FACULTE DE MEDECINE
. .
..c:\\.:
..»Ô,
THE5E
/.'
C ,1
' :
': t-/'
,-
THE5E
,-
\\
/
Présentée au Département de Microbiologie
de
L'UNIVERSITE
DE
SHERBROOKE
Pour l'obtention du grade de
PHILOSOPHAE
DOCTOR
(Ph. D.)
....
,
( MICROBIOLOGIE )
Par
1
1
"..--_0.
..
~
Corn/an
A.
de SOUZA
B.
sc. (Microbiologie). M. SC. (Microbiologie)
REGULATION DES GENES EUCARYOTIQ!lES:
ETUDES GENETIQ!lES DU METABOLISME DU GALACTOSE, DES GENES
galk et hpt DANS LES CELLULES SOMATIQ!lES
D'HAMSTER
CHINOIS
SHERBROOKE.
QUEBEC.
CANADA,
MAI
1982

1
,
1
J
1,
1
A la mémoire de ma très chère
regrettée grand'mère, Marguerite Séndé

SOMMAIRE
r
Nous décrîvons dans
une première partie de cette thèse, les
of
,
caractéristiques biochimique et génétique de cinq mutants de cellules
i
somatiques d'hamster chinois.
Nos résultats montrent que quatre de ces cinq mutants: A13G9,
34Al3G32, 2A13G14 et V6IG15 comparés aux cellules de type sauvage ont:
1) un faible taux respiratoire, 2) un cycle de Krebs altéré, 3) un taux
réduite de production de CO
à partir de substrats radiomarqués pyruvate-
2
14
14
14
14
l-C
,pyruvate-2-C
,B-hydroxybutyrate-3-C
,glutamate-5-C
et as-
partate.
Il n'ont pas une activité appréciable en NADH oxydase sensible
à la roténone et sont mutés au niveau du complexe 1 de la chaine d'oxy-
dation phosphorylative.
Par contre, le mutant P12GXl
a les mêmes pro-
priétés que les cellules de type sauvage.
.,<:~,~:l-:~I:-~~·-:/~..
.,<:~,~:l-:~I:-~~·-:/~
Les études de complémentation entre ces mUtants -GAt-et\\des
.
.,
.,
~
;'

l
,
, , ' ,
mutants représentant les sept groupes de compLêaent at t orrvde
complélIlentatlon~;4e Scheffler
"
..
indiquent que les souches A13G9, 34A13G32 et V6I~15 'définis~nt deux
nouveaux groupes de complémentation (VIII et IX), i~'ants A13G9 et
34A13G32 définissent un cistron; P12GXl ne complémente pas le mutant
CCL16-B9 du groupe IV et serait donc affecté au niveau du succinate dé-
shydrogenase.
Le mutant 2Al3G14 est de type chevauchant et ne complé-
mente pas les mutants des groupes Il, VI et V79-G20.
i i i

iv
Notre deuxième étude a porté sur dix mutants de cellules soma-
tiques d'hamster chinois résistants à 8 mg/ml de 2-déoxygalactose et
R,
R
dépourvus de toute activité galactokinasique (Dga , galk d'allèle nul).
L'analyse génétique et immunologique de ces mutants montre que l'allèle
R
S
Dga
est récessif par rapport à l'allèle Dga
de type sauvage, et que
les mutations galk définissent un seul cistron.
De plus, nos résultats
i
montrent l'existence des gènes de structure dans ces mutants dépourvus
t
R
1
R
d'activité.
En effet, tous les la mutants Dga
galk d'allèle nul testés
+
contiennent du matériel immunologique antigalk (ie sont CRM ) et sont
donc affectés dans le gène de structure de la galactokinase.
1
t
Nous avons ensuite montré que les réversions des cellules défi-
1
1
cientes pour l'enzyme hypoxanthine phosphoribosyltransférase (RPRT),
~,t
induite par l'adénovirus de type 2 résultent également des mutations
i
dans le gène de structure de l'RPRT et que ces mutations sont de même
type que celles induites par l'EMS.
De plus,
elles ne nécessitent pas
l'intégration stable de l'ADN d'ad2.

REMERCIEMENTS
Les travaux présentés dans cette thèse ont été effectués sous
la direction du professeur Jean-Paul Thirion.
Qu'il me soit permis
de l'assurer de ma reconnaissance.
Je remercie très particulièrement les docteurs: Brian TALBOT.
Indu B. MAITI et Majambu MBlKAY.
L'intérêt constant qu'ils ont porté
à mes recherches et leur participation m'ont permis d'atteindre les
objectifs de ce travail.
Je remercie les professeurs:
Joseph
Weber
• Mario Nemirovsky
et Yves Langelier qui ont bien voulu accepter de juger ce travail.
J'adresse mes remerciements:. aux membres du laboratoire du pro-
fesseur Joseph Weber pour leur collaboration, à mes collègues de labo-
ratoire. à tout le corps professoral et aux techniciens du département
de microbiologie.
Les mots ne s aur fona
saurlons exprimer ma gratitude et ma reconnaissance:
- à mes parents pour tous les sacrifices qu'ils ont consentis
pour assurer mon éducation.
- à mon oncle Laté AVLA J.B. LAWSON qui a guidé mes premiers
pas. ses conseils et son support matériel ont contribué à mon éducation.
v

vi
- à mon frère et à mes soeurs qui ont po r.t
por,té un intérêt parti-
ê
culier à mes études et partagé mes difficultés.
- à Pierrette F. HUDON qui par sa présence et ses conseils m'a
aidé à surmonter les stress relatifs à mes recherches.
Je remercie Mme Diane Laliberté pour le travail de dactylogra-
phie, et tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à l'élaboration
de ce travail.

TABLE DES MATIERES
Sommaire. • •
iH
- Remerciements
v
Table des matières.
vii
Liste des illustrations
xi
Liste des tableaux.
xiii
Introduction. • • •
1
CHAPITRE I: Matériel et méthodes.
9
- Cellules, milieux et conditions de culture.
10
- Isolement des cellules hybrides
11
- Caryotype
12
3R
3
3R
3
- Incorporation de galactose- R
hypoxanthine- R
t
hypoxanthine-
t
3R
3
thymidine- R dans le produit précipitable au TCA.
12
i
- Mesure de la production de CO •
2•
13
2
- Isolement des mitochondries . .
14
1
1
- Consommation d'oxygène par les cellules et mito-
chondries isolées • . .
14
- Mesure de l'activité de NADR oxydase, de succinate
oxydase et de alpha-glycerophosphate oxydase • • .
15
- Sélection de mutants galk d'allèle nul et totale-
ment résistants au 2-déoxygalactose . . •
15
- Test de la résistance au 2-déoxygalactose
16
- Préparation des extraits cellulaires et dosage
enzymatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
vii

viii
1
1
1
i
a - Préparation des extraits cellulaires.
16
b - Activité de la galactokinase dans les
1
les
extraits cellulaires • • • • • • •
17
r
c - Activité de l'hypoxanthine phosphoribosyl-
transférase
17
1
!
- Dosage de la quantité de protéine dans les extraits
!
cellulaires
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
- Préparation des anticorps antigalactokinase
1
,
,
d'hamster chinois et immuno-inhibition de l'acti-
1
vité galactokinasique dans les extraits cellu-
laires • • • • •
18
a - Préparation des anticorps
18
b - Immuno-inhibition de l'activité galacto-
kinasique
19
c - Dosage de matériel immunogénique (CRM) dans
les extraits cellulaires des mutants galk
d'allèle nul et résistants au 2-déoxygalactose.
20
CHAPITRE II: Caractérisation biochimique et génétique des
mutants de phénotype GAL-, et sensible au 2-déoxy-
galact ose • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • •
22
- Consommation d'oxygène par les cellules
23
- Etude de complémentation entre les mutants GAL
24
- Caractérisation biochimique des mutants GAL- ••
25
- Activité mitochondriale dans les cellules de type
sauvage et les mutants GAL
27

ix
- Les activités: succinate oxydase, ~-glycerophosphate
oxydase, et NADH oxydase dans les cellules du type
sauvage et les mutants •
28
CHAPITRE III: Etude génétique et immunologique des mutations
somatiques résistantes au 2-déoxygalactose
52
- Test de fluctuation • •
54
- Sélection de mutants galk d'allèle nul et totalement
résistants au 2-déoxygalactose • •
54
R
- Caractérisation des mutants Dga
galk d'allèle
nul. . .
. . .
55
R
- Récessivité du phénotype Dga
56
R
- Etude de complémentation entre les mutants Dga
d'allèle nul • • • • • •
57
R
- Caractérisation immunologique des mutants Dga
galk d'allèle nul • • • •
58
a - Immuno-inhibition de l'activité galactoki-
nasique • • • • • •
58
b - Dosage de matériel immunogénique (cross-
reacting material) dans les extraits cellu-
laires des mutants galk d'allèle nul et ré-
sistants au 2-déoxygalactose
59
CHAPITRE IV: Caractérisation immunologique des révertants des
cellules Hpt-13 déficientes pour l'hypoxanthine
phosphoribosyltransférase. Evidence pour des
+
mutations de structure au locus hpt
90

x
- Caractéristiques des révertants •
91
i
- Immunoprécipitation de l'activité de l'enzyme HPRT
dans les cellules des révertants
92
Discussion et conclusion. • • •
96
1
Annexe l
- Liste des abbréviations
104
r
Annexe II
105
!!r
Annexe III
106
Annexe IV
107
Bibliographie •
108
1
f!
1~
t
t
t!
i
1

LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1.
La voie métabolique de Leloir pour le catabolisme
du galactose. • •
8
Figure 2.
Phénotype typique d'un clone mutant GAL .
38
Figure 3.
40
Etude de complémentation des mutants GAL
Figure 4.
42
Figure S.
Le cycle tricarboxylique . • • • • . • •
44
Figure 6.
La chaine respiratoire des électrons et le site
d'action de différents inhibiteurs • . .
46
Figure 7.
Consommation d'oxygène par les mitochondries des
cellules de type sauvage et des mutants .
48
Figure 8.
Activités NADH oxydase, succinate oxydase et
a-glycerophosphate oxydase dans les mitochondries
ouvertes des cellules de type sauvage et des mu-
tants . • •
SO
Figure 9.
Le Pedigree des souches
80
Figure 10.
Distribution de l'activité galactokinasique des
clones résistants au 2-deoxygalactose . •
82
Figure 11.
Courbe d'inactivation en 2-deoxygalactose
84
Figure 12.
Effet cytotoxique du 2-deoxygalactose . •
86
Figure 13.
Courbe d'immuno-inhibition de l'activité galacto-
kinasique dans l'extrait des cellules de type
sauvage V6.
• .
.
.
.
.

.

88
Figure 14.
Courbe d'immuno-inhibition de l'activité de
l'enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase
xi

xii
dans l'extrait des cellules de type sauvage et
des révertants
. . . . . . . .
94

LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1.
Taux respiratoire des cellules de type sauvage
et des mutants GAL . • •
30
Tableau 2.
Etude de comp1émentation des mutants GAL
32
Tableau 3.
Activité du cycle de Krebs dans les cellules de
type sauvage et les mutants GAL-
34
Tableau 4.
Activités, succinate oxydase, a-g1ycerophosphate
oxydase et NADH oxydase dans les lignées ce11u-
1aires de type sauvage et mutants.
36
Tableau 5.
Efficacité de clonage relative des souches paren-
R
tales et des mutants Dga
ga1k d'allèle nul . •
63
Tableau 6.
Croissance des cellules en différents milieux.
65
Tableau 7.
Incorporation de tritium et activité spécifique
de la ga1actokinase dans les cellules de type
R
sauvage et les mutants Dga , ga1k d'allèle nul
67
Tableau 8.
Incorporation de tritium et activité spécifique
de la ga1actokinase dans les cellules hybrides
69
Tableau 9.
Phénotype et génotype des différentes lignées
cellulaires.
71
R
Tableau 10.
Etude de comp1émentation entre les mutants Dga ,
ga1k d'allèle nul . • • •
73
Tableau 11.
Détection de matériel immunogénique (cross-
reacting materia1; (CRM)) dans l'extrait ce11u-
xiii

xiv
R,
R
laire des mutants Dga , galk d'allèle nul.
75
nul.
Tableau 12.
Liste non-exhaustive de variants résistants aux
médicaments . • . • • • . . . . . . . . . .
77
.

INTRODUCTION
La régulation de l'expression des gènes dans les cellules soma-
1
tiques animales n'est pas encore aussi bien élucidée que celle des 'micro-
organismes.
L'étude du métabolisme des carbohydrates chez les bactéries
a permis de comprendre la régulation des opérons chez les prokaryotes
(JACOB et MONOD, 1961; AMES et al., 1972).
Par conséquent, nous avons
pensé qu'une approche similaire avec les cellules de mammifères en cul-
ture pouvait conduire à la compréhension de la différentiation cellu-
laire. Nous avons donc choisi d'étudier principalement le métabolisme
du galactose et de .l'hypoxanthine dans les cellules somatiques d'hamster
chinois comme modèle de régulation des gènes dans les cellules animales.
Le catabolisme du galactose se fait au moyen de trois enzymes (kinase,
transférase, épimérase) de la voie métabolique de Leloir (Leloir, 1951;
figure 1).
Une voie métabolique secondaire, allant du D-galactose au
y-galactonolactone a été également proposée mais non confirmée (CORN et
SEGAL, 1973; CUATRECASAS et SEGAL, 1966); cette réaction serait catalysée
par la galactose déshydrogénase (E.C. 1.1.1.48).
Une mauvaise utilisa-
tion du galactose dûe à des déficiences d'origine génétique de l'un ou
l'autre des enzymes de la voie de Leloir cause chez l'homme des maladies
héréditaires telles: la galactosémie et la cataracte juvénile (TEDESCO
et MELLMAN, 1971; GITZELMANN, 1967; GITZELMANN et STEINMANN, 1973). Des
cellules de mammifères, rares sont celles qui peuvent utiliser en culture
le galactose exogène comme seule source de carbone.
La lignée V6
d'hamster chinois est l'une d'entre elles.
Elle pousse aussi bien en

2
présence de galactose qu'en présence de glucose (THIRION et al., 1976).
Elle constitue de ce fait un matériel de choix pour l'étude de la régula-
tion des gènes impliqués dans le métabolisme du galactose parce qu'elle
offre la possibilité d'isoler des mutants affectés dans ce métabolisme.
Les mécanismes de la régulation du catabolisme du galactose sont
relativement bien connus chez Escherichia coli (E. coli) (ADYA et SHAPIRO,
1969) et Saccharomycès cerevisiae (S. cerevisioe) (DOUGLAS et HAWTHORNE,
1964). Les gènes de structure des trois enzymes impliqués dans le méta-
bolisme du galactose sont génétiquement liés.
Ces trois gènes codent
respectivement pour la galactokinase (EC. 2.7.1.6), la galactose-l-
phosphate uridyl transférase (EC. 2.7.7.12), et la UDP-galactose-4-épi-
merase (EC. 5.1.3.2). Chez~coli, ces gènes de structure forment un
opéron (ADHYA et SHAPIRO, 1969).
Plusieurs sites régulateurs
ont été
identifiés: des mutations constitutives cis-dominantes (de type OC) près
du gène galE (épimerase) dérépriment les trois enzymes; des mutations
polaires et suppressibles cis-dominantes à l'extrémité proximale du
gène galE diminuent le niveau des 3 enzymes; des mutations constitutives
S
(de type galR-), et des mutations de type galR
répriment l'induction
de ces enzymes par le D-galactose ou le D-fucose (PARKS et al., 1971).
Chez Saccharomyces cerevisiae, les trois gènes de structure gall, ga17
et gallO qui codent respectivement pour la kinase, la transférase et
l'épimerase sont localisés près du centromère du chromosome II (DOUGLAS
et HAWTHORNE, 1964). Deux loci régulateurs (galBO et ga14) non-liés ont
1
été identifiés. Le gène galBO code pour une protéine qui exerce un con-
!
trôle négatif sur le gène galBl, une région interne du gène ga14. Le
1
~
1

3
produit du gène ga14 contrale positivement l'expression des trois gènes
de
structure gall. ga17 et gallO (DOUGLAS et HAWTHORNE. 1966; BASSEL
et MORTIMER. 1971; NOGI et al •• 1977; MATSUMOTO et al •• 1978).
De tels mécanismes n'ont pas encore été mis en évidence chez
les cellules animales; mais des études ont montré que le galactose
n'induit pas l'augmentation de l'activité cellulaire des trois enzymes
(épimérase. transférase. kinase; CHACKO et al .• 1972; THIRION. 1972;
STERN et KROOTH. 1975 (a); 1975 (o)).
Des mutants de cellules somatiques d'hamster chinois spécifiques
pour le métabolisme du galactose ont donc été isolés dans notre labora-
toire pour étudier la régulation des gènes impliqués dans ce métabolisme
dans les cellules d'hamster chinois.
Thirion et al. (1976) ont isolé
des mutants incapables de pousser en milieu contenant du galactose
(phénotype GAL-) à partir de cellules d'hamster chinois mutagénisées.
en utilisant le 5'bromodéoxyuridine (BrdUrd). la lumière et du milieu
contenant du galactose. Des mutants de phénotypes GAL- ont également été
isolés dans deux autres laboratoires.
Chu et ses collaborateurs ont isolés ces mutants à partir des
cellules V79 d'hamster chinois par la m@me méthode que Thirion et al.
(1976) sauf que leur milieu de sélection contenait du pyruvate. Ils
ont observé que leurs mutants ne poussent pas en milieu contenant du
galactose. fructose. mannose et galactose-l-phosphate; de plus ces mu-
tants exhibent une réduction des activités galactose-l-P-uridyltransférase.

4
(CHU et al., 197Z), NADP-isocitrate déshydrogénase et phosphoglucomutase
(SUN et al., 1975), comparées aux cellules du type sauvage.
Des mutants auxotrophes soit pour le CO /HC0
ou pour l'aspara-
Z/HC0
Z
3
gine ont été isolés dans le laboratoire de Scheffler (DeFRANCESCO et al.,
1976; SCHEFFLER, I.E., 1974).
La caractérisation de ces mutants a montré
qu'ils ont un phénotype GAL- et sont déficients pour les enzymes impli-
qués dans la chaine respiratoire des électrons (succinate déshydrogénase,
métabolisme d'énergie, NADH-Coenzy Q réductase). Les tests de complémen-
tation entre ces mutants montrent qu'ils définissent sept groupes de
complémentation.
Un des mutants de Chu complémente tous les mutants des
sept groupes de comp lémentat ion , ce qui suggèrerait
que les deux mé-
thodes de sélection pourraient conduire
à des mutations, à des loci
différents avec des défectuosités biochimiques différentes.
Dans une première partie de notre travail, nous avons donc étu-
dié en détail cinq des mutants GAL- isolés dans notre laboratoire. Leurs
caractérisations biochimiques et génétiques ont montré qu'ils ont 1) un
faible taux respiratoire, Z) une activité du cycle de Krebs réduite,
3) une dépendance absolue en glucose pour soutenir un taux élevé de la
glycolyse, 4) la consommation d'oxygène de leurs mitochondries est fai-
blement stimulée par le malate.
Ils sont affectés dans la chaine res-
piratoire des électrons, du NADH au coenzyme Q.
Leurs mitochondries
n'ont pas une activité appréciable en NADH oxidase sensible à la roténone.
Nos mutants ont été comparés à sept autres de Scheffler représentant
sept groupes de complémentation.
Trois d'entre eux complémentent ces

5
sept mutants et définissent deux nouveaux groupes de complémentation
(VIII et IX), deux sont dans le m@me groupe de complémentation et le
cinquième ne complémente pas CCL16-B9, un mutant de Scheffler défectif
pour la succinate déshydrogénase.
Nous avons également montré que le
phénotype GAL- de ces mutants résulte d'une défectuosité dans le coenzyme
Q de la chaine respiratoire et non dans la voie métabolique de Leloir.
Ces mutants sont très importants pour les études
de génétique des
cellules somatiques et en particulier pour l'étude de fonctions mito-
chondriales.
Thirion et al., (1976) ont isolé par une autre méthode des mu-
tants de cellules somatiques d'hamster chinois résistants au 2-déoxyga-
lactose et défectifs pour la galactokinase (EC. 2.7.6) un enzyme de la
voie métabolique de Leloir.
Parmi ces mutants certains sont totalement
résistants au 2-déoxygalactose et dépourvus de toute activité galacto-
kinasique (mutants d'allèle nul); les autres mutants ont des propriétés cinétiques
galactokinasiques différentes de celles des cellules du type sauvage. Ces ré-
sultats suggèrent que la résistance au 2-déoxygalactose résulterait
soit de l'absence de synthèse de la galactokinase, soit de mutations
dans le(s) gène(s) de structure de la galactokinase. Afin de vérifier
ces hypothèses et d'étudier la régulation et la structure des gènes de
la galactokinase nous avons développé une nouvelle méthode pour sélec-
R
tionner des mutants Dga ,galK
d'allèle nul avec une plus grande fré-
quence.
Ces mutants ont été analysés pour la récessivité, la complémen-
tation et la présence de matériel immunologique ("cross-reacting mate-
+
rial". CRM).
Des mutants de structure CRM
(voir tableau 12) et de

6
régulation CRM
ont déjà été isolés pour la résistance à la 8-azaguanine
(BEAUDET et al., 1973; WAHL et al., 1975; FENWICK et CASKEY, 1975;
FENWICK et al., 1977).
Ces auteurs ont émis l'hypothèse que le phé-
notype CRM- avait une origine épigénétique (HARRIS, 1971; MEZGER-FREED,
1972; SIMINOVITCH, 1976).
En ce qui concerne la résistance au 2-déoxy-
galactose et la déficience en galactokinase, nous avons démontré qu'elles
résultent de changements génétiques (CLAVERIE et al., 1979) plutôt que
R
d'évènements induits par l'agent sélectif.
Les mutants Dga
galk
d'allèle nul sont donc très importants pour étudier les mécanismes de
tels changements phénotypiques.
Nous décrivons dans
la deuxième partie
de cette thèse, leurs caractéristiques génétiques et immunologiques.
L'analyse des hybrides entre ces mutants et des cellules de type sauvage
montre que l'allèle mutant DgaR
Dga
est récessif par rapport à l'allèle
S
sauvage Dga
Les tests de complémentation entre les mutants étudiés
montrent que ces derniers définissent un seul groupe de complémentation.
+
De plus, ces mutants sont CRM
c'est-à-dire contiennent du matériel
immunoprécipitable par les anticorps antigalactokinase d'hamster chinois.
Ils proviendraient donc de mutations dans le gène de structure de la
galactokinase.
Dans cet effort global pour comprendre la régulation
des gènes dans les cellules d'hamster chinois, nous avons aussi étudié
le locus Hprt (hypoxanthine phosphoribosyltransférase). McCann et al.
(1975) ont montré que les virus transformants agissent également comme
mutagène.
D'autres chercheurs ont observé que l'infection des cellules
d'hamster chinois par le virus SV40 (Simian Virus 40) augmente la fré-
quence de la résistance aux drogues (GOLDBERG et DEFENDI, 1979; MARSHAK
et al., 1975;
STRAUSS et al., 1978; THElLE et al., 1976) ou de la

7
réversion de l'auxotrophie pour la glutamine à la prototrophie (VARSHAVER
et al., 1977).
Le virus SV40 et les adénovirus induisent des mutations
dans les cellules non permissives
(BELLETT et al., 1979; MARENGO et al.,
1981; MARSHAK et al., 1975; THElLE et al., 1976).
Bien que ces muta-
tions aient été détectées à différents loci, leur nature n'est pas encore
bien connue. Marengo et àl. (1981) ont montré que l'adénovirus de type
2 (ad2) augmente le taux de rp.version des cellules déficientes pour
l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase
(RPRT). Ils ont identifié deux
classes de révertants par la mobilité électrophorétique de l'enzyme
RPRT: une classe comigre avec l'RPRT de type sauvage et l'autre migre
plus vite.
Nous avons donc analysé ces deux classes de révertants afin
de déterminer la nature des reversions induites par l'adénovirus type 2
au locus RPRT.
Nos études immunologiques montrent que les phénotypes
révertants des cellules Rpt-13, spontanés ou induits soit par les par-
ticules incomplètes d'adénovirus type 2, soit par le sulfonate d'éthyl
méthane (EMS), résultent des mutations dans le gène de structure de
l'enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transférase.
Les résultats présentés dans cette thèse font l'objet de publi-
cations (voir annexe II, III, IV).

8
Figure 1
La voie métabolique de Leloir
pour le catabolisme du galactose
Galactokinàse
GALACTOSE +ATP
Galactose-l-Phosphate
+
ADP
2.
GALACTOSE-l-P0
Galactose-l-P0
4
Glucose-I-P0
+
4
4
4
+
,...

+
UDP-Glucose
UDP-Galactose
uridyltransférase
UDP-galactose-4-épimerase
3.
UDP-Galactose

UDP-glucose.

CHAPITRE l
Matériel et Méthodes

MATERIEL ET METHODES
Cellules, milieux et conditions de culture
Les cellules somatiques de hamster chinois V79 (FORD et
YERGANIAN, 1958) ont été clonées trois fois successives; V6, un de
ces clones, a été utilisé.
Les mutants indépendants: A13G9, 34A13G3Z,
ZA13G14, V6IG15 et PlZGXl ont été isolés à partir de V6 (THIRION et
al., 1976),
ils ne poussent pas en milieu contenant du galactose au
lieu du glucose (phénotype GAL-).
Le pédigree des autres lignées
cellulaires est décrit à la figure 9.
Les cellules ont été ensemencées
dans des boites de pétri ou des bouteilles, en milieu minimal (~) ou
en milieu de Dulbecco (DMEM) avec 8% de serum de veau foetal (FCS) sans
antibiotique.
La culture des cellules a été faite dans des incubateurs
oC.
o
air-COZ à 37 C.
Le milieu DMEM sans glucose ou galactose, sanS inositol,
sans praline, a été préparé selon la méthode décrite par Smith et al.
(1960).
Les mutants G8, G14, GZO, BIO, B9, G7, Gll, GZ9 déficients pour
les enzymes impliqués dans la chaine respiratoire des électrons ont été
obtenus du laboratoire de Scheffler (Université de Californie, San
Diego).
Ils ont été ensemencés dans du milieu DMEM avec 0.34 mM d'as-
paragine, 1 mM de pyruvate et 44 mM de sodium bicarbonate sans antibio-
tiques.
Le sérum de veau foetal dialysé (DFCS) a été dialysé à 4°C
(un volume de sérum de veau foetal contre trente (30) volumes de tampon

11
phosphate salin (PBS, pH 7.2) (DULBECCO et VOGT, 1954), le tampon a été
changé toutes les 8 heures, pendant 32 heures).
Isolement des cellulès hybrides
La fusion cellulaire a été faite selon la méthode décrite par
6
Pontecorvo, G. (1975), Davidson et Gerald (1976).
2X10
cellules environ
de chaque lignée cellulaire ont été mélangées à 105 cellules de l'autre
souche et ensemençées dans un disque de 10 cm de diamètre en milieu MEM
o
avec 8% FCS.
Après deux jours d'incubation à 37 C, les cellules semi-
confluentes ont été lavées deux fois avec du PBS.
2 ml d'une solution
50% (Poids/volume) de polyéthylène glycol 1000 (PEG) dans du milieu
DMEM sans sucre et sans serum ont été ajoutés aux cellules.
Après 60
secondes, la solution de PEG a été retirée; les cellules ont été lavées
trois fois avec du PBS et inc'lbées 48 heures dans du DMEM avec 8% FCS
oC.
o
à 37 C.
Elles ont été ensuite trypsinisées et ensemencées dans 10 ml
de milieu de sélection.
Le milieu HAT (5.5 ~M de améthoptérine, 0.016
mM de thymidine et 0.1 mM de hypoxanthine; SZYBALSKI, SZYBALSKA et
RAGNI, 1962) ou le milieu DMEM avec 25 mM de galactose au lieu du glu-
cose , 10% DFCS, a été utilisé comme milieu de sélection.
Après trois
0C
0
jours d'incubation à 37 C le milieu de sélection a été retiré;
les
o
cellules ont été lavées et incuDPes de nouveau à 37 C avec 10 ml de
5
milieu de sélection frais.
Dans l'expérience contrôle, 2X10
cellules
environ de chaque lignée cellulaire ont été fusionnées dans les mêmes
conditions sélectives.
8 à la jours plus tard les disques ont été colorés
avec 10% de bleu de méthylène dans 70% d'isopropanol (STANLEY, CALLIBOT

12
et SIMINOVITCH, 1975) et les clones hybrides comptés; leur fréquence
3
d'apparition est d'environ 10-
Les clones hybrides ont été isolés
et caractérisés par leurs caryotypes, leur capacité de pousser en
3H,
3
milieu sélectif et par leur habileté à incorporer l'hypoxanthine- H,
3H
3
3H.
3
la thymidine- H et le galactose- H.
Détermination du nombre de chromosomes (caryotype)
6
2Xl0
cellules environ en phase logarithmique ont été exposées
oC.
o
à 0.05 ~g/ml de colchicine pendant 2 heures à 37 C.
Les cellules ont
été trypsinisées, centrifugées et resuspendues dans une solution 0.5%
KCl (milieu hypotonique) pendant 10 minutes. Elles ont été ensuite
lavées trois fois dans une solution méthanol-acide acétique, 3:1 (v:v),
puis fixées sur des lames de microscope mouillées à OOC.
3R,
3
3R,
3
3R
3
Incorporation de galactose- R, hypoxanthine-
ypoxanthine- R, thymidine- R dans les
produits précipitables au TCA (acide trichloroacétique)
5
2Xl0
cellules environ ont été ensemencées dans un disque de
3.5 cm de diamètre en milieu MEM avec 8% FCS et soit 5 ~l de galactose-
3H
3
3H
3
(0.01 mM, 0.5 mCi) ou de la thymidine- H (6.7 mM, 0.2 mCi) ou de
3
-6
0
l'hypoxanthine- H (10
M, 0.02 mCi) et incubées à 37 C pendant 48
heures. Le milieu radioactif a été retiré et les cellules semi-confluen-
tes ont été lavées deux fois avec du PBS (pH 7.2).
Les cellules ont
été ensuite trypsinisées, récoltées dans 0.5 ml de PBS et mises dans
un tube.
5 ~l
d'une solution de NaOH (SN) ont été ajoutés pour

13
lyser les cellules; les macromolécules ont été ensuite précipitées avec
5 ml de TCA (acide trichloroacétique) à 10% à DoC.
Ce précipité a été
recueilli sur filtre de fibre de verre WHATMAN (grade GF/A) de 2.4 cm
de diamètre.
Les filtres ont été lavés avec du TCA 5% puis avec 95%
d'éthanol.
Ils ont été ensuite séchés sous une lampe infra-rouge. La
radioactivité est mesurée dans un compteur à scintillation.
Mesure de la produètion de COZ
La production de CO
radioactif a été mesurée selon la méthode
2
6
décrite par Scheffler (1974).
2Xl0
cellules environ ont été ensemencées
dans un erlenmeyer de 25 ml, 3 ml de milieu DMEM et 8% FCS, incubées
0C
0
à 37 C pendant 24 heures.
Le milieu a été retiré et les cellules lavées
trois fois avec du tampon TD (25 mM de Tris-HCl, pH 7.4, 0.14 M de NaCl,
5 mM de KCl, 0.7 mM de Na HP0 ); puis 2 ml de tampon TD avec un substrat
2HP0
2
4);
4
radioactif (0.1 uCi) spécifique ont été ajoutés. L'erlenmeyer a été
hermétiquement fermé avec un bouchon muni d'un petit puits en plastique.
Après 2 heures d'incubation à 370C,
370 C, 0.5 ml de TCA 50% ont été ajoutés
pour lyser les cellules, et 0.2 ml d'une solution de NaOH (0.2 M) ont
été mis dans le puits en plastique.
L'erlenmeyer a été incubé à la tem-
0C)
0
pérature de la pièce (20 C) pendant 1 heure (période de la fixation du
CO
radioactif par la solution de NaOH).
La solution de NaOH a été
2
transférée dans une fiole à scintillation avec 10 ml de liquide à scin-
tillation au Triton X-lOO pour échantillon aqueux
(IHLER et al., 1969)
et la radioactivité a été mesurée dans un compteur à scintillation.

14
Isolement des mitochondries
8
l-3X10
cellules environ en phase logarithmi~ue ont été homo-
généisées à OOC dans 3 ml de sucrose (0.25 M) EDTA ~2 mM) et Tris-HCl
(50 mM, pH 7.4).
L'homogénat a été centrifugé à 500xg pendant 7 minutes
et le surnageant recueilli.
Le culot a été resuspendu dans 3 ml du même
tampon et la procédure répétée deux fois (DeFRANCESCO et al., 1976).
Les surnageants ont été ensuite mélangés et centrifugés à 15000 xg pen-
dant 15 minutes pour précipiter les mitochondries.
Consommation d'oxygène par les cellules et les mitochondries isolées
La quantité d'oxygène consommée par les cellules a été mesurée
selon la méthode décrite par DeFrancesco et al (1975).
L'électrode à
oxygène (Clark) munie d'un enregistreur automatique (YSI oxygen monitor,
model 53) a été utilisée à cet effet.
Les cellules ont été trypsinisées,
lavées avec du tampon TD et suspendues dans 2 ml de tampon TD et la sus-
pension placée dans la chambre (GILSON) de l'électrode.
La suspension
cellulaire a été constamment agitée au moyen d'un barreau magnétique.
oC.
o
Le taux de consommation d'oxygène par les cellules a été mesuré à 37 C.
La concentration en oxygène du tampon TD a été de 210 ~M environ.
La consommation d'oxygène par les mitochondries a été mesurée
0C
0
à 37 C au moyen d'une électrode à oxygène (Clark) dans 2 ml de sucrose
(0.25 M) EDTA (0.2 mm), MgC1
(1.0 ~r), KCl (10 mM), tampon K HP0
2
2HP0
2
4
(10 mM, pH 7.3), selon la méthode décrite par DeFrancesco et al., (1976).

15
Les substrats ont été ajoutés les uns après les autres jusqu'à une con-
centration finale de 2.5-5 mM.
Mesure de l'activité de NADH oxydase, de succinate oxydase et de alpha-
glycérophosphate oxydase
NADH oxydase, succinate oxydase, et alpha-glycérophosphate
oxydase ont été mesurés par "polarographie" selon la méthode décrite par
Ihler et Rupp (1969).
Les mitochondries ont été congelées et déconge-
lées très rapidement trois fois successives pour les rendre perméables
0C
0
au NADH.
La consommation d'oxygène a été mesurée à 30 C pendant les
45 minutes qui ont suivi la préparation des mitochondries.
Sélection de mutants galk d'allèle nul et totalement résistants au 2-
déoxygalactose
Les mutants totalement résistants au 2-déoxygalactose ont été
isolés de la façon suivante:
6
5XlO
cellules ont été mutagénisées
pendant 4 heures dans 10 ml
de milieu MEM, 8% FCS avec 10 ~l de sulfonate d'éthyl méthane (EMS)
(FREEZE,197l; McCANN et al., 1975).
Les cellules survivantes (20%
environ) ont été lavées 4 fois avec du PBS et t ryps In Lsêes ,
try?sinisées. Elles ont été
ensuite ensemencées dans du milieu MEM et 8% FCS et incubées pendant
0C
0
48 heures à 37 C pour permettre l'expression des mutations.
Ces cellu-
les ont été ensuite
réensemencées à la densité de 105 cellules par

16
disque de 10 cm de diamètre en milieu M!11, 8% FCS et 4 mg/ml de 2-déo-
oC,
o
xygalactose.
Après troîs jours d'incubation à 37 C, les cellules ont
été à nouveau trypsinisées et ensemencées dans un disque de 10 cm de
0C
0
diamètre en présence de 5 mg/ml de 2-déoxygalactose et incubées à 37 C
pendant 3 jours.
Les cellules ont été une fois de plus trypsinisées
0C
0
et incubées à 37 C en présence de 8 mg/ml de 2-déoxygalactose. 14 à 21
jours plus tard les clones ont été isolés et testés pour la résistance
au 2-déoxygalactose, et leur déficience en activité galactokinase.
Test de la résistance au 2-déoxygalactose
La sensibilité au 2-déoxygalactose des cellules a été testée
selon la méthode décrite par Thirion et al. (1976). 250 cellules environ
ont été ensemencées dans des disques de 6 cm de diamètre en présence
de 4 ml de milieu minimal (MEM) avec 8% FCS et différentes concentra-
tions de 2-déoxygalactose (3 mM, 6 mM, 15 mM et 30 mM).
Après 10-16
0C
0
jours d'incubation à 37 C les colonies ont i!!té fixées
avec un mélange de
méthanol et d'acide acétique (3:1, v:v), colorés au bleu de méthylène
(1% de bleu de méthylène dans 70% d'isopropanol) et comptés.
Préparation des extraits cellulaires et dosage enzymatique
A - Préparation des extraits cellulaires
6
7
5XlO -10
cellules environ en phase logarithmique ont été lavées
avec du PBS, centrifugées et resuspendues dans 1 ml de tampon d'extrac-
i

17
tion (Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, MgC1
10 mM, KCl 30 mM, 0.5% Triton X-lOO,
2
o
dithiothréitol 1 mM).
Après une incubation de 15 minutes à 4 C, la
suspension cellulaire a été centrifugée à 95000 xg pendant 90 minutes.
Le surnageant (extrait cellulaire) a été recueilli dans un tube.
B - Activité de la galactokinase dans les extraits cellulaires
50 ~l de l'extrait cellulaire (10 à 150 ~g de protéine) ont été
o
14
incubés à 37 C avec 5 ~l de galactose-C
(0.1 ~Ci) 25 ~l de galactose
4
4XlO-
M, 20 ~l d'ATP 0.02 M (pH 7.0). Des aliquots pris à différents
intervalles de temps (0-60 minutes) ont été analysés par électrophorèse
sur papier WHATMAN 3MM pendant 20 minutes à 50 volts/cm dans une solu-
tion acétique 5% (acide-eau) dont le pH a été aj usté à 3.5 avec de 1 'hy-
14
droxyde d'ammonium.
Le galactose-C
reste à l'origine et le galactose-
14_l_P
14
C
_l_P migre entre deux colorants, le xylène cyanol bleu FF et l'orange
G. Les zones radioactives ont été localisées, découpées et comptées dans
un compteur à scintillation.
C - Activité de l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase (~PRT)
50 mM de Tris-HCl (pH 7.3), 0.6 mM de phosphoribosylpyrophosphate
(PRPP), 5 mM de MgC12, 5 mM de MgK -EDTA, 1 mM de dithiothreitol, 1 ~Ci
2-EDTA,
2
3
de l'hypoxanthine- H (2.9 Ci/mmol) par ml, 60 ~M d'hypoxanthine ont été
mélangés à 15% (v/v) d'extrait cellulaire (10 à 50 ~g de protéine) et
oC.
o
incubés à 37 C.
Les aliquots pris à différents intervalles de temps
(0-60 minutes) ont été analysés par électrophorèse sur papier Whatman

18
3MM dans la m@me solution décrite pour la galactokinase.
L'hypoxanthine-
3H
3
3H)
3
3H
3
reste à l'origine et l'inosine-5'-monophosphate- H (IMP_ H) migre
entre deux colorants,
le xylène cyanol bleu FF et la fuchsine acide
rouge.
Les zones radioactives ont été localisées, découpées et comptées
dans un compteur à scintillation.
Dosage de la quantité de protéines dans les extraits cellulaires
La quantité de protéines dans les extraits cellulaires a été
mesurée en utilisant le réactif Bio-Rad (Technical bulletin 1050). Le
réactif Bio-Rad dilué 1:4 (v:v) avec l'eau bidistillée a été filtré sur
papier Whatman no. 1.
De 1 à 100 ~l de l'extrait cellulaire (20 ~g à
140 ~g de protéine) ont été mélangés à 5 ml du réactif dilué et incubés
oC)
o
à la température de la pièce (20 C) pendant 5 minutes.
La densité opti-
que a été lue à 595 nm dans un spectrophotomètre. et comparée il celle
d'une protéine standard (albumine de sérum bovin) de concentration connue.
Préparation des anticorps antigalactokinase d'hamster chinois et immuno-
inhibition de l'activité galactokinasigue dans les extraits cellulaires
A - Préparation des anticorps
La protéine galactokinase a été purifiée par Talbot et Thirion
(1982).
Après la purification finale par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide au sodium de dodécylsulfate (gel-SDS) (LAEMMLI, 1970).

19
La partie du gel contenant une seule bande de protéine ayant une activité
galactokinasique a été homogénéisée dans 1 ml de PBS et la suspension
a été injectée à un lapin à différents endroits de son dos pendant
quatre semaines à raison de 150 ~g de galactokinase par semaine
(WEINTRAUB et RAYMOND, 1963).
Le lapin a été saigné la cinquième
semaine, le sang a été centrifugé et le sérum recueilli.
10 ml de ce
sérum ont été dialysés contre un litre de PBS (pH 7.2).
Le PBS a été
remplacé ensuite toutes les 8 heures pendant 24 heures. Le sérum a été
testé pour l'activité antigalactokinasique.
B - Immuno-inhibition de l'activité galactokinasique
L'inhibition de l'activité enzymatique de la galactokinase par
le sérum de lapin anti-galactokinase d'hamster chinois a été mesurée
par titration d'une quantité constante de la galactokinase des cellules
de type sauvage V6, contre différentes concentrations de sérum.
400 ~g environ de protéines d'extraits cellulaires de V6 ont
été mélangés à 50 ~l, 100 ~l et 150 ~l de sérum de lapin anti-galacto-
kinase de foie d'hamster chinois dans un volume total de 250 ~l.
Les
tubes ont été incubés pendant 30 minutes à la température de la pièce
oC)
o
oC.
o
(20 C) et ensuite pendant 16 heures à 4 C.
50 ~l de sérum de chèvre
anti IgG de lapin dilué 1:10 ont été ajoutés aux tubes pour précipiter
le complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) et l'excès d'anticorps. Les
0C
0
tubes ont été ensuite incubés 4 heures à 4 C et centrifugés à 13000 xg
oC.
o
pendant 15 minutes à 4 C.
L'activité galactokinasique dans les surna-

20
geants a été mesurée selon la méthode décrite précédemment.
L'activité
de l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase a été également mesurée
dans ces mêmes surnageants comme contrôle négatif, l'activité enzyma-
tique initiale dans les extraits cellulaires de V6 a été mesurée dans
les tubes "contrôles" dans lesquels le sérum immun est remplacé par du
sérum normal de lapin.
Dosage de matériel immunogénique ("cross reacting material" (CRM»
dans
les extraits cellulaires des mutants galk d'allèle nul et résistants
au 2-déoxygalàctose
Le dosage de CRM a été fait selon la méthode déjà décrite par
Strauss et al. (1978) pour l'enzyme RPRT, avec quelques modifications:
100 ~l des extraits cellulaires (400-500 ~g de protéine) des
cellules mutantes ont été mélangés à 150 ~l de sérum de lapin anti-
galactokinase de hamster chinois, (cette quantité d'anticorps précipite
90-95% de l'activité galactokinasique) et les tubes incubés pendant 30
oC)
o
minutes à la température de la pièce (20 C) puis pendant 16 heures à
100 ~l des extraits cellulaires (400-500 ~g de protéine) des
cellules du type sauvage V6 ont été ajoutés et les tubes incubés pen-
0C
0
oC.
o
dant 30 minutes à 20 C et pendant 16 heures à 4 C.
50 ~l de sérum de
chèvre anti IgG de lapin (Miles Yeda) ont été ajoutés, et les tubes
incubés pendant 4 heures à 4°C. Ils ont été ensuite centrifugés à 13000

21
xg pendant 15 minutes.
L'activité ga1actokinasique dans les surnageants
a été mesurée.
Les tuées contr61es ont été traités d'une façon simi-
1
]aire sauf que le sérum normal a été utilisé à la place du sérum immun.
100% d'activité CRM des cellules du type sauvage V6 a été
mesurée dans un tuée "contra1e" contenant 400-500 ).Jg de protéine des
extraits de V6 mélangés avec 150 ).J1 de sérum de lapin anti-ga1actokinase
d'hamster chinois et traité par la procédure décrite pour la titration.
!l
1
1

CHAPITRE rr
n
Caractérisation biochimique et génétique
des mutants de phénotype GAL- et sensible au 2-déoxygalactose

RESULTATS
Scheffler et ses collaborateurs (DeFRANCESCO et al., 1976;
SCHEFFLER, 1974; SODERBERG et al., 1977; DITTA, 1977; SODERBERG et al.,
1979), ont isolé des mutants auxotrophes soit pour le CO /HC0
soit pour
2/HC0
2
3
l'asparagine. Ces mutants ont un phénotype GAL-, une activité du cycle de
Krebs réduite. Ils sont déficients pour les enzymes impliqués dans la
chaine respiratoire des électrons et définissent sept groupes de complé-
mentation.
Par conséquent, puisque ces mutants étaient GAL-, il était
possible que nos mutants (THIRION et al., 1976) puissent être eux aussi
affectés dans le cycle de Krebs.
Nous avons donc entrepris de le véri-
fier. Cinq mutants GAL- indépendants, A13G9, 34A13G32, 2A13G14, V6IG15,
et P12GXl ont été analysés biochimiquement et génétiquement.
Ce travail a été fait en collaboration avec Indu B. Maiti.
Consommation d'oxygène par les cellules
La quantité d'oxygène consommée par les cellules sauvages et
mutantes a été mesurée par la méthode décrite à la section Matériel
et Méthodes. Le tableau 1 montre les taux respiratoires des cellules
des cinq mutants GAL- comparés à ceux des cellules de type sauvage V6 et
de deux mutants de Scheffler V79-G8 et CCL16-B9, affectés dans la
chaine respiratoire des électrons. Les mutants A13G9, 34A13G32, 2A13G14
et V6IG15 ont seulement de Il à 25% du taux respiratoire des cellules

24
de type sauvage, tandis que les deux mutants P12GX1, CCL16-B9 et les
cellules de type sauvage ont presque le même taux.
La consommation
d'oxygène dans les cellules de type sauvage est inhibée à 90% environ
par 2.S ~ de roténone et 3.6 ~M d'antimycine et à 100% par 100 ~M de
cyanure de potassium. Par contre, la faible consommation d'oxygène dans
les cellules mutantes n'est ni sensible à 2.S ~M de roténone ni à 3.6
~ d'antimycine, mais elle est inhibée à 100% par 100 ~M de cyanure de
potassium. (expérience faite sur des mitochondries isolées figures 7 et 8).
Ces résultats indiquent que les mutants: A13G9, 34A13G32, 2A13G14 et
V6IG1S sont défectifs dans la chaine respiratoire des électrons et que
le mutant P12GXl serait semblable à CCL16-B9 un mutant déficient pour
la succinate déshydrogénase. La caractérisation de ces mutants est
maintenant décrite plus en détail.
Etude de complémentation entre les mutants GAL
,
Nous avons caractérisé par analyse génétique les cinq mutants
GAL
indépendants et un mutant de chacun des sept groupes de complémen-
1
tation définis par les mutants GAL
isolés par Scheffler. Chaque mutant
!
a été hybridé avec chacun des onze autres mutants et avec lui-même.
Comme contrôle nos mutants ont été hybridés avec un autre mutant GAL
défectif pour la galactokinase: GALKl (THIRION et al., 1976).
Le critère génétique de complémentation est la restoration du
h~
+
p enotype
h~
p
GAL
du type sauvage dans les cellules hybrides (SODERBERG
et al., 1979; CHU, 1974).
Les clones hybrides
ont été caractérisés par
1
leurs caryotypes qui varient entre 38 et 44 chromosomes comparés à 18 et
1

25
23 pour les souches parentales.
Dans certains cas, la complémentation
de deux mutations a été confirmée par reclonage des cellules hybrides à
basse densité en milieu sélectif.
Les résultats sont présentés au tableau
2 et par les figures 3 et 4.
Les mutations A13G9 et 34A13G32 ne se complémentent pas.
Elles
définissent donc un cistron.
La mutation V6IG15 complémente tous les
autres mutants.
Ces trois mutants définissent donc deux nouveaux groupes
de complémentations (VIII et IX).
Le mutant 2A13G14 ne complémente pas
les mutants du groupe II, VI.
Il est donc du type "chevauchant" comme
certains mutants GAL
isolés par Chu et Scheffler.
Les mutants P12GXl
et CCL16-B9 [déficient pour la succinate déshydrogénase (SOTTOCASA et al.,
1967)J ne se complémentent pas et sont donc dans le même groupe de com-
plémentation; ce résultat confirme celui du tableau 1 sur la mesure de
la consommation d'oxygène.
Le mutant GALKI déficient pour la galacto-
kinase complémente comme prévu, toutes les mutations testées.
Caractérisation biochimique des mutants GAL-
L'analyse génétique de nos mutants GAL
nous a permis de réduire
le travail de l'étude biochimique étant donné que les caractéristiques
des mutants de Scheffler sont connues: les mutants B9 (groupe IV) et.
B7 (groupe V) sont respectivement défectifs pour la succinate déshydro-
génase (SODERBERG et al., 1977) et la synthèse de protéines mitochon-
driales.
Les mutants des groupes l, II et VII sont défectifs dans le
complexe l de la chaine respiratoire des électrons (BREEN et SCHEFFLER,

26
1979).
L'analyse génétique a montré que deux de nos cinq mutations sont
dans deux groupes de complémentations identifiés respectivement pour le
complexe l (2A13G14) et la succinate déshydrogénase (p12GXl).
Les trois
1
1
autres mutants À13Gg, 34A13G32 et V6IG15 qui définissent deux nouveaux
1
groupes de complémentation ont fait l'objet d'une étude plus détaillée.
Les mutants A13G9, 34A13G32 et V6IG15 ont un taux respiratoire
de 13-25% des cellules de type sauvage.
Ces taux sont très proches de
ceux des mutants des groupes l, II et VII.
Ils pourraient donc être
affectés soit dans le cycle de Krebs (figure 5) soit dans la chaine
respiratoire des électrons (figure 6).
Nous avons donc mesuré l'activité du cycle de Krebs dans les
lignées cellulaires de type sauvage et mutant
par l'évaluation de la
d
i
d
l4CO
à
i
d
d·ff~
b
d"
~
C14
pro uct on
e
2
part r
e
1
erents su strats ra 10marques au C14
pro uct on
e
2
part r
e
1
erents su strats ra 10marques au

Les résultats sont présentés au tableau 3.
Les taux de production de
14
CO
à partir de pyruvate-l-C
dans les mutants: A13G9, 34A13G32,
2
2A13G14 et V6IG15 sont respectivement, 16, 20, 6 et 12% des cellules de
type sauvage.
Le faible taux de métabolisme dans ces mutants indique
que l'activité du complexe pyruvate déshydrogénase in vivo est réduite
ou bloquée, puisqu'il est connu que ces cellules n'ont pas une activité
appréciable en pyruvate carboxylase.
Cette interprétation est supportée
14
par le très faible taux (4-12%) du métabolisme de pyruvate-2-C
par
14
les mêmes mutants GAL-, puisque la conversion du pyruvate-2-C
en
acetyl-CoA serait nécessaire pour produire du l4co2•
Par ailleurs, la
co2 •
Par ailleurs,
production de CO
à partir du B-hydroxybutyrate par ces mutants est de
2

27
11-50% des cellules de type sauvage.
Ce substrat converti en acétyl-CoA
produit normalement du CO
après un tour complet du cycle de Krebs, ce
2
qui indique une faible inhibition soit du cycle de Krebs soit de la
conversion du S-hydroxybutyrate en acétyl-CoA.
Ces mutants produisent
14
10-25% de CO
des cellules de type sauvage à partir du glutamate-5-C
,
2
ce qui suggère un blocage possible dans le complexe a-cétoglutarate dé-
shydrogénase.
Ils produisent 21-78% de l4CO
CO
des cellules de type
2
14
sauvage à partir de l'aspartate-U-
C ce qui montre que le cycle de Krebs
fonctionne au moins quelque peu à partir de l'oxaloacétate jusqu'à
l'a-cétoglutarate.
De tous ces résultats ont en déduit que le cycle de
Krebs est altéré dans ces mutants.
Puisqu'ils ont jusqu'à présent toutes
les caractéristiques de mutants du complexe l de la chaine respiratoire
des électrons (BREEN et SCHEFFLER,' 1979), il est probable qu'ilssoient
affectés dans ce complexe.
C'est ce que nous avons vérifié.
Activité mitochondriale dans les cellules de type sauvage et les mutants
~L
La consommation d'oxygène par les mitochondries intactes des
cellules de type sauvage et des mutants a été mesurée en présence de
différents substrats et inhibiteurs afin de détecter toute défectuosité
dans la chaine respiratoire des électrons.
Les résultats sont présentés
à la figure 7.
Le malate stimule la consommation d'oxygène dans les
mitochondries des cellules de type sauvage et de P12GXl, mais n'a pas
d'effet sur les mitochondries des mutants: A13G9, 34A13G32, 2A13G14 et
V6IG15.
Par contre, le succinate et l'a-glycérophosphate stimulent la

28
consommation d'02 de la même façon dans les mitochondries de type sauvage
1
et mutantes.
Notons que dans tous les cas la consommation stimulée par
•1
~
le succinate, est inhibée par le malonate (un inhibiteur du succinate
1
f
déshydrogénase) et que celle stimulée par l'a-glycérophosphate est tota-
lement inhibée par l'antimycine A un inhibiteur de complexe II de la
1
t!
chaine respiratoire des électrons.
Ces résultats indiquent que la
1
f
chaine respiratoire des électrons est altérée dans quatre des cinq mu-
tants à partir du NADH au coenzyme Q et que par contre la portion du
1
1
succinate a-glycérophosphate-coenzyme Q-oxygène est normale.
t
normale.
tl
Les activités: succinate oxydase. a-glycérophosphate oxydase et NADH
oxydase dans les cellules du type sauvage et les mutants
Afin de vérifier les hypothèses précédentes, les activités de
la succinate oxydase, a-glycprophosphate et NADH oxydase des cellules
1
du type sauvage et des mutants ont été mesurées.
1
Le succinate et l'a-glycérophosphate stimulent la consommation
1
d'oxygène dans les mitochondries ouvertes de type sauvage et mutantes.
1
!
Ces réactions sont respectivement inhibées par le malonate à 95% et
f
f!
complètement par l mM de cyanure de potassium (figure 8),
Les deux
complètement par l mM de cyanure de potassium (figure 8),
Les
1
types de mitochondries possèdent donc les activités succinate oxydase
i
r
et a-glycérophosphate oxydase.
La chaine respiratoire des électrons
dans ces lignées cellulaires est donc fonctionnelle à partir du coenzyme
Q jusqu'à l'oxygène moléculaire.
Par contre, la rotenone inhibe l'acti-
vité du NADH oxydase à 60% dans les mitochondries de type sauvage. mais

29
est sans effet sur cette activité dans les mutants (figure 8}.
Le tableau
4, montre les activités spécifiques des succinate oxydase, a-glycérophos-
phate oxydase et NADH oxydase dans les mitochondries de type sauvage et
du mutant 2A13G14.
55% de l'activité NADH oxydase totale des cellules de type sauvage
-7
sont inhibés par 5XlO
M de rotenone, mais cette inhibition est de 3%
seulement dans le mutant 2A13G14.
Les activités du succinate oxydase et
deI 'a-glycérophosphate oxydase sont les m@mes pour les deux typesde mito-
chondries, les trois autres mutants: A13G9, 34A13G32 et V6IG15 ont les
mêmes activités (aux erreurs expérimentales près} que 2A13G14.
Ces ré-
sultats ne démontrent pas, mais suggèrent que dans les mitochondries
mutantes le NADH serait probablement oxydé via une voie non-phosphory-
lante par le NADH oxydase insensible à la rotenone (SOTTOCASA et al.,
1967; BREEN et SCHEFFL
S
ER , 1979).
En résumé, nos résultats montrent que: trois des mutants phéno-
type GAL-: A13G9, 34A13G32 et V6IG15 définissent deux nouveaux groupes
de complémentation (VIII et IX), que, le mutant 2A13G14 est du type
"chevauchant" car ne complémente pas les mutants des groupes II et VII,
et que le mutant P12GXl est dans le même groupe que CCL16-B9 (groupe IV).
Ces mutants ont: un faible taux respiratoire, une activité du cycle de
Krebs réduite, une très faible activité NADH oxydase sensible à la rote-
none.
Ils sont affectés dans le complexe l (NADH-coenzyme Q) de la chaine
respiratoire des électrons et non dans la voie métabolique de Leloir.

TABLEAU 1
Taux respiratoire des cellules de type sauvage
1
et des mutants GAL
f
1
Souches
Respiration
Taux relatif
7
1
7
a
(~mol 02/h/IO
cellules)
(%)b
cellules)
1
1
V6 (type sauvage)
2.02
±
0.2
100
P12GXl
2.385 ±
0.2
118
1
A13G9
0.505 ±
0.05
25
34A13G32
0.282 ±
0.05
14
2A13G14
0.242 ±
0.04
12
V6IG15
0.263 ±
0.04
13
V79-G8
0.222 ±
0.04
11
* CCL16 (type sauvage)
2.63
±
0.7
100
* CCLl6-B9
2.17
±
0.32
82.6

32
Tableau 2
* Les mutants GAL- de cellules de hamster chinois représen-
tant les groupes de complémentation l à VII nous ont été fournis par
le laboratoire de Scheffler.
Les lignées cellulaires G8, G14, G20,
G7, Gll et G29 sont isolées à partir de V79, B9 et B10 sont isolées
de CCL16 et sont respectivement nommées, CCL16-B9 et CCL16-B10.
La
lignée cellulaire V79-G20 est un "mutant chevauchant" et ne complémente
pas les mutants des groupes l et II.
Les mutants A13G9, 34A13G32,
2A13G14, V6IG1S et P12GXl sont isolés à partir de V6 dans notre labo-
ratoire.
La souche DR2R16l0 est résistante au 2-déoxygalactose et
défective dans la protéine galactokinase.
Abbréviations:
+ complémentation; - absence de complémentation;
PF n'a pas été faite.

30
Tableau 1
(a) Ces valeurs sont la moyenne d'au moins trois mesures ± SD.
(b) Les valeurs sont exprimées en pourcentage de la valeur obtenue pour
les cellules de type sauvage V6.
* Ces valeurs sont tirées de la littérature (Scheff1er, 1974).

ETUDE DE COMPLEMENTATION DES Ml1rANTS GAL
*GrI GrIl GrlaGrII
GrIll GrIV GrV GrVI GrVII
G8
GI4
G20
BIO
B9
G7
GII
G29
AI3G9 34AI3G32 2AI3GI4 V6IGI5 PI2GXI
DR2RI610
G8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PF
GI4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PF
G20
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PF
BIO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PF
B9
+
+
+
+
+
+
+
PF
G7
+
+
+
+
+
+
+
PF
GU
+
+
+
+
+
PF
G29
+
+
+
+
+
PF
A13G9
+
+
+
+
34A13G32
+
+
+
+
2A13G14
+
+
+
V6IGI5
+
+
P12GXI
+
DR2RI610

34
Tableau 3
*
Ces valeurs sont la moyenne d'au moins trois mesures ± SD.
Les valeurs sont exprimées en pourcentage des valeurs obtenues pour
les cellules de type sauvage V6.
Le taux absolu du métabolisme dans
7
les cellules de type sauvage exprimé en nmo1e/h/10
cellules pour les
14
14
14
substrats: pyruvate-1-C
• pyruvate-2-C
• glutamate-S-C
• 6-hydroxy-
14
14
butyrate-3-C
et aspartate-U-C
est respectivement: 44, 21, 3.13,
'0.48, 1.16.

TABLEAU 3
ACTIVITE DU CYCLE DE KREBS DANS LES CELLULES DE TYPE SAUVAGE ET LES MUTANTS GAL
Taux relatif de production de CO
(%) *
2
Substrat
V6
A13G9
34A13G32
2A13G14
V6IG15
P12GX1
V79-G8
(W. T.)
(control)
14
Pyruvate-1-C
100
16±5
20±1
6±1
12±2
U9±23
2.0tO.4
14
Pyruvate-2-C
100
6±1
l2±1
4±1
7±1
10H2
3.0±0.6
8-Uydroxybutyrate
100
49±1
40±2
35±1
U±1
102±1
2.0±0.4
14
Gutamate-5-C
100
12.6±2.0
14±2
25±1
10±2
146±5
8.50±0.16
14
Aspartate-U-C
100
78±4
53±2
47±1
2H2
122±2
2H4

36
Tableau 4
* Ces valeurs sont la moyenne d'au moins deux mesures. La
concentration des substrats: succinate, a-glycérophosphate, NADH est
respectivement 2.5 mM, 2.5 mM, 0.5 mM.
L'activité totale du NADH
oxydase est mesurée en absence de rotenone, l'activité mesurée en pré-
-7
sence de 5XlO
M de rotenone est celle du NADH oxydase non sensible
au rotenone, la soustraction de ces deux activités donne la valeur de
celle du NADH oxydase sensible à la rotenone.

TABLEAU 4
LES ACTIVITES: SUCCINATE OXYDASE, a-GLYCEROPHOSPHATE OXYDASE ET NADH OXYDASE
DANS LES LIGNEES CELLULAIRES DE TYPE SAUVAGE ET MUTANTS.
*Activité spécifique
(nmo1e d'oxygène consommé/min/mg de protéine)
V6 (W.T.)
2A13G14 (mutant GAL-)
Succinate oxydase
38.9
42.0
a-glycérophosphate oxydase
11.8
12.2
activité totale de NADH oxydase
9.2
7.82
NADH oxydase non sensible au rotenone
4.2
7.60
NADH oxydase sensible au rotenone
S.O
0.22
- - - - - - - - - - "~-"~-

38
Figure 2
Phénotype typique d'un clone mutant GAL-.
200 cellules environ sont ensemencées dans des disques de 6 cm
de diamètre en présence de 5 ml de milieu DMEM, 25 mM de glucose et 10%
FCS.
Après 7 jours d'incubation à 37°C, un des disques a été coloré au
bleu de méthylène; les autres sont lavés 4 fois avec 4 ml de PBS et
0C
0
incubés à 37 C en présence de 5 ml de milieu DMEM avec soit 25 mM de
galactose ou 25 mM de glucose et 10% DFCS.
Ils sont ensuite colorés
oC.
o
après 4 h d'incubation à 37 C.
Les clones mutants se sont désintégrés
en présence du galactose (figure 2B) mais pas en présence du glucose
(figure 2A).

b

40
Figure 3
Etude de complémentation entre les mutants GAL
isolés dans
notre laboratoire.
Les conditions
expérimentales sont décrites au
chapitre Matériel et méthodes.

34A13
2A13
A13G9
G32
G14
V61G15 P12GX1 GALK1
t ~~
.-.
- ~," .. :".~
~~ l'''C;;-!'~~
..-. _....
l'''C;;-!'~~
,
,
1'.\\ C··
"..........
.-.-. ,
/
/
, r:»> ,
1'.\\ C··
".r-,
.-.-.
r ,.
...". ":.
' ..~.. .;."
1
• •
' .
"••..
"
,..
...,,'....'O...... ~
' .
"
.....
A13G9
","- •
.. , ........... ~
'
•. ~ .• ' •• ~. ~'" ft
."

~~...~
...
,. ~;- ~~~ ,-1 :;.
: • ,;
• ...•.:~
.•
• • .. _.
.. •
~
1.. "
,'
..,.......~ \\.~~ ~ ....
.
'fi
al..:.". ~
1.. "
,'
..,.......~ \\.~~ ~
'..
~
~
..
".
'..
~
~
"
.
.......~ ..
~
.e';"'-:::"'"
~~.~.,. ~""'"
~""'"y
. : : - : : . . , . ,
y
. : : - : : . . , .
..,.
-----
....
""-- - " " " "
,
,
~..
A'"
·fI.
, .
" "
/~ ._~=-:.,
.~...
,e • •
.•.'
. " .

.

.
' .
. . . .
~ "j .' "..
..".". .
.:.
;. ..
, . . . . ' • . ' .
J
,,"
' . . .
/
~..
A'"
·fI.
, .
" "
r". ._~=-:.,
,.
. f··
.'
.~...
'.1.
\\
1 ,e • •
.•.'
.
..
\\ .
. , .
. . . .
~ "j .' "..
.." .
.:.
;.
, . . . . ' • . ' .
J
. " .

' ,
. , .

,,"
' . . .
/
f··
.'
1
»
.
'.1.
\\
:-.'O .".

.
'
34A13G32
r .. ".
. ..'lf.-.
'lf.- . . . '..

..
• ,.

..

l'· ~.
:-...~••-: ''';~i .~~:.,. •. ~~.
'" •
-:
."...•'f
l'· ~.
:-...~••-: ''';~i .~~:.,. •. ~~.
'" •
':"
."...•
_~.J
t ·f~
; .
.
_ . : . ,
'"
:
" .
~ -."':,
: : . .. _~.J
t ·f~ ••"
••
; .
.
_ . : . ,
'"
..
,
"-.
/ ' ,
:. ,;..
.. •..,ç
-.
", .
..
'-'.
'1"
~
"'~
'..~
.
'-'.
~
..•:"
.
"~"'"
•.~~....
.......-;"'~~-..
.'
~
..•:"
.
"~"'"
•.~~....
.:
'
,.. ''''
r :~. ....
r :
,-•.•
...'J..... ~.
: ;•.:...
•• ri." . .
\\
.'
...
.......".\\
: ;•.:...
•• ri." .
\\
.'
...
.. .
"
' ."
..
. .. " .
' ."
.. .
"
~
" ..
2A13G14
,·~Y·{~~·.:, t~:~j~;
I~\\. ~.:'Yo-'..';
,6.- _. -, _"\\ ..
,
~.:'Yo-'..
,6.- _. -, _'\\. ..
,
,
1
,
<
\\ t
f
' .
,-:
·l·· • .
,
-:
"
V61G15

.

.

\\:. :"': :.,
~ __i
... .
~
..
.
_ _ i
... .
..
..--
P12GX1
GALK1

42
Figure 4
Comparaison des mutants GAL
isolés dans notre laboratoire à
ceux de Scheffler par analyse de complémentation.
Les conditions expé-
rimentales sont décrites au chapitre Matériel et méthodes.

P12
34A13
2A13
GX1
A13G9
G32
G14 V61G15
.J .... ~•
. . . ~
. . . '- ..•
t.·
........ "',
89
~I ' <,\\ ~
1.'"
•••
:,r ".". ,.;......
~I ' ••\\
1.'"
•••
:,r ".". ,.;.
' .
' .

• •
. "
1.
. .'
,
1
.,
....... ) ~'/
"'-..
.
....~..."...('
.~.,!;.\\~~.
•t '$':-. '.. ..
810
~('~,"...('
.~.,!;.\\~~
•t '$':-. '..
._.
: . . . . _.' .e
~('~,!~(l'••:~i-::.,'.•
....,.•,
_..•
....,.•,
_.
\\~...
. , .
-
• .l.'
. . . ..1>-.
. . . .
-,
.. '
'.
.-
/
.
/
("
\\
."
.
. 1

r'
\\
. 1

1
"
f
J~
G7
1
,J\\
..
'r.' 1 ~ -
1
,J\\
..
'r.'

.
1
_
~
-
~.
,
./
.
./
/
~
. .'
..

'
..

, :
.... t ....
~~'.'.
Ga
Q;~..::~.:.~.;..
.~\\" 1;~;~:\\9
..
'.' ~,J. ..... ~"
••••' •
.
Q;~..::~.:.~.;..
.~\\" 1;~;~:\\9
..
'.' ~,J. ..... ~"
••••'
.'••''4J.~....

'4J.~.... '1


-
.•.•• ~
'
'1


-
.•.•• ~
.
'-",.',
rtt
' - " , . ' ,
. ,
- ; t .
..

"
t . .
• ... ',fl
.... ....
'\\,~ .... ,
..
i' e. ',:'/
~...;.~:....
;.~:....~..
~.~~V'
"-. . .J'
~
'~'.w.
,..,.,..~.
• •.'

'~;")Io
..'
.. ••,,;
•• .•
,,; ~
.• ..
..J
.(•..•.,. "l,"::\\"
....:.~ ,,~.r , ..,
J
....'~ ........ ~. ~......
'y' '.....
~
'y' '.....l')t'>~ '.•• ,'' _~:-.•.,•• :'-~t ... ~.:c-.'...;
:: ",." ..•.,;
..•
t:
l, "" l
~ <>:
. . . . . \\..'
\\ . . '
,'
,'
...
...
o(~ •• ~ .... 'l,'. ':",J •.•.,.
Jo. ,r.
:
0' -.
-. : . ' .:t
.:t
~ ,','., Jo. ,r.
lit
,
-'. 'loI'
" ,.' " '1 1" .0,.
~ '.' ..... :....~. "Î' '.. "t:';
".-.~ ',\\"',j' ••'.:0:. -,' J. .•.•. ,.l
,,,",-,,.t• ..(,,,, .~
\\ ••••..•~ <1<1 • • ,'~ •••"\\~ ••• ' ........ ,
G 11
-..
-
, :
-'J~".'l
':~.
....
/
...l~·.··"':." .. :·,··;j··
" . :
l
, ' 1 " . 1
.~.
"
._
(.....
t .....:.
..... •
•. ',. ,;;~
· .•.'t.·'
·.,.'t.·'
-·,:'~...
-·,:'~ :·,;i
.......'. .
.-
..
....
G 14
: .. '.,
....:
14
~:::':":<~/?
" \\
~.
G 20
\\(
"--~
\\(
G 29
\\(
\\(
\\
\\(
G 29
. \\
1
,l
. \\
1
1

44
Figure 5
Les différentes étapes du cycle de Krebs.
Krebs, H.A. (1970); Albert L. Lehninger (1970).

CYCLE TRICARBOXYLIQUE
PYRUVATE
I,-P_y_R_U_V_A_T-:Ed.-_---- Pyruvate deshydrogenase
2f
Pyruvate carboxylase - - - - - - _ \\
IACETYl-COAI ......t---------
......
111-hydrolCYbutyrate 1
1Aspartatel
1
Transaminase
........-
.....
- - - - - - - Citrate synthetase
L------------+~OXALOACETATE
Malate deshydrogenase - _ _"""'RNADH
_
CITRATE
MALATE
NAD
\\
..
.
Aconitase
Cil-ACONITASE
---------1
.
fumarase ---------1
fumarase
FUMARAI E
1..
Aconitase
Succinate deshydrogenase
. ,
IS CITRATE
..
NAD
Isocitrate
IsocitratB deshydrogenase
SUCCINATE
CoA
.-..~'....
NADH
Succinyl CoA synthetase
synthetasB
.."
SUCCINYL CoA
a-CETOGLUTARATE
NADH
Glutamate
NADH
NAD
..
deshydrogenase
NAD
a-Cetoglutarate
a-CetoglutaratB
IGiutamatel_
BIOSYNTHESE
deshydrogenase
DES ACIDES AMINES

46
Figure 6
Le transport des électrons jusqu'à l'oxygène moléculaire se
fait par une suite de réactions d'oxydo-réduction qui se déroulent
dans la membrane interne des mitochondries et mettant en jeu les cons-
tituants de la chaine respiratoire:
Le complexe l, appelé NADH-coen-
zyme Q réductase (renferme la NADH-déshydrogénase); le complexe II,
ou succinate-coenzyme Q réductase (renferme la succinodéshydrogénase
et le cytochrome b);
le complexe III, ou coenzyme Q-cytochrome C (con-
tient les cytochromes b et c, et le coenzyme Q) et le complexe IV ou
cytochrome oxydase contient les cytochromes a et a
Le transport des
3
électrons peut être inhibé en certains points de la chaine par diverses
substances:
Rotenone, Antimycine A et cyanure.
A. Berkaloff et al. (1978).

y - .
-
f
_
"';W'V
- .. ,
,-1
CHAINE RESPIRATOIRE DES ELECTRONS ET LE SITE D'ACTION DE DIFFERENTS INHIBITEURS
SUCCINATE
lFP2
MALATE
ROTENONE
ANTIMyelNE
CYANURE
+----.
ISOCITRATE ---_~ NADH---_~FP.
ISOCITRATE ---_~ NADH---_~
CoQ - . cytb - t - C y t c , - - cytc _cytaa3 ~ 0;
GLUTAMATE
Ol- GL YCEROLPHOSPHATE

48
Figure 7
La consommation d'oxygène par les mitochondries des cellules
de type sauvage et des mutants.
Les flèches indiquent les substrats
et inhibiteurs ajoutés: (1) ma1ate et pyruvate (2.5 mM),
(2) rotenone
-7
(5XlO
M), (3) succinate (2.5 mM), (4) malonate (2.5 mM), (5) a-glycé-
rophosphate (2.5 mM) et (6) antimycine A (2.5 ~M).
La quantité des
protéines mitochondria1es des cellules est: V6, 2.0 mg; P12GX1, 2.1 mg;
A13G9, 2.3 mg; 34A13G32, 2.2 mg; 2A13G14 2.1 mg; V6IG1S, 2.0 mg.

V 6
P12 Gx1
w
Z
w
o
A13 G9
>
"x0..
34A13 G32
Cl
Q3
Z
-0 0
E
-
E
t
e
t:
t-
t
2A13 G14
<t
0
CIO
CC
~
1-
Vs 1G15·
~
Vs 1G15·
Z
w
U
Z
0
U
5 min.
TEMPS

50
Figure 8
Evaluation de l'activité de NADH oxydase, succinate oxydase et
~-glycérophosphate oxydase dans les mitochondries ouvertes des cellules
de type sauvage et des mutants. Les flèches indiquent les substrats et
inhibiteurs aj outés: (1) succinate (2.5 mM), (2) malonate (2.5 mM),
-7
.
(3) NADH (0.5 mM), (4) rotenone (5XlO
M). (5) a-glycérophosphate
(2.5 mM), (6) antimycine A (2.5 jlM) et (7) cyanure de potassium (1 mM).
La quantité de protéine mitochondriale des cellules est: V6, 1.9 mg;
P12GXl, 2.0 mg; Al3G9, 2.1 mg; 34A13G32, 2.0 mg; 2A13G14, 2.2 mg; V6IG15,
2.0 mg.

P12 Gx
G 1
x
A 13 G9 -----.;
~A13 G32 ----.;
w
:2
w
.e,:,
>
2A13 G14---.....;
Q)
X
IIco ~
Vs 1G15
IIco
Vs 1G15
0
-
r-
«
CC
r-
:2
w
U
:2
o
· U
5 min.
TEMPS

CHAPITRE III
Etude génétique et immunologique des
mutations somatiques résistantes au 2-déoxygalactose

RESULTATS
Nous avons montré au chapitre précédent que les mutants du phé-
notype GAL
étudiés sont affectés au niveau du cycle de Krebs et du com-
plexe l de la chaIne d'oxydation phosphorylative.
Le phénotype GAL
de
ces mutants n'est donc pas spécifiquement lié au métabolisme du galac-
tose, mais serait par contre dn au fait que la conversion du galactose
en glucose dans ces cellules ne se fait pas assez vite pour soutenir un
taux élevé de glycolyse.
En effet, en l'absence de phosphorylation oxy-
dative, la production d'ATP proviendrait presque exclusivement de la
glycolyse.
Dans les cellules GAL- elle ne serait donc pas assez élevée
pour leur permettre de survivre.
Ainsi, si ces mutants sont très impor-
tants pour l'étude des fonctions mitochondria1es, ils le sont moins pour
l'étude des gènes impliqués dans la voie métabolique de Leloir (figure 1).
Une autre méthode a donc été utilisée pour sélectionner des mu-
tants spécifiques pour le métabolisme du galactose.
Thirion et al.
(1976)
ont ainsi isolé des mutants de cellules somatiques d'hamster chinois ré-
sistants au 2-déoxygalactose et défectifs pour la ga1actokinase (E.C. 2.7.1.6)
pour étudier la régulation et la structure de(s) gène(s) de la galacto-
kinase. La fréquence d'apparition de ces clones résistants au 2-déoxyga-
l
(D
R)
,~ ,
1

h-
R
actose (Dga
augmente apres mutagenese;
es p enotypes Dga
actose
ga
augmente apres mutagenese;
es p enotypes
sont sta-
bles après de nombreuses générations en l'absence de l'agent sélectif.
Ces observations suggèrent mais ne démontrent pas l'origine génétique de
cette variation.
Nous avons donc effectué un test de fluctuation à la
- - - - - - - - - - -
l
- - - - - - - - - - - -

54
R
Luria et DelbrUck pour montrer que ces variants Dga
étaient vraisembla-
blement le résultat d'évènement génétique (changement de séquences nucléo-
tidiques
du DNA; Claverie et al., 1979).
R
Thirion et al. (1976) ont émis l'hypothèse que les mutants Dga ,
galk d'allèle nul seraient affectés soit dans le(s) gène(s) de structure
soit dans le(s) gène(s) de régulation.
Afin de vérifier ces hypothèses
R
nous avons donc isolé d'autres mutants Dga , galk d'allèle nul.
La
figure 9 montre le pédigree de ces souches.
Nous décrivons dans ce
chapitre les propriétés immunologiques et génétiques de ces mutants.
R,
R
Les souches Dga , galk d'allèle nul ont été analysées pour la présence
ou l'absence de matériel immunologique (CRM) contre des anticorps anti-
protéine galactokinase d'hamster chinois purifiée (TALBOT et THIRION,
1982).
Elles ont été analysées ensuite par le test de complémentation
pour déterminer combien de cistrons définissent ces mutations.
Sélection de mutants galk d'allèle nul et totalement résistants au
2-déoxygalactose
1
Thirion et al. (1976) ont isolé des mutants complètement résis-
1
1
1
1
1
1

55
tants au 2-déoxygalactose et dépourvus de toute activité galactokinasique
R,
R
(Dga , galk allèle nul). Afin d'étudier les différentes types de mutations
(absence de l'enzyme, altération de l'affinité enzyme-substrat) desquelles
R,
R
pourraient résulter les mutants Dga , g~lk allèle nul, nous avons développé
une nouvelle méthode (décrite à la section Matériel et méthodes) pour
R
sélectionner sept autres mutants Dga , galk allèle nul indépendants:
GALK5, GALK6, GALK7, GALK8, GALK9, GALKIO et GALKll.
Cette méthode
utilise une concentration élevée de 2-déoxygalactose (48 mM) et augmente
alors la proportion des mutants galk d'allèle nul, parmi les mutants
R
R
Dga
(figure 10). Ces mutants Dga , galk allèle nul sont isolés à partir
des souches DR2, Tyk6DC
et V6IP (voir pédigrée à la figure 9).
DR2 et
4
Tyk6DC
sont partiellement résistant au 2-déoxygalactose et sont res-
4
pectivement déficientes pour l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase
(HPRT-) et la thymidine kinase (TK-), l'addition de ces deux marqueurs
non liés à la souche sauvage ne change pas ses propriétés vis-à-vis
R
d'un autre marqueur indépendant comme Dga
(Claverie et al., 1979).
La souche V6IP est sensible au 2-déoxygalactose et auxotrophe pour l'ino-
sitol et la proline(LABRECQUE et THIRION, 1977).
R
Caractérisation des mutants Dga
galk d'allèle nul
R
Tous les sept mutants Dga , galk d'allèle nul sont complètement
résistants au Dga (c'est-à-dire à 48 mM de Dga).
Le Tableau 6 montre
leur efficacité de clonage en présence de différentes concentrations
de Dga, et la figure Il la courbe d'inactivation.
Ces mutants ont un
phénotype GAL-, ils ne poussent pas en milieu DMEM contenant 25 mM de

56
galactose. Le tableau 6 montre les différents phénotypes des souches.
3H
3
Ils n'incorporent pas le galactose- H et n'ont pas d'activité galacto-
kinasique (E.C. 2.7.1.6) détectable. De plus, les souches
GALKS, GALK6
3H.
3
et GALK7 comme leur lignée parentale n'incorporent pas l'hypoxanthine- H.
3H.
3
De même GALK8 et GALK9 n'incorporent pas la thymidine- H.
GALKIO et
3H
3
3H
3
GALKll incorporent l'hypoxanthine- H et thymidine- H tel que prévu par
leurs phénotypes sauvages pour les deux marqueurs HPRT et TK.
Les acti-
vités enzymatiques de ces mutants sont présentées dans le tableau 7. Les
R
phénotypes Dga
et GAL- sont stables après de nombreuses générations en
l'absence de l'agent sélectif (le 2-déoxygalactose).
R
Récessivitédu phénotype Dga
Afin de vérifier si les mutations qui affectent le gène de la
R
galactokinase dans les cellules Dga
sont récessives ou dominantes,
chaque mutant a été hybridé avec soit la souche Hpt13 (phénotype HPRT-
S)
S
S).
S
Dga ) soit avec Tyk6 (phénotype TK-, Dga ).
La fusion cellulaire a été
faite selon la méthode décrite dans la section Matériel et méthodes.
Les hybrides ont été sélectionnés
par la complémentation de deux mar-
queurs récessifs HPRT
et TK
des lignées cellulaires parentales en
milieu HAT (SZYBALSKI, SZYBALSKA et RAGNI, 1962; LITTLEFIELD, 1964),
sauf pour la fusion de la souche Hpt13 et les mutants GALKIO et GALKll
où les hybrides ont été sélectionnés en milieu HAT sans inositol ni
proline par complémentation du marqueur HPRT- et de deux autres récessifs
R•
R
inositol et proline.
On ne sélectionne pas pour le marqueur Dga •

57
Les cellules hybrides ont été reclonées deux fois en milieu
3
sélectif et testées pour l'incorporation de l'hypoxanthine- H et la
3
thymidine- H.
3
thymidine-
Le tableau 8 indique les résultats.
Tous les hybrides
3H
3
3H.
3
analysés incorporent la thymidine- H et l'hypoxanthine- H.
De plus,
ces hybrides hyHpt13-GALKlO et hyHpt13-GALKll poussent en milieu HAT
sans proline ni inositol.
Nous pouvons conclure que ces clones sont
de vrais hybrides, puisque 1) la fréquence de réversion aux phénotypes
parentaux
est inférieure à 1%, 2) leurs caryotypes est de 38-44 chro-
mosomes comparés à 18-23 pour les lignées parentales (voir tableau
9,
S
R
pour le génotype et le phénotype).
Ces hybrides Dga XDga
incorporent
3
le galactose- H et ont une activité galactokinasique (tableau 8), ce
R
qui démontre que l'allèle Dga
est récessif par rapport à l'allèle
S
sauvage Dga •
R
Etude de complémentation entre les mutants Dga , galk d'allèle nul
Afin de déterminer le nombre de cistrons qui définissent les
mutations galk, nous avons analysé par étude de complémentation, les
sept mutants indépendants: GALK5, GALK6, GALK7, GALK8, GALK9, GALKIO
R,
R
et GALKll, et trois autres mutants indépendants, Dga , galk d'allèle
nul isolés par Banville (1977~tThirion et al. (1976): GALKI. GALK2 et
GALK4. Chaque mutant est hybridé avec chacun des neuf autres mutants
et avec lui-même. Dans l'expérience contrôle, les mutants sont hybridés
avec des mutants GAL-A13G9, 34A13G32 et V6IG15 (voir chapitre précédent).
!
Les résultats sont présentés dans les tableaux 8 et 10.
Les résultats sont présentés dans les tableaux 8 et
1

58
Dans un premier test,le critère de complémentation est la resto-
+
ration du phénotype sauvage GAL
dans les hybrides.
Les mutants ont
été fusionnés en utilisant du DMEM, 10% DFCS et 25 mM galactose au lieu
du glucose comme milieu sélectif.
Les 10 mutants analysés ne se complé-
mentent pas, mais comme prévu complémentent tous les mutants GAL
A13G9,
1
A13G9,
34A13G32 et V6IG15 (tableau 10).
j
Dans le second test, les hybrides ont été sélectionnés par com-
plémentation de deux marqueurs récessifs RPRT
et TK
en milieu HAT.
GALK2 un des 10 mutants galk d'allèle nul est hybridé avec cinq autres
mutants galk d'allèle nul: GALKl, GALK4, GALK5, GALK6 et GALK7. Les
clones hybrides OP.t été isolés et caractérisés.
Comme le montrent les
+
+
résultats dans le tableau 8, ils ont le phénotype TK ,RPRT
mais, par
3
contre, n'incorporent pas le galactose- R et n'ont pas d'activité galac-
R
tokinasique détectable; ce qui indique que les 10 mutants Dga , galk
d'allèle nul définissent un seul groupe de complémentation.
R
Caractérisation immunologique des mutants Dga
salk d'allèle nul
R,
R
Afin de caractériser les mutants Dga , galk d'allèle nul par
analyse immunologique, la protéine galactokinase a été purifiée (TALBOT
et TRIRION, 1982) et les anticorps antigalactokinases préparés selon
la méthode décrite à la section Matériel et méthodes.
a - Immuno-inhibition de l'activité galactokinasique

59
L'inhibition spécifique de l'activité ga1actokinasique par le
sérum de lapin anti-ga1actokinase d'hamster chinois a été mesurée par
titration d'une quantité constante de la ga1actokinase des cellules de
type sauvage V6, contre différentes concentrations de sérum.
La figure
13 en montre les résultats: le sérum immun précipite 90-95% de l'acti-
vité ga1actokinasique dans les cellules; par contre, le sérum normal
est sans effet. De plus, le sérum immun ne précipite pas l'enzyme phos-
phoribosy1transférase (RPRT) des cellules d'hamster chinois, ni la pro-
téine ga1actokinase des lignées cellulaires LMTK de souris.
Ces résu1-
tats indiquent que les anticorps anti-ga1actokinases obtenus
sont bien
spécifiques à la ga1actokinase cellulaire d'hamster chinois.
b - Dosage de matériel immuno1ogique ("cross reacting mate rial"
(CRM»
dans les extraits cellulaires des mutants ga1k d'allèle nul et
résistants au 2-déoxyga1actose
Le terme "cross reacting materia1" (CRM) est employé dans ce
texte pour décrire la protéine ga1actokinase enzymatiquement inactive
mais capable de réagir avec les anticorps antiga1actokinase de hamster
chinois purifiée.
L'expérience d'immuno-inhibition (STRAUSS et al.,
1978) a été effectuée selon la méthode décrite à la section Matériel et
méthodes pour détecter le CRM dans les extraits cellulaires.
Les mu-
R
tants Dga
utilisés pour ce test n'ont pas d'activité ga1actokinasique
détectable (tableau 7), et ne stimulent ni n'inhibent pas la ga1acto-
kinase de type sauvage.
De même les sera utilisés ne contiennent pas
d'activité ga1actokinasique.
La présence ou l'absence de CRM de la

60
R,
R
protéine galactokinase dans les extraits des mutants Dga , galk d'allèle
nul a été mesurée quantitativement: 100 ~l d'une solution (4 mg/ml de
protéine) d'extrait cellulaire des cellules de type sauvage contiennent
100% de CRM.
L'activité de cette quantité de galactokinase est réduite
de 90% par 150 ~l de sérum antigalactokinase.
Si 100 ~l de l'extrait
R
cellulaire (4 mg/ml) d'un mutant Dga
contenant 0% de CRM (c'est-à-dire
CRM-) sont mélangés à 150 ~l de serum immun, il n'y aura pas de forma-
tion de complexe antigène-anticorps (Ag-Ac), en ajoutant ensuite à ce
mélange 100 ~l d'extrait cellulaire (4 mg/ml) de type sauvage, l'acti-
vité galactokinasique du type sauvage serait réduite de 90% environ.
Par contre, si l'extrait du mutant contient 100% de CRM (c'est-à-
+
dire CRM)
l'anticorps formerait le complexe Ag-Ac avec la protéine
galactokinase inactive du type mutant et ne serait donc pas disponible
pour précipiter l'activité galactokinasique des cellules du type sauvage.
R
, 1 ~
~
+
Tous les mutants Dga
galk d a lele nul testes sont CRM
èt semblent
synthétiser la même quantité de la protéine galactokinase que les cellu-
les du type sauvage (le tableau 11); ces mutants sont donc affectés
dans le gène de structure de la galactokinase.

1
t
1
1
Tableau 5
500 cellules environ sont ensemencées dans des disques de
6 cm de diamètre en présence de milieu DMEM, 10% FCS contenant diffé-
rentes concentrations de 2-déoxyga1actose. Après 7-14 jours d'incuba-
o
tion à 37 C les clones sont fixés au méthanol-acide acétique (3:1 v/v),
colorés au bleu de méthylène et comptés.
L'effet cytotoxique du 2-deoxyga1actose est montré à la figure 12.
* Les clones GALK1, GALK2, GALK4, GALKS, GALK7, GALK8, GALK9,
GALK10, GALK11 ont le même profil que GALK7.

TABLEAU 5
EFFICACITE DE CLONAGE RELATIVE DES SOUCHES PARENTALES ET
R
DES MUTANTS Dga • galk D'ALLELE NUL
Concentration de
Efficacité relative de clonage
2-déoxygalactose
V6 et Hpt13
Tyk6
Clone résistant
(GALK6)*
(mM)
o
100
100
100
100
3
11
< 0.5
71
88
6
6
< 0.5
58
95
15
0.5
< 0.5
7
102
30
< 0.5
< 0.5
< 0.5
99

65
Tahleau 6
R
Croissance des cellules de type sauvage et des mutants Dga
en
6
différents milieux.
10
cellules environ de chaque souche sont ense-
mencées dans des disques de 6 cm en présence de 5 ml de milieu: Milieu
HAT [DMEM, 10% FCS, hypoxanthine (0.1 mM), thymidine (0.016 mM),
amethoptérine (5.5 ~M)] ou milieu DMEM + galactose (DMEM, 10% DFCS,
25 mM de galactose au lieu du glucose), ou milieu DMEM + glucose (DMEM,
10% DFCS, 25 mM de glucose), ou milieu DMEM ino-pro- (DMEM + 10% DFCS,
25 mM de glucose, sans inositol sans proline) ou milieu DMEM + Dga
(DMEM, 10% FCS, 4 mg/ml de 2-déoxygalactose).
La croissance des cellu-
les en présence de ces différents milieux est déterminée par un examen
oC.
o
au microscope de l'état des cellules après 4-5 jours d'incubation à 37 C.
++ indique une croissance normale.
+ indique une croissance lente.
indique une absence de croissance.

TABLEAU 6
R
CARACTERISTIQUES DES MUTANTS Dga , galk D'ALLELE NUL
* Croissance des cellules en différents milieux
Souches
HAT
DMEM+Galactose
DMEM+Glucose
DMEM ino pro
DMEM+Dga
V6
+ +
+ +
+ +
+ +
DR2
+
+ +
+ +
+
Tyk6C RIS
+
+ +
+ +
+
SRIS
S
Tyk6DC
+
+ +
+ +
+
4
V6IP
+ +
+ +
+ +
GALKI
+ +
+ +
+ +
GALK2
+ +
+ +
+ +
GALK4
+ +
+ +
+ +
GALKS
+ +
+ +
+ +
GALK6
+ +
+ +
+ +
GALK7
+ +
+ +
+ +
GALK8
+ +
+ +
+ +
GALK9
+ +
+ +
+ +
GALKIO
+ +
+ +
+ +
GALKll
+ +
+ +
+ +
+ +
croissance normale
+
croissance plus lente
pas de croissance

67
Tableau 7
La mesure de l'incorporation de tritium à partir de différentes
substances radiomarquées et de l'activité spécifique de la galacto-
kinase ont été effectuées selon les méthodes décrites au chapitre
Matériel et méthodes.
Les valeurs indiquées sont la moyenne d'au moins
trois expériences. L'erreur relative pour le test d'incorporation et
la mesure de l'activité galactokinasique est respectivement de 3% et
6%.
* L'incorporation est exprimée en % des cellules de type sau-
vage V6.
Dans les conditions de ces expériences, l'incorporation de
tritium à partir de 3H-D-galactose, 3H-hypoxanthine et 3H-thymidine des
cellules de type sauvage est respectivement: 9000CPM, 3700 CPM et SOOO
cm.
** L'activité spécifique de la galactokinase est exprimée en
oC.
o
nmole de galactose-l-phosphate produit par mg par minute à 37 C.

TABLEAU 7
INCORPORATION DE TRITIUM ET ACTIVITE SPECIFIQUE DE LA GALACTOKINASE
R,
R
DANS LES CELLULES DE TYPE SAUVAGE ET LES MUTANTS Dga , galk D'ALLELE NUL
*Incorporation relative du tritium
** Activité spécifique
Souches
de la galactokinase
3
3
3
H-D-galactose
H-hypoxanthine
H-thymidine
V6
100
100
100
4.80±0.28
Hpt13
94.0±2.8
11.0±0.3
91.0±2.7
4.30±0.26
Tyk6
79.0±2.4
87.0±2.6
<5
3. 80±0. 11
GALKI
<3
10. O±O. 3
89.0±2.6
<0.1
GALK2
<5
89. 0±2. 7
4.0±0.1
<0.1
GALK4
<3
8.0±0.2
78.0±2.3
<0.1
GALK5
<3
10.0±0.3
80.0±2.4
<0.1
GALK6
<3
6.0±0.2
80.0±2.4
<0.1
GALK7
<3
8.0±0.2
77. 0±2. 3
<0.1
GALK8
<5
80.0±2.4
<4
<0.1
GALK9
<3
99 ± 3
<5
<0.1
GALKIO
<3
92.0±2.8
86.0±2.6
<0.1
GALKll
3.0±0.09
80.0±2.4
94.0±2.8
<0.1
Tyk6DC
48.0±1.4
90. 0±2. 7
<5
2.70±0.08
4

69
Tableau 8
Incorporation de tritium à partir de différentes substances
radiomarquées et de l'activité spécifique de la ga1actokinase.
Les
mesures ont été effectuées selon les méthodes décrites au chapitre l
(Matériel et méthodes).
Les valeurs indiquées sont la moyenne d'au
moins trois expériences.
L'erreur relative pour le test d'incorpora-
tion et la mesure de l'activité ga1actokinasique est respectivement
de 3% et 6%.
* L'incorporation est exprimée en % des cellules hybrides
"contrôle" hyHpt13-Tyk6.
Dans les conditions de ces expériences l' in-
corporation de tritium à partir de 3H-D-ga1actose, 3H-hypoxanthine et
3H-thymidine des cellules hybrides contrôles est respectivement 11400
CPM, 4000 CPM et 3000 CPM.
** L'activité spécifique de la ga1actokinase est exprimée en
o
nmo1e de ga1actose-1-phosphate produit par mg par minute à 37 C.

TABLEAU
8
INCORPORATION DE TRITIUM ET ACTIVITE SPECIFIQUE DE LA GALACTOKINASE
DANS LES CELLULES HYBRIDES
* Incorporation relative du tritium
**
Souches hybrides
Activité spécifique
hybrides
de la ga1actokinase
3
3
3
H-D-ga1actose
H-hypoxanthine
H-thymidine
Récessivité
hyHpt13-Tyk6
100
100
100
5.2 ± 0.3
hyTyk6-GALK1
74.0 ± 2.2
74.0 ± 2.2
95.0 ± 2.8
3.5 ± 0.2
hyHpt13-GALK2
86.0 ± 2.6
93.0 ± 2.8
90.0 ± 2.7
3.4 ± 0.2
hyTyk6-GALK4
74.0 ± 2.2
80.0 ± 2.4
102
± 3
3.0 ± 0.2
hyTyk6-GALK5
77.0 ± 2.3
76.0 ± 2.3
75.0 ± 2.2
3.6 ± 0.2
hyTyk6-GALK6
70.0 ± 2.1
96.0 ± 2.8
74.0 ± 2.2
2.7 ± 0.1
hyTyk6-GALK7
68.0 ± 2.0
106 ± 3
85.0 ± 2.5
2.2 ± 0.1
hyHpt13-GALK8
76.0 ± 2.2
102 ± 3
89.0 ± 2.6
3.0 ± 0.2
hyHpt13-GALK9
80.0 ± 2.4
88.0 ± 2.6
96.0 ± 2.8
2.8 ± 0.1
hyHpt13-GALKlO
74.0 ± 2.2
87.0 ± 2.6
115.0 ± 3.4
2.3 ± 0.1
hyHpt13-GALKll
81.0 ± 2.4
98.0 ± 2.9
123.0 ± 3.7
2.0 ± 0.1
Comp1émentation
hyHpt13-Tyk6
100
100
100
hyGALK2-GALK1
2.40 ± 0.07
93.0 ± 2.8
96.0 ± 2.8
<0.1
hyGALK2-GALK4
1.70 ± 0.05
97.0 ± 2.9
86.0 ± 2.5
<0.1
hyGALK2-GALK5
1.80 ± 0.05
90.0 ± 2.7
110.0 ± 3.3
<0.1
hyGALK2-GALK6
2.50 ± 0.07
98.0 ± 2.9
91.0 ± 2.7
<0.1
hyGALK2-GALK7
2.09 ± 0.06
95.0 ± 2.8
107.0 ± 3.2
<0.1

71
Tableau
9
Le génotype probable des souches parentales et des cellules
hybrides a été déterminé par le test d'incorporation du tritium à par-
3 3 3
tir de
H-hypoxanthine,
H-thymidine,
H-galactose, la mesure de l'ac-
tivité galactokinase (voir tableaux 7,8,9) et la croissance des cellules
en milieu HAT.
S
Le phénotype Dga
est déterminé par la croissance ou non des
cellules en milieu DMEM, 10% FCS et 4 mg/ml de 2-déoxygalactose.
* Le nombre de chromosomes est la moyenne de 30 cellules
étalées sur les lamelles de microscope.

TABLEAU 9
PHENOTYPE ET GENOTYPE DES DIFFERENTES LIGNEES CELLULAIRES
Souche
Genotype
Phenotype
*Caryotype
probable
Cellules Parentales
S
Hpt13
hpt13 gal*+
Dga
20
s
Tyk6
tyk6 galk
Dga
19
R
GALKl
hpt13 galkl
Dga
21
R
GALK2
tyk6 galk2
Dga
22
R
GALK4
hpt13 galk4
Dga
20
R
GALK5
hpt13 galk5
Dga
21
R
GALK6
hpt13 galk6
Dg~
20
GALK7
hpt13 galk7
Dg~
23
GALK8
tyk6 galk8
Dga
24
R
GALK9
tyk6 galk9
Dga
18
R
GALK10
galklO
Dga
21
R
GALKll
galkll
Dga
21
Cellules Hybrides
1 - Contrôle
--------
S
hyHpt13-Tyk6
galk+/galk+
Dga
44
2 - Récessivité
----------
S
hyTyk6-GALKl
galk+/galk
Dgas
36
s
hyHpt13-GALK2
Dgas
38
s
hyTyk6-GALK4
Dgas
40
s
hyTyk6-GALK5
Dgas
41
s
hyTyk6-GALK6
Dgas
39
s
hyTyk6-GALK7
Dgas
36
s
hyHpt13-GALK8
Dgas
41
s
hyHpt13-GALK9
Dgas
42
s
hyHpt13-GALK10
46
1
Dga
46
,
Dgas
hyHp t13-GALKll
Dga
39
l'
39
3 - ~~!~~~!~!~~~
R
hyGALK2-GALKl
galk / galk
Dga
40
R
hyGALK2-GALK4
Dga
42
R
1
hyGALK2-GALK5
Dga
43
R
hyGALK2-GALK6
Dg~
40
hyGALK2-GALK7
Dga
38
1
t
i
1
1

73
Tableau 10
R,
R
La complémentation entre les mutants Dga , galk d'allèle nul
a été effectuée selon la méthode décrite au chapitre l (Matériel et
méthodes) •
Le milieu DMEM, 10% DFCS et 25 mM de galactose au lieu du glu-
cose a été utilisé comme milieu de sélection.
* Les souches A13G9, 34A13G32 et V6IG15 sont des mutants GAL
affectés au niveau du complexe l de la chaine d'oxydation phosphoryla-
tive.
A13G9 et 34A13G32 sont dans le même groupe de complémentation
(voir chapitre II).
+ indique la complémentation entre les souches.
- indique l'absence de complémentation.

TABLEAU 10
R
ETUDE DE COMPLEMENTATION ENTRE LES MUTANTS Dga , galk D'ALLELE NUL
R,
R
Mutants Dga , galk
d'allèle nul
GALKI GALK2 GALK4 GALKS GALK6 GALK7 GALK8 GALK9 GALKIO GALKll
A13G9
34A13G32
V6IGIS
GALKI
+
+
+
GALK2
+
+
+
GALK4
+
+
+
GALKS
+
+
+
GALK6
+
+
+
GALK7
+
+
+
GALK8
+
+
+
GALK9
+
+
+
GALKIO
+
+
+
GALKll
+
+
+
A13G9
+
34A13G32
+
V6IGIS

75
Tableau 11
La quantité de matériel immunogénique dans l'extrait cellulaire
R,
R
des mutants Dga , galk d'allèle nul a été mesurée selon la méthode dé-
crite au chapitre l (Matériel et méthodes).
(a)
100 pl de tampon d'extraction sont ajoutés pour compléter
le volume à 400 pl.
(b)
Extrait frais des cellules de type sauvage V6.
(c)
L'activité galactokinasique dans les surnageants est ex-
primée en % de l'activité mesurée pour l'extrait des cellules de V6
traité avec du sérum non-immun.
Les valeurs des colonnes A et B indi-
quent respectivement l'activité dans les tubes traités avec du serum
de lapin antigalactokinase de hamster chinois et du sérum de lapin non-
immun.
* La concentration en protéine des extraits cellulaires est
4 mg/ml environ.
** Les valeurs représentent la moyenne d'au moins 4 expériences
indépendantes l'erreur relative est de ±6%.

DETECTION DE MATERIEL IMMUNOGENIQUE (CROSS-REACTING MATERIAL; (CRM»
R
DANS L'EXTRAIT CELLULAIRE DES MUTANTS Dga , ga1k D'ALLELE NUL
(c)
Souches
*Extrait cellulaire
Sérum
Extrait cellulaire de V6(b)
cellulaire de
Activité ga1actokinasique
(lJl)
antiga1actokinase
(u
(lJ 1)
(4 mg/ml)
(u
(lJ 1)
(4 mg/ml)
A
B
V6 (a)
100
150
0
**10.0±0.6
100±6
GALK1
100
150
100
92.0±5.5
97.0±5.8
GALK2
100
150
100
95.0±5.7
96.0±5.7
GALK4
100
150
100
97.0±5.8
98.0±5.8
GALK5
100
150
100
94.0±5.6
96.0±5.7
GALK6
100
150
100
93.0±5.5
95.0±5.7
GALK7
100
150
100
96.0±5.7
97.0±5.8
GALK8
100
150
100
90.0±5.4
94.0±5.6
GALK9
100
150
100
89.0±5.3
91.0±5.4
GALKlO
100
150
100
94.0±5.6
97.0±5.8
GALKll
100
150
100
96.0±5.7
100 ± 6
V6
100
150
100
**98.0±5.8
212 ± 12
.. _.,--,~..----,
_ ._ .,--,~..- - - -
_ .

77
Tableau 12
Liste non-exhaustive de variants résistants aux médicaments.
(Wright et al., 1980).

TABLEAU 12
Agent sélectif
Fonction altérée
Référence
Alcool Allyl
Alcool déshydrogénase
Thirion et Talbot, (1978).
Amphotericine B
Synthèse de cholestérol
Hidaka et al. (1978).
S-aspartylhydroxamate
Asparagine synthétase
Gantt et al. (1980).
5-azacytidine
Différentiation cellulaire
Ng et al. (1977),
Taylor et Jones (1979).
Azetidine
Biosynthèse de proline
Wasmuth et Caskey (1976).
Canavanine
Argininosuccinate synthétase
Jacoby (1978).
2-déoxygalactose
Galactokinase
Claverie et al. (1979).
Toxine-diphtérique
Moehring et Moehring (1977)
Emetine
Gupta et Siminovitch (1977,
1978a, b; 1980).
Cryptop1eurine
Synthèse des protéines
Il
11
protéines
Trichodermine
"
"
Boersma et al. (1979)
"
Tylocrebrine
"
"
Reichenbecher et Caskey
"
(1979) •
B1astidine S
"
"
Kuwano et al. (1977).
"
Cycloheximide
"
"
PBche et al. (1975).
"
5,6,dichloro-l-S-D
Synthèse de RNA
Gupta et Simminovitch (1980
Ribofuranosyl
"
"
"
"
Benzimidazole
"
"
"
"
Ethionine
Menadione réductase
Caboche (1976).
Fluorocitrate
Aconitase
Wright (1975).
25-hydroxycholestéro1
HMG-CoA réductase
Sinensky et al. (1979 a, b)
8-azaguanine
HPRT
Szybalski (1958).
ou
6-thioguanine

Agent sélectif
Fonction altérée
Référence
2-6 diaminopurine
APRT
Lieberman et Ove (1960).
6-méthy1thiopurine
"
"
"
ribonuc1eoside
Tubercidine
Adénosine kinase
Chan et al. (1973),
IshU et Green (1973).
Toyocamycine
"
"
Bennett et al. (1966),
"
Bennett et al.
McBurney et Whitmore (1975),
Gupta et Simminovitch
(1978(c»,
Rabin et Gottesman (1979).
5,Bromodéoxyuridine
Thymidine kinase
Kit et al. (1963),
(BrdUrd)
Clive et al. (1972).
Cytosine arabinoside
Déoxycytidine kinase
Déschamps et al. (1974),
(Ara-C)
De Saint Vincent et Buttin
(1973).
M:ethotrexate
Déhydrofo1ate réductase
Fischer (1962),
Litt1efie1d (1969).
flydroxyurea
Ribonuc1éotide réductase
Wright et Lewis (1974).
a-amanitine
RNA po1ymerase II
Chan et al. (1972),
Amati et al. (1975).
:olchicine
Protéines membranaires
Till et al. (1973),
et
Ling et Thompson (1974).
)uaba!ne
1ethy1g1yoxy1-bisguany1-
Transport de polyamine
Mandel et F1intoff (1978).
hydraxone
l-méthyornithine
Ornithine décarboxylase
Mamont et al. (1978).
)ligomycine et ventu-
Phosphory1ation oxydative
Lagarde et Siminovitch
ricidine
(1979) •
lydroch1oride procaine
Membrane plasmique
Yau et al. (1979).
l'unicamycine
Biosynthèse de glycoprotéine
Sudo et Onodera (1979).
membranaire
Tirus
Inconnue
Taber et aL (1976 a, b) ,
b).

80
Figure 9
Pédigrée des souches de type sauvage et des mutants résistants
au 2-déoxygalactose.
Les cellules ont été mutagénéisées selon la mé-
thode décrite par Thirion et al. (1976).
La souche V6IP est auxotrophe
pour inositol et proline (LABRECQUE et TRIRION, 1977). Les souches
Hpt13 et Tyk6 sont respectivement déficientes pour l'enzyme hypoxanthine
phosphoribosyltransférase (RPRT) et la thymidine kinase (TK) (TRIRION
et al. (1976);
CLAVERIE et al. (1979).
Les lignées cellulaires DR2,
Tyk6C RlS et Tyk6DC
sont partiellement résistantes au 2-déoxygalactose.
SRlS
S
4
Les souches GALK sont résistantes à 8 mg/ml de 2-déoxygalactose.

PEDIGREE DES SOUCHES
V79
(FORD ET YERGANIAN 1958)
1
CLONAGE
V6
1
MUTAGENESE
1
MUTAGENESE
V6IP
MUTAGENESE
(ino--pro-}
1
Hpt13 (HPRT-}
MUTAGENESE
Tyk6 (TK-)
A
1
A
MUTAGENESE
GALKIO
GALK11
MUTAGENESE
DR2
Tyk6C5R15
Tyk6DC4
MUTAGENESE
MUTAGENESE
MÙTAGENESE
GALKI GALK4 GALK5 GALK6 GALK7
GALK2
A
GALKI GALK4 GALK5 GALK6 GALK7
GALK2
GALK8 GALK9

82
Figure la
50 clones résistants au 2-déoxygalactose ont été isolés à partir
des cellules mutagénéisées de la souche DR2 selon la méthode décrite au
chapitre (Matériel et méthodes).
L'activité spécifique de la galacto-
R
kinase dans l'extrait de ces clones Dga
est exprimée en % de l'acti-
vité de la souche DR2.

----------
-------
Distribution de l'activite galactokinasique dans la population des clones
resitants résistants au 2-Deoxygalactose
50
40
w
U
Z
w
::>
30
d
w
a:
LL
20
15%
10%
10%
10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ACTIVITE SPECIFIQUE DE LA GALACTOKINASE (%)

84
Figure Il
Courbe d'inactivation en 2-déoxygalactose des souches: Hpt13 (e),
Tyk6DC
(0), GALK7 (ô).
500 cellules environ sont ensemencées dans des
4
disques de 6 cm de diamètre en présence de milieu DMEM, 10% FCS conte-
nant différentes concentrations de 2-déoxygalactose.
Après 7-14 jours
d'incubation à 37°C, les clones sont fixés au méthanol-acide acétique
(3:1 v/v), colorés au bleu de méthylène et comptés.

100 ..k---r-~----fr-------""'t']
10
CI)
~
Z
<t
>
->a:
~
1
w
Cl
?fi
0.1
3
6
15
30
2-DEOXYGALACTOSE (mM)

86
Figure 12
Effet cytotoxique du 2-déoxygalactose sur les cellules de type
4
sauvage V6.
10
cellules environ ont été ensemencées dans des disques
de 6 cm en présence de 5 ml de milieu DMEM, 10% FCS (Figure l2A) et
DMEM, 10% FCS et 8 mg/ml de 2-déoxygalactose (figure l2B).
Les photos
oC.
o
sont prises après 4 jours d'incubation à 37 C.

.a
b

88
Figure 13
Courbe d'immuno-inhibition de l'activité ga1actokinasique dans
l'extrait des cellules de type sauvage V6.
(____.) inhibition de
l'activité ga1actokinasique dans l'extrait des cellules V6 par le sérum
de lapin antiga1actokinase d'hamster chinois.
Effet du sérum de lapin
antiga1actokinase d'hamster chinois sur: (~) l'enzyme RPRT des
cellules V6 et (~) la ga1actokinase des cellules L de souris (LMTK).
Sérum de lapin non-immun sur la ga1actokinase des cellules de V6 (o---e).

100 r~:::::~~:::::::===~----o
W
-1
<!
-
....
-
z-w::>
o
-CI)<!
Z
-~
o
....
CJ
50
<!
-1
<!
Cl
w
....
->-
....
CJ
<!
-Cl
~
10
50
100
150
SERUM (IJI)

1
J
CHAPITRE IV
Caractérisation immunologique des révertants
des cellules Hpt-13 déficientes pour
l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase
+
Evidence pour des mutations de structure au locus hpt

1
!!
RESULTATS
!
1
(1
!
Marengo et al. (1981) ont isolé des révertants des cellules
\\
Hpt-13 déficientes pour l'hypoxanthine phosphoribosyl transférase
1
(HPRT).
Certains de ces révertants sont spontanés; d'autres ont été
induits soit par le sulfonate d'éthyl méthane (EMS) soit par les parti-
cules incomplètes d'adénovirus type 2.
De plus, ils définissent deux
classes en fonction de la mobilité électrophorétique de leurs enzymes
RPRT.
Certains comigrent avec l'enzyme de type sauvage et les autres
migrent plus vite.
Nous avons caractérisé par analyse immunologique
sept révertants: S19, S30, B3-l, B3-2, ad7A, ad14 et RV25, représentant
les deux classes, afin de montrer que l'enzyme RPRT révertant est bien
de type hamster-chinois et ne provient pas d'une autre source, comme,
par exemple, d'une infection de mycoplasme ou d'un transfert du DNA
humain de HeLa (Marengo et al., 1981). Par conséquent, comme dans le
+
,
chapitre précédent avec le locus galk , les revertants sont le résultat
de mutations dans le gène de structure de l'enzyme hypoxanthine phos-
+
phoribosyl transférase hpt •
Caractéristiques des révertants:
1
!11
Tous les révertants étudiés ont été obtenus à'partir de la sou-
~
che GALK1, un mutant résistant à la 8-azaguanine et au 2-déoxygalactose
et dépourvu de toute activité hypoxanthine phosphoribosyl transférasique
1
transférasique
i
(HPRT) et galactokinasique détectables.
Les souches S19 et S30 sont
1
sont
!1
1
1

92
des revértants spontanés; B3-l, B3-2 sont induits par le sulfonate d'éthyl
méthane (EMS); ad7A, ad14 par des particules incomplètes d'adénovirus
type 2 (ad2) et RV25 par la particule incomplète ts4 d'ad2.
Ils défi-
nissent deux classes en fonction de la migration électrophorétique de
l'enzyme HPRT; les enzymes de B3-2 et ad14 comigrent avec celui de
V6 (type sauvage); ceux des autres mutants migrent plus vite.
Immunoprécipitation de l'activité de l'enzyme HPRT dans les cellules
des révertants:
Afin de montrer que les enzymes HPRT des revertants sont de type
hamster-chinois, les extraits cellulaires ont été préparés, incubés avec
du sérum anti HPRT d'hamster chinois et l'activité de l'enzyme HPRT
mesurée.
6
Pour chaque essai 5Xl0
cellules en phase logarithmique ont été
lavées, resuspendues dans 1 ml de tampon d'extraction (10 mM de Tris-
HCl, pH 7.4, 10 mM de MgC1 , 30 mM de KCl, 0.5% Triton X-lOO, 1 mM de
2,
2
0C
0
dithiothréitol), incubées à 4 C pendant 15 minutes, centrifugées pendant
90 minutes à 95000 xg et le surnageant recueilli.
La quantité de pro-
téine a été déterminée par la méthode BioRad (Technical bulletin 1050).
250 ~g de protéine cellulaire ont été ajoutés à 10 ~l ou 60~1 de sérum
de mouton anti HPRT d'hamster chinois (fourni par Raymond G. Fonwick,
Baylor College of Medicine, Houston) dilué 1:10.
Le volume a été com-
plété à 250 ~l avec 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4.
Les tubes ont été incu-
0C
0
oC.
o
bés pendant 30 minutes à 20 C et ensuite l6h à 4 C.
15 ~l de sérum de

93
lapin anti IgG de mouton (Miles-Yeda) dilué 1:10 ont été ajoutés dans les
tubes pour précipiter le complexe antigène-anticorps (Ag-Ac) et l'excès
0C
0
d'anticorps.
Les tubes ont été ensuite incubés 4h à 4 C et centrifugés
oC.
o
à 13000 xg pendant 15 minutes à 4 C.
L'activité de l'hypoxanthine phos-
phoribosyltransférase dans les surnageants a été mesurée, tel que décrit
à la section Matériel et Méthodes. L'activité enzymatique initiale dans
les extraits cellulaires a été mesurée dans les tubes "contrôles" dans
lesquels le sérum immun a été remplacé par du sérum normal de mouton.
Ces résultats sont présentés à la figure 14.
Le sérum normal
n'inhibe pas l'activité RPRT dans les cellules de type sauvage V6. Par
contre, le sérum immun bloque l'activité RPRT dans tous les clones testés,
mais ne précipite pas l'RPRT dans les cellules humaines HeLa (expérience
préliminaire), ce qui indique que les enzymes HPRT présents dans les
révertants sont bien de type hamster-chinois.
Ils ne proviennent donc
pas d'autres sources (mycoplasme, Hela etc).
Ils résultent de mutation
dans le gène de structure de l'enzyme HPRT puisque les différences élec-
trophorétiques impliquent des mutations dans le gène de structure.

94
Figure 14
Courbe d'immuno-inhibition de l'activité de l'enzyme hypoxan-
thine phosphoribosyltransférase (RPRT) dans l'extrait des cellules de
type sauvage et des révertants.
(0
0) effet du sérum de mouton non-immun sur l'RPRT des
cellules de type sauvage V6.
Inhibition de l'activité de RPRT dans
l'extrait des cellules par le sérum de mouton anti RPRT d'hamster chi-
nois: (e---e) V6; (~ ) B3-l; (~ ) ad14; (6---6) B3-2; (~ )
RV25; (.---.) ad7A; (~)S30; (~S19.
Les révertants: B3-l,
B3-2 sont induits par l'EMS; ad7A, ad14 par des particules incomplètes
d'ad2; RV25 par des particules incompletes d'ad2ts4 SI9 et S30 sont
des révertants spontanés.

1
1
l
100~~-o-
f
100~~-o-
-o
1
1
vs (W.T) !
1
1
1
1
1
1
[
1
LU
~
<X:
-
1
-~-
!
~
i
-
Z
-~CCe,~
530
::I:
50
LU
83-2
~
-
>
ad 14
-
>
83-1
-~
o
VS (W.T)
u
<X:
-.
0
5 19
?fl.
ad 7A
RV 25
10
60
SER UM< Jt!b

1
1
1
l
1
t
1
,
1
1
1
!
DISCUSSION ET CONCLUSION

97
i
Nos études ont porté sur trois types de mutants: les mutants
affectés au niveau du complexe l de la chaine d'oxydation phosphorylative,
de la galactokinase et de l'RPRT.
r
!
Nous avons présenté dans une première partie, les caractéristi-
ques biochimiques et génétiques de cinq mutants de phénotype GAL
et
1
et
!
leur comparaison avec d'autres mutants représentant les sept groupes de
!
1
complémentation identifiés par Scheffler.
Quatre de ces cinq mutants:
1
A13G9, 34A13G3Z, ZA13G14 et V6IG1S ont les propriétés suivantes: un
1
faible taux respiratoire, un phénotype GAL
(figure Z) une activité du
!
cycle de Krebs réduite, une lésion au niveau de complexe l de la chaIne
1
,
;
d'oxydation phosphorylative, et un taux réduit de production de COZ à
1
l,
.
14
14
14
part1r de: pyruvate-I-C
,pyruvate-Z-C
,S-hydroxybutyrate-3-C
,
14
14
glutamate-S-C
et aspartate-4-C

Ce taux est respectivement de 6-Z0%;
1
1
4-1Z%; ll-SO%; 10-ZS% et Zl-78% de celui des cellules de type sauvage.
!
14
Par contre, le taux de production de COZ à partir du pyruvate-l-C
par
les 3S mutants isolés par Scheffler est moins de 1% ce qui suggèreraient
1
que les deux méthodes de sélection pourraient conduire à des mutations
1
à des loci différents menant à des phénotypes différents.
t
1
Cette hypothèse est supportée par le fait que les mutants A13G9,
34A13G3Z et V6IG1S définissent deux nouveaux groupes de complémentation
et que le mutant P1ZGXI diffère des autres mutants.
Le taux respiratoire,
l'activité du cycle de Krebs, la production de COZ à partir de différents
substrats et l'activité de la chaine respiratoire des électrons de ce
dernier ne diffèrent pas de façon significative de ceux des cellules de

98
1
!
type sauvage.
Ce mutant serait probablement affecté au niveau du succinate
déshydrogénase puisqu'il ne complémente pas le mutant CCL16-B9 du groupe
IV.
De plus, les quatre mutants du complexe l
(A13G9, 34A13G32, 2A13G14
et V6IG15) n'ont pas une activité appréciable en NADH oxydase sensible
à la roténone.
Ceci entraînerait probablement une accumulation du NADH
dans les mitochondries, et donc une rétro-inhibition des étapes généra-
trices de NADH du cycle de Krebs et réduirait donc les différentes acti-
vités de ce cycle.
Le mutant 2A13G14 ne complémente pas les mutants
l
mutants
f
des groupes II, VI et V79-G20 tandis que les trois autres (A13G9, 34A13G32
et V6IG15) définissent deux nouveaux groupes de complémentation (VIII et
IX).
Ces mutations définissant quatre groupes de complémentation affec-
tant le complexe l, ce nombre de groupe de complémentation n'est pas
surprenant si l'on se refère par exemple à la structure du complexe l
des mitochondries des cellules de boeuf.
Ce dernier contient au moins
16 polypeptides (DOOIJEWAARD et al., 1978; RAGAN, 1976). Les mutants
de type "chevauchant" comme 2A13G14 et V79-G20 isolé par Scheffler
(SODERBERG et al., 1979) et quelques-uns de Chu (CHU et al., 1972) sont
inhabituels en génétique.
Ces types de mutants pourraient être: soit
tous liés, soit des mutants polaires comme ceux de l'opéron lactose de
E.coli, des mutants de régulation ou des mutants à la jonction entre un
intron et un exon.
En effet, si on considère que la structure de deux
gènes liés de cellules de mammifères est: Exon-jonctions-intron-jonction
2 pour le premier gène et Exon-jonction 3-intron-jontion 4 pour le
second, alors une mutation à la jonction 2 pourrait entraîner l'épissage
avec la jonction 4, résultant en une délétion du mRNA correspondant à la
région jonction 1- jonction 4.

99
Les souches A13G9, 34A13G32, 2A13G14 et V6IG15 ont les propriétés
de véritables mutants: leur fréquence d'apparition est augmentée après
mutagénèse au sulfonate d'éthyl méthane (THIRION et al., 1976); le phé-
notype GAL
est stable après de nombreuses générations en absence de
sélection; ces cellules ont une altération de fonction spécifique au
niveau de la chaine respiratoire des électrons et ces mutations peuvent
être classer en groupes de complémentation.
Les mutations décrites précédemment sont très importantes pour
l'étude des fonctions mitochondriales, mais ne peuvent pas être consi-
dérées comme spécifique pour le métabolisme du galactose.
Notre deu-
xième étude a donc été faite sur des mutants affectant la galactokinase.
+
Nous avons montré que des mutants galk d'allèle nul pour le locus galk
peuvent être isolés.
~'analyse des cellules hybrides (Dga~gaS) entre
R
les mutants Dga
galk d'allèle nul et les cellules de type sauvage sen-
S
+
sible au 2-déoxygalactose, Dga , galk
a révélé que les allèles galk
+
sont récessifs par rapport à l'allèle de type sauvage galk • Le locus
pour la galactokinase serait synthénique avec le locus autosomal thymi-
.
+
dine k1nase (tyk ) (McBRIDE et al., 1978).
Nous avons donc montré que
des marqueurs récessifs à un locus autosomal peuvent être isolés dans
des cellules diplo!des. Ces résultats sont confirmés par des résultats
antérieurs: des mutations récessives ont déjà été isolés pour d'autres
marqueurs: des mutants auxotrophes (McBURNEY et WHITMORE, 1974; PATTERSON,
1975; MEUTH et al., 1979); des mutants de résistance à la lectine (WRIGHT,
1973; STANLEY et al., 1975(a), 1975 (b); STANLEY et SIMINOVITCH, 1977;
JACOBY, 1978) à la 2,6 diaminopurine (JONES et SARGENT, 1974; CHASIN ,

100
1974), et à la 8-azaguanine (BEAUDET et al., 1973; SHARP et al., 1978).
Ces mutations autosomales récessives suggèrent que les cellules de
hamster chinois et probablement les cellules des autres mammifères de-
viennent fonctionnellement hémizygotes au cours de leur évolution en
culture (KAO et PUCK, 1967; 1968).
Donc les différents loci à partir
desquels une mutation conduit à la résistance au 2-déoxygalactose peuvent
exister comme d'uniques copies fonctionnelles dans la lignée cellulaire
diplo!de; c'est le cas pour la résistance à l'émétine (GUPTA et al.,
R,
R
1978, CAMPBELL et WORTON, 1979).
Ces mutants Dga , galk d'allèle nul
résultent de mutations dans le gène de structure de la galactokinase.
Ceci est un résultat important car il montre l'existence de gènes de
structure.
Certains mutants dépourvus d'activité hypoxanthine phospho-
ribosyltransférase (RPRT) et résistantes à la 8-azaguanine (BEAUDET
+
et al., 1975; CASKEY et KRUH, 1979; EISPSTEN et al., 1979) sont CRM .
Par conséquent, les phénotypes RPRT- et GALK- résultent de mutations
dans les gènes de structure des enzymes correspondants.
A noter que
d'autres mutants RPRT
ne contenaient pas de matériel immunologique
anti HPRT (i.e. RPRT-, CRM-) (BEAUDET et al., 1973; WAHL et al., 1975).
R
Nous n'avons pas isolé de mutants Dga
CRM
parmi les 10 mutants galk
t
d'allèle nul analysés pour plusieurs raisons: soit que nous n'avons pas
r
analysé assez de mutants, soit que les mutations galk CRM- sont léthales.
1
-
+
Comme avec les mutants RPRT
CRM
des cellules de souris L, qui ne se
1
R,
R
complémentent pas (WAHL et al., 1975), nos dix mutants Dga , galk d'allèle
+
nul, CRM
définissent eux aussi un seul cistron.
Ceci confirme les ré-
1
sultats obtenus que
la galactokinase qui est une protéine monomérique
~i1

Ml
(TALBOT et THIRION, 1982).
Il est donc normal que différentes mutations
affectant un seul polypeptide ne se complémentent pas.
Ce résultat
,
confirme les observations de Whitfield et al. (1978); avec les cellules
"
ovariennes d'hamster chinois (CHa) dont les mutants complètement résis-
tants au 2-déoxygalactose ne complémentent pas les mutations partielle-
ment résistantes.
1
R
En résumé nos résultats montrent que: le phénotype Dga
survient
1
f
spontanément et au hasard dans les cellules avec un taux de mutation de
1
-s
,
-s
la
par cellule par génération, la fréquence d'apparition des clones
résistants augmente après mutagénèse au sulfonate d'éthyl méthane; les
mutants sont affectés dans l'activité galactokinasique (THIRION et al.,
1976; CLAVERIE et al., 1979).
Les allèles ~alk sont récessifs par
+
rapport à l'allèle de type sauvage galk ;
ces
mutations sont dans
le gène de structure de la galactokinase; les mutations galk définissent
un seul cistron.
!
De la même façon, la dernière partie de notre travail porte sur
les mutations au locus Hpt13.
Nos résultats montrent que les reversions
1
des cellules Hpt-13 déficientes pour l'hypoxanthine phosphoribosyltrans-
1
férase (RPRT) et induites par l'adéno 2 résultent également de mutations
dans le gène de structure de l'RPRT et que ces mutations sont de même
t
1
type que celles induites par l'EMS.
Nous (RAPTIS et al., 1982) avons
i1
vérifié que les clones revertants ne contiennent pas de séquences d'ADN
d'adénovirus type 2 (ad2).
Nous en concluons donc que les mutations
1
observées au locushpt13 ne nécessite pas l'intégration stable de l'ADN
1
d'ad2.
Ceci confirme les résultats observés avec l'adénovirus type S
!~
1

102
(BELLETT et YOUNGHUSBAND, 1979).
Nos résultats diffèrent cependant
des résultats obtenus avec les mutants induits par le virus SV40 qui
contiennent l'ADN du virus SV40.
Il est donc fort probable que le
SV4Q et l'ad2 induisent des mutations dans les cellules par des méca-
nismes différents ou encore que l'intégration stable de SV40 est indé-
pendante de son effet mutagénique.
Tous ces résultats combinés avec
ceux déjà publiés (MARENGO et al., 1981) indiquent quelques propriétés
intéressantes de la mutation hpt13 et des propriétés mutagéniques pour
l'ad2.
La mutation hpt13
a la propriété de donner après infection avec
ad2, deux classes de révertants qui diffèrent l'une de l'autre par la
mobilité électrophorétique de leur enzyme RPRT.
L'une migre comme le
type sauvage; l'autre migre plus vite (point isoélectrique plus bas),
son activité spécifique n'est que de 2.5% environ de celle du type
sauvage (MARENGO et al., 1981).
Elle est immunologiquement semblable
à la première.
Ces résultats indiquent donc que cette dernière classe
de révertants résulte probablement d'une mutation intracistronique
supprimant le phénotype mutant et que hpt13 est une mutation dans le
+
gène de structure hpt , très probablement une mutation ponctuelle dont
la réversion peut être induite par infection avec l'ad2.
Les trois classes de mutants étudiées dans cette thèse sont
très importantes pour la génétique des cellules somatiques de mammi-
fères.
Elles constituent une première étape dans l'étude de l'organisa-
tion du génome des mammifères.
Les mutants affectés au niveau du complexe l fournissent le

103
moyen d'étudier les fonctions mitochondriales.
Les différents groupes
de complémentation des mutations affectant le même complexe enzymatique
offrent la possibilité d'étudier des gè~es fonctionnellementliés et le
contrôle de l'expression de tels gènes,.
Ils constituent des systèmes
très intéressants pour l'étude du métabolisme dans les cellules en cul-
ture, de la biogénèse et de l'interaction des produits des gènes nu-
cléaires et mitochondriaux.
R
Le marqueur Dga
est très utile pour étudier l'expression géné-
tique dans les cellules eucaryotes, comme en témoignent les récents tra-
vaux de SchUmperli et al. (1982) qui ont utilisé la souche GALKl un de
R,
R
nos mutants Dga , galk d'allèle nul pour étudier l'expression du gène
de la galactokinase de E. coli dans les cellules de mammifère galk-.
La souche hpt13 est le premier indicateur permettant de détecter
les mutations induites de type EMS comme en témoignent nos études sur
l'adénovirus.
Elle est pour l'instant l'équivalant des souches bacté-
riennes (AMES et al., 1972) pour tester les produits mutagènes à la
Ames (McCANN et al., 1975), mais ~vec des cellules somatiques au lieu
des bactéries.
Naturellement, les mutations induites par adénovirus
détectées avec hpt13 pourraient représenter seulement une classe de
telles mutations, adénovirus peut aussi bien induire d'autres types de
mutations qui ne sont pas encore détectés faute de souches indicatrices
convenables.

104
ANNEXE rl
LISTE DES ABBREVIATIONS
Ag-Ac
Complexe antigène-anticorps
Antigalk
Antigalactokinase
Anti IgG
Anti-immunoglobulines
BrdUrd
5-bromodéoxyuride
CRM
"cross-reacting material" (Matériel immunogénique)
DFCS
Sérum de veau fétal dialysé
Dga
2-déoxygalactose
R
Dga
Résistant au 2-déoxygalactose
S
Dga
Sensible au 2-déoxygalactose
DMEM
Milieu de Eagle avec la modification de Dulbecco
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Acide éthylène diamine tétraacétique
EMS
Sulfonate d'éthyl méthane
FCS
Sérum de veau fétal
GAL
Galactose
GALK
Galactokinase
Le gène de la galactokinase
HAT
Hypoxanthine (0.1 mM); thymidine (0.016 mM) et thymidine
(5.5 \\lM)
RPRT
Hypoxanthine phosphoribosyltransférase
Le gène de RPRT
1
i,
Milieu essentiel minimal (contient 1 mg/ml de glucose)
Milieu essentiel minimal (contient 1 mg/ml de
!
NADH
Nicotinamide-adénine dinucléotide

PBS
Tampon phosphate salin
PEG
Polyéthylène glycol 1000 (PEG)
P:V
Poids par volume
TCA
Acide trichloroacétique
TK
Thymidine kinase
tyk
Gène de la thymidine kinase
v:v
volume:volume

108
BIBLIOGRAPHIE
ADHYA, S.L. et J.A. SHAPIRO. (1969). The galactose operon of E. coli K12.
Genetics 62: 231-247.
AMATI, P.; BLASI, F.; DIPORZIO, U.; RICCIO, A. et TRABONI, C. (1975).
Hamster a-amanitin resistant RNA po1ymerase II able to transcribe
po1yoma virus genome in somatic ce11 hybrids.
Proc. Nat1. Acad.
Sei. U.S.A. 72: 753-757.
AMES, B.N.; E.G. GUERNEY, J.A. MILLER et H. BARTSCH. (1972). Carcinogens
as frameshift mutagens: Metabolites and derivatives of 2-acety1-
aminof1uorene and other aromatic carcinogens.
Proc. Nat1. Acad.
Sei. U.S.A. 69: 3128-3132.
BAKER, R.M. (1979). Nature and use of ouabain-resistant mutants. Dans
Banbury report 2. Edité par A.W. Hsie, J.P. ONei11 et V.K.
1
McEihney, Co1d Spring Harbor Laboratory, New York. pp: 237-247.
!
1
BAKER, R.M.; BRUNETTE, D.M.; MANKOVITZ, R.; THOMPSON, L.H.; WHITMORE,
t!
G.F.; SIMINOVITCH, L. et TILL, J.E. (1974). Ouabain-resistant
!
Ouabain-resistant
mutants of mouse and hamster ce11s in culture. Ce11 1: 9-21.
1
t
BANVILLE, D. (1977).
Isolement et caractérisation de mutants ga1acto-
kinase- résistants au 2-déoxyga1actose.
Mémoire de Maîtrise-ès-
1
Science, Faculté de Médecine, Université de Sherbrooke. pp. 23-26.
BASSEL, J. et MORTIMER, R. (1971). Genetic oder
of the galactose struc-
tura1 genes in Saccharomyces cerevisioe. J. Bacterio1. 108: 179-
1
i
183.
1
~
1

109
BEAUDET, A.L.; D.J. ROUFA et C.T. CASKEY. (1973). Mutations affecting
the structure of hypoxanthine: guanine phosphoribosyltransferase
in cultured chinese hamster cells.
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.
70: 320-324.
BELLETT, A.J.D., et H.B. YOUNGHUSBAND. (1979). Spontaneous, mutagen-
induced and adenovirus induced anchorage inde pendent tumorigenic
variants of mouse cells.
J. Cell. Physiol. 101: 33-48.
BENNETT, L.L. Jr.; SCHNEBLI, H.D.; VAIL, M.H.; ALLAN, P.W. et MONTGOMERY,
J.A. (1966).
Purine ribonucleoside kinase activity and resis-
tance to some analogs of adenosine. Mol. Pharmacol. 2: 432-443.
BERKALOFF, A., JACQUES BOURGUET, PIERRE FAVARD et JEAN-CLAUDE LACROIX.
(1978). dans Biologie et physiologie cellulaires II.
Cellules
et virus. Edition Hermann. pp: 109-118.
BOERSMA, D.; McGILL. S.; MOLLENKAMP, J. et ROUFA. D.J. (1979). Emetine
resistance in cbinese hamster cells. Analysis of ribosomal pro-
teins prepared from mutant cells. J. Biol. Chem. 254: 559-567.
BREEN, G.A.M.; et SCHEFFLER, I.E. (1979). Respiration-Deficient-chinese
hamster cell mutants: Biochemical characterization. Somat. Cell.
Genet. 5: 441-451.
CABOCHE, M. (1976). Methionine metabolism in BHK cells: Selection and
characterization of ethionine resistant clones. J. Cell. Physiol.
87: 321-336.
CAMPBELL, C.E. et WORTON, R.G.
(1979). Evidence obtained by induced
mutation frequency analysis for functional hemizygosity at the
emt locus in CHa cells.
Somat. Cell. Genet. 5: 51-65.
CASKEY, C.T. et KRUH, G.D. (19791. The RPRT Locus. Cell 12: 371-381.

110
CHACKO, C.M.; L. McCRONE et H.L. NADLER. (1972). A study of ga1actokinase
galactokinase
and glucose-4-epimerase from normal and ga1actosemic
galactosemic skin fibro-
b1asts.
blasts. Biochim. Biophys. Acta. 284: 552-555.
CHAN, T.; ISHII, K.; LONG, C. et GREEN, R. (1973). Purine excretion by
mamma1ian
mammalian ce11s
cells deficient in adenosine kinase. J. Ce11.
Cell. Physio1.
Physiol.
81: 315-322.
CHAN, V.L.; WHITMORE, G.F. et SIMINOVITCR, L. (1972). Mamma1ian
Mammalian ce11s
cells
with a1tered
altered forros of RNA po1ymerase
polymerase II.
Proc. Nat1.
Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 69: 3119-3123.
CHASIN,
.A. (1974). Mutations affecting adenine phosphoribosy1transferase
phosphoribosyltransferase
activity in chinese hamster ce11s.
cells. Ce11
Cell 2: 37-41.
CHU, E.R.Y. (1974). Induction and ana1ysis
analysis of gene mutations in cu1tured
cultured
mamma1ian
mammalian somatic ce11s.
cells. (Symposium on mutagenesis XIII, Inter-
national Congress of Genetics).
Genetics 78: 115-132.
CHU, E.R.Y., SUN, N.e.; et CHANG, C.C. (1972). Induction of auxotrophic
mutations by treatment of chinese hamster ce11s
cells with 5-bromo-
deoxyuridine and black 1ight.
light.
Proc. Nat1.
Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69:
3459-3463.
CLAVERIE, J.M.; C.A. de SOUZA; J.P. TRIRION. (1979). Mutations of
chinese hamster somatic ce11s
cells from 2-deoxyga1actose
2-deoxygalactose sensitivity
to resistance. Genetics: 92: 563-572.
CLIVE, P.; FLAMM, W.G.; MACHESKO, M.R. et BERNHEIM, N.J. (1972). A muta-
tiona1
tional assay system using the thymidine kinase locus in mouse
1ymphoma
lymphoma ce11s.
cells. Mutat. Res. 16: 77-87.
CORN, R.M. et S. SEGAL. (1973). Galactose metabo1ism
metabolism and its regu1ation.
regulation.
Metabo1ism
Metabolism 22: 627-642.

111
1
!
!~
CUATRECASAS, P. et S. SEGAL. (1966). Mammalian galactose dehydrogenase
fi
identification and purification in rat liver. J. Biol. Chem.
identification and purification in rat liver. J. Biol.
!
241: 5904-5909.
DAVIDSON, R.L. et P.S. GERALD. (1976).
Improved techniques for the induc-
1
rl
tion of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol.
1
Somat. Cell. Genet. 2: 165-176.
DeFRANCESCO, L.; SCHEFFLER, I.E. et BISSELL, M.J. (1976). A respiration-
deficient chinese hamster cell line with a defect in NADH-coenzyme
Q reductase. J. Biol. Chem. 251: 4588-4595.
DeFRANCESCO, L.; WERNTZ, D. et SCHEFFLER, I.E. (1975). Conditionally lethal
mutations in chinese hamster cells-characterization of a cell line
with a possible defect in the Krebs cycle. J. Ce11. Physiol. 85:
293-306.
DESCHAMPS, M.; De SAINT VINCENT, B.R.; EURARD, C.; SASSI, M. et BUTTIN,
G. (1974). Studies on l-B-D-Arabinofluranosyl-cytosine-resistant
mutants of chinese hamster fibroblasts. II. High resistance to
Ara-C as a genetic marker for cellular hybridization. Exp. Cell.
Res. 86: 269-279.
De SAINT VINCENT, B.R. et BUTTIN, G. (1979). Studies on l-B-D-Arabino-
furanosyl-cytosine resistant mutants of chinese hamster fibro-
blasts. III. Joint resistance to arabinofuranosyl cytosine and
to excess thymidine. A semi-dominant manifestation of deoxycyti-
dine triphosphate pool expansion. Somat. Cell. Genet. 5: 67-82.
De SOUZA, A.C. (1979). Etude somatiques spontanées résistantes au 2-déoxy-
galactose. Mémoire de maîtrise ès-science, Faculté de médecine,
Université de Sherbrooke: p. 20.
DITTA, G.; SODERBERG, K.; et SCHEFFLER, I.E. (1977). Chinese hamster
cell mutant with defective mitochondrial proteins synthesis. Nature
268: 64-66.

112
DONNELLY, M. and I.E. SCHEFFLER. (1976). Energy metabolism in respiration-
deficient and wild-type chine se hamster fibroblasts in culture.
J. Cell. Physiol. 89: 39-51.
DOOIJEWAARD, G., DeBRUIN, G.J.M.; Van DIJK, P.J. et BLATER, E.C. (1978).
Characterization of type-I NADH dehydrogenase polydispersity,
molecular weight and polypeptide composition. Biochem. Biophys.
Acta. 501: 458-469.
DOUGLAS, H.C. et HAWTHORNE, D.C.
(1966).
Regulation of genes controlling
synthesis of the galactose pathway enzymes in yeast. Genetics 54:
911-916.
DOUGLAS, H.C. et HAWTHORNE, D.C.
(1964). Enzymatic expression and genetic
linkage of genes controlling galactose utilization in Saccharo-
myces. Genetics 49: 837-844.
DULBECCO, R., et M. VOGT. (1954). Plaque formation and isolation of pure
lines with poliomyelitis viruses. J. Exp. Med. 99: 167-182.
EPSTEIN, J., GHANGAS, G.S.; LEYVA, A.; MILAN, G. et LITTLEFIELD, J.W.
+
(1979). Analysis of HGPRT- CRM
human lymphoblast mutants. Somat.
Cell. Genet. 5: 809-820.
FENWICK, R. et CASKEY, C. (1975). Mutant chinese hamster cells with a
1
thermosensitive hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase.
Cell 5: 115.
1
115.
1
f
FENWICK, R.G. Jr.; SAWYER, T.H.; KRUH, G.D.; ASTRIN, K.H. et CASKEY, C.T.
!
(1977). Forward and reverse mutations affecting the kinetics
1
and apparent molecular weight of mammalian HGPRT.
Cell 12:
383-391.
1
FISCHER, G.A. (1961). Increased levels of folie acid reductase as a

113
1
!
mechanism of resistance to amethopterin in leukemia cells. Biochem.
Pharmacol. 7: 75-77.
1
FORD, D.K. et YERGAGNlAN. (1958). Observations on the chromosomes of
i
r
chine se hamster cells in tissue culture.
J. Nat. Cane. Inst.
r
Inst.
1
f
21: 393-425.
FREEZE, E. (1971).
Chemical mutagens principles and methods for ~heir
detection. A. Hollander Ed., Plenum Press, New York!: 1-56.
GANTT, J.S.; CHIANG, C.S.; HATFIELD, G.W. et ARFIN, S.M. (1980). Chinese
hamster ovary cells resistant to B-aspartylhydroxamate contain
increased levels of asparagine synthetase. J. Biol. Chem. 255:
4808-4813.
GITZELMANN, R. (1967). Hereditary galactokinase deficiency, a newly
recognized case of Juvenile cataracts. Pediat. Res. 1: 14-23.
GITZELMANN, R. et STEINMANN.
(1973). Uridine diphosphate gal-4-epi-
merase deficiency II. Clinical follow-up, Biochemial studies and
family investigation. Helv. Poediat. Acta. 28: 497-510.
GOLDBERG, S. et V. DEFENDI (1979). Increased mutation rates in doubly
viral transformed chinese hamster cells. Somat. Cell. Genet. 5:
887-895.
GUPTA, R.S.; CHAN, D.Y.H. et L. SIMINOVITCH. (1978).
Evidence for func-
R
tional hemizygosity at the EMT
locus in CHa cells through segre-
gation analysis. Cell 14: 1007-1013.
GUPTA, R.S. et L. SIMINOVITCH. (1977) Mutants of CHO cells resistant to
the protein synthesis inhibitors cryptopleurine and tylocrebrine.
Genetic and biochemical evidence for common site of action of
emetine, cryptopleurine, tylocrebrine at tubulosine. Biochemis-

114
try 16: 3209-3214.
GUPTA, R.S. et SIMINOVITCH, L. (1978a). Genetic and biochemica1 charac-
terization of mutants of CHO ce11s resistant to the protein syn-
thesis inhibitor trichodermin. Somat. Ce11. Genet. 4: 355-375.
GUPTA, R.S. et SIMINOVITCH, L. (1978b). The isolation and characteriza-
tion of mutants of human dip10ïd fibrob1asts resistant to diph-
teria toxin. Proc. Nat1. Acad. Sei. U.S.A. 75: 3337-3340.
GUPTA, R.S. et SIMINOVITCH, L. (1978c). Genetic and biochemica1 studies
with the adenosine ana10gs toyocamycin and tubercidin: Mutation
at the adenosine kinase locus in chinese hamster ce11s.
Somat. Ce11. Genet. 4: 715-735.
GUPTA, R.S. et SIMINOVITCH, L. (1980). DRB resistance in chinese hamster
and human ce11s: Genetic and biochemica1 characteristics of the
selection system.
Somat. Ce11. Genet. 6: 151-169.
HARRIS, Morgan. (1971). Mutation rates in ce11s at different p10ïdy
1eve1s. J. Ce11. Physio1. 78: 177-184.
Hidaka, K.; ENnO, H.; AKIYAMA, S. et S.I. KUWAMO, M. (1978). Isolation
and characterization of amphotericin B-resistant ce11 1ines in
chinese hamster ce11s.
Ce11 14: 415-421.
IHLER, G. et RUPP, W.D. (1969). Strand-specifie transfer of donor DNA
during conjugation in ~ coli. Proc. Nat1. Acad. Sei. U.S.A. 63:
138-143.
ISHII, K. et GREEN, H. (1973). Letha1ity of adenosine for cu1tured mam-
ma1ian ce11s by Interference with pyrimidine biosynthesis. J.
Ce11. Sei. 13: 429-439.
JACOB, F. et J. MONOD. (1961). Genetic regu1atory mode1s in the synthesis

115
of proteins. J. Mol. Biol. 3: 318.
JACOBY, L.B. (1978). Canavanine-resistant variants of human lymphoblasts.
Somat. Cell. Genet. 4: 221-231.
JONES, G. et SARGENT, P.
(1974). Mutants of cultured chinese hamster
cells deficient in adenine phosphoribosyltransferase. Cell 2:
43-54.
KAO, F. et PUCK, T. (1967).
Genetics of somatic mammalian cells, IV.
Properties of chinese hamster cell mutants with respect to the
requirement for proline. Genetics~: 513-524.
KAO, F. et PUCK, T. (1968). Genetics of somatic mammalian cells chinese
hamster cells. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 60: 1275-1281.
KIT, S.; DUBBS, D.R.; PIEKARSKI, L.J. et HSU, T.C. (1963). Deletion of
thymidine kinase activity from L cells resistant to bromodeoxy-
uridine. Exp. Cell. Res. 1!: 297-312.
KREBS, H.A. (1970). The history of the tricarboxylic acid cycle.
Pers-
pect. Biol. ~red. 14: 154-170.
KUWANO, M., MATSUI, K., TAKENAKA, K.; AKlYAMA, S. et ENDO, H. (1977).
A mouse leukemia cell mutant resistant to blastidin S. Int. J.
Cancer 20: 296-302.
LABRECQUE, R. et J.P. THIRION. (1977). Action of FdUrd and dcyd on the
incorporation of BrdUrd in chinese hamster somatic cell DNA and
the isolation of auxotrophic mutants. J. Cell. Physiol. 90: 321-
328.
,
LAEMANLI, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227: 680-685.
1

116
LAGARDE, A.E. et SIMINOVITCH, L. (1979). Studies on chinese hamster ovary
mutants showing multiple cross-resistance to oxidative phosphory-
1ation inhibitors. Somat. Ce11. Genet. 5: 847-871.
LEHNINGER, A.L. (1970). dans Biochemistry. 2e Ed. Worth Pub1ishers, Inc.
pp. 443-473.
LELOIR, L.E. (1951). Enzymatic transformation of uridine diphosphate
glucose into galactose derivative. Arch. Biochem. Biophsy. 33:
186-190.
LIEBERMAN, I. et OVE, P. (1960). Enzyme studies with mutant mammalian
cel1s. J. Biol. Chem. 235: 1765-1768.
LING, V. et THOMPSON, L.H.
(1974).
Reduced permeability in CHO cells
as a mechanism of resistance to colchicine. J. Cell. Physio1.
83: 103-116.
LITTLEFIELD, J.W. (1964). Selection of hybrids from mating of fibrob1asts
in vitro and their presumed recombinants. Science 145: 709-710.
LITTLEFIELD, J.W.
(1969). Hybridization of hamster cel1s with high and
low folate reductase activity.
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 62:
88-95.
LURIA, S.E. et M. DELBRUCK.
(1943). Mutations of bacteria from virus
sensitivity to virus resistance. Genetics 28: 491-511.
MAITI, I.B.; C.A. de SOUZA, et J.P. THIRION. (1981). Biochemica1 and
genetic characterization of respiration-deficient mutants of
chinese hamster cells with a GAL- phenotype. Somat. Cel1. Genet.
7: 567-582.
MAMONT, P.S.; DUCHESNE, M.C.; GROVE, J. et TARDIF, C. (1978). Initial
characterization of a RTC cell variant partially resistant to

117
the anti-proliferative effect of ornithine decarbonylate inhibi-
tors. Exp. Cell. Res. 115: 387-393.
MANDEL, J.-L. et FLINTOFF, W.F. (1978). Isolation of mutant mammalian
cells altered in polyamine transport. J. Cell. Physiol. 22:
335-344.
MARENGO, C.; MBlKAY, M.; WEBER, J.; J.P. THIRION. (1981). Adenovirus-
induced mutations at the hypoxanthine phosphoribosyltransferase
locus of chinese hamster cells. J. Virol. 38: 184-190.
MARSHAK, M.I.; N.B. VARSHAVER et N.I. SHAPIRO.
(1975).
Induction of
gene mutations and chromos omal aberrations by simian virus 40
in cultured mammalian cells.
Mutat. Res. 30: 383-395.
MATSUMOTO, K.; TOH-E, A. et OSHIMA, Y. (1978).
Genetic control of
galactokinase synthesis in saccharomyces cerevisioe: Evidence
for constitutive expression of the positive regulatory gene
ga14.
J. Bacteriol. 134: 446-457.
MAYHEW, E. (1972). Ion transport by ouabain resistant and sensitive
Ehrlich Ascites carcinoma cells.
J. Cell. Physiol. ~: 441-452.
Mc BRIDE , O.W.; J.W. BURCH et F.H. RUDDLE (1978). Cotransfer of thymidine
kinase and galactokinase genes by chromosome-mediated gene trans-
fer. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75: 914-918.
1
McBURNEY , M.W. et WHITMORE, G.F. (1975). Mutants of chinese hamster
!
cells resistant to adenosine.
J. Cell. Physiol. 85: 87-100.
t1
McBURNEY , M.W. et WHITMORE, G.F. (1974). Characterization of a chinese
1
,
f
hamster cell with a
temperature sensitive mutation in folate
1
metabolism. Cell 2: 173.
1
173.
t
1

118
Mc BURNEY , M. et WHITMORE, G. (1974). Selection for temperature sensitive
mutants of diplofd and tetraplofd mammalian cells. J. Cell.
Physiol. 83: 69.
,
69.
!
McCANN, J.; N.E. SPINGARN, J. KOBORI et B.N. AMES,. (1975). Detection of
carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor
plasmids. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72: 979-983.
MEUTH, M.; TRUDEL, M. et SIMINOVITCH, L. (1979). Selection of chinese
hamster cells auxotrophic for thymidine by l-S-D-arabinofura-
nosyl cytosine. Somat. Cell. Genet. ~: 303-318.
MEZGER-FREED, L. (1972). Effect of plo!dy and mutagens on bromodeoxyuri-
dine resistance in haplo!d and diplo!d frog cells. Nature New
Biol. 235: 245-246.
MOEHRING, T.J.
et MOEHRING, J.M. (1977). Selection and characterization
of cells resistant to diphteria toxin and Pseudomonas exotoxin
A: presumptive translational mutants. Cell 11: 447-454.
NG, S.K.; ROGERS, J. et SANWAL, B.D.
(1977). Alterations in differentia-
tion and pyrimidine pathway enzymes in 5-azacytidine resistant
variants of a myoblast line. J. Cell. Physiol. 90: 361-374.
NOGI, Y., MATSUMOTO, K.; TOH-E, A. et OSHIMA, Y. (1977). Interaction of
super-repressible and dominant constitutive muçations for the
synthesis of galactose pathway enzymes in saccharomyces cere-
visioe. Mol. Gen. Genet. 152: 137-144.
PATTERSON, D. (1975). Somat. Cell. Genet. 1: 91.
1
91.
PARKS, J.S.; M.E. GOTTESMAN; K. SHIMADA; R.A. WEISBERG; R.L. PERLMAN et
1
I. PASTAN. (1971). Isolation of the gal repressor. Proc. Natl.
1
Acad. Sei. U.S.A. 68: 1891-1895.

119
POCHE, H.; VARS HAVER , N.B. et GEISSLER, E. (1975). Cyc10heximide resis-
tance in chinese hamster ce11s. I. Spontaneous mutagenesis.
Mutat. Res. 27:
399-406.
PONTECORVO, G. (1975). Production of mamma1ian somatic ce11 hybrids by
means of polyethylene glycol treatment. Somat. Ce11. Genet. 1:
397-400.
RABIN, M.S. et GOTTESMAN, M.M. (1979). High frequency of mutation to
tubercidin resistance in CHO ce11s. Somat. Ce11. Genet. 5: 571-
583.
RAPTIS, L.; C.A. de SOUZA; MBIKAY, M.; J.P. THIRION et WEBER, J. (1982).
Stable integration of adenovirus DNA is not required for the
induction of mutations in the hypoxanthine phosphoribosy1trans-
ferase gene in chinese hamster ce11s. (sous presse).
REICHENBECHER, V.E. et CASKEY, C.T. (1979). Emetine-resistant chinese
hamster ce11s. The identification of an e1ectrophoretica11y
a1tered protein of the 40S ribosoma1 subunit.
J. Biol. Chem.
254: 6207-6210.
SHARP, J.D.; CAPECCHI, N.E. et CAPECCHI, M.R. (1973). A1tered enzymes
in drug-resistant variants of mamma1ian tissue culture ce11s.
Proc. Nat1. Acad. Sei. U.S.A. 70: 3145-3149.
SCHEFFLER, I.E. (1974). Conditiona1 1etha1 mutants of chinese hamster
ce11s: mutants requiring exogenous carbondioxide for growth.
J. Ce11. Physio1. 83: 219-230.
SCHUMPERLI, D.; BRUCE H. HOWARD et MARTIN ROSENBERG. (1982) Efficient
expression of Escherichia coli ga1actokinase gene in mamma1ian
ce11s. Proc. Nat1. Acad. Sei. U.S.A. 79: 257-261.

120
SIMINOVITCH, L. (1976).
On the nature of hereditable variation in cul-
tured somatic cells. Cell 7: 1-11.
SINENSKY, M.; DUWE, G. et PINKERTON, F.
(1979a).
Defective regulation
of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in a somatic
cell mutant.
J. Biol. Chem. 254: 4482-4486.
SINENSKY, M.; PINKERTON, F.; SUTHERLAND, E. et SIMON, F.R. (1979b). Rate
+
+
limitation of (Na +K ) stimulated adenosine triphosphatase by
membrane acyl chain odering.
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:
4893-4897.
SMITH, J.D.; G. FREEMAN; M. VOGT et R. DULBECCO. (1960). The nucleic
acid of polyoma virus.
Virology 1l: 185-196.
SODERBERG, K.; DITTA, G.S. et SCHEFFLER, I.E. (1977). Mamma1ian cells
with defective mitochondrial functions: a chinese hamster mutant
cell line lacking succinate dehydrogenase activity. Cell 10:
697-702.
SODERBERG, K.; J.T. MASCARELLO; G.A.M. BREEN et I.E. SCHEFFLER. (1979).
Respiration-deficient chine se hamster cell mutants: Genetic
characterization. Somat. Cell. Genet.
5: 225-240.
SOTTOCASA, G.L., KUYLENSTIERNA, B.; ERNSTER, L. et BERGSTRAND , A. (1967).
An electron-transport system associated with the outer membrane
of liver mitochondria. J. Cell. Biol. 32: 415-438.
STANLEY, P. CAILLIBOT, V. et SIMINOVITCH, L. (1975a). Stable alterations
at the cell membrane of chinese hamster ovary ce Ils resistant
to the cytotoxicity of phytohemagglutinin. Somat. Cell. Genet.
1: 3-26.
STANLEY, P.; CAILLIBOT, V. et SIMINOVITCH, L. (1975b).
Selection and

121
characterization of eight phenotypica11y distinct 1ines of bectin-
resistant chine se hamster ovary ce11s. CeIl ~: 121-128.
STANLEY, P. et SIMINOVITCH, L. (1977). Comp1ementation between mutants
of CHO ce11s resistant to a variety of plant 1ectins.
Somat.
Ce11. Genet. 3: 391-405.
STERN, E.S. et R.S. KROOTH. (1975a).
Studies on the regu1ation of the
three enzymes of the Le10ir pathway in cu1tured mamma1ian ce11s.
J. Cell Physiol. 86: 91-104.
STERN, E.S. et R.S. KROOTH.
(1975b).
Studies on the regulation of the
three enzymes of the Le10ir pathway in cu1tured mamma1ian ce11s.
J. Ce11. Physio1. ~: 105-110.
STRAUSS, M.; M. THElLE, R. ECKERT, et GEISSLER
(1978).
Detection of
antigenica11y active mutant HGPRT after mutagenesis with simian
virus 40. Mutat. Res. 51: 297-300.
suno, T. et ONODERA, K. (1979). Isolation and characterization of tuni-
camycin resistant mutants from chinese hamster ovary ce11s.
J. CeU. Physiol. 101: 149-156.
SUN, N.C.; C.C. CHANG et CHU,E.H.Y. (1975). Mutant hamster ceUs exhibiting
a p1eiotropic effect on carbohydrate metabo1ism. Proc. Nat1. Acad.
Sei. U.S.A. 72:
469-473.
SZYBALSKI, W.; E.H. SZYBALSKA et RAGNI,
• (1962).
Genetic studies
with human ce11 1ines. Nat. Cancer Inst. Monogr. 1: 75-89.
SZYBALSKI, w. (1958). Resistance to 8-azaguanine, a selective Marker
for a human cel1 1ine. Microbio1. Genet. Bull. 16: 30.
TABER, R.; ALEXANDER, V. et WHITFORD, W. (1976). Persistent reovirus
infection of CHO ce11s resulting in virus resistance. J. Virol.

122
17: 513-524.
TABER, R.;
ALEXANDER, V. et WALD, N. Jr.
(1976). The selection of
virus-resistant chinese hamster ovary cells.
Cell 8: 529-533.
TALBOT, B. et J.P. THIRION. (1982). Isolation, purification and partial
characterization of galactokinase from chinese hamster liver.
(sous presse).
TAYLOR, S.M. et JONES, P.A. (1979).
Multiple new phenotypes induced
in lOT! and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell 12: 771-
779.
TEDESCO, T.A. et W.J. MELLMAN. (1971). Galactosemia: Evidence for a
structural gene mutation. Science 172: 727-728.
TILL, J.E.; BAKER, R.M.; BRUNETTE, D.M.; LING, V.; THOMPSON, L.H. et
WRIGHT, J.A. (1973).
Genetic regulation of membrane function
in mammalian cells in culture. Federation Proc. 32: 29-33.
THElLE, M.; S. SCHERNECK, et E. GEISSLER. (1976).
Mutagenesis by simian
virus 40.
I. Detection of mutations in chinese hamster cell
lines using different resistance markers. Mutat. Res. 37: 111-
124.
THIRION, J.P. (1972).
Regulation of UDP-glucose-4-epimerase activity.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 47: 15-21.
THIRION, J.P.; D. BANVILLE et H. NOEL. (1976). Galactokinase mutants of
chinese hamster somatic cells resistant to 2-deoxygalactose.
Genetics 83: 137-147.
THIRION, J.P.; R. LABRECQUE et T.P. VU.
(1976).
Selection of chinese
hamster somatic cell mutants after irradiation of Budr-labelled
cells. J. Cell. Physiol. 87: 135-140.

123
THIRION, J.P. et TALBOT, B. (1978). A1coho1 dehydrogenase mutants of
chinese hamster somatic ce11s resistant to a11y1 a1coho1.
Genetics 88: 343-356.
VARSHAVER, N.B.; M.I. MARSHAK; E.V. LUSS; L.V. GORBUNOVA et N.I. SHAPIRO.
(1977). Spontaneous, chemica1 and viral mutagenesis in tempera-
ture-sensitive glutamine requiring chinese hamster ce11s. Mutat.
Res. 43: 263-278.
WAHL, G.M., S.H. HUGHES et M.R. CAPECCHI. (1975). Immuno1ogica1 charac-
terization of hypoxanthine-guanine phosphoribosy1transferase
mutants of mouse L ce11s: Evidence for mutations at different
foci in the HGPRT gene.
J. Ce11. Physio1. 85: 307-320.
WASMUTH, J.J. et CASKEY, C.T. (1976).
Biochemica1 characterization of
azetidine carboxy1ic acid-resistant chinese hamster ce11s. Ce11
8:
71-77.
WEINTRAUB, M. et RAYMOND, S. (1963). Antiserum prepared with acry1amide
gel used as adjuvant. Science 142: 1677-1678.
WHITIFIELD, C.D.; B. BUCHSBAUM, R. BOSTEDOR et E.H.Y. CHU, 1978). Inverse
re1ationship between ga1actokinase activity and 2-deoxyga1actose
resistance in chinese hamster ovary ce11s.
Somat. Ce11. Genet.
4: 699-713.
WRIGHT, J.A. (1973).
Evidence for p1eiotropic changes in 1ines of
chinese hamster ovary ce11s resistant to concanava1in A and phyto-
hemagg1utinin P.
J. Ce11. Biol. 56: 666-675.
WRIGHT, J.A. (1975).
A1tered aconitase activity in hamster ce11s se1ec-
ted for resistance to f1uorocitrate.
Biochem. Biophys. Res.
Commun. 66: 578-585.

124
WRIGHT, J.A. et LEWIS, W.H. (1974).
Evidence of a common site of action
for the antitumor agents, hydroxyurea and guanazo1e.
J. Ce11.
Physio1. 83: 437-440.
WRIGHT, J.A.; LEWIS, W.H. et C.L.J. PARFETT. (1980).
Somatic ce11
genetics: A review of drug resistance, 1ectin resistance and
gene transfer in mamma1ian ce11s in culture.
Cano J. Genet.
Cyto1. 22: 443-496.
YAU, T.M.; KIM, S.C. et CRISSMAN, H.A. (1979). Selection and characteri-
zation of a variant of murine L5178Y 1ymphoma resistant to local
anesthetics. J. Ce11. Physio1. 99: 239-246.


ANNEXE III
Stable Integration of Adenovirus DNA is not
Required for the Induction of Mutations in the
Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Gene in
Chinese Hamster Cells.
l,
l
Leda Raptis , Aristide Comlan de Souza, Majambu M'Bikay,
2
Jean-Paul Thirion and Joseph Weber
Département de Microbiologie, Faculté de Médecine,
Cenere Hospitalier Universitaire, Sherbrooke, Québec,
Canada J1H 5N4
l Present address: Department of Biochemical Sciences, Princeton
University, Princeton, N.J. 08544.
2 To whom reprint requests should be addresscd.

2.
ABST~~CT
ABST~~CT
1
Adenovirus type 2 induces EMS-like mutations at the hpt 13 locus
1
coding for hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) in Chinese
hamster cells (J. Viral. ~, 184-190, 1981). In this report we show
1
that; (a) the hpt-13 mutation is in the structural gene of HPRT, (b)
adenovirus induces intracistronic revers ion mutations which suppress
1
the hpt-13 phenotype, and (c) the stable integration of adenovirus DNA
l
is not required for the induction of these mutations.
ï
1
i
!i
f
1
l

Because malignant transformation of cells is a multistep process,
the observation that transforming viruses also act as mutagens is of
considerable interest (5). Both SV40 and adenoviruses induce mutations
in nonpermissive cells (l, 3, 4, 7). Although mutations have been de-
tected at a variety of genetic loci, almost nothing is known about
how they are induced. We have recently shown that adenovirus type 2
(Ad2) increased the reversion rate of hypoxanthine phosphoribosyl trans-
ferase (HPRT) negative cells, Hpt-13 (3). Two classes of revertants
were observed by means of the electrophoretic mobility of RPRT; those
which comigrated with the wild-type RPRT and those which migrated
faster (3). In the present report we address the problem of the nature
of the mutations induced and the question of whether stable integration
of adenovirus DNA is required for mutagenesis. We show that the IlPRT
enzyme of both classes of revertants is immunoprecipitable with anti-
serum against wild-type HPRT and that none of the clones examined con-
tained Ad2 DNA.
To demonstrate that the IIPRT enzymes from the revertants are
related (Chinese hamster-like), extracts were prepared, incubated with
antiserum and the remaining enzyme activity measured. For each assay
6
5X10
cells were washed, resuspended in buffer (10 mM Tris-HC1, pH 7.4,
10 m!-j HgClz' 30 mM KC1, 0.5% Triton X-100, l mM dithiothreitol), incu-
z'
o
bated at 4 C for 15 min., centrifuged for 90 min. at 95,000 X g and
the supernatant collected. Protein content was determined by the Bio-
Rad method (technical bulletin 1050). For immunoprecipitation 230 ~g of
extract was added to 10 ~l or 60 ~l of sheep anti-Chinese hamster HPRT
(kindly supplied by Dr. Raymond G. Fenwick, Baylor College of Medicine,
Houston) diluted 1:10 and la m~l Tris-HC1, pH 7.4 was added to a total

4.
0e
0
volume of 250 U1. The tubes were incubatcd at 20 e for 30 min, then
ovcrnight at 40e.
40 e. Then 15 U 1 of 1:10 diluted rabbit-anti sheep IgG
.
0
(~iles-Yeda) was added, the tubes were lncubated for 4 hours at 4 e and
centrifu~ed at 13000 X g. The remaining enzyme activity in the su~er-
natants was determined exactly as described before (3). Initial enzyme
activity of the extracts was determined in control tubes which were
similarly treated but with normal sheep serum substituted for the
immune serum. As shown in Fig. 1 for the parental wild-type cell (V6)
normal serum did not inhibit HPRT activity. Immune serum, on the other
hand, blocked the HPRT activity of all the clones tested, regardless of
electrophoretic mobility. We conclude that all the revertants contain
ehinese hamster-like HPRT enzyme, rulin~ out foreign HPRT due for
instance to mycoplasma infection. Therefore the mutations induced by
Ad2 which gave rise to the revertants occurred in the structural gene
for the HPRT enzyme.
Phage Mu causes mutations in its host cell by Integration.
Similarly, SV40 DNA sequences persist in cell mutants isolated after
mutagenesis with SV40 (6). To determine whether the revertant clones
contain Ad2 DNA sequences, we hybridized cellular DNA with AJ2 DNA. The
6
DNA from about 20X10
cells was purified, digested completely with
either EcoRI or HindIII, electrophoresed in a 1% agarose gel, and
blotted onto nitrocellulose as described previously (2). The filters
were hybridized with a nicktranslated Ad2 probe (2). Fig. 2 shows posi-
tive hybridization only with control DNA:
(a) ~dIII digested Ad2 nNA
at two genome equivalents per cell genome, and (b) Ad5-transformed cell
DNA (293 cells) digested with HindIII. Similar results were obtained
when the DNA from the clones was digested with EcoRI. Since none of the

5.
clones tested contained Ad2 DNA, we concluded that the observed muta-
tions at the hE! IJ locus did not require the stable integration of Ad2
n~A. Similar results were reported in an entirely different test system
using Ad5 as a mutagen and selecting for anchorage-independent growth
of mouse cells (1). A different situation appears to occur in the case
of SV40, where most of the mutant cell clones continue to harbour SV40
DNA (6). It is possible that SV40 and adenoviruses muta te cells by
different mechanisms or that the persistence of SV40 is independent of
its mutagenic effect.
Finally, the results obtained above and in our first publication
(J) indicate sorne very interesting properties for the hE! IJ mutation
and the mutagenic properties of adenovirus. hE! IJ has the property
to give two classes of revertants upon infection. One whose HPRT enzyme
behaves like wild-type, the other whose HPRT enzyme migrates electro-
phoretically faster than wild-type, has a lower pl, has about 2.5% of
the wild-type specifie activity (J) and is immunologically related to
Chinese hamster. The results indicate therefore that this last class of
revertant results most probably from an intracistronic mutation sup-
pressing the mutant phenotype and that ~ IJ is a mutation in the
structural ~+ gene, most probably a point mutation which can be
induced to revert upon infection. HPT-IJ is therefore a suitable indi-
cator to detect adeno-induced and EMS-like mutagenesis and can be of
sorne use for testing mutagens à la Ames (5), but in somatic cells
instead of bacteria. Naturally, the adeno-induced mutations detected
with HPT-IJ may represent only one class of such mutations, adeno may
weIL induce other types of mutations not yet detected because of the
absence of suitable indicator strains.

6.
ACKNm"'LEDG~lENTS
ACKNm"'LEDG~lENTS
We are ~rateful to Dr. R. Fenwick for his gift of HPRT antisera.
This study was supported by grants from the National Cancer Institute
of Canada awarded to J.W. and J.P.T. and the Medical Research Council
~i Canada(~IT4860)to J.P.T. J.W. 1s a Research Associate of the NCrC and
J.P.T. is Chercheur-Boursier of the province of Québec.

7.
REFERENCES
1.
Bellett, A.J.D., and Younghusband, H.B. J. Celle Physiol. 101,
33-48 (1979).
2.
Brown, M., and Weber, J. J. Virole 107, 306-310 (1980).
3.
Marengo, C., Mbikay, M., Weber, J., and Thirion, J.P. J. Virole
38, 184-190 (1981).
4.
Marshak, M.I., Varshaver, B.N., and Shapiro, N.I. Mutat. Res. 30,
383-395 (1975).
5.
McCann, J., Spingaru, N.E., Kobori, K., and Ames, B.N. Proc.
Natl. Acad. Sei. USA Zl, 979-983 (1975).
6.
Theile, M., Scherneck, S., and Geissler, E. Arch. of Virole 11,
293-309 (1980).
7.
Theile, M., Strauss, M., Luebbe, L., Scherneck, S., Krause, H.,
and Geissler, E. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. ~, 377-382
(1980).

!
Fig. 1.
Immunoprecipitation of HPRT enzyme activity of the
1
Fig. 1.
Immunoprecipitation of HPRT enzyme activity of the
ravertant ce11 1ines. Ce11 extracts were precipitated with Chinese
f
hamster anti-HPRT serum and the remaining enzyme activity measured. 5ee
text for detai1s. Empty circ1es are the WT V6 ce11 extracts incubated
1
with normal serum. 519 and 530 are spontancous revertantSj B3-1, B3-2
1
are ethy1methane su1phonate induced revertantSj ad7A, ad14 are Ad2-
i
incomp1ete partic1es induced revertantSj RV25 is an Ad2 ts4 incomp1ete
partic1e induced revertant. Of the two e1ectrophoretic mobi1ity classes
of IlPRT identified previous1y (3), .B3-2 and Ad14 had mobilities
identica1 to V6, whi1e the others had mobi1ities faster than V6.
Fig. 2.
50uthern b10t and hybridization ana1ysis of DNA from re-
vertant ce11 1ines. DNA from HPRT~ ca11 1ines se1ected after muta-
genesis with Ad2 (1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13,14,15,16,18,20,21), a
spontaneous revertant (10), and HeLa ce11 D~A (19) were digested with
HindIII and e1ectrophoresed on a 1% agarose gel, transferred to nitro-
cellulose and hybridized with nick-trans1ated Ad2 probe DNA. Positive
contro1s were two genome equiva1ents of ~dIII digested Ad2 DNA (17)
and EcoRI digcsted Ad5 transformed 293 ce11 DNA (22). The numbers at
the right are size markers in base pairs of DNA.

%
INITIAL HPRT ACTIVITY
~
-
~
o
-l>Z~-enl'Tl:xls~
en
::ua
<
<
ID a
ID
en
::ua
QI
<0.
QI~o. ~
<0.
QI~o.
CD
~ ...
~
~ ...
- I- I
- I-
-~ ~
-~
U1~
-
U1~
~
lE
~
....
-
-
-
1 2 3 4 5 6 7 a 9 10 11 12 13 ~4 15 1617 la 19
19 20 21 22
-.-l.-:~••
-.-l.-:~ L- ~~i'~.' ! _.!. _t -:.• -~--~~-_.~;,
-~--~~-_.~;, ~-~ .!--!.__.~_!_.~~
' • •
~.'fJI'.'"
,
..........
• •
"111
"111
. . . . . .
_ .
• • • •
"

"
. '




~"'. .:f'j. '.'
i
e-
.-
JI,.
..•._ . 'Of; ':". '.
' ' ' ' . .
_
' • . Ii . . . ,. •
".
". ;.:'
.:'
~.:~: ~:
~
»,
';..
.
.
~.~;.:.•
~.~;.:.. ",
'....
."' ~ .•".
, .... '
. '.

•• ; -" t..•
t. .-:4:
.•

, ' • • -


•• • • ' : ....
i.
.
C.
-. ~ ..
··.·t
•.
•. . . . .i.

""(.' • •

• •
" .
•.
•. . . . .i.

""(.' • •

• •
"
$:
; .
.., ..,.......

-.
v' ..
; .
.., .. ,.......

-.
\\.
::~k.
.~_.
"',.:
..
~
,"
''';'.
' {
..
..o."

: . . . .. -"
..
..o."

: . . . .. .~;~',.
..- -.':~';:
, .
• . : '


.',' ·~-~·~·~.7 " ~ 8235
".
.

,".
' . '

-.
.
.-....
....
.
-, ..
r'
~-
... •
". "..... ".' . t~ t .. ~
..;: .. -,- -.
.... .: ".- ':'' ~
- . ..

,".
' . '

-.
.
.-....
....
.
", ..
r'
~-
... •
" . . . . . ".'
t~ t ..
..;: .. -,- -.
.... .: ".- ':'' ~
- . ..
..:';;'"
..
\\.0
\\.0
. :"5307
.
..,
." ...
,.
•..
"
. ,.
.', ~~ " ..
,.' t
,.'
r:
r'
• • • • •
:~~ •
\\'~' ~..
-:~
'~"Of
• ~..

. . . ; -:~.....<
•• ,
; .
/
• •
. . . ;
. ;<
•• ,
; .
•-3477.
.. ., '.

1
'4"
....
-, .
.~
~ .. .::~1:; • .'."-
1.,:
~,,'~.•••""
.
• ~
.'. . t#......•
~'-...
-s , ••
• ""
.
• ~
.'. . t#......•
'oii:I
",'
'.
..•• .~ 0:
,.

,
".-.
~ ..
1
'.'
"".,1 . . . . . . .
....••
'.
·01
: .
.
.
.., ..
.
..,
.
.... ~
~ "".,1 .......
.. ..• •
'.
·01
: .
. ..,..
..

1
' .

1I'I!IlI • • •
~
•••••
. • • • . •
l
' I I ' .~.
. . ,
..
..
.. . . . . .
'JI .....
.
. • .
• •
. •

• •
• •
~
.....
0',.
. :
l"
• • •
. . . .
..
..

i .411.
.'
...
~ ".'
~.• 1..'

> _.
':'. ~..
.-'
..
.-'
' .

'il'"
~'.
l'~.

«.'
..~ W·"" •
~
o.
...
• • • e. -.
..
'
", . . . " .
; \\ • •
.
' .

'il'"
~'.
l'~.

«.'
..
'.
.. .".... "'.' ..
.';..... .. .
.
~.

• •
~ W·""

~
o.
...
• • • e. -.
..
'
", . . . " .
; \\ • •
. '
.. .".... "'.' ..
.';..... .. .
.
~.

• •
. "
~

·'-988
'.~'
~ ~'-::'!' .. ....
..

'.~'
~ ~'-::'!' .. ....
..
. "
~ ..••.
: .:t... c:'.- . :
..••• ,',
e
'.
," ~
: .:t... c:'.- . :
..••• ,',
e
....
... " .• ...
'.
..... .' :.'
~
fi.·... ... ~"..' '\\
...
.'
__ e,.. .,'

,
.
..
"
. •
...
'.
..... .' :.'
~
fi.·... ... ~"..' '\\
...
__ e,.. .,'
• .. -.
,
,
..
".
~
,. .:
. " ' . .
....
".
~
,. .:
. " ' . .

ANNEXE IV
107
IV
I}rnUNOLOGICAL AND GENETIC CHARACTERIZATION OF
2-DEOXYGALACTOSE-RESISTANT, GALACTOKINASE DEFICIENT MUTANTS OF CHINESE
HAMSTER CULS: EVIDENCE FOR STRUCTURAL NUTATIONS IN THE GALK GENE
Comlan Aristide de Souza, Brian Talbot,
Denis Banville and Jean-Paul Thirion*
Département de Microbiologie
Centre Hospitalier Universitaire
Faculté de Médecine
. Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Qué
Canada
J1H SN4
* To whom reprint request should be addressed.
Running title: CRM+ galactokinase mutations 2-deoxygalactose resistance.

1
ABSTRACT
1
1
Ten independent mutants resistant to 2-deoxygalactose and without
1
!
any galactokinase activity (null allele mutations) were isolated from
1
1~
mutagenized Chinese hamster somatic cells. They were analyzed for the
mutagenized Chinese hamster somatic cells. They were analyzed for
1
presence of serologically cross-reacting material (CRM) using antiserum
generated against highly purified Chinese hamster galactokinase. Ali
1
ten mutants contain CRM activity (i.e. were CRM+). This indicates that
1
ail the mutations arose as a result of mutations in the galactokinase
1
galactokinase
structural gene. Complementation analysis among them shows that the
ten mutations define one cistron.
1
1
1

INTRODUCTION
Chinese hamster cell variants resistant to 2-deoxygalactose
R
(Dga ) are mutants (1). They have between 11. and 501. of the galacto-
kinase activity of the wild-type cells (2,3). Such drug resistant
mutants, with their consequent enzyme deficiencies, are the resuLt of
either structural (21-24) or regulatory (25,3) mutations.
ln order to determine the type and organization of the mutations
R
R
producing the Dga
phenotype we have characterized the Dga
mutants
which have no detectable galactokinase activity.
We have already purified Chinese hamster liver galactokinase
(5), thus the identification of structural mutations is possible
through the detection of crossreacting material (CRM) in null allele
mutants as described for 8 azaguanine resistance at the
hprt locus
(4). AlI the null allele mutants tested were C~I+ i.e. aIl possessed
inactive galactokinase protein.
To study the genetic organization and control of these mutants
R
it is important to determine whether the Dga
marker is dominant or
recessive to the wild-type aIle le. In this paper we report that in
S)
S
R
R
hybrids between Dga sensitive (Dga ) and Dga
cells, the Dga
allele is
S
recessive to the wild-type Dga
allele. A subsequent complementation
analysis of the null allele mutants demonscrated chat all the mutations
are in one cistron.
These resulcs demonscrate that the null allele phenotypes are
due to mutations ln the same structural gene. Thls supports the hypo-
thesis thac galactokinase is a monomeric or homodimeric prote in.

MATERIALS AND METHODS
Cells, media and culture conditions
Chinese hamster cells were grown as already described (2). The
dose responses of wild-type or mutant cells were determined as des-
cribed (2).
Selection of somatic cell hybrids
Cell-cell hybridization was carried out using polyethylene glycol
as described (6,7). HAT medium (5.5
m amenopterin, 0.016 mM thymidine
and 0.1 mM hypoxanthine (8)) or DMEM with 25 mM galactose instead of
glucose (9), were used as selective media. The plates were stained
with 1~ methylene b1ue in 701. isopropano1 (10) ta score for hybrid
clones.
ln parallel for each hybridization, the unmixed parental cell
types were fused and assayed under the same selective conditions as
R
the controls ta determine the frequency of revers ion for the Bud
and
R
Aza
markers in the hybridization experiments. The frequency of rever-
sion was less than 0.1% of the frequency of hybrids detected. The hy-
br id characters of the colonies were confirmed by their karyotypes,
their volumes, and their ability ta grow in HAT medium.
Mutagenesis and selection of null allele mutants
Mutagenesis and the isolation of mutant DR2R1610 have already
been described (2,12). Seven new mutants were isolated following a
procedure slightly different from the one described for DR2R1610. Wild
6
type V
cell lines were seeded at a cell density of about Sx10
cells
6

per petri. Each culture was th en mutagenized, washed to remove the
EMS and then grown for two days to allow the mutation to be expressed.
About 105 cells were then seeded in 10 cm petri dishes containing 4
mg/ml of 2-deoxygalactose. After three days, the medium was replaced 1
with fresh medium containing 5 mg/ml of 2-deoxygalactose. Three daysl
later, the surviving cells were seeded in petri dishes containing 8
mg/ml of 2-deoxygalactose. After a further 14 to 19 days, the clones
were picked and tested for 2-deoxygalactose resistance and galactoki-
nase activity. The seven independent null allele mutants were recloned
twice and stored in liquid nitrogen.
Preparation of cellular extract
0C
0
Extracts of cells were prepared at 40 C as follows: The medium
6
7
of exponential phase cell layers (about 5x10
to 10
cells) was remo-
ved. The cells were washed in PBS without CaCl , suspended in 1 ml
2,
2
of Extraction Buffer (10 mM Tris-Hel, pH 7.4, 10 mM Mgcl , 30 mM KCl,
2,
2
0.57. Triton X-100, 1 mM dithiothreitol) and incubated at 40C
40 C for 15
minutes. The suspension was then centrifuged for 90 min at 95000xg
and the supernatant collected. Galactokinase was assayed as described
(2).
Prote in determination:
Protein concentrations were determnined by the method of Bradford
(12) using "BioRad dye reagent".
Purification of Galactokinase and Preparation of rabbit anti-galactoki-
nase serum
Galactokinase was partially purified as described (5). The final

, /
/
step in the purification was preparative polyacrylamide slab gel elec-
t r o pho r e s i s ,
trophoresis. The electrode buffer was 7 mM P0 , 100 mH glycine, 1 mN
4,
4
MgEOTA, 0.25 mM dithiothreitol (pH 7.4). The gel concentration was
7.5% and the gel buffer concentration was twice that of the electrode
buffer. Electrophoresis was performed at 40 mA, 150 volts for 5 hours
at less than SoC.
After electrophoresis, the gel was sliced and 3 mm cubes from
each slice were immersed for 16 hours in 50
l of galactokinase assay
mixture. 25
l samples wereremoved and the relative concentrations
of 14C_O_galactose and 14c-galactose-1-p04 were determined as described
(2).
The purity of thegalactokinase was ckecked by running 3 mm cubes
of this gel on SOS acrylamide gels (13).
Slices containing galactokinase activity and a single band of
prote in (about 150
g) were homogenized in a Oounce homogenizer in
phosphate buffered saline until the suspension would pass through a
22 gauge needle. The suspension was injected subcutaneously into multi-
ple sites on the back of a rabbit. This was repeated each week for
four weeks. At week five rabbit serum was collected and tested for
its anti-galactokinase activity.
Catabolism of galactose, hypoxanthine and thymidine
Incorporation of tritium from JH-D-galactose, 3H-hypoxanthine
and 3H-thymidine was performed as described by Claverie et al (1).
Galactokinase immunoprecipitation
The galactokinase precipitating capacity of purified rabbit anti-

serum was measured by titrating a constant amount of v6 wild-type cell
galactokinase against increasing concentrations of anti-serum. Approxi-
mately 400
g of V6 cell extract was added ta 50
l, 100
land 150
1
l of dialyzed rabbit anti-serum generated against hamster liver galac-
f
tokinase. The total volume was made up ta 250
l and the tubes were
1
oC.
o
incubated for 30 min at 200
20
C followed by 16 hours at 4 C. The antigen-
antibody complex plus the excess antibody was then precipitated by the
1
,
addition of 50
l of 10 fold diluted goat-antirabbit IgG (Miles-Yeda).
t
f
0C
0
The tubes were incubated at 4 C for 4 hours followed by centrifugation
0C.
0
at 13000xg for 15 min at 4 C. The galactokinase enzyme activity remai-
ning in the supernatants was determined as previously described (2).
Hypoxanthine phosphoribosyl transferase activity in the same superna-
tants was determined (15) as negative control.
Other controls contained normal rabbit serum.
Cross reacting material (CRM) assay
CRM assays were performed by modification of the procedure of
Strauss et al (1978) for HPRT (16); 100
l of mutant cell extract
(400-500
g of protein) was added ta 150
l of rabbit anti-Chinese
hamster liver galactokinase. This amount of antibody precipitated
90-95% of galactokinase enzyme activity, giving maximal sensitivity in
0C
0
the CRM assay. The tubes were incubated at 20 C for 30 minutes followed
by 16 hrs at 40C.
40 C. 100
l of V6 wi1d-type cell extract (400-500
g of
protein) was then added and the tubes were incubated at 200C
200 C for 30
oC.
o
minutes followed by 16 hours at 4 C. 50
l of 1:10 diluted goat-anti-
rabbit IgG (Miles-Yeda) was added and the tubes were incubated for 4
0C
0
hours at 4 C and centrifuged at 13000xg for 15 minutes. The control
tubes contained non-immune rabbit serum.
The 100% CR}I activity of V6 wild-type cell was determined in

a control containing 400-500
g of cell extract protein treated with
150
l of rabbit anti-Chinese hamster liver galactokinase as described
in the titration procedure.

RESULTS
1
1
1
R
Isolation of Dga-, null allele galk mutants
Thirion et al (1976) (1) have already isolated null allele galK
1
mutants. ln order to characterize in detail the mutations giving rise
1
R
to Dga
null allele galK mutants, we used a new method to isolate seven
1
other highly 2-deoxygalactose resistant, independent null allele galK
,
i
1
mutants: 6DR2DC , 1DR2DC , 11DR2DC , TyK6DC R
, TyK6DC R , V6IPDC
1
V6IPDC
7,
7
2,
2
3,
3
4R
4 10,
10
4R
4 7,
7
19
19
and V6IPDC
as described in Materials and Methods. The method employed
22
22
high concentrations of 2-deoxygalactose (Bmg/ml) and thus increased
R
the proportion of null allele mutations among the Dga
mutants. These
null allele mutant cells were isolated from cell lines DR2, TyK6DC ,
4,
4
and v6IP which were originally derived from V79 cells as shown in
figure 1. DR2 and TyK6DC
are partially resistant to 2-deoxygalactose
4
and are respectively HPRT- and TK- (thymidine kinase). The addition
of these two unlinked markers to the wild-type line did not change
R
its properties regarding other independent markers such as Dga
(1);
V6IP is sensitive to 2-deoxygalactose and auxotrophic for the two nutri-
tional requirements inositol and proline (17).
R
Characterization of Dga- mutants
R
AlI seven Dga , null allele galK mutants are highly resistant
to Dga (i.e. they cloned at 8 mg/ml of 2-deoxygalactose). Table 1 shows
their relative cloning efficiencies in the presence of various concen-
trations of 2-deoxygalactose. Their inactivation curves were not signi-
ficantly different from one another (detailed inactivation curves have
been already published for a representative selection of mutants) (1,2).

The mutants do not grow at all in DHEM containing galactose ins-
tead of glucose, but they grow as fast as the wild-type cells in mlE}1
with glucose (2).
Table 2 shows the results of assays for galactokinase activity
and incorporation of 3H-D-galactose, 3H-hypoxanthine and 3H-thymidine
as described in Materials and Methods.
The mutant cells have no detectable galactokinase activity and
3
do not incorporate
H-D-galactose. In addition, lines 6DR2DC , lDR2DC ,
7,
7
2,
2
llDR2DC , in common with their parental cells, do ~ot incorpora te 3H_
H_
3,
3
hypoxanthine. Similarly TyK6DC R
and TyK6DCR
do not incorpora te
4R
4 7
10
10
3H-thymidine. V6IPDC
and V6IPDC
incorporate 3H-hypoxanthine and
19
19
22
22
3H-thymidine as expected from their wild-type origine
R
The Dga , null allelle galK mutants were grown and cloned in
the absence of 2-deoxygalactose for several generations. They retained
their 2-deoxygalactose resistant phenotype and their inability to grow
R
in the presence of galactose. This indicates that Dga
is a stable
hereditary alteration of normal cells.
R
.
Recessivity of the Dga- phenotype
Somatic cell hybrids were obtained by fusion of each null allele
mutant with HptB or TyK6 as described in Materials and Methods. Hybrids
cells were selected on the basis of complementation of the two reces-
sive markers, HPRT- and TK-.
For the fusion of Hpt13 with V6IPdc
and V6IPDC
, the hybrids
19
19
22,
22
were selected by complementation of the HPRT- marker and the two reces-
sive auxotrophic markers inositol and proline. V6IPDC
and V6iPDC
19
19
22
22
are auxotrophic for these two nutritional requirements. In this case
the hybrids were selected in HAT medium without inositol and proline.

R
1
The other mutants were selected in HAT ~edium (8,18). Dga
was an unse-
1
lected marker in both cases. The hybrids were recloned twice in the
selective medium and assayed for their incorporation of 3H-hypoxanthine
and 3H-thymidine.
1
Table 3 shows that all the hybrids tested were found to incorpo-
1
incorpo-
rate 3H-thymidine and 3H-hypoxanthine (19). In addition the hybrids
1
hybrids
2hyHpt13 - V6IPDC
and 3hyHptB - V6IPDC
grow in HAT medium without
19
19
22
22
inositol and proline.
We conclude that they are true hybrids since the frequency of
reversion was less than 1% of the frequency of hybrids detected. In
addition, an analysis of their karyotypes reveals that they contain
38-44 chromosomes compared to 18-23 for their parental cell lines.
3
These hybrids incorporate
H-D-galactose and have galactokinase acti-
vit Y (table 3).
R
These results demonstrate that the Dga
allele is recessive to
S
the wild-type Dga
allele.
Complementation analysis
Table 4 shows the results of a genetic analysis carried out with
our seven independent null allele galK mutants and the three indepen-
dent null allele galK mutants: DR2R16l0, 9DR2RA, TyK6D44CSR15 isolated
by Banville (19). Each mutant was hybridized with each of the other
null allele galK mutants and with itself. In addition, as a "control",
the mutants were hybridized with A13G9, 34A13G32, V6IGlS which are
defective in the defective in the electron transport system from NADH
to coenzyme Q (21) and thus have a Gal- phenotype.

1
The ten mutants analyzed do not complement each other, but as
expected, the y complement all the Gal- mutants (A13G9, 34A13G32,
V6IG1S) defective in the electron transport chain.
c
,
1
In the sesbnd test of complementation, hybrids were selected
on the basis o f '
ofl complementation of two recessive markers HPRT- and
TK- using HAT medium as selective medium. TyK6D44CSR1S' one of the
10 independent null allele galK mutants was hybridized with five other
null allele galK muttants, 6DR2DC , 9DR2RA, DR2R1610, 1DR2DC2:f,
7,
7
llDR2DC • The hybrid clones were picked and shown to be hybrids from
3•
3
their karyotypes. These hybrids were recloned twice in the selective
medium and tested for their phenotype. They all proved to be TK+ HPRT+
but they have no detectable galactokinase activity (table 3).
These results demonstrate that the 10 null allele GalkK mutants
are in the same complementation group.
Detection of serologically cross reacting material
The term "cross reacting material" (CRM) is used here to describe
an enzymatically inactive protein capable of reacting with the antibody
directed against purified galactokinase. A precipitation-inhibition
assay (17) was used to detect CRM in the cell extract (table S). The
content of CRM or the "ancigenicicy" of inactive galaccokinase from
R
the Dga , null allele galK mutant was determined quantitatively accor-
ding co the cheoretical concept thac 100
l of extract (4 mg/ml) of
V6 cells (Wild-type) contain 100% CRM. After addition of lS0
1 of
our galaccokinase anciserum we obtained a relacive residual enzyme
activity of 10% in the supernatant solution. Thus if the mutant ex-
tract concains 100% CRM, then the antibody activity will be reduced

to less than 10% and, upon addition Gf the wild-type extract, the galac-
tokinase should retain 100% of its activity. If the mutant cells con-
tained 0% Cffi4, then the antibody should not be complexed and the rela-
tive enzyme activity should be inhibited completely to about 10%.
R
All the Dga 1 null allele galK mutants used in this assay had no
detectable galactokinase activity (less than 0.1%) and did not stimu-
late or inhibit wild-type galactokinase. The sera used were assayed and
found to be free of (and specific for) galactokinase activity •
. +
The results demonstrate that all the mutants are CRM
and appear
to synthesize "normal" amounts of galactokinase enzyme protein.

DISCUSSION
1
Seven Chinese hamster cell lines,
highly resistant to 2-deoxyga-
R
lactose (Dga ) were isolated from mutagenized populations of partially
1
Dga resistant (DR2, TyK6DC ) and Oga sensitive (V61P) cell lines. The
4)
4
1
mutants possess no galactokinase activity and are thus classified as
!
R
Dga , null allele galK mutants.
R
An analysis of the Oga
phenotype and in ~ galactokinase
R
S
activity in Oga
x Oga
hybrid cells shows that the galK mutations
+
are recessive to the galK
alleles. A complementation analysis of all
R
R
possible Oga
x Oga
hybrid cells reveals that all seven independent
mutations are in the same cistron.
Similar complementation results have been reported for mouse
L-cell which had structural defects in the gene for HPRT (HPRT- C~~+)
(4). Our observations also appear to agree with those of Whitfield
et al (1978) (20) whose highly Oga-resistant Chinese hamster ovary
cell lines did not complement mutants with low resistance to Dga. Such
results are consistant with the model of galactokinase as a monomeric
or homodimeric protein (5) with a single structural gene.
R
We analysed ten of our Oga
null allele galK mutants for the
presence of serologically cross reacting material (CRM). They all syn-
thesize normal amounts of enzymatically inactive protein capable of
reacting with the antibody directed against purified galactokinase
+
R
(i.e. are all CRH ). Thus all our Oga
null allele galK mutants arose
from mutations in the galK structural gene. Similar structural gene
mutations have been postulated for resistance to other drugs such as
amanitin (22), ouabain (23) and colchicine (24). However,
in the
case of hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) mutants resis-

+
tant to 8 azaguanine and deficient in HPRT. The frequency of CRM
tant to 8 azaguanine and deficient in HPRT. The frequency of
and
CRM- mutation appears to vary from species to species: 60% CRM- for
mouse cells (4), 35% CRM- for Chinese hamster cells (26), yet 0% CRM-
for spontaneous and virus induced HPRT- cell lines (16). lt may be that
the CRM- phenotype for HPRT- is a product of epigenetic changes as
suggested by Beaudet (26). A CRM- phenotype in our cell lines can only
arise by mutation in a regulatory gene (1). There are several possible
reasons why all of· our mutants are CRM+. One explanation whicl1 follows·
from the work of Stern and Kroth (30) is that the genetic regulatory
elements for galactokinase do not operate in fibroblast cells in
culture, even though the enzyme may be inducible in other tissues. Thus
the variability of the results reported for HPRT mutants (4,16,26) may
be due to the tissue origin of the cell lines rather than the species
origine Another possible explanation for the lack of CRM- mutants is
that the regulatory elements may be much smaller than the structural
gene, as is the case for the protein metallothionein (31) and thus the
probability of a mutation occurring in the regulatory gene is corres-
pondingly reduced. A large number of mutants would have to be screened
to resolve these questions.
ln addition, when the results are viewed from the aspect of galac-
tose metaboli~m/they demonstrate that structural mutations in the galac-
tokinase gene prevent the cell from using galactose as an energy
source. Thus the J-galactonolactose pathway previously proposed as a
J-galactonolactose pathway previously proposed as
catabolic route for galactose (27,28,29) is not sufficiently active to
support the growth of our cells.

i
BIBLIOGRAPHY
1. Thirion, J.P., Banville, D. and H. Noel.
(1976) Genetics 83: 137-
147.
2. CHU, E.H.Y., Sun, N.C. and CC. Chang. (1972) Proc ,
Proc. Na t l ,
'latl. Acad. Sci.
USA 69: 3459-3463.
3. Wahl, G.M., Hughes, S.H. and M.R. Capecchi. (1975) J. Cell Physiol.
85: 307-320.
4. Talbot, B. and J.P. Thirion. (1982)
5. Pontocowo, G. (1975) Somat. Cell Genet. 1: 397-400.
6. Davidson, R.L. and P.S. Gerald. (1976) Somat. Cell Genet., 2: 165-
176.
7. Szyba1ski,
W., Szybalska, E.H. and Ragni.
(1962) Nat. Cancer Inst.
-Monogr. 2: 75-89.
8.
9. Stanley, P., Caillibot, V. and L. Siminovitch. (1975) Cell 6: 121-
128.
10. Thirion, J.P., Labrecque, R. and T.P. Vu. (1976) J. Cell Physiol.
87: 135-140.
11.
12. Laemnli, U.K. (1970) Nature 227: 680-685.
13. Heintraub, M. and S. Raymond. (1963) Science 142: 1677-1678.
14. Claverie, J.M., de Souza, C.A. and
J.P. Thirion. (1979) Genetics
~: 563-572.
15. Marengo, C., Mbikay, M., Weber, J. and J.P. Thirion. (1981) J.
Virol. 38(1): 184-190.
16. Strauss, M., Theile, M., Eckert, R. and Geissler. (1978) Mutat.
Res. 51: 297-300.

1
17. Labrecque, R. and J.P. Thirion. (1977) J. Ce11 Physio1. 90: 321-328.
l
18. Litt1efie1d, J.W. (1964) Science 145: 709-710.
1
19. Banville, D. (1977) Mémoire de Maîtrise, Université de Sherbrooke.
1
!
20. Whitefie1d, C.D., Buchsbaum, B., Bostedor, R. and E.H.Y. Chu.
(1978) Somat. Ce11 Genet. ~: 699-713.
21. Chan, V.L., Whitemore, G.F. and L. Siminovitch. (1972) Proc. Nat1.
1
Acad. Sci. USA 69: 3119-3123.
1
3119-3123.
22. Mayhew, E. (1972) J. Ce11 Physio1. 79: 441-452.
23. Baker, R.M., Brunette, D.M., Mankovitz, R., Thompson,' L.H., Whit-
more, G.F., Siminovitch, L. and J.E. Till. (1974) Ce11 1: 9-21.
24. Ling, V. and L.H. Thompson.
(1914) J. Ce11 Physio1 83: 103-116.
25. Beaudet, A.L., Roufa, D.J. and C.T. Caskey. (1973) Proc. Nat1.
Acad. Sci USA 70: 320-324.
26. Cohn, R.M. and 5. Segal. (1973) Metabo1ism 22: 627-642.
27. Cuatrecasas, P. and S. Segal. (1966) J. Biol. Chem. 241: 5904-5909.
28. Hill, H.Z. and T.T. Puck. (1973) Science 179: 1136-1139.

TABLf: 1
Relative cloning efficiency for parental cell lines and
2-deoxygalactose resistant clones isolated
Relative cloning efficiency
Dga Concentration
in the med ium (mM)
Hpt13 & V6
TyK6
Dr2 & TyK6DC
& TyK6C5R
Resistant clone lDR2DC *
4
15
15
2
o
100
100
100
100
3
11
<0.5
71
88
6
6
<0.5
58
95
15
<0.5
<0.5
7
102
30
0.5
0.5
0.5
99
* Clones GAL KI to GAL KIl have similar cloning efficiency.

---'-'-----'-----_.
TABLE 2
Galactose, Hypoxanthine & Thymidine incorporation and galactokinase activity
of the wild-type and DgaR,
DgaR, null allele galK mutants clones
*Relative tritium incorporation
Galactokinase**
Cell Unes
3H-D-galactose
3H-hypoxanthine
3H-thymidine
Specifie Activity
V6
100
100
100
4.8
±
0.28
Hptl3
94 ± 2.8
11 ± 0.3
91 ± 2.7
4.3
±
0.26
GALK4
<3
8 ± 0.2
78 ± 2.3
<0.1
GALKS
<3
10 ± 0.3
80 ± 2.4
<0.1
GALK6
<3
6
80 ± 2.4
<0.1
GALK7
<3
8 ± 0.2
77 ± 2.3
<0.1
GALKI
<3
10 ± 0.3
89 ± 2.6
<0.1
TyK6
79 ± 2.4
87 ± 2.6
S
3.8
±
0.11
TyK6DC4
48 ± 1.4
90 ± 2.7
S
2.7
±
0.08
GALK2
<S
89 ± 2.7
4 ± 0.12
<0.1
GALK9
<S
80 ± 2.4
4
<0.1
GALK8
<3
99 ± 3
S
<0.1
GALKlO
<3
92 ± 2.8
86 ± 2.6
<0.1
GALKl1
/3 ± 0.09
80 ± 2.4
94 ± 2.8
<0.1
* The values are the average of at least 3 experiments. The relative error was ±3% tritium incorporation from
3H-D-galactose, 3H-hypoxanthine and 3H-
H- thymidine
t hymidine and galactokinase specifie activity was as described in
Materials and Methods. The Incorporations are expressed as a measured percentage of V6 wild t)pe cell lines.
Under the condition of these experiments, the incorporations of tritium from 3H-D-galactose,
H-hypoxanthine
and 3H-
H- thymidine
t hymidine for V6 wild-type cell lines are respectively, 9000 cpm, 3700 cpm and SOOO cpm.
** The values are the average of at least 3 experiments. The relative error was ±6%. The galactokinase
specifie activities are expressed in ~mole'of galactose-l-phosphate produced per mg per min at 370
37
C.

----_._--- ,~----------------------------_._--------
TABLE 3
Tritium incorporation and ga1actokinase activity of hybrid ce11s
*Re1ative tritium incorporation
Ga1actokinase**
Hybrid ce11s
Specific Activity
3H-D-ga1actose
3H-hypoxanthine
3H-thymidine
Recessivity
5 hyHpt13-Tyk6
100
100
100
5.2 ± 0.312
2 hyTyk6-GALK4
74 ± 2.2
80 ± 2.4
102 ± 3.06
3
± 0.18
3hyTyk6-GALK5
77 ± 2.3
76 ± 2.28
75 ± 2.25
3.6 ± 0.216
1 hyTyk6-GALK6
70 ± 2.1
96 ± 2.88
74 ± 2.2
2.7 ± 0.162
4 hyTyk6-GALK7
68 ± 2.04
106 ± 3.18
85 ± 2.55
2.2 ± 0.132
2 hyTyk6-GALKl
74 ± 2.2
74 ± 2.2
95 ±
95
2.85
3.5 ± 0.21
1 hyHpt13-GALK2
86 ± 2.58
93 ±
93
2.79
90 ± 2.7
3.4 ± 0.204
3 hyHpt13-GALK9
76 ± 2.28
102 ± 3.06
89 ± 2.67
3
± 0.18
1 hyHpt13-GALK8
80 ± 2.4
88 ± 2.64
96 ± 2.88
2.8 ± 0.168
2 hyHpt13-GALKlO
74 ± 2.2
87 ± 2.61
115 ± 3.45
2.3 ±
2.3
0.138
3 hyHpt13-GALK11
81 ± 2.43
98 ± 2.94
123 ± 3.69
2
±
2
0.12
Comp1ementation
5 hyHpt13-Tyk6
100
100
100
2 hyTyk6D44C5R15-GALK4
1.7±0.051
97 ±
97
2.91
86 ±
86
2.58
< 0.1
1 hyTyk6D44C5R15-GALK5
1.8±0.054
90 ± 2.7
110 ± 3.3
< 0.1
3 hyTyk6D44C5R15-GALK6
2.5±0.075
98 ± 2.94
91 ±
91
2.73
< 0.1
2 hyTyk6D44C5R15-GALK7
2.09±0.0627
95 ±
95
2.85
107 ± 3.21
< 0.1
4 hyTyk6D44CSR1S-GALKl
2. 4±0. 072
93 ±
93
2.79
96 ± 2.88
< 0.1
* The values are the average of at 1east 3 e~periments.
The relative error was about ±3%. The incor-
porations ~re expressed as a percentage of ~ hyHpt13-Tyk6 "control hybrid". The incorporation of tri-
3a
3
tium from
H-D-ga1actose,
H-hypoxanthine,
H-thymidine for "control hybrid" is respective1y about
11400 cîm, 4000 c~m and 3000 cpm.
** The va ues are t e average of at 1east 3 experiments.
The relative error was ±6%.
The ga1acto-
kinase specific activity is
expressed in ~mo1e of ga1actose-1-phosphate produced per mg per min at
37°C.

TABLI! 4
Co~le~ntation analyaia of OgaR,
OgaR, null ailele BaU[ mutanta
Dla R
Dla ,
R
null allde Ballt _tanta
"GAL-
GALK~
GALK5
GALK6
CALlt7
GALKl
CALK2
GALK9
GALK8
GALKlO
GALKll
A13G9
34A13G32
V6IG15
GALK~
+
+
+
Gl{I;JC5
+
+
+
GALK6
+
+
+
GALK7
+
+
+
GALKI
+
+
+
GALKZ
+
+
+
GALK9
+
+
+
GALK8
+
+
+
GALKlO
+
+
+
GALKll
+
+
+
Al3G9
Al3G9
+
34A13GaZ
13GaZ
+
V6IG15
Complementation analyaia of OgaR null allele J!!! _tanta vaa perfor.ed aa deaeribed in "ateriala and Methoda.
DHEH vith 25 -" lalaetoae inatead
of 11ucoae, 10% DFCS vae ueed ae eeleetive aediua.
"AI3G9, 3~AI3G32,V6IG15 ere GAL- _tente defeetive in eeleetion traneport ehein. Al3G9 end 34A13G32 are in the ea~ eomple~ntetion Iroup ("a!ti,
de Souza, Thidon, 1981)
+ atanda for eomplementetionl - for abeenee of e~le.
e~le .nt.tion

TABLE 5
Detection of "cross reacting mate rial" in DgaR
Dga
nu11 a11e1e ga1 K
ga1
mutants
GALACTOKln~E ACTIVITY
Ce11 1ines
Ce11 extract
Antise rum
V6(b)ce11 extract
(\\lI)
(\\lI)
(\\lI)
A
B(c)
A
V6(a)
100
150
0
* 10 ±
10
0.6
100
GALK4
100
150
100
97 ± 5.8
98 ± 5.8
GALK5
100
150
100
94 ± 5.6
96 ± 5.7
GALK6
100
150
100
93 ± 5.5
95 ± 5.7
GALK7
100
150
100
96 ± 5.7
97 ± 5.8
GALK1
100
150
100
92 ± 5.5
97 ± 5.8
GALK2
100
150
100
95 ± 5.7
96 ± 5.7
GALK9
100
150
100
90 ± 5.4
94 ± 5.6
GALK8
100
150
100
89 ± 5.3
91 ± 5.4
GALIClO
100
150
100
94 ± 5.6
97 ± 5.8
GALKll
100
150
100
96 ± 5.7
100
V6
100
150
100
* 98 ±
98
5.8
212 ±12.
This experiment was performed as described in Hateria~ and Hethods.
(a) 100 \\lI of extration buffer was added to complete the volume to 400 \\lI.
The protein concentration
of ce11 extract was about 4 mg/ml.
(b) V6 fresh ce11 extract was added as described in Hateria1s and Hethods.
The ga1actokinase activity
was mesured in 50 \\lI of supernatant. the activity is enzyme units per mg of V6 ce11 extract protein
(a unit ~ 1 pmo1e of ga1actose-1-phosphate produced per min at 37°C).
100% is the activity obtained
with V6 ce11 extract treated wit~ normal rabbit serum.
* The average of at 1east 4 independent experiments. The relative error was ±6%.
(c) The values obtained with simi1ar1y treated with normal rabbit serum substituted for the immune serum.

1
Pedigree of the strains
1
V79 (Ford anâ Yerganian 19S8)
1
Cloned 3 times
1
V6 (W. T.)
mutagenesis
lIIUtagenesis
mutagenesis
\\
V6IP (ino-, pro-)
1
1
1
Hpt13 (BPRr)
TyK6 (Tr)
1
mutagenesis
1
mutagenesis
GALKl~l
DR2
mutagenesis
1
1
mutagenesis
TyK6Cs R.1.S
rYk6DC
rYk6DC4
1
.1
mutagenesis
:c
1
GALK4
GALKS
GALK6
GALK7
GALK2
1
GALK4
GALKS
GALK6
GALK7
GALK9
GALK8
Figure 1 - Pedigree of the different strains which gave rise to DgaR,
DgaR, null
allele galK lIIUtants. Mutagenesis was carried out with ethyl methane sulfonate
(Thirion et al, 1976). V6IP is a double auxotroph inositol- proline- (Labrecque
& Thirion, 1977). Hpt13 and TyK6 are respectively deficient for hypoxantine
phosphoriboxyl transferase (BPRr-) and thymidine kinase (TK-) (Thirion et al,
1976; Thirion and Talbot, 1978; Claverie et al, 1979). DR2, TyK6CSR1S and
SR1S
TyK6DC4 are partially resistant to 2-deoxygalactose. The strains underlined
are fully resistant to 2-deoxygalactose (8 mg/ml).

100
>-
...s
-:>~
IJJ·
!Q
z
-~

~
o
(.)
<t 50
...J
<t
C)
...J
<t
E
z
~
o
10
50
100
150
ANTISERUM ()JI)

omatic Ce// Genetics,
Genetics. Vol. 7. No. 5.. 1981. pp. 567-582
ANNEXE
II
iochemical and Genetic Characterization of
espiration-Deficient Mutants of Chinese Hamster
ells with a Gal- Phenotype
du B. Maiti, Aristide Comlan de Souza, and Jean-Paul Thirion
èpartement
épartement de Microbiologie. Centre Hospitalier Universitaire. Faculté de Médecine,
niversitê
niversité de Sherbrooke. Sherbrooke. Québec, Canada JI H 5N4
eceived 4 March 1981-Fina1 18 May 1981
bstract-Four Chinese hamster somatic ce// mutants A13G9. 34A/3G32.
A13G14. and V6IG 15 with a eut:
Ga/- phenotype have the fo//owing character-
tics: (1) a 10w respiration rate; (2) a reduced Krebs cycle activity; (3) a /ow
vel of stimulation of oxygen consumption of mutant mitochondria by
a1ate; (4) an absolute dependence on an ample supply of glucose to sustain
high rate of glycolysis; (5) a defect in the electron transport chain from
ADN to coenzyme Q; and (6) no appreciable activity of rotenone-sensitive
ADN oxidase in mutant mitochondria. These four mutants and another

utant,
utant. P12GX1. were analyzed by comp/ementation analysis using seven
ther respira tory mutants of Dr. Scheffler which define seven complementa-
'on groups (I-VII). P12GX1 fails to complement mutant CCLl6-B9 (group
V). A13G9 and 34A13G32 do not complement each other. Mutants V6/G15.
13G9, and 34A13G32 define two new groups of complementation (VIII and
J, while 2A13G14 does not complement mutants of groups II and VI.
INTRODUCTION
Chu et al. (1) isolated spontaneous V79 Chinese hamster somatic cell
Jal- mutants (unable to grow on galactose) using BrdU, galactose, and black
ght (1). Sun et al. (2) reported that their mutants were unable to grow on
. xogenous galactose, fructose, mannose, and galactose-I-phosphate. They
und an appreciable reduction in the activities of galactose-I-P-uridyl
ansferase (1), NADP-isocitrate dehydrogenase, and phosphoglucornutase,
phosphoglucomutase,
hen compared to wild type cells (2).
In the laboratory of Dr. I.E. Scheffler, respiration-deficient mutants,
efective in succinate dehydrogenase, energy metabolism, and NADH-
567
0098-0366/81/0900-0567S03.00/0 © 1981 Plenum Publishing Corporation

568
Maiti et at
f
coenzyme Q reductase of the electron transport chain, were isolated a~
a.uxotrophs either for COdHC0 or asparagine (3-6). Further characterizat
3 or asparagine (3-6). Further
3
tron
tlOn of these mutants showed that their
thelr phenotype was also Gal -. comPlel
mentation analysis among 35 respiration-deficient mutants showed the exis
tence of seven complementation groups (7). One of the mutants of Dr. Ch .
was also characterized geneticaIly. It complemented aIl 35 respiration]
respiration·
deficient mutants. This and the biochemical characterization suggested tha··
the two methods of selection yield Gal- mutants at dilferent loci witi
dilferent biochemical defects.
Thirion et al. have also isolated a large number of such Gal- mutant
among eth yimet ha ne sulfonate mutagenized Chinese hamster V6 ceIls (8)
This paper describes the biochemical and genetic properties of five of the
We report that: (I)three mutants complement the mutants of Scheffier, the
define two additional complementation groups; (2) four mutants are defectiv
in the electron transport chain from NADH to coenzyme Q, while the fift
mutant does not complement the succinate dehydrogenase mutant CCLI 6
B9; (3) they have an absolute dependence on an ample supply of glucose t
sustain a high rate of glycolysis; and (4) their Gal- phenotype is the resuit
a defect in energy metabolism and not of a defect in the galactose Leloi
pathway.
MATERIALS AND METHODS
Ce/l Culture. Independent Gal- mutants were isolated from the V6 ce
line as described (8). The ceIls were cultured in monolayers using Dulbecco
modified Eagle's medium (DMEM) containing 8% fetal calf serum (FCS)
10% donor calf serum (DCS) as described (9). The respiration-deficie
mutants were obtained from Dr. Scheffier (University of California, Sa
Diego, California). They were grown in DMEM medium with 0.34 m
asparagine, 1 mM pyruvate, and 44 mM sodium bicarbonate without antib]
antib~
otics.
'
Cell Fusion. About 105
10 ceIls of each mutant were seeded in a 3.5-c'l
petri dish with 2 ml of DMEM, 8% FCS, 1 mM pyruvate, and 0.34 m .
asparagine at 37°C. After two days, the semiconfluent ceIl layers we
washed twice with phosphate-bulfered saline (PBS) and then covered with
ml of 50% wIv polyethylene glycol 1000 in serum-free DMEM for 60 se
The polyethylene glycol solution was removed. The cells were washed thr .
times with PBS and incubated at 37°C in DMEM with 8% FCS, 1 m
pyruvate, and 0.34 mM asparagine. After two days the medium was remove
and the ceIls were washed four times with PBS, trypsinized, and seeded ~
IO-cm petri dishes with 10 ml of selection medium (DMEM with 25 mN
mN
galactose instead of glucose, 10% dialyzed FCS, 1 mM pyruvate, and O.~l

569
M asparagine). After incubation for three days at 37°C, the medium was
eplaced with the same fresh medium. After 12 days the plates were stained
ith methylene blue to score for hybrid clones. In the control experiments
bout 2 x 105
10 cells of each mutant were seeded in each petri dish. These
. usion experiments were repeated at least three times. Sorne of the hybrid
lones were isolated and shown to be hybrids as determined by their
aryotype and their cell volume.
Measurement of COl Evolution. Radioactive CO2 production was
2 production
easured as described (6). About 1-2 x 105
10 cells were seeded in each of a
eries of 25-ml Erlenmeyer flasks containing 3 ml of DMEM and 8% FCS
nd incubated at 37°C. The next day the medium was rernoved,
removed, the cells were
ashed three times with TD buffer (25 mM Tris HCl, pH 7.4, 0.14 M
aCI, 5 mM KCI, 0.7 mM Na2HP04), followed by the addition of 2 ml of
D buffer containing a specified radioactive substrate (0.1 JLCi). The flasks
ere tightly closed with a serum cap holding a small plastic weil. After 2 h at
7°C, the cells were killed with 0.5 ml of 50% trichloroacetic acid (TCA).
bout 0.2 ml of 0.2 M NaOH was then injected into the plastic well, and the
asks were left at room temperature for 1 h to trap CO2.2. The NaOH solution
as then transfered into a scintillation vial containing 10 ml of toluene-
riton X-I00 scintillation fluid (10). The radioactive samples were counted in
Packard scintillation counter (model 3380) with 78% efficiency for 14C.
Isolation of Mitochondria. Ali operations were done at 0-4°C unless
therwise stated. The cells (1-3 x 108
10 ) ,
), collected from late log phase, were
omogenized at DoC in 3 ml of 0.25 M sucrose with 2 mM EDTA and 50 mM
ris HCI (pH 7.4) by 50 strokes of a Wheaton glass homogenizer. The
omogenate was centrifuged at 500g for 7 min. The supernatant was
ollected, the pellet was resuspended in 3 ml of the same buffer, and the
rocedure was repeated twice (3). The combined supernatants were centri-
ged at 15,000g for 15 min to yield a mitochondrial pellet.
Oxygen Consumption by Whole Cells and Isolated Mitochondria. The
easurement of the oxygen consumption by whole cells was as described (4).
he trypsinized cells were washed once with TD buffer. The rate of oxygen
nsumption by the cells in 2 ml TD buffer was measured in an electrode
hamber (Gilson) with constant stirring at 37°C using a Clark oxygen
ectrode fitted with an automatic recorder (YSI Oxygen Monitor, model
3). The oxygen concentration in solution was assumed to be 210 JLM.
The oxygen consumption of whole mitochondria in 2 ml of 0.25 M
crose, 0.2 mM EDTA, \\.0 mM MgCI 2, 10 mM KCI, 10 mM K
2, 10 mM KCI, 10 mM
2HP0
2HP04
uffer (pH 7.3) was measured at 37°C with a Clark oxygen electrode as
escribed (3). Substrates were added sequentially to a final concentration of
.5-5 mM.
NADH Oxidase,
Oxidase. Succinate Oxidase, and alpha-Glycerophosphate

,
i
570
Maiti et aIt
t
i
Oxidase Activity,
Activity. NADH oxidase, succinate oxidase, and aIPha_glycej'
rophosphate oxidase were measured polarographically as described (11) ...••
Mitochondria in 2 ml of 33 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) wer .'
rapidly frozen and thawed three times in order to make them permeable t
NADH. Oxygen consumption was measured at 30°C within 45 min 0
preparation.
l
Protein Estimation. Protein was estimated using a protein dye (Bioi
Rad, Technical Bulletin 1050, April 1977).
1
Chemicals. Rotenone and antimycin A were from Sigma. The radioacj'
tive compounds [1- ' 4C]pyruvate
[1- '4C]pyruvate (7.8 mCi/mmol), [2- 14C]pyruvate
[2- 14C]pyruvate (8.0 mCi .'.
mmol), [3- '4C]beta-hydroxybutyrate
[3- '4C]beta-hydroxybutyrate (10.9 mCi/mmol), [5- ' 4C]glutamat
[5- '4C]glutamat
(47.6 mCi/mmol), and [U- 14C]aspartate
[U- 14C]aspartate (229 mCi/mmol) were from Nel'
England Nuclear.
RESULTS
f
Phenotype of Cel! Lines. Figure 1 shows the typical phenotype of a Ga~'
mutant clone. About 200 mutant or wild-type cells were seeded in petri dishe ..'
in DMEM with glucose and 10% FCS. After seven days one of the petr
dishes was stained with methylene blue; the others were washed four time
with 4 ml of PBS, incubated in DMEM with either 5 mM galactose or 5 m
glucose and 10% DFCS at 37°C. They were stained after 4 h of incubation'
The mutant clones disintegrated in the presence of galactose (Fig. lA) bul
did not in the presence of glucose (Fig. 1B),
1
thereby justifying the appellati01
L.'.~iU,,~~.~~
B
....
,1
~ !','-t,..;"'~)'.,:
,1
~ !','-t,..;"'~)'.,:....
~. :,
....:~~.Il.~~
t ~. rÇi-
r~
l'
.•~
.• ,:,.i.i,/.J.'i!.' ',' s:
;~ ~:.
,
,
-t'" l~~~
';r~
.;:~~
, ·.·~).::l·f?~..
·.·~).::l·f?~ , . ~~;.~..
~~;. j..
~..
1
, ..., : . « i J ·
.
, ..., : . « i J ·
-...{:;\\·'l':U
"~'
1
~:';:;'r-~!
.t.:r ..,JI"~
J
' ,:'~
" ; . , ' .. . : '
,',
J
' ,:'~
" ; . , ' .. . : '
-
..;,0i~·:lJ .~, ~~ !
'..",\\:";.~;'j),~t~E~'~·
: t':. )o:~~~~~:..
,".~ '. ,~'''.,.~ ~~',
"l:~.'''\\
. ",\\:";.~;'j),~t~E~'~·
: t':. )o:~~~~~:..
"
1.'
,".~ -, ,~'''.,.~ ~~',
"l:~.'''\\
"
1.'
~ ll::-
",
,. """"11,-'"
......
.~
f
'," ':;'l"'~'~
" \\ 1 - " ;
·\\.'''''4·~;'·>1··#
,-
,~ .•~,,!
. . . "04'
. : "
...
...
• •
'J.;'
, '(
i
":"J.~ ;,.:{'I;".~''''''.:.,
l
.~.::5:r!.~,::·~! ._~~:t<'.:', 1
.: ", '.~ '. 't '."
'." ' ...' "':. -...1'
1
• • • t~
,..
._
._ "'''''., -:-".t..)
t
a...
.
a...
·.·.':I.~ ...
...-Al......
-Al
.02.':·
Î
Fig. 1. Illustration of the Gal- mutant phenotype. Mutant clone after 4 h in 5 mM glucose (Al
mutant clone after 4 h in 5 mM galactose (8).
!

Respiration Mutants
571
Gal- for the cell mutant phenotype. In contrast, the morphology (not shown)
of the wild-type clones in both sugar solutions was not basically different from
the morphology shown in Fig. 1B.
1
Five independent mutants were then
further analyzed biochemically and genetically.
Oxygen Consumption by Whole Cel/s. As measured with a Clark
oxygen electrode, the respiration rates (Table 1) of the five Gal- mutant cells
were compared with those of the wild-type cells, V6, and of two known
respiration-deficient mutants, V79-G8 and CCL16-B9, from Dr. Scheffler's
laboratory. Our mutants define two classes. Mutants A13G9, 34A13G32,
2A 13G14, and V6IG 15 have only 11-25% of the wild-type respiration rate,
while the respiration rates of the two mutants P12GXI and CCL16-B9 and
the two wild-type cells are almost the same. Oxygen consumption of wild-type
V6 cells was inhibited about 90% by 2.5 JlM rotenone or 3.6 JlM antimycin
and 100% by 100 JlM potassium cyanide. The low level of oxygen consump-
tion of the mutants was insensitive to 2.5 JlM rotenone and 3.6 JlM antimycin
but 100% inhibited by 100 JlM potassium cyanide. However, at much higher
concentrations of rote none (15 JlM) or antimycin (12.6 JlM), the oxygen
consumption of mutant cell lines was also 90% inhibited. These resuIts
indicate that A13G9, 34A13G32, 2A13GI4, and V6IG15 mutants are
defective in respiration and that P12GXI and CCL16-B9 may be similar.
These mutants were then further characterized.
Complementation Analysis. A genetic analysis was carried out with our
five independent mutants and one mutant of each of the seven complementa-
tion groups isolated in Scheffler's laboratory. Each mutant was hybridized
with each of the Il other mutants and with itself. In addition sorne of the
mutants were hybridized with DR2Rl61O (19), another Gal- mutant defec-
Table 1. Respiration Rate of Wild-Type and Mutant CeIls
Respiration
1
(~moJ OI!
OI!
Relative
Celllines
hjl01 cells)"
rate (%)"
V6(W.T.)
2.02 ± 0.2
100
1
PI2GXI
2.385 ± 0.2
118
AI3G9
0.505 ± 0.05
25
34AI3G32
0.282 ± 0.05
14
2AI3GI4
0.242 ± 0.04
12
V6IGI5
0.263 ± 0.04
13
V79-G8
0.222 ± 0.04
Il
CCLI 6 (W.T.)
2.63 ± 0.7
100
CCLl6-B9
2.17±0.32
82.6
•Average value of at least three measurements ±± SD.
"The relative rates were compared to the appropriate wild type V6 or CCLl6 cells.
ceUs. The values for
CCLI 6 and CCLl6-B9 were from the literature (6).

Table 2. Complementation Analysis of Gal- Mutants"
Overlapping
Gr. 1 Gr. II
Gr. 1 & II
Gr. III Gr. IV Gr. V Gr. VI Gr. VII
DRI610
G8
GI4
G20
BIO
B9
G7
Gll
G29
AI3G9
34AI3G32
2AI3GI4 V6IGl5 Pl2GXI
GalKl
G8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
GI4
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
G20
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ND
BIO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
B9
+
+
+
+
+
+
+
ND
G7
+
+
+
+
+
+
+
ND
+
GIl
+
+
+
+
+
ND
+
G29
+
+
+
+
+
ND
AI3G9
+
+
+
+
34Al3G32
+
+
+
+
2A13G14
+
+
+
V6IGI5
+
+
PI2GXI
+
RI610
"The Chinese hamster cell mutants representing complementation groups I-VII were obtained from Dr. Scheffler's
Scheffier's laboratory. The celllines G8, G 14,
G20, G7, G'l l ,
Gll, and G29 were isolated from V79; BIO and B9 were isolated from CCLI6. Their full names are CCL16-BIO and CCL16-B9,
respectively. The cellline V79-G20 called "overlapping mutant" does not complement mutants of groups 1 and II. The mutants AI 3G9, 34A 13G32,
2A 13GI4, V6IG 15 and PI2GXI were isolated from the V6 cellline in our laboratory. The cellline DR2RI6l0 (GalKI) is defective in galactokinase
and hypoxanthine phosphoribosyltransferase and was isolated in our laboratory. Abbreviations: ND, not done; + stands for complementation; - for
absence of complementation.
!!!-
-~.""".,~":,",-.~""" .•
.•~~.,..-",,_.-_.,
~~.,..-",,_.-_., . .,.,..,...
.,.,.., ,-~.----,..,.,....,,,
,-~.----,..,.,....,,, .....,--,....-."""'".......,.,.~
....
...
-."""'".......,.,.~ ..,.'~_."".',-,...,..-..--
...
.......
..,.'~_."".',-,...,..-..--
_
.......
" " '.... ,~.,,.~->,.....
,~.,,.~->,.. ~"......
,"--.,
......
........~,~,..,"',-
........
.....
..... ,.',..."...".,--.-_....,.,-...""."",~
...""."",~

[
l
573
f
î
34A13
2A13
2A13
A13G9
G32
G14
V6IQ15 P12GX1 GALK1
1
Al3G9
1
1
34A13G32
1
2Al3G14
V6lG15
J
P12GX1
'
GALKl
1
1Fig.
1 2. Complementation analysis among Gal- mutants. Hybridization of Chinese hamster
mutants with defects in respiration were performed. Gal"
Gal+ hybrids were scored in DMEM with
galactose, pyruvate and DFCS as described in MateriaIs and Methods.
Methods,
tive for galactokinase. The genetic criterion for complementation was the
restoration of the wild-type Gal"
Gal+ phenotype in the cell hybrids as described in
two other papers for similar mutants (7, 12). In several instances the hybrid
clones were picked and shown to be hybrids from their kariotypes and their
cellular volumes. In sorne cases, the complementation of two mutations was
confirmed by retesting the hybrid clones in selective medium at lower
densities. Table 2 and Figs. 2 and 3 show the following results: The A 13G9
and 34Al3G32 mutations did not complement one another. They are,
therefore, in the same complementation group. The V6IG 15 mutation
complements ail the other mutants. Therefore these three mutants define two
additional complementation groups, hereafter called groups VIII and IX.
Mutant 2A 13G 14 does not complement mutants of group II, VI, and is thus
also of the overlapping type. This result confirms the unusual feature of sorne
of the mutants of Chu and Scheffier, who were the first to show the existence
of overlapping complementation groups in soma tic ceJls and for which no
explanation has yet been provided. As predicted from the rate of oxygen
consumption (Table 3), mutants Pl2GX 1 and CCLl6- B9 [deficient in
succinate dehydrogenase (13)], do not complement one another and are
therefore in the same complementation group. As expected the galactokinase
DR2Rl61O mutation does complement ail the mutations tested.

t
f
i
574
Maiti et al.l
~
!
.P12
MA13 2A13
&Xl .A13G9G32
Q14 V$1G15
89
810
07
G8
G 11
014
020
029
!
Fig.3. Hybridization of Chinese hamster mutants with defects in respiration. The description ofl
celllines are given in Table 2. Details are in Materials and Methods.
!
t
(
ln summary then, from the analysis of complementation carried out with]
with/
five Gal- mutants from our laboratory and seven from Scheffier's laboratoryl
we conclude that three new respiratory defective mutations define twol
additional groups of complementation, while the other two are in known
complementation groups.
1
Biochemical Characterization. The genetic analysis of our mutants wasl
aimed at reducing the amount of laborious biochemical analysis since the.
characterizations of several of Scheffier's mutants were known: Mutants 89,·
(group IV) and 87 (group V) have a very much reduced level of succinate
dehydrogenase activity (14) and a defect in mitochondrial protein synthesis,
(15), respectively. Mutants of groups r,
l, Il, and VII are defective in complex Il.
of the electron transport chain (16). We have shown above that two of our five
mutations are
in the known complementation group for complex Il
1

~;,,,,,,,,
..
~
_ _.,, '
_ _
• " '
_
t '
'
. .
i'· l'"llt't
·· b ''"~ii.lo;r;;• .
,
_h_
._h
·
'''' '5'
__
_ _
_
_
__% '''_ _ ..'''•..:t
i!" _ _
..
....._ ~
- ., .
,
-
_
_
_
_
-
-t '
'
. .
i'- l'"llt'(
---b"'-"'"~"'ii.lo;r;;
. .
•. .
W
Table
Table 3. Krebs Cycle Activity of Wild- Type and Mutant Cel! Lines
Relative rate of 14C02
14C02 release (%)"
V6
V79-G8
Substrate
(W-T.)
(W.T.)
AI3G9
34AI3G32
2AI3GI4
V6IGI5
PI2GXI
(control)
[I-"C] Pyruvate
100
16 ± 5
20 ± 1
6 ± 1
12 ± 2
119 ± 23
2±A
2±.4
[2_14C]
[2_ 14C] Pyruvate
100
6±1
12 ± 1
4 ± 1
7 ± 1
101 ± 2
3 ± _6
.6
[3_'4C]
[3_ '4C]{3- Hydroxybutyrate
100
49 ± 1
40 ± 2
35 ± 1
Il ± 1
102 ± 1
2±A
2 ± .4
[5-'4C]Glutamate
100
12.6 ± 2
14 ± 2
25 ± 1
JO ± 2
146 ± 5
8.5 ± .16
[U-'4C]Aspartate
100
78 ± 4
53 ± 2
47 ± 1
21 ± 2
122 ± 2
21 ± 4
sn
Q Average value of at
least three determination ±
and the values were expressed as percentage of wild type. Absolute rate (nmol/h/IO' cells) of
metabolism of these substrates in wild type were: for [l_14C]pyruvate, 44 nmol/h/lO' cells; for [2_'4C]pyruvate, 21 nmol/h/lO' cells; for
[5-'4C]glutamate, 3.13 nmol/h/lO' cells; for [3_14C]{3-hydroxybutyrate,
[3_14C]{3-hydroxybutyrate, 0.48 nmol/h/lO' cells; and for [U-'4C]aspartate, 1.16 nmol/h/lO' cells.

576
Maiti et al. 1
(
(2AI3GI4) and for succinate dehydrogenase (PI2GXI). The other three ]
three!
mutants define two additional complementation groups. Experiments were !
thus designed to characterize them
thcm further.
i
Mutants A13G9, 34A13G32, and V61G15 have rates of endogenous 1
respiration of the order of 13-25% of the wild-type cells. These rates were i
very similar to the rates determined for the mutants of groups 1, II, and VII !
(see for instance V79-G8 and 2A13G14, Table 1). They could thus be r
defective in the Krebs cycle or in the electron transport.
i
The activity of the Krebs cycle of the wild-type and the mutant celllines t
was determined by COz evolution with different "Cvlabeled
14C-Iabeled substrates (Table 1
3). The rates of production of 14COz from [1- 14C]pyruvate
[1- 14C]pyruvate in A13G9,1
34A 13G32, 2A 13G 14, and V61G 15 were 16, 20, 6, and 12% of the wild-type, l,
respectively. The low rate of mctabolism for these mutants indicates that the 1
activity of the pyruvate dehydrogenase complex in vivo is reduced or blocked [
since these cell lines do not have any appreciable levels of pyruvate carbox- i
ylase activity. The very low rate (4-12%) of metabolism of [2_14C]pyruvate
[2_ 14C]pyruvate t
by the same Gal- mutants supports this interpretation since conversion of i
[2_14C]pyruvate
[2_ 14C]pyruvate to acetyl-CoA would be necessary to produce 14COz. Simi- l
lady substrate [3-'4C]{j-hydroxybutyrate,
[3- '4C]{j-hydroxybutyrate, when converted to acetyl-CoA, 1
produces 14COz after one complete turn of the Krebs cycle. The release of !
14COz from that source was about 11-50% in these respiration-deficient!
mutants compared to wild-type cells. This indicates a moderate inhibition 1
either of the Krebs cycle or of the conversion of {j-hydroxybutyrate to i
acetyl-CoA. The release of J4COZ from [5- J4C]glutamate
[5- J4C]glutamate was about 1O-25%!
compared to wild-type, which suggests a possible block in the a-ketoglutarate i
dehydrogenase complex. Similar measurements with
[U- J4C]aspartate
[U- J4C]aspartate i
showed a significant release of J4COz (21-78% of the wild type), indicating i
that the Krebs cycle was operating at least to sorne extent from oxaloacetate 1
to œ-ketoglutarate.
a-ketoglutarate. These results demonstrate that the Krebs cycle is 1
impaired in these four mutants and, since they have similar characteristics ,
with known mutants of complex 1 (16), this suggests similar biochernical ]
biochemical!
defect for them.
:
Mitochondrial Activity of Wild-Type and Mutant
Mulant Ce/l Lines. The 1
oxygen consumption by intact wild-type or mutant mitochondria was 1
compared in the presence of various substrates and inhibitors to determine 1
any defect in the electron transport chain. Figure 4 shows that malate i
stimulates oxygen consumption in wild-type and PI2GX 1 mitochondria but f
not in A13G9, 34AI3G32, 2A13G14, and V61G15 mitochondria. In the]
thef
wild-type and P12GX l ,
l, the stimulation was almost totally inhibited by 5 x !
10- 4
10-
mM rotenone or antimycin (not shown). In contrast, succinate and 1
a-glycerophosphate stimulate the oxygen consumption at about the same rate!
in both wild-type and mutant mitochondria. It is to be noted that in ail cases!
the oxygen consumption, as stimulated by succinate, was inhibited by malo-l
~

Respiration Mutants
577
V 6
P12 Gxl
5
1
A13 G9
1
34A13 G32
z
o
H
2A 13 G14 ---'---...!.----!
~
V
8
V 61G15
6 1G15
Z
r.4
r.4
U
II ZoU
II00 Zr.4r.4ol.'><
1
X
o
1
5 min.
j
TIME
Fig. 4. Oxygen consumption by intact mitochondria from wild-type and mutant cells. The
amount of oxygen remaining in solution was measured with an oxygen electrode. The following
substrates or inhibitors were added sequentially as indicated by the arrows: (1) malate and
pyruvate (2.5 mM each), (2) rotenone (5 x 10- 7
10- M), (3) succinate (2.5 mM), (4) malonate (2.5
mM), (5) a-glycerophosphate (2.5 mM), and (6) antimycin A (2.5 ).LM). The amount of
mitochondrial protein from wild-type or mutant cell Iines was as follows: V6, 2.0 mg; PI2GXI,
2.1 mg, A13G9, 2.3 mg; 34A13G32, 2.2 mg; 2A13G14, 2.1 mg; V61G15, 2.0 mg.
nate (Fig. 4). Similarly, a-glycerophosphate-dependent oxygen consumption
was totally inhibited by antimycin A, an inhibitor of complex III of the
. electron transport chain. These results indicate that the electron transport
chain from NADH to coenzyme Q is impaired in four of the five mutants,
whereas the portion of the chain from succinate and a-glycerophosphate
through coenzyme Q to oxygen is normal.
Succinate Oxidase,
Oxidase. a-Glycerophosphate Oxidase, and NADH Oxidase
Activies of Wild-Type and Mutant Cell Lines. In order to confirm the
previous results, the succinate oxidase, a-glycerophosphate oxidase, and
NADH oxidase activities were compared in wild-type and mutant cells.
Succinate stimulated the oxygen consumption of both wild-type and mutant
broken mitochondria, while malonate inhibited that reaction by 95% (Fig. 5).
Similarly, a-glycerophosphate also stimulated oxygen consumption in both
wild-type and mutant mitochondria, while 1 mM KeN completely inhibited
that reaction. Therefore, wild-type and mutant mitochondria have similar

578
Maiti et al.
P12 G x 1
A13 G9
5
1
,
6
34A13 G32
j
7
j
1
5 min.
T'ME
!
Fig. 5. Polarographic assay of NADH oxidase, succinate oxidase,
oxidase. and o-glycerophosphatej
a-glycerophosphatel
oxidase with broken mitochondria from wild-type and mutant cell lines. The amount of oxygen t
remaining in solution was measured with an oxygen electrode. The following substrates and 1
inhibitors were added sequentially as indicated by the arrows: (1) succinate (2.5 mM), (2)'
malonate (2.5 mM), (3) NADH (0.5 mM), (4) rote none (5 x 10-' M), (5) a-glycerophosphatel
(2.5 mM). (6) antimycin A (2.5 "M), (7) potassium cyanide (1 mM). The amount of wild-typel
and mutant mitochondrial protein taken in the assay was as follows: V6, 1.9 mg; PI2GXI, 2.0 mg.,.
A13G9, 2.1 mg; 34A13G32, 2.0 mg; 2A13G14, 2.2 mg; V6IGI5, 2.0 mg.
l
,,
1
succinate and a-glycerophosphate oxidase activities. The electron transport,1
transport,1
chain from coenzyme Q to oxygen is functional in aIl cell lines. In contrast,
contrast.
the NADH oxidase activity in wild-type mitochondria was about 60%
inhibited by rotenone, while that same activity in mutant mitochondria was
almost
almast totally insensitive to rote none (Fig. 5). Table 4 shows the specifie
specific
activities of succinate oxidase, a-glycerophosphate oxidase, and NADH
oxidase in the wild type and in the 2Al3Gl4 mutant. Both have comparable
succinate oxidase, a-glycerophosphate oxidase, and total NADH oxidase]
oxidase.
activities. In the wild type about 55% of the total NADH activity is inhibited
by 5 x 10- 7
10- M rotenone, whereas in the mutant the inhibition of that activity

llespiration Mutants
579
Table 4. Succinate Oxidase, a-Glycerophosphate Oxidase, and NADH Oxidase Activities of
Wild-Type and Mutant Cell Lines"
Lines'
Specifie activity
(nmol O2 consumed/rnin/mg
consumed/min/mg protein)
2A13GI4
Wild-type V6
(respiration-deficient)
Succinate oxidase
38.9
42.0
a-Glycerophosphate
oxidase
11.8
12.2
Total activity
ofNADH oxidase
9.2
7.82
Rotenone-insensitive
NADH oxidase
4.2
7.60
Rotenone-sensitive
NADH oxidase
5.0
0.22
The assay procedure has been described in Materials and Methods. Substrate concentrations
are as indicated in the legend of Fig. 5. Total NADH oxidase activity was measured in the
absence of rotenone. The activity measured in the presence of rotenone represents rote none-
insensitive NADH oxidase; the subtraction of the latter from the total activity gives the
rote none-sensitive NADH oxidase activity. The numbers are the average value of at least two
measurements.
. s about 3% (Table 4). With the three other mutants A13G9, 34A13G32, and
~6IG 15, these same activities were similar to the one obtained with 2A 13G14
within the experimental error). Although not demonstrated but already
uggested (13, 16), these results would indicate that, in mutant mitochondria,
NADH is probably oxidized via a nonphosphorylating pathway using a
otenone-insensitive NADH oxidase. In surnmary,
summary, the four mutants A13G9,
~4AI3G32, 2A13G14, and V6IG15 are defective in the electron transport
chain
L;hain from NADH to coenzyme Q.
DISCUSSION
Somatic cell mutants with a Gal- phenotype have been isolated in three
places. In Scheffler's
Scheffier's laboratory the mutants were first isolated as auxotrophs
or asparagine and CO 2• They were subsequently shown to be Gal- and
2• They were subsequently shown
to be Gal-
espiration defective. In Chu's laboratory the mutants were isolated as Gal-
; using BrdU, black light, and a medium containing galactose and pyruvate.
Sorne of them were reported to be low in the activities of galactose-l-P-uridyl
ransferase (7), isocitrate dehydrogenase, and phosphoglucomutase (2). In
pur Iaboratory,
laboratory, the mutants were isolated as described by Dr. Chu, except
hat a medium containing galactose and no pyruvate was used (8). This paper
eports the characterization of five mutants and their comparison with seven
known
~nown respiratory mutants representing seven complementation groups.

1
580
Maiti et al.J
1
The properties of the four mutants A13G9, 34A13G32, 2A13G14, andf
V6IG15 are: (1) a low rate of respiration; (2) a Gal- phenotype; (3) af
reduced Krebs cycle activity (Table 3); (4) a lesion in the electron transportl
chain from NADH to coenzyme Q; and (5) a reduced rate of CO 2 production!
2
from
[1- 14C]pyruvate,
[1- 14C]pyruvate,
[2- 14C]pyruvate,
[2- 14C]pyruvate,
[3- 14Cll3-hydroxybutyrate,
[3- 14Cll3-hydroxybutyrate,
[5-1
[5-1
"Cjglutamate,
14C]glutamate, and [U- 14C]aspartate
[U- 14C]aspartate of 6-20%, 4-12%, 11-50%, 10-25%,t
and 21-78% of the wild-type cell, respectively. In contrast, the rate of C0 1
.•2
production from [1_14C]pyruvate
[1_ 14C]pyruvate with 35 of Scheffier's mutants is less th an
1%
1
of wild-type, suggesting that the two modes of selection yield mutants!
with different phenotypes representing mutations at different loci. This,
suggestion is supported by our studies of mutants A 13G9, 34A 13G32, andl
V6IG 15, which define two new additional groups of complementation, and of!
mutant PI2GXl, which differs from the other four mutants: Its rate of!
respiration, its Krebs cycle activity, the production of CO 2 from different 14CI
2 from different
substrates, and its electron transport chain activities are not significantlYI
different from the wild type. This mutant is most probably defective in
succinate dehydrogenase since it does not complement mutant CCLI6-B9 o~
group IV previously characterized. In addition, the four respiration-deficient .•.
mutants have no appreciable rotenone-sensitive NADH oxidase activity. This
most probably leads to the accumulation of NADH in the mitochondria
which, by feedback, inhibits the NADH-generating steps of the Krebs cyclet
and reduces the different Krebs cycle activities. Interestingly enough, these]
theseJ
mutants defective in respiration have been selected as oar .
Gal-. Apparently the
rate of conversion of galactose to glucose is not fast enough to sustain a high
rate of glycolysis. As a consequence, the rate of production of ATP may not
be high enough for the cells to survive.
The selection used for the isolation of these mutants was originally
designed to provide us with mutants defective tor the enzyme of the Leloir
pathway (galactokinase, galactose-l-P-uridyl transferase, UDP-Gal-epimer-l
ase). About one hundred Gal- mutants were th us selected. They lyse in thel
presence of galactose as a carbon source. They complemented DR2R 1610, al
galactokinase mutant. A reconstruction experiment was therefore carried out'
using DR2R1610 defective for galactokinase and galactose metabolism to
determine the possibility of selecting gal K mutants using BrdU and galac-
tose. About 150 cells of DR2R1610 mixed with about 106
10 wild-type cells were
grown as described (8) in the presence of galactose and BrdU and irradiated
with black light. The survivors were grown in glucose with 2-deOXygalactosel
as described for the selection of DR2R1610 (9). The results showed that
about 10% of the DR2R 1610 cells survived the selection procedure, indicat-
ing that this .procedure could eventua~ly be used to select the rare (about 1 in!
107
10 mutagenized
mutagemzed cells) Gal- galactokinase
galactokmase mutants.
1
1
t\\

Respiration Mutants
581
The properties of the respira tory deficient Gal- clones suggest to us that
these clones must be mutants rather than variants since (1) ethylmethane
sulfonate, a mutagenic agent, increases their frequency about tenfold (8); (2)
the Gal- phenotype is preserved from generation to generation in absence of
any selection (these mutants have been grown for several years without any
phenotypic change); (3) there is a specifie
specific functional alteration of the
respiratory chain in four of five mutants; and (4) finally, in complementation
analysis, these variants behave like mutants since it is possible to order these
mutations in complementation groups. Therefore the selection of Gal-
mutants described here provide new and valuable mutants for the studies of
soma tic cell genetics and mitochondrial functions in particular.
Among the four mutants defective in the NADH-coenzyme Q pathway,
2AI3G 14 does not complement mutants of group II, VI, and V79-G20, while
the three others (AI3G9, 34A13G32 and V61G15) define two new comple-
mentation groups (VIII and IX). Thus, mutations Iying in four complementa-
tion groups are now known to affect complex 1, suggesting that a genetic
dissection of complex 1 is possible. This rather large number of complementa-
· tion groups is not unexpected since complex 1 of beef mitochondria is known
to contain at least 16 polypeptides and other chemical moieties (17-19).
Finally, the existence of overlapping mutants, such as 2A13GI4 and
Scheffler's
Scheffier's V79-G20 (7) and sorne of the mutants of Dr. Chu (1), is quite
unusual in somatic cell genetics. Therefore, in addition to the commentaries
already published (7), it is appropria te to make the following remarks: these
mutants could be (1) ail linked; (2) polar mutants, like those of the lactose
operon in E. Coli; (3) regulatory mutants; or (4) mutants at the junction
between intron and exon. If one considers that the structure of two mamma-
lian linked genes is for the first gene: exon-junction l-intron-junction 2, and
for the second gene: exon-junction 3-intron-junction 4-exon, then a muta-
tion at junction 2 could possibly promote splicing with junction 4, resulting in
a deletion of the corresponding mRNA for the en tire junction I-junction 4
· region.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Dr. Scheffier for making his mutants available to us and
without whom this work wou Id not have been possible. We thank Drs,
Drs. H.
Penfold and B. Talbot for critical reading of this manuscript. Financial
support of the Medical Research Council of Canada (MT. 4860) and the
March of Dimes Foundation is gratefully acknowledged. Dr. J.-P. Thirion is
· supported by a Medical Research Council of Québec career development
award.
j
j

582
Maiti et al.
LITERATURE CITED
1.
Chu, E.H.Y., Sun, N.C., and Chang, C.c. (1972). Proe. Natl. Aead. Sei. U.S.A.
69:3459-3463.
2.
Sun, N.C., Chang, c.c., and Chu, E.H.Y. (1975). Proe. Natl. Aead. Sei. U.S.A.
72:469--473.
3.
De Francesco, L., Scheftler, I.E., and Bissell, M.J. (1976). J. Biol. Chem. 251:4588--4595.
4.
De Francesco, L., Werntz, D., and Scheffler,
Scheftler, I.E. (1975). J. Ce//. Physio/. 85:293-306.
5.
Donnely, M., and Scheffler,
Scheftler, I.E. (1976). J. Ce//. Physiol. 89:39-54.
6.
Scheftler, I.E. (1974). J. Ce//. Physiol. 83:219-230.
7.
Soderberg, K., Mascarello, J.T., Breen, G.A.M., and Scheffler,
Scheftler, I.E. (1979). Somat,
Somat. Ce//
Genet. 5:225-240.
8.
Thirion, J.-P., Labrecque, R., and Vu, T.P. (1976). J. Ce//. Physiol. 87:135-140.
9.
Thirion, J.-P., Banville, D., and Noel, H. (1976). Geneties 83:137-147.
10.
Ihler, G, and Rupp, W.D. (1969). Proe. Natl. Aead. Sei. U.S.A. 63:138-143.
Il.
Ragan, C.I., and Bloxharn,
B1oxham, D.P. (1977). Bioehem. J. 163:605-615.
12.
Chu, E.H.Y. (1974). Geneties 78:115-132.
13.
Sottocasa, G.L., Kuylenstierna, B., Ernster, L., and Bergstrand, A. (1967). J. Ce// Biol.
32:414--415.
14.
Soderberg, K., Ditta, G.S., and Scheftler, I.E. (1977). Ce// 10:697-702.
15.
Ditta, G., Soderberg, K., and Scheffler,
Scheftler, I.E. (1977). Nature 268:64-66.
16.
Breen, G.A.M., and Scheffler,
Scheftler, I.E. (1979). Somat. Ce// Genet. 5:441--451.
5:441--451.
17.
Dooijewaard, G., De Bruin, G.J.M., Van Dijk, P.J., and Slater, E.C. (1978). Bioehem.
Biophys. Aeta 501:458--469.

501:458--469.
18.
Hatefi, Y. (1978). Methods Enzymol. 53:11-14.
19.
Ragan, c.r.
c.I. (1976). Bioehem. J. 154:295-305.