MUSEUM NATIONAL
UNIVERSITE
4).
D'HISTOIRE NATURELLE
PIERRE ET MARIE CURIE
DE PARIS
PARIS VI
THE S E
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE
DOCTEUR ES SCIENCES PHYSIQUES
PRÉSENTÉE PAR
AUGUSTII'J BERE
ETUDES PHYSICQ-CHIMIQOES ET PHOTOCHfMIQUES
DES INTERACTIONS DE DERIVES DU DIAZAPYRENE
AVEC LES ACIDES NUCLEIQUES
SOUTENUE LE 17 OCTOBRE 1988
JURY
~1R . C.
HELENE
PRESIDENT
MR. J.M. LEHN
MME T.
MONTENAY-GARESTIER
rvlR . B.
VALEUR
EXAMINATEURS
MR. P.
VIGNY
MR. C.M. GARY-BOBO
..
\\'-~~~
'-.,
A
Michèle
Violette et Stéphanie
Danièle
et Paul
Le temps de l'absence ...
Je voudrais
témoigner
toute ma
reconnaissance à Monsieur Claude
HELENE,
Professeur
au
Muséum
National
d'Histoire
Naturelle,
Membre
de
l'Institut, qui a bien voulu m'accueillir dans son laboratoire pour me faire
acquérir une grande formation scientifique. Ce travail doit beaucoup à
sa
grande culture scientifique très rigoureuse.
Je suis reconnaissant envers Monsieur Jean-Marie LEHN,
Professeur
à l'Université Louis Pasteur de Strasbourg, Prix Nobel, d'avoir accepter de
juger ce travail, mais aussi d'avoir aimablement mis à ma disposition tous
les produits dont j'avais besoin.
~~.Q..
Je remercie également Monsieur Pierre VIGNY,
Professeur à l'Uni-
versi té Pierre et Mar ie Cur ie (PARIS VI), Mons ieur Bernard VALEUR,
Profes-
seur
au
Conservatoire
National
des
Arts
et
Métiers,
Monsieur
Claude
M.
GARY-BOBO,
Professeur
à
l'Uni versité
Pierre
et
Marie
Curie
(PARIS
VI),
d'avoir accepté de juger ce travail.
Madam~ Thérèse MONTENAY-GARESTIER,
Maître
de
Conférences,
Sous-
Directeur au Muséum National d'Histoire Naturelle a porté sur ce travail une
attention toute particulière. Je lui témoigne toute ma reconnaissance.
Mons ieur Mi chel ROUGEE, Maître de Conférences, Sous-Directeur au
Muséum National d'Histoire Naturelle m'a permis de m'initier aux techniques
de fluorescence dynamique. Je le remercie vivement.
Les produits utilisés au cours de ce travail ont été synthétisés à
l'Institut
Le
Bel
de
l'Université
Louis
Pasteur
de
Strasbourg
par
A.J.
BLACKER, J. JAZWINSKI et F.X. WILHELM. Qu'ils trouvent ici l'expression de
mes remerciements.
Les oligonucléotides ont été synthétisés au Centre de Biophysique
Moléculaire d'Orléans dans le laboratoire de Chimie dirigé par Monsieur N.T.
THUONG.
Qu'il trouve ici ainsi
que mesdemoiselles U.
ASSELINE et V. ROIG,
l'expression de mes remerciements.
Mademoiselle
M.
TAKASUGI,
Monsieur
L.
PERROUAULT
m'ont
aidé
à
réaliser certa.ines expér iences décrites dans ce travai 1.
Qu'ils en soient
remerciés.
Les membres du laboratoire, Mesdames N. LOREAU, C. VEVER-BIZET, E.
SAISON-BEHMOARAS,
Mesdemoiselles M.
CHEVRIER,
C.
CHAVANY,
Messieurs
R.V.
BENSASSON, D.
BRAULT, C. CAZENAVE, M. DELLINGER, J.C. FRANCOIS, T. LE DOAN,
P. RAINASSE, E. RICHARD, J.S. SUN, J.J. TOULME, P. VERSPIEREN, m'ont apporté
à des titres divers un encouragement qui m'a beaucoup soutE:nu au cours de
mon séjour. Je leur témoigne mon amitié.
Je voudrais remercier très particulièrement Mesdames C. ALVAREZ,
H.
PARTHENAY
et
Mademoiselle
C.
MESMACQUE
qui
ont
dactylographié
le
manuscrit avec beaucoup de patience, mais aussi avec beaucoup de sympathie à
mon égéil'd.
Je remercie enfin Madame R. DEBET qui m'a apporté un concours pour
la
recherche
des
références bibliographiques 1
Mons ieur O.
DELGADO qui
a
assuré les tirages photographiques et Monsieur J. L. MERGNY qui m' a aidé à
parfaire ce document.
SOM MAI R E
INTRODUCTION GENERALE
Références bibliographiques
5
MATERIEL ET METHODES
PRINCIPES ET BASES THEORIQUES
8
l
- EQUATIONS FONDAMENTALES EN SPECTROSCOPIE D'ABSORPTION
ET D'EMISSION MOLECULAIRE
10
1. Equations fondamentales
10
2. Application de la fluorescence
14
3. Polarisation de fluorescence
16
II
- DICHROISME LINEAIRE
19
III - REACTIONS DE PHOTOOXIDATION_DES ACIDES NUCLEIQUES
PHOTOSENSIBILISEES P7/:R~ltotd~'NTS
22
,-~,.
~
-~
J'/;
\\ '.\\
IV
- TOPOLOGIE DE L' liDN S,URENF(OÛL'Êl t
. )1. '. \\ •
30
\\9 \\
~-
-'-,1
\\\\\\ J,é!
V
- MISE EN OEUVRE EXPERIMElllÀ'bE
. ''''11''
33
.
1. AbsorptlOn
~:me.~~~
-
.
33
2. Fluorescence
34
3. Méthodes biochimiques
39
Références bibliographiques
45
CHAPITRE l
PROPRIETES SPECTROSCOPIQUES DU CHLORURE DE N,N'-DIMETHYL-
2,7-DIAZAPYRENIUM (MDAp2+) ET DE 2,2-[METHYLENE-DI-(1 ,4-
PHENYLENEMETHYLENE-DIYL)]-BIS-(7-N-METHYL-2,7-
DIAZAPYRENIUM) (BIS-DAp4+)
. . . . .
50
l
- ABSORPTION ET EMISSION DU MDAp2+ ET DU BIS-DAp4+
50
1. Propriétés d'absorption
. . . . .
50
2. Propriétés d'émission de fluorescence
57
II
- INHIBITION DE LA FLUORESCENCE DU MDAp2+ ET DU BIS-DAp4+
PAR LES HALOGENURES
63
1. Inhibition de la fluorescence statique
63
2. Inhibition dynamique de la fluorescence
65
III - INTERACTION DU MDAP2+ ET DU BIS-DAP4+ AVEC LES
MONONUCLEOTIDES
72
1. Etude en absorption
72
2. Etude en fluorescence statique
76
3. Etude en fluorescence dynamique
80
Références bibliographiques
83
CHAPITRE II
INTERACTION DU MDAp2+ ET DU BIS-DAp4+ AVEC LES ACIDES
NUCLEIQUES
85
l
-
ETUDE EN ABSORPTION
85
1 • Interaction avec les acides nucléiques
en simple brin
.
. . . . . . .
85
2. Interaction avec les acides nucléiques en
double brin
.
.
91
II
- ETUDE EN FLUORESCENCE
99
1. MDAP2+
99
2. bis-DAp4+
102
III - FLUORESCENCE DYNAMIQUE
103
a) Polyd(G-C)-polyd(G-C)
103
b) ADN de thymus de veau
104
c) Polyd(A-T)-polyd(A-T)
105
d) Poly(dA)-poly(dT)
105
IV
- DENATURATION THERMIQUE DES ACIDES NUCLEIQUES EN
PRESENCE DU MDAp2+
. . . .
. . . .
107
1. Dénaturation suivie en absorption
107
2. Fluorescence
109
V
- DICHROISME LINEAIRE DES COMPLEXES ACIDES NUCLEIQUES-
MDAp2+ / BIS-DAp4+
. . . . . . . . . . . . . . .
118
VI
- DETORSION DE L'ADN SURENROULE DE pBR322 PAR LE MDAp2+
ET LE BIS- DAp 4+
.
123
Références bibliographiques
129
CHAPITRE III
DEGRADATION PHOTOCHIMIQUE DES ACIDES NUCLEIQUES PAR LE
MDAP2+ ET LE BIS-DAp4+ : NUCLEASES ARTIFICIELLES
132
INTRODUCTION
132
l
- DEGRADATION D'OLIGONUCLEOTIDES PAR LE MDAP2+ ET LE
BIS-DAP4+
. . . .
135
1. Profil de la dégradation
136
2. Produits de dégradation
139
3. Efficacité de dégradation
140
4. Cinétique de dégradation
144
I I
- DEGRADATION DU 27MERE-AS PAR L'OLIGOTHYMIDYLATE
TS-MDAP2+
.
. . . .
147
1. Profil de dégradation du 27mère-As par TS-MDAP2 t
147
2. Cinétique de dégradation
. . . .
153
3. Effet de la concentration en TS-MDAP2+
157
4. Effet de la concentration ionique
163
CONCLUSION
167
Références bibliographiques
168
CONCLUSION GENERALE
170
INTRODUCTION
L'expression des gènes dans une ce llule dépend à la fo is de sa
fonction, de sa différenciation, mais aussi de son état physiologique. Cette
expression différentielle des gènes est
soumise
à une régulation en fonc-
tion des besoins cellulaires et de l'environnement. Le premier mécanisme de
régulation qui ait été découvert porte sur le métabolisme du lactose chez le
colibacille. Ce mécanisme comme ceux qui furent découverts par la suite chez
d'autres
procaryotes ou chez
les eukaryotes fait
intervenir
une protéine
régulatr ice. D' une fa~on générale les protéines régulatr ices . interv iennent
en se fixant sur une partie reconnue de l'acide nucléique soit au niveau de
l'ADN pour activer ou pour inhiber la transcription du gène en ARN messager,
soi t sur le pré-ARN messager pour contrôler son épissage en ARN messager,
soit
enfin
au
niveau
de
l'ARN
messager
pour
moduler
sa
traduction
en
protéine.
Cette
régulation
repose
essentiellement
sur
la
reconnaissance
spécifique d'une séquence donnée de l'acide nucléique par la protéine régu-
latrice. Cette reconnaissance met en jeu :
- des interactions non spécifiques : des li&isons électrostatiques
s'établissent entre les phosphates du squelette phosphodiester de l'acide
nucléique et les résidus des acides aminés basiques de la protéine;
2
-
des
interactions spécifiques notamment des
liaisons hydrogène
avec les bases nucléiques, des interactions d'empilement des noyaux aroma-
tiques des acides aminés avec ceux
des bases et enfin une reconnaissance de
la structure secondaire de l'acide nucléique par la structure tertiaire de
la protéine (1-9).
La découverte de la régulation de la traduction par des ARN courts
ou ARN anti-sens montre que les acides nucléiques peuvent intervenir comme
agents régulateurs de l'expression génétique. (10-14). Ce mécanisme de régu-
lation a aussi été mis en évidence lors de la réplication de certains
plas-
mides
(15). La reconnaissance d'une séquence de
l'ARN messager par l'ARN
anti-sens
repose
sur
la
complémentarité
des
paires
de
bases
par
des
liaisons
hydrogène
qui
assurent
une
grande
spéc ific ité à
l'interaction.
Cette reconnaissance dépend de la longueur de l'oligonucléotide (47).
La possibili té de réguler l'expression des gènes d'une façon sé-
lective par des oligonucléotides consti tue donc une autre stratégie et une
approche fondamentale
intéressante dans la mesure où la synthèse de ces
oligonucléotides peut être réalisée par voie enzymatique (16, 17, 43) ou par
voie chimique (18-23, 44).
La synthèse chimique permet de nombreuses modifications des oligo-
nucléotides qui les rendent résistants aux endonucléases. En incorporant des
anomères a des nucléosides à la place des anomères S naturels (24-27) ou en
introduisant des méthylphosphonates à la place des phosphates par exemple,
on accroît de manière considérable la résistance aux nucléases des oligo-
nucléotides modifiés. De plus cette dernière mo_dification augmente la per-
méabilité membranaire des oligophosphonates ainsi obtenus (28, 29).
La stabilité du complexe très spécifique
formé entre l 'oligonu-
,
cléotide et sa cible est
fortement accrue par l'intercalation d'un agent
intercalant couplé par liaison covalente à l'oligonucléotide. Cette nouvelle
famille de molécules a été développée par le Professeur
Claude Hélène au
laboratoire de
Biophysique du Muséum
Nat ional
d' Histoire
Naturelle
en
collaboration avec l'équipe du Dr. Nguyen T. Thuong au
Centre de Biophy-
sique Moléculaire (CNRS) à Orléans (29-33, 44).
3
Ces nouvelles molécules (ONSI) sont capables d'inhiber la traduc-
tion d'un ARN messager aussi
bien in vitro que in vivo (23,
34,
46). La
fixation d'un oligonucléotide couplé à un agent
intercalant (ONSI)
sur sa
cible complémentaire reste cependant soumise à la loi d'action de masse et
une
expression résiduelle
du
gène-cible
sera
toujours
observée.
Afin
de
rendre l'inhibition
irréversible, il
a
été
couplé
à
ces
oligonucléo-
tides des agents chimiques susceptibles de créer des dommages sur l'acide
nucléique cible.
Ces composés chimiques induisent des dommages sur l' ac ide
nucléique cible soit par activation chimique, soit par activation photonique
(27, 35, 36).
Couplé
à
des
oligonucléotides,
l'EDTA
en
présence
de
Fe 3+,
l 'orthophénanthroline
en
présence
de
Cu 2+ provoquent
une
coupure
de
la
chaîne
phosphodiester
de
l'acide
nucléique
cible.
L'amor~age de
la
réaction
est
effectuée
par
l'addition
d'un
réducteur.
(27-35,
45).
La
réaction de coupure de la cible
est due à la production des radicaux hydro-
xyles OH" dans le milieu. Le transfert d'un électron du cation métallique
vers l'oxygène moléculaire est à l'origine d'une
succession de
réactions
conduisant à la production du radical hydroxyle (réactions de Fenton).
Les dérivés possédant un groupement azide,
la proflavine et les
porphyrines couplés de fa~on covalente
à des oligonucléotides provoquent la
formation
de
pontages entre l 'oligonucléotide et
sa
cible
complémentaire
sous irradiation. Le traitement de ces complexes par la pipéridine génère
des coupures de la cible au niveau des pontages (36-39).
Les intercalants des acides nucléiques sont généralement des molé-
cules aromatiques, planes et chargées. Diverses molécules de ce type ont été
utilisées comme agent intercalant lié à l 'oligonucléotide : l'acridine,
la
2-méthoxy, 6-chloro, 9-aminoacridine, la proflavine (4~, 45).
C'est dans ce cadre que nous nous sommes intéressés aux nouvelles
molécules dér i vées du pyrène qui ont été synthétisées
dans le laboratoire
du Professeur Jean Marie
Lehn à l'Institut Le Bel de l'Université Louis
Pasteur
de
Strasbourg
(40-42).
L'étude
de
ces
molécules,
le
N,N'-diméthyl-2,7-diazapyrène
(MDAp2+)
et
son
dimère
le
bis-DAp4+
(cf.
figure 8 du chapitre matériel et méthodes) et de leur interaction avec
les
acides nucléiques fait l'objet de ce travail.
4
Nous avons étudié les propriétés physicochimiques de ces nouvelles
molécules ainsi que
les propr iétés photochimiques qui leur confèrent
des
caractér istiques d "'endonucléas es" lorsqu' e lIes sont couplées à des oligonu-
cléotides.
Le chap itre l résume l'essentie l des propriétés spectroscop iques
des deux composés libres et en présence de certains inhibiteurs de fluores-
cence
étudiées
par
spectroscopie
d'absorption
et
d'émission.
Les
interactions avec les mononucléotides sont aussi abordées dans cette partie.
Le chapitre II traite des interactions de ces molécules avec les
acides
nucléiques
en
simple
et
en
double
brin
étudiées
par
les
mêmes
méthodes. Les résultats du dichroïsme linéaire nous ont permis de déterminer
l'angle moyen que fait la molécule de MDAP2+ avec l'axe de la double hélice
des acides nucléiques. Ce résultat est un argument favorable à l'intercala-
tion de cette molécule entre les paires de bases. Il est également montré
par voie
biochimique que ces nouvelles molécules
détordent
l'ADN suren-
roulé à la manière de certains intercalants
(48).
La dégradation des acides nucléiques par ces
composés
libres et
couplés
à
un
octathymidylate
est
étudiée
dans
le
chapitre
III
par
des
méthodes biochimiques. Les résultats
montrent que l'hybridation de l'octa-
thymidylate protège la séquence
complémentaire cible et que les dommages
causés sur la cible s'observent de chaque côté de cette zone de protection.
Les résultats obtenus montrent que dans nos conditions expérimentales il se
forme toujours Une
proportion importante de triple hélice. Couplées à des
oligonucléotides,
ces
nouvelles molécules
se
comportent
comme
des
"endo-
nucléases" spécifiques d'une séquence déterminée de l'ADN.
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Thèse
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MATERIEL ET METHODES
8
PRINCIPES ET BASES THEORIQUES
Au cours de ce
travail,
nous
avons
utilisé
essentiellement
des
méthodes
spectroscopiques
pour
suivre
les
interactions
entre
les
acides
nucléiques et les colorants :
- absorption moléculaire
- fluorescence statique et dynamique
- dichroïsme linéaire
Nous
avons
également
utilisé
les
techniques
électrophorétiques
pour séparer les différents topoisomères du plasmide pBR 322 en fonction du
taux de surenroulement et de la charge nette de chaque topoisomère. Enfin,
nous résumons dans
ce chapitre les bases théoriques des mécanismes
des
réactions d'oxydation des acides nucléiques photosensibilis~es par les colo-
rants qui ont été utilisés.
9
Etats singulets
Etats triplets
5 J
t
Conversion
interne
~
~
5,
' .
6
-1
1-
Relaxation
c..
vibrationnelle
'"
§
~
.-
v
CD
....
(
onversion
C
(
V'l
~
interne
)
VI
(
~
)
1
V
~
+ - -
V'l
~ ~s,
)
Conversion
CD
)
Il
intersystème )
"'
1-
)
-
(
~
((
1
~
u
~.
.,..
U
elaxation
0
R
~
-
vib rationnelle
~
~
~ Conversion
intersystème
~Z
)
~
et
u..
~
ILl
U
<;,
("'1
V'l
<;,
~
~
w
~
a:
Relaxation
0
1
)
:r
vibrationnelle
a.
)
V'l
(
.,..
1
1
(
{
0
?
â:
-
"
...
Figure 1
Diagramme
de
Jablonski
et
transitions
mises
en
jeu
lors
de
l'excitation d'une molécule organique.
10
l - EQUATIONS
FONDAMENTALES
EN
SPECTROSCOPIE
D'ABSORPTION
ET
D'EMISSION
MOLECULAIRE
1. Equations fondamentales
j
•
Les molécules, à l'exceptlon de l'oxygène moléculaire, sont en so-
I
lut ion à la température ambiante dans
leur état fondamental singulet So.
L'absorption d'une radiation lumineuse fait passer la molécule de son état
fondamental
singulet
So
à un état
exci té singulet
Sn dans
un
temps de
l'ordre de 10- 15 seconde. La désactivation de l'état excité Sn vers l'état
fondamental
So s'effectue suivant plusieurs mécanismes
représentés par le
diagramme de
Jablonski (figure 1).
La
différence
d'énergie
entre
deux
ni veaux
exci tés
Sn
et Sn-l
(n > 1) étant faible, la conversion interne d'un état Sn (n > 1) à l'état Sl
s'effectue très rapidement et conduit la molécule au niveau vibrationnnel le
plus bas sans émission de photon avec une constante de vitesse de l'ordre de
10+ 12 s-l.
La désactivation de l'état Sl
vers l'état So s'effectue beaucoup
plus lentement, la différence d'énergie entre ces deux états étant beaucoup
plus
grande.
Plusieurs mécanismes
de désactivation de l'état Sl
entrent
alors en compétition.
,--::;"----
~::K.'\\... '/\\l "
~
t...'~
,\\.
/~
~__---............. • ra :.;\\...
a) Une désactivation non radiative pal\\ ?',ihaxation vibrationnelle
/. ~'r
,
\\
-"\\
avec une constante de vitesse kS nr • ~\\~_ ,.- --2.~~) ,~~
\\ '
./',.:
b) L'émission d'un photon fqtt"passer J:i'1molécule de l'état Sl à
,,~f f)f'mQnt'\\J.ç~
9
1
l'état So avec une constante de vitesse KF~de~r~ordre de 10+
s-
: c'est le
phénomène de fluorescence.
c) Le niveau d'énergie d'un état triplet est toujours inférieur à
celui de l'état singulet correspondant
: une conversion
intersystème peut
dépeupler l'état Sl
pour peupler l'état Tl
avec une constante kcis. L'état
triplet peut alors se désactiver de façon non radiative avec une constante
de vitesse kTnr ou par émission d'un photon avec une constante de vitesse
1 1
kpH de l'ordre de 10+ 6 à 10- 1 s-l :c'est le phénomène de la phosphorescence.
L'absorption de la lumière par une solution suit la loi de Beer-
Lambert
. .
IlIa
et A
Log 10/1
E.C.L
(l)
o~ - IoetI représentent l'intensité lumiDeuse incidente et émer-
.. gente • .
- A est l'absorbance de la solution.·
-
c._. est
le
coeff ic ient
décadique·d' extinction
molaire
(M-l
cm- 1 ).
- C est la concentration du soluté en.molarité •
.. ..,... l est le trajet optique (cm).·
Si I~bs est la quantité de lumiè~e ~bsorbée pa~ unité de temps et
par unité de volume,
la concentration des ·moléèLiies excitées à l'état S1
[C*] peut s'éérire à tout moment:
d [C*]
I abs -
L
ki [C*]
( 2)
dt
o~
Lki
Lorsque
la
solution
est
soumise
à
une
excitation continue,
on
admetqu'à l'état stationnaire la variation de la concentration des molécules
excitées en fonction du temps "est nulle :
d[C*]
-------
a
dt
d'où
Iabs
L
ki [C*]
(3)
12
Par
contre,
lorsque
la
solution est soumise à une
illumination
théoriquement infiniment brève, le nombre de molécules de l'état S1 qui se
désactivent vers l'état Sa par les différents mécanismes représentés sur le
diagramme de Jablonski suit la relation suivante:
d[C*]
dt
(4 )
L'intégration de l'équation (4) conduit à
t
[C*]
[Ca*]exp (- ----)
(5 )
TF
L' intensi té de
fluorescence
observée après
l'exci tation
décroi t
alors de façon exponentielle :
t
f(t)
kF [Ca*]exp (- ----)
(6)
TF
On appelle temps de vie radiatif,
Ta = 1/kF, le
temps de vie de
fluorescence
thé or ique d'une molécule dont
le
seul
mode
de
désactivation
serait l'émission d'un photon de fluorescence.
TF est le temps de vie de fluorescence de l'état singulet S1. Il
tient compte 1e tous les mécanismes possibles de désactivation de l'état
s, .
(7)
Le rendement quantique de fluorescence est alors défini comme le
rapport du nombre de photons de fluorescence émis sur le r.orrbre
total de
photons absorbés par la molécule.
13
epF
[CO*]-l J
f(t) dt
o
TF
TO
(8)
D'après la
loi
de
Beer-Lambert,
la
concentration des
molécules
excitées [Co*] est égale à la quantité de lumière absorbée (1 0 -1)
et l'on
peut alors écrire
[Co*]
(9)
L'intensité
totale
de
fluorescence
émise
en
fonction
du
temps
devient
epF
t
f(t)
• exp (- ----)
( 10)
TF
TF
Lorsque l'absorbance de la solution est faible, à grande
dilution
A
ECI < 0,05), la relation (10) peut s'écrire:
epF
t
f(t)
2,3 E l[C] 1
exp (- ----)
( 11 )
0
TF
TF
Dans une solution contenant plusieurs espèces excitées,
la fluo-
rescence observée est la somme de la fluorescence de chaque espèce i
n
epi F
t
F(t)
I 2,3 q·l[cd 1
------
exp (-
-----)
( 12)
0
i =1
TiF
TiF
Si l'on intègre cette relation en fonction du temps, on obt ient
n
F
2,3 l t Ei [Ci] epi F
i=l
14
Pour
une
excitation
brève,
l'analyse du déclin
de
fluorescence
doit
en pr incipe
permettre l' identif icat ion du
nombre d' expèces
fluores-
centes présentes dans la solution (relation '2).
2. Applications de la fluorescence
La molécule exci tée reste dans son état singulet S,
pendant un
temps relativement long par rapport au temps d'excitation. Durant ce temps,
outre
les
différents
mécanismes
de
désactivation
déjà
cités
dans
le
diagramme de Jablonski,
la molécule peut voir son émission de fluorescence
modifiée par d'autres phénomènes:
- L'environnement du milieu : la relaxation de la cage du solvant
autour du moment de transition de la molécule excitée peut déplacer
l'émis-
sion de fluorescence vers de plus faibles énergies.
-
La molécule excitée peut transférer son énergie
vers d'autres
molécules
présentes
dans
la solution
ce phénomène peut conduire à des
réactions photochimiques et/ou à une désactivation non radiative du chromo-
phare. On parle alors d'extinction de fluorescence par transfert d'énergie.
- Le transfert d'énergie peut également se produire vers l'oxygène
moléculaire
via
l'état
triplet
du
chromophore
pour
générer
de
l'oxygène
singulet
qui
est
à
l'origine
de
nombreuses
réactions
d'oxydation
des
composés organiques.
-
Une
interaction soi t
de l'état fondamental
Sa soit de l'état
excité S, avec un inhibiteur de fluorescence peut conduire à une inhibition
de la fluorescence du chromophore
: un
inhibiteur de fluorescence est une
substance qui n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde d'excitation du
chromophore, mais qui éteint la fluore5cence de ce dernier. Plusieurs méca-
nismes peuvent expliquer cette inhibition suivant les deux schémas réaction-
nels suivants :
a) Inhibition statique
L'inhibiteur de fluorescence noté Q interagit à l'état fondamental
15
avec le chromophore pour donner un complexe (AQ) qui n'émet plus de fluo-
rescence.
A + Q ~ AQ
K
( 14 )
La fluorescence mesurée reste toujours proportionnelle à la concentration de
l'espèce libre A. Si a
est la fraction de A complexé avec l'inhibiteur Q
(AQ), alors:
F
K (1 - a) [AJ o
Fo
K [A]o
et
Fo-F/F
ail-a = K[ QJ ou
Fo/F
1 + K[QJ
( 15 )
La constante K mesurée à partir de la variation de l'intensité de
fluorescence en fonction de la concentration en inhibiteur Q représente la
constante d'équilibre de la réaction de complexation à l'état fondamental.
L'intensité de fluorescence diminue mais le temps de vie reste inchangé.
b) Inhibition dynamique
Si le complexe avec
l'inhibiteur se forme avec le chromophore à
l'état excité,
la désactivation de ce complexe entre alors en compétition
avec les autres modes de désactivation de l'état Sl'
A* + Q
A + Q
Si
kQ est la constante cinétique de désactivation de
A* par Q, alors le
temps de vie de fluorescence de l'état excité 1 varie suivant la relation
où 10 est le temps de vie de fI uorescence du chromophore en l'absence de
16
l'inhibiteur Q et kQ est la constante de vitesse mesurant l'accessibilité du
chromophore excité à l'inhibiteur. Le produit kQ TO est appelé constante de
Stern-Volmer.
L'extinction de la fluorescence se traduit alors par un raccour-
cissement du temps de vie. Cette extinction croit quand la concentration en
inhibiteur
augmente
et
devient
très
importante
quand
le temps de vie de
l'espèce libre est long.
3. Polarisation statique
Dans une solution fluide isotrope, les moments dipolaires de tran-
-+
-+
sition d'absorption ~a et d'émission ~e des molécules sont orientés de façon
statistique comme
les
molécules
elles-mêmes.
La
probabilité
d'absorption
- + - + 2
,-+
d'un photon pour une transition donnée est proportionnelle à < ~a.K > ou K
est le vecteur unitaire du champ électrique de l'onde incidente. Lorsque la
solution est excitée par une lumière polarisée, la distribution des molécu-
les excitées devient anisotrope (1,2). C'est le phénomène de la photosélec-
tian.
Les moments de transi tian en absorption ïia font un angle B avec les
-+
moments de transition en émission ~e. Pour une lumière polarisée
verticale-
ment
le rapport
de
polarisation
est
donnée
par
l'équation de
Perrin
et
Jablonski (3,6) :
p
(3 cos 2 B - 1 )/(cos2 B + 3)
On mesure l'anisotropie statique par la relation
3 cos 2 B - 1
r
( 18 )
5
2
1
1
ou
(
)-1
r
( 19 )
3
p
3
Des équations (17) et (19), on déduit l'intervalle de variation de r et de
p :
\\ 7
EXCITATION
VERTICALE
+-
échantillon
EXCITATION
HORIZONTALE
+-
échantillon
Figure 2
Schéma pour la mesure de l'anisotropie de fluorescence.
• MC signifie monochromateur.
· (IVV + 2 IVH) représente l'intensité totale de fluorescence.
· Pour corriger
l'effet de la dépolarisation introduite par les
monochromateurs,
IVV est rempla~ée par GIVV oG G est un facteur de correc-
tion défini
par: G = IHV/IHH
IHH et IHV désignent les intensités de fluo-
rescenc~ lorsque le polariseur en excitation est placé horizontalement
et
celui en émission est placé respectivement soit à l'horizontale,
soit à la
verticale.
18
2
et
5
5
3
2
Dans la pratique, l'anisotropie statique de fluorescence
r et le
rapport de polarisation p sont mesurés par les relations suivantes :
IVV - IVH
r
=
(20a)
IVV + 2 IVH
IVV - IVH
p
(20b)
IVV + IVH
Dans
ces
formules,
IVV
et
IVH
représentent
respectivement
leS
intensités de fluorescence mesurées lorsque le polariseur à l'émission est
parallèle ou perpendiculaire au polarisateur à l'excitation en position ver-
ticale (figure 2).
La polarisation d'une molécule en solution rigide est indépendante
du temps,
mais en solution la polarisation varie en
fonction de nombreux
paramètres. Avant d'émettre un photon de fluorescence,
la molécule excitée
peut être soumise à diverses contraintes qui provoquent une dépolarisation
de l'émission:
- mouvement brownien
- déformations rotationnelles et vibrationnelles
transferts d'énergie à une autre molécule de même nature,
mais
possédant une orientation différente ou à une molécule de nature
différente.
19
II - DICHRüISME LINEAIRE
Lorsqu'une
solution
d'acides
nucléiques
est
soumise à l'action
d'une
force
extérieure
favorisant
une
orientation
préférentielle
de
ces
macromolécules,
(champ
électrique,
force
hydrodynamique),
les
molécules
tendent à s'orienter avec le grand axe de la double hélice parallèlement au'
champ de
la
force
extérieure
(7-10).
La
différence
d'absorption
d'une
lumière polarisée soit parallèlement (Ail) soit
perpendiculairement (Al) au
champ de la force imposée permet de définir le
dichroïsme linéaire ~A (À)
et le dichroïsme linéaire réduit ~A/A (À).
M
(À) =
Ail - Al
~A/A (À) = 3/2 (3 cos 2 a - 1) f(E)
A (À) représente l'absorption isotrope de la solution non soumise
à l'action du champ d'orientation.
f(E) est une fonction qui définit le pourcentage de l'orientation
des macromolécules en fonction de l'intensité du champ d'orientation. Cette
fonction
tend vers l'unité lorsque la valeur du champ d'orientation aug-
mente, toutes les molécules s'orientant
parallèlement au champ de la
force
externe. (11-17, 76-78).
a représente l'angle formé entre le moment dipolaire de transition
d'absorption des bases nucléiques et l'axe de la double hélice
qui
est
parallèle au champ d'orientation.
La valeur
théorique limite du dichroïsme linéaire réduit est de
-1,50 ce qui correspond à une valeur de l'angle a de 90°. Dans ces condi-
tions, le moment dipolaire de transition d'absorption qui est
contenu
dans
le plan des bases, fait un angle de 90° avec l'axe de la double hélice (17).
Expérimentalement,
pour
la forme
B de
l'ADN,
les
résultats
des
mesures du dichroïsme linéaire réduit donnent un angle de 73° + 2 qui est
assez différent de la valeur de 83° + 1 obtenu par mesures cristallographiques
sur des fi br es d'ADN (1 3, 18, 19).
20
Pour
des
acides
nucléiques de haut poids moléculaire,
f(E)
tend
effecti vement vers 1 dans le cas où la force extér ieure est un champ élec-
trique
(11-17).
Lorsque
la
force
extérieure est
une
force hydrodynamique
(cellule de Couette)
le
facteur
d'orientation reste
très
faible
(23,
24,
76,77).
Application
Lorsque
de
pet i tes
mo lécules
aromat iques
chargées
interagissent
avec les acides nucléiques, deux types de complexes peuvent être caractéri-
sés : un complexe externe de nature électrostatique entre les phosphates et
les charges portées par les molécules aromatiques et un complexe d'interca-
lation de la molécule entre deux paires
de bases à l'intérieur de la double
hélice.
Même si
la
molécule possède
un plan de
symétrie,
l'intercalation
dans un environnement
asymétrique, induit un dichroïsme linéaire. La mesure
de ce
dichroïsme induit permet de connaître l'angle que fait le plan de la
molécule avec l'axe de la double hélice et permet donc de distinguer théori-
quement un complexe externe d'un
complexe d'intercalation.
le dichroïsme linéaire réduit du colorant qui absorbe en dehors de
la zone d'absorption des bases est alors:
~A (chromophore)
3
-----------------
(>.)
=
---:- __ (3
cos 2 8 - 1)
f( E)
A
~\\tJiR!ê4
".;;.S'·
/1~~
rV~ ~..~
v
r>
'\\
-~
Si
l'on admet que les bases"-(lueléiques"';font un angle de 90° par
rapport à l'axe de l'hélice (16,
1t~26) i~~s le\\ ~Jnchrorsme réduit dans la
\\ ~ \\
',,- J~.)1
zone d'absorption des bases (260 nm)~\\!~st:
~ ;.,{:;,
\\ 0 /
"-.~-.',1
~r)(;
é~/
~.~:~~~~~.~
3
3
(260 )
[(3 cos 2 (90) - 1)J
f(E)
= - - - -
f(E)
A
2
2
Pour s'affranchir
du facteur
d' or ientation f (E) qui dépend beau-
coup de l'intensité et de la nature de la force extérieure d'orientation, le
pararamètre A'
a été défini
: il relie le dichroïsme réduit dans la bande
d'absorption
du
colorant
à celui
observé
dans
la
bande
d'absorption
des
bases nUCléiques.
21
Le paramètre A' permet de calculer l'angle a que fait le moment de
transition
d'absorption
du
colorant
avec
le
grand
axe
de
l'hélice
de
l'acide nucléique. (20-22, 78).
6A 1 A (À)
(colorant)
A'
1 - 3 cos 2 a
(23 )
M 1 A (260 nm)
Cos a
[1/3 (1
-
A' )J1/2
(24)
ou 6AI A 0)
représente le dichroïsme linéaire réduit du complexe dans la
zone d'absorption du colorant.
MI A (260) est le dichroïsme linéaire réduit des bases nucléiques à 260
nm.
A' varie de - 2 à + 1 lorsque l'angle a varie de 0 à 90°.
La
figure
3
représente
la
variation
du
rapport
A'
entre
le
dichroïsme
linéaire
rédui t
dans
la
bande
d'absorption du chromophore et
celui mesuré dans
la bande d'absorption des bases nucléiques (260 nm)
en
fonction de l'angle 6.
+1.0
Ur -------J'-----..j
-1.0
, IdeQl
Figure 3 . Var' t'
.
la Ion du rapport A' entre le dichroïsme linéaire réduit dans
d
l
la bande d'absorption du chromophore
(visible)
et celui mesu é
l ~ns l a bande d'absorption des bases nucléiques (260 nm)
en fonction ~
l ,an~ e 6 que, fait le plan du chromophore avec l'axe de la double hélic de
aCIde nucléIque.
e
e
22
III - REACTIONS
DE
PHOTOOXIDATION DES ACIDES NUCLEIQUES PHOTOSENSIBILISEES
PAR DES COLORANTS
Dans les réactions de photooxidation des acides nucléiques ou des
bases nucléiques par les photosensibilisateurs, on admet généralement que le
photosensibilisateur
intervient
comme
une
entité
réactive
dans
son
état
triplet ou dans son état singulet (25,26). Deux grands mécanismes
découlent
de ces réactions photosensibilisées.
Le processus du type l est caractérisé par une interaction pri-
maire du substrat avec l'état excité
triplet et/ou singulet du photosensi-
bilisateur.
Ces
réactions conduisent à la formation de radicaux soi t
par
transfert d'électron soit
par
transfert
ct' atome d' hydrogène.
Les
radicaux
formés interagissent avec l'oxygène moléculaire et conduisent à la formation
de composés d'oxygénation.
Parmi
les réactions
de
photoox idat ion
par
les
radicaux, on peut distinguer d'une fa90n générale quatre types de mécanismes
réactionnels
- Dans les milieux polaires,
la formation d'un complexe à trans-
fert de charge avec l'oxygène moléculaire conduit à la formation de l'anion
superoxyde 02'-'
P+aqueux + 02'-aqueux
~
réactions
- Le photosensibilisateur à l'état excité peut interagir directe-
ment avec les bases nucléiques en cédant ou en
acceptant un électron dans
une réaction d'oxydo-réduction. Le radical anion formé réagit avec l'oxygène
moléculaire pour produire l'anion superoxyde 02·-.
p* + B
p.- +
réactions
23
- L'interaction du photosensibilisateur excité avec le
substrat
peut se traduire par le transfert d'un atome d'hYdrogène.
p* + aH
-+
PH·
+
a-
BOO-
-+
P + BOOH
PH"
- Enfin le photosensibilisateur à l'état excité subit une disso-
ciation intramoléculaire avec formation de radicaux qui vont réagir sur le
substrat et finalement conduire à la réaction d'oxydation_
p*
-+
P-
02
P + a- -
oxydation
Lorsque
l'anion
superoxyde
02--
est
formé dans le milieu,
plu-
sieurs schémas de réactions d'oxydation peuvent avoir lieu parmi lesquels on
peut citer :
- une réaction de dismutation engendrant de
l'eau oxygénée_ Cette
réaction quoique exergonique est très lente en milieu neutre_ (79, 80)_
.02-- + 02--
----*
02
+ 02 2-
2H+
2°2--
- en présence de certains cations métalliques, l'anion super oxyde
peut perdre son électron dans une réaction d'oxyda-réduction,
conduisant à
la formation du radical hydroxyle OH- suivant la réaction de Haber et Weiss_
°2-- + Fe 3+ - Fe2+ + °2
2H+
02-- + 02-- - H202 + 02
H20 2 + Fe 2+ ------+ OH- + OH" + Fe 3+
24
aIl a
HN~~')
~"N,AN
H2N
-y-0~
AcO )--1
AcO
Figure 4A
Produits
d'oxydation· du
3',
S'-di-O-acétyl-2'-désoxyguanosine
par l'oxygène singulet d'après Cadet J. et collaborateurs (26).
288
counts
310
NH
Il
H2N""--N=< COOH
NH
ACOy
331
AcO
channel
mi
Figure
4B
Figure 48
Principal
produit
de
photooxydation du
3'.
5'-di-O-acétyl-2'-
déoxyguanosine résultant des réactions photochimiques du type 1.
Spectre de masse d'après Cadet J. et collaborateurs (26).
25
- un atome d'hydrogène peut être arraché à un substrat pour former
l'hydropéroxyde H02· qui se dismute pour former l'eau oxygénée
RH + 02·-
?
R-
+ H02·
H02· + H02·
?
H20 2 + 02
La formation de ces espèces réacti ves dans le mil ieu
conduit à
des réactions d'oxydation des bases nucléiques et à la coupure de la chaine
phosphodiester des acides nucléiques. (26).
Dans le processus du type II, le photosensibilisateur réagit dans
son état triplet avec l'oxygène moléculaire dans son état fondamental pour
donner de l'oxygène singulet
L'oxygène singulet,
une fois formé,
peut se désactiver ou donner
lieu à des réactions d'oxydation:
?
3°2 + h\\i
(émission à 1270 nm)
10 2 *
?
30 2 + chaleur (non radiative)
+ Q
30
?
2 + Q
(inhibition)
+ A
?
A02
(photooxyda tion)
L'importance et le rendement des réactions de photooxidation dé-
pend de la nature du photosensibilisateur (26). Les .produits de photooxida-
tion d'un même substrat sont différents
suivant
le mécanisme mis en
jeu.
Ainsi l'oxydation de la 3', 5'-di-O-acétyl-2'-désoxyguanosine par l'oxygène
singulet
conduit
principalement à
la
formation
de
l'acide
N-C3' ,5'-di-O-
acétyl-2'-désoxY-B-D-érythropentofuranosyl) cyanurique et à la 9-(3' ,5'-di-
O-acétyl-2'-désoxY-B-D-érythopentofura~osyl)4-,8-dihydro-4-hydroxy-8-oxogua
nine (figure 4). Dans la photodégradation du même produit par le mécanisme
du
type
l,
les
produits
obtenus
sont
les
anomères
Cl
et
B
du
3' ,5'-di-O-acétyl-2'-désoxy-O-érythropentofuranose. (26, 81).
La photooxydation des bases pyrimidiques fait intervenir un méca-
nisme du type l par transfert d'électron du noyau pyrimidique vers le
pho-
26
Figure SA
Fi~ure SB
Figure 5
Réactions
du
radical
cation
du
noyau
pyrimidique
produit
par
photosensibilisation
avec
la
ménadione,
d'après
Cadet
J.
et
collaborateurs (26).
27
a
Il
CH20H
HNr
O?'~N)
o
?i
?i
HOV°-J
:,y
Il
CH3
CH2.
/yCH200H)--I
HN~
HN
1
HN
1
HO
O~~:)
O~~N
_W
02
O~~N -<
HO~ Hë~ HO~
HO
HO
HO
Figure 6
Déprotonation du radical cation de la thymidine'. Ce rad.:1cal ca-
tion est produit par un transfert d'électron du noyau py~imidiQue
vers le photosenslbillsateur dans son état triplet (d'après Cadet
J. et collaborateurs (26)).
1
1
6cH2
Base
o~a~
o~-
~
R02'
01
-RO:-o2
-
-
a 0-0
a a
a
1
1
1
\\
1
1
O=P-O-
6cH2
1
OH-
...
OCH~~H
OH
~H
02
OH
-
• H
'0
ft
1
a a
Q=P-o-
a
1
,
1
Figure 7
Un
des
mécanismes
possibles
de
formation
de
sites
labiles
en
milieu alcalin sur les acides nucléiques par suite de l'abstrac-
tion de l'hydrogène sur le carbone C (2') du désoxyribose d'après
Cadet J. et collaborateurs (26).
28
tosensibilisateur dans l'état
triplet
(26-27). Le radical cation du noyau
pyrimidique peut s 'hydrater selon le schéma de la figure 5 ou
perdre
un
proton suivant
celui
de
la figure 6 (26-30). Ces
deux
schémas repré-
sentent le devenir du radical cation de la thymine produit par photosensibi-
lisation avec la ménadione.
Ce photosensibilisateur n'induit pas de réac-
tions
au niveau des bases puriques mais essentiellement au niveau des bases
pyrimidiques (27). Les radicaux formés au niveau du sucre peuvent conduire à
une coupure de la chaîne en milieu basique suivant le mécanisme de la figure
7.
L'action de l'oxygène singulet dans les réactions de photooxyda-
tian peut être aisément distinguée des autres processus. Pour cela il suffit
de séparer la solution contenant le substrat du photosensibilisateur fixé
sur une plaque par une mince couche d'air (31). Dans ces conditions le temps
de vie de l'oxygène singulet étant de 40 à 50 ms à la pression d'une
atmos-
phère, l'oxygène singulet produit par irradiation du
photosensibilisateur
fixé sur la plaque peut diffuser jusqu'à la solution
contenant le substrat,
la réaction d'oxydation se produisant à la surface de cette solution. Ainsi
plusieurs substrats ou des
concentrations
différentes
d'un même
substrat
peuvent être étudiées dans la même expérience.Il suffit pour cela de dispo-
ser d'une cellule présentant plusieurs compartiments séparés de façon étan-
che.
Cette méthodologie permet de distinguer les mécanismes du
type
l
et
ceux
faisant
intervenir
l'oxygène
singulet.
Le
rose
bengale,
le
bleu de
méthylène ont ainsi été utilisés avec succès pour oxyder la guanine, l'his-
tidine et le tryptophane (31). L'utilisation de l'ADN circulaire du plasmide
pBR322 a permis de montrer que l'oxygène singulet formai t des produits de
photooxydation
labiles
en
milieu
basique
(32).
La mutagénicité
de
l'ADN
irradié en présence de l'oxygène singulet généré par la méthode de Midden et
Wang conduit le plus souvent à une transversion G ~ T suggérant ainsi que la
guanine est la cible privilégiée de l'oxygène singulet. (33,82).
Lorsque le photosensibilisateur induit la formation d'un complexe
physique stable avec les acides nucléiques (c'est à dire intercalé entre les
paires de bases ou fixé
dans
l'un des sillons de l'ADN),
les
réactions
photosensibilisées peuvent faire intervenir soit l'état triplet, soit l'état
singulet du photosensibilisateur. L'interaction perturbe l'état singulet du
photosensibilisateur fixé affectant ainsi ses propriétés d'émission de fluo-
rescence.
Des ligands fixés dans
le peti t
sillon de
l'ADN
comme le 4',
29
6-diamino-2-phenylindole
(DAPI)
ont généralement -leur fluorescence exaltée
(34-36). La fluorescence des
intercalants est soi t
exaltée par toutes les
paires de bases (Bromure d'éthidium) soit inhibée au voisinage des paires de
bases G-C (acridine, bleu de méthylène)
<37-41).
Peu de molécules ont leur
fluorescence complètement éteinte à la fois par les paires de bases A-T et
G-C. Les deux seuls exemples connus sont le tryptophane (42-44) et le cation
10-méthylacridinium (45).
Dans cette thèse, nous démontrons qu'une nouvelle famille de molé-
cules déri vées du diazapyrène voient
leur fluorescence
totalement éteinte
par toutes les bases nucléiques.
Cette inhibi tion totale de leur fl uores-
cence pourrait être attribuée à une réaction du type l par transfert d'élec-
tron des bases vers l'état singulet des diazapyrènes. De plus ces molécules
photosensibilisent la coupure de la chaîne phosphodiester des acides nucléi-
ques en milieu neutre. Ces nouvelles molécules, couplées à des oligonucléo-
tides dirigés contre une séquence cible de l'ADN,
peuvent constituer une
nouvelle
famille
d'endonucléases
permettant
de
couper
la chaîne phospho-
diester de l'acide nucléique par activation photonique.
30
IV - TOPOLOGIE DE L'ADN SURENROULE
1. Concept de base - Définition
Une molécule d'ADN est constituée de deux chaînes linéaires qui
s'enroulent l'une autour de l'autre avec une orientation (5'~ 3') antipa-
rallèle.
La périodicité de l'hélice ainsi
formée
est caractérisée par le
nombre de paires de bases dans un tour d'hélice (soit entre 9,5 et 11 sui-
vant la structure de l'ADN considéré).
Lorsque les deux brins de chaque chaîne sont fermés,
la molécule
d'ADN devient circulaire. Le cercle formé par
les deux brins peut alors,
•
sous des contraintes externes, se surenrouler sur lui-même formant ainsi des
supertours à la manière d'une vrille. La plupart des plasmides bactériens se
présentent ainsi
dans les conditions physiologiques
ou sous l'action de
colorants pouvant favoriser ou défavoriser cette superstructure (46-50). Les
trois paramètres qui permettent de caractériser une
telle superstructure
sont :
-
Le
nombre
topologi que
L
Le
nombre
topolog iq ue
dé fin i t
le
nombre de fois qu'un brin traverse le plan dans
lequel
est placé l'autre
brin(47-52). Si dans un ADN circulaire non surenroulé Lo est la Valeur
du
nombre topologique et si L est la nouvelle valeur pour le même ADN suren-
roulé, la différence entre les deux nombres topologiques définit le sens du
surenroulement. ~L = L - La
Si
~L
< 0, on dit que l'ADN est sous enroulé ou négativement
surenroulé.
Si ~ > 0,
l'ADN est positivement surenroulé. Le nombre topolo-
gique d'un ADN est nécessairement un nombre entier.
- Le nombre de tours d'hélice T : T = N/h où N est le nombre total
de paires de bases et h le nombre de paires de bases par tour d'hélice.
31
- Le taux de supertour (W) : Il représente le nombre d'enlacements
de la double hélice sur elle-même. (53, 54).
Les trois paramètres utilisés pour caractériser l'ADN circulaire
sont reliés entre eux par la relation suivante (52-55) :
L
W + T
La périodicité hélicoïdale de l'ADN a pu être mesurée par l'action
de
nucléases
sur
de
l'ADN adsorbé
sur
des
surfaces
solides
(56-59).
La
valeur obtenue est
voisine de
10,5 paires de bases ce qui correspond au
nombre
de paires de bases
d'un tour d'hélice dans la forme B de l'ADN.
Le surenroulement de l'ADN dans la cellule est contrôlé p'ar une
classe d'enzymes appelées gyrases ou topoisomérases. Les topoisomérases
II
qui
surenroulent
négativement
l'ADN
dépendent
de
l'ATP
et
de
Mg2+
(50,60,61). Les topoisomérases du type l par contre, relaxent l'ADN suren-
roulé en ADN non surenroulé. Cette réaction ne consomme pas d'énergie, mais
utilise l'énergie emmagasinée dans
les supertours. Ces enzymes coupent
un
brin de l'ADN,
font
tourner un brin l'un autour de l'autre puis lient les
extrémités coupées (62). Le surenroulement de l'ADN correspond donc à
une
forme
de
stockage
de
l'énergie
permettant
de
relaxer
les
chaînes
aux
fourches de réplication (63).
2. Application
L'action d'agents
intercalants
peut
induire la relaxation d'une
molécule d'ADN surenroulée. Dans ces
conditions, on obtient des molécules
d'ADN qui
ne diffèrent
entre elles que par le nombre de supertours.
Ces
différentes molécules sont appelées des topoisomères. Ces différents topo-
isomères peuvent être visualisés par microscope électronique, ou séparés par
électrophorèse dans un gel d'agarose bidimentionnel en présence d'un inter-
calant. Dans une première étape,
l'ADN surenroulé est relaxé par la topo-
isomérase l
pour engendrer les différents
topoisomères.
L'échantillon est
alors soumis à une électrophorèse dans la
1ere dimension.
Les différents
topoisomères sont séparés
en fonction de leur nombre de supertours. Le gel
32
est ensuite incubé dans un tampon contenant l'intercalant puis une deuxième
électrophorèse est réalisée perpendiculairement à la première dimension. Les
différentes taches observées sur le gel correspondent à des molécules d'ADN
qui diffèrent les unes des autres par leur taux de surenroulement. Pendant
l'incubation, la fixation de l'intercalant induit une décroissance du nombre
de supertours, de sorte que les molécules qui étaient surenroulées négative-
ment deviennent de moins en moins surenroulées et celles qui étaient suren-
roulées positivement gagnent des supertours positifs et migrent alors plus
vite.
Dans
la première dimension,
les topoisomères comportant le même
nombre de supertours, qu'ils soient positifs ou négatifs, migrent de la même
faÇ)on.
Une tache donnée peut représenter aussi
bien un topoisomère avec n
supertours
positifs
ou
négatifs.
Dans
la
première
dimension,
ces
deux
topoisomères
ne seront pas résolus. Supposons que la fixation d'une concen-
tration
donnée
de
l'intercalant
fasse
perdre
3
supertours
négatifs,
le
topoisomère
qui
avait
trois
supertours négatifs devient relaché et migre
moins vite que celui qui avait trois supertours positifs puisqu'il possède
maintenant six supertours positifs.
33
v - MISE EN OEUVRE EXPERIMENTALE
1. Absorption
Les spectres d'absorption sont enregistrés sur un spectrophotomè-
tre du type UVIKON 820 ou UVIKON 860.
L'échantillon est maintenu à une
température constante par un cryostat à circulation
(HUSER HS40). Les cel-
lules de mesure en quartz suprasil ont des trajets optiques variant de 2 à
10 mm et des volumes utiles de 400 ~l à 2 ml. Les spectres sont enregistrés
avec une cuve témoin en référence. A basse température (autour de OOC), un
courant d'azote gazeux est dirigé sur la face de chaque cellule pour éviter
la formation de buée sur les parois. La vitesse de défilement choisie est de
50 nm/rnn et le spectre est enregistré dans le domaine de 600 à 300 nm après
avoir fait un zéro à 600 nm, région o~ les colorants ainsi que leurs com-
plexes avec les acides nucléiques n'absorbent pas.
Les
titrations
sont
effectuées
en
ajoutant
dans
la cellule de
mesure contenant le colorant,
de petits volumes d'une solution concentrée
des mononucléotides ou de polynucléotides. La cellule de référence contient
toujours le tampon. Après chaque addition, l'enregistrement est différé de 5
minutes afin d'atteindre l'équilibre de température. Les spectres d'absorp-
tion sont corrigés de la dilution.
Dissociation thermique des complexes suivie en absorption. Chaque
courbe de dissociation thermique coopérative est caractérisée par
une tem-
pérature Tm pour laquelle la moitié de la double hélice ou du complexe acide
nucléique-colorant est dissociée.
Les courbes de dénaturation thermique des
oligonucléotides libres ou complexés aux colorants sont enregistrées à plu-
s ieurs
longueurs d'onde.
Le spectrophotomètre UVIKON
820
est
équipé d'un
système
de
programmation
permettant
de
suivre
l'absorbance
de
plusieurs
échantillons à différentes longUeurs d'onde en fonction de la température.
L'absorbance
du
colorant
est
enregistrée
dans
la
région
450
nrn-300
nrn,
région dans laquelle les polynucléotides
n'absorbent pas et parallèlement
dans l'UV où les deux composés absorbent fortement.
La vitesse de montée et
de descente en
température est fixée à
34
0,1°C/rnn. A cette vitesse,
les erreurs systématiques dans la détermination
de la température de demi-dissociation Tm sont réduites. Les variations de
concentration par évaporation aux températures élevées sont négligeables et
l'absorbance de chaque solution est vérifiée après chaque cycle à 20°C.
La pente de la courbe de fusion est reliée à l'enthalpie (flH) de
la dissociation par la relation suivante (64)
da
flH
6RTm2 (----)
dT
T = Tm
où Tm est la température de demi-dissociation,
et a représente la fraction
de complexe dissocié.
La variation du Tm est reliée à la concentration en oligonucléo-
tides par la relation de Damle (65).
flS
2,3 R
- - - -
+
log Cm
(24 )
dans laquelle Cm représente la concentration en oligonucléotide libre à la
température de demi-dissociation Tm.
2. Fluorescence
2.1. Fluorescence statique
Les spectres d'excitation et d'émission de
fluorescence ont été
enregistrés sur un spectrofluorimètre SPEX,
Fluorolog F1Tl1. Un dispositif
permet la correction des fluctuations de la lampe dans le temps (Xénon
450
Watts),
des transmissions des monochromateurs d'excitation
et
des divers
diopt:"es.
La
Rhodamine
101,
placée devant un photomultiplicateur de réfé-
rence, délivre à tout instant un signal référence proportionnel à l'inten-
sité de la lampe. Le Fluorolog F1Tl1 est muni de trois monochromateurs dis-
posés en T par rapport au faisceau d'excitation. Cette disposition permet de
35
faire des mesures de polarisation ou d'anisotropie de fluorescence rapides
et précises. Le monochromateur à l'excitation, gravé à 1200 traits/mm est
blazé
à
250
nm.
Les
deux
monochromateurs
à
l'émission
gravés
à
1200
traits/mm sont blazés à 500 nm.
Le
spectrofluorimètre est aussi
équipé
d'un module
de
contrôle
d'acquisition et de traitement des spectres comprenant:
-
deux
ensembles
de
détection avec
des
photomultiplicateurs du
type R 928 (RESEARCH INC.) refroidis thermoélectriquement par effet Peltier
et qui enregistrant le signal de fluorescence.
-
un microordinateur
DM
18
permet
de piloter les
différentes
unités du spectrofluorimètre d'une part, d'accumuler et de traiter les spec-
tres sur des disquettes, d'autre part.
Les échantillons sont en général contenus dans des cuves en quartz
su~rasil analogues à celles
utilisées
en
absorption,
de
trajet
optique
variant de 2 à 10 mm et de volume utile de 450 ~l à 1 ml. La température des
cellules
est
maintenue constante
par
un
support
thermostaté.
Un
courant
d'azote
gazeux est utilisé pour enlever toute buée
sur la paroi des cel-
lules à basse température. Des bandes passantes des monochromateurs de 0,2 à
2 nm et une vitesse de défilement des monochromateurs de 0,2 à 0,5 nm/se-
conde ont été généralement utilisées pour les enregistrements.
* Les rendements quantiques de fluorescence <p ont été déterminés
par comparaison avec un produit de référence R dont le rendement quantique
est connu et en utilisant la relation sui vante (66) :
Q
A <P
(25 )
Les
termes
A et
Q désignant respectivement,
l'absorbance de la
solution à
la
longueur d'onde
d' exci tation et l'intégrale
du spectre de
fluorescence.
L'indice r
se rapporte au
produit utilisé Comme référence
dont le rendement quantique
est connu.
L' absorbance de
la solution à la
longueur d'onde d'excitation est toujours inférieu~à 0,05 unité d'absorban-
ce pour minimiser l'effet de filtre
interne.
36
La 9-aminoacridine dans le tampon cacodylate de sodium
10 mM à
pH7, a été utilisé comme produit de référence (67, 68).
* Les titrations isothermes en émission de fluorescence sont ef-
fectuées de la même manière qu'en absorption: de petites quantités de mono-
nucléotides ou de polynucléotides sont ajoutées à une solution contenant le
colorant. Lorsque la température est stabilisée après 5 minutes, l'intensité
de fluorescence au maximum d'émission,
ou le spectre d'émission de fluores-
cence sont enregistrés.
La longueur d'onde
d'excitation est toujours choisie à un point
isobestique déterminé d'après les spectres d' absorpt ion. Tous les spectres
d'excitation et d'émission de fluorescence sont corrigés de la dilution.
* La dissociation thermique des complexes est suivie en émission
de fluorescence en excitant toujours en un point isobestique déterminé par
les titrations isothermes en absorption et en suivant la variation de l'in-
tensité d'émission de fluorescence du colorant. La vitesse de montée ou
de
descente en température est toujours de 0,1 °C/mn. La dérivée de la
courbe
IF = f(T) permet de déterminer la température de demi-dissociation Tm.
* La mesure de l'anisotropie statique a été faite sur le spectro-
fluorimètre en utilisant des polariseurs du type Glan Thomson transparents
dans l'ultraviolet. La disposition en T des monochromateurs permet un enre-
gistrement automatique de l'anisotropie. A l'émission, les deux polariseurs
sont croisés tandis qu'à l'excitation le polariseur est orienté alternati-
vement à
la
vertic?le
et à
l 'horizontale
par
le module
de
contrôle
et
d' acquisi tion des données.
L'uni té de
calcul détermine automatiquement le
facteur de correction G = IHV/IHH, et les spectres de polarisation en exci-
tation ou en émission peuvent être ensuite enregistrés.
* Luminescence à basse température
Un
dispositif
constitué
d'un
Dewar
de
section
carrée
rempli
d'azote liquide permet d'obtenir la luminescence totale d'un échantillon à
77 K.
L'échantillon est placé dans un tube en quartz suprasi l de 3 mm de
diamètre qui plonge dans le Dewar.
Le solvant utilisé dans ces conditions
est en général un mélange d'éthylèneglycol et de tampon ou de glycérol ~t de
37
tampon. La méthode utilisée pour obtenir le spectre de phosphorescence con-
siste à utiliser un système de fenêtres tournantes reglées de telle manière
que la fenêtre à l'émission soi t ouverte, quand celle à l' exci tation
est
fermée. Dans ces conditions seule la luminescence caractérisée par un temps
de vie long est observée (supérieur à 1 ms).
Lorsque les fenêtres sont ouvertes simultanément à l'excitation et
à l'émission la luminescence totale est observée.
2.2. Fluorescence dynamique
a. Mesure de temps de vie de fluorescence
L'appareil de mesure du temps de vie de fluorescence construit par
EDIN8URGH
INSTRUMENTS modèle
199M
est
un
spectrofluorimètre
impulsionnel
utilisant la méthode du photoélectron unique
(69).
-l'excitation lumineuse est produite par la décharge d'un conden-
sa teur
entre deux électrodes
plongées
dans
un
gaz
sous
pression
rédui te
(Azote, Hydrogène ou deutérium).
-
le
photon
de
fluorescence
émis
par
la solution
irradiée
est
recueilli à angle droit sur la cathode d'un photomultiplicateur 22548 re-
froidi à - 30°C par effet Peltier.
- le signal produit par ce photoélectron sur l'anode est envoyé à
un convertisseur temps-amplitude (TAC) et constitue le signal "stop" enre-
gistré par un ~nalyseur multicanaux (MCA). Le signal "start" est fourni par
l'éclair de la lampe par l'intermédiqire d'un photomultiplicateur de réfé-
rence.
Le rôle du TAC est alors de déli vrer à l'analyseur multicanaux un
signal proportionnel au temps qui sépare les deux signaux "start" et "stop".
Le
MCA incrémente alors d'une unité le nombre d'évènements déjà enregistrés
dans le canal dont l'adresse correspond au signal délivré par le TAC. Le TAC
e3t réinitialisé par l'Aclair de la lampe pour un nouveau cycle. Le nombre
d'évènements enregistrés dans chaque canal du MCA au bout d'un temps donné
représente la probabilité pour que l'émission d'un photon de fluorescence se
fasse au temps correspondant à l'adresse de chaque canal après le début du
flash. Le déclin obtenu représente la probabilité d'émission de fluorescence
de l'échantillon en fonction du temps.
38
- le déclin de fluorescence ainsi que le profil de la lampe seule
(obtenu avec une solution diffusante de ludox) sont transférés sur un mini-
ordinateur PDP-1173 (GETEK) et mémorisés sur des disquettes pour une analyse
ultérieure.
- la courbe enregistrée sur l'analyseur multicanaux ne représente
pas le vrai déclin de fluorescence de l'échantillon étudié. Ceci est dû au
fait que le flash de la lampe n'est pas instantané mais présente une durée
dont la largeur est d'environ de 1,5 ns. Cette courbe f(t) est donc un pro-
duit de convolution du profil de la lampe g(t)
et du déclin théorique de
fluorescence de l'échantillon F(t).
t
f
(t)
J g(t)
F(t-x)dx
g(t) *
F(t)
(25 )
o
L'analyse consiste à proposer un modèle de déclin
mono ou multi-
exponentiel et à ajuster les différents paramètres intervenant
pour obtenir
le meilleur ajustement possible entre la courbe calculée
F'(t) par recon-
volution et la courbe expérimentale f(t).
Le critère d'ajustement des deux
courbes est un test classique par minimisation du X 2
r
réduit.
510
(Fi - Yi)2
Xr 2
L
----------
(26 )
N
i = 1
Yi
Yi
représente les
valeurs des
points expérimentaux,
Fi,
celle des
points
calculés et N le nombre de degrés de liberté.
Le nombre de degrés de l i berté N = n - m où n est le nombre de
points considérés: 510 canaux recueillant l'émission de fluorescence dans
le MCA et m le nombre de paramètres à ajuster dans le modèle choisi. Pour un
échantillon dont la distribution des probabilités obéit à une statistique de
Poisson, comme c'est le cas en émission de fluorescence, la valeur théorique
du Xr 2 = 1.
Le programme de calcul synthétise la courbe de déclin de fluores-
cence F'(t) et la compare à la courbe expérimentale f(t). Cette démarche est
la plus rapide et permet un meilleur ajustement des différents paramètres du
modèle plutôt
que
la démarche
inverse
qui
consisterai t
à
déconvoluer
la
courbe expérimentale par rapport au profil de la lampe (70).
39
Les programmes utilsés permettent d'ajuster les courbes expérimen-
tales de déclin de fluorescence à des courbes théoriques du type
n
t
f(t)
L bi exp (----)
i =1
Ti
a é> représente le bruit de fond.
n peut prendre les valeurs 1, 2 ou 3 suivant que le déclin est
analysé avec un modèle mono, bi ou triexponentiel.
Le programme itère en ajustant les différentes valeurs des para-
mètres du modèle
choisi
ainsi
que
le
déplacement
de
la lampe
(D)
pour
obtenir la valeur minimale du x 2
r . Les différents paramètres ajustés sont
les temps de vie de
fluorescence
(Ti),
leurs poids respectifs normalisés
(ai), le bruit de fond (ao ), et le déplacement de la lampe (D).
bi
ai
(28)
n
L bi
i=l
On définit le temps de vie moyen <T> par
n
n
n
<T>
l api
l bpi 1 l bi
(29 )
i=1
i =1
i =1
Pour
qu'une
analyse
soit
statistiquement
signif icati ve pour
un
modèle à un, deux ou trois temps de vie, le nombre minimum d'évènements dans
le canal maximal doit être au moins de 5000, 8000 et 12000 respectivement.
3. Méthodes biochimiques
a. Mar.quage des oiigonucléotides
Les différents oligonucléotides ont été marqués à
leur extrémité
5'. Ce marquage est réalisé en incubant un échantillon d'oligonucléotide (10
40
picomoles) avec la polynucléotidyl-kinase du phage T4 durant 30 minutes à
37°C en présence de l'ATP marqué au phosphore 32 en position
'Y
(32p yATP)
dans le tampon suivant
50 mM Tris-MC1,
la mM MgC12' 5 mM OTT, 0,1 mM
spermine, 0,1 mM EDTA pH 7,6.
L'échantillon est alors traité par un mélange phénol-alcool isoa-
mylique
(lV/2V)
puis
précipité dans
70%
d'éthanol.
Après
séchage
il
est
repris dans un tampon la mM cacodylate pH 7.
b. Electrophorèse sur gel dénaturant
L'irradiation des échantillons est faite à l'aide d'un banc op-
tique équipé d'une lampe à vapeur de mercure de 200 Watts basse pression.
Une plaque de verre et un filtre aqueux permettent d'éliminer les rayonne-
ments de courtes longueurs d'onde
(À
< 300 nm). Le banc est équipé d'un
porte-cuve thermostatable permettant de
maintenir constante la température
durant le temps d'irradiation.
Les échantillons irradiés en présence des différents photosensibi-
lisateurs
sont
précipités
dans
70%
d'éthanol
contenant
0,3
M d'acétate
d'ammonium et 5 ~g de t-RNA, séchés, puis repris dans 20 ~l d'eau. Ce volume
est alors fractionnné en deux parties.
- la ~l sont de nouveau séchés et repris dans le colorant de char-
ge puis chargés sur un gel dénaturant. Ce gel révèle les coupures directes
produites
sur
l'oligonucléotide
par
les
photosensibilisateurs
en
milieu
neutre.
10 ~l sont repris dans 1 M pipéridine,
incubés
la minutes à
90°C puis lyophilisés à sec. Le culot est lavé deux fois avec 200 ~l d'eau,
séché et repris dans le colorant de charge de Maxam-Gilbert
(71).
Ce gel
révèle les produits de photooxidation labiles en milieu basique.
Les gels dénaturants (20 % acrylamide, 0,5 % bis-acrylamide,
7 M
urée) sont soumis à une électrophorèse haute tension dans un tampon TBE (90
mM Tris,
90 mM acide borique,
2 mM EDTA)
pendant deux heures à 40 Watts
constants. Les gels sont ensuite autoradiographiés sur des films FUJI (X-Ray
Film) à - 7üoC avec un écran amplificateur (KODAK) pendant 12 à
125 heures
suivant la quantité de radioactivité initialement chargée.
41
L' intensi té
de
chaque
bande
est
estimée
soit en
découpant
les
différentes
bandes
sur
le
gel
et
en
comptant
la
radioactivité
présente
(compteur LKB) soit en densitométrant les films avec un densitomètre à laser
LKB-2222-020.
c. Préparation du plasmide pBR 322
Le
plasmide
pBR
322
a
été
préparé
à
partir
d'une
souche
d'Escherichia coli
,HB 101. La purification est réalisée par ultracentrifu-
gation dans un gradient de chlorure de césium saturé en bromure d'éthidium
(72).
Le bromure d'éthidium est
ensuite retiré de l'échantillon par une
extraction exhaustive à l'alcool isoamylique (6 fois)
puis par dialyse
(5
fois)
contre un tampon 10 mM Tris,
2 mM EDTA. Dans ces conditions, on ob-
tient
uniquement de l'ADN du plasmide
surenroulé sans
contamination avec
l'ADN bactérien.
d. Gels d'agarose
Pour obtenir les différents topoisomères du plasmide pBR 322, 20
~g de l'ADN du plasmide sont incubés pendant 1 heure à 37°C avec 10 unités
de la
topoisomérase l
(AMERSHAM)
dans
un tampon 35 mM Tris pH 8,
5 mM
Mg C12'
5 mM spermidine,
5 mM DTT,
12 mM KCl,
0,01% BSA. L'échantillon est
traité par un mélange phénol-alcool isoamylique (1 V/ 2V), et préc ipité dans
70% d'éthanol. 3 ~g de l'AÙN du plasmide sont repris dans un colorant: (60
% glycérol, 0,1
% bleu de bromophénol),
puis chargés sur un gel d'agarose
0,8%. Le gel d'agarose est soumis à une électrophorèse pendant 12 heures à
2 Volts/cm dans un tampon borate /ammoniaque 50 mM pH 7,5.
Après la première migration, le gel est incubé à l'obscurité dans
deux litres de tampon contenant le ligand à étudier pendant
12 heures. Une
deuxième électrophorèse orientée perpendiculairement à la première est alors
~éalisée dans le tampon d'incubation contenant le ligand à 2 Volts/cm
pen-
dant 15
heures. Le gel est finalement incubé dans une solution 10-6 M de
bromure d'éthiàium et photographié sous illumination ultraviolette.
42
4. Matériel
Le chlorure de
N,N'-2,7-diméthyldiazapyrénium (MDAP2+),
et
de
2,2'[méthylène-di-(1 ,4-phénylèneméthylè~e-diyl)J-bis-(7-N-méthyl-2,7-diaza
pyrénium)
(bis-DAp4+) ont été synthétisés au laboratoire du Professeur Jean
Mar ie LEHN à l' Insti tut LE BEL de l'Uni versi té Louis Pasteur à Strasbourg
(73),
la figure 8 représente les formules chimiques des deux composés. Les
solutions aqueuses de ces produits sont conservées au réfrigérateur à + 4°C
et à l'obscurité. Nous avons vérifié leur conservation en mesurant périodi-
quement leurs spectres d'absorption et d'excitation de fluorescence à diffé-
rentes longueurs d'onde d'émission.
Le
bromure
d'éthidium
est
un
produit
commercial
MERCK.
La
9-aminoacridine est également un produit MERCK qui a été purifié par chroma-
tographie sur couche mince (Silico Gel 60 F254) dans un mélange d'éthanol-
toI uène (1 VIl V) .
Tous les solvants organiques utilisés sont des produits Fluka ou
MERCK de qualité "UVASOL". Nous avons vérifié l'absence d'impuretés fluores-
centes avant leur utilisation.
Les mononucléotides et
les polynucléotides sont des produi ts PL
Biochemicals.
Les oligonucléotides cibles : 27mère-A8. 27mère-T8, ont été
syn-
thétisés à Orléans par l'équipe du Dr. N.T. Thuong (U. Asseline, V. Roig, M.
Chassignol), pu:i:s purifiés par HPLC et électrophorèse sur gel d'acrylamide
(74,75,82,83).
Les octathymidylates
B-TS-MDAP2+ et a-MDAp2+-T8
ont été obtenus
par la synthèse d'un octathymidylate par la méthode des phosphotriesters en
solution. Le couplage du MDAp2+ par un bras pentaméthylène s'effectue en 3'
ou en 5' sur un thiophosphate.
CDc8J\\\\
N
\\
1
~ CD
Il
N-R
-
-
B
n-N~-R
CD"=Q=JCD
l'()l'mut,,
,:llllnJ'lue
<Je
Il.1I·-dlmélhyl-2.1-dl.l~''r~I·6,durn
(A)
r,l
II"
<,.;>-[rn6lhylène-dl-( 1. ~-phénylèneméthylèlle-dlylJ. lJls-(7-tl-méthyt-
2,ï-di.l::.lpY"énlu",l ([J).
43
Les séquences nucléotidiques des différents oligonucléotides ont été véri-
fiés sur gel par la méthode de Maxam-Gilbert. (71).
27mère-As :
(5') T.G A G T GAG T A A A A A A A A T GAG T G C C A A
(3')
27mère- Ts :
(5') T T G G CAC T C A T T T T T T T TAC T CAC T C A
(3')
32mère- A6 :
(5') T C C T GAT A A A G GAG GAG A T G A A G A A A A A A T G A (3')
32mère- T6 :
(5') T C A T T T T TTC TTC A T C T C C T C C T T T A T C A G G A
(3')
(dA)10
(5') OH A A A A A A A A A Ap (3')
(dA)S :
(5') OH A A A A A A A Ap (3')
(dT)S :
(5') OH T T T T T T T Tp (3')
o
"
(5') OH T T T T T T T T - P - S - (CH2)4 - CH2 - MDAp2+
"o
o
"
MDAP2+ - (CH2)4 - CH2 - S - P - T T T T T T T T (3')
"o
44
La concentration de tous les produits utilisés a été déterminée
chaque fois par absorption ultraviolette ou visible en utilisant les coeffi-
cients d'extinction molaire qui figurent dans le tableau l.
TABLEAU l
Espèces (pH = 7, T = 20°C)
À max
E:
max x 103
(nm)
(W 1 cm- 1)
AMP
259
15,4
GMP
252
13,7
CMP
271
13,0
TMP
267
9,6
dAMP
259
15,2
dGMP
252
1 3,7
dCMP
271
13,0
dTMP
267
9,6
poly(rA)
257
9,4
poly( dG)
253
10, 1
poly( dC)
274
7,4
poly(dA)
257
8,6
poly(dT)
264
8,52
polyd(A-T)-polyd(A-T)
262
6,6
poly(dA)-poly(dT)
260
6,0
poly(rA)-poly(dT)
260
6,9
polyd(G-C)-polyd(G-C)
255
8,4
poly(dG)-poly(dC)
253
7,4
ADN thymus de veau
260
6,5
27mère-A8
260
9,0
27mère- T8
260
9,0
32mère- A6
260
9,0
32mère- T6
260
9,0
(dA)10
.
257
10,4
( dA)8
257
10,8
( dT)8
2uj
9,6
B-T8-MDAP2+
420
12,65
a-MDAp2+-T8
420
12,65
MDAP2+
418
15,8
bis-DAP4+
419,5
25,2
Bromure d'éthidium
480
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CHAPITRE_l
PROPRIËTËS SPECTROSCOPIQUES DU CHLORURE D~
N, N' -DI MÉTHYL-2,7-DI AZAPYRENI UM (MDAp2+)
,
ET DE 2,2-[MÉTHYLÈNE-DI(1,4-PHÉNYLÈNEMÉTHYLÈNE-DIYL)J
BIS-(7-N-MÉTHYL-2,7-DIAZAPYRÉNIUM) (BIS-DAp4+)
50
1. PROPRIETES SPECTROSCOPIQUES
D'ABSORPTION ET D'EMISSION DU MDAP2+ ET DU
BIS-DAp4+
1. Propriétés d'absorption
Les deux composés: le MDAP2+ et son dimère, le bis-DAp4+, absor-
bent dans le visible et dans l'ultraviolet. Les spectres d'absorption de ces
deux composés sont caractérisés par trois bandes d'absorption centrées res-
pectivement à 247 nm, 334,5 nm et 417,5 nm pour le MDAP2+, 250 nm, 337 nm et
420 nm pour le bis-DAP4+ (figure 1.1).
Les deux colorants ne comportent pas dans leur structure chimique
de groupements pouvant être protonés ou déprotonés en fonction du pH. C'est
ainsi que leur spectre d'absorption moléculaire ne change pas lorsque le pH
varie de 0 à 8. En milieu tr~s basique, les spectres d'absorption moléculai-
re évoluent en fonction du temps et l'on observe une précipitation des deux
produits.
Les deux transitions situép.s dans le visible et le proche ultra-
violet présentent une structure vibronique bien résolue. Les maxima de ces
bandes vibroniques sont déplacés de deux nanomètres environ vers les grandes
longueurs
d'onde dans le bis-DAp4+ par rapport au monomère le MDAp2+. La
51
1,16.--_."..-
----,
A
Q)
u
c:
lQ
.Q
0,58
...
0
1/1
.Q
lQ
220
290
360
430
500 -À(nm)
1,6 8 r - - - - n - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ,
B
Q)
u
c:
lQ
.Q
0,84
...
0
1/1
.Q
lQ
220
290
360
430
500 À (nm)
figure r.l
Spectres d'absorption moléculaire du MDAp2+ (A) et du bis-DA
(8) dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
52
figure 1.1 représente les spectres d'absorption moléculaire des deux compo-
sés dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
La
différence
d'énergie
observée
entre
les
bandes
vibroniques
centrées respectivement à 417,5 nm (23950 cm- 1 ), 394 nm (25380 cm- 1 ), 372 nm
(26880 cm- 1 ), soit environ 1500 cm- 1 correspond à l'énergie de vibration des
liaisons C-C du noyau aromatique dans le plan de la molécule
(1).
Cette
même différence d'énergie s'observe sur la deuxième bande centrée autour de
334 nm.
La mesure de la polarisation de fluorescence à basse température
(77
K)
ainsi
que
du
dichroïsme
magnétique
circulaire
du
pyrène
et
du
2.7-diazapyrène
a
permis
d'attribuer
aux
différentes
bandes
du
spectre
d'absorption moléculaire, les différentes transitions électroniques corres-
pondantes. La figure 1.2 représente les formules chimiques du pyrène avec
les deux axes d'orientation de la molécule (A),
du 2,7 diazapyrène (8), du
MDAp2+ (C) et du bis-DAp4+ (0). La substitution des carbones C2 et
C7 par
des atomes d'azote dans la molécule de pyrène donne
un noyau diazapyrène
qui conserve les mêmes axes de symétrie (2).
La figure I.3.A représente le spectre de polarisation de fluores-
cence du MDAP2+ (2,94 10-6 M) dans le mélange tampon cacodylate-glycérol à
- 20°C et la figure 1.3.8 illustre les spectres de dichroïsme
magnétique
circulaire,
de
polarisation d'excitation
de
fluorescence
et
les spectres
d'excitation de fluorescence du pyrène ainsi que du 2,7-diazapyrène obtenus
à basse température (77 K). Cette figure est tirée de l'article de THULSTRUP
E.W., DOWNING J.W., MICHL J.
paru dans Chemical Physics (1977) :3, 307-319
(2). Les résultats
de cet
article montrent l'existence de quatre transi-
tions électroniques TI,TI* des états singulets excités du pyrène et de quel-
ques diazapyrènes. La comparaison des spectres d'absorption moléculaire et
d 'exci tation
de
fluorescence
du
MDAp2+
et
du
bis-DA p4+
aux spectres
des
figures 1.3 nous a permis d'assigner aux différentes bandes d'absorption les
transitions électroniques correspondantes:
- La t~ansition Lb :
Cette
transi tion est
polarisée suivant
l'axe
y dans
le pyrène
(26900
cm- 1 ).
Elle
se
déplace
vers
les grandes longueurs d'onde sur
les
spectres
d'absorption
des
différents
diazapyrènes
26200
cm- 1 pour
le
53
B
'1
'\\
R-N
N-R
Œ-
-Œ
c
D
Figur~ I.2
Formules chimiques développées du pyrène avec les deux axes de
symétrie de la molécule (A),
du 2,7-diazapyrène (8), du MDAp2+
(C) et du bis-D Ap 4+ (0).
.'i4
JO
,
I:;O~_......:,'S,--_-.-;SO
IBI..
1
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-1
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2'5
)0
J5
10
Fig. I. PYlenc (1). Ta\\,: ~leD sl'ccLIum, centel: deglce of po-
IJrizalioll of nUOlCSCCIlCC anù of nuolcsccnce e.lcilation. Moni-
rig. 2. 2,7-Diazapyrene (2,7·1). See caption to fig. 1. length
tOling wavdengths alc inùicatcd. Uottom: z·polarized (rullline)
and direction of the lines indicating calculated trallsitions give
am) y-\\,olari7cd (bruken linc) Icduced absorption cueves (albi-
the value of -sgn BII + log BI. The calculated results shown
I,ary scalc). CalculJtcù transitiuns (SECl·!) are inuic:llcd by
are those obtained by Sel.
fuillincs (z·rcbli1.cd), brokcn lines (y·polJrîzed), anù cilcles
(synllllctly·fullJiùùcn). Ali calculJtcd B tcrms are zero. Osci!-
btor strength is indicated lJy line thickn~ss.
.
['ï.gUt''?
L3B:
Cette
CigUC'8
est
extraite
de
l'article
de
THULSTRU"P E.\\-/.,
I)OHNING .J,W., MICHL .J.
(1977) dans:
"Excited sLnglet states of
IJyr'enes.
Polari zation
dic'ections
ând
t1agnetic
Circulai'
l)lctlf'oïslO of i\\zapyrenes", Chemical Physics (1977) ~, 307-319.
0,5
0,4
0,3
z
0,2
0
f-
0,1
<r
(/)
c::
<!
°
0,1
..J
0
a.
0,2
- 0,3
395
345
395
445
À (nrn)
Figure I.3A
Spectre de
"
fl
d
2+
polar~sat~on
de
uorescence
u MDAP
(2,94 10-6 M) dans un mélange tampon cacodylate-
glycérol il. - 20°C.
55
2,7-diazapyrène, 23950 cm- 1 pour le MDAp2+ et 23800 cm- 1 dans le bis-DAP4+.
- La transition La :
Cette seconde transition se trouve à 29600 cm- 1 dans le pyrène.
Elle est polarisée parallèlement à l'axe z. La substitution des carbones C2
et C7 par les azotes dans les diazapyrènes ne provoque pas un déplacement
important de cet te transi t ion dans la sér ie qui nous concerne.
Ainsi elle
reste centrée à 29600 cm- 1 dans le 2,7-diazapyrène, à 29900 cm- 1 dans le
MDAP2+ et à 29670 dans le bis-DAp4+.
- La transition Bb :
Centrée à 36200 cm- 1 dans le pyrène, elle se trouve très déplacée
vers les courtes longueurs d'onde dans les diazapyrènes. Elle est polarisée
suivant l'axe y et est située à 39100 cm- 1 dans le 2,7-diazapyrène, à
40500
cm- 1 dans le MDAP2+ et à 40000 cm- 1 dans le bis-DAp4+.
- La transition Ba :
Cette transition, fortement polarisée selon l'axe z dans le pyrène
à
41100
cm-l,
est
déplacée
vers
les
courtes
longueurs
d'onde
dans
le
2, 7-diazapyrène.
Elle
se
déplace encore
plus
vers
les
courtes
longueurs
d'onde dans le MDAp2+ ainsi que dans le bis-DAp4+ autour de 48780 cm- 1 . Elle
est masquée par la transition Bb.
La détermination des coefficients décadiques d'extinction molaire
a été faite comme suit: 500 mg de chaque produit sont séchés à l'étuve en
présence de P205 jusqu'à l'obtention d'un poids constant.
A partir de ces
produi ts secs,
de
petites quantités sont pesées entre
1 mg et 500 llg et
dissoutes soit dans du tampon cacodylate 10 mM à pH 7 soit directement dans
de l'eau bidistillée. Les spectres d'absorption moléculaire sont alors enre-
gistrés dans une cuve de quartz suprasil de 1 cm de parcours optique contre
du tampon ou de l'eau dans la cellule de référence.
Les dilutions effectuées au 1/ lOe,
au 1/ 100e et au 1/ 1000e mon-
trent que l' absorbance des deux composés
sui t la loi de Beer-Lambert. Les
phénomènes d'agrégation ou d' autoassociation ne sont donc pas observables
dans la gamme de concentrations que nous avons utilisée.
56
A partir de l'absorbance de chaque produit, les coefficients déca-
diques d'extinction
molaire
ont
été
déterminés
en
utilisant
la
relation
suivante :
A. M. v
e: =
(1)
m. l
où
A
absorbance de la solution
ID
masse de l'échantillon
l
trajet optique de la cuve de mesure
M
masse molaire du produit
v = volume de la solution.
Les coefficients décadiques d'extinction molaire déterminés dans
le tampon cacodylate la mM, à pH 7 et à 20°C sont identiques à ceux obtenus
en dissolvant directement les produits dans de l'eau bidistillée. Le tableau
I.A résume les longueurs d'onde des maxima d'absorption et les coefficients
d'extinction molaire correspondants.
MDAp2+
bis-DAP4+
À
(nm)
e: . (W 1 .cm- 1 )
À
(nm)
e:(W 1.cm- 1)
417,5
15800
420
25200
393,5
8200
395
13300
378
2600
374
4900
334
35000
:3.:,5,5
66500
• 318,5
22000
321
43000
305
8000
307
19000
294
3ljOO
295
10800
2lj6,5
68000
250
125000
TABLEAU I.A
Caractéristiques spectrales du MDAp2+ et du bis-DAP4+ dans le tampon caco-
dylate la mM à pH 7 et à 20°C.
57
Les
solutions
concentrées
des
deux
produi ts
sont
conservées
à
l'abri
de
la
lumière à
+ 4 oC.
Dans ces
condi tions,
aucune
var iation de
l'absorbance n'est observée même sur une longue période (3 mois)
2. Propriétés d'émission de fluorescence statique
a) Spectres d'excitation et d'émission de fluorescence
Le spectre d'émission de fluorescence d'un composé porté sur une
échelle en nombre d'onde es t
théor iquement l'image du spectre d'absorption
de la transition électronique So ~ Sl. Les spectres d'émission de fluores-
cence du MDAp2+ ainsi que du bis-DAP4+ sont en effet symétriques des spec-
tres de la première bande d'aborption.Les figures 1.4 et 1.5 représentent
les spectres d'émission et d'excitation de fluorescence du MDAP2+ ainsi que
du bis-DAP4+ dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
Le spectre d'émission du MDAP2+ est très résolu et présente trois
principales bandes vibroniques à 423 nm, 450 nm et 475 nm. Le même type de
spectre est observé pour le bis-DAP4+ avec un déplacement des bandes vibro-
niques de 4 nm environ vers les grandes longueurs d'onde soit à 427 nm, 455
nm et à
480 nm.
La différence d'énergie entre ces différentes bandes du
spectre d'émission de fluorescence (~ 1300 cm- 1 ) correspond à l'énergie de
la vibration active en absorption (voir ci-dessus).
Les
spectres
d' exci tation
de
fluorescence
présentent
les mêmes
maxima que les spectres d'absorption. Les mêmes spectres sont obtenus lors-
que l'on observe la fluorescence "du côté bleu" (420 nm) ou "du côté rouge"
(480 nm) du spectre d'émission de fluorescence. Dans ces conditions, l'émis-
sion de fluorescence observée soi t
dans le tar.Jpon cacodylate soi t dans de
l'eau correspond à celle d'une seule entité chimique.
Dans les solvants visqueux comme le glycérol ou l'éthylène-glycol,
les deux transi tions dans le proche ultrav iolet sont déplacées
vers les
grandes longueurs d'onde.
La transition centrée à
417,5 nm dans l'eau ou
dans le tampon cacodylate se déplace à 420,5 nm, et celle située à 334 nm se
58
10
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i \\
1
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5
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0
400
500
600
À(nm)
figure ~.LJA
Spectres d'excitation ct d'émission de fluorescence du MDAp2+
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
59
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500
600
À (nm)
)
Figur'? I. !lB
Spectres
d''?xcitation
et
d'émission
de
fluorescence
du
bis-DAp4+ dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 à 20°C.
60
déplace à 337 nm pour les solutions du MDAp2+. Les mêmes déplacements sont
observés pour le bis-DAp4+ dans le glycérol ou l'éthylène-glycol. Parallèle-
ment à ce déplacement des spectres d'absorption moléculaire, on observe un
déplacement des spectres d'émission de fluorescence vers les grandes lon-
gueurs d'onde de l'ordre de 3 nm.
Dans le tampon cacodylate,
un déplacement des spectres d'excita-
tion et d'émission de fluorescence
se produi t
également vers les grandes
longueurs d'onde lorsque la température varie de -5°C à + 20°C. Au delà de
cette température, seule une diminution de l'intensité de fluorescence est
observée vraisemblablement due à une augmentation de la constante de désac-
tivation non radiative.
A très basse température (77 K), le spectre d'excitation de fluo-
rescence du MDAp2+ se déplace par contre vers les courtes longueurs d'onde.
Le maximum de la première bande à l'excitation comme à l'émission se trouve
alors à 410 nm.
Dans ces conditions,
la molécule est immobilisée et l'on
peut déterminer la position de la transition 0 ~ o. Le spectre d'émission de
fluorescence reste toujours structuré avec des
bandes vibroniques à 410 nm,
425 nm, 443 nm et 465 nm.
b) Rendement quantique de fluorescence
Les
rendements
quantiques
de
fluorescence
du
MDAp2+
et
du
bis-DAp4+ ont été mesurés par rapport au rendement quantique de la 9-amino-
acri0ine prise comme produit de référence (3). Le spectre d'absorption molé-
culaire ainsi que le spectre d'émission de fluorescence de la 9-aminoacridi-
ne recouvrent les mêmes domaines de longueur d'onde que ceux des deux com-
posés.
Pour
des
solutions ayant
la même absorbance à la longueur d'onde
d'excitation, le rapport de l'intégrale du spectre d'émission de fluorescen-
ce par rapport à celle de la 9-aminoacridine permet de déduire le rendement
quantique de fluorescence.
L' absorbance de chaque solution 2.
la
longueur
d'onde d'excitation est
toujours inférieure à 0,05 pour minimiser l'effet
d'écran interne.
61
Dans
ces
conditions,
nous avons retrouvé
les mêmes valeurs des
rendements quantiques de fluorescence
quelle que
soi t
la
longueur
d'onde
d'excitation si l'on corrige les mesures de l'absorbance à la longueur d'on-
de correspondante.
Le
tableau
LB.
résume les valeurs des rendements quantiques de
fluorescence des trois composés dans les tampons utilisés.
Nature du Tampon
9AA
MDAp2+
bis-DAp1J+
H20 à pH = 7,0
0,96
0,81
0,043
Tampon cacodylate
. ..
..
10 mM
0,96
0,76
0,043
pH = 7,0
Tampon cacodylate
10 mM, Na Cl 100 mM
0,96
0,40
0,026
pH = 7,0
"' -
Tampon cacodylate
10 mM,Na CI04 2 M
0,96
0,85
0,070
pH = 7,0
TABLEAU 1.B
Rendements quantiques de fluorescence de la 9AA, du MDAP2+ et du bis-DAP4+
dans différents tampons à 20°C. Le rendement quantique de la 9-aminoacridine
(9AA) a été pris comme référence.
c) Fluorescence résolue dans le temps
Les courbes représentant le déclin de fluorescence du MDAP2+
seul
peuvent être ajustées à un seul
temps de v ie quelle que soi t
la longueur
d'onde d'émission. A la température ambiante (20°C) la fluorescence observée
correspond certainement à l'émission de l'état relaxé.
Le temps de vie de
l'état Franck-Condon est
beaucoup trop court
pour être mesuré à 20°C.
Le
temps de vie de l'état relaxé mesuré dans de l'eau ou dans le tampon cocady-
late 10 mM à pH 7 et à 20°C est de 10,80 + 0,20 ns pour le MDAP2+.
62
Dans les mêmes conditions expérimentales de tampon et de tempéra-
ture,
le déclin de fluorescence du bis-DAp4+ ne peut être analysé avec un
modèle à un seul état correspondant à un seul temps de vie. Il faut faire
intervenir un modèle à trois états pour obtenir un ajustement
satisfaisant
du déclin de fluorescence :
Î
une
composante
longue
dont
le
temps
de
vie
est
de
10,70 + 0,20 ns. Sa contribution à la fluorescence totale est de 62 %.
- un temps moyen de 3,70 + 0,10 ns qui contribue pour 8 % seule-
ment à
l'émission
totale.
- enfin un temps très court de 0,15 + 0,05 ns dont la contribution
de 30 % à la fluorescence
totale est plus
importante que celle du temps
moyen.
Le
bis-DAP4+
présente
certainement
plusieurs
conformations
en
solution en raison de la flexibilité partielle du bras de liaison entre les
deux cycles. Le temps de vie long, identique à celui du MDAp2+, est dû à une
conformation où les deux cycles sont très éloignés l'un de l'autre (confor-
mation "ouverte"). Le temps le plus court doit correspondre à une conforma-
tion où les deux cycles sont empilés l'un sur l'autre et le temps intermé-
diaire
à une troisième forme où les deux cycles interagissent sans être
complètement empilés.
Les mesures de
RMN ont
montré
que
les
deux noyaux
aromatiques sont
partiellement empilés l'un sur l'autre (4).
63
II. INHIBITION DE LA FLUORESCENCE DU MDAP2+ ET DU BIS-DAP4+ PAR LES IONS
HALOGENURES ET LES IONS PHOSPHATES
1. Inhibition de la fluorescence statique
Les anions halogénures (Cl-, Br-, 1-) éteignent la fluorescence du
MDAP2+ ainsi que celle du bis-DAp4+. Aucun déplacement des spectres d'émis-
sion de fluorescence n'est observé et les maxima
des différentes bandes
vibroniques restent centrés aux mêmes longueurs d'onde que celles observées
sur le spectre d'émission du MADP2+ ou du bis-DAP4+ en l'absence de concen-
trations élevées des anions.
L'inhibition de
la fluorescence des
composés organiques par les
ions halogénures notamment les ions bromures et les ions iodures est inter-
prétée
comme un
effet d'atome lourd (5, 8). Cet effet peut être
décrit
par un couplage spin-orbite de l'état excité du chromophore avec les orbita-
les vacantes des atomes lourds qui provoque une désactivation supplémentaire
de l'état excité du chromophore.
La figure 1.6 représente la variation relative de l' intensi té de
fluorescence du MDAp2+ en présence de concentrations croissantes en Cl-, Br-
et
r- et de HP042-. L' inhibi tian de la fluorescence du MDAp2+ augmente
lorsqu'on passe des ions chlorures aux ions bromures et enfin aux ions iodu-
res.
Cette extinction de la fluorescence du chromophore résulte bien d'un
effet d'atome lourd où le couplage spin-orbite est favorisé lorsque le nu-
méro atomique Z de l'atome augmente (9-11).
Par contre, en présence du perchlorate de sodium, on observe une
légère augmentation du rendement quantique de fluorescence du MDAp2+ (voir
tableau I.B). Les ions C104-, en remplaçant les ions Cl- dans le voisinage
du MDAP2+, suppriment l'inhibition de fluorescence due à ces derniers. Les
ions CL04- sont en effet des inhibiteurs de fluorescence moins efficaces que
les ions chlorures.
Les ions phosphates éteignent aussi la fluorescènce du MDAP2+ et
du bis-DAp4+. Cette inhibition de la fluorescence par les ions phosphates
est beaucoup plus faible que celle observée en présence des halogénures
64
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0,2
0,4
M
E'igur,= 1.6: I/ariationsrelativesdel'intensité de fluorescence Flr o du 1\\~DAP2""
~n Drésence de dif rér8nts inhi bi teurs externes dans le t2moon
cacodylate
19 mM· à pH 7 et à 20°C. La concentration initiale en l'1DAp2~ ~St
de 4,0 x 10- 0 H.
La longueur d'onde d'8xcitation est de 395 nm ~t l'émission
est recueillie dU maxunum de l'émission de fluorescence soit à 1J23 nm.
a)
KI
;
b)
K8r
;
c)
NaCl;
d)
Na2HP04.
65
La
variation
relative
de
l'intensité
de
fluorescence
des
deux
composés
en
fonction
de
la
concentration
en
halogénures
n'est
pas
une
droi te.
Il semble donc coexister plusieurs mécanismes de désacti vat ion des
deux produits par les inhibiteurs externes: une inhibition à l'état fonda-
mental mais aussi une inhibition avec l'état excité des deux chromophores.
2. Inhibition dynamique de la fluorescence
Le
temps de
vie
du MDAp2+
diminue
lorsque la concentration en
inhibiteur externe augmente.
Le déclin de
fluorescence
ne
peut cependant
être ajusté avec un seul temps de vie sauf en présence des ions phosphates.
Les ions phosphates éteignent d'une façon moins drastique la fluorescence du
MDAP2+. La diminution du rapport ~F/' (tableau I.C) montre qu'une partie de
l'inhibition de la fluorescence du chromophore est due à la formation d'un
complexe à l'état fondamental dont le rendement quantique de fluorescence
est très faible par rapport au chromophore libre.
[ HP0 42-J (M)
~F
,(ns)
X2
~F/'·107 (ns- l )
1
0
0,81
10,80
1 , 12
7,50
9,95 10-3
0,72
9,70
1 ,18
7,42
5,83 10-2
0,60
8,90
1 ,28
6,74
9,52 10-2
0,56
8,60
1 ,00
6,51
0,182
0,49
8,30
1 ,05
5,90
0,333
0,43
7,90
1 ,24
5,44
TABLEAU I.C
Var iation du
temps
de v ie
et
du
rendement
quantique
de
fluorescence
du
MDAP2+ en fonction de la concentration en ions phosphates. La concentration
en MDAp2+ est de 1,00 10-5 M et la température de 20°C.
66
La variation relative de
temps de vie de fluorescence en fonction de la
concentration en
[HP042-]
'oh
= f
[HP042-J permet d'estimer la constante
cinétique d' accessi bili té kq du chromophore exci té aux ions HP042-. Cette
constante déduite des valeurs du tableau I.C. est de 5,6 107 M-l s -l. Cette
valeur très faible confirme que le processus d'inhibition de la fluorescence
du MDAp2+ n'est pas entièrement contrôlé par la diffusion.
La diminution du temps de vie de fluorescence du MDAp2+ en pré-
sence
des anions Cl-,
r- et Br- ne peut non plus être expliquée par un
mécanisme de désactivation simple.
Le déclin de fluorescence du MDAp2+ en
présence ge ces halogénures ne peut être ajusté de façon satisfaisante qu'en
faisant intervenir au moins deux temps de vie.
- un temps long qui décroît avec la concentration en inhibiteurs
externes.
- un temps court dont la contribution à la fluorescence totale est
faible rendant sa détermination peu précise. Compte tenu de la forte inhibi-
tion de la fluorescence du MDAp2+ par les halogénures,
ce deuxième temps
peut-être attribué soit à des impuretés résiduelles, soit à la photodégrada-
tion du MDAp2+ au cours de l'analyse. En
effet, l'inhibition de la fluores-
cence étant forte,
il faut
beaucoup de temps pour acquérir expérimentale-
ment la courbe de déclin de fluorescence. De plus, en présence de traces de
donneurs d'électrons, (amines, alcools), le MDAp2+ peut former sous irradia-
tion le radical cation MDAP+o. Ce radical cation est produit par irradiation
d'une solution dés aérée dp. MDAp2+ et présente une bande d'absoprtion intense
vers .475 nm. Lorsque l'on fait barboter de l'oxygène dans la solution on
régénère le MDAp2+. Ce radical cation peut-être aussi produit par une réduc-
tion électrochimique (12-16).
Son spectre de résonance paramagnétique a été
caractérisé par Bruhin (1975) (17).
Dans nos conditions expérimentales où nous travaillon3 en présence
d'oxygène,
la concentration de cette forme réduite sera donc dépendante de
la concentration en 02 et du temps d'irradiation. Au début de la titration ,
le déclin est obtenu en moins de la mn tandis qu'en fin de titration lorsque
l'émission
est
très
faible,
il
faut
environ
2 heures
pour
accumuler
la
courbe de déclin.
67
Pour des solutions parfaitement dégagées, l'analyse du déclin de
fluorescence avec un seul temps de vie n'est pas satisfaisante. Il apparaît
toujours un temps très court
(à la limite de
la résolution de l'appareil)
dont la contribution à la fluorescence totale est toujours très faible. Dans
ces conditions, il semble que ce temps corresponde à un produit de la dégra-
dation du MDAP2+.
L'ensemble
des
résultats
de
fluorescence
statique et
dynamique
montre qu'il existe en présence des halogénures plusieurs types de complexes
aussi bien avec
l'état fondamental qU'avec l'état excité du chromophore.
- Un complexe à l'état fondamental dont la contribution à la fluo-
rescence doit être nulle
surtout en présence des ions bromures et iodures
où l'extinction de la fluorescence est totale. Aux faibles concentrations en
inhibiteurs, sa contribution reste toujours
très faible.
- Un complexe collisionnel à l'état excité qui induit une diminu-
tion du temps de vie de fluorescence du MDAP2+.
Etant donné l'existence d'au moins deux mécanismes d'inhibition,
l'analyse simple de la variation de l'intensité de fluorescence et du temps
de vie peut être faite suivant le schéma cinétique ci-dessous (18-21).
k+ e
A*
+
Q
AQ*
k_ e
jki
EC 1 C j
j
c 1kr
j
kr
kt C
Kg
A
+
Q
AQ
68
Selon ce
schéma,
l'inhibiteur
peut
réagir
à l'état
fondamental
pour donner un complexe AQ avec une constante d'équilibre Kg. L'inhibiteur
peut aussi réagir avec l'état excité du chromophore pour donner un complexe
AQ* avec une constante d'équilibre Ke . Le chromophore A et le complexe AQ
absorbent à la longueur d'onde d' exc ita tion avec respecti vement
un coeff i-
cient d'extinction molaire E ~t EC.
Selon
le
schéma
cinétique
proposé
ci-dessus,
la
variation
de
l'intensité de fluorescence du chromophore en fonction de la concentration
en inhibiteur Q peut être mise sous la forme suivante:
F
(2)
où les temps de vie de fluorescence et les rendements quantiques de fluo-
rescence du chromophore libre A*
('o,qo) et du complexe AQ* ('OC,qoC) sont
donnés par les relations suivantes:
1/(kf+ ki)
1/(k f C+ki C)
Fo et F sont les intensi tés de fluorescence mesurées en l'absence et en
présence de l'inhibiteur Q.
a = [A]/[A]b
R
qoC/qo est le rapport des rendements quantiques de fluorescence.
Dans les complexes avec le MDAP2+,
aucune variation de l'absor-
bance n'est observable en présence des inhibiteurs, de telle sorte que l'on
peut considérer que E est très peu différent de EC.
De plus, les spectres
d'émission de fluorescence restent
parfaitement homothétiques
en présence
des différents inhibiteurs. On observe simplement une diminution de l'inten-
sité de fluorescence.
Dans le modèle proposé ci-dessus, on doit observer expérimentale-
ment deux
temps de v ie qui
var ient
avec
la
concentration en
inhibi teurs
suivant les relations ci-dessous (18, 20) :
69
(a+b) - [(a-b)2+4c]1/2
-------------------------
(3)
11
2
(a+b) + [(a+b)2+4c]1/2
------------------------
(4 )
12
2
où
a
+ k+ e [Q]
(5 )
10
b
(6 )
c
L'analyse des résultats de fluorescence statique suivant le méca-
nisme proposé ci-dessus donne les valeurs résumées dans le tableau I.D.
10
10C
R
k+ e
k- r
Ke
Kg
(ns)
(ns)
(W 1 s-l)
(s-
(M-1
(W 1 )
[cr]
10,80
2,80
0,24
3
1010
3,6
109
'" 8
'" 30
[Br- ]
10,80
'" 0,1
+
0
4
1010
2
108
'" 20
'" 30
[r-
10,80
'" 0,1
+
0
4,4
1010
1 ,6
108
'" 275
'" 75
TABLEAU I.D
Analyse
de
l'inhibition
de
la
fluorescence
du
MDAp2+
par
les
anions
halogénures suivant un modèle à deux états.
Les valeurs du tableau I.D.
montrent que le modèlE; à deux états
pour expliquer l'inhibition de la fluorescence du MDAp2+ par les ions halo-
génuresn'est pas totalement satisfaisant
car dans le cas des ions bromures
et
iodures,
la fluorescence est totalement éteinte pour des concentrations
très élevées (autour de 1 M). Il semble donc se former aux fortes concentra-
70
tions en bromures et en iodures un autre
type de complexe dont le rendement
quantique de fluorescence est nul.
La variation relative du temps long en fonction de la, concentra-
tion en inhibiteur donne des valeurs de la constante cinétique d'accessibi-
lité (k+ e ) du MDAp2+ excité par les ions halogénures différentes de celles
obtenues en fluorescence statique.
[Cl- ]
4,0 x 108
[Br- ]
2,0 x 1010
[r- ]
2,6 x 1010
Ces différences montrent que l' inhibi tion de la fluorescence du
MDAp2+ par les anions halogénures est beaucoup plus complexes que ne l'in-
dique le schéma cinétique proposé ci-dessus :
-
i l
se forme
sûrement
un
complexe avec
l'état
fondamental
du
MDAP2+.
Ce ,complexe ne possède pas une absorbance différente de celui du
MDAp2+ libre puisqu'aucune variation de l'absorbance ne s'observe sur les
deux premières bandes d'absorption (417,5 nm et 334 nm). Le rendement quan-
tique de ce complexe doit être très faible puisque l'intensité de fluores-
cence décroft rapidement en fonction de la concentration en inhibiteurs ;
il se forme aussi des complexes à l'état excité puisque le temps
de vie de fl uorescence diminue quand
la concentration en
inhibi teur aug-
men te.
L'extinction totale de la fl uorescence du MDAp2+ en présence de
1
molaire en ions iodures indique qu'il ne se forme pas un seul complexe mais
plusieurs dont le dernier a un rendement quantique nul. La difficulté d'ana-
lyser ce système est illustrée par la variation du temps de vis de fluores-
cence du MDAp2+ en présence de KI résumée dans le tableau I.E.
71
<,>
<!>F/<,>
[KI] (M)
<!>F
'1 (ns)
Fl
'2(ns)
F2
X2
(ns)
10 7 (ns-
0
0,81
10,80
100
0,99
7,50
8,0
10-4
0,57
8,09
100
1 ,20
7,05
1 ,60
10-3
0,45
6,72
97,6
0,96
2,4
1 ,05
5,87
7,67
2,40
10-3
0,36
5,55
96,4
0,99
3,6
1 , 16
4,78
7,53
4,00
10-3
0,26
4,34
93,4
0,74
6,6
1 ,03
3,28
7,93
7,97
10-3
0,15
3,12
87,3
1 ,390
12,7
0,98
2,69
5,58
1 , 19
10-2
0,10
2,57
61 ,8
1 ,60
38,2
1 ,07
2,09
4,78
1 ,59
10-2
0,07
1,83
87,6
0,74
12,4
1 ,46
1 ,55
4,52
1 ,89
10-2
0,06
1,58
82,8
0,61
17,2
1 ,72
1 ,24
4,84
2,76
10-2
0,04
1 ,26
76,2
0,60
23,8
1 ,54
1 ,00
4,00
1
0
TABLEAU I.E:
Analyse du déclin de fluorescence du MDAp2+ en fonction de la concentration
en KI à 20°C. La concentration en MDAP2+ est de 6 10-6 M.
72
III. INTERACTION DU MDAP2+ ET DU BIS-DAp4+ AVEC LES· MONONUCLEOTIDES
1. Etude en absorption
Les titrations ont été réalisées .dans
le tampon cacodylate 10 mM
pH 7 et à 20°C en l'absence de sel. Les titrations de ces composés par les
mononucléotides font apparaître sur leurs spectres d'absorption trois carac-
téristiques communes
-
un déplacement du spectre d'absorption des deux composés vers
les grandes longueurs d'onde: ce déplacement est plus important en présence
des bases puriques. Ainsi dans les titrations du MDAp2+ par les désoxymono-
nucléotides, on observe un déplacement du spectre vers le rouge de 1,5 nm en
présence du dGMP,
2,5 nm avec le dATP,
1 nm avec le dCMP et le dTMP. Les
mêmes déplacements sont observés en présence du bis-DAp4+ (tableaux 1.1 et
I.J) .
- un hypochromisme dans les deux premières bandes d'absorption des
deux composés. Cet hypochromisme est plus important en présence des bases
puriques.
-
l'existence de points
isobestiques sur les spectres d'absorp-
tion : ces points isobestiques sont bien définis en présence des bases puri-
ques.
La figure 1.7 représente les spectres d'absorption du MDAP2+ titré
par le dGMP. En même temps que l'on observe une diminutjon de l'absorbance à
417,5
nm,
plusieurs points isobestiques apparaissent.
En présence du dGMP
sept
points
isobestiques
sont
visibles
sur
les
spectres
d'absorption
à
423,5 nm, 405,5 nm, 400,5 nm, 380 nm, 367,5 nm, 338 nm et 314 nm.
L'existence
d'un si grand nombre de points isobestiques démontre
la pr8sence d'un seul
type de complexe à l'état fondamental dont le spectre
d'absorption 8St différent de celui du composé libre.
Les ti trations du bis-DAP4+ par les quatre
mononucléotides font
apparaître les mêmes phénomènes spectroscopiques.
La figure 1.8 représente
les spectres d'absorption du bis-DAp4+ titré par le GMP.
73
0.210
CIl
o
C
RI
..c
o
ln
..c
RI
0.105
o
350
375
400
425
À( nm)
Figur'C? I. 7 : Spectres d'absorption moléculaire
du
MOAP2+ ti tré par
le dGMP
dans
le
tampon
cacodylate
10
mM
à
pH
7
et
à
20°C.
La
concentr2tion en MOAp2+ est de
1,27 x
10-5 M et les différents spectres du
haut
vers
le
bas
correspondent
aux
valeurs
suivantes
du
rapport
PlO
(phosphate sur colorant).
0
;
16;
32;
49;
65
; 81;
97
;
113;
130 et
1 46.
0,35 r - - - - - - - - - - - - -
-,
CIl
o
C
RI
..c
...
o
ln
..c
RI
0.17
o
350
375
400
425
450
À(nm)
,
. '" d b ' s - DAP4+ (l, 2 9 ;< 10 - ;, .1)
figure r.8 : SDectres d'absorption moleculalr~
li
l
G'lP
dans
1"
tampon
e~ présence de quanti tés croissantes en
l'
-
cacodylate
10 mM,
pH 7 à 20°C.
Les différents spectres du haut '1:rs l'C? bas
'vantes du rapport PlO: 0 ;7,3
; 15,J ; 23.3
SUL
j
cor"",s pondent aux 'raleurs
J1
j
]8,3 ; u6,5 ; 54,] j 62 et 69,8.
74
1
1
2
A
Ao
3
4
0.5
a
200
400
600
800
plo
figure 1.9
Variation
relative
de
l'abs6rbance du MDAp2+
(1,27 x 10-5 M)
suivie à 417,5 mm en présencé des quatre désoxymononucléotides,
dans le tampon cacodylate 101mM, pH 7 à 20°C.
1. dTMP ; 2. dCMP ; 3. dAMP ; 4. dGMP.
A
1f'E:""""
...,
Ao
1
0,8
2
0,6
3
4
0,4 L.-
---'-
L . . - _ .
...l-
- - - l ' - -
...-I
o
100
200
300
400
500
figure 1.10
Variation relative de
l'absorbance du bis-DAp 4+ (1,30 x 10-5
M) suivie à 420 nm en présence des quatre mononucléotides.
l· TMP ; 2. CMP ; 1. AMP ; ~. CMP.
75
Les
variations
relatives
de
l'absorbance mesurée à
417,5
nm et
420 nm respectivement avec lé MDAp2+ et le
bis~DAp4+ en présence des quatre
mononucléotides sont représentées sur les figures 1.9 et 1.10.
Aux
fortes
concentrations
en
mononucléotides
la
variation
de
l'absorbance atteint un plateau à partir duquel on peut estimer le pourcen-
tage d'hypochromisme.
Les caractéristiques spectrales du MDAP2+ et du bis-DAp4+ titrés
par les mononucléotides sont regroupés dans les tableaux I.H et 1.1.
La variation de l'absorbance en fonction de la concentration en
nucléotides permet d'estimer la constante d'association à l'état fondamental
en utilisant l'équation (8) ci-dessous.
K
MDAP2+ + N
complexe
K
bis-DAP4+ + N
complexe
------- + -------
•
---
•
(8)
Ao-A oo
AO-Aoo
K
[N]
où Ao
absorbance initiale
A
absorbance de la solution au cours de la titration
absorbance limite à concentration saturante en nucléotides
[N]
concentration en nucléotides
K
constante d'équilibre.
Les
constantes
d'équilibre
calculées
pour
le
MDAP2+
et
le
bis-DAp4+ sont regroupées dans le tableau l.F.
76
MDAp2+
bis-DAp4+
!
K (W 1 )
K (M-l)
dAMP
280
AMP
2200
dGMP
280
GMP
2980
dCMP
770
CMP
640
dTMP
120
TMP
340
TABLEAU I.F
Constantes d'association du MDAp2+ et du bis-DAp4+ avec les mononucléotides
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C. Les constantes d'associa-
tion ont été déterminées à partir de la variation de l'absorbance du MDPA2+
à 417,5 nm et du bis-DAp4+ à 420 nm en présence des quatre mononuclétides.
2. Fluorescence statique
Les
quatre mononucléotides
éte ignent
la
fluorescence
des
deux
composés MDAp2+ et bis-DAp4+.
Les
spectres
d 'exci tation
de
fluorescence
restent
semblables à
ceux des composés libres quand la concentration en mononucléotides augmente.
Les maxima d'excitation restent respectivement à 417,5 nm et 334,5 nm pour
le MDAp2+, 420 nm et 336,5 nm pour le bis-DAp4+. Les spectres d'excitation
de fluorescence sont invariants en
position lorsque l'émission est suivie
aux court~s longueurs d'onde, du côté bleu
de l'émission (420 nm) de
même
qu'aux grandes longueurs d'onde, du côté rouge de l'émission (450 nm). Tout
se passe donc comme si
la fluorescence observée étai t due uniquement aux
molécules
libres.
La
fluorescence
des
complexes
est
donc
pratiquement
éteinte.
Les spectres d'émission de fluorescence ne subissent aucun dépla-
cement
et
les
maxima
restent
à
423
nm pour
le
MDAp2+,
427
nm
pour
le
bis-DAP4+. Pour de très fortes concentrations
en nucléotides, les spectres
d'émission
des
complexes
avec
le
bis-DAp4+
se déplacent
de
427
nm
vers
423 nm correspondant au maximum d'émission du monomère.
·77
10
~
ni
~
---Q)ur:
Q)
u
rh
Q)
...
0
:::J
5
-Q)
"0
'Q)
-rhr:
Q)
-r:
0
400
475
550
À (nm)
Figure 1.11
: Spectres d'émission de fluorescence du MOAp2+ (7,50 x 10-6 M)
en présence du dAMP dans
le
tampon
cacodylate
10 mM,
pH
7 à
20°C.
La
longueur d'onde est
un
point.
isobestique déterminé en absorption.
Les différents spectres correspondent. aux valeurs suivantes du rapport PlO:
A : ° ; 8 : 208 ; C : 732 ; D : 4882.
10
~
CIl
:i
---<IlUr:
<Il
u
III
<Il
...
0
:::J
5
-<Il
"0
-<Il
-IIIc:
<Il
-c:
0
400
500
600 À(nm)
Figure 1.12: Spectre d'émission de
fluorescence
du bis-DAP4+ (1,30 x 10-')
t1)
titré
Dar
le G11P dans
le
tampon cacodylate 10 mM,
pH
7 à
20°C.
La
longueur
d'onde
d'excitation
(400,5
nm)
est
un
point.
isobest~que
déterminé en absorotion. Les différent.s spectres du haut vers le bas corres-
pondenc aux '[aleur~ sui '[antes du rapport P/D : 0 ; 18,7 ; 37,3 ; 56 ; 74,7 ;
112 et I L1 9,5.
78
0.8
F
Fo
0.6
1
0.4
2
0.2
3
0
0
0
0
500
1000
1500
2000
plo
2
Figure I.
13 : Variation relative de l'intensité de fluorescence du MDAp +
(7,50 x 10~6 M) en présence des différents mononucléotides
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C. L'émission de fluorescence
est recueillie à 423 nm tandis que l'excitation est toujours un point iso-
bestique déterminé en absorption.
1 : dTMP, 2 : dCMP, 3 : dAMP, 4 : dGMP.
F
1
Fa
0,8
0,6
0.4
0,2
o
o
100
200
300
400
500
plo
Figure I.
14 : Variation relative de l'intensité de fluorescence du bis-DAp 4+
(1,30 x 10-5 M) en présence des différents mononucléotides
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C. L'excitation est toujours
un point isobestique et l'émission de fluorescence est recueillie au maximum
d'émission, soit à 427 nm.
1: GMP, 2 : AMP, 3 : CMP, 4 : TMP.
79
Les figures 1.11 et 1.12 représentent respectivement
les spectres
d'émission de fluorescence du MDAp2+ titré par le dAMP et du bis-DAp4+ titré
par le GMP.
En titration isotherme, l'excitation
est toujours choisie à une
longueur d'onde
isobestique
déterminée
sur
les
spectres d'absorption.
On
suppose ici, comme on le verra en fluorescence dynamique, que le rendement
quantique du complexe est très faible.
Les figures 1.13 et 1.14 représen-
tent les variations de l'intensité de fluorescence du MDAp2+ et du bis-DAp4+
en présence des différents mononucléotides dans le tampon cacodylate 10 mM à
pH 7 et à 20°C. La
représentation de la variation de fluorescence suivant
l'équation (2) permet une estimation des constantes d'association à l'état
fondamental
entre les deux composés et les mononucléotides.
MDAp2+
bis-DAp4+
Kg (M-l)
Kg (W 1 )
dAMP
615
AMP
1970
dGMP
660
GMP
1970
dCMP
205
CMP
560
dTMP
135
TMP
490
TABLEAU 1.G
Constantes d'association du MDAp2+ et du bis-DAp4+ avec les quatre mononu-
cléotides.
Les valeurs des constantes d'association mesurées en fluorescence
diffèrent un peu de celles obtenues par absorption. Les faibles variations
observées en absorption induisent une erreur très importante sur la détermi-
nation des constantes
d'association. Les valeurs obtenues en fluorescence
sont donc plus correctes.
80
3. Fluorescence dynamique
Le déclin de fluorescence du MDAp2+ dans le tampon cacodylate à
20°C peut être ajusté avec un seul temps de vie de fluorescence de
10,8 ns.
En présence des différents mononucléotides, on observe une diminution de ce
temps de vie. Le déclin ne peut plus alors être ajusté avec un seul temps de
vie : il faut faire intervenir un deuxième temps lorsque la concentration en
nucléotides augmente. Ceci explique que la désactivation du MDAp2+ par les
mononucléotides fasse intervenir au moins deux mécanismes
- une 'désactivation de l'état excité qui se traduit par un rac-
courcissement du temps de vie de l'état excité,
- une inhibition à l'état fondamental: la constante d'association
du MDAP2+ avec les bases reste relativement faible (voir les résultats obte-
nus en fluorescence statique),
il s'ensuit que la proportion du complexe à
l'état fondamental reste faible.
De plus son rendement quantique de fluo-
rescence est petit par rapport à celui du MDAp2+ libre.
Le temps inférieur à la nanoseconde contribue pour très peu (envi-
ron 5 %) à la fluQrescence totale. Il peut être _attribué comme nous l'avons
déjà vu avec les halogénures à des produi ts de dégradation du MDAp2+ ou à
des complexes avec l'état excité du MDAp2+ dans lesquels interviennent plu-
sieurs molécules de mononucléotides.
L'analyse de
la
variation
du
temps
de
vie
de
fluorescence
de
l'état excité permet cependant une estimation des constantes d'accessibilité
du MDAP2+
par les mononucléotides.
Ce
temps
varie
suivant
l'équation de
Stern-Volmer. La pente des droites permet d'es timer la valeur de la cons-
tante de
vitesse d'inhibition du MDAp2+ par les mononucléotides. Les résul-
tats sont regroupés ci-dessous.
81
' 0
(ns)
k+ e '0 (M-1)
k+ e (M-l s-l )
AMP
10,80
84
7,78 109
CMP
10 ,80
103
9,54 109
CMP
10,80
94
8,70 109
TMP
10,80
53
4,91 109
TABLEAU I.H
Constantes
cinétiques
d' inhibi tion
de
la
fluorescence
du
MDAp2+ à l'état excité par les mononucléotides.
Ces cons-
tantes sont déduites des variations relatives du temps long
en fonction de la concentration en nucléotides
Conclusion
La
fluorescence
du
MDAp2+
est
totalement
éteinte
par
les
ions
bromures et iodures. Cette extinction totale suppose un mécanisme plus com-
plexe que celui que nous avons proposé. Il doit certainement se former aux
fortes
concentrations
en
inhibiteurs
des
complexes
dont
les
rendements
quantiques de fluorescence sont nuls.
L' inhibi tion
de
la
fluorescence
du
MDAp2+
par
les
nucléotides
n'est pas due à la présence des phosphates qui ont un effet inhibiteur très
faible
jusqu'à
une concentration de
10-2 M (cf.
tableau
I.C)
mais à
une
interaction du composé avec les bases nucléiques. Cette inhibition est plus
forte en présence des bases puriques.
La présence d'un deuxième temps dont la contribution à la fluo-
rescence totale est faible montre que la désactivation de l'état excité du
MDAp2+ fait intervenir plusieurs types de complexes. En présence des bases
puriques, la fluorescence de ces complBxes est totalement éteinte.
82
1 1 hypochromlsme
HIJAPZ+ 0
max)
(nm)
U17.5
33~ .5
HDAPZ+ lA max)
(nm)
uza
335
18
+
336.5
3Z1
316.5
dAIIP lA Isobestlque)(nm)
~23.5
~09
396
388
330
HDAPZ' (A max)
(nm)
~ 19
335
35
+
dGHP (A Isobestlque)(nm)
UZ3.5
U05,5
~00.5
380
361.5
338
31~
HDAP2+ (A max)
( nm)
~18.5
335
7
.
316
dTI1P 0
isobestlque)(nm)
U22
385
337.5
HDAP2+ (A max)
(nm)
~18.5
33~.5
9
+
dCHP 0
isobestique)(nm)
u2u
313
TABLEAU 1.1 : TI tration du ~IDAP2+ par les mononucléotldes dans le tampon cacodylate la mH. pH 7 à 20'C. La concentr~
tlon en MIJAp2+ est constante et égale à 1.3 10-5 H.
Le pourcentage
d'hypochromls me est estimé à tres
forte concentration en mononucléotldes (' 10- 2 M) lorsque l'absorbance à ~\\7 ,5 nm corrigée de la dilution atteint un
plateau.
Il Hypochromisme
bis-DAP4+ lA max)
(nm)
~19,5
336.5
bls-DAp4+ 0
max)
(nm)
42~,5
339
+
55
AHP (A lsobestique) (nm)
~21
406.5
400
380
366.5
3~0.5
328
326
bis-DAP4+ (A max)
(nm)
~23
339
,
54
CHP (A lsobestlque) (nm)
42u .5
~01.5
400,5
383
318,5
366,5
3~O,5
326
b19-DAP4+ (A max)
(nm)
~20,5
337.5
.
23
THP (A isobestlque) (nm)
~2~
401,5
362,5
3~1
310
bls-DAp4' lA max)
(nm)
~22
338
+
33
OIP lA lsobestique) (nm)
~23
~05,5
~00,5
36~
3~0.5
328.0
325.5
TABLEAU I.J : Ti tratlon du
bis-DAP~+ par les mononucléotides dans le tampon cacodylate
10 mH pH 1 et à 20'C.
La
concentration en bis-DAP~' est de 1.8 10-5 M. Le pourcen~age c 'hypochromlsme est estimé à très forte
concentration en ~nonucléotides (' 10-2 M) lorsque l'absorbance à ~20 nm corrigée de la dilution atteint un plateau.
83
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CHAPITRE II
INTERACTIONS DU MDAp2+ ET DU BIS-DAp 4+
AVEC LES ACIDES NUCLÉIQUES
85
1. ETUDE EN ABSORPTION
1. Interaction avec les acides nucléiques en simple brin
Les
titrations du MDAp2+ et du bis-DAp4+ par les polynucléotides
en simple brin comme en double brin sont
caractérisées
par
trois
types de
modifications
spectroscopiques.
Ces
modifications
sont
du
même
type
que
celles observées, lorsque de
petites
molécules chargées se fixent sur une
matrice polyanionique (1-4).
un
déplacement
du spectre d'absorption des deux composés
vers
les
grandes
longueurs d'onde.
Ce
déplacement
varie
avec
la
nature
et
la
structure du polynucléotide.
Ainsi,
le plus faible déplacement est observé
dans la titration du MDAp2+ par le poly(dA)
: ce déplacement est de 1,5 nm.
Par contre,
dans la titration du bis-DAp4+ par le poly(rA),
le déplacement
du spectre d' absorpt ion
vers
les
grandes
longueurs
ct' onde at te int
11
nm.
Qualitativement,
les phénomènes observés sur les spectres d'absorption sont
analogues à ceux observés lors des titrations de ces deux composés par les
mononucléotides.
86
- - - - - -
~ Hypochroml sme
à~17.5nm
HDAP2+
~ max (nro)
"17.5
33~,5
<
15800
35000
ADN
~ max (nm)
~25 .5
3~1
À
tsobestiQue (nm)
"2"
"07
"00.5
383.5
37~ .5
370
3~0
302
62
polyd(G-C)-polyd(G-C)
~ max (nm)
~26
3~q
~ Isobe.tlque (nm)
"2" .5
~07
"00.5
383.5
376
368.5
3~0.5
302.5
67
polyd(A-T)-polyd(A-T)
~ max (nm)
"2"
3~~.5
~ I,obe,tlque (nm)
"23,5
~06
396.5
383
372
339.5
300
5~
poly(dA)-poly(dT)
~ max (nm)
~21
336.5
~ I.obe,tlque (nm)
"23
~05
~oo
382
375
367.5
338
32Q.5
300.5
37
poly(dA)
~ max (nm)
~ 19
335
~ I.obe,tique (nm)
"2~
383
3~0
303
55
poly(dT)
~ max (nm)
~20
336.5
~ I.obe.tique (nm)
"21
~05.5
397
381
375
365.5
337
327
322.5
312.5
20
poly(rA)
~ max (nm)
~23,5
336.5
~
Isobe.tlque (nm)
"23
"06,5
399,5
38~,5
338.5
327
32Q
60
TABLEAU II .A
Caractéristiques des spectre. d'absorption
du MDAP2+ libre
et complexé aux différent. polynucléotides dan. le
tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20'C.
l Hypochromlsme
à Q19.5 nID
bls-DAP"+
~ max (nm)
~19.5
336,5
<
25200
66500
ADN
~ max (nm)
~27
~ Isobestlque (nro)
~26
~09
~02.5
385.5
377
372
3Q3
300
67
polyd(G-C)-polyd(G-C)
~ max (nm)
~26.5
~ lsobe.tlque (nro)
~26.5
~08.5
~03
38~
376.5
371.5
3~~
302
66
polyd(A-T)-polyd(A-T)
~ max (nm)
~23.5
~ I.obe.tlque (nm)
~25.5
~07.5
~02
385,5
3~2
296
62
poly(dA)-poly(dT)
~ max (nm)
~21
~ I.obe.tlque (nm)
~25.5
~07 .5
"02
383.5
370.5
3~1
~~
poly(rA)
~ max (nm)
"30
~ I.obe.tlque (nm)
~25
~10.5
~00.5
388.5
3~2
331
327
30~
70
poly(rG)
~ max (nm)
~2~, 5
~ I.obest Ique (nm)
~2~.5
"10,5
399
388,5
3~1
330
326
31 ~
310.5
305.5
~O
poly(rC)
~ max (nm)
"20,5
~
i.obe,tlque ( nm)
,
"2",5
"1 "
3~1
332
326
317
36
1
TABLEAU Il.B
Caractéristiques des spectres d'absorption du bls-OAP2+ libre et complexé aux différents polynucléotides dans
le tampon cacody late 10 mM, flaC! 1DO mM à pH 7 et à 20'C.
87
- un hypochromisme dans les deux premières bandes
des
deux
com-
posés : Il est plus important pour les polynucléotides contenant les bases
puriques que pour ceux contenant les bases pyrimidiques, ce phénomène a déjà
été
observé avec
les
mononucléotides.
L'hypochromisme
dans
la
première
bande d'absorption (417,5 nm) du MDAp2+ atteint 60 % dans la titration avec
le poly(rA) et 70 % dans la titration du bis-DAp4+ avec le poly(rA).
Les caractéristiques spectrales des deux colorants en présence des
différents polynucléotides sont regroupées dans les tableaux II.A et II.B.
pOly(dA)
La fixation du MDAP2+ sur le poly(dA) induit un hypochromisme de
55 % dans la première bande d'absorption du ligand
(417,5 nm).
Le spectre
d'absorption
se
déplace
vers
les
grandes
longueurs
d'onde
de
1,5
nm
(417,5 nm + 419 nm). Quatre points isobestiques apparaissent respectivement
à
424 nm, 383 nm, 340 nm et 303 nm.
poly(rA)
L'hypochromisme sur la première bande d'absorption atteint 60 % en
présence du MDAp2+ et 70 % en présence du bis-DAP4+. Les spectres d'absorp-
tion du MDAP2+ et du bis-DAP4+ se déplacent respectivement de 6 nm et 11 nm
vers les grandes longueurs d'onde.
Dans l'un et l'autre cas,
les spectres
d'absorption présentent plusieurs points
isobestiques.
La multi plicité de
ces
points
isobestiques
démontre
l'existence à l'état
fondamental
d'un
seul type de complexe entre chacun des deux ligands avec les polynucléo-
tides.
Les
principaux
points
isobestiques
observés
sur
le
spectre
d'absorption des deux ligands sont situés respectivement à 423 nm, 406,5 nm,
399,5 nm,
384,5 nm, 338,5 nm,
327 nm et 324 nm pour le MDAP2+ et
425 nm,
410,5 nm,
400,5 nm,
388,5 nm,
342 nm,
331
nm,
327 nm et 304
nm pour le
bis-DAp4+.
88
La figure
II. 1 représente
les spectres d'absorption du
MDAp2+
titré avec le poly(rA).
poly(dT)
L' hypochromisme
observé sur les spectres d'absorption du MDAp2+
titré par le poly(dT) est plus faible que pour les autres homopolynucléoti-
des. Il est d'environ 20 %. Plusieurs points isobestiques sont situés res-
pectivement à 421 nm, 405,5 nm, 397 nm,
381 nm,
375 nm,
365,5 nm,
337 nm,
327 nm,
322,5 nm et 312,5 nm. Le déplacement des spectres d'absorption vers
les grandes longueurs d'onde est
de 2,5 nm.
Cet te valeur se si tue entre
celle observée avec le poly(dA) (1,5 nm) et avec le poly(rA) (6 nm).
poly(rG)
L'hypochromisme des spectres d'absorption du bis-DAP4+ complexé au
poly(rG)
(40 %)
est
moins important que lorsque ce dernier est complexé
avec le poly(rA) (70 %). Les spectres se déplacent de 7 nm vers les grandes
longueurs d'onde et plusieurs points isobestiques sont observés respective-
ment à 424,5 nm, 410,5 nm, 399 nm, 388,5 nm, 341 nm, 330 nm, 326 nm, 314 nm,
310,5 nm et 305,5 nm. La figure II.2 représente les spectres d'absorption du
bis- DAp 4+ titré par le poly(rG).
poly (rC)
Le maximum d'absorption du bis-DAP4+ complexé au poly(rC) se dé-
place
de
419,5
nm
à
420,5
nm
et
l'hypochromisme
de
la
première
bande
d'absorption atteint 36 %. Ici comme dans les autres cas, plusieurs points
isobestiques apparaissent
sur
les
spectres
d' a~sorption respecti vement
à
424,5 nm, 414 nm, 341 nm, 332 nm, 326 nm et 317 nm.
Le MDAP2+ est le bis-DAP4+ se fixent sur les polynucléotides
en
simple brin. Cette fixation provoque un déplacement du spectre d'absorption
des
deux
composés
vers
les
grandes
longueurs
d'onde
et
un
hypochromisme
important est observé sur les deux premières transitions. La variation rela-
89
0,2
CIl
U
c
m
.Q
...
,;~
0
li)
.Q
m
0,1
o3oLo-----.:::::::::::.--~40:-:-0--~~==rm--"7:500 À (n m)
Figure 11.1: Spectres d'absorption du MDAp2+ (5.70 x 10- 6 M) titré par le
poly(rA) dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C. Les
différents spectres (du haut vers le bas à ~17,5 nm) correspondent aux va-
leurs suivantes du rapport P/D : 0 ; 9,6
; 20
; 40
; 59,8
; 79,8 , 99,7 ;
120 et 160.
0,45
1
CD
U
c
m
.Q
o
li)
.Q
m
0,22
o
280
420
550
À(nm)
Figure 11.2 : Spectres d'absorption du bis-DAP~+ (7,06 x 10-6 M) titré, par
l
ly(rG) dans le tampon cacodylate 10 mM, t,JaCl 100 mt~ a pli
7 et à 20°C.
e
Les po
différents spectres ( du haut
l
vers.
ba
e
a ~19
s , 5 n~)
.
cor-
respondent aux valeurs
.
SUlvan tes du rappor t P/D
0
: ;
0
" 5 . l
" 1,5
;
2
;
2,5 ; 3,5 ; 4,5 et 5,5.
90
A
Ao
1
0,8
0,6
0,4 L . . - - -_ _..I...-
.J.....
...L..
......L
--.J
o
50
100
150
200
p/D
Figure II.3
Variation relative de
l'absorbance du MDAp2+
(6,0 x 10- 6 M)
mesurée à 417.5 nm en présence des différents polynucléotides
en simple brin dans le tampon cacodylate 10 mM, pH 7 à 20°C.
1 - poly(dT)
2 - poly(rA)
3 - poly(dA)
A
1
.\\
0,8
~\\\\.
1
0,6
\\.
"Q --4l
_--0------- -------0-.
Q
-----0---
.\\
2
\\
0,4
\\ ''0..__..0----0----0---0-----------------0
3
o
5
10
15
20
25
p/D
Figure II.4
Variation 'relative de l'absorbance du bis-DAp4+ (6.75 x 10- 6
M) mesurée à 420 nm en présence des différents polynucléotides
dans le tampon cacodylate 10 mM, NaCl 100 mM pH 7 à 20°C:
1 : poly(rC) ; .? : poly(rG) ; l
: poly(rfl).
91
ti ve de
l' absorbance mesurée sur la première bande d'absorption des deux
ligands est représentée sur les figures II.3. et II.4. Enfin on observe plu-
sieurs points isobestiques sur les spectres d'absorption. L'existence de ce
grand nombre de points isobestiques montre que dans la gamme de concentra-
tions en polynucléotides utilisée, un seul type de complexe est formé.
2. Interaction avec les acides nucléiques en double brin
Les acides nucléiques en double brin utilisés pour les titrations
du MDAP2+
et
du
bis-DAP4+
sont
l'ADN
de thymus de veau, le po~yd(A-T)
polyd(A-T),
le
polyd(G-C)-polyd(G-C),
le
poly(dA)-poly(dT)
et
le
poly(rA)-poly(dT).
Les spectres d'absorption des deux colorants subissent un déplace-
ment
vers les grandes
longueurs d'onde,
ce déplacement
es t
d'autant
plus
important que le pourcentage en paire de bases (G-C) augmente.
L'hypochromisme observé sur les deux premières bandes d'absorption
est plus important avec le polyd(G-C)-polyd(G-C) qu'avec les autres
poly-
nucléotides.
Enfin,
comme dans les titrations avec les polynucléotides en sim-
ple
brin,
plusieurs
points
isobestiques
apparaissent
sur
les
spectres
d'absorption.
ADN de thymus de veau
Les titrations avec le MDAP2+ ont été réalisées à faible concen-
tration ionique dans le tampon
cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C tandis
qu'elles ont été faites à haute concentration ionique avec le bis-DAp4+. En
effet, à faible force ionique, le bis-DAp4+ provoque la formation d'agrégats
qui préci~itent. Les titrations ont donc été réalisées dans le tampon caco-
dylate 10 mM, NaCl 100 mM à pH 7 et à 20 oC.
92
Le
maximum de
l'absorption
du MDAp2+
se déplace de
417,5 nm à
425,5
nm tandis que celui du bis- DAp 4+ se
déplace de 419,5 nm à 427 nm.
L'hypochromisme observé dans la première bande d'absorption est de 62 % pour
le MDAp2+ et 67 % pour le bis- DAp 4+. Plusieurs points isobestiques apparais-
sent sur les spectres d'absorption. Les longueurs d'onde de ces points iso-
bestiques sont déplacées d'environ 2 nm vers les grandes longueurs d'onde
dans les complexes avec le bis-DAp4+ par rapport à ceux avec le
MDAp2+.
polyd(G-C)-polyd(G-C)
Le déplacement du spectre d'absorption vers les grandes longueurs
d'onde est de 7 nm dans les deux cas et l'hypochromisme de 67 % avec le
MDAp2+ et 66 % avec le bis-DAp4+. Le maximum du spectre limite du complexe
bis-DAP4+_polyd(G-C)-polyd(G-C) se situe en un point isobestique (426,5 nm).
Les
longueurs d'onde des autres
points
isobestiques
sont
les mêmes
que
celles mesurées en présence d'ADN de thymus de veau.
polyd(A-T)-polyd(A-T)
L' hypochromisme est voisin de celui observé lors de la ti tration
des deux composés par le polyd(G-C)-polyd(G-C) soit 54 % en
présence du
MDAp2+ et 62 % en présence du bis-DAp4+. Les spectres d'absorption du MDAp2+
se déplacent vers les grandes longueurs d'onde de 6,5 nm.
Les points iso-
bestiques apparaissent aux longueurs d'onde sui vantes
423,5 nm,
406 nm,
396,5 nm, 383 nm,
372 nm,
339,5 nm et 300 nm. Au début de la titration du
biS-DAp4+ par le polyd(A-T)-polyd(A-T) on observe des points isobestiques
à
425,5 nm,
407,5 nm,
402 nm,
385,5 nm,
342 nm,
296
nm
pour
des
rapports
phosphates 1 ligands
inférieurs à 10. Au delà de ce rapport les spectres
d'absorption
se
déplacent
vers
les
grandes
longueurs
d'onde.
Le
maximum
d'absorption du bis-DAp4+ dans les complexes se situe alors à 423,5 nm.
poly(dA)-poly(dT)
En
absorption,
on
observe
les
mêmes
variations
spectrales
du
MDAp2+
et
du
bis-DAp4+
que
celles
obtenues lors des
ti trations avec
les
93
1,26 .--_ _---.-
-----,
G)
u
c:
111
...
.Q
o
Ul
.Q
111
0,63
300
400
500
À(nm)
Figure 11.5 : Spectres d'absorption du MOAp2+
(J.57 x 10-5 M)
titré par le
polyd(A-T)-polyd(A-T)
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7
et
à
20°C.
Les
différents
spectres
correspondent
(du
haut
vers
le
bas
à
417,5 nm) aux valeurs suivantes du rapport PlO: 0 ; 1,2 ; 2,3 ; 3.5 ; 4,6
5,8 ; 7 et 8,1.
0,46
G)
u
c:
111
.Q
...
o
Ul
.Q
111
0,23
('
o
300
430
550
Figure 11.6 : Spectres d'absorption du bis-OAP4+
(6,98 x 10- 6 ~I) titré par
le polyd(G-C)-polyd(G-C) dans le tampon cacodylate 10 mM, NaCl
100 mM à pH 7 et à 20°C. Les différents spectres correspondent (de haut en
bas à 1119,5 nm) aux valeurs suivantes du rapport
PlO:
0
; 0,119
; 0,97
;
1,115 ; 1,93; ::!,i12 ; 2,90 ; 3.37 ; 3.87 et 4,33.
94
1
A
Ao
1
0.5
2
3
4
o o
25
50
75
100
plo
.
. .
1 "
2+
F~gure II.5bis
Var~at~on re at~ve de 1 absorbance du MDAP
(3,5 10-5 H) mesurée à 417,5 nm en présence
du poly(dA)-poly(dT)
(1)
; du polyd(A-T)-polyd(A-T)
(2)
; du polyd(G-C)-polyd(G-C) (4) et de l'ADN de
thymus de veau (3). Tampon cacodylate 10 mM,
pH 7 à 20°C.
A
Ao 0.8
0.6
1
0.4
2
~
3
02
o
o
5
10
15
20
25
pl D
.
4+
Figure II. 6bis
Variation relative de l'absorbance du b~s-DAP
suivie à 420 nm dans le tampon cacodylate 10 ~1,
NaCl 100 mM à pH 7 et à 20°C. (1) polyd(A-T)-
polyd(A-T), (2) ADN de thymus de veau,
(3) polyd(G-C)-polyd(G-C).
95
autres polynucléotides. L'hypochromisme est néanmoins moins important : 37 %
pour
le
MDAp2+
et
4.4
% pour
le
bis-DAp4+.
Le
déplacement
des
spectres
d'absorption vers les grandes longueurs d'onde
est le même pour les deux
composés (3,5 nm). Il est moins important que pour les autres polynucléoti-
des. On observe encore plusieurs points isobestiques : 423 nm,
405 nm,
400
nm,
382 nm,
375 nm,
367,5 nm,
338 nm,
324,5 nm,
300,5 nm sur les spectres
d'absorption du bis- DAp 4+.
La
figure
II.5
représente les spectres d'absorption du MDAp2+
titré par le polyd(A-T)-polyd(A-T) dans le tampon cacodylate 10 mM, pH 7
et
à
20°C.
Les
spectres
d'absorption
du
bis-DAp4+
en
présence
du
polyd(C-C)-polyd(C-C) sont illustrés sur la figure II.6.
Les
tableaux
II.A
et
II.8.
résument
l'ensemble
des
variations
spectroscopiques du MDAp2+ et du bis-DAp4+ complexés aux différents polynu-
cléotides.
La variation relative de l'absorbance du MDAp2+ mesurée à 417,5 nm
en présence des polynucléotides en double brin est représentée sur la figure
II.5 bis, et celle du bis-DAp4+ à 420 nm sur la figure II.6 bis.
Parmi les différents modèles proposés pour analyser de façon quan-
ti tative
la
fixation
de
petites
molécules
sur
des
macromolécules,
celui
proposé par Mc Chee et Von Hippel se distingue par la simplicité de sa for-
mulation mathématique. (5, 6). Ce modèle
décrit la fixation de ligands
sur
une matrice macromoléculaire homogène et linéaire,
de
longueur
infinie
en
terme d'équilibre thermodynamique à l'aide de trois paramètres:
n, la taille du site de fixation du ligand,
K, la constante d'affinité intrinsèque de fixation du ligand sur
un site isolé
w, le degré de coopérativité entre les ligands.
Suivant la valeur de w, la fixation des ligands est dite coopéra-
tive si w > 1 et anti-coopérative si w < 1. Lorsque w = 1, il n'existe aucu-
ne interaction entre les ligands fixés.
96
Les équations formulées par M9 Ghee et Von Hippel sont
- pour une fixation non coopérative (w
1)
n-1
v/Lf = K(l-nv)
• [(l-nv) 11-(n-1)v]
(1)
- pour une fixation coopérative (w ~ 1)
v
[( 2w-1 )( 1-nv)+v-R]
n-1
K(l-nv)
------------------
Lf
[2 (w-1 )( 1-nv)]
où
R
[[1-(n-1 )vJ2+4 wv(1-nv)]1/2
v
représente
la
densité
de
fixation
v
[ligands' fixés]
1
[matrice]
Lf est la concentration en ligands libres.
La variation de l'absorbance du MDAP2+ (418 nm ou 334 nrn) en pré-
sence
des
différents
polynucléotides
a été
analysée
suivant ce
modèle à
l'aide d'un programme d'ajustement de moindres carrés mis au point par le
Dr. Gérard Lancelot au Centre de Biophysique Moléculaire à Orléans. Le ta-
bleau ci-dessous rassemble les paramètres thermodynamiques des différentes
fixations.
1
ll
K (W
n
w
ADN de thymus de veau
2,5 105
6,8
0,5
polyd(G-C)-polyd(G-C)
1 , 1 106
6
0,3
polyd(A-T)-polyd(A-T)
1 ,4 105
6
0,9
poly(dA)-poly(dT)
6,0 103
5,5
3,5
poly(dT)
4,3 103
6
TABLEAU II .C
Paramètres de la fixation du MDAP2+ sur les acides nucléiques dans le tampon
cacodylate 10 mM
à pH 7 et à 20°C.
97
La fixation du MDAp2+ est beaucoup plus forte sur les acides nu-
cléiques en double brin qu'en simple brin. La fixation est plus importante
sur le polyd(G-C)-polyd(G-C) que sur le polyd(A-T)-polyd(A-T).
La valeur de n varie entre 6 et 7 phosphates aussi bien sur les
simples brins que sur les doubles brins. La valeur de west inférieure à 1
pour les acides nucléiques en double brin sauf pour le poly(dA)-poly(dT).
Ceci démontre que la fixation du MDAp2+ est anticoopérative. La taille du
site, voisine de 3 paires de bases est la valeur généralement trouvée lors
de la fixation de certains colorants sur les acides nucléiques (7-9).
Le
cas
du
poly(dA)-poly(dT)
est
différent
de
celui
des
autres
polynucléotides en double hélice. La structure de ce duplex est bien parti-
culière et i l a été proposé que les deux chaînes n'adoptent
pas
la même
conformation,
le
nombre
de
paires
de
bases
par
tour
d'hélice
10,1
étant
inférieur à ce que l'on trouve dans les autres
formes d'acides nucléiques
(10,5 paires de bases par tour d'hélice)
(10-14). Des résultats cristallo-
graphiques récents montrent que des liaisons hydrogènes di tes
"bifurquées"
se forment entre deux paires de bases A-T successives (15). Cette particu-
larité explique que le poly(dA)-poly(dT) n'ait pas une structure favorable à
l'intercalation d'où une constante d'équilibre plus faible. La fixation d'un
ligand provoque une modification de structure qui favorise ensuite la fixa-
tion dans les sites voisins. Il en résulte une coopérativité positive (w >
1) contrairement aux autres polynucléotides en double brin. Ce comportement
a été aussi trouvé lors de la fixation de la daunomycine et de l'iodure de
propidium sur le poly(dA)-poly(dT) (16, 17).
Les
constantes
de
fixation
du
bis-DAp4+ sont
plus élevées
que
celle du MDAp2+, de plus cette fixation
est aussi forte sur les polynucléo-
tides en simple br in que sur
les duplex
(tableau II. D).
La f ixat ion est
anticoopérative et la taille de fixation (6 < n < 7) est la même que pour le
MDAp2+.
Cec i
s'expliquerai t
si
un
seul
noyau
diazapyrène
interagi t
avec
l'acide nucléique tandis que l'autre moitié ,interagit avec une autre molécu-
le. Ce système de fixation intercaténaire
provoque la formation d'agrégats
observés à faible force ionique et dans les déplacements anormaux du plasmi-
98
de pBR 322 dans les gels d'électrophorèse (voir la dernière partie de ce
chapitre).
1 K (W')
n
w
ADN de thymus de veau
1 ,3 10 6
7
0,9
polyd(G-C)-polyd(G-C)
2,3 107
5,5
0,3
polyd(A-T)-polyd(A-T)
3,0 105
6,
0,7
poly( rG)
3,3 107
6,6
0,7
poly(rC)
1 ,0 107
6,5
0,3
TABLEAU II.D
Constantes de fixation du bis-DAP4+ sur les acides nucléiques à 20°C dans le
tampon cacodylate 10 mM, NaCl, 100 mM à pH 7 et à 20°C.
99
II. ETUDE EN FLUORESCENCE
Nous avons vu au chapitre l que toutes les bases nucléiques étei-
gnent la fluorescence du MDAp2+ ainsi que celle du bis-DAp4+. Il en est de
même pour les oligonucléotides en simple ou en double brin. Cette extinction
de fluorescence est pratiquement totale avec l'ADN de thymus de veau et le
polyd(G-C)-polyd(G-C).
Avec les autres
polynucléotides l'inhibition
de la
fluorescence est très grande car en fin de titration la fluorescence
rési-
duelle est toujours inférieure à 1 % de la fluorescence initiale et ce dès
que le rapport phosphate sur ligand atteint 100 à faible force ionique.
1. MDAp2+
Les spectres d'excitation et d'émission de fluorescence du MDAP2+
en présence du poly(dA)-poly(dT) sont représentés sur la figure 11.7.
Les
mêmes
types
de
spectres
sont
obtenus avec
les
autres
polynucléotides et
l'ADN de thymus de veau. Le maximum d'émission du MDAp2+ est situé à 423 nm.
Au cours des titrations avec les différents polynucléotides, l'intensité de
fluorescence diminue
sans déplacement du maximum
d'émission. Tout se passe
donc comme si la fluorescence observée n'était due qu'à la molécule libre.
La variation relative de l' intensi té de fl uorescence mesurée au
maximum de chaque bande vibronique est la même. L'inhibition est d'autant
plus forte que le polynucléotide est riche en guanine. Les polynucléotides
en double brin sont plus efficaces pour éteindre cette fluorescence. La fi-
gure II.8 représente la variation relative de l'intensité de fluorescenne du
MDAP2+
mesurée
à
423
nm
en
présence
de
l'ADN
de
thymus
de
veau,
du
polyd(G-C)-polyd(G-C), du polyd(A-T)-polyd(A-T) et du poly(dA)-poly(dT).
On
observe qu'à forte concentration en polynucléotides toutes les courbes ten-
dent vers une valeur résiduelle très faible du rapport F/FO, sauf dans les
compl exes
avec
le
poly( dA) -pol y( dT)
où
la
f l uorescence
rés iduelle
reste
relativement importante.
Les spectres d'excitation de fluorescence du MDAP2+ sont eux aussi
bien résolus en présence des polynucléotides. Les maxima enregistrés sur ces
spectres correspondent aux maxima observés sur les spectres d'absorption du
MDAp2+ libre.
La première transition So 7
Sl
a son maximum à 417,5 nm et
100
10
---cg:i
.......,
CI.)
0
c
CI.)
0
CIl
CI.)
...
0
:J
5 -
-CI.)
'C
-4)
+J
CIl
C
CI.)
+J
C
0
390
495
600
À (nm)
Figure II.7A : Spectres d'émission de fluorescence de MDAP2+ (6,13 X 10- 6 M)
en présence du poly(dA)-poly(dT) dans le tampon cacodylate 10
mM à pH 7 et à 20°C. Les différents spectres (du haut vers le bas) corres-
pondent aux valeurs suivantes du rapport PlO: 0 ; 9,6 ; 28,4 ; 88,7 et 279.
La longueur d'onde d'excitation est un point isobestique déterminé sur les
spectres d'absorption (382 nm).
10
---IV:i
-...-
G)
0
c
G)
0
et)
G)
...
0
::]
5
-G)
"
-4)
...
CI)
ccv...
c
350
400
450 À(nm)
Figure II.78
Spectres d'excitation de fluorescence du MDAp2+ (6,13 x 10- 6
M)
en
présence
du
poly(dA)-poly(dT).
La
longueur
d'onde
d'émission est de 450 nm. Les conditions expérimentales sont
les mêmes que celles de la figure II.7A.
101
0.8
F
Fo
0.6
0.4
0.2
o
25
50
75
plo
Figure 11.8
Variation
relative
de
l'intensité de
fluor'escence
du
MDAP2+
mesurée à 423 nm dans le tampon cacodylate 10
mM pH 7 à 20°C
en présence des acides nucléiques en double brin. La longueur d'onde d'exci-
tation
est
toujours
un
point
isobestique
déterminé
sur
les
spectres
ù'absorption.
1 - polyd(G-C)-polyd(G-C) : la concentration en MDAP2+ est de 7,10 10- 6 M et
la longueur d'onde d'excitatIon est de 371 nm.
2 - ADN de thymus de veau : la concentration en MDAp2+ est de 1,53 10- 5 M et
la longueur d'onde d'excitation est de 400 nm.
3 - polyd(A-T)-polyd(A-T) : la concentration en MDAP2+ est de 4,60 10-6 11 et
la longueur d'onde d'excitation est de 380 nm.
11-
poly(dA)-poly(dT)
: la concentration en MDAP2+ et de 6,10 10-6 r~ et la
longueur d'onde d'excitation est de 382 nm.
1.0
.........
iii
:i
' - ' "
al
0
c:
al
U
III
al
...
0
5
~
al
"tl
'CII
III
C
Q.l
C
0
400
GUO
À (nm)
r'jglJl'~_ll.:2 : Spectr'es d'émission de fluor'escence du bis-\\)Apll' (2,'(0 x
10- 6 I~)
en
présence du
polyd(G-C)-[)olyd(G-C)
dilll;,
1.,
tampon
car.üdyLüe 10 mr~, NaCl 100 mM à pH 7 et à 20°C. Les (Jiffér'ents specLr'(~s dlJ
Il,lUI:
vel's lil b<ls corres[)ondcnt aux valeurs suiv3ntcs du rap[)or't [JIll:
0 ;
0,2')
; 0,')
; 1,12 et 5,96.
La longueur' d'onde d'exr.itation
(1100,''»
(~,;t 1111
po i Il t.
i.S{)\\H'é' t. i (i' i'~ .
102
deux bandes vibroniques à 394 nm et 375 nm. La transition Sl ~ S2 présente
un maximum à
334,5 nm et trois bandes vibroniques à 319 nm, 305,5 nm et 293
nm.
Aucun déplacement du spectre d'excitation n'est observé alors que
les spectres d' absorpt ion se modif ient cons idérablement
(voir les spectres
d'absorption représentés sur la figure II.4). Ici aussi tout indique que la
fluorescence
recueillie
est
essentiellement
due
à
l'émission
du
MDAp2+
libre.
Les spectres d'excitation de fluorescence sont identiques lorsque
l'on observe la fluorescence du côté des faibles longueurs d'onde (420 nm)
ou du côté des grandes longueurs d'onde (475 nm) du spectre d'émission. Ce
résultat
est
en accord_élveç
les
variat ions
de
l'intensité d' émiss ion de
fluorescence en présence des différents polynucléotides et confirme que la
fluorescence mesurée est due pour une grande part au colorant libre.
2. bis-DAP4+
Comme dans le cas du monomère,
la fluorescence du bis-DAp4+ est
éteinte par tous les polynucléotides et l'ADN de thymus de veau.
Les spectres d'émission de fluorescence du bis-DAp4+
présentent
également une structure vibronique bien résolue avec des maxima à 427 nm,
450 nm et un épaulement à 480 nm. En présence des différents polynucléotides
on observe une diminution de l'intensité de fluorescence à 427 nm. En pré-
sence de l'ADN et du polyd(G-C)-polyd(G-C)
la diminution de l'intensité de
fluoresence à 427 nm est suivie aux fortes concentrations en phosphates
par
une inversion de l'intensité des bandes vibroniques. La bande centrée à 450
nm se déplace vers 445 nm et devient la plus intense tandis que celle cen-
trée à 427 nm se déplace progressi vement 'fers 423 nm. Néanmoins aux très
fortes concentrations en polyd( G-C) -polyd( G-C)
ou en ADN,
la fluorescence
totale du complexe devient pratiquement nulle.
La figure II.9 représente les spectres d'émission de fluorescence
du bis-DAp4+ titré par le polyd(G-C)-polyd(G-C).
103
III. FLUORESCENCE DYNAMIQUE
Le
déclin
de
fluorescence
du
MDAP2+
est
monoexponentiel et
le
temps de vie de 10,8 ns. Dans les complexes avec les acides nucléiques,
le
déclin de fluorescence ne peut plus être ajusté à un seul temps de vie sauf
dans
les
complexes
avec
le
polyd(G-C)-polyd(G-C).
Pour
tous
les
autres
acides nucléiques en simple
comme en double brin,
il faut faire intervenir
au moins un deuxième temps de vie pour obtenir un ajustement satisfaisant du
déclin de fluorescence.
a) polyd(G-C)-polyd(G-C)
Quelle que soit la longueur d'onde d'émission à laquelle on re-
cueille la fluorescence, on observe toujours un seul temps de v ie dont la
valeur moyenne est de 9,8 ns. Ce temps peut être attribué au MDAP2+ fixé de
fa~on électrostatique avec les phosphates du polynucléotide. Le raccourcis-
sement du temps de vie (10,8 ns à 9,8 ns) correspond à une inhibition par
les phosphates. Le tableau ci-dessous résume les résultats d'une titration
du MDAP2+ par le polyd(G-C)-polyd(G-C).
[polyd(G-C)-polyd(G-C)] (M)
PID
1(ns)
X2
FIFo
0
0
10,80
1 , 14
4,06
10-5
6,57
9,81
1 , 16
0,2515
6,90
10-5
11 , 3
9,83
0,99
0,0836
2,71
10-4
47
9,81
1 ,08
0,006
5,03
10-4
94
9,83
1 ,03
0,0026
7,04
10- 4
141
9,81
1 ,07
0,0023
1 ,035 10-3
234,5
9,74
1 ,03
0,0022
TABLEAU II. E :
Analyse du déclin de fluorescence du MDAp2+ (6,25 10-6 M) en
présence de
quantités croissantes de polyd(G-C)-polyd(G-C) dans le tampon cacodylate
10
mM,
à pH
7 et à 20°C.
La
longueur d'onde d'excitation est de
335 nm et
l'émission est recueillie à 423 nm.
104
L'ensemble des
résultats
contenus dans le
tableau ci -dessus,
de
même que la variation de l'intensité de fluorescence du MDAp2+ en présence
du polyd(G-C)-polyd(G-C), montre que la fluorescence de ce composé est tota-
lement éteinte par les bases G-C à l'exception d'une très faible fraction
«
1 %) probablement fixée de façon externe près des phosphates.
b) ADN de thymus de veau
Dans les complexes formés avec l'ADN, le déclin de fluorescence du
MDAp2+ ne peut plus être ajusté avec un seul temps de vie. Nous avons tenté
d'ajuster le déclin avec successivement deux et trois temps de vie sans une
amélioration significative de la valeur du X2 . Dans ces conditions, le mo-
dèle à deux temps de vie nous a semblé le plus satisfaisant pour décrire
l'extinction de fluorescence du MDAP2+ par l'ADN de thymus de veau.
PlO
'1 (ns)
F1
'2 (ns)
F2
X2
FIFo
[MDAP2+]=6,96 10-5 (M)
47 ,5
4,47
92
9,60
8
1 ,05 (a)
0,33
[ADN]
=3,30 10-3 (M)
[MDAP2+]=1,O
10-5 (M)
220
4,20
88
8,80
12
1,14 (b)
0,55
[ADN]
=2,20 10-3 (M)
TABLEAU II .F
Analyse du déclin de fluorescence du MDAP2+ complexé avec l'ADN de thymus de
veau dans le tampon cacodylate 10 mM pH 7 à 20°C (a) et dans le tampon caco-
dylate 10 mM, NaCl 100 mM pH 7 à 20°C (b).
L'existence d'au moins
deux
temps
de
vie
montre
que
le MDAp2+
complexé dans l'ADN n'est pas totalement éteint. Les deux temps de vie cor-
respondent sans doute au MDAp2+ fixé de façon externe, l'un au voisinage des
paires (G-C) (8,8 ns) et l'autre (4,20 ns) au voisinage des paires de bases
(A-T)
mais
non
intercalé.
Ce
temps de
4,20
ns peut être attribué à des
105
molécules de MOAp2+
situées au voisinage des paires (A-T) mais non inter-
calées puisque nous avons vu précédemment que la fluorescence du MOAp2+ est
totalement éteinte au voisinage des paires de bases (C-C).
c) polyd(A-T)-polyd(A-T)
Ici aussi,
le déclin de fluorescence du MOAp2+ ne peut plus être
ajusté avec un seul temps de vie mais avec au moins deux temps : un temps
court de l'ordre de 3,20 ns , un temps long de 9,90 ns.
PlO
1" 1( ns)
Fl
1"2(ns)
F2
X2
FIFo
[MOAP2+] = 4,91 10-6 (M)
294
3,20
54
9,85
46
1 ,07
0,006
[polyd(A-T)-POlyd(A-T)]=1,44 10-3 (M)
TABLEAU II.C
Analyse du déclin de fluorescence
du MOAp2+
complexé avec
le polyd(A-T)-
polyd(A-T) dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
d) poly(dA)-poly(dT)
Nous retrouvons ici aussi
le même type de déclin que nous avons
déjà observé en présence du polyd(A-T)-polyd(A-T), à savoir un déclin
pou-
vant être ajusté avec deux temps de
vie
de 4,65 ns correspondant à
des
molécules de MOAp2+ en interaction avec les bases mais non intel'calées et
9,90 ns correspondant au MOAp2+ fixé de façon électrostatique externe.
PlO
Tl ( ns)
FIFo
108
4,65
51
9,90
49
1,10
0,26
[poly(dA)-pOly(dT)] = 2,11 10-3 (M)
.
1
TABLEAU II. H
Analyse du déclin de fluorescence du MOAp2+ en présence du poly(dA)-poly(dT)
dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
106
Les résultats de fluorescence statique et dynamique montrent que
la fluorescence du MDAP2+ est éteinte par les acides nucléiques. Cette inhi-
bition de la fluorescence est totale au voisinage des paires de bases (G-C).
Au voisinage des paires de bases A-T l'inhibition de la fluorescence n'est
pas totale mais très importante puisqu'en fluorescence statique la fluores-
cence résiduelle est inférieure à 1 % de la fluorescence initiale. Beaucoup
de ligands qui interagissent avec les acides nucléiques voient leur fluores-
cence éteinte au voisinage des paires (G-C)
; c'est le cas de la 9-amino-
acridine, de la proflavine, de la 3-aminoacridine. D'autres comme l'acridine
orange, le bromure d'éthidium, ou le 3-diméthylaminoacridine ont leur fluo-
rescence exaltée ou restent insensibles quel que soit le site de fixation.
Seul le cation 10-méthylacridinium voit sa fluorescence pratiquement éteinte
quel que soit le site de fixation. Le MDAp2+ se comporte donc comme ce der-
nier colorant et peut donc être placé dans la classe III de la classificati-
on des intercalants proposée par KUBOTA (9).
Conclusion
En
présence du polyd(G-C)-polyd(G-C),
la fluorescence du MDAP2+
est totalement éteinte. L'analyse du déclin de fluorescence donne un temps
de l'ordre de 9,90 ns qui peut être attribué au MDAP2+ fixé de façon élec-
trostatique avec les phosphates.
En présence des autres polynucléotides et de l'ADN de thymus de
veau, l'analyse du déclin de fluorescence montre l'existence d'au moins deux
temps
- un temps long
(entre 8,80 ns et 9,9 ns) dont la valeur moyenne
se rapproche du temps trouvé en présence du polyd(G-C)-polyd(G-C). Ce temps
peut alors être attribué aux molécules de MDAP2+ qui interagissent avec les
phosphates
un
temps
court
qui
varie
entre
3.20
ns
dans
le
polyd(A-T)-polyd(A-T) et ~,65 ns dans le poly(dA)-poly(dT). Ce temps de vie
correspond à des molécules fixées de façon externe mais qui interagissent
avec les bases A-T.
\\07
IV. DENATURATION THERMIQUE DES ACIDES NUCLEIQUES EN PRESENCE DU MDAp2+
La dénaturation thermique des acides nucléiques en présence ou en
l'absence du MDAP2+ a été suivie en mesurant l'absorbance dans l'ultraviolet
à 260 nm,
domaine d'absorption des bases et du MDAp2+, mais aussi à 418 nm
où seul le colorant libre ou complexé absorbe.
Nous avons également déterminé les courbes de fusion en suivant
uniquement la variation de la fluorescence du chromophore complexé avec les
acides nucléiques. Au cours de la montée en température, l'émission du colo-
rant est suivie à la fois à la longueur d'onde de son maximum d'émission
(423 nm)
mais aussi
à plus grande longeur d'onde
(450 nm). Les résultats
obtenus à ces deux longueurs d'onde sont tous identiques.
1. Dénaturation des acides nucléiques suivie en absorption
La dénaturation des acides nucléiques est réalisée dans le tampon
cacodylate
10 mM.
A cette concentration
en
tampon,
la fusion des acides
nucléiques s'effectue avant 100 Oc sauf pour le polyd(G-C)-polyd(G-C) qui a
une
température
de
demi-dissociation
très
élevée
(T
~ 95°C). Le tableau
ci-dessous donne les valeurs des températures de demi-dissociation (Tm) des
différents acides nucléiques q~e nous avons utilisés.
[ P0 4-] (M)
Tm (OC)
ADN de thymus de veau
1 ,00 10· 4
68
poly(dA)-poly(dT)
1 ,09 10-lj
50
polyd(A-T)-polyd(A-T)
1 , 10 lO-lj
42,S
poly(rA)-poly(dT)
1 ,05 10-4
lj7,5
poly(dG)-poly(dC)
1 ,57 10-4
76
polyd(G-C)-polyd(G-C)
1 , 1lj 10- 4
~ 95
TABLEAU II.I :
Température de demi-dissociation des acides nucléiques en double brin déter-
minée en suivant l'absorbance à 260 nm dans le tampon cacodylate 10 mM à
pH 7. Ces résultats sont directement comparables à ceux obtenus en fluores-
cence dans le même tampon et aux mêmes concentrations en acides nucléiques.
108
polyd(A-T)-polyd(A-T)
La température
de
demi-dissociation du
polyd(A-T)-polyd(A-T)
en
présence du MOAp2+ mesurée à 418 nm (zone d'absorptio~ du ligand) est plus
élevée d'environ 5°C que celle déterminée en suivant l'absorbance à 260 nm.
Cette différence de température peut-être attribuée à une fixation du colo:
rant sur les simples brins au cours de la dénaturation de la double hélice.
Cependant,
pour
un
rapport
PlO = 8,3,
qui
correspond
à
une molécule de
MDAp2+ pour quatre paires de base, donc proche de la valeur de n déterminée
par l'équation de Mc Ghee et Von Hippel (3 < n < 3,5 paires de bases) la
température de demi-dissociation est pratiquement la même lorsque l'on suit
l'absorbance
à 260 nm ou à 418 nm.
L'augmentation du Tm du polyd(A-T)-polyd(A-T) est nette lorsque la
concentration en MOAp2+ augmente. Cette augmentation du Tm correspond à une
stabilisation
de
la double
hélice.
Le
tableau
II.J résume
les
résultats
obtenus dans le tampon cacodylate
1 mM à pH 7 en suivant la variation de
l'absorbance du polynucléotide seul à 260 nm,
du complexe
polynucléotide-
ligand à 260 nm et à 418 nm. La concentration en
polyd(A-T)-polyd(A-T) est
constante et égale à 2,50 10-4 M en phosphates.
[MOAP2+] (M)
PlO
Tm (OC)
Tm (OC)
(260 nm)
(418 nm)
0
25,3
3,0 10-6
83,3
27
33,5
7.5 10-6
33,3
30
37,7
1 ,5 10-5
16,7
38
42,6
3,0 10-5
8,3
46
47,7
TABLEAU II.J
Température de demi-dissociation du polyd(A-T)-polyd(A-T)
en fonction de la
concentration en MOAp2+ dans le tampon cacodylate 1 mM à pH 7. La concentra-
tion initial~ en polyd(A-T)-polyd(A-T) est de 2,50 10-4 en phosphates.
109
2. Fluorescence
La fluorescence du MDAp2+
décroit linéairement avec la tempéra-
ture. Cette décroissance du rendement quantique de fluorescence en fonction
de la température est attribuée à une augmentation de la constante de désac-
tivation non radiative. La dénaturation thermique des complexes acides nu-
clé iques
-
MDAp2+
peut
donc
être sui v ie
en
mesurant
la fl uorescence du
MDAp2+ libre au fur et à mesure que celui-ci se dissocie de l'acide nucléi-
que.
La longueur d'onde d'excitation des solutions contenant les acides
nucléiques et le MDAp2+ est toujours un point isobestique déterminé sur les
spectres d'absorption de façon à ce que l'on puisse négliger la variation de
l'absorbance du ligand au cours de la dénaturation. La disposition en T du
spectrofluorimètre permet une acquisition simultanée de l'intensité de fluo-
rescence à plusieurs longueurs d'onde (423 nm et 450 nm). La courbe repré-
sentant la variation de l'intensité de fluorescence en fonction de la tempé-
rature est directement acquise sur une disquette et des programmes de trai-
tement permettent de dériver cette courbe pour obtenir la
température de
demi-dissociation. Les Tm obtenus soit en suivant la fluorescence à 423 nm
soit à 450 nm sont identiques.
a) poly(dA)-poly(dT)
La
figure
II.l0
représente
les
courbes de fusion
du
poly(dA)-
poly(dT) pour plusieurs concentration en MDAP2+ dans le tampon cacodylate 10
mM à pH 7. On constate que la température de demi-dissociation augmente avec
la concentration en MDAp2+ : cette augmentation
d'environ 11°C à saturation
des sites de fixation est très importante et démontrp. que la
fixation du
MDAp2+ stabilise la structure du poly(dA)-poly(dT).
Le tableau ci-dessous
donne les résultats obtenus à par'tir des courbes de la figure II. la.
110
10
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1
ni
1
1
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1
.....-
1
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1
0
1
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C
1
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1
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1
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1
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1
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1
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QI
1
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1
-
1
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~
c
1
1
QI
1
-
1
C
1
1
0
40
60
80 T(oC)
Figure II.l0A : Courbes de dénaturation thermique du poly(dA)-poly(dT) (1,0
x 10- 4 M) en présence du MDAp2+ dans le tampon cacodylate 10
mM à pH 7.
La longueur d'onde d'excitation (382 nm)
est un point
isobes-
tique, et l'émission est recueillie à 423 nm en fonction de la température.
La concentration en MDAP2+ est de
a)
1,86
10-7 M ;
b)
8,67 10-7 M ; c)
1,73 10-6 M et d) 1,90 10-5 M.
abc
d
10
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10
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QI
0
C
QI
0
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0
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1
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I
QI
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....
li)
C
QI
-C
o
)) \\V, \\
40
60
Figure II.l0B
Courbes dérivées de celles de la figure II.l0A et permettant
de déterminer la température de demi-dissociation.
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10
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20
50
Figure II. 11 A: Courbes de
dénaturat ion thermi que des
complexes polyd (A-T)-
polyd(A-T)-~IDAP2+ dans le tampon cacodylate la mM à pH 7. Ces
courbes représentent l'émission de fluorescence du ligand en fonction de la
tem4érature. La concentration en polyd(A-T)-polyd(A-T) est constante et de
10-
M en phosphates. La concentration en MDAP2+ est respectivement de a
:
4,92 10-7 M ; b : 8,36 10-7 ~1 ; c : 2,15 10-6 M ; d : 4,36 10-6 M et e :
8,00 10-6 r-1.
abc d
e
10
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-
Il
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1 \\
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-
1J1 1
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III
\\
\\
CE)
.' .1
i( \\
\\
"'/
1111
20
50
Figure II.1IB
Dérivées premières des courbes de la figure 1lA.
112
[MDAp2+]
(M)
P/D
Tm( OC)
(423 nm)
50
1 ,86 10-7
542
53,8
8,67 10-7
116,3
54,4
1 ,73 10-6
58,3
55,8
1 ,90 10-5
5,3
61 ,3
TABLEAU II .K
Température
de
demi-dissociation
du
poly(dA)-poly(dT)
(1,00810- 4 M)
en
présence
du
MDAp2+
dans
le
tampon
cacodylate
10
mM.
Le
Tm
du
poly(dA)-poly(dT) seul a été déterminé en suivant l'absorbance de la solu-
tion à 260 nm. Le Tm des complexes est déterminé en suivant la fluorescence
du MDAP2+, soit à 423 nm, soit à 450 nm.
b) polyd(A-T)-polyd(A-T)
Le tableau II.L résume les valeurs des températures de demi-disso-
ciation du
polyd(A-T)-polyd(A-T)
complexé avec
le MDAP2+.
Au
voisinage du
rapport P/D = 6 <3 paires de bases)
l'augmentation du Tm est plus
grande
que celle observée avec le poly(dA)-poly(dT). Le polyd(A-T)-polyd(A-T) pos-
sède une structure qui favorise l'intercalation des colorants par rapport à
la structure du poly(dA)-poly(dT) (10-14,
18-19).
La
stabili sat ion
de
la structure
du
poly( dA) -poly( dT)
peut-être
due essentiellement à la diminution de
la répulsion des
charges négati ves
des phosphates
lorsque ceux-ci
sont
en
interaction avec
les
charges
posi-
ti ves du MDAp2+.
Les
figures
11
représentent
les
courbes de
fusion
du
polyd(A-T)-polyd(A-T)
complexé au MDAp2+
lorsque l'on suit la fluorescence
du ligand en fon~tion de la température.
113
[MDAp2+] ( M)
PlO
Tm (OC)
(423 nm)
42,5
2,40 10-7
404,3
47,8
4,92 10-7
197,7
47,9
8,36 10-7
116,5
48,9
2,15 10-6
45,3
50
4,36 10-6
22,3
52,8
8,00 10-6
12,2
56,2
1,68 10-6
5,8
59,7
TABLEAU II .L
Température de demi-dissociation du polyd(A-T)-polyd(A-T)
(=
10-4 M)
en
présence du MDAP2+ dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 en suivant l'émis-
sion de fluorescence du MDAp2+ à 423 nm.
Le Tm du polynucléot ide seul est
déterminé par absorption.
c) polyd(G-C)-polyd(G-C)
Au
début
de
ce
chapi tre,
nous
avons
vu que la fluorescence du
MDAP2+ est totalement éteinte en présence du polyd(G-C)-polyd(G-C). D'autre
part, la température de fusion du polyd(G-C)-polyd(G-C) dans le tampon caco-
dylate 10 mM est très élevée, de sorte que les résultats obtenus en présence
du MDPA2+ restent très qualitatifs. Néanmoins ces résultats mettent claire-
ment en évidence une stabilisation de la structure du polyd(G-C)-polyd(G-C).
Le tableau ci-dessous donne quelques valeurs du Tm du polyd(G-C)-polyd(G-C)
(= 10-4 M)
en présence du MDAP2+, toujours dans le tampon cacodylate 10 mM.
114
10
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C
IV
-C
0
20
60
100 T(oC)
Figure II.12 : Courbe de dénaturation thermique du complexe ADN de thymus de
veau-MDAp2+
dans
le
tampon
cacodylate
10
mM
à
pH
7.
La
concentration en ADN est de 9.81 10-5 M en phosphates ~t celle 0U MDAP2+ est
de 9.33 10-7 M. La courbe Ca) représente l'émission du ligand suivie à 423
nm en fonction de la température "et la courbe Cb) est la dérivée première de
la courbe Ca).
115
[MDAP2+] ( M)
PID
Tm (OC)
(423 nm)
-
95°C
2,39 10-7
450
97
3,00 10-7
360
98,4
9,80 10-6
10,3
> 100
1 ,97 10-5
5, 1
> 100
TABLEAU II .M
Température de fusion du polyd(G-C)-polyd(G-C) dans le tampon cacodylate 10
mM en présence de MDAP2+. Le Tm du polynucléotide seul a été déterminé par
absorpt ion.
d) ADN de thymus de veau
La
figure
II .12
représente
les
courbes
de
fusion
de
l'ADN de
thymus de veau en présence de 9,33 10-7 M
en MDAP2+ dans le tampon cacody-
late 10 mM. L'émission de fluorescence du composé
est mesuré à 423 nm et
l'excitation est un point isobestique déterminé en absorption. Sur la courbe
(a) qui représente la fusion de l'ADN, non seulement la transition s'effec-
;:;ue sur un doma ine de température très grand. ma is on observe
aussi plu-
sieurs transitions. Le tableau ci-dessous rassemble les valeurs des diffé-
rents Tm de l'ADN complexé avec le MDAP2+. La concentration en ADN est cons-
tante et égale à 9,81 10-5 en phosphate.
La dénaturation thermique de
l'ADN de
thymus de veau (42 % G-C)
suivie en
absorption
fait
apparaître une seule transition.
La
largeur
de
cette transition (environ 15°C) est très grande comparée à celle
observée
sur les courbes de fusion des polynucléotides (de 2 à 5 OC). La température
de
fusion
Tm est sensible à la composition en
base d'un acide
nucléique
donné. Les fluctuat ions en pourcentage de paires de bases (G-C)
le long de
la molécule induisent des variations locales du Tm' Il s'ensuit que la fu-
116
sion de l'ADN n'obéit pas à un modèle simple de deux états discrets double
brin-simple brin. La fusion
se produit de façon progressive des régions à
faible
teneur
en
(G-C)
vers
les zones
de
teneur croissante
en
paires de
bases (G-C). En incorporant des homologues de bases qui possèdent un
pou-
voir d'empilement plus faible
que la paire(G-C).
dans un ADN. Reich E. et
collaborateurs ont montré que l'on pouvait mettre en évidence par absorption
deux transitions dans l'ADN où l'on a remplacé les paires de bases (G-C) par
les paires (I-C) (22).
1
[MDAP2+] (M)
PlO
Tm (OC)
-
-
68
-
-
1 .98 10-7
498
76.3
82.2
88
2.37 10-7
414
79.1
83.5
87,7
5.13 10-7
191
79.9
85.5
90.3
9.33 10-7
105
80.8
87.3
92.5
3.75 10-6
26
82.7
88
94.5
TABLEAU II .N
Température
de
demi-dissociation de l'ADN de
thymus
de
veau
(42 % G-C)
complexé avec le MDAp2+ dans le tampon cacodylate la mM. La concentration en
ADN est de 9.81
10-5 M en phosphates. Le Tm de l'ADN seul a été déterminé
par absorption.
L'existence des fluctuations en pourcentage de paires de bases G-C
est ainsi mis en évidence sur les courbes de dénaturation thermique de l'ADN
de thymus de veau en présence du MDAp2+.
La fl uorescence qui est beaucoup
plus sensible que l'absorption permet de suivre les variations locales de
l'environnemEnt du cnromophore lié à l'ADN. Ainsi on peut suivre indirecte-
ment les fluctuations locales de la composition en paires de bases (A-T) de
l'ADN ayant fixé le chromophore.Sur la figure 11.12.
la courbe (a) montre
..:;
117
plusieurs points de transition qui peuvent refléter la distribution statis-
tique du pourcentage de paires de base (G-C)
le long de l'ADN,
tandis que
sur les figures
II. 1üA et II. 11
une seule transi tion est observée en pré-
sence des polynucléotides en double brin.
118
V. DICHROISME
LINEAIRE
DES
COMPLEXES
ACIDES
NUCLEIQUES
-
MDAp2+
ET
BIS-
DAp4+
Le dichroïsme linéaire est défini par la relation suivante
où
A Il représente l' absorbance de la solut ion pour une lumière pola-
risée
parallèlement
au
champ
de
la
force
d'orientation
(champ
électrique. champ hydrodynamique).
Al
représente l' absorbance de la solution pour une lumière pola-
risée perpendiculairement au champ d'orientation.
Le dichroïsme linéaire réduit ~A/A (À) est le dichroïsme linéaire
rapporté à l'absorbance totale de la solution pour chaque longueur d'onde.
Le
dichroïsme
linéaire des
complexes du MDAp2+ et du bis-DAP4+
avec les acides nucléiques est négatif dans les bandes d'absorption des deux
composés (300 nm-450 nm). Il en est de même dans le domaine d'absorption des
bases nucléiques (260 nm).
Le
moment
de
transition
en
absorption
à
260
nm
des
bases
nucléiques est contenu dans
le plan des bases. Nous avons vu précédemment
(chapi tre 1) que les deux moments de transi tion en absorption (334 nm et
417.5 nm) du MDAp2+ sont également dans le plan de la molécule et perpendi-
culaires l'une à l'autre.
On doit
donc s'attendre à
ce
que
le signe du
dichroïsme
linéaire des
complexes avec l'ADN
soi t
le même que celui de
l'ADN tout seul dans l'hypothèse où l'on postule une intercalation du noyau
aromatique des ligands
entre les paires de bases.
L'applie:ation d'un
champ d'orientation
(orientation
par
écoule-
ment. orientation
par un champ électrique). a pour effet d'orienter l'axe
de l'hélice de l'acide nucléique parallèlement au champ. Il s'ensuit que le
plan
de
bases
et
des
colorants
intercalés
devient
perpendiculaire
à
ce
champ. Si l'on choisit des conditions où toutes les molécules de MDAp2+ ou
du bis-DAP4+ sont fixées sur les acides nucléiques. la mesure du
dichroïsme
linéaire réduit permet alors d'estimer l'angle que fait le moment de transi-
119
tion en absorption de chaque transi tion avec l'axe principal de la double
hélice. Dans le cas du MDAp2+ où les deux moments de transition en absorp-
tion contenus dans le plan de la molécule sont perpendiculaires l'une par
rapport à l'autre,
la détermination de l'angle qui
fait chaque ·transition
avec l'axe de la double hélice,
doit
permettre une
estimation de l'angle
moyen que fait le plan de la molécule avec la double hélice.
!J. A
3
(cos 2 8 - 1) f (E)
(4 )
A
2
Le degré d'orientation des molécules dépend du facteur f(E) qui
lui aussi
dépend de la nature et de l' intensi té de la force d'orientation
(23-29).
Dans les mêmes condi tions de travail,
on s'affranchi t du facteur
f(E) en comparant directement le dichroïsme linéaire réduit mesuré dans les
bandes d'absorption du chromophore à celui mesuré dans le domaine d'absorp-
tion des bases nucléiques (30).
Si on accepte que l'angle a entre le plan des bases et l'axe
de
l'hélice est peu différent de 90° alors:
~A/A (À) colorant
A'
-------------------
~A/A (260 nm) ADN
3 cos 2 8 - 1
3 cos 2 8 - 1
3 cos 2 a - 1
3 cos 2 (90) - 1
1 - 3 cos 2 8
(5 )
Le rapport du dichroï sme linéaire réduit au maximum d' absorpt ion
des complexes (426 nm et 337 nm) par rapport à celui de l'ADN à 260 nm per-
met alors une estimation de l'angle 8. L'équation (5) montre que pour une
transition donnée du chromophore, la valeur de A' doit être constante.
La figure II.13 représente le spectre d'absorption du complexe ADN
de thymus de veau MDAp2+ (A), du spectre de dichroïsme linéaire du complexe
(B) et du spectre de dichroïsme linéaire réduit de complexe (C).
120
A
41
u
0.2
c:
<Il
oC
0
.,
0, ,
oC
'"
o
"---------~-~-~~-~--~-~--~-~-~-~'~~~.~~-I
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-0,2
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1
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•
00 ••
•
o 00 ••
•
o
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o
•••
•
o ••
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o
• ••••
••
•
o •
~•• <1
o
•
o
OCP
o
.2
.
.(~l'OcCeY.>
•
•
(C)
.... ..
250
JOO
J50
Figure II.13 : Spectres d'absorption
(A),
du dichroisme linéaire (B) et du
dichroïsme 'linéaire réduit
CC)
du complexe ADN de
thymus de
veau (3,70 10- 4 M) et du MDAP2+ (2,0 10-5 M) dans le tampon cacodylate 1 mM,
NaCl 1 mM, EDTA 0,2 mM à pH 7 et à 20°C. Sur la figure II.13 (B) la courbe 1
correspond à l'ADN seul,
la courbe 2 au complexe. La courbe 3 es t la même
que la courbe 2 mais avec une échelle agrandie (à droite). Sur la figure
II.13 (C), la courbe avec les ronds clairs correspond au rapport P/D ~ 95 et
celle avec les ronds noirs à un P/D = 18,5. L'orientation des molécules est
due à un champ hydrodynamique dans une cellule de Couette.
121
Dans la zone d'absorption des bases
(220-300 mn),
le dichroisme
linéaire réduit augmente en fonction de la concentration en MDAP2+.
Cette
augmentation du dichroIsme linéaire est observée sur tous les acides nucléi-
ques en présence du MDAP2+ ainsi que du bis-DAp4+. L'accroissement du
di-
chroYsme linéaire des acides nucléiques dans la bande d'absorption des bases
peut être attribué à une meilleure orientation de l'axe de
l'hélice à la
suite de la fixation du ligand. La fixation du ligand augmente la rigidité
du duplex qui s'oriente alors plus facilement suivant le champ
hydrodyna-
mique.
( a)
[MDAP2+] ( M)
P/D
M/A
M/A
M/A
A'
A'
(260 nm)
(340 nm)
(426 nm)
(340 nm)
(426 nm)
3,90 10-6
95
- 2,07
- 1 ,57
- 1 ,85
0,76
0,89
7,90 10-6
47
- 2,03
- 1,70
- 1 ,83
0,84
0,90
2,00 10-5
18,5
- 2,25
- 2,44
- 2 , 15
1 ,08
0,96
3,90 10-5
9,5
- 2,59
- 2,44
- 2,28
0,94
0,88
* 7,90 10-6
47
- 1 ,68
- 1,59
- 1 ,55
0,95
0,92
(b)
bis-DAp4+ (M)
P/D
M/A
M/A
M/A
A'
A'
(260 nm)
(340 nm)
(426 nm)
(340 nm)
(426 nm)
3,08 10-6
10O
- 3,77
- 1, 6ë
- 1 ,88
0,43
0,50
6,16 10-6
50
- 4,23
- 1,69
- 1 ,89
0,40
0,45
1 ,54 10-5
20
- 4,38
- 1,74
- 2,00
0,40
0,46
TABLEAU II .0
DichroIsme linéaire réduit des complexes AD~! de thymus de veau
(42 % G-C) avec
le MDAP2+ et le bis-DAp4+. La concentration en ADN est de 3,70 10- 4 M en pré-
sence du MDAP2+ (a) et de 3,08 10- 4 M avec le bis-DAp4+. Tous les complexes sont
préparés dans
le tampon cacodylate 1 mM,
NaCl 1 mM,
EDTA 0,2 mM à pH 7 et à
20°C. Dans le tableau II.0 (a), à la ligne comportant un astérisque, le complexe
avec le MDAp2+ est réalisé dans le tampon cacodylate 1 mM, NaCl 10 mM, EDTA 0,2
mM afin de déterminer l'influence de la concentration en sel.
122
Dans le domaine d'absorption des ligands,
le dichroïsme linéaire
réduit reste sensiblement
la même
pour
les
différentes
concentrations
en
ligands
compte
tenu
des
erreurs
de
mesure
dues
aux
faibles
valeurs
de
l'absorbance.
Le
tableau
II.O
résume
les
valeurs
du
dichroIsme
linéaire
réduit ~A/A des complexes formés entre l'ADN de thymus de· veau et le MDAp2+
(a) et le bis-DAp4+ (b).
Les valeurs du rapport A'
déduites du tableau ci-dessus montrent
que l'angle que fait le moment de transi tion en absorption du MDAp2+ avec
l'axe de l'hélice de l'ADN est sensiblement le même lorsque que l'on suit la
première ou la deuxième transition. Sur la première bande d'absorption (426
nm), la valeur de A' est très voisine de 0,91 ce qui correspond à un angle 8
de 80° et sur la deuxième bande d'absorption la valeur moyenne de A' est la
même. La valeur de l'angle 8 montre que le plan de la molécule du MDAP2+ qui
contient les deux moments de transitions est pratiquement parallèle à celui
des bases nucléiques.
Dans les complexes avec
le bis-DAP4+,
la valeur moyenne de A' à
426 nm (0,47)
est voisine aussi
de celle que l'on trouve sur la deuxième
bande
d'absorption
à 336
nm
(A'
0,41).
Ces
valeurs correspondent à
un
angle moyen de 65 et 64 degrés respectivement.
Cette valeur angulaire est
assez éloignée de ce que l'on attend pour un complexe d'intercalation.
Cependant,
la molécule
de
bis-DAp4+
comporte
dans
sa
structure
chimique deux ""oyaux diazapyrène reliés entre eux par deux noyaux benzèni-
ques
: il s'ensuit une certaine rigidité dans la molécule. Les deux noyaux
diazapyrène ne sont pas dans ces conditions parallèles. L'intercalation d'un
noyau peut défavoriser une intercalation ultérieure de l'autre noyau sur la
même chaine de l'acide nucléique.
Comme nous le verrons au paragraphe sui-
vant,
la deuxième moitié semble interagir avec une autre molécule d'acide
nucléique.
Ceci provoque un
"pontage"
intercatenaire que l'on
observe
sur
les gels bidimensionnels du pBR322 en présence du bis-DAp4+.
123
VI. DETORSION DE L'ADN SURENROULE DU pBR322 PAR LE MDAp2+ ET LE BIS-DAp4+
La topoisomérase l
catalyse la coupure et la fermeture de l'ADN
surenroulé soit positivement soit négativement. Au cours de cet acte cata-
lytique, elle génère une famille de topoisomères qui différent les uns des
autres par leur
nombre de supertours (31-35).
Les colorants qui s'intercalent dans la double hélice de l'ADN,
provoquent un allongement du pas de l'hélice et une diminution de l'angle
des
paires de
bases
(36-39).
Pour
un
ADN circulaire
surenroulé
cette
détorsion des
paires de bases provoque une diminution du taux de surenrou-
lement qui peut-être v1sualisée sur un gel d'électrophorèse.
Les figures II.14,15 et 16 représentent des gels d'électrophorèse
à deux dimensions de l'ADN du plasmide pBR322 en présence du MDAp2+. L'ADN
du plasmide pBR322 est traité une heure à 37 Oc avec la topoisomérase l pour
relaxer le nombre de supertours négatifs. On obtient une solution contenant
une famille de topoisomères dont le nombre de supertours négatifs diminue
par rapport au nombre initial de supertours du PBR322 qui est de -33 (40).
Dans
la première dimension
de
l'électrophorèse,
les
molécules
d'ADN sont séparées en fonction de leur nombre topologique donc en fonction
de la valeur absolue du nombre de supertours.
Les molécules ayant un taux
absolu de surenroulement élevé migrent plus vi te. Le surenroulement réduit
la taille de la molécule d'ADN et facilite son passage à travers les pores
du gel d'agarose.
Dans la deuxième dimension, la migration électrophorétique se fait
perpendiculairement à la première. Le gel est auparavant incubé pendant 12
heures dans un tampon contenant soit le MDAP2+ soit le bis-DAp4+. La fixa-
tion des ligands sur les molécules d'ADN provoque une diminution
du nombre
de supertours. Les molécules d'ADN qui possédaient dans la première dimen-
sion des supertours positifs verront leur nombre de supertours augmenter et
migreront plus vite. Les molécules qui avaient des supertours négatifs ver-
ront ce nombre diminuer en valeur absolue et migreront
moins vite que les
précédentes (40).
124
2
- r-----~~
+
1
+
Figure II.14 : Gel
d'électrophorèse
bidimensionnel
de
l'ADN
du
plasmide
pBR322 (3 ~g) en présence du MDAp2+ (1.72 x 10-6 M) dans le
tampon borate 50 mM à pH 7,5 et à la température ambiante.
Les différents
topoisomères du plasmide traités par la topoisomérase
l
sont séparés dans
la
première
électrophorèse
(du
haut
vers
le
bas)
en
fonction
du
nombre
absolu de leurs supertours pendant 12 heures sous une tension constante de 2
volts par cm. Le gel est ensui te
incubé pendant 12 heures dans le
tampon
borate contenant 1.72 x 10-6 M de MDAP+2 pendant une nuit à l'obscurité. La
deuxième
migration
électrophorétique
perpendiculaire
à
la
première
(de
gauche à droite)
est réalisée dans le tampon contenant le MDAP2+
(1,72 x
10-6 M) pendant 16 heures sous une tension constante de 2 volts par cm.
2
1
figure Ir. 15
Gel
hidimensionnel
de
l'!\\DN du rlasmi,jc p13ru;):?
(j,b Ilg)
,-:n
rrésence de 11,20 x 10- 8 il en BET.
Les conditions expérimen-
tales sont les mêmes que celles de la CigW'A [1.1 11.
125
2
+
1
+
(A)
-
2
+
1
+
(B)
en pr'ésence du
Gel bidimensionnel de l'ADN du plasmide pBR322
Figure 11.16
l'èS
mêmes que
bis-DAp11+.
Les
conditions
expét'.imentales
sont
celles de la figure II.13.
2,50 x 10- 9 Il
A
[ADN]
3 Ilg ; [biS-DAp11+ J
lj, 3 x
10 -8 r-1
B
[ADNJ
3 Wg
[bis- DAP4 +]
126
A cause donc de cette différence de mobilité électrophorétique les
molécules
d'ADN
surenroulées
soit
posi ti vement
soi t
négati vement
peuvent
être séparées lorsqu'elles ont fixé un intercalant. Elles se retrouvent dans
la deuxième dimension de chaque côté de l'arc et chaque tache correspond à
une
molécule
ayant
un
nombre
de
supertours
bien défini.
Les molécules
surenroulées posi ti vement se trouvent
sur le
côté droit
de l'arc et
les
surenroulées négativement se trouvent sur le côté gauche, lorsque la migra-
tion dans la deuxième dimension a lieu de la gauche vers la droite (Figure
II. 14).
a. MDAp2+
La
figure
II.14
représente
un
gel
bidimensionnel
du
plasmide
pBR322 ayant complexé le MDAP2+. Dans la première dimension (du haut vers le
bas) les différents topoisomères d'un échantillon de 5 ~g d'ADN traité par
la topoisomérase l sont séparés en fonction de leur nombre absolu de super-
tours. Le gel est ensuite incubé dans un tampon de borate d'ammonium 50 mM à
pH 7,5 contenant 1,72 10-6 M en MDAp2+ pendant 12 heures. Dans la deuxième
dimension (de gauche à droite) les différents topoisomères qui ont fixé le
MDAp2+ migrent du côté droit de l'arc pour les supertours positifs et du
côté gauche pour les supertours négatifs.
b. Bromure d'éthidium (BET)
La
figure
II.15
représente
le
gel
bidimensionnel
du
plasmide
pBR322 (3,6 ~g) en présence de 3,7 10-8 M en bromure d'éthidium qui est un
des intercalants les mieux caractérisés (37-40).
Dans la deuxième dimension, on observe seulement la partie gauche
de l'arc ce qui signifie qu'à la température de l'expérience (20°C) l'équi-
libre thermodynamique n'a pas favorisé la formation de molécules ayant des
supertours positifs (40-43).
127
La comparaison des figures II.14 et II.15 démontre clairement que
si le bromure d'éthidium déroule l'ADN surenroulé par intercalation, il
est
vraisemblable que le MDAp2+ agit aussi comme un intercalant. Ces résultats
sont en accord avec ceux obtenus par dichrorsme linéaire.
Tous
sont
en
faveur d'une intercalation du MDAp2+ dans l'ADN.
Plusieurs agents sont aussi connus pour dérouler l'ADN surenroulé
comme les solvants organiques ou la température (41, 45). Nous avons vérifié
que dans nos condtions expérimentales la détorsion de l'ADN était uniquement
due à la fixation des ligands. La figure II.16 (A) représente un gel bidi-
mensionnel de 3,0 ~g de pBR322 en présence de 2,50 10-9 M en bis-DAp4. Dans
les conditions de concentration en colorant, la quantité en bis-DAp4+ fixée
n'est pas suffisante pour provoquer une perte de supertours négatifs, alors
tous les topoisomères migrent de la même façon dans la première et la deu-
xième dimension et se retrouvent sur la diagonale du gel.
c. bis-DAp4+
Les gels bidimensionnels de pBR322 en présence du bis-DAp4+ sont
représentés sur les figures 11.16 (A et B). Dans la deuxième dimension,
la
migration des différents
topoisomères se fait
d'une façon anormale.
Cette
migration anormale est causée par :
l'effet de charge du colorant (4 charges positives) qui retar-
dent toutes les molécules dans la deuxième dimension,
-
les photocoupures sur un brin de l'ADN: chaque fois qu'il se
produi t
une coupure
sur un br in,
l'ADN se déroule pour donner
une
forme
relachée (ouverte et circulaire). Dans ces conditions tous les topoisomères
qui
auront
subi
un seul dommage
se
convertissent
sous
forme
relachée
et
migrent de la même façon dans la deuxième électrophorèse. Les produits de
ces dommages photochimiques sont si tués sur une verticale dans
la figure
11.16 (B).
- la bis-intercalation : la figure II .16 (B) montre à la fois la
formation d'un arc, l'effet des photodommages et l'effet de la bis-interca-
lat ion.
Cette bis-intercalation provoque une mi gration anorma le des d iffé-
rents topoisomères comme l'indique la partie
droite de la figue II.16 (B).
128
Les résultats sont en accord avec ceux obtenus en dichroïsme li-
néaire.
Ils
montrent
que
pour
une
bis-intercalation
ou
une
interaction
intercaténaire, la formation de pontages impose des contraintes à la struc-
ture de l'ADN et modifie les propriétés hydrodynamiques de la molécule.
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CHAPITRE III
DÉGRADATION PHOTOCHIMIQUE DES ACIDES NUCLÉIQUES PAR
LE MDAP2+ ET LE BIS-DAp4+ : NUCLÉAS ES ARTIFICIELLES
132
INTRODUCTION
Certaines molécules organiques libres ou complexées à des cations
métalliques ont la propriété d'induire une dégradation irréversible du sque-
lette
phosphodiester des
acides
nucléiques.
D'autres
molécules par contre
alkylent les bases nucléiques et les rendent labiles en milieu
alcalin (1).
Enfin,
certaines
molécules
sous
l'effet
d'une
radiation
lumineuse
se
fixent de façon covalente aux acides nucléiques.
Parmi celles-ci les furo-
coumarines,
les porphyrines et des molécules portant un
groupement azido
ont été
utilisées. pour sensibiliser la
dégradation
des
acides
nucléiques
(2 -6 ) .
Le complexe orthophénanthroline-cui vre.
en présence d'un
réduc-
teur.
hydrolyse la chaine phosphodiester
des
acides
nucléiques
(7-9).
La
dégradation est beaucoup plus efficace sur le double brin qua sur le simple
brin
(10). Cette réaction a
été utilisée pour faire l'étude de la structu-
re secondaire
des promoteurs
de
l'opéron lactose
(11 , 12). Si on lie un
oligonucléotide à cet agent chimiquement acti vable.
l'ensemble se comporte
alors
comme
une
nucléase
artificielle
pour
la
cible
complémentaire
de
l'oligonucléotide (9, 13-15).
Le complexe EDTA-Fer possède également en milieu neutre une acti-
vité nucléasique. Il a été montré que l'EDTA couplé de façon covalente à un
oligonucléotide induisait des coupures sur une séquence complémentaire, en
présence d'un réducteur qui décienche la réaction chimique (9, 15).
Les
porphyrines
ferriques
dégradent
aussi
le squelette phospho-
diester des ac ides nucléiques.
Couplées à des oligonucléotides,
elles
in-
duisent des pontages sur les cibles complémentaires. Le traitement de
ces
pontages en milieu basique conduit à une coupure de la chaîne complémentaire
cible 0, 5, 16).
La proflavine et les porphyrines (non métallées) sont capables de
former des liaisons covalentes avec les bases nucléiques sous
irradiation
lumineuse.
Il
en
est
de
même
de
dérivés
azido
comme
l'azidophenacyl
ou
l'azidoproflavine.
Lorsque
ces
groupements
photoactifs
sont
attachés
de
façon covalente à l'extrémité d'un oligonucléotide les réactions de photo-
pontage sont ciblées sur la séquence complémentaire de l'oligonucléotide (5,
14 ).•
Dans ces différents types de réactions,
le signal qui
ini tie la
réaction est de nature soit chimique (l'addition d'un réducteur dans le cas
des
complexes orthophénanthroline-cui vre,
EDTA -Fe ou porphyr ine- Fe), soit
une excitation lumineuse dans le cas de la proflavine ou des porphyrines.
Dans ce chapitre, nous montrons que le MDAP2+ et le bis-DAP4+ sous
irradiation
lumineuse 0.
> 300 nm) provoquent des coupures du squelette
phosphodiester 'des ac ides nucléi ques.
Les
coupures ont
un rendement
plus
important
au
ni veau
des
guanines
et
beaucoup
plus faible
au
ni veau
des
autres
bases
nucléiques.
Le
traitement
en
milieu
alcalin
des
acides
nucléiques irradiés en présence de ces deux
composés met en évidence une
augmentat ion du pourcentage de coupures au
ni veau de tous les si tes par
rapport au pourcentage observé en milieu neutre.
En plus donc des coupures
directes induites en milieu neutre, les deux
composés favorisent aussi des
photodommages sur toutes les bases nucléiques. Ce sont ces dommages qui sont
révélés par un traitement en milieu basique.
134
Lorsque
l'on
irradie
l'ADN
surenroulé
du
plasmide
pBR
322
en
présence
du
MDAP2+
ou
du
bis-DAP4+,
on
observe
sur
un
gel
d'agarose,
l'apparition
de
la
forme
linéaire
de
l'ADN
correspondant
à
la
coupure
simultanée des deux brins, et d'une forme circulaire où seul un brin a été
coupé. Ces coupures photosensibilisées des acides nucléiques par les deux
composés ont été mises en évidence par Blacker A.J., Jazwinski J., Lehn J.M.
et Wilhelm en 1986 (17-18).
135
1. DEGRADATION D'OLIGONUCLEOTIDES PAR LE MDAP2+ ET LE BIS-DAp4+
La dégradation photochimique des acides nucléiques en simple et en
double brin par le MDAP2+ et le bis-DAp4+ a été essentiellement étudiée sur
des oligonucléotides de séquence connue. Ce sont des oligonucléotides
cons-
titués de 27 nucléotides contenant une séquence A8 ou T8 et qui seront dési-
gnés par la suite par 27mère-A8 ou 27mère-T8. (cf. matériel et méthodes pour
la séquence).
L'extrémité 5' de l'oligonucléotide a été marquée radioactivement
par voie enzymatique avec la polynucléotide kinase du phage T4 en présence
d'ATP [r
-
32p].
Les produits de dégradation
sont ensuite séparés selon
leur taille par électrophorèse sur un gel de polyacry lamide. Pour une con-
centration constante en 27mère-A8, des concentrations croissantes de MDAp2+
et de bis-DAP4+ sont ajoutées dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7. Les
solutions sont irradiées avec une lampe HBO de 200 Watts pendant 30 minutes
à 20°C.
Un filtre constitué d'une cuve de verre remplie d'eau est utilisé
pour absorber toutes les radiations de longueur d'onde inférieure à 300 nm.
Après
irradiation,
les
échantillons
sont
précipités
par
de
l'éthanol
en
présence de 1 Ug de tARN. Cette étape est nécessaire car elle permet d'éli-
miner les deux produits qui provoquent une trainée au cours de l'électro-
phorèse.
Le précipité est alors repris avec 20 ul d'eau et fractionné en
deux parties. Le premier aliquot est lyophilisé et repris directement dans
le colorant de charge, puis chargé sur un gel. Les coupures qui apparaissent
sur l'autoradiogramme de ce gel sont des coupures qui se sont produites en
milieu neutre. La deuxième fraction est traitée avec 100 ul de pipéridine
1 M 10 minutes à 90 oC. Elle e!'lt:. congelée, lyophilisée et rincée deux fois
avec
200
ul
d'eau
avan t
d' être rep ris e à
son
tour dans le coloran t
de
charge, et chargée sur un gel de polyacrylamide. L'autoradiogramme de ce gel
révèle les coupures induites en milieu neutre plus celles qui apparaissent
après trai tement en milieu basique. Ces coupures sont dues essentiellement
aux dommages causés sur les bases nucléiques.
La migration électrophorétique s'effectue à puissance constante de
40 Watts pendant trois heures dans le tampon 1 TBE (Tris 90 mM, borate 90
mM,
EDTA
1 mM).
Les
gels sont ensuite autoradiographiés à
-70°C
sur
des
films Fuji (X-Ray) pendant 12 à 48 heures suivant la quantité de radioacti-
v ité chargée.
136
1. Profil de la dégradation
La figure III. lA représente l'autoradiogramme d'un gel "neutre" du
27mère-AB
irradié en présence de quanti tés croissantes de MDAp2+ dans
le
tampon cacodylate 10 mM pH 7 et à 20°C. Les puits 9 et 10 sont les témoins
irradiés et non irradiés.
Lorsque la concentration en MDAp2+
augmente du
puits B vers le puits 1 les coupures sont plus intenses au niveau
de toutes
les
bases.
L'efficacité
des
coupures
est
plus
importante
au
niveau
des
guanines aussi bien en milieu neutre qu'après traitement en milieu basique
(figure III.2A).
L'analyse
quanti tati ve
des
densi togrammes
permet
de
déterminer
l'efficacité de coupure au niveau de chaque base:
- Les guanines du côté 5'
(G6 et GB) sont touchées de la même ma-
nière soit environ 1.5 % de dégradation en milieu neutre.
Après traitement
en milieu basique (figure III.2A) ce pourcentage augmente à 7% environ.
Les guanines du côté 3'
(G19. G20 et G23) ont un pourcentage de
dégradation
(4
à 5%)
plus élevé que du côté 5'. Lorsque les échanti.llons
sont traités en milieu basique pour révéler les dommages subis par les bases
on retrouve les mêmes pourcentages de dégradation.
- Les adénines contigues dans la séquence AB sont peu dégradées
mais avec la même efficacité en milieu neutre et en milieu basique (pourcen-
tage de coupure de l'ordre de
%). Les adénines situées entre deux guanines
sont par contre plus touchées (A7 et A20) surtout en milieu neutre.
Les thymines si tuées du côté 5'
(T5 et T9) sont moins touchées
(0,7 %) que celles situées du côté 3' en milieu neutre. En milieu basique le
pourcentage redevient le même.
- Les cytosines ne sont pas beaucoup touchées aussi bien en milieu
neutre qu'en milieu basique.
Les figures
III.1B et III.2B représentent les profils d'un den-
13.7
3'
A
A
CCGTGAlAAAA • .~ 'li
A
...
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..
A
...
A
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A
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G
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'...
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."'i:?
Figure IIL1A : Autoradiogramme
d'un
gel
"neutre"
du
27mère-A8
(1,35
x
10-7 M en phosphates) irradié 30 minutes en fonction de la
concentration en MDAP2+ dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C.
Les différents puits contiennent respectivement les concentrations suivantes
en MDAp2+ : 1 : 2,77 x 10-6 M ; 2 : 2,OlJ x 10-6 M ; 3 : 1,36 x 10-6 M ; lJ :
6,79 x 10-7 -M
;
5
:
1,37
x 10-7 M ;
6 :
1,37 x-1O-9 M;
7
: 6,86 x
10-9 M
8 : 2,77-x 10-6 M ~ témoin non-irradié
9 : témoin sans MDAp2+
irradié ; 10 : tèmoin sans MDAP2+ non irradié.
al
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,/\\...
o
110
220
distance
de
migration (mm)
Fi~UI'e
Densitogramme
du
puits
n03
de
la
figure
III.1i\\
montrant
IlI.1I3
l'efficacité de coupure au niveau de chaque base.
138
-"-....
; t ;,..~
'"
te·
s
••~ -
".. -
Figure III.2A : Autoradiogramme
d'un gel
de
séquence
du
27mère-A8
C2,74 x
10-7
M en
phosphates)
irradié
30
minutes
en
présence
du
MDAP2+ puis traité 10 minutes par la pipéridine 1 molaire. L'irradiation est
félite dans le tampon cacodylate 10 mM à pH 7 et à 20°C. La concentration en
MDAP2+ est respectivement de : 1 : 2,78 x 10-5 M ; 2 : 2,08 x 10-5 M ; 3
1,39 x 10-5 M j
4 : 8,68 x lO- o M j 5 : 5,56 x 1O-6 -M j 6 : 3,13 x 10-6 M
7 i 1,110 x 10-6 M j 8 : 2,78 x 10-5 M-Ctémoin avec MDAp2+-non irradié)
9
témoin sans MDAp2+ irradié j 10 : témoin sans MDAp2+ non irradié .
Il
.{\\
1
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.....
0
110
220
distance
de
migration (mm)
f..i~llr~_~I1.2f3
DensitoGI'amme
du
puits
n07
de
la
figure
III.2f\\
montrant
J 'c:rrL(~;,r.ité de coupure au niV(!élU de chélque
b;,s0..
139
sitograrnme
du
puits
n03
du
gel
"neutre"
et
du
puits
n07
du
gel
dit
"basique".
Le profil de dégradation des oligonucléotides par le bis-DAP4+ est
le même que celui observé en présence du MDAP2+. Aux mêmes concentrations en
colorants,
le bis-DAP4+ est plus efficace que le MDAp2+. Les guanines sont
toujours les bases les plus touchées.
2. Produits de dégradation
Les produits de la réaction de coupures du 27mère-A8 par le MDAp2+
et le bis-DAP4+ en milieu neutre migrent
sur un gel dénaturant au même
niveau que les produits de dégradation de la réaction chimique (G + A) de
Maxam Gilbert. On peut donc conclure que ces produits ont leurs extrémités
sous forme 3' phosphomonoesters (19).
Par contre les échantillons traités en milieu basique (pipéridine
molaire,
10 minutes à 90°C)
présentent
un
dédoublement
des
bandes
des
produi ts
de dégradation.
Les
bandes
les
plus
intenses
migrent
comme
les
produits de la réaction de Maxam Gilbert. Il apparait cependant une deuxième
bande moins intense qui migre plus lentement que la bande principale. Sur la
figure III.2A ces bandes sont nettement visibles au niveau de l'adénine 3.
de la guanine 4. de la thymine 5. de la guanine 6, de l'adénine 7 et de la
guanine 8 et même au ni veau de la thymine 9.
Les mêmes bandes secondaires
devraient apparaitre au niveau de toutes les bases ; leur visualisation est
simpleme!1t limi-tée par la limi te de résolution du gel.
Il
existe donc
en
milieu basique des produits secondaires de la réaction,
soi t des produits
d'ouverture des cycles puriques en milieu basique, soit des produits déphos-
phorylés à leur extrémité 3'.
L'identification des produits de dégradation dans le cas du com-
plexe orthophénanthrol ine cuivre a
permi s
à Dav id
Sigman de
proposer
un
mécanisme pour la coupure du squelette phosphodiester des acides nucléiques.
Ce mécanisme postule une attaque du sucre par un radical hydroxyle condui-
sant
au
départ
de
la
base
et
à
la
coupure
du squelette phosphodiester
(20,21) .
140
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O·p,O H- C'> ;:,:;;
C
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0
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H
H
5-MF
Par le schéma (a). on aboutit à un oligo 3' phosphate marqué en 5'
tandis que par le schéma (b) on obtient un oligonucléotide ayant en 3' un
phosphoglycolate
qui
migre différemment du
précédent.
Le
phosphoglycolate
disparaît en milieu basique.
3. Efficacité de coupure
Les
figures
IV.3,
4 et 5
illustrent
le
pourcentage de
coupure
induite sur le
27mère-As
par le MDAp2+
ainsi
que le bis-DAp4+ en milieu
neutre et après traitement en milieu basique. La concentration du 27mère-As.
du 27mère-Ts ou du duplex est de 2.70 10-7 M en phosphate dans toutes
les
expériences. Les pourcentages de coupure ont
été calculés en découpant les
bandes du gel correspondant au 27mère non dégradé et aux produits de
cou-
pure. Un témoin ne contenant pas de photosensibilisateur a aussi été irradié
30 minutes à 20°C pour servir de référence aux coupures non spécifiques. Le
pourcentage de dégradation du
témoin est toujours
inférieur à 3 % ce qui
correspond dans nos expériences au bruit de fond.
141
a. MDAp2+
La
figure
III.3
représente
les
pourcentages
de
dégradation
du
27mère-As et du 27mère-Ts sensibilisés par le MDAp2+. En milieu neutre on
obtient jusqu'à 50 % de coupure sur chaque oligonucléotide. La légère aug-
mentation des coupures (; 60 %) sur le 27mère-Ts est due essentiellement à
la présence des deux guanines du côté 5' de l'oligonucléotide. L'efficacité
de coupure étant
plus grande
au ni veau des guanines,
chaque fois
qu'une
coupure se produi t à leur niveau, on perd la radioactivité de telle sorte
que l'on ne voit plus les coupures produites au niveau des autres sites.
Le traitement des échantillons en milieu basique augmente le pour-
centage de dégradation qui atteint pratiquement
90 % sur les deux oligonu-
cléotides. La différence de 40 % observée entre le pourcentage de dégrada-
tion en milieu "basique" et "neutre" représente les dommages
(photooxyda-
tion) photochimiques subis par les bases au cours de l'irradiation. Il y a
donc
pratiquement autant de coupures directes du squelette phosphodiester
qu'il y a d'oxydation de bases.
25 % de coupures sont observées dans les mêmes conditions sur le
duplex en milieu neutre. Après traitement par la pipéridine ce pourcentage
double pour les mêmes raisons que ci-dessus. La figure III.5 présente les
efficacités de coupure du duplex par le MDAp2+.
b. bis-DAp4+
La
dégradation
du 27mère-Ts
et
du
duplex
par
le
bis-DAp4+
est
représentée sur les figures 111.4 et 111.5. 'Sur le simple brin, le pourcen-
tage de dégradation en milieu neutre est de 50 % il est très voisin de celui
observé avec le MDAp2+.
Sur le duplex
(figure III.5),
la dégradation est
beaucoup plus importante qu'avec le MDAP2+, de plus ce pourcentage est at-
teint pour de plus faibles concentrations en bis-DAP4+.
Le trai tement des échantillons
irradiés en milieu basique donne
pratiquement le même résultat : 90 à 95 % de dégradation sur le simple brin
et sur le duplex.
142
100
4
2
---6--------
z
0
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3
ct
c
- -- - - -0-
1
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- - - \\.J
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o
w
C
0\\0
0
0
1
2
3
[MDAP 2+]
• lOS
Figure 111.3 : Efficacité de dégradation des oligonucléotides par le
MDAP2+
et
le
bis-DAp4+
en
milieu
neutre
et
après
traitement
des
échantillons en milieu basique. La concentration en oligonucléotides est de
2,70 x 10-7 M en phosphate. Le temps d'irradiation est de 30 minutes dans le
tampon cacodylate 10 mM pH 7 à 20°C.
Les pourcentages ont été calculés à
partir du comptage de la radioactivité des bandes des 27 mères intactes et
des produits de dégradation.
~
27mère-AB + MDAp2+ en milieu neutre ;
2
27mère-AB + MDAp2+ traité par 1 M pipéridine
3
27mère-TB + MDAp2+ en milieu neutre ;
4
27mère-TB + MDAp2+ traité par 1 M pipéridine.
100
2
z
0
-
~
ct
c
o
50
1
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w
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0
0
1
2
3
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.
4+]
S
BlS-DAP
.
10
Figure III.II
Efficacité
de dégradation du 27mère-TB
par
le bis-DAp4+ en
milieu neutre (1) et après traitement des échantillons par la
pipéridine 1 molaire (2). Les conditions cxpérimenti'l]"~ ~lOnl.
celles de la figure 11.3.
143
100
4
z
o
o
-1-
+
et
Q
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2
---O
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~ 50
LU
3
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1
o
o
1
2
[
.
4+]
B1S-DAP
Figure 111.5 : Efficacité
de
dégradation
du
27
mère
duplex
(27mère-A8-27mère-T8)
(2,80
x 10-7 M en
phosphates)
par le
MDAp2+
et
le
bis-DAP!J+.
Les conditions expérimentales
sont
les mêmes que
celles de la figure 111.3.
1
27mère duplex + MDAp2+ en milieu neutre ;
2
27mère duplex + MDAP2+ traité par la pipérldine
3
27mère duplex + bis-DAp!J+ en milieu neutre;
~
27mère duplex + bis-DAP!J+ traité par la pipéridlne.
144
4. Cinétique de dégradation des oligonucléotides
La figure 111.6 représente la cinétique de dégradation du 27 mère
duplex par le MDAp2+ en milieu neutre et après traitement des échantillons
par la pipéridine. Dans ces conditions, au bout d'une heure d'irradiation on
obtient un plateau qui correspond à 30 % de coupures en milieu neutre et
70 %en milieu basique. Les points correspondant au temps t = 0 représentent
en fait les coupures
provoquées par l'absorption de la lumière naturelle
pendant la durée de l'expérience. Ces coupures sont très faibles en milieu
neutre, mais deviennent toujours importantes quand l'échantillon est traité
par la pipéridine.
Le pui ts nOS de
la figure
III. 2A montre le profil
de
dégradation par l'absorption de la
lumière naturelle (la trainée noire sur
l'ensemble du puits correspond sans doute à une élimination seulement par-
tielle du MDAP4+ utilisé à forte concentration).
La figure
III. 7 représente les cinétiques
de
coupure
du
duplex
par le bis-DAp4+.
En milieu neutre,
la dégradation est totale au bout de
deux
heures
d'irradiation.
L'efficacité
de
dégradation
du
duplex
par
le
bis-DAp4+ est plus importante que celle du MDAp2+. On notera sur la figure
111.7 que l'échantillon non irradié présente des coupures en milieu neutre
qui
sont
considérablement
amplifiées
en
milieu
basique.
Ce
résultat
est
vraisemblablement dO à l'action de la lumière ambiante. La comparaison avec
la figure 111.6 montre que les dommages des bases sont plus importants avec
le bis-DAp4+ qu'avec le MDAP2+.
Conclusion
Les nouvelles molécules MDAp2+ et bis-DAP4+ qui se fixent sur les
acides nucléiques en simple et en double brin sont capables de sensibiliser
une dégradation des acides nucléiques lorsque l'on irradie le mélange avec
des radiations de longueurs d'onde supérieures à 300 nm (17). Les coupures
du squelette phosphodiester des acides
nucléiques sont directement obser-
vables en milieu neutre.
De plus des photodommages
induits au niveau des
bases sont révélés par traitement en milieu alcalin. Le bis-DAp4+ est plus
efficace comme photosensibilisateur que le MDAp2+ en raison de sa plus forte
affinité pour les acides nucléiques.
145
100
z
2
0
•
-.-
•
-et
C
-et
50
0::
C)
LU
1
C
0\\0
0
0
60
120
180 Temps (mn)
~'iglll'e III.6
Cin~tique de d~gradation du 27mère duplex (8,70 x 10-7 M en
phospl1ates)
par
le
MDAp2+
(8,40
x
10- 6
M)
dans
le
tampon
cacodylate 10 mM pH 7 à 20°C.
1
milieu neutre
2" : apl'ès tt'aitement des ~chantillons par la pipéridine.
100
z
0
-.--et
C
-et
50
0::
C)
LU
C
0\\0
0
o
60
120
180
Temps(mn)
Fi~ul'e lII. 7
Cin~tiqlle de d~gradation du 27m~re duplex (8,40 x 10-7 M en
phospha tes)
par le bis-DAP4 + (8,110 x 10-6 M) dans le tampon
cacodylate 10 mM pH 7 à 20°C.
1
milieu neutre
~ : après traitement des ~chantillons pal' la pip~ridine.
146
En milieu neutre,
les coupures sont plus intenses au niveau des
guanines
mais
d'autres
liaisons
phosphodiesters
sont
également
coupées,
notamment au niveau des adénines dans les séquences GAG. Par contre, peu de
coupures sont
observées au
niveau de
la séquence AB.
Ce résultat semble
indiquer que la fixation du MDAp2+ dépend de la séquence des bases. En mi-
lieu basique les dommages produits au niveau
des
bases sont révélés.
La
guanine est de loin .la base la plus modifiée, probablement par photooxyda-
tion.
147
II. DEGRADATION DU 27MERE-AS PAR L'OLIGOTHYMIDYLATE TS-MDAp2+
Dans le but de pouvoir utiliser ces nouvelles molécules pour cou-
per de façon sélective les acides nucléiques. le MDAp2+ a été couplé par un
bras pentamethylène à
un oligothymidylate
(TS)
par
l'intermédiaire d'une
liaison phosphothioester en posi tion 3'. Le 27mère-As possède une séquence
AS complémentaire de l'oligonucléotide ainsi synthétisé. La complémentarité
de
ces deux séquences doi t
permettre de
localiser le MDAp2+ sur un si te
unique au niveau du 27mère-As. l'ensemble mimant une nucléase artificielle
activable par une irradiation lumineuse.
1. Profil de dégradation du 27mère-As par T8-MDAP2+
La figure III.S présente l'autoradiogramme du gel obtenu en milieu
neutre avec le 27mère-As irradié en présence de concentrations croissantes
en TS-MDAp2+. Des coupures sont observées au niveau des guanines situées du
côté 3' de la séquence AS mais leur intensité ne dépend pas de la concentra-
tion en TS-MDAP2+. Par contre une coupure au niveau du nucléotide T1S appa-
raît
quand la
concentration de TS -MDAp2+
augmente.
Son ampli tu de at teint
10 % du 27mère à une concentration de 5,4 x 10-6 M (tableau III.A). En même
temps apparaissent deux bandes correspondant à des espèces qui migrent plus
lentement que le 27mère (tableau 111.8). La figure III.9A présente le den-
sitogramme du gel correspondant à la concentration 5,4 x 10-6 M en TS-MDAP2+
et la figure III.9B montre la variation des coupures au niveau des nucléo-
tides T1S. G19 et GS en fonction de la concentration en TS-MDAP2+.
Par analogie avec les résultats obtenus avec d'autres groupements
photoactifs
(proflav ine.
az idophénacyl.
az idoproflav ine,
porphyrines),
les
espèces qui migrent plus lentement que le 27mère peuvent être identifiées à
des produits de pontage de TS -MDAp2+ sur le 27mère induits par l'irradia-
tion.
Lorsque les échantillons du 27mère-As sont traités 10 minutes à
90°C par la pipéridine 1 molaire,
le profil de dégradation
devient diffé-
rent
de
celui
observé
en milieu
neutre.
La figure
III .10A représente un
autoradiogramme du
27mère-As irradié en présence du TS-MDAP2+ et traité par
la pipéridine.
148
«
T
5'
~~@$i4tig*ûi4ith-1è<jè.·ti·'WÙ5iJ
Figure 111.B : Autoradiogramme d'un gel de séquence du 27mère-AB irradié en
fonction
de
la
concentration
en
TB-MDAP2+
dans
le
tampon
cacodylate 10 mM, NaCI 250 mM à pH 7 et à DOC. Le temps d'irradiation est de
30
minutes.
La
concentration
en
27
mère-As
est
de
lO- B M et
celle
du
TS-MDAP2+ est respectivement de 0,13
; 0,27
; O,5/j
O,Bl;
l,OS;
l,S9
;
2,7
et
5,/j
\\.lM
du
puits
1
au
puits
8.
Le
puits
9
constitue
le
témoin
27mère-As irradié 30 mn sans TB-MDAP2+.
3
CIl
u
::
~
.0
2
""
....
0
l-
V>
.0
CI:
~
0,4 l=::::::::::==~===i:::=--~-----:;2~0-;:-O----'
20
100
distance
de
migration (mm)
Figure III. 9A
Densitogramme
du puits oOB du gel de
la
figure
IlL8 mon-
trant
l 'efficaci té de
coupure
de
chaque
base du
27mère-AB
par TB- MDAP 2+.
149
Z
10
o
1-
<{
Cl
<{
0::
t.:>
LU
Cl
°10
5
o
().--o---.Q-
- - - ------0--- ---- -- ---- ~--.
O
,"
,
1
1
,,,
1
lb
le
~-~--&--------~-----------T-~I
1
o
o
2
4
Fie;ure III.9B
Pourcentage de coupure du 27mère-As par TS-MDAp2+ au
niveau
de la guanine GS,
G19 et de la thymine 1'lS. Les conditions
expérimentales sont celles de la figure 111.8.
150
Figure III. 10A
Autoradiogramme
d'un gel de
séquence du 27mère-AB irradié
en fonction
de la concentration en TB-MDAP2+ .
Les
échan-
tillons
sont
traités 10 minutes à 90°C
par
la
pipéridine
1
M.
Les
candi tions
expérimentales
sont
celles
de
la
figure III.B.
2
UI
U
c:
ca
c:o
.0
....
....
o
~ 1
ca
!
0,4
20
100
200
distance
de
migration (mm)
figure III.l0B
Densitogramme du puits n08 du gel de la figure 10A montrant
l'efficacité
de
coupure
des
bases
d
? ' { '
TB-MDAP2+.
U
~ mere-AB
par
151
[TS-MDAP2+] .10 6 (M)
0,13
0,27
0,54
O,Sl
l,OS
1 ,89
2,7
5,4
% coupure T18
0,S2
0,83
2,22
1,S4
2,50
3,60
6,8
10,23
% coupure G19
2,86
4,04
4,96
4,20
4,30
3,43
4,2
4,24
% coupure GS
0,79
1 ,03
0,79
0,82
0,71
0,78
0,83
0,72
TABLEAU III.A
Pourcentage de coupure de trois bases du 27mère-As (10-8 M en extrémités) en
présence de quantité croissante de T8-MDAP2+ dans le tampon cacodylate 10 mM
NaCl 250 mM à pH 7 et à OoC. Le temps d'irradiation est de 30
minutes.
0,27
0,54
O,Sl
1 ,08
1 ,S9
2,7
5,4
%pontage l
0,72
0,79
1 ,33
1 ,4
1 ,47
1 ,75
2,09
2,63
%pontage II
0,72
0,90
1 ,62
1 ,85
2,07
2,S5
3,25
4,09
TABLEAU III. B
Pourcentage de pontages induits sur le 27mère-AS par le T8-MDAP2+ en
milieu
neutre. Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles de la figure
III .S .
Cette figure montre que
la coupure maximum se produit au niveau de la thymine lS ;
des
coupures
importantes
sont
observées
au
ni veau
des
trois
guanines (G19, G21, et G23) du côté 3' ;
la région AS est protégée sauf l'adénine 17 qui est partielle-
ment coupée ;
- les
trois
guanines
du côté 5'
(G4,
G6 et GS)
sont également
touchées sans que l'on observe une augmentation des coupures par
rapport à celles observées en milieu neutre.
152
le MDAp2+ étant fixé du côté 3' de l'oligothymidylate les coupures
sont attendues du côté 5' du 27mère dans le cas d'un appariement antiparal-
lèle. La base la
plus proche du site de coupure est alors la thymine T9.
En milieu neutre, les coupures sur cette base sont très faibles et
l'on retrouve le même résultat après avoir traité les échantillons en milieu
basique. Le tableau III. C ci-dessous donne le pourcentage des coupures des
guanines GB, G19 et des thymines T9 et T17.
[TB-MDAp2+] 010 6 ( M)
0,13
0,27
0,54
O,Bl
l,OB
l,B9
2,7
5,4
% coupure GB
6,6
4,4
5,0
5,7
4, 1
2,B
3, 1
3,2
% coupure T9
1 ,9
1 ,3
1 ,4
1 ,4
1 ,4
1 ,4
0,9
0,9
% coupure T1B
1 ,7
1 ,6
2,6
3,4
6,2
5
7,7
9,3
% coupure G19
6,6
6,6
B,2
7,5
10,7
6,4
6,7
5,5
TABLEAU III.C
Pourcentage de coupures au niveau des guanines GB, G19 des thymines T9, T1B
du 27mère-AB irradié en présence de l'oligonucléotide TB-MDAp2+. Les
condi-
tions
expérimentales sont
les mêmes
que
celles
de
la figure
III.B.
Les
échantillons ont été traités par la pipéridine 1 molaire pendant 10 minutes
à 90 Oc avant d'être chargés sur le gel de séquence.
La comparaison des tableaux III.A et III.C montre que
-
les coupures sur la guanine
19 du 27mère restent
constantes
quand la concentration en TB-MOAP2+ augmente aussi bien en milieu "neutre"
(4 %) qu'en milieu "basique" (7 %). L'augmentation des coupures après
trai-
tement en milieu basique montre que les bases qui ont subi des photodommages
sont labiles en milieu
alcalin. Il y a donc un enrichissement des coupures
sur cette base lorsque l'on traite les échantillons par la pipéridine 1 M ;
153
- la guanine S qui n'était pas touchée en milieu neutre voit ses
coupures enrichies après traitement en milieu basique. Cependant le taux de
coupures diminue lorsque la concentration en TS-MOAP2+ augmente. La dispari-
tion des pontages ne semble donc pas enrichir cette coupure ;
-
la
thymine Tg
est
très faiblement
révélée
en milieu
basique
alors qu'elle ne l'était pas en milieu neutre;
- la thymine T1S qui
est la plus touchée en milieu neutre l'est
aussi
après trai tement en mil ieu basique.
La dispari tion des
pontages
se
traduit
essentiellement
par
un
enrichissement
des
coupures au
niveau de
cette base.
2. Cinétique de dégradation du 27mère-AS par le TS-MOAp2+
Une concentration de
1,6 10-6 M de 27mère-As est incubée avec la
même
concentration en TS -MOAp2+ à zéro deg ré pendant deux heures dans le
tampon cacodylate 10 mM, NaCI 250 mM à pH 7 pour former le duplex. Le duplex
est ensuite irradié à zéro degré. Les échantillons sont
prélevés en fonc-
tion du temps d' irrad iat ion et analysés sur un gel
de
séquence en mil ieu
neutre, ou après traitement en milieu basique.
Les figures 111.11 et 111.12 représentent respectivement les auto-
radiogrammes des
gels
de
séquence de
la dégradation du 27mère-As par le
TS-MOAP2+ en milieu neutre et après traitement des échantillons par la pipé-
ridine 1 M.
Les conditions d'hybridation du TS-MOAP2+ sur le 27mère-As:
(une
concentration en sel de 250 mM
NaCI
et
une concentration équimolaire des
deux oligonucléotides) ne sont pas favorables
à la formation d'une triple
hélice. Par conséquent les coupures observées sur le 27mère-As
indiquent la
localisation du groupement acti vable (MOAP2+) et l'orientation du
brin TS
sur la séquence complémentaire
AS.
154
..•.: ..
Figure III.llA
Cinétique
de
dégradation
du
27mère-A8
(1,57
x
10- 6
r~ en
extrémités) par le T8-MDAP2+ (1,86 x 10-6 M en
extrémités)
dans le
tampon cacodylate 10 mM,
NaCl 250 mM à
rH 7 et à
OoC.
Cet autoradiogrammn
révèle les coupures directes pro-
duites en milieu neutre.
2
"uc:
co
.c
o
<Il
.c.
co
0,4
5
100
200
distance
de
migration (mm)
Figur'E: UI.118
Oensitogramme
liu
puits
nOS
<30 minlJtèS <l'irr'alli"ltion) dll
gel
lie
la
figure
[I1.l1i\\
dOllllétnt
l'effiC:é,,~iLé de C;lllJlllH'l,
dll
::''(rnèt'e-I~1l ,111 Il i veau rit: Cildqll<2 IJél:;,;.
\\55
--
. '~
Figure III.12A
: Autoradiogramme
du
gel
de
séquence
du
27mère- AS (1,57 x
6
10-
M)
dégradé par
le T8-MDAp2+
(1,68 x
10- 6 M) en fonc-
tion du
temps d' irradiation
:
tampon cacodylate
10 mM,
NaCl
100 mM à
pH 7
et
à
OOC.
Ce
gel
représente
les
coupures
r<2vélées
par
un
traitement
des
échantillons par la DiDéridinp. 1 M.
II)
u
c
'" 0,8
.a
0
"'
oC
<:l
0,6
0,45 L------.:.-------Je--:==----~-____;2~0~O;-----J
5
100
distance
de
migr<:tion (mm)
Figure III.12B
Densitogramme
du
puits
nOS
(30
minlJt,~s (j'it't'acliêltion) du
gel
(je
la
figure
IlI.12J\\
(jorl!li'lnt
]'cft'icacitâ
cle
coupure
du 27mère-As au niveau ,112 etlélqlw I)d~e.
156
Les
coupures
les
plus
intenses
sont
observées
du
côté
3'
du
27 mère- A8 et portent essentiellement sur les guanines G19, G21
et G23. La
thymine
T18 et l'adénine A17 sont aussi révélées avec une intensi té plus
faible que les guanines.
Du côté 5'
seules les guanines G4, G6 et G8 sont
révélées.
En mil ieu neutre,
toutes les coupures augmentent en fonction du
temps d'irradiation aussi
bien du
côté
3'
que
du
côté
5'
du
27mère.
Les
coupures les plus intenses se si tuent toujours du côté 3' au niveau de la
guanine G19 et de la thymine T18.
Lorsque les échantillons sont traités en milieu basique,
on ob-
serve
une
augmentation
du
pourcentage
de
coupure
par
rapport
au
milieu
neutre. Du côté 5' de la cible l'intensité des bandes de la guanine G8 aug-
mente toujours en fonction du temps, par contre du côté 3' les coupures au
niveau de la thymine T18 et G19 restent relativement constantes. Le tableau
ci-dessous résume les pourcentages de coupures au niveau des trois bases G8,
temps (rnn)
5
10
15
20
30
neutre
0,98
1 ,90
2,4
3,3
3,9
G8
pipéridine
2,99
5,45
7 ,94
8,15
8,71
neutre
2,70
3,7
4,5
5,5
6,0
T18
pipéri~ine
2,40
3,49
3,74
4,29
3,81
neutre
5,70
9,8
12,0
13,3
13,3
G19
pipéridine
18,83
24,42
22,14
19,30
12,60
TABLEAU III .0
Cinétique de coupure des bases G8, T18 et G19 du 27mère-A8
par
T8-MOAP2+
en milieu neutre et après traitement
par la pipéridine.
Ces
pourcentages
ont été calculés par densitométrie des autoradiogrammes des gels des figures
111.11 et 111.12.
157
3. Effet de la concentration en TB-MDAp2+
L'énergie libre d'association du TS-MDAP2+ sur sa séquence cible
est la somme des énergies libres de~ interactions suivantes (21-24)
- l'énergie libre de l'appariement de la séquence TS sur la sé-
quence AS complémentaire,
- l'énergie de l'interaction du bras pentaméthylène
- l'énergie d'interaction du MDAP2+ avec le duplex ainsi formé.
En première approximation, on peut donc écrire que
l1GONBI
De cette relation, on peut estimer
la
constante d'équilibre
du
système à une température donnée par la relation suivante :
KONBI
KON • KB • KI
La constante d'éqUilibre du système peut être déterminée en sui-
vant la dénaturation thermique du complexe ainsi
formé en fonction de la
température. La température de demi-dissociation du duplex est reliée à la
concentration de l'oligonucléotide libre à la tempéraature Tm par la rela-
tion de Damle (25) :
l1S
2,3 R
----- +
log Cm
La constante d'équilibre entre l'oligonucléotide TS et le poly(rA)
est de
1,9
10 7 Wl
à 273 K et de 2,3 10 11
Wl
lorsque l'oligonucléotide
porte un intercalant en l'occurrence l'acridine (21-24).
La constante d'association de l'oligonucléotide TS-MDAP2+ sur la
séquence complémentaire est certainement du même ordre de grandeur que celle
du TS -Acr.
158
A
0,9
0, 8
0,7
o
2
3
Figure 111. 13/\\
Titration
du
TS-MDAP2+' par
l'ol1gonucléotide
(d/\\)10
dans
le tampon cacodylate 10 mM, NaCl 100 mM à pH 7 et à 5°C. La
concentration
Initiale en TS-MDAP2+ est de 6,SIJ x 10-6 M
et la variation de l'absorbanc~ est suivie à
1J20 nm.
F
0,8
0,6
0,4
0,2
o
5
10
1 5
20
25
30
Figure IIl.13B : Tltration du TB-MDAP2+
par le poly(rA) suivie en émIssion
ue fluorescence.
Le rapport flfo représente l'intensIté de
fluorescence du TB-MDAP2+ seul et en présence du poly(rA). La concentration
du TI3-MDAp2+ est de
3,32 x 10-6 M,
la longueur d'onde d'excitation est de
3'15 !lm et l'émIssion est recueillie à 423 nm.
159
La
figure
111.13A
représente
la
variation
de
l'absorbance
du
TS-MDAp2+ mesurée à 420 nm en
fonction de la concentration en (dA)10 à 5 Oc
dans un tampon contenant 100 mM NaCl. Il semble se former deux complexes:
l'un
avec
une
stoechiométrie
de
deux
TS
par
(dA)10,
l'autre
avec
une
stoechiométrie 1:1.
La ti tration du TS-MDAP2+ par le poly(rA) dans les mêmes condi-
tions de température et de force ionique montre qu'il se forme seulement un
complexe 1/1. La figure 111.138 montre la variation de l'intensité de fluo-
rescence du TS-MDAP2+ en fonction de la concentration en poly(rA). L'inten-
si té de fluorescence diminue jusqu'à un rapport [P04-] /
[MDAP2+] =' S qui
correspond à un complexe 1/1. Elle reste ensuite stable jusqu'à un rapport
20 puis croit au delà. En effet, au début de la titration, la concentration
en
ligands en l'occurrence le TS-MDAp2+,
est
en gros excès,
et
ceux-ci
s'agrègent sur la matrice, puis ils se redistribuent au fur et à mesure que
la
concentration
en
matrice
augmente.
La
fixation
du
TS-MDAP2+
sur
le
poly(rA)
étant
une association
coopérati ve,
le signal
spectroscopique du
ligand (MDAp2+) utilisé pour suivre l'association varie lui aussi au cours
de la titration en fonction de la densité de
fixation (26). Les deux types
de complexes ont des absorbances différentes. Ce phénomène explique la lé-
gère augmentation observée de l'intensité de fluorescence pour des rapports
[P04-] / [MDAP2+] supérieurs à 20.
Pour distinguer les différentes structures qui peuvent se former
entre le TS-MDAP2+ et le
27mère-As,
(double ou triple hélice) nous avons
suivi
la
dégradation
du
27mère-As
en
fonction
de
la
concentration
en
TS-MDAp2+.
T,a figure
IIl.14A représente l'autoradiogramme d'un gel de sé-
quence du 27mère-As
irradié
en présence de concentrations croissantes en
TS-MDAP2+.
La
concentration
en
27mère-As
(1,6
10-6 M en extrémités)
est
constante dans toutes les expériences. Dans le puits A, la concentration en
TS-MDAP2+ est de 1,6 10-7 M soit 10 fois plus faible que celle de la cible
complémentaire.
Dans le puits
B,
elle est égale à celle de la cible et
enfin dans le puits C, elle est 10 fois plus grande que celle du 27mère-As.
Dans les puits A et B, la concentration de l'oligothymidylate et
l'absence de sel ne doivent pas favoriser la formation d'une triple hélice.
Dans ces conditions
si l'appariement entre le 27mère-As et le TS-MDAP2+
se
fait de façon antiparallèle, alors les coupures sont attendues du côté 5' et
160
Figure III.14A : Cel de
séquence du 27mère-Ag en
milieu "neutre". La con-
centration en 27~gre-Ag
est de l,57 . 10
M dans
tous les puits. Les puits
A, B et C ne contiennent
pas de sel et la concen-
.
L+
trat~on en Tg-MDAP
est
de :
puits A
1 ,67
M
puits B
1,67
M
puits C
1,67
M
Les puits D,E et F con-_6
tiennent chacun 1,67.10
M
en Tg-~IDAP2+ et 100 mM,
250 mM, 500 mM de NaCI,
respectivement.
Les puits 1,2,3, 4 et 5
contiennent la même con-
centration en T8-MDAP2+
(1 ,67. 10-5 M) et 0, 1 ;
0,25, 0,5 ; 0,75 et 1 mM
en NaCI, respectivement.
Figure III. J4B : Autora-
diogramme du gel de
séquence du 27mère-Ag . Les
conditions expérimentales
sont identiques à celles
de la figure III.14A. Les
~chantillons ont été
-
traités 10 minutes à 90°C
par la .pipéridine 1 M.
--------
2
<I.J
U
C
III
.0
o
U)
.0
rJ
1
100
200
distance
de
migration (mm)
Figure III.15A
Densi togramme
du
pui ts
8
de
la
figure
III.1~A
donnant
l'efficacité
de
coupures
au
niveau
de
chaque
base
du
27mère- Aa·
2
<I.J
U
C
cv
.Q
~
0
U)
.Q
rJ
1
0,4
5
100
200
distance
de
migration (mm)
Figure III.158
Densitogramme
du
puits
B de
la
figure
III. 1~B
donnant
l'efficacité
de
coupures
au
niveau
de
chaque
base
du
27mère- Aa·
162
les bases touchées seraient la thymine Tg, la guanine GB, l'adénine A7 ~t la
guanine G6.
Manifestement,
sur les
pui ts
A et
8 de la figure
III. 14 les
bases les plus touchées sont les trois guanines du côté 3' du 27 mère-AB.
Dans le puits C,
où la concentration en TB-MDAp2+ est la fois plus grande
que la cible, les pourcentages de coupures sont respectivement de 2 % pour
la guanine GB, '3
% pour la
thymine T1B
et
la
% pour la guanine Glg.
La
thymine Tg du côté 5' n'est pas du tout révélée quelle que soit la concen-
tration en TB-MDAP2+. Cependant c'est la base qui devait être la plus
tou-
chée dans le cas d'un appariement antiparallèle du TB-MDAp2+ sur la séquence
complémentaire. Le TB-MDAP2+ semble donc s'apparier parallèlement au 27mère-
AB ou alors favoriser la formation de triple hélice.
Lorsque les échantillons sont traités en milieu basique, les cou-
pures augmentent du côté 5' du 27mère-AB. La figure 111.148 représente l'au-
toradiogramme
du
gel
de
séquence
du
27mère-AB
irradié
en
présence
du
TB-MDAp2+ lorsque les échantillons sont traités par la pipéridine 1 M. La
disparition des pontages s'effectue essentiellement au profit d'une accumu-
lation
des coupures sur les trois guanines
(G4,
G6 et GB) du côté 5' du
27mère-AB. La figure III.15 représente les densi togrammes des pui ts 8 des
figures
III.14A et 8. Cette figure permet de visualiser
l'intensité de
coupure au niveau de chaque base.
Au
cours
de l'irradiation,
le
TB-MDAP2+
peut
s'autodégrader et
libérer ainsi
dans le milieu de petits fragments d 'oligothymidylate et du
MDAp2+ libre. Ces petits fragments' ou le MDAp2+ libre en se fixant sur le
27mère-AB pourraient être à l'origine des coupures observées du côté 3'
de
la cible.
Pour cela le TB-MDAP2+ a été marqué en 5' et nous avons vérifié
que les produits marqués correspondaient bien à un TB-MDAP2+ qui migre comme
un oligo Tl0. La réduction du nombre de charges et la présence du colorant
retardent la migration de l"oligonucléot ide sur un gel
de polyacry lamide.
Lorsque le TB-MDAp2+ est irradié, on observe une dégradation de l'oligonu-
cléotide avec apparition de fragments plus courts.
En introduisant dans le milieu réactionnel un
produit servant de
piége pour le MDAp2+, on peut alors masquer les coupures non
spécifiques et
ne faire apparaitre que les coupures spécifiques dues au TB-MDAP2+ apparié
sur
la
cible
complémentaire.
Pour
cela,
un
grand
excès
de
polyd(G-C)-polyd(G-C) a été ajouté dans le milieu réactionnel pour piéger le
163
MDAp2+ libre
dont la constante de fixation sur ce polynucléotide (1,0 106
M-l) est très élevée.
La figure 111.16 représente l'autoradiogramme d'un gel de séquence
du 27mère-A8 (1,6 10-6 M) irradié en présence du TB-MDAp2+
(puits A, B
et
C) et en présence d'un excès en polyd(G-C)-polyd(G-C)
(puits D, E et F).
Les puits A, B et C contiennent respectivement l,6B 10-6 M ; B,4
10-6 M et l,6B 10-5 M en TB-MDAp2+. La concentration en sel est de 100 mM.
Les
guanines
de chaque côté de la séquence AB
sont touchées.
Par contre
l'adénine A17 et la thymine T1B du côté 3' du 27mère sont plus touchées que
l'adénine Al0 et la thymine Tg du côté 5'.
Les pui ts -D, E et F contiennent 1 ,6B 10-6 M ; B,4 10-6 M et 1 ,68
10-5
M respectivement
en
TB-MDAp2+
et
1 ,30
10-4
M (en
phosphate)
de
polyd(G-C)-polyd(G-C). Le profi l de coupure observé sur ces
trois puits est
le même que celui observé sur les puits A, B et C. Ce résultat démontre que
l'addition du polyd(G-C)-polyd(G-C) pour piéger les produits de dégradation
du TB-MDAP2+ ne modifie cas le profil de dégradation du 27mère-A8. Les cou-
pures les plus importantes sont touj ours du côté 3'
de la séquence AB du
27mère et ne sont donc pas dues à du MDAp2+ libre ou à de courts oligonu-
cléotides portant toujours le MDAp2+.
Lorsque les échantillons sont traités en milieu basique,
on ob-
serve une disparition des pontages et une augmentation de la dégradation du
27mère du côté 5'. Les guanines G4,
G6 et GB sont révélées avec beaucoup
plus d' intensi té. La thymine Tg et l'adénine AlO qui sont absentes sur la
figure 111.16 sont maintenant révélées. La figure 111.17 représente l 'auto-
radiogramme du gel de séquence du 27mère-AB. Les condi tions expérimentales
sont les mêmes que celles de la figure 111.16, et les échantillons ont été
traités 10 minutes à gO Oc par la pipéridine 1 M.
4. Effet de la concentration ionique
La formation d'une triple hélice est favorisée par une augmenta-
tion de la force ionique par la présence de certaines polyamines comme la
spermine et aussi
par certains polyols
(éthylèneglycol)
qui
réduisent
la
164
J.
f l .,'."i,
;JO
f
.. --
. -
• ...,.
....
• _.".
'!-:
Figure 16
Figure 17
Figure III. 16 : Autorad iogramme
du
gel
de
séquence
du
27mère-AB
(1,60
x
10- 6
M)
irradié
en
fonction
de
la
concentration
en
TS-MDAP2+
seul
(puits A,
B,
C)
et en présence d'un excès
de polyd(G-C)-
polyd(G-C) dans le tampon cacodylate 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7 à OOC.
Puits A : !TB-MDAP2+j = 1,6 x 10- 6 M
Puits B:
TS-MDAP2+
=
B,4 x 10-6 M
Puit~ C:
TB-MDAP2+
=
1,6 x 10- 5 M
Les
puits
D,
E et
F contiennent
respectivement
les mêmes
concentrations en Ta-MDAP2+ que les puits A, B et C, de plus ils contiennent
1,30 x 10- 4 M de polyd(G-C)-polyd(G-C).
Figure 111.17
Les
conditions
expérimentales
sont
celles
de
la
figul'e
111.16. Les échantillons sont traités 10 minutes à 90°C par
la pipéridine 1 M.
165
répulsion des charges négatives des phosphates (27-32). Lorsque
la concen-
tration en NaCI augmente, l'intensité et la spécificité des coupures, pro-
duites par le TB-MDAP2+ sur le 27mère en
milieu neutre du côté 3' de la
séquence complémentaire, augmentent.
La figure
III .14A montre l'effet de la concentration ionique sur
le profil de dégradation du 27mère-AB.
- Les puits D, E et F contiennent 1,6 10-6 M en 27 mère AB et 1,6
10-6 M en TB-MDAP2+. La concentration en sel est respectivement de 100 mM,
250 mM et 500 mM. A faible force ionique,
les bases les plus touchées sont
toutes du côté 3' de la séquence AB. Lorsque la concentration en NaCl aug-
mente, les coupures apparaissent des deux côtés de la séquence AB. Ces cou-
pures ne peuvent être interprétées que par la formation d'une triple hélice.
Il apparaît en outre des produits de pontage en quantité croissante.
Dans les pui ts 1 à 5,
la concentration en TB-MDAp2+ est 10 fois
supérieure à celle du 27mère-AB.
La concenÙation en NaCl varie de 100 mM
dans le puits 1 à 1 M dans le puits 5. Le profil de dégradation observé met
encore en évidence des coupures de chaque côté de la séquence AB. Dans ces
conditions, et comme démontré précédemment, ces résultats prouvent la forma-
tion d'une triple hélice entre la séquence AB du 27 mère et de TB-MDAp2+.
Le
trai tement
des
échantillons
par
la
pipér id ine
M (figure
III.14B) augmente l'intensité de coupure au niveau de toutes les bases mais
surtout du côté 5' de la séquence AB. Le tableau ci-dessous donne le pour-
centage de coupures de trois bases prises de chaque côté de la séquence AB,
Ces pourcentages ont été calculés à
partir des densitogrammes des figures
III.14A et B. On observe un enrichissement des coupures sur les guanines
GB
et G19' par contre le pourcentage reste relativement constant au niveau de
la thymine T1B.
Les coupures observées sur cette base sont donc des coupures spé-
cifiques et tendent à montrer que le TB-MDAP2+ s'oriente de façon parallèle
à la séquence
AB
du
27mère.
L'enrichissement des
coupures au niveau des
trois guanines de chaque côté de
la séquence AB
peut être attribué à la
formation d'une triple hélice.
Cette triple hélice se forme même à faible
force ionique pUisqu'à 100 mm NaCl (puits 7) on observe déjà
3 % de coupure
166
sur la guanine GS, et S,5 % sur la guanine G19 en milieu neutre. Le traite-
ment en milieu basique fait passer ce pourcentage de 9 %à 1~ % respective-
ment. A partir de
250 mM en NaCl les coupures sont de même ordre
de gran-
deur de chaque côté de la séquence AS : soit S %en milieu neutre et 16 %en
milieu basique pour la guanine GS, 9,3 % en milieu neutre et 13,5 % en mi-
lieu basique pour la guanine G19 de chaque côt~~e la séquence AS.
[TS -MDAp2+] = 1,6 10-6 M
[TS -MDAp2+] = 1 ,6 10-5 M
[NaCI]
100 mM
250 mM
500 mM
100 mM
250 mM
500 mM
700 mM
1000 mM
neutre
1 ,02
1 ,98
2,72
3,2
8,03
10
8,58
8,62
G8
pipéridine
~,~1
5,73
7,26
8,65
15,70
17 ,05
16,02
1~ ,81
neutre
3,65
5,86
6,96
6
10,50
15,~~
16,92
17 ,32
.
T18
pipéridine
5,93
5,39
6,07
7,98
9,16
8,35
S,02
9,2~
neutre
10,28
8 , 1~
6,~5
8,5
10,92
S,S7
S,69
8,81
G19
pipéridine
17,~9
13,78
11 ,20
1~ ,02
16,20
13,~S
12,97
11 ,92
TABLEAU III. E
Pourcentages
de. dégradation du
27
mère
AS par T8 -MDAp2+ mesurés sur les
bases GS, T1S, et G19 en fonction de la cncentration en NaCI. La concentra-
tion en 27 mère AS est égale à 1,6 10-6 M.
167
Conclusion
TS-MDAP2+ semble toujours former une triple hélice avec le 27mère-
AS et ce aussi bien à faible qu'à haute concentration en NaCl. L'irradiation
des complexes induit:
- des coupures en milieu neutre du côté 3' du 27mère-As dues au TS
apparié
parallèlement.
Ce
dernier
est
alors
apparié
par, des
liaisons
Hoogsteen ;
- des pontages du TS -MDAP2+ sur la cible complémentaire
: deux
types de pontage correspondent à l'attachement d'un et de deux TS sur
le
27mère-As ;
- des réactions d'oxydation des guanines du côté 5'
: ces réac-
tions ne conduisent pas à des coupures importantes en milieu neutre, mais le
trai tement en
milieu basique met
clairement
en évidence des
coupures
au
niveau de ces guanines. Les produits d'oxydation du 27mère-As peuvent migrer-
en milieu neutre soit comme le 27mère intact ou être inclus dans les pro-
duits de pontage
- les produi ts de pontage trai tés en milieu basique donnent des
fragments plus courts que le 27mère,
du 27mère intact ou des produi ts de
27mère altérés mais migrant de la même façon.
Dans cette interprétation, les deux molécules de MDAp2+ sont cer-
tainement dans des environnements différents puisqu'ils sont liés à des TS
qui n'ont pas le même mode de liaison hydrogène avec la séquence AS.
Bien
que la séquence soit identique sur cinq bases de chaque côté de la séquence
AS.
la structure est dissymétrique et doit favoriser une interaction plus
forte de la molécule de MDAp2+ du côté 3'. La guanine étant meilleur donneur
d'électron que la thymine, les réactions de coupures du squelette phospho-
diester sont très prononcées au niveau de cette base des deux côtés de la
séquence AB,
168
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CONCLUSION GENERALE
170
Le MDAp2+ et le bis-DAp4+, molécules dérivées du
noyau pyrène, se
révèlent avoir des caractéristiques spectrales très intéressantes.
- Les spectres d'absorption dans le proche ultraviolet présentent
deux bandes bien séparées très résolues en bandes vibroniques pour le MDAp2+
et pour le -bis-DAp4+. Les résultats de polarisation de fluorescence montrent
que ces deux transi tions contenues dans le plan du noyau diazapyrène sont
perpendiculaires l'une à l'autre.
- Les spectres d'émission de fluorescence sont aussi très résolus
et sont l'image miroir du
spectre
d'excitation
et
d'absorption dans
la
première transition. Ils sont légèrement déplacés vers les grandes longueurs
d'onde pour le bis-DAp4+.
- Le rendement quantique de fluorescence du MDAP2+ dans les solu-
tions
aqueuses
est
très
élevé
(0,81),
beaucoup
plus
élevé
que
celui
du
dimère bis-DAp4+.
Le fluorescence de ces deux molécules est totalement étetnte par
les ions bromures et iodures par effet d'atome lourd.
Elle est
également
éteinte par les bases nucléiques.
Cette inhibi tion de la fluorescence des
deux composés, plus efficace en présence de bases puriques que
de
bases
171
pyrimidiques,
peut être attribuée à une interaction d'empilement du noyau
diazapyrène avec celui des bases, empilement plus favorable dans le cas des
bases
puriques
que
pyrimidiques,
en
plus
de
l' inhibi tion
collisionnelle
limitée par la diffusion.
Ces nouvelles molécules interagissent avec les
acides nucléiques
en simple et double brin. Ces interactions modifient profondément les pro-
priétés spectroscopiques des deux composés.
-
Le déplacement des spectres d'absorption vers les grandes lon-
gueur,s d'onde s'accompagne d'un hypochromïsme important sur les deux pre-
mières bandes d'absorption.
- L'émission de fluorescence est totalement inhibée par les acides
nucléiques en simple ou en double brin. Cette inhibition est d'autant plus
forte que le polynucléotide est plus riche en paires de bases G-C, mais les
paires de bases A-T éteignent aussi cette fluorescence.
Les colorants qui s'intercalent dans la double hélice des acides
nucléiques
ont
la propr iété
de
dérouler
l'ADN
surenroulé.
Les
résultats
électrophorétiques
démontrent
que
le
MDAp2+
se
comporte
aussi
comme
un
intercalant car il déroule l'ADN surenroulé.
De plus les résultats du di-
chroïsme linéaire montrent que le plan du noyau diazapyrène fait un
angle
moyen de 80° avec l'axe de la double hélice des acides nucléiques. La fixa-
tion du MDAP2+ sur le poly(dA)-poly(dT) est coopérative tandis qu'elle est
anticoopérative avec les autres polynucléotides en double brin. Cette dif-
férence de comp'ortement est aussi une propri.0té des molécules qui s' inter-
calent
dans
la
double
hélice.
L'ensemble
de
ces
résultats
constitue
un
faisceau d'arguments en faveur d'une interaction par intercalation du noyau
diazapyrène avec les acides nucléiques.
Lorsque les acides nucléiques sont irradiés (À > 300 nm) en pré-
sence de ces deux composés, on observe à la fois une coupure du squelette
phosphodiester et une oxydation des bases nucléiques. La guanine est de loin
la base la plus touchée.
Un
des
mécanismes
possibles
de l'oxydation
des
bases par le MDAp2+ et le bis-DAP~+ est le transfert d'un électron des bases
vers le noyau diazapyrène pour générer un radical cation MDAP+'~ Ce radical
cation peut réagir soit directement sur les bases, soit avec l'oxygène molé-
172
culaire
pour
générer
l'anion
superoxyde
°2-°.
L'évolution
de
cet
anion
superoxyde conduit à la production dans le milieu du radical hydroxyle OHo.
Ce
radical
en
arrachant
un atome
d'hydrogène sur le carbone C'2 du sucre
conduit à une coupure du squelette phosphodiester des acides nucléiques.
Ces molécules sont donc des agents de coupure puissants des acides
nucléiques.
Couplé
de
fa90n
covalente
sur
un
oligonucléotide
l'ensemble
(oligonucléotide-MDAp2+)
se comporte comme
une "endonucléase artif ic ielle"
sur un acide nucléique cible complémentaire de l 'oligonucléotide.
Nous avons montré
que dans
le
système
utilisé pour
suivre les
prop ri étés
photochimi ques
de ces molécules
(27mère-As/Ts -MDAp2+).
l' oligo-
thymidylate couplé
au MDAp2+ semble toujours favoriser la formation d'une
triple hélice avec l 'oligonucléotide comportant 27 nucléotides et contenant
une séquence de 8 adénines contigües.
Une dégradation de l'acide nucléique
cible est alors observée de chaque côté de la séquence AS protégée de même
que
la
formation
de
pontages
correspondant
à
la fixation
covalente
d'un
octathymidylate puis de deux sur le 27 mère-As. Ce comportement est vraisem-
blablement dû à une très grande énergie d'empilement du noyau diazapyrène
avec les bases de chaque côté de la mini-double hélice favorisant ainsi la
formation de triple hélice.
Ces molécules qui dégradeqt les~a~ides nucléiques constituent donc
comme les porphyrines de nouvelle.:f~~u'~~~a~'~e'~c\\apablesde Pho'toinaCti ver les
virus par irra'diation avec uneli~4r.e de 'ro~~eur d'onde supérieure à 300
i
("-
I-! /in
\\
-'\\
nm.
De plus.
le MDAp2+ couplé ~ ~e\\ fâ9'orï~aiJ.~~};e à un oligonucléotide. se
comporte comme une endonucléase ~ur,,~j~,cJ.YéiqUecible. L'ensemble peut
donc ainsi consti tuer un nouvel \\0,Ut,il perm~.,.yt:'t.f(nt d'inhiber de fa90n sélec-
~'''''' 'e rnen 1Sv\\~",Y
ti ve l'express ion d'un gène
indés ir'1.b"-ré~éu de bloquer la réplication des
v iru s.