UNI VER S l TEP A RIS - SUD
UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE DE Ctt~IE THERAPEUTIQUE
ANNEE
1981 - 1982
THE S E
présent~e
A L'UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE DE
CHIMIE THERAPEUTIQUE
DE
L'UNIVERSITE PARIS-SUD
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE TROISIEME CYCLE
DANS LES DISCIPLINES P~~CEUTIQUF.S
par
M. MALAN-KLA ANGLADE
Titre de la thèsè !
DERIVES D'HYDROLYSE ET D'HYDROGENATION DE L'M1IDON
CONTROLE ANALYTIQUE DE LEU~ QUALITE
et
ETUDE DES SUCRES DE REVERSION
-.-.-~-':lI'-.-.-
soutenue le 16/06/82
JURY
Président
M~ PRo F. PELLERIN - rapporteùr
Membres
M. PRo M. itAMON
-
"
M. PRo M. GUERNET -
II
M. PRo JC. GOüNELU:
M. P. LEROY
- 1 -
A Monsieur le Professeur F. PELLERIN
Professeur de Chimie Analytique
à la Faculté de Pharmacie PARIS XI~
Pharmacien des Hôpitaux de Paris,
qui depuis trois années nous a accueillis dans son laboratôire, nous à
~
fait bénéficier de ses conseils dans le domaine de la Chimie Analytique
et a bien voulu nous faire l'honneur de présider cette thèse; qu'il
trouve ici l'expression de notre vive gratitude et le témoignage de notre
attachement.
A Monsieur le Professeur M. HAMO~
Professeur de Chimie Analytique à la Faculté de Pharmacie PARIS xt,
Directeur scientifique de la Pharmacie Centtale des Hôpitaux de Paris.
Nous lui exprimons nos remerciements pour l'accueil bienveillant et pour
l'honneur qu'il nous a fait de faire partie du Jury de thèse.
A ~onsieur le Professeur M. GUERNET
Professeur de Chimie Analytique à la Faculté de Pharmacie PARIS xt,
Pharmacien des hôpitaux.
Nous exprimons nos remerciements d'avoir accepté de juger ce travail et
de faire partie du Jury de thèse.
- 2 -
A Monsieur le Professeur J.C. GOUNELLE
Professeur de Physiologie à la Faculté de Pharmàcie PARIS XI.
Nous lui adressons l'expression de notre reconnaissance pour avoir bien
voulu juger ce travail et faire partie du Jury de thèse.
A Monsieur P. LEROY
De la Société ROQUETTE Frères,
qu'il trouve ici l'expression de notre sincère amitié pour toute sa
sollicitude durant nos séjours à la Société ROQUETTE à LESTREM. Nous
tenons aussi à le remercier d'avoir accepté de faire partie du Jury de thèse.
- 3 -
A Monsieur M. RUCHETTE
A Mademoiselle F. VERWAERDE
de la Société
ROQUETTE Frères.
Nous exprimons notre reconnaissance et nos remerciements pour leur
étroite collaboration.
•
A Madame o. BAYLOCQ
A Madame C. MAJCHERCZYK
Ainsi qu'à tous les amis du laboratoire de Chimie Analytlqueet de la
Pharmacie de l'Hôpital d'EAUBONNE que nous tenons à ·as&urer de notre profond
àttachement pour leur accueil chaleureux et la sympathie qu'ils nous ont
manifestée au cours de notre séjour.
A Monsieur A. CONTIVAL
A Monsieur COVIN
de la Société TECHNICON.
Nous tenons à les remercier pour l'aide matériel qui nous a permis de
réaliser la deuxième partie de ce travail.
- 4 -
A mes Parents,
A tous ceux qui me sont chers
A tous ceux qui m'ont aidé.
- 5 -
INTRODUCTION
=~.~===.===.
Les produits d'hydrolyse de l'amidon sont utilisés pour
leur pOUVOlr sucrant et figurent, à ce titre, parmi les édulcorants nutri-
tifs, en raison de leur pouvoir calorique élevé. Leur emploi est lié aux
qualités technologiques qui dépendent elles-mêmes du degré d'hydrolyse des
produits obtenus.
Les méthodes d'hydrolyse permettent de préparer une gamme de
produits destinés à des emplois multiples comme éd~lcorants ou comme ali-
ments
c'est ainsi que les maltodextrines, obtenues par hydrolyse enzyma-
tique à l'a amylase, figurent parmi les produits destinés à l'alimentation
par sonde et dans certaines préparations pour enfants.
L'hydrogénation de ces produits conduit à des dérivés qUl
sont employés en industrie comme sucre de remplacement du saccharose jugé
trop cariogène. Cette utilisation a été envisagée en raison des propriétés
biologiques intéressantes de ces dérivés hydrogén~s pour la prévention de
ta carie. Les hexitols sont en effet connus comme dépourvus de propriété
cariogène du fait de leur faible pouvoir fermentescible. Ce caractère est
suffisant pour orienter l'emploi des dérivés hydrogériés, notamment dans
les produits de confiserie consommés en quantité plus importante pour les
enfants. Tel est le cas du Lycasin, couramment utilisé dans de nombreux
pays européens pour la fabrication de bonbons.
- 6 -
Le Professeur F. PELLERI~ nous a demandé d'entreprendre
une étude analytique des hydrolysats d'amidon pour un contrôle de qualité
et de rechercher les produits de réversion. Ce sont des produits de
réaction secondaire formés par recombinaison de mol~cules de dextrose ou
o glucose. Les travaux et vérifications expérimentales ont été entrepris
dans le but d'établir une monographie définissant les critères d'identité
et de pureté.
Cette étude a aussi pour objet de servir de base pour la
fixation de normes officielles. soit à l'échelle internationale et mon-
diale - O.M.S (Organisation ~ondiale de la Santé). F.A.O. (Organisation
de l'Alimentation et de l'Agriculture). soit à l'échelon européen -
C.E.E. (Communauté Economique Européenne). soit enfin à l'échelon nationàl
pour l'utilisation dans diverses pharmacopées. l'étude apporte ainsi la
justification du choix des techniques employées pour l'analyse des échan-
tillons.
La réalisation pratique de ce travail a bénéficié des acquis
que constituent les travaux effectués dans le domaine général de l'analyse
des glucides pour l'étude de qualité du produit; alors que la mise en
évidence des sucres de réversion n'a pas encore abouti à une solution sa~
tisfaisante. klle a pu être menée grâce à l'obligeance de la Société
ROQUETTE Frèr~s qui nous a fait bénéficier de son expérience. nous a fourni
les échantillons et a mis à notre disposition les appareils et le matériel
nécessaires 1 des essais particuliers.
Le présent mémoire comporterà trois parties
Après les généralit~s sur la préparation industrielle des pro-
dui ts d' hydrolyse. seront envisagées les méthodes d'analyse qui' permettent
d'assurer un'contrôle de qualité des hydrolysats ainsi obtenu~. La troisièmè
partie sera consacrée à la recherche des sucres de réversion par une ~tude
- ? -
comparative de deux hydrolysats ; l'un obtenu par voie acide et l'autre
par voie enzymatique. Ces "sucres particuliers" doivent servir de test
qualitatif pou~ l'ider.tification des procédés d'hydrolyse.
- 8 -
P. LAN
INTRODUCTION
Première Partie: 4ES HYDROLYSATS D'AMIDO~
•••••
:::I=a• • •=~.:a
a
..
l - STRUCTURE DE L'AMIDON ET NATURE DES PRODUITS D'HYDROLYSE
1.\\ - STRUCTURE DE L'AMIDON
page
\\ 1
1.2 - HYDROLYSATS D'AMIDON
page
t 3
II - METHODES D'HYDROLYSE
II. \\ - GENERALITES SUR LES METHODES D'HYDROLYSE
page
\\4
II.2 - HYDROLYSE ACIDE
page
IS
II.2.1 - fEi~~i2!_~!-!!-!~!~od!
page
15
II.2.2 - Produits de réversion
---------------------
page
t 7
II.3 - HYDROLYSE ENZYMATIQUE
page
21
II.3.\\ - ~!!!~E!E!!_a!~ér!~!_~!_!~~!
page
2t·
II.3.2 - f!2e!i~!és_de!_S!2i!_81yS2!ig~!
hI~E2!!!!!!
pà.gè
22
11.3.2.1 - q amylaSe
page
22
It.3.2.2 - aamylàse
page
23
II.3.2.3 - amyloglùcosidase
page
23
III - COMPOSITION ET PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DES
PRODUITS D'HYDROLYSE DE L'AMIDON
111.1 - LES PRODUITS D'HYDROLYSE DE L'AMIDON
page
26
111.1.1 - b~!_~-!~2~!!~!i~!!
page
28
111.\\.2 - b!!_!!iE22!_~!_g!~~!~
p'1gé
28
III.I.j - 1!_4!!!!2!~
pAge
29
- 9 -
111.2
- CARACTERES DES PRODUITS D'HYDROLYSE
page
30
1
111.2.1 - Ç~~!i~~!_~~~h~~!~gig~~!
page
30
111.2.2 - Q~i!i!~~i~~!_~~!_2E~~~i~!
~~hr~E~lr!~
page
32
Deuxième Partie
=-=....=-__
CONTROLE DE QUALITE DES HYDROLYSATS
a_:a.. , . . _
D'AMIDON
IV - OBJECTIF DU CONTROLE DES HYDROLYSATS D'AMIDON
IV.I - CARACTERES LIES AUX CONDITIONS
page
37
IV.I.I - g~E!~~~E~!_2hl!ic~:~hi~ig~~!
page
37
IV. 1'.2 - g!E!~~~E~!_~~~h~~!~~ig~~!
page
38
IV.2 - ETUDE ANALYTIQUE DE LA COMPOSITION DES HYDROLYSMS page
IV.2.1 - ~Ei~~i2~!_~~_~~~h~~~!
page
41
IV.2.2 - ~~~h~~~!_~~i!i!~~!
page
42
I~.3 - INTERPRETATION DES CHROMATOGRAMMES
page
44
IV.4 - ETUDE COMPAREE DU COMPORTEMENT ALA SAcCltAUFlCAnoN page
49
Troisième
• • • • a • • •
nàrtie:
: l : : I : I I " .
LES PRODUITS DE REVERSION
V - MISE EN EVIDENCE ET IDENTIFICATION DES PRODUITS DE REVERSION
V.I - REALISATION EXPERIMENTALE DE LA REVERSION
page
55
V. .1.. 1 - ~_2!!.ÜE_~~~~~_!~!~~i~!!~!!_r!e.;~~~!~ page
55
V.l.2 - ~_2!!~iE_~~~~h~ti!1~~!_2E~hr~!~~_~_ page
60
V.2 - APPLICATION A DES HYDROLYSATS INDUSTRIELS
page
60
V.2.1 - g~~~~is~_~~_~E!i~~!~~~
page
61
V.2.2 - ~!!~~i~~~~~~~~_2~E_Ç~g~~~
page
61
V:2.3 - Fractionnement sur col~nne ~harbon
~êïIt;-----------------------------
------
page
62
page
63
1
- la -
V.3 - ANALYSE DES ~CHANTILLONS PAR C.G.L.
page
67
page
67
V.3.1 - ~Ei~~iE~_~~_!~_~~~h2~~
page
V.3.2 - ~~~~1~!~!_~~_i~~~EEE~~~~i2~!
68
V.4 - ANALYSE DES tCHANTILLONS PAR RESINE ECHANGEUSE
D'ANIONS
page
70
page
V.4.1 - ~Ei~siE~_~~_1~_~~~h2~~
71
page
V.4.2 - Ç2~~i~i~~~_~:~eEli~~~i2~
73
page
V.4.3 -
74
~~~~1~~~~_~~_!~~~EEE~E!~i2~~
INTERPRETATIONS GENERALES (VI)
VI.I
CONTROLE DE QUALITE DES HYDROLYSATS
page
85
VI.2 - ETUDE DES SUCRES DE REVERSION
page
86
VI.2.I - ~~!1Y~~_2~E_~hE2~~~gE!E~i~_g~~_lig~i~~
page
87
VI.2.2 - ghE~~~2gE~E~i~_~~E_E~~i~~_~Sh~~g~~~~
d'anions
page
88
CONCLUSION
page
89
Annexe l
- METHODE LUFF SCHOORL
page
90
Annexe II - ESSAI LIMITE NICKEL
page
93
Annexe III - REACTIF AU AgN0
/ NaOH
page
94
3
Annexe IV - CHROMATOGRAPHIE DE PERMEATION SUR GEL
page
95
Annexe V - CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION SUR COLONNE
CHARBON-CELITE
page
96
Annexe VI - CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAtrlE fERFORMANCE page
97
Annexe VII- CHROMATOGRAPHIE GAZ LIQUIDE
page
98
Annexe VIII- SEPARATION DES HOLOSIDES
page 101
BIBLIOGRAPHIE
page 107
- 11 -
LES HYDROLYSATS D'AMIDON
l - STRUCTURE DE L'AMIDON ET NATURE DES PRODUITS D'HYDROLYSE
Synthétisé par voie biochimique grâce au processus d'assimila-
tion chlorophyllienne, l'amidon est une des principales sources de glûcides
pour l'organisme. Il représente à ce titre la réserve nutritionnelle la plus
répandue du règne végétal. On le trouve surtout accumulé dans les graines
o
de légumineuses et de céréales (généralement utilisées sous forme de farine),
dans les tubercules et les racines.
Au plan chimique, l'amidon est un polyholoside complexe dont
l'unité fondamentale est la molécule de dextrose ou D glucose, aldohexose
de formule brute C
H
06'
6
12
1.1 STRUCTURE DE L'AMIDON
L'édifice de l'amidon est habituellement décrit comme
résultant de la constitution de deux fractions distinctes de polysaccharides
dont les proportions relatives varient en fonction de l'origine = (fig. 1).
- Un constituant mineur: l'amylose, polymère non ramifié,
formé d'une chaîne d'unités a D glucopyranosyl, chimiquement liés par des
liaisons
a 1 - 4 ; c'est-à-dire le type de liaison osidique du maltose.
L'amylose donne une coloration bleue avec l'iode.
- Un constituant majeur: l'amylopectine, polymère ramifié,
constitué de molécules de dextrose ( a D glucose) également unies par des
liaisons osidiques a 1 - 4 ; les ramifications étant àssurées par de&
liaisons
a 1 - 6 type isomaltose.
L'amylopectine donne une coloration rouge violacée en
présence d'iode.
Les liaisons glucosidiques engagent les hydroxy~s pseudo-"
aldéhydiques porteurs de la propriété réductrice de là molécule de base et
suppriment donc ce caractère dans les chaînes hautement polymèrisées.
- 12 -
Figure 1
STRUCTURES DES CHAINES MOLECULAIRES DE t 1 AMIDON
AMYLOSE
AMYLOPECTINE
- 13 -
Les études de structure de l'amidon effectu~es par
THOMPSON et WOLFROM (65) ont démontré la présence de liàison a
1 - 3
dans les chaînes d'amidon. Ces faits ont été confirmés par la détection
de nigérose, diholoside à liaison a 1 - 3 , d'une part dans les hydrolysats
acides obtenus dans des conditions peu agressives, et d'autre part dans
des hydrolysats enzymatiques (1).
1.2 - LES HYDROLYSATS D'AMIDON
Les substances édulcoranteS dérivées de l'amidon sont
obtenues par dépolymérisation des composés par hydrolyse acide ou par
hydrolyse enzymatique. Cette opération est une réaction au cours de laquelle
la molécule d'amidon est scindée en dextrose et holosides de différents de-
grés de polymérisation, selon les conditions d'hydrolyse.
L'hydrolyse libère les fonctions aldéhydiques des Unités
dextrose constituant la molécule d'amidon et f~t apparaître un pouvoir ré-
ducteur d'autant plus élevé que l'hydrolyse sera pll\\~ poussée.
Par hydrolyse ménagée, l'on aboutit à une gamme de produUs
aux applications multiples que nous développerons dans le chapître traitant
des produits d'hydrolyse.
L'hydrolyse complète de l'amidon conduirait à une solu-
tion de dextrose. Les études ultérieures montreront que l'hydrolyse complète
n'est pas atteinte dans la pratique industrielle du fait de l'affinité des
voies d'hydrolyse pour tel ou tel type de liaison et des réactions secon-
daires qui apparaîssent dans le milieu.
En effet, certains auteurs dont KEER (31) pensent que
cette voie,qui fut dans le passé la seule utilisable pour réaliser les hy-
drolyses, favorise la formation de produits de dégradation comme
l' hydroxyméthylfurfu.tal et des produi ts de recombinaison, dits produi ts de
réversion. Le mécanisme exact de la formation de ces produits particuliers
n'est pas encore élucidé quant aux conditions de leur apparition dans un
milieu tel que l'hydrolysat.
-
14 -
L'évolution des connaissances sur l'utilisation des
enzymes. leur facilité d'emploi tendent actuellement à préférer l'hydro-
lyse par voie enzymatique à l'hydrolyse par voie acide.
Parmi les problèmes liés à l'hydrolyse et aux facteurs
qui affecte~t son efficacité. la spécificité d'action de l'agent hydrolysani.
surtout lorsqu'il s'agit des enzymes. constitue à notre point de'vue l'élé-
ment prépondérant.
Diverses opinions. parfois contradictoires ont été
émises à partir d'observations effectuées sur la facilité de rupture des
liaisons constituant la chaîne moléculaire de l'amidon.
Dans le cas de l'hydrolyse acide, par exemple, certains
auteurs (20) estiment que la scission des liaisons d 1 - 6 est identique à
celle des liaisons a 1 - 4. Pour PEAT et WHELAN (44), l'hydrolyse des
liaisons a 1 - 6 est beaucoup plus lente que celle des a 1 - 4. Ces auteurs
ont montré que les liaisons a 1 - 4 sont environ 4 fois plus sensibles que
les liaisons a 1 - 6, et ceci compte tenu de la position de la liaison dans
la molécule.
Les divergences d'observation proviennent, dans le cas
des hydrolyses enzymatiques, de l'origine et du degré de pureté de l'enzyme,
et dans le cas de l'acide. du type d'acide numéral utilisé.
II - METHODES D'HYDROLYSE
II.1 -
GENERALITES SUR LES METHODES D'HYDROLYSE
Les méthodes dihydrolyse, utilisées pendant plusieurs
années dans les industries sucrières, étaient toutes basées sur l'utilisa-
tion de l'acide sulf~rique ou de l'acide chlorhydrique à chaud.
Depuis quelques années, l'utilisation aisée de prépara-
tions commerciales d'enzymes telles que l'a amylase, la a amylase et
l'amyloglucosidase, tend à faire de l'hydrolyse enzymatique la méthode in-
dustrielle de choix. Ces enzymes hydrolysent sélectivement les liaisons
- 15 -
glucosidiques, à l'inverse des acides minéraux, de telle sorte que les
enzymes permettent l'obtention d'hydrolysats de composition variée, mais
contrôlable. De plus, la saccharification enzymat~ue pat l'amyloglucosidase
permet une production quantitative de dextrose avec un rendement nettement
supérieur à celui obtenu par la voie acide seule. Dès lors l'hydrolyse
acide continue à n'être utilisée que pour l'obtention d'une gamme de pro-
duits moyennement hydrolysés .
•
Après ce rappel sur les structures de l'amidon et
avant une étude approfondie d'une méthode d'hydrolyse, il nouS paraît
utile de préciser quelques notions nécessaires à la définition des produits
dérivés de l'amidon.
Les dérivés d'hydrolyse sont caractérisés par leur
degré d'hydrolyse qui est 9éterminée par le dosage du pouvoir réducteur
de l'hydrolysat. Ce pouvoir est lié aux fonctions aldéhydiques libérées
.
au cours de l' hydro lyse.
On appelle Dextrose équivalent ou D.E., le pouvoir
réducteur d'un produit exprimé en équivalent dextrose. Par exemple, un
hydrolysat de DE = 25 est un hydrolysat dont 100 g de matière sèche ont
un pouvoir réducteur identique à 25 g de dextrose pur.
Notion de Dx
------------
La notion de Dx représente la teneur vraie en dextrose
libre. La méthode la plus précise pour déterminer cette teneur est le do-
sage par la glucose oxydase (26).
II.2 - HYDROLYSE ACIDE
L'hydrolyse acide utilise l'action conjuguée de l'aci-
dité du milieu pH s
2, de la température e • 140 D , et la durée du traitement
(la à 20 minutes) qui sont les conditions classiques d'hydrolyse en industri~
Hydrolyse
Recombinaison
AMIDON
~ DEXTROSE
,
7'
PRODUITS DE REVERSION
H+
e
Hydrolyse
CHO-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH
DESHYDRATATION
HYDROXYMETHYLFURFURALDEHYDE
D
0\\
HOCH
CHO
2
•
ACIDE LEVULINIQUE
ACIDE FORMIQUE
Figure 2
- 17 -
Le mécanisme d'attaque des liaisons est de type non
spécifique, se traduisant par une coupure au hasard des liaisons a 1 - 4
et à un degré moindre, des liaisons a 1 - 6. La voie acide conduit à un
mélange complexe de mono, di, triholosides, et à des oligoholosides ; cer-
taines études ont permis de vérifier que l'hydrolyse acide ne laisse pas
subsister dans l'hydrolysat de longues chaînes de polyholosides.
Lorsque l'hydrolyse acide devient intense, elle s'ac-
compagne d'une destruction partielle des produits formés faisant apparaître
dans le milieu des artefacts qui ne sont pas caractéristiques de la struc-
ture originelle de l'amidon tels que l'hydroxyméthylfurfuraldehyde et les
produits de réversion. Ces produits sont des polyholosides qui se forme-
raient au cours de l'hydrolyse, par recombinaison de molécules de dextrose.
Des travaux indiquent que les produits de réversion sont en équilibre avec
les molécules de dextrose du milieu ; les conditions de cet équilibre sont
la température, l'acidité du milieu et la concentration en glucose (fig.2).
II.2.2 - Produits de réversion
---------------------
La recherche des produits de réversion dans les produits
d'hydrolyse acide industrielle a été rendue nécessaire à la suite de diffi-
cultés rencontrées au cours de la séparation du glucose par cristallisation.
En effet, selon SIL1N et SAPEND1NA (54), la présence de 1 g de produit de
réversion dans les eaux mères de cristallisation ou "hydrols", empêche la
cristallisation de 2 g de glucose. En pratique, la présence de sucre de
réversion affecte l'efficacité de la méthode d'hydrolyse car la perte totàle
en glucose représente le tiers de la quantité théoriquement attendue.
La notion de réversion introduite par WaHL (75) a été
définitivement adoptée depuis 1953 à la suite des travaux de WOLFROM
et
COLL (77) sur la synthèse d ' oligosaccharides, à partir de monosaccharides
en milieu acide minéral~
Les premières expériences de synthèse de disaccharides,
à partir de
monosaccharides en milieu acide minéral, ont abouti à un
nombre indéfini de produits probablement de plusieurs types, dont des
- 18 -
oligo et polyholosides. Les techniques d'analyse n'ayant pas permis de
les séparer, ces produits ont été désignés sous des appellations diverses
telles que gallisin, revertose, dextrinose et Ô dextrose. Le premier disac-
charide de synthèse a été identifié par FISCHER en 1890 (12) et nommé
Isomaltose ; quelques années plus tard, fut isolé le gentiobiose qui était,
au départ, confondu avec l'isomaltose. La formation du gentiobiose au cours
de la réversion a été confirmée par les travaux de ISAJEV qui confirmaient
également la formation préférentielle des liaisons 1 - 6 au cours du proces-
sus de réversion. Nous avons retenu quatre disaccharides qui peuvent résul-
ter d'une réversion (fig. lb).
Les travaux effectués avec d'autres oses ont montré que
le phénomène de réversion est également possible avec des monosaccharides
tels que: 0 galactose, xylose et arabinose.
Le mécanisme de formation des liaisons de réversion
n'est pas encore exactement connu
les travaux effectués à partir de solu-
tions pures de dextrose, et cités précédemment, indiquent que le processus
de formation est une réaction de condensation de molécules de dextrose cata-
lysée par des ions hydrogène. Or, il n'est pas encore prouvé que la réversion
se déroule de manière prépondérante à l'égard des monosaccharides. En effet,
SROCYN5KI et COLL (59) ont montré, par analyse chromatographique sur couche
mince avec du dextrose marqué au C
, que la réversion au cours de l'hydroly-
14
se pouvait s'effectuer selon deux voies:
- Condensation de deux molécules de dextrose accompagnée
de la formation
de diholosides avec des liaisons de type 1 - 6,
- Addition de molécules de dextrose, également par des
liaisons 1 - 6, aux oligosaccharides présents dans la solution.
Cette étude est intéressante, mais les méthodes de
détection ne permetten~ pas de se prononcer quant au mécanisme réel au
niveau des polyholosides. La difficulté à définir parfois les produits de
réversion relève du fait que certains diholosides (type Isomaltose) peuvent
résulter aussi bien d'une réversion que d'une hydrolyse normale. A ce titre
- 19 -
citons deux travaux contradictoires : des études expérimentales, concernant
la nature des liaisons résistant à l'hydrolyse acide, ont montré que
l'Isomaltose des hydrolysats provient des liaisons a 1 - 6 de l'amidon, et
non de la réversion (1 et 20) ; Al' inverse,SROCYNSKI et Ceu.(~) ont constaté
que l'isomaltose est le diho1oside qui se forme de manière prépondérante
au cours d'une attaque par voie acide.
A partir de ceS observations, il convient d'envisager
l'étude des sucres de réversion de manière précise, de façon à adapter la
recherche à la composition de l'échantillon. C'est-à-dire qu'une telle
étude ne sera effective que si sont pris en compte :
- la prêsence en faible quantité des sucres de
réversion dans les hydro1ysats, et donc de la nécessité de traiter les
échantillons afin de les concentrer.
- la complexité du mélange de départ en holosides
et des changements qu'il subit au cours des traitements.
Il est bon de noter que le comportement des oses dif-
fère d'une solution pure de dextrose à un hydro1ysat ; ceci a été montré
par des études chromatographiques comparées d'une solution de dextrose
soumise à la réversion pendant 5 heures à 120 0 et un hydro1ysat traité dans
des conditions analogues.
Munis de toutes ces données, nous avons estimé nécessaire
de définir les produits de réversion comme étant des dérivés de repo1yméri-
sation du dextrose, formés par des liaisons autres que a 1 - 4, avec une
prédominance des liaisons 1 - 6, étant entendu que le type a 1 - 6, en
faible quantité, résulte des liaisons naturelles de l'amidon. La formation
de ces produits est catalysée par l'acidité ét la température du milieu.
- 20 -
Figure Ibis: SUCRE DE REVERSION
MALTOSE
TREHALOSE
OH
•
CELLOBIOSE
01-1
OH
GENTIOBIOSE
ISOMALTOSE ET SON ANOMERE
- 21 -
II.3 - HYDROLYSE ENZYMATIQUE
La dégradation enzymatique de l'amidon a fait l'objet
de multiples recherches pour élucider la structure de l'amidon et pour
préciser les transformations qu'il subit au cours des processus digestifs
et technologiques.
G
L'hydrolyse industrielle peut être comparée à l'hydro-
lyse enzymatique obtenue lors de la digestion. L'amidon subit en effet, à
divers niveaux du tractus digestif, l'action des enzymes avec une transfor-
mation quantitative en glucose indispensable à l'organisme et véhiculé
par le sang à la dose constante de 1 g/l (glycémie)~
Les enzymes utilisées industriellement sont d'origines
diverses, le plus souvent végétales ou produits par la fermentation de micro-
organismes. Le mécanisme d'action est en général connu pour ces enzymes qui
sont utilisées seules ou couplées en fonction des hydrolysats que l'on veut
produire.
Nous envisageons l'étude des trois familles d'enzymes
qui sont les plus utilisées en industrie pour préparer les hydrolysats. A
l'intérieur de ces familles, nous décrirons les caractères principaux des
enzymes qui entrent dans la fabrication ou le traitement des échantillons
utilisés dans la partie analytique de notre travail.
Les trois enzymes sont des glucosides hydrolases,
c'est-à-dire qu'elles hydrolysent les constituants macromoléculaires de
l'amidon au niveau des liaisons glucosidiques ; ce sont:
- a amylase E.C. 3211
- a amylase E.C. 3212
- amyloglucosidase E.C. 3213
- 22 -
Leur action consiste à rompre, avec intervention
d'une molécule d'eau, les liaisons glucosidiques des constituants macro-
moléculaires de l'amidon. Ces enzymes agissent comme catalyseurs en quan-
tité infinitésimale; c'est ainsi qu'une molécule de a amylase pure est
capable d'hydrolyser 2.300.000 liaisons glucosidiques / minutes au voisi-
nage de son optimum d'action.
Leur action est irréversible et répond au schéma
réactionnel suivant
RO + R' + H - OH
catalys~
)
ROH + R' OH
enzymatlque
R varie dè 1 à n unités dextrose.
Cette méthode d'hydrolyse permet d'obtenir une variété
de produits dont la composition dépend de paramètres tels que :
- la nature de l'enzyme, donc sa spécificité d'attaque
des liaisons, caractère régissant la composition de l'hydrolysat.
- la durée de l'attaque enzymatique qui conditionne
le degré d'hydrolyse.
- le pH du tampon et la température du milieu qui con-
ditionnent la rapidité et l'efficacité d'action de l'enzyme. Ces conditions
doivent être strictement définies pour que l'enzyme soit à son optimum
d' ac tion.
II.3.2.1 - ~~g~Xl!~~~g~~~~~~~=;.~.~!~~!~~:
~!~~!~g~X~~g!Xg~.~~~~s~~~1
Les a amylases se recontrent chez les animaux, les
végétaux et les micro-organismes. Les a amylases utilisées en industrie
sont obtenues à partir de micro-organismes tels que le bacillus subtilis
et l'aspergillus oryzae. Les modes d'action et la spécificité de ces enzymes
montrent une certaine diversité. L' a amylase qui est une exo-amylase cata-
lyse la scission des liaisons glucosidiques a 1 - 4 dans les polysaccharides
- 23 -
contenant trois, ou plus, d'unités glucose, alors que l'hydrolyse des
liaisons proches des unités terminales est très ralentie. Ceci explique
la propension particulière de cette enzyme à former, à des stades intermé-
diaires, des holosides moyens, de degré de polymérisation (D.P.) 3 et 6.
Le produit de la réaction est un mélange d'une faible quantité de glucose
et maltose et d'oligoholosides. Elle sera le plus souvent utilisée pour la
préparation des mal todextrines.
II.3.2.2. - }=~~~1~~;m2~m2=~sl_:z~=sÀ~S~~2~
~1~2~~~~21~~2s~~~~=~~l~
Présentes chez les végétaux supérieurs (malt, blé,
soja), les
B amylases ont été mieux connues grâce à TROMA et KOSRLAND (35)
qui ont étudié leur activité et leur mécanisme.
La
B amylase est une exo-amylase hautement spécifique
des liaisons a 1 - 4, elle agit de façon méthodique en libérant des molé-
cules de maltose à partir des extrémités non réductrices des chaînes d'an-
hydroglucose. Des attaques successives similaires se poursuivent jusqu'à
une conversion .to tale en mal tose. Il es t reconnu que la
B amylase pure
ne convertit pas tout le polyholoside en maltose, son action reste bloquée
au niveau des liaisons a 1 - 6, qui laissent subsister des fractions ré-
sistantes à l'enzyme, ce sont les "dextrines limites".
Cependant, la conversion ne s'effectue qu'à environ
80 7., la nature précise de l'obstacle à une
B amylolyse totale n'est pas
totalement élucidée; parmi des origines possibles, citons le blocage de
l'activité enzymatique au niveau des liaisons a 1 - 6 qui laissent subsis-
ter des fractions résistantes, appelées parfois 8
dextrines limites.
II.3.2.3. - Amyloglucosidase ou a 1 - 4 Glucano-
••=_
2~_==_.===.~====~==~==.~
.~_==
Découvertes il y a une vingtaine d'années dans les moi-
sissures (Aspergillus niger), les bactéries et les levures, les amylogluco-
- 24 -
sides sont actuellement bien connus quant à leur spécificité et leur mé-
canisme d'action.
Cette enzyme n'est pas utilisée dans la pratique indus-
trielle pour la préparation d'hydrolysats proprement dits, mais pour la
saccharification totale enzymatique de l'amidon en vue d'une préparation
quantitative du glucose (dextrose).
On aboutit à une transformation pres-
que totale du substrat en dextrose (taux de conversion théorique: 100 %),
en fait, les techniques'actuelles de saccharification enzymatique ne permet-
tent d'atteindre que 97 de D.E.
Cette capacité de conversion tient de la faculté de
l'enzyme à catalyser à la fois la rupture des liaisons a 1 - 4,
a
1 - 6
et
a
1 - 3. Selon PAZUR et KLEPPE (41), la vitesse d'hydrolyse des
liaisons
a 1 - 6 et a 1 - 3 est plus faible que celle des liaisons a 1 - 4.
Ils estiment également que l'hydrolyse des longues chaînes est plus rapide
que celle des courtes chaînes.
Avant de présenter un schéma des modes d'attaque des
facteurs d'hydrolyse (Fig.3), il nous paraît important de signaler que l'ex-
périence industriel montre que la voie enzymatique est la méthode la plus.
utilisée en réalisant ~ivers couplages, aussi bien pour la préparation d'hy-
drolysats intermédiaires que pour la conversion totale en glucose.
En préambule à la partie analytique de notre travail,
et pour terminer ce chapitre des méthodes d'hydrolyse, il convient de pré-
ciser que l'hydrolyse enzymatique représente,pour les industries sucrières
qui la réalisent, l'aboutissement de nombreuses années de recherches. Elle
permet de produire des hydrolysats aux qualités précises et contrôlables en
évitant les inconvénients rencontrés lors de l'hydrolyse acide. Dans ce cas,
est-il possible de mettre en évidence, par une étude de la composition, un
traceur qui permettrRit de distinguer un hydrolysat ayant subi, â une ét~pe
intermédiaire de sa production, l'action d'un acide minéral d'un hydrolysat
entièrement enzymatique ? Il nous a semblé que les produits de réversion
dont la formation est favorisée par l'aciditê et là température du milieu
- 25 -
Figure 3
METHODES D'HYDROLYSE
HYDROLYSE ACIDE
HYDROLYSE A a
AMYLASE
HYD?-.OLYSE A LA
e A.MYLASE
HYDROLYSE A L'AMYLOGLUCOSIDASE
- 26 -
sont utilisables à cette fin (74). Il est bien entendu que cette recherche
sera envisagée comme test de qualité utilisable pour un contrôle de qualité.
III - COMPOSITION ET PROPRIETES PHYSICOCHIMIQUES DES PRODUITS D'HYDROLYSE
DE L'AMIDON.
Utilisé depuis plusieurs années sous forme de poudre
(fécule ou amidon) et de son unité de base D glucose, l'amidon a connu de-
puis quelques années un développement important pour ses dérivés résultant
de l'hydrolyse partiell~ et ses dérivés d'hydrogénation. Ce regain.d'inté-
rêt correspond à la nécessité pour les industriels de trouver des sucres de
remplacement du saccharose jugé trop cariogène pour certaines applications(2).
Doués d'un pouvoir calorique élévé, mais de saveur sucrée
plus faib~e, ces dérivés d'hydrolyse de l'amidon possèdent en outre des par-
ticularités biologiques et technologiques qui leur permettent d'occuper une
place importante dan~ les industri~s alimentair~s et pharmaceutiques.
111.1 - LES PRODUITS D'HYDROLYSE DE L'AMIDON
Les produits d'hydrolyse de l'amidon sont des mélanges
d'holosides dont la composition dépend à la fois de la méthode d'hydrolyse
mise en oeuvre et de la durée de la réaction. Ces produits seront princi-
palement caractérisés par leur D.E. OU Dextrose Equivalent, de telle sorte
que l'on distingue trois familles de produits d'hydrolyse représentées dans
le tableau 1. Nous y décrivons aussi bien les dérivés d'hydrolyse que les
dérivés d'hydrogénation
L'hydrolyse acide est utilisée en industrie pour prépa-
rer des hydrolysats de D.E. = 30 - 45, alors que l'hydrolyse enzymatique
permet d'obtenir une gamme de produits de' D.E. désiré. En effet, lorsque
pour des raisons technologiques, il paraît nécessaire de rechercher un
sirop de glucose à profil glucidique particulier, par exemple riche en mal-
tose, ceci peut être obtenu par la voie enzymatique.
- 27 -
SCHEMA D'HYDROLYSE DE L'AMIDON
ET DERIVES HYDROGENES
DE .. 0
Dérivés
AMIDON
Dérivés hydrogénés
d'hydrolyse
-
z
MALTODEXTRINES
MALTODEXTRINES
0
HYDROGENES
DE .. 20
1-1
~
HYDROLYSATS
~
o QI
tJ'1;l
QI
;:l ....
;:l
D'AMIDON
<
.-l
tJ
0"
c.:>
....
Cll
u
OU
z
DE .. "43
~
>.
SIROPS
tù
N
c::
DE
GLUCOSE
QI
c.:>
DE ..
QI
1--------+ LYCASIN
-- ----
0
1----------------- -a--
80/55
tJ
;:l
=:
.-l
c.:>
Cl
DE ,. 6S
><
::I:
SIROES DE SORB ITOL
DE .. 100
DEXTROSE
SORBITOL
- TABLEAU l -
- 28 -
La connaissance de la composition des hydrolysats
d'amidon a été rendue possible grâce aux méthodes chromatographiques qui
ont connu un important développement depuis quelques années. Ces méthodes
constituent un instrument indispensable pour l'analyse de tels produits dont
la composition est parfois complexe.
Ces études permettent de donner des définitions en accord
avec la Directive "Sucres" - J.O. des Communautés du 27/12/1973, déjà adop-
tée dans la plupart des pays membres (85). Ces définitions sont utiles pour
distinguer les produits obtenus à divers stades de l'hydrolyse.
111.1.1 - Maltodextrines
--------------
Ce sont des hydrolysats de faible D.E. (entre 3 et 20)~
obtenus généralement par hydrolyse enzymatique (principalement a amylase)
et présentés sous forme de poudre obtenue par atomisation et dont le taux
d'humidité doit être inférieur à 5 %.
Le terme "Dextrine" est parfois utilisé pour remplacer
le terme "Polysaccharide" dans l'appellation "Maltodextrine" .
."r-.~-
Les sirops de glucose sont définis au J.O. des
Communautés comme des solutions aqueuses purifiées et concentrées de sac-
charides nutritifs, obtenus à partir d'amidon et / ou de fécule et répon-
dant aux caractéristiques suivantes :
- matière sèche : pas mo~ns de 70 % en poids,
- D.E. < 20 % en poids sur la matière sèche,
exprimé en D glucose.
- Cendres sulfatées < 1 % en poids sur la matière
sèc,he.
- S02 en général < 20 ppm, mais ce chiffre peut être
limité selon les dispositions propres à chaque pa~
jusqu'à 400 ppm.
- 29 -
La concentration à 70 % de matière sèche permet d'assu-
rer une meilleure stabilité bactériologique.
Cette définition regroupe tous les hydrolysats dont le
D.E. se situe entre 20 et 100. En tenant compte des réalités industrielles,
il nous paraît plus exact de dire que les sirops de glucoses sont des solu-
tions aqueuses purifiées et concentrées de saccharides nutritifs de D.E. 20
à 70 obtenus par hydrolyse acide (30 à 45 de D.E.) ou enzymatique avec une
teneur en matière sèche de 70 % au moins.
..
111.1.3. - Dextrose
--------
Pour éliminer toute ambiguité, on utilise dans l'indus-
trie le terme "Dextrose" pour désigner le D glucose.
L'hydrolyse enzymatique la plus complète de l'amidon
(
a amylase + amyloglucosidase) conduit à un sirop riche en dextrose. Les
cristaux
de dextrose sont obtenus par concentration et cristallisation en
plusi~L'rs j~ts.
Par hydrogénation de ces dérivés d'hydrolyse il est possi-
ble de préparer une gamme de produits hydrogénés dont certains présentent un
intérêt alimentaire particulier. A ce titre, le Lycasin 80/55 est utilisé en
confiserie pour ses propriétés non cariogènes.
Le lycasin est un sirop de glucose hydrogéné obtenu à par-
tir d'un hydrolysat résultant d'une hydrolyse enzymatique à l'a et a amylase
jusqu'à D.E. de 48-52 et technologiquement fait pour la fabrication de
bonbons.
Ces produits d'hydrolyse de l'amidon exigent une défini-
tion qUl permette de les distinguer des autres produits existant sur le
marché et produits, soit par des réactions d'addition comme le carboxyméthyl-
amidon et le glycerol propylamidon. soit par polymérisation du dextrose com-
!Ile le polydextrose.
Le polydextrose est obtenu par condensation au hasard de
molécules de dextrose avec des molécules de sorbitol et d'acide ~itrique
Cette polymérisation se traduit par une prédominance des liaisons de type
1 - 6.
- 30 -
111.2 - CARACTERES DES PRODUITS D'HYDROLYSE
Deux propriétés expliquent l'intérêt porté aux produits
d'hydrolyse de l'amidon. Ce sont leurs qualités technologiques et leurs
propriétés biologiques.
Quatre propriétés interviennent de manière prépondé-
rante dans la définition des qualités technologiques des hydrolysats en vue
de leur utilisation dans l'industrie alimentaire, ce sont:
la viscosité
- le pouvoir liant
- le pouvoir anticristallisant
la saveur sucrée.
Pour un faible degré d'hydrolyse, les polysaccharides
supérieurs confèrent à l'hydrolysat une texture longue et filante, donc
une viscosité élevée. Celle-ci varie en raison inverse du degré d'hydrolyse,
de même que le pouvoir liant. En règle générale, pour des hydrolysats de
moyen D.E., on peut atteindre des concentrations élevées en matière sèche
sans qu'il y ait cristallisation. Les oligosaccharides assurent cet équilibre
de telle sorte que les hydrolysats de D.E. élevê ont tendance à cristalli-
ser.
La saveur sucrée des produits d'hydrolyse de l'amidon
est inférieure à celle du saccharose considéré comme le sucre de référence
ces produits doivent donc leur intérêt à d'autres qualités.
- Saccharose : 1
- sirop bas D.E.
: 0,4
- Sirop haut D.E. : 0,6
- Dextrose: 0,7
- 31 -
PROPRIETES GENERALES DES DIFFERENTS SIROPS DE GLUCOSE -
MALTODEXTRINES - DEXTROSE
- d'après leur degré de transformation ou hydrolyse
par ràpport à l'amidon -
Amidon
Dextro~e
PROPRIETES
DE 'bOas DE
.. ) .. 6
DE eleve
CONFEREES
A
,
)
DE .-20
Slrops de glucose
L'UTILISATION
MD 05
MD 05 a
SG 25
SG 59
Mal todextrines
VISCOSITE
(
-
HYGROSCOPICITE
)
POUVOIR LIANT -
(
COHESION
POUVOIR ANTI-
CRISTALLISANT
(
SAVEUR SUCREE
)
VALEUR NUTRITIVE
(
) .
POUVOIR REDUCTEUR -
BRUNISSEMENT
)
- TABLEAU II -
- 32 -
L'hydrolyse de l'amidon donne des préparations siru-
peuses plus ou moins transformées qui sont utilisées telle quelles ou
soumises l
l'hydrogénation ou l
l'isomérisation pour donner une famille de
produits utilisables dans oe nombreux domaines, notamment en pharmacie et
dans les industries alimentaires.
Les maltodextrines qui sont des hydrolysats de faible
D.E. constituent d'excellents nutriments pour l'alimentation par sonde et
pour les aliments destinéS aux nourrissons. L'équipement enzymatique du
tube digestif permet la-transformation des polymères en dextrose. Il
semble que la vitesse d'assimilation ne soit pas influencée par le degré
d'hydrolyse. Dans le cas contraire, des problèmes de tolérance digestive
et d'osmolarité auraient pu se poser. Ce chapître n'a pas fait l'objet d'une
étude dans le cadre de notre travail.
Par hydrolyse ménagée, on obtient des produits appelés
sirops de glucose. Ces sirops constituent des matières premières importan-
tes pour la chocolaterie et la confiserie. Ces produits entrent également
dans la formulation galénique des pastilles et des dragées.
Les hydrolysats très riches en dextrose sont préparés par
saccharification enzYmatique et le dextrose, sépar~ par cristallisations
successives, est utilisé pour la préparation de solutés massifs de glucose
apyrogène pour perfusion.
A la Pharmacopée 1972, sont inscri ts 3 "glucoses" regrou-
pés sous deux définitions :
- glucose anhydre et le glucose monohydrate utilisés
pour l'alimentation parentérale.
- sirop de glucose improprement appelé glucose liquiœ,
utilisable dans les pâtes officinales (Pharmacopée 1965).
- 33 -
A côté de ces produits, se développe également l'uti-
lisation des dérivés hydrogénés :
- le sorbitol est utilisé depuis longtemps comme chola-
gogue et régulateur du transit intestinal.
- le développement des sirops de glucose hydrogéné est
plus varié et plus récent. Les sirops de sorbitol sont utilisés comme hu-
mectants dans les pâtes dentifrices et leur utilisation comme substitut de
la glycérine connaît un important développement .
..
- le lycasin que nous avons défini précédemment fait
également partie de cette famille. C'est un dérivé technologiquement apte
pour la fabrication de bonbons, et déjà utilisé dans de nombreux pays étran-
gers.
Son utilisation en confiserie est devenue recommanda-
ble parce que les itols sont connus pour leur faible pouvoir cariogène, en
raison des propriétés moins acidogènes en présence des bactéries de la
plaque dentaire (Streptococcus mutans).
Pour l'histoir~, nous dirons que le lycasin a démarré
sa carrière en Suède et dans les Pays Scandinaves, puis en Suisse où la
mise au point de techniques sophistiquées d'étude de pH intraoral par le
Professeur MULHEMAN a confirmé cette propriété. Les mesures effectuées par
microélectrode et radiotélémétrie ont en effet confirmé la chute du pH au
niveau de la plaque dentaire, plus faible avec le lycasin qu'après inges-
tion de saccharose (Fig. 4).
Ces études ont permis de donner au lycasin les caracté-
ristiques physicochimiques pouvant satisfaire aux qualités biologiques
"inoffensifs pour les dents" exigées par la réglementation des pays utilisa-
teurs.
Les courbes suivantes indiquent les variations de pH au
niveau de la plaque dentaire, après ingestion de divers produits sucrés, en
comparaison avec le LYCAS1N.
- 34 -
Figure 4
Sucrose
Fruc tose
Glucose
•
1
c. '- : :
1
7
1
: ;
',1 :
• l '
•
1
1:
1
Sucrose
:~
. Sorb i to F
Ma 1 ci to 1
pc Lycasin 80/55
1 :
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::'1:'
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j. pH 1:
~ '!
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Fruit toffee
frui t toffee
citron
orange
Lycasin 80/55
Lycasin 80/55
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.
- 35 -
Deuxième Partie
CONTROLE DE QUALITE DES HYDROLYSATS D'AMIDON
===~~•• caa~~==a
Il n'est certes pas possible de définir dans l'absolu
la qualité et de concevoir les produits adaptés à satisfaire ces normes.
Néanmoins, nous proposons ici deux appréciations qui apparaissent à la lec-
ture du dictionnaire et qui orientent l'esprit de notre travail.
La qualité est définie comme étant :
- la manière d'être d'une chose, ce qui détermine sa
nature
attribut, caractère, propriétés.
- ou l'excellence d'une chose, d'un produit, c'est-à-
dire son degré de perfection.
Ces deux sens de la qualité nous. conduisent à envisager
l'appréciation de la qualité en référence à un modèle implicite qui, pour
des raisons technologiques, s'est imposé comme norme.
La qualité ne SP. contLôle pas, mais elle se fabrique.
et le contrôle analytique rend compte de la constance de fabrication et de
l'ensemble des spécifications définies à tous les stades. La qualité est
donc un acquis et son contrôle consiste en fait à décrire les caractéristi-
ques du produit et à les fixer comme normes.
Celles-ci sont fixées en fonction des conditions de fa-
brication
industrielle et de l'expérience acquise quant à l'homogénéité
des lots et de la constance des résultats. Cette conception de la notion
de qualité autorise à envis~ger le contrôle de qualité
- dans le cas d'une vérification de la composition d'un
hydrolysat obtenu industriellement et destiné à un usage précis, pour s'as-
surer
qu'il correspond au produit attendu.
- conformité du produit aux caractéristiques technologi-
ques exigées pour satisfaire à l'emploi.
- 36 -
Les méthodes de contrôle doivent permettre de s'assu-
rer, d'une part des caractéristiques physico-chimiques, et d'autre part de
la composition moyenne du produit, étant entendù que les techniques emplo-
yées doivent être rapides, efficaces et peu onéreuses. Ce contrôle doit
être perçu comme une détection d'écart par rapport aux limites fixées, qui
sont celles de la qualité du produit affecté à tel ou tel usage, afin de
les compenser. Il ne constitue donc pas seulement une mesure absolue, mais
une vérification de la conformité à l'intervalle des limites fixées.
Ce type d'étude fait appel à des méthodes d'analyse
nombreuses et variées (physique, chimique et bactériologique), de réali-
sation parfois délicate. Dans cet ensemble, nous avons tenté de faire un
choix des méthodes faciles à interpréter, avec l'espoir que l'exécution
soit simple et rapide. Dans le domaine de l'analyse des holosides, la
chromatographie est devenue un moyen courant d'analyse qualitative et quan-
titative. Ces techniques sont employées au Laboratoire et dans l'Industrie,
aussi bien pour l'analyse proprement dite que pour la préparation et la
purification de constituants.
La structure de ces produits leur confère des caractères
qui posent des problèmes pour certains types d'analyse; c'est alnpl que
l'absence de groupement chromophore ne permet pas la détection des glucides
en spectrophotomètrie ultra-violette.
IV - OBJECTIF DU CONTROLE DES HYDROLYSATS D'AMIDON
Il ne s'agit pas de mesurer des constantes au sens
physique du terme, mais d'établir des spécifications (teneurs maximales ou
teneurs minimales) qui peuvent être assurées par une bonne pratique de fa-
brication.
L~9 méthodes analytiques utilisées pour effectuer ce
contrôle seront, d'une part des méthodes classiques de mesures des proprié-
tés physico-chimiques, et d'autre part des techniques chromatographiques qui,
~âce à l'automatisation des systèmes (chromatographie liquide à haute
performance) permettent des analyses rapides et d'application pratique.
- 37 -
IV. 1 - CARACTERES LIES AUX CONDITIONS D'HYDROLYSE
Les hydro1ysats d'amidon sont obtenus par hydrolyse
acide chlorhydrique ou par hydrolyse enzymatique dans des conditions de
pH obtenues par le choix d'un tampon adéquat. Ces sels minéraux sont
capables de perturber la séparation des glucides de l'échantillon à ana-
lyser. Ils doivent être éliminés par passage sur des résines échangeuses
d'ions
à lit mixte, avant toute analyse.
Les méthodes utilisées pour vérifier ces caractères
sont, pour la plupart, des méthodes simples, employées dans de nombreux
domaines et applicables aux hydrolyses pour contrôler leur aptitude à
l'usage industriel auquel ils sont destinés.
Cette détermination est effectuée par pH-métrie à
l'électrode combinée (verre/calomel) sur une solution d'hydrolysat amenée
à 40 7. de matière sèche.
Sa détermination est importante pour la fixation des
caractères des produits hydrogénés destinés à la confiserie.
Résultat: le résultat varie de pH 6 à 7.
Déterminée par les méthodes conductimétriques, cette
mesure renseigne sur la teneur résiduelle en ions minéràux de l'hydroly-
sato Elle n'exclut pas la recherche individuelle des ions lorsque ceux-ci
ont été introduits au cours de la préparation de l'hydrolysat.
- 38 -
IV.I.I.3 - Recherche d'éléments toxiaues :
==_=22~3 • • • • =.s.aaa_.=~••~3••••
Arsenic
~=:====
- Effectuée suivant la méthode B de la Pharmacopée IX,
page II 250. -
On peut signaler cependant que cette recherche, ainsi
que celle d'autres métaux, comme le plomb, est liée à l'origine de l'acide
minéral (acide sulfurique) utilisé dans le passé pour réaliser les hydro-
lyses acides. Cette recherche ne représente plus le même intérêt dans la
mesu~e où l'acide chlorhydrique est c;lui actuellement utilisé dans l'in-
dustrie pour réaliser les hydrolyses et que, de plus, les hydrolysea entiè-
rement enzymatiques se généralisent.
Résultat : inférieur à 1 ppm.
Cette recherche est surtout effectuée sur les hydro-
lysats hydrogénés afin de doser les résidus du catalyseur utilisé pour la
réaction d'hydrogénation. La méthode à la diméthylglyoxime est d'applica-
tion courante, la spectrophotométrie par absorption atomique constitue une
technique de dosage rapide et beaucoup plus précise.
Résultat
essai limite : 1 ppm
IV.I.2.1 - Matière sèche
=••=_==aa=_=.
Comme nous l'avons indiqué dans la définition des
hydrolysats d'amidon, la matière sèche intervient dans le maintien de la
stabilité bactériologique et physique car il peut apparaître des phéno-
mènes de rétrogradation pour les maltodextrines (d'où leur conservation
sous forme de poudre ou de cristallisation pour les hydrulysats à haut D.E.).
Trois méthodes sont utilisables pour déterminer cette teneur :
1/- Dosage de l'eau par la micro-méthode de KARt FISCHER
- 39 -
2/- Détermination de l'indice de réfraction et
calcul de la matière sèche d'après un facteur de cODrection.
3/- Dessicàtion de l'hydrolysat à 100°C jusqu'à poids
constant.
Parmi toutes ces méthodes, la détermination de la
matière sèche par mesure de l'indice de réfraction a ét~ utilisée le plus
souvent durant notre travail, car elle a le mérite d'être simple, rapide
et surtout facile à réaliser. Les autres méthodes sont, dès lors, utilisées
pour une confirmation.
IV.l.2.2 -
la viscosité
====::r=-=====a::=r
La viscosité des produits d'hydrolyse constitue un
caractère technologique important car elle conditionne l'aptitude à l'em-
ploi. Elle règle en effet, de façon certaine, la fluidité, le pouvoir
liant et la cohésion de l'hydrolysat. En somme, sa détermination est capi-
tale pour la connaissance des propriétés rhéologiques du produit.
De plus, elle donne sur le plan analytique des indica-
tions sur la masse moléculaire moyenne du produit, et varie en raison
inverse du degré d'hydrolyse.
A la Pharmacopée 1972, la mesure de la viscosité s'effec-
tue par le viscosimètre capillaire d'OT5WALD. Cependant, il est apparu pré-
férable de recourir à la méthode du viscosimètre à bille
celle-ci est
fondée sur la durée de chute d'une bille par comparaison à une gamme témoin.
Ce type d'appareil, très répàndu pour l'étude des fluides
newtonniens, est basé sur la vitesse de chute d'une bille dans un cylindre
rempli du liquide à étudier. Le diamètre de la bille étant petit par rapport
à celui du cylindre, on peut utiliser la Loi de STOKES :
2
n =
2
9" (p - p ) ~
s
V
En
pratique, on chronomètre le temps de passage de la
- 40 -
bille entre deux repères (le liquide ne doit donc pas être opaque)
situés suffisamment loin des extrémités du tube, c'est-à-dire dans la
zone où la bille se déplace à vitesse constante.
De nombreuses corrections sont indispensables, c'est
pourquoi il est préférable d'effectuer des mesures d'étalonnage en utili-
sant un liquide de masse volumique et de viscosité connus.
Ce procédé se révèle particulièrement mieux adapté
à l'interprétation pour l'étude de viscosité.
La détermination du degré d'hydrolyse est effectuée par
le dosage du pouvoir réducteur de l'hydrolysat selon la méthode de
Gabriel BERTRAND, décrite à la Pharmacopée.
Ce dosage utilise la propriété réductrice des oses et
de certains oligoholosides dont la fonction aldéhyde ou cétone est libre
vis-à-vis des ions métalliques, en particulier des ions cuivriques, en
milieu alcalin. Cette réaction non stoechiométrique peut cependant être
utilisée quantitativement en respectant des conditions précises et en opé-
rant par comparaison avec des solutions étalons de sucre à doser.
Une deuxième méthode, préconisée par LAYNE et EYNON,
est couramment utilisée dans les industries sucrières. C'est une variante
de la méthode utilisant la liqueur de Felhing, rendue plus précise par
l'emploi du bleu de méthylène comme réactif indicateur (erreur maximum
1 %).
Dans le cadre de notre travail, cette détermination
a été effectuée par la méthode de LUFF SCHOORL dont l'usage comme méthode
internationale officielle est envisagé dans le domaine de l'analyse
alimentaire. (Annexe 1).
- 41 -
Les méthodes que nous venons de traiter sont clas-
siquement utilisées pour contrôler les qualités premières des hydrolysats
il paraît nécessaire d'ajouter, suivant la méthodologie envisagée, des
études faites dans le cadre d'une analyse plus pou~sée en vue d'une meil-
leures connaissance des produits d'hydrolyse.
Cette étude consiste à déterminer la répartition des
poids moléculaires dont les proportions varient avec les méthodes d'hydro-
lyse. Les méthodes utilisées seront développées avec précision car elles ne
figurent pas comme telles parmi les méthodes officielles d'analyse, et ont
nécessité parfois une mise au point particulière.
IV.2 - ETUDE ANALYTIQUE DE LA COMPOSITION DES HYDROLYSATS
Les très nombreux procédés d'analyse qualitative et
quantitativ~ de glucides figurent dans la bibliographie; dans notre tra-
vail, nous avons élaboré la méthodologie à suivre pour l'analyse des hydro-
lysats d'amidon.
Le principe général des méthodes décrites repose sur
les techniques chromatographiques :
- les techniques simples servant de test qualitatif,
comme la chromatographie sur couche mince ou CCM.
- les techniques automatisées comme là chromatographie
sur colonne avec auto-analyseur et la chromatographie liquide a haute
performance ou HPLC.
La chromatographie sur couche mince est utilisée comme
teSt qualitatif sensible pour l'analyse de glucides simples ~ mais s'avère
insuffisante pour l'analyse de produits complexes comme les hydrolysats
composés en partie de hauts polymères. Elle s'impose, néanmoins, comme
la première technique d'analyse basée sur la séparation de composés.
- 42 -
La chromatographie gaz liquide, du fait de sa sensibi-
lité élevée, est largement utilisée pour l'analyse des traces de glucides
mais elle nécessite un traitement de l' échanti llon qui doit être rendu
volatil; de plus, elle ne permet pas de mettre en évidence les polymères
supérieurs aux diholosides.
La chromàtographie sur colonne constitue l'outil de
choix pour l'analyse des sucres car elle permet une analyse réelle de l'é-
chantillon sans traitement préalable. De plus, grâce à l'automatisation de
système comme l'HPLC, ce type d'analyse devient rapide et d'application
pratique.
IV.2.2 - ~§~~~~~~_~~~!~~§~~_E~~E_!~§~~~~_!~!!l~~q~_2~
!!~~~EC?~i!~2~
Selon le procédé que nous proposons, la CCM représente
la première étape d'une investigation car elle donne des indications sur
la répartition des produits à analyser.
IV.2.2.1 - Chromatograehie sur couche mince
====_.==-=~-==~-===•• ~=.=._==._.
- Plaque de cellulose
- Le système de solvant utilisé est le suivant
Acétate d'éthyle
65
Pyridine
35
Eau
20
Acide acétique
7
- Quantité déposée: 5 ul d'une préparation de l'échan-
tillon en essai à 50 mg/ml
- Réactif : AgN0
/ NaOH (Annexe III).
3
La révélation est obtenue par pulvérisation du réactif
au Nitrate d'argent et séchage à l'étuve à 1100 pendant 5 minutes pour
fixer les taches. Ce réactif n'est pas spécifique et les taches apparais-
sent en brun.
- 43 -
D'après nos essais, la séparation des oligoholosides
jusqu'à un degré de polymérisation 10 ou D.P.
\\0 et l'élution sont d'au-
tant plus améliorées que l'on réalise plus de migrations successives de
longues durées. La séparation obtenue dépend des poids moléculaires
cela
nous permet d'envisager les méthodes chromatographiques sur colonne.
IV.Z.Z.Z. S~~~~~~2~~!2bi~_g~~~Sl~~~g~__~!lS~!;
~ig~_~~_5b~~~~~S~~22!~_g~_g~~~~g~i~~_g~~_~~l_i~~~~~~_~~l
La chromatographie sur colonne constitue,pour l'analyse
des hydrolysats, une méthode de choix parce qu'elle est d'application pra-
tique et ne nécessite pas de transformation préalable des échantillons à
analyser.
Avant d'envisager l'aspect pratique du sujet, il paraît
nécessaire de rappeler les trois principes de séparation, utilisables en
chromatographie sur colonne :
- la chromatographie d'adsorption (charbon-célite)
- la chromatographie de perméation sur gel (Biogel PZ)
- la chromatographie de partage (par résine échangeuse
d'ions).
L'étude analytique de la composition des hydrolysats ne
peut être envisagée qu'à travers ses caractéristiques moléculaires. C'est
pourquoi, nous proposons la chromatographie d'exclusion diffusion ou la
chromatographie de perméation sur gel qui, sans être sélective, réalise un
tamisage moléculaire et donne avec précision la répartition moléculaire des
constituants de l'hydrolysat.
La séparation effectuée sur colonne de Biogel Pz
gel
de polyacrylamide est décrite à l'annexe IV.
Après séparation, les di.. fférents polymères sont identi-
fiés par la méthode colorimétrique à l'Orcinol sulfurique. Le principe de
la méthode originale de TILLMANS et PHILLIPI (6],) repose sur la condensa-
tion de l'orcinol (dihydroxytoluène) avec les produits de dégradation des
- 44 -
hexoses par l'acide sulfurique.
La méthode a été plusieurs fois remaniée puis automa-
tisée par TOLLIER et ROBIN (68). Cette méthode de détection calorimétrique
est actuellement d'usage répandue en analyse alimentàire.
La colonne de Biogel Pz permet une séparation plus éten-
due des divers polymères, cependant, la durée de là manipulàtion (5 heures),
nous a conduits le plus souvent à pratiquer la chromatographie liquide!
haute performance d'application rapide et de mise en oeuvre facile.
Elle réalise néanmoins une séparation moins étendue
et là détection est effeètuée par réfractométrie différentielle, car les
sucres ne possèdent pas de groupements chromophores et ne sont donc pas
dosables par des détecteurs à UV. Cette méthode doit être considérêe
comme la plus adaptée à une analyse de routine.
IV.3 - INTERPRETATION DES CHROMATOGRAMMES
La chromatographie de filtration-exclusion fournit des
renseignements précieux, à la fois sur la complexité des hydrolysats et sur
la distribution des masses moléculaires des divers holosides (Fig. 5,6,7 -
Tableau III).
. t'examen des chromatogrammes montre que pour un même
D.E., la composition des hydrolysats varie en fonction du type d'hydrolyse,
et dàns le cas des hydrolysats enzymatiques, en fonction de l'enzyme utili-
sée.
La composltlon de l'hydrolysat acide semble plus équili-
brée ; les oligosaccharides possèdent, en effet, presque tous la même hau-
teur de pic. De plus, l'hydrolysat acide contient très peu de polysacchari-
des supérieurs.
L'hydrolysat obtenu par l'action de la a amylsase présen-
te un pic élevé en disaccharides, ce qui correspond! là propriété de
l'enzyme de produire des hydrolysats riches en maltose.
- 45 -
Figure 5
ETUDE DE LA REPARTITION DES OL'rGOSACCHARIDES DE DEUX HYDROLYSATS
SG33
~M
n
a. a.
"C
"C"C
•
SG30E
N
a.
"C
~M
a. a.
"C"C
- 46 -
ETUDE DE LA REPARTITION DES OLIGOSACCHARIDES DE DEUX HYDROLYSATS
SG 25
,..
..
M
0-
Lt) ~
Co
"t:J
0-0-"t:J
"t:J"t:J
MDü5
et)
O-N
"t:J
0-
-c
,..
~I
Figure 6
- 47 -
ETUDE DE LA REPARTITION DES OLIGOSACCHARIDES DE DEUX HYDROLYSATS
SG 37
SG40E
Figure 7
- 48 -
MALTOOEXTRINES ET SIROPS DE GLUCOSE DE O.E. MOYEN
REPARTITION DES OLIGOHOLOSIOES
i\\n 05 ~ 07 *SG 25 'SG 33 ~G1!30E ilSG 37 SJ'l40E R'bCLYS
O.E
18-20
25-28 28-31
31-34
31-34
36-39
38-41
40-43
OP t
2.0
3.0
10.0
11.0
4.0
13.0
3.0
1\\.0
OP 2
6.5
9.5-
7.5
9.5
18.0
12.0
37.0
20.0
OP 3
8.0
10.0
7.0
9.0
14.0
10.0
18.0
1\\.0
OP 4
6.5
7.5
7.0
8.2
1\\.0
8.0
8.5
9.0
OP 5
6.0
9.5
6.5
7.5
6.0
7.5
1.1
5.5
OP 6
12.0
15.0
6.0
6.5
5.0
6.5
0.9
4.8
OP 7
9.0
6.0
5.0
6.0
4.0
5.5
1.2
4.5
OP 8
4.0
2.5
4.0
5.0
2.5
5.0
1.6
4.0
OP 9
3.0
1.5
3.0
4.0
2.0
4.0
2.0
4.0
OP 10
2.0
\\.5
2.0
3.5
.1.5
3.0
1.2
3.5
OP
5.0
5.0
23.0
20.0
9.0
15.0
7.0
1\\.5
\\0 à 20
OP
36.0
29.0
19.0
10 .0
23.0
10.5
18.0
11.2
>20
* Acide
+ Cl Amylase
III a Amylase
TABLEAU III
- 49 -
A partir de cette étude de composition, il nous a
pàru opportun de comparer le comportement des hydrolysats ayant subl;
soit une liquéfaction acide, soit une liquéfaction enzymatique, lorsqu'ils
sont soumis à une saccharification complète à l'amyloglucosidase.
IV.4 - ETUDE COMPAREE DU COMPORTEMENT A LA SACCHARIFICATION
Comme signalé dans le chapitre traitant la réverslon,
l'hydrolyse acide à âté décrite comme inductrice de produits de réverslon.
Pout vérifier ce phénomène, nous avons entrepris une étude comparée du com-
portement à la saccharification d'hydrolysats obtenus par voie acide
et/ou enzymatique.
Les produits de la liquéfaction sont saccharifiés dans
les conditions optimales d'activité de l'amyloglucosidase (pH 4,3 - e • 60°-
enzyme à 2%
0 ) ,
La détermination du degré d'hydrolyse ou D.E. est effec-
tuée par le Œ0sage du pouvoir réducte~r par la m~thode du LUFF SCHOORL
(Annexe l ) et celle de la teneur en dextrose vrai, par la méthode à la
glucose oxydase.
- ~!i~~!2~_g~_12_~~!h2g~_g~_g~!~~i~2~!~~_g~_1!_~~~!~!_!~-81~~~~!
vrai ou Dx -
Les réactions peuvent se résumer ainsi
Glucose
acide gluconique + H 0
2 2
Glucose + H20 + 02
Oxydase
t
Là glucose oxydase oxyde le glucose en gluconolactone
avec libération de péroxyde d'hydrogène. En présence d'eau, la gluconolac-
tone se transforme en acide gluconique.
Ensuite une péroxydase décompose le péroxyde d'hydrogène
et oxyde catalytiquement un donateur d'hydrogène (O. toluidine,
O. dianisidine) par le passage de la forme réduite incolore à la forme
oxydée colorée.
- 50 -
Péroxydase
--...-._-~, D color~ + 2 H 0.
2
La glucose oxydase n'agissant que Sur le glucose, permet
un dosage hautement spécifique. Par contre, la deuxième étape peut être
perturbée par des oxydants ou des réducteurs tels que ie
glutathion
et la vitamine C.
Les résultats obtenus (Tableaux IV et V et Fig. 8 et 9)
o
indiquent que la saccharification enzymatique est beaucoup plus efficace
après liquéfaction à l' a amylase et identique pour tous les échantillons
quels qu'aient été leur "Dextrose Equivalent de départ.
DanS le cas des échantillons ayant subi une liquéfaction
acide, les résultats montrent que le D.E. final diminue lorsque le degré
d'hydrolyse initial est élevé.
Ils indiquent aussi que la saccharification est moins ef-
fi~ace après la liquéfaction acide, D.E final ~ 94,5 - valeur inférieure à
celle de la liquéfaction enzymatique: 97,4.
Une augmentation de la teneur en polysaccharides appa-
raît pour les échantillons acides ayant subi une liquéfaction plus poussée
aù détriment du dextrose.
Ces observations nous ont conduits à envisager là recher-
che de facteurs pouvant être responsables de tels phénomènes ; ceci par
comparaison de deux hydrolysats (Acide, enzyme) dans le but de mettre en
évidence un polymère "particulier" qui peut être considéré comme traceur
d'une voie d'hydrolyse, en particulier de l'hydrolyse acide. Cette recher-
che constitue, dans notre hypothèse de travail, un contrôle de qualité par
lé fait de l'existence de produits de réversion •
..
- 51 -
COMPARAISON DE LA SACCHARIFICATION DE L'AMIDON
APRES LIQUEFACTION ACIDE ET LIQUEFACTION ENZYMATIQUE
LIQUEFACTION AL' Il AMYLASE
•
D.E. de Départ
12
17
20
22
27
31
D.E. final
-
97.4
97.5
97.3
97.4
97.5
97.3
Dextrose vrai Dx
93.3
94.1
93.6
93.7
93.0
93.3
Polysaccharides
6.1
5.9
6.4
6.3
7.0
6.7
TABLEAU
IV
LIQUEFACTION PAR L'ACIDE
D.E. de DépaI!t
12
15
20
27
38
42
D.E. final
94.5
93.0
92 .5
91
89
87.5
Dx
91
88
85
83
80
77
Polysaccharides
9
12
15
17
20
23
TABLEAU
V
- 53 -
LES PRODUITS DE REVERSION
V - MISE EN EVIDENCE ET IDENTIFICATION DES PRODUITS DE REVERSION
L'étude bibliographique permet de donner deux hypo-
thèses de formation des produits de révèrsion. En effet, WHISTLER et
COLL (74) d'une part, SROCYNSKI et COLL (58) d'autre part, estiment que
les produits de réversion apparaissent dans certaines conditions de pH
et de température par :
- recombinaison de molécules de dextrose entre elles t
- ou par liaison d'une molécule de dextrose aux oligo-
saccharides présents dans la solution.
En fait, seul le premier mécanisme de formation a pu
être vérifié. Les recherches connues actuellement et qui ont été entrepri-
ses à parti r de solutionsde dextrose pur soumises à la réversion en milieu
acide et à température élevée, ont permis de vérifier ce phénomène.
Selon THOMPSON et COLL (65) dont les travaux regroupent
les études antérieures, les diholosides ci-dessous cités peuvent être for-
més au cours d'un processus de réversion, par recombinaison de deux molécu-
les de dextrose. La connaissance de ces produits : isolement et identifica-
tion, a bénéficié de l'introduction des méthodes chromatographiques qui se
sont révélées d'usage très pratique.
Diholosides de réversion
- Isomaltose
CI D
- 6
- Gentiobiose
a D
- 6
- Trehalose
a D
- 1
- Cellobiose
a D
- 4
- Kojibiose
CI D
- 2
- 52 -
.-
cU
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0
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~
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1-0
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ln
- 54 -
1
j
1
!
Il parait évident que l'interprétation des phénomènes
1
observés dans ces conditions reste discutable lorsqu'il s'agit de les
1
transposer aux hydrolysats dont là composition est parfois très complexe.
1
Ceci explique sans doute pourquoi la mise en évidence de ces sucres de
i
réversion dans les hydrolysats n'a p~s abouti à des solution~ satisfaisan-
tes dans les ouvrages relatifs aux problèmes liés aux conditions d'hydro-
lyse et à l'analyse des sucres issus d'une telle transformation.
Nous avons donc entrepris de rechercher les sucres de
réversion à partir d'hydrolysats obtenus dans les conditions d'hydrolyse
en industrie, afin d'étudier les conditions de formation, leur niveau de
formation et leur influence sur la qualité finale du produit.
La difficulté de cette méthode est double:
- Les produits de réversion, siils existent, le sont en
faible quantité et, comme nous l'avons dit précédemment, leur étude ne sera
effectuée que si l'on tient compte de cette caractéristique.
- Les études connues actuellement ont été réalisées à
partir de solution pure de dextrose ou d'hydrolysat acide ayant dépassé
le stade d'hydrolyse complète.
Nous avons choisi de rechercher les sucres de réversion
sur des hydrolysats partiels constituant les plus faibles hydrolysats aci-
des utilisables en industrie alimentaire.
Les échantillons SG 25 et MD 05 ont été choisis car ils
constituent les produits au D.E. les plus voisins qui peuvent être obtenus
. industriellement, soit par la voie acide (SC 25), soit par la voie
enzymatique (MD OS). Cette étude a pour objectif de trouver un test quali-
tatif sûr, qui permette de distinguer un dérivé d'hydrolyse préparé par
voie entièrement enzymatique, d'un autre ayant subi, à un stade intermé-
diaire; la pius faible attaque acide. Dès lors, ta deuxième partie du
travail devra montrer qu'une faible attaque acide est suffisante pour faire
apparaltre des sucres de réversion.
- 55 -
Nous ne revlendrons pas sur les nombreux problèmeS
que pose la mise en évidence de ces "sucres particuliers", ils ont été
développés dans les chapitres précédents. Nous insisterons sur le fait que
leS sucres de réversion, même lorsqu'ils existent dans un hydrolysat, le
sont en très faible quantité. C'est pourquoi la tentative de leur mise en
évidence ne pourra être envisagée que si l'on procède à une élimination
au moins partielle du glucose qui représente environ 90 % en poids sec
d'un produit d'hydrolyse complète. Ceci sera réalisé
soit par concentra-
tion obtenue par levuration du glucose, soit par fractionnement de l'échan-
tillon à analyser.
Parmi les méthodes chromatographiques utilisables poùr
l'analyse des sucres, nombreuses sont celles qui ùtilisent la séparation
suivant le poids moléculaire. Or, l'étude envisagée ici se propose d'ac-
complir une séparation de diho10sides, donc de poids moléculaires identi-
ques. Deux méthodes nous permettront de la réaliser
- Chromatographie gaz
liquide,
- thromatographie sur résine échangeuse d'ions.
V.I.- REALISATION EXPERIMENTALE DE LA REVERSION
Cette réversion a été accomplie dans les conditions
de préparation industrielle des dérivés d'hydrolyse par la voie acide en
faisant toutefois varier la durée de la réaction.
La solution de dextrose pur est à 5 % de matière sèche
et amenée à pH ~ 2 par l'acide chlorhydrique 2 N. Les échantillons sont en-
suite soumis à la température de 120 0 pendant 1/2 heure, 1 heure et 2 heures.
La réaction terminée, les produits obtenus sont neutra-
lisés par la soude NaOH 2 N et dessalés sur des résines à lit mixte
(BI0REX R.G. Grade SOI x 8, 20-50 mesh) , afin d'éviter les perturbations
que les sels pourraient provoquer pendant la séparation chromatographiqùe.
- 56 -.
Figure la
COMPARAISON REVERSION EXPERIMENTALE
1 h
et
2 h
•
IH
2H
l =
0,4 %
l ' '
3 %
td
CI)
o
~
CI)
H
VIT 5 cm/mn
- 57 -
Figure 11
SG 25 HYDROLYSE ACIDE COMPLETE
Isomaltose : 12,7 %
Maltose : 3 %
100 g de produit commercial
SG 25
VIT JO cm/mn
- sa -
Figure 12
MD OS HYDROLYSE ENZYMATIQUE COMPLETE
Isomaltose : 4.8 r.
Maltose: \\ r.
par \\00 g de produit commercial
MDOS
\\
VIT JO cm/mn
- 59 -
Figure 13
Comparaison produrts d'hydrolyse directe
SG25
MD05
l
l
:1
2,4 %
:1
l ,2 %
..
M .- 4 7-
M
3 %
~
0
E-"
H
E-"
~
,.J
0
,.J
E-"
0
H
E-"
E-"
H
,.J
E-"
;l
,.J
0
E-"
~
0
H
CI)
E-"
H
~
0
CI)
H
VIT 5cmjmn
- 60 -
Les échantillons sont ensuite analysés par chromato-
graphie gaz liquide après oximation et silylation dans les conditions défi-
nies à l'annexe VII).
Résul tat (Fig. 10)
Teneur Isomaltose
1 h - 0,4 %
2 h - 3,0 %
Deux hydrolysats industriels qui ont subi, l'un une
liquéfaction acide SC 25, et l'autre une liquéfaction enzymatique MD 05,
sont soumis à une hydrolyse complète.
L'échantillon SC 25 est hydrolysé en milieu acide
chlorhydrique pH
2 et à 120°, jusqu'à un D.E. ~ 75 - 80.
L'échantillon MD 05 est attaqué par l'amyloglucosidase,
enzyme saccharifiante, jusqu'à un D.E. de 90 - 95.
Les échantillons sont neutralisés ct désionisé~ sur des
résines à lit mixte avant d'être soumis à une levuration (saccharomyces
cerevisae), afin de diminuer leur teneur en glucose, étant entendu que les
sucres de réversion ne sont pas fermentescibles. Les résidus ainsi obtenus
sont analysés par chromatographie gaz liquide après oxtmation et silylation.
.
Résultat MD OS
Isomal tose
4,8 %
Maltose
1, a %
Résultat SC 25
Isomaltose
12,7 %
Mal tose
3,0 %
V.2 - APPLICATION A DES HYDROLYSATS INDUSTRIELS
Cette recherche a été appliquée aux hydrolysats indus-
triels afin de déceler, par analyse chromatographi.que, un pic particulier
pouvant correspondre à un polymère du dextrose, et présent uniquement dans
l'échantillon SC 25.
- 61 -
V.2.1 - Conduite du traitement
----------------------
L'analyse directe a été effectuée de manière à faire
apparaître les disaccharides autres que le maltose, normalement présents
en faible quantité dans les hydrolysats. Ceci sera possible sur une prise
d'essai suffisante pour permettre la détection de l'isomaltose. Les échan-
tillons sont analysés après hydrogénation et silylation (Fig. 13).
Résultat SG 25
Isomaltitol: 1,2 i.
Maltitol
3,0 i.
Résultat MD 05
Isomaltitol: 2,4 i.
Maltitol
4,0 i.
Cette étude paraît insuffisante pour conclure quant à
la présence des sucres de réversion dans les échantillons analysés. Pour
cela, et en raison de la complexité des hydrolysats, un traitement en vue
d'enrichir les échantillons en sucre de réversion a été entrepris. Il aura
pour but :
- d'éliminer le dextrose de l'échantillon sou~s à une
hydrolyse complète. Il représente en effet 90 i. du produit final,
- et de fractionner les hydrolysats pour rechercher le
niveau de formation de ces sucres de réversion.
V.2.2 - ~E~s~i~~~~~~~~_e~E_S~E~~~~~8E~e~!~_~~E_S~~~h~
mince
Chromatographie sur couche m~nce de silice G 60 F.
- Le mélange solvant utilisé pour la migration est le
suivant :
Propanol
70
Ethanol
la
Eau distillée
20
- 62 -
- Quanti té déposée :
5 ~l d'une solution à 50 mg/ml sur le côté,
300 Ul de la même solution, étalés en bande
centrale sur la cm.
Après la migration, les taches latérales sont révélées
par carbonisation des glucides à chaud (110°) après pulvérisation du réac-
tif à l'acide sulfurique concentré dissous dans l'éthanol.
La plaque est ensuite découpée en différentes zones
de manière à pouvoir isoler les holosides de degré de polymérisation (OP)
1 à 3. Ces zones sont grattées, éluées, filtrées et concentrées, avant
d'être analysées après oximation et silylation suivant la méthode de dosage
des diholosides en chromatographie gaz liquide.
V.2.3 - Fractionnement sur colonne Charbon-Cêlite
-----------------------------------------
Le fractionnement des holosides peut être également
réalisé par chromatographie d'absorption sur colonne de Charbon-Célite
50/50 -(Annexe V).
Cette technique constitue une méthode de choix pour la
séparation des sirops de sucre. L'avantage du charbon réside dans sa capa-
cité de chargement, mais la colonne doit être renouvellée après chaque
élution. Un inconvénient cependant: son incapacité à séparer les isomères
de même degré de polymérisation.
Le gradient est réalisé par la variation de la composi-
tion de l'éluant en éthanol. Deux gradients ont été utilisés de manière à
séparer deux fractions :
fraction 1
eau / éthanol à 25 %
- fraction 2
eau / éthanol à 40 %.
- 63 -
L'analyse des deux fractions obtenues par chromato-
graphie liquide à haute performance sur une colonne de résine échangeuse
2
de càtions (BIORAO AG 50W x 4 sous forme ca +) -
(Annexe VI) a permis de
conclure à la composition suivante (Fig 15 et 16) :
- fraction 1
D.P.
- 8
- fraction 2
D.P. < 9
Les deux fractions sont analysées par chromatographie
~
gaz liquide après saccharification à l'amyloglucosidase. Cette attaque a
pour but de réduire la longueur des chaînes afin de les rendre dosables
par C.G.C.
Les deux échantillons SG 25 et MD 05 sont soumis à
une saccharification totale enzYmatique dans les conditions optimales d'ac-
tivité de l'amyloglucosidase (pH = 4,3 - e = 60) jusqu'à un D.E. = 90, le
degré d'hydrolyse étant déterminé par le dosage du pouvoir réducteur par
la méthode de LUFF SCHOORL. (Annexe 1).
Les hydrolysats ainsi obtenus sont soumis à la fermenta-
tion par l'action de la levure de boulangerie (saccharomyces cerevisae) en
présence de phosphate de potassium, sous aération pour éviter la formation
d'une quantité trop importante d'alcool. L'élimination du glucose est suivie
par la technique de dosage à la glucose oxydase (27).
Lorsque le glucose n'est plus décelable, la solution est
filtrée et désionisée sur des résines à lit mixte (BIORAO Grade R.G. 501 x 8)
avant d'être concentrée sous vide à environ 70 % de matière sèche, ceci afin
d'assurer la stabilité bactériologique des échantillons traités. L'analyse
des produits ainsi obtenus par HPLC nous a conduits à limiter notre recher-
che aux disaccharides~ (Fig.14).
- 64 -
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- 67 -
V.3 - ANALYSE DES ECHANTILLONS PAR CHROMATOGRAPHIE GAZ
LIQUIDE
La chromatographie gaz liquide est largement utilisée
du fait de sa sensibilité pour l'analyse de traces de certains sucres
dans les aliments. Son champ d'application a été élargi considérablement
par l'utilisation de dérivés triméthylsylilés qui ont permis de rendre
les sucres volatils. L'adjonction de ce radical apolaire confère à la mo-
lécùle une grande volatibilité et une meilleure stabilité aù choc thermique
que constitue l'injection.
La silylation des sucres est réalisée classiquement par
l'hexaméthyldisilazane (HMDS) , dans la pyridine, suivant le schéma réac-
tionnel suivant :
3 ROH + Me SiNHSIMe
+ MeSiCl --~) 3 ROSiMe
+ NH Cl
3
3
3
4
Cette réaction est très sensible aux traces d'humidité
et les hydrolysats doivent être évaporés à siccité avant d'effectuer la
réaction d'éthérification. L'eau, présente en faible quantité dans nos
èchantillons, ne gène pas la réaction lorsque celle-ci est catalysée par
l'acide trifluoroacétique.
Lors du dosage des disaccharides par chromatographie
gaz liquide, certains holosides apparaîssent sous forme de deux anomères
a
et 8 (liés à la position du OH en 1), ce qui conduit à un chromatogramme
complexe. Pour éviter cet inconvénient, l'holoside est réduit en polyol
ou converti en oxime avant la silylation.
L'oximation est une réaction de condensation d'une
amine l
Hydroxylamine avec l'aldehyde des hexoaldoses.
H
H
............C= 0 + NH OH----~' . '-.....C ===N - on + H 0
2
/
2
/ "
- 68 -
tes chromatogrammes, obtenus à partir des échantillons,
ayant subi une réversion expédmentlle, mon trent que :
- La composition de l'échantillon est uniquement cons-
tituée de dextrose après une 1/2 heure de réversion,
- un pic ayant les caractéristiques analytiques de
l'isomaltose (temps de rétention, dédoublement de pic) apparaît apr~s
1 heure de réversion (Fig. Il).
- il n~y a pas d'évolution notable après 2 heures de
réaction; une diminution de la teneur en isomaltose a été observée sur cer-
tains échantillons.
Ces résultats permettent d'affirmer que l'isomaltose
est un diholoside qui peut résulter d'une réversion, et permettent de con-
firmer que la recombinaison est possible en milieu acide pH + 2,et à chaud
e ,. 120 0 •
Cette étude ne correspond pas exactement à l'objectif
que nous poursuivons; elle montre en effet la formation de produits de
réversion à partir du dextrose. Inversement, nous recherchons ces produits
de réversion à partir de l'hydrolyse de l'amidon. C'est pourquoi dans l'é-
tape suivante de notre démarche. deux hydrolysats liquéfiés industriellement
ont été soumis, l'un à la réversion expérimentale SG 25, l'autre à une hydro-
lyse enzymatique complète MD 05.
Les chromatogrammes montrent une teneur importante en
isomaltose de l'échantillon SG ,25 : la quantité trouvée (12,7 %) ne permet
pas d'attribuer sa présence au seul fait des liaisons naturelles a 1 - 6
de l'amidon. Il apparaît donc que sur un produit d'hydrolyse soumis à des
conditions sévères, la réversion est possible.
L'étude par fractionnement entrepris pour élucider la
zone de formation des sucres de réversion n'a pas donné de résul tat intéres-
sant, car elle a été pratiquée sur des hydrolysats industriels dont l'analyse
a montré la formation de deux diholosides - Isomaltose et Maltose - que ce
soit sur la fraction obtenue par séparation sur chromatographie sur couche
- 69 -
CHROM. LIQ. GAZ
1
i
,
1
·
SG25
· MDüS
1
·
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1
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E
E
Vit 5Mm/mn
Figure 17
- 70 -
mince, ou sur colonne de Charbon-Célite.
L'analyse des échantillons soumis à une concentration
par levuration et évaporation indique la présence de maltose, maltulose
et isomal tose (Fig. 17).
SIROP DE
MD OS
SG 25
GLUCOSE
MALTOSE
0,78 %
0,75 %
0,85 %
•
ISOMALTOSE
S,OO %
3,30 %
3,55 %
MALTULOSE
2 PICS INCONNUS
La présence de ces pics inconnus dans les deux types
d'hydrolysat ne permet pas de les uciliser comme traceur et de conclure
quant aux conditions probables de leur apparition.
Les analyses effectuées précédemment ne permettent pas
d'affirmer la présence de produits rp.sultant d'une réversion dans les
échantillons MD OS et SG 25 à analyser. De plus, la méthode résolutive
utilisée pour l'analyse des échantillons est la chromatographie gaz liquide
dont la capacité de détection se limite aux mono et diholosides. Or, elle
nécessite un chauffage de l'échantillon pour le rendre volatil, ceci suppose
une destruction partielle du produit. Il nous a semblé nécessaire, pour ces
raisons, d'envisager une méthode complémentaire d'analyse, moins agressive
et susceptible de permettre la séparation des triholosides
en l'occurence,
la chromatographie de partage sur résine échangeuse d'ions.
V.4 - ANALYSE DES ECHANTILLONS PAR CHROMATOGRAPHIE SUR RESINE
ECHANGEUSE D'ANIONS (Annexe VIII)
L'analyse par cette méthode a été entreprise car, par chro-
matographie gaz liquide, les chromatogrammes obtenus montrent de nombreux pics
inconnus dont la présence peut être liée aux conditions de réaction
(silylation et chauffage).
- 71 -
Le principe de la méthode est fondé sur la séparation
de complexes acides formés par les diholosides avec les ions borate, sur
une résine anionique base forte.
L'utilisation de réactions chimiques en solution per-
met, en effet, d'accroître sensiblement la sélectivité des résines échan-
geuses d'ions et offre un éventail de possibilités pour la séparation de
composés voisins.
Le caractère particulier des glucides qui ne sont pas
ionisés normalement, mais capables de former des anions en se complexant
avec les ions borate, est bien connu. La fixation donne lieu à une réQr-
ganisation de la structure moléculaire des espèces complexables et la for-
mation des complexes peut être schématisée de la manière suivante :
1
rJ
e
-1--OHC---4f~ B<O-~-
H BOZ + Z
+ H+
- T
OH
Œ--0 0-1-
L'équilibre de la réaction montre que la stabilité du
complexe est fonction du pH.
La méthode de séparation des holosides par chromatogra-
phie sur résine échangeusé d'ions sous forme boratée a été intlroduite par
(33)
KHYM et ZILL, puis développée par de nombreux auteurs dont SAMUELSON et
JOHNSON ( 48-49) qui ont mis au point un procédé permettant de séparer les
mono, les di et les triholosides. La technique est actuellement automatisée
sur des chaînes Technicon (64).
La capacité de fixation des complexes boratés sur les
résines est fonction de divers paramètres
Poids moléculaire des éléments à séparer,
- nombre de radicaux hydroxylés,
- configuration spatiale des molécules.
-
72 -
L'augmentation du nombre de OH entraîne une diminu-
tion marquée de l'affinité de la molécule pour la résine. Il a été démon-
tré que l'OH en cis joue un rôle très important dans la formation de ces
complexes.
L'élution est obtenue au moyen d'un gradient de tampon
borate de pH 8 à 9,5. le pH optimal adopté est de 9,5, afin de limiter les
risques de dégradation des glucides que pourraît entraîner un tampon de
pH trop basique. L'ordre d'élution obtenu dépend de la nature des holosides
et du nombre d'ions borate complexés.
Les monosaccharides qui possèdent un plus grand coeffi-
cient de distribution què les diholosides seront plus fortement retenus et
ainsi de suite.
Après la séparation, les glucides sont dosés par la mé-
thode colorimétrique à l'orcinol surlfurique avec mesure de l'absorbance à
420 mm ; cette longueur d'onde correspond à l'absorbance du complexe boraté
avec le réactif.
Le mélange passe dans un cOlorimètre à cuve à flux conti-
nu, et les variations de la densité optique du mélange à analyser sont en-
registrés en continu.
Les paramètres de la séparation sont les suivants
- changement de la résine : un mauvais tassement affecte
l'efficacité de la résine.
- gradient d'élution : le pH et la force ionique doivent
croître de manière progressive et régulière.
- température de la colonne: elle conditionne la résolu-
tion de la résine. Une température trop importante dénature les propriétés
de la résine.
- débit d'élution ; il doit être moyen car un débit trop
important entraîne une mauvaise séparation. En pratique, le débit sera choi-
si en fonction du mélange à analyser.
- 73 -
Avant d'effectuer l'analyse proprement dite des
échantillons, une étude rapide en vue de tester l'efficacité des résines
a été pratiquée sur deux types de résines anioniques base forte :
- Résine BIORAD AG Ix8 - 200-400 mesh, constituée par
un copolymère de styrène et divinylbenzène, avec un taux de réticulation
de 8 % et une granulométrie de 30 à 40 ~m. Le groupement échang~ur est un
ammonium quaternaire.
- Réaine chromobeads S. constituée de polystyrène sulfoné
avec les chaînes latérales en divinylbenzène. Le taux de réticulation est de
8 % et la granulométrie est de 22 ~m.
Cet essai a consisté en une séparation de 12 holosides
que la plupart des méthodes d'analyse ne permettent pas de séparer aisément.
Les nombreux essais effectués mettent en évidence la bonne qualité de la sé-
paration des diholosides avec la résine type chromobeads S. En effet, les
passages sur la résine AG Ix8 du mélange étalon ont conduit à un chromato-
gramme avec des pics aplatis que les modifications de débit et de hauteur de
colonne n'ont pas améliorées. En revanche, la séparation sur la résine de
chromobeads S., après un conditionnement effectué avec les précautions dé-
crites à l'Annexe VIII, a abouti à une bonne résolution dès les permières
analyses.
Dans le système utilisé pour l'analyse, les paramètres
de l'élution varient de façon continue, ce qui améliore le pouvoir de ré-
solution.
Ce gradient continu de pH et de force ionique est fourni
par un module appelé Autograd.
L'Autograd est constitué de 9 chambres isolées mais pou-
vant communiquer à leur base. Le remplissage des cuv~s est réalisé de ma-
nière à établir dans le temps un gradient continu (Annexe VIII). La quantité
de tampon doit être suffisante pour éluer la totalité dés holosides à sépa-
rer.
- 74 -
Les tampons sont préparés à partir de solutions de
concentration croissante en acide borique, et la force ionique est assu-
rée par une solution de chlorure de sodium (NaCl). Le pH des tampons est
ajusté avec Une solution de NaOH 3N.
Les glucides élués forment un complexe avec l'orcinol
en milieu sulfurique (70 % V/V) et à chaud (Température: 95°C), se. colorent
et absorbent à 420 nm. Le mélange étalon utilisé pour évaluer la capacité
de séparation des résines est un mélange de 12 holosides présents dans la
solution à 0,50 mg/ml. Les chromatogrammes obtenus indiquent une bonne qua-
lité de séparation et une bonne sensibilité de la méthode.
Le chromatogramme étalon peut être interprêté de la
manière suivante
- les composés polyhydroxylés et non réducteurs, tels
que le saccharose et le tréhalose qui n'ont pas d'hydroxyle adjacent en
cis, ont une faible affinité pour la résine anionique. Ils sont, de ce fait,
elués en premier.
- le cellobiose, le maltose et le lactose possèdent un
hydroxyde en cis par mutarotation et sont fortement ionisês. De ce fait, ces
diholosides ont une affinité plus grande que le tréhalose et le saccharose;
ils seront élués après ces derniers.
- le gentiobiose avec une liaison a 1 - 6 peut former
un isomère du furanose et~possède une affinité plus grande que les monosac-
charides. Son élut ion sera postérieure à celle du glucose.
L'application de la méthode à l'analyse des échantillons
MD 05 et SG 25 concentrés par levuration après hydrolyse complète à l'amylo-
glucosidase, a permis d'obtenir les chromatogrammes que nous avons interpré-
tés de la manière sui vante :
1
- 7S -
La chromatographie gaz liquide utilisée précédemment
pour l'analyse des échantillons a montré que les produits étaient composés
de nombreux holosides. Trois ont été identifiés à partir de leurs paramè-
tres chromatographiques : ce sont la maltose, l'isomaltose et le maltulose.
"
Etant donné la composition identique des deux échantil-
lons, comme en témoigne le même nombre de pics, il nous a paru nécessaire
de compléter l'identification des pics inconnus par une séparation sur les
résines échangeuses d'ions. Cette méthode présente, en effet, l'avantage
de séparer les composés sans la nécessité de tes chauffer pour les rendre
volatils. De ce fait, elle évite la dégradation éventuelle des composés et
l'apparitiqn d'artefacts.
Les nombreux essais effectués sur les résines échangeuses
d'ions ont montré que les échantillons analysés ont une une composition
identique. Ces résultats ne peuvent donc pas être exploités en vue d'une
identification du type d'hydrolyse qui a permis de produire l'échantillon
tout au moins si cette distinction est envisagée de manière qualitative.
(Fig. 18 à 24).
Les holosides séparés correspondent au maltose, glucose
et gentiobiose dont les caractéristiques analytiques sont bien définies pour
cette technique d'analyse. (Temps de rétention. position par rapport à
l'étalon interne).
La méthode des ajouts dosés a permis d'identifier trois
pics inconnus apparus sur le chromatogramme. Ils correspondent au
maltotriose, à l'isomaltose et au gentiobiose. En effet, l'addition d'une
quantité connue d'holoside témoin pouvant résulter soit d'une Hydrolyse
partielle, soit d'Une réversion, permet de conclure de façon certaine sur
l'identité du produit dont la teneur se trouve ainsi accrue.
Il subsiste un pic inconnu qui ne se superpose ni au
cellobiose ni au tréhalose qui peuvent résulter d'une réversion ou d'une
réaction secondaire à l'hydrolyse par certaines enzymes. Il semble que ce
pic correspond au maltulose que nous avons identifié par chromatographie
gaz liquide. Malheureusement, l'absence de témoin maltulose ne nous a pas
permis de confirmer cette opinion,
- 76 -
En dehors du fait que cette analyse permet de démontrer
qu'il ne peut pas apparaître de produit de réversion dans un hydrolys&t
moyen, il convient de faire quelques remarques concernant les teneurs en
maltose et isomaltose.
.
Pour traiter ces échantillons, il a fallu utiliser la
capacité du Saccharomyces cerevisae (levure de boulangerie) à fermenter
le glucose. Cette levure est capable de fermenter l'isomaltose et les
produits de réversion, mais ~lle hydrolyse le maltose en glucose qui sera
fermenté ensuite ; ceci explique la très faible teneur en maltose observée
dans les échantillons analysés.
La seconde remarque concerne la teneur en isomaltose
dont l'utilisation comme traceur d'hydrolyse acide a été envisagée pour
l'identification des hydrolysats à haut O.E. En effet, il représente le
premier disaccharide qui a été obtenu après la réversion expérimentale pra-
tiquée sur une solution de dextrose pour et sur l'hydrolysat. Ce choix ne
fait pas perdre de vue que l'isomaltose peut résulter de l'hydrolyse normale
de l'amidon du fait de la présence de liaisons
a
1. - 6 dans la structure
de l'amidon.
En effet, les nombreux essais que nous avons effectués ont
montré une teneur relativement constante (3 à 5 7.) dans les produits d'hy-
drolyse enzymatique complète. Ces valeurs correspondent à la proportion de
liaison
a 1 - 6 dans la structure de l'amidon. Par contre, les échantillons
·préparés par la voie acide ont atteint des terteurs· en isomaltose de 10 à-:t2 %.
Compte tenu de ce résultat, il nous a semblé intéressant
d'utiliser l'isomaltose comme traceur de l'hydrolyse acide sur des hydro-
lysats à haut O.E. lorsque sa teneur excède 5 %. L'application de ce test
aux hydrolysats de O.E. moyen ne peut être envisagée de façon certaine du
fait de la présence d'oligoholisides qui gênent l'analyse directe.
- 77-
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- 83 -
- 84 -
~~!s~i~!;.f~~~i~.: INTERPRETATIONS GENERALES (VI)
Ainsi que nous l'avons indiqué au début de notre tra-
vail, notre étude a été entreprise dans le but de retenir les méthodes ana-
lytiques qui permettent d'assurer un contrôle de qualité des produits
d'hydrolyse de l'amidon dont l'emploi en alimentation et en pharmacie ne
cesse de se développer. Ce contrôle de qualité est assuré par la détermina-
tlon de la composition des hydrolysats et par l'évaluàtion des propriétés
technologiques.
L'ét~de de la composition du produit, et donc de la ré-
partition moléculaire, a été possible grâce aux méthodes chromatographiques,
qu'elles soient simples comme la chromatographie sur couche mince, ou plus
fiahies comme la chromatographie d'exclusion-diffusion sur colonne de
Biogel Pz et la chromatographie liquide à haute
performance.
Ces méthodes
permettent, les unes, d'assurer une séparation des divers holosides de
OP 1 à ZO, c'est le cas de la chromatographie d'exclusion-diffusion -mais
sa mise en oeuvre (préparation de la colonne et durée de la s~paration) ne
permet pas de l'utiliser en analyse de routine-, et d'autres, d~ass~rer une
séparation suffisante des oligosaccharides, comme la chromatographie liquide
a haute performance; d'application plus aisée et rapide et qui a été utili-
sée durant notre travail pour les analyses de routine. Nous ne reviendrons
pas sur l'aspect techniquè du sujet qui à été largement développé dans les
chapitre précédents.
La chromatographie liquide a haute performance et la
chromatographie d'exclusion-diffusion sont des méthodes peu résolutives
mais très utiles pour étudier la répartition moléculaire des hydrolysats.
Les analyses effectuées par chromatographie et pour l'étude des caractères
-technologiques permettent de tirer un certain nombre de conclusions rela-
tives au contrôle de la qualité.
- 85 -
VI.I - CONTROLE DE QUALITE DES HYDROLYSATS
Les chromatogrammes obtenus indiquent que la composi-
tion des produits d'hydrolyse varie de manière très appréciable suivant la
m~thode d'hydrolyse utilisée.
En effet, la chromatographie d'exclusion-diffusion et
la chromatographie liquide à haute performance ont montré que les hydroly-
sats obtenus çn industrie par l'action de l'a amyiase Sont riches en oligo-
holosides de DP 3 et DP 6. avec une faible teneur en glucose.
Ellet permettent de confirmèr que la S amylase est bien
spécifique des liaisons ct t - 4 avec libération dé diholosides; de telle
sorte que le produit d'hydrolyse est quasiment constitué de maltose.
L'analyse des hydrolysats résultânt d'une attaque par
l'acide chlorhydrique a montré une répartition plus homogène et une dispa-
rition des polysaccharides supérieurs en faveur des oligosaccharides. Dans
une certaine mesure. si l'hydrolysat n'a subi aucun traitement ultérieur.
cette caractéristique constitue un indice et peut être considérée comme
critère d'identification d'un hydrolysat acide.
Nous avions défini les produits d'hydrolyse comme étant
caractérisés par leur degré d'hydrolyse détermin~ Â partir du pouvoir réduc-
teur. Celui-ci sera diautant plus ~levé qUà l'hydr01yse aura été plus pous-
&~è. Ce paramètre a été déterminée ~ar la méthode dé LUFF SCHOORL (Annexe t).
Les résultats obtenus pèrmettènt de donner la comp~sition
du ~roduit d'hydrolyse complètè obtenue par saccharification enzymatique ~
- glucose ~
92 - 95 %
- disaccharide l 3 7.
Les hydrolysats à haut D.E. employés en industrie ét
obtenus par la voie acide. possèdent un D.E. • 44. Au-dèlà; nous assistons
â une dégradation des produits formés et à una formation dé sucres de révér-
sion. Ceci sera développé dans la deuxième partié dé cè chapître.
- 86 -
A côt~ des étudès qui permettênt dé rendre compte
dê là composition du produit; il nous a paru nécess~ire de rechercher de4
teâts qui permettent d'~và1uer 1es qua1ités technologiques des hydro1ysat~
(matière sèche et viscosit~). C'est dans cet objectif que nous àvons ènvi-
sàg~ la détermination de 1a viscoité qui conditionné léS propriétés rhéo-
logiques des hydro1ysàts. Celle-ci est d'autant plus élevée que l'hydro1YSat
contient plus de polyholosides à OP moyennement ~levé. Cette propri~t~ est
en relation étroite àvec 1e pouvoir anticrista11isant dés produits d'hydro-
lyse. Le viscosimètre à bille, utilisé pour effectuer nos mesures, est dé
mise en oeuvre aisée et constitue un outil simp1e et bien adapt~ pour une
méilleure évàluation de là qualité du produit.
Deux types d'étude s'imposent pour le contrô1e des
dérivés hydrogénés ; ce sont la recherche du Ni comme résidu de catalyseur
et la mesure du pa pour les produits destinés à la èonfiserie. Le pa doit
être compris entre 6 - 7 ; cela constitue un critère important pour l'~và1u
ation des tests de carie.
Pour terminer l'étude de la composition des produits
d'hydro1yse de l'amidon et des critères assurant leur qualité, nous avons
entrepris une étude comparative de l'influence de là 1iquéfaction sur 1à
saccharification. Les résultats obtenus ont conduit à impliquer les pro-
duits de réversion dans le phénomène de résistance à 1'hydro1yse. Il appa-
raît. en effet, que la saccharification enzymatique est d'àutant pius in-
compl~te que 1a préhydrolyse acide àura été plu~ pouss~é.
VI.2 - ETUDE DES SUCRES DE REVERSION
La recherche des sucres de réversion a donc été envisa~
dàns le but de les utiliser comme traceurs de l'hydro1yse acide. Les tra-
vaux effectués dans 1e domaine de li ana 1yse des dérivé~ d i hydro1yse ont mèrl-
tté que l'hydrolysé acide produit, dans certaineS conditions (concentration
ên glucose, acidité db milieu et température), dès aucres dè réversion oU
produits de recombinaison.
- 87 -
Notre objectif était de rechercher ces produits et
de mettre en évidence l'hydrolyse acide par un test qualitatif. La nature
des échantillons, d'une part, et les méthodes d'analyse; d'autre part,
apportent la justification de la recherche au niveau des disaccharideS et
des traitements auxquels ont été soumis les échantillons.
La chromatographie gaz liquide, bien qu'elle n~cessite
une longue préparation de l' êchanti 110n, constitue une méthode d'une bonne
résolution pour l'analyse de traces de sucre .
•
En complément à cette analyse, la chromatographie sur
résine échangeuse d'ions sera utilisée car el1è présente l'avantage par rap-
port à la chromatographie gaz liquide d'éviter le chauffage de l'échantil-
lon et permet une analyse plus spécifique dàns là mesure où elle met en jeu
l'affinité des holosides vis-à-vis des groupements. fonctionnels de la
" .
reSlne.
L'analyse directe des deux échantillons par CGL ne montre
aucune différence quant à leur composition. Une étude expérimentale réali-
sée, d'une part à partir de glucose pur, et d'autre part à partir d'échan-
tillons soumis à la réversion, à montré que la réversion est possible
puisqu'il apparaît dans le milieu de 1iisoma1tose en quantit~ importante.
LèS hydro1ysats moyens industriels sOùIDis ~galement 3
là réversion ont présenté une teneur plus élevée en isoma1tose pour le
SG 25 que là fraction MD OS. Ceci nous permet de conclure que dans les pro-
duits d'hydrolyse à haut D.E., l'isoma1tose est utilisable comme tràceur
d'une attaque acide lorsque sa teneur dans le prod. uit
d' hydrolyse excède
5 %, valeur maximale observêe sur des hydrolysats enzymatiques.
L'analyse d'hydro1ysats moyens industriels, dont les
saccharides résistan~ à l'hydrolyse enzymatiqùe ont été concentrés par le-
vuratiùn après saccharification enzymatique, montré que les échantillons
SG 25 et MD OS ont une composition identique. Mais à côté des diho10sides
normalement attendus, comme le maltose et l'isoma1tose; nous avons d~ce1é
la présence de maltu10se et de deux produits inconnus.
- 88 -
Pour compléter ces identifications et afin d'éviter
tés traitements nécessaires pour le dosage en chromatographie gaz liquide.
it nous a semblé intéressant d1entreprendre une recherche par chromâtogra-
phie sur résine échangeuse d'anions qui offre l'avantage d'analyser diem-
bléë les mono, di et triholosides.
Les nombreux essais comparatifs en vue de tester les
résine AG [xe et chromobeads S. nous ont conduit à adopter cette derni~rè
qui assure une meilleure séparation des diholosides.
Les chromatogrammes obtenus né Sont pas distincts et
possèdent le même nombre de substances. Certains holosides tels que le
glucose et le maltose ont été facilement identifiés alors que le gentiobiose,
l'isomaltose et le maltotriose ne l'ont été qu'après àddidond'une quanti-
té connue de témoin. Cette manière de procéder par des ajouts dosés a permis
de montrer que le dernier pic inconnu ne correspond ni au cellobiose. ni
au tréhalose. En tenant compte du résultat obtenu par chromatographie gaz
liquide. nous avons émis l'hypothèse suivant laquelle le pic pourrait cor-
respondre au maltulose. L'absence de témoin maltuloSé n'a pas permis de le
prouver.
Cette analyse confirme la difficulté à'utiliser les pro-
duits de réversion comme traceur de lihydrolyse acide ménagée. Elle permet
dé conclure que ceS produits né peuvent pas être utilis~s comme traceurs
d'hydrolyse acide sur des Hvdrolysats moyens. Par contre. lorsque dès condi-
tions d'hydrolyse acide plus sévères (préparation dé dextrose) sont utili-
sées pour la préparation dé ceux-ci. la teneur en isomàltose;interprét~é dé
mànière quantitative, peut être utilisée à cette fin.
- 89 -
CONCLUSION
==.~======
L'objectif de ce présent travail à été de colliger les
méthodes analytiques et de choisir les mieux àdaptées en analyse alimen-
taire pour l'étude des produits d'hydrolyse.
Les méthodes retenues nouS ont permis d'étudier, d'une
part la composition des produits et d'évaluer leurs qualités technologiques,
d'autre part de recheTcher les produits secondàires des réactions d'hydro-
lyse.
Les m~thodes chromatographiques utilisées (chromatogra-
phie d'exc1usion-fi1t~àtionet chromatographiè liquide à haute performance)
pour l'analyse des échantillons, ont permis de rendre compte de la composi-
tion bien définie des hydro1ysats. Dans une certaine mesure, ce type d'ana-
lyse peut permettre d'identifier un hydro1ysat acide qui se caractérise
toujours par une composition équilibrée. Etant entendu que cette distinc-
tion est effectuée sur un hydro1ysat n'ayant pas subi de traitement u1tériar.
Le~ études effectuées pour la mise en évidence d'un tra-
ceur d'hydrolyse acide ont permis également de montrer que les liaisons 1-6
sont celles qui se forment de façon prépondérante èn milieu acide et à
chaud, à partir du dextrose. Du fàit de la présence naturelle des
1iaisons a t - 6 (type isomaltose) dans là structure dè l'amidon, son àppa-
rition dans certaines limites (inférieur à 5 %) ne peut être interprétée
comme résultant d'une réversion.
D'àprès nos essais effectués sur de~ hydro1ysàts 1iqué-
fiés industriellement et soumis à là réversion; il êst permis de conclurè
que la présence d'isoma1tose à une teneur supériéurè à 5 % dans les hydro1y-
sats à haut D.E. est le signe d'une attàque àcide.
L'uti1isàtion de 1 1 isoma1tose dans les tests de différen-
tiation est donc envisageable de manière quantitative; èt sur des éch~ntii
tons qui ont subi une hydrolyse poù~s~e.
- 90 -
ANNEXE 1
DOSAGE DES SUCRES REDUCTEURS PAR LA METHODE DE LUFF SCHOORL
Cette méthode a été utilisée pour le dosage des sUcres réducteurs parce-
qu'elle ten~ maintenant à remplacer les méthodes de Gabriel BERTRAND et
de TAYNE et EYNON dans l'analyse alimentaire; son application comme
méthode internationale officielle est actuellement envisagêe.
Préparation du réactif
- Dissoudre ~éparément ;
50 g d'acide citrique dans 50 ml d'eau,
25 g de sulfate cuivrique dans 100 ml d'eau,
388 g de carbonate sodique pur cristallisé dans 400 ml d'eau
chaude.
- Verser ensuite prudemment la solution d'acide citrique dans la solution
de carbonate sodique, et,au mélange obtenu,ajouter la solution de sulfate
cuivrique.
Compléter ensuite à 1 L.
Avant d'utiliser le réactif, il est nécessaire de vérifier certains
paramètres :
1 - Le réactif doit être NIlO en cuivre.
A 25 ml de réactif, ajouter] g de KI
et 25 mi de H S0
25 %"
2
4
Titrer ensuite par le thiosulfate de Na NIlO en présence
dtempois d'amidon introduit en fin de titrage.
nT < 25 ml
2 - Le réactif doit être 1.2 à 1.5 N en Na CO] et NaHCO]
2
A 1 ml de réactif, ajouter 9 ml d'eau et 2S ml d'HC1 NIlO.
Chauffer 1 h au bain-marie bouillant dans un erlenmeyer
ouvert.
- 91 -
Refroidir et ramener ~u volume primitif.
Titrer par NaOH NilO en présence de Phénol phtaléine.
nN ~ 6 ml
3 -
Le réactif doit être 1.2 N.i 1.5 N en Na C0 .
2
3
Titrer en présence de Ph~no1 phtaléine 1 ml de r~actif
pur nC1 NilO en agitant.
Le terme de l~ réaction est marqu~ par la disparition
de la coloration violette.
6 ml < nltCl < 7.5 ml
Mode opératoire
- Introduire 4ans un matras d'erlenmeyer de 250 ml. 25 ml exactement mesu-
rés de la solution à doser (renfermant environ 30 mg de glucose) et 25 ml
exac tement me surés d1.1 réac ti f de LUFF SCaOORL.
- Après addition de pierre ponce; surmonter le matras d1un réfrigérant
ascendant et maintenir celle-ci pendant 10 minutes éxactement. La solution
est refroidie puis additionnée de 3 g de 1 K dissoué dans un peu d'eau ét
ensuite 25 ml de a so
a 25 i. introduit avec pr~càution par petites
2
4
frac tions.
Titrer l'iode libéré par le thiosulfate de Na NilO èn pr~sence diempois
d' amidon ~ 5 ml ajout~s en fin de titrage. N
- Titrer en parallèle un témoin trait~ dans les mêmes conditions en rempla-
çànt là solution sucr~e par dé 1 i eau distill~e.~'.
tà teneur en ~lément réductetir è~t donnée suiv~ht lé tàbleàu ~92)' N'-N.
TABLE DE LUFF-SCHOORL
-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-
Glucose
Fructose
Sucre inverti
Galactose
Maltose
Lact.ose
Lactose
anhydre
hydraté
ml
mg
~
mg
mg
mg
ml
Na
s;-
2 S2 03
C6 ~2 06
C6 HI2 06
CI2H22011
CI2 H22 011
CI2 H;- 011
Na 2
03
•
NIlO
H?O
1---
NIlO
1
2.4
2.7
3.0
3.6
3.8
1
2
4.8
5.5
7.3
7.3
7.7
2
3
7.2
8.3
11.7
11.0
11.6
3
\\0
N
4
9.7
11• 2
15.6
14.7
15.5
4
5
12.2
14.1
19.6
18.4
19.4
5
6
14.7
17.0
23.5
22. 1
23.3
6
7
17.2
20.0
27.5
25.8
27. 2
7
8
19.8
23.0
31.5
29.5
31.1
8
9
22.4
26.0
35.5
33.2
35.0
9
10
25.0
29.0
39.5
37.0
39.0
10
Il
27.6
32.0
43.5
40.8
43.0
Il
12
30.3
35.0
47.5
44.6
47.0
12
13
33.0
38.1
51.6
48.4
51.0
13
14
35.7
41.2
57.7
52.2
55.0
14
15
38.5
44.4
59.8
56.0
59.0
15
16
41.3
47.6
63.9
59.9
63. 1
16
17
44.2
50.8
68.2
63.8
67.2
17
18
47.1
54.0
72.2
67.7
71.3
18
19
50.0
57.3
76.5
71.7
75.5
19
20
53.0
60.7
80.9
75.7
79.7
20
21
56.0
64.2
85.4
79.8
84.0
21
22
59.1
67.7
90.0
83.9
88.3
22
23
62.2
71.3
94.6
88.0
92.6
23
- 93 -
ANNEXE II
ESSAI LIMITE DU NICKEL
Méthode au diméthylglyoxime
- Peser 1 g de diméthylglyoxime, ajouter environ 50 ml d'alcool absolu et
de l'ammoniaque jusqu'à dissolution: environ 10 ml.
- réaliser la minéralisation sêche de 1 g de produi~. Reprendre par 5 ml
d'eau et ajouter 10 ml de solution de diméthylglyoxime.
Homogénéiser et comparer à un témoin réalisé de la maniêre suivante
Ajouter 1 ml de solution à 0.01 g/IOO de Ni à 4 ml d'eau et
10 ml de la solution de diméthylglyoxime .
. Homogénéiser, la coloration de l'essai doit être égale ou moins
intense que celle du témoin (10 ppm).
- 94 -
ANNEXE III
REACTIF AU AgN0
/ NaOH
3
Réactif 1
0.5 ml d'une solution saturée de nitrate d'argent (AgN0 ),
3
Compléter à \\00 ml avec de l'acétone,
Dissoudre ensuite le précipité avec 5 ml d'eau distillée.
Réactif 2
2 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans un peu d'eau,
Compléter ensuite à \\00 ml avec du méthanol.
Pulvériser le réactif \\ pu~s le réactif 2 et laisser développer les taches
à l'étuve à 100 0 C pendant 2 minutes.
- 95 -
ANNEXE IV
CHROMATOGRAPHIE DE PE~~ATION SUR GEL
Biogel P
Polyacrylamide de granulométrie <37u.
2
Colonne
•
Longueur
2 m
Diamètre
1.5 cm
e calotte
65 cm
Eluant
Eau bidistillée
- débit : 0.42 ml/mn
Solution à déposer
50 ml d'une solution à 1.5 g/IOO ml d'eau, de l'hydro-
lysat à analyser.
Détection par auto-analyseur Technicon
Réactif: Orcinol sulfurique à 1 g/l dans H S0
70 i. V/V.
2
4
Schéma
Le principe de la détection est le même utilisé pour l'analyse
de résine échangeuse d'anion.
- 96 -
ANNEXE V
CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION SUR COLONNE CHARBON-CELITE
- Le charbon joue le rôle d'absorbant.
- La célite (terre de diatomées) renferme environ 95 % de SiOZ'
La célite est utilisée pour éviter un tassement trop important du
charbon et donc pour faciliter l'élution.
La séparation sur cette colonne sera réalisée de la manière suivante : ce
sont les molécules contenant le plus grand nombre de groupement polaire qui
sont les plus facilement adsorbées. Les monosaccharides seront élués en
premier, puis les di et les triholosides.
Colonne : Charbon - Célite sa/sa
Hauteur
50 cm
Diamètre
4 cm
Débit
ml/mn
Eluant
I.Z L d'un mélange eau-éthanol Z5 %
Eluant 2
I.Z L d'un mélange eau-éthanol 40 %.
Quantité déposée
50 ml d'une solution de maltodextrine à IZ g/30 ml d'eau.
Remplir la colonne avec la quantité nécessaire d'un mélange
charbon - célite 50/50, laisser stabiliser plusieurs heures par gravité.
Retirer ensuite l'excédent d'éluant et déposer la substance à
analyser .
. Faire ensuite p~sser l'éluant 1 au moyen d'une pompe péristaltique
à un débit de 1 ml/mn.
- 97 -
ANNEXE VI
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
2
- Résine échangeuse de cation AGSOW x 4 sous forme de Ca + 200-400 mesh.
- Résine échangeuse cationique d'acide fort avec des groupements fonction-
nels acide sulfonique attachés à un copolymère styrène divinylbenzène 4 %.
Colonne
pour obtenir une bonne séparation, il est nécessaire d'utiliser
2 colonnes placées en série.
Longueur
30 cm
Diamètre
7.8 mm
. Température
de l'élution
.. Débit
Eluant
Eau bidistillée dégazée.
Quantité injectée : 10 ~l
Les hydrolysats sont dilués à \\0 bx et filtrés sur millipore de 22 ~
avant d'être injectés.
Détecteur
Réfractomètre différentiel.
- 98 -
ANNEXE VII
CHROMATOGRAPHIE GAZ LIQUIDE
Cette méthode a été utilisée tout au long de notre travail pour une
recherche précise
des disaccharides.
Colonne
Gaz chrom Q 100 - 120 mesh
5 % OV 225.
Longueur
1.5 m
Diamètre
1/8.
Débits
N
30 mllmn
2
Air
400 mllmn
H
28 mllmn
2
Température :
a
200 Q -
pour assurer une ligne de base constante
e
Quantité injectée
1 III
Déroulement
5 mm/mn.
Afin d'obtenir des pics biens séparés et reproductibles, les substances
à chromatographier ont été soumises à une oximation ou une hydrogénation
avant rI être si lylées.
La prise d'essai dépend de l'importance relative des produitS recherchés,
de telle sorte que pour un hydrolysat HO qui n'a subi aucun traitement.
P.e ... 250 mg.
- 99 -
Alors que pour un hydrolysat Hl qui a subi une cristallisation,
P.e. s
150 mg.
OXIMATION
Réactiis
1 /- 6 Phényl 0 glucoside à 1 g/l dans la pyridine
2 /- Chlorhydrate d'hydroxylamine à 85 g/l dans la pyridine.
A une prise d'essai de 150 mg, ajouter la ml exactement mesurés de la
solution étalon de 6Phényl D glucoside et agiter.
Dans une éprouvette, reprendre 1 ml de la solution ainsi obtenue et
ajouter 1 ml d'une solution de chlorydrate d'hydroxylamine.
Mettre au bain-marie à 70°, pendant 40 minutes exactement.
Laisser refroidir et faire le dérivé silylé.
SILYLATION
Au produit obtenu précédemment, ajouter 1 ml d'hexaméthyldisylazane
+ 0.1 ml d'acide trifluoroacétique avec beaucoup de précaution.
Agiter prudemment et laisser reposer 30 minutes à 20°C.
Injecter 1 ~l du surnageant.
HYDROGENATION
Dans un erlenmeyer de 100 ml, peser 150 mg de produit sec, soit en tenant
compte de la matière sèche :
150 x 100
Pe a
MS
Ajouter 150 mg de borohydrure de Na et diluer à 50 ml avec de l'eau.
Agiter 1/2 heure.
Faire cesser l'hydrogénation en versant de l'acide acétique jusqu'à cessa-
tion du bouillonnement.
- 100 -
Passer ensuite sur une résine échangeuse de cation Amberlite AG50W x 4
sous forme H et éluer avec 50 ml d'eau.
Evaporer à sec et laver avec du méthanol. S'il apparaît un précipité
blanc, évaporer le méthanol et reprendre par t ml d'une solution étalon
contenant 25 mg de squalane/ml de Pyridine et ajouter 9 ml du pyridine.
Agiter fortement et faire un dérivé silylé.
- 101 -
ANNEXE VIII
SEPARATION DES MONO, DI et TRIHOLOSIDES
Cette étude a été entreprise dans le but de séparer les holosides résiduels
après saccharification et levuration de 2 maltodextrines MDOS et MD2S. Cette
séparation a été envisagée parce que la chromatographie sur résine échan-
geuse d'ion permet une analyse réelle de l'échantill~n sans nécessité de
chauffage, comme ce fut le cas pour l'analyse par chromatographie en phase
gazeuse.
Les résines sont mises sous forme boratée et l'élution est obtenue par
un gradient en acide borique dont la force ionique est améliorée par des
solutions de NaCl de concentration croissante.
Les glucides sont dosés, à la sortie de la colonne après réaction avec
l'orcinol en milieu sulfurique et à chaud, par calorimétrie à 420 nm.
Le mélange de réactif et la détection
sont automatisés sur des
chaînes Technicon.
kéactifs
Solution d'orcinol sulfurique à
g/IOOO ml diacide sulfurique
(H S0 ) 70 %.
2
4
Diluer d'abord l'acide, laisser refroidir avant d'ajouter l'orcinol
afin d'éviter une coloration trop intense du réactif .
. Solution de régénération
Tétraborate de Potassium K B 0 4H 0 en solution à 10 g/IOOO ml .
2 4 7
2
• NaOH
4N.
102 -
Tampons d '_élution
· Tampon 1
Acide borique 0, 1 M
6.184 g/l
ajusté à pH = 8
· Tampon 2
Acide borique 0, 1 M
6.184 g/l
+ NaCl
0,05 M
2.922 g/l
ajusté à pH .. 8
· Tampon 3
Acide borique 0, 1 M
6.184 g/l
+ NaCl
0, 1 M
5.844 g/l
• Tampon 4
Acide borique 0,2 M
12.368 g/l
ajusté à pit • 8
• Tampon 5
Acide bprique 0,2 M
12,368 g/l
+ NaCl
0,2 M
Il ,688 g/l
ajusté à pH .. 9,5
Le pH final a été ajusté à pH '" 9,5.
Solution étalon
• Etalon interne Ribose
Prise d'essai: 0.1 ml d'une solution à 50 mg/100 ml soit 50 mg.
• Etalons sucres témoins
Prise d'essai: 50 mg de chaque sucre.
Echantillon à analyser
0,1 ml d'une solutlon à 50 mg/100 ml d'eau.
Solution de rinçage
NaOH 1 N.
Rêsine : Chromobeads S - 20 ~m
Résine échangeuse d'anion de base forte
Styrène divinylbenzène 8%.
Colonne
. hauteur C. 750 mm
R. 700 mm
- 103 -
Débit : environ 0.80 ml/mn
Il nous paraît nécessaire de signaler qu'un débit trop important affecte
la résolution ; en revanche, un faible débit améliore la séparation mais les
pics sortent en traînée.
Température de la calotte: 53.5°C - 55°C
La colonne est maintenue à une température constante par une double enve-
loppe dans laquelle circule un liquide.
Mode opératoire Thermostaté
- Préparation de la colonne
Le diamètre aes particules étant < 20~, la colonne est remplie
par la méthode de la voie humide.
La résine est mise à gonfler dans de l'eau bidistillée quelques
heures avant le remplissage de la cplonne.
La résine se tasse par gravité d'abord, ensuite à l'aide d'une
micropompe réglée au débit d'utilisation de la colonne. L'eau est utilisée
cOlIDlle éluant d.ans la première phase du tassement, ensuite une solution N de
NaDa en quantité suffisante pour déplacer les ions Cl
de la résine (environ
20 fois le volume de résine).
Le lit de résine est soumis à la fixation de l'ion tétraborate
par régénération pendant 24 h, avec une solution de tetraborate de Potassium
à 10 %.
La résine est alors prête à l'analyse.
Avant l'introduction de l'échantillon, il est nécessaire
d'assurer l'équilibre de la résine; ceci est obtenu par passage du
tampon nO) au débit fixé précédemment pendant 1 h.
En travaillant de cette manière, nous avons obtenu uüe bonne
résolution dès les premiers dépôts.
- 104 -
- Introduction de l'échantillon
• Enlever le liquide surnageant au-dessus de la résine
avec précaution, pour éviter de mettre en suspension des partlcu1es.
· Déposer au sommet de la résine, 0.1 ml exactement
mesuré et rincer les parois avec 0.1 ml de tampon nOI.
Faire pénétrer le dépôt dans la résine en exerçant
une pression d'air au haut de la colonne.
Remplir ensuite la colonne jusqu'à débordement et
adapter le haut de colonne en prenant soin de chasser l'air dont la pré-
sence sous forme d'une simple bulle annule la pression.
· Enfin, brancher le système autograde des gradients.
Entre chaque analyse d'échantillon, laisser régénérer la
résine durant 8 heures, par passage d'une solution de tétraborate à \\0 I,
et équilibrer 1 heure avec le tampon n01 .
•
- 105 -
GRADIENT D'ELUTION POUR LA CHROMATOGRAPHIE DES SUCRES
PH 8
PH 8
PH 8
PH 8
!PH 9 t 5
CHAMBRES
TAMŒ10N l
TAMPON II
TAMPON III
TAMPON IV
~AMPON V
1
50 ml
2
50 ml
3
25 ml
25 ml
4
20 mL
30 ml
5
25 ml
25 ml
6
25 ml
25 ml
7
25 ml
25 ml
8
50 ml
9
50 ml
-
106 -
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