THESE
présentée
A L'U.F.R. DE SCIENCES DE L'UNIVERSITE DE NANTES
par
Brehima DIAWARA
pour obten ir le titre
de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE NANTES
Sciences et Techniques des Productions Agricoles
spécialité "Sciences de J'Aliment"
CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA CONSERVATION DU RIZ PADDY
SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES, ASPECTS MICROBIOLOGIQUES
ET CONSEQUENCES TECHNOLOGIQUES,
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1POU" L'EN5!3JGNEA1ENi S' ip':kllr.:Un
C. A. M. fi. S ~
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soutenue le 26 Mai 1988 devant la cornrmssion dr:xam
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r.r~Q:.str~ sous n°
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M. S. RENAUDIN
-pfé~sident--,~~~~'I_:p,'2:" '-1
M. J.N. HALLET
M. D. RICHARD-MOLARD
M. G.L. HENNEBERT
Examinateurs
M. J.L. MULTON
M. B. PASCAT

---

A V A N T - PRO P 0 S
Ce tnavaif a été enneetué au Labonato~e de Mi~obioiogie et Te~hnoiogie
CéAéalièJtu (L.M.T.C.) de i'Ir!J.l-ÛtlLt Na.û.onai de La: Re~hM~he AgJtonomique,
à Nantu.
Je JtemMue tnè-6 vivement Mor!J.lieUJt V. RICHARV-MOLARD, V~eueUJt de
Re~hM~he à i'I.N.R.A., de m'avoiJt a~~u~ dar!J.l -6on fabo~oiJte, et de m'avo~
naJ.;t bénéOiuM de -6 U nombJtwx cor!J.l Ui-6 et -6ugg utio r!J.l au ~OuJt-6 du expVtimen-
.ta;t,lOr!J.l et de La. Jtédailion de ce tnavaif.
Mu -6indJtu JtemMuementô vont à Mor!J.lieUJt ie PJt0nU-6eM S. RENAUVIN,
PJt0nU-6eM à i'UniVeMité de Nantu, d'avoiJt bien voulu me naiJte l'honneUJt de
pJté-6idM mon jUJtIj de thè-6e. Qu'il tnouve i u l'expJtu-6ion de ma Jtupeetuw-6e
gJtatitud e.
Je JtemMue Mon-6ieUJt J.N. HALLET, PJt0nU-6eM à l'UniveMité de Nantu,
d'avoiJt a~~epté de jugM ce tnavail et d'UJte membJte de mon jUJtIj.
\\
J'expJtime toute ma Jte~onnai-6-6an~e à MU-6ieuJt-6 G.L. HENNEBERT, PJt0nU-6eM
à l' UniveJv~ité Catholique de Louvain et B. PASCAT, PJt0nU-6eUJt à l'UniVeMité de
RUm-6, qui ont bien voulu a~~eptM la ~hMge d'UJte iu JtappoJtteuJt-6 de ce tnavail.
Je JtemMue -6in~èJtement Mon-6ieUJt J. L. MULTON, PJtonU-6eUJt-Cor!J.lultant à
i' ENSIA de Ma-6-6lj, qui a guidé mU début-6 dans i' étude du -6todwge et de Là
consenvat.ion du denJtéu aiimentaiftu, poun: avo.o: bienvou1.u naiJte paJttie du jUJtIj.
If. m'ut agJtéable d'aMU-6M mu -6in~èJtu JtemMuement.6 à Mon-6ieUJt
B. CAHAGNIER, VoueUJt-IngénieUJt à l'I.N.R.A. de NanteJ.J, poUJt -6a paJttiUpa.û.on
acxive. à fa Jtéaii-6a.û.on de ce tnavaif, et de m'avoiJt .tJta.n-6mif.J -6U ~onnai-6-6an~U
et Mn e.nthouJ.J,{.lu,me en mi~obioiogie. Son aide m'a été paJtti~ulièJtement pJtéuw-6e.
Je Jte.mMue Mon-6ieM J. FAURE, ViJteueM du LaboJtatoiJte de Te~hnologie
à l'I.R.A.T. de Montpe.f.liM, qui m'a initié aux. mé.thodu d'anaflj-6u techno-
iogiquu.
Je tien-6 à expJtimM i u toute ma Jte~onnai-6-6an~e. à MUe L. LESAGE,
ChMgé de Re~hM~he à i' l . N. R.A. de Nantu, poUJt l'aide et lu co n-6Ui-6
qu'eUe m'a appoJtté.-6 tout au iong de ~e.:tte. étude.
Je Jte.mMue vivement Mon-6ieUJt C. VESSERME et Madame V. ME LCI ON pou):
Leu»: a-6-6i-6tan~e. te~hnique et i' intéAét qu' w ont appordê.« à fa Jtéali-6ation
de ~e.:tte thè.-6 e.,
Je me. doi-6 aUMi de Jte.mMUM, poun: leM aimable ~of.iaboJtation,
MOn-6ieUJt L. HELARY, MR.R.e C. ALLAIN~SARRAZIN, MUe E. GUERIN, Madame N. MOUHOUS-
RIOU et Madame C. NICOLAS.
Que Madame C. CHAVIGNAUV, poUJt -6on enni~a~é et -6on dévoueme.nt, tnouve
i u i' expJtu-6ion de mU plU-6 vin-6 JtemMuement.6.
EnOin que touxe» Les peJ!.J.>onnU qui, à du ti:tftu diveJ!.J.>, ont ~o~bué
à fa Jtéali-6ation de ce ina» ail , tnouvent i u r.e témoignage de ma pJtononde
Jte~onnai-6-6an~e.

---

A mU panent»,
et: à mU ami: (e l -6 •

---

INTRODUCTION
1
- T R A V A U X A N TER lEU R S -
I. ECOSYSTEME POST-RECOLTE DES GRAINS
5
1.1. COMPOSANTES PRINCIPALES
5
1 .1 . 1. GRAINS DE CEREALE
5
1 . 1.2. MICROFLORE
7
- Interactions microbiennes
13
1.1.3. INSECTES
14
1.2. IMPORTANCE DE L'AW DANS L'ECOLOGIE MICROBIENNE
1-5
1.3. INFLUENCE DES AUTRES PARAMETRES DE L'ENVIRONNEMENT
18
2. ROLE DE L'OXYGENE DANS LA PHYSIOLOGIE DES MICROMYCETES
19
2.1. CROISSANCE EN AEROBIOSE
20
2.1.1. OXYDATIONS BIOLOGIQUES. TYPES RESPIRATOIRES
20
2.1.2. ROLE DE L'OXYGENE DANS LA BIOSYNTHESE DE L'ERGOSTEROL
22
_-:-""'='~
d~~\\NE. et''-14~
- Principales étapes de'Q..~a s:yn-thèse:;~qe l'ergostérol
«.:
(~\\
ft ( ~ ~~~/
r:
';.. \\i
2.2. CROISSANCE EN ANAEROBIOSE . ;_.. ~.o••••••••:;.~. • • • • • • • • • • • • • • •
25
\\?J \\
!)ff
.
\\
" "'",,-
"Q
. ' ,
~
.t.)
2.2.1. METABOLISME ANAEROBIE (FERMENTAT,<rm{)
26
.~,.,ç,~'
2.2.2. CROISSANCE D'ESPECES MYCELIENNES
27

---

2.3. NOTION D'ESPECES MICROAEROPHILES
28
3. ATMOSPHERES CONTROLEES ET COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES
30
3.1. EFFET DU DIOXIDE DE CARBONE SUR LA CROISSANCE
DES MICROMYCETES
30
3.2. COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES AUX ATMOSPHERES
CONTROLEES EN FONCTION DE L'AW
32
3.3. MYCOTOXINOGENESE ET ATMOSPHERES CONTROLEES
34
4. APPLICATIONS PRATIQUES DU STOCKAGE DES GRAINS SOUS
ATMOSPHERES CONTROLEES
35
4.1. PRINCIPES DU STOCKAGE SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
35
- Evolution microbiologique des grains humides
4.2. OBTENTION ET MAINTIEN DES ATMOSPHERES PAUVRES
EN OXYGENE
38
4.3. EFFETS DU STOCKAGE SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES SUR
LES CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET TECHNOLOGIQUES
DES GRAINS
39
4.3.1. VIABILITE DES GRAINS
39
4.3.2. MODIFICATIONS BIOCHIMIQUES
40
4.3.3. MODIFICATIONS DES QUALITES FONCTIONNELLES
ET TECHNOLOGIQUES
42
- MAT E RIE L S E T
MET H 0 DES -
1. MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
45

---

GRAINS DE RIZ PADDY
45
2. METHODES
45
2.1. DETERMINATION DE L'ETAT D'HYDRATATION DU RIZ PADDy
45
2.1.1. TENEUR EN EAU
45
2.1 .2. ACTIVITE DE l'EAU
46
- Principe de mesure
- Eléments théoriques
2.2. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES
50
Méthode des dilutions-ensemencements
2.3. METHODE DE DETERMINATION DU POIDS DE LA BIOMASSE FORMEE
PAR LES LEVURES
51
2.4. EXTRACTION ET DOSAGE DE L'ERGOSTEROL
52
2.4.1. EXTRACTION
52
2.4·2. DOSAGE
54
2.5. DETERMINATION DE L'ACTIVITE LIPASIQUE
55
2.5.1. PREPARATION DE L'ECHANTILLON
56
2.5.2. MODE OPERATOIRE
56
2 . 5. 3 . DOSAGE
57
2.5.4. EXPRESSION DES RESULTATS
57
2.6. DOSAGE DE L'ACIDITE GRASSE
59
2.7. DOSAGE DE LIAFLATOXINE B
60
1

---

2.7.1. EXTRACTION ET PURIFICATION
60
2.7.2. DOSAGE
60
2.8. DETERMINATION DE LA COMPOSITION DE L'ATMOSPHERE
INTERGRANULAIRE
62
MESURE DES GAZ (0
- CO
62
2
2)
- Oxygène
- Dioxide de carbone
2.9.
REALISATION D'ATMOSPHERES CONTROLEES
65
2.10. DETERMINATION DES CARACTERISTIQUES TECHNOLOGIQUES
DU RIZ PADDY
67
2.10.1. PREPARATION DES ECHANTILLONS
67
2.10.2. CARACTERISTIQUES DE L'USINAGE
69
2.10.3. CARACTERISTIQUES VISCOELASTIQUES
70
- T R A V A U X
P ERS 0 N N E L S -
1. VARIATION DES ECHANGES GAZEUX DANS L'ECOSYSTEME EN FONCTION DE
L'AW DES GRAINS DE RIZ ET COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES EN
ANAEROBIOSE ET SOUS CO
PUR
72
2
1.1. INFLUENCE DE L'ACTIVITE DE L'EAU DES GRAINS SUR LA VITESSE
DE CONSOMMATION DE L' O INTERGRANULAIRE EN CELLULES ETANCHES
72
2
1.1.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
72
1.1.2. RESULTATS
72
a - Evolution de l'atmosphère intergranulaire
en fonction de l'a
des grains
72
w

---

b - Evolution apparente de la microflore au
cours de la phase aérobie
73
c - Quotients respiratoires apparents
76
d - Adsorption du CO
sur les grains
77
2
1.1.3. DISCUSSION
.
77
1.2. EFFET DE L'ANAEROBIOSE STRICTE ET DU CO
PUR SUR L'EVOLUTION
2
MICROBIOLOGIQUE DES GRAINS DE RIZ PADDY HUMIDES
.
79
1 . 2 . 1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
.
79
1.2.2. RESULTATS
.
80
a - Evolution des microorganismes
80
b - Evolution de l'acidité grasse des grains
.
82
1 .2.3. DISCUSSION
.
83
2. ROLE DES TRES FAIBLES QUANTITES D'02 SUR L'EVOLUTION MICROBIOLOGIQUE
85
2.1. RECHERCHE DES QUANTITES MINIMALES D'02 NECESSAIRES
A LA CROISSANCE DES MICROMYCETES DES GRAINS EN
FONCTION DE L'ACTIVITE DE L'EAU
85
2.1.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
85
2.1.2. RESULTATS
86
a - Evolution quantitative et qualitative
de la microflore
86
b - Croissances pondérales estimées par les
teneurs en ergostérol des grains
89

---

c - Teneur en acides gras libres des grains et
l'activité lipasique
.
89
2.1.3. DISCUSSION
.
92
2.2. INFLUENCE DE QUANTITES D'OZ CROISSANTES SUR L'EVOLUTION
DES MICROMYCETES DES GRAINS ET SUR LA MYCOTOXINOGENESE .....
93
2.2.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
.
93
2.2.2. RESULTATS
95
a - Relations entre les quantités d'02 injectées
et le CO
mesuré
95
2
b - Evolution microbiologique
97
c - Corrélation entre teneur en ergostérol des grains
et quantités d'02 disponible
100
d - Evolution de l'acidité grasse et de l'activité
lipasique
101
e - Teneur en aflatoxine BI des grains
101
2.2.3. DISCUSSION
101
3. EFFET DU COZ SUR LE COMPORTEMENT DES ESPECES XEROTOLERANTES DU
RIZ PADDY CONSERVE A 0,87 D'AW
106
3.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
106
3·Z. RESULTATS
107
3·2.1. VARIATION DE LA CONSOMMATION DE L'02 PAR L'ECOSYSTEME
EN FONCTION DE LA NATURE DU GAZ COMPLEMENT
107

---

3.2.2. EVOLUTION DE LA SPOROGENESE
108
3.2.3. CROISSANCE FONGIQUE PONDERALE
109
3.2.4. EVOLUTION DE L'ACTIVITE LIPASIQUE ET DE
L' ACIDITE GRASSE DES GRAINS
112
3.2.5. TENEUR EN AFLATOXINE BI DES GRAINS
113
3.3. CONCLUSION
113
4. EVOLUTION DES CARACTERISTIQUES TECHNOLOGIQUES DES GRAINS DE RIZ
PADDY CONSERVES SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
114
4.1. CARACTERISTIQUES D'USINAGE
114
4.1.1. RENDEMENTS
114
4.1.2. TAUX DE BRISURES
115
4.2. CARACTERISTIQUES VISCOELASTIQUES
119
4. 2. 1. GONFLEMENT
119
4.2.2. COMPRESSIBILITE
120
4.2.3. RECOUVRANCE ELASTIQUE
120
4.3. CONCLUSION
124
5. COMPORTEMENT DES ESPECES CARACTERISTIQUES ETUDIEES EN CULTURES
PURES EN FONCTION DES MELANGES GAZEUX ET DE L'AW
124
5.1. ESPECES FONGIQUES REPRESENTATIVES DE LA MYCOFLORE
DES GRAINS HUMIDES CONSERVES SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
125
5. 1 . 1. MOISISSURES
126

---

a - Aspergillus candidus Link
126
b - Penicillium cyclopium Westling
127
5.1.2. SOUCHES DE LEVURES ISOLEES
127
a - Cryptococcus hungaricus (Zsolt) Phaff et FeIl ... 127
b - Hyphopichia burtonii (Boidin et al.), Von Arx
et Van der Walt
129
c - Candida sp.
132
5.2. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
134
MILIEUX DE CULTURES UTILISES
134
5.3. RESULTATS ET DISCUSSIONS
137
5.3.1. CROISSANCE DES MOISISSURES CARACTERISTIQUES
SUR RIZ STERILISE
137
5.3.2. CROISSANCE D'ASPERGILLUS CANDIDUS SUR MILIEU
SYNTHETIQUE SOLIDE
143
5.3.3. CROISSANCE D'HYPHOPICHIA BURTONII SUR GRAINS
STERILISES A AW 0,90
145
5.3.4. CROISSANCE D'HYPHOPICHIA BURTONII SUR MILIEU
LIQUIDE SYNTHETIQUE
147
RESUME ET CONCLUSION GENERALE
151

---

INTRODUCTION
Les céréales ont depuis toujours constituées la principale ressource
alimentaire de
l' homme.
C'est ainsi que
le stockage
et la conservation
entre
la
récolte
et
l'utilisation
des
grains
de
céréales
demeurent
et
demeureront longtemps inévitable.
La connaissance des phénomènes régissant
leur conservation et la maîtrise des techniques de
leur stockage restent
donc déterminantes.
Aujourd'hui,
les pertes demeurent encore très importantes,
mais le
problème de la conservation se pose en termes très différents suivant les
pays, en particulier selon le niveau technologique. Selon une estimation de
la F.A.O.,
les
pays
ayant une
technologie
avancée
ne
subissent
que
de
faibles pourcentages de pertes,
de 1 à 2 % environ mais ces pourcentages
portent sur de
très
grandes quanti tés
inversement,
dans
les
pays a
technologie peu avancée ou ne maîtrisant pas encore les méthodes éprouvées,
ces
pertes
après
récolte
peuvent
atteindre
jusqu'à
30
%,
ce
qui
est
considérable même Sl elles ne portent que
sur de moindres tonnages.
Dans
tous les cas, des insuffisances apparaissent dans les pratiques, mais aussi
dans les techniques de stockage,
malgré les nombreuses innovations qui ont
été introduites au cours des siècles à travers le monde pour conserver des
produits intacts
séchage,
étuvage,
conservation en épis ou en gerbes,
ventilation, etc.
On
sait
que
la
conservation
des
grains
de
céréales
se
heurte
essentiellement
à
des
problèmes
d'ordre
microbiologique,
dès
lors
que
l'humidité résiduelle permet le développent et l'activité métabolique des
microorganismes qui constituent leur microflore.
Il reste
cependant bien
difficile de
chiffrer,
même approximativement,
ce
que
représentent les
problèmes dus à ces microorganismes sur le plan économique.

---

-
2 -
Quelles
que
soient
les
zones
géographiques
de
production
et
les
conditions
climatiques
avant
et
pendant
la
récolte,
les
grains
sont
toujours porteurs de microorganismes très divers et parfois très nombreux :
bactéries,
levures et moisissures,
dont l'activité dépend essentiel~ement
de l'humidité du grain et,
dans une moindre mesure,
de la température si
l'on
considère
les
méthodes
de
conservation
habituelles
en
silos
non
étanches, sous atmosphère non contrôlée.
Dans ces conditions de libre atmosphère,
et peut-être
plus encore
lorsque le grain est ventilé,
l'activité des microorganismes est d'autant
plus intense et rapide que l'humidité et la température sont plus élevées.
Il
existe
cependant
une
limite
hydrique
inférieure
à
cette
activité
microbienne,
limite qui,
exprlmee en terme d'activité thermodynamique de
l'eau,
se
situe aux environs de
l'a
0,70 et en-deça de laquelle aucune
w
activité
des
microorganismes
les
plus
xérophiles
(Aspergillus
repens,
Monascus bisporus) n'est possible,
meme si les formes végétatives de ces
moisissures peuvent survivre très longtemps dans de telles conditions.
Au dessus de ce seuil et en l'absence d'autres barrières s'opposant
au
développement microbien,
telles
que
refroidissement,
réfrigération,
irradiation,
produits antifongiques,
etc., une croissance des moisissures
xérophiles et xérotolérantes se produit inéluctablement mais à des vitesses
qui, à nouveau, dépendent étroitement des conditions hydriques. Ainsi, même
un blé commercialisé à une teneur en eau de 16 %(SH) est-il le siège d'une
croissance
très
lente
des
moisissures
qu'il
héberge,
crolssance
qui
demandera plusieurs mois à température ordinaire pour provoquer au niveau
du grain
des
altérations
perceptibles ou mesurables,
comme la présence
visible
de
moisissures,
la
perte
de
pouvoir
germinatif
ou
encore
l' augmentation de
l' acidité grasse,
pour ne
ci ter que
les
plus connues
parmi ces altérations.

---

-
3 -
Il est donc tout à fait essentiel de garder en mémoire que dans tous
les
cas
réels
de
conservation
de
grains
en
atmosphère
libre,
les
microorganismes,
et plus particulièrement les moisissures,
restent actifs
et
la
"bonne
conservation" n ' est
assurée que
pour des
durées limitées,
correspondant a des degrés d'altération acceptables pour le consommateur ou
l'industrie. Ce n'est par conséquent qu'arbitrairement que l'on distinguera
des grains
"secs" et des grains
"humides"
et la limite hydrique retenue
pourra varier considérablement suivant les critères de qualité retenus et
les durées de conservation recherchées.
Depuis
la
plus
haute
antiquité,
les
céréaliers
connaissent
empiriquement cette relation entre l' humidi té des
grains
et la durée de
conserva tion,
et le
séchage naturel ou artificiel des grains a toujours
représenté le moyen le plus sur de stabilisation des récoltes vis-à-vis des
microorganismes.
Malheureusement,
en raison notamment de l'extension des
zones cultivées, de l'intensification des productions et de la mécanisation
des techniques de récolte,
il est de
plus en
plus souvent nécessaire de
faire appel au séchage artificiel,
ou aux produits chimiques, ce qui, dans
tous les pays développés ou non,
représente une contrainte économique très
lourde.
Le séchage des grains avant leur entrée au
silo de
stockage ni est
d' ailleurs
pas
toujours
une
condition
suffisante
de
bonne
conservation
puisque,
en
zones
climatiques
peu
favorables,
la
réhumidification
progressive
des
stocks
s'observe
souvent
en
raison
par
exemple
de
variations thermiques induisant des migrations d'eau dans les
stocks,
ou
même simplement lorsque le grain s'équilibre lentement avec une trop forte
humidité relative externe.
La santé du consommateur est à considérer en
priori té lorsque l'on
envisage
l'utilisation
des
produits
chimiques
conservateurs
pour
la
maîtrise
des
flores
de
stockage.
Si
dans
les
pays
développés,
la

---

-
4 -
règlementation
de
l'utilisation
de
ces
produits
est
de
plus
en
plus
stricte,
le marché des fongicides et insecticides s'étend librement dans
les pays
les
moins
avancés
et
les
risques
réels
de
ces
produits
dans
l'alimentation humaine sont pour la plupart ignorés par l'utilisateur et le
consommateur.
C'est
pour
tenter
de
répondre
aux
insuffisances
des
systèmes
traditionnels
que
les
technologues
s'intéressent
beaucoup
à
l'heure
actuelle
aux
techniques
de
conservation
sous
atmosphères
contrôlées.
L'objectif principal du travail présenté ici a été de préciser les limites
théoriques
et pratiques
de
ces
modes de
conservation,
et
notamment de
définir
les
quantités
cri tiques
d'oxygène
pour
la
croissance
des
micromycètes.

---

- TRAVAUX ANTËRIEURS -

---

-
5
-
1. ECOSYSTEME POST-RECOLTE DES GRAINS
Un
stock
de
gralns
est
un
écosystème
artificiel
constitué
de
plusieurs entités vivantes.
Assurer la bonne conservation des grains après
récolte revient
à
stabiliser
momentanément l'écosystème ou tout au
moins
ralentir suffisamment son activité vitale.
1.1. COMPOSANTES PRINCIPALES
1.1.1. GRAINS DE CEREALES
Les grains de céréales (ou caryopses) sont des organismes vivants en
état de
vie ralentie
et caractérisés
par une
déshydratation
poussée
qui
entraîne une
réduction importante de leur activité métabolique.
Cet état
physiologique exceptionnel fait qu'on peut considérer les grains comme des
formes naturelles de préservation (COME, 1982) qui n'échappent cependant pas
à l'activité dégradante des processus de vieillissement ou aux atteintes de
différentes causes d'altération comme les moisissures ou les insectes.
Dans
la
littérature,
d'innombrables
travaux
sont
consacrés
à
ces
phénomènes
d'altération (BOTTOMLEY et al.,
1950;
CHRISTENSEN,
1972; CHRISTENSEN et
KAUF~~NN, 1974 ; FLEURAT-LESSARD, 1982
MULTON, 1982).
Le
germe
étant
la
structure
essentielle
du
grain
(ou
semence
surtout),
a
une
activité
respiratoire dont
l'intensité dépend du niveau
d'hydratation
(COME,
1982).
De ce
fait,
il
ne
résiste
aux conditions
difficiles
(température,
anoxie)
que
s'il
est
suffisamment
déshydraté
(ROBERTS et ABDALLA, 1968
COME, 1982 ; PETRUZELLI, 1986).
Selon BENNICI
et al.
(1984)
le
vieillissement des
grains
est
un
phénomène
progressif
caractérisé
par
la
détérioration
de
différents
processus
métaboliques,
notamment
dus
à
des
cassures
irréparables
des
chromosomes
qui
aboutit
à
la
perte
de
l'énergie
germinative
et
de
la
viabilité du caryopse.
Il précise que
ces
processus dépendent aussi des

---

-
6 -
facteurs externes tels que la température et l'activité de l'eau des grains
au champ,
ou durant le stockage.
SEMENIUK (1954) et ROBERTS (197Z) notent
que le degré de détérioration des grains durant le stockage est dépendant de
trois facteurs majeurs
:
la température,
l'humidité et la composition de
l'atmosphère
intergranulaire.
PETRUZELLI
(1986)
confirme
que
les
modifications
physiques
et
métaboliques
dans
les
grains
stockés
sont
probablement toutes accélérées quand la température augmente,
alors que le
comportement des grains à une augmentation de la teneur en eau paraît être
plus complexe.
Les
grains
en
vrac
offrent
la
particularité d' être
cons ti tué s de
particules granulaires indépendantes,
entre lesquelles il existe un volume
d'air interstitiel relativement important correspondant à 40 % environ du
volume
total
apparent.
Cette
structure
granulaire
offre
un
très
grand
intérêt, car il est possible d'insuffler des gaz et de maintenir (si le silo
est étanche)
une
atmosphère
de
composition
connue à travers
la masse de
grains (atmosphère contrôlée).
Cette masse d'air intergranulaire tend à se mettre en équilibre de
température,
d'humidité
relative
et
de
gaz
avec
les
grains.
Si
les
interactions entre les deux premlers facteurs et les grains sont déjà bien
étudiées à ce jour (MULTON,
1980,
198z),
les échanges gazeux au seln de
l'écosystème,
prenant en compte les processus respiratoires et fermentaires
dans les
phénomènes de
sorption des
gaz
sur
les grains
eux-mêmes,
sont
beaucoup moins bien connus.
YAMAMOTO et MITSUDA (1980) montrent par exemple
à partir des travaux réalisés sur différents produits (céréales, oléagineux,
protéine
pure) ,
que
le
phénomène
d'adsorption
du
COZ
gazeux
est
essentiellement dû à l'interaction entre ce
gaz
et
les
acides
aminés
ou
protéines selon les réactions suivantes
- Formation de carbamate
R - NH Z -t- COZ _...._---D>- H - NH COOH

---

-
7 -
Réaction anionique
HZO + COZ
~
HZ C0
~
HC0 3- + H+
..
4
3
..
OH + COZ
H CO -
...
3
R -1- NH
+ H CO -
• (R - NH
(HC0 - )
3+
3
...
3+)
3
Ils
indiquent
que
le
stockage
des
grains
sous
COZ
favorise
le
processus
de
diffusion
de
ce
gaz
dans
le
grain,
et
la
formation
de
carbamates a partir de
l'interaction entre
le COZ
gazeux et
les groupes
fonctionnels des protéines à l'interface grains/atmosphère.
1.1.Z. MICROFLORE
Les
grains
issus
du
champ
hébergent
une
microflore
importante et
caractéristique composée de très nombreux genres de bactéries,
moisissures,
levures et actinomycètes (CHRISTENSEN et KAUF~~NN,
1974
RICHARD-MOLARD,
198z ; PELHATE, 198Z).
L' acti vi té
de
la
flore
bactérienne
et
notamment
les
bactéries
lactiques
(aéro-anaérobie
facultatives)
représente
un
des
paramètres
déterminant la conservation des grains réputés humides.
Les
acti vi tés de
l'eau,
minimales
pour leur développement,
sont généralement
considérées
comme voisines de 0,90 (LEITSNER et RODEL,
1976;
RICHARD-MOLARD,
198Z),
mals
il
resterait
à
préciser
quelles
variations
ces
acti vi tés
de
l'eau
limites
peuvent
subir
en
fonction
des
fluctuations
d'autres
paramètres
physiques de l'environnement,
notamment de la quantité d'oxygène disponible
dans l'atmosphère intergranulaire.
- Les levures ne forment pas un groupe systématique homogène basé sur
leur mode de
reproduction,
ma i s elles se
présentent le
plus généralement
sous forme
unicellulaire meme
s i ,
pour
beaucoup
d' entre-elles,
il
est
souvent
possible
d'observer
la
formation
de
pseudo-mycélium,
voire
de
mycélium vrai.

---

-
8 -
Leurs caractères morphologiques et sexuels permettent de les répartir
essentiellement
dans
deux
classes
de
champignons
microscopiques,
les
Ascomycotinés et les Deutéromycotinés ou Fungi imperfecti comme le montre le
tableau 1.· Elles peuvent présenter soit un mode de reproduction végétatif
s'effectuant,
par bourgeonnement ou par scissiparité, soit une reproduction
sexuée en formant des asques libres et nus de forme très variable contenant
des ascospores, ou encore les deux types de multiplication.
1
1
CLASSES
1
ORDRES
PRINCIPAUX GENRES
1
1
1
1
1------------------------1-------------------- ---------------------------1
ASCOMYCETES
1
1
1
1
- Hemi-ascomycètes
Endomycétales
Saccharomyces, Hansenula
1
(Levures ascosporogènes)
Pichia, Hyphopichia
1
Torulospora
1
1
- Euascomycètes
1
Eurotiales
Monascus, Byssochlamys
1
1
Eurotium, Eupenicillium
1
------------------------1-------------------- ---------------------------1
1
1
DEUTEROMYCETES
1
-Levures
Candida, Cryptococcus
1
1
Rhodotorula, Trichosporon 1
1
1
ou
1
HYPHOMYCETALES
1
1
1
1
-Moisissures
Aspergillus, Penicillium
1
1
Geotrichum, Sporendonema
1
FUNGI IMPERFECTI
1
Trichoderma, Trichotheciuml
1
Paecilomyces, Verticullium 1
1
Cladosporium,
1
1
Scopulariopsis
1
1
Stemphylium,
1
1
Helminthosporium,
1
Alternaria, Fusarium
1
1
1
1
Tableau 1
Classification simplifiée des micromycètes (levures et
moisissures) des grains de céréales
La morphologie des levures peut dépendre de la composition gazeuse
environnante et notamment de la pression d'oxygène.
TABAK et COOKE (1968b)
indiquent qu 1 il
existe une
corrélation entre le bourgeonnement de Candida

---

-
9 -
albicans et l'augmentation de la pression d'oxygène,
et que la croissance
pseudo-mycélienne
pourrait
être
corrélée
avec
les
faibles
pressions
partielles d'oxygène.
A moins que l'espèce manifeste mOlns d'exigence pour
l'oxygène,
il est établi que
la réduction de
la concentration d'oxygène
favorise la sporulation de certaines levures (ANDREASEN, 1954).
-
L'appareil végétatif
des micromycètes
filamenteux est
le
thalle
constitué d'hyphes,
dont l'ensemble constitue le mycélium (Figure 1).
Le
filament
mycélien
peut
être
non
cloisonné
(Zygomicotina)
ou
typiquement
cloisonné (Ascomycotina,
Deutéromycotina)
dans ce cas,
les éléments de
l'hyphe communiquent entre eux par des pores.
De part et d'autre du pore de
communication se trouvent de petits organites qui interviennent par exemple
pour bloquer l'orifice de communication en cas de rupture du filament ou de
dégradation due à la sénescence (AINSWORTH et SUSSMAN, 1966).
Contrairement aux levures,
l'appareil végétatif des
moisissures ne
présente
pas
d'unité
cellulaire
et
montre
une
masse
de
cytoplasme
multinuclée, mobile, contenue dans un système de tubes ramifiés (mycélium).
Cependant,
différents genres de moisissures,
Mucor et Aspergillus,
peuvent donner lieu à des formes levures lorsqu'ils se développent sous de
très faibles pressions d'oxygène (TABAK et COOKE, 1968b ; ESCOULA et LEBARS,
1973 ; RICHARD-MOLARD, 198z) ou sous une atmosphère très riche en dioxide de
carbone (BARTNICKI-GARCIA et NJCKERSON, 196Z). Ces auteurs expliquent que la
modification de
la morphologie cellulaire observée
chez les
mucorales
se
développant sous COZ'
est accompagnée notamment par des modifications dans
la composition chimique de la paroi cellulaire,
et que
ces modifications
dans la
structure des
parois
sont
directement
liées
a
la
différence
de
développement de la morphologie cellulaire.
Le processus de germination des spores
est la première étape de la
croissance mycélienne.
De ce fait, il est bien sur sujet à des stimulations
ou des inhibitions par de très nombreux facteurs de l'environnement.
C'est

---

la -
-
.
h -
s e n t a t i on sc
~f;~~".---- ~.-~~\\
!f c p., \\VI (:; ~
Figure
"/ ,,)
d '-l~
.
1 :
f
Re pr
emat:ë!q~e-'e
a crolJs~::a;,nce
è
mycélienne des moisissu~~J\\(d'aprèsR~~UEBERT, 1987)
. </~.~, Qb2V
(A)
spore fongique initial~\\..I;-I'o
(/~'i7
_
. . . . '_'o.}(~Ii1nor(l.r~';/
(B)
debut de ramlflcatlon lat~r.ale~~-
(C)
extrémité de l'hyphe (zone d'activité métabolique
intense)
(D)
détail de la cloison transversale (montrant pores
et corps de Woronine)
(E)
Réunion par contact/dissolution des parois puis par
Eusion des cytoplasmes, entre deux filaments mycéliens
(Anatosmose)

---

-
Il -
ainsi que selon YAMAGITA (1963), le COZ a une plus grande influence que l'OZ
sur
la
germination
des
spores
fongiques.
La
sensibilité
des espèces à ce gaz a fait l'objet d'une étude réalisée par GIBB et WALSH
(1980) qui montrent que la stimulation de la germination des spores par le
COz a
été
seulement
marquée dans
le cas d' Aspergillus
ustus
et Fusariurn
solani
ils précisent que dans ces conditions,
la croissance des espèces
nécessite
la
présence
dans
le
milieu
de
quelques
consituants
actifs
(vitamines du groupe B).
La reproduction chez les moisissures peut se faire par voie sexuee ou
asexuée
(Figure
Z).
De
loin
la
plus
fréquemment
rencontrée
chez
les
moisissures,
la reproduction asexuée (ou multiplication végétative) conduit
à
la
formation
des
spores
ou
conidies
qU1
constituent
des
organes
de
dissémination très
puissants des espèces.
Certaines espèces sont en outre
capables d'une reproduction sexuée (Ascomycètes).
Les moisissures
et levures sont fréquemment
hétérothalliques
la
reproduction
sexuée
se
produit
Sl
deux
mycéliums
de
signe
opposé
se
rencontrent.
Dans un environnement donné,
l'apparition d'un mode de reproduction
(sexuée ou asexuée) est sous la dépendance de nombreux facteurs biotiques et
abiotiques.
Selon WILSON (1960),
les microconidies de Fusarium oxysporurn,
Fusarium
cubense
forment
des
tubes
germinatifs
qui
produisent
des
chlamydospores sous une atmosphère enrichie en dioxide de carbone.
MAGAN et
LACEY
(1984a)
montrent
que
Aspergillus
repens
et
A.
candidus
produisent
encore des conidies sous 1 % d'oxygène et à 0,85 d'a
cependant,
à 10 %
w
d'oxygène et à 0,80 d'a,
A.
repens produit seulement des cleistothèces
w
(reproduction
sexuée),
mais
produit des
conidiophores
et cleistothèces à
Zl %d'oxygène et à 0,98 d'a.
Il est difficile de distinguer un rôle clair
w
de
l'oxygène
sur
le
déclenchement
de
l'un
ou
l'autre
de
ces
modes
de
reproduction chez les eurotiales à partir de ces résultats,
dans la mesure

---

-
12 -
Reproduction asexuée
~Cycle normal ~__~
~ ~
Germination çÉ
Mycélium
1
(Jl8
Ascospore
Reproduction
sexuée
~ Form~tion
~ ascogene
\\~...~O&J~
Asque
~(2
/
<;
Cleistothèce
Figure 2
Cycle de reproduction asexuée et sexuée d'une
mOlSlssure du genre Aspergillus
(Ascomycètes)
production des conidies immédiatement
après la germination
çy~!~_~~~~~! : production importante de biomasse après
la germination des spores

---

-
13 -
o~ le reg1me du flux gazeux est continu dans ces expérimentations,
et que
par
conséquent,
les
quantités
d'oxygène
disponible
ne
sont
jamais
que
relativement limitées pour la stimulation d'un type de reproduction.
- INTERACTIONS MICROBIENNES
Les
différents
comportements
des
micromycètes
vis-à-vis
de
l'environnement gaze~x,
observés par ces auteurs sur milieux modèles,
sont
par ailleurs difficilement transposables à un écosystème.
Seules de rares
études ont été réalisées en détail sur de tels systèmes o~ règne une grande
diversité
de
microorganismes
et
faisant
intervenir
par
conséquent
des
phénomènes de compétition interspécifique.
Cependant,
ces interactions entre microorganismes ont notamment fait
l' obj et d'une étude récente par CUERO et al.
(1987) qui observent que la
croissance
d'Aspergillus
flavus
et
la
biosynthèse
d'aflatoxine
BI
sont
stimulées par les levures et les bactéries sur maïs et r1Z humides irradiés.
Ils
notent
au
meme
moment
une
augmentation
de
la
biomasse
quand
une
interaction s'établit entre A.
flavus et Hyphopichia burtonii ou Bacillus
amyloliquefaciens.
WISEMAN
et
MARTH
(1981) ,
utilisant
Aspergillus
parasiticus
et
Streptococcus
lactis
comme
organismes
en
compétition,
observent une inhibition du développement d'A.
parasiticus seulement si les
deux espèces sont cultivées simultanément ou Sl S. lactis se développe avant
A. parasiticus.
Généralement,
sur
les
grains
stockés
après
récolte,
a
lieu
une
succession
de
microorganismes
déterminés
par
les
conditions
de
l'environnement,
spécialement
l'activité de
l'eau,
la
température
et la
composition de l'atmosphère intergranulaire (CHRISTENSEN et KAUFMAN,
1974;
PELHATE,
1968,
1982).
Ainsi,
à chaque niveau écologique, les grains sont
naturellement
porteurs d'une microflore
essentiellement déterminée
par le
milieu et les paramètres physico-chimiques de l'environnement.

---

-
14 -
Les données actuelles relatives à l'influence éventuelle du niveau de
l'inoculurn à l'origine,
de
la nature
et de
l'évolution des
interactions
microbiennes dans les produits conservés surtout sous atmosphères contrôlées
sont remarquablement rares (RICHARD-MOLARD, 1988).
1.1.3.
INSECTES
Les insectes
sont aussi considérés comme une
cause d'altération de
tout premier plan,
essentiellement par la consommation directe qu'ils font
des grains
stockés (perte de matière
sèche),
par les souillures diverses
dont ils sont responsables et les contaminations dont ils sont les vecteurs
privilégiés.
Leur
seule présence
est néfaste
et déprécie
le
stock
tout
entier quel que soit leur nombre (FLEURAT-LESSARD, 1982).
De nos jours,
l'usage des atmosphères modifiées est fréquent pour le
contrôle des insectes dans les produits stockés.
Ainsi,
les concentrations
de dioxide de carbone nécessaires pour le contrôle des insectes n'excèdent
pas 40 à 60 %(CALDERON,
1981; PASTER et al., 1983). Ces données indiquent
que la concentration du dioxide de carbone nécessaire pour le contrôle des
insectes est de
loin au-dessous de
celle nécessaire pour le
contrôle des
moisissures de stockage (PASTER et al., 1983). Cependant, FLEURAT-LESSARD et
Le
TORC' H précisent
que
si
cet
acquis
est
assez
précis
sur
les
formes
adultes,
il l'est beaucoup moins sur les formes larvaires, notamment celles
qui accomplissent leur développement à l'intérieur des grains (communication
personnelle).
SHEJBAL (1979),
Le TORC'H (1986) observent que les faibles pressions
partielles d'oxygène
«
1 %) sont suffisantes pour éliminer les insectes de
stockage. BANKS (1981) indique que bien que faisable techniquement, il n'est
pas
nécessaire
de
maintenir
indéfiniment
sous
atmosphère
contrôlée
des
grains secs «
12 % s.h.) pour prévenir le développement des insectes.
Il
note en conséquence que la technique de stockage sous atmosphère contrôlée

---

-
15 -
est désignée seulement pour désinfecter les grains stockés,
et l'exposition
indéfinie sous atmosphère contrôlée n'est pas nécessaire pour atteindre cet
objectif dans les silos étanches. Cependant, la composition gazeuse efficace
contre les insectes des produits stockés varie non seulement avec le temps
d'exposition, mais aussi avec la température et l'humidité (BAlLEY et BANKS,
1980). BANKS (1981) précise que les atmosphères insecticides typiques sont
1 %d'OZ dans l'N
(anoxie), et 60 %de COZ (toxique) dans 40 %d'air.
Z
1.Z. IMPORTANCE DE L'AW DANS L'ECOLOGIE MICROBIENNE
L'équilibre
thermodynamique
n'est
jamais réalisé dans
les
systèmes
réels
de
conservation,
ne
serait-ce
qu'en
raison
des
variations
de
température extérieure. Ainsi, dans le cas des grains et graines stockés, il
arrive
fréquemment
que
des
changements
de
température,
générateurs
de
gradients thermiques,
entraînent immédiatement un transfert de vapeur d'eau
favorisant
ou
activant
l'évolution
enzymatique
ou
microbiologique
dans
l'écosystème.
Si l'activité de l'eau du produit est très élevée,
cette évolution
peut débuter le
plus
souvent
par
un développement
de
bactéries
qui
sont
principalement des Entérobactéries,
des Pseudomonas et des Lactobacillus en
cas d'ensilage.
Les
humidités
relatives
restent
les
plus
déterminantes
et
vont
expliquer les différences de comportement du complexe grain-microorganismes.
C'est ainsi que le comportement comparé de quelques moisissures des grains a
permis de les répartir en trois groupes écologiques habituellement reconnus
(SEMENIUK, 1954 ; PELHATE, 1968 ; LEITSNER et RODEL, 1976)
les hygrophiles
(Fusarium,
Alternaria,
Epicoccum,
Helminthosporium),
les
mésophiles
(Cladosporiwn,
Mucorales, Trichoderma, les Penicilliums et quelques espèces
d'Aspergillus) et les xérophiles (Aspergillus
restrictus,
A.
repens,
A.
candidus,
A.
versicolor, A. echinulatus). Cependant, cette subdivision des

---

-
16 -
mOlslssures en groupes écologiques en fonction de leur besoin en eau reste
toute relative. Si les espèces hygrophiles sont facilement identifiables par
leurs exigences hydriques,
la répartition des autres espèces en mésophiles
et xérophiles reste arbitraire.
La
figure
3
indique
les
effets
d'une
réduction
de
l'activité
thermodynamique de l'eau (a ) sur la croissance,
le temps de la tence ,
la
w
vitesse de développement et du nlveau maximum d'envahissement des grains par
un microorganisme donné (RICHARD-MOLARD, 1985).
Phase
Phase
exponentielle
stationnaire
~
AW t n---
Ul
Q)
H
::l
Ul
Ul
.,",
Ul
.,",
o
E
~ /
.
.AW (21. _ _
Ul
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Ul
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I
-'G-----1......
-
+- ~
a w lim i. te.
.
1
---"·-1
1
1
----------....·-1
Phase de latence
Temps
AW (T»AW (2»AW (3)
Figure 3
Effet de la réduction de l'a
sur la
w
croissance des moisissures

---

-
17 -
A partir de ces données théoriques cependant,
seules des prévisions
de conservation assez grossières peuvent être faites,
dans la mesure où les
connaissance~ actuelles
ne
permettent
encore
qu'une
intégration
assez
sommaire de nombreux paramètres de l'écosystème.
Il
est
difficile
de
distinguer,
chez
les
levures,
des
groupes
écologiques.
Ces
difficultés
peuvent
être
fonction
des
exigences
particulières
de
ces
espèces
vis-à-vis
des
autres
paramètres
de
l'environnement,
notamment la composition gazeuse et la nature du substrat.
Les
a
minimales
nécessaires
pour leur croissance varient de 0,88
à 0,96
w
(SEMENIUK,
1954).
Ce dernier auteur indique que les levures peuvent être
hygrophiles ou mésophiles.
Par contre,
LEISTNER et RODEL (1976) montrent que les minima d'aw
requis pour la multiplication de quelques genres peuvent être plus faibles
(Tableau 2).
Genres
a
Genres
a
w
w
Rhodotorula
0,92
Candida
0,88
Pichia
Il
Torulopsis
Il
Hanseluna
0,90
Saccharomyces
0,80
Saccharomyces
Il
Saccharomyces
0,62
Tableau
2
: Activité de l'eau minimale de croissance de quelques
genres de levures (d'après LEITSNER et RODEL, 1976)
Ces microorganismes présents sur les grains très réceptifs au moment
de la récolte, ne se développent que quand les conditions de l'environnement
et surtout l'a
deviennent favorables à leur activité métabolique.
w

---

-
18 -
Hais,
pour
la
plupart
des
espèces
susceptibles
de
coloniser
les
grains, préciser la vitesse de croissance à des a
supérieures à l'a
limite
w
w
de développement,
reste encore du domaine de l'observation empirique.
Dans
les
systèmes
traditionnels
de
stockage
de
grains
secs
(a
$;
0,70) ,
le
w
principal
inconvénient
du
développement
des
espèces
xérophiles
paraît
résider dans leur effet déstabilisateur à plus
ou moins
long terme
en
effet,
aérobies
confirmés,
ces
microorganismes
utilisent
les
réserves
glucidiques
et
lipidiques
du
grain
en
produisant
en
contrepartie
de
la
chaleur et
de
l'eau
en
plus
du COZ.
Ceci entraîne
progressivement
des
élévations de
l'a
et
de
la température du
stock et ouvre la voie
à des
w
espèces mésophiles et hygrophiles,
plus exigeantes en eau,
mais aussi plus
dégradantes comme Aspergillus candidus,
A.
flavus ou Penicillium cyclopium
par
exemple
(PELHATE,
198z) .
Avec
quelques
variantes,
ces
processus
s'enclenchent avec une vitesse d'autant plus grande que l'humidité initiale
du grain mlS en conservation sera plus élevée.
1.3. INFLUENCE DES AUTRES PARAMETRES DE L'ENVIRONNEMENT
Tandis
que
les
effets individuels
des
facteurs
de
l'environnement
sont bien
connus,
ceux
dus à
leurs
interactions,
et notamment
avec
la
composition atmosphérique sont moins connus.
Bien que
l'importance de
l'activité de
l'eau sur l'écosystème
soit
aujourd'hui bien établie,
d'autres facteurs abiotiques comme la température
ou la composition de l'atmosphère intergranulaire constituent des paramètres
qUl
peuvent
infléchir
de
manière
caractéristique
l'évolution
microbiologique.
Ainsi,
GOLDING
(1940a)
observe
que
des
souches
de
Penicillium
roqueforti
sont
plus
affectées
au-dessus
de
l'optimum
de
température de développement sous de faibles pressions d'oxygène. ESCOULA et
LEBARS (1973) observent que la température optimale de croissance de Mucor
racemosus
et
Rhizopus
arrhizus
est
proche
de
30°C
en
anaérobiose
et

---

-
19 -
respectivement de
ZO-Z5°C et
35-36°c en
aérobiose.
Il note
que
pour les
températures maximales de développement en anaérobiose et en aérobiose d'une
même souche, l'écart peut être d'intensité variable et de signe contraire.
Les travaux de KLEBS rapportés par TABAK et COOKE (1968b) indiquent
que
les
facteurs
de
l'environnement
qui
affectent
le
processus
de
la
germination ou de
survie des
spores sont les memes qui prévalent pour le
développement,
à savoir:
l'humidité, la température, le pH, le type et la
concentration des nutriments,
la lumière et la composition de l'atmosphère
(rapports OZ' NZ' COZ)·
Il existe une triple interaction entre l'humidité,
la température et
la composition de l'atmosphère qui pourrait être utilisée pour optimiser la
maîtrise du développement fongique
en atmosphère
contrôlée
(BUSTA
et al.
1980) .
2. ROLE DE L'OXYGENE DANS LA PHYSIOLOGIE DES MICROORGANISMES
Le rôle de l'oxygène dans la physiologie des microorganismes a fait
l'objet de nombreuses études (AINSWORTH et SUSSMAN,
1966;
TABAK et COOKE,
1968a et b), mais ces études sont déjà anciennes et ne pouvaient être menées
avec les moyens analytiques dont nous disposons aujourd'hui.
Les micromycètes ont besoin d'oxygène pour leur activité catabolique
(énergétique) et anabolique (synthèse de composés constitutifs),
et ne sont
pas
capables
de
se
développer
en
absence
d'oxygène,
bien
que
la
concentration minimale qui permettrait une croissance satisfaisante puisse,
semble-t-il, être très faible (COCHRANE, 1958 ; DAVID et KIRSOP, 1973).

---

-
20 -
Z.l. CROISSANCE EN AEROBIOSE
Z.l.l. OXYDATIONS BIOLOGIQUES. TYPE RESPIRATOIRE
La plupart des micromycètes dépendent entièrement de la respiration
comme source d'énergie fondamentale.
Ces microorganismes ne peuvent pas se
développer sans
l'oxygène moléculaire qui constitue pour eux un nutriment
essentiel (STANIER et al., 1966 ; SMITH et BERRY, 1975).
L'oxydation des molécules organiques comme le glucose,
au dépend de
l'oxygène (accepteur final)
est la première réaction productrice d'énergie
chimique
(ATP)
dans
les
cellules
fongiques.
Cette
énergie
est
ensuite
utilisée pour alimenter les réactions de synthèses endothermiques grâce à un
système de réactions couplées.
Ces réactions nécessaires à la croissance et
à
la multiplication
des microorganismes
ne
peuvent
se
produire
sans
cet
apport
énergétique.
Cependant,
SUSSMAN
(1966)
indique
que
les
enzymes
respiratoires
ne
sont
pas
directement
impliquées
dans
le
processus
d'activation des ascospores dormant de Neurospora.
Il est établi que
le
pourcentage d'oxygène nécessaire
pour le bon
fonctionnement
des
enzymes
respiratoires
varie
en
fonction
des
espèces
fongiques.
Ainsi,
Oospora lactis exige 0,4Z9 mg d'OZ/l pour sa croissance,
Penicillium roqueforti demande plus (0,78) tandis que Aspergillus flavus, ~
niger,
P.
expansum et P. notatum sont inhib~s=à~38 ; 0,56 ; 0,56 et 0,80
"
&CAJNEer:;;~
mg d'Oz/l d'eau respectlvement (MILLER e~~GOLDING~~1~~9).
MAGAN et LACEY
/(,~(
-7\\
/!>'
(~
( 1984a ) déterminent par
contre la concellitra1s,i0nEd '.oxy:g-ène nécessaire pour
\\~~~ \\\\~Î~}
réduire de moitié le taux de c ro i s s ancéydes cultures eiiCposées. à l'air libre
, '", ,-, ~ 'i-Ir
(LC50 OZ);
ils trouvent pour Cladosporium" ~~~tr{ïdes, P. cyclopium et
A.
candidus des valeurs de 0,14 ;
Z,4 et 0,45 %à z3°C et à 0,90 d'a.
P.
w
roqueforti, considéré comme une espèce particulièrement tolérante à l'anoxie
(PELHATE,
1975) montre une LC
Oz inférieure à 0,14 %' Cette espèce est la
50

---

-
21 -
plus tolérante aux très faibles concentrations d'oxygène contrairement aux
résultats
obtenus par MILLER et GOLDING (1949)
qui semblent
surestimer le
besoin réel en Oz de ces espèces fongiques.
Ces
expériences réalisées en
flux continu
permettent difficilement
d'obtenir
des
résultats
précis
reproductibles
car
la
quantité
d'oxygène
disponible dans la phase gazeuse ou liquide ne peut être évaluée.
Actuellement,
rien
ne
nous
permet
de
définir
ni
de
déterminer
l'aptitude d'un microorganisme à consommer plus d'oxygène que d'autres.
Par contre, au delà d'une certaine limite, l'oxygène peut produire un
effet represseur sur le processus d'oxydation,
entraînant une inhibition de
la croissance. TABAK et COOKE (1968b) indiquent qu'une concentration d'OZ de
76
% inhibe la croissance des moisissures filamenteuses
et
levures.
Aspergillus
niger,
A.
wentii
et
Penicillium
digitatum
ne
peuvent
se
développer
sous
une
pression d'OZ élevée,
et une
accumulation importante
diacide pyruvique
a été
observée dans
les hyphes
cet acide organique
disparaît des hyphes après exposition à l'air (CALDWELL,
1963). Ces auteurs
observent que
la production de pigment par les champignons microscopiques
est
altérée
sous
les
pressions
d' °
élevées.
L'utilisation
des
Z
concentrations
élevées
de
l'oxygène
dans
la
recherche
des
mécanismes
de
contrôle
de
la
croissance fongique
n'a cependant
pas
fait
l'objet d' une
étude approfondie
et il existe très
peu d'études
établissant une
relation
entre degré d'inhibition et concentration en OZ.
Le fonctionnement
des enzymes
respiratoires dépend aussi des autres
facteurs
de
l'environnement.
Selon ces mêmes auteurs,
l'oxygénation des
cytochromes est gênée par le COZ'
et augmente à la lumière.
Des études sur
la concentration du COZ nécessaire pour l'inhibition de ces réactions sont
rares et difficiles à établir,
d'autant plus qu'elle varie aussi selon les
espèces
et
les
facteurs
physico-chimiques
de
l'environnement
(SMITH
et
BERRY,
1975).

---

- 22 -
2.1.2. ROLE DE L'OXYGENE DANS LA BIOSYNTHESE DE L'ERGOSTEROL
L'ergostérol,
caractérisé
par
quatre
cycles
carbonés
dont
trois
cyclohexaniques
(Figure
4)
est
le
stérol
majeur
dans
la
plupart
des
mi.cr-omycè t es (WEETE,
1973).
Les connaissances actuelles sur la biosynthèse
de
l'ergostérol
et
des
mycostérols
d'une
manière
générale,
ont
été
essentiellement
acquises
en
étudiant
leur
synthèse
dans
les
ascomycètes
inférieures (levures).
Me
26
HO
Figure 4
Structure de l'ergostérol
ergosta 5,7, 22-triène 3-01
Certaines
étapes
de
la
chaîne
de
réaction
de
biosynthèse
sont
aérobies,
d' autres
sont anaérobies
(FRYBERG et al.,
1973
BENVENISTE,
1986) .
La
synthèse
de
ce
composé
indispensable
à
la
croissance
des
moisissures
et
des
levures
dépend
donc
directement
de
l'oxygène
de
l'atmosphère environnante.

---

- 23 -
- Principales étapes de la synthèse de l'ergostérol
Les
différentes
étapes
réalisées
au
cours
de
la
réaction
de
biosynthèse de l'ergostérol sont (Figure 5)
1 - Transfo.rmation de l'acétyl COA en
squalène.
De nombreuses recherches
effectuées surtout
sur les
levures montrent une
accumulation du
squalène
dans les cellules placées en anaérobiose (DAVID et KIRSOP,
1973
ELLIOT,
1977).
Dans ces conditions, les levures et certaines moisissures deviennent
auxotrophes pour l'ergostérol (ANDREASEN et SITER,
1954;
HOSSACK et ROSE,
1976) .
2 -
La cyclisation
du
squalène
en
stérol
(lanostérol)
qu i
nécessite un
système enzymatique complexe (squalène oxydo-cyclase) ne peut se faire qu'en
présence d'oxygène,
et le squalène accumulé en anaérobiose
est rapidement
transformé en lanostérol en présence d'oxygène comme l'illustre la figure 5.
3 -
La transformation
du
lanostérol
en
ergostérol
est
surtout
mise
en
évidence grace à l'action spécifique de certains fongicides.
Elle exige les
étapes suivantes
- déméthylation du lanostérol aux carbones C ( 1) et C
qui sont
4
14(2)
des
sites
spécifiques
des
inhibiteurs
de
biosynthèse
d'ergostérol
(ou
fongicides)
comme
l'imidazole et
la morpholine
(FALANDRE et
al.,
1987) .
L'accumulation
des
stérols
à C
et
C
méthylés cause
semble-t-il,
une
4
14
perturbation
des
activités
membranaires
et
inhibe
la
croissance
et
la
reproduction fongique (BALDWIN, 1983 ; BURDEN et al., 1987),
- alkylation sur le carbone C24,
- isomérisation de la double liaison entre les C
et C
du lanestérol
8
9
au C
et C
de l'ergostérol,
7
8
- les C
et Cs désaturases permettent la formation de deux doubles
22
liaisons respectivement
entre les carbones C
et C
d'une part,
et les
22
Z3
carbones Cs et C
d'autre part de l'ergostérol. Ces enzymes sont inhibées en
6
absence d'oxygène
(SEKULA et
NES,
1981).
L'importance de
l'oxygène dans

---

- 24 -
2 acétyl - COA
acétoacétyl - COA
squalène
oxydo-cyclase
2
Lanostérol
26
24b==<~5
27
2
3
1 - - - - - _ 3 CO
3CH
2
3
e
Ergostérol
Figure 5 : Réaction de biosynthèse
de l'ergostérol
(1)
(2)
déméthylation du lanostérol
au carbone C
et C
4
I4
110
(3)
isomérisation de la double
liaison entre le Cs et Cg
Il
du lanostérol au C
et Cs
7
de l'ergostérol
(4)
(5)
introduction des doubles liaisons
entre les Cs et C
(4) et les
6
Cn
et C
(5)
23

---

- 25 -
l'activité de ces désaturases a été observée par plusieurs auteurs
(BURDEN
et al.,
1987
HATA et al., 1987). Ces auteurs suggèrent que l'activité de
la C
désaturase est aussi inhibée par le monoxide de carbone.
Si l'action
2 2
spécifique . de
ce
gaz
toxique
sur
la
biosynthèse
de
l'ergostérol
est
vérifiée,
on
pourrait
penser
que
l'accumulation
d'autres
types
de
mycostérols tel que le lanostérol qui ne nécessite pas l'action de la C22
peut avoir lieu dans les cellules.
2.2. CROISSANCE EN ANAEROBIOSE
Il existe d'autres microorganismes dont les
réactions
énergétiques
n'exigent pas d'oxygène et d'autres
qu i
sont inhibés
ou
tués
en présence
d'oxygène
:
ce sont des anaérobies facultatifs et les anaérobies stricts,
rencontrés le plus souvent parmi les bactéries. Selon STANIER et al. (1966),
il
est
probable
que
la
sensibilité
à
l'oxygène
de
ces
microorganismes
s'explique par la nécessité qu'ils ont de maintenir leurs enzymes à l'état
réduit.
En
présence
d'air,
ces
enzymes
s'oxydent
et
les
réactions
métaboliques
essentielles
sont
alors
bloquées.
Certains
de
ces
microorganismes ne possèdent pas de catalase et sont tués par l'OZ de l'air
qui conduit à la formation de péroxyde d'hydrogène (H
toxique pour la
20 2),
cellule.
Pour d'autres, les mécanismes précis de l'inhibition par l'oxygène
de l'air restent inconnus.
Les
microorganismes
anaérobies
facultatifs
peuvent
par
contre
se
développer
en
présence
ou
en
absence
d'air,
pourvu
que
les
facteurs
biotiques
nécessaires
soient
présents
dans
le
milieu.
C'est
le
cas
de
nombreuses
bactéries
et
levures
des
grains
qui
peuvent
passer
d'un
métabolisme aérobie (respiratoire) à un métabolisme fermentatif suivant les
conditions environnantes (disponibilité de 1 '°2' concentration en sucre).

---

- 26 -
Les quelques
études réalisées sur les possibilités de croissance en
anaérobiose chez certaines moisissures et levures sont discutables de deux
façons:
d'une part, il est difficile de distinguer la croissance anaérobie
du métabolisme anaérobie (fermentation),
et d'autre part,
l'établissement
des conditions
d'anaérobiose
stricte
n'est
pas
toujours
assurée dans
les
experlences rapportées.
Z.Z.l. METABOLISME ANAEROBIE (FEfu~ENTATION)
Les bactéries lactiques et sans doute beaucoup de levures portées par
les grains sont capables d'utiliser les substrats carbonés et notamment les
oses et diholosides par voie fermentaire. Le COZ et les métabolites formés à
partir
de
l'acide
pyruvique
(éthanol.
acide
lac tique,
acétate,
etc. )
s'accumulent dans le milieu.
Dans
ce
type
de
métabolisme,
l'accepteur
final
est
un
composé
organique:
acide lactique ou éthanol pour ne citer que les plus fréquents.
Il
semble
donc
évident
que
l'absence
d'oxygène
ne
peut
inhiber
cette
activité fermentaire.
Selon CLEVSTROM et al.
(1983)
certaines espèces d'Aspergillus,
de
Fusarium et de Mucor peuvent produire de l'éthanol ou de l'acide lactique
par fermentation,
lorsque l'oxygène est
limité ou absent dans
le milieu.
Cette activité n'est cependant pas suffisamment productrice d'énergie pour
permettre une croissance appréciable ;
mais aussi,
selon certains auteurs
(ANDREASEN et STIER,
1954; BARTNICKI-GARCIA et NICKERSON, 1961), l'oxygène
est indispensable à la structure cellulaire même pour les souches de levures
fermentatives,
et donc
qui peuvent
se passer d' 0
dans
leur métabolisme
Z
énergétique principal.

---

- 27 -
2.2.2. CROISSANCE DES ESPECES MYCELIENNES
Il est aujourd'hui acquis que certaines souches de levures ont besoin
de l'oxygène comme facteur de croissance (DAVID et KIRSOP,
1973).
En fait,
dans
ce
ca s.,
l'oxygène
ne
Joue
plus le
rôle d'accepteur
d'électron du
métabolisme
respiratoire
mais
intervient
pour
la
synthèse
de
composés
membranaires
(stérols,
acides
gras
insaturés)
sans lesquels
la membrane
cytoplasmique est gravement altérée (HOSSACK et ROSE,
1976; SEKULA et NES,
1981).
Différentes autres
espèces,
Aspergillus
niger,
Penicillium
spp.,
Trichoderma,
Fusarium
spp.
et
Mucor
peuvent
se
développer
en
absence
d'oxygène, mais exigent la biotine, la thiamine et l'acide nicotinique comme
facteur de
croissance
(BARTNICKI-GARCIA et NICKERSON,
196Za
SMITH et
BERRY,
1975).
Des études faites par BARTNICKI-GARCIA et al. (196Zb) sur la
croissance
de
Mucor
rOUXll
montrent
que
dans
de
telles
conditions
d'anaérobiose,
seuls
les hexoses
peuvent
être utilisés
corrune sources de
carbone.
Selon GUNNER et ALEXANDER
(1964),
la présence d'ions inorganiques,
MnO
NO 3
Fe 3+
pouvant
dans
une
certaine
mesure
remplacer
l'OZ
Z
moléculaire corrune accepteur terminal,
permet de réduire les exigences vis-
à-vis de ces facteurs biotiques essentiels.
La c r oi.s sance
en
absence
d'oxygène a été également rapportée pour
d'autres moisissures cultivées sur milieu synthétique (Tableau 3).
Dans ces
études,
la croissance est évaluée simplement par le diamètre des colonies,
procédé
qui
ne
permet
qu'une
évaluation
très
grossière
des
biomasses
formées.

---

- 28 -
1
1
CROISSANCE EN
ESPECES
1
1
1
ANAEROBIOSE
1
AUTEURS
1
1------------------- -------------------------1---------------------------
1
1
1
+.
Mucor sp
1
BARTNICKI-GARCIA (1961)
1
1
STOTZKY (1965)
1
1
RICHARD-MOLARD (1982)
1
1
1
+
Absidia spinosa
1
BARTNICKI-GARCIA (1962a)
1
Absidia sp
1
STOTZKY (1965)
1
1
CURTIS (1969)
1
1
1
+
Geotrichum candidum
1
STOTZKY (1965)
1
1
CURTIS (1969)
1
1
1
++
Fusarium moniliforme
1
WALSH (1972)
1
1
,
++
F. oxysporum
1
TABAK et COOKE (1968)
1
F. cubense
1
SMITH et BERRY (1975)
1
1
1
++
Rhizipus spp
1
BARTNICKI-GARCIA (1962a)
1
Cephalosporium
1
CURTIS (1969)
acremonium
1
1
1
1
Tableau
3
Croissance de quelques esp~ces fongiques en anaérobiose
(+) croissance limitée; (++) croissance normale
2.3. NOTION D'ESPECES MICROAEROPHILES
Si la tr~s grande majorité des esp~ces fongiques montre de fait un
développement optimum en présence d'air,
certaines se développeraient mieux
avec
des
pressions
partielles
d'oxyg~ne considérablement
inférieures
à
celles que l'on rencontre dans l'air (BOTTOMLEY et al.,
1950; BULLERMAN et
al.,
1984).
Ces e s pèc e s ,
s'accomodant bien de conditions gazeuses un peu
plus confinées, sont souvent qualifiées de microaérophiles.
Le mécanisme
de
cette
demande
limitée
en
oxygène
est
mal
connu.
STANIER et al. (1966) sugg~re que ce phénomène pourrait être probablement la
manifestation
de
la
sensibilité
de
certaines
enzymes
en
mi Li eux
oxydant
fort,
malgré
une
exigence
en
oxygène
certaine
pour
leur
métabolisme
énergétique.

---

- 29 -
La plupart
des
études
de
laboratoire
prétendent que des
pressions
partielles d'oxygène de l'ordre de 3 à 5 % ne sont pas limitantes pour les
moisissures des grains (FOLLSTAD,
1966
PASTER et al.,
1983). On observe
cependant que
les
travaux publiés ne donnent
jamais que des
résultats de
dénombrement et ne quantifient pas la biomasse effectivement obtenue.
BROWN, 19ZZ ; BARTNICKI-GARCIA et NICKERSON, 1961 ; RICHARD-MOLARD et
al., 1980 montrent de plus qu'au dessous de 1 %d'oxygène, la sporulation de
la plupart des espèces se trouve fortement affectée même
si les genres et
espèces les plus tolérants se montrent encore capables de se développer sous
moins de 0,01 %d'OZ (BOTTOMLEY et al., 1950).
Les espèces capables de montrer une croissance optimale à ZO,9 %d'OZ
(air) et/ou sous des pressions d'OZ extrêmement faibles (0,01 %par exemple)
sont encore très mal définies dans la littérature.
Aussi,
les
mesures
de
la
croissance
généralement
estimées
visuellement ou par dénombrement de conidies, ne permettent généralement pas
de
préciser le mode de
croissance et le type
de
reproduction
(sexuée ou
asexuée) favorisés par le stress atmosphérique.
Cependant,
selon AINSWORTH
et SUSSMAN (1966),
la production de périthèces de Neurospora sitophila est
inhibée aux faibles concentrations d'OZ où la croissance a été normale.
On connaît encore très mal les espèces fongiques pour ce qui concerne
leurs
exigences
réelles
vis-à-vis
de
l'OZ.
De telles
données
seraient
pourtant précieuses en l'état actuel de nos connaissances par exemple pour
prévoir la croissance et la production de métabolites secondaires dans des
conditions d'OZ limité,
non seulement sur grains mais aussi pour tous les
produits alimentaires emballés, dont le marché se développe de plus en plus.

---

-
30 -
3· ATMOSPHERES CONTROLEES ET COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES
3.1 EFFET DU DIOXIDE DE CARBONE SUR LA CROISSANCE DES MICROMYCETES
Le COZ a longtemps
été considéré comme le principal inhibiteur des
microorgani~mes des produits conservés sous atmosphères contrôlées (MOSELEY
et al.,
1971).
Cependant,
beaucoup d'informations disponibles, basées sur
l'étude des effets du COZ sur la conidiogénèse indiquent que la production
des spores est souvent plus rapidement inhibée que le développement normal
(ADAH et HI1LER,
1954).
D'autres travaux montrent que la sporulation chez
certaines
espèces,
sous
certaines
conditions
de
l'environnement,
est
stimulée ou n'est pas affectée par une concentration de COZ de 15 % (HAGAN
et LACEY, 1984).
PELHATE (1968) trouve que Fusarium culmorum et Penicillium roqueforti
se développent à ZO %de COZ et à ZooC,
mais pas Alternaria tenuiesina,
A.
furnigatus et P.
cyclopium.
La croissance des colonies d' A.
ochraceus est
partiellement inhibée à 60 % de COZ et totalement à 80 % (PASTER et al.,
1983).
Enfin,
à
partir d'expériences
réalisées sur trois
souches de
P.
roqueforti,
GOLDING
(1940) observe que
ces
différentes
souches
ont
des
tolérances différentes vis-à-vis du COZ'
Les
divergences,
souvent
observées
dans
l'effet
du
sur
le
comportement
des
espèces
ou
dans
les
concentrations
limites
ce
gaz
exigées pour l'inhibition de leur croissance,
s'expliquent par le fait que
la concentration d'OZ'
bien que réduite dans ces conditions,
n'est pas le
plus souvent prise en compte.
Le mécanisme d'action du COZ reste encore mal connu.
Pour mieux le
comprendre, plusieurs auteurs (FANESTIL et al., 1963 ; KING et NAGEL, 1975
PICHARD et al.,
1985) ont axe leurs études sur l'effet du COZ
sur des
enzymes,
particulièrement
celles
du
cycle
de
Krebs
et
de
la
chaîne
respiratoire,
en
tentant de
vérifier
son effet
éventuel
sur les
enzymes
décarboxylantes
(à
travers
un
effet
d'action
de
masse)
ou
non

---

-
31 -
décarboxylantes.
Il ressort de ces études que l'effet du COZ sur une enzyme
dépend de la nature
et de
l'origine de
cette dernière,
ainsi que
de la
concentration en COZ' Ainsi, le COZ inhibe la lipase de Candida cylindracea,
et cette inhibition est influencée par la température,
le pH et l'addition
++
++
de Fe
et Mg
(PICHARD et al.,
1985).
FANESTIL et al.
(1963) rapportent
que le COZ stimule l'activité de l'ATPase mitochondrial.
Certains auteurs suggèrent que l'acidification du milieu,
provoquée
par le COZ est la cause de l'effet bactériostatique de ce gaz (JAMES A.D. et
al., 1984).
Si de
nombreux travaux montrent un
effet inhibiteur du COZ sur la
croissance des microorganismes,
il a été aussi démontré que de nombreuses
espèces hygrophiles sont nettement stimulées par des pressions partielles de
l'ordre de
10 à
lS % (GIBB et WALSH,
1980
;
MAGAN et LACEY,
1984a) .
Certaines d'entre-elles sont capables de l'utiliser comme source de carbone,
par exemple pour la
synthèse des acides tricarboxyliques
et acides
aminés
associés (BUSHELL et BUL, 1974).
A.
niger,
A.
terreus,
A.
oryzae et Rhizopus nigricans utilisent
seulement le COZ au cours de la germination des conidies et la consommation
devient faible
ou s'annule avec la croissance (STOVER,
196Z
YAMAGITA,
1963).
Par contre, A. niger utilise le COZ en proportion avec sa croissance
en poids
(BARINOVA,
196Z).
Cet auteur conclut que
le
COZ
prend part au
métabolisme fongique seulement un court moment.
Selon YAMAGITA,
la taille
des conidies est affectée par l'absence du COZ dans l'environnement et la
concentration optimale pour la germination des conidies d'A.
niger est de
0,1 %environ. GIBB et WALSH (1980), observent des résultats similaires avec
A. ustus et F. solani.
Le tableau 4 rapporte la sensibilité de quelques espèces au dioxide
de carbone.

---

- 32 -
COMPOSITION GAZEUSE
CROISSANCE
ESPECES
AUTEURS
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
z %Oz + Z % COZ
++
Penicillium roqueforti
LITTLEFIELD et al.(1966)
4,Z % Oz + 80 % COZ
++
P. roqueforti
GOLDING (1940 ab)
5 à
10 % COZ
++
P. roqueforti
~1AGAN et LACEY (1984a)
40 % COZ
++
P. martensii
LILLEHOJ (1972)
Zo % Oz + 60 % COZ
++
Aspergillus flavus
LANDERS et al. (1967)
Zo % Oz + 80 % COZ
A. flavus
3 %Oz + 8z % COZ
++
A. fla vus
JACKSON et PRESS (1967)
80 - 100 % COZ
A. ochraceus
PASTER etaI. (1983)
- - -
5 -
10 % COZ
++
Alternaria alternata
MGAN et LACEY (1984)
80 % COZ
++
Xéromyces bisporus
DALLYN (1969 )
ï8 % COZ
++
Byssoclamys nivea
YATES (1969)
3,5 - 75,3 % COZ
++
Fusarium oxysporum
TABAK et COOKE (1968)
100 % COZ
F. oxysporum
STOVER (196z)
30 -
60 % COZ
++
Botrytis cinerea
BROWN (19ZZ)
Z5 % COZ
Saccharomyces
TABAK et COOKE (1968 )
cerevisiae
S. baillii
Tableau 4
: Effet du COZ sur la croissance de quelques espèces fongiques
(++)
croissance normale; (-) inhibition partielle
(--) inhibition totale.
3.Z. COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES AUX ATMOSPHERES CONTROLEES
EN FONCTION DE L'ACTIVITE DE L'EAU
Les
données
scientifiques
concernant
les
effets
des
principales
composantes de l'atmosphère,
OZ'
COZ'
N
sur les bactéries,
levures et
Z'
moisissures
des
gralns
sont
aujourd'hui
nombreuses,
mais
souvent
contradictoires.
Ceci ne provient pas seulement de la diversité des produits

---

- 33 -
contrôlés, mais aussi de la variété dans la méthodologie ou de la sensibilité
des techniques utilisées.
Il faut souligner que très souvent,
ces résultats
ont été
obtenus
en
conditions
expérimentales
de
labo ra toire,
au
maximum
d'hydratation (FOLLSTAD,
1966
WILSON et al., 1975
GIBB et WALSH, 1980 ;
GIUSEPPIN, 1984).
En
première
approximation,
c'est
donc
à
partir
des
niveaux
d' hydra ta tion que
l'on peut
à nouveau distinguer deux catégories de
grains
humides,
selon
qu'ils
se
si tuent
à
des a
supérieure s ou
inférieures à
w
environ 0,90 à
ZOOC
(RICHARD-MOLARD,
1985).
Ainsi,
sur les grains
très
humides,
à une teneur en eau supérieure à ZO %,
la croissance de germes
microaérophiles ou anaérobies facultatifs, levures et bactéries lactiques est
possible, en théorie, et quelles que soient les conditions d'étanchéité, ceci
d'autant
plus
rapidement
que
l'humidité
sera
plus
élevée
(CAHAGNIER
et
POISSON, 1973 ; RICHARD-MOLARD et al., 1984 ; VANBELLE et al., 1985).
Par contre,
très peu de données permettent actuellement d'estimer les
effets
d'une
réduction
de
la
pression
partielle
d'oxygène
combinée
a
l'abaissement,
par séchage,
de
l'activité de
l'eau sur la croissance des
moisissures et des levures.
En expérimentant
sur des
espèces pures,
représentatives
tant de
la
mycoflore hygrophile que de la mycoflore de stockage,
MAGAN et LACEY (1984a)
ont mis en évidence des effets synergiques d'une réduction simultanée de l'Oz
disponible et de l ' a ,
sur la croissance des moisissures
pour Penicillium
w
roqueforti par exemple,
une réduction de la pression partielle d'O
a moins
Z
de 0,14 % allonge la phase de latence jusqu'à 4 jours à a
maximale (0,98),
w
et jusqu'à près de
ZO Jours
à une
a
de 0,85.
Des
effets similaires sont
w
observés
par
ces
auteurs
avec
un
abaissement
de
la
température
la
croissance linéaire de Fusarium culmorum est réduite de moitié à Z3°C si 1'0 Z
résiduel est de l'ordre de 0,1 %alors qu'à une température de 14°C,
le meme
résultat est obtenu avec une pression partielle d'OZ d'environ 10 %.

---

- 34 -
Il
faut
cependant
observer
que
pour
la
plupart,
ces
données
de
laboratoire
restent
très
difficilement
transposables
aux
systèmes
très
complexes
que
sont
les
grains
humides
sous
atmosphères
confinées
ou
contrôlées..
Elles ne
permettent pas
encore par
exemple de
prévoir l'effet
d'une réduction d'OZ disponible
sur des populations microbiennes mélangées,
lorsque plusieurs espèces sont en compétition.
3.3. MYCOTOXINOGENESE ET ATMOSPHERES CONTROLEES
Il semble que la production de toxines par les espèces fongiques peut
être
affectée
par
des
taux
élevés
de
dioxide
de
carbone
ou
d'azote.
Toutefois, les concentrations inhibitrices peuvent être différentes selon les
espèces et les conditions expérimentales.
FABRI et al. (1980) indiquent que les atmosphères riches en dioxide de
carbone ou d'azote avec de
très
faibles
pourcentages d'oxygène donnent de
bons résultats en limitant la croissance des moisissures et la production des
toxines
dans les
stocks de
céréales.
Ils
notent
cependant
qu'une
faible
quanti té d' afla toxine
est formée
sur des grains
de
blé
stockés
sous
azote
(OZ = 0,003 %) et indiquent que 15 ~g/kg d'aflatoxine sont formés
sur maïs
fraîchement récolté à 18,8 % s.h.
et stocké hermétiquement sous 14,3 % de
COZ + 0,5 %d'OZ + 85,Z %d'N
pendant 109 jours à Z5°C.
Z
LANDERS et al.
(1967)
indiquent que
l'inhibition de
la biosynthèse
d'aflatoxine ne se produit qu'à des concentrations d'oxygène de 5 à 1 % en
combinaison avec ZO et 80 %de dioxide de carbone.
CLEVSTROM et al.
(1983) soulignent l'importance de la composition du
milieu de
culture
sur
l'inhibition de
la biosynthèse
d'aflatoxine
par
le
dioxide
de
carbone
en
montrant
que
l'enrichissement
de
l'atmosphère
en
dioxide de carbone empêche la formation d'aflatoxine dans un milieu contenant
de la vitamine D.

---

- 35 -
Selon
PASTER
et al.
(1983),
Aspergillus
ochraceus croît
sous
des
atmosphères contrôlées de 5 à 1 %d'OZ sans COZ' et la quantité d'ochratoxine
produite est la même
que celle produite par les
colonies
exposées à l'air
libre. La quantité d'ochratoxine produite par les colonies après exposition à
l'atmosphère libre est trois fois supérieure à celle formée par les colonies
exposées à l'air libre (15 pg/g).
LILLEHOJ et al. (197Z) ne détectent aucune
trace d'acide pénicillique sur maïs humide inoculé avec Penicillium martensii
et incubé pendant quatre semaines à 5 et 10 GC sous une atmosphère de 60 %de
COZ·
L'usage
des
atmosphères
contrôlées
pour
les
stockages
en
vrac des
grains peut être pratique et offrir une voie de contrôle dans l'accumulation
des mycotoxines,
si l'action réelle du COZ sur la c r oi s s an ce
fongique est
vérifiée.
Selon PASTER et al.
(1983),
l'effet inhibiteur du
dioxide de
carbone
n'est
probablement
pas
dû
à
un
effet
direct
sur
la
croissance
mycélienne qui n'est que retardée à 60 %de COZ'
4. APPLICATIONS PRATIQUES DU STOCKAGE DES GRAINS SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
4.1. PRINCIPES DU STOCKAGE SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
Dans leur principe,
les techniques de stockage de grains humides sous
atmosphères
contrôlées
ou
confinées
mettent
en
Jeu
deux
processus
bien
distincts et éventuellement complémentaires:
d'une part,
supprimer ou tout
au
moins
limiter
les
processus
respiratoires
en
maintenant
une
pr-e s s i.on
partielle
d'O
aussi
faible
que
possible
dans
l'atmosphère
gazeuse
Z
intergranulaire
(HYDE,
1974)
et d'autre
part,
mettre
à
profit
un effet
inhiteur éventuel du gaz carbonique à forte concentration sur les populations
microbiennes du grain (DANIELS et al., 1984).

---

- 36 -
MILNER et GEDDES (1954) ont ~t~ parmi les premiers à montrer le r81e
pr-é pondé r-ant
des
microorganismes et
tout
particulièrement
des moisissures,
dans l'accroissement des échanges d'un stock de
grains,
dès
lors
que
son
humi.di.t
d
é
é pa s se
14 -
14,5 % s.h.,
c'est-à-dire
quand
la
croissance des
moisissures x~rophiles devient possible (SEMENIUK, 1954).
Les donn~es qui d~montrent le r81e très faible jou~ par l'embryon dans
les
processus
respiratoires aux humi.di.t é s
Levé e s
ont
t
é
é
é
le
plus
souvent
obtenues
de
manière
indirecte,
par
exemple
en
supprimant
le
germe
mé c an i.quemen t
ou
en
l i.mi.nant
l'essentiel des moisissures,
par traitement
é
chimique en surface ou meme par abrasion du p~ricarpe.
Ainsi, les travaux de
GOLIK (1968) rapport~s par ALEXEEVA et al.
(198z) indiquent que l'intensit~
respiratoire des grains
de
maïs de
faible
humidi t
n'est pas
supé r i eur-e a
é
1 mg de COZ rejet~ par 100 g de matière sèche,
pendant Z4 heures et à des
t.empér a tures
de
Z5 -
30°C.
Selon CHRISTENSEN et KAUFMANN (1974),
le bl.é
trai t
avec
fongicides
à
ZO
% d' humidi té produit environ Z5 grammes de
é
COZ/quintal et/Z4 heures
ce meme quintal de bl~ non trait~ produit 10 fois
plus de COZ' ce qui montre la part essentielle jou~e par la mycoflore dans la
respiration et les ~changes gazeux de l'~cosystème.
Cependant,
il
convient
de
consid~rer
simultan~ment
les
exigences
hydriques
des
di f'f'ér-e nt e s composantes de
la microflore des
grains
et leur
comportement vis-à-vis des atmosphères contrôl~es.
- Evolution microbiologique des grains humides
Lorsque la teneur en eau des grains d~passe 19 - zo % (s.h.),
ainsi
qu'il a ~t~ dit au d~but de ce chapitre, deux processus microbiologiques bien
distincts prennent une importance consid~rable.
Le premier,
qui s'observe
d j
sur des
grains
à
18 -
19 % (s. h.)
surtout
sur de
longues durées de
é
à
conservation est le
développement ct 1 espèces
appartenant
aux
Aspergillus et
Penicillium, mais aussi des levures.

---

- 37 -
Le second
processus à prendre en considération est le développement
des
bactéries
lactiques
(Lactobacillus,
Leuconostoc,
Streptococcus,
Pediococcus),
anaérobies
facultatives qui vont,
par leur activité homo ou
hétéro-fermentaire, inévitablement modifier les caractéristiques biochimiques
et
organoleptiques
du
grain.
Il
serait
donc
du
plus
grand
intérêt
de
connaître les limites hydriques permettant la croissance
sur grains de ces
sporulations
bactériennes
dans
le
cas des grains
humides
sous
atmosphères
contrôlées.
Si
en
anoxie,
les
conidies
de
moisissures
sont
progressivement
détruites
et
ce
d'autant
plus
rapidement
que
l'humidité
est
plus
élevée
(RICHARD-MOLARD et al.,
1980) ,
l'évolution de
la
perte de
viabilité des
spores en fonction des quantités d'oxygène disponible est peu étudiée.
Selon
BURMEISTER
et
HARTMAN
(1966),
les
genres
et
espèces
se
développant
sur maïs humide
sont principalement Hansenula anomal a (Hansen)
Sydow et Candida krusei (Cast Berkout),
levures capables d'assimiler l'acide
lactique. De nombreux auteurs mentionnent le genre Candida sur la plupart des
grains conservés humides en silos étanches. Sur riz humide, TEUNISSON (1954b)
a isolé en particulier Endomycopsis chodatii (Nechitech) Wickerlam et Burton,
Hansenula anomala, Pichia farinosa (Linder) Hansen, Candida tropicalis (Cart)
et C.
krusei.
GONEN et CALDERON (1968) indiquent que Hansenula anomala et
Trichosporon
sp
sont
les
espèces
dominantes
sur
du
sorgho
humide
stocké
hermétiquement.
Il n'en reste pas moins
que
cette microflore
très
particulière des
grains humides
en
silos
étanches
reste
beaucoup moins
bien connue
que les
moisissures des grains stockés en atmosphères libres.

---

- 38 -
4.2. OBTENTION ET MAINTIEN DES ATMOSPHERES PAUVRES EN OXYGENE
A des activités d'eau élevées,
la demande microbiologique en oxygène
est très élevée.
Si l'écosystème est rendu complètement isolé de l'amosphère
extérieure
par
l' utilisation
d'une
enveloppe
protectrice
parfaitement
étanche,
il peut se mettre en situation d'anoxie et produire "en échange" du
dioxide de carbone comme cela a été indiqué antérieurement.
La vitesse de ce
mécanisme
est
intimement
liée
a
plusieurs
facteurs
(température,
a
et
w
étanchéité du silo). Ces facteurs sont évidemment hautement interdépendants.
Avec des structures de grande dimension,
il est extrêmement difficile
d'obtenir et de maintenir une anaérobiose complète en pratique. Les meilleurs
résultats pour des capacités supérieures à 2 ou 3 tonnes ont été obtenus avec
des silos métalliques hermétiques verrouillés avec du mastic (HYDE, 1974).
La demande microbiologique en oxygène augmente très rapidement avec la
teneur en eau des grains stockés dans ces structures et la pression partielle
d'oxygène
dans
le
silo
donne une
très faible
mesure,
moins de
0,5 % en
général.
Cette mesure,
cependant,
ne donne pas la quantité d'oxygène qui
pénètre dans le silo et explique de très faibles fuites dues à la porosité ou
à
la
perméabilité
à
l'oxygène
du
matériel utilisé.
Des
expérimentations
récentes sur du maïs stocké à 20 % s.h.
dans des silos de capacité de 8 m3,
fait
d'un
film
plastique
métallisé
complexe,
donnent
une
conservation
satisfaisante
(pour
l'alimentation
des
animaux)
pour
un
an
avec
une
perméabilité à l'oxygène d'environ 43 cm3/m2/jour et à
20°C (RICHARD-MOLARD
et al.,
données non publiées);
cela,
malgré le développement des levures
(Candida spp.).
HYDE
et
OXLEY
(1960)
notent
qu'un
stockage
présentant
de
légères
fuites peut être utilisé de manière satisfaisante à condition que la quantité
d'oxygène pénétrant dans le silo soit inférieure à 0,5 %par jour.

---

- 39 -
Des
faibles
concentrations
d'oxygène
peuvent
être
créées
dans
les
structures
de
stockage
par
l'usage
d'azote
ou
du
dioxide
de
carbone
commercial.
Dans ce cas,
dès la fermeture du silo "étanche",
l'atmosphère
interne est purgée et remplacée par ces gaz de substitution injectés dans le
silo. L'objectif de cette méthode est de placer très rapidement le stock sous
anoxie
partielle
ou
totale,
avec
pour
effets
l'arrêt
des
processus
respiratoires
et
de
croissance,
et
la
mort
progressive
des
insectes
et
moisissures.
4.3. EFFETS DU STOCKAGE SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES SUR LES
CARACTERISTIQUES PHYSIOLOGIQUES ET TECHNOLOGIQUES
DES GRAINS
4.3.1. VIABILITE DES GRAINS
La
faculté
germinative
des
grains,
considérée
comme
un
critère
sensible
de
la
qualité
de
conservation
en
atmosphère
libre,
paraît
spécialement difficile à maintenir à un niveau élevé en anoxie
quand l'aw
dépasse les valeurs de 0,85 environ.
En effet, comme CHRISTENSEN et KAUFMANN
(1974) l'indiquent,
dès que l'humidité des grains dépasse un niveau où les
moisissures
de
stockage
peuvent
se
développer,
la
viabilité
des
grains
diminue très rapidement.
Par conséquent,
les atmosphères pauvres en oxygène
qui
inhibent
la
croissance
de
ces
microorganismes
peuvent
permettre
le
maintien de
la faculté
germinative même à des a
élevées (ROBERT,
1968
w
ALEXEEVA et al., 1982 i BENNICI et al.
1984).
Cependant,
PETRUZELLI
(1986)
rapporte
l'existence
d'un
seuil
d'hydratation (24 % s.h.) à partir duquel la présence d'oxygène implique une
activation
du
métabolisme
des
grains.
HYDE
(1962)
observe
aussi
que
la
viabilité des grains de blé stockés hermétiquement à 24 %s.h. a été réduite à
un faible nlveau.

---

- 40 -
Le blé stocké sous
une atmosphère d'azote (0
~
0,4 %) à 18 % s.h.
2
maintient un taux de viabilité élevé (97
%) pendant deux mois,
tandis que
celui du témoin diminue
jusqu'à 18 %durant la meme période (GLASS et al.,
1959) .
Cep~ndant,
il
semble
qu'à
de
telles humidités
et même
quand la
croissance fongique est complètement inhibée par l'anoxie,
la viabilité des
grains ne peut pas être préservée pour de longues périodes (PETERSON et al.
1956) .
L'existence d'une activité respiratoire d'une certaine importance des
grains au cours du stockage
est très
controversée
(BARTON,
1965
;
COME,
1982).
Les
tissus
périphériques
du
caryopse
(enveloppes)
contiennent
des
composés
phénoliques
selon
certains
auteurs
(COME,
1982)
qui
empêchent
l'accès de l'embryon par l'oxygène.
Le grain assurerait sa longévité par une
limitation du métabolisme
résiduel qua
dépend du degré d' hydratation et de
l'oxygène disponible (OSBORNE et al.
1981).
La possibilité de maintenir la
viabilité des grains humides pour de longues périodes apparaît problématique
quelles que soient les conditions de stockage (QUAGLIA et al. 1980).
4.3.2. MODIFICATIONS BIOCHIMIQUES
GLASS et al.
(1959),
LYNCH et al. (1962), observent une accumulation
des
sucres
réducteurs
et
non
réducteurs
sur
les
grains
stockés
sous
une
atmosphère
d'azote
et
de
dioxide
de
carbone
en
absence
de
développement
fongique.
Cette accumulation montre que les activités a et
8 amylasiques ne
sont pas influencées par les atmosphères pauvres en oxygène (IWASAKI et TANI,
1967). Ces sucres libres peuvent favoriser les processus de fermentation dans
le cas des grains humides ou entrer dans les réactions de brunissement non-
enzymatiques.
Par contre,
pour les grains
à
humidité intermédiaire,
une
atmosphère pauvre en oxygène conduit a une réduction significative des pertes
de matière sèche.

---

- 41 -
La fraction lipidique cst la première à subir des altérations durant
le stockage (POMERANZ,
1974). Deux mécanismes principaux expliquent cet état
de fait.
D'une part,
l'oxydation directe des grains détériorés durant la
récolte dont les lipides ne sont pas protégés longtemps par les anti-oxygène
na turels qui sont les
tocophérols si tués dans les
enveloppes du grain,
et
d'autre
part,
l'hydrolyse
de
la
fraction
lipidique,
spécialement
les
triglycérides par les lipases,
essentiellement d'origine
fongique
(LESAGE,
RICHARD-MOLARD et DRAPRON, 1985).
On
peut
ainsi
considérer
que
l'élimination
de
l'oxygène
inter-
granulaire pourrait prévenir ces mecanlsmes d'altération des
lipides durant
le
stockage
des
grains
à
humidité
intermédiaire.
Cette
hypothèse
a
été
largement confirmée par plusieurs expérimentations à l'échelle pilote sur des
grains de céréales (BOTTOMLEY et al.,
1950; CHRISTENSEN et KAUFMANN, 1974
SHEJBAL, 1979 ; ALEXEEVA et al., 198Z).
Dans
des
conditions
d'anoxie
partielle,
il
est
toujours
possible
d'invoquer les processus d'auto-oxydation et/ou d'hydrolyse des
lipides par
les enzymes
des microorganismes en faible
croissance.
D'autres hypothèses
suggèrent que les lipases microbiennes formées antérieurement à l'anoxie par
la mycoflore
de
champ
peuvent maintenir
une
activité
acidifiante même
en
absence de croissance microbienne (RICHARD-MOLARD et al.,
1980;
LESAGE et
al.,
1985).
La qualité des grains au début du stockage est d'une importance
considérable à cet égard.
Il
existe
peu
de
données
sur
la
modification
biochimique
des
protéines,
peptides
et
amino-acides
des
grains
stockés
sous
atmosphères
modifées. ALEXEEVA et al. (198z) montrent une stabilité des protéines du maïs
stocké deux mois sous anoxie
(OZ ~
1 % s. h.
environ) et à des températures
situées entre 15 et ZooC.
Des observations analogues ont été faites sur du
maïs stocké à 17,4 %s.h. sous azote atmosphérique pendant huit mois (QUAGLIA
et al.,
L980
SOlvUNHI et al . ,
L98Z).
ALEXEEVA et al.
(198z) indiquent

---

- 42 -
cependant que la protéolyse microbienne dans l'ensilage du maïs conduit à une
augmentation importante de la teneur en azote non protéique,
tandis qu'une
réduction significative des amino-acides essentiels telles que la lysine et
l'arginine peut être observée dans
la
solution d'azote
soluble
(AUMAITRE,
1982) .
Les céréales sont généralement considérées comme une source importante
de vitamines telles que la thiamine,
l'inositol,
le riboflavine et vitamine
E. Le niveau de vitamine E ne peut pas apparemment être maintenu sur l'orge à
28 %s.h. stocké pendant 10 mois sous des conditions hermétiques (HAKKAREIMEN
et TYOPPONEN,
1983).
YOUNG et al.
(1975) rapportent la destruction de la
vitamine E dans les céréales humides traitées avec l'acide propionique,
ce
qui est dû à l'humidité des grains et non au traitement sous anoxie ou avec
l'acide.
Les travaux de RICE et al. (1985) sur l'orge humide (24 %s.h.) stocké
en anaérobiose et à des températures de 12 à 15°C suggèrent que le degré de
l'humidité
des
grains
est
un
facteur
secondaire
dans
la
stabilité
des
tocophérols, qui restent parfaitement bien conservés sous anoxie stricte. Ces
résultats ont été confirmés par d'autres auteurs à la faveur du stockage sous
atmosphères modifiées.
Il
est
généralement
admis
qu'à
des
teneurs
en
eau
de
25
% s.h.
environ,
la perte en matière sèche est inférieure à 1 %,
tandis que sur les
grains très humides (35 % s. h.
ou plus),
le coût de la fermentation peut
atteindre 4 %ou meme plus, en perte de matière sèche (FORBES, 1964).
4.3.3. MODIFICATIONS DES QUALITES FONCTIONNELLES ET TECHNOLOGIQUES
Il est bien établi que
l'essentiel
des
qualités
technologiques des
grains à activité d'eau réduite sont aussi bien conservées sous atmosphères
modifiées qu'en atmosphère libre. Cependant, aux activités d'eau élevées, les
grains
sont
mieux
conservés
sous
atmosphère
pauvre
en
oxygène
qu'en

---

-
43 -
atmosphère libre,
mais la qualité renforcée des blés humides par exemple ne
peut être maintenue que pour une courte période qui diminue quand l'humidité
augmente (LEDU, 1968).
La teneur en gluten du blé à 18 - 20 %s.h.
reste inchangée durant le
stockage sous azote, mais sa qualité et sa valeur boulangère ne se conservent
pas plus de deux ou trois mois (SHVECOVA et SUSEDON,
1959).
L'aptitude au
broyage du blé à humidité intermédiaire n'est
pas appréciablement modifiée
durant le stockage sous atmosphère modifiée,
mais après deux ou trois mois,
le volume du pain obtenu décroît significativement (GLASS et al.,
1959) et
les
propriétés rhéologiques de
la pâte
sont modifiées.
POMERANZ,
1974
QUAGLIA et al.,
1980;
RICHARD-MOLARD et al.,
1984,
observent sur du maïs
humide
(21 à 22 % s.h.)
stocké
à
18°c dans des mini
silos
métalliques
hermétiques
une
légère
modification
des
propriétés
fonctionnelles
des
protéines
sans
cependant
qu'aucune
variation
significative
de
la
teneur
totale
en
azote
n'apparaisse
après
une
annee
de
stockage.
Il
est
vraisemblable que l'augmentation de l'acidité observée par ailleurs,
causée
soit
par
de
faibles
activités fermentaires
sur grains
humides,
soi t
par
l'activité
lipasique
résiduelle,
ou
encore
par
le
CO
qui
est
toujours
2
produit ou additionné à ces conditions, a un effet négatif sur les propriétés
fonctionnelles des protéines (SHVECOVA et al.,
1959;
PELHATE et THERIAULT,
1979 ; RICHARD-MOLARD et al., 1984).
La
persistance
de
quelques
activités
enzymatiques
sous atmosphères
modifiées
implique
des
modifications
pour
les
qualités
technologiques,
organoleptiques ou nutritionnelles des produits.
L'activité de l ' a
amylase
du riz
fraîchement
récolté,
par exemple,
est
responsable d'une certaine
extension du caractère collant en cuisson (ZELENY,
1954). Ainsi, le stockage
du riz humide
sous atmosphère contrôlée renforcerait
cette caractéristique
(SYARIEF,
1982) considérée avantageuse ou non pour la qualité du riz selon
les pays et les coutumes alimentaires.

---

- 44 -
Dans beaucoup d'expérimentations de stockage sous atmosphère modifiée,
les modifications des
propriétés organoleptiques des
grains
stockés
et de
leurs produits peuvent être observées à des teneurs en eau superleures à 16 %
s.h. (HYDE, .1974). Pour le blé stocké à 17 %s.h. en atmosphère confinée et à
22°C (niveau d'oxygène résiduel non spécifié),
GUILBOT et POISSON (1963) ont
montré l'apparition d'odeurs inhabituelles après un mois environ, et après 10
jours seulement si la teneur en eau atteint 21 %s.h.
SHEJBAL (1980) indique
que le riz stocké en anoxie à une teneur en eau supérieure
a
16,5
% s.h.
présente une forte odeur
(due à la
"respiration anaérobique")
rendant les
grains impropres à la consommation humaine.
Les mécanismes d'oxydation des
lipides et la production de
certains constituants volatils as SOCles
à
une
odeur du moisi (comme l'octène 1 01 3) sont inhibés en anoxie (RICHARD-MOLARD
et al.,
1980).
Par contre, l'apparition des odeurs de fermentation est très
souvent décrite (LEDU, 1968 ; HYDE, 1974 ; RICHARD-MOLARD, 1984).
Une étude effectuée par ANTHONI et al.
(1979) sur riz humide (JO %
s.h.) stocké dans différentes structures d'emballages hermétiques, montre que
des odeurs particulières se développent sur les grains témoins
(tels quels)
au bout de quelques jours,
tandis que les grains ayant subi une désinfection
superficielle préalable par immersion dans une solution antibiotique, gardent
leurs caractéristiques organoleptiques intactes.
Néanmoins,
les conséquences sur la valeur nutritive pour les animaux
sont relativement négligeables
et beaucoup d' auteurs
admettent l'obtention
d'une alimentation très efficace pour les grains peu humides.
Ainsi, dans le
cas
du
maïs
humide
ensilé,
AUMAITRE
(1982)
rapporte
des
résultats
peu
favorables
pour
l'alimentation
des
pigeons
et
poules
cependant,
des
meilleurs résultats sont obtenus avec des grains stockés pendant six mois à
21 - 22 %s.h. (RICHARD-MOLARD et al., 1984).

---

- MATÉRIELS ET MÉTHODES -

---

- 45 -
1. MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
GRAINS DE RIZ PADDY
Deux-lots de riz paddy (Oryza sativa L.) en provenance de Camargue et
présentant deux états mycologiques différents sont utilisés pour l'étude du
comportement
évolutif
de
telles
populations
microbiennes
aux différentes
compositions gazeuses.
Le premier lot de grain provient dl un silo commercial.
Récol té en
1984,
il a été stocké pendant 5 mois à 14 %de teneur en eau (s.h.) sous
atmosphère
renouvelée.
La
mycoflore
est
par
conséquent
constituée
essentiellement
de
moisissures
(de
stockage)
xérotolérantes
du
genre
Aspergillus (A. candidus, A. wentii, A. ochraceus, A. niger, A. flavus et A.
terreus),
Penicillium (P.
cyclopium,
P. granulatum, P. chrysogenum) et de
l'Eurotium glaucus.
Le deuxième
lot provient
d r une
station
expérimentale.
Récol té
en
1985,
la teneur en eau des grains est ramenée a 14,5 %s.h.
après séchage.
Contrairement au
lot
précédent,
il n r a
pas été
stocké longuement
avant
étude,
et la mycoflore est dominée essentiellement par le genre Alternaria,
Epicoccum,
Nigrospora et Cladosporium.
Les espèces de
stockage sont
par
contre
très
faiblement
représentées
par
Aspergillus
candidus,
Eurotium
glaucus et le genre Penicillium.
2. METHODES
2.1. DETERMINATION DE L'ETAT D'HYDRATATION DU RIZ PADDY
2.1.1. TENEUR EN EAU
Le dosage de l'eau est effectué suivant la norme AFNOR V-03-707,
par
séchage à l'étuve CHOPIN à 130°C de 5 à 10 grammes de produit pendant deux
heures.
Les grains de
riz paddy sont préalablement broyés au
broyeur IKA
refroidi pendant deux minutes.

---

- 46 -
Les résultats sont exprimés en grammes d'eau rapportés a 100 grammes
de substance humide (% s.h.).
2.1.2. ACTIVITE DE L'EAU
L'activité de l'eau dans un produit hygroscopique (grains de rlZ par
exemple)
en
équilibre
thermodynamique
peut
s'identifier
à
l'humidité
relative d'équilibre
(H.R.E.),
c'est-à-dire
au
rapport
de
la
pr-es s i on
partielle de vapeur d'eau en équilibre avec le produit (Pw),
à la pression
de vapeur saturante (p'w), à la même température (T)
HRE
PW
a w
100
P'W
(T)
Cette
relation
permet
la
détermination
pratique
de
l'a
non
w'
mesurable directement.
Les deux grandeurs (a
et H.R.E.) mesurées sur les
w
échelles de 0 à 100 %pour l'H.R.E.
et 0 a 1 pour l'a
n'ont pas la même
w'
signification physique (Figure
6).
L'a
se rapporte à l'état de l'eau dans
w
le produit, tandis que l'H.R.E. décrit la pression de vapeur d'eau.
- Principe de mesure
La
mesure
de
l'humidité
relative
d'équilibre
dans
une
enceinte
confinée isotherme (à 25°C: O,l°C) contenant l'échantillon est effectuée à
l'aide du
capteur hygrométrique
électronique ROTRONIC dont
on connaît la
courbe
d'étalonnage.
Le
capteur
contient
un
électrolyte
hygroscopique
gélifié dont l'impédance varie avec l'hydratation.
L'échantillon à mesurer impose une humidité relative avec laquelle le
capteur se met en équilibre, et dans ces conditions la mesure de l'impédance
du capteur donne directement l'activité de l'eau du produit.

---

- 47 -
La mesure de l'activité de l'eau est réalisée en enfermant environ 5
grammes
de
riz
paddy
dans
l'enceinte
de
mesure
étanche.
Le
temps
d'équilibrage du
produit est
d'environ 3
heures,
et la précision de
la
mesure est de l'ordre de ! 0,005 a .
w
- Eléments théoriques
L'activité de
l'eau
(a )
est
un
paramètre
thermodynamique
qui
se
w
définit par rapport au potentiel chimique de l'eau, soit
f (P,T) -
P réf (P,T)
RT ln
a
e
w
potentiel chimique de l'eau dans le produit
Il réf
potentiel chimique de l'eau pure à la même température
T(OK) et à la meme pression (P)
R
constante des gaz parfaits
a
activité thermodynamique de l'eau.
w
A température donnée,
il existe pour un produit (grains de céréales
par
exemple) ,
en
équilibre
thermodynamique
avec
l'atmosphère
qui
l'environne,
une relation entre la teneur en eau du produit et l'a
de ce
w
produit.
Cette relation est exprimée par des courbes isothermes de sorption
d'allure toujours sigmoïde pour les grains (GUILBOT et LINDENBERG, 1960).
Par ailleurs,
la courbe de sorption-désorption des grains tel que le
riz paddy (Figure 7) présente généralement une hystérésis,
de sorte qu'une
meme teneur en eau peut conduire à deux valeurs différentes de l ' a ,
ce qui
w
empêche d'espérer une précision meilleure que l'amplitude de l'hystérésis à
l'a
considérée.
w

---

- 48 -
HR"E
0
25
50
75
100
l
l
1
l
l
0
025
050
075
1
aw
+-Produil
sec
•
~Produi( •
Pro d uir
a
humide
.humidile
inte r me
•
di aire
Figure 6
Caractéristique de l'état de l'eau dans les gralns vis-à-vis
de l'humidité relative (HR) en équilibre
L'a
d'un
produit
humide
ou
à
humidité
intermédiaire
est
une
YI
caractéristique
physico-chimique
importante
pour
l'évaluation
de
sa
stabilité
microbiologique.
Dans
le
cas des
produits
comme les
grains
de
céréales,
pour
lesquels
les
conditions
d' équilibre
varient
au
cours
du
temps,
le
résultat de
la mesure
n'est pas
toujours
une
activité
au
sens
thermodynamique,
mais
il
conserve
un
intérêt
technologique
et
pratique
évident
(GUILBERT
et
MORIN,
1986) .
Il
donne
ainsi
des
valeurs
"plus
généralisables"
pour décrire des activités microbiennes (SCOTT,
1957) dans
la mesure où un seuil hydrique de développement pour une espèce donnée reste
valable
d'un
substrat
à
l'autre,
alors
que
les
teneurs
en
eau
correspondantes seront différentes.

---

, S
r-r-
FIGURE 7
T
- . , - '.- 1 1 r- F~
1 1- ; ! l ,._I.~ --! I/i:--
Oc SOR PTr0J'
r
1 L_
/ _
_
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1
I l L
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/\\
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T5Ql
RIZ PAOJY
~;~-:D-~:~,:~~·l-D~:~l;:~~:1
~-------1'-~-I--·-------I---~
i
'
l
,
1
0. 1 1 2
1
5 . 3 4 1 0 . 0 7 0
i
4.97
i
0.226
\\
7.32
I12J.1l2
i
6 . 2 4 - ;
0.327
1
8.89
I[
0 . 2 2 6
i
8.01
!
1
1
1
0.438
H'-C32
Gl.438
[
Ll.03
1
1
CO. 577
11.9ô
0 . 5 7 7 . 1 2 . 3 6 1
0.7C08
13.97
0.708
14. St
0. 753
14.85
lZJ.753
15.S0
1
0. 843
1B.84
0.843
t9.24-
0. 903
19.42
0.903
19. 9~
0.827
20.8B
0.327
22.7l
0. 969
25.17
1ïl.309
29.905
S. HYST.
3. 4-
2 0
Désorption
10
1 0
,
0
1
-
1
!
1
l2l
0 . ;2
0 . 4-
0 .
B
0 .
G
Avv
REGRESSION
ADS.
W,.,.,-7.808
K - 0. 657
C - 22.232
RMS%-1.8
(C_
A_
B )
DES.
W,.,.,-ELI2l37
K - 0.676
C - 30J. 786
RMS%-2.7
1

---

- 50 -
Le terme de produit alimentaire à "humidité intermédiaire" ou à "aw
intermédiaire" correspond sur le plan microbiologique aux a
comprises entre
w
0,65 et 0,85 (Figure 6).
Des limites aussi preclses ont bien sur quelque
chose d'arbitraire mais on notera que la limite inférieure (a
= 0,6
0,65)
w
correspond en première approximation au point critique d'apparition de l'eau
"solvante" (fraction d'eau faiblement liée) pour la plupart des produits.
2.2. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES
METHODE DES DILUTIONS-ENSEMENCEMENTS
Les microorganismes présents sur les grains sont dénombrés après mlse
en suspension dans une solution physiologique,
suivant la norme AFNOR v-18-
301:
100 grammes de rlZ paddy sont verses aseptiquement dans un bol mixer
(\\varing-Blendor)
d' un
litre contenant
400 ml
de
diluant
stérile
(NaCl
8,5 g
Bacto-peptone Difco 1 g ;
Tween 80:
0,033 g ;
eau distillée
q.s.p. 1000 ml pH = 7).
Après 20 minutes de trempage, afin de revivifier les microorganismes,
les grains
sont broyés
1,5 minutes
à la vitesse de
20 000 tours/min.
La
suspension-mère
ainsi
obtenue
est
soumise
à
l'analyse
microbiologique
proprement dite, par la méthode classique des "dilutions-ensemencements".
Pour
donner
à
la
méthode
une
meilleure
précision,
l'analyse
est
toujours faite en double.
La
mycoflore
des
grains
étant
riche
en
espèce
de
stockage
très
sporulante, ce sont surtout les propagules fongiques qui sont dénombrées. Ce
procédé ne révèle cependant que les germes revivifiables et ne permet pas le
dénombrement des germes morts,
et encore moins une mesure de la biomasse
fongique développée.
Les milieux de culture utilisés pour révéler la microflore des grains
du
riz
paddy
sont
des
géloses
et
figurent
parmi
ceux
employés
en
microbiologie générale.

---

- 51 -
Deux milieux de culture gélosés sont utilisés pour révéler la flore
fongique
l'une a
20 g d'extrait de
malt par litre et l'autre
à
50 g
d'extrait de malt et 50 g de chlorure de sodium par litre pour la mise en
évidence des
espèces
plus xérophiles.
Un antibiotique
(chloramphénicol à
0,1 %) est
rajouté à
ces milieux.
La durée
d'incubation
pour
la
flore
fongique est de 7 jours à 27°C.
Le
milieu
sélectif
de
Rogosa
est
utilisé
pour
la
détermination
globale de la flore lactique principalement les
lactobacilles.
Le pH est
ajusté
à
5,5
par
addition
de
1,32
ml
d'acide
acétique.
L'actidione
(antifongique)
est
ajouté
a
ce
milieu
de
culture
afin
d'éliminer
le
développement des moisissures et levures. L'incubation est faite 72 heures à
Les
résultats
sont
exprimés
en
nombre
de
germes
par
gramme
de
substance
sèche
(G/g
s s . ) pour
les
levures et
les bactéries.
Pour les
v
moisissures, la méthode des dilutions-ensemencements dénombre la quantité de
propagules
fongiques
(surtout
de s
spores
dans
le cas
de
nos
essais)
par
gramme de substance sèche (p/g s.s.).
Les courbes établies à partir de ces
résultats sont donc des courbes de sporulation.
2.3. METHODE DE DETERMINATION DU POIDS DE LA BIOMASSE FORMEE
PAR LES LEVURES
Les
suspensions
dans
lesquelles
les
levures
sont
les
seules
particules en
suspension sont centrifugées pendant 20 minutes
à raison de
3000 tours par minute.
La biomasse ou le culot est récupérée puis lavée à
l'eau
distillée
afin
d'éliminer
le
milieu
de
culture
retenu
par
les
cellules.
Ces
opérations
sont
effectuées
à
trois
reprises
avant
la
déshydratation complète
de
la
biomasse
par lyophilisation puis
sous
P205
jusqu'à l'obtention d'un poids sec constant.

---

- 52 -
2.4. EXTRACTION ET DOSAGE DE L'ERGOSTEROL
La méthode utilisée,
décrite par SElTZ et al.
(1977) et adaptée par
CAHAGNIER et al. (1984) met en oeuvre un dosage par absorption spécifique de
l'ergostérol dans
l' U. V.
La molécule d'ergostérol possède notamment deux
doubles liaisons en C
et C
5- 6
7_8.
L'absorption (U.V.) maximale est obtenue à 282 nm.
Les différentes
phases
de
la
méthode
d'extraction
et
de
purification
de
l'ergostérol
à
partir des grains et de la biomasse formée par les levures sont illustrées
par le schéma de la figure 8.
2.4.1. EXTRACTION
50 grammes de riz paddy ou la totalité de la biomasse d'Hyphopichia
burtonii lyophilisés
sont
broyés
respectivement dans
100 ml de
méthanol,
pendant deux minutes à l'aide du broyeur Waring-Blendor pour les grains et à
l'Ultra turax pour le mycélium. Ce dernier est au préalable ré humidifié avec
10 ml d'eau.
Pour les grains broyés,
le mélange est centrifugé pendant 10 minutes
à
raison
de
6000
tours/min.
et
le
surnageant
récupéré.
Une
deuxième
extraction est effectuée dans
les mêmes conditions à
partir des culots de
centrifugation.
L'extrait de levure broyé est réajusté avec une addition de 100 ml de
méthanol.
Les
surnageants
réunis
et
l' extrait
de
levure
broyé
sont
ensuite
saponifiés
par
de
la
potasse
alcoolique
(KOH
20 g
+
50
ml d'alcool
éthylique), 30 minutes sous reflux à 60 - 70°C.
Les
stérols sont
extraits deux fois de
l'insaponifiable par
100 ml
d'éther de
pétrole
(60
-
SOOC).
L' extrai t
obtenu
est concentré
jusqu'à
environ LO ml à l'aide de l'évaporateur rotatif et purifié par passage sur

---

-
53 -
Biomasse
Riz paddy
(50 g)
de levure
Eau:
10m l
Méthanol
(100 ml)
Méthanol
:
100 ml
Extraction 2 mn
Extraction 2 fois
2 mn
Ultra-Turax
Waring-Blendor
Surnageant
Centrifugation
1 Extrait
Ethanol 50 ml
--------.~ KOH 20 g ......~----
+
100 ml de Méthanol
Saponification 30 mn
~
Eau 50 ml
Extraction des stérols
par l'éther de pétrole
2 x 100 ml
Agitation magnétique
2 fois 20 mn
~
Séparation
Récupération de la phase
constituée d'éther de pétrole
~
Evaporation jusqu'à la ml
t
Purification sur colonne
de silice.
Elution par le
CH
CL
l 2
Evaporation à sec pu~s
reprise par
la ml CH
CL
2
2
+
Dosage
par
HPLC
Figure 8
Extraction et purification de l'ergostérol

---

- 54 -
une colonne (200 x 15 mm) de gel de silice (Kiesel gel 60,
Merck 70).
Les
stérols sont élués par 60 ml de chlorure de méthylène,
puis l'éluat purifié
est évaporé à sec à l'aide de l'évaporateur rotatif.
Le résidu sec est ensuite repris par 10 ml de chlorure de méthylène.
2.4.2. DOSAGE
L'ergostérol est dosé par chromatographie liquide haute performance
(HPLC).
L'appareillage utilisé comprend une
pompe Milton Roy constametric
IIG,
un
détecteur U. V.
spectromonitor III
réglé
à
282
nm,
une
vanne
d'injection à boucle d'un volume de 10 pl et un enregistreur de sensibilité
10 mv pleine échelle.
10 pl de l'extrait correspondant au volume de la boucle sont injectés
dans une colonne en acier inoxydable,
de 125 mm x 5 mm,
remplie de silice
Lichrosorb SI 60 de granulométrie 5 r'
L'élution s'effectue à une pression
6
de 450
PSI
(3,1
x 10
Pa)
par
la phase
mobile composée
de
chlorure
de
méthylène et d'isopropanol
(99,5 -
0,5 V/V) avec
un débit
de
1,5 ml par
minute.
La figure 9 représente un chromatogramme obtenu à partir d'un extrait
de riz paddy.
Les
résultats
sont
exprimés
en
pg
d'ergostérol
par
gramme
de
substance sèche. La répétabilité sur l'ensemble de la méthode est de l'ordre
de 2 %et la sensibilité voisine de 0,02 pg/g.

---

- 55 -
Riz-paddy
,
1
1
•
2
4
min
Figure 9
Chromatogramme d'un extrait de rlZ paddy
2.5. DETERMINATION DE L'ACTIVITE LIPASIQUE
Le principe de
la méthode utilisée
est fondé
sur le
dosage,
par
chromatographie en phase gazeuse (CPG) de la quantité d'acides gras libérés
au
bout
d'un
temps
donné
dans
un
mélange
de
produit
(à
analyser)
préalablement délipidé et d'huile d'olive,
placé à température et humidité
relative constantes (DRAPRON et SCLAFANI, 1969).
Les différentes
phases de la méthode de détermination de l'activité
lipasique sur les grains de riz paddy sont représentées par la figure 10.

---

- 56 -
2.5.1. PREPARATION DE L'ECHANTILLON
10 grammes
de
riz
paddy,
convenablement
déshydratés
sous
vide en
présence de
P
(teneur
en eau
10 % s.h.)
sont broyés
au
broyeur
IKA
20 5
refroidi puis tamisés sans rejet (diamètre des particules
0,4 mm).
Les
moutures
obtenues
sont
ensui te
délipidées
à
l' hexane
à
température ambiante à l'aide d'un Soxhlet modifié selon la méthode décrite
par GENOT et al. (1984). Les lipides extractibles à l'hexane correspondent à
la fraction "lipides libres" ainsi nommée en raison des interactions faibles
de
cette
fraction
avec
les
autres
composants
du
produit.
Les
"lipides
libres",
consti tués
d'une
majorité
de
lipides
apolaires
(triglycérides,
diglycérides,
monoglycérides
et acides gras libres) représentent 85 %des
lipides totaux du riz paddy (MORISSON,
1978). La mouture délipidée obtenue,
non dénaturée, servira pour la détermination de l'activité lipasique.
2.5.2. MODE OPERATOIRE
L'huile d'olive
(100 mg) est incorporée au produit délipidé
(2
g )
sous forme d'une solution dans l'éther.
Le solvant est ensuite éliminé par
évaporation, a l'air libre en agitant constamment le mélange, puis sous vide
au dessicateur en présence de paraffine.
Les
échantillons
sont
ensuite
conditionnés
sous
vide
dans
un
dessicateur contenant une solution saturée de
(NH
S04 (80 % HR) et placé
4)2
dans une étuve à 30°C pendant 72 heures.
A l'issue
des
72
heures,
l' activi té
lipasique
présente
dans
le
produit
et intervenant
sur l'huile
d'olive
est
bloquée
en
extrayant
les
lipides d'huile d'olive à
l'hexane
(50 ml)
contenant une quantité connue
d' acide margarique (solution de
C
dans
l' hexane:
2 mg/ml)
qui servira
17
d'étalon interne lors de la chromatographie en phase gazeuse.

---

- 57 -
Le mélange est centrifugé pendant 20 minutes à 3000 tours/mn,
et le
surnageant
est
récupéré
et concentré sous
vide
à
l'aide d'un évaporateur
rotatif. Le concentrat est repris dans 10 ml d'hexane.
L'extrait hexanique est soumis à une chromatographie sur couche mince
de
silice
G
60
(épaisseur
0,6
mm)
par
le
mélange
hexane/éther
diéthylique/acide formique
(60/40/1
V/V/V).
Après
révélation à l'iode
d'une
partie
du
chromatogramme,
les
acides
gras
sont
récupérés
quanti-
tativement,
puis
élués
par
l'éther
diéthylique.
Après
méthylation
au
diazométhane,
les esters méthyliques récupérés dans le disulfure de carbone
sont analysés par chromatographie en phase gazeuse.
2.5.3. DOSAGE
Les esters méthyliques sont separes et dosés par C.P.G.
sur colonne
capillaire.
Le chromatographe GIRDEL 300 utilisé est muni d'un détecteur à
ionisation de flamme relié à un enregistreur SERVOTRACE type PE 7523 couplé
à un intégrateur ICAP 10 capable de calculer directement les quantités des
acides gras
séparés,
en
se servant de l'acide margarique introduit
comme
étalon interne.
La colonne capillaire utilisée est en verre sodocalcique B
de 50 m
44
de longueur et 0,35 mm de diamètre interne.
La phase stationnaire employée
est le
CARBOWAX 20
M.
La
température du
four
est
de
18aoC,
celle
de
l'injecteur et du détecteur de 200°C.
Le débit du gaz vecteur (Helium) est
de 20 ml/mn et la fuite
diviseur de
1/40ème.
Les
débits de
l'air et de
l'hydrogène sont respectivement de 400 ml/mn et 25 ml/mn.
2.5.4. EXPRESSION DES RESULTATS
L'activité
lipasique
déterminée à
partir
des
grains
de
r i z
paddy
examinés est représentée par la quantité totale d'acides gras (exprimées en
micromoles d'ac:ide oléique) libérée en 72 heures, par gramme de produit sec.

---

- 58 -
Riz paddy broyé
() a g)
réfrigérant
Extraction à l'Hexane des lipides
cartouche
au Soxhlet modifié
capillaire
l
Extrait Hexanique
Mouture délipidée
(2 g)
lipidique
(extrait lipasique)
Ballon
1
+
. . . - - - -
huile d'olive
(100 mg)
(substrat)
- évaporation du solvant
- dosage par gravimétrie
- addition d'un étalon interne (C I 7)
- récupération des lipides
Incubation
72 H à 30°C
+
et 80 Ïo HR
Séparation globale des lipides <iIII~q-----
_1.
,ur eoue~ m'nee
Extraction des lipides
à l'hexane
J
',urnage""t
fil
li Triglycérides
,
~
Il
Acides gras libres
..
Centrifugation
-: Diglycérides )-3
-
l
- ' cl ]-2
Monog ycerl es
Dépôt
Azote
Récupération des acides gras
Chromatographie
Méthylation
phase gazeuse
----tl~~ éther\\
_ _~~~ des esters
méthyliques
mélange
réactionnel
acides gras
+ méthanol
Figure 10
Extraction des Acides gras libres

---

- 59 -
x -
(y - Z)
QA
n
ou QA
mg d'acide oléique par g s.s./72 h
x
quantité d'acide oléique obtenue en C.P.G.
y
quantité d'acide oléique dans l'huile l'olive
(1 %= 0,25 mg)
Z
quantité d'acide oléique libérée dans le produit sans huile
d'olive au départ
n
quantité de mouture délipidée
QA.
x 1
AL
3
282.10
o~ AL
micromole d'acide oléique par g s.s./72 h
2.6. DOSAGE DE L'ACIDITE GRASSE
La technique employée est celle décrite dans la norme AFNOR NF V03-
712 appliquée aux céréales.
L'acidité
grasse
représente
classiquement
les
acides
gras
libres
extractibles par l'éthanol à
95 % (v/V) à la température du laboratoire.
Après centrifugation de l'extrait éthanolique,
une partie aliquote (20 ml)
du surnageant
est titrée par l'hydroxyde de sodium
(N/20).
L'acidité
est
exprimée conventionnellement en grammes d'acide sulfurique pour 100 grammes
de matière sèche et donnée par la relation :
7,35 x (VI - Vo) x T
\\00
AG
m
100 - H

---

- 60 -
ou V1
volume de la solution d'hydroxyde de sodium utilisé par
la titration (ml)
VO
volume de la solution d'hydroxyde de sodium utilisé pour
l'essai à blanc (ml)
m
masse de la prise d'essai (g)
T
titre exact de la solution de NaoH utilisée
H
teneur en eau de l'échantillon pour l'essai en %s.h.
2·7. DOSAGE DE L'AFLATOXINE B1
2.7.1. EXTRACTION ET PURIFICATION
La méthode utilisée est celle de la norme AFNOR v-18-200 (Figure 11).
Elle est basée sur la solubilité de la toxine dans les solvants organiques
tel que le chloroforme.
L'extraction au moyen de ce solvant est obtenue par
agitation mécanique de l'échantillon finement broyé.
2.7.2. DOSAGE
L'aflatoxine
B
est
dosée
par
chromatographie
liquide
haute
1
performance.
L'appareil utilisé est du type HPLC LDC (Milton Roy) constitué
d'une pompe constametric III,
d'une colonne
Spherisorb NH
25 cm et d'un
2
détecteur fluoromonitor.
Les mesures sont effectuées à la longueur d'onde
d'excitation de 362 nm correspondant au maximum d'absorption de l'aflatoxine
B
L'intensité maximale à l'émission (410 - 430 nm) est obtenue quand la
1.
molécule de
toxine
se
trouve
en
solution
dans
un
solvant
chloré,
d'où
l'intérêt
d'utiliser
une
phase
mobile
constituée
par
le
mélange dichlo-
rométhane-méthanol (99,5 + 0,5 ml) dans laquelle entre en grande proportion
le dichlorométhane.

---

-
61 -
Riz-paddy
+
Extraction à froid
agitation 30 min à l'agitateur secoueur
Filtration sur filtre de papier Whatman
puis récupération de 50 ml d'extrait
chloroformique
Purification sur colonne de silice
(5 g Na
S04' 10 g silice, lOg Na
S04)
2
2
(colonne : 22 mm x 300 mm)
~
Délipidation et élimination d'autres
composés indésirables
(pigments)
100 ml d'hexane, puis 100 ml d'éther
Elution Je la toxine par 150 ml du mélange
chloroforme/méthanol (97/3,V/V)
+
Evaporation sous vide à 40°C
puis sous N2
+
Concentration de l'extrait
500 pl
Dosage par H.P.L.C.
Figure Il
Méthode d'extraction et de dosage de l'aflatoxine BI

---

- 62 -
6
La pression et le débit sont respectivement de 1000 Psi (6,895 x 10
Pa) et de 2 ml par minute. Le volume d'extrait injecté est de 10 pl.
Z.s. DETERMINATION DE LA COMPOSITION DE L'ATMOSPHERE
INTERGRANULAIRE
La croissance microbienne a pour effet de
modifier considérablement
la
composition
de
l'atmosphère
intergranulaire
dans
laquelle
elle
se
déroule.
Ainsi,
parallèlement à la consommation de l'oxygène, on assiste à
l'apparition de la biomasse (ergostérol par exemple) et de sous produits du
métabolisme comme le dioxide de carbone.
L'étude des variations de ces gaz
permet de suivre l'évolution de la croissance.
C'est ainsi qu'en considérant 1'°
comme substrat,
MONOD établit une
2
relation empirique liant le taux de croissance à la concentration de l'OZ.
°2
où
JI
taux de croissance (ou rendement pondéral)
pm
productivité maximale de biomasse
KO
concentration d'OZ pour laquelle le taux de croissance prend la
Z
moitié de sa valeur maximale.
MESURE DES GAZ (OZ - COZ)
Les principes de mesures de l'OZ et du dioxide de carbone sont basés
sur les propriétés physiques de ces gaz.
Nous avons utilisé pour nos essais
un analyseur magnétodynamique d'OZ du type Aü 10Z et un Binos du
type LH
pour la mesure du dioxide de carbone.

---

- 63 -
- Oxygène
L'OZ est un dipôle sensible aux champs magnétiques et donc mesurable
par des
appar~ils de type paramagnétique.
Pour faciliter les comparaisons
entre différents gaz,
il est communément attribué à l'OZ la valeur 100 et à
l'N
totalement insensible au champ, la valeur 0,000. Le tableau 5 donne les
Z
susceptiblités magnétiques relatives (50) de quelques gaz usuels, l'OZ étant
le plus sensible avec une susceptibilité de 100,
l'azote totalement neutre
donnant la borne inférieure.
GAZ
SO
- Air sec (moyenne)
+
ZO,97
- Azote (N
0,000
Z)
- Dioxide de carbone (COZ)
0,Z7
- Oxygène (OZ)
+ 100,000
- Monoxyde de carbone (Co)
+
0,01
- Hydrogène (HZ)
+
0,Z4
- Vapeur d'eau
O,OZ
Tableau 5
Susceptibilités magnétiques relatives (50) de
quelques gaz usuels.
Ainsi,
la perturbation de lecture due à la présence d'autres gaz est
le plus souvent inférieure au pour cent si le zéro de l'appareil a été fait
à
l'N
(gaz
de
zéro)
et
le
tarage
à
l'air
(gaz
étalon).
Une mesure
Z
d'étalonnage
est
nécessaire
avant
chaque
utilisation.
La
preclslon
de
l'appareil est de ~ 0,1 %d'OZ.

---

- 64 -
Si le gaz porteur n'est pas l'N
la formule permettant de déterminer
Z'
l'erreur commise par la présence d'autres gaz lors des analyses s'écrit de
la manière suivante
%
So (100 - VL)
d'OZ
vrai
VL
-
100
(2)
ou VL
valeur lue
So
susceptibilité magnétique relative des gaz des mélanges autres
que OZ. La valeur du dioxide de carbone comme gaz porteur a été
surtout prise en considération pour nos essais.
- Dioxide de carbone
Les molécules d'N
d'O
et d'argon (Ar) qui constituent la quasi-
Z'
Z
totalité de l'air sont presque aUSSl transparentes à la lumière T.R. qu'à la
lumière visible,
c'est-à-dire qu'elles ne l'absorbent pas.
Cependant,
un
certain nombre de molécules gazeuses présentes dans l'air montrent une bande
d'absorption dans l'T.R.
: c'est le cas notamment du COZ.
L'absorption
du
rayonnement
infra-rouge
est
proportionnel
à
la
concentration du dioxide de carbone et n'est influencée par aucun autre des
composants gazeux les plus fréquents.
A nouveau,
l'N
est utilisé comme gaz de zéro pour l'étalonnage de
Z
l'appareil.
Pour les
plages de
mesure
supérieures à
0,5 %,
nous
avons
utilisé directement l'air qui ne contient qu'une quantité négligeable de COZ
(0,03 %).
Pour l'exactitude de la mesure,
nous avons effectué le réglage
avant toute injection ou contrôle en fonction des mélanges gazeux utilisés
contenant
des
concentrations
précises
du
COZ
obtenues
à
l'aide
d'un
mélangeur Leybold-Heraeus GHBH spécialement adapté.

---

- 65 -
2.9. REALISATION D'ATMOSPHERES CONTROLEES
Le
contrôle
des
atmosphères
expérimentales
est
réalisé
dans
des
micro-silos' (5 par série d'essai)
en altuglass imperméable au
gaz,
d'une
capacité
de
10
litres.
Des
quantités
d'O
exactement
connues
sont
Z
journellement introduites dans les cellules en mélangeant des gaz
(H.P.) en
proportions
convenables
et
en
alimentant
chacune
des
cellules
avec
ces
mélanges par un balayage de quelques minutes
(Z à
3 minutes).
On néglige
dans
ces essais,
la quantité d'OZ
consommée
par l'écosystème
pendant la
durée du balayage.
La figure 1Z représente le schéma expérimental pour les
différents essais réalisés.
Une
série de
15 mesures
différentes a
été au
préalable
effectuée
pendant une
période de
Z4 heures
sur chaque cellule contenant au
départ
0,8 %d'OZ'
afin de déterminer la répétabilité de la méthode de mesure et
l'étanchéité des micro-silos.
Les résultats obtenus sont les suivants
moyenne
0,71
écart-type
0,03
Les
erreurs
dues
a~x
artefacts
de
la
mesure
peuvent
donc
être
considérées comme négligeables pour les pourcentages d'oxygène mesurés.
Les
quantités
d'oxygène
fournies
à
l'écosystème
sont
calculées
théoriquement.
Ces valeurs sont obtenues à partir du volume d'OZ introduit
dans l'espace intergranulaire et de la masse de grains (6,Z kg) que renferme
les micro-silos. Pour une concentration d'oxygène connue dans la cellule, la
quantité équivalente d'oxygène obtenue à partir du calcul théorique est:

---

- 66 -
5
Pompe
4
Mélangeur de
gaz
MGV
:·iesureur
paramagnétique
d'02
2
:'lesureur de
C02
Absorption IR
MICRO
SILO
AIR
c
Figure 12 : Représentation schématique du dispositif expérimental
1.
joint vitron O-Ring
2. altuglass (paroi transparente du micro-silo)
3. manomètre
4. entrée de mélanges gazeux expérimentaux
5. sortie de mélanges gazeux expérimentaux

---

- 67 -
pourcentage d'OZ dans la cellule (%)
VE.
volume de l'espace intergranulaire (litre)
l
volume d'OZ dans la cellule (ml)
La
quantité
d'oxygène
disponible
qui
occuperait
à
l'état
gazeux
l'espace intergranulaire est
VLO Z
- - x 3Z
QL Oz (quantité d'OZ libre exprimée en gramme)
ZZ,4
La quanti té d'OZ fournie
par gramme de substance
sèche et par jour
est donc
QL0 2
QMO
(quantité d'OZ disponible par gramme de matière
Z
6,z
sèche)
Z.10. DETERMINATION DES CARACTERISTIQUES TECHNOLOGIQUES
DU RIZ PADDY
Z.10.1. PREPARATION DES ECHANTILLONS
La
qualité
technologique
du
riz
paddy
stocké
sous
différentes
atmosphères
contrôlées
et a
diverses H.R.
est
estimée
par les
qualités
d'usinages et culinaires.
Nous avons utilisé les deux lots du riz déjà décrits:
l'un, récolté
en 1984 et
stocké
5 mois dans un silo commercial en Camargue,
est très
hétérogène;
l'autre provient d'une station expérimentale et est constitué
d'une
variété
pure.
Il
est
bien
établi
que
parml
les
facteurs
qUl

---

- 68 -
influencent
la
qualité
technologique
du
rlZ,
la
variété
joue
un
rôle
essentiel (JULIANO et a I . ,
1965) tout comme les conditions de rammassage,
séchage et stockage (SYARIEF, 1983).
Les
échantillons
du
premier
lot
de
riz
(ou
lot
commercial)
réhumidifiés à 0,95 d'a
sont conservés un mois à - 20°C après le stockage
w
expérimental afin de stopper toute activité microbienne possible à cette aw
critique.
Ils
sont ensuite préséchés sous P
dans un dessicateur placé
20 5
dans une étuve à 30°C pendant 72 heures.
Par contre,
les échantillons de riz réhumidifié à 0,90 et 0,87 sont
préséchés immédiatement après étude, sans conservation au froid comme décrit
pour les essais précédents.
Il
est
nécessaire
de
noter
quelques
observations
concernant
ces
traitements successifs.
La réhydratation du r i.z sui vie d'un séchage cause beaucoup plus de
fissuration des grains qu 1 un
séchage sur des grains non réhydratés
(KUNZE
O.R.
et al.,
1965).
Les grains fissurés sont généralement brisés au cours
des opérations
ultérieures de
décorticage et de
blanchiment
(KUNZE O.R.,
1977) .
Par ailleurs,
la conservation du rlZ humide au froid semble avoir un
effet bénéfique sur le rendement d'usinage (CHIKUBU, 1970).
Les traitements utilisés,
réhydratation,
congélation, séchage, nous
amèneront donc à interpréter nos résultats avec prudence surtout pour ce qui
concerne les grains humides (à 0,95 d'a ).
w
Les échantillons séchés sont conservés dans une salle conditionnée à
une température de 20°C et à une humidité relative de 70 %de manière à ce
que leur teneur en eau se stabilise vers 14 % s.h.
au bout de 3 semaines
(FEILLET et REDON, 1971).

---

- 69 -
2.10.1. CARACTERISTIQUES DE L'USINAGE
L'usinage est l'opération qui consiste à débarrasser le riz paddy de
ses balles
(décorticage)
et
le riz
cargo ainsi obtenu de
ses
envoloppes
(blanchiment).
Au cours de ces opérations, le germe et les couches externes
du
grain
(péricarpe,
assise
protéique,
quelques
cellules
amylacées
de
l'endosperme) sont progressivement éliminés.
L'état et l'aspect du produit
fini ou riz blanchi dépend du traitement auquel le grain a été soumis.
Une
certaine
proportion
des
grains
se
brise
par
ailleurs,
les
grains
défectueux tels que les grains crayeux se retrouvent dans les brisures (taux
de brisure).
50
grammes
de
riz
sont
décortiqués
dans
un
appareil
à
rouleaux
"Sataki" puis blanchis à l'aide d'une micro-rizerie à cone "universale" de
chez 11aL\\fIA11 dans les conditions décrites par FEILLET et REDON (1971).
Le
réglage du cône de la micro-rizerie est identique pour tous les essais
: 3
minutes à 20 divisions (degré de serrage du cône à blanchir). Après usinage,
les grains blanchis entiers sont séparés des brisures et des grains crayeux
par un triage manuel précédé d'un passage sur une grille alvéolée.
Tous les échantillons ont été analysés deux fois pour les opérations
de décorticage,
polissage et
taux de
brisures.
Les
caractéristiques de
l'usinage sont mesurées par les rapports suivants:
Poids du r~z cargo
Rendement au décorticage
x 100
( 1)
Poids du r~z paddy
(R.D. )
Poids du r~z entier blanchi
Rendement à l'usinage
x 100
(2)
Poids du r~z paddy
(R. U. )

---

-
70 -
Poids des grains brisés après blanchiment
Taux de brisure
x 100
(3)
Poids du riz blanchi total
(T. B. )
Les qualités technologiques seront meilleures si les rendements sont
élevés et le taux de brisures faible.
Z.10.3. CARACTERISTIQUES VISCOELASTIQUES DU RIZ CUIT
Le
viscoélastographe utilisé
permet d r évaluer
les caractéristiques
viscoélastiques
du
rlZ
cuit
en
traçant
les
courbes
de
déformation
en
fonction du temps sous une force constante (courbe de retard),
puis après
suppression de la force (recouvrance) (FEILLET et al., 1977).
Cuisson:
1,5 gramme de rlZ entier blanchi est cuit dans une boule
à thé au bain-marie dans une eau désionisée bouillante.
Après 17 minutes de
cuisson,
le riz est égoutté dans la boule,
placé dans une boîte de Pétri
saturée en vapeur d'eau en prenant soin de bien séparer les grains les uns
des autres.
- Mesure : une heure après la fin de la cuisson, 3 grains de riz sont
placés sur le porte-échantillon du viscoélastographe préalablement réglé de
la manière suivante
force exercée:
700 g;
durée d'application de la
force:
40 secondes
durée de rebondissement ou de la recouvrance:
ZO
secondes. Sur le viscoélastogramme obtenu (Figure 13), on mesure l'épaisseur
(E en mm) du riz cuit avant l'application de la force, après écrasement (el)
et après
rebondissement
(e
La mesure est répétée 5 fois par temps de
Z).
cuisson,
et
pour chaque
temps de
cuisson,
les
grandeurs
mesurées
sont
définies comme ci-dessous

---

1
-
71 -
1
Poids du riz cuit
Gonflement (G)
E
x
100
1
Poids de l'échantillon avant CUlsson
Compressibilité (C)
x 100
1
=
E
(déformation totale à la
1
compression)
1
Recouvrance élastique (R.E.)
x 100
E - e 1
(déformation recouvrable qui
1
correspond à la manifestation
1
de l'élasticité totale de
l'échantillon)
1
"
1
!
.... polI COf, on de
~
.~errOII de
10 ro- c e
10 tor ce
1
1
1
1
o
o
40
60
Duree du cycle (secondes)
1
Figure 13
Exemple de viscoélastograrnrne, E est l'épaisseur initiale du riz
avant application de la force, el l'épaisseur après écrasement,
1
e z l'épaisseur après recouvrance.
1
Le riz
sera considéré de
qualité
meilleure
si le gonflement
et la
recouvrance élastique donnent des valeurs élevées, et la compressibilité des
1
valeurs faibles pour un temps de cuisson donné.
1
1

---

1
1
1
1
1
1
1
1
1
- TRAVAUX PERSONNELS -
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
o
1

---

-
72 -
1
1
1. VARIATION DES ECHANGES GAZEUX DANS L'ECOSYSTEME EN FONCTION DE L'AW
DES GRAINS DE RIZ ET COMPORTEMENT DES MICROORGANISMES EN ANAEROBIOSE
ET SOUS COZ PUR
1
1.1. INFLUENCE DE L'ACTIVITE DE L'EAU DES GRAINS SUR LA VITESSE
1
DE CONSOMMATION DE L'OZ INTERGRANULAIRE, EN CELLULES ETANCHES
1.1.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1
Cet essai est réalisé avec des grains de riz
paddy du
premier lot,
réhumidifiés et homogénéisés à des a
de 0,76
0,86 ; 0,90 et 0,95 pendant
w
1
5 jours à SoC.
Les grains sont répartis en fonction de l'a
dans 5 micro-
1
w
silos de 10 litres.
Chaque enceinte correspond donc à un état d'hydratation
1
des grains.
Les grains à 0,70 d'a
sont utilisés tels quels sans réhumidification
w
1
préalable.
Les micro-silos remplis et fermés hermétiquement sont placés dans une
1
chambre
thermosta tée à
25 .± laC.
L'évolution
des
gaz
dans
l'atmosphère
intergranulaire est suivie par des mesures fréquentes afin de déterminer le
1
moment précis où la pression partielle de 1'0
s'annulle dans chaque micro-
2
silo,
ce
qui est
mis
en
évidence à
l'aide
d' un
mesureur
d' 0
de
type
Z
1
magnétodynamique,
utilisant
les
propriétés
paramagnétiques
de
ce
gaz,
préalablement étalonné sur l'air ambiant et sur de l'N
pur.
1
Z
1
1.1.2. RESULTATS
1
a - Evolution de l'atmosphère intergranulaire en fonction
de lIaw
1
Comme le montre la figure 14,
la diminution de la
teneur en O
au
2
cours des essais est étroitement liée à l'a
des grains.
A 0,95 a
(24,5 %
w
w
s.h.) et à 25 + laC,
l'anoxie complète (02~ 0,1 %) est obtenue au bout de
1
D
1

---

-
73 -
1
ZO heures.
Cependant,
à 0,90 d' a
( 19 , 5 % s. h . ) ,
aucune trace d'OZ n'est
w
détectable à partir du 3ème jour,
et pour les grains à 0,86 d ra
(17,3 %
w
1
s.h.), l'anaérobiose n'est réalisée qu'au bout de 9 jours de stockage.
Seule une faible disparition partielle de
l'OZ a
pu être observée
1
après 3 mois de stockage du riz paddy à 0,70 d'a
(14 %s.h.).
w
1
La figure 15 montre parallèlement à la réduction de l'oxygène comme
1
l' on pouvait
le
prévoir,
que
la
production
du
COZ
est
fonction
de
la
consommation d'OZ'
mais que les très fortes concentrations en COZ obtenues
dans les micro-silos contenant les grains à a ~ 0,90 suggèrent l'existence
w
1
d'autres mécanismes de production de COZ.
1
Ces résultats
sont similaires
à ceux obtenus notamment
par FORBES
1
( 1964) ,
WILLS
et
al.
(1983)
qUl
observent
une
concentration
inférieure ou égale à
ZO % dans des bocaux étanches contenant des grains
réhtmidifiés jusqu'à des teneurs en eau de 18 - zo % (s.h.).
1
1
b - Evolution apparente de la microflore au cours
de la phase aérobie
1
Les bactéries lactiques et tout
spécialement les Lactobacillus spp.
1
se multiplient
très
rapidement
sur
le
riz
paddy
stocké
à
0,95
d'a
et
w
atteignent un niveau supérieur à 10 7 germes par gramme au bout de ZO heures
seulement (Figure 16A), temps nécessaire pour atteindre l'anoxie.
1
Des
tes ts
réalisés
sur
galeries
API
50
pour
ces
bactéries
Gram+
1
cultivées sur le milieu sélectif ROGOSA révèlent que ce sont essentiellement
1
des Lactobacillus hétérofermentaires.
L.
plantarum et deux autres espèces
non identifiées ont été isolées,
mais le L.
plantarum semble être l'espèce
1
dominante sur les grains stockés sous ces conditions.
1
1
1

---

1
- 74 -
1
1
•
20 *'--""'"
" ,
"<,
\\ *,
•
1
" ',---_.---..---
6
-..
'-."
1
---'-..•___. aVII0.70
1
.-.--
1,.
1
/)-. •..
1
10
1
1
6
\\
1
1
5
10
20
30
40
JOURS
1
1
'I
Figure 14: vitesse de consormnation de "OZ en fonction de
aw
des grains de riz
1
cO
%
2
1
30
<lVII 0.95
1
20
1
;, VII 0.90
*1
6
;.1 VII 0.8 6
*
ç:
1
6.-
1
:1 1
10
1
a VII 0.76
1
/*
6.
/ '
* , /
. 1
.",."" --
1
_-,,'. *
..
a VII 0.70
;
--
-
1\\
•••.•. c->:
. _ ' _ • •
_ . _ . _ . _ .
:;=t---. 1/1 _. - •
-1/- 11
o V
,
g
o
jL-..-J
10
20
30
40
85
JOURS
Figure 15: produc t i on ete'COZ è:tI fonction de l 'aw
des gralns de riz

---

1
- 7S -
1
germes/g
A
P02: 20.9%
7
10 _
~W:O.9~
1
1
6
10 _
__-...cMc.:...0=-':.,::
" sis ~_r es
d
~
e_sc.:...to::...::..c:.:..k::.a3!.g~e
•
1
Figure 16
Développement apparent
de la microflore du riz
_._.~.u.!..!..!!.s~~ures_._.
. *
1
~
10
paddy durant la phase
i
aérobie (à 0,95 (8) et
1
- - - 0
0,90 (A) d' a )
3
A
w
10
S P P .o-oooooo
di d ~oo-ooooo
1
C a ~ooooo
. 0 -
....
0
0 0
2
10
A
L---=-o'
--J
Abscisse
durée d'obtention de
o
60
1
Heures
l'anaérobiose en heures
1
Ordonnée
Nombre de germes (de
moisissures, de
1
gcrmcs/g
Lactobacillus spp. et
de levures) par gramme
7
1
10 _
de grain.
1
6
10
1
•
*
1
,./'
1
Moisissures de
stockage
;;><
a
/ â
1
* , . / '
0,.......··········..··.....·
Sc-
s.>
3
o),Qo'
1
10 _
ÇL?'So'
0
o
0
.........
2
10 " - - - - - - - - - - - - -
--J
o
Heures
20
o
1

---

1
- 76 -
1
Pour
des
ralsons
méthodologiques,
les
dénombrements
mycologiques
effectués ne permettent pas de conclure à une augmentation significative des
1
levures en ZO heures
à 0,95 d'a
ou en 3 jours à 0,90 d'a
bien qu'on
w
w'
observe une multiplication apparente des espèces dans ces conditions.
1
A 0,90
d'a ,
la
croissance des
Lactobacillus est
inhibée et
les
w
populations régressent légèrement (Figure 168).
1
Aux a
réduites (0,86;
0,76; 0,70), l'OZ disparaît progressivement
w
sans aucune modification microbiologique mesurable.
1
1
c - Quotients respiratoires apparents
1
Le quotient respiratoire apparent (Q.R.A.),
est exprimé par le rap-
port entre la quantité de
COZ
produit et
l'OZ consommé par l'écosystème
1
comme l'indique la figure 17.
Pour les grains à une
a
inférieure ou égale à 0,86,
ce
rapport
w
correspond à une valeur voisine de 0,65.
Aux a
élevées (0,95 et 0,90),
1
le
w
Q.R.A.
augmente sensiblement par rapport aux valeurs décrites pour de tels
1
écosystèmes où sont consommés des glucides.
Ainsi,
il est de 1,5 à 0,95
1
d'a, et de 0,90 pour les gralns a 0,90 d'a, ce qui est nettement supérieur
w
w
aux valeurs obtenues par HYDE et OXLEY
(1960)
qui mesurent des
quotients
1
respiratoires variant de 0,60 à 0,65 avec de l'orge
stocké dans
les mêmes
conditions à des teneurs en eau allant de 18 à Z4 % (s.h.). Dans nos essais,
1
ces valeurs sont seulement trouvées avec des grains de riz à des teneurs en
eau inférieures ou égales à 17,3 %(s.h.).
1
Le Q.R.A.,
très élevé à 0,95 et 0,90 d'a
s'accompagne sur le plan
w'
microbiologique
d'une
1
multiplication
importante
de
Lactobacillus
et
probablement des levures.
Par contre,
aux a
inférieures ou égales à 0,86,
1
w
aucune production du COZ par fermentation n'est possible et par conséquent
tout l'OZ intergranulaire est converti en COZ par la respiration des espèces
1
xérotolérantes, les insectes s'ils sont présents, et le grain lui-même.
1
1
1

---

1
- 77 -
1
Le volume occupé par l'atmosphère intergranulaire étant de 3,5 litres
1
dans nos essais, la quantité d'OZ dans les micro-silos remplis de grains est
de 1,05 gramme.
Dans ces conditions, la respiration ne consomme pas plus de
1
1 gramme de matière sèche environ, et les pertes sur le plan économique sont
1
négligeables tant que les processus fermentaires n'interviennent pas.
1
d - Adsorption du COZ sur les grains
Le déficit observé entre la quantité de COZ produit et la quantité
1
dlO
consommée (Tableau 6) peut aussi s'expliquer en partie par l'adsorption
Z
1
sur les grains d'une partie du gaz produit par l'écosystème.
Le coefficient
d'adsorption calculé augmente quand l'a
des grains diminue.
w
1
Les
valeurs
calculées
obtenues
dans
ces
conditions expérimentales
sont environ 3 fois plus faibles que celles publiées par YAMAMOTO et MITSUDA
1
(1980) dans leurs études sur l'adsorption du COZ par le riz, qui montraient,
par exemple,
une fixation de près de 0,30 ml de gaz par gramme de grains à
1
0,70 d'a.
Ces différences importantes pourraient être dues à l'effet de la
w
réhumidification et à l'état physique des grains.
Cependant,
ces auteurs
1
observent
également
que
la
capacité
d'adsorption
du COZ
est inversement
proportionnelle
à
l'a
des
grains,
ce
qui
suggère
que
le
mécanisme
w
1
d'adsorption ne
fait
pas intervenir des
phénomènes de
dissolution du
COZ
1
dans l'eau retenue par les grains.
1
1.1.3. DISCUSSION
1
Pour ce qui concerne l'évolution de l'OZ et du COZ dans l'atmosphère
intergranulaire,
les résultats obtenus montrent qu'à des a
des grains
de
w
0,86,
la quantité d'OZ disponible en début d'essai est rapidement consommée
1
sans qu'aucune activité fongique ne
soi t
mesurable par les méthodes dont
1
nous
disposons.
Ce
seuil
hydrique
correspond
aussi
à
l'a
limite
ne
w
1
1
1

---

- 78 -
1
CO 2
i 0lr )
pr()duil\\,OI
1
1
20
1
15
1
10
1
5
1
OIC....--_....L-_ _........L..._ _---J.
L....-
_
1
o
5
10
15
20
")
b
b
(0./0 )
(2 a sor e
1
o a w (J.<}.ï
.
* aw 0.90 . 2, aw 0.86 ... aw 0.76
1
1
Figure 17
Relation entre le CO
produit et 1'°
consommé
2
2
durant le stockage hermétique du riz à différentes a w
1
1
-
i---··-·-----·-
.
--
total
CO
dans la
CO
adsorbé
Coefficient
1
2
2
phase gazeuse
(g)
d'adsorption
1_::J_C02(g)
(g)
(ml/g)
-
1
i 0.76
0.72
0.73
0.057
0.86
1.4 4
1.10
0.34
0.028
1
0.90
1.23
0.21
0.017
1 070
O, 17
1
1
1
1.
-:...
1
~
1
Tableau 6
Adsorption du CO
sur du r~z paddy en
2
relation avec l'aw
1
1
1

---

1
- 79 -
1-
permettant aucune activité fermentaire sur les grains et par conséquent,
la
1
quantité
de
COZ
produit
ne
peut
être
que
le
résultat
d'une
activité
respiratoire de l'écosystème.
1
L'adsorption du COZ sur les grains dépend significativement de l'aw
des grains,
mais
s'il
est prouvé
que
les grains adsorbent
une
quanti té
1
importante de COZ' l'effet éventuel de ce gaz adsorbé sur la physiologie des
1
microorganismes n'a pas été démontré.
L'étude de ces mécanismes peut être
importante et
utile dans l'étude du
comportement des
microorganismes des
1
grains.
La
vitesse de
consommation de
110Z par l'écosystème est
sans doute
1
aussi fonction du niveau de l'inoculum,
de l'âge et de la composition de la
microflore.
Mais
compte-tenu
de
la
charge
microbienne
des
gralns
à
1
l'origine, des méthodes utilisées et de la durée très limitée de nos essais,
il
est
difficile
d'interpréter
avec
certitude
ces
résultats
microbio-
1
logiques;
ce
qui
nous
a
amené
a
étudier
ces
évolutions
sur
une
durée
significativement
plus
importante
et
sous
une
même
anaérobiose
auto-
1
produite,
comparée à une anoxie artificiellement établie dès le début des
1
essais au moyen du COZ.
1
1.Z. EFFET DE L'ANAEROBIOSE STRICTE ET DU COZ PUR SUR L'EVOLUTION
MICROBIOLOGIQUE DES GRAINS DE RIZ PADDY HUMIDES
1.Z.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1
Ces essais de conservation sont réalisés avec des grains de riz paddy
n
de
meme
provenance
que
ceux
utilisés
lors
des
essais
précédents,
et
conviennent donc particulièrement à la recherche des espèces sensibles d'une
1
part à l'anaérobiose,
et d'autre part,
à une atmosphère de COZ. Les grains
sont
réhumidifiés
(par
addition
d'eau
stérile)
et
homogénéisés
(à
4°C
pendant 5 jours)
jusqu'à une teneur en eau de Z4,5 %s.h.
correspondant à
une a
de 0,95.
1
w
1
1

---

1
- So -
1
Sur deux séries de 5 micro-silos remplis chacun complètement de riz
paddy PUlS placés à Z5 + 1°C, l'anaérobiose est obtenue:
1
- soit naturellement par la fermeture hermétique des micro-silos, et dans ce
1
cas,
les processus d'oxydation se produisant dans
l'écosystème entraînent
une anoxie stricte en moins de ZO heures (Cf. 111.1.1.) ;
soit artificiellement,
1
par balayage
avec du
COZ pur
a
raison
de
150
ml/seconde
jusqu'à
l'obtention
d'une
anOXle
stricte
(soit
10
minutes
1
environ), l'OZ intergranulaire étant simplement remplacé par du COZ.
L'anaérobiose (OZ
0,1 %) est vérifiée par la mesure de la pression
1
résiduelle d'OZ comme indiqué ci-dessus.
1
1.Z.Z. RESULTATS
1
a - Evolution des microorganismes
Le comportement des microorganismes du riz paddy stocké sous COZ et
1
sous atmosphère confinée est illustré par la figure ISA.
Seuls les Lactobacillus ont été capables d'un développement important
1
sous
ces
conditions
hydro-atmosphériques.
Les
levures
régressent
sensiblement jusqu'à la fin des essais,
ce qui démontre la dépendance des
1
levures vis-à-vis
de
l'OZ et confirme celle des moisissures.
Les
spores
1
d'Aspergillus candidus et d'Eurotium amstelodami maintiennent cependant leur
1
viabilité sur les grains
en fin de stockage,
après plus de 3 mois.
Par
contre,
à cette date,
le nombre de
spores viables de Penicillium spp. a
diminué considérablement
et ces
espèces ne
sont
plus
détectables
par
la
1
méthode de dénombrement utilisée (Figure ISB).
1
La stabilité des teneurs en ergostérol,
voisine de 6 pg/g pendant la
durée
de
conservation
(Figure
ISA)
confirme
l'absence de
croissance des
1
micromycètes dans ces conditions et, au
passage, on peut noter l'intérêt du
1
dosage à posteriori de
ce
composé qui démontre
une infection passée même
lorsque tout germe revivifiable a disparu.
1
1
1

---

1
- 81 -
1
Germes/g
Ergostérol (pg/g)
1 c / I - - - - -
~_......,
1
1
1
A
1
1
1
1
40
50
60
107
JOL:RS
1
Figure 18
Evolution de la microflore,
Spores/g
de la teneur en ergostérol
1
des grains (A) et des
espèces dominantes (B)
sur riz conservé sous
1
B
COz pur (.) et en atmosphère
confinée (-*)
1
1
J
'", .~
la
.
.:
' \\ .
~
EurorillIn
'\\;:
~~J..--.. g laucus
. . . . . . . . . . .
~
1
~""".,
,
2
10
'\\
'\\
1
1
1
10
1
20
..10
1
1

---

1
- 82 -
1
Ces essais ne montrent pas d'influence particulière des atmosphères
de
COZ
pur
sur
la
vitesse
de
régression
des
micromycètes
et
sur
le
1
développement des Lactobacillus.
Ces
résultats
sont
similaires
à
ceux
obtenus
par
DANIELS
et
al.
1
(1984) qUl indiquent que le COZ n'est inhibiteur que sur les bactéries Gram~
1
b - Evolution de l'acidité grasse des grains
1
Apparemment,
le taux d'acidité grasse augmente fortement au cours du
stockage comme le montre le tableau 7.
Il est en fin d'essai 4 fois plus
1
élevé
que
la
valeur initiale,
et cela
quel que
soit
le
mélange
gazeux
1
expérimental (COZ pur ou atmosphère confinée).
L'activité métabolique des
moisissures
et
des
levures
étant
inhibée
sous
ces
conditions,
cette
1
augmentation de l'acidité grasse observée sur les grains ne peut se corréler
qu'avec le développement important des Lactobacillus.
Ceux-ci produisent de
1
l'acide lac tique
et dl autres
acides organlques,
acides
à
chaînes
courtes
1
qui,
sans aucun doute,
sont extraits par l'alcool à 95°. Ils viennent donc
fausser la mesure de l'acidité grasse préconisée classiquement comme indice
1
de la qualité de conservation des grains plus secs.
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

1
- 83 -
1
1
Durée (jour) 1
Acidité des grains (g H S0 / 100 g s.s.)
2
1
4
\\-----------------------------------------------------
1Atmosphères
1
TO
1
5
1
15
1
30
1
50
1
107
1
1contrôlées
1
1
1
1
1
1
1-----------------1--------1--------1--------1--------1--------1--------
1
1
1
1
1
1
1
1
1
COZ
1
0,03
1
0,046 1
0,055 1
0,078 1
0,11 1
0,12
\\-----------------1--------1--------1--------1--------1--------\\--------
1
1
Atmosphère
1
1
1
1
1
1
1
confinée
1
0,03
1
0,0461
0,054 1
0,0761
0,11 1
0,12
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 7
Evolution de l'acidité grasse des grains de rlZ stockés a
0,95 d'a
et sous atmosphères contrôlées.
w
1
1
1.Z.3. DISCUSSION
1
Si le
niveau d'oxygène dans les atmosphères
modifiées
étudiées
est
resté constamment en dessous du seuil mesurable,
des surpressions ont été
1
observées
tout
au
long
des
trois
mois
de
l'essai.
Ces
surpressions
ne
s'expliquent
que
par le COZ produit par les lactiques hétéro-fermentaires
1
tels que Lactobacillus plantarum.
1
L'activité de ces espèces est de plus à l'origine de l'acidification
des grains.
Aussi,
selon ROLANDO et al.
(1985),
l'inoculation des grains
1
avec L. plant arum accélère la production d'acide dans les stades précoces de
la
fermentation,
et
une
atmosphère
de
COZ
n'altère
pas
cette
activité
1
fermentaire.
1
Cependant,
l'importance de la production du CO
dans ces conditions
2
ne
pourra
être
réellement
estimée
et
appréciée
tant
que
les
processus
1
d'adsorption de ce gaz sur les grains ne seront pas entièrement élucidés.

---

1
- 84 -
1
L'accumula tion naturelle
ou
artificielle
du
COZ
dans
l'atmosphère
intergranulaire et des acides organiques sur grains,
et l'absence totale de
1
1'0
constituent dans ces conditions un ensemble de facteurs défavorables à
Z
1
la sporulation et à la viabilité
des germes
fongiques.
Bien
qu'il
soit
difficile
de
dissocier
et
de
pr'ec i s e r
l'action
de
ces
facteurs
sur
le
comportement des microorganismes des grains,
l'anoxie est sans aucun doute
1
la
cause
principale
de
la
régression
de
la
viabilité
des
propagules
1
fongiques.
Contrairement aux résultats de l'évolution apparente de ces espèces
1
observées
lors
des
premiers
essais
(Cf.
111.1.1.),
les
levures
ne
se
développent pas lorsque l'anaérobiose est totale.
1
Quelle que soit leur a ,
les grains peuvent donc être conservés dans
w
1
de
meilleures
conditions
si
et
seulement
si
le
silo
est
parfaitement
étanche. Pour les grains très humides cependant (a
0,90), le développement
1
w
des Lactobacillus, non pathogènes et non toxiques, mais acidifiants, ne peut
être contrôlé ni en anaérobiose stricte ni sous atmosphère de COZ pur.
1
Dans
l'état
actuel
des
techniques
de
construction
des
silos
1
hermétiques,
il
n'existe
malheureusement
sans
doute
pas
de
structure
suffisamment étanche, et la recherche des niveaux limites d'O
permettant la
Z
1
croissance
des
moisissures
et
des
levures,
en
fonction
de
l'état
1
d'hydratation des grains,
est une étape indispensable si l'on veut préciser
les limites pratiques de ces procédés de conservation,
et les traduire pour
1
le technologue en termes de porosité des matériaux ou de niveaux de fuite
acceptables.
1
1
1
1
1
1

---

1
- 85 -
1
z. ROLE DES TRES FAIBLES QUANTITES D'OZ EXPERIMENTALES SUR L'EVOLUTION
MICROBIENNE
1
Z.I. RECHERCHE DES QUANTITES MINIMALES DIO
NECESSAIRES A LA
Z
1
CROISSANCE DES MICROMYCETES DES GRAINS, EN FONCTION DE
L'ACTIVITE DE L'EAU
1
Z.l.l. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Deux activités de l'eau
(a
0,95 et a
0,87) ont été retenues pour
w
w
1
cette partie de
notre étude.
La première caractérise des
grains récoltés
1
très
humides
et
susceptibles
de
supporter
la
croissance
de
bactéries
lactiques,
la seconde limite l'activité microbiologique à un développement
1
éventuel des levures et des moisissures.
Dans chacune des deux séries,
1Z
cellules entièrement remplies de grains correctement réhumidifiés sont mises
1
en
oeuvre.
Les
atmosphères
intergranulaires
y
sont
contrôlées
par
un
balayage
quotidien
de
quelques
minutes
balayage
qui
renouvelle
donc
1
l'amosphère
chaque
jour
et
permet
d'introduire
des
quantités
connues
1
d'oxygène.
La quantité minimale que la méthode de purge nous permet d'introduire
1
avec une
certaine fiabilité
es t de
5 pg d'Oz par gramme de
matière sèche
et par
Z4 heures.
Nous
négligeons
l'oxygène
consomme
par
l'écosystème,
1
pendant les 3 minutes de purge quotidienne.
1
Pour comparaison,
un essai
parallèle
est
conduit
avec
un
apport
quotidien d'oxygène du double,
soit 10 pg/gs.s./jour. Ces apports d'oxygène
sont
réalisés
au
moyen
d'un
mélangeur
OZ/COZ
qui
permet
au
mieux
une
1
proportion
dl oxygène
de
0,5
% dans le mélange
(Cf
Z. 9.
Matériels
et
1
Méthodes).
Un
mélange
à
1
% d'OZ dans
le
COZ
permet
d'obtenir
la
concentration correspondant
1
à 10 pg/d'OZ/gs.s./jour.
Ces
valeurs tiennent
compte
de
la
correction
imposée
par
la
présence
du
COZ
dont
l'effet
paramagnétique propre fausse la mesure de l'oxygène (Cf z.8.
Matériels et
1
Méthodes) .
1
1
1

---

1
- 86 -
1
Z.l.Z. RESULTATS
a - Evolution quantitative et qualitative
1
de la microflore
1
Les
figures
19 et
ZO montrent
l'influence de
l'a
et les faibles
w
teneurs en Oz sur 11évolution des bactéries et levures.
La présence de 5 et
10 pg d'OZ par gramme et par jour provoque une modification importante de la
1
dynamique microbienne qui dépend étroitement de l'a
des grains.
1
w
Une mul tiplica tion
importante
des
Lactobacillus
s'observe
sur
les
1
grains à ° 95 d'a
. par contre à 0,87, ces espèces régressent sensiblement.
,
w '
Ce comportement des Lactobacillus
s' explique par la réduction de l'a
qui
w
1
devient ici le facteur limitant.
A 0,95 d'a,
les levures se multiplient
w
activement
sur les grains.
Trois espèces
principales
ont été
isolées
et
1
identifiées
Cryptococcus hungaricus (Zsolt) Phaff et FeIl,
Candida sp.
1
d'une
part
(dénommées
"autres
levures"
sur
les
figures)
et
Hyphopichia
burtonii (BOrDIN et al.) Von Arx et Van der Walt d'autre part.
A 0,87 d'a,
w
les deux premières espèces,
qui sont à l'évidence des espèces hygrophiles,
1
ne sont plus capables
de se maintenir et seule Hyphopichia burtonii,
qui
1
manifeste
donc
une
tendance
à
la
xérotolérance,
se
multiplie
signifi-
cativement. Le taux de croissance de l'espèce est cependant plus important à
1
0,95 a
qu'à 0,87 a .
w
w
Avec
5 pg/g
comme
avec
10
pg/g d'OZ
introduits
chaque
Jour,
la
1
viabilité des spores fongiques régresse dès le début du stockage des grains
1
à 0,95 d'a.
Cependant, à 0,87 d'a, cette régression ne s'observe qu'après
w
w
80 jours (Figure ZIA).
La diminution du nombre des spores revivifiables est
1
d'autant plus
rapide
que
l'a
des grains est élevée,
mais ne
semble pas
w
modifiée par les quantités d'OZ étudiées.
1
La résistance des
spores dans ces conditions varie d'une
espèce à
1
l'autre
le
nombre
de
spores
viables
d' Eurotium
amstelodami
et
de
Penicillium
cyclopium
diminue
dès
le
début
des
essais,
tandis
que
la
1
1
1

---

- 87 -
Germes/g
Figure 19: évolution des levures et bactéries sur les grains de riz
paddy conservés à 0,95 d'a
et en présence de faibles
quantités d'OZ (---) 5 wg ~IOZ/g ss/j
(--) la wg d'OZ/g ss/j
Germes/g
10'
6
la
)
la
1a
Figure 20: effet des traces d'OZ sur l'évolution des bactéries et
levures sur riz paddy conservé à 0,87 d'~
(---) 5 Wg d'OZ/g ss/j
(---) 10 Wg d'OZ/g ss/j

---

-
88 -
Spores/g
A
3
10
2
10
\\
\\
80
ERGOSTEROL ~g/gss
10
8
B
2
Figure 21
Evolution des moisissures (A),
de la teneur en
ergostérol (B)
des grains stockés sous des faibles
teneurs en 02
(à 0,95 et 0,87 d'aJ
(+)
5 ug d'02 /3/j/C0 2 (6) 10)Jg/g/j + CO2

---

1
- 89 -
1
viabilité des
spores fongiques
d'Aspergillus candidus ne régresse qu'après
JO et 50 jours respectivement à 5 et 10 pg d'OZ par gramme et à 0,95 d'a
1
w.
Dans tous les cas,
aucune espèce ne se maintient au delà de 140 jours pour
1
les grains a 0,87 d'a
et de 107 jours pour les grains à 0,95 d'a.
w
w
1
b - Croissance pondérale estimée par la teneur
en ergostérol des grains
1
Contrairement
à ce
qui
a
été obtenu
en anaérobiose
stricte,
une
légère
augmentation
de
la
teneur
en
ergostérol
des
grains
est
observée
1
lorsque
de
faibles
quantités
d'O
sont
fournies
à
l'écosystème
COmme
Z
l'indique la figure
ZlB.
Elle
semble légèrement
plus
prononcée en début
1
d'essai sur les grains à 0,95 d'a
recevant 10 pg d'OZ par gramme/jour. Sans
w
doute corrélée avec la croissance des levures,
la teneur en ergostérol des
1
grains dans les deux séries indiquerait une croissance pondérale très faible
1
des populations
et ne
reflète rai t donc
pas le développement que
suggèrent
les courbes de sporulation,
notamment pour Hyphopichia burtonii à 0,87 a .
w
1
6,
Pourtant,
à des niveaux de 5.10
107 spores par gramme,
le développement
1
des levures devient visible à
l'oeil
nu,
ce
qui ne
préjuge en
rien de
l'altération biochimique ou technologique des grains.
1
1
c - Teneur en acides gras libres des grains
et activité lipasique
1
La figure 2Z montre l'évolution de l'acidité "grasse" en fonction des
faibles teneurs en Oz et de l'a
des grains.
A 0,87 d'a,
l'acidité reste
1
w
w
stable pendant toute la durée des essais,
quelle que soit la quantité d'OZ
1
étudiée et malgré le développement d' H.
burtonii.
Par contre,
elle est
multipliée par 9 sur les grains à 0,95 d'a
alors qu'en anaérobiose stricte,
w
cette acidification ne fait que quadrupler.
1
1
1
1

---

- 90 -
1
1
1
1
0.35
/.'6
l '
1
, /
l '
0.3
. /
1·
/ /
1
.
/
0.25
/
/
a w O.9 5
/ /
1
.
1
.
/
0.2
1
.
.
/
1
.
•. 1
1
1
.
0.15
.
/
l
,/
.
/ '
1
.
. /
0.1
1
.·t/"·
/ '
/:f~'
0.05
1
o
.==-~-===..
'J>:---~-.....,l,.~----:01~-~--:Jl.~
1
JOURS
1
1
Figure 22
Evolution de l'acidité des grains stockés
sous atmosphères contrôlées et à 0,95 et
1
0,87 d'a.
w
1
1
1
1
1
1
1

---

1
- 91 -
1
Le tableau 8 montre,
dans les memes conditions expérimentales,
une
stabilité de l'activité lipasique et donc
la teneur réelle en acides gras
1
libres des grains. Ceci permet de penser que l'acididité élevée des grains à
0,95 d'a
n'est
qu'une
acidité
organique
et
due
aux
Lactobacillus,
et
1
w
surtout
aux
"autres
levures"
qui
certainement,
ont
des
activités
1
fermentaires acidifiantes dans ces conditions.
1
Durée (jour) \\ Activité lipasique (p mole de C
de s.s.
18:1/g
1
IEssai
par 72 heures
1
1quantité
1-----------------------------------------------
1
1 d 1 0
(ug/g/j )
2
1
TO
1
5
1
50
1-------------------1---------------1---------------\\---------------
1
1
1
1
1
1
5
1
28,7
1
33,7
1
22,5
1
1
1
1
1
1
10
1
28,7
1
33,9
1
22,8
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 8
Activité lipasique mesurée sur les grains à 0,95 d'aw
au cours de la première phase de conservation
1
1
1
1
1
1
1
1
1

---

1
- 9Z -
1
Z.1.3. CONCLUSION
1
Il
est
généralement
admis
que
les
pressions
partielles
d'O Z
1
inférieures
à
1
% dans l'atmosphère intergranulaire suffisent pour la
stabilisation microbiologique
des
grains
conservés à
des acti vi tés
d'eau
1
inférieures a 0,90 (WILSON,
1975;
BANKS,
1981;
RICHARD-MOLARD,
1982;
WILLS et al., 1983). Les résultats de ces essais réalisés avec des quantités
1
précises et extrêmement faibles
d'OZ
(5
et 10 pg/gs.s.jjour),
et
sur des
grains à 0,95 et 0,87 d'a
font ressortir les conclusions suivantes
w
1
-
A une
meme
a
(0,95),
la
régression
du
nombre
de
spores
fongiques
w
revivifiables est plus rapide
en presence de faibles
quantités d'O
qu'en
2
1
anaérobiose stricte.
Pour une même durée de conservation,
107 jours,
les
moisissures ne
sont pas
dénombrables
en fin d'essai dans
le premier cas,
1
4
tandis
qu 1 en anaérobiose,
le nombre de
conidies viables
est de
10
par
1
gramme,
ce qui montre l'importance de l'action combinée de 1'0
et de l'a
2
w
sur la destruction des
spores.
A 0,87 a
des grains,
et dans
les mêmes
w
1
conditions atmosphériques,
la réduction
du
nombre
de
spores
viables
ne
s'observe qu'après 3 mois de stockage environ
1
- Cryptococcus hungaricus et Candida sp. se multiplient activement seulement
1
sur les grains conservés à 0,95 d'a. La réduction de l'a
des grains à 0,87
w
w
devient le facteur limitant pour la croissance de ces espèces.
Hyphopichia
1
burtonii est la
seule
espèce
qui
se
développe
aux a
intermédiaires.
La
w
moindre trace d'OZ dans l'espace intergranulaire paraît lui suffire.
1
Ceci confirme le caractère aérobie
strict de
ces levures que
nous
1
désignerons dorénavant par l'appellation "levures de stockage" en raison des
1
conditions écophysiologiques très particulières qui permettent leur essor.
1
1
1
1

---

1
- 93 -
1
Les
quantités
très
faibles
d'oxygène introduites
sont
tout
à fait
limitantes pour les moisissures mais n'empêchent pas le développement de ces
1
levures
de
stockage.
Ces
conditions
ne
permettent
cependant
pas
une
production de biomasse importante sur les grains.
1
Dans ces conditions,
les moisissures sont meme incapables d'assurer
1
leur survie
et
il reste à déterminer la quantité d'OZ nécessaire
pour la
1
croissance de ces espèces dégradantes et éventuellement toxinogènes.
1
Z.Z. INFLUENCE DE QUANTITES D'OZ CROISSANTES SUR L'EVOLUTION DES
MICROMYCETES DES GRAINS ET SUR LA MYCOTOXINOGENESE
1
Z.Z.l. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Les
grains
de
riz
de
la
récolte 1985,
moins
contaminés
par les
1
espèces de stockage sont utilisés dans ces essais de stockage expérimental,
1
apres réhumidification et équilibrage à une a
de 0,90 soit 19,5 %(s.h.).
w
Les grains sont à l'origine ensemencés avec des conidies d'une souche
1
d'Aspergillus flavus
toxinogène,
âgées de 7 Jours et cultivées sur du riz
stérilisé.
1
Pour cela,
10 grains moisis sont agités
5 minutes dans une fiole
stérilisée contenant 100 ml d'eau physiologique et en présence de 50 billes
1
de verre stérilisées de 3 mm de
diamètre.
La suspension est filtrée puis
1
homogénéisée avec un Pot ter .
Après une
série de
dilutions successives
au
1/100ème dans de l'eau physiologique, le nombre de spores de chaque dilution
1
6
est déterminé à l'aide du compteur Coulter,
et la dilution renfermant 1.10
1
spores/ml est retenue pour la réhumidification des grains.
La
réhydratation
des
grains
étant
réalisée
par
lot
de
6,z
kg,
1
correspondant à la capacité d'une cellule, le nombre de propagules fongiques
rapportées par gramme de
matière sèche est de 8.10 3 .
Selon SHARMA et al.
1
(1980),
des niveaux de contamination plus élevés, à l'origine, risqueraient
d'atténuer l'aptitude à la toxinogénèse.
1
1
1

---

1
- 94 -
1
Les cellules sont remplies de grains ainsi contaminés puis placées à
Z5
+
lOC
pendant
toute
la
durée
des
essais.
Elles
sont
fermées
1
hermétiquement
et
des
quantités
connues
d'oxygène
sont
quotidiennement
1
introduites,
suivant la procédure décrite précédemment.
Cinq cellules sont
affectées à l'étude de chaque niveau d'oxygénation,
l'oxygène étant dilué
1
cette
fois-ci
dans
l' N
Cinq
prélèvements
sont
effectués
au
cours
de
Z.
l'expérience par ouverture d'une cellule à chaque fois.
1
Quatre
niveaux
d'oxygénation
croissants
sont
étudiés,
avec
des
quantités d'oxygène introduites journellement de 5,
10,
35 et 60 pg/g de
1
grain.
1
Suivant le niveau de développement des populations microbiennes,
ces
quantités peuvent n'être que partiellement consommées en Z4 heures,
et une
1
mesure
de
l'oxygène
résiduel
est
réalisée
avant
chaque
nouvelle
introduction.
Par différence,
et en négligeant l'effet des 1 à 3 % de COZ
1
générés dans le système, nous connaissons les quantités d'oxygène exactement
1
consommées.
1
• Justification du protocole expérimental
Le choix des
grains
très
faiblement
contaminés
par les
espèces
de
1
stockage
est
fondamental
pour
ce
qui
concerne
l'étude
du
comportement
1
évolutif de
ces espèces
en fonction de la quantité d'OZ disponible,
mais
aussi favorable à un développement de la souche toxinogène.
1
Les Lactobacillus tolèrent les fortes concentrations de COZ comme il
a été démontré
ci-dessus,
mais ce gaz pourrait avoir une action
sur le
1
comportement des micromycètes (Cf 3.1.
Travaux Antérieurs).
Ainsi,
pour
1
l'étude de l'effet propre de quantités variables d'OZ'
il est nécessaire de
supprimer le COZ dans la composition des mélanges gazeux expérimentés mais
1
aussi
d'évacuer
journellement
la
part
produite
par
l'écosystème
dans
l'atmosphère intergranulaire par balayage.
1
1
1

---

- 95 -
L'activité
de
l'eau
des
grains
retenue
(0,90)
correspond
non
seulement à l'a
limite pour la croissance des Lactobacillus (RICHARD-MOLARD
w
et al.,
1984) mais
aussi à l'a
optimale
pour la croissance de
beaucoup
w
d'espèces xérotolérantes.
Cette a
est de ce fait favorable pour l'étude de
w
la sensibilité de ces espèces à différentes quantités d'OZ.
1
z.z.z. RESULTATS ET DISCUSSION
1
a - Relations entre les quantités d'OZ injectées et
le COZ mesuré
1
L'évolution de la production du COZ dans l'atmosphère intergranulaire
en fonction des quantités d'OZ disponibles est illustrée par la figure Z3.
1
La teneur
en
eau des grains
reste voisine de
ZO % (s. h.)
pendant
1
toute la durée des
essais.
Les
quanti tés moyennes de
dioxide de
carbone
produites,
exprimées
en pg/g s , s./ jour,
restent
stables
pendant toute la
durée de stockage,
pour les faibles quantités d'OZ fournies à l'écosystème.
1
Elles
sont de 48,
5Z et 64 ug pour des
quanti tés d'OZ
injectées corres-
1
pondant respectivement à 5,
10,
et 35 pg/gs.s./jour. Elles font apparaître
un
excédent de
COZ
(40
pg/gs.s./jour)
dont
il convient
de
voir
s'il se
1
corrèle avec des activités fermentaires microbiennes.
1
Par
contre,
un
apport
de
60
pg
d'OZ
est
suffisant
pour
que
la
1
quantité de COZ produite augmente significativement au cours des essais : de
80 pg/gs.s./jour de COZ produit en début d'essai,
elle passe par exemple à
1
137 après 60 jours de conservation.
Là aussi, un excédent de COZ de l'ordre
de 40 pg/gs.s./jour est observé
dès le début des essais,
et la quantité de
1
COz produite augmente chaque jour jusqu'à la fin des essais.
1
1
1
1

---

- 96 -
CO 2 produit
pg/gs.s / jour
140
.8·---A----O
"" "
120
"
ft'
,,
,,
,,
,
,P
,
100
,,
"
"
.."
80
ca fi "
"
* *
60
"* ~ J'.( .x--.H.........-._._.
'*
- . - . _ .
. . . I o - - L - - -.!-,..
*
..A-
..A..
.u.....-.v-.---.;..._
•
*
8
·--------~---~----.---~-f--~--~----~-----~----~------~
• - . -v-.t-- -_ . - . - ' . _ . _ . L- ~_.----A
40
•
20
20
40
60
80
100
JOURS
Figure 23
Variation de la production de CO
dans l'écosystème
2
en fonction de la quantité d'02 disponible.
ct) 5 ug d'O/g/jour
(6)
10 ug d'02/g/jour
C~)35 ug d'02/g/jour
Ce) 60 ug d'O/g/jour

---

1
- 97 -
1
b - Evolution micro biologique
1
L'évolution des
Lactobacillus à cette a
limite des
grains
(0,90)
w
paraît fonction de la quantité d'OZ disponible
comme le
montre
la figure
1
Z4A.
Un
développement
lent
de
ces
bactéries
s'observe
sous
5
et
10
pg/gs.s./jour d'OZ.
Par contre sous 60, les Lactobacillus sont complètement
1
inhibées.
Il
est
peu
probable
que
le
facteur
influant
soit
ici
1'0Z
1
disponible. On pensera plutôt à des effets indirects de compétition avec des
populations (moisissures) qui elles, sont favorisées par l'OZ.
1
Les autres
levures
(Figure Z4A),
Cryptococcus hungaricus et Candida
sp.
régressent sensiblement en début d'essai pour les quantités d'OZ de 5,
1
10 et 35 pg/gramme,
puis montrent à partir du ZOème jour un développement
1
progressif
jusqu'en
fin
d'essai.
Sous
60
pg
d'OZ/gramme,
ces
espèces
régressent
puis
disparaissent
au
profit des
moisissures
ou
d' Hyphopichia
1
burtonii par exemple.
Pour ce qUl concerne les "levures de stockage", notamment H. burtonii,
1
la figure
Z4B
montre
qu'avec
5 et
10
pg
d'OZ
par
gramme,
le
taux de
croissance de
l'espèce reste
important pendant
toute la durée des
essais.
1
Avec 35 et 60 pg d'OZ par gramme,
la croissance de l'espèce est plus rapide
1
dès le début des essais,
ce qui laisse apparaître que l'espèce est sensible
à la quantité d'OZ disponible bien que la souche présente les deux types de
1
métabolisme,
fermentaire et/ou respiratoire.
En présence de 5,
10 et 35 pg
d'OZ/gramme et par jour,
la viabilité des espèces hygrophiles,
Alternaria,
1
Epicoccum,
Cladosporium,
et
des
espèces
xérotolérantes,
Aspergillus
1
candidus, A. flavus et Penicillium spp. diminue et s'annule dès le début des
essais (Figure
Z5A).
La perte de viabilité des propagules fongiques est
1
d'autant plus rapide que
la quantité d'OZ disponible est plus faible.
Ces
quantités d'OZ fournies à l'écosystème sont sans aucun doute inférieures au
1
minimum d'OZ
nécessaire
pour
initier la
croissance,
surtout
en
présence
1
d'une population de levure de stockage importante.
1
1

---

1
- 98 -
1
Germes/g
1
l_L"\\"[J r L ')
1
.-------
1
1
A
1
Figure 24 :
l.n ct o b a r it l n-,
Evolution des levures
1
_ _ _ _ _ _ L
51Jgd,02
~/
(C. hungaricus et Candida
'-__________
.. 35 /,gd,02
sp) et des Lactobacillus
1
lcf,
//.~
l
.. ,~
sur les grains conserves
à 0,90 d'a
en fonction
w
ol
/
~.
1
10-!-L.-,~.
de la teneur en oxygène.
. 6 0 IJgd,02
o
20
40
60
80
100
JOURS
1
H YPHOPICHIA
BURTON"
A
autres levures et
Lactobacillus
1
Germes/g
B
Hyphopichia burtonii
ld
1
L. 51'9
d,02
. - . - - . . . . . . . . GO fgd,02
• 101'9 d,02
6
---:....
10
1
3 5 f g
d,02
(*) 35
5
.;<
~g/d'02/g/j
----Cl'
1
10
(t) 10 pg/d'02/g/ j
•;
,
(.6)
5 pg/d'O/g/j
1
4
10
B
1
1/)
J
10
1
l 'Î
ili
;y" ..c
2
" '
10 00---;;;;----::;";:;----;f;::--~:'_::_--....L-
20
40
60
80
100
1
JOURS
1
1

---

1
-
99 -
Spores/g
G
10
1
e
_
•
O
Cl
1
1
1
A
1
2
10
1
1
10
1
1
10
30
50
60
JOURS
1
Spores/g
6
10
1
0 -
5
.><.
o
10
.>: /18-----.
0
1
•
Q
6 _ 6 _ 6
-.-----6
_____
4
1
10
B
1
1
1
10 ~-__:_:__-__:::l:::__-..l...---J.....-......--...,J"._
o
10
20
30
40
50
60
1
JOURS
Figure 25 : Evolution des moisissures xérotolérantes en fonction des
1
quantités d'02 disponible.
A
(0)
60lJgd'02
(~) 35 lJgd'02
(6)
IOlJg d'02
( A.)
5 ug d' 02
1
B
(e) Aspergillus candidus
(m)
Penicilliwn epp .
( 6) Aspergi llus flavus
1
1

---

-
100 -
L'introduction de 60 pg d'OZ/gramme dans les memes conditions stimule
au
contraire la
conidiogénèse des
espèces xérotolérantes
appartenant aux
genres Aspergillus et Penicillium.
En présence de telles quantités d'OZ' le
nombre
de
spores
viables
augmente
rapidement
avec
un
coefficient
de
multiplication de près de 1000 pour A. candidus et Penicillium spp. après 60
jours (Figure Z5B).
A.
flavus par contre,
introduit ici comme contaminant
artificiel,
sporule difficilement,
avec un coefficient mul tiplica teur de
moins de ZO.
c - Corrélation entre teneur en ergostérol des grains
et quantités d'OZ disponibles
L'évolution
de
la
teneur en
ergostérol des
grains
en
fonction de
quantités croissantes d'OZ est représentée par la figure z6.
Les teneurs en ergostérol des grains en fin d'essai sont de 4,5 ; 5
et 7 pg/g respectivement à 5,
10 et 35 pg d'OZ par gramme,
alors que la
valeur initiale en début d'essai
est de 4 pg/g.
Ces valeurs
restent ici
encore
peu
différentes
mais
montrent
néanmoins
en
fin
d'essai
une
augmentation
sensible
de
la
biomasse
fongique
qui
peut
sans
doute
correspondre à la croissance d'Ho burtonii.
Par contre,
avec 60 pg d'Oz/g/jour,
une augmentation plus rapide de
la teneur en ergostérol des grains est observée et le palier de 7 pg/g est
atteint dès le
Sème jour
de
conservation.
Cette augmentation
peut
être
rapprochée de la croissance plus rapide d'Ho
burtonii dans ces conditions
ainsi que de celle des moisissures xérotolérantes montrée par la figure
Z5.
Il paraît clair que
cette quantité d'OZ permet d'initier un développement
significatif
des
moisissures,
mais
n'est
que
tout
juste
suffisante
à
entretenir les populations formées à un niveau constant après une croissance
exponentielle.
Cette phase est d'autant
plus importante
et rapide
que la
quantité d'OZ disponible est plus élevée.

---

- 101 -
d - Evolution de l'acidité grasse et de l'activité lipasique
Pour les grains conservés à 0,90 d'a
et en présence de 5,
10 et 35
w
pg d'OZ/g, l'acidité des grains reste stable (Tableau
9), ce qui montre que
l'activité des Lactobacillus est négligeable à cette hydratation.
Cependant,
l'acidité (Tableau 9
et l'activité lipasique (Tableau
10) augmentent respectivement de 5 et 40 %en présence de 60 pg d'Oz/go
Les
très
faibles
évolutions
de
l'acidité
observée
sous
5,
10
et
35
pg
d' 0Z/g/ jour
en
parallèle
avec
l'augmentation
du
nombre
de
germes
revivifiables d'Ho
burtonii permettent de
rapporter cette augmentation de
l'activité lipasique à la croissance des moisissures,
plutôt qu'à une forte
activité lipolytique de la levure.
e - Teneur en aflatoxine BI des grains
Aucune trace d'aflatoxine BI n'est mesurable
sur les grains
quelle
que soit la quantité d'O
étudiée.
L'inhibition complète de la biosynthèse
Z
d'aflatoxine BI meme à 60 pg d'OZ qui permet le développement de la souche
toxinogène CA.
flavus) ne peut s'expliquer que par la restriction de l'OZ
d'une part, et d'autre part, la contamination artificielle des grains par A.
flavus rend l'espèce peu compétitive dans l'écosystème.
Z.Z.3. DISCUSSION
L'étude
de
quantités
croissantes
d'O
sur
l'évolution
de
la
Z
croissance fongique estimée par la
sporulation et la teneur
en ergostérol
des grains,
de
l'activité
lipasique
déterminée d'une part
par l'acidité
grasse et d'autre
part
par la mesure de
l' activité lipasique,
et
de
la
production du
COZ
montre
que
la quantité d'OZ
qui répond
à
une activité
métabolique mesurable est de 60 pg/g et par jour. Au dessous de cette valeur

---

-
102 -
1
Quantités
1
Durée des essais (jours)
1
dia
1-----------------------------------------------------1
2
disponibles
1
a
1
la
1
22
1
38
1
49
1
90
1
IllYgs •s . jj our 1
1
1
1
1
1
1
1--------------1--------1--------1--------1--------1--------1--------1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
5
1 0,028
1 0,027
1 0,030
1 0,028
1 0,030
1 0,029
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
10
1 0,028
1 0,030
1 0,030
1 0,029
1 0,031
1 0,029
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
10
1
24
1
38
1
80
1 100
1
1--------1--------1--------1--------1--------1--------1
1
1
1
1
1
1
1
35
1
0,027
1
0,029
1
0,030
1
0,028
1
0,031
1
0,030
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
5
1
15
1
28
1
36
1
48
1
62
1
1--------1--------1--------1--------1--------1--------1--------1
1
1
1
1
1
1
1
1
60
1 0,028
1 0,030
1 0,034
1 0,035
1 0,036
1 0,035
1 0,034
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 9 : Evolution du taux d'acidité des grains conservés à 0,90 d'aw
(exprimé en gramme d'H
par 100 grammes de substance sèche)
2S04
en fonction de la quantité d'02 disponible dans l'atmosphère
intergranulaire.

---

- 103 -
1
Quantités
1
Durée des essais (jours)
1
diO
\\-------------------------------------------------------1
2
disponibles
1
0
1
5
1 15
1 28
1 36
1 48
1 62
1
1
pgjgj j
1
1
1
1
1
1
1
1
1--------------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
60
1 33
1
1 40
1
1 46
1
1 47
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 10
:
Activité
lipasique (exprimée
en micromoles
de
C
l/g
18
s.s./72 h) des grains stockés à 0,90 d'a
et avec 60 ug d I0
w
2/g/j
Ergosterol JJg/g s.s
10
8
2
O~--.L...---..J....---...L---....L-----L-­
o
20
40
60
80
100
JOURS
Figure 26
Teneur en ergostérol des gralns conservés à 0,90
et en présence de différentes quantités d'a 2
(19) 60 )Jg d'a
(*)
35 )Jg d'a
2
2
(6)
5 )Jg d'a
(.)
la )Jg d'a
2
2

---

- 104 -
critique, l'OZ devient le facteur limitant tant pour la sporulation que pour
la
production
de
biomasse
et
par
conséquent
celle
de
mycotoxines
(en
particulier l'aflatoxine B1).
Dans tous
les
cas,
la teneur en
ergostérol des grains
mesurée au
cours des
essais et qu i. varu e de
4 à 7 pg/g rentre dans
les
fourchettes
correspondant aux valeurs limites acceptables qUl sont de 3 à 7 pg/g pour le
blé et l'orge conservés
à l'air libre (CAHAGNIER et al.,
1984).
Il faut
cependant préciser que ces valeurs limites peuvent avoir des significations
différentes
sur
le
plan
qualité
des
grains,
selon
notamment
que
la
conservation se fait en atmosphère libre ou sous atmosphères contrôlées.
Aux faibles quantités d'OZ: 5, 10, 35 pg/gs.s./jour, pour lesquelles
l'activité
métabolique
des
moisissures
est
indécelable,
la
production
journalière de
COZ est
constante et montre un excédent de près de 40 pg/g
s.s./jour, par rapport à ce que peuvent produire les activités respiratoires
dans l'écosystème.
Cet excès de COZ ne peut donc s'expliquer que par des
mécanismes fermentatifs d'origine microbienne ou réalisés par les grains de
riz eux-mêmes
qUl produiraient alors environ 1 ppm de COZ par jour et par
gramme.
En effet,
la fermentation se produisant dans les grains de riz est
d'autant plus élevée que la pression partielle de l'OZ est faible (TAYLOR,
194Z).
Une telle fermentation intracellulaire du riz paddy conservé sous NZ
a déjà été
aussi
rapportée
par
SHEJBAL et
De BOISLAHBERT
(198z).
Cette
explication est
d'autant plus
probable
que
Candida
sp.
et
Cryptococcus
hungaricus,
espèces dominantes,
ne sont pas reconnues comme fermentatives.
Seule H. burtonii est fermentative. Or, son activité fermentaire estimée par
la production du
COZ n'augmente pas
avec la multiplication importante de
l'espèce au cours des expériences.

---

- 105 -
Avec 60 ~g d'Oz/gs.s/jour,
les quantités de COZ produites par Jour
augmentent dans
le
temps
jusqu'en fin d'essai ou on observe
un
début de
stabilisation.
Dans ce cas aussi,
apparaît un excédent de 40 ~g/g dès le
début des
essais,
excédent
qui augmente au
cours du temps.
Cette forte
production
de
COZ
ne
peut
évidemment
pas
s'expliquer
par
l'activité
respiratoire des aérobies (moisissures, levures, grains) puisque l'OZ est le
facteur limitant. Là encore, la fermentation intracellulaire des grains doit
être évoquée,
et on se poserait donc la question du rôle de l'OZ
dans les
processus fermentaires.
Cependant, le développement rapide et important d'Ho burtonii à 60 ~g
d'Oz qui se fait parallèlement à cette surproduction du COZ pourrait de même
signifier
que
l'activité
fermentaire
de
l'espèce
est
stimulée
par
ces
nivea~x d'oxygénation dès le début des essais.
Les différents comportements des moisissures et levures
observés en
fonction de
la disponibilité
de
l'OZ
sont donc
difficiles
à
interpréter
compte-tenu de
la complexité des populations
en
compétition
vis-à-vis de
l'oxygène et plus particulièrement entre H. burtonii et les moisissures. Ces
levures,
se contentant facilement de faibles quantités d'OZ présentes dans
l'atmosphère intergranulaire,
peuvent gêner directement ou indirectement la
croissance des
moisissures.
Aux quanti tés d'OZ
supérieures,
notamment à
partir de 60 pg/g, l'effet limitant se manifeste moins et la sporulation des
espèces
xérotolérantes
augmente
parallèlement
à
la
sporulation
d'Ho
burtonii, les autres "levures de stockage" n'étant pas compétitives dans ces
conditions régressent. Cependant, cette quantité d'OZ reste encore limitante
vis-à-vis de la croissance mycélienne.

---

-
106 -
3. EFFET DU COZ SUR LE COMPORTEMENT DES ESPECES XEROTOLERANTES
DU RIZ PADDY CONSERVE A 0,87 D'AW
Les
essais
conduits
jusqu'ici
et
les
résultats
obtenus,
pour
originaux qu'ils soient, suffisent à tracer les limites microbiologiques des
procédés de conservation des grains humides sous atmosphères contrôlées.
Ils ne permettent cependant pas de définir avec précision le rôle que
peut
jouer le
COZ dans
le comportement des micromycètes
filamenteux.
La
question reste donc posée de savoir dans quelle mesure le COZ peut exercer
un effet stabilisant sur ces micromycètes,
éventuellement toxinogènes.
Un
tel
effet
inhibiteur
pourrait
permettre
de
compenser
des
pressions
partielles d'OZ trop élevées,
generees dans un silo réel par des porosités
ou des fuites toujours existantes.
Dans cette optique,
nous avons réalisé deux séries d'essais avec une
meme quantité d'OZ supérieure à la quantité critique définie dans les essais
précédents, et complémentée d'une part par un mélange COZ/N
et d'autre part
Z
par de l'N Z.
3.1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Les
essais de
conservation sont effectués
avec des lots de
grains
fortement contaminés,
de la récolte 1984.
De la meme manière que dans les
essais précédents, les grains sont réhumidifiés jusqu'à une teneur en eau de
17,8 % (s.h.),
soit 0,87 d'a,
PU1S
homogénéisés
et ensemencés avec une
w
souche toxinogène d'Aspergillus flavus.
Dix cellules remplies de gralns et placées à une température de
Z5 2
1°C sont
utilisées
pour
l'étude
des
effets
du
COZ.
Cinq
cellules
ne
reçoivent que de l'azote pur comme gaz de complément et servent de
témoin
dans ces expériences. Pour les cinq cellules restantes, le gaz de complément
est un mélange COZ/N
à 50 %de gaz carbonique. L'atmosphère intergranulaire
Z

---

- 107 -
est contrôlée,
puis réajustée chaque jour à un niveau de 10 %d'oxygène et,
dans les deux cas,
les quantités d'OZ disponible par gramme de graln et par
Z4 heures sont ainsi fixées à 80 pg.
En
effet,
le
seuil
d'oxygénation
permettant
la
croissance
des
moisissures xérotolérantes dans l'écosystème,
est de 60 pg/gs.s./jour (Cf
z.z.).
Dans le but de préciser l'action du COZ sur la croissance fongique,
nous avons utilisé une quantité d'O
supérieure à la quantité critique,
80
Z
pg
d'O/gs.s./jour.
Dans
ces
conditions
donc,
l'OZ
ne
doit
plus
être
considéré
comme
un
facteur
limitant
absolu
pour
la
croissance
des
moisissures.
Une série de
cellules remplies des memes
grains
mais
conservées a
l'air libre sert de référence générale dans ces essais.
3.Z. RESULTATS
3.Z.1. VARIATION DE LA CONSO~n-IATION DE L'OZ PAR L'ECOSYSTEHE
EN FONCTION DE LA NATURE DU GAZ COHPLEHENT
Le tableau 11 montre que la vitesse d'utilisation de l'OZ par l'écosystème
est très dépendante de la nature du gaz complément, azote ou gaz carbonique.
Les 80 pg par gramme d'OZ fournis à l'écosystème par jour et dilués
dans l'N
sont totalement consommés à partir du ZOème jour de stockage.
Par
Z
contre,
la
consommation n'est
que
progressive
en
présence du
COZ et ne
dépasse pas un maximum de 40 pg/g/jour,
ce qui ne représente que la moitié
de la quantité d'OZ disponible.
Après 30 jours d'essai,
la consommation
diminue même légèrement sous COZ/N Z'

---

- 108 -
1
1
Quantité moyenne d'OZ consommé par jour (pg/g)
1
1--------------------------------------------------------------1
1
1
1
1
5
1 15
1 ZO
1 30
1 40
1 50
1 60
1
1----------1-------1-------1-------1-------1-------1------1-------1-------1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 CO/N
1 1Z
1 zs
1 35
1 40
1 39
1 37
1 38
1
1
Z
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 N pur
1 30
1 54
1 60
1 80
1 80
1 80
1 80
1 80
1
Z
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Tableau 11
Quantité moyenne d'OZ consommée par Jour en fonction de la
nature du complément (N
pur ou NZ/CO
Z
Z)
3.Z.Z. EVOLUTION DE LA SPOROGENESE
Pour
une
même
quanti té
d' Oz introduite,
soi t
80
pg par
gramme,
la présence de
50 % de COZ'
soit 500 pg par gramme suffit pour
inhiber fortement la sporulation des espèces xérotolérantes,
contrairement
au mélange OZ/N
pur (considéré comme témoin) qui n'empêche pas la formation
Z
des spores (Figure Z7A). Le nombre total de spores par gramme de grain passe
de 105 à 7.10 5 et Z.10 7 (g/g) respectivement. Dans tous les cas, les espèces
dominantes sont Aspergillus candidus,
A.
flavus, Penicillium cyclopium, P.
granulatum, P. chrysogenum et Eurotium amstelodami.
Nous utilisons ce terme lmpropre puisque nous parlons en fait du nombre de
propagules. Nous le faisons cependant parce que les germes dénombrés sont
essentiellement des spores et conidies.

---

- 109 -
Hyphopichia burtonii est la seule levure qui se développe de manière
importante
sous
le mélange gazeux renfermant une
forte
proportion de
COZ
(Figure Z7B),
alors que la sporulation des moisissures est considérablement
freinée dans ces conditions. Probablement masquée par les moisissures qui se
développent
sous
N
et
à
l'air
libre,
la
sporulation
de
l'espèce
est
Z
beaucoup
plus
importante
sous
COZ
oùle nombre
de
spores
fongiques
reste
pratiquement stable.
Le COZ semble donc avoir un effet
sélectif
sur les
espèces présentes.
En fait,
la vitesse de la conidiogénèse est la même en début d'essai
sous tous les mélanges gazeux étudiés.
L'effet du COZ s'exprime à partir du
10ème
Jour
de
stockage,
et
1'0
(dilué
dans
liN ) devient
le
facteur
Z
Z
limitant à partir du ZOème Jour.
Le taux de croissance plus élevé dans ce
dernier
cas
s'accompagne
d'une
consommation
plus
rapide
des
80
]lg
d'OZ
fournie par gramme et par Jour.
3.Z.3. CROISSANCE FONGIQUE PONDERALE
L'évolution de
la teneur en
ergostérol des
grains
en
fonction des
mélanges gazeux est illustrée par la figure Z8A.
La croissance
de
la
biomasse
fongique
estimée
par
la
teneur
en
ergostérol des grains est inhibée sous COZ et ne dépasse pas 7,5 ]lg/g en fin
d'essai, ce qui est à la limite du significatif. Par contre, au même moment,
cette teneur en ergostérol est de 18 pg/g sous azote et atteint 65 pg/g en
atmosphère libre, ce qui confirme tout à fait les résultats déjà discutés de
l'effet de ces gaz sur la sporogénèse.
Tandis qu'à l'air libre et sous COZ'
la conidiogénèse évolue parallèlement à la teneur en ergostérol des gralns,
une
dissociation
apparente
entre
les
cinétiques
de
sporulation
et
de
croissance pondérale s'observe sur les grains conservés sous OZ/NZ'

---

-
110 -
Spores/g
8
Moisissures xérotolérantes
10
---*
*
__ - - 8 - - - 8
6 . - - - - - 6 . - - 6 .
"t-----
A
/
(*)
Atmosphère libre
(e)
02(80 IJg/g) + N
10
2
(6.)
02(80 IJg/g) + CO / N
2
2
104L-_...l...-_---L._ _L-_...L.-_......L..._----L
_
o
10
20
30
40
50
60
JOURS
Germes/g
8
10
Hyphopichia burtonii
B
(6.)
02 (80 IJg/g)
+ CO/N 2
5
10
J ()lll~ S
Figure 27
Effet du CO
sur la sporogénèse des espèces
2
xérotolérantes.
A
moisissures
B
Hyphopichia burtonii

---

-
1 Il -
Ergosrcrol }Jgjg s.s
•
60
50
A
40
Figure 28 :
30
(A) Effet du CO
sur la
2
croissance
mycélienne
estimée par la teneur en
20
ergostérol des grains
.>: _e-----e (B) Evolution de l'activité
--
lipasique correspondante
10
_---e------
d i;:.;- ~~ ~- --6. . - -- -- 6. -_. - 6.
( .. ) atmosphère libre
• ..;y
(Gt) 02 (80 Wg/g)
+ N2
Q I---'--_...L.-
......L.-_L----l-.------I
(~) 02 (80 Wg/g) + CO2/N2
o
10
20
30
40
50
60
70
JOURS
Acr iviré lipasique
v-» Cf8: IjgS.Sj72h
90
..
..~ B
80
/
,.
60 _
~* /,/"//
./
»>:
•
» > :
"
,,'
"
*
,"
,,,"
40 k ,""
. " ,
. _ 6 . - - - - 6.
",.
. ..;..-- - 6. -
..- -
",
6. . - - . - - -
:: --
..
20
o
o
10
20
30
40
50
60
70
JOURS

---

-
112 -
3.Z.4. EVOLUTION DE L'ACTIVITE LIPASIQUE ET DE
L'ACIDITE GRASSE DES GRAINS
L'action
inhibitrice
du
gaz
carbonique
se
retrouve
au
niveau
de
l'activité
lipasique
mesurable
dans
les
grains
(activité
qui
dépend
essentiellement de la croissance fongique) comme le montre la figure 28 B. Par
rapport aux grains conservés en atmosphère libre,
on observe une réduction
relative de l'activité lipasique de ZZ %sous N et de 56 %sous COZ.
De la
Z
même manière,
le taux d'acidité est de 0,14;
0,05 et 0,OZ9 g H
s.s.
ZS04/g
respectivement (Figure Z9).
On
peut
donc
ici
confirmer
l'effet
inhibiteur
du
COZ
sur
la
croissance des moisissures lipolytiques,
et par contre observer que
sans
doute, ce gaz nia pas d'effet inhibiteur sur l'activité lipasique elle-même.
0,14
*
0.12
•
0,1
./
0.08
0,06
.---e
e-----------
---+:.::::.~-----~------.-.6-'_.-.6._'-L\\
0.02
JOURS
Figure 29 : Evolution de l'acidité grasse des graIns conservés
sous atmosphères contrôlées.
(:?l!:)
atmosphère libre
(g)
sa IJg d' O g + N
2/
2
(6) 80 ~g d'02/ g + CO 2/N 2

---

- 113 -
3.Z·5· TENEUR EN AFLATOXINE ~l DES GRAINS
Les grains conservés à l'air libre ne contiennent en fin d'essai que
Z)3 pg/kg d'aflatoxine.
Sous N
ils renferment 3 pg/kg)
tandis que sous
Z)
COZ)
la production d'aflatoxine El est complètement inhibée et aucune trace
n'est mesurable dans ces conditions expérimentales.
Cette très faible production d'aflatoxine El dans les deux premiers
cas s'explique
sans doute comme il a été déjà souligné,
par le fait
que
Aspergillus flavus artificiellement introduit dans l'écosystème)
se trouve
soumis à
la forte
compétition des
espèces préexistantes
et naturellement
implantées,
et qui se développent de manière dominante. Même si l'essai est
peu concluant,
on notera l'absence de toute trace de toxine sous atmosphère
de COZ'
absence qui se corrèle bien avec l'inhibition de la croissance et
confirme le rôle du COZ.
3.3. CONCLUSION
Pour
un
inoculum
initial
de
germes
par
gramme
et
pour
une
quanti té dl Oz de
80
microgrammes par
gramme et par
jour,
la croissance
fongique est très significa ti vement gênée par la présence de COZ en forte
proportion.
Dans les conditions de faible oxygénation étudiées,
une atmosphère à
50
% de COZ inhibe très fortement la conidiogénèse et la croissance
mycélienne des espèces fongiques ainsi que leur activité lipolytique.
Nous
pensons
que
ces
résultats
démontrent
l'action
inhibitrice
relative
du
COZ
sur
la
croissance
des
populations
fongiques
dans
ces
conditions non limites d'oxygénation (Cf 3.Z.Z.).
Ces conditions favorisent
cependant
la
croissance
d' Hyphopichia
burtonii
qui
peut
d'ailleurs
s'expliquer en partie par l'élimination des compétiteurs par le COZ
ceci
permet
de
penser
que
le
développement
de
l'espèce
n'est
pas

---

- 114 -
significativement influencé par ce gaz.
Dans le meme temps, les figures Z7B
et Z8A ne montrent pas de relation claire entre le nombre
de blastospores
formées par l'espèce et la teneur en ergostérol des grains.
Dans
les
memes
conditions,
en
absence
de
COZ'
on
observe
un
développement sans
équivoque des moisissures xérotolérantes,
sensiblement
inférieur cependant à ce qui s'observe en atmosphère libre.
La croissance
fongique limitée sous OZ/N
est bien sûr due à la restriction de l'OZ qui se
Z
manifeste surtout sur la sporulation à partir du ZOème
jour.
A partir de
cette
date,
la
quantité
d'OZ
disponible
par
Jour
(80
pg/g)
devient
inférieure à la demande en Oz des populations fongiques en développement, et
d'une certaine manière,
une
stabilisation microbiologique des
grains
est
obtenue.
Hyphopichia burtonii n'apparaît pas sur les grains conserves dans les
conditions ou une
croissance des moisissures est observée.
L'espèce n'est
donc plus
compéti ti ve
quand
l'atmosphère intergranulaire
est
favorable
à
l'activité des moisissures.
4. EVOLUTION DES CARACTERISTIQUES TECHNOLOGIQUES DES GRAINS DE RIZ PADDY
CONSERVES SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
4.1. CARACTERISTIQUES D'USINAGE
4.1.1. RENDEMENTS
Quels que soient le mélange gazeQx et l'a
des grains étudiés,
les
w
rendements
au
décorticage
et
à l'usinage
restent
remarquablement
stables
tout au long des essais
(Tableaux 1Z,
13 et 14).
Des résultats similaires
ont été obtenus par SYARIEF (1983) qui observe une stabilité des rendements
à l'usinage pour
les
grains de
riz
stockés à 0,85 a
et
sous atmosphère
w
confinée
il note
cependant une
forte diminution des rendements
lorsque
l'a
des gralns stockés en atmosphère libre est supérieure à 0,80.
w

---

-
115 -
Les résultats obtenus en fin d'essai sur les grains conservés à 0,95
d'a
et
en
présence
de
10
pg
d'OZ/g/jour
ne
semblent
pas
un
artefact
w
expérimental,
mais
sont
sans
doute dus aux
traitements
particuliers des
grains.
4.1.Z. TAUX DE BRISURES
Comme on pouvait s' y
attendre,
le taux de
brisures est grandement
affecté
par
le
conditionnement
des
grains
(tableaux
13
et
14).
L'aug-
mentation
des
taux
de
brisures
est
proportionnelle
à
la
quantité
d'eau
adsorbée par les grains lors de la réhumidification
de 13,4 %, il passe à
35 ;
41,6 et 70,6 %pour des a
finales des grains de 0,87
0,90 et 0,95.
w
Dans tous les
cas,
ces valeurs restent bien supérieures
à celles du riz
commercialisable qui
est de
10 % environ.
La
variété ou
le mélange
de
variétés,
et l'histoire des grains sont des facteurs qu'il faut également
prendre en compte, mais que nous ignorons pour les échantillons de grains de
0,95 et 0,87 d'a.
w
Pour les grains conservés à 0,95 d'a
et sous atmosphère confinée, le
w
taux de brisures est à 58 % inférieur au ni veau initial.
Dans
les memes
conditions mais
avec
5
et 10
pg d'OZ/gramme
complétés avec
du COZ'
il
diminue légèrement en fonction du temps (tableau 1Z).
Le taux de brisures reste relativement stable pour les grains à 0,90
et
0,87
d'a
et
n'est
donc
pas
sensible
aux
mélanges
gazeux
utilisés
w
(tableaux 13 et 14).
Il
est établi que le taux de
brisures augmente de
manière d'autant plus importante que l'a
des grains
est élevée,
tout au
v
moins
pour
ce
qui
concerne
les
grains
stockés
en
atmosphère
libre.
Cependant,
les
résultats
de
nos
essais
montrent
que
les
atmosphères
contrôlées peuvent
limiter les
variations du
taux de
brisures même aQX aw
élevées
des
grains.
Ceci
pourrait
s'expliquer
par
l'absence
d'activité
fongique.
Mais, malgré l'existence d'une sporulation importante des espèces

---

-
116 -
1
Qualité 1
Atmosphère confinée
techno- 1--------------------------------------------------
logique 1
Rendement au
1
Rendement à
1
Taux de
Durée
1
décorticage
1
l'usinage
1
brisure
(jours)
1
R.D (%)
1
R.U (%)
1
T.B (%)
----------------1----------------1----------------1----------------
Ta
1
84
1
63
1
71
-'>
84
1
1
66
1
39
107
1
84
1
66
1
41
1
1
1
1
1
1
COz pur
1
1--------------------------------------------------1
1
1
1
1
107
1
84
1
64
1
71
1
1
1
1
1
1
1
1
Oz (= 5 pg/g/j) + COZ
1
----------------1--------------------------------------------------
Ta
84
63
71
1
1
1
-'>
1
83
1
6z
1
71
15
1
84
1
63
1
74
30
1
84
1
66
1
6z
50
1
84
1
64
1
60
107
1
84
1
63
1
69
1
1
1
1
1
1
Oz (= 10 pg/g/j) + COz
1
1--------------------------------------------------1
1
1
1
1
5
1
84
1
63
1
75
1
15
1
84
1
63
1
66
1
30
1
85
1
65
1
6z
1
50
1
83
1
64
1
67
1
107
1
83
1
58
1
93
1
1
1
1
1
Tableau 1Z
Evolution du R.D, R.U et du T.B du riz paddy conservé à
0,95 d'a
en anaérobiose et en présence de 5 et 10 pg
d 'Ozlght'ur

---

-
117 -
1
Qualité
Rendement au
Rendement à
Taux de
1
Techno-
décorticage
l'usinage
brisure
1
logique
R.D (%)
R.U (%)
T.B (%)
1
1
1
Essais/Durée
1
1
1
(jours)
1
1
1---------------------\\---------------- ---------------- ----------------/
1
1
1
O
(=5 pg/g/j) + N
2
2 1
1
1
84
67
42
:
82
~8
1
68
42
1
38
1
85
67
36
1
50
1
83
67
35
1
95
1
83
66
35
1
1
1
O
(=10 pg/g/j)+ N
2
2 1
1
1
1
20
1
83
65
30
38
1
1
83
65
36
/
50
1
83
66
35
1
95
1
84
66
35
1
1
O
(=35 pg/g/j)+ N
1
2
2 1
1
1
24
1
1
83
66
37
38
1
1
84
67
33
1
80
1
82
67
31
1
100
/
84
66
33
1
1
1
O
(=60 pg/g/j)+ N
2
2 1
1
1
15
1
1
84
66
39
1
28
1
84
68
49
1
36
1
84
66
45
1
62
1
83
66
43
1
1
Tableau 13
Evolution du R.D, R.U et du T.B du riz paddy conservé
à 0,90 d'a
et en fonction des teneurs en O
w
2

---

-
liB -
1
Qualité
Rendement au
Rendement à
Taux de
1
techno-
décorticage
l'usinage
brisure
1
logique
R.D (%)
R. U (%)
T.B (%)
1
Essais
Durée (jours)
--------------------- ---------------- ---------------- ----------------
T
83
67
O
35
Oz (=5 pg/g/j ) + COZ
7
83
68
39
z8
83
68
41
48
83
68
4Z
77
84
66
51
10Z
85
69
38
140
83
69
40
Oz (=10 pg/g/j)+CO Z
7
85
68
38
z8
84
69
37
48
88
70
38
77
85
69
39
10Z
84
69
40
140
85
69
39
Oz (=80 )lg/g/j )
+ COZ + N
86
67
Z
43
86
67
40
0Z(=80 )lg/g/j)+ NZ
85
67
40
86
66
41
85
69
38
86
69
37
Tableau 14
Evolution du R.D, R.U et du T.B du riz paddy conservé
sous atmosphères contrôlées et à 0,87 d'aw

---

- 119 -
xérotolérantes (Aspergillus candidus, A. flavus, Penicillium sp. et Eurotium
amstelodami)
sur les grains
stockés
à
0,90 dia
et en
présence de
60 rg
w
d'OZ/g/jour,
l'évolution du taux de brisures est peu significative. Il faut
aussi
noter
que
la
croissance
de
ces
espèces
se
résume
à
une
simple
sporulation.
A l'a
maximale
étudiée
(0 95)
les
grains
usinés
prennent
une
w
'
,
coloration jaune à partir du 30ème Jour de stockage,
ce qui ne se produit
pas
aux
a
réduites.
Ceci
pourrait
se
traduire
par
une
adhésion
des
w
téguments sur la couche externe amylacée de l'endosperme à cette a
élevée.
w
4.2. CARACTERISTIQUES VISCOELASTIQUES
L'évolution des caractéristiques viscoélastiques
en fonction
de
la
composition
de
l'atmosphère
intergranulaire
et
de
l'a
des
grains
est
w
rapportée dans les tableaux
15, 16 et 17.
4.Z.1. GONFLEMENT
A 0,95 d'a,
le gonflement des grains est stabilisé sous atmosphère
w
confinée et sous COZ pur.
A la meme a
et avec des faibles teneurs en Oz (5
w
et 10 rg/g/j) accompagnés de COZ'
la capacité de rétention d'eau des gralns
(ou gonflement) augmente lors de la cuisson.
Elle est plus importante à 10
flg d'Ozlg/j
qu'à
5
pg
d'OZ
(tableau
15).
Il
est
cependant
difficile
d'expliquer
l'augmentation
du
gonflement
des
grains
par
la
présence
de
faibles quanti tés
dl Oz disponible
ou
par
l' excès de
COZ dans
le
mélange
gazeux.
La réduction de l'a
à 0,87 stabilise le gonflement pour un taux d'OZ
w
de 5 rg/g/j,
par contre,
à 10 ug, il augmente sensiblement pendant les 140
jours de stockage (tableau 16).
Les mêmes évolutions sont observées sur les
grains conservés à 0,90 d'a
et en présence de 5,
10,
35 et 60 ~g d'OZ/g/j
w
complétés cette fois ci avec de l'azote (tableau 17).

---

-
120 -
D'une manière générale,
ces essais montrent que la conservation du
riz
paddy
sous
des
mélanges
gazeux
"appauvris"
en
OZ'
permettant
un
développement
important
des
"levures
de
stockage",
est
favorable
à
l'augmentation du gonflement des grains quelle que
soit l'a
alors qu'il
w'
décroît quand l'a
des grains stockés en atmosphère libre augmente (SYARIEF,
w
1983).
Cette évolution ne dépend donc pas de la nature des gaz compléments
(COZ - N
Ceci rejoint les résultats obtenus par IWASAKI et TANI (1967),
Z)'
qui
montrent
que
les
atmosphères
de
COZ
n' ont
pas
d'influence
sur
les
caractéristiques technologiques du riz.
4.Z.Z. COMPRESSIBILITE
Aucune modification importante de
la compressibilité n'est observée
dans ces conditions hydro-atmosphériques de stockage
(Tableaux 15,
16 et
17).
Elle est de l'ordre de 75 %pour les grains aux trois a
étudiées. Les
w
différences observées ne semblent pas significatives.
4.Z.3. RECOUVRANCE ELASTIQUE
Sous COZ' la valeur de la recouvrance élastique reste très voisine de
celle du témoin qui est de 6,6 %.
Cependant, sous atmosphère confinée, elle
passe de
6,6 à 10,4 % en fin d'essai.
Contrairement à l'évolution de la
recouvrance élastique qui augmente avec l'a
des
grains de riz
conservés
w
sous atmosphère libre (LISCH et LAUNAY, 1975 ; SYARIEF, 1983), l'anaérobiose
semble stabiliser et même réduire la recouvrance élastique des grains à 0,95
d'a
(tableau 15).
w
La présence
de faible
teneur en
OZ'
soi t
5 pg/g/ j
entraîne
une
diminution de la recouvrance élastique jusqu'à une valeur minimale de 4,5 %
au 15ème jour de
stockage puis augmente à 8 %'
Elle continue cependant à
diminuer pour un niveau d'OZ de 10 yg/g/j et atteint 3 % en fin d'essai. A
0,87 d'a
des grains,
elle reste stable à toutes les teneurs en Oz étudiées
w

---

121 -
1
1
Viscoélas-
1
ticité
ATMOSPHERE CONFINEE
1
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 Durée
Gonflement
ICompressibilité 1
Recouvrance
1(jours)
%
1
%
1 élastique (%)
1---------------- ----------------1----------------1----------------
1
1
1
1
Ta
207
1
74
1
7
1 )
210
1
72
1
9
1
100
202
1
69
1
10
1
1
1
1
1
1
CO
PUR
2
1
1--------------------------------------------------1
1
1
1
1
100
1
212
1
75
1
6
1
1
1
1
1
1
1
O
1
(= 5 pg/g/jour + CO
2
2)
1
1--------------------------------------------------1
1
1
1
5
1
207
1
75
1
6
15
206
79
5
1
30
195
59
6
1
50
234
75
1
7
95
221
71
1
8
1
1
1
1
O
(= 10 pg/g/jour) + CO
2
2)
1
1--------------------------------------------------1
1
1
1
1
5
1
193
1
75
1
6
1
15
1
202
1
77
1
5
1
30
1
222
1
76
1
5
1
50
1
225
1
77
1
5
1
95
1
241
1
81
1
3
1
1
1
1
1
Tableau 15
Evolution des caractéristiques viscoélastiques du riz
paddy conservé à 0,95 d'a
et sous plusieurs mélanges
w
gazeux

---

- lZZ -
1
1
Viscoélas-
Gonflement
Compressibilité
Recouvrance
1
ticité
%
%
élastique (%)
IGaz
1 durée
(jours)
\\-------------------- ---------------- ----------------
1
1
T
Z75
78
6
1
Oz (=~pg/g(j) +CO Z
1
1
7
191
77
7
1
z8
189
77
6
48
189
79
5
77
190
80
5
10Z
190
77
7
140
189
77
6
0Z=(10 pg/g/j)+CO Z
7
174
75
7
z8
175
79
5
48
18z
75
7
77
190
78
6
10Z
195
75
,
7
140
195
77
6
0Z(=80 pg/g/j)+CO Z
8
Z07
77
7
14
ZOO
77
6
47
196
77
5
56
197
73
8
Oz (=80 l1g/g/j )
+ COZ + NZ
8
193
78
6
56
189
79
5
Tableau
16
: Evolution des caractéristiques viscoélastiques du rlZ
conservé à 0,87 d'a
et sous atmosphères contrôlées
w

---

-
123 -
1
1
1
Visoélas-I
1
1
ticité
Gonflement
1
1
1 Compressibilité
Recouvrance
1Gaz
%
1
%
élastique co
Idurée (jours)
1
1-------------------- ---------------- ---------------- ----------------
1
T
193
O
73
8
O
(= 5pg/ gjj ) + N2
2
20
193
69
13
38
203
77
5
50
198
75
7
95
211
74
7
O
pg/g/j)+ N
2(=10
2
20
185
77
12
38
211
77
5
50
224
78
5
95
196
75
7
O
,ug/gjj)+ N
2(=35
2
24
193
74
7
38
206
73
8
80
209
78
5
100
214
83
4
O
pg/g/j)+ N
2(=60
2
15
207
71
10
28
188
70
9
36
233
70
12
62
191
74
9
Tableau 17
Evolution des caractéristiques viscoélastiques du riz
conservé à 0,90 et sous plusieurs teneurs en O2

---

- 1Z4 -
et cela
quelle
que
soit la
nature du
gaz complément
(tableau 16).
Par
contre, à 0,90 d'a, elle a tendance à diminuer au cours de la conservation,
w
exception faite cependant des grains stockés en présence de 60 pg d'OZ/g/j
où une certaine stabilité de la recouvrance élastique est observée (tableau
17) .
4.3. CONCLUSION
D'une manière générale,
aux faibles a
des gralns,
aucune variation
w
importante ne s'observe au cours du stockage expérimental
sous atmosphères
controlées,
excepté le gonflement des grains qui augmente dans la plupart
des échantillons issus du stockage des grains sous atmosphère appauvrie en
OZ.
Cependant,
on peut
souligner aussi une èliminution de la
recouvrance
élastique aux a
réduites des gralns,
et du taux de brisures en atmosphère
w
confinée et à 0,95 d'a.
On ne peut donc dégager une conclusion à partir de
w
ces analyses technologiques sans que d'autres essais ne
viennent confirmer
ces données.
5. COMPORTEMENT DES ESPECES CARACTERISTIQUES, ETUDIEES EN CULTURES PURES
EN FONCTION DES MELANGES GAZEUX ET DE L'AW
Les expérimentations précédentes,
réalisées sur grains a différents
degrés dl humidi té
et
stockés
sous atmosphères pauvres
ou très
pauvres
en
oxygène,
ont permis de mettre en évidence une microflore caractéristique,
essentiellement dominée par des levures. Ces levures, que nous qualifions de
levures "de stockage" parce qu'il ne semble pas qu'elles aient jusqu'ici été
décri tes
sur
grains
en
dehors
de
ces
conditions
très
particulières
de
conservation, représentent clairement le facteur microbiologique limitant en
matière de conservation en silos hermétiques.

---

- 125 -
En
effet,
au
contraire
des
moisissures
banales
comme
Aspergillus
ou
Penicillium,
il semble que la moindre trace d'oxygène suffise à initier un
développement important de ces levures, alors que comme nous l'avons montré,
il faut au minimum 60 à 80 pg/g/ j
d'oxygène pour obtenir un développement
décelable chez les moisissures.
Ces
niveaux
d'oxygénation
minimum
permettant
un
développement
fongique dans les grains à humidité intermédiaire,
ont un intérêt pratique
évident,
me me s'ils restent difficiles à exprimer en termes de micro-fuites
ou de
porosité pour des
cellules de
stockage étanche.
Il faut
cependant
souligner qu r ils
ont été
établis avec des grains
porteurs de
populations
microbiennes aérobies et complexes, se partageant en quelque sorte l'oxygène
disponible, et il nous a paru nécessaire de décrire les comportements de ces
différentes populations
prises
séparément,
de
manière à affiner l' inter-
prétation des résultats complexes que nous avons obtenus jusqu'ici.
5.1. ESPECES FONGIQUES REPRESENTATIVES DE LA MYCOFLORE DES
GRAINS HUMIDES CONSERVES SOUS ATMOSPHERES CONTROLEES
L'étude du comportement des espèces pures sous différentes conditions
gazeuses s'est portée essentiellement sur des micromycètes isolés au début
ou au cours des essais rapportés précédemment.
Pour les espèces dites "de stockage",
Aspergillus candidus (Link) et
Penicillium cyclopium (Westling) sont retenus pour ces études en raison de
leur fréquence d'apparition.
Cryptococcus hungaricus (Zsalt) Phaff et FeIl,
Hyphopichia burtonii
(Boidin et al.),
Von Arx et Van der Walt,
et Candida sp.
constituant les
principales "levures de
stockage" dans les essais antérieurs,
notre choix
s'est en
particulier porté
sur H.
burtonii
qui
paraît
être
une
espèce

---

- 126 -
particulièrement
"microaérotolérante",
se développant
sous
des
quanti tés
d'O
extrêmement
faibles.
C'est
aussi
l'espèce
la
plus
constamment
2
rencontrée dans les essais sur grains.
5.1.1. MOISISSURES
a - Aspergillus candidus Link
-,,-
Cette
espèce se caractérise sur milieu de
culture,
MEA,
par un
thalle et des
fructifications
de
couleur
blanche d'aspect
cotonneux.
Le
diamètre des colonies est de 1,5 à 2 cm après 7 jours d'incubation à 25°C,
et peut atteindre 4 à 5 cm après 2 semaines d'incubation.
Les têtes conidiennes sont globuleuses et peuvent atteindre 600 à 800
lm de diamètre à maturité,
200 à 300 rm et souvent même moins de 100 pm pour
les têtes jeunes (Figure 30).
La taille des conidiophores varie selon les
souches : de moins de 500 pm à plus de 1000 pm de long, et de 5 p à 10 ou 20
um de diamètre.
Ils sont lisses,
occasionnellement cloisonnés et du type
1
bi-sériés.
Le diamètre des vésicules varie de 10 à 50 um environ
elles
1
sont généralement fertiles sur toute leur surface et
portent une première
rangée d'éléments (métules) de 2,5 à 8 pm de large et de 10 à 30 rm de long.
Les
phialides
de
5 -
8 x 2
-
3,5
pm sont
insérées
sur
les métules
et
produisent des conid~es globuleuses de taille allant de 2,5 à 4 pm.
L'espèce
est
largement
répandue
dans
la
nature
et
est
très
fréquemment
isolée
des
grains
stockés
sur
lesquels
son
développement
constitue une des causes primaires d'échauffement des stocks (CHRISTENSEN et
KAUFMANN, 1974).
Le milieu Malt extract agar est composé d'extrait de malt (20 g), de
peptone (1 g), de glucose (20 g), d'agar-agar (15 g) et d'eau (1000 ml)

---

- 127 -
L'activité de l'eau minimale et optimale pour la croissance de l'espèce est
de 0,75 et 0,90 respectivement (PELHATE, 1982).
b - Penicillium cyclopium Westling
L'espèce
se
caractérise sur
milieu
de
culture
par
une
croissance
rapide.
La taille des thalles atteint 2 à 5 cm de diamètre après
7 jours
d'incubation à 27°C.
Les
thalles de couleur bleu-verdâtre,
et
à tendance
fasciculée montrent une tendance à l'aggrégation,
voire à la fasciculation
des conidiophores. L'odeur de moisi prononcée sur MEA est caractéristique de
l'espèce.
Les conidiophores sont typiquement rugueux et terverticillés, mais on
rencontre aussi souvent des
exemplaires bi verticillés
asymétriques
une
première
branche
asymétrique
prend
naissance
a
la
portion
basale
du
conidiophore et supporte une ou plusieurs ramifications de 15 - 30 x 2,5-
3,S um (Figure
30). Chaque ramification est à l'origine de 3 à 4 métules de
10 - 15 x 2,5 -
3,3 um,
chacun supportant 4 à 8 phialides ampulliformes
mesurant 7 à 10 um de long et 2,2 à 2,8 um de large.
Les conidies à paroi lisse sont de forme sphéroïdale a ellipsoïdale
et sont de 3,5 - 4 um et 3,3 - 4 x 2,5 - 3 um respectivement.
L'activité
de
l'eau
minimale
et
optimale
pour
la
croissance
de
l'espèce est de 0,82 et 0,95 respectivement selon PELHATE (1968),
espèce
ubiquiste et cosmopolite généralement rencontrée sur les produits végéta~x,
spécialement sur les céréales et autres aliments.
5.1.2. SOUCHES DE LEVURES ISOLEES
a - Crytococcus hungaricus (Zsolt) Phaff et FeIl
L'espèce est généralement unicellulaire avec des cellules sphériques
ou ovoïdes de 4 - 6,3 x 5 - 8,7 pm.

---

-
128 -
conidie
1-"""-'-_- .
metulae
branche
"d"ophore
Conl l
"
" "Ilium
Pen&c&
cyclop&um
conidies - - - .- ~Dy,~,
phialides
metulae
petite
large vésicule
"d"ophore
Conl l
d"d S
.l.l.us
ASp8Y'g&
can t. u
Figure JO
Thon et
a
R pel' (1949)
d'après
l (tG6S)
et Raper et Fe nn e .
_

---

- 129 -
Ces cellules sont souvent regroupées par paires ou en amas comme le
montre
la
planche
lA.
Le
bourgeonnement
est
multilatéral,
et
occasionnellement les cellules filles
restent associées
à la
cellule mère
par un petit denticule proéminent qui subsiste sur la cellule mere après la
séparation
de
la
cellule
fille.
Ce
caractère
rapproche
l'espèce
des
Stérigmatomyces FeIl.
Sur milieu
MEA gélosé,
l'espèce produit
typiquement des
pigments
caroténoïdes après
1 mois.
Les
jeunes cultures ne
sont généralement que
faiblement pigmentées.
L'espèce
ne
produit
pas de
pseudo-mycélium et
n'a pas
de
pouvoir
fermentaire connu (Tableau 18).
b - Hyphopichia burtonii (Boidin et al.) Van den Arx et
Van der Walt
H.
burtonii est une levure ascosporée produisant un pseudo-mycélium
et
des
blastospores
sur
denticule
en
conditions
"aé rob i e s It
et
un
bourgeonnement multipolaire en aérobiose
(HENNEBERT,
1988,
communication
personnelle).
L'espèce est hétérothallique et se caractérise aussi par un
développement abondant de mycélium vrai comme le montre la planche 2.
Chaque
asque contient
1 à
4 spores
en forme
de
chapeau
qui
sont
libres à maturité.
Des athrospores sont aussi produites
par l'espèce qui
possède par ailleurs un pouvoir fermentaire réel (Tableau 19).
Une espèce très voisine,
sinon la meme,
a sans doute été isolée et
décrite,
sur riz humide conservé en confiné,
par TEUNISSON (1954) sous le
nom d'Endomycopsis chodatii.

---

A
Cryptococcus hungaricus
(zsolt) phaff et fell
B

---

-
130 -
MUCL 29261 ~ Ul
?HYSIOLOGY TEST
Fermentation
O-Glucose
-
- !1elibiose
f-
-
O-Galactose
- - - Cellobiose
- - -
O-Xylose
- - - ~e thy 1- c< -O-Gl ucos i de - - -
Suc rose
- - - ~elezitose
- - -
~laltose
- - - Raffinose
- - -
'X-C\\-Treha los e
- - - lnulin
- - -
Lactose
- - -
Soluble Starch
- - -
Assimilation of carbon compounds
'l:J ~~
D-Glucose
-+ t-
Soluble Starch
+
Without vitamins
D-Galactose
-+ +
Glycerol
- -
Without Myo-Inositol
L-Sorbose
- +
Meso-Erythri tol
- -
Without Ca pantothenate(B3)
L-Rhamnose
L
+
Ribitol
- -
Without Biotin (H)
D-Gl ucos ami ne
- -
Xylitol
- -
IHthout Thiamin (El)
D-Ribose
-T
+
L-Arabinitol
Without Biotin+Thiamin
D-Xylose
+ +
D-Glucitol
-t-
+
Without Pyridoxine (B6)
D-Arabinose
-+ +1
~annitol
1-
+
Without Siacin (PP)
L-Arabinose
1-1+
Galactitol
- -
Without PABA ('..1)
Suc rose
t +
'lyo-Inositol
-t- +
Without folic Acid ('1)
:"altose
1- +
D-Glucono-~-Lactone
1+ +
'oiith 0,017- Cyc l oh e x i mi d e
A--::\\-Treha lose
1: -+
2-Keto-O-Gluconate
\\.li th 0,1% Cvc l.oh e x i mi d e
Lactose
-t +
S-Keto-D-Gluconate
Acid Production
~elibiose
-t +
:)-Gluconate
"!. !
Hydrolvsis of Arbutin
Ce l Lob i o s e
t, +
D-Glucuronate
"!.
~
Hydrolvsis of fat
1ethvl--~D-Glucoside
-+ 1-
DL-Lactate
~
!
Urease Âctivitv
+ ~
'1elezitose
.,. 1"
Succinate
+ -t-
Starch Production
.,.
Ra f f i n o s e
+
Citrate
- -
at 2S'C
+ +
nu l i n
-j-
ï
'lethanol
- -
at 31)'C
- -
:;alicin
- -
Ethanol
-+ +
at 37'C
- -
\\
\\rbutin
~t+
507- Glucose
at 42'C
- -
1
1 60;:
Glucose
\\ssimilation of nitrogen compounds
"o c a s s i urc Nitrite
-1
Cad ave r i ne
+-t
Creatinine
-1
'otassium Nitrate
-+ +1
L-Lvsine
+ +
èthy l'amine Hcl
+ +[
Creatine
- -
Tableau
18
Caractéristiques métaboliques de Cryptococcus hungaricus
(communication personnelle G.. L.. HENNEBERT)

---

A
1jHYPhOPiChia burtonii
;:i'
,
(Boidin et al) von Arx &
van der Walt
B

---

-
131
MUCL 29259 " HB
"!lYS IOLOGY TEST
Fennentation
t6 l'i~ Iid
tJ IV i'~'
:)-G l uco s e
-t-+
+
Melibioge
)-Galar.tose
Cellobiose
,)-X'"lose
Methyl- c( -D-G l u co s i de
Sucrose
+ + of-
Melezitose
··Ial tose
;.
+ + Ra f f i no s e
i- f-
(-C'r-Treha loge
-+ -+ 1- Lnu l i n
·.actose
Soluble Starch
~ssimilation of carbon compounds
:z~ ~O
D-Glucose
-+ of-
Soluble Starch
r-
\\.Jithout vitamins
- -j
~-Galactosp.
+ t-
Glycerol
-+ +
Without Myo-Inositol
1
L-Sorbose
- -
Meso-Erythritol
-e-
-r
Without Ca pantothenate(B3)
1
L-Rhamnose
-
-
Ribitol
-t-
+
Without Biotin (H)
1
~-Glucosamine
- -
Xylitol
- -
\\.fi thout Th i amin (El)
1
)-Ribose
"!. !
L-Arabinitol
Without Biotin+ThialDin
1
)-:\\yLose
-
1
-
D-Glucitol
-t- i-
Without Pyridoxine (B6)
l
)-Arabinose
- -
~annitol
+ t-
Wi thout Niaein (PP)
1
L-Arabinose
... -r-
Galactitol
- -
Without PABA (!'i)
!
-
Sucrose
-;.
+
'lyo-Inositol
- - \\.Iithout folie Aci d (~)
1
~altose
;.
+
D-Glucono-g-Lactone
- -
\\.fi th 0,017. Cyeloheximide
~-j\\-Trehalose
~
+
2-Keto-D-Gluconate
iWi th o.iz Cyeloheximide
Lactose
- -
5-Keto-D-Gluconate
Acid Production·
'lelibiose
- -
D-Gluconate
- -
Hydrolysis of Arbut i n
CeUobiose
- -
D-Glucuronate
- -
Hydrolysis of fat
'lethyl-1-D-Glucoside
- -
DL-Lactate
- -
Urease Ac t i v i tv
- -
"e le zi tos e
- -1
Succinate
-t- -t
Starch Production
Raffinose
- -
Ci t r at e
-t i-
at 25°C
1-
+
Inulin
- -
'lethanol
--
at 30°C
+ -t-
Salicin
- -
Ethanol
-t-+
at 37°C
'+ 1"
,\\rbutin
± +
507- Glucose
at 42°C
-
1
607- Glucose
Assimilation of nitrogen comoounés
Potassium ~itrite
-1
Cadaverine
Creàtinine
Dotassium Nitrate
L-Lysine
-+ +
Er hy l ami n e Hel
t
of-
Cre~tine
Tableau 19
caractéristiques métaboliques d'Hyphopichia burtonii
(communication personnelle C.L. HENNEBERT)

---

A
B

---

- 132 -
c - Candida sp.
La souche isolée aussi de nos essais sur grains est anascosporogène
et
présente
la
plupart
des
caractéristiques
d'un
Candida.
Elle
n'est
cependant pas fermentative (Tableau 20).
Or,
dans ce genre,
seules deux
espèces ne
sont pas fermentatives
Candida famata
(Harrisson)
Meyer
et
Yanow et Candida glaebosa Komagata et Nakase.
La première ne produit pas de
pseudo-mycélium et C.
glaebosa manifeste une tendance à l'allongement des
cellules, sans toutefois former de véritables articules mycéliens.
Notre
souche
se
caractérise
par
contre
par
la
production
d'un
pseudo-mycélium important (Planche 3). Ce dernier fait la rapprocherait donc
de
la
souche
(malheureusement
fermentative)
que
DIDDENS
décrit
comme
appartenant au genre Hyalodendron,
dont la taxonomie est encore quelque peu
incertaine.
La souche est classée par HENNEBERT (1988) comme une espèce nouvelle
de Candida,
proche de C.
glaebosa,
à moins qu'il ne s'agisse d'une espèce
déjà décrite dans Hyalodendron.

---

- 133 -
MUCl 29260 ~ P'1
PHYSIOlOGY TEST
Fermentation
D-Glucose
- - -
!'Ielibiose
- - -
D-Galactose
- - - Cellobiose
-
- -
D-Xylose
- - -
~e thyl- c< -D-G lucos ide - - -
Sucrose
- - -
~elezitose
-
- -
~L:l1 tose
- - - Raffinose
- - -
:<-C\\-Trehalose
-
- -
Inu l in
-
- -
lactose
-\\- - 50 l ub l e Starch
- - -
Assimilation of carbon cornpounds
~ ~d
D-Glucose
Soluble Starch
'1 j)
\\.lithout vitamins
- -
1 ...
D-Galactose
-tl-r
Glycerol
- -
r.... i thou t
Myo-Inositol
l-Sorhose
-1-
Heso-Erythritol
- -
\\.lithout Ca pantothenate(B3)
L-Rhamnose
-
-
Ribitol
- -
\\.lithout Biotin (H)
D-Glucosamine
- -
Xv l i t o l
- -
\\.Jithout Thiamin (E 1)
D-Ribose
- -
Lr-Ar ab i n i t o I
\\.lithout Biotin+Thiamin
D-Xvlose
+ -r-
D-Glucitol
-t- +
\\.lithout Pyridoxine (B6)
D-Arabinose
- -
'1anni t o l
-t -r-
\\.li thou t Niacin (PP)
LrAr ab i n o s e
-tl-r
Galactitol
- -
\\.lithout PABA C'i)
Suc rose
ïl+
'lyo-Inositol
- -
\\.li thout f o l i c Acid ('1)
~altose
-+ +
D-Glucono-~-lactone
-t-+
l.Ji th o.crz Cy c l oh e x i œi d e
1-A-Trehalose
r-I-
2-Keto-D-Gluconate
\\.li th 0,1% Cycloheximide
lactose
l-tlt
5-Keto-D-Gluconate
Acid Production
'1elibiose
-+I-r
D-Gluconate
-\\-
Hydrolvsis of Arb u t i n
Cellobiose
1"11-
D-Glucuronate
- -
Evdrolysis of fat
'1et~yl-~D-Glucoside
+\\-r
Dl-lactate
,-le lurease Ac t i v i t v
-
:-'elezitose
l-tl+
Succinate
-rIT
Starch Production
Raffinose
-tl+
Citrate
- -
at 25·C
+1+
lnulin
1-1-
'1ethanol
-
-
at 30·C
+1+
i
Saticin
- l -
1 Ethanol
-t- +
at 37·C
-!
I+I-r
1
Ar b u t i n
50?: Glucose
at 42'c
- !
'1
i
Il
1 fiOZ
Glucose
1
Assimilation of nitrogen cODpounès
Potassium ~itrite
[-1 -1
1 Ca d a ve r i n e
-
-
Creatinine
-i
Potassium Nitrate
1-1-[ 1 L-Lysine
- -
i
Ethylamine Hcl
~
-
- '
.
-
-
.Cr e a t i n e
\\
'Tableau 20
Caractéristiques métaboliques de Candida sp.
(communication personnelle G.L. HENNEBERT)

---

- 134 -
5.2. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Parmi
les
moisissures
caractéristiques,
Aspergillus
candidus
et
Penicillium cyclopium sont les deux espèces retenues pour ces études.
Les
souches utilisées
ont
été
isolées de
grains humides
au
cours
des
essais
précédents. L'Aspergillus candidus est très fréquemment isolé de grains à aw
comprises entre
0,85 et 0,90 en atmosphères insuffisamment confinées.
Le
Penicillium cyclopium est certainement moins xérotolérant mais
sa présence
régulière sur gralns en fait une espèce caractéristique de tels écosystèmes.
C'est
cependant
de
loin
Hyphopichia
burtonii
qu.i
est
l'espèce
la
plus
intéressante à étudier ici en raison de sa tolérance aux faibles activités
de l' eau.
e' est la seule levure que nous rencontrons encore,
en anoxie
partielle,
à a
0,87 et, du fait de son très faible besoin, en apparence au
w
moins, en oxygène.
Il a
par ailleurs
été
établi
que
cette
espèce
est
capable
de
se
procurer de l'énergie par fermentation,
et l'on peut donc se demander dans
quelle mesure
ces aptitudes
réunies permettent d'expliquer les croissances
observées, en milieux complexes, en quasi absence d'oxgyène
MILIEUX DE CULTURES UTILISES
-
Les
cultures d' espèces
pures
en atmosphères
contrôlées
ont
été
essentiellement réalisées sur deux sortes de substrats.
Des grains de rlZ
paddy,
réhumidifiés
à
a
0,90 comme
décrit plus haut
et
stérilisés
par
w
auto-clavage 40 minutes à 110 G e,
sont répartis dans des fioles de Roux de 1
litre,
à
raison de
300 grammes
par fiole.
L' ensemencement
par l'espèce
6
choisie est fait à partir d'une suspension de 10
spores par ml.
3 ml de
l'inoculum sont introduits dans chaque fiole et sont pris en compte lors de
la réhumidification pour l'obtention de 0.90 d'a.
Sur cette
quantité de
,
W
spores,
un
certain
pouccentage
est
revLvifiable
après
analyse

---

- 135 -
microbiologique de la suspension-mère et des grains ensemencés.
Ainsi,
le
nombre de spores par gramme obtenu en début d'essai et pour chaque espèce,
est illustré par le tableau Zl.
Concentration de
1
Nombre de spores
Nombre de spores
1
la suspension
revivifiables
revivifiables
mère déterminée
1
dans la sus-
sur les grains
Espèces
au compteur
1
pension-mère
après l'ense-
Coulter
1
(spores/ml)
mencement
(spores/ml)
1
(spores/g)
1
--------------------1-----------------
1
4
Hyphop. burtonii
1
1.10 ,..,
Asper. candidus
1
7.10"
Penie. cyclopium
1
8
3
.10
1
Tableau Zl
Nombre de spores revivifiables dans la suspension-mère et
sur grains après dénombrement au compteur-Coulter
Trois
séries
(de
4
à
5 fioles
selon
l ' atmosphère
étudiée)
sont
ensemencées avec une espèce, puis mises à incuber dans des cellules étanches
placées à
Z5 + 1°C.
Les mélanges gazeux expérimentaux correspondant aux
séries sont:
air libre,
10 %d'OZ + 50 %COZ + 40 %N
et 10 %Oz + 90 %
Z
N
La quantité réelle d'oxygène disponible par gramme de grain et par Jour
Z'
est de Z,5 mg/go

---

- 136 -
- En parallèle,
le milieu liquide est utilisé pour l'étude de
la
croissance
pondérale et
de
la
teneur en
ergostérol correspondante
de
la
souche d 1Hyphopichia burtonii. Le milieu, à une a
de 0,90, est constitué de
w
glycérol (ZOO g/l),
du glucose (Z4 g/l),
d'extrait de levure (8 g/l) et de
l'eau (800 g/l).
Le milieu est réparti dans des
fioles cylindroconiques de 500 ml à
raison de 100 ml par fiole,
puis stérilisé à l'autoclave à 110°C pendant 40
minutes.
Après
stérilisation,
l'a
du
milieu
est
vérifiée
avant
w
l'introduction de l'inoculum qui a un effet négligeable sur la variation de
6
l i a .
Chaque fiole est ensemencée avec 1.10
germes soit 1.104 germes/ml de
w
milieu de culture,
puis mise à incuber à Z5 + 1°C et sous quatre mélanges
gazeux
air libre,
N
pur (OZ résiduel = 71 mg), 1,5 g dlO
+ N
et 1,5 g
Z
Z
Z
d'OZ
+
COZ/N
ce
qui
correspond
en
pourcentage
de
gaz
pour
les
deux
Z'
derniers mélanges à 10 %Oz + N et 10 %Oz + 50 %COz + 40 %N
Z
Z'
Le poids du mycélium formé et sa teneur en ergostérol sont mesures à
partir des cultures recueillies dans deux fioles à chaque prélèvement,
- Des cultures sur milieux artificiels gélosés ont été réalisées pour
l'étude du comportement d' Aspergillus candidus.
Cet
essai
est
réalisé
à
partir d'un
milieu
de
base
gélosé
mélangé
à
du
glycérol
en
proportion
variable suivant les activités de l'eau désirées.
Les quantités de glycérol
rapportées par litre sont de 350 et zoo grammes pour des a
de 0,88 et 0,94
w
respectivement. L'a
maximale (0,98) est obtenue sans glycérol.
w
Les
différents
milieux
sont
répartis
dans
des
boîtes
de
Pétri
à
raison de 9 ml par boîte.
Pour chaque a ,
deux séries de 10 boîtes sont
w
ensemencées par 0,5 ml d'une suspension de 10 spores/ml environ; l'inoculum
est
déposé
puis
étalé
à
la
surface
du
milieu,
de
sorte
que
l'a
de
w
l'ensemble
ne
soit
pas
significativement
modifiée
par
l'ensemencement.

---

- 137 -
La première série de boite est enfermée dans une enceinte hermétique
de
10 litres contenant
1 g d'O
et la seconde,
enfermée dans
les neme s
Z
conditions, ne renferme que 71 mg d'OZ.
5.3. RESULTATS ET DISCUSSIONS
5.3.1. CnOISSANCE DES MOISISSURES CARACTERISTIQUES
SUR RIZ STERILISE
Sur
gralns
stériles,
a
une
a
de 0,90
et avec
une
introduction
w
journalière
d'oxygène
de
Z,5
mg/g
de
grain,
la
croissance
et
la
conidiogénèse
des
deux
souches
étudiées
sont
conformes
à
ce
qul
était
attendu, ainsi que le montrent les figures 31(A,B) et 3Z(A,B). L'Aspergillus
candidus est pratiquement à son optimum hydrique et la croissance mycélienne
du témoin "air libre"
est tout à fait semblable à celle déjà décri te dans
des conditions expérimentales voisines par CAHAGNIER (1984).
Le s quantités
d'oxygène
apportées
journellement
sont
presque
30
fois
supérieures
aux
quantités limites que nous avons déterminées précédemmrnt, et seul un retard
de croissance pondérale peut être obtenu dans ces conditions.
Par contre,
lorsque le COZ est utilisé dans le mélange à concentrations significatives
(50 %),
un effet inhibit~ur tout à fait considérable est obtenu,
qui se
traduirait par un allongement de près de 10 Jours de la durée de stabilité
apparente
des
grains.
La
conidiogénèse
est
ralentie
et
la
croissance
mycélienne prat i quemen t bloquée dans ces conditions.
Les teneurs en oxygène
disponible sont suffisantes pour qu'on ne puisse soupçonner une
influence
SlŒ
les taux d'ergostérol mycélien.
Le Penicillium cyclopium montre une évolution tout à fait similaire,
mais moins rapide,
la différence avec l'espèce précédente s'expliquant sans
aucun
doute
par
une
xérotolérance
mOlns
importante,
l'a
0,90
étant
w
inférieureà l'optimum hyftisur de
l'espèce,
selon PELHATE
(1968).
Cette
limitation hydrique associée à la réduction de l'oxygène disponible entraine

---

- 138 -
Spores/g
__ 0
0
0 - - · -
8
la
J
JO
*~
/1}----
~
/
/
•
/
..
A
--
/
",/'
/
./
/
/
, /
li
-:"
/
i"
......»--
103 L-
'---
-'--
....l.-_
a
la
20
30
JOURS
Ergosrerol ~g/g s.s
300
250
200
150
B
100
/'1-
~_.
/l:?-/
.>: .......- •.. ---'
50
, . /
..•.......-
o ~_~~-.~-~~~:..- •
•.--------Jf.
o
10
20
30
JOURS
Figure JI
Effet du dioxide de carbone sur la conidiogénèse (A)
et la teneur en ergostérol des grains (B) à 0,90 d'a
YI
et contaminés ?ar Aspergillus candidus
(0)
2,5 mg d'02 (g + N
(*) air libre
2)
(~) 2,5 mg d'02/ g + CO 2/N2

---

- 139 -
Spores/g
----~-~
~-*
._-_·-----0
0 ' -
/
/"
.•
A
103~
~,=-
-'----
-'--_
o
10
20
30
JOURS
Ergus\\erul
pg/gs.s
300
250
200
B
150
100
/Ji.
50
~ ~
H/
-- t----------...
~y. ~ ------:t.:::=:---- --_._ .•
o
~-.-...----'.
.- . -
o
10
20
30
JOURS
Figure 32
Effet du dioxide de carbone sur la conidiogênèse (A)
et la teneur en ergostêrol (B) des grains (à 0,90 d'a)
cont&~inês par Penicilliwn cyclovium
W
(e)
2,5 mg d'O/g + N
(l:?-)
air libre
2
(~) 2,5 mg d'02/ g + CO Z/N2

---

- 140 -
une non-croissance à peu près totale,
et l'inhibition par le COZ n'est plus
perceptible que sur la sporula tion.
On notera .iu passage que le n onbr-e des
propagules dénombrables
est peu représentatif de la croissance effective ;
deux niveaux voisins pouvant correspondre,
suivant les conditions,
à des
croissances très différentes.
Les
figures
33 retracent,
pour ces deux espèces,
la consommation
effective d'oxygène,
par jour,
rapportée au gramme de grain. Les quantités
d'oxygène considérées,
qui représentent ici la "demance microbiologique en
oxygène" du système (DMO) sont les quantités effectivement consommées. Elles
sont donc très faibles en début d'essai,
lorsque la population fongique est
rédui te aux
conidies d'ensemencement
en
cours
de
germination,
et
elles
augmentent
régulièrement
au
fur
et
à
mesure
que
cette
population
se
développe.
Pour l'Aspergillus comme pour le Penicillium,
ces courbes recoupent
remarquablement les observations précédentes : A. candidus, qui se développe
très
significativement
au
cours
de
l'essai,
réalise
une
consommation
croissante d'oxygène
jusqu'aux environs
du
15ème
Jour,
et
une
activité
lipolytique très importante sous N
(Figure 34).
A ce stade,
la population
Z
consomme
journellement
la totalité
de
l' oxygène
introduit
et
le
facteur
devient évidemment limitant,
la vitesse de développement ne peut plus
tr e
ê
que
constante,
ce qui
ni est pas
immédiatement apparent
sur les
courbes
montrant l'évolution de l'ergostérol (Figures 31A et B).
Pour Penicillium
cyclopium,
la croissance très faible due à l'a
se confirme au niveau de la
w
DMO qui n'augmente pas avec le temps,
meme si une
faible
augmentation de
l'activité lipolytique est observée sous N '
Ceci suggère que le niveau de
Z
7
10
germes
par gramme atteint dans
cet essai
n'est
pas
accompagné d'une
croissance pondérale mycélienne importante (Figure 3Z), et que l'on est sans
doute
en
présence
d'une
altération
"superficielle"
du
grain)
sans
conséquence véritable au plan biochimique ou nutritionnel.

---

-
141 -
D.M.O.
3 mg d "o4 g / jr
2,5
O==-===-"lF==:......::. N2
2
•
Aspergillus
candidus
1
* __~C02
10
20
30
jours
25
2
Penicillium
cyclopium
1
10
20
jours
Figure 33
Effet du dioxide de carbone sur la demande microbiologique
en 02 des espèces pures cultivées sur grains stériles.
(e) 2,5 mg d'02/g/jour + N2
(x) 2,5 mg d'02/g/jour + CO 2 /N2

---

- 142 -
~ III SO.t/IOO ~S.'i
012
Aspepgillus candidus
Penicillium cyclopium
(B)
»::
(A)
01
0.1
*
*---
_e
0.08
, / o----~_.0-'-- 0.08
-:
/
;::...
..'
/
0.06
0.06
/
/
,.
..
_.JI.------..
0.04
"'T'-f-
f . /
.// --'_o
.-e
_____ lf---
,-/.---'.
/ '
..
, /
-
0.02
/ /
~':/'
.-----..-.JI.-
oL....--------L-
---L
- ' - -
oL-------!':;-----~----____;t
o
10
20
30
o
10
20
30
JOURS
JOURS
gH1S04/loogs.s
0.12
~M CIX, '/M'.,/71h
eo
(D)
Hyphopichia buptonii
(C)
0.1
70
.--------.~
/
~eperqi.LLue
60
•
candidus
0.08
___________·Penicillium
50
/ ;
f'~'
cucl.opium
0.06
4Q
0.04
30
20
0.02
Hyphopichia
la
buirtorn.i.
=='t:=
0
-~-",_D.--.6 _ _ L:':.
0
10
15
30
JOURS
JOURS
Figure 34
Evolution de l'acidité grasse CA, B, C) et de l'activité lipolytique
sur grains CD).
A, B, C =
C*) air libre, C*) 2,5 mg d'O/g + C0
Ce ) 2,5 mg d'O/g + N
2/N 2
2
D
C., *, 6) 2, 5 mg 1d ' °21g + N2

---

- 143 -
Il
convient
de
rappeler
ici
que
dans
c~s
essais
sur
substrats
solides,
il n' est pas possible de récolter le mycélium f o: mé et
seule la
mesure des
teneurs
en
ergostérol donne
une
estimation
de
la
croissance.
L'idée est bien entendu criticable puisque la biosynthèse de ce stérol est
aérobie
dans
ses
étapes
terminales
et
que
l'on
pourrait
imaginer
une
formation
de
mycélium
"pauvre
en
ergostérol",
la
fonctionnalité
de
la
membrane étant assurée par d'autres composés non décrits jusqu'ici dans les
travaux publiés. Les méthodes que nous avons pu mettre en oeuvre au cours de
notre travail ne permettent pas de lever cette ambiguïté.
5.3.2. CROISSANCE D'ASPERGILLUS CANDIDUS SUR MILIEU
SYNTHETIQUE SOLIDE
Une approche de la question a été tentée en développant des thalles
diA.
candidus
sur milieux synthétiques gélosés,
à trois a
différentes,
w
(0,98, 0,94 et 0,88), et sous deux conditions d'oxygénation, la première non
limitante d'02' 19/jour, et la seconde limitante qui est de 71 mg d'02/jour.
Dans les conditions expérimentales réalisées,
l'observation directe
des
thalles
est
particulièrement
aisée
et
il
nous
a
paru
suffisant
de
mesurer à intervalles réguliers le diamètre des colonies.
Les courbes de la
figure
35 confirment les
observations déjà faites
et montrent
bien,
aux
trois hydratations,
un allongement de la phase de latence et une diminution
de la vitesse de croissance du fait de la restriction d'oxygène.
Ce que ne montrent pas ces courbes, c'est une différence très notable
dans l'aspect des thalles qui sont d'une texture d'autant plus lâche et peu
dense,
voire
zonée,
que
l'anaérobiose
est
plus
poussée.
Sans
être
quantitatifs
et
sans
prétendre
comparer
une
croissance
sur
gélose,
en
présence d'un milieu riche,
à un développent sur grains de riz,
il parait

---

- 144 -
Diametre des colonies
(mm)
JOURS
Diametre des colonies
(mm)
50
40
JO
20
10
O_ _-=.:===_...L-
--'-
----'_
o
Figure 35
Effet de la restriction de 1'°
sur la croissance
2
d'Aspergillus candidus sur milleu synthétique
sOLide et à trois a
différentes.
w
( . ) a
=0,98
( 6 ) a
=094
(1r)a
=0,88
w
w '
w

---

- 145 -
~ossible de considérer que les mesures effectuées indirectement sur grains
sont
valides
et
traduisent
bien
un
développement mycélien
d'autant plus
faible que l'oxygène est plus limité et l'a
plus basse.
w
5.3.3. CROISSANCE D'HYPHOPICHIA BURTONII, SUR GRAINS
STERILISES, ~ AW 0,90
Ainsi
qu'il
a
été
montré
dans
les
expérimentations
précédentes,
Hyphopichia burtonii est par excellence le microorganisme capable de mettre
en échec
toute tentative
pra tique de
conservation de
grains
semi-humides.
Selon nos premiers résultats,
la moindre trace
d'oxygène en
permet,
en
effet, le développement.
4
Reprenant
l'étude
avec
des
grains
uniquement
contaminés
(10
germes/g) avec cette espèce,
et sous des conditions gazeuses similaires à
celles
expérimentées
sur
moisissures,
nous
avons
obtenu
les
résultats
présentés sur la figure 36.
L'observation la plus immédiate est sans doute
de
ne
constater
aucune
différence
significative
dans
la
sporulation
de
l'espèce en fonction des atmosphères gazeuses réalisées.
Ni la restriction
d'oxygène, ni l'introduction massive (50 %) de COZ ne semblent avoir d'effet
par
rapport
à
l'atmosphère
libre.
Les
figures
36
et
34D
montrant
respectivement
l'évolution
de
la
teneur
en
ergostérol
des
grains
et
de
l'activité
lipolytique
sur
gralns,
sont
tout
aussi
intéressantes
à
considérer puisqu'elles suggèrent une croissance non mesurable de la souche,
et ce,
meme en atmosphère libre,
alors que la sporulation est à l'évidence
très active,
au moins dans les 15 premiers jours de l'essai.
On notera ici
qu' Hyphopichia burtonii
se
comporte
de
manière
très
similaire
sur grains
stérilisés (non vivants) et sur grains vivants et porteurs d'une microflore
naturelle abondante et variée, et que l'espèce paraît tout à fait insensible
au gaz carbonique.

---

- 146 -
Germes/g
6
10
1
10
6
10
A
5
10
Sporu la tian
4
10
:J
10
0
10
20
30
JOURS
Ergoster ol pg gs.s
300
250
200
150
B
100
Teneur en ergostérol
50
_.
:dtlr.....-:
0
0
10
20
30
JOURS
Evolution de la sporulation et de la teneur en
ergostérol des grains (à 0,90 d'a) contaminés par
Hyphopichia burtonii et exposés sgus différents
mélanges gazeux.
( 1:r) a Ir lib r e
( Gl) 2, 5 mg d r 0 1g + N2
2
(*)
2,5 mg d'O?/g + CO
IN?
_
2 -

---

- 147 -
I l
n'est
donc
plus
question
d'évoquer
des
compétitions
levures/moisissures
ou
levures/grains
pour
expliquer
les
résultats
surprenants obtenus.
A nouveau,
par conséquent,
se pose la question de
savoir si dans ces situations écologiques très particulières,
et avec ces
espèces
microaérotolérantes,
l'ergostérol
reste
représentatif
de
la
croissance pondérale.
5.3.4. CROISSANCE D'HYPHOPICHIA BURTONII EN MILIEU
LIQUIDE SYNTHETIQUE
Au contraire de P.
cyclopium, Hyphopichia burtonii se développe très
bien à lIa
étudiée et ne nous paraît donc pas non plus être explicatif des
w
courbes de la figure 36. Il nous a donc paru indispensable d'approfondir ces
questions en étudiant, sous des conditions gazeuses analogues, la croissance
pondérale
et
les
teneurs
en
ergostérol
des
mycéliums
formés
par
cette
levure.
Les résultats obtenus sont présentés dans les figures 37 et 38.
Les
courbes représentant la sporulation (Figure 37A) n'accusent un fléchissement
que
lorsque
l'oxygène
est
le
plus
sévèrement
limité.
Les
croissances
pondérales à 30 jours s'échelonnent de 300 à 400 mg de mycélium,
ce qui est
tout à fait comparable aux mesures faites
dans des conditions identiques,
aux restrictions d'oxygène près,
par CAHAGNIER (1984) avec A. candidus. Sur
ce
critère,
on
n'observe
qu'un
effet
limité
des
compositions
gazeuses
réalisées
et
on
vérifie
la
non-inhibition
par
le
COZ'
Les
mesures
d'ergostérol rapportées à la figure 38B sont a exprimer par rapport au poids
de mycélium obtenu, et ces rapports donnés à la figure 37B montrent des taux
d'ergostérol du même ordre de grandeur (10 à ZO mg/g de mycélium sec),
que
ceux observés chez diverses moisissures développées en atmosphère libre. Les

---

- 148 -
Germes/ml
..
6
10
'.
,
,
A
,
,,
5
,
10
,
.
4
10
J
10 ~O-------;~-----::"-:::----""""'-
10
20
30
JOURS
mg crg.jm g de mycel. sec
0,06
e
0.05
0.04
B
0.03
0.02
0.01
O;:;-
--:"::--
.....L..-
........JL...-
o
10
20
30
JOURS
Figure 37 : Culture d'Hyphopichia burtonii en milieu synthétique
liquide
(A) = nombre de germes formés par ml de milieu de culture
(B) = mg d'ergostérol synthétisé par mg de mycélium sec
(-te)
au libre
(e )
1,5 g d '02/ j our + N2
(*)
1,5 g d'O/jour + CO/N
(m) N
pur (02
71 mg)
2
2

---

- 149 -
valeurs très élevées observées en début d'essai (Figure 37B) sont bien sur
entachées dlune forte erreur relative, les biomasses formées a 3 jours étant
très faibles dans tous les essais.
Pour des spéculations évidemment criticables,
nous avons essayé
de déterminer,
par le calcul, dans quelle mesure les 100 millions de spores
dénombrées
à
30
Jours
sur
les
grains
stériles
(Figure
36A)
étaient
compatibles avec les quelques 10 à 15 pg/g de grains d'ergostérol que nous
dosons à cette date. En admettant un diamètre moyen de 5 pm pour ces spores,
une densité voisine de 1 que nous justifions par une teneur en eau que lion
peut estimer entre 90 et 95 %et un taux moyen d'ergostérol de 1 à 2 mg/g de
biomasse,
le calcul montre
que
les
spores
seules donnent des
teneurs
en
ergostérol de l'ordre de 30 pg/g de grain quand leur teneur en eau est de 90
%SH et de 15 à 20 pg/g si cette teneur en eau est de 95 %SH.
Compte-tenu des approximations faites,
on se trouve donc tout à fait
dans la gamme des valeurs effectivement trouvées,
ce qui permet de penser
que le développement d'Hyphopichia burtonii sous forme
quasi unicellulaire
sur riz,
quelles que soient les conditions gazeuses environnantes,
est une
réalité.
Au contraire, pour simples qu'ils soient, les milieux de cultures
synthétiques étudiées,
riches en sucres simples et en différents facteurs
biotiques
apportés
par
l'extrait
de
levure,
constituent
des
milieux
suffisants pour supporter le développement mycélien de ces espèces.

---

-
150 -
Ill" de 'nyu:liunJ sec
400
350
300
250
200
A
150
100
50
0
0
la
20
30
JOURS
mlo\\ dÎ:q~oslc:r()1
6
*
5
4
*-7---------
/
--. ..
:
..--:
~:Z'''-----';
:--
* ...-----
! .• --'
*
3
B
2
!71/·~·
'f
•
l, /
o~------------------___:~
a
la
20
30
Figure 38
Culture d'Hyphopichia burtonii en milieu synthétique
liquide.
(A)
quantité de biomasse formée (mg de mycélium sec) pour
100 ml de milieu de culture
(E)
=
quantité correspondante d'ergostérol synthétisé
(',ç,)
an libre
(fê)
1,5 g d'O/jour + N2
(*)
1,5 g d'02/jour + CO 2/N2
(m) N2 pur
(02
II mg)

---

- 151 -
RESUME ET CONCLUSION GENERALE
Dans
la
première
partie
de
notre
travail
les
essais
réalisés
nous
ont
permis
de
préciser,
en
fonction
de
l'activité
thermodynamique
de
l'eau
dans
les
grains,
les
posssibilités
et
les
limites
d'utilisation
des
atmosphères
modifiées
pour
le
stockage du
riz
paddy.
Les
rôles
respectifs
de
l'oxygène et du
gaz
carbonique
dans
l'évolution
de
la
microflore
des
grains
humides
stockés
sous
atmosphères
contrôlées ont
pu être établis.
Les
résultats
obtenus
démontrent
que
dans
des
structures
de
stockage
réellement
étanches,
l'activité
métabolique
de
l'écosystème
est
suffisante
pour
créer
une
anoxie
avant
toute
détérioration
mesurable
des
grains,
dès
lors
qu'ils
n'ont
pas
subi
de
prétraitements
susceptibles
d'avoir
détruit
leur
microflore
naturelle
et ceci quelle Que soit l'aw , si l'on met à part les
processus fermentaires
qui
se manifestent inévitablement au-dessus de 0,91
d'aw.
Par cette étude, nous avons pu préciser qu'en anoxie stricte, à 0,95 d'aw , le
cortège
floristique
se
simplifiait
progressivement
pour
se
résumer
à la
présence
prépondérante
de
Lactobacillus
après environ
trois mois,
à 25°C.
Cependant, à
cette
aw
des
grains,
aucune
différence
dans
l'évolution
de
la
microflore
n'a
été
observée entre
grains
stockés
sous
atrnophère confinée et
ceux
conservés
sous
gaz
carbonique
pur.
Par ailleurs,
ni
la
multiplication des
Lactobacillus ni la perte de
viabilité des
conidies ne sont
influencées par le gaz carbonique.
Il
est
généralement
admis
que
des
pressions
partielles
d'oxygène
inférieures
à
%,dans
l'atmosphère
intergranulaire,suffisent
pour
la
stabilisation
microbiologique
des
grains
conservés
à des
aw
inférieures à 0,90. Les résultats des
essais
que
nous
avons
réalisés
avec
des
quantités
d'oxygéne
extrêmement
faibles
font
ressortir
que
, en
comparaison
avec
l'anoxie
compléte
, des
traces
d'oxygène
favorisent la
destruction des spores fongiques
pré-installées . La
perte de
viabilité
des
spores étant d'autant
plus rapide que l'aw
des grains est plus élevée.
Par contre,

---

-
J 52 -
la
conservation
du
riz
paddy
sous
de
très
faibles
teneurs
en
oxygène
conduit
à
sélèctionner
une
microflore
très
particulière
constituée
essentiellement
de
levures
dont
le développement est pourtant totalement inhibé en
anoxie
stricte.
Parmi ces levures , seule Hyphopichia
burtonii
(BüIDIN et ru Von Arx et Van der
Walt se développe à toutes les aw
étudiées au cours de ces essais conduits
sous de
faibles
quantités
d'oxygène,
la
croissance
des
moisissures
de
stockage
étant
totalement
inhibée
dans
ces
conditions.
Comparée
aux
autres
levures
(Cryptococcus
hungaricus (Zsolt) Phaff et Feil, Candida
sp
etc ... )
rencontrées
au
cours de ces mêmes essais, cette espèce manifeste la plus résistance aux
faibles
aw.
Par
cette
étude,
nous
avons
pu
approcher
la
notion
de
quantité
d'oxygène
minimale permettant une
croissance
fongique
mesurable sur grains
à
0,90
d'aw. Ce
"seuil"
serait
de
l'ordre
de
60
ug
d'oxygène/gramme/jour
et
est
de
très
loin
supérieur
à celui
qui
permet
le
développement
des
levures
de
stockage.
Cette
méthode
de
conservation
à
un
taux
d'oxygène
inférieur
à
cette
valeur
limite
permet
de
concurrencer
avantageusement
les
techniques
de
conservation
des
grains
humides
par
les
agents
chimiques
(acide
propionique
par exemple).
Nos
résultats
montrent
qu'indirectement
et
à
postériori,
la
qualité
mycologique
des
grains
stockés
peut
permettre
d'évaluer
les
quantités
d'oxygène
pénétrant
quotidiennement
dans
un
silo.
Le
travail
expérimental
réalisé
sur
grains
de
nz
paddy
donnent
un
éclairage nouveau
en
ce
qui
concerne
l'action
du
gaz carbonique
sur la
croissance
des
moisissures
et
des
levures.
En
effet,
de
nos
résultats,
il
ressort
tout
à
fait
clairement que
le gaz
carbonique n'a
aucun
effet
sur
les
levures
. Par contre,
il
favorise
indirectement
leur
développement
par
l'inhibition
partielle
qu'il
exerce
sur
les
moisissures
de
stockage.
Contrairement
à
certains
auteurs,
nous
avons
observé
sans
ambiguité
que
le
gaz
carbonique
n'e x erc ait
qu'un
effet
inhibiteur
limité sur la
nore
fongique,
inhibition
qui
ne
fait
que s'ajouter à celle
créée
par

---

- 153 -
l'anoxie.
En
aucun
cas,
le
gaz carbonique
seul
ne
peut
stabiliser des
grains
humides.
Sur le
plan
de
la
qualité
technologique,
aucune conclusion généralisable n'a
pu
être dégagée.
Cependant,
un
gonflement plus
important des
grains conservés
à
0,95
et
0,90
d'aw,
quels
que
soient
les
mélanges
gazeux
étudiés,
excepté
l'atmosphère
confinée
permet
de
penser
à
une
différence
de
qualité
des
grains
après
cuisson.
La
qualité
organoleptique
des
grains
conservés
à
0,95
d'aw
est
également modifiée
par la persistance de
saveurs acides après cuisson. Par contre,
celle des grains stockés à 0,90 et 0,87 d'aw reste inchangée, quelle que soit la durée
de
stockage.
Actuellement,
cette
méthode
de
conservation
est
seulement
utilisée
en
Europe
pour
des
céréales
destinées
à
l'alimentation
animale.
Cependant,
des
tentatives toutes récentes de maîtrise des
processus fermentaires et de contrôle
.
.
des
m rc roorg aru sme s
permettent
de
penser
que,
dans
un
avenir
proche,
l'industrie
agro-alimentaire
pourrait
utiliser
des
grains
stockés
humides
et
ayant
subit
une
fermentation
contrôlée
pour
créer
des
produits
nouveaux
pour
l'alimentation
humaine.
La
deuxième
partie
de
notre
travail
concernant
des
expérimentations
plus
théorique
nous
ont
permis
non
seulement
de
mieux
comprendre
les
besoins
réels en oxygène des espèces étudiées en fonction de
la composition gazeuse, mais
également
d'apporter
quelques
informations
utiles
sur
la
croissance
des
levures
sur substrat céréalier et
sur milieu
modèle.
Ces
études
montrent
que
la
demande
microbiologique
en
oxygène
(D.M.O)
d'As12ergillus
candidus Link et Penicillium
cyclopium
Westling
évolue
peu
en
fonction
du
temps
et
en
présence
d'une
forte
teneur
en
gaz
carbonique.
Cette
faible demande observée se
traduit sur le plan de
la croissance par une sporulation
importante
(bien
que
inhibée
par
rapport
à l'air
libre),
alors
que
la
teneur
en
ergostérol
reste
pratiquement
stable
surtout
chez
P.
cyclopium. Ce qui
traduit une

---

- 154 -
faible
croissance
mycélienne.
Ces
observations
suggèrent
que
les
altérations
restent
superficielles,
et
confirment
l'absence
d'altération
mesurable
sur
le
plan
biochimique et
technologique. Le
gaz carbonique a donc
un
effet
inhibiteur sur la
D.M.a de ces espèces.
Sur milieu de culture gélosé et pour une même aw, l'effet de la restriction de
l'oxygène sur la croissance radiale des espèces se résume à une augmentation de la
phase
de
latence
et
une
diminution
de
la
vitesse
de
croissance
et
du
diamètre
maximal
des
thalles.
Cependant,
la
présence
de
quelques
PPm
(microgramme/gramme)
d'oxygène
dans
l'azote
pur
suffisent
à
obtenir
un
thalle.
Les
résultats
obtenus
aux
trois
aw
testées
permettent
de
mettre
en
évidence
une
synergie entre
la
restriction de
l'oxygène et
l'activité de
l'eau
sur la
croissance
des
espèces.
Ce
travail
nous
a
permis
de
préciser
le
comportement
des
levures
et
notamment
celui
d'Hyphopichia
burtonii
qui
reste
similaire
sur grains
stérilisés
(non
vivants)
et
sur
les
grains
vivants
hébergeant
une
microflore
naturelle
très
complexe.
L'espèce
est
peu
sensible
à
la
restriction
d'oxygène,
tant
que
celle-ci
n'est
pas
totale.
Cette
extrême
tolérance
vis-à-vis
d'une
restriction
d'oxygène
pourrait,
à
l'avenir,
être
qualifiée de"microaérotolérance".
Cette
espèce
est
tout
à
fait
insensible
à une
teneur maximale en
gaz carbonique.
En
milieu
liquide,
et
en
présence de
faibles
quantités d'oxygène, et/ou
sous
gaz
carbonique,
les
teneurs
intracellulaires
en
ergostérol
d'Hyphopichia
burtonii
ne
sont
jamais
inférieures
à
celles
trouvées
dans
des
cultures
réalisées
en
atmosphère
libre
ainsi
qu'à
celles
trouvées
pour
les
moisissures.
Nous
n'avons
donc aucune raison de
penser que
les
déterminations
faites
sur riz,
stérile ou
non,
ne
représentent
pas
effectivement
la
croissance
pondérale
chez
cette
levure.
Dans
ces conditions expérimentales, les
taux d'ergostérol
qui
sont de
10
à 20
rng/g de
mycelium
sec
suivant les
mélanges gazeux,
évoluent
peu
et
restent
stables
pendant
la
phase
exponenLielle
et
stationnaire.

---

- 155 -
Ces
observations,
aux
conséquences
très
importantes
sur
le
plan
pratique,
nous
ont permis de
constater que
le niveau
élevé des
blastospores
de
levures
sur
les
grains et plus particulièrement
pour Hyphopichia
burtonii ne se traduit que
par
un
développement
mycélien
non
mesurable,
et
des
altérations
du
grain
plus
visibles
que profondes.
En
effet,
dans
ces
conditions
expérimentales,
les
teneurs
en
ergostérol
des
grains
varient
de
4
à
7
ug/g.
Ce
qui
correspond
aux
valeurs
limités
acceptables
pour
les
grains
conservés
à
l'air
libre
permettant
le
développement
des
moisissures
de
stockage.
Mais,
ces
valeurs
limites
ont
des
significations
très
différentes,
sur
le
plan
qualité
des
grains,
selon
la
nature
des
espèces spécifiques en
croissance.
Ainsi, pour les grains conservés en
présence de
faibles
quantités
d'oxygène,
permettant
un
développement
important
des
levures,
un
taux
d'ergostérol
de
7
Ilg/g
est
suffisant
pour
modifier
la
qualité
organoleptique
des
grains.
Pour ces levures , les grains de rIZ paddy et les céréales dans leur ensemble
sont sans doute en
fait
de
mauvais
substrats de
croissance.
Et
leur développement
superficiel, a sans doute
peu
de
conséquence pour les
grains tant que
les
levures
développées
restent
des
germes
banaux,
non
pathogènes
pour
l'homme
ou
pour
l'animal.
En conclusion, l'ensemble de
nos résultats conduit à distinguer deux types de
situation
radicalement
différent
en
ce
qui
concerne
l'évolution
microbiologique
de denrées
alimentaires
conservées
sous atmosphères
modifiées
:
-
Dans
le
premier
cas,
les
produits
vivants
(grains
de
céréales
par
exemple)
porteur
d'une
microflore
importante
dont
la
D.M.O.
est
plus
élevée,
l'anoxie
est
obtenue
très
aisément
par
autoconsommation.
La
stabilité
microbiologique
est
possible
à
l'origine
de
la
conservation
sous
atmosphères
modifiées
et aux aw
inférieures à 0,90.

---

- 156 -
- Dans
le deuxième cas,
pour les
produits
alimentaires non
vivants,
portant très
peu de germes de contamination, la D.M.a est très
faible et l'oxygène
résiduel
dans
les
gaz
industriels
les
plus
pur
est
suffisant
pour
développer
un
thalle.
La
stabilisation
microbiologique
de
ces
produits
par
les
atmosphères
modifiées
paraît difficile.
Sur le plan scientifique, au terme de cette étude, inévitablement limitée dans
le temps, des questions importantes restent posées
L'existence
de
métabolisme
fermentaire
chez
certaines
levures
rencontrées
rend
difficile
l'évaluation du
besoin
réel
en
oxygène.
Le
seul
fonctionnement
de
telles
activités
fermentaires
suffit-il
à
satisfaire
le
besoin
énergétique,
la
biosynthèse des
stérols ne demandant
alors
qu'un
minimum
d'oxygène qu'il
serait
intéressant
de
préciser
encore.
Le développement impo.rtanj c ra~~1il~,res, sur les grains conservées dans ces
.: ,'.'
'\\<'}~\\
conditions
éCOPhysiologiqUé;>::~:~s('}~ql;le nous avons isolées et identifiées
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sont qualifiées ici de "levJ'r.és :k~ty/~Kàge'~ ~t sont à l'évidence le matériel de choix
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pour de telles études.
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---

RESUME
Des
expériences
réalisées
sur
grains
stockés
en
cellules
étanches
à
différente activités de
l'eau ont permis de
montrer qu'il
était inutile de
créer une
atmosphère
anoxique
artificielle
pour
stabiliser
les
populations
microbiennes
naturelles.
Une
relation
quantitative
directe
existe
entre
la
croissance,
et
la
quantité
d'oxygène
disponible
dans
l'écosystème.
Aux
très
faibles
pressions
partielles
d'oxygène,
la
perte
de
viabilité
des
propagules
fongiques
est
d'autant
plus
rapide
que
l'activité
de
l'eau
des
grains
est
plus
élevée.
Les
qualités
technologiques
des
grains
restent
stables
pour
les
activités
d'eau
inférieures
à
0,95.
Seules
des
levures
sont
capables
de
se
développer
dans
ces
conditions
gazeuses,
dès
lors
que
l'activité
de
l'eau
est
supérieure
ou
égale
à
0,86.
Le
développement
d'Hyphopichia
burtonii (Boidin et al) Von Arx et Van Der Walt en
présence
de
traces
infimes
d'oxygène
et
l'arrêt
de
sa
croissance
en
anaérobiose
stricte
montrent
que
c'est
une
espèce
"rnicroaérotolérante".
En
enceintes
étanches
le
dioxyde
de
carbone
a
un
effet
inhibition
sur
les
populations
fongiques
(Aspergillus,
Penicillium).
Cependant,
le
dioxyde
de
carbone
employé
seul
ne
saurait
assurer
la
stabilité
microbiologique
des
grains
humides,
conservés
en
structures
insuffisament
étanches.
Quelques
soient
les
conditions
gazeuses
réalisées,
les
taux
d'ergostérol
intracellulaire
chez
Hyphopichia
burtonii
restent
constants.
Ceci
permet
une
interprétation
fine
des
comportements
et
des
évolutions
microbiennes
même
sous
atmosphères modifiées
; et
montre que
le riz
paddy est un
substrat de
croissance
peu
favorable,
relativement,
pour ces
"levures de
stockage".

---

CI
1·
1
RESUME
1·
Des
expériences
réalisées
sur
grains
stockés
en
cellules
étanches
à
différente activités de l'eau ont permis de
montrer qu'il était
inutile de
créer une
1
atmosphère
anoxique
artificielle
pour
stabiliser
les
populations
microbiennes
1
naturelles.
Une
relation
quantitative
directe
existe
entre
la
croissance,
el
la
quantité
d'oxygène
disponible
dans
l'écosystème.
Aux
très
faibles
pressions
1·
part iel les
d'oxygène,
la
perte
de
viabil ité
des
propagules
fongiques
est
d'autant
plus
rapide
que
l'activité
de
l'eau
des
grains
est
plus
élevée.
Les
qualités
l'
technologiques
des
grains
restent
stables
pour
les
activités
d'eau
inférieures
à
l,
0.95.
Seules
des
levures
sont
capables
de
se
développer
dans
ces
conditions
1·
gazeuses,
dès
lors
que
l'activité
de
l'eau
est
supérieure
ou
égale
à
0.86.
Le
développement
d'Hyphopichia
burtonii (Boidin et al) Von Arx. et Van Der Walt en
1
présence
de
traces
infimes
d'oxygène
et
l'arrêt
de
sa
croissance
en
anaérobiose
stricte
montrent
que
c'est
une
espèce
"microaérotolérante".
1
En
enceintes étanches le
dioxyde de
carbone
a
un
effet
inhibition sur les
1
populat ions
fongiques
(Aspergillus,
Penicillium).
Cependant,
le
dioxyde
de
carbone
employé
seul
ne
saurait
assurer
la
stabilité
microbiologique
des
grains
1
humides,
conservés
en
structures
insuffisament
étanches.
Quelques
soient
les
conditions
gazeuses
réalisées,
les
taux
d'ergostérol
1
intrace llul aire
chez
Hyphopicbia
burtonii
restent
constants.
Ceci
permet
une
1
interprétation
fine
des
comportements
et
des
évolutions
microbiennes
même
sous
atmosphères modifiées ; et montre que le
riz
paddy est un
substrat de
croissance
1
peu favorable,
relativement, pour ces "levures de
stockage".
1
1
1.
~I

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