RÉPUBLIQUE DE CÔTE-D'IVOIRE
UNION - DISCIPLINE -TRAVAil
MINIST~RE DE L'ÉDUCATION NATIONALE
NO d'Ordre 59
THESE
Présentée à la Faculté des Sciences d'Abidjan.
En vue d'obtenir le grade de
Docteur 3e Cycle
(Spécialité Chimie Organique)
Par
LEYDET ALAIN
D.E.A. de Chimie Organique, Professeur Certifié à l'E.N.S.
synthèse et activité oncostatique
de nitrosourées d'Amino-acides
Soutenue le 7 janvier; 981
devant la Commission d'Examen
JURY
Pro TOURÉ VAKABA
Président
Pro .I.L. IMBACH
Pro R.
CABANNES
Examinateurs
Pro J.M. FAVRE
Pro J.L. MONTÉRO

---

A Monsieur
TOURE
VAKABA
Professeur à la Faculté des Sciences d'Abidjan -
Directeur de l'Ecole Normale Supérieure dlAbidjan.
A Monsieur
IMBACH
Professeur à l'Université des Sciences et Techniques du
Languedoc à Montpellier -
Directeur du Laboratoire de Chimie Bio-Organique.
A Monsieur
CABANNES
Professeur à la Faculté de Médecine d'Abidjan -
Directeur du Centre d'Hématologie et d'immunologie
au C.H.U.
de Cocody.
A Monsieur
FAVRE
Professeur à la faculté des Sciences d'Abidjan -
Chef d~ Département de Physiologie Végétale.
A Monsieur
MONTERO
Professeur à la Faculté des Sciences d'Abidjan -
Directeur du Laboratoire de Chimie Thérapeutique.

---

A.VANT-PROPOS
Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Chimie
Thérapeutique de la Faculté des Sciences d'Abidjan que dirige
Monsieur le Professeur MONTERO.
Je tiens â lui exprimer mes sincères remerciements
pour m'avoir initié à la recherche. Ses connaissances, sa
rigueur scientifique et son efficacité resteront pour moi un
exemple.
Je remercie vivement Monsieur le Professeur TOURE
VAKABA pour l'honneur qu'il me fait en acceptant de présider
le jury de cette thèse.
Monsieur le Professeur IMBACH a accepté de se
déplacer jusqu'â ABIDJAN pour juger ce travail. Qu'il trouve
ici l'expression de mes plus vifs remerciements.
Je suis reconnaissant â Monsieur le Professeur
CABANNES d'avoir bien voulu juger ce travail.
Mes remerciements vont également â Monsieur le
Professeur FAVRE qui a accepté de siéger à ce jury.
Je remercie également Monsieur SEGUIN pour la
réalisation des tests biologiques lIin vitro ll , et Mademoiselle
CHENU de l'I.C.I.G. de Villejuif, qui a effectué les tests
lIin vivo ll de nos produits,
Mes remerciements s'adressent également à tous mes
camarades du Laboratoire qui m'ont toujours manifesté la plus
grande sympathie et ont rendu plus agréable mon travail.
Je remercie enfin tous les services techniques
notamment Messieurs BLANC et CASARI ainsi que Mademoiselle
YOBOUET et Madame FONLUPT qui ont contribué â la réalisation
de ce travail.
A• L •

---

S , O.M-M·A 1 R E
Pages
- INTRODUCTION
1
- 1er CHAPITRE
LES N-CHLORO-2-ETHYL UREES
D'AMINO-ACIDES
4
1) Les amino-acides liposolubles
6
II) Exemple d'amino-acide hydrosoluble
la L-sérine
10
III) Exemple dlamino-acide soufré
la L-méthionine
14
IV) Exemple dlamino-acide acides
les acides
L-aspartique et L-glutanique
15
V) Exemple de dipeptide : L-alanyl-L-leucine
17
- 2èmeCHAPITRE
LES N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREES
D'AMINO-ACIDES
1 ) Méthodes de nitrosation
21
II) Les N-chloro-2-éthyl nitrosourées d1amino-
acides liposolubles
24
II 1) Les N-chloro-2-éthyl
nitrosourées dérivées de
1a L-sérine
26
IV) La N-chloro-2-éthyl nitrosourée du L-méthionate
de méthyle
30
V) Les N-chloro-2-éthyl nitrosourée des ami no-
acides acides
31
VI) La N-chloro-2-éthyl nitrosourée du L-alanyl-L-
leucinate de méthyle
33
- 3ème CHAPITRE : LES TESTS BIOLOGIQUES
36
1) Activités biologiques
36
II) Test lIin vitro"
38
III) Test lIin vivo"
43

---

Pages
- CONCLUSION
47
- PARTIE EXPERIMENTALE
49
- BIBLIOGRAPHIE
84

---

- 1 -
1 N T R 0 DUC T ION
Parmi tous les composés antitumoraux connus notre choix s'est
porté sur les chloro-2-éthyl nitrosourées pour les raisons suivantes :
- Ces composés présentent une activité oncostatique reCOnnue (1).
- Ils sont de préparation relativement aisée.
- De plus notre laboratoire possédait une certaine expérience
dans ce domaine.
les nitrosourées dites de première génération telles que le
B.C.H.U
1 (2) .... (10), le C.C.N.U ~ (11) ... (17), et le méthyl C.C.N.U.
! (18) .•• (21) montrent une ~rande activité antitumorale sur certaines tumeurs
expérimentales (22) (23) telle que la leucemie l 1210, et sont déjà employés
avec profit en clinique humaine.
B.C.N.U
1
NO
1
R - NH - C - N - CH - CH - Cl
R=o- C.C.N.U 2
"
2
2
o
R = C H V : Me. C.C.N.U
3
Dans llétude de leur mécanisme d'action par double marquage,
il a pu être constaté une action alkylante sur les acides nucléiques, et
une action carbamoylante capable d'inhiber fortement la réparation de
lIA.D.N
(24).
Un tel mécanisme expliquerait pourquoi ces dérivés sont très
mutagènes et cancérogènes (25). D'autre part des effets secondaires impor-
tants ont pu être mis en évidence
tels que:
- toxicité myélolde
- toxicité hépatique
- effet illlllunoslJppressif
qui limitent leur utilisation (2) ... (21).

---

- 2 -
Une amélioration notable fut apportée avec les nitrosourées
de "2ème Ç1énération ll par l'introduction d'un vecteur glycosylé tel que
le glucose dans la chlorozotocine i (26), et le ribose dans la R.F.C.N.U.
5
et la R.P.C.N.U ~
(27) ... (31). En effet une diminution de la toxicité
et la suppression de l 1 effet immunodépressif sont observés avec la
R.F.C.N.U. (32) aux doses cliniques.
HO
OH
Chlorozotocine 4
NH
/
o = C'\\~ - CH2 - CH2 - Cl
NO
N-@- CB,~~
02
~ Ir-r NH
o
0
X
R.F.C.N.U.
5
NO
1
NH - C - N - CH 2 - CH2 - Cl
R.P.C.N.U
6
"
o
AcO
OAc
L'apparition de cellules chimiorésistantes notamment chez un
mutant de l'Escherichia Coli au
B.C.N.U
(3),
ainsi que la diminution
des effets secondaires principalement l'effet thrombopénique, nous ont
conduit à rechercher de nouvelles nitrosourées.
Par là même nous avons voulu associer à la fonction chloro-2-
éthyl nitrosourée des dipeptides
suceptibles de présenter des activités
biologiques.

---

- 3 -
L'association de ces deux entités conduit a des molécules
de taille plus importante, or récemment
V.A. LEVIN
a confirmé que les
nitrosourées étaient particulièrement aptes a franchir la barrière
céphalo-méningée ainsi que certaines molécules de taille
importante
(33).
Avant de réaliser des nitrosourées de dipeptides, il
nous a semblé préférable de commencer par des acides aminés, tels que
la L-alanine, la L-valine, la L-leucine, la L-sérine, la L-méthionine.
et les acides L-aspartique et L-glutamique. Enfin nous avons synthétisé
une chloro-2-éthyl nitrosourée du dipeptide L-alanyl-L-leucinate de
méthyle.
Notre étude se scindera en trois parties, les chloro-2-éthyl
urées d'amino-acides et du dipeptide.dans un premier chapitre. les nitro-
saurées correspondantes constitueront le second chapitre et enfin dans une
troisiême partie
nous exposerons les résultats des tests biologiques.
Les tests "in vitrail effectués sur nos composés ont
été réalisés au Laboratoire de Physiolopie vé9étale de l'Université d'Abidjan. et
les tests "in vivo" à l' I.e.I. G.
de Villejuif.

---

- 4 -


1ER œAPIlŒ~I
LES
N-CHLORO-2-ETHYL UREES D'AMINO-ACIDES
==========================================
La synthèse des N-chloro-2-éthyl urées d'amino-acides a été
effectuée par l'action de l'isocyanate de chloro-2-éthyle sur un acide aminé
protégé sur sa fonction acide. L'action directe de l'isocyanate de chloro-2-
éthyle
sur l'acide aminé libre conduit à plusieurs composés, et l'urée
attendue est obtenue avec un très faible rendement.
Pour protéger la fonction acide des acides aminés, nous avons
préparé les esters méthyliques et éthyliques, obtenus sous forme de chlorhy-
drates.
La méthode d'estérification la plus couramment utilisée consiste
à faire passer un courant gazeux de chlorure d'hydrogène sec, sur une suspension
de l'acide aminé dans l'alcool
méthylique ou éthylique anhydre selon le cas,
à DoC
jusqu'à saturation.
Une seconde méthode, que nous avons préférée la plupart du
temps grâce à sa facilité de
mise en oeuvre, consiste à ajouter du chlorure
de thionyle à DoC, à une suspension de l'acide aminé dans l'alcool méthy-
lique ou éthylique.
Les conditions expérimentales de l'action de l'isocyanate
de chloro-2-éthyle sur le chlorhydrate ester de 1 'amino-acide sont les
suivantes :
1°) - l'addition de l'isocyanate de chloro-2-éthyle s'effec-
tue à DoC, sous agitation magnétique, sur une solution dans un minimum
d'eau distillée du chlorhydrate ester de llamino-acide ;
2°) - l'addition est réalisée sur une suspension du chlorhy-
drate ester dans le dichlorométhane en présence d'une base telle que la
pyridine ou la triéthylamine, à DoC et sous agitation magnétique.
La réaction est poursuivie 24 heures quand la pyridine est
utilisée, alors que 4 à 5 heures suffisent avec la triéthylamine.
Des deux méthodes nous avons utilisé
préférentiellement
la seconde, en effet dans le premier cas la formation de N-chloro-2-éthyl
urée de l'amino-acide s'accompagne de la présence de bis chloro-2-

---

- 5 -
éthyl urée (34). Ce produit dont la structure est déterminée sans ambiguité
par son spectre de R.M.N., provient de la condensation de l 'isocyanate de
chloro-2-éthyle sur la chloro-2-éthyl amine. La présence d'eau favorise
l'hydrolyse partielle de l 'isocyanate de chloro-2-éthyle suivant le schéma
suivant: (Fig. 1)
Cl - CH2 - CH2 - N = C = 0
[Cl - CH 2 - CH2 - NH - COOHJ
t
Cl - CH 2 - CH2 - NH2 + CO2
Cl - CH2 - CH2 - N = C = 0 + Cl - CH2 - CH2 - NH2
Cl - CH
- CH
- NH - C - NH - CH 2 - CH2-Cl
.
2
2
Il
o
7
- Fi g. 1 -
(B.C.U.)
J.A. MONTGOMERY et Coll. (35) ont constaté qu'en milieu aqueux et en
présence de triéthylamine, l 'isocyanate de chloro-2-éthyle conduit à la
bis chloro-2-éthyl urée l (B.C.U). Cependant ces auteurs remarquent qu'en
présence d'une amine primaire, l 'isocyanate de chloro-2-éthyle réagit
préférentiellement avec celle-ci pour donner une urée assymétrique.
Les amino-acides utilisés dans nos condensations peuvent se
classer en quatre catégories :
- les amino-acides liposolubles tels que la L-alaoine,
la L-valine et la L-leucine.
- les amino-acides hydrosolubles tels que la L-sérine
- les amino-acides soufrés tels que la L-méthionine
- les amino-acides acides tels que les acides
L-aspartique et L-glutamique.

---

- 6 -
Toutes nos condensations peuvent être schématisées de la manière suivante
Cl - CH
- CH
- N = C = 0
R - ÇH - COOCH
2 2 )
R - CH - COOCH
3
3
1
Pyridine
1
NH + Cl-
CH 2C1 2 1
ou
NH
3
T.E.A
1
C = 0
!
NH
1
CH 2
1
CH 2
1
Cl
Les urées dlamino-acides obtenues se présentent sous la
forme de solides blancs.
Nous avons aussi réalisé une condensation sur un dipeptide,
tel que le L-alanyl-L-leucinate de méthyle, qui sera exposée à la fin du
présent chapitre.
Il - LES AMINO-ACIDES LIPOSOLUBLES.
La condensation de l lisocyanate de chloro-2-éthyle sur les
chlorhydrates esters méthyliques de la L-alanine (36), L-valine (37) et
la L-leucine (38) nous a conduit aux urées
~,~ et
10
~ COOCH3
CH
- CH
8
3
" NH - rr - NH - CH2 - CH2 - Cl
o

---

- 7 -
/
COOCH 3
9
CH - CH '"
,.1
NH - C - NH - CH
- CH _- Cl
Il
2
2'
o
, "
COOCH 3
/
10
CH - CH
- CH
2
CH~
" " NH - C - NH - CH2 - ~H2 - Cl
Il
"'"
.
a
~
Pour obtenir le
[(chlOro-2-éthYl)-3 uréido] -2-L-alaninate
de méthyle nous avons effectué la condensation en milieu aqueux et l 'urée ~
etait obtenue avec un rendement de 60 à 70 %. Mais une chr:-0matographie"
; 1
.
( ' " . , '
,"
':'" J"
" , .
- .... ,~; ;;l-n')
:) 1· ':....;r'h'1'l.
,'.: ..:\\<"!
'.1.;'
r
sur colofllie'à ~el de silice s'avérait nécessa.,reafHf'de'sepa'rer-Ta-biS-'
"
:
. " 1 : l.
-
,"
~ 21,.
r d ~.rl r
.\\
~'. ';) [ l r ': .
chloro-2-éthyl urée Z de l'urée .ê..
." " .' -'
., .,..1 ,_. '
. _
[
, . ..
' - . < . '':'" ".
~
-:- ~" 1
~
~ ,-\\ 1
D1 autre part 'afirl d1 éviter'la formation"de 'B.C'.U
7, nous
avons réalisé la condensation en milieu 'anhydre, én\\Jtilisant du-dichlbro-
méthane comme'solvant eh présenée de triéthYla~;ne.DahrcJcas là formation
de B_C~U'esf évitée et p~r là mêMe la chro~atograPh~~lisdr'~otbn~e'~;~e1~&e'-
silice devient in'utile, par'~contre l'urée '~étai~!obte~ue(iàvèc un faibl'~
rendement (24 %). ,.
.',
"
.;:,:!
',5'-;'3:: ;~ r
,- ~'.'i
• -,
J
(
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_ ': .
De m~me pou,; '13~ .Rrépa:a~i~n~d~·r,'&~hl'qr~;~~~;1~~j·~0L~~~i~~I;';v':
2-L-vali~.ate d~ méthyle .n,~\\JS ~y?qs ~é~,l.isé ,la cQ~qe~~a~~8g 9êBsè79Yi)p,1~h,102!r:?
rométhane en présence soi t de pyri di ne soit de tri éth~~51f1!9~'i:[)a2~i ~e~ .;' r r;~:
deux cas le rendement est pratiquement le même, de l'ordre de 40 %, ma s
en présence de pyridine une chromatographie s'avère nécessaire pour
obtenir l'urée
~ exempte d'impuretés, par contre en utilisant la
triéthylamine les impuretés sont éliminées par lavage.

---

- 8 -
Nous avons opéré de même pour l'urée
la; dans tous les cas
les urées cristallisent dans un mélanqe chloroforme-éther de Pétrole, bien
que pour l'urée
la
la cristallisation soit longue et difficile.
La stucture des urées précédentes a pu être établie sans
ambiguité parl'étude de leurs spectres de R.M.N.
Pour la suite de notre exposé, et dans tous les développements
concernant la spectroscopie de R.M.N, nous adopterons la nomenclature
figurant ci-dessous (Fig.2)
1
2 / ' COOCH3
CH
l'
2'
3'
4'
"NH - C - NH - CH2 - CH2 - Cl
Il
a
- Fig. 2 -
Les déplacements chimiques seront exprimés en b p.p.m
par rapport au
T.M.S
utilisé comme référence interne.
Pour les urées ~, ~ et
la, le proton H-1' résonne
sous la forme d'un doublet par suite du couplage avec H-2. Ce doublet est
observable à des champs faibles. Le triplet correspondant au proton H-3'
dû aux couplages avec H-4', se situe à des champs légèrement supérieurs.
Dans le cas. des urées ~ et 10 . le doublet de H-l' et le triplet de H-3'
sont très voisins et par la même les constantes de couplages sont
impossibles à déterminer. Ces deux signaux, sensibles à la dilution et
facilement échangeables par addition d'eau lourde, sont donc attribuables
sans ambiguité aux deux protons N-H. Leurs déplacements chimiques sont
indiqués dans le tableau
1.

---

HJC
COaCHJ
\\
/
CH-eH-CH
/ 2 ,
HC
NH-C-NH-CH-CH-Cl
3
Il
'2
2
o
r
Il
i ri
~I
1
\\
I l l . , "
I I " , l , . , IJ , . " I ! . , . j ! !
I l . !
r, ..
L
1
I I
1
8.0
70
00
50
4.0
3.0
'2.0
1.0
0
SPECTRE
R MN
60 MHZ
DE
10

---

- 9 -
TABLEAU
I
Urée
H-I'
H-3'
H-2
H(OC!!3)
H-4'
H-5
/
~
;
8
6,57 (d)
6,41 (t)
4,16 (m)
3,6 (s)
3,33 (m):
3,53(t}
-
nMSOd 6
JI '_2=7Hz
J 3 '-4' = 6Hz
90 MHz
1
9
-
5,80 (m)
4,47 (m)
3,8 (8)
3,63
CnCl
5,87
5,73.
3
60 MHz
10
-
5,77 (m)
4,57 (m)
3,8 (8)
3,67
CnCl
5,83
5,70
3
60 MHz
Le proton H-2 lié au carbone assymétrique de l 'acide aminé résonne sous la
forme d'un multiplet dont le déplacement chimique est rapporté dans le ta-
bleau I.
Le remplacement des protons N-H par du deutérium entra'ne une
simplification du multiplet du proton H-2 en un doublet pour l'urée
9, en
un triplet pour l'urée .!Q, et en un quartet pour
l 'urée ~.
Les protons du ~roupement méthoxy résonnent sous la forme
d'un
sin9ulet. Les protons méthyléniques du 9roupement chloro-2-éthyl
urêido
NH - CH
- CH
- Cl
constituent un système
A
2
2
2 B2 X et résonnent
dans la plupart des cas sous forme d'un multiplet peu étalé. Ce multiplet
étant da à la faible différence des déplacements chimiques de ces protons.

---

- 10 -
Les protons des groupements méthyle
~, isopropyle ~ et
isobutyle !Q qui caractérisent ces amino-acides
sont
t
~arfaitement déter-
minés en spectroscopie de
R.M.N
et leurs déplacements chimiques sont
indiqués dans la partie expérimentale.
Les urées d'amino-acides obtenues présentent une absorption
1
infra-rouge intense entre 1600 cm- 1 et 1700 cm-
due à la vibration de
valence du groupement carbonyle de l'urée et de l'ester. Les vibrations de
-1
valence des liaisons
N-H et C-H sont éqalement observables à 3400 et 3000 cm
1
En outre la bande amide secondaire se s~tue vers 1500 cm- .
11/ - EXEMPLE D'AMINO-ACIDE HYDROSOLUBLE: LA L-SERINE
La condensation de l 'isocyanate de chloro-2-éthyle sur le
chlorhydrate ester méthylique de la L-sérlne dans le dichlorométhane en
présence de pyridine, aboutit à la formation de deux composés révélés par
C.C.M
et facilement séparés par chromatographie sur colonne
t
à gel de silice.
Le composé l! est l'urée attendue, par contre le composé 12
résulte de la double condensation de l 'isocyanate de chloro-2-éthyle sur
la fonction hydroxyle de la L-sérine et sur la fonction amine.
COOCH 3
/
'HO - CH - CH
11
2
- C - NH - CH
- CH
- Cl
"'" NH
2
Il
2
o
/COOCH3
12
Cl - CH
- CH
- NH - C - 0 - CH
2
2
Il
2 - CH
o
- C - NH - CH
- CH
- Cl
"'" NH
2
Il
2
o

---

- 11 -
Afin de moduler le caractère hydrosoluble de la L-sérine
nous avons estérifié la fonction hydroxyle libre dans l'urée II en formant
respectivement le paranitrobenzoate
13, l'acétate
14
et le chloroacétate 15.
COOCH
/
3
C - a - CH
- CH
13
2
Il
a
' " NH - C - NH - CH
- CH
- Cl
il
2
2
a
COOCH3
/ '
CH
- C - a - CH
- CH
3
Il
14
a
2
" " NH - C - NH - CH - CH - Cl
li
2
2
a
COOCH3
../'
Cl - CH
CH
2 - C - a -
2 - CH
15
Ila
~NH - C - NH - CH - CH - Cl
il
2
2
a
Le paranitrobenzoate
13
et le chloroacétate
15
sont obtenus en faisant
réagir respectivement sur une solution de l'urée
Il
dans le dichlorométhane
en présence de pyridine les chlorures de paranitrobenzoylè et de chloroacétyle.
L'urée estérifiée 1l cristallise dans le méthanol, et l 'urée ~ dans un
mélange chloroforme-ether de pétrole.
Les rendements respectifs sont de
l'ordre de 60 %et de 80 %.
Pour la préparation de l'acétate li nous opérons sans
solvant en faisant réagir sur l'urée libre ll, en présence de pyridine,
l'anhydride acétique.
L'acétate
14
cristallise par addition d'éther de
pétrole, et le rendement est de 80 %.
La structure des urées .!l., 11., 11, li,
15
a pu
être déterminée sans ambiguité à partir de leurs spectres de R.M.N.

---

- . l
m
n
m
M-
=r
Urée
H-I'
H-3'
H-4'
H-5'
H(OC!!3)
H-2
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0
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N
II
6,43(d)
6,56(t)
3,58 (m)
3,67 (s)
4,26 (m)
3,38 (m)
-
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ml
-g M-
If
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JI' _2=9H
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'<
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4,73 (m)
4,56 (d)
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· · . . 3 - 2 z
s=
=r "'Cl
. .
. . .
-s
.....,
-s
. '"
"' . "",--...., .........
ml
='
0
m
m
M-
(Il
0
QI
='
15
6, 13
3,67 (m)
3,83 (s)
4,90 (m)
4,57 (d)
(Il
(Il
(Il
-
0
(Il
='
~ ::z
M-
I
(6,20)
(6,07)
ml
J
=
:::I:
..
3- 2
4 H
. .z.
-s
M-
QI
-s
.....
"'Cl
,
a..
"'Cl
..0
s=
•
0
s=
-s
m 1.0
Après échange par D 0
M-
-s
2
ml
a..
0
(Il
m
s=
"'Cl
TABLEAU
II
a..
- . l
m
QI
QI
3
='
m
(Il
(Il
='
ml
M-
-s
......
='
m
..
......
N

---

cr z
cD"
.....
....
o
en Cl. w (,) ~ ca:: w
a:: :E Z
C»
o
o w

---

- 13 -
Outre les éléments communs consiqnés dans le tableau
II, la spectroscopie
de R.M.N permet d'identifier sans ambiouité les composés de la L-sérine
que nous avons synthétisés.
L'urée de la L-sérine non estérifiée l!, présente en R.M.N
un signal élargi centré à 5,03 p.p.m correspondant au proton de la fonc-
tion alcool. De plus ce proton est échangeable par deutériation.
Pour le carbamate
12, le groupement chloro-2-éthyl carbamate
8
7
6
5 4 - -
Cl - CH
CH
2
2 - NH
C - a - présente plusieurs signaux en spectroscopie
Ila
de R.M.N, le proton H-6 apparaît sous forme d'un triplet, à champ plus
faible que les protons
H-1' et H-3', centré à 7,43 ppm (J
=
6- 7
6 Hz)'
Les signaux des protons H-7, H-8 se ~uperposent à ceux des protons
H-4 ' , H-5 1 et par la même!l 'attribution exacte des signaux de ces quatre
protons est impossible.
Le paranitrobenzoate 11 est facilement identifiable, en effet
le signal ,des protons aromatiques apparaît à champ faible ( 0 = 8,27 ppm)
sous forme d'un quartet correspondant à un système A B dégénéré en système
2 2
AB.
L'acétate 1i émet en spectroscopie de R.M.N, outre les
éléments communs aux autres urées, le siqnal des protons méthyliques
du groupement acétate qui apparaît sous forme d'un singulet à 2,12 ppm.
De même pour le chloroacétate
~, le signal des protons
méthylènes
du groupement chloroacétate apparaît sous forme d'un sin-
gulet à champ plus faible 4,15 p.p.m.
Dans tous les spectres de R.M.N des composés de la
L-s&rine que nous avons synthétisés, l'addition d'eau lourde entraine
la disparition des signaux des protons H-1 ' et H-3' et une simplifica-
tion du signal multiplet du proton H-2 en un triplet dont la constante
de couplage
J = 4 ou 5 Hz
est identique à celle du doublet des
protons H-3.

---

- 14 -
D'autre part, les spectres I.R., outre les bandes caracté-
ristiques des urées d'ami no-acides, mettent en évidence un épaulement à
1
3500 cm-
du
à la liaison O-H pour l'urée
!!' une bande d'absorption à
1690 cm- 1 due à la vibration de valence du groupement carbonyle de la
fonction carbamate de l'urée lf. Pour les urées estérifiées les spectres
I.R.
présentent des bandes d'absorption caractéristiques, notamment en
1
raison des vibrations de valence des liaisons, C-H aromatiques à 3040 cm-
et N-O du groupement nitro à 1545 cm- 1 et 1360 cm- 1 pour le paranitroben-
zoate
13.
La liaison c-o des Ç1roupements acétate del 'urée .!i et chloro-
acétate de llurée
15
présente des bandes d'absorption respectivement à
1220 cm- 1 et 1235 cm- 1.
111/ - EXEMPLE DIAMINO-ACIDE SOUFRE: LA L-METHIONINE
----------------------------------------------.
La condensation de l'isocyanate de chloro-2-éthyle sur le
chlorhydrate de L-méthionate de méthyle(39) en suspension dans le dichloro-
méthane, en présence de pyridine, conduit à l 'urée ~ selon le schéma suivant
Cl-CH 2-CH2-N=C=0
CH 2C1 ' pyridine
2
/COOCH3
CH ~NH - C - NH
Ilo
16
La structure de l'urée ~ a pu être établie sans ambiguité
grâce à son spectre de R.M.N, pour l 'interpretation duquel nous utiliserons
la nomenclature suivante:
1
6 5 4
3
2 /COOCH3
CH
- S - CH
3
- CH
2
2 - CH
l'
2' 3'
4'
51
~- NH ~ CH
' " NH -
2 - CH 2 - Cl
o

---

- 15 -
Le spectre dans le deutério-chloroforme a 60 MH de l'urée la
fait
z
-
apparaitre a 6 p.p.m un doublet et un triplet superposés; ce signal
échangeable par deutériation est attribuable sans ambiguité au protons
H-1' et H-3'. A 4,63 p.p.m se situe un multiplet d'intensité relative
égale a 1 attribuable au proton H-2. A 3,8 p.p.m apparait un signal,
d'intensité relative égale a 3, sous forme de singulet correspondant aux
protons du groupement méthoxy. Les protons H-4' et H-5' du groupement
chloro-2-éthyl apparaissent sous forme d'un signal unique a 3,63 p.p.m.
A 2,6 p.p.m se situe un multiplet d',ntensité relative égale a 2, attri-
buable aux protons méthyléniques
H-3 .
A 2,13 p.p.m appara't un triplet au milieu duquel se situe un singulet
l'ensemble du signaJ présente une intensité relative égale a 50 Le
triplet est attribuable aux protons méthyléniques H-4 (J3-4 = 5 Hz)'
alors que le singulet est dû a la résonance des protons H-6 (CH -S-)
3
D'autre part le spectre 'infra-rouge du [(chloro-2-éthyl)-
3 uréido J -2-L-méthionate de méthyle, met en évidence la bande d'absorp-
1
tion due a la vibration de valence de la liaison
S-CH
a 1310 cm- .
3
IV/ - EXEMPLE D'AMINO-ACIDES ACIDES: LES ACIDES L-ASPARTIQUE ET L-GLUTAMIQUE
Nous avons protégé les fonctions acides en formant respectivement
les chlorhydrates di-esters éthyliques pour l'acide L-aspartique (40) et
méthyliques pour l'acide-L-glutamique (41).
La condensation de l 'isocyanate de chloro-2-éthyle sur les
chlorhydrates de L-aspartate d'éthyle et de L-glutamate de méthyle aboutit
a la formation des urées 17 et 18.
-
1
611
711
7
6
5
4 3 2
~
cao CH2 - CH3
CH
C - CH
- CH
3. - CH 2 - a -
2
l'
2'
3'
4'
5!
Il
a
NH - C - NH - CH
- CH
2
2 - Cl
Ila
17

---

- 16 -
1 7"
COOCH
7
6
5
4
3
2
3
/
CH
- CH
3 - 0 - C - CH 2
- CH
2
l'
2'
3'
4'
5'
1/
0
"" NH - C- NH - CH - CH - Cl
2
2
il
0
18
La structure des urées
lZ et ~ a pu ètre établie par
spectroscopie de
R,M.N, dont les éléments communs sont consignés dans le
tableau
111.
TABLEAU
I I I .
Urées
H-1 '
H-3'
H-4 '
H-5'
H-2
H-3
6,13
3,65 (m)
4,83 (m)
2,97 (d)
17
d et t
-
superposés
J 3- 2 = 4Hz
5,90
3,65 (m)
4,57 (m)
2,4 (m)
18
-
d et t
superposés
•
Spectres à 60 MHz dans COC1 3.
Dans le spectre de l'urée lZ apparaissent les signaux de
deux groupements éthoxy, et le sïrmal des protons méthyléniques H-6 et H-6"
sous forme d'un multïplet centré à 4,22 p.p.m, ainsi que celui des protons
méthyliques H-7 et H-7"
sous forme d'un trïplet à 1,28 p.pom (J = 7 Hz)'
Pour l'urée
18
les protons H-7 et H-7" des groupes méthoxy
apparaissent sous forme de sïn9ulets à 3,8 et 3,73 p.p.m et les protons
H-4 sous forme d'un triplet à 2,2 p.p.m (J = 6 Hz)'

---

- 17 -
VI - EXEMPLE DE DI PEPTIDE : L-ftLANYL-L-LEUCINE
Pour la préparation de ce dipeptide nous avons protégé la
fonction amine de la L-alanine parle ~lroupe carbobenzoxy (ou benzyloxy-
carbonyle), introduit en 1932 par BERGMANN et ZERVAS (42). La carboben-
zoxy-L-alanine est obtenue facilement par la méthode de SHOTTEN-BAUMANN
(43), par action du chloroformiate de benzyle sur le sel de sodium de l'a-
cide aminé dans l'eau, a froid, en milieu fortement alcalin.
La carbobenzoxy-L-alanine est obtenue avec un bon rendement (70-80 %)
(42) (44).
La carbobenzoxy-L-alanine 1:2. est couplée au L-leucinate de méthyle 20
obtenu
en neutralisant a froid une solution aqueuse de chlorhydrate de
L-leucinate de méthyle (45) (46).
Nous avons utilisé comme agent de condensation soit la
dicyclohexylcarbodiimide (47) soit l'hexachlorocyclotriphosphatriazène
(48) avec comme solvant l'acétate d'éthyle.
a - C - NH - CH - COOH
+
H N - CH - COOCH
2
3
Il
1
1
a
CH
CH
3
2
1
CH
19
/ , \\
20
CH
CH
3
3
D.C.C
AcOEt
- NH - CH - C - NH - CH - COaCH
!ô'-CH - a - C
1
3
~ 2
Il
1
Il
a
CH
a
CH
3
2
!
CH
21
/
CH3

---

- 18 -
Le dipeptide carbobenzoxy-L-alanyl-L-leucinate de méthyle
21
est
obtenu avec un excellent rendement de 80 à 90 % (49)0
Le déblocage de la fonction amine du dipeptide c'est-à-dire
l'élimination du groupe carbobenzoxy s'effectue facilement:
- soit par hydr.ogénation catalytique douce en présence
diacide chlorhydrique ou acétique avec dégagement de gaz carbonique, forma-
tion de toluène, et obtention du chlorhydrate ou de l lacétate du peptide.
Le catalyseur utilisé est soit du palladium sur charbon, soit du palladium
"black" (50) (51), soit l 1 oxyde de platine (52) ;
- soit en utilisant une solution diacide bromhydrique dans
l'acide acétique glacial, avec dépagement de gaz carbonique~ formation
de bromure de benzyle et obtention du bromhydrate du peptide (53).
IQ\\-CH - 0 - C-
~2
NH - CH - C - NH -
Il
1
Il
o
CH
0
3
21
HBr
AcOH
+
Br-
H N - CH - C - NH - CH - COOCH
+
3
1
3
1
Il
CH
0
CH
3
2
1
CH
/ "
CH3
CH3
22

---

- 19 -
A partir du bromhydrate
22
nous préparons la N-chloro-2-éthyl urée du
peptide
23, en effectuant la condensation de 1lisocyanate de chloro-2-
éthyle dans le dichlorométhane à O°C, en présence dlun excès de trié-
thylamine. Llurée
23
est obtenue avec un rendement de 60 à 70 %0
- CH - C - NH - CH - COOCH
1
Il
~
3
CH
0
CH
3
2
1
CH
22
/
CH
CH
3
'" 3
Cl - CH
- CH
- N ~ C = 0
2
2
CH C1 , Et N
2
2
3
Cl - CH
- CH
- NH - C - NH - CH - C - NH - CH - COOCH
2
2
Il
1 3
il
3
!
o
CH
0
CH
3
2
1
CH
23
/
CH
CH
3
'" 3
La structure ~e llurée
23
a pu être établie sans ambiguité
grâce à son spectre de R.M.N (Fig. 3). Afin dleffectuer l lattribution des
signauxdes divers protons de cette molécule nous utiliserons la nomenclature
suivante
11
3
2
2 1
3 1
4 1
51
- C - CH - NH - C - NH - CH
- CH
- Cl
~I
2
2
11
Il
o
CH
o
3
- Fig.3 -

---

- 20 -
A champ faible nous trouvons 3 signaux échangeables par deutériation et
d'intensité relative égale à 1 correspondant aux protons NH, soit H-l ' ,
H-3' et H-4. Tout d'abord à 7,93 p.p.m se situe un doublet ayant une
constante de couplage de 7 Hz' Ni le déplacement chimique, ni la constante
de couplage ne correspondent au proton
H-l', et par conséquent ce signal
est attribuable
au proton H-4 de la liaison peptidique.
A 6,66 p.p.m se situe un doublet dont la constante de couplage est égale
à 9 Hz' ce qui correspond au proton H-l' puis à 6,33 p.p.m
nous trouvons
un triplet mal résolu correspondant au proton H-3'.
A champ plus élevé soit 4,6 p.p.m
se situe un multiplet d'intensité
relative.éqale à2 et attribuable aux deux protons méthines H::"2 et H-5,
ces deux protons ayant le même environnement. A 3,8 p.p.m
nous retrou-
vons sous la forme d'un singulet les 3 protons du groupement protecteur
méthoxy de la fonction acide de la L-leucine. A3,63 p.p.m
se situe
le signal unique des protons H-4 1 et H-5 1 de la chaîne chloro-2-éthyl.
A champ élevé nous avons les siqnaux relatifs aux groupe-
ments caractéristiques des deux amino-acides, soit à 1,7 p.p.m
un
multiplet d'intensité relative éqale à 3 correspondant aux protons
H-6 et H-7 de la L-leucine. A 1,4 p.p.m
un doublet ayant une constante
de couplage de 7 Hz d'intensité relative égale à 3 correspondant aux
protons méthyliques H-l de la L-alani~e.
Enfin à 0,97 p.p.m nous trouvons un signal sous forme de
doublet d'intensité relative égale à 6, ayant une constante de couplage
de 5 Hz, correspondant aux protons H-8 et H-9
des deux méthyles du
groupement isobutyle de la L-leucine.
En spectroscopie Infra-Rouge on retrouve les bandes d'ab-
sorpti on caractéri sti ques des vi brati ons de valence des J iaisons N-H à
3340 et 32.60 cm-l, C,:",Hà 2950 cm-l.L'absorption intense due à la vibration
de valence du groupement carbonyle de l'ester se situe à 1730 cm-l, et de
l'urée à 1620 cm- l . En outre sont observables les bandes amides l à
1650 cm-l, amide II à 1550 cm-l, et amide III à 1290 cm- l . Les vibrations de
valence de la .liaison C-Cl présentent une absorption infra-rouge à 740 et 640 cm- l .
Toutes les urées synthétisées précédemment ont été nitrosées afin
d'obtenir les chloro-2-éthyl nitrosourées correspondantes. Les développements
relatifs aux nitrosourées constitueront le second chapitre.

---

U I 0.., o U
U-U-u l
Z I
U=O
U-U I
Z T
U=o
Z I
U I
U l
U
l
1
1
1
l
1
1
1
IN
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2
tJ:)
o
2: J:
o w
N

---

- 21 -
1_ 2ÈME
_ _ _
CHAPITRE
_ _ _ _ _
1
....4
LES N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREES DIAMINO-ACIDES
=====================================:===========
Il -
METHODES DE NITROSATION
Plusieurs techniques expérimentales permettent d'obtenir les
chloro-2-éthyl nitrosourées, le choix de l lune d!elles est fonction de
l'urée considérée,
La nitrosation consiste à substituer un atome d'hydrogène
porté par un atome d'azote de la chaine chloro-2-éthyl uréido par un groupe-
ment nitroso-NO.
Parmi les techniques de nitrosation nous citerons tout d'abord
l'utilisation du trioxyde d'azote par JOHNSTON et coll
(26) dans le cas de
la chlorozotocine i, et par HESSLER et JAHNKE (54) dans le cas de la strep-
tozotocine 25.
OH
NH
0 = C /
25
..........
~ - CH3
NO
B. BANNISTER (58) préconise l 'emploi du chlorure de nitrosyle liquéfié
que l'on ajoute à une solution de l'urée à nitroser dans la pyridine.
Une troisième méthode utilisée par JOHNSTON et coll (55)
néc~ssite l'emploi du nitrite de sodium sur une solution de l'urée à
nitroser dans l'acide formique. Cette technique que nous avons utilisé
préférentiellement présente l lavantage de minimiser les nitrosations
parasites.

---

- 22 -
Au cours de la nitrosation d'une chloro-2-éthyl urée deux
positions sont suceptibles d!être nitrosées, mais seule la position du groupe
nitroso sur 1lazote 31 est intéressante au point de vue chimiothérapie.
En effet, dans cette position, la chloro-2-éthyl nitrosourée
se scindera entre le carbonyl et l'azote portant le groupe nitroso pour
donner d'une part un isocyanate et de l'autre un dérivé diazohydroxyde
instable redonnant un ion vinyl carbonium aux propriétés alkylantes (59)
(Fi g. 4)
NO
11
2'
13 1
4 1
5'
R - NH - C - N - CH 2 - CH2 - Cl
Il
o
+
- - - )
= N
+ OH- + 0 = C = N - R
l
- Fig. 4 -
Par contre si la position 11 est nitrosée, la formation de 1 lion carbonium
est impossible et les propriétés oncostatiques disparaissent.
JOHNSTON et coll (55) (56) ont constaté 1lexistence de nitrosations parasites
dans le cas des N-chloro-2-éthyl urées substituées par un groupement alicy-
clique ou aromatique.
NO
1
R - NH - C - N - CH 2 - CH - Cl
2
Il
o
24 a
R - NH - C - NH - CH2 - CH2 - Cl ~
Il
NO
o
!
24
R - N - C - NH - CH 2 - CH2 - Cl
1/o
24 b

---

- 23 -
Ces auteurs ont obtenu le composé nitrosé 24 a
seul, en
utilisant l'acide formique non dilué (98-100 %) et du nitrite de sodium
anhydre. Par contre en milieu aqueux, c'est-à-dire acide formique à 85 %,
ou en utilisant une solution aqueuse de nitrite de sodium, le composé de
nitrosation parasite
24 b est obtenu en proportion non négligeable.(55)
Au cours de la nitrosation des N-chloro-2-éthyl urées d'amino
acides, nous avons constaté l lexistence de nitrosations parasites si llacide
formique et le nitrite de sodium n'étalent pas anhydres.
COOCH
COOCH
3
./'
3
/
R - CH
NO
R - CH
"-
1
NH - C - N - CH
- CH
Cl
" N- C - NH - CH2 - CH2 - Cl
Il
2
2
1
el
0
NO
0
25 a
25 b
Les deux composés 25 a et 25 h, dans lesquels le Radical R caractérise
l 'amino acide, représentent les deux possibilités suceptibles de se présenter
au cours d'une réaction de nitrosation. Le composé
25 b résulte d'une
nitrosation parasite, décelable par CCM. En effet les deux produits présentent
des Rf légèrement différents. Ces deux composés sont parfaitement identifia-
bles en spectroscopie de RoM.N, En effet les protons N-H et ceux de la chaine
chloro-2-éthyl résonnent sous la forme de signaux différents
Le composé attendu
25 a
donne en spectroscopie de R.M.N
un doublet pour le proton NH, et deux triplets distincts pour les protons
méthyléniques de la chaîne chloro-2-éthyl 0
Par contre le composé ~ présente en spectroscopie de R.M.N.
un triplet pour le proton NH, et un signal multiplet, analogue à celui des
urées, pour les protons de la chaine chloro-2-éthyl,
Donc la spectroscopie de R.M.N permet de déterminer le site
de nitrosation dans une chloro-2-éthyl nitrosourée d'amino acide,
D'autre part une nitrosourée présente en spectroscopie I.R.
un déplacement de la bande d'absorption du groupement carbonyle vers les
longueurs d'onde plus élevées (57),

---

- 24 -
De plus l lexistence de nitrosations parasites sous forme d'un
mélange de composés du type
25 a et
25 b ou (24 a et 24 b) entraîne
l'apparition d'un dédoublement des bandes d'absorption pour les bandes
C=O et N-H dans le spectre I.R (56),
Pour l a suite de cet exposé nous adopter ons le même pl an
que nous avons utilisé pour le deuxième chapitre concernant les chloro-2-
éthyl urées d'amino acides.
11/ - LES N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREES D'AMINO-ACIDES LIPOSOLUBLES.
Les chloro-2-éthyl urées des amino-acides tels que la L-alanine
~t la L-valine ~ et la L-leucine lQ, ont été nitrosées par l laction du nitrite
de sodium anhydre en présence d'acide formique 98-100 %. Les nitrosourées
correspondantes 26, ~ et 28 sont obtenues avec un excéllent rendement de
llordre de 90 %.
1
3
2
COOCH3
CH
- CH
3
---- 11 2' NO 41 51
26
~
13'
NH - C - N - CH 2 - CH2 - Cl
Il
0
4
1
CH
COOCH
3
3
3
2
...........
/ '
CH
- CH
5
11
21 NO
4'
5'
./'
"
13 1
CH
NH - C - N - CH
3
2 - CH 2 - Cl
27
Il
0
5
1
CH3
COOCH3
"- 4 3
2
/'
CH - CH 2 - CH
11
21 NO
4'
5'
6
/
~
1
'3
NH - C - N - CH
- CH
2
2 - Cl
28
CH3
Il0

---

- 25 -
Ces trois composés se présentent sous la forme d'une huile
jaune incristallisable, parfaitement homogène en C.C.M dans différents
mélanges de solvants.
En spectroscopie I.R, ces composés présentent une bande
1
d'absorption due à la vibration de valence de la liaison N-NO à 1500 cm-
pour la
nitrosourée
26
et 1495 cm- 1 pour les nitrosourées
27 et 28.
La structure des nitrosourées
26, ~ et
28
est déterminée
sans ambiguité par spectroscopie de R.M.N.
Nous adopterons la nomenclature figurant sur les schémas
26, ~ et 28.
Les déplacements chimiques seront exprimés en
b p.p.m
par rapport au T MS utilisé comme référence intense.
Dans les nitrosourées
26,~, 28
le proton H-l' résonne
sous la forme d'un doublet par suite du couplage avec le proton H-2.
Ce doublet est observable à 9~04 p.p.m (26), 7,6 p.p.m (27), et 7,37 p.p.m
(28)
pour les nitrosourées considérées.
Le proton H-2, lié au carbone
asymétrique de l'acide aminé,
résonne sous la forme d1un multiplet à 4,51 p.p.m pour la nitrosourée 26,
à 4,73 p.p.m pour la nitrosourée 27, et 4,77 p.p.m
pour la nitrosourée 28.
Par ailleurs, ce multiplet comme pour les urées correspondantes, se simplifie
par deutériation en un doublet pour la nitrosourée ~, en un triplet pour la
nitrosourée 28, et en un quartet pour la nitrosourée
26.
Les protons du Çlroupement méthoxy résonnent sous la forme
d'un singulet observable à 3,67 p.p.m, 3,87 p.p.m et 3,83 p.p.m pour les
nitrosourées correspondantes ~, 27 et 28.
Les protons méthyléniques de la chaîne chloro-2-éthyl,
du fait de la présence du groupement nitroso sur l'atome d'azote N-3',
résonnent sous la forme de deux triplets distincts ayant la même
constante de couplage. L'ensemble des déplacements chimiques est indiqué
dans le tableau
IV.

---

- 26 -
TABLEAU
IV
SPECTRES DE R.M.N
Nitrosourée
H-)'
H-2
OCH
H-4'
H-5'
3
26
-
9,04 (cl)
4,5) (m)
3,67 (s)
3,58 (m)
4, ) ) ( t)
OMSO cl 6
J )'-2 = 7 5H
J 5 '-4'= 7H
90 MH
'
z
z
z
27
7,6 (cl)
4,73 (m)
3,87 (8)
3,57 ( t)
4,27 ( t)
-
COC1 3
J), -2 = 8 H
J
z
4 '-5'= 6H
J
z
5 '-4'= 6 Hz
60 MHz
28
-
7,37 (cl)
4,77 (m)
3,83 (8)
3,53 (t)
4,23 ( t)
COC1 3
J )'-2 = 8 H
J
z
4 '-5'= 7H
J
z
5 '-4'= 7 Hz
60 MHz
Les protons des 9roupements méthyle de l'alanine 26, isopropyle
de la valine 27, et isobutyle de la leucine 28, sont parfaitement déterminés
en spectroscopie de R.M.N ; leurs déplacements chimiques sont indiqués dans
la partie expérimentale.
111/ - LES N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREES DERIVEES DE LA L-SERINE.
Les urées de la séri ne li bre ..!.!., dIJ carbama te 11, du para-
nitrobenzoate 13, de l'acétate 14 et de chloroacétate 15 ont été nitrosées
afin d'obtenir les nitrosourées correspondantes
29, 30, ll, 32 et 33.
HO -
NO
1
29
NH - C - N - CH 2 - CH2 - Cl
Ilo

---

- 27 -
/
COOCH3
Cl - CH
- CH
- NH - C - 0 - CH 2 - CH
30
2
2
Il
NO
,
o
"'" NH - C - N- CH - CH - Cl
2
Il
2
o
-RY-
COOCH3
NO
C - 0 - CH
- CH /
2~11
NO
31
2
""-
1
o
NH - C - N - CH
- CH
- Cl
2
2
Il
o
/
COOCH3
C - 0 - CH
- CH
32
NO
Il
2
1
o
NH - C - N - CH
- CH
- Cl
2
2
Il
o
COOCH 3
/
Cl - CH
- C - 0 - CH
- CH
33
2
NO
1
2
"
"'"
o
NH - C - N - CH
- CH
- Cl
2
2
Il
o
L'urée du L-sérinate de méthyle l! présentant un caractère
hydrosoluble a été nitrosée, en solution dans le dichlorométhane à O°C et
en présence de pyridine, par le chlorure de nitrosyle. Les autres urées
ont été nitrosées en solution dans 1 'acide formique pur par le nitrite de
sodium anhydre. Les nitrosourées correspondantes sont obtenues sous forme
d'huile jaune avec un rendement voisin de 90 %.
Dans le cas du carbamate 12

---

- 28 -
1
COOCH3
8
7
6
5
4
3
2 /
Cl - CH
- CH
- NH - C - o - CH
- CH
2
2
2
11
21 31
41
51
12
JI
'-.....
0
NH - C - NH - CH
- CH
- Cl
2
2
Il
0
deux positions N-6 et N-3 1 sont susceptibles d~être nitrosées, En effet la
nitrosation de ce composé aboutit à un mélange de dérivés séparés par
chromatographie sur colonne de gel de silice.
Le plus abondant est un dérivé mononitrosé, en effet llétude
de son spectre de R.M.N fait apparaître deux signaux correspondant aux
protons N-H. Un doublet dlintensité relative égale à 1 apparait à 7,95 p.p.m
et attribuable au proton H-1 1, puis un triplet d'intensité relative égale
à 1 apparait à 5,9 p.p.m attribuable soit au proton H-3 1 soit au proton H-6.
Les protons H-3 1 et H-6 appartiennent chacun à une chaîne chloro-2-éthyl et
ont par conséquent le même environnement. On ne peut les différencier et la
détermination du site de nitrosation est impossible.
La structure des autres nitrosourées 29, 1!, 32 et 33
a
pu être établie à partir de leur spectre de R.M.N. Les déplacements chimi-
ques des protons communs aux quatre
nitrosourées sont indiqués dans le
tableau V.
Afin dlidentifier les protons considérés nous utiliserons la
nomenclature suivante (Fig.5)
1
COOCH3
3
2 /
R - 0 - CH
- CH
2
11
" 21 NO 4' 51
13'
NH - C - N - CH2 - CH - Cl
2
\\1
0
- Fig. 5-

---

..
•
U
0 0 U
I
....
,.I/
U
l'''t
U=o
0
U l
U
Z-z 0
t
1
1
1
Z I
U=o
U I
U Ï
U
l
1
1
IN
J
i
.. ~
.. 0
.. Q
.. q
Q
o
en CL W 0 ~ a: W
0
w
~
:E
z
ID
0
::E
:I:
c W
~I
N

---

TABLEAU V
SPECTRES DE RMN à 60 MHz dans CDCl 3
Nitrosourées
H-]'
H-4'
H-5'
H(OC!!])
H-2
H-3
29
7,87 (d)
3,58 (t)
4,20 (t)
3,83 (s)
4,75 (m)
4,08 (d)
-
J] '-2 = 8H
J -
= 4H
z
J 4 '-5' = 7Hz
J 5 '-4' = 7Hz
3 2
z
31
7,83 (d)
3,53 (t)
4,22 (t)
3,93 (s)
5, ] 7 (m)
4,93 (d)
-
J ]'-2 = 9H
=
z
J
J -
4H
4 '-5' = 7H z
J 5 '-4 = 7Hz
3 2
z
32
7,77 (d)
3,55 (t)
4,22 (t)
3,88 (s)
5, ° (m)
4,6 (d)
-
J
=
1'-2 = 8H
-
4H
z
J 4 '-5 = 7Hz
J 5 '-4' = 7Hz
J 3 2
z
33
7,78 (d)
3,57 (t)
4,23 (t)
3,90 (s)
5,07 (m)
4,73 (d)
-
J] , -2 = 8H
-
= 4H
z
J 4 '-5' = 7Hz
J 5 '-4' = 7Hz
J 3 2
z
N
\\,0
"""" .••.."\\'''''1'....-",.,/.\\;,,,.. - ..é....,,"."""~,'l,'·"'.· ,~,",.•.~.«--""'..,.~.
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---

- 30 -
Outre les éléments communs indiqués dans le tableau V, les spectres de
R.M.N
des nitrosourées
29,~, 32 et 33
présentent des signaux permettant
de les identifier.
Pour la nitrosourée 29, on observe un signal élargi d'intensi-
té relative égale à 1, échangeable
par deutériation correspondant au proton
du groupement hydroxyle de la sérine.
Le paranitrobenzoate ~ est identifiable en spectroscopie de
R.M.N par l'apparition du signal des protons aromatiques à champ faible
à 8,28 p.p.m.
L'acétate
32 présente un signal singulet à 2,1 p.p.m
attribuable aux protons méthyliques
du groupement acétate.
De même pour le chloroacétate 33, on observe à 4,15 p.p.m
un signal singulet d'intensité relative égale à 2 correspondant aux
protons méthyléniques du groupement chloroacétate.
Pour tous les dérivés de la L-sérine, l'addition d'eau lourde entraine la
disparition
du signal correspondant au proton NH-1' et la simplification
du signal multiplet du proton H-2 en un triplet. Ce triplet est dû à la
suppression du couplage avec H-1' échan9é par le deutérium et possède
une constante de couplage de 4 ou 5 Hz.
D'autre part ces mêmes composés présentent en spectroscopie
I.R une absorption due à la vibration de valence de la liaison N-NO
comprise entre 1490 et 1500 cm- 1.
IV/ - LA N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREE DU L-METHIONATE DE METHYLE.
Nous avons nitrosé l'urée de L-méthionate de méthyle ~
par le nitrite de sodium anhydre en présence d'acide formique pur.
La nitrosourée 34 est obtenue sous forme d'une huile jaune incristallisable.
1
COOCH3
6
5
4
3
2
. /
CH
- S - CH
- CH
3
2
2 - CH " l' 2'
34
NH - C
Ir
o

---

•
uIz o
~ ~Z-Z
"
U
r. ~
U
1
~ U ~ U
0'1
...
/
± 6=0
I
U I
U
IN
I~
.~
.
U)
0-
W
u t- a: w
.
[

---

-
------~
- 31 -
La structure de la nitrosourée 34 a pu être établie grâce à la spectroscopie
de R.M. N.
Le spectre dans le deutério-ch1oroforme
à 60 MHz de 34 fait apparaître à
7,7 p.p.m un doublet (J = 8 Hz)' ce si~na1 échangeable par deutériation est
attribuable au proton H-1'. A 4,91 p.p.m se situe un signal multiplet
d'intensité relative égale à 1, qui se simplifie par deutériation et provient
de la résonance du proton H-2. A 4,23 p.p.m apparait un triplet (J = 7 Hz)
d'intensité relative égale à 2 correspondant aux protons H-5 1.
A 3,83 p.p.m se situe un singulet dlintensité relative égale à 3, dû
à la résonance des protons du groupement méthoxy.
A 3,55 p.p.m apparait un triplet (J = 7 Hz) d'intensité relative égale
à 2 et correspondant à la résonance des protons H-4'.
A 2,6 p.p.m se situe un signal multiplet dlintensité relative égale à 2
et attribuable aux protons méthy1éniques H-3.
A 2,17 p.~.m on trouve un sipna1 multiplet au milieu duquel apparait un
signal singulet dû aux trois protons H-6 du groupe méthyle mercaptan.
Le signal multiplet correspond à la résonance des protons méthy1éniques H-4.
En spectroscopie IR, la nitrosourée 34
présente une bande
d'absorption due à la vibration de valence de la liaison N-NO à 1490 cm- 1.
VI LES N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREES DES AMINO-ACIDES ACIDES.
----------------------------------------------------------
Les urées 17 de 1lacide L-aspartique et 18 de l'acide
L-g1utamique ont été nitrosées par l'action du nitrite de sodium anhydre
en présence d'acide formique pur.
Les nitrosourées correspondantes
35
et
36
sont obtenues sous forme
d ' hui1e incristallisable.
1 6"
7"
COOCH
CH
2
3
7
6
5
4
3
2
,,/
CH 3 - CH2 - o - C - CH2 - CH
~031
35
Il
" 11 21
41
51
0
NH - C - N - CH
- CH
2
2 - Cl
Il
0
\\!
f!

---

- 32 -
1
7"
cao CH
7
6
5
4
3
2
3
/ '
CH
- a - C - CH - CH - CH
3
2
2
l'
2'
~03' 41
51
36
Il
""-
a
NH - C - N
- CH
- CH
2
2 - Cl
il
a
L'étude en spectroscopie de R.M,N des nitrosourées ~ et 36
a permis
dlétablir leurs structures.
Les déplacements chimiques des protons comparables dans les deux nitro-
sourées sont indiqués dans le tableau VI,
TABLEAU VI
SPECTRES R.M.N à 60 MHz dans COC1 3
Nitrosourée
H-I'
H-4'
H-5'
H-2
H-3
35
7 98 (cl)
3 56 (t)
4 28 (m)
5 05 (m)
3 12(cl)
t
t
t
t
t
-
JI '-2 = 8H
J
=5H
z
4 '-5' =7H
J
z
3- 2
z
36
7 78 (cl)
3 43 (t)
4 23 (t)
4 73 (m)
2 4 (m)
t
t
t
t
t
-
JI' -2 = 8H
J 4 '-5' =7H
J 5 '-4' =7H
z
z
z
Outre les éléments rapportés dans ce tableau, le spectre de
R.M.N de la nitrosourée ~ comporte les si9naux des deux groupements
éthoxy. Les signaux des protons méthyléniques H-6 et H-6 11 apparaissent sous
forme d'un multiplet superposé au si9nal du proton H-5 1 à 4,28 p.p.m. Le
signal des protons méthyléniques
H-7 et H-7"
apparait sous la forme dlun
triplet à 1,3 p.p.m avec une constante de couplage J6- 7 = 7 Hz'

---

- 33 -
Pour la nitrosourée
36
les signaux des protons H-7
et
H-7 11
des groupements méthoxy apparaissent sous forme de singulets à 3,83
et 3,7 p.p.m. De même le signal des protons H-4
est superposé à celui
des protons H-3 sous la forme d'un multiplet centré à 2,4 p.p.m.
La spectroscopie I.R
met en évidence les bandes d'absorp-
tion de la vibration de valence de la liaison N-NO à 1500 cm- 1 pour la nitro-
sourée 35
et à 1492 cm-1 pour la nitrosourée
36.
VIl - LA N-CHLORO-2-ETHYL NITROSOUREE DU L-ALANYL-L-LEUCINATE DE METHYLE
Nous avons effectué la nitrosation de l •urée du dipeptide
L-ala-L-leuOMe
23
par l'action du chlorure de nitrosyle et du nitrite
de sodium.
L'action du chlorure de nitrosyle sur une solution dans le
dichlorométhane d'urée à nitroser, à DoC et en présence de pyridine,
conduit à une huile jaune. La chromatographie· sur couche mince de cette
huile révèle en U.V., la présence de deux composés ayant des Rf très
voisins.
Par analyse en C.L.H.P.
la présence des 2 composés est mise en évidence.
Le support utilisé étant une colonne microporasil, avec comme éluant un
mélange chloroforme 95 %et acétonitrile 5 %. La détection est réalisée
en U.V. Ces deux composés ont des temps de rétention de 19,2 mn pour le
composé minoritaire et de 26 mn pour le composé majoritaire. Le composé
minoritaire étant le résultat d'une nitrosation parasite en position N-l',
le majoritaire étant le composé attendu. La proportion des deux produits
dans le
di agramme de l a Fi g. 6 a
est envi ron de 1/3.
Le mélange de composés est confirmé en spectroscopie de
R.M.N par la présence dans le spectre de 3 signaux échangeables par
deutériation et correspondants aux protons N-H.

---

- 34 -
Deux doublets d'intensité relative égale à un et un triplet
dont l'intégration est inférieure à un. Les deux doublets correspondent
au composé majoritaire nitrosé en position 31 , l'existence du triplet
révèle la présence en proportion inférieure d'un composé de nitrosation
parasi te en 1'.
Le composé attendu
37
ayant la structure suivante
NO
5
4
3
2
l'
2'
3'
4'
5'
1
CH
OOC - CH - NH - C - CH
- NH - C - N - CH
- CH
- Cl
3
2
37
2
1/
6/
11
Il
a
a
CH
CH
2
3
71
CH
8/
,,9
CH3
CH3
Afin de minimiser la nitrosation parasite, nous avons
nitrosé l'urée du dipeptide ~ en utilisant la méthode préconisée par
JOHNSrON et coll (56), qui consiste à ajouter du nitrite de sodium à une
solution de l'urée dans l'acide formique.
L'huile obtenue a été analysée en C.L.H.P
avec comme éluant
un mélange chloroforme 95 % - acétonitrile 5 %dans les mêmes conditions
que précédemment.
Le diagramme obtenu par enregistrement indique la pré-
sence des deux composés dans des proportions plus faibles.
Le composé parasite représente le dixième de la nitrosation (FiQ. 6 b).
En répétant l'expérience avec de l'acide formique fraîchement
distillé, et du nitrite de sodium anhydre, la proportion du composé parasite
est négligeable (Fig. 6 cl. L'huile obtenue dans cette expérience cristallise
en chambre froide au bout de 15 jours.

---

..
•
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-u-
J
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.
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1
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•
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~
· · ·
..

---

NO
1
CHOOC - CH-NH-C - CH-NH-C-N-CH- CH - CI
:s
2
2
1
Il
1
JI
CH
0
CH]
0
2
1
CH
/
"
C~
CH)
.
'1 . . . . LA ••• 1 .. ', .• J ...... ( •••• 1 •.•• 1. '"
L
S
f t '
j . ft ••
8.0
70
60
5.0
4.0
3.0
1.0
1.0
0
SPECTRE
R MN
80 MHZ
DE ~
•

---

- 35 -
Le spectre de R.M.N
de la nitrosourée
37
permet de
confirmer sa structure. Pour l 'attribution des signaux nous utiliserons la
nomenclature indiquée précédemment.
A champ faible nous trouvons deux signaux échangeables par
deutériation et d'intensité relative é9ale à 1 correspondant aux protons NH.
A 7,8 p.p.m
se situe un doublet ayant une constante de couplage de 7 Hz
correspondant au proton H-4 de la liaison peptidique.
A 6,97 p.p.m
apparaît un doublet de constante de couplage égale à 9 Hz
et attribuable au proton H-1'.
A 4,6 p.p.m
se situe un multiplet d'intensité relative égale à 2 et
attribuable aux deux protons méthines H-2 et H-5, ces deux protons ayant
même environnement.
A 4,22 p.p.m
apparaît un triplet, d'intensité relative égale à 2 et de
constante de couplage de 7 Hz' attribuable aux protons H-5' de la chaîne
chloro-2-éthyl.
A 3,8 p.p.m
nous retrouvons sous la forme d'un singulet le siQnal des trois
protons du groupe méthoxy.
A 3,57 p.p.m
se situe un triplet, d'intensité relative égale à deux et
de constante de couplage de 7 Hz'
attribuable aux protons H-4' de la
chaîne chloro-2-éthyl.
A champ fort nous trouvons un multiplet à 1,57 p.p.m
d'intensité relative
égale à 6 correspondant à la superposition des signaux des protons H-1
de la L-alanine, H-6 et H-7 de la L-leucine. A 0,93 p.p.m
on observe un
doublet d'intensité relative éQale à 6, ayant une constante de couplage de
5 Hz' correspondant aux protons méthyliques H-8 et H-9 de la L-leucine.
L'étude du spectre
I.R
de la chloro-2-éthyl nitrosourée
du dipeptide met en évidence l'absorption de la vibration de valence de la
liaison N-NO à 1490 cm- 1
Toutes les urées précédemment décrites ont été testées
afin d'évaluer leur activité antimitotique.
Les développements concernant les tests biologiques constitueront le
chapitre suivant.

---

- 36 -
3ËME CHAPITPE
/ _ - - - - - _ - - - ! /
LES TESTS BIOLOGIQUES
=====================
Il -
ACTIVITE BIOLOGIQUE.
Le mode d'action des chloro-2-éthyl nitrosourées s'apparente
aux composés alkylants. En effet au cours de la métabolisation une nitro-
sourée du type
NO
1
R - NH - C - N - CH
- CH
- Cl
Il
2
2
o
se scinde entre le carbonyl et l'atome d'azote portant le groupe nitroso
pour donner d'une part un isocyanate et de l'autre un dérivé diazohydroxyde
instable donnant un ion vinyl carbonium après élimination de chlorure
d'hydrogène (Fig. 7) (59)
NO
1
R - NH - C - N - CH
- CH
- Cl
---) Cl - CH
- CH
- N = N+ + OH- + R - N =C=O
"
2
2
2
2
o
t
Cl - CH
CH +
2 -
2
l
CH
= CH+
+ HCl
2
- Fig. 7 -

---

- 37 -
De par
la formation
de l'ion vinyl carbonium on peut s'attendre à ce
que les nitrosourées se comportent comme des agents alkylants monofonctionnels.
Les agents alkylants réagissent avec les centres nucléo-
philes présents sur les acides aminés, les protéines, les enzymes et les
acides nucléiques. On admet 9énéralement que la véritable cible de ces
agents est l'A.D.N. (60).
Parmi les centres nucléophiles de l'A.D.N suceptibles de
réagir avec les agents alkylants, on peut citer les trois bases, guanine,
adénine et cytosine. Des trois bases, la guanine est particulièrement visée
notamment l'atome d'azote N-7 qui représente à 90 % la position préféren-
tielle d'alkylation (61)
La cytotoxicité des agents alkylants dépend de la présence du système de
réparation de l'A.D.N.
L'avantage des nitrosourées sur les agents simplement
alkylants, est dû à la libération de l 'isocyanate, qui agit sur les
enzymes de réparation de l'A.D.N, et par la même augmente l'activité de
ces composés (24).

---

- 38 -
11/ - TEST "IN VITRO".
L'activité antimitotique des composés synthétisés est
évaluée "in vitro" en utilisant un test biologique basé sur l'inhibition
de croissance de la racine de Lépidium sativum L..
La technique mise en oeuvre par F. GAGIU et coll. (62)
puis reprise par d'autres chercheurs (63, 64, 65) permet, en utilisant
de la méthylcellulose 1 %, de résoudre partiellement le problème posé par
l'insolubilité dans l'eau de la plupart des substances. En effet, la
méthylcellulose 1 %n'établit pas avec les nitrosourées une suspension
colloïdale homogène. Nous avons donc utilisé comme solvant le diméthyl-
sulfoxyde (DMSO).
L'ensemble des 12 nitrosourées synthétisées a été testé
par comparaison avec une nitrosourée de 1ère génération la (chloro-2-éthyl)-
1 cyclohexyl-3 nitrosourée
C.C.N.U
2.
Pour ce bio-test, nous avons utilisé le Lépidium Sativum L.
(cultivar Cresson alénois frisé) selon une méthode décrite par ailleurs
(62). Nous la résumons brièvement.
La germination des graines s'effectue dans l'obscurité, et a
la température de 28°C. Cette germination est réalisée dans une boîte de Pé-
tri (diamètre 15 cm) pourvue de 2 disques de papier-filtre, et contenant
10 ml d'eau distillée et 3 9rammes de Çlraines réparties uniformément.
Après 24 heures 20 plantules sont disposées dans une boîte
de Pétri (diamètre 9 cm) contenant deux disques de papier filtre et 4 ml
de solution a tester.
Pour chaque nitrosourée un gradient est réalisé aux concen-
trations suivantes: 0,10 , 0,075 , 0,050,
0,025 milligramme par
millilitre de solution aqueuse.
La dissolution des nitrosourées s'effectue dans la même
quantité de diméthylsulfoxyde (DMSO) soit
0,02 ml/ml quelque soit la
concentration utilisée.

---

- 39 -
Lors d'un test,
deux boîtes de Petri sont mises en oeuvre pour chaque
concentration et pour le témoin. Chaque substance est testée 4 fois soit
un total de 160 plantules. Les dilutions sont effectuées et administrées
rapidement
pour éviter la décomposition des nitrosourées à éprouver.
L'inhibition de la croissance est déterminée par comparai-
son de l'allongement des racines du lot traité avec celui du lot témoin.
Si l Ion désigne par L la longueur initiale, correspondant
o
à la longueur de la racine de la plantule 24 heures après la mise en
germination, et L la lon9ueur au temps final 24 heures après le début du
t
test
l,allonpement
absolu
~L
est:
~L = L
- L
t
0
La comparaison d'allongement absolu d'un lot traité
~LTR avec celui
d'un lot témoin
~LTE
conduit à exprimer la grandeur relative
dont le pourcentage indique le coefficient d'inhibition
l % =
x 100
L'action inhibitrice, sur la croissance des racines de
Lépidium sativum obtenue avec les nitrosourées testées aux concentrations
indiquées antérieurement, est exprimée en pourcentage par rapport à
l'allongement absolu du lot témoin (tableau VII).

---

- 40 -
TABLEAU
VII
C : mg/ml
0,1
0,075
0,050
0,025
C.C.N.U
2
76,9
58,3
39,2
25,5
-
Ala.CNU
26
64,5
63,1
54,1
41,7
-
Val. CNU
27
40,7
33,3
29,6
4,3
-
Leu.CNU
28
62,5
53,7
42,3
29
-
Ser-CNU
29
33,6
27,4
18
9,1
-
CU.Ser CNU
30
29,5
24,7
19,3
5,0
-
PNB Ser CNU
31
15,3
9,8
0,2
+ 1,7
-
AcO Ser CNU
32
36,4
26
23,5
12,6
-
Cl AcO Ser CNU
33
41,4
35,3
30,2
15,4
-
Met CNU
34
49,8
42,2
36,5
25,8
-
Asp CNU
35
48,4
40,2
31
20,1
-
Glu CNU
36
51,7
41,4
34,8
21
-
CNU.Ala-LeuOMe
37
69,4
63,1
49,1
32,6
-

---

- 41 -
Aux concentrations inférieures à 0,1 m9/ml seules les nitrosourées de
la L-alanine, de la L-leucine et du dipeptide Ala LeuOMe sont plus actives
que la
C.C.N.U.
Avec les nitrosourées les plus actives sur la croissance des
racines
du Lépidium sativum, c'est-à-dire les nitrosourées Ala CNU 26,
Leu CNU 28, et le dipeptide ~, nous avons déterminé à quelles concentra-
tions pondérales et molaires nous obtenions 100 %d'inhibition.
Les mesures sont effectuées à des concentrations plus élevées
que précédemment, avec comme composé de référence la
C.C.N.U
2.
Les résultats sont indiqués dans le tableau
VIII.
TABLEAU
VIII
100 % d'inhibition
Poids
100 % d' inhibi tion
Nitrosourée
Concentrations en mg/kg
Moléculaire
Concentratio~6en mole/
kg (la
)
C.C.N.D
2
0,5 - 0,4
233,5
2, 14 -
1, 71
-
Ala CND
26
0,5 - 0,4
237,5
2, la -
1,68
-
Leu CND
28
0,6 - 0,5
279,5
2, 14 - 1, 79
-
Ala Leu CND 37
0,75 - 0,6
350,5
2,14 - 1,71
-
Des résultats de ce test, il ressort que ces trois
nitrosourées, ainsi que le composé de référence c'est-à-dire la
C.C.N.U,
ont des activités comparables.
Toutefois dans le cas de la
C.C.N.U, les racines des
plantules mesurées sont molles et mortes, alors que pour les nitrosourées
dlamino-acides, elles sont fermes.

---

- 42 -
Il semblerait que ce test mette en évidence deux actions
différentes, l lune à caractère cytotoxique et l lautre à caractère anti-
mitotique. Ces deux modes d'action paraissent coexister.
La cytotoxicité semble être plus importante pour le composé de référence
la C.C.N.U, que pour les nitrosourées dlamino-acides.
Cette supposition pourrait être confirmée dans une étude
ultérieure, au cours de laquelle on effectuerait une analyse au niveau
cellulaire.
L'ensemble des résultats obtenus devait
nous permettre
d1établir une première sélection des nltrosourées les plus actives.
Afin de confirmer les résultats obtenus Ilin vitro", toutes
les nitrosourées synthétisées ont été testées "in vivo" sur une tumeur
lymphoblastique induite: la leucémie
L 1210.

---

- 43 -
1111 - TEST "IN VIVO".
L'activité oncostatique a été évaluée "in vivo" sur un
tumeur expérimentale: la leucémie L 1210,
Ce test est effectué sur des souris
F (DBA 2) inoculées avec 105 cellules
de leucémie L 1210 par voie intrapéritonéale.
Aux jours 1,5 et 9 les composés à étudier sont injectés, à
différentes doses, en suspension dans l'huile d'olive.
La mortalité des animaux a été étudiée et l'autopsie
indique si la mort est due à la leucémie ou à l'action toxique de la
droçlUe.
Les résultats pour les doses spécifiques de chaque drogue
sont exprimés en prolongation de survie
Ps, La prolongation de survie est
égale
à TIC x 100 ou T représente la moyenne de survie du groupe de
souris traitées et C celle du ~roupe
contrôle.
Un produit est considéré comme actif lorsque la prolonga-
tion de survie
Ps
est supérieure ou égale à 125 %.
Si dans un 9roupe traité plus de 50 %des animaux sont
guéris, la valeur de prolongation de survie de ce groupe est infinie.
Les résultats des tests "in vivo" sur la leucémie L 1210
sont indiqués sous forme de dia9ramme dans la Fig. 8, et sous forme de
tableau. (Tableau
IX).

---

- 44 -
TABLEAU
IX
NlTROSOUREES
Doses mg/kg
Ps
Statistique
DL50
N° lClG
1O
123
S (p = 0,04)
Leu CNU
28
16
142
S (p = 0,001)
65 mg/kg
-
1581
30
92
NS
8
94
NS
Ala CNU
26
1O
108
S (p = 0,02)
40 mg/kg
-
1582
20
71
NS
240
38
toxique
PNB Ser CNU 31
96
61
toxique
-
45 mg/kg
25
143
S (p = 0,03)
1703
15
16O
S (p = 0,001)
10
125
S (p = 0,01)
250
38
toxique
100
30
toxique
CU Ser CNU
30
40
92
un peu toxique
45 mg/kg
-
20
136
S (p = 0,01)
1704
15
160
S (p = 0,001)
10
114
NS
125
NS
50
158
ASP CNU
35
20
118
NS
80 mg/kg
-
1730
8
98
NS

---

··lé
GO
- - -
_
-_ ...._---- .... -----...
100
letG
ICIG
1512
1103
150
. 'Ye
~c
., -------- ------ -------------- ----------------
100
.e'G
ICIG
'CIG
1104
1130
1736
100 "-----...;.-----~-~20O:-:'ll.~
... -""*--..&.----------
'0 10
~
~c
fil
-
- - -
- - -
-
-
-
-
-
-
.- -
- - - -
-
- - - - - - - -
ICI.
ICIG
200
117.
177J
1$0 •
125
1 00 .......-....---~~---....- __----'--~:__~--
..

---

r

---

- 45 -
TABLEAU
IX
(suite)
NITROSOUREES
Dose mg/kg
Ps
Statistique
DL50
N° ICIG
Glu CND
36
125
-
toxique
-
50
-
-
1736
20
-
-
la mg/kg
8
-
NS
4
-
NS
2
-
NS
125
-
toxique
Cl AcO Ser CND
50
-
toxique
33
-
40
-
NS
1771
30
110
NS
38 mg/kg
20
00
S
15
183
S
8
125
S
5
158
S
50
-
toxique
AcO Ser CNU 32
35
116
NS
-
1773
20
133
S
33 mg/kg
8
118
NS
3.2
108
NS

---

- 46 -
L'examen, d1une part des courbes T/C établies en fonction des doses
injectées (Fi9.8), et d1autre part, du tableau IX, montre que parmi
l'ensemble des 8 composés testés, la nitrosourée du chloroacétate de la
L-sérine (ICIG 1771) est la plus active. L'activité antimitotique des
nitrosourées d'amino-acides testées sur la leucémie L 1210
est faible
en général. Deux sont inactives, celle de la L-alanine
26
et de l'acide
L-glutamique
36.
Nos composés sont dans l 'ensemble toxiques avec une DL SO
de l 'ordre de 30 à 40 mg/k~ en moyenne.

---

- 47 -
CON C LUS ION
Nous avons dans ce travail réalisé la synthèse de nouvelles
chloro-2-éthyl nitrosourées, comportant un ami no-acide ou un dipeptide comme
molécule de transport, conformément à la notion de "pro-drug".
Ces composés, dont la structure a été déterminée à partir
des données spectroscopiques, ont été testés d'une part "in vitro" sur la
croissance des racines du Lépidium sativum et d'autre part "in vivo" sur
une tumeur expérimentale la
leucémie L 1210.
Les nitrosourées d'amino-acides ont présenté à divers degrés
une activité inhibitrice sur la croissance en longueur de la racine de
Lépidium sativum. La nitrosourée du dipeptide L-alanyl-L-leucinate de méthyle,
est la plus active dans ce test.
Ce bio-test devait nous permettre d'établir une sélection
des nitrosourées synthétisées afin de les éprouver "in vivo" sur une tumeur
lymphoblastique, la leucémie L 1210.
L'activité antimitotique évaluée "-in vivo" des nitrosourées
d'amino-acides est faible dans l'ensemble, excepté
celle du chloroacétate
du L-sérinate de méthyle.
De l'étude des résultats du "test in vivo", ressort
la
difficulté d'établir une relation entre la structure et l'activité d'une
drogue. En effet, dans une même série d'amino-acides il existe des diffé-
rences notables d'activité.
De même l'étude comparative des deux tests montre que des
nitrosourées inactives "in vivo" présentent une activité "in vitro".

---

- 48 -
Afin d'améliorer l'activité antitumorale de nos compo-
sés, nous pensons dans une prochaine étude réaliser, d1une part la synthèse
de nitrosourées dlamino-acides dont la fonction acide sera libre, et
d1autre part la synthèse de nitrosourées de peptides pouvant eux-même
présenter une activité biolo9ique.

---

- 49 -
PARTIE
EXPERIMENTALE
Les points de fusion ont été pris en capillaire sur un
appareil BUCHI SMP-20 ; ils ne sont pas corrigés.
Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées
sur feuille d'aluminium (0,2 mm) recouverte de gel de silice
60 F
MERCK. Les spots sont détectés à l'U.V. ou révélés à
254
l'iode et à la ninhydrine (0,1 % dans l'ethanol).
Les chromatographies analytiques ont été réalisées sur
C.L.H.P. LC 440 WATERS. Les spectres I.R. ont été réalisés
au Laboratoire sur un spectrophotomètre LEITZ modèle III. G
et récemment sur un spectrophotomètre pYE UNICAM SP 3-200.
Les spectres R.M.N. ont été enregistrés sur les
appareils VARIAN A - 60 à ABIDJAN, et EM - 390 du laboratoire
de Résonance Magnétique Nucléaire de l'Université des Sciences
et Techniques du Languedoc.
Les spectres de masse ont été effectués sur spectrographe
JEOL J.M.S. D 100 à l'Université des Sciences et Techniques
du Languedoc à MONTPELLIER.
Les microanalyses ont été effectuées par le service
central d'analyse du C.N.R.S. à VERNAISON. Tous les composés
pour lesquels le mot analyse est indiqué, suivi d'une formule
explicite, ont fourni des résultats analytiques correspondant
à la formule attendue à + 0,4 % près.
Les éléments dosés sont indiqués entre parenthèses.

---

-
50 -
Chlo~hyd~ate de L-alanlnate de méthyle
Le chlorhydrate de L-alaninate de méthyle est obtenu en
versant goutte à goutte 7,4 ml (0,203 mole) de chlorure de
thionyle, fraîchement distillé, à oQe et sous agitation
magnétique, à une suspension de 10,4 g (0,116 mole) de
L-alanine dans 30 ml de méthanol anhydre.
La réaction est poursulvle 4 heures à température ambiante,
puis 2 heures à 40°C, à l'abri de l'humidité avec une garde à
chlorure de calcium.
La solution est évaporée sous vide à une température
inférieure à 50 0 e, et 10 ml de tétrahydrofuranne anhydre sont
ajoutés à l'huile résiduelle.
L'évaporation s'effectue dans les mêmes conditions,
l'huile incolore obtenue cristallise avec de l'éther anhydre.
15,9 g. de cristaux sont obtenus, soit un rendement de 87 %.
Les cristaux fortement hydroscopiques sont conservés dans
un dessicateur contenant de l'anhydride phosphorique.
Point de fusion : 106 - 107 Oc
F. Litt.
: 108°C (36)
[(Chlo~o-2-éthyl)-3-u~eZdo]-2-L-alanlnate de méthyle. 8
Dans 30 ml de dichlorométhane, sont ajoutés 2,2 g de
chlorhydrate de L-alaninate de méthyle (15,8 10- 3 mole), en
présence d'un équivalent de triéthylamine soit 2,1 ml. Au
mélange réactionnel mis dans un bain de glace, sont ajoutés
goutte à goutte et sous agitation magnétique, 1,62 ml de
chloro-2-éthyl isocyanate (18,9 10- 3 mole). L'agitation est
poursuivie 4 heures après retour à la température ambiante.

---

- 51 -
Après évaporation sous vide, le résidu est dissous dans
300 ml de chlàroforme et les différents lavages sont effectués.
Deux fois à l'acide chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau,
deux fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium,
et trois rinçages à l'eau. La phase organique est séchée sur
sulfate de sodium anhydre, essorée et évaporée sous vide à une
température inférieure à 50°C. 0,78 g. sont recueillis sous
forme de poudre blanche (rendement 24 %).
Point de fusion:
126 - 127°C après recristallisation dans
un mélange chloroforme-éther de pétrole.
1
I.R.
KBr u cm-
-
(N-H) 3400, (C-H) 2980
(C=O, ester) 1745, (C=O, amide) 1620
(-C-NH-, amide II)
1595, (C-Cl) 780-755.
Ilo
R.M.N.
: (90 MHz' DMSOd )
6
lH (H -1 ' ) doublet à 591 ,5 H
(6,57 ppm) Jl'_2=7H
-
z
z
lH (H-3') triplet à 577 H
(6,41 ppm) J 3 '-4' = 6H
-
z
z
lH (H- 2)
multiplet à 374 H
(4, 16 ppm)
-
z
3H (OC!:!.3) singulet à 324 H
(3,6 ppm)
-
z
2H (H - 5' ) triplet à 318 H
(3,53 ppm)
-
z
2H (H - 4' ) multiplet à 300 H
(3,33 ppm)
-
z
3H (H-3) doublet à 109 H
(1 ,21 ppm) J
= 7H
z
3- 2
z
Masse
PM
208,5
[(Chlo~o-2-é~hyl)-3-ni~~o~o]-2-L-alanina~e de mé~hyle - ~
3
Une solution de 1,23 g (5,9 10-
mole) de N-chloro-2-éthyl
urée de L-alaninate de méthyle dans 30 ml de chloroforme, en

---

- 52 -
présence de 2 ml de pyridine, est traversée par un courant gazeux
de chlorure de nitrosyle à O°C et sous agitation magnétique.
La réaction est suivie à l'aide de la chromatographie sur
couche mince. Cette dernière est pratiquement complète au bout
de 15 mn.
L'addition de glace au milieu réactionnel précipite une huile
jaune. 100 ml de chloroforme sont ajoutés, après décantation les
différents lavages sont effectués, deux fois à l'acide chlorhy-
drique 10 %, trois fois à l'eau, deux fois avec une solution
saturée de bicarbonate de sodium, et trois rinçages à l'eau.
La phase organique recueillie est séchée sur du sulfate de
sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C. 0,94 g sont recueillis sous forme d'une huile
jaune incristallisable, (rendement 67 %).
Rf
0,67 dans un mélange chloroforme 90-méthanol 10.
1
I.R.
film u cm-
: (N-H)
3400, (C-H)
2980
(C=O, ester) 1730, (N-NO) 1500,
(C-Cl)
782 - 755
R.M.N.
1H (H-1 ' ) doublet à 814 H
(9,04 ppm) J 1' - 2 = 7 ,5 H
-
z
z
1H (H- 2) multiplet à 406 H
(4,51 ppm)
-
z
2H (H - 5 ' ) triplet à 370 H
( 4 , 11 ppm) J 5 '-4' = 7H
-
z
z
3H (OC!h) singulet à 330 Hz (3,67 ppm)
-
2H (H-4') multiplet à 322 H
(3,58 ppm)
-
z
3H (H-3) doublet à 130,5 Hz (1 ,45 ppm) J
= 7H
3- 2
z
L'addition d'eau lourde entraîne la disparition du signal
relatif au proton porté par N1 et la simplification du multiplet

---

- 53 -
du proton porté par le carbone C
en un quartet (J -
=
2
6H )
2 3
z
Chlo4hyd4ate de L-val~nate de méthyle
A une suspension de 11,7 g (0,1 mole) de L-valine dans
100 ml de méthanol anhydre, 7,4 ml (0,2 mole) de chlorure de
thionyle sont ajoutés goutte à goutte à O°C et sous agitation
magnétique.
La réaction, préservée de l'humidité par une garde à
chlorure de calcium, est poursuivie 4 heures à température
ambiante et 2 heures à 40°C.
La solution est évaporée sous vide à plusieurs reprises
avec du méthanol à une température inférieure à 50°C. L'huile
résiduelle cristallise avec de l'éther anhydre.
14,8 g. de cristaux blancs sont obtenus (rendement 88 %).
Les cristaux sont conservés dans un déssicateur à anhydride
phosphorique.
Point de fusion:
146-150 oC
Litt.
: 146-149°C (37)
[(Chlono-2-éthylJ-3-uneZdo] -2-L-val~nate de méthyle - ~
A une suspension de 2,66 g de chlorhydrate de L-valinate
3
de méthyle (15,4.10-
mole) dans 30 ml de dichlorométhane,
sont ajoutés à OoC un équivalent de triéthylamine soit 2,2 ml,
puis goutte à goutte 1,58 ml de chloro-2-éthyl isocyanate
(18,5.10- 3 mole) sous agitation magnétique. La réaction est
poursuivie 4 heures à température ambiante.
Après évaporation sous vide du dichlorométhane à une
température inférieure à 50°C.

---

- 54 -
Ce dernier est remplacé par 100 ml de chloroforme et les
différents lavages sont effectués, deux fois à l'acide
chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau, deux fois avec une
solution saturée de bicarbonate de sodium, puis trois rinçages
à l'eau. La phase organique recueillie est séchée sur sulfate
de sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide, 1,41 g
de cristaux sont obtenus, soit un rendement de 38 %.
Point de fusion:
100-101°C après recristallisation dans
un mélange chloroforme-éther de pétrole.
Rf
0,51 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10.
-1
1. R.
(KBr)
u
cm
(N-H) 3300, (C-H) 2970
(C=O, ester)
1730, (C=O, amide)
1655,
(CO-NH, amide II)
1575, (C-Cl) 780 - 735.
R.M.N.
2H (H-1, H-3) doublet et triplet
superposés à - 352 Hz (5,87 ppm) }5,80 ppm
- 344 Hz (5,73 ppm)
1H (H-2) quadruplet à 268 Hz (4,47 ppm)
3H (OC~3)
singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
4H (H-4' et H-5') multiplet à 218 Hz (3,63 ppm)
1H (H-3) multiplet à 128 Hz (2,13 ppm)
6H (H-4, H-5)
2 doublets 57,5 Hz (0,96 ppm)
53,5 Hz (0,89 ppm)
J
=
=
4 - 3
J 5 - 3
7H z
Masse
PM : 236,5
Analyse

---

- 55 -
[(Chtono-2-éthytJ-3-n~tno~o] -2-L-vat~nate de méthyte - 21
3
A 1,35 g (5,7.10-
mole) de N-chloro-2-éthyl urée du
L-valinate de méthyle dissous dans un minimum d'acide formique,
sont ajoutés à O°C et sous agitation magnétique, 3 équivalents de
nitrite de sodium soit 1,18 gu par petites fractions.
L'addition s'échelonne sur 1 heure au bout de laquelle
de la glace est ajoutée au milieu réactionnel. L'huile jaune
obtenue est extraite au chloroforme, sur lequel les différents
lavages sont effectués, trois fois à l'eau, deux fois avec une
solution de bicarbonate de sodium saturée et trois rinçages à
l'eau.
La phase organique recueillie est séchée sur du sulfate de
sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C.
1,25 g. sont obtenus sous forme d'une huile jaune incristal-
lisable (rendement 83 %). Le produit est homogène en CCM avec un
Rf de 0,69 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10.
I.R.
film u cm- l
: (N-H) 3360, (C-H)
2980
(C=O, ester) 1730, (CO-NH, amide II) 1525,
(N-NO) 1495, (C-CI) 789-755.
R.M.N.
: (60 MHz' CDCI 3)
lH (H-l') doublet à 456 Hz (7,6 ppm) J
8H
l '-2 =
z
lH (H-2) multiplet à 284 Hz (4,73 ppm)
2H (H-5') triplet à 256 Hz (4,27 ppm) J 5 '-4' =
3H (OC~3) singulet à 232 Hz (3,87 ppm)
2H (H-4') triplet à 214 Hz (3,57 ppm) J
6H
4 '-5' =
z
1H (H-3) multiplet à 142 Hz (2,37 ppm)
6H (H-4, H-5) 2 doublets 63,5 Hz (1,06 ppm)
60,5 Hz (1 ppm)
J
=
=
4 - 3
J 5 - 3
7H z

---

-
56 -
Chlo~hyd~ate de L-leucinate de méthyle
A une suspension de 13,1 g (0,1 mole) de L-Ieucine dans
100 ml de méthanol anhydre, sont ajoutés goutte à goutte 7,4 ml
de chlorure de thionyle (0,2 mole) à oOe et sous agitation
magnétique. La réaction, à l'abri de l'humidité par une garde
de chlorure de calcium, est poursuivie 4 heures à température
ambiante et 2 heures à 40 0 eo
La solution est évaporée sous vide, à température inférieure
à 50°C.
La masse blanchâtre est mise sous agitation pendant
24 heures avec 100 ml d'éther anhydre. Après filtration sous
pression réduite, 15,1 g de cristaux blancs sont obtenus
(rendement 84 %).
Point de fusion:
147°C-148°C
Litt.
: 147°C (38)
[IChlo~o-2-éthyl)-3-u~eZdo]-2-L-leucinate de méthyle - 10
A 3,69 g. de chlorhydrate de L-Ieucinate de méthyle
3
(20,4.10-
mole) en suspension dans 50 ml de dichlorométhane,
sont ajoutés à oOe 2 ml de pyridine, puis goutte à goutte 2,1 ml
de chloro-2-éthyl isocyanate (24,5.10- 3 mole)
La réaction est poursuivie 24 heures après retour à la
température ambiante. Le dichlorométhane est évaporé sous vide
à une température inférieure à 50°C, puis trois fois avec du
benzène pour éliminer la pyridine. Le résidu est dissous dans
150 ml de chlo:oforme, ,et les différents lavages sont effectués,
deux fois à l'acide chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau, deux
fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium, et trois
rinçages à l'eau. La phase organique recueillie est séchée sur
sulfate de sodium, essorée puis évaporée sous vide. L'huile

---

- 57 -
siduelle est chromatographiée sur colonne à gel de silice
60 (230-400 mesh) avec comme éluant acétate d'éthyle 40 -
enzène 60. Le produit obtenu est homogène en CCM avec un
de 0,29 dans un solvant acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
Après cristallisation dans un mélange chloroforme-éther
pétrole, 2,1 g. de cristaux blancs sont recueillis
(rendement: 41 %).
Point de fusion
I.R.
KBr u cm- 1 (N-H) 3300, (C-H)
2980
(C=O) 1730, (C=O, amide) 1650, (CO-NH, amide II) 1570,
(C-Cl) 770-735.
R.M.N.
(60 MHz' CDCI 3)
2H (H-1', H-3') doublet et triplet superposés -
- 350 Hz (5,83 ppm) { 5,77 ppm
- 342 H
(5,7 ppm)
z
1H (H-2) multiplet à 274 Hz (4,57 ppm)
3H (-OC~3)
singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
4H (H-4', H-5') multiplet à 220 Hz (3,67 ppm)
3H (H-3, H-4) multiplet à 98 Hz (1,63 ppm)
6H (H-5, H-6) doublet à 58 Hz (0,97 ppm)
J 5- 4 = J 6- 4 = 5H z
Masse: M+ à 250 - PM : 250,5
[IChlo~o-2-éthYll-3-n~~~o~o]-2-L-leu~~na~e de méthyle - 28
3
A une solution de 2,82 g (11,2.10-
mole) d'urée 10 dans
un minimum d'acide formique, sont ajoutés à O°C et sous agitation
magnétique, 3 équivalents de nitrite de sodium soit 2,33 g.

---

- 58 -
L'addition par petites quantités du nitrite de sodium est
répartie sur 45 minutes. Au bout de 15 minutes de la glace
pilée est ajoutée au mélange réactionnel. L'huile jaune obtenue
est extraite par 200 ml de chloroforme, et les différents
lavages sont effectués.
La phase organique est séchée, essorée puis évaporée sous
vide à une température inférieure à 50°C.
2,51 g sont obtenus sous forme d'huile jaune incristal-
lisable
(rendement 80 %). Le produit est homogène en CCM avec
un Rf de 0,61 dans un éluant acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
1
I.R.
: film u cm-
: (N-H) 3390, (C-H)
2970
(C=O, ester) 1730,
(CO-NH, amide II) 1535, (N-NO) 1495,
(C-Cl) 790 - 760.
R.M.N.
: (60 MHz' CDC1 )
3
lH (H-l ') doublet à 442 Hz (7,37 ppm) J '-2 = 8H
1
z
lH (H-2) multiplet à 286 Hz (4,77 ppm)
2H (H-5') triplet à 254 Hz (4,23 ppm) J 5 '-4' = 7H z
3H (OC~3) singulet à 230 Hz (3,83 ppm)
2H (H-4') triplet à 212 Hz (3,53 ppm) J 4 '-5' = 7H z
3H (H-4, H-3) multiplet à 106 H
(1,77 ppm)
z
6H (H-5, H-6) doublet à 59 Hz (0,98 ppm) J = 6H z
[(ChloJto-2-éthyl)-3-u.JteZdo] -2-L-.ôé't-tl1ate de méthyle
3
A une suspension de 5,62 g (36.10-
mole) de chlorhydrate de
L-s rinate de méthyle dans 30 ml de dichlorométhane, en présence
d'une quantité équimoléculaire de pyridine soit 3,5 ml, sont
ajoutés goutte à goutte, à O°C et sous agitation magnétique,
3,7 ml (43.10- 3 mole) de chloro-2-éthyl isocyanate.

---

- 59 -
L'agitation est poursuivie pendant 24 heures à température
ambiante.
Le solvant est évaporé sous vide à une température inférieure
à 50°C, puis l'opération est répétée trois fois avec 50 ml de
benzène afin d'éliminer la pyridine. La chromatographie sur
couche
mince
révèle la présence de deux composés, l'urée
attendue et le carbamate. L'urée ayant un Rf de 0,21 pour un
éluant chloroforme 90 - Méthanol 10, le carbamate ayant un Rf
de 0,42 dans le même mélange de solvants.
La séparation des deux composés est possible grâce à une
chromatographie sur colonne à gel de silice montée au chloro-
forme, puis en éluant respectivement avec les mélanges chloro-
forme 98 méthanol 2, chloroforme 96 - méthanol 4, et chloro-
forme 94 - méthanol 6.
Après évaporation sous vide, 5,03 g d'urée sont obtenus,
soit un rendement de 62 % et 1,87 g. de carbamate (rendement
15 %).
CCC'hloltO-2-éthyl) -3-ulteZdo] -2-L-~é1t,(.na.te de méthyle - Il
Point de fusion : 98 - 100°C après recristallisation
dans un mélange chloroforme-éther.
22
[a]
= + 22,3 (C = l, pyridine)
D
I.R.
KBr \\)
-1
cm
(O-H) 3500, (N-H) 3300,
(C-H) 2940,
(C=O, ester) 1720,
(C=O, amide) 1625, (CO-NH, amide II) 1550
(C-Cl)
770 - 740
R.M.N . .
(90 MHz' DMSOd )
6

---

- 60 -
1H (H-1') doublet à 579 Hz (6,43 ppm) J 1 '-2 = 9H z
1H (H-3') triplet à 590 Hz (6,56 ppm) J 3 '-4' = 6H z
1H (OH) singulet à 453 H
(5,03 ppm)
-
z
1H (H-2) multiplet à 383 H
(4,26 ppm)
z
3H (OC~3) singulet à 330 Hz (3,67 ppm)
4H (H-4', H-5') multiplet à 322 Hz (3,58 ppm)
2H (H-3) doublet à 304 Hz (3,38 ppm) J
=
3- 2
5H z
Masse
pic isotopique à 194 (perte de 30
CH O)
2
PM = 224,5
alcool
.
Analyse
C7H13ClN204 (C, H, 111)
[rChlofLD-2- _ê. thyl J - 3 -YLLtIL Of., 0
-2-L- f.,ê.'Lina-te. de. mê.thyle. - 29
3
1,41 g.
(6,3.10-
mole) de N-chloro-2-éthyl urée du
L-sérinate de méthyle sont dissous dans 30 ml de dichlorométhane.
La solution en présence de 2 ml de pyridine, est traversée,
à OoC et sous agitation magnétique par un courant gazeux de
chlorure de nitrosyle. La réaction suivie par CCM, est complète
au bout de 15 minutes.
Le solvant est évaporé sous vide, en évitant de chauffer
au delà de 50·C, l'opération est répètée 3 fois avec du
benzène afin dtéliminer la pyridine. L'huile résiduelle est
par la suite chromatographiée sur une colonne à gel de silice
60 (230 - 400 mesh) montée avec du chloroforme, puis éluée
avec un mélange chloroforme 98 - méthanol 2. 1,21 g sont obtenus
sous forme d'huile jaune incristallisable, soit un rendement
de 76 %.
Rf : 0,37 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10.
-1
I.R. - film u cm
: (O-H) épaulement à 3550,
(N-H) 3330,
(C-H) 2920,
(C=O) ester) 1710,
(CO-NH, amide II) 1515, (N-NO) 1485,
(C-Cl)
775 - 748.

---

- 61 -
R.M.N.
lH (H-l') doublet à 472 Hz (7,87 ppm) J
8H
l '-2 =
z
lH (H-4) signal élargi à 310 Hz (5,16 ppm)
lH (H-2) multiplet à 285 H
(4,75 ppm)
z
2H (H-5') triplet à 252 Hz (4,2 ppm) J
= 7H
5 '-4'
z
2H (H-3) doublet à 245 Hz (4,08 ppm) J
4H
3- 2 =
z
3H (OC~3) singulet à 230 Hz (3,83 ppm)
2H (H-4') triplet à 215 Hz (3,58 ppm) J
7H
4 '-5' =
z
(O-Chlo~o-2-éthyl ~~~b~moyl) - [(Chlo~o-2-éthylJ-3-u~eZdo]-2­
L-~é~in~te de méthyle - 72
Point de fusion
128
129°C après recristallisation dans
un mélange méthanol, éther, éther de pétrole
22
[a]
= + 11,3 (C=l/pyridine)
D
I.R.
: KRr u cm- l
(N-H) 3330, (C-H) 2950,
(C-O, ester) 1750
(C=O, carbamate) 1690, (C=O, amide) 1630,
(CO-NH, amide II) 1560, (C-Cl) 776 et 752.
R.M.N.
lH (H-6) triplet à 669 Hz (7,43 ppm) J 6- 7 = 6Hz
lH (H-l') doublet à 588 Hz (6,53 ppm) J l '-2 = 8H z
lH (H-3') triplet à 570 Hz (6,33 ppm) J 3'-4' = 6Hz
lH (H-2) multiplet à 402 Hz (4,47 ppm)
2H (H-3) doublet 376 Hz (4,18 ppm) J -
= 5H
3 2
z
3H (OC~3) singulet à 330 Hz (3,67 ppm)
4H (H-7, H-8) multiplet à 320 H
(3,56 ppm)
z
4H (H-4', H-5') multiplet à 300 H
(3,33 ppm).
z
Masse : M+ à 329 - PM = 330 (présence de 2 atomes de chlore)

---

- 62 -
Nl~o~ou~ée du ea~bamate - 30
Dans un minimum d'acide formique est dissous 1 g de
0-chloro-2-éthyl carbamoyl, N-chloro-2-éthyl urée du
3
L-sérinate de méthyle (3.10-
mole). 3 équivalents de nitrite
de sodium sont ajoutés à OoC et sous agitation magnétique, soit
0,62 g. par petites fractions pendant 1 heure. Puis de la glace
est ajoutée au milieu réactionnel, une huile précipite extraite
au chloroforme. La phase organique est lavée trois fois avec de
l'eau, deux fois avec une solution de bicarbonate de sodium et
rincée trois fois à l'eau.
Après les lavages, le chloroforme est séché sur du sulfate
de sodium anhydre, essoré puis évaporé sous vide à une température
inférieure à 50°C. 0,84 g. sont obtenus sous forme d'huile jaune
incristallisable, soit un rendement de 72 %. Après chromatographie
sur colonne à gel de silice, le composé nononitrosé est obtenu.
Rf : 0,58 dans un mélange chloroforme 98 - méthanol 12.
22
[ a ]
= + 1,0 (C = 1/CHC1 )
3
D
IR
film u cm- 1
(N-H) 3350,
(C-H) 2920,
(C=O, ester) 1720, (CO-NH, amide II) 1525,
(N-NO) 1490, (C-Cl) 778 - 752.
R.M.N.
1H (H-1 ') doublet à 476 H
(7,93 ppm) J 1 ' _2 = 8H
-
z
z
1H (H-6) ou (H- 3' ) triplet à 352 H
(5,87 ppm) J = 5H
-
z
z
lH (H- 2) multiplet à 300 H
(5,0 ppm)
-
z
2H (H-3) doublet à 276 Hz (4,6 ppm) J 3- 2 = 5H
-
z
2H (H-5') ou (H-8) triplet à 253 H
(4,22 ppm) J = 7H
-
z
z
3H (OC!!3) singulet à 352 H
(3,87 ppm)
-
z
6H (H-4' , H-7 et H- 8)
ou
multiplet à 216 H
(3,6 ppm)
z
(H-7, H-4' et H-5')
Analyse

---

- 63 -
(O-Pananitnobenzoate)-[(Chloho-2-~thyl)-3-uheZdo]-2-L
.6 êJi.inate de m~th!:f.e.e - .!..i
A une solution de 0,33 g (1,5.10- 3 mole) de N-chloro-2-
éthyl urée du L-sérinate de méthyle dans 10 ml de chloroforme,
sont ajoutés à OoC et sous agitation magnétique respectivement
3 ml de pyridine et 1 g. de chlorure de paranitrobenzoyle. Au
bout d'une heure le chloroforme est évaporé sous vide et
l'opération est répétée 3 fois avec du benzène afin d'éliminer
la pyridine. Au produit de la réaction, sont ajoutés 30 ml de
chloroforme, la solution est lavée deux fois avec 15 ml de
bicarbonate de sodium saturée et trois fois avec le même volume
d'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre,
essorée puis évaporée sous vide à une température inférieure à
50°C. Le résidu cristallise par addition de méthanol.
Après filtration sur buchner, 0,29 g. de cristaux sont
recueillis, soit un rendement de 53 %.
Rf : 0,57 dans CHC1
90 - MeOH 10
3
Point de fusion
22
[a.]
= + 18,7 (C = 1, pyridine).
D
I.R.
KBr u cm- 1
(N-H) 3330, (C-H, aromatique) 3040, (C-H, aliphatique)
2960, (C=O, esters) 1750, (C=O, amide) 1630, (CO-NH,
amide II) 1590, (N-O, nitro) 1545 et 1360, (para-
substitution) 840-810, (C-Cl) 758.
R.M.N.
4H (noyau aromatique) q à 745 Hz (8,27 ppm)
-
1H (H-1 ' ) doublet à 612 H
(6,80 ppm) J 1 '-2 = 9H
-
z
z
1H (H-3' ) triplet à 583 Hz (6,48 ppm) J 3 '-4' = 6Hz
1H (H-2) multiplet à 426 H
(4,73 ppm)
-
z
2H (H-3) doublet à 410 H
(4,56 ppm) J
= 4,5H
z
3 - 2
z

---

- 64 -
3H (OC!:!3) singulet à 334 H
(3,71 ppm)
-
z
2H (H-5') multiplet à 320 H
(3,56 ppm)
-
z
2H (H-4') multiplet à 302 Hz (3,36 ppm)
Masse
M+ à 373
PM .. 373,5.
(O-Pahanithobenzoate)-[(Chioho-2-éthyil-3-nitho~o] -2-L-
~éhinate de méthyie - i l
0,96 g.
(2,6.10- 3 mole) d!urée sont dissous dans un minimum
d'acide formique, à OQC et sous agitation magnétique, 3 équivalents
de nitrite de sodium soit 0,54 g. sont ajoutés par petites
fractions échelonnées sur une heure.
Après addition de glace, 11huile qui précipite est extraite
au chloroforme, après décantation les différents lavages sont
effectués. La phase organique recueillie est séchée, essorée
puis évaporée. Le résidu est alors purifié par chromatographie
sur colonne à gel de silice 60 (70 - 230 mesh ASTM) avec comme
éluant du chloroforme. 0,88 g. sont obtenus sous forme d'huile
jaune.
Rf : 0,68 dans chloroforme 98 - méthanol 2.
22
[a]
= +
20,7 (C=1/CHCI )
3
D
I.R.
film v cm- 1 : (N-H)
3360 , (C-H, aromatique) 3060,
(C-H, aliphatique)
2940,
(C=O, ester) 1750,
(C=O, amide) 1720, (CO-NH, amide II) 1530,
(N-O, nitro) 1510, (N-NO) 1490
(para-substitution) 830-800,
(C-CI) 783.

---

- 65 -
R.M.N.
4H aromatiques à 497 Hz (8,28 ppm)
1H (H-1') doublet à 470 Hz (7,83 ppm) J
'-2
1
=
9H z
1H (H-2) multiplet à 310 Hz (5,17 ppm)
2H (H-3) doublet à 296 Hz (4,93 ppm) J -
3 2 = 4H z
2H (H-5') triplet à 253 Hz (4,22 ppm) J 5 '-4' = 7H z
3H (OC~3) singulet à 236 Hz (3,93 ppm)
2H (H-4') triplet à 212 Hz (3,53 ppm) J 4 '-5' = 7H z
IO-ae~tatel - [[Chio~o-2-~thyil-3-u~eXdo] -2-L-~~~inate
de m~thyie - 14
A 2 g. de N-chloro-2-éthyl urée du L-sérinate de méthyle,
en solution dans 5 ml de pyridine, sont ajoutés à O°C et sous
agitation magnétique, 5 ml d'anhydride acétique fraîchement
distillé.
La réaction est poursulvle 2 heures à température ambiante.
Le contenu est versé dans 200 ml de chloroforme qui est lavé
deux fois à l'acide chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau, deux
fois au bicarbonate de sodium saturé, puis rincé trois fois à
l'eau.
La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium
anhydre, essorée puis évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C.
1,93 g. sont recueillis sous forme d'huile incolore
(rendement 81 %) qui cristallise par addition d'éther de pétrole.
Point de fusion:
78,5 - 80°C.

---

- 66 -
Rf
0,59 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10
I.R.
KBr u cm- 1
(N-H) 3400, (C-H) 2980, (C=O, esters) 1750
(C=O, amide) 1650, (CO-NH, amide II) 1580
(C-O, acétate) 1220 cm,
(C-Cl) 793 - 755
R.M.N.
2H (H-1', H-3) doublet et triplet superposés
centrés à 368 Hz (6,13 ppm)
1H (H-2) multiplet à 290 Hz (4,83 ppm)
2H (H-3) doublet à 268 Hz (4,47 ppm) J -
= 4H
3 2
z
3H (OC~3) singulet à 231 Hz (3,85 ppm)
4H (H-4', H-5') multiplet à 221 Hz (3,68 ppm)
3H (H-6) singulet à 127 Hz (2,12 ppm)
L'échange par D 0 plus 2 gouttes d'acide trifluoracétique
2
entraîne la disparition du signal des protons portés par N '
1
et N ', et une simplification du multiplet du proton porté par
3
C
en triplet
2
(J = 4,5 Hz) .
Masse: M+ à 266 - PM = 266,5
(O-ac.étate.J
- [(c.h.f..ottO-2- éthy.f..J -3-nLttto.6o ] -2-L-
.6étt~nate. de. méthy.f..e. - i!
Dans un minimum d'acide formique sont dissous 1,13 g
d'urée (4,2.10- 3 mole). A O°C et sous agitation magnétique
3 équivalents de nitrite de sodium soit 0,875 g
sont ajoutés
à la solution. L'addition par petites fractions se poursuit
pendant 45 mn, l'agitation est maintenue pendant 15 mn.
De la glace pilée est ajoutée au mélange réactionnel,

---

- 67 -
l'huile qui précipite est extraite par 200 ml de chloroforme,
et les différents lavages sont effectués; trois fois à l'eau,
deux fois avec une solution saturée de bicarbonate de sodium.
La phase organique est séchée, essorée puis évaporée à faible
température. Le résidu est placé sous vide de 0,5 mm de
mercure pendant 12 heures, 1,19 g, d'huile sont obtenus sous
forme d'huile jaune incristallisable (rendement 96 %).
La nitrosourée est homogène en CCM avec un Rf de 0,47
dans un éluant acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
1
LR.
film \\: cm-
: (N-H) 3400, (C-H) 2970,
(C=O, ester)
1745,
(CO-NH, amide II) 1525,
eN-NO)
1490,
(CH -CO-0)
1235, (C-Cl) 790 - 758
3
R.M.N.
1H (H-]') doublet à 466 Hz (7,77 ppm) J = 8H
-
z
1H (H- 2) multiplet à 300 H
(5,0 ppm)
-
z
2H (H-3) doublet à 276 H
(4,6 ppm) J
= 4H
-
z
3- 2
z
2H (H - 5 ' ) triplet à 253 H
(4,22 ppm) J 5' -4' = 7H
-
z
z
3H (OC!!3 ) singulet à 233 H
(3,88 ppm)
-
z
2H (H-4') triplet à 213 H
(3,55 ppm) J 4 '-5' = 7H
-
z
z
3H (H-6) singulet à 126 H
( 2 , 1 ppm)
z
IO-Chlo~oaQétatel-[(Qhlo~o-2-éthylJ-3-u~e2do]-2-L­
.6éJt-tYl.ate de rnéthfile - 15
A une solution de 1,95 g,
(8,7.10- 3 mole) de N-chloro-
2-éthyl urée du L-sérinate de méthyle dans 30 ml de dichlo-
rométhane, sont ajoutés à OG e respectivement 5 ml de pyridine
et 2 équivalents soit 1,39 ml de chlorure de chloracétyle sous
agitation magnétique. La réaction est complète au bout de
15 minutes.

---

- 68 -
Le solvant est évaporé sous vide, l'opération est répétée
3 fois avec du benzène afin d'éliminer la pyridine.
L'huile obtenue est chromatographiée sur colonne à g l de
silice 60 (230 - 400 mesh) montée avec du chloroforme, puis
éluée avec un mélange chloroforme 98 - acétate d'éthyle 2.
2 g. de cristaux sont ainsi obtenus
(rendement 76 %). Le produit
est homogène en CCM avec un Rf de 0,43 dans un mélange
chloroforme 90 - Méthanol 10.
Point de fusion:
83 - 84°C après recristallisation dans
un mélange chloroforme-éther de pétrole.
I.R.
KBr u cm- 1 (N-H)
3300,
(C-H)
2970
(C=O, esters) 1720, (C=O, amide) 1665
(CO-NH, amide II) 1570, (C-O, chloracétate) 1235
(C-Cl) 770 (large)
R.M.N
(60 Hz ' CDCI )
3
2H (H-l', H-3') doublet et triplet superposés
- 372 Hz (6,2 ppm)
{6,13 ppm
- 364 Hz (6,07 ppm)
lH (H-2) multiplet à 294 Hz (4,9 ppm)
2H (H-3) doublet à 274 Hz (4,57 ppm) J 3- 2 = 4H z
2H (H-6) singulet à 249 Hz (4,15 ppm)
3H (OC~3) singulet à 230 Hz (3,83 ppm)
4H (H-4', H-5') multiplet à 220 Hz (3,67 ppm)
L'échange par D 0 plus 2 gouttes d'acide trifluoracétique
2
entraîne la disparition du signal des protons portés par NIl et
N'3 et le multiplet du proton porté par C
devient un triplet
2
J
= 4 Hz.
Masse
PM = 301
(présence de 2 atomes de chlore)

---

- 69 -
10-c.hio/[oac.é.tate.) -[Cc.hlo/[o-2- é.thyil -3-ni..t/[o-6o] -2-L-
-6é.'l.i..na.te. de. mêthyie. - li
1,18 g.
(3,9.10- 3 mole) d~O-chloroacétate, N-chloro-2-éthyl
urée du L-s rinate de méthyle sont dlSS0US dans un minimum
d'acide formique. A O~C et sous agitation magnétique, sont
ajoutés pendant 45 mn et par petites quantités, 3 équivalents
de nitrite de sodium soit 0,82 g .. Après 15 mn, l'addition de
glace pilée et d'eau distillée entraîne la formation d'un
précipité huileux. Après extraction avec 200 ml de chloroforme,
les différents lavages sont effectués. Le chloroforme est séché
sur sulfate de sodium anhydre, essoré puis évaporé à faible
température. L'huile jaune obtenue est ensuite placée sous vide
de 0,5 mm de mercure pendant 24 heures, 1,21 g. d'huile jaune
incristallisable sont obtenus (rendement 94 %).
La nitrosourée est homogène en CCM avec un Rf de 0,49 dans
un éluant acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
I.R.
film u cm- 1 : (N-H) 3400, (C-H) 2970
(C=O, ester) 1740, (CO-NH, amide II) 1530
(N-NO) 1495, (CICH -CO-0) 1250, (C-CI)
790-755.
2
R.M.N.
(60 MH , CDCI )
z
3
1H (H -1 ' ) doublet à 467 H
(7,78 ppm) J 1 '-2
8H
-
z
z
1H (H-2) multiplet à 304 H
(5,07 ppm)
z
2H (H-3) doublet à 284 H
(4,73 ppm) J
= 4H
-
z
3- 2
z
2H (H-6) singulet à 249 H
(4,15 ppm)
-
z
2H (H-5') triplet à 254 H
(4,23 ppm) J 5' -4' = 7H~
-
z
e
3H (OC~3) singulet à 234 Hz (3,9 ppm)
-
2H (H-4') triplet à 214 Hz (3,57 ppm) J 4' -5' = 7H z
.
Analyse . C9H13Cl2N306 (C, H, N)

---

-
70 -
ChloJthydJta.te. de. L-méth.i..ona.te. de. méthyle.
La technique de E. Fischer est utilisée. Une suspension
de 14,9 g. de L-méthionine,
(0,1 mole) dans 150 ml de méthanol
anhydre, est traversée par un courant de chlorure d'hydrogène
sec, à température ambiante, jusqu'à dissolution complète,
puis à O°C jusqu'à saturation.
La réaction, isolée de l'humidité par une garde à chlorure
de calcium, est poursuivie 4 heures à température ambiante.
La solution est évaporée sous vide, à température inférieure
à 50°C , l'huile résiduelle cristallise dans de l'éther anhydre.
16,9 g. de cristaux blancs sont recueillis (rendement 85 %).
Point de fusion:
147 - 148°C
Litt.
: 149 - 150°C (39)
[(Chlo~d~2-éthyl)-3-uJte.ldo]-2-L-méth.i..ona.te.de. méthyle. - 16
A 4,7 g. de chlorhydrate de L-méthionate de méthyle
-3
(23,5.10
mole) en suspension dans 50 ml de dichlorométhane, en
présence d'un équivalent de pyridine soit 2,3 ml, sont ajoutés
3
à O°C
2,42 ml de chloro-2-éthyl isocyanate (28,2.10-
mole).
La réaction est poursuivie pendant 24 heures à température
ambiante. La solution est évaporée sous vide, à une température
inférieure à 50°C, puis trois fois avec du benzène afin
d'éliminer la pyridine. Le mélange réactionnel est dissous dans
150 ml de chloroforme, et les différents lavages sont effectués
deux fois à l'acide chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau,
deux fois au bicarbonate de sodium saturé, et trois rinçages à
l'eau.
La phase organique est séchée, essorée puis évaporée,
l'huile résiduelle cristallise dans un mélange chloroforme-éther
de pétrole, 2,15 g. de cristaux sont obtenus (rendement 34 %).

---

- 71 -
Point de fusion
78 - 79 Oc
Rf
0,21 dans un éluant acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
I.R.
KBr u cm- 1 (N-H) 3330,
(C-H) 2980,
(C=O, ester) 1730, (C=O,amide) 1625
(CO-NH, amide II) 1590,
(S-CH ) 1310, (C-Cl) 790 - 753.
3
R.M.N.
2H (H-l', H-3') doublet et triplet superposés
364 Hz (6,07 ppm)
{ 6,0 ppm
356 Hz (5,93 ppm)
lH (H-2) multiplet à 278 Hz (4,63 ppm)
3H (OC~3)
singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
4H (H-4', H-5') multiplet à 218 Hz (3,63 ppm)
2H (H-3) multiplet à 156 Hz (2,6 ppm)
2H (H-4) triplet à 128 Hz(J 4- 3 = 5H z){ 2,13 ppm
3H (H-6) singulet à 128 Hz
Masse: M+ à 268 - PM : 268,5
[(Chlo~o-2-éthyl)-3-n~t~o~o]-2-L-méth~onatede méthyle - 34
Dans un mInImum d'acide formique sont dissous 1,14 g.
(4,3.10- 3 mole) de N-chloro-2-éthyl urée de L-méthionate de
méthyle. A cette solution, agitée magnétiquement et à O°C,
sont ajoutés par petites fractions échelonnées sur une heure,
3 équivalents de nitrite de sodium soit 0,88 g, Par addition
de glace une huile jaune précipite. Après extraction avec du
chloroforme, les différents lavages sont effectués, trois fois
à l'eau, deux fois avec une solution saturée de bicarbonate de
sodium, et trois rinçages à l'eau.

---

- 72 -
La phase organique recueillie est séchée sur du sulfate de
sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide en évitant de
dépasser une température de 50°C. 1,1 g. sont obtenus sous forme
d'huile jaune incristallisable (rendement 87 %), homogène en
CCM avec un Rf de 0,57 dans un mélange acétate d'éthyle 40 -
benzène 60.
-1
1. R.
film u cm
- (N-H) 3360, (C-H) 2980,
(C=O, ester) 1730, (CO-NH, amide II) 1530,
(N-NO) 1490, (S-CH ) 1300, (C-Cl) 790 - 753.
3
R.M.N.
1H (H-l') doublet à 462 Hz (7,7 ppm) J l '-2 = 8Hz
lH (H-2) multiplet à 295 Hz (4,91 ppm)
2H (H-5') triplet à 254 Hz (4,23 ppm) J 5 '-4' = 7Hz
3H (OC~3) singulet à 230 Hz (3,83 ppm)
2H (H-4') triplet à 213 Hz (3,55 ppm) J 4'-5' = 7H z
2H (H-3) multiplet à 156 Hz (2,6 ppm)
2H (H-4) multiplet} superposés à 130 H (2,17 ppm).
3H (H-6) singulet
z
Le chlorhydrate de L-aspartate d'éthyle est obtenu en
versant goutte à goutte 24 ml de chlorure de thionyle,
fraîchement distillé, à OoC et sous agitation magnétique,
à une suspension de 15 g (0,11 mole) d'acide L-aspartique dans
220 ml d'éthanol anhydre.
La réaction, isolée de l'humidité par une garde à chlorure
de calcium, est poursuivie 4 heures à température ambiante et
2 heures à 40°C.

---

- 73 -
La solution est évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C. L'huile obtenue cristallise dans l'éther
anhydre. 18,5 g. de cristaux, sont obtenus, soit un rendement
de 82 %.
Point de fusion : 108 - 1090C
Litt. 109 - 110°C (40)
[(Chlo~o-2-éthyl)-3-u~eXdo]-2-L-a~pa~tated'éthyle - li
A une suspension de 7,1 g.
(31,5.10- 3 mole) de chlorhydrate
de L-aspartate d'éthyle dans 50 ml de dichlorométhane, en
présence d'un excés de pyridine soit 5 ml, sont ajoutés goutte
à goutte, à O°C et sous agitation magnétique, 3 ml de chloro-2-
3
éthyl isocyanate (35.10-
mole).
La réaction, préservée de l'humidité par une garde à
chlorure de calcium, est poursuivie 24 heures à température
ambiante.
Le solvant est évaporé sous vide, puis l'opération est
répétée 3 fois en présence de benzène. Le résidu est dissous
dans 150 ml de chloroforme, et les différents lavages sont
effectués.
La phase organique recueillie est séchée sur sulfate de
sodium anhydre, essorée puis évaporée.
L'huile résiduelle cristallise dans un mélange méthanol,
éther, éther de pétrole.
6,02 g. sont recueillis sous forme de cristaux blancs,
soit un rendement de 65 %.
Point de fusion : 65 - 67°C

---

- 74 -
Rf
0,56 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10.
I.R.
KBr u cm -1
(N-H) 3350, (C-H)
2980
(C=O, ester) 1730, (C=O, amide) 1630,
(C-NH, amide II) 1580, (C-CI)
775-735.
Il
o
R.M.N.
(60 MHz, CDCI )
3
2H (H-1', H-3') massif mal résolu
- 372 H
(6 , 2 ppm)
z
- 364 H
(6,07 ppm)
z
1H (H-2) multiplet à 290 Hz (4,83 ppm)
4H (-C~2-0) multiplet à 253 Hz (4,22 ppm)
(H6-H6' )
4H (H-4', H-5') massif centré à 219 Hz (3,65 ppm)
2H (H-3) doublet à 178 Hz (2,97 ppm) J -
= 4H
3 2
z
6H (H-7, H-7") triplet à 77 H
(1,28 ppm)
z
J 7- 6 = 7H z
J 7"-6" = 7H z
Masse
M+ ....a 29 4 - PM : 294 , 5 •
[(Chlono-2-éthyll-3-nitno&o]-2-L-a&pantate d'éthyle - 35
3
A une solution de 2,15 g.
(7,3.10-
mole) d'urée dans un
minimum d'acide formique, sont ajoutés à OCC et sous agitation
magnétique, 3 équivalents de nitrite de sodium soit 1,5 g. par
petites fractions pendant 45 minutes. Au bout de 15 minutes de
la glace pilée est ajoutée au milieu fractionnel, l'huile qui
précipite est extraite par 200 ml de chloroforme, et les
différents lavages sont effectués. La phase organique recueillie
est séchée sur sulfate de sodium anhydre, essorée puis évaporée
sous vide. 2,13 g. sont obtenus sous forme d'une huile jaune
incristallisable (rendement 90 %), homogène en CCM avec un

---

- 75 -
Rf de 0,70 dans un mélange chloroforme 90 - méthanol 10.
l
I.R.
film u cm-
: (N-H) 3400, (C-H) 2980
(C=O, ester) 1730, (CO-NH, amide II) 1525,
(N-NO) 1500, (C-CI) 787 - 752,
R.M.N.
(60 MHz' CDCI 3)
lH (H-l') doublet à 479 Hz (7,98 ppm) J '-2 = 8H
l
z
lH (H-2) multiplet à 303 Hz (5,05 ppm)
4H
(H-6, H-6")
2H } (H-5')
multiplet à 257 Hz (4,28 ppm)
2H (H-4') triplet à 214 Hz (3,56 ppm) J 4 '-5' = 7H z
2H (H-3) doublet à 187 Hz (3,12 ppm) J -
= 5H
3 2
z
6H (H-7, H-7") triplet à 78 Hz (1,3 ppm) J 6- 7 = 7H z
Chlo4hyd4ate de L-glutamate de méthyle
3
29 cm
de chlorure de thionyle (0,4 mole) sont ajoutés
goutte à goutte à une suspension de 25,7 g. d'acide L-glutamique
3
(0,175 mole) dans 190 cm
de méthanol anhydre refroidie à OOC,
et agitée magnétiquement.
Dès la fin de l'addition, la réaction est poursuivie 3 heures
à température ambiante et 2 heures à 40°C. Aprés évaporation
sous vide du méthanol, l'huile est reprise par de l'éther
anhydre, 17,9 g. sont recueillis sous forme de poudre blanche
(rendement 75 %).
Point de fusion: 112 - 114°C
Litt.
: 113 - 114°C (41)
[IChlo4o-2-éthyl!-3-u4eZdo]-2-L-glutamate de méthyle - 18
3
4,74 g (22,4.10-
mole) de chlorhydrate de L-glutamate de

---

- 76 -
méthyle sont mis en suspension dans 50 ml de dichlorométhane,
en présence d'un équivalent de pyridine soit 1,8 ml.
A la température de O°C et goutte à goutte, 2,3 ml de
chloro-2-éthyl isocyanate (26.9.10- 3 mole) sont ajoutés
sous agitation magnétique. L'agitation est maintenue à
température ambiante pendant 24 heures.
La solution est évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C, l'opération est répétée 3 fois en présence
de benzène afin d'éliminer la pyridine. La résidu est dissous
dans 150 ml de chloroforme et les différents lavages sont
effectués. La phase organique recueillie est séchée, essorée
puis évaporée sous vide. L1huile résiduelle cristallise dan$
un mélange chloroforme-éther de pétrole. 2,52 g. de cristaux
sont recueillis (rendement 40 %).
Point de fusion: 80 - 81°C
Rf
0,15 avec un éluant acétate déthyle 40 - benzène 60.
1
I.R.
KBr u cm-
(N-H) 3330, (C-H) 2960
(C=O, esters) 1740, (C=O, amide) 1635,
(CO-NH, amide II) 1580, (C-Cl) 785 - 735.
R.M.N.
2H (H-1' ,H-3') doublet et triplet superposés
- 358 Hz (5.97 ppm)
- 350 Hz (5.83 ppm)
1H (H-2) multiplet à 274 H
(4,57 ppm)
7"
z
3H (-OC~3
) singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
3H (-OC~37) singulet à 224 Hz (3.73 ppm)
4H (H-4', H-5') massif à 219 Hz (3,65 ppm)
2H (H-3) multiplet à 144 Hz (2,4 ppm)
2H (H-4) triplet à 132 Hz (2.2 ppm)

---

- 77 -
Masse : M+ à 280 - PM : 280,5
[(Chlo~o-2-éthyl)-3-nit~o~oJ-2-L-glutamatede méthyle ~ 36
-3
A une solution de 1,77 g (6,3.10
mole) de N-chloro-2-
éthyl urée du L-glutamate de méthyle dans un minimum d'acide
formique, sont ajoutés à O°C et sous agitation magnétique, 3
équivalents de nitrite de sodium soit 1,30 g par petites fractions.
On poursuit l'addition pendant une heure au bout de laquelle
de la glace est ajoutée au milieu réactionnel. Une huile jaune
précipite, extraite avec du chloroforme, et les différents
lavages sont effectués. La phase organique recueillie est séchée,
essorée puis évaporée sous vide à une température inférieure à
SOoC. 1,76 g sont obtenus sous forme d'huile jaune incristal-
lisable (rendement 90 %), homogène en CCM et présentant un Rf
de 0,51 dans un mélange acétate d'éthyle 40 - benzène 60.
1
I.R.
film u cm-
:
(N-H) 3375,
(C-H)
2970,
(C=O, ester)
1740,
(CO-NH, amide II)
1540,
(N-NO)
1492,
(C-Cl) 789 - 752.
1H (H-1 ') doublet à 467 Hz (7,78 ppm) J
'-2 = 8H
1
z
1H (H-2) multiplet à 284 H
(4,73 ppm)
z
2H (H-5') triplet à 254 H
(4,23 ppm) J 5 '-4' = 7Hz
7"
z
3H (OC[3
) singulet à 230 Hz (3,83 ppm)
3H (OC~37) singulet à 222 Hz (3,7 ppm)
2H (H-4') triplet à 206 Hz (3,43 ppm) J 4 '-5' = 7Hz
4H (H-4, H-3) massif centré à 144 Hz (2,4 ppm)

---

- 78 -
Ca~bobenzoxy-L-alan~ne - 19
A une solution de 8,9 g (0,1 mole) de L-alanine dans 25 ml
de soude 4 N, sont ajoutés à O°C et sous agitation magnétique,
en 3 fractions successives 30 ml de soude 4 N et 15,6 ml
(0,12 mole) de chloformiate de benzyle.
Après une demi-heure de forte agitation, 150 ml d'éther
sont ajoutés pour extraire l'excès de chloroformiate de benzyle.
La phase aqueuse est neutralisée par de l'acide chlorhydrique
5 N jusqu'à pH 2, puis extraite par 3 fois 150 ml d'acétate
d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium
anhydre, essorée puis évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C.
La carbobenzoxy-L-alanine cristallise par addition d'éther
de pétrole, 17,7 g sont recueillis sous forme de cristaux blancs
soit un rendement de 79 %.
Point de fusion : 85 - 86°C
Litt. 87°C (42)
L-leucina~e de mé~hyle - 20
On obtient l'ester libre en neutralisant à O°C, une solution
aqueuse du chlorhydrate (5 g dans 20 ml) par addition de carbonate
de potassium par petites quantités jusqu'à pH 9. On extrait par
trois fois 100 ml d'éther, la phase organique recueillie est
séchée, essorée puis évaporée sous vide à basse température.
3,1 g de l'ester méthylique de la L-Ieucine sont obtenus sous
forme d'huile utilisée immédiatement (rendement 75 %).
Ca~bobenzoxw-L-alanwl-L-leuc~na~e
de mé~hwle - !l
3
A 2,39 g de L-Ieucinate de méthyle (16,5.10-
mole) en
solution dans 50 ml d'acétate d'éthyle, sont ajoutés 3,68 g
3
de carbobenzoxy-L-alanine (16,5.10-
mole) puis 3,40 g de
dicyclohexylcarbodiimide. La solution à température ambiante

---

- 79 -
est agitée magnétiquement, et préservée de l'humidité par une
garde à chlorure de calcium. Un précipité blanc de dicyclohexyl-
urée se forme immédiatement, l'agitation est poursuivie pendant
24 heures.
Le mélange réactionnel est filtré sur terre d'infusoires
pour éliminer la dicyclohexylurée. Le solvant est évaporé puis
remplacé par 200 ml de chloroforme sur lequel les différents
lavages sont effectués; 2 fois à l'acide chlorhydriquè 10 %,
3 fois à l'eau, 2 fois avec une solution saturée de bicarbonate
de sodium et 3 rinçages à l'eau.
La phase organique recueillie est séchée sur sulfate de
sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide à une température
inférieure à 50°C. Une huile légèrement jaune incristallisable (49)
est obtenue, tirée sous un vide de 0,5 mm de mercure pendant
24 heures, 4,8 g. sont recueillis soit un rendement de 86 %.
3
3,6 g.
(10,7.10-
mole) de Carbobenzoxy-L-alanyl-L-
leucinate de méthyle sont dissous dans 5 ml d'acide acétique
glacial. Un courant gazeux de bromure d'hydrogène sec traverse
la solution agitée magnétiquement. L'ensemble est isolé de
l'humidité ambiante par une garde à chlorure de calcium. Le
dégagement de gaz carbonique apparait au bout de 10 minutes et
cesse au bout d'une heure environ. La solution est alors versée
dans 300 ml d'ether anhydre avec apparition d'un précipité blanc
de brornhydrate de L-alanyl-L-Ieucinate de méthyle. Après 12 heures
en chambre froide, l'éther est évaporé, l'opération est répétée
3 fois, l'huile résiduelle est alors dissoute dans du tétra-
hydrofuranne, et après évaporation du solvant donne 2,19 g. de
mousse blanchâtre très hydroscopique (rendement environ 70 %).
Lebromhydrate 22 est conservé dans un dessicateur à anhydre
phosphorique.

---

- 80 -
(Chlo~o-2-éthylJ-u~éZdo-3-L-alanyl-L-leuQinate de méthyle - 23
3
2,19 g (7,4.10-
mole) de bromhydrate de L-alanyl-L
leucinate de méthyle sont mis en suspension dans 30 ml de
dichlorométhane. A O°C et sous agitation magnétique, sont
3
ajoutés un excés de triéthylamine soit 5 ml et 0,76 ml (8,9.10-
mole) de chloro-2-éthyl isocyanate. L'agitation est poursuivie
4 heures à température ambiante. Le solvant est évaporé sous
vide à une température inférieure à 50°C. 200 ml de chloroforme
sont ajoutés au résidu, et les lavages sont effectués, deux fois
à l'acide chlorhydrique 10 %, trois fois à l'eau, deux fois avec
une solution saturée de bicarbonate de sodium et trois rincages à
l'eau .. Aprés décantation, la phase organique est séchée sur
sulfate de sodium anhydre, essorée puis évaporée sous vide. Une
huile contenant des cristaux est obtenue, elle cristallise dans
un mélange chloroforme-ether de pétrole. 1,5 g, de cristaux sont
recueillis (rendement 63 %).
Point de fusion:
143 - 144°C après recristallisation dans
un mélange chloroforme-ether de pétrole.
Rf
0,72 dans un mélange chloroforme
8 - méthanol 2 .
-1
I.R.
: KBr v cm
(N-H) 3340 - 3260,
(C-H) 2950
(C=O, ester) 1730, (C=O, amide)
1620
Bande amide l 1650, amide II 1550, amide III 1290.
1250 - 1150, (C-Cl)
740 - 640.
R.M.N.
(60 MHz' CDCI )
3
1H (H-4, NH-4) doublet à 476 H
(7,93 ppm)
z
J
-
= 7Hz
4 5
1H (H-l' , NH-1 ') doublet à 400 H
(6,66 ppm)
z
J 1 '-2 = 9Hz
1H (H- 3' , NH- 3' ) triplet mal résolu à 380 Hz
(6,33 ppm)

---

- 81 -
2H (H-2, H-5) multiplet à 276 H
(4,6 ppm)
z
3H (-OC~3) singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
4H (H-4', H-5') signal unique à 218 H
(3,63 ppm)
z
3H (H-6, H-7) multiplet à 102 Hz (1,7 ppm)
3H (H-l) doublet à 84 Hz (1,4 ppm) J -
l 2 = 7H z
6H (H-8, H-9) doublet à 58 H
(0,97 ppm)
z
J 8- 7 = J 9- 7 = 5H z
Masse
:r.t = 321
PM = 321,5
[(Chlono-2-éthyl)-3-n~tno~o]-2-L-alanyl-L-leue~nate
de
méthyle - 31
méthode A : nitrosation par le chlorure de nitrosyle.
-3
Une solution de 0,85 g (2,64,10
mole) d'urée II dans 30 ml
de dichlorométhane, en présence de 0,5 ml de pyridine, est
traversée par un courant gazeux de chlorure de nitrosyle à O°C
et sous agitation magnétique. La réaction suivie par CCM est
pratiquement complète au bout de 15 mn.
L'addition de glace au milieu réactionnel précipite une
huile jaune. Après extraction au chloroforme, les différents
lavages sont effectués. 0,85 g d'huile jaune incristallisable
sont obtenus après évaporation du solvant (rendement 92 %).
La présence de deux composés de nitrosation est révélée
en C.L.H.P. Les temps de rétention sont respectivement de
19,2 mn pour le composé de nitrosation parasite et de 26 mn
pour le composé attendu (nitrosation en 3').
Conditions d'analyse en C.L.H.P.
: éluant chloroforme 95 % -
acétonitrile 5 % - support colonne microporasil {phase normale)
vitesse d'élution : 2 ml/mn
vitesse de défilement : 0,08 cm/mn.

---

- 82 -
méthod~ B : nitrosation par le nitrite de sodium.
3
A une solution de 1,71 g d'urée ~ (5,32.10-
mole) dans
30 ml d'acide formique fraîchement distillé, sont ajoutés
3 équivalents de nitrite de sodium anhydre soit 1,01 g.
L'addition de nitrite de sodium est échelonnée sur 1 heure.
L'addition de glace au milieu réactionnel précipite une
huile jaune. Aprés extraction au chloroforme, les différents
lavages sont effectués. La phase organique est séchée sur
sulfate de sodium anhydre, essorée puis évaporée à une
température inférieure à 50°C.
1,68 g d'huile jaune sont recueillis (rendement 90 %).
Cette huile est homogène en CoC.M. avec un Rf de 0,65 dans
un mélange chloroforme 9 - methanol 1.
L'analyse en C.L.H.P. de l'huile précédente révèle
l'existence d'un composé de nitrosation parasite en proportion
négligeable.
L'huile précédente cristallise au bout de 15 jours de
chambre froide, cette cristallisation est améliorée par
addition d'éther anhydre.
PF
50 - 52°C - solide jaune pâle légèrement hydroscopique.
IR
film \\) cm- 1 (N-H) 3300, (C-H) 2950,
(C=O, ester) 1750, (C=O, amide) 1720,
Bande amide l
1660, (CO-NH, amide II) 1520,
(N-NO) 1490, ester 1250, (C-Cl) 740 - 640.
R.M.N.
: (60 MHz' CDC1 3)
1H (H-4, NH-4) doublet à 468 Hz (7,8 ppm) J 4- 5 = 7H z
1H (H-1', NH-1') doublet à 418 Hz (6,97 ppm)
J 1 ,_ 2 = 9H z

---

- 83 -
2H (H-2, H-5) multiplet à 282 Hz (4,7 ppm)
2H (H-5') triplet à 253 Hz (4,22 ppm) J 5 '-4' = 7H z
3H (-OC~3)
singulet à 228 Hz (3,8 ppm)
2H (H-4') triplet à 214 Hz (3,57 ppm) J 4 '-5' = 7Hz
6H (H-l, H-6, H-7) multiplet à 94 Hz (1,57 ppm)
6H (H-8, H-9) doublet à 56 Hz (0,93 ppm) J -
= 5H
7 8
z

---

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(41) - O.M. FRIEDMANN, A.M. SELIGMAN,
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19 54, 1.i-, 6 5 8 •
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SpJt-irLge.Jt Ve.Jtia.g, Be.Jti-irL,
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J.N. VAVIVSON,
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COHN,
Ed., Ac.ade.m-ic.
PJt e..6.6 ., Ne.w - Y0 Jt k. ,
1966, v 0 .e.. 5, 89 •
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Ch-im. Th e.Jt .,
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P. CHEVALLET, J. CASTEL, H. ORZALESI,
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1979,.!...i,
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Vu et approuvé
Abidjan~ le la Décembre 1980
Le Doyen de la Faculté des Sciences
1
f1
TaURE BAKARY
Vu et permis d'imprimer
djan, le la Décembre 1980
Le Recteur
.
• , 1
V. CH. DIARRASSOUBA

---