N,j d'ordre: 1350
TIIESE
Présentée 0 l'Uniuersité des Sciences et Techniques de Lille
Hendres ürtois
pour obtenir le qrude de Docteur de 3ème (:ycle
en Diologie et Physiologie nnimilles
6ouroIJnga RBymond BElEMTOUGRI
DETECTION IrvHvlUNOHISTOCHIrvlIQUE DE ~IIOLECULES
PEPTIDIQUES ET D'Al'vlINES . LEUR COEXISTENCE
DANS LE SYSTEtvlE NERVEUX D'AESHNA
CYANEA ( INSECTE, ODONATE)
'--CONSEIL- A.FR!C~~~l~.ï ET (V'lALGACI-lE\\
POUR l.'ENSEIGNEiV\\ENT SUPERiEUR 1
; c. A. M. E. S. -
O.U!:,~~~OUGOU \\
\\ I\\rrivée . () B. .AOU.!. .t~;j;:l
1
\\ Enregistré_ :ous.. n° fJl-,~~2j}J1~- J
Soutenue le 5 juillet 1986 deuent Iii Commission d'EHdmen
PrésirJent
M.
PORCHEl
Rdpporteur
J.c.
ANOR 1ES
EHdrnindteurs :
N.
DHAINAUT-COURTOIS
G.
TRAMU
Que ce :tJtavlLU. so.d: aUM-t .te ;témo-tgnage de tm. ftec.onna-tManc.e à ;toLU.)
ceux qu.-<:., pM .teu.JtJ.; c.onJ.;~, tu.des e.:t enc.oUftagemenM, on:t [Je.Jtmw ;.;a
fté.ci.Li.!.J atio n •
so~mIPE
Pages
INTRODUCTION
MATERIEL ET ~ETHODES
5
Matériel
5
Méthodes
5
l
- Préparation des tissus
5
1) En vue de l'obtention des coupes à la paraffine
5
2) En vue de l'obtention des coupes au cryostat
5
I I - Techniques irnmunohistochimiques
6
1) Principe des réactions
6
2) Sérums utilisés
6
3) Procédure employée
7
a)
Incubation du sérum spécifiqùe
7
b) Incubation du sérum marqué
7
c) Révélation
7
d) Spécificité de l'immunsérum
7
III - Technique de transport rétrograde
8
CHAPITRE 1 : Détection de substances apparentées à des neuropeptides
et à des hormones peptidiques de~~s
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2) Immunoréactivité anti-insuline ll1aflfSU~e
17
3) Immunoréactivité anti-motiline
19
4) Irnmunoréactivité anti-polypeptide intestinal vasoactif
20
5) Immunoréactivité anti-somatolibérine
22
6) Irnmunoréactivité anti-gastrolibérine
23
7) Immunoréactivité anti-substance P
24
II - Localisation de cellules renfermant un matériel apparenté
à des opioides
25
1) Immunoréactivité anti-leucine-enképhaline
26
2) Immunoréactivité anti-méthionine-enképhaline
29
3) Immunoréactivité anti-a-néo-endorphine
31
4) Irnmunoréactivité anti-dynorphine
33
CHAPITRE II
Détection d'un peptide propre aux Insectes
la proctolir.e
39
Immunoréactivité anti-proctoline
39
CHAPITRE III : Détection d'une amine: la sérotonine
41
CHAPITRE IV
Détection d'un même neurone par plusieurs anticorps
46
l - Détection d'un même neurone par des anticorps dirigés
co~tre divers peptides mammaliens
47
1)
Par anticorps dirigés contre des peptides mammaliens
apparentés: le VIP et l'hpGRF
47
2) Par anticorps dirigés contre des peptides mammaliens
non apparentés
48
a) Neurones détectés par les anticorps anti-VIP et
-hpGRF
48
a) Présentant une
immunoréactivité anti-CCK 8
48
B) Présentant une immunoréactivité anti-motiline
49
b) Neurones détectés par des anticorps anti-opioides
49
a) Présentant une immunoréactivité anti-CCK 8
49
S) Présentant une immunoréactivité anti-motiline
51
c) Neurones détectés par les anticorps anti-CCK 8 et
-GRP
51
II - Détection d'un même neurone par deux anticorps dirigés,
l'un contre un peptide mammalien (CCK) , l'autre, contre
un peptide d'Insecte (proctoline)
53
III - Coexistence d'une amine: la sérotonine et d'un peptide
apparenté à la cholécystokinine
53
CHAPITRE ,V : Analyse des relations cerveau-corps cardiaque
56
CONCLUSION GÉr<iÉRALE
58
Chez les Insectes, de nombreuses fonctions hormonales ont été
attribuées à des peptides. Schématiquement, ceux-ci contrôlent:
(1)
l'activité musculaire intestinale (Brown, 1975 ; Cook et Holman, 1979
Shukle et Judson, 1984), cardiaque (Mordue et Goldsworthy, 1969 ; Miller,
1979 ; S-Rozsa et Miller, 1981), oviductaire (Cook et Meola, 1978) ou
squelettique (Piek et Mantel, 1977 ; Mayet Coll., 1979 ; Witten et O'Shea,
1985) ; (2) l'utilisation des lipides (Mayer et Candy, 1969) ; 0) la glycémie
(Mordue et Goldsworthy, 1969 ; Migliori-Natalizi, 1970
Tager et Coll.,
1975, 1976 ; Jones, 1978 ; Witten et Coll., 1983, 1984
O'Shea et Coll.,
1984 ; Scarborough et Coll.,
1984)
(4) la diurèse (Maddrell.1963
Mordue
et Goldsworthy, 1969 ; Maddrell et Gee, 1974 ; Hughes, 1979 ; (5) la diapause
(Isobe et Coll.,
1973, 1975) ; (6) le tannage de la cuticule (Fraenckel et coll.,
1966 ; Fogal et Fraenckel, 1969) ; (7) la mue (Nagasawa et Coll.,
1985)
(8) la métamorphose (Granger et Coll., 1984 ; Rembold et Coll., 1986).
La localisation précise d'une molécule peptidique dans le cerveau,
le ganglion sous-oesophagien ou les corps cardiaques nécessite la connaissance
de la séquence en acides aminés, laquelle est indispensable à la synthèse du
peptide, ce qui constitue un préalable à la confection d'un anticorps
spécifique. A ce jour, seules les séquences de la proctoline (Brown,
1975), de
l'hormone
adipocinétique (AKH)
(Stone et Coll., 1976) et celle de l'hormone
prothoracotrope (Nagasawa et Coll., 1985) sont connues.
Les difficultés d'isolement de ces molécules expliquent que nous
n'ayons à IInotrell disposition que les seuls anticorps anti-AKH et anti-
proctoline. Par contre,de nombreux peptides ont été
identifiés dans le
système nerveux et le système gastro-entéro-flancréatique des Mammifères.
L'opinionJselon laquelle les hormones peptidiques et neuropeptides sont
apparus très tôt au cours de l'évolution,sans que leur séquence en acides
aminés n'ait subi de modifications profondes,nous a amené à rechercher,
dans le système nerveux d'un insecte, des molécules apparentées à des
peptides de Mammifères. Si de nombreuses substances apparentées à des
peptides de Mammifères ont été identifiées dans le système nerveux des
Insectes (cholécystokinine (CCK)/gastrine, glucagon, insuline, polypeptide
pancréatique (pp), somatostatine, enképhalines, endorphines, polypeptide
intestinal vasoactif (VIP), vasopressine, ocytocine, sécrétine, calcitonine,
somatolibérine, gonadolibérine, ACTH, motiline,
... ), rares sont, cependant
à ce jour, les cas où des recherches systématiques ont été entreprises et
où plusieurs substances ont été identifiées chez un même insecte. C'est le
~ 2 -
cas d'un Orthoptère, Lo~~ta mig~ato4ia (Rémy et Coll., 1977 ; Doerr-Schott
et Coll., 1978;
Rémy et Dubois, 1981 ; Romeuf et Rémy, 1984), de deux
Lépidoptères, Mandu~a ~exta (El-Salhy et Coll., 1983) et Bombyx mo4i
(Yui et Coll., 1980), de deux Diptères, E~~t~ aen~ (El-Salhy et Coll.,
1980) et Caltipho~a ~yt~o~ephala (Duve et Thorpe, 1979, 1980, 1981, 1982
et 1983), d'un Dictyoptère, P~planeta am~~ana (Fujita et Coll., 1981),
d'un Coléoptère, Lep~not~a de~emlinéata (Veenstra et Schooneveld, 1984 ;
Veenstra et Coll., 1984 ; Veenstra et Yanaihara, 1984 ; Veenstra et Coll.,
1985a et b).
Plus rares encore, sont les cas où plusieurs peptides ont été
identifiés dans une même cellule du système nerveux d'un insecte. A ce jour,
seules des substances apparentées au FMRF amide et à la vasopressine (VP1)
(Veenstra et Coll., 1984), au FMRF amide et à la proctoline (Veenstra et
Coll., 19~5a), à la vasopressine (VP4) et au polypeptide pancréatique
(Veenstra et Coll., 1984), à la motiline et à la prolactine, à la vasopressine
et à la prolactine, à l'ocytocine, la prolactine et la S-endorphine, au FMRF
amide, au polypeptide pancréatique, au
MSH et à la gastrine (Veenstra et
Coll.,
1985b) ont été ~olocalisées dans le
système nerveux d'un insecte,
le doryphore Lep~not~a de~~neata.
La démonstration de la coexistence d'un peptide et d'une amlne
constitue une exception chez les Insectes. A notre connaissance, seuls
Vieillemaringe et Coll.
(1982) d'une part, Takeda et Coll.
(1986) d'autre
part ont conclu respectivement à la colocalisation de catécholamines et de
peptides dans la p~ int~~~eb~ de LO~~5ta mig~ato~~a, de dopamine
et d'a-endorphine dans le ganglion sous-oesophagien de Bombyx mo4i.
Une recherche approfondie de substances apparentées à des hormones
peptidiques ou des neuropeptides de Mammifères et la démonstration de
nombreux cas de colocalisation dans le cerveau et le ganglion sous-oesophagien
d'A~hna ~yanea font l'objet de notre travail. Ainsi, des substances apparentées
à différentes familles de peptides de Vertébrés ont été étudiées qu'il
s'agisse de neurohormones hypothalamiques (corticolibérine, somatostatine,
gonadolibérine), d'opioides (leucine-enképhaline, méthionine-enképhaline,
dynorphine, a-néo-endorphine, 0 -MSH) ou de peptides du système gastro-entéro-
pancréatique (peptide intestinal vasoactif, cholécystokinine, substance P,
insuline, somatolibérine, motiline, gastrolibérine). Nous avons également
étudié la localisation de la proctoline et celle d'une amine biogène : la
5-hydroxytryptamine (5 HT) ou sérotonine.
Le cerveau des Insectes résulte de la fusion, au-dessus de
l'oesophage, de la masse nerveuse de l'acron et des neuromères des ganglions
- 3
correspondant aux deux p~emiers métamères céphaliques. Ainsi le cerveau se
compose de trois parties:
1) le protocérébron ou cerveau antérieur bilobé
qui, par les lobes optiques, est en relation avec les yeux composés. La
p~ ~nt~~~eb~~ en position dorsale regroupe la plupart des cellules
neurosécrétrices telles que les ont mises en évidence les colorations
classiques (Clark, Azan ... ). 2) Le deutocérébron ou cerveau moyen correspond
aux lobes antennaires réunis par une commissure sus-oesophagienne. 3)
Le
tritocérébron ou cerveau postérieur comprend deux masses nerveuses séparées
par l'oesophage. Par le collier périoesophagien, il communique avec le
ganglion sous-oesophagien.
La morphologie du cerveau d'A~h~a ~ya~ea (Fig. 1) est conforme à
celle exposée ci-dessus.
Situé ventralement, le ganglion sous-oesophagien résulte de la
fusion des neuromères correspondant aux métamères mandibulaire, maxillaire
et labial.
Fig.!.: Vue dorsale du complexe cerveau-corps cardiaques de la larve du
dernier stade d'A~h~a ~ya~ea (AO : aorte; BR : cerveau
CC: corps'
cardiaque
; FG : ganglion frontal
FN: nerfs frontaux
NCC: nerfs
cardiaques internes ; OG : ganglions optiques ; R/N : nerf récurrent ;
la flèche indique la région antérieure)
(photo F. Schaller et M. Charlet
In : Neurohemal organs of Arthropods. Their development, evolution, structure,
and functions. A.P. Gupta ed.).
Chez les Insectes, les corps cardiaques (~o~po~a ~~dia~a) sont
des organes neurohémaux qui reçoivent les produits de sécrétion de cellules
nerveuses du protocérébron par l'intermédiaire de deux nerfs pairs, les
- 4 -
nerfs cardiaques internes (nccI) ~ssus de deux groupes médians de cellules
appartenant à la p~~nt~c~eb~~ et les nerfs cardiaques èxternes
(nccII) originaires de deux groupes cellulaires latéraux. Seule l'existence
des nccI et des cellules de la p~ int~c~eb~~~ dont ils proviennent,
a pu être démontrée avec certitude chez les Odonates (Schaller et Meunier,
1968
Charlet, 1972 ; Schaller et Charlet, 1983) bien que Gabe et Arvy
(1952) aient préalablement mentionné l'existence des nccII.
Une technique basée sur le transport rétrograde de molécules
telles que la péroxydase de Raifort ou le chlorure de cobalt nous a permis
en les injectant dans le
corps cardiaque, de localiser certains groupes
cellulaires dont les terminaisons nerveuses y sont situées.
MATÉRI EL ET MÉTHODES
- 5 -
Matériel
La plupart des larves d'Ae.6hYLa cucneo: utilisées.ont été capturées
en automne en période de prédiapause. Elles ont été maintenues en diapause
à une température comprise entre 0° et 10° C sous une photopériode hivernale
naturelle. La diapéuse est rompue en plaçant les larves à 20° C sous une
photopériode de jours longs:
16 h. de lumière et 8 h. d'obscurité. Leur
nourriture quotidienne est constituée de larves de chironome.
Les larves sont sacrifiées à l'avant dernier stade (ADS) , cinq à
s~x jours après la mue; la durée moyenne de l'avant dernier stade étant dans
ces conditions de quatorze jours.
Méthodes
l - Préparation des tissus
QuellQ.. que soit la procédure employée, les larves sont décapitées et
les têtes plongées dans le fixateur.
1) En vue de l'obtention des coupes à la paraffine
Les têtes sont immergées dans le liquide de Bouin hollande sublimé
sans acide acétique puis, après déshydratation, incluses dans la paraffine et
débitées en coupes sériées de 6 ~m d'épaisseur.
2) En vue de l'obtention des coupes au cryostat
Les têtes sont placées dans une solution d'acide picrique-formal-
déhyde (PAF) (Stéfanini et Coll., 1967) pendant 24 h. puis lavées, à 4° C
pendant 24 h , dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,6 contenant 5 % de suc ro se ,
L'enrobage est réalisé par immersion des têtes dans du Tissue-Tek
ou du cryoform. L'ensemble est plongé dans du méthyl-2-butane refroidi par
l'azote liquide et les coupes réalisées à-20° C au cryostat.
Les coupes transversales de 12 u m sont recueillies une à une et collées
sur des lames. traitées à la gélatine-alun de chrome. En vue d'une comparaison
de réactions obtenues après incubation avec des sérums différents, les coupes sont
recueillies
individuellement et placées alternativement sur deux lames diffé-
rentes.
- 6 -
II - Techniques immunohistochimiques
1) Principe des réactions
Nous avons utilisé des réactions de type indirect (Coons, 1978)
qui se déroulent en deux temps.
a)
l'immunsérum spécifique de l'antigène recherché est produit
chez le lapin.
b)
le sérum utilisé comme révélateur est produit par immunisation
d'un mouton ou d'une chèvre contre les immunoglobulines de
lapin. Ce deuxième sérum est couplé au marqueur, la péroxydase
de Raifort.
Cette méthode de type indirect présente deux avantages majeurs
1) le marqueur (péroxydase) n'est pas couplé diLectement à
l'immunoglobuline spécifique, ce qui êv i.t e une dénaturation plus ou moins
importante de celle-ci.
2) l'emploi d'une deuxième immunoglobuline permet d'augmenter le
nombre des unités de marqueur par site antigénique donc la sensibilité de la
réaction.
2) Sérums utilisés
Les immunsérums anti-cholécystokinine 8 non sulfatée (CCK8NS),
- cholécystokinine 8 sulfatée (CCK-8S), - somatolibérine (hp GRF)
(antigène
isolé d'une tumeur pancréatique humaine), - polypeptide intestinal vasoactif
(VIP), - vasopressine, - corticolibérine (CRF) , - substance P, - sérotonine,
- méthionine-enképhaline (Met-Enképhaline), - leucine-enképhaline (Leu-Enké-
phaline), - gonadolibérine (LHRH), - a-néoendorphine, -. S-endorphine,
- proctoline, - Neuropeptide Y (NPY) , - motiline, ~ somatostatine (SRIF),
- ,gastrolibérine (GRP) , - ~-MSH ont été utilisés. Tous sauf l'immunsérum
anti-insuline (nO PP 1246L, Cambridge Medical Diagnostics Inc) ont été
fournis par G. TRAMU (D.
156 INSERM).
Le sérum anti-immunoglobuline de lapin marqué à la péroxydase est
commercialisé par l'Institut Pasteur ou par Biosys.
- 7 -
3) Procédure employée
a) incubation du sérum spécifique
Après déparaffinage (coupes à la paraffine) ou séchage pendant
un minimum de temps à la
température ambiante (coupes au cryostat), les
coupes sont placées pendant un minimum de quinze minutes dans du tampon
de Coons pH 7,2.
L'incubation des coupes en presence du sérum spécifique est
réalisée pendant 12 h. à 4° C et en chambre humide afin d'éviter tout
risque de dessèchement. L'irnmunsérum est dilué au 1/200 dans du tampon
de Coons pH 7,2 contenant 0,25 % de triton X 100.
b) incubation
du sérum marqué
Après incubation par l'anticorps spécifique, les coupes sont
rincées dans deux bains de tampon de Coons puis incubées 45 mn. à 4° C
en chambre humide avec le sérum marqué à la péroxydase, dilué au 1/40
dans du tampon de Coons sans azide.
Ce sérum marqué est constitué d'immunoglobulines de Mouton anti-
lapin entières ou d'immunoglobulines de Mouton anti-lapin fraction Fab
couplées à la péroxydase de Raifort.
c) révélation
Après rinçage dans du tampon de Coons puis dans l'eau distillée,
l'activité péroxydasique est révélée par une réaction enzymatique colorée
le chromogène utilisé étant le 4-chloro-1-naphtol et le .subst r at 1 'H202.
Le précipité bleu-violet apparu étant soluble dans le toluène et le benzène,
le montage se fait dans la glycérine diluée (glycérine 9 volJtampon de Coons
1 vol.). Les lames ainsi montées sont examinées au microscope photonique.
d) spécificité de l'immunsérum
Elle est réalisée par des réactions d'absorption d'un anticorps
spécifique par l'antigène correspondant ou par divers antigènes susceptibles
de se complexer aux immunoglobulines de lapin. L'irnmunsérum ainsi saturé
est appliqué en alternance avec l'immunsérum non absorbé sur des coupes
sériées. L'absorption de l'immunsérum par l'antigène correspondant doit
provoquer l'inhibition du marquage enzymatique.
- 8 -
III - Technique de transport rétrograde
Des larves du dernier stade (DS) âgées de c~nq à s~x jours ont
été utilisées.
Après avo~r fait un volet dans la partie dorsale de la tête, le
cerveau est déplacé vers l'avant de façon à mettre en évidence le
corps
cardiaque. celui-ci est alors injecté
pendant 2 à 3 h. par une solution
de péroxydase de Raifort (Horseradish peroxidase (HRP) type VI Sigma) à
l'aide
d'une microélectrode reliée à un stimulateur électrique.
Afin d'éviter toute dessiccation, l'animal, fixé sur une plaque
de liège, est immergé dans une solution de Ringer. Après décapitation, la
tête est plongée dans une solution de tampon phosphate 0, 1 M contenant du
glutaraldéhyde à 2 % pendant 2 h. à 4° C puis dans du tampon phosphate 0,1 M
contenant 5 % de sucrase pendant une nuit à 4° c.
La coloration in toto est réalisée en deux temps:
(1) 3 h. à 4° C
dans une solution de diaminobenzidine (DAB) dans du tampon phosphate 0,1 M
(2) 3 h. à température ambiante dans la solution de DAB addit.ionnée de
10 % d'HZO
à 0,3 %. Un lavage rapide (1 mn) dans le tampon phosphate 0,1 M
Z
précède la déshydratation et l'inclusion dans la paraffine.
CHAPITRE I
DETECTION DE SUBSTANCES APPARENTEES
ADES NEUROPEPTIDES ET ADES
HORrüNES PEPTIDIQUES DE MAMMIFERES
:'.
- 9 -
Des immunsérums dirigés contre des peptides du système entéro-
gastro-pancréatique ou du système nerveux de Mammifères ont été utilisés
sur des coupes aucryostat et dans la majorité des cas su~ coupes ~ la paraffine.
Si certains
d'entre eux (sérums anti-LHRH, -CRF, -tHSH, -angiotensine,
-vasopressine) n'ont donné aucune réponse que ce soit au niveau des cellules
ou des fibres nerveuses, d'autres sérums ont permis de caractériser de façon
précise de nombreux groupes cellulaires du cerveau et du ganglion sous-oeso-
phagien. Toutefois, en immunohistochimie,
l'intensité du marquage et le
nombre de cellules immunoréactives varient assez fréquemment d'un individu
à
un autre, peut-être en fonction du stade physiologique, voire du moment
du cycle nycthéméral auquel l'animal a été sacrifié. Les descriptions qui
suivent concernent l'ensemble des cellules qui réagissent avec une intensité
satisfaisante bien que parfois modérée et font état de certains groupes
cellulaires qui ne sont pas détectés de façon systématique.
- la -
l - LOCAL! SATI ON DE CELLULES RENFERMANT UN MATÉR l EL APPARENTÉ
À DES PEPTIDES DU SYSTÈME ENTÉRO-GASTRO-PANCRÉATIQUE DE
MAMMIFÈRES
Nous considérons sous le vocable de peptides du système entéro-
gastro-pancréatique, les peptides primitivement mis en évidence au niveau
du tube digestif et/ou de ses glandes annexes. Ce sont la gastrine/cholécys-
tokinine, l'insuline, la motiline, le polypeptide intestinal vaso actif,
la somatolibérine.
1)
Immunoréactivité anti-cholécystokinine/gastrine
La CCK 6ut p,~vement ~~ofée en tant que ~~a~o~apeptide
(CCK-33) de f'~nt~~tin g~êfe du po~~ [Mutt et Jo~p~~, 1968, 1971). Son
act.ion p~nupafe ,0' exe~~e ,oM fa ~oYLtJta~on de fa vé,o~~ufe bil.,L~e.
Comme fa CCK po,o,oède fe même peYLtapeptide ~~boxy-t~~naf que fa ga,o~ne,
r.es ,oé~UJM ,opéu6~que-6 dé,tedent à fa 6o~ fa CCK et fa ga.,,~~ne d'où. fa
dénomin~on d'~mmuno~éa~v~é anti-CCK/ga,o~ne.
IrUuafement mùe en év~den~e daM fe ,tube ~ge-6u6, fa CCK 6ut
égafement déte~tée dan,o fe ~~veau (Vand~haeghen et CoU., 1975 J /sou,o 60June
d'une mofé~ufe pfu,o p~e (CCK-8J ne ~en6eJunant que r.es 8 a~e;;s~aJn:çI:UI!.>
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Nous avons utilisé deux immunsérums, l'un dirigé~c~rt~r~0~~~d
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peptide C-terminal sulfaté de la cholécystokinine (CCK-8S), 1~~~~t~~~0ntre
le même octapeptide dont le résidu tyrosine n'est pas sulfaté (CCK-8NS).
Observations sur coupes à congélation
Au niveau des lobes optiques
Dans la médulla, une dizaine de strates de fibres varlqueuses
parallèles réagissent au sérum anti-CCK-8NS alors qu'une seule d'entre elles
est intensément marquée après incubation avec le sérum anti-CCK-8S (PlI.
figs.b-d). Plusieurs groupes de cellules sont observés au voisinage de la
médulla. Deux d'entre eux sont particulièrement importants soit par le
nombre, soit par la taille des cellules immunoréactives : (1) Le premier
concerne plus d'une cinquantaine de petites cellules réagissant intensément
à l'immunsérum anti-CCK-8NS (Pl l, fig.
c) de façon nettement moins importante
voire nulle au sérum anti-CCK-8S (Pl l, fig. d). (2) Le second groupe comprend
Bloc diagramme
1
Localisation des groupes cellulaires réagissant
5
2~
à un immunsérum anti-CCK-SN8.
3~·
~1
~:,,.~;,".t--(;.
-
Il -
dix à douze cellules de grande taille (20-25 ~m de diamètre) (Pl l, fig. b)
fortement réactives aux deux immunsérums. Dans la partie plus postérieure,
quelques quinze à vingt cellules très faiblement immunoréactives (7-10 ~m
de diamètre) et quelques rares cellules de taille moyenne, modérément
marquées envoient leurs trajets axonaux vers le neuropile de la médulla.
Dans la lobula, les couches concentriques de fibres immunoréactives
sont moins régulières et prononcées que dans la médulla. La plupart d'entre
elles
semblent avoir une origine protocérébrale bien que quelques rares
cellules puissent être observées au voisinage de la lobula (Pl l, fig. e).
Enfin deux couches de fibres immunoréactives s'observent dans la
lamina.
Au n~veau du protocérébron
Les groupes de cellules immunoréactives ont été numérotés
de
la partie antérieure à la partie postérieure du cerveau comme l'indique le
tableau 1 et le bloc diagramme 1. Certains des groupes que nous avons
définis sont composites et regroupent plusieurs populations neuronales.
Ainsi les groupes latéro-dorsal (groupe 14) et latéral (groupe 9) qu~
occupent une aire relativement importante contiennent, en plus de petits
neurones, des corps cellulaires de taille moyenne et de grande taille.
Dans un même groupe, quelques cellules peuvent apparaître fortement
marquées alors que d'autres ne réagissent que faiblement à l'immunsérum
(par exemple dans le groupe 1, seules les cellules de petite taille sont
intensément colorées). Le marquage de certaines cellules (par exemple des
groupes 6,7, 10 et 16) est aussi intense après incubation avec l'immunsérum
anti-CCK-8S qu'avec l'immunsérum anti-CCK-8NS. Au contraire, les grosses
cellules piriformes du groupe 13
comme la plupart des petites cellules des
groupes 8, 9,
12, 14 et 15 ne réagissent pas ou très faiblement à l'immunsérum
anti-CCK-8S.
Au n~veau du tritocérébron
Plusieurs groupes comportant au total 12 à 15 cellules immunoréactives
sont situés antérieurement en position latéro-ventrale ou dorsale, à proximité
du neuropile tritocérébral. Plus postérieurement,3 à 4 cellules de taille
moyenne, faiblement marquées sont localisées latéro-dorsalement et autant
sont présentes en position plus dorsale. Le marquage
diffère quelque peu
~ 12 -
: Intensité du marquage:
roupe
nombre de
taille
localisation
lulaire:
cellules
CCK-SNS
figures
CCK-SS
+
+
4-6 grandes
à
++
à
+
10
paramédiane
Pl. l, figs. g et h
4 petites
+++
+++
paramédiane
2
15-20
très petite
++
+
Pl. I.fig. f
dorsale
+
+
sagittale
Pl. l,fig. f
3
2
très grande
- à +++
à +
dorsale
Pl. II, figs. a et b
:
+
4
3-4
ur
peti te
+
dorsale
petite à
5
10
: :
à
++
a à +
latéro-ventrale'
moyenne
dorsale
6
2
moyenne
+++
+++
parasagittale
dorsale
7
4-5
grande
+++
++
Pl. II~figs. c et d
paramédiane
+
8
10
petite
: -
à +
a à :
latéro-dorsale
: +
12 petites
à
+
o à :
9
16
latérale
Pl. II,figs.c et d
4 grandes
++
++
10
3
grande
+++
+++
latéro-ventrale:
Pl II figs. c et d
1 1
grande
: +
: +
ventrale
Pl. II, fig. c
+
centrale à
12
10
petite
à ++
a à +
Pl. II,fi8s.e et f
ventrale
+
13
4-5
grande
+++
o à
dorsale
Pl. II .f i.gs e et f
5 _petites
: +
14
10
5 moyennes
latéro-dorsale
Pl. IIJfigs.e et f
:
+
à
++
à grandes
+
15
12
petite
: +
a à -
latérale
Pl. II,figs.e et f
16
2
grande
+++
+++
centrale
Pl II, figs. eet f
Tableau
Localisation des groupes cellulaires du protocerebron (tous les
groupes ont une disposition symétrique).
-
13 -
selon les types cellulaires (les cellules latéro-ventrales sont les plus
intensément marquées) et l'immunsérum utilisé; les réactions sont toujours
moins nettes après incubation avec l'immunsérum anti-CCK-8S.
Au n~veau
du corps cardiaque
Une immunoréactivité s'observe d'une part dans certaines cellules
du
corps cardiaque
et d'autre part dans les fibres nerveuses et terminaisons
axonales issues probablement de cellules protocérébrales, via les ~~vi
~o~po~ ~ahdia~ (nccI). Ainsi du matériel apparenté à la cholécystokinine
existe en tant que peptide extrinsèque (protocérébral) et intrinsèque,
contrairement à ce qu~ a été décrit chez la blatte Leu~ophaea mad~ae
(Hansen et Coll., 1982), chez laquelle une même molécule peptidique ne semble pas
être à la fois d'origine extrinsèque et intrinsèque.
Au niveau du système nerveux stomatogastrique
Plus d'une dizaine de cellules de grande taille (25 ~m de diamètre)
(Pl. III, figs. a et b) sont marquées dans la partie antérieure du ganglion
frontal après incubation avec les sérums anti-CCK-8S ou anti-CCK-8NS. De plus,
15 à 20 cellules de taille moyenne situées dans
la partie postérieure du
ganglion réagissent uniquement à l'immunsérum anti-CCK-8NS.
Au n~veau du ganglion sous-oesophagien
Une douzaine de groupes cellulaires symétriques renfermant une ou
plusieurs cellules réagissent à l'immunsérum anti-CCK-8NS. La distribution
de ces neurones est résumée dans le bloc diagramme 1. Quand l'immunsérum
anti-CCK-8S est utilisé au lieu de l'immunsérum anti-CCK-8NS, les dépôts
immunoréactifs sont fréquemment moins intenses. Ainsi, la plupart des
cellules CCK-8NS positives sont faiblement marquées par l'irnmunsérum
anti-CCK-8S (par exemple les groupes 2, 3 et 5, les petites cellules du
groupe 10). Seules, les grosses cellules des groupes 8 et 9 et quelques
cellules de taille moyenne du groupe 12 apparaissent intensément marquées
par les deux immunsérums.
Observations sur coupes à la paraffine
Seul,le sérum anti-CCK-8NS a été testé. De nombreux groupes
cellulaires détectés sur
coupes au cryostat ne sont pas marqués
(ex.
cellules paramédianes
de la partie antérieure du protocérébron, cellules
- 14 -
'Intensité du marquage.
~roupe
nombre de
taille
localisation
figures
llulaire:
cellules
CCK-8NS
CCK-8S
6-8
grande
0
à
+
0
: Lat é ro-rdo rs a l e
: +
parasagittale
2
3
petite
++
Pl. III,fig. e
centro-dorsale
: +
parasagittale
3
3
petite
++
Pl. III,figs.c-e
centro-ventrale:
+
+
4
2-3
"peti te
- à +
: -
latéro-ventrale:
5
3
grande
+++
: +
latéro-dorsale
Pl. III,figs. c-e
+
6
2
moyenne
: -
à
+++
?
médio-ventrale
2
grandes
7
4-5
++
à
+++
+
à
++
médio-dorsale
: 2-3 moyennes
8
grande
+++
+++
ventrale
Pl. III.fig.h
9
grande
+++
+++
médio-ventrale
Pl. IIIJfigs f-h
+
la grandes
: -
à
++
0
à
+
:
la
12
latéro-ventrale
Pl. III,figs.i-k
: 3-4 moyennes
++
à
+++:
+
:
+
11
grande
+++
0
à
-
latérale
Pl. III, f i.gs . l-n
+
6-8 moyennes
: +
à
+++
à ++
12
15
+
médio-dorsale
Pl. III,figs. i-p
:8-10 très grandes + à
+++
à ++
Tableau 2
Localisation des ~roupes cellulaires du ganglion sous-
oesophagien (tous les groupes ont une disposition
symétrique sauf les groupes 7 et 12).
-
15 -
média-dorsales de la partie postérieure du ganglion sous-oesophagien ... ).
Toutefois, en cas de réponse positive, l'intensité de la réaction est aussi
forte que sur coupes au cryostat .
Discussion
Chez les Mammifères, l'hormone intestinale, la cholécystokinine
est présente en grande quantité dans les systèmes nerveux périphérique et
central, plus particulièrement dans le système nerveux central qui apparaît
comme le site principal de production de la cholécystokinine. Chez les
Insectes, peu d'études ont été réalisées jusqu'à présent. Trois groupes
symétriques de 3 à 4 cellules réagissant au pentapeptide C-terminal de la
gastrine sont présents dans le cerveau de la mouche E~t~ aen~
(El-Salhy et Coll., 1980).
Cinq groupes de neurones immunoréactifs ont été décrits chez la
mouche bleue Cattzpho~a vom~o~a
(Duve et Thorpe, 1981). Un gaupe unique
de 3 à 4 cellules immunoréactives s'observe dans chaque moitié du protocérébron
de Manduea ~exta (El-Salhy et Coll., 1983). Ainsi chez toutes ces espèces,
le nombre de cellules CCK/gastrine positives reste toujours modéré.
Chez A~hna eyanea le nombre de cellules immunoréactives est
nettement plus important que dans les espèces étudiées jusqu'à présent.
En effet,plus d'une centaine de cellules réagissent à l'immunsérum anti-CCK-8NS
dans chaque moitié du cerveau. Elles constituent 16 groupes dans le seul
protocérébron et 12 dans le ganglion sous-oesophagien. Ces divergences peuvent
correspondre,soit à de vraies différences spécifiques,soit à des variations
liées à la sensibilité des immunsérums utilisés par les différents auteurs.
Deux problèmes inhérents aux études immunohistochimiques concernent
en effet, l'un la spécificité,
l'autre la sensibilité des anticorps.
Dans nos contrôles, l'immunoréactivité disparaît après absorption de
l'immunsérum par un excès de l'antigène correspondant. De plus, par RIA,;:
il a été démontré que l'immunsérum anti-CCK-8NS donne de fortes réactions
croisées avec la cholécystokinine-8NS, -8S et la gastrine (1-17), mais pas
avec la substance P,
la somatostatine, les leu- et met-enképhalines, la
S-endorphine, le peptide FMRF-amide (Studler et Coll., 1984). En conclusion,
s~ nos immunsérums apparaissent hautement spécifiques, ils ne permettent pas
de dissocier une immunoréactivité anti-gastrine d'une immunoréactivité anti-CCK.
;: radi o i
~o~mmunoassay
-
16 -
En règle générale, la réaction est toujours beaucoup plus
importante quand l'immunsérurn anti-CCK-8NS est employé au lieu de
l'immunsérum anti-CCK-8S. Seules,les cellules CCK-8NS très intensément
(+++) ou intensément (++) marquées présentent une forte réaction avec
l'immunsérum anti-CCK-8S. Les cellules plus faiblement réactives (+) sont
difficilement reconnaissables lorsque l'irnrnunsérurn anti-CCK-8S est employé.
Il semble donc logique de penser que la localisation immunohistochimique du
matériel apparenté à la cholécystokinine est quelque peu entravée par une
sensibilité trop faible de l'immunsérum anti-CCK-8S. Cependant, un tel
argument ne permet pas d'expliquer pourquoi certains corps cellulaires de
grande taille comme ceux du groupe 13 du protocérébron qui sont fortement
marqués par l'immunsérum anti-CCK-8NS ne sont pas ou très difficilement
détectés après incubation avec l'immunsérum anti-CCK-8S. Le fait que)quelques
neurones peuvent réagir avec des anticorps dirigés contre d'autres peptides,
comme c'est le cas des neurones du groupe 13 qui montrent une immunoréactivité
avec l'immunsérum anti-hp. GRF (cf chapitre IV), ne permet pas de répondre
à cette question.
Des différences de marquage des neurones d'un même groupe,comme
c'est le cas des gros neurones du septième groupe du ganglion sous-oesophagien,
reflètent probablement les variations de quantité d'antigène présentJplutôt
que des différences dans l'irnrnunoréactivité du peptide. Bien que nous n'ayons
pas chez les Insectes d'informations relatives à la structure de la molécule
ou des molécules apparentées à la cholécystokinine, il est probable que, comme
chez les Mammifères,différentes formes moléculaires soient présentes dans le
système nerveux et soient,par conséquent~plus ou moins bien reconnues par nos
irnmunsérums.
De nombreux peptides apparentés à ceux de Mammifères ont été
décrits dans les corps cardiaques de Leu~ophaea madekae (Hansen et Coll., 1982)~
mais,jusqu'à présent,une substance apparentée à la cholécystokinine a été
uniquement mise en évidence dans les corps cardiaques de Cattipho~a vo~o~a
(Duve et Thorpe, 1984). Nos résultats concordent avec ceux de Duve et Thorpe
chez Cattipho~a : le marquage concerne à la fois les terminaisons axonales et
les cellules glandulaires. Ainsi, comme c'est souvent le cas dans un organe
neurohémal, en plus du rôle neur~transmetteur ou neuromodulateur (non démontrés
mais fort probables dans les centres nerveux), la substance apparentée à la
cholécystokinine pourrait jouer un rôle neurohormonal.
Bloc diagramme 2
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-insuline.
_~!t;îr~:
~.,~,; ~~
~
~
lJW
~.;..,"!':'"f<'
-17 -
2) Immunoréactivité anti-insuline
L'ilUu..Une. Mt une. mo.téc..uf.e pe.ptilÜque de. 57 audM amtné.ô, c.olU.tUuée
de. 2 c.hcûnM c.onpJte.nan..t JtMpe.c.tivemmt 27 (c.hcûne. A) et 30 «cedes amtné-6
(c.hcûne. B J, dont .t'ac.tion hypogiyc.émtan..te. a été paktic.u..UèJte.me.nt bie.n étab.tie.
c.he.z .tM Mamn<.ÔèJtM . Le. po.type.ptide. à. -6on oUg--lne., .ta pJtépJtoilUuUne., c.orrpoJt.te.
770 audM amtné.ô (Be.U et c.o.U., 7979 J. L'e.xc.Mion de. -6on e.:dJtérrn:..té. N teJtmtna.te.
[25 audM aminé.ô J ÔouJtrU.t.ta pltoilUuUne., .taque.Ue. c.onpJte.nd, e.n pfu-6 des 2
c.hMnM A et B, un pe.ptide. .tM c.onne.c..tan..t. Ce. pe.ptide., dont La. -6 éque.nc.e. Mt
vaJU..ab.te. -6u--lvant .tu U pèC.M, e.,,~t ôoJtml • dans .te. C.M de. .t rilUu..Une. ~ium:Une.,
de. 34 audM amtné.ô.
De nombreux péricaryons sont révélés dans le système nerveux
central après fixation au Bouin hollande sublimé (bloc diagranune 2). Au
niveau des lobes optiques, deux groupes de cellules inununoréactives sont
détectés:
(1) le premier comprend quinze à vingt cellules dorsales de
taille moyenne qui envoient leurs axones vers la médulla (Pl. IV,figs. b,
e et f)
; (2) le second est constitué de deux cellules de taille moyenne
et d'une dizaine de très petites cellules situées ventralement au voisinage
de la lobula (Pl. IV,fig. b).
Dix groupes de cellules inununoréactives s'observent dans chaque
moitié du protocérébron (tableau 3) . La numérotation est faite de la région
antérieure vers la région postérieure.
Groupe cellulaire
Nombre de cellùles
Taille
Localisation
Figures
moyenne
centrale
Pl. IV,fig. e
2
4-5
petite
:paramédiane,dorsale:
Pl. IV,fig. e
3
2-3
petite
dorsale
4
~20
petite
latéro-ventrale
Pl. IV
g
1 f i g .
parasagittale
5
2-3
petite
~ [pevw intCJJtc.eftebJuLtto )
param'édiane
6
3
moyenne
: (paJv~ inteJtc.eJte.bJt4 ) Pl. IV,fig. h
7
5-6
petite
latéro-dorsale
8
5-6
petite
latérale
9
4
grande
dorsale
Pl. IV,fig. J
10
4-5
petite
latéro-dorsale
- 18 -
Trois groupes de quatre à s~x petites cellules sont
situés autour
du neuropile tritocérébral,respectivement en position latéro-ventrale
(Pl. IV,figs. c et dl,
latérale et dorsale (Pl. IV,fig. f).
Trois groupes symétriques de quelques cellules immunoréactives
(une ou deux) sont présents dans le ganglion sous-oesophagien:
(1) une
petite cellule médio-ventrale antérieure ; (2) deux petites cellules
latéro-ventrales ; (3) une cellule latérale de taille moyenne. Par ailleurs,
une grande cellule dorsale réagit à l'immunsérum dans la partie postérieure
du ganglion. Aucun corps cellulaire n'est détecté dans le ganglion frontal
bien que de nombreuses fibres soient intensément marquées (Pl. IV,fig. a)
Des terminaisons axonales présentes dans le
corps cardiaque
sont également
marquées.
Seules les cellules protocérébrales du groupe 9 sont détectées
sur coupes au cryostat (Pl. IV, fig. il.
Discussion
Des substances apparentées à l'insuline ont été détectées par
radioimmunoassay ou par immunohistochimie dans le système nerveux de
nombreux Insectes : Callipho~a vomitonia (Duve et Thorpe, 1979), Bombyx
moni (Yui et coll., 1980), E~t~ aen~ (El-Salhy et coll., 1980),
Mandu.c.a .6ex.:ta (E'l r-Sal.hy et coll., 1983), O.6tnirUa nu.b-i1.~ (Lavenseau
et coll.,
1984), Leptinot~a dec.0mtine~ta (Veenstra et- coll., 1985b).
Par ailleurs des peptides apparentés à l'insuline ont été décrits dans les
corps cardiaques (Tager et coll., 1976 ; Orchard et Loughton, 1980) et
dans l'intestin moyen (Ishay et coll., 1976 ; Moreau et coll., 1981
Lequellec et coll., 1982).
Des études récentes (Kramer et coll., 1982 ; Duve et Thorpe,
1984 ; O'Connor et Baxter, 1985) ont démontré que la séquence peptidique
de l'insuline des Insectes est très proche de celle de l'insuline mammalienne.
Ses fonctions seraient de même analogues à celles exercées par l'insuline
de Mammifères. Ainsi, elle joue le rôle de facteur hypoglycémiant et favorise
la pénétration du glucose dans les cellules adipeuses du rat (O'Connor et
Baxter, 1985).
La séquence peptidique de l'hormone prothoracotrope (PTTH) de
Bombyx mo-~ montre de grandes homologies avec celle de la chaîne A de
Bloc diagramme 3
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un iuwunsérum anti-motiline
(c)
: sur coupes à congélation
(p)
: sur coupes à la paraffine
pc
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.. ~~s;t~~~ii ':<'~~·f·.'"
'.!Y~V5~~~T1~~·~BW;;.'.
~t":~-;1~"~:~~~';
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,,~
~;:,"~;~~':f;fC ~~
~
~
- 19 -
l'insuline (Nagasawa et coll., 1985). Quoique la PTTR de Bombyx m~ ne
reconnaisse pas l'anticorps anti-cobaye dirigé contre l'insuline porcine
(Nagasawa et coll., 1985), il n'est pas exclu
qu'un immunsérum anti-insuline
ne puisse, chez d'autres Insectes, révéler des cellules de la p~ ~nt~c~eb~~
sécrétant la PTTR. Chez A~hna cyanea, nous avons pu observer, dans cette
partie du cerveau, deux types cellulaires qui réagissent à l'immunsérum
anti-insuline : de petites cellules parasagittales et de grandes cellules
latérales. Ainsi,
l'un ou l'autre de ces groupes cellulaires pourrait-il
intervenir dans le contrôle de la sécrétion des glandes ventrales, sources
de la PTTR.
3) Immunoréactivité .anti-motiline
La moûUne ~t un po.typeptide de 22 aud~ am~né,~ qtu, à. .t' o~g~ne ,
6ut -wo.té
de.t' ~nt~tin de pOl!.C (BJWWtl et coU., 1972). EUe do.c: Mn
nom au 6ail qu'e.t.e.e p~ovoque d~ co~~onô de .ta p~o~ ~tomaca.te. Une
~ub~tance app~entée à .ta motil1ne, Quo~que di66é~ente (B~n6e.e.d et
Ko~chak, ;985) a été éga.tement détec;tée danô .te c~veau des Mam~6è~~.
ObserJations sur coupes à congélation
De nombreuses fibres nerveuses immunoréactives s'observent dans
le cerveau (Pl.
V,fig. f) et le ganglion sous-oesophagien (Pl. V fig. d·).
Elles sont aUSSl présentes dans"le ganglion frontal (Pl. V fig. a) et dans
les lobes optiques, quoique moins abondantes. Des cellules immunoréactives
s'observent au voisin~ge des lobes optiques, dans la partie postérieure du
protocérébron et dans le ganglion sous-oesophagien (bloc diagramme 3).
Quelques cellules de taille moyenne, faiblement réactives existent
antérieurement au voisinage de la médulla~ Dans le 'protocérébron, les cellules
immunoréactives sont uniquement localisées dans la partie postérieure et cons-
tituent trois groupes symétriques:
(1) trois à quatre grandes cellules dorsales
(Pl. V, fig. c ) •. (2) que Lque svr a r e s petites
cellules latéro-dorsales, (3) une cellule
latéro-ventrale de taille moyenne. Dans le ganglion sous-oesophagien, les
cellules irnrnunoréactives apparaissent toujours de façon isolée. Des cellules
de taille moyenne à très grande, situées repectivement en position latéro-
dorsale et lat§ro-ventrale (Pl. V, figs. d et e) dans la partie
Bloc diagramme 4
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérurn anti-VIP (observation sur coupes
à congélation).
~;t.,....~t.\\.:
~
- 20 -
antérieure de chaque moitié du ganglion. De plus, deux cellules médio-
dorsales de taille moyenne et une cellule ventrale sont situées en
position sagittale (Pl. V,fig. e). PostérieurementJon observe une cellule
latéro-ventrale de taille moyenne et une cellule médio-dorsale. Seules)
quelques terminaisons axonales sont révélées par l'immunsérum anti-motiline
dans le
corps cardiaque .
Observations sur coupes à la paraffine
Quelques cellules non visibles sur coupes au cryostat s'observent
sur coupes à la paraffine. Dans le protocérébron, il s'agit de deux grandes
cellules paramédianes dorsales (Pl. V,fig. b), auxquelles s'ajoutent, de
façon inconstante, deux grandes cellules centrales. Par contre, certains
types cellulaires ne sont plus détectés ; ainsi les cellules latéro-dorsales
protocérébrales et les grandes cellules latérales du ganglion sous-oesophagien.
Discussion
Chez les Insectes, seuls,à ce jour Veenstra et coll.
(198Sb) ont
décrit une immunoréactivité anti-motiline chez le doryphore L~ptinot~~a
d~eemtin~ata ; la recherche
d'une substance apparentée à la motiline
ayant, préalablement, été tentée)sans succès)chez Manduca ~~xta (El-Salhy
et coll.,
1983).
4) Immunoréactivité anti-polypeptide intestinal vasoactif (VIP}
Observations sur coupes à congélation
Trois g~oupes symétriques de cellules protocérébrales réagissent
à l'immunsérum anti-VIP (bloc diagramme 4)
: (1) deux grandes cellules
rondes paramédianes (Pl. V,fig. 1), (2) cinq à six petites cellules latéro-
dorsales (Pl. V, fig. 1), (3) deux à trois petites cellules centrales parasagittales
(Pl. V,fig. 1). Dans le tritocérébron, quatre à cinq petites cellules
Bloc diagramme 5
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-VIP (observation sur coupes
Q
la paraffine).
~
~
~
~
,... 2.1 -
ainsi que 2 cellules latéro-dorsales de taille moyenne. Par ailleurs, 3-4 grandes
cellules protocérébrales dorsales réagissent de façon inconstante et leur
marquage, lorsqu'il est présent reste toujours très faible.
Seules,deux à trois cellules VIP-positives s'observent de façon
bilatérale dans la partie postérieure du ganglion sous-oesophagien.
Aucun corps cellulaire n'est détecté dans le ganglion frontal bien que des
fibres nerveuses soient marquées (Pl. V,fig. g). Du matériel immunoréactif
est également présent dans le
corps cardiaque
et des fibres nerveuses
apparaissent marquées dans la médulla et la lobula (Pl. V)fig. i).
Observations sur coupes à la paraffine.
A la suite d'une fixation au Bouin hollande sublimé. plusieurs groupes
/
supplémentaires de cellules réagissent au sérum anti-VIP (bloc diagramme 5).
Dans le protocérébron, quatre groupes symétriques de cellules
immunoréactives s'ajoutent à ceux précédemment décrits:
(1) deux cellules
latéro-dorsales antérieures (Pl. V,fig. h).
(2) une dizaine de petites
cellules latéro-ventrales antérieures, (3) trois à quatre petites cellules
paramédianes postérieures, (4) une ou. deux grandes cellules centrales.
- -------- -Dans le i::rùo-éé"r€bron,en
plus des cellules latéro-ventrales (Pl. V,
f~g. j),trois à quatre petites cellules dorsales (Pl. V, fig.k) ainsi qu'une
cellule de taille moyenne sont m~ses en évidence.
Dans le ganglion sous-oesophagien , trois paires de petites cellules
médio-dorsales, deux paires de petites cellules médio-ventrales et une paire
de cellules médio-ventrales de taille moyenne sont situées antérieurement.
Une seule cellule ventrale de taille moyenne et une paire de ceilules latéro~
. _.
~l:!ntr~les_ s'observent plus postérieurement.
Discussion
Comme chez les Mammifères, du matériel apparenté au VIP est présent
à la fois dans l'intestin moyen (Andries et Tramu,
1984) et dans le système
nerveux d'A~hna Qyanea. Du matériel apparenté au VIP a été précédemment
décrit dans le système nerveux de P~pfaneta am~Qana (Fujita et coll., 1981)
et dans celui de ManduQa ~exta (El-Sahly et coll., 1983). Par contre, Veenstra
et coll.
(1985b) n'ont pas décelé d'immunoréactivité anti-VIP chez
Lep:tinotaJtOa deQeYnÜ.neata. Bien que des différences puissent exister entre
insectes d'espèces différentes, il semble vraisemblable que celles-ci soient,
comme cela est le cas chez l'aeshne,_dues à l'utilisation de fixateurs différents
et/ou à la sensibilité de l'immunsérum utilisé.
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- 22 -
5) Immunoréactivité anti-somatolibérine
Le.o .6omUolibéJrJ.n.e.o [GRF)
ou 6ac..te.uJt.6 de. libé.Jtaü.on. de. .f..'hoJtrnDn.e.
de. CJto.0.'>.6anc.e. htjpophtj.6a.Â.Jte. orU: été ·.0.'>o.f..ée.o Jtéc.e.mme.rU: de. tume.u.M panc./téatique..6
de. paü.e.nU atieJ..n.:t.6 d' ac.Jto mé galie. (Gt..U..U e.mtn. e.t c.oU., 1982 ; Riv-te.Jt et
c.oU., 1982). I.f...6' ag,i;t de. deu. x pe.ptide.o t/tè.6 vo.0.'>iYl.-6 c.o npoJttarU: Jte.o pe.c.tiv e.me.Y!.t
40 et 44 ac.-i.de.o amtn.é..6. P.f..u.6 Jtéc.e.mme.n.t e.n.c.oJte., Spie.o.6 et c.oU.
(1983) aM
.0.'> o.f..é un.e. .6 a rrrUo libéJt-i.n.e. htjpotha1..a.mtque. [Jth GRF) .
L'immunsérum que nous avons utilisé est dirigé contre le hp (1-44)
GRF. Les résultats sont identiques sur coupes au cryostat et sur coupes à la
paraffine (bloc diagramme 6).
Plusieurs groupes de cellules immunoréactives sont localisés dans
le cerveau d'Ae.ohYLa c.tjan.e.a. Plus d'une cinquantaine de petites cellules
(12-15 ~m de diamètre) sont situées en position latérale)dans la partie
antérieure,au voisinage des lobes optiques. Des fibres nerveuses issues de
ces péricaryons pénétrent dans la lamina (Pl. VI, fig. a). Des groupes symé-
triques de cellules immunoréactives sont situés dans la partie postérieure
du protocérébron. Le premier d'entre eux est situé latéro-dorsalement)à
proximité des lobes optiques et comprend quatre à cinq petites cellules
(12-15 um de diamètre) (Pl. VI,figs.d et f). Quatre à cinq grandes cellules
piriformes (25-30 ~m de diamètre), situées en position plus médiane,constituent
le second groupe (Pl. VI,figs. d, f et h). Le troisième groupe est composé
de deux petites .cellules média-centrales (15 ~m de diamètre). Par ailleurs,
une ou deux petites cellules latérales (Pl. VI,fig. f) et autant de cellules
de grande taille (Pl. VI,fig. h) paramédianes réagissent faiblement et de
façon inconstante à l'immunsérum.
De nombreuses fibres intensément marquées s'observent dans les
n.e.Jtvi c.oJtpon-<..o c.aJtd-i.ac.-i. (nccI) (Pl. VI,fig. b) de même que leurs terminaisons
dans le
corps cardiaque . Dans le tritocérébron, quatre paires de petites
cellules immunoréactives (15 ~m de diamètre) sont observées en position
latéro-ventrale,à proximité du neuropile tritocérébral (Pl. VI,fig. c).
Des cellules hp GRF positives sont également présentes dans le
ganglion sous-oesophagien. Deux groupes de petites cellules (15 ~m de
diamètre) (deux à trois paires de cellules dorsales et autant de ventrales)
sont localisés dans la partie antérieure,en position sagittale (Pl VI,fig. ~).
Une grande cellule (30 ~m de diamètre) est située ventralement dans la partie
postérieure (Pl. VI,fig. g) tandis que deux grandes cellules situées plus
- 23 -
postérieurement, en position latérale ou latéro-ventrale sont faiblement
marqu~es. Aucun corps cellulaire n'est détecté lorsque l'anticorps anti-hp
GRF est saturé par l'antigène correspondant.
Discussion
Une irnmunoréactivité anti-hp GRF a également été décelée dans le
tube digestif d'AeAhna Qyanea (Andries et Tramu, 1984, 1985a) et de
Blab~~ ~Ô~ (Andries et Tramu 1985b). Elle est également détectée
dans le cerveau des Annélides (Dhainaut-Courtois et coll., 1986). Jusqu'à
présent, elle n'a pas été mentionnée dans le système nerveux des Insectes,
très probablement en raison de la découverte toute récente de ce peptide.
Par sa séquence peptidique, le GRF s'apparente aux peptides de
la famille de la sécrétine et du VIP. Entre les positions 1 et 7 de son
extrémité N-terminale, le GRF possède en effet 4· résidus identiques avec
le VIP, 3 avec la sécrétine et 2 avec le glucagon. Il est de ce fait env~­
sageable que le sérum anti-hp GRF puisse reconnaître un peptide de cette
famille. Nous avons mentionné,préalablement,l'existence d'une irnmunoréactivité
anti-VIP chez les Insectes. De même des substances apparentées respectivement
à la sécrétine (El-Salhy et coll., 1980, 1983) et au glucagon (Tager et coll.,
1976 ; El-Salhy et coll., 1983 ; Raabe,. 1985) ont été mises en' évidence
dans leur système nerveux.
6) Irnmunoréactivité anti-gastrolibérine (GRP)
Le GRP est: W1 heptaQo-5 apeptide (27 audeA ami.né,.,~l qui out -<A oté.
en 1979 pan MQ Vonatd et Qott. à p~ de t'eAtomaQ de ponQ. La -5équenQe
deA 10 acoies ami.nû de Mn edJtémi.té
C-t~mi.nate eAt identique, à W1
aude ami.né.· pnè..6)à Q~e de ta bombûine, un tmadé.Qapeptide ~oté de
la peau d'Amphibien (An~t~i et Qott., 1971).
Peu de cellules réagissent à l'immunsérum anti-GRP. Elles se
limitent à 4 grandes cellules sagittales (Pl. VII.fig. a) de la partie
antérieure du p ro t o cê rêb ron et à une
'ou deux petites cellules latéro-
dorsales (Pl. VII,fig. b), lesquelles sont faiblement réactives alors que les
fibres serveuses apparaissent toujours très nettement marquées (Pl. VII.fig. c).
- 24 -
Au n~veau du tritocérébron, l'immunoréactivité reste exclusivement
localisée dans les fibres nerveuses du neu rop i.Le (P;. VII,fig.d).; aucun
corps cellulaire n'apparaissant marqué. Il en est de même pour les ganglions
sous-oesophagien (Pl. VII fig. e) et frontal.
Discussion
La séquence des acides aminés du GRP est vo~s~ne de celle de
la bombésine et le marquage anti-GRP disparaît après absorption de l'immun-
sérum par la bombésine (du moins chez les Insectes) (Veenstra et Yanaihara,
1984). Pour ces raisons, nous parlerons d'immunoréactivité anti-GRP/bombésine.
Une réaction anti-GRP/bombésine a été observée dans le système
nerveux de nombreux insectes (Veenstra et Yanaihara, 1984) quoiqu'elle
n'ait pu être démontrée chez tous les Insectes étudiés (El-Salhy et coll.,
1980, 1983 ; Veenstra et Yanaihara, 1984). Si,dans quelques espèces, des
neurones immunoréactifs sont obseryés dans les mêmes régions du cerveau en
nombre sensiblement constant, dans d'autres, leur nombre diffère nettement,
allant d'un seul groupe de 4 cellules (MU.-6ca dom~tica)
à plusieurs centaines
de cellules (Lo~ta mi~atonia), du moins si l'on inclut les lobes optiques.
Rappelons que chez l' ae s hne , le nombre de cellules réagissant à l'immunsérum
reste tou~ours
très faible.
Le dipeptide de l'extréQité C-terminale du GRP est identique à
celui de la substance P, ce qui rend envisageable une possible réaction
croisée entre le GRP et la substance P (Roth et coll., 1982). Co~me nous
le verrons, bien que nous ayons mi.s en évidence des fibres nerveuses par
l'immunsérum anti-substance P, nous n'avons pas réussi à détecter de
corps cellulaire. Comme, par ailleurs, la disposition des fibres nerveuses
immunoréactives à l'un et à l'autre des immunsérums diffère, il ne semble
donc pas que l'éventualité d'une réaction croisée puisse être retenue.
7) Immunoréactivité anti-substance P
CorWttUAe.rœYL-t aux aiunes pe.ptid~ du J.JtjJ.Jtèrœ e.YL-téJtO-gMtJw-pan.CJtéatique.,
fa J.JubJ.Jtance. P 6ut d'aboJtd ~ofée. de. f'htjpothafa~
(Chan.g e.t Le.e.man,
1970 ; Chan.g e.t colf., 1971) avaYL-t de. f'itfte. de. f'~YL-t~tin. [Stude.Jt e.t
colf., 1973). If J.J' ag,U: d'un. pe.ptide. de. 11 aci.des amin.u dont: f~ 60n.c.tiorv.'> ~
e.n.coJte. mû déMM~ à ce. j OUlt) appa.JuLW~~ e.YL-t rruLûpf~ : trOdu1.ation. de. fa
rro~é. ~YL-te.J.Jtin.afe., tJtaM miM~On. de. f' ~n.6oJtrra;t{.on. YlOuce.ptive. ...
~ .25 -
Bien qu'une réaction modérée soit observable au niveau de certaines
fibres nerveuses protocérébrales (Pl. VII,fig. f) aucun corps cellulaire
n'a été détecté avec certitude que ce soit dans le cerveau, le ganglion
sous-oesophagien ou le ganglion frontal. Une réaction plus nette s'observe
par contre au niveau des terminaisons nerveuses présentes dans le
corps
cardiaque
(Pl. VII,fig. g).
Discussion
Préalablement à notre étude, une immunoréactivité anti-substance P
a été démontrée dans le cerveau (El-Salhy et coll.,
1980, 1983 ; Benedeczky
et coll.,
1982) et les corps cardiaques (Hansen et coll.,
1982) d'Insectes.
Elle est également présente dans les cellules endocrines du tube digestif
(Andries et Tramu, 1984, 1985a et b ) .
II - LOCALISATION DE CELLULES RENFE~~T UN MATÉRIEL
APPAREI~TÉ À DES OPIOlDES
Au C.OuM de. fa dvuu.èJte. déc.e.YlMe., p.tu..6~e.uM pe.pude.-6 ayant des
ac.tiv..Ltu b~ofo g.lqUe.-6 de. type. rro/tph.UUque. ont été A...6ofu ch«z fu Mammt6è./te.-6
e.t /te.gttoupu daYl)., fa 6amû1.e. des op~o~de.-6. I.t6 cc rrp/te.YlYle.nt de.ux pe.Yltape.pudu,
fa fe.uuYle. et: fa rrét~OMYle. e.Ylképh~Yle.-6, A...6ofé.6 dè..6 1975 dans fe. c.e./tve.au
(Hughe.-6 et c.oU. ) et des rroféc.ufe.-6 de. pfM gttaYlde. t~e. c.onte.rtaYlt fa .6 éque.Ylc.e.
pe.pu~que. de.-6 e.Ylképh~Yle.-6 c.o~ f'a-Yléo-e.Yldo/tp~Yle.
(KaYlgavJa e.t c.ott.,
19(9) et fa dYYlo/tp~Yle. (Gofd6tuYl et c.oU., 19(9) q~ c.o rrp/te.YlYle.nt /tu pe.c..tiVe.lfen;t
9 et 17 aude.-6 amtYlu.
Che.z fe.-6 Mamtrn:.6 ënes , ttto~ p/téC.uM e.uM pote.Yltiw de.,,~ e.rtképh~Yle.-6
.6ont C.OYlYlU.6 : fa p/toop~ome.faYlOc.otttiYle. (Nak~~ et c.oU., 1979 J, fa p/toe.Ylké-
phaf-tYle. (Comb et c.oU., 1982, Noda et c.oU., 1982, Gubfe.tt et c.oU., 1982 Jet
fa p/todYYlo/tp~Yle.. (K~d~ et c.oU., 1982 J. La p/toe.Ylképh~Yle. mammalie.YlYle.
/te.Yl6e.ttme 6 c.op~u de. me.t-e.Ylképh~Yle. et UYle. de. fe.u-e.Ylképh~Yle.,
fa p/toop~omé.­
faYloc.ottUYle. UYle. .6 e.ufe. met- e.Ylképh~Yle. et fa p/tO dYYlo/tp~Yle., qui e.-6t fe. p/téC.uM e.U!t
de. fa dYYlo/tp~Yle. et de. f'a-Yléo-e.Yldo/tp~Yle.,
3 c.op~e.-6 de. fe.u-e.Ylképhaf-tYle..
Ayant à notre disposition 4 antisérums : anti-mét-enképhaline,
-leu-enképhaline, -a-néo-endorphine, -dynorphine, nous avons réalisé une
étude comparative en incubant de façon alternée des coupes sériées avec l'un
ou l'autre de ces anticorps.
Bloc diagramme 7
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-leu-enképhaline.
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~..:.?~:;~6 ~.'~
~.:.-i-if·.~
- 26 -
Comme pour un même anticonps, la réactivité observée sur coupes
au cryostat et à la paraffine n'est pas forcément identique, nous avons
tenu
à comparer les résultats obtenus avec des procédures de fixation."
différentes. Cela
est
réalisable lorsque les groupes de cellules immuno-
réactives sont relativement importants et suffisamment isolés les uns des
autres.
1) Immunoréactivité anti-leucine-enképhaline
Observations sur coupes à congélation
Une seule cellule réactive de taille moyenne est détectée au
voisinage des lobes optiques (Pl. VIII, figs. a et b ) bien que de nombreuses
fibres immunoréactives soient observées dans la médulla et la lobula. A
noter cependant deux cellules situées non loin de la médulla, réagissant
l'une faiblement, l'autre modérément à l' immunsérum anti-leucine-enképhaline
(Pl. VIII,fig. a).
De nombreux groupes symétriques de cellules leu-enképhaline
positives
sont observés dans le protocérébron (tableau 4, bloc diagramme 7). Dans la
partie antérieure, un pre6ier groupe est constitué de deux à trois cellules
paramédianes de taille moyenne (Pl. VIII,fig. b).Deux paires de très grandes
cellules sagittales (40 ~m de diamètre) forment le second groupe (Pl. VIII,
fig. c). Plus postérieurement, deux grandes cellules paramédianes sont très
faiblement,voire' non immunoréactives (groupe 3)
(Pl.-VIII~fig. e ) tandis
que quatre à six cellules (Pl. VIII
d), intensément marquées, sont situées
1 f i g .
dorsalement (groupe 4). Quatre groupes composés de deux à quatre ou cinq
petites cellules sont,respectivement,situés en position latéro-dorsale
(groupe 5)
(Pl. VIII,fig. e ) , latérale (groupe 6)
(Pl. VIII)fig. e ) centrale
(groupes 7 et 8)
(Pl. VIII,fig. d) et v~ntrale (groupe 9). Trois grandes
cellules, modérément à intensément immunoréactives}9'observent respectivement
en position latéro-dorsale (groupe 10), latéro-ventrale (groupe II) (Pl. VIII,
fig. e) et latérale (groupe 12). Des fibres nerveuses des n~v~ ~o~po~
~~dia~ (nccI) et leurs terminaisons axonales dans le
corps cardiaque
apparaissent marquées. Quelques rares petites cellules immunoréactives sont
présentes, certaines ventralement, d'autres dorsalement par rapport au
neuropile tritocérébral. Seules des fibres nerveuses sont observées dans
le ganglion frontal.
De la partie antérieure à la partie postérieure du ganglion
sous-oesophagien, six groupes symétriques de cellules réagissent à l'immun-.
sérum anti-leu-enképhaline (tableau 5). Le premier d'entre eux est constitué
de deux paires de petites cellules médio-ventrales, (Pl. IX,fig. a);le second
Etude comparative ap r
s
i.ncuo at i on avec les serums an c r-me c-e ns ep o a
ë
i i ue ,
-u-ut::u-t::uuuJ.PU.Llu::,
-dynorphineo
+
.
Intensités:
(-)
très faible,
inconstanteJ(+)
faible\\ {++) forte
Intensité du marquage
Réactivité
sur coupes &. congélation
sur coupes à la paraffine
Groupe
Nombre
faille
:Localisation ;leu-enké- :met-enké-:
a-néo-
dynor-
: leu-enké:': me t-enké-:
a-néo-
:
dynor- °
: cellulaire
de cellules
phaline
: phaline
:endorphine: phine
~ phaline : phaline
:endorphine: phine
2-3
moyenne
: p ar amêd i ane .:
+ +
:+-
:
:
2
2
très grande :
sagittale :
+
+'
:
:
:
:
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- +
3
2-3
grande
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:
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+
+
+
+
+
dorsale
+
+
4
4-6
petite
:
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:
+
+
+
- -
+
5
3-4
pe tite
:latérodorsa:be;
+
:- -
:
+
6
2-3
petite
:
latérale
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-
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+
+
- -
7
2
peti te
:
centrale
:
+ +
+ +
+
+
:
:
:
:
+
+
8
2
petite
:
centrale
:
:
:
:
+
9
4-5
petite
:
ventrale
:
-
à +
:
.
.
.
.
.
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.
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°
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+
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o
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1 1
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Réactivité
Intensité du marquage
sur coupes à congélation
sur coupes à la paraffine
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Nombre
Taille
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:Localisation "1
1
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: phaline
:endorphine: phine
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.
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. phaline
: phaline
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+
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-
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:
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2
2-3
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+
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grande
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3
1
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+
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·
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4
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1
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+ +
-
+
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·
.
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5
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très grande
:latéroventral~
+ +
+
-
+
+
·
.
·
.
6
moyenne
;latéroventral~
+ +
+
Tableau 5
Localisation des cellules du ganglion sous-oesophagien réagissant au sérum anti-
leu-enképhaline.
Etude comparative après incubation avec les sérums anti-met-enképhaline,
-a-néo-endorphine, -dynorphîne.
Intensités:
(:!:)
très faible,
i ncon s t ant e j G )
faible~(++) forte
N
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Bloc diagramme 8
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-met-enképhaline.
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~
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- 29 -
regroupe deux à trois cellules dorsales de taille moyenne. Chacun des
quatre autres groupes ne comporte qu'une seule grande ~ voire très grande,
cellule localisée respectivement en position latéro-dorsale (Pl. IX,fig. c),
latéro-ventrale (Pl. IX,fig. e) ou latérale (Pl. IX,fig. f).
A l'exception des grandes cellules sagittales situées dàns la
partie antérieure du protocérébro~, l'immunoréactivité est supprimée lorsque
Il immunsérum anti-leu-enképhaline est saturé par l'antigène correspondant
(5 mg/ml de sérum non dilué).
Observations sur coupes à la paraffine
Les résultats obtenus sur coupes à la paraffine après fixation au
Bouin
hollande sublimé ne sont pas comp létement superposables à ceux
obtenus sur coupes au cryostat après fixation au PAF (tableaux 4 et 5).
Les résultats observés sur coupes à la paraffine sont inconstants ; parfois
aucune cellule protocérébrale n'est détectée (seulement quelques rares
cellules du ganglion sous-oesophagien le sont), parfois la plupart des
cellules réactives observées sur coupes au cryostat apparaissent marquées
(cf.
tableaux4 et S·et bloc diagramme 7). Dans ces cas cependant, certaines
cellules ne sont pas marquées (groupes l, 2, 3, 5 et 9 du protocérébron)
alors que d'autres cellules, non détectées précédemment, apparaissent
faiblement marquées (c'est le cas de trois à quatre grandes cellules dorsales
et de deux grandes cellules centrales de la partie postérieure du protocérébron
a~nsi que de petites cellules parasagittales de la partie antérieure du
ganglion sous-oesophagien).
2) Immunoréactivité anti-méthionine-enképhaline
Le nombre de cellules réagissant, sur coupes au cryostat à
l'immunsérum anti-méthionine-enképhaline est moins important que celui
des cellules leu-enképhaline
positives (tableaux 4et 5, bloc diagramme 8).
Ainsi, seules les cellules des groupes 3, "S, 7, 8 et Il du protocérébron
(Pl. VIII,fig. f) et des groupes 3, 4 et 5 du ganglion sous-oesophagien
(Pl. IX,figs. b et d) présentent une immunoréactivité anti-met-enképhaline.
De façon générale, les dépôts immunoréactifs sont moins intenses quand
l'immunsérum anti-met-enképhaline est utilisé au lieu de l'immunsérum anti-
leu-enképhaline, exception faite des cellules du groupe 7 et surtout de celles
du groupe 3 (Pl. VIII,fig. f) qui présentent un marquage plus net. Par ailleurs,
six à huit petites cellules de la p~ int~~e~eb~~6 sont observées de
façon inconstante et leur marquage, lorsqu'il existe, est particulièrement
faible. Les fibres des n~vi ~o~po~ ~~dia~ (nccI) apparaissent fortement
- 30 -
Tableau 6
Localisation des groupes cellulaires protocérébraux réagissant.
après fixation au Bouin hollande sublimé, au sérum an t i.r-u-rnêo-:
endorphine.
Intensités:
(+) faible, (++) forte,
(+++) très forte
Groupe
Nombre
intensité
Taille
.Localisation
figures
: ce l l.u l a i re
de cellules
: du marquage
- .
5-6
grande
+
paramédiane
.
5-6
petite
-
+++
2
'" 10
:moyenne
paramédiane
+
Pl X~fig. b
3
'" 20
petite
dorsale
++
Pl X)fig. b
paramédiane
4
grande
++
dorsale
5
5
petite
dorsale
+
6
12
petite :latéroventrale:
+
p ar amêd i.ane
+
7
nombreux
;>etite
dorsale
8
3
grande
paramédiane
+t-
:Pl X,figs. e et g:
9
grande
latérodorsale:
++
:
10
6-8
petite
latérodorsale:
+
Pl X,fig. e
11
grande
latérale
++
12
3-4
petite
latérale
+
'-
Pl X, fig. e
.
-
13
3
grande : l at rove n
ê
t r a l s :
++
.
-
Pl x,figs.
14
4
grande
dorsale
+++
e, g, et i
15
4
grande
centrale
++
16
5-6
petite :latérodorsale
++
17
2
grande
ventrale
+++
Pl X,fig. i
Bloc diagramme 9
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-a-néo-endorphine
(observation sur coupes à congélation).
;~~r::~~t1rJ1iJ' '~. ,;';;:..
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~.•.."...~tof:'
~
- 31 -
marquées ainsi que leurs terminaisons dans le
corps cardiaque . Quelques
rares fibres ,s'observent dans le ganglion frontal.
Sur coupes à la paraffine, après fixation au Bouin hollande sublimé,
la principale différence concerne le~ grandes cellules sagittales (groupe 2)
de la partie antérieure du protocérébron qui apparaissent marquées par
l'immunsérum anti-met-enképhaline.
Lorsque l'immunsérum anti-met-enképhaline est saturé par un
excès de leu-enképhaline (5 mg/ml de sérum non dilué) le marquage persiste,
particulièrement dans le
corps cardiaque
(Pl. VIII,figs. i et j) et les
très grandes cellules symétriques latéro-dorsales et latéro-ventrales
(Pl. VIII)figs. g et h) du ganglion sous-oesophagien.
3) Immunoréactivité anti-a-néo-endorphine
Observations sur coupes à congélation (bloc diagramme 9)
Quelques rares petites cellules latéro-dorsales et deux grandes
cellules
dorsales
pararnédianes
s'observent
de façon symétrique
dans
la
partie postérieure
du
protocérébron.
Dans
le
tritocérébron,
deux
à trois
cellules
faiblement
marquées
sont situées
ventralement,
taûdis
que deux
cellules
de
.taille
moyenne
s'observent
latéro-dorsalement
(Pl. IX,fig. h). Ces dernières (Pl. IX,fig. i) ainsi que les nombreuses
fibres nerveuses protocérébrales restent marquées lorsque l'immunsérum
anti-a-néo-endorphine est saturé par un excès de leu-enképhaline (5 mg/ml
de sérum non dilué). Seules des fibres nerveuses apparaissent marquées dans
le ganglion frontal. Bien qu'aucun corps cellulaire ne soie détecté
avec
certitude, sauf une paire de petites cellules sagittales très antérieures, quel-
ques fibres nerveuses,modérément à fortement marquées,sont visibles dans le
neuropile du ganglion sous-oesophagien. Certaines terminaisons nerveuses, présentes
dans le
corps cardiaque ,sont également marquées.
Observations sur coupes à la paraffine (bloc diagramme 10)
De nombreuses cellules irnmunoréactives apparaissent à la fois dans
le cerveau et les ganglions sous-oesophagien et frontal.
Dans le ganglion frontal, une dizaine de grandes cellules (Pl X,fig.a)et une
soixantaine de petites cellules sont marquées (Pl. X,fig. c). Deux populations
de neurones envoient leurs axones vers les lobes optiques:
(1) antérieurement
plus d'une centaine de petites cellules sont faiblement marquées; (2) cinq
à six cellules de taille moyenne, fortement iHrnunoréactives sont situees
plus postérieurement (Pl. X,fig. d). Une troisième population d'une vingtaine
de cellules de taille moyenne est située dans la
partie latéro-dorsale du
Bloc diagramme \\0
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-a-néo-endorphine
(observation sur coupe; à la paraffine).
1~
9
~lg~)~t~:,
= - - - -
~
lJ9
- 32 -
:Groupe cellulaire
Nombre de cellules
Taille
Localisacion.
Figures
2-3
petite
médiodarsale
Pl X fig. f
2
4
petite
:médioventrale : Pl X figs. f et h:
dorsale à
3
4-5
grande
: Pl X figs. f, h, j:
:latérodorsale
très
4
:latérodorsale
Pl X fig.
grande
J
5
2
moyenne
médiodorsale
r
6
grande :latéroventrale:
7
2-3
petite
ventrale
8
moyenne :médioventrale
9
3-4
petite :latéroventrale:
la
: c moyenne
:médioventrale
11
5-6
moyenne
médiodorsale
12
.. moyenne
latérale
Tablea].l 7
Localisation des groupes cellulaires du ganglion sous-oesophagien
réagissant, après fixation au Bouin hollande sublimé, au sérum
anti-a-néo-endorphine.
- 33 -
protocérébron au voisinage de la médulla sans qu'on puisse affirmer que
ses cellules innervent les lobes optiques.
De la partie antérieure à la partie postérieure du protocérébron
sont distingués dix sept groupes symétriques de cellules immunoréactives
(tableau 6).
Dans le ganglion sous-oesophagien, douze groupes de cellules
réagissant à l'immunsérum anti-a-néo-endorphine sont mis en évidence
(tableau 7).
4) Immunoréactivité anti-dynorphine
Seules,quelques cellules réagissent à l'immunsérum anti-dynorphine
et la réaction reste tou}ours
très modérée.
L'immunoréactivité concerne essentiellement deux cellules symétriques
dorsales paramédianes (Pl. IX,fig. g) et autant de petites cellules
latéro-dorsales de la partie postérieure du protocérébron. Parfois, les
grandes cellules du ganglion sous-oesophagien qui réagissent aux immunsérums
anti-met- et -leu-enképhalines apparaissent faiblement marquées,de même
que quelques rares petites cellules situées dans la partie antérieure de
façon: sagittale. Enfin,une cellule faiblement immunoréactive s'observe au
voisinage de la médulla. Le
corps cardiaque
ainsi
que les n~v~
~o~po~ ~andia~ (nccI; apparaissent faiblement marqués et la réaction
persiste lorsque l'immunsérum anti-dynorphine est saturé par un excès de
leu-enképhaline (5 mg/ml de sérum non dilué).
Aucun marquage n'est observé après fixation au Bouin hollande sublimé.
Discussion
Dans une m~se au point récente, Udenfriend (1984) affirmait que
les substances apparentées aux enképhalines mises en évidence chez les
Invertébrés se comportent, en HPLC, différemment des opioides mammaliens.
Il en concluait qu'elles ne peuvent dériver de la proenképhaline ou de la
prodynorphine.
Cependant, l'existence,dans le cerveau de la blatte,de
sites
de liaison ayant une grande affinité pour un analogue de la met-enképhaline
(Stéfano et Scharrer, 1981) plaide en faveur d'un rôle des opiacés dans le
système ne rveux de s insecte s. Par ailleurs, depuis la mise au p.oint d' Udenfriend,
Leung et Stéfano (1983) ont déterminé la séquence peptidique d'opioides
présents chez la moule My.:tû.U!.J e.d~ et démontré qu'il s'agit des "véritables,"
leu- et met-enképhalines. De même, dans la glande
du sinus de
- 34 -
CancinU6 maenao, Jaros et coll. (1985) ont m~s en évidence des substances
radioimmunoactives'ayant des temps de rétention identiques à ceux des
met- et leu-enképhalines de synthèse.
Chez les Insectes, seules les substances apparentées aux enképhalines
(Cros et coll., 1978 ; El-Salhy et coll., 1980, 1983 ; Rémy et Dubois, 1981 ;
Hansen et coll., 1982 ; Pages et coll., 1983 ; Romeuf et Rémy, 1984
Verhaert et De Loof, 1985) et aux endorphines (Rémy et coll., 1978, 1979
El-Salhy et coll., 1980, 1983.
; Hansen et coll., 1982
Duve et Thorpe,
1983 ; Veenstra et coll., 1985b) ont été démontrées,soit dans le système
nerveux central,soit dans les corps cardiaques.
Une comparaison, cellule à cellule, entre différentes réactions
s'avère souvent difficile à cause des variations enregistrées dans l'intensité
du marquage,et parfois même dans le nombre de cellules réactionnelles,
probablement en relation avec l'état physiologique,à moins que ce ne soit
avec un éventuel cycle nycthéméral. De plus, les résultats obtenus different
souvent selon les fixateurs,et éventuellement,les méthodes d'inclusion utilisés.
Enfin,certains groupes ne contiennent qu'une ou quelques rares petites cellules,
qu~ ne se retrouvent pas forcément sur deux coupes sériées. C'est pourquoi
nous nous sommes intéressé ,dans notre étude comparative,aux seuls groupes
cellulaires suffisamment aisés à reconnaître cl'une préparation à l'autre:,
et dont la réactivité aux différents anticorps était reproductible.
Suivant leur immunoréactivité aux différents sérums testés, les
cellules peuvent être classées en quatre groupes ~ (1) cellules réactives
aux immunsérums anti-leu, -met-enképhalines et -a-néo-endorphine. Ce sont
les grandes cellules du ganglion sous-oesophagien et trois groupes de cellules
protoeérébrales : les grandes cellules paramédianes, les petites cellules
latéro-dorsales et une grande cellule latéro-ventrale. La plupart d'entre
elles réagissent également à l' immunsérum anti-dynorphine. Les grandes cellules
du ganglion sous-oesophagien restent toujours marquées après saturation de
l'immunsérum anti-met-enképhaline par un excès de leu-enképhaline. (2) cellules
réagissant aux immunsérums anti-leu-enképhaline et -a-néo-endorphine : c'est
le cas des petites cellulès paramédianes de la partie antérieure du protocérébron
et de deux paires de grandes cellules centrales de la partie postérieure du
protocérébron,ainsi que d'une paire de cellules dorsales antérieures de taille
moyenne d~ ganglion sous-oesophagien. (3) cellules réagissant uniquement à
l'immunsérum anti-a-néo-endorphine : il s'agit des cellules du ganglion frontal,
- 35 -
des cellules latéro-dorsales du tritocérébron et,
dans le ganglion
sous-oesophagien, de cellules
dorsales à latéro-dorsales antérieures,
ainsi que de petites cellules latéro-ventrales postérieures. Le marquage
persiste lorsque l'immunsérum anti-a-néo-endorphine est saturé par un
excès de leu-enképhaline. (4) Cellules réagissant uniquement à l'immunsérum
anti-leu-enképhaline. Nous avons observé d'autre part, sur coupes à la
paraffine, un groupe de quatre à cinq grandes cellules piriformes dans la
partie postérieure du protocérébron,et, d'autre part, sur coupes au cryostat
(fixation faite au PAF), un groupe de petites cellules ventrales protocérébrales.
Les grandes cellules sagittales,présentes dans la partie antérieure
du protocérébron,réagissent aux immunsérums anti-leu et -met-enképhalines.
Cependant, le marquage n'est pas spécifique puisque la réaction persiste
lorsque l'irnmunsérum anti-leu-enképhaline est saturé par l'antigène correspondant.
L'a-néo-endorphine et la dynorphine 17 correspondent à une molécule
de leu-enképhaline pourvue d'une extension C-terminale
comportant respectivement
4 et 12 acides aminés. Il est,de ce fait,vraisemblable qu'elles puissent
être les précurseurs de la leu-enképhaline. C'est pourquoi il était intéressant
de vérifier si l'immunsérum anti-leu-enképhaline révèle également les cellules
détectées par les immunsérums anti-a-néo-endorphine
et -dynorphine et V1ce
versa. Bien que les réactions soient toujours très faibles, sur coupes au
cryostat, particulièrement avec les immunsérums anti-dynorphine et -a-néo-
endorphine, il est évident que certaines cellules réagissent à la fois aux
irnmunsérums anti-leu-enképhaline, -dynorphine et -a-néo-endorphine. Ainsi,
il est tentant de penser que les réactions obtenues avec les immunsérums anti-
a-néo-endorphine et -leu-enképhaline (et quelquefois
avec l'immunsérum anti-
dynorphine) détectent la présence d'un peptide apparenté à la famille de
la prodynorphine.
Bien que l'a-néo-endorphine contienne la séquence de la leu-enképhaline,
plusieurs groupes cellulaires marqués par l'immunséTum anti-a-néo-endorphine
ne le sont pas
par l'immunsérum anti-leu-enképhaline. Ce résultat est renforcé
par le fait que certaines cellules et fibres nerveuses qui réagissent à
l~immunsérum anti-a-néo-endorphine restent marquées lorsque l'immunsérum est
saturé par un excès
de leu-enképhaline. Ainsi, l'immunsérum anti-a-néo-endorphine
semblerait plutôt dirigé contre l'extension C terminale de la molécule que
vers la séquence leu-enképhaline. Il est non moins remarquable que certaines
cellules,qui réagissent à l'immunsérum anti-leu-enképhaline,ne sont pas
marquées par l'immunsérum anti-a~néo-endorphine. Cependant, leur nombre
réduit,et plus particulièrement l'inconstance et la faiblesse de leur marquage
- 36 -
ne permettent pas de tirer de conclusions définitives, si ce n'est qu'elles
constituent une preuve supplémentaire
de la spécificité de nos sérums.
La détection d'immunoréactivités anti-leu~enképhaline et -met-
enképhaline dans une même cellule peut s'expliquer
par la présence d'un
précurseur commun à la met- et à la leu-enképhaline et de ce fait apparenté
à la proenképhaline.
Les tests de spécificité concernant les irnrnunsérums anti-leu et
anti-met-enképhalines ont été précédemment décrits (Tramu et coll., 1981).
Par RIA, il a été démontré que la met-enképhaline ne se fixait pas "à
l'immunsérum anti-leu-enképhaline,et qu'un excès 250 fois molaire de leu-
enképhaline était nécessaire pour inhiber la fixation de
met-enképhaline.
Par ailleurs ,la méthode d'immunohémolyse passive indirecte a perDis de
montrer que l'immunsérum anti-leu-enképhaline montre deux fois plus dtaffinité
pour la leu- que pour la met-enképhaline,alors que l'immunsérum anti-met-
enképhaline se fixe 10 fois plus facilement à la met- qu'à la leu-enképhaline.
La grande spécificité de l'immunsérum anti-met-enképhaline peut
ainsi expliquer que, dans notre matériel, particulièrement dans les grandes
cellules du ganglion sous-oesophagien, aucune réaction croisée ne soit détectée
entre les sérums anti-met et -leu-enképhalines. Ces cellules apparaissent
parfois faiblement marquées sur coupes au cryostat par l'irnmunsérum anti-
dynorphine,alors que la réaction est plus importante sur coupes à la paraffine
avec l'immunsérum anti-a-néo-endorphine. Ces résultats se comprennent, si l'on
admet que,dans certaines conditions de fixation et d'inclusion, les immunsérums
anti-dynorphine et -a-néo-~~àorphine sont susceptibles de reconnaître des
sites antigéniques de la leu-enképhaline.
L'extension de la réaction anti-a-néo-endorphine, observée sur
coupes à la paraffine après fixation au Bouin hollande sublimé, pourrait
suggérer que l'épitope est peu accessible dans les conditions de fixation et
d'inclusion moins drastiques, qui sont celles réalisées lors de la confection
de coupes à congélation. Il semblerait, en fait, que ce soit l'étape de la
fixation qui soit la plus critiqu~,dans la mesure où des résultats comparables
sont obtenus sur coupes à la paraffine, et à congélation, après utilisation
du même fixateur, le Bouin
hollande sublimé.
- 37 -
Bien que la structure du (des) peptide(s) qui lie(nt) nos
anticorps (anti-leu-enképhaline, -met-enkephaline, -a-néo-endorphine,
-dynorphine) reste inconnue, nous pouvons conclure que deux substances différentes
sont reconnues, la pre6ière par les immunsérums anti-leu-enképhaline et
-a-néo-endorphine, éventuellement par l'immunsérum anti-dynorphine
la
deuxième par les immunsérums anti-leu et -met-enképhalines.
Conclusion
Nous avons testé sur le système nerveux d'un insecte, la larve
d'A~hna Qyanea, divers immunsérums dirigés contre des peptides de Mammifères.
Une réaction positive a été détectée après utilisation d'II d'entre eux,
7 étaient dirigés contre des peptides du système entéro-gastro-pancréatique,
4 contre des opioides.
Les contrôles effectués, en particulier la saturation des sérums
par l'antigène correspondant ou par un antigène hétérologue, permettent de
conclure à la spécificité des immunsérums utilisés. Cependant, comme nous
l'avons souligné à plusieurs reprises, certains résultats sont susceptibles
de varier d'une préparation à l'autre, peut·être en relation avec un état
physiologique donné, ou de différer suivant les procédures de fixation et
d'inclusion utilisées. Il n'empêche que certains groupes cellulaires, pour
un immunsérum donné, présentent de façon régulière une immunoréactivité et ce,
quels que
soient les modes de fixation et d'inclusion. Le fait que des
réactions ne soient pas observées avec l'une ou l'autre des méthodes de
fixation n'a cependant rien de bien surprenant. Ainsi, chez le doryphore,
Leptinot~a deQemtineata, Veenstra et coll. (1985b) ont signalé que le
marquage anti-a-néo-endorphine n'est décelable qu'après fixation au Bouin
hollande sublimé. De telles variations, même si elles sont souvent moins
spectaculaires, existent également chez les Mammifères (Tramu, 1980).
L'obtention d'une réponse positive ne signifie pas que nous
soyons en présence de la molécule peptidique contre laquelle l'anticorps
a été élaboré; tout au plus, cela signifie-t'il que le peptide réactionnel
possède un ou plusieurs sites antigéniques (de quelques acides lminés) en
commun awec le peptide originel. Il semblerait,cependant, que la majorité
des molécules peptidiques ait relativement, peu changé au cours de l'évolution.
Ainsi, comme nous l'avons noté, la leu et la met-enképhalines ont
été
mises en évidence
chez la moule (Leung et Stéfano, 1983). On peut donc
raisonnablement ,penser que certaines des substances apparentées aux peptides
- 38 -
mammaliens m~ses en évidence dans notre étude puissent être, structurellement,
très proches de ceux-ci.
Le rôle de ces substances reste enigmatique
trois rôles potentiels
peuvent être envisagés : ceux de neurotransmetteur, de neuromodulateur et
de neurohormone. A l'appui des deux premiers rôles, la mise en évidence par
Stéfano et Scharrer (1981) dans le cerveau de la blatte, LeuQophaea made~e
de sites de liaison pour un analogue de la met-enképhaline. A l'appui du
troisième rôle, la présence de matériel immunoréactif CCK +, hp GRF ~,
VIP +, met-enképhaline +, insuline +, etc ... dans certaines fibres nerveuses
des nerfs cardiaques internes (nccI) et dans leurs terminaisons dans le
corps cardiaque '.
Il est logique de penser que divers peptides transitent
des cellules protocérébrales, via les nccI, jusqu'au corps cardiaque
où
ils seront libérés dans l'hérnolymphe. Il est plus surprenant de constater
que relativement peu de cellules de la p~ ~nt~Q~eb~~ sont marquées
alors que de nombreuses fibres des nccI et de nombreuses terminaisons
nerveuses présentes dans le
corps cardiaque
le sont. Deux explications
sont possibles:
(1) la plupart des cellules de la p~ ~nt~Q~eb4~
sont de petite taille ; leur cytoplasme peu abondant expliquerait que peu
de matériel antigénique existe dans le corps cellulaire, lequel deviêndrait, de ce
fait, difficilement détectable. Ainsi, seules,les cellules de grande taille,
pararnédianes, dénommées de type C par Charlet (1972) en raison de leurs
affinités tinctoriqles pour l'azocarmin, sont observables (ex. immunoréàctivité
anti-VIP, -met-enképhaline, -insuline, -motiline ... ) (2) en plus des nccI,
il existerait, en provenance de. groupes cellulaires plus latéraux, une
seconde voie de cheminement des produits de sécrétion du protocérébron
(cf. chapitre V). Ainsi, de nombreuses terminaisons nerveuses pourraient
être marquées dans le
corps cardiaque
alors que seul l'est un nombre
restreint de fibres des nccI.
CHAPITRE II
DETECTION D'UN PEPTIDE PROPRE PLlX INSECTES :
LA PffiCTOLI NE
- 39 -
Ainsi que nous l'avons souligné en introduction, à ce jour,
seules/ont été établies, les séquences de 3 peptides: la proctoline,
l'hormone adipocinétique (AKH) et l'hormone prothoracotrope (PTTH),
laquelle n'est, cependant, pas commercialisée. Comme nous n'avions
pas à notre disposition d'immunsérum anti-AKH, notre étude se limite
à la démonstration de cellules réagissant au sérum anti-proctoline.
Immunoréactivité anti-proctoline
La PJtoc;touVle es: W1. peVltapeptide (AJtg - TYJt - Leu- PltO- TM)
qLU, à. .t'oJtigiVle out ~cilé c.hez .ta b.tafte PeJUp.taVleta ameJtic.aVla (BJtOWVl, 1975,;
BJtOWVl et Sta.Jtltaft, 1975 ; Sta.Jtltaft et BJtOWVl, 19J 5 ). Chez t.es tns ec;teJ.J ,
.ta PJtoc;touVle c.o vr.tJtô.te .t' ac.tivdé mua c.u..tcUJte -<'VlteJ.JtiVla..te (BJtOWVl, 1975 ;
COOQ et Ho.tmaVl, 1979 J, c.a.Jtd4a.que (MLtteJt, 1979 ; S-Roz~a et M-<..t.teJt, 1981 J,
ov-<'duc;tcUJte (COOQ et Meo.ta, 1978) et ~que.te:tt.<..que (P-<'eQ et Mantet, 19n ;
Mayet c.oU.,
1979 J. EVl pM de ~eJ.J oOVlc.tioM pétUphéJtiqueJ.J, eUe aga c.omme
VleUltot!ta.MmetteUlt OIL Yl.eU/wmodu..tateUlt dans Le: ~y~tème Yl.eJtveux c.evr.tJta..t,
[AgJtic.ola et c.oU., 1985 J.
Des cellules proctoline positives s'observent à la fois dans
la partie postérieure du protocérébron et dans le tritocérébron (bloc
diagramme Il). Trois à quatre petites ce l l.u Les latéro-dorsales tritocérébrales
(Pl XI,fig. a), deux grandes cellules paramédianes (Pl XI,fig.c) et deux
cellules dorsales protocérébrales de taille moyenne (Pl XI,fig. d) sont
situées dans chaque moitié du
cerveau
. Quelques fibres immunoréactives
sont détectées dans le ganglion frontal de même que le sont certaines
terminaisons axonales présentes dans le
corps cardiaque
(Pl Xljfig. e).
Aucun corps cellulaire n'est détecté dans le ganglion sous-oesophagien
et quelques très rares fibres nerveuses sont seulement observées dans le
neuropile (Pl XI)fig. f) .
. Sur coupes à la paraffine, en plus des cellules décrites, quelques
cellules de taille moyenne situées au voisinage de la médulla réagissent à
l'anticorps anti-proctoline (Pl XI,fig. b).
Discussion
Des études récentes ont détecté une immunoréactivité anti-proctoline
dans le système nerveux central de la blatte, PeJUp.taVleta a.meJUc.ana
(Eckert et coll., 1981 ; Bishop et O'Shea, 1982), du doryphore
LeptiYl.o~a
Bloc diagramme Il
Localisation des groupes cellulaires réagissant
à un immunsérum anti-proctoline.
0..-.,
~11)ii.~~*iÙ!/"·';"i"..
~l~l';~~~~f:'i~";t-7!i~
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~
- 40 -
deQemtineata
(Veenstra et coll., 1985a) et de la sauterelle, SQ~tOQe~Qa
nite~ (Keshishian et O'Shea, 1985).
U~e immunoréactivité anti-proctoline est également observable
dans le cerveau d'A~hna Qyanea, mais seuls quelques neurones sont marqués.
Ainsi, nos résultats s'accordent avec les observations de Veenstra et coll.
(1985a), selon lesquelles quelques très rares neurones renfermant une
substance apparentée à la proctoline,si ce n'est aucun, sont présents
dans le cerveau des Insectes;
l'immunoréactivité anti-proctoline étant
surtout détectée dans la chaîne nerveuse et plus particulièrement dans le
dernier segment abdominal innervant l'intestin postérieur (Agricola et
coll., 1985).
CHAPITRE III
DETECTION D'UNE j1JvlIr~E :
lA SEROTOO lNE
-41 -
Les am~nes biogène~1 telles
la dopamine, 1 'octopamine , la
noradrénaline, la sérotonine,sont présentes en quantité iIDFortante dans
le système nerveux des Insectes (réf. dans Evans, 1980).
Plusieurs méthodes ont été employées pour les localiser. La
plus ancienne, la méthode d'histofluorescence de Falck-Hillarp permet
de différencier les structures renfermant des catécholamines de celles
contenant de la sérotonine. Une seconde voie d'approche consiste en un
marquage par voie autoradiographique. Une troisième méthode)quant à elle,
est basée sur l'obtention d'anticorps dirigés contre certaines des enzymes
nécessaires à la synthèse de l'amine. Ainsi, des anticorps anti-tryptophane
hydroxylase permettent de détecter les cellules sérotoninergiques.
Ces méthodes, cependant, manquent pour une grande part de
sensibilité et parfois même de spécificité (cf. Steinbusch et coll., 1982).
Elles sont remplacées désormais par des techniques immunohistochimiques
faisant appel à la réalisation d'anticorps dirigés contre les amines
mêmes. Ces anticorps ont a~ns~ permis de détecter chez les Insectes la
dopamine (Vieillemaringe et coll., 1984 ; Takeda et coll., 1986) et la
sérotonine (Bishop et O'Shea, 1983 ; Klemm, 1983 ; Klemm
et Sundler, 1983
Nassel et Klemm, 1983 ; Nassel et coll., 1983 ; Klemm et coll., 1984 ; Nishiit-
sutsuji-Uwo ~t
coll., 1984 ; Schürmann et Klemm, 1984 ; Taghert et
Goodman,
1984 ; Tyrer et coll., 1984 ; Nas se I et Cantera, 1985 ; Davis, 1985).
Notre ~tude concerne la détection de l'immunoréactivité anti-
sérotonine, laquelle ne s'observe que sur coupes au cryostat.
Au n~veau des lobes optiques·
Un marquage anti-5 HT fort à modéré est décelable au niveau des
lobes optiques. Six fines strates parallèles de fibres immunoréactives
présentant
des varicosités entrent dans la constitution de la médulla,
(Pl. XII~ f i.gs , a et c ) ; le marquage apparaissant plus intense au niveau
des trois couches les plus ~xternes. Dans la lobula (Pl.XII,figs.a et c),
les cercles concentriques de fibres immunoréactives sont plus lâches et
moins ordonnés que dans la médulla. La disposition des fibres sérotoniner-
giques de la lamina
rappelle celle des fibres aminergiques observées après
utilisation de la méthode de Falck-Hillarp (Klemm,
1976).
Même s~ certaines fibres immunoréactives présentes dans le neuropile
des ganglions optiques, notamment celles de la lobula, semblent avoir une
origine protocérébrale extrinsèque (la localisation de leurs péricaryons
reste inconnue), de nombreuses fibres sont issues des péricaryons situés
au voisinage des médulla et lobula. Selon leur taille et leur localisation,
- 42 -
quatre groupes de cellules peuvent être distingués:
(1) Antérieurement
30 à 40 cellules de taille moyenne (15-20 ~m de diamètre), fortement
immunoréactives envoient leurs axones vers le neuropile de la médulla
(Pl~XII,fig. a). (2) De telles cellules se retrouvent également en
position postérieure à proximité de la médulla.
(3) Dans la partie
postérieure, plus d'une centaine de très petites cellules (Pl.XII,fig. c)
(7-1 0 um de diamètre) faiblement à modérémentimmunoréactives, sont
mëlées à des cellules de même taille non réactives. Leurs très
fins
axones pénètrent dans le neuropile de la médulla. (4) Dix à douze
grandes cellules dorsales (25-30 ~m de diamètre), intensément marquées,
constituent le quatrième
groupe; leurs trajets axonaux forment certaines
des fibres immunoréactives du neuropile.
Au n~veau du protocérébron
Bien que des fibres immunoréactives existent dans tout le
protocérébron, peu de cellules y sont détectées excepté dans sa partie
postérieure. Dans la p~ ~~Q~eb~~, deux à trois paires de cellules
parasagittales de taille moyenne (15 ~m de diamètre) (Pl.XII1fig. d) sont
situées dans la
partie antérieure, alors que trois groupes symétriques,
contenant une à trois cellules de taille moyenne, sont localisés dans une
position plus postérieure. Comme le
marquage reste toujours modéré
voire inexistant, nous ne pouvons pas confirmer sa spécificité par notre
test de saturation. Une réaction s'observe dans quelques fibres des n~v~
QO~PO~ Q~diaci (nccI) ; elle est
plus nette dans le
corps cardiaque
même'.. Cependant, l'immunoréactivité
du
corps card i.aque
n'est pas complètement
supprimée après saturation de l'immunsérum anti-5 HT par l'antigène correspondant.
Dans la partie postérieure du protocérébron, plusieurs groupes
symétriques de cellules immunoréactives entourent le neuropile. Dorsalement,
on distingue trois groupes de cellules immunoréactives : (1) une très
grande cellule allongée (30 ~m de diamètre) fortement immunoréactive se
trouve en position latérale. (2) Deux petites cellules (15 ~m de diamètre)
modérément marquées
s'observent en position plus médiane. (3) Deux grandes
cellules dorsales (30 ~m de diamètre) (Pl.XII,fig. f), intensément marquées,
constituent le troisième groupe. Plus d'une dizaine de cellules de petite
taille et une très grande cellule (30 ~m de diamètre) sont situées très
postérieurement en position centrale. Enfin, quelques rares petites cellules
latéro-ventrales (souvent une) sont parfois observées.
- 43 -
Au n~veau du deutocérébron et tritocérébron
Des fibres nerveuses sont toujours présentes dans leur neuropile.
Le nombre de cellules 5-HT positives situées au voisinage du neuropile
reste toujours modeste. Seules, quelques petites cellules sont localisées
dans la partie dorsale, à proximité des neuropiles tritocérébral et
deutocérébral.
Au n~veau du ganglion frontal
Quinze à vingt cellules de grande taille (20-25 ~m de diamètre)
(Pl.XII,fig. b) réagissent de façon modérée, voire intense, à l'immunsérum
anti-5 HT. Certaines cellules en forme de T présentent une répartition
axonale symétrique bilatérale.
Au n~veau du ganglion sous-oesophagien
Antérieurement, trois à quatre grandes cellules symétriques
(30 ~m de diamètre) (Pl.XII,fig. e) sont situées latéro-dorsalement,
tandis que plusieurs petites cellules sont présentes latéro-ventralement.
Plus postérieurement deux groupes de deux à trois paires de petites
cellules paramédianes sont localisés,
l'un en position dorsale, l'autre
ventralement (Pl XII,fig. g). Enfin, quatre à six cellules ventrales
à latéro-ventrales, s'observent postérieurement de chaque côté du ganglion
sous-oesophagien. De nombreuses fibres immunoréactives, dont certaines
de très grande taille, traversent le neuropile et le connectif périoesophagien.
Contrôles
Al' exception
du
corps cardiaque , où elle se maintient quo i.que
affaiblie, l'immunoréactivité disparaît lorsque l'immunsérum est absorbé
par un excès de l'antigène correspondant (4 mg/ml). Elle peT.siste lorsqu'on
ajoute un excès de dopamine (4 mg/ml) à l'immunsérum anti-5 HT.
Discussion
Selon des études récentes, il apparaît que l'immunohistochimie
est une méthode plus sensible et plus fiable que ne l'est l'histofluorescence
utilisée~jusqu'à présent,dans la localisation des amines biogènes
(Steinbusch et coll., 1982). Ainsi, le nombre de cellules 5-HT positives
détectées chez les Insectes est supérieur à celui détecté selon la méthode
- 44 -
de Falck-Hillarp (Klemm et coll., 1984).
Relativement peu d'études,ayant trait à la localisation de 5-HT
dans le système nerveux d'Insectes ,ont été réalisées jusqu'à présent
(cf. Introduction). La plupart d'entre elles concerne
la blatte
Peniptaneta a~cana (Bishop et O'Shea, 1983 ; Klemm et coll., 1984
Nishiitsutsuji-Uwo et coll., 1984 ; Davis, 1985). Les résultats peu
concordants
enregistrés par différents auteurs étudiant la localisation
des cellules sérotooinergiques chez cet insecte, (Bishop et O'Shea,
Klemm et coll. d'une part, Nishiitsutsuji-Uwo et coll. d'autre part) posent
le problème de la spécificité des anticorps utilisés. Les structures qui
réagissent à notre immunsérum ne sont plus marquées quand celui-ci est
saturé par un excès d'antigène. Cependant, notre immunsérum p~ésente de
réactions croisées avec la tryptamine et la 5-méthoxytryptamine (5 MT),
ce qui laisse supposer que l'immunsérum reconnait la 5 HT, ou un composé
apparenté à la 5 MT'Tramu et co l l , , 1934). L'immunsérum anti-5 HT utilisé
ne marque aucun corps cellulaire dopaminergique dans le système nerveux
de Mammifères (Tramu, communication personnelle) et la réaction persiste
dans notre matériel quand l'immunsérum est saturé par un excès de dopamine.
Ainsi, le risque que l'immunsérum anti-5 HI marque les structures dopaminer-
giques est nul.
Elofsson et Klemm (1972) ont, préalablement à notre étude, m~s
en évidence des neurones mono aminergiques chez les Odonates par la méthode
de fluorescence de Falck -
Hillarp. Selon ces auteurs, quatre couches de
fluorescence verte et deux couches de fluorescence jaune,correspondant
probablement aux fibres sérotoninergiques,s'observent dans la médulla. Les
fibres de fluorescence jaune peuvent être également détectées dans la
lobula, alors qu'elles sont absentes dans la lamina. Un groupe unique de
péricaryons de fluorescence jaune se situe à proximité de la médulla.
Nos résultats montrent que la réaction sérotoninergiqueest
be aucnupjp lus importante que ce lie décrite précédemment. Six couches de
fibres et quatre groupes cellulaires
immunoréactifs, dont un de très
grande taille, existent dans la médulla. Probablement, lors de l'étude
d'Elofsson et Klemm (1972), l'intense fluorescence verte due aux catécholamines
recouvrait et masquait' rapidement-la faible fluorescence jaune qui correspondait
à la sérotonine, ce qui expliquerait les résultats par "défaut" observés
par ces auteurs. Un tel argument, s~il a?par ailleurs, été é,:oqu~ par Nassel
- 45 -
et Klemm (1983) dans leur étude relative à la localisation des fibres
sérotoninergiques au niveau des lobes optiques de SQ~toQehQa ghegania,
P~planeta am~Qana et Calliphona ehyt~oQephala, ne permet cepèndant
pas d'expliquer pourquoi des corps cellulaires (particulièrement ceux de
grande taille) ne sont pas détectés par la méthode de Falck-Hillarp.
Des corps cellulaires sérotoninergiques de grande taille s'observent
dans le ganglion frontal. Ils
apparaissent marqués de façon spécifique
dans la mesure où ils ~e s'observent pas après absorption de l.'immunsérum
par l'antigène correspondant,contrairement à ce qui a été décrit chez
P~plan~a am~Qana (Nishiitsutsuji-Uwo et coll., 1984). Cependant,
Davis (1985) a observé une soixantaine de corps cellulaires sérotoninergiques
dans le ganglion frontal de cet insecte. Selon cet auteur, les fibres
sérotonine!giques présentes dans le système nerveux stomatogastrique .
innerveraient les
glandes salivaires et les muscles des intestins antérieur
et moyen. De même, chez A~hna Qyanea (fu1dries et Tramu, 1984, 1985a),
la musculature circulaire du gésier et de la tunique conjonctivo-musculaire,
entourant l'épithélium de l'intestin moyen, renferment une très intense
innervation sérotoninergique.
Dans le système nerveux, la plupart des cellules réagissant à
l'immunsérum anti-5 HT Sont localiséeS dans la partie postérieure du
protocérébron. Il en est de même; comme nous l'avons vu (cf. ~hapitres l, II,
III), pour les cellules réagissant à des immunsérums anti-peptidiquestels
que les sérums anti-cholécystokinine, anti-hp GRF ou anti-VIP ...
GJAP·ITfE IV
DETECTION D/LI~~ r1EME I~ELIRONE
PAR PWSIEJJRS ,L\\NTICORPS
- 46 -
Le principe de DALE, formulé dans les années 50, stipule qu'un
unique transmetteur caractérise chaque population neuronale. Cependant,
depuis la dernière décennie, la démonstration, souvent renouvelée, du
moins chez les Mammifères, de la présence de plusieurs transmetteurs dans
un même neurone, a modifié nos conceptions relatives à ce postulat. Trois
grandes catégories de co-localisations ont été détectées
(1) présence conjointe de 2 neurotransmetteurs classiques. Les
premières démonstrations remontent en 1974 et ont été effectuées dans le
système nerveux de gastéropodes, l'aplysie (Brownstein et coll., 1974) et
l'escargot (Hanley et coll., 1974). Quoique ces travaux initiaux furent
critiqués, l'existence de telles co-localisations fut confirmée par la suite.
Ainsi des associations entre acide gamma-butyrique (GABA) et sérotonine
(Belin
et coll., 1981 ; Pujol, 1984) , GABA et dopamine
(Everitt
et coll.,
1984) ont été
décrites dans le système nerveux des Mammifères.
(2) présence conjointe d'un neurotransmetteur classique et d'un
peptide. La démonstration en a été, maintes fois, renouvelée chez les Vertébrés
sérotonine/substance P (Chan-Palay, 1979 ; Chan-Palay et coll., 1978
Hokfelt et coll., 1978
Singer et coll., 1979 ; Pelletier et coll., 1981
Johansson et coll., 1981 ; Lovick et Hunt, 1983 ; Hancock, 1984), CCK/dopamine
(Hokfelt et coll., 1980), acétylcholine/polypeptide pancréatique (Lundberg et
coll., 1979 ; Johansson et Lundberg, 1981); sérotonine/enképhaline (Galzer et
coll., 1981)
;
noradrenaline/enképhaline (Klein et coll., 1982), adrénaline/
CCK (Hëkfelt et coll., 1984), GABA/CCK (Somogyi et coll., 1984) dopamine/GRF
(Okamura ~t co~l., 1985).
Chez les Invertébrés, seule démonstration, celle d'une molécule
apparentée au CCK, mise en évidence dans des neurones d'Helix (Osborne et
coll., 1982).
(3) présence
conjointe de 2 peptides. Ici encore, les exemples sont
innombrables chez les Mammifères. Un seul d'entre eux, celui concernant les
différents peptides
décelés en même temps que des enképhalines, suffira à
rendre compte de la diversité des associations rencontrées : enképhalines/ocytocine
(Martin et Voigt, 1981 ; Martin et coll., 1983
Vanderhaeghen et coll., 1983),
/vasopressine (Martin et Voigt, 1981
Martin et coll., 1983), /neurophysine
(Coulter et coll., 1981), /substance P (Erichsen et coll., 1982), /pol)~epti~e
pancréatique (Hunt et coll., 1981), /somatostatine (Tramu et coll., 1981,
Beauvillain et coll., 1984), /VIP (Leboulenger et coll., 1983),
/corticolibérine
(CRF) (Hëkfelt et coll., 1983). Dans les cas reportés ci-dessus, les deux
peptides ne tirent pas leur origine d'un même précurseur. Il n'en est pas
- 47 -
de même des associations met-enképhaline, B-endorphine, ACTH, MSH, les 4
peptides dérivant d'un même précurseur, la proopiomélanocortine ou des
associations leu-enképhaline, a-néo-endorphine, dynorphine qui, elles,
sont rendues possibles par le clivage de la prodynorphine.
Chez l'aeshne, nous avons utilisé la technique des coupes sériées,
incubées alternativement avec des immunsérums différents, afin de démontrer
la coexistence peptide-amine (en l'occurrence, la sérotonine) et l'association
de peptides différents entre eux, qu'ils soient apparentés ou non.
l - Détection d'un même neurone par des anticorps dirigés contre
divers peptides mammaliens
Deux cas sont à envisager, suivant que les peptides contre lesquels
ont été synthétisés les anticorps sont apparentés ou non.
1) Par anticorps dirigés contre des peptides mammaliens
apparentés: le VIP et l'hpGRF
Le VIP etl'hpGRF présentent, au point de vue structure, de grandes
homologies ; 4 des 8 résidus aminés de la partie N terminale sont en effet
communs aux deux peptides. Une homologie, plus nette encore, existe, par
ailleurs entre l'hpGRF et le PHM, un peptide de 27 acides aminés provenant
du même précu~seur que le VIP (Itoh et coll., 1983).
Les observations réalisées sur coupes au cryostat révèlent que les
cellules intensément marquées par le sérum anti-VIP ne le sont pas ou le sont
très faiblement par l'immunsérum anti-hpGRF. C'est le cas, par exemple, des
cellules paramédianes, dorsales de la partie postérieure du protocérébron
(Pl.XIII, figs.a et b). De même, les cellules réagissant fortement
au sérum
anti-hpGRF sont peu ou prou immunoréactives au sérum anti-VIP. Ainsi les
cellules dorsales piriformes de la partie postérieure du protocétébron sont
difficilement observables, après incubation avec le sérum anti-VIP (Pl.XIII
figs.c et d).
Les différences de réactions, même s~ elles subsistent, sont bien
mo~ns apparentes sur coupes à la paraffine que sur coupes à congélati~n
(Pl. XIII, figs. e-g). On ne peut cependant affirmer que toutes les cellules
VIP positives réagissent au sérum anti-hpGRF et vice versa. C'est le cas
en particulier de certaines cellules de petite taille (ex. : petites cell~les
protocérébrales latéro-dorsales, VIP positives). Il est possible, sinon
probable, que dans ce cas, l'immunoréactivité n'est pas détectée en raison du
peu de matériel antigénique que renferment ces cellules.
- 48 -
De l'ensemble de ces observations, il ressort que, sous certaines
conditions de fixation, certaines cellules sont révélées à la fois par les
sérums anti-VIP et anti-hpGRF. Faut-il en conclure qu'il s'agit du même peptide
révélé par les 2 antisérums ? La très nette différence de marquage observée
entre les 2 populations cellulaires, l'une GRF (+++)/VIP (+), l'autre GRF (+)/
VIP (+++) ne plaide pas en faveur de la détection d'une molécule unique. Il
est, en effet, difficile d'admettre qu'une même molécule peptidique, susceptible
d'être mise en évidence par deux anticorps différents puisse, suivant le
type cellulaire dans lequel elle se trouve, être plus facilement décelée par
l'un ou l'autre anticorps. Par ailleurs, comme la saturation du sérum anti-hpGRF
par un excès de VIP ou, inversement, celle du sérum anti-VIP par du GRF,
n'inhibe pas la réaction, on peut conclure à l'existence de sites antigéniques
différents réactifs à l'un ou à l'autre anticorps.
Il est donc vraisemblable que nous nous trouvons en présence de 2
peptides différents, probablement apparentés comme le sont le VIP et le GRF
mammaliens, ayant en commun un ou quelques (peu) épitopes, lesquels, sous
certaines conditions de fixation, seraient révélés par le sérum hétérologue.
On ne peut, non plus, exclure que ces peptides puissent dériver d'un même précurseur
comme le PHM et le VIP mammaliens dar-s la mesure où leurs synthèses seraient
régulées à un niveau post-translationnel comme cela semble être le cas pour le
VIP et le PHI (peptide, à 2 acides aminés près, identique au PHM) dans
certains neurones hypothalamiques du rat (Itoh et coll., 1983).
2) Par anticorps dirigés contre des peptièes mammaliens non
apparentés
a) Neurones détectés par les anticorps anti-VIP et -hpGRF
Certains des neurones détectés par les anticorps anti-VIP et -hpGRF
présentent également une irnmunoréactivité anti-CCK 8 et/ou -motiline.
~) Présentant une irnmunoréactivité anti-CCK.8
+
immunoréactivités anti-hpGRF/-CCK 8
Tous les groupes cellulaires qu~ réagissent au sérum hpGRF réagissent
fortement au sérum anti-CCK 8 NS, que ce soit au n~veau du ganglion sous-oesophagien
(Pl.XIV figs.a et b) ou du protocérébron (Pl.XIV figs.e et f).
Aucune réaction croisée n'a été décelée, la saturation du sérum
anti-hpGRF par un excès Je CCK 8 NS (Pl.XIV figs. c et d) n'inhibe pas la
réaction pas plus que ne le fait la saturation du sérum anti-CCK par un
excès d'hpGRF.
-
49 -
+ irnmunoréactivités
anti-VIpj--CCK 8
Notre étude a été réalisée sur coupes à con8élation et concerne
donc exclusivement les groupes cellulaires réagissant au VIP après fixation
au PAF. Ce sont de petites cellules latéro-ventrales tritocérébrales
(Pl.XIV figs.i et j), de grandes cellules paramédianes et dorsales et de
petites cellules latéro-dorsales protocérébrales (Pl.XIV figs·g et h). Toutes
sont également marquées par le sérum anti-CCK 8. La préincubation du sérum
anti-VIP par un excès de CCK 8 NS n'inhibe pas la réaction.
Une immunoréactivité anti-CCK 8 s'observe dans des cellules réagissant
aux sérums anti-hpGRF et-VIP et parfois,
sous certaines conditions de fixation,
aux 2 antisérums. L'absence de réaction croisée permet d'affirmer que ce sont
des sites antigéniques différents qui sont détectés par les anticorps anti-CCK 8
ou par les anticorps dirigés contre le VIP ou l'hpGRF. La réaction toujours
nette, voire très nette, obtenue après incubation avec le sérum anti-CCK8
traduit le grand nombre de sites antigéniques auxquels se lient les anticorps
anti-CCK 8.
S)
Présentant une irnmunoréactivité anti-motiline
Certaines cellules hpGRF positives sont révélées par un sérum anti-
motiline, qu'il s'agisse.· des cellules La t é r o-rve n t r a Le s (Pl.XV f i g s- f et g)
et de la cellule médio-ventrale (Pl.XV figs.c et d) du ganglion sous-oesophagien
ou des grandes cellules dorsales piriformes (Pl.XV figs.a et b).
Contrairement au marquage anti-CCK qui est très intense, l'irnmunoréactivitl
anti-motiline reste toujours modérée.
b) Neurones détectés par des anticorps anti-opioides
Des neurones détectés par l'un des anticorps anti-opioides utilisés
(anti-leu-enképhaline, -met-enképhaline, -a-néo-endorphine et -dynorphine) le
sont également par les anticorps anti-CCK 8 et/ou motiline.
a) [résentant une irnmunoréactivité anti~CCK 8
+ immunoréactivités anti-leu-enképhaline/~CCK8
La plupart, des cellules leu-enképhaline
positives réagissent au
sérum anti-CCK 8 NS. Il s'agit dans le ganglion sous-oesophagien de deux
cellules parasagittales dorsales antérieures (Pl.XVI figs.g et j) et de deux
cellules latéro~ventrales postérieures (Pl.XVI figs.f et i). Il faut cependant
noter l'absence de réactionanti-CCK8au niveau des grandes cellules latéro-
dorsales et latéro-ventrales du ganglion sous-oesophagien. Dans la partie antérieure
du protocérébron, 4 grandes cellules sagittales et quelques cellules paramédianes
plus petites (Pl.XVI figs.a et c) sont marquées par les deux irnmunsérums.
- 58 -
Dans la partie postérieure du protoeérébron, le double marquage intéresse
de grandes cellules latérales et latéro-ventrales (Pl.XVI figs.e et h) et
de petites cellules latéro-dorsales et centrales. Enfin, l'unique cellule
leu-enképhaline positive innervant les lobes optiques, réagit aux sérums
anti-CCK 8 (Pl.XVI figs.b et d). Elle
est incluse dans un groupe d'une
dizaine de cellules CCK 8 NS positives.
Par suite de l'absence de séquences peptidiques communes à la
leu-enképhaline et au CCK 8 NS, nous n:avons pas saturé les sérums p.ar
l'antigène hétérologue. Par contre, la saturation a été faite par l'antigène
correspondant. Rappelons que ces contrôles nous ont permis de vérifier la
spécificité de nos réactions (sauf celle qui concerne les grandes cellules
sagittales du protocérébron, lesquelles restent marquées après incubation
avec le sérum anti-leu-enképhaline saturé)
.
+ immunoréactivités anti-dynorphine 1-17f(CK 8
Les rares cellules qui, sur coupes au cryostat, réagissent faiblement
au sérum anti-dynorphine le font très intensément au sérum
anti-CCK 8 NS.
La double réaction concerne quelques petites cellules parasagittales de
la partie antérieure du ganglion sous-oesophagien et, dans ch~que moitié
du protocérébron, deux groupes symétriques constitués, l'un de deux grandes
cellules pararnédianes (Pl.XVI ~igs.k et 1), l'autre de quelques petites
cellules latéro-dorsales.
+ immunoréactivités anti-a-néa-endorphine/-CCK 8
La comparaison a été effectuée sur coupes à la paraffine et sur
coupes à congélation. Les rares cellules réagissant
au sérum anti-a-néo-
endorphine sur coupes au cryostat sont marquées par le sérum anti-CCK 8.
Sur coupes à la paraffine, de nombreuses cellules du protocérébron
sont à la fois détectées par les sérums anti-CCK 8 NS et anti-a-néo-endorphine,
en particulier dans la région postérieure, qu'il s'agisse.de cellules latérales
(Pf.XVII figs. b et d), latéro-dorsales (Pl.XVII figs·b et d), dorsales
(Pl.XVII figs.i-k) ou ventrales (Pl.XVII figs.j et k). Au niveau de la
p~6 ~nt~c~eb~~, 2 paires de grandes cellules paramédianes sont marquées
par les 2 sérums (Pl.XVII figs.e et g)
; le sérum anti-a-néo-endorphine détectant
de plus quelques petites cellules.
De nombreuses cellules du ganglion frontal et une dizaine de cellules
innervant les lobes optiques sont révélées par les deux sérums (Pl.XV!I figs.a et c).
Nombre de cellules du ganglion sous-oesophagien sont, également,
doublement marquées. Cependant, les grandes cellules latéro-dorsaleset latéro-
ventrales (Pl.XVII figs. f et h) qui réagissent au sérum anti-a-néo-endorphine
- 51 -
ainsi qu'aux sérums anti-leu et -met-enképhalines ne réagisser.: pas au
sérum anti-CCK 8.
Comme nous l'avons noté
chapitre l, il est probable que 2 peptides,
l'un dérivant d'une molécule "apparentée" à la proenképhaline, l'autre d'une
mo l.êcu Le "voisine" de la prodynorphine, soient présents dans le système
nerveux de l'aeshne.
Les cellules réagissant uniquement aux immunsérums anti-leu-enképhaline
et -a-néo-endorphine (ex. petites cellules paramédianes de la·partie antérieure
du.protocérébron, cellules centrales de la partie postérieure du protocérébron)
réagissent au sérum anti-CCK 8 NS~ Un tel résultat constitue un argument en
faveur du marquage, par le sérum anti-CCK 8 NS, d'un peptide issu d'une molécule
voisine de la prodynorphine. Nous ne pouvons cependant exclure l'hypothèse
selon laquelle un peptide "CCK-like" différent de la molécule opioide
serait
présent dans ces cellules.
Inversement, comme le sérum anti-CCK 8 ne met pas en évidence les
grandes cellules latéro-dorsales et latéro-ventrales du ganglion sous-oesophagien,
lesquelles sont détectées à la fois par les sérums anti-met, -leu-enképhalines,
-a-néo-endorphine, -dynorphine, il est logique de penser que le sérum anti-CCK 8
ne réagit ?as avec le peptide dérivant d'une molécule apparentée à la proenképhaline.
Une telle interprétation ne vaut que pour les types cellulaires les
plus aisément identifiables. Elle demande confirmation avant que nous ne puissions
l'étendre à l'ensemble des cellules réagissant aux différents sérums anti-opioides.
S) Présentant une immunoréactivité anti-motiline
Les grandes cellules latéro-dorsales et latéro-ventrales de la partie
antérieure du ganglion sous-oesophagien réagissent faiblement au sérum anti-
motiline (Pl.XV figs.e et h). Rappelons que ces dernières sont également marquées
par les sérums anti-met, -leu-enképhalines, -a-néo-endorphine et ·-dynorphine.
En cas de saturation du sérum anti-motiline par un excès de leu-enképhaline,
il n'y a pas inhibition du marquage. Ainsi la molécule peptidique apparentée
à la motiline, semble associée GU faire partie de la molécule opiacée dérivant
d'un précurseur de type proenképhaline.
c) Neurones détectés par les anticorps anti-CCK 8 et -GRP
Les grandes cellules sagittales de la partie anté~ieure du protocérébron
sont marquées, à la fois par les sérums anti-CCK 8 et anti-GRP (Pl.XV figs·i et j).
- 52 -
Conclusion
Il est possible de distinguer, les uns des autres, des groupes
cellulaires suivant l'irnmunoréactivité qu'ils présentent à divers sérums
dirigés contre des peptides mammaliens non apparentés. Malgré la difficulté
résultant entre autres du fait que les comparaisons ont été effectuées, les
unes sur coupes au cryostat, les autres sur coupes à la paraffine, plusieurs
types de réponse ont été obtenus
- (VIP + GRF)/CCK : cellules paramédianes dorsales et cellules
piriformes dorsales de la partie postérieure du protocérébron. Les cellules
piriformes sont également détectées par un sérum anti-motiline.
- (leu-enképhaline + a-néo-endorphine)/CCK : petites cellules para-
médianes antérieures et petites cellules centrales postérieures du protocérébron.
- a-néo-endorphine/CCK : ex. cellules du ganglion frontal, grandes
cellules paramédianes antérieures du protocérébron.
- (met-enképhaline + leu-enképhaline + a-néo-endorphine)/mociline
grandes
eêllules latéro-dorsales et latéro-ventrales de la partie antérieure
du ganglion sous-oesophagien.
CCK/GRP : cellules sagittales de la partie antérieure du protocérébron.
Notre étude n'est pas exhaustive, il est probable que d'autres
associations existent
ainsi le sérum anti-insuline révèle des cellules
paramédianes de la p~ int~~~eb~~ (cf. Pl.IV fig. h) et de grandes cellules
dorsales de la partie postérieure du protocérébron (cf. Pl.IV fig. j).dont la
position est
identique à celle des cellules révélées par les sérums anti-hpGRF
et anti-VIP .•.
Par ailleurs, il faut noter que nombre de cellules ne sont m1ses en
évidence que par un seul sérum. Ainsi de nombreuses cellules le sont oniquement
par le sérum anti-CCK 8.
Dans le cas d'une immunoréactivité à 2 ou plusieurs sérums dirigés
contre des peptides mammaliens non apparentés, deux explications peuvent être
envisagées:
la première stipule que la molécule peptidique d'insecte, différente
des deux peptides ~ammaliens contre lesquels ont été élaborés les anticorps,
possède des sites antigéniques révélés par les deux sérums; la seconde, que
chaque sérum révèle un peptide particulier.
Il est certain que nous n'avons pas d'élément de réponse irréfutavle
en faveur de l'une ou l'autre interprétation. Le seul, qui sàit intéressant à
noter, concerne l'existence d'une immunoréactivité à un anticorps donné (en
l'occurrence 1 '.anti-motiline) dans certaines et non dans toutes les cellules
- 53 -
réagissant à d'autres anticorps (anti-VIP, -hpGRF, -CCK). Dans ce cas,
il y a toutes chances pour que l'anticorps anti-motiline détecte un
peptide différent de celui m~s en évidence par les anticorps anti-VIP,
-hpGRF et -CCK.
II - DÉTECTION D'UN MÊME NEURONE PAR DEUX ANTICORPS DIRIGÉS,
L'UN, CONTRE LIN PEPTIDE f'W'MALIEN (CCK), L'AUTRE, CONTRE
LIN PEPTIDE D'INSECTE (PROCTOLINE)
Les cellules dorsales paramédianes (Pl.XVIII figs a et b) et latéro-
dorsales (Pl.XVIII figs c et d) protocérébrales qui réagissent au sérum anti-
proctoline, présentent également une immunoréactivité anti-CCK 8. Il est remarquable
de constater que les rares cellules à proctoline font partie de 2 groupes comprenant
de nombreuses cellules réagissant au sérum anti-CCK 8. Nous confirmons ainsi l'hété-
généité
des
groupes cellulaires tels que nous les définissons sur critères
morphologiques et/ou immunohistochimiques.
Comme il n'existe aucune séquence peptidique commune entre la proctoline
et l'octapeptide C terminal
de la cholecystokinine, nous pouvons conclure à
l'existence de sites antigéniques différents révélés par les deux antiséLums.
Ces épitopes appartiennent probablement à deux peptides différents puisqu'il
est en effet vraisemblable que le sérum anti-proctoline révèle la proctoline
et non une molécule apparentée. Nous ne pouvons, toutefois, totalement exclure
l'idée selon laquelle l'anticorps anti-CCK détecte des sites antigéniques
d'un éventuel précurseur de la proctoline (lequel reste encore à démontrer ... ).
III -COEXISTENCED'UNE Afv1INE : LA SÉROTONINE ET D'UN PEPTIDE
APPARENTÉ À LA CHOLECYSTOKININE
Pour mettre en évidence une éventuelle colocalisation de la sérotonine
et de peptides dans le système nerveux
et le ganglion sous-oesophagien
d'A~hna.cyanea, des coupes sériées ont été incubées alternativement avec un
sérum anti-5 HT ou avec l'un des sérums respectivement dirigés contre le
CCK-8 NS, la substance P,
les leu- et met-enképhalines, le VIP présent dans
les neurones sérotoninergiques.
- 54 -
Des neurones réagissant aux immunsérums anti-CCK-8 NS et anti-5 HT
ont été observés aussi bien, dans le système nerveux central, que dans le
système nerveux stomatogastrique d'A~6hna Qyanea. Quatre groupes cellulaires
réagissent à l'immunsérum anti-5 HT au voisinage des lobes optiques. Seules,
les grandes cellules (20-25 wm de diamètre) immunoréactives à l'immunsérum
anti-5 HT renferment également du matériel réagissant au sérum anti-CCK-8 NS
(Pl.XIX figs.d et e). Dans le ganglion sous-oesophagien, trois à quatre paires
de grandes cellules antéro-dorsales (20-25 wm de diamètre) sont fortement
marquées par les deux immunsérums (Pl.XIX f i gs . f-h). Enfin, des cellules de
grande taille (20-25 wm de diamètre) du ganglion frontal (Pl.XIX figs.a-c)
qui réagissent fortement à l'immunsérum anti-5 HT, présentent une faible immuno-
réactivité à l'immunsérum anti-CCK-8 NS.
Comme nous l'avons indiqué
chapitre III, l'immunoréactivité disparaît
lorsque les anticorps spécifiques anti-CCK-8 NS et anti-5 HT sont saturés par
leur antigène correspondant, tandis que le marquage persiste quand l'immunsérum
anti-5 HT est saturé par la dopamine.
Discussion - Conclusion
Nos résultats démontrent, pour la première fois, la coexistence d'un
matériel apparenté au CCK-8 NS et à la sérotonine dans les systèmes nerveux
central et stomatogastrique d'un insecte.
Certains neurones, réagissant à la fois aux immunsérums anti-CCK-8 NS
et anti-5 HT, apparaissent marqués avec la même intensité (c'est le cas des
cellules innervant les lobes optiques ou des cellules antéro-dorsales du
ganglion sous-oesophagien), tandis que d'aut~es présentent une forte immuno-
réactivité avec l'immunsérum anti-5 HT et une réaction faible ou modérée avec
l'immunsérum anti-CCK-8 NS (c'est le cas des cellules du ganglion frontal). En
nous fondant sur les différences de marquage immunohistochimique observées, il
semble logique de suggérer que le peptide et l'amine sont localisés dans des
vésicules différentes, même si nous ne pouvons exclure l'éventualité qu'ils
puissent coexister dans les mêmes vésicules, comme c'est le cas pour la sérotonine
et la substance P chez le rat (Pelletier et coll., 1981).
Nous ne pouvons que spéculer sur l'importance de la coexistence d'un
peptide avec une molécule neurotransmettrice classique. Chez les Insectes, comme
chez les Vertébrés, la présence de grande quantité de matériel apparenté à la
cholécystokinine/gastrine suppose une activité neurotransmettrice ou neuromodula-
trice même si une partie non négligeable du matériel protocérébral est acheminé
jusqu'au
corps cardiaque
où il sera libéré dans l'hémolymphe pour y jouer un
rôle hormonal. Dans le neurone géant d'H~x ~p~a, la cholécystokinine diminue
- 55 -
l'effet excitateur de la sérotonine et augmente son effet inhibiteur
(Bokisch et coll., 1983). Dans ce cas, la cholécystokinine, en plus de
son action directe sur le potentiel membranaire, module l'action de la sérotonine.
Ces observations suggèrent l'un des éventuels rôles physiologiques de la
cholécystokinine chez les Invertébrés, à savoir moduler l'action de neuro-
transmetteurs.classiques comme cela semble être par ailleurs le cas pour la
substance P chez les Vertébrés (Pernow, 1983).
rnAPITREV
ANALYSE DES RELATIONS CERJEDtJ-CORPS CARDIAOJE
- 56 -
Depuis l'observation princeps de La Vail et La Vail (1972), la
péroxydase de Raifort a été maintes fois utilisée, ne serait-ce que chez
les Insectes (Sivasubramanian et Nassel, 1985 ; Watson et Burrows, 1985 ;
Watson et coll., 1985 ... ), pour localiser des massifs neuronaux ou déter-
miner des trajets axonaux. Le principe de la réaction est basé, d~_une part,
sur le transfert rétrograde de la protéine des terminaisons axonales vers
le corps
cellulaire et, d'autre part, sur la détection de l'enzyme par une
solution de diamino-benzidine en présence d'eau oxygénée.
Comme nous l'avons noté, chez A~hna Qljanea, de nombreuses termi-
na i s ons axonales sont marquées, au niveau
du
corps cardiaque , ap nê s incubation
avec des immunsérums dirigés contre des peptides mammaliens (anti-CCK, -VIP,
-hpGRF, -leu-enképhaline, -met-enképhaline, -a-néo-endorphine, -dynorphine)
ou d'insecte (anti-proctoline). Les fibres des nerfs cardiaques internes
(nccI) dans lesquelles cheminent les produits de secrétion originaires de
cellules de la p~ ~nt~Q~ebn~ apparaissent également immunoréactives
à la majorité des antisérums, bien que leur nombre soit parfois relativement
faible, comparé à celui des terminaisons nerveuses présentes dans le
corps
cardiaque .
Chez les Insectes, il est classiquement admis que les produits
de secrétion des deux massifs pairs de cellules protocérébrales sont
acheminés jusqu'aux corps cardiaques par 11intermédiaire de deux nerfs, les nerfs
cardiaques internes (nccI) et les nerfs cardiaques externes (nccII). Chez
les Odonates, bien qu'Arvy et Gabe (1952) les aient mentionnés,aucune preuve
tangible de l'existence des nccII n'a été fournie jusqu'à ce jour.
Nous avons tenté de les démontrer en injectant de la péroxydase
de Raifort dans le
corps cardiaque , grice à une ~icroélectrode reliée
à un stimulateur électrique. Bien que la révélation de l'activité pérox~dasique
ne nous ait pas permis
d'observer ni les nccI, ni les cellules de la
p~ ~nt~Q~ebn~, elle a rendu possible la détection, dans la partie
postérieure du protocérébron, ~de deux
groupes symétriques d'une vingtaine
de petites cellules latéro-dorsales (Pl.XX, figs.b-e) dont les fibres nerveuses
gagnent le
corps éardiaque
(Pl.XX, figs.a et b). Il est très probable que
ces fibres constituent les nccII, tels qu'ils ont été démontrés dans les autres
ordres d'insectes.
- 57 -
Ces résultats sont à rapprocher de ceux que nous avons obtenus
en immunohistochimie. Des cellules de petite taille de la partie postérieure
du protocérébron, situées en position latéro-dorsale, réagissent à divers
immunsérums, anti-CCK 8 (Pl.II, fig.e), -hpGRF, -VIP (Pl.V fig. 1), -leu-
enképhaline (Pl.VII fig. d), -x-néo-endorphine (Pl.X fig~ e), -insuline,
-proct61ine (Pl.XI fig. d), -motiline. Il est raisonnable de penser que
ce sont certaines de ces cellules dont les fibres constituent les nccII.
CONCWS ION GENERAlE
- 58 -
Chez les Insectes, les peptides possèdent trois rôles potentiels,
ceux de neurotransmetteur, de neuromodulateur et de neurohormone. Ce sont,
pour la plupart, des peptides issus des corps cardiaques qui contrôlent les
fonctions physiologiques de l'insecte. Toutefois, beaucoup d'entre eux sont,
en fait, originaires du cerveau d'où ils transitent jusqu'aux organes neuro-
hémaux, via les nerfs cardiaques.
L'obtention d'immunsérums, dirigés contre de tels peptides, permettrait
de localiser aisément leur lieu de synthèse. Les difficultés d'isolement de ces
molécules peptidiques font, cependant, que nos conna~ssances restent très
fragmentaires, quant à la localisation des cellules peptidergiques. Par contre,
de nombreux peptides ont été identifiés dans le système nerveux et le système
gastro-entéro-pancréatique des Mammifères et autant d'immunsérums réalisés.
En utilisant les immunsérums dirigés contre ces peptides mamma l i.e ns nou savon s
tenté de répondre à plusieurs questions
(1) les molécules peptidiques présentes chez les Mammifères,
existent-elles chez les Insectes ?
(2) plusieurs molécules peptidiques peuvent-elles coexister dans
un même neurone ?
(3) une molécule peptidique peut-elle exister conjointement avec un
neurotransmetteur classique aminergique ?
Par ailleurs, comme seule l'existence des nerfs cardiaques internes
avait été démontrée, avec certitude, chez les Odonates, il était intéressant
de préciser les relations entre le cerveau et le corps cardiaque
Les réponses suivantes ont été fournies
(1) De nombreuses cellules du cerveau et du ganglion sous-oesophagien,
parfois du système stomatogastrique, réagissent de façon spécifique à des
anticorps dirigés contre des peptides mammaliens (CCK 8, insuline, motiline,
VIP, hpGRF, leucine-enképhaline, méthionine-enképhaline, a-néo-endorphine ... ).
Les réponses obtenues varient avec les immunsérums utilisés. Ainsi,
s~ certains d'entre eux ne mettent en évidence que peu de cellules (ex. sérum
anti-GRP), d'autres, en particulier les sérums anti-CCK-8 NS et -a-néo-endorphine
en détectent plusieurs centaines.
Trois problèmes inhérents aux études irnmunohistochimiques concernent
la spécificité, la sensibilité des immunsérums et le mode de fixation. Nous avons
plusieurs fois mentionné la spécificité de nos immunsérums et les contrôles que
- 59 -
nous avons effectués. De même, nous avons discuté leur sensibilité, en particulier
celle des sérums anti-CCK-S NS et -CCK-S S. La réponse est souvent fonction du
fixateur utilisé, éventuellement du mode d'inclusion. Ainsi, l'immunoréactivité
anti-a-néo-endorphine est décelée essentiellement après fixation au Bouin hollande
sublimé,alors que la réactivité aux sérums anti-CCK-S (S et NS) est plus nette
après fixation au PAF et confection des coupes à congélation:
Des terminaisons axonales présentes dans le corps cardiaque et des
fibres des nerfs cardiaques internes sont marquées après incubation avec de
nombreux immunsérums : -anti-CCK, -hpGRF, -VIP, -méthionine-enképhaline,
ce qui laisse supposer que les peptides ainsi mis en évidence possèdent bien
une fonction hormonale. Il faut également noter que les sérums -CCK-8 détectent non
seulement, les terminaisons axonales mais également certaines cellules glandulaires
du corps cardiaque.
Dans le cadre d'une réaction positive, il n'est possible de conclure
qu'à l'existence de substances peptidiques ayant un ou plusieurs sites antigéniques
communs avec la molécule peptidique originelle de Mammifères. Néanmàins, il
est vraisemblable qu'il existe, chez les Insectes, des précurseurs peptidiques
qu~ s'apparentent aux précurseurs des peptides mammaliens. Ainsi, certains
neurones réagissent aux sérums anti-leucine et
-méthionine enképhA.lines, d'autres
aux sérums anti-leucine-enképhaline et -a-néo-endorphine comme le font, respecti-
vement, chez les Mammifères, les cellules renfermant les dérivés
de la proenképha-
line et de la prodynorphine.
(2) Un même neurone peut être détecté par plusieurs immunsérums dirigés
contre des peptides non apparentés (ex. CCK/leucine-enképhaline ; CCK/VIP
CCK/proctoline ... ). Bien qu'il soit possible, s~non vraisemblable, que deux peptid~
différents soient ainsi mis en évidence, on ne peut, toutefois, totalement
exclure l'idée selon laquelle un même peptide d'insecte ne puisse posséder des
épitopes qui seraient révélés par deux anticorps dirigés contre deux peptides
mammaliens non apparentés.
(3) Un peptide peut coexister avec un neurotransmetteur classique.
Ainsi, une substance apparentée à la cholécystokinine est présente dans
certaines cellules sérotoninergiques des systèmes nerveux stomatogastrique
et
central. Il est probable, qûe, chez les Invertébrés comme chez les Vertébrés,
l'un des rôles possibles du peptide coexistant avec un neurotransmetteur aminergique
est d'en moduler l'action.
- 60 -
(4) Chez les Odonates, comme chez les autres Insectes, les produits
de sécrétion du protocérébron sont véhiculés jusqu'au corps cardiaque par
deux nerfs pairs: les nerfs cardiaques internes et externes. Les axones
constituant
ces derniers sont issus de deux massifs cellulaires localisés
dans la partie postérieure du cerveau, en position latéro-dorsale.
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PLANCHE l
Immunoréactivités anti-CCK-8 NS (figs. a, b, c, e, f et g) et -CCK-8S
(figs. d et h) mises en évidence sur coupes à c~ngélation.
Fig. a
tritocérébron ; petites cellules ventrales réagissant au sérum anti-
CCK-8 NS. x 120.
F~èS' a à e : lobes optiques.
Fig. b : réponse à un sérum anti-CCK-8 NS ; cellules dorsales innervant
la médulla (m.)
; 10 strates de fibres nerveuses (1 à 10)
présentes dans la médulla (1. : lobula). x 120.
Figs. c et d : médulla ; nombreuses couches de fibres détectées par le
sérum anti-CCK-8 NS (fig. c) et, de façon bien moins nette, par
le sérum anti-CCK-8S' (fig. d)
; petites cellules CCK-8 NS
positives (flèche) innervant la médulla. x 110.
Fig. e
répoüse à un sérum anti-CCK-8 NS ; petites cellules (flèche) à
proximité de la lobula
(m.
médulla). x 110.
Figs. f à h : protocérébron, région antérieure.
Fig. f : réactivité à un sérum anti-CCK-8 NS
petites cellules para-
médianes (flèche) et grande cellule sagittale (flèche évidée).
x 100 •
. F~gs. g et h : réponse de coupes sériées à un sérum anti-CCK-8 NS (fig. g)
et CCK-as (fig. h)
; cellules paramédianes (flèches) et cellules
(flèches évidées) innervant la médulla. x 100.
~'l
e
,/
/..~
___....!..1:...
9
h
PLANCHE II
Immunoréactivités anti-CCK-S NS (figs.a, c et e) et -CCK-SS (figs. b,
d et f) mises en évidence sur coupea à congélation adjacentes.
Figs. a et b : région antérieure du protocérébron ; réponses aux sérums anti-
CCK-S NS (fig. a) et -CCK-SS (fig. b)
cellules sagittales (flèches)x 110.
Figs. c-f : région postérieure du protocérébron
réponses aux sérums anti-CCK-S NS
(figs. c et e) et -CCK-SS (figs. d et f). Cellulea des groupes 7, 9,
10, 14, 16 détectées,avec la même intensité,. par les deux antisérums
cellules des groupes S, Il, 12, 15 révélées par le sérum anti-CCK-S NS
et de façon beaucoup moins nette par le sérum anti-CCK-SS (c.e. : corps
cardi~que).Figs. c et d : x 100, Figs. e et f : x 120.
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PLANCHE III
Immunoréactivités anti-CCK-S NS (figs. a, c, e, f, h, i, k, l, n et p)
et -CCK-8S (figs. b, d, g, f, m et 0) mises en évidence sur coupes à con~élation
adjacentes.
Figs. a et b : ganglion frontal, réponse
aux immunsérums anti-CCK-8 NS (fig. a)
et -CCK-8S (fig. b). x 200.
Figs. c-e : ganglion sous-oesophagien, partie antérieur~.· .Cellules des groupes
2, 3 et 5 révélées par les sérums anti-CCK-8 NS (figs. c et e) et
-CCK-8S (fig. d). x 110.
Figs. f-h : ganglion sous-oesophagien, partie médiane. Cellules des groupes 8 et 9
révélées avec la même intensité par les sérums anti-CCK-8 NS (f!gs. f et
h) et -CCK-8S (fig· g). x 110.
Figs. ~-p : ganglion sous-oesoph?gien, partie postérieure. Cellules des groupes
10,
Il et 12 révélées par les sérums anti-CCK-8 NS (figs. i, k, l, n et
p) et -CCK-8S (figs. j, m et 0). x 110.
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PLANCHE IV
Immunoréactivité anti-insuline mise en évidence sur coupes à la
paraffine (f~gs . . a-h et j) et sur coupe à congé l a t i.on (fie. i).
Fig. a
ganglion frontal, fibres nerveuses (flèche). x 160.
Fig. b
lobe optique ; cellules innervant la médulla (flèche) et la lobula
(flèche évidée). x 110.
Figs. c et d : tritocérébron
petites cellules (flèches) situées latéro-_
ventralement. x 110.
Fig. e
partie antérieure du protocérébron ; cellule centrale (flèche), cellule
paramédiane (pointe de flèche) et cellules inne~'ant les lobes optiques
(flèche évidée). x 90.
Fig. f
tritocérébron et lobe optique gauches
cellules immunoréactives
(flèches). x gO.
Fig. g
protocérébron, partie médiane
petites cellules latéro-ventrales (flèche).
x 90.
Figs. h-j
protocérébron, partie postérieure ; cellules paramédianes (flèches)
(fig. h) et
cellules dorsales (flèches) (figs. i et j) (c.e. : corps
cardiaque). x 120.
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PLANCHE V
Immunoréactivités anti-motiline (figs. a-f) et -VIP (figs. g-l).
Figs. a-f : immunoréactivité anti-motiline.
Eig. a
ganglion frontal; fibres nerveuses (flèche). x 110.
Fig. b
protocérébron, région postérieure
cellule (flèche) de la
paJt.6 in;teAc.eAe.blLai.M. xii o.
Fig. c
protocérébron, région postérieure
cellules dorsales (flèchp).
x 120.
Fig. d
ganglion sous-oesophagien, région antérieure ; cellules latéro-
dorsale (flèche évidée) et latéro-ventrale (flèche). x 110.
Fig. e
glanglion sous-oesophagien, région médiane ; cellules sagittale
(flèche évidée) et latéro-ventrales (flèches). x 110.
Fig. f
tritocérébron (t.) et connectif périoesophagien ; fibres
nerveuses.
Figs. g-l
immunoréactivité anti-VIP
Fig. g
ganglion frontal, fibres nerveuses (flèche).
Fig. h
protocérébron, région antérieure
cellule latéro-dorsale
(flèche évidée). x 110.
Fig. ~
lobe optique, médulla (m.) et lobula (1.)
fibres nerveuses.
x 110.
Fig. J et k : tritocérébron
cellules latéro-ventrale (flèche) (fig. j)
et dorsales (flèche) (fig. k). x 110.
Fig. 1
protocérébron, région postérieure; cellules paramédianes
(flèche évidée), latéro-dorsales (flèche noire) et centrales
(pointes de flèches). x 110.
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PLANCHE VI
Immunoréactivité anti-somatolibérine.
Fig. a
médulla, petites cellules (flèche). x 140.
Fig. b
protocérébron, région antérieure, n~vi eo~po~ e~diaci (nccI)
(flèche). x 140.
Fig. c
tritocérébron, pe~ites cellules latéro-ventrales (flèche). x 140.
Fig. d
protocérébron, région postérieure.; grandes cellules dorsales piriformes
(flèche) et petite cellule latéro-dorsale (flèche évidée). x 140.
Fig. e
ganglion sous-oesophagien, région antérieure ; petites cellules médio-
dorsales (flèche) et média-ventrales (flèche évidée). x 140.
Fig. f
protocérébron, région postérieure; cellules dorsales piriformes (flèche),
latéro-dorsales (flèche évidée) et latérale (pointe de flèche). x 140.
Fig. g
ganglion sous-oesophagien, région médiane ; cellule média-ventrale
impaire (flèche). x 110.
Fig. h
protocérébron, région postérieure ; cellules dorsales piriformes (flèche)
et paramédiane (flèche évidée). x 150.
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PLANCHE VII
Immunoréactivités anti-GRP (figs. a-e) et -substance P (figs. f et g).
Fig. a
protocérébron, région antérieure; grande cellule sagittale (flèche
évidée). x 120.
Fig. b
protocérébron, région postérieure; petite ce 1 ~ule latérale (flèche
évidée). x 110.
Fig. c
protocérébron, région postérieure, fibres nerveuses. x 280.
Fig. d
tritocérébron, i:ibres nerv~uses. x 110.
Fig. e
ganglion sous-oesophagien, fibres nerveuses. x 110.
Fig. f
protocéfébron, région postérieure, fibres nerveuses. x 300.
Fig. g
corps cardiaque.
(t,c.). x 110.
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PLANCHE VIII
Immunoréactivités anti-leucine-enképhaline (figs. a-e) et -méthionine-
enképhaline (figs;. f-j):.
Fig. a : protocérébron-lobe optique, région antérieure ; cellule innervant la
méJulla (flèche) et cellules à la limite du protocérébron et du lobe
optique (flèche évidée). x 110.
Fig. b
protocérébron, région antérieure ; cellule paramédiane protocérébrale
(flèche) et cellule (flèche évidée) innervant la médulla. x 110.
Fig.c: protocérébron, région antérieure; cellules sagittales (flèche). x 110.
Fig. d : protocérébron, région postérieure ; cellules latéro-dorsale (flèche),
centrale (flèche évidée) et latéro-ventrale (pointe de flèche) (c.e.
corps cardi aque.Lv. x 110.
Figs. e et f : protocérébron, région postérieure, coupes adjacentes; cellules
par améd i ane . (flèche), latéro-dorsale (flèche évidée),latéro-ventrale
(pointe de flèche) et latérale (flèche courbe). x 110.
Figs. g et h : ganglion sous-oesophagien, région antérieure, coupes adjacentes
cellule latéro-ventrale (flèches). x 110.
Fig. g
sérum anti-méthionine-enképhaline.
Fig. h
sérum anti-méthionine-enképhaline saturé par la leucine-enké-
phaline.
Figs. ~ et j
corps cardiaque , coupes adjacentes. x 1la.
Fig. ~
sérum anti~méthionine-enképhaline.
Fig. J
sérum anti-méthionine-enképhaline saturé par la leucine-enké-
phaline.
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PLANCHE IX
Immunoréactivités anti-leucine-enképhaline (figs. a, c, e et f).
-méthionine-enképhaline (figs. b et d),_dynorphine (Fig. g) et -~-néo-endorphine
(figs. h et i).
Fig. a
ganglion sous-oesophagien, région antérieure
petites cellule8 ventrales
(flèches). x 110.
Figs.b et c : ganglion sous-oesophagien, région antérieure, coupes adjacentes,;
grande cellule latéro-dorsale (flèche). x 100.
Fig8. d et e : ganglion sous-oesophagien, région antérieure, coupes adjacentes
grande cellule latéro-ventrale (flèche). x 100.
Fig. f : gan3lion sous-oesophagien, région postérieure ; cellule latérale
(flèche). x 110.
Fig. g
protocérébron, région postérieure ; cellules paramédianes (flèches)
(c.c. : corps cardiaque
). x 110.
Figs. h et i : tritocérébron, coupes adjacentes
cellules latérales (flèches). x 110
Fig. h
sérum anti-a-riéo-endorphine.
Fig. i,
sérum anti-a-néo-endorphine saturé par la leucine-enképhaline.
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PLANCHE X
Immunoréactivité anti-cr-néo-endorphine.
Fig. a
ganglion frontal (g.f.) et tritocérébron {t.), région antérieure
grandes cellules du ganglion frontal et petites cellules du
tritocérébron. x 90.
Fig. b
protocérébron, région antérieure ; cellules paramédianes (flèche) et
très petites cellules dorsales (flèche évidée). x 100.
Fig. c
ganglion frontal, région postérieure; cellules immunoréactives (flèche).
x 100.
Fig. d
protocérébron et lobe optique droit
cellules innervant la médulla
(flèche). x 100.
Fig. e
protocérébron, région postérieure ; cellules paramédianes (flèches),
dorsale (flèche courbe), latéro-dorsales (flèche évidée) et latérale
(pointe de flèche). x 120.
Fig. f
ganglion sous-oesophagien, région antérieure ; cellules médio-ventrales
(pointesde flèche), médie-dorsales (flèches évidées) .et
latéro-dorsale
(flèche). x 120.
Fig. g
protocérébron, région postérieure ; cellules paramédianes (flèches)
et dorsales (flèches courbes) (c.e.
: corps cardiaque).
x 120.
Fig. h
ganglion sous-oesophagien, région antérieure ; cellules latéro-dorsales
(flèches) et médio-ventrales (pointes de flèches). x 120.
Fig. 1
protocérébron, région postérieure ; cellules ventrales (flèches évidées)
et dorsales (flèches courbes). x 120.
Fig. J
ganglion sous-oesophagien, région antérieure
cellules dorsale (flèche)
et latéro-dorsales (flèches évidées). x 120.
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PLANCHE XI
Immunoréactivité anti-proctoline.
Fig. a
tritocérébron, petite
cellule dorsale (flèche). x 110.
Fig. b
lobe optique droit, médulla (m.) et lobula (1.)
; cellule (flèche)
innervant la médulla. x 120.
Fig. c
protocérébron, région postérieure
cellules paramédianes dorsales
(flèche). x 100.
Fig. d
protocérébron, région postérieure
cellule latéro-dorsale (flèche). x 110.
Fig. e
corps cardiaque . x 120.
Fig. f
ganglion sous-oesophagien, région médiane. x 110.
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PLANCHE XII
Irnmunoréactivité anti-séroto~ine.
Fig. a
lobe optique gauche, médulla (m.) comprenant 6 couches de fibres
nerveuses et lobula (1.)
; cellule latérale (flèche) innervant la
médulla. x 140.
Fig. b
ganglion frontal, région antérieure. x 140.
Fig. c
l6be optique droit, médulla (m.) comprenant 6 strates de fibres nerveuses
et lobula (1.)
; nombreuses petites cellules (flèche) innervant la
médulla. x 140.
Fig. d
protocérébron, région postérieure; cellules parasagittales (flèches). x 140
Fig. e
ganglion sous-oesophagien, région antérieure ; cellules latéro-dorsales
(flèches). x 140.
Fig. f
protocérébron, région postérieure; cellules latéro-dorsales (flèche). x 140
Fig. g
ganglion sous-oesophagien, région médiane ; petites cellules médio-
ventrales (flèches). x 140.
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PLANCHE XIII
Immunoréactivités anti-hpGRF/-VIP révélées sur coupes adjacentes. à
congélation (figs. a-d) ou à paraffine (figs. e-g).
Figs. a et b : protocérébron, région postérieure ; immunoréactivités anti-VIP
(fig. a) et -hpGRF (fig. b) des cellules paramédianes dorsales
(flèches évidées). x 110.
Figs. c et d : protocérébron, région postérieure ; immunoréactivités anti-VIP
(fig. c) et -hpGRF (fig. d) des cellules piriformes dorsales (flèches
évidées). x 110.
Figs. e-g : protocérébron, région postérieure; immunoréactivités anti-VIP
(figs. e et g) et -hpGRF (fig. b)
des cellules piriformes dorsales
(flèches évidées). x 80.
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PLANCHE XIV
Immunoréactivités anti-CCK-8 NS/-hpGRF et anti-CCK-8 NS/-VIP révélées
sur coupes adjacentes.
Figs. a et b : ganglion sous-oesophagien, région antérieure; immunoréactivités
anti-CCK-8 NS (fig. a) et -hpGRF (fig. b) de petites cellules médio-
dorsales (flèches) et médio-ventrales (flèches évidées). x 90.
Figs. c et d : ganglion sous-oesophagien, région antérieure; marquage (flèches
évidées) après incubation avec le sérum anti-hpGRF saturé (fig. d)
ou non (fig. c) avec un excès de CCK-8 NS. x 90.
Figs. e et f : protocérébron, région postérieure
immunoréactivités anti-CCK-8 NS
(fig. e) et -hpGRF (fig. f) des cellules dorsales piriformes (flèches
évidées). x 120.
Figs. g et h : protocérébron, région postérieure; immunoréactivités anti-CCK-8 NS
(fig. g) et -VIP (fig. h) des cellules paramédianes dorsales (flèches
évidées), latéro-dorsales (flèches) et centrales (pointes de flèche).
x 100.
Figs. i et j : tritocérébron ; immunoréactivités anti-CCK-8 NS (fig. i) et -VIP
(fig. j) de petites cellules latéro-ventrales (flèches évidées). x 150.
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PLANCHE XV
Immunoréactivités anti-motiline/-hpGRF, anti-motiline/-leu-enképhaline
et anti-CCK-8 NS/-GRP révélées sur coupes adjacentes.
Figs. a et b : protocérébron, région postérieure; immunoréactivités anti-motiline
(fig. a) et -hpGRF (fig. b ) d·lune cellule dorsale piriforme (flèches).
x 110.
Figs. c et d : ganglion sous-oesophagien, région médiane; immunoréactivités
anti-motiline (fig. c) et -hpGRF (fig. d) d'une cellule
ventrale
sagittale (flèches). x 110.
Figs. f et g : ganglion sous-oesophagien, région postérieure ; immunoréactivités
anti-motiline (fig. f ) et -hpGRF (fig. g) d.'.une cellule latéro-ventrale
(flèches). x 110.
Figs. e et h : ganglion sous-oesophagien, région antérieure
immunoréactivités
anti-motiline (fig. c) et -leu-enképhaline (fig. h) de cellules
latéro-dorsales (flèches). x 110.
Figs. L et j
: protocérébron, région antérieure ; immunoréactivités anti-CCK-8 NS
(fig. i) et -GRP (fig. j) des cellules sagittales (flèches). x 110.
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PLANCHE XVI
Immunoréactivités anti-leucine-enképhaline/-CCK-8 NS (figs. a-j)
et anti-dynorphine/-CCK-8 NS (figs. k et 1) révélées sur coupes adjacentes.
Figs. a et c : protocérébron, région antérieure et lobe optique droit. Cellules
immunoréactives aux sérums anti-CCK-8 NS (fig. a) et -leu-enképhaline
(fig. c)
(flèches évidées) et au seul sérum anti-CCK-8 NS (flèches
noires). x 110.
Figs. b et d : lobe optique droit; cellules immunoréactives aux sérums anti-CCK-8 NS
(fig. b) et -leu-enképhaline (fig. d) (flèches évidées) et aux seuls
sérums anti-leu-enképhaline (flèche noire) ou -CCK-8 NS (pointe de
flèche). x 110.
Figs. e et h : protocérébron, région postérieure ; immunoréactivité aux sérums anti-
CCK-8 NS (fig. e) et~leu-enképhaline (fig. h) (flèches). x 110.
Figs. f et i : ganglion sous-oesophagien, région postérieure; immunoréactivité
aux sérums anti-CCK-8 NS (fig. f) et anti-leucine-enképhaline (fig. i)
(flèches). x 110.
Figs. g et j : ganglion sous-oesophagien, région antérieure; immunoréactivités
aux sérums anti-CCK-8 NS (fig. g) et -leu-enképhaline (fig. j) (flèches
évidées), au seul sérum anti-leu-enképhaline (flèche no i re ) , x 110.
Figs. k et 1 : prbtocérébron, région postérieure ; immu~oréactivitésaux sérums
anti-CCK-8 NS (fig. k) et -dynorphine (fig~ 1) (flèches). x 110.
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PLANCHE XVII
Immunoréactivités anti-a-néo-endorphine (figs. a, b, e, f, i et k)
et -CCK-S NS (figs. c, d, g, h
et j)
mises en évidence sur coupes adjacentes.
Figs. a et c : protocérébron et lobe optique gauche ; cellules innervant les
lobes optiques réagissant aux sérums anti-a-néo-endorphine (fig. a) et
-CCK-S NS (fig. c ) (flèches). x 110.
Figs. b et d : protocérébron, région postérieure; cellules latérale (flèches)
et latéro-dorsale (pointes de flèche) réagissant aux sérums anti-a-
néo-endor~hine (fig. b) et -CCK-S NS (fig. d). x 110.
Figs. e et g : protocérébron, p~ ~nt~c~eb~~ (p.i.);cellules paramédianes
(flèches) réagissant aux sérums anti-a-néo-endorphine (fig. e) et
-CC:{-S NS (fig. g) . x 110.
Figs. f et h : ganglion sous-oesophagien, cellule latéro-ventrale (flèche) réagissant
au sérum anti-a-néo-endorphine (fig. f) et non au sérum anti-CCK-S NS
(fig. h ) , x 90.
Figs. i-k : protocérébron, région postérieure; cellules dorsales (flèches) et
ventrale (pointe de flèche) réagissant aux sérums anti-a-néo-endorphine
(figs. i et k ) et -CCK-S NS (fig. j). x 90.
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PLANCHE XVIII
Immunoréactivités anti-proc~oline (figs. a et c) et -CCK-8 NS
(figs. b et d) mises en évidence sur coupes adjacentes.
Figs. a et b : protocérébron. région postérieure; cellule paramédiane réasissant
aux sérums anti-proctoline (fig. a) et -CCK-8 NS (fig. b)
(flèches
évidées). x \\\\0.
Figs. c et d : protocérébron. région postérieure; cellule" dorsale réagissant
aux sérums anti-proctoline (fig. c) et -CCK-8 NS (fig. d)
(flèches
évidées). x 110.
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PLANCHE XIX
Immunoréactivités anti-sérotonine (figs. b, e, g) et -CCK-8 NS
(figs. a, c, d, f et h) mises en évidence
sur coupes adjacentes.
Figs. a-c : ganglion frontal ; cellules immunoréactives aux sérums anti-CCK-8 NS
(figs. a et c) et -sérotonine (fig. b). x 300.
Figs. d et e : lobe optique droit; cellules immunoréactives {flèches) aux sérums
anti-CCK-8 NS (fig. d) et -5-HT (fig. e), innervant la médulla (m.)
(1. : lobula). x 140.
Figs. f-h : ganglion sous-oesophagien, région antérieure; cellules latéro-dorsales
réagissant aux sérums anti-CCK-8 NS (figs. f et h) et -5-HT (fig. g)
(flèches). x 120.
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PLANCHE XX
Relations cerveau-corps cardiaque
mises en évidence par l'injection
de péroxydase dans
le- corps cardiaque.
Figs. a-d : protocérébron, région postérieure ; coupes sériées
m~se en évidence
successive des nerfs se rendant aux corps cardiaques (figs. a et b)
(flèches évidées) et de petites cellules latéro-dorsales (figs. b-d)
(flèches évidées). x 110.
Fig. e
protocérébron, région postérieure ; démonstration de deux groupes symé-
triques de cellules marquées (flèches évidées) (c.e. : corps cardiaque ).
x 180.
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