UNIDERSITE PRRIS-SUD
UN ITE D'ENSE16NEMENT n DE RECHERCHE DES SC1ENCES
PHRRMRCEUTI QUES n BIOL061QUES
RNNEE : 1984-1985
Série DOCTORAT n·4
THESE
présentée
A L'UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE
DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
DE L'UNI VERSITE PARIS-SUD
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNI VERSITE DE PARIS-SUD
MENTION SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
Degui MONNn
r.'1. -.. "ri'
.
~ ~ - .j.
./~
Titre de la thèse:
MODULATION DE LA &LYCOSYLRTION DE L't.(l-&LYCOPRD'ŒINE
RCIDE DE RAT. EFFET DE LA D-&ALACTOSAMINE ET
DU PHENOBRRBITRL
Jury: Président: Monsieur le Professeur J. AGNERAY
Membres: Monsieur le Professeur R. ENGLER
Monsieur le Professeur B. FOURNET
rapporteur
Madame le Professeur G. DURAND
rapp~rt~ur
A Monsieur le Professeur J. AGNERAY,
qui m'a accueilli dans son laboratoire
et me fait l'honneur d'accepter la
présidence de cette thèse. En témoi-
gnage de l'assurance de fidèle atta-
chement et profond respect.
A Madame le Professeur G. DURAND,
qui m'a inspiré le sujet de cette thèse
et en a toujours suivi la réalisation
avec beaucoup d'intérêt et de bien-
veillance. En témoignage de toute ma
reconnaissance et de mon respectueux
attachement.
A Monsieur le Professeur B. FOURNET,
qui a maintes reprises, après m'avoir
accueilli dans son laboratoire, m'a
fait bénéficier de ses larges connais-
sances dans le domaine de l'analyse
de structure des oligosaccharides et
qui a bien voulu faire partie du jury
qu'il trouve ici l'expression de ma
bien vive gratitude.
A Monsieur le Professeur R. ENGLER,
qui m'a fait l'honneur de bien vouloir
juger cette thèse, je l'en remercie
vivement.
\\
.
A Madame le Professeur J. FEGER,
qui m'a donné de si nombreuses marques
d'intérêt et dont j'ai tant apprécié
le profond savoir. En témoignage de
très vive reconnaissance et respec-
tueuse affection.
A Monsieur le Professeur D. DURAND,
pour l'intérêt et le soutien qu'il m'a
apporté dans la réalisation de ce
travail, je l'assure de ma profonde
et bien respectueuse gratitude.
A Monsieur D. BlOU,
qui m'a initié aux méthodes immunochimi-
ques et chromatographiques. Avec ma
profonde reconnaissance à laquelle
s'ajoutent des liens de profonde amitié
qui ont pris naissance au cours de ce
travail.
A Monsieur P. CARDON,
avec qui une partie de ce travail a été
réalisée. Sa compétence dans l'analyse
des glycannes et sa bonne humeur m'ont
été infiniment précieuses.
J'adresse mes sincères remerciements à
Monsieur J. DAVY,
pour son soutien dans l'interprétation
des résultats et qui a su mettre en
valeur les photographies de ce travail.
Monsieur le Professeur J.R. DIDRY,
pour les conseils qu'il m'a donnés pour
l'interprétation statistique des résul-
tats.
Monsieur R. COUDERC,
pour l'aide qu'il m'a apportée dans la
réalisation de l'électrophorèse en
gel de polyacrylamide.
A tous mes collègues et amis du Laboratoire de Biochimie
leur gentillesse, les services rendus
quotidiennement m'ont aidé bien des
fois à surmonter les moments de décou-
ragement.
A Madame J. BARTOLI,
qu'elle trouve ici mes sincères remer-
ciements pour la dactylographie de
cette thèse.
A ma femme,
en témoignage de mon amour. Je la remer-
cie pour tous les sacrifices qu'elle a
dû accepter pour me permettre de réa-
liser ce travail.
A mes beaux-parents,
A mes parents,
à qUl je dois tout.
A tous mes frères et soeurs,
A mes fils,
\\
A mon oncle et ma tante,
\\
A mon frère Blaise et ma belle soeur Lili
en reconnaissance de leur constant et
affectueux soutien.
A tous mes amis.
TABLE DES MATIERES
Pages
INTRODUCTION
l
1. RAPPEL DE LA STRUCTURE DES GLYCOPROTEINES
2
II. BIOSYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES DE TYPE N-OSIDYL
5
III. HETEROGENEITE DE LA CHAINE GLYCANNIQUE DES
GLYCOPROTEINES
18
IV. HEPATITE EXPERIMENTALE A LA GALACTOSAMINE CHEZ LE RAT
23
V. L'INDUCTION PAR LE PHENOBARBITAL ET SES CONSEQUENCES
26
MATERIEL ET TECHNIQUES UTILISES
28
A. TECHNIQUES D'INDUCTION
29
B. TECHNIQUES DE DOSAGES H1MUNOCHIMIQUES
31
C. TECHNIQUES D'IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE CROISEE EN
CONCANAVALINE A (CIAE CON A)
39
D. PREPARATION DES IMMUNSERUMS
43
E. PURIFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
45
F. APPROCHE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE
L' al-GLYCOPROTEINE ACIDE D~::: J~7\\T:;i'~;:I"">"
61
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RESULTATS
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69
1. EFFET DES DIVERS PRODUITS SUR·t:A~"t\\l~SE PROTEIQUE
CHEZ LE RAT
'
.( ,,,,;7-
69
A. Effet de la galactosamine sur les concentrations
des protéines sériques
71
B. Incidence du
traitement par le phénobarbital
sur les valeurs sériques des protéines spécifiques
73
et totales de Rat
C. Cinétique d'apparition des protéines sériques sous
l'effet conjugué du PB et de l'essence de térébenthine
75
II. ETUDE DE L'HETEROGENEITE DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE DE
RAT. ETUDE DIRECTE SUR SERUM
81
A. Modification du degré de sialylation
82
B. Microhétérogénéité en position interne par immuno-
affinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
(CIAE Con A)
84
1) Hétérogénéité de l'al-GPA de Rat Normal
84
II) Altération de l'al-GPA en CIAE-Con A sous
l'effet de divers produits
88
III. ETUDE· STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE L'al-GLYCO-
PROTEINE ACIDE DE RATS NORMAUX ET TRAITES PAR LE
PHENOBARBITAL
99
A. Etude de la copule glycanniq~e,de l'a1:glycop:otéine
acide de rats normaux et tra1tes au pnenobarb1tal
100
B. Etude de la copule glycannique de l'al-GPA RPBS CMI
et RPBS CM2
113
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
119
BIBLIOGRAPHIE
128
A B R E V 1 A T ION S
;.
I-Ig
microgramme
mg
milligramme
9
gramme
kg
kilogramme
)JI
microlitre
ml
millilitre
l
litre
mm
millimètre
cm
centimètre
s
seconde
min
minute
h
heure
J
jour
E.T.
essence de térébenthine
GaIN
galactosamine
PB
phénobarbital
Gal
galactose
Man
mannose
ruc
fucose
GlcNAc
N-acétylglucosamine
N-AN
acide N-acétylneuraminique
ASAT
asparagine aminotransférase
ALAT
alanine aminotransférase
GnT l
N-acétylglucosaminyltransférase l
GnT II
N-acétylglucosaminyltransférase II
GnT III
N-acétylglucosaminyltransférase III
GnT IV
N-acétylglucosaminyltransférase IV
GnT V
N-acétylglucosaminyltransférase V
Gal T
galactosyltransférase
CIAE
immunoaffinoélectrophorèse croisée
Con A
Concanavaline A
IDR
immunodiffusion radiale
ElOm
électroimmunodiffusion monodimensionnelle
ElOb
électroimmunodiffusion bidimensionnelle
1.5.
immunsérum
Ag
antigène
Ac
anticorps
B5A
sérumalbumine bovine
al-GPA
al-glycoprotéine acide
CaCl
chlorure de calcium
2
MgCl
chlorure de magnésium
2
MnCl
chlorure de manganèse
2
P.E.G.
polyéthylène glycol
CMc
carboxyméthyl cellulose
DEAE
diéthylaminoéthyl
C.P.G.
chromatographie en phase gazeuse
HPLC
chromatographie liquide à haute pression
R.E.L.
réticulum endoplasmique lisse
R.E.R.
réticulum endoplasmique rugueux
G
Golgi
ARNm
acide ribonucléique messager
Asn
asparagine
5er
sérine
Thr
thréonine
UTP
uridine tri-phosphate
UDP
uridine di-phosphate
UMP
uridine mono-phosphate
Glc-I-P
glucose-I-phosphate
GaIN-I-P
galactosamine-I-phosphate
HDL
high density lipoproteins
LDL
low density lipoproteins
VLDL
very low density lipoproteins
RMN
résonance magnétique nucléaire
al-GPA RN
al-glycoprotéine acide de rat normal
al-GPA RPB
al-glycoprotéine acide de rat traité par le phéno-
barbital
TABLE DES FIGURES
Pages
l - Liaisons entre résidus aminoacyls,et osidyls dans
les glycoprotéines
2
2 - Noyau pentasaccharidique ou "core" des N-glycoprotéines
sériques
3
3 - Exemples des 3 classes majeures du type "Asn-oligo-
saccharide"
4
4 - Structure du dolichol pyrophosphate
5
5 - Structure du précurseur "lipide-oligosaccharide" des
N-glycoprotéines
5
6 - Schéma de biosynthèse des glycoprotéines sériques
6
7 - Niveau d'action des glycosidases
8
8 - Poin~d'action des N~acétylglucosaminyltransférasessur le
"pentamannosyl"
10
9 - Structure des chaînes glycanniques de l'al-glycoprotéine
acide humaine
17
10 - Structure de la chaîne glycannique de l'ovalbumine du
groupe III
19
Il - al-gl~coprotéine acide humaine --N sites de glyco-
sylat10n ; ---- 2 ponts disulfure
19
12 - Métabolisme de la galactosamine dans le foie
24
13 - Courbe d'étalonnage de la détermination de la désia-
lylation de l'al-GPA de rat
37
14 - Immunoélectrophorèse en quinconce
38
15 - Plaque de gel d'agarose de la 1ère électrophorèse
41
16 - Plaque de gel d~agarose de la 2ème électrophorèse
42
17 - Electroimmunodiffusion bidimensionnelle de Laurell
de sérum de rat contre l'immunsérum de lapin anti-
al-glycoprotéine acide de rat
44
18 - Immunoélectrophorèse de sérum de rat normal et de
sérum de rat inflammé contre l'immunsérum préparé
44
19 - Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions exclues
ou éluées lors d'une chromatographie sur DEAE trisacryl
51
20 - Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions éluées
ou retenues lors d'une chromatographie sur CM 52
52
21 - Immunoeffinoélectraphorèse croisée en Con A de sérum
et de l'a1-GPA isolée
contre un immun sérum de lapin
anti-a - GPA de rat.
53
l
22 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A des produits
de la 3ème préparation contre un immunsérum anti al-GPA
de rat
54
23 - Immunoélectrophorèse selon Grabar de l'al-glycoprotéine
acide (a -GPA la g/l) purifiée contre un immunsérum de
lapin an ti-protéines sériques surchargé en anti-al-GPA
de rat
58
24 - Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des glycosides
66
25 - Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des méthyl-
glycosides
67
26 - Effet de la D-galactosamine sur les taux sériques de
l'al-glycoprotéine acide~des protéines totales et
sur l'activité alanine aminotrans~érase
72
27 - Effet du phénobarbital sur la concentration sérique
de l'al-glycoprotéine acide
74
28 - Cinétique d'apparition de lIaI-glycoprotéine acide
en fonction du temps après inJection du phénobarbital
et de la solution de NaCl 0,15 M
76
29 - Evolution de la concentration sérique en albumine
après traitement par le phénobarbital (PB) et par
l'essence de térébenthine (ET)
77
30 - Evolution de la concentration sérique en al-glyco-
protéine acide (a -GPA) après traitement par le
phénobarbital (PB} et par l'essence de térébenthine (ET)
79
31 - Effet cumulé de l'association phénobarbital (PB) et
essence de térébenthine (ET) sur la concentration sérique
de l'al-glycoprotéine acide (al-GPA)
80
32 - Modification dans le degré de sialylation de l'a -
glycoprotéine acide et l'activité sérique de l'alanine
aminotransférase
après injection de D-galactosamine
chez le rat
83
33 - Hétérogénéité de l'a -glycoprotéine acide de Rat en
immunoaffinoélectrop~orèse croisée en Concanavaline A
(CIAE Con A)
86
34 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'al-glycoprotéine acide de rat traité à la D-
galactosamine
90
35 - Effet de la galactosamine sur le degré d'hyposialylation
de l'al-glycoprotéine acide et sur le rapport RI des
isotypes 1/2+3+4 calculé après immunoaffinoélectropho-
rèse croisée en Concanavaline A
91
36 - Modification des différents isotypes de l'al-glyco-
protéine acide de rat en immunoaffinoélectrophorèse
croisée en Concanavaline A
93
37 - Cinétique de variation des valeurs relatives' des dif-
férents isotypes de l'al-glycoprotéine acide consécu-
tives au traitement par le phénobarbital
94
38 - Effet de l'essence de térébenthine sur l'évolution des
isotypes de l'al-glycoprotéine sérique lors de l'analyse
en immunoaffinoelectrophorèse croisée en Concanavaline A
96
39 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'al-glycoprotéine acide de rat traité par l'ensemble
phénobarbital (PB) et essence de térébenthine (ET)
97
40 - Analyse des oligosaccharides de l'al-GPA RN
en chromatographie sur AX 10
107
41 - Analyse des oligosaccharides de l'at-GPA RPB .
en chromatographie sur AX 10
108
TABLE DES TABLEAUX
Pages
l - Types de liaisons galactosyles dans les glycoprotéines
12
II. Types de liaisons sialosyles dans les glycoprotéines
13
III. Types de liaisons fucosyles dans les glycoprotéines
15
IV. Caractères physico-chimiques de l'al-glycoprotéine
acide de rat
46
V. Mode de détermination des rapports molaires en mono-
saccharides par chromatographie en phase gazeuse
68
VI. Concentrations sériques en al-glycoprotéine acide,
albumine et protides totaux chez le Rat Sprague-
Dawley normal
70
VII. Valeurs de l'al-glycoprotéine acide dans les sérums dilués
84
VIII. Effet de concentrations croissantes en Concanavaline A
sur les valeurs relatives des isotypes de l'al-glyco-
protéine acide
87
IX. Distribution des proportions relatives des 4 isotypes de
l'al-glycoprotéine acide de rat normal
87
X. Proportions des isotypes l, 2, 3 et 4 et rapport RI des
isotypes 1/2+3+4 calculés après une immunoaffinoélectro-
phorèse croisée en Concanavaline A de l'al-glycoprotéine
acide de rat traité par la D-galactosamine
89
XI. Rapport molaire des monosaccharides présents dans l'a -
l
glycoprotéine acide de rat après méthanolyse et tri-
fluoroacétylation
101
XII. Composition en monosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide de rat
101
XIII. Comparaison de la composition en sucres de l'al-glyco-
protéine acide de rat rapportée par divers auteurs
102
XIV. Nombre de résidus dans la protéine
104
XV. Temps de rétention et ordre de sortie des dérivés glycan-
niques sur Micro-Pak AX la
105
XVI. Composition en sucres des fractions obtenues par chro-
matographie semi-préparative des oligosaçcharides libérés
par hydrazinolyse
109
XVII. Proportion des diverses fractions oligosaccharidiques
d'al-GPA RN et d'al-GPA RP8 séparées sur AX 10
III
XVIII. Pourcentage de chaque fraction par rapport à la glyco-
protéine totale
112
XIX. Composition molaire en monosaccharides
114
XX. Composition en monosaccharides des fractions al-GPA
RPBS CMI et al-GPA RPBS CM2
114
XXI. Composition molaire en monosaccharides des dérivés de
l'a1-GPA RPBS CMI et de l'al-GPA RPBS CM2 après AX 10
116
XXII. Proportion des diverses fractions oligosaccharidiques
après AX 10
117
XXIII. Teneur des différentes fractions dans la glycoprotéine
117
l
l N T R 0 DUC T ION
L'al-glycoprotéine acide (al-GPA) ou orosomucoïde est une glyco-
protéine présente dans le plasma des mammifères. Elle se distingue des
autres glycoprotéines sériques par l'importance de sa copule glycannique,
sa richesse en résidus sialyls, ce qui lui confère des propriétés physico-
chimiques particulières. C'est aussi l'une des molécules les plus étudiées
sur le plan de la structure.
Deux grands types d'hétérogénéités ont été mis en évidence, selon
qu'elles affectent la copule peptidique ou la copule glycannique.
Les premières correspondent à des variants dûs à la substitution
de résidus aminoacyls mis en évidence par analyse en gel d'amidon à pH 5 ou
par clivage au bromure de cyanogène suivi d'une digestion trypsique (Schmid
1975, gS). La cause en apparait d'ordre génétique. Nous n'aborderons pas
leur étude.
Le second type d'hétérogénéité concerne la chaine glycanne et
correspond à ce qui a été appelé des "microhétérogénéités" (Schmid,
1975,98 ).
De plus en plus il semble que certains états pathologiques soient
corrélés avec des variations relatives dans ces microhétérogénéités. Or,
de nombreux exemples ont montré que structure et propriétés physiologiques
sont étroitement reliées. Bien que l'on connaisse mal à l'heure actuelle le
rôle de l' al-GPA, on peut espérer que la mise en évidence d'anomalies de
structure de la chaine glycanne contribuera
à mettre en évidence son rôle
exact.
C'est la raison pour laquelle nous avons utilisé deux modèles
de pathologie animale induisant au niveau de l'al-GPA des modifications
de la structure glycannique que nous avons étudiées.
En préambule il semble nécessaire de rappeler les étapes de la
synthèse des chaines glycannes des glycoprotéines.
2
I, RAPPEL DE LA STRUCTURE DES GLYCOPROTEINES
De nombreuses protéines d'eucaryotes sont glycosylées. Le
mécanisme de glycosylation est complexe et a survécu à l'évolution, de
la levure à l'homme. L'effort d'une cellule pour glycosyler les protéines
est substantiel. Cependant, les connaissances actuelles sur le r81e bio-
logique des chaînes glycanniques des glycoprotéines sont limitées.
Kornfeld (1982, S~ ) et Montreuil (1980, 1i ) ont proposé de classer les
glycoprotéines en 2 groupes :
- les glycoprotéines-N-glycosylées
- les glycoprotéines-O-glycosylées
• Dans les N-glycosyl-protéines, la liaison osidique s'établit
entre le groupe NH
en y d'une asparagine de la copule polypeptidique et
2
l'hydroxyle ~émiacétalique 8 d'un 2-acétamido 2-désoxy D-glucose (N-acétyl-
glucosamine) (fig.la).
NH-CO - CH
- CH - COOH
2
1
NH 2
a)
o
R
tH - CH - COOH
b)
1
NH 2
Figure l
Liaisons entre résidus aminoacy&s et osidyls dans les glycoprotéines
a) liaison N-osidique entre unrésidu.asparaginyl et un résidu 8-N-
acétylglucosaminyl des protéines N-glycosylees
b) liaison O-osidique entre un résidu aminoacyl (R = H, sérine
R = CH , thréonine) et un résidu 8-N-acétylgalactosaminyl des
3
protéines O-glycosylées.
3
• Les O-glycosyl-protéines sont caractérisées par une liaison
covalente entre la fonction alcool primaire ou secondaire d'un résidu
aminoacyl.(sérine ou thréonine) et un reste osidyl (fig.lb).
Cette étude portera uniquement sur le groupe N-glycosylé qui
est lui-même divisé en 3 classes. On y retrouve toujours un noyau commun
pentasaccharidique interne: le "core" (fig.2).
(81) Asn
Fiqure 2
Noyau pentasaccharidique ou "core" des N-glycoprotéines sériques
c'est un manno-tri-osido-di-N-acétylchitobiose lié à un résidu as-
paraginyl. l, 2, 3, 4, 4' : numérotations conventionnelles des oses
et osamines.
La figure 3 indique la composition chimique de chacune des 3
classes
r~che en mannose, complexe et hybride.
- Dans le type riche en mannose ou oligomannosidique, le penta-
saccharide de base est substitué uniquement par des résidus mannosyls.
- Le type co/nplexe porte sur les restes mannosyls du "core" des
groupements N-acétyllactosaminyls.
Le type hybride est constitué d'un mélange des deux restes
mannosyl et N-acétyllactosaminyl.
Bien qu'hétérogènes dans leur structure, ces 3 types dérivent
d'un seul et unique précurseur: "lipide-sucres" (Harpaz et Schachter
1980,~3 ; Tabas et Kornfeld 1978,109 ). Dans les conditions physiologiques
normales, on ne trouve le plus souvent qu'une seule classe d' oligosaccharides
dans une molécule donnée. Il existe des exceptions à cette règle. Ainsi
pour les IgM, trois résidus asparaginyls sont substitués par une chaine de
type complexe alors que les 2 autres le sont par une chaine oligomanno-
sidique (Putnam et al, 1973, g6 ).
Ce mode de distribution est mal expliqué, il semblerait que la
configuration de la protéine et la localisation de l'oligosaccharide sur
le polypeptide influent sur l'extension du processus de biosynthèse.
SA.
SA
0'.'0""
102.'0'"
(/)
Gal
Gal
Gal
lIan
Man
Man
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10',.
0'.• '
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Man
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u
1 Fuc ~~----- GlcNAc
GlcNAc
GleNAc
,
L __ 1- - - - - - - - - _ -,- __ -
_
----1- ------'
Asn
Asn
Asn
Complexe
Hybride
Oligomannosidique
Figure ) : Exemples des ) classes majeures du type "Asn-ollgosaccharide"
emprunté à (J(ornfe1d, 1982, 53 ).
~
5
II. BIOSYNTHESE DES OLlGOSACCHARIDES DE TYPE N-OSIDYL
La biosynthèse des glycoprotéines de type N-osidyl se fait en
4 étapes
a) Synthèse d'oligosaccharide riche en restes mannosyls et
glucosyls sur un intermédiaire dolicholpyrophosphate (fig.4).
Fi9ure 4 : Structure du dolichol pyrophosphate: n = 12 à 21
b) Transfert de l'oligosaccharide (fig.5) du lipide sur l'accep-
teur protéique.
Gle
cr 1,2 ~
Gle
a 1,3 ~
Glc
o 1,3 ~
Man
-Man
Man
01,2 ~
01,2 +
~a1,2
Man
Man
Man
a1,2 +
.
01,3\\
/al,6
Man
Man
al~
./'0:1,6
Man
~.Gl,4
GleNAc
• )31,4
GleNAc
1
p
1
•
p
1
Oolichol
Figure 5
Structure du précurseur "lipide-oligosaccharide" des
N-glycoprotéines : c'èst un tétra décasaccharide lié
au dolichol pyrophosphate. Son transfert exige la pré-
sence du résidu di-N-acétylchitobiosyl et surtout des
résidus glucosyls de l'extrémité non réductrice.
Emprunté à Kornfeld (1982, 53 ).
6
c) Action de glycosidases sur l'oligosaccharide lié sur la
protéine (glucosidases et mannosidases). Les résidus glycosyls et manno-
syls sont libérés progressivement à partir de l'extrémité terminale non
réductrice.
d) Elongation de l'oligosaccharide par action séquentielle de
glycosyltransférases spécifiques.
II.1. SITES SUBCELLULAIRES DE LA GLYCOSYLATION
La glycosylation a lieu dans la cellule (fig.6). Les sucres
proches de la liaison glycanne-protéine (Man et GleNAc internes) sont
incorporés
dans le
réticulum endoplasmique rugueux (R.E.R.) alors
que les restes osidyls de l'extrémité non réductrice (GleNAc externes, Gal,
Fuc et N-AN) sont incorporés dans les saccules golgiens (G). (Schachter et al,
1982,93
; Schachter, 1984,95
) •
\\
\\
MP
\\
\\
\\
i
\\
Figure 6
Schéma de biosynthèse des glycoprotéines sériques : les glyco-
protéines sont représentées par les lignes discontinues. Les
peptides naissants sont assemblés au niveau du réticulum ru-
gueux. Lors de leur cheminement dans les systèmes membranaires, les
peptides sont glycosylés et ensuite sécrétés dans le milieu extra-
cellulaire. Abréviations : RER, réticulum endoplasmique rugueux
REL, réticulum endoplasmique lisse ; G, Golgi ; VS, vésicule de
sécrétion ; MP, membrane plasmique ; Tn, Tl, T2, T3, glycosyl-
transférases. Tn pouvant désigner la glycosyltransférase participant
au transfert du "core" tandis que Tl, T2 et T3 représenteraient
respectivement les sialyl, galactosyl et N-acétylglucosaminyl-
transférases intervenant dans la synthèse de l'extrémité non réduc-
trice.Emprunté à Bennett et al (1974,11.).
7
La glycosylation s'effectue par action catalytique d'enzymes
membranaires des canalicules,
les glycosyltransférases, au fur et à
mesure du cheminement des chaînes peptidiques dans le système RER-G.
Lorsque les sialyls et fucosyltransférases ont ag~ il y a formation de
vésicules, puis, après pinocytose, les glycoprotéines destinées à la sécré-
tion dans le milieu extracellulaire sont libérées (Bennett et al 1974,i1).
II.2. PREASSEMBLAGE ET TRANSFERT D'OLIGOSACCHARIDE A PARTIR D'UN DERIVE
DOLICHOL PYROPHOSPHATE
L'hypothèse actuelle retenue est qu'il existe un précurseur
commun, le tétradécasaccharide-lipide (fig.S) pour toutes les chaînes
N-glycosidyles. Utilisant la tunicamycine qui inhibe la fixation de Glc
NAc sur le dolicholpyrophosphate, Lehle et Tanner (1976,5'+ ), Struck et Lennarz
(1977,106 )ont montré une absence totale de chaîne glycannique sur une
molécule normalement glycosylée. Les enzymes intervenant sont membranaires
et la glycosylation apparaît avoir lieu principalement dans le RER.
Behrens et al (1973, ,,0 ) et Parodi et al (1972, ~2. ) furent les
premiers à rapporter le transfert d'oligosaccharides. La séquence de liai-
son peptidique est toujours Asn-x-Ser/Thr où x représente un acide aminé
quelconque. Cette séquence, bien qu'existant sur la protéine, ne conduit
pas toujours à une glycosylation. L'enzyme de transfert serait présent dans
le RER (Khalkhali et Marshall, 1975,51 ). Le trans~ert exige le résidu di~
N~acétylchitobiosyl et les Fésidus glucosyls de l'extrémité non réductrice
II.3. DEGLYCOSYLATION DES GLYCOPEPTIDES NAISSANT: LES GLYCOSIDASES (fig.7)
Le transfert du tétradécaoligosaccharide GlcNAc Man Glc
sur la
2
9
3
protéine est suivi d'une déglycosylation catalysée par des glycosidases
spécifiques : glucosidases et mannosidases.
8
Glc
0<. 1-2 glucosidase ~ a 1,2 +
l
Glc
--::1 a 1,3 ~
~ 1-3 glucosidase ----. .
Glc
I~01,3~
Man
Man
Man
J. -Mannosidase l
~ 01,2 ~
01,2 ~ ~
t01,24-10( -Mannosidase l
~
Man
Man
Man
01,2 +
01,3\\+-
lal,6~-<-MannosidaseII
Man
Man
o 1~
,.--a1,6
Man
~$31,4
G-lcNAc
+131,4
GleNAc
~
Asn
Figure 7
Niveau d'action des glycosidases ; ce transfert du tétra
décasaccharide sur le résidu asparaginyl est suivi d'une
déglycosylation séquentielle catalysée par des enzymes spé-
cifiques. Emprunté à Kornfeld (1982,53 ).
II.3.1. ~:~_2!~~~~!~~~:~_!_~~!1~2_2!~~~~!~~~:_!_:!_~~!1~2
2!~~~~!~~~:_!!·
Deux formes sont connues et présentent une haute spécificitéd'action
sur le glycanne riche en mannose. Elles peuvent être purifiées sur des
critères physicochimiques par filtration sur gel ou sur échangeurs d'ions
(Grinna et Robbins, 1979, 39 ). Les glucosidases l et -I l agiraientvraisembla-
blement sur l'oligosaccharide branché sur le peptide, clivant respectivement
les résidus glucosyls en position
~1,2
et
al,3 • Ces 2 enzymes se trou-
vent localisées dans le RER. Leur localisation est compatible avec le site
de biosynthèse des glycopeptides précurseurs. La déglucosylation débuterait
immédiatement après le transfert du tétradécasaccharide sur le peptide
(Elting et al 1980, 31 ).
II.3.2. Mannosidases
On en distingue deux types
9
• La mannosidase 1
L'étape suivante est la conversion de l'oligosaccharide déglu-
cosylé GlcNAc
Man
en une unité "pentamannosy~"par clivage des 4 résidus
2
9
mannosyls liés enal,2 • La coupure est catalysée par la mannosidase 1.
• La mannosidase II
Elle ne peut agir qu'après la
GlcNAc transférase 1 (GnTI) c'est
à dire l'enzyme qui, comme nous le verrons, initie la formation de la première
antenne. Elle catalyse alors l'hydrolyse des liaisonsmannosyles al-3 et
al-6 du Man al-6 du "core" interne. Il semble par contre qu'après action des
GnT III et IV, la mannosidase II ne puisse plus agir.
Les études séquentielles de Tabas etKornfeld(1979,1~O) et de Harpaz
et Schachter (1980, ~3 ) ont-montré que ces 2 activités se trouvent localisées
dans les membranes de Golgi.
II.4. LES N-ACETYL GLUCOSAMINVLTRANSFERASES (GnT) (fig.8)
Nous ne parlerons que des GnT à l'origine des structures bi, tri,
ou tétraantennées des N-glycoprotéines. En effet, il pourrait exister jus-
qu'à 14 types de liaisons glucosaminylesdans les différents types de glycannes
étudiés jusqu'à ce jour (Beyer et al, 1981, ~3 ). Sur 7 GnJ susceptibles d'in-
tervenir dans la formation des antennes,
4 ont été identifiées et partiel-
lement caractérisées (Schachter et al, 1982, 9~ ; Schachter, 1984,95 ).
II.4.1. ~:~~~!~!_2!~~~~~~!~~!!:~~~!~:~~~_!_~~_9~!!
(Oppenheimer et Hill, 1981, 'ft ; Harpaz et Schachter 1980,4'3)
C'est une transférase bien étudiée. Elle initie l'élongation de
la structure du "core" des oligosaccharides du type N-acétyl lactosaminyl en
catalysant la fixation de GlcNAc en position
61,2
sur le mannose en
al,3
du "core". Son substrat physiologique est la structure pentamannosyle Glc
NAc
Ma"s (Tabas et Kornfeld, 1978,109 ; Li et Kornfeld, 1978,59 ). Son
2
absence se traduit par une accumulation de GlCNAc
Ma"s dans des cellules
2
ovariennes de hamster mutées. On obtient alors une structure riche en mannose
sur laquelle les processus ultérieurs de glycosylation ne peuvent pas avoir
lieu.
10
Mannosidase II
Gn! III
~I
\\
~~5\\ I~~~
GnT l -
Man
.....\\
Man
GnT IJ
al~
~16
/
.
Man
'
GnT IV
~~1,4
GleNAc
~Dl,4
GleNAc
1
Peptide-~sn-peptide
Figure 8
Points d'action des
N-acétylglucosaminyltransférases sur le
"pentamannosyl" : la GnT
initie l'élon2ation de la chaine
I
glycannique. La GnTII et la GnT IV controlent le processus
de biosynthèse après action de la (al,3) et (al,6) mannosidase II.
L'activité de ces 3 dernières enzymes est bloquée par la GnT III
Le composé issu de l'action de la mannosidase II est le substrat
de la GnT II (Narasimhan et al, 1977, 1~ ). La GnT II contrôle la formation
de la deuxième antenne en catalysant la fixation de QlcNAc en position
81,2
du Man en
::t1,6
du "core". La GnT II ne peut pas agir en l'absence de
la GNT 1.
~,_:.t-""".....
II.4.3. N-acétyl gluco~mihyitr~s~éraseIII ou GnT III
------------- ,~--),..---...~- ..:-:~-------------------
t-.,-"
,/"
' "
I(~'\\
.....
.'
" ,
Cette enzyme cataly .:; ~acf~aéiO~'f '§Ire Glc NAc en ~1-4 du t~an
lié en 8 du core, à condition 'u'tl y ait ey :) ion préalable de la GnT 1.
\\
'
.
'".'
Si par contre la GnT III agit avant ou plus,' pidement que la mannosidase II,
on obtient une chaine intercalair~ tlè.:.t{< hybride comme dans l'ovalbumine.
(fig. 10) .I!.e produit des GnTIIetN peut être aussi substrat de la GnT III, ce qui
11
conduit à des structures intercalaires bi et triantennées. Il semble qu'aucun
processus d'élongation n'ait lieu sur ce résidu GleNAc lié en 61-4. Il
faut enfin noter que ce reste
GleNAc diminue l'affinité de la concanavaline A
pour les restes mannosyls de structures biantennées intercalaires (Schachter et
al 1982,9'; ; Narasimhan et al, 1981, 14- ).
II.4.4. N-acétyl glucosaminyltransférase IV et GnTV
-------------------------------------------
La GnT IV (Gleeson et Schachter, 1983,36 ) catalyse la liaison
GleNAc 61-4 sur le Man al-3 du pentasaccharide, ce qui amorce la formation
de la 3ème antenne. Une GnT catalysant la liaison GleNAc 61-6 sur le Man
a 1-6 a été identifiée par son activité de transfert (Cummings et al,
1982, 2.6
; Yamashita et al, 1985, ~24 ). Elle correspondrait à la GnT V selon
la numérotation de Schachter.
II.5. GALACTOSYLTRANSFERASES (Paquet et al, 1984,~1
Blanken et al, 1984,-15
Généralement, dans les N-glycoprotéines sériques, le Gal apparait
en un seul endroit sur les glycannes de type "Asn- GleNAc", en position
pénultième de l'extrémité non réductrice des N-glycoprotéines. Le transfert du
Gal à partir de l'UDP Gal conduit à la formation d'un résidu N-acétyllactosamin)
terminal. Il existerait cependant d'autres galactosyltransférases (Tableau 1).
La plus étudiée est la galactosyltransférase formant la liaison
61,4
N-acétyl lactosaminyle (Beyer et al, 1981, /16 ).
II.6. SIALYLTRANSFERASES
L'acide sialique est généralement lié en position terminale des
glycoprotéines. Au moins 9 types de liaisons sialosyles sont possibles. Les
liaisons les plus rencontrées sont de type N-AN a2,6 Gal et N-AN 02,3 Gal
(Paulson et al, 1977,~3 ). (Tableau II).
Paulson et al (1978,S4) puis Van Den Eijnden et al (1980,-1-\\l,.),
examinant la sialylation d'asialoglycoprotéines sériques in vitro ont montré
que l'incorporation du N-AU se fait selon un mode biphasique et préférentiel-
lement sur la branche portant le Man en al,3.
l2
TABLEAU l
TYPES DE LIAISONS GALACTOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Galactose-N-acétylglucosamine
Galactose-N-acétylgalactosamine
a
b
GalSl,4 GlcNAc-
GalSl,3 GalNAc-
GalSl,3 GlcNAc-
GalSl,6 GalNAc-
GalSl,6GlcNAc-
Galcü , 3 GalNAc-
Galactose-galactose
a
Galal,3 Gal-
GalSl,3Gal-
GalSl,6 Gal-
a) enzymes purifiées et caractérisées
b) activité identifiée dans les tissus
13
TABLEAU II
TYPES DE LIAISONS SIALOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Acide Sialique-galactose
a
Siaa2,6 ,GalSl,4 GlcNAc-
b
Siaa2,3 GalSl,4 GlcNAc-
a
Siaa2,3 GalSl,3 GalNAc-
Siaa2,4 GalSl,4 GalNAc-
Siaa2,4 GalSl,3 GlcNAc-
Acide sialique-N-acétylgalactosamine
a
Siaa2,6 GalNAca-
Acide sialique-N-acétylglucosamine
Siaa2,4 GlcNAc-
Siaa2,6 GlcNAc-
Acide sialique-acide sialique
b
Siaa2,8 Siaa2
aJ sialyltransférases purifiées
bJsialyltransférases connues
14
II.7. FUCOSYLTRANSFERASES
La fucosylation intervient à la dernière étape de la biosynthèse.
Bien qu'il y ait sept types de liaison fucosy~Tableau III), très peu de
fucosyltransférases ont été isolées.
La fucosyltransférase catalysant la liaison
al,6
sur la GleNAc
du reste N-acétyl lactosaminyl est la plus répandue (Wilson et al. 1976.120;
Longmore et Schachter, 1980,60 ). Son substrat est le composé issu de
l'action de la mannosidase II. Cependant, elle peut intervenir en plusieurs
points du schéma de synthèse (Schachter et al, 1982,9~). Cependant, la fuco-
syltransférase ne peut agir s'il y a eu action préalable de la GnT III ou de
la galactosyltransférase.
Selon Prieels et al (1981,i5), une seule transférase établirait
les liaisons
al,4
et ,al,3. du Fuc sur le résidu N-acétyl lactosaminyl
des antennes et la fucosylation en
al,3
de la
GleNAc des antennes inter-
dirait la sialylation en position terminale (paulson et al, 1978,~4).
II.8. MANNOSYLTRANSFERASES
Elles conduisent à la formation du type simple riche en mannose
des organismes inférieurs.
II.9. CONCLUSION
La génération des oligosaccharides est de type séquentiel. Pour
les trois types,tous les résidus Glc et certains Man sont séquentiellement
clivés de l'oligosaccharide de départ après son transfert sur l'asparagine
du peptide.
Dans le cas des types complexe et hybride, la GnT l donne l'ordre
d'élongation de la chaine glycannique, la GnT II et la GnT IV contrôlent le
processus d'élongation alors que la GnT III intervient en limitant le nombre
d'antennes. Les sucres terminaux (Gal, Fuc, N-AN) sont transférés sur la
chaine glycannique en formation pendant ou juste avant la sécrétion des
protéines. Dans le cas de l'al-glycoprotéine acide (al-GPA) humaine sécrétée/
15
TABLEAU III
TYPES DE LIAISONS FUCOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Fucose-galactose
Fucose-N-acétylglucosamine
a
a
Fucal,2 Gall3-
Fucal,4 (Gall31.3) GlcNAcl3-
a
Fucal,6 Gall3-
Fucal , 3 (Gall31,4) GlcNAcl3-
b
Fucal,3 Gall3-
Fucal,6 (R-GlcNAcl31,4) GlcNAcl3-
Fucose-fucose
Fucal,3
Fuc
a) Fucosyltransférases largement purifiées
b) Activité identifiée dans les tissus
16
ce schéma de biosynthèse aboutit à la formation de structures complexes
bi, tri et tétraantennées comme l'indique la figure 9
(Yoshima et al, 1981,
)125 ; Fournet et al, 1978, 3~ ).
Si la GnT III agit avant la mannosidase lIon obtient une structure
hybride semblable à celle de l'ovalbumine (fig.lO.) (J. Montreuil, 1980,~~ ).
L'information gouvernant la synthèse des types oligomannosidique
est complexe et mal définie puisque certaines protéines possèdent les deux
types de structure (Sefton, 1977,99 ; Kehry 'et 'al, 1979,4-~; Putnam et al, 0
1973, S6).
Cependant, on peut bien penser que cette information pourrait être
vraisemblablement présente dans le microenvironnement déterminé par la
protéine (structures secondaire, tertiaire et quaternaire).
Les glycosyltransférases sont intégrées dans les structures mem-
branaires de la cellule. Elles sont généralement localisées dans le Golgi 00
(Feischer, 1981,32 ; Bretz et al, 1980,20). Cependal"tt, Sturgess et al, 1973,1O't)
signalent une localisation des fucosyltransférases au niveau de la membrane
plasmique.Nous rediscuterons plus précisément de ces localisations dans la
discussIon.
Au cours de divers états inflammatoires ou de certains processus
terminaux, ces enzymes: galactosyl, sialyl et fucosyltransférases, peuvent
être libérés dans le milieu extra-cellulaire (Kaplan et al, 1983, \\t6 ).
Cal 81,4 ClcNAc ~Han
al 6
~
17
Han 81,4 Cl cNAc 81,4 ClcNAc!!...Asn
A
Cal ~ ClcNAc ~ Han ~,)
Cal 81,4 CleNAc 81,2 Han
,
~Han 81,4 ClcNAc 81,4 ClcNAc!!.Asn
B
Cal 81,4 ClcNAc 81,2 Han ~,)
Cal ~ClcNAc ~
Cal ~ CleNAc .ê!d. Han
1 6
~Han 81,4 ClcNAc 81,4 ClcNAc.!!....Asn·
BF
C 1 81,4 Cl NA
81,2 H
~
a
- -
c
c - - an"""""- 1 )
Cal ~ CleNAc ~
a ,
81,4
1al,)
fuc
Cal 81,4 CleNAc ~
Cal 81,4 CleNAc ~ Han al,6
81 4
BI 4
61
-...:.. Han_'_ CleNAc -!... ClcNAc -
Asn
C
Cal 81,4 CleNAc 81,2 Han ~,)
Cal 61,4 CleNAc ~
Cal 81,4 CleNAc
81,6
Cal~ClcNAc~Han al,6
~ Han 81,4 ClcNAc 81,4 ClcNAc ~sn
CF
Cal Bl,4 CleNAc 81,2 Han~,) - -
Cal 61,4 CleNAc~,4
1al,)
fuc
Cal 61,4 CleNAC~,6
.
Cal 61,4 CleNAc 81,2 Han
1 6
fuc~l,)
~ Han 61,4 ClcNAc 81,4 ClcNAc ~ Asn
0
Cal 8l,4ClcNAc ~Han~,)
,,-:.
,
fuc
al,)
/
Cal ~ ClcNAc /
61,1+
Cal 81,4 GlcNAc 81,) Cal 61,4 GleNA~1,6
Ha~al,6
Cal 81,4 CleNAc./6l,2
Han 61,4 GleNAc 81,4 CleNAc 8l-N
E
Cal 61,4 CleNAc~
/ a l , )
81,7.: Han
Cal 61,4 ClcNAc ~,~
Cal 81,4 CleNAc
81,6
""'-Ha~1,6
.
Gal 6l,4 CleNAc 81,) Cal 61,4 CICNAc/8l ,2 Han 61,4 CleNAc 81,4 ClcNAc 8l-N
G
Cal 81,4 ClcNAc
/
al )
-
::....
'
81,t Han
Cal 81,4 ClCNAC~l.lt
Figure 9
Structures des chaînes glycanniques de l'~l-glycoprotéine acide humaine.
A, B, BF, C et CF : structures selon Fournet et al (1978,33), D, E et
G : nouvelles chaînes glycanniques tétraantennées proposées par Yoshima
et al. U98l, 12,5) ; les restes sialyls sont omis.
18
II 1. HETEROGENE rTE DE LA CHAI NE GLYCANN l QUE DES GLYCOPROTE INES
L'hétérogénéité de la structure glycannique résulterait des
modifications co ou post-traductionnelles qui peuvent se porter au moins
à trois niveaux :
a) sur le nombre de chaînes
b) sur le degré de ramification des chaînes
c) sur la nature du reste odisyl en position terminale
111.1. VARIATION DU NOMBRE DE CHAINES
L'analyse des séquences des acides aminés de nombreuses glyco-
protéines et les études de la glycosylation in vitro ont montré que le
tripeptide de séquence Asn-X-Thr/Ser représente le "signal" de glycosy-
lation.
L'ovalbumine possède deux sites potentiels de glycosylation -Asn293-
Leu-Thr- et Asn3U-Leu-Ser-. Cette protéine, synthétisée .in vivo, n'est
glycosylée qu'au niveau du résidu acide aminé 293 ; dénaturée 9U en petits
fragments, elle peut l'être également 'in vitro sur le résidu Asn
.
311
Récemment,Yamashita et al (1983,123) ont montré que les molé-
cules des y-glutamyltrar.speptidases(y-GT) purifiées à partir des cellules
d'hépatome de rat, avaient quatre fois plus de chaînes "Asn-oligosaccha-
rides"que celles du foie normal. L'enzyme du foie a quatre chaînes glycan-
niques alors que celle de l'hépatome en aurait 12.
Le même type de modification a été observé au niveau de l'ŒI-GPA
humaine. En effet, l'ŒI-GPA humaine possède 5 sites potentiels de glyco-
sylation tous situés sur la partie N-terminale de la molécule (fig.11)
(Schmide.t al, 1973,91' ). Cependant, à partir d'un extrait de foies métastasique:
Chandrasekaran et al(1984,23 ) ont isolé et purifié 2 formes d'ŒI-GPA
19
GlcNAc
Man
(Sl,2)
l
"(0'.1,3/) Man
Man
"M
(0'.1,6)
an
~
~al,6)
Man - - - -__ GlcNAc
(0'.1,3)
(Sl,4)
1
R
Figure 10
Structure de la chaine glycannique de l'ovalbumine du
groupe III : la présence de la GlcNAc sur le Man en S
du "core" bloque l'activité de la (0'.1,3) (0'.1,6) mannosidase,
par conséquent l'élongation de la branche portée par le Man
en (0'.1,6). SI 4
SI
(R = GlcNAc
'
GlcNAc_Asn)
N
5
1
15
38
N
54
N
164
1
r
1
1
7
72
N
N
Figure Il
al-glycoprotéine acide humaine (Schmid et al, 1973,g~).
___ N sites de glycosylation
---- 2 ponts disulfure.
20
humaine. La forme légère de 37.000 daltons ne comprendrait que 3 à 4
chaînes glycanniques par molécule alors que la forme lourde de 45.000
en contiendrait 5 à 6.
Ces variations du nombre de chaînes suggèrent qu'une partie
des séquences Asn-X-Thr/Ser du polypeptide serait dissimulée dans les plis
de la chaîne polypeptidique et deviendrait ainsi inaccessible aux enzymes
dans certaines conditions.
111.2. MODIFICATIONS PORTANT SUR LE DEGRE DE RAMIFICATION
La Concanavaline A (Con A) est une lectine qui reconnaît spéci-
fiquement dans une glycoprotéine les restes mannopyranosyls.
L'interaction entre la Con A et la glycoprotéine dépend toutefois
de l'accessibilité des restes mannosyls. Lorsque la chaîne glycannique est
peu ramifiée (structure biantennée), les restes mannosyls sont accessibles
et lient la Con A. A l'inverse, les restes mannosyls des formes tétra-
antennées sont masqués à la Con A et aucune interaction ne se produit. Il
existe entre ces deux extrêmes des formes intermédiaires qui sont partiel-
lement reconnues par la Con A.
Par chromatographie sur Con A Sepharose, il a été possible de
séparer ces différentes formes et de mettre en éyidence, par une étude
..
structurale complète des chaînes glyc,ann,es,. .1,'·aspect mul tiantenné des
........-., -,
.
formes non retenues par la Con A et le caractère biantenné des formes
retenues (Krusius et al 1976,54 ; Bayard et al, 1983,9 ~
La proportion entre ces différentes chaînes
et leur nature peuvent être
modifiées au cours de certaines pathologies.
Dans l' al-GPA de métastases hépatiques, les formes bi, tri et
tétraantennées représentent respectivement 20, 50 et 30 % (Chandrasekaran
et al, 1984,23 ). Dans la gamma GT isolée d'hépatome de rat, il apparaît
à côté des chaînes de type N-acétyllactosam.inyl, des chaînes oligomannosyles
alors que la_gamma GT isolée de foies sains n'est constituée que de chaînes
~ type N-acétyllactosaminyl (Yamashita et al, 1983,~23).
21
A côté de ces études de structure qui nécessitent au préalable
la purification de la glycoprotéine, une méthode d'immunoaffinoélectro-
phorèse en Con A a été développée par B~g-Hansen et al (1975,~G ).
Elle permet d'établir pour une glycoprotéine donnée la proportion des
différentes formes antennées. Ainsi, au cours de la grossesse ou lors d'un
traitement par les oestrogènes, on observe une augmentation de la concen-
tration plasmatique de l'ul-GPA portant principale~~nt sur les formes tri
et tétraantennées (Wells et al 1981,~~g; Raynes 1982,gS ). A l'inverse,
au cours de la phase aiguë de l'inflammation, l'augmentation de la concen-
tration plasmatique en u1-GPA porte essentiellement sur la forme biantennée
(Nicollet et al, 1981,l5- ). D'autres glycoprotéines plasmatiques ont été
étudiées par ce protocole analytique. Chez les sujets cirrhotiques, Spik
et al (1983,~04) ont montré que la structure glycannique de la transferrine
était modifiée avec, en particulier, apparition d'une forme non retenue par
la Con A.
111.3. MODIFICATIONS DU RESTE OSIDYL EN POSITION TERMINALE
Ce troisième type de modification constitue la micro hétérogénéité
périphérique caractérisée par la présence ou non d'un résidu fucosyl sur le
résidu GlcNAc le plus externe de la copule glycannique, et d'un résidu sialyl
en position terminale.
En chromatographiant l'ul-GPA sur une DEAE cellulose, Schmid et
al (1962,~ô ) ont obtenu 9 fractions de"composition en acides aminés très
voisines. Le polymorphisme est donc dû à des variations au niveau des unités
polysaccharidiques. Schmid et ses collaborateurs constatent en effet que le
pourcentage d'oses neutres diminue de la première à la dernière fraction,
tandis que le pourcentage de restes sialyls augmente.
Divers auteurs remarquent plus tard que, lorsque la
force ionique augmente, les fractions contiennent de moins en moins de
résidus fucosyls et de plus en plus de"résidus sialyls. Ceci est en accord
avec les travaux de Paulson et al (1978, 8~ ) qui démontrèrent que la
22
sialylation et la fucosylation de llŒl-GPA sont mutuellement exclues. Des
études récentes ont toutefois montré la coexistence de ces 2 restes osidyls
sur une même antenne de l'ŒI-GPA isolée de métastases hépatiques
(Chandrasekaran et al 1984,2.3 ).
Dans diverses atteintes pathologiques et en particulier en
pathologie hépatique, une hyposialylation des glycoprotéines plasmatiques
a été mise en évidence. Marshall et al 0.978 ,66 ), Arima (1979, Q,
)
ont montré qu'au cours des atteintes hépatiques, il y avait accumulation
de matériel hyposialylé sans en préciser la nature.
Stibler etàl (1979,~05 ) mettent en évidence un variant hyposialylé de
la transferrine lors d'une imprégnation éthylique aiguë. Plus récemment,
dans notre laboratoire, et par un protocole original, il a été montré que
plusieurs glycoprotéines pouvaient être hyposialylées au cours des cirrhoses.
Les résultats les plus significatifs sont obtenus avec l'ŒI-GPA. Plus
l'insuffisance hépatocellulaire est grave, plus la probabilité d'une hypo-
sialylation de l'ŒI-GPA est grande (Bordas et al, 1981,1~ ; Serbource-Goguel
et al, 1983, --100 ) •
Beaucoup de ces données ont été acquises chez l'homme. Pour
rechercher l'origine de ces altérations, il est préférable d'avoir un modèle
animal. Deux modèles ont été choisis: des rats traités à la galactosamine
et au phénobarbital. Comme nous le verrons ci-dessous, ces 2 molécules
entraînent des modifications morphologiques des organelles cellulaires et
en particulier du réticulum endoplasmique. On pouvait donc espérer des
modifications dans la synthèse des chaînes glycanniques des glycoprotéines
de sécrétion.
23
IV. HEPATITE EXPERIMENTALE A LA GALACTOSAMINE CHEZ LE RAT
IV.l. METABOLISME DE LA GALACTOSAMINE (GaIN) (figure 12)(Decker et Keppler,
1972,2,1 )
Après injection, la GaIN suit la voie du métabolisme du Gal. La
formation de la GalN-lP est catalysée par la galactok~nase. Il y a ensuite
formation d'UDP GaIN grâce à l'UDP uridyl transférase suivie de la conversion
en UDP GlcN par l' UDP Gal-4' -épimérase. Ce mécanisme entraîne une accumulation
d'UDP GalNAc et d'UDP GlcNAc suivie d'un déficit important et prolongé en
UDP Glc, UDP Gal, UTP, UDP et UMP (Reynolds et Reutter, 197~ 89 ) et vraissembl
blement en nucléotides
sucres, synthétisés à partir de ces derniers composés.
IV.2. CONSEQUENCES IMMEDIATES
L'injection isolée de la GaIN est suivie dès les premiers jours
d'une augmentation du taux sérique des transaminases (SGOT ou ASAT et SGPT ou
ALAT) et de la bilirubine. En microscopie électronique, le réticulum endo-
plasmique rugueux (R.E.R.) apparaît réduit, dilaté et pauvre en ribosomes
alors que le réticulum endoplasmique lisse (R.E.L.) présente une hypertrophie
généralisée (Decker et Keppler, 1972,Zf). La production puis l'accumulation
des UDP hexosamines dans le foie provoquent :
a) un déficit en uridylates avec pour conséquence une diminution
de la synthèse d'ARN
b) une synthèse accrue d'un polysaccharide basique: l'amino-
glycogène qui s'aggrège aux ribosomes et au réticulum endo-
plasmique (Meszaros et al, 1976, 61 ; Mandl et al, 1982, 65 ).
Toutefois, ces altérations cliniques et biologiques peuvent se
manifester à des degrés variables suivant le protocole d'intoxication
- si le protocole consiste en une seule injection, certains symp-
tômes peuvent n'apparaître que transitoirement. Par contre des injections répé~
tées de GaIN provoquent une hépatite progressive puis chronique conduisant
à une cirrhose au bout de 6 mois.
- dans des conditions de renouvellement rapide des constituants
cellulaires, on note une certaine résistance à la GaIN ; la toxicité est
plus faible. Ce phénomène est observé au cours de la croissance rapide
24
des hépatocytes chez les animaux nouveau-nés et après une hépatectomie
partielle.
- l'administration d'uridine ou d'orotate couplée à des injections
répétées de GaIN entra!ne une adaptation du foie à l'intoxication. Dans ces
conditions, la biosynthèse d'uridylates est plus active. Il en résulte une
diminution moins prononcée et/ou prolongée en UTP et UDP Glc (Decker et al,
1971,2'6 ).
CH 0H
2
OH~
OH 0"", ( H, OH )
H
H
H
NH2
GaIN
Orotate
l
galactokinase
l
l
GalN-l-P
IDP Glc ~UTP == :=::; IMP
UDP Glc
~-~Glc-l;P
uridyltransférase
1
1
UDP GaIN
UDP Gal
II
4' -épimérase
UDP GleN _ _~} UDP GleNAc ~L====::::7' UDP GalNAc
Figure 12
Métabolisme de la galactosamine dans le foie (Decker & Keppler,1972/2
GalN-l-P : ~-D-galactosamine-l-phosphate ; UDP GleN: uridine
di phosphate glucosamine ; UDP GleNAc : uridine di-phosphate N-
acétyl glucosamine ; UMP : uridylate ; UTP : uridine tri-phos-
phate ; UDP Glc : uridine di-phosphate glucose.
25
IV.3. ACTION SUR LA SYNTHESE PROTEIQUE
Deux mécanismes simultanés et indépendants entra!nent une inhibi-
tion de la synthèse protéique.
a) diminution du taux de synthèse d'ARN due au déficit en UTP
b) inhibition d'incorporation d'acides aminés dans les peptides
naissant du fait de l'aggrégation du R.E.R. et des ribosomes
par l' aminoglycogène (Mandl et al, 1979, 64 ). Ainsi les tIBvaux
de Sawamura et al (1981,92) ont révélé qu'après injection d'une
"seule dose (900 mg/kg de poids) la GaIN provoque une insuffisance
hépatocellulaire grave entraînant une diminution marquée de la
concentration sérique en protéines. La teneur des microsomes en
protéines dont le récepteur des asialoglycoprotéines est égale-
ment diminuée.
IV.4 •. CONSEQUENCES PREVISIBLES DE L'INDUCTION A LA GALACTOSAMINE (GalNAc)
L'orientation préférentielle de certains substrats (mono-nucléo-
tides) vers le métabolisme de la GaIN et l'accumulation de divers produits
de ce métabolisme peuvent avoir d'autres conséquences que celles déjà décrites
et touchér:.là biosynthèse des protéines. Plusieurs remarques peuvent être
faites :
- l'aggrégation de l'aminoglycogène avec le réticulum endoplasmique
peut limiter les étapes métaboliques de cet organite. L'action des glycosyl-
transférases membranaires peut être partiellement ralentie. La synthèse et
le turn over de ces enzymes peuvent être aussi altérés. L'altération au
niveau des glycoprotéines sériques serait double :
a) diminution de la synthèse de la copule peptidique
b) défaut de glycosylation
- par suite du déficit en UDP Glc et UDP Gal, il n'est pas exclu
qu'il y ait un déficit intracellulaire en certains nucléotides-sucres,
substrats des glycosyltransférases. Ceci peut conduire à la formation de
chaînes glycanniques incomplètes.
- par contre, la disponibilité accrue en UDP GlcNAc à la suite du
métabolisme de la GaIN pourrait favoriser son incorporation et augmenter
la proportion des chaînes de structure du type complexe tri ou tétraantennée.
26
V. L' l NDUCTION PAR LE PHENOBARBIrAL ET SES CONSEQUENCES
Le phénobarbital (PB) est un hypnotique capable d'induire la
synthèse d'une grande variété d'enzymes hépatiques dont le système des
mono-oxygénases, la glutathiontransférase et l'UDP-glucuronyltransférase
(Griffin et al, 1984,38 ; Tavoloni et al, 1983,~11 ). Généralement,
l'induction par le PB s'accompagne de l'augmentation du métabolisme d'une
variété de substances soit endogènes tels que les acides gras, les stéroïdes ••
soit exogènes comme les médicaments, les pesticides et les hydrocarbures
(Conney, 1967,2.5).
Le PB reste à l'heure actuelle un produit largement étudié pour
son remarquable pouvoir d'induction des enzymes du système mono-oxygénasique.
Très peu d'études portent sur la biosynthèse des protéines et glycoprotéines
circulantes.
Cependant, après un traitement au PB, on note des modifications
ultrastructurales dans le réticulum endoplasmique comparables à celles
observées lors de la phase aiguë de réaction à une blessure : augmentation
du R.E.R. avec une polymérisation accrue des ribosomes (Orrenius et al,
1965,~~ ; Turchen et al, 1977,~1; ). Ces modifications sont suivies d'une
induction de diverses enzymes qui se trouvent la plupart liées ou associées
au R.E.
Prenons comme exemple d'enzyme, l'UDP glucuronyltransférase qui
assure le transfert d'un reste osidyl (glucuronyl) sur un récepteur adequat
(bilirubine, paranitrophénol ••• ) selon la réaction
UDP glucuronate + Accepteur-OH -->~glucurono conjugué + UDP
Cette enzyme a une faible activité chez le nouveau-né prématuré
il en résulte parfois un défaut de conjugaison de la bilirubine avec appa-
rition d'un ictère. Le PB a un tel pouvoir d'induction de synthèse de cette
enzyme qu'il est utilisé en thérapeutique pour lutter contre l'accumulation
de la bilirubine libre en favorisant sa conjugaison et par là même arrêter
l'ictère.
D'autre part, lors de la blessure, l'hypertrophie du R.E. est
suivie d'une synthèse accrue de glycosyltransférases (Turchen et al, 1977,~~3)
et de glycoprotéines comme l'al-GPA.
27
Qu'en est-il au cours de l'induction par le PB de la synthèse
protéique et en particulier des glycoprotéines dont la glycosylation est
assurée par les glycosyltransférases au cours de leur cheminement à travers
le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi?
Nous nous proposons, dans ce travail, d'étudier par des techniques
analytiques les microhétérogénéités éventuelles de la chaîne glycannique des
glycoprotéines.
- Nous avons retenu une glycoprotéine: l'al-glycoprotéine acide
dont nous avons préparé l'immunsérum monospécifique
- Nous avons retenu 2 protocoles d'analyse:
a) étude de la sialylation par un protocole immunochimique
basée sur la détermination sérique de l'al-glycoprotéine acide par immuno-
diffusion radiale et électroimmunodiffusion monodimensionnelle. Ceci cons-
titue l'hétérogénéité mineure ou en position terminale.
b) étude de l'hétérogénéité majeure ou degré de,ramification
des chaînes glycanniques en immunoaffinoélectrophorèse croisée utilisant
la Concanavaline A dans la première dimension.
- Dans la dernière partie; "nous présenterons les_~remiers'éléments
de structùre des glycannes de l'al-GPA isolés-de" rats normaux et traités par
le PB.
28
MATERIEL ET TECHNIQUES
UTILISES
29
A.- TECHNIQUES D'INDUCTION
1) ANIMAUX
Nous avons utilisé des rats mâles de race SPRAGUE DAWLEY pesant
entre 250 et 300 g. Les animaux sont nourris pendant toute la durée du trai-
tement et boivent de l'eau potable.
2) INDUCTEURS
• Phénobarbital sodique Sigma
• Chlorhydrate de galactosamine Merk
• Essence de térébenthine Onyx
3) HEPATITE EXPERIMENTALE A LA GALACTOSAMINE
(Sawamura et al 1981,92, )
Les animaux ont reçu,
par voie intrapéritonéale, une
injection unique d'une solution de galactosamine (GaIN) à raison de 900 mg/kg
de poids corporel. A cette dose,la GaIN est susceptible de provoquer une
souffrance hépatocellulaire grave et réversible (Decker et Keppler 1972,2t ).
4) INDUCTION AU PHENOBARBITAL-Na
Le traitement est pratiqué selon un procédé voisin de ceux de
Williams et al (1979,119 ) et de Ohlsson et Jergil (1977,16 ). Des rats
mâles ont reçu, par voie intrapéritonéale,6 injections d'une solution de
phénobarbital (PB) (40 mg/ml d'une solution de NaCl 0,15 M) à la dose de
40 mg/kg de poids corporel. Les injections sont faites toutes les 12 heures
aux mêmes heures.
5) INFLAMMATION A L'ESSENCE DE TEREBENTHINE
1 ml d'essence de térébenthine (E.T.) est injecté par voie sous-
30
cutanée dans l'aire scapulaire.
6) TRAITEMENT AU PB PUIS A L'E.T.
L'induction est effectuée en deux étapes. Les rats ont été d'abord
traités au PB (cf. protocole induction au PB) pendant 3 jours, puis au 4ème
jour ils ont reçu chacun une injection unique d'E.T.
7) RECUEIL DU SERUM
Un premier prélèvement est effectué sur tous les rats avant
les traitements. Nous avons ensuite pratiqué un prélèvement quotidien
(toujours à la même heure) de 0,5 ml par ponction intracardiaque:
- à pqrtir de la 12ème heure après la dernière injection de PB
- 24 heures après l'injection de la GalN ou de l'E.T.
Il faut noter que lorsque les traitements au PB et à l'E.T.
sont associés, les prélèvements débutent à partir du 3ème jour de trai-
tement au PB suivant le schéma ci-dessous.
J*
J *
J *0
J l
J 2
3
4
J *5
~lt~i~t~t~f~t~-----------
J l, J 2, J 3 ••••••• Jours (24 heures)
* Prélèvements effectués après une légère anesthésie à l'éther
t 6 injections de PB par intervalle de 12 heures
+Injection unique d'E.T. au 4ème jour
•
•
31
8) ANIMAUX TEMOINS
Parallèlement, nous avons préparé deux séries de rats témoins
- Première série
Les animaux ont reçu une solution de NaCl 0,15 M sous un volume
identique à celui dans lequel ont été dissous
la GaIN ou le PB.
Des prélèvements intracardiaques sous anesthésie à l'éther sont
réalisés selon le protocole ci-dessus.
- Deuxième série
Les animaux n'ont reçu ni produit, ni solution de NaCl 0,15 M.
Ils ont simplement été prélevés aux temps indiqués après anes-
thésie. Cette série a été faite dans le but de voir le seul effet
de l'anesthésie et de la ponction intra-cardiaque.
B.- TECHNIQUES DE DOSAGES IMMUNOCHIMIQUES
1) REACTIFS
- Plaque plastique : Gel Bond TM film 10,2 cm X 16 m X 0,1 mm,
Marine Colloids (Flobio France), découpé aux dimensions choisies
avant emploi.
Tampon Véronal pH 8,6 Force ionique 0,05
· Véronal ............•.. l,6 9
• Véronal sodé •••••••••• 8,24 g
• Azide de sodium ••••••• 200 mg
• Eau distillée q.s.p ••• 2000 ml
- Gel d'agarose : solution d'indubiose A
(Industrie Biologique
37
Française : IBF) à l p.cent dans le tampon Véronal pH 8,6, obtenue
par dissolution à chaud dans un bain marie bouillant. Le gel est
ensuite réparti dans des tubes en verre et conservé à +4°C.
32
- Jmmunsérums (J.S.)
• J.S. de lapin anti-protéines totales de rat in flammé fourni par
D. Biou
• J.S. de lapin monospécifique anti-al-glycoprotéine acide de rat
• J.S. de lapin monospécifique anti-albumine de rat.
La préparation des immun sérums est décrite au paragraphe D.
- Colorant : bleu brillant de Coomassie G250 Serva (Tébu S.A. France)
à 0,5 p.cent
• Bleu brillant de Coomassie •••
5 g
• Acide acétique pur •••••••••••• 100 ml
· Ethanol à 96° ...•••••..••..... 450 ml
· Eau distillée
. 450 ml
- Décolorant
• Ethanol à 96° ••••••••••••••••• 450 ml
• Acide acétique pur •••••••••••• 100 ml
• Eau distillée ••••••••••••••••• 450 ml
2) JMMUNODJFFUSJON RADJALE
(Mancini et al 1965,63 ).
2.1.- Principe
Dérivant des travaux de Ouchterlony (1958, i9
) et de Oudin
(1952,80 ), l'immunodiffusion radiale (IDR) est une méthode quantitative
très utilisée à l'heure actuelle. Elle est basée sur la formation d'un
complexe antigène-anticorps (Ag-Ac). Celui-ci se forme entre un Ag diffusant
radialement à partir d'un puits de dépôt et un Ac inclus dans un gel d'agarose
à un certain pourcentage.
33
2.2. - Expression mathématique (Mancini et al 1965,63)
L'analyse des différents paramètres après diffusion complète
permet d'établir la relation reliant la surface de l'anneau de précipi-
tation à la quantité d'Ag déposée.
2
02 = 4 VAg
• CAg + d
PnhT
,
ou VAg
Volume d'Ag déposé (pl)
CAg
Concentration d'Ag (g/lOO ml)
P
Pourcentage d'l.S. dans le gel
h
hauteur du gel (mm)
0
Diamètre du cercle de précipitation (mm)
d
diamètre du puits de dépôt
2
La droite d'étalonnage 0
= f (CAg) permet de déterminer la
concentration en Ag d'une solution inconnue.
2.3. Technique
Sur une plaque plastique 10 X 10 cm préalablement dégraissée à
l'éthanol nous coulons 15 ml de gel liquéfié. contenant 3 à. 4,5 p.cent
d'J.S.
Après refroidissement du gel des puits sont creusés et nous
y
déposons 5 rI de sérum à doser. Le maintien des plaques 48 heures à
température ambiante et en chambre humide, permet d'atteindre l'équilibre
de diffusion.
2.4. Révélation et lecture de la plaque
Après diffusion, la plaque est séchée par deux compressions
successives de 5 minutes sous du papier filtre puis lavée 2 fois 15 minutes
par une solution de NaCl 0,15 M et enfin séchée quelques heures à l'étuve à
37°C.
34
La plaque est ensuite colorée par la solution de bleu de coomassie pendant
15 mn puis décolorée par passages successifs dans des bains de décolorant.
- La lecture est effectuée en mesurant les diamètres des cercles
de précipitation au 1/10° de millimètre. Nous portons alors sur une courbe
d'étalonnage le carré des diamètres en fonction de la concentration d'une
gamme standard.
3) ELECTROIMMUNODIFFUSION MONODIMENSIONNELLE DE LAURELL (1966,56 )(EIDm)
3.1.Principe
C'est une technique de dosage des protéines plus rapide et plus
sensible que l'IDR. Deux phénomènes interviennent:
Migration électrophorétique des protéines à pH 8,6 dans un gel
d'agarose •
• Formation d'un complexe insoluble entre une protéine antigénique
et l'Ac spécifique correspondant incorporé dans le gel.
Au cours de sa migration, l'Ag diffuse latéralement et est neu-
tralisé par l'Ac. Il en résulte la formation d'un cône dont le sommet se
redissout par apport d'Ag. A l'équilibre de migration et de diffusion la
surface du pic de précipitation est proportionnelle à la quantité d'Ag déposée.
3.2. Technique
Sur une plaque de gel d'agarose 10 X 10 X 0,15 cm contenant
2 à3 p. cent dII.S, des puits de 2 mm de diamètre sont pratiqués tous les
3 mm. La plaque est ensuite transférée sur un support de migration réfrigéré.
Le contact avec le tampon véronal pH 8,6 des compartiments anodique et
cathodique est assuré par 5 épaisseurs de papier Whatman N°l (10 X 10 cm).
L'Ag est ensuite déposé sous une prise d'essai de 5 fI sous faible voltage
(2,5 V/cm) pour éviter sa diffusion latérale. La migration est effectuée
sous 10 V/cm pendant 4 heures.
35
3.3. R~v~lation (cf. § 2.4) et lecture de la plaque
En fin de migration, il en r~sulte un pic de pr~cipitation,
stable, dont la surface, c'est-à-dire la hauteur du pic, est proportion-
nelle à la quantit~ d'Ag d~pos~e. Nous mesurons donc la distance (en mm) com-
prise entre le centre du puits et le sommet du pic. Une gamme ~talon d~
pos~e sous le même volume et ayant migr~ sur la même plaque permet d'obtenir
la concentration antig~nique de la prise d'essai après lecture de la hauteur
du pic correspondant. La relation h = f (CAg) est de type lin~aire où :
h = hauteur du pic (mm)
CAg = concentration de l'antigène (mg/l)
4) PRINCIPE DE LA SOUS-EVALUATION (S.E.) (Biou et al 1984, 1~
Les courbes reliant la d~sialylation de diverses glycoprot~ines
humaines: al-GPA, al-antitrypsine (Bordas et al, 1982,19 ) h~mopexine et
Cl-inactivateur (Serbouce-Goguel et al 1984,~o1 ) à la sous-~valuation
obtenue en EIDm par rapport à l'IDR avaient pr~alablement ~t~ établies. Le
protocole a donc ~t~ transpos~ à l' al-GPA de rat en tenant compte des
caract~ristiques physico-chimiques.
A 2,5 mg d' al-GPA native dans 5 ml de tampon ac~tate, 235 pmol
pH 5,50, NaCl 705 pmol, CaC1
42 ~mol, est ajout~e la neuraminidase (E.C
2
3.2.1.18) de Vibriocholerae (200 mU/mg de protéine). Au cours de l'incu-
bation men~e à 37°C et à des intervalles de temps allant de 0 à 120 min
diverses aliquotes sont pr~lev~es puis neutralis~es par une solution de glycine-
soude
0,05 mmol/l, pH 9, EDTA 18 mmol/l. La teneur en acide sialique
lib~r~ est alors dos~e par la m~thodede Warren (1959,~~5) et l' al-GPA
par IDR et EIDm après dilution ad~quate. Il apparaît qu'en fonction du
temps d'incubation le traitement de l' al-GPA native par la neuraminidase
conduit à une lib~ration progressive d'acide sialique allant jusqu'à 60 %
du taux initial.
Nous notons ~galement que les concentrations en al-GPA des di-
verses aliquotes, d~termin~es par IDR restent constantes alors qu'elles
diminuent progressivement au cours de leur ~valuation en EIDm. La sous-
36
évaluation par l'EIOm relative à l'TOR est fonction du pourcentage d'acide
sialique libéré dans le milieu réactionnel. La courbe reliant le pourcen-
tage de désialylation au pourcentage de sous-évaluation est représentée sur
la figure 13 •
Compte tenu des coefficients de variation des deux méthodes
(JOR et EJOm) une sous-évaluation ~ 5 % ou une désialylation ~ 12 %
doit être considérée comme non significative (Biou et al 1984,~4 ). Ainsi
lors de la mise en évidence d'une sous-évaluation en EJOm par rapport à
l'JOR de la concentration en CII-GPA d'un sérum, nous parlerons d'hypo-
sialylation de façon à ne pas préjuger du mécanisme présidant à ce défaut
de sialylation : défaut de synthèse ou désialylation dans le milieu circu-
lant. O'autre part, la découverte d'une concentration plus élevée en EIOm
par rapport à l'IOR pourrait aller dans le sens d'une hypersialylation.
Toutefois, aucune relation entre ces deux paramètres n'a pu être établie.
L'équation de la droite y = 1,42 + 0,86 x est obtenue par régres-
sion orthogonale; x représente le degré d'hyposialylation et y le degré
de sous-évaluation (Biou et al 1984,"",~ ). L'équation établie pour l' CI I-GPA
humaine est y = 25,6 + 0,42 x (Bordas, 1981,1l ). Il apparaît que pour
un même degré de désialylation de ces deux glycoprotéines la sous-évaluation
obtenue avec l' CI I-GPA de rat est plus faible que celle mesurée pour l' CI 1-
GPA humaine. Cette différence peut être dûe à des variations dans la compo-
sition tant en acides aminés qu'en sucres.
La teneur de l' CII-GPA en restes sialyls est plus faible chez le
rat (9 p.cent) que chez l'homme (12 p.cent). Ils interviennent donc moins
dans la charge électrique globale de l' CI I-GPA de rat.
La composition en acides aminés chargés à pH 8,6 et surtout
l'existence d'acides aminés très chargés à la partie C terminale de la chaine
peptidique de l' CII-GPA de rat, non retrouvée dans celle de l'homme, atténuant
l'effetdel'hyposialylation (Ricca et Taylor, 1981,QO).
5) IMMUNOELECTROOJFFUSION EN QUINCONCE
5.1. Principe
L'immunoélectrophorèse en quinconce est une méthode très sensible,
50
-
-
40
~
30
c
....
~
<
:=>
~
~
20
1
en
:=>
o
en
y
1,42
+
O,86x
10
..
10
20
30
40
50
60
70
D[SJALYLATIOtl (\\l
Figure 13
Courbe d'étalonnage de la détermination de la
désialylation de l' Ct I-GPA de rat obtenue par
régression linéaire.
y = 1,42 + 0,86 x
ou y = sous-évaluation
x = désialylation
38
semi-quantitative, surtout utilisée pour suivre une ou plusieurs pro-
téines au cours d'une purification.
La première étape consiste en une diffusion des différentes
protéines
dans un gel sans J.S., la deuxième étant une migration élec-
trophorétique dans un gel contenant un immun sérum anti-protéines totales
ou monospécifique. Si l'immunsérum est polyvalent, plusieurs protéines
peuvent être identifiées et une impureté détectée. La révélation par un
immunsérum spécifique permet de déceler
la protéine dans les différentes
aliquotes d'un éluat et de procéder à leur regroupement.
5.2. Technique (figure 14)
Dans un gel d'agarose sans J.S. (flg.14a) nous pratiquons des
puits disposés en quinconce dans lesquels nous déposons les échantillons
à analyser. Ceux-ci sont mis à diffuser pendant 90 minutes dans une chambre
humide à température ambiante. Puis, nous prenons une bande 3 X 10 cm du
gel précédent, correspondant à la zone de diffusion protéique. Nous la
transférons à l'extrémité cathodique d'une nouvelle plaque d'une solution
d'agarose à l p.cent contenant un J.S. (Fig~4b) de lapin anti-protéines
totales ou anti-Ctl-GPA de rat. fJne tension de 2,5 V/cm est appliquée pen-
dant 18 heures.
5.3. Révélation (cf. § B.2.4)
o
0
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
e ®
Figure 14: Jmmunoélectrophorèse en quinconce. a) gel de diffusion,
b) gel contenant un J.S. anti-protéines totales ou monospécifique.
C.- TECHNIQUE D'ItvfvlUNQ-AFFINOELECTROPHORESE CROISEE CClAE) EN
CONCANAVAL1NE A
1. REACTIFS
- Plaque plastique (cf.§ B.l)
- Tampon tris-véronal pH 8,6 (Wells et al 1981,1-1~ )
Tris
72 mM
,8,7 9 (PM = 121)
• Véronal
24 mM
4,4 9 (PM = 184)
• Lactate de calcium
0,4mM
0,12 9 (PM = 308)
• Azide de sodium
0,2mM
0,01 9 (PM = 65)
• Eau distillée q.s.p.
1000 ml
- Gel d'agarose à l p.cent dans le tampon tris-véronal. Agarose
type II (Sigma, France) (pour préparation - voir § B.l)
- Le
méthyl a-D-glucopyrannoside (Sigma, France)
- polyéthylène glycol (PEG) poids moléculaire 6000 (Prolabo, France)
- Lectine: Concanavaline A (Con A) Lot nO 649 (IBF, France).
La Con A (50 g/l) extemporanément dissoute dans une solution de
CaC1 , MgC1
et MnC1
à l mM respectivement est utilisée à la
2
2
2
2
concentration finale de 150 pg/cm
dans le gel de la première
électrophorèse.
- Colorant et décolorant (cf. § B.l)
2. PRINCIPE DE LA CIAE-Con A
L'immunoélectrophorèse bidimensionnelle (EIDb) décrite par
Laurell (1965,55 ) puis Weeke
(1973, A-t6) est une technique
faisant intervenir 2 migrations successives dans un champ électrique.
- La première est une électrophorèse de zone dans un gel
dépourvu d'I.S.
la deuxième, perpendiculaire à la première est une immuno-
électrodiffusion dans un gel contenant 1'1.5. spécifique de
la protéine à étudier.
40
En 1975 B~g-Hansen et al (1Ô ) ont introduit la CIAE qui
apporte quelques modifications de l'EIDb.
a) La CIAE fait intervenir la Con A dans la première électro-
phorèse. En effet, la Con A est une lectine qui, par interaction bio-
spécifique, se lie aux résidus mannopyrannosyls des glycannes. Son affinité
pour ces sucres d'une part, la teneur et/ou l'accessibilité de ceux-ci
d'autre part conduisent à la séparation de différentes formes glycoprotéiques.
b) La présence d'a-méthyl D gluco
ou mannopyrannoside favorise
la dissociation des complexes glycoprotéine-Con A et permet une meilleure
identification des formes les plus retenues par la Con A. L'immunsérum mono-
spécifique permet une révélation des différentes formes de l'a - GPA.
l
3) TECHNIQUE
Nous procédons à deux électrophorèses successives.
3.1. Première électrophorèse
La plaque de la première migration (10 X 10 cm) comporte deux
parties (fig. 15).
La partie a (6 X 10 X 0,2 cm) est recouverte de gel d'agarose
à l p.cent contenant de la Con A préalablement dissoute dans
une solution de CaC1
ImM, MgC1
ImM et MnC1
ImM. Nous pratiquons
2
2
2
dans ce gel des puits distants de 1. cm et à 1,5 cm de la cathode.
15 fI de sérum dilué à 100 mg/l d'al-GPA sont déposés.
- La deuxième partie b (4 X 10 X 0,2 cm) est recouverte de gel
de référence (gel d'agarose sans Con A). Un mélange de sérum-
albumine (BSA) (Sigma) et de bleu de bromophénol déposé dans
ce gel permet de suivre la migration.
La migration électrophorétique est réalisée sous une tension de
10 V/cm pendant 90 à 120 mm dans le tampon tris-véronal pH 8,6.
41
,
a
b
1
r \\
r \\
I!"'\\
1"\\
r \\
........,
'-"
........"
' - /
'-JI
pl
p2
p3
p4
p5
Figure 15 : Plaque de gel d'agarose de la 1ère électrophorèse
.
a
gel d'agarose avec Con A
b
gel d'agarose sans Con A
pl, p2, p3 et p4 : puits de dépôt des échantillons
.
p5
puits de dépôt de la BSA colorée au bleu
3.2. Deuxième électrophorèse (fig. 16)
Le gel a de la première dimension est découpé en bandes de
1,5 X 10 cm transférées sur des plaques de la X la cm divisées en 3 parties
- la bande a la X 1,5 X 0,2 cm de la première électropho-
rèse est placée à 2,5 cm du bord cathodique de la plaque.
- le quart de la plaque d du côté de la cathode (la X 2,5 X 0,2 cm)
est recouverte de gel de référence.
- les 3/5 de la plaque c la X 6 XO,12 cm sont recouverts par un
gel d'agarose à l p.cent contenant l'J.S. de lapin anti-al-GPA
,
/
2 ,
.
,
de rat a l fI cm , le methyl a-D glucopyrannoslde a 4 p.cent
compétiteur de la Con A et le PEG à 2 p.cent (P/V).
La migration électrophorétique est de 18 heures sous 2,5 V/cm.
42
+
c
0
a
al
E
,al
N
d
- ---- - - - - - - - - - - - - - -...
~ +
1ère électrophorèse
Figure 16 : Plaque de gel d'agarose de la 2ème électrophorèse.
a : gel 10 X 10 X 0,2 cm de la 1ère électrophorèse
c : gel 10 X 6 X 0,12 cm contenant l'Ac et le
méthylglucopyrannoside + PEG
d
gel 10 X 2,5 X 0,2 cm de référence sans Con A
4) REVELATION (cf. § B.2.4.) LECTURE DES PLAQUES
La surface de chaque pic est mesurée par planimétrie (plani-
mètre A ott Kemplen Bayern). Elle est ensuite comparée à la surface
totale des pics.
5) CONSEQUENCES PRATIQUES
La CIAE est d'abord qualitative puis quantitative à condition
43
de déposer dans les puits une quantité connue de glycoprotéine.
Elle permet d'identifier les sous-populations de l'al-GPA
sérique selon leur affinité pour la Con A et de suivre les modifications
et/ou les altérations des glycannes au cours du traitement.
D.- PREPARATION DES IMMUNSERUMS CI.S.)
1) ANTIGENES
- albumine de rat
- al-glycoprotéine acide de rat
2) IMMUNISATION
(Biou et al 1984,.1*
)
Nous utilisons des lapins de la race "NEO ZELANDAIS" (Iffa-Credo).
Le protocole est le suivant: 250 microgrammes d'albumine ou de
al-glycoprotéine acide de rat désialylée sont dissous
dans 2 ml d'une
émulsion de NaCl 0,15 M et d'adjuvant complet de Freund (v/v) puis injectés
par voie sous-cutanée chez le lapin à raison de 0,25 ml dans chaque patte
arrière et de 10 injections de 0,15 ml dans la peau du dos. Nous effectuons
ensuite un rappel au 30ème jour à 50 p.cent de la première dose injectée.
Au maximum de la réponse, le sang est prélevé par ponction intra-cardiaque
tous les 15 jours. L'immunsérum est conservé en présence d'azide de sodium
à l p.mille et de glycérol à 10 p.cent.
3) CONTROLE DE LA MONOSPECIFICITE DE L'I.S.
Ceci est réalisé par la technique de Laurell bidimensionnelle
(1965,55 ) et par immunoélectrophorèse. Le pic et l'arc uniques observés
respectivement sur les figures 17 et 18 confirment la monospécificité de
1'1.5. obtenu.
'44
4. CALCUL DU TITRE DE L'l.S.
Nous avons appliqué la méthode de t·lancini et al (1965,63 ).
Le titre est exprimé en milligramme d'antigène neutralisé par millilitre
d'immunsérum.
Figure17
Electroimmunodiffusion bidimensionnelle de Laurell de sérum
de rat contre l'immunsérum de lapin anti-Œl-glycoprotéine
acide de rat.
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__
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Figure 18
Immunoélectrophorèse de serum de rat normal (1) et de sérum
de rat inflammé (2) contre l'immunsérum préparé (3).
45
E.- PURIFICATION DE LA~l-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
INTRODUCTION
L'al-glycoprotéine acide (al-GPA) présente dans le sérum de rat
normal fait partie du groupe des protéines de la "phase aiguë" dont la
,
concentration sérique augmente dans les processus inflammatoires et neo-
plasiques.
Les différentes techniques de préparation exploitent toutes à l'heure
actuelle son caractère acide. En effet, son point isoélectrique (pl) très
bas 2,95 (Jamieson et al 1972, 4~ ) permet de la séparer des autres protéines
du sérum après précipitation au sulfate d'ammonium suivie du
passage du
surnageant sur des résines échangeuses d'ions (Kawasaki et al 1966,1+~
Yoshima et al 1981,-1.2..5).
Dans ce chapitre, nous présentons la préparation de l'al-GPA'par
chromatographie sur deux supports échangeurs d'ions à partir de sérum de
rats normaux et traités au phénobarbital et par chromatographie d'immuno-
affinité à partir de la protéine partiellement isolée.
L'al-GPA se distingue des autres protéines par sa forte teneur en
sucres
(25 à 34 %),
un pl bas lié à sa richesse en résidus
sialyls dont la proportion conditionne sa mobilité électrophorétique. La
protéine native à pH 8,6 présente une mobilité al "sur acétate de cellulose.
Sa masse moléculaire estimée à environ 40.000 dépend de la technique utilisée.
1) ISOLEMENT DE L'al-GPA PAR ECHANGE D'IONS
1.1. Principe de l'échange d'ions
Un échangeur d'ions est constitué d'une matrice insoluble sur
laquelle sont fixés des groupes chargés à caractère acide ou basique dont
la neutralité électrique est assurée par des contre-ions. Ceux-ci peuvent
46
TABLEAU IV : CARACTERES PHYSICO-CHIMIQUES
DE L'ol-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
Kawasaki
Jamieson
Charlwood
Shibata
et al
et al
et al
et al
(1966,4-8)
(1972, !flf)
(1976,2If.)
(1977 ,102)
PM
35.000
43.000
43.000
79.000
S 1%
3,30
3,12
3,16
20
pl
2,95
lcm
~ 1 %
4,16
280 nm
Composition de la copule glycannique (p.cent)
Hexoses
15,3
14,4
10,5
13,1
(Gal,Man)
Hexosamine
8,3
9,5
7,3
6,7
Acide
10,0
10,2
5,0
7,6-
sialique
Fucose
0,4
0,3
47
être réversiblement échangés avec des molécules protéiques ionisées de
même signe apportées par la phase mobile. En effet, la somme algébrique
des charges portées par une protéine constitue sa charge nette. Celle-ci
varie essentiellement en fonction du pH et de la concentration en ions du
milieu.
Nous avons exploité ces deux facteurs (pH et concentration en
ions) et purifié l'ŒI-GPA par deux chromatographies successives sur échan-
geurs d'ions.
A pH 3,7 l'ŒI-GPA est théoriquement seule à se fixer sur une
diéthylaminoéthyl-trisacryl (échangeur anionique). Au même pH elle est
totalement exclue d'une carboxyméthylcellulose alors que les autres pro-
téines sont retenues. A chaque étape les protéines fixées sur l'un ou
l'autre échangeur sont
élevées
par augmentation de la force ionique
de la phase mobile.
1.2. Matériel et réactifs
Oiéthylaminoéthyl-trisacryl
OEA~ LKB
Carboxyméthyl cellulose
CM 52 Whatman
- Pompe mini puIs Gilson
- Collecteur de fractions
: les produits en sortie de
colonne sont recueillis dans un collecteur ISCO modèle 120
(Roucaire France).
- Module optique: la densité optique (DO) de l'effluent est
mesurée à 280 nm par passage dans un détecteur u.v. modèle
UA6 ISCO Roucaire.
- Enregistreur I1Absorbance monitor model UA5 11 couplé au module
optique
Gradient mixer LKB
- Colonnes 1,6 X 40 cm Pharmacia France
Tampon
Tl
Tampon acétate 0,01 M pH 3,7
Acétate de Na, 3H 0 •••••••••• 0,1496 g
2
Acide acétique (d=1,04) ••••••• 0,53 ml
Eau distillée q.s.p •••.••••••• 1000 ml
48
T
Tampon acétate
2
0,1 M pH 3,7
Acétate de Na, 3H O ...........
2
l,52 g
Acide acétique ................ 5,33 ml
Eau distillée q.s.p •••••••••••• 1000 ml
T
Tampon acétate l M pH 3,7
3
Acétate de Na, 3H 0 •••••••••••• 16,04 g
2
Acide acétique ••••••••••••••••• 53,29 g
Eau distillée q.s.p •••••••••••• 1000 ml
,
.
- Echantillons
trois lots de serum de rats mâles Sprague-
Dawley ont été destinés à la préparation de l'ŒI-GPA.
,
a) "Pool" de serums de 25 rats normaux ou RN
,
b) "Pool" de serums de 10 rats traités au phénobarbital ou RPB
c) "Pool" de sérums sélectionnés de 17 rats traités au phéno-
barbital ou RPBS. Le sérum de chaque rat de ce lot a été
séparément étudié. Ainsi, le "pool" RPBS est constitué de
sérums dont la teneur en ŒI-GPA est supérieure ou égale à
500 mg/le
Pour chaque échantillon, le sang est recueilli par ponction dans
l'aorte abdominale après anesthésie au Nembutal R. Lorsque les rats sont
traités par le phénobarbital, le prélèvement est effectu~ 3 jours après la
dernière injection, c'est-à-dire lorsque la concentration en~-GPA est
maximale.
1.3. Mode opératoire
Les échantillons sont successivement dialysés contre de l'eau
distillée, les tampons T , T
puis contre le tampon de chromatographie Tl.
3
2
Lors des dialyses, le précipité formé est éliminé par centrifugation. Ce
précipité constitué essentiellement d'euglobulines apparaît dès la dialyse
en eau distillée. Ces opérations de dialyse permettent d'éliminer des
substances susceptibles de précipiter au cours des chromatographies et
donc, d'entraver l'élution.
49
65 à 70 ml d'échantillon dialysé contenant 20 à 50 mg d'ŒI-GPA
sont introduits sur la colonne de 30 ml de DEAT sous un débit de 30 ml h- l
La colonne est ensuite lavée par le tampon Tl. Les protéines non fixées
sont recueillies en une seule fraction. L'élution des protéines retenues
telle que l'ŒI-GPA est effectuée par un gradient de NaCl ° à l Mde
10 mM/cm de pente dans le tampon Tl (acétate 0,01 M pH 3,7) et l'ŒI-GPA
est habituellement éluée à 0,15 M de NaCl.
La fraction éluée, après dialyse contre le tampon Tl' est déposée
sur la colonne de 34 ml de CM 52. L'exclusion et l'élution sont effectuées
comme décrites précédemment.
1.4. Analyses qualitatives et quantitatives des préparations
Les pics correspondant aux exclus et aux éluats sont dialysés,
concentrés par diafiltration contre de l'eau distillée puis lyophilisés.
Des études immunochimiques sont réalisées sur des aliquotes de
chacune des fractions :
1°) Pour mettre en évidence les contaminants éventuels, deux méthodes
sont retenues: l'immunoélectrophorèse selon Grabar etBurtin,
(1964,b1) et l'immunoélectrophorèse en quinconce. L'immunsérum
utilisé est un immunsérum de lapin anti-protéines sériques de rat.
Une électrophorèse en quinconce est réalisée simultanément en pré-
sence d'un immun sérum anti-ŒI-GPA de rat.,
2°) Pour déterminer la concentration en ŒI-GPA des préparations. Les
méthodes de Mancini et al (1965,63) (IDR) et de Laurell (1966,56 )
(EID) sont effectuées. L'immunsérum est un immun sérum de lapin anti-
ŒI-GPA de rat.
3°) Pour déterminer les différentes sous-populations de l'ŒI-GPA.
Une immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A est
réalisée.
50
L'analyse des deux préparations RN et RPB montre que
L'al-GPA est retenue sur la DEAET puis éluée par le gradient
NaC!. (Fig.19) •
• Sur la CM 52 l'al-GPA est exclusivement contenue dans l'exclu.
(Fig.20).
En immunoaffinoélectrophorèse croisée,le profil des produits
purifiés est strictement identique à celui du sérum correspondant.(Fig.2U.
Cependant, après sélection des sérums des rats traités par le phéno-
barbital (RPBS), la préparative menée dans les mêmes conditions indique la
présence de l'al-GPA dans l'exclu et dans l'éluat de la CM 52. Le compor-
tement en Con A-immunoaffinoélectrophorèse montre curieusement des sous-
populations d'al-GPA non retenue RPBS CMI et retenue RPBS CM2 respectivement
dans l'exclu et dans l'éluat. Toutefois, les deux profils associés
sont
superposables à celui du sérum initial (~g.22) .L'analyse immunochimique
révèle une fraction exclue: RPBS CMI pure tandis que la fraction éluée de
la CM52 : RPBS CM2 présente des contaminants majeurs que nous avons éliminés
par chromatographie d'immunoaffinité.
2) ISOLEMENT DE L'a1-GPA PAR IMMUNOAFFINITE A PARTIR DE LA FRACTION
RPBS CM2
2.1. Matériel et réactifs
_ Sépharose 4BCNBr Pharmacia
- Colonne 12 X l cm IBF
- Tampon de chromatographie: Borate 0,125 M pH 8,3, NaCl 0,5 M
Acide orthoborique (PM 61,83) •••••••••••••••• 61,8 g
Tétraborate di-sodique (PM 381)lOH20 ••••••• 95,4 9
NaCl
290,6 9
Eau distillée q.s.p •••••••••••••••••••••••••• 10 litres
51
,
a
b
\\
1
\\
*,
i,~
10
"
_
r·
n
,,"\\
/"'\\
/"\\
%
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;
" 1
15
19 '
5
9
15
19
1
5
9
t
t
Figure 19
Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions exclues
et éluées lors d'une chromatographie sur DEAE trisacryl.
puits l
échantillon de départ
puits 2-9
: fractions exclues
puits 10-19 : fractions éluées
Les immunoélectrophorèses en quinconce des fractions collectées
contre
a) un immunsérum monospécifique anti Œ -GPA de rat
1
b) un immunsérum anti-protéines totales de rat
montrent que l' ŒI-GPA est totalement retenue sur la DEAET. Elle est ensuite
totalement éluée au début du gradient (0,15 mole/l) mais généralement avec
d'autres protéines.
52
a
1
1
S
1 5 . 23
1
23
do 0 0 0 00 0 0 0 0
0
o 0 00 0 0 00900 0
00··0 0 0 0 0
0
0 .f) 0
° O O O Q G O O O O O
10
10
Figure 20
Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions éluées et
retenues lors d'une chromatographie sur CM 52.
puits 1
pool de l'éluat DEAET contenant l' ŒI-GPA
puits 2 à 9
fractions exclues
puits 10
pool des fractions exclues concentré
puits Il à 23
fractions éluées
L'analvse des diverses fractions contre un immunsérum anti-
protéines totales ~fig. b) et contre un anti - ŒI-GPA (fig.
a) montre
que la protéine est totalement et isolément exclue de la CM 52 (fig. b,
puits 2 à 9).
53
b
a
4
4
Figure 21
Immunoaffinoélectrophorèse crOlsee en Con A de sérumea)
et de l' Œl-GPA isolée(b;contre un immunsérum de
lapin anti- ŒI-GPA de rat.
Après purification, l'ŒI-GPA est toujours constituée
des 4 isotypes dans des proportions identiques à celles calculées
lors de l'étude du plasma. 1,2,3 et 4 représentent les différents
isotypes de l'al-GPA.
54
4
a
b
c
Figure 22
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A des produits
de la 3ème préparation contre un immunsérum anti-ŒI-GPA de rat.
La fraction exclue de la CM RPBS CMI c) est constituée de 3
pics (l, 2, 3) plus ou moins retenus par la Con A alors que la fraction
éluée par le gradient RPBS CM2 est totalement retenue en l seul pic b) (4).
Les deux images b) et c) regroupées sont similaires à celle du
pool de départ RPBS a) constituée de 4 pics (l, 2, 3 et 4).
55
- Tampon d'élution : glycine HCl 0,2 M pH 2,6
Glycine (PM 75,07) •••••••••••••• 15,1 g
Eau distillée q.s.p ••••••••••••• l litre
Hel q.s.p
pH 2,6
- Solution de neutralisation de l'éluat
phosphate dipotassique
l M pH 8-9
K HP0
(PM 228,23) ••••••••.••••• 228,23 g
2
4
Eau distillée q.s.p ••••••••••••• l litre
- Solution de neutralisation du support
phosphate dipotassique
0,2 M pH 8-9
- Anticorps anti-ŒI-GPA monospécifiques : ces anticorps sont
préparés par immunoaffinité à partir d'un immunsérum de lapin
antiŒI-GPA de rat sur Sépharose-ŒI-GPA. Le protocole de cou-
plage de 24 mg d'ŒI-GPA sur 16 ml de Sépharose CNBr et les
conditions de réalisation de la chromatographie sont identiques
à celles décrites dans le protocole ci-dessous.
- Echantillon: RPBS CM2 lyophilisé. C'est la fraction retenue
sur la CM 52 lorsque les sérums des rats traités par le phéno-
barbital ont été sélectionnés.
2.2. Préparation du support d'affinité Sépharose-anti ŒI-GPA
Le Sépharose CNBr, 3 g, est préalablement gonflé en milieu
chlorhydrique ImM pendant 15 mn. La protéine, 16 mg d'Tg
monospécifique
anti ŒI-GPA en solution dans le tampon borate 0,125 M pH 8,3, est mise à
coupler surIe support sous agitation rotative à +4°C pendant 24 heures.
Les groupements réactifs résiduels sont ensuite bloqués par une solution
d'éthanolamine lM pH 8 pendant 2 heures à température ambiante. L'immuno-
adsorbant est enfin alternativement lavé par un tampon acétate 0,1 M pH 4
et le tampon borate.
56
2.3. Chromatographie
Mode opératoire
10 ml d'immunoadsorbant sont introduits dans une colonne 12 X l cm
puis tassés et équilibrés dans le tampon borate à 40 ml h- l •
L'échantillon, 6 mg, dissousdans 6 ml du même tampon est intro-
l
duit sur le support à 6 ml h-
à température ambiante du laboratoire.
La colonne est alors abondamment lavée par le tampon de chromatographie
l
à 32 ml h-
à +4°C jusqu'à retour de la ~.O. mesurée à 280 nm à la ligne de
base.
L'élution de l'ŒI-GPA fixée est effectuée par le tampon glycine
HCl 0,2 M pH 2,6. L'immunoadsorbant et l'éluat sont immédiatement et res-
pectivement neutralisés par le phosphate dipotassique 0,2 M et l M.
57
BILAN DE LA PURIFICATION - DISCUSSION
Quatre produits ont été obtenus :
l - al-GPA/RN : al-glycoprotéine acide purifiée à partir du pool
de sérums de rats normaux.
2 - al-GPA/RPB : al-glycoprotéine acide isolée du pool de sérums
de rats traités par le phénobarbital (80 mg/j/kg de poids corporel)
3 - al-GPA/RPBS - CMI
4 - al-GPA/RPBS - CM2
Ces deux derniers produits sont issus du "pool" de sérums sélec-
tionnés (RPBS) après le traitement des rats par le phénobarbital.
Chaque sérum de ce "pool" contient au moins 500 mg/l dl arGPA.
- al-GPA/RPBS-CM
est la fraction d' a - GPA non retenue
I
l
sur la CM-cellulose. Elle contient le 1/4 de l' al-GPA présente
dans le pool RPBS initial.
- a -GPA/RPBS-CM
représente la fraction d' al-GPA (les 3/4 du pool)
l
2
éluée de la CM-cellulose avec des impuretés qui sont ensuite
éliminées par une chromatographie d'immunoaffinité.
Les techniques d'isolement utilisées nous ont conduit à l'obtention
d'une glycoprotéine pure selon l'immunoélectrophorèse en quinconce (fig.20)
et les techniques citées ci-dessous •
• L'immunoélectrophorèse, selon la technique de Grabar et Burtin
(1964,~~ ) de l'~l-GPA à 10 g/l des diverses préparatives contre un immun-
sérum de lapin anti-protéines sériques de rat ne montre qu'un seul arc (Fig.23)
• L'électrophorèse en gel de polyacrylamide (10 %) en présence
de sodium dodécyl-sulfate montre une bande homogène.
Le poids moléculaire .
de l'al-GPA/RN et de l'al-GPA/RPB est
respectivement de 43.000 et 45.000
daltons.
58
0
0
0
1
2
3
5
Figure 23: Immunoélectrophorèse selon Grabar de l'al-glycoprotéine acide
(Œl-GPA 10 g/l) purifiée contre un immun sérum de lapin anti-
protéines sériques surchargé en anti- Œ1-GPA de rat.
1 :Œl-GPA/RN ; 2 : Œl-GPA/RPB;
3: Œl-GPA/RPBS-CM l
4 : Π-GPA/RPBS-CM
et 5 : Œl-GPA de rat purifiée dans notre
l
2
laboratoire.
59
- A part le pool de sérums de rats sélectionnés (RPBS) dont
les produits purifiés RPBS-CM
et RPBS-CM
présentent des profils dif-
I
2
férents en CIAE Con A (figure 22 Ct b ), l'analyse des deux autres pro-
duits (al-GPA/RN et al-GPA/RPB) ne montre aucune modification des sous-
populations de l'al-GPA au cours des diverses étapes d'isolement.
- D'autre part, la concentration de l'al-GPA des divers pools
de sérums de départ et de l'al-GPA en solution après isolement ont été
dosés en IDR et en EIDm. Le degré de sialylation est ensuite discuté dans
le schéma suivant :
· Situation dans le sérum (avant purification)
IDR(mg/l)
EIDm(mg/l)
al-GPA/RN
201
212
sialylation normale
al-GPA/RPB
531
561
· Situation après purification (al-GPA purifiée en solution)
IDR(mg/l)
EIDm(mg/l)
al-GPA/RN
243
263
sialylation normale
al-GPA/RPB
321
327
Deux produits sont issus de l'al-GPA/RPBS.
· Situation dans le sérum
IDR(mg/l)
EIDm(mg/l)
al-GPA/RPBS
814
814
sialylation normale
· Situation après purification
IDR(mg/l)
EIDm(mg/l)
al-GPA/RPBS-CM
499
547
sialylation normale
I
al-GPA/RPBS-CM2
468
402
~~e~~!~!~!~!!~~
i
Quel que soit le "pool" de sérums de départ le taux de sialylation
est normal
i i Dans les deux premières préparations (al-GPA/RN etal-GPA/RPB) à
l'issue de la purification nous n'avons noté aucune différence
60
significative entre l'IDR et l'EIDm dans les limites de la
précision des deux techniques (c'est-à-dire 12 p.cent d'hypo-
sialylation). Nous avons déjà discuté de ce point précédemment
(§ 4 Matériel & Méthodes). Au cours des différentes étapes mises
en oeuvre, les liaisons sialosyles fragiles ne sont pas rompues
et la sialylation reste normale.
iii Dans la dernière préparative, il y a deux produits
• L'al-GPA/RPBS-CM
est normalement sialylée
I
• Pour l'a -GPA/RPBS-CM , et c'est la première fois au cours
l
2
de notre étude préparative, nous montrons une sous-évaluation
en EIDm de l'ordre de 14 p.cent, c'est-à-dire une hyposialyla-
tion de l'ordre de 20 p.cent.
Il ne s'agit pas d'une désialylatian extemporanée qui intervien-
drait lors de la purification puisque, dans les préparations précédentes,
aucune désialylation n'a été détectée. Il s'agit donc d'un défaut de sialy-
lation de l'al-GPA présente dans le "pool" de sérums soigneusement sélectionnés
Il faut toutefois admettre que cette hyposialylation n'est pas détectée sur
ce "pool". L'explication suivante peut être avancée: sur la base des teneurs
eno.t -GPA, cette fraction constitue les 3/4 du "pool" et est donc partiellement
diluée par la fraction RPBS-CM
dont la sialylation est normale. L'hyposia-
I
lylation de l'al-GPA de ce "pool" ne serait plus que de 15 %. Nous serions
alors dans des zones d'hyposialylation que notre protocole peut tout juste
apprécier.
Cette hyposialylation entraîne une augmentation du point isoionique
et la fixation de cette fraction à pH 3,70 sur carboxymethylcellulose, ce qui
ne s'était pas produit lors de la purification de l'al-GPA à partir de sérums
non sélectionnés. L'analyse de la composition molaire en oses des glycannes
de cette fraction confirmera d'ailleurs son caractère moins acide.
61
F. - APPROCHE STRUCTlIRALE DES OLIGOSACCHARIDES DE L'~l-GLYCOPROTEINE
ACIDE DE RAT
1) PREPARATION DES OLIGOSACCHARIDES
L'hydrazinolyse est une étape très souvent utilisée pour l'étude
des glycannes des glycoprotéines. Elle permet le clivage de la liaison N-
glycosylaminyle. Dans une étape ultérieure, les groupements aminés libres
sont N-réacétylés et les oligosaccharides résultant sont réduits par le
borohydrure de potassium.
Nous avons appliqué cette technique à l'isolement des oligosaccha-
rides de l'ol-GPA purifiée à partir de RN, RPB, RPBS-CM
et RPBS-CM
définis
I
2
dans le chapitre E de la partie matériel et méthodes.
1.1 Hydrazinolyse (Bayard et Fournet 1976, 1
A l'aide d'une pipette Pasteur, l'hydrazine Pierc~est introduite
dans un tube en verre type Sovirel R contenant la glycoprotéine lyophilisée
(1 ml pour 6 à 10 mg de glycoprotéine). Le produit est ensuite porté à
lOS oC pendant 24 heures.
A ce moment, il est repris par du toluène et
évaporé au rotavapor à +30 0 C. L'excès d'hydrazine est piégé par une solution
d'acide sulfurique. Le résidu est repris par un volume d'eau et les oligo-
saccharides sont précipités par 10 volumes d'éthanol durant une nuit à -20°C.
1.2 N-réacétylation
Après précipitation à l'éthanol, le précipité est redissous par
une solution saturée de bicarbonate (2 ml pour 2 mg de glycannes) et l'anhy-
dride acétique est ajouté toutes les 20 min pendant 2 heures par aliquotes
de 10 fI pour 3 mg de glycannes. (agiter le tube à chaque addition d'anhydride
acétique).
1.3 Réduction par le borohydrure de potassium
Le milieu réactionnel est amené à pH 9-10 par de la soude normale
et le borohydrure de potassium est ajouté à raison de l mg/mg de glycanne.
62
Au bout de 2 heures, la réaction est arrêtée par addition de Dowex
50 X 8 (H+ 200-400 mesh), (Biorad). La solution est filtrée sur laine
de verre et évaporée à sec par du méthanol distillé. Enfin, le résidu
est repris dans un minimum d'eau pure et les sels sont éliminés par chro-
matographie sur Biogel P2.
1.4 Dessalage après hydrazinolyse, N-acétylation et réduction
Le déssalage est effectué par chromatographie sur une colonne
de Biogel P2. Il est pratiqué en vue d'éliminer les borates et acétates
susceptibles d'intervenir dans les opérations ultérieures.
Colonne
fabrication artisanale 2 X 20 cm support Biogel P2 (Biorad)
Eluant
eau puré, solution d'acide acétique 0,05 %
. • Echantillons : hydraziriolysats
• Pompe LC 5A SHIMADZU (Touzart et Mati~non)
2
Pression maximale affichée 50 kg/cm
Pression de travail : 20 kg/cm2
Boucle d'injection: volume total 500 pl
• Spectrophotométrie, Uvicord
2138 (LKB)
0,5'Ude. D.O. pleine échelle
Longueur d'onde 206 nm
• Enregistreur monocanal 2210 (LKB)
Sensibilité 0,1 V
Déroulement du papier Imm/min •.
2) SEPARATION DES OLIGOSACCHARIDES PAR ECHANGE D'IONS
2.1 Principe
500 à 1500 ~g de glycannes obtenus suivant le protocole décrit
ci-dessus sont chromatographiés sur un échangeur d'anions (silicate-amine
quaternaire). Les oligosaccharides sont séparés en fonction de leurs charges
acides par un gradient phosphate de potassium 0,5 M pH 5,2.
63
2.2
HPLC échangeuse d'ions sur une colonne Micro-Pak-AXIO
(Baenziger et Natowicz, 1981, ~
Le micro-Pak AXIO est un support échangeur d'anions. Il permet
de séparer les oligosaccharides selon leur teneur en résidus sialyls. Les oligo-
saccharides neutres sont totalement exclus du support tandis que les tétra-
sialyls fortement retenus seront élués par le gradient phosphate en dernière
position.
Colonne 0,4 X 40 cm
support Micro-Pak AXIO échangeur
d'anions (Varian)
Pompe: Spectra Physics SP 8750 munie d'une boucle d'injection
de volume total de 500 ~l
2
Pression maximale affichée 200 kg/cm
Débit l ml/min
Système délivreur de solvants (eau et tampon phosphate) micro-
processorisé - Spectra Physics SP 8700.
Programmation du gradient d'élution :
temps (min)
eau (%)
tampon phosphate 0,5 M pH 5,2 (%)
o
100
0
8
100
0
15
97,5
2,5
25
97,5
2,5
35
95
5
45
95
5
80
60
40
• Détecteur uv modèle 8400 (Spectra Physics)
longueur d'onde 206 nm
• Intégrateur-enregistreur informatisé modèle 4.100 (Spectra Physics)
2.3
Déssalage par HPLC sur une colonne Aguagel
Ce déssalage permet d'éliminer les phosphates contenus dans
les pics d'élution après HPLC sur micro-Pak AXIO.
64
• Support : Aquagel P2 10}lm (équivalent P6);
Polymer Laboratories Ohio USA (Touzart et Matignon)
• Pompe LC 5A Shimadzu
2
Pression maximale 200 kg/cm
2
Pression de travail 80 kg/cm
Boucle d'injection: volume maximum 500 pl
Débit 0,2 ml/min
• Cellule UV UVICORDS 2138 LKB
À 206 nm
• Enregistreur A 25 (Varian)
sensibilité 100 mV
déroulement du papier 0,5 mm/min
3) IDENTIFICATION ET COMPOSITION DES FRACTIONS SEPAREES SUR
ECHANGEUR D'IONS
Les diverses fractions après fractionnement sur AXIO et
déssalage sur Aquagel sont méthanolysées puis analysées en chromato-
graphie en phase gazeuse (CPG).
3.1 Méthanolyse-triméthylsilylation
(Kamerling et al 1975, "'; )
Environ 20 pg de glycannes et 4 pg de mannitol sont méthanolysés
par 500 pl de méthanol chlorhydrique 0,5 N pendant 24 heures à 80°C. Après
addition de l mg de carbonate d'argent puis de 20 pl d'anhydride acétique
le tube est placé à l'obscurité pendant 24 heures. Le produit est séché à
l'azote après deux extractions des corps gras à l'heptane anhydre. Les
monosaccharides sont ensuite silylés par 100 pl d'un mélange: bis-(triméthyl-
silyl) tri-fluoroacétamide/pyridine distillée (volume à volume).
3.2 Méthanolyse-trifluoroacétylation
(Zanetta et al 1972,-12.6 ).
65
300 à 700 pg de glycannes ou glycoprotéines sont méthanolysés
en présence de 30 à 50 fg de mésoinositol pendant 24 heures à aooc. Le
produit est ensuite évaporé sous azote puis trifluoroacétylé par 200 pl
d'un mélange anhydride trifluoroacétique/dichlorométhane au bain de sable
à 150°C 2 fois 5 min.
3.3
Analyse en chromatographie en phase gazeuse (CPG)
• Sur colonne OV 210
Les méthylglucosides trifluoroacétylés sont analysés en CPG
sur une colonne de verre (0,3 X 300 cm) remplie de silicone OV 210 à 5 %
sur varaport 30 "mesh" aO-lOO, température programmée de 100 à 220°C à
raison de 2°C/min, sous un débit de gaz vecteur (azote) de 10 ml/min •
• Sur colonne capillaire CP Sil. 5CS (25 X 0,22 mm)
Les glycosyls triméthylsilylés sont analysés en CPG sur un ap-
pareil type Girdel 300 muni d'un injecteur évaporateur en verre et d'un
détecteur à ionisation de flamme couplé à un intégrateur Spectra Physics
4100, température programmée de 120 à 240°C à raison de 2°C/min, sous une
pression d'entrée de 0,6 bar d'hélium.
Les figures 24 &25 indiquent respectivement les tracés de
l'analyse quantitative des sucres. Le mode de calcul des rapports molaires
des différents monosaccharides est représenté dans le tableau V.
\\ '."
i,
'11
i
Man
Glc
Mannito
GlcNAc
GJ.c
t,l-AN
'
t1
Gal
.a
Figure 24:
Chro~atographie en phase gazeuse.(CPG)
des glycosides trim~thylsilyl~s sur une colonne capillaire 511.5CB
0\\
0\\
\\
\\
""'--r-:-l- ,·1---\\--,,-1--'-'1---1 'Hf
1
l
--'-"'r---.~'-'
1
- .. -- .~.- ......
'-+--1--1
1
1
. - - . - -1----1--1·,-· -I-'·'··I---l---... - - .-.- -- -
---1----··1-1--1--·-1-\\--1-1---1--··+-1------1 . - -1----1.. -- N~N
~
'-'''I'-
,,-- .~--._ .._...- . -
. - - ' . S~tJGt- _
r-t~-+----I---.'''''--''''
-·..
- -
---·,--··--+-+-I-~-- ,-,. --1
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- -1--:--1 . i'
-+-I!
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...--- ---
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Mar·-
~'--I-----I--'
Gl NAci
--.- --1-1_'_·_·_
_ ..~- ... -f----'--"-" ->---0 ,_.
--.\\'---'1--+-~--.-
.... -....··--I--·I-+-H-·I---+---411
1
1·
1
I--t-
. -Gal
.---...-- ..--t--I---I--.~.+---+--t--+--I--
..
. _
___o'
_
... - --- - _o.
__ . _. __.
,
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-'- - ---'-- - ·-LW--Ut-~·-H-I~_eHTH_1t1rD
.---t~,- 1
_.. _.
, _ • • • _ .
_ .
_ _ • • _
-
_ _
0 -
1
1
1
1---4-
!=r-.-=,~:~;-T---=~TTTTn-~l 11---1-1 i_J-eJ-J-J-I-l=T
Figure 25
Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des méthylglycosides
trifluoroacétylés sur une colonne OV 210
0\\
'-J
68
TABLEAU V
MODE DE
l>ETERMINATION DES RAPPORTS MOLAIRES EN MONOSACCHARIDES
PAR CHROMATOGRAPHIE !:N P!iASE GAZEUSE
O<l-CPA DE RAT 965 p9
Masse 1 mfthanolyser (Quantité de ~nosaccharides totaux 125 i 250 y) :
- Quantit' de méthanol/HCl 0,5 N, de mfthanol/HCl 1,5 N (1)
(Concentrations 1 p. 1 000)
- Quantité de mésoinositol i introduire:
50 p9,
- Dél1pidation : ~ - non
NCIIIS
Fuc
Gal
Man
Glc
GaUlAC Glc.'IlAc
NANA
NGNA
Mé soinos!toI
Masse moléculaire
164
180
180
180
221
221
309
325
Bautpur R. c!e, pics <cm)
0,5
7,5
12,1
8,8
9,2
10,2
.
H. Etalon
0,75
0,78
0,87
~,48
0,48
H. temoin
B'Monosaccharides
0,95
~,735
1,18
0,86
0,9
B. témoin
M. monosaccharides
0,066
0,94
1,.36
1,8
1,88
M. témoin
Masses ~ (lIg)
. 3,3
47
68
90
94
No=bre de micromoles
0,02
0,26
0,38
0,4
0,3
Rapports molaires
0,15
2
3
3,1
2,4
Socmes des masses
0,9 "
15,5 "
22,5 "
30 "
31 "
et pourcentage
Rapport oses/osamines
Rapport oses/acides sialiques
G.L.C.
H : Hauteur; M : masse; témoin : mésoinosito1
M. Fuc
H.monosaccharide
0,05
0 0
ExpIe :
M. témoin
= 0,75 =
, 66
M.Monosaccharides
H. témoin
M. témoin
H. Etalon
H. temoin
Masse Fuc <p9) =0,066 X M.Témoin
0,066 X 50
fl9 = 3,3 f9
(1) selon la nature des produits volatils.
RESULTATS
69
I.
EFFET DE DIVERS PRODUITS SUR LA
SYNTHESE PROTEIQUE CHEZ LE RAT
70
Dans cette première partie nous avons consacré notre étude
à l'évolution de la concentration de certaines protéines sériques:
l'al-glycoprotéine acide (al-GPA), l'albumine et les protides totaux,
après traitement de rats miles Sprague-Dawley (250-300 g) par la gèlacto-
samine (GaIN), le phénobarbital (PB) et l'essence de térébenthine (E.T.).
Les concentrations en al-GPA et albumine ont été dosées par des
méthodes immunochimiques (IDR et EIDm) utilisant les immunsérums dont nous
avons décrit la préparation dans le chapitre matériel et méthodes. L'étalon-
nage est réalisé avec un pool de sérums dont la teneur en al-GPA et albumine
est établie par mesure comparative
avec la protéine standard préalablement
purifiée. Pour apprécier les retentissements éventuels que pourraient avoir
les divers produits sur la concentration de l'ensemble des protéines de
sécrétion, nous avons dosé les protides totaux par la méthode de Lowry.
Les valeurs obtenues chez des rats normaux sont représentés dans
le tableau VI.
TABLEAU VI
Concentrations sériques en al-glycoprotéine acide (al-GPA),
albumine et protides totaux chez le Rat Sprague-Dawley normal
al-GPA*
albumine*
protides totaux
mgll (m +ET)
gll (m + ET)
182 + 44
27 + 3
68 + 4
n = 25
n= 25
.n = Il
* valeurs déterminées en immunodiffusion radiale simple.
71
A.- EFFET DE LA GALACTOSAMII'lE (GALN) SUR LES CONCENTRATIONS DES
PROTEINES SERIQUES
(Monnet et al, 1~85a, 69 )
Les premiers essais ont consisté en une injection de doses
variables de GaIN à des rats
600, 900 et 1350 mg/kg de poids corporel.
Les résultats ont montré que quelle que soit la dose, les variations des
paramètres biologiques cités ci-dessoussont identiques et la mortalité,
la même. La dose de 900 mg/kg a été retenue comme l'avaient d'ailleurs fait
d'autres auteurs (Sawamura et al 1981, 9Z ).
Les variations séquentielles de la concentration des diverses
protéines sériques ont été examinées durant 9 jours après injection unique
de D-GalN (900 mg/kg de poids corporel).
Parallèlement, des rats ponctionnés après anesthésie à l'éther
ont servi de témoins. Seule la concentration en ClI-GPA, chez ces témoins,
m~ntre une légère augmentation dès le 2ème jour pour rester constante durant
toute la période d'étude.
Après traitement à la GaIN, tout d'abord l'activitéde l'alanine
aminotransaminase (ALAT) puis les concentrations en ClI-GPA, albumine et
protides totaux ont été mesurées de manière à apprécier l'importance de
la cytolyse et de la déficience hépatocellulaire. Apparemment la cytolyse
est le premier phénomène observé puisque l'activité ALAT croit rapidement
et atteint une valeur maximale à J
bien que ce maximum soit variable d'un
2
animal à l'autre. Cette activité décroît progressivement pour atteindre la
valeur initiale à J
ou J
(fig.26). La concentration en albumine n'est que
4
5
légèremenL modifiée.
Les concentrations en ClI-GPA et en protides totaux subissent
une diminution et atteignent une valeur minimale respectivement de 55 %
et 19 % entre J
et J • Le retour à la valeur de base est beaucoup plus
2
3
lent. Nous avons tenu compte de l'effet positif de l'anesthésie et de la
ponction cardiaque observé chez les témoins pour calculer l'effet propre
de la GaIN chez les rats traités. La variation des fractions protéiques
des rats GaIN comparées à celles des rats témoins est représentée sur la
figure 26.
72
-1
l'tl
.-1
~ 60
0
.j,.)
-t
X
c:
-t
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l'tl
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0
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0
a..
l
l
2
3
4
5
6
7
8
9
Jours
l '
Figure 26
Effet de la D-galactosamine (900 mg/kg de poids corporel)
sur les taux sériques de l'~l-glycoprotéine acide (n = 5)
*-*,des protéines totales (n = 5)O~ et sur l'activité alanine
aminotransférase ....
73
B.- INCIDENCE DU TRAITEMENT PAR LE PHENOBARBITAL (PB) SUR LES VALEURS
SERIQUES DES PROTEINES SPECIFIQUES ET TOTALES CHEZ LE RAT
1) EFFET DE LA DOSE DU PB SUR LE TAUX SERIQUE DE Lla1-GPA
L1évolution de la concentration de llal-GPA en fonction de la
dose du PB a été d1abord étudiée. Nous avons, à cet effet, constitué 5
lots de 8 rats. Chaque lot est traité pendant 3 jours soit par une solution
de NaCl 0,15 Msoit par le PB à des doses variant de 40 à 130 mg/kg/j. Un
dosage quotidien de la concentration sérique de llal-GPA est alors effectué
à partir de la dernière injection (cf. § Matériel &Méthodes).
Quelle que soit la dose du PB, la concentration maximale en
al-GPA est atteinte à J , c1est-à-dire 3 jours après la dernière injection.
6
Ce sont ces valeurs présentées dans la figure 27 qui ont été comparées pour
apprécier lleffet du PB en fonction de la dose administrée. Il appara!t
qu1à une dose de 80 mg/kg/j, lleffet du PB est maximal. Cette dose a donc
été retenue pour les études ultérieures.
Au cours de ces essais préliminaires, nous avons effectué un
dosage du PB sérique par méthode immunoenzymatique sur TDX ABBOT (Lu-Steffes
et al 1982, 61 ). Les résultats obtenus montrent que,3 jours après la
dernière injection du PB, la concentration sérique en PB est négligeable
0,1 mg/l) alors qu1elle était de 26,3 ! 1,Omg/l (~! s.m, n = 5) quelques
heures après le traitement. Ceci montre que le PB a une sorte d1effet
II re tard ll
sur la concentration plasmatique en al-GPA qui doit résulter de la
mise en jeu d1un certain nombre d1étapes métaboliques intracellulaires plus
ou moins longues à slétablir.
2) CINETIQUE D1APPARITION DES PROTEINES SERIQUES
L1étude est menée sur des rats traités pendant 3 jours soit par
le PB (80 mg/kg/j ; i.p.), soit par une solution de NaCl 0,15 M. Des prélè-
vements de sang suivis de dosage des protéines sont effectués pendant 8
jours et ce à partir du 3ème jour.
74
Taux sérique
0( I-GPA mg/ l
4500
1000
500
O'------I------.....L.--..L..---.J----------~
40
80
100
130
Phénobarbital
mg/kg/j
Figure 27
Effet du phénobarbital sur la concentration sérique de l'~l
glycoprotéine acide. Chaque point représenté la moyenne des
valeurs obtenues sur 8 rats, 3 jours après la dernière injection
(J >·
6
75
Dans les deux séries, la concentration sérique en ŒI-GPA évolue
en fonction du temps selon une courbe biphasique (figure 28 ).
Dans le groupe des rats traités par le PB, le taux sérique de
l'ŒI-GPA atteint un maximum 3 jours après la dernière injection: 1115 +
189 mg/l (m : s.m.), ce qui représente une augmentation d'environ 6 fois
par rapport à la valeur mesurée avant le traitement. Chez les témoins
(rats traités par la solution de NaCl 0,15M) le maximum est à J
: 536 +
2
50 mg/l (m : s.m), le facteur de multiplication est d'environ 3. L'effet
propre du PB est donc multiplié par 3 en moyenne. Dans les deux groupes
nous notons ensuite une décroissance sans toutefois un retour à la valeur
initiale.
Les concentrations sériques en albumine et en protides totaux
ne présentent aucune variation significative quel que soit le groupe étudié
(figure 29 ).
C.- CINETIQUE D'APPARITION DES PROTEINES SERIQUES SOUS L'EFFET CONJUGUE
DU PB ET DE L'ESSENCE DE TEREBENTHINE (ET)
L'augmentation de la concentration en ŒI-GPA sous l'effet du PB
est à rapprocher de celle déjà observée au cours de la réponse inflammatoire.
Nous avons voulu comparer les effets du PB à ceux de l'ET et de l'ensemble
PB + ET.
1) EFFET DE L'ESSENCE DE TEREBENTHINE
Au préalable, nous avons étudié l'effet d'une seule injection
d'ET avec en parallèle une série d'animaux témoins uniquement ponctionnés
après anesthésie à l'éther. Dans cette série témoin, seule la concentration
en ŒI-GPA présente une légère augmentation dès le 2ème jour en se maintenant
ultérieurement au même niveau. Par contre, lorsque les rats reçoivent une
injection d'ET, il s'ensuit une nette augmentation de la concentration de
l' ŒI-GPA dès le 1er jour avec un maximum à J
: 3264
2
+ 167 mg/l (m + s.m.)
soit 19 fois le taux initial.
76
mg!l
1500
<:
C-
e:."
1
- t
d
o
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
JOURS
Figure 28
Cinétique d'apparition de l'~l-Glycoprotéine acide
en fonction du temps après injection du phénobarbital
80 mg/kg/j (~ n = 4) et de la solution de NaCl 0,15 M
(....
Il = 3).
77
1
1 PB (n = 4)
~
~ PB , ET (n =3)
~
1 ET (n =5)
VIL
40
w
z
....J
<
20
JO
J3
J4
J5
J6
J7
J8
Jg
J10
JOURS
Ess.1é.
,
,
,
,
,
!
1
JO
J1
J2
)3
J4
J5
)6
Figure 29
Evolution de la concentration sérique en albumine
après traitement par le phénobarbital (PB) et par
l'essence de térébenthine (ET).
La concentration en albumine est déterminée par immuno-
diffusion radiale: ....... traitement par le PB (80 mg/kg/j) ; *--*
injection d'ET; 0-0. traitement par les 2 produits. La concentration
en albumine à JO est de 27 ~ 3 g/l (m ~ ET ; n = 25).
78
La concentration en sérumalbumine évolue en sens inverse, la
diminution est maximale à J
(39 %) (figure 29) alors que la concentration
3
en protéines totales ne présente aucune variation significative.
2) EFFET CONJUGUE DU PB ET DE L'ET
L'effet de l'association (PB + ET) est étudié au cours d'un
protocole bien précis : traitement par le PB pendant 3 jours puis injection
d'ET au 4ème jour de façon à avoir au même jour l'effet maximum de chacun
de ces produits. Dans ces conditions, le dosage quotidien de la concentration
sérique de l'al-GPA montre une forte augmentation. Le maximum 4257 : 114 mg/l
(m + s.m~) à J
est d'environ 22 fois le taux de départ.
6
La concentration en sérumalbumine comme dans le traitement par
l'ET diminue avec un maximum à J
de 40 % (figure 29). Le taux des protéines
7
totales reste inchangé durant toute la période d'étude.
Il a été constaté que les injections successives intrapéritonéaies
de solution de NaCl 0,15 M ainsi que les ponctions cardiaques précédées d'une
anesthésie à l'éther entraînaient une augmentation de la concentration en
al-GPA. L'effet réel du PB, de l'ET et de l'association est do~c apprécié
et disc~té sur les valeurs obtenues après avoir soustrait de la concentration
mesurée chez les rats traités~celle évaluée chez les rats témoins correspon-
dants (figure 30 ) •
Dans les groupes l (PB) et II (ET), la concentration maximale en
al-GPA : 579 : 40 mg/l, 3053 : 167 mg/l (m : s.m.), est atteinte respecti-
vement à J
et J • Dans le groupe III (PB + ET) on note que la teneur maxi-
6
2
male en al-GPA obtenue 6 jours après le début du traitement par le PB ou 2
jours après l'injection de l'ET est de 3721 + 124 mg/l (m + s.m.).
L'effet du traitement mixte (PB + ET) est comparé à la somme
des effets des deux traitements séparés (PB et ET) (figure 31 ) •
a) Quantitativement les deux effets sont équivalents (aires des
courbes non significativement différentes)
b) Les valeurs obtenues jour par jour ne sont pas significativement
différentes (test t)
c) Les variations observées de jour à jour peuvent être expliquées
uniquement par les variations aléatoires (test du carré moyen des
différences successives) M
0 8).
d) L'entrelacement des 2 courbes confirme les observations précé-
dentes.
1
79
r
r PB (n =4)
P
=)l PB, ET (n =6)
r
1 ET (n =5)
mgjL
3000
2000
oc:(
a.
e."
1
~
d
1000
r
Jo
J3
Js
J6
J7
Js
J9
J10
JOURS
,
,
,
Ess.ië. '
!
.
1
jo
jl
j2
j3
j4
JS
j6
Figure 30
Evolution de la concentration sérique enCl\\l-glycoprotéine
acide (\\l-GPA) après traitement par le phenobarbital (PB)
et par l essence de térébenthine (E.T.)
La concentration en ~ -GPA est déterminée par immuno-
diffusion radiale • .--.
traitement par le PB (80 mg/kg/j) ; *-k in-
jection de l'E.T. : ~ traitement par les 2 produits. Les concen-
trations en~l-GPA sont calculées en soustrayant des concentrations
obtenues au cours des traitements celles obtenues dans les groupes
témoins correspondants (ponctions cardiaques suivies ou non d'injec-
tions intrapéritonéales d'une solution de NaCl 0,15 M). La concentra-
tion en~l-GPA à JO est de 182 + 44 mg/l (m + ET ; n = 25).
80
r
____ PB et E.T.
mg/l
associés (n=6).
PB et E. T.
&----6 (n=4 à 5)
3000
«
000
C-
U1
...-i
<::l
.1000
a
l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Jours
Figure 31
Effet cumulé de l'association phénobarbital (PB) et essence
de térébenthine (E.T.) sur la concentration sérique de l'~l
glycoprotéine acide (~l-GPA).
---. Effet des deux produits conjugués
.--. Somme des effets des deux produits pris isolément.
Les barres représentent l'écart type de la moyenne.
Calcul de l'écart type d'une différence "d" (a-b) ou d'une
somme "s" (a+b) : ()2d
= ria + q2b
s
81
II.
ETUDE DE L'HETEROGENEITE DE L'o(l-GLYCOPROTEINE
==============================================
(o(l-GPA) DE RAT
---------------
ETUDE DIRECTE SUR SERUM
82
Puisque nous avons pu montrer des différences de la concentration
sérique en ŒI-GPA, nous avons poursuivi ce travail par l'étude des variations
susceptibles d'intervenir au niveau de la copule glycannique.
- Soit à l~extrémité non réductrice de la partie glycannique en
recherchant une hypo ou une hypersialylation,
- Soit dans la répartition des différentes sous-populations ou
isotypes en immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A.
A.- MODIFICATION DU DEGRE DE SIALYLATION
L'hétérogénéité mineure ou en position terminale est recherchée par
un dosage systématique de l'ŒI-GPA sérique en IDR et EIOm chez les rats traités
par la GaIN et par le PB. La sous-évaluation est calculée et la fraction
hyposialylée est ensuite déterminée à partir de la courbe standard préala-
blement établie (§ 4 Matériel et Méthodes).
• Quel que soit le groupe de rats témoins étudiés, aucune différence
significative entre les valeurs obtenues en IOR et en EIOm n'est observée.
Il n'y a donc pas de modification du degré de sialylation de l'ŒI-GPA à la
suite des simples ponctions cardiaques et des anesthésies.
• Lorsque les animaux sont traités par la GaIN, l'Œl~GPA présente
une légère hyposialylation à J , le maximum est atteint à J • Ou fait de la
2
4
susceptibilité individuelle,l'hyposialylation est plus ou moins prononcée,
c'est-à-dire entre 17 % et 30 % selon les animaux. Toutefois, le taux maximal
apparaIt généralement lors de la décroissance de l'activité AlAT (Monnet et al l,
1985,
69). La figure32 montre l'évolution type chez le rat. A J
l'ŒI-GPA
1
6
apparaît de nouveau sialylée.
1
~~E
• Chez les rats traités par le PB, l'étude séquentielle de la
1
~t
fraction sialylée ne montre aucune altération. Cependant, à J , jour où la
6
~
~
t
concentration sériqùe ~n Œ1-GPA est maximale, la concentration mesurée par
~
~r
EIOm est régulièrement plus élevée que celle obtenue en IDR. Nous pourrions
t
f
donc envisager une légère hypersialylation de la glycoprotéine.
t!
83
1-1 ALAT (UI/L)
*-* fraction hyposialylée (%)
0,32
00
0,27
600
0,22
300
0,17
°
l
2
3
4
5
6
7
8
9
Figure 32
Modification dans le degré de sialylation de ll~l-glycoprotéine
acide (~) et l'activité sérique de l'alanine aminotransfé-
rase (ALAI) (~) apr~~.injection de O-galactosamine (900 mg/kg)
chez le ra t.
84
Pour conclure sur ce point, les conditions de dosage de
l'Ctl-GPA par EIDm et IDR ont été légèrement modifiées de façon à ce
que les mêmes dilutions de sérum puissent être utilisées dans les
deux techniques. Dans ces conditions, comme l'indique le tableau VII, aucune
différence significative n'est observée entre les deux méthodes. Les
légères variations observées précédemment dans les concentrations en
Ctl-GPA étaient le reflet de petites erreurs de dilution.
Aucune variation du degré de sialylation de l'Ctl-GPA n'est
observée au cours du traitement par le PB de cette série expérimentale.
TABLEAU VII
VALEURS DE L'Ct1-GLYCOPROTEINE ACIDE DANS LES SERUMS DILUES
Sérums
IDR
EIDm
IDR-EIDM
IDR-EIDmX 100
H.S.*
dilués
(mg/!)
(mg/l)
(mg/l)
IDR
l
52
53
l
2
Q)
2
45
47,5
2,5
5
>
•..-1
+.J
3
47,5
50
2,5
5
n:l
C)
•..-1
4
52
57
5
10
q...
•..-1
c:
5
45
47,5
2,5
5
Cl
•..-1
li)
6
41
43
2
5
c:
0
c:
* H.S. : hypersialylation
Les concentrations en Ctl-GPA sont dosées
sur la même dilution
simultanément en IDR et en EIDm.
B.- MICROHETEROGENEITE EN POSITION INTERNE PAR IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE
CROISEE EN CONCANAVALINE A(CIAE CON A)
I. HETEROGENEITE DE L'Ct1-GPA DE RAT NORMAL
L'électroimmunodiffusion bidimensionnelle de sérum humain
(sans Con A dans la première dimension) contre un immunsérum de lapin
85
anti-al-GP~ présente un pic de précipitation homogène. Quand la Con A
est introduite dans le gel de la première dimension, le précipité est
composé de 4 fractions protéiques reflétant probablement des degrés
variables d'interaction et/ou un différent nombre de sites de liaison
biospécifique entre la lectine et l'al-GPA humaine
(Hansen et al,
1984, 41 ).
La Con A est immobile dans les conditions expérimentales. Elle
reconnaît les résidus a-D mannopyrannosyls dans une glycoprotéine sérique.
L'apparition de plusieurs pics en CIAE Con A à partir d'un antigène unique
est donc le reflet d'une hétérogénéité de la copule glycannique.
Chez le rat, peu d'études ont été consacrées au comportement des
glycoprotéines en CIAE Con A. Nous avons par conséquent appliqué cette
technique à l'étude de l'al-GPA de Rat et étudi~ les modifications éven-
tuelles dans les traitements réalisés.
1) Détermination de la concentration idéale en Con A dans le
gel de la première dimension
Dans un premier temps, nous avons effectué un dépôt d'une
quanti té constante d' al-GPA pour des concentrations croissantes en Con A. Il appa-
raît que,pour des concentrations en Con A supérieures ou égales à 150 ~g/cm2
soit 0,75 g/l dans le gel de la première électrophorèse, nous obtenons des
profils identiques et reproductibles constitués de 4 pics (figure 33,
tableau VIIil.
2) Comm~ il faut des conditi~ns extrêmement rigoureuses pour
déterminer quantitativement les proportions des différents isotypes, nous
avons défini les conditions suivantes:
- les sérums sont d'abord dilués dans une solution de NaCl 0,15 M
à 100 mg/l d'al-GPA et nous en déposons 15 pl par puits (1,5 pg d'al-GPA).
- Nous avons utilisé la même concentration d'immunsérum (1 ~1/cm2
ou 8 pl/ml) dans le gel de la deuxième électrophorèse.
La même concentration en Con A : 150 pg/cm2 est introduite
chaque fois dans le gel de la première dimension.
Les proportions relatives des quatre pics ou isotypes de l'al-GPA
1
de rats normaux calculées par planimétrie sont représentées dans le tableau IX.!,
l
1
1
86
Figure 33
Hétérogénéité de l!~l-glycoprotéine acide (~l-GPA) de Rat en
immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A (CIAE Con A).
Effet de la concentration de la Con A dans la première électropho-
rèse sur le profil protéique plaques 1-3.
2
2
(1) : Con A 0,5 g/l (100 pg/cm ) - (2) : 0,75 g/l (150 pg/cm ) - (3) : l g/l
2
(200 pg/cm ) dans le gel, 15 pl d1un sérum à 0,1 g/l d'~l-GPA par dépôt.
Première migration de 90-100 min à 7,5-10 V/cm. Deuxième migration de 18 h sous
2,5 V/cm dans un gel contenant un immun sérum de lapin anti-~l-GPA (8 pl/ml ou
1 ~1/cm2), (titre = 0,3 mg/ml) ; du polyéthylèneglycol 6000 (2 p.cent) et du
,
méthyl 0( -D-glucopyranoside (4 p.cent).
!
l
1
[
1
87
TABLEAU VIII
EFFET DE CONCENTRATIONS CROISSANTES EN CONCANAVALINE A SUR LES
VALEURS RELATIVES DES ISOTYPES DE Llal-GLYCOPROTEINE ACIDE
l
2
3
4
Isotype
Isotype
Isotype
Isotype
non
faiblement
moyennement
retenu
retenu
retenu
retenu
(%)
(%)
(%)
(%)
Con A
2
100 rg/ cm
15
25
32
28
Con A
2
150 pg/cm
15
24
22
39
Con A
2
200 pg/cm
15,5
23
23
38,5
Les valeurs sont issues de 3 plaques qui ont migré simultanément.
Les tracés correspondants sont présentés dans la figure 33.
TABLEAU IX
DISTRIBUTION DES PROPORTIONS RELATIVES DES 4 ISOTYPES DE L'a -
l
GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT NORMAL
Isotypes
l
2
3
4
Valeurs
relatives
18 + 4
25 + 3
18 + 3
39 + 6
0,22 + 0,02
0,62 + 0,06
(%)
Les valeurs sont calculées par planimétrie et représentent la moyenne
déterminée sur le sérum de 30 animaux (m + écart type)
RI = 1/2 + 3 + 4
R =
2
4/1 + 2 + 3
88
II. ALTERATION DE L' a1-GPA DE RAT EN CIAE - CON ASOUS
L'EFFET DE DIVERS PRODUITS
1) Distribution des 4 isotypes de rats témoins
L'étude est réalisée sur les rats témoins ayant subi le maximum
de manipulations : injections de solution de NaCl 0,15 M pendant 3 jours
suivies de ponctions cardiaques quotidiennes après anesthésie à l'éther.
L'analyse en CIAE Con A (figure 36 a) ne montre aucune variation
significative des 4 isotypes de l'al-GPA bien que le taux sérique de celle-
ci soit élevé. Les modifications dans les proportions relatives des dif-
férents isotypes comme nous le verrons plus loin, sont' bien consécutives
au produit injecté.
2) Effet de la GaIN sur les fractions de l'a1-GPA
(Monnet et al 1985, 69).
Les profils protéiques ont été examinés pendant 9 jours après
une injection isolée de GaIN (900 mg/kg). Les proportions relatives des
divers isotypes après estimation de l'aire délimitée par les lignes de
précipitation sont présentées dans le tableau
X • Sur la figure 34
les amplitudes des isotypes l, 2 et 4 sont nettement altérées tandis que
la modification de l'isotype 3 est moins prononcée.
Les variations des isotypes se manifestent par paire
la diminution
des
fractions retenues 3 et 4 s'accompagne d'une augmentation des fraètions non
retenues l et 2. Remarquons qu'en fin d'~tude (J6 à J9) les fractions l et
2 restent augmentées alors que la fraction 4 est diminuée.
Les modifications du profil immunoélectrophorétique de l'al-GPA
des rats traités par la GaIN se présentent en 3 phases dont deux sont
identiques (figure 35 ).
Pendant la première phase, à J 2, nous assistons à une croissance
maximale des isotypes non liés à la Con A contrebalancée par une décrois-
sance relative de l'isotype retenu par la Con A. Pendant la même période,
le rapport RI des isotypes 1/2+3+4 atteint son maximum et l'al-GPA ne pré~
sente qu'une légère hyposialylation. Ces modifications reflètent sans doute
89
TABLEAU X
Proportions des isotypes l, 2, 3 et 4 et rapport RI des isotypes 1/2+3+4
calculés après une immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de lIaI-glycoprotéine acide de rat traité par la D-galactosamine (900 mg/kg)
~ 1 2 3 4 lR=.of2+3+4
JOURS
-------------- ---------- ----------- ----------- ----------- -------------
JO
17.5
24
20
39
0.21
JI
26.5
25.5
16
32
0.36
J
39.5
27.5
10
23
0.65
2
J
20
19
15
46
0.25
3
J
21
29
21
29
0.26
4
J
27.5
30.5
22
20
0.38
5
J
34.5
31
12
23
0.52
6
J7
31.5
30.5
13.5
24.5
0.46
J8
30
33
16
21
0.43
J9
33
31
15
21
0,49
90
Jz,c; . "f\\,
~.,,! :
Figure 34
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'~l-glycoprotéine acide de rat traité à la D-galactosamine
(900 mg/kg).
JO : avant injection ; J , J , J
et J
jours suivant
2
3
4 , J 6
9
l'injection.
l, Q: 3 et 4 représentent les fractions
liées ou non à la Con A.
91
0,80
.... Rapport des isotypes
~ Fraction hyposialylée
. RI = -=-l=--",_
de 110. I-GPA
2+3+4
0,60
0,27
0,40
0,22
!
!
!
0,20
0,17
1
1
!
1
1
i
1
,
o
l
i
2
3
4
5
6
7
8
9
i-l
Jours
~
a
~
Figure 35
Effet de la galactosamine (900 mg/kg de poids corporel)
sur le degré dlhyposialylation de ll~l-glycoprotéine
acide ~
et sur le rapport RI des isotypes 1/2+3+4
IHIcalculé après une immunoaffinoélectrophorèse croisée
en Concanavaline A.
92
un état transitoire consécutif à une accumulation d'UDP-N-acétylglucosamines,
substrats nécessaires à la synthèse de structures complexes hautement
branchées non reconnues par la Con A.
La deuxième phase est courte (1 à 2 jours). Elle est caractérisée
par un retour total du profil de l'Œl-GPA en CIAE Con A vers les valeurs
initiales avec par contre une hyposialylationmaximale. Il apparaît que les
chaînes oligosaccharidiques ne sont pas totalement terminées. Nous pouvons
suggérer que ce défaut partiel de sialylation est peut-être dûe à une di-
minution de la teneur en accepteurs susceptibles de recevoir les restes
sialyls, c'est-à-dire portant des restes galactosyls situés en position
terminale des glycannes. Une diminution progressive de la teneur intracel-
lulaire en UDP galactose entraînerait un déficit progressif en résidus
galactosyls et de ce fait en résidus sialyls.
Dans la troisième phase, le profil de l'Œl-GPA en CIAE Con A
est identique à celui de la première phase. A la fin de cette période,
le rapport des isotypes 1/2+3+4 reste augmenté pendant que la sialylation
redevient normale. La persistance de l'évolution des isotypes non liés à
la Con A reflèterait une altération des organelles intracellulaires et
l'installation d'une insuffisance hépatocellulaire.Nous reviendrons plus en
détail sur ces hypothèses au cours de la discussion générale.
3) Modification 2u profil de l'a -GPA après traitement au PB
4
(Monnet et al 1985, 0;0 ).
Comme dans le traitement par la GaIN, l'Œl-GPA des rats traités
par le PB présente des isotypes dont les proportions relatives varient en
fonction du temps (figure 36 b) •
En réalité, trois isotypes subissent une modification importante.
Sur la figure 37 nous notons en effet une variation biphasique des valeurs
relatives des fractions de l' Œl-GPA non retenue (isotype 1), faiblement
retenue (isotype 2) et de la fraction fortement retenue (isotype 4).
Les valeurs de la fraction moyennement retenue (isotype 3)
restent pratiquement inchangées au cours des 10 jours d'étude.
93
a
b
2
:".
,
4
3
1
....
.
2
1
3
."
L--__ ~IiI
Ïj~ii·~~··.#1iti;·;;:"'~ï;'"
4
,.....,..
·Iio._ _
'."II:i'.
..... -----.-;,,--------
...
/
}
......
)
~.
i
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1
"~'.
L-L~
1
.
. .
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'
.
1
,
.
l
":
•
"
•
"di>·>
_
1
1i
Il
Il
, !
1
Figure 36
Modification des différents isotypes de l'~l-glycoprotéine
acide de rat en immunoaffinoélectrophorèse croisée en
Concanavaline A.
(a)
après traitement par une solution de NaCl 0,15 M
j ' •
(b)
apres traitement par le phénobarbital.
JO avant 1& traitement - J
à J
3
IO après le traitement.
94
4
R
= --=--=-....",..-
2
1+2+3
60
/ \\
50
/
\\
l, 2~
~
1
\\
---
,*
\\
fil
Q)
/
\\.
a.
40
>.
~
·--4
/
\\
0
fil
-*/
\\
-.-1
fil
,., *-
\\
Q)
\\::l
30
fil
/ '
\\
,.,
Q)
\\
>
-.-1
~
ro
.-.Q)
1-1
20
,5(
fil
1-1
:::l
Q)
.-.ro
>
10
--.6--....--.....-......--...--.....-.....
0 . .
------"'--~·
1 2 3
4 5 6
7
8
9
10
Figure 37
Cinétique de variation des valeurs relatives -des différents
isotypes de l'~l-glycoprotéine acide consécutives au traitement
par le phénobarbital_
()-() Fraction l anodique non retenue
..lt1I Fractions 2et 3modérément retenues
~ Fraction 4 cathodique fortement retenue
....- - . rapport R = 4
2
1+2+3
95
~'isotype 4 présente une nette augmentation quelques jours après l'arrêt
du traitement et atteint un maximum à J • La période d'augmentation de
6
ses valeurs correspond simultanément à une diminution des valeurs de
l'isotype l avec un taux minimal à J • Nous avons préféré dans cette étude
6
exploiter le rapport R = 4/1t2+3. Il atteint une valeur maximale à J
2
6
(figure 37 ) •
4) Le traitement par l' E. T. par l'association PB, E. T•. et leurs
conséquences
4.1 EFFET DE L'E.T.
Lorsque les rats sont traités à l'E.T. les modifications sont
beaucoup plus spectaculaires. Seul l~isotype 4 fortement retenu persiste
et présente une forte augmentation. Les autres, l, 2 et 3, tendent à
disparaître avec des délimitations peu précises, ce qui rend impossible
la détermination des proportions par planimétrie. La figure 38 montre l'évo-
lution typique des isotypes. 24 heures après l'injection du produit, nous
notons une disparition quasi totale de la forme non retenue (isotype 1);
ce profil type reste identique tout au long de l'étude.
4.2 EFFET DES DEUX PRODUITS ASSOCIES (PB -E.T.)
L'association PB et E.T. (cf. § 6 de Matériel et Méthodes)
èonduit dans un premier temps à une diminution progressive des fractions
l et 2 et à une augmentation de la fraction 4. Ceci est dû à l'effet
propre du PB. L'injection de l'E.T. entraîne dès J
la disparition des
5
isotypes l, 2 et 3 et l'augmentation de l'isotype 4 (Fig. 39).
96
Figure 38·
Effet de l'essence de térébenthine sur l'évolution des
isotypes de l'~l-glycoprotéine sérique lors de l'analyse en
immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A.
JO avant et JI à J 4 après l'injection
97
Figure 39
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A de
l'1 -g1ycoprotéine acide de rat traité par l'ensemble
1
phénobarbital (PB) et essence de térébenthine (E.T.).
JO : avant traitement - J , J
: après traitement par le PB -
3
4
J
à J
5
7 : jours suivant l'injection du PB puis de l'E.T.
L'E.T. est injectée à J •
4
98
Nous venons~de mettre en évidence que chez le rat, la GaIN et le PB
provoquent respectivement une diminution et une augmentation de la concen-
tration sérique de l'al-GPA. Une telle situation résulterait de la diminu-
tion ou de l'élévation proportionnelle du taux de synthès~ dans le foie,
bien démontrée par di vers auteurs (Macintyre et al, 1985, 62. ).
Après un traitement par la GaIN et le PB, des modifications dans
la composition des chaînes glycanniques sont aussi mises en évidence. Si
nous assimilons l'isotype fortement retenu par la Con A à une structure
riche en résidus mannosyls ou en résidus mannosyls accessibles (diantennée),
à l'inverse l'isotype non retenu aura des structures dont les restes man-
nosyls sont peu ou inaccessibles (structures N-acétyllactosaminy~stetra
antennées).Nous pouvons donner diverses interprétations aux modifications
observées. Limitons·nous aux résultats obtenus avec le PB.
1) Des études récentes indiquent que le précurseur intrahépatique
de l'al-GPA chez le rat est plus riche en résidus mannosyls que la glyco-
protéine mature sérique. D'autre part, ce précurseur montre une haute
affini té pour la Con A (Nagashima et al, 1980, ':f2, ).
Ce comportement laisse croire que par la suite de l'augmenta-
tion de la synthèse causée par le PB voire l'E.T., le processus de glyco-
sylation du précurseur de la cellule hépatique pourrait être accéléré.
Ainsi, des intermédiaires de ce processus seraient sécrétés dans le sang
constituant les formes d'al-GPA fortement liées à la Con A.
f!
2) Nous pourrions proposer une autre explication.
t
L'al-GPA au moins chez l' homme, présente une hété.t'ogénéité dans la
composition des chaînes glycanniques (Fournet et al 1978,33 ). Si cette
1
hétérogénéité existe chez le rat, la réponse au PB pourrait se traduire
1
par une stimulation préférentielle de la synthèse de formes fortement
fr,,
retenues par la Con A.
!
~.
La seule façon d'apporter une preuve à ces considérations est d'éta-
ti
blir la structure de l'al-GPA ainsi modifiée.
!
f
Nous avons limité notre étude structurale à l'a1-GPA de rats traités
par le PB en la comparant à celle de rats témoins.
1
t1
f!
99
III
!
1
ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE
1
1
L'~l-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RATS NORMAUX
1~
ET TRAITES PAR LE PHENOBARBITAL
ri
i!i~l!î
1
f1
f!i,
100
A,- ETIJDE DE LA COPULE GLYCANNIQUE DE Lb(.l-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RATS
NORMAUX ET TRAITES PAR LE PHENOBARBITAL
l} COMPOSITION CHIMIQUE EN SUCRES
Environ 400 à 700 pg d'al-GPA (RN et RPB) purifiée comme décrit
précédemment (cf. § isolement) sont directement méthanolysés. Les mono-
saccharides en résultant sont trifluoroacétylés et dosés en chromatographie
en phase gazeuse (CPG) sur une colonne en verre remplie de silicone OV 210
(cf.cllapitre F, § 3 d~ la partie "Matériel et techniques".)
Les rapports molaires des sucres sont ensuite calculés sur la
base de 3 résidus mannosyls par chaine glycannique (tableau XI). La compo-
sition molaire est la même pour les 2 préparations (al-GPA RN et al-GPA RPB),
d'autre part, il semble que les structures di et triantennées soient pré-
dominantes. L'augmentation de l'isotype fortement retenu par la Con A lors
de la CIAE Con A n'est donc pas dûe à la présence d'al-GPA ayant conservé des
structures oligomannosidiques.
Si nous examinons les pourcentages de chaque monosaccharide de
l'al-GPA RPB, nous notons une nette augmentation par rapport à ceux de
l'al-GPA RN (tableau XII~ Le taux des sucres totaux calculé
par rapport
à la glycoprotéine totale est respectivement de 26 p.cent et 31,7 p.cent
pour l'al-GPA RN et l'al-GPA RPB. Cette différence explique la légère dif-
férence observée lors de la détermination de la masse moléculaire apparente en
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate.
Dans la littérature, l'al-GPA de rat contient entre 21 et 37 p.cent
Il
de sucres totaux. Toutefois, quand nous examinons les valeurs des divers
1.
auteurs rapportées dans le tableauXIII, nous pouvons remarquer que cette
.
i
dispersion dépend énormément du traitement préalable subi par l'animal.
i
(
Chez le rat normal (RN), malgré la valeur rapportée par Kawasaki et al
i
(1966, \\tB ,) qui trouvent une teneur en sucres de 34 p.cent, l'al-GPA contient
1
en moyenne 25 p.cent de sucres totaux (Weimer et Winzler, 1955,A1~; Sarcione, 1
~)
1963, 91 ; et Charlwood et al, 1976, 214-}. Cette valeur est en accord avec
t
notre résultat : 26 p.cent.
101
TABLEAU XI
RAPPORT MOLAIRE DES MONOSACCHARIDES PRESENTS DANS L~-GLYCOPROTEINE
ACIDE DE RAT APRES METHANOLYSE ET TRJFLUOROACETYLATION
Monosaccharides (mol/mol de glycanne)
Souche d'al-GPA
Fuc
Gal
Man
GlcNAc
N-AN
œ~
RN
0,28
2,36
3
3,6
3
RPB
0,26
2,30
3
3,6
2,9
Fuc = fucose - Gal = galactose - Man = mannose - GlcNAc = N-acétyl-
glucosamine - N-AN= acide N-acétylneuraminique.
a : calculé sur la base de 3 résidus Man par mol de glycanne
TABLEAU XII
COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE
DE RAT
Monosaccharides (g/100 9 d'al-GPA).
f
ft
GlcNAc
N-AN
Total
1
Fuc
Gal
Man
!~
11
1
al-GPA RN
0,4
4
5
7,5
9
26
If
f
Ctl-GPA RPB
0,51
4,9
6,4
9,4
10,5
31,7
~'
.~
TABLEAU XIII
COMPARAISON DE LA COMPOSITION EN SUCRES DE L'ul-GLYCOPROTEINE ACIDE (ul-GPA) DE RAT
RAPPORTEE PAR DIVERS AUTEURS
Monosaccharides
(9/ 100 9 d'Œ1-GPA
)
Hexose
He><osamine
N-AN
ruc
TOTAL
RAT
Man+Gal
GleNAc
Weimer et Winzler 1955
9,9
6,4
5,1
-
21,4
Normal
Sarcione 1963
9,9
6,4
5,7
-
22
Normal
Kawasaki et al 1966
15,3
8,3
10
0,4
34
Normal
Jamieson et al 1972
14,4
9,5
10,2
-
34,1
Inflammé ET*
Charlwood et al 1976
10,5
7,3
5
-
22,8
Normal
Shibata et al 1977
13,1
6,7
7,6
0,3
27,7
Inflammé ET*
Nagashima et al 1980
14,9
12,4
10,1
-
37,4
Inflammé ET*
cette étude
9
7,5
9
0,4
26
Normal
cette étude
11,3
9,4
10,5
0,5
31,7
Phénobarbital
cette étude
12
9,3
9,7
0,3
31,3
Inflammé ET*
Man : mannose - Gal : galactose - GleNAc : N-acétylglucosamine - N-AN
acide N-acétylneuraminique
*ET : essence de térébenthine
.....
o
N
103
Lorsque la glycoprotéine est purifiée à partir de sérum de
rats inflammés à l'essence de térébenthine (al-GPA ET)~les taux des
sucres totaux et des hexoses (Man + Gal) sont par contre supérieurs.
La teneur moyenne en sucres totaux (33 p.cent) de l'al-GPA isolée par
Jamieson et al (1972,44 ), Shibata et al (1977,A02) et Nagashima et
al (1980,1~ ) est pre~que identique à celle que nous trouvons pour
l'al-GPA des rats traités par le phénobarbital et par l'essence de téré-
benthine (tableau XIII).
Il apparait donc que l'al-GPA RPB et l'al-GPA ET présentent
quelques caractéristiques communes puisque l'al-GPA ET que nous avons
parallèlement purifiée a 31,3 p.cent de sucres. D'autre part, le profil
de l'al-GPA ET en CIAE Con A est caractérisé par une augmentation des
isotypes fortement liés à la Con A. Ce comportement est retrouvé avec
l'al-GPA RPB (Monnet et al 1985,
10).
Les résultats exprimés en mole de résidus osidyls par mole
de glycoprotéine permettent d'envisager le nombre de chaînes glycan-
niques par molécule (tableauXIV). Par exemple, l'al-GPA RPB a 15,90
résidus mannosyls/mole de glycoprotéine alors que l'al-GPA RN en ren-
ferme Il,97/mole de glycoprotéine. Si nous considérons qu'il y a 3 résidus
mannosyls par chaine glycannique, il y aurait 5 glycannes par mole d'a -
l
GPA RPB et 4 par mole d'al-GPA RN. Nagashima et al (1980,12) suggèrent eux
aussi la présence de 5 chaînes complexes pour l'al-GPA isolée du sérum
de rats traités par l'essence de térébenthine. Ces résultats sont obtenus
par déduction de données expérimentales et non par analyse directe.
Cependant, ils paraissent plausibles puisque Ricca et Taylor en 1981 (90).)
en étudiant la structure de l' ARNm de l'al-GPA de rat,ont mis en évidence
6 sites potentiels de N-glycosylation.
é
Le même type de variation a déjà été rapporté dans deux cas :
k
t
i
le nombre de chaînes Asn-oligosaccharidiques des y-glutaminyl-
f
t
transpeptidases du foie de rat normal est passé de 4 dans le
l'
foie normal à 12 dans les celîules d'hépatome (Yamashita &al, 1983 .•
123).
ii A partir d'un extrait de métastases hépatiques humaines,
~
Chandrasekaran et al en 1984 (23) isolent deux formes d'al-GPA : 1
l'une comprenant 3 à 4 chaines glycanniques, l'autre contenant
t
5 à 6 chaines. L'al-GPA chez l'homme sain contient 5 sites
1
potentiels et 5 chaines Asn-oligosaccharidiques.
104
TABLEAU XIV
NOMBRE DE RESIDUS DANS LA PROTEINE
Monosaccharides ( mol/mol d' CXI-G~A)
Fuc
Gal
Man
GlcNAc
N-AN
cxl-GPA RN
1,07
9,46
11,97
14,40
12,33
(3,99)b
cxl-GPA RPB
1,39
12,14
15,90
19,08
15,38
(5,30)b
a
Poids moléculaire de l' cxl-GPA RN et de l' cxl-GPA RPB estimés
à 43.000 et 45.000 respectivement.
b
Nombre de chaînes glycanniques, calculé sur la base de 3 résidus
mannosyls par chaine glycannique.
105
Dans le but de préciser l'origine des différences observées
entre l'al-GPA RN et l'al-GPA RPB dans leur profil CIAE Con A, nous avons
poursuivi notre recherche en effectuant une séparation des oligosaccharides
en fonction de leur caractère acide sur une résine échangeuse d'anions.
2)
PREPARATION DE SIALYLGLYCANNES D'~l-GPA RN ET al-GPA RPB'PAR
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PRESSION (HPLC) SUR MICRO-PAK AXIO
Du fait de la présence d'acide N-acétylneuraminique, les glycannes
peuvent être séparés selon leur charge par chromatographie sur une résine
échangeuse d'anions, le Micro-Pak AXIO (40 X 0,4 cm). La désorption des
glycannes du support est effectuée en 80 min par un gradient phosphate
0,5 M pH 5,2, allant de 0 à 40 % délivré grâce à un microprocesseur. La
programmation du gradient est donné dans le paragraphe II de la partie
"Techniques". Dans ces conditions, on obtient habituellement 5 fractions dont 1
l'ordre de sortie est dressé dans le tableau XV ci-dessous :
1
TABLEAU XV
1
TEMPS DE RETENTION ET ORDRE DE SORTIE DES DERIVES GLYCANNIQUES SUR
i,
MICRO-PAK AXIO (40 X 0,4 cm)
!
!
Oligosaccharides
Temps (min)
Tampon phosphate (%)
Eau
r
fi
l Neutres
5
0
100
~
u
2 Monosialyls
20-25
2,5
97,5
"
~
3 Disialyls
30-35
4
!
96
1
4 Trisialyls
40-45
5
95
f
î
5 tétrasialyls
50-60
iO-30
90-70
i~
1;
~:
!
f
i
Nous avons appliqué ce schéma à l'analyse de nos produits.
Ainsi 3 à 5 mg d'al-GPA RN et d'al-GPA RPB sont soumis à une hydrazi-
nolyse. Les oligosaccharides en résultant sont re-N-acétylés, réduits par
le borohydrure, puis dessalés par filtration sur une colonne de Biogel P2.
Les glycannes ainsi obtenus sont ensuite séparés sur le Micro-Pak AXIO.
106
Les produits en sortie de colonne sont suivis à 206 nm grâce
à un détecteur UV modèle 8400 (Spectra Physics). Sur la figure 40, le tracé
de l'al-GPA RN montre S fractions distinctes (FI à FS) dont la répartition
reflète le degré d'interaction des oligosaccharides avec le support.
Le tracé de l'al-GPA RPB présente plusieurs pics que nous avons
regroupés en S fractions en fonction de leur temps de rétention (figure 41).
D'autre part, il faut noter que la révélation des sucres sur plaques im-
prégnées de réactif à l'orcinol-sulfurique (Merck) ne montre aucune pro-
portionnalité entre l'importance de la surface des pics et la quantité de
sucre dans les fractio~s.
Composition et rapport molaire des fractions après analyse en CPG
Après avoir éliminé les phosphates sur Biogel P2, chaque fraction
est soumise à une méthanolyse-triméthylsilylation puis dosée en CPG. Les
rapports molaires des monosaccharides des diverses fractions sont présentés
dans le tableau XVI.
1) ~l-GPA RN
L'analyse des fractions issues de l'al-GPA RN conduit aux
résultats suivants : les fractions FI, F2, F3, F4 et FS sont composées
d'oligosaccharides respectivement neutres, mono, di, tri et tétrasialylés.
i
Les fractions FI, F2 et F3 ont essentiellement une structure diantennée tandiSI
que F4 et FS sont essentiellement tri et tétraantennées.
t
r
2) ~l-GPA RPB
J
f
f
. 1
Les fractions de l'al-GPA RPB présentent les mêmes compositions
~
à savoir: les fractions FI, F2.et:F3 sont respectivement des oligosaccha-
t
f
rides neutres, mono et disialylés et diantennés. La fraction F4 est tri-
!~
sialylée et triantennée. La Sème fraction (FS) dont le temps d'élution
correspond à celui des dérivés tétrasialyls, apparait en fait de manière
inattendue, constituée d'oligosaccharides trisialylés et essentiellement
triantennés.
0<
T..-pon phoaphate
1t°1/
O,S MpH S,Z
( %)
/
"\\ V\\
/
.... \\f.l
}i\\', ,,>'
1\\' //
1 ,/
f
t'
/
lO
n
~/
f)
1
1\\
r~
rit
!
~
1
fl
~
~
10
fi
1
....... - - -
~/
-
J
- --,.
--~ -
....-- ... .-'" -
10
20
]0
ltO
so
~
70
figure 40 : Analyse des oligosaccharides de 11 QI-CPA RN sur résine échangeuse d'anions
Hicro-Pak AX 10 (40 X 0,4 cm).
Dans le texte, fI à f5 : fractions oligosaccharidiques séparées
en fonction de leur charge.
, ,
1
Co 1 /'"
l -
o
....,
Tampon phosphate
F3
40
0,5 H pH 5,2
/
(!li)
/
f5
/
/
/
f2
30
/
~
/
/
~
N
/
:>
:::l
~
fl
20
c:
'"of
J! 1\\
..
10
~I \\A.
""""II-
_
.,.
- - . ~
... r -- --
.",.
-
-
'
. .
.
10
20
30
40
50
60
70
Figure 41: Analyse des oligosaccharides de l' ~l-GPA RPB sur résine échangeuse d'anions
Micro-Pak AX 10 (40 X 0,4 cm).
FI à F5 : fractions oligosaccharidiques séparées en fonctIon ~e leur charge
1-'
o
CD
TABLEAU XVI
COMPOSITION EN SUCRES DES FRACTIONS OBTENUES PAR CHROMATOGRAPHIE SEMI-PREPARATIVE DES OLIGOSACCHARIDES
LIBERES PAR HYDRAZINOLYSE
RAPPORT MOLAIRE DES MONOSACCHARIDES
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
CXI-GPA RN
nd
2
3
0,75
o
FI
cxI-GPA RPB
nd
0,46
3
2
o
CXI-GPA RN
nd
2,16
3
2,5
1,4
.--e-."", .-e-e
F2
cxI-GPA RPB
nd
2,10
3
2,2
0,8
/
N-AN-.-e-.
-.-e-.
N-AN
F3
cxI-GPA RN
nd
1,6
3
3,3
1,6
"'-
/ . - e - e
cxI-GPA RPB
nd
2,08
3
3,4
2,0
N-AN-.-e-.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
-.-e-.
N-AN
F4
cxI-GPA RN
nd
2,6
3
4,1
2,6
N-AN __ -.e". __. - e - e
cxI-GPA RPB
nd
"
2,7
3
3,6
2,92
N-AN - . - e--
F5
cxI-GPA RN
nd
3,6
3
4,25
3,7
cxI-GPA RPB
nd
2,6
3
4
3
- e GleNAc ; -+ Man
-.Gal
FI à F5 : fractions l à 5
nd : non détectable
1-'
o
\\0
110
L'absence d'un résidu GleNAc que nous observons dans les rapports
molaires des fractions, résulte de la destruction du résidu GleNAc du point
d'attache (GlcNAc-Asn) lors de l'hydrazinolyse. Il faut aussi noter que le
résidu fucosyl bien que présent, n'est pas significativement détecté au
cours des mesures.
Les proportions de chacune des fractions des deux produits
calculées à partir du poids de glycannes
soumis à la séparation, sont
données dans le tableau XVILLes oligosaccharides neutres de l'al-GPA R~
ne représentent qu'une proportion négligeable du total; 1,3 p.cent,
comme l'ont montré Yoshima et al (1981,126), tandis que leur taux dans
l'al-GPA RPB est significativement élevé: 12,2 p.cent. Les proportions
des mono et disialyls de l'al-GPA RN et de l'al-GPA RPB~sont presque iden-
tiques. Si nous assimilons la fraction F5de l'al-GPA RPB à des oligosaccha-
rides triantennés, trisialylés, le fait le plus remarquable est l'absence
quasi totale des dérivés tétraantennés, tétrasialylés, et la forte propor-
tion des dérivés trisialyls dans l'al-GPA RPB (46,8 p.cent contre 25,5
p.cent dans l'al-GPA RN).
Les proportions relatives des 4 ou 5 types de glycannes sont
ensuite exprimées par rapport à la glycoprotéine totale (tableau XVIII); nous
avons tenu compte de la teneur en sucres qui est plus élevée pour l'al-GPA RPB.
que pour l'al-GPA RN. Les résultats ont pu ainsi être comparés à ceux obtenus
au cours des études immunochimiques effectuées directement sur le sérum.
i
Alors que nous n'avions pas détecté d'hyposialylation de
l'al-GPA sur les sérums de rats traités par le phénobarbital,
nous mettons en évidence dans cette étude d'analyse des gly-
cannes une augmentation de Il p.cent des oligosaccharides neutres
pour l'al-GPA RPB. Cette valeur se situe à la limite de la
~sensibilité de notre protocole de mesure de l'hyposialylation.
ii Le rapport des fractions diantennées sur les fractions tri
et tétraantennées est de 0,9 pour l'al-GPA RN et 1,14 pour
l'al-GPA RPB. Il apparait donc un décalage vers les structures
moins branchées qui de plus ne sont pas totalement sialylées.
En CIAE Con A le rapport de l'isotype retenu par la Con A sur
les isotypes peu ou pas retenus (1+2+3) est de 0,64 pour
l'al-GPA RN et 0,88 pour l'al-GPA RPB. Il apparait donc que,
TABLEAU XVII
PROPORTION ·DES DIVERSES FRACTIONS OLIGOSACCHARIDIQUES D'uI-GPA RN ET D'ul-GPA RPB SEPAREES SUR AXIO
ul-GPA RN
ul-GPA RPB
Nombre de
Nombre de
Caractère
Pourcentage*
Caractère
Pourcentage*
branches
branches
F1
neutre
2
1,3
neutre
2
12,2
F2
monosialyl
2
9
monosialyl
2
8,2
F3
disialyl
2
37,2
disialyl
2
32,8
F4
trisialyl
3
25,5
trisialyl
3
30,6
F5
tétrasialyl
14-
27
trisialyl
3
16,2
* pourcentage estimé à partir du poids total d'oligosaccharides soumis àla séparation
~
~
~
112
TABLEAU XVIII
POURCENTAGE DE CHAQUE FRACTION PAR RAPPORT A LA GLYCOPROTEINE TOTALE
C't1-GPA RN
C't1-GPA RPB
FI
neutre
0,34
3,86
F2
monosia1y1
2,34
2,60
F3
disia1y1
9,67
10,39
F4
trisia1y1
6,63
14,83
F5
tétrasia1yl
7,02
0
R3*
0,9
1,14
* R3
rapport diantenne/tri + tétraantennes
113
ce qui est détecté en CIAE Con A ne correspond pas exactement
aux structures envisagées. Le comportement en CIAE Con A des
diantennés n'est pas homogène. L'isotype 3 renferme certainement
des diantennés, ce qui entraîne une sous-estimation dans l'éva-
luation de ce type d'antenne lors
de la CIAE.
B.- ETUDE DE LA COPULE GLYCANNIQUE DE L'Ctl-GPA RPBS CM1 ET RPBS CM2
Dans cette partie nous analysons les structures des fractions
Ctl-GPA RPBS-CM I et Ctl-GPA RPBS-CM2 obtenues sur CM-cellulose après sélection
des sérums de rats traités par le phénobarbital sur la base de la concentra-
tion plasmatique en Ctl-GPA ~ 500 mg/!.
Ctl-GPA RPBS-CM
représente la pop~lation non retenue sur CM-
I
cellulose constituée d'isotypes peu et non liés par la Con A.
Ctl-GPA RPBS-CM
représente la population retenue sur la CM-
2
cellulose, purifiée ensuite par chromatographie d'immunoaffinité. En
CIAE Con A elle est sous la forme d'un pic unique (fi~ 22 b). La quantité
d'Ctl-GPA dans cette fraction correspond à 3 fois celle de la fraction
RPBS-CMl •
1) ANALYSE EN CPG ET COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDES
Le dosage et la détermination des rapports molaires des sucres
ont été menés comme il a été décrit précédemment dans le § ~l).
Nous constatons que les deux produits présentent des rapports
molaires totalement différents (tableau XIX). La fraction Ctl-GPA RPBS-CMI
présente une composition molaire en sucres proche de celle des structures
triantennées et tétrasialylées, tandis que celle de l'Ctl-GPA RPBS-CM
se
2
rapproche des glycannes diantennés monosialylées.
La composition pondérale en sucres des 2 fractions est rapportée
dans le tableau XX
• Alors que le taux de sucres totaux n'est pas très
différent: 36,2 p.cent pour l'Ctl-GPA RPBS CM
contre 30,2
I
% pour l'Ctl-GPA
RPBS-CM , la teneur en résidus sialyls est fortement diminuée dans
2
l'Ctl-GPA RPBS-CM2•
114
TABLEAU XIX
COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDES
DES FRACTIONS a1-GPA RPBS-CMI et ~l-GPA RPBS-CM2
Monosaccharides (mol/mol de glycanne)
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
al-GPA RPBS-CM
0,18
2,78
I
3
3,79
3,69
al-GPA RPBS-CM
nd*
2,10
2
3
2,75
1,06
TABLEAU XX
COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES DES FRACTIONS al-GPA RPBS-CM
ET
I
al-GPA RPBS-CM2
Monosaccharides (g/lOO g d'a I-GPA)
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
TOTAL
al-GPA RPBS-CM
6,15
9,61
14,10
36,2
I
0,46
5,89
al-GPA RPBS-CM
9,79
9,92
3,75
30,2
2
nd*
6,70
*nd
valeur non détectable
115
2) ANALYSE DES DIFFERENTES ~LAS~ES DBTENUESAPRES SEPARATION
DES DEUX PRODUITS SUR AX 10
La séparation semi-préparative sur Micro-Pak AXIO suivie de
l'analyse en CPG (voir chap.A & 2
des diverses espèces ou dérivés
conduisent aux résultats suivants
5 dérivés (Dl à D5) sont obtenus (tableau XXI). Le dérivé Dl
existe màis quantitativement l'analyse en CPG n'est pas interprétable.
Nous pouvons simplement dire qu'il n'y a pas de résidus sialyls et qu'il
s'agit donc d'une fraction neutre.
D2 est monosialylé : la teneur en Gal est en faveur d'une
structure triantennée alors que celle de la GleNAc est favorable à une
structure biantennée. Il est donc probable que ce dérivé soit impur tout
en contenant surtout des diantennes.
L'étude des dérivés D3, D4 et D5 montre une teneur en résidus
sialyls plus élevée que ne le laisse prévoir le nombre de résidus.galac-
tosyls. S'agit-il d'une réalité ou d'une erreur analytique?
Nous considérerons donc essentiellement le nombre de résidus
Gal. D3 serait diantenné, D4 et D5 triantennés. Nous retrouvons le phéno-
mène observé pour l'al-GPA RPB à savoir l'absence quasi totale de glycannes
de structure tétraantennée.
Les dérivés neutres (Dl) dans le tableau XXII représentent environ
17 p.cent du poids total des oligosaccharides, soit 6,4 p.cent de la
glycoprotéine, compte tenu de sa teneur en sucres totaux de 36,2 p.cent
(tableauXXIID.Ce taux de 6,4 p.cent n'est pas détectable par notre protocole
d'hyposialylation et effectivement nous n'avions pas mis en évidence une
hyposialylation.
Rappelons que c'est cette fraction qui augmente lors du trai-
tement par le phénobarbital et qui a donc retenu le plus notre attention.
l
i
t
TABLEAU XXI
COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDES DES DERIVES DE L'ul-GPA RPBS-CMI ET DE~uI-GPA RPBS-CM2
APRES AX 10
Monosaccharides
(mol/mol d'oligosaccharlde)
Fuc
Gal
Man
GlcNAc
N.I"N
uI-GPA RPBS-CMI
Dl
ul-GPA RPBS-CM
nd
1,96
3
2,5
2
°
UI-GPA RPBS-CM
2,66
3,31
I
0,33
3
J.,11
D2
UI-GPA RPBS-CM
nd
2,1
3
2,75
1,07
2
ul-GPA RPBS-CM
2,10
3,52
2,84
I
0,10
3
D3
ul-GPA RPBS-CM
nd
2,c5
3
3
2,10
2
ul-GPA RPBS-CMI
0,15
2,60
3
3,89
3,55
D4
UI-GPA RPBS-CM2
ul-GPA RPBS-CMI
0,14
2,69
3
4,6
5,49
D5
u - GPA RPBS-CM
l
2
t--
t--
nd = valeur non détectable - Dl à D5 = dérivés obtenus sur AX 10
0\\
-.".-.....,"'_._..._,...,_....",-_.
...-",.._-=_._-----_.
~,,",".,._,~-~
117
TABLEAU XXII
PROPORTION DES DIVERSES FRACTIONS OLIGOSACCHARIDIQUES APRES AXI0
___P_ds
X 100
Fractions
Pds total d'oligosaccharide
Ct -GPA RPBS-CM
1
2
Dl
17,6
42
D2
5,4
42
D3
26,1
16
D4
31,3
o
D5
19,5
o
TABLEAU XXIII
TENEUR DES DIFFERENTES FRACTIONS DANS LA GLYCOPROTEINE
Poids
Fraction
- - - - - - - - X 100
Poids glycoprotéine
Ct1-GPA RPBS-CM2
Dl
6,37
12,68
D2
1,95
12,68
D3
9,45
4,83
D4
11,33
o
D5
7,06
o
118
3 dérivés Dl, D2 et D3 sont obtenus. L'analyse de ceux-ci
montre clairement que ce sont respectivement des oligosaccharides neutres,
mono et disialylés de structures complexes diantennées (tableauxxD. Le
pourcentage de chaque dérivé est rapporté dans le tableau XXII >. Sachant que
la population ŒI-GPA RPBS~CM2 renferme 30,2 p.cent de sucres totaux, la
teneur de chacun des dérivés séparés sur AXIO dans la glycoprotéine peut
être recalculée. Ceci nous donne 12,68 p.cent de neutres (Dl), 12,68 p.cent
de monosialyls (D2) et 4,83 p.cent de disialyls (D3). L'hyposialylation
de cette population~-GPA RPBS-CM
est importante compte tenu du pourcentage
2
des dérivés neutres et monosialyls. Elle avait déjà été détectée par notre
protocole immunochimique qui avait conduit à une hyposialylation de 20 p.
cent. Il apparaît donc que le fait d'avoir sélectionné les animaux dans leur
réponse au phénobarbital se traduise par une augmentation de la teneur
en oligosaccharides neutres.
A la suite de cette étude, nous pouvons affirmer que chez le
rat, le traitement par le phénobarbital provoque une élévation de la
teneur en restes osidyls de l'ŒI-GPA. Il y a probablement une augmentation
du nombre de chaînes glycanniques bien que les techniques utilisées ne nous
aient pas permis'de déterminer véritablement le nombre de liaisons Asn-
oligosaccharidiques.
D'autre part, l'ŒI-GPA de rat traité par le phénobarbital
possède des chaînes glycanniques de type N-acétyllactosaminyl moins
branchées et incomplètes (présence d'oligosaccharides neutres et mono-
sialylés). Ces structures moins branchées sont formées aux dépens de
structures tétraantennées. Ces résultats sont largement confirmés lors
de l'étude de la fraction~-GPA RPBS-CM
qui se traduit par une absence
1
totale d'oligosaccharides tétraantennés et par une augmentation impor-
tante de glycannes diantennés à caractère n~ltre.
f
1
f
i
r
1
t
!!Î
t
DISCUSSION GENERALE
ET CONCLUSION
119
Notre travail a eu essentiellement pour objectif la mise au
point de modèles expérimentaux permettant d'étudier les variations de
structures des glycannes de l'Œl-GPA. Nous avons toutefois étudié si-
multanément les variations de sa concentration plasmatique par rapport
à celles de la concentration en protides totaux et en albumine.
Nous avons choisi deux types de substances qui, d'après les
données de la littérature, sont
susceptibles d'avoir des effets opposés
la GaIN conduisant à une insuffisance hépatocellulaire et le PB inducteur
puissant des enzymes hépatiques. Le PB a été étudié seul ou en association
avec l'essence de térébenthine.
Les résultats analytiques sont examinés et commentés au long
des chapitres précédents. Dans cette discussion générale, nos résultats
seront confrontés aux données existant dans la littérature en tenant
compte d'une part du métabolisme des glycoprotéines et d'autre part, des
modifications du métabolisme hépatique provoquées par ces substances.
Nous traiterons d'abord des effets de la GaIN pour aborder plus longuement
et en dernier lieu l'action du PB.
Plusieurs phénomènes ont lieu lors de l'injection de la GaIN.
La plupart d'entre-eux sont bien étudiés et sont la" conséquence de la
dépression sélective d'uridylates du fait de leur participation au méta-
bolisme de la GaIN (Decker et Keppler, 1972,2~ ). Il en résulte un
développement rapide d'une insuffisance hépatocellulaire sévère comparable
t
à l'hépatite virale humaine (Decker et al, 1971,28 ).
1
Bien que nous n'ayons abordé dans ce travail chez le rat que
l'étude des protéines totales sériques et de 2 protéines spécifiques
1
Œl-GPA et albumine, nos résultats font apparaître clairement que la
synthèse protéique est affectée. La diminution de la concentration plas-
matique en Œl-GPA est la plus spectaculaire (55 p.cent à J3), celle de
la concentration en albumine et en p~otides totaux est plus modérée.
120
L'effondrement des taux des protéines plasmatiques et intra-
hépatiques est globalement retrouvé par tous les auteurs, quelle que
soit la dose de GaIN injectée. (Monier et Wagle, 1971, 68 ; Mandl et al,
1979, 64 ; Sawamura et al, 1981,92. ; Mandl et al, 1982,65
). Nous ne
reprendrons que quelques études: celles de Bauer et al (1974,6
), de
Sawamura et al (1981, 92. ) et de Sirowej et al (1980,10; ).
A côté d'une diminution de l'incorporation de leucine radio-
marquée dans les protéines plasmatiques, Bauer et al (1974, 6 ) notent
également une diminution de la vitesse de sécrétion de l'ensemble des
glycoprotéines plasmatiques. Ils montrent aussi que la fraction albuminique
i
présente dans le Golgi est diminuée de moitié.
1
D'autres altérations importantes sont aussi rapportées par
1
!
Sawamura et al (1981, 92 ). L'injection de la GaIN (900 mg/kg de poids
corporel) s'est accompagnée d'une diminution marquée du taux des protéines
1
sériques et surtout des protéines microsomales comme le cytochrome P 450.
1
Les holoprotéines et les glycoprotéines ne sont pas les seuls
1
éléments dont la concentration plasmatique est modifiée. La teneur en
1
a-lipoprotéines est aussi diminuée à l'électrophorèse en gel d'agarose
l
(Sirowej et al, 1980,~03 ). En gel de polyacrylamide,les C-apoprotéines
1
l
dans les VLDL et HDL sont les plus atteintes.
!
Toutes ces modifications sont dues bien sûr à un déficit en
uraciles nucléotides mais aussi à la formation d'un polysaccharide
i
basique, l'aminoglycogène qui précipite in situ le réticulum endoplasmique
1
\\
et les ribosomes. (Mandl et al, 1979,64 ; Mandl et al, 1982,65 ).
1
Dans la littérature, très peu d'informations portent sur la partie
1
~
glycannique et ses modifications au cours du traitement par la GaIN. Au
~
~
cours de notre étude, nous avons observé une hyposialylation et une aug-
mentation des isotypes d' al-GPA non ou peu retenus par la Con A.
La diminution de la teneur en restes sialyls aussi bien que
celle des autres résidus osidyls a été observée par Kiss et al (1981,5~
dans les lipoprotéines des classes VLDL et LDL. S'agit-il d'une diminution
de la teneur des seuls résidus sialyls ou est-ce un phénomène plus général
touchant les autres résidus osidyls ? Dans l'état actuel de nos travaux,
il est impossible de le dire. Toutefois, d'après les résultats de Bauer
et al (1974, 5
) nous pouvons suggérer que l'hyposialylation est liée
121
au fait que l'accepteur susceptible de recevoir le résidu sialyl sous
l'action d'une sialyltransférase est inadéquat ou en concentration in-
suffisante. Nous pouvons trouver deux raisons à cela. i) Lors d'études
in vitro l'activité de la galactosyltransférase est partiellement inhibée
par les métabolites de la GaIN qui s'accumulent lors de l'intoxication.
ii) La galactosyltransférase est capable de transférer) à un pourcentage
certes faible, la galactosamine au lieu du gal sur l'accepteur endogène.
Il en résulte vraisemblablement une diminution de l'incorporation du reste
galactosyl dans les glycoprotéines d'où un appauvrissement ultérieur en
résidu sialyl en position terminale.
Nous pourrions donc admettre que l'hyposialylation de l' al-GPA
est un phénomène secondaire consécutif à un trouble de synthèse situé
plus en "amont ll • L'étùde des isotypes en CIAE Con A va dans ce sens.
De plus, la présence de matériel désialylé a été mise en
évidence par Sawamura et al (1981,92 ). Leur protocole utilisé est
différent du nôtre, mais a conduit aux mêmes résultats. Ces auteurs ont
mesuré la quantité d'asialoglycoprotéines sériques par une technique
d'inhibition. A une concentration de récepteur d'Ashwell (membrane plas-
matique hépatique) est ajouté un volume déterminé de sérum de rat dialysé.
A
'
.
b ·
t·
l
'
d' 1251
. l
-d
t ·
pres Incu atlon op Ima e, un exces
aSIa oorosomUCOI e es
In-
troduit dans le milieu réactionnel. La radioactivité fixée est d'autant plus
faible que le sérum étudié est plus riche en asialoglycoprotéines. Ils ont,
par ailleurs, signalé une diminution de synthèse du récepteur hépatique
d'épuration des asialoglycoprotéines (Ashwell et MoreIl, 1974,3
).
L'analyse des variations séquentielles des structures glycanniques
en CIAE Con A sous l'effet de la GaIN nous a montré 3 phases.
La première est caractérisée pendant les 3 premiers jours par
une élévation des isotypes peu ou pas retenus. Deux explications peuvent
être avancées
1) Il est montré que lors de l'administration de la GaIN, les
uraciles nucléotides sont bloqués par une forte concentration non physio-
logique de GaIN à partir de laquelle se forment des UDP-hexosamines et
N-acétylhexosamines (Keppler et al, 1970,50 ). Dans ces conditions, la
cellule hépatique se trouverait en présence d'une forte teneur en UDP-
GlcNAc, substrats potentiels des GnT responsables du degré de branchement
des glycoprotéines du type complexe (Schachter, 1984,95 ). Nous rappelons
122
que plus le nombre d'antennes est élevé, moins la glycoprotéine est
reconnue par la Con A ; et inversement, moins les résidus mannosyls du core
sont encombrés, plus elle est reconnue (Krusius et al, 1976,5~ ; Bayard
et Kerckaert, 1980,6
). Nous pouvons donc suggérer que, lors de cette
première phase, il y ait synthèse accrue de molécules d' ŒI-GPA hautement
branchées.
2) Par ailleurs, il est rapporté par les travaux de Bauer et al
(1974, 6
) que la galactosyltransférase (GalT) dans le Golgi est inhibée
par les métabolites de la GaIN. Le transfert accru de résidus GleNAc grâce
à l'action des GnT pourrait d'autant mieux se faire que le transfert du
reste Gal peut être partiellement bloqué. En effet~ toute fixation de
résidu Gal sur une branche de glycanne
interdit toute possibilité d'action
des GnT sur les autres antennes (sur les autres restes Man) (Schachter
et al, 1983, 94 ). En d'autres termes, dans notre situation, une diminution
ou inhibition de la galactosylation peut correspondre ou provoquer une
augmentation du degré de branchement des glycannes.
Il est à noter qu'une structure complexe di-antennée reconnue
par la Con A ne l'est plus lorsqu'elle porte un résidu GleNAc sur le
résidu Man en f3 du core (Schachter et al, 1982, 9~
et Bayard et al, 1983,9
ce qui entraînerait aussi une augmentation de l'isotype non retenu.
Entre 33 et 34, le profil de l'o(l-GPA en CIAE Con A s'est
caractérisé par un retour vers les valeurs de base. Cette période correspond
à la deuxième phase. Nous rappelons que c'est à cette deuxième phase très
courte que nous avons observé une hyposialylation maximale.
La dernière phase ressemble à la première, mais l'élévation des
isotypes peu ou pas retenus demeure à la fin de notre période d'étude. Les
mécanismes à l'origine sont sûrement différents de ceux de la première
phase. D'autres points de contrôle de la glycosylation peuvent être
modifiés après l'hépatite à la GaIN. Citons l'effet de la séquence pol y-
peptidique sur la spécificité des transférases, la distribution des trans-
férases le long du système endomembranaire, la compartimentation et la
disponibilité des substrats (Dunphy et Rothman, 1983,30 ; Schachter et
al, 1983, 94- ; Barthelson et Roth, 1985, 5
). Il serait difficile de
comparer nos résultats à ceux d'autres auteurs~qu'aucune étude de
structure n'a été réalisée au-delà de 5 jours. Toutefois, selon Lesch
123
et al (1970,58 )~la restauration des modifications ultrastructurales
du foie ne survient qu'au bout de 7 à 12 jours. La persistance de l'élé-
vation des formes non liées à la Con A entre J5 et J9 pourrait donc indi-
quer une affection chronique du foie. Ces résultats sont comparables à
ceux obtenus dans la cirrhose alcoolique et dans l'hépatite virale où
les formes de transferrine non liées à la Con A ont été retrouvées (Spik et
al, 1983,10l.\\-).
Lorsque les rats sont traités par le PB, il s'ensuit une
augmentation significative de la concentration plasmatique en ŒI-GPA
sans variation de la concentration en protides totaux et en albumine.
L'effet du PB a surtout été étudié sur les enzymes du métabo-
lisme des médicaments (Conney, 1967,25 ; Williams et al, 1979,~~9 ;
Yacobi et al, 1977a,~Z1). Son rôle dans le métabolisme des protéines
intrahépatiques et des protéines de sécrétion a déjà été étudié par divers
auteurs. L'interprétation des résultats est parfois délicate. Les proto-
coles sont souvent
très différents : protocole in vivo aigu ou chro-
nique (Kato et al, 1965,4~ ; Yacobi et al, 1977b,~ZZ), étude sur coupes
de foie, hépatocytes isolés ou fractions subcellulaires (Tuma et al, 1978,
"'-\\2.; Ragnotti et Aletti, 1978, g? ; Cajone et Bernelli-Zazzera, 1984,2Z ).
Le plus souvent, le métabolisme protéique est apprécié après incorporation
d'acides aminés radiomarqués dans les peptides naissants, par la mesure
de la radioactivité contenue dans le précipité trichloroacétique. Il arrive
parfois que certaines protéines, comme l'albumine, soient dosées spécifi-
quement. L'absence de variation de la concentration sérique en albumine
que nous avons observée a déjà été rapportée par Yacobi et al (1977a,121)
et Brinkschulte et Breyer-Pfaff (1982, ~1 ), tout comme l'absence de
modification de la teneur en séromucoïde acido-soluble (Brinkschulte et
Breyer-Pfaff, 1982,21 ). L'ŒI-GPA, bien que constituant majeur de cette
fraction, est loin d'être la seule, il nous est donc difficile de comparer
nos valeurs à celles des séromucoïdes.
D'autre part, divers auteurs ont montré que, sous l'effet du PB,
il Y avait une augmentation de la synthèse des protéines du R.E. précédée
d'un accroissement de la transcription (Glazer et Sartorelli, 1972,3~ ;
Ragnotti et Aletti, 1978, 81 ; Hardwick et al, 1983, ll-2 ). Ce phénomène
s'accompagne d'une hypertrophie du foie et d'une élévation dunombre de
124
polyribosomes associés au R.E. Tuma et al (1978,1AZ ) ont étudié un
effet immédiat aigu (100 mg de PB/kg en une seule injection), de plus
leur étude est faite 12 heures après le traitement. Ce temps est trop
court puisque c'est seulement 16 à 18 heures après des administrations
répétées de PB qu'on note une activité transcriptionnelle positive
(Hardwick et al, 1983,~Z ). Ce n'est aussi qu'après un temps de latence
de 48 à 72 heures que des variations d'activités enzymatiques ou d'effets
pharmacologiques sont observés. C'est ainsi qu'à 36, c'est-à-dire 3 jours
après la dernière injection du PB, alors que la concentration plasmatique
1
1
en al-GPA a atteint son maximum, le PB n'est détectable qu'à l'état de
1
1
trace.
!
Le PB comme l'essence de térébenthine sont des produits inducteurs
1
qui provoquent des modifications ultrastructurales du R.E. Ces modifications
1
sont suivies d'une augmentation du R.E. avec une polymérisation accrue des
f
t
ribosomes (Orrenius et al,1965, 18 ; Turchen et al, 1977,A13). Puisque
k
i•i
l' al-GPA est une protéine majeure de l'inflammation chez le rat (3amieson
t
et al, 1972, 4~) nous avons associé le PB à l'essence de térébenthine et
~
observé un effet additif de leurs effets sur la concentration plasmatique
de l'al-GPA. Le PB n'altère donc en rien l'effet de l'essenqe de térébenthine
1
f
sur la synthèse eü la sécrétion de l'al-GPA.
t,!!
Il est maintenant prouvé que l'essence de térébenthine agit
~f~
essentiellement en induisant la synthèse de l'ARN messager de l'al-GPA
(Diarra-Mehrpour et al, 1985,29 ). Nous ne pouvons pas avancer encore un
f1
tel mécanisme pour expliquer cet effet PB. C'est toutefois une hypothèse
i
raisonnable de travail puisqu'il a été parfaitement démontré que le PB
!
induit la synthèse de formes moléculaires bien déterminées de cytochrome
P-450 avec accumulation des ARN messagers correspondants.
1
!
L'étude analytique en CIAE Con A puis l'analyse de structure
-1
de l'al-GPA de rats traités par le PB présentent les résultats suivants
r-
- augmentation en sucres totaux, orientation des chaînes glycan-
1
!
niques vers des structures moins ramifiées et incomplètes. Le fait le plus
t
marquant est la disparition des glycannes tétraantennés que l'on retrouve dans f
l'al-GPA de rat normal. Il reste toujours difficile de conclure sur le nombre
1
~
de résidus sialyls élevé par rapport au nombre d'antennes dans les isotypes
!
peu ou pas retenus. Yoshima et al (1981,1Z5 ) ont identifié 2 restes sialyls
125
sur une antenne du fait de la séquence GalSl-3 GleNAc. Par ailleurs,
Bernard et al (1984,~~ ) ont rapporté la présence de 2 restes sialyls sur
une même antenne.
Si nous considérons l'effet inducteur du PB, nous pouvons
suggérer que les altérations des structures glycanniques surviennent
essentiellement lors du processus de glycosylation et non lors de la
phase de dégradation. Ces altérations n'ont pas lieu sur la partie interne
des oligosaccharides qui est remarquablement invariable d'une N-glycosyl-
protéine à une autre.
Quels sont les systèmes enzymatiques qui ont pu alors échapper
au contrôle ?
1) Les activités GnTI et mannosidasique II (Harpaz et Schachter,
1980, \\4,:;
; Allen et al, 1984, -1
ne peuvent pas être mises en cause. Ce
qui est certain c'est qu'il n'y a pas de diminution de ces activités
puisque nous n'avons pas identifié de structures oligomannosidique et
de type mixte.
2) L'activité de la GnT III catalysant la fixation d'un résidu
GleNAc intercalaire sur le résidu Man en S du core (Narasimhan et al,
1981,14 ) ne s'exprime ni dans l'ul-GPA RN ni dans l' ul-GPA RPB.
3) Du fait de l'absence des structures tétraantennées dans
l'ul-GPA de rat traité par le PB, nous pouvons admettre que l'activité
GnT V initiant la 4ème antenne est inhibée ou inexistante.
1
4) Puisque les structures bi et triantennées sont augmentées
on pourrait penser que l'activité de la GnT II et de la GnT IV catalysant
respectivement leur formation (Narasimhan et al, 1977, 13 ; Gleeson et
al, 1982,;;5 ) sont élevées. En fait, il parait plus logique de baser
notre discussion sur la comparaison de l'activité des Gn5 et celle de la
galactosyltransférase. Nous rappelons que tout transfert d'un résidu Gal
sur une antenne en cours de synthèse bloque toute fixation ultérieure d'un
reste GleNAc sur les résidus Man du "core". Par conséquent, il nous semble
que c'est à ce niveau que se situe l'effet du PB. En effet, une plus grande
'efficacité dans la fixation du résidu Gal limiterait le transfert du
126
GlcNAc en Sl.4 sur le Man al.3 (augmentation des diantennes), ou inhi-
berait totalement l'action de la GnT V en Sl.6 sur le Man al.6 (absence de
tétraantennes et augmentation des triantennes).
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer
l'efficacité de la galactosyltransférase par rapport à celle des GnTs.
i
Nous pouvons tout simplement admettre qu'il y a eu induction
spécifique de l'activité
galactosyltransférasique qui est dès lors
augmentée par rapport à celles des GnTs.
ii Le cheminement de la glycoprotéine dans les compartiments
intracellulaires peut être accéléré de telle façon que les enzymes loca-
lisées dans des organelles bien déterminées ne peuvent pas agir au maximum.
En d'autres termes, la glycoprotéine pourrait quitter rapidement le Golgi-
cis sans l'action maximale des GnTs qui y sont localisées. La galactosyl-
transférase et les sialyltransférases (partiellement) peuvent ensuite agir
sur les structures moins branchées. Récemment, Macintyre et al (1985,62 )
ont bien montré qu'au cours de la réponse inflammatoire, il y a augmentation
de la vitesse de la sécrétion de la protéine C-réactive. Si un tel méca-
nisme a lieu lors du traitement par le PB, le séjour intracellulaire de
l' al-GPA serait écourté et elle serait sécrétée avec des structures
glycanniques moins ramifiées et incomplètes.
iii La disponibilité des glycosyltransférases dans des zones
spécifiques des lobules hépatiques (zones périportale et centrolobulaire)
peut être incriminée dans les modifications. Certains isotypes pourraient
être synthétisés dans une zone cellulaire spécifique.
Supposons que les cellules centrolobulaires aient une activité
en GlcNAc Ts plus élevée que celle en galactosyltransférase. L'activité
de la galactosyltransférase pourrait être augmentée par le PB dont on sait
qu'il induit préférentiellement les enzymes de la zone centrolobulaire
(Gumucio et al, 1978, ~O ). Il en résulterait une inhibition partielle ou
totale des GlcNAc Ts et donc une sécrétion accrue de glycannes moins
antennés. La détermination de l'activité de certaines glycosyltransférases
serait intéressante. Il est toutefois indispensable de mieux préciser la
structure des glycannes par des études en RMN.
,
127
En tout dernier lieu, nous voudrions insister sur l'intérêt
prédictif des techniques immunochimiques directement applicables sur
,
serum.
En ce qui concerne le protocole d'évaluation de l'hyposialy-
lation, nous avons fixé une limite d'interprétation qui, au vu
des
résultats, est trop stricte. Nous pourrions en fait établir 3 zones
une zone de sialylation normale correspondant à une sous-évaluation en
EID par rapport à l'IDR comprise entre 0 et .5 %, une 2ème zone de sous-
évaluation comprise entre 5 et 10 % pour laquelle l'hyposialylation,
quoique faible, doit être prise en considération, une 3ème zone située
au-delà de 10 % avec une hyposialylation nette, largement confirmée par
la détermination de la teneur en restes sialyls de l'ŒI-GPA RPBS CM2.
- La CIAE Con A réalisée sur sérum nous apporte des résultats
mieux cernés sur le plan quantitatif. L'évolution des valeurs relatives
de chaque isotype ou des rapports RI et R2 est plus précise. Dans le
modèle PB, il apparait que l'accroissement dans la proportion de l'isotype
fortement retenu est bien dû à une augmentation dans la proportion des
glycannes diantennés. Cependant, le rapport R2 (isotypes 4/1+2+3) apparait
plus faible lorsqu'il est comparé au rapport R3 diantennes/tri et (ou)
tétraantennes déterminé lors de l'étude des glycannes de l' ŒI-GPA purifiée
• Chaque isotype identifié en CIAE Con A ne correspond pas à une
structure glycannique bien déterminée. Toutefois, l'intérêt diagnostic
(Wells et al,1981,~1g; Nicollet et al, 1981, 15) et prédictif de cette
technique n'en demeure pas moins vrai.
Avec ces 2 protocoles immunochimiques applicables à toute
glycoprotéine dans la mesure où nous disposons de l'immunsérum corres-
pondant, nous disposons d'un outil extrêmement précieux pour détecter
des altérations de structure des glycannes d'une glycoprotéine.
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