MEMOIRE
DE
LA
THESE
présentée
A L'UNIVERSITE D'ORLEANS
U.E.R. DE SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES
pour l'obtention du titre de
DOCTEUR DE 3ème CYCLE
EN
BIOPHYSICOCHIMIE MOLECULAIRE
par
Augustin BERE
1
CONTRlBUnON A L'ETUDE DES INTERAcnONS ACIDES NUCLEIQUES _
PROTEINES : MISE EN EVIDENCE DE LA FORMATION DE COMPLEXES
TERNAIRES ENTRE LES POLYNUCLEOnDES ET DES POLVPEPnDES
(Tyrx' GIlly) n, PAR L'INTERMEDIAIRE DE CAnON~o METALLIQUES.
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. POUR l.'Er-.J5EIGNi::N'I[;l'J,{ SU;)CR:E:Ual
1
C. ,o... M. E. S. -
OUAGADOUGOU
~ Arrivée ., ·8·8 .AOYT.1995.....
1_ Enregist~é sou~~~22· __t_· o'
Soutenue le 17 Mai 1977 devant la Commission d'examen :
MM. Marius
PTAK. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Président
Claude
HELENE
Rapporteur
Michel
MONSIGNY
.
Mme Simone OSTROWETSKY
Examinateurs
M. Philippe GRIVET
.

Ce travail a été réalisé au Centre de Biophysique Moléculaire du
C.N.R.S. à Orléans. Je voudrais témoigner ici toute ma reconnaissance et mon
admiration à Monsieur Claude HELENE.. Professeur au Muséum National d'Histoire
Naturelle .. et Directeur de ce laboratoire qui.. avec une grande patience.. m'a
initié à la Recherche. J'ai été très heureux de pouvoir bénéficier de sa grande
culture scientifique et de ses qualités humaines. Ses précieux conseils et

son appui constant m'ont permis de bien mener ce travail qui.. au demeurant..
lui doit tout. Je voudrais qu'il trouve dans ces mots l'expression de ma
profonde gratitude.
Je suis très reconnaissant à Monsieur Marius PTAK.. Professeur à
l'Université d'Orléans.. de m'avoir fait l'honneur de présider le jury
et pour les conseils qu'il m'a si souvent prodigués.
Mes remerciements s'adressent tout particulièrement à Madame
Simone OSTROWETSKY.. Professeur à l'Université d'Orléans.. pour l'intérêt qu'
elle a manifesté pour ce travail.. et surtout
pov~ l'aide humaine qu'elle m'a
donnée dans les premières années de mes études à l'Université d'Orléans. Je
suis heurev.x de lui exprimer ma profonde reconnaissance.
Monsieur Michel MONSIGNY.. Professeur à l'Université d'Orléans.,
a bien voulu juger ce travail.. qu'il soit assuré de ma reconnaissance sincère
pour l'enthousiasme qu'il a faitnattre en moi tout au long de mes études.
Monsieur <Jean-Philippe GRIVET.. Professeur à l'Université d'Orléans
a porté un intérêt évident à ce travail; au cours de nombreuses discussions..
j'ai pu profiter de ses conseils utiles.. et de sa culture scientifique. Je
lui témoigne ici toute ma reconnaissance.
Je voudrais associer à mes remerciements Monsieur Jean-Claude
MAURIZOT.. Mattre de Recherche au C.N.R.S ... Monsieur Michel CHARLIER.. Chargé
de Recherche au C.N.R.S. pour leur participation à ma formation scientifique.

Je les en remercie vivement.
J'adresse d'amicaux remerciements à tous mes camarades d'équipe..
Alain GERVAIS.. Francine TOULME.. Maurice DURAND.. Gérard LANCELOT.. Jean RAMSTEIN..
dont l'amitié m'a toujours été précieuse.
Enfin.. je remercie Madame Maryvonne PELLE et Monsieur Pierre BRETON
pour Zeur contribution à la réalisation de ce mémoire.

T A BLE
DES
MAT 1ER E S
INTRODUCTION
l
CHAPITRE
l
-
l<lATERIELS ET METHODES
1- PRODUITS UTILISES
4
1.
Acides nucléiques
4
2.
Peptides et polypeptides
5
3.
Les ions métalliques
5
11- TECHNIQUES EXPERIM~JTALES ET MODES OPERATOIRE
6
1.
Absorption ultraviolette
6
2.
Fluorescence
6
\\ - i\\ l ,,' ",,",,-
3.DichroIsme circulaire t'/~\\'i- '- ,,-
1
1
4..
11lesures des pH
1~0'
\\
8
f,~
\\
~.
)
WlAPITRE
II -
-=ETU=;;:;.DE~D::.:E=-=L;;.;A:"";;;'==~~=""'::'~~R-==";:";'=­
SUR LE POLY
1-
INTRODUCTION
10
11- ETUDE PAR ABSORPTION UV
10
1.
Poly(A)
10
2.
Poly( C)
14
3.
ADN de thymus de veau
j
16
l

111-
DICHROIS~E CIRCULAIRE

1..
Po1Y(A)

2..
Po1y( C)
20
3.
ADN de thymus de veau
22
IV-
DISCUSSIOn
25
CHAPITRE
III
~. ETUDE DE LA F'IXATION ms CATIONS
2
Mg + t
zn2+ z cu2+, SUR LES POLYPEPTIDES
1-
INTRODUCTION
28
11- ABSORPTlmt
30
111- FLUORESC~TCE
30
1V-
DICHROISME CIRCULAIRE
34
V-
DISCUSSION
41
CHA.PIT~~
IV
-
MISE EN E'J'IDENCE DE LA J:i'OIù"llATION
DE CO:i,IPL EXES TERN AI R~
1-
INTRODUCTION.
44
II-
ABSORpôrOIN
44
111- f.~UORESCENCE
46
2
1.
Poly(A)-M +- polypeptides
46
2.
Poly(~)_M2+_ polypeptides
50
IV~
DICHROISME CIRCULAIRE
53·
1.
Complexes ternaires avec le poly( A)
5J
2.
Complexse ternaires avec le poly( C)
55
J •.
Complexes ternaires avec l'ADN de thymus
de veau
60
v-
DISCUSSION
64
CONCLUSION
67
BIBLIOGRAPHIE
11

J
1
LISTE DES ABREVIATIONS
E.D.T.A.
Acide éthylènediaminetétraacétiQue
Ac-Glu-Tyr-Glu-NHEt
N-acétyl-L-glutamyl-L-tyrosyl-L-glutamyl
éthylamide
Ac-Glu-Glu-Tyr-Glu-NHEt
N-acétyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-tyrosyl-
L-glyta~yl éthylamide
( Tyr-Glu)
Poly-(L-tyrosyl-L-glutamyl)
n
( Glu-Tyr-Glu) n
Poly-(L-glut~~yl-L-tyrosyl-L-glutamyl)
T'fq,.
(Glu-Tyr~Glu)
Poly-(L-glutamyl-L-tyrosyl-L-tyrosyl-L-
n
glutamyl)
(Glu-Glu-Tyr-Glu)
Poly-(L-glutamyl-L-glutamyl-L-tyrosyl-L-
n
glutamyl)
Lys-Tyr-Lys
L-lysyl-L-tyrosyl-L-lysine
Lys-Trp-Lys
L-lysyl-L-tryptophanyl-L-lysine
Poly(A)
Acide polyriboadénylique
Poly( C)
Acide polyribocytidylique
ADN
Acide désoxyribonucléique
j
1

1 N T R 0 DUC T ION
La reconnaissance spécifique des acides nucléiques par les
protéines repose essentiellement sur une complémentarité conformation-
nelle, permettant l'établissement des interactions spécifiques entre les
bases et les chaînes latérales des acides aminés. Ces interactions peu-
vent s'établir directement, mais aussi d'une façon indirecte, dans la
mesure où une troisième espèce chimique, un cation métallique par exem-
ple, peut servir de pont entre les deux composants du système.
Les ions métalliques jouent un rôle sinon indispensàble, du
moins important dans presque toutes les fonctions biologiques des acides
nucléiques: d'une part, ouelles que soient les précautions prises lors
des préparations, on les retrouve toujours fortements liés aux ADN et
aux ARN (Wacker et Vallee, 1959) ; parmi ces ions, le zinc, le magné-
sium, le calcium et le cuivre se rencontrent en quantité importante
(Andronikashvili, 1968
Bilokobylskii et al., 1968). D'autre part,
l'activité fonctionnelle des acides ribonucléiques (ARN ribosomaux, ~qN
de transfert~ ARN messagers) est intimement liée à la présence de cations
métalliques (TaI, 1968) tel que le magnésium qui intervient dans la
reconnaissance spécifique des ARN de transfert par les amino-acyl-t- ARN
synthétases (Walters et Van 00, 1971).

Certains ions métallique~ nossèlient une activité mutagène:
la mutation "petite" chez la levure, in,:iui te sous l'action du cuivre, du
cobalt, du nickel, du manganèse et du cadmium (Linde_green et al., 1958),
les mutations par déplacement du cad.re de lecture dites "Frame shift
mutations" induites par le cuivre chez Bacillus subtilis (Weed et
Longfellow, 1954 ; Heed, 1963) traduisant l'importance du rôle des ca-
tions métalliques dans les fonctions biologiques des acides nucléiques.
Si l'activité fonctionnelle des acides nucléiques est Presque
totalement dépendante d'ions métalliques, les enzymes impliquées dans leur
métabolisme ne fonctionnent pour la plupart qu'en présence d'ions biva-
lents. Il apparaît que beaucoup de ces protéines sont des métallo-enzy-
:res, et, que le métal le plus souvent identifié soit le zinc. Scrutton
et al., (1971) ont mont~é que l'ARN polymérase d'Escherichia coli con-
tient deux atomegrammes de zinc liés par mole d'enzyme. Cette même ARN
polymérase perd toute spécificité d'initiation en présence de manganèse
(Breslow et al., 1966). Les ADN polymérases d'Escherichia coli et de
l'oursin de mer contiennent
respectivement, deux et quatre atomes de-
zinc par molécule d'enzyme (Slater et al., 1971) et il semble que la
reverse transcriptase du virus des cellules myéloblastiques d'oiseaux
comporte aussi deux atomes de zinc par molécule de protéine (Auld et
al., 1974). D'a.utres enZ;YïIles sont spécifiquement inhibées par des a.gents
2
complexants des ions z'''a + comme la I,IO-phénanthroline alors qu'elles
ne le sont pas avec des isomères du même produit qui ne complexent pas
2
les ions Zn +. Il en est ainsi de la désoxynucléotidyl transférase de
thymus de veau (Chang et al., 1970), de l'ARN polymérase du foie de rat,
de la reverse transcriptase du virus du sarcome de Rous (Valenzuela,
I97J), de même Que la nucléotidyl-t-ARN synthétase (Kenneth et al.,
1975). Ces ions métalliques fortement liés aux enzymes doivent participer
à l'acte catalytique, en maintenant une structure active des enzymes,
nécessaire à la formation de complexes spécifiques avec les acides nuclé-
iques.
Dans ces interactions spécifiques directes ou indirectes entre
les acides nucléioues et les protéines, les résidus aromatiques des aci-
des aminés peuvent jouer un rôle particulier co~me en témoigne leur
présence dans les sites actifs de certaines nucléases. Les interactions

d'empilement entre les bases et ces résidus ont été mises en évidence
aussi bien en solution aqueuse congelée (Montenay-Garestier et Hélène,
1968 ; 1911 ; 19105) qu'à la température ambiante (Dimicoli et aL, 1911).
L'étude de la fixation sur les acides nucléiques de peptides contenant
des acides aminés aromatiques (Lys-Tyr-Lys, Lys-Trp-Lys) a permis ensui-
te de mettre en évidence cette interaction d'empilement dans les com-
plexes formés (Dimicoli et Hélène, 1914 ; Brun et al., 1915 ; Durand
et al., 1915 ; 1916 ; Toulmé et al., 1914 ; Toulmé et Hélène, 1911).
Dans le but de préciser le rôle que pourra.ient jouer les ca-
tions métalliques dans l'association des protéines et dès acides nuclé-
iques, nous nous sommes intéressés aux interactions qui pouvaient pren-
dre naissance par l'intermédiaire de cations métalliques, entre des poly-
peptides contenant l'acide glutamique et la tyrosine, et des polynuclé-
otides de synthèse \\Poly(A), poly(C) de même qu'avec des acides nucléi-
ques naturels (ADN de thj~uS de veau ). Les répulsions électrostatiques
entre les groupements phosphates de l'acide nucléique d'une part, et
les groupements carboxyliques des résidus de l'acide glutamique
d'autre part, empêchent en effet une interaction directe entre ces
deux types de polymères. Par contre un cation métallique peut servir
de " pont ll entre les deux macromolécules et introduire de la sorte des
interactions spécifiques entre leurs constituants •. La mise en évidence
de tels complexes ternaires doit contribuer à une meilleure connaissance
du rôle des cations métalliques dans les associations protéines-acides
nucléiques; elle doit aussi permettre une étude des interactions entre
les groupements chimiques des deux polymères que peut induire la
formation de complexes ternaires.
Dans les chapitres II et III, nous avons présenté les résultats
concernant les complexes binaires acides nucléiQ.ues-cations métalliques
et polypeptides-cations métalliaues. L'étude des propriétés des complexes
bina.ires était nécessaire pour aborder celle des complexes ternaires Q.ue
nous avons exposée au chapitre IV. Les différentes méthodes spectrosco-
piques que nous avons utilisées pour l'étude des complexes binaires et
ternaires ont été essentiellement, l'absorption, la fluorescence et le
dichroïsme circulaire.

CHA PIT R E l
MATERIELS ~T METHODES

l - PRODUITS UTILISES
Le poly(A) et le poly(C) sont des produits commerciaux Miles.
Les solutions mères, environ 5 10-jM, ont été préparées par disso-
lution directe des polynucléotides dans une solution saline de
NaCI0
ou de NaCl à la force ionique désirée. Les concentrations
4
ont été déterminées à partir des spectres d'absorption à pH 1,5,
en utilisant comme coefficient d'extinction molaire par phosphate:
I
I
Poly(A)
4
E (251 nm) :: 1,01 x I0 M-
x cm-
-1
Poly( c)
E
6,09 x IOJM-I x cm
(268 nm) ::
Avant chaque expérience, nous nous sommes assurés que lespolynu-
cléotides étaient sous leur forme hélicoïdale simple brin, en véri-
fiant le pH et en enregistrant leur spectre de dichroïsme circu-
laire.
L'ADN de thymus de veau a été préparé selon la méthode classique
de Kay et al., (1952). La déprotéinisation initiale, réalisée par
agitation répétée de la. solution d'ADN dissout da.ns l iIl. NaCL avec
un mélange de chloroforme-alcool iso-runylique (Sevag et al., I9j8)
de même que le trai ternent à la pronase, a été réalisée par le groupe
de Madame Sadron. Nous avons seulement assuré une déprotéinisation
poussée par un traitement de l'ADN' a.u phénol fraîchement distillé.
La solution mère a été conservée dans un tampon citrate 0,015 M,
NaCl 0,15 fil à pH 7. Nous avons ensuite réalisé des dialyses contre
NaCI0
pour éliminer le tampon et pour ajuster la concentration sali-
4
ne souhaitée. La concentration de l'ADN a été déterminée par son
-1
-1
spectre d'absorption, en prenant 6 500 M
x cm
comme coefficient
d'extinction molaire par phosphate à 256 nm.

- 5 -
2) Peptides et polypeptides
------------------------
Tous les peptides que nous avons utilisés ont été synthétisés
au laboratoire par Yves Trudelle qui nous en a fait don. Les
solutions mères ont été préparées par dissolution des polypep-
tides dans une solution aqueuse de soude contenant autant d'équi-
valents de soude que de résidus peptidiques. En effet, pour une
bonne solubilisation des polypeptides, il était nécessaire d'io-
niser la tyrosine afin d'éviter les phénomènes d'agrégation;
puis, chaque fois,nous avons ajusté le pH à 7,5. Les solutions
ainsi obtenues ont été dialysées contre du NaCI0
à la concen-
4
tration désirée.
Les concentrations de tous les polypeptides ont été détermi-
nées par leurs spectres d'absorption UV. La valeur de
1
I
1 420 M-
x cm-
a été prise comme coefficient d'extinction molai-
.re
de
la tyrosine à 275 nm. Les peptides et polypeptides uti-
lisés ont été les suivants :
Ac-Glu-Tyr-Glu-NHEt
Ac-Glu-Glu-Tyr-Glu-NHEt
( Tyr-Glu) n
( GI u-Tyr-Gl u) n
(Glu-Glu-Tyr-Glu) n
(Glu-Tyr-Tyr-Glu) n
3) Ions métalliques
-------------~
Les sels métallioues, CuCI , Cu(CI0 )2' ZnCI , Zn(CI0 )2'
2
4
2
4
MgC1 , Mg(CI0 )2 sont des produits commerciaux Merck. Les
2
4
concentrations des solutions mères de ces ions, de même que celle
de NaCI et NaCI0 , ont été déterminées par spectrophotométrie
4
d'absorption atomique par le service de chimie analytique du
B.R.G.M.
1
1

ô
II - 'rECHNHJU2::3 EXPERD:EN'rALES gr!, NOiE~) OPERA'l'OIRES
1) Absorption ultraviolette
-----_......------.-.-:.-------
Les spectres d'absorption ont été enregistrés sur des spectro-
photomètres à double faisceau Cary 14 et Beckman Acta III.
Pour réaliser les spectres d1absorption différentielle, nous
avons utilisé un jeu de quatre cuves en quartz de trajet optique
de 5 ou de 10 mm, que nous avons numérotées A, B, C et D. Les
cuves A et B contiennent au dé~art à la même. concentration, le
sol't a.e polypeptlC1.e
même volume soit de polynucléotide~soit encore le mélange des
deu.x. Les cuves C et D sont remplies avec le même volume de la
solution de NaCI0 . Nous réalisons la ligne de base en plaçant les
4
cuves A et C, dans le compartiment de mesure et les cuves B et D
en référence. Dans le compartiment de mesure, nous ajoutons la
solution d'ions métalliques dans la cuve A ; en référence, le
même volume d'ions métalliques est ajouté dans la cuve D conte-
nant la solution de NaCI0 . Pour tenir compte de. la dilution,
4
un volume identique de NaCI0
est ajouté à la cuve B contenant
4
soit le polynucléotide, soit le polypeptide, soit le mélange
des deux polymères. Enfin, nous enregistrons le spectre diffé-
rentiel.
Le système de que,tre cuves permet de tenir compte de la con-
tribution du cuivre en dessous de 250 run dans la zone de concen-
trations où nous avons travaillé.
Les mesures des intensités de fluorescence ont été faites à
200C sur un spectrofluorimètre Jobin-Yvon équipé en double fais-
ceau et muni d1un dispositif de correction automatique des fluc-
tuations de la lampe. La description complète de l'appareil a déjà
été faite par J.J. Toulmé (1974). La longueur d'onde d1excitation
de la tyrosine est de 275 nm tandis que le maximum de son émission

- 7 -
de fluorescence se situe ver~ ~o6 nm. La mise en évidence de la
formation de complexes ternaires entre les polypeptides et les
acides nucléiques par l'intermédiaire des ions métalliques a pu
être faite en suivant la variation de l'intensité de fluores-
cence de la tyrosine, la fluorescence des bases nucléiaues étant
négligeable à la température ambiante. Nous aVons utilisé deux
protocoles pour suivre la formation de tels complexes.
Protocole A : Nous partons d'une solution de polypeptide à laquel-
le nous ajoutons le polynucléotide. L'addition du polynucléotide
entraine une diminution de l'intensité de fluorescence du poly-
peptide due à l'effet d'écran (longueur d'onde d'excitation:
215 nm) qui peut être corrigée grâce à une courbe étalon. Puis,
nous ajoutons des quantités croissantes d'une solution concentrée
d'ion métallique.
1
Protocole B : A la solution de peptide, nous ajoutons le cation.
métallique jusqu'à un rapport
[M2+J
R -
- [Tyr]
donné, puis nous ajoutons le polynucléotide.
Dans l'un ou l'autre cas, le zinc exaltant la fluorescence de
la tyrosine, l'extinction de cette fluorescence autre que celle
due à l'effet d'écran peut être considérée comme une preuve de
la formation de complexes ternaires entre le polypeptide et le
polynucléotide.
Les spectres de dichroïsme circulaire ont été enregistrés sur
un dichrographe Jobin-Yvon Mark III, à la température ordinaire.
L'appareil est continuellement balayé par un courant d'azote, ce
qui permet un gain ITh~ineux important dans l'ultraviolet lointain
et aussi, une meilleure résolution des spectres. La grande sensi-
bilité de l'appareil nous a permis de travailler avec de faibles
1

-u
concentrations en produits.
Nous avons exprimé nos résultats en intensité dichroïque ou
en ellipticité molaire
[e ]
d x S
Il E
=
o X l
d = distance du spectre à la ligne de base
S = sensibilité de l'appareil
l = trajet optique de la cuve
C = concentration exprimée en moles x litre- l
[eJ= j jOO x Il E
Dans le cas des complexes ternaires, nous avons représenté
l'absorbance dichroïque
Il A en fonction de la longueur d'onde
IlA
= d x S
Nous avons utilisé en dichroïsme, les mêmes protocoles expé-
rimentaux qu'en fluorescence. Nous sommes, cependant, toujours
partis d'une solution de polynucléotide et nous avons suivi la
variation relative de l'intensité dichroïque
de la première
bande positive. ~~ effet, dans la région aromatique, la contri-
bution des polypeptides est négligeable devant le dichroïsme des
polynucléotides.
Les pH ont été mesurés en utilisant un pH-mètre Radiometer
TTT l C équipé d'un système d'axpansion d'échelle permettant de
lire le centième d'unité pH. Avant chaque mesure, le pH-mètre a
été étalonné en utilisant une solution étalon de pH = 6,88. Une
électrode combinée nous a permis d'effectuer des mesures de pH
sur de faibles volumes de solution et directement dans les cuves
de mesure.
L'addition d'ions métalliques aux solutions de polynucléotides

- 9 -
ou de polypeptides entraîne une variation de pH pouvant attein-
dre 0,3 unité pH aux fcr~as concentrations en ions métalliques
et notamment en cuivre. No~s avons évité d'ajuster le pH après
l'addition d'ions métalliques et ce, pour éviter d'une part la
formation d'hydroxyde insoluble et d'autre part, parce que ces
légères variations du pH, ne modifiaient pas de façon qualita-
tive, la formation des complexes binaires et ternaires.
! '

CHA PIT R E
II
ETUDE DE LA FIXATION DES IONS METALLIQUES SUR LE
POLY(A), le, POLY(C) ET LtAD~ DE THYMUS DE VEAU.

-
IO -
l - INTRODUCTION
La fixation des ions métalliques sur le poly(A) et le poly(C)
dans leur conformation hélicoïdale simple brin entraîne des modifi-
cations de leurs propriétés optiques comparables à l'effet d'une
élévation de la température (Shin et al., 1972 ; 1973). L'hyper-
chromisme observé sur les spectres d'absorption, de même que les
variations des spectres dichroïques indiquent une désorganisation
de la structure hélicoïdale et un désempilement des bases.
Les sites potentiels de fixation des ions métalliques sur les
polynucléotides sont d'une part les phosphates, d'autre part les
bases. La fixation purement électrostatique sur les phosphates
entraîne une stabilisation de la structure hélicoïdale due à une
diminution des répulsions électrostatiques entre les groupements
phosphates. C'est ce que l'on observe avec les ions divalents comme
2
Mg + qui se fixent essentiellement au niveau des phosphates (Shin
2
2
et al., 1972 ; I97j). Par contre, les ions eu2+ , Zn + et Co +
peuvent former des complexes de chélation avec les bases, entraî-
nant de ce fait une modification importante des propriétés optiques
des polynucléotides (Eichhorn et al., 1967, 1968 ; Rifkind et al.,
1976). Nous avons utilisé les variations de ces propriétés spectros-
copiques pour cara.ctériser la fixation des ions métalliques sur le
poly(A), le poly(C) et l'ADN de thymus de veau.
II - ETUDE EN ABSORPTION UV
1) ~oly(Al
C,LI. M E
.~--~
\\
_\\
s
,
....'!!,
2
,
vç"',
La fixation des ions Mg + sur le Pol~(~~m~me que sur le
poly(C) à pH neutre provoque une faible variation de leur spec-
tre d'absorption. Cette fixation se produit à très faible force
ionique, elle entraîne une légère hypochromicité au maximum d'ab-
sorption de ces polynucléotides. Shin et al. (1972) ont inter-
prété l'hypochromicité comme correspondant à une stabilisation de
la structure hélicoïdale, par suite d'une réduction des interac-
tions répulsives entre les phosphates.

- 'II -
3
+ 0,05
poly(A) lO-"M, Na Cl 10-
M
o
R.
2
E - 0,05
c
N
lJ"'l
N
Ô
Cl
<1
- 0, 1
_
0
0 ,
0
0
0_
_
t2...
_
-
-
-
-
-
0
o
Variation de l'absorbance différentielle à 2)2 nm du
2
2
poly(A), IO-4M, en présence de Cu + (CUC1 ) et de Zn +
2
(znC1 ) dans NaCI 10-3H, à pH 7 et à 25°C.
2
11 (DO) .---~--------------­
_?5
. \\
1
.
i
\\
Spectres d'absorp-
"
i
\\
+
tion différentielle
0,06
;
"'
.1
"'.
du poly(A) 9,56
;
'.
.
\\
10-5
...
M, en présence
,
1

2
i
'.
de Cu + (Cu(Cl0 )2)
+ 0.04
\\
·
\\
,
.
4
·
\\
,
.
dans NaCl0
0,2 M,
,
\\
4
,
'.
·1
2
\\•
à pH ~7 et à 25°C.
"
\\ .
,. ........
'.
\\ \\
.
/ , ' .
\\
i ..'
.......
.
Les chiffres indi-
+ 0,02
\\ \\
. 1
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.......
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-
- '"
[eu2+]
o
R
- [P04- ]
pol y( A) ~56 1Q_5M
NaCL04 0,2 M
R
0,2
- ..--
+ CU(CL04h
R = 0,6
..........
R = l
210
250
300
.« nm)

-12-
2
Les ions Zn 2+ et Cu + de par leur fixation sur le poly(A),
entraîne par contre un déplacement du spectre d'absorption vers les
grandes longueurs d'onde. Si nous appelons
2
R = [M +J
[pO4]
deux types de modification du spectre d'absorption peuvent être
mis en évidence en fonction du rapport R.
a) Faible force ioniaue
A trés faible force ionioue (IO-JM, NaCl ou NaCI0 ) et
4
aux faibles valeurs du rapport R, les spectres différentiels se
caractérisent notamment par un hypochromisme important dont le
maximun se situe autour de 252 nm. Cet effet est comparable à
celui observ8 sur le même polynucléotide en présence des ions oog2+
2
La fixAtion des ions zn 2+ comme des ions Cu + , à faible force
ionique, stabilise la forme hélicoïdale du poly(A). Cette fixation
se situe essentiellement au niveau des phosphates. Sur la figure
III nous avons représenté la variation de l'absorption différentiel-
le à 252 nm en fonction du rapport R •
La comparaison des deux courbes met en évidence, une différence
2
2
entre l'affinité de Zn + et de Cu + pour le poly(A). Pour R(C,25,
2
la fixation de Zn~+ et de Cu + produit les mêmes effets spectros-
copiques. Au-delà de ce rapport, nous atteignons un plateau pour
les ions Zn~+ et ce jusqu'à R ~ 2. La courbe ~(DO) en fonction de
H réaugmente au-delà de cette valeur. Par contre, avec les ions
2
cu +, il apparaît un hyperchromisme dans la bande d'absorption du
poly(A) au-delà du rapport R )
0,25. Ces deux effets antagonistes
sur l'absorption du poly(A) mettent en évidence au moins deux
types de fixation :
• une fixation sur les phosphates qui stabilise la
forme hélicoïdale et se ma.nifeste par un hypochromisme ; cette
2
fixation est do:ninante dans le cas des ions Zn + même aux fortes
valeurs du rapport R (R ~ 2) •
• la fixation sur les bases
déstabilise l'hélice du

-13-
l::i (DO)
Li{DO}
a
(2E30nm)
,..,
,
\\
\\
0,2
\\
,
b
\\
\\
/
,
\\
/
\\
\\
l '
0,1
\\
,
\\
\\
" \\
"
\\
\\
\\
"
\\
\\
'
\\
,
,,'
\\.
\\
0,5
1
R
,,~
'.
\\
'_-.-"'-
....
\\
0,12
... \\
'. \\
'.
\\
". \\
d
". \\
'. \\
.'
...-............
.... \\
"
~...
-..,
':.
\\
".
..-'
'"
~ ' .....
"
.,-'
., .•.
'",
, .........._... -""....
, ...
......_--
.....................:.::::
"-
J
250
300
350
A( nm)
Figure 11 :
3
Spectres d'absorption différentielle du poly(C) 1,56
10-~1,
2
3
en présence de Cu + (CU(Cl0 )2) dans NaCI0
10- M, pH 7: à 25°C.
4
4
(a)
R= l
(b)
R = 0,6
(c)
R = 0,4
(d)
R = 0,2
En encart, variation de l'absorbance différentielle à
280 nm en fonction de R.
6 (DO) .--
-
--,
pol~C)t56 10-'\\"
5
+ Zn++
• 0,1
o
- 0,1
250
300
~(nm)
Fis:ure 11 :
4
Spectres d f absorption différentielle du poly( C). 1,56 10-4~"
en présence de Zn2+ (Zn(ClO ) ) dans NaCI0
10-3 M à pH~7 et à
4 2
4
250C. Les chiffres indin_uent la valeur du rapport n

-14-
L
poly( A) et entraîne une aug-:'",e!ltatio:, de l' absorbanc-". Les ions Gu +
: ; .l
possédent une plus grande affinité pour les bases
rI
_ .
oue les ions .:.n

b) Haute force ionique (Na+ ~ 0,1 ~)
2
~
La fixation des ions Zn + comme les ions Cu'+ sur les
phosphates est défavoris8e par la cOr:1pét i tior 'Nec les ions Na+ •
Dans ces conditions, la stabilisation de la forme hélicoïdale du
poly(A) est trés faible. Sur la fi~~re 11 , nous avons représentA
2
les spectres d'absorption différentielle de la f '
t '
d
eu2+
l.xa l.on
e
sur le poly(A) dans 0,2 M NaCl0 • Ces spectres sont composés
4
essentiellement de deux bandes: l'une positive entre 2b2,5 et
300 nm, l'autre négative, est centrée autour de 253 nm. La bande
négative augmente jusau'à R = 2 puis diminue par suite de la grande
variation de l'absorbance de la ba~de positive. L'hyperchromisme
2
qui apparaît au-delà de R >2 pour les ions cu +, R > 10 pour les
2
ions Zn + (0,2 M, NaCI0 ) peut ~~re attribuée à la fixation sur
4
les bases qui entraîne leur d2sempilement total.
Sur les figures II) et 11 , nous avons reurésenté les
4
spectres d'absorption différentielle obtenus pour la fixation de
2
2
Cu + et de Zn + sur le poly(C) à faible force ionicue.
La f ·
t'
' Z ·
l.xa l.on Ge
n 2+
t ' "
.
en ralne une nypoch
. ' t ' -
roml.Cl. e a '8o
2
nm
aux faibles valeurs du rapf10rt R. Il se:nble donc que dans ces
conditions de force ionicue, 18 fixation sur les phosphates soit
prépondérante.
2
Par contre, dans le cas des ion0 Cu + qui poss~dent
une plus grande affinité pour la cytosine, la fixation sur la
base intervient m~me aux trés faibles valeurs du rapport R. ~ur
la figure II
en encart, nous avons représenté la va.riation de la
j
densité optioue différentielle ?i ',~Cnm. ~lle atteint un plateau
pour R = 0,5. Au-delà de R = 0,5, lq densité optique continue de
croître lér;èr,",n8nt, cett'" absorption résiduelle pOuvélnt être
attribuée à l ' ap;'1ari tion d'une di· fusion de la l urclière par les

- 15 -
b. (DO)
ADN
1,5 10-4M NoCL04 10-3 M
+ Zn++
+ 0,06
+ O,Ol,.
~
15
+ 0:02
0
_0,02
A
ADN
DO~2
No<l..O~ 0,1 M
+0,03
+ Cu++
+0,02
+0,01
0
-q01
-0,02
13
250
300
A(nm)
2+
( A) Spectres différentiels du complexe ADN-Zn
dans
- )
-L'
NaC10
10
M, pH
6,5 et à 25°G
ADN = 1,5 10
tM. Les chiffres
4
indiquent la valeur du ra.pport R.
(B) Spectres d'absorption differentielle du complexe
ADN-Cu 2+ d'aprés Schreiber (1972). Les chiffres indioueht la
valeur du rapport R.

- 16 -
agréf,ats. Du point de vue plect~ost3_ticue, la necltràlisation des
charges correspond à H = 0,5 ; c'est ce 0ue nous observons expéri-
2 + "
.
,
mentaler::ent dans le cas des ions Cu
dont l' aft lnl te pour la
cytosine est beaucoup plus forte oue pour l'adenine.
Les r~sultats d'absorption mettent en (vidence Que la
2+
2+
(
)
(
fixation de Zn
et de Cu
sur le poly A
et le poly C), fait
intervenir au moins deux types de complexes :
• un complexe électrost~tioue entre les phosphates et
ces ions divalents, vraisemblable:r,ent dominant à faible force
ioniQue et aux faibles valeurs du rêpport R. Ce complexe stabilise
la forme hélicoidale des polynucléotides •
• un complexe faisant intervenir les bases : il est
essentiellement dominant à haute force ioniaue (Ropars, 19b5)
il
déstabilise la structure hélicoid,::le du poly( A) et du poly( C).
j) ~~~-~~_!~~~~~-~~-~~~~
La figure 11
représente les spectres différentiels
5
2
obtenus pour l'ADN de thymus de veau en présence de zn + dans
j
IO-
M NaCI0
(figure 1I
). La figure 1I
représente les spectres
4
5A
5B
2
différentiels obtenus dans 0,1 M NaCI0
pour la fixation de Cu +
4
sur l'ADN, d'aprés Schreiber (19:2). Ces spectres sont Qualita-
tiv8ment comparables et présentent un maximum autour de 290 nm et
un minimum vers 250 nm. Zimmer (1974) a interprété ces spectres
comme étant caractéristiques de la cytosine protonée. En effet, la
densité opti~ue différentielle à 29J nm tend vers un plateau en
fonction du rapnort R ; ce plateau, différent d'un ADN à l'autre,
au~nente avec le pourcentage en bases (G + C) de l'ADN considéré.
2
2
Il semble donc gue les ions Zn + comme les ions Cu + aient une
plus grande affinité pour la paire GC.
II - DICHH.OIS;,:3; CIRCULHRE
1) E~!;[i~l
A la température ambiante et à pH neutre, le poly(A)

- 17 -
C
++
poly(A) +
U
"'1·
6"
~
"'"'1"''''
, , __ v . . TI
l .
"
Spectres de dichroïsme cir-
+ 20
culaire du poly(A), en pré-
2+
sence de
de Cu

poly(A) == 1,96 10-4M, NaCl
+10
0,1 1,1, pH ~ 7 et à. 25°C.
( a)
R == 0
(b)
R = 0,58
o
( c)
R
1,04
(d)
R = 1,50
(e)
R == 3,24
-10
,:!:
",:
;i
!i
- 20 L-:.J._-L_..J-_J.-.--l_-L_..I-_.J.-.-..J._--'
200
no
240
2ôO
2110
300
"( nm)
ôl:
l<'if,Ure l 1 :
6é.
7
(263,5 nm)
Variation de ltinte~-
............,
o,n
....
Q
sité dichroïque du
......
,.•....\\,
poly(A) à 263,5 nm en
.••.,
0,6
présence d'ions métal-
o
-",..•.
"'\\.,
liques à différentes
",<...•.
0,4
valeurs de la force
..,.....•.•~
ionique.
...
poly( A) _.
_t:.
")C ••••••••••• x
.
5
10 ..lM.
0,2
d
2+
(a) + Cu
, NaClO C, 5 vi
2+
4
(b)
IO-JIIl
L _ _=:::=t::::=O
- . l . - -
- L
- - l..
- - '
+ Zn
, NaCIO ,;....
2+
2
4
6
Il
R
( c) + Cu
, NaCIü 4 0,2 M
(d)
2+
+ Cu
, NaClO4 TO-3
-
r''1

- 18 -
adopte une conformation hélicoidale à un seul brin. Le spectre
(Le dichroïsme circulaire de cette conform<Jtion présente dans la
région 230-320 nm deux bandes dichroïques d' intensi tés sensible:nent
pgales et de signes opposés: une bande positive centrée à 263,5 nm
et une bande négative dont le maxiM~~ se situe à 247,5 nm (Van
Holde, iüchelson et Brahms, 1965).
2+
2+
Les ions Zn
et Cu
provoquent un d 6 placement du
spectre vers les grandes longueurs d'onde en mê~e temps que l'on
observe une diminution de l'intensité dichroïque. Aux fortes valeur3
du rapport R, ea bande positive se déplace vers 275 nm alors que
la bande négdtive se situe autour de 251 nm. La figure 11
illustre
6
2+
les spectres dichroïques du poly(A) en présence de Cu
dans
0,1 fil NaCl.
L'effet de la force ioni0ue sur la variation relative de
l'intensité dichroïque à 263,5 ~~ est illustré par la figure 11
:
7
2
A faible force ionique, la fixation des ions Zn + entraî-
ne une légère au@nentation du dichroïsme du poly(A) aux faibles
valeurs de R. (R <0,5). Cet effet sur le dichroïsme est à rappro-
cher de l'hypochromisme observée en absorption différentielle dans
les mêmes conditions. Il confirme une stabilisation de la confor-
mation hélicoïdale; le complexe cui se forme dans ces conditions
est essentiellement de nature électrostatique et correspond à la
fixation du cation métallique sur les phosphates.
Dans les mêmes conditions de force ionique (IO-3M, NaCl)
on observe une légére aU@nentation de l'intensité dichroïque du
2
poly(A) en pré2ence de faibles concentrations en Cu +. Rifkind et
al. (IS76), ont montré que l'augmentation de la force rotationnell~
du poly(A) est effective même au rapoort
dans l'eau (.b'J.L':'Hre il).

19 -
r'
- -
. - --- ,- ----,---
- T
---_~
-l/" POl" i~;
..-----.--------$1
~
,/~: 0
0
1
b -2i
:
~
1
0
~
y/
-3r
~Nael
Effet de la force
g
-4
i'
ionique sur la.
r
-5-.
"
fi:c~.t.i()!l des ions
l::=~=-4 ~__. ~ __~ ~
2+
( )
Cu
sur
le poly A
r;~,~~~~- ",~-=~-~-:.~~~=~=--~l
et le poly(C).
1, -,
/
j
D'aprés Rifkind
et al., (1976).
L n ,
.
g'i:.
/0
i
-3
, /
,
1
/ 0 1
-4k~~o/
~
~~
o
0 2
0.4
0 6
0 8
1 0
COPPER/RESIDUE
Fi~. 2. The ~ffecl of jonic slrength on the C,,(II)-induced changes in mean residue rnl<tlion
rU] for ,jl1::le-str'lOd~d 1.5 x 10-' M polY(Al and po\\y(C) at pH 7.0 and 2.')OC. Cu2. addffi
os euelJ •
26
l,ligure 110:
'"
24
pH 7.5
Spectre d.e dichroîs-
me ciroulaire et
~22
\\
...,....
\\
7
d.'absorption du
....
" \\
'-J20
' , \\
poly(C) à pH aci-
\\.\\
18
, \\
,fJ \\
,
\\ \\.
de et neutre. A
\\
\\ ' ... pH 7.S
"
\\
....
1
\\
pH 4,0 le solva:lt
\\
16
\\
... \\.
, "
\\
\\
...
/
1
\\
est 0,1 M NaCl,
I~ -
\\
...... _ .. /
1
\\
0,05 îl\\ acétate ;
\\
1
12
:\\
1
pH-4.0 \\
, /
A pH 1,5, le s01-
10
'\\
/
vant est 0,1 M KF,
'-'"
3
8
0,01 M Tris. Les
6
2
sgectres dichroï-
aues sont enreeis-
trés à QOC, ceux
2
d'absorption à 25°C.
oL--_L---:...---I-----~~_...=:L'>oIO
D'aprés ~aurizot
-2
(191 0 ) •
-6
-6
210
220
230
2'"'0
250
260
270
280
290
300

- 20 -
La fiiation au niv~au des phosphates a un effet contraire
à une élévation de la température, sur la structure du poly(A).
A haute force ioniaue (~igure 11 ), la fixation des ions
7
métallioues sur les phosphates étant désavc.!1t2,c-ée par ra.pport à la
chélation sur les bases,orr'. ~'observe plus une augmentation de l'inten-
sité dichroïque du poly(A) aux faibles valeurs de H, mais au con-
traire une diminution.
Dans tous les cas, les variations relatives de l'intensité
du dichroïsme circulaire à 263,5 nm et à 247,5 nm en fonction du
ra.pport R sont toutes coopératives. Cette coopérativité n'apparaît
oue lors de la formation du deuxième type de complexe, celui impli-
quant les bases. La fixation purement électrostatique diminue le
potentiel électrostatique le long :~e la. chaîne polyanionique et l'on
doit s'a+,tendre à ce que cette fixation soit anticoopérative. Par
contre la fixation sur les bases peut produire un désempilement de
plusieurs bases et la coopérativité observé~pourrait être liée à ce
phénoméne (voir discussion).
Comme le poly( A), le poly( C) peut ~\\\\
t.
lof
d
deux confor:rations
",' ~~\\\\"'n::.-,=[ l-l4~,
à la température ambiante, en fonction d~~pH
a'~~gure II,
nous avons regroupé les spectres d' absor~~'on et ~e. ~9\\roïsme9
~N\\~
"
C'
1
circulaire de ces deux ccnformations (d'âp ~urizl ti~I970). Les
J
\\
~(J)i
différences a.uali tatives et quantitatives e tre ce
c.t,5}C"f. conforma-
~<,"'/
tions sont bien nettes. Nous avons travaillé à· p~e~tre sur la
conformation hélicoïdale simple brin qui présente essentiellement
dans la région 230-320 nm une seule bande positive de forte inten-
sité, centrée sur 276 nm.
2
En présence de Zn + et de eu2+ ,
les spectres de di-
chroïsme circulaire se déplacent vers le rouge, l'intensité dichroï-
que à 276 nm diminue fortement. La variation relative d.e l'intensitR
dichroïque à 276 nm en fonction du rapport R est comparable à celle
observée
avec le poly1A).

-
2I -
t::ffet de la fixatio.:1
2+
?-l.
è..2S ions Cu
et Zn - .
sur l'intensité
dichroïque du poly(C)
è. 276 nm •
•.
0,2
o
2
4
6
R
M
a
+ 2
,-~
,
"
,
\\
,
\\
"
b......... _"
: /
"',
.' i e
,\\
,
" c
-,
+ 1
• 1
\\
Spectres de dichrois;('è
· .

, .1
, 1
circulaire de l'ADN de
,.
'1
,
th~nus de veau, en présence
o U-iJl..F..4-----4-f-;----~~
de cu2+, dans NaC10
IO-Jt<l, .
4
pH 6,5 et à. 25°C
ADN == IO- 4l.i.
(a)
R
-1
(b)
°
R
,
== 0,2
1
,
(c)
R
0,4
1
( d)
R ~
_2
l
( e)
R
4
200
250
300
,((nm)

- 22 -
L'augmentation de l'intensité dichroïque aux faibles
2
concentrations en zn + et à faible force ioninue indique une
stabilisation de la conformation hélicoïdale. Cette stabilisation
est plus imnortante pour le poly(C) oue pour le poly(A). Aux fortes
2+
C 2+
- .. b' l'
.... l
f
h '1 .
valeurs de R, les ions Zn
comrr.e
'u
des.lia 1 lsen~
8.
orme
e.l-
coïdale du poly(C).
Sur la figure 1110' est représentée la variation de l'in-
tensité dichroïque à 276 nm, en fonction du rapport R. Lors de la
2
fixation des ions Cu +, on n'observe pas une augmentation du
dichroïs-
me aux faibles valeurs de H. La courbe
(276 nm)
tl E 0
en fonction de R décroît rapiderr;ent. Ceci peut s'expliouer par l'a+'·
f ·
.
lnl t 'e p l us grandes d es .lons Cu 2+ pour l a cyt '
OSlne que pour l'
"
aue·-
nine. Rifkind et al. (1976) ont observé le même phénoméne en disper-
2
sion optioue rotatoire : selon eux, le fait oue les ions Cu +
n'augmentent pas la force rotationnelle du poly( C) mê!:le à trés fai-
ble force ioniQue (Pjgure 11 ) pourrait être attribué à une augmen-
8
tation de la rigidité du squelette phosphodiester, de telle sorte
la neutralisation des phosphates ne renforce pas les interactions
entre les bases cytidilioues. "Jous pensons oue cette hypothése ne
2
neut pas exnlinuer les résultats obtenus avec les ions zn +, puisque
ces derniers sont capables de stabiliser la structure hélicoïdale
du poly(C). Il nous paraît plus vraisemblable oue l'affinité plus
2
grande des ions Cu + pour la cytosine masque l'effet de stabilisation
dU à la fixation de ces mimes ions sur les phosphates. ~ême l faible
force ionioue, le complexe de chélation est nrépondérant sur le
complexe électrostatioue.
Les spectres de dichroïsme circulaire de l'AJN de thymus
2
ele veRU en présence des ions Cu + à faible force ionioue (IO-.)M,
i'JaCIO 4) ont été regroupés sur la fi€,"Ure
l I n . A faible force ionioue,
J
1
1

- 23 -
6E
llE o
[AD NJ :: 1,5 1O~4M
(275nm)
NoCL04
O,B
1M
O,2M
0,6
0,4
0,2
o
05
1
15
2
R
W-l C"'I!1re' 1.l~·


- h
12 •
Variation de-l'intensité dichroïque de l'ADN de thJnu~
2
de veau en présence des ions Cu + et en fonction de
la force ionique.
ADN = 1,5 IO-~~, pH 6,5 et à 25°C.
,"

- 24 -
la variation des. spectres dichroïques montre Qu'il existe au moins
2
2
deux étapes dans la fixation des ions Zn + et Cu + sur l'ADN:
2
- Pour R <I,(R =
Cu +
/P0 -), la bande négative centrée
4
autour de 247 nm varie trés peu, tandis que la bande positive se
déplace vers les grandes longueurs d'onde, en même temps que son
intensité diminue.
- Au-delà de R >1,5, les spectres dichroïques subissent
des modifications importantes : la bande négative qui jusque là ne
variait pas décroît rapidement tout en restant centrée autour de 247
nm ; une légére augmentation affecte la bande positive en même temps
qu'elle se déplace à nouveau vers les courtes longueurs d'onde. Pour
R >4 le spectre dichroïque se rapproche de celui de l'ADN dénatu:
(Liebe et al., 1972). Richard H. et al., 1971, 1973), Eichhorn et
al. (1968) ont montré que la température de dénaturation de l'ADN
était fortement abaissée en présence des ions eu2+, au-delà du
3
rapport R = 3 dans 10- M NaCl.
2
La fixation des ions Zn + entraîne Qualitativement les
2
mêmes modifications spectrales que celle des ions Cu + ; la dif-
férence réside essentiellement dans le fait qu'il faut beaucoup plus
2
2
de Zn + que de Cu + pour observer les mêmes effets.
La variation relative de l'intensité dichroïaue à 275 nm
confirme l'interprétation que nous avons donnée ci-dessus, à savoir
.
d
.
C 2+
ou'il existe plusieurs
étapes dont la fixation
es 10ns
u
sur
l'ADN. Les courbes sont regroupées sur la figure 1112. Pour R <0,2,
la variation de l'intensité dichroï~ue est quasiment linéaire à 275
nm, tandis qu'elle est nulle à 247~~. L'amplitude des deux bandes
décroît moins vite jusqu'à R ~ 0,6 (dans IO-~ NaCI0 ) puis la ban-
4
de positive réaugmente faiblement. Les deux étapes sont nettement
caractérisées lorsque l'on compare les effets observés à différentes
forces ioni~ues. Ainsi dans 0,1 M NaCI0 , seule l'étape oui corres-
4
pond à une décroissance lente du dichroïsme est observée (pour les
mêmes valeurs de rapport R).

- 25 -
Nous retrouvons donC pour l'ADN deux types de fixation:
- une fixation électrostati~ue au niveau des phosphates,
sensible à la force ioninue, et stabilisant la double hélice de
l'ADN. Cette stabili~ation se manifeste par une augmentation de la
température de dénaturation de l'ADN (Liebe
et al., 1968).
un complexe de chélation avec les bases entraînant une
dénaturation de l'ADN aux fortes concentrations en ions métalliques.
IV -
DISCUSSION
1) ~~~~~l~~!~~~~_~~~~~~~l~_~~~~
Les résultats des études spectroscopiques (absorption dif-
férentielle et dichroïsme circulaire) mettent clairement en évidence
2+
2+
deux types de complexes entre les ions Zn
et Cu
d'une part, le
poly(A) et le poly(C) d'autre part.
2 J
a) Aux faibles valeurs du rapport
R =
[M+
, les cations
[PO4-J
divalents
se fixent d'abord et préférentiellement sur les phosphates.
Cette fixation diminue les répulsions électrostatiques entre les
groupements phosphates et entraîne une stabilisation de la structure
hélicoïdale du polynucléotide. Cet effet est surtout visible à
faible force ioniaue. Il est le seul observable avec les ions com~e
2+
...g
qui n'interagissent qu'avec les phosphates.
2
2
b) Aux valeurs plus élevées du rapport R, les ions zn + et Cu + se
fixent sur les bases des polynucléotides en simple brin. Cette
fixation entraîne un hyperchromisme dans la bande d'absorption et
.
une diminution importante du dichroïsme circulaire des polynucléo-
tides en même temps que les spectres d'absorrtion et de dichroïsme
se déplacent vers le rouge. La formation de ce t;'lpe de complexe est
sensible à la force ionique: ceci peut s'expliquer si l'on fait
intervenir la chélation simultanée d'une base et d'un phosphate.
Gette hypothpse paraît vraisemblable dans la mesure où la fixation
2
2
des ions Cu + et de Zn + sur les nucléosides (ad~nosine et cytidine)

-
26 -
est de deux à trois ordres de grandeurs plus faible que la fixation
sur les nucléotides ou polynucléotides correspondants (I<'rey et al.,
Ij72 ;
Nathan Berger et al., 1971).
Les variations du dichroïsme circulaire en fonction du
2+
2+
rapport R montrent que la fixation des ions Zn
et Cu
sur les
polynucléotides est un phénoméne coopératif qui peut avoir au moins
deux origines :
2
a) la formation d'un chélate base _r'1 +- phosphate désta-
bilise plusieurs bases et favorise une fixation coopérative des ions
sur les bases désempilées.
b) des chélates peuvent se former par l'intermédiaire de
llion métallique entre une base et un phosphate non adjacents, soit
sur la même chaîne, soit sur deux chaînes distinctes du polynucléo-
tide : il en résulte la formation d'une boucle oft les bases sont
désempilées, ce qui conduit à une fixation coopérative. Cette
hypothése a été proposée par Rifkind et al. (1976) pour expliquer
que les variations des propriétés spectroscopiques des polynucléo-
2
tides en fonction de l'activité des ions Cu + soient dépendantes de
de la concentration en polyméres (shéma lIA).
2
La fixation des ions Zn + sur le poly(C) est comparable à
2
celle sur le poly(A), sauf aux faibles concentrations en Zn + où la
stabilisation du poly(C) est beaucoup plus importante. ?ar contre,
2
les ions Cu + possédent une plus grande affinité pour le poly(C) que
pour le poly(A);
ceci explique que même dans l'eau, et au..'C faibles
2
valeurs du rapportR, les ions Cu + soient "incapables" de stabiliser
la forme hélicoïdale du poly(C).
2) ADN
Comme tout cation, les
2+
,2+
ions Cu
et Zn
peuvent jouer
le rôle d'ion compensateur et se lier électrostatiquerr.ent aux
pho~phat~.Ce type de complexe est sensible 2. IR force ionique, il
devient négligeable dans 0,1 M NaCIC~ (Ropars, 1966).
"T

?7
~C" + LCu
1
/
~
c
-
......
+
Pontages
P ontoges
1nter- chaînas
Intra- chaines
~chéma lIA
Le deuxiéme type de complexe fait intervenir une chéla-
tion sur les bases, il proveQue une déstabilisation de la double
hélice de l'ADN. Les sites potentiels de fixation sont: une
2
2
2
chélation base:-r-l + -base ou base-H + -phosphate. Les ions Cu +peu-
vent e!l effet former des complexes "sand"'lich" entre deux e;uanines
superposées (Daune et al., 1973). Le spectre différentiel de l'ADA
l
,
.
C 2+ - h
t
f
. .
d -
comp eye aux lons
u
a
au e
oree lOnlQUe correspon
a une proto-
nation de la c~·to3ine r?S1ll tan;t de la forr:lation de ce type de comple-
xe (Zimmer, 1974).
2
Les complexes base-M + -phosphate se forment essentielle-
ment entre la guanine (N ) et le phosphate voisin. Ils provoquent
7
une grande déstabilisation de la double hFlice en abaissent la
température de dénaturation de 11 ADN (Vemter et Zimmer, 1966). Aux
2+
fortes ccncentr?.tions en
Cu
,on observe une fusion de 11 AJ)N avec
la forr'tation de chélates COi~;ne dans le CélS des polynu.cléotides er.
sirrple brin.

CHA PIT R E
III
ETUDE DE LA FIXATION DES CATIONS
2
2
2
Ylg +,
Zn +,
CU +, SUR L~;S PC'LYPEPTIDES

- 28 -
l - INTRODUCTION
L'existence d'interactions entre les chaines latéra-
les de 12 tyrosine et du tryptophane et les bases des polynucléotides
en simple brin a déjà été démontrée. Deux types d'associations non
covalentes ont été décrites : des interactions d'empilement (Montenay-
Garestier et Hélène, 1968, 1971 ; Dimicoli et Hélène, 1971, 1974 ;
Wagner et al., 1972) et aussi l'établissement de liaison hydrogène
(Sellini et al., 1973). Les peptides basiques du type Lys-Tyr-Lys,
Lys-Trp-Lys peuvent interagir directement avec la chaîne polyanioni-
que. De telles interactions pourraient aussi s'établir par l'intermé-
diaire d'ions métallioues, si la lysine est remplacée par un acide
aminé acide en l'occurence l'acide glutamique. Lorsoue le polypeptide
porte uniouement des charges négatives (copolymères Glu, Tyr pa.r exemple),
les répulsions électrostatiques aves les phosphates de l'acide nucléioue
ou du polynucléotide empêchent la formation de complexes d'association.
Les cations métalliques susceptibles de se lier simultan{ment aux deux
macromolécules peuvent permettre la form2ticn de li2isons dans le comple-
xe ternaire polypeptide-cation-polynucléotide.
Les peptides que nous avons utilisés sont tous des copo-
lymères de la tyrosine et de l
'2cide glutamique. Ils ont été synthéti-
sés par Y. Trudelle (1974). Dans l'eau et ~ pH neutre les polypeptides
adoptent une conformation désordonnée, tandis que dans les solvants orga-
niques comme le triméthylphosphate, ils peuvent adopter une conformation
hélicoïdale (Spach et Trudelle, 1974). Dans cette conformation, les chai-
nes latérales de la tyrosine forment une superhélice autour du squelette
peptidique.
En présence de magnésium et en solution aqueuse neutre
les polypeptides ne montrent aucun changement de conformation, les .spec-
tres de dichroïsme circulaire restent semblables à celui d'une chaîne
désordonnée. Par centre, le zinc et le cuivre induisent de par leur fixa-
tion une organisation structurale comme en t?moignent les spectres
dichroïques.
Nous avons utilisé l'absorption, la fluorescence et le
dichroïsme circulaire pour caract"riser la fixation du zinc, du cuivre
et du magnfsium sur ces pol~~eptides.

- 29 -
l1 (DO) 1"--------------....,
(GLU-TYR-GLU) n
++
+ Zn
+ 0,03
3pectres différentiels de
(GlU-'[yr-Glu)nIO-4M en
2
urésence de Zn + dans NaCIO
.
-
4
+ 0.02
I~ -3M, pH ~ 7 et à 250C.
Les chiffres indiouent la
+ 0.01
valeur du rapport :
o
- 0.01
210
230
250
270
290
ÂCI"m)
A(OO)
r---------------~---.;..,..-___;
.F'igure Ir1 2
++
+
Cu
8pectres d'absorption
Q4
différentielle de
(Glu-Tyr-Glu)
IO-~l en
n 2
présence de Cu + dans
0,3
NaCI0
0,2 M et à 25°C.
4
Les chiffres indiquent
0.2
la valeur du rapport
0,1
o
220
240
260
2110
300
320
A(hm)

- 30'-
II - AB::>ORPTICN
2
L'addition de Zn + à une solution de polypeptide provo-
que une augmentation de l'absorcance et un déplacement du maxim~~ d'ab-
sorption de 275 nm à 277 ~~. Sur la figure III,
nous avons représenté
les spectres d'absorption différentielle du polypeptide (Glu-Tyr-Glu) n
2
en présence de Zn + à faible force ionique (lO-J M NaCI0
) L'apparition
4
d'un spectre différentiel dans la région aromatique montre que la fixa-
2
tion des ions Zn + sur C8 polypeptide modifie l'environnement de la chai-
ne latérale de la tyrosine. Pour des rapports R < ô, il apparai t deux
points isobestiques à 275 nm et à 249 nm ; au-delà de ce rapport, les
solutions deviennent troubles et diffusent beaucoup de lumière.
L
.
C 2+
t
d ·

d
l f
b
es 10ns
u
provoouen
une gran e var1a 10n
e
a -
sorption de tous les polypeptides aue.si bien dans la région aromatioue
où le maximum d'absorption à 275 nm disperaît, oue dans la région pepti-
dique. Les spectres différentiels obtenus sont composés d'une forte ban-
de positive centrée autour de 245 nrn avec un épaulement à 286 nm. L'ab-
sorbance différentielle à 245 llffi varie linéair~ment avec la concentra-
tion en cuivre, jusqu'à la neutralisatic'n des charges. Cette bande cor-.
respond à une absorption du cuivre complexé (Figure 111
). Au-delà ùu
2
rapport
[Cu2+J
=
0,5
[GlU]
qui correspond à la neutralisation des groupements carboxyliques, les
solutions commencent à diffuser et ce même à très haute force ionique
(1 IiI NaCI0
).
4
III - FLUCRESC~NCE
Nous avons vérifié que le rendement de fluorescence de
la tyrosine dans tous les polypeptides restait constant entre pH 6 et
pH 8. En présence d'ions métallir'ues, nous avons observé trois modifi-
cations de la fluorescence de la tyrosine.

-.H -
..L
10
(305 nm)
1,2
Mg++
1
O,B
0,6
0,4
( GLU-TYR-GLU)n
++
Cu
0,2
R
1
2
3
4
5
Figure III ~ :
Variation relative de l'intensité de fluorescence de (Glu-Tyr-Glu)n
en présence des ions métalli0ues
Tyr = 3,52 10-5M, NaC104
2
3
R = [M
10- f4, p~! 7 et à 20 o G.
+J
[Tyr]
1
t;;"
Figure 111
:
(305 nm)
0,5 M
(GLU-TV R-GLU) n
4
o
Extinction de la
++
O,B
+ Cu
fluorescence de
(G1 u-Tyr-G1u)n par
2+
les ions Cu
en
0,6
f,_nction de la for-
ce ioniqu~
.,
-5
Tyr = J,52 10
M,
0,4
pH~7 et à 20° C.
0,2
o
2
3
4
R

-
32 -
Nous avons regroupé sur la figure II1 , les varia-
j
tions de la fluorescence de la tyrosine dans le polypeptide (Glu-Tyr-
Glu)
en fonction du rapport
n
[j,12+]
R =
pour les trois cations métallioues :
[ryrJ
2+
Mg
,
C 2+
U

2
a) en présence des ions Mg +, la fluorescence de la
2
tyrosine n'est pas modifiée. Les ions Mg + semblent jouer à cet égard,
un rôle d'ions compensateurs au même titre que les ions Na+. Leur fixa-
tion ne modifie pas l'environnement de la tyrosine.
2
b) les ions zn + augmentent le rendement de fluorescence
de la tyrosine de l'ordre de 2U ~ • Cette augmentation de la fluorescence
2
de la tyrosine en présence d'ions zn + avait déjà été mcntrée par Pesce
et al.
(1964) sur des copolymères statistiques (Glu, Tyr)

n
Elle a été interprétée comme due à une diminution d e l'inhibition de la
fluorescence de la tyrosine par le groupement carboxylioue ionisé. Il
semble donc oue cans les polypeptides oue n,-us avons utilisés, le site
2
de fixation des ions Zn + soit le groupement carboxylique d·", l'Acide
glutamique.
c) à très faible force ioniaue, l'inhibition de la fluorescence
2
de la tyrosine par les ions Cu + est totale dès que l'on a neutralisé
les charges négatives des groupements carboxyliques. Nous avons représen-
té sur la fieure 1114 l'influence de la force ionique sur la fixation des
2
ions Cu + sur le polypeptide ( Glu-~~-Glu ) • Les mêmes résultats ont été
n
obtenus avec les autres polypeptides.
2
Les ions Zn + se lient aux résidus glutamioues des poly-
peptides étudiés ici et au@nentent l'intensité de fluorescence des
résidus tyrosine en diminuant l'effet inhibiteur du groupement
2
carboxylioue ionisé. Les ions Cu + se lient certainement d'abord
2
sur
aux groupements COO- commes les ions Zn +, puis'lla lia.ison pepti-
di0ue lorsque la. concentration en cuivre aug,~ente. (Voir les
résultat obtenus en dichroïsme circulaire l)

- .B-
2
Les
ions Cu + se fixent sur les groupements NH
et
2
COO- du tr~rptoph'me et de la tyrosine Libres.
Cette fixation entraîne
une inhibition à" la fluorescence de ces deux acides aminés sans que
le cuivre ne soit directement lié aux cycles aromatiques. Différents
mécanismes peuvent être avancés pour expliquer cette extinction de
2+
la fluorescence. Les ions Cu
sont de bons accepteurs d'électrons et
les cycles aromatiques du tryptophane comme de la tyrosine peuvent
2

transférer un flectron dans l'état exicé vers le cuivre. L'ion Cu +
étant paramagnétique, peut provoquer, soit une désactivation non ra-
diative de l'état singulet excité, soit une augmentation de la proba-
bilité de couplage Spin-orbite
;t donc favoriser une conversion
Singulet-Triplet, puis Triplet état fondamental très efficace. Ces
différents mécanismes peuvent expliquer l'inhibition de fluorescence
2
de la tyrosine dans les polypeptides par les ions Cu + fixés sur les
résidus glutamioues, sans qu'il y ait de liaison directe de ces ions
avec la tyrosine. Il suffit pour celà que la chaîne latérale de la
tyrosine soit suffis~mment proche du cuivre dans l'espace,ce que doit
permettre la structure hdicoïdale adoptée par ces polypeptides en pré-
2
sence des ions Cu + (voir chapitre III 4).
(GLU-TYR -GLU) n
Fi~ 111
:
..
++
5
+ '"'9
Effet de la fixation des ions
2
Mg + sur le dicrhroisme de
+ 1
(Glu-Tyr-Glu)n
dans NaCIO' 4
lO-jl<l, pH ~ 1 et à 25° c.
Tyr = 5
lO-5M•
Les chiffres
_ 1
indinuent la v21eur du rapport
L'intensité dichroioue est ex~
_4
primée par résidu peptidique.
_ 5 l---L._.1----L--L--.L..--..l--.....-o
mo
200
220
240 ;. (nm)

- 34-
IV -
DIGHROlSh~ CIRCULAIRE
Les spectres de dichroïsme circulaire des différents
polypeptides restent qualitativement les mêmes en fonction de la
force ionique à pH 7. Comparés au spectre dichroïque du poly-L-
glutamate à pH neutre, ils en différent essentiellement par la
bande positive centrée autour de 227 nm qui provient de la contri-
bution de la chaîne latérale de la tyrosine. Cette contribution se
manifeste également sur l'intensité de la bande à 198 nm qui diminue
en présence de tyrosine. Ces spectres sont cependant proches du
spectre limite de la forme désordonnée publié par Adler et al.
tI968) pour le poly-L-glutamate, Greenfield et Fasman (1969) pour
la polylysine. En effet, ces deux polypeptides sont considérés
comme des modéles de la forme désordonnpe du sQuelette peptidicue
des protéines. Pour certains auteurs, ce spectre limite correspond
à une forme complètement désordonnée (Greenfield et F'asman, 1969 ;
Zimmerman et al., 1975) tandis que pour d'autres (Tiffany et Krimm,
1968, 1969) il correspondrait à une chaîne étendue du fait de la
répulsion des charges.
Pour la fixation des ions métalliques, les résultats de
dichroïsme circulaire sont en accord avec ceux obtenus en fluores-
cence.
a) la fixation du magnésium n'entraîne aucune modification
importante des spectres dichroïques de tous les polypeptides étudiés.
Ils restent sous la forr'le désordonnée. Nous avons représenté sur la
figure 111
les spectres de dichroï~me circulaire de (G1U-Tyr-GIU)n
5
dans la région peptidique, en présence de mAgnésium. Les mêmes
spectres ont été obtenus pour les autres pclypeptides. Ces résultat~
sont en accord avec ceux obtenus en fluorescence et démontrent que le
rr.agnésium joue un rôle d'ion compensateur, et ne se fixe pas sur
il
des sites spécifi~ues.
"1
b) les ions Zn 2+ et Cu 2+ , par contre entraînent de part
J
leur fixation, une organisation du squelette peptidique et modifient
J
-1
le dichroïsme de la chFtîns lat,'r::!.Je de la tyrosin:",.
1

- j5 -
[eJ
+100
li'ig-ü.re III,... A :
- -
0-'1.
Dichroïsme de la tyrosine
o
dans les diff~rents pol~~ep­
tides, dans NaCl0 4
lO-jM, pH 7,2 et à 25 0 C.
-100
(a)
(Glu-Glu-Tyr-Glu) n
(b)
(Glu-Tyr-Glu) n
(c)
(Glu-Tyr-Tyr-Glu) n
-200
240
260
2BO
300 A(nm)
[eJ
"(,'1" .,.."
""
1'11

.1.'
,"'j
'::.
6:0.
+600
(GLU -TYR-GLU) n
++
+ Cu
Effet de la fixation des
2
ions Cu
+ sur le dich-
+ 300
roïsme de (Glu-Tyr-Glu) n
dans la région aromatinue
[Tyr]
4,9.)
lO-4M,
a
NaCI0
lO-J M et à 25°C.
4
L~ellipticité molaire est
exprim2e par rapport à
-300
la concentration en ty-
rosine. Les chiffres
indinuent la valeur du
r-,!~-,---,~...........--,_-,---,__
- 600
,---,_-...J
240
260
2<30
300 ~(nm)

- j6 -
[eJ
(GLU-TYR-TYR-GLU) n
. Figure III 7A :
+500
++
+ Cu
Spectres dichro!ques dans
la région aromati~ue du
o
complexe (Glu-Tyr-Tyr-
)
2+
Glu n - Cu
dans NaCI0 4
10-3;1., pH
.....
7 et à.
-500
25°C.
[Tyr] = 5,14 10-\\r.
Les chiffres indiquent le
-1000
rapport
-1500
240
260
2BO
300
A(nm)
[sJ
(GLU-GLU- TYR-GLU) n
Figure 1II
:
7B
+ 200
++
+ Cu
Effet de la fixation de
a
2+
Cu
sur le polypeptide
(Glu-Glu-Tyr-Glu) n
-200
4,85
lO--~~ dans llaCI04
lO-3 N,
pH ~ 7 et à. 25°c.
Les chiffres indiquent la
v leur du rapport R.
- 600
_ BOO
-1000
240
260
2~lO
300
A(nml

- J7 -
.
2+
2+
Dans 13. r?gion 2romatJ.~u8, en l'absence de Zn
et Cu
,
le spectre de dichroYsœe circulaire de la tyrosine est essentiel-
lement le même dans les polypeptides étudiés. Il se compose d'une
bande nAgative centrée à 276 nm avec un épaule!r.ent vers 282 nro
(Figure 111
et 111 ).
6
7
E
.
d
Z 2+
t
C 2+
b
+ t·
n presence
e
n
e u , on 0 serve une auernenvé!. lon
importante de l'intensité dichroïque. Dans le cas du polypeptide
(Glu-Tyr-Glu)n le spectre dichroïque se dédouble en deux bandes:
une banele positive à
282 nm et une bande négative à 260 n'n. La
2
fixation
de Cu + modifie clonc l'environnement de la chaîne lé:-r: ".le
de la tyrosine. Les modifications du spectre dichroïque des poly-
peptides dans la région aromatique sont difficilement interprétablcf'l
d'une part parce que lé, bande néga.tive à 276 nm est partiellement
recouvprte par une b~mde positive à 270 nm qui est visible sur les
spectres de la poly(L-tyrosine) et de la tyrosine (Beychok et al.,
1964 ; Hookel' et al., 1970 ; Shechter et al., I97I~ d'autre part
parce que le dichroïsme dans cette région est trés sensible à l'orien-
tation du résidu phénolique de la tyrosine (Chen et Woody, 1971).
2) ~~~~~~_E~E!i~~z~~
2
2
La fixation des ions Zn + et Cu + sur tous les polypeptides
se traduit par un~ modification irnportaYlte des spectres dichroïques.
Les spectres dichroïques (Fi~~res III
et 111 ) se rapprochent de
S
9
celui d'une structure en hélice a •
Nous retrouvons ici encore une différence entre le zinc
et le cuivre, ce dernier étant plus etficace. Les spectres de
dichroïsme circulaire sont tous caractérisés par une forte transi-
tion positive vers 192 nm et une bande négative entre 200 et 2JOnm.
Ils se rapprochent du spp-ctre d.e l 'héliceot ca.ractérisé par une
transition positive à 192 nrn (TT~TT~)et deux transitions néga.-
tives à 210 nm (
TT --)0- TT *
1/) et 224 nm ( n --+TT * ) de la
liaison peptidioue. Compte tenu de la. forte contribution d.e la.
tyrosine dans cette rée:ion, on observe des variations importantes
dans les intensités dichroï~ues (tableau IlIA)

- ~8 -
[8J. 1Q-I,r--------.--r[8:::;O-:.1::0-T~ 0::-1----,
+4
(220 nm)
i'1.· t'M, "''''
11- l

l
<;u.~~
SA.
_0,5
-
1
Dichroïsme de (Glu-Tyr-
+3
_1,5
~lu) 9,86 10-5M en
n
?
présence des ions Cu- T
+2
2
R
dans NaCI0
IO-3M, pH ~ 7
4
et à 25°C. En encart,
la variation de l'ellln~
+1
ticité molaire à 220 nm
en fonction de R.
R
-1
++
+ Cu
1BO
200
220
240
260
A(nm)
2+
La fixation des ions Zn
sur
++
+ Zn
(Glu-l1'yr-Glu)
provoque la.
n
forma.tion d'une structure proche
cie l ' hélice ~ gauche.
5
[l'yrJ
;:: 5 IO- N, NaClü4 IO-3N,
pH~ 7 et à 25°C. Les chiffres
+ 4
indiouent la valeur du rapport R.
+2
L'intensité dichroïque est
o
ra~ené à la concentration en
liaison peptidique
-2
[eJ ;:: 3 300 x t:J. E
-6
1lJO
200
220
21,0
,((nm)

- 3.9 -
[aJ.
4
10-
+3
U
(220 nm)
-0,5
+2
-
1
Spectres dichroïque dans
2
R
la région peptidique de
+1
(G1u-Glu-T,yr-G1u)
-6
n
9,7
10
M en présence

des ions Cu
dans
10-j
NaCIO 4
H, pH ~ 7
et à 25° C.
-1
(GLU-GLU-TYR-GLU)n
++
+
C u
_2
ma
200
220
240
260
,.( (rvn)
(GLU-TYR-TYR-GLlJ) n
++
+ C u
+3
Spectre de dichroïsme circu-
1aire de ( Glu-Tyr-Tyr-G1u)nen
2
présence des ions Cu + dans
NaCl0
10-':>M, pH ~ 7 et à
4
25°C.
[Tyr]
chiffres indiquent la valeur
du ra.pport R.
-1
-2
ma
200
220
240 ),(nm)

- 40 -
~ 192 210 224
[8J deg. x cm 'l'd.cim
(TYR-GLU) n +Cu++
+ 34500
-10000
-11 000
(GLU-TYR-GLU)n+Cu++
+ 42000
-17 000
-1B 000
(GLU-TYR-GLU) n +Zn++
+42300
-21 BOO
-22 300
(GLU~GLU-TYR-GLU)n+Cu++
+ 32 000
-13 000
-12 000
(GLU-TYR-TYR-GLU) n + Cu++
+ 41 000
- 4 000
= a
hélice ct
( a )
+ 60 750
-26 400
- 29 400
Ta"" l e<>u' ïTI
IJ
--
- -
A
(a) DomardA. (1976).
Trudelle et spach (1974) ont montré que ces. différents
polypeptides pouvaient adopter une cor.formé'tion hélicoïdale d3.ns le
triméthYlphosphate. Dans les sC'·lvants oreaniques, le groupement
carboxylioue de l'acide glutamique n'éta.nt pas ionisé, l'absence
de répulsion électrostatique
rend possible la forma~ion d'une
structure ordonnée. L'ionisation de ces groupement dans l'eau et ê,
pH neutre crée des répulsions électrostatiaues et fait que ces
polypeptides adoptent une ccnforrr:2:tion "désordonnée". Lp_ fixation· rj(?,.
.
Z 2+
t
C 2+
.
l'
l
'
d l '
t l
lons
TI
e
u
neu~ra lBe
es c~arge
e ces po yanlons e
eur
permet d'adopter une conformation réguliére.
Les spectres dichroïques obtenus dans la région peptidi-
que montrent ce~end.iëcnt d<>c, différences C1ualitatives voire o.uantit21:i-
ves avec le spectre limite d'une h~lice et. Ceci est dn b. la

- 41 -
du spectre. Les sJ)'ectres dichoïrmes de
(Glu- 'l'yr-TtJr-Glu)n en présence
2
2
des ions Zn + ou Cu + montrent ef~ectivement la contribution
importante de la tyrosine. L'intensité des bandes négatives entre
200 et 220 nm correspor..dant aux transitions de la liaison pepti-
dique devient trés faible et s'annule même vers 224 nm. Dans ces
conditions, l'interprétation du sp 0 ctre dichroïque en terme de con-
forM';tion du squelette pepetidique devient difficile si l'on ne
dispose pas des résultats obtenus par d' a'utres techniques. Les
spectres dichroïques de (Glu-'ryr-CluÀ et de (Glu-Glu-Tyr-G1U)n se
rapprochent be8.ucoup plus de celui ri 'une hélice c::I. et concord,ent
avec les résultats obtenus par 'l'rudelle et Spach (1974).
v - DISCUSSICN
2
2
La fixation des ions Zn + et Cu + sur les polypeptides
(Tyr, G1U)n provoque la formation d'une structure proche de l'hélice~.
Les spectres dichroïque;:; dans la ré[T,ion pepticLioue montrent cepen-
dant une contribution importante de la tyrosine.
Les groupements COO- de l'acide glu~amique constituent
certainement les sites préférentiels de fixation des ions métal-
2
lieues. La fixation des ions Zn + aU61nentent le rendement de
fluorescence de la tyrosine en diminuant l'effet inhibiteur des
groupements carboxyliques ionisés. L'inhibition de fluorescence
2
de la tyrosine par les ions Cu + peut être expliqué'
soit par un
transfert de charge, soit par une augmentation de la probabilité
de couplage Spin-Orbi te favoriaant un'3 C0llVE'rsion Singulet-Triplet,
soit enfin par un mécanœsme de désactivation non radiative de
l'état Singulet. La structure hélicoïdale adoptée par les polypep-
~
tides met sûrement les ions Cu'_+ au voisinage immédiat du noyau
phénolioue et rend possible ces différents mécanisme de désactivation
de la tyrosine.
2
Aux faibles copc\\8ntrR.tions en ions Cu +, il est probable
o,ue seulR les groupes COO- soient liés au cation mp.tallique. En
effet, la formation cl' U'.'l0 héliGe ~ renuiert que les groupe:nents
-:Œ- de la liaison peptidioue soient engaGés dans la fori'lation de --',)
liaisons hyàrop"<)~J'l ·'V.:C l':.: (~~'C;'~;'·-·:",,'nt'·.
G
O. Lu fixution de Cu-

- 42 -
sur 1<'1. liaison peptiditlue s'accompagne s'un ionisa.tion du groupe
-NH- incompatible avec une structure hélicoïdale mainte~ue p?-r les
liaisons hydrogéne. Cette ionisation ne se produit qu'aux fortes
2
concentrations en Cu + ou l'on observe une disparition des sper.~~2.s
dichroïaues et la formation d'agrégats.
Ce] (223 nm) .10 - "
.0.4
(GLU-TYR-GLU)"
0t-t~,,=,---------------------l
-0,2
-0,6
-o.u
- 1.2
- 1.4
_ 1,6
_1,U
- 2
1
2
3
4
R
Figure IIIIO
Variation de l'ellipticité molaire de ( Glu-Tyr-Glu) n
.
2+
2+
à 223 nm en présence des lons Cu
et Zn
dans NaCI0
IO-31/[,
4
pH 7 et à 25°C.
[Tyr]= 5 IO-5M.
1

- 43 -
~ur la figure IIl
nous avons représenté la variation
la
de l' intensi té dichroïque à. 22.,) nm pour la fixation du zinc et du
cuivre s ....lr (Glu-'I'yr-Glu) • Cette fixation est relativ:cment coopé-
n
rative. Il naraît VréÜSel'lbl-3.'ble oue la fixation d'un ion entraîne
la form::,tion d.' un segment d' hélice 0( irnYJlique.nt plus de trois
résidus peptidiques, il en résulte une stabilisation accrue de cette
h~lice du fait de la neutralisation des charges et par suite de
l'établissement de liaisons hydrogéne. Cette stabilisation de l'héli-
ce des polypeptides est à rapprocher de celle observée pour les
polynucléotides à faible concentration en ions métalliques.
Nous n'avons pas pu réaliser une étude quantitative de
cette fixation car d'une part, nous avons travaillé tians un milieu
non tamponné avec une variation faible mais continue du pH, et
d'autre part, les complexes ainsi formés deviennent vite insolubles.
les agrég,lts et les précipités qui se forment peuvent conduire à
une interprétation quantitative erronée.
Les résultats o'btenus dérnontr-ent cependant que les ions
métalliques peuvent contribuer à créer une structure locale bien
définie dans une protéine et de ce fait favoriser des interactions
sD?cifiques soit dans l'acte enzymatique, soit dans la fixation
de lieands et en particulier dans ln reconna.issance des acides
nucléiques.

CHAPITRE
IV
MISE EN EVIDENCE DE LA :F'ORMATIOU DE COMPLEXES TE.WAIRES

44
l - INTRODUCTION
Parmi les facteurs qui interviennent dans' la reconnaissance
spécifique des acides nucléiques par les protéines, la complémentarité
structurale doit ~tre associée à àes interactions spécifiques entre les
bases et les cha!nes latérales des acides aminés. La présence d'ions
mé~alliquea dans la quasi-totalité de ces systèmes permet de penser que
leur raIe es~ non moins important : Ces ions peuvent avoir un raIe struc-
tural aussi bien pour les protéines que pour les acides nucléiques .. Dans
ces conditions, ils peuvent promouvoir des conformations locales complé-
mentaires qui favorisent des interactions directes. Le fait que les ions
Zn 2+ et eu 2+ favorisent le passage vers une conformation hélicoIdale
des polypeptides que nous avons étudiés, témoigne de ce raIe.
Dans les systèmes: enzymatiques qui gouvernent le métabolime
des acides nucléiques, les ions métalliqueffipeuvent jouer un raIe d'in-
termédiaire, permettant la formation de complexes ternaires actifs,
bases-cation-acides aminés, voire participer à l'acte catalytique lui-
même. Cette participation est importante dans d'autres systèmes biolo-
giques, notamment dans les processus d'oxydo-réduction •.
Les techniques que nous avons employées (fluorescenoe, di-
chroïsme circulaire) nous ont permis de mettre en évidence la formation
de complexes ternaires entre les polynucléotides
poly(A), poly (c) e~
les copolypeptides de l'acide glutamicue et. de la tyrosine (Glu , Ty~ )
~
x
Y n
par l'intermédiaire notamment des ions Zn 2+ et Cu 2+.
II - ABSORPTION
Aux erreurs expérimentales près, le spectre d'absorption
d'un mélange polynucléotide-polypeptide, se trouve être la somme des
spectres d'absorption des deux polymères. L'addition d'ions métalliques
(zn 2+ ou eu2+) provoque une variation de l 'absorbance totale, et un
déplacement du spectre vers le rouge.

45
A (DO)
3
+ 015
+01
+005
-005
1. (om)
- 0 1 l-..~......L...--I..--"_,l-.~""",--I.."""'---'
210
230
250
270
290
310
Figure IV
:
I
Spectres d'absorption différentielle des mélanges binaires (Glu-
2
Tyr-Glu)
-Zn 2+ (1', poly (A)-zn +_(2),. et du mélange ternaire
n 2
poly (A)-~~ +-(Glu-œyr-Glu) (3). Dans tous les cas la concen-
n
tration en polymère est la m~me ~
poly(A) = Tyr = 1,01 lO-4pl ; zn2+ = 4 10-\\1" NaCIO 4 10-3)1~ pH:~7
e-t à 25°0.
t\\
Figure IV
:
1
li (DO) . . . - - - , - - - - - - - - -
2
pofy(AI . . . . . . +
0.6
Spectres différentiels du mélange
4
(gh. -~,r-g1")" 10-
1
"'1
1
+ C\\I+·
ternaire poly(A)_Cu2+-( GIUl-Tyr-
Glu) • Les chiffres indiquent la.
n
valeur du rapport
[Cu! 2+J
R =[PO4- ]
0.3
NaCIO4 0,2 Mt
plli~l et à 25°'C.
0.2
Poly(A)
5
= 9,9 10-
M.
0,1
o L-'---'--'--'--..._'--..::::::...&....-::i:::::x:::::=~
220
240
2S0
2!10
300
320
340

- 46 -
Sur la figure IV , nous avons regroupé les spectres d'absorp-
1
2
tion différentielle des systèmes binaires; poly(A)-Zn: +, (Glu-Tyr-
Glu) _zn 2+et le spectre différentiel obtenu avec le mélange ternaire.
n
2
Pour une m~me concentration en polymères et en ions zn +, le spectre
différentiel du mélange ternaire est très différent de 6eux des
complexes binaires d:'une part, d "autre part il ne peut ~tre obtenu
par une combinaison linéaire des spectres binaires •. Ce spectre se
2
rapproche d'avantage des spectres du système binaire pOly(A)-Zn +
pour de plus fortes concentrations en zn2+ (Voir la figure 11
: les
2
m~mes spectres ont été obtenus pour de plus fortes concentrations
2
en ions Zn +) ~ Tout se passe donc comme si la présence du polypep-
tide augmentait l'affinité des ions zn2+ pour le poly(A)_
2
Les spectres différentiels du système ternaire poly(A)-eu +-
(Glu-Tyr-Glu) n sont illustrés par la figure IV2- Il appara!t dans
le mélange' ternaire une bande d'absorption vers 265 nm ; cette
bande qui n'existe pas dans les systèmes' binaires doit probablement
correspondre à l'absorption du cuivre dans le complexe' ternaire.
(Voir figures 11
et 111 )
2
2
III - FLUORESCENCE
Comme nous l'avons déjà mentionné au chapitre III, les ions
eu2+ éteignent la fluorescence de la tyrosine dans tous les poly-
2
peptides, alors que les ions Zn +augmentent l'intensité de l'émis-
sion de fluorescence de l'ordre de 20 %. La figure IV3.- représente
l'effet du poly(A) et de zn2+sur le spectre d'émission de fluores-
cence du poly-(Glu-Tyr-Glu). En présence de poly(A), la diminution
de l'intensité de fluorescence est due à l'effet d'écran du poly-
nucléotide à la longueur d'onde d'excitation (275 nm). La diminu-
tion ultérieure de l'intensité de fluorescence en présence des ions
zn2+d'une part, le fait que l'addition d'E.D.T.A. restaure l'émis-
sion initiale d'autre part, montrent qu'il se forme dans ces condi-
2
tions un complexe ternaire POly(A)-zn +-(Glu-Tyr-G1U)n

47
60
1:
..
c
..ë
H
40
lfigure IV.l :
D'après Hélène C.
(197<'5)
300
320
340
A(nm)
Figure~
5
Fluorescence spectra of (1) 8.2 x 10-
M (Glu-Tyr-Glu)n' (2) solu-
tion (1) + 1. 25 x 10- 4 M poly(A), (3) solution (2) + 3.7 x 10- 4 M ZnC12 and (4)
solution (3) + 1 mM EDTA. SaIne buffer as in figure 2. The decrease in fluo-
r~scenç,e intensity observed upon addition of poly(A) (spectrum 2) is due to the
screening effect of the polynucleotide at the excitation wave1ength (275 nm).
The increase in scattered light observed with solution 3 was also observed when
ZnC1
was added to poly(A) alone .
2
....L (305 nm)
10
\\2
0,0
0,6
q4
0,2
0
5
10
15
R
1t1.'1
lt'igure IV4:
Variaton de la fluorescence de (Glu-Tyr-Glu)
en pré-
t
,
1
n
2
sence de- Zn + (1) comparée à celle obtenue en présence
de poly(A).,
10-5M + Zn2+
(I) [Tyr]
= 5,52
10-51\\1 ...
(2) [Tyr]
= 5,52
poly(A)
.
Z 2+
ajoute les ~ons
n
..
L' additon ,d-e poly( A) à la solution de polypeptide provoque une di-
minutnon de l'intensité de fluorescence de la tyrosine due à l'effet
d'écran (longueur d'onde d'excitation 275 nm).
2 + / .
j
R = Zn
.' ~, NaCIO4 10-
M, pH 7.,
tr
(~) L1~~1-; ?D~Lf\\1:. 3.~1.,;'nJ ~~'''' Q~CI~t& ~-. \\.oIM LM

- 48 -
Sur la figure IV , nous avons représen~é la variation relati-
4
ve de l'intensité de l'émission de fluorescence à 305 ~~ du polypeptide
2
(G1u-Tyr-G1u)
en présence d'ions Zn + et de po1y(A). Lorsque la con-
n
centration du po1y(A) est grande par rapport à celle du polypeptide,
la diminution de l'intensité de fluorescence est faible même aux fortes
t
t .
Z 2+
D
dOt
0
°
1
1
b '
°
concen ra J.ons en 1.ons
n
..
ans ces con 1. 1.ons,
es camp exes
1.na1res
sont favorisés par rapport au complexe ternaire •. Par contre, quand
la concentration en po1y(A) est voisine de celle du polypeptide, il se
forme un complexe ternaire et l'extinction de f1wo~scence de la
tyrosine devient plus importante •.
Dans l'un et l'autre cas, la f1uores-cence de la tyrosine:
augment e d , abord
°
,
d'
1.n 1.quant que 1
°
es 1.ons Zn2+ se fO
t
T
1.xen
sur ~e: po1y-
.
peptide avant que le complexe ternaire ne se forme •. Pendant cette
étape,. l'absorption du mélange varie peu; l'augmentation de l ' absor-
bance et le déplacement du spectre d'absorption vers le rouge ne se
produisant qu'au moment où la fluorescence diminue.
La figure rV
montre le résultat obtenu lorsque partant
5
2
d'une solution de polypeptide, l'on ajoute les ions Zn + jusqu'à
saturer le polymère, puis ensuite du po1y(A). La courbe (r) représente
l'effet d'écran du po1y(A) seul; la courbe (2) , l'effet des ions zn2+,
puis celui dupo1y(A) ajouté ensuite. Le rapport de ces deux courbes
que représente la courbe (3) montre que l'extinction de la fluorescence
du polypeptide atteint un maximum lorsque la cocentration du po1y(A)
est voisine de celle du polypeptide ( exprimée en tyrosine ).
Nous avons obtenu les mêmes résultats avec les polypeptides
(G1u-G1u-Tyr-Glu)
et (G1u-Tyr-Tyr-G1u)
• Dans tous les cas, les
n
n
complexes ternaires ne se forment que lorsque la concentration en
polypeptide exprimée en motif
est voisine de celle du po1y(A).,

49
.J.. 1305 nm)
1,5 r1o
-r-
-,
0,5
R
o'--_........._ _..L-_---'
oJ--
--'oL
---.I
3
6
9
1
2
3
polylAI.10 H
Figure
IV
:
5
Mise en évidence de la formation de complexe ternaire
2
POIY(A)-zn +-(GlU-Tyr-Glu)IIl_ La courbe (IY représente l'effet
d'écran du poly(A) sur la fluorescence de (GIU-Tyr-GIU)n.'
2
Partant d'une solution de polypeptide, on ajoute des ions Zn +
jusqu'à un rapport:
2
[zn +J
R =
[Tyr] = 9
puis l'on ajoute du poly(A) (courbe 2): on constate une diminution
importante de la fluorescence du polypeptide par rapport à l'effet
d'écran~ La courbe (j) qui est le rapport de la courbe (2) sur
l'effet d'écran donne le degré d'extinction de la fluore·scence
de la tyrosine dans le complexe ternaire : soit environ 50~ •

- 50 -
1
ïO(305 nm)
1,5 ....--_ _- - . . , , - - . - - - - - - - - - - - - - ,
0,5
R
o
2
4
6
1
2
3
poly (C ) " 10 +"
Figure IV
: Variation relative de l'intensité de fluorescence de
6
2
-
(Glu-Glu-Tyr-Glu)
en présence de Zn + et du poly(C).
n
La courbe (1) représente l'effet d'écran du poly(C) seul. La courbe
(2) est obtenue- de la façon suivante: on part d'une solution de poly-
2+.
,.
peptide à laquelle on· ajoute les ions Zn
Jusqu a l'obtention d'un
2
palier correspondant à une saturation du polypeptide en Zn + (R = 6 ).
On ajoute ensuite le poly( C) .' La courbe (.~,. qui est le rapport de la
courbe (2) sur l'effet d'écran permet d'estimer le degré d'extinction
de fluorescence de la tyrosine. Cette extinction de fluorescence est
du même ordre de grandeur que l'exaltation produite initialement par
l'additio~
2
des ions Zn + •
Les figures IV
et IV
illustrent l'action du poly(C) et des
6
7
2
ions Zn + sur la fluorescence des polypeptides. Les polypeptides
(Glu-Glu-Tyr-Glu)
et (Glu-Tyr-Tyr-Glu)
ne semblent pas former de
n
n
2
complexes ternaires avec le poly(C) en présence des ions Zn + •
L'extinction de la fluorescence de ces polypeptides parle poly(C) est
du même ordre de grandeur que l'augmentation produite initialement par
2
les ions Zn +. La figure 1V
montre que le rapport des courbes 1/2
6
est peu différent de 1. On peut donc penser que :
- soit la chaîne latérale de la tyrosine n'intera~it pas aV~c

- 5I -
la cytosine dans le complexe ternaire,
soit qu'il ne se forme pas de complexe ternaire, mais
seulement des complexes binaires: le polY(C) entrant en compétition
2
avec le polypeptide pour la fixation des ions Zn +.
Par I;(>ntre, le poly-( Glu-T;rr-Glu) est plus apte à former
des complexes "ternaires avec le polyt C) si l'on s'en réfÈlr(1 à
l 'extinction d·~ fluoresc~nce (Figure IV ) .' La concentration en Com-
7
plexes ternaires est maximlL~ lorsque la concentration en poly(C) est
voisine de celle du polypeptide.
_1 (305nm)
10
1,2
\\
\\
\\
\\
\\
1
\\
3
• 'b- - - -,; - - -cr - - - ~ - - - fi - - _Cl. - - -0- - -
....+
O,B
'"....... 2
"
0,6
0,4
0,2
R
a
2
4
05
1
15
2
poly (C) .. 10+~
V~o.t~
Pigure IV
:
Mkah~~.~ de la fluorescence de (Glu-Tyr-GlU)n dans le
7
2
complexe ternaire Poly(C)-zn +-(Glu-Tyr-Glu) • Les conditions opéra-
n
toires sont celles de la figure IV • L'inhibition de fluorescence de
6
la tyrosine dans le complexe ternaire est de l'ordre de J5 ~.,
Courbe (2)
effet d'écran.
Courbe (J)
rappo!'t de la courbe (1) sur l'effet d'écran •.
[Tyr]
= 5,0 IO-5Di, NaCI0
IO-JM, pH~7, à. 20°C ..
4
L'extinction de la fluorescence de la tyrosine dans les mf-
l
.
l
.
Z 2+
t
.
l
~
anges terna~res montre que
es ~ons
n
peuven
promouvo~r
a ~orma-
tion de complexes ternaires entre les polynucléotides en simple brin
et les polypeptides du type (Gl u, 'l'yI')
• Les, résultats obtenus en
n
f1 uorescence ne permettent pas de préciser la nature des interactions

- 52 -
qui expliqueraient l'inhibition de la. fluorescence de la tyrosine dans
les complexes ternaires. La formation de liaisons hydrogène, l'empile-
ment de la tyrosine avec les bases, le transfert d'énergie de la tyro-
sine vers les bases sont des causes possibles de l'extinction de
fluorescence.
f). E (263,5 nm)
~Eo
poly(A)
1
1
Zn++
+
O,B
0,6
0,4
2
0,2
R
05
1
15
2
4
6
B
10
E:~.10+~
Figure IV
:
Comparaison de la modification du dïchroïsme du poly(A)
8
2
dans les complexes ternaires poly(A)-M +-(Glu-Tyr-Glu)
.
~
n
(Mg2+ et Zn2+).A' une solution de poly(A) 5 10-~M dans
2
2
NaCI0
IO-3};l, on ajoute les ions Mg + (1) et Zn + (2) pour obtenir un
4
2
rapport R = M2+/P04=~ • Laddi~ion des ions Mg + ne modifie pas de façon
2
importante le dichroïsme du poly(A), alors que les ions Zn + provoquent
une diminution de l'intensité dichroïque de 15 ~ • On ajoute ensuite
2
le polypeptide: en présence des ions Zn + , l'intensité dichroïque'
du poly(A) diminue jusqu'à ce que la concentration en polypeptide soit
voisine de celle du poly(~) (2) • Dans ces conditions il se forme
2
un complexe ternaire POly(A)-zn +-polypeptide. A droite, la variation
2
de l'intensité dichroïque du poly(A) en présence de Zn + •
Poly(À) = 5,0 10-5M, NaCI0
10-~~, pH'~7 et à 25°C.
4

- 53. -
IV -
DICEROISl,ΠCIRCULAIRE
2+
, les ions Cu
sont ceux
qui favorisent le plus la formation de complexes ternaires avec les
polypeptides (Glu,Tyr)n- Sur la figure 1V ,
8
nous avons comparé l'action
d
.
Z 2+ -
Il
d
. . . - 2+ - f
. b
f
. .
( 1 - j
es ~ons
n
a ce
e
es ~ons .l!g
a
aJ. le
orce ~onJ.que
0
Iii
2
NaCI0 ) •. L'addition du polypeptide au mélange POly(A)-Zn + entra!ne
4
une diminution importante du dichroïsme du poly(A), alors qu'en pré-
2
sence de Mg +, l'effet est ext!~mement faible. Tout se passe comme
si l'ad.dition du pol:,{peptià.e augmentait l'affinité des ions
2
Zn +pour
le poly(A). Les changements du spectre dichroïque induits par l'ad-
2
dition de polypeptide au mélangepoly(A)-Zn +sont en effet analogues
à ceux observés par l'addition des ions Zn 2+en forte concentration
au pol~A).
Dans les m~mes conditions de force ionique (lO-3M NaClû )
4
2
la fixation des ions Cu +sur le poly(A) est très grande, et entra!ne
une variation rapide de l'intensité dichroïque m~me ~ux trè~ faibles
concentrations en ions eu 2+. Il ne nous a pas été possible de suivre
la formation de complexes ternaires à faible force ionique par le
dichroïsme circulaire. Par contre, à force ionique élevée (0,2 à 0,5
M NaCl0 ), la formation. de complexes ternaires se traduit par une
4
forte diminution de l' intensité dichroïs~~~" du poly(A). Le spectre
évolue de la mBme façon que lors de l ' addi tion des ions eu2+au poly (;:,
seul. Nous avons illustré sur les figures Ivget IVIOl'influence
de la force ionique sur la formation, des complexes ternaires.
2
Dans 0,2 !J1 NaCl, les complexes ternaires pOly(A)_eu +_
polypeptide se forment lorsque le rapport R = ~~~+/P04- est voisin
de 3.
Lorsque R augmente, les ions eu2+libres en solution
2
favorisent la formation de complexe binaire polypeptide-Cu +au dé-
2
triment du complexe ternaire polY(A)-eu +-polypeptide.

- 54 -
-M(263.5nm)
~ Co>
AE
011
no 0:,
0.11
0.6
Il. ,
O.,
0,11
0.2
0.11
0.2
o L...-........_.i.-.....L-I
o
2
"
,
R
2
,
6
Il
R
0,6
0,'
2
0,2
.. 0 ....... - 0 - - _ _ ... 0
..
o
2
Fie;ure IV
l"i,RUre IV 10
9
Figure IV
:
Variation relative de l'intensité dichroïque du polY(A)
9
2
dans le complexe ternaire POly(A)-Cu +-(Glu-Tyr-Glu) •
n
Le protocole expérimental consiste à partir d'une solution de poly(~)
2
à laquelle on ajoute les ions Cu + jusqu'il. u.n rapport R donné
(les
chiffres sur la figure donnent la valeur de ce rapport) ; puis on
réalise l'addition du polypeptide. En encart, nous avons représenté
la variation du dichroïsme du poly(A) à 26J,5 nm dans les mêmes condi-
2
tions de concentration et de force ioniQue en présence des ions Cu +
Poly(A) = 5,0 IO-5M, NaCl 0,2 M, pH~7 et à 25°C.
J:t'i gure IV10 :
Le mode opératoire, de même que les conditions expéri-
mentales sont les mêmes que ceux de la figure IV •
9
Ici, nous avons travaillé dans 0,5 M NaCl.
2
L'addition ultérieure de (Glu-Tyr-Glu)
au mélange binaire polY(A)-Cu +
n
provoque un abaissement important du dichroïsme du poly(A). Le poly-
2
peptide
favorise la fixation des ions Cu + sur le poly(A); nous
pouvons interpréter cette variation comme étant due à la formation du
complexe ternaire.
Courbe (1)
R = 2
Courbe (2)
R = 3
Courbe (j)
R = 4

- 55 -
Dans 0,5 b1 NaCl, l'importance du complexe ternaire aug-
mente jusqu'aux valeurs de R=4.Au-delà, on retrouve le même phéno-
2
mène que dans 0,2 M NaCl. Le complexe binaire polypeptide-eu +prend
les ions eu2+fixés au pol~(A) et provoque une réaugmentation de
l'intensité dichro!que •. La sensibilité des complexes ternaires à la
force ionique, montre l'importance des interactions électrostatiques
mises' en jeu. Quelle oue soit la fo:t'ce ionique considérée, la varia-
tion relative de l'intensité dichro!que du poly(A) à 263,5 nm at-
teint une valeur limite lorsque la concentration en polypeptide est
voisine de celle du poly(A). Nous avions trouvé un résultat analogue
en fluorescence avec les ions zn2+.
Sur la figure IVil' nous avons comparé l'action des
différents polypeptides sur le poly(A) pour un rapport eu 2+/po- = 2,
4
dans 0,5 M NaCl •. L'effet maximum observé en dichro!sme circulaire
décro!t dans l'ordre (Glu-T-Jr-fryr-Glu ) ) (Glu-Tyr-Glu ) ) (Glu-
n
n
Glu-Tyr-Glu ). La fixation' des monomères n'induit que de faibles
n
variations du dichroïsme du poly(A) ..
Les spectres dichro!ques des complexes ternaires dans
la région pep'tidique montrent que les polypeptides adoptent tou-
jours une conformation hélico!dale (figure IV
). Le maintien de
12
la structure hélico!dale dans les complexes ternaires peut expli-
quer la grande désorganisation du p~lY(A). En effet, si des inte-
ractions entre la chaîne latérale de la tyrosine et les bases ont
lieu (extinctioru de fluorescence), il faut imaginer que le poly(A)
s'enroule en superhélice autour du polypeptide, ce qui déstabili-
sera de façon importante l'empilement initial des bases du poly(A).
2) Complexes ternaires avec le poly- (C)
.
------------------------------~
La mise en évidence de la formation de complexes
ternaires entre le poly{C) et les polypeptides par l'intermédiaire
des ions
2
Zn +a été faite à faible force ionique. Dans ces condi-
tions, la constante de fixation des ions zn2+sur le poly(C) est du
même ordre de grandeur que celle avec les polypeptides. La figure 1VI.,)

- 56 -
li A .10 4
~ (263,5 "ml
Aco
...
'-;::;;:::::::::::a:::;:;::::=::::::=:;::q
~

1
. . .,
0
.
+10
2
a
f"": ~
o.n
1\\\\
1
' :
+5
,
,.
1
1:
1 :
1 :
, :
0.6
1 :
\\ :
~ :
o t-....~-+--~lr:""":--1""'"'""---..::~
0.4
\\..
/
+- ......+-+-+~
-5
0.2
-10
01.--_ _-"-_ _--<
........
200
250
l("ml
300
Figure IV
Pigure 1V
II
12
lt'igure IV
Action des différents peptides et polypeptides sur
I1
2
le dichroïsme du poly(A) en présence des ions Gu +:
poly(A) = 5 10-5M, NaCl 0,5 M, R = 2
(1)- Ac-Glu-Glu-Tyr-GluIDIEt
(2)- Ac-Glu-Tyr-Glu~HEt
(1)-(Glu-Glu-Tyr-Glu) n
(4) - (Glu-'ryr-Gl~) n
(5)- (Glu-Tyr-Tyr-Glu) n
Les monomères ne modifient pas de façon importante l'intensité dichroï-
que du poly(A) tandis que les polymères provoquent une désorganisation
de la structure h~licoïdale du poly(A) dans les complexes ternaires.
Figure IV
:
Nous avons représenté l'absorbance dichroïque du
I2
mélange poly(A)-(Glu-Tyr-Glu)
et celle du complexe
n
2
2
ternaire en présence des ions Cu + •. Lorsque la quanti té de Cu + augmen-
te, le spectre dichroIque dans la région aromatique qui est dû essen-
tiellement à la contribution du poly(A) disparaît tandis que dans la
région peptidique, le spectre évolue vers celui d'une hélice a • Dans
cette dernière régi9n, la contribution du polypeptide devient prépon-
dérante..
(NaCl0
0,2 M, pH~1, à 25°C.)
4
(a)
spectre du mélange poly(A) 5 10-5M + (Glu-Tyr-Glu)
5 IO-5M
n
5
(b) poly(A) 5 IO- M + (Glu-Tyr-Glu)n 5 IO-5I11 + Cu2+ 5 IO- 5N•.
2
4
(c) poly(A) 5 Io-5M + (Glu-Tyr-Glu)n 5 IO-5M + Cu + 2 IO- M.

- 57 -
montre la variation r'elative de l ' intensité dfchroïque du
poly(C) à 276 nm en présence des ions z.."12+et de (GIU-Tyr-Glu ).
n
Pour un rapport zn2+/Po-4= .3., l' addi tion ultérieure du polypeptide
2
au mélange POly(C)-Zn +provoque une diminution de l'intensité di-
chroïque du polY,(C) comparable à l'action des ions Zn 2+seuls pour
des rapports R) 5. Lorsque la concentration; en peptide dépasse celle
du poly(C), on ebserve une augmentation du dichroïsme du polynu-
2
cléotide due à la fo!~ation: du complexe binaire pOlypeptide-Zn +.
Le complexe binaire provoque la dissociationl du complexe ternaire.
l1E
-l:\\Eo
A
(276 nm) 1
ou
04
)
++
poly (e
+ Zn
02
R
o
05
1
15
2
4
6
Figure IV
:
13
La formation du complexe ternaire polY(C)-zm2+_(Glu-~
Glu)
provoque une diminution import~~te de l'intensité dichro!que
n
du poly(C). La figure IVlj(A) représente l'effet de (Glu-Tyr-Glu)n
sur le dichroïsme du complexe binaire polY(C)-zn2~(pol~(C) lO-~l,
Zn2+ .3. lO-~4). La figure IV
(B) est la variation relative de
lj
l'intensité dichroïque du poly(C) en présence de zn2+.
NaCIO 4 lO-JM, pH~7, à 25°C.

- 58 -
La figure IV
donne les spectres de dichro!sme circu-
14
2
laire des complexes ternaires poly(C)-Cu +-(Glu-Tyr-Glu) • Compte
n
tenu des erreurs expérimentales, le spectre dichroïque du mélange
poly(C)-polypeptide est très peu différent de la somme des spectres
des deux polymères séparés. En présence de quantité croissante du
eu2+, la bande positive centrée à 276 nm diminue et se déplace vers
le rouge~ Cette bande est essentiellement due au poly(C), car la
contribution du polypeptide est négligeable dans la région aroma-
tique. Dans la régionpeptidique, le spectre dichroïque du mélange
ternaire évolue vers celui d'une hélice a • En présence des ions
~
.
~
(
Cu
comme des ~ons zn
, l'intensité du spectre dichroïque du poly C)
est très faible entre 185 et 240 nm. Le spectre. dichroIque du
complexe ternaire· dans cette région est donc du essentiellement à
la contribution du polypeptide. Le polypeptide adopte donc une con-
formation hélicoïdale aussi bien dans le complexe ternaire que dans
le complexe binaire.
A haute force ionique (0,2 ; 0,5 1Y1 NaClO ), la variation
relative de l'intensité dichroïque du poly(C) en présence des ions
eu2+et des polypeptides est comparable à celle du poly(A) (voir
figures IVget IV ). Comme pour le poly(A), les complexes poly( C}.-
10
Zn2+-polypeptides et poly( c)_eu2+_ polypeptides se forment lorsque
la concentration des deux polymères est du même ordre de grandeur.
La mise en évidence de ces complexes ternaires a été fait~ à faible
2
force ionique pour les ions Zn +et à haute force ionique pour les
ions eu2+qui possèdent une plus grande affinité pour les deux poly-
mères.

o
0+1
<1
1
~j
1
j
1
A(nm)
190
210
230
250
270
290
310
Figure: IV
:
14
Spectres dichroïques du complexe ternaire po1y(C)-eu2+_
( Glu-Tyr-Glu) • Le sp ectre (1) est celui du mé1 ange- po1y( C) -( Gl u-
n
Tyr-Glu) il est peu différent· de la somme des spectres des deux
n
polymères. En présence de eu2+, l'intensité du spectre diminue dans
la région aromatique, tandi s qu ':il apparaît dans la région pepti-
dique un spectre proche de celui de l'hélice a.
(1) poly( C)
10-4r'1 + (G1u-Tyr-G1u)
10-~1
n
(2) poly( C)
10-~ + (G1u-Tyr-Glu) 10-~ + eu2+2 10-5r.l
n
(3) po1y( C)
10-~'1 + (Glu-Tyr-Glu) 10-\\1 + eu2+ 10-4rcl
n
(4) po1y(C) 1,75
lO-~ + (G1u-Tyr-Glu) lO-~~ + eu2+2 10-~1.
n
J
NaC10
10- M, pHi~7, 25° C.
4

- 60 -
3) Complexes ternaires avec l'ADN de thymus de veau
-----_....._---------------------
Le spectre de dichro!sme circulaire de l'ADN de thymus de
veau est esserrtiellement constitué d'une b~~de positive autour de
275 Dm et une ba.."lde négative à 247 nm .. La fixa.tion des ions eu2+
sur l'ADN à haute force ionique (0,2 M NaCl0 ) diminue l'intensité
4
de la bande positive d'environ 45 %pour un rapport eu2+jPO-
= j.
4
En présence de polypeptides, la bande positive diminue tandis que
la bande négative à 247 nm augmente du fait. de la contribution des
polypeptides •.
liE 1.2 . . . . . - - - - - - - - - - - - - - - - , - - - - - - - - ,
liE o
/,'-0'00
ADN + cti+
(27~nm)
, ....,
00
+
,.
~"o
a
1
.-+' oa'O
..0 ••••• ••••• 0" ••••••0" ••••• 0 ••••
0
00 •••
°b"o'o
... ,
+.. +....
""+ ............+
o.n
0,6
0.4
0,2
05
15
2
2
3
4
5
L'addition du polypeptide (GlU-GlU-Tyr-GluÀ au mélange
2
binaire ADN;..eu +provoque une variation du dichroIsme de l'ADN com-
parable à celle observée en excès d'ions eu2+.
(a) eu2+/PO_
= 1
4
(b) eu2+/PO-
= 2
4
(0) eu2+/PO-
= J
4
ADN = 10-~, NaCl0
0,2 M, pH
6,5, 25°C.
4

61
l!.ë.
l!.E. 1,2
Ra'
ADN +C ++
u
(275 nml
/~--+--..,---tfo +
+ - +
R .. 2
..,..
0
.............
0
0
O,U
R.. '


0,6
0,4
0,2
.4
R
(GLU-TYR-GLU)n.10
0
0.5
1,5
2
2
3
4
5
Figure IV
:
16
Variation relative de l'intensité dichro~que de l'ADN en
2
présence du Cu +et de (Glu-Tyr-Glu) • Aux faibles valeurs de
n
2
R = cu +/PO- , l'augment~tion de l'intensité dichroï~ue correspond
4
certainement à une compétition entre l'ADN et le polypeptide pour
2+
.
la fixation des ions Cu
~ Pour R = J, la diminution du dichro~sme
indique la formation de complexe ternaire déstabilisant la double
hélice de l'ADN
ADN lO-~, NaCl0
0,2 M, pH 6,5, 25°C.
4

Sur les figures IV
et IV
, nous a",fons représenté la
15
l6
variation relative de l'intensité dichroïque de l'ADN en présence
2
des ions Cu +et des polypeptides (Glu-Tyr-Glu) et (Gl'.-.-Glu-Tyr-Glu)
:
2+/
n
n
Pour un rapport Cu
PO-4 :: l"
Wes
2
polypeptides déplacent les ions Cu +fixés sur l'ADN, ce qui en-
traîne une réaugmentation du dichroïsme à 275 nm. Avec (Glu-Tyr-Glu) n
l'augmentation du dichroïsme de l'ADN se stabilise lorsque la con-
centration en polypeptide est voisine de celle de l'ADN donc de celle
aussi des ions eu2+. Cette augmentation correspond à 15 %du d~chroïsme
. initial, soit la moitié de l'effet produit par les ions eu2+
.1E
(Jo %) pour le rapport R = 1. L'augmentation de
6 E o
aux fàibles concentrations de (Glu-Glu-Tyr-Glu) est suivie d'un
n
retour au dichroïsme initial. Si l'on tient compte du dichro!sme des
l
t . d
d l "
t .
,
d
eu2+
po ypep 1 es
ans
a reg10n aroma 1que en presence
e
, on ne
peut pas conclure à la formation de ccmplexes ternaires. Les varia-
tions observées sont du même ordre de grandeur que celles dues à
l'action des ions eu2+seuls sur le dichroïsme des polypeptides.
Au rapport R = 2, les m~mes remarques s'imposent avec
(Glu-T.Yr-GIUÀ ; tandis que les variations' du dichroïsme de l'ADN à
275 nm devie~~ent plus significatives avec (Glu-Glu-~Yr-Glu) •
n
ft. partir de R :: 3, même si l'on tient compte de la con-
tribution des polypeptides, la variation de l'intensité dichroïque
de l'AD~ devient significative et prouve que la conformation de
l'ADN est modifiée par la présence des polypeptides. Avec (Glu-T.1r-
GIU)n' il se forme un complexe ternaire lorsque sa concentration est
voisine de celle de l'ADN.> (Glu-Glu-Tyr-Glu) provoque une variation
n
continue du dichroïsme et nous n'avons pas pu atteindre un plateau,
car au-delà de j
lO-~l en polypeptide, la diffusion devient impor-
tante, entra!nant une modification de la forme des spectres dichroïques.
Nous avons représenté les spectres dichro!ques sur la figure
IV
• Le spectre 4 de cette figure est celui obtenu pour une solution
I7
diffusante ..

ADN
10-' M
• Cu··
R::3
...
• (GLU-GLU-TYR-GLU) n
•o~.0'5 1
1
1
o
1
1
o
:
, ' - - - -
<1
.
,
------
1
"
--
o l-+'----Hi---,r--~~~~-------=-'"__j
l
,
:
'
'\\
l
"
\\. ~
:

l
,
-0.5
\\ :
:
~ 1
,
"
,
,
'
.\\
'
1\\
'
1" ,. ,
_ 1
, ·.....'.f !
1
....
'
,..\\......."
"
,
"'(nml
.,'
\\
1
: ,
,
""- .. '
230
250
270
290
310
330
350
370
Figure IV
:
17
Absorbance dichro~que des mélanges ternaires ADN_eu2+_
(Glu-Glu-Tyr-Glu) n
2
(1) ADtl + Cu + R = 3
2
(2) ADN + Cu + R = j + (Glu-Glu-Tyr-Glu)
5,13 10-5M
2
n - 5
(j) ADN + eu + R = 3 + (Clu-Glu-Tyr-Glu)
1,02 10
M
n
2
(4) ADN + Cu + R = 3 + (Glu-Glu-Tyr-Glu)
~,07 10-5M
n
Le spectre (4) est celui obtenu pour une solution diffusante~
ADN =. 1,0 10-'\\1, NaClO 4 0,2 !il, pH 6,5, 250 c.
Il
bl
d
1
·
eu+ 2
.
t
.
1
sem
e
one que
es ~ons
pU1ssen
promouvo1r
a
formation de complexes ternaires entre l'ADN et les polypeptides •.
Compte tenu de l'insolubilité et de la diffusion des complexes, leur
caractérisation par les techniques utilisées et surtout dans nos
conditions expérimentales (absence de tampon) s'est avérée difficile.

- 64 -
v- DISCüSSlü,li
En l'absence d'ions métalliques, nous n'avons aucu."'l.e preuve
d'interaction possible entre les polynucléotides
po1y(A}, po1y(C}
ou l'ADN de thymus de veau et les polypeptides (Tyr, G1U.)n que nous
avons utilisés.
L'extinction de la fluorescence de la tyrosine, le dépla-
cement des spectres d'absorption vers le rouge, la déstabilisation
accrue des bases du po1y(A) et du po1y(C) par les polypeptides en
présence d'ions métalliques concutrent à montrer la formation de
complexes ternaires •. Ces complexes sont sensibles à la force ionique.
L'action de l'E.D.T.A. restaure les propriétés spectroscopiques des
polynucléotides et des polypeptides. Il est vraisemblable que l'ion
2
métallique, en l'occurence zn2+ ou eu +, assure un pontage entre les
deux polymères.
2
1) La formation d'~~ complexe ternaire p01ynuC1éotide-zn +
2
(eu +)-po1ypeptide s'accompagne d'un changement de conformation des
deux polymères. Il semble que le polypeptide adopte une conformation
en hélice ex tandis qu'un désempi1ement des bases est observé dans le
polynucléotide. La formation d'une hélice ex est observée cl.ans le com-
2
plexe binaire zn2+(eu +}_po1ypeptide et résulte de la fixation du
cation métallique sur les groupements carbo~liques de l'acide glu-
tamique. Le désempi1ement des bases du polynucléotide est analoeue
à celui observé lors de la formation du complexe binaire zn2+(eu2+)_
polynucléotide. Il résulte de la formation d'un chélate du cation
métallique avec une base et un phosphate. Il semble donc que dans
les complexes ternaires, les liaisons du cation avec les deux poly-
mères soient identiques à celles observées dans les complexes bi-
naires.
2) Plusieurs phénomènes peuvent expliquer l'extinction
de la fluorescence de la tyrosine d'une part et le désempi1ement
des bases d'autre part :

- 65 _0
a) la formation de liaison hydroeène entre le groupement
OH de la tyrosine et les bases (NI' N , N , de l'adénine; N , 02=0
3
7
j
de la cytosine) peut entraîner une extinction de la fluorescence
de la tyrosine' (Fei telson, 1964). La formation de liaison hydrogène
entre l'adénine et les dérivés du phénol a déjà été démontrée par
Sellini et al ., (1973)~ Cette possibilité pourrait être vérifiée
en travaillant avec des dérivés ü-méthylés de la tyrosine.
b) l'empilement de la tyrosine avec les bases des poly-
nucléotides en simple brin a été démontré par Nova.l< et al., (1973),
Hélène et Dimicoli (1972), Dimicoli et Hélène (1974). Ces interac-
tions ont été aussi mises en évidence avec l'ADN natif par Gabbay
et al., (1972, 1973). Ce type de complexe favrosie un transfert
d'énerb~e de la tyrosine vers les bases et conduit à une ex·tinction
de la fluorescence de la tyrosine. Le transfert d'énergie des bases
vers la tyrosine est peu probable Car le temps de vie de l'état sin-
gulet des ba.ses est très court 2. la température ordinaire (Vigny,
1974 ; Montenay-Garestier, 1975).
0) la formation d'un complexe à transfert de charge entre
la tyrosine considéré Comme un bon donneur-d'élection et les bases
peut aussi être une des causes de l'extinction de fluorescence de
la tyrosine.
Avec l'ADN de thymus de veau, les résultats obtenus en
dichroïsme circulaire semblent montrer que la formation de complexes
ternaires n'est réalisée qu'aux fortes valeurs du rapport R. Pour
2
des valeurs du rapport Cu +/PO;) 3, da."'lS NaGIO 4 IO-~, la température
de dénaturation de l'ADN est considérablement abaissée (Liebe ~l.,
1972). La fixation ultériel1re des polypeptides pourrait entraîner
une dénaturation totale de l'ADN, ce qui expliquerait l'apparition
dtag régata responsables de la grande diffusion observée.

- 66 -
Il serait donc nécessaire de travailler dans un tampon adéquat
pour solubiliser au mieux les complexes formés afin de pouvoir
suivre de façon correcte, les variations de leurs propriétés spec-
troscopiques.

- 67 -
CON C LUS ION
L'ensemble des résultats que nous avons exposés montrent
que les cations métalliques peuvent promouvoir la formation de
complexes ternaires entre les polynucléotides (ou les acides nu-
cléiques) et les polypeptides acides du type (Tyr, Glu)n. L'étude
de ces complexes ternaires peut contribuer à une meilleure connais-
sance du rôle des cations métalliques dans le métabolisme des acides
nucléiques et aux interactions qu'ils peuvent promouvoir dans les
associations acides nucléiques-pro"téines.
2
La fixation des ions Zn +et eu2+sur les polypeptides
(Tyr, Glu)nprovoque l'apparition d'une structure régulière proche
de l'hélice a • Ce résultat démontre d'une part, que les cations
métalliques peuvent contribuer dans les systèmes biologiques à
l'édification de la conformation des protéines, et d'autre part que
ce rôle purement structural doit se retrouver dans les métal1o-
enzymes impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques. Le~
ions métalliques peuvent en effet maintenir une conformation locale
bien définie permettan~ la reconnaissance spécifique des deu~ ma-
~.&
cromolécules. Cependant, le fait que l'activité
des en-
zymes du métabolisme des acides nucléiques dépende de la présence
d'ions bivalents, peut faire penser à un second rôle possible des
cations métalliques. Ils interviendraient soit en neutralisant les
groupements chargés négativement (phosphates) pour permettre une
approche de l'enzyme, soit en favorisant une dénaturation locale
de l'acide nucléiqu&permettant l'acte enzymatique, soit enfin en
servant de pont entre les detL~ macromolécules. Dans tous les cas,
ils assurent une géométrie bien définie dans le système ternaire
qui favorise la réactivité des groupements chimiques en présence.
2
L'action des ions métalliques (Zn +, eu 2+) sur les poly-
nucléotides en simple brin est comparable à une élévation de la
température.

- 68 -
Cepenè.ant, la dénaturation de ces polynucléotides en présence de
cations métalliques est lL"l phénomène coopératif tandis que la déna-
turation par la température n'est pas coopérative. La différence
entre ces deux types de dénaturation peut être interprêtée par le
mécanisme suivant :
a) La fixation puremen~ électrostatique sur les phosphates
est un phénomène anticoopératif en raison de la diminution progres-
sive du potentiel électrostatique au cours de la fixation, et de la
répulsion entre les cations fixés. Elle stabilise la forme héli-
co!dale des polynucléotides et à ce titre, elle est comparable à la
fixation des mêmes cations sur les polypeptides que nous avons uti-
lisés.
2
b) La formation de chélates base-M +-phosphate ou base-M 2+-
base soit sur la même cha!ne, soit sur deux chaînes distinctes des
polynucléotides provoque le désempilement de plusieurs bases. Il
s'en suit une déstabilisation importante de la structure hélicoïdale
des polymères que l'on peut observer en dichroIsme circulaire.
c) La désorganisation coopérative de la structure héli-
co!dale due à la formation de chélates s'accompagne d'une fixation
coopérative des ions métalliques sur les polynucléotiques.
La fixation d.es ions métalliques sur l'ADN natifi s'accom-
pagne de phénomènes comparables à ceux observés pour la fixation des
mêmes ions sur les polynucléotides de synthèse : la neutralisation
des phosphates stabilise' la double hélice de l'ADN en diminuant les
répulsions électrostatiques; elle augmente la stabilité thennique
de l'ADN (Eichhorn et al., 1968 ; Zimmer et al., 1974). La formation
de chélates avec les bases provoque au contraire une déstabilisation
de la double hélice et abaisse considérablement la température de
dénaturation de l'ADN.
La formation de complexes ternaires polypeptides-cations-
polynucléotides a été mise en évidence par trois méthodes différentes

- 69 -
absorption différentielle, dichroïsme circulaire et fluorescence.
Les effets des ions métalliques dans les complexes ternaires sont
semblables à ceux que nous avons observés dans les complexes bi-
naires :
a) Une désorganisation de la structure hélicoïdale des
polynucléotides.
b) Un maintien de la conformation hélicoïdale des polypep-
tides.
Il semble donc que dans les complexes ternaires, l'ion
métallique assure un pontage entre les groupements carboxyliques
des résidus glutalnigues des polypeptides et les phosphates de
l'acide nucléique. Les bases participent à la formation de chélates
ce qui entra!ne une perte de la structure hélicoïdale des polynu-
cléotiques.
Plusieurs types d'interactions peuvent apparaître dans les
complexes ternaires ainsi formés :
a) Des interactions par liaison hydrogène entre le groupe-
ment hydroxyl de la tyrosine et les bases. Elles peuvent ~tre à
l'origine de l'extinction de fluorescence de la tyrosine dans les
complexes ternaires. La tyrosine peut en effet dans l'état excité
perdre un proton en présence d'un bon accepteur de proton (bases
nucléiques).
b) Un transfert d'énergie de la tyrosine vers les bases
est possible à la température ordinaire. La distance critique de
o
Fôrster varie de 10 à 17 A suivant la nature de la base (Chen,
1967 ; Montenay-Garestier, 1975). La fluorescence de la tyrosine
sera donc éteinte si le noyau phénol se trouve à une distance des
bases de l'ordre d'une dizaine d'Angstroms.

7n
,-
c) L'emi)ile:n<3nt du cycle aromatique à.e la tyrosine avec
les bases nucléiques peut également entraîner une extinction de
fluorescence de la tyrosine~ Elle provoque d~ns ces conditions Wl
désempilement des bases~
Les résultats que nous avons obtenus démontrent que les
cations métalliques peuvent promouvoir des interactions spécifiques
entre les acides nucléiques et les polypeptides du tyPe (Tyr, Glu) •
n
L'étude des interactions créétbdans ces complexes ternaires par
d'autres techniques (m~N, infra-rouge) s'avère intéressante. L'élu-
cidation de la structure des complexes ternaires peut contribuer à
la connaissance de la spécificité des interactions acides nucléiques-
protéines en général et en particulier du rôle des cations métalli-
ques de ces associations.

- 71 -
BIBLIOGRAPHIE
Adler A.J., Hoving R., Potter J., Wells M. et Fastman G.D., J. Amer.
Chom. Soc. (1968) 2Q, 47J6-4738.
Andronikashvi1i E.L., Dok1 Ak~ Na~~. SSSR (1968) 122, 979-984.
Au1d D.S., Kawagushi H., Livingston D.M. et Vallee B.L., Biochem ..
Biophys. Res. Comm. (1974) 21, 967-971.
Ilokobylskii A.r., Ginturie E.N., 1<10su1ishivi1i L.M. et Kaarabadze
N.V., Biofis (1968) 13, 650-655.
Berger N.A. et Eichhorn G.L., Biochemistry (1971) 30, 1847-1857.
Beychok S. et Fasman G.D., Biochemistry (1964) l, 1675-1678.
Bre10w E. et Girotti A.W., J. Biol .. Chem. (1966) 241, 5651-5660.
Brun F., Thèse d'Universit~, Orléans (1975).
Brun 1"., Tou1mé J.J. et Hélène C., Biochemistry (1975) 14, 558-565.
Chang L.M. et Bo11um F.J., Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1970) &2,
1041-1048.
Chen A.K. et Woody R.W., J. Amer .. Chem. Soc. (1971) ~, 29-37.
Chen R.F., Anal. Letters (1967) l, 35-42.
Dimico1i J.L. et Hélène C., Biochimie (1971) 2l, jJl-345.
Dimico1i J.L. et Hélène C., Biochemistry (1974) 1J, 714-72J.
Dimic01i J.L. et Hélène C., Biochemistry (1974) 11, 72j-7jO.
Domard A., Thèse de Doctorat d'Etat, Grenoble (1976).
Durand M., Thèse de Doctorat d'Etat, Orléans (1976).
Durand M., Maurizot J.C. et Hélène C., Febs Letters (1976) 11, 9-12.
Durand M., Maurizot J.C., Borazan H.N. et Hélène C., Biochemistry
(1975) 11, 563-569.
Eichhorn ~.L. et Tarien E., Biopo1ymers (1967) 2, 273-281.
Eichhorn G.L., Butzow J.J., Clark P. et Tarien E., Biopo1ymers
(1967) 2, 283-296.
Eichhorn G.L. et Shin Y.A., J. ~~er. Chem. Soc. (1968) 2Q, 7j2J-7j28.
Feite1son J., J •. Phys. Chem. (1964) 68, j9l-j96.
Frey C.M. et Stuehr J.E., J. Amer. Chem. Soc. (1972) 21, 8898-8904.

- 72 -
Gabbay E.J., Sandford K. et Baxter G.~., Biochemistry (1972) Il,
j429-j4j5 ..
Gabbay E.J., Sandford K., Baxter C.S. et Kapicak L., Biochem:istry
(1973) ~, 4021-4029.
Greenfield N.J. et Fasm~~ G.D., Biochemistry (1969) 8, 4108-4116.
Héléne C. et Dimicoli J.L., Febs Letters (1972) 26, 6-10.
Hélène C., Nucleic Acids Research (1975) 2, 961-969.
Richard H., Schreibrer J.P. et Daune M., Biopolymers (197J) 12,
1-10.
Richard R. et Pacault A., Biopolymers (1971) 10, 2299-2J07.
Hooker T.M. et Sohellman J.A., Biopolymers (1970) .2., Ij19-1348.
Kay E.R.M., Simmons N.S. et Dounce A.L., J. Amer. Chem. Soc.
(1952) 11, 1274-1276.
Kenneth R.W. et Schofied P., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1975)
64, 262-266.
Lawaczeck R. et Wagner K.G., J. Magn. Res. (1972) 8, 164-174.
Liebe C.D. A+' Stuehr E.J., Biopo1ymers (1972) Il, 145-166.
Liebe C.D. et Stuehr E.J., Biopolyrners (1972) 11, 167-184.
Linde green C. C., Naga! S. et Nagaï H., Nature (1958) 182, 446- 448
Maurizot J.C., Thèse de Doctorat d'~~at, Orléans (1970).
Montenay-Garestier T. et Hélène C., Nature (1968) 217., 844-845.
Montenay-Garestier 'l'. et Hélène C., Biochemistry (1971) 10, JOO-j06.
Montenay-Garestier T. et Hélène C., J. Chem. Phys. (197J) lQ,
Ij85-lj90.
Montenay-Garestier T., Photochem. Photobiol. (1975) 22, 3-6.
Novak R.L. et Dohmal J., Nature New Biol. (197J) 11l, 155-157.
Pesce A., Bodenheirner K., Norlanti K. et Fasman G. D., J. Amer. Chem.
Soc. (1964) 86, 5669-5675 .•
Rif'kind J.M., Shin Y.A., Heim J.H. et Eichhorn G.L., Biopolymers
(1976) 12, 1879c 1902.
Rinaudo l'Il. et Domard A., J. Amer. Chem. Soc. (1975) ..2.§"
6j60-6j64.
Ropars C., Mem. Museum Nat. Hist. Nat. (1966) Série D~, 1-58.
Schreiber J.P., Thèse de Doctorat d'Etat, Strasbourg (1972).
Schre:i.ber J .P. et Daune TI;., Biopolymers (1969) .§., Ij9-152.
Scrutton tl.C., vlu C.iv. et Goldthwait D.A., Proc. Nat. Acad. Sei.
USA (1971) 68, 2497-2501.

- 73 -
Sellini H., iijaurizot J. C., Dimicoli J .L. et Hélène C., Febs Letters
(1973) jO, 219-224.
Shearer W.T., Bradshan R.A. et Gurd F.R.N., J. Biol. Chem. (1967)
.lli, 5451-5460.
Shechter B., Shechter l., Ramachandran J., Conway-Jacobs A. et Sela
M., ~ur. J. Biochem. (1971) 20, jOl-308.
Sevag M. G., Lackman D.B'. et Smolens J., J. Biol. Chem. (19Ja) 1:11,
425-4J6.
Shin Y.A., Heim J.M. et ~ïchhorn G.L., Bioinorg. Chem. (1972) l,
149-16J.
Shin Y.A., Biopolymers (1973) ~, 2459-2475.
Slater J.P., Mildvan A.S. et Loebs L.A., Biochem. Biophys. Res.
Comm. (1971) ~, J7-43.
Tal M., Biochim. Biophys. Acta (19 68) ili, 564-565.
Tiffany M.L. et Krimm S. , Biopolymers (1968) &., lJ79-1J82.
rriffany M.L. et Krimm S. , Biopolymers (1968) 6, 1767-1770.
Tiffany lii.L. et Krimm S. , Biopolymers (1969) 8, 347-J59.
rriffany roT.L. et Krimm S. , Biopolymers (1972) 11., 2J09-2316.
rroulmé J.J. , Thèse de 3ème Cycle, Orl éans (19ï 4).
Toulmé J.J., Charlier M. et Hélène
Acad. Sci. USA
(1974) ll, 3185-3188.
Toulmé J.J. et Hélène C., J. Biol.
244-249.
Trudel1e Y., Polymers (1974) 16, 9
Trudel1e Y. et Spack G., Polymers
Van Holde K.E., Michelson A.M. et
Biol. (1965)
12, 726-7J9.
Valenzuela P., Morris R.W., Faras A., Levison W. et Rutter W.J.,
Biochem. Biophys. Res. Comm. (197j) 2i, 10j6-1041.
Venner H. et Zimmer C., Biopolymers (1966) ~, 321-335.
Vignis P., Thèse de Doctorat d'Etat, Paris (1974).
Wacker W. E. C. et Vallee B.·L., J. Biol. Chem. (1959) ill, J257-j262.
Walters J.A.L. et Van 00 G.A.J., Biopolymers (1971) 10, 11-20.
Weed L.L. et Longfellow D.J., J. Bacteriol. (1954) &1., 27- 33
Weed L.L., J. Bacteriol. (196j) ~, 1003- 1010
Zimmer C., Luck G. et Triebel H., Biopolymers (1974) 13, 425-453.