.
-'~1.' ,.
(."~,, ..,.
,
,
"l
•
"
'-
THE S E
présentée
pour l'obtention du
titre de
DOCTEUR DE 3ËME CVCLE
",
EN CHIMIE .
ETUDE CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE D'UN COMPOSË FORTEMENT MUTAGËNE
APPARENTÉ AUX PRODUITS DE PYROLYSE DE PROTÉINES:
L' PJ-1I NO-3 [·iéTHYL-LI DI PyrUDO [1,2-A: 3: 2' -D] UlI D,l\\ZOLE
MN.
l'f.H.
DURAND
Président
J.F.
DUPIN
1
F.
PONCELET
' .
Exacinateurs
G..
SAINT-RUF
'1
1 :
.;

---

Ce mémoire a été réalisé au Centre de Biophysique Moléculaire à
Orléans •
.Que le Professeur c. Hélène~ Directeur de ce centre trouve ici
l'expression de ma profonde recdnnaissœwe.
Je sa-z,s gré à M. ~e Proofesseur M. H. Durand d'avoir accepté la "
présidence du jury.
Je remercie vivement M. le Professeur J. F. Dupin d'avoir bien
voulu examiner ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement M. F. Poncelet, Profes-
, seur à l'Université Catholique de Louvain; une fructueuse coZlaboration
avec son laboratoire nous a permis de déve lopper not2~e ét:-<de ~ notŒ"J77ent sur
le plan de la mutagénèse chimique.
Je suis heureuse d'exprimer toute ma reconr~issance à M. G. Saint-Ruf~
Responsable du gr~upe de cancérogénèse chimique qui a guidé not'l'e travail avec
constance et sollicitude.
-.
Que mes collègues de laboratoire et toutes celles et tous ceux qui
m'ont toujours encouragée et aidée soient assurés de ma grati~ude.
/
--~

---

Etude chimique et biochimique d'un composé fortement mutagène
apparenté aux produits de pyrolyse de protélnes
l'amino -
3
méthyl -
4 d.ipyrido
C1, 2· - a
3 'J 2' - dJ imidazole

---

TABLES DES MA1I~F~S
Page
.3
Introduction
l
La canc~rog~~~se chimique
II
Les produit~ de pyrolyse
III
But et Motivation de notre ~tude
Première partie
Synthèse et Propri~t~s physico-chimiques
22
de l'amino -
3 m~thyl - 4 dipyrido
(1,2 - a : 3',2' - dJ imidazole et de ses
pr~curseurs
Introduction
l
Pr~paration du pr~curseur - ·Prcpri~t~s
physico-chimiques
II
Synthèse de l'hét~rocycle m~thyl - 4 ~
dip~Trido .(1,2 - a : 3 ~ 2' - d) imidazole
III
N{tratio~ de l'h~t~rocycle
IV
Passage à l'amine
V
Synthèse de glu
P -
2
VI
Conclusions
Etude des propri~t~s mutagènes des amines
43
Troisième partie
Etude des effets biochimiques de l'amino -.3
51
m~ thy l - 4 di pyr id 0
(1, 2 - a : 3 ~ 2' - dJ
imidazole .et de s~s d~riv~s sur 'le système
oxydase à fonction mixte et le cytochrorr.e
P - 450 chez le rat
Quatrième parti~
Action de l'amine et de ses m6tabolites in
61
Yi tro sur l'ADN.
Conclusion générale
68

---

3
INTRODT:C~ICN
1- Le~Kent~_2....aES.§!QE;h"es
Parmi le~ cali~es du Can~€r chez l'homme; les facteurs de l'en-
vironnerr ent ont, un gI'E.ncl rôle. Ces facteurs ~OlJt l'es radiat.ions
(soleil, radioactivité,' rayons X), les virus et surtout le~ Froduits
chimiques.
Rappelcns que la Irerr.ièrE: mise en €vic:.er.ce
du rôle cE.rJ;~rorène
d'une substance pr6sente dans notre environLeme~t a ~té effectu~e
Far L'TI méclecin anglai.s Sir PERCliiAL POTT' en 1775. Il a remarqué une
fréquEnce anormalement élevée de ca,ncers de scrû-tum chez les jeunes
ramoneurs en contact perw.ar-ent avec la suie.
Un siècle après, une relation causa,le fut suggérée entre les
nombreux carcers de la peau qui apparaissent chez les ouvri~rs gou-
droDceurs et les substances chiffiiques contenues dans le gcudro~ de
houille, nota.:nmEnt par les Ja::,Jonais YANAGlwA et ICHIKAWA qui .purent
induire des t.umeurs dans les oreilles de lapir:: en lés·badigeonnant
avec le goudron de houille (1). L~ p~riode suivan~fut d~minée lar-
gement par l'étude de 1& chimie d~s hydrocarbures polycycliques
cancérogènes ; durant cette péricde Ernest KEKNAWAY et al (1,) iden-
iifièrent le premier ~ancérogène chimique pur le dibenz (a, h)
anthracène. Ils isolèrent et identifi~rent un cancércg~ne potentiel
le benzo (a) pyrène du goudro~ de houilleo
Plus tard on trol:.va, que certaines amiL(!S étaient caflcérogènes
puis vinrent les CO~FOS~S aliphatiques de diff~rents genres chimi-
ques·; les J3 - propiC'lactones, If!~" sels inol'gani,<;,ul"S comme les
chrorr:.a.tes de calcit.'m, les métaux (nic1{el, cobal t) et plus rÉcemmer:t
t:ne série de pr.cduits nature~~ d'o!'iriDe animale oL', végétalE' exem-
pIe: les alcaloYdes de la pyrrolizidine, l'aflatoxine D1, le sa-
frole,
la cycasine et la ~ytomicire C (1).

---

4
Durant ces deux Ei~cles on a ideciifié un grand nombre de com-
posés capables d'induire des cancers chez l'ho~ne exposé aQX produits
de l'industrie cl:imique
(colorants,. matières plastiGues, dériyés du
p~trole, l'industrie de. l'amiante, du nickel et du ctrcme).
Outre l'industrie chimique,
certains él~ments de notre mode de
vie,
certaines habitudes soci~les (tabagisme, alcoolisme), alimen-
taires
(additifs .alimentaires,
colorants,
excès de corFs gras, mode
de cuisson des al~ments) etcosώtiques sont potentiellement capatles
d'induire des cancers crez i.'lomme.
Parall~lemeDt k ce travail de collections des données et d'ec-
qu~tes épidémiologiques poursuivi encore afin d'ir-di<juer les molé-
cules qui semblent avoir une action cancérog~rie pa.rmi· celles aux-
quelles nous SOlf.mes exposés,
les efforts des che.r~heurs sont axés
'dans la ccmpréhension du mécanisme d'action de ces produitb chimi-
ques.
2- Propri été~_ d eS-Si!n cé.!'og~!1~~_ç!J_tmiqucs
La grande ma.jorité des ca.ncérogènes ?himiques sont des composés
organiques avec un poids moléculaire relativement faible inférieur
à 500. Ces substances organiques sont g~néralement liposolubles et
pauvrement tydrcsolubles k part quel~ues exceptions. Ces produits
chimiçues app~rtiennent ~ des familles 'chimiques très différentes
ce sont aussi bien des produits synthétiques que des prod~its nat~~
reIs ..
La plupart de ces compQsés ne ~nt pa.s actifs directement.• Dans
-
l'organisme et pa.rfois m~me au niveau de la cellule ils sont m~ta-
bolisés par de's enzymes ;
les métaboli tes formés sont soi t
inactifs
et ils sont éliminés par voie biliaire ou urinaire
:
le rrétabolisme
joue daris ce cas un rGle'd6toxif~cateur, soit a.ctifs,
ce sont alors
des canc~rogÈnes ultimes ~lectrophiles à vie brève capables d.e réagir
avec de nor.rbreuses molécules nucléophiles de la cellule: ADN, ARN,
prctéines. En gros l'acti"V"ité cancérogène d'un procluit àans un tissu
donné varie selon que les enzymes de ce tissu transforment ce pro-
duit en r.J.é-Labolit€'s
actifs ou. inactifs et ces enzymes ,varient d'un
tissU à'l'autre, d'où la notion d'organe-cible.

---

5
3- Nute,génèse et_ Cancé!:.2.Ei.n~s.Q
Il a été démon1.:.ré re_r diverSES techniqu€s
nota,lJ'ment 'par la mi-
croscopie électronique que les agents cancérogènes se fixent sur
l'ADK (2)
et d~avtres ms_cromoléct:les cellulaires. Ces agents y pro-
voq~ent des modific&tions structurales.
En 1917 T. BO\\~RI (1) suggère que la cancérogénèse .est une con-
séquence de la rre.tatior. somatique de la r:oà:j""jcation è.e '1 'ADN.
OrL
sait que la mutation somatique affecte les cellules dè l'organisme
et non les cell~lEs Eexuelles. L'une des propri~t~s du tissu canc~­
rélix étant une division incontrôlée des cellules on cOITprend qu'une
mutation affecta~t 1& ou les g~nes qui contrôlent la division cel-
lulaire puisse ~tre décisive pour l'avenir des cellules de l'orga-
nisme.
La mutation apparaît donc saui' rares exceptions ccr.lme inùispen-
sable à l'apparition et au dévelcpperr.ent d'un cancer. Il y a trois
remarques destinées à me-t.ire à l ' érreuve la thèse sel~n laquelle
certains év~nements primai~es à l'appariti~n ~'un cancer sont des
mutations
:
1) Dans la plupart des cas toutes les cellules d'une tumeur ont une
crigine commune soi tune se.ule cellule de d.épart dont le tlatériel
généti~ue a été modifié
2) Dans le cas de Xéroderma rigment~e les individus atteints sont
sujets à des cancers cutanés induits par la lumière faute de pcuvoir
.
réparer les dOIT.mages causés par It~K par les rayons ultraviolets. On
a pu déœontrer chez l'homme que la persistance"des lésions induites
sur l t ADK cellulaire paI' l'exposition au soleil est directerr.ent res'-
ponsable du développerr.ent de cancers
j) La majorité des cancérogènes provoquent des mutations chez les
bactéries.
L'excellente corrélation (plus de 90 7~) entre le pouvoir muta-
g~ne chez les bactéries et le pouvoir cancércg~ne chez l'animal ou
chez Ilhomme pour I,lusde 300 produits chimiques pE·rmet de concevoir
des tests rapides de mutagénicite parmi lesquels celui d'Ames
(3/.
La méthode consiste b examiner le pouvçir mutagène d'un produ~t su~
l es bactéries après métabolisation par une pr(~rarat,ion Ir.icrcsomaJ.e
de foie de rat.

---

.,
6
On utilise une sôuche 'de bactérie Salmonella Thypllimur~um qui
porte unc mutation his- c'est à ~ire cette ~~ctérie Est incapable
de se multiplier sur un milieu de culture ne cor-tenant paE l'histidine •
alors qu'une bactérie norma.1 e ou sa.uvage 1'.is+ est cE.pable de synthé-
tiser de l 'histidine à .parti.r des éléments contenus dans le milieu.
On déclenche dans le r.1ilieu une série de mutéi.tior... s qui tr8.n~forrLent
his- en his+. Après on quantifie la fréquence de ces reversions en
fOIlciion de la dc~€ du produit mu~.agf·ne testé en àér.o:::bi~ant le nombre
de bactéries revertantes. Cette technique est actuellement largement
utilisée pour définir la mutagénicité de nombreux produitso
4- Activation métabolique
Certains composés cancérogènes notarr~ent ceux de la classe des
amines et amides aromatiques in,duisent systématiquement des twneurs
dans les
organes comme le fQie e~ la vessie quelque soit la ·façon
dor.t ces corrrosés sont administrés ~ l'animal (voie orale, inj ection
intraveineuse ou' intrapéritonéale)
cette observation suggère que
ces composés sont modifiés ,dans ces organe~ avant de se fixer sur
l'ADK. C'est l'activation métabolique.
MILLER et al
(4)
ont introduit le c~ncept général selon lequel
le prcdui i· r8sul tant de l ' a,ct'i va tion métabolique d'un CRollC érogène
(métaboli te ul time o~ canc érogène ultime) étai.t Ull proQui t fort emen t
~lectrophile c'est à dire une molécule ayant des atome~ relativement
déficiBr.ts en ilectrons
; ces atomes sont capables de réagi~ avec les'
sites nucléophiles c'est à dire des atomes riches en électrons en
général des atomes d'azo-Le et d'ox~-g~ne qui sont présents dans l'ADKo
Un composé cancérogène donné se trouve en général converti par ac-
tivation métabolique en un ou plusieurs métabolites ultimes électrci-
philes.
A ;l'exception de certains cancérogènes alkylants ou acylants,
pratiquerr.ent tous les cancérogènes actuellement étudiés sont métabo-
lisés pour donner un dérivé électrophile. Ce sont donc des précancé-
rogènes qui doivent être convertis en cancérogènes ultimeE. Ces con-
versions sont habituellement catalysées per des enzymes et 'doivent
inclure la formation de un ou plusieurs m~taboli{es interm€diair~s ou
,
.
cancérogÈr.es proxinla't:x. La figure 1 montre u.n exemple de 'conversion
en métabolites d'une amine canc:érogène l'ac€tylaminofluorène
(5). Ce
schéma est valable pour toutes les amires aromatique~ d'u~e façon
générale.

---

'
,
,
Canc~rog~n~s ultimes possibles
Precancerogen.e
Cancérogène proximal
+ ..,-:AC
N 1
)lOS03
'ç~~~
1
0)(
~~- .
~v-~
+e.
NAOPH+Û2
AC'f' t""'''~ l~ (~)
-~
.....
•
ll.v.fli. EA ( P-li5 o)
>
+ ..........H
N
N
~_
1
N ""AC
N -AC
AC(H)
)f.OAC
"
"'OH
'H
·;JM);«dJa.~(d)
+ H-t,0,t,
1
+",-AC
N
/
')(,.OAC
~
/
N-AC
'O·
N+O-.
fig 1 l'activ~tion métabolique de 2 acétylaminofluor~ne

---

8
Pour les agents alkilants or~ dl.stingue deux classes : ceux qui
nécessitent une activaiicn m(,taboliquc et ceux qui IlE.: nécessitent
pas ~'activatlono Les agents rilkylants ou acylartS qui ne nécessitent
paf' d ' activation rnétaboliqu-e sont considérés commE Des entités défi-
cientes en éleotrons. Ils ~éagissent spontanément avec les sites nu-
cléopbiles des protéines et d'acides nucléiques en tran~formRnt ces
constituants en dérivés substitués rendus le plus souvent inaptes
~ remplir le~r"f~ncticn. La figure 2 moLtre quelques compos~s de
cette catégorieo
Les agents al~ylants
o
.l- ~
a.lkyl méthane sulfcnates
R!. 0-S-CH3
": ~
,
0
B propiolactones +_?I~- T~
o _C~
""0
Les agep-}s acylants
chlorurE. de dimé"thyl carbamyle
CH3......
+' ... 0
N -CJ
-
CI
CH-J"
"
-==\\- , + 0
N acétyl imidazole
1
f'1+C~H3
N.:=/-.. ,
"Ou alors ils se comportent comrlle les alkylni ircsamides et les
alkylnitrqsimides
(5) qui nécessitent seulement une réaction avec
certains nucléophiles comme l'e&u,
les thiols,
les groupes amines
pour ~tre convertis en esp~;e électrophile qui introduit un groupe
alkyle dans la macro~olécule (fig 3).

---

9
[ CH 3+ Jt N2"
i
N methyl nitrosourée MNU
..-
CH3 N2 OH
a
I l
CH3_t;J-C-N~
>
NO
r
?
N methyl N nitro N nit.rosoguanidine NNNG
CH3 -N-NO
H
. t'tH
R_SH
CH3-~-C- N-N~
NO
~
fig 3
Les autres agents alkylants nécessitent une tran~rmation en-
zymatique avant de réagir avec l'ADN. Dans cette catégorie on retrou-
ve les dialkylnitrosamines et. les d.ialkylaryltriazènes (fig 4) dont
l' acti vi té cancérogÈme dépend de la d.éalk;ylation cn zymatique oxyda-
tive en intermédiaire qui se décompose spontanément en" agents alky-
lants.
Dimethyl nitrosamine
Y
<CH3l:/_N_NO
enZ <T1e> [ CH3 _~_NO -"C~N20HJ _[CH;] +N2
Dimet.hyl 3,3 phenyltriazène
R". N =N -CH3 en'%. yme
R
N _ N
N - C H3
.
H +"
"
"
'cH3
[0)
~ -
-
-
'H
--~)R_~_N::N_Cfi:3 ~R_NH2'tN2"..-cH+
~ "
3
avec
R: @
fig 4
Les préca.ncércgènes de structure variée sont co:r:.vertis in Yi~
pn réacti"fs électrophi les 'par un !lom bre vari éd' enzymes, beau coup
de ces réactions sont de naiure oxydative et se produisent d'abord
dans le réticulum endoFlasmique qui est le sit,e principal du métabo-
lisme d'une grande v~riété de molécules étrang~res liposolubles.

---

10
Comme enz;ymeso~ y trouve les cytochrorr:es P 450 oxydases, les épo-
xydes hydrases et les flavoprotéines amines oxydases,
le yrincipal
étant le cytochrome P 450 qui oxyde une grande variét.é de molécules.
Un exemple d'une réactipn d'oxydation enz)~atique dans le réticulum
endcplasmique est le passage de l'acétylamine à l'acétylhydroxylamine
ceci grlce h une rrol~cule d'oxyg~De qui se fend pour former un atome
è.'oxygè-ne fortement électrophile et qui attaClue l'acétylamine pour
donner son homologue N hydroxyle.
Il y a donc forrr.ation des· cancé-
rogènes proximaux.qui évoluent soit en métabolites inactifs soit en
métabolites actifs ou cancircgènes ultimes. Ces can~érogènes ultimes
très toxiqu~s peuvent tuer la cellule o~ se fixer électiverr:ent sur
les ncyaux des cellules cibles et y provoquer une._f.1Q.çl.~ficaticn de la
/.-~".,...- '
structure de l'ADN.
, ,.'
.. /:_\\-
i
:
Dans les acides nuclérques la guanine eist La;. ~'a·e-'è Îa .plus nu-
2.
o .
" ' . ' /
cléophile et elle est attaquée aux atomes N ... 3 , N - 7, ~;, 06 et
C -
8
; l'adénine est attaquée' avx atomes N - .1, N ... 3:{t: N' - 7 ; la
2
4
cytosine N -
3 et la thymine 0
et 0
(5). La figure-'5 nous montre
les sites attaqués dans l'ADN.
CH3
~
~5~o'" H
6
4
'
/ '
T
N
N1
3N........
•
N~
sucré' "-Y
H.... N /""6
1/
~~1A 1
...;Jo
. / .
2
4
:>
/ '
~3
N
N
./"
1
sucre
fig 5 Les sites de fixation des cancérogènes dans l'ADN
Dans les protéines les atomes de soufre de la méthionine et de
la cystéïne)les az?tes du cycle histidine et les deux positions de
la tyrosine sont les atomes nucléophiles substitués par les résidus
car:cércgènes. l'e degré avec] equel les f,i tes nùcléophiles sont at.ta-
qués in' 'y_~.Y.2. vari e beaucoup et dépend des facteurs él e ctrcnique s et.
stériques.

---

11
5- ~écaEi~!TI~.9l'sible de la ca;!Jcérügénèse chimique
Il existe deux mécanismes plausibles par lesquels les composés
cancé~og~nes conduisent ~ mod~fier le cassage gén~tique (2)
a) Les_muj:,.?-tis·ns d~_re.d'~
Dans les cellules l'ADK est le support de l'information géné-
tique. On sait qu'au cours du renouvellement des ~issus de r..ouvelles
cellules se forment par d.ivision des cellules souches : une molécule
m~re d'ADN donne deux nouvelles molécules filles d'ADK cort.enant
strictement la même information génétique c'est la réplication. Cette
infQr~ation gén~t.ique est donn~e par l'ordre dars lequel sont en-
chainés les nucléotides le long de l'ADN.
Dans les mutations directes la modification chimique d'une base
d'ADN perturbe l'information génétique de la cellule conduisant ainsi
à une lecture erronée de l'ADK iors de sa réplication. Aussi dans
les nouvelles molécules filles d'ADK qui se forment la base modifiée
va diriger l'incorporation d'une base autre que celle qui était nor-
malement autorisée.
·Exemple
: Normalerr.ent la cytosine est incorporée
en face de la guanine ; la fr éthyla tion de l ' a- .
6
tome 0
de la guanine favorise l'existence d'u~e
forme chimique alternative dite tautorn~re de la
guanine en face de laquelle pourra être appariée
une thymine au lieu d'une cytosine
(6).
Il Y a donc changement fonctuel du message g6n~tique sur le brin
naissant puisque la cytosine est remplacée Far la thymine. Cela peut
expliquer' la Illutagén~se directe induite par l'alkylation d'une base
6
d'ADN précisément la méthylation en' 0
de la guanine. Il a été mon-
tré récemment qu'il existait une corrélation entre la persistance du
dérivé méthylé de, la .guanine dans le cerveau de rat et l'induction
de tumeurs spéci fiquelf,en t
dans c et organe. La prés enc e des dérivés
6
méthylés en 0
de 'la guanine semble être à l'origine de la rr:~tagé­
n~se et de la cancérogénèse. Cette alkylation provoque une lésion
.
,
informative qui cr..ange le sens du message génétique. Les autres bases
de l'ADN Adenine, 'Thymine,. Cytosine sont aussi des cibles de nombreux
cancérogènes
(7).

---

12
b) LeL mut.a tions indirectes
Dans celles ci la modification chimique n'es~ qu'un. ~v~nemcnt
préa1"able à la mutation. Ce type de mutations a surtout été €tudié
chez les bactéries dans le cas des lésions de l'ADN provo(f.uées pa,r
les rayor~s ultravio lets. Cette lés ion ne moc}:;. fi e pë,~; le mE s sage gé-
nétique c'est une l~siûn non informative. Elle peut @~rE d~e à la
forma.ti on d'un climÈ' re en. tre deux thyr.:.ine s adj ace:r: ts sur la chaîne
d'AD:J : les deux- thymines se retrouvent anorm2.lerr:ent liées. Cette
lésion proyù(f.ue l-e blocage de la ré:çlication et il.y aurait. arrêt
de la division cellulaire s'il n'existait dans la plupart descel~
Iules (chez' la bactérie et ctez l'hom::nE;1) :un m8car-isrne de réFaratior..
de ces lésions grâce à des enzymes qui extir:çent. la zone défectueuse
de l'ADN et restaurent le ~essage g~nétique.avant qu~ la réplication
.ait lieu. Si ce mécanisme ne fonctionne pas il y a un deuxième sys-
tème de sauvetage qui se met en route (8)0 Ce système baptisé
"réparation SOS" n'excise Fa.s la lésion, il va reccnstituer la dou-
ble hélice de l'ADK sa,Ds s'occuper des errel.'.rs introduites dans le
message codeo La réplicatiop.. aura lieu ma,is les cellules fille's au-
,
,
l'ont un message altere.
Si l'altération initiale de l'ADX cons~itue l'évèneœent majeur
dans le ~éclenchement d'un cancer, d'autres facteurs encore mal ccn-
nus doivent. intervenir ultérieurer.:.ent vour transformer une cellule
normale en cellule canc~reuseo Ainsi on distingue de&x ~tapes dans
la cancérogénèse chimique c'est le postulat de BEHEi\\TBLOf· (9).
Une étape.. dO' ini t iat.ioll
Dans cette étape sous l'influer.cE d'ur.. agent canc6rogène soit
d~recternent s?it après activation m8tabolique il y a modifiration de
l'ADX. Les di.fférEnts mécanismes de réraratior.. de l'AD:\\' en élimiha~t
ou r..on les défauts 0& mftme en les réparant d'u~~ façcn erronée ~ont
jouer un l'Ble décisif dans le d~clenchement du proc~ssus car.c6reuxo
Cette étape recouvre denc l'ensemble des ph6r.omènes chimiquEs et
physiques qui corduisE-D.t à l:üe modification de l'ADN. Cette modifi-
cation de l'ADN pe.ut s'exprimer ou être répriméeo
Une' ét..é1L~_C:_e.Jrq.!,oti.2I!
C'e~t l'ens~~ble de ph6ncm~nes cellulaires ercore lnccnrus et
qui permettent l'expression de cette TI'0dification réprjmée. L'initia-
i:i~n €~t UIJe (-tape l'aride et irr{yersiL'le nlol':3 q1..E::' la I-lo;::otiorl Gst
une étape prolongée et réyersible à SOL début.

---

13
En résuoé un cancer est da en général à ULe seule lignée cel-
lulaire qui ~chappe aux centrales nermaux decrcissauce d~n~ l'orga-
nisme. Lorsqu'un produit à potentialit~ mutag~ne est intrcduit dans
l'organisme,
il subit une transformation métabolique
(pour la plu-
·p~rt). Le m?tab'ûli te s' il e~t actif provoque UI_e rr.odification de
l'ADX (mui.:atior~s) ; or toute"cellule Yivarte possède dE;s s:ystèrr.es
enzymatiques cape,bles de r~farer les 1~si0nR ap:r:arues au niveau de
son ADK. Certains de ces systèmes enzymatiques re~:.taurent l' intégra-
lité de l'infor~ation gén~tique en opérant la coupure du fragment
d'AD~ erron~ (e~cision) et en le remplaçant p~r une s~quence d'ADN
intacte (synthèse r~paratrice). Il y a ~galement la "r~paration SOS"
elle reconstitue la double hélice de l'ADK sans s'occuper des erreurs
introduites dans le message code: Il en résulte une modification du
code g~nétique de l'ADN et donc apparition de mutatior~so Si la r~pa­
ration est parfaite la cellule redeviendra normale si elle est im-
parfaite la mutation devient d~fin~tive et si cette cellule açquiert
.
en plus de la mutation la· faculté de se reproduire indéfinim8r,t elle
devient cancéreuse.

---

14
11- LES PPODCITS DE PYROLYSE
----'---_.----- --,----".... ,.
Il est connu depuis longtemps que la fyrolyse de c~rtaines
st: bs tanc e~, or ga.rü que s no tamrn Eni la houi Il e, le t,abac et l e ~ pro-
t~ines conduit ~ des cornpos~s multiples qui sont ees hydrc.arbures
ou des h~t~rocycles et il e~t maintenant ~vident ~u'il y a une cor-
r~lati~n enire la pr~sence de tels produits ds pollution dans l'en-.
vironneDent e;t l ' ir..ci('ence du cancer chez l'homme.
On sait que le premier canc~rcg~ne identifi~ il Y,a deux si~­
cle3 fut isol~ du charbon de houille. Les produits de pyrolyse de
la houille' sont essentiellerr:el}t des hydrccarbures p~lycycliques
pe,rmi lescluels le be:r:zo (à) pyrène 1. pt:issant conc:ro[è::e lJ.è"On a
identifié égaleI:1ert clans les ccrdepsats de fUirl(~eS de tabac,
les gaz
d' ~chaprement d' autoIr.cbiles, dans la suie cl les gOLèàrcns. Il est
responsable du c&ncer de l'oeso~hage et des bronches. La CCDlbustion
du k~ros~ne et du bois donn~ le cyclopent~no (cd) pyrène CPEP 1~ il
provient ~galemeIl-~ du noir de charbon et des gf:,Z des aut.olf,0biles.
R~cen:ment cet hydroca.1'ture ~ prouvé' UIJe bauie rrutag{nici té' c·n',-(rs
les Salmonella Thyphimul'ium c1a1".8 les c1.!:J.iul'es ~e cellules de Eouris
et dans lymphoblastes diploYdes de l'homme
(10).
1
Il est clair que dans le tabac,
en dehors de la nicoi~ne: il,·
a les hydrocaTbures aromatiques polycycliques et les h~t~ro~ycles
a~ot~s (11). La pyrolyse deE feuilles de tabac dOllIIC ~es am~ries a1'o-
mati~ues telle que la narhth~'lamillc canc6rog~~~ pOUl ~a YE~8i€. Parci
le:..~ composés de I:-rolyse des acic'..€~ a.minéE' ~ de~ rrctÉirlf's et de ] a
nicotine,
il y a les cc~pos~s azot~s h6téro~yclique5 : pyrroles,

---

15
pyridines, py:azines et leurs d€rivés
quinolines,
~doles, car-
bazoles, acridines.
Exell'p~..2.
l'acide proline donne le pyrrole
aprÈs pyrolyse,
le tfyptophane do~~e les indoles,
le skatole (12)
et la quinolineo
A haute température la nicotine donne la quincline,
l'isoqui-
noline indole et skatole (13),
le dibenz (a,j) acridine et le di-
b~nz {a,h) ~cridine cancérog~ne pour l'hommeo La ~igure 6 donne les
différents produits de pyrolyse du tabac. Dans les condEnsats de
fumée de tabac on trouve surtout des composés azotés hétérocycles
condeLsés parmi lesquels les indoles,
les carbazoles,
~es carbolines,
Harmane et Norharmane, quinoline benzothiazolEs, pyrazines bicycli-
ques et l-es ni trosamines. Certal.ns. de ces déri vés sont nor. mu.tag~nes,
.
d'autres sont cornutag~nes (Harmane et Norharmane), mutag~nes ou can-
cérog~nes.

---

16
~.a Les hétéro~es sim~
-0
pyr.nie
pyridine
pyrazine
6.b Les hétérocy~es condensés
- ~~~-g~~~~!~~~~
@XQ)
qUlnoline
isoquinoline
quinoxaline
Les indoles
[§:C-(~
N
H
H
indole
J -
méthyl indole
pyri~o (2,Jb)
. (Skato.le)
indole
HarmaEe
-
Les carbazoles
Norharmane
carbazole
N
H
Dibenzo
(c,g)
carbazole
-
Les acridines
dibenz
(a,j) acri~ine
dibor:z
(a,h)
acridine
fig 6 Le~__ proq.uj.t s..1'§·_J?,yroJ.~3e du tabac
6.a Les hétérocycles'simplss
6.b Les h6térocyles condensés

---

17
Des découvertes récentes ont m04tré qu'en dehors' du tabac la
pyrolyse d'autres substances naturelles notamrr.e~t d~.certain5 ali-
ments ,pouvait conduire à la fo~mation de· produits ~étérocycliques
cancérogènes.
Dar.s le cadre de recherche sur l'étiologie du Cancer, SUGIHURA
et al
(14) ont observé une nette corrélation entre la fréquer-ce des
cancers d'estomac· et la consommation du poisson dans' la population
Japonaise. Ils ont pu isoler à part~r du poisson grillé des produits
fortement mutagènes
; mutagénici té mesurée par le. test dl Ames
(15).
ParallÈleme:c.t à ces travaux COHNONER et al
(16) ont isolé de la
viande cuite de différentes manières des produits fortement mutagènes.
Cette mutagénicité est trop forte pour @tre attribuée au benzopyrènc.
Pour rechercher les éléffients contenus dans le poisson et suscep-
tibles de donner ces produits mutagènes arrès combustion incomplète,
ils ont pyrolysé les lipides et les protéines';
seuls les pyrolysats
des protéines présentaient des propriétés mutagèneso Par ailleurs les
pyrolysats de divers acides aminés se sont révélés muta~ènes : Tryp-
.tophane, Sérine, Ala:nj.ne, ATginine,
Ornithine, Acide glutamique
(15).
Les produits mutagènes des pyrolysats de L tryptophan e ont, été
isolés et leurs structures déterminées par rayons X (17) • Ce sont :
Trp
p
1 ou 3 amino
1 ,4 :- diméthyl 5 II pyrido (4,3
b ). indole et
Trp
p
2 ou 3 amino
1
méthyl 5 H pyrido (4,3
b) indole.
Trp .... p -
1
Trp - p - 2
Ces deux mutagènes sont aussi présents dar.s la· viande grillée
(18)
et dans le goudron des cigarettes
(19).
Deux autres produits ont été isolé5 des pyrolysats du L tryp-
·1.ophané il s'~git de Norhamane et harmane qui agissent comme comu-
tagènes (20).

---

18
Norharmane
Harmane
DEl~X hmir-es 0<.- ce-l'bolines ont été isolÉes des prcclld ts de
pyrolyse ~e la globuline ~e soja don~ lE structure Établie aux
rayons X montre qu~il s'agitrespe(;tiyemeIlt du 2 -
amino -
9 Il
pyrido
(2,3 -
b) indole l
et du 2-amino -
3_méthyl -' 9 H pyrido
(2,3 -
b)
(2,,3 -' b)
indole 4
(21).
3
4
Tableau 1
-----_._----_...
Cornpc~És
Xomtr€
de 'rfvertants/
boîte d(· Petri
.uroG.uit i.est&
2 amino fluorène
11 300
1Q
2 acétylamino fluorène
. 4 823
10
2 acétcxyacétylamino fluor~~e'
886
5
Aflatoxine B
2 260
1
0,1
glu
p
1
13 ïOO
Î
glu
p
2
1 600'
1

---

19
Ces produits sont fortement mutagènes envers les souctes dE Sal-
monella ThyphimuriumTA 98 et TA 100.
,
Quant ~ l'acide glutamique, sa pyrolyse conduit ~ l'a~ino -
2
méthyl -
6 dipyrido
0,2 - a : 3" 2' - àJ imidazc'le d 8signé sous le
nom de glu
P -
1 et de l'a1:ino -
2 dipyrido
(1,2 -
a
:
3~ 2'
d]
imidazole ou glu
P -
2 (14) 0
glL' -
F _. 2
Ces prcduits sont également isolés de la. caséine .(22), du· poisson
grillé, de la viande grillée
(23
;
24)
et de la Eeiche grillée
(uniquerr.ent l'amino ~ 2 dipyrido 0,2 - a
3~ 2' - d) imidazole)
(25).
Ils présentent une activité ha~teme~t mutagène vis ~ Yis de la
lignée TA 98 ae Salmonella Thyphü:urium en présence de prépa,ration
microsomale.
Grâce au test d'Ames sur une sO"l',che de bactéri es Salmonella Th'y-
phimurium on peut comparer la mutagénicité de certains comrosés de
pyrolyse ~ celle de certains cancérog~nes bien connus ·(26). Le ta-
bleau 1 nous donne qUElques c~iffreso
En outre,une étude in vitro sur l'activité de glu -
P -
1 sur
(:es cellules d'embryon de harrster a montré que ce composé était ·cyto-
toxique ~ la dose de 50 t.4.g/ml mais' qu'il pcuvai t induire une trans-
formation morphologique de 'cellules aux concentrations de l'ordre de
10. à, 20 J{g/ml .(27). Ce qui laisse supposer ctez ce composé UIle can-:
cérogénicité rlausibleo
Enfin dEs études préliminaires de HASnl:lOTO et al(28)
et DL01lJRA
et al
(29)
sur la réactivité de glu -
P - 1 vis ~ Yis de l'ADN ont
montré que cette aœine ou son m6iabolite ultimp se fix~rait h la fois
covalentement sur le C -
8 de la guanine et par intercallation entre
les paires de base de la wacromoléc~le.

---

20
111- BC"T ET ~·lOTIVAT.IOK DE NOTRE ETUDE
Il est à remarquer que ces deux dernières amines hétérocycliques
le glu - P
1 et le glu - P -
2 présentent une très grande parenté
de structure avec.l'amino -
2 fluorène cancérogène bien connudGnt
ils peuvent être considérés comme des isostères azctéso
Il nous a denc paru intéressant dans le cadre des travaux effec-
tués dans le laboratoire sur les mécanismes d'action des amines aro-
matiques cancérog~nes et notamment sur les d€rivés
de l'amino -
2
fluerène,
d'entreprendre une étude sur ces nouy&lles amines hétérocy-
cliques à poten~ialité cancérogène.
, ;
"
Un pre bl~me imI,ortant reste posé~' "en effet .pour la compréhension
du ou des mécanismes d'actiun des ~~ines ~~?céf~?nes : l'expérience
montre qu'il Y a une variation trè~_ imfd'y't'aI;.te. d,~~lS la proportion
"
•
. . '
/
Q"
relative des addui ts formés impliqu~~ 'les 4~}":)?rincipaux s:j. t.es
de la guanine le C -.8 et NH 2 - 2 qu~'tlpn.--~~~ de l'amino - 2 flu-
...... "''''''''----.....:::16'''
Grène à l'amino -
4 biphényle ou à l'amino - 2 ph6nanthrène, amines
structurellement apparentéeso
Il en découle à première. vue qu~ la
nature du noyau,
sa géométrie
ou sa structurè électronique doivent
jouer un rôle non négligeable dans l'orientation de la réaction du
métabolite ultime avec l'acide nucléïqueo
On peut se demander d~s lors dans le cas du glu - P - 1 et du
.
glu -
P -
2 quelle peut-être l'influence des azotes intracycliques
sur les propriétés mutagènes et éventuelleoent danc6rogènes de c~s
composés. En outre on pe~t se po~er la question de savoir si cette
mutagénicité est due essentiellement à l'amine en tant que telle et
donc impliquant le rr.ême mécanisme que celui admis pour les amines
aromatiques ou,
au moins en partie au noyau lui-même.
Ces considétations jointes à l'intéiJt pratique de ces composés
pour le~sciences de l'en~irûnneme~t et l'étude de la ~ancérogènèse
"alimentaire" nous ont conduit à nous intéresser à un analogue du
glu - P -
1 l ' aminû -
3 -
rnéthyl -
4 dil)yrido
(1,2 -
a
: 3' 2' - dJ
)
imidazole .2. et son ho"nlOlogue méth,ylé 6.

---

21
Le composé 2. susceptible de s~ former également lors de _la py-
rolyse de l t acide L - -glutamique est plus pl'G-cl:e de Ir amino -
2
fluor~ne
l par la position de la fonction amine.
6
7
La première partie de ce travail est consacrée à la synthèse de
ces corps et de leurs intermédiRires ce qui a n6cessit6 un important
travail de chimieo
L'étude de leur mutagénicité qui fait l'objet de la deuxième
partie a été réalisée e~ collab6ra~ion avec le laboratoire de. Monsieur
le Professet:.r POKCELET à BR.CXELLES. Elle a montré que le noyau lui-
mOrne n'est pas mtltagène mais que les composés 5 et ~ 6taient fortement
mutagènes
(beaucoup plus que le glu -
F -
2) h l'égar~ de diff6rentes
souches de Salmonella Thyphimurium avec ou sans préparation microso-
male.
La troisième partie est consacr6e ~ une étude de l'effet biochi-
mique de ces corps chez le ~at su~ deux systèm(,s enzymatiques li6s au
cytochrome P -
450 là zoxazolamine hydroxylase- et la diméthyl nitro-
sarnine deméthylase. Cette étude a montré que tout comITe chez certains
composés mutagènes connus,
ces composés exercent une action répressive
sur le cytochrome P -
450,
induisent, ·la biosynthèse de la diméthyl-
-nitrosamine dé~éthylase alors qu'ils inhibent la biosynthèse de la
zoxazolamine hyd~oxylase.
La quatrième partie est consacrée k une étude préliminaire de
la synthèse des différents métabolites possibles de ces composés et
à la vérification de leur réactivité vis ~ vis de l'AD~.

---

22
PREMIERE PARTIE :
_._---
Synthèse et Propriétés physicc-chimiques de
l'amino -
3 méthyl -
4 dipyrido
0,2 - a.: 3: 2' - cl]
imidazcle et de ses précurseurs.
Introduction
Le dipyrido (1,2 -a : 3' 2' - d] imidazo l e consti tue un hétéro-
)
,
cycle nouveau encore très peu étudie sur le plan chimiq~e et physico-
chimique.
Une partie importante'de notre travail a èonsisté dans la mise
au point d'une méthode de synthèse satisfaisante de ce noyau et no-
tamment de son dérivé méthylé en posi t.ion 4.-. La méthode qui nous a
semblé la plus commode consiste ~ faire réagir comme le mo~tre le
schéma 1
8
9
Sohé~~
de la méthyl vinyl"cétone sur l ' amino -
3 imidazc
C1 ,2 - aJ pyridine
~ en présence d'un réactif cyclodéshydratant. L'interm~diaire ou
pré~urseur 2 n'existant pas dans le coœrr.erce a du @tre lui-m6me pré-
p·aré.
Une réaction de nitration de l'hétérocycle dont la tectllique a
été mise au point dans ce travail nous a fourni
un déri,é m0nonitré
en position 3 dont la réduction nous a fourni l'amine corre~pondante
(Schéma 2).

---

23
~~:JQ_I
N"
~N
~
H3
10
Schéma 2
Ces différentes étapes sont décrites dans le d~tail dans les
pages suivantes.
I - PHEPARATIOK DU PRECURSEUR -
PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
1) Générali tjs.
Notre premier objectif a été de synthétiser l'amino -
3 imidazo
o,2 - aJ pyridine 9 précurseur de notre hétérocyc le. Dans l' lm des
nombreux schémas de synthès~ du précurseur que nou~ avons imaginés
'( cf D .E,.A.), no~s avons synthétisé le pyridylardnoacétoni tri le U
comme intermédiaire de réaction pour faire ensuite une cyclisation en.
présence de l'anhydride acétiqu~ avoir l'acétamido -
3 imidazo
0,2 -
aJ pyridine n passer à l'arr-ino - 3 imidazo (1,2 - a) pyridine
9 après hydrolyse de l'acétamide comrr,e le montre le schéma 3
8
12
13
Schéma 3
Pour la première étape nous avons modifié la technique décrite
par, N. IV. BRISTOl', et al
(30)
en opérant en milieu aqueux eE présence
.
'
,du composé d'additioh.du formaldéhyde avec le bisulfite de sodium
ceci a eu pour effèt 'd'augmenter le rendE:ment qui passe de 45 à 60 %
pour le dérivé non méthylé.

---

24
L'~tude spectorn~triquè du compo~~ 12 a r~v~l~ que d~tait en .fait
la forme tautomère de l'amine 9
RÙH...{;~N....,,--_>
12
9
en IR il Y a absence de la bande CN et la RHN montre que .la forme
cyclique est pr~dominante dans l'~quilibre ci-dessus notamrr.ent
pour les d~riv~s R = H et R = 7 - CH 3
2) Par-f::.ie e~.I?Ari!J1entale
On dissout 1,5 moles de complexe bisulfitique de formaldéhyde
de sodium dans 375 cc d'eau. On chauffe
ce mcilange dans un bain
d'huile à 95°. On ajoute 1,5 moles d'amincpyrid~ne. On chauffe pen-
dant 1 ~ 2 heures et on ajoute 3 moles de cyanure de sodium dissoutes
dans 300' cc d'eau. Apr'ès 4 heures de r~action on filtre et le fil trat
encore tiède est extrait au ctlorure de m~thylène s~ch~ sur cac1
e~
2
on ~vapore sous vide: le produit solide marron obtenu recristallise
du benzène en donnant des cristaux jaunes.
B) Propri~tés phy.s.i.eo-.chimi~.2.
1) Caractérjstigu~s physique~
Les c~ract~ristiques physiques des produits obtenus sont r~surnés
dans le tableau 2.
R
F.*
Rdt %
Masse
Form ule
Solvant
...--.----1--- - - - -
H
124°
60
133,15
C
H
benzène
7 :t>;3
7
.~,._.
"7
1
- CH
129 - 131 °
40
147,15
C
H
benzène
3
8
}
--->-----'--'-'-
* Pour les points de fusion,
on emploie la méthode d~ tube capil-
_laire avec un appareil BUchi de Tottoli

---

25
2) EtuiL~_~l'~
Les résultats de spectres RMN sont donnés dans le tableau ).
Les valeurs de déplacements chimiques des différents protons sont
do~nées en ppm et les constantes de cGuplage en C.P.S. La
figure 7
montre le spectre d'un de ces ccmposés"enregistré dans
Cnel)
référerce T.M.S.
sur un appareil Hitachi ~erkin Elmer R. 24B.
)) Etud.e_ LR.
Les spectres ont été enregistrés sur un appareil Perkin Elmer
297 en paEtillage de KBR. Nous avons pu. attribuer quelques bandes
dues aux principales vibrations par comparaison aïlX dérivés de la
pyridise (31)
:
C = C ; C = N ; C - N ; C - Il ; N - Il. Les figures
8 et 9 montrent les spectres des deux com:rosés. L'analyse des deux
.spectres donne les bandes sbivantes
:
R
H
-1
3320,
3075 cm
vibration d'allongement
N
II
-1
1630,
1605 CIT.
vibration de déformation
N
H
-
-1
1560, 1500 cm
vibration d'allongement
C
N, C
C
=
=
-1
j 360,
1290 cm
vibration d' allongemen t
C
N
-1
1120 cm
vibration de déformation
C - II (cycle)
R = 7 - C~3
-1
3380,
3150 cm
vibratior. d'allongement
N - II
-1
2980,
2920 cm
vibration d'allongement
C
II (de CH )
3
-1
1650,
1615 cm
vibration de déformation
N - H
-1
1570, 1500 cm .
vibration d'allongement
C
N, C
C
1 )50,
-1
1310 cm
vibratior. d'allongerrent
C - N
-1
1110 cm
vibration de déformatior.
C .,... I-I (c:ycle)
L'abse:C.ce -de bandes aux environs de 2210 - 2260
-1
cn~
caracté-
ristique dtA. groupe Cr: montre que ces decx ccmfosés existent préfé-
rentiellement sous la forme cyclique.

---

o -
~
o
1.."
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'"
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<
. '"
(
...<!:
c
j-----'----+f-----+- ---r-----~r-.----1!1 1.
§:.
!i
---~
- ..

---

26
4) Etude U.V.
-
~
Les principales bandes du composé ~ (R = H) sont les suivantes
Max ).. nm (E.),
233
(4, 20 ),
280
(3, 47), 3 33 (3, 41 ) •
11- SYNTHES_E. DE L'HETEROCYCLE (méthyl - 4 dipyrido' 0,2 - a
3'
2' -
d) imidazole
)
1) Généralités
-------
Pour créer l'hétérocycle nous avons fait agir sur le précurseur
2. un des rOéactifs de cycloconqensation des amines aromatiques ·la
méthylvinylcétone.
Schéma 4
La méthyl vinylcétone réagi t
sur les ar:1Ïnes selon la réaction
de Doebner MILLER
(32) pour donner des méthyl -
4 quinoléines.
C_~IPBELL et SCHAFFNER (33) ont montré' qu'on pouvait amÉliorer de
façon très sensible les rendements en opérant en présence d'un agent
oxydant et d'un agent de condensation dans de conditions douces et
d'acidité moyenne. Nous avons utilisé le chlorure ferrique comme
age?t oxydap-t et le chlorure de zinc comme agent de condensation.
2) Part:i-~ ~e~.é.rif!:l.-€p.i.ale
Dans uh tricol muni d'un réfrigéra~t, d'une anlpoule à brome et
d'un thermomètre on met 0,0625 mole d'aJllino -
3 imiciazo
(1,2 -
a)
pyridine ; 0,1
mole de chlorure de fer
(Fecl
6 II 0), O~OC7 mole de
3
2
chlorure de zinc et 50 ml d'éthanol. Le mélange est
challffé dans un
bain d'huile.
Quand la température intérieure atteint 65° on ajoute
gcutte à goutte 0,05 mole de mÉLh'ylvinylcétone Je tèlle SGrl:e qt:e la
température intérieure ne dépa.sse pas ïOo. On porte ensl:i te le mé'laEO"e
<:>

---

27
réactionnel au reflux pendant 12 heures. Après refroidissement on
rédu.i t la quanti té de solvant sous vide puis on basifie le r'ésidu
avec la soude à 25 %. On chasse ensuite à sec, recueille le résidu
et fait une extraction au soxhlet avec l'hexane. Le produit recris-
'tallise de l'hexane SJus forme de cristaux fins de couleur jaune.
1) Caracté,!'.ï.s.t,i.9..u.€.s
phy.s.i.<Lu_e~
" Elles sdnt 'résumées dans le tableau 4.
2) Etude RHN
L'étude comparative des spectres nous a permis de caractériser
les signaux propres aux différents .protons du. noyau. On remarque
que les protons en position 9 et 2 sont généralemént assez déblin-
dés, com~e dans le cas du noyau simple de la pyridine (34). Le
tableau 5 nous dcnne les déplacements chimisues en ppm'des protons
et les constantes de couplage en <;p.So La figure 10 montre le spec-
tre d'un de ces Bomposés enregistré dans
Cne1 3 , référence TMS,
sur un appareil Varian A 600
1
.
3 Etude 1.R.
Les spûctres ont été enregistrés sur un appareil Perkin Elmer 297
en pa.stillage de KBR. Nous avons pu attribuer quelques bandes impor-
tantes. L'analyse des spectres donne 6 séries de bandes:
aO) 3100,,3040
-1
cm
vibration d'allongEment
C
II (noyau)
b)
-1
2960,
2920 cm
vibration d'allongemer.,t
C
H (CE )
3
-1
c) 1645, 1620 cm
vibration d'allongelT'ent
C
C conjugué
d) 1500 cm-1
vibration d'allonge;nellt
C == C, C == N
-1
e) 1380, 1270 cm
vibration d'allonge:l'ent
C
N
f) 1235, 10CC
-1
cm
vibration de dé fon,a ti on
C
H
Les figures 11 et 12 nous montrent les spEctres.

---

'b.t)
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.::
g
.::r

---

1
J

---

28
Tah l t:.f.ll-l
)posés NH
.CH
2
3
H2
H5
H6
H
H
7
8
= H
3,4
7,3 (s)
7,9 (m)
6,8 (m)
6,75 (m)
7,4 (m)
J _ = 7
J _ = 7
5 6
7 6
J 8_ = 7
7
J 5~7= 2
L=
7CE 3,7
2,8 (s)
7,62 (s)
8,45 (d)
1
7 ,12 (d)
7,4 (m)
~
J _ = 7
J _ = 7
5 6
6 5
•
1
k) -- sinO'ulet
e
(d) = doublet
(t) = triplet
(m)
.
= multiplet
Tableau 4
l
Calc1.1lé
Trouvé
FO
Rdt
Hasse
Formule
Solvant
C
H
N
C
H
N
IH
150 0
48%
183,2
C
H N
Hexane
11
72,1
9 3
4,95 22,94 ~2,13
5,00
22,75
1
-CE
151
3
0
40%
. 197,23 C12H11N3
Hexane
.
R
H2
~3
H6
~
H8
H
CH
9
CH
3
3
8,41
(d)
7,38 (d) 7,80 (m) 7,55 (m) 6,88 (m) 8,83 (m)
H
2,85 (s)
J
=
=
2_
4
=
=
3
J 3_2 4· J 6_
7
=
7
7
J _
7
J
7 8
8_9
J 9_.s= 7
. r
1
1
-CH 3 !8,25 (d)
7,30 (d) 7,45 ( s )
6,80 (d) 8,65 (d) 2,80 (s) 2~7 (s)
1
i
;J 2_3= 5
,
-- . j
i
s) = sing-ulef
(d) = doublet
(m) = multiplet

---

29
4) Et\\l-de_p~.
Les spectres ont 6t6 r~alis~s dacs l'~thanol sur un speritom~tre
Carry. Les r~sultats exp~rimentaux sont donn~s dans le tableau 6.
Les del~; compos~s pr~sentent ees spectres de mgme allure g~nJrale
.av'e c toute foiti' un 1 ~ gel' effet hyperchrome pour 1 e dér2. v~ monorn~-
thylé ~,ar rappo::.'-:' à son homologue dim~thyl~. La figure 13 :c;ontre le
spectre de l'UN Jes
compos~s dans l'éthanol ; E-D nlilieu FCl - éthanol
le spectre du COIT.posé monom~thylé est modifi~ comrr-e le ~ontre la fi-
gure 13 •
j
tableau 6
1
1
r-- R =7 -.CH .3
1
I.~ ._n_m_ffi_a_x
-+
l_o_g_é_m_a_x_ Jr-__À_n_~
l~g~aX
__, _
1
1
234
4:.49
j
234
1
4,48
239
4,61
240
4,56
4,10'
260
4,12
3,95-
270
4,01
3,83
336
3,80
L~~~338
-_._,---,....-.-----
A) §..Y!}J.h~se chirr..igue
1) Généralités.
Les' différentes tentatives de nitration pa~ les méthodes usuelles
no~amment par le mélange sulfonitrique à chaud (35) ou en présence
~'acide sulfurique à froid ou à chaud (36) sont restées sans succ~s.
Nous avons finalement mis au point une technique de nitration du
noyau consistant à opérer uniquement en présence d'acide nitriq\\le
fumant d = 1,49. Cette nitration nous a conduit à un coœros6 monoLi-
tré auquel nous avons attribué la structure 11
de ~éthyl - 4 nitro.3
dipyrido
(1,2 -
a
: 3') 2'
-
dJ
imidazolc sur la base des donn~es de
j
R.M.N. et pa.r réf~rence à la nitration de la pyridine et. de ce11e du
3H méthyl -
3 imidazo -
(4,5 -
b) pyridine qui se font en méta de
l'azote intracyclique
(37).
1
i

---

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i
1
i

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. C
1~

---

30
2) Partie ~xpérime~tal~
Dans un erlen de lOO cc,
on met 20 cc d'acide nitrique fumant
d = 1,49. On le refroidit dans la glace et on y ajoute par petites
portions 5- g
de produit 10 ;
l'addition terminée on chauffe le
'mélange 100,- 110 0 pendant 2 heures. Après refroidissement on verse
le mélange réactionnel dans de la glace, au hesoin on neutralise avec
de la soude k 20 %. Il se forme un précipité Jaune qui recristallise
de l'éthanol en prismes jatmes.
1) Cara~tfristiques physiques
elles sont résumées dans le tableau 7. Les points de fusion sont
pris sur un microscope k point de fusion Leitzo
R
FO
Rdt %
Masse
Formule
H
250 0
48
228
C11 Hg v·'4 °2
7 - CH
240 0
45
242
H
:'J
3
C12
10
4 °2
2) E t.ud.~Jt?'1N
Les d~plac~ments des protons et les constantes de couplag~ sont~
résumés dans le ~ableau 8. Les figures 14 et 15 montrent les spec-
tres des deux composés enregistrés dans
Cne1
'
référence TMS sur
3
un.appareil Hitachi Perkin Elmer R. 24B.

---

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0
~
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---

31
,
R
H
H
2
E .
4
H6
H7
8
H9
H
8,21
(s)
3,21
7,54 (d)
7,61
6,94 (m)
8,76 (d ).
.:[6 _ 7 = 4
J 9 _ 8 = 8
7 - CH
8,23 (s)
2,83
7,40
3
(s)
2,50
6,84
8,65 (d)
.
3) Etud~_I.R.
Les spectres ont été enregistrés sur un appareil Perkin Elmer
297 en pastillage de KBR. Les figures 16 et 17 montrent les spectres
des deux composés. L'analyse des spectres donne 5 séries de bandes.
a) 2920
-1
cm
vibration d'allungement
C ~ II (cycle)
b) 1640
-1
cm
vibration d'allongement
C = C conjugué
c) 1535 - 1495
-1
cm
vibration d'allongement
C
C et C ='N
=
d) 1390
1270
-1
vibration d'allongement
C
-
cm
-
N
e) 1235 - 1085
-1
cm
vibration de déformation C - H
IV- PASSAGE A L '.MIINE
A)
Synth~se chimigue
1) GénéI§li tés
La réduction du dérivé nitré .se fait par action de l'hydrate
d'hydrazine en €xc~s ( 3 moles pour 1 mole,de produit nitré) au re-
flux dans l'éthanol en présence de nickel Raney •
•

---

32
2)
Partie exp~rimeLtale
On porte au reflux pendant une heure
et demie le m{~ange de
0,013 mole de produit nitré 11 dans 120 cc d'éthanol, une spatule
de nickel Raney et 0,03.9 mole d'hydrate d'hydrazüwo On filtre à
chau~ évapore tout le solvant sous vide et le produit recristallise
d~ benz~ne sous forme de cristaux fins de couleur jaun~ verdltre.
1
1
1) Caract~ristigues phvsigues
i
1
Elles sont résumées dans le tableau 9.
f
1
1
,
!
R
FO
Rdt ot
I -
Nasse
Formule
R
232 - 233 0
50
j
198
C
H
11
K
10
4
-
7 - CR
198 -
3
199 0
60
212
C
H
N
12
12
4
1
,
1
2) Etud~RoHo~o
Î
!,
Les déplacements chimiquE's en ppm et les constantes de couplage "en
C.P.S. des différents pr6tons sont résum6s dans le tableau 10~ Les fi-
gures 18 et 19 montrent les spe c tres enregi strés dftns Clle1) sur un
1
appareil Hitachi Perkin Elmer R. 24B.
ft,
t
tableau 10
H
R
2
%
H
R
4
Ii
6
R
H
7
1
8
,
9
.
!
6)50(5)
H
-:'50
2.,65(5 )
6)75(m)
~55
7,20
8,45(dJ
J
_
6
7~ 4
J 9 _ 8= 8
1
i
r-CH
7) 20(5)
3
~95
2,50(5)
~53(s)
~33
6, 70
~27 Cd)
,
1
(5)
!
=.
singulet
(d) =. doublet
(m) = multiplet
f
\\f,
f
l
t
~
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1
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1
!

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33
3) Etude I.R.
Les spectres ont ~t~ enregistr~s sur un appareil .PerRin Elmer
297 en pastillage de KBR. Les ~igures 20 et 21 montrent les spectres
de· ces deux amines. L'analyse des spectres nous donne les bandes sui-
vantes
-1
3400, 3200 cm
vibration d'allongement
NB (amine laire)
1
-1
i
1605 cm
vibration d'allongement
C = C conjugu~
-1
1500
1405 cm
vibration d'allongerr.ent
C = C et C = N
-1
1380 -
1270 cm
vibration d'allongement
C
N
1
-1
850 -
620 cm
vibration de déformation C - H.
:1
f
4) Etude U.V.
Les spectres r~alis~s dans l'éthanol donnent pour les positions
des maxima :
1
R = H
Max ~ (E), 212 nm (4,308), 253 (4,216), 380 nm (3,830)
R = 7 - CR3
Max~ (~), a16 nm .(3,749), 255 nm (3,769)
La figure 22 montre le spectre du comI'os é R = H.
1
1
V- SYNTHESE DE GLU - P - 2
---_. - ~--" . -----~~-- .
Pour avoir un élément de oomparaison nous avons préparé l'amino
-
2 dipyrido
(1,2 -
a :
3~ 2' - dJ imidazole ou glu - P - 2 dont les
,
propriétés sont déjà connues dans la littérature (38). Nous l'avons
obtenu par cyclocondensation du chloroacrylonitrile sur le pr~curseur
1
1
2 en présence du chlorure d'aluminium (38).
f
1 ) Partie expérimentale
On met dans un tricol 12 g d'aT'"1ino - 3 imidazo (1 ,2 - a) pyridine,
1
t
100 ml de CH
C1
anhydre
2
et ·19,35 g de chloroacrylonitrile. On y
2

---

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t
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- \\
c>
~"-;..'
~.Jo'
"".~
f;
c

---

34
ajoute par petites portions le chlorure d'aluminium. Puis on chauffe
le m61ange dans un bain d'huile ~ 100 0 pendant 48 heures. Apr~s re-
froidissement on chasse le solvant sous vide,
aj oute de 1·' eau clans
l ~ rÉ siè.u Cl bteIl;u,
fai tune rrem i~ re ex trac tion a11 benzèI1 e ~
enSll i t e
on èasifie la phase aqueuse avec de la soude 20 % et on fait une
deuxième extraction ~ l'acétate d'éthyle, on évapore le solvant or-
ganique sous vide' et chromatographie le résidu sur une colonne d'alu-
mine neutre en utilisant le mélaEge chlorure de méthylèn.e -
héxane
comme él~ant. On obtient ainsi des cristaux qui r&cri~tallisent du
t.enzène po
2) Etude R.M.N.
La figure 23 montre le spectre dans CDC1
de ce composé. Les
3
déplacements chimiques des différents protons sont dans le tableau
11 •
tableau 11
H
H
H
H
H
H
H
2
3
4
6
7
8
9
4,47
6,72 (d)
'7,97 (d)
6,75
(d)
7,55
(m)
7,20 (m)
8,45 (m)
.
3) Etud_e_I .R.
La figure 24 montre le spectre de ce compcsé. L'analyse du spec-
tre donne les bandes suivantes
:
1340,
3170
-1
cm
vibration d'allongement
N
H
-
(amine Iaire)
1650 -
1600
-1
cm
vibrat.ion d'allongement
C
C conjugué
1575,
1410
vibration d'allongemcni
C
C et C = N
1375
1260
-1
cm
vibration d'allongen;en-t
C
N
1130
-1
cm
vibration de dé forP.:& ti on C
H

---

..~-
._--=

---

(
8
','1
,-n

---

3.5
4) Etude U.V.
La figure 22 montre le spectre de ce comrosé. Les pripcipales
positions des maxima sont:
}lax À (E.)
210 cm (4,175)
255 nm (4,109)
382 (3,747).
VI- CONCLUSIONS
Halgré les problèmes de synthèse organique auxquels nous nous
sommes heurtés tant au niveau de la synthèse du pr~curseur ~u'au
niveau de la synthèse du tricycle,
nous avons pu- mettre au point
une méttode d'élaboration pratique d'un hétérocycle nouveau le
dipyrido
(1,2 - a : )"> 2 1 -
d] imidazo] t
qui
revêt un intérêt im-
portant notamment. pour la cancérogén~se chimique.
Pour résoudre nos problèmes de vérification ou de d~termination
de structure nous avons utilisé los méttodes physico-chimiques notam-
ment la R.M.N.,
l'I.R.
et dans certains cas l'U.V.
La résonance magnétique nucléaire s'est révélée la. méthode la
plus efficace pour résoudre ne"s probÊmes de structure. No.us n' avons-
pas trouvé de produit de référence daEs la littérature. Quoique le
noyau soit semblable à celui de .l'~minorluorène, les azotes intra-
cycliques de notre noyau ont apporté bealJCOUp de rr,odificatiohs tant
sqr le plan de la synthèse chimique ~ue celui de l'étude physico-
.
chimique.
Les spectres de ces prcduits présentent des massifs aromatiques
avec des effets de blindage et de déblindage impol'tant,s ce qui nous
a permis une bonne interprétation. Nous avons donc pu caractériser
les signaux propre~ aux différents protons.
Pour le pré6urseur 2 l'analyse des spectres a été faite par com-
paraison ~vec le spectre ~u noyau non substitué rapporté par PAOLINI
et al
(36). Le groupement :\\TH
exerce un effet de blindage non négli-
2
geable not,arnr0nt sur le proton H
en péri. L8, subsii tution par un
j
groupe méthylé du poyau p:n'idinique exerce un léger effet de déblin-
dage Sur les protons en .Q2:iho cle ce grouIHwcr.t.
L'absence de
.
S l enallx

---

36
pour les protons NH en .position 1 et CH
en position 2 pel'œet de dire
2
~ue la ferme cyclique est prcidcminante par rapport
à la-forme ouverte.
Pour le tricycle dipyrido
0,2 -
a-:
3'J 2'
-
d)
imidazole et ses déri-
v~s nitr~s et aminés n6us avops pu analyser les spectres p~r comparai-
son des constantes de couplage et par
recoupement avec les déplace-
merts chimiqc:.es des pretons du noyac imidazo
C1, 2 - aJ ·pyridir.e et par
comparaison des différents produits que nous avons pu isoler. En.géné-
1al les protons 2 et 9 sont déblindés
;
ceci est dû au fait qu'ils
sont en ortho d'un azote iD:iracyclique. Quand on passe du noyau sirr.ple
au dérivé nitré et à l'amine on observe un effet de blindage notamment
sur le protdn H
et H •· La substitution" du noyau par un groupement
2
9
méthyle provoque un effet de blindage su::" les protons en orthoè.e ce
groupement.
~
1
Les spectres d'absorption dans l'Infra-Rougé nous ont permis de
1
confirmer certains résultats obtenus en R.M.N. notammen~ l'absence
t
.
-1
de bandes 2210 -
2260 cm
pour 10 con,posé 2. qui confilme
1
<;.ue
] e pro-
duit existe préférentiellement sous la forme cyclique. A la lumière
des tables d'id€~tification spectrométriques (39) ct par cOffiparaison
1
avec les spectres des cycles pyridine,
imidazole,
benzimidazole qui
coœposent les diff6rents noyaux étudiés ainsi qu'en tenant compte de
1
,
certains ph&ncmènos comme :
'.
l'existence de liaison :t--ydrogène qui peut causer" des change-
ments dans
le comportement vibrationnel du noyau.
Î,
-
la nature et la position des substituants qui peuvent causer
!
d~s variations des bandes én position et en intensité nous avons pu
1
attribuer que~ques bandes dûes aux principales vibrations C ~ C ;
C = N ; C - N ; C - H et N - H. Nous avons retenu en gros 5 grandes
1
régions.
1
i-
-1
1) région 3100 -
2900 cm
l
1
~
Dans tous
les cas il y a une bande cn+re 3120 et 304C cm-
attri-
buable au C -
H du .noyau à l'état d'hybridation sp2. Les bandes de
vibration
C - H à l'état d'hybridation sp3 sortent vers 2960 - 2920
-1
cm
-1
2) région 1645 -
1485 cm
1
Les bandes de vibraticn des liaisCons du cycle C = C conjllgué et
\\
1
C
N
6
c.
-1
6
-1
-1
=
sortent vers 1 45 -
1 \\.:40 cm
; 1 00 cm
1520 -
1490 cm···
t
t1
t

---

37
Ces 3 séries de bandes ont ~ peu pr~s la m@me intensité.
l
-1
1
3) région 1380 -
1290 cm
Dans tous les cas il y a deux bandes qui
apV2raissent.
.
El] cs
,
paraü'sent caractéri~tiques du noyau dipyrido (1,2 - a
3' 2' - dJ
)
irriidazole.
-1
4) région 1235 -
1000 cm
Dans cette région il y a plusieurs bandes attribuables aux vi-
brations de déformation de la liaison C - H.
-1
5) région 900 - 700 cm
y apparaissent des bandes assez fortes résultant probablement
des d6formations du groupe NH
se superposant aux bande~ caractéris-
2
tiques des carbones non substitués de l'hétérocycle.
L'ultraviolet ne nous' a pas été d'un gran~ apI8rt quant à la
résolution de noè probl~~es de structures. Nous avons cependant fait
les spectres de quelques composés notammeLt les corr.posés 2.~ .LQ, !.l,
5. Le spectre du composé 2. (fig. 13) est divisé en deux régions
dans la premi~re région nous avons une bande d'assez forte intensité
(À nm = 233 log~ = 4,20) et dat.f: 1& deuxième ]'égion ECUS ayons deux
bandes. Le ~p~~ctr€ du royau, dipyrido (1,2 - a : 3~ 2' - d)' imidazole
(fig.
13) présente en gros deux r~gions distinctes; dans la première
qui s'étend jusqu'à 280 nm se dét,achen~ 4 bandes: une pre..'lère sous
forme d' ~pa,111 emer: t
(À nm = 234 log é. = 4,49), une' deuxième bande de
forte absorption vers 239 -
240 nm et deux autres bandes d'absorption
assez faible ~ 260 _. 270 um. Les bané'es de ferte absorption sont de
type K dites conjuguées elles résu~teraient des transitionsn~n~
La deuxièm~ région regroupe une suite des maxima moins intenses : on
a 5 bandes et deux épaulements vers 288 et 330 'nrr.• L'aspect des ban-
des de cette deuxième région sous forne de multiples pics fins semble
1
indiquer que ce sont des bandes de type B dites benzénoîdes.
l1f
. ,
Ponr les dérivés amines 5 et glu - P -
2 (fig.
22) on peut alse-
t
ment comparer leurs spectres dont l'allure gén~rale est très proche.
,
Ils présentent deux régions; dans la première qui s'étend jusqu'~
270 no il y a une inflexi6n nette vers 220 nm ~t 1 ban~e de fort~
,
absorption vers 255 nm elle est dE; type K.Dans
la deuxième région
on voit se détacher 2 bandes aux environs de 310 et 380 rm et deux
épaulements vers 290 et 300 nm.
1
1
1
1

---

38
La nature basique du noyat~ est mise en évidence pa.r une modificaticn
significative du spectre en rrilieu Hel -
éthanol,
comme le montre le
spectre du méthyl -
4 dipyrido. (1,2 -
a
:
3',
2' -
d)
imidazole
(fig. LI).
Il faut signaler enfin que tous les dérivés de l'hétérocycle
d.i.pyrido
Cl, 2 - a : 3', 2' - d) imidazc le ainsi que le noyau lui-
m@me présentent
une forte fluorescence bleue violac~e d.ans le vi-
sible en solution dans l'eau Oli dans les solvants organiques.

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39
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43
DECXIEJv'E PARTIE
---_._-- --_.-
Et~de deE proFri6t~s mutag~nes de l'amino - J
métt.yl - 4 dil'yrido (1,2 - a : J') 2' - d] imj,dazc'le
et de SES dérivés
Nous avops vu que glu - P -
1 1 et que glu - P -
2 2 sont lieux
amines forte~ent mutag~res ~vi se forrrent eu co~rs de la corrhustion
incoD~l~te de l'acide L - glutamique. Cette d{co~verte est d'une im-
portance conEid~rable car l'acide glutamiquA se trouVE dans de nom-
brecses prot~ines alime~t~ires. Du reste ces deux amiL€S
ont ~t~
id€r~ifi~cs l'une et/ou l'autle, dans Jes pyrclysats de certains
prcduits aliffientaires' tels que l~ casfIne (1) et le calmar ~6chd (2).
glu - P -
1 qui ne diff~re de glu - P -
2 que par la Ir{sence
d'un rn~thyle en position 7 a une activit~ mut2g~nc
,
• -P •
SpCCJ.J H;UC
cnvi-
ron 20 fois sup~rieure ~ celle de ce dernier. Il a 6t6 rnontr~ par
ailleurs qu'en faisant varier la position sur les différents somQp.ts
du r.oyau l1étérocycliquE l' oe c.bteI'ui i. des varictions irnror~.antes d!l
pouvoir rnutag~lle des procluit.:; rc'scltant.s (3). D('~ o1JsC'T'-vatiorrs ~,ill1i­
lah'eE ont ét~ faites avec les d0rjvés du Trp - p - 1. (anino - 3
dim6tbyl - 1,4 pyrido
(4,3 -
b) in~ole 16 produit mutag~ne isol~ du
pyrolysat du D,L - tryptophane (4,.5).
CeE différer.t,es o1Jseryatiofls soul~ver.t. le problème irnportan t non
encorE r8so1 u 'du llJ{c~anisme d' action ~es prcdui ts mutE.g-ènes.
J

---

44
i
R ùJQ
~ ~N 1 ....-.: A
0j
i
H3
1 R :::6'Ne
glu
P
1
)
R ::: H
A ::: NH 2
2 R ::: H
glu - P -
2
4 R =-7-Me
A = NIL,<..
.2- R ::: H
A
N0 2
6 R =- 7_~1 e
A ::: 1\\°2
7 R ::: H
A
NH
CO
CH )
_.
8 R =~Me
A = NB - CO
CE;.
9 R = H
A = NHon
10 R.
H
N"'- aCOCH)
. , A =
........ COCH)
C1MtN-OJO
CH3
CH3
11
R = H
12
R =7.Ne
1 )
i
~~J-rNH2
1
R~N)
f
14
R = H
CH'3
1
f
1 5
R :::7.Ne
.!..§. Trp -
p -
1
i!
t
Et. si l'on aè.r.l€t
pour émircmment plausihle le concept de la rruté:t.ion
8Dw~tique
1
COffirre base de la'canc~rog~n~se (6,7) il reEte h d6t€r~iner
f:
;
;
quels sont les facteurs qui influent sur la l'~activité des ffi6tabolites
f
vis ~ vis des aci~es nucléiques. Parmi ces facteurs il parait évident
r1
~'priori 1ue la nat.ure du substrat mo16culaire de ].'esp~ce r6agissante
f
est. susceptible de jouGr un l'Ble non Ilcigligeableo Il nous a peru do~c
1
!
int6ressant d'étudier l'activité mutagÈ-De éventuelle de l'arr,ino -
)
f
m{thyl - 4 diryri~o i~idazole 3 et de son hOfficlogDE m~thylé 4 e~ corr-
~
paraison avec celles non seulemert du glu - P -
1 et du glu
P -
2
1
mais encore ~ve~ celles rossibles du noyau non porteur d'une foncti0n
f1
amine (çorr.posés 1...1 et 1...?).
1
ri
!
Pour C onp l éter not l'€
É tud e nou::
2YOn s <5 tudi é é ga,l en:ent l' acti vi té
!
~utag~n8 des compos~s nitr6s cOI're~rondants .2. et 6 des ac~tamides 7
et 8 et. des dE'ux méi,abolites plausibles de l'am:i:r;e 1., l'hydl'c:xylamine 2.
1
~~

---

45
et le dérivé N.,N - acétox,yacétylé·1.Q en plus nous avon~' me:::;uré l'ac-
tiyité du diazoxyle ..l.1 produit majeur de dégradation è..e l'hydrcxyla-
mine 2. et qui ri sque de soui 11er égal eœent le pr celui t 1.Q •.
~l a t ci r i,e] ~ .e t_ 21.6 thi).dg§.
Les diff{ren~s cOffiposés testés ont été d~crits dans la prEmi~re
l'artie. la E:ynth~se de l 'hydro:ylamiT'e 2. et des dÉriYés 10 et .11
pst rapportée dans la troisibme partie.
Les essàis ·ont été faits avec des solutions aquEuses ou hydro-
1
alcooliques sur 6 süt'ches différEI:tts de ~2.1morlell.§l-1'.h.::.::Il~i:;
..ul'iE!lL.:
souches TA 98, TA 1537, TA 1538 sensibles aux agents de type fra-
1
TA1535
meshiftjsouches TA IOO,TA 1530~sensibles aux age~ts 8ubs~ituants
!
des paires de bases tels que les age~ts alkylants.
1
t
Sye tème_ :9'c ti ya t~];..r.
!
On a utili8é'des rats adultes mâles de souche Wistar pesant de
200 l
250 g. Les rats subissent un prétrai~emEnt lar injection pé-
1
ritonéale d'arochlor 1254 (500 mg/kg) en solution dans de l'huile
de œaYs (200 mg/ml) cinq jours avant le sacrifice. On fait alors
1
un prélèyement aseptique des foies,
SOUIU:t
ceux-ci à tŒ8 hcmog6né-
fi
Ysation par centrifugation ~ 9000 g dans 3
vol~med d'unc' ~o]ution
stéri~e de Kel C,15 ~I et on réc~p~re la fraction pest miiochondriale
(technique classi~ue (8)).
1
Le S 9 mix est pr~par~ suivant la technique de Ames et al (8)
1
f
en ajoutant Ciu HgCl.t (8JLmole/ml mix},. du. Kel (33J{':jlolE/ml nix) du
j:hosphate de sodium (100j-Lmole/rr.l mix), du gluco~e - 6 - phosphate
(5 ..Jl,mole/ml mix). et. du NA DP+ (4.)lmole/ml mix) à 10~fiLl de S9/ml
!
mix ( soit 25 mg àe foi e humid.e/ml mi1.
i
1
1
J'est~2..Yr b()îi ~_i.E?_r~t!i
f1
Le~ tests sont réalis~s en triple en m6Jangeant les dilutions du
r
;
~ubstrat
i
(0,1 ml/boîte), 2 _ 8.10 8 bactéries d'une culture d'une
1
nuit dans du nutrient broth (Difco) par boîte et du Sa mixte (C,5
~
1
.,
ml/boîte) dan~ dn -:-,op 2,gar mnintenv en Stèr:,,-uEic:~ C, 45° C
(2 r.lllr,oîte)
supplémenté en hi stiC'tine-bic t.ine (0,05 mN ) qui es t
er:.~ td t( c OV.l é en
tt
double co:~ch0 sur du minimal g] ucose agn.r (Vogel Banner E r:'0è.inm)
f,
précoulé en boîtes de Pétri.
1
1
~
i
tt

---

46
Les boties sont incub~es 48 h~ures à 37° dans l'obscurit~ et
les colonies macroscopiques,
correspond&nt ~ des colonies de rever-
tants his + sont dénombrées. La toxicit~ éventuelle du slibstrat est
évaluée par d6terœination du nombre de bactéries Survivan~ss.Les essais
ont été fai.ts en pr4sence
t
1" b
'
.
e
en
a
senee ne
~"
sys~eme metabolique
activateur.
Ré st.: l~a t s~t~·~.§~i..2P
Le· tableau 1 montre l'effet rr.ut.agène des 15 prcdui. ts essay~s
r-i
sur les 6 so-~:ches de Salmonella Thyphimurium utilisées dans l' expé-
~
"
ï
ri~8nt~tion; et le tableau 2 mesure l'effet spécifique de la ~uta­
1
gtnicit~ en fonction du rombre de revertanti ~ his ~ per bette ou
par microgramme. Ces deux tableaux. rapportent les r~sultats obtenus
en pr~sence de syst~me activateur S9 mixe La présence d~ préparB-
1
r
tiür: rr.icrnscf.1ule s'est avérée n{cessaire dans tou~ le:5- cas essayés
saJ:.f da.n~·cE'lui de l'hydrc.;,ylarr..ine.2. et. des cc~r!po~:{s nitrÉs.2.. et ~
1
!1
rOUT
lesquels ULe certaine mutagénicité s'est ~arisfest~e en absence
de tout syst~me activateur.
,
1
!1
Il ressort des résultats que le ccrr.pos~ 3 l'arrino
3 méthyl - 4
1
dipyridyl -
imidazole faisant l'objet de notre étude est beaucoup
1
l
plus actif que le glu·- P - 2 prü corr.me référe:c.ee
(prè., de 20 fois)
J
glu - P -
1 est seuleœent 18 foi~ plus ~~tif que le gl~
P -
2
1
r
dan::: nos teEts.
!
!
L'adjonction d'un méthyle suppl~mer:taire en· position 7 diminue
consid~rablement l'activit~. Ainsi, l'activité du composé 4 est
11
sensiblement égale h celle du glu
P -
2,
ce qui demeure toutefois
1
assez impC'Tta.n~,.
i!1
1
Le noyau lui-m@me ainsi que son dériTé 7 -m6thylé (co~poséB
.!.l.et li) sont pratiçuement dépourvus d'activit~, il:: ne manisfes-
'tent llne certaine act.iyit~ qu'à partir de 1 microg-ramme, dose au-è.elà
1
de laquelle l'effet toxique prédonüne. Ce résuJü.. t.~ rapI,roché au fait
!t
ClUE' les dériv~s du glu - P - 2 méthylés sur les positions 4, 6, 7, 8
l,
!
ou 9 du noyau sont mutag~nes (3) sugg~rent l'id6c qu~ l'activit~ mu-
f
tag€~,€
f
ne procède pa..~ d'une :ol'me Glctiye in;plic:w:..f'..( la fOl-matior...i'
1
une crène oxyde cemme chez le~, :b.ydrocu.rbul'es arC'J11n~ü~ut.·s.
1
Par ailleurs, parai les composés testés,
l'hydroxylamine ~ s'est
1
fl'ontl'ée la plus active (près de 65 fois l'actiYité du glu - P -
2 et
!
ti,

---

47
TABLEAU 1
Effet mutag~ne des compos~s test~s *
Effet
Souches
(TA) d€
s. Thyprimurium
ICom:pos~s
mut.agène
98
100
1530
1535
1537
1538
!
-
lGlu
~
- P - 1
++++
•
•
-
-
•
•
1
j·Glu - P - 2
+++
•
•
-
-
•
•
1
+++++
•
•
•
lt
•
•
4
++++
•
•
-
•
•
0
-
,
2-
++++
•
•
fi
0
•
0
6
++++
CI
-
•
G
l)
&
0
7
+++
•
•
•
{9
&
0
8
+++
•
•
0
•
0
CJ
-
2-
++++++
•
•
Cl
•
•
•
10
+++
0
0
0
G
0
0
11
+
Q
-
-
-
•
ct
12
+
0
-
-
-
0
"
13
-
-
-
-
-
...
-
-
14
-
-
-
-
-
-
-
-
15
-
-
-
-
-
-
-
+ importance de l'effet mutagène
- effet nul
e effet positif sur la souche testée

---

48
TABLEAU 2
Act{vit~ sp~cifique de Glu
P -
1 et de
ses dériv~s sur la souche TA 98 Ge S. Thyphimurium *
1
~
*r,
,
tom:r:oses
Revertants/botte
RevertantsO{g
,
-
fiu - P - 1
196 (0,001 )
19 600
lfllu - P - 2
109 (O·, 1 )
1 090
'1
i
l.
217 (0,01 )
21 700
1
!,
4
11O (0,01 )
1 100
-
1
!
,
1
250 (0,1)
2 500
.
6
259 (0, 1 )
2 590
-
1
Z
450 (1 )
450
8
225 (1)
225
-
2-
702 (0,001)
70 cao
-
10
62 (0,1 )
620
-
11
120 (10.00 )
0
. -
12
110 (1000 )
1
0
-
f
1
1
* Les chiffres entre parenthèses indiçuent la quantit~
en micro-
graœme <le compos~ test~ par l:otte. Le ncmbre de revertant.s spon-
1
tan~s par boîte est.en moyenne de 26 ; compte en a ét~ tenu.
f
1
1
1
1
i

---

49
32 fois celle de l'amine dont elle dérive) les acÉtamides 7 et. 8
et
le dérivé acétoxylé 1.Q. sont pour leur :i..='art d'act.ivité moyenneo Joints
au fait qUE- l'hydroxylamine est active n:ême sans activation métaboli-
que,
CES
ré~ultvts laisèent 10nser qu~ l'hydrcxylation de la fonctior
amine co~sti~ue une ~tape esse~tielle dan~ l'apFarition des propri6-
tés mutagè!:E2. Il est pro babl e, dans c e ca~ que l' hy<.iroxylamin e co:"'l::'-
titue le métabolite ultime. Cette hypoth~se
est confcriée par les
résultats des travauX" de IllE,SIO:\\" (d.A':'lES (9) qui Ohi. T1,ontré CilF le N.-
hydrcxylamino - 2 fluor~n€: ?st égalen:ent un puissant mutag~ne dans
leu::" test et par les travavx de STCCT et al
(10) qui ont montré Ciue
l'incutatior" du N,N -
acétylhydroxyla~irio - 2 fluorbrE avec du cyto-
;
,
sol hépai,iquE cc:~"è.uisait à de l 'hyaro:ylamino - 2 - fluol'èneo
t
1
Il faut no-t,e.r que le ccmposé .:!..l qui est le pro<lui t rnaj E'ur de dé-
1
gradation ~e l'hydroxylamine 9 est sans a~cunc activité mutagène
!
dans le test utilisé;
il en est de mêoe des composés l± et 12 qui sont
f
e:es interrr.édiaires de synH:'È~2e, les précnr,30t:rs dt: noyau Iyrido
t
(1,2 - a : 3',2' - d) im:'daze·le. Cette étude d8moütIe enfin l'impor-
f
tance de la position ~u groupement ~H2 co~paré au glu - P - 1 et du
glu - P -
2 dont la fonction XH
se trcuve en position 2, le compos6
2
l s'est r6v~1~ beauccup plus actif~ Il est vrai~eœblable que la pr6-
sence du YE
en positior: 3 en méta de l'azote intracycJique privilé-
2
!
giE électroniqucffisnt l'activit~ de l'ion nitr{nium qui, en d6!irlitive,
constitue l'eEpèce électrophile ré2,gi~sante 2.vec les mELcrcri'olécules,
f
il est possible égalenent Clue la pl'ésE-nce du [?r('l1y.ement T1ét.hyle en
1
i
Iosit.ion 01'1-]1.0 renforce cette activité COTllLe cela a. ét6 démontré pe,r
1
HECHT et aJ
(11) pour les dérivés':N -
oxydés d(> l'aniline et de ses
ft
analogt~es ~
l
f
1
ir!
1
r
,
1·
1
~
1

---

50
Bi bl iograpb i e deuxiè1!!~J~.E.:ti e
(1) K. Yameiuchi ; H. Zénda ; T. Kcsuge
T. Okamoto et T. Sugi-
mura Gann 70,849,
,(1979)
(2) K. Yamaguchi ; K. Shudo
T. Okamoto
T. St:.girr:ura et
T. Kosuge
Gann 71,
1980
(3) K. Takeda ; K. Shudo; T. Ok&.moto ; M. Nagao
K. w'akabayashi
et T. Sugimura
Carcinogenesis 1, 889,
1980
(4) M. Nagao ; Y. Takahashi ; T. Yahagi ; T. Sugimura ; K. Takeda
K. Shudo et T. Okamo to
earc inogenes i s 1, 451
1980
(5) J.M. Pûzuto ; P.P~ Lau; Y. Luh ; P.D. Meore ; G.X. Wogan
et S •.M. Hecht
Proc. Natl. Acad. Sci.
77, 1427,
1980
(6) E.C. ~filler Pt. J.A.- Miller in "Cher.1ical mui.agens IH'incillles
and methods for their detection"
ed. A. Hollaender, vol 1
P 83
Ne"\\\\- York 1971
(7) B.N. ArnE'S ; 'LE. Dl:.rston
E. Yarr.L~.ald et F.D. Lee
Proc. Natl. Acad. Sei. 70, 2281,
1973
(8) B.N. Ames; J. Mc Cann et E. YAmaf'aki
}~tation l'es. 31, 347,
197~
(9) W. Durston et B.N. Ames
Pl' 0 C • Nat 1. Ac a.d. Sei. 71, 737,
1974
(10) D.L. Stout; J.N Baptist ; Th. S. ~latney and CR Shaw
Cancer Letters 1, 269,
1976
(11) S.S. Hecht ; K. El Bayoumy ; L. Tulley et. E. Lavoie
J. made Chem. 22, 981,
1979

---

51
Troisième partie
Etude des effets biochimiques de l'amino -
3
méthyl -
4 dipyrido
(1,2 -
a
:
3 j 2 t
-
d]
imidazole et de ses d~rivés sur le syst~~e
oxyda~.e à fonction mixte et le cytochrome
P-45Ü chez le rat
Depui s l es travaux de Crarr:er et al en 19·60 (1)
il es t
bi en
établi que le mécanisme d'action des amines aromatiques passe par
la N-hydroxylation de ces composés,
étape qt;.i COJèstitue sans doute
la clé de leur activité (2). Il en serait de mên:e, nous l'avons vu
pot;.r l'activité mutag~ne d~ glu - P -
1 et de ses analogues
(3).
Cette oxydation de la fonction amine se fait entre autre par
l'interm~diaire du système oxydase à fonction mixte localis6 dans
le réticulum endoplasmiq~e (4-6). Thorgevison et al
(4) ainsi que
Bara et al
(5)
ont mOIltré le r61e du cytoctrome P-45Ü dans le mé-
tabolisme de l ' acétylaminc -
2 fluorène et Kiese (7) a passé e.n
revue la liste- des amine~ et des amides aromfltiques quï'sont N-oxydés
in vitro par les micrcsome~ du foie de diff6rentes esp~cc~ animales.
Les microsomes de foie humain sont aussi capables d'induire la'N-
o~ydation de ces amines (8). Le sctéma suivant illustre cette acti-
v&tion des amines •
. ~
~
Ar
N, - - - - - - - - - - - - - , ; > Ar - N"
.
H
microsomes+(O~)+XAnFB
Oh
.
,
~
;~!
Le syst~me monocxygénase P-45ü joce un rôle clé dans le con-
1
l'
trôle et le métabolisme des drogues à l'int~rie~r des cellules (9).
1
D'uDe façon générale l'intervention du cytochrome P-45Ü a pour effet
1
d'introduire dans la structure des substances exogènes des groupe-
f
ments hydroxylés' pour les i-endre plus hydropbyles et par conséquent
1
!
plus facilement ~liminélble~ c'e~t donc ayant tout un rôle d6toxifi-
1
1
f
cateur.
1
î
1
,
Toutefois dans l~ cas des composés cancérog~nes
(hydrocarbures
f!
J

---

52
et amines aroma.tiques)
les métaboli tes formés sont des espèces élec-
trophiles actives
(9-10) capables de réagir avec les macromolécules
cellulaires. On voit donc que le système P-450 joue un r81'e capi tal
~an.s la cancérog.énèse et la ~utagénèse chimiquE- (9-13). Il faut nater
I?ar ailleers que les composés chimiquEs n'agisse-nt pas de la m~me
façon au regard du systèmE- hydroxylasique.
Certains co:nI'OS~S peuvent
exercer un effet inducteur sur le cytochrome P-450 et certaines mo-
nooxygénases qui
er dépendent;
d'autres au co~traire exercert u~
effet dépresseur ou inhibiteur sur ces m@mes systèmes. -Il estévident
que l'inductioL GU la suppression par un composé de
la biosynthèse
de 'certaines' en~ymes impliquées dans le mé-tabolisme des su1:-stances
exogènes peut affecter de façon non L~gligeable l'incidence du phé-
nomène de tu morigèriffie-ou de mutagènese.
Ces différentes raisons nous ont incités ~ étudier les effets
biochimiques de l ' amino -
3 mé~hyl - 4 dipyrido (1,2_ - a : 3 '-, 2'
-
dJ imidazole
en ccmparaison avec
le glu -
P -
2 et ceri.airs déri-
vés, d'une part s~r le cytochrorre P-45Ü et d'autre fsrt sur deux
systèmes enzymatiques qui en._ dépendent.:
la_zoxazolamine hydroxylase
(z.h.ase),
une enzyme ffiicrosomale comrre système inductible typique
et la dÎméthylni tro samine de ~méthylase (DKl\\'"-d-as e) système r érressi-
ble typique *.
Le choix de ces deux systèmes a-été dicté ~r partie far le fait
que les travaux des différents auteurs
(14-16) ont montré que les
inducteurs classiques comme les hydrccarbures polycycliques àromati-
ques ou les barbituriques induisaier-t la biosynthèse de
la zoxazola-
mine hydroxylase avec la même intensité qu'il réprimaient la biosyn-
thèse de la dim-éthylnitrosamine hydroxylase ce qui
impliquerait une
certaine corrélation-entre ces deux propriétés.
MA, térj..e~t Néth,9des
La zexazolamine
(amino -
2 chlore -
5 benzcxazele)
et la dimé-
thylni t~osamine sont des produi ts comrrerciau.x en provenance de KC(K
1
(New York). Les produi ts étudiés
: glu -
P -
2 ...l-,
amino -
3 méthyl
1
1
*1.es terrnE-s "inductible" et 'répressible" sont usés pour di~tinguer
la caracité de la zoxazolamine hydrclase ou de
la dim0thylnitrcsami-
1
ne hydroxylase de voir croître ou décroître Ipt~r quantité par suite
d'une activation ou d'une inhibition de
lel.'r synih(>se de n.Q..':2,.
1
)

---

53
-
4 dipyrido
(1,2 -
a
:
)'; 2'
-
d]' imiclazole .L, méthyl - 4
dipyrido
(1,2 - a : )~.1 2' - d) imidazole ..2.., le dirnéthyl - 4,6 a.ipyrido
(1 ,2 - a : ) ') 2' - d) imidazo 1 e -±-' son anal ogue dimét.hyl~ en position
4,7. ..2-., l'an.alo~ue dimét.hylé en 4,.9 --L, le composé nitré
7
et. son
Yomologue
8
o~t été synthéiisés d'apr~s la méthode décrite dans la
-
première pe.rtie.
Les rats utilisés sont des males de so~cheSprague Davley (IFFA-
CREDO) agés de trois mois environ pesant 120 à 1)0 g et sot~is dès
une semaine avant l'expérience à un régime alimentaire synthét.ique ri-
cha.envitamines. Les produits à étudier sont dissous dans du DXSO
et la solution est injectée par voie intrap~ritonéale à chalue animal
à la dose de 20 mg par kg de poids corporel.
~èlJ)
Rl
CHa
1
2-
A
NH
)
R =R =R =H
2
1
2
3
7
A = NO
~
2
R1=Ne, R2=R)=H
8
A
KO
.2..- R ...R =l{, R =Ne
2
1
3
2
6
R 1=R.:=H, R =He
3
Les effets sur l'activité de la zoxazolamine hydroxylase ont été
d~terminés. selon la technique décrite par Brown (17) et CCUL~y (18) et
basée sur la mesure de la durée de paralysie induite par la zcxazola-
mine chez le rat traité par le produit à essayer en ccn:paraison avec
le témoin qui lui ne reçoit pas le produit mais unique~ent la zoxazcla-
mine. Celle-ci est adrrinistrée aux rats
(traités et témoins), dissoute
dans un mélange de HCI N et de solution iSGtonique
(1
:
) V/V) par
injection intrapéritonéale à la dose de 60 mg par kg 24 heures après
l~ trait~ment des animaux par les produits à étudier. La paralysie
tot.ale avec affaissement dES animaux s' illstnlle entre 1 et ~ mirn.:tes
après l'injection de la zoxazolamine et sa durée est comptée à partir
de ce moment jusqu'à celui oh les rats se remettent sur leurs pattes.
L'activité inductrice exercée par Jes prcauits essay€s
sur l~
synth~se de la zoxa.zolamine hydroxylase est d'autart plus irande que
la durée est plus courte par rapport à celle dE~ té~oins. Inverse-
ment plus la durée est longue par rapport aux témoins plus grande est
l'activité inhibitrice.

---

54
L'action sur la diméthylnitrosamine hydroxylase a été détermi-
née selon la technique de Friedffian
(19) en dosant la quantité de
fo'rmaldE5hyde formé aprè s 1 heure d'incubation d'un gramme d' homogéna t
de foie frais ttaité par de l!acide trichlorcacétique k 10 %.
Les animaux'sont exanguinés sans anesthésie 24 heures après
traiterrent,
leurs foies prélevés,
pesés et homogénéisés par centri-
fugation k 10 000 g. On utilise la fraction post m~tochondrialeo
Le dosage des protéïnes da~s cette fraction est fait selon la
technique de Lowry et al
(20)0 Le cytochroœe P-45Ü est m~suré ~elon
la technique de Mc Lean (21)
en se basant sur l'intensité du pic
d'absorption de l'homogénat de foie,k 450 nm. Les résultats sont
exprimés en nanomoles par gramme de foie frais.
Résultats:
Les résultats des essais sont rassemblés dans les tableaux
1
et 2
Effets sur le cytochrome P-450
Les composés se divisent en deux groupes distincts :
a) Ceux qui exercent un effet dépressif sur le taux de cytochroma
P-450 par rapport k la quantité mesurée chez les animaux témoins
non traités. Ce sont les ccmposés -1-, ~, -1-, ~. C'est k dire
'ceux porteurs d'une fonction- amine ou d'un groupement nitré.
b) Les composés non fonctionnels ~,-±-, -2-,
6
exercent a~ con-
traire un effet indu~teur sur le taux de cytochro~e P-450. On notera
que c'est le composé ...i... porteur d'un méthyl en position 9 qui est
le plus aetif.
( ' -
L'action de ces différents produits reste négligeable tant sur
1
la croissance du foie des animaux trai tés que sur la concentrai,ion .
en protéïnes par uni té de poids de tissus
(les valeurs de P:>
0,05
étant non significatives).

---

TAnu: 1 .'/;
---_."
A- Eff,!L~..Y~'_.2f diEyrid.c ..;._imidazo
B- Effe.s:i:2-.2L d.i.I?yrid 0 - imi!1 azo
c- Pre t_e..i!!§._conj. cnt. p~...:r;__l i ver
d(~ri-'::'ati~~~EJ2.!:.E~Lj;i~
c16r j vaj;.i.Y.-9Lqn the 1 i_\\T.9L..K!.2lv th
cyiochrome P-450
--..:...-
_._.,--
-,-,~_.-:----
Pl'otej.ns concen-
p
~ornpounds J),)/I/g liver
~ of rep:-
p
Com})ounds
Ijivcr weight
P
Com})ounds
nverage(g)
tration
ression- or
(mf,:/g à e foie)
inùuction +
Contl'ols'
5,3I9tO,7(6)
Controls
55.6 ± "1,48(6)
~ontrols
30,52t4,O(6)
l
4,857: 0.4(6)
>0,0:) (NS)
-
<0,01
l
56,8I"!: 9,7(6)
>O,O]\\lS)
T
20,2,11: 2 ,5(6)
_33,68
-'.
2-
4 ,ï27 ~ 0,5(6)
>0 , 05(NS)
.
_32,67
<0,01
2
56,8I;t 9,9(6)
2
2C,5?:t3,6(6)
-
>O,O'J(NS)
-
3
5,98 ±. 0,7(6)
>0,05(riS)
>0,05(NS)
3
'57,871:5,1(6)
>O,O'JWsJ
)
33,22t5,I(6) .8,80
.J
-
i -
6,19 !. 0,9 (6)
::0,01
4
60,34:t 5(6)
>O,OS(NS)
If
36,0?t5,ry(6) ~I8,02
0, OI<P<O, 05
-
_5_
6,36 "!: 1(6)
<0,01
<0,01
5
')Q,62 t 4,4(6)
>O,O'·(NS)
:5
]8,83!4,'{(6) ... 27,2"1·
--
6
6,625"t
1(6)
<0,01
<0,01
-
6
61,6 !
5 (6)
>0, o· (NS)
6
46,o6±6,2(6) ...50,92
-
-
7
4,50 t
O,5(b)
::0,05
<O,O:ANS)
rr
57,95:!: 10,1(6) >o,O:{NS)
7
27,8"! 4 ")(6) _8,91
5
-
-
8
4,865 t 0,6(6) >0,05(NS)
8
21,76~2,8(6) _28,70
<0,01
8
·58,22;t II (6)
:;.(),O;{NS)
-
g:
*The number of each cclumn repl'esent. the average follo"ed by their sta,ndard deviat.ion ,d th
.
,
the ,number of rats in parenthesis • P is the probability issued from the stuc1cnt "t" test. Any P
value above 0,05 is ccnsidered aE no significant (NB)
l._ ~
+
~~_,""""""~._...
,., ..."._.,',.".,.....,.........~' •.".,"''"''.,...,,..~_,''''_ .•'''..-.-,......_'~..'"'.' """",,,_,,,,,,,,,,,~,,,
,",.~,u·."~~.,,,,,.,·~,."'" ._.,.. ,.,~,·.~'",-~~"'~,!'",~·~_",.'i~.....,.'"...,.-:,'..."<,.,.-=·•.,,--c,,;'"".."'..~" ...C',..,_.,.,,"',.•_....~.,..,....,~..._ ..~.__.-~e-.,..,."""~~".,,.,_.".,',.,._.~....,.._·'"""'".....~"·..''''''''·.''r''';:r'.~.,_·,·-,~.''' .....,,,...,'-._.....·,··.··,~-'"~'''.-'.,v.-.~·,.··.·~-'''''"''~"'.''·_,, ." ,"<"". __i.'.~·_.,•."""',·.~_,,.,,~. ""'.~.•,o,,..._..,'~,~,.•~~·._,·"',·._ •.•,......-,••,,--.

---

TAilLE 2 *
~The number 6f each column represent average given with their standard deviatibn
(JI
folloved by the number of rat in parenthesis
• P is the probability issued from the student
0)
"t" testa
~~·"""""'''''~
~_'_'''''-'~~·_'~_'''.M;_",'·''''"''''~_'"".~"""".,.,
~,,,,,,,,,,,"",,-,,,,,,,,",,.....-.~..,.."r" '_~""-'">~'"";....,"".,n''J."o'''''.k~'''''''''~~''··''''''''',",,,T''-'''''=".· ••"',,~.'",·,"·"" ...N_'~·•.··".•"•.,·~'·_•. _·_..,,..._;..,".._~ ....~_~"'~'_._.,,,. __'.=,,..,...."''''',.~ .....~.?'' '_..._ .•••_ ••. ~._.~,_ ·,.."·~·_"·.-=.,- ..,.,..........",..".,,,••·."~.,,"..,~_,...,...;,_,",."'~,m"._.~""~'''"'';~"',,...,,''''''-"''''''''',~" ......'...,.~'''__,•.<,..,.,~~._~ ....,.._w_...._._...
._.._,_."

---

57
Effet sur la bio synthè s e de la zo~,azol~rr:in e-ÈY;) roxy las e
Cet effet a ~t~ d~termin~ in vivo. La validit~ de la c{tbcde
repose sur l'~tude de Couney et al (18) qui ont montr~ qu'~l existe
un parall~lisme ~troi t
entre l'augmenta,tien du taux de zcxazolamine
.
"
~ydroxylase d~terrrin~e in vitro sur un homog~nat de foie et la di-
min~tion de la dur~e de paralYsie induite par tous les prceuit~ es-
say~s et vice versa. Un avantage du procéù~ est la prise en compte
de la totalit~ de zoxazolarrine hydrox)"lase induite dans l'a~imal
i l est connu en effet que les enzymes oxydatives d~toxifiantes
existent dans une large vari~t~ de tissus autrffi que le foie
(22)0
Les composés ~tudiés se divisent ~gale~ert en 2 groupEs
:
a) Ceux qui inhibent la synthèse de la zoxazolamine hydroxylase. Ce
sont les composés à grouperrents fonction:r:els
1
,
2 ,
7 ,
8 .
-
- -
b) Ceux qui,
au contraire exercent un effet inducteur • Les e00posés
.
3 ,
4 ,
5,
6 . Parmi ceux-ci c'est ercore' le ccnpcsé
6
qui
- - - - - -
est le plus actif~
~ffet l'll.!'. Ja_.1?i-.2.§.Y!1.:th~~de-la.'y.iJ!1~thYJ.nitr 0.E am il] e d~méthyl aSL
Noes retrouvons les m@mes deux groupes de
composés
:
le groupe
(a) qui exerce un effet fortement
inducte~r et le ~rcupe (b) qui
exerce un effet r~presseur.
Il est à remarquer que l'effet inducteur exerc~ sur la d_im~thyl­
nitrosamine d~m~thylase est beauceup plus intense que l'effet inverse
exerc~ sur la zoxazolamine ~ydroxylase et inversement l'effet répres-
seur sur la dim.~thylnitro samine dérr.éthylas e et pl us fai ble (lue l'effet
inducteur de zoxazclamine.
Discllssion
Notre ~tude a montr~ que par leurs effets sur les trois syst~mes
uti li s ~"S cytochrome P-450,
z.h. ase et m:X-d-as e,
les dEfri v~ s du dipy-
ridyl imidazole étudi~s se divisaient en deux groupes distincts
a)
Ceux qui r~priment le cytochrome P-450,
inhibent la z.h.ase et
induisent le ,"r~pressible" m·1N-d-ase. Ce sont les déri....-és a::-,inés et
ni tr~s
1 ,
2 ,
7 ,
8 .
---- -
-

---

58
b) Ceux qui exer~ent l'effet inverse
induction du cytochrowe P-450,
induction de la zoxazclamine hydroxylase,
répression de là DHN-d-aseo
Ce sont les dérivés non fonctionnels mais porteurs de groupements
mét.hylés.
L'activité augmente quand on passe de un à deux méthyles et varie
de façon importante avec la position de ces deux m~thyles. C'est le
composé substitut ~n position 4 et 9 qui s'est montr~ le plus actif
dans tous les cas.
Le parailélisme des' effets exercés par ces deux groupes de com-
posés issus d'une m@rne famille est ici frappant
et rejoint leE obser-
vations faites par d'autresauteurs
(14-16)
SUT
le parallélisme exis-
tant entre la z.h.ase
(syst~me inductible) et la D~N-d-ase (syst~me
répressible) dans leur réponse à l'administration d'inducteur tels
que les hydrocarbures aromé! tiques,
les biphényl es halogénés 'etc 0.0
Ces deux types de propriétés varient de façon similaire en fonction
de certains paramètres
: tai,lle, géom0trie ou planéité de la molécule
et seœbler:t obéir aux mêmes lois de régulation génétiClue
(23) mettant
ainsi en évidence une relation miroir-image entre l'induction et la
répreEsion des de~x syst~mes enzymHtiques (24)0
Le cytochrome hépatique P-450 et les monooxyg6nases qui en dé-
pendent interv"iennent dans la détoxification des substa'nces exog~ne~.
On peut préEumer que l'action toxique d'un composé sera d'autant plus
grande que le composé est capable d'inhiber la production ou le travail
du cytochrome P-45Ü.
L'étude de· la mui.-agénicité des dérivés du dipyridy.l imidazole a
montré que les d~rivés ne portant pas de groupe~ents fonctionnel~
étaient pratique~ent d~pourvus d'activité mutag~ne alors que les déri-
vés arrinés
1
et
2
et nitrés .1- et l
étaient d€s
puissants
mutag~nes.
Il découle de l'étude faite de nos produits une ccrrélation
entre effets bioçhimiques ~ur le s~5t~Ge hydrcxyla5~~ue chez le rat
et pouvoirs mutag~nes vis à vis des bactéries qui mérite d'être notée.

---

59
Bibliographie 3ème partie.
(1)
J.W. Cramer, J.A. Hille'C' ei E.C. Miller
J. Biol Chem
235, 885,
(1960)
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th
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September
Baden
p 187
ii
1
1
l
1
1
l

---

61
QUATRIENE PARTIE
Action de l'amine e~ de ses m6tabolites
in vitro sur l'ADN.
Intrcduction
,
Il est'co~nu que la canc~rog~nicit~ des amines aromatiques dans
l'organisme d~pend de leur conversion en hydroxylamines ou m~tabo­
lites proximaux (1). Ces hydroxylamines subissent ensuite une m~ta­
bolisation enzymatique qui les transforme en sulfate ester et NN'
ac~toxyac~tylaIT!ine comFosés très r~actifs appelés cancérogènes ul-
times
(s6h~ma 1). La dernièr~ étape
de ce métabolisme conduit k un
composé électrophile l'ion nitrenium ou le carbocation qui réagit
avec les sites nuclécphiles de l'ADN comme cela a pu être mis en
évidence avec l'acétoxyacétylamino fluorèue
(ACO~\\F) à la fois in
vivo et in vitro.
AH
)N~AC
+
)N'R
...... R
)N-R
)~NR
.>
-OAC
>
#
.......
<:
\\+H
Schéma 1
Hashimoto et al
(2)
ont rapporté que le glu-- P -
1 se fixait
également sur l '.ADN de façon covalente pour denner un produi t
de
substitution sur le C -
8. Selofi ces auteurs,
le métabolite ultime
serait non pas l'hydroxylamine ccrrespondante mais son dérivé d'o-
.acétylation.
En 'vue de l'étude de l'action de l ' al1'ino -
2 méthyl -
4 dipyrido
(1,2 -
a
: 3'] 2'
- dJ
imidazole, nous avons entrepris la préparation
du dérivé N,~
acétox,yacétylé correspondant en al:IT.ettant qu'il J.)ou-
vait constituer un modèle valable de m6tabolite par r~ference au tra-
vail de Hashimoto ·d'une part et à ce que l'on ccnna!t d'autre part
sur le mécanisme d'action des amines aromatiques.

---

62
Le sch~~a 2 indi~ue la voie utilis6e pour acc~der ~ ce corps.
~. I~
~N
16
bC
Gché".B, 2
oCH::;
Nous avons pc iso].er l'hydrcxylamine 14 en faisallt une réduc-
tion méLagéE' è.u è.éri yé ni tré en. prfJS€ECe
d·e· H S et de la triethy-:
2
lamine selon la pr~c~dure d~criie pour N - Oil AF (3). L'hydrcxylamine
.obtenu.e est ur: composé très peu stable CJ.ui se décompose rapid~ment
h l'air en diazoxy corr€spon~ant, aussi la m~thode qui nous a sem~lé
la plus cOlr.r:lode et la plus rentable est) celle d.écrite pa.r J .G. v!esira
(4) ~lle I>E':':'::.et d'obten.ir le dériYé monoacet,ylé 15 sans iso~_er l'hy-
àroxyJanine.
On .fait UlH: rudusi:ior.. p<:riif>lle èu cCfllposé 1..l pê"r acticn
de l'hyàrate. d'hYclrazine en ~:résence de cr.arbol' raJladié ~uiyie d'
.une a."cé tyla t i on en llrés ene e de ch lorure d' ac étyle. Le d.ér i vé n:ono-
acétylé 1.2 irai té er, rd.lieu sodis.ue par de l ' a.nhydricle acetique ccn-
duit à l'acotoY'y2.cetylamir..o -
3 :néthyJ -
4 djpyriCo 0,2 - a : 3:' 2'
-
d]
imid~zole do~t la str~cture a été vérifiée pa~ R.M.N. et 1.R.
1
!
après purificat.icn en cr.romatograpJ-:ie sur cOl:che épaisse.
Les
spec-
1
tres U.V.
OEt
été réalisés .sur ur.. specfrof.lètre Cary 14. Les spectres
1.R. sur UL appareil Perkin Elmer 297, les spectres R.M.~. sur un
appareil Hitachi Perkin Elmer Ry 24B.
MatériE.·ls et ~léUod.es-
Préparation Qes ~é~lites
1) K h~.2~U:'J.ami~.::_~_méth'yl - 4 diF2'jA~.
t
i'L"L.=-.?-_: 3 ') 2' =_ 9J.-Jrr._isl~zo)~_ ..LJ1
f.
1
i
Dans une solt:tion cor.tE:nant 3 g de d~rivé ni tl'é 1..l., 150 ml de
D.M.F.
et 90 nll de triethylamiut on fait pa,sser un ccurant o.e R S
2
1
f
pe~eant JO ~in~tes. Apr~s UL repos de 24 heures ~ 0 0 , on reprend
le mélange rar l'acGtate d'éthyle:
la,-é€
avec de
l'eau ccnter.aht
1
1
des traces d'hydrcsulfite de sodium
(0,001 %),
la phase organique
est séchée rapiderrent avec Na S0
et réduite sous vièe à
25°
jusqu'à
2
4
début de pr~cipitation. Le pr~cipité est essoré rapiderrent lavé à
1
1
,
t

---

63
l'hexane et s~ch~ dens un ~eEsicateur sous vide en pr6sence da CaC1 2
à 5°.
Le spectre lJ3l. de ce rTvèllit
(fig 25) dans l ' ~thanol donne des
maXlma à 237,
297,
310 et 370 nm.
Ce pr~duit est tr~s instable il se transforme assez rapidement
en d6riv~ diszoxy correspon~ant. L'~volution de cette transformation
a pu être suivie en U.V.
(fig 25)
2) f..r é pE2:"--a.ti-S~---.S1lL) -,-)' "":_cl i a 2: Q:'-Y _~j_nl éthL\\
4, 4'- d~yridyl imidazole
On met 1 g de produit nitr~ 11
en solution ~ans de l'~thanol
aqueux
(77 ml d'alcool pour 100 ml de solutio&). On y ajoute 0,4 g
de CaC1
dü:sous danE un ml d' eéW plis 1 g de zinC' en foudre
• On
2
porte CE' mélange au reflux pendant 1 h30. Après· refrcidissemeFt on
essore un précipi té qui recristallise de la pyrid~_ne anhydre en un
produi t
orange foncé.
FO >
di pyridc
G ,2 - a
3 " 2'
dl imide,zole:
On met 3 g de d6riv~ nitr~ 11 dans 75 ml de THF 0& Y ajuu~e 750
mg de charbon ralladi~. Ce mél~nge ~tant agit~ vigoure~~ement k 0° on
y ajoute goutte à gOlJtte 3 ml d'hydrate d'hydrazinE dE: telle r.1BI'_ière
que la temp~rature he d6passe Fas 10° et on maintient sous agitation
pendant cin~ minut 'es. Puis après,
on y ajoute 4,5 ml de tri~thylamine
puis 12 ml de chlorure d'ac~tyle dans 36 ml de THF en 6vitant ~ue la
!
t,eœpératul"'enedér·a~se 30°. On laisse la réaction ~.. tcmI,6rature ambiante
!
pendant une heure" puis on ajoute deD~ le milieu r~~~tionnel une so-
j
r
lution satu=~e de bicarbonate de soude et on agite vigoureusement
1
,
pendant 30 minutes,
ensuite on filtre et extrait le filtrat àl'ac~­
f
tat'e d' éthyl~, séché sur Na S0
et r~dl1it ,sous vidE:. On essore le
2
4
1
.r~sidu et le g~che S~~S vide en pt~sEnce de CaCl, ~ 5°. On obtient
"-
un prcdui t
j aUlle qui 'fond à. 1 20° •
1

---

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o
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---

64
Spectre U.V.
(fig ~6) dans l'~thanol
max ~ 250, 270, 350, 365 nm
L'analyse du spectre I.R. du cOlq:'osù l i (.fig 27) dODre les banè.es
'sui vantes
3100
-1
crr.
correEpondant'aux vibrations d'allongement, de C
H (noyau)
-1
2920 cm
cOI'respondant aux vi bra ti onE; d'allongpment de C
°
-1
1635,1530 cm
correspor~d.ant av.x vibrat.ions d' a-llongRm ent de C = C con:ugœ
1500,1440
-1
CID
correspondant au.x vibratior..s d'allongerr~nt de C
C et.
C = N
-1
13.85,1270 cm
·C 0 rre sponéian t
aux vibrations d'allongement de C - N
-1
1235, 1075 cm
correspondant av.x vibrations dE déforma t·ion
C
H (cycle)
-1
965, 750 en:
correspond.ant aux vibrations de défonlation
C - If (carac-
-téristique du noyau pyridine)
Le spectre R.M.N.
(fig 28) a ~té réalisé dans le DMSO référence
TIfS. Ce spectre présente les signaux suivants
2 singulets ~ 1,87 et 2,55 ppm correspondant aux signaux des protons
CH3 •
_
1 singulet h 6,93 ppm cor~espondant
au proton H •
2
1 massif s~tendant sur 7,17
7,62 ppm rEpr~~entant
les signaux
des protons H
et H •
8
6
1 massif h 8,44 pprr corresp~ndant au p~oton H •
7
1 doublet déblindé h 8,72'ppm correEpond&nt au prcton en p~ri H •
9
1 singulet k 9,54 ~prr ccirespond.ant au Froto~ OH.
4) ~:!LN.L-~.§j'.2.EY~s:.§_t;Llamino-=-Jm~tbYl--=-.1
§-ipv!J-Ao_CL..2_=...a-=_.34.- 2' =-.fl).IT!ide.7.~~:
16
!
,
Dans un erlen de 50ml dans lequel on fait passer un ccurant d'
,
!
~zote, on dissout 1g de dérivé monoacétylé l i da.ns 25 ml de soude
!
0,5 N. bn y ajoute 0,4 ml d'anhydride acéti~ue et on agite pendant
10 minutes k t O ambiante ensuite on extrait h l'ac~tate d'~thyleJs~che
rapidement avec Na2S04 , réduit sous viee ~ 25 0 il se for~e un pr6cipité
1
1
que l'on essore et lave h l'hexane. OG obtient cr~ prodcit
~
j2Ul1C
clair
~ui fond h 125 0 -130°. Ce produit instable se transforme en U~ rroduit
jaune. foncé dont le spectre U.V. est différent, de celui du produit .l§..
1
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---

65
Les caract~ristiques physico-chimiques du produit frafchement
isol~ sont les suivantes.
Le spectre R.M.N. du composé 16 (fig 29) a ~t~ r~alis~ dans le
DMSO r~f~rence T.M.S.
L'analyse de ce~ectre donne leE d6placement~ chimiques suivants
pour les diff~renis protons
3 singulets correspondant aux signaux de 3 CH - _
3
un premier singulet vers 2,17 ppm.
un deuxième vers 2,30 ppm.
un t.roisième vers 2,60 ?pITl qui correspoLdrait au CH
aromat.ique.
3
un massif vers 6,97 ppm d'intensit~ 1 correspondant au proton H -
2
-
un massif s'~tendant 7-7,59 ppITl d'intensit~ 3 et repr~sentant les
signaux des protons H8 , H6 et H -
7
un dOl.::.blet fortement. déblind~ à, 8,72 ppm correspondant au .proton
en p~ri H •
9
L'analyse du spectre I.R.
(fig30 ) donne les bandes suivantes:
-1
3100 cm
correspondant aux vibrations d'allongement de C -
H (noyau)
-1
,2940 cm
correspon~an~ aux vibrations d'allongement de C
H (CE )
3
-1
1800 cm
correspondant aux vibrations d'allongement èe C
0
1
o
f
(N" -
"C - .CH3)
-1
f
1680 cm
correspon~ant aux vibrations d'a~longement de C = 0
1
0
i
(N
"C
CH )
3
1
~
1640,1600
-1
cm
correspondant BUX vibrations d'allongement ce C = C Conjuguf
-1
1500,1440 cm
correspondant aux vibrations d'allongemeht de C
C , C = N r-
1370,1260
-1
I
cm
correspondant aux. vibrations d'alloLgement de C
N
t
-1
1 250, 1000 cm
corr-espondant aux vibrations de d~forma-Lion
C
H
,
1
(cycle)I..•
965, 650 cm-
correspond.ant aux vibrations de déformation
C
H (caraci
-t~ristique du noyau pyridine)
1
1
La pr~sence de deux bandes C
0 l'une à 1800 cm-
pouvant être
1
attribuée au groupement N -
0 - CO
CH
et l'autre' à 1680 cm-
pou-
t
3
vant être attribu~e au grcupement amide N - CO - CH} apporte la con-
f
firmation de la structure postulée
(5-7),
Spectre U.V.
(fig 31 ) .
max: 262, 275,
}49 et 362 nm.
1
f

---

J
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!1,ll,
1
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L---..----.--..

---

66
Ré2,eti9'!!'-_~'y"ec l"ADK-!latif
Nous avons utilisé de l'ADK de thymus de veau en proy'enance de
Sigma.
On dissout 2 mg de canc~rig~ne dans 1 ml d'éthanol dans un tube
à essai.. Or. y ajoute 4 ml d'une solution d'ADl\\- natif en SGluticŒL dans
3
2
un tampon de citrate de sodium 210--
M et chlorure de sod.ium 10-
M
(pH ~ 7). On fait une inc~batiGn de 12 he~res ~ 37° dans l'obscurit~.
Apr~s refroidissement on y ~joute 1 ml de phénol et 0,5 ml de crlor~re
de sodium 1N. On agite vigoureusement pendeni, 15 minute~ puis on cen-
trifuge pen~ant 40 minute~. On recueille la phase aqueuse. aL la met
dans un boudin et on dialyse contre un tampon citrate de sodium
210-~et chlorure d.e sodium 10-2 N pendant 48heu.res, en renouvellant
le tampon toute~ les 8 heures.
Le spectre U.V. de cette solution d'AD?\\' Ir.ontre ur~e mod:'fication
de la région qui s'étend de 400 B, 300 '71<1)L,
ce qui laisse supposer
qu'il y a réaction entre l'ADX et le cancérigène.
f
Il :res te à dét ermin er le taux de !Lod ifi cation et les caractéri sti-
i
1
ques pr.ys i co-chimiques de l'ADK modi fi é
f
0
Ce' travai] es t ae tuell ellll?nt
en cours.
1
~.
r
1
f

---

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1
f
~
1
1
!
t
1

---

68
CO-N CLUS ION
-------------------

---

69
Les résuLtats exposés dans Les pages qui précèdent sont. Le
fruit d'une étude effectuée dans Le cadre des recherches menées au Laboratoire
sur La cancérogenèse chimique._ L'objectif de ces recherches est d'essayer de
cerner et de comprendre Les phénomènes qui entourent Le décLenchement du pro-
. .
cessus de ca~cérisation à'La suite de L'agression de L'organisme par un compo-
sé chimique exogène.
Une hypothèse Largement admise aujourd'hui, bien que faisant
L'objet de queLques controverses, attribue Les évènements primaires de La
cancérisation à des mutations somatiques. Ces mutations seraient La conséquence
de dommages provoqués chez certaines macromoLécuLes bioLogiques, notamment
L'acide desoxyribonucLéique, p~rteur de L'information génétique, par L'attaque
du cancérogène chimique. PLus précisément, eLLes pourraient être Le résuLtat
d'une non-réparation du DNA endomrnagé ou des erreurs commises Lors de La ré-
paration de ceLui-ci par Les enz~nes de reconnaissance.
En tout état de cause, vu sous cet angLe, Le phénomène de
mutation sembLe jouer un rôLe capitaL dans L'étape d'initiatiC!n du processus
tumorigène. A ce niveau, un probLème non encore résoLu se pose pour La compré-
hension de cette étape d'initiation, c'est La nature des reLations qui exis~
tent entre L'importance des défauts'Locaux induits dans La doubLe héLice du
-DNA et La structure du composé chimique ~~cteur. Une meiLLeure approche de
-ce problème ne .pourrait que cLarifier ceLui de La corréLation entre mlltagéni--
cité et cancérogénicité.
De toute évidence; La connaissance du rôLe et des mécanismes
d'action des agents cancérogènes potentieLs est nécessa-ire pour La réaL'isation
d 'w~e poLitique prophyLactique rat;ionneLLe contl'e Les risques 'inhérents à La
présence de no~breuses substances chimiques présentes dans notre environnement
(on estime que 60 à 80 % des cancers
humains sont provoqués par ces substances).
On sait del?uis :ong-cemps que beaucoup de ces substances pren-
nent naissance au cours de L. con:~7usticn incompLète de cel'tains pl'oduits nat.u-
reLs (cf J. SclimeLtz et D. Hoffman, CarcinoÇJenesis Corrrpr. SUl'V., L976, 1 J 225).

---

70
Le cas des dérivés de La houiLLe et des produits de pyroLyse
du tabac est aujourd'hui bien connu. Moins bien connu est qeLui de La combus-
tion incompLète des aLiments. Or, iL a été montré au cours de ces toutes der-
nières années que certains aliments habitueLs de L'homme, viande de boeuf,
poisson, seiche, case~ne et certains protéines et acides aminés essentieLs
conduisaient par pyroLyse à La formation de produits fortement mutagènes.
Cer~ains de ces produits on~ été isoLés et identifiés.
Parmi eux, deux ont reter.u pGrticuîièrement notre attention
.
en raison du'fait, d'une part, qu'iLs se forment aussi bien dans La combustion
du poisson (sardine), de La seiche et de La case~ne que ~e ceLLe de L'acide
L-g!utamique, un acide aminé que L'on rencontre dans de nombreuses protéines
et qui rentre dans La composition de pLusieurs médicaments et d'additifs aLi-
mentaires, et que d'autre part, i.Ls se situent parl?1i Les comYJosés Les pLus
rrrutagènes actueLLement .connus L'amino-2 m{;;hyL-e Ci':Pjl,ido
[1,2-0.: :3',2 '-dJ
imidazoLe appeLé Glu-P-J et L'amino-2 d~yrido [1,2-0.: 3' 2'-d-7 imidazoLe
dit .:lLu-P-2.
En vue d'approfondir Les relations entre La structure moLécu-
Laire et Les propriétés biologiques, n::;us a:1ons. !ocal.isé notre étude SUl' une
amine isomère du GLu-P'-l, L'amino-3 méthyl-4 d1,~:;.yrido [J,2 '-a: 3,2 '-d]
imidazoLe et pLusieurs de ces dérivés.
Cne partie pure'""":ent chimique de n~-:::re travail a cons1:sté à
mettre au point des méthodes d'accès adéqua-::.es à ces composés. Le noyau'Lui:..
même constitue un hétérocycl.e nouveau 30nt nous avons réaLisé pour Le première
-fois La synthèse. La nitration de L'hétérocycLe a été réaLisée par une méthode
originaLe que nous avons mise au point. Nous avons, en outre, synthétr:sé Le
N-hydroxyLamino-3 méthyL-4 c~l.·)yrido-im~dazoLe ainsi que Le dérivé N,N-acét?xyL-
fl
·acétyLé. correspondant. IL s. 'Qgit ?à d. 'v.ne s~mthèse délicate que nous avons mise
1
au point après pLusieurs ten-';atives en raison d:i. caractère fortement instabLe
de ces deux composés.
1
t
La' pureté et La structure de ces diJ~érents produits ont été
!
vérifiées par La conjugaison.de p:usie,œs techniques physico-chimiques:
chl'o»;atographie, spector:éti'ie d 'absorpr;ion, RMN et pa.r L'anâLyse centésimaLe.

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Sur le plan biochimiq~e~ nous avons étudié la mutagénicité de nos
produits~ leurs effets biologiques sur le système hydroxylasique à fonction
mixte chez le rat~ leur interaction avec le DNA.
L'étude mutagène~ menée selon la technique d'A~es sur différentes
souches de Salmonella thyPhymurium~ en présence et en absence de système
métabolique activateur~ a permis ~ noter plusieurs faits intéressants:
a} l'hétérocycle lui-même est dépourvu d'effet mutagène aux faibles
doses. Cette observation laisse penser que le mécanisme d'action du Glu-P-l
et du Glu-P-2 n'implique pas la formation d'un intermédiaire époxyde comme
dans le cas des hydrocarbures aromatiques ou de certains hétérocycles
apperents .
b} le dérivé aminé en position 3 est beaucQup plus actif que le
'1
Glu-P-2. Cette activité varie aVec le nombre et la position d6s gpoupements
méthylcs~ observation en accord avec celle faite~ par ailleurs s par Takeda
et al. La présence du méthyle_en position 4 augmente l'activité mutagène en
1
raison ,sans doute du fait qu "il tend à renforcer le caractère électrophile
1
de l'ion J1dtrél7"/:wn et plus probab lement perce qu'en masquant la po si tion
4~ il di~inue nettement les possibilités de dégradation de l'espèce réagis-
sante en produit 4-hydroXl/,é ina_ctif.
1
c} le dérivé N-hydroxylé s'est montré extrèmement actif {plus de
32 fois l'activité de l'amine dont eUe dél,ive}. Cette mutagénicité se mani-
feste même en l'absence de S!) mix alors que le dérivé N-N-ac~toX1J acétyl~
requiert le système _activateur et ne laisse appara-ttre qu'une activité moyen-
ne. Ces résultats peuvent signifier que la N-hydroxylation constitue une éta-
pe essentielle dans l'apparition des propriétés mutagènes des amines de la
série du Glu-P-2 et que la N-hydroxylamine correspondante constitue sans doute
1
le métabolite ultime dans le mécanisme de mutatio~.
1
d} le fait que la mutagénicité de l'amino-3 méthyl-4 dZpyrido-imidazole
s'exerce vis-è.-'/:is de toutes les souches de S. Thuphurr:'..œiw'T! tes "!Aes sUGoèrent
...
..
v'"
que la fixati~n de ces,co"'Posés (ou ~e leurs metabolites) svy le DNA se fait
avec substitution sur ,les paires de bases et insertion à l'intérieur de la
double hélice provoquant des déformations locales et des l.J.sions p:us ou

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4
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moins réparables. Cette hypothèse est confortée par les travœ~ de Scribner
et al (J.D. Scribner, S.R. Fisk et N.K. Scribner, Chem. Biol. Interactions,
1979, 26, 11) sur le mécanisme d'action des amines aromatiques c~ncérogènes
et une obse~Jation récente de ImamUra et al (M. Im~ura, K. T~kc3~, K. Shudo,
T. Okamato, C. Nagata et M. Kodama, B.B.R.C., 1980, 96, ~11) qui cnt conclu
à la suite d'une étude en dichro'tsme linéaire que le Glu-P-2 et 2e8 analog'.A.es
méthylés se fixaient par intercallation sur le DNA.
Un~ approche possible dans la compréhension du mécanisme d'action des
agents cancérogènes potentiels consiste à étudier leur cc~Oy.~e~2y.~ vis-à-vis
du système hydroxylasique à fonction mixte chez l'animal. Ce système joue un
r()le important notamment dans la détoxification par hydrc:::yla-'::i01: C!.es composés
chimiques introduits dans l'organisme. Mais il arrive q'<A.e ccr-;ains composés de
transformation scient eV~-~8mes plus n?cifs pour l'crgan~s~e ~uc :~S p}'eduits
.
.
de départ. C'est le cas des· cancérogènes chimiques (hydrccarb"..>.l'es et arrines
aromatiques notamMent), qui ne doivent leur activité indésirable qu'à leur
interaction avec en particulier le Cytochrome P-_450 et lf?s hy,;'roxylases qui
lui sont rattachées dont C!.écoùle leur tranE:foY'mation en ecpèc,,~s électrc?hiles
capables de réagir avec les macromolécules cellulaires.
Un troisième volet de notre travail a consisté cene à {;~~ier les
effets biochimiques de nos composés sur le cytochrorr:g hé;;atiq::2 ?-.;SO crzez
le rat et sur deux systèmes enzymatiques qui lui sont litJ.s la zoxc::.olamine
hyâroxylase connue pour être un système inductible et la diméthylnitrosamine
déméthylase, système répressible typique.
Cette étude a perrrlis de diviser les cOT'7Posés qu,- en l'nt f,-:.itl 'objet
en deux groupes :
1) Les composés porteurs d'une fonction aminé ou. d'un groupement nitro:
ils répriment le cytochrome P-450 inhibent la zoxazoZamir:e hydl'oxy:'ase et in-
duisent la dim~thylnitrosamine de;·:.f:thyl.:::.sc.
2) Les composés non fonctionnels,
l'hétérocycle lui-~~me et ses déri-
vés c-mé;;hyUs : ils pl'ovoquent l'induction du c"Jtoc';;l'ome~ P-4; J, c~-:le ~;e Î-a
,
zoxazolŒ~;ine hydroxylase, et la répression de la dirr.:-thy>itr~'sami'::3 d~~':Jthyl-
lase.

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Les deux groupes de composés ont donc des effets tout à fait inverseS
sup les trois systèmes oxydases essayés.
On peut noter une corrélation entre les effets respectifs de ces
dev.x groupes et leurs pouvoirs mutagènes respectifs : le premier gï'oupe qui
répnme le cytochrome P-4S0 est composé de produits fOl't'ement rrrutagènes tandis
que le deuxième groupe est formé de produits sans activité mutagène notable.
Il y a là une relation que .nous comptons approfondir par la suite.
Â4vtÜl
Enfin~ un quatrième volet de noty'eV'" act~~llerye'K±
en cours~ consiste
,
\\
' . - -
ri'
à étudier les interactions de l' amino-3 -rn..-éthy~':"4~dipyr~ °midazole avec le
..
DNA et ses monomères en vue de déterminer le mode de fi/ tian, la nature des
adduits et l'importance des déformations conformatio~lles induites par cètte
.~-
fixation. Pour ce faire~ nous avons préparé le métabolite supposé de cette
amine~ par référence au N~N-acétoxyacetylamino-2 fluorène admis comme métabolite
vaZable du cancérogène bien connu~ l'amino-2 fluorènc.
Une étude préliminaire nous a montré que~ sous certaines conditions
d'incubation~ notre métabolité se fixait sv~ le DNA natif. Il reste à déterminer
l'ampleur des modifications induites~ les propriétés du DNA modifié~
la nature
des adduits formés.
Cela fait partie du programme de recherche à'venir du laboratoipe.

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