FACULTE DE MEDECINE
\\
THE5E
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Présentée au Département de Microbiologie
de
L'UNIVERSITE
DE
SHERBROOKE
Pour l'obtention du grade de
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MAITRISE
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Corn/an
A.
de SOUZA
Bachelier
Es
Sciences (Microbiologie)
de L'Université de Montréal
ETUDES
DES MUTATIONS SOMATIQ!lES SPONTANBES
RBsISTANTES
AU 2 - DBOXYGALACTOSE
FEVRIER
1979
,.
l...'-
i i
A MES PARENTS
1
1
iii
SOMMAIRE
Des tests de fluctuation à la Luria et Delbrllck ont
été effectués pour déterminer la fréquence des variations
spontanées des cellules somatiques de hamster chinois rela-
tives à la résistance au 2-déoxygalactose.
Ces études mon-
trent que les taux de mutation des souches V6, Hpt13, Tyk6,
DR2, sont de l'ordre de l
à 3.5 X 10- 5
10-
par cellule et par
génération.
Parmi les clones résistants, seize furent ca-
ractérisés en détails.
Ils incorporent moins de
3H-D-Galac-
tose que les souches parentales, leur activité spécifique
galactokinase CE.C.2.7.1.6) est moindre que l'activité spé-
cifique du type sauvage.
L'analyse statistique de la dis-
tribut ion des clones résistants indique que la résistance au
2-déoxygalactose est un évènement survenant spontanément et
au hasard et qu'il n'est pas induit par l'agent sélectif.
iv
REMERCIEMENTS
Ce travail a été effectué sous la direction du doc-
teur Jean-Paul Thirion.
Qu'il me soit permis de lui témoi-
gner ma gratitude pour sa patience, ses conseils, son sup-
port financier et l'intérêt constant qu'il a porté à mes re-
cherches.
Je remercie très sincèrement le docteur Jean-Michel
Claverie, pour ses conseils et sa participation aux analyses
statistiques des résultats.
Les docteurs, Marcel Bastin et Liat Tan, qUl ont bien
voulu accepter de juger ce travail.
Qu'il me soit permlS d'adresser mes vifs remercie-
ments aux membres du laboratoire du docteur Jean-Paul Thi-
rion, à tout le corps professoral, aux étudiants et techni-
Clens du département de microbiologie et à tous ceux qui de
près ou de loin ont contribué à l'élaboration de ce travail.
TABLE DES MATIERES
PAGE TITRE
•
l
DEDICACE .
·
.
. i i
SOMMAIRE .
.
· i i i
REMERCIEMENTS
•
lV
TABLE DES MATIERES
·
• v
LISTE DES FIGURES
· vii
LISTE DES TABLEAUX
· viii
INTRODUCTION .
.
.
·
. l
MATERIEL ET METHODES
·
•
•
3
Cellules, milieux et conditions de culture.
• 3
Test de la résistance au 2-déoxygalactose
• 3
Dosage enzymatique et mesure de la quantité
de protéine dans les extraits cellulaires
•
• 4
a)
Activité spécifique de la galactokinase
· 4
b)
Mesure de la quantité de protéine
·
5
Incorporation du 3H
3
dans le produit précipi-
table au TCA (acide trichloroacétique)
. . . . .
·
6
a)
3H-D-galactose
· 6
b)
3H-thymidine et 3H-hypoxanthine
. .
7
Expériences du test de fluctuation
.
•
•
• 7
RESULTATS
· Il
Test de fluctuation
Il
Test de Kolmogorov-Smirnov
·
.
. 14
!
vi
Calcul du taux de mutation
.
.
.
.
.
.
.
.
.
15
Caractérisation des clones résistants
obtenus durant les tests de fluctuation
.
.
.
.
.
31
a)
Test de la résistance au 2-déoxygalactose
31
b)
Effet cytotoxique du Dga
31
c)
Incorporation du 3 H dans le produit pré-
cipitable au TCA (acide trichloroacétique)
et activité galactokinase
.
.
.
31
CONCbUSION
42
ANNEXE
Liste des Abbréviations
•
•
• 4 '7
BIBLIOGRAPHIE
48
BIBLIOGRAPHIE
vii
LISTE DES FIGURES
FIGURE l
Pedigree des souches
.
.
.
.
.
.
.
.
.
•
.
. 10
FIGURE 2
Effet cytotoxique du 2-déoxygalactose
S,
S
sur les différentes souches:
Dga
,
P-R
R
0
Dga
,Dga
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 4
FIGURE 3
La VOle métabolique du galactose
.
.
.
.
.
41
: .
viii
LISTE DES TABLEAUX
1.
Test de fluctuation avec V6 .
. . .
17
2.
Test de fluctuation avec Hpt13
. . .
18
3 •
Test de fluctuation avec Tyk6
.
19
4 .
Test de fluctuation avec DR2
. . .
. . .
20
5.
Test de fluctuation, analyse statistique
.
22
6.
Valeurs de la déviation maximale entre les
fréquences cumulées expérimentales et théo-
riques pour les contrôles
24
contrôles
7 .
Valeurs du paramètre K eN > 30)
.
24
8.
Valeurs critiques de
D
dans le test de
Kolmogorov-Smirnov pour une variable
26
9.
Valeurs critiques de
K
dans le test de
Kolmogorov-Smirnov
27
10.
Taux de mutation pour les quatre souches
30
Efficacité de clônage des souches parentales
et des clones
Dga R
Dga
en présence de différen-
tes concentrations de Dga
.
.
.
. .
. . .
12.
Incorporation du
3H dans le produit précipi-
table au TCA à partir du
3H-galactose,
3H-hypoxanthine et
3H-thymidine
.
.
36
13.
Activité spécifique de la galactokinase des
souches parentales et des .clones résistants
.
38
1
INTRODUCTION
Ces dernières années, des progrès considérables ont
été accomplis dans la détection et l'isolement des variants
de phénotypes stables.
Les exemples les plus connus sont
les clones résistants aux drogues:
à la 8-azaguanine (SZY-
BLASKI et al, 1962; CHU et al, 1969; SHARP, CAPECCHI et CA-
PECCHI, 1972), à l'a-amanitine (CHAN et al, 1972; SOMERS,
PEARSON et INGLES, 1975), à la cycloheximide (POCHE et al,
1975; POCHE, VASHAVER et GEISSLER, 1975), à la ouabaine (MAY-
HEW, 1972; BAKER et al, 1974 ARIETT et al, 1976; MANKOVITZ
et al, 1974), à la colchicine (LING et THOMPSON, 1974; LING,
1975) et au 2-déoxygalactose (THIRION et al, 1976).
Les auteurs ont constaté que la fréquence d'appari-
tion de ces clones résistants augmente après mutagenèse; que
les phénotypes résistants sont stables après de nombreuses
générations en l'absence d'agent sélectif.
Par conséquent
ces observations suggèrent mais ne démontrent pas l'origine
génétique de ces variations.
Elles indiquent seulement la
possibilité d'évènements génétiques (SIMINOVITCH, 1976).
La
possibilité pour nous de le montrer est d'effectuer un test
à la LURIA et DELBRUCK.
2
Dans ce travail, nous décrivons donc les résultats
de plusieurs tests de fluctuation à la LURIA et DELBRUCK
(1943) effectués avec quatre lignées de cellule de hamster
chinois que nous avons utilisées dans le but de montrer que
R
les variants Dga
étaient le résultat d'évènements généti-
ques (changement de séquences nucléotidiques; réarrangement
dans la structure primaire du DNA).
L'analyse de nos résultats par la méthode statisti-
.
que de KOLMOGOROV-SMIRNOV démontre clairement l'apparition
spontanée et au hasard du phénotype résistant dans les po-
pulations de cellules du type sauvage.
Elle rejette l'hy-
pothèse de tout processus d'induction.
Ces résultats com-
binés à ceux déjà obtenus (THIRION et al, 1976) démontrent
R
que le caractère Dga
résulte d'un évènement génétique et
constitue ainsi un marqueur utile pour l'analyse génétique
des cellules de hamster chinois.
Ce travail fait l'objet d'une publication dans la
revue américaine GENETICS
(CLAVERIE, de SOUZA, THIRION;
1979 sous presse).
3
MATERIEL ET METHODES
Cellules, milieux et conditions de culture
Les cellules sont ensemencées dans des disques, en
milieu minimal (MEM) avec 8% de sérum de veau foetal
(rCS).
La croissance des cellules se fait dans des incubateurs
oC.
o
air-C0 2 ·à 37 C.
Les principales souches utilisées:
V6,
2 ·à
37
Hpt13, Tyk6 et DR2 sont respectivement, sauvages, résistan-
tes, à la 8-azaguanine, au BrdUrd et partiellement résistan-
tes au 2-déoxygalactose,
(THIRION, BANVILLE et NOEL, 1976).
Le pédigrée de ces lignées cellulaires est décrit à la fi-
gure 1.
Test de la résistance au 2-déoxygalactose
La sensibilité au 2-déoxygalactose des cellules sau-
vages et des variants a été testée tel que décrit par THI-
RION et al,
(1976).
250 cellules environ sont ensemencées
dans des disques de 6 cm de diamètre en présence de 4 ml de
milieu minimal (MEM) avec 8% de sérum de veau foetal
(rCS)
et différentes concentrations de 2-déoxygalactose:
3 mM,
oC,
o
6 mM, 15 mM et 30 mM.
Après 10-16 jours d'incubation à 37 C,
les clones sont fixés avec un mélange de méth~nol et d'acide
4
acétique (3:1, V:V), colorés au bleu de méthylène (1% de
bleu de méthylène dans 70% d'isopropanol) et comptés.
La
réponse au 2-déoxygalactose est définie comme la concentra-
tion de 2-déoxygalactose qui inhibe la formation de clones
à 50% après 10-16 jours.
Cette concentration est désignée
R50.
La R50 des souches sensibles, partiellement et tota-
lement résistantes, est respectivement 0-0.6 mM, 0.6-6 mM
et supérieure à 6 mM.
Dosage enzymatique et mesure de la quantité de protéine dans
les extraits cellulaires
a)
Activité spécifique de la galactokinase
L'activité spécifique de la galactokinase (E.C.2.7.
1.6) des souches a été mesurée in vitro de la façon suivan-
te.
Des cellules en phase exponentielle (environ l
x 10 6
10 )
sont
lavées deux fois avec 10 ml de PBS avec MgC1 2 sans CaC1 2
(PBSM).
On ajoute l
ml de trypsine - EDTA.
Après 90 se-
condes, la trypsine est retirée et remplacée par 5 ml de
PBSM.
Les cellules sont incubées pendant 5 à 10 minutes à
la température de la pièce.
Les cellules détachées sont
centrifugées pendant 5 minutes, à 2.850 rpm (International
Clinical Centrifuge Model C.L.), resuspendues en PBSM et re-
centrifugées.
Les cellules sont resuspendues dans 0.5 ml
5
de tampon d'extraction 0.1 M phosphate K - Na (pH 7.2) et
lys~es par sonification (deux fois trois secondes) ~ OOC au
moyen d'un sonicateur Artex (FARMINGALE, N.Y. 11735).
Les
d~bris cellulaires sont centrifug~s ~ 4500 rpm dans une cen-
trifugeuse SORVALL RC-3 munle du rotor HG-4, ~ 40C
40 C pendant
10 minutes.
Le surnageant ou extrait cellulaire est recueil-
li dans un tube.
50 ~l de cet extrait cellulaire est incu-
b~ ~ 370C
37 0 C avec 20 ~l d'ATP 0.02 M (pH 7), 25 ~l de galacto-
se 4 x 10-~M et 5 ~l de galactose-l~C (0.1 ~Ci).
Des ali-
quots pris ~ diff~rents intervalles de temps (0, 15, 30, 45,
60 minutes), sont analys~s par ~lectrophorèse sur papier
WHATMAN 3MM.
Le galactose est s~par~ du galactose-l-phos-
phate, le galactose reste ~ l'origine et le galactose-l-
phosphate migre entre les deux colorants xylène cyanol bleu
FF
et orange
G dans une solution a cê t Lque
ac~tique 5% (acide-eau)
dont le pH a ~.t~ a j us t
ajust~ ~
ê
3.5 avec de l'hydroxyde d'ammonium.
Les zones radioactives sont localis~es, d~coup~es et comp-
t~es dans un compteur ~ scintillation.
b)
Mesure de la quantit~ de prot~ine
La quantit~ de prot~ines dans les extraits cellu-
laires est mesur~e par la m~thode de BIO-RAD.
Le r~actif
BIO-RAD est dilu~ (1:4, v/v) avec de l'eau distill~e et fil-
tr~ sur papier WHATMAN no. 1.
0.1 ml de l'extrait cellulaire (20 ~g ~ 140 ~g de prot~ine)
6
est analysé en présence de 5 ml du réactif BIO-RAD dilué
à la température de la pièce.
La lecture de la densité op~
tique à 595 nm est faite après 5 minutes d'incubation au
spectophotomètre.
Incorporation du 3H dans le produit précipitable au TCA
(acide trichloroacétique)
a)
3H-D-galactose
2 X 105 cellules environ sont ensemencées dans des
disques de 3.5 cm de diamètre en présence de 2 ml du milieu
minimal (MEM) et 8% de fCS.
On ajoute au milieu 5 Ul de
3H-D-galactose (0 ..01 mM, 0.5 mCi) 'soit 300000 CPM environ
et 5 Ul de galactose froid 4 mM.
Les disques sont incubés
à 37 0C
37 0 C jusqu'à ce que les cellules deviennent confluentes
(2-3 jours).
Le milieu radioactif est retiré, et les cel~
Iules sont lavées deux fois avec du PBS (avec MgC12)'
On
ajoute 0.5 ml de trypsine - EDTA, après 60 secondes la tryp-
sine est retirée et remplacée par 0.5 ml du même PBS.
Les
cellules sont détachées et·transférées dans des tubes.
On
ajoute à chaque tube 0.05 ml environ de NaOH (SN) pour lyser
les cellules, et 5 ml de TCA (acide trichloroacétique) 10%
...
0
5 . .
..
a 0 C contenant du galactose (10- M).
Le precipite
a 0 C contenant du galactose (10- M).
Le
est re-
cueilli sur filtre de fibre de verre WHATMAN (grade Gf/A)
7
de 2.4 cm de diamètre.
Les fibres de verre sont lavées avec
du TCA 5% contenant du galactose (IO-SM), puis avec 95% d'é-
thanol.
Elles sont ensuite séchées sous une lampe infrarou-
ge.
La radioactivité est mesurée dans un compteur à scin-
tillation.
b)
3H-thymidine et 3H-hypoxanthine
Les expériences ont été effectuées telles que décri-
tes précédemment.
Dans le cas de l'incorporation de la
3H-thymidine, le
3H-D-galactose est remplacé par 6.7 x 10-3M
de 3H-thymidine (100 ~Ci/ml) et le galactose par la thymidi-
ne 10-sM.
L,3H-hypoxanthine
L'3H-hypoxanthine 10-6M (10 ~Ci/ml) et l'hypoxan-
thine 10-sM remplacent respectivement le
3H-D-galactose et
le galactose dans l'incorporation de l'3H-hypoxanthine.
Expériences du test de fluctuation
Les tests de fluctuation ont été effectués pour cha-
cune des quatre lignées cellulaires:
V6, Hpt13, Tyk6 et DR2
de la façon suivante:
Pour chaque expérience, 500 cellules enVlron sont ensemen-
cées dans 35 à 40 disques de 3.5 cm de diamètre contenant
2 ml de milieu minimal (MEM) avec 8% de fCS.
Les disques
8
sont incubés à 37 0C
37 0 C jusqu'à ce que la densité cellulaire
soit d'environ 2 ± 0.2 x 10 4
10
cellules par disque (à peu pr~s
7 jours).
Les cellules sont ensuite trypsinées et mises en
sélection dans 35 à 40 disques de 10 cm de diamètre conte-
nant 8 ml de milieu minimal (MEM) avec 8% de FCS et 48 mM
de 2-déoxygalactose.
Comme contrôle de chaque expérience,
500 cellules environ ont ét~ ensemencées dans un disque de
3.5 cm de diamètre dans les mêmes conditions que pour l'ex-
périence, mais les cellules ont été incubées jusqu'à ce que
la densité cellulaire soit d'environ 4 ± 0.4 x 105 cellules
par disque.
La culture est ensuite distribuée également
dans 20 disques de 10 cm de diamètre en présence de 8 ml de
milieu MEM 8% de FCS et 48 mM de 2-déoxygalactose pour la
sélection.
Après trois jours de sélection, pour l'expérien-
ce et le contrôle, le milieu est retiré et remplacé par du
milieu frais de même composition que le milieu de .sélection.
Douze jours plus .tard, les clones résistants sont isolés pour
une caractérisation plus poussée de ces derniers.
9
FIGURE
l
Cette figure montre le pédigrée des principales sou-
ches utilisées dans ce travail.
La souche V6 dérive de la
V79 par clônage.
Les souches Hpt13, Tyk6 et DR2 dérivent
de la V6 par mutagén~se au sulfonate d'éthylméthane.
La
Hpt13 est résistance à la 8-azaguanine, la Tyk6 au BrdUrd
et la DR2 est partiellement résistante au 2-déoxygalactose.
(THIRION et al, 1976).
10
FIGURE
1
LE PEDIGREE DES SOUCHES
V 9 (FORD et YERGANIAN, 1958)
C ONAGE (3 fois)
V6
MUTAGENESE
Tyk6
Hpt13
MUTAGENESE
~R2
Il
RESULTATS
Tests de fluctuation
Afin de comprendre l'origine du changement phénoty-
pl que de la sensibilité ~ la résistance au 2-déoxygalacto-
se, nous avons effectué des tests de fluctuation avec qua-
tre souches:
V6, Hpt13, Tyk6 et DR2 qui dérivent toutes de
la souche V79 (Figure 1).
Pour chaque expérience (désignée par la suite par
le mot "EXPERIENCE"), 500 cellules environ sont
~
sont ensemencees
dans 35 ~ 40 disques de 3.5 cm de diamètre.
Les disques
sont incubés ~ 37 0C
37 0 C jusqu'~ ce que la densité cellulaire
atteigne 2 ± 0.2 x 10~ cellules par disque au bout de 6 ~ 7
jours.
Les cellules sont ensuite trypsinées et ensemencées
dans 35 ~ 40 disques de 10 cm de diamètre en présence de
8 ml du milieu (MEM),
8% de FCS et 48 mM de 2-déoxygalacto-
se.
Comme contrôle de chaque expérience (désignée par la
suite par le mot "contrôle"), 500 cellules environ ont été
ensemencées dans un disque de 3.5 cm de diamètre.
Les cel-
Iules ont été incubées jusqu'~ ce que la densité cellulai-
.
re atteigne 4 ± 0.4 x 105 cellules par disque.
La culture
est ensuite divisée également en vingt parties dans des dis-
ques de 10 cm de diamètre en présence de 48 mM de 2-déoxyga-
lactose.
Dans le cas de l'expérience, les cultures en
12
sélection sont indépendantes alors que pour le contrôle, les
cellules mlses en sélection proviennent d'une seule et même
culture.
Selon LURIA et DELBRUCK (1943), si l'agent sélec-
t i f (le 2-déoxygalactose) induisait le changement de sensi-
ble à résistant, le nombre de clones résistants dans les
disques de l'expérience devrait suivre une distribution de
Poisson, car toutes les cellules se comporteraient de la mê-
me façon vis-à-vis de l'agent sélectif; ce que l'on exprime
mathématiquement en disant que la variance et la moyenne de
la distribution sont peu différentes l'une de l'autre.
Ce-
pendant si dans les cellules en culture, les mutations se
produisent comme des évènements régis par les lois du hasard,
avant qu'elles ne soient exposées au 2-déoxygalactose, quel-
ques cultures peuvent ne pas contenir de clones résistants,
tandis que cell€s
dans lesquelles les mutations sont surve-
nues tôt au cours de la période d'incubation, doivent conte-
nir de nombreux clones résistants (voir Tableaux l
et 4).
La distribution ne suit pas une loi de Poisson; ce que l'on
exprime mathématiquement encore en disant que la variance et
la moyenne de la distribution sont bien différentes.
Par
contre pour le "contrôle", le nombre de clones résistants
par disque devrait toujours suivre une distrioution de Pois-
son, puisque les cellules en sélection proviennent d'une seu-
le et même culture.
Ainsi, en résumé, l'origine rnutationnel-
le du changement phénotypique implique deux choses:
13
1)
Pour le "contrôle", le nombre de clones par disque doit
suivre une loi de Poisson (c'est-à-dire que le rapport
moyenne sur variance est voisin de la valeur 1) et
2)
Dans le cas de l'expérience, ce nombre doit SUlvre une
distribution à très haute variance incompatible avec
une loi de Poisson (le rapport moyenne sur variance est
alors très différent de la valeur 1).
L'origine adaptative du changement phénotypique se
traduit au contraire par une distribution de Poisson du nom-
bre de clones par disque dans le cas du "contrôle" et de
l'expérience.
Les tableaux l,
2,
3 et 4 montrent les résultats obtenus a-
vec chaque lignée cellulaire.
Comme l'une des propriétés de la loi de Poisson est que la
moyenne est égale à la variance (m = a 2
a )) , la première ana-
a 2
a
lyse de nos résultats sera la comparaison du rapport
m
pour l'expérience et le "contrôle" (Tableau 5).
Ces rap-
ports n'excèdent jamais deux pour les "contrôles" mais sont
toujours supérieurs à six pour les "expériences".
Ce ré-
sultat indique que la distribution des clones est différen-
te dans le "contrôle" et dans "l'expérience".
Cette dis-
tribution semble être plus compatible avec une loi de Pois-
son dans le cas du "contrôle" que dans le cas de l'expérien-
ce.
En effet, pour le "contrôle", la variance n'est que H:-
gèrement supérieure à la moyenne, tandis que dans le cas de
14
l'expérience, elle a une valeur SlX fois supérieure à la
moyenne (Tableau 5), ce qui est incompatible avec la loi
de Poisson.
De plus l'hypothèse mutationnelle implique
l'existence de ce que l'on appelle en anglais "Jack pot",
c'est-à-dire l'existence d'expériences dans lesquelles on
observe un très grand nombre de clones résistants (1,000 à
5,000 sur 2 x 10~ cellules) résultat d'un évènement géné-
tique très précoce qui survient par chance dans les cultu-
res (ce que nous avons observé tableaux l
et 4).
Nous al-
Ions donner maintenant un sens précis à ,ces observations
en effectuant le test statistique de KOLMOGOROV-SMIRNOV.
Test de KOLMOGOROV-SMIRNOV
Le test de KOLMOGOROV-SMIRNOV est effectué de la ma-
nièresuivante:
Pour chaque échantillon, on calcule les é-
R)
R
carts entre les fréquences
(apparition des clones Dga ) cu-
mulées expérimentales et théoriques.
On prend ensuite la
valeur de la déviation maximale (DMAX, Tableau 6) et on con-
sulte le tableau 8, Sl la taille de l'échantillon n'est pas
supérieure à trente (30).
Si la taille de l'échantillon
est supérieure à trente (30), on calcule un "paramètre K"
(K = DMAX x ~ tableau 7 et on consulte le tableau 9.
Nous avons utilisé ce test pour vérifier la compatibilité
des distributions observées avec la loi de POlsson, en pre-
nant la moyenne de chaque échantillon comme estimateur de
15
la population parentale.
Nous trouvons que tous les échan-
tillons du "contrôle"
sont compatibles avec une loi de Pois-
son de moyenne "m" au seuil 5% (P > 0.05) et même à 10% dans
le cas de la V6 et Hpt13, tandis que tous les échantillons
de "l'expérience" sont incompatibles avec la loi de Pois-
son de moyenne "m" à un seuil meilleur que 0.2% (P < 0.001).
Ainsi le test indique que l'origine mutationnelle de l'appa-
R
rition des clones Dga
est beaucoup plus probable qu'une 0-
rigine adaptative de l'agent sélectif.
Ces observations du
test de fluctuation et les précédents résultats
(THIRION
R
et al, 1976) démontrent que le phénotype Dga
résulte d'un
évènement génétique plutôt que d'un évènement épigénique.
Calcul du taux de mutation
Bien que compatible avec une loi de Poisson (au
R
seuil de 5% (P > 0.05) la distribution des clones Dga
par
disque dans les "contrôles" montre une variance légèrement
2
- , .
...
...
0
superleure a la moyenne (1.56 < - - < 2, tableau 5).
Ceci
m
suggère qu'un mécanisme perturbe la distribution des clones
et augmente la variance de la distribution observée.
Une
analyse détaillée des différences entre la distribution théo-
rique de la loi de Poisson et celle observée, montre que les
écarts les plus importants sont concentrés dans la région
.
R.
R
des fréquences de 0 (zéro) et l
(un) clone Dga
.
Indiquant
16
que la moyenne "m" utilisée pour le calcul de la distribu-
tion théorique est, dans chaque cas, légèrement surévaluée.
Une explication simple de cette perturbation est que
la manipulation des .disques durant la sélection, en particu-
lier le changement du milieu après trois jours, augmente lé-
R
gèrement le nombre de clones Dga
(par division des clones
existants) dans les disques où i l y en a,
laissant évidem-
R
ment inchangé le nombre de clones Dga
des disques qUl ne
possèdent pas de clones (zéro clone).
Pour cette raison,
nous avons utilisé et recommandons la méthode de F
(LURIA
b
et DELBRUCK) pour calculer le taux de mutation.
Dans la génétique des cellules somatiques où de tels
artéfacts sont la règle plutôt que l'exception, la méthode
F
est plus appropriée que toute autre méthode utilisant les
o
moyennes ou les médianes (LEA et COULSON, 1949).
Le taux de mutation de chaque lignée cellulaire est
indiqué dans le tableau 10.
Ces valeurs ne sont pas signi-
ficativement différentes pour les souches:
V6, Hpt13 et
Tyk6; leur moyenne est 1.2 ± 0.2 x 10- 5
10-
par cellule et par
génération.
La valeur de la DR2 est significativement
(P >-0.05) supérieure à la moyenne des trois précédents:
3.5 ± 0.3 x 10- 5
10-
par cellule et par génération.
17
TABLEAU 1
TEST DE FLUCTUATION AVEC V6
Expérience
Contrôle
Nombre de cultures
37
1
Nombre d'échantillons
1
20
par culture
Nombre de disques R
avec N clones Dga
N = 0 clone
27
12
1
1
2
2
0
3
3-4
3
3
5-8
2
0
9-16
2
0
2,000 1
2,000 '1
2
0
* Bien que cette valeur élevée soit en accord avec les fluc-
tuations espérées dans le test à la LURIA - DELBRUCK (1943);
nous ne l'avons pas utilisée dans le calcul de la moyenne
et la variance afin de rendre le test statistique plus sen-
sible.
18
TABLEAU 2
TEST DE FLUCTUATION AVEC Hpt13
Expérience
Contrôle
Nombre de cultures
35
l
Nombre d'échantillons
l
20
par culture
Nombre de disques R
avec N clones Dga
N = 0 clone
26
14
-1
l
l
2
l
3
3-4
l
2
5-8
3
0
9-16
3
0
19
TABLEAU 3
TEST DE FLUCTUATION AVEC Tyk6
Expérience
Contrôle
Nombre de cultures
36
l
Nombre d'échantillons
l
20
par culture
Nombre de disques R
avec N clones Dga
avec N clones
N = 0 clone
23
12
l
6
0
2
0
3
3-4
2
5
5-8
3
0
9-16
2
0
20
TABLEAU 4
TEST DE FLUCTUATION AVEC DR2
Expérience
Contrôle
Nombre de cultures
36
l
Nombre d'échantillons
l
20
par culture
Nombre de disques R
avec N clones Dga
N = 0 clones
13
10
l
2
0
2
l
4
3-4
3
5
5-8
6
l
9-16
5
0
17-32
3
0
33-64
l
0
65-128
l
0
2,000'"
l
0
* Voir remarques (Tableau 1).
21
TABLEAU
5
Les valeurs de la moyenne (m) et de la varlance
2)
varlance
2
(0
)
ont ~t~ calcul~es pour les ~chantillons des ex~~riences et
des contrôles par les formules suivantes:
• f.l
m
= la moyenne de l'~chantillon
N
= taille de
= taille
l'~chantillon
x·
= nombre de clones
l
= nombre de
l
f.
= fr~quence des clones
l
(m_x.)2
l
2
0
= varlance de l'~chantillon
22
TABLEAU 5
TESTS DE FLUCTUATION, ANALYSE STATISTIQUE
Souches
Moyenne
Variance
( = fi )
fi
Expérience
1. 37
9.72
7.09
V6
Contrôle
0.85
1. 33
1. 56
Expérience
1. 74
12.59
7.24
Hpt13
Contrôle
0.65
1.13
1. 73
Expérience
1. 61
10.79
6.70
Tyk6
Contrôle
1.15
2.2
1. 91
Expérience
7.97
117.5
22.58
DR2
Contrôle
1.5
2.75
1.83
23
TABLEAU
6
Pour chaque exp~riencè contrôle, les ~carts entre
R
les fr~quences (apparition des clones Dga ) cumul~es exp~-
rimentales et théoriques ont ~t~ calcul~s.
Ce tableau indique la valeur absolue de la d~via-
tion maximale (DMAX) pour chaque souche.
TABLEAU
7
Ce tableau montre les valeurs du paramètre
K
(K = DMAX x ~) calcul~es pour chaque expérience où la
taille
N
des échantillons est sup~rieure à trente (N > 30).
Les valeurs indiqu~es dans ces deux tableaux per-
mettent de déterminer les seuils dans le test de Kolmogo-
rov - Smirnov au moyen des tables 8 et 9.
24
TABLEAU 6
VALEURS DE LA DEVIATION MAXIMALE (DMAX) ENTRE
LES FREQUENCES CUMULEES EXPERIMENTALES ET
THEORIQUES POUR LES CONTROLES
Souches
DMAX
V6
0.1726
Hpt13
0.1780
Tyk6
0.2769
DR2
0.2769
TABLEAU 7
VALEURS DU PARAMETRE K (N > 30)
Souches
DMAX
K ( = D x
N)
V6
0.5177
3.063
Hpt13
0.5678
3.359
Tyk6
0.4392
2.635
DR2
0.4431
2.621
25
TABLEAU
8
Cette table est tirée de:
RAY MEDDIS
Statistical Handbook for Non-Statisticians, p.
63.
Elle permet de déterminer les seuils dans le test de
Kolmogorov -
Smirnov au moyen des valeurs de DMAX données
par la table 6.
*Taille de l'échantillon des expériences contrôles.
26
TABLEAU 8
VALEURS CRITIQUES DE D DANS LE TEST DE
KOLMOGOROX-SMIRNOV POUR UNE VARIABLE
Seuils
10%
5%
2%
0.2%
Taille de
l'échantillon
N
1
D>0.95
0.975
0.99
0.999
2
0.78
0.84
0.90
0.97
3
0.64
0.71
0.78
0.90
4
0.57
0.62
0.69
0.82
5
0.51
0.56
0.63
0.75
6
0.47
0.52
0.58
0.70
7
0.44
0.48
0.54
0.65
8
0.41
0.45
0.51
0.61
9
0.39
0.43
0.48
0.58
10
0.37
0.41
0.46
0.56
11
0.35
0.39
0.44
0.53
12
O. 34
0.38
0.42
0.51
13
0.33
0.36
0.40
0.49
14
O. 31
0.35
0.39
0.48
15
0.30
0.34
0.38
0.46
16
0.29
0.33
0.37
0.45
17
0.29
0.32
0.36
0.43
18
0.28
0.31
0.35
0.42
19
0.27
0.30
0.34
0.41
~', 2 0
0.26
0.29
0.33
0.40
21
0.26
0.29
0.32
0.39
22
0.25
0.28
0.31
0.38
23
0.25
0.27
0.31
0.38
24
0.24
0.27
0.30
0.37
25
0.24
0.26
0.30
0.36
26
0.23
0.26
0.29
0.35
27
0.23
0.25
0.28
0.34
28
0.22
0.25
o.28
0.34
29
0.22
0.24
0.27
0.33
30
0.22
0.24
0.27
0.33
27
TABLEAU
9
VALEURS CRITIQUES DE
K
DANS LE TEST
DE KOLMOGOROV -
SMIRNOV
Seuils
10%
5%
2%
0.2%
K
1.22
1.36
1.51
1.86
Cette table est tirée de:
RAY MEDPIS
Statistical Handbook for Non-Statisticians, p.
62.
Elle est utilisée dans le test de K -
S pour déter-
mlner les seuils quand la taille de l'échantillon est supé-
rieure à trente CN > 30).
Pour être significative,
la valeur de
K
doit être
supérieure aux valeurs de cette table.
Les valeurs du paramètre
K
pour les souches sont
données par la table 7.
28
TABLEAU
10
Les valeurs des taux de mutation indiquées dans ce
tableau ont été calculées par la méthode de F
(LURIA -
o
DELBRUCK, 1943).
Pour un échantillon de moyenne "m", la loi de Pois-
son s'écrit:
x
m
P
=
P
---:-nT
m(x)
x!e
-m
x = 0
P
= e
m = - LnP
0
0
A
A
P
=
m =
Ln-
0
B
B
m
= nombre moyen de mutations par disque
p m(x) = probabilité qu'il y ait x mutations par disque
m(x)
= probabilité qu'il y ait
x
mutations par
x
= nombre de clones par disque
.,
A
= nombre de disques avec zero clone
B
= nombre total de disques
La probabilité
dp
pour une cellule de muter pen-
dant un int€rvalle
de temps
dt:
s!E. = a
dt
dp = adt
29
t
= temps moyen de division d'une cellule divisée par Ln2
a = chance de mutation pour chaque cellule par unité de
temps.
Pour Nt cellules:
dp- = adt Nt
Le nombre moyen
dm
de mutation pendant un inter-
valle de temps dt:
dm = adt Nt
Nt
f
dm
f
= m = a(N
=
- N )
N
t
0
N0
Nt
= nombre de cellules au temps
t
N
= nombre de cellules au temps
t
= nombre de cellules au temps
= 0
=
0
m
a
=
= a x Ln2
(valeurs indiquées dans le tableau)
= taux de mutation par cellule par cycle de division.
30
TABLEAU 10
TAUX DE MUTATION POUR LES QUATRE SOUCHES
Souches
Taux de mutation
(par cellule et par cycle de division)
V6
1.1 ± o• 2 x 10- 5
10-
Hpt13
1.0 ± o• 2 x 10- 5
10-
Tyk6
1.5 ± O. 3 x 10- 5
10-
DR2
3.5 ± 0.3 x 10- 5
10-
31
Caractérisation des clones résistants obtenus durant les
tests de fluctuation
Pour chaque souche, quatre clones indépendants (Dl,
D2, D3, D4)
sont piqués au hasard et caractérisés.
a)
Test de la résistance au 2-déoxygalactose.
L'efficacité de clônage en présence de différentes con-
centrations de
Dga
a été mesurée pour les 16 clones.
Les résultats résumés dans le tableau Il montrent qu'ils
sont tous résistants au Dga.
b)
Effet cytotoxique du
Dga
sur les souches parentales
et les clones obtenus.
La figure 2 montre la morphologie de ces lignées cellu-
laires en présence du 2-déoxygalactose.
c)
Incorporation du
3H
dans le produit précipitable au
TCA (acide trichloroacétique) des souches parentales et
les clones obtenus; et leur activité galactokinase (E.C.
2.7.1.6).
Les 16 clones incorporent moins le
3H-D-galactose
et leur activité galactokinase est moindre que celle des
souches parentales correspondant.
(Les résultats sont in-
diqués dans les tableaux 12 et 13).
On s'aperçoit que l'ac-
tivité galactokinase dans ces clones résistants est parfois
32
considérable.
(Voir par exemple:
Hpt13 D3 et Tyk6 D2),
ce qui indiquerait que pour une cellule, la résistance au
2-déoxygalactose n'est pas nécessairement reliée au nlveau
de la galactokinase.
Les résultats de ces tests montrent
que les clones obtenus lors des tests de fluctuation sont
bien ceux que nous voulions étudier, étant donné qu'ils ont
l
.~ ~
(D
R
k)
l
~ .
A
.~ ~
(D
R
k)
l
~
A
l es memes proprletes
ga
et ~ ·que
es clones reS1S-
tants déjà isolés dans notre laboratoire (THIRION et al,
1976).
33
TABLEAU
Il
La sensibilité au 2-déoxygalactose, des souches pa-
R
rentales et des 16 clones Dga
isolés lors des tests de
fluctuation,
a été testée tel que décrit au chapitre "Ma-
tériel et Méthode".
La souche parentale V6 en présence du
2-déoxygalactose est semblable à la Hpt13 et n'est pas re-
présentée dans ce tableau.
34
TABLEAU 11
EFFICACITE DE CLONAGE DES SOUCHES PARENTALES ET DES CLONES
R
Dga
EN PRESENCE DE DIFFERENTES CONCENTRATIONS DE Dga
Efficacité de clonage
Souches parentales
Concentration
W"..
W"
de Dga (mM)
Clone Dga
Type
Hpt13
Tyk6
DR2
0
100
100
100
100
3
11
o. 5
71
88
6
6
o. 5
58
95
15
O. 5
o. 5
7
102
30
o. 5
o. 5
o. 5
99
..
h
Les va l eurs d' un seul c l one D
ga
R
sont .lnd'
.,
lquees d
h
Les va l eurs d' un seul c l one D
ga
R
sont .lnd'
.,
lquees
ans ce
R
tableau car tous les 16 clones Dga
isolés ont sensible-
ment aux erreurs d'expérience près la même résistance au
2-déoxygalactose.
35
TABLEAU
12
Pour chacun des quatre tests de fluctuation effec-
tués avec les souches:
V6, Hpt13, Tyk6 et DR2,
quatre clo-
R
nes Dga
ont été pris au hasard dans des disques différents
(clones indépendants) et testés pour l'incorporation du
3H
à partir du galactose, de l'hypoxanthine et de la thymidin~,
tel que décrit au chapitre "Matériel et Méthodes".
Dans
les conditions de cette expérience, l'incorporation du
3H_
galactose est de l'ordre de 8,000 CPM pour la V6, Hpt13 et
R
Tyk6, à 5,000 CPM pour la DR2.
Les clones Dga
(désignés
Dl, D2, D3, D4)
incorporent moins le
3H-galactose que les
souches parentales dont ils dérivent.
R
Les clones Dga
et les souches parentales correspon-
dant incorporent l'hypoxanthine et la thymidine de la même
façon.
La V6 (type sauvage) incorpore bien l'hypoxanthine
et la thymidine.
La Hpt13 et la DR2 (déficientes pour l'en-
zyme hypoxanthine phosphoriboxyl transferase) n'incorporent
pas l'hypoxanthine.
La Tyk6 (déficiente pour la thymidine
kinase) n'incorporent pas la thymidine.
36
TABLEAU 12
INCORPORATION DU 3H DANS LE PRODUIT PRECIPITABLE AU TCA
A PARTIR DE 3H-GALACTOSE,
3H-HYPOXANTHINE ET 3H-THYMIDINE
Souches
Galactose
Hypoxanthine
Thymidine
CPM
%
CPM
CPM
V6
(Parentale)
7774
100
149836
12467
V6 Dl
3626
47
139880
12460
V6 D2
1334
17
147800
12520
V6 D3
3092
40
149825
12470
V6 D4
2484
32
148970
12250
Hpt13 (Parenta le)
6852
100
1520
9994
Hpt13 Dl
3496
51
1512
12320
Hpt13 D2
2116
31
1527
10525
Hpt13 D3
3730
54
1518
11392
Hpt13 D4
1270
18
1514
10418
Tyk6
(Parentale)
5896
100
16380
267
Tyk6 Dl
3116
53
18332
262
Tyk6 D2
3482
59
16410
260
Tyk6 D3
1298
22
16335
265
Tyk6 D4
2566
43
16320
262
DR2 (Parentale)
4935
100
1104
10236
DR2 Dl
1198
24
1100
10420
DR2 D2
3512
71
1106
9987
DR2 D3
3100
63
1112
11200
DR2 D4
2132
43
1094
10310
37 .
TABLEAU
13
L'activité spécifique de la galactokinase (E.C.2.7.
1.6) a été mesurée pour les souches parentales et les 16
R
clones Dga
(indépendants), tel que décrit au chapitre "Ma-
tériel et Méthodes".
Dans les conditions de cette expérien-
ce, l'activité spécifique de la galactokinase (E.C.2.7.1.6)
est d'environ 5.1 ± 0.3 unités/mg pour la V6, Hpt13 et Tyk6
et 3.1 ± 0.2 unités/mg pour la DR2 (une unité = nmole de ga-
oC).
o
lactose-l-phosphate produit par minute à 37 C).
L'activité
R
des 16 clones Dga
est moindre que celle des souches paren-
tales correspondant.
38
TABLEAU 13
ACTIVITE SPECIFIQUE DE LA GALACTOKINASE (E.C.2.7.1.6)
DES SOUCHES PARENTALES ET DES CLONES RESISTANTS
Souches
Activité spécifique
- - - -
- - -
(en unités/mg)
%
V6 (Parentale)
5.4
100
V6 Dl
2.7
50
V6 D2
1. 93
36
V6 D3
2.76
51
V6 D4
2.74
51
Hpt13 (Parentale)
4.9
100
Hpt13 Dl
2.75
56
Hpt13 D2
2.098
43
Hpt13 D3
2.49
51
Hpt13 D4
2.1
43
Tyk6 (Parentale)
5. 2
100
Tyk6 Dl
2.57
49
Tyk6 D2
2.007
38
Tyk6 D3
1. 818
34
Tyk6 D4
2.21
42
DR2 (Parentale)
3.1
100
DR2 Dl
1. 658
53
DR2 D2
2.035
66
DR2 D3
2.009
64
DR2 D4
1. 77
57
39
FIGURE
2
EFFET CYTOTOXIQUE DU 2-DEOXYGALACTOSE SUR
S
P-R
R
LES DIFFERENTES SOUCHES
Dga, Dga
et Dga
Les clichés l, 3 et 5 montrent respectivement les
S
P-R
R
lignées cellulaires Dga
,Dga
et Dga.
Ces cellules (en-
viron 10
cellules) ont été ensemencées en MEM avec 8% de
FCS en l'absence de 2-déoxygalactose.
Les clichés 2, 4 et
6 montrent les mêmes souches dans l'ordre pré-cité.
Ces
cellules sont ensemencées dans les mêmes conditions sauf
que du 2-déoxygalactose a été ajouté au milieu 5 mg/ml de
S
P-R
Dga pour les souches Dga
et Dga
(clichés 2 et 4) et
R
8 mg/ml pour la souche Dga
(cliché 6) •
Les clichés ont
oC.
o
été pris 7-12 jours d'incubation à 37 C.
En présence de 5 mg/ml de Dga, toutes les cellules
S
P-R
Dga
sont mortes.
On observe pour les cellules Dga
quel-
ques cellules dont la morphologie témoigne de leur état par-
tiellement résistant à l'agent cytotoxique.
Par contre les
R
cellules Dga
poussent comme si elles étaient en milieu nor-
mal.
4U
Figure 2
41
FIGURE
3
LA VOIE METABOLIQUE DU GALACTOSE
(SUPPOSEE DANS LES CELLULES DE MAMMIFERE)
GALACTOSE
'-----ATP
ADP
GALACTOSE-1-PHOSPHATE
RIDINE DIPHOSPHO-
URIDINE DIPHOSPHO-
GLUCOSE
GALACTOSE-1-PHOSPHATE
URIDYL TRANSFERASE
GALACTOSE-4-EPIMERASE
NAD+
URIDINE DIPHOSPHO-
GALACTOSE
GLUCOSE-1-PHOSPHATE
PHOSPHOGLUCOMUTASE
GLUCOSE-6-PHOSPHATE
GLYCOGENE
42
CONCLUSION
Les expériences du test de fluctuation effectuées
avec les quatre souches de cellules somatiques de hamster
chinois:
V6, Hpt13, Tyk6 et la DR2 démontrent que le chan-
S)
S
gement de phénotype de sensible (Dga ) au 2-déoxygalactose
~ .
( R )
~ ...
~
t
reslstant
Dga
est un evenement survenant spontanement e
reslstant
Dga
est un evenement survenant spontanement
au hasard dans les cellules et n'est pas induit par l'agent
sélectif (2-déoxygalactose).
Les résultats du test de fluc-
tuation et les précédentes observations de THIRION et al,
(1976) à savoir:
que la fréquence des clones résistants
R)
R
(Dga ) augmente avec l'agent mutagène (EMS) et que le phéno-
R
type Dga
est reproductible après de nombreuses générations
en absence de l'agent sélectif, démontrent que la résistance
au 2-déoxygalactose résulte d'une vraie mutation.
Le carac-
R
tère Dga
constitue alors un marqueur convenable pour l'ana-
lyse génétique des cellules de hamster chinois.
Les phéno-
types de ce nouveau marqueur sont liés entre eux, mais ils
sont quelque peu différents l'un de l'autre.
Par exemple,
il n'y a pas de relation entre le degré de résistance au
2-déoxygalactose et l'activité galactokinase (E.C.2.7.1.6)
dans aucun mutant.
C'est un fait que tous les seize clones
résistants au 2-déoxygalactose analysés ont moins d'activi-
té galactokinase (E.C.2.7.l.6) que leurs lignées cellulai-
res parentales respectives.
Cependant on observe parmi ces
43
clones résistants une grande variation des degrés de l'acti-
vité galactokinase et de l'incorporation du
3H-D-galactose.
Et vice-versa des clones ayant les mêmes activités galacto-
kinase (E.C.2.7.1.6) peuvent être complètement ou partiel-
lement résistants au 2-déoxygalactose.
Par exemple les mu-
tants complètement résistants:
Hpt13 D3 et Tyk6 D2 et le
mutant partiellement résistant DR2 ont la même activité ga-
lactokinase (E.C.2.7.1.6).
Aussi THIRION et al,
(1976) ont-
ils isolé des mutants complètement résistants qui sont soit
GAL+ ou GAL- (qui peuvent pousser ou non en présence du ga-
lactose).
Ces observations suggèrent que le changement de
S)
S
R)
R
phénotype sensible (Dga ) au 2-déoxygalactose résistant (Dga )
peut survenir par différents types de mutation à différents
loci et par différents mécanismes (absence d'une enzyme, al-
tération de l'affinité enzyme-substrat ou une altération de
la perméabilité membranaire).
,
,
l
..
R
·1
En resume,
e caractere Dga
est un marqueur utl
En resume,
e caractere Dga
est un marqueur
e
pour étudier l'organisation génétique du génome de cellule
de mammifère pour le métabolisme du D-galactose.
Les taux
de mutation mesurés à partir des expériences du test de
fluctuation ne sont pas significativement différents pour
les souches V6, Hpt13 et Tyk6, leur moyenne est de 1.2 ±
0.2 x 10- 5
10-
par cellule par génération.
Pour la DR2 ce taux
est légèrement malS significativement élevé:
3.5 X 10- 5
10-
par
génération.
Il est intéressant de noter que les souches V6,
44
Hpt13 et Tyk6 ont le même taux de mutation, considérant le
fait que la Hpt13 et Tyk6 dérivent de la V6 par un traite-
ment mutagénique (Figure 1).
En effet ceci indique d'une
part, que l'addition de deux marqueurs non liés hpt et tyk
à la souche sauvage ne change pas ses propriétés vis-à-vis
R
d'un autre marqueur indépendant comme Dga
qui est probable-
ment synthénique avec tyk+
(McBRIDE et al, 1978), mais qui
+
ne l'est pas avec hpt
(ROSENSTRAUS et CHASIN, 1975), et sug-
gère d'autre part que la ploidie de ces trois souches (V6,
Hpt13, Tyk6) est la même pour les loci examinés.
Aussi avons-nous noté que le taux de mutation de
R
Dga
de la souche DR2 partiellement résistante est environ
trois fois celui des trois autres souches sensibles.
SAR-
GENT et JONES (1974) ont isolé des mutants partiellement et
complètement résistants au 2 ,6 diaminopurine, déficients
pour l'enzyme adenine phosphoribosyl transférase.
Ils ont
conclu que leur lignée cellulaire du type sauvage était ho-
.
.
(
+ /
+)
mozygote dlplolde
apt
apt
mozygote dlplolde
apt
alors que leur mutant par-
tiellement et complètement résistant seraient respectivement,
hétérozygote (apt+ /apt) et homozygote (apt/apt).
Si nous appliquons le même raisonnement à nos li-
·R
gnées cellulaires Dga , le taux de mutation pour la souche
DR2 serait approximativement la racine carrée des taux de
mutation des trois autres souches, V6, Hpt13 et Tyk6, ce que
45
nous n'avions pas observé.
Nous proposons une autre expli-
cation simple, la souche DR2 étant déjà affectée par une mu-
tation dans la voie métabolique du galactose (Figure 3), les
R
mutants Dga
peuvent en dériver par deux processus diffé-
rents:
soit par une mutation au site conférant la résis-
tance complète au 2-déoxygalactose, ou par une mutation con-
férant une résistance partielle au 2-déoxygalactose.'
La
combinaison de cette mutation avec celle pré-existante dans
la lignée cellulaire DR2 confèrerait une résistance complè-
te.
Ainsi le taux de mutation des mutants complètement ré-
sistants attendus à partir de la DR2 serait aiors légèrement
supérieur à celui des mutants obtenus à partir du type sau-
vage (V6, Hpt13, Tyk.6).
En général les études des mutations des cellules so-
matiques se font sur les cellules mutagénisées.
Un petit
nombre seulement de taux de mutation spontanée a été mesur~
chez les cellules de hamster chisois.
Ces taux de mutation
varient entre 10- 6
10-
et 10- 8
10-
par cellule et par génération
pour la résistance aux agents suivants:
8-azaguanine (1.5 x
10- 8
10- ; CHU et al, 1969), ouabaine (5 x 10- 8
10-
;
BAKER et al,
1974) et émetine (4.9 x 10- 7
10-
;
GUPTA et SIMINOVITCH 1976).
Pour la résistance à l'émetine, il y a quelques évidences
que le locus impliqué est présent une seule fois (hemizygo-
sité),
(GUPTA et al, 1978).
Les taux de mutation les plus
élevés pour les cellules de hamster chinois sont 4 x 10- 6
10-
et 1.3 x 10- 5
10- , obtenus respectivement par BrdUrd (CABOCHE,
46
1974) et 2,6 diaminopurine (CHASIN, 1974).
Dans ces deux
cas, les évidences montrent là aussi l'existence d'un seul
gène fonctionnel.
Le taux de mutation spontanée est 2.6 x
10- 4
10-
par cellule et par g~nération, pour la perte du trans-
port de la thymidine (BRESLOW et GOLDSBY, 1969).
Dans d'au-
tres systèmes, tel que le système qui étudie des cellules du
myelome de souris, productrices d'immunoglobuline, les taux
de mutation spontanée sont supérieurs à
2 x 10- 3
10-
par cellu-
le et par génération (BAUMAL et al, 1973).
En résumé les taux de mutation varient énormément
chez les cellules somatiques, ces variations ne réflètent
pas nécessairement les différences de ploidie entre les sou-
ches (des ta!lX de mutation variant de 10- 7
10-
à 10- 4
10-
pour cer-
tains loci fonctionnellement hémizygotes).
Elles sont plu-
tôt le reflet de propriétés intrinsèques à chaque locus.
R
Les valeurs trouvées pour le marqueur Dga
se si-
tuent parmi les plus élevés taux de mutation pour les li-
gnées cellulaires comparables.
Ce qui suggère que les dif-
férents loci à partir desquels une mutation conduit à la ré-
sistance au 2-déoxygalactose peuvent exister comme d'uniques
copies fonctionnelles dans la lignée cellulaire diploide,
R
V6.
De telle hémizygosité pour les loci Dga
est compati-
R)
R
ble avec le fait que tous les mutants résistants (Dga ) tes-
tés dans notre laboratoire se comportent d'une façon réces-
sive dans les cellules hybrides.
47
ANNEXE
LISTE DES ABBREVIATIONS
apt
adenine phosphoribosyl transferase
BrdUrd
5-bromodéoxyuridine
Dga
2-déoxygalactose
Dga P- R
DgaP-
partiellement résistant au 2-déoxygalactose
R
Dga
résistant au 2-déoxygalactose
S
Dga
sensible au 2-déoxygalactose
DNA
acide-déoxyribonucléique
EMS
sulfonate d'éthyl méthane
FCS
sérum de veau foetal
galk
galactokinase
hpt
hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase
MEM
milieu essentiel minimal (contient l mg/ml de glucose)
PBS
tampon phosphate salin
PB SM
tampon phosphate salin avec MgC1 2
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acide trichloroacétique
tyk
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V:V
volume par volume
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