présentée à la
Faculté des Sciences et Techniques
œ
L'UNIVERSITE NATIONALE DE COTE D'fY..OIRE~_~~~.,.-_ .. ~
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"CONSEil AFR1CAH\\j ET l;.~.!\\LG:;\\~:: ,;.
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1FOUR L'ENSE!GNEJVH':NI SUtr.:;::~:
pour obtemr le grade de
" C. A. M. E. S. -
OU/-\\GADOUGOL
1: Arr"v'
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DOCTEUR ES SCIENCES NATURELI!JE:-~1r~;:tr"l~~'~lUJl' 1995" .....
11
---...~"--~~~$tm .;(l2 J5. '..
par
Séverin
AKE
UTILISATION DES VITRO-:N1ETHODES DANS
L'ETUDE DES RELATIONS ROTE - PATHOGENE
DU COUPLE Platanus acerifolia / Ceratocystis fimbriata
ESSAIS D'INDUCTION DE CARACTERES
DE RESISTANCE A LA MALADIE
DANS DES CULTURES DE CALS
soutenue le:
/lA VlCM' 1989
devant la commission d'examen:
Président:
B. TOURE
Professeur à l'Université Nationale de Côte
d'Ivoire
Examinateurs
H. DURANTON Membre de l'Académie des Sciences, Professeur à
l'Université L. Pasteur de Strasbourg
G. ANOMA
Professeur à l'Université Nationale de Côte
d'Ivoire
L. GRILLET
Maître de conférences à l'Université de Provence
Aix - Marseille l
P. ABO ANNO
Maître de conférences à l'Université Nationale de
Côte d'Ivoire
A Michaël,
Si tu reçois ( Ses) paroles, et si tu concerves
Avec soins auprès de toi ( Ses) commandements. de manière
A prêter attention a la Sagesse avec ton oreille,
Pour incliner ton coeur vers le Discernement,
Si d'autre part ,
Tu appelles l'Intélligence , et si vers le Discernement
Tu fais retentir ta voix, si tu continues à chercher celà
Comme de l'argent, et si tu recherches sans relâche
Comme des trésors cachés, alors tu comprendras
La crainte de YHWH , et tu trouveras
La Connaissance du ( Très Haut) .
PROV;2:1-6 (La BIBLE, T.M.N)
Séverin Aké
- 1988
UNIVERSITE NATIONALE DE COTE D'IVOIRE
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
Département de Botanique et de Biologie végétale
Laboratoire de Physiologie végétale
22 BP 582 Abidjan 22
UNIVERSITI;:
DE
PROVENCE
AIX-MARSEILLE l
FACULTE DES SCIENCES
St CHARLES
Laboratoire de Physiologie cellulaire végétale
3, place Victor Hugo
13331 Marseille Cedex 3
Le travail de recherche exposé dans ce mémoire a bénéficié du
financement du Conseil Régional Provence-Alpes-Côte-d' Azur.
AVANT PROPOS
Le
travail
présenté
dans
ce
mémoire
a
été
effectué
au
Laboratoire de Physiologie cellulaire Végétale de la Faculté des
Sciences St Charles de l'Université
d'Aix-Marseille l, dirigé
par le Professeur Claude LAMBERT.
Monsieur le Professeur LAMBERT a été mon Responsable,
durant
toute
ma
formation
sci"entifique
à
Marseille,
et
ce,
depuis l'initiation du travail de ce mémoire en 1982 dans l'ex-
Laboratoire
de
Biochimie
Fonctionnelle
des
Plantes
à
Mars eille- Luminy,
et qui
s'es t
pours ui vi
au Laboratoire
de
Physiologie Cellulaire Végétale.
Qu'il veuille trouver ici l'expression de mes remerciements,
pour toute cette formation scientifique que j'ai reçue auprès de
lui,
tant pour l'intérêt constant qu'il a porté aux différents
aspects de ce travail, que pour les conseils et suggestions qu'il
m' a prodigués.
Je
tiens
également
à
exprimer
au
Professeur
LAMBERT,
toute ma reconnaissance pour avoir favorisé mon recrutement
en tant qu'assistant-associé, à l'Université de Provence.
Que
Monsieur
le
Professeur
Bakary
TOURE,
Recteur
de
l'Université Nationale de Côte d'Ivoire, trouve l'expression de
ma
gratitude
pour
l' honneur
qu'il
me
fait
en
acceptant
d'assurer la présidence de ce jury de thèse.
Je
SUIS
reconnaissant
à
Monsieur
le
Professeur
Henri
DURANTON, d'avoir accepté de faire partie de ce jury, malgré
ses nombreuses et importantes res pons abilités.
Mes
remerciements
vont à Madame le Professeur Gladys
ANOMA,
Chef du Département de Botanique et de Biologie
végétale de la Faculté des Sciences
et Techniques (FAST) de
l'Université Nationale de Côte d'Ivoire,
ainsi qu'à
Monsieur le professeur Abo ANNO, responsable
du Laboratoire de Physiologie végétale de la FAST, pour avoir
accepté d'examiner et de juger ce travail.
Madame Lydia GRILLET, Maître de conférences à la Faculté
des
Sciences
St
Charles,
a
été
responsable-adjoint
du
Laboratoire
quand
Monsieur
le
Professeur
LAMBERT
fut
momentanément appelé à d'autres fonctions à l'Académie de .
Limoges.
A
ce
titre,
elle
s'est
efforcée
d'assumer
les
responsabilités
d'encadrement et
a
facilité
mon introduction
auprès
de
Monsieur
Hervé
DARBON.
Qu'elle
trouve
ici
l'expression
de
tous
mes
remerciements
pour
cette
collaboration, sans omettre sa gentillesse. Merci Lydia!
Une partie du travail de ce mémoire a été réalisée sous la
direction technique
de
Monsieur Hervé DARBON,
Maître de
recherche au Laboratoire de Biochimie de l'INSERM, au Centre
Hospitalier Régional Nord de Marseille.
J'ai bénéficié de sa
grande expérience des techniques de séparations et d'analyses
en rapport avec des toxines protéiques. Monsieur DARBON m'a
prodigué
des
conseils
et
s ugges tions.
Qu'il
trouve
aus si
l'expression de tous mes remerciements, pour- cette fructueuse
collaboration.
Monsieur
Francis
SAUVAN
a
collaboré
à
la
réalisation
technique des tests de pathogénicité in vivo
des préparations
microscopiques,
pour la préparation de l'iconographie de ce
mémoire. Je ne saurai oublier les services rendus lors de mon
départ du Laboratoire. Merci Francis!
J' ai
bénéficié
de
la
collaboration
amicale
de
tous
les
collègues du Laboratoire, les s ugges tions des uns et des autres
ont été utiles et très appréciées.
Monsieur Jacques RABIER,
bien amicalement,
en souvenir
de toutes ces années de collaboration,
Mademoiselle Ghyslène PARA, avec encore les souvenirs de
sa marque d'amitié,
Monsieur
N' goran
AHOUSSOU,
que
je
remercie
très
amicalement pour les
liens
étroits
et les
nombreux
services
qu'il m'a
spontanément rendus.
Je ne saurai passer sous silence, ces liens
sympathiques de
travail que j'ai eus
avec :Mlles
Oriane PAFADNAM,
Gisèle
LAWSON-ANOKO,
Christine
DEZAN,
Messieurs
Brahim
LOTMANI et Mohamed Badr EL SABROUT, Merci à tous!
Tous mes remerciements vont également à Monsieur SALIOU
pour sa
note critique, ainsi qu'à Monsieur Alain SEGUIN pour
avoir accepté de relire avec dévouement, ce manuscrit.
Je ne s aurai oublier Mons ieur Louis ROURE pour s on aide
technique et sa sympathie.
Madame
Sylviane
CESSIA
au
sécrétariat
de
l'UFR
de
Sciences Naturelles a été d'une extrême gentilles se et a joué un
rôle
très
positif
pour
le
renouvellement
de
mon
poste
d'assistant-Associé. Qu'elle trouve ici l'expression de toute ma
reconnais sance.
Je remercie tous les autres collègues que j'ai eu la joie de
rencontrer au Laboratoire, pour leur l,soutien
réconfortant.
Le travail de mise en page et d'impression de ce mémoire a
été réalisé en aimable collaboration avec Monsieur Dominique
BONAVITA au Laboratoire de Population et Environnement de
l' ORSTOM,
à
la
Faculté
des
Sciences
St
Charles.
Je
lui
exprime ma reconnaissance,
,
tout comme aux
équipes des Laboratoires de Génétique et
d'Electronique de la FAST, qui ont permis la réalisation d'une
partie de la mise en page de ce mémoire.
Enfin, j'aimerais remercier tous les collègues du Laboratoire.
de Physiologie Végétale de la FAST, pour m'avoir accueilli.
. ) •. T
SIGLES
ANA:
acide naphtalène acétique
ADN:
acide désoxyribonucléique
AUB-BO:
isolat Aubagne Bras-Or
Ap:
appréssorium
6-BAP:
6-benzylaminopurine
ba:
bourrelets annulaires
C:
cellule de cal
CC:
cordon cytoplasmique
CI:
cultures indéfinies
CF:
chlorose foliaire
Ch:
développement de chancre
cm:
centimètre
cms:
cytoplasme mâle stérile
Con A:
concanavaline A
CP:
cals primaires
CU:
cérato-ulmine
2,4 D:
acide dichloro 2,4 -phénoxyacétique
oC:
degré Celcius
EN:
enveloppe nucléaire
EXT,INT:
extérieur, intérieur de la cellule
ex:
exemple
FB:
fimbriatane
g/1:
gramme par litre
h:
heure
l:
point d'inoculation
IC:
amas cellulaires en croissance active
If:
inclusion fibrillaire
ro
J C1~"" "" '"crc:a.... .
K:
kinétine
.
~v
lGtv.., "'. t..t...
M 862:
isolat Michelet 862
MA:
matrice amorphe
MG:
milieu gélosé
ML:
milieu liquide
MP:
plasmalemme
M:
mitochondries
My:
mycélium,
MW:
Morel et Wethmore
mg:
milligramme
min:
minute
mm:
millimètre
MEB:
microscopie électronique à balayage
MET:
microscopie électronique à transmission
MS:
Murashige et Skoog
N:
noyau
nm:
nanomètre
nmole:
nanomole
Nu:
nucléole
/j:
par jour
P 427, P 416: isolat Prado 427 et 416
§:
paragraphe
PDA:
potatoe dextrose agar
Pi:
paroi intermédiaire
PL:
plaste
pl:
proliférations par les.Jenticelles
pm:
proliférations médullaires
pmole:
picomole
PM:
poids moléculaire
%:
pourcentage
Pp:
paroi
Ps:
peroxysomes
q.s.p.f:
quantité suffisante pour faire
R:
racines
Re:
réaction callogène de cicatrisation
RE:
réticulum endoplasmique
RP-HPLC:
rever.se phase - .high perfonnance liquid chromatography
"::'fJ~
1.vto.~.... 110- "'" ""'"
Sa:
substance amorphe
SH:
Schenk-Hildebrant
SORG:
isolat de Sorgue
s:
secondes
Sa:
substance amorphe
tn:
tissus en nécrose
UDO:
unité de densité optique
j.tM:
micromolaire
j.tl:
microlitre
VAC:
vacuome
Vac:
vacuoles
Vés;
vésicules
VIG:
isolat Vigouroux.
v / v:
volume / volume
vol:
volume
SOMMAIRE
INTRODUCTION:
1
LE PLATANE
ET LA PATHOLOGIE DU CHANCRE COLORE.
""",C~H~A~P-""I-""T-=-R=E=------,,-I :
HISTORIQUE
5
5
A / Mécanismes de la pathogénèse
végétale.
A 1 - Définitions
5
A 2 - Etapes initiales
6
6
6
6
- Pénétration directe
7
8
A 3 - Mécanismes d'attaque.
A 3 _ 1 - Les enzymes
8
A 3 _ 2 - Les régulateurs de croissance
8
A 3 _ 3 - Les toxines
8
A 4 - Réponses de hôte dans la pathogénèse
9
A 4 _ 1 - Réponses structurales
9
A 4 _ 2 - Réponses physiologiques
10
-Changements dans la perméabilité cellulaire.
10
- Perturbation des relations hydriques
10
au niveau du végéta1.
. Interférence au niveau du transport.
10
hydrique.
A 5 - Implication des toxines dans les relations
12
hôte- pathogène.
A 5 - 1 - Définitions
12
A 5 _ 2 - Classification
14
A 5 _ 3 - Essais biologiques
15
A 5 _ 4 - Rôle des toxines dans le processus de
15
la pathogénèse.
- Processus d'infection
15
- Modifications ultrastructurales
22
- Modifications physiologiques
22
B /
La culture in vitro
de matériel végétal
25
en relation avec les recherches phytopathologiques.
B 1 - Culture in vitro
de végétaux ligneux: historique.
25
B 2 - Culture de tissus et
Phytopathologie
27
B 2 _ 1- Cultures associées hôte - pathogène
27
B 2 _ 2 - La sélection in vitro
27
- Origine des variations somac1onales
28
- Exploitation des variations somaclonales
29
en phytopathologie.
B 2 _ 3 -Expression et évaluation de la résistance in vitro
31
CHAPITRE
II:
MATERIEL ET METHODES
33
A /
Matériels biologiques.
33
A 1 -
Matériel végétal
33
A 2 - Matériel fongique
33
B /
Cultures et méthodes.
35
B 1 - Isolement et culture du champignon
35
B 1 _ 1 - Culture sur milieu semi-solide
35
B 1 _ 2 - Culture en milieu PDA liquide agité
35
B 2 - Isolement et culture de tissus in vitro
37
de platane
B 2 _1 - Culture de tissus de cals
37
- Initiation
37
- Cultures indéfinies
37
B 2_2 - Cultures de suspensions cellulaires de platane.
37
B 3 - Microbouturage et micropropagation
à partir de bourgeons axillaires.
42
C / Techniques
42
C 1 -Techniques
culturales
42
C 1-1 - Stérilisations
42
- Champignon
42
- Matériel végétal (platane)
42
Cultures de tissus initiales
43
Microboutures initiales
43
CI -2 - Milieux de culture
43
- Champignon
43
- Cultures végétales
45
Milieu de base
45
Facteurs de croissance
45
C 1 _ 3 -Réalisation d'un filtrat de culture stérile
46
du champignon.
C 1 _ 4 -Techniques d'inoculation
46
- ln vivo
46
- Inoculation par le champignon.
46
- Inoculation par du filtrat
47
de culture du champignon.
- ln vitro
47
- Inoculation par le champignon
47
- Inoculation par le filtrat de culture
48
CI-5 - Technique de sélection et expression
d'une résistance in vitro àC fimbriata
48
- Réalisation d'une pression sélective
48
- Evaluation d'une résistance au champignon.
49
C 2 /Techniques liées aux Observations microscopiques
50
C 2-1 - Microscopie photonique
50
C 2-2 - Microscopie électronique à balayage (MEB)
50
C 2-3 - Microscopie électronique à transmission (MET)
50
C 3 / Techniques de purifications
51
C 3 -1
- Filtration sur gel
51
C 3-2 -"Revers~ phase" H P L C (Chromatographie
liquide à haute performance en phase inverse).
51
C 3-3 - Analyse de la composition en amino-acides
52
C 3-4 - Chromatographie d'affinité sur Con-A ultrogel 4B
52
C 3-5 - Test biologique d'activité
sur les cultures de tissus de cals
53
C4 /
Méthodes de mesures et
d'évaluation des résultats
53
C 4 -1 - Mesure de la croissance des tissus et des cellules
53
- Tissus de cals
53
- Suspensions
54
C 4 -2 - Expression de la résistance des cultures de tissus de
cals, au champignon
54
C 4- 3 - Test biologique de l'activité toxique des substances
issues du filtrat de culture de Ceratocystis fimbriata
55
CHAPITRE
III: Etablissement de
cultures
de cals
et de cellules de Platanus
acerifolia.
57
AI INTRODUCTION
57
BI RESULTATS
61
- Cultures de tissus de cals
61
- Formation de cals, cultures initiales
61
- Cultures indéfinies de tissus de cals de platane
63
- Rapport auxine cytokinine.
63
- Suspensions cellulaires de platane
67
CI DISCUSSION
69
- Culture de tissus de cals
69
- Suspensions cellulaires de platane
70
CHAPITRE IV: Etude des conditions de micropropagation
à partir de méristèmes axillaires
73
AI INTRODUCTION
73
BI RESULTATS
75
- En milieu de base sans honnone de croissance
75
- Réaction des explants sous l'action des cytokinines.
75
- Régénération complète de vitroplants.
79
CI DISCUSSION
79
CHAPITRE
V
Etude des relations hôte-pathogène
sur des boutures de platane.
83
NThITRODUCTION
83
BI RESULTATS
83
- Evolution des symptômes de dépérissement de
boutures de platane in vivo
83
- Réaction des tissus hôtes inoculés par le champignon
ou par le filtrat stérile de son milieu de croissance
92
- Développement d'un chancre
93
CI DISCUSSION
94
CHAPITRE
VI: Etude des relations hôte-pathogène in vitro
sur les cultures de tissus de cals de platane.
99
AI
INTRODUCTION
99
BI
RESULTATS
107
- Observations pathologiques de tissus de cals infectés.
107
- Modifications ultra-structurales.
107
CI
DISCUSSION
117
CHAPITRE VII : Effet de pression sélective du filtrat de
culture du champignon sur les cultures de cals.
expression de la résistance au pathogène.
123
A / INTRODUCTION
123
B/RESULTATS
124
- Effet du filtrat de culture de Ceratocystis fimbriata
124
- Induction et sélection de lignées cellulaires
124
- Expression de la résistance de lignées cellulaires
sélectionnées en présence du filtrat toxique
125
CI DISCUSSION
140
CHAPITRE VIII:
Recherche et purification à partir du
filtrat de culture de Ceratocystis fimbriata
d'une toxine (fimbriatane) impliquée
dans la pathogénèse.
145
A 1 INTRODUCTION
145
BI
RESULTATS
146
- Purification et recherche de fractions à activité toxique.
146
- Détennination de la composition en amino-acides.
147
CI
DISCUSSION
158
CONCLUSIONS GENERALES
161
PERSPECTIVES
168
INDEX BIBLIOGRAPHIQUE.
173-
194
INTRODUCTION
LE PLATANE ET
LA PATHOLOGIE DU CHANCRE COLORE
Le genre Platanus
comprendrait 7 à 10 espèces, dont le platane
(Platanus acerifolia ), très grand arbre pouvant atteindre 30 à 40 mètres de
haut et 1 mètre de diamètre. C'est un hybride interspécifique apparu
spontanément vers les années 1670 en Angleterre [Oxford Botanic Garden,
(HENRY et FLOOD,1919) par croisement entre les deux importantes
espèces Platanus occidentalis (qui croit à l'état spontané dans le sud-est
de l'Amérique du Nord) et Platanus orientalis, originaire du bassin
oriental de la méditerranée.
A cause de ces caractéristiques hybrides de grande vigueur et de
rapidité de croissance, il s'est par la suite imposé par rapport aux deux
espèces parentales, en tant qu'arbre d'alignement. Sous cet aspect, il
représente le principal arbre des agglomérations méridionales (près de 95
% des zones d'ombrage des cités). Hormis la production de bois (ROL et
VENET,1951), les platanes ont une grande valeur ornementale, et
présentent une grande résistance aux pollutions urbaines.
En même temps qu'il subit l'influence de phénomènes abiotiques
générés par les conditions même du milieu physique dans lequel l'arbre se
développe, qui peuvent conduire à des affections de type chlorose
calcaire, diffusion de produits nocifs dans le sol etc ... ,le platane est aussi
menacé par des affections d'ordre parasitaire:
le tigre
(feuilles qui
#
ternissent),
l'oïdium, l'anthracnose, les atteintes de champignons
lignivores (le bois des branches et des charpentières). Ces affections ne
Introduction
sont préjudiciables que chez les arbres aux possibilités de résistance
diminuée s.
Une àutre affection parasitaire se présente d'une toute autre façon', par
rapport aux précédentes. Elle atteint le bois des troncs et des branches et
fait partie des affections chancreuses des arbres. Nous décrirons quelques
traits particuliers de ces types d'affections chancreuses, en raison de
l'incidence considérable qu'elles ont sur les peuplements arboricoles.
Les chancres peuvent être définis comme des zones localisées de
nécrose, apparaissant finalement au niveau de l'écorce de rameaux ou de
branches (ZABEL, 1964). Les maladies chancreuses sont variées et
comportent les trois types suivants:
- les chancres diffus dans lesquels le pathogène se multiplie rapidement
à travers l'écorce, en tuant l'hôte par envahissement total.
- les chancres perpétuels dans lesquels finissent par s'établir un
équilibre entre le pathogène et l'hôte: les tâches chancreuses se
développent lentement, coïncidant avec les rythmes de croissance de
l'arbre.
- les maladies chancreuses dites annuelles, dans lesquelles des
parasites facultatifs de l'hôte deviennent temporairement pathogènes
durant des périodes caractérisées par des stress inhabituels
causés par
l'environnement. Une description exhaustive de telles pathologies a été
faite par BOYCE (1961).
Nous retiendrons que l'impact des maladies chancreuses est très
variable. Il peut aller depuis celui qui provoque de petites altérations
presque inoffensives, au niveau de l'écorce externe (ex: La maladie
chancreuse
de
Pinus
strobus, dûe à
Calisiopsis ) jusqu'à un
envahissement total des branches et des rameaux avec la mort plus ou
moins rapide de l'hôte - la maladie chancreuse à Endothélia, qui cause une
extinction brusque de nombreuses espèces forestières, - la maladie du
chancre coloré du platane).
La pathologie du chancre coloré du platane se caractérise par un
dépérissement total de 'l'arbre, à court terme (2 à 3 ans). L'agent
2
Séverin
AKE
responsable est un champignon
de la famille des Ascomycètes,
Ceratocystis fimbriata E. et H. f platani (WALTER,1946). Etant donné
l'influence que l'activité humàine semble avoir dans la dissémination et la
progression de la maladie, des luttes directes prophylaxiques ont été
mises en oeuvre (Anonyme, 1985).
D'autre part, FERRARI et PICHENOT (1974), TAWIL et al. (1982),
TAWIL (1984), ont tenté, à titre curatif et préventif, une lutte directe par
action de fongicides systémiques. Aucun de ces traitements n'a permis
d'obtenir des résultats durables.
Actuellement, les recherches s'orientent vers la sélection génétique
pour une résistance à cette grave affection, soit par mutagenèse avec
irradiation de semences (VIGOUROUX, 1986), soit par la voie de
méthodes de culture in vitro: c'est vers ce type de recherche que nous
nous sommes orientés.
Notre objectif est d'induire dans des cultures de platane in vitro, une
résistance au niveau cellulaire, à Ceratocystis fimbriata, qui puisse
ensuite s'exprimer chez des régénérats de telles cultures.Ceci néccessitait
l'obtention de cultures
in vitro
de platane,
ainsi qu'une bonne
connaissance des relations hôte-parasite (antérieurement, aucun travail de
ce type n'a été réalisé sur ce couple).
Le travail présenté dans ce mémoire est une contribution à l'étude des
relations hôte-parasite, par la culture in vitro.
Dans les chapitres III et IV, nous étudions les caractéristiques et les
modalités d'obtention de matériels biologiques sous forme de cultures de
tissus de cals, de suspensions cellulaires, et de microplants régénérés à
partir de bourgeons axillaires mis en culture.
Les chapitres suivants (V à VIII) présentent les résultats qui
concernent plus particulièrement les relations hôte-parasite. Le système de
culture de tissus de cals de platane est utilisé comme matérièl végétal dans
ces expériences. Cependant, au chapitre V, nous avons d'abord cherché
au préalable, in vivo
en serre,
sur de jeunes boutures de platane
Introduction
3
inoculées, l'expression des
symptômes visibles dans la pathogenèse.
Comparativement, une étude des interactions P. acerifolia -Cfimbriata,
est faite par la réalisation de cultures associées: c'est l'objet du chapitre
VI.
Ces résultats nous ont permis d'envisager l'intervention des toxines
dans l'expression de la maladie. Les chapitres VII et VIII traitent
respectivement de la possibilité d'exercer une pression de milieu de
culture (en utilisant du filtrat de culture du champignon) sur les cals de
platane, conduisant à l'appariton d'une résistance au champignon, ainsi
que de la mise en évidence et la purification d'une protéine excrétée par le
champignon, qui présente une toxicité pour les cellules de platane.
4
Séverin
AKE
CHAPITRE 1:
HISTORIQUE
A / -MECANISMES DE LA PATHOGENESE
VEGETALE.
A 1 -Définitions
La pathogenèse
végétale
est
définie
comme
la
séquence
d'événements qui surviennent durant le développement de la maladie. Elle
peut être aussi vue comme une lutte entre une plante et un pathogène, dont
la modification d'un seul facteur (ex: la température) peut décider de la
finalité de cette lutte (DALY, 1972).
- Pathogène et parasite.
Le terme de pathogène est généralement clairement appliqué à des
agents biotiques classiques (champignons, bactéries, virus) qui causent la
plupart des maladies des plantes.
Le terme de parasite est utilisé pour un organisme ou un virus qui
existe en intime association avec un autre organisme vivant duquel il dévie
une partie de nutriments dont il a besoin pour vivre (THROWER, 1966).
- Pathogénicité et réaction à la maladie.
La pathogénicité se réfère à la capacité d'un pathogène, à induire une
maladie ou à faire partie du processus de cause. La virulence est un
terme quantitatif qui dénote, pour un organisme, une grande capacité à
induire une maladie.
Les réactions des plantes au pathogènes peuvent être décrites à des
degrés variés allant de la résistance complète à un développement maximal
des symptômes de la maladie.
Les réactions dites hypersensibles sont celles dans lesquelles un
Historique
5
nombre limité de cellules hôtes sont tuées rapidement, et le pathogène se
trouve contenu dans une lésion nécrotique localisée.
L'hypersensibilité peut être vue comme une réactivité cellulaire
extrême qui peut conférer un haut degré de résistance à la maladie, à la
plante entière. Elle reflète une impossibilité de la plante et du pathogène à
coexister; ces réactions sont alors qualifiées d'incompatibles.
Au contraire, les réactions dans lesquelles le pathogène se multiplie à
l'intérieur de la plante, sans entraîner une mort rapide des cellules hôtes,
sont définies comme compatibles.
Le concept de tolérance, comme étant
un type de résistance à une
maladie, a été discuté par SCHAFERT (1971).
A2- Etapes initiales dans la pathogénèse.
A2_! - Le contact
La pathogenèse causée par les agents infectieux commence quand le
pathogène entre en contact avec une région infectible du végétal.
Dans le cadre de la pathogenèse du chancre coloré du platane, il semble
que les blessures occasionnées au niveau des axes caulinaires ou
racinaires sont essentiellement les voies de contact et de pénétration
(VIGOUROUX,1985; FERRARI et PICHENOT,1974; TAWIL et al.
1982).Toutefois, beaucoup de champignons pathogènes établissent un
contact de manière fortuite. Des vecteurs divers (HICKMAN et HO,1966;
WEBSTER,1969) sont aussi impliqués dans la réalisation de ce contact:
insectes, nématodes, exudats de racine.
A2-2 - La pénétration
- A travers les blessures et les
ouvertures naturelles.
Beaucoup de champignons pathogènes pénètrent les plantes hôtes à
travers les blessures ou les ouvertures naturelles tel que les stomates, les
6
Séverin
AKE
hydathodes, les lenticelles, etc ... En fonction du mode de pénétration,
deux types généraux de pathogènes peuvent être reconnus:
a) Les pathogènes de blessure (wound pathogens). Comme le terme
<
l'indique, ceux-ci entrent par les blessures et se développent seulement
dans les tissus morts ou en voie de nécrose.
b) La deuxième
catégorie regroupe la plupart
des champignons
responsables des rouilles. Ceux-ci entreraient généralement par les
stomates, puis se
développeraient entre les cellules, en produisant des
structures de
pénétration spécialisées, les haustoria.
- Pénétration directe
Une fois le contact établi, la pénétration par le pathogène, nécessite les
étapes suivantes. La spore ou la propagule (ou le plus souvent une
structure spécialisée appelée "appressorium"), produite par le tube
germinatif, devient très adhérente à la surface de la plante.
Alors une pointe de pénétration se forme, laquelle passe à travers la
cuticule (si elle est présente), ensuite à travers la paroi cellulaire et enfin
dans le protoplasme. Cette pointe de pénétration exerce t-elle une pression
mécanique à travers la cuticule ou bien le passage du tube de pénétration
est-il facilité
par la dégradation enzymatique de ces barrières? Dans
quelle mesure ces barrières de pénétration confèrent-elles une résistance
au pathogène?
Quelque soit le cas, il semble qu'une activité enzymatique localisée ou
diffuse, apparait jouer un rôle primaire alors que la force mécanique; si
elle est en cause, jouerait un rôle secondaire (WHEELER, 1975).
L'évidence que les barrières de pénétration jouent un rôle dans la
résistance à la maladie, est limitée à quelques cas particuliers.
En général, les pathogènes pénètrent dans les plantes résistantes ou
sensibles, soit de manière comparable, soit faiblement retardée dans les
tissus de plantes résistantes. Le
blocage complet de la pénétration des
tissus, même très résistants, est probablement râre (WHEELER, 1975).
Historique
7
A 3 - Mécanismes d'attaque.
Les champignons pathogènes de~ végétaux possèdent des "annes"
chimiques qui sont des enzymes, des régulateurs de croissance, des
toxines. Leur séparation en trois classes est quelque peu arbitraire,
car
certains enzymes et certains régulateurs de croissance produisent des
effets toxiques, et certaines toxines possèderaient des propriétés de
régulateurs de croissance.
A3-1 - Les enzymes
Les enzymes de champigons pathogènes de végétaux, dégradent des
structures aussi complexes que les parois cellulaires. Leurs actions
peuvent être séquentielles ou concomittantes. Les enzymes de type lyases
et hydrolases pectiques, initient la dégradation de la paroi en brisant sa
rigidité (WHEELER, 1975), ensuite les constituants ainsi exposés
subissent l'attaque séquentielle d'autres enzymes (hémi-cellulases,
protéases, cellulases) provenant soit de la plante soit du pathogène.
HALL et WOOD (1973) pensent que la mort cellulaire causée par les
enzymes pectiques, pourrait être due à un effet osmotique, lequel
résulterait de la rupture du plasmalemme.
A3-2 - Les régulateurs de croissance.
La plupart des types majeurs de régulateurs de croissance chez les
végétaux
(auxines,
gibbéréllines,
cytokinines,
éthylène,
acide
abscissique) sont également produits par des bactéries et des champignons
variés. Ces faits indiquent que les régulateurs de croissance jouent un
rôle dans plusieurs maladies. Toutefois l'évidence de leur intervention
dans les premières étapes de l'attaque, serait très limitée.
A3-3 - Les toxines
Les toxines en tant que produits impliqués dans certaines interactions
hôte-pathogène, seront abordées au paragraphe AS'
8
Sp.verin
AKE
A 4 - Réponses de l'hôte dans la pathogenèse.
A4 -1 - Réponses structurales
Certaines modifications survenant dans la pathogénèse sont associées
aux parois des cellules de la plante-hôte. Des structures complexes à
inclusions membraneuses, localisées aux aires immédiatement au-dessous,
ou adjacentes à la pointe de pénétration de l'hyphe mycélien, ont été
appelées du terme de"papilles" (AIST,1976).
Ces structures constituent la réponse morphologique la plus visible.
Le fait que ces structures soient très réduites ou même absentes dans
les interactions résistantes, suggèrent que celles-ci fonctionneraient dans
le maintient d'une relation compatible durant les premiers stades
d'infection des tissus sensibles.
D'autres modifications concernent la paroi elle-même. En effet, des
lésions grandes ou petites, en forme de pustules, se forment au-dessous
de la surface intérieure de la paroi. Ces lésions ont été décrites sous les
termes de"pustules", "formations lirnitantes" (LUKE et al., 1966).Elles
sont constituées par une matrice transparente aux électrons, dans laquelle
se trouvent enchassés des
matériels amorphes ou membranaires.
BRACKER et LITTLEFIELD (1973) ont donné le terme "appositions" à
ces structures.
Les appositions, contrairement aux papilles, ne sont pas limitées aux
aires de pénétration, et leur formation ne dépend pas de forces mécaniques
puisqu'elles ont été décrites également dans les tissus traités avec des
pathotoxines.
Au niveau des membranes et des organites cellulaires, des changements
pathologiques ont été décrits. Il y aurait une activité sécrétoire (complèxe
golgien) accrue qui se traduirait par la formation de nombreuses
vésicules.
Une discontinuité du plasmalemme serait observée durant les premiers
stades de la pathogenèse. WEBSTER (1969), ainsi que BRACKER et
LITTLEFIELD (1973) ont rapporté une augmentation importante des
Historique
9
ribosomes. D'autres organites cellulaires subiraient des modifications,
mais les significations de ces changements sont bien souvent inconnues
ou demeurent sujettes à de nombeuses interprétations selon les auteurs.
A4-2 - Réponses physiologiques.
- Changements dans la perméablité
cellulaire.
WHEELER et LUKE (1963) ont suggéré que des changements dans la
perméabilité cellulaire
pourraient constituer l'évènement initial dans la
pathogenèse. Toutefois les mécanismes d'action n'ont pas été clairement
élucidés.
- Perturbation des relations hydriques
au niveau du végétal.
Même dans les pathologies non classées comme maladies de
dépérissement, les tissus atteints présentent souvent dans la dernière
phase, un dés sèchement rapide
et important qui devient létal.
Néanmoins, comme la plupart des travaux sur l'étude des modifications
hydriques ont été effectués sur des cas pathologiques dans lesquels le
dépérissement a été le symptôme majeur, nous aborderons, avec un peu
plus de détails cet aspect, (eu égard aussi à la pathologie de dépérissement
du platane).
Au moins trois causes majeures de dépérissement pathologique peuvent
être
distinguées,
qui
incluent
l'incapacité
d'absorption
d'eau,
l'interférence au niveau du transport de l'eau et une perturbation du
fonctionnement des stomates.
Interférence au niveau
du transport hydrique.
Les champignons et les bactéries, qui causent les dépérissements
vasculaires, envahissent et s'établissent dans les vaisseaux conducteurs
10
Séverin
A.KE
du végétal. En général les champignons pathogènes demeurent confinés
dans les vaisseaux du bois
tant que la plante est moribonde, tandis que
les cellules bactériennes s'en échappent pour former des cavités ou poches
dans les tissus adjacents. Ensuite, les cellules bactériennes ou les
conidies ou les spores de champignons, sont entraînées par le flux
hydrique lié à la transpiration, dans les pétioles et les feuilles au niveau
du végétal entier, en développant des infections.
Un tel transport justifierait la rapide propagation du pathogène et le
développement d'infections systémiques même chez de grands arbres
(DIMOND,1970).
Il existe des cas où le végétal prévient la migration du pathogène en
développant rapidement une réponse d'hôte par formation de gels. Une
telle réaction est associée à la résistance (exemple: la résistance chez le
genre Musa, à la maladie de dépérissement due au Fusarium (BECKMAN,
1964).
En ce qui concerne le mécanisme responsable des symptômes des
maladies de dépérissement vasculaire, différentes approches s'opposent
encore, et font l'objet de vigoureux débats. Deux mécanismes généraux
ont été proposés:
-incapacité du système vasculaire de la plante à assurer de manière
adéquate un approvisionnement en eau du végétal et,
-perturbation de la perméabilité des cellules foliaires. Ce deuxième
aspect sera abordé plus en détail, au paragraphe AS (Implication
des
toxines ... ).
Certains
auteurs
qui
sont
en
faveur
de
l'hypothèse
sur
un
disfonctionnement vasculaire, comme étant la cause majeure de
dépérissement, citent en exemple l'évidence que la résistance au flux
hydrique est fortement accrue chez les plantes malades.
Dans des
segments de tige infectés par de nombreux pathogènes, la résistance au
flux hydrique est généralement accrue de 4 à 60 fois. Cependant chez des
plantes de tomates infectées par Fusarium, ce niveau du flux peut être
réduit à celui des plantes saines, (DIMOND, 1970; DUNIWA Y, 1973).
Historique
Il
Deux types de facteurs sont mentionnés comme impliqués dans
l'accroissement de la résistance au flux hydrique dans les maladies de
dépérissement chez les 'végétaux:
-la biomasse du pathogène ou ensemble avec des structures de
réactions induites tels les tyloses et les gels vasculaires (DIMOND,
1970), peut causer une occlusion partielle ou complète de gros vaisseaux
de la tige.Toutefois, comme la résistance de la tige est faible, ces facteurs
réduiraient rarement le flux hydrique, suffisamment de manière à causer
le dépérissement du végétal.
-d'autres facteurs qui peuvent être impliqués sont les polysaccharides
extra-cellulaires de haut poids moléculaire, produits par le pathogène ou
clivés des parois des vaisseaux par des enzymes hydrolytiques (HUS AIN
et KELMAN, 1957).
Etudiant les mécanismes de dépérissement, STROBEL (1967) a
également abouti à la conclusion que les macromolécules extra-cellulaires
induiraient une perte hydrique en affectant les membranes cellulaires des
feuilles. Ces macromolécules pourraient aussi encrasser les ultrafiltres
des pores des vaisseaux, ce qui entraînerait une restriction de la diffusion
ou du transport latéral.
D'autre part, ces macromolécules peuvent obstruer aussi les petits
vaisseaux dans les pétioles et les feuilles. Bien que ce concept général
soit beaucoup admis, DUNIW A y
(1973) croit qu'à l'exception de
quelques pathologies de dépérissement (exemple: la fusariose de la
tomate), les résistances au flux hydrique rapportées dans l'ensemble des
cas de dépérissements vasculaires, ne sont pas suffisantes pour justifier le
dépérissement pathologique.
AS -1..nplication des toxines dans les relations
hôte-pathogène
AS -1-
Définitions
Le terme de toxine a été utilisé avec différentes significations en
pathologie végétale. Selon PRINGLE et SCHEFFER (1964), une toxine
12
Séverin
AKE
est considérée comme un produit d'un micro-organisme (autre qu'une
enzyme) qui cause de façon manifeste un effet néfaste aux tissus des
plantes, et qui est reconnue être impliquée dans le développement d'une
maladie.
Certains termes ont été utilisés en rapport avec les toxines (tab.1)
(WHEELER et LUKE, 1963). Ainsi, les toxines qui jouent un rôle
important dans les causes de maladies, ont été nommées pathotoxines.
Par exemple, la victorine, toxine produite par Helminthosporium
victoriae,
est de loin, la plus puissante pathotoxine connue. LUKE et
GRACEN (1972) suggèrent sa nature polypeptidique.
Plusieurs espèces de cette protéine ont été décrites par WHEELER et
LUKE (1963). D'autres pathotoxines tels que la T-toxine, produite par
helminthosporium maydis (SMEDEGARD-PETERSON et NELSON,1969),
la phaséotoxine et la syringomycine (BACKMAN et DEVAY, 1971) ont
été décrites comme étant des peptides.
Le terme de vivotoxine a été utilisé par DIMOND et W AGGONER
(1953) pour décrire des substances produites in vivo par le pathogène ou
l'hôte, et qui auraient une fonction dans le développement de la maladie
mais ne seraient pas impliquées dans la cause initiale.
Le terme de phytotoxine généralement utilisé, signifierait une toxine
nuisible aux plantes plutôt qu'une toxine produite par la plante.
Pour des substances produites par des champignons, mais qui seraient
toxiques aux animaux, le terme généralement accepté est mycotoxine.
Des discussions sur les terminologies des toxines en relation avec les
pathologies végétales ont été présentées par LUKE et GRACEN (1972) et
par GRANITI (1972).
Spécificité hôte et non-hôte
Une toxine est dite hôte-spécifique quand elle a uniquement
une
grande activité biologique sur la plante, hôte du pathogène qui produit la
toxine. Inversement une toxine est hôte-non spécifique quand elle
affecte une plus grande proportion de plantes que ne le fait le
micro-organisme qui le produit.
Pour SCHEFFER et PRINGLE (1967) les toxines peuvent être des
déterminants primaires ou secondaires dans les pathologies qu'elles
Historique
13
déterminent. Les détem1inants primaires sont définis comme essentiels à
la colonisation des plantes hôtes par les pathogènes responsables et au
développement de la maladie. Les déterminants secondaires
entrent en
compte pour certains symptômes ou contribuent à la virulence, mais ne
seraient pas essentiels pour la colonisation.
En pratique, la différence entre ces deux types de déterminants n'a
jamais pu être clairement définie. Les toxines seraient incluses dans ces
deux catégories. YODER (1980) préfère les termes simplifiés de facteurs
de pathogénicité et facteurs de virulence.
AS-2 -Classification
De nombreuses tentatives de classification des toxines, qui affectent
les plantes, ont été proposées.
Un premier schéma évident de classification est basé sur les
caractéristiques chimiques (tab. l).Par exemple, on sait
que certaines
toxines sont des peptides de faible poids moléculaire, d'autres sont de
types terpénoïques, et d'autres enfin contien nent des carbohydrates.
Toutefois, le fait qu'il existe de nombreuses
toxines dont le (ou les)
rôle(s) n'est (ne sont) pas déterminées) (par ce que très peu de choses
sont connues d'elles), limite une tentative de classification chimique.
D'autres classifications sont basées sur le type d'organisme produisant
la toxine (champignon, bactérie, etc... ). Là encore, la classification n'est
pas satisfaisante par ce que chaque type de pathogène peut produire des
toxines qui diffèrent radicalement les unes des autres, dans leurs actions
ou dans leurs caractéristiques chimiques.
Il est aussi possible de classifier les toxines sur la base de leurs
activités
biologiques,
soit
en
tant
qu'inhibiteurs
d'enzymes,
anti-métabolites ou affectant la membrane plasmique, etc ....
14
Séverin
AKE
AS-3 - Essais biologiques
Les études de détermination du (ou des) rôle (s) des toxines dans la
pathogenèse dépendent des essais biologiques mis en oeuvre. Ces essais
sont utilisés, pour détecter des toxines, rechercher leurs structures et
leurs fonctions,mais également pour déterminer si des toxines sont
impliquées dans la pathogenèse.
Pour atteindre ces objectifs variés, les essais biologiques que
l'expérimentateur retient, doivent être considérés en terme de spécificité,
de facilité à être quantifié, de simplicité et de reproductibilité.
Par exemple, pour la conduite d'une purification de toxine, la
caractéristique importante de l'essai biologique le plus approprié devrait
être une grande sensibilité. Pour la recherche d'une résistance à une
maladie par exemple, la priorité serait plutôt dans l'efficacité de l'éssai
biologique choisi.
Pour détecter de nouvelles toxines, les essais biologiques
ont été
souvent utilisés. Ce sont par exemple les essais
sur des sections
d'entre-noeuds de rameau, sur des disques foliaires, sur la croissance de
racines de jeunes plantules, et sur la multiplication cellulaire de
protoplastes (EARLE et al., 1978).
AS-4 - Rôle des toxines dans le processus
de la pathogenèse.
- Processus d'infection.
Selon LUDWIG (1960), les toxines pourraient jouer un rôle complexe
indirect dans la pénétration
pour certains couples hôtes-champignons
pathogènes. Il ressort des travaux de WHEELER (1977), de PADDOCK
(1953), que des toxines produites par des pathogènes, ne seraient pas
nécessaires pour la colonisation des tissus hôtes.
Historique
15
AI - Dérivés d'amino-acides:
1 - Acide fusarique(24)(GAÜMANN, 1957, 1958) et dérivés:( carboxypyridines)
- Acide picolinique (28). Produite par Piricularia orizae (TAMARI et KAn, 1954).
- Acide 5- n- butylthiazole- 2 - carboxylic (29) (HERSFELD et al. (1953)
Activité: - inhibition de la gennination de spores de champignons, de l'activité
polyphénoloxydase, de la croissance de semences de riz - effet sur la perméabilité
hydrique - dépérissement chez la tomate.
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29
28
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2 - Marasmines.
- Lycomarasmine (30) = Aspergillomarasmine (31)(Aspergillus sp) (HARDEG
GER et al., 1963) =Toxin C de Pyrenophora teres (BACH et al.,1979).
Activité: - Sur les feuilles chez l'orge, sur des sections de tiges chez la tomate.
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3 - Tentoxine. (38); (peptide tetracyclique); produite par Alternaria alternata (RICH et MA
THIAPARANAM,1974).
Activité: - inhibition du transport d'électrons couplé à l'activité ATPasique de chloro
plastes isolés.
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38
16
Séverin
AKE
4 - Malfonnines.· (Pentapeptides cycliques)
- Malfonnine A (43) (MARINO et CURTIS, 1961). Isolée du filtrat de culture de
certaines lignées bactériennes (CURTIS, 1958); produite par Aspergillus niger .
- Malfonnin B2 prcxluite par Phaseolus aureus, et Ph. vulgaris
Activité: - grande activité de régulateur de croissance, induction de malformation de tiges et
de pétioles, élongation de tiges, courbure des racines chez le maïs, inhibition dce
la for mation de racines adventives, stimulation de l'abscission - propriétés ami
biotiques - toxicité chez les mammifères.
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43
5 - Toxines d'Alternalia mali. (Tetradepsipeptides cycliques) (OKUNO et al., 1975).
Trois toxines hôte-spécifiques.
- AM Toxin l (44), AM Toxin II (45), AM Toxin III (46).
Activité: - Induction de nécrose des nervures foliaires chez le pommier
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44
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- CH 3
6 - Enniatines. (Cyclohexadepsipeptides), prcxluites par plusieurs espèces de Fusarium (RUS
SEL,1946)
- Enniatine B (52)
Activité: - Toxicité bactérienne, fongique et aux tiges de végétaux.
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53
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54
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Historique
17
55
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BI - Acétogénines.
1 - Toxine d'Helminthos,porium maydis Race T. (Toxine hôte spécifique) (KONO et
al.,1980).
Activité: Stimulation de l'oxydation mitochondriale par le NaDH et le succinate,
dans des tiges étiolées de semences de maïs sensibles
2·- Grégatines et Graminine A. (Acides tétroniques)
.
- Grégatine A (56), B(57); (KOBAYASm et Ui, 1979); produite par Cephal
osporium gre gatum
- Graminine A (60); produite par Cephalosporium gramineum
Activité: - dépérissement chez le haricot - brunissement vasculaire dans des tiges chez
le blé - anti microbienne.
- Vivotoxine (61) (Acide téhuazoïque); (UMETSU et al.,1974)
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H
CH; CH-C)H 7
61
3 - Pyrénocines A (62); (B (63); produites par des cultures de Pyrenochaeta terrestris
(SATO etai., 1979)
Activité: - Inhibition de croissance des racines (chez l'oignon, le riz, la laitue), de
la gennination de semences chez la laitue.
62
.R ;CO-CH; CH<r<.)
63
A=CC-CH z -CH{OHI-C;""3
4 - Epoxidon et métabolites associés.
- Phyllosinol (64) (SAKAMURA et al., 1969); est identique à l' époxidon
(substance anti mitotique isolée chez Penicillium sp, CLOSSE et al.,
1966)
- Phyllostine (65) (SAKAMURA et al., 1971); produite par Phyllostica sp
Activité: - Inhibition de la croissance de plantules (riz, laitue, ,), de l'élongation auxi
ne-dépendante de segments de coleoptiles chez Avena sp , de l'élongation
gibberelline-dépendante d'hypocotyles de laitue - stimulation à très faible
dose (l0 -9 M) de la formation de racines ad ventives de tiges chez Azukia
angularis .
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Séverin
AKE
66
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68
R;H
5 - Decumbine (Ascotoxines); Produites par AscJwchyta imperfecta
- Ascotoxine; (SUZUKI et al., 1970); identique à la Décumbine (72, de
Penicillium de cumbens; SINGLETON et al., 1958)
Activité: inhibition de la croissance de plantules chez le colza et la Luzerne.
72
6 - Naphtazarines.(Pigments) (KERN, 1972; 1978). Produites par des lignés pathogènes
de plusieurs espèces de Fusarium
- Marticine, Isomanicine (73) - Fusarubine (74) - Javanacine (75) - nor-
Javanacine (76) - Novarubine (77).
Activité: l'isomanicine est très phytotoxique, cause la penneabilité membranaire
des cellules foliaires de plantules chez le pois - (75) et (76) sont plus tox
iques aux microorganismes - Réaction des naphtazarines avec la thiamine
pyrophosphate, inhibition de la décarboxylation du pyruvate et de la
décarboxilation oxydative des céto-acides - phytotoxiques, antibctériens,
antifongiques et insecticides.
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CH,OH
H
CI • Terpénoïdes.
1 - Sesquiterpènes.
al - Helminthosporal et composée associés. Produite dans des filtrats de culture
d'Helminthosporium sativum.
- Helminthosporal (79) (MANDER et al., 1974)
- Vitoxinine (98); composante terpénoique de la victorine (8000 fois
moins toxique que la vetorine.
Activité: - inhibition de la germination et de la croissance chez plusieurs espèces
végétales, de la respiration tissulaire chez le riz, du transfert
d'électron dans la phosphorilation oxydative (végétaux et animaux).
bl - Toxine d'Helminthosporium victoriae .
- Victorine; (S CHEFER, 1976). Toxine hôte spécifique à très haute
toxicité et spécificité extrême; à 2 composantes: - peptidique (cy
clique?) et sesquiterpène.
.
Activité: - toxicité chez des espèces d'avoines sensibles et chez différentes cé
réales.
Historique
19
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2
'"',C "C / OH
HZ
98
cl - 12,13 - Epoxytrichothecenes. Vastes groupes de métabolites biologiquement actifs;
généralement considérés comme des mycotoxines (MIROCHA et CHRIS
TENSEN,1974). - Micotoxine T - 2 (103)
Activité: - (103) dépérissement sévère et nécrose de plantules, inhibition de la
germination chez le pois - les trycothecènes sont des irritants cutanés,
extremement toxiques à très faible concentration aux mammifères, antimi
crobiens, insecticides. beaucoup de ces métabolites de pathogènes
végétaux, peuvent dans cenains cas être des déterminants primaires ou
secondaires de la pathogénicité.
99
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101
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102
H:;=R?= ~~:~.:: = l--'
103
=: = ,...;. :':2: C·::.:·~2·="1 : ... ~;::.
::~: ~(, : c:: : .... ~
2 - Diterpènes.
al - Colletotrichines (104); produites par des espèces de Colletotricum sp
(GOHBARA et al., 1978)
Activité: - (104) et (106) causent la nécrose des feuilles chez le tabac
- inhibition de la croissance de plantules (riz), activité respiratoire
mitochondriale.
20
Séverin
AKE
b/ - Fusicoccines et Cotylénines.
- Fusicoccine: (109); produite par Fusicoccwr:z amygdali Del.
(Balio et al., 1934)
- Cotylenine:O isolée chez Cladosporium sp. (Sassa et al., 1970)
Activité: - phytotoxiques (coléoptile de maïs) - régulateur de crois
sance (109) - interaction avec la membrane plasmique O,
R.
8,
H.
8,
".1-
R
lOS
CGCE,
H
H
C''XH
ri
C'r',
·-CE ,C[:,
109
COCH,
H
H
COCE,
H
C(Co-: ) -CH =C,
1 1 0
COCil,
H
COC~i..
H
H
C (CU. -CH =CH
1 1 1
coca,
H
H
H
cou:, C (Cli, ~.~ - C:1 =C:1,:
1 12
COCil,
E
~
Il
E
C !C:.), --C~; =C2,
1 1 J
H
H
H
COCH
H
Clei.le -CH =C;:
1. 14
H
H
Cf)C~! !
H
H
C(CH:!:;-CB=CE:
1 15
H
H
H
H
COC!.
CiC:-:.),-CH=CH
1 16
H
..
H
E
H
C (C:: .. i,-·=ti =CH,
1 1 7
COCH,
COCO;,
COCE,
COCIl-.
COCci.
C (Cl:,\\,--CH =CH,
3 - Sesterterpènes.
- Ophiobolines A (130) et B 131); (CORDELL, 1974).
Activité: - Inhibiteur de la croissance des racines, des co1eoptiles, des tiges
et des plantules (riz) - stimule à très faible concentration
- cWorose et nécrose de tiges (riz).
130
131
TABLEAU 1: Quelques exemples de toxines fongiques.
(adapté de BALLIO, A. 1981).
Historique
21
- Modifications ultrastructurales.
En dehors des réactions cellulaires directement liées à la pénétration
physique des hyphes infectieux, les modifications assoCiées aux parois ou
affectant celles-ci, aux membranes et organites cytoplasmiques, ont été
aussi décrites dans les modifications ultrastructurales sous l'effet des
toxines.
HANCHEY et al. (1968) puis WHEELER (1974) suggèrent que les
modifications de types
"papillae" et
"appositions If, pourraient fournir
une protection localisée contre les effets des agents toxiques.
- Modifications physiologiques.
Les symptômes visuels communs associés à l'action des toxines sont:
la chlorose,
la nécrose,
les
perturbations
de
la
croissance,
le
dépérissement du végétal.
Bien que des toxines produites par des pathogènes, puissent causer des
nécroses à une certaine concentration, la plupart des toxines dont la cause
dans la pathogénèse a été établie, ne provoquent pas une mort rapide aux
concentrations que l'on pourrait espérer dans la nature (à l'exception de
quelques cas).
En général, la chlorose et la nécrose sont toutetois des
symptômes nécessitant plusieurs jours pour se développer, ce qui
implique que ceux-ci sont des
effets secondaires d'évènement(s)
moléculaire(s) primaire(s), (TEMPLETON, 1972; HALLOIN,et al.,
1970).
Comme nous venons de le discuter (§ A _ ), il paraît évident que le
4 2
déséquilibre hydrique puisse survenir par bouchage vasculaire ou par
perte
excessive
d'eau
à
partir
des
tissus
foliaires
(possible
disfonctionnement membranaire) (MARRE, 1978; TURNER, 1972).
Toutefois, depuis plusieurs années, les recherches sur les toxines
impliquées dans les pathologies de dépérissement ont dominé le champ
des investigations sur les phytotoxines, principalement par ce que le
dépérissement apparait impliquer des toxines qui agissent à distance, à
partir du site d'infection (GÀUMANN, 1958 a; KERN, 1972).
Ces chercheurs ont isolé et caractérisé à partir de Fusaria
et d'autres
22
Séverin
AKE
pathogènes. des composés toxiques qui sont capables de désorganiser la
perméabilité des cellules foliaires.
Certains de ces composés. la lycomarasmine par exemple. n'ont jamais
été détectés chez des plantes malades alors que d'autres. tels que l'acide
fusarique et la marticine. ont été isolés en quantités suffisantes de plantes
infectées. pour expliquer ou justifier lIn dépérissement ou d'autres
symptômes de maladies.
Les adversaires- de l'hypothèse des toxines indiquent que l'acide
fusarique ou d'autres toxines impliquées dans le dépérissement. ne
reproduisent pas à elles seules la totalité des symptômes visibles et les
changements physiologiques observés chez les plantes infectées.
Ceci. évidemment.
n'exclut pas l'implication de plusieurs toxines qui
puissent agir de manière séquentielle ou de concert.
En attendant que d'autres
critiques soient conçus. le mécanisme
responsable des symptômes des maladies vasculaires demeurera encore
dans l'incertitude.
On peut observer que les deux mécanismes hypothétiques qui ont été
proposés ne sont pas mutuellement exclusifs.
Il est tout à fait possible que le dépérissement puisse résulter à la fois
des effets combinés de l'occlusion vasculaire et de toxines impliquées
dans le dépérissement.
Il est aussi possible que. dans certains cas. l'occlusion vasculaire
puisse jouer le rôle majeur tandis que. dans d'autres. les toxines puissent
être principalement responsables.
T AKAI et al.
(1979a) ont résumé les informations sur une petite
protéine (PM: 10 000 D) obtenue à partir de cultures de Ceratocystis ulmi
Cette protéine provoquerait le dépérissement et la chlorose similaires à
ceux observés dans la graphiose (maladie de dépérissement) de l'orme
blanc.
Les ormes prédisposés sont très sensibles alors que les ormes
résistants sont moins sensibles. Un aspect intéressant de ces travaux
provient des propriétés physiques de la protéine. Son aggrégation en de
Historique
23
hauts polymères peut être induite par des changements physiques tels que
le refroidissement ou le barbotage de gaz dans des solutions protéiques, et
ce processus semble être réversible. De telles propriétés particulières
pourraient jouer un rôle dans les symptômes du dépérissement.
La protéine est formée abondamment en culture (140 mgll) et apparaît
être associée
avec
la différenciation., de
structures
spéciales
de
reproduction (synnema) dans les cultures de C. ulmi .
La perturbation et l'inhibition de la croissance peuvent être une
conséquence secondaire de l'action des toxines.
En effet, selon le(s) site(s) d'action(s), les toxines peuvent
affecter le
métabolisme des acides nucléiques (action directe sur la mitose) ou
interférer avec l'action d'hormones endogènes de la croissance. Les effets
sur la croissance semblent aussi impliquer une perturbation des voies de
transformation énergétiques.
Les effets des toxines sur la croissance revêtent une grande importance
expérimentale car ils permettent de démontrer que l'action de celles-ci
peut impliquer d'autres processus biochimiques cellulaires (LADO et al.,
1972; MITCHELL, 1978; TAKAI et al., 1979b).
Les réponses biologiques sur l'inhibition de la croissance permettent
également une expérimentation sur des' tissus, à cause de l'absence d'une
mort rapide des cellules, contrairement à c'e qui est observé dans les
symptômes chlorotiques et nécrotiques.
La modification endogène du flux ionique entre les cellules et les
membranes constitue un symptôme de l'action des toxines (DUNKLE,
1981).
Le test biologique mesurant le flux ionique transmembranaire, a été
couramment utilisé pour l'étude de l'activité de pathotoxines. Le flux
ionique consiste en deux composantes - l'éflux et l'influx - qui,
séparément ou ensemble, peuvent être contrôlés par les processus
métaboliques dans le cytoplasme ou dans les organites associés.
D'autres symptômes biochimiques ont été aussi décrits et utilisés dans
les recherches sur les pathotoxines végétales.
24
Séverin
AKE
On peut citer le symptôme de l'augmentation des phénomènes
respiratoires.
Celui-ci a été décrit comme universel dans les cas de
pathologies végétales
(DAL Y, 1976) Toutefois, dans les maladies
impliquant l'action prépondérante de toxines, ce phénomène semble être
d'une importance limitée.
B / LA CULTURE IN VITRO
DE MATERIEL
VEGETAL, EN RELATION AVEC LES
RECHERCHES PHYTOPATHOLOGIQUES.
B
- Culture in vitro
des végétaux
1
ligneux: historique.
Les techniques de culture in vitro chez les végétaux ligneux ont connu
un grand essor ces dernières décennies et ont ouvert de nombreuses voies
de recherche et d'applications. Malgré cet essor important, les tissus de
certains végétaux surtout les espèces ligneuses, ce sont montrés
particulièrement délicats à entretenir.
Dans les années 1930, certains auteurs dont GAUTHERET (1934 a et
b; 1940) obtinrent chez les conifères, des tissus de cals à partir d'explants
de type cambial. Ces cultures déclinaient en peu de temps et une
croissance indéf'mie n'a pu être obtenue. Les premières cultures indéfinies
ont été établies chez le genre Sequoïa (BALL, 1950), à partir de jeunes
tiges situées à la base du tronc. Ces auteurs initièrent des cultures de cals
chez le genre V/mus et rapportèrent la production de tiges adventives à
partir de cals, mais aussi la tendance à la formation de trachéides, dans
ces cultures, ce qui ne favorise pas leur entretien.
Les cultures de tissus ou de cellules d'arbres ont été utiles dans divers
domaines d'études (biochimiques, effets hormonaux etc ... ). Les travaux
Historique
25
de LAMPORT et NORTHCOTE (1960) chez Acer pseudoplatanus,
illustrent cette vaste application.
Ces auteurs isolèrent des cultures indéfinies de cals qui ont; par la
suite, été utilisées pour l'étude de l'activité de cèrtains enzymes
(SIMONA et SOPANEN, 1970), et l'étude de la fonnation de la paroi et
des
aspects
structuraux
de
la
division
cellulaire
(ROBERT et
NORTHCOTE, 1970 a,b).
LESCURE (1969) a isolé à partir de ces mêmes cultures de cals, des
mutants autonomes pour la dépendance vis à vis des auxines. Enfin, à
partir de suspensions cellulaires établies, STREAT et al. (1968) firent des
études cinétiques sur la croissance et le métabolisme cellulaires.
Toutefois la tendance des cultures in vitro chez les végétaux ligneux, à
produire des substances inhibitrices de nature phénolique, constitue une
des principales difficultés dans l'établissement et le maintien
de ces
cultures.
En rapport avec les exigences honnonales, certains explants sont
entièrement dépendants des auxines, pour le développement callogène,
alors que d'autres donnent des cultures indéfinies de cals qui paraissent
autonomes par rapport à ces hormones.
En ce qui concerne la multiplication végétative in vitro, des difficultés
ont été reconnues dans l'obtention d'une induction caulogène à partir de
bourgeons adventifs, et aussi dans l'induction d'une rhizogénèse.
Sur un plan phytopathologique, les travaux de MOREL et MARTIN
(1952) ont constitué les premières tentatives réussies d'obtention de
plantes saines par la culture in vitro de méristèmes de dalhia virosée.
GEISSBÜHLER et SKOOG(1957), ROMBERGER et al. (1970),
DAVID et al. (1979), BONGA (1982), a:insi que THOMAS et al. (1983)
ont fait un historique exhaustif concernant la culture in vitro des espèces
végétales ligneuses.
26
Séverin
AKE
B
- Cultures de tissus et phytopathologie.
2
B2-1 - Cultures associées hôte-pathogène.
Les premiers travaux relatifs à l'utilisation des cultures de tissus en
phytopathologie ont été réalisés par MOREL (1948). Un des objectifs
principaux était d'étudier le comportement de parasites obligatoires sur les
tissus végétaux cultivés in vitro. Des études du même type furent aussi
effectuées chez le genre Pinus .
Un autre objectif poursuivi dans la réalisation des cultures associées
hôte-pathogène est d'étudier l'expression de la résistance aux pathogènes
chez les tissus végétaux mis en culture.
En rapport avec
l'expression de cette résistance, les réactions
dépendraient pour beaucoup des couples hôte-pathogène.
INGRAM (1980) fit une synthèse concernant les cultures associées. La
mise en oeuvre de ces techniques présente surtout un intérêt dans l'étude
des relations hôte-pathogène.
B2-2 - La sélection in vitro.
Le développement des techniques de culture in vitro chez les végétaux,
revêt un aspect qualitatif qui ouvre d'importantes possibilités de sélection
de génotypes nouveaux.
Il s'agit notamment de l'utilisation de plantes haploïdes, ainsi que la
régénération de plantes entières à partir de cellules ou de protoplastes, ce
qui permet l'exploitation des ressources de la variabilité, de l'hybridation
somatique ou de techniques de recombinaison d'ADN en vue de
l'introduction de gènes étrangers (DEMARLY,1972; SEILLEUR,1984).
LARKIN
et
SCOWCROFT
(1981)
suggérèrent
d'appeller
"somaclonale", la variabilité constatée parmi des plantes régénerées de
cultures de cellules ou de tissus d'un végétal donné.
Historique
27
, L'obtention d'une variabilité naturelle ou induite au niveau de cellules
ou groupes de cellules, a été possible et a permis d'isoler entre autres,
des mutants de carotte résistants à des analogues 'd'acides aminés
(WIDHLOM, 1972) et de tabac résistants à des antibiotiques (MALIGA et
al. 1973).
- Origine des variations somaclonales.
Les variations somaclonales peuvent trouver leur onglne dans les
modifications du matériel génétique qui sont présentes dans les cellules
différenciées de l'expIant et non exprimées au niveau du tissu excisé.
Cependant il semble normal que la culture de tissus est l'origine la plus
probable des variations observées.
Chez les plantes régénérées, des comportements anormaux des
chromosomes ont été observés lors de la méiose, suggérant l'existence
d'anomalies
(ou mutations) chromosomiques (Mac COYet al.,1979;
ORTON,1980). Ces mutations chromosomiques sont le résultat de
modifications du matériel génétique.
Les perturbations de l'environnement du fragment excisé puis mis en
culture, seraient la cause de modifications du matérièl génétique, tant
nucléaire que cytoplasmique; ces modifications survenant dès les
premières replications, seraient transmises de mitose en mitose, à moins
de disparaître avec la mon de la cellule, si elles sont létales.
SEILLEUR (1984) est d'avis que la fréquence plus élevée des
variations rencontrées pannis les somaclones issus de protoplastes,
pourrait être justifiée
par la présence
de
stress
supplémentaire
nécessairement lié à la préparation des protoplastes.
On estime également que des éléments de transposition (Mac
CLINTOCK, 1956) peuvent être à l'origine de variations somaclonales.
SEILLEUR (1984) suggère la présence d'un système de régulation
cellulaire reposant sur la présence de tels éléments transposables, utilisés
par la cellule comme moyen pour créer une variabilité, lui permettant de
28
Séverin
AKE
s'adapter à des conditions nouvelles d'environnement, comme celles
rencontrées in vitro. Une fois réalisée, la variation est transmise aux
tissus par mitose, et aux générations sexuées, par méiose.
Toutes les variations somaclonales ne peuvent être expliquées par
l'apparition de mutations au cours du cycle" de régénération.
Le phénotype peut être considéré comme le résultat de l'expression
intégrée (DEMARLY, 1986) et programmé (SIBI, 1976) de l'information
génétique de chaque cellule, laquelle est sous la dépendance des relations
internes entre cellules, entre tissus, entre organes,
et des relations
externes entre le végétal et son environnement.
L'apparition de variations somaclonales subtiles pourrait s'expliquer
par
une
évolution
modifiée
du
programme
génétique,
suite
à
l'environnement
inhabituel
que
constitue
la
culture in vitro; le
développement ultérieur aboutissant à la régénération du végétal serait
modifié, mémoire de l'évènement perturbateur.
Au niveau cellulaire, les travaux de MEINS et LUTZ (1979) ont mis en
évidence une altération de phénotype cellulaire, lors du passage par un
état antérieur: le phénomène d'''habituation'' à la cytokinine de cellules de
cals de tabac, initiés de tissus de moëlle, de feuilles, de cortex, d'une
même plante diffère selon l'origine du tissu, bien que toute cellule soit
totipotente quelque soit son origine.
Il apparaît ainsi que des variations somaclonales subtiles pourraient
être la conséquence de phénomènes épigénétiques.
-Exploitation des variations somaclonales
en phytopathologie.
L'objectif de la sélection in vitro eu égard à la phytopathologie, vise à
mettre au point des techniques adaptées aux méthodes développées in
vitro, en vue de la multiplication et de l'obtention de nouveaux caractères
héréditaires chez les végétaux.
Elle a pour objectif de permettre l'obtention précoce et rapide de
variants utiles, aussi bien dans le domaine de la résistance aux pesticides,
Historiqu.e
29
au froid, aux sols salins, pour rechercher des génotypes mieux adaptés
aux techniques de production moins exigentes en énergie, que dans le
domaine de la résistance aux parasites.
Dans cette dernière perspective, la technique la plus simple consiste à
soumettre le matérièl végétal à l'action d'agents chimiques liés à la
pathogenèse. Ces toxines ou leurs analogues appropriés, pourront dès
lors exercer une pression sélective in vitro, pouvant aboutir à l'obtention
de lignées cellulaires résistantes ou tolérantes à la maladie considérée.
CARLSON (1974) montra la voie; il opéra une pression sélective sur
des cellules haploïdes de tabac à l'aide d'une substance chimique, la
méthionine sulfoximide, analogue supposé de la toxine de P seudomonas
tabaci et obtint des régénérats résistants à ce pathogène. Depuis lors, des
pressions sélectives, généralement séquentielles, furent réalisées à l'aide
de pathotoxines fongiques, introduites dans le milieu de culture, et donc
appliquées à une population cellulaire constituée de cellules isolées ou de
cals.
GENGENBACH
et al. (1975;1977),
à
l'aide
de
la
toxine
d'Helminthosporium maydis appliquée à des cultures cellulaires de maïs à
cytoplasme cms-T régénérèrent des plantes résistantes à H. maydis, mais
à cytoplasme mâle fertile.
MATERN et al. (1978), par pression sélective à l'aide de la toxine
d'Alternaria solani appliquée à une culture de protoplastes de pomme de
terre, obtinrent des régénérats résistants à A. solani.
DUTRECQ (1980) sélectionna des cals d'orge résistants aux toxines de
Helminthosporium sativum, malheureusement non-organogènes.
BEHNKE (1979) sélectionna des cals de pomme de terre, résistants au
filtrat de culture de phytophtora infestans
et en régénéra des plantes
résistantes.
THANUTONG et al. (1983) sélectionnèrent des protoclones de tabac
résistants aux toxines de pseudomonas
syringuae
pv. tabaci et
30
Séverin
AKE
d'Alternaria alternata. Des plantes régénérées de cals sélectionnés
présentaient des variations morphologiques et un grand nombre d'entre
elles étaient résistantes à l'infection des pathogènes su~dits; de plus, elles
transmirent leur résistance à leur descendance.
En conclusion, diverses possibilités peuvent être utilisées pour la
sélection de plantes résistantes:
-soumettre des plantes régénérées, variants somaclonaux, à des
méthodes conventionnelles telle que la sélection réalisée au champ, au
cours de toute la période de végétation dans des conditions naturelles de
plantation et d'infestation. La sélection peut se faire aussi en conditions
contrôlées après inoculation artificielle.
-pratiquer la sélection in vitro et ne régénérer qu'à partir de cellules
ou de cals résistants, et vérifier la résistance des plantes régénérées.
-éventuellement, si la variabilité obtenue du fait de la culture cellulaire
est insuffisante, on peut soumettre la culture à un traitement mutagène
avant de lui appliquer la pression sélective adéquate.
B2-3 - Expression et évaluation
de la résistance in vitro.
HELGESON et al.
(1972) montrent que sur des cultures associées
hôte-pathogène, le taux de colonisation par le pathogène diffère, selon
que les tissus proviennent de plantes sensibles ou résistantes à celui-ci.
Ce taux serait influencé par de nombreux facteurs tels que la température, la
concentration d'inoculum, l'aspect morphologique des tissus, la concentration en
hormones des milieux de culture, le génotype du tissu végétal mis en culture et du
pathogène.
Ces auteurs démontrent également que c'est le même gène qui
conditionne
la résistance du tabac à P hytophtora parasitica
var.
nicotianae (Ppn), dans les cultures de tissus et chez la plante entière.
Historique
31
Pour réaliser nos expériences, nous avons utilisé diverses techniques,.
tant au niveau des cultures des matériels biologiques (végétal et
fongique), que des observations et des mesures expérimentales. Il nous a
paru important d'en préciser dans le chapître suivant, les caractéristiques
et les modalités d'application.
32
Séverin
AKE
CHAPITRE II:
MATERIELS ET METHODES.
A / MATERIELS BIOLOGIQUES.
Al
- Matériel végétal.
Notre matériel d'étude est le platane (Platanus acerifolia ). Une partie de
cette étude, qui a porté sur l'apparition des symtômes de la pathologie du
chancre coloré et son développement,
ainsi que
sur la virulence
du
champignon, a été faite sur des boutures saines de deux ans, provenant
du jardin municipal de St Menet (Espaces Verts de la ville de Marseille).
Celles-ci sont entretenues dans la serre de l'Université de Provence.
Pour les cultures in vitro, les explants primaires ont été prélevés sur des
arbres sains situés en zone urbaine. Les cals isolés ont été initiés à partir
de ces jeunes rameaux.
Des suspensions cellulaires en milieu liquide agité ont été établies à partir
des cultures de tissus de cals, et enfin, des microplants sont régénérés à
partir de méristèmes axillaires.
Bien que les conditions d'établissement de ces différents matériels
biologiques in vitro
de platane, aient fait l'objet de nos recherches,
seules les cultures de tissus
de cals ont été utilisés
pour les
expérimentations phytopathologiques in vitro.
A
- Matériel fongique.
2
Le champignon responsable du dépérissement du platane a été déjà isolé et
Matériels et méthodes
33
FIGURE 2: Culture en milieu gelosé (PDA), du champignon Ceratocystis
fimriata E et H W (Walter) f platani, responsable du dépérissement de
P latanUs acerifolia.
FIGURE 3: Microscopie photonique (G: 400) d'une culture en
milieu
liquide (PDA), de Ceratocystis fimbriata
C::I
differenclation
à
partir
d'hyphes
mycéliens.
34
Séverin AKE
décrit par FERRARI et PICHENOT, (1974). Il s'agit du champignon
Ascomycète Ceratocystis jimbriata
E et H f platani (Walter). Nous
l'avons isolé suivant les critères décrits par ces auteurs, à partir de
carottages effectués sur des arbres gravement atteints par la maladie.
B 1 CULTURES ET I\\1ETHüDES.
B
- Isolement et culture du champignon
1
Pour l'isolement et l'établissement
de cultures de C. jimbriata, les
carottages ont été effectués dans des arbres présentant un stade très
avancé de dépérissement, au niveau des zones de chancre (écorce
craquelée en mosaïque).
Les carottes sont sectionnées et rapidement
stérilisées avant d'être introduites sur le milieu de culture.
B
- Cultures sur milieu semi solide
1-1
Les carottes stériles sont sectionnées en petits disques de 3 mm
d'épaisseur et sont placées sur le milieu PDA (potato dextrose agar)
(TUITE,
1969), dans des boites de Petri (90 xiO mm), puis incubées à
25 oC. Au bout de 24 h on note un développement mycélien issu des
disques. Les
cultures non contaminées sont ensuite transférées et
purifiées par plusieurs transferts après prélèvements des exudats au
sommet des périthèces typiques, sur milieu PDA neuf (fig. 3). Les
cultures homogènes obtenues sont tranférées chaque 20j sur milieu neuf,
par prélèvement de disques (3 à 5 mm) de tapis mycélien. La virulence des
isolats du champignon peut être vérifiée par des inoculations périodiques
de boutures de platane en serre.
B
- Culture en milieu PDA liquide agité.
1-2
Les cultures en milieu liquide agité (fig.2) sont réalisées par inoculation
d'un milieu de culture PDA non gélosé, avec un disque de tapis mycélien
de C. jimbriata , provenant d'une culture en mileu gelosé. Un disque de 5
MatérieLs et méthodes
35
TABLEAU II: Méthode de stérilisation des explants de platane
( RAMEAU )
1
Lavage puis rinçage avec H 0
distilée
2
!fi
Solution de Mercryllaurylé (solution pour usage externe)
à 10 % pendant 5 mn
Ethanol à 70 0 pendant quelques secondes
.-
Solution d'hypochloryte de Na (eau de Javel) à 10 %
pendant 40 à 60 min
':lII
3 rinçages successifs dans H 0 stérile
2
1
DECOUPAGE ET ENSEMENCEMENT
FIGURE 4: Méthode de préparation et de mise en culture d'entre-
noeuds de platane.
T
S
E
T: Paroi de tube
S: Support
E: ExpIant
36
Séverin
AKE
mm de diamètre est transféré dans une fiole de 1000 ml contenant 300 ml
de milieu. Les cultures sont ensuite placées sur un agitateur circulaire
horizontal (Lab-Line Shaker) à 125 rpm. Les conditions de culture sont
les mêmes que celles des cultures en milieu semi-solide'.
Les cultures en suspensions liquides agitées sont réalisées pour pouvoir
préparer des
filtrats
de
culture
du champignon qui
serviront à
l'inoculation de l'hôte, à la réalisation d'une pression sélective in vitro, et
permettront la recherche de substances impliquées dans le processus
pathogène.
B
Isolement et culture de tissus de platane ln vitro.
2
B _! - Cultures de tissus de cals.
2
-Initiation
Les explants primaires sont sectionnés en morceaux de 10 mm environ, et
divisés chacun, en deux parties dans le sens longitudinal (fig. 4). Après
stérilisation (tab. II), les deux surfaces internes de l'expIant sont mises
en contact avec le milieu nutritif adapté de la formulation de M.S.(tab.
III), en présence de 2,4D et de kinétine, à des concentrations qui seront
définies ultérieurement.
- Cultures indéfinies
Les cals primaires formés sont cultivés par plusieurs transferts sur le
milieu MS modifié, avant d'avoir une croissance autonome.
B 2-2 - Cultures de suspensions cellulaires de
platane.
N os expérimentations sur l'étude des interactions hôte-pathogène n'ont
pas été effectuées avec ce type de culture.
Toutefois, nous avons étudié les modalités de réalisation de ce système de
MatérieLs et méthodes
37
TABLEAU
Ill; Composition
nutritive
selon
SKOOG
et
MU RASHIGE
(1962).
Sels
minéraux
Solutions
stock
,
Concentra tion
mg/I
mM
g/I
Macroéléments
NH 4N0 3
1650
20,6
16,5
Solution A
KN0 3
1900
18,8
19,0
CaCI 2 2H 2O
440
3,0
4,4
MgS0 4 7H 2O
370
1,5
3,7
KH 2 P0 4
170
1,2
1,7
flM
FeS047H20
27,8
100
2,78
Solution C
Na 2 EDTA
37,3
100
3,73
Microéléments
MnS04 4H 2O
22,3
100
22,3
ZnS047H20
8,6
30
8,6
H
6,2
3 B0 3
100
6,2
KI
0,8
5,0
0,8
Na2M04 2H 2O
0,2
1,0
0,2
CuS04 5H 2O
0,02
0,1
0,02
CoC'2 6H 2O
0,02
0,1
0,02
Constituants orQanigues
mM
Myo-inositol
100
0,5
10
Solution 0
Glycine
2
0,02
0,2
IlM
Ac. nicotinique HCl
0,5
4,0
0,5
Solution E
Pyridoxine HCl
0,5
2,4
0,5
Thiamine HCl
0,4
1,2
0,1
Solution F
mM
Glutamine
200
1,3
Saccharose
30000
87,6
Bacto Agar
10000
les milieux sont réalisés à partir de solutions-mères, par dilution dans un litre de:
Stock A: 100 ml;
Stock B: 1 ml; Stock C: 10 ml; Stock D: 10 ml;
Stock E: 1 ml; Stock F: 4 ml. le pH de la solution est ajusté à 5,7 avec du KOH 0,1 N.
H20 distillée:
q.s.p.f.
1000 ml.
j8
Séverin
AKE
TABLEAU IV: Formulation nutritive adaptée
de JOUANNEAU (1973)
Sels minéraux:
Macroéléments
Concentration
Solutions stock
(mg/I)
(mM)
(g/I)
KN03
6550
64,7
65,5
CaCI2 , 2H 20
440
3,4
4,4
MgS04 ,7H 20
440
1,6
4,4
KH2P04
170
1,2
1,7
FeS04 , 7H 20
278,5
1,0
2,78
Na2 EDTA
372,5
1,1
3,72
Microéléments:
identiques au TABLEAU Il
Constituants organigues:
Matériels et méthodes
39
TABLEAU V: Milieu de SHENK-HILDEBRANT(SH)(1972) modifié.
Sels minéraux:
Macroéléments
Concentration
Solutions stock
mg/l
mM
gll
KN03
2500
24,7
25
Solution A-SH
CaCl22H20
200
1,8
2,0
MgS04 7H20
400
3,3
4,0
NH4H2P04
300
2,6
3,0
J.1M
Na2EDTA
15
44,6
1,5
Solution C-SH
FeS04 7H20
20
71,9
2,0
Microéléments
MnS04 H20
10
60,0
10
Solution B-SH
ZnS04 7H20
1,0
3.5
1,0
H3 S03
5,0 79,3
5,0
KI
1,0
6,0
1,0
Na2M042H20
0,1
0,4
0,1
CuS045H20
0,2
0,8
0,2
CoCI26H20
0,1
0,4
0,1
Vitamines
Thiamine HCl
5,0 14
1,0 Solution F-SH
Nicotinamide
5,0 40
5,0
Pyridoxine HCl
0,5
2,4
0,5 Solution E-SH
Autres
mM
Myo-inositol
1000
5,5
100
Solution D-SH
Saccharose
30000
87,6
Le mélange des constituants nutritifs pour la culture des suspensions cellulaires de platane, a été
réalisé comme suite: 100 ml de Sol. A-SH; 1 ml de Sol. B-SH; 10 ml de Sol. C-SH; 5 ml de Sol.
F-SH; 1 ml de Sol. E-SH; 10 ml de Sol. D-SH.
H20: q.s.p.f.
1000 ml.
40
Séverin
AKE
culture, à cause de l'intérêt qu'il présente pour la recherche de produits de
synthèse cellulaire notamment les phytoalexines, mais également par ce
qu'il facilite la régénération et la préparation de protoplastes à partir de
cultures de tissus établies.
Cette technique de culture permet aussi une meilleure accessibilité des
cellules aux différents facteurs du milieu.
La mise en culture initiale de la suspension est réalisée avec les cals
établis. Après dissociation, les suspensions sont entretenues par transfert
après chaque cycle de culture (14 j) d'un aliquote dans un milieu de
culture neuf. Un volume de 35 ml d'inoculum d'une culture mère en phase
stationnaire de croissance, est adjoint à 350 ml de milieu d'entretien.
Les suspensions sont agitées selon le même procédé décrit pour les
cultures liquides du champignon. La fréquence de l'agitation circulaire
horizontale étant de 96 rpm.
Différents milieux ont été utilisés pour l'étude qualitative des effets des
teneurs en sels sur les cultures.
Le milieu d'entretien dérive de celui de MS (qui a la plus forte teneur en
sels).
La composition nutritive de JOUANNEAU(1966; 1973) (JO) (tab. IV) se
caractérise surtout par le fait que l'azote minéral des macro-éléments, est
apporté essentiellement sous forme d'ions nitrates (KN03'); les ions
ammonium étant par contre absents.
Le milieu de SHENK-HILDEBRANDT (1972) (SH)
est comparable à
celui de JO, mais aussi à celui de MS. La teneur en sels est cependant très
faible (tab. V).
Le milieu de culture dans chaque cas, est complémenté en 2,4 D et en
kinétine.
Matériels et méthodes
41
BI
- Microbouturage et micropropagation
3
à partir de bourgeons axillaires.
L'initiation est faite à partir de méristèmes axillaires situés aux noeuds
des rameaux de platane. Les boutons renfermant les méristèmes axillaires
sont stérilisés et ensemencés sur le milieu nutritif dont la composition
dérive
des
formulations
de
MS
(1969),
HELLER
(1953)
(H),WETHMORE et MOREL(1949) (WM),comme indiqué ( tab. V).
Les milieux sont, selon l'expérimentation, complémentés en ANA et/ou en
6-BAP. Les boutons axillaires sont ensemencés, encore solidaires d'une
portion d'entre-noeud; cette précaution limite le taux d'échecs.
Les cultures du matériel végétal de platane in vitro sont entretenues en
salle de culture, conditionnée à 25 ±l°C. L'intensité de la lumière est
d'environ 2000 lux, assurée par des tubes fluorescents (Phyllips
"blanc-super")
C
/
TECHNIQUES.
Cl - Techniques culturales
C
- Stérilisations.
1-1
- Champignon.
Pour l'isolement de C. fimbriata, les carottes effectués dans les troncs de
platane, sont directement récupérées dans une feuille de cellophane.
Avant d'être utilisées pour l'enJ\\emencement des milieux nutritifs, les
morceaux de carotte sont stérilisés dans l'éthanol à 70 % pendant 2 à 5 s
puis flambés afin d'éliminer d'éventuelles contaminations externes.
- Matériel végétal (platane).
La méthode de stérilisation utilisée a permis de réduire le taux de
42
Séverin
AKE
contaminations externes de platane tout en ménageant au maximum le taux
de survie des explantats.
Cultures de tissus initiales.
Les entre-noeuds de rameau subissent une stérilisation externe par
passage dans une solution de mercryl laurylé à 10 % pendant 5 à 10 min,
puis dans l'éthanol à 70 % pendant 1 min. Ceux-ci sont enfin plongés
dans une solution d'hypochlorite de Na à 10 % pendant 40 à 60 min puis
rincés abondamment par 3 rinçages successifs dans H 0 stérile pendant
2
respectivement 10, 20 et 30 min.
Microboutures initiales
Le même protocole de stérilisation a été utilisé, en prenant quelques
précautions supplémentaires pour ménager les méristèmes axillaires
fragiles. A cause des risques de contaminations accrues au niveau des
boutons axillaires, ceux-ci ont été scarifiés avant le premier trempage,
afin de faciliter la pénétration des produits.
C
- Milieux de culture
1-2
- Champignon
Le milieu PDA adapté de TUTTE (1969) permet un bon développement du
pathogène. Une inoculation de jeunes boutures de platane en serre par des
prélèvements de cultures du champignon sur ce milieu semi-solide, permet
de vérifier que celui-ci conserve bien ses capacités pathogènes.
Le protocole de réalisation du milieu nutritif a été antérieurement décrit
par FERRARI et PTCHENOT,(l974), TAWTL et al., (1982):
pour un volume final, q.s.p.f. = 3 000 ml, il faut 600 g
de pomme de
terre, 30 g de saccharose, 45 g de bacto agar. On réalise un extrait de
pomme de terre après un bain marie de 30 min, auquel sont adjoints le
Matérièls et méthodes
43
TABLEAU VI: Protocole de réalisation d'un filtrat stérile à partir
de culture en suspensions de
Ceratocystis fimbriata
Cultures agitées de Ceratocystisfimbriata
1
1
1
1
Surnageant
1 Culot 1 ( spores, hyphes conidies, etc ... )
1
Stérilisations successives
( sur membranes Millipore, type GSWP, 8 à 0,22 ~m)
1
Filtrat stérile
1
Résidus
1
1
1
Concentration par évaporation sous vide
Filtrat stérile concentré
44
Séverin
AKE
saccharose et l'agar. Ce mélange final
est stérilisé comme pour la
préparation des cultures végétales, par autoclavage à 120 0 C pendant 35
mIn.
- Cultures végétales
Milieu de base
Pour les cultures de tiss!Js, le milieu de base dérive de celui de MS dont la
composition est décrite dans le tableau III.
1 % d'agar est adjoint au
milieu. La teneur en saccharose est de 30 g Il. Pour les cultures de
cellules, le milieu de base dérive soit du milieu MS, JO, ou SH.
La teneur en saccharose de ces milieux est réduite à 10 gll. Pour le
microbouturage et la micro- propagation, le milieu de base est l'adaptation
des formulations nutritives de MS, H, MW, respectivement pour les
compositions en macro-éléments, micro-éléments et vitamines.
Ces différents milieux de base ont été complémentés selon le cas par des
facteurs de croissance.
Facteurs de croissance.
Pour l'initiation et l'entretien des cultures de tissus de
cals de platane,
ainsi que pour les suspensions cellulaires, le 2,4D et la kinétine ont été
utilisés.
Les expériences de micropropagation avec régénération des bourgeons
axillaires, ont été réalisés en présence d'ANA et de BA.
Des solutions mères de kinétine, de 2,4 D, d'ANA, de 6-BAP, (produits
Sigma) sont préparées selon les modalités habituelles. Pour une solution
mère de 200 J...lM de chaque hormone, une quantité appropriée de soluté est
neutralisée par 0,5 à 1ml de HCL ou de KOH 0,1 N (pour les cytokinines)
ou dissoute dans l'éthanol (pour les auxines), et amenée à 100 ml de
volume final. Les solutions mères ainsi réalisées sont diluées dans le
milieu de culture de base selon les besoins de l'expérimentation.
Matériels et méthodes
45
C
-Réalisation d'un filtrat de culture stérile
1-3
du champignon.
Un isolat du champignon est cultivé en milieu liquide agitée (comme décrit
au § B 1- 2) à partir d'une culture en milieu semi solide du même isolat
virulent. Après 20 j de croissance, les suspensions sont collectées puis
filtrées selon le protocole décrit au tableau V.
C
- Techniques d'inoculation
1-4
- III vivo
Inoculation par le champignon.
Afin d'éprouver le caractère de virulence des isolats du champignon et de
décrire les différents symptômes dans la pathogenèse, les boutures de
platane en serre, sont inoculées. Une incision de 3 à 5 mm de longueur est
effectuée tangentiellement à travers l'écorce, à mi-hauteur de la tige
principale, afin d'observer éventuellement le sens d'évolution des
symptômes. L'incision réalisée affecte très peu le bois des tiges. Un
disque de tapis mycélien de 5 mm de diamètre environ, est découpé à
l'emporte pièce et inséré dans chaque incision. Par exemple, pour chacun
des trois isolats P 416, P 427, M 862, dix boutures de platane ont été
inoculées. Chaque série d'inoculation par isolat, est effectué avec des
prélèvements d'une seule et même boîte de pétri (culture en milieu semi
solide).
Un disque de milieu gelosé non inoculé, stérile, est également inséré dans
les incisions de plantes témoins.
46
Séverin
AKE
Inoculation par du filtrat
de culture stérile du champignon.
Afin de comparer les effets éventuels des inoculations par C. fimbriata ou
par son filtrat stérile de culture, d'autres boutures sont inoculées comme
décrit au paragraphe précédent.
L'inoculum est un aliquote du filtrat de culture du champignon. Le
protocole suivant a été utilisé:
la zone à inoculer est nettoyée (éthanol 70 %) puis l'incision faite avec un
scalpel stérile. Après insertion d'un support de coton hydrophyle
chirurgical dans l'incision, un aliquote de 500 J..Ll de filtrat y est
incorporé.
Des boutures témoins sont inoculées selon le même procédé, avec 500 J..Ll
H 0 ou de milieu PDA liquide. Les incisions d'inoculation sont protégées
2
par un film plastique (Parafilm) afin d'éviter un déssèchement et
d'éventuelles contaminations externes.
Les cultures en serre sont maintenues dans des conditions ambiantes (20 à
30°
C) pendant toute
l'expérience,
des
observations
sont
faites
régulièrement.
- In vitro
Inoculation par le champignon
Dans le but de rechercher l'expression d'un effet pathogène in vitro sur
les cultures de tissus
de platane, des cals en croissance sont inoculés
avec un peu de tapis mycélien d'une culture de C. fimbriata , en milieu
gelosé.
Le prélèvement est effectué délicatement afin d'éviter un entrainement d'
agar, puis mis sur les tissus, en évitant tout contact avec le milieu nutritif
des cals.
Le développement rapide d'hyphes mycéliens sur ces cultures, exprimera
la sensibilité vis à vis du champignon, de ces tissus hôtes in vitro, comme
Matériels et méthodes
47
c'est le cas sur les boutures in vivo . . Des cultures d'e tissus de cals non
inoculées servent de témoins.
Inoculation par le filtrat de culture.
Dans ces expériences, on recherche les effets toxiques éventuels du filtrat
de culture du pathogène
sur les cultures de tissus hôtes. Le protocole
expérimental est celui utilisé pour la réalisation d'une pression sélective
décrit au paragraphe suivant (§ C - ).
l 5
C
5 -Technique de sélection et expression
1-
d'une résistance in vitro à C. fimbriata .
- Réalisation d'une pression sélective
Le filtrat de culture stérile est incorporé à différentes concentrations, au
milieu nutritif des cals, dans des tubes de culture. Les dilutions sont
réalisées de manière à avoir le même volume final de milieu nutritif par
tube de culture. Dans les cultures témoins, le filtrat de culture est
remplacé par du milieu PDA ou par H 0.
2
Les cultures en présence de fortes concentrations de filtrat (à partir de 50
% v/v), sont maintenues plus longtemps en culture, dans le but de
rechercher au sein de la masse des tissus, des lignées cellulaires qui
maintiendraient une croissance active par rapport au reste des tissus. De
tels amas cellulaires sont transférés ensuite sur du milieu nutritif neuf
auquel est encore incorporé du filtrat de culture du champignon, mais en
concentration plus faible (20 à 30 %
v/v), pendant deux cycles
supplémentaires de culture. Les tissus ainsi sélectionnés sont, par la
suite, multipliés par fractionnements à chaque transfert sur le milieu
nutritif d'entretien.
48
Séverin
AKE
- Evaluation d'une résistanc y au
champignon.
Dans ces expenences, on détermine la résistance des tissus de cals
sélectionnés en présence du filtrat toxique. Pour celà ces tissus sont
inoculés secondairement par le champignon pathogène C.fimbriata.
Les cultures de tissus en phase stationnaire de croissance peuvent être
inoculés avec un peu de tapis mycélien, comme décrit au paragraphe
"inoculation par le champignon" .
Toutefois, pour évaluer le dégré de colonisation des tissus, nous avons
effectué un contrôle plus précis de la quantité d'inoculum, en réalisant
une suspension sporale. Cette suspension pour l'inoculation est réalisée à
partir d'une culture de C. fimbriata
en milieu gelosé, de la manière
suivante:
4 ml d'H20 sont étalés sur une surface de culture puis collectés dans des
cuves Eppendorf, et centrifugés (centrifugeuse Eppendorf) pendant lS
min à 8 000 g, à la température ambiante. Le culot est repris dans 1ml
d'H 20 stérile et donne une suspension mère utilisée pour l'inoculation des
cals.
Une numération sur cellule de Malassez est effectuée afin de déterminer la
concentration des spores.
Pour localiser la zone inoculée dans les cultures de tissus, un anneau de
repère en téflon, de 3 mm de diamètre est posé avant l'inoculation, au
sommet des cals. Un aliquote de S J..1l est introduit à l'intérieur du repère.
On évite ainsi un contact direct des spores avec le milieu nutritif MS de
croissance des tissus.
Des cultures témoins de cals n'ayant pas été mis en contact avec le filtrat
de culture du champignon, sont également inoculées. Les cultures sont
incubées
pendant
24
h
à
l'obscurité,
puis
une
évaluation
du
développement des hyphes mycéliens sur les tissus, est faite à intervalle
de 2 j pendant 14 j.
Matériels et méthodes
49
C
/ Techniques liées aux observations
2
microscopiques
En plus
de
l'observation
directe
des
cultures,
les
observations
microscopiques ont été réalisées pour les études histologiques.
C
_
- Microscopie photonique
2 1
Les suspensions de cellules de platane ou les suspensions sporales de C.
fimbriata peuvent être observées directement dans une goutte d'eau, entre
lame et lamelle sans aucune coloration particulière.
Les préparations des coupes histologiques dans les cals et dans les tiges
de platane sont faites selon les methodes classiques usuelles. Les
observations ont été faites sur un microscope Wild Heerbrugg type M 20.
C _ - Microscopie électronique à balayage (MEB)
2 2
Les tissus de platane observés par cette technique, subissent une
déshydratation progressive très douce, dans des bains successifs
d'éthanol à 25,50, 70, 80 et 100 %, pendant 15 min par bain.
Après déshydratation, les échantillons subissent une déssication selon la
méthode de séchage au point critique permettant une meilleure
conservation de la structure cellulaire. L'éthanol est ensuite s~b~titué par le
CO", à la température et à la pression critiques de 32 oC à 10 bars.
La métallisation des tissus est réalisée par pulvérisation cathodique
or-paladium sur un métalliseur Polaron, puis les tissus sont observés au
MEB (JEOL JSM 35), puis photographiés.
C
- Microscopie électronique à
2-3
transmission (MET).
Les échantillons sont fixés par une solution de glutaraldéhyde à 25 % (l
50
Séverin
AKE
volume) et du cacodylate de Na à 0-;1 M pH 7,4 (S-vol) pendant 1 à 2
heures. Ceci ~est suivi de 3 lavages d'une heure chacun, dans du tampon:
cacodylate à 0,2 M pH 7,4 à 3,6 % de mannitol. Les échantillons sont
post-fixés pendant 1 h dans une solution osmique à 1 %' (0504 à 20 % +
du cacodylate de Na 0,1 M, pH 7,2 ).
Une déshydratation très douce est effectuée dans l'éthanol à 30 %, 50 %
et 70 %, pendant respectivement 1 h, 2 fois 1h 30 min, et toute une nuit à
la chambre froide, (3 fois 1h) dans l'éthanol à 100 % puis dans le
mélange éthanol 100 % - propylène durant 2 h.
L'inclusion est réalisée de la manière suivante: oxyde de propylène -
araldite, pendant 3 fois 1h, respectivement dans les mélanges 3/4 - 1/4,
1/4 - 3/4 dans le but d'imprégner progressivement les échantillons par l'
araldite. [Le milieu complet d'araldite est constitué de la ml de résine
d'araldite +
la ml de durcisseur + 1ml de phtalate de butyle + 0,6 ml
d'accélérateur] .
La polymérisation de l'araldite est réalisée pendant 72 h. Après inclusion
des échantillons, des coupes fines ont été réalisées et montées sur des
grilles. Le contrastage est dfectué sur un système automatique (LKB
Ultro-stainer 2168): acétate d'uranyl: 40 min à 40 oC; citrate de plomb: 3
min à 20 oC. les sections montées sur grille sont observées avec un MET
(JEOL J5M 100 C) opérant sous 45 kV.
C 3
/
Techniques de purification
Dans le but de rechercher une (ou plusieurs) substance(s) à partir du
filtrat de culture de C. fimbriata
qui a (ont) une activité toxique sur les
tissus de platane, nous avons procédé selon les étapes suivantes.
C
- Filtration sur gel
3-1
Un aliquote de 5 ml de filtrat concentré du pathogène, obtenu à partir de
200 ml de filtrat initial, est fractionné sur biogel P la (Bio-Rad) de 1 cm
Matériels et méthodes
51
-:.,
de diamètre sur 30 cm de hauteur, équilibré en acide acétique à 1 %
Des .différentes fractions éluées (10 ml / h) par le même solvant; sont
collectées à raison de 3 ml par tube, et leur densité op~ique à 280 nm est
déterminée. Les fractions pathogènes sont réunies et re-chromatographiées
sur Sephadex G 75, comme précédement.
C
-"Reverse Phase" HPLC (Chromatographie
3-2
l'
"d
' h
rf
h ' )
lqUl e a
aute pe ormance en p ase mverse
Les fractions actives sont analysées par chromatographie liquide à haute
performance en phase inverse (Kratos) sur une colonne de silice greffée
en C8, de 0,2 cm de diamètre sur 25 cm de long (Beckman). L'élution est
effectuée par un gradient acétonitrile / formiate d'ammonium, à pH 5,7,
de 1/10 à 5/10 (v/v).
C _
- Analyse de la compositio'n en amino-acides
3 3
La fraction contenant l'activité pathogène est hydrolysée (hydrolyse acide
HCl 6 N à 110 0 C) pendant 20 h, puis une analyse de la composition en
amino-acides est faite sur un analyseur Beckman.
C
-
Chromatographie d'affinité
3-4
sur Con-A ultrogel 4B.
Dans le but de déterminer une glycosylation éventuelle de la fraction
toxique purifiée, un volume de 0,5 ml de cette fraction est introduit sur
une colonne de Con-A sépharose 4B Ultrogel (1/5 cm) équilibré en
tampon acétate 0,1 M pH 6, en présence d'ions Mn++, Mg++, Ca++.
Un "décrochage
est
effectué
avec
une
solution
de
méthyl,
13
mannopyranoside à 0,2 M, dans du tampon acétate 0,1 M pH 6. Les
différentes fractions (élution et décrochage) sont collectées selon un débit
de 10 ml/h, pour un volume de 1ml/tube, et leur densité optique à 280 nm
est déterminée.
L'activité biologique des fractions (avant et après décrochage) est testée.
52
Séverin
AKE
C 3-5 -Test biologique d'activité sur les
cultures de tissus de cals
Les essais biologiques de toxicité sont basés sur l'inhibition de la
croissance des tissus de cals de platane. A chaque étape des séparations
chromatographiques, chaque fraction est lyophilisée et les résidus sont
dissous dans un aliquote approprié d'H20 en tenant compte des rapports
entre les différents pics d'élution. Avant inoculation des tissus, chaque
fraction est enfin stérilisée séparément sur une membrane filtrante
(Millipore 0,22 ~).
L'inoculation est effectué directement sur les cals, afin d'éviter une
dilution immédiate dans le milieu nutritif MS, ce qui atténuerait ou
retarderait un éventuel effet inhibiteur.
L'inoculation est faite après fractionnement et transfert des tissus sur un
milieu nutritif neuf, à raison de 100 ~l de solution par tube de culture
(environ 250 mg de masse de tissus sur un volume de milieu MS /tube de
culture, de 10 ml). Les systèmes de culture-tests sont incubées pendant 24
h, dans l'obscurité. Après remise à la lumière,
les masses fraîches et
sèches des tissus sont mesurées au bout de 20 j.
C 4
/ Méthodes de mesures et d'évaluation
des résultats
C 4-1 - Mesure de la croissance des tissus
et des cellules
- Tissus de cals
Pour mesurer la masse de matière fraîche (MF), les tissus sont collectés
en fin d'expérience et leur masse
déterminée, en tenant compte des
différences de tare au début et à la fin de l'expérience de la manière
suivante:
Matériels et méthodes
53
on mesure la masse ml (du tube de culture + le milieu-nutritif), puis après
inoculation par un amas de tissus, on détermine la masse (m2)
correspondant à ml + masse des tissus.En fin de croissance, on détermine
de nouveau la masse du tube(m3).
Les tissus sont alors ôtés délicatement des tubes, puis les masses m4 des
tubes (sans les tissus) sont mesurées. l'incrément de croissance est donné
par la différence de (m3 - m4) et (m2 - ml). La masse de matière sèche est
obtenue après séchage d'une partie aliquote des tissus frais, à l'étuve (60
OC) pendant 3 j.
- Suspensions
Pour mesurer la masse de matière fraîche, les suspensions cellulaires sont
collectées sur un entonnoir de verre fritté (porosité 1). Un rinçage des
cellules est effectué 4 fois, avec une solution minérale isotonique (KCl 20
mM + EDTA 5mM), sous vide partiel, pour assurer un meilleur essorage.
La masse de matière fraîche est déterminée par la différence des masSes de
l'entonnoir avant et après l'opération.
C 4-2 - Expression de la résistance des cultures
de tissus de cals, au champignon.
Le développement des hyphes mycéliens sur les tissus de cals, est estimé
par un système numérique. Les valeurs assignées sont:
o : Pas de hyphes mycéliens sur les tissus
1 : Colonisation très faible ( 2 % de la surface du cal)
3 : Plage mycélienne = 50 %
4 : Plage mycélienne = 75 %
5 : Colonisation totale des tissus par les hyphes mycéliens
Pour chacune des différentes lignées cellulaires sélectionnées en présence
du filtrat, 12 tubes ont été inoculés. L'évaluation numérique est faite à
intervalle de 2 j, pendant 14 j, après l'inoculation des tissus en phase
54
Séverin
AKE
stationnaire de croissance. Chacun des 12 tubes (par lignée cellulaire) est
évalué séparément, et les points expérimentaux indiqués sur les figures,
proviennent de valeurs moyennes de 12 tubes.
C 4-3 -Test biologique de l'activité toxique
des substances issues du filtrat de
culture de Ceratocystis firnbriata.
Chaque point expérimental représente en fait une valeur de
8 ou 12
mesures, valeurs exprimées en pourcentage par rapport à celle des
cultures témoins. Quand une mesure semble abérrante par rapport au reste
d'une même série de mesures, le test d'élimination de Dixon (DIXON,
1951) est appliqué pour justifier le rejet de telles valeurs.
A chaque étape du fractionnement chromatographique, seule la fraction
déterminant la plus forte activité inhibitrice ~ 50 % par rapport au témoin,
est retenue.
Même dans ce cas, pour certaines fractions, il est tenu compte de l'activité
spécifique (par exemple une D.O. plus faible correspondant à un effet
inhibiteur plus important).
Les expériences qui suivent ont été répétées au mOIns 2 fois. Pour
l'identification de chaque point expérimental, une dizaine (8 à 12) de
tubes de cultures ont été utilisés, et la position relative de ces valeurs
expérimentales les unes par rapport aux autres, n'est pas modifiée au
cours d'expériences successives.
Matériels et méthodes
55
CHAPITRE III:
ETABLISSEMENT DE
CULTURES DE CALS ET DE
CELLULES
DE
Platanus
acerifolia..
N INTRODUCTION.
Comme nous l'avons souligné dans l'introduction générale
(chapitre
I), la recherche d'une approche d'étude de la pathologie du 'chancre
coloré' par les vitro-méthodes, exige l'obtention de matériels biologiques
in vitro sous forme de cultures de tissus, de cellules ou de microplants.
Pour atteindre cet objectif, les explants primaires ont été prélévés d'arbres
sains en agglomération urbaine.
Pour l'obtention des cultures de tissus de cals, nous distinguons deux
étapes: dans les cultures initiales, les réactions des explants aboutissent à
la formation de cals primaires. A partir de ces cultures initiales, sont
secondairement établies des cultures indéfinies.
Enfin nous avons recherché les conditions optimales de la composition
hormonale des milieux de cultures, afin d'obtenir une croissance et une
stimulation satisfaisantes des tissus.
57
FIGURES
5 à 10 : Proliférations callogènes à paFtir de
différents explants de Platanus acerifolia.
FIG. S, 6 - Explants primaires sur milieu MS liquide avec support de
papier-filtre sans cendres (Dulrieu). 5: proliférations callogènes à la base
d'un pétiole, 6: proliférations callogènes au niveau d'un limbe foliaire.
CP: cals primaires, ML: milieu liquide.
FIG. 7 - Les proliférations se développent beaucoup plus sur les
parties non sectionnées de l'expIant, au niveau des lenticelles (pl). De tels
cals primaires sont chlorophylliens.
FIG. 8 - ExpIant de platane sur un milieu MS non gélosé. La figure
montre des proliférations sur les sections, en forme de bourrelets en
anneau (b a). Des cals primaires se forment également dans la zone
centrale médullaire (pm).
FIG. 9 - Observation microscopique en contraste de phase, de la
coupe transversale d'un expIant primaire en culture. La figure montre des
cellules
de
parenchyme en intense
activité
mitotique.
On note
l'allongement des formes cellulaires (flèches).
FIG. 10 - Culture indéfinie de tissus de cals de platane, en milieu MS
semi-solide
58
Séverin
AKE
Cultures de cals et de cellules
59
TABLEAU
VU: Quelques aspects des réactions en culture
illvitro, de rameaux de platane. \\
Les explants proviennent de platane de l'agglomération Marseillaise:
LUMINY (8ème arrondissement) , St JEROME (l2ème arrondissement).
Proliférations callogènes:
(+ + + +)
- Très abondantes et précoces.
(+)
- Très faibles et tardives.
al Proliférations importantes d'origine cambiale apparaissant
sur les
sections et formant des bourrelets annulaires (fig. 8).
bl Proliférations chlorophylliennes apparaissant au niveau des
lenticelles (fig. 7).
cl Proliférations moins importantes, et se formant sur les sections au
niveau du parenchyme médullaire (fig. 8).
Provenance
Période
Réactions en culture
des explants
climatique
initiaux
Importance
Types de
des
prol i férations
proliférations
observées
Janvier -
40 % a et b
Mars
+ + +
60 % a
St JEROME
Juin -
100 % abc
Septembre
+
Décembre -
100%a
Mars
+ + + +
LUMINY
Juin -
100 % b
Septembre
+
60
Séverin
AKE
A partir de ces tissus de cals, nous avons recherché les conditions
nutritives permettant d'établir un autre système de culture,
les
suspensions cellulaires en milieu liquide agité. En effet, ce système de
culture présente des particularités intéressantes, comme celà a été décrit
au paragraphe B 2-2.
BI RESULTATS
Cultures de tissus de cals
-Formation de cals, cultures initiales.
La composition de base de
MS a permis d'initier avec succès des
proliférations cellulaires qui se forment principalement sur les parties
sectionnées de l'expIant (fig.5), mais apparaissent également au nlVeau
des lenticelles à partir du 10è j de culture (fig. 7).
Les proliférations sont induites en présence de kinétine et de 2,4 D à
0,5 J-lM. Les amas cellulaires au niveau des sections sont fermes et
blanc-jaunâtres (fig. 5, 8), tandis que ceux apparaissant au niveau des
lenticelles, sont très chlrorophylliennes et moins fermes (fig. 7).
Selon les parties du végétal, utilisées comme expIant, et selon les
saisons, les réactions en culture présentent quelques particularités (tab.
VII):
Les explants réagissent plus vite en donnant des cals primaires
abondants, dans le cas des prélèvements de rameaux effectués durant la
période hiver-printemps, alors que cette réaction est très faible pour les
prélèvements d'été (tat." . VII).
Les premières proliférations apparaissent
d'abord
sur les sections
des
explants, quelque soit l'origine du pied mère
et le moment de
Cultures de cals el de cellules
61
TABLEAU
VTTI:
Effet de différentes concentrations en 2,4
D
et
en
kinétine sur la
croissance
de
cultures
de
cals
de
platane,
(mesures de masse de matière fraîche).
Les valeurs moyennes sont celles obtenues après 2 cycles de cultures
(2 x 20 j), dans les mêmes conditions expérimentales pour chaque point
mesuré.
KINETINE
_
~M
o
0,1
0,5
1
5
-
2,4 D
( !lM)
------,
, ---------------------------------
..
,
1
1 0,10
0,60
0,15
0,08
°
: 007
1
1
'
1
1
,
\\
\\
"'-------'
~--------------------------------,
; - - - - - ,
,
, ---------------------------------
1
1,10
1
1,17
1,34
0,90
0,46
"1
0,1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
,
1
0,78
1
0,5
1
0,43
1
1
1,16
1,20
0,90
1
,------""
"------- -------------------------- '"
62
Séverin
AKE
prélèvement(tab.VU, fig. 5,8). Les proliférations que l'on ot>serve au
niveau des lenticelles (fig.7), apparaissent surtoût sur les explants
prélevés en été.
-Cultures indéfinies des tissus de cals de platane.
Les proliférations cellulaires qui constituent les cultures initiales,
peuvent être isolées des explants et transférés sur un milieu neuf de
culture, après une période de 30 à 40 j. Les tissus excrètent des composés
inhibiteurs qui nuisent à leur croissance.
L'apport d'acide ascorbique à 5g /1 au milieu nutritif, et la pratique de
cycles de transferts plus courts, ont permis d'atténuer ces effets.
Si les cultures indéfinies de cals de platane sont maintenues sur le
milieu
nutritif de base de MS, on note un brunissement important de
l'ensemble des tissus. Une réduction de la teneur en sels, jusqu'à 50%
(essentiellement des macroéléments)
a permis d'atténuer très fortement
ces effets.
La stabilisation des cultures est très nettement améliorée par 5 à 10%
de lait de coco incorporé au milieu nutritif. Toutefois, plusieurs cycles de
culture sont nécessaires à cette stabilisation.
- Rapport auxine / cytokinine.
En vue d'optimiser le rapport hormonal des cultures, des tissus de cals
sont fractionnés (65 mg MF) à partir de cultures-mères en phase
stationnaire de croissance, puis transférées sur les milieux-tests dont
seules les
concentrations en auxine (2,4 D) et en cytokinine (kinétine)
sont modifiées.
Cultures de cals et de cellules
63
,Q,.F...:.T...
G....U""-"-R"'"'E........,S---"1....1........à~1....4-=- : Cult u re sen m Bi e u
li q ui d e
agité
de
suspensions
cellulaires
de
pla tane,
obtenues à partir de cultures de tissus de
cals.
FIG. Il: AI Suspensions en milieu liquide adapté de JOU ANNEAU
(1973) (J 0). On peut noter la coloration caractéristique due à la synthèse
et l'excrétion de pigments.
B 1 Suspensions en milieu MS modifié.
FIG. 12: Observation microscopique de cellules de platane cultivées
en milieu MS modifié. On remarque l'importante activité mitotique des
cellules dont les fonnes sont presques arrondies. Les flèches indiquent les
foyers nécrotiques.
FIG. 13: Observation de cellules de platane, en milieu JO. On note la
synthèse et l'accumulation de pigments (fig. lIA) au niveau des cellules.
Dans ces conditions de culture, les formes cellulaires deviennent plutôt
allongées. Les mitoses conduisent à des cellules disposées en files.
FIG. 14:
Détail d'une cellule, dans les mêmes conditions de culture
que celles de la
fig. 13. Le contenu cellulaire présente des foyers de
pigmentation intense (flèches). (Observation microscopique en contraste
de phase, sous filtre bleu-azur).
64
Séverin
AKE
Cultures de cals et de cellules
65
Une.évaluation (qualitative et quantitative) est faite après 2 cycles de
culture de 20jours, dans des conditions identiques ..pour chaque point
expérimental. Les valeurs portées dans le tab. VIII/mettent en évidence les
faits suivants:
-en l'absence de 2,4 D et de kinétine, c'est à dire sans aucune
hormone exogène, la croissance des tissus est pratiquement nulle.
-en présence de 2,4 D et/ou de la kinétine.
La stimulation de la croissance par le 2,4 D seul à 0,1 ).lM, est
importante par rapport au témoin (0) sans hormone exogène (> 15 fois).
Un optimun de la stimulation est atteinte pour 0,5 ).lM. Au delà, l'effet sur
la croissance n'est pas modifié (valeurs non figurées),
sauf pour des
concentrations supérieures àlO ).lM pour lesquelles, au contraire, un effet
inhibiteur est observé.
Malgré la stimulation de la croissance des cals sous l'influence du 2,4
D seul comme régulateur hormonal, nous avons remarqué que les cultures
de tissus présentent encore des brunissements nécrotiques dont la
précO~ité et l'importance varient en fonction de la teneur en auxine du
'"'-
milieu nutritif.
Dans les séries expérimentales où la kinétine est incorporée au milieu
de culture des cals, comme seule hormone de croissance, on observe
comme dans les séries en présence de 2,4 D seul,un effet stimulateur.
Toutefois en présence de kinétine seule, la stimulation à 0,1 ).lM est très
faible par rapport au témoin (0) sans hormone exogène (>1,42), et par
rapport
à l'effet du 2,4 D seul à 0,1 ).lM «11 fois). La gamme de
concentrations correspondant à une stimulation optimale de la croissance
est plus localisée à 0,5 ).lM.
Par contre, aux concentrations supérieures
à 0,5 ).lM, la kinétine a un effet très inhibiteur.
66
Séverin
AKE
-Dans les cultures en présence de 2,4 D et de kinétine, la stimulation
optimale de la croissance est obtenue pour des concentrations de 0,1 J.l.M
(2,4 D) et de 0,5 J.l.M (kinétine).
BI
Suspensions cellulaires
de platane
A partir des cultures indéfinies de tissus de cals de platane, nous avons
recherché les conditions d'établissement de suspensions cellulaires, en
milieu liquide agité.
Les tissus en présence de concentrations équimolaires (0,15 J.l.M 1 0,15
J.l.M) de 2,4 D et de kinétine sont plus facilement dissociés dans les
conditions
d'agitation des cultures,sur un plan Shister à une vitesse de
96 rpm.
Pour la recherche de la formulation nutntlVe appropnee, seules les
critères de la concentration minérale et de la forme d'apport de l'azote
(N0 3 - NR4+) ont été retenus. Celà nous a conduit à comparer les effets
des milieux MS, JO, et SR. Les
concentrations hormonales démeurent
donc inchangées dans ces essais.
Les suspensions cellulaires peuvent être initiées sur le même milieu
que celui retenu pour la croissance indéfinie des cals. Cependant, la
croissance mesurée, baisse au cours du second cycle de culture, et les
amas cellulaires nécrosés deviennent importants (fig.12).
Parallèlement à ces cultures en milieu MS, d'autres suspensions sont
initié~s en milieu J O. Au bout d'un cycle de culture, une comparaison des
suspensions, permet de noter les particularités suivantes:
-En milieu JO, les suspensions ont une coloration rose (fig. lIA) qui
devient très marquée en fin de cycle de culture. Cette accumulation de
métabolites est très remarquable pour une forte proportion des cellules en
suspensions (fig.13). Au niveau du cytoplasme cellulaire, l'observation
Cultures de cals et de cellules
67
en contraste de phase met en évidence des localisations de forte
pigmentation (fig.14).
-Au contraire, en milieu MS modifié, les cultures ne 'présentent ,pas une
accumulation de tels métabolites (fig. 11 B, et 12); elles
paraissent
même légèrement verdâtres.
-Dans une autre série expérimentale, des suspensions cellulaires sont
réalisées avec la composition nutritive SH, qui a une teneur en sels plus
réduite que celle des milieux
MS ou JO (tab. III IV et V). Dans ces
conditions de culture, on observe
une stimulation importante de la
croissance, et les cellules survivent aux transferts en milieu nutritif neuf à
la fin de chaque cycle de culture.
Pour un inoculum, de densité cellulaire équivalente à 5 g /1,
l'augmentation de croissance après 14 j de culture (phase stationnaire) est
en moyenne de 60g de cellules fraîches /1 de suspensions. La qualité des
cultures est comparable à celle des' cultures en milieu MS. (fig.11 B).
68
Séverin
AKE
CI DISCUSSION.
- Culture de tissus de cals.
L'initiation des cultures de tissus de cals a pu être conduite à partir de
jeunes rameaux
.d'un an d'âge, en présence de concentrations
relativement faibles (0,3 à 0,5 J-lM) de 2,4 D et de kinétine.
Les réactions des explants mis en culture, présentent quelques
particularités
en relation avec les variations saisonnières: -en période
d'intense activité cambiale, les
rameaux mis en culture
in vitro,
répondent plus faiblement à la stimulation hormonale, comparativement à
ceux prélevés en période où l'activité mitotique cambiale est très ralentie
ou nulle.
Par ailleurs, de très jeunes tiges en croissance active issues de
bourgeons de
l'année en cours, n'ont pas developpé de proliférations
callogènes in vitro. On peut remarquer que selon la position des rameaux
sur l'arbre, ceux qui constituent des rejets à la base du tronc
ou des
charpentières sont plus apte~
à la calogenèse que ceux prélevés au
sommet de branches plus petites.
L'excrétion de substances qui, oxydées, nuisent
qualitativement et
quantitativement à la croissance des tissus, semble être une caractéristique
généralement décrite chez les végétaux ligneux, plus particulièrement
chez les espèces arborescentes (GAUTHERET, 1959;
BALL, 1950;
AHOUSSOU, 1987).
La croissance et la qualité des cultures de cals de platane sont en
relation avec la balance molaire qui concerne le 2,4 D et
la kinétine.
En l'absence de ces deux hormones, la croissance des cals est nulle, ce
qui traduit le fait que ces cultures ne sont pas autonomes pour le besoin
en régulateurs exogènes de croissance.
Par contre, ces tissus de cals de platane ont une exigence pour chaque
Cultures de cals et de cellules
69
type de régulateur hormonal, auxine et cytokinine.
La stimu~ation des
cals de platane est donc
entièrement auxine et cytokiiline-dépendante. La
dépendance pour le 2,4 D est plus marquée
que celle pour la kinétine.
Ces observations se retrouvent dans le cas de cultures in vitro d'Acer
pseudoplatanus , isolées par LAMPORT et NORTHCOTE (1960), dont la
croissance n'est pas autonome. Dans leurs cas l'exigence hormonale est
entièrement de type auxinique (2,4 D).
-Suspensions
cellulaires.
Selon les conditions nutritives, les suspensions cellulaires de platane
présentent des différences de coloration, caractéristiques de la formulation
nutritive utilisée.
Nous avons en effet montré que le milieu nutritif JO permet aux
cellules d'exprimer des capacités de synthèse et d'accumulation de
métabolites secondaires, probablement des anthocyanes.
Ce processus d'élaboration de métabolites dans certaines conditions de
culture in vitro, a été également décrit par WESCOTT et HENSHAW
(1976) dans des suspensions cellulaires d'Acer pseudoplatanus.
Une comparaison des compositions minérales des milieux nutritifs JO
et MS (tab.IVet III), permet de noter la concentration importante en ions
NH + et NO 3- pour le milieu nutritif MS: Le rapport N0 - /NH 4 + est de
4
3
2,15.
Au contraire les ions NH + font totalement défaut dans la composition
4
des macroéléments JO. L'azote minérale étant dans ce cas éssentiellement
fournie sous forme
N0
par les ions
K+N0 -, le rapport
3
3
N0 3-/NH + est infini (+00).
4
Les résultats observés dans les cultures en milieu JO, suggèrent que
l'élaboration
importante des métabolites colorés peut être mise en
relation avec le manque d'ions ammonium (NH +).
4
Toutefois quand l'on considère le cas de la formulation nutrive SH, le
rapport
N0 -/NH + est de 8,33 c'est-à-dire une teneur en N0 - plus
3
4
3
70
Séverin
AKE
faible
de 2,6 fois celle du milieu JO et de Il,8 fois'êelle du.milieu MS.
L'ensemble de ces comparaisons entre les milieux nutritifs MS, JO. et
SH, permet de suggérer qu'en présence d'ions NH4+, il semble avoir un
blocage
de
l'élaboration et de
l'accumulation 'de métaboli.tt..~
phénoliques par les cellules en culture.
Cependant il ressort qu'une teneur en ions N0 3 de plus en plus
importante favoriserait cette accumulation.
Il Y aurait donc une influence de la balance ionique NB 4+ IN°3-. Une
telle influence été décrite par RIDEAU et al. (1980) qui en recherchant
divers alcaloïdes dans les tissus d'arbres cultivés in vitro, ont montré
qu'un rapport des ions (NH +/N0 - = 2) favoriserait la synthèse de
4
3
certains alcaloïdes.
Cette influence de la balance ionique NH +/N0 - sur la synthèse de
4
3
métabolites phénoliques, peut être
rapprochée de nos résultats chez
Platanus acerifolia .. Toutefois dans notre cas, les métabolites ne sont pas
encore identifiés, et les rapports ioniques sont différents de ceux décrits
par ces auteurs.
L'ensemble de nos résultats est en faveur d'une réelle utilité des
cultures de suspensions cellulaires d'arbres, notamment pour cette
possibilité de faire exprimer des capacités cellulaires nouvelles, en
modifiant l'environnement nutritif.
Par ailleurs nous avons observé que cette accumulation de pigments
dans les suspensions cellulaires, survient pendant la phase stationnaire de
croissance, c'est-à-dire en fin de cycle de culture et non pendant la phase
exponentielle de croissance (résultats non figurés).
Ces faits suggèrent un effet
antagoniste net entre l'élaboration
importante de
ces métabolites et l'activité de
stimulation de la
multiplication cellulaire (PAUPARDIN, 1972).
Cultures de cals et de cellules
71
1
D'autre part, si l'on augmente la' teneur en 2,4D de ces cultures
(au-delà de
0,3 J-lM), un brunissement nécrotique est observé en fin de
cycle de croissance. Cette observation semble avoir un rapport avec le
méta1?olisme phénolique. Si cette hypothèse est exacte; on peut p~nser à
une régulation de ce type de métabolisme par les auxines.
TABATA et al. (1975) ont rapporté une stimulation importante
de
certains composés phénoliques dans des cultures de tissus de Cassia tora,
sous l'effet du 2,4 D.
-t-
Dans d'autres cultures (Morin~a citrifolia)
c'est plutôt l'ANA qui
stimulerait cette synthèse alors que le 2,4 D serait sarts effet (ZENK et
al., 1975).
Sur un plan phytopathologique, la maitrise des conditions nutritives et
des modalités d'établissement, tant de cultures de tissus de cals que de
suspensions cellulaires
de platane, va permettre dans les chapitres qui
suivent, l'étude notemment des relations hôte-pathogène dans cette
interaction Platane -Ceratocystis fimbriata.
~ Q.vbiocci'a~
72
Séverin AKE
CHAPITRE IV:
ETUDE DES CONDITIONS DE MICROPROPAGATION
A PARTIR DE MERISTEMES AXILLAIRES.
AI INTRODUCTION.
En rapport avec l'établissement de matériels biologiques de platane in
vitro, il nous a semblé utile d'étudier aussi les conditions d'induction et
de développement de microplants de platane, à partir de méristèmes
axillaires.
En effet une bonne maîtrise des conditions de micropropagation d'un
végétal, constitue la phase finale de tout prograrne de sélection et permet
ainsi de trouver une exploitation immédiate dans divers domaines
d'utilisation, en agriculture, en horticulture ou en sylviculture forestière.
D'autre part, sur un plan d'étude de la pathogenèse, l'obtention de
rnicroplants par régénération à partir d'apex axillaires permet de disposer
de plantes homogènes pour des tests comparatifs dans les études de la
pathogenèse.
Comme dans le chapître précédent sur les tissus de cals et les
suspensions cellulaires, nous décrirons aussi l'incidence des conditions
nutritives sur les réactions des explants en culture.
73
TABLEAU
IX: Formulation nutritive de base pour l'induction et le
développement de vitroplants à partir de méristèmes axillaires de Platane
Concentration
Composition
mg/l
---------------------------------------------------------------------------------
Macro-éléments
a*
NH4N03
10300
825
KN03
9400
950
CaCl22H2O
1500
440
MgS047H20
750
185
KH2P04
620
85
Micro-éléments
Na2EDTA
100,5
37,5
FeS047H20
100
27,85
b*
AICl3
17,25
0,03
H3B03
15,87
1
ZnS04
3,48
1
MnS044H20
0,6
0,1
CuS045H20
0,12
0,03
NiCl26H20
0,12
0,03
KI
0,06
0,01
Vitamines
c*
Myo inositol
506,6
100
Acide nicotinique
8,1
1
Pyridoxine HCL
4,8
1
Thiamine HCL
2,9
1
Pantothénate de Ca
2,0
1
Biotine
0,04
0,01
Amino-acides
Acide glutamique
998,9
146
Source de carbone
Saccharose
29.214
10.000
*Adaptation des milieux de culture de: a*(Skoog et Murashige), b*(HelIer), c*
(Morel et Wethmore).
74
Séverin
AKE
BI RESULTATS.
Les microboutures sont réalisées sur différents milieux nutritifs
gélosés à partir de bourgeons
prélevés dans
les conditions
décrites
au chapitre II,(§ B 2-3 ). Après 7 j
de
mise en culture, on observe les
réactions suivantes:
- en milieu de base (MB) sans hormone de croissance.
La fig. 15 présente une tige feuillée (axe caulinaire et feuilles) initiée
et développée dans les conditions nutritives décrites au tab. IX. 100 %
des essais présentent une telle réaction.
Les tiges feuillées induites dans ces conditions ont un dévelopement de
type monocaule qui devient très ralenti,
même après un transfert sur
milieu nutritif neuf. Après 2 semaines de culture, certaines microtiges
feuillées (5 %) différencient des racines, comme il est montré sur la fig.
15.
- réaction des explants sous l'action des cytokinines.
Dans ces expériences, les cultures sont initiées sur la même
composition nutritive de base (MB) décrite au tab. IX
, mais à laquelle
est incorporée une cytokinine, à différentes concentrations.
M icrobouturage-micropropagation
75
FIGUR E
15:
Vitroplant
de
platane,
régénéré
en
milieu
nutritif de
base
(tableau 1). Le développement de la tige est
monocaulinaire (flèche), et les bourgeons axillaires aux aisselles foliaires
sont latents. Une rhizogénèse survient à la base de la tige feuillée chez 5
% des vitroplants . MG: milieu gélosé
FIGURES
16 à 18:
Régénération de microtiges feuillées de
platane, en milieu nutritif de basecomplémenté en 6-BAP (0,1
à 50 ~M).
FIG. 16:
Nombreuses
microtiges régénérées (en bas) tout autour
d'une microtige feuillée principale (flèche) comparable à celle de la figure
1.
FIG. 17:
Phase de multiplication. Induction de ramifications
caulinaires à partir de microtiges feuillées adventives, en présence de
6-BAP (25 à 50 ~M)
FIG. 18: Induction d'un développement racinaire, à la base des tiges
feuillées, sous l'action de l'ANA (0,01 à 0,1 ~M). R: racines induites.
Cp: zone callogène.
76
Séverin
AKE
Mieroboururage-mieropropagarion
77
1
Les figures 16 à 18 présentent les réactions des e-xplants en présence
de 6-BAP comme seule hormone exogène incorporée au milieu nutritif:
en présence de concentrations 0,1 à 25 J...lM, on observe:
al l'induction et le développement d'une microtige feuillée principale
(fig. 16, flèche) comparable à celle induite en l'absence d'hormone
exogène.
bl de nombreuses autres microtiges feuillées plus petites, à la base.
en présence de 25 à 50 J...lM, les effets décrits sur la fig. 16
sont amplifiés. Un développement de cals primaires affecte l'expIant à la
base des microtiges feuillées. Au sein de ce développement callogène,
sont régénérées de nombreuses microtiges adventives.
L'élongation de l'ensemble des
axes
caulinaires devient plus
importante et les méristèmes axillaires aux aisselles foliaires sont
fortement
stimulés (fig.17,
flèches),
mettant
ainsi en place les
ramifications latérales de la tige feuillée.
Chaque ramification axillaire utilisée comme explantat, développe une
microtige feuillée après un transfert à nouveau sur milieu de base.
La vigueur de croissance des proliférations caulinaires adventives sous
l'effet de la 6-BAP, est accrue quand le milieu nutritif contient aussi de
l'ANA à très faible concentration (0,01 J...lM).
Nous n'avons observé aucun de ces effets dans les cultures en
présence de kinétine.
78
Séverin
AKE
- Régénération complète de vitroplants.
A partir de microtiges feuillées développées, une rhizogénèse est
induite par transfert sur le milieu nutritif de base (MB) auquel est
incorporé l'ANA à très faible concentration (0,01 à 0,1 J..1M) (fig.18).
On obtient des résultats-similaires si l'ANA est incorporé en même
temps au milieu d'induction et de développement des tiges feuillées.
CI DISCUSSION.
L'induction et le développement de microtiges feuillées de P latanus
acerifolia
est obtenue à partir de bourgeons axillaires. Les réactions des
explants sont déterminées par les conditions nutritives de culture.
Il ressort des résultats sur l'induction en milieu non complémenté en
auxine et en cytokinine (MB), que certains constituants du milieu nutritif
sont déterminants pour la stimulation des capacités organogènes de ces
explants de platane.
Une conclusion parallèle est apportée par les travaux de DAVID et al.,
1978;
ISEMUKALI,1979),
sur
des
cultures
in vitro d'espèces
arborescentes. Ces auteurs ont décrit l'importance de certains composants
du milieu nutritif sur l'induction, qui créeraient des conditions optimales
pour l'activité caulogène des cytokinines.
Toutefois dans nos expériences, nous n'avons pas recherché quels
composants du milieu nutritif, seraient impliqués dans ces effets, si telle
était réellement le cas. Cependant le développement d'une microtige
Microbouturage-micropropagation
79
feuillée est effective, bien que le milieu nutritif ne soit pas complémenté
en cytokinine.
Ces observations suggèrent que les méristèmes axillaires s~mblent
donc avoir une grande aptitude à l'induction caulogène.
On peut également penser que ceux-ci ne présentent pas ou très
faiblement, de phénomène de dormance de bourgeons.
Par ailleurs VIEITEZ et al. (1966) ont isolé de boutures de Platanus
ori entalis
des dérivés indoliques qui auraient des propriétés de
stimulation de la croissance.
Si de tels dérivés sont présents chez Platanus acerifolia, espèce
hybride de P. orientalis et P. occidentalis, et qu'en plus ils puissent avoir
une activité caulogène, alors ils pourraient être impliqués dans une telle
sensibilité à l'induction, chez le platane.
Le ralentissement de la croissance de la tige feuillée, qui survient dans
les conditions de culture en milieu de base, peut être rapproché des
corrélations inhibitrices (COURDUROUX, 1980) qui finissent par
s'établir entre le milieu nutritif et certains tissus de l'expIant, et ainsi
conditionner le développement du méristème caulinaire.
Nous avons fait d'autres observations en rapport avec l'apport du 2,4
D (5 J..l.M) au milieu nutritif de base. Cette auxine exerce un effet
inhibiteur net sur l'induction de la caulogenèse.
A l'opposé, le 2,4 D stimule la formation de cals à partir de ces
mêmes explants.
80
Séverin
AKE
-
Concernant la régénération de microtiges adventives dans les cultures
en présence de 6-BAP "(0,1 à 50 J..LM), les résultats suggèrent que cette
cytokinine se montre particulièrement déterminante pour la conduite d'une
micropropagation du platane.
Des observations analogues ont été faites chez d'autres espèces
ligneuses (DONKERS et EVERS,1985; RANCILLAC, 1979).
Cependant les concentrations d'hormone, utilisées dans nos essais (50
J..LM) sont 20 fois plus faibles. Des doses supérieures (75 j..tM) induisent
des développements de microtiges anormales d'aspect vitrifié (VIEITEZ
et al., 1985; BOTTCHER,1988).
Ces différents effets réponses-doses du 6-BAP, ainsi que le rôle des
auxines et/ou
des cytokinines dans la régulation de la croissance
et
l'organogénèse dans les cultures de tissus in vitro, ont été discuté par
SKOOG et SCHMITH (1979).
Les microtiges induites en présence de concentrations optimales
pourraient provenir soit de territoires méristématiques de l'expIant, à la
base de la tige feuillée
principale induite, soit
de tissus non
méristématiques, mais plus réceptifs
à l'induction organogène en
présence de 6-BAP.
Le développement de cals associés aux microtiges semble être une
expression de l'intense activité mitotique sous l'action de la 6-BAP (25 à
50 j..tM).
Les microtiges feuillées régénérées dans ces conditions sont de type"
mixtes ou "combinées" (V ASIL,1980). Par conséquent celles-ci pourraient
avoir été affectées, totalement ou en partie, par des
variations
somaclonales.
Des criblages doivent être effectués sur des plantules issues de telles
régénérations
pour
rechercher
celles
pouvant
présenter
des
caractéristiques intéressantes.
Microbouturage-micropropagation
81
La rhizogénèse, qui peut survènir dans des conditions de culture sans
hormone exogène (MB), ou celle induite en présence <fANA à très faible
concentration, révèle en fait la facilité à l'enracinement généralement
décrite chez le genre Platanus (VIEITEZ et al., 1966).
Les vitroplants multipliés sont transférables en serre surun mélange de
tourbe et de vermiculite après
4 à 6 semaines de culture in vitro. Le
pourcentage de survie à ce transfert est de l'ordre de 50%, et dépend pour
beaucoup de l'environnement hygrométrique qui doit être maintenu
proche de la saturation.
Une amélioration de ces conditions de transfert s'impose encore pour
augmenter le taux de survie.
82
Séverin
AKE
CHAPITRE V:
ETUDE DES RELATIONS HOTE - PATHOGENE
SUR DES BOUTURES DE PLATANE.
AI INTRODUCTION.
Les expériences qui font l'objet de ce chapitre ont été effectuées sur de
jeunes boutures de platane in vivo , et ont porté sur l'apparition des
symptômes de la pathologie du chancre coloré et son développement, ainsi
que sur la virulence de C fimbriata.
Afin de rechercher des symptômes primaires observables dans la
pathogenèse, des boutures
ont été inoculées par des isolats
du
champignon (comme décrit au § C l -4 ), ou par le filtrat stérile du milieu
de croissance de celui-ci (§ C - ; C _ ).
l 3
l 4
BI RESULTATS.
Evolution des symptômes de dépérissements
de boutures de platane in vivo
Trente jours après l'inoculation par le champignon, on peut observer
un dépérissement foliaire général affectant les feuilles des parties
83
FIGURE
19:
Dépérissement foliaire
d'un jeune Platane
inoculé par Ceratocystis fimbriata.
Stade avancé de dépérissement, avec chlorose foliaire (CF). Le
dépérissement affecte des feuilles de part et d'autre du point d'
inoculation.
FIGURE 20;
Vue rapprochée d'une tige de platane, 8 à 10
semaines après l'inoculation par Ceratocystis fimbriata.
Aucune réaction callogène de cicatrisation au niveau de la blessure
d'inoculation (I). On observe un développement de chancre (Ch) au
niveau
de
l'écorce,
qui
progresse
de
part
et
d'autre
du
point
d'inoculation.
84
Séverin
AKE
.. ,
19 1 20
Pathogenèse in vivo
85
.:...F.....I....,.G
.........
U'-"R~E...S~2.......
1_à--=2-"'3'-L: Evolution des symptômes de dépérissement
foliaires
chez
des
boutures
de
platane
inoculées
par
le
champignon C. fimbriata~
FIG. 21: Symptôme causé par l'isolai du champignon M 862.
FIG. 22 et 23: Symptômes causés respectivement par les isolats 416
P
et 427 P .
Dégréd'évolution du dépérissement.
(0)
DAucun symptôme apparent de dépérissement foliaire.
(++)
D -Feuilles en début de fanaison, non désséchées.
(+++) lil-Dépérisement accentué, fe~l1es sèches mais non chlorosées.
(+++ ) HtiW~ -Dépérissement foliaire total: chlorose très accentuée.
Histogrammes:
Ordonnées: Chaque histogramme indique le % des boutures de platanes,
présentant un même dégré de dépérissement, au cours de l'évolution du
symptôme foliaire.
Abscisses: Temps d'observations (en jours), après inoculation par le
champignon.
86
Séverin
AKE
L~Q l.. AT r..,1 862
ISOLAT
P
416
ISOLAT P
427
0:
a
QJ.~
100
E~
.QJ §:
E.QJ
C
:JQJ
_u
§~
- : J
Co
~u
.~ :::J
Q.ra
50
o
30
L
a
60
90
o
30
60
90
o
30
60
90
Temps de culture (en jours)
21
p'atlzogenèsc III VIVO
87
-.....
FIG LJ R E 24 : Bou t ure scie pla t a Il c t é III () i Il S CilS C n- C , li t i1isée s
pour l'étude de la pathogénèse ill vivo.
FIGURE 25: Boutures de platane témoins. c.elaii c1'une
incision d'inoculation (1) au niveau de la ti!!e principale.
On peut noter la réaction cicatricielle par développement de cal de
blessure (RC)
FIGURES
26
et
27: Effet
comparé
du
filtrat
stérile
de
cuiture
de
C.
fimbriata,
sur
la
réaction callogène
de
cicatrisation de boutures de platane.
FIG.
26:
Coupe transversale au point d'inoculation, d'une tige de
platane témoin. On remarque la réaction callogène de cicatrisation (RC).
FIG.
27:
Coupe transversale au point d'inoculation, d'une tige de
platane inoculée par du filtrat stérile de culture de C. fimbriata . On peut
noter, contrairement à la figure 26, l'absence d'un développement
callogène de cicatrisation.
88
Séverin
AKE
24
25
+
26
27
Pathogenèse in vivo
89
FIGURES 28 et 29:
Observations photomicrosco piques de
coupes
tangentielles
dans
des
segments
de
tiges
de
platane
atteint de chancre coloré.
FIG. 28: Tissus de l'écorce montrant un développement mycélien
(My) intracellulaire de C. fimbriauz. On remarque un passage de hyphes
mycéliens par des jonctions intercellulaires (flèches) G= 400.
FIG.
29:
Développement mycélien (My) dans les cellules de
vaisseaux conducteurs, avec passage. par des orifices entre les cellules G=
400.
:~:
FIGURE
30: Observation
au
MEB
d'une
tige
de platane
atteint de chancre coloré. Coupe tangentielle d'un tube criblé. On
remarque l'enchevêtrement mycélien (My)
avec passage par les
ponctuations des vaisseaux.
90
Séverin
AKE
..
..',..'-
,,
29
30
Pathogenèse in vivo
91.
terminales
des
boutures,
au dessus du point d'inoculation,
pUIS
progressivement les
parties
inférieures
en dessous
(fig.19,
20).
L'ensemble des feuilles et des pétioles sont repliés vers le bas. Ce
symptôme évolue dans le temps et aboutit à une chlorose générale.
Les fig. 21 à 23 présentent
l'évolution dans le temps du symptôme
causé par chacun des isolats
P 416, P 427, M 862, chez des boutures
inoculées. On peut noter que chaque isolat testé aboutit au dépérissement
foliaire
avec
toutefois
de
légères
différences
dans
la cinétique
d'établissement du symptôme.
Réaction des tissus hôtes inoculés par le
champignon
ou par le filtrat stérile de son milieu de croissance.
Une comparaison des incisions d'inoculation des boutures, selon que
l'on utilise le champignon ou le filtrat stérile de culture, permet de
distinguer le fait suivant:
les plantes inoculées avec Ceratocystis fimbriata ne présentent aucun
développement callogène de cicatrisation (fig. 20) contrairement aux
plantes témoins (fig. 24, 25, 26).
Dans une autre série expérimentale, des boutures de même âge ont été
inoculées. dans les mêmes conditions que précédemment, sauf que
l'inoculum est constitué par le filtrat de culture du champignon.
On observe le même symptôme que celui obtenu en présence du
pathogène à savoir l'absence de cicatrisation (fig. 27).
92
Séverin
AKE
Développement ct 'un chancre.
Le développement d'une tâche brunâtre (fig. 20) au niveau de l'écorce,
à partir des incisions d'inoculation, peut être
observé à partir de huit
semaines.
Ce développement chancreux progrèsse de part et d'autre de ce point
d'inoculation, de manière presque uniforme. Les parties caulinaires
atteintes sont nécrosées et sèches.
Le développement du chancre ne commence pas simultanément chez
l'ensemble des boutures inoculées. Pour chacun des trois isolats de
Ceratoc)'stis fimbriata , on peut déterminer une vitèsse moyenne de
développement du chancre au niveau des tiges principales inoculées, de 10
mm de diamètre environ: 1,3 mm /j pour l'isolat P 427, 1,4 mm /j (isolat
P 416) et 0,9 mm /j (isolat M 862).
Les fig. 28 à 30 représentent des coupes tangentielles dans des tissus
immédiatement adjacents au front de progression du chancre.
On peut remarquer un développement mycélien à l'intérieur des cellules
de l'écorce (fig. 28) et également des vaisseaux conducteurs (fig. 29).
Les
hyphes
mycéliens
se
ramifient
et
traversent
les
jonctions
intercellulaires (fig. 28) et passent à travers des ponctuations de
vaisseaux conducteurs (fig. 29,30).
On observe également un brunissement interne et externe des parois
des cellules envahies (fig. 28, 29).
Pathogenèse in vivo
93
CI DISCUSSION.
L'évolution comparée des symptômes induits par les différents isolats
de C. fimbriata, traduit des caractéristiques similaires de virulence.
Ceux-ci pourraient provenir d'une souche virulente commune dite "souche
marseillaise" dont le foyer initial de dissémination recoupe en effet les
lieux de provenance de ces isolats (FERRARI et PICHENOT, 1974).
Quel '1u~ soit l'isolat, le premier symptôme visible est un dépérissement
foliaire qui affecte les parties terminales des boutures mais aussi les
parties basales par rapport au point d'inoculation.
Durant ces symptômes, des essais de révélation (en déposant des
fragments de tiges sur un milieu nutritif PDA) de la présence du
champignon dans les parties de tige en dehors du point d'inoculation, et
des tissus immédiatement adjacents, ont été négatüs.
Ce fait semble être en faveur d'une croissance limitée du pathogène
dans les tissus avant le dépérissement, et indique que la plante limiterait
dans un sens, le développement des hyphes mycéliens jusqu'à ce que les
symptômes primaires surviennent.
Ces
observations
suggèrent que ces
premiers
symptômes
de
dépérissement foliaire ne résulteraient pas d'une action physique liée à la
croissance
directe
du
pathogène,
par exemple
une
insuffisance
d'approvisionnement hydrique par le système vasculaire, qui serait
consécutive à un envahissement total de ce végétal par le chan1pignon.
94
Séverin
AKE
Dans d'autres cas de pathologies
impliquant des champignons,
certains auteurs (STRUCKMEYER et al.,1954; WILSON,1961; YOUNG,
1969) ont décrit l'absence générale d'hyphes
et de conidies dans les
tissus
hôtes inoculés avant l'expression de symptômes de dépé-
ris sements.
L'hypothèse d'une occlusion locale de gros vaisseaux conducteurs, ne
nous paraît pas applicable dans ces symptômes primaires, bien qu'elle
puisse être effectivement vérifiée dans une phase postérieure très avancée
de la pathogénèse (FERRARI et PICHENOT, 1974).
Au contraire une action de substances émises, est plus vrai;..semblable
dans ces symptômes. Si tel est le cas, on pourrait penser:
--
-soit à des polysaccharides produits par le pathogène, ou clivés des
parois des vaisseaux par des enzymes hydrolytiques, qui obstruant les
petits vaisseaux dans les pétioles et les feuilles, conduiraient à une
restriction du transport latéral (STROBEL, 1967).
-soit à un rôle joué par des agents toxiques de dépérissement
(GAUMANN,1958 a; KERN,1972).
Dans ce cas, ces agents produits par le pathogène seraient excrétés
dans tout le végétal; leur accumulation induirait une toxicité croissante à
l'égard des
tissus de l'hôte.
-soit, comme celà a été décrit dans la pathologie chancreuse chez
Populus tremuloides (JACOBI et Mac DONALD,1980), les toxines
pourraient causer directement un développement de chancre, en
provoquant la nécrose des tissus en avance de la progression du
champignon.
Le développement du chancre visible, apparaît comme un symptôme
bien postérieur au dépérissement foliaire. Il présente un aspect de nécrose
limitée qui progresse de proche en proche à partir du point d'inoculation.
Pathogenèse in vivo
95
Les
observations
cytologiques
des
tissus
atteints
et
ceux
immédiatement adjacents, ont effectivement montré des structures du
champignon en développement.
La réaction de coloration brunâtre observée au niveau des parois des
tissus envahis, semble être une réponse hôte. Elle peut être expliquée
probablement par l'accumulation où l'oxydation de composés phénoliques
similaires à ceux décrits par GAGNON (1957) dans des coupes de tissus
chez le genre Vlmus, infectés par Ceratocystis ulmi.
Bien que,des hyphes soient couramment observés passant à travers les
..~. - ,-
parois cellulaires - soit par les pores des vaisseaux et par d'autres
jonctions intercellulaires probablement de type "plasmodesmes"- on ne
peut dire clairement s'il y a une pénétration directe active de la paroi en
dehors de ces ouvertures naturelles.
L'ensemble de ces observations permet de suggérer que le symptôme
de développement du chancre "sensus stricto", apparaît être une
conséquence directe du développement du champignon.
Ce symptôme étant bien postérieur dans la pathogenèse, on peut penser
que,
d'une
manière
indirecte,
les
effets
toxiques
qui
seraient
probablement en cause dans le symptôme de dépérissement 'foliaire,
conditionnent cet envahissement rapide ultérieur des tissus hôtes par le
champignon.
Par ailleurs, la comparaison des incisions des boutures inoculées par le
champignon, avec des plantes témoins, révèle une perte de la capacité
naturelle des premières à former des cals de cicatrisation, c'est-à-dire une
incapacité des tissus à entrer dans un processus de division cellulaire
active.
96
Séverin
AKE
Ce symptôme ne concerne pas uniquement l'entaille d'inoculation mais
l'ensemble du végétal, comme celà a été décrit par ailleurs (VIGOUROUX
,1985; ANONYME,1984,1985).
Dans ce type de symptôme, le champignon ne semble pas être
directement mis en cause.
En effet, quand on inocule des boutures de platane, dans les mêmes
conditions d'expérimentation, avec du filtrat de culture stérile du
champignon, on détermine le même type de réaction chez l'hôte.
Ces observations suggèrent que des métabolites du champignon
seraient excrétés dans le milieu de croissance, et interféreraient
négativement dans la formation de la callogénèse cicatricielle.
Cette hypothèse corrobore celle formulée à propos du dépérissement
foliaire.
Dans ces deux types de symptômes primaires, des substances
différentes pourraient être mises en cause.
Si tel est le cas, celles-ci pourraient agir séquentiellement ou ensemble
dans la pathogenèse et avoir des cibles différents dans leurs effets
physiologiques. Toutefois rien ne permet de retenir une telle conclusion,
en effet il peut y avoir identité entre les métabolites qui seraient
impliqués.
D'autres espèces de Ceratocysris ont été rapportées, comme produisant
des quantités détectables de matériels toxiques qui n'ont toutefois pas été
purifiés.
En ce qui concerne Ceratocysris fimbriara E et H f platani, ces
quelques particularités dans la pathologie du chancre coloré du platane
dont il est responsable, sont en faveur d'une influence déterminante
préalable de métabolites toxiques du pathogène.
Pal/zogenèse in vivo
97
Certes
nous
n'avons
pas
observé
de
symptômes
foliaires
caractéristiques, pouvant être pris en compte chez la totalité des boutures
inoculées avec le filtrat stérile de C. jimbriata ..
A ce sujet, il convient de remarquer que les conditons d'une meilleure
pénétration de la totalité du filtrat inoculé, au niveau des incisions,
doivent être améliorées.
Egalement les concentrations en substances actives, du volume de
filtrat introduit, pourraient n'avoir pas atteint un seuil de toxicité
induisant des symptômes foliaires caractéristiques, même si l'inhibition
de la formation de cals de cicatrisation est déjà effective.
98
Séverin
AKE
.......;0....
.. ",.
CHAPITRE VI:
ETUDE DES RELATIONS HOTE-PATHOGENE IN VITRO
SUR DES CULTURES
DE CALS DE
PLATANE.
AI INTRODUCTION.
Nous venons de montrer les différents aspects de la pathogenèse in
vivo. Mais quelle serait le comportement de C. fimbriata sur des cultures
in vitro de tissus de cals isolés de l'hôte?
Nous avons recherché une expression des interactions entre le
champignon et l'hôte cultivé in vitro.
En effet, des cultures associées hôte-pathogène ont été utilisées par de
nombreux auteurs pour des études, notamment du comportement de
parasites obligatoires, mais aussi de l'expression de la résistance aux
pathogènes chez les tissus végétaux mis en culture (chap:l,§ B 2).
99
FIGURES 31 et 32: Images au MEB de tissus de cals de
platane, infectés par
C.fimbriata.
FIG. 31: Germination de spores de C. fimbriata , sur les cals inoculés
directement, ainsi que leur développement en hyphes mycéliens G= 4296.
FIG. 32:
Colonisation mycélienne des tissus de cals, suivant les
contours des amas cellulaires. (C): contour cellulaire, (HM): hyphe
mycélien, (Sp): spore. G= 4296.
100
Séverin
AKE
Pathogen'
ese in
.
vitro
101
FIGURE
33: Images obtenues au MEB de tissus de cals de
platane infectés par C .fimbriata.
Développement et enchevètrement mycéliens reliant des amas
cellulaires non contigüs, au sein des tissus.
FIGURES
34 et 35:
Images obtenues au MET de tissus de cals
de platane infectés par C.
fimbriata.
Surface de cellules hôtes présentant un affaissement plus ou moins
accentué au contact des structures du pathogène. G= 13070.
FIG. 34: Hyphe infectieux (HM).G= 8990.
FIG.
35: Formation d'une pointe de pénétration, par une spore
du
champignon au contact de la paroi cellulaire. (P): G= 4851.
102
Séverin
AKE
·.-d.
N\\~~~~
.~"
-.
_.
''''.-
&
Pachogcnèse in vitro
103
FIGURES 36 à 39:
Images obtenues au i\\1EI3 ct au i\\1ET de
tissus de cals de platane infectés par C. fimbriata.
FIG. 36, 37, 39: Pénétration des cellules hôtes par des hyphes
infectieux. La pénétration dans chaque cas est perpendiculaire à la paroi
de la cellule hôte. On peut noter la constriction de l'hyphe au passage par
la paroi. G= 21022 (fig.36)
G= 25078 (fig.37).
FIG. 38 et 39:
Formation de structures de type "appressorium", à
partir desquelles des hyphes infectieux pénètrent les parois des cellules
hôtes. 38:
(MEB) Appressorium formé
à
l'extrémité d'un hyphe
intercellulaire.G x 2508. 39: (MET)
Constriction de l'hyphe infectieux à
travers la paroi (flèches), suivie d'un élargissement à l'intérieur du
cytoplasme.G= 22138.
104
Séverin
AKE
EXT
';-.,
!NT
. f ; .
,;;~,!, : ..__.
.,!"--,,,*-~.
)
.'
36
37
-1-
38
39
,
PalhogcnesC IOn vitro
105
EXT
40
FIGURE 40: Image au MET d'une coupe de cellule dans des
tissus de cals de platane infectés par C. fimbriata.
Détérioration localisée, affectant la paroi pectocellulosique envahie
entre les couches interne et externe, par des hyphes infectieux.G= 5888.
106
Séverin
AKE
BI RESULTATS.
Observations pathologiques de tissus de cals infectés.
Des cals de 3 semaines sont infectés par dépôt en surface d'un
fragment de mycélium. Les observations au microscope électronique à
balayage 6 j après l'inoculation, montrent que les spores du champignon
germent et développent des hyphes mycéliens sur les tissus de cals
directement inoculés (fig. 31).
Les hyphes en développement suivent les contours cellulaires et
apparaissent étroitement accolés aux parois des cellules (fig. 32), mais
également fonnent des liaisons entre des amas cellulaires non contigüs au
sein des tissus (fig. 31 et 33).
Le mycélium peut former des structures de type "appressorium" à partir
desquelles les hyphes infectieux pénètrent les parois (fig. 38 et 39).
Toutefois cette structure n'est pas systématiquement formée dans tous les
cas de pénétration (fig. 36, 37).
Les figures 34, 35, 36, 37 et 39
montrent la pénétration de cellules
hôtes par le champignon.
La surface des cellules hôtes (fig. 34 et 35) présente un affaissement
plus ou moins accentué, au contact des hyphes mycéliens du champignon.
Par contre les figures 36, 37 et 39, sont des exemples de pénétration
active fréquemment observés. Dans ce cas, la pénétration de cellules hôtes
par les hyphes infectieux se fait perpendiculairement (ou presque), à la
Pathogenèse in vitro
107
FIGURES 41 à 42: Images obtenues au MET de tissus de cals
de platane non inFectés.
Les cellules paraissent isolées au sein des tissus (fig. 42a). On
remarque la forme régulière et presque arrondie des parois cellulaires
(fig. 41a, 42a). (Vac): vacuome très important et uniforme. (Cy):
cytoplasme pariétal. (N): noyau. (Nu): Nucléole se présentant sous forme
d'une seule inclusion très dense aux électrons.G= 5153.
FIG. 41b: on peut observer: le plasmalemme (MP), très accolé à la
paroi(P), l'enveloppe nucléaire(EN) très dense et continue.G= 14788.
FIG. 42b: cellules filles
de tissus de cals de platane. On remarque:
une paroi intermédiaire (PI) moins épaisse, que la paroi externe, le
réticulum endoplasmique (RE) en spires concentriques très denses aux
électrons. (M): mitochondrie, (Pl): plaste.G= 5888.
108
Séverin
AKE
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110
Séverin
AKE
surface cellulaire (fig. 34, 36, 37 et 39).
Au point de pénétration des cellules hôtes, les hyphes infectieux
subissent une constriction, puis s'élargissent de nouveau dans le
cytoplasme de la cellule infectée (fig.36, 37,39).
Cependant la paroi elle-même peut être envahie entre ses deux couches
interne et externe par des hyphes d'infection (fig. 40).
Modifications ultra-structurales.
Les observations au MET montrent que les cellules saines de cals de
platane présentent en coupe, une forme presque arrondie, avec des
cellules non contigues (fig. 42a).
Le contenu cellulaire est occupé dans la presque totalité, par une
grande vacuole. Le cytoplasme est rejeté vers la périphérie, appliqué
contre la paroi pectocellulosique (fig. 41 et 42).
Les cellules infectées par le champignon présentent des modifications
morphologiques: Les cellules sont très irrégu lières, apparaîssent plus
grandes (fig.43); le vacuome présente des rétrécissements par endroits
(fig. 46, flèches).
Le dévéloppement des hyphes infectieux intracellulaires (fig. 45)
entraine des modifications à différents niveaux: le vacuome est perforé de
pan en pan, le tonoplaste est morcelé en plusieurs panies (fig. 43 et 44).
entraînant la formation de petites vacuoles ou de vésicules (fig. 44 et
45).
Certains organites cellulaires sont modifiés dans leur nombre et/ou
dans leur structure.
Ainsi les noyaux des cellules infectées présentent un état de
dégénérescence
(fig.47
et
48).
La
structure
nucléaire
apparaît
companimentée: des zones de granulations très denses aux électrons
entourent d'autres zones de granulations moins denses. Le noyau est
parfois envahi par des hyphes mycéliens intracellulaires (fig. 47).
Pathogenèse in vitro
111
FIGURES 43 à 49: Images obtenues au MET de tissus de
cals
de
pla ta ne,
infectés
par C.fi ln b ri ala::
mod ifica tions
pathologiques structurales.
FIG. 43,44: hyphes infectieux (My) pénétrant des cellules hôtes. On
note un affaissement de la paroi autour du point de pénétration (fig. 43
flèches), une perte de sa rigidité (déformation cellulaire) par rapport à
celle des cellules non infectées. Il y a rupture du tonoplaste, avec
formation de petites vésicules (Vs). Le vacuome (Vac) est morcelé (fig.
43, 44).G= 4418 (fig.43); G= 5888 (fig.44).
FIG. 45:
grande rupture tonoplastique faisant apparaitre un cordon
cytoplasmique (Cc), et des vacuoles (vac). Le noyau (N) est
en état de
dégénérescence.G= 5153.
FIG. 46: déformation cellulaire très accentuée. On note un décollement
important du tonoplaste, donnant l'aspect d'une "fausse plasmolyse"
(flèches).G= 7358.
FIG. 47 à 49: dégénérescence nucléaire présentant des petits amas de
zones granulaires plus ou moins denses; le nucléole (Nu) se présente sous
forme de 3 à 4 zones denses. Des inclusions fibrilaires (If) sont en
faisceaux, dans une matrice amorphe (Ma) ( If) (fig. 47, 48).
47:
noyau envahi par des hyphes mycéliens intracellulaires. G=
17768.
48: enveloppe nucléaire (En) de noyau en début de dégénérescence,
amaincie et discontinue.
De nombreuses mitochondries (M),sont
présentes entre le noyau et la paroi pecto-cellulosique.G= 22138.
49: détail d'une inclusion paracristalline en forme de faisceaux
fibrillaires à l'intérieur d'un noyau dégénerescent.G= 135043.
112
Séverin
AKE
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114
Séverin
AKE
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115
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49
116
Séverin
AKE
L'enveloppe nucléaire apparaît irrégulière et mince (fig. 48), le nucléole
se désagrège (fig. 41, 47 et 48).
Dans ces noyaux dégénérescents, des inclusions paracristallines sous
forme de faisceau de fibres dans une matrice amorphe (figures 47, 48 et
49) sont fréquentes.
Autour du noyau
en dégénérescence, des mitochondries apparaissent
plus nombreuses du côté accolé à la paroi cellulaire (fig.48). Une
comparaison avec c1es cellules saines montrent que clans les cas
pathologiques, les
mitochondries semblent réduites dans leur taille (fig.
41,42 et 48).
Par ailleurs des peroxysomes sont souvent observés au voisinage du
réticulum endoplasmique - très dense aux élec trons - dans les cellules
saines comme dans les cellules infectées(fig. 42 et 50 à 53).
CI DISCUSSION
Les résultats obtenus lors de l'infection des tissus de cals de platane
in vitro
mettent en évidence la colonisation des tissus de l'hôte par le
champignon et sa capacité à pénétrer ces tissus.
Cette pénétration semble se faire dans certains cas par l'intermédiaire
de structures de type "appressoria", fortement accolées à la paroi des
cellules hôtes.
La détérioration localisée de la paroi, consécutive au développement
mycélien entre les couches externe et interne, semble être un effet
purement mécanique.
Les hyphes infectieux pénètrent les cellules
hôtes
avec une
constriction
lors du franchissement de la paroi. L'observation
de ces
points de pénétration ne justifie pas une action mécanique, malgré le fait
que la paroi cellulaire immédiatement en contact avec les structures
d'infection du pathogène, puisse présenter une légère dépression.
Pathogenèse in vitro
117
FIGURES
50
à
53:
Ultrastructures
cellulaires
dans
des
tissus
de cals
de platane, infectés par C. fimbriata, observées
au MET.
Filaments concentriques denses de réticulum endoplasmique (RE) (fig.
50,51,53). (va): vacuoles (fig.50). G~
23100.
Péroxisome (Ps), avec nuc1éoide (nc) bien visible (fig. 50), ou associé
au RE (fig. 51).G == 25078
Plasmalemme (MP) bien délimité par rapport à la paroi (fig. 50, 51,
53). On peut noter quelques points de décolements (invagination ?) (fig.
51, 53).
Mitochondries (M) (fig. 51, 52), et plastes (Pl) présentant des globules
lipidiques (gl) et des corps prolamelaires (Cpr) (fig. 52, 53) G::;
29488
(52).
118
Séverin
AKE
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50, 51
52'53
f'wilOgcni:se in vitro
119
Il est probable, vue la topographie des tissus de cals, telle qu'on
l'observe au MEB, qu'un affaissement localisé au niveau de la fonne
cellulaire puisse présenter en coupes histologiques, de telles figures.
Au contraire, la pénétration de la paroi par les hyphes infectieux du
pathogène serait due à un ramollissement pariétal de nature chimique.
Vraisemblablement des enzymes libérées assoupliraient la paroi et
faciliteraient la pénétration.
Cette hypothèse est corroborée par le fait que la production d'enzymes
dégradant la paroi chez des esp~ses de champignons apparentées, a été
déjà suggérée (HIGGINS, 1961).
Observée au MET, la pénétration des cellules hôtes par le pathogène
provoque un effondrement des structures de la paroi, qui entraîne la perte
de sa rigidité.
Les modifications qui surviennent au niveau de la forme et de la taille
des cellules hôtes, traduisent des effets d'hyperplasie et d'hypertrophie
suivie du développement intracellulaire des hyphes mycéliens de
C eratocystis jimbriata.
Les modifications intracellulaires ne semblent concerner que certains
organites, par exemple celles survenant au niveau de l'activité vacuolaire
totale, mitochondriale, et peut-être aussi des peroxysomes - souvent
observés dans ces cellules -.
Nous ne savons pas précisément ce que représente l'association entre
les filaments du réticulum endoplasmique et
les peroxysomes dans ces
cellules infectées.
Mise à part le fait que ces organites sont formés par bourgeonnement
du réticulum endoplasmique lisse (BERKALOFF et al.,198l), il a été
rapporté qu'une forte activité peroxysomale semble d'avantage impliquée
dans le développement d'un mécanisme général de
résistance, comme
l'intensification du processus de lignification, plutôt que dans une action
120
Séverin
AXE
spécifique directe, visant à détruire le pathogène.
Une conclusion parallèle ressort des travaux de
COULOMB et
COULOMB (1973), sur l'activité peroxydasique dans les cellules hôtes
chez le genre Capsicum, après infection.
Une autre caractérisque révélée au MET concerne les modifications
intranucléaires. Alors que dans les cellules saines, le nucléole se présente
généralement sous fomle d'une seule condensation granulaire dense, les
noyaux dégénérescents des cellules infectées présentent deux ou trois
condensations nucléolaires plus petites, au voisinage de structures
particulières en faisceau de fibres dans une matrice amorphe.
Bien
que,
contrairement
au
nucléole,
de
telles
structures
paracristallines ne constituent pas des composants indispensables du
noyau, certains auteurs (FREY-WYSSLING et MÜHLETHALER, 1965)
ont suggéré qu'une interaction existerait entre ces deux inclusions
nucléaires, de sorte qu'à une diminution du volume du nucléole
correspondrait une augmentation de la taille de cette formation fibreuse, et
inversement. Ces inclusions ont été décrites par ces auteurs comme une
forme de stockage de substances de réserve.
Pour d'autres elles représenteraient . des indices de perturbations
physiologiques.
En effet, TISCHLER, (1934) et KÜSTER (1951) ont rapporté que chez
certaines familles de plantes, les noyaux cellulaires contiennent une
protéine cristalline. De telles structures disparaitraient quand la plante
souffre d'un stress de malnutrition. Ainsi, les noyaux cellulaires de
Pinguicula* (KLEIN, 1882) qui contiendrait de gros critaux durant le
printemps, ne contiendraient plus ceux-ci pendant l'hiver. Si des
protéines sont fournies artificiellement à travers les feuilles, à ce végétal
insectivore, des vacuoles protéiques sont générées à l'intérieur du noyau
(SAURER, 1962).
Ces
travaux renforcent le point de vue selon lequel ces inclusions
seraient une forme de stockage
de substances de nature protéique.
BARTON, (1967) et ARSANTO (1973) ont également suggéré une origine
protéique possible de telles inclusions, ainsi que le matériel amorphe dans
Patlzogenèse in vitro
121
lequel elles sont observées, chez une fougère du genre Asplenium .
RICHTER
(1958)
a
indiqué
que
ces
structures
paracristallÏiles
représenteraient aussi un indice de troubles pathologiques.
Cette dernière hypothèse est en accord avec nos observations. Celles-ci
suggèrent que la présence de ces structures proches du nucléole est en
faveur d'une interaction étroite avec celui-ci.
Ces
structures
constituent
vrais semblablement
une
réaction
intranucléaire d'une désorganisation pathologique, puisque les cellules
concernées ont été infectées par le champignon pathogène C. fimbriata.
Nous
n'avons
pas
connaissance
toutefois
de la signification
physiologique de ces structures quand à leur aspect de faisceaux
fibrillaires en forme de "balai".
122
Séverin AKE
· .
CHAPITRE VII :
EFFET DE PRESSION SELECTIVE
DU FILTRAT DE CULTURE DU CHAMPIGNON
SUR LES
CULTURES
DE
CALS.
EXPRESSION DE LA RESISTANCE
AU PATHOGENE.
AI INTRODUCTION.
Comme nous venons de le discuter dans les expérimentations in vivo
au chapitre V, le filtrat stérile de culture du champignon, exerce une
inhibition
sur
la
réaction
callogène
de
cicatrisation.
Nous
l'expérimentons, à titre de comparaison, sur les cultures de tissus de cals
de platane, dans le cadre de l'étude des relations hôte-pathogène in vitro.
D'autre part, comme nous l'avons indiqué au chapitre 1 (§ B _ ), dans
2 3
une perspective de sélection in vitro pour la résistance à une pathologie,
une des techniques très employées consiste
à soumettre le matériel
végétal à l'action d'agents chimiques liés à la pathogenèse. Sur ce plan
aussi, le filtrat de culture de C. fimbriata pourra permettre d'induire et de
sélectionner des lignées cellulaires.
123
B/ RESULTATS.
Effet du filtrat de culture de Ceratocystis fimbriata
L'incorporation du filtrat de culture du champignon est réalisée selon
le protocole expérimental décrit au § C 1-5. Le tableau X présente
l'inhibition comparée de la croissance de cals mis selon le cas, en
présence de concentrations croissantes (2 à 40 % v/v) de milieu PDA ou
de filtrat de culture, avec la croissance de cals témoins. Après
20 j de
culture, les masses de matières ,fraîche et sèche sont respectivement
déterminées.
En présence de 40 % du filtrat de culture du champignon, ajouté au
milieu synthétique MS, la croissance des cals, exprimée en masse de
matière fraîche, subit une inhibition de 68 %, accompagnée d'un
brunissement des tissus (fig. 54 et 55). Un effet inhibiteur de 30 % est
obtenu sur la croissance des cals en milieu MS additionné d'extrait du
milieu PDA à 40 %.
InduCtion et sélection de lignées cellulaires
Après 4 à 6 semaines, certains cals mis en présence de filtrat toxique
(40 % v/v) présentent des zones de croissance active, détectables par leur
couleur plus claire par rapport à la masse brune nécrosée du reste des
tissus (fig. 56 et 57).
124
Séverin
AKE
Ces ilôts cellulaires qui semblent échapper à la toxicité du filtrat de
culture du pathogène en maintenant une croissance active, sont remis une
deuxième fois en culture, en présence de filtrat, avant d'être multipliés
par 3 à 4 cycles de transferts (4 x 20 jours) pour le test d'expression de la
résistance, sur un milieu nutritif neuf MS.
Expression de la résistance de lignées cellulaires
sélectionnées
en présence du filtrat toxique.
La fig. 58 montre l'évolution en fonction du temps du développement
d'hyphes mycéliens sur des lignées cellulaires de cals en phase
stationnaire de croissance (20 j), inoculés directement avec les spores de
C eratocystis fimbriata .
La description visuelle de l'accroissement de la colonisation des tissus
est facilitée par la formation progressive, à partir d'hyphes mycéliens, de
structures de reproduction que sont les périthèces.
Des différences dans le développement mycélien, deviennent évidentes
2 j après l'inoculation.
-Dans certaines cultures (courbe II fig. 58 A), le développement
mycélien devient très vite important et couvre plus de 50% des tissus, au
bout de 5 j. Dans les 3 j qui suivent, les tissus sont totalement recouverts
par des hyphes mycéliens de C. fimbriata (fig. 59).
Cette évolution de la colonisation est comparable à celle observée sur
des tissus de cals non sélectionnés pour leur croissance en présence du
filtrat toxique du champignon.
Il ressort de ces observations que certaines déscendances cellulaires
parmi les cals sélectionnés pour leur croissance active, sont encore
sensibles au champignon.
Pression sélective. expression de la résistance - in vitro
125
-Dans d'autres lignées cellulaires par contre, aucun développement
mycélien est observé (courbe t4 fig. 58 A) (courbes t l t2 t3 t4. fig. 58 B)
(fig. 61). Ces lignées cellulaires expriment donc une résistance au
développement mycélien du champignon.
-Entre ces 2 types de réactions opposées, il existe des réactions
intermédiaires qui sont figurées par les courbes t2 et t3 (fig. 58 A et fig.
60). Dans ces cultures, 5 j après l'inoculation, le développement mycélien
couvre moins de 50% des tissus. Mais au bout des 3 j suivants le
développement devient très important (> 50%) (courbe t , fig. 58 A).
2
La
courbe t3 (fig. 58 A) montre des cas de lignées cellulaires sur
lesquelles la colonisation mycélienne débute tardivement, seulement à
partir du 6 ème j après l'inoculation. Mais dans ce cas, le développement
mycélien est localisé et demeure très inférieur à 50 % même jusqu'au
14ème j de culture (fig. 60).
Aucun développement mycélien n'est observé sur des tissus témoins
sélectionnés pour leur croissance active en présence du filtrat stérile, mais
inoculés par le champignon.
Des observations plus fines des tissus hôtes au MEB dans les 2 cas
d'interactions sensibles et résistantes, révèlent que:
-La colonisation mycélienne est effectivement importante, avec
formation de nombreux périthèces sur les tissus sensibles (fig. 62 et 63).
-Dans les interactions résistantes, on n'observe pas de colonisation de
l'ensemble
des
tissus
hôtes
(fig.
64).Toutefois
un
très
faible
développement mycélien à partir des spores, limité à l'endroit de
l'inoculation, peut être décelé (fig. 65).
126
Séverin
AKE
TABLEAU X: Inhibition comparée de la croissance de cals de
Platanus
acérifolia
sur
milieu
de
culture
synthétique
MS
additionné: soit de milieu PDA, soit de filtrat de culture de C.
fim briata (isolat P 416).
Le filtrat provient d'une culture agée de 20 j, réalisée en milieu PDA
liquide. Les cals proviennent de culture en fin de phase exponentielle de
croissance (15 j) et sont repiqués sur milieu synthétique. Les cals sont
mis selon le cas, en présence de concentrations croissantes (2 à 40 % v/v)
de milieu PDA ou de filtrat de culture.
Les mesures de masses de matières fraîche et sèche sont réalisées après
10 j et sont exprimées en % par rapport au témoin. Chaque valeur fournie
est une moyenne de 8 mesures.
Concentration
Taux d'inhibition de la
croissance des cals
par rapport au témoin (%).
Milieu PDA (%)
Filtrat âe culture
de C.fimbriata
Matière fraîche
Matière sèche
2
0
15
la
20
a
15
15
35
a
35
35
a
2
8
15
a
20
35
35
a
40
68
65
Pression sélective. expression de la résistance - in vitro
127
FIG URES 54 et 55: Cultures de tissus de cals de Platane, en présence
ou en absence de filtrat de culture de C. fimbriata .
FIG. 54: Cultures de cals témoins à 20 j de croissance, sur milieu de culture (MS)
FIG. 55: Cultures de même âge, dont les tissus ont été inoculés avec du filtrat stérile
de culture du champignon. On remarque la très forte inhibition nécrotique de la croissance
des tissus par rapport au témoin.
128
Séverin
AKE
54
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Pression sélective, expression de la résistance - in vitro
129
FIGURES 56 et 57: Amas cellulaires' en croissance active
(lC) dans des cultures de tissus de cals de platane soumis à
l'effet du filtrat de culture de C.fimbriata.
FIG.56: Cals en présence de 40 % v/v de filtrat stérile de culture du
champignon, après 40 j de culture. Tn: tissus en nécrose; MG: milieu
nutritif gélosé.
FIG. 57: Détail d'amas cellulaires en croissance active, dans des tissus
de cals nécrosés.
130
Séverin
AKE
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56
57
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Pression sélective. expression de la résistance - in vitro
131
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C i n é t i que
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a'il .Y pile s
mycéliens de C. fimbriata
, sur des cultures de tissus de cals
de Platane.
Après plusieurs repiquages [3 ou 4 cycles de culture (3 ou 4 x 20
jours)], les descendances cellulaires issues de cals sélectionnés pour leur
croissance active différentielle, sont inoculées
avec 5 J..1.1 / tube de
suspensions de spores (60 x 104 spores / ml) du pathogène.
Le développement mycélien issu de la gennination des spores, sur les
tissus de cals est évalué dans le temps.
Abscisses: temps en jours
Ordonnées: échelle d'appréciation du développement de hyphes
mycéliens sur les tissus de cals (adaptée de MILLER et MAXWELL
1984).
o : Aucun développement mycélien perceptible
1 : Colonisation très faible: 2 % de la totalité du cal
2 : Plage mycélienne égale à 50 %
4
:,Plage mycélienne égale à 75 %
5
: Colonisation totale des tissus par les hyphes mycéliens.
(1 l' 12' 13' 14) = Tissus de cals multipliés à partir d'amas cellulaires
A ou B sélectionnés pour leur croissance active en présence de filtrat
toxique de C. fimbriata.
132
Séverin
AKE
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z
®
3
2
58
a
z
6
8
la
12
14
Pression sélective. exp·ression de la résistance - in vitro
133
FIGURES 59 <1 (lI:
Evaluation de la résistance: cultures de
tissus
de
cals
de
platane
inoculés
avec
des
spores
de
C.
fimbriata.
Les cals sont issus de la multiplication d'amas cellulaires sélectionnés
en présence de filtrat toxique de C. fimbriata , pour leur croissance
différentielle active.
FIG. 59: Colonisation précoce et totale de la totalité des tissus, par le
champignon: interaction de type sensible
FIG. 60: Colonisation tardive et partièlle, localisée sur les tissus de
cals; hétérogenéité de la population cellulaire:
résistance ou sensibilité
partielles.
FIG. 61:
Aucune structure de croissance du champignon n'est
observée sur la totalité des tissus: résistance totale.
134
Séverin
AKE
c.n
<.Cl
C>
o
C>
....
59
60
61
Pression sélective. expression de la résistance - 111 vitro
135
FIGURES
62 et fi3 : MEB de cultures de cals de platane,
sensibles au C. fimbriata.
Dans
cette
interaction
de
type
compatible,
on
observe
un
développement précoce de hyphes mycéliens à partir des spores.
FIG. 62: Observation de la surface de tissus, montrant des spores en
germination (Sp) suivie d'un développement mycélien(flèches). Des
périthèces (Pt) sont formés. G= 640.
FIG., 63:
Vue rapprohée de spores (Sp) germées. On remarque le
mycélium (My) enchevêtré entre les cellules (C). G= 8990.
136
Séverin
AKE
-1rf "".
'. "':."
. 1"-.
Pression séleclive. expression de la résiswnce - in vilro
137
FIGURES
64
et
65: Images au
MEB de tissus de cals de
platane, inoculés avec C. fimbriata.
FIG. 64:
Observation générale de la surface d'un cal résistant. Dans
cete interaction de type incompatible, on n'observe pas de colonisation
mycélienne des tissus, contrairement à l'interaction sensible (fig. 62). G=
870.
FIG. 65:
Vue rapprochée de tissus de cals(c) résistants. Dans cette
interaction résistante où les tissus n'apparaissent pas colonisés (fig. 64),
on peut remarquer qu'il y a une germination de spores, qui conduit à un
développement mycélien, cependant très réduite et localisé (flèche). G=
3450.
138
Séverin
AKE
Pression sélective. expression de la résistance - in vitro
139
CI DISCUSSION.
Dans le système de culture de tissus de cals in vitro, les résultats ont
montré:
- D'une part, que le filtrat de culture stérile du champignon, inhibe
fortement la croissance de ces cultures de cals. Cet effet en présence du
filtrat, peut être rapproché de celui que nous avons décrit dans la
pathogénèse in vivo (chap. V), au moins sur le plan de l'inhibition de
l'activité mitotique de la callogenèse.
En rapport aveè le champignon, cette inhibition. exercée in vitro sur les
tissus, est une fois de plus, en faveur d'une excrétion de substances
spécifiques toxiques.
Il apparait évident que de telles substances ne sont pas produites en
réponse. à l'interaction hôte-pathogène, mais semblent faire panie des
produits métaboliques usuels qui résultent du développement du
champignon, puisqu'elles peuvent être produites et excrétées en dehors
des tissus de l'hôte.
-D'autre pan, nous avons montré que des amas cellulaires peuvent être
sélectionnés pour leur croissance active différentielle, par rappon au reste
des tissus dont la croissance est au contraire inhibée en présence du filtrat
stérile de culture du champignon.
140
Séverin
AKE
Dans une deuxième série d'expériences, l'inoculation des descendances
cellulaires issues de ces amas sélectionnés, par le champignon, a révélé
que certaines cultures se caractérisent par l'absence de développement
d'hyphes mycéliens.
Dans
d'autres cultures au contraire, des
hyphes
mycéliens se
développent et colonisent rapidement les tissus sensibles.
Ces observations suggèrent deux remarques importantes:
- des tissus sélectionnés à partir de cals sensibles sont devenus
effectivement résistants au champignon.
- dans ce couple hôte-pathogène, le fait que les tissus hôtes puissent
être colonisés par le développement d' hyphes mycéliens, ou au contraire
qu'il y ait une restriction ou une absence de développement mycélien sur
les tissus, peut constituer un critère valable d'évaluation, respectivement
de la sensibilité ou de la résistance de cultures de tissus in vitro.
Nos résultats sur le couple Platanus acerifolia /Ceratocystis fimbriata
sont corroborés par les travaux de MILLER et MAXWELL (1984) dans les
systèmes de culture in vitro suivants: l'v/édicago sativa 1 Pmm etGlycine
max 1 Pmg.
En effet, ces auteurs décrivent un critère d'évaluation similaire,basée
sur une différence de colonisation des tissus de cals par le pathogène,
dans chacun des deux exemples.
Dans -les interactions
résistantes entre Platanus
acerifolia
et
Ceratocystis fimbriata , le développement du champignon n'est en aucun
cas inhibé de manière absolue. Nous n'avons pas noté de décoloration
spécifique associée à ces interactions.
Pression sélective, expression de la résistance - in vitro
141
Par ailleurs, l'effet de pression sélective du filtrat stérile de culture du
champignon a été effective et indique que l'induction d'une variation de
type résistance à une maladie, est possible et celà sans que les tissus
cultivés subissent au préalable des traitements mutagènes chimiques ou
physiques comme celà a déjà été développé dans d'autres systèmes in
vitro.
Les différences de réactions (sensibles, résistantes ou intermédiaires)
des lignées cellulaires en présence de C. fimbriata, semblent exprimer une
hétérogénéité de la population cellulaire des cals sélectionnés.
De telles différences de réactivité pourraient être dûes à l'existence à la
fois, de cellules sensibles et de cellules résistantes au sein des ilôts de
cals sélectionnés pour leur croissance active différentielle.
Ainsi le fractionnement de ces tissus à chaque transfert sur un milieu
de culture neuf pourrait avoir modifié les proportions relatives des
catégories cellulaires (BEHNKE 1979).
On peut également penser que les tissus sensibles ou ceux ayant un
type de réaction intermédiaire, pourraient comporter des lignées
cellulaires non suffisamment induites vers une résistance, en présence du
filtrat toxique.
Sur un autre plan, en rapport avec la composition hormonale du milieu
nutritif, certains auteurs
(GERALDINE et al.,1978;
MILLER et
MAXWELL, 1983) ont montré que la résistance à la pathologie in vitro,
semble influencée par la concentration en cytokinine~ du milieu de
croissance.
142
Séverin
AKE
MAXWELL (1984) décrit dans le couple Médicago sativa
/ Pmg,
qu'une baisse de la teneur en cytokinine du milieu se traduit par une
modification de la texture des tissus, qui deviennent plus friables. Dans
ces conditions, les tissus présentent un développement mycélien plus
étendu, c'est à dire que ces cals deviendraient apparemment plus
sensibles.
Dans un autre système impliquant Nicotiana tabacum
et Ppn,
GERALDINE et al.( 1978) HELGESON et al.(l972) rapportent que
l'augmentation de la teneur en kinétine ou en benzyladénine, relativement
à la teneur en auxine dans le milieu de croissance, supprimerait la
résistance au champignon.
Dans notre système de culture impliquant Platanus
acerifolia
/Ceratocystis fimbriata, nous n'avons pas étudié l'influence d'une
variation de la teneur en cytokinine dans le milieu nutritif, sur
l'expression de la sensibilité ou de la résistance des cals vis à vis du
pathogène.
-Nous observons toutefois que la teneur en kinétine dans nos cultures
est véritablement très faible « 0,2 J.l.M) , et que les tissus sensibles ou
résistants présentent une texture comparable,c'est à dire qu'il~__~ont peu __~ __
compacts et facilement dissociés en culture liquide agitée.
Cependant, en accord av-e-c-les observations faites par HELGESON et
al. (1978) les lignées cellulaires présentant une résistance, ont été
obtenues dans ces conditions de culture de faible teneur en cytokinine.
Cette étude indique que ce système de culture impliquant les tissus de
cals de Platane et C. fimbriata , est approprié pour l'examen de facteurs
qui pourraient influencer l'expression de la résistance à la pathologie du
chancre coloré du Platane.
Pression sélective. expression de la résistance - in vitro
143
CHAPITRE VIII:
RECHERCHE ET PURIFICATION A
PARTIR
DU FILTRAT DE CULTURE DE Ceratocystis fimbriata ,
D'UNE TOXINE (FIMBRIATANE)
IMPLIQUEE
DANS LA
PATHOGENESE.
N INTRODUCTION.
Comme nous venons de le décrire, les indices de l'existence d'une
excrétion de substances toxiques par C. fimbriata sont nombreux. TI nous
a semblé indispensable de rechercher à partir du filtrat de culture, une ou
des fractions présentant un effet toxique sur la croissance des tissus de
platane. Nous avons orienté nos recherches vers des fractions protéiques.
En effet beaucoup de toxines d'origine
fongiques sont constiuées, en
totalité ou en partie, de protéines. D'autre part dans le dépérissement chez
le genre Ulmus causé par Ceratocystis ulmi , TAKAI et al (1979 a et b)
ont rapporté qu'une protéine, la cérato-ulmine, déterminait les symptômes
de la maladie.
Cette étude est rendue possible par la mise en évidence de l'inhibition
de croissance des cals en présence des filtrats de culture (chap. VII), car
cette inhibition nous sert de test biologique de toxicité.
Fimbriatane
145
BI RESULTATS
Purification et recherche de fractions à activité toxique.
A partir de filtrat de culture préparé et concentré comme celà a été
indiqué (chap. U,§ C - ), le fractionnement sur Biogel P 10 pennet de
l 3
séparer 2 fractions PI et PU;
seulement PI possède l'activité pathogène
(fig. 66 A). Cette fraction représentant 8 % de l'absorbance (à 280 nm)
totale disposée, est re-chromatographiée sur
Sephadex G 75. Deux
fractions sont séparées (fig. 66 B); l'activité pathogène se retrouvant dans
la partie descendante du
2ème pic (fraction GIll). Les deux étapes de
filtration
sur
gel
nous
ont
ainsi
permis
d'obtenir
un
facteur
d'enrichissement de 39 fois.
Le matériel pathogène élué de la colonne de Sephadex G 75 possède
une hérogénéité importante démontrée sur RP-HPLC (fig. 67). Cependant
un seul pic noté
G III-3 possède l'activité pathogène. Cette fraction G
III-3 a été finalement amenée à homogénéité par passage sur la même
colonne ,mais dans des conditions plus résolutives (fig. 68 et 69)
permettant d'éliminer deux produits contaminants représentant 35 % (fig.
69) de l'absorbance à 280 nm. Le facteur d'enrichissement a ainsi été
porté à 540.
146
Séverin
AKE
Détermination de la composition en amino-acides.
Une analyse d'amino-acides (fig. 70, tab. X et XI), des fractions a , b
et
c (fig. 69) a été effectuée après hydrolyse acide (HCl 6N , 110°C
pendant 20 h) sur un analyseur BECKMAN, montrant d'une part le
caractère non protéique des fractions b et c (non montré sur la figure), et
donnant d'autre part, la
composition en amino-acides de la fraction a
(fig. 69, tab. X). 220 pmoles de protéine pathogène ont ainsi été
purifiées.
La masse molaire calculée à partir de cette analyse est de 15
044 D, en accord avec le comportement chromarographique sur Biogel P
10.
Fimbriatane
147
FIGURE 66:
Gel filtration de filtrat de culture de Cerato-
cystis fimbriata (P 416).
A: Séparation sur Biogel PlO. Les hachures représentent les fractions
possédartt une importante activité toxique.
B: Re-chromatographie du pic Pl en sortie de Biogel, sur Sephadex G
75. Les parties hachurées (G ID) correspondent aux fractions ayant une
activité toxique.
148
Séverin
AKE
A
J
l l
09
,
~I
0,6
0,3
E
c:
0
CO
0
N
,ca
0
10
20
30
Q)
B
()
c:
ca
.c
0,4
G1
~
0
tJ)
.c
<1:
0.3
Oi?
01
o
10
20
30
40
E!ution volume (ml )
66
Fimbriatane
149
FIGURES 67 à 69: Chromatographie en RP-HPLC, sur colonne
ultrosphère octyi 5 J..lm d'un extrait de filtrat de culture de C.
fimbriata.
FIG. 67: Fractionnement du pic GIn' après élution sur Séphadex G 75.
On remarque l'hétérogénéité importante de ce pic G nI . La partie hachurée
(G In -3 ) représente les fractions ayant une activité toxique.
FIG. 68: Enrichissement de la purification du pic Grn-3 .(INJ= inject.
A:fraction nO
28, B: fraction nO
32, C: fraction nO
34, D: re-
chromatographie en conditions très résolutives, des pics (3) provenant de
A B et C.
Comme on peut le remarquer sur la figure 66 B, l'activité toxique se
retrouve dans la 2ème partie
du pic Gill' corespondant à plusieurs
fractions (28 à 34) (fig. 68 A, 68 B et 68 C). On peut donc augmenter
l'enrichissement du pic G III-3.Les conditions de purification plus
résolutives (fig. 68 D et 69), permettent d'éliminer 2 pics contaminants b
etc.
FIG. 69: fractionnement en conditions plus résolutives des pics
d'élution (3) (fig. 68 A B et C),(fig. 68 D plus résolutive).
150
Séverin
AKE
o
o
::J
,......
o
o
6
12
18
1
TErt.ps DE RETENTION (min)
67
Fimbriatane
151
/1
A
(28 )
B
(32.)
•. ......JV~
o
INJ
t
o
5
10
15
20
25
30
TEMPS (min)
68
152
Séverin
AKE
a
/
E
0:
C
=
C\\J
~
CI
=:l
ca
C
c-
INJ
l
\\~/
~l
- - '
\\J
.0
.5
1 0
115
e,o
TEMPS (min)
69
Fimbriatalle
153
FIGURE
70:
Chromatographie
d'amino-acides
de
la
fimbriatane (fraction a du pic G
-
).
III 3
A : Chromatogramme de l'hydrolysat (HCl 6 N à 110 oC, pendant 20
h)
B : Chromatogramme étalon standard
154
Séverin
AKE
75
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225
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-
5'
...p
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~
......
VI
VI
TABLEAU
X~
Composition en amino-acides de fimbriatane~
comparativement à celle de la cérato-ulmine.
Fimbriatane
Cérato-ulmine
( TAKAI et al 1979)
Résidus
nmoles
Rapports
Rapports
Asp
0, 263
* Il,97
( 12 )
14
Thr
0,140
6,37
( 7)
9
Ser
0,502
22,86
( 23 )
16
Glu
0,448
*20,40
( 20 )
7
Gly
0,750
*34,15
( 34 )
12
AIa
0,196
*8,92
( 9)
8
Val
0,152
*6,92
( 7)
9
Met
0,020
0,91
(
1 )
°
ne
0,115
*5,24
( 5)
3
Leu
0,213
*9,70
( 10 )
16
Tyr
0,082
3,73
( 4)
1
Phe
0,087
*3,96
( 4)
2
His
0,022
*1,00
(
1 )
lys
0,148
*6,74
( 7)
arg
0,207
9,42
( 10 )
3
-------------------------------
152
128
156
Séverin
AKE
TABLEAU XIE
Analyse qualitative comparative en amino-acides
de fimbriatane et de Cérato-ulmine.
==================================================
Fimbriatane
Cérato-ulmine
=============================================
Arnino-acides:
aromatiques
0,06
0,03
alcools
-0,20
0,19
acides
0,21
0,16
basiques
0,11
0,03
aliphatiques
0,42
0,45
Poids moléculaires:
15.044
12.923
==================================================
(Valeurs exprimées en fractions de l'unité)
Fimbriatane
157
DISCUSSION
La méthode de purification utilisée, associe des caractéristiques de
taille moléculaire et de degré d'hydrophobicité. L'utilisation dans ce cas,
de colonne semi-microbore (2 mm de diamètre intérieur) a permis la
purification du facteur toxique, inhibiteur de la croissance des tissus de
cals, en
très faible
quantité. 500 pmoles de cette protéine ont été
purifiées à partir de 15 ml de filtrat de culture de Ceratocystis fimbriata
âgé de 20 j. Le comportement en RP-HPLC, dans des conditions de
gradient très résolutives, ainsi que l'analyse de la composition en amino-
acides donnant des valeurs expérimentales très proches des entiers sont
très en faveur d'un haut degré de pureté de cette protéine, minoritaire
dans le surnageant de culture.
Le fractionnement sur Biogel P 10 permet de séparer deux populations
de protéines par leur taille moléculaire. La fraction PI possédant l'activité
toxique est éluée pratiquement dans le volume mort, indiquant un poids
moléculaire apparent d'environ 18 000 D. Ceci est bien en accord avec le
poids moléculaire calculé à partir de l'analyse d'amino-acides (15 044 D).
Cependant, le fractionnement de PI sur Sephadex G 75 permettant la
séparation entre une fraction GIde haut poids moléculaire - puisque éluée
dans le volume mort - et une fraction GIn contenant l'activité pathogène
indique par celle-ci, une masse molaire plus faible. Ceci peut être dû à des
phénomènes d'adsorption sur la matrice du gel séphadex, ces adsorptions
pouvant intervenir du fait de la présence de résidus aromatiques à la
surface de la protéine.
158
Séverin
AKE
Cette protéine nommée fimbriatane (du nom du champignon pathogène
Cerarocystis fimbriata E et H f. platani), peut être comparée à la cérato-
ulmine (CU) de C erarocystis tllmi :
- sur le plan chromatographique, la purification par RP-HPLC de
fimbriatane (FB) révèle un caractère hydrophobe. de même que la CU.
- par ailleurs, ces deux protéines sont co-purifiées avec 2 molécules
non protéiques, possédant une absorption optique à 280 nm. séparées par
leur différence d'hydrophobicité.
- L'analyse des compositions en amino-acides révèle dans les 2 cas.
une taille voisine (15 044 et 13 000 D pour respectivement FB et CU,
ainsi que des compositions voisines. Cependant FB ne possède ni proline
ni cystéine, contrairement à CU, indiquant une conformation peut-être
moins rigide pour FB.
- Une chromatographie d'affinité
sur
Con A Sepharose révèle que
l'activité toxique n'étant pas retenue,
FB ne possède pas de motifs
glycosidiques "high mannose type," lesquels sont les plus représentés
dans les protéines. Un résultat similaire a été obtenu pour CU, protéine
non glycosylée. Un essai de dégradation récurrente selon la méthode
automatique d'EDMAN (EDMAN, 1967; SPACKMAN et al., 1958) n'a
pas permis d'identifier l'amino-acide N-terminal. Cinq cycles ont été
effectués, confirmant celà. FB semble donc posséder une extrémité N-
terminale bloquée, soit par cyclisation de la protéine~contrairement à
CU dont l'extrémité N-terminale est libre (TAKAI et al., 1979 b).
Fimbriatane
159
CONCLUSIONS GENERALES
Les expériences que nous avons effectuées ont abouti aux résultats que
nous venons de discuter respectivement en relation avec:
- l'obtention de matériels biologiques in vitro de Platanus
acerifolia ,
- l'étude des différents aspects de la pathogenèse in vivo
et in vitro,
- la possibilité d'obtenir par.effet de pression sélective,
une résistance in .vitro,
- la recherche et la purification d'une protéine impliquée
dans la pathogenèse de la maladie du chancre coloré
du platane.
Nous avons étudié les caractéristiques et les modalités d'obtention de
matériels biologiques in vitro de platane, sous forme de cultures de tissus
de cals, de suspensions cellulaires, et de microplants régénerés à partir
de bourgeons axillaires.
L'initiation des cultures de cals a été effective, soit à partir de jeunes
rameaux, de feuilles,ou de pétioles foliaires, en pré§ence de 2,4 D (0,1 à
Conclusions générales
161
0,3 J.lM) et de kinétine (0,3 à 0,5 J.lM). La réceptivité des rameaux à la
stimulation callogène est plus importante dans le cas où ceux-ci sont
prélevés en période d'activité cambiale faible ou nulle. Cette réceptivité
est meilleure quand les explants proviennent de rejets formés dans les
parties basales plus âgées du végétal. Nous avons montré que, tant dans
les cultures initiales que dans les cultures indéfinies, la stimulation de la
croissance est toujours auxine et cytokinine-dépendante, bien que les
teneurs d'hormones requises
dans ces dernières soient relativement plus
faibles, de 0, l
à 0,2 J.lM.
Concernant l'établissement de suspensions cellulaires de platane, nous
avons étudié les conditions nutritives de leur réalisation. les résultats ont
montré qu'en milieu liquide agité, les suspensions c·ellulaires de platane
réagissent intensément à une modification de la balance ionique NH4+/
N0 -, par la synthèse et l'accumulation de pigments.
3
Cet effet produit par la modification de l'environnement nutritif, peut
être exploité dans le cadre d'expériences sur la production· de composés
spécifiques in vitro, par la déviation. de voies métaboliques.
Sur un plan phytopathologique, des produits du métabolisme des
phénols (phytoalexines) (KEEN, 1981) ont été impliqués dans le
processus de la résistance aux maladies.
D'autres auteurs dont KUC, (1976) ont cependant montré que dans
certaines cultures de tissus in vitro, des phytoalexines sont normalement
synthétisées aussi bien par des souches résistantes que par des souches
sensibles à un pathogène donné.
Dans le cadre de cette hypothèse sur la production de phytoalexines,
les suspensions cellulaires de platane pourraient constituer un système de
culture adapté pour l'étude de leur induction et de la régulation de leur
biosynthèse.
162
Séverin
AKE
En relation avec l'induction et le développement de microplants de
platane in vitro, nous avons montré là encore que les réactions des
explants en culture sont détem1inées par les conditions nutritives.
Si le 2,4 D est efficace dans la réalisation des cultures de tissus et de
cellules, par contre cette auxine inhibe fortement l'induction de la
caulogenèse à partir des méristèmes axillaires de platane.
La multiplication des vitroplants a été conduite en présence de 6-BAP
et d'ANA. A
ce sujet, la régénération de nombreuses microtiges
adventives, permet de s'interroger sur l'état organogène réel des tissus à
partir desquels elles sont fOm1ées.
Ces tissus constituent-ils des territoires méristématiques latents? Ont-
ils été rendus plus réceptifs dans les conditions d'induction cauldgène des
cultures?
Les observations cytologiques au MET de ces tissus, peuvent apporter
des éléments de réponse.
On comparera dans ce cas leur aspect physiologique par rapport à celui
des autres tissus des
entre-noeuds de tige. Si la deuxième hypothèse se
vérifie, la multiplication pourrait ne plus être de typeconfom1e, ~ cause
notamment de l'induction possible d'une variabilité cellulaire
qui serait
principalement liée à l'effet auxinique du 2,4D.
Dans chacune des deux hypothèses, dans les cas où une callogenèse
interfère avec la régénération de tiges feuillées adventives, les vitroplartts
obtenus pourraient, comme dans le cas de la seconde hypothèse, ne pas
être génétiquement de type confom1e ou modèle parental.
Dans ces conditions, on devrait pouvoir faire un criblage des
vitroplants -regénérés, pour rechercher éventuellement des
variants
présentant des caractéristiques de résistance au pathogène.
Conclusions ginérales
163
Cette orientation sur la possibilité d'utilisation des vitroplantsde
platane, serait une suite logique qui découlerait de nos résultats:
- soit dans des conditions de multiplication de type confonne [dans ce
cas la reproductibilité des conditions d'étude des relations hôte-parasite
est meilleure]
- soit dans des conditions où la régénération est de type non confonne,
afin de sélectionner des variants somaclonaux de platane].
Nous avons étudié les différents aspects des relations hôte-pathogène
entre P latanus acerifolia
et C eratocystis fimbriata , in vivo , et nous
avons aussi recherché l'expression de cette interaction sur le système de
culture de cals in vitro.
I,n
vivo, sur des boutures de platane en serre, l'ensemble des
observations que nous avons faites, pennettent de distinguer des étapes
dans la pathogenèse, que l'on peut regrouper en deux phases:
- aucun développement du chancre n'est visible, le champignon reste
localisé dans la zone d'inoculation, mais détermine déjà chez les boutures,
des symptômes de dépérissement que constituent le dépérissement foliaire
général et l'inhibition des capacités de réaction callogène de cicatrisation.
Ces
observations· suggèrent que ces symptômes sont déterminés
probablement par une action de substances toxiques du pathogène. C'est
effectivement - le cas puisque des boutures inoculées avec du filtrat de
culture du champignon, déterminent dans les mêmes conditions, le
symptôme d'inhibition des capacités de réaction callogène de cicatrisaton.
- dans une
deuxième phase, le développement d'un chancre
sensus
stricto
dans lequel le pathogène détennine une nécrose tissulaire· par
envahissement progressif; apparait être un symptôme postérieur à ceux
164
Séverin AKE
décrits dans la première phase, et qui semble être une conséquence directe
du développement du pathogène lui-même dans les tissus infectés.
Dans cette hypothèse, l'action du ou (des) facteur(s) qui serai(en)t en
cause dans les symptômes primaires décrits dans la première phase,
pourrait avoir conditionné ou facilité indirectement le développement
postérieur du chancre.
III
vitro. sur les cultures de cals de platane, nous avons mIS en
évidence que le champignon colonise les tissus de l'hôte.
La capacité intrinsèque du champignon à pénétrer activement,
probablement par action enzymatique, les parois cellulaires
au sein des
tissus, a été clairement mise en évidence dans nos résultats.
Le filtrat stérile de C. fimbriata
exerce un effet inhibiteur important
sur la croissance des cals.
Une comparaison de l'étude des interactions entre les cultures de tissus
de platane et C. fimbriata d'une part, avec les observations' de la
pathogénèse in vivo sur de jeunes boutures d'autre part, permet de faire
les remarques suivantes:
-la sensibilité de l'hôte vis-à-vis de ce champi .. gnon pathogène
s'exprime donc dans le système de culture in vitro, par la colonisation de
ces tissus hôtes.
-Ceratocystis fimbriata pénètre effectivement à l'intérieur des cellules
hôtes.
-l'inhibition de la croissance des cals par le filtrat stérile seul, peut être
rapprochée de l'inhibition de la formation de cals cicatritiels, observée
dans la pathogénèse in vivo.
Cone/usions générales
165
Concernant l'induction et la
sélection in vitro, les résultats exposés
ont fait ressortir le fait qu'une pression sélective exercée sur les tissus de
cals, à l'aide du filtrat stérile de culture de C. fimbriata, permet de
sélectionner des lignées cellulaires de cals qui maintiennent une croissance
active, malgré l'effet inhibiteur de ce filtrat.
Le fait que de telles lignées cellulaires aient déterminé des différences
dans la colonisation des tissus par ce pathogène, révèle que le caractère
de résistance peut être exprimé dans les cultures de tissus in vitro, par une
absence ou une faible colonisation des tissus hôtes, tout comme le
caractère de sensibilité à C. fimbriata,
qui est exprimé par un
développement rapide· et important d'hyphes mycéliens sur les tissus
infectés.
Ces résultats suggèrent, en accord avec d~autres travaux sur les
cultures de tissus de plantes (SCOWCROFT et.LARKIN,1982), qu'une
résistance générale vis-à-vis d'un champignon pathogène peut être obtenue
après qu'une pression sélective ait été exercée à l'aide d'un filtrat stérile
de son milieu de croissance.
Cette possibilité d'induction expérimentale d'une résistance, même au
niveau cellulaire, à C. fimbriata, devrait pouvoir être exploitée dans la
\\
recherche des caractéristiques de résistance générale in vivo à la
pathologie du chancre coloré.
Dans cette perspective, le caractère de résistance acquise au niveau
cellulaire pourrait être retrouvé chez des plantes régénérées à partir de ces
tissus.
Comme celà a été généralement décrit (GAUTHERET, 1959; DEREK et
WHITE, 1982), les capacités de régénération des cultures de tissus ou de
cellules in vitro. de plantes, semblent diminuer, dans le cas de cultures
166
Séverin
AKE
longtemps entretenues.
Dans notre cas, chez P latanus acenfalia , bien qu'il nous ait été
possible d'induire une organogénèse de bourgeon et de racine sur des cals
primaires (résultats non publiés), les cultures stabilisées de tissus de cals
par contre, ne nous ont pas permis d'obtenir une organogenèse de
bourgeons.
Etant donné que les réponses morphogénétiques à partir de cultures de
tissus, présentent des différences marquées qui sont beaucoup liées aux
génotypes végétaux, les conditions nutritives de regénération devraient
pouvoir encore être améliorées.
DEREK et WHITE (1984) ont rapporté dans des exemples de
régénération de plantes à partir de cultures de tissus longtemps
entretenues (24 mois), que certains facteurs
nutritifs influencent
positivement et considérablement la capacité de regénération des tissus en
culture:
le passage d'un milieu semi-solide en milieu liquide agité, l'effet
positif de la teneur en ions NH +, l'absence d'auxine (2;4 D) et la teneur
4
en 6-BAP etc ... La prise en compte de telles modifications devrait
permettre d'obtenir une réponse morphbgénétique des lignées cellulaires
résistantes au pathogène.
Enfin, nous avons recherché et purifié une protéine,· à partir du filtrat
stérile de culture toxique de C. fimbriata , qui exerce un effet inhibiteur
important sur la .croissance des cultures de tissus in vitro de P latanus
acerifalia. Cette protéine de poids moléculaire de 15 000 D a pu être
purifiée en combinant des techniques de séparation par tamisage
moléculaire et par l'hydrophobicité.
Une comparaison de cette protéine - la fimbriatane: FB - avec la cérato-
u1mine (CU), toxine impliquée dans la pathologie de dépérissement chez le
Conclusions générales
167
genre Vlmus , et produite par Ceratocystis ulmi, a montré que:
FB et CU sont des protéines hydrophobes,
ont des poids moléculaires voisins,
apparaissent non glycosylées,
et sont co-purififiées avec 2 molécules non protéiques.
Toutefois FB et CU ne semblent pas aVOIr une structure tri-
dirnentionnelle similaire, détenninée par la séquence en amino-acides.
En effet, alors que CU apparait linéaire,
FB semble cyclique ou avoir une extrémité N -tenninale bloquée.
A ce sujet, on devrait pouvoir apporter une réponse en utilisant
un
enzyme de coupure, à spécificité étroite, puis faire un "séquençage" des
différents fragments polypeptidiques (figure 71).
On pourrait par exemple, utiliser une endoprotéinase-arginine-C, cet
enzyme faisant des coupures après tous les résidus arginine de la protéine.
Puisque les résultats de l'analyse en amino-acides de FB ne donnent
qu'une seule arginine, il n'y aura dans ce cas, qu'un seul morceau dont
une arginine se trouve à une extrémité. Dans le cas d'une extrémité N-
terminale bloquée, la coupure mettrait en évidence deux .morceaux
polypeptidiques que l'on caractérisera par "séquençage". Une extrémité
des morceaux se tenninera par une arginine.
Une autre méthode .consisterait à utiliser la trypsine. Dans. ce cas, cet
enzyme provoquera des. coupures après tous les résidus basiques (lysine
ou arginine) de la protéine.
PERSPECTIVES
Sur le plan de la 'pathogenèse, nous avons montré que le filtrat
de
culture de C. fimbriata détermine l'inhibition de la capacité' de réaction
cicatricielle in vivo chez le végétal, effet cbrr~lé avec l'inhibition de la
croissance des tissus de cals in vitro.
168
Séverin
AKE
..~
1/ Cas d'une structure çyclique.
PA-C
---....8~----- --------t
2/ - Cas d'une structure linéaire.
PA - C
0-0-----0
FIGURE 71: Structures possibles defimbriatane, après une
coupure
par une enzyme de type endoprotéinase-argine-C
-0-0-0-
chaines d'amino-acides.
Arg: arginiile. 1/: coupure
Conclusions générales
169
Dans le test biologique d'activité de
fimbriatane, effectué sur les
cultures de tissus de cals de platane, nous avons aussi montré que cette
protéine détermine le même effet, c'est-à-dire l'inhibition importante de la
croissance des tissus.
Ainsi, fimbriatane est nécessairement impliquée dans la pathogenèse in
vivo, au moins dans le symptôme primaire d'inhibition de l'activité de la
callogenèse cicatricielle.
Par ailleurs, nous n'avons pas expérimenté FB dans d'autres tests
biologiques d'activité, notamment ceux utilisant des organes du végétal in
vivo (disques foliaires, segments de tige, pétioles, semences, etc ... ).
En rapport avec le test biologique de segments de tige, on pourrait
mettre en contact des sections de tige de platane avec une solution de FB
dont on réalisera différentes concentrations, puis on déterminera
l'importance des réactions callogènes en les comparant à celles de tiges
témoins en contact d'eau.
Egalement FB devrait pouvoir être expérimentée sur des tests
biologiques développés
chez d'autres
végétaux.
Celà permettrait
d'apprécier le degré de spécificité d'hôte de cette toxine.
D'autre part l'ensemble des observations ultrastructurales des tissus
infectés, dont nous avons discutées, permettent de dire que FB rie serait
pas directement responsable de la destruction des tissus résultant de'"
.
~
l'envahissement cellulaire par les hyphes mycéliens
directement
responsable du développement chancreux.
S
En rapport avec le rôle possible des toxines dans la pathogenèse,
BRETELL eco'al. (1980), CHALEFF (981) ont montré que le caractêre
pathogène d'un champignon peut être entièrement dû à la synthèse et
170
Séverin
AKE
l'excrétion de toxines. Dans d'autres cas, la pathogénicité serait co-
déterminée (SACRISTAN,1982) par des toxines, dans ces cas, la (ou les)
toxine(s) ne déterminerai(en)t pas seule(s) la totalité des symptômes de là
pathologie.
Nos résultats sur l'étude du dépérissement du platane in vivo et in
vitro et de l'effet de la fimbriatane, sont plutôt en faveur de cette seconde
hypothèse; l'effet d'envahissement physique par le champignon étant,
dans notre cas, très postérieur aux autres symptômes décrits.
Si le rôle majeur de FB dans la pathogenèse
se confirme, on devrait
pouvoir rechercher ses relations avec la pathogénicité au nIveau
moléculaire.
Dans cette perspective, le développement d'un test immunologique
spécifique pour FB est possible. Un tel outil peut servir pour
un
diagnostic rapide et sensible.
En effet, si FB est spécifique de C eratocystis fimbriata, ce test devrait
permettre d'identifier le champignon. Dans ce cas FB servirait comme un
marqueur biochimique pour différencier C. fimbriata d'autres espèces du
même genre.
D'autre part, si la production et l'excrétion de cette protéine sont liées
à la virulence, ce test permettra aussi de comparer les réactions de
différentes souches de Ceratocystis fimbriata
virulentes et celles non
viru1entes.
En
effet,
nous
avons
constaté
(résultats
non
figurés)
qu'un
fractionnement des filtrats de culture d'autres isolats virulents CM 862,P-
427, AUB-BO,. SORG, VIG,) sur Biogel PlO et Sephadex G 75, ont
présenté des pics_ d'élution comparables à ceux que nous avons obtenu
avec l'isolat P 416.
Conclusions générales
171
Du point de vue du champignon lui-même, nous ne savons pas le rôle
physiologique de FB, et aussi si cette protéine est un composant intégral
produit dans une structure particulière du champignon.
Les propriétés de surface de FB, à savoir l'hydrophobicité, font penser
au fait que cette protéine puisse faciliter la dispersion et la conservation
de la (ou des) structurees) dans la(les)quelle(s) elle est produite.
De quelle m.anière sa production et sa secrétion sont-elles contrôlées'?
Ceci est encore un domaine d'investigation qui mérite d'être poursuivi.
La finalité d'une telle étude prendrait en compte le développement de lutte
biologique (PIONNAT et TRAMIER, 1983; GINDRAT, 1983) contre cette
pathologie.
L'ensemble de nos résultats sur l'utilisation des systèmes de culture in
vitro de Platanus acerifolia
s'inscrit en faveur de l'opportunité et de
l'utilité d'ur..
emp loi de systèmes
expérimentaux simples et contrôlés,
comme modèles d'études à divers niveaux, notamment
de différents
facteurs pouvant être impliqués dans les interactions plante-pathogène.
Les développements futurs résultant de l'application de cette voie de
recherche au couple Platanus acerifolia / Ceratocystis fimbriata , seraient
une suite directe de nos résultats.
172
Séverin
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194
Séverin
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déterminant la plus forte inhibition de la croissance des cals} :::
50 % par rapport au 'témoinJ'est retenue, Chaq uepoint
expérimental représente en fai t une valeur moyenne de 8 ou 12
mesures) valeur exprimée en pourcentage par rapport à celle des
culture témoins,
Réalisation de l'essai. biologique: § C3-S}
Mesure de la croissance des cultures de tissus: § C4-l}
Annexe 1
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Annexe III
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Annexe IV
UTILISATION DES VITRO-MÉTHODES
DANS L'ÉTUDE
DES RELATIONS HÔTE-PATHOGÈNE DU COUPLE
Platanus acerifolia / Ceratocystis fimbriata
ESSAIS D'INDUCTION DE CARACTÈRE
DE RÉSISTANCE À LA MALADIE
DANS DES CULTURES DE CALS.
lRlE§UOOlE: Une étude des caractéristiques et des modalités d'obtention de cultures
in vitro de tissus et de cellules, ainsi que de microplantules de platane, a permis ,
d'établir un système expérimental d'étude des relations avec le champignon patho-
gène Ceratocystis fimbriata responsable de la pathologie du chancre coloré.
Ainsi, la réalisation de cultures associées in vitro a permis de rechercher une
expression des interactions hôte-pathogène dans ce système. Une comparaison est ,,'
faite avec l'étude de la symptomatologie in vivo.
Un effet de pression sélective du filtrat de culture du pathogène sur les cultures de
cals a conduit àl'induction de lignées cellulaires dont la résistance est ensuite,évaluée
en présence du pathogène.
Le fractionnementchromatographique de filtrat obtenu à partir de cultures liquides
agitées du champignon, a permis la purification d'une protéine toxique impliquée
dans la pathologie. L'effet sur la croissance des cals de platane const~tue un test
biologique de l'activité de la toxine.
Platanus acerifolia - Ceratocystis fimbriata -
culture in vitro - cals - cellules - champignon -
hôte-pathogène -Toxines -
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