Université
Louis Pasteur
de Strasbourg
U.E.R. des Sciences de la Vie et de la Terre
• TH SE •
Edouard
Régulation de la lactase intestinale
chez le rat adulte
Soutenue le 19 décembre 1986
..
devant la commIssIon d'examen
Président: Mr G.Vlncendon
Rappor1eurs
ExamInateurs
Membres: Mrs Y.Boulanger
Mme K.Haffen
A.Puigserver
Mr
F.Raur

---

o
Doctorat nouveau
régime
o

---

2
A mes parents
A Bà Nsi et Ernvo Nsi
A Monsieur le Professeur Ebel, qui rn/a permis de suivre
j/enseignement
du
DEA
de
Biologie
Moléculaire
et
Cellulaire
dont
il
assume
la
responsabilité, rn/ouvrant
ainsi
les
portes
du
monde
fascinant
de
la
recherche
scientifique.
Qu/i 1 veuil le bien trouver ici I/expression de ma
plus grande reconnaissance.
C/est à Francis Raul, que je, dois mon initiation à la recherche.
Il
a
dirigé
ce
travail avec minutie et rigueur en me faisant bénéficier de son
expérience scientifique et de ses critiques amicales. Je suis conscient
de
lui
devoir
beaucoup
et
je
lui
exprime
ici
toute
mon
estime
et ma
., grat i tude.
A Katy Haffen, que je tiens à remercier
de
rn/avoir
soutenu
par
ses
conseils et encouragements tout au long de mes recherches.
A Monsieur
J.F.
Grenier,
qui
a
bien
voulu
me faire confiance en
rn/accueillant dans son laboratoire en 1981.
Je voudrais exprimer ma plus grande reconnaissance à J.F.
Launay
avec
lequel
co Il abor
étroitement,
é
pour
son
esprit
critique
et
constructif.
Je remercie vivement : Francine Gossé ; Marie-Thérèse Vanier
Michel
Galluser
et
Patrick
Gendry,
pour I/aide précieuse qu/ils rn/ont accordée
sous les formes les
plus
diverses
dans
une
symphatique
atmosphère
de
travai 1.

---

3
Je tiens aussI à
remercIer
Yvonne
HuffschmIdt,
pour
I/excellent
travail
de
dactylographie; Bernard Lafleuriel, qui a réalisé les schémas
et figures avec beaucoup de soin et d/efficacité et à Claudia Haffen,
pour
son dévouement et la qualité de ses photographies.
J/exprime
ma
plus vive gratitude à toutes les personnes de l/Unité 61
qui, de prés ou de loin, m/ont fait bénéficier de leur aide.
Enfin, je remercie sincèrement: Monsieur Puigserver et
Messieurs
les
Professeurs
Boulanger
et
Vincendon,
qui
me
font I/honneur de juger ce
travai 1.

---

4
S O M
M
A
.1
R
E
Pages
Avant propos et but du travai 1
6
Introduction générale...............................................
7
Méthodologie générale
27
PREMIERE PARTIE
Modifications des enzymes de la bordure en brosse intestinale au
cours du jeûne al imentaire chez le rat adulte
42
DEUXIEME PARTIE
Régulation par la thyroxine de l'expression de la lactase
intestinale chez le rat adulte
50
TROISIEME PARTIE
Mise en évidence d'une glycoprotéine intracellulaire enzymatiquement
inactive correspondant à la lactase
'"
58
CONCLUSION GENERALE
72
REFERENCES BIBL IORAPH lOUES •...•..............•.••.........•..•..•.••
76

---

5
TABLE DES MAT l ERES
89
DOCUMENTS ANNEXES
PUBLICATIONS
97

---

6
A v a n t - p r o p o s
e t
b u t
du
t r a v a i l .
Le travail exposé dans la présente thèse a été réalisé à
l/Unité
de
Recherche
de
Biologie
Cellulaire
et
de Physiopathologie digestive
(INSERM U61, Strasbourg), au sein de l/équipe développée par Francis RAUL.
L/objectif
général
de j/équipe concerne j/étude des mécanismes impliqués
1
dans l'adaptation des fonctions digestives sous J/effet
des
hormones
et
des
nutriments. Notre travail de thèse porte sur l/étude de la régulation
1
de la lactase intestinale chez le rat adulte
et
se
subdivise
en
trois
1
parties:
1
La première partie est consacrée à la recherche d/une stimulation
spécifique de la lactase intestinale.
1
La deuxième partie concerne
plus
particul ièrement
l/étude
des
1
mécanismes impliqués dans la régulation de cette stimulation.
La
troisième
partie
porte
sur
la
mise
en
évidence dans le
1
compartiment intracellulaire d/une glycoprotéine de haut poids moléculaire
1 .
enzymatiquement inactive correspondant à la lactase.
Dans
l/exposé de nos travaux, les résultats sont discutés au fur
1
et à mesure de leur analyse.
1
1
1
1
1

---

". -.'
7
l
N
T
R
0
D U C
T
I O N
G
E
N
E
R
A L E

---

8
A
1. Notions générales sur la structure et la fonction de l'intestin grele
du rat.
1.1. Organisation structurale.
La muqueuse de l'intestin grêle se compose de trois zones
la
muscularis
mucosae, qui est constituée par une couche peu
épaisse de cel Jules musculaires séparant la muqueuse de la sous muqueuse.
la
lamina
propria,
qui
comble
l'espace
compris
entre
la
muscularis
mucosae et l'épithél ium intestinal, est composée de différents
types cel luI aires (fibroblastes,
macrophages,
lymphocytes,
mastocytes).
El le contient également des fibres de collagène, nerveuses et musculaires.
D'autre part, el le comprend
le
système
vasculaire
et
lymphatique
des
vi 1losités.
- ]'épithél ium intestinal, composé d;une seule couche de cel Iules
cyl irtdriques, . forme
les
villosités
et
les
cryptes.
Il
assure
les
principales
fonctions de l'intestin. L'épithél ium intestinal est soumis à
un renouvellement constant et rapide
dont
la
vitesse
est
fonction
de
l'espèce considérée environ 48 heures chez le rat (Lipkin, 1981).
Ce
renouvellement
résulte
d'une
prolifération cellulaire très
active au niveau des cel Jules des cryptes accompagnée d'une migration
des
cellulès
le
long
de
l'axe vi 1 lositaire. Quand elles atteignent le pOle

---

;
:-
. f< .• ; :~. ,."
"~. " "
• ~ !._.
,' ". !
,~. ~ .'
. { 9
apIcal
des
vIllosItés,
les
cel Iules
sont
lIbérées
dans
la
lumIère
IntestInale.
Le processus dé divisIon cellulaIre est IntImement lIé à la
mIgratIon
et
à
la
dIfférencIatIon
cellulaIre
le
long
de
1/ axe
villositaire. AInsi, tout facteur agissant sur la prolIfératIon ~eliulaire
est
susceptIble
d/entratner
des
modificatIons
structurales
et
fonctIonnelles de la muqueuse intestinale.
L/épIthélium
Intestinal
est
constItué prIncIpalement de quatre
types cellulaires
(Figure 1) :
- l/entérocyte, est la cellule la plus représentée
(90
à
95%).
Cette
cellule
hautement spécIalIsée assure les fonctIons Intestinales de
dIgestIon et de sécrétIon. La bordure en brosse, quI est constItuée par un
replIement
de
la
membrane - apIcale,
contient
toutes
les
hydrolases
," implIquées dans les phénomènes de dIgestion.
- la cellule à mucus (envIron 6 %) est présente tout le
long
de
I/axe
crypto-villositaire.
Elle
est
caractérisée
par
la
présence de
nombreux grains de mucus dans sa partie apicale. Les mucines élaborées
et
sécrètées
par
ces
cellules ont essentiellement un rOle protecteur de la
muqueuse intestinale.
- la cellule de Paneth (envivon 3 à 7
%),
sItuée
au
fond
des
cryptes
de
I/intestin
grêle, possède des granules apicaux denses, et un
rétIculum endoplasmique granuleux abondant. Son rOle physiologique
est
à
I/heure
actuelle
encore mal défini. Cependant la présence de lysosyme et
d/immunoglobuline A dans
ces
cellules,
suggère
leur
Intervention
en
~ réponse à une prolifératIon microbIenne et à une stimulation antIgénIque
(Rodning et coll., 1982).

---

10
10 fi
I-------l
~ rf. en térocy te
....... t à mucus
......c( t
endocrine'
Paneth
e
epi thelium
Ip : lamina propria
Fig. 1
•. Structure de la villosité intestinale

---

Il
- la cel Iule endocrine <environ
0,6
%),
présente
à
tous
les
niveaux
de
I/épithélium,
possède de nombreux granules de sécrétion dont
I/aspect
caractérise
le
type
cellulaire.
Ces
cellules
ont
un
râle
physiologique
important
car
el les permettent la sécrétion spécifique de
nombreux peptides régulateurs des fonctions intestinales.
1.2. Maturation des cellules épithéliales le long de l/axe
vi llositaire.
L/ axe vi 1lositaire peut être subdivisé en trois zones suivant les
caractéristiques
morphologiques
des· cel lules
épithél iales
absorbantes
<entérocytes) décrites par Leblond et Cheng (1976).
- la zone des cryptes,
située
au
fond
de
la
villosité,
est
constituée
de
cellules
indifférenciées.
Le
noyau
qui
contient de la
chromatine diffuse est situé au pâle basal de la cel lule. La
présence
de
nombreux
ribosomes libres et la rareté des organites intracytoplasmiques,
tels l/apparei 1 de Golgi, les mitochondries et le réticulum
endoplasmique
caractérisent
ces
cellules.
Le système microvi] lositaire apical est peu
développé. Ces cel lules sont capables de se diviser.
- la zone de différenciation, localisée à la partie basale de
la
vi 1losité,
constitue
une
zone
intermédiaire
entre
les
cryptes et la
vi J losité, où les ceJlules
acquièrent
une
forme
plus
cylindrique.
Le
cytoplasme s'enrichit en organites intracellulaires et les microvillosités
augmentent en tai 1 Je et en nombre.
- la zone des entérocytes matures,
est
située
dans
la
partie
latérale
et
apicale
de
la
vi 1 losité.
La partie la plus apicale de la

---

12
vi 1losité est la zone de desquamation cellulaire. Ces
ce] Iules
possèdent
une
forme
cyl indrique.
El les
sont
polarisées
et sont essentiel lement
caractérisées par la présence à leur pôle apical d/une bordure
en
brosse
formée
de
microvi 1 losités
dont] /axe contient les éléments fibrillaires
<actine,
fi laments
intermédiaires)
qui
constituent
le
cytosquelette
<Mooseker
et
Howe,
1982).
Cette
membrane
apicale
est
composée
de
glycoprotéines dont les
parties
glycosidiques
externes
à
la
membrane
forment le gJycocalyx ou fuzz. Les entérocytes sont 1iés entre eux par des
complexes de jonctions apicaux <20nula occludens, adherens et
desmosomes)
dont
l/importance
fonctionnel le
est
grande
puisqu/ils
assurent
une
barrière sélective pour les constituants de
la
lumière
intestinale.
Le
cytoplasme
est
pourvu d/un système membranaire très développé (réticulum
endoplasmique,
apparei 1
de
Golgi,
mitochondries)
et
ne
possède
que
quelques
rares
ribosomes
libres.
Le
noyau,
qui
contient des amas de
chromatine dense, est situé au centre de la cel Iule.
La
migration
des
cel Iules
le
Jong
de
J / axe
vil 1os i ta ire
s/accompagne
de
transformations
morphologiques
et de modifications des
activités
enzymatiques.
Dans
la
zone
des
cryptes,
les
cellules
indifférenciées
possèdent
les
enzymes
nécessaires
à
la
division
cellulaire. Dans la zone de différenciation, les enzymes
de
la
division
sont
progressivement remplacées par cel les impliquées dans les phénomènes
de digestion et sont
pour
la
plupart
localisées
dans
la
bordure
en
brosse.
1.3. Organisation de la bordure en brosse.
La bordure en brosse intestinale est impliquée dans les fonctions
spécialisées
des
cel Iules
absorbantes,
tel les
l/hydrolyse
des

---

13
macromolécules al imentaires et I/absorption. L/organisation moléculaire de
la membrane de la bordure en brosse est assimi lée au modèle de la mosaique
fluide
de
Singer
et
Nicholson
(1972).
La
matrice de la mosaique est
constituée par une double couche de phosphol ipides dans laque] le
on
peut
distinguer deux catégories de proteines:
les
protéines
extrinsèques, qui sont liées à la membrane par
des liaisons électrostatiques. Ces proteines peuvent être dissociées de la
membrane
par différents traitements qui n/affectent pas sa structure. Les
chaines
01 igosaccharidiques
des
glycoproteines
membranaires
sont
exclusivement situées sur la face externe.
les
protéines intrinsèques, qui sont associées aux 1ipides de
la membrane par des interactions de type hydrophobe.
Les
enzymes
de
la
bordure
en
brosse
intestinale
sont
des
glycoprotéines qui appartiennent pour la plupart à la classe des protéines
extrinsèques. La sensibi 1 ité différentiel le des enzymes de la
bordure
en
brosse
à
divers
solubil isants
a
été
utilisée pour déterminer Je mode
d/ancrage dans la membrane, des enzymes les unes par
rapport
aux
autres
(Nordstrom, 1972 a,b ; Louvard et coll., 1973 a,b).
La
bordure
en
brosse est constituée par les microvi 1losités et
par un réseau fibriJ laire dense:
le
coussin
fibrillaire
ou
"terminal
web".
Les
microvi J losités
sont
constituées
d/un
faisceau
axial de
microfi laments qui sont composés essentiellement
de
fi laments
d/actine.
Ces
fi Jaments sont rel iés entre eux de façon périodique par la vi l line et
lafimbrine. Le faisceau axial est rel ié à la membrane des microvi 1losités
par
des
ponts
latéraux
qui
sont
composés
d/un
complexe

---

14
calmoduline
110K-CM
/'
myosine
,
filaments 1
intermédiaires
(cytokératine)
Figure 2
Représentation schématique du cytosquelette de la bordure
en brosse.

---

15
calmodul ine-protéine 110 kd.
Les filaments d'actine, se prolongent dans le coussin fibri 1laire
sous jacent, sous forme de fines radicules.
Les
radicules
sont
rel iées
entre
elles
par
un
réseau
dense
de
filaments dépourvu d'actine mais
contenant la myosine, la protéine TW 260/240, ainsi que des
fi laments
de
cytokératine (Mooseker, 1985) (Figure 2).
2.
Données récentes sur les hydrolases intestinales.
2.1. Nature et fonction des principales hydrolases de la bordure
en brosse intestinale.
Les
enzymes
hydrolytiques
de
la
bordure en brosse complètent
l'hydrolyse commencée par les enzymes saI ivaires et
pancréatiques.
El les
regroupent: les glucosidases, les peptidases et la phosphatase alcal ine.
2.1.1. Les glucosidases.
Elles
sont impliquées dans la digestion finale des disaccharides
ou de molécules plus complexes
comme
le
maltotriose
ou
les
dextrines
limites.
Les
monosaccharides
J ibérés
par
les
réactions
enzymatiques
peuvent être absorbés par la cellule intestinale.
Parmi les glucosidases, on peut distinguer plusieurs
enzymes
ou
complexes enzymatiques:
- la saccharase-isomaltase
Le
complexe
saccharase-isomaltase
est
l'une
des
protéines
majeures de la bordure en brosse intestinale. Il est composé de deux

---

16
sous-unités
(chacune
représentée
par
une
seule
chaine polypeptidique
glycosylée).
- la sous-unité saccharase (de poids moléculaire environ 120 kd) hydrolyse
les
01 igo
et
disaccharides
à
liaison« 1-4
plus
particul ièrement le
saccharose, le maltose et le maltotriose.
- la sous-unité isomaltase (de
poids
moléculaire
approximatif
140
kd)
hydrolyse
principalement
les
oligosaccharides
à
1iaison
~ 1-6
et le
maltose (Semenza, 1986). Le complexe saccharase-isomaltase est
un
dimère
appelé
communément
pro-sucrase-isomaltase dans la membrane de la bordure
en brosse. Son poids
moléculaire
est
évalué
chez
le
porc
à
260
kd
(Danielsen, 1982 ; Danielsen et coll., 1984 a).
De
plus, l'emploi combiné d'agents solubi lisants (Triton X100 et
papaine) et la mise en évidence de la séquence primaire des acides
aminés
de
la pro-sucrase-isomaltase déduite à partir du cDNA (Hunziker et coll.,
1986) ont
permis
de
préciser
le
mode
d'intégration
de
ce
complexe
enzymatique
dans
la
membrane
de
la bordure en brosse. Ainsi, seule la
sous-unité isomaltase est associée à la membrane de la bordure en
brosse.
El le
est
en effet constituée d'une partie hydrophi le externe responsable
de l'activité enzymatique, d'une
partie
hydrophobe,
local isée
dans
la
région
N-terminale, incluse dans la membrane lui servant d'ancre et enfin
d'un prolongement cytoplasmique.
- la glucoamylase.
Cette enzyme forme un complexe avec
la
maltase
(Maestracci
et
coll.,
1975
Flanagan
et
Forstner,
1977
et
1978). La glucoamylase
hydrolyse
l'amylose,
le
maltotriose
et
le
maltose
en
glucose.
La
glucoamylase a un poids moléculaire de 245 kd chez le porc (Daniel sen et

---

17
coll., 1983 a ; Danielsen et col 1., 1984 a) et de
250
kd
chez
le
rat
(Alpers
et
coll., 1986) ; el le est composée de deux sous-unités de poids
moléculaire environ 125 kd et 135 kd cSor e nsen et co l l . , 1982 ; Alpers
et
col l.,
1986). Le complexe glucoamylase a deux sites actifs, qui diffèrent
par leur stabi 1i té à la chaleur (Sjostrom et coll., 1983), La glucoamylase
semble
être,
cependant,
un
hétérodimère
similaire
à
la
saccharase,
supposant qu/i 1 y a un site actif par sous-unité.
D/autre part, Je mode d/ancrage du complexe glucoamylase dans
la
membrane
de
la bordure en brosse est mal connu. Cependant, chez le porc,
il a été montré que j/enzyme a un segment hydrophi le, suivi
par
un
long
segment
hydrophobe
servant
d/ancre dans la région N-terminale (Semenza,
1986) .
- La lactase ou f?galactosidase neutre.
La lactase est associée à une activité phJorizine hydrolase
dans
plusieurs
espèces dont le rat, le hamster et l horrrne (Schleger-Haueter et
r
coll., 1971 ; Colombo et coll., 1973). La lactase contient donc deux sites
actifs,
un
site
hydrolyse, le lactose, le cel lobiose, le cel lotriose et
faiblement la cellulose, et J/autre
hydrolyse
la
phlorizine.
Le
poids
moléculaire de la lactase amphiphi 1ique chez l/homme et le porc est évalué
à 320 kd (Semenza, 1986) ; el le est composée de deux sous-unités de
poids
moléculaire
160 kd chez le porc et l hornme (Skovbjerg et coll .. 1984). De
r
plus, le poids moléculaire de la forme hydrophi le est de 280 kd (Skovbjerg
et
coll.,
1981,
1982).
A
l heur e actuelle, on ignore l'idendité de la
r
sous-unité qui est ancrée dans la membrane,
ainsi
que
l/endroit
de
la
chaine polypeptidique où est local isé le segment hydrophobe. Les résultats
de Kenny et Maroux (1982), montrent que l/ancre traverse la membrane de la
bordure en brosse intestinale. Toutefois, on peut spéculer que la lactase

---

18
est
ancrée
dans la membrane de la bordure en brosse par Il intermédiaire
de sa sous-unité phlorizine-hydrolase, peut-être à la région
N-terminale.
Il
nia
cependant pas été
t ab l i si
les deux sites actifs sont portés par
é
des sous-unités différentes.
2.1.2. les peptidases
L/aminopeptidase N, l'enzyme la plus abondante de ce groupe,
est
présente
dans
toutes les espèces investiguées Cl/homme, le lapin, le rat
et le porc), et est composée d/un seul type de sous-unité ayant
un
poids
moléculaire
de
160
kd.
Cette
enzyme
chez
le
lapin
est
sous forme
monomèrique, et sous forme homodimèrique chez d/autres
espèces
Kim
et
Br ophy ,
1976
Feracc i
et
Maroux,
1980
Hiwada
et
coll .. 1980).
Liaminopeptidase N hydrolyse des 01 igopeptides résultant de
la
digestion
pepsique et pancréatique des protéines. Les acides aminés libres, les di-
et tripeptides ainsi 1ibérés sont absorbés et l/hydrolyse finale en acides
aminés
libres de ces peptides est effectuée par des di - et tripeptidases
intracellulaires solubles CFeracci et coll., 1981).
L/aminopeptidase N, protéine transmembranaire CKenny
et
Maroux,
1982), est ancrée dans la membrane de la bordure en brosse intestinale par
un segment hydrophobe local isé dans la région
N-terminale
de
la
chaine
po l ypep t i d l que CFeracci et coll., 1982).
Dans
le
cas
de
la
forme
homodimèrique
de
l/enzyme, chaque
monomère est ancré
à
la
membrane
par
son
propre
segment
hydrophobe
CSemenza, 1986).

---

19
2.1.3. la phosphatase alcal ine.
La
phosphatase
alcal l ne
catalyse
J/hydrolyse
des
esters
phosphoriques en mi lieu alcal in. Le
rôle
physiologique
exact
de
cette
enzyme
dans
J/intestin
est
mal
défini.
Il
est vraisemblable qu/elle
intervient
dans
j/hydrolyse
des
composés
phosphorylés
présents
dans
l/alimentation.
Il
a
également
été proposé que la phosphatase alcal ine
pourrait jouer un
rôle
dans
les
mécanismes
de
transport
de
calcium
cYosbi zava
et
col].,
1976)
ou de la t.hiamine CMatsuda et coll .. 1978).
Chez le rat, le poids moléculaire de la phosphatase alcaline est évalué
à
145 kd CSeetharam et coll., 1977).
2.2. Biosynthèse des enzymes de la membrane de la bordure en
brosse intestinale.
Les
glucosidases
et les peptidases de la bordure en brosse sont
toutes des glycoprotéines et leur biosynthèse se déroule suivant un schéma
similaire.
Dans
la
plupart
des cas étudiés, les deux liaisons N- et 0-
glycosidiques ont été trouvées CNoren et co] 1., 1986 ; Massey
et
Maroux,
1985) .
Les
précurseurs
enzymatiques,
N-
glycosyJés
et
fortement
mannosylés,
se
déplacent
du
réticulum
endop]asmique
rugueux
vers
l 'apparei 1
de
Golgi CHubbard et l ve t t , 1981). La g]ycosyJation terminale
qui consiste en la perte de la
plupart
des
résidus
de
mannose
et
la
fixation du galactose, du fucose et de 1'acide sial ique CHubbard et Ivatt,
1981),
ainsi
que
la
0-
glycosylation
ont
lieu
dans
les
membranes
Golgiennes,
conduisant
aux
formes
finales des enzymes de la bordure en
brosse.

---

20
Le cytosquelette de I/entérocyte doit permettre le transport
des
enzymes
vers
la
bordure
en
brosse,
ce
transport
s/effectuant
vraisemblablement sous forme de vésicules (Danielsen et coll., 1986) ; les
microtubules
devraient
être
directement
impl iqués
dans
le
transport
post-golgien (Quaroni et coll., 1979; Danielsen et
coll.,
1983
b) .
Le
mécanisme
intrace! iulaire du tri des enzymes de la membrane de la bordure
en brosse reste cependant encore inconnu.
2.2.1. La saccharase-isomaltase.
De nombreuses études ont montré que la saccharase-isomaltase
est
,
~f2"Ar--~ ~ .~"',
synthétisée en une seule chaine polypeptidiquer~d)e'_poi-dsriio'héculaire260 kd
s-. /
", -,,,-
.c0
-,
:,'\\
chez le porc et ) 1 homme (Sjostrom et col]., f1~980
; .,Daniè,ls~~n
et
coll.,
l''J \\ C p.. I~-_ 1
\\
1982
Hauri et coll., 1982 ; 1985;
Skovb\\~e.r~î982), Jt;;~2'30 kd chez le
\\CÇ. -.-,
/ ' " r
ra t ( '" 1
t
11
1986)
.
t
. t
'\\"'1"
r. pers e
C O . ,
,
qUI es. ensu i e
'é~
J~~I
b
d
l
r
c~~~~~~~a mem rane
e
a
bordure
en brosse par des protéases pancréatiques en deux sous-unités non
identiques (Riby et Kretchmer, 1985).
La pro-saccharase-isomaltase a les mêmes proprietés
catalytiques
et
immunologiques
que la saccharase-isomaltase finale ce qui suggère que
la
forme
pro-saccharase-isomaltase
et
le
complexe
final,
ont
des
structures
secondaires
et
tertiaires
très
similaires
ou
identiques
(Sjorstrom et coll., 1980 ; Hauri et coll., 1982).
2.2.2. La glucoamylase.
Cette enzyme est synthétisée en une seule
chaine
po]ypeptidique
précurseur
de
poids moléculaire 260 kd chez le pigeon (Prakash et coll.,
1983), et 245 kd chez le porc (Danie)sen et coll., 1983a), qui est
cl ivée

---

21
dans
la
membrane
de
la
bordure
en brosse en deux sous-unités par les
enzymes pancréatiques. en particul ier par ]/élastase (Semenza. 1986).
2.2.3. La lactase.
Le cas de la lactase est quelque peu différent.
En
effet,
chez
l homme
(Skovbjerg
et
coll., 1984) et chez le porc
r
t Dan l e l sen et coll.,
1984b), la lactase intestinale est synthétisée en un polypeptide de
poids
moléculaire
245 kd. qui est intracel lulairement cl ivé en deux sous-unités
identiques. Cette hypothése est corroborée par les résultats de
Hauri
et
coll. (1985a)selon lesquels le clivage de la lactase serait indépendant de
la présence des protéases pancréatiques et devrait déjà avoir lieu dans le
compartiment
intraceJ lulaire.
Il
convient
de
noter
que
ce
cl ivage
protéolytique a ] ieu aprés
la
glycosyJation
du
complexe
et
comme
un
événement
post-golgien. La leupeptine inhibiteur des endoprotéases inhibe
le cl ivage protéolytique mais n/empêche pas le transport de l/enzyme
vers
la
membrane
de
la
bordure
en
brosse
intestinale.
En présence de la
Jeupeptine. la lactase qui apparait dans la
membrane
de
la
bordure
en
brosse a un poids moléculaire de 260 kd, indiquant que la protéolyse n/est
pas essentiel le pour le transport (Danielsen et coll .• 1984 b).
2.2.4. L/arninopeptidase N.
De nombreux résultats concourent à montrer que I/aminopeptidase N
intestinale
est
synthétisée
en
un
polypeptide
précurseur
de
poids
moléculaire 166 kd chez le porc et l horrme t Dan l e l sen , 1982 ; Danielsen et
r
coll..
1983
a,b; Danielsen et coll., 1984 a ; Hauri et coll .• 1985a),et
130 kd chez le rat (Ahnen et coll., 1982
1983),
celui-ci
est
ensuite
cl ivé
en
ses polypeptides constitutifs dans la membrane de la bordure en

---

22
brosse par des protéases pancréatiques.
3.
Régulation des enzymes de la bordure en brosse intestinale chez le
rat adul te.
3.1. Facteurs hormonaux.
Contrairement à ce qui se passe
pendant
la
période
néonatale,
I/activité
des
enzymes
de la bordure en brosse chez le rat adulte n/est
pas régulée par les glucocorticoides. Ainsi, ] lactivi té de
la
saccharase
n/est
pas
modifiée
par
des
administrations d/hydrocortisone ou par la
surrénalectomie CDeren et coll., 1967).
L/induction du diabète expérimental chez le rat
adulte
provoque
une
augmentation
de
I/activité
des
disaccharidases.
Des
injections
dl insul ine normal isent
les valeurs de ces enzymes.
L/augmentation
de
la
saccharase
est
due
à
une
diminution
de la vitesse de dégradation des
molécules enzymatiques CKoldovsky, 1981). Cependant
dans
les
conditions
normales
]/effet
de j/insu] ine sur les activités des disaccharidases nia
pas encore été prouvé, Il intestin grêle semble
cependant
être
un
tissu
relativement insensible à j/insul ine CPuigserver et coll., 1986).
11
existe
des
données
contradictoires
dans
la
littérature
concernant J/effet
des
hormones
thyràidiennes
sur
les
activités
des
disaccharidases
intestinales.
Certains
ont
suggéré
que
les activités
spécifiques de la saccharase
et
de
la
lactase
sont
augmentées
après
injections
de
thyroxine.
Par
contre,
d'autres
travaux ont montré que
]/administration de
thyroxine
nia
aucun
effet
sur
]/activité
de
la
saccharase, et diminue ]/activité de la lactase CKoldovsky, 1981).

---

23
3.2. Facteurs nutritionnels.
De
nombreuses
études
ont
été
entreprises
afin de déterminer
l'effet des substrats nutritionnels. El les concernent essentiellement
les
effets
des
hydrates
de
carbone
et
des
protéjnes
sur l'activité des
disaccharidases et des peptidases intestinales.
3.2.1. Effet des hydrates de carbone sur la saccharase.
Il a été montré gue ]' ingestion
du
saccharose
ou
du
fructose
augmente
de
façon
significative les activités de ]a saccharase et de la
maltase. Ces observations sont valables aussi bien chez le
rat
adulte
Deren
et coll., 1967) gue chez l'homme (Rosensweig et cc l l . , 1968, 1969
Rosensweig, 1975).
Cette stimulation a pu être également obtenue ln
vitro
dans
le
cas
d'explants
de
muqueuse
intestinale
maintenus
en culture (Raul et
coll.,
1981).
Le
site
ce] lulaire
d'action
du
saccharose
correspond
essentiel ]ement
aux
cel Iules
immatures
des cryptes et de la base de la
v i Il osi té. En effet, 1e saccharose provoque une augmentati on de l' acti v i té
de la saccharase principalement dans ces ce] luJes alors qu'une stimulation
plus faible s'exerce au niveau
des
cel Jules
matures
du
sommet
de
la
vi] losité (Ulshen et Grand, 1979 ; Raul et coll., 1980). Le saccharose est
capable d'induire une néosynthèse de
molécules
de
saccharase
dans
les
cel Jules
cibles
CRau 1
et
col 1., 1980 ; Cézard et co l l . , 1983 ; Riby et
Kretchmer,
1984).
Ces
phénomènes
adaptatifs
sont
également
sous
la
dépendance
d'une
néosynthèse d'ARN cellulaires (Raul et col J., 1982). Le
saccharose présent dans la lumière intestinale pouvant stimuler j'activité
des
ARN
polymérases
impl iquées
dans
la
synthèse des ARN messagers et

---

24
ribosomiques
CRaul
et
Von
der
De cken ,
1985).
Il
est
cependant
vraisemblable
que
la
stimulation de la saccharase fasse en fait appel à
toute une
série
de
modifications
intervenant
en
cascades
allant
de
l'expression
génique
aux
mécanismes impl iqués dans la glycosylation, le
transport intracel lu]aire et ]' intégration dans la bordure en brosse.
3.2.2. Effet des hydrates de carbone sur la lactase.
L'administration
d'un
régime
hyperglucidique
contenant
du
saccharose
ou
d'autres
hydrates
de
carbones
(glucose,
fructose,
galactose ... ) peut provoquer une augmentation de l'activité de la
lactase
intestinale
(Bustamante
et
coll.,
1981
Goda et coll., 1984). Cette
stimulation, qui n'est pas spécifique à la
lactase
dans
les
conditions
expérimentales
uti 1isées
puisque
les
autres
disaccharidases ont leurs
activités également augmentées, est accompagnée par une élévation du
taux
de
lactase
immunoréactive.
L'augmentation de l/activité de la lactase a
lieu dans
les
cel Iules
matures
de
la
vi 1Josité,
indiquant
que
des
mécanismes
différents sont impl iqués dans la régulation nutritionnel le de
la lactase et de la saccharase
CRaul
et
col J.,
1980,
Goda
et
coll.,
1985) .
3.2.3. Effet des protéines sur I/aminopeptidase N.
L'administration
d'un
régime
hyperprotidique
induit
une
augmentation
concomitante
de
l rac t i vl t.é
et
de
l'immunoréactivité
de
l arn i nopep t l dase
(Gaucher
et
Puigserver,
1985).
Cette
stimulation
r
nutritionnel le s'exerce principalement dans les cel Iules matures du sommet
de la vi llosité CF. Raul, communication personnel le).

---

25
4.
Données actuelles sur l/évolution de la lactase intestinale et
l/hypolactasie de l/adulte.
4.1. Evolution enzymatique.
Au
cours
de
la
phase
foetale
ont
1ieu
des
modifications
fonctionnelles qui vont permettre à la muqueuse intestinale d/être adaptée
à l/al imentation lactée que l/animal recevra à
la
naissance.
En
effet,
chez
le
nouveau-né,
le
seul
sucre
présent dans j/alimentation est le
lactose.
Ainsi,
chez
le
rat,
l/activité
lactasique
présente
dans
l'intestin
dès
le
18e
Jour
de gestation atteint son taux maximum à la
naissance alors qu/il n/existe pas encore d/activité saccharasique
(Doell
et
Kretchmer,
1962).
Pendant
la
phase
néonatale qui s/étend Jusqu/au
sevrage
(3e
semaine
de
vie
post-natale),
l/activlté
de
la
lactase
Intestinale
diminue
et
atteint
les valeurs faibles caractéristiques de
l/adulte. La diminution de cette activité va de pair avec l'apparitlon
de
l'actlvlté
saccharaslque
qui
permettra
à
j/lntestln
de
s/adapter
à
l/alimentation riche
en
hydrate
de
carbone
caractéristique
de
l/Age
adulte.
Chez
l'homme
l'actlvlté
de la lactase faiblement présente dans
l/Intestln dès le deuxième mols de gestation (Lacroix et coll., 1984)
est
maximale
à
la
naissance
(Aurrlcchlo
et
coll.,
1965, Grand et coll.,
1976).
4.2. L/hypolactasie Intestinale de l/adulte.
Le déclin de l/actlvité de la lactase intestinale est bien établi
chez
la
plupart
des mammifères (Sahl, 1978). Il était communément admis
que l/espèce humaine
possède
une
activité
lactaslque
élevée
à
l/âge
adulte.
Cependant,
Il
est maintenant prouvé que le niveau de l'activlté

---

26
lactasique diminue d/une façon importante à l/Age adulte dans
70%
de
la
population mondiale (Johnson, 1981).
Ce
décI in
peut
survenir
à
j/Age de 5 ans chez les enfants de
l/Europe du Nord (Welsh et coll., 1978) et dès l/Age de
2
ans
chez
les
enfants
noirs
et
asiatiques
(Keusch
et
coll., 1969). La distribution
géographique des déficiences en lactase
à
l/Age
adulte
montre
que
si
seulement 10 à 15% d/Européens du Nord sont déficients en lactase, ce taux
peut atteindre 95% dans les populations asiatiques et
africaines
ou
les
populations noires américaines d/origine africaine (Flatz et coll., 1982).
L/hypolactasie
de
type
adulte
entraîne
des
troubles
importants
de
malabsorption
après
ingestion
de
lait (Auricchio et coll., 1963). Pour
expliquer le maintien d/une activité lactasique à l/Age adulte j/hypothèse
la
plus
avancée
est
cel le
d/une mutation sur le gène régulateur de la
lactase empêchant l/arrêt normal de la synthèse de l'enzyme et
permettant
ainsi la persistence d/une activité lactasique élevée pendant toute la vie
de l'individu CFlatz et co l l ; , 1986>-
Plusieurs
hypothèses
ont
été
proposées
pour
expliquer
le
mécanisme du déclin de l/activité de la lactase intestinale chez l/adulte.
Il a été suggéré que le gène de la lactase serait un gène "temporel"
dont
l'activité
serait
négligeable
chez
l'adulte (Enck et Whitehead, 1986).
Certains ont proposé que la synthèse de la lactase serait faible et que le
catabol isme
de
l'enzyme
serait augmenté spécifiquement (Crane et col l"
1976 ; Skovbjerg et coll., 1980). Par contre, Tsuboi et coll.
(1981)
ont
suggéré
que
la réduction de la vie de J/entérocyte à l/Age adulte serait
responsable en partie de la chute d/activité de
la
lactase
intestinale.
Enfin
pour
Jonas
et
col l,
(1985)
une modification dans la vitesse de
synthèse de la lactase pourrait jouer un rOle dans la
diminution
de
son
activité.
En fait, les mécanismes moléculaires du déclin de l/activité de
la lactase intestinale après le sevrage restent à être élucidés.

---

27
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D O L
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G
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G
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,
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\\\\

---

28
Seules
les techniques ayant nécessité des mises au point spécifiques pour
notre étude seront détail Jées dans ce chapitre.
1. Matériel Biologique.
Nos travaux ont été éffectués sur j/intestin de rats
adultes
et
de
rats
nourrissons élevés au laboratoire (rats de souche Wistar). L/&ge
et le nombre
des
animaux
utilisés
varient
en
fonction
du
protocole
expérimental
uti lisé.
La majorité de nos expérimentations a été réalisée
sur
le
jéjunum
proximal,
celui-ci
étant
le
plus
riche
en
enzymes
digestives (Semenza, 1968).
2. Technique d/isolement séquentiel des cel Iules épithéliales
intestinales le long de l' axe crypte-villosité.
Le
principe de la méthode est basé sur le détachement progressif
des cel Iules du sommet de la villosité jusqu/à la base
des
cryptes
des
incubations
successives
dans
une
solution
dissociante (Raul et col l.,
1977). Aprésprélévement de segments de jéjunum proximal (20 cm),
ceux-ci
sont lavés dans une solution de NaCI 0,9% et retournés sur une baguette de
verre. Chaque segment est placé
dans
un
flacon
contenant
5
ml
d/une
solution
saline
tamponnée
pH
7,2
(PBS) dépourvue d/ions Ca++ et Mg++,
contenant de l'EDTA 1,5 mM et du dithiothreitoJ 0,5 mM. La préparation est
incubée
à
37°C
dans
un
bain-marie
NEW
BRUNSWICK sous agitation (150
agitations par minute). Toutes les 10 minutes,
le
mi 1 ieu
contenant
les

---

29
cel Jules
épithéliales
! ibérées
du
tissu
est
receui IIi. Les fractions
cellulaires sont lavées deux fois dans un mi 1 ieu
de
culture
synthétique
Ham
flO ou dans une solution PBS contenant des ions Catt et Mgtt, dans le
double
but
de
restaurer
une
concentration
ionique
physiologique
et
d'empêcher
toute
action
de
l'EDTA
résiduel.
Après
chaque lavage, la
suspension cellulaire est centrifugée à 900 g pendant 10 minutes à 4°C. Le
culot
cellulaire
ainsi obtenu est congelé à -20·C jusqu'à j'exploitation
biochimique survenant dans un délai de 48 h au maximum.
Les culots cellulaires correspondant
aux
différentes
fractions
sont
remis
en
suspension et homogéneisés dans du tampon Tris-Mannitol:
Mannitol 50 mM, Tris 2 mM, pH
-
1
(
,
.L
•
Les
activites
enzymatiques
et
ies
protéines
sont déterminées dans les homogénats de chaque culot cel lulaire
et sont exprimées en fonction du pourcentage de cel Jules
isolées.
Ainsi,
la
proportion
relative
de
cel Jules
isolées
à
un
niveau
de
j'axe
vi 1 lositaire est estimée par le contenu protéique de toutes les
fractions
obtenues jusqu'à ce niveau exprimé en pourcentage.
La
détermination
des activités enzymatiques permet de mettre en
évidence des gradients enzymatiques le long de l'axe
villositaire
et
de
définir des compartiments cellulaires <Raul et coll., 1977, 1980).
3. Techniques de dosaqes enzymatiques.
Les
enzymes
étudiées
sont
essentiel Jement
les
marqueurs
Spécifiques de la
bordure
en
brosse
lactase,
maltase,
saccharase.
aminopeptidase
et phosphatase alcal ine. Les activités de la saccharase et
de la maltase sont déterminées selon la méthode
de
Messer
et
Dahlqvist
(1966).
Le
dosage
de
l'activité
de
la
lactase est effectué selon la
technique
de
Koldovsky
et
coll.
(1969)
en
présence
de
p-chloromercuri-benzoate <PCMB, 20 mM) pour inhiber l'activité de la

---

30
pgalactosidase acide résiduel le. L'activité de
la
phosphatase
alcal ine
est
évaluée
selon
la
méthode de Garen et Levinthal (1960), le substrat
uti lisé étant le p-nitrophenylphosphate. L'activité de ]'aminopeptidase
N
est
mesurée
d'après
la
méthode
de I~aroux et co) 1. (1973), le substrat
uti 1 i sé étant la L-alal ine-p-nitroani 1 ide.
Les
activités
enzymatiques
sont
exprimées
en
activités
spécifiques
(mU/mg
protéine). Une unité enzymatique correspond à 1 pmoJe
de
produit
formé
ou
libéré
par
minute,
dans
les
conditions
de
,.
l'expérience.
Les
protéines sont dosées par la méthode de Lowry et col J.
(1951) avec ]a sérum-albumine comme standard.
4. Préparation et séparation des protéines membranaires.
4.1. Isolement des bordures en brosse.
La purification de la fraction membranaire des bordures en brosse
est réalisée selon la technique de Schmitz et coll. <19(3),
La
muqueuse
prélevée
par grattage ou les fractions cellulaires
isolées le long de l'axe vi 1lositaire sont homogéneisées dans une solution
tampon Tris-Mannitol 50 mM, Tris 2 mM pH 7,1.
Cette
homogénéisation
est complétée par ultrasonication pendant
10 secondes (Sonifier B-12, Branson).
Une
al iquote
de
J'homogénat
est
prélevée
pour
déterminer
le
contenu
en
protéines
et
les
activités
enzymatiques. Du CaC1 2 à la concentration finale 10 mM est ajouté
et
les
membranes
celluJaires
(réticulum endoplasmique, membranes basolatérales)
sont précipitées séléctivement par les ions
Ca++.
Une
centrifugation
à
1.200
g
pendant
10 minutes permet la sédimentation de ces membranes. Le
surnageant contenant les membranes des bordures en brosse est soumis à une
ultracentrifugation
à 33.500 g pendant 30 minutes. Le culot contenant les

---

31
membranes des bordures en brosse est repris par 50nication dans 250 à
500
~I
d/eau
ultrapure.
Les
protéines
et
les activités enzymatiques sont
déterminées sur cette fraction.
Le fait que les bordures en brosse ne soient pas affectées par la
concentration
en ions Ca++ semble indiquer que leur électronégativité est
moins importante que cel le des autres membranes. En
dehors
du
fait
que
cette
technique
de
purification des bordures en brosse. mise au point à
l'origine sur l r i nt est l n humain,
est
rapide
et
reproductible.
elle
a
l'avantage
de pouvoir s/appl iquer à de nombreuses espèces animales (rats,
hamster,
1 ap in,
etc ... ) .
Les
bordures
en
brosse
sont
faiblement
con t arn l nees
par
G
autres s t ruc t ur es surJceilulaices ainsi que l/ë.ttestent
la détermination des activités
enzymatiques
résiduel les
de
la. lactase
deshydrogénase
LDH
(enzyme
caractéristique
de la phase soluble>. de
J/ATPase Mg++ dépendante (mitochondries) et de ]/ATPase Na+ Kt
dépendante
(membranes
basoJatérales>
(F.
Raul
et
co l l . ,
1978).
Le
degré
de
purification est estimé par j'augmentation des activités
spécifiques
des
enzymes marqueurs de la bordure en brosse (saccharase, lactase).
4.2. Préparation des membranes intracellulaires.
La
technique
de
préparation des membranes intracel iuJaires est
réal i sé e selon Ja méthode de Danielsen et col]. <1981 a.) ,
La fraction membranaire précipitée avec du CaCl~ obtenue au cours
de la purification des bordures en brosse est remise en suspension dans Je
tampon Tris-Mannitol, contenant du CoCI:z.. 10 mf'1 et centrifugée
à
j.500
9
pendant
15
minutes. Le culot obtenu est remis en suspension dans le même
tampon et centrifugé une dernière fois à 1.500 g. Le culot est ensuite mis
en
suspension dans du tampon Tris-HCI 5 mM pH 7,1 et centrifugé à 4.000 g
pendant 15 minutes. Le culot membranaire est remis en suspension
dans
du

---

32
tampon
Tris-HCI
5
mM
pH
7,1
contenant du triton X-IOO à 1% et incubé
pendant 30 minutes à 37'C.
Après
une
ultracentrifugation
à
100.000
9
pendant
30
minutes,
le
surnageant
obtenu
contient
les
protéines
solubi 1 isées des
membranes
intracellulaires.
Le
surnageant
subit
une
succession
de
di lutions
et
de
concentrations à l'aide d'une cartouche
fi ltre (Mi 11 ipore) dans le but d'obtenir une di lut ion de 30 x par
rapport
à
la
conce~tration
initiale.
Finalement
]'échanti 1 ion
est ]yophil isé
pendant la nuit et ensuite repris dans 1 ml d'eau ultrapure.
5. Purification de la lactase.
Toutes les étapes de la purification sont effectuées à
4'C· sauf
exceptions. Le jéjunum entier est prélevé sur des rats nourrissons agés de
15 jours. Les segments sont ouverts et lavés avec une solution de
NaC!
à
0,9%
et
homogéneisés
dans
Je tampon Tris-Mannitol. Les membranes de la
bordure en brosse sont isolées de l'homogénat
de
muqueuse
comme
décrit
antérieurement
(paragraphe
4.1.). Le culot contenant les membranes de Ja
bordure en brosse
purifiées
est
remis
en
suspension
dans
un
tampon
phosphate
la
mM
pH
6,0 (Tampon A). Les membranes sont ensuite incubées
avec de la papaïne insoluble (Sigma Chemical Co.) à la concentration de la
p9 de papa1ne par mg de protéine pendant 30 minutes à 37"C dans un
bain-marie
sous
agitation.
La
fraction
contenant
les
protéines
solubl 1 isées est récupérée après une centrifugation de 30 minutes à
20.000 g.
Le
surnageant,
apres
concentration
par
ultra-filtration.
est
dépOSé sur une colonne d'agarose I,S x 100 cm (Bio-Gel A-IS m
Bio-Rad)
prééqui 1ibrée
dans
le
même
tampon A. Nous avons choisi l'agarose comme
support
chromatographique,
car
cette
matrice
est
composée
de
polysaccharides possédant des 1 iaisons ;3 1-4 glycosidiques. La lactase qui

---

33
est
une r-galactosidase sera ainsi retardée par des interactions avec la
matrice faci 1itant ainsi sa séparation des autres glucosidases en dépit du
poids
moléculaire
simi Jaire
de
toutes
les hydrolases de la bordure en
brosse. Un pic majeur de lactase est ainsi élué à un volume
d/élution
de
112 ml
(Publication D. Figure n.
Les fractions du pic de la lactase issues de la colonne d/agarose
sont rassemblées et ensuite fractionnées sur une colonne
d/hydroxyapatite
x
9
cm
(HA
ultrogel
; IBF). L!hydroxyapatite. qui est une forme de
phosphate de calcium cristal] isée. retient sélectivement
la
lactase
qui
est
éluée
à une concentration de 150 mM en tampon phosphate (Publ ication
D, F i gurel b ) .
Les
fractions
du
pic
de
la
lactase
issues
de
la
colonne
d/hydroxyapatite
sont
ensuite
dialysées
et
concentrées. Les protéines
obtenues au cours des différentes étapes de
purification
sont
analysées
par électrophorèse sur gel de polyacry]amide (Publ ication D, Figure 2>.
5.1. Immunisation des animaux et tests immuno-enzymatiques.
Une
al iquote de lactase purifiée (50 ~g) est di luée dans du NaCl
à 0,9% mélangée à de j/adJuvant de
Freund
complet
et
est
injectée
de
manière
sous-cutanée en 4 points à des lapins. Une deuxième injection est
réa 1i sée après 28 jours. Le sang est r ecue i Iii au niveau de
1a
ve i ne
de
I/orei 1le
10 jours après la dernière injection. Après coagulation du sang
et rétraction du caillot, le sérum est récupéré et conservé à -20·C.
Nous
avons
etudie
le
sérum
anti-lactase
par
une
technique
immuno-enzymatique
uti J isant
le
test
indirect
ELI Sl>,.
selon
une
modification de la méthode de Clark et Adams ( 1977) .
La lactase
pure
(6
fg/ml ) est
adsorbée
sur
une
plaque
en
polystyrène
( SARSTEDT) ,
3
heures
à
température
ambiante.
Lr excè s

---

34
d'antigène
est lavé avec un tampon PBS-Tween pH 7,2 (NaC] 140 mM ; KH~ PO~
1,5 mM ; Nat HP0l;- 8 mM ; Tve en 20 0,05%),
Des
dilutions,
dans
ce
même
Lampon,
du
sérum
anti-lactase
à
tester
sont
ensuite deposées sur la
plaque. Après développement de la réaction antigène-anticorps (3 heures
à
température
ambiante), les anticorps n/ayant pas réagi sont lavés avec le
tampon PBS-Tween. La quantité d'anticorps anti-lactase fixée
est
révélée
grace
à
la
fixation
pendant 18 heures à 4'C d'un deuxième anticorps de
chèvre antl-IgG de lapin,
marqué
à
la
peroxidase.
Aprés
addition
du
substrat, ABTS (2-2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazol ine sulphonate»
1 m~/ml,
l'enzyme
développe
en
présence
d'eau
oxygénée,
une
coloration
dont
j'intensité
est
proportionnelle
à
la quantité d'anticorps anti-Iactase
fixée. La réaction est arrétée avec de iazide de sodium
à
0,01%
et
la
densité optique de chaque échanti] lon est mesurée à 410 nm.
Dans le but d'obtenir une courbe standard servant à déterminer la
quantité de lactase dans un échantillon biologique, nous avons réalisé
le
test
de
compétition
qui consiste à préincuber l'antisérum di lué 1/l000e
avec des concentrations connues et croissantes d'antigène al lant de
0,01 p9 à 10 jJg/ml (Publication D,Figure 3~,
6. Technique de séparation et d'identification des protéines membranaires
après électrophorèse.
6.1. Electrophorèse.
La
séparation
des
protéines
membranaires
est
réal isée
par
électrophorèse
sur
gel
de
polyacrylamide soit sur des gels homogénes à
7,5%,
soit
sur
des
gradients
4-12%
d'acrylamide
en
présence
de
dodecylsulfate de sodium (SDS) à 0,1% selon la méthode de Laemml i (1970),
Les bordures en brosse ou les protéines des membranes

---

35
intracellulaires
sont
incubées en présence d/un tampon Tris-HCI 60 mM pH
6,8 ; SDS 3%
glycérol 10% ; bleu de bromophénol 0,001%. Après 10 minutes
dl incubation à 25·C, en fonction des expérimentations, une quantité de 100
}Jg à 200 ,)9 de protéines est déposée sur gel.
Vélectrophorèse
est
soit
réal isée
sous une intensité de 2,5 mA/gel pendant 7 heures dans le cas de
gels cyl indriques (concentration 7.5%) soit à une intensité de
30
mA/gel
pendant
4
heures
dans
le
cas
de gels en plaques (gràdient 4-12%). Le
tampon d/électrophorèse est formé de Tris-HCI 25 mM, pH 8,3;
glycine
12
mM, SDS 0, Po.
6.2. Révélation des bandes protéiques et des activités enzymatiques.
Après
électrophorèse,
les
gels
cy) indriques
sont
coupés
longitudinalement en deux parties égales. Une moitié de gel
est
uti lisée
pour
la
révélation
des bandes protéiques. Dans ce but, la moitié du gel
est fixée au TCA 12% pendan t 1a nu i t,les bandes proté i ques
son t
ensu i te
colorées
par
le
bleu de coomassie (0.25%) pendant 30 minutes à 50·C. La
décoloration
s'éffectue
à
65·C
dans
un
mélange
de
méthanol-acide
acétique-eau
(10:7:83,
V/V).
Le profi 1 protéique est déterminé à J/aide
d/un spectrophotomètre Vernon à 565 nm.
L/autre moitié de gel est congelée dans de
la
carboglace,
puis
coupée
en
tranches
de
0,5 mm à l ra i de dun "Mickle Gel Slicer" afin de
déterminer les activités enzymatiques. L/élution des enzymes se
fait
par
incubation
de
chaque tranche dans 1 ml d/eau ultrapure pendant la nuit à
4"C. Puis, sur chacune d'entre el les, sont déterminées les activités de la
saccharase
et
de
la
lactase.
Les
déterminations
enzymatiques
étant
semi-quantitatives, les résultats
sont
exprimés
en
un i t es
arbitraires
(densité
optique>,
La
comparaison
des
mobilités
relatives
(RF)
des
différentes bandes protéiques et des pics d'activités enzymatiques
permet

---

36
d'établ ir de manière précise la superposition d'une ou plusieurs activités
enzymatiques et d'une bande protéique.
Bien
que
ces
techniques
aboutissent
à
des
résultats
trés
reproductibles
et
très satisfaisants pour la séparation des protéines de
haut poids moléculaire, ei les ont
plusieurs
1imitations
techniques
qui
méritent d'être précisées.
6.2.1. Problèmes liés à l/emploi du détergent.
Il
est
bien
connu
que
le
SDS,
qui
permet
une
excellente
solub! 1 isatiün
des
protéines
rnernbr aria i [es,
! " j nc onve n j er: t
d'inhiber ou d'inactiver une éventuel le activité enzymatique. Néanmoins du
fait de leur nature glycoprotéique, les enzymes de la
bordure
en
brosse
intestinale
présentent
une
assez grande résistance au traitement par Je
SDS. Il convient également de remarquer que II influence
du
SDS
sur
les
différentes enzymes de la bordure en brosse n'est pas uniforme CMaestracci
et co! J., 1975).
Ainsi, les disaccharidases manifestent des sensibi 1ités variables
face
à
J'action
du
détergent, mais leurs activités enzymatiques peuvent
être mesurées sur geJ. Cette différence de
sensibi 1ité
au
SDS
pourrait
provenir
des
) iaisons
plus ou moins importantes de ces enzymes avec les
) ipides membranaires, ) iaisons qui seraient nécessaires dans certains
cas
pour
assurer
leur
stabilité et leur fonction. Cette technique ne pet-met
donc pas de rel ier quantitativement l'intensité d'une bande protéique avec
le niveau réel de son activité enzymatique. Seule une relation quaI itaLlve
peut-être étab! le.
L"éfficacité d/un autre agent solubilisant, le
Triton
X-I00,
a
également
été
éprouvée
CMaestracci
et col l., 1975 ; Boedeker et col l.,
1976). Ce détergent a
l'avantage
de
préserver
environ
70
à
90%
des

---

37
activités
enzymatiques j par contre il ne permet pas une bonne séparation
des bandes protéiques par électrophorèse. Ainsi, la solubi 1isation par
Je
Triton
X-I00 (1%) des protéines de la bordure en brosse du jéjunum humain
suivie de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Triton X-I00 à 0,1%)
permet de visual iser 5 à 6 bandes protéiques. Cependant, toutes ces bandes
restent localisées près du point d/application
de
l/échanti 1Ion
et
les
activités
des
disaccharidases
se retrouvent toutes réunies en une seule
bande protéique voisine de l/origine.
6.2.2. Problèmes liés à la correspondance entre les bandes protéiques
et les activités enzymatiques.
On
ne
peut
attribuer
avec
certitude
une
bande
protéique
exclusivement
à une protéine ou à un complexe enzymatique que dans le cas
où
l/absence
de
cette
bande
protéique
coincide
avec
j/absence
de
j/activité
correspondante.
De
tel les
observations ont été
faites d/une part chez le rat, où i/on a pu montrer
que
l/absence
ainsi
que l/apparition de l'activité de la saccharase-isomaltase est en relation
directe avec l/existence
d/une
bande
protéique
d/autre
part,
chez
l 'hom~e,
dans
des
cas
d/intolérance
au saccharose, due à l'absence de
saccharase-isomaltase, où la bande protéique qui correspond à ce
complexe
enzymatique n/est pas présente (Preiser et coll., 1974 j Schmitz et coll.,
1974, 1980)
Dans nos conditions expérimentales, la préparation de la fraction
membranaire
des
bordures en brosse ne comporte pas l/él imination du core
microfi larnentaire. Pourtant, du fait de leur faible poids moléculaire, les
protéines
de
type
actine
qui
le constituent n/ interfèrent pas avec les
protéines enzymatiques de poids moléculaire élevé.

---

38
6.3. Electrotransfert.
Après
électrophorèse,
1es
gels
en
plaques
sont
coupés
longitudinalement
en
deux
parties égales. Une moitié de gel est colorée
avec du bleu de coomassie (0,15%) pendant 1 heure à 50·C.
L/autre
moitié
est
soumise
à
I/électrotransfert des protéines du gel de polyacrylamide
vers une feui 1le de nitrocel Julose ayant une dimension de pores de 0,45 pm
suivant
la
méthode
de Towbin et coll. (1979). Le transfert est effectué
pendant 18 heures à température ambIante à une intensIté de 500 mA dans un
tampon Tris 25 m.11 pH 8,3 glycine 192 mM en présence de méthanol 20%.
6.4. Détection immunologiaue.
L/im~unodétection
des protéines sur la feui J le de nitrocellulose
est réal isée seion la méthode de Tsang et coll. (1983). La saturatIon
des
sites
de fixation non spécIfiques est effectuée en incubant la feui 1le de
nitroceJ lulose pendant 1 heure à 40·C dans du sérum normal de chèvre
dans
un
tampon PBS pH 7,2. Puis, la feui 1le de nitrocellulose est incubée avec
le sérum anti-!actase pendant 1 heure à
la
température
a~iante.
Après
incubation
avec
des
anticorps
de chèvre anti IgG de lapin marqués à la
péroxidase, les protéines im~unoréactives sont révélées
avec
0,25
mg/ml
d/o-dianisidine
en
présence
d/eau
oxygénée
à
0,01
% dans un tampon
PBS-Tween pH 7,2 (Tween 20 à 0,3%). La réaction colorimétrique est arrêtée
avec
0,1%
d/azide
de
sodium.
Le tfu~pon PBS-Tween est uti 1isé pour les
lavages entre les
incubations
et
pour
réal iser
toutes
les
di lutions
dl anticorps.

---

39
6.5. Détection des glycoprotéines.
Après
transfert
sur
feuille
de nitrocellulose, l af f i ni t
des
r
é
glycoprotéines
membranaires
pour
différentes
lectines
est
déterminée
suivant
une modification de la méthode décrite par Glass et coll. (1981).
La feui 1le de nitrocellulose est
saturée
avec
une
solution
d/albumine
bovine
à
3% préalablement traitée avec l/aci~e périodique dans un tampon
PBS pendant 1 heure à 40'C.
La
feuil le
de
nitrocellulose
est
ensuite
incubée
avec des lectines biotyni lées di luées dans du tampon PBS pH 7,2 :
Concanava l i ne A (Con A> 5 jJg/ml ;
Ul ex
europaeus
(OEA-I)
et
Phaseolus
vu l çer I s
(PHA-E>
10 JJ9/m1,
pendant
à
15
heures
à la température
amb i e.nte . La feui j Je de n i t r oce ) l u l cse est lavée 5 fois avec du tampon PBS
et
est
ensuite
incubée
pendant
30
mi nutes
avec
de
la
streptavidine-péroxydê..se
di luée
dans
du
PBS
contenant
1%
d/albumine
bovine.
Après 5 lavages, les complexes lectine-glycoprotéine sont révélés
avec 0,25 mg/ml de 3,3/ dj~TJinobenzidine en
présence
d/eau
oxygénée
à
0,01%
dans
un
tampon
Tris-Hel
50 mM pH 7,4 ; NaCl 200 ~M. La réaction
colorimétrique est arrétée avec de l/azide de sodium à 0,1%.
6.6. Interactions des lectines solubles avec des glycoprotéines
membranaires.
Dans le but de précipiter sélectivement certaines
glycoprotéines
des
membranes
intracellulaires du rat adulte ou nourrisson, une al iquote
de protéines solubi 1isées (200 ~g>
est
incubée
avec
la
même
quantité
d/Olex
europaeus
pendant 15 heures à 4·C. Les complexes lectine-protéine
sont sédimentés à 100.000 g pendant 15 minutes.
Le
surnageant
(fraction
qui
nIa pas réagi) est analysé sur gel de po]yacrylamide (gradient 4-12%>

---

40
et
transféré sur feui 1le de nitrocellulose. Les protéines immunoréactives
sont détectées sur la feui 1Je de nitrocellulose comme décrit au paragraphe
(6.4. ) .
7. Administration de précurseur radioactif et mesure de la radioactivité.
7.1. Administration de précurseur radioactif.
Dans
le
but
d'étudier la néosynthèse de la lactase au cours du
jeûne, de
la
val ine
tritiée
est
uti 1isée
comme
indicateur
pour
la
synthèse
des
protéines.
Ainsi,
500
p Ci de L- G,4 (n)_3~ val ine (38
Ci/mmol, Amersham, UK) sont injectés par voie intrapéritonéale
48
heures
avant le sacrifice.
7.2. Mesure de la radioactivité incorporée dans les protéines
enzymatigues.
Les
protéines
marquées sont séparées par électrophorèse sur gel
de polyacrylamide cylindrique. Après section
longitudinale
du
gel,
une
moitié
est coupée en tranche de 0,5 mm. Les tranches sont incubées à 50'C
dans 100 fi d'eau oxygénée jusqu'à complète dissolution du gel
(12
à
16
heures).
L'évaluation
du bruit de fond est effectuée sur les tranches de
gel postérieures au front. Les résultats sont exprimés en cpm par
tranche
de gel.
8. Administration d'inhibiteurs de la synthèse protéigue.
Dans
le
but
d'étudier
le
mécanisme
d'action
du jeûne, deux
inhibiteurs de synthèse
protéique
ont
été
uti lisés.
La
cycloheximide

---

4 l
(inhibiteur
de
la
traduction)
ou
l/actinomicyne
D (inhibiteur de la
transcription)est injectée par voie intrapéritonéale. La dose
journal ière
est de 0,5 ~g par gramme de poids corporel pour Ja cycloheximide et de 0,1
~g par gramme de poids pour l'actinomycine D. L' injection est réalisée une
fois
par
jour
pendant 2 jours. Les rats témoins reçoivent simultanément
une injection de NaCl à 0,9%.
9. Mode d/administration des hormones.
9.1. Rats adultes.
Afin d/étudier l/effet de certaines hormones sur J/expression
de
la lactase au cours du Jeûne, les rats reçoivent par voie intrapéritonéale
de J/hydrocortisone di luée dans du NaCI à 0,9%
ou
de
la
D-L
thyroxine
dissout
dans
NaOH
10
mM.
L/hormone
est administrée une fois par Jour
pendant 3 Jours
avant
Je
sacrifice.
T -
~a
dose
journal ière
est
25
;;.g
d/hydrocortisone
ou
de
0,5 ~g de thyroxine par gramme de poids. Pour un
certain nombre d/animaux une thyroïdectomie est réal isée un mois avant
Je
début de l/expérimentation.
9.2. Rats nourrissons.
Dans
le
but
d/étudier
l/effet
des hormones thyroldiennes sur
l'expression
de
la
lactase
pendant
la
période
néonatale,
des
rats
nourrissons
~gés de 8 Jours reçoivent par voie intrapéritonéale de la D-L
thyroxine dissoute dans NaOH 10 mM. L/hormone est administrée une fois par
~
jour
pendant
4 jours avant le sacrifice. La dose quotidienne est de 1 ~g
par gramme de poids corporel.

---

42
PREMIERE
PARTIE
M o d i f i c a t i o n s
d e s
e n z y m e s
de
1 a
b o r d u r e
en
b r o s s e
i n t e s t i n a l e
au
c o u r s
du
.
""
-Jeune
a 1 i me n t a i r e
c h e z
l e
r a t
a d u l t e .

---

43
RESULTATS
1. Effet du jeûne alimentaire sur les activités des enzymes
intestinales (Publ ication A).
A
Modifications of brush border enzyme activities during
starvation in the jejunum and ileum of adult rats.
Raul F., Noriega R., Doffoel M., Grenier J.F.,
Haffen K. (1982). Enzyme, 28, 328-335.
2. Effets de l/actinomycine D et de la cycloheximide sur la
stimulation de Ja lactase par Je ieûne (Publication B).
B
Stimulation of lactase synthesis induced by starvation in
the jejunum of adult rat.
Nsi-Ernvo E., Raul F. (1984). Enzyme, 31, 45-49.
3. Effet du jéùne sur les profi ls protéigues et enzymatiques des
protéines de la bordure en brosse (Publication B).
DISCUSSION

---

44
RESULTATS
Chez
la
plupart
des
mammifères
l'activité
de la lactase est
maximale à la naissance et diminue pour atteindre les
valeurs
basses
de
l'adulte
au
moment
du
sevrage. Certains auteurs ont tenté de maintenir
l'activité lactasique en prolongeant la consommation postnatale de lait ou
de
lactose (Girardet et coll., 1964 ; Koldovsky 1981), cependant la chute
de l'activité lactasique n'a ainsi pu être retardée que de quelques jours.
Chez
l'adulte,
une
stimulation
de
l'activité lactasique a été obtenue
après administration d'un régime hyperglucidique pendant
plusieurs
jours
(Bustamante
et
coll.,
1981).
Cependant,
dans
ces
conditions,
la
stimulation de la lactase ne peut être considérée
comme
spécifique,
car
l'augmentation
de
l'activité des autres disaccharidases de la bordure en
brosse est parallèle à cel le de la lactase intestinale.
Nous
avons
cherché
à
définir
une
condition
physiologique
induisant
une
stimulation
spécifique
de
l'activité de la lactase dans
l'intestin grêle du rat adulte.
1. Effet du Jeûne alimentaire sur les activités des enzymes intestinales.
Les activités de l'aminopeptidase, de
la
saccharase
et
de
la
lactase sont mesurées dans le jéjunum de rat adulte au cours d'une période
de cinq jours de jeCne. Les activités enzymatiques sont déterminées
aussi
bien
dans
les
homogénats de muqueuse que dans les bordures en brosse et
exprimées en activités par la longueur Qu
segment
intestinal
(activités
segmentales)
ou
en
activités
par
milligramme
de
protéine (activités
spécifiques).
L'activité segmentale de la lactase est stimulée dans le
jéjunum

---

45
au cours du jeûne (Pub] ication A, Figure 2).
Cette
stimulation
qui
est
déjà perceptible après 24 heures de jeûne, est maximale à 48 heures. Après
cette période, l/activité diminue
progressivement
pour
atteindre
après
cinq
jours les valeurs trouvées chez les rats témoins nourris normalement
(Pub! ication A, Figure 2A). Au cours des deux premiers jours de jeûne, les
activités
segmentales de la saccharase et de l 'arninopeptidase ne sont pas
modifiées significativement quand on les compare aux vaieurs trouvées chez
les
rats
nourris normalement. Cependant, une diminution significative de
ces deux activités est observée au cours des trois derniers jours de jeûne
(Pub] ication A, FigJre 2A).
L/activité
spécifique de la lactase est stimulée aussi bien dans
les homogénats de muqueuse que
o=ns
les
bordures
en
brosse
jéjunales
(Publication
A,
FigJre
3),
La stimulation maXlmaie est obtenue après 48
heures de jeûne et une augmentation de 3 à 4 fois est
notée
par
rapport
aux
valeurs
témoins. Ce niveau élevé d/activité est maintenu jusqu/au 4e
jour de jeOne.
L/activité spécifique de ia saccharase dans les homogénats et les
bordures
en
brosse
n/est pas diminuée significativement par le jeûne au
cours des 4 premiers jours <Publ ication A, FigJre 3 a et b).
2. Effets de l/actinomycine D et de la cycloheximide sur la stimulation
de la lactase par le jeûne.
Les effets d/une administration quotidienne d/actinomycine
D ou
de cycloheximide sur les activités enzymatiques de la bordure en brosse au
cours d/une période de jeûne de 48 heures sont illustrés dans le tableau l
(Publication B).
L/activité
spécifique
de
l/arninopeptidase reste stable dans la
bordure en brosse au cours du jeûne, et l/administration des antibiotiques

---

46
ne modifie pas 1'activité de l/aminopeptidase. L/activité spécifique de la
saccharase n/est pas modifiée après 48 heures de jeûne.
Par
contre,
une
chute significative de l'activité spécifique de la saccharase est observée
après
des
injections
d/actinomycine
D ou
de
cycloheximide.
Il
est
intéressant
de
noter
que
ces
deux
inhibiteurs
exercent
des
effets
simi laires sur j/activité de la saccharase. En ce qui concerne la lactase,
l/administration
de
l'actinomycine
D
ne
modifie pas la stimulation de
l'activité de la lactase obtenue par le jeûne, cependant la
cycloheximide
inhibe complètement cette stimulation (Pub] ication B. Tableau 1).
r.
3. Effet du jeune sur les Drofi Is protéiaues et enzymatiaues des
protéines de la bordure en brosse.
L/étude
des
profi ls
protéiques
et
enzymatiques des protéines
membranaires
de
]a
bordure
en
brosse
après
séparation
sur
gel
de
polyacry]a~ide
en
présence
de SDS, montre que l/activité lactasique est
obtenue dans une seule bande protéique (Pub] ication B, Figure 1 >.
Pour une même quantité de protéines
déposée
(150
~g/gel >,
des
modifications
quantitatives
pour
certaines
bandes
protéiques
sont
observées chez le rat à jeûn depuis 48 heures par rapport au témoin nourri
normalement.
Ai ris l ,
la
bande
protéique
correspondant
à
l'activité
lactasique est plus intense chez Je rat à jeCn. Le pic
correspondant
sur
le densitogramme voit sa surface doubler par rapport au témoin non à jeCn,
de
plus
Il ac t i v i té
lactasique
correspondante
est
également
significativement augmentée (Publ ication B, Figure 1>.
L' t ude
de
1
é
1
incorporation
de
la
L-~HJ valine dans la bande
protéique. correspondant à i 'activité de la lactase après
séparation
sur
gel
de
polyacrylamide,
montre
une
augmentation
de j/incorporation du
précurseur radioactif dans cette bande
protéique
chez
l'animal
à
jeCn

---

47
(Pub} ication
B,
Tableau II). Des injections de cycloheximide au cours du
jeûne inhibent complètement ]1 incorporation du précurseur radioactif
dans
la
bande
protéique
correspondant
à
la lactase (Publication B, Tableau
II).

---

48
DISCUSSION
Il est bien établ i que le
jeûne
provoque
une
atrophie
de
la
muqueuse
intestinale.
En
effet, la vitesse de migration des cel Iules le
long de l'axe vil lositaire est ralentie, la tai 1le des cel Iules matures et
indifférenciées
est
diminuée
et
une
chute
du
contenu
en
DNA et en
protéines de la muqueuse est observée au cours du jeûne <Altmann,
1972
Brown et coll., 1963).
Nos résultats montrent clairement que aussi bien dans la muqueuse
que dans la bordure en brosse intestinale, l'activité de
la
lactase
est
stimulée
spécifiquement
par
le
jeûne
indépendamment
du
système
de
référence uti lisé, c'est-à-dire, soit la longueur
du
segment
intestinal
dans le cas de l'activité segmentale soit le contenu protéique dans le cas
de l'activité spécifique. L'activité segmentale est le reflet direct de la
capacité
digestive
du
segment
intestinal
considéré,
alors
qu'une
augmentation de l'activité spécifique de l'enzyme peut-être simplement
la
conséquence
d'une
diminution
de
la quantité de protéines présente dans
l'échantil Ion. Cette stimulation de l'activité de la lactase débute
après
24
heures
de
jeûne et atteint sont maximum après 48 heures. Le fait que
l'activité de la lactase soit stimulée dans les deux systèmes de référence
montre
que
cette
stimulation
ne
peut-être
la
conséquence
que
d'un
accroissement
de
l'équipement
enzymatique
de
la
bordure
en
brosse
intestinale.
La
technique de séparation des protéines de la bordure en brosse
et
de
caractérisation
des
activités
enzymatiques
sur
gel
de
polyacrylamide,
a
permis
de
montrer
que
le jeûne modifie les profils
protéiques et enzymatiques. L'absence d'un effet de l'actinomycine
D sur
l'activité de la lactase, montre que l'augmentation du nombre de molécules

---

49
de lactase induite par
le
jeûne
n'est
pas
régulée
au
niveau
de
la
transcription,
mais
plutôt
à
un
niveau co-ou post-traductionnel com~e
l'indique les résultats obtenus après le traitement avec la cycloheximide.
En
effet,
cet
antibiotique
inhibe
complètement
l'effet stimulateur du
jeûne sur l'activité de la lactase ainsi
que
l'incorporation
de
L- [3 H]
val ine dans la bande protéique correspondante.
Les
mécanismes impl iqués dans la stimulation de l'activité de la
lactase chez J'adulte sont inconnus. Il a été proposé qu'une réduction
de
la vitesse de migration des entérocytes consécutive au jeûne pourrait être
responsable de cette stimulation (Tsuboi et coll.,
1980).
Cependant,
un
tel
mécanisme entrainant une augmentatIon du nombre d'entérocytes matures
devrait conduire à la stimulation conjointe de la saccharase
et
non
pas
uniquement
de la lactase. Il est bien ètabl i qu'au cours du développement
postnatal de l'intestin, le décI in de i'activité de la lactase est associé
à
l'élévation
de
la
concentration
des
hormones
thyro1diennes et des
cor t l cost.ér o'l oes dans le plasma (Henning, 1978 a et b) et
que
le
niveau
élevé de l'activité lactasique peut-être maintenu par ]'hypophysectomie ou
thyrcïdectomie (Yeh et Moog, 19(4). D'autre part, il a été montré que
des
injections
de
thyroxine,
à
des
rats
adultes
nourris
normalement,
provoquent une diminution de l'activité lactasique dans
le
jéjunum
sans
affecter la saccharase (Celano et coll., 1977).
Tous ces résultats concourent à montrer que l'activité lactasique
pourrait être sous
contrOle
hormonal.
Ainsi,
nous
nous
proposons
de
démontrer
le
rOle
possible
de
ces
hormones,
dans
la stimulation de
l'activité lactasique au cours du jeûne chez le rat adulte.

---

50
DEUXIEME
PARTIE
R é g u l a t i o n
p a r
l a
t h y r o x i ne
de
l / e x p r e s s i o n
de
l a
l a c t a s e
i n t e s t i n a l e
c h e z
1 e
r a t
adu 1 t e .

---

51
RESULTATS
1. Rôle de la thyrQxine. de j/hydrQcQrtisQne et de la
thyrQidectomie-sur l/activité de la lactase stimulée par le
jeÛne (Publication C).
C : Lactase activity is under hQrmQnal cQntrQI in the
intestine Qf adult rat.
Rau} F., NQriega R., Nsi-EmVQ E., DQffQel M.,
Grenier J.F. (1983). Gut, 24, 648-652.
1.1. EVQlutiQn de }/activité de la lactase le IQng de I/axe
villQsitaire.
1.2. MQdificatiQns des activités spécifiques de la saccharase
et de la lactase dans la bQrdure en brQsse intestinale.
2. PurificatiQn de la lactase intestinale (PublicatiQn D).
D : Impr oved pur l f l cat Ion of rat intestinal lactase.
Nsi-EmvQ E., Launay J.F., Raul F. (1986). Gen. PhysiQI.
BiQphys., 5, 53-59.
3. Effet du Jeûne et de la thyrQxine sur la quantité de
lactase irmnunQréactive dans le Jéjunum de rat adulte.
(PublicatiQn E).
E : MQdulatiQn by thyrQxine Qf the amQunt Qf lactase prQtein
in the jejunum Qf adult.rats.
Nsi-EmvQ E., Launay J.F., Raul F. (1986). Enzyme,
( in press).
DISCUSSION

---

52
RESULTATS
Chez
le
rat
adulte,
après
une période de jeûne de 48 heures,
l/activité de la lactase intestinale est stimulée au niveau de la
bordure
en
brosse
jéjunale
alors que celle de la saccharase n/est pas modifiée.
Parmi les
facteurs
susceptibles
d/intervenir
dans
cette
stimulation,
pourraient
figurer
les
hormones
thyroïdiennes
et
les
glucocorticostéroides. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié
les
effets
de
la
thyroïdectomie et de l adml n l et r at i on de thyroxine ou
r
d/hydrocortisone
sur la régJlation de la lactase.
1. RÔle de la thyrox-ine. de I/hydrocortisone et de la thyrOidectomie sur
I/activité de la lactase stimulée par le Jeûne.
1.1. Evolution de I/activité de la lactase le long de l/axe
villositaire (Publication C. Figure 1).
L/évolution
de
I/activité
lactasique.
le
long
de
1/ axe
vil lositaire a été comparée chez des rats témoins nourris normalement/chez
des rats soumis à un jeûne alimentaire de 48 heures, période au
cours
de
laquelle
I/activité
de
la
lactase est maximale et chez des rats à jeûn
après injection de thyroxine. L/augrnentation de I/activité de
la
lactase
qui
est détectable dès 24 heures de jeûne est localisée dans les cellules
du sommet de
la
villosité.
Des
injeètions
quotidiennes
de
thyroxine
pendant
trois
jours
avant
le
sacrifice,
inhibent
I/augrnentation
de
I/activité de la lactase induite par le jeûne.

---

53
1.2. Modifications des activItés spécifIques de la saccharase et de
la lactase dans la bordure en brosse Intestinale (PublIcation C,
Figure 2).
Les
effets
de
la
thyroxine,
de
l'hydrocortisone
et
de
la
thyroidectomie sur les activités de la saccharase et de la
lactase,
sont
comparés chez des rats nourris et à jeOn. Le jeOne et la thyroïdectomie ne
modifient pas l'activité spécifique de
la
saccharase.
En
revanche
une
diminution
significative
de
l'activité est mesurée chez les rats à jeOn
re~evant des injections de thyroxine ou d'hydrocortisone.
L'injection de thyroxine inhibe complètement la stimulation de la
lactase
provoquée
par
le
jeOne.
Des injections d'hydrocortisone ou la
thyroïdectomie ne modifient pas l'effet stimulateur induit par
le
jeûne,
les
valeurs de l'activité de la lactase obtenues dans ces conditions sont
similaires à cel les mesurées chez les témoins à jeOn. Par contre,
lorsque
l'animal
à
jeOn
thyroidectomisé
reçoit des injections de thyroxine, on
observe une inhibition de j'augmentation de
la
lactase.
Chez
les
rats
nourris, un~ augmentation significative de l'activité lactasique est notée
un mois après la thyroidectomie.
2. Purification de la lactase intestinale.
Pour préciser nos connaissances sur la régulation de
la
lactase
intestinale,
nous
avons purifié cette enzyme dans le but de préparer des
anticorps anti-lactase spécifiques.
Afin d'éviter plusieurs étapes de
purification
susceptibles
de
dénaturer
la
lactase,
nous
avons
élaboré
une
méthode
rapide
de
purification impl iquant seulement
deux
étapes
chromatographiques
(voir
méthodologie
générale).
Le
rendement
et
les
différentes étapes de la
purification sont résumés dans le tableau 1 (Publication D).

---

54
Le degré de purification obtenu est de 500
fois
par
rapport
à
l'homogénat initial avec un rendement de 13,8%. L'étude par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide en mi 1ieu dénaturant des protéines
obtenues
au
cours
des
différentes
étapes
de
purification,
montre
une
grande
homogénéité de la protéine lactase (Publ ication D, Figure 2 D).
L'antisérum obtenu à partir de la lactase purifiée est
testé
en
ELISA
avant
et
après
adsorption
sur
de
la lactase pure. La figure 3
(Publ ication D) montre qu'une concentration de 10 ~g/ml
en
lactase
est
suffisante
pour
inhiber
à
95% l'activité anticorps d'un sérum dilué au
1/1000e. La courbe
d'inhibition
ainsi
obtenue
peut
servir
de
courbe
standard
pour
déterminer la quantité de lactase présente dans un extrait
inconnu. La partie 1inéaire de la courbe permet d'évaluer des quantités de
lactase de l'ordre de 0,25 à 2,5 pg/ml.
Aucune
inhibition
de l'activité anticorps est observée quand la
maltase intestinale est substituée à la· lactase.
En ce qui concerne la
spécificité
de
l'antisérum,
nous
avons
montré
que
la
préincubation
des bordures en brosse avec de l'antisérum
anti-Iactase
inactive
spécifiquement
l'activité
de
la
lactase
sans
interférer
avec les activités de la maltase, de l'aminopeptidase et de la
phosphatase alcal ine (Publ ication D, Tableau 2).
3. Effet du Jeûne et de la thyroxine sur la quantité de lactase
immunoréactive dans le Jéjunum de rat adulte (Publication E).
Afin de déterminer si la stimulation de l'activité de la
lactase
induite
par
le
jeûne
s'accompagne d'une augmentation de la quantité de
lactase immunoréactive dans les bordures en brosse et dans le compartiment
intracellulaire, nous avons étudié l'effet du jeûne et de l'administration
de la thyroxine sur la concentration en lactase immunoréactive.
Dans
ces
deux
conditions,
nous
avons
pu
déterminer
le
taux
de
lactase

---

55
immunoréactive dans des extraits de fractions
membranaires
en
uti] isant
les courbes d'inhibition de la fixation anticorps-antigène obtenues par le
test de compétition (ELISA).
La figure 1A montre les courbes d'inhibition
obtenues
avec
des
concentrations
croissantes
de
protéines
solubil isées
à
partir
des
membranes
intracellulaires
précipitées
avec
du
CaCI~
Les
courbes
obtenues
avec
des taux croissants de protéines solubilisées à partir des
bordures en brosse sont illustrées dans la figure lB.
Les
concentrations
de
lactase
immunoréactive dans les extraits sont déterminées à partir de
la courbe standard,
qui
est
linéaire
entre
0,25
et
2,5
~g/ml.
Les
résultats
montrent
que
chez
les
rats
à
jeOn, la quantité de lactase
immunoréact i ve est augmentée dans 1es extrai ts l' papaÏ ne '1 des
bordures
en
brosse,
alors que les injections de thyroxine inhibent cette augmentation
(Publication E, Tableau 1). De même,
dans
les
extraits
protéiques
des
membranes
intracellulaires,
une
augmentation
de la quantité de lactase
immunoréactive est observée chez les rats à jeOn. La lactase présente dans
ce
compartiment
cellulaire
ne
possède
pas
d'activité
enzymatique
significative. Les injections de thyroxine
au
cours
du
jeOne
inhibent
l'augmentation de la quantité de lactase immunoréactive obtenue dans cette
fraction membranaire (Pub] ication E, Tableau 1).

---

56
DISCUSSION
Au
moment
du
sevrage,
l'activité
de
la
lactase intestinale
diminue fortement pour atteindre les valeurs
basses
caractéristiques
de
l'adulte.
Pendant
la
même période, une augmentation de la concentration
.circulante de la thyroxine et des glucocorticoides est observée
(Henning,
1981).
De ce fait, ces hormones pourraient être impliquées dans le déclin
de l'activité lactasique. Pour tester cette hypothèse, nous
avons
étudié
les
effets
de
la thyroxine, de l'hydrocortisone et de la thyroidectomie
sur l'activité de
la
lactase
chez
le
rat
adulte
à
jeûn
et
nourri
normalement.
Les
résultats
montrent
que
les
injections
de thyroxine
inhibent complètement la stimulation de l'activité lactasique induite
par
le
jeûne
sans
modifier
l'activité
de
la
saccharase,
alors
que
l 'hydrocortisone n'a aucun effet sur l'activité de la lactase.
L'effet inhibiteur de la thyroxine sur l'activité de la lactase à
récemment
été
confirmé
chez
le
rat
au
cours
de
la période foetale
(Simon-Assmann et coll., 1984). En effet, il a été montré que la thyroxine
inhibe
l'augmentation de la lactase induite par la dexamethasone, lorsque
des explants intestinaux de
foetus
de
rat
sont
maintenus
en
culture
pendant 48 heures.
Nous
avons montré que la stimulation de l'activité de la lactase
induite par le jeûne s'accompagne d'une augmentation de la quantité de
la
lactase
immunoréactive
dans les bordures en brosse et dans les membranes
intracellulaires de l'entérocyte. Dans tous les
cas,
les
injections
de
thyroxine
inhibent
ce
phénomène. Il convient de remarquer que le faible
taux
d'immunoréactivité
détecté
dans
les
extraits
des
membranes
intracellulaires est lié au fait que le taux de protéines total extrait de
ces membranes est 15 fois supérieur à celui obtenu à partir
des
bordures

---

57
en brosse purifiées. La présence de la
lactase
immunoréactive
dans
les
membranes
intracellulaires
a
aussi
été décrite dans les entérocytes de
porc et chez l/homme (Danlelsen et
col l.,
1981 b;
Skovbjerg
et
col l.,
1984).
La modulation par la thyroxine de l/activité de la lactase n/est
pas
la
conséquence
d/une
modification
qui
a
lieu
au
niveau
de
l/archltecture
de
la villosité ou de la masse protéique. Il a été montré
qu/une injection quotidienne d/hormones
thyroïdiennes
pendant
12
jours
chez
des
rats nourris normalement, provoque une diminution significative
de l/activité de la lactase dans la bordure en brosse. Cet effet n/est pas
la
conséquence
de variations dans la cinétique cellulaire (Gutschmidt et
coll., 1981).
Chez le rat adulte,
la
concentration
plasmatique
en
hormones
thyroidiennes
est fortement diminuée au cours du jeûne (Goodman et coll.,
1980). Ainsi,
il
peut-être
proposé
que
]/augmentation
de
l/activité
lactasique
observée au cours du jeûne est la conséquence d/une diminution
de la concentration en thyroxine. Cette situation peut-être rapprochée
de
cel le
existant au cours de la période d/allaitement du rat nourrisson par
le fait que chez le nourrisson, la
concentration
plasmatique
faible
en
hormones
thyroïdiennes
est
associée à une forte activité lactasique. La
régulation de l/activité de la lactase par la thyroxine chez le rat adulte
à
jeûn,
implique
des mécanismes moléculaires agissant à un niveau co-ou
post-traductionnel (voir première partie), qui devraient être similaires à
ceux
opérant
pendant
la
chute
de la lactase au moment du sevrage dans
l/intestin de la plupart des mammifères.

---

58
TROISIEME
PARTIE
Mise
en
é v i d e n c e
d ' u n e
g l y c o p r o t e i n e
i n t r a c e l l u l a i r e
e n z y m a t i q u e m e n t
i n a c t i v e
c o r r e s p o n d a n t
à
l a
l a c t a s e .

---

59
RESULTATS
1. Formes moléculaires de la lactase chez le rat adulte et
nourrisson.
2. Affinité de certaines lectines pour les glycoprotéines
membranaires.
3. Effets de la thyroxine sur I/expression de la lactase du
rat nourrisson.
DISCUSSION

---

60
RESULTATS
Les
travaux
relatifs
à cette dernière partie sont actuellement
soumis pour publication.
Des formes moléculaires de la lactase ont déjà été décrites
dans
le
compartiment
intracellulaire
d'entérocytes
chez
le porc et l'homme
<Danielsen et coll., 1981b; Skovberg et
coll.,
1984).
Il
nous
a
paru
intéressant
d'étudier les formes moléculaires de cette enzyme chez le rat
adulte et nourrisson et les répercussions de l'administration de thyroxine
sur la lactase du rat nourrisson compte tenu du rOle de cette hormone dans
la maturation post-natale de l'intestin (Henning, 1981).
1. Formes moléculaires de la lactase chez le rat adulte et nourrisson.
Afin d'identifier
les
différentes
formes
moléculaires
de
la
lactase,
les protéines solubilisées des membranes de la bordure en brosse
et des
membranes
intracellulaires
du
rat
adulte
et
nourrisson
sont
analysées
sur
gel
de
polyacrylamide.
Les
profils
correspondant à la
séparation électrophorétique des protéines sont il lustrés dans la
figure 3.
La détermination de l'activité lactasique dans les gels (Raul
et
coll.,
1978),
montre
que
la
lactase enzymatiquement active a un poids
moléculaire apparent de 170 K et constitue la forme prédominante dans
les
membranes
de
la bordure en brosse du rat nourrisson (Figure 3, n° 1). Le
polypeptide 170 K correspond à une protéine mineure
dans
la
bordure
en
brosse du rat adul te (Figure 3, n° 2).

---

61
200~ ~L
..-
98 ...
~
68~
43-.
~
1
3
4
FIgure 3
Analyse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS des
protéines solubi 1isées à partir des bordures en brosse et des
membranes Intracellulaires précipitées par Je Ca++ chez les rats
adultes et nourrissons.
Protéines des bordures en brosse: 1) rat nourrisson, 2) rat
adu J te.
Protéines des membranes Intracellulaires: 3) rat nourrisson,
4) rat adulte.
L : bande protéique correspondant à l'activité lactaslque.
Les protéines sont colorées au bleu de coomassle.
Standards de poids moléculaire: myoslne (200.000), phosphorylase
B (98.000), albumine sérique de boeuf (68.000), ovalbumine
(43.000).

---

62
Dans
la
bordure en brosse du rat adulte trois formes de lactase
immunoréactives sont identifiées (300 K, 170 K et 110 K), alors
que
dans
la
bordure en brosse du rat nourrisson on observe principalement la forme
170 K, la lactase immunoréactive 300 K représente une forme mineure
à
ce
stade du développement (Figure 4, n° 1 et 2).
Dans le compartiment intracellulaire du rat adulte et nourrisson,
d~s formes moléculaires de lactase enzymatiquement actives n'ont
pas
été
trouvées
(Figure
3,
n°
3
et
4).
La séparation électrophorètique des
protéinesmembranaires
suivie
de
leur
transfert
sur
feuil le
de
nitrocellulose
et de la détectIon immunoenzymatique de la lactase, montre
notamment l'existence d'une forme
de
lactase
inactive
ayant
un
poids
moléculaire
de
300
K dans les membranes intracel lulaires du rat adulte
(Figure 4, n° 4). Ce polypeptide (300 k) n'existe qu'à
l'état
de
traces
chez le rat nourrisson (Figure 4, n° 3).
2. Affinité de certaines lectines pour les glycoprotéines membranaires.
La
figure
5
il lustre
la
capacité
de
fixation
de certaines
lectines, pour les
protéines
isolées
des
bordures
en
brosse
et
des
membranes intracellulaires du rat nourrisson et de l'adulte.
Les
trois lectines étudiées: Concanaval ine A (Con A), Phaseolus
vulgaris
(PHA-E)
et
Ulex
europeaus
(UEA-I)
présentent
une
affinité
variable
en
fonction des protéines séparées et du stade de développement
du rat. Ainsi, l'affinité la plus intense est cel le qui est obtenue
entre
la
Con
A et
les
protéines
intracellulaires
de
l'adulte. Les autres
lectines (PHA-E et UEA-I) présentent une affinité plus importante pour les
protéines
de
la
bordure
en
brosse de l'adulte. Il est à remarquer que
toutes les lectines étudiées
se
fixent
sur
le
polypeptide
300
K du
compartiment intracel lulaire du rat adulte.

---

63
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1
2
3
4
Figure 4
!mmunodétectlon de la lactase.
Les protélnes.membranalres s9nt séparées sur gel de
polyacryJamide en présence de SDS puIs transférées sur feuille
de nltrocelluJose.
La présence de lactase est détectée à llalde dl anticorps
polyclonaux monospéciflques. Les anticorps fixés sont révélés
par la péroxydase couplée à des Immunoglobul Ines antl-IgG de
lapin.
Pour des détails supplémentaires voir la fIgure 3.

---

64
Con A
PHA-E
UEA r
i '.,
Inll';
Il~<r, ~,
I~:
1
. . . . .
~,,~~;'~
if"-~ ..-f~
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'!'~
~""
~.
~ ~. ~
~,.,,,,,?,..
:J,t
~~'~l-'!'!
~7,'.
1'- .•
::.~
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
FIgure 5
Détection de glycoprotéines à l'aide de différentes lectines.
Les échantll Jons testés sont Identiques à ceux décrits dans la
figure 3. Après électrotransfert sur feul J Je de nitrocellulose
l'affInité de la Con A, de la PHA-E et de ]/UEA-I pour les
glycoprotéines est révélée par la péroxydase.

---

65
En
ce
qui
concerne
le
rat
nourrisson,
la
Con
A présente
l/affinité
la plus importante, PHA-E interagit peu avec les protéines des
fractions membranaires, alors que UEA-I ne présente aucune
affinité
pour
les protéines du rat nourrisson.
3. Effets de la thyroxine sur l/expression de la lactase chez le rat
nourrIsson.
L/administration
quotidienne de thyroxine à des rats nourrissons
pendant une durée de 4 jours, provoque une
chute
de
50%
de
l/activité
spécifique de la lactase dans la bordure en brosse intestinale <Tableau).
La
séparation
électrophorétique
des
protéines
suivie de leur
transfert
sur
feuil le
de
nitrocellulose
et
de
la
détection
immunoenzymatique
de la lactase, montre une augmentation importante de la
quantité du polypeptide 300 K enzymatiquement inactif dans
les
membranes
intracellulaires des rats reçevant des injections de thyroxine
<Figure 6>-
Afin
de
déterminer si le polypeptide 300 K qui apparait chez le
nourrisson
après
injections
de
thyroxine
présente
les
mêmes
caractéristiques que la forme détectée chez l/adulte, nous avons précipité
sélectivement les protéines des membranes intracellulaires par la
lectine
UEA-I. Une disparition de la forme immunoréactive 300 K correspondant à la
lactase est observée dans ces
conditions
indiquant
que
cette
protéine
correspond
bien à la forme intracellulaire mise en évidence chez l/adulte
<Figure 6).

---

66
TABLEAU
Effets de l'administration de thyroxine sur l'activité lactasique dans les
homogénats de muqueuse et dans les bordures en brosse du rat nourrisson.
Acti v i té de la lactase (mU/mg protein)
\\
Animaux
Homogénat de muqueuse
Bordure en brosse
Rats adu 1tes
2.3 + 0.2
35.5 + 0.4
(n = 6)
Rats nourrissons
25.9 -= 1.9
232 + 19.2
-
(n = 5)
Rats nourrissons
13.0 + 1.3*
111
+ 9.6
-
-
+ thyroxine
(n = 5)
Les résultats correspondent aux moyennes! SEM. n = nombre d'animaux
* p < 0.01 (test de Wilcoxon).

---

67
1
1
\\" .
-~.­
..
~-~'
4
Floure 6
Immunodétection de la lactase après séparatIon
électrophorétique et électrotransfert des protéInes des
membranes intrace! lulaires des rats nourrissons et adultes.
1> rat adulte
2) rat nourrlsson contrOle
3) rat nourrlsson injecté avec la thyroxine
4) Idem 3 + prétraitement des protéInes membranalres par UEA-I.

---

68
DISCUSSION
En fonction des conditions expérimentales on note
une
variation
des
profi ls
électrophorétiques
obtenus
pour
la
lactase.
Ainsi, dans
I/intestin de rat, cinq bandes protéiques correspondant à la
lactase
ont
été
mises
en évidence par électrophorèse en présence d/agents réducteurs
et dénaturants, la bande protéique
majeure
ayant
un
poids
moléculaire
apparent
de
132
K (Birkenmeier et Alpers, 1973). Jonas et coll. (1985)
n/ont identifié qu/une seule bande protéique de poids
moléculaire
127
K
correspondant
à la lactase dans les membranes de la bordure en brosse des
rats adultes et nourrissons. D/autres auteurs ont
mis
en
évidence
deux
formes
moléculaires
avec respectivement un poids moléculaire de 200 K et
160 K (Cousineau
et
Green,
1980).
Cependant,
en
I/absence
d/agents
réducteurs,
la
présence
d/une forme de haut poids moléculaire (270 K) a
été décrite dans les entérocytes de rat (Neu et coll., 1984).
Chez I/homme, il
a
tout
d/abord
été
montré
que
la
lactase
existait
sous
la
forme
d/une
seule bande protéique possédant un poids
moléculaire de 160 K (Skovbjerg et
coll.,
1981).
Cependant,
Potter
et
col l.
(1985)
ont
décrit
une
autre
forme
moléculaire pour la lactase
possédant un poids moléculaire de 320 K. Ces formes moléculaires présentes
chez
l/homme
(160
K et
320 K) sont principalement local isées dans les
membranes de la bordure en brosse (Bolton et col l., 1985).
Une
forme
de
haut
poids
moléculaire
(245 K) a également été mise en évidence dans le
compartiment intracel Julaire des entérocytes humains (Skovbjerg et
coll.,
1984)
Nos
résultats
montrent,
après
séparation électrophorétique en
présence de SDS et en absence d/agents réducteurs, la
présence
de
trois
formes
de
poids
moléculaires: 300 K, 170 K et 110 K localisées dans la
bordure en brosse de I/lntestin de rat adulte. Les résultats obtenus
sont

---

69
simi laires
lorsque
l'électrophorèse
est
réalisée
en
présence
d'urée
démontrant ainsi
que
les
différentes
formes
ne
résultent
pas
d'une
agrégation
non
spécifique
des
protéines.
Le
polypeptide
170 K n'est
présent que dans la bordure en brosse intestinale et correspond à la forme
enzymatiquement
active.
Cette
forme
est
prédominante
chez
le
rat
nourrisson. Le polypeptide 300 K qui est particul ièrement
important
dans
les
membranes
intracellulaires de l'adulte, n'est présent qu'en quantité
négligeable chez le nourrisson.
En étudiant l'affinité des lectines pour
les
bandes
protéiques
transferées
sur
feuil le
de
nitrocellulose,
nous
avons
observé
des
modifications
importantes
quant
à
la
glycosylation
des
protéines
membranaires chez le rat nourrisson et adulte. C'est ainsi que chez le rat
adulte, la Con A présente une affinité importante pour les
protéines
des
membranes
intracellulaires
et
en particul ier pour le polypeptide 300 K,
indiquant la présence de nombreux groupements mannose dans ces
protéines.
La
lectine
PHA-E
qui
se
fixe
préférentiellement
sur
des
résidus
01 igosaccharidiques ne marque que faiblement les protéines membranaires du
rat
nourrisson.
Il
convient
de
remarquer
que
UEA-I
qui
se
fixe
spécifiquement
sur
le
fucose
ne
présente
aucune
affinité
pour
les
protéines
membranaires
du
rat
nourrisson,
suggérant
que
la
lactase
intestinale contient une quantité très faible de fucose
au
cours
de
la
période néonatale. Ces derniers résultats sont en accord avec ceux obtenus
par Torres-Pinedo et coll. (1984), montrant que
le
taux
de
groupements
fucose
est
faible
dans la bordure en brosse du rat nourrisson et que la
fucosylation des protéines a lieu au moment du sevrage.
Nous avons montré que le contenu en
fucose
est
plus
important
dans
les protéines membranaires du rat adulte et en particulier au niveau
du polypeptide 300 K présent dans le compartiment
intracellulaire.
Il
a
été
bien
établi
par
des
études
antérieures
que
l'administration de
thyroxine
ou
d'hydrocortisone
à
des
rats
nourrissons,
provoque
une

---

70
augmentation
du
contenu
en
fucose
dans les protéines de la bordure en
brosse (Mahmood et coll .,1985). Il est d'autre part
bien
connu
que
ces
hormones
jouent
un rOle important dans la maturation de l'intestin grêle
au moment du sevrage (Henning,
1981).
De
plus,
il
a
été
montré
que
l'administration
de
thyroxine
exogène module l'expression de la lactase
chez le rat adulte (Raul et coll.,
1983
Hewitt
et
Smith,
1986)
et
accélère
le
déclin de l'activité lactasique dans l'intestin du foetus et
du rat nourrisson (Simon-Assmann et coll., 1984 ; Paul et Flatz, 1983).
Afin
de
vérifier
si
des
modifications
intervenant
dans
la
glycosylation
de
la
lactase
sont
associées
au
déclin
de l'activité
lactasique, nous avons induit une maturation intestinale précoce
par
des
injections
de
thyroxine
exogène
à
des rats nourrissons. Les résultats
montrent que la thyroxine induit une chute
de
l'activité
lactasique
et
provoque
conjointement
une
augmentation
de
la
concentration
du
polypeptide 300 K fucosylé correspondant à la lactase dans le compartiment
intracellulaire des entérocytes du rat nourrisson.
Nous
avons
ainsi
montré que le déclin de l'activité lactasique
chez le rat est associé à des modifications au niveau de la
glycosylation
de
la protéine enzymatique. Ces modifications provoquent une augmentation
de la quantité de lactase inactive sous une forme fortement mannosylée
et
fucosylée
dans le compartiment intracellulaire. Il est probable que cette
forme de lactase soit faiblement transférée à la surface cellulaire et
de
ce
fait rapidement dégradée à l'intérieur de la cel Iule par des protéases
endogènes.
Actuellement, il semble difficile d'extrapoler un tel mécanisme à
d'autres
espèces
pour
expliquer
l'apparition de l'hypolactasie de type
adulte. Cependant, il convient de noter qu'un mécanisme
similaire
a
été
proposé par Hauri et coll. (1985~chez des patients présentant un déficit

---

71
congénital
en
saccharase-isomaltase
pour
lesquels l/enzyme est bloquée
intracellulairement
dans
l/entérocyte
sous
une
forme
hautement
mannosylée.

---

72
CONCLUSION
GENERALE

---

73
Le
présent
travail
avait pour objectif de préciser certains des
facteurs intervenant dans la
régulation
de
l'expression
de
la
lactase
intestinale chez l'adulte.
Il
convient
de
rappeler
que
chez
la
plupart des mammifères,
l'activité de la lactase est très élevée à la naissance puis
diminue
pour
atteindre au moment du sevrage les valeurs basses caractéristiques du stade
adulte.
Nous
avons
défini
une
condition
physiologique
induisant
une
stimulation spécifique de l'activité de la lactase dans l'intestin grêle du
rat adulte. Ainsi, nous avons pu montrer que le jeûne al imentaire
provoque
une
stimulation
spécifique de l'activité lactasique et que la stimulation
de cette activité est restreinte aux cel Iules différenciées du sommet de la
vi 1losité.
De
plus,
nous
avons observé que la stimulation de l'activité
lactasique consécutive au jeûne est la conséquence
d'un
accroissement
de
l'équipement
enzymatique
dans
la
bordure
en
brosse intestinale. Cette
stimulation de l'activité lactasique n'est que faiblement
inhibée
lorsque
la
synthèse
des
ARN cellulaires est bloquée alors qu'el le est totalement
inhibée par l'action des inhibiteurs de la synthèse protéique indiquant que
la régulation de la lactase s'effectue à un niveau post-transcriptionnel.

---

74
A partir
de
ces
résultats,
nous
avons émis l'hypothèse selon laquel le
l'activité de la lactase
intestinale
chez
l'adulte
pourrait
être
sous
régulation
hormonale.
Ainsi,
nos
résultats
montrent
que
le
taux
de
thyroxine a une action régulatrice
sur
l'expression
de
la
lactase.
En
effet,
c'est
seulement
en provoquant une diminution du taux de thyroxine
soit
par
la
thyroïdectomie,
soit
par
le
jeûne,
qu'une
stimulation
spécifique
de
l'activité de la lactase est obtenue dans l'intestin de rat
adulte. De plus, des injections de thyroxine inhibent complètement
l'effet
stimulateur
du
jeûne
sur
l'activité
de
la
lactase,
alors
que
les
corticoïdes n'ont aucun effet. Ces résultats sont en faveur
d'un
contrOle
de l'activité de la lactase intestinale chez le rat adulte par les hormones
thyroï di ennes.
A l'aide d'anticorps
polyclonaux
monospécifiques
obtenus
après
purification
de
l'enzyme suivant une technique originale mise au point au
laboratoire, il nous a été possible de
démontrer
que
la
stimulation
de
l'activité
de
la
lactase
induite
par
le
jeûne
s'accompagne
d'une
augmentation de la quantité de
lactase immunoréactive dans les bordures en
brosse
et
dans
les membranes intracellulaires de l'entérocyte. Dans tous
les cas, des injections de thyroxine inhibent ce phénomène.
La séparation électrophorétique des protéines membranaires
suivie
de
leur
transfert
sur feui 1le de nitrocel lulose et immunodétection de la
lactase révèle l'existence d'une glycoprotéine enzymatiquement inactive
de
poids moléculaire 300 K correspondant à la lactase. Cette forme moléculaire
de la lactase
est
présente
de
façon
importante
dans
le
compartiment
intracel lulaire
du rat adulte alors qu'el le n'existe qu'à l'état de traces
chez le rat
nourrisson
ou
l'activité~ lactasique
est
très
élevée.
En
étudiant
l'affinité de certaines lectines pour les protéines membranaires,
nous avons mis en évidence que la lectine UEA-I qui se fixe spécifiquement

---

75
sur
le
fucose
présente
une
importante
affinité pour la protéine 300 K
localisée dans les membranes intracellulaires du rat adulte,
indiquant
la
présence de nombreux groupements fucose dans cette protéine. Il convient de
remarquer
que
UEA-I
ne
présente
aucune
affinité
pour
les
protéines
membranaires
du
rat
nourrisson, suggérant que la lactase intestinale est
une glycoprotéine contenant une quantité très faible de fucose
pendant
la
période néonatale.
Nos
résultats montrent que des injections de thyroxine provoquent
une chute de l'activité lactasique chez le rat nourrisson et
conjointement
une
augmentation
de
la
concentration
de
la
protéine
300 K fucosylée
correspondant
à
la
lactase
dans
le
compartiment
intracellulaire
d'entérocytes du rat nourrisson.
Ces
résultats
semblent
indiquer
que
le
déclin
de l'activité
lactasique
chez
le
rat
pourrait
.être
associé
à
des
modifications
intervenant
dans
la
glycosylation de la molécule de lactase au moment du
sevrage. Ces
modifications
pourraient
provoquer
l'accumulation
de
la
lactase
dans
les
membranes
intracellulaires
sous
une
forme
inactive
fortement mannosylée et fucosylée qui serait faiblement transférée dans
la
bordure en brosse et dégradée à l'intérieur de la cel Iule par les protéases
endogènes.
Ce mécanisme pourrait contribuer à expliquer au
moins
en
partie
l'apparition
de l'hypolactasie de type adulte au moment du sevrage chez la
plupart des mammifères.

---

76
R
E
F E R
E
N e E
S
B
l
B
L l O
G
R
A
P H I
Q U E
S

---

77
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1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

8<;
TABLE
DES
MATIERES
Pages
Sommaire
4
Avant propos et but du travai 1 •••••..•.•••.••••••••••••••••••.•••.•.
6
Introduction générale...............................................
7
1. Notions générales sur la structure et la fonction de l'intestin
grêle du rat
8
1.1. Organisation structurale
8
1.2. Maturation des cel Iules épithéliales le long de l'axe
vil los i ta ire
11
.. :.-
1;3. Organisation de la bordure en brosse
- 12
2. Données récentes sur les hydrolases intestinales
.
15
1
2.1. Nature et fonction des principales hydrolases de la
bordure en brosse intestinale
.
15
1
2.1.1. Les glucosidases
.
15
1
2.1.2. Les peptidases
18
2.1.3. La phosphatase alcaline
.
19
1
2.2. Biosynthèse des enzymes de la membrane de la bordure
1
en brosse intestinale
.
19
2.2.1. La saccharase-isomaltase
.
20
1
2.2.2. La 9 1ucoamy 1ase
.
20
1
2.2.3. L5. lactase
.
1

---

90
2.2.4. L'ami nopep t i dase N
21
3. Régulation des enzymes de la bordure en brosse intestinale
chez le rat adulte
22
3.1. Facteurs hormonaux
22
3.2. Facteurs nutritionnels.....................................
23
3.2.1. Effet des hydrates de carbone sur la
saccharase
23
3.2.2. Effet des hydrates de carbone sur la lactase
24
3.2.3. Effet des protéines sur j'aminopeptidase N
24
4. Données actuel les sur l'évolution de la lactase intestinale
et l'hypolactasie de j'adulte
25
4.1. Evolution enzymatique
25
4.2. L'hypolactasie intestinale de l'adulte
25
METHODOLOGIE GENERALE
27
1. Matériel bioloqique
28
2. Technique d'isolement séquentiel des cel Iules épithél iales
"
intestinales le lonq de l'axe crypte-vi 1 losité
28
3. Techniques de dosaqes enzymatiques
29
4. Préparation et separation des protéines membranaires
30

---

91
4.1. Isolement des bordures en brosse
30
4.2. Préparation des membranes intracellulaires
31
5. Purification de la lactase.......................................
32
5.1. Immunisation des animaux et tests immuno-enzymatiques
33
6. Technique de séparation et d'identification des protéines
membranaires après électrophorèse
34
6. 1. Elect rophorèse
34
6.2. Révélation des bandes protéiques et des activités
enz yma tiques
35
6.2.1. Problèmes liés à l'emploi du détergent
36
6.2.2. Problèmes liés à la correspondance entre les
bandes protéiques et les activités enzymatiques
37
6.3. Electrotransfert
38
6.4. Détection immunologique
38
6.5. Détection des glycoprotéines
39
6.6. Interactions des lectines solubles avec des glycoprotéines
membranaires
39
7. Administration de précurseur radioactif et mesure de la
radi oact i V-1 té
40
7.1. Administration de précurseur radioactif ..
40
7.2. Mesure de la radioactivité incorporée dans les protéines
enzymatiques
40
8.
Administràtion o'inhiDiteurs dela synthèse proteique
40

---

92
9. Mode d'administration des hormones
41
9.1. Rats adultes
41
9.2. Rats nourrissons...........................................
41
PREMIERE PARTIE
Modifications des enzymes de la bordure en brosse intestinale au
cours du jeûne al imentaire chez le rat adulte.
42
RESULTATS
44
1. Effet du jeÛne alimentaire sur les activités des enzymes
intestinales
44
2. Effets de l'actinomycine D et de la cycloheximide sur la
stimulation de la lactase par le Jeûne
45
3. Effet du jeûne sur les profi ls protéiques et enzymatiques des
protéines de la bordure en brosse
46
DISCUSSION ................................................................................................... "" ..........
48

---

93
DEUXIEME PARTIE
Régulation par la thyroxine de l'expression de la lactase
intestinale chez le rat adulte
50
RESULTATS
52
1. Role de la thyroxine. de l'hydrocortisone et de la thyroidectomie
sur l'activité de la lactase stimulée par le jeûne
52
1.1. Evolution de l'activité de la lactase le long de l'axe
vil 1os i ta i re
52
1.2. Modifications des activités spécifiques de la saccharase
et de la lactase dans la bordure en brosse intestInale .....
53
2. PurificatIon de la lactase intestinale
53
-1\\
-
3. Effet du leune et de la thyroxine sur la quantité de lactase
lmmunoréactive dans le Jéjunum de rat adulte.
.•••........
54
DISCUSSION ••••.••••..........•.•...•..•.................•••••••..••.
56
. TROISIEME PARTIE
Mise en évidence d'une glycoprotéIne intracel Julaire enzymatiquement
i nactl ve correspondant à 1a 1actase
58
RESULTATS ...........................................................
60

---

94
1. FQrmes mQléculalres de la lactase chez le rat adulte et
nourrisson
60
2. Affinité de certaines lectines pQur les glycQprQtéines
membçana i [es
62
3. Effets de la thyrQxine sur l'expressiQn de la lactase chez
]e rat nourr1ssoo
65
DISCUSSION
68
CONCLUSION GENERALE ..................................................................................................
72
,"-,. .
. "".
.",
'
REFERENCÊS'aiBLIOGRAPHIQUES ..................................................................................
76
DOCUMENTS ANNEXES
PUBLICATIONS
97
LISTE DES PUBLICATIONS
.
98
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Improvcd purification of rat intestinal lactase. Gen. Physiol. Biophys.
(1986) s. 53-59.
E. Nsi-Emvo, J.F. Launay, F. Raul.
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128
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ModulatIon by thyroxine of the amount of lactase protein in the jejunum
of adult rats. Enzyme (1986) sous presse.
E. Nsi-Emvo, J.F. Launay, F. Raul.
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1
Structure de la villosité intestinale
la
,
Figure 2
Représentation schématique du cytosquelette de
1a bordure en brosse
14

---

96
Figure 3
Analyse sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS des protéines solubilisées à partir des bordures
en brosse et des membranes intracellulaires précipitées
par le Ca++ chez les rats adultes et nourrissons .. '..... ,
61
Figure 4
Immunodétection de la lactase
.
63
Figure 5
Détection de glycoprotéines à I~aide de différentes
lectines.................................................
64
Tableau
Effets de I~administration de thyroxine sur I~activité
lactasique dans les homogénats de muqueuse et dans les
bordures en brosse du rat nourrisson
66
Figure 6
Immunodétection de la lactase après des injections de
thyroxine à des rats nourrissons
67
,

---

97
D O C
U M E
N
T
S
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A
N
N
E
X
E
S
P U B
L I e
A
T
I O N
S
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"
"
,

---

98
L l s t e
d e s
p u b l i c a t l o n s
A. Modifications of brush border enzyme act lv l tïes during starvation in
the jejunum and ileum of adult rats. Enzyme (1982) 2e, 328-335.
F. Raul, R. Noriega, M. Doffoel, J.F. Grenier, K. Haffen.
B. Stimulation of lactase synthesis induced by starvation in the jejunum
of adul t rat. Enzyme (1984) ~, 45-49.
. . .
.
E. Nsf~F.nlvci,'F . Raul.
c. Lactase activity is under hormonal control in the intestine of adult
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F. Raul, R. Noriega, E. Nsi-Emvo, M. Doffoel, J.F. Grenier.
D. Improved purification of rat intestinal lactase. Gen. Physiol. Biophys.
,(1986) s. 53-59.
E. Nsi-Emvo, J.F. Launay, F. Raul.
E. Modulation by thyroxine of the amount of lactase protein in the jejunum
of adult rats. Enzyme (1986) sous presse.
E. Nsi-Emvo, J.F. Launay, F. Raul.

---

99

---

100
Enzyme 28: 328-335 (1982)
Modifications of Brush Border Enzyme Activities during
Starvation in the .Jejunum and Ileum of Adult Rats
Francis Raul. Rolando Noriega. Michel Doffoel. Jacques F. Grenier, Katy Haffen
Inserm Unité 61, Strasbourg, France
Key Words. Starvation . Brush border· Enzymes· Jejunum· Ileum
Abstract. Aminopeptidase, lactase and sucrase activities have been followed during 5 days
in the jejunum and in the ileum of starved adult rats. Enzyme activities have been determined
in the mucosal hornogenates as weil as in the purified brush border membranes and expressed
as activities per intestinallength (segmental activities) or as activities per milligram ofprotein
(specifie activities).
The segrnental and specifie activity of aminopeptidase was increased in the ileum during
thefirst 2 days of'starvation, suggesting that arninopeptidase may have during the first days of
starvation a conservative role by preventing an important loss of tissue protein.
In ail conditions, lactase activity was strikingly enhanced by starvation whereas sucrase
activity showed no changes or decreased activity. Lactase stimulation was initiated during the
first 24 h of starvation reaching its maximum after 2 days. The various experimental condi-
tions leading to a specifie or to a nonspecific stimulation of intestinal lactase activity have
been discussed.
Introduction
after several days of starvation. Il is notewor-
thy that almost a1l these studies have been
Numerous studies have been performed
performed on mucosal homogenates only
on the effects of starvation on small intestinal
and mostly at a given time after beginning of
epithelium.
However,
contlicting
results
starvation. In the present investigation, we
1
have been obtained concerning the adapta-
have followed during 5 da ys the evolution of
tion of intestinal enzymes to starvation. For
sucrase, lactase and arninopeptidase activi-
exarnplc, sucrase activity has bccn reported
ties in the jejunum and in the ileum of
1
. to dccrcase [2, 8: 9] or not to change [20, 22,
starved adult rats. Enzyme activities were
25]; lactase activity has becn shown to be
determined in the mucosal homogenates as
increased [16, 20] or only weakly modified
weil as in puri fied brush border mem brancs,
1
[9] and aminopeptidase activity has bccn re-
The results were expressed in two distinct ref-
portcd to decrease [141 or not to change [ 151
erence systems: the total scgmental activity
1
1
1

---

101
(enzyme actrvity per intestinal length) and
mg
the specifie activity (enzyme activity per mil-
,
ligram of protein).
1
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1
,
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1
1
Material and Methods
,
...<::
·
,
,
Animais
Adult Wistar rats weighing 300-350 g .....ere di-
·•, o
2
4
5 davs
0"
vided into 6 groups of 8 rats and individually houscd
in metabolic cages. The rats were given laboratory
chow and water ad libitum. After an adaptation period
of 3 days, the food but not the water was rernoved
Fig. 1. Protein content (mg protein per segment) of
from the 5 experimental groups at 9.00 a.m. and one
mucosal homogenates (-) or of brush border mem-
group of rats was killed every 24 h until the 5th day. 2
branes (- - -) in the jejunum (e) and in the ileum (A) of
rats from the normally fed group (controis) were sacri-
adult rats during starvation. Each point represents the
liced at the same time. Since no important variations
mean (mg) of the protein content of 8 animais.
were noted for the enzyme activities measured at the
difTerent days in the fed controls, the values obtained
for each enzyme were pooled.
Results
The proximal part of the jejunum and of the ileum
were resected. The proximal part of the jejunum corn-
Evolution of Body Weight and Protein
prised the lirst 10 cm extending from the ligament of
Treitz. The proximal part of the ileum consisted of a
Content
1O-cm segment extending from the middle of the small
A progressive decrease of the body weight
intestine. The length was measured by stretching the
of the animaIs was.observed during starva-
intestine with a 3 g weight.
tien. The most important loss in weight oc-
curred during the first 24 h of starvation. The
Enzyme Assays
The intestinal segments of each animal were ev-
initial average weight which was of334.66 ±
erted and the mucosa was scraped with a glass siide.
6.18 g (mean ± SE, n =8) dropped to 311.00
Preparations of mucosal hornogenatcs and of brush
± 5.67 g after 1 da y, thereafter the loss of
border membranes have been described previously
weight was approximately 15 g/starved day.
(23J. The following enzyme activities were deter-
At the end of the experimental period (5th
mined: sucrase (EC 3.2.1.48) was assayed accord-
ing to Messer and Dahlqvist [21], arninopeptidase
day) the weight of the rats reached 252.80 ±
(EC 3.4.1 1.2) according to Maroux et al. (18J us-
6.85 g. As shown in figure l, the evolution of
ing L-alanine-p-nitroanilide as substrate.
Lactase
the protein content of the jejunum and of the
(EC 3.2. 1.23) was measured in the presence of
ileum was similar in both the mucosa and the
p-chloromercuribenzoate according to Koldovsky et al.
brush border membranes during starvation.
[13J.
Enzyme activities were expresscd as specifie activ-
An important decJine of the protein content
. ities: milliunits per, milligram of protein or as total
was noted after the first 2 da ys of starvation .
segmenta]
1
activities: units per total intestinal segment
The brush border protein yield was not sig-
(10 cm). 1 U of activity cquals 1 urnol of product
nificantly different in the jejunum and in the
forrncd per minute at 37 oc. Protcins wcre assayed
ileum until the 4th day, thereaftcr the protcin
according to the method of LOIITI' ct al. (17]. Studcnt's
1
t test was used to determine signiticant differences
yield was reduced by 50% in both intestinal
betwccn treatment mcans,
segments.
1
1
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---

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Fig. 2. Segmental activity (units per intestinallength) of aminopeptidase (-), lactase (- - -) and sucrase (.... l.
in the jejunum (A) and in the ileum (8) of adult rat during starvation. Each point represents the mean ± SE ln =
8). The asterisks indicate significant dilTerences between the starved and fed rats. The shaded area corresponds to
the value of enzyme activity mcasured in the nonstarved rats. • p < 0.05; •• p < 0.01.
Effect of Starvation on Intestinal Enzyme
and aminopeptidase in the jejunum whcn
Activities
compared to the ileum. In the jejunum. su-
Modifications in the Segmentai Activities.
crase and aminopeptidase segmental activi-
The segmental acti vity of lactase increased in
ties did not show any significant changes
the jejunum and the ileum during starvation
during the first 2 days of starvation whcn
(fig. 2). A 3-fold increase was noted in both
compared to the nonstarved animais. Nev-
the jejunum and the ileum after a 2-day fast
ertheless, during the following days a signifi-
when compared to the nonstarved con trois.
cant and progressi ve decrease was mcasurcd
Thereafter, in the jejunum. lactase activity
for these two activities (fig. 2A). In contrast,
progressively declined reaching by 5 days of
in the ileum the segmental activity of sucrase
starvation the levels found in the controls
,
did not show any significant change in C0111-
(fig. 2A). In the ileum. lactase maintained its
parison to the controls throughout the exper-
high levcl ofactivity until the 4th day ofstar-
imental
period (fig.2B).
Concerning the
vation (fig. 213).
evolution of the segmental activity of arnino-
Differences were notcd in the evolution
peptidase in the ileum. this enzyme activity
pattern of the scgmental activities of sucrase
exhibited first an increase, reaching its ma xi-
1
1
1

---

103
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Fig. 3. Specifie activity of aminopeptidase (-), lactase (- - -) and sucrase (
) of the mucosal hornogcnates
(A, C) and of the brush border membranes (B, D) in the jejunum (e) and ileum ( ) of adult rats during starvation.
Otherwise see legend to figure 2.
mum by the 2nd day of starvation and there-
brush border membranes in the jejunum and
after dropped significantly when cornparcd to
in the ileum (fig. 3). In ail conditions, maxi-
the nonstarved controls (fig. 2B).
mum stimulation was measured after 2 days
of starvation and a 3- to 4-fold increase in the
Modifications ill the Specifie Activities.
specifie activity was detected. This high levet
The specifie activity of lactase was enhanecd
of activity was maintained until day 4 of star-
in both the rnucosal hornogcnatcs and the
vation. At da)' 5, lactase activity dcclined to a
1

---

104
level still significantly higher than that found
report we show that, in the jejunum and in
in the con trois.
the ileum, the protein loss is very similar in
Concerning the specifie activities of su-
the mucosa and in the purified brush border
crase and aminopeptidase, modifications in
membranes during the 5 days of starvation.
the evolution patterns of these enzymes dur-
Furthermore, the modifications of the en-
ing starvation were obtained in the jejunum
zyme activities in the jejunum as weil as in
when compared to the ileum. In thejejunum,
the ileum should not be attributed to difler-
the specifie activity of sucrase did not exhibit
ences occurring at the level of brush border
any significant change in the mucosal ho-
membrane purification. Indeed, the brush
mogenates or in the brush border membranes
border protein yield is not significantly mod-
during the first 4 days of starvation (fig. 3A,
ified in the jejunum when compared to the
B). In contrast, aminopeptidase-specific ac-
ileum. On the other hand, the degree of puri-
tivity showed a significant increase in the
fication for a given enzyme did not show sig-
brush border membranes after day 3 when
nificant changes during the whole experimen-
compared to the controls (fig. 3B), whereas
tal period.
no modifications were measured in the jeju-
The distal part of the intestine exhibits an
nal homogenates (fig. 3A). In the ileum, the
increased capacity to digest proteins during
specifie activity of sucrase was significantly
starvation. Indeed, the segmental as weil as
enhanced after 2 days of starvation in both
the specifie aetivity of arninopeptidasc is en-
the mucosal homogenates and in the brush
hanced in the ileum during the first 2 days of
border membranes (fig. 3e, 0) and remained
starvation but declined thereafter. In con-
at this leveJ throughout the starvation period.
trast, in thejejunum, the segmental activity is
The specifie activity of aminopeptidase was
decreased by starvation but the specifie activ-
increased as soon as the 1st day of starvation
ity is not modified in the brush border mem-
in the mucosal homogenates, the values
branes during the first days and is stimulated
reaching a plateau untiJ day 5 (fig. 3C). In
after day 3. Increased peptidase activity has
contrast, in the brush border mem branes, the
been reported in the intestine during starva-
specifie activity ofaminopeptidase was max-
tion, but also in other tissues during organ
imum 2 days after the beginning of starvation
atrophy [15]. The difTerences in the evolution
and then dropped the following day to the
pattern of aminopeptidase in the jejunum
level of the con trois (fig. 3D).
and in the ileum during starvation can be
explained by the fact that this enzyme may be
involved in the breakdown of body protcins
Discussion
of the intestinal cells derived from shed epi-
thelium. These sources of substrate will he
It is weil known that starvation causes
more important during the first days of star-
atrophie changes in mucosal architecture.
.-
vation and digested more effectively in the
The cell migration rate from crypt to villus
distal part of the intestine. In this regard.
tip is retarded, villus and crypt height are
arninopeptidase may have during the first
diminished and extensive dccreasc of muco-
days of starvation a conservativc raie by pre-
saI DNA and protein content is noted during
venting a too important loss of tissue pro-
food deprivation [1. 4.7.20]. In the present
teins. The importance of a propcr reference

---

105
system used in the expression of enzyme
life span of the enterocytes is increased as the
activity is revealcd by the modified evolution
consequence of the reduction of the cell mi-
patterns of arninopeptidase or of sucrase ac-
gration rate [l, 7], it may be suggested that
tivities whcn the rcsults are expressed with
the enzymic stimulation does not occur in
two distinct denorninators: either intestinal
newly synthesized cells but rather in the dif-
Icngth in the case of segrnental activity or
ferentiated enterocytes. In this regard, recent
protcin content in the case of specifie activi-
findings obtained in other experimental con-
ty, Our results have shown that decreased or
ditions have led ta similar conclusions. In-
no change in the segmental activities of ami-
deed, it has been shown that in the bypassed
nopeptidase or sucrase corresponded to an
intestine lactase activity is stimulated [27].
.increase in the corresponding specifie activi-
The bypassed segment can in several aspects
ty. In this case segmental activity should be
be compared to the normal intestine during
eonsidered as the proper reference system
starvation. In both conditions, the intestinal
and is directly related to the digestive capac-
segments are food deprived and the epithelial
ity of the intestine whereas the inerease in the
cells present a reduction of their migration
specifie activity is in fact mainly the conse-
rate, suggesting a causal relationship between
quence of the intestinal protein loss observed
lactase accumulation and enterocyte life span
during starvation.
[27]. However, it is weil known, under nor-
Independent of the reference system used,
mal conditions, that lactase and sucrase ac-
segmenta! or specifie activity, the present pa-
tivities are both located in the mature entero-
per c1early shows that in the mucosa as weil
cytes [26]. In this regard, it is to be expected
as in the brush border membranes, intestinal
that an increased number of mature entero-
lactase activity is strikingly enhanced by star-
cytes should lead to increased activities of
vation. This stimulation of lactase activity is
both lactase and sucrase. Our results show
initiated during the first 24 h of starvation
that in the jejunum the segmental activity of
and reached its maximum after 2 days. Of
lactase is increased during starvation whereas
interest is the finding that in the two mea-
sucrase segmental activity declined. Further-
surernent systems which are referred either to
more, at the brush border membrane level,
intestinallength or to protein content, identi-
the stimulation of lactase-specifie activity is
cal results are obtained on the evolution pat-
associated with no changes in sucrase activi-
tern of lactase activity during starvation. Our
ty. These findings suggest that lactase stimu-
results show that the stimulation of lactase
lation provoked by starvation may not be
activity provoked by starvation in the jeju-
related entirely to the increase of cellular life
num and in the ileum is the réflection of an
span, at least in the jejunum. At the level of
increase in the enzymatic equipment of the
the ilcal brush border membrane, both lac-
gut, despite the protein loss and the shorten-
tase- and sucrase-specific activities arc in-
,ing of the villi [1). and also of the brush bor-
creased by starvation but it must be ernpha-
1
der membranes of the enterocytes. The
sized that sucrase activity is always lower in
mcchanisms in volved in lactase stimulation
the ileum and that the stimulation observed
1
are unknown, but sirice the stimulation of
during starvation led sucrase activity to the
lactase activity takcs place in a fcw hours
level found in the jejunum of the nonstarved
artel' the bcginning of starvation and that the
control rats.
1
1
1

---

106
Previous investigations [16] have demon-
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The authors would likr ta thank F. Goss« and :If.
1J Koldovsky, O.; Asp, N.G.:
Dahlqvist, A.: A
GII{{IISCI' for excellent tcchnical assistance. This study
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was supporicd by DG RST (grant No. 81.4.1312).
'acid' 11-galaclosidase in hornogcnatcs of rat small
1
1
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dases. Analyt Biochem. /4: 376-392 (1966).
22 Powell, G.K.; McElveen, M.A.: EtTeet of pro-
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Received: August 12, 1981
23 Raul, F.; Simon, P.M.; Kedinger, M.; Grenier,
Accepted: October 15,1981
J.F.; HatTen, K.: Separation and characterization
of intestinal brush border enzymes in adult rats
F. Raul,
and in suckling rats un der normal conditions and
Inserm U-61,
after hydrocortisone injections. Enzyme 23: 89-97
Avenue Molière,
1
(1978).
F-67200 Strasbourg-Hautepierre (France)
1
,
1
1
1
1

---

108
o
o
,

---

109
-
Q 1984S. Kargcr AG. Basci
Enzyme 31: 45--49 (1984)
OOI3-9432f84f0311~045S2.75fO
Stimulation of Lactase Synthesis Induced by Starvation in the
.Iejunum of Adult Rat
Edouard Nsi-Emvo, Francis Raul
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), Strasbourg, France
Key Words. Intestine· Brush border· Starvation . Lactase· Actinomycin D .
Cyclohexirnidé".
..-. '~.~"~~~.-
'
Abstract.The effects of actinomycin D and of cycloheximide administration have bcen
investigated on the enzyme activities of the jejunal brush border membrane in adult rats after
a 48-hour period of starvation. The modifications in the protein and enzyme patterns of the
brush border membrane and the incorporation of radiolabelled amino acid in the protein
band corresponding to lactase have been studied in the nourished and in the starved animal.
The results show that actinomycin D administration did not rnodify the stimulation oflactase
activity caused by starvation whereas cycloheximide completely inhibited this process. The
stimulation oflactase activity, in the starved animal, is related to a quantitative increase of the
corresponding protein band and with enhanced incorporation of L-[3H]valine in this protcin
band after separation of brush border proteins by gel electrophoresis. Il is concluded that the
stimulation of lactase activity observed during starvation is the consequence of de novo
synthesis of lactase molecules and that this process is regulated at a translational level. A
general hypothesis is proposed in order to c1ear up partly the mechanism involved in the
stimulation of lactase activity by food deprivation in the adult rat.
Introduction
tase activity is independent of the reference
system used for expression of enzyme activ-
Various reports have shown that food de-
ity which is either the total enzyme activity
privation causes an increase of intestinal lac-
per intestinal segment or the specifie enzyme
ta se activity in adult rats [1-4]. ln previous
activity per mg protein. These findings led us
investigations we have observed that maxi-
to propose that the stimulation of lactase
1
muru stimulation' ofintestinallactase activity
activity caused by food deprivation is the
is obtained 48 h after the initiation of starva-
consequence of an increased number of lac-
1
tion [3] and that this effect is dependent on
tase molecules in the
intestinal rnucosa,
the level of circulating thyroid hormones [5].
rather than a reflection of the loss in tissue
Il is noteworthy that the stimulation or lac-
protein due to starvation. In order to get a
1
1
1

---

110
better insight into the mcchanisms involved
The proximal part of the jejunum comprising the
in the stimulation of intcstinallactasc activi-
first la cm extending from the ligament of Trcitz was
resccted, The length of the intestinal segment was
ty, wc have investigated the effects of two
mcasured by stretching the intestine with a 3-gram
inhibitors of protein synthesis, actinomycin
weight.
D and cycloheximidc, on lactase activity in
the brush border membrane of the starved
Label/cd Precursor Administration
In four experimental series, L-[3Hlvaline was uscd
rat. In parallel, the modifications of the brush
as indicator for protein synthesis. For this purposc,
border membrane protein pattern provoked
500 !lCi/rat of L-[3,4(n).3H) valine (38 Ci/rnmol, Am-
by starvation were determined after separa-
ersham, UK) were injected intraperitoneally 48 h be-
tion by gel electrophoresis and the level of
fore killing.
radiolabelled aminoacid incorporation was
Experiments witn Inhibitors
compared in the protein band corresponding
Cyclohexirnide or actinornycin 0 (Sigma. Chcrni-
to lactase activity in the nourished and in the
cal Co.) were injected intraperitoneally each day at 4
starved' animal.
p.rn. during the experimental period of 48 h. The daily
dosage was 0.5 ug/g body weight for cyclohcxirnide
and 0.1 ug/g body weight for actinomycin D. Control
rats were simultaneously injected with 0.9% NaCI.
Materials and Methods
Enzyme Assa.l's
Animais
The intestinal segments were evcrtcd and the mu-
Adult Wistar rats weighing 330-380 g were ran-
cosa was scraped with a glass slide. The procedure of
domly divided into two groups and individually housed
brush border membrane purification has bccn de-
in metabolic cages. The rats wcre givcn a laboratory
scribed previously [6,7). The following enzyme activi-
chow and water ad libitum. After an adaptation period
ties were detcrmined: sucrase (EC 3.2.1.48) was as-
of three days, the food was removed from the experi-
sayed according to Messer and Dahlqvist [R). amine-
mental group at 9.00 a.m. The rats werc starved during
peptidase (EC 3.4.11.2.) according ta Maroux et al. [9J
48 hours and killed at 9.00 a.m. at the same time as
with L-alanine-p-nitroanilide as substrate. Lactase
nourished animais from the control group.
(EC 3.2.1.23) was measured in the presence of p-chlo-
Table I. Effects of inhibitors of protcin synthesis on the activities of brush border enzymes during a 48-hour
period of starva lion
Enzyme specifie activity, mU/mg protein
sucrase
lactase
arninopeptidase
Starvcd contrais (n = 10)
313.09 ± 22.86 a
82.85 ± 5.44 a
359.35±21.16a
Starved + actinornycin 0 (0.1 II/g) (n = la)
235.76±21.43 b
66.15 ± 6.05 a
404.23 ± 25.7 2a
Starved + cyclohcximidc (0.5 ug/g) (n = la)
214.47± 17.30b
38.51 ::t 2.65b
329.74±29.IO'
.
"
Nourishcd (n = 15)
330.94 ± 12.68a
30.79 ± 3. lOb
325.06 ± 17.95a
The results shown arc the mean ± SE. n = Numbcr of animais. For cach enzyme rneans not sharing a
cornmon supcrscript lcttcr dilTer significantly (a.h p < 0.01). The injection ofactinomycin DIo siarvcd rats in-
hibitcd RNA synthcsis hy 40% and cyclohcximidc administration causcd a 60% reduction of protcin synthcsis.
1
1
1

---

1 1 1
romercuribenzoate [10]. Brush border enzyme activi-
night incubation of gel elùate aliquots with their re-
ties were expressed as specifie activities: milliunits per
spective substrate. For radioactivity determination,
milligram of protein. 1 unit of activity equals 1 urnol
each slice was burned in a Packard Tri-Carb Sampie
ofproduct formed per minute at 37 oc. Proteins were
Oxidizer B 306 and counted in a liquid scintillation
assayed according to the method of Lowry et al. [II].
spectrophotometer (Intertechnique).
Student's t-test was used to determine signilicant dif-
ferences between treatment means.
Separation of Brush Border Membrane Protcins
Results
Details of the techniques have been described else-
where [7). The brush border membrane proteins were
separated by polyacrylamide gel elctrophoresis in the
The effects of a daily administration of
presence of sodium dodecyl sulfate (SOS). After elec-
actinomycin D or cycloheximide on the
trophoresis, the gels were eut longitudinally into two
brushborder enzyme activities during a 48-
equal halves, One half was fixed with 0.72 mollI tri-
hour period of starvation are ilIustrated in
chloroacetic acid, the protein bands were stained with
. Coomassie brillant blue and the gels were scanned
table 1.
with a Vernon spectrophotorneter. The other halfwas
The specifie activity 'of aminopeptidase
frozen and cut into O.4-mm slices with a Mickle Gel
showed remarkable stability in the brush bor-
Slicer for subsequent enzyme or radioactivity determi-
der membrane. Neither starvation, nor ad-
nations.
ministration of the antibiotics did modify
Enzymes were eluted from the gel slices by over-
night incubation in 1ml ofdistilled water at 4 oc. lac-
aminopeptidase activity. The specifie activ-
tase and sucrase activities were determined after ovcr-
ity of sucrase was not dècreased after 48 h of
food deprivation but a significant drop was
observed after actinomycin D or cyclohexi-
mide injections. Both inhibitors exhibited
Table II. Variation of L-[3H)valine incorporation
in the protein band corresponding to lactase activity
similar effects on sucrase activity: Lactase
aller electrophoretic separation of jcjunal brush bor-
activity was significantly enhanced by starva-
der ,proteins
tion. Actinomycin D administration did not
i
modify this adaptative process whereas cy-
L-[3H]valine incorporation
clohexirnide completely inhibited the stimu-
(total cprn in protein band)
lation of lactase activity.
_
experi-
experi-
experi-
experi-
The protein patterns of the brush border
ment 1
ment 2
ment 3
ment 4
membrane proteins obtained by gel electro-
phoresis were similar in the starved and in the
Nourished
1,193
1,018
710
967
nourished state (fig. 1). However, a quantita-
Starved
1,742
1,510
1,316
1,486
tive increase of the protein band correspond-
Starved +
ing to lactase activity was obtained in the
cycloheximide
starved animal. Administration of L-[3H]va-
(0.5 ug/g)
1,032
1,025
690
925
,
line 48 h before sacrifice led to increased
Each experimental series cornpriscd one animal or
incorporation of the labelled precursor into
each group. 500 ~Ci of L-[3H)valine was injectcd
the protein band associated with lactase activ-
intraperitoncally 48 h before killing. The sarnc
ity in the starved animal. Cycloheximidc in-
amount or radioactivity was layered onto each gel
(20,000 cprn per gel).
jections inhibited the incorporation of L-
[3H]valine in the protein band (table Il).
1
1
1

---

112
Nourished
Starved
00
00.
.....-.
,
1
,
1
1
1
1
!.'
"
:
."
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1
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sucrase'.
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'
:.::-::':-~~ _:_-
.....
:
·
1
L~.:··..· : :-.
---~ ------;-----........
1-.- - "--j-
:0.055
0.18
0 . 2 5 ' Lactase'
0.055
Relative mobiiities
Fig. 1. Represen tati ve protein and enzyme patterns of brush border membranes of normally nourished (lcft)
and 48-hour starved (right) adult rats after electrophoresis on 75 g/l polyacrylamide gels in the presence ofSDS.
Samples corresponding to 150 ug ofproteins were layered onto the gels. A halfgel was scanned at 565 mm with a
Vernon spectrophotometer after stainingïscan at the top). Sucrase and lactase activities have been determined in
a serniquantative manner on the corresponding half gel and are indicated in optical densities (OD).
Discussion
fected either by starvation alone or by actino-
mycin D treatment, confirming previous find-
1
The present study shows, for the first time,
ings [3, 12, 1'3]. In contrast, sucrase speci lie
that the stimulation of lactase activity ob-
acti vit y decreased in the starved animal aftcr
1
served durirjg starvation is the consequence of
administration of actinomycin D, sirnilar re-
de novo synthesis of lactase molecules in the
sults have been obtained previously by others
jejunal mucosa. The rcsults obtaincd with the
[14]. The lack ofactinomycin D effect on lac-
1
two inhibitors of protcin synthesis on the
tase activity indicates that the synthesis of
brush border enzyme activities are ofpeculiar
lactase molecules induced by starvation is not
interest: arninopcptidasc activity was not af-
regulated at the level of transcription but
1

---

113
rather at a translational level. This conclusion
5 Raul, F.; Noriega, R.; Nsi-Emvo, E.; Doffoel, M.;
can be drawn from the results obtaincd after
Grenier, J.F.: Lactase activity is under hormonal
control in the intestine of adult rat. Gut 24: 648-
cyclohcximide
treatment.
This antibiotic
652 (1983).
completely inhibited the stimulatory effect of
6 Schmitz, J.; Preiser, H.; Maestracci, D.; Ghosh,
starvation on lactase activity and also the
B.K.; Cerda, JJ.; Crane, R.K.: Purification of the
incorporation of L-[3H]valine in the protein -
human intestinal brush border membrane. Bio-
band corresponding to lactase activity ob-
chim. biophys, Acta 323: 98-112 (1973).
7 Raul, F.; Simon, P.M.; Kedinger, M; Grenier, J.F.;
tained by gel electrophoresis. The present re-
HafTen, K.: Separation and characterization of in-
port cornbined with our previous results [3, 5]
testinal brush border enzymes in adult rats and in
conceming the starvation-induced stimula-
suckJing rats under normal conditions and after
tion of intestinal lactase activity in the adult
hydrocortisone
injections.
Enzyme 23: 89-97
rat, lead us to propose the following hypothe-
(1978).
8 Messer, M.; Dahlqvist, A.: A one step ultra mi-
sis: starvation by Iowering the IeveI of circu-
cromethod for the assay of intestinal disacchari-
Iating thyroid hormones provokes increased
dases. Analyt. Biochem. 14: 376-392(1966).
. lactase synthesis. Thyroid hormone acts nor-
9 Maroux, S.; Louvard, D.; Baratti, J.: The arnino-
mally as a negative efTector for lactase synthe-
peptidase from hog intestinal brush border. Bio-
sis. The low hormonal IeveI caused by food
chim. biophys, Acta 321: 282-295 (1973).
10 Koldovsky, O.; Asp, N.G.; Dahlqvist, A.: A
deprivation induces a stimulation of messen-
method for the separate assay of 'neutra!' and
ger RNA translation resulting in an increased
'acid' l3-galactosidase in 'homogenates of rat small
rate ofJactase synthesis in the mature entero-
intestinal mucosa. Analyt, Biochem. 27: 409~ 18
cytes [5] during the first hours of starvation.
( 1969).
Il Lowry, O.H.; Rosebrough, NJ.; Farr, A.L.; Ran-
dall, RJ.: Pratein measurement with the Folin
phenol reagent. J. biol. Chem. 193: 265-275
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(1951).
12 Kimura, T.; Selo, A.; Yoshida, A.: EfTeet of diets
, We thank Miss F. Gossé and Mr. M. Gal/user for
00 intestinal disaccharidase and leucine amino-
excellent technical assistance.
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1
1
1

---

114

---

J 15
CIII, lYS), 24, 648-652
Lactase activity is undcr hormonal control in the
intestine of adult rat
r RAUL, R NORIEGA. E NSI·EMVO, M DOFFOEL, AND J F GRENIEI{
From the Unité 61 de /ïNSERAI, Strasbourg, France
SUM~I"RY
111 the adult rat. sturvatiou during 48 hours led 10 a three lokl increuse of lactase
specifie uctivity ill the iutestiual brush border membranes. Thyroxine injection during the thrcc
days belore death (0,5 f.1.g./g duily) inhihitcd the stimulation of lactase activity iuduccd hy
starvation without modifying sucruse activity whercas hydrocortisone injections (25 IL g/g duily)
or thyroidectomy dit! Ilot modify the stimulntory cffect of starvation on lactase uctivity. Thcsc
results suggcsts Cl specifie hortuonul control of intestinal lactase activity in the rat.
Fuuctiunul adaptai ion in the intestine uf the lat
111011 lactase activity wns rclatcd 10 thyroid luurtion.
occurs siruultnncously with the dict.uy carhohydratc
lor cxamplc: (1) the normal dcclcase in Lll'l,lsc
change iuking place al wcauiug. kading, ln a markc.l
nctivity al wcuuing parnllclcd the risc in the sruuu
dccrcasc in Iactusc activity
alld
stiruul.uiou 01
conccutratiou 01 thyruxiuc.!" (2) jejllll;I1 1,ll'LN'
sucrusc activity .' 2
activity is dccrcuscd hy thyroxine iujcrtinu» ill
Il has hccn shown that lactase activity in the
non-starve d adult
rals,I7 I~ (:q starv.uiou. a
intestine 01 adult rai was euhanccd by dictai y
condition which provokcd stimulation 01 /ad;lse
larlose3-S hui also by varions cnrhohydr.ucs.":" No
acriviry,
causcd
reduce d circulalin/!
le vcl
(II
specifie stimulation however , was obtuincd unde r
thyroxine in adult rnr.!"
these conditions as the increasc 01 othcr hrush
III ortler to gain more insiglll into the mcch.misrus
border enzyme
activitics
(sucrusc ,
mnlt ase )
involved in the regulation 01 lactase artidly in Ille
parallclcd that of lactase activiry. Up 10 the present,
intestine of adult rais wc have Învestig;\\lcd Ille
the only known condition thnt Ied 10 a specifie
cflccts of thyroxine or glucocorl icoid injeri iOllS ;I/ld
stimulation of lactase activity wus food dcpriva-
of thyroidecrouiy on
the stimulruion 01
Iarlasl'
lion. III Il As shown previously' 1 food dcprivatiou
uctiviry iuduced hy srarvation.
provoked a siguiûcaut incrensc in the specifie hui
also in the segmenta! activitics of jcjuual lactase
l\\ lethods
during the Iirst 24 ho urs of starvatiou, maximum
stimulation being reached by 48 hours, whcrcas the
ANIMAI.S
artivities of ether brush border euyzymcs either
Expcrimcuts wcre performcd with rulul; \\\\'i~[;11 .;rh
wcre not modified or werc decrcase.l. In contrast , it
wcighing 3UIl 10 351l g kcpt in individual ml'lailldi,'
has been shown thnt sucrase acrivity WOlS spcciücully
cages. Rats were fed a conuncrcinl labor.uorv (iJ,,\\\\'
enllanced hy dietary suc rose in lhe illtestine 01 adull
atllibiJ/l1I1 bdme initial ion (If lite expci illlclltalÎI li 1.
rats,12-H sucruse inducing ncosynlhesis of sucrase
The anilllais \\\\'ele starvcd lor 48 houls hui IctTi''-l't!
lIIolecules.l.) 15
\\Vatel ar/libitu/Il and wele killeLi allhe SOIllle lillll' OIS
These resu/ls suggest lhat laclasc allli sucrase ;lIe
normally fed rais. The pmxilnal paIl 01 liJeiej\\llllllll
1
regulaled by different mechanisills and \\\\'e ha\\'c
was rcsected. il illcluLied Ille firsl III l'ni L'X1l'lIllil\\g
proposed," litai
regulalion 01 inteslinal lactase
Imlll
lhe
ligalnenl
ul Tlcitz.
TiJe
k/l!~lh \\\\;IS
activily lIIighl be Linder horl\\1onal l'olltml in the
.lIe;\\SIIlCd by strelchil\\g Ille illll'slillc \\\\'ilh a .1 g
1
adul!. In this reg'lrd, the 1\\10st serious candida les
wcigllt and the segllleni was ll11siJed Il'jlh a l'IIld
s<'elll ta he the lhyroid hormones as V;lliollS physio-
saline Sollliion.
logical and experilllentai conditions h,)Vl' illllicated
I1\\JHMONAI. IRE,\\TMENI
(\\lhJIl''1l,. (1'1 cou(")I'0lllkn(c: 1" FI:llIcjç ICIIl 1. INSFHl\\1 l.lllih.t fI! ..~ 1\\\\ 1.'11111.'
M\\·lic>rc. IlnOO SII;I'..lh IUIF. Fr:lIKC'.
I~;rls wcre ÎlljcCled il\\tIOlllL~lit(llle;dl)' \\\\ith Il\\tll'"
1
lkrc:jq:d 1111 pllbllralinn III ScplclIIhcr 14S2
ClJltisllllC (Sigma) diluled il\\ 1)·9(;;· s;rlil\\c III \\\\iliJ
IJ·LS
1

---

116
DL-thyroxine (Sigma) dissolvcd in O·tll M NaOI!.
One in jeclio Il was performcd <Iaily timing the thrcc
15
Villus
.lays bdorc dcath. Dosages wcrc 25 /lg hydre-
C'>I'I
,
cortisone (If (J'S/tg thyroxine per!!l urn hody wcight.
,
t J______
:
Thyroidcctumy WOlS cnrried out one mont h hcfurc
o~
,
expcl inicnt initial ion, the lhyroid hcing 'disscctcd
0",
1
out undcr the disscctiug microscope.
EXPERIMENTAL TECIINIQUES
~o~
To ohtain sequential ccII rclease from villus IiI' 10
-e.:..::::.:-e, _ 1 \\
the crypt base, the intestinal segment wus cverted
~....:...... ;\\
and suhmiued 10 successive
incubations of
I(J
minutes al 3re in phosplrrue-buffercd saline (no
C}<, f\\lg2 <) coutaining 1·5 mf\\1 EDTA aIII1(J·5 mM
i T~~
dirhiothrcitol under agitation al
150 rpm in a
~
~
f)f~Y\\
'----------~--:...---~ .-~
wuterbath shaker, the released cclls werc colleclcd
10
20
30
LO
50
60
70
00
90
IO'J
% of cens isolcted
as dcscrihcd earlier. 14 211
The ccii fractions or the wholc Illllcos ,'1 obtuincd
fig. 1 Representative gradient of lactase activitv ;11
alter scraping the eutire intestinu! segment with a
intestinal ails isolatcd along tlic ,'iIlIU-0.l'/'1 I/.Ii.\\ inlcd ,,1/
glass slidc werc homogcnised in 50 mlvl mannitol.
({I-lI), ;11 rats starvcd fOT 48 JIOIII"I (0-0' (/11";11 1"<1/1 .11<lIT".1
2 mM Tris (pli 7,1). Brush border membranes
Ji>r48 hours and injectrd d(/;I)' with IhYI"o.r;IIC dl/l illii tlu:
wcrc isolated from the whole mucosal luunogcuatc
IJII('e '/(/)"5 bcfore dcutl: (e-e). l ltuulrrd prr (('III oI,d/,
as dcscrihcd prc\\"iously.21 22 Sucrase (El: ).2.1.'IH)
;.1<1/(/1('<1 ccnl"CSpOII,Ü to the 511/11 of tlu: .I;·"CI;'I/'f t'.IJ" ".1.1".1 ,'\\
1)/""11';'1. 711c PC1"CCIII(/ge of cclls isolatcd ;11 CI/ch ."/("(1".1.1; 1"('
"'as assaycd according 10 Messer and 1)ô1hlq\\"i~1.2.1
/;"1/('1;'11/ \\l'as dctcrmincd />.1' the 1'1"(1/"111;011 otccll nnuei«
Lactase (EC 3.2.1.23) was measurcd ill the plüencc
isolated ill "gil'l'II [raction.
of p-chloromercuribcnzoate according 10 Koklovsky
elll/.2~
Enzyme
activitics
were
exprcsscd
as specifie
activitics: milliunits (mU) per milligram of protein,
fed animais.
Neverthelcss, sucrase activity
was
One unit of activity equals 1 }l.lIIol of product
sigultlcautly reduced . in the
fecl
rats
rcceiving
Iormcd per minute at 37°C. i'rutcins werc assaycd
hormonal injections during the threc days. Thus. in
according 10 the method of Lowry cl (//25 Stuclcnt's 1
the feJ rats injcelcd with thyroxine or wirh hydru-
lesl wus used 10 determine signilicant differences
cortisone the
values for sucrase
acrivity wci c
betwceu trcatmcut rueuns.
rcspectivcly 271·BO± I5·,Hi mU/mg protcin
and
23R·27±17·15 IIlU/mg protciu a11c1 of Dll·l).I± 12·6H
mU/mg proie in in the Ied coutrols (p<IH11I1). In
contrast , the red thyroidectomised animais cxhibitcd
EVOI.UTlON or r.ACTASE ACTIVITY ALONG Till'
similnr values for sucrase activity as thosc of the
"1 l. 1.U S -CRY ri" A X 1S
controls (Fig. 2).
Whcu compared with the norlllally fcd raIs, lhose
Couceruing lactase. starvation dnring ~R 1I1l111s
fasled L1l1ring a 4R hour perind showed an illcreasc in
provoked a significanl slilllllialion of ilS specifie
laclasc aClivily ail alollg Iile villus axis, Illaxillluul
aClivily from 29·61 ±2.2B mU/mg prolcin in Ille kd
slillllliatioll occurreLl ill lhe Illalurc elllcrocyles frolll
rai 1(1 7Y·BO±7,76 IIlU/mg proll.'in in Ihe slarn:d
Ihc ,illus lip (Fig. 1). A daily injection of lhyroxinc
anima\\.
Ncilller
hydrocortisone injections
1I(l1
1
durill!!- Ihc Ihree days bcfme t!c;1l11 inltihiled lltc
Ihyroiderl(llllY ditl llIoclify Ihe slimulalury dkct
~lillllll;ltioll of Iaclasc aClivil)' illdlln:d by Sl;trvalioll,
l'allse,1 by slarvalion as Ihe "alues for laclase aclivily
lhc paltern of laclase aclivily of lhe slar\\'cd lai
(liJlaillL'd limier Ihcsc conr!ilions \\l'cre silllilar III
'n:cei"jllg IhymxÏlfe WolS Illell silllilar 10 Ille olle
IhllSC llleasl\\lcll in Ihe slarvell cOlllrols alld "'L'Il"
1
(lbsen'cd for lhc kt! rai (Fig. 1),
respcclivcly of 70·22±4·llhIlU/llIg protcin :rnd
7)·17±7·29 mU/mg prolein. III cOlllrasl, lhYlllXilll:
M(lllll'ICATlUNS OF SUCRASE AND LACTASE
injeclions cOlllplelcly
illhihiled
lhe
stinlUlalll/ y
1
S l' E (" 1 FI C .\\ C TI VIT 1l' SIN [J Il li S \\1 Il 0 Ill) E Il
cfkcl of slarvalioll 011 laclase ;lcli\\'ily.
Il I\\";I~;
ME~llIll,\\NES
1111!c W()( litYthal, in Ihl: fed rats. !;\\clasc :\\cli\\'Îty "'as
Tlle specifie aclivily of sucrase was 1101 IllOdilicd by
signirirantly inCfeased afler lhyroid.:cloIllY. ";III1l'S
SI;lIl"alioll ill Ihe "ariolls L'xpclilllclItal cOllditiollS
rl.'aching <t(}·o7± 2·711 IlILJ/mg pllllcin (p<[I·(IIII) III
1
Wil':ll cOlllparL'd willl Iile al'livily IllC;\\SlIll.'t1 ill 111<:
the fcd animal olle 1I101l111 aflci lityrniLiL'c!lllllj".
1
1

---

117
650
Sucrase
400
kinetics as it has been shawn that a daily injection of
tetraiodothyronine for 12 days provoked a rnarked
~'
t
300
t
decrease in jejunal brush border lactase which was
caused by a direct effect and not mediated through
rI-
,
7-
+\\
"
variations in cell kinetics. III
'",
"
200
' <
1!11
Of interest was the
finding
that starvation
~
produced a stimulatory effect on. lactase activity
c
~~
'~
Qi '(la
essentially in the mature cells of the villus and that
ëa.
this stimulatory effect was inhibited by thyroxine.
C7l
1
7.'
E
1 ;;!'
z <
1
' - -
'--; - - -
Measurements of lactase activity along the villus-
\\..._J
'----'
l-J
crypt axis performed 24 hours after the initiation of
::J
,Lactase
starvation led
to similar results although the
E'OO
;
concentrations of lactase activity were lower ail
**
**
along the villus. The present results confirrned that
~*
two different cellular compartments were involved
~.
If;j
~
in lactase stimulation and in sucrase stimulation
50
Î~:<'•
along the villus-crypt axis. Indeed lactase stimula-
li!
+1
tion mediated by starvation or by dietary Iactors"
rfl
WM
rf-'
~
fi"
"i
r:
occurred in the mature cells of the villus whereas
<1
sucrase stimulation induced by dietary carbo-
z
~
~l , J
I!!J
«?d
hydrates occurred mainly in the immature cells of
,
the villus base. 14 2627
An important aspect to be discussed in relation la
our present findings is the fact that dietary carbo-
hydrates have. under given conditions, a stimulatory
effect on intestinal lactase activity as has been shown
Fig, 2 SI'I'C!(iC activitics of
by many authors. ~9
ill/es/il/a/ SI/crau and lac/ose il/
26 These results seern at first
l'"r!(ied hrush border membranes of[ed rats (0) and of rats
sight in conflict with the present report intlicating a
starvedfor -18 hours (m). VariOIlS experimental conditions
specifie hormonal effect on lactase activity in the
arc described III/der Methods. Results shawn are the
adult. Mainly two types of experimental procedures
I/Iean ±Sf. Number ofanimals is indicated il/ parentheses.
have been used to investigate the influence of
··p<O·OOl (olle tailed Student's t test}.
dietary carbohydrates on brush border enzymes. ln
the first experimental procedure. rats were starved
for several hours and. then re-fed a high carbo-
Discussion
hydrate diet , under these conditions only sucrase
and maltase activities were markedly increased by
This study clearly showed the
dependency of
the
diet
whereas
lactase
activity
was
not
intestinal lactase activity on
the
thyroxine
modified, IJ 14 27 ln this case. lactase activity which
concentration in the rat. Indeed, it was only be
was already enhanced by starvation was not further
lowering the thyroxine level either by thyroidectomy
increased by the
dietary carbohydrates which
or by starvation 19 that a specifie increase of lactase
stirnulated specificalJy sucrase and. maltase activities.
activity was obtained in the intestine. On the other
ln the second experimental procedure rats werc
hand. thyroxine injections inhibited completely the
kept for several weeks on a low carbohydrate diet
stimulatory effect induced by starvation on lactase
and thereafter fed with increasing amounts of
activity without modifying sucrase activity, whereas
carbohydrates'"? 26 leading to a stimulation of not
hydrocortisone exhibited no effect on the activities
only sucrase and
maltase. but also of lactase
of intestinal disaccharidases.
activities. This latter procedure led to a non-specifie
The thyroxine mediated eflects on lactase activity
increase in lactase activity which might result from a
did not result from modification occurring at the
general increase of cellular metabolisrn. A key rule
levet of villus architecture or of protein mass. Thus,
of thyroxine on the regulation of lactase activity cau
starvation during 48 hours caused a 20% shortening
be proposed during the weaning period. At weaning
of the villus height in ail conditions. Furthermore,
the rat switched from a relative low-carbohydrate
the brush border protein yield was not signilicantly
diet (milk) 10 a relative high-carbohydrate dict
modified by the various treatments. ln addition we
(50-60% carbohydrates) and this dietary modifica-
cari assume
that the modifications obscrved in
tion led ta increased activitics of maltase and sucrasc
lactase activity were not mediated by changes in cell
1
whereas lactase
activity at the saille lime was
1
1

---

118
lowered ami remained Olt a low levet in the adult.' Il
Dowling RH, Riechen EO, eds. Mfrllallis"'.~ of
is noteworthy that during weaning increascd intake
intestinal adaptation. Lancaster: MTP Press, 19R,l:
(If dietary carbohydrates will have
153-68.
110
effecl on
lactase activity. In fact. it is now weil known that
9 Raul F, DoHoel M, Marescaux J, Boekel R. Grenier
JF. Ellects of chronic alcohol administration and <1 high
timing the saille period increased concentration of
carbohydrate-low protein diet on the activites of the
circulating thyroxine is detected!" and may explain
jejunal brush border enzymes in the rat. Gut 19R2; 23:
the lowering of lactase activity. In adult rat, starva-
962-7.
.
tion by reducing the thyroxine concentration 19 will
lU Lichtenberger L, Welsh JD, Johnson LR. Rclatiouship
cause increased lactase activity, a situation which
between the changes in gastrin Ievels and intestinal
has sirnilarities with the suckling period by the fact
properties in the starved rat. Am J Dig Dis 1976; 21:
that during this period thyroxine concentration is
33-8.
~
Il Raul
very low and associated with high lactase activity,
F, Doffoel M, Noriega R, Grenier .IF, Ilallen K.
Modifications of brush border enzyme activities during
Our present results suggest thal the regulalory
starvation in the jejunum and ileum of adult rats,
processes involved in lactase activity in adult rat are
Enzyme 1982; 28: 328-35.
similar to those operating during the
postnatal
12 Deren JJ, Broitman SA. Zamcheck N. Eîlect of dict
period both involving thyroxine. The. rnolecular
upon
intestinal disaccharidases and disaccharide
mechanisms of the regulation of lactase activity by
absorption. J Clin Invest 1967; 46: IR6--95.
thyroxine remain entirely to be elucidaled.
13 Kimura T, Seto A, Yoshida A. Effect of diets on
intestinal disaccharidase and leucine- arninopcptidasc
This study was supported by INSERM and by
activities in refed rats. J Nutr 1978; 108: IU87-97.
DGRST (Grant n" 81 L 1312). We would like to
14 Raul F, Simon PM. Kedinger M. Grenier JF, 1brrcn
acknowledge the excellent technical assistance of
K. Ellect of sucrose refeeding on disaccharidasc and
aminopeptidase activities of intestinal villus and crypt
Miss Francine Gossé and Michel Ga\\luser.
cells in adult rats.· Evidence for a sucrose dependent
induction of suerasein the crypt cells. Biochim Bi0l'Ilp
Acla 198U; 630: 1-9.
15 Cezard JP, Broyart JP, Cuisiner-Gleizes P, Mathieu II.
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22 Raul F, Simon PM, Kedinger M, Grenier JF, Ilallcu
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1
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border enzymes in adult rats and in suckling rats undcr
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normal conditions and after hydrocortisone injections.
8 Koldovsky O. Bustamante S, Yamada K. Adaptability
Enzyme 1978; 23: R9-97.
of lactase and sucrnse activity in jcjunoilcum of adult
23 Messer M, Dahlqvist A. A one slep ultral11icrolltelhod
r<lls 10 changes in intake of st;'lrch, sucrose, laclose.
for the <l5S<lY of inlestinal disaccharid<J5es. A/I/I
glucose, fructose and galactose. In: Robinson JWL,
Biuc/lel1l Biop/l)'s 1966; 14: 376--92.
1
1

---

119
Raul, Noriega, Nsi-Emvo, Doffoel, and Grenier
24 Koldovsky 0, Asp NG. Dahlqvist A. A rnethod for the
26 Yamada K, Buslamante S, Koldovsky O. Dielary
separate assay of "neutra!" and "acid" {J-galactosidase
induced rapid increase of rai jejunal sucrase and lactase
in hornogenates or rai srnall intestinal mucosa. Allal
activity in ail regions of the villus. FEBS Leu 1981; 129:
Biochem 1969; 27: 4(]1}-IR.
.
89-92.
25 Lowry 011. Roschrough NJ. Fnrr AL. Randall RJ.
27 Uishen MH. Grand RJ. Site of subtratc stimulation or
Protein measurerncnt with the Fo/in phenol rcagent. J
jejunal sucrase in the rat. J Clin lnvest 1979; 64:
Biol Chem 1951: 193: 265-74.
1097-102.
,
1

---

120
,

---

121
Gen. Physiol. Biophys. (1986), 5, 53-59
Improved Purification of Rat Intestinal Lactase
E. NSI-EMVO, J. F. LAUNAY and F. RAUL
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 61,
3 avenue Molière, 67200 Strasbourg, France
Abstract. A rapid and improved method to obtain purified lactase from rat
intestine is described. The purification procedure involved only two chrornatog-
raphic steps. The degree of purification was far above (500 fold) the values reached
with c1assical methods. Rabbit antisera raised to the purified lactase were charac-
terized using conventional immunological techniques. The specificity of the lactase
antibodies was confirmed by the lack of interference on maltase, aminopeptidase
and alkaline phosphatase activities measured after papain extraction of the
membrane proteins.
Key words: Rat -
Intestine -
Lactase -
Antibodies -
Lactase purification
Introduction
Lactase (EC 3.2.1.23) is associated with phlorizin hydrolase (EC 3.2.1.62) in the
form of a dimeric complex specifically anchored in the intestinal microvillus
membrane. Lactase represents the main disaccharidase activity in the brush border
1
membrane of the suckling rat. The enzyme exhibits maximal activity shortly after
birth and low activity after weaning (Doell and Kretchmer 1962; Henning and
Kretchmer 1973). Lactase has attracted much attention since low levels of enzyme
1
activity have been found under normal conditions in the intestinal mucosa of the
major part of the adult population in the world. Intestinal hypolactasia causes
1
c1inical symptoms following the ingestion of milk and is also a common feature
associated with intestinal diseases like coeliac disease or gastroenteritis (Auricchio
et al. 1963; Dahlqvist et al. 1963; Freiburghaus et al. 1976; Sahi 1978; Simoons
1
1978). \\V.e describe here a convenient method for the purification of lactase from
suckling rat intestine by two chromatographie steps following papa in extraction of
brush border membrane proteins. By this procedure lactase of a high purity was
1
,
obtained and used for the preparation of specifie antisera. The specificity of the
antisera was measured by conventional immunological techniques and by the
1
ability of the membrane-bound antibodies to interfere with the papain extraction of
the brush border enzymes.
1
1
œ

---

122
Materials and Melhods
Enzyme preparation: The small intestine extending From the ligament of Treitz to mid ileum was
excised Irorn 15 day old Wistar rats. The segments were opened and washed with 0.9% NaCI and
homogenized in 50 mmolll mannitol, 2 mmolll Tris, pH 7.1. The brush border membranes were isolatcd
From mucosal hornogcnatc as dcscribed previously (Schmitz et al. 1973; Raul et al. 1978). The pellet
containing the purified brush border membranes was resuspended in 10 mmolll potassium phosphate
buffer pH 6.0 (Buffer A). The membranes were then incubated with insoluble papain (Sigma Chemical
Co.) at a concentration of 10 J.lg papain per mg prote in for 35 minutes at 37 oc. Alter centrifugation of
the samples at 20,OOOxg for 30 minutes, the resulting supernatant containing the solubilized proteins
was lractionated on a 1.5 x 100 cm column of agarose (Bio-Gel, A-15 m; Bio-Rad) at a Ilow rate of
9 ml/h. The etution medium was buffer A. A major peak of lactase was eluted atl12 ml elution volume.
The fractions of the lactase peak were fractionated further on a 1 x 9 cm column of hydroxyapatite
(HAUllrogel; IDF). The column was washed with buffer A. Lactase was retair •ed and eluted al
a concentration of 150 mmolll phosphate buffer. The lactase fractions were dialyzed in buffer A and
concentrated,
Enzyme assays: Lactase activity was measured in the presence of p-chloromercuribenzoate (Koldovsky
et al. 1969), maltase (EC 3.2.1.20) was assayed according 10 Messer and Dahlqvist (1966). Aminopep-
tidase (EC 3.4.11.2) was determined with L-alanine-p-nitroanilide as substrate (Maroux et al. 1973)
and alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1.) was measured with p-nitrophenyl-phosphate as substrate
(Garen and Levinthal 1960). One unit of enzyme activity equals 1 urnol of product formed per minute
at 37 oc.
lmmunological procedures: Rabbits were immunised by subcutaneous injection of 50 J.lg purified
lactase mixed with 0.5 ml complete Freund's adjuvant. The injection was repeated once 3 weeks later.
Bleedings were made three weeks alter the last injection and the sera were tested by the ELISA
technique for antibody titers. Ali the immunological reactions were performed in 10 m.mol/l sodium
phosphate at pH 7.4 (Clark and Adams 1977). Competition assays were carried out by varying the
amounts of competitor (lactase or maltase) to be incubated with various dilutions of rabbit serum under
conditions of excess antigen on the plate. The antigen-antibody complex was revealed by incubation
with sheep anti-rabbit antibodies linked with peroxidase, Peroxidase activity was rneasured in the
presence of 0.01% H 20 2 and
1 mg/ml ABTS «2.2'-azino)-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonatej;
Boehringer Mannheim) as substrates (Clark and Adams 1977).
1
Results and Discussion
1
Enzyme purification: The c1ear solubilized protein solution obtained after papain
extraction of the brush border membrane was directly applied on a column of
agarose. Agarose was chosen since its matrix is made of polysaccharides with f31-4
1
glycosidic bounds. Lactase which is the only tJ-glycosidase of the brush border
membrane should normally be retarded by interactions with the matrix and
separated from the œ-glycosidases despite similar molecular weights of ail these
1
enzymes. Indeed, the solution profile showed that maltase was eluted belore
lactase (Fig. la). Most of the maltase was weil separated from lactase, however
sorne overlapping of maltase was always present in the peak of lactase. Lactase was
1
then selectively adsorbed on a hydroxyapatite column and subsequently eluted at
1
1
1

---

123
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1
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80
Fraction number
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/.:.:.:.::..<
;..;::.-: __.-._ J. 1 \\···L
o
10
20
30
Fraction numbet
Fig. 1. (a) Fractionation of brush border membrane proteins on aga rose column (Bio-Gel, A-15m) (b)
Fractionation of peak 1 corresponding ta lactase activity on hydroxyapatite Ultrogel column. The
absorbance was measured at 280 nm ( ...... ). Activities of lactase (--) and maltase (- - -) were
determined in the eluted fractions.
a concentration of 150 mmol/I potassium phosphate buffer (Fig. 1b). A summary
of yields and purificationsteps for intestinal lactase is given in Table 1. lt is
noteworthy that a 500 fold purification was obtained for lactase with this pro-
cedure. The degree of purification is far above those obtained by other methods
(Schlegel-Haueter et al. 1972; Tsuboi et al. 1979; Cousineau and Green 1980;
Goda et al. 1984). The ratio between lactase and the other pro teins is higher in the
purified brush border membrane when compared to that found in whole
hornogenate. Thus, our improvement may arise from the use of purified brush
border membranes for papain extraction instead of mucosal homogenates. The
proteins obtained at the various purification steps were analysed by SDS polyac-
1
rylamide slab gel electrophoresis (Fig. 2). Lactase which is one of the main proteins
1
1

---

124
Each enzyme preparation comprised 22 to 24 infant rats. The starting material corresponded to
10-15 g of freshly excised small intestine.
Table 2. Lack of Interference hy bound antilactase on maltase, aminopeptidase and alkaline phosphat-
ase extraction with papain from the brush border membranes.
Enzyme specifie activities (mU/mg prot)
Membrane treatment
Arnino-
Alkaline
Lactase
Maltase
peptidase
phosphatase
Membrane alone
119
148
52
856
Membrane +
bound antilactase
0.70
146
48
847
Aliquots of membrane (50 Ilg membrane proteins) were placed in two sets of tubes and incubated eithcr
with excess antilactase (5 III antiserum) or with control serum (5 III serum) for 18 h at 4 "C in 500 III
medium containing 0.1 % serum albumin, 10 mmol/I sodium phosphate, 5% Tween 20, pH 6.0. Proteins
were extracted from the brush border membranes by papain digestion. The resulting extracts were
assayed for lactase, maltase, aminopeptidase and alkaline phosphatase activities.
in the brush border membrane of the suckling rat (Fig. 2B), showed a high degree
of purity after isolation on hydroxyapatite (Fig. 2D).
ImmunologicaI stuâics: Purified lactase yielded from hydroxyapatite column was
injected into rabbits for immunization. To characterize the reactivity of the rabbit
arxiserum with lactase a number of standard immunological techniques were
initially employed. Using rocket immunoelectrophoresis or Ouchterlony assays,
a distinct immunoprecipitin line was visible with partially or completely purified
preparations of lactase. No precipitin lines were observed with a purified prepara-

---

125
~
....•
D,
'.. .i
F'rg. 2. Protein gel electrophoresis on 5-15% SOS polyacrylamide slab gel (Rochette-Egly et al. 1984).
Protein samples were denatured by boiling for 5 min in 12 mmol/l Tris Hel buffer (pH 8.5), 1% SOS.
0.1% dithioerythritol (OTE). The gels were stained with Coomassie Blue. A: mucosal homogenate
(150 J!g protein) B: brush border membrane proteins (150 J!g protein) C: papainized extract of the
brush border membrane (75 J!g protein) D: purified lactase (15 J!g protein).
1
tion of maltase (unpublished observations). Figure 3 shows a typical standard
inhibition curve obtained with various concentrations of lactase ranging from lOto
1
10000 ng/ml. The useful portion of the S-shaped inhibition curve extended from
about 250to 25001g lactase/ml. This kind of inhibition curve may be used to
1
accurately measure relative lactase concentrations in biological samples using
purilied rat intestinal lactase as a standard. No inhibition of antibody binding was
observed when purified maltase was used instead of lactase. The extractions
1
properties by papain of various enzymes from the brush border membrane
containing bound antilactase are illustrated in Table 2. Preloading the brush border
membrane with antilactase inactivated specifically lactase but had no ellects on the
1
extraction of maltase, aminopeptidase and alkaline phosphatase from the meru-
1
H

---

126
100
80
Cl
z 60
cZ
ID
'if!. 40
20
10
10'
10 J
LACTASE ("9/ml)
Fig. 3. Competition between bound and free lactase against antilactase. Samples of cornpetitor proteins
ranging from lOng to lDj.tg/ml were incubated with diluted rabbit antiserum (l/1000e) for 120 min at
20"C. Samples were further processed as outlined under "Materials and Methods".
brane. These results were in agreement with those obtained by Tsuboi et al. (1979)
with brush border lactase and maltase and were extended in the present study to
other enzymes not related to disaccharide hydrolysis, confirming the high specifici-
ty of lactase antisera.
Acknowledgements. Mrs. F. Gossé and M. T. Vanier are gratefully acknowledged for their excellent
technical assistance.
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Received April 4, 1985 1 Accepted June 24, 1985
,
1

---

128
,

---

129
Modulation by Thyroxine of the Amount ojLactase Proteiu in
J
the Jejunum of Adult Rats
Edouard Nsi Em\\'O. Jean-Francois Launay. Francis Raul
lJ-61 Inserm. Slrthourg. France
Key Words. Lactase· Thyroxine . Jejunum· Brush border membranes· Starvation
Ahslracl. Adult rats starvcd for 48 h rcccivcd a daily injection of thyroxine ovcr a 3-day
period before they were killed. \\Vhen compared to nourished animais. starvation provokcd a
"\\
4-io 5-fold increase in imrnunoreactive lactase protein. which paralleled a similar stimula-
tici'n of lactase activity in the brush border membranes of the proximal jejunum, Exogcnous
thyroxine completcly inhibitcd the starvation-induccd incrcase in irnrnunorcactivc lactase
protcinin both the irnraccllular and thc brush border membranes.
Introduction
. '.~-~ .' ..
• Lactasejsthc specifie intestinal ~-galacto-
.'r. ,:~"l!" .'.'.
...
sidase which'!èâtalyzes the hydrolysis of lac-
,\\
tose, the only disaccharide present in milk.
ln most mammals, including rats. lactase ac-
tivity is high during the suckling pcriod,
whcrcas it rcachcs very low values attcr
weaning in the aduh [1). The molecular
rnechanisrn acting in the developrnental de-
cline of intestinal lactase activity romains 10
be clucidatcd. Howcvcr, in adult rats. stimu-
latiol~f lactase activity has bccn rcportcd
either followiag carhohydrate ingestion [2-
5] or during starvation [6. 7),
The dictary-induccd increasc in lactase
activity does not sccrn to be specifie. sincc
ether disaccharidases are also suuiulatcd
and lactase stimulation is indepcndcnt on
the nature of the carbohydrare ingcstcd [3.
41· IL has also bccn shawn tluu the stimula-
lion of lactase activity by diciary carbohv-
draies occursconcomitanttv with an incrcase
in the amount of lactase protcin [81

---

130
The starvation-induccd stimulation of
The Calf'-precipitable fractions obtaincd c.Iuring
lactase rcachcs a plateau after 48 h [7] and is
the brush border membrane purification procedure
(12) wcrtbcuhall-d lor t5 min al 37°(: in l~n triton '\\
restricted to the mature enterocytes [9]. Lac-
X-IOO. Sm.\\! Tri\\·HCI bufTer (pH 7.1). Afrcr ccntrif-
rase is the only disaccharidase to be stimu-
ugation of the sumples al 3.S0Ug for 1S min. Ih...
lated by starvation in the jejunum of adjult
n:sulting supcrnarant containcd the solubitiecd baso-
rats and, as shown prcviously. the stimula-
laierai and intraccllular membrane prorcins. The su-
tion proccss involvcs hormonal ctfcct: thy-
pernalan~nc.le'" b a series of conceuuations ami '1
dilutions using an imrncrsihlc ultrafiltcr Il\\lilliporcl
roid hormones are acting normally as a neg-
in ordcr 10 reach a ,ll)-Iold dilution as comparcd 10 the
ative elfector for lactase activity [9-11) and
initial sample, Finally. the lio~ samplev were 1'0-
~ 0
starvation by lowering th~\\"el of circulauug
ophilizcd ovcrnight and rcsuspcndcd in 1 ml of dis-
thyroid hormones provokcs a stimulation of
tilled watcr,
intestinal lactase (9).
l'reparut iU11 cJf.I 11/is('/"UIII
In the present report. we have investi-
Lactase was puri lied from the brush border meru-
gated whether exogenous thyroxine induces
branes nf the jejuno-ileurn IIf 1S-daYO<lld suckling rais
changes in the amount of lactase protcin
by a sequence of stcps including solubilizauon hy
concornitantly with modifications occurr ing
papa in. Bio-Gel A·1.5 m (Rio-Rad) and hvdroxyapu-
at the lcvcl of lactase activity in the brush
tite-Ultrogel (lOF) column chrornatography. This re-
sultcd in a SOO-fold purilication 10 a specifie acuvitv
border membranes and in the intracellular
0
of 10 Ulmg of prote in (13). Aruiserum was prcparcd
membranes in the jejunum of starved rats.
by injecting rabbits subcutaneously lin the buck with
50 ug purilied lactase mixed with 0,5 ml of Frcunds
complete adjuvant. The injection was repcatcd once J
Materlals and Mcthods
weeks later. Bleedings were made 3 weeks alier the
last injection. Monospcrilicity of anti~rum against
Animais
lactase was conflrmed by conventional irnruunologi-
Experimentations were performed with adult Wis-
cal techniques and by the lack of interference wuh
tar rats weighing JOO-350 g. The rats wcrc kepl indi-
ether brush border proteins [!JI.
vidually in mcrabolic cages and wcre fcd a laboratory
chuw ad libitum. Sorne rats were starved for 48 h and
Enzvtne and lmmunological Assavs
were killed at the sarnc time like normally fed rats.
Lactase activity was dctcrrnincd according io Kol-
dovsky ct al. [t41. Protcin was measured b~ Ihl'
Hormonai Treatmcnt
method of Lowry et al. (15J. lmmunoreactive lactase
Animais wcrc inject cd intrapcritoneally with DL·
in the samples was quantilied by an enzymc-linkcd
thyroxine {Sigma Chernical Co., dissolvcd in 0.01 :11
imrnunoabsorbant assay (EUSAI following competi-
:"/aOH. One injection W:lS given dailv tn starved rats
tion assays. Thèse antigen inhibition assays were car-
during the J da ys bctorc dcath. Dosages werc 0.5 pg
ried out by varying the amounts of antigcn preincu-
thyroxine pcr gram body wcighr.
bated with seriai dilutions of the antiscra in phos-
phate-buffered saline. After incubation for.! h. JOn l' 1
Prefluraliull ,,([//1('51Î1IUI Sanrpll'J"
of the reaction mixtures wcrc pipcucd inro wdls
Sludies were reali7.ed on the pro:\\imal par1 of the
coated wilh puri lied lactase. The plaies "'cre washnl
jejunum. which induded the Iirst 10 cm e:\\ll"nding
and lhe relali,oe amount of antibody was r~veakd hy
I"rom Ihe ligament of Treitzo The jejunal mucosa.
incubation with shecp anti-rabbil anlibodics lilll.:l'd
oblained by scraping tlte inleslinal surface wilh a
...ilh pcro:\\ic.lase [1310 Pero:\\idasc aelivÎly ...a\\ Illl'a-
glass siide. was hnmogenized in 50 m.~1 manitol. :!
sured using 0.20 mg/ml nf (I-dianisidine anJ 0001 0 "
m.!1 Tris-HCI fpH 7.1)0 The brushLmembranes were Lbol"de~
H~O:.
isolaled accon.ling 10 Schmit7. el al. (12). The l11el11-
!lr3nes were inrubated for 30 min al 37 oC in 10 mM
pOlassium bullCr (pH 6.0) conlaining insoluble pa-
Results and Discussion
pain (Sigma. Chcmical Co.) at a concentration of 10
lJg!mg protein. o·\\ftercenlrifugation of lhe samples at
20.000 g lor JO mir<'. the reslllting supernatant con-
The percentage of proteill solubiliz-:d
tained the solubili7.cd brush border proleins,
from CaJ+.precipitablc membranes and frOI11
brush border membranes were similar in lhe
various experimental conditions. As sho\\vn
in table l. activity oflactase was higher in the
papain extract from brush
border 1Il':11l-
brancs of.thc stan'cd animais, Furthcrrnore.
thc data confirm our previous report, show-
ing that the starvation-induced stil11ul<Jlioll
ofbcl<JSC activity was inhibiteJ br thYI'lJ.\\ine
i IIjrct iOlls [91. r111111U noreacl i vc laclas.: 1'10-

---

13 j
Table 1. Effects of starvation and thyroxine injections on lactase acuvity and irnrnunorcactivc lactase in the
jejunum of adult rais
Nourished rais
Srarved rats
Starved rats injecrcd
with th) roxinc
Lactase activity in papaiu cxtracts of
3S.~5 ± 4.8~J
164.39 ± 13.32" 4~.50 ± 4JlJ'
hrush border membranes. mU/mg protein
Lactase immunoreactivity in papain extracts of
I-UO:!: :!.9~·'
~O.OO:!: 4.05"
13.3(J± 3.35,'
brush border membranes. ug/rng protcin
Lactase irnmunorcacuvity in triton X-IOO cxtracrs
O.:!J .!.O,O~·'
0.62.!.O.Oyb
lUU .10.05·
of Ca-r-prccipitarcd membranes. J1g/mg prorcin
Results are presented as rneans ± SEM for 5 animals in ench group. Lactase ucuvity was 1\\01 detectahle in
the fractions corrcsponding 10 rhc Ca-v-prccipuablc membranes.
a. 1> The means not sharing a common supcrscript in the sa me row arc significantly different from cach other
(p < 0.05) as analyzed with Wilcoxon's test for unpaired sam pies
fig, l. Representative antigcn inhibuion curvcs.
lnhibiuon (If antibody binding 10 coaied purified lac-
rase is pcrformcd with solubilized protcins from Ca l ' -
prccipiiatcd membranes (A) and from brush border
membranes (8). The perce ni age of maximal absor-
hance is ploucd scmilogarithrnically against
the
amouru of protcin addcd. - - - - Starvcd rats:
.
- srarved rais injecred wiih thyroxine; - - = nour-
ished rais.
( R)
\\~)
\\00
-
100
,..•- ...........
"'~.;;.~:~.:~.,\\
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90
90
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.... rllO I-.l n
- z 5 10 20 50 200
'C<'
sooc ccnc cnt-cuon ("~ 1
100

---

132
rein was deterruined by ELISA assay follow-
those observed in the brush border meru-
ing competition assays. The antigcn inhibi-
branes in function of the experimental con-
tion curves wcrc constructed by a scrnilog
ditions. Thus.
a J-fold
increase in the
plot of the pcrccutagc of maximal absor-
amount of lactase protein was mcasurcd ar-
barree (i.e. no inhibiting antigen present) ver-
ter 48 h of sturvation in the Ca!'-precÎ\\li-
sus the amount of membrane protein ex-
tated membranes, whereas thyroxine injec-
tracts (fig, 1). Representative curves ob-
tion cornplctcly inhibiicd th is cffcct. 1The
taincd with incrcasing concentrations of pro-
presence of immunoreacti vc lactase protci Il
tein solubilizcd from Ca-v-prccipitablc baso-
has also been described in the Ca~'-prccipi­
lateral
and
intracellular membranes are
iated membranes from pig and human y
shown in ligure 1A. Those obtained with
rocytes (16, 171·
increasing amounts of protein solubilizcd
The ·present data conlÏrm our prcvrous
from puriticd brush border membranes arc
rcsults showing that thyroxine inhibits the
illustratcd in ligure 1B. Ali absorba nec val-
starvation-induccd stimulation of lactase ac-
ues were corrected for nonspecific binding
tivity. Furtherrnore, we demonstrate that
by using nonimmune serum (usually less
these effects are related ta changes in the
than 3 % of the maximal value). Purilied lac-
amount of lactase protein in bath the brush
tase was used as standard ta construct cali-
border and intraccllular membranes.
bration curves.
These calibration curves
The hormonal modulation of lactase in
gave a value of O. 7 pg of lactase protein for a
the starved rat iuvolves regulatory mer ha-
50% inhibition of antibody binding. The
nisrns acting at a co- or/and posttranslational
arnount of lactase protein in the sarnplcs was
lcvcl [18] which might be similar ta thosc
calculatcd from the mcasurcd absorbanccs
opcrating during the normal postwcaniug
using the lincar part of the sigmoidal calibra-
decline of lactase activiiy in the intestine of
tion curve (between 20 and 75% of maximal
rnarnmals.
absorbance), taking into accouru the protein
concentration of the sarnplcs. The values ob-
tained for the concentrations of irnruunorc-
Acknowledgement
active lactase werc expressed in micrograms
The auihors would Iikc II> thank Francine GOSSE
of lactase protein per milligrams of protein
for excellent tcchnical assistance.
(table 1). Similar resu1ts 10 those found for
lactase activity were obtaincd in the brush
border membrane cxtracts, A 4- ta 5-foJd
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1he starved rats and paralleled the 4-fpld
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icstinal enzyme adaptation 10 normal diets nf dit-
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activity was not delectable. but irnrnunore-
10 incrcascd iruakc of u-saccharidcs (smrch. ~1I'
activelactase was.present (table IL! ft must
l'rose) in isocaloric diets. J. Nutr. III: IJ.lJ_')jJ
be emphasized that the appareni low arnount
t 1981).
of lactase protein dctcctcd in the cxirucrs or
the Ca-t-prccipitatcd membranes which is
refcrred ta ihcir protein content is rclared ta
the fact thar the arnount of total pruiein
extracred
from
Ca-'<prccipiuucd
meru-
brunes cxcccdcd bv 15-fold the olle obiuincd
troru purificd brush border membranes. In
the protein extracts of the Ca 2'-prccipitatcd
membranes, the variations of lactase i1l1l11l1-
norcactivirv [ollowcd the samc paucrus as

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