO. Le cyclohéximide retarde légèrement les convulsions
induites par la MSO. La métyrapone les retarde de quelques heures. Les
inhibiteurs de la synthèse protéique inhibent partiellement l'induction
de la FDPase par la MSO dans le cortex cérébral, le tronc cérébral et le
cervelet de la Souris. L'actinomycine D semble plus active que le cyclo-
héximide. La métyrapone inhibe également l'augmentation de l'activité de
l'enzyme sous l'action de la MSO.
Les constantes de résistance à la chaleur et à l'action de la trypsine
de l'enzyme induite sont plus élevées que celles de l'enzyme normale.
Le taux de métabolites intermédiaires, ,le fructose-1,6-biphosphate, le
glycéraldéhyde-3-phosphate et le dihydroxyacétone-3-phosphate ne chan-
gent pas dans l'encéphale de la Souris. Dans les trois régions étudiées,
4,8, 24 et 48 heures après l'administration de la molécule, aucune va-
riation notable n'a été observée.
Ces résultats montrent que la MSO induit une augmentation de la biosyn-
thèse globale de la FDPase dans l'encéphale. Cette action est sélective.
L'inhibition partielle de cette induction par les inhibiteurs de la syn-
thèse protéique indique qu'il y a une activation du pouvoir catalytique
parallèle à l'augmentation de la biosynthèse. La MSO semble protéger par-
tiellement l'enzyme contre la protéolyse. Cette molécule semble agir sur
la régulation de la biosynthèse de la FDPase.
La régulation de la biosynthèse de la FDPase a été étudiée. Le taux de

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- 213 -
synthèse et le taux de dégradation ont été déterminés par une méthode
immunologique décrite par McGINNIS et DE VELLIS (12) et par CIARANELLO et
AXELROO (13). L'antisérum a été préparé chez le Lapin avec la FDPase pu-
rifiée du cortex cérébral du Rat. Sa spécificité a été vérifiée par la
technique de double diffusion d'OUCHTERLONY. Une immunotitration a été
effectuée. La synthèse et la dégradation ont été déterminées par double
incorporation de la valine [14C] et de la valine [3H].
L'anti-FOPase est monospécifique. Les plaques d'OUCHTERLONY n'indiquent
qu'une seule bande de précipité. Par immunotitration, le point d'activité
nulle déterminé avec l'enzyme induite
est plus important que celui de
l'enzyme normale. Le rapport de ces points et le rapprot des activités
enzymatiques ne sont pas semblables. Par double incorporation de la va-
line radioactive, on a montré que la MSO accélère le taux de synthèse de
la FDPase. Le taux de dégradation ne change pas. La biosynthèse a été ac-
cessoirement étudiée par immunoprécipitation. Les résultats sont sembla-
bles à ceux de l'étude précédente.
On peut déduire de ces expériences que la MSO n'affecte pas la dégrada-
tion de la FDPase, mais accélère sa synthèse de nova. Le nombre de molé-
cules de la FOPase augmente sous l'action du convulsivant.
La détermination du taux de nucléotides cycliques dans l'encéphale a été
effectuée par la méthode de radiocompétition de GILMAN
(14) modifiée
pour l'AMP cyclique et la méthode de radioimmunologie de STEINER et coll.
(15) pour le GMP cyclique.
Le taux d'AMP cyclique ne change pas notablement dans le cortex cérébral,
le striatum, l'hypothalamus et le cervelet du Rat et dans le cortex céré-
bral de la Souris pendant les périodes préconvulsive, convulsive et post-
convulsive. On observe une légère diminution non significative de ce
taux. La concentration en GMP cyclique reste constante pendant la période
préconvulsive et post-convulsive dans le cortex cérébral, le tronc céré-
bral et le cervelet de la Souris. Mais pendant la période convulsive, à
la dose de 100 mg/kg, la MSO provoque une augmentation significative dans
les trois régions étudiées, en particulier dans le tronc cérébral. Pendant
la période préconvulsive, juste avant les convulsions et juste après les
convulsions, le taux de GMP cyclique est notablement plus élevé dans le

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- 214 -
tronc cérébral mais pàs dans les autres structures. A la dose de 50
mg/kg, qui ne provoque pas de convulsions, la teneur tissulaire en GMP
cyclique augmente uniquement dans le tronc cérébral.
Ces résultats ont été interprétés par HEVOR et GAYET (15, 16) en consi-
dérant la genèse des convulsions induites par la MSO. Le manque d'action
de la MSO sur le taux d'AMP cyclique semble être en accord avec l'accu-
mulation intracérébrale de glycogène induite par la MSO.
Ce travail montre que l'augmentation de la gluconéogénèse et l'accumu-
lation intracérébrale de glycogène ne sont vraisemblablement pas directe-
ment impliquées dans le déclenchement des convulsions induites par la MSO.
Mais, ces phénomènes augmentent le potentiel énergétique du tissu ner-
veux et doivent fournir l'énergie nécessaire pour entretenir l'hyperexci-
tabilité des neurones. La MSO induisant une accumulation de glycogène
dans l'astrocyte, il est probable qu'il y a
un transfert de métabolites
énergétiques entre cette cellule et le neurone. Le GMP cyclique pourrait
être impliqué dans la genèse des convulsions en participant aux phénomènes
de phosphorylation. Par ces propriétés, en tant que molécule provoquant
une hyperactivité neuronique, la MSO se distingue de certaines autres mo-
lécules de ce type comme le pentétrazol, la picrotoxine, l'amphétamine
(18).
CONCLUSION
Les recherches neurochimiques dans les différents laboratoires ont appor-
té un certain nombre d'éléments sur les mécanismes métaboliques liés aux
convulsions. Les causes du déclenchement des convulsions sont encore ob-
scures. Plusieurs altérations métaboliques associées aux crises ont été
observées dans le système nerveux central. Le présent travail montre une
altération du métabolisme énergétique et du métabolisme du GMP cyclique
cérébral dans les convùlsions épileptiformes induites par la MSO. Les ré-
sultats obtenus nous ont permis de faire plusieurs spéculations sur les
mécanismes qui entraînent l'accumulation du glycogène dans le cerveau du
Rat et de la Souris soumis à la MSO et sur les mécanismes qui déclenchent
les convulsions. Cependant, plusieurs points restent à éclaicir:

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- 215 -
- Peut-on étendre ces spéculations à d'autres modèles? Comme dans l'effet
d'embrasement chez le Chat il n'y a pas formation d'astrocytes réaction-
nels activés, il apparaît que les mécanismes métaboliques liés aux con-
vulsions ne doivent pas suivre le même processus dans tous les modèles.
D'autre part, dans les modèles où les crises épileptiformes apparaissent
rapidement, en particulier celles qui ne sont pas induites par administra-
tion de molécules comme dans l'épilepsie photosensible, il est peu proba-
ble que de telles variations se produisent avant le déclenchement des
crises. L'accumulation de glycogène et l'activation de la FDPase doivent
nécessiter un certain délai.
- Une preuve matérielle de l'incorporation du glucose néoformé dans le
glycogène intracérébral devrait être faite. Bien qu'il y ait une forte pro-
babilité que l'altération du métabolisme énprgétique se produise dans l'as-
trocyte, on doit montrer expérimentalement la localisation topographique
14C
de cette altération. Les méthodes isotopiques utilisant le 2_
désoxy-
glucose pourrait donner une indication sur l'utilisation du glucose péri-
phérique par le cerveau du Rat et de la Souris soumis à la MSO. La locali-
sation de la FDPase peut être réalisée par une méthode immunologique. Dans
ce sens, les IgG anti-FDPase ont été déjà purifiées dans notre laboratoire
et feront l'objet d'études ultérieures.
- Si le GMP cyclique est impliqué dans la genèse des convulsions, quelles
seraient les conséquences d'une inhibition de la guanylate cyclase?
Les travaux en cours dans notre laboratoire permettront peut-être de
répondre à certaines de ces questions. Le développement de la neurochi-
mie de l'épilepsie, l'étude des mécanismes moléculaires des benzodiazépines
(19), de la diphénylhydantoïne (20), les observations biochimiques (21)
et l'apparition d'autres modèles (22, 23) apporteront, sans doute, des
éléments de réponse au problème de la genèse des convulsions épilepti-
formes.

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VII, 29, 206
***

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NOM
DE
L'ETUDIANT
HEVOR Tobias Kokou
NATURE DE LA THESE
Docteur es Sciences
VU, APPROUVE
et PERMIS D'IMPRIMER
1
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NANCY LE
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LE PRESIDENT DE L'UNIVERSITE DE NANCY
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