UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP -DAKAR
FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARIVlACIEi'
"
ANNEE 1991
LES HEPATITES NON-A NON-B :
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE ET ETUDE EPIDEMIOLOGIGUE'
A DAKAR ET DANS SA REGION
soutenue le 26 janvier 1991
par
Madame Aminata 5ALL/ r ----, ---=
,
!. ONSEll AFRICAïN~ '- "" '-, -,
i POUR l'ENSEIGNEM
MAtGACH~,
: C. A. MES
ENT SUPERIEUR!
... - OUAGAD
1
Arr;v~e 2.J .ADU.r.1995 OUGOU!
1Enregistré ~OUSn. -
'
f
MEMBRES DU JURY~~~"
',"
'H. D'1' ~: '1, 3' . ,:
Président ~
M. René NDOYE, Professeur
Membres:
M. Amadou Moustapha SOW, Professeur
M. Doudou BA. Professeur
M. Lamine DIAKHATE, Professeur
M. Abibou SAMB, Professeur
Directeur de Thèse:
M. Jacques PILLOT, Professeur
Co-directeur:
Docteur Bernard LEGUENNO
Invité:
Docteur Jean-Pierre DIGOUTTE

---

Ce travail a été réalisé avec l'aide d'un contrat de
recherche
DREP n° 90/071 en collaboration avec
-
L'Institut Pasteur de Dakar
(service virologie médicale)
- L'Institut Pasteur de Paris (service immunologie microbienne)
- L'hôpital Antoine Béclère Clamart (service immunologie)

---

JE DEDIE CE TRAVAIL
- A mon MARI
Ta patience et ta compréhension sont inestimables.
Sans ces
deux qualités qui te glorifient, ce travail n'aurait jamais
pu être réalisé avec autant de sérénité et de lucidité.
Ce travail est donc le tien.
- A mes PARENTS
Que de sacrifices consentis pour la réussite de vos
enfants !
Puisse ce travail vous donner satisfaction et vous procurer
de la joie.
- A ma soeur Aïssatou SALL, et à mon frère Cheikh T. SALL
In memoriam.
- A mes enfants
- A toute ma famille
- A toute ma belle-famille
- A mes amies
Tout particulièrement
Mme DIENG Khady SECK et
Mme DIOP Awa GUEYE

---

A NOS MAITRES ET JUGES
Toutes VOS ,critiques et vos suggestions seront bien
acceptées.
Votre
ardeur et votre passion du travail
font
de vous des
Etres appréciés.
Vos
réalisation
scientifiques
font
de
vous
des
Hommes
respectés.
Vous êtes donc des juges dignes de ce nom.
Au Professeur Jacques PILLOT
- Directeur de l'Unité d'Immunologie Microbienne
Institut Pasteur Paris
- Chef du Service de Bactériologie-Immunologie
de l'Hôpital Antoine BECLERE
- Professeur de Microbiologie à la Faculté de
Médecine de l'Université Paris VI
Vous nous avez accueilli dans vos Laboratoires et permis la
réalisation de ce travail que vous avez dirigé avec
bienveillance et enthousiasme.
Votre support financier et technique ont été indispensables
à son accomplissement.
Soyez-en remercié et soyez assuré de mon admiration.
Au Docteur Bernard LEGUENNO
- Chef du Service de virologie Médicale de
l'Institut Pasteur de Dakar
Vous nous avez accueilli dans votre service plusieurs années
durant.
Vos conseils et suggestions tout au long de ce travail ont
été d1un grand apport.
En témoignage de mes remerciements.

---

JE REMERCIE
- Tout le personnel du laboratoire d'analyses biologiques de
l'Institut d'Hygiène Sociale tout particulièrement Mme DIOP Sata
DIAGNE pour sa participation à l'étude expérimentale.
Tout
le
personnel
du
laboratoire
de
Pharmacologie/
Physiologie de l'UCAD plus particulièrement le Professeur Babacar
FAYE,
et Mme DIENG Cathy FAYE.
- Toute l'équipe de Physiologie Médicale de l'UCAD.
Le
personnel
du
laboratoire
d'immunologie
de
l' Hôpital
Antoine BECLERE et tout particulièrement :
Mme LAZIZI Yamina auprès de qui j'ai trouvé un soutien moral et
scientifique sans faille durant mes multiples séjours en France.
Mme Liliane KEROS
Mme Solange D' AZAMBUJA, Mme Marie José BRIANTAIS, Serge, Edi the"
Marie Françoise.
-
Le personnel
du
laboratoire d'Immunologie
Microbienne de
l'Institut
Pasteur
de
Paris, en
particulier
Hakima,
Bernadette,
Agathe.
L'équipe
du
Département
Informatique
de
l'ENSUT
tout
particulièrement Mr CORENTHIN et Mr BASSENE.
- Toute la famille BLOT pour leur sincère amitié

---

- p
L
A
li
INTRODUCTION
SITUATION DU PROBLEME
PREMIERE PARTIE = DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE E :
MISE AU POINT D'UN TEST DE DEPISTAGE DES SUJETS INFECTES PAR LE
VHE
ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMAL
TRANSMISSION
DU VHE AU SINGE.
1 - Matériel et méthode
2 - Résultats
3 - Tests d'inoculations croisées
PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES ET MARQUAGE
1 - PREPARATION DES IgG ANTI VHE A PARTIR DE SERUMS DE
SUJETS INFECTES PAR LE VHE.
1) Matériel
2) Méthode
II - SEPARATION DES ANTICORPS ANTI VHE DE SINGES
PAR METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
1)
-
Préparation des IgM anti VHE
2)
-
Préparation des IgG anti VHE
3)
Controle de pureté des IgM et IgG préparées
4)
- Concentration desÉ.·,:immunoglobulines préparées
et déterminat~~r~e-l~:t~neur en proteines.
III - MARQUAGE DES IgG FRACTIONNEES' { (~'1;,
\\\\ "::.\\
1)
- pour immunoe\\z}mol~e / '1
:C', """
,~'/.,
,<:".~"
a)
marquage à la,p$r.oxy~ase
,
,t>~r:;lJpe.' .
•
b)
marquage a la oe-'t?a,""'galactosldase
2)
- pour immunofluorescence.
3)
-
Controle du marquage.

---

METHODES ANALYTIQUES
RECHERCHE DES ANTICORPS ANTI VHE DANS LES SERUMS DE SINGES
- Etude de la réaction immunoglobuline fluorescente
sur coupe de foie de singes infectés
RECHERCHE DE L'ANTIGENE VHE DANS LES SELLES DE
SUJETS INFECTES :
l
- par microscopie. électronique
II
- par culture cellulaire
III - par techniques immunoenzymatiques
DEUXIEME PARTIE : DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C = ETUDE
CRITIQUE DES METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTI HCV.
A - METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTI HCV
1)
Points communs
2)
Points différentiels
B - ETUDE DE LA SPECIFICITE DES TESTS DE DETECTION
1) Méthode
2)
Résultats.
TROISIEME PARTIE
: ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DES HEPATITES NA NB A
DAKAR ET DANS SA REGION
A - RECHERCHE DE L'HEPATITE E DANS UNE POPULATION DE
SUJETS ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE
1) Méthode
2) Résultats
B -
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C
1)
Détermination de la prévalence du portage des
anticorps antiHCV dans la population générale
2)
Détermination de la prévalence du portage des
anticorps antiHCV chez les donneurs de sang.
3) Recherche des facteurs de risque de portage des
anticorps antiHCV

---

4)
Evaluation du risque de transmission de
l'hépatite C pour 100 unités de sang
transfusées par rapport à d'autres maladies
transmissibles par voie parentérale
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION GENERALE
CINQUIEME PARTIE
CONCLUSION
SIXIEME PARTIE
: BIBLIOGRAPHIE.

---

-
LISTE DES ABREVIATIONS -
AgHBs
Antigène Australia
AgVHE
Antigène du virus de l'Hépatite E
BSA
Bovin serum Albumin
B W
Bordet Wassermann
CMV
cytomegalovirus
DEAE
Diethylaminoéthyl
DO
Densité optique
EBV
virus d'Epstein Barr
EDTA
Sel de l'acide éthylène diamine tétracétique
ELISA
Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
E l A
Electro Immuno Assay
Fc
Partie constante de l'IgG
HIV
Human Immunodeficiency Virus
IgM
Immunoglobuline type M
IgG
Immunoglobuline type G
ITCF
Isothiocyamate de fluorescéine
K D
Kilodalton
Kb
Kilobase
NANB
non-A,
non-B
NANBNC
non A, non B, non C
NaBH4
Borohydrure de Sodium
ONPG
Ortho nitrophényl Bêta galactopyrannoside
OPD
Ortho phénylène diamine
PAGE
Electrophorèse en gel de polyacrylamide
PBS
Phosphate buffer salin
PEG
Polyethylène glycol

---

PCR
Polymérisation Chain Reaction.
SGOT
Sel de l'acide glutamo-oxaloacétique
SGPT
Sel de l'acide glutamo-pyruvique
SOD
Superoxyde dismutase
VCA
Antigène Viral Capsidiaire
VHA
HAV
Virus de l'Hépatite A
VHB
Virus de l'Hépatite B
VHC
Virus de l'Hépatite C
VHE
Virus de l'Hépatite E
YF
Yellow Fever (fièvre jaune)

---

-
LISTE
DES
TABLEAUX
ET
FIGURES-
Tableau
1
Le virus de l'Hépatite C
Principales
caractéristiques
Tableau
2
situation taxonomique probable du virus
de l'Hépatite C
Tableau
3
: Principales caractéristiques du VHE
Tableau
4
Diagnostic par soustraction des Hépatites
non A, non B
Tableau
5
Résultat des selles de malades de
Constantine
par méthode d'immunocapture des IgM
Tableau
6
Résultat des selles de malades de Constantine
dans le système THjSpH avec des IgG marquées à
la péroxydase
Tableau
7
Résultat des selles de malades de Constantine
testées dans les systèmes THjSpH avec des IgG
marquées à la Bêta galactosidase
Tableau
8
Résultat des selles de malades de Constantine
dans le système TSjSpS avec des IgG marquées à
la péroxydase
Tableau
9
Résultat des selles de malades de Constantine
testées dans le système TsjSpS avec des IgG marquées
à
la Bêta galactosidase
Tableau 10
Résultat des selles de Constantine testées dans le
système TsjSpS avec comme liquide de saturation le
lait écrémé à 4 %
Tableau Il
Recherche de la protéine Fv dans les selles
positives de malades de Constantine
Tableau 12
Résultat des selles de Constantine après passage
sur immunoadsorbant
Tableau 13
Réexamen des selles de malades de Constantine
après passage sur immunoadsorbant d'IgM monoclonale
Tableau 14
Résultat des selles de Bangkok après passage
sur
immunoadsorbant
Tableau 15
Résultat du contrôle de spécif~cité de la réaction
immuno-enzymatique par recherche de l'antigène VHE

---

Tableau 16
Résultat du contrôle de la spécificité de la
réaction immuno-enzymatique par réactions
d'inhibition
Tableau 17
Résultat du contrôle de la spécificité de la
réaction immunoenzymatique par réactions
d'inhibition avec des IgM et avec des IgG
Tableau 18
Résultat du contrôle de la spécificité de
la
réaction immunoenzymatique par des réactions témoins
Tableau 19
Résultat du contrôle de la spécificité des méthodes
de détection du VHC
Tableau 20
Résultat de la recherche des marqueurs viraux dans
les sérums de sujets DAKAROIS atteints d'Hépatite
aiguë
Tableau 21
Résultat de la recherche des anticorps anti HCV
dans les serums de sujets atteints d'Hépatite aiguë
à DAKAR
Tableau 22
Résultat de la recherche de l'AgVHE dans les
selles de sujets atteints d'Hépatite aiguë à DAKAR
Tableau 23
Résultat de la recherche de l'AgVHE dans les selles
de sujets atteints d'Hépatite aiguë à DAKAR après
passage sur immunoadsorbant
Tableau 24
Résultat de la recherche des facteurs de risque
de portage des anticorps antiHCV à DAKAR
Tableau 25
Résultat de la recherche des anticorps antiHCV
en relation avec des marqueurs indirects des
Hépatites
Tableau 26
Propriétés physico-chimiques et biologiques des
agents responsables des Hépatites NANB

---

- FIG URE S -
Figure 1
Evolution des transaminases chez le singe témoin
SI
Figure 2
Evolution des transaminases chez le singe témoin
S2
Figure 3
Evolution des transaminases chez le singe témoin
S3
Figure 4
Evolution des transaminases chez le singe témoin
S4
Figure 5
Evolution des transaminases chez le singe PATAS S5
inoculé avec l'extrait de selles chloroformé
Figure 6
Evolution des transaminases chez le singe PATAS S6
inoculé avec l'extrait de selles non chloroformé
Figure 7
Evolution des transaminases chez le singe
cercopithèque S7 inoculé avec l'extrait de selles
chloroformé
Figure 8
Evolution des transaminases chez le singe
cercopithèque S8 inoculé avec l'extrait de selles
non chloroformé
Figure 9
Evolution des transaminases chez le singe S9 après
inoculation croisée
Figure 10
Evolution des transaminases chez le singe S10 après
inoculation croisée
Figure Il
Résultat du fractionnement des anticorps antiVHE sur
S300
Figure 12
Evolution de la "proteine Fv" chez le singe (par
rapport au SGPT)
Figure 13
Evolution de la protéine Fv chez le singe
(par
rapport au SGPT)
Figure 14
Evolution de l'AgVHE chez le singe S8
(par rapport
au SGOT)
Figure 15
Evolution de l'AgVHE chez le singe S8
(par rapport
au SGPT)
Figure 16
Histogramme de répartition de la prévalence des
anticorps antiVHE en fonction de la tranche d'âge
Figure 17
Cinétique de l'évolution des anticorps antiVHC en
fonction du temps
(séroconversion précoce)

---

Figure 18
Cinétique de l'évolution des anticorps antiVHC en
fonction du temps
(séroconversion tardive).

---

INTRODUCTION

---

si
de
nombreuses
infections
virales
sont
susceptibles
de
provoquer des hépatites,
le vocable "hépatite virale"
a
surtout
été réservé aux hépatites A et
B qui
se
différencient
par des
critères cliniques, épidémiologiques et étiologiques.
En effet depuis la découverte de l'antigène Australia (AgHBs)
par BLUMBERG et collaborateurs en 1967
(13),
et la visualisation
du virus de l'hépatite A au microscope électronique en 1973
(27),
les agents viraux de ces deux types d'hépatite sont actuellement
bien connus; et des tests très performants pour la caractérisation
des
virions
ou
de
leurs
antigènes,
ou
la
mise
en
évidence
d'anticorps spécifiques furent mis au point.
c'est dans ce contexte que l'on s'est rendu compte,
que des
agents viraux,
autres que le virus de
l'hépatite A (VHA)
ou le
virus
de
l'hépatite
B
(VHB) ,
étaient
à
l'origine
d'hépatites
transmissibles donc infectieuses,
qui
jusque
là,
échappaient au
diagnostic biologique.
De telles hépatites furent groupées sous le nom d'''hépatite
non-A non-B".
Mais
il
convient de
préciser
que
ce
groupe
bien
que
très
hétérogène exclut néanmoins :
- les hépatites bactériennes,
- les hépatites parasitaires,
- les hépatites médicamenteuses
les hépatites auto-immunes et même
les hépatites virales dues au cytomégalovirus, ou au virus
d'Epstein Barr, ou encore au virus Delta.
Très rapidement,
des données épidémiologiques,
virologiques
et cliniques ont permis d'individualiser deux formes d'hépatites
non-A non-B (39-48-70-77-89).
La première ressemble à l'hépatite A ; elle est transmise par
voie entérale, est dénuée de tout risque de chronicité ; elle est
surtout
fréquente
dans
les
pays
sous
développés
où
elle
est
responsable
de
morbidité
et
mortalité
accrues
chez
la
femme
enceinte au troisième trimestre de la grossesse (3-23-26-49-57-64-
1

---

80) .
L'agent causal
récemment découvert est dénommé VHE
(17)
et
l'on parle alors d'hépatite E.
La
seconde
forme
ressemble
à
l'hépatite
B
elle
est
essentiellement transmise par voie parentérale (5-14-32-40-41) et
évoluerait vers la chronicité dans 50 à 80 % des cas
(50-66-68)
aboutissant à
la cirrhose et au cancer primitif du foie
(12-81).
Plusieurs agents en seraient probablement responsables
i
mais le
principal,
identifié récemment, a été dénommé VHC par la majorité
des auteurs,
et l'on parle alors d'hépatite C~
si
l'identification
du
VHC
et
du
VHE
constitue
à
l ' heure
actuelle un progrès décisif pour la santé publique,
le diagnostic
biologique des infections correspondantes pose encore problème.
En effet,
les tests de dépistage des sujets infectés par le
VHC ou le VHE, sont à l'état de recherche pour l'hépatite Ei alors
que pour l'hépatite C, nous disposons à l'heure actuelle de tests
immuno-enzymatiques, qui détectent les anticorps dirigés contre un
antigène exprimé lors de l'affection par le virus C (anti HCV) dans
le
sérum ou
le plasma.
Mais
ces
tests
posent des
problèmes de
spécificité et les sérologies positives doivent être interprétées
avec prudence lorsque le sérum contient des immuncomplexes, dans
les cas de dysglobulinémie, et même dans certaines affections avec
dysfonctionnement hépatique.
Ce sont ces deux problèmes majeurs qui nous ont conduit :
1-
à
la
mise
au
point
d'un
test
de
dépistage
des
sujets
infectés par le VHE.
2- à une étude critique des tests de détection des anticorps
antiHcV, avant d'entreprendre l'étude épidémiologique des hépatites
NA NB à Dakar et dans sa région.
2

---

SITUATION DU PROBlEME

---

Depuis de nombreuses années déjà,
et grâce à la microscopie
électronique,
les agents responsables des hépatites A et
B sont
bien connus.
Le virus de l'hépatite A ou VHA est un virus de très petite
taille,
non enveloppé et dont l'information génétique est portée
par un génome à ARN.
Il détermine une virémie de courte durée, de
deux à trois semaines. Pendant cette période le virus est excrété
en
abondance
et
uniquement
dans
les
matières
fécales,
ce
qui
détermine
un
mode
de
contamination
féco-orale
autour
du
suj et
atteint,
du
fait
des conditions d'hygiène précaires.
L'immunité
conférée par ce virus est très stable.
Le virus de l'hépatite B ou VHB est très différent. Sa partie
centrale
comprend
un
déterminant
antigénique
appelé
HBc
et
un
·génome
à
ADN
qui
porte
l'information
génétique.
Ce
virus
est
enveloppé et son enveloppe porte le déterminant antigénique HBs.
Si l'on exclut les formes fulminantes,
la virémie déterminée par
ce virus est toujours prolongée et deux cas de figure peuvent se
présenter:
-
soit
le
sujet guérit
dans
90
% des
cas
après
une
virémie de six à huit semaines ;
- soit le sujet devient porteur chronique dans 10 % des cas.
La transmission se fait principalement par voie sanguine ou
sexuelle. Le virus n'est pas éliminé dans les matières fécales mais
on
le
retrouve
dans
les
sécrétions
telles
que
la
salive,
les
larmes,
la sueur ou encore les sécrétions génitales.
Cette
parfaite
connaissance
des
VHA
et VHB
a
permis
à
la
recherche dans le domaine des hépatites de faire un grand bond et
la
terminologie
"hépatites
non-A,
non-B"
fut
introduite
pour
désigner des hépatites dont les agents étiologiques n'étaient pas
identifiés,
mais qui apparaissent sérologiquement distinctes des
hépatites A et B (4-8-28-29-33-78).
Quels sont donc ces virus des hépatites non-A non-B ?
A
l'heure
actuelle,
deux
virus
peuvent
être
sûrement
incriminés
(2-14-48-62)
3

---

- l'un ubiquitaire, déterminerait une virémie prolongée.
Il n'est
pas apparemment éliminé par les matières
fécales et son mode de
contamination est très voisin de celui du virus B.
Ce virus est
dit virus non-A non-B, liB like", mais c'est surtout la dénomination
de VHC (virus de l'hépatite C) qui est reconnue par la majorité des
auteurs depuis 1989.
Il s'agit d'un virus à ARN dont la classification taxonomique
est encore mal définie.
En
effet,
les
comparaisons
de
séquences
en
nucléotides
indiquent
des
homologies
avec
le
groupe
des
Flavivirus
(en
particulier
virus
de
la
dengue
et
de
la
fièvre
jaune),
des
Pestivirus et même de virus de plantes (20-51-55-62).
Les
principales
caractéristiques
du
VHC
et
la
position
taxonomique des virus voisins sont mentionnées dans les tableaux
suivants :
4

---

LE VIRUS DE L'HEPATITE C
Prévalence
Infection
aractéristique
Modèle
lassification
~tigènes utilisables pour
la recherche d'anticorps
20 à 40 % des
75 % des cas
Evolution vers la
Chimpanzé Flavivirus vraisemblable Protéine non structurale
cas d'hépatites
chronicité dans
ARN à simple brin, 10 KI: recombinante (20)
aiguës reconnues
50 à 60 % des cas
Une seule phase de lec-
en radioimmunologie ou ELISA
dans les pays
ture
Foie de chimpanzé ou de
développés
Densité = 1,09-1,11
patients infectés en
ii
Diamètre = 60 nm
immunofluorescence indirecte
1
Pas de transcriptase in- (réaction de blocage,
verse
Krawczynski (51)
~on encore visualisé au
Microscope électronique
Pas de culture cellulaire
1
Tableau n" 1
SITUATION TAXONOMIQUE POSSIBLE DU VIRUS DE L'HEPATITE C
Principales caractéristiques
Famille
Genres
Groupes
ARN +
Flaviridae
Flavivirus
Fièvre jaune (virus amaril)
Simple brin
ARN génomique
Dengue
10-11 000 paires de bases
non polyadénylé
Encéphalite japonaise
Pas d'ARN subgé-
Yest-Nile, encéphalite de
nomique
Saint-Louis
Encéphalite à tiques
ARN +
Togaviridae
Togavi rus
Virus de la rubéole
Simple brin
1 ARN génomique
Virus Sinbis
11-12 000 paires de bases
polyadénylé
Pestivirus
Peste porcine
ARN génomique non Maladie des muqueuses
polyadénylé
Pas d'ARN subgé-
Diarrhée bovine
nomique
Border-disease des moutons
Tableau n° 2
Ce n'est que récemment que le VHC a été caractérisé dans son génomJ
de façon originale,
par purification et clonage de ses acides nUcléiqueJ
dans
le plasma d'un chimpanzé infecté avec
le sérum d'un sujet porteuJ
d'une hépatite chronique NANB post-transfusionnelle (20).
;1
j
On distingue schématiquement deux régions :
les régions structurales qui codent pour les antigènes d'enveloppe e
5

---

......:
de capside.
-
la région non structurale qui code en particulier pour des
protéineE
impliquées dans la réplication virale.
:1
Les figures 1 et 2 proposent un schéma de son organisatio~ généralE
et de son génome que l'on subdivise en gènes st.ructuraux
(C,
PrM,
E)
e,~\\
gènes non structuraux (NSl, NS2, NS3,
NS4, NSS).
Les
déterminants
codés
par
les
régions
E
et
NSI
semblent
particulièrement
importants pour
l ' immunogénici té
et
l' antigénicité d~~
particules virales.
$" 9!
1Protéine
)\\", .1b::~r. ~
d'enveloppe E·
y., .
.&J...F-
{
J:'
Protéine
~.
.
..':'." ~ de membrane M
~:
~
~
. ~ Prot{oine
i f ....
.~~"B de nucléocapsic1e C
~'.
",:~
~J!J[~~Jt~
Figure 1 : Représentati.on schém~~ique
du virus C par analogie aux f1avlvlrus.
Figure 2 : Représentation schématique de l'organisation génétique des flavivirus
(réalisée par Vincent Deubel, Laboratoire des Arbovirus, Institut Pasteur Fondation)
AUG
10 723 nucléotides
stop
5'
STRUCTURAL
NON STRUCTURAL
3'
IA_A_~_AII·I
·IAllr~
C
prM
E
NS1
NS2A NS2B
NS3
NS4A NS48
NS5
(113) (166)
(495)
(352)
(218) (130)
(618)
(150) (248)
(900)
C 5-1
IIÂ I
pr
M
C 100-3
(75)
La région 5' du génome virai code pour des protéines de structure intervenant dans la composition de la capside et de I"enveloppe virale.
La région 3' code pour des protéines de régulation dont le rôle reste mal connu Les régions E et NS1 semblent très importantes pour l'anligénicilé des
particules.
La région du génome viral soulignée en trait plein est celle qui a été initialement clonée par Chiron. Le test anti-HCV (Chiron-Ortho-Abbott) repose donc sur
l'expression de l'antigène correspondant.
6

---

L'autre virus incriminé dans ces hépatites NANB est proche du virus
A.
La contamination se fait par les aliments souillés par les matières
fécales de sujets infectés par ce virus NANB (9). Ce virus est dit "NANB",
liA like" ou également "VRE".
Dans
certains
pays d'Afrique
ou d'Asie,
ce
virus
existe
à
l'état
endémique,
mais il sévit également soit de manière sporadique soit sous
la forme d'épidémies, dans de nombreux pays sous développés. Déjà en 1955
en
Inde,
29
mille
cas
d'hépatites
à
transmission
orale
avaient
été
identifiés (60-83). En 1975, une épidémie semblable survenait en Inde dans
la ville de Ahmedabad
(71).
Des études sérologiques ont révélé qu'il ne
s'agissait ni d'hépatite A, ni d'hépatite B.
Plus récemment encore, en 1980, dans la ville de Kashmir, une épidémie
fut rapportée (79-86). Des études épidémiologiques et cliniques menées dans
d'autres pays sur les hépatites ont révélé des épidémies en Asie du Sud-
Est (58),
au Népal dans la vallée du Katmandu
(38-46),
au Pakistan
(21).
De telles épidémies sont également survenues en Afrique du Nord, en ALGERIE
(10-59),
en Afrique de l'Ouest en COTE d'IVOIRE
(69),
en Afrique de
l'Est au Soudan (1) et en Somalie (57), et plus récemment encore au Mexique
(80), en Amérique du Nord et au Japon(88).
La plus importante est apparue
en Chine où plus de 100 mille cas ont été recensés entre septembre 1986 et
avril 1988.
Dans
toutes
ces
épidémies,
le mode
de
transmission
retenu
est
la
transmission hydrique(1-8-19-36-37-45) .
7

---

1~4.,
DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DE L'HEPATITE E.
Balayan et al.,
1983;
Belabbes et al.,
1985;
Favorov et al.,
1986;.
Pattanayak.,
1986; Shakhgildyan et al.,
1986;
pillot et al.,
1987;
et autre sources.
8

---

Pour caractériser le virus,
de nombreuses recherches au microscope
électronique ont été réalisées, soit à partir de selles de patients ou de
singes infectés (15), soit dans des coupes de foie de singes infectés (7-
15), soit dans la bile où le virus semble présent en grande quantité et où
même un clonage du génome viral a pu être obtenu.
Dans 4 % des cas, des
particules virales d'un diamètre de
27-38
nm ont été mises en évidence
(15); et on admet aujourd'hui qu'il s'agit d'un virus non enveloppé de 32
nm de diamètre en moyenne.
Son génome a été cloné et séquencé (16-67).
Il est constitué d'un ARN simple brin de 7600
nucléotides.
Il
fait
partie de la famille des Calicivirus (16).
Deux particularités caractérisent ce virus
-
celle de donner des hépatites fulminantes chez la femme enceinte avec
10 à 40 % de mortalité
- une variabilité très significative de souches provenant de différentes
régions du globe (16).
Les principales caractéristiques de ce virus sont mentionnées dans
le tableau suivant :
Prévalence
Caractéristique clinique
Modèle animal
Classification
IMe
Infection asymptomatique
Sensibilité de presque
CaLicivirus
Cas sporadiques
dans 30 à 50 % des
cas
toutes les espèces de
ARN à simple brun
50 % des hépatites
Taux de mortalité 1-3 %
singes (chimpanzé,
8,5 Kb
aiguës chez l'enfant:
sauf chez la femme encein- Rhésus, cynomolgus,
Densité = 1,29
80 % chez les femmes
te
cercopithèque)
Diamètre =
enceintes
30 - 33 nm
Visualisé dans les
Népal
Pas d'évoLution vers La
seLLes, La bile
Epidémies dans La
chronicité
Pas de culture
saison humide
Cas sporadiques entre
les épidémies
80 % des hépatites
Tableau n D 3
9

---

Si des progrès importants ont été réalisés ces dernières années pOUl
la
caractérisation
du
VHC
et
du
VHE,
le
diagnostic
des
infectio~~
1
1
l'
correspondantes,
jusqu'à très récemment ne se faisait que par exclusidl
l
'
des autres formes d'hépatites à partir de leur marqueurs viraux.
1
1
Le tableau suivant récapitule les principaux marqueurs qui peuveBi
être
recherchés,
mais
il
convient
de
préciser
que
l'on
se
contenB(
g énéralement d'un seul marqueur considéré comme optimal,
plus fiable,
Ji
inscrit
en caractère gras dans notre tableau.
il
DIAGNOSTIC PAR SOUSTRACTION DES HEPATITES NON-A NON-B
:1
Hépatites
,
A
B
Virus delta CMV EBV YF
antigène viral
-
(selles)
1
Hybridation DNA
-
ou RNA (selles)
IgM anti-virusA
-
(sérum)
DNA polyrnérase
-
(sérum)
1
Hybridation DNA
-
1
1
(sérum)
,
Antigène pré-S2
-
,
(sérum)
1
,
IgM anti-HBc
-
1
(sérum)
Antigène viral
-
1
(sérum)
...,~-
,
IgM anti-Delta
;"{J('IvE;:-.
~
_
ft..
;
,'-
!~
,
(sujets AgHBs+)
<'
"'"~\\?:,
~~(~ ."
IgM anti-CMV
IgM anti-VCA
\\.
,..
trgM anti-YF
-;, ::..•.•'
e,v<
",. .
<":.
~
fl~.m.•{\\
~
\\O~~
-
-
Les
tests
à
la
fois
les
plus
simples
et
les
plus
significatifs
pou~
l'exclusion du virus considéré sont en caractère gras. Tableau n° 4
10

---

1
1
1
:1
Cette méthode très
laborieuse de diagnostic des hépatites NANB,
d~
même que la gravité du problème de santé publique qu'elles représenten~1
devaient très vite orienter vers la recherche de marqueurs plus SPécifiqu~!
1
en vue d'un diagnostic plus fiable.
11
, ,
i t

---

PREMIERE PARTIE:
MISE AU POINT D'UN TEST DE
DEPISTAGE
DES, SUJETS INFECTES PAR
lEVHE

---

Dans la perspective d'un dépistage des sujets infectés par
le VHE,
nous avons élaboré différents protocoles de recherche,
les uns visant à
rechercher
les déterminants
antigéniques du
virus dans les selles et sa visualisation au microscope
les
autres visant à mettre en évidence des anticorps antiVHE.
Pour
la
recherche
du
virus
ou
de
ses
déterminants
antigéniques,
nous avons mis en jeu :
. l ' immunomicroscopie électronique pour la recherche directe
du virus dans les selles,
. la culture cellulaire à partir des selles,
les tests immunoenzymatiques de capture d'antigène sur
les selles.
Pour
la
recherche
des
anticorps
anti
VHE,
c'est
la
microscopie à immunofluorescence qui a été mise en jeu.
Toutes ces techniques nécessitent soit une source d'antigène
VHE, soit une source d'anticorps anti VHE. c'est pourquoi, nous
avons eu recours :
- A)
à la transmission du VHE au singe
B)
à des méthodes préparatives à savoir
1.
la
préparation d' IgG anti
VHE
à
partir de
sérums
de
sujets infectés par le VHE,
2.
la
séparation
par
méthodes
chromatographiques
des
anticorps anti VHE
(IgM et IgG)
à
partir de sérums de singes
infectés.
3.
le marquage des IgG fractionnées pour leur utilisation
comme outil analytique.
12

---

ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMAL:
TRANSMISSION DU VHE AU
SINGE

---

..
i
Depuis que l'existence d'un virus NANB à transmission oro-
fécale
fut
reconnue,
plusieurs
publications
se
succèdèrent
confirmant
la
présence
de
ce
virus
dans
de
nombreux
pays,
notamment dans les pays en voie de développement.
Des protocoles expérimentaux d'étude furent proposés et le
modèle retenu fut la transmission du virus à la race simienne.
Différentes
espèces
de
singes
ont
été
testées
cynomolgus,
Rhésus, Saïmiri ... (6-15-69-73-74-76-77).
Dans
le même sens,
nous avons donc tenté de
transmettre
l'hépatite NANB à deux espèces de singe retrouvées au Sénégal:
Erythrocebus Patas et Cercopithecus Eathiops.
1. Matériel et méthode
a)
-
matériel
Lors d'une épidémie d' hépatite virale à transmission hydrique
survenue
en
Constantine,
des
selles
et
des
sérums
de
suj ets
atteints
avaient
été
collectés
pendant
la
phase
aiguë
de
la
maladie.
A partir des sérums,
différents marqueurs viraux des
hépatites infectieuses ont été recherchés. L'absence d'IgM anti
HAV,
d'IgM anti-HBc,
d'IgM anti-Delta,
d'IgM anti-CMV,
d'IgM
anti-VCA a permis de retenir le diagnostic d'hépatite non-A non-
B.
Le mode de transmission a
permis de
retenir le diagnostic
d'hépatite
non-A
non-B
type
E.
A
partir
des
selles,
des
extractions
du
virus
ont
été
réalisées
suivant
des
méthodes
classiques d'extraction d'entérovirus.
1ère technique
- Faire une suspension de selles à 10 % en PBS
(cf préparation
des tampons)
- centrifuger à 5 000 tours/minute pendant dix minutes
Agiter le surnageant avec 0,5 ml de chloroforme
centrifuger à 5 000 tours/minute pendant dix minutes
Recueillir la phase aqueuse
- Passer sur filtre 0,22 f et récupérer le filtrat qui constitue
l'inoculum.
13

---

2éme technique
- Faire une suspension de selles à la % en PB8
- Centrifuger à 5 000 tours/minute pendant trente minutes
- Filtrer sur filtre 0,22 p et récupérer le filtrat.
b)
Méthode
- Phase d'observation ou de pré-inoculation
Pendant
cette
période,
les
singes
après
avoir
été
déparasités (lvermec lM ou Mintézol suspension), sont suivis sur
le
plan biologique.
Un
bilan
hépatique
a
été
réalisé
et
les
transaminases sériques ont été dosées chaque semaine pendant un
mois.
Les
selles ont été
également
recueillies
pendant cette
période.
- Phase d'inoculation
Un lot de 8 singes ne possédant ni anticorps antiHAV,
ni
anticorps anti-HBc,
répartis en 3 groupes selon l'espèce a été
utilisé dans notre expérimentation.
- Le groupe 1 est constitué de 4 singes témoins dont 2 de type
Patas
(81,
8_2)
et 2 de type Cercopithèque
(83,84). Ces singes
témoins ont été inoculés avec des selles humaines ne comportant
aucun agent infectieux reconnu.
-
Le groupe 2
comprend
1 singe Patas
(85)
ayant reçu 0,5 ml
d'extrait chloroformé de selles d'un sujet atteint d'hépatite E
(El),
1 singe Patas
(86)
ayant reçu 0,5 ml d'extrait de selles
non chloroformé du même sujet (E2).
-
Le
groupe
3
comprend
également
1
singe
Cercopithèque
(87)
inoculé avec 0,5 ml dl extrai t
El,
1
singe Cercopithèque
(88)
inoculé avec 0,5 ml d'extrait E2.
La voie d'administration utilisée est la voie intraveineuse.
Les
selles
de
ces
différents
singes
furent
collectées
quotidiennement, les sérums hebdomadairement, et conservés
à
-80·C.
2.
Résultats
14

---

Dans le groupe 1 : aucune variation sensible des transaminases
n'a été observée (cf courbes 81, 82, 83, 84).
Dans le groupe 2 :
85
pas d'élévation des transaminases (cf courbe 85),
86
élévation des transaminases au bout de 10 jours (cf
courbe 86).
Dans le groupe 3 :
87
pas d'élévation des transaminases (cf courbe 87),
88
on observe une augmentation considérable des transaminases
au bout de 4 semaines (cf courbe 88).
15

---

Evolution des transminases chez le singe PATA5 TEMOIN - 51
300 i
1
I~ SGor 1
...- SGPT
250
200
150
\\0
.--i
100
50
0'
,
l
,
,
,
,
,
1
,
1
,
,
•
,
,
l
,
,
ft
,
,
,
,
I l
-21
-11
-1
9
19
29
39
49
59
69
79
89
99
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe PATA5 TEMOIN - 52
300 i
,
I~ SGOT 1
-+-
SGPT
250
200
150
[ '
r-i
100
50
-11
-1
9
19
29
39
49
59
69
79
89
99
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE TEMOIN - 53
300 i
i
1--+- SGPT 1
SGOf
250
200
co
150
ri
100
50
o l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
1
1
l
,
l
,
l
,
1 1
- 2 1
- 1 1
- 1
9
1 9
29
39
49
59
69
79
89
99
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE TEMOIN - 54
300 1
1
I~-+ SGPT 1
SGor
250
200
150
0'\\
ri
100
50
o l
,
,
,
l
,
,
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
I l
-21
-11
-1
9
19
29
39
49
59
69
79
89
99
Jours

---

Evolution des Transminases chez le singe PATA5 - 55
300 i
i
I~ san 1
-+-
SGPT
250
200
150
o
N
100
50
o 1
ft
1
ft
,
J
,
, 1 f t
l
,
l
,
l
,
1
t
1
!
'
,
1
1
1
,
J
-30
-20
-10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe PATA5 - 56
300.
i
-a-
SGOT
......
SGIT
250
200
150
r-i
N
100
50
o '
,
l
,
l
,
,
, 1
ft
l
,
l
,
,
ft
,
,
,
ft
1
1
l
,
1
1
1
-30
-20
-10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours
/

---

Evolution des transminases chez le singe Cercopitheque - 57
300'
,
I~...... SGPT 1
SGOT
250
200
150
N
N
100
50
o '
,
l
,
,
1
l
,
,
ft
l
,
1
1
l
,
,
•
l
,
l
,
1
1
l
,
1
-30
-20
-10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe CERCOPITHEQUE - S8
300.
1
1- SGar1
......
SGPT
200
M
N
100
.,~,.
o l
,
1
l
,
,
,
,
,
,
,
1
l
,
,
,
l
,
l
,
1
1
1
-21
-11
-1
9
19
29
39
49
59
69
79
89
99
JOUIS

---

3. Tests d'inoculations croisées
Ne
disposant
d'aucun
test
biologique
de
dépistage
des
marqu~urs du VHE,
et pour vérifier que le virus inoculé était
différent du VHC et ne possédait aucune communauté antigénique
avec
ce
dernier,
des
tests
d'inoculations
croisées
ont
été
pratiqués.
a)
Technique
Ce test porte sur deux singes type Cercopithèque: l'un S9
fut infecté expérimentalement par des selles de sujets atteints
d'hépatite NANB épidémique
l'autre,
SlO,
par le sérum d'un
malade atteint d'une hépâtite NANB post-transfusionnelle.
S9
4 semaines après l'inoculation, une élévation importante
des transaminases fut observée suivie d'un retour à la
normale 4 semaines plus tard (cf courbe) .
S10 : Une élévation plus modérée des transaminases fut obtenue
au bout de 5 semaines avec retour à la normale 4 semaines plus
tard. C'est à ce moment là que les inoculations croisées furent
pratiquées,
c'est-à-dire que le singe S9 était inoculé avec le
sérum d'un malade atteint d'hépatite C à la phase aiguë et le
singe S10 avec les selles de sujets atteints d'hépatite E pendant
la montée des transaminases.
b)
Résultats
si
l'on exclut les
formes
d'hépatite à
rechute,
on peut
conclure que le virus inoculé est différent du VHC et qu'il ne
possède aucune communauté antigénique avec celui-ci; puisque une
élévation
des
transaminases
sériques,
témoin
d' une
hépatite
clinique, fut observée 20 jours après ces réactions croisées (cf
courbes S9, 810).
24

---

Evolution des transminases chez le singe - 59
400 1
1
l;r SGar1
350
-+-
SGPr
300
250
l!)
200
N
150
100
50
o l
,
1
?"
l
,
l
,
l
,
l
,
l
,
1
l
,
1
1
1
1
l
,
l
,
1
l
,
l
,
,
,
l
,
l
,
1
-30
-20
-10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
Jours

---

Evolution des transminases chez le singe - 510
400 1
1
-Go
SGOT
-+-
SGPT
300
200
\\.0
N
100
o 1
ft
,
,
,
,
,
,
,
,
l
,
l
,
l
,
,
ft
,
,
,
l
,
,
l
,
l
,
,
e
,
,
,
,
,
l
,
-30
-20
-10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
Jours

---

PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES
ET MARQUAGE

---

l
-
PRE PAR A T ION
DES
l
g G
A N T l
- V H E
A
PAR TIR
D E S E R U M S
D E S U J E T S
l
N FEe TES
PAR
L E V H E
1) Matériel
il s'agit de sérum de malades atteints d'hépatite virale à
transmission hydrique,
survenue à Bangkok lors d'une épidémie.
Les
sérums ont été prélevés chez
ces sujets pendant
la phase
convalescence de la maladie,
c'est-à-dire après le retour à la
normale des transaminases.
2) Méthode
La
préparation
se
fait
à
partir
des
sérums
des
malades
convalescents par relargage à l'aide de sels neutres.
a.
Principe
Le
sulfate
d'ammonium
à
demi-saturation
précipite
les
fractions riches en IgG.
b. Technique
- Préparation de la solution saturée de sulfate d'ammonium
Dissoudre 1 g de sulfate d'ammonium par ml d'eau distillée à
50°C.
Ajouter du sulfate jusqu'à saturation,
ajuster le pH
à
7.
Saturation du sérum
Les IgG précipitent en grande partie à
40 % de saturation.
Il
faut calculer la quantité de solution saturée à
utiliser
par la formule
saturation 2 -
saturation 1
1
-
saturation 2
Saturation 1
degré de saturation de départ du sérum
Saturation 2
degré de saturation que l'on veut obtenir.
Exemple
:
à
partir de
sérum
frais,
combien
de ml
de
sulfate
d'ammonium saturé faut-il
ajouter pour obtenir une solution à
40 % ?
27

---

0,40 - °
0,4
=
0,66
soit 66 %
1
- 0,4
0,6
Donc pour 100 ml de sérum,
il faudra ajouter 66 ml de solution
saturée de sulfate d'ammonium.
- Mettre le mélange une nuit à +4°C.
- Centrifuger à faible vitesse
(2
000 t/mn)
pendant la minutes
et recueillir le culot de centrifugation qui contient les IgG.
Le culot est alors repris dans du tampon PBS sous un volume
de 1 ml.
Dessaler
cette
solution
en
dialysant
dans
du
tampon
PBS
pendant 48 heures.
-
Vérifier au troisième jour que l'eau de dialyse ne contient
plus de
traces de sulfate d'ammonium en effectuant la réaction
de
Nessler.
- Réaction de Nessler
A 2 gouttes d'eau de dialyse,
ajouter 0,7 ml de réactif de
Nessler,
puis
3 ml
de
lessive de
soude
l ' appari tion d'une
coloration rouille indique la présence de sulfate d'ammonium.
Dialyser à
nouveau jusqu'à disparition de cette coloration de
l'eau de dialyse. Les IgG ainsi préparées peuvent être conservées
à +4°C.
28

---

II
SEP A RAT ION
DES
A N TIC ° R P S A N T l
- V H E (IgM -
IgG)
DE SINGES
1. préparation des IgM antiVHE
Elle
se
fait
à
partir
d'un
pool
de
sérums
du
singe
S8
recueillis
pendant
la
montée
des
transaminases
par
un
fractionnement en gel filtration sur colonne.
a)
-
principe
C'est une méthode de filtration sur tamis moléculaire qui
sépare
des
protéines
de
même
solubilité
mais
de
poids
moléculaires différents.
b)
-
Technique
Préparation de la colonne
Elle nécessite un choix judicieux de la colonne, du tampon
et du gel.
Choix de la colonne :
Il dépend de la quantité de produit
à injecter et de son volume.
5 à 10 ml de sérum : colonne Pharmacia K50-100
(soit 5 cm de
diamètre,
100 cm de longueur). Volume de la colonne = 1,8 1.
1 à
2 ml de sérum : colonne Pharmacia K25-100 ou SR25-100 ou
colonne Wright GA-22 x 90. Volume de la colonne = 530 ml.
0,5 ml
:
colonne Pharmacia K15 x 100 ou K16 x 100 ou colonne
Wright GA-16 x 90. Volume de la colonne = 200 ml.
0,25 à 0,5 ml de sérum:
colonne Pharmacia K9-60 ou colonne
Wright GA-10 x 60. Volume de la colonne = 38 ml.
Débit de la colonne : il dépend de sa taille, de la nature
du gel et de la qualité de la séparation.
Les valeurs moyennes
sont" les suivantes
- pour une K50-100
30
à
50 ml/heure
- pour une K25-100
7
à
15 ml/heure
- pour une K15-100
2,5 à
8 ml/heure.
choix du gel en fonction du poids moléculaire à séparer
Poids moléculaire > 1 million : Sepharoses (notamment Sepharose
CLB) .
29

---

Poids moléculaire compris entre 80 mille et 1 million
Sephacryl
S300.
Poids moléculaire compris entre 20 mille et 150 mille
Sephacryl
S200.
Poids moléculaire < 20 mille: Sephadex G75 ou G50.
Choix du
tampon
:
Habituellement,
on
utilise du
tampon
PBS-azide à 1/1000 0,15 M PH 7,2.
Remarque
:
Le tampon utilisé,
de même que le gel doivent être
dégazés.
Comment dégazer le tampon ?
-
Dans une fiole à vide, mettre environ deux fois le volume de
la colonne de tampon.
- Mettre sous agitation magnétique faible.
Recouvrir avec un bouchon trop large, puis relier à une trompe
à eau puissante pendant un quart d'heure.
-
Pour
casser
le
vide,
arrêter
l'agitateur
magnétique,
puis
retirer
le
tuyau
avant
d'arrêter
la
pompe
(sinon
risque
de
reflux) .
Comment dégazer le gel ?
La
même
technique
que
celle
pour
dégazer
le
tampon
est
utilisée,
mais diluer préalablement le gel
de moitié dans
du
tampon dégazé.
- Mettre sous agitation lente afin de ne pas briser les billes
de gel.
Installation de la colonne
La colonne est installée verticalement (vérifier dans toutes
les directions avec un niveau à eau).
-
installer un réservoir en haut de la colonne
en bas de la colonne, mettre un tuyau de longueur supérieure
à celle de la colonne
- remplir entièrement la colonne avec du tampon dégazé et purger
le tuyau de sortie
- verser le gel doucement dans la colonne au-dessus du tampon
dans lequel il tombe en formant des volutes
installer
la
pompe
qui
doit
être
reliée
à
l ' extrémité
inférieure de la colonne par un tuyau le plus court
possible,
30

---

et
dont
le
débit
est
supérieur
au
débit
d'utilisation
pour
permettre au gel de se tasser.
-
laisser
le
gel
se
tasser.
Le
gel
est correctement tassé
lorsque son niveau
supérieur dans
le haut de
la
colonne ne
varie plus
- enlever l'excès de gel
- enlever le réservoir
-
installer l'adaptateur en l'enfonçant légèrement dans le gel
le visser solidement
Pour purger l'air du tuyau du bas,
laisser couler l'eau de
la colonne. Pour purger la pompe, la faire marcher à vide avant
de la relier à la colonne. Le tuyau d'arrivée à la pompe plonge
dans le tampon par l'intermédiaire d'un microtube en verre qui
l'empêche de flotter. Le tuyau de sortie de la colonne est relié
directement au collecteur de fractions où la collection se fait
en
gouttes
(100
gouttes
= environ
5
ml)
ou
en
temps.
Ce
collecteur est en relation avec un enregistreur qui inscrit la
forme globale de la courbe.
La lecture
Les fractions sont analysées par absorption dans l'UV à 280
nm.
Les
densités
optiques obtenues
au
spectrophotomètre sont
reportées sur une coufbe en fonction du volume d'élution
:
la
courbe présente alors trois pics s ' i l s'agit d'un sérum:
1er pic correspondant aux IgM (PM = 1000 Kd)
2éme pic est celui des IgG (PM = 150 Kd)
3éme pic représente l'albumine (PM = 68 Kd).
Dans notre étude, pour la séparation des immunoglobulines,
nous avons choisi une colonne Pharmacia K2S-100, le gel Sephacryl
S300 et du tampon PBS azide à 1/1000 comme éluant.
31

---

c)
-
Résultats
Les résultats obtenus sont les suivants
4,0
3,5
3,0
8
t::
0
2,5
00
N
,C\\i
0
:::l
cr'
2,0
'P
§<
'0
~
.....en
1,5
t::
0
0.
1,0
0,5
0,0
0
50
100
150
200
250
300
350
Volume d1élution en ml
1er pic
IgM
2e
pic = IgG
3e
pic = albumine.
Les
différentes
fractions
correspondant
aux
IgM
ont
été
collectées et dialysées dans du tampon PBS pendant trois jours
avant d'être soumises à un contrôle de pureté.
32

---

2. préparation des IgG antiVHE
On utilise un pool de sérums du singe S8 recueillis pendant
la phase de convalescence de la maladie, que l'on fractionne par
chromatographie
pur
résines
échangeuses
d'ions.
Nous
avons
utilisé comme support: DEAE Trisacryl M,
IBF.
a)
-
principe
Il est basé sur la propriété des protéines à s'associer aux
groupes
chargés
fixés
sur
les
résines.
Plus
la
protéine
est
chargée, c'est-à-dire éloignée de son point isoélectrique, plus
fortement
elle
se
fixe.
On
obtient
l' élution
en
augmentant
progressivement la force ionique.
b)
-
Technique
Après
avoir
séparé
les
fractions
d' IgM
et
d' IgG
par
chromatographie sur S300, dialyser les IgG dans du tampon
Tris
HCl 0,025 M, Nacl 0,035 M, pH 8,8 pendant 48 heures,
-
Déposer
l'échantillon sur
la colonne à
raison de
5 ml
de
sérum pour 15 ml de gel équilibré dans le même tampon
(volume
gel/volume d'échantillon = 3).
Le débit est de l'ordre de 50 ml/heure. Sous ces conditions,
seules les IgG ne sont pas retenues par le support et sont éluées
dans un pic étroit.
Le degré de pureté des
IgG éluées est de
99,5%
.
Remarque
:
La capacité maximale de la DEAE Trisacryl M est de
50 mg de protéines par ml de gel. Cette technique est applicable
à
différentes
espèces
animales
mais
avec
un
degré
de
pureté
variable.
Espèce
Pureté IgG
Rat
++
Souris
Lapin
++
Mouton
++
Chèvre
+
Porc
++
Chien
++
Homme
+
33

---

3. Contrôle de pureté des IqM et IqG préparées
Il se fait par immunodiffusion sur gel suivant la technique
classique d'outcherlony.
a)
-
principe
L'antigène
en
solution
diffuse
dans
un
gel
contenant
l'anticorps. Les deux réactifs (antigène et anticorps) diffusent
l'un vers l'autre dans une couche de gel vierge et lorsqu'ils se
rencontrent,
i l y a formation d'un arc de précipitation.
b)
-
Technique
Préparation du gel
Le gel est composé
d'agarose = 0,6 g
PEG 6000
3 g
tampon
100 ml
Le tampon est ainsi préparé
Tris 0,02
M
2,42
g
glycine 0,01 M
0,75
g
EDTA 0,01 M
2,9
g
eau QSP
=
1 000 ml
Le
mélange
se
fait
sur
agitateur
chauffant
et
il
est
conservé
en
chambre
humide.
Le
gel
est
alors
coulé
sur
une
surface de verre
(plaque de verre ou boîte de Pétri)
et après
solidification,
des
sources de diffusion
sous
forme
de
puits
circulaires sont creusées avec un emporte-pièce dans la gélose.
On dépose dans deux puits différents l'antigène et l'anticorps,
et la diffusion se fait pendant 48 h en chambre humide.
c)
-
Résultats
Par
cette
technique
nous
avons
pu
contrôler
que
les
immunoglobulines que nous avons préparées étaient pures.
34

---

4. Concentration des immunoglobulines préparées et
détermination de la teneur en protéines
Cette
concentration
se
fait
par
ultrafiltration
sous
différence de pression.
a)
-
Technique
Dans
une
fiole
à
vide,
on
place
un
boyau
à
dialyse
parfaitement
étanche
dans
lequel
on
introduit
la
suspension
d'immunoglobulines à concentrer. La fiole est reliée à une trompe
à
eau et bouchée hermétiquement.
Il règne ainsi dans la fiole,
une pression inférieure à celle existant dans le boyau, de telle
sorte
que
l'eau
puisse
s'échapper
du
boyau
alors
que
les
protéines
sont
retenues
à
l'intérieur du
sac
à
dialyse
qui
constitue en fait une membrane semi-perméable. La teneur finale
en protéines est évaluée au spectrophotomètre UV à 280 nm.
35

---

III - MAR QUA G EDE S I g G
FRA C T ION NEE S
Nos
IgG
fractionnées
ont
été
marquées
soit
pour
usage
ultérieur en immunoenzymologie (peroxydase-bêta-galactosidase),
soit pour immunofluorescence (fluorescéine).
1)
-
pour immunoenzymoloqie
a)
Marquage à la péroxydase
Réactifs
- eau parfaitement déionisée,
bidistillée
- peroxydase
acétate
de
sodium
anhydre
Acide
acétique
carbonate
disodique anhydre - carbonate monosodique - sodium métapériodate
- sodium borohydrure.
Technique
- Premier jour
A 8 mg de peroxydase dans 1 ml H20, ajouter 0,8
ml de NaI04
0,1 M (21 mg/ml)
en agitant.
Laisser 20
à
30 min
maximum à température ambiante. Dialyser cette solution une nuit
à +4°C contre un tampon acide acétique-acétate de sodium 10-3 M
pH4,
4
(1 1)
(cf préparation des tampons).
Dialyser simultanément 5 mg d'IgG
(volume compris entre 0,2 et
0,5 ml) contre du tampon carbonate 10-2 M pH 9,5 une nuit à +4°C
(2 XII)
(cf préparation des tampons).
- Deuxième jour: Mélanger les solutions d'IgG et de péroxydase.
Volume final compris entre 2 et 2,5 ml.
La solution se trouble
parfois : elle redevient limpide après alcalinisation.
Alcalinisation
ajouter 40
à
60 pl
de tampon carbonate 1 M.
Contrôler le pH. si pH < 9,0 ajouter du tampon carbonate 1 M par
aliquotes de 10 pl.
Laisser 3 heures à température ambiante à l'obscurité.
Ajouter 100 pl de NaBH4 à 4 mg/ml en eau distillée et laisser 2
heures à +4°C.
Dialyser contre du PBS
(2 x l I )
une nuit à +4°C.
-
Troisième jour:
Diluer à
l'aide d'un tube gradué à
50 % en
glycérol.
Bien homogénéiser.
Le conjugué est stable à -20°C pendant au moins un an.
36

---

b)
Marquage à la bêta-galactosidase
Principe
La préparation du conjugué anticorpsjbêta-galactosidase se
fait par la glutaraldéhyde qui est fixée aux anticorps, selon la
technique de GUESDON-AVRAMEAS et TERNYNCK (34).
Cette méthode permet l'association de l'enzyme à la protéine
par
l'intermédiaire
des
groupements
aldéhydes
de
la
glutaraldéhyde
qui
réagissent avec
les
groupements
aminés
de
l'anticorps et de l'enzyme.
Technique
La bêta-galactosidase,
à
raison de
la mg est additionnée
de 5 mg d'anticorps sous un
volume total de 2 ml
; le mélange
est dialysé toute la nuit contre du tampon phosphate 0,1 M pH
6,8
(cf préparation des tampons).
On ajoute le lendemain à ce
mélange,
maintenu
sous
agitation,
100pl
d'une
solution
de
glutaraldéhyde à 1 % dans du tampon phosphate 0,1 M pH 6,8. Après
3 heures de contact à la température du laboratoire,
on ajoute
une solution de lysine
(ou de tout autre réactif contenant des
groupements NH2 libres)
en tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 pour
obtenir une concentration finale en lysine de 0,1 M.
Celle-ci,
laissée
en
contact
pendant
2
heures
à
la
température
du
laboratoire, permet le blocage de l'excès de glutaraldéhyde.
Conservation
Les conjugués à la péroxydase ou à la bêta-galactosidase,
sont enfin dialysés contre du PBS pendant 3 jours à +4°C,
puis
centrifugés 20 minutes à 3.000 g, et un volume égal de glycérol
est
ajouté
comme
conservateur.
Le
mélange
peut
alors
être
conservé sans antiseptique à -20°C.
37

---

2. pour immunofluorescence
a) Marquage des IgG par la fluoresceine
Technique
On utilise l'isothiocyanate de fluorescéine Mérieux
(ITCF).
La
solution
de
protéines
à
conjuguer
est
ajustée
à
20
mg/l
(mesure
de
la
DO
à
280
nm
avec
précision).
Avant
de
mettre
l'ITCF, il faut ajuster le pH à 9 en ajoutant l/lOème du volume
de tampon carbonate O,S M aux protéines.
L'isothiocyanate de fluorescéine ne se dissout qu'à PH 9.
Ajouter l'ITCF à la solution de protéines à conjuguer en raison
de 1 mg pour 40 mg de protéines
- Laisser en agitation douce et continue une nuit à +4°C
- Séparer alors les protéines marquées sur Sephadex GSO.
Séparation des protéines marquées sur Sephadex GSO
-
Laver le gel avec du PBS
2 à
3 fois
puisque
le gel est en
tampon phosphate.
Pour
celà
centrifuger
à
3.000
tours/minute
pendant S minutes et éliminer le surnageant
- Verser alors le gel dans une colonne de manière à ce que la
hauteur de la colonne soit dix fois supérieure à son diamètre.
Il faut S ml de gel pour 1 ml de solution à chromatographier ;
-Laver la colonne en continu pendant 40 minutes environ avec
l'eau physiologique tamponnée:
- Déposer délicatement la solution conjuguée sur le papier filtre
en haut du gel et laisser couler.
Résultats
Les protéines marquées
sont éluées
les
premières et
les
fractions correspondantes sont colorées,
suivies des protéines
non marquées dont les fractions correspondantes sont incolores.
L'ITCF libre est éliminée dans les dernières fractions colorées.
On fait un pool des premières fractions
colorées qui ont
été recueillies et on évalue la teneur en protéines à
280
nm
puis à 496 nm.
La concentration finale en protéines exprimée en ng/ml est
donnée par la formule
38

---

DO 280 nm -
0,46
(DO 496 nm)
p
=-~---------------------------
1,4
J~ :R = concentration en protéines
j
0,46
= facteur de correction dû à l'ITCF
1,4
= absorption dans l'UV de 1 mg de protéines.
Après quoi,
on calcule le poids de l'ITCF en gamma/ml.
Il
est donné par la formule :
DO
(496)
F
=
-------
0,21
1 gamma d'ITCF a une absorption de 0,21 à 496 nm
Calculer le rapport F/P. Ce rapport doit être compris entre
3 et 6.
Les immunoglobulines marquées à
la fluorescéine ainsi
préparées sont épuisées sur de la poudre de foie de boeuf.
Technique d'épuisement
-
On utilise 100 mg de poudre de foie de boeuf pour 20 mg de
protéines marquées ;
-
A cette poudre réhydratée au préalable,
ajouter la solution
de protéines marquées ;
- Laisser le mélange une heure à la température du laboratoire,
puis une nuit à +4°C.
Cette méthode permet de capter tous les anticorps anti-foie,
il ne reste que les anticorps anti-virus donc toute fluorescence
observée au microscope sera spécifique du virus.
De plus les immunoglobulines non marquées sont faiblement
chargées tandis que
celles qui sont marquées sont plus chargées
négativement.
Dans ce cas,
les anticorps anti-tissus ou anti-
cellules qui portent des charges positives vont se lier par des
liaisons
électrostatiques
avec
les
protéines
marquées
à
la
fluorescéine.
Il s'agit de liaisons non spécifiques.
L'épuisement
par
la
poudre
débarrasse
de
ces
forces
électronégatives
donc
les
seules
liaisons
présentes
seront
ensuite
des
liaisons
immunologiques
entre
le
virus
et
les
anticorps marqués.
Remarque : A la place de la poudre de foie,
on peut utiliser un
sérum polymérisé avec du glutaraldéhyde qui
donne un gel.
La
technique d'épuisement reste inchangée.
39

---

3. Contrôle du marquage
a)
- Matériel
- Plaques à microtitration
SI : substrat spécifique pour béta-galactosidase (ONPG 8 mg dans
2 ml d'H20+ PM2 8 ml + mercaptoéthanol
56 pl).
S2
: substrat spécifique pour péroxydase (OPD 2 mg/ml + tampon
citrate +1 ul/ml d'H202).
- Tampon de saturation (BSA 0,5/1000 + Tween 20 à 1/1000 + PBS)
- Tampon de lavage (PBS + Tween 20 à 1/1000)
-
R3
:
IgG de lapin anti-Fc(gamma)
humain dont la méthode de
préparation est décrite en annexe).
b)
-
Technique
Sur une plaque Nunc,
incuber à
37°C l'anti-Fc
(gamma)
à
une
concentration de 5 gamma/ml de PBS, puis une nuit à +4°C ;
-
A l'aide du tampon de saturation
(200 Pl/puits),
saturer la
plaque 2 à 3 heures à 37°C;
- Laver avec la solution de lavage
Ajouter l'IgG marquée diluée dans le tampon de saturation à
40 gamma/ml et incuber 1 heure à 37°C;
- Laver plusieurs fois.
si l'IgG est marquée à la bêta-galactosidase, ajouter 100
pl de substrat 1, puis 50 pl de carbonate de Na et lire à
405
nm.
si
l'IgG est marquée à
la péroxydase,
ajouter
100 pl
de
substrat 2, puis 50 pl d'acide sulfurique 4N et lire à 496 nm.
40

---

METHODES ANALYTIQUES

---

RECHERCHE DES ANTICORPS
ANTIVHE DANS LE SERUM

---

ETUDE DE LA REACTION IMMUNOGLOBULINE FLUORESCENTE
SUR COUPE DE FOIE DE SINGE INFECTE
1. Principe
Des coupes de foie de singe infecté expérimentalement sont
mis
en
contact
avec
les
IgG
marquées
à
la
fluorescéine
des
malades à tester.
si le virus est présent dans les coupes de foie, il se forme
une réaction antigène/anticorps que l'on visualise au microscope
à
irnrnunofluorescence.
2. Technique
La technique utilisée est l'irnrnunofluorescence directe
- A partir des biopsies de foie de singe infecté par le VHE et
montées sur cryobed, on réalise à l'aide d'un cryostat des coupes
de 5 u que l'on
dépose sur lames
-
Sécher à
l'air libre et
fixer à
l'éther pendant 5 minutes.
Ajouter 50 à
100 fI d'IgG de malades à tester, marquées à la
fluorescéine ;
Incuber 30 minutes à 37°C en chambre humide
~
-
Laver 3 ou 4 fois en PBS puis en eau distillée
- Monter en glycérine tamponnée avec une lamelle
- Observer à l'aide d'un microscope à irnrnunofluorescence.
3. Résultats
Nous avons utilisé comme source d'antigène VHE le foie du
singe Patas infecté expérimentalement prélevé chaque semaine par
biopsie à l'aiguille, après inoculation.
41

---

Les résultats ont été constamment négatifs.
sérum de singe
IFD
Avant inoculation
J7
(7 jours après inoculation)
J14
J21
J30
J37
J44
42

---

RECHERCHE
DE
L'ANTIGENE
VHE
DANS
LES
SELLES
DE
SUJETS
INFECTES

---

l
- RECHERCHE DE LIANTIGENE VHE PAR IMMUNOMICROSCOPIE
ELECTRONIQUE
1. Technique
- Des suspensions à 10 % en PBS ont été réalisées avec les selles
du singe S8 recueillies quotidiennement
- centrifuger à 5.000 tours/mn pendant 30 minutes
-
Passer sur filtre 0,22 p
-
A partir d'l ml de filtrat,
faire une ultracentrifugation à
30.000 tours/mn pendant 4 heures soit 100.000 g
(BECKMANN R50)
-
Reprendre le culot dans un volume minimum de surnageant
(50
ul environ)
- Faire une coloration négative en mettant en contact une goutte
du culot viral avec une goutte de réactif phospho-tungstique (cf
préparation en annexe)
- Déposer une goutte du mélange sur une grille et laisser sécher
- Observer au microscope électronique.
Par cette technique,
nous n'avons pas pu détecter le VHE
dans les selles que nous avons testées, ce qui nous a conduit à
améliorer cette technique de la manière suivante :
-
A deux gouttes de la suspension du culot viral,
ajouter une
quantité équivalente d'IgM de malades atteints d'hépatite E
- Mettre à l'étuve à 37°C pendant une heure
- Aj outer alors l ' anti-p commercial (monoclonal anti-IgM humaine)
dilué au l/lOOème
-
Faire une ultracentrifugation à
95.000 tours/mn
(400.000 g)
pendant 5 minutes sur BECKMANN TL 100.
-
Remettre
le
culot
en
suspension dans
un
volume
minimum de
surnageant
- Observer alors au microscope électronique.
2.
Résultats
Ils sont restés tout aussi décevants : la recherche du VHE
dans les mêmes selles que précédemment,
s'est avérée négative.
43

---

II -
RECHERCHE DU VHE PAR CULTURE CELLULAIRE
1. Culture des lignées cellulaires utilisées
Les lignées cellulaires utilisées sont :
- La lignée PLC PRF5 (Alexander) = lignée d'hépatocytes dérivée
d'un hépatocarcinome d'un sujet porteur d'antigène HBs.
- La lignée HepG2 = lignée dérivée d'un hépatoblastome humain.
Ces
cellules
se
cultivent
dans
des
boîtes
de
culture
stériles (Falcon) en plastique de 25 cm2, dans une étuve à 37°C
en atmosphère à 5 % de C02.
Le milieu de culture est
Le milieu Dulbecco MEM (GIBCO-BRL)
additionné de 10 %
de sérum de veau foetal.
2.
Inoculation des cultures cellulaires
-
Les extraits de selles supposés contenir le VHE sont passés
sur filtre
0,22 p puis dilués dans le milieu de culture sans
sérum de veau foetal.
- Déposer 0,5 ml de cet extrait sur la culture.
- Incuber 1 heure à 37°C.
- Ajouter alors 4,5 ml de milieu complet (l'inoculum est alors
au 1/10ème).
Le premier renouvellement du milieu se fait 24 heures après,
puis toutes les 48 heures.
3.
Lecture
La
recherche
de
l'antigène
VHE
se
fait
par
immunofluorescence
indirecte,
et
la
recherche
de
l'effet
cytopathogène par microscope électronique.
Recherche de l'antigène VHE par immunofluorescence indirecte.
Mettre
sur
les
cellules
inoculées
50
à
100
pl
de
sérum
contenant des immunoglobulines antiVHE, et dilué en PBS (dilution
minimale au 1/20ème)
- Laisser incuber à 37 OC en chambre humide une à deux heures.
44

---

-
Laver en tampon PBS trois fois.
Ajouter 50
à
100pl d'antiglobulines humaines marquées à
la
fluorescéine
(antilgG,
M humaines Pasteur ou Mérieux)
diluées
en PBS.
-
Faire une contre coloration au Bleu Evans (5mn).
-
Laver en eau distillée et monter en glycérine tamponnée avec
une lamelle.
Recherche de l'effet cytopathogène
Elle
se
fait
directement
au
microscope
électronique
au
grossissement 40.000.
4. Résultats
En microscopie électronique aucun effet
cytopathogène n'a
été observé de même la culture sIest avérée négative.
Mais il
faut souligner à ce propos que jusqu'à ce jour aucune technique
de culture du VHE n'a pu être mise au point malgré des recherches
laborieuses menées par plusieurs équipes.
45

---

III - MISE AU POINT D'UNE METHODE OPTIMALE DE DETECTION
DE L'ANTIGENE VHE DANS LES SELLES PAR TECHNIQUES
IMMUNOENZYMATIQUES.
1. PRINCIPE GENERAL
1
1
1
1
1
1
,..........:---=::...:...:..:..--,-:....::..---=:..=.:......---------=---------,1
~~U.!i
.
~.-
.~ 1
-------1
1
1
1
Support
Selle
IConjugué :
Chromogenèse
1
recouvert
à tester
IIgG humaine
1
d'IgM
Imarquée à la
1
antiVHE
Ibéta-galactosidase
1
46

---

2. TECHNIQUES
1) Technique par immunocapture des IgM
a) Matériel et réactifs :
- Plaques de microtitration,
- Tampon PBS
- Solution d'anti-p commercial,
- Sérum total de malades en phase aiguë d'hépatite E,
- R1 = solution de lavage (PBS, Tween 20 : 1 %0),
- R2 = IgG humaine de sujets présumés convalescents d'hépatite
E,marquée à la péroxydase,
R3 = milieu réactionnel de l'enzyme
comprimé d'OPD tampon
citrate + H202,
- R4 = solution d'arrêt (H2S044N).
b) Méthode
Premier jour
- Sensibiliser les plaques avec 100 pl/puits de solution d'anti-
u à 5 gamma/ml de PBS. Placer les plaques 1 heure à 37°C puis une
nuit à +4°C.
-
Laver alors 3 fois les plaques avec la solution R1.
Ajouter
100 pl de sérums de sujets infectés dilués au 1/100e et incuber
1 heure à 37°C.
Deuxième jour
saturer les plaques avec une solution de bovalbumine à 1/1000
pendant 2 heures à 37°C;
- Préparer parallèlement les extraits de selles à tester et des
selles
témoins
de
sujets
sains
ne
comportant
aucun
agent
infectieux (au moins 5)
-
Pour
celà,
faire
une
suspension
de
selles
à
10
% en
PBS,
centrifuger
à
5.000
tours/mn
pendant
30
minutes.
Passer
le
surnageant sur filtre 0,22 p et recueillir le filtrat;
- Laver 3 fois les plaques
47

---

- Ajouter les extraits de selles à tester et les selles témoins
en raison de 100 pl/puits
- Mettre les plaques 1 heure à 37°C puis une nuit à +4°C.
Troisième jour
- Laver les plaques 3 fois ;
Mettre 100 pl de R2 à une concentration optimale qui est de 2
gamma/ml et incuber 1 heure à 37°C
- Laver plusieurs fois les plaques (au moins 3 fois) et ajouter
100 pl de réactif R3 à préparer extemporanèment
- Laisser agir 5 minutes à l'obscurité;
Arrêter la réaction avec 50 pl de R4/puits.
Lire à 496 nm sur
lecteur plaque ELISA.
L' intensi té
de
la coloration
lue
en densité optique,
est
proportionnelle
à
la
quantité
de
conjugué
lié,
et
donc
éventuellement à
la concentration d'antigène VHE présent dans
les échantillons de selles.
Les résultats sont exprimés en PIN,
c'est-à-dire
DO de l'échantillon
moyenne des DO des témoins négatifs
Le résultat est considéré comme positif lorsque PIN > 2,1 soit
une DO supérieure à 2 a des DO témoins.
c)
-
Résultats
Nous avons testé des selles de sujets
infectés par VHE
lors d'une épidémie de Constantine,
pendant la phase aiguë de
la maladie dans deux systèmes :
-
Un système témoin constitué de sérum de sujet sain n'ayant
jamais
été
en
contact
avec
le
VHE
et
les
IgG marquées
à
la
péroxydase du même sujet.
- Un système spécifique comprenant un pool de sérums de sujets
infectés par le VHE pendant la phase aiguë de la maladie, et les
IgG marquées à la péroxydase de ces mêmes sujets pendant la phase
de convalescence.
48

---

Les résultats sont les suivants
Selles testées
Système témoin
système spécifique 1
PIN
PIN
1
1
Tl
1,2
1,3
T2
1,3
1,7
T3
0,80
0,60
T4
1,13
1,02
T5
0,90
1,1
Cyt 22
2,20*
3,18*
Cyt 23
1,90
1,66
Cyt 34
2,7*
5,3*
Cyt 3
4,2*
7,6*
Cyt 9
2,1*
2,5*
Cyt 11
3,2*
3,8*
Cyt 12
0,8
0,90
Cyt 17 017
1,21
1,18
Cyt 28 002
1,61
2,01
T
selles témoins ne contenant aucun agent infectieux
Cyt
= selles de malades de Constantine testées
Tableau n° 5
Comme le montre le tableau précédent, ces résultats ne sont
pas
concluants
puisqu'on
observe
100
%
de
réactions
non
spécifiques.
Pour obtenir des réactions plus spécifiques, nous avons mis
en jeu la technique par séparation des IgM qui elle, utilise des
IgM et des IgG purifiées.
49

---

2. Technique par fixation directe des IgM sur support
a) Matériel et réactifs
Quatre systèmes ont été réalisés
-
Un système témoin humain TH qui consiste à
sensibiliser les
plaques à microtitration avec de l'IgM fractionnée de sujet sain
et révéler avec l'IgG marquée du même sujet.
-
Un système témoin singe TS
qui
consiste à
sensibiliser
les
plaques avec l'IgM du singe S8 avant inoculation et révéler avec
l'IgG marquée du même singe avant inoculation.
- Un système spécifique humain SpH qui consiste à sensibiliser
les plaques avec l'IgM de sujet atteint d'hépatite E pendant la
phase aiguë et révéler avec l'IgG marquée du même sujet pendant
la phase de convalescence.
- Un système spécifique singe Sp qui consiste à sensibiliser les
plaques
avec
l'IgM
du
singe
S8
pendant
la
montée
des
transaminases et révéler avec l'IgG marquée du même singe après
retour à la normale des transaminases.
Les
IgG
utilisées
ont
été
marquées
avec
la
bêta-
galactosidase et la péroxydase, et les substrats révélateurs de
ces enzymes sont respectivement
-
le mélange: ONPG 4 mg/ml;
PM2
; bêta-mercapto~thanol 0,1 M
7 pl/ml PM2
;
- l'OPD + tampon citrate + H202.
50

---

b) Méthode
Les plaques sensibilisées sont placées 1 heure à 37°C, puis
une nuit à +4°C.
-
Laver les plaques avec le liquide de lavage PBS + Tween 20
à 1/1000.
- Saturer alors les plaques avec 200 ul de liquide de saturation
(BSA 0,5/1000, Tween 20 0,5/1000, PBS 100 ml)
- Placer les plaques à l'étuve à 37°C pendant 2 heures
Laver les plaques 3 fois et déposer les extraits de selles à
tester à raison de 100 pl/puits,
laisser une heure à 37°C puis
une nuit à +4°C ;
- Laver les plaques 3 fois
;
Ajouter l'IgG marquée diluée dans le liquide de saturation à
la concentration de 1 gamma/ml
- Laver les plaques au moins
3 fois
- Ajouter les substrats spécifiques (100 pl/puib)
-
Bloquer les réactions soit avec du carbonate 1,43 M si l'IgG
est marquée à la bêta-galactosidase soit avec l'acide sulfurique
4N si l'IgG est marquée avec la péroxydase.
c)
-
Résultats
51

---

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE DANS LE SYSTEME TH/SpH
AVEC DES IgG
MARQUEES A LA PEROXYDASE
Selles testées
système témoin TH
système spécifique SpH
PIN
PIN
Tl
1,30
1,00
T2
1
1,01
T3
0,91
1,01
T4
1,08
1,21
T5
0,75
0,35
T6
1,10
0,50
T7
1,10
0,90
T8
1,20
0,60
T9
1,00
0,90
Cyt 1
2,62*
3,18*
Cyt 2
1,12
1,04
Cyt 4
1,84
0,83
Cyt 7
1,30
0,36
Cyt 8
1,43
0,66
Cyt 9
0,65
0,20
Cyt 10
2,20*
0,84
Cyt Il
0,80
3,72*
Cyt 12
1,30
0,20
Cyt 13
0,34
0,56
Cyt 14
2,30*
1,81
Cyt 15
1,53
0,45
Cyt 16
1,65
2,54*
Cyt 17
1,34
1,45
Cyt 18
2,35*
2,18*
Cyt 19
1,84
1,45
Cyt 20
1,46
3,72*
Cyt 21
1,28
0,72
Cyt 22
0,80
0,63
Cyt 23
1,57
0,74
Cyt 24
7,26*
2,45*
Cyt 25
3,11*
5,27*
Cyt 27
1,23
0,81
Cyt 28
2,11*
0,92
Cyt 34
1,67
5,81*
Cyt 35
1,60
0,47
Cyt 36
4,07*
7,08*
Cyt 37
5,01*
10,7*
Tableau n°
6
T
= selles de sujets sains
Cyt
= selles de malades de Constantine
52

---

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE TESTEES DANS LES SYSTEMES
TH/SpH AVEC DES IgG MARQUEES A LA BETA-GALACTOSIDASE
Selles testées
Système témoin TH
Système spécifique SpH
PIN
PIN
Tl
1,30
1,00
T2
1
1,01
T3
0,91
1,01
T4
1,08
1,21
T5
0,75
0,35
T6
1,10
0,50
T7
1,10
0,90
T8
1,20
0,60
T9
1,00
0,90
Cyt 1
2,62 *
3,18*
Cyt 2
1,12
1,04
Cyt 4
1,84
0,83
Cyt 7
1,30
0,36
Cyt 8
1,43
0,66
Cyt 9
0,65
0,20
Cyt 10
2,20*
0,84
Cyt Il
0,80
3,72*
cyt 12
1,30
0,20
Cyt 13
0,34
0,56
Cyt 14
2,30*
1,81
Cyt 15
l,53
0,45
Cyt 16
1,65
2,54*
Cyt 17
1,34
1,45
Cyt 18
2,35*
2,18*
Cyt 19
1,84
1,45
Cyt 20
1,46
3,72*
Cyt 21
1,28
0,72
Cyt 22
0,80
0,63
Cyt 23
l,57
0,74
Cyt 24
7,26*
2,45*
Cyt 25
3,11*
5,27*
Cyt 27
1,23
0,81
Cyt 28
2,11*
0,92
Cyt 34
1,67
5,81*
Cyt 35
1,60
0,47
Cyt 36
4,07*
7,08*
Cyt 37
5,01*
10,7*
Tableau n°
7
T
= sellés de sujets sains
Cyt
selles de malades de Constantine
53

---

SELLES DE CONSTANTINE DANS LE SYSTEME TS/SpS AVEC DES IgG
MARQUEES A LA PEROXYDASE
1
Selles testées
Système témoin TS
Système spécifique spsi
1
PIN
PIN
1
1
1
1
Tl
1,80
1,02
1
1
T2
1,20
1,20
1
T3
l,50
1
0,53
)
T4
1
1,02
0,95
1
T5
1,60
1
1,30
1
Cyt
1
1
2,60
4,10*
1
Cyt 10
1
1,10
0,90
1
1
Cyt 14
1,60
1,45
1
Cyt 15
1,35
1,90
1
1
1
Cyt 18
2,32*
2,91*
1
Cyt 20
2,60*
3,10*
1
1
1
Cyt 24
2,08
5,2*
1
1
Cyt 25
2,19*
5,60*
1
Cyt 26
3,10*
1
4,9*
1
1
Cyt 28
1,60
1,20
1
Cyt 35
5,5*
1
11,9*
1
Cyt 36
2,97*
1
6,03*
1
1
Cyt 37
4,60*
10,70*
1
Cyt 38
3,60*
1
4,01*
1
Tableau n° 8
T
selles témoins de sujets sains
Cyt = selles de malades de Constantine
54

---

SELLES DE MALADES DE CONSTANTINE TESTEES DANS LE SYSTEME TSISpS
AVEC DES IgG MARQUEES A LA BETA-GALACTOSIDASE
Iselles testées
système témoin TS
système spécifique SpS
1
1
1
PIN
PIN
1
1
1
Tl
1,20
1
0,80
1
T2
0,80
0,60
1
1
T3
1
0,90
1,00
T4
1,00
1,18
1
1
1
T5
1
0,72
0,80
1
Cyt 1
1,90
1
4,20*
Cyt 10
1
1,12
0,80
Cyt 14
1,30
1,75
1
Cyt 15
1,10
1,20
1
Cyt 18
-1
1,23
2,70*
Cyt 20
1,35
2,80*
1
Cyt 24
1
1,80
5,6*
Cyt 25
2,07*
1
6,10*
Cyt 26
1
2,39*
4,7*
Cyt 28
1,20
0,90
1
Cyt 35
1
3,14*
12,6*
Cyt 36
2
1
7,05*
Cyt 37
1
3,11*
11,2*
Cyt 38
2,88*
1
3,9
Tableau n°
9
T
=
selles de sujets sains
Cyt =
selles de malades de Constantine
55

---

Ces résultats montrent :
que
le
marquage
à
la
péroxydase
donne
des
réactions
non
spécifiques dans 95 % des cas contre 64 % pour le marquage à la
bêta-galactosidase pour lequel nous avons opté.
- de même 60 % des réactions positives sont non spécifiques dans
le système humain contre 40 % dans le système singe. Nous avons
donc abandonné le système humain au profit du système singe que
nous avons cherché à améliorer.
Pour celà le lait écrémé à 4 % connu comme agent de blocage
non
spécifique
en
Westernblot
et
qui
en
Elisa
permet
l'utilisation
de
certains
systèmes
où
les
réactions
non
spécifiques
sont
fréquentes
(au
risque
de
diminuer
la
sensibilité)
a été mis en jeu comme agent de saturation et de
dilution à la.place de la BSA.
Comme
en
atteste
le
tableau
suivant
aucune
amélioration
sensible n'a été obtenue, seul le bruit de fond est diminué sans
que la positivité des réactions ne soit affectée.
56

---

SELLES
DE
CONSTANTINE
TESTEES
DANS
LE
SYSTEME
TSISpS
AVEC
COMME LIQUIDE DE SATURATION LE LAIT ECREME A 4 %
Selles testées
système Témoin TS
système spécifique spsi
PIN
PIN
1
1
Tl
0,80
0,60
T2
0,45
0,40
T3
0,60
0,80
T4
0,80
1,50
T5
0,70
0,60
Cyt 1
1,05
5*
Cyt 10
0,90
0,50
Cyt 14
0,80
0,73
Cyt 15
0,63
0,58
Cyt 18
0,79
3,11
Cyt 20
0,90
4,5
Cyt 24
1,10
5,3
Cyt 25
1,81
6,90
Cyt 26
2,15*
4,93*
Cyt 28
0,80
0,79
Cyt 35
2,60*
11,5*
Cyt 36
1,03
6,8*
Cyt 37
2,6*
10,7*
Cyt 38
2,10*
4*
Tableau n° 10
T
selles témoins de sujets sains
Cyt = selles de malaqes de Constantine
57

---

c'est dans ce contexte qu'une étude menée par l'équipe du
Pr J.
PILLOT
(61)
devait nous orienter vers la recherche d'une
protéine non spécifique appelée "Protéine Fv".
En effet,
cette
étude met en évidence l'existence de cette protéine dans
les
selles d'hépatite non-A non-B. Cette protéine est capable de se
combiner
de
manière
non
immune
avec
la
maj ori té
des
immunoglobulines
humaines
quelque
soit
leur
isotype
ou
leur
allotype.
Ce
facteur
est
également
présent
chez
35
% des
hépatites B ainsi que chez 6,7 % des témoins (fréquence attendue
des porteurs sains).
La
protéine
est
spécifique
du
fragment
Fab
et
plus
précisément du fragment Fv et du domaine VH.
La
molécule
est
une
sialoglycoprotéine
acide
(pHi
=
4)
hydrophobe, trypsine et chymotrypsine résistante. Al' état natif,
son poids moléculaire apparent
est de
175
Kda
en
SDS-PAGE
préparative,
il
est de 85
Kda,
ce
qui
suggère une
structure
dimérique. L'origine hépatique a été démontrée par sa détection
dans
la
bile
et
le
foie
de
patients
ayant
subi
une
transplantation hépatique pour hépatite non-A non-B fulminante.
Les meilleures conditions permettant de caractériser cette
protéine Fv mettent en jeu une IgM monoclonale préparée à partir
du sérum d'un sujet atteint de la maladie de Waldenstrom et une
IgG d'enfant de 6 mois à 1 an marquée à la péroxydase.
Par cette technique,
nous avons recherché la protéine Fv
dans les selles du singe infecté expérimentalement par le VHE;
et dans les différentes selles de Constantine positives.
C'est ainsi que nous avons pu détecter chez
le singe ce
facteur qui apparaît avant la montée des transaminases comme le
montrent les f igures suivantes; et qui serait un marqueur précoce
des hépatites.
58

---

Evolution de la protéine Fv chez le singe 58
300 1
1
10
-e-
SGar
-+-
Prot Fv
8
200
1
X
?---i
\\
1 6
§
t
IV
\\
~ >~
en
~
l!)
0
1-<
Cf'.J
~
4
1
1/ \\
~
1
100
2
•
' .
1
. '
. ,
'
1
1
1
1
1
1
1
1
l
,
l
,
I , l
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours

---

Evolution de la protéine Fv Chez le singe S8
300 1
1
la
-e-
SGPT
~
Prot Fv
250
8
200
1
/~
1 6
;;.
0
t
1S0r
1 1\\\\
~
\\0
....
0
t
0
Cf)
'"'
~
4
1
1
1
\\\\
A
1
100
2
50
•
' , '
l '
"
'
a
l
,
l
,
,
,
l
,
,
,
l
,
,
1
1
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours
f~t7-,--'- -

---

Ql,lant
à
la
recherche
de
cette protéine dans
les
selles de
Constantine, les résultats obtenus sont les suivants
RECHERCHE DE LA PROTEINE Fv DANS LES SELLES POSITIVES DE
MALADES DE CONSTANTINE
1
Selles testées 1 système témoin
système spécifique Protéine
Ts
sps
Fv
PIN
PIN
PIN
Tl
1,20
0,80
1,01
T2
0,80
0,60
1,20
T3
0,90
1,00
0,90
T4
1,00
1,18
0,70
T5
0,72
0,80
0,95
Cyt
1,90
4,20*
1,6
Cyt 18
1,23
2,70*
1,08
Cyt 20
1,35
2,80*
1,3
Cyt 24
1,80
5,6*
2,8*
Cyt 25
2,07*
6,10*
2,60*
Cyt 26
2,39*
4,7*
2,85*
Cyt 35
3,14*
12,6*
4,11*
Cyt 36
2
7,05*
3,8*
Cyt 37
3,11*
11,2*
4,7*
Cyt 38
2,88*
3,9*
3,01*
Tableau n° 11
T
=
selles témoins de sujets sains
Cyt = selles de malades de Constantine
61

---

D'après
ces
résultats,
ces
réactions
non
spécifiques
semblent
liées
à
l'existence
de
cette
protéine
Fv
qui
est
présente dans 70 % des selles positives.
Nous avons alors émis
l'hypothèse que le passage des selles sur immunoadsorbant d'IgM
monoclonale devrait donc éliminer ces réactions non spécifiques.
Préparation de L'immunoadsorbant
L'immunoadsorption sur Sépharose
activé a été effectuée selon
la méthode de March et Cuatrecasas modifiée par l'introduction
de Bromure de cyanogène (BrCn) en solution dans l'acétronitrile.
Pour 50 mg de protéines à fixer,
on utilise 10 ml de Sépharose
4B (Pharmacia) .A un volume de Sépharose 4B tassé par décantation,
on ajoute un volume d'eau distillée et 2 volumes de carbonate de
sodium 2M.
Dans cette suspension,
on introduit 1/20e de volume
de BrCn dissout dans l'acétonitrile, à raison de 2 g de BrCn pour
1 ml d'acétonitrile.
Cette opération est effectuée rapidement,
sous
hotte
aspirante
et
avec
agitation
pendant
2
minutes.
Ensuite, le Sépharose est rapidement lavé sur un verre fritté n°
3
raccordé
à
une
fiole
à
vide,
avec
un
grand
excès
d'eau
distillée froide
(4°C). On lave ensuite en tampon carbonate 0,1
M pH9 à +4°C. Après ce dernier lavage, le Sépharose est dispersé
toujours à +4°C, dans le tampon carbonate
(10 ml pour 10 ml de
Sépharose). Les protéines dialysées en tampon carbonate 0,1 M pH
9 sont ajoutées, goutte à goutte en agitant, puis laissées sous
agitation
douce
à
+4°C
pendant
18
heures.
Le
Sépharose
est
ensuite refiltré sur verre fritté,
le filtrat est recueilli en
vue
de
calculer
le
rendement
de
fixation
de
la
protéine
au
Sépharose activé,
par absorption à
280
nm.
On
traite ensuite
l'immunoadsorbant par l'éthanolaminé 1 M pH 9 pendant 2 h à la
température du laboratoire,
en agitation douce afin de saturer
les sites actifs lib~es. Puis, l'immunoadsorbant est traité par
l'agent d'élution qui sera utilisé ultérieurement pour extraire
la
substance
fixée
chlorure de magnésium
5 M ou
un
tampon
glycine pH 2,8 ou encore un mélange d'acide acétique dioxane pH
2,9 (acide acétique 0,2 M + 10 % de dioxane). Après lavage en eau
physiologique,
l'immunoadsorbant est prêt à l'emploi.
62

---

Technique
Les selles à tester sont adsorbées par addition de 2 volumes
d'extraits de selles à un volume d'immunoadsorbant.
Le mélange
est maintenu sous agitation douce une nuit à +4°C.
Centrifuger
alors 10 min à 2.000 tlmn et recueillir les surnageants qui sont
à nouveau testés par la technique décrite précédemment.
selles testées
système témoin Ts
système spécifique spsl
PIN
PIN
1
1
Tl
0,88
0,80
1
T2
1,04
0,92
1
T3
1,16
1
1
T4
1,12
1,44
1
Cyt 26
0,8
0,8
1
Cyt 35
1,16
14,56*
1
Cyt 37
1,24
3*
1
Cyt 38
0,84
1,32
1
Tableau n°
12
T
selles témoins de sujets sains
Cyt
selles de malades de Constantine
63

---

Comme le montre le tableau précédent, pour les quatre selles
étudiées,
deux conservent leur activité en système spécifique
tandis que les deux autres la perdent. Ce qui est en faveur pour
ces dernières d'une interférence de la protéine Fv.
Ces
résultats semblent donc confirmer notre hypothèse et
nous
ont
conduit
à
la
recherche
de
l'antigène
VHE
et
de
la
protéine Fv dans les selles du singe infecté, dans différentes
selles de sujets atteints d'hépatite épidémique à
Constantine
et
à
Bangkok
après
passage
systématique
sur
immunoadsorbant,
avant d'entreprendre cette même étude sur les selles de sujets
atteints d'hépatite aiguë à Dakar et dans sa région.
Résultats
:
1) chez le singe infecté l'antigène VHE est détectable dès
la troisième semaine après l'inoculation c'est-à-dire pendant la
période
d' incubation,
avant
la
montée
des
transaminases
(cf
courbes suivantes).
64

---

Evolution de l'AgVHE dans les selles du singe S8
300 i
1
30
-0-
SGPT
-+-
AgVHE
250
200
20
lîI
t
~
150
:r:
\\.0
o
;>
U')
00
~
100
10
50
. . . . . . '
l
,
l
,
I i i
,
1
1
l
,
l
,
1
1
1
1
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours
....•.•••""'y
t~_·

---

Evolution de l'AgVHE dans les selles du singe 58
300 1
1 30
-0-
SGOT
...... AgVHE
200
20
~
b
::c:
\\0
o
>
\\0
0.0
Cf)
~
100
10
a
. " . .
,
l
,
,
l
,
1 1 f t
,
1
)
1
l
,
l
,
,
1
1
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Jours
<rWmr'-"
~fl(.('

---

2) Résultats des selles de malades de Constantine
REEXAMEN
DES
SELLES
DE MALADES DE
CONSTANTINE APRES
PASSAGE
SUR IMMUNOADSORBANT D'IgM MONOCLONALE
1
1
selles testéeslsystème Témoin Tslsystème spécifique Protéine 1
PIN
Sps PIN
Fv
Tl
1,20
0,90
0,80
T2
0,90
0,80
0,60
T3
0,90
1
0,60
T4
1,20
1,10
0,30
T5
0,70
0,78
0,50
Cyt 1
2,05
4,30*
0,90
Cyt 10
1,12
1,00
0,80
Cyt 14
1,40
1,36
0,96
Cyt 15
1,01
1,20
0,50
Cyt 20
1,20
3,10*
0,68
Cyt 24
1,20
6,9*
0,45
Cyt 25
l,50
6,20*
0,50
Cyt 26
0,95
1,28
0,61
Cyt 28
1,12
1,00
0,72
Cyt 35
1,1
14*
0,81
Cyt 36
0,95
6,9*
0,85
Cyt 37
1,1
3,5*
0,65
Cyt 26
0,95
1,28
0,50
Tableau n°
13
T
=
selles témoins de sujets sains
Cyt
selles de malades de Constantine
67

---

3) Résultats des selles de malades de Bangkok
SELLES DE MALADES DE BANGKOK APRES PASSAGE
SUR IMMUNOADSORBANT D'IgM MONOCLONALE
1
1
1
Selles testéeslsystème Témoin Tslsystème spécifique Protéine 1
PIN
PIN
Fv
Tl
1,12
l,OS
1,03
T2
0,80
1,02
0,03
T3
1,5
0,68
0,70
T4
0,35
0,20
1,35
T5
1,83
l,6O
l,51
SR002
0,7
0,9
0,90
SR008
1,8
1,5
0,89
SR012
0,65
0,5
0,79
SR021
1,25
1,5
0,93
SR022
0,8
0,52
0,43
SR028
0,70
0,50
0,50
SR031
0,68
0,50
0,53
SR036
1,89
1,6
1,12
SR046
2,01
1,7
l,50
SR050
0,60
0,4
0,42
SR051
l,50
0,6
0,69
SR053
0,62
2,9*
0,80
SR059
0,50
0,7
0,90
SR064
0,91
3,1*
0,60
SR066
0,82
2,5
l,OS
RTA050
0,60
3,6*
l,2O
RTA056
0,60
0,60
0,56
HH153
0,50
0,49
0,46
SR019
0,6
2,7*
0,78
Tableau n°
14
Tl,
T2
. . .
selles témoins de sujets sains
SR
-
RTA -
HH
selles de malades de Bangkok
68

---

Dès
lors,
nous
avons
alors
entrepris
un
contrôle
de
la
spécificité du système de détection que nous avons mis au point.
Pour ce faire :
- 18 selles de malades atteints d'hépatite aiguë à Dakar ont été
testées dans notre système
de même que 18 selles de sujets
témoins ne souffrant d'aucune atteinte hépatique évidente.
- des réactions d'inhibition et des réactions témoins utilisant
différents anticorps d'une part, et les selles positives d'autre
part, ont été réalisées.
69

---

CONTROLE DE LA SPECIFICITE DE LA REACTION
1.)
Par recherche de l'antigène VHE chez les différents
sujets atteints d'hépatite aiguë à Dakar.
Selles test'ées
Nombre
1 Protéine
F
Nombre de positifl
en AgVHE
1
1
Selles de sujets
4
2
1
1
atteints d'hépa-
tite A
Selles de sujets
9
4
0
atteints d'hépa-
tite B
Selles de sujets
3
1
0
atteints d'hépa-
tite C
Selles de sujets
1
0
0
atteints d'hépa-
tite à CMV
selles de sujetsl
1
0
0
atteints d'hépa-I
tite à EBV
Selles de sujetsl
18
5
0
témoins dakaroisl
ne souffrant d'
aucune atteinte
hépatique évi-
dente.
Tableau n°
15
70

---

2.)
Réactions d'inhibition
a)
principe
Les selles adsorbées après passage sur immunoadsorbant d'une
IgM monoclonale
sont
incubées
avec
des
sérums
contenant
des
anticorps antiVHE.
Les antigènes VHE sont alors supposés se complexer et ne
devraient
plus
réagir ultérieurement,
lorsqu'ils
sont mis
en
réaction dans le système de détection précédemment défini.
b)
Technique
On réalise différentes dilutions
(1/10,
1/20,
1/40,
1/80,
1/100)
à
partir d'un mélange d'IgM et d'IgG provenant du singe
S8 infecté par le VHE, à 2,5 mg/ml pour chaque immunoglobuline.
A 100 pl de cette solution d'anticorps spécifiques,
on
ajoute 100 fI de selles antérieurement reconnues comme contenant
l'antigène associé à l'infection par le VHE.
Laisser en contact 2 heures à 37°C puis une nuit à +4°C.
Passer à nouveau les selles dans le système spécifique.
c)
résultats
71

---

Résultats
lavant inhibition 1après inhibition
1
Iselles testées Ac anti-VHEI
PIN
PIN
1
Pl
1
1/10
6,9
0,90
1
1/20
0,89
1/40
0,93
1
1
1/80
1,37
1/100
l,50
1
1
1
P2
1/10
6,20
1,18
1/20
1,12
1
1/40
1,10
1
1
1/80
1,25
1/100
1,35
1
P3
1/10
6,9
0,60
1
1
1/20
0,90
1/40
0,80
1
1
1/80
1,01
1/100
1,63
P4
1/10
3,10
1,10
1/20
1,25
1/40
1,80
1/80
2,10*
1/100
2,30*
P5
1/10
3,50
0,60
1/20
0,80
1/40
0,80
1/80
0,83
1/100
0,90
Tableau n°
16
Pl -
P2
.•• =
selles positives dans le système de détection
spécifique.
72

---

Pour savoir si l'inhibition était obtenue avec les IgM ou
avec les IgG,
l'une des selles positives
(Pl)
a été incubée et
avec
les
IgM,
et
avec
les
IgG du
singe
infecté
à
2,5
mg/ml
diluées au 1/10, 1/20, 1/40, 1/100, 1/200e.
Les résultats obtenus sont les suivants
Iselle positive
Selle positive
Selle positive
1
1dans le système de
incubée avec les
incubée avec les
1
1 détection
PIN
IgM antiVHE (2,5
IgG antiVHE
(2,5
1
mg/ml) diluées
mg/ml)
diluées
1
dilutions
PIN
dilutions
PIN 1
1
Pl
6,9
1/10
0,375
1/10
1,75 1
1/20
0,375
1/20
0,3751
1/40
0,31
1/40
0,9381
1/80
0,25
1/80
0,19
1
1/100
1,00
1/100
0,81
1
1/200
1,00
1/200
0,81
1
Tableau n° 17
Ces résultats montrent bien que la
réaction d'inhibition
est obtenue avec les deux types d'anticorps et que le test de
dépistage semble spécifique.
Pour confirmer cette spécificité des réactions témoins ont
été réalisées.
73

---

3.)
Réactions témoins
Pour
réaliser
ces
réactions
témoins
l'une
des
selles
positives est incubée avec des sérums de malades dilués au 1110e,
au 1/50e,
et au 11100e et contenant soit des IgM antiHAV,
soit
des IgM antiHbc,
soit des IgM antiCMV,
soit des IgM antiVCA et
avec le sérum du malade contenant des IgM antiHAV,
et dont les
selles s'étaient avérées positives dans notre système et que nous
avons appelé sérum douteux.
Résultats
serum conte-
Sérum conte-
Sérum contenant
Sérum contenant
Sérum douteux
nant des IgM
nant des IgM
des IgM anti VCA
des 1gM ant i CMV
anti HAV
ant i Hbc
dilutions PIN
di luti ons
PIN
di lutions
PIN
DILUTIONS
PIN
di lutions
PIN
selle posi-
tive P/N=6,9
1/10
5,31
1/10
5,00
1/10
5,62
1/10
5,75
1/10
D,50
1/50
5,31
1/50
5,37
1/50
5,56
1/50
5,56
1/50
0,93
1/100
6,062
1/100
5,37
1/100
5,18
1/100
7,87
1/100
1,50
Ces réactions témoins prouvent donc que ce test est bien
spécifique
et
la
réaction d'inhibition obtenue à
partir du
sérum "douteux" nous permet de conclure que ce sérum contient
et des anticorps antiHAV et des anticorps antiVHE.
74

---

DEUXIEME PARTIE:
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
DE l'HEPATITE C :
ETUDE CRITIQUE DES TESTS
DE DETECTION
DES ANTICORPS ANTIHCVg

---

Depuis que la recherche systématique de l'antigène HBs chez
les donneurs de sang a été rendue obligatoire dans de nombreux
pays, l'incidence des hépatites post-transfusionnelles a diminué
de manière très sensible mais beaucoup moins qu'on ne pouvait
l'espérer.
En
effet,
i l
a
été montré que
l'hépatite
C représente
à
l'heure actuelle 50 à 90 % des hépatites post-transfusionnelles
(81) et constitue pour certains pays un véritable fléau en santé
publique.
Des tests de détection des anticorps anti VHC dans le sérum
ou dans
le
plasma
ont
été mis
au
point
permettant
certes
de
réduire cette redoutable complication des transfusions sanguines.
Ces
anticorps
reconnaissent
une
protéine
de
la
région
non
structurale du VHC probablement
impliquée dans
la
réplication
virale. L'avantage de ce point est qu'il existerait une relation
entre le taux de l'anticorps anti-HCV et la réplication virale
et donc l'infectiosité du sérum.
Des études expérimentales sur le chimpanzé menées par Weiner
et al.
(85)
ont permis de le démontrer.
Mais ces tests posent des problèmes de
spécificité comme
le prouvent les études suivantes.
75

---

AI METHODES DE DETECTION DES ANTICORPS ANTIHCV
A l'heure actuelle, pour la recherche des anticorps antiHCV
nous disposons de techniques immunoenzymatiques :
- tests de screening en Elisa
(Ortho Elisa et Abbott ElA).
-
tests
de
confirmation
par
immunoblot
(Chiron
Riba,
Abbott
Inhibition)
(53).
Tous ces tests présentent des points communs et quelques
points différentiels.
1)
-
POINTS COMMUNS
a)
-
principe
Tous ces tests ont le même principe à savoir
un
support
réactionnel
revêtu
d'un
antigène
recombinant
spécifique de HCV est mis en contact avec le sérum ou le plasma
à tester.
si l'anticorps antiHCV est présent dans le prélèvement, des
complexes
antigène-anticorps
vont
se
former
à
la
surface
du
support réactionnel après incubation.
Dans le cas contraire, aucun complexe ne se fixera,
et les
protéines plasmatiques ou sériques libres seront évacuées lors
du lavage.
Une immunoglobuline anti
humaine marquée à
la peroxydase
est alors
ajoutée
et peut se
fixer
aux anticorps
spécifiques
déjà couplés aux antigènes ,viraux.
si ces complexes immuns sont absents, le conjugué libre est
évacué au cours du lavage.
Enfin,
un système de détection enzymatique spécifique est
ajouté entraînant l'apparition d'une coloration révélatrice de
la présence d'anticorps antiHCV.
La réaction est stoppée soit grâce à un réactif bloquant
(H2S04) , soit
par
lavage
et
l ' intensi té
de
la
coloration
est
proportionnelle à la quantité de conjugué lié et par delà à la
concentration d'anticorps anti-HCV présents dans le prélèvement.
b)
-
l'antigène
76

---

Il
s'agit d'un antigène recombinant
spécifique de HCV et
préparé de la manière suivante :
Concentré d'Antigènes HCV
ARN HCV extrait
ADNC synthétisé
Insertion au phage
~gt
11
9
Transfection de
Transfection
E.
Coli
levure
( 5QZ><SZ>e;z;>J
Isolement d'un clone réagissant
avec le sérum d'un chimpanzé
contenant le HCV
...~ 1
bJ-{
1
0===lTFr~
Protéine C-100-3
Protéine 5-1-1
~
/
utilisées comme source d'Ag
recombinant spécifique de HCV.
77

---

2)
-
POINTS DIFFERENTIELS
a)
-
le support
Il est constitué
- soit de micropuits revêtus de l'antigène pour le kit Ortho,
-
soit de billes revêtues du même antigène pour le kit Abbott
ou encore
- de membrane de nitrocellulose pour les tests de confirmation.
b)
-
les immunoglobulines marquées
Pour les tests screening, l'immunoglobuline marquée est une
immunoglobuline monoclonale de souris antihumaine dans le système
ortho,
alors qu'il s'agit d'une immunoglobuline polyclonale de
lapin antihumaine dans le test Abbott.
Quant
aux
tests
de
confirmation,
les
immunoglobulines
marquées utilisées sont des immunoglobulines de chèvre anti IgG
humaine.
78

---

BI - ETUDE DE LA SPECIFICITE DE CES TESTS
1)
Méthode
Pour
étudier
la
spécificité
de
ces
tests
une
étude
rétrospective a
été réalisée sur différents sérums présentant
une réaction positive :
en IgM anti HAV
=
10
en latex waaler rose = 10
en facteur antinucléaire, antiDNA
= 20
et sur des sérums de sujets atteints d'hépatites auto-
immunes = 13
- ou de cirrhoses alcooliques = 142
Chacun
de
ces
sérums
a
été
étudié
dans
les
4
tests
précédemment cités.
2)
Résultats
Les
résultats
obtenus ont
été
consignés
dans
le
tableau
suivant :
79

---

1 Sérums
Nombre
Ortho 1
Chiron
Abbott Abbott
testé
Elisal
Riba
ElA
inhibition
1
1
1
lanti HAV IgM+
la
3
1
3
2
1
1
1
lanti Hbc IgM+
9
a
a
a
a
/
1
1
1 latex
Waaler
la
4
2
2
1
1
IRose +
1
1
1 Facteur
anti-
20
la
4
5
1
1
1 nucléaire
1
lantiDNA +
1
1
1 Hépatites
13
7
4
7
6
1
1 auto-immunes
1
1
/cirrhoses
142
42
22
38
11
1
1 alcooliques
1
1
Tableau n°
18
Que faut-il conclure de cette étude ?
1) - les sérums trouvés positifs en Elisa ne sont pas tous
confirmés par les tests proposés et les discordances observées
(surtout pour les sérums faiblement positifs)
ne permettent pas
de rendre un résultat sûr.
2)
l ' hétérogénéi té
de
ces
résultats
montre
que
llutilisation des tests de confirmation est nécessaire et sans
doute pas suffisante pour établir le diagnostic d'une infection
par le virus c, notamment dans les situations pathologiques, où
aucun facteur de risque n1est rapporté.
80

---

TROISIEME PARTIE:
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE
DES HEPATITES
NON-A NON-B A DAKAR ET
DANS SA- REGION

---

~S~..1l
A -
RECHERCHE DE L'HEPATITE E DANS UNE POPULATION
DE SUJETS ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE A DAKAR
1)
Méthode
Cette étude porte sur
30 cas de
sujets adultes
atteints
d'hépatite aiguë parfaitement définie sur le plan clinique. Sur
le plan biologique, le dosage des transaminases sériques (SGOT-
SGPT) ,
de
la
bilirubine
(directe,
indirecte
et
totale),
des
phosphatases alcalines et des gammaGT ont permis de confirmer le
diagnostic d'hépatite.
Le retour à la normale des transaminases 3 mois après,
et
un
contrôle
clinique,
ont
permis
de
confirmer
le
diagnostic
d'hépatite aiguë.
A partir des sérums de ces malades,
différents marqueurs
viraux ont été recherchés,
à
savoir :
-
les IgM anti-HAV,
-
l'antigène HBs et les IgM anti-HBc,
-
les IgM anti-CMV,
-
les IgM anti-vCA,
-
les marqueurs de la fièvre jaune.
2)
Résultats
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau suivant:
82

---

RECHERCHE DES MARQUEURS VIRAUX DANS LES SERUMS DE SUJETS
ATTEINTS D'HEPATITE AlGUE
Marqueurs d'hépatite
Nombre de cas positifs
IgM anti-HAV
4
Antigène HBs
9
dont IgMHbc+
5
dont IgMHbc-
4
IgM anti-VCA
1
IgM anti-CMV
1
IgM anti-virus amaril
o
1
Tableau n° 19
D'après ces résultats, nous pouvons déduire que 50 % de ces
hépatites aiguës de l'adulte sont NANB.
Nous avons alors entrepris la recherche des anticorps anti
HCV dans
les sérums correspondants.
Pour ce
faire,
les sérums
d'hépatite NANB ont été testés dans les kits Abbott et dans les
kits Ortho.
Les résultats suivants ont été obtenus
Noobre
Noobre
X
Noobre
X
SérUllS NANB
Positifs Ortho
Positivité Ortho Positifs Abbott Positivité Abbott
15
3
20
3
20
Tableau n°
20
83

---

Ces
résultats
ont
été
confirmés
par
des
tests
de
confirmations disponibles également,
et commercialisés par les
mêmes
laboratoires que
précédemment cités.
Ces
tests montrent
que les anticorps anti-HCV sont effectivement présents dans 20%
des cas.
A partir des selles de ces sujets et des selles témoins,
nous
avons recherché
l'antigène VHE,
et les résultats obtenus
sont consignés dans le tableau suivant :
1
\\selles testées
Nombre
Nombre de positifs
en AgVHE
1
1 , - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - -
Selles de sujets
4
1
atteints d'hépatite A
Selles de sujets
9
o
atteints d'hépatite B
Selles de sujets
3
o
atteints d'hépatite C
Selles de sujets
1
o
atteints d'hépatite
à CMV
Selles de sujets
1
o
atteints d'hépatite
à EBV
Selles de sujets
12
5
atteints d'hépatite
à
sérologie négative
Selles de sujets témoins
30
1
Dakarois ne souffrant
d'aucune atteinte hép-
tique évidente
Tableau n°
21
84

---

Nous constatons que parmi les 12 sujets atteints d'hépatite
non A non B non C, 5 présentent une réaction positive en AgVHE.
En guise de contrôle ces 12 selles ont été testées à nouveau
dans
notre
système
spécifique
singe
après
passage
sur
immunoadsorbant,
et les résultats suivants ont été obtenus
RECHERCHE DE L'ANTIGENE VHE CHEZ DES SUJETS ATTEINTS
D'HEPATITE AlGUE NANB A DAKAR
Selles testées
système Ts
Système Sps
PIN
PIN
Tl
0,80
0,60
T2
1,12
0,90
T3
0,83
0,72
T4
0,79
0,81
T5
1,25
0,98
81
1,12
0,93
82
1,89
1,13
83
0,78
0,66
84
0,74
0,80
85
0,92
0,90
86
1,42
1,23
87
1,66
1,67
88
1,06
4,5*
89
1,61
7,9*
810
1,31
12,6*
811
0,91
11,9*
812
1,09
6,3*
8
=
selles de sujets atteints d'hépatite aiguë NANB à DAKAR
T
selles de sujets témoins.
Tableau n°
22
85

---

Cinq de ces
selles sont effectivement positives en AgVHE
soit un pourcentage de 41,66 % des hépatites non A non B
non C.
D'après cette étude, si aucun cas d'épidémie d'hépatite n'a
été signalé à ce jour au Sénégal, nous pouvons cependant affirmer
qu'il
existe
des
cas
sporadiques
d ' hépatite
non
A non
B qui
représentent 50 % des hépatites aiguës dans notre étude dont 17
% sont confirmés en VHE et 10% en VHC.
86

---

B -
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C
Cette étude a pour but :
- de déterminer la prévalence du portage des anticorps anti HCV
dans la population générale et chez les donneurs de sang ;
- de rechercher les facteurs de risque de portage des anticorps
antiHCV ;
- de rechercher une corrélation entre la présence des anticorps
anti HCV et des marqueurs indirects tels que les transaminases
sériques (SGOT - SGPT) dont la recherche systématique est rendue
obligatoire
dans
certains
pays,
mais
non encore
pratiquée
au
Sénégal.
-
d'évaluer le risque de transmission de l'hépatite C pour 100
unités
de
sang
transfusées
par
rapport
à
d' autres
affections
transmissibles par voie parentérale telles que la syphilis,
le
SIDA ou encore l'hépatite B.
1
-
Détermination de la prévalence du portage des
anticorps anti HCV dans la population générale.
Cette étude porte sur 950 suj ets apparemment sains, répartis
en deux groupes,
representatifs de la population sénégalaise.
Le premier groupe comprend 500 sujets de 15 à 55 ans et le
deuxieme groupe 450 sujets de 55 à 90 ans.
Ces
suj ets
sont groupés
par tranche d'âge
et
les
sérums
sont étudiés unitairement à l'aide du test Elisa screening Ortho.
Chaque
échantillon
positif
ou
douteux
est
réétudié
et
confirmé en immunoblot (Riba anti HCV Ortho) puis reclassé parmi
les sérums anti HCV positifs ou négatifs.
Les résultats montrent :
a)
une
prévalence
globale
de
portage
de
0,73
% avec
une
certaine variabilité suivant la tranche d'âge considérée
(cf.
histogramme de répartition des âges).
87

---

Prévalence
du
portage
des
anticorps
anti-HCV
dans
la population
générale suivant les classes d'âge
%
20
Lill
ELISA positif
EJ
RIBA positif
co
co
10
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-55
56-59
60-64
65-69
70-74
> 74
Age
ifll'f,~""'····
, .
~:.:.~

---

b) - qu'il n'y a pas de différence significative suivant le sexe.
Test de Fisher (p = 0,45).
HCV
Femmes
Hommes
Total
négatifs
490
4S3.
950
positifs
5
2
7
Prévalence
1,02 ~0
O,4S ~0
0,73%1
1
Tableau n°
23
2 -
Détermination de la prévalence du portage des
anticorps antiHCV chez les donneurs de sang.
L'étude porte sur 383 donneurs, bénévoles, non sélectionnés
prélevés au Centre National de Transfusion Sanguine de DAKAR.
A partir de leur sérum la recherche des anticorps antiHCV
a été effectuée.
Les
résultats
montrent
une
prévalence
du
portage
des
anticorps antiHcV de 0,5 % après confirmation.
Les donneurs sont alors divisés en 2 groupes distincts :
les porteurs de l'AgHbs et les non porteurs afin de trouver une
corrélation
entre
le
portage
de
l' AgHBs
et
la
présence
des
anticorps anti HCV.
Résultats
AgHBs +
AgHBs-
Nombre de cas
56
325
HCV +
1
1
89

---

Soit une prévalence du portage des anticorps anti HCV de
1,78% chez les donneurs AgHBs+ versus 0,3
% chez
les donneurs
AgHBs-. P = 0,27 non significatif.
3
-
Recherche des facteurs de risque de portage des
anticorps antiHCV.
Compte tenu des données épidémiologiques et cliniques en
ce
qui
concerne
l' hépati te
C,
3
facteurs
de
risque
ont
été
recherchés :
- l'hospitalisation,
- la transfusion,
- antécédent d'hépatite.
Les résultats obtenus sont les suivants
Facteurs de
1 Nombre
total
HCV
HCV
risque
positifs
négatifsl
1
1
Hospitalisation 1
83
1
82
1
Transfusion
5
0
5
1
1
Antécédent
1
17
2
15
d'hépatite
1
1
Sans antécédent
769
4
765
1
Tableau n°
24
90

---

D'après
ces
résultats
il
n' y
aurait
pas
de
différence
statistiquement significative entre
le
groupe
témoin
et
le
groupe
de
suj ets
ayant
déj à
été
hospitalisés
(p = 0,21),
-
le groupe témoin et les sujets ayant déjà été transfusés.
Par
contre
le
risque
est
net
chez
des
sujets
ayant
des
antécédents d'hépatite (p = 0,000016).
Nous avons également cherché à établir une relation entre
la présence des anticorps antiHCV et des marqueurs indirects des
hépatites. Pour ce faire les sujets sont divisés en 2 groupes
- ceux ayant des transaminases normales
(SGOT-SGPT < 25 UI/I)
- ceux ayant des transaminases élevées (SGOT-SGPT > 25 UI/I).
(technique Biomérieux)
Les résultats montrent
1
sujets ayant des
sujets ayant des
1
transaminases sériques
transaminases sé-I
1
normales
riques élevées
1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . - ,
IHCV
1
6
Ipositifs
1
IHCV
847
96
1 négatifs
1
1 Total
848
102
Tableau na
25
La
différence
entre
les
2
groupes
est
statistiquement
significative
(p = 8.10- 6
et on peut dire qu'il existe une
corrélation entre le portage des anticorps antiHCV et le taux
de transaminases sériques.
Dans le même sens,
il faut souligner que les deux donneurs
antiHCV+ dans notre étude, ont des transaminases élevées.
91

---

4 -
Evaluation du risque de transmission de l'hépatite C
pour 100 unités de sang transfusées par rapport a
d'autres maladies transmissibles par voie parentérale.
Chez les donneurs de sang, si le dépistage n'était pas fait,
,le risque de transmission de :
- l'hépatite B serait de 14,62 % (73 donneurs/500 sont AgHbs+)
- celui de transmettre le SIDA serait de 1,04 % (6 donneurs/500
sont HIV+)
celui
de
transmettre
la
syphilis
serait
de
0,78
%
(4
donneurs/500 sont BW +)
-
et enfin celui de transmettre l'hépatite C est de 0,50 % (2
donneurs/500 sont antiVHC +) .
92

---

DISCUSSION GENERALE

---

l
-
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE E
A -
ETUDE EXPERIMENTALE SUR L'ANIMAL
Cette étude que nous avons menée, permet de conclure
1.
Les
espèces
de
singe
retrouvées
au
Sénégal
sont
sensibles au VHE et pourront ainsi être utilisés comme source
d'antigène pour nos travaux ultérieurs.
2.
La sensibilité des singes au VHE est variable d'une
espèce à l'autre.
3.
Le temps d'incubation de la maladie varie de 10 à 30
jours. Ce délai a largement été confirmé par de nombreux auteurs
(23-26-65)
et
lion
retient
aujourd'hui
que
la
période
d'incubation varie en moyenne de 20 à 32 jours.
4.
L'élévation
des
transaminases
constitue
un
bon
marqueur biochimique de l'hépatite E.
5.
Le virus de l ' hépatite E est probablement sensible
au chloroforme voir même inactivé (30).
Cette sensibilité du virus à différents agents chimiques a
également
été
rapportée
par
d'autres
auteurs
(31-71)
et
récapitulée dans le tableau suivant
PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES ET BIOLOGIQUE DES AGENTS
RESPONSABLES DES HEPATITES NANB
Filtration 220 nm
passe
chaleur (60 0
10h)
sensible
,
Formol
(1/1000)
sensible
Chloroforme 10%
sensible
Ethanol
sensible ou non
Tableau n°
26
93

---

Quant
aux
méthodes
que
nous
avons
utilisées
pour
le
dépistage des
sujets
infectés
par
le
VHE,
une
étude
critique
nous permettra de mieux opter pour une technique.
B - ETUDE CRITIQUE DES TECHNIQUES UTILISEES
POUR LE DEPISTAGE DES SUJETS INFECTES PAR LE VHE
1
-
L1immunofluorescence pour la recherche des
anticorps antiVHE
Par la méthode de recherche que nous avons utilisée,
nous
n'avons
pu
détecter
aucun
anticorps
antiVHE
dans
les
sérums
testés parce que très probablement le foie que nous avons utilisé
comme source d'antigène ne contenait pas le VHE.
En effet,
une étude américaine ultérieure menée au Center
of
Diseases
Control
par
BRADLEY
et
collaborateurs
(16),
et
utilisant
la
même
technique,
s'est
soldée
par
des
résultats
positifs.
Ils ont pu
retrouvé
le VHE
dans
les
hépatocytes de
foie de singe
infecté expérimentalement le premier
jour de la
montée
des
transaminases,
et
ont
mis
au
point
un
système
de
détection des anticorps antiVHE à partir de ce foie
(17).
Nous avons donc déduit que la réplication du VHE dans le
foie
était
très
brève
et
que
les
biopsies
que
nous
avons
utilisées avaient été réalisées trop tardivement.
Par ailleurs, il nous plaît de souligner que nos différents
sérums ont été contrôlés par la même équipe et que le sérum de
notre singe S8 a été retrouvé positif en anticorps antiVHE après
inoculation
et
négati f
avant
inoculation.
·Mais
il
faut
le
reconnaître il s'agit là d'une méthode qu'on ne peut utiliser en
routine et qui reste réservée à la recherche; parce que :
-
les réactifs ne sont pas renouvelables,
-
il y a difficulté de standardisation.
Les appl ications possibles seraient l 'util isation dl un sérum
confirmé positif en anticorps, marqué, qui servirait à rechercher
l'antigène VHE dans les coupes de
foie;
ou bien l'utilisation
d'un
système foie positif/sérum marqué positif utilisable pour
94

---

la sérologie en série dans un test de blocage (les sérums étudiés
seront alors utilisés non marqués) .
2 -
Recherche du virion dans les selles
a)
-
par microscopie électronique
Bien
qu'ayant
multiplié
nos
recherches
et
essayé
de
nombreuses techniques de microscopie électronique, les résultats
sont restés négatifs, cependant qu'il était montré dans certaines
études la présence de particules de 27
à 32 nm dans les selles
de
suj ets
atteints
d 1 hépatite
E
(15).
Mais
il
convient
de
préciser que ces particules n'étaient retrouvées que dans 4 % des
cas.
De ces expériences nous avons déduit :
- que la quantité de VHE éliminée dans les selles était faible
nécessitant
donc
un
enrichissement.
Cette
déduction
était
d'autant plus logique que des méthodes de purification virale
par gradient de sucrose ou de chlorure de Césium que nous avons
entreprises ne nous ont jamais permis d'isoler le virus à partir
des
selles.
Toutes
ces
difficultés,
de
même
que
le
faible
pourcentage de positivité constaté limitent donc
l'utilisation
de cette méthode.
b)
-
par culture cellulaire
Tous
nos
essais
de
culture
cellulaire
sur
lignée
hépatocytaire HepG2 et PLcPRF5 ne nous ont pas permis d'observer
un
effet cytopathogène caractéristique du VHE.
Le
VHE
ne
provoque-t-il
pas
d'effet
cytopathogène
?
In
vitro,
il est difficile de
répondre
à
cette
question puisque
jusqu'à ce jour aucune équipe de chercheurs n'a pu cultiver ce
virus.
si
cet
échec
constaté
face
aux
techniques
usuelles
de
culture virale pourrait s'expliquer par une fragilité du virus,
ou
encore
par
des
conditions
de
conservation
difficiles
à
respecter
il
semble
plutôt
lié
à
la
nature
du
produit
95

---

pathologique en l'occurrence les selles qui peuvent contenir de
nombreuses substances cytotoxiques.
Il
faudrait
dans
ce
cas
peut-être
avoir
recours
à
des
techniques de purification virale à partir des selles, ou de la
bile, où le virus semble également présent avant d'entreprendre
la culture cellulaire.
In vivo,
les biopsies hépatiques que nous avons effectuées
chez
le
singe
infecté
expérimentalement
n'ont
révélé
aucune
lésion caractéristique au niveau des hépatocytes.
Par contre chez l'homme des études bien documentées portant
sur
des
biopsies
de
foie
réalisées
chez
des
sujets
décédés
d'hépatite
E
fulminante
ont
permis
de
décrire
des
lésions
caractéristiques
(22-35-64-65).
Mais
les
différents
résultats
présentés ne sont pas tous concordants et des investigations plus
poussées seraient certes nécessaires.
3
-
Recherche de l'antigène VHE par techniques
immuno-enzymatiques.
Les
différentes
techniques
mises
au
point
permettent
de
tirer les conclusions suivantes :
La
recherche de
l'antigène VHE dans
les
selles
à
partir
d'un système humain donne de moins bons résultats que le système
singe.
Nous avons émis l'hypothèse que dans les selles on peut
retrouver
des
substances
telles
que
les
lipopolysaccharides
bactériens,
et
certains
germes
saprophytes
de
la
flore
intestinale,
qui peuvent se
lier aux sites anticorps des
IgM
fixées sur le support réactionnel, et aux fragments Fab des IgG
marquées donnant des réactions non spécifiques (95 % dans notre
étude).
C'est la raison pour laquelle nous avons abandonné le
système
humain
au
profit
du
système
singe
que
nous
avons
optimisé.
En fait,
à côté des substances d'origine bactérienne de la
flore intestinale saprophyte il existe d'autres substances non
spécifiques pouvant se lier soit aux IgG, soit aux IgM de manière
non immune et pouvant interférer avec le système spécifique.
En effet,
d'après nos résultats,
la protéine Fv que nous
96

---

avons décrite précédemment semble être la principale cause de
ces réactions non spécifiques puisque le passage des selles sur
immunoadsorbant d' IgM monoclonale qui élimine la protéine Fv fait
disparaître ces réactions dans 100 % des cas.
Mais il
faut cependant remarquer que lorsque le seuil de
positivité
est
faible
(PIN
<
3)
l'utilisation
de
l'immunoadsorbant peut perturber les réactions dans
la mesure
où
une
partie
de
l'antigène
spécifique
peut
se
fixer
sur
l'immunoadsorbant donnant ainsi de faux résultats négatifs. Dans
de tels
cas,
le contrôle devra
Si effectuer
par des
réactions
d'inhibition sur des selles non adsorbées.
Mais il faut cependant dire que si la protéine Fv est source
de
réactions
non
spécifiques,
sa
recherche
semble
fort
intéressante dans la mesure où elle est le témoin précoce d'une
inflammation hépatique.
Chez
le singe,
elle apparait 20 jours
après
11 inoculation
alors
que
les
transaminases
ne
s'élèvent
qu'au bout de 25 jours.
Chez
l'homme,
à
défaut d'étude menée avant la montée des
transaminases, ont peut dire que son apparition dans les selles
est contemporaine de l'élévation des transaminases sériques.
Le passage en revue de toutes les techniques que nous avons
util isées
pour
le
dépistage
des
suj ets
infectés
par
le
VHE,
révèle
que
les
meilleurs
résultats
ont
été
obtenus
avec
les
techniques immunoenzymatiques; qui pour être valables, rappelons
le doivent utiliser :
- des anticorps antiVHE d'origine non humaine
-
des IgG marquées à la béta-galactosidase qui révèlent moins
la protéine F que les IgG marquées à la péroxydase.
Des études
menées
par
l'équipe
du
Professeur
Jacques
PILLOT
(61)
l'ont
effectivement prouvé.
et
enfin
des
selles
passées
sur
immunoadsorbant
d'IgM
monoclonale pour éliminer les réactions non spécifiques.
97

---

· '..~
"!§
,;.
C- ACQUISITIONS ET PERSPECTIVES
Grâce à ces techniques immuno-enzymatiques,
nous avons pu
mettre
au
point
une
méthode
spécifique
reproductible
de
détection de l'antigène VHE dans les selles des malades infectés.
Malgré
une
variabilité
des
souches
de
VHE
provenant
de
différentes
régions
du
globe,
signalée par
certains
auteurs,
nous
pouvons
dire
qu'il
existe
au
moins
une
communauté
antigénique entre ces différentes souches.
En
effet
par
cette
technique,
nous
avons
pu
retrouver
l'antigène VHE dans les selles de malades atteints d'hépatite E
de différentes provenances
- de la Thaïlande (dans 26 % des selles de malades de Bangkok)
-
de
l'Afrique du
Nord
(dans
38
% des
selles de
malades
de
Constantine) .
- de l'Afrique de l'Ouest, au Sénégal où nous avons retrouvé des
cas sporadiques d'hépatite E à Dakar
(33
% des hépatites NANB
dans notre étude).
Mais il faut cependant remarquer que cet antigène apparaît
précocement dans les selles,
dès la période d'incubation chez
l'animal, pendant la montée des transaminases chez l'homme
et
que par cette technique le diagnostic de l'hépatite E ne peut se
faire que pendant la phase aiguë de la maladie.
Mais
si
l'on sait aujourd'hui
qu'aucun
cas
d'hépatite E
chronique n'a été signalé chez l'homme ou chez l'animal, on peut
dire
que
la
majeure
partie
des
hépatites
E
pourront
être
diagnostiquées par cette méthode. Il s'agit là d'une contribution
importante dans le domaine de recherche des hépatites,
surtout
si l'on sait qu'à l ' heure actuelle nous ne disposons d'aucun test
utilisable en routine pour le diagnostic de l'hépatite E.
Cependant une question subsiste : Quand disparaît l'antigène
VHE chez l'homme?
98

---

Si nous pouvons donner une réponse à cette question en ce
qui
concerne
le
singe où
l'antigène n'est plus détectable au
delà du 42ème jour après inoculation, chez l'homme un suivi dans
le temps de l'évolution de cet antigène s'avère nécessaire.
Des
études
prochaines
nous
permettront
certainement
de
répondre à cette question.
Mais l'apparition précoce de l'antigène détecté qui apparaît
avant la montée des transaminases chez l'animal, sa présence de
courte durée dans les selles, de même que les problèmes inhérents
au
traitement
et
à
la
conservation
des
selles,
rendent
bien
compte
de
l'intérêt
de
développer
un
test
sérologique
de
détection des anticorps antiVHE, à partir d'antigène produit chez
le singe.
C'est
pourquoi
nous
incluons
dans
nos
perspectives
immédiates de recherche l'inoculation de plusieurs singes genre
cercopithèque, afin d'obtenir à partir de leur foie,
ou de leur
selle, ou de leur bile, une quantité suffisante en antigène VHE.
Ainsi,
nous pourrons réaliser:
-
soit des monoclonaux à
partir du VHE pour la recherche des
anticorps antiVHE dans le sérum ou le plasma;
- soit mettre au point une technique de dépistage par
"Dot-Blot" par fixation directe de l'antigène VHE sur membrane.
Ainsi
nous
pourrons
étudier
l'évolution
des
anticorps
anti VHE
chez
le
singe
et
par
transposition
chez
l' homme;
et
disposer de tests d'utilisation plus malléables en routine.
Mais dores et déjà nous pouvons dire que nous sommes armés
si une épidémie d'hépatite E arrivait à se déclarer au Sénégal.
99

---

Par ailleurs, dans le cadre de la prévention de l'hépatite,
nous incluons dans nos perspectives de recherche, la préparation
d'immunoglobulines à partir de sujets ayant été infectés par le
VHE,
et
ayant
acquis
une
immunité.
L'injection
de
telles
immunoglobulines pourrait assurer une immunisation passive chez
des
sujets
à
risque,
et
plus
particulièrement
chez
la
femme
enceinte,
chez
qui
une
telle
prophylaxie
peut
être
particulièrement
intéressante
en
attendant
de
disposer
d'un
vaccin éventuel.
100

---

II -
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L'HEPATITE C :
L'étude critique que nous avons menée en ce qui concerne
les méthodes de dépistage des sujets infectés par le VHC,
nous
permet d'affirmer que le diagnostic biologique de l'hépatite C
par la recherche des anticorps antiHCV, pose encore de nombreux
problèmes.
En effet,
on sait que certains cas d'hépatite C,
ne sont
pas reconnus comme tels,
et restent sérologiquement muets.
Il
faut d'ailleurs souligner à ce propos, que le sérum du chimpanzé
qUl
a
servl
à
l'identification
du
virus
ne
contenait
pas
d'anticorps
antiVHC;
prouvant
ainsi
que
les
cas
les
plus
infectieux, peuvent en être dépourvus.
- La recherche de ces anticorps au cours des hépatites C aiguës
est peu contributive.
En effet une étude récente montre que si
les
anticorps
antiHCV
sont
parfois
contemporains
du
pic
des
transaminases comme en atteste la figure suivante,
il
sont le plus souvent retardés par rapport à celui-ci
(82).
X FOIS LA
NORM~lE
l~.ooT
.\\
i
"Wr
\\
5.00~
e\\
1
_
o.oo~1----I../_\\_-._.........=.---=--_--+-__.~~~
11618J
, l8I8J
1/1QI8J
1/12r8J
Cinétique des anti- VHC et évolution des SGPT d
1
aIlS le temps.
101

---

l1,
En fait,
ils ne sont guère détectables que dans 40% des cas
seulement au cours du premier mois.
En effet,
pour environ la
moitié des cas,
la séroconversion est tardive
(63-82),
entre 2
et
12
mois,
alors
que
pour
la
moitié
de
ces
malades
les
transaminases sont déjà revenues à la normale.
1D~1
u.oo1
,0.ooJ
\\
~'ooL
•
0 00
.~.-.
•
•
•
1
1
•
11 10m2
1/12182
3111/83
V4/8.:l
Cin~tique des anti· VHC et ~volution des SGPT dans le temps.
- Ces tests de détection des anticorps antiHCV posent également
des
problèmes
d'interprétation
infection
ancienne
avec
élimination du virus ou infection actuelle?
-
De plus comme nous l'avons montré ces tests semblent être à
l'origine des réactions non spécifiques
réactions positives
dans
les
hépatites
auto-immunes,
dans
les
affections
où
le
facteur rhumatoïde est présent, dans les hépatites A aiguës, et
même dans les cirrhoses alcooliques.
Certains de ces résultats
ont été confirmés par d'autres études.
102
j

---

Plusieurs
hypothèses
sont
avancées
pour
expliquer
ces
probables faux positifs.
-
La présence au cours des hépatites auto-immunes d'un
(auto)
anticorps
oligoclonal de spécificité
indéterminée,
réagissant
également avec l'antigène C 100-3 du kit.
(54).
- La présence d'un anticorps anti-idiotype se fixant à la phase
solide du kit et liant également les IgG.
(54).
- Ou bien la présence d'anticorps circulants dirigés contre la
superoxyde-dismutase (SaD). En effet on sait que l'antigène cible
des tests HCV ELISA est un polypeptide de fusion C 100-3/S00; et
le contrôle des sérums de 19 sujets antiHCV positifs,
dont 10
sont atteints d'hépatite NANB chronique post-transfusionnelle,
et 9 d'hépatite chronique active auto-immune, par une recherche
d'anticorps anti-sOO, montre que les antigènes SaD sont toujours
absents dans le premier groupe et touj ours présents dans l'autre.
(43) .
- Ou la présence d'anticorps de faible affinité, plus sensibles
au lavage à l'urée 8 moles/l, seraient également responsables de
certains faux positifs des tests HCV ELISA,
observés au cours
d'hépatopathies variées (87).
-
Ou
encore
la
présence
d'anticorps
non
spécifiques
dirigés
contre des Togavirus ou de Flavivirus autres que le virus de
l'hépatite
C,circulant
en
milieu
tropical
,qui
réagiraient
également avec la proteine C 100-3 du kit
(étude en cours par
notre équipe) .
De plus des discordances très nettes apparaissent suivant
les
techniques
utilisées
A
titre
d'exemple
4
%
de
séropositivité en anticorps antiHCV ont été observés chez les
donneurs de sang sénégalais en "screening Elisa" versus 0,4 %
en "Immunoblot".
Cette situation semble préoccupante surtout si
l'on sait
que
la
maj eure
partie
des
études
épidémiologiques
dont
nous
disposons
à
l ' heure
actuelle
ont
été
effectuées
avant
l'utilisation de ces tests de confirmation
(24-25-44-52).
Ces
études ne doivent être interprétées qu'après contrôle par ces
tests.
103

---

Tous
ces problèmes mettent
l'accent sur la nécessité de
disposer de tests plus performants , plus spécifiques donc plus
fiables surtout si l'on sait que le VHC est caractérisé par un
vaste
réservoir
de
porteurs
chroniques
asymptomatiques
dont
certains évoluent de manière insidieuse
vers la cirrhose et le
cancer primitif du foie.
104

---

III -
ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE DES HEPATITES NANB
L'étude épidémiologique que nous avons
entreprise permet
de tirer ies conclusions suivantes :
-
l'hépatite E existe bien au Sénégal. Dans notre échantillon,
elle représente 42 % des hépatites NANBNC et 17 % des hépatites
aiguës chez l'adulte.
Ce pourcentage semble nettement inférieur à celui observé
dans certains pays en voie de développement où l'on rapporte que
l'hépatite E représente entre 50 et 90% des hépatites virales
aiguës (65). Une enquête à plus large échelle, serait peut-être
nécessaire pour confirmer le pourcentage que nous avons obtenu.
Cependant
ce
pourcentage
relativement
faible,
ne
doit
nullement
détourner notre
attention du
risque
d'épidémie
qui
existe; épidémies, rappelons le, sont survenues dans de nombreux
pays d'Afrique et d'Asie.
- Toujours dans notre étude, cette hépatite ne concerne que les
jeunes
adultes
de
21
à
40
ans.
Ces
résultats
semblent
donc
confirmer les conclusions de
l'étude menée par RAMALINGASWANI
V.
et collaborateurs
(59)
qui disaient
je ci te
:
"l' hépati te
NANB
à
transmission entérale touche avec une
égale
fréquence
l'homme et la femme et s'observe principalement chez
le jeune
adulte entre 15 et 40 ans".
Quant à l'étude épidémiologique de l'hépatite C, elle nous
permet de constater :
-
le faible pourcentage du portage des anticorps antiHCV dans
la population
générale
(0, 73 %)
et
chez
les
donneurs
de
sang
(0,5%);
pourcentages certes sous estimés,
si l'on sait qu'une
étude récente a montré la possibilité de détecter par PCR l'ARN
HCV dans le sérum et le foie de sujets apparemment séronégatifs,
incluant des sujets avec hépatite chronique, mais également des
donneurs de sang. Elle nous permet également de constater que la
prévalence des anticorps anti-HCV augmente avec l'âge jusqu'à la
quatrième décennie, puis décroit ensuite, reflétant probablement
la disparition des anticorps détectables
avec le temps. Il faut
remarquer que de telles conclusions sont également rapportées
105

---

par une étude américaine récente.
(72).
Cependant,
on
constate
également
dans
notre
étude
une
prévalence relativement élevée de 4,12% (4 antiHCV+/97 étudiés)
dans la tranche d'âge G5~G9 ans. Des études ultérieures pourront
certainement nous éclairer sur cette forte prévalence.
de
formuler
les
recommandations
suivantes
les
tests
actuellement
commercialisés
pour
la
détection
des
anticorps
antiHCV par screening
Elisa
ne
doivent
pas
être utilisés
de
manière systématique dans nos centres de transfusion sanguine.
En effet ils donnent 90% de réactions positives non spécifiques.
Et si l'on sait que près de 20% des donneurs de sang sont
éliminés puisque porteurs de l'AgHBs, plus de 2% éliminés puisque
porteurs du HIV ou du Tréponéma pallidum; ces fausses réactions
positives, ne feraient que limiter à tort, le nombre de donneurs
déjà nettement insuffisant; sans vouloir parler du coût élevé de
ces
recherches,
qui
serait
de
12.500
F
CFA
pour
un
seul
dépistage.
A
défaut,
l'utilisation
de
mélanges
de
solvants
et
de
détergents destinés à l'inactivation virale serait peut être à
envisager
au
moins
pour
la
préparation
des
fractions
plasmatiques. Ces procédés sont aujourd'hui couramment employés
et ont
fait
la preuve de
leur efficacité dans
certains
pays
d'Europe.
(42).
- De proposer un schéma simple, qui pourrait être retenu devant
tout don de sang en attendant de disposer de tests plus fiables
pour le diagnostic de l'hépatite C,
et plus accessibles sur le
plan économique.
lOG

---

..
1
DONNEURS DE SANG
- -
- -
-
lA9"HBS~
BW+
HIV+ :
1- - - --
RECUSER LE DON
DOSAGE DES TRANSAMINASES
SERIQUES
TRANSAMINASES
NORMALES
1 - -
- . -
-
-
-
-
-
-
-
- - 1
,TRANSAMINASES
~TRANSAMfuASES-- ~l
1
,
IFAIBLEMENT ELEVEES
1
'ELEVEES> 2 FOIS J
1
1
,25 < SGOT/SGPT < 65 UII,
!LA NORMALE
'
RETENIR LE
DON
RECUSER LE DON
EXPLIQUEES
INEXPLIQUEES
(alcool,
obésité ... )
l
,__ L_ _ RECUSER LE DON
1
RECHERCHE DES l
1
1
:
ANTICORPS
1
1
ANTI-HCV
1
L---l-----~
ANTI-HCV-
ANTI-HCV+
1
RETENIR LE DON
RECUSER LE DON
107

---

En
effet
ce
schéma
s'inspire
des
résultats
d'une
étude
hollandaise
(56)
qui
montre
une
prévalence
du
portage
des
anticorps
antiHCVde
0,6%
chez
des
donneurs
de
sang
à
transaminasémie
normale;
de
10%
à
transaminasémie
faiblement
élevée
(une à deux fois la normale),
mais de manière répétée;
de 24% chez les donneurs dont le taux de transaminases sériques
est supérieur à deux fois la normale.
Il
s'inspire également de notre
étude dakaroise
où nous
avons constaté que 80% des sujets porteurs des anticorps anti-
HCV,
et
100% des donneurs de sang anti-HCV+,
ont un taux de
transaminases sériques élevé avec une moyenne de 70 UI/l pour
les SGOT et les SGPT.
Donc en attendant de disposer de tests plus fiables pour
le
diagnostic
de
l'hépatite
C,
le
dosage
systématique
des
transaminases sériques chez les donneurs de sang constituerait
une prévention au moins
partiellement efficace de
l ' hépatite
NANB post-transfusionnelle.
108

---

CONCLUSION

---

Au terme de notre étude,
nous pouvons dire que les tests
commercialisés actuellement pour le dépistage des sujets infectés
par le VHC permettent de détecter des anticorps dirigés contre
un antigène exprimé lors d'une hépatite NANB appelée hépatite
«
C » .
Ces
tests
permettent
certes
de
détecter
50
à
80
% des
hépatites transmises par voie parentérale autres que l'hépatite
B permettant
ainsi
de
réduire
considérablement
les
hépatites
post-transfusionnelles.
cependant ces tests posent encore de sérieux problèmes :
- les anticorps antiHCV ne sont détectables en moyenne que dans
30 à 40 % des hépatites aiguës,
ils n'apparaissent qu'après 3 à
4 mois d'évolution. Il paraît donc essentiel de pouvoir disposer
d'un
marqueur
plus
précoce
de
l'infection,
tant
en
ce
qui
concerne
les
exigences
de
la
sécurité
transfusionnelle,
que
celles du diagnostic clinique des infections aiguës.
De plus comme nous l'avons montré, ces tests semblent être
à l'origine de nombreuses réactions non spécifiques; 50 à 60 %
dans certaines situations pathologiques, 90 % en milieu tropical
plus précisément à DAKAR où notre étude a été menée.
Ces réactions non spécifiques semblent liées au fait que
l'antigène utilisé pour la détection des anticorps antiVHC est
une protéine fonctionnelle et non pas structurale du VHC.
Dès
lors,
il
parait
imperleux
de
se
diriger
vers
le
recherche d'autres marqueurs pl us spécifiques, pour un diagnostic
biologique fiable de l'hépatite C.
L'espoir est permis, si l'on sait aujourd'hui,qu'une équipe
de chercheurs japonais a pu isoler une protéine de structure du
VHC de 22 KD,
reconnue par les anticorps présents dans le sérum
d'un patient atteint d'hépatite NANB chronique.
Cette protéine a déjà été partiellement purifiée en vue de
la préparation d'un test ELISA pour la détection d'un anticorps
anti 22KD dans les sérums de patients atteints d'hépatite NANB.
Les essais préliminaires utilisant ce test encore à l'état
de recherche montrent que non seulement la majorité des hépatites
C chroniques sont diagnostiquées,
mais également les hépatites
C aiguës.
109

---

De tels tests sembleraient donc plus performants pour le
diagnostic biologique de l'hépatite C.
Sinon,
un appel à
l'amplification genlque comme l'a déjà
suggéré HOUGHTON serait peut-être nécessaire.
En effet,
la PCR permet la détection de l'ARN HCV,
et ce
de façon précoce, puisque dans les expériences de transmission
à des chimpanzés, l'ARN a pu être détecté dans les premiers jours
suivant l'inoculation. La PCR devrait donc pouvoir permettre une
estimation sensible et très directe de la virémie.
La PCR peut
cependant poser plusieurs problèmes
-
risque de contamination inhérent à ces techniques.
- nécessité d'utiliser des séquences adaptées à l'isolat du fait
de la variabilité génétique éventuelle.
(47).
-
nécessité d'une bonne conservation des sérums car l'ARN HCV
est manifestement facilement dégradé.
Seules des comparaisons permettront de dire si l'estimation
de
la
virémie
peut
être
réalisée
au
mieux
par
des
tests
sérologiques, ou par des techniques de biologie moléculaire comme
la PCR.
C'est dire donc que les méthodes actuelles de diagnostic
de
l ' hépatite
C
loin
d'être
satisfaisantes,
sont
en
pleine
évolution et ouvrent ainsi une voie de recherche.
Quant au diagnostic biologique de l'hépatite E, comme nous
l'avons exposé précédemment,
nous avons pu mettre au point une
méthode spécifique de détection de l'antigène VHE, qui a permis
de nous rendre compte de l'existence du VHE au Sénégal.
Même si le nombre de cas étudié semble limité, les résultats
sont
statistiquement
interprétables
et
nous
pouvons
dire
que
l'hépatite E représente 42 % des hépatites NANBNC et 17 % des
hépatites aiguës de l'adulte dans notre échantillon.
110

---

Cependant en combinant les tests actuels de détection des
anticorps antiHCV et notre méthode de détection de l'antigène
VHE, on se rend compte que 47 % des hépatites NANB aiguës à DAKAR
restent encore non identifiées.
Nous
savons
déj à
qu'il
existe
des
formes
d' hépatite
C
séronégatives, et des études en immunomarquage et amplification
moléculaire dans le foie ont déjà permis de le démontrer dans au
moins
15
% des
cas
(18).
Cette
situation
est
finalement
comparable
à
celle
toujours
d'actualité
des
hépatites
B
séronégatives
au
cours
desquelles
le
VHB
est
uniquement
détectable
par
PCR,
ces
cas
étant
toujours
classés
sérologiquement dans le groupe des hépatites NANB résiduelles
(18). Cette situation démontre bien la nécessité de disposer de
tests spécifiques, fiables, très performants pour pouvoir parler
d'hépatite C ou d'hépatite E et pose par là même le problème de
la
terminologie
d' hépatite
NANB
qui
devient
impropre,
et
la
suggestion de certains auteurs
(18-81)
de parler "d'hépatites
séronégatives" devient justifiée.
Ce
terme
refléterait
ainsi
le
besoin
de
rechercher
de
nouveaux marqueurs, tant pour le VHB que pour le VHC ou le VHE
ou tout autre virus.
Et ce n'est que grâce à de tels progrès
qu'il
sera
possible
de
préciser
l'existence
de
virus
supplémentaires, et de pouvoir répondre à la question que l'on
se pose actuellement, à savoir
"Existe-t-il plus de cinq virus des hépatites 7".
I I I

---

BIBLIOGRAPHIE

---

1
Al Arabi MA, Hyams KC, Mahgoub M, Al Haq AA, El
Ghoreb N.
(1987).
Non-A non-B hepatitis in Omdurman,
Sudan. J Med Virol, 21,
217-222.
2
Alter HJ,
Purcell RH, Holland PV et al.
(1978).
Transmissible agent in non-A non-B hepatitis.
Lancet
1,
459-463.
3
Alter MJ, Gerety RJ et al.
(1982).
Sporadic non-A
non-B hepatitis. Frequency and epidemiology in an
urban US population. J.
Infect Dis, 145, 886-893.
4
Alter,
Purcell HJ et al.
(1984).
Non-A non-B
hepatitis. A review and interim report of an
ongoing prospective study.
In : Viral hepatitis.
Edited by GN Vyas,
Franklin Institute Press.
Philadelphia,
359-369.
5
Alter MJ, purcell RH,
shih JW, Melpolder JC,
Houghton M,
Choo QL,
Kuo G.
(1989).
Detection
of antibody to hepatitis C virus in prospectively
followed transfusion recipients with acute and
chronic non-A non-B hepatitis.
N Engl J
Med,
321,
1494-1500.
6
Andzhaparidze AG,
Balayan MS,
Savinov AP,
BRAGINSKY
DM et al.
(1986).
Non-A non-B hepatitis transmitted
by the fecal oral mode experimentally produced in
monkeys. Vopr. Virusol.,
31,
73-81.
7
Arankalle VA, Ticehurst J,
Sreenivasan MA et al.
(1988).
Aetiological association of a virus-like
particle with enterically transmitted non-A non-B
hepatitis.
Lancet,
1,
1550-553.
112

---

8
Balayan MS, Agafonov VI, Andzhaparidze AG et al.
(1982).
Viral hepatitis,
similar in clinical picture
and epidemiology to hepatitis A but differing from
it, etiologically. Microbiol Epidemiol Irnrnunobiol,
8,
79-84.
9
Balayan MS, Andjaparidze AG, Savinskaya SS et al.
(1983).
Evidence for a virus in non-A non-B
hepatits transmitted via the fecal oral route.
Intervirology, 20,
23-31.
10
Bellabes H,
Bougerrnouh A,
Benatallah A,
Illoul G
(1982).
Study of an outbreak of non-A non-B
hepatitis in Algeria.
Proceeding of the VIII IFIPD
Congress Session Non-A non-B hepatitis,
Stockholm,
Sweden.
11
Bellabes EH,
Bourguerrnouh A,
Benatallah A,
Illoul G
(1985).
Epidemie non-A non-B hepatitis in Algeria
Strong evidence for its spreading by water. J. Med
Virology,
16,
257-263.
12
Betman M, Alter HJ,
Ishak KG, purcell RH et al.
(1979).
The chronic sequelae of non~A non-B
hepatitis. Ann Inter Med.,
91,
1-6.
13
Blurnberg BS, Gerstley BJS, Hugerford DA,
London WT,
Sutnick AI.
(1967).
A serum antigen (Australia
antigen)
in down's syndrome,
leukaemia and
hepatitis. Ann Inter Med.,
66,
924-930.
14
Bradley DW, Maynard JE,
Popper H et al.
(1983).
Post-transfusion non-A non-B hepatitis
physico-chemical properties and two distinct agents.
J
Inf Dis,
148,
254-265.
113

---

15
Bradley DW, Krawczynski K., Cook EH Jr et al.
(1987). Enterically transmitted non-A non-B
hepatitis : seriaI passage of disease in cynomolgus
macaques and tamarins and recovery of disease-
associated 27 to 34 nm virus-like particles. Proc
Natl Acad Sei, USA, 84,
6277-6281.
16
Bradley DW, Andjaparidze, Cook EH
et al.
(1988).
Aetiological agent of enterically transmitted non-A
non-B hepatitis. J Gen Virol, 69, 731-738.
17
Bradley DW (1989). The virus of enterically
transmitted non-A non-B hepatitis. Symposium of
non-A non-B hepatitis and blood borne infectious
diseases, Tokyo, Elsevier (à paraître) .
18
Brechot
C.
(1990)
Le
virus
de
l ' hépatite
C
une
découverte de la biologie moléculaire.
Gastroentérol. Clin Biol, 14, 54-56.
19
Charkraborty S, Datta M,
Pasha ST, Kumar S.
(1982).
Non-A non-B hepatitis. A common source outbreak
traced to savage contamination of drinking water.
J. Commun Dis, 14, 41-46.
20
Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR,
Bradley DW,
Houghton M.
(1989).
Isolation of a cDNA clone
derived from a blood borne non-A non-B hepatitis
genome. Science, 244,
359-361.
21
Decodk KM,
Bradley DW, Sandford NG et al.
(1987).
Epidemie non-A non-B hepatitis in patients from
Pakistan. Ann Internat. Med., 106,
227-230.
114

---

22
Desmet VJ,
Devos R.
(1985). Ultrastructural findings
in non-A non-B hepatitis.
In Brunner H, Thaler H
(eds).
"Hepatology : A fetschrift for Hans Popper",
New-York, Raven Press, 159-175.
23
Dienstag JL.
(1983). Non-A non-B hepatitis.
1. Recognition, epidemiology and clinical features.
II. Experimental transmission putative virus agents
and markers and prevention. Gastroenterology, 85,
439-462.
24
Esteban M, Viladomin l, Gonzales A, Roget M et al.
(1989). Hepatitis C virus antibodies among risk
group in Spain. Lancet, 2,
294-297.
25
Farrow LJ, Stewart JS, Stern H,
Clifford RE et al.
(1981). Non-A non-B hepatitis in West London. Lancet
1,
982-984.
26
Favorov MO,
Khukhlovich PA,
Zavrov GK et al.
(1986).
Clinical and epidemiological features and diagnosis
of viral non-A non-B hepatitis with fecal oral
transmission mechanism. Vopr Virusol,
1,
65-69.
Y;>--,\\, \\~j9.oJ
27
Feinstone SM,
Zapilian AZ,
Purcell RH.
(1973).
Detection by immune electronmicroscopy of a virus-
like antigen associated with acute illness.
Science, 182, 1026-1028.
28
Feinstone SN, Kaprikran AZ,
Purcell RH.
(1975).
Transfusion associated hepatitis not due to viral
hepatitis A or B. The New England Journal of
Medicine, 292,
767-770.
29
Feinstone SN, Hoofnagle JM.
(1984).
Non-A non-B
may be B hepatitis. The New England Journal of
Medicine,
311, 185-188.
115

---

30
Feinstone SN, Mihalih et al.
(1987).
Inactivation
of hepatitis B virus and non-A non-B hepatitis by
chloroform.
Infect Immun, 41,
816-821.
31
Fields HA, Mc Caustland KA,
Bradley DW et al.
(1982)
Enterically Non-A, Non-B virus : physical, chemical
and immunological properties. J
Immunol Methods,
51,
149-157.
32
Fletcher ML, Trowell JM, Craske J,
Pawen K,
Rizza CR.
(1983). Non-A non-B hepatitis after
transfusion of factor VIII in unfrequently treated
patients. Br Med J, 287, 1754-1757.
33
Francis DP, Hadler SC, Prendergast TJ.
(1984).
Occurence of hepatitis A, Band non-A non-B in the
united states.CDC sentinal country hepatitis study.
Amer J Med, 76,
69-74.
34
Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas.
(1979).
In
Histochem Cytochem. Technics Handbook.
35
Gupta DN, Smetana HF.
(1957). The histopathology
of viral hepatitis as seen in Dehli epidemic
(1955-56). Indian Journal of Medical Research, 1,
145-151.
36
Gust ID, Purcell RH.
(1987). Report of a workshop
waterborne non-A non-B hepatitis. J.
infect Dis,
156, 630-635.
37
Gust ID,
Purcell RH.
(1987). Report of a workshop :
Waterborne non-A non-B hepatitis from the virus
laboratory, Fairfield Hospital, Fairfield Victoria,
Australia and the National Institute of Allergy and
Infectious Diseases, National institute of Health,
Bethesda, Maryland.
116

---

38
Hillis A, Shrestha SM, Saha NK.
(1973). An epidemic
of infectious hepatitis in the Kathmandu Valley.
Journal of Nepal Medical Association, 11, 145-151.
39
Hollinger FB, Mosley JW, Szmuness W et al.
(1980).
Transfusion transmitted viruses study : experimental
evidence of two non-A non-B hepatitis agents. J
Infect Dis, 142,
400-407.
40
Hollinger FB, Khan et al.
(1983).
NANB hepatitis
following blood transfusion risk factors associated
with donor characterization. Viral Hepatitis,
International Symposium, Edited by Szumess, Alter et
al.,
Franklin Institute Press,
Philadelphia,
361- ~
41
Hopf U, Moller B, Kuther 0 et al.
(1990).
Long-term
follow-up of post transfusion and sporadic chronic
hepatitis non-A, non-B and frequency of circulating
antibodies to hepatitis C virus
(HCV)
J Hepatol, 10,
69-76.
42
Horowitz MS, Horowitz B, Rooks C, Hilgartner MW.
(1988). Virus safety solvent/detergent~treated
antihaemophilic factor concentrate.
Lancet, 2,
186-189.
43
Ikeda
Y.
et
al.
(1990)
Correlation
anticorps
anti-
SOD/anticorps anti-HCV, d'après une étude sur 19 sujets
anti-HCV positifs.
Lancet, 335, 1345-1346.
44
Janot C, Couroucé AM, Maniez M.
(1989). Antibodies
to hepatitis C virus in French blood donors.
Lancet,
2,
796-797.
117

---

45
Joshi YK, Babu S, Sarin S, Tandon BN et al.
(1985).
Immunoprophylaxis of epidemic non-A non-B hepatitis.
Indian J Med Res, 81, 18-19.
46
Kane MA, Bradley DW, Shrestha et al.
(1984).
Epidemie non-A non-B hepatitis in Nepal : recovery
of a possible etiologic agent and transmission
studies. J. Amer Med Ass, 252,
3140-3145.
. 47
Kaneko S. et al.
(1990). Variabilité génétique du
virus de l'hépatite C. Lancet, 1, 976.
48
Khuroo MS (1980). Study of an epidemic of non-A non-B
hepatitis : possibility of another human hepatitis
virus different from post-transfusion non-A non-B
type. Am J Med,
68, 818-824.
49
Khuroo MS, Duermeyer W,
Zargar et al.
(1983). Acute
sporadic non-A non-B hepatitis in India. Am J
Epidemiology, 118, 360-364.
50
Koff RS, Galambos JJ.
(1987). Viral hepatitis In :
Schiff L, Schiff ER JB ed. Diseases of the Liver.
Philadelphia
Lippincott Company: 457-581.
51
Krawczynski C.
(1989).
Immunohistochemical
identification of hepatitis C associated antigen
in liver. International Symposium on non-A non-B
hepatitis and blood borne infectious diseases,
Tokyo, Elsevier (à paraître).
52
Kuhn LP, Seidl S, Stangel W et al.
(1989). Antibody
to hepatitis C virus in German blood donors.
Lancet,
2,
324.
118

---

53
Kuo G, Choo QL, Alter HJ, Gitnick AG, Redeker AG,
Purcell RH, Miyamura T, Dienstag Alter MJ, stevens
CE, Tegtmever GE, Bonino F, Colombo M, Lee WS, Kuo
C, Berger K, Shus~er JR, Overby LR, Bradley DW,
Houghton M.
(1989). An assay for circulating
antibodies to a major etiologic virus of human
non-A non-B hepatitis. Science, 244,
362-363.
54
Mc Farlane IG. et al.
(1990). Hépatites chroniques
actives
auto-immunes
faux
positifs
des
tests
HCV
Elisa? . Lancet, 335, 754-757.
55
Miller RH,
Purcell RH.
(1990). HCV and virus like.
Proc. Natl. Acad. Sciences, 87,
2057-2061.
56
Morgan C. et al.
(1990). Attitude don-donneur
arbre
décisionnel. Lancet,
l,
921.
z.:---------
- - - - - -
t 57
Morbidity and mortality weekly report. Centers of
Disease Control.
(1987). Enterically transmitted
non-A non-B hepatitis East Africa. US Department~
Health and Human Services/Public Health Service,
36/n D 10, 241-244.
58
Myint H, Soe MM, Khin T, Myint Tin KM.
(1985).
A clinical and epidemiological study of an epidemic
non-A non-B hepatitis in Rangoon. Am J Tropical Med
Hyg, 345, 1183-1188.
59
Nouasria B, Trepo C,
Larouze B et al.(1987). Non-A
non-B acute hepatitis in Eastern Aigerian adults.
Transactions of the Royal Society of Tropical
Medicine and Hygiene, 78,
137-138.
119

---

60
Pavri KM, BNiphadkar et al.
(1972).
Retrospective
studies on Australia antigen in sera collected
during the epidemic of viral hepatitis at Delhi
in 1956. india J Med Res,
60,
1575-1578.
61
Pillot J, Sharma MD,
Lazizi Y,
Budkowska A,
Dauguet
C, Galimand M, Sarthou JL (1987).
Immunological
characterization of a viral agent involved epidemic
and sporadic non-A non-B hepatitis. Ann Inst
Pasteur/Virol,
138,
145-158.
62
pillot J
(1990).
Données récentes sur les virus des
hépatites non-A non-B. Qui sont-ils ? Combien
sont-ils ?
Ann Inst Pasteur/Actualités, 83-89.
63
Prince, Brotman AM,
Grady et al.
(1989).
Long
incubation post-transfusion hepatitis without
serological evidence of exposure to hepatitis B
virus. Lancet, 2,
241-246.
64
Purcell RH, Ticehurst JR.
(1988).
Enterically
transmitted non-A non-B hepatitis. Epidemiology
and clinical charateristics.
Zuckerman AJ (ed)
:
"Viral Hepatitis and liver Disease". New-York:
Alan R,
liss,
inc,
131-137.
65
Ramalingaswani V,
Purcell RH.
(1988).
Waterborne
Non-A, Non-B, hepatitis. Lancet,
1,
571-573.
66
Reesink HW, Van Der Poel CL.
(1989).
Blood
transfusion and hepatitis : still a threat?
Blut,
58,
1-6.
67
Reyes GR, Purdy MA, Kim JP et al.
(1989).
Isolation of a cDNA from the virus responsible for
enterically transmitted non-A, non-B hepatitis.
Science, 247,
1335-1399.
120

---

68
Rosenbaum J, Carneiro B, Dhumeaux D, Trepo C.
(1984). Hépatites virales Non-A, Non-B.
Gastroenterol Clin Biol, 8, 273-287.
69
Sarthou JL, Budkowska A, Sharma MD, Lhuillier M,
pillot J.
(1986). Characterization of an antigen-
antibody system associated with epidemic non-A non-B
hepatitis in West Africa and experimental
transmission of an infectious agent to primates.
Ann Inst Pasteur/Virol., 137E, 225-232.
70
Smuness W, Alter HJ, Maynard JE.
(1981). Viral
hepatitis. International Symposium, Philadelphia,
Franklin Institute Press, 305-317.
71
Sreenvasan MA, Banerjee et al.
(1978).
Epidemiological investigations of an oubreak of
infectious hepatitis in Ahmedabad City during 1975-
1976. Indian J Med Res,
67, 197-206.
72
Stevens CE. et al.
(1990). A preliminary study in
volunteer blood donors.
In
New York Blood Center,
JAMA, 263, 49-53.
73
Tabor E., Gerety RJ,
Drucker JA, Sef et al.
(1978).
Transmission of non-A non-B hepatitis from man to
chimpanzee. Lancet, 2, 463-466.
74
Tabor E, April M, Seef LB, Gerety RJ.
(1979).
Acquired immunity to human non-A non-B hepatitis.
Cross-challenge of chimpanzees with three infectious
human sera. J
Inf Dis, 140, 789-793.
75
Tabor E, Gerety ·RJ.
(1980).
Inactivation of an agent
of non-A non-B hepatitis by formaI in. J
inf Dis,
142, 767-770.
121

---

76
Tabor E (1981).
Development and application to the
chimpanzee animal model for human NANB hepatitis.
Edited by Gerety, Academie Press, New-York,
189-206.
77
Tabor E, Snoy P, Jackson DR et al.
(1984).
Additional evidence for more than one afflut
of human non-A non-B hepatitis. Transmission and
passage studies in chimpanzees. Transfusion, 24,
224-230.
78
Tabor E.
(1985). The three viruses of non-A non-B
hepatitis. Lancet,
l, 743-745.
79
Tandon BN, Joshi SK, Gandhi BM et al.
(1982).
An epidemic of non-A non-B hepatitis in North
India.
indian J Med Res, 75, 739-744.
80
Tavera C, Velazquez 0, Avila C et al.
(1987).
Enterically transmitted non-A non-B hepatitis
Mexico Morbidity and Mortality Weekly Report.
Atlanta. United states Department of Health,
Education and Welfare,
Public Health Service,
Center for Disease Control,
36,
597-602.
81
Trepo C.
(1990).
Identification du virus de
l'hépatite C (VHC)
: un progrès décisif pour la
santé publique. Med Sciences,
6,
98-107.
82
Van Der Poel et al.
(1989). Anti-hepatitis C
antibodies and non-A non-B post-transfusion
hepatitis in the Netherlands. Lancet,
2,
297-
298.
83
Viswanathan R.
(1957).
Infectious hepatitis in Delhi
(1955-1956). A critical epidemiological study.
Indian Journal of Medical Research,
34, 1-29.
122

---

84
Wands JR,
Lieberman HM, Muchmore E,
Isselbacher K,
Shafritz DA.
(1982). Detection and transmission in
Chimpanzees of hepatitis B virus-related agents
formerly designated Non-A, Non-B hepatitis.
Proc Natl Acad science, 79,
7552-7556.
85
Weiner AJ, Kuo G,
Bradley DW et al.
(1990).
Detection of hepatitis C viral sequences in non-A,
non-B hepatitis.
Lancet, 1, 355.
86
Wong OC, Purcell RH, Streentvasan MA,
Prasad SR,
Pavri M.
(1980). Epidemie and endemic hepatitis in
India
Evidence
for
a
non-A non-B
hepatitis virus
etiology. Lancet,
1980, 2,
876-879.
87
Wreghitt TG, et al.
(1990). False positive reactions'
with ortho ELISA :
immunological and Chemical
considerations. Lancet, 1, 789.
88
Yamauchi M, Nakayima H, Kinura K et al.
(1983).
An epidemic of non-A non-B hepatitis in Japan. Am
J Gastroenterol, 78,
652-655.
89
Yoshizawa H,
Ithoh,
Iwahin.
(1983).
Demonstration of
two different types of non-A non-B hepatitis by
reinfection and cross-challenge studies in
chimpanzees. Gastroenterology, 81,
197-213.

---

AIlTIlTEXE
l
-
PREPARATION DES IgG DE LAPIN ANTI Fc (t)
HUMAIN
Elle se fait en deux étapes :
-
Préparation du
fragment
Fc (gamma)
humain par la méthode de
PORTER qui est appliquée à des IgG humaines purifiées sur OEAE
cellulose.
A
1
g
d' IgG
dissoute
dans
100
ml
de
tampon
phosphate
monopotassique disodique 0,1 M pH 7,2, on ajoute 44,6 mg d'acide
éthylène diamine tétracétique (EOTA), puis 96,6 mg de L-cystéine
et 10 mg de papaïne cristallisée (Merck). Après incubation de 3
heures·
à
37 oC,
on
dialyse
contre
du
tampon
phosphate
monopotassique disodique 0,1 M pH 7,2.
On filtre sur Séphadex
G100 dans ce même tampon pour éliminer les IgG non digérées qui
sortent dans le premier pic exclu et les produits de dégradation
qui sortent dans un troisième pic. Le deuxième pic qui contient
les fragments d'IgG est concentré et dialysé en tampon phosphate
monopotassique disodique 0,005 M pH 7 , 2. A ce stade, des cristaux
de
Fc
(gamma)
apparaissent
dans
le
sac
de
dialyse.
on
les
recueille
par
centrifugation
et
les
purifie
par
six
cristallisations
successives
réalisées
par
dialyse
en
eau
distillée froide, avec redissolution en tampon acétate 0,1 M pH
5,4. Le contenu du deuxième pic dialysé est ensuite
fractionné sur OEAE 52 équilibrée en tampon phosphate 0,005 M
pH
7,2.
Les
fragments
Fab
ne
sont
pas
retenus
dans
ces
conditions.
Les
fragments
Fc
(gamma)
sont
élués
en
tampon
phosphate 0,3 M pH 7,2.
A ce stade,
les fractions ne sont pas
généralement rigoureusement pures,
ce qui rend nécessaire une
dernière purification.
Pour ce faire,
les fragments Fc
(gamma)
sont passés
sur un
immunoadsorbant d' IgG de mouton anti-Fab,
pour éliminer les impuretés résiduelles.
La caractérisation immunologique des produits est réalisée
par immunodiffusion double en gel vis-à-vis d'anti-sérum humain
total,
d'anti-IgG,
d'anti-Fab et d'anti-Fc
(gamma).
La pureté
biochimique est établie et le contrôle des masses moléculaires
est réalisé par électrophorèse en gel de polyacrylamide sos.
- Immunisation du lapin
Elle se fait par injection intramusculaire,
toutes les 3
semaines,
de 100 mg de protéines dans 0,2 ml d'eau physiogique
en présence d'un vol urne d'adj uvant complet de Freund. L' évolution
du
taux
des
anticorps
et
leur
spécificité
est
suivie
par
immunodiffusion
en
gel
et
hémagglutination
passive,
et
les
saignées sont réalisées au moment jugé opportun, en général après
3 ou 4 injections de l'antigène.
/
/

---

II -
PREPARATION DES REACTIFS ET TAMPONS UTILISES
A -
T A M P 0 N S
1 -
Tampon Tris
(hydroxymethyl)
aminométhane :
A : 0,2 M solution de Tris hydroxyméthyl aminométhane
(24.2 g dans 1000 ml)
B :
0.2 M HeL
50 ml de A + x ml de B,
compléter à 200 ml.
x
pH
5.0
9.0
8.1
8.8
12.2
8.6
16.5
8.4
21.9
8.2
26.8
8.0
32.5
7.8
38.4
7.6
41.4
7.4
44.2
7.2
2 -
Tampon bicarbonate-carbonate
A
0.2 M solution de carbonate anhydre de sodium
(21.2 g dans 1000 ml).
B
0.2 M solution bicarbonate de sodium (16.8 g dans
1000 ml).
x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.
x
y
pH
4.0
46.0
9.2
7.5
42.5
9.3
9.5
40.5
9.4
13.0
37.0
9.5
16.0
34.0
9.6
19.5
30.5
9.7
22.0
28.0
9.8
25.0
25.0
9.9
27.5
22.5
10.0
30.0
20.0
10.1
33.0
17.0
10.2
35.5
14.5
10.3
38.5
11. 5
10.4
40.5
9.5
10.5
42.5
7.5
10.6
45.0
5.0
10.7
G.E.
Delory et E. J. King, J.
Biochem.,
1945,
39,
245
/
1
1
1
1

---

3 -
Tampon phosphate:
A
0.2 M solution phosphate monobasique de sodium
(27.8 g dans 1000 ml).
B
0.2 M solution de phosphate dibasique de sodium
(53.65 g de Na2HP047 H20 ou 71.7 g de NaHP04
12 H20 dans 1000 ml).
x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.
x
y
pH
x
y
pH
93.5
6.5
5.7
45.0
55.0
6.9
92.0
8.0
5.8
39.0
61.0
7.0
90.0
10.0
5.9
33.0
67.0
7.1
87.7
12.3
6.0
28.0
72.0
7.2
85.0
15.0
6.1
23.0
77.0
7.3
81.5
18.5
6.2
19.0
81. 0
7.4
77.5
22.5
6.3
16.0
84.0
7.5
73.5
26.5
6.4
13.0
87.0
7.6
68.5
31. 5
6.5
10.5
90.5
7.7
62.5
37.5
6.6
8.5
91.5
7.8
56.5
43.5
6.7
7.0
93.0
7.9
51.0
49.0
6.8
5.3
94.7
8.0
S.P.L. Sorensen,
Biochem.
Z.,
1909,
21,
131
1909,
22,
352
4 - Tampon acétate:
A
0.2 M solution diacide (11.55 ml dans 100 ml)
B
0.2 M solution dlacétate de sodium (16.4 de C2H302Na
ou 27.2 g de C2H302Na 3H20 dans 1000 ml).
x ml de A + y ml de B, compléter à 100 ml.
x
y
pH
acide acétique
acétate de Na
46.3
3.7
3.6
44.0
6.0
3.8
41.0
9.0
4.0
36.8
13.2
4.2
30.5
19.5
4.4
25.5
24.5
4.6
20.0
30.0
4.8
14.8
35.2
5.0
10.5
39.5
5.2
8.8
41.2
5.4
4.8
45.2
5.6
G.S. walpole, J. Chem. Soc. , 1914, 105, 2501

---

.
3
- Tampon phosphate
A
0.2 M solution phosphate monobasique de sodium
(27.8 g dans 1000 ml).
B
0.2 M solution de phosphate dibasique de sodium
(53.65 g de Na2HP047 H20 ou 71. 7 g de NaHP04
12 H20 dans 1000 ml).
x ml de A + y ml de B, compléter à 200 ml.
x
y
pH
x
y
pH
93.5
6.5
5.7
45.0
55.0
6.9
92.0
8.0
5.8
39.0
61. 0
7.0
90.0
10.0
5.9
33.0
67.0
7.1
87.7
12.3
6.0
28.0
72.0
7.2
85.0
15.0
6.1
23.0
77.0
7.3
81. 5
18.5
6.2
19.0
81. 0
7.4
77.5
22.5
6.3
16.0
84.0
7.5
73.5
26.5
6.4
13.0
87.0
7.6
68.5
31. 5
6.5
10.5
90.5
7.7
62.5
37.5
6.6
8.5
91. 5
7.8
56.5
43.5
6.7
7.0
93.0
7.9
51.0
49.0
6.8
5.3
94.7
8.0
S.P.L. Sorensen,
Biochem.
Z. ,
1909,
21,
131
1909,
22,
352
.
4
- Tampon acétate
A
0.2 M solution d'acide (11.55 ml dans 100 ml)
B
0.2 M solution d'acétate de sodium (16.4 de C2H302Na
ou 27.2 g de C2H302Na 3H20 dans 1000 ml).
x ml de A + y ml de B, compléter à 100 ml.
x
y
pH
acide acétique
acétate de Na
46.3
3.7
3.6
44.0
6.0
3.8
41.0
9.0
4.0
36.8
13.2
4.2
30.5
19.5
4.4
25.5
24.5
4.6
20.0
30.0
4.8
14.8
35.2
5.0
10.5
39.5
5.2
8.8
41. 2
5.4
4.8
45.2
5.6
G.S. Walpole, J. Chem. Soc. , 1914, 105, 2501

---

,. '-
.
B - REACTIFS
1 -
PM2
Tampon phosphate 0,1 M PH 7,4
Titriplex : 2
mM
MgS04
1
mM
MnS04
:
0,2 mM
2 -
Réactif phospho-tunqstique
Acide ortho-phosphorique
0,01 N
Tungstate de sodium
0,5 mM

---