UNIVERSITÉ
PARIS
VII
Année 1987
THÈSE
Pour le DIPLOME DE DOCTEUR DE 3e CYCLE
(OPTION IMMUNOLOGI E)
par
Anatole TOU NKARA
"
l
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CONTRIBUTION A L'ETUDE DU RECEPTEUR ERYTHROCYTAIRE
DE PLASMODIUM FALCIPARUM
Présentée et soutenue publiquement le
27 MARS 1987
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Devant la Commission d'examen:
Monsieur le Professeur Arthur Donny STROSBERG, Président
Monsieur le Docteur Jean-Pierre CARTRON, Membre
Monsieur le Professeur André PAVIA, Membre
Monsieur le Professeur Daniel CAM US, Rapporteur
Monsieur le Professeur Charles SALMON, MembFe

---

SOMMAIRE
INTRODUCTION
p. 1
ROLE DES STRUCTURES DE GROUPE SANGUIN
p. 5
11
ROLE DES GLYCOPROTEINES DE L'ERYTHROCYTE HUMAIN
DANS L'INVASION PAR PLASMODIUM FALCIPARUM
p.5
III
ROLE DES STRUCTURES GLUCIDIQUES DANS LE PROCESSUS
D'INVASION DU GLOBULE ROUGE PAR PLASMODIUM
FALCIPARUM
p. 8
a) Rôle de l'acide sialique
p. 8
b) Rôle des oligosaccharides alcali-labiles et alcali-stables
de la glycophorine
p. 9
c) Rôle des sucres simples
p. 9
IV
PRINCIPALES GL YCOPROTEINES DE LA MEMBRANE ER YTHROCYTAIRE ET
LES STRUCTURES OLIGOSACCHARIDIQUES ASSOCIEES
p. 9
IV.l
La glycophorine A
p.9
IV.2
La glycophorine B
p. 10
Schémas des glycophorines
p. 11
IV.3
La glycophorine C
p. 12
IV./4.
Les chaînes oligosaccharidiques portées par les glycophorines
p. 12
V
LES OBJECTIFS DU TRAVAIL..-
p. 14-
MATERlELS E.T METHODES
1
RAPPEl- DE LA CINETIQUE DU CYCLE ERYTHROCYTAIRE DE
P. FALCIPARUM
p. 17

---

U'
II
MILIEU DE CULTURE
Le RPMI-164-0
p. 17
Le sérum humain
p. 17
Les globules rouges humains
p. 18
III
LES SYSTEMES DE CULTURE
p. 18
Culture asynchrone
p. 19
Culture synchrone
p•. 20
a) Méthodes basées sur la densi té des cellules
p. 20
b) Méthodes basées sur la lyse préférentielle
p. 20
c) Méthodes basées sur le blocage réversible de la
synthèse de l'ADN parasitaire
p• 21
• La technique de synchronisation au sorbitol que nous avons
utilisée
p. 21
Culture synchrone en microplaque
p.
21
IV
METHODES D'APPRECIATION DE LA CROISSANCE. PARASITAIRE
p.
22
a) Parasitémie sur frottis minces colorés au Giemsa "R"
p.
22
· Le frottis
p.
22
• La coloration
p.
23
• Lecture du frottis coloré
po- 23
b) Incorporation de 3H-Hypoxanthine
p.
24
• Le principe de la méthode
p.
24
• La méthode
p.
25
V
EXPERIENCES D'INHIBITION DE L'INVASION
p.
26
.. Principe
p.
26
• Inhibition à l'aide de peptides de synthèse
p.
27
a) Liste et origine des peptides
p.
27
b) Méthode
p.
28
c) Etude de la toxicité des inhibiteurs
VI
UTIUSATION D'HEMATIES DE. PHENOTYPES RARES
p.
29
VI.l
Hématies Cad.
p.
29
VI..2 Hématies Wr<a+b-)
p.
30
VI')
Méthode
p.
31

---

.........
RESULTATS
1
ETUDE DES PARAMETRES DE LA MICROTECHNIQUE DE CULTURE
IN VITRO DE PLASMODIUM FALCIPARUM
p. 33
1.1
EFFET DE LA CONCENTRATION DE 3H-HYPOXANTHINE
p.
33
Conditions d'expériences
p.
33
Résultats
p.
33
Commentaires
p.
33
1.2
EFFET DU TEMPS DE PRECULTURE
p.
35
Conditions d'expérience
p.
35
Résultats
p.
35
Commentaires
p.
35
1.3
EFFET DU TEMPS D'INCORPORATION DE 3H-HYPOXANTHINE
p.
37
Conditions d'expérience
p.
37
Résultats
p.
38
Commentaires
p.
38
1.4-
EFFET DE. LA PARASITEMIE INJTIALE.-
p.
39
Conditions d'expériences
p.
39
Résultats
p.
39
Commentaires
p.
41
1.5
EFFET DE L.'HEMATOCRITE
p.
41
a) Résultats dans le système de culture asynchrone en microplaque
p.
41
b) Résultats dans le système de culture synchrone en microplaque
p.
42
Commentaires
p.
43
1.6
EFFET DU TEMPS DE VIEILLISSEMENT DES GLOBULES ROUGES HUMAINS
A +4-0
VARIATION DE L.'HEMATOCRITE ET DES FACTEURS INDIVIDUELS
p.
44
Résultats (Tableaux: et figures}
p.
45-46
Commentaires
p.
47
1.7
CONCLUSION DE L'ETUDE. DES CONDITIONS EXPERIMENTALES DE
MICROCULTURE DE P. FALCIPARUM
p.
48
II
ETUDE DU RECEPTEUR ERYTHROCYTAIRE DE PLASMODIUM' FALCIPARUM
PAR DES EXPERIENCES D'IMPALUDATION IN VITRO D'HEMATIES PORTANT
DES STRUCTURES DE GROUPE SANGUIN RARES
p.
50
Il.1
IMPALUDATION IN VITRO D'HEMATIES Cad
p.
50
Ir.2
IMPALUDATION IN VITRO D'HEMATIES Wr(a+b-)
p.
52

---

IV
III
EXPERIENCES D'INHIBITION IN VITRO DE LA CROISSANCE
DE PLASMOorU FALCIPARUM
p 53
IlI.1
ROLE DES SUCRES SIMPLES
p 53
a) Sucres testés dans le système d'inhibition de culture synchrone
p 53
b) RésuLtats
p 53
I1I.2
ROLE DES OLlGOSACCHARIDES
p. 59
a) Structures oligosaccharidiques testées dans le système d'inhibition
de culture synchrone
p. 59
b) RésuLtats
p.6Q
III.)
ROLE DE QUELQUES GL YCOPROTEINES D'ORIGINE HUMAINE
ET ANIMALE
P'61
Structures oLigosaccharidiques associées aux glycoprotéines
p.62
RESULTATS:
p.63
a) Glycoprotéines des fluides biologiques
p.63
b) Glycoprotéines de la membrane érythrocytaire
p~64
c) Effet du glycopeptide de la bande) sur la croissance
in vitro de Plasmodium falciparum
p. 69
Structure de l'érythroglycan de la bande)
p)O
I1I.4-
ROLE. DE LA STRUCTURE POL YPEPTIDIQUE DE LA GLYCOPHORIN E A p. 71
ETUDIEE A L'AIDE DE PEPTIDES DE SYNTHESE
p,71
I1I.5
ETUDE DE LA TOXICITE DES INHIBITEURS
pJ8
.,~
.-'
DISCUSSION ET CONCLUSION
P'80
ROLE DES STRUCTURES GLUCIDIQUES
p.83
ROLE. DES ACIDES SIALlQUES
p.84
ROLE. DE LA N-ACETYLGLUCOSAMINE
p.85
ROLE DE. L'E.XTREMITE. NH2-TERMINALE. DE LA MOLE.CULE
P'87
DE. LA Gl..YCOPHOR.INE. A
0'·87
ROLE DES PEPTIDES DE SYNTHESE
p. 89
BlBUOCRAPHIE
p. 92

---

2
Plasmodium falciparum (WELCH, 1897) est un protozoaire sanguicole appartenant à
l'ordre des EIMERIIDEA, au sous-ordre des HAEMOSPORIIDEA, à la famille des
PLASMODlIDAE et au genre PLASMODIUM.
Largement répandu dans les régions tropicales et équatoriales, il est transmis par
la piqûre de l'anophèle femelle comme les autres espèces plasmodiales parasites de
l'homme
(Plasmodium
vivax,
Plasmodium
ovale
et
Plasmodium
malariae).
Responsable de 50% des cas de paludisme humain, il détermine la fièvre dite
"Tierce maligne", évoluant de façon aiguë en entraînant souvent la mort.
La lutte contre ce fléau consistera à rompre l'un des maillons de la chaîne du cycle
biologique du protozoaire. Le schéma n°
1 résume
ce cycle biologique qui
comprend:
- une multiplication sexuée chez l'insecte appelée sporogonie ou gamogonie,
- une multiplication asexuée chez l'homme, appelée schizogonie. Alors que la
schizogonie exoérythrocytaire se déroulant dans les hépatocytes dure 5 jours, la
schizogonie endo-érythrocytaire ne dure que 4-8 heures.
Depuis l'adoption en
1955
du
programme
d'éradication
de la maladie par
l'Organisation
Mondiale
de
la Santé,
le
paludisme
demeure
toujours
une
préoccupation importante pour le clinicien, l'épidémiologiste et le chercheur.
Cliniciens et épidémiologistes sont confrontés à l'heure actuelle au problème de
l'apparition des souches résistantes aux antipaludéens de synthèse. Quant aux
chercheurs, ils cheminent dans deux grands axes :
- la recherche d'un vaccin efficace, rendue difficile par le problème des
variations
antigéniques,
oblige les
uns
à
se
pen·cher.• sur
les
protéines
immunogènes du parasite;
- la recherche du mécanisme de penetration du parasite dans l'érythrocyte
humain ouvre des perspectives depuis que TRAGER et" JENSEN en 1976 ont
réussi à maintenir en culture à long terme le Plasmodium falciparum.
C'est dans cette deuxième voie que nous nous sommes engagés pour la réalisatiorr
de cette thèse au
moment où des données en~ourageantes suggèrent" que
Plasmodium falciparum pénétrerait dans l'érythrocyte humain par- l'intermidiaire
d'un récepteur spécifique probablement de nature glyco-protéique : MILLER et al.
0973, 1975, 1976, 1977t" 1983) ; PERKINS et al. (1981) ;_ PASVOL et al. (1982 ;
BREUER et al. (983).
En effet, des études de microscopie électronique d'abord réalisées" avec des
plasmodiums d'autres espèces tels que Plasmodium gallinaceum,
Plasmodium
ber~hei, Plasmodium
knowlesi,
Plasmodium
vivax
et
ensuite' Plasmodium
fa!ciparum, ont montré que· le parasite responsable du paludisme (aviaire, simien et
humain), ne pénètre pas dans l'hématie par effraction de la membrane de celle-ci,
f·

---

Schéma 1
Cycle biologique de Plasmodium falciparum
1"UI(llall .u,
Il...1. I ...~I" .....il.1
.."
~_.--l"'I~I'ISIS]
~,.~-
'QSQUIfO
lCIIlD.rs
LIFE CYCLE 0': Pla~cs•.!t!!! lalcl.QjrulD-
IN ... " ....."lS
Schéma 2 - Processus d'invasion de l'érythrocyte humain par
Plasmodium falciparum: selon HERMENTIN et al., 1984-.
®1.lacc:idental c:ontac:t
3)eryth r ocyte-
defàrmation
--
-_.
4Jreorientatio", and:
apical attachment
5)apical comphtx-
ery th r oc:y te-
junct ion forma t ion
-- -
6J inv1liÎ "at ion
7'interioritatinn

---

mais plutôt par un processus d'endocytose selon une séquence bien preClse
d'évènements. Voir schéma n° 2 selon HERMENTIN résultant des travaux des
auteurs suivants: ROGERS et al. (1969) ; DVORAK et' al. (1975) ; AfKAWA et al.
(1983) ; ENDERS et al. (1983) ; HERMENTIN et al. (1983 et 1984-).
La séquence des évènements se déroule comme suit:
a) Contact accidentel du mérozoite avec la surface de l'hématie.
b) Attachement du mérozoite à la surface du globule rouge au point de contact.
e) Déformation rapide et étendue de l'érythrocyte durant 9 à 15 s.
d) Réorientation et attachement de l'extrémité apicale du parasite de façon que
cette extrémité antérieure soit directement apposée à la surface du globule
rouge.
e) Formation d'une jonction réalisée par le complexe (Apex - Erythrocyte) à
partir de laquelle la membrane érythrocytaire est légèrement déformée pour
engendrer une dépression concave autour de l'apex du mérozoite.
f) Invagination de la cellule hôte, processus qui dure 15 secondes environ.
g) Internalisation du mérozoite vacuolisé.
A quel
mécanisme moléculaire
précis
peut-on attribuer
cette cascade de
modifications de la membrane érythrocytaire aboutissant à l'internalisation du
protozoaire dans l'hématie?
On vient justement de, montrer- que d'autres parasites tels que Entamoeba
histolytica histolytica, responsable de la dysenterie colique et de l'abcès amibien du
foie, ~'attachent spécüiquement à. l'épithélium intestinal grâce à un récepteur de
nature- glucidique, la N-acetyl-glucosamine- (KOBILER et MIRELMAN, 1980). Et
quelques années auparavant, OFEK et coll. (1977) avaient- montré que le mannose
était' le récepteur d'Escherichia. coli à. la surface des cellules muqueuses de
l'homme- ; SILVERBLATT (1974-) avait montré par la microscopie électronique que
Proteus mirabilis responsable de la pyélonéphrite ascendante s'attache, grâce aux
pUis,. aux cellules épithéliales du bassinet du' rat. On commençait' à connaître les
spécificités. des lectines. qui reconnaissaient ci"es: sti-u~es glucidiques sur les
hématies (SHARON et' al~,. 19n)..
Par ailleurs,. des étUdes épidémiologiques. ont' fait' obsérver- que' la prévalence de
l'endémie- palustre à. Plasmodium vivax' était' plus faible- dans les populations à
nombre plus; élevé d'indfvidus de- groupe sanguin' Dufty· négatif (MILLER et al.,..
19n). En 'outre, les ~éthodes de'culture à court terme de Plasmodium vivax et
Plasmodium knowlesi ont montré que les hématies Quffy négatives n'étaient pas
infestables par ces parasites (HOWARD et al., 1.981), ce qui a fait'logiquement
penser que l'antigène Duffy était le récepteur de "Plasmodium vivax.

---

5
S'il est fort probable que l'antigène Duffy soit le récepteur de Plasmodium vivax,
l'on ne connatt pas jusqu'ici la structure biochimique de cet antigène. Cependant,
les résultats obtenus SUl" la non infestabilité des hématies Duffy négatives' par
Plasmodium vivax, les résultat:i des études de microscopie électronique, la notion
de récepteur- à la surface des cellules humaines pour les microorganismes (bactéries
et parasites) ont incité de nombreuses équipes à entreprendre l'étude du mécanisme
de pénétration de Plasmodium falciparum dans l'érythrocyte humain~ ce. d'autant
plus que ce parasite est désormais cultivable in vitro (TRAGER et JENSEN, 1976).
Si les méthodes d'approche semblent diverses, les objectifs sont les mêmes
préciser la structure responsable de la pénétration du parasite dans l'hématie.
1
ROLE DES STRUCTURES DE GROUPE SANGUIN
L'infestation in vitro d'hématies provenant de donneurs rares chez lesquels une
structure antigénique commune est absente a tout d'abord été examinée par
MILLER et al., 1977. Ils ont mis en culture P. falciparum d'une part, et d'autre part
P. Knowlesi avec les hématies suivantes: Oh, Rh nuH, Ko, JK(a-b-), Lu(a-b-), Tn,.
Ge<-), En(a-), 5-s-U-, Fy(a-b-), Rh+, Rh-.
Ils ont alors observé une réduction importante de l'invasion des hématies. (Fy(a-b-)
par' P. Knowlesi, ainsi qu'une réduction importante des hématies En(a-) par' P.
falciparum.
En ce qui concerne P. Knowlesi avec les hématies Fy(a-b-), il y a en fait
attachement du parasite à l'hématie, mais sans internalisation (MILLER et al.,
1979).
En ce qui concerne P. falciparum, la réduction substantielle de l'invasion des
hématies En(a-) suggère un rôle prépondérant de la glycophorine A_ En' effet, les
hématies EN(a-) décrites par FURUHJELM et al., 1969 à l'occasion d'un accident
transfusionnel possèdent un déficit important en glycophorine A signalé par DAHR
et al., 1976 ; GAHMBERG et al., 1976. Plusieurs'autres auteurs..s!intéressent alors
au rôle des structures de groupe sanguin dans le processus d'invasion de l'hématie
par- le parasite du paludisme: PASVOL et al., 1982; HOWARD et al., 1982 ;
FACER et al., 1983. Le schéma n° 3 selon HERMENTIN et al. 1984- résume bien les
résultats de ces auteurs. tout en lllus.tranties déficits en différentesglycophorines.
L'ensemble de ces travaux fait jouer un rôle central aux g1ycophorines. (A; B et C)
de la membrane érythrocytaire dan~ le processus d'invasion par P. fcticiparum.
Il ROLE
DES
GLYCOPROTEINES
DE.
L'ERYTHROCYTE
HUMAIN
DANS
L'INVASION PAR PLASMODIUM FALCIPARUM
Les travaux de MILLER 1977 montrant la résistance des hématies En(a-) ont été
complétés par d'autres permettant d'étudier l'infestabilité des hématies traitées

---

i~ .
~-; ..
6
Selon HERMENTIN et al. 1984
Type
Glyc:o-
Susceptibilité des globules rouges à l'invasion par
cellulaire
phorines
P. falciœrum exprilnée en pourcentage par rapport
au ténDin
MILLER et al. PASVOL
PASVQL
Hawm
FACER
PASVOL
et al.
et al..
et al.
et al.
\\~ camp UPA UPA Camp WA-W 'TJPA
NE
100
100
100
100
100
100
-\\j~
31
NE/T
22
38
36
5
11
~
7,5
48 (MEl?)
24
47 (GY)
8 (QI)
11
En (a-)
39 (AP)
14 (RL)
26
37 (MEl?)
Jlu=
En(a-)/T"
16 (MEP)
S-s-L....
87
72
87
34
30·
57
~"
7,7
a,7
S-s-U-/T'
"\\]=
52
8,8
8,5-
1,9
7,.4
~
5,6
p
57 (PL)
PlI'
22 (PL)
NE.
= él:yt:bJ:Dcyte normal e
~= Localisation de ll~gènewrb -
sur la gIyccphor1ne A
En (a-) = él:ytfu:ocyte déficiente
en glycophorine A
o oligosa.ccharide à liai son Q-glyccsi-
s-s-U- = éryt:hl:ocyt:es dêficientes
dique
en: glya:lphorine B
• chaine" saccharidique à liaison N-glyc:o-
P
= éryt:hrocyt:es déficientes
sidique_
en glyccphor1nes C
+si.te de clivage de la ttypsine
T
= éryt:hrocyt:es traitées
souches" pl.asm::xtiales = canp = souche, ~
à la trypsine
UPA
= Ugando Palo
WA-W = ''West African
GW = individu venant de Finlande
strain of Wel1CXJl'œ/Li.verpoo1 ft
AP et MEP = individus venant
RL = indi.vidà'=~canada.

---

7
par des enzymes protéolytiques: MILLER et aL, 1977 ; BREUER et al., 1982 ;
PASVOL et a1.~ 1982 ; FACER, 1983 ; HOWARD et al., 1982. Il a été montré que
les hématies traitées par la trypsine qui clive la glycophorine A, deviennent
résistantes à ~invasion. Les hématies. traitées par la chymotrypsine qui clive la
glycophorine B deviennent partiellernent résistantes. Par .ailleurs~ l'on sait que la
glycophorine A est la sialoglycoprotéine majoritaire de l'érythrocyte humain
(FURTHMAYR et al., 1978,.1981). La glycophorine A semble jouer un rôle central
et il apparaît utile de déterminer quelle<s) région(s) de cette molécule est
concernée dans le processus d'invasion de l'érythrocyte humain par Plasmodium
falciparum. Pour cela, la molécule a été soumise à l'action de la trypsine qui a
permis d'obtenir différents fragments testés dans l'invasion quant à leur pouvoir
inhibiteur. Les. différents fragments. trypsiques. sont les suivants : schéma nO if.
(selon TOMITA et MARCHESU.
20
,
40
!
6,0
8p
100
131
s.
1
Tl
T3
1
TA
,U, T4
T2
if5 1
Tandis que. BREUER et aL 1983 n'observent une inhibition significative de l'invasion
qu'avec le fragment T6. PERKINS 1984- obtient une inhibition importante avec le
fragment Tl et T6" PERKINS a par ailleurs inhibé la croissance parasitaire in vitro
à l'aide d'anticorps antigiycophorine A et a pu purifier les antigènes du mérozoite
de P. falciparum sur une matrice insoiuble de glycophorine A.
Le rôle de la.glycophorine C a été mis en évidence par les travaux de PASVOL et
al. 1984- qui ont montré que les. hématies Gerbich négatives. (Ge-), déficientes en
glycophorine C, sont partiellement résistantes à l'invasion. Ce résultat est en
contradiction avec celui de MILLER et al. 1977.
Toujours, dans le: but: de préciser la. portion de. la. molécule de glycophorine- A
conceméedans.l~processus d'invasion~ CARTRON et aL 1983 ont montré que les
hématies. M&Mg. sont normalement infestables. Ces cellUles sont caractérisées par-
le fait que leur &\\'ycophorine A possède à l'extrémité NHZ terminale la séquence:
suivante :.. 1Leu,..2S.er-3Thr-lf.Asp-5GI~
; ce qui signifie qu'une' anomalie: de
l'extrémité NHZ terminale n'empêche pas l'infestation par Plasmodium falciparum.
Ces auteurs. ont aussi. décrit une nouvelle cellule résistante': Cad. Nous reparlerons
des· hématies Cad. dans. le chapitre "Matériels et Méthodes". D'ores et déj~ nous
pouvons signaler que ces hématies sont caractérisées pal"' une anomalie de
glycosylation au niveau de leur glycophorine A. La structure biochimique de
l'antigène Cad veint d'!tre élucidée' pa D. BLANCHARD et J.? CARTRON 1983.
Sur la molécule de glycophorine A, une région a été décrite sous le nom de Wrb

---

8
(RlDGWELL et al. 1983). Elle correspond à une portion en hélice cC de la molécule.
Des controverses existent également à propos du rÔle joué par la portion Wrb de la
molécule de glycophorine A dans le processus d'invasion.' Les résultats des travaux
de HERMENTIN et al. 1984a, FACER et al. 1984, SCHULMAN et al. 1984,
CARTRON et al. 1984 sont en contradiction avec ceux de PASVOL et al. 1983.
Une autre glycoprotéine de la membrane érythrocytaire, la bande 3 a fait l'objet de
nombreuses études pour préciser son rôle dans le processus d'invasion. Mais les
résultats là encore sont discordants : MILLER et al. (l983) constatent qu'un
anticorps monoclonal (A90 3) anti-bande 3 des érythrocytes Rhésus bloque l'invasion
par P. Knowlesi. SCHULMAN et al. 1983, BREUER et al. 1983, considèrent que la
bande 3 n'est pas impliquée dans le processus d'invasion de l'érythrocyte par P.
falciparum. Tandis que OKOYE et al. 1985, FRIEDMAN et al. 1985 utilisent avec
succès la bande 3 incorporée dans des liposomes pour bloquer l'invasion in vitro des
érythrocytes humains par P. falciparum.
TOUNKARA et al. (en préparation) n'observent aucune inhibition de la croissance
in vitro de P. falciparum en culture synchrone à l'aide de l'érythroglycan de la
bande 3 utilisée à des concentrations inférieures à 200 pg/ml.
Au total, les glycophorines A, B et C sont impliquées dans le processus d'invasion
du globule rouge humain par P. falciparum. La plupart des travaux menés jusqu'ici
n'ont concerné que la glycophorine A qui est la plus représentée sur la membrane
du globule rouge. Et l'on ignore jusqu'ici quelle est la portion de cette molécule qui
joue le plus grand rôle dans le processus d'invasion.
III ROLE DES STRUCTURES GLUCIDIQUES DANS LE PROCESSUS D'INVASION
OU GLOBULE ROUGE PAR PLASMODIUM FALCIPARUM
a) Rôle de l'acide sialique
La réduction de l'invasion avec les hématies En(a-}, Tn et les hématies traitées-
par- les enzymes a
logiquement évoqué le rôle de la charge' négative,
essentiellement portée par- l'acide sialique des glycoprotéines- 'membranaires.
Différentes équipes ont étudié le rôle de l'acide sialique en- l'introduisant dans
des cultures in vitro de P. falciparum. Mais les résultats obtenus soulèVent
égalem~t des controverses:, JUNGERy et a1~ 1983' obtiennent environ 509&
d'invasion par rapport au· témoin sans acide sialique lorsqU'ils introduisent
NeuAc à la concentration de JOmM. Alors que HERMENTIN et al. 1984b
obtiennent 74- à 9796 d'invasion en utilisant des concentrations de l'ordre de
10mM de NeuAc. EtVANDERBERG et al. 1982 trouvent 50% d'invëision avec 23'
, mM de NeuAc. Ces résultats contradictoires ne sont pas en faveur d'un rôle
probable joué par l'acide sialique dans l'invasion.

---

9
b) Rôle des oligosaccharidiques alcali-labiles et alcali-stables
de la glycophorine A.
Nous rappelons ces structures dans le paragraphe des glycoprotéines de la
membrane. Les résultats obtenus par HERMENTIN et al. 1984a indiquent que
ces oligosaccharides ne jouent pas un rôle important. Mais VANDERBERG et al.
1985 pensent que ces structures oligosaccharidiques deviennent inhibitrices de
l'invasion lorsqu'elles forment un cluster incluant l'acide sialique.
c) Rôle des sucres simples
De nombreuses équipes ont étudié le rôle de différents sucres simples dans
l'espoir d'identifier le récepteur de P. falciparum. Des résultats très variables
ont été obtenus par différentes équipes lorsqu'elles ont couplé les sucres simples
à des protéines. Et il semble que le moyen de couplage influe sur les résultats:
HERMENTIN et al.. 1984b, SCHULMAN et al. 1984b, BREUER et al. 1984,
GUPTA et al. 1984.
Parmi tous les sucres sirtlples testés dans les expenences d'inhibition de la
croissance in vitro de P. falciparum, seule la. N-acétyl-glucosamine siest
montrée régulièrement inhibitrice. Testée au départ par STOWELL et al. 1980,
WEISS et' al... 1981,_ ces auteurs. lui reconnaissent un bon effet inhibiteur de
l'invasion. Mais: la plupart des auteurs l'ayant par la suite introduite dans des
systèmes. de- culture in vitro' lui attribuent également un effet toxique :
HOWARD et al. 1982, JUNGERY et al. 1983, HERMENTIN et al. 1983, 1984.
Au total, l'étude du rôle joué par les structures glucidiques ne nous permet pas
non plus d'indiquer parmi les sucres testés celui qui pourrait être le récepteur
spécifique de P. falciparum.
A l'heure- actuelle,. l'on commencê à connaître la structure des principales
glycoprotéines de la membrane ainsi que. celle de- leurs oligosaccharides
branchés (voir revue- générale par Anstee 198 O. Nous. allons brièvement
rappeler ces principales glycoprotéines; et olig,osaccharida avec leurs structures
car elles. constituent' pour nous> aussi, des éléments importants. dans.. notre
méthode d'approche du récepteur érythrocytaire de P.- falciparum..
IV PRlNCIPALES~ GLYCOPROTEINES· DE L.A MEMBRANE.. ERYTHROCYTAIRE.
E.T LES STRUCTURES OLIGOSACCHARIDIQ~ES ASSOCIEES
1°} La glycophorine A ou
(GPc( ) (Anstee 1981,..SAL.MON et. al. 1984)
C'est la sialoglycoprotéine majoritaire de la· membrane érythroCy'taire.. Elle
, porte les antigènes M et N de- groupe sanguin. Sa structure a été élucidée par
MARCHESI et FURTHMA YR. Il s'agit d'un polypeptide de 131 aminoacides de

---

10
poids moléculaire 31000 dont 40% sont représentés par la protéine et 60% de
glucide.
Cette glycoprotéine transmembranaire est constituée de 3 domaines:
- le premier domaine aminoterminal comprend 70 aminoacides hydrophiles
situés à l'extérieur de la cellule. Il porte 15 chaînes oligosaccharidiques
reliées par une serine ou une thréonine par une liaison O-glycosidique
alcalilabile à la charpente protéique. Il porte également sur l'asparagine
26 un complexe oligosaccharidique relié par une liaison N-glycosidique
alcalistable.
- le deuxième domaine de la molécule localisé entre les aminoacides 73, à
95 traverse la bicouche lipidique. Il est constitué de plusieurs amino-
acides hydrophobes. Ce caractère explique la tendance spontanée de la
glycophorine à s'aggréger en solution saline.
- le troisième domaine de la molécule comprend l'extrémité C terminale
et est constitué de 30 aminoacides situés à l'intérieur de la cellule dans le
cytoplasme.
Enfin il faut signaler que la glycophorine A semble être présente
exclusivement sur les cellules de la lignée- érythroïdes, et elle est
détectée
durant
la
différenciation
cellulaire
sur les
normoblastes
basophiles au moment où commence la synthèse de l'hémoglobine.
Le schéma nO 5 nous montre une représentation de cette structure de la
glycophorine A.
2°) La glycophorine B ou (GP ô ),
,
\\
Voir revue par Anstee 1981, SALMON eyal. +984.
C'est une glycoprotéine transmembr~r4airede' "?:.O 000 4altons. avec un petit
i
.
' . '
fragment cytoplasmique. Cette- molécul~ est· associée av~ les antigènes 55,- "N"
et li de groupe sanguin (DAHR et al. 1980.-:; FURTH'MI\\;~ et al. 1978b). Elle est"
"
' /
moins connue sur le plan structural que la gijrcolfuorine. A.. On sait cependant
que les 26 premiers aminoacides son~ identiques à ceux de la glycophorine A du
moins chez le sujet de. groupe. N. L'Asparagine- 26 n'est" pas- glycosylée- comme
dans la glycophorine A. Et l'absence de mannose et de N-acétyl-glucosamine
suggère que les chaînes oligosaccharidiques ne sont pas· branchées par des
liaisons N-glycosidiques-, mais" seulement par des liaisons O-glycoSidiques. Entre
les aminoacides.. 26 et: 35, il n'y a plus d'homologie avec la séquence de la
glycophorine A. Enfin,- il faut préciser que c'est le polymorphisme en position 29
(Meth/Thr) qui est" responsable de la variation antigénique 5s..
. La molécule complète- a été
récemment" purifiée et séquencée dans le
laboratoire en collaboration avec le Dr. Wolfgang DAHR et le schéma nO 6

---

11
Schéma nO 5
HUMAN
GlYCOPHORIH A
GPA
SER S~R T~R T~R GGLY VAL ALA KET HIS T~R StR T~R S~R StR StR
15
LEU +.
+
LU
..
+
+-..
+-
VAL THR Lys SER TYR ILE SER SER GLN THR ASH Asp THR HIS Lys
30
+
+
+
ARG Asp THR TYR ALA ALA THR PRO ARG ALA HIS GLU VAL SER GLU
45
+
+
ILE SER VAL ARG THR VAL TYR PRO PRO GLU GLu GLU THR GL Y GLU
GO
ARG VAL GLN LEU ALA HIS HI S PitE SER GLU PRO GLU ILE TltR LEU
75
ILE ILE PHE GLY VAL HET AlA GLY VAl ILE GLY THR ILE LEU LEU
90
ILE SER TYR GLY ILE ARG ARG LEU ILE Lys Lys SER PRO SER Asp
lOS
VAL lys PRO LEU PRO SEI PRO Asp THR Asp VAL PRO LEU SER SER
120
VAL GLU ILE GLu ASN PRO GLu THR SER Asp GLJI
Schma nO 6
Q.YCOPHORlll 8
GPB +- +- +-
+-
+-
+-
+
+- ·S+
LEU SER THR THR GLu VAL ALA HET HIs THR SEI THR SER SER
ER
15
+-
+
+
+
+
1".
HET GL
VAl.. THIl Lvs SER TYR ILE. Su Su GLN THR ASN GLv \\JLU THil
Y
30
Gu LEU VAl. HIs. ARG PHE THR VAL PRO Au PRO VAL. VAl. ILE ILE
45
LEU ILE .ILE LEU(SER)VAL HET ALA GLv tLE tLE GLY THR ILE LEU
60
LEU-ILE SER TYR SER ILE ARG ARG LEU' tLE Lys
Schéma:. Il- 'r
fLYCOPHOR:IM.: ~
Gfe
+-+
+-
. + - +
+-
HET TRP Su THR ARG SER PRO ASH· Su THR ALA TR" PRO LEU SElf
15
LEU Glu PRO Asp PRO Gu HET" AL", StR ALA- StR TtR TtR HET HIS
30
+-
+
+-
fo-
THt THR THR ILE Au GLu PRO Asp P"RO GLy HET SER Gu TRP PRO
45
Asp Gu ARG HET GLu THR Su THR PRo THR ILE HET A~ ILE. VAl.
60
VAl ILE ALA GLY VAl ILE ALA ALA VAL ALA ILE VAL. LEU VAL SEI
75
LEU LEU PHr VAl. HET LEU ARG TYR HET TYR ARG ,lts Lvs Gu THI
90
TYR HIS THR ASN GLu ALA Lys GLY THI GLU PHE ALA· GLu Su ALA
lOS
Asp ALA ALA LEU GLN GLY Asp PRO ALA LEU GLN Asp ALA Ga.Y Asp
120
SER SER ARG Lys GLu TYR PHE tLE
*. N~LYÇAHES
... :; Q-GLYCANES

---

12
représente la structure proposée.
)0) La ~lycophorineC ou
(GP1)
Cette glycophorine porte les antigènes de groupe sanguin Gerbich. La structure
polypeptidique complète de la molécule a été déduite
de la séquence
nucléotidique du cDNA et cloné à partir d'une banque de RNA messagers de
réticulocytes humains (COLIN et al. 1986). Contrairement aux glycophorines A
et 8, la glycophorine C est solidement associée au cytosquelette membranaire
(Anstee et al. 1984-).
Le schéma n~ 7 montre la structure proposée par COLIN et al. 1986.
4-0) Les chaînes oligosaccharidiques portées par les glycophorines
Elles sont de deux types:
- Structures O-glycanes alcalilabiles présentes sur les glycophorines A, B
et C
Le schéma proposé par THOMAS et al. 1969 est le suivant:
Neul\\c
~a2.6
Gall1(1-3)GaiNAc-Q-Ser (Thr)
taZ.3
NeuAc
- Structures N-glycosidiques alcali-stables présentes sur les glycophorines
A et C selon YOSHIMA et al. 1980 et IRIMURA et al. 1981)
NeuAcaZ-6Galt31-4 GlcNAct31-2 Man
L·Fuc
\\81.6
1al.6.
GlcNAct31-4Man t31-4 GlcNAct31-4GlcNAc-Asn
/t31.3
NeuAcaZ-6Gàlt31-4-GlcNAct31-2 Man
5°) Les structures oligosaccharidiques.cheZ' les Variants de la glycophorine-
Variants par glycosylation anormale- portant sur la glycophodne ~ et &
(schéma nO 8).

---

..
13
Schema no8:
Variants par glycosylation anormale portant sur la
qlycophorine 0( et 6
Structures prédominantes
S2écificité
l -
T
3 -
GA~ 1-3GALNAc-Q-SER(THR)
DAHR et al.
(1974)
~ -
NEUAccz 2,
6
.
GALNAc-Q-SER(THR)
Ot..IGOSACCHARIDES
,3
commum. à M et N
(iA~ l
5" -
HEUA~2'6
GALHAc-Q-SER<THR)
;
HEUAccz2~3GAL l'
CAO
6 -
NeuACa2,
6
GALNAc~l\\
ÎGALNAc-O-SER(THR)
~
;
GAla t'
BLANCHARD
3"
et al.
/
NEUAcJ.2
( 1983 )

---

14-
V LES OBJECTIFS DU TRAVAIL
De l'ensemble des travaux publiés, il apparaît que le parasite du paludisme humain
pénètre dans l'hématie après fixation préalable sur la membrane. Lors de ce
processus de fixation des structures glycoprotéiques de l'érythrocyte ont été
impliquées en particulier les glycophorines A, B et C. la glycophorine A est la
sialoglycoprotéine majoritaire, la mieux connue sur le plan structural et a fait
l'objet de nombreux travaux. Cependant, on ignore quelle portion de cette molécule
joue le rôle de récepteur spécifique de P. falciparum. S'agit-il d'une portion
protéique ou d'une portion glucidique de la molécule? L'objectif de ce travail
consiste essentiellement à étudier cette question. L'approche choisie consiste à
inhiber in vitro
la pénétration des
mérozoites de P. falciparum
dans
les
érythrocytes humains à l'aide de polypeptides de synthèse dont la séquence est
déduite de celle de la glycophorine A. Nous avons également étudié le pouvoir
inhibiteur de structures saccharidiques natives et synthétiques. A cette stratégie
directe, nous avons associé une autre démarche qui consiste à étudier l'infestabilité
d'hématies de phénotypes rares.

---

16
CINETIQUE DU CYCLE ENDO-ERYTHROCYTAIRE TELLE QUE L'ON PEUT
L'OBSERVER A PARTIR D'UNE CULTURE SYNCHRONE
Le Plasmodium falcipar.um passe par. différents stades évolutifs lors de son cyde
endo-érythrocytaire. La coloration au Giemsa nous permet de distinguer ces stades
évolutifs comme nous le montre le schéma nO 9. A partir d'une culture invitro nous
observons dans les premières heures après la synchronisation au sorbitol des
parasites. au stade anneau. Il slagit de la vacuole d'endocytose au tour du mérozoïte
prenant l'aspect d'une bague à chaton. Ce stade anneau peut être observé pendant 8
à 12 heures. Vers la l2ème heure l'anneau disparaît pour faire place à un
cytoplasme bleu qui se développe progressivement avec le temps, autour d'un noyau
rouge: c'est le stade trophozoïte- jeune d'aspect amiboïde dans l'érythrocyte. A la
2lJème heure le cytoplasme a presque rempli l'hématie et le noyau s'est divisé
plusieurs fois (8 à 32) : c'est le stade schizonte. Entre la 26ème et la 3.3ème heure
après la synchronisation on assite à l'éclatement des schizontes libérant de
nouveaux. mérozoïtes envahissant de nouvelles hématies. Et vers la 36ème heure de
nouveaux anneaux sont visibles sur le frottis coloré au Glemsa.
Schéma n° 9
- CIN~TIQUE DU CYCLE ENDO-ERYTHROCYTAIRE TELLE QUE ~'ON PEUT'~'08SERVER
À PARTIR D'UNE CULTURE SYNCHRONE
t
• 0
1Z heur• •
26 heure.
33
36 heure.

---

17'
Il
MILIEU DE CULTURE
Le RPMI-1640
- Solution de RPMI-1640 prête à l'emploi dans la culture du Plasmodium:
1 sachet de RPMI-1640 en poudre pour 1 litre soit 10,41g contenant 2mM
de L-Glutamine sans bicarbonate de sodium, réf. 1060120 des Laboratoires
FLOW.
8,34 g de :-.1-2 Hydroxyéthyl piperazine - N 2 éthane sulfonic-acic(Hepes)
soit 35 mM, des Laboratoires SIGMA réf. H 3375
30 mM de NaHCO 3.
5 ml de gentamycine EUROBIO réf. Gen 3000 soit- 50 mg.
q.s.p. 1 Litre eau distillée stérile.
Laisser dissoudre sous agitation douce à la température de laboratoire·,
vérifier le pH qui doit être ajusté à 7,4.
Filtrer stérilement à l'aide de filtre millipore de 0,22)l' réf. SLGS 025BS.
Répartir stérilement en aliquotes, puis congeler à _20°C. Décongélation
au moment de l'emploi par incubation à 37G C au bain-marie, ensuite
addition de 10 % de sérum humain (v/v).
Le sérum humain
C'est un mélange de sérum de plusieurs donneurs de sang de groupes
différents.
Après filtration sur filtre millipore de 0,22 fi' le pool de sérum est
aliquoté et congelé à - 20G C jusqu'au moment de son utilisation. Il' est
utilisé à la concentration finale de 10% (v/v) dans le milieu RPMI 1640.
La nécessité de sérum humain dans le milieu de culture du Plasmodium a
été montrée par TRAGER et JENSEN en' 1976-..
Le sérum d'un don unique de sang peu't être .utilisé avec su~cès~ mais le
pool de sérum es't préférable car il donne de meilleurs résultats.
Les sérums d'animaux ont été essayés également par de nombreux auteurs
mais.. les meilleurs résultats ont été obtenus avec le sérum humain
-
." ..
(TRAGER et JENSEN, 1976; NIVET et PEREIRA da SILVA, 1983)•. 11 fau't
cependant signaler que SAX et RlECKMAN, 1980 on't utilisé avec succès
le sérum de lapin.
La facteur contenu dans le sérum, responsable de la croissance du parasite
n'est pas déterminé avec précision. On sait seulement qu'il s'agit de
facteurs dialysables du sérum (JENSEN, 1983).
Il est recommandé d'éviter le sérum de sujets ayant séjourné en zones
d'endémie palustre ou ayant subi un traitement récent aux antipaludéens.

---

18
Globules rouges humains
Ils sont de groupe 0
Rh+ sauf dans les expériences d'impaludation
d'hématies rares provenant de donneurs exception':lels. Ils sont obtenus par
ponction· veineuse- sur anticoagulant A.C.D. (Acide Citrique Dextrose).
Le sang total est bien mélangé par agitation douce et aliquoté puis
conservé à + 4-°C pendant au minimum 7 Jours avant son utilisation. Ce
temps
de vieillissement des
globules
rouges
à +4°C a
beaucoup
d'importance pour la croissance parasitaire comme nous le montrerons
plus tard dans l'étude des paramètres de culture.
La spécificité d'espèces pour le Plasmodium empêche d'utiliser des
globules rouges d'autres animaux que le singe, mais la quantité limitée de
sang que l'on peut prélever chez le singe limite également l'utilisation de
cet animal comme source de globules rouges.
Enfin, il faut admettre que l'on connaît à l'heure actuelle beaucoup plus
d'informations su~ la membrane des globules rouges humains que sur .celle
des. globules rouges d'autres espèces. animales.
Pratiquement, les globules rouges séparés du plasma, des leucocytes et
plaquettes par centrifugation à. 1000 g pendant la minutes, sont repris
dans du. milieu RPMI-1640 sans sérum et soumis à 3 lavages par
centrüugation à 1000 g. pendant la minutes.
A la fin du 3ème lavage,. le culot globulaire est repris dans 50% de RPMI-
sérum. Cette suspension sera utilisée pour diluer les globules rouges
parasités de culture, eux-mêmes en suspension dans 50% de RPMI-
SERUM.
III LES SYSTEMES DE. CULTURE.
CULTURE ASYNCHRONE
Nous avons adopté la méthode de TRAGER et JENSEN (1977) en boîtes de
Pétri. Elle nous, permet d'entretenir'. la. souche- du parasite avec tous les stades
évolutifs possibles. Les boîtes.. de. Pétri utilisées. sont de: 35 et 93 mm de
diamètre- (FALCON. réf. 1005 et L008).. La. souche de parasite: entretenue :
SOUCHE DUMORTIER acclimatée aux- conditions de culture in vitro dans notre
laboratoire à partir du sang du malade Dumortier prélevé pendant une crise
aiguë d'accès palustre.

---

r.-
19
• Méthode
Les globules rouges parasités sont lavés trois fois dans du milieu RPMI-1640
sans sérum humain par centrifugation à 500 g pendant 10 minutes. Ensuite, le
culot de globules rouges parasités est repris dans du milieu RPMI-SERUM de
façon à avoir un hématocrite de 50% (moitié culot globulaire - moitié RPMI-
SERUM).
Les globules rouges normaux de groupe 0 Rh+ vieillis pendant au moins 7 jours à
+ 4°C sont également lavés 3 fois dans du milieu RPMI-1640 sans SERUM par
centrifugation à 1000 g pendant la minutes. Et le culot est repris avec du
milieu RPMI-SERUM de façon à avoir 50% d'hématocrite•
• Mise en culture en boîtes de Pétri
Les globules rouges parasités sont mélangés avec les globules rouges normaux
vieillis à +4-°C de façon à obtenir une parasitémie de O,Z % avec un hématocrite
de 50%. On ramène après l'hématocrite à 10% avec du RPMI-SERUM, puis l'on
distribue la suspension dans les boîtes de pétri en mettant 7,5 ml dans les boîtes
de 93 mm de diamètre et 1,5 ml dans les boîtes de 35 mm de diamètre•. Les
boîtes sont' placées sur" le tamis d'un dessicateur dans lequel l'humidité est
assurée par un récipient contenant' de l'eau distillée. Une- bougie est' allumée à
côté des boîtes de Pétri. Le couvercle du' dessicateur siliconé permet' de
refermer hermétiquement celui-ci. A l'extinction de' la bougie,. on ouvre
rapidement le robinet placé au sommet du' couvercle et on le- referme aussitôt
de manière à faire pénétrer une petite quantité d'air. L'enceinte reste pauvre en
Oz et riche- en COZ,
Le dessicateur est placé dans une étuve à 37°C.
Le changement de milieu est quotidien par décantation du milieu ancien sans
remettre en suspension les hématies et par addition de milieu neuf en
respectant les quantités habituelles et" l'hématrocrite de 10%.
L.'apport" de globules rouges normaux est bihebdomadaire, mais nécessite trois
lavages des contenus des boîtes de Pétri et 3 lavages.. des. globules rouges·
normaux - comme décrit. ci-dessus:
La croissance parasitaire- 'est contrôlée quoti~énnement' par lecture au
microscope optique de- frottis minces colorés réalisés- à partir des boîtes- de.
culture ce qui permet. de diluer correctement les globules parasités avec les·
globules rouges normaux pour rétablir la parasitémie autour de- O,Z%.

---

20
• Remarque
La aoissance parasitaire semble meilleure en petites boîtes de pétri qu'en
grande boîte de pétri, la seule différence dans les conditions de culture
étant le paramètre surface de culture.
CULTURE SYNCHRONE
Elle nous permet .d'obtenir des parasites de même âge et par conséquent de
travailler avec un stade évolutif précis (schizontes, mérozoites, anneaux,
trophozoites).
Pour synchroniser une culture, de nombreuses méthodes ont été préconisées par
différents auteurs ; toutes ces méthodes peuvent se regrouper sous quelques
principes directeurs :
a> Méthodes basées sur la densité des cellules
Sachant que les hématies parasitées sont de densités différentes selon l'âge du
parasite, et que les formes âgées confèrent à l'hématie une densité plus faible
(Joseph HAMBURGER et Julius KREIR,. 1976b), on peut obtenir des parasites de
même âge par centrifug~tion des hématies parasitées sur un gradient de
densité. Différents gradients de densité ont été utilisés:
- FICOLL (J.E. MREMA et al., 1979 ; LUND and POWERS, 1976)
- PLASMAGEL ou PHYSIOGEL (ROBERT T. REESE et al., 1979 ; PASVOL et
al., 1978)
- METRIZAMIDE. (ELISIE M. EUGUI et al., 1979)
- SUCROSE (WILLIAMSON and COVER, 1966)
- ALBUMINE HUMAINE. (FERREBEE et GEIMÀN, 1946)
- ALBUMINE. BOVINE. (ROWLEY et al., 1967 ; SIDDIqUI et .al., 1978a, b
EINSEN,. 1977)
- STRACTAN Il (Mc ALISTER and GORDON,. 1976)
."
b) Méthodes basées sur la lyse-préférentielle
On peut également détruire spécifiquement lës parasites âgés pour ne conserver
que les stades jeunes dits anneaux. A ce-niveau, différentes substances ont été
également utilisées sur- le principe de l'hémolyse par hyperosmolarité. Certains
auteurs utilisent le Manitol (LAMBROS C. and VANDENBERG J.P.,. 1979) ;
d'autres utilisent le Sorbitol 596... Dans les deux cas,. l'on aboutit à la lyse des
trophozoites âgés et des schizontes pour n'avoir que des anneàux viables.
, Signalons que la technique au Sorbitol a été également décrite pour la première
fois par les mêmes auteurs, LAMB ROS C.. et VANDENBERG, 1979.
Notre préférence va à cette deuxième méthode qui est moins longue et plus
simple. La technique au Manitol nécessite des lavages supplémentaires avant et
après avec un tampon de digestion.

---

21
c) Méthode basée sur le blocage réversible de la synthèse de l'ADN parasitaire
Il semble selon certains auteurs tels INSELBURG et BANYAL (1984) que l'on
puisse bloquer de façon réversible la synthèse de l'ADN parasitaire avec
l'hydroxy-urée- et l'aphidicoline. C'est donc une technique très lourde même si
les auteurs qui l'on mise au point lui attribuent les meilleures performances de
synchronisation (80 - 9096)•
• La technique de synchronisation au SORBITOL 596 que nous avons
utilisée
- La solution de Sorbitol 596 (5g de Sorbitol dans 100 ml d'eau distillée) est
filtrée stérilement sur filtre Millipore de 0,22 p.
- La culture asynchrone est récupérée à partir des bottes de pétri et lavée
trois fois dans du RPMI-SERUM par centrifugation à 500 g pendant 5
minutes.
- Le culot de globules parasités ainsi lavés est repris dans la solution de
Sorbitol 596 à raison de 0,2 ml de globules parasités pour 3 ml de Sorbitol
596.
- Homogénéisation douce et incubation à la température du laboratoire
pendant 5 minutes selon la plupart des auteurs puis contrôle de la
synchronisation après trois lavages comme précédemment décrit, sur
frottis colorés au Giemsa "Rit.
- La synchronisation doit être réalisée 2 fois en général selon la plupart
des auteurs. Nous avons constaté qu'une incubation d'emblée de 30
minutes avec le· Sorbitol 596 nous épargnait une deuxième synchronisation
lorsque- nous vérifions les résultats sur frottis minces colorés. Par ailleurs,
nous. n'avons
pas constaté de dommage
pour
les
parasites qui se
développent normalement.
- Les globules parasités, synchronisés et lavés trois fois sont remis en
suspension dans du RPMI-SERUM de façon à obtenir un hématocrite de-
50%. Et selon le même schéma de l'entretien de souche, l'on réalise la
mise en culture avec une parasitémie- initiale- de- 0,296 et"' lm' hématocrite
final de 10% en botte' de Pétri..
CULTURE SYNCHRONE EN MICROPLAQUE
Nous avons mis au point la culture synchrone en mieroplaque de 96 puits fond
plat NUNCLON DELTA réf. f3065 POLYLABO-Paul-Block.
-
.
La culture est synchronisée au Sorbitol 596 - comme précédemment déCrit - et
'correctement diluée en globules rouges normaux pour obtenir la parasitémie
désirée. Pour les expériences d'inhibition, nous réalisons généralement des

---

22
parasitémies de l'ordre. de O,if. à 0,596.
L'hématocrite est maintenu à 2,596 pour toutes les expériences d'inhibition, et
le volume total de la culture par puits de microplaque restera maintenu à 100 fI
tout au long de ce travail.
La suspension des globules rouges parasités,. diluée avec des globules rouges
normaux vieillis à +4-°C pour ramenerla parasité mie à 0,if.96 est donc encore
mélangée avec une certaines quantité de RPMI-SERUM pour ramener le tout à
un hématocrite final de 2,5 %, puis ce mélange est distribué sous un volume de
100 rI dans les puits de microplaque.
Remarques:
Il y a une très grande variabilité dans les puits périphériques, probablement due
à un certain degré d'évaporation du milieu. Ces puits périphériques sont donc à
éviter dans la distribution des cellules et doivent être remplis néanmoins de
milieu RPMI. Une autre source de variabilité· dans les puits. peut être due à un
mauvais mélange des cellules parasitées: et des cellules non parasitées, et il faut
par conséquent sans cesse réhomogénéiser- la suspension d'hématies tout au long
de la manipulation.
- La micro plaque refermée est incubée dans un dessicateur en atmosphère
humide et appauvrie en 02 par allumage d'une bougie, l'ensemble est placé
à 37°C dans l'étuve.
- Le changement de milieu est quotidien•. A ce niveau, il faut agir très
délicatement" pour n& pas remettre en. suspension les hématies lors de
l'aspiration du surnageant.
IV METHODES D'APPRECIATION DE· LA CROISSANCE PARASITAIRE.
al PARASITEMIE SUR FROTTIS MINCES COLORES AU GIEMSA "R"
Chaque étape de nos expériences est contrôlée grâce à la lecture au
microscope op.tique d'un frottis mince coloré au "Giemsa R"•
• Le frottis
Il est réalisé de la façon suivante: après une bonne homogénéisation de la
suspension de globules rouges parasités, une goutte est: prélevée à l'aide de
la pipette Pasteur et déposée à l'une des extrémités d'une lame porte-
objet propre et dégraissée. A l'aide d'une deuxième lame ou d'une lamelle

---

~
,.-.
'.-
23
inclinée au contact de la goutte qui diffuse le long du bord de la lamelle,
l'on étale la goutte dans un mouvement régulier vers l'extrémité libre de
la lame porte-objet, tout en maintenant la lamelle avec le même angle
d'inclinaison,
soit
4-5°C.
Le
frottis
mince
ainsi
réalisé
est
séché
rapidement par agitation de la lame ou par ventilation•
• La coloration
Le Giemsa "R" (réf. A 3:55 Prolabo) est dilué avec le tampon de
coloration. &0 gouttes de Glemsa "R" pour 4-0 ml de tampon. Il faut
vérifier quotidiennement avant usage le pH du tampon qui doit être de 7,2
et éviter les préparations de colorant des jours précédents, car l'on risque
soit une perte d'activité du colorant soIt la formation d'agrégats dans le
colorant rendant difficile la lecture.
La lame- de frottis est immergée 2 minutes dans du méthanol pour fixer la
préparation ; puis elle est séchée par ventilation. Ensuite, l'on recouvre
entièrement la lame posée hor izontalement, face frottis vers le haut,
avec le colorant Giemsa "R". On laisse incuber à la température ambiante
pendant 12 minutes. La lame est ensuite abondamment lavée à l'eau du
robinet, puis séchée par ventilation•
• Lecture du frottis coloré
Elle s'effectue au microscope- optique à l'objectif 100 à l'immersion. L'on
compte la champs microscopiques, soit environ 2000 hématies, et l'on
calcule le pourcentage d'hématies- parasitées. Il peut exister quelques
petites difficu1tés, dans l!identification des parasites; ilfaut savoir que les
parasites du paludisme se présentent normalement comme des éléments
intra-érythrocytaires (et quelques fois extra-érythrocytaires pour peu de
.
-_._--
temps en ce qui concerne les mérozoit~)~ La taille des parasites varie en
fonction cIu.. stade- évolutif comme le montre le schéma; n ca. la::
•
,"
.,.
Hématies
Mérozoites
contenant
Trophozoite
Trophozoite
Schizonte
libres
un Anneau
jeune
âgé

---

24-
- La taille de l'hématie
7 à 8 P
"
des mérozoites libres 0,1 à 0,2f
"
"l'anneau l à 2 r.
La coloration au Giemsa "R" donne au parasite un cytoplasme bleu et un
noyau rouge grenat dans une hématie de couleur grise ou jaune orange.
Les dtificultés d'identtiication sont essentiellement représentées par la
superposition des plaquettes sur l'hématie, les inclusions érythrocytaires
dues à la dégradation de l'hémoglobine qui précipite sous forme de grains,
les granulations provenant de l'éclatement des polynucléaires, les dépôts
granuleux du colorant vieilli.
b) INCORPORATION D' 3H-HYPOXANTHINE
Après avoir. mis au point "la technique de culture asynchrone et synchrone
en microplaque, nous avons mis au point la méthode d'incorporation d' 3H_
Hypoxanthine en nous inspirant de la technique originale de CHULA y et
al. (1983) que nous avons
modifiée
et
adaptée à
la
microplaque
NUNCL.ON-DELTA de 96 puits fond plat.
Nous définirons dans le chapître "Résultats" la valeur optimum des
principaux paramètres de la culture..
• Le principe de la méthode d'incorporation d' ~-Hypoxanthine
Le taux de croissance parasitaire est obligatoirement le reflet de la
synthèse de l'ADN. Une appréciation de cette synthèse suffirait à donner
une image réelle de la croissance parasitaire, qui serait plus précise que
l'appréciation par comptage- microscopique sujette à. de nombreux aléas,.
depuis. le: prélèvement de: la goutte de: globules parasités jusqu'à l'examen
microscopique: lui-même. Par conséquent, il est préférable de suivre la
synthèse de l'ADN par un précurseur radio-actif qui permettra, par le
comptage de la radioactivité
incorporée,
d'apprécier la croissance
parasitaire..

---

25
Nous verrons qu'il existe une bonne corrélation entre parasité mie et
radioactivité incorporée au cours de la culture. De plus, la précision de la
méthode d'incorporation du traceur radioactif est supérieure à celle de
coloration•
. La méthode
- une culture de parasites est synchronisée au Sorbitol 5%. Le stade
évolutif du parasite est contrôlé par lecture microscopique de frottis
minces colorés au Giemsa "R".
- Distribution en microplaque de la suspension d'hématies parasitées
synchrones sous un volume de t00]li par puits.
- Au stade trophozoite désiré, addition, après décantation du milieu
ancien, de milieu neuf contenant 0,5 uci dans 100 jl1 d' 3H-Hypoxanthine.
- Incubation à 37°C dans les conditions de culture habituelles.
-
Un "pulse"
de
18 à~ 2lf.. heures est réalisé pour permettre une
incorporation maximale de radioactivité. (Nous entendons par "pulse" le
temps durant lequel nous avons laissé en contact l'Hypoxanthine et les
globules parasités).
- Réalisation d'un frottis mince coloré au Giemsa "R", puis congélation de
la microplaque à -20°C.
- La décongélation lentraihe la lyse spontanée des globules rouges sans
addition d'autres réactifs. Un autre avantage de cette méthode est que
nous pouvons ëiifférer la suite-des opérations par cette congélation compte
tenu de la longue période du tritium (3H).
- Après décongélationp- le contenu de chaque puits est individuellement
aspiré à-l'aide d'un système multicanaux (SKATRON) ; puis passé à travers
un filtre Whatmann de microfibres de verre (HARVESTER Fll.TER Cat n°
7810505 Flow Laboratories). Le filtre retient l'ADN des parasites.
- Séchage des filtres par incubation à 50°C dans l'étuve pendant 60
minutes.

---

26
- Découpage, à l'aide d'un emporte-pièce, des rondelles de fitre séchées
correspondant aux contenus des puits de culture récoltés.
- Chaque rondelle est déposée à l'aide d'une pince dans un tube en
plastique numéroté auquel on ajoute 0,5
ml de
liquide scintillant
la.C.s.TM Amersham Cat n° 196321) à base de Xylène.
- Comptage de la radioactivité j3 émise dans un compteur à scintillation
liquide de type LKB.
- Les résultats sont donnés en cpm lcoups par minute), et nous calculons la
moyenne des cpm dans trois puits car nos expériences sont généralement
réalisées en tripliqué pour chaque concentration de produit testée.
V EXPERIENCES D'INHIBITION DE L'INVASION
PRINCIPE
Il consiste à mettre en compétition l'inhibiteur et le récepteur érythrocytaire
pour la fixation du parasite au stade mérozoite lexo-érythrocytaire).
Pour les expériences d'inhibition de l'infestation,. nous avons suivi la. croissance
des parasites; en étudiant simultanément l'incorporation d'Hypoxanthine tritiée
et le comptage direct des parasites- après coloration au Giemsa "R". Les
inhibiteurs testés :
sucres simples, oligosaccharides,
glycoprotéines,
sont
généralement dilués en milieu RP MI sans sérum.
Les principales étapes que nous avons suivies. se décomposent ainsi-:
Réalisation
d'une
culture
synchrone
en
microplaque
comme
précédemment décrit
- Au; stade schizonte~ environ- 3 à 5 heures avant la. libération des
mérozoitesy. nous introduisons l'inhibiteur en solution- dans le milieu RMPI-
SERUM et nous laissons incuber pendant 2e,. heures dans les conditions
habituelles de culture.
- Arrêt de l'incorporation de l'isotope radio-actif par congélation de la
microplaque,
et:
comptage
de
la
radioactivité
incorporée
après
décongélation selon la méthode précédemment décrite. La comparaison
des moyennes de cpm des puits ayant reçu l'inhibiteur, avec celles des
puits témoins n'ayant pas reçu l'inhibiteur, mais seulement le milieu

---

27
RPMI-SERUMt- nous permet de savoir le degré d'inhibition que nous
exprimons en pourcentage d'inhibition.
INHIBITION A L.'AIDE DE PEPTIDES DE SYNTHESE
al Liste des peptides utilisés et Origine
- Les peptides utilisés dans ce travail ont été synthétisés par l'équipe du
Professeur PAVIA (AVIGNON).
La séquence des peptides utilisés s'apparente à celle de la glycophorine
A:
Région
Séquence
Poids
molèëUiaire
55-59
Glu- Glu- Glu-Thr-Gly + ITFA
676,60
58-62
Thr- Gly-Gly-Arg-Val + 2TFA
824,62
60-64-
Glu- Arg-Val-Glu-Leu + 2TFA
979,80
65-69
Ala- His- His- Phe- Set" + 3TFA
933,72.
70-74
Glu-Pro-Glu-Ile-Thr + 1TFA
699,72
72-76
Glu-Ile-Thr-Leu-Ile + ITFA
700,80
Asn - Gly - Glu - Thr - Gly - GIn -+ ITFA
984-,00
Mi·II
Asn - Asp - Lys - His - Lys - + 4TFA
1087,70
67-71
His - Phe - Ser - Glu - Pro +- 2TFA
839,74-
Légende: TFA =Acide trifluoro-acétique
A notre connaissance, l'utilisation de telles substances dans l'inhibition de
la croissance in vitro de- Plasmodium· falciparum' n'a encore jamais- été
décrite-.
b) Méthode
- Solubilisation des peptides de synthèse-:: la solubilisation ditecte dans le
milieu RPMI-164-0 provoque un abaissement de pH de ce milieu aux
alentours de 2 ou 3, ce qui a un effet toxique considérable sur la culture.

---

28
L'ajustement du pH par différents tampons s'est avéré inutilisable car
également toxique pour les parasites; ces tampons sont: TRIS, HEPES,
BICARBONATE.
- La neutralisation du pH par la soude 0,1 N est cependant possible, car la
même quantité de NaOH utilisée pour neutraliser l'acidité des peptides
n'entraînait aucune anomalie de croissance parasitaire lorsqu'elle était
introduite dans le milieu RPMI-SERUM et neutralisée par un acide (TFA)
tel que celui utilisé lors de la synthèse des peptides, puisque ces derniers
sont obtenus sous forme de sels de trifluoroacétate.
- Le peptide de synthèse n'est pas solubilisé directement dans le milieu
RPMI-SERUM, mais d'abord dans NaCI 0,15 M.
- Après neutralisation à pH 7,2, la solution est filtrée stérilement (filtre
Millipore de 0,22 f)
; puis diluée en milieu RPMI-SERUM .i la
concentration finale désirée.
- L'introduction de la solution RPMI-SERUM-PEPTIDE neutralisée dans le
milieu de culture s'effectue le jour même de la préparation alors que les
parasites sont au stade Schizonte 3 à 5 heures avant la libération des
mérozoïtes. d'une culture parfaitement synchrone en microplaque••
- Incubation 24 heures, puis remplacement du milieu au peptide par un
milieu contenant 0,5 )lei d' 3H-Hypoxanthine dans 100 pl par puits.
- Chaque étape est, bien entendu, suivie par l'examen d'un frottis mince
coloré au. Glemsa "R.!'..
- Après 24- heures de- "pulse", la suite des opérations est identique à celle
déjà. décrite,. ~ savoie- ~. arrêt" de-la réaction par congélation" filtration sur
fibre de verre et comptage de la radioactivité comme plus haut.
c) Etude de la toxicité des inhibiteurs
Lorsqu'un inhibiteur est toxique pour les parasites,. il provoque un blocage
de maturation· des formes jeunes. visibles sur des. frottis mincès. colorés au
Giemsa, (HOWARD et al., 1982, PASVOL et al., 1983). On peut également
observer une inhibition de la synthèse protéique (BREUER et al., 1983).

---

29
Pour réaliser les études de toxicité, les étapes suivantes ont été
réalisées:
- Synchronisation de la culture en microplaque.
- Addition de l'inhibiteur, en prévoyant des puits témoins sans
inhibiteur.
- Prélèvement toutes les 2 heures pour effectuer un frottis mince
coloré au Giemsa et lecture au microscope optique.
VII UTILISATION D'HEMATIES DE PHENOTYPES RARES
Une approche fructueuse du rôle potentiel des structures de surface de
l'érythrocyte en tant que récepteur des mérozoites consiste à tester in vitro
l'infestabilité d'hématies rares caractérisées par des anomalies ou des déficits
de structures antigéniques.
Ce phénotype a été identifié à l'origine chez des sujets de groupe 0 ou B dont
les hématies étaient agglutinées par- la lectine de Dolichas bifloiUs qui
reconnaît habituellement les globules rouges Al.
- Il s'agit d'un phénotype exceptionnel, O,07%- seulement en France, transmis
comme un caractère Mendélien. (GERBAL et al., 1976).
- Le sucre immunodominant est la N-acétylgalactosamine (SANGER et al.,
1971).
- L'antigène Cad est localisé sur les glycophorines A et B et sur des gangliosides
érythrocytaires (CARTRON et al., 1982; BLANCHARD et al., 1983)..
. - La structure. biochimique- de l'antigène vient récemment d'être- définie- par D.
BLANCHARD et al~, 19&3'. U· s'agit d'Un" pentasaccharide dont la structure a été
déjà. mentionnée avec les variants par glycosylation anormale. voir page 13.
- La présence de l'antigène Cad sur les molécules de glycophorines nous
intéressent- particulièrement, car nous savons que ces molécules sont impliquées
dans la structure du récepteur érythrocytaire de Plasmodium falcip:arum.

---

30
Les hématies Cad ayant une glycophorine dilférente par glycosylation anormale
se laissent-elles envahir par Plasmodium falciparum en culture- in vitro ?
Autrement dit, la structure Cad est-elle impliquée dans celle du récepteur
érythrocytaire de Plasmodium falciparum •
2°) HEMA ms Wr (a+ b-)
Le système Wright (Wr) a été décrit comme un système monomorphique
constitué par- un gène de très grande fréquence: le gène Wrb et" un gène de très
faible fréquence: le gène Wra. La revue générale faite par SALMON et al. 1984
nous indique : le phénotype habituellement rencontré· est Wr(a- b+),
le
phénotype rare est Wr(a+ b+). Le phénotype Wr(a+b-) est exceptionnel•.
Il existe une relation mal définie entre ce système et le système En(a). En
effet, on rencontre le phénotype Wr(a- b-) chez le sujet En(a-) et chez certains
variants- caractérisés par la. présence d'une glycophorine- A érythrocytaire
anormale. Cependant';. les. hématies
En(a-) sont déficientes en glycophorine· A
alorS" que les hématies Wr(b-) possèdent une. quantité normalement détectable
de cette glycoprotéine.
L'antigène. Wrb a été récemment localisé par RIDGWELL. et al. (1983) sur la
molécule de glycophorine A, comme étant constitué par la portion- en g( hélice
de la molécule, située entre les aminoacides 55 et 70. DAHR et al. (1983)
précisent la position de l'antigène Wrb sur la molécule de glycophorine A entre
le résidu 62. et 72. Il serait par conséquent intéressant de savoir si cette région
de la protéine est impliquée dans le site récepteur de Plasmodium falciparum.
Une façon indirecte de répondre à cette question consiste à tester l'infestabilité
des hématies Wr(a+b-) qui sont déficientes en cette structure.
Les premiers travaux réalisés dans ce sens par PASVOL et al.. (1982), suggèrent
que l'antigène Wr b
est bien
impliqué
dans
la structure
du
récepteur
érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Par ailleurs,. les anticorps anti Wrb
s'opposeraient à l'invasion in vitro des hématies par Plasmodium falciparum.
(PASVOL et al., 1982).

---

31
Etant donné la rareté du phénotype Wr(a+ b-) et comme nous avons eu
l'opportunité d'obtenir un échantillon sanguin, il nous a paru intéressant de
répéter les expériences préliminaires de PASVOL et al. (1982)..
3°) METHODE
Les hématies Cad obtenues à partir du sujet décrit par CAZAL (1968) ont été
lavées 3 fois en miÜeu RPMI-SERUM ainsi que les hématies parasitées de la
souche Dumortier. Le mélange des hématies parasitées avec les hématies non
parasitées (ici hématies Cad), est réalisé comme précédemment décrit. Les
hématies Cad restent la source d'hématies non parasitées lors des dilutions tout
au long de la culture qui est réalisée en microplaque. L'appréciation de la
croissance parasitaire a- été réalisée par les- deux méthodes : le comptage
microscopique de la parasitémie et l'incorporation d'Hypoxanthine tritiée.
L'expérience d'impaludation des hématies Cad a duré 20 jours.
En ce qui concerne les hématies Wr(a+ b-) e~ Wr (a- b+), ces hématies nous ont
été envoyées en même-temps par le Docteur GREENWALT et Miss WILKINSON
du Centre de Transfusion de CINCINNATI (USA). Ces hématies ont été utilisées
comme source d'hématies neuves. non parasitées· dans. un système- de culture
asynchrone en boîte de pétri de 35 mm de diamètre.
L'expérience d'impaludation in vitro des hématies Wda+ b-) et Wr(a- b+) a duré
14- jours. La croissance parasitaire
a. été
appréciée par
le
comptage
microscopique de la parasitémie...

---

32
RESULTATS
\\

---

33
1
ETUDE DES PARAMETRES DE LA MICRO-TECHNIQUE DE CULTURE IN
VITRO DE PLASMODIUM FALCIPARUM
1.1 EFFET DE LA CONCENTRATION D' 3H-HYPOXANTHINE
CONDITIONS D'EXPERIENCE:
- Culture asynchrone en microplaque
- Parasitémie initiale: 0,2 96
- Souche Dumortier de Plasmodium falciparum
- Hématocrite 5 96
_. Volume total de la culture: 100 ral/puits
-
3H-Hypoxanthine
:
poids
moléculaire
136,
activité
spécifique
6,2Ci/mmol, soit 4.5,6 mCi/mg (Laboratoires AMERSHAM)
- Temps d'incorporation d' 3H-Hypoxanthine : 2if. heures
- Temps de préculture : 3 jours
- Durée totale de la culture: 4. jours.
RESULTATS: Tableau 1
Concentration
0,5
0,25
0,12
0,06
0,03
0,015
0,007
0,0039
en u.Ci/puits
C.P.M.
MJyenne de
14 961
13953 13 683 13 622
6 594
3 254
1 371
807
10 puits
Ecart-type
1 234
1 131
1 067
543
443
133
78
362
Effet"
de la
concentration
d' 3H-Hypoxanthine sur
la croissance
parasitaire appréciée par le- comptage de la radioaetivité incorporée danS"
un système de culture asynchrone
COMMENTAIRES :
Nous observon~ que l'incorporation est proportionnelle à. la concentration de
l'hypoxanthine- radioactive utilisée dans le milieu de culture jusqu'au taux de
0,062 fCi/puits. Ensuite, elle décrit un plateau. La concentration de 0,5 pCi
correspond donc à. un excès d'hypoxanthine ; mais nous observons que cet excès
n'est pas nuisible à. la croissance parasitaire.

---

34
Nous avons travaillé avec un système de culture asynchrone, et selon CAMBELL
et al. 1979, le taux d'incorporation dans un tel système n'est plus fonction du
stade évolutü du parasite, mais est un paramètre constant par unité de temps.
Le fait que l'incorporation atteigne un plateau peut être dO à une forte
parasitémie et à l'interconversion des bases puriques utilisées par les parasites
comme le mentionnent CHULAY et al. 1983 ; WEBSTER and WHAUN, 1981.
Mais signalons également que CHULAy et al., 1983, observent que la réduction
de l'incorporation de l'hypoxanthine tritiée peut être due lors des fortes
parasitémies à l'accumulation des métabolites acides dans le milieu de culture.
Nous-même avons observé que la croissance parasitaire ne se poursuit pas dans
des milieux de pH < 7,2. Nous observons également une dispersion modérée des
écarts-types
qui témoigne d'une certaine variabilité
dans
la croissance
parasitaire d'un puits à l'autre (Tableau 1). Les hypothèses les plus facilement
concevables pour expliquer cette variabilité sont les suivantes:
- Culture non synchrone:
En effet, les parasites existent dans ce cas à tous les stades évolutifs
possibles dans le- puits de culture. Et il est fort évident que la synthèse de
l'ADN ne soit pas identique à tous les stades évolutifs du parasite.
-
Une suspension
parasitaire
d'homogénéité
imparfaite
ne
donnant pas
exactement la même parasitémie initiale dans tous les puits.
L'incorporation
d'hypoxanthine
tritiée est donc soumise à
de
multiples
paramètres.. Il nous semble tout à fait justüié de les étudier avant d'aborder
l'étude du récepteur érythrocytaire de Plasmodium falciparum.
Nous.. choisirons pour nos expériences ultérieures la concentration de 0,5
fCi/puits correspondant à un excès d'hypoxanthine tritiée pour les raisons
suivantes:
- l!incorporation est soumise à de multiples facteurs de variations comme- nous
venons de le mentionner ci-dessus.
- L.'activité spécüique de l'hypoxanthine tritiée est variable d'un lot à un autre.
- L.'excès d'hypoxanthine tritiée nous met à l'abri d'un épuisement du milieu en
purines lors des fortes parasitémies.
'.. Cet excès n'est pas nuisible à la croissance parasitaire.

---

35
1.2 EFFET DU TEMPS DE PRECULTURE
Le temps de préculture est le temps qui s'écoule entre le début de la culture en
microplaque et le début de l'incorporation d'hypoxanthine tritiée.
CONDITIONS D'EXPERIENCE
- Culture deux fois synchronisée au sorbitol 5%.
- Autres conditions identiques à ceUes de l'étude précédente.
RESULTATS : Tableau II ; Tableau III
COMMENTAIRES:
Le tableau II montre que la radioactivité incorporée augmente avec le temps de
précu1ture. Il en est de même de la parasitémie.
Contrairement à l'expérience précédente, les écarts-types sont beaucoup moins
importants et leurs différences sont plus réduites ; en effet, ils représentent
respectivement 5%, 6%, 4-%, 8% des moyennes de cpm de 8 heures, 24- heures,
4-8 heures, et 72 heures de préculture.
L'examen microscopique des frottis a montré un début de désynchronisation de
la culture dans les puits correspondants à 72 heures de préculture. Cette
désynchronisation pourrait être responsable du plus grand écart-type observé
dans ces puits de 72 heures de préculture•.
La radioactivité incorporée et la parasitémie au cours de la culture sont
directement proportionnelles au temps de- préculture. Mais les résultats de la
parasitémie pris isolément rendent moins bien compte de cette relation car on
observe- un plateau entre 24- heures et 4-8 heures. Ceci indique que le- seul
comptage de la parasitémie peut être un moyen assez imprécis de l'appréciation
de la croissance parasitaire.
Comme· cela est attendu, le tableau III montre que le parasite au.. stade
schizonte incorpore beaucoup plus d'3H-Hypoxanthine qu'au. stade anneau..
Nos résultats sont en accord avec ceux de CHULAY et al. 1983. Mais ceci n'est
vérifié- que dans les. conditions. de culture synchrone.

---

36
Tableau II
TEMPS DE PRECULTURE
8
24
48
72
M:Jyenne des œt
1 951,8
3 173,2.
18 437,5
26 291,7
dans 7 puits
Ecart-typ!
111,8
206,4
766,5
2 208
Parasitémi.e sur
2000 hémties
0,3 %
1,4 %
1,7 %
6,19 %
à la. fin du
"pulse"
Effet du temps de préculture sur l'incorporation d'3H-Hypoxanthine et sur
la croissance parasitaire.
"pulse" =Incorporation d,3H-Hypoxanthine.
Tableau III
Stade Anneau
Stade Schizonte
Ino::n:paration
d,3H-Hyp::lxarrl:hi en
0,0046 à
",0,021
C.P.M. par l seuL
0,0084
parasite
~ p a r
460 à-
'" 2 100
lOS parasi.tes;
(C.Ir.M'.)
840 .
RaIe du stade évolutif du parasite dans l'incorporation d'Hypoxanthine-
tritiée.

---

37
Nous pouvons constater que.la parasitémie augmente légèrement la 8ème et la
Zif.ème heure; puis elle décrit presque un plateau entre la Zif.ème et if.8ème
heure ensuite elle augmente de façon considérable.. Nous pouvons facilement
interpréter ce phénomène en nous référant au cycle biologique du parasite: en
effet, après la synchronisation vers la Zif.ème heure commence l'éclatement des
premiers schizontes d'où l'augmentation de la parasité mie constatée entre 8 et
Zif. heures. Entre Zif. et if.8ème heure, nous sommes en présence des schizontes de
Zème génération dont seulement un petit nombre a libéré des mézoroites d'où la
presque stabilité du comptage de la parasité mie. Et vers la 7Zème heure, nous
sommes en présence de schizontes de 3ème génération et de quelques
mézoroites d'où le résultat explosif de la parasitémie.
L'incorporation d,3H-Hypoxanthine par contre témoigne assez rapidement de la
synthèse d'ADN comme le montre le résultat du tableau II. Parasitémie et
incorporation d'Hypoxanthine tritiée sont deux méthodes complémentaires pour
apprécier des niveaux différents d'un même phénomène.
Sur un frottis sanguin, il nlest pas facile de distinguer les mérozoites libres.
C'est ce qui explique également les résultats de parasitémie du tableau II.
1.3 EFFET DU TEMPS D'INCORPORATION D'3H-HYPOXANTHINE
Le temps d'incorporation d,3H-Hypoxanthine (temps de "pulse") est le temps
pendant lequell'hypoxanthine tritiée est présente dans le milieu de culture.
LES CONDITIONS D'EXPERIENCE:
- Culture synchrone en microplaque-
-Parasitémie initiale 0,296-
- Hématocrite 596
- Temps-de préculture TL Heures
- Concentration d,3H-HypoxanthineO,5fei/puits;
- Variation du temps d!incubation des cellules en présence d!hypoxanthine.

---

38
RESULTATS : Tableau IV
TEMPS D'INCORPORATION O,3a-HYPOXANTHINE
EN HEURES
2
4
6
17
19
21
24
MJyeme des
C.P.M. incor- 2 309,1
4 962,7
9 124,7
33 386
32 103
29 994
34 779
I;XJJ:és
Ecart-type
129,3
347
1 095
2 527
2 403,5
3 058
3 374
= 5 t
= 6 %
12 %
T,5 %
7,4 %
10 t
9 %
Parasitémie
sur 2000 héma-
N:N
ties à la fin
1,7 %
1,6 %
5,4 %
6 %
7,5 %
6,8 %
FAIT
du "pulse"
Effet de la variation du temps d'incorporation dt3 H-Hypoxanthine sur le
taux. d'incorporation et SUi la parasitémie dans un système de culture
synchrone en microplaque. L'incorporation est exprimée en cpm (coups par
minute).
COMMENTAIRES:
Le tableau IV montre que la quantité d,)H-Hypoxanthine: incorporée, exprimée
en cpm (coups par- minute) est directement liée au temps de contact des cellules
avec Pisotope radioactif jusqu'à la 17è heure. Entre 17 et Zif. heures~ les cpm
incorporés ne varient plus de manière significative,. ce qui se- traduit par
l'amorce d'un
plateau. Il ne nous. il; pas- paru. nécessaire- de poursuivre
l'expérience au-delà. de cete- zone de plat.eatt qui.: marque- le- maximum de
synthèse de: l'ADN. Cette expérience est. intéressante parce qu'elle· nous indique
qu'il est inutile de prolonger le temps d'incorporation au-delà de 18 à 24- Heures.
Quant aux résultats de la parasitémie, nous pouvons constater qu'ils ne
décrivent pas avec précision la croissance parasitaire. En effet, entre la 17è et
19è heure, nous obtenons 5,4.96 et 696 de parasitémie contre 33386 et 32103 cpm
respectivement. Ce qui veut dire que la différence entre 5,4.96 et 696 de

---

39
parasitémie n'est pas significative, car entre la 17è et 19è heure, il n'y a pas eu
d'augmentation du nombre de parasites comme le témoignent les cpm. Et
théoriquement, il ne devrait pas Y en avoir si l'on se réfère au cycle biologique
du parasite..
L'examen
microscopique
qui
permet
d'apprécier
la
parasitémie
reste
indispensable pour suivre l'évolution morphologique du parasite à chaque étape
de l'expérience.
1.4-
EFFET DE LA PARASITENtIE INITIALE
Nous appelons parasité mie initiale, la quantité de parasites intra-cellulaires au
début de la culture en microplaque.
CONDITIONS D'EXPERIENCE:
Compte tenu des résultats précédents, nous avons adopté les paramètres
suivants :
- Hématocrite 5%
_ Temps de préculture 72 heures
_ Temps d'incorporation ddH-Hypoxanthine 24- heures
_ Parasitémie initiale variable
_ Les autres conditions restent inchangées.
- Culture sycnhrone
RESULTATS: Tableau V, Fig. 1, Fig. 2
Tableau V
TEMPS D'INCORPORATION O,3H-HYPOXANTHINE
EN HEURES
2
4
6
17
19
21
24
~de6
C.P.K. 1ncCr- 2 309,1
4 962,7
9 124,7
33 386
32 103
29 994
34 n9
pc:ds
Ecal:t-t:na
129,3
347
1 095
2. 52.7
2. 403,5
3 OSS
3 374
= 5 ,
= 6 ,
12 ,
T,5'
7,4 \\"
10 \\-
9 ,
Parasitémi.e-
sur 2000 héma-
N:ti
t:i.es ~ la fin
1,7 \\-
1,6 ,
5,4 ,
6 ,
7,5 ,
6,8 ,
du. wpul.se__
FAIT"
Effet de- la. variation de- la. pacasitémie initia.le sur la croissancilt
pacasitaire- dans un système de culture synchrone avec: appréciation de
cette croissance pac l'incorporation dt3H-Hypaxanthine et par le comptage
microscopique de la. pacasitémie.

---

40
Fig.!
~
9
8
Z
w
7
w
- 6
~
5
~.
·W
...
- 4
~.
en
.c
3
/
a::
~
~/
0,1
0,4
0,7
PAAASITEMIE INITIALE EN Of.,
'b
Fig. 2
-
~
le
en
30
·w
a:
0
ll.
a:
20
/Il
0
u
~
/..
10
~
a.:
/•
u
0,1
0.4
0,7
PARASI TEM lE. INITIALE EN Of.,
Fig. l :
Effet de la variation de la parasitémie initiale sur la croissance
parasitaire appréciée par le comptage de la parasitémie finale dans
un système de culture synchrone de Plasmodium falciparum.
Fig. 2:
Effectde la variation de la parasitémie initiale sur
l'incor-poration d'Hypoxanthine tritiée dans un système de culture-
synchrone in- vitro. de Plasmodium falciparum.

---

4.1
COMMENTAIRES:
Le tableau V montre que la parasitémie finale. de la culture dépend de la
parasitémie initiale. Nous n'observons pas de grandes différences entre les
écarts-types des différents puits. D'un point de vue purement pratique, on peut
signaler la difficulté de contrôler avec précision une dilution d'une suspension
cellulaire à parasitémie très faible; et le risque d'obtenir des puits de culture
sans aucun parasite existe compte tenu de cette faible parasitémie initiale et
de la faible quantité totale du volume de culture 100 fI. En partant d'une
parasitémie > 0,1 %, l'homogénéité est plus facile à obtenir ; et les résultats
sont plus reproductibles d'un puits à un autre.
Nous choisirons par conséquent des parasité mies initiales comprises entre 0,2 et
1% dans nos expériences ultérieures.
Les Fig. l et 2 montrent qu'il existe une relation directe entre parasitémie
initiale et croissance parasitaire. L'appréciation de la croissance parasitaire est
plus reproductible et plus sensible par la technique isotopique.
1.5 EFFET DE L'HEMATOCRITE
Par définition, l'hématocrite est le volume relatif des globules rouges dans un
volume donné de sang total. Il est exprimé en pourcentage par rapport au volume
de sang total. Ici, nous ne travaillons pas directement avec du sang total, mais avec
des hématies lavées et remises en suspension dans le milieu de culture. Nous avons
fait varier l'hématocrite-dans des systèmes de culture synchrone et asynchrone.
al RESULTATS DANS LE SYSTEME DE CULTURE ASYNCHRONE EN
MICRO PLAQUE :: Tableau VI et: Fig.. 3
TABLEAU VI
HEMATOClU.TE EN
2-
3
4
5
6
"7
8
9
la
~des-
C.E1oM.
5200 " 000
16000 22000 28000 26000 24000
23000
12400 2 000
ParasitSa1e
~ la fin cm
-;ru-"
T
2,3:
3,5
l
2,5
2
1,5
1,2
0,8
0,7
Effet
de la
variation
de
l'hématocrite
sur
l'incorporation
ae
3H-

---

4-2
Hypoxanthine et sur la parasitémie c'est-à-dire l'effet de l'hématocrite
sur la croissance parasitaire.
b)
RESULTATS DANS LE SYSTEME DE CULTURE SYNCHRONE EN
MICROPLAQUE: Fig. 4- et Tableau VII •
(''0
Fig. 3
-)(
"~
aS!
30
16 z
a:
0
14 UJ
~
12 UJ
cr 20
-
0
10
~
U
"UJ
z
8
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-
-
la
6
(J)
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a.:
4
cc.
~
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2
u
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-.......
~
....-
1
a
2
3 4
5 6
7 8 9 la
HEMATOCRITE EN %
C")-
o
.-
Fig. 4
)(
,e
0
(/)
30
W
14 Z
a:
l.IJ
0
12
a.
l.IJ
20
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la
0
:E
u
8
lJJ
1-
Z
6
- la
r.fJ
- - - --"- 4 ~
~
Cl:
a.:
2
~
U
1
0,6 1
2
3
4-
5
HEMATOCRITE EN %
Fig. 3 :
Effet de l'hématocrite sur la.. croissance, parasitaire-dans- UŒ-
système de-culture ASYNCHRONE
Fig. 4-::
Effet de l'hématocrite- sur la croissance parasitaire dans un
système de culture SYNCHRONE
appréciation de la croissance par l'incorporation
d'3H-Hypoxanthine
_
appréciation de la croissance par le comptage de la

---

43
parasitémie sur frottis mince coloré au Giemsa
TABLEAU VU
HEMATOCRITE EN %
5
2,5
1,25
0,62
Moyenne des C.P.M.
20 875
16 470
6 895
1 637
Ecart-type
1 733
1 904
SOS
50S
Parasitémie à la
4
3
2,6
fin du "pulse"
NON COMPTEE
Effet de la variation de l'hématocrite sur la croissance- parasitaire
appréciée par l'incorporation d'3H-Hypoxanthine et par le comptage de la
parasitémie dans
un
système de culture
synchrone de
Plasmodium
falciparum
COMMENTAIRES:
Les résultats obtenus dans le système de culture asynchrone montrent que la
croissance
parasitaire
augmente
avec
l'hématocrite
pour
atteindre
un
maximum, puis diminue alors que l'hématocrite augmente. Pour un hématocrite-
de 1096, nous n'avons que très peu de croissance parasitaire en micro plaque
comme le montre la figure 8. La meilleure croissance parasitaire se situe entre
2 et 596 d'hématocrite.
La diminution de la croissance parasitaire dans les conditions d'hématocrite
élevé, est expliquée par certains auteurs- tels que- CHULAy et al. 1983, de la
façon
suivante : il y aurait seulement une diminution de l'incorporation
d'Hypoxanthine. tritiée grâce à la présence- de purines non radioactives en
c~ncentrations plus fortes- lorsque l'hématocrite est' plus élevé. Par ailleurs,
selon ces mêmes auteurs- l'on observerait un phénomène- analogue lorsqu~dans le
milieu de culture-Ie sérum humain est remplacé par" le- plasma: humain- qui
contient pl~ de purines.. Nous constatons que lorsque le système- d~ culture est
au repos ~s l'étuve, 'les hématies sédimentent sur un fonet plat." en une- demi-
heure.. ta diffusion des facteurs nécessaires à la croissance du parasite pourrait
être- perturbée pour les- valeurs les plus élevées de l'hématocrite. La Fig.- 3
montre que l'optimum d'hématocrite se situe entre 2 et 596. C'est pourquoi nous
nlavons étudié dans le système de culture synchrone que la zone de variation de
l'hématocrite comprise entre 0 et 596. Nous nous apercevons alors, que dans le

---

système de culture synchrone, l'on obtient un taux d'incorporation d'3H-
hypoxanthine qui augmente rapidement entre a et 2,596 d'hématocrite ; et à
partir de l'hématocrite de 2,596, la pente de la courbe diminue visiblement Fig.
4-.
Précisons que l'hématocrite de 596 correspond à environ 750 000 hématies par
mm3, et l'hématocrite de 2,596 à environ 375 000 hématies par mm3• Il est
évident qu'avec l'hématocrite de 2,596, le nombre total de sites récepteurs
érythrocytaires de Plasmodium falciparum est inférieur à celui qui existe dans
les conditions d'hématocrite 596. Or, nos expériences ultérieures seront des
expériences d'inhibition compétitive vis-à-vis de ces sites récepteurs éventuels.
Le choix d'un hématocrite plus faible réduira donc le nombre de ces récepteurs
et permettra d'utiliser des quantités plus faibles d'inhibiteurs. Nous choisirons
par conséquent l'hématocrite de 2,596 pour nos expériences ultérieures car :
- il permet une bonne croissance parasitaire dans le système de culture
synchrone en microplaque ;
_. il est assez. bas pour permettre une réduction du nombre de sites récepteurs
érythrocytaires à inhiber et d'envisager une diminution de la quantité des
inhibiteurs à. utiliser.
1.6 EFFET DU TEMPS DE VIEILLISSEMENT DES GLOBULES ROUGES HUMAINS A
+lf.°C
VARIATION DE L'HEMATOCRITE. ET DES FACTEURS INDIVIDUELS
La culture in vitro. du parasite nécessite des globules rouges humains, de groupe
o Rh.... conservés. à +lf.~C en milieu. plasmatique•. Pendant combien. de temps
peut-on. laisser ces 1 h~maties. à +lf.°C sans inconvénient pour la croissan~e
parasitaire,? Des facteurs, individuels s'ajoutent-ils aux. autres facteurs,tels que
l'hématocrite pour influer sur la croissance parasitaire? Pour répondre à ces
questions~ nous. avons réalisé. des,. cultures synchrones.. en' microplaque en
utilisant des. hématies vieillies provenant d'individus différents. Uétude de la
variation de ces. paramètres. (temps de vieillissement et hématocrite) avec 4-
types. d'hématies est reg!"oupée dans le- tableau.. VUL et illustrée par ~es figures 5,
6. et 7..

---

Tableau VU!
i.:.
HEMATOCRITE
TEMPS YJElL-
r.R4SJTEtiIE
c.r.H·
PARASITEtiIE
c.r·H.
PARASITEHIE
C.P.H.
PARASITEHIE
C.P.H.
LISSEtŒ"T
HEtU'fJES 1
HEH.TIES 1
HEMATIES II
HEMATIES II
HEMATIES III
HEHATIES III
HEMATIES IV
HEMATIES
(en Jo~rlf)
(en $)
(en S)
(en J)
(en J)
- , . /
":
0,5
805
0,5
461
0,5
324
0,8
610
~
1,1
H16
0,11
981
1,3
1024
1,4
985
0,62
1~
0,1f
2050
1,3
3lf08
5
5161
7,2
5357
16
~,8
5516
3,05
8528
1,5
1452
0,5
1210
- ,
~
0,1
2119
0,8
1711
0,3
994
0,4
1942
8
3,5
1f186
1, If
3513
4
3341
3
3391
1,25
1~
6,~
10459
5,2
1840
1,6
3051
10,9
11321
16
9,1
25620
10,8
25189
6,1
112491
9,8
10458
~
0,8
3599
0,9
4910
0,1
831t
0,1
2954
8
6,9
10208
5
9561
5,1
1803
1t,9
9358
2,5
12
1~,5
11451
0,1
1080
0,6
1892
1t,9
10905
l~
6,6
20185
1,1
16096
1,5
24119
9,6
21340
Tableau VIII,·
Eff~t 4u vieillJas~œent in vitro des hématies. Effe~ de la variation de l'hématocrite,
et ,ffet dea faoteurQ in4ivi4uels aur la croissance de Plasmodium falciparum in vitro
de~ srstèmes de culture synchrone.
~
\\JI

---

4-6
25
Pig. 5
~2 20
..IJ)
·W
~
~
/
0
15
/
~
~
/
0
/
U
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~
,
10
~
~
u
5
12
16
TEMPS DE VIEILLISSEMENT EN JOURS
Fig. 6
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Fig. 7
-x·IJ)
"""~
~ 2
o
o
~ 15
-X
o
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o
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~ 15
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~
5
54~-~:L---...
4-
12
18
..
12
16
TEMPS DE VlE/lUSSEMENT EN JOURS
TEMPS DE. VIEIlUSSEMENT EN JOURS
LEGENDE: F1q.
5, 6, 7
(Ern:1" DO' T!ICPS OC V'IEU.LISSEMDI'
dtta h. . .t1•• ;\\ . . -C sur l' incarporat1oD
d' Ja-tlypou.ath1rle par Pla~ua flÜ.ci.Jl!!"I8
dae: ua; .,.st'" de. ClI.1.t:are syDe:bftIne ..
œ1œoplaq1M 1•
o
o
o
•
11- IV
----_.
•
11· a%

---

4-7
COMMENTAIRES:
Nous constatons que les variations de l'hématocrite donnent des résultats
analogues à ceux obtenus précédemment; l'hématocrite de 2,596 donne les
meilleurs taux de croissance dans le système de culture synchrone en
microplaque~ par
ailleurs,.
le
taux
de
croissance
parasitaire
augmente
régulièrement avec l'hématocrite.
Les quatre hématies ont des comportements individuels légèrement différents
les uns des autres à chaque série d'expériences. Ce que l'on peut interpréter par
l'existence de facteurs individuels influant sur la croissance parasitaire. Mais il
convient de remarquer que ces facteurs individuels n'empêchent pas de
retrouver les résultats déjà observés.
Le temps de vieillissement à +4°C est sQrement un paramètre important: en
effet, lorsque les hématies niont que 4- jours de vieillissement à +4°C, la
croissance parasitaire est très faible
Fig.
la, 11, 12. Quelle que soit
l'hématocrite utilisé,.. nous n'avons jamais pu obtenir une parasitémie > 196 en
maintenant les mêmes conditions d'expérience pour les quatre hématies vieillies
de 4 Jours à +4-°C.
Le meilleur temps de vieillissement se situe autour de 2 semaines à +4°C.
L'expérience quotidienne nous a permis de reconfirmer plusieurs fois ces
résultats.
Après 25 jours de vieillissement à +4°C, l'on est quelque fois surpris de
constater une faible croissance parasitaire, mais aussi un certain degré
d'hémolyse attesté· par la lecture microscopique de frottis minces colorés au
Giemsa.

---

48
1.7 CONCLUSION DE L'ETUDE DES CONDITIONS EXPERIMENTALES
DE MICROCULTURE DE P. FALCIPARUM
- L'étude de la concentration d'3H-Hypoxanthine nous a permis de constater que
la croissance parasitaire était possible à 0,5 }lCi d' 3H-Hypoxanthine et que les
cpm enregistrés à cette concentration sont les plus élevés. L'analyse de ce
premier paramètre nous a permis d'observer une variabilité dans les résultats ;
ce qui nous a conduit à étudier d'autres paramètres. Nous avons observé que la
synchronisation diminuait la variabilité
des résultats.
Dans
une
culture
asynchrone, l'incorporation est fonction du temps de contact avec le précurseur
radioactif, mais la culture synchrone nous indique qu'en réalité c'est le stade
schizonte qui incorpore le plus de radioactivité tandis que les stades anneau n'en
incorporent pratiquement pas. Nos résultats rejoignent là encore ceux de
CHULAy et al. 1983.
- Le temps de préculture, le temps d'incorporation d'3H-hypoxanthine, la
parasitémie initiale, sont tous des paramètres dont dépendent directement la
croissance. parasitaire et l'incorporation d,3H-Hypoxanthine. Nous avons choisi
les conditions optimales d'utilisation de ces paramètres:
- parasitémie initiale: 0,2 à 1%
- le temps de préculture = 48 heures: il est très important de ne pas rater
ce temps qui correspond au stade schizonte de 2è génération. C'est le
meilleur
moment
pour
incorporer
l'Hypoxanthine
tritiée,
et
aussi
l'expérience prouve que c'est à ce stade que l'on observe le moins de
variabilité d'un puits à l'autre dans la microculture comme nous le
montrent les résultats Tableaux II et III.
- L'étude de l'hématocrite dans la culture présente un intérêt évident pour nous
car, il reflète indirectement le nombre de sites érythrocytaires que nous aurons
à inhiber dans les expériences ultérieures. L'hématocrite de 2,596 est celui qui
répond le mieux à nos objectifs.
- L'étude du temps de vieillissement des érythrocytes nous a. permis d'observer
qu'il est inutile d'utiliser des hématies fraîchement prélevées. Elles ne sont pas
favorables à la croissance parasitaire. Au contraire, des hématies: c()nservées à
+q.°C doivent être utilisées en gardant à l'esprit que le meilleur temps de
vieillissement de celles-ci est de deux semaines. Au-delà de ce délai, l'on peut
quelquefois
observer
une
réduction
de
la
croissance
parasitaire
dQe

---

probablement au degré d'hémolyse qui augmente.
-
Enfin,
il existe des
variations
individuelles
notées
d'une
préparation
érythrocytaire à une autre.
Cette analyse des conditions expérimentales nous donne par conséquent une
idée de la complexité du système que nous utilisons pour étudier le récepteur
érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Néanmoins, en maîtrisant au mieux
ces paramètres, nous pouvons disposer d!un outil très sensible. En effet,. nous
pouvons suivre la croissance parasitaire grâce au marquage de la synthèse de
l'ADN, tout en contrôlant chaque étape par l'examen microscopique de frottis
minces colorés au Giemsa.

---

50
II
ETUDE
OU
RECEPTEUR
ERYTHROCYTAIRE
DE
PLASMODIUM
FALCIPARUM
PAR
DES
EXPERIENCES
D'IMPALUDATION
IN
VITRO
D'HEMATIES PORTANT DES STRUCTURES DE GROUPE SANGUIN RARE
Nous avons voulu, dans un premier temps, vérifier que la mesure de la
croissance parasitaire par l'incorporation d'3H-Hypoxanthine permettait de
confirmer des résultats antérieurs obtenus dans un système de culture
asynchrone, dans lequel la croissance parasitaire est mesurée par comptage
microscopique sur frottis minces colorés au Giemsa. Par exemple, il a été
montré auparavant que les hématies de groupe sanguin Cad résistent in vitro à
l'infestation par les mérozoïtes de Plasmodium falciparum (CARTRON et al.,.
1983).
Dans ce paragraphe, nous avons répété ces expériences dans notre système en
utilisant un nouveau prélèvement du sujet de groupe Cad.
II.IIMPALUDATION IN VITRO DES HEMATIES CAO
Nous avons déjà défini les hématies Cad dans le chapitre d'introduction à la
page 7.
Le tableau IX nous montre que les hématies Cad et les hématies témoins
normales ont des taux d'invasion à peu près équivalents au 4-è et 8è jours de
culture après leur prélèvement. Ceci s'interprète facilement car l'on est en fait
en présence de suspension cellulaire comprenant encore des hématies normales
diluées par les hématies Cad. Au fur- et" à. mesure des dilutions bihebdomadaires,
la quantité d'hématies normales diminue et celle des hématies Cad augmente
pour ne laisser place en définitive qu'aux hématies Cad dans le milieu; on
observe alors une diminution importante de l'infestation des globules rouges Cad
par le Plasmodium falciparum ..
Au bout de 20 jours de OJlture, il ne reste- plus- dans le milieu que 0,2.5.106
cellules normales contre 4-9,75.106 cellules Cad dans. ce système de culture
asynchrone
en
microplaque (tableau IX). Ces
résultats conduisent à la
conclusion que les hématies Cad sont quasi totalement réfractaires à l'invasion
in vitro par Plasmodium falciparum".

---

TABLEAU
IX
J\\GE~ jours
C.P.M.
AGE des
PARASlTEMIE
% PARASlTEMIE
CELLULES NON Cad
des Globules
llUlRPORES
Globules
A lA FIN de
INITIALE
EN REACTION (lib)
dl EXPERIENCE
au DEBUI' de
Dilution (
t-D~ sur
A lA FIN de l'expérience
%)
l'EXPERIEN::E
10 puits
l'expé~
en%
en jours
Cad
< 24 heures
0,2
(1/10)
23 181
4
2,3
li
l
TénpiJl
< 24 heures
0,2
(1/10)
21 962
4
5,1
Cad
4
0,28
(1/8)
13 119
8
1,8
1,7
II
Ténpin
4
0,6
(1/8)
11 393
8
2,7
Cad ..
8
0,25
(1/7)
1 468
12
0,3
l,2
III
Ténp.tn
8
0,21
(1/7)
24 568
12
6,9
Cad
12
0,15
(1/2)
790
16
0,3
IV
TénPin
12
0,2
(1/34)
36 614
16
4,7
Cad
16
0,15
(1/2)
476
20
0,07
0,2
V
TénPin
16
0,2
(1/23)
31 992
20
11,6
Tableau IX - Culture asynchrone en microplaque de la s04che Dumortier qe Plasmodium falciparum
avec dilution bihebdomadaire en globules rouges Cad. La croissance parasitaire
est appréciée par deux techniques: l'incorporation d'
3H-Hypoxanthine (0,5 ~ci/puits)
et comptage microscopique de la parasitémie sur frottis minces colorés au Giemsa.
NC:
NON Cad = cellules normales.
\\"n
....

---

52
1.2.IMPALUDATION IN VITRO D'HEMATIES Wr(a+ b-)
Au moment où cette étude' a été menée, nous n'avions pas encore mis au point
le système de culture en micro plaque. La technique utilisée a été celle de
TRAGER et JENSEN en boites de Pétri. Les hématies Wr(a+ b-) ont été définies
dans l'introduction. Nos résultats obtenus à l'aide d'un prélèvement fraîchement
collecté chez le donneur Wr(a+ b-) démontrent clairement que les hématies
Wr(a+b-) sont normalement infestables in vitro par les mérozoites de ~
falciparum et' ont fait l'objet d'une publication dans le journal "Lancet"
(CARTRON et al., 1981f.).
Ces résultats contredisent l'opinion répandue à l'époque concernant le rôle joué
parla structure Wrb, elle-même mal définie, dans le mécanisme de pénétration
de Plasmodium falciparum dans l'hématie humaine. En effet, on pensait que
l'antigène Wrb était le récepteur de Plasmodium falciparum parce que les
anticorps anti Wrb bloquent l'invasion érythrocytaire du parasite (PASVOL et
JUNGERY, 1983), et parce que les hématies Wr(a+b-) seraient réfractaires à
l'invasion in vitro par le parasite (PASVOL et al., 1982). Des travaux publiés
indépendamment par plusieurs groupes (HERMENTIN et al., 1981f. ; FACER et
al., 1981f.) confirment nos résultats, démontrant ainsi de manière formelle que
l'antigène Wrb n'est pas impliqué comme récepteur de P. falciparum.

---

O~OJS
THELANCET.AUGUST 25.1984
INVAStON OFwr(a+b-)AND lI'r(a-b+)ERYTHaOCYTES IV
w,b ANTIGF.N NOT RP.QUIRED FOR INVASION
P FALOPAalJM
OF Hl:MAN ERVTIfROCVTES BY
PLASMODIUM FALQPARUM
SC.....I
... of plrnailld
Rlood .,..." 01
A......
per....
ctlla M daI'
S1a.-GlycophoriD A~ rhe main human red 'ceU membrane
tryltuocYln uNd
&. .....
~C..I
g1ycoprocein, may œ Ihe- predominant receptor for rhe nulJriIl
bpor.-",.
for ...........•
(daI't)
• daI' It
z
l
5
6
plt.asile PfiUlffOIii"", /aloparu",. 1·7 Red cells It'elIled wilh IryptiIr,
,
1
WI(.·I>-l
O'Z(IIIII)
O· ..
whl~h c1eava glycophorin A, are noc invlded by metozoiul;
,
WI(•• b-)
O·Z (11111)
1·4
~u,:,/icd g1ycophonn A md ils prOleolytic frllmenls scroallr
Z
WI(•• b-)
7
0'\\ (1" 1
O·.
1·7'
Inh~bil ~ozolle innsion; rcd cells coatcd wilb antiglycophorill A
WI(.-b.)
7
0·1 (1111)
1·0
Z·U
anllbodln. reslst ,"fntalion; and En· (a-) erythroeyles. which lICk
g1yco~bonn A, are much leu sensitive 10 invasion than nonnal ni
l
'&'I(•• b-)
10
O'Z (III )
O·,
1'10
WI(.-b·1
10
0'1(111 )
cells. ,. The interaction of merozoiles wilh Ihe red œil surface ia
1'1
1,4'
a1so ClIrbobydnre depmdenr, tinœ neuruninidue-IrCiled œlblJJ
4
WI(•• b-)
14
0'1 (1114)
0'4\\ I·IJ 1·70 Z· 10
md Tn erytbroc:ytCl(whicb areddicienl in sialic aodand galactœrj
.".-b.)
14
0'1 (1111) 0·411 0'7' 1'00 Z·.,
ue vny resiSlIDI 10 invasioa. 5,. CId red cella, wbicb Clrry unlllllà
".I(••I>-r. _
r
F,; W".-b.~.-,01 bl"ocH,_ S.... R.d ,dl pII<-JPCI _ .
carboftydrlte chaine GD g1ycophorin A, Ire Ibo refraaory ro.
-
....1... br .he
iaJobulia ......... , b _ .....W.. "'1lod1 ....110 ..._
merozoile invasion.'
...........;.w,b "'Ilod1(BIlIC 14).
tV'I_ '" ..._~ ilIIIicala diIMI_ ol_,. M. . . . .u.- ...,..._
~e porenlial raie of1specifrc pepriduequmœ ofg1ycopborillA
lIClIng Il mocher receptor for e!llry of Ihe parasite 'NIl recCIIII,
"""'.'
sugesled. The receplor might he rellted ro Ibe b100d group W~
anugen since mtj-Wrb mtibodies black plrasite invasion and tlle
very rare Wr(a + b-) red œlls (10 far only one family, Fr. hu bem
0_.
1. Milkr LJ, Ha,.. ID. McA..wr FM, SIli.... T,
JR. ~ MH.
identifiai) whicb cany a normal content of glycophorin A but DCI
E...... r.. dill"a........ trylllrOCJN aud_ ' ......... r.. 1bo _ _ pao...n
b
1'14.-_ foJa,.",-
Wr mtigen Ire noc invaded in vitro by merozoites.5These rcsults
,l1li"""'_.-1Eq._1977: 1... nl-.1.
z. P.,k.", M. (""'bit..,. ./Toct. ol .,.,.Iuoqtn _bn.. p....... _ '110 .......
seem to he in agreement wilh sludies using En(a-) red celb wbicb
...._ol'heb...... _ ,.. _.(~/.un_I'
•• ,II_ctu.J
Ire a1so Iyped Wr(b-) but Ire de/icient in g1ycophorin A.
Cal B" l'II:'" 561-.7".
]. Dao lE, La LT. Compnll'" ioIlIlIirioo br ..........,.,.......,..
From these data, it III" proposcd.5 Ihat invasion of h\\lllllll
II~ ol
pcDOUI_..,I',.."..,... .c.1 T..,MNH" 1911;"'1164...7.
ef)'~rocyt~ by lhe merozoiles ofPfalcifNIrll'" is a multislep process
4. 1I'naMM,~1D.v.-...J•. ..".,...../._"-'f
_
stlrung Wltb a recognition step which involves binding la rhe
i
ibil...ol_ _• ...-.rorydncyr... ü ' I ' . _ I..I;'.. -"07.
c3:"bohydrate ch:uns of g1ycophorin A, followed by Ihe intemalil-
5. P
G. J..-,. M, 1 1 ' _ DJ. P . . - SF, AaaIoo DI. T _ MIA.
GlycopIIoria ... ~ _. .'IIo . . . . . _I'~J-..-.
anon of the plrmte ..hich requires the interaction wilh a pepride
l.4-a 1"2; il: 947- 51.
s~ena: of giycopborin A prnumably rdated ta Ibe b100d group
•. ,.......G.W_IS,W_DJ.~dIf
.... _ ~....
5
W,.. mugm. ,9 Recendy 'Ne had lhe opportUDity ta obtlÙn SOlDe
iA_..,1bo
...-.,."...,.J-..-. N_19Il;ZI7._.
7. lINv 'tIIV, G
H, CI"-'IMci' IL AlI..., ol ....
.....
frcsb sterile blood from Ihe Wr(1+ b-) donor(Fr) u weil as from 1
b. . . . rryrIuocJIa: .110 .11"_ .r c...- .l1li •
.r
CODtrol Wr(- b +) donor (Spa) collectcd at lhe same time It the Paul
.ryùIrocya~LS"'_~Aao1tU;,... 265-72.
1. Hozwonh Blood Center in Cincinnati. Boeh samplCi were sent ta
L"c.n- IP, f'rwO. Loooiior Mo SoooIior Jr: s.-.a..., ,. _.., ~
P..is
under
idential
conditions
md
were
invcstigated
_.1
I " ' - o l - b.... ..,..,..,.....,..,_ _ ........
H " " 191]: Ua 6J9-·n.
Iimu!tmeously for infestuion in vitro by Pfalciparv", merozoites.·
9. Itidpolilt. T _ MJA, A.uI.DJ. n. w,b ...... '
for ~
Tbe invwon experimems were clone in triplieate ailer agang Ibe
lolG_ - - . ia . -
, _ .r '110
_
red ceU. u .·C for 5. 7, 10, and 1. days.
•. . .1,........ ol
'
_
S
1191); 28Ir Z7)-76-
10. Bmu WV,ItaIluc)
O'G
H.c.IIOoaWkZl.
lu thecontinuous uynchronous culrure syltem uscd about 3'Ve of
JloIoo(~_
..,....,..,1....
olll""""" ,. 1'10_ foJa
o l b _
nid œlls cqmain tbe parlSitCl arler 3-6 days, when cultures were
1._.lM);CIl 111-40.
Il. Dabr W. AdnMa iD !IID
....,.. ol _
•_ _
Itlfted with 0·1 or D' 2'Ve of paruitiscd cells by dilution wilh non-
infected·~hrocyts.As shawn in the tlble, there- is no signifiant
.......,....._i....nlI_IIcIaCaapaal.'SO'.IoocIT..........
MIIIIIdI" 1.... U-Z7 lutr.
difi'erenœ bclween Ihe Wr(a+b-) and Wr(I-b+) erythrocytes,
12. H_llJ. H.,.. ID, McGi-. MH. MàIIer Ul. Snsdioa _ dlD'" ol"''''-
"bich wae- bocb suscqnible- ta merozoite invasion. a1thougb tbt:
,d1at,..,...a··napoon ... _..,n-~_
puaite count wu always slillhtly lowcr wilh the Wr(I+b-) red
Mol ~,.._1911;. lOriS.
Il. PIIII'OI
cd1I.
G."-_ DI. T _ MJA. G""""" C _'110
of ....... ..,
Howevcr, Ihe strain ofPfaicifNlrllwrwa mail\\tained in culture
l' _ _~ Loo-. 1914;0: 907....
for 15 days wilh bolb Ibe "'r(I + b-) md Wr(a-b+) red œlls. Thesc
results unambi~ously demoastme ibat, in contrast ta tbe findings
oI'P1mI1 et u.. Wr(a+b-) erytbrocytes arc normally invlded in
Yitto by'Pfa/ciptJrrmr. OurSludy indiClltes tha the presence ofW,b.
1lIli&al is DOt 1 requiranenr for enuy ofmerozoites into human red
bIood œlls. Other studiCi bave sbown. bowever, tbar internai
hydropbobie domains of glYCOlhorin A are tœ more stable
anachment sitCS"for merozoitCl.1 Sïnce ami-Wrb mtibodies black
1110 the innsioa procas, it is possible lbat this dTect occun br
-'Ung 1 peptiœ sequenœ whiclr is clOR la or is cOnnectai witb
dieWrb structure. The Wrb mtigen hu hem assigned ta a peptide
].P.CunON
IeqUmce betwem residues 55 md 70 of g1ycophorin A.9 However,
A.TOUNItoUA
reœnt evideDœsugestslM in tbisregion theaminoacid sequences
ofglycophorill A from. Wr(a+b-) lIDCi Wr(a-b.+) erytbrocytes lrC'
O. Paou
ideDlical. Il
M. LutUEJt
. Dat.OlI'the-biacking Clpacityof glycopeptides10'sugat thar thl:'
]. P. Souumt
primary evem for mur oC merœoites into red cells. involves the
reftrSiblt: binciine.of the-panaite-{widr .. IOW' affiniry constant) to·
ùlyllled. strUCtUres- followed by a second but- Jtronger bindin&"1
(cblrlcter1sed br a biglr afliniry constlDt) la .. rceeptof' (peptidt:
sequenœ).located ncar tbe Iipid bilayer. Whether or nOC a specifie
peptide- sequence ÎS" involved' Ur- Ihis- process rentai.,.. la bC"
determined sinœ it hu hem poSlUIated that boch g1ycopborin B and
C, rtIO minor redœll membrmeglycoproteins (wbich arrysimil.,.
albli-Iabile Q.21yœsidic cbains), let as potential. recepton for P
/lIkipttrrDlf. 2,5,7:rO,IZ.Jl

---

53
Ill. EXPERIENCES
D'INHIBITION
IN
VITRO
DE
LA
CROISSANCE
DE
PLASMODIUM FALCIPAR UM
Ces expenences ont pour objet d'étudier le pouvoir inhibiteur des différentes
substances dans le but de préciser la nature du récepteur érythrocytaire de
Plasmodium falciparum. Nous avons examiné dans ce chapitre le rôle éventuel des
structures glucidiques associées aux glycoprotéines membranaires.
II1.I.
ROLE DES SUCRES SIMPLES
al SUCRES TESTES
DANS
LE
SYSTEME
D'INHIBITION
DE
CULTURE
SYNCHRONE
Le Glucoset le Galactose, la N-acétylgalactosamine (GalNAc), la N-
acétylglucosamine (GleNAc).
b) RESULTATS
Le glucose, le galactose ne sont pas inhibiteurs de l'invasion in vitro des
érythrocytes humains par Plasmodium falciparum dans· une gamme de
concentration allant jusqu'à 50 mM. (tableau X et Fig.. 8).
La N-acétylgalactosamine est" faiblement inhibitrice; mais seulement aux
fortes concentrations. (lf.0 à lf.896. d'inhibition à. 50 mM). A cette. même
concentration,. le.. "glucose et le. galactose n'inhibent pas. de manière
significative.
Pour le galactose, le glucose et la N-acétylg,a1aetosamine, ces expédences
on1:" été menées en deux séries :. la série. n° L cocr-espond. à.. J!expérience où
l'inhibiteur a été introduit au stade trophozoIte_ La. série. n- II correspond
à. l'expérience dans laquelle le sucre inhibiteur a été- introduit au stade
schizonte. Nous pouvons constater que. dans. les.. séries. Il° [et II,. le sucre
GaiN Ac devient inhibiteur à partir de.lf.O· mM. avec 27 et Z496 d'inhibition
respectivement. Il Il'y a que peu de différence entre l'effet de GalNAc
dans les expériences l et II à cet~e concentration. Nous pouvons par
conséquent suggérer que L'inhibition de croissance du parasite résulte d'un
effet toxique de ce sucre à forte concentration.

---

Les courbes de la Fig. 8 montrent que la N-acétylglucosamine donne 50%
d'inhibition entre 15 et 20 mM. Nous avons toujours obtenu Ce même profil
d'inhibition avec la N-acétylglucosamine comme la plupart des auteurs ayant
testé ce sucre sur la croissance in vitro du Plasmodium. Nous nous sommes
également posé la question de savoir si cet effet inhibiteur n'est pas da à la
toxicité du sucre plutôt qu'à un effet de compétition entre le sucre et un
éventuel récepteur érythrocytaire pour le parasite. Pour tenter de répondre à
cette question, nous avons effectué des expériences d'inhibition en introduisant
l'inhibiteur à divers stades évolutifs:
- Le stade trophozoïte : survient 8 à 10 heures après la synchronisation. Le
parasite ne se présente plus comme une "bague à chatonn, mais plutôt comme
une cellule présentant. un cytoplasme réduit visible d'aspect bleu autour d'un
noyau rouge foncé, le tout entièrement inclus dans l'érythrocyte. C'est à ce
stade, que nous ajoutons le GlcNAc à la culture synchrone (Expérience "GlcNAc
In).
- Le stade schizonte : C'est le stade où le parasite a rempli l'érythrocyte et son
noyau s'est divisé. L'éClatement de l'hématie qui est imminent libérera des
mérozoïtes au nombre de 16 à 32. Avant la libération des mérozoïtes, nous
ajoutons la GlcNAc au contenu d'une microplaque de culture (Expérience
"GlcNAc Ir').
- Le stade trophozoite de 2è generation après la synchronisation : Les
mérozoïtes libérés par l'éclatement des schizontes vont recoloniser d'autres
hématies et subir une maturation pour devenir anneaux, puis trophozoïtes. Et
cest à ce stade que nous introduisons la GlcNAc dans une microplaque de
culture synchrone (Expérience "GlcNAc Ill").
L'évaluation de la croissance du parasite s'effectue comme cela a été décrit
dans Matériels et Méthodes.
Le tableau XI montre les résultats de cette série de 3 expériences. Les
expériences nGleNAc l'r et "GlcNAc III" donnent des. profils d'inhibition à peu
près équivalents.. Tandis que l'expérience "GlcNAc Ir' exprime un profil
d'inhibition qui se détache nettement des deux autres (Fig.. 9).
L'inhibition constatée dans les expériences "GlcNAc 1" et "GleNAc lIr' signe
'l'effet toxique de GlcNAc ; en effet~ dans ces plaques les parasites sont
intracellulaires ; il n'y a pas de compétition entre le sucre et d'éventuels

---

55
récepteurs érythrocytaires pour la fixation du parasite.
Par contre, la forte inhibition dans la plaque II peut signifier une superposition
de deux effets : l'effet toxique ci-dessus évoqué, et l'effet inhibiteur par
compétition, puisque les parasites à un moment donné entrent en contact direct
avec la GleNAc dans le milieu. Et par ailleurs, l'effet inhibiteur- est beaucoup.
plus important. Cette série d'expériences amène à la conclusion suivante: la N-
acétylglucosamine pourrait jouer un rôle dans la structure du récepteur-
érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Le groupement N-acétyl assurerait
probablement une partie de ce rôle puisque ce groupement est également porté
par la GaIN Ac (voir Fig. 8 et Fig. 9) qui possède un faible effet inhibiteur que
n'ont pas les sucres non N-acétylés tels que le glucose et le galactose.
L'inhibition par GalNAc est cependant minime par rapport à celle de GleNAc.
Enfin, la GleNAc montre un effet toxique vis-à-vis des formes jeunes intra-
érythrocytaires du parasite. Cet effet toxique sera étudié plus loin en même
temps que celui des peptides synthétiques. Ce double caractère de GleNAc est
certainement à l'origine des diverses controverses dont fait état la littérature
dans les différ-entes publications concernant ce sucre: JUNGERY et al. 1983,
HO WARD et al. 1982 ; SCHULMAN et al. 1984.

---

TA8LBAU X
Ct:I1oentra-
Ga1We I
GalNAc n
Ga1kt:oIe I
Ga1lIcl:.ose II
Gl\\JCX)8è I
GllicOse II
t.ialII de
l'1nhib1-
C.P.M.
Para-
C.P.M.
Para-
C.P.M.
l'ara-
C.P.H.
Para-
c.P.H.
Parà-
c.p.H.
Pàra-
t:eœ
site
site
site
site
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19 S81l
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22 177
6,4'
17 330
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moDi
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100 1
100 ,
100 1
100 1
95 •
or
15 961
S,OS,
28 724
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19 931
7,5'
19 559
S,j,
20 897
6,9\\
18 477
3,29t
SnH
. 82 ,
100 ,
100 ,
tOO ,
99 t
911
.
Tabelau X
• PlasmodIum falclparurn
- .. - - ~
~
-
-
Glucose 1 1 slucoae aJout~ Il la culture .,nchrone au .tade trophozoTte.
Glucose 11 1 glucose aJout~ Il la culture .,nehrone au .tade .chlzonte.
Galactose 1
)
GaIN Ac 1
)
GlIlNAe " N-lIc~t,lirlllaetoillmlne
Galactose Il
)
Idem
GaIN Ac Il
)
Idem
TEMOIN =MILIEU RPMI-SERUM

---

57
Fig. 8
100r.,....:::::=---~~...-..::::;:;J~~
~
.........,;..J..-c:::-'~
z
w
en
·W
~li:
8
~
~
~
o
5
15
30
40
50'
CONCENTRATIONS EN mM
Fig. 8,1 -Effet da. _rea~ la- =o18a_ lA 'I1tzo _
Pla.-dl_ taldparua ..- culture ~ ea m.c:roplaqae.
Â
â:
â
4
lI~tyl""9al~aaa1Ae ajouu.. ~ 1& culture. &1& .tadII
Uopbosolta
• • • •
lI-Ac6tyl""9al~cu»aaa1Ae ajouu.... la culw- ail atadII
acbl-e.a
At " ~ Â lI-Ac6tyl 9lu_AaiAe·ajoue.... la culture _ .~
acb1-e.a
'Ir 'If * * ~1A. NDa Mlc:e.
Fig. 9
~
Z
w
en
75
·W
li:
0
~
cr
50
0
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~
~
25
.IL
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5,
15
30
40
50
CONCENTRATIONS EN- mM
Pig. 9. Effet da ClcllAc (~tyl 9luco.am-) au' 1& =01_ lA
dtzo cSer pn.-.cllua talc1puua .. 41ff'r_u ~a '_lutU••
••1-----4•. - - - . .
ClclUl4 1 1 GlcllAc lAUo4u1t 4aft.. la cult~ _
.cade
tropho_lt.
0 ......---40)---00
GlcllAc IX 1 GlcllAc lAU04ult 4ana 1& aalw- _
.~
UOpho_lta <Sa 4 - . U _ 9'-raU_ apr'. la
ayncb~l. .U _
.IÂ~--..,A""--"'.
GlcNAC II 1 ClcllAc lAU04ult 4ana la culw- -
.~
ach180Dta

---

58
TABLEAU XI
Concentrations
C.
P.
H.
PARASI'!'TI'IIE EN %
en m.'1
GleNfl.c l
GleNAc II
GleNAc III
Gle
Gle
Gle
Nl\\c l
Nl\\c II
Nl\\c III
TEMJlli
4 623,3
3 860
3 977,3
11,5
3,08
3,5
GleNAc 50rnr1
343,3
271
811,6
4
0,2
0,7
TEMJlli
4 619,3
3 556
3 873
3,5
3,2
4,1
GleNAc 4OmM
1 223,3
177
2 074
0,6
0,1
1,3
'mDlli
4 980
5 066
4 549
3,.9
3,7
3,9
GleNAc 3ÜITLM
2 334,6
270
2 876
1, 1
0,6
1,6
'!'ElvOlli
6 729,3
4 691,5
4 014
4,2
2,3
3,6
GleNAc 2OmM
4 784
1 938
4 163
2,5
1,6
3,6
'l.'ilDlli
5 564
3 912
5 176
2,7
3,8
2,2
GleNAc 1OmM
5 749
3 318
4 876
3,9
3,4
4,2
'l.'ilDlli
6 610
4 825
5 835
4,4
2,7
3,19
GleNAc 5mM
4 681
4 097
4 858
3,8
3,4
3,6
Tableau XI :
Effet de Glc NAc sur trois staàp.s évolutifs àe PlasIT'odium
falciparum en culture synchrone en microplaque. Appréciation
de
la
croissance
parasitaire
par
incorporation
d'
3H-
Hypoxanthine
et
par
comptage
microscopique
de
la
parasitémie sur frottis minces colorés au Giemsa.
GleNAc 1 : introduction de GleNAc dans la culture au stade
trophozoite
GleNAc II : introduction de GleNAc dans la culture au stade
schizonte
GleNAc III :
introduction de GleNAc dans la culture au
~
stade trophozoïte de 2è génération après la
synchronisation
GleNAc:
N-acétylglucosamine
TEMOIN = MILIEU RPMI-SERUM

---

59
llI.2
ROLE DES OLIGOSACCHARIDES
a) STRUCTURES
OLIGOSACCHARIDIQUES
TESTEES
DANS
LE
SYSTEME
D'INHIBITION DE CULTURE SYNCHRONE:
Neu Ac 0(2 - 3Lac
(N3Lac)
Neu Act{2 - 6Lac
(N6Lac = I(MA.»
Gal~ l - 4-GICNACfll-3 Gal
(Lac3G)
Galfll - 4-GlcNAc
(LacNAc)
Toutes ces structures oligosaccharidiques existent à la surface du globule rouge
associées à des glycolipides ou des glycoprotéines. Nous avons voulu savoir si
l'acide sialique joue un
rôle particulier dans
la structure du récepteur
érythrocytaire de
Plasmodium falciparum en testant les deux structures
suivantes: NeuACc( 2-3Lac et NeuAc G(2-6Lac dans lesquelles l'acide sialique se
trouve lié au lactose respectivement par une liaison 0(2-3 et ~2-6 glycosidique.
Les trois autres structures testées constituent des précurseurs des antigènes A
B, H, Lewis et Pl de groupe sanguin (WATKINS et al. 1980, HAKOMORI et al.
1981). En effet, Gall! 1-4-GlcNAc - ~1-6Gal est" l'oligosaccharide reconnu par
des auto anticorps anti 1 (FEIZI et al. 1972) en particulier celui connu selon la
dénomination Ma. Cette structure serait par conséquent une partie de l'antigène
1. Selon WATANABE 1979, la structure 1 est la suivante :
Galp 1-4- GlcNACJS1
6Gal;!1-4- GlcNAcft 1 •••
Gal~ 1-4- GlcNAcft 1 ~
Quant" à la structure- Galj3 1-4- GIcNAcft 1-3 Gal, elle représente le motif de
base qui par répétition donne- naissance à l'antigène i.
Gal{)1-q;. GleNAc est le disaccharide de base de type II sur-- lequel sont
construits de façon séquentielle et coordonnée l'antigène H et Lewis grâce à
une fucosyltransférase, puis-l'antigène A ou B grâce à une GalNAc-transférase
ou une Gal-transférase; (WATANABE et al. 1975, 1978, 1979, HAKOMORI S.,
1981 ; WATKINS et al. 1980).

---

60
Ces structures bien entendu ne sont pas spécifiques des globules rouges mais
existent également sur beaucoup d'autres tissus et organes : HAKOMORI S.
1970, SAMUELSSON B.E. et al. 1975, TOKURA et al. 1952, MASMUNE et al.
1951.
Nous avons testé tous ces oligosaccharides à la concentration unique de 2
mg/ml dans le système d'inhibition de culture synchrone. 'de Plasmodium
falciparum.
RESULTATS:
Le
tableau
XII
montre
qu'à
la
concentration
unique
de
2mg/ml.
Les
oligosaccharides présentent le même profil d'inhibition, soit environ 50%. N3Lac et
N6Lac qui sont des structures comportant de l'acide sialique font partie de ces
oligosaccharides donnant une inhibition d'environ 50%. L'acide sialique dans ces
deux
types
de
liaison
ne
se- montre
pas
plus. inhibiteur
que
les
autres
oligosaccharides testés. Nous en déduisons que l'acide ne joue pas un rôle important
dans la structure du récepteur érythrocytaire de Plasmodium falciparum.
Tableau XII :
COncentra-
Oligosaccharides (1)
tions en
C.P.M.
%-
II!3'/rnl
incorporés
d'Inhibition
NeuAc ..(2-3 r.ac
31 235
58
NeuAc 042-6 r.ac
36 015
52
2
~-4~"1-3 GaJ.
(~G)
36 536
52
GaJ. ~1 -4 Gldmc
(LacNP.c)
30 338
60
'InDIN RPMI-5ERIJr.l
75 001
a
Effet des oligosaccharides sur la croissance in vitro de Plasmodium
falciparum en culture synchrone
(1) concentration de 2mg/ml

---

61
CONCLUSIONS
DE
L'ETUDE
DU
ROLE
DES
SUCRES
SIMPLES
ET
DES
OLIGOSACCHARIDES
Parmi tous les sucres testés, seule la N-acétylglucosamine s'est montrée la plus
inhibitrice de la croissance in vitro du parasite. Il s'agit d'un sucre réducteur dont
le rôle peut être à la fois toxique et inhibiteur par compétition avec une structure
du récepteur. Le groupement N-acétyl semble jouer un rôle modéré dans l'effet
inhibiteur, que nous retrouvons à un faible degré avec la GaiN Ac.
Nous ne pouvons pas à partir des expériences ci-dessus attribuer de rôle majeur à
l'acide sialique. Mais le taux d'inhibition d'environ 50% obtenu avec le N3Lac et
N6Lac nous invite à étudier davantage le rôle de cet acide sialique en utilisant des
glycoprotéines dont les structures oligosaccharidiques sont connues.
III.3
ROLE DE QUELQUES GLYCOPROTEINES D'ORIGINE HUMAINE ET
ANIMALE
Nous avons étudié le rôle des glycoprotéines dont les structures oligosaccharidiques
sont bien connues. Ce sont:
- les glycoprotéines· de- la membrane- érythrocytaire : les glycophorines et la
bande 3 ;
- les glycoprotéines provenant de différents liquides ou milieux biologiques : la
fetuine, l'orosomucoide, l'ovomucoide" la mucine de l'estomac humain et la
mucine de l'estomac bovin.
La structure des chaînes glycaniques associées à ces glycoprotéines est rappelée
dans le tableau XIII..

---

62
'rABUltJ IIII
STRUCTURES OLlGOSACCHARIDES ASSOCIES AUX GLYCOPROTEINES
atICOPROTEIIŒS
lUTEURS_
a) O-GLrCANES ALCALI-LABILES
NeuAc a< 2-3 Gal ~ 1-3 GalNAc 0( ,-SerlThr
Q.lycophor1ne~ THOMAS, D.B. '19'69-
Fetuine
SPIRO, R.G. 1974-
1 Gt. 2-6
NeuAc
fininogène
CARLSON, D.M. 1968
Cerveau de rat LOMBART, C.G., 1974
Hucine
BERTOLINI, M.,1970
FINNE, J.. 1975
NeuAc ~ 2-6 GalNAc-Ser
Glycophorin Tn
DAHR, W•• 1974
Gal-GleNAc ~
MUCINE
SLOMIANY" B.L••198lf..
Gal-GlcNAc-Gal-GlcNAc
Gal-GlcNAc /
,
1
GalNAc-Ser/Thr
NeuAc
\\
Gal-NeuAc
b') N~r:.YCANES ALCALI-STABLEs"
GlcNAe ' "
Man
GlcNAe- ..""
"
OVOMUCOIDE,
Han-GlcNkc-GleNAc:-f$" -bIT
YAMASHITA,. K.,.. 1983,
/
GleNAc ........
Man
GleNAc../'
NeuAc-Gal-G1.CNAc """'-
Man
NeuAc-Gal-GlcNAo.'"
" -
OROSOMUCOIDE
FOURNET, B., 1979
Man-GleNAc 0( Asn
NeuAc-Gal-GleNAc ~
/
,
œan
Heule-Gal-GlcNAc /

---

63
RESULTATS:
a) GLYCOPROTEINES DES FLUIDES BIOLOGIQUES
Le tableau XIV nous montre que seule la mucine de l'estomac humain est
légèrement inhibitrice; mais cet effet inhibiteur est 100 fois plus faible que
celui de la glycophorine A qui est considérée comme le principal récepteur
comme le montreront les expériences ultérieures. C'est pourquoi nous pensons
que cette légère inhibition de la croissance parasitaire par la mucine de
l'estomac humain est probablement non spécifique. Nous remarquerons que les
effets del'ovomucolde glycoprotéine pauvre en NeuAc, sont comparables à ceux
de l'orosomucoIde, glycoprotéine riche en NeuAc. Ces deux glycoprotéines ne
sont pas inhibitrices de la croissance parasitaire. L'on peut par conséquent
penser que l'acide sialique du moins sous cette forme n'est pas impliqué dans la
structure du récepteur érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Ces résultats
rejoignent
ceux
du
tableau
XII à propos de l'effet direct de certains
oHgosaccharides sur la croissance parasitaire.
TABLEAU XIV
<ncEN!'RA-
FEI'OINE
0r0r01OCDIDE
OVCl-IDCDIDE
HOCINE
!-1OCINE
TIONS EN
E:S'roMAC HmmJli FSl'Cl<W: DE
nq/Id
OOEUF
C.P .M.
P %
C.P.M.
P %
C.P .M.
P %
C.P.U.
P % C.P.H.
P %
3
3 821
1,6
3 698
1,7
4 614-
2,6
1 173
0,8
2417
1,2
Ténoin
3 872
1,6
4 928
2,4
4 664
3,2
5 063
2,1
2 927
-
1,5
3 838
2,8
4 872
2,7
4 649
2,18
3 418
1,8"
Z 918
1,9
Téncin
3 505
1,4
4 530
2,1
4 690
3,1
4 887
2,3.
2 n6
1,4
0,75
3 942
1,4-
5 195
2,07
4- 724-
2,1
4 141
3,4- 2 998
1,2
Téncin
4- 065
2,1
4- 837
2,42
5 016
2,08
4 814
1',6
3' 054
2,.1
0,37
4 251
1,7
5 059
1,6
4 780
4
4 352
2,2
Z 838
1,9
Ténoin
3 855
'-,10
5 067
1,4
4 817
2,5
4 821
1,7 2 809
1,4
Effet" des glycoprotéines solubles, sur- la croissance in vitro de
Plasmodium falciparum en culture ,synchrone.

---

64-
b) GLYCOPROTEINES DE LA MEMBRANE ER YTHROCYTAIRE
Nous avons examiné le pouvoir inhibiteur des glycophorines A et B en solution,
isolées d'une part à partir des hématies normales, d'autre part à partir des hématies
provenant de donneurs rares de groupe sanguin Tn et Cad. Ces hématies ont été
choisies car les cellules natives de ces donneurs sont réfractaires in vitro à la
pénétration des mérozoites (cf chapître précédent). Ces préparations ont été
testées dans notre système d'inhibition de culture synchrone sous différentes
formes : les unes ont été utilisées à l'état natif après purification à partir de
membranes
érythrocytaires,
les
autres
après
modification
chimique
:
soit
éthoxyformylation des résidus histidines selon la méthode de SCHINDLER et al.,
1976 et PRIEELS et al. 1979 soit désialylation à l'aide d'une neuraminidase ou par
traitement par H2S0", O.OIN. Ces modifications ont été réalisées au laboratoire par
F. PILLER et D. BLANCHARD.
Les résultats sont rassemblés dans les tableaux XV et XVI illustrés par la figure 10.
Nous constatons que la glycophorine A possède un effet inhibiteur déjà signalé
par d'autres auteurs tels que PERKINS 1981, 1982, 198"" BREUER et al. 1983,
DEAS et LEE 1981. Environ 50% d'inhibition dans la gamme de concentration
25-35 flg/ ml.
L'effet de la glycophorine- A native n'est pas différent de celui de la
glycophorine A désialylée. Nous en déduisons que l'inhibition de la croissance
parasitaire par la glycophorine n'est pas due à la présence de l'acide sialique.
La glycophorine A native n'est' pas plus inhibitrice que la glycophorine A
modifiée sur les histidines. Nous en déduisons que les histidines de la structure
primaire
ne semblent pas être responsables de l'effet inhibiteur de la
glycophorine sur la croissance parasitaire.
-
La glycophorine Tn: :-. est" un· variant" par glycosylation anormale de la
glycophorine A, (voir Introduetion).Elle donne une courbe de croissance
parasitaire (Fig. 10); qui nlest" pas significativement différente de celles
observées avec les trois autres glycophorines précédentes (A native~ modifiée,
désialylée). Nous en déduisons que les structures oligosaccharidiques de la
glycophorine A ne semblent pas. jouer un rôle important dans la structure du
récepteur.
Il convient de noter ici que les glycophorines, provenant d'hématies désialylées
et d'hématies Tn sont normalement inhibitrices alors que les érythrocytes dont
elles proviennent sont réfractaires à l'infestàtion par les mérozoites.

---

65
TABLEAU
XV
a::N:EN1'RA-
Gt.YOOPlDRINE B
TICNS E1l
C.P.M.
% ne
% INH
~g/ml
T
69 827
97
50
1 464
2
98
T
71 101
99
25
1 709
2
98
T
70 553
98
12,5.
27 764
38
62
T
69 563
97
6,25
73 930
103
O.
T
69 913
97
3,5
74 520
104
0
T
78 672
109
1,7S
77 819
108
O,
Ta:leau XV : Effet de la glycophorine- B
Croissance in vitro de- Plasmodium falciparum
en culture synchrone.
~ INC = 'Vord'Incarporation des C.~.M_ par-
rapport au témoin RPMI sans glycophorine
ClAt INH = Oh- d'inhibition
C·.P:M. = nombre de coups- par minute-
T =témoin sans glycoprotéine

---

Tableau XV!
._-
Cbncen-
trat.kns
Glyoopll:>rine A
Glya>(Ù)rine ~ (m)
Glya>poorine Tn
G1YCDpOOrine CaLi
•
en
C.P.M~
%~
~ INH
C.P.H.
, m::
i !NU
C.P.M.
% roc
% INH
C.P.M.
, ne
% JNH
eg/ml
T
87 466
97
97 381
103
0
66 415
50
7 08~
7
~3
q 920
7
93
6 955
7
93
(60)
88 944
127
0
T
89 949
99
95 344
101
67 135
25
44 870
49
51
52 334
58
42
52 927
56
44
(46)
77 987
114
0
T
90 730
100
93 636
99
1
68 515
12,5
75 455
83
17
73 008
81
19
76 754
81
19
(I2)
67 761
99
1
T
94 408
104
88 216
94
6
69 155
6,25
80 480
89
11
78 493
87
13
91 954
98
2
(5)
70 611
103
0
4J'
4J'
T
90 720
100
93 574
99
1
66 734
3,5
85 788
95
5
85 506
95
5
87 730
93
7
(3)
71 234
104
0
T
86 668
96
94 767
101
0
70 602
1,75
87 806
97
3
86 347
95
5
96 815
103
0
(2)
73 932
108
0
Tableau XVI:
Effet de différentes ~Iycophorines sur la croissance in vitro de Plasmodium falciparum
en culture synchrone.
% INC = % d'incorporation par rapport à la moyenne des C.P.M. des témoins
% INH = % 41inhibition
C.ll.M. =nombre de coups par minute
Glycophorine A(m) = Glycophorine A modifiée sur les histidines par éthoxyformylation
; Les valeurs entre parenthèses indiquent les inhibitions observées lors d'une seconde expérience

---

67
EFFECT OF GL YCOPROTEINS
Fig. 10
ON INVASION PROCESS
'"
0
'-
,,- 9 ~ :~
-
-e_
c:
la
~,
0
(J
80
~
0
,~
•
'#
~
G)
&0
~
as
-Q.;::,
al
40
c:.
-
&..
-c:as
)(
0
20
~
>-
.&=
lt~lt
1
~
...
0
10
20
30
40
50
&0
concentration (I-lg/ml)
o .. fetuin: A" orosomucoid~: &. _. ovomur:oid ;
cr= glycophorinA:
)(. .. glycophorin B :
.=glycophorin A(desialylal"!d) ;
V' = glycophorin A from Tn red cells
.=glycophorin-Afrom.Cad.red.cells

---

68
La glycophorine Cad montre un résultat attendu mais très intéressant. Elle
donne-Ie même profil d'inhibition que le témoin RPMI-SERUM. C'est-à-dire que
la glycophorine Cad en solution n'est pas inhibitrice de la croissance in vitro de
Plasmodium falciparum ce qui corrèle bien avec les résultats antérieurs
montrant que les hématies Cad étaient réfractaires à L'invasion in vitro par
Plasmodium falciparum (Tableau IX). La glycophot"ine Cad, sans doute à cause
de sa particularité structurale est inapte à fixer le mérozoite de Plasmodium
falciparum
à
la surface de
l'hématie
;
par
conséquent
les
tentatives
d'impaludation in vitro de ces hématies restent sans succès.
- La glycophorine B nous montre un résultat inattendu ! En effet, lors. de
plusieurs expériences, elle s'est toujours
montrée plus inhibitrice de la
croissance parasitaire que la glycophorine A.
Puisque les anomalies de glycosylation, les modifications des structures
saccharidiques
(désialylation),
semblent
démontrer
que
les
structures
oligosaccharidiques de la glycophorine A ne jouent pas un rôle important dans la
structure du récepteur. Il est possible que la forte inhibition de la glycophorine
B comparée à celle de la glycophorine A reflète simplement une différence de
structure. polypeptidique de ces deux- glycoprotéines.

---

69
c) EFFET OU GL YCOPEPTIDE DE LA BANDE 3 SUR LA CROISSANCE IN
VITRO DE PLASMODIUM FALCIPARUM
La bande 3 est une glycoprotéine transmembranaire de 93 kDa dont l'extrémité
NH2 terminale est intra cytoplasmique contrairement aux glycophorines dont
l'extrémité NH2 terminale est située à l'extérieur de la membrane. C'est une
glycoprotéine comportant une chaîne N-glycosidique contenant une structure
répétée par un nombre variable d'unités -N-acétyllactosamine (figure- 11). Cette
chaîne porte l'antigènes Ii et aussi les antigènes de groupe sanguin A, B et RH
(ANNE J. 1980, FUKUDA et al. 1981). Le rôle essentiel de la bande 3 est le
transport d'anions à travers la membrane (WILLIAMS et al. 1979 ; TANNER et
al. 1979 ; KNAUF 1979, 1982). L'extrémité intracytoplasmique contracte aussi
de nombreuses inter-relations avec d'autres structures protéiques- et celles du
cytosquelette. Ces structures comprennent : l'aldolase, la glycéraldéhyde-3-
phosphate déhydrogénase, la phosphofructokinase, la bande 4-2 et l'hémoglobine
; GILLIES R.J. 1982.
Nous avons étudié une préparation de glycopeptides contenant la chaîne N-
glycosidique qui a été obtenue après digestion de la bande 3 par la pronase (F.
PILLER). Ces glycopeptides ont été testés dans le système d'inhibition de la
culture synchrone de P. falciparum. Les résultats du tableau XVII indique que
les glycopeptides de la Bande 3 ne sont pas inhibiteurs de la croissance
parasitaire in vitro dans la gamme de concentration utilisée. Ces résultats
s'opposent à ceux décrits récemment par FRIEDMAN et al. 1985, OKOYE et al.,
1985. Nos résultas suggèrent que cette glycoprotéine n'est pas directement
impliquée dans la structure du récepteur.
TABLEAU
XVU
an:entrations
C.P.M.
%
en lJ.g/mL
il1ool:parés
d'I:nhi..bi.tion
200
40 580
0
150
44 427
0
100
50 709
0
50
49 485
0
TnDINS RPMI-sœJM
31 921
:0
Tableau XVIl
Effet des glycopeptides de la bande 3 sur la
croissance in vitro de ~lasmodium falciparum
en culture
synchrone.

---

Fig. t 1
Brallclwd LuctosuminoglYt'ufI (Bande 3)
a-Ct '" -'C'tllA4:t.
'- U, - 4C'cllA4:.'
c..~.- 'GIdIAd'
\\
\\
,
,
,
,
tuc
tl-Ct",-4"tllAd'" JI,......... ,. - 'C'tIlAc~'- J('" U.-.c'cdell'- JI1-,'"Il'- 4G'cIlAc.1 - JCU ._, -. i'cNAcll'- JI.~oG' '1'- 4G'cNAc"- ](;."" - .Cld'ic_I-1141""\\
1
.
In
,
,
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.~I.'-'CIcllAdt - jc,1;1-4ClcllAcJi-lICtl"-4ClcNAcU- J'HIC,Ut-'C.cllAcAI"1",""/
,
,
/
.
1
o
l-"II'-.GlcNAc"
I(G.UHG'cIiAc'.'
"
STRUCTURE
SELoN
FUKUDA
ËT
AL 1 1984

---

71
Ill.4
ROLE DE LA STRUCTURE POLYPEPTIDIQUE DE LA GL YCOPHORINE
A ETUDIE A L'AIDE DE PEPTIDES DE SYNTHESE
Les résultats sont regroupés dans la figure 12 etdans les tableaux XVIII, XIX et
XX. Pour illustrer ces résultats, nous avons calculé les concentrations 50%
inhibitrices de chaque pentapeptide utilisé en nous référant aux courbes
d'incorporation de 3H-Hypoxanthine et en corrigeant les valeurs obtenues sur
les courbes par l'effet du témoin interne, l'acide trifluoro-acétique.
METHODE DE CALCUL
La figure 12 représente les courbes d'incorporation de 3H-Hypoxanthine pour
chaque pentapeptide et pour les deux témoins correspondant à l'absence de
peptide dans le milieu de culture (témoin RPMI-serum) et à la présence d'acide
trifluoroacétique (TFA) (neutralisé) dans les proportions molaires équivalentes à
celles présentes dans chaque solution de peptides (voir Matériels et Méthodes).
Ces courbes sont déduites des résultats du tableau XVIII. Si un peptide donne un
effet de 50% d'inhibition à une concentration donnée, et l'acide trifluoro
acétique à cette même concentation donne un effet inhibiteur de AY au lieu de
0, nous dirons que le peptide a en réalité un effet inhibiteur non plus de 50% à
cette concentration, mais de50 - Ay. En effet, chaque peptide est synthétisé
sous forme d'un sel. de trifluoroacétate, et il faut" donc tenir compte du nombre
de molécules de TFA par peptide. A partir du pourcentage d'inhibition corrigé,
l'on déduit la concentration 50% inhibitrice vraie. la figure 13 illustre de
manière très frappante l'effet de chaque peptide par sa concentration 50%
inhibitrice.
commentaires:
Nous remarquons que les pentapeptides des régions 55-59 et" 72-76 ne sont que
modérément inhibiteurs. Les pentapeptides de la région 60-70 sont les meilleurs
inhibiteurs. Il existe un pentapeptide qui dépasse tous les autres par son effet"
inhibiteur : il s'agit du pentapeptide comprenant les résidus 65 à 69. La
séquence de ce peptide est: Ala.-His - His -Phe -Sel'.
Nous remarquons que cette séquence porte deux histidines adjacentes, ce qui lui
donne une charge nette positive. La très forte inhibition de la croissance
parasitaire obtenue avec ce pentapeptide est-elle due à la présence de ces deux
. histidines dans la séquence?
Un effet de charge n'explique pas le résultat obtenu avec le pentapeptide 65-69,

---

72
car le peptide Mill contenant une séquence Lys - His - Lys, fortement chargée,
n'est pas inhibiteur (tableau XVIII). Il convient de remarquer que le peptide. Mill
qui représente la séquence 26-30 de la glycophorine A n'est pas non plus
inhibiteur, ce qui suggère d'une part que les peptides utilisés n'ont pas d'effets
cytotoxiques prononcés et d'autre part que le phénomène d'inhibition de
croissance observé est spécifiquement obtenu avec la séquence 65-69 de la
glycophorine A. On remarque aussi que le peptide 55 caractéristique de la
séquence 26-33 de la glycophorine B ne possède pas d'effet inhibiteur
significatif, ce qui confirme la spécificité du phénomène décrit plus haut. Ces
arguments nous permettent de rechercher d'autres explications à la forte
inhibition obtenue avec le peptide 65-69. Nous avons aussi vérifié qu'un peptide
plus grand (région 62-70) englobant la séquence 65-69 est également un
excellent inhibiteur de la croissance du parasite (Tableaux XIX et XX).

---

,
!.
~.
.. TABLEAU _XVlll
i
tÎ'
'-
Coocentra-
PENTAPEPTIDES DE SYNTHESE
1
l
tioOfi en mli
55-59
58-62
60-64
65-59
67-71
70-74
72-76
ss
Mill
i
f
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
l.
20
20
80
3
97
3,3
96,7
3
97
1,5 98,5
10
90
1
99
5,6 94,4
1,5
99
~.
1
,
10
48
52
24
76
9
91
10
90
15
85
70
30
24
76
95
5
54
46
5
79
21
59
41
39
61
32
68
57
43
70
30
143
0
90
10
126
0
2,5
70
30
68
32
55
45
48
52
81
19
87
13
12
0
89
11
113
0
1,25
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
102
0
117
0
91
9
119
0
Tableau XYIll
Effet des peptapeptides de synthèse sur la croissance in vitro de
Plasmodium falciparum.
a)
= , de C.P.M. incorporés
b)
= ~ d'inhibition.
Couple de chiffres séparés par un -
comme 55-59
: premier résidu et dernier
résidu du pentapeptide.
ss = peptide s~nthétique dont la séquence est déduite de celle de la glyco-
phorine c;) et non
0(.
Mill = peptide synthétique dont la séquence est déduite du variant de la
glycophorine ~ dans laquelle une mutation en position 28 a remplacé la
thréonine par la méthionine ou la lysine. Ce variant de la glycophorine~
p'est pas glycosylé sur l'asparagine 26.
......
\\0.)

---

TABLEAU XIX
NONAPEPTIDE 62 - 71
PEPTIDE 72 - 74
Concentrations
en mM
C,!?H.
% IN.
% INR.
C.P.M.
% INC.
% INR.
10
210
0,4
99
2 251
4
96
5
1065
2
98
21 200 .
41
59
-
2(5
&795
1~
87
37 371
72
28
~
31214
60
-
~
44 374
86
~
~
0,62
43215
84
16
48 812
95
5
~
O,~
4q l4~
89
I l
54 890
106
0
TablefiQ ~lX
- Effet des peptià~s qe synthèse sur la croissance in vitro de
Plasmodium falciparum.
~ INC. = ~ d'incorporation
i
INij. = % d'inhibition.

---

TABLEAU XX
N° du le~ et der-
nie+ +ésidu du
Séquences en amino-acides
Poids
Concentrations 50 ,
polypeptide d~
moléculaires
inhibitrices
synthèse
en mM
55 - 59
Glu-Glu-Glu-Thr-Gly t
ITFA
676,6
8,3
58 - 62
Thr-Gly-Gly-Arg-Val t 2TFA
824,62
4,8
60 - 64
Glu-~rg-V~l-Glu-Leu
t
2TFA
979,8
3
65 - 6~
~lq-"is-His-Phe-Ser
t
3TFA
933,72
1,37
67 - 7l
"~s-Phe-Ser-Glu-Pro
+ 2TFA
839,74
4,6
70 - 74
Gl~-Pro-Glu-Ile-Thr
t
1TFA
699,72
5,95
72 - 76
Glu-Ile-Thr-Leu-Ile + 1TFA
700,8
10
62 - 70
Val-Gln-Leu-Ala-His-His-Phe-Ser-Glu t3TFA 1400
1,75
'.1
\\.II
ss
ASn-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Leu-Val + ITFA
984
24
Mill
Asn-~sp-Lys-His-Lys
t
4TFA
1087,7
)100
Tableau XX
Effet des polypeptides synthétiques sur la croissance in vitro de
Plasmodium falciparum exprimé par les concentrations 50 , inhibitrices.
TFA = Acide trifluoro-acétique.

---

76
Fig. 12
10
iF 75
z
w
(/)
·w
a:
00-a: S
0
(.)
~
~
0.:
U 25
~5
10
CONCENTRATIONS EH mM
PEPTIDES DE SYNTHESE
Flq.
EHet doc peptides .ynthitiqu. . .ur la croi . .""ce in vitro
de P. !alciparu•. Appr~clatlon d. la crc!=sance par le \\
de C.P.K. lnçerports .~ fonction de lA concentrAtion en ~
de. peptide. d~ cynth••~ d.n. des système. d~ culture .ynchron~
le
•
* "N!lllOln RPKI
~
"N!lllOin TFA
Cl
~
~
os
.
•
--------. 55-59
~
72-16
- - - - -
10-1(
~----l---'
58~2
Q
lil
liJ
6a~
~
6S~9
.At.
Â-----Â
62-71
61-71

---

77
CONCENTRATION 111111111 GlYINB
A 50." INHIBITIOI
FIG 13
9
8
7
6
5
3
........
••...•....•....•. .. ..
••..••......•.... :::::::::::
2
Glu Gru Glu~ Thr Gly Glu Arg V.I Glu Lea AI. His Hil Plie Ser Gia Pro GI. ne Thr L. III
55 5& 57 58 59 60 61 62 63 6~ 65 6& 67 68 69 70 71 72 7! 74 75 71
IN VITRO
INHIBITION OF THE INVASION OF HUMAN RED CELLS
BV
PLASMODIUM
FALCIPARUM WITH PEPTIDES
RELA TED TO GLYCOPHORIN
A

---

77
COIICEIITUTlOllIIt 1111I) 61Y1"&
A 50 \\ IIIHIBJTlOI
FIG 13
9
8
7
6
4
3
•................
2
:::::::::::::::::
:.:.:
.
Glu Glu Glu Thr Gly Glu Ara Val Glu Lell Ala His His Plie Ser Gia Pra Gia ne Thr L. Ile
55 5&· 57 5B 59 60 61 62 63 6~ 6i 6& riT 68 69 70 7t 72 73 7~ 75 7'
IN VITRO
INHIBITION OF THE INVASION OF HUMAN RED CELLS
SY
PLASMODIUM
FALCIPARUM WITH PEPTIDES
RELATED TO GLYCOPHORIN
A

---

78
I1I.5
ETUDE DE LA TOXICITE. DES INHIBITEURS
Les effets inhibiteurs que nous avons observés en utilisant divers peptides
peuvent être dus à leur toxicité plutôt qu'à un phénomène de compétition avec
les structures réceptrices à la surface des hématies. Nous avons donc soumis
des schizontes jeunes à l'effet des substances inhibitrices et procédé à des
pélèvements toutes les deux heures pour suivre la maturation de ces parasites
sur des frottis minces colorés au Giemsa.
Nous avons testé en parallèle:
_. un peptide de synthèse habituellement inhibiteur,
- un sucre habituellement inhibiteur tel que la N-acétylglucosamine
(GlcNAc),
- le témoin Acide trifluoro acétique neutralisé (TFA),
- le témoin RPMI-SERUM.
Nous avons pu faire les constations suivantes (tableau XXI)
Les
schizontes
évoluent de
la
même
façon
dans
les
puits
contenant
respectivement le RPMI-SERUM, le TFA, et le peptide synthétique. Cependant
les puits. contenant la GlcNAc donnent des parasites dont l'évolution est
anormale, se traduisant par un blocage de maturation des schizontes (comme
cela a déjà été signalé antérieurement). Dès la quatrième heure, nous observons
en effet des schizontes rétractés pour la plupart à un pôle de l'hématie avec. des
noyaux peu visibles et noirs, un cytoplasme réduit. Une image identique
s'observe encore à la huitième heure, alors que dans. les autres puits ne
contenant' pas de GleNAc, les· parasites sont déjà arrivés au stade mérozoite et
anneaux. Quelle voie métabolique du parasite est-elle bloquée par la GleNAc?
Cette question reste sans réponse. pour- l'instant;. Quant aux peptides de
synthèse-, il semble que leur- effet sur la croissance des parasites se limite au
stade mérozoite, mais n'empêche pas la. maturation intra-érythrocytaire des
schizontes.

---

f]lBLEJlU
XXl
~ UMolN ~PMI-SfR~M Ipepti~ 61-11i 10mM IGLcNAci 20mM
ITfAi 20mM
,chifQflt, viable
IlPyitUx rougl[!s
1 c\\'l"l'IO'!I'e ~Ie~
~H
©
.~
@
Sfhiz~mte "i~le
sctaizonte
.il
noyaux peu visibles_noirs
t1 4H
1
~ 1
~ ICVloplaSmtt r~u~ •••••..u"
merozoi,~
schizonte
.il
noyaux peu visibles
~
1
schizonte
\\0
cytoplasme redu·.
ijH
1
p ,
0
,
p
~
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.:::. u
,'1 0
.
"
1 F--
1 @
'
Il
~"
1 l
'
Aflne...~
parasites
absents ou
parasite~ absents
ou
erozô..te
aH
rares
1
1:0)
ran~s
;G)
'l'ableau 4(Xl
Effet des différents inhibiteurs sur l'évolution des schizontes
iotra érythrocytalres . .
Etude visualisée de la toxicité des inhibiteurs.

---

80
DISCUSSION ET CONCLUSIONS

---

81
Pour étudier le récepteur de Plasmodium falciparum, nous avons été amenés à
adapter la technique de TRAGER et JENSEN (1976) aux conditions de culture du
parasite en microplaque. Nous avons suivi la croissance parasitaire par deux
méthodes:
- la méthode d'incorporation d'hypoxanthine tritiée que nous avons mise au point
en nous inspirant des travaux de CHULAy et al. 1983 ;
- et la méthode de comptage microscopique de· la parasitémie sur frottis minces
colorés au Glemsa.
La première méthode est plus sensible comme le montrent nos résultats. Elle
reflète directement la croissance parasitaire car eUe est le témoin de la synthèse
d'ADN. En effet, de récentes études ont montré que le plasmodium utilise les
purines exogènes, mais est incapable de réaliser leur synthèse "de novo".
(SHERMAN et al. 1977, MANDHAR et al•. 1975,. WEBSTER et al. 1981). ; et
l'hypoxanthine . est la base
purique majoritairement
utilisée pr
Plasmodium
falciparum pour la synthèse des acides nucléiques, WEBSTER et al. 1981.
Nous nous sommes aperçus que de nombreux paramètres llés à l'utilisation de cette
microtechnique pouvaient influer sur
les
résultats
et- rendre difficile leur
interprétation.. Aussi,. avons-nous décidé d'étudier- au préalable les conditions
d'utilisation de la méthode. Nous avons donc défini les conditions optimales de la
culture en étudiant l'influence. de la quantité et du temps de contact ("pulsé")
d'hypoxanthine tritiée introduite, de l'hématocrite, du temps de préculture, et de la
parasitémie initiale•. Nous avons. constaté aussi la nécessité du vieillissement à
+lf.°C en milieu plasmatique des hématies. à. tester. TRAGER. et JENSEN (1976) ont
aussi montré que le sérum humain était indispensable dans le milieu culture, et
NP/ET et al_ (1983) décrivent. des facteurs. dialysables. du sérum comme étant des
facteurs de croissance du parasite.
Pour:: démontrec" que des structures moléculaires. à. la surface de la membrane
érythrocytaireconstituent des éléments du récepteur pour Plasmodium falciparum,
nous avons fondé notre logique sur les deux principes suivants :
1°) une absence ou une altération des structures réceptrices à. la surface de
l'érythrocyte rend celui-ci non infestable par Plasmodium "falciparum.
2°) des structures
solubles
analogues
du
récepteur
peuvent
entrer
en

---

82
compétition avec les -structures présentes à la surface de l'érythrocyte et
inhiber l'invasion par Plasmodium falciparum.
Nous
avons
montré
et confirmé que la glycophorine A, sialoglycoprotéine
majoritaire de l'érythrocyte humain, apparaît comme un des récepteurs principaux_
de Plasmodium falciparum, (PERKINS 1982, PASVOL et al. 1982, MILLER et al.
1977). Les autres glycophorines sont aussi impliquées (PASVOL et al., 1982), mais
c'est
la
glycophorine
A qui
est
la
mieux
connue sur
le
plan
structural
(FURTHMAYR et al. 1978). Nous souhaitions préciser quelle portion de la molécule
joue un rôle dans l'intéraction avec les mérozoites. Ceci présente un intérêt
évident dans la perspective de définition de la structure du récepteur lui-même
ainsi que la nature des molécules spécifiques- du mérozoite qui interviennent dans
cette interaction (préparation d'un vaccin). œ Plasmodium falcipar.um es't en effet
l'agent du paludisme le plus meurtrier par ses complications (accès pernicieux
palustre, paludisme viscéral évolutif, fièvre bilieuse hémoglobinurique. AMBROISE
-THOMAS 1984). Son 'traitement et sa prophylaxie- sont rendus difficiles par la
multiplication de souches résistantes aux antipaludéens usuels, (GENTILLINI et al.
1980, ONORI et al. 1982, PETERS W. 1982). E't la fabrication de vaccin efficace
est empêchée par la variation antigénique (Mc BRIDE et al. 1982, WILSON 1980,
HOMMEL et al. 1983). Pour toutes ces raisons, nous pensons que la connaissance
précise de la structure du récepteur pourrai't ouvrir d'autres perspectives en
matière de lutte contre ce fléau responsable de plus d'un million de décès par an.
Nous avons choisi deux stratégies différentes' mais complémentaires :-
- Tester l'infestabilité in vitro par Plasmodium falciparumdes hématies portan't
des variants rares des sialoglycoprotéines érythrocytaires.
- Tester des structures connues apparentées ou établies- à partir de celle de la
glycophorine- A.
Nous avons al'aide de ces deux méhtàdes d'approche essayé de répondre- aces deux
questions essentielles.:-
- Les structures glucidiques de la glycophorine A jouent-elles un rôle dans celle
du récepteur de Plasmodium falciparum ?
- Quelle portion protéique joue-t-elle le plus grand rôle dans la structure du
récepteur ?

---

83
ROLf. DES STRUCTURES GLUCIOIQUES
Nos expériences d'impaludation in vitro d'hématies Cad ont montré des résuitats
intéressants car les hématies Cad sont réfractaires à l'invasion in vitro par les
parasites. Or il se trouve que ces hématies sont caractérisées par la présence à leur
surface d'une
structure
antigénique
immunodominante
contenant
de
la
N-
acétylgalactosamine (GalNAc). Cette structure fait partie d'un pentasaccharide
défini par D. BLANCHARD et al. 1983 qui est présent à la fois sur la glycophorine
A et B des hématies Cad (CARTRON et al. 1982).
Nos résultats établis à l'aide de la technique à l'hypoxanthine tritiée confirment
que les hématies Cad sont réfractaires à l'infestation in vitro par le parasite
(CARTRON et al. 1983). Ces auteurs ont travaillé dans un système de culture
asynchrone en boîte de Pétri en adoptant comme seule méthode d'appréciation de
la croissance parasitaire le comptage microscopique de la parasitémie sur frottis
minces colorés au Giemsa.
Nos résultats suggèrent que la présence des structures Cad empêche l'invasion des
hématies par le parasite. Cependant, les expériences d'inhibition avec des sucres
simples ont bien montré que la GalNAc n'était pas un bon inhibiteur de lacroissance
in vitro de Plasmodium falciparum.
Comme la glycophorine purifiée à partir des hématies Cad n'inhibe pas l'invasion in
vitro des hématies normales par Plasmodium falciparum, il est logique de penser
que les structures de la surface du mérozoite sont incapables de reconnaître cette
glycophorine modifiée et par conséquent il n'y a pas d'inhibition de l'invasion des
cellules normales. Ces résultats plaident en faveur du rôle important de la
glycophorine normale en tant" que récepteur- spécifique du parasite.
Les. rés~ltats obse~vés avec 'les cellules' Tn d'une part et les glycoprotéines Tn
purifiées·d'autre part sont plus düficiles à interpréter. En effet, plusieurs équipes
ont montré que les "cellules Tn ~ont·pactiéilement résistantes in vitro à l'infestation
par- les mérozoïtes (PASVOL èt al~_ 198Z, CARTRON et" al.- 1983). De manière
surp~nantë cependant, la giycoprotéine Tn purifiée à partir' dès ~rythrocytes
inhibe l'infestation des hématies normales tout comme la glycophorine A non
modUiée. On sait que la glycophorine Tn comporte une altération de la structure
des chaînes O-glycosidiques due à un
déficit en j.1-i-3-galactosyltransférase
(CARTRON et al. 1978) conduisant à une diminution du contenu en acides siaUques
et en galactose. La structure Tn normalement cryptique (GaINAc-o-Ser) se trouve

---

ainsi exposée.
Comme la glycophorine Tn inhibe encore l'infestation in vitro (tout comme la
glycophorine A désialylée), cela signifie que cette molécule porte les motifs
indispensables à sa reconnaissance par les mérozoïtes. Il est donc possible qu'il
existe une hétérogénéité des récepteurs de Plasmodium falciparum.
Nous avons
testé une autre glycoprotéine (en fait un glycopeptide nommé
érythroglycane) importante de la membrane érythrocytaire qui est la bande 3. Le
tableau XVII montre que cette glycoprotéine ne fait pas partie de la structure du
récepteur. Nos résultats sont en contradiction avec ceux de OKOYE et al. 1985,
FRIEDMAN et al. 1985, ceux antérieurs de MILLER et al. 1977 ; BREUER et al.
1983. Nos conditions techniques sont différentes de celles de ces auteurs qui ont
utilsié des liposomes renfermant la bande 3.
ROLE DES ACIDES SIALIQUES
Parmi les structures glucidiques de la molécule de glycophorine A, nous savons que
l'acide sialique occupe une place importante, et c'est lui qui confère au globule
rouge sa charge négative. Les acides sialiques jouent-ils un rôle dans la structure
du récepteur?
Les résultats des expériences d'inhibition à l'aide d'oligosaccharides de structures
connues ne montrent pas une forte inhibition avec les oligosaccharides contenant
de l'acide sialique. En effet, N3Lac et N6Lac donnent respectivement 58% et 52%
d'inhibition. Mais il faut être prudent quant à l'interprétation de ces résultats, car
une seule expérience a été réalisée- à. cause- de- la quantité- limitée- de matériel.
disponibLe. Nous a~ons déjà signalé les controverses concernant le rôle:. de l'acide
sialiqu~ : certains auteurs trouvent .une forte inhibition de l'inv~on avec l'acide
sialique, pour d'autres l'inhibition ne dépasse g.uère 50% à la. concentra~on de 23
mM~ Nos résultats. rejoignent ceux de JUNGERY et al. 1983, et ceux de
VANDERBERG et al. 1985. BREUER' et al. 1983 n'observent que 13% dd'inhibition
avec 2 mg/ml de N3Lac... En présence d'acide sialique à 3 mg/ml, on observe 17%
d'inhibition de· ~invasion des érythrocytes par Plasmodium falciparum.
Afin d'étudier le rôle potentiel de l'acide sialique sous diverses présentations, nous
avons testé des glycoprotéines dont les structures oligosaccharidiques sont connues,

---

85
à savoir : la fetuine, l'orosomucoide, l'ovomucoide, la mucine de l'estomac. Il
apparaît que l'orosomucoide et l'ovomucoide possèdent des effets inhibiteurs à. peu
près
identiques
sur. la
croissance
parasitaire.
Or
l'orosomucoide
est
une
glycoprotéine riche en acide sialique, alors. que l'ovomucoide en est pauvre mais
contient des quantités importantes de GlcNAc en position normale. Ce résultat
indique que l'acide sialique en soi ne joue pas de rôle direct dans la structure du
récepteur. Nos résultats rejoignent donc ceux de BREUER et al. 1983. Cependant,
les controverses des différents auteurs et nos résultats avec N6Lac et N3Lac
suggèrent de nuancer l'interprétation concernant le rôle de l'acide sialique car
celui-ci pourrait peut-être jouer un rôle soit de par sa configuration spatiale qui
l'apparente à la N-acétylglucosamine, soit par un effet de "cluster" laccumulation
en amas des résidus NeuAc sur une glycoprotéine) entraînant en outre un effet
électrostatique
par
apparition
d'une
charge
locale
fortement
négative
(VANDERBERG et al. 1985).
L'invasion du globule rouge par Plasmodium falciparum est un processus se
déroulant en plusieurs étapes séquentielles commençant par une phase de fixation
non spécifique. Cette phase initiale serait due aux structures oligosaccharidiques
entre autres la GleNAc et l'acide sialique ; l'invasion cependant ne survient
qu'après la réorientation et l'apposition de l'extrémité apicale du parasite sur la
membrane érythrocytaire consécutive sans doute à une reconnaissance spécifique
d'un récepteur. La spécifIcité de cette étape pourrait être liée à une séquence
peptidique particulière du récepteur.
Au total, nous pensons que l'acide sialique n'est pas impliqué directement dans la
structure du récepteur et qu'il n'intervient" pas dans la phase de fixation spécifique.
D'ailleurs nous n'avons pas trouvé de différence significative entre l'effet inhibiteur
de la glycophorine A normale et de la glycophorine A désialylée, comme d'ailleurs
avec la g~ycophorineTn qui elle aussi est pauvre en acides sialiques.
ROLE DE LA N-ACETYLGLUCOSAMINE
La GleNAc est un sucre qui entre dans la composition de nombreuses chaînes
oligosaccharidiques des. glycoprotéines, en particulier de la glycophorine A.
Plusieurs auteurs ont testé ce sucre dans des systèmes d'inhibition de· la croissance
in vitro de Plasmodium falciparum, (JUNGERY et al. 1983, PASVOL et al. 1983,

---

86
HERMENnN et al. 1985, BREUER et al. 1983, etc•••).
Nos résultats sont concordants avec ceux des différentes équipes et indiquent que
la GleNAc est le "meilleur inhibiteur" parmi tous les sucres testés. (Tableaux X, XI~
Fig. 8 et 9). La plupart des auteurs pensent cependant" que la GleNAc est toxique
pour le parasite ; BREUER et al. (1983) ont montré qu'il bloque l'incorporation
d'3H-isoleucine, c'est-à-dire qu'il inhibe la synthèse protéique. Selon JUNGER y et
al. (1983), il est toxique pour les formes matures du parasite qui rendent" la
membrane érythrocytaire perméable à plusieurs types de petites molécules comme
les sucres tels que GleNAc. Cependant, ces auteurs pensent que la ~eilleure façon
de tester l'effet toxique du sucre serait de l'incuber avec les stades mérozoïtes du
parasite et ensuite tester l'infestabilité des hématies par ces mêmes mérozoïtes.
Le problème que cela pose est la très grande difficulté d'obtenir des mérozoïtes
viables purifiés en quantité suffisante. Nous avons contourné cette difficulté par
l'observation microscopique au cours du temps des parasites incubés en présence de
ce sucre et nous avons constat~ un blocage de maturation des schizontes. Nous
avons également testé l'effet de GleNAc sur différentes stades évolutifs du
parasite et montré la superposition probable d'un phénomène de toxicité et
d'inhibition compétitive.
L'ovo~ucoïde qui possède une quantité importante de GleNAc en position terminale
n'est pratiquement pas inhibiteur. Par ailleurs, HERMENTIN et al. 1984- observent
que les oligosaccharides de la glycophorine A liés par des liaisons O-glycosidiques à
la charpente protéique sont" inhibiteurs de l'invasion en particulier : Gal~ 1-3 Gal
NAc-.
La structure GleNAc /3 "1-4- GleNAc (chitobiose) semble également être
inhibitrice.
Cet ensemble de résultats suggère que GleNAc n'agit pas seulement par effet
toxique. Certains auteurs comme VANDERBERG et" al.. (1985) ~uggèrent" que la
GleNAc intervient dans la structure du récepteur en association avec la NeuAc
(acide sialique) en formant un "cluster". Cette idée peut" être retenue quand on
admet" que cet" ensemble de structures oligosaccharidiques ou de "cluster"
oligosaccharidiques n'intervient" que dans la phase de- reconnaissance et" de fixation
non spécifique du mérozoïte.
On peut" en définitive penser que les structures oligosaccharidiques jouent un rôle
dans la formation du récepteur érythrocytaire de Plasmodium falciparum, mais à
l'heure actuelle l'on ignoore la configuration spatiale des oligosaccharides sur les
molécules natives.

---

87
ROLE DE L'EXTREMITE. NH2-TERMINALE DE LA MOLECULE DE GL YCOPHORINE A
Plasmodium falciparum ne fait pas de différence entre les hématies dont les
glycophorines A portent des spécificités de groupe sanguin M, N, ou Mg (CARTRON
et al. 1983) En effet, l'infestabilité des hématies MN, NN, MN, MgMg in vitro est
normale. M, N, Mg sont des antigènes de groupe sanguin appartenant au système
MNSs dont la spécificité est liée à la séquence en acides aminés de la glycophorine
(FURTHMA YR et al. 1978) ; M, N, Mg correspondent à un polymorphisme dans la
région des 5 premiers acides aminés de la glycophorine A. Par conséquent, il est
probable que l'extrémité NH2 terminale de cette glycoprotéine ne comporte pas un
motif essentiel dans la structure du récepteur.
ROLE
DE
LA
PARTIE
TRYPSINE
RESISTANTE
DE
LA
MOLECULE
DE
GLYCOPHORINE A - CONTRIBUTION DE L'ANTIGENE Wrb
L'antigène Wrb est un antigène présent à la surface de la plupart des hématies
humaines. Il a été récemment suggéré que l'antigène Wrb est porté par la molécule
de glycophorine A (RIDGWELL 1983) entre les résidus d'acides aminés 55 et 70.
DAHR et al. 1983 précisent que cet antigène pourrait être localisé- entre les résidus
62 et 72.
Les hématies des sujets de phénotype Wr (a+ b-) sont déficientes en antigène Wrb•
C'est pourquoi nous avons testé leur infestabilité in vitro par Plasmodium
falciparum pour déterminer si cet antigène- est nécessaire- dans la structure du
récepteur du parasite.
Contrairement à des travaux préliminaires (PASVOL et' al.. 1.982), nous constatons
que les hématies Wr(a+b-) sont bien infestables par- Plasmodium falciparum in vitro
(CARTRON etal. 1984). Nos résultats sont en accord avec:cetJX;de HERMENTIN et
al. 1984. Nous en déduisons que là; zone- Wrb de la molécule de glycophorine A ne
fait pas partie du récepteur é-rythrocytaire de Plasmoèüurrdalciparum.
Les expériences d'impaludation d'hématies porteuses de variants des portions
protéiques de la molécule de glycophorine A suggèrent donc que ni l'extrémité NH2
-terminale, ni la séquence des résidus 62 à 72 ~'appartiennent à la' structure du
récepteur. Il convient' de remarquer cependant que l'antigène Wrb n'a pas été
formellement localisé sur la glycophorine A. Dans l'état actuel des connaissances,
-

---

88
l'analyse structurale de la glycophorine A extraite des membranes d'un sujet
Wrta+b-) chez· lequel l'antigène Wrb est absent, n'indique aucune altération de
séquence de la glycophorine A entre les résidus 64 et 68 (HERMENTIN et al. 1983).
Cependant, aucune donnée de séquence nlest disponible dans la région 69 -72.
Par ailleurs, si nous considérons le pouvoir inhibiteur des peptides de synthèse, nous
constatons que le meilleur inhibiteur correspond à la partie N-terminale du
fragment T6 (obtenu par hydrolyse trypsique de la glycophorine A, séquence 65 a
69), c'est-a-dire a une séquence ne comprenant pas la région hydrophobe du peptide
T6. De plus, ce peptide est localisé a l'extérieur de la membrane, dans la zone
plausible de fixation du parasite. T6 englobe la zone présumée de l'antigène Wr b•
Nous pensons donc que la zone Wrb serait proche ou contiguë au récepteur. Cet
argument est fortement appuyé par le fait que les anticorps monoclonaux anti Wrb
n'inhibent pas la croissance in vitro du parasite (HERMENTIN et al.
1983)
contrairement aux résultats antérieurs de PASVOL et al. (1982)
Schéma n°
11 (Fragments trypsiques de la glycophorine A selon TOMITA et
MARCHESn
20
40
60·
80
100
120
131
i
i
i
il
CHYMOTRYPSIN
CHl
CH6
CH4
1 CHsl
CHZ
1
CH3
TRYPSIN
1
1
TI
T3
T6
Ir)
T4
1
TZ
1Tsi
1 dT1 Tl IdTlnlt1TS'
~1d
1
T1Cl
<GLYCQSYLATED.
NH~~""""'rTi---l-~-l.-..L-J,.~------------COOH
OUTSIOE

---

89
ROLE DES PEPTIDES DE SYNTHESE
Les études d'inhibition à l'aide de glycopeptides trypsiques. indiquent que la portion
protéique de la molécule de glycophorine A potentiellement impliquée dans la
structure du récepteur n'est pas définie avec précision. C'est pourquoi nous avons
choisi
l'utilisation
de
peptides synthétiques
déduits
de
la
séquence
de
la
glycophorine A pour localiser plus précisément la région susceptible d'entrer dans
la structure du récepteur. A notre connaissance, de telles. structures n'ont jusqu'ici
jamais été utilisées pour définir le récepteur de Plasmodium falciparum.
Nous avons observé qu'il existe des peptides très inhibiteurs et des peptides peu
inhibiteurs. Il est intéressant de remarquer que les pentapeptides situés de part et
d'autre de la séquence 65-69 sont les moins inhibiteurs. Il est encore plus
intéressant de remarquer que parmi les polypeptides utilisés (Fig. 13), l'un d'entre
eux qui correspond à la séquence 65-69 de la glycophorine A s'individualise par son
fort effet inhibiteur. Nous constatons que cette séquence comprend la zone dévolue
à l'antigène Wrb (62 à 72). Nous rejoignons l'idée que le récepteur se trouve proche
ou contigu à la zone Wrb ; ce résultat montre en fait qu'il pourrait correspondre à
une partie mais non à la totalité de la séquence présumée Wrb•
Il es~ important de signaler que le peptide 65-69 qui est inclus dans le fragment
trypsique T6 de la glycophorine A Ne comporte pas la région hydrophobe de ce
dernier et conserve cependant un excellent pouvoir inhibiteur. Divers travaux
récents. (BREUER et al., 1985 ; HERMENTIN et al.. 1986) montrent en effet que de
nombreux. groupements hydrophobes présentent une toxicité importante dans les
tests d'invasion in vitro et peuvent entraîner des résultats erronés d'interprétation
sur le rôle inhibiteur des structures considérées.
Le polypeptide le plus inhibiteur (65 -69) porte dans sa séquence. deux histidines
adjacentes, ce qui donne à la molécule une ch~ge nette. positive mais l'effet
inhibiteur de ce polypeptide 65 - 69 ne semble pas lié à un effet électrostatique car
il n'y a aucune différence entre la glycophorine. native et la g1ycophorine modifiée
sur les. histidines au. niveau. de leur effet inhibiteur de. la croissance. parasitaire.
Cependant, il convient de signaler que la stabilité du produit obtenu après
modification des résidus histidines n'est pas très bonne.
Nous avons déjà argumenté plus haut le fait que l'effet de charge apporté par les
histidines n'explique pas. le résultat obtenu. avec le peptide 65-69 ; en effet, le
peptide Mill contenant une séquence Lys-His-Lys fortement chargée n'est pas

---

90
,"
inhibiteur. Il en est de même pour le peptide ss caractéristique de la séquence 26-
33 de la glycophorine B.
Lorsque nous avons comparé l'effet inhibiteur de la glycophorine A à celui de la
glycophorine B, nous avons constaté que la glycophorine B est un :neil1eur
inhibiteur, bien qu'un tel résultat ne soit pas retrouvé par d'autres (VANDERBERG
et al, 1985) peu-être à cause d'une différence de préparation des glycoprotéines.
Cependant, la comparaison des séquences des deux glycophorines A et B montre
qu'il existe dans la région extramembranaire de la glycophorîne B une- portion de
structure analogue par sa séquence et sa charge au pentapeptide 65-69 de la
glycophorîne A. Cette région se situe entre les résidus 32 et 37 de la glycophorine
B dont" la séquence en acides aminés est: Leu-Val-His-Arg-Phe-Thr. (La séquence
du peptide 65-69 est :
Leu-Ala-His-His-Phe-Ser).
Dans
la
séquence
de
la
glycophorine A, le peptide 65-69 est" relié à un acide glutamique- qui par sa charge
négative pourrait atténuer la charge nette dans la région 65-69. Au contraire, dans
la séquence de la glycophorine B le peptide analogue (32-37) nlest pas relié à un
acide aminé chargé.
y. -
, -
-,'
Au total, nos résultats montrent que les glycophorinesérythrocy'taires représentent
,~.
sans doute les principaux récepteurs de Plasmodium falciparum. Il existe dans leur
séquence protéique une zone limitée entrant dans la structure du récepteur. Cette
zone limitée renferme des acides aminés basiques conférant une charge positive-
plus importante à cette portion de' la molécule. Pour ce qui concerne la
..;.
glycophorine A, c'est la zone correspondant au pentapeptide 65-69 qui constitue
l'élément essentiel. Quant à la glycophorine B ce- serait" la zone- correspondant au
pentapeptide 32-37~
Aucune séquence analogue n'est identifiable dans la séquence primaire de la
t_ glycophorine C, ce-- qui suggère qu'il niexiste peut-être pas- une structure unique
responsable de la fixation spécifique du parasite~
~
~. Le rôle des structures oligosaccharidiques est incontestable; mais celui de l'acide
I~-·:·-- sialiqueselimiterait"àlafixationnonspécifiquedumérozoitesurIeglobulerouge.
"
;;,;
Oans l'avenir, ce travail pourrait être poursuivi en étudiant le pouvoir inhibiteur
~:~.
d'un peptide de synthèse représentant un oligomère de la séquence 65-69 afin de
déterminer si la répétition de l'épitope entraîne une augmentation du pouvoir
inhibiteur. L'accroissement de la taille de l'inhibiteur éviterait également tout
effet" toxique sur la croissance parasitaire
puisqu'une telle molécule serait
~.. -
...-

---

91
incapable de pénétrer dans la cellule. Enfin ce polymère pourrait être insolubilisé
et utilisé pour isoler et caractériser les structures moléculaires de la surface du
parasite qui entrent en interaction avec la surface du globule rouge. Une meilleure
connaissance de ces molécules est en effet indispensable pour la préparation de
vaccin à usage prophylactique.

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RESUME
Après avoir mis au point une microtechnique de culture
in
vitro
de
plasmodium falcipariJm,
et défini
les conditions
optimales des différents pcrc!m~tres liés à cette technique, nous
stru cI} f-:: d,.' ,- ~,"
'.
_n
des
héma~ie s
de
,l/cln. essayé d'inhiber
,.
L'e-
p, [cie iparum dans des
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substances
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ou syn1hétiques
Mors ClES
Plasmodium falciparum,
Récepteur é,y~hrocytaire,
Inhibition de l'Invasion
r-----
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