THE5E
DE
DOCTORAT DE 3erne CYCLE
DE
DEVELOPPEMENT
ET AMELIORATION DES VEGETAUX
( MENTION
présenté
à
FACULTE DES SCIENCES DE St CHARLES
de
L'UNIVERSITE
D~IX - MARSEILLE 1
par
Sévérin
AKE
pour
obtenir
le
grade
de
Docteur de
Sujet de la thèse :
contribution à l'étude des activités de
quelques analogues structuraux de cytokinines
sur la croissance et !e verdissement de
suspensions cellulaires de Nicotiana
tabacum
Soutenue le
1984
devant la Commission d'examen
MM.
CLAUDE
LAMBERT
président
CLAUDE
PÉAUD- LENÔEL
]
Mlles
CAMILLE BULARD
examinateurs
MATHILDE PICHENOT

---

A
MES
PARENTS
A
MA
CHERE
DELPHINE
Il existe de l'or
Et aussi une abondance de coraux,
Mais les lèvres de la
" connaissance "
Sont des vases précieux.
PROVo 20: 15 TMN

---

Séverin AKE
REM E Rel E MEN T 5
Le travail présenté dans ce mémoire a été effectué au
Laboratoire de Biochimie Fonctionnelle des Plantes,à la Faculté
des Sciences de Luminy,sous la direction de Monsieur Claude Péaud-
Lenoël.
Je suis heureux de pouvoir lui exprimer ma profonde
reconnaissance pour m'avoir fait bénéficier de sa grande expérience,
de son dévouement inlassable, pour l'intérêt constant qu'il a porté
au déroulement de mes expériences et pour les conseils et suggestions
qu'il m'a prodigués.
J'ai débuté ma formation scientifique avec le Professeur C.
Lambert,qui m'a mis en contact avec l'équipe dirigée par Monsieur
Péaud-Lenoël.
Qu'il trouve l'expression de ma gratitude pour les
responsabilités qu'il s'est toujours efforcé d'assumer à mon égard,
et de l'honneur qu'il me fait en assurant la présidence de ce jury.
Je suis reconnaissant aux Professeurs C.Bulard et
M.Pichenot pour avoir accepté d'examiner et de juger ce travail.
J'ai apprécié la collaboration de Mlle M.
Axelos,
ses
conseils et suggestions pour la pratique des cultures en milieu
liquide. Qu'elle veuille bien accepter mes vifs remerciements.
Mes sincères remerciements vont à Mr.
B.
Teyssendier de la
Serve pour sa collaboration et ses conseils dont j'ai bénéficiés.
J'ai été sensible à l'aide technique empreinte de
sympathie de Mmes C.Canavaggia
M.C.
Durand
et
Mlle M.
Grau.
Je ne s'aurai oublier Mme Mailland,pour la gentillesse
qu'elle m'a toujours manifestée.

---

Séverin AKE
2
Je tiens à exprimer mes vifs remerciements à ceux de
l'équipe qui ont assuré le travail de mise en page de ce mémoire,
Mlle S.
Campolo et Mme J.
Bernard ont collaboré très aimablement.
Que Monsieur Jacques Briand de la Bibliothèque inter-
universitaire de Lwüny,trouve l'expression de ma reconnaissance
pour son aide spontanée et amicale à la documentation bibliographique.
Enfin,je remercie tous les collègues que j'ai eu la joie
de rencontrer au Laboratoire, pour leur soutient réconfortant.

---

Séverin AKE
3
SOM MAI R E
CHAPITRE I. HISTORIQUE, INTRODUCTION
Page
A. Activités Biologiques des cytokinines
9
1. Multiplication cellulaire
10
2. Différenciation et organogénèse.
11
3. Effets métaboliques des cytokinines
13
Différenciatiorr de l'appareil photosynthétique,
Biosynthèse de pigments
Relation avec les structures membranaires
B.
Analogies structurales et Activités
17
1. Dérivés de l'adénine
17
Chaînes latérales et position en
Noyau adénine et substitutions
2. Analogues Antagonistes des Cytok i ni nes "
21
Analogues de type pyrazolo 4,3-d pyrimidine
Pyrrolo 2,3-d pyrimidines
Autres structures à activité anti-cytokinine
3. Phénylurées et dérivés du benzimidazole
22
Phénylurées. diphénylurées et activités cytokinines
N-phenyl-N'(4-pyridyl)urées
Benzimidazole et dérivés
Cas du 5,6-dichloro~-D-ribofuranOSYI-benZimidazole
C. Mode d'action des cytokinines
29
1. Incorporation dans les ARN
29

---

4
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
Page
2. Sites d'action
30
O. Conclusions
31
CHAPITRE II.- MATERIEL BIOLOGIQUE ET METHODES
A. Matériel biologique
33
B. Exigence en cytokinine de la lignée 19
stimulation de la
33
croissance et de la chlorophyllogénèse
C. Cultures de Cellules et Méthodes analytiques
34
1. Cultures de cals en milieu solide
34
2. Suspensions cellulaires; milieux de culture liquides
34
Initiation et entretien des suspensions
Ambiance des cultures
3. Cultures expérimentales
39
Suspensions mères
Milieux de culture
Analogues structuraux
Ensemencement des milieux expérimentaux
4. Méthodes de mesure
41
Mesures de la croissance cellulaire
Numérations
Mesures de la chlorophyllogénèse

---

Séverin AKE
5
CHAPITRE III. CROISSANCE ET CHLOROPHYLLOGENESE
CYTOKININE-DEPENDANTE DE LA LIGNEE 19
Page
A. Résultats
49
1. Effet de dose
49
2. Cinétique de croissance et chlorophyllogénèse
49
B. Conclusions
50
CHAPITRE IV. ACTIVITES DE DEUX N-PHENYL-N'(4-PYRIDYL)UREES
SUR LA CROISSANCE ET LA DIFFERENCIATION CELLULAIRES
A. Résultats
55
1. Stimulation de la croissance
55
2. Synthèse de chlorophylles
58
3~ Taux différentiels de synthèse
58
B. Discussion
63
CHAPITRE V. ETUDE DE L'EFFET DU 5,6-DICHLORO-(3-D-RIBOFURANOSYL-
BENZIMIDAZOLE EN PRESENCE OU EN L'ABSENCE DE CYTOKININE
A. Résultats
65
1. Introduction
65
2. Plan expérimental
65

---

6
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
Page
3. Effet du ORB sur la croissance cellulaire
65
ORB ajouté au milieu de base
ORB en présence de cytokinine
4. Effet du ORB sur la chlorophyllogénèse
66
ORB ajouté au milieu de base
ORB en présence de cytokinine
5. Recherche d'une activité spécifique du ORB sur la
synthèse de chlorophylle a ou b
74
6. Evaluation en pourcentage de l'effet du ORB sur la
croissance ou la chlorophyllogénèse
75
B. Discussion
75
CHAPITRE VI. CONCLUSIONS GENERALES
80
INDEX BIBLIOGRAPHIQUE
83

---

Séverin AKE
7
A B R E V l A T ION S
A l A
Acide indole-3,acétique
B l
Benzimidazole
BzIAde
N6-benzyladénine
2,4 0
acide 2,4,dichlorophénoxyacétique
ORB
5,6,dichloro~-O-ribofuranosyl-benzimidazole
o 0 P A
dioxyphénylalanine
E G T A
acide éthylèneglycol bis-(amino-2 ethyléther)-
N,N,NI ,NI ,-tétraacétique)
E 0 T A
acide éthylènediamine-tetra-acétique
i6Ade
N6,(~2-isopentenyl)adénine
INA
acide isonicotinique
K
kinétine
K 0
kinétine + 0 R B
1-meAde
1,methy l-adén i ne
MF P
facteur de maturation protéique
MB C
methyl-benzimidazole-2-yl-carbamate
4 P U
N-phényl, NI (4-pyridyl)urée
4 P U-30
N-phényl, NI(2-CI,4-pyridyl)urée
ORIGINE DES PRODUITS CHIMIQUES
4 PU et 4PU-30 : Nous
remercions le Professeur Y. Isogai (College of
General
Education, University
of Tokyo,
Komaba,
Meguro-Ku, Tokyo,
Japon) pour llenvoi très apprécié de ces substances.
ORB : Calbiochem, Behring France
MOTS CLEFS
Analogue structural, Cytokinine, ORB, phényl,pyridyl-urées
Cellules de Tabac, Cultures en Suspension

---

Séverin AKE
9
CHAPITRE l
l N T R 0 DUC T ION,
HIS TOR l QUE
Les
cytokinines sont
considérées essentiellement
comme
des phyto-
hormones au même titre que les gibberellines, les auxines, l'acide abscis-
sique, l'éthylène [Thimann,
1972J. Ce terme englobe toutes les substances
synthétiques ou
naturelles présentant des activités
biologiques qui sont
celles exercées par la N6-furfurylaminOpurine (kinétine), la première à
être identifiée [Miller et al., 1956J.
Ces activités
sont variées et
peuvent s'observer à
chaque stade de
l 'ontogénèse
végétale. Cette
classe de
substances
intervient notamment
dans la
régulation de la
floraison, la germination,
la ramification, la
fructification et la sénescence [Revues de Skoog et Schmitz, 1979J.
Cependant, une définition plus restrictive est donnée aux cytokinines
en tant que substances stimulant la division cellulaire de certains tissus
végétaux cultivés
in vitro, tels
que le parenchyme
médullaire de Tabac,
dans un
milieu de
culture chimiquement
défini et contenant
une auxine.
C'est par
analogie aux auxines
(définies comme étant
des substances qui
stimulent l'élongation de cellules végétales dans certains systèmes biolo-
giques de
la même manière que le fait
l'acide indole-3-acétique) que les
cytokinines sont définies comme stimulateurs de la division cellulaire.
Les cytokinines ont fait l 'objet de nombreux travaux: bien que leurs
modes d'action
ne soient pas
complètement élucidés, il
n'en demeure pas
moins
Que de
nombreuses connaissances ont
été acquises.
Celles-ci sont
exposées dans des
revues générales ou spécialisées.
Sans vouloir
être exhaustif dans tous les domaines
d'études de ces
hormones, il
nous semble indispensable d'en
rappeler l'essentiel. Toute-
fois, nous mettrons l'accent sur les structures communes de ces hormones.
A.- ACTIVITES BIOLOGIQUES DES CYTOKININES
Les cytokinines exercent
plusieurs effets biologiques, notamment sur
les
phénomènes de
croissance, de
différenciation, d'organogénèse
et de
sénescence. Nous décrirons quelques uns de ces effets.

---

10
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
1/ Multiplication cellulaire
Les travaux pour élucider
le mode d'action des cytokinines, ont com-
mencé par la recherche de
systèmes biologiques sensibles. Pour ce qui est
de
la croissance
cytokinine-dépendante,
très peu
de
systèmes ont
été
développés de façon
précise. L'on peut citer le cas
des tissus de paren-
chyme de tabac et les
cultures de suspensions cellulaires qui en dérivent
[Das et al., 1956 ; Jouanneau, 1966J, les cultures de tissus et de suspen-
sions cellulaires dérivant de cotylédons de Pois. Fosket et Torrey [1969J,
Phillips
et Torrey
[1973J,
précisèrent
le système
constitué par
les
explants
provenant de la partie corticale de racine de Pois.
Au niveau du végétal entier, l'effet des cytokinines sur la croissan-
ce a été mis en évidence
dans des expériences chez le Soja. Ainsi Holm et
Key [1969J,
montrent qu'après excision des
racines, l'arrêt du transport
d'hormones vers
les parties aériennes, entraîne
notamment le ralentisse-
ment de la croissance de la
tige ou de l'hypocotyle. Dans ces conditions,
l'addition d'une cytokinine et d'acide gibberellique permet de rétablir la
croissance de la partie apicale
des hypocotyles de Soja. Thimann et Sachs
[1966J travaillant
sur des
plantes entières,
rapportent la levée
de la
dominance apicale
exercée par l'apex sur
les bourgeons axillaires, après
l'addition de cytokinine : on observe une reprise de l'activité mitotique,
puis
la croissance
des
bourgeons axillaires
et la
ramification de
la
plante. Il
Œ.ssort de·\\ces résultats que
l'action des cytokinines suggère
.
-, <: .
1
un con°(trôle
stimulant,;o:des zones
méristématiques chez les
végétaux, con-
\\
,
jointe~ent avec d'àutr~s hormones.
,
-
- . /;/
La
croJ~.~_~onc'ê:;/ d1une plante consti tue un phénomène phys io logi que
complexe, compte tenu
des corrélations hormonales variées auxquelles elle
est
soumise. Ces
difficultés rendent délicate
l'analyse de
l'effet des
cytokinines sur la croissance des organes végétaux.
Cet effet
sur la croissance
des tissus végétaux a été mieux étudié
grâce à la technique de culture
in vitro. Par des essais sur des explants
de parenchyme
médullaire provenant de
parties adultes de
tige de Tabac,
Das
et al.
[1956J,
mentionnent qu'une
forte
activité mitotique
n'est
provoquée que par l'addition simultanée de kinétine et d'auxine.
Toutefois, la
sensibilité des
tissus végétaux aux
cytokinines exo-
gènes n'est
pas un phénomène
général. En effet, il
existe de nombreuses
souches de
tissus végétaux capables
de croître indéfiniment
en présence

---

Séverin AKE
11
seulement
d'auxine. Lamport
[1964J, a
isolé
une souche
d'Erable (Acer
pseudoplatanus), dont
la croissance est assurée
(depuis cette date) uni-
quement par du 2,4 0 comme facteur de croissance.
Chez le Pois, Torrey et
Fosket [1970J, ont montré que l'exigence vis
à vis
des cytokinines exogènes
peut différer entre les
tissus d'un même
organe
végétal. Alors
que les
cellules du
péricycle sont
induites par
l'auxine, celles du
parenchyme cortical n'entrent en division que lorsque
le milieu contient aussi une cytokinine.
Des études sur
la stimulation de croissance cytokinine-dépendante au
niveau
biochimique, ont
été menées sur
des systèmes
biologiques diffé-
rents.
En rapport
avec la
synthèse de l'ADN,
Simard [1971J,
ainsi que
Jouanneau et Tandeau de Marsac [1973
aJ, arrivent à la conclusion que les
cytokinines ne
sont pas nécessaires
à la synthèse de
l'ADN. Phillips et
Torrey, [1972J, trouvent
des résultats contraires avec des cellules d'ex-
plants corticaux de segments racinaires de pois.
21 Différenciation et organogénèse
Les cytokinines jouent également un rôle important dans les processus
de différenciation et d'organogénèse.
Des expériences
effectuées sur des cals de
Tabac par Skoog, [1944J,
indiquèrent
des effets
d'une
interaction entre
l'auxine, l'adénine
et
d'autres facteurs. Sur cette base, Skoog, [1950J, propose le concept d'une
régulation quantitative multifactorielle.
De nombreuses études montrèrent
en effet des
interactions entre hormones (auxines, cytokinines, gibberel-
1ines), substrats
et facteurs de l'ambiance
[Gautheret, 1969; Murashige,
1974J.
La
division des
cellules polyploïdes du
parenchyme cortical
de la
racine de Pois nécessite la présence d'une auxine et d'une cytokinine.
Seules
les
cellules ayant
subi
deux cycles
de
division évolueront
en
trachéides, après avoir liquéfié leur paroi [Torrey et al., (1971)J.
Dans d'autres
systèmes, les cytokinines
contrôlent distinctement la
multiplication
cellulaire et
la
différenciation ainsi
que llont
montré
Fosket et Torrey
[1969J avec des tissus de Soja,
et Oppenoorth [1976J sur
des segments de pétiole de Phaseolus sp. Dans ce dernier exemple, une

---

12
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
application de
kinétine favorise la
formation de trachéides
et la lï"gni-
fication du
sclérenchyme, en même
temps qu'elle stimule
la division cel-
lulaire
au niveaü
du cambiüm,
du xylème et
du parenchyme.
Les hormones
endogènes auraient donc
naturellement une certaine répartition qui contri-
buerait beaucoup au processus de différenciation.
Le contrôle distinct de
la multiplication cellulaire et de la diffé-
renciation a été bien
mis en
évidence dans les
expériences de
Skoog et
Miller [1957J
chez le tissu
de moëlle de tabac.
Les phénomènes d'organo-
génèse apparaissent
seulement quand le rapport
des concentrations auxine/
cytokinine
est loin
de lléquilibre.
La
différenciation ne
devient dqnc
Dossible que lorsqu'est réalisée une balance hormonale déterminée.
TABLEAU I.- Différenciation des
tissus de Tabac cultivés in vitro, suivant
la concentration des hormones végétales dans le milieu.
Auxine
Stimulation(tige)
mais aussi inhibition.
(racine)
(1)
c:
croissance isodiamétrique
.....
c
.-
~
o
~
u
@YTOKININEJ<~UXINEJ
Stimulation(racine)
mais aussi inhibition(tige)

---

Séverin AKE
13
Cette
relation quantitative
constitue
une base
importante des
méthodes
actuelles
utilisées
dans la
régénération
végétative
des plantules
(en
horticulture
aussi
bien
qu'en
agriculture),
à
partir
de
tissus,
de
méristèmes, de
suspensions cellulaires ou
protoplastes, [Murashige, 1974,
1977J.
En
ce qui
concerne la
technique des
protoplastes, Takebe
et al.,
[1971J, ainsi
que Melchers et Labib [1974J,
insistent sur l'importance de
la quantité
appropriée de cytokinine exogène utilisée,
aussi bien pour ~a
préparation de protoplastes viables que pour la régénération de plantes qui
s'ensuit.
Nous avons mentionné
plus haut, que les processus de différenciation
et d'organogénèse étaient
sous l (influence de facteurs de l'ambiance (qua-
lité de
la lumière, longueur du jour,
température). L'intervention de ces
facteurs sur
les capacités régénératrices
chez les végétaux,
pourrait se
faire "via" leurs influences
sur les hormones endogènes, notamment sur les
quantités internes de cytokinines, ainsi que Heide, [1965J l'a suggéré dans
des travaux sur la rhizogénèse et la formation de bourgeons des boutures de
Bégonia. Chez certains
végétaux, Lactuca [Dershug et Miller 1967J, Dendro-
phthoe, [Nag
et Johri, 1970J, Torenia
[Bajaj,
1972J, des applications de
cytokinine peuvent induire la formation de bourgeons.
Quels sont les évènements biochimiques liés à l'effet des cytokinines
sur la différenciation? Thorpe et Murashige [1968J rapportent que dans les
cultures de_ tissus de
Tabac, la différenciation
des bourgeons se
fait à
partir de zones préférentielles d'activité mitotique. Dans de tels cas, ils
constatent un effet global sur
la synthèse des protéines. Par des méthodes
immunologiques,
Boutenko et
Volodarsky
[1968J indiquent
la présence
de
protéines spécifiques dans des cals de tissus de Tabac, en croissance ou en
voie de différenciation.
Il
ne fait
aucun doute
que la complexité
de ces
systèmes experl-
mentaux constitue
une entrave à
une investigation de
l'effet moléculaire
des cytokinines.
3/ Effet métabolique des cytokinines
Des essais
biologiques rapides
ont été
développés sur la
base des
effets spécifiques
des cytokinines
dans les
cellules: la
rétention des
chlorophylles dans
les feuilles sénescentes traitées
avec des cytokinines

---

14
Analogues cytokinines!croissance cellulaire
[Varga et Bruinsma, 1973J ;
la
synthèse
cytokinine-dépendante
de
chlorophylle,
dans
des
systèmes cotylédonaires [Fletcher et
al., 1973J, et également dans le sys-
tème de
suspensions cellulaires de Tabac sensible
aux cytokinines pour ce
ca ractère, [Jouanneau, 1966 J .
D1autres
essais biologiques
des cytokinines
sont
souvent utilisés
comme
les
biosynthèses de
beta-cyanines
(Amaranthine) et
d'anthocyanes
[Biddington et al., 1973J.
De
nombreux
auteurs
ont décrit
l'effet
des
cytokinines sur
les
phénomènes de mobilisation et de transport qui concourent à la formation et
au
maintien d'organites
cellulaires
et des
structures membranaires.
La
biosynthèse des chlorophylles
et plusieurs autres constituants cellulaires
dépendent de ces phénomènes de mobilisation et de transport.
- Différenciation de llappareil photosynthétique
La
différenciation chloroplastique, stimulée
par les
cytokinines a
fait l'objet de nombreux travaux.
En 1965, Stetler et Laetsch ont constaté
que ces
hormones étaient indispensables à
la maturation des chloroplastes
dans une culture de tissu de
Tabac dont la croissance est indépendante des
cytokinines exogènes. Les
proplastes évoluent en chloroplastes lorsque les
cultures sont
illuminées, pourvu qu'une
cytokinine soit présente
dans le
milieu. En
1'absence de celle-ci,
les proplastes ne
différencient pas de
lamelles chloroplastiques, ni ne synthétisent des pigments chlorophylliens.
La différenciation
morphologique et fonctionnelle
des chloroplastes s'ef-
fectue seulement
en présence de
cytokinines. Possingham et
Smith [1972J,
expérimentèrent la N6-benzyladénine, et la zéatine sur des disques de
feuilles d'Epinard, et
indiquent 1'accroissement du nombre des chloroplas-
tes pa r ce Il u1e .
Feierabend
[1969J a
montré qu'en
appliquant de
la kinétine
à des
plantules étiolés de Seigle, il
en résultait après plusieurs jours (96 h),
une
augmentation spécifique
de l'activité
d'enzymes localisées
dans les
chloroplastes, en l'occurrence
la carboxydismutase et la glycéraldehyde 3-
phosphate
déshydrogénase NADP-dépendante. Leur
vitesse de
synthèsé était
déterminée par la concentration intracellulaire de cytokinine.
Il ressort des travaux de Fletcher et al., [1973J avec les cotylédons

---

Séverin AKE
15
de concombre, de Stobart et Shewry
[1972J sur les feuilles d'Orge, que les
cytokinines ont
une action sur les
activités enzymatiques impliquées dans
la
voie de
biosynthèse
de la
chlorophylle, notamment
celle de
l'acide
amino-Iévulinique synthétase, une enzyme clé de cette voie.
Dans les
cultures de cellules
de Tabac sensibles,
la formation des
thylakoïdes
chloroplastiques
nécessite un
apport
de cytokinine
exogène
[Seyer et al., 1975J. C'est sur ce même système biologique que Péaud-Lenoël
et Axelos
[1981, 1983J, rapportent que la
présence de certaines protéines
plastidiales
n'est décelable
que lorsque
les
cellules sont
pourvues en
cytokinines. Les
protéines du complexe
collecteur de lumière
(LHCP) sont
les plus
remarquables de ces substances. Ce
fait semble vérifié également
chez d'autres végétaux tel que Cucumis sativum [Toshihide et al., 1981J.
- Biosynthèse de pigments
La
biosynthèse
de beta-cyanine
(amaranthine)
dans les
cotylédons
d'Amaranthus est
régulée par le système
photorécepteur du phytochrome. La
lumière rouge
(R, 660 nm)
favorise la synthèse,
alors que dans
le rouge
lointain (FR, 730-735 nm) la stimulation R (lumière rouge) est reversée.
Dans
les
cotylédons
maintenus
à l'obscurité
l'Amaranthine
n'est
synthétisée
qu'après application
d'une cytokinine
exogène
[Bamberger et
Meyer,
1960]. Colomas et
Bulard .• [1975J démontrèrent
que
la lumière
FR
pouvait
empêcher la
synthèse d'amaranthine
stimulée
par R également en
présence
de
kinétine.
Par
ailleurs,
l'acide
gibberellique
inhibe
la
synthèse du
pigment à la
lumière, mais n'empêche pas
la synthèse induite
par la kinétine à l'obscurité [Kinsman
et al., 1977]. Ils aboutissent à la
conclusion que
l'action stimulatrice de la kinétine
sur la biosynthèse de
beta-cyanine serait une imitation
de celle due à la lumière, c'est-à-dire,
un acroissement des "pools" de la tyrosine et de la DOPA-oxidase.
La synthèse
des anthocyanes est également
favorisée par les cytoki-
nines. Chez
le Chou rouge,
Bassim et Pecket
[1975J mettent cet
effet en
relation avec
la perméabilité membranaire.
Mentionnons aussi que
la bio-
synthèse des
pigments caroténoïdes est aussi soumise
à une régulation par
les hormones végétales. Sur des
cultures dérivées de racines de carottes à
pigmentation
rouge, Mok
et al., [1976J
appliquèrent des
combinaisons de
2,40 et de
cytokinine. La coloration du cal varie
du rouge foncé au jaune
quand
les
proportions
des hormones
varient
d'une
extrême (absence
de

---

16
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
cytokinine) à l'autre (absence de
2,4 0). Nous avons constaté (données non
publiées), que les cultures de tissus ainsi que les suspensions cellulaires
de Platanus
acerifolia ont un comportement similaire en
présence de 2,4 0
et de kinétine.
Cette
variation quantitative
de
la pigmentation
en
réponse à
un
rapport cytokinine/2,4 0 croissant réflète une
synthèse des xanthophylles
à partir des caroténoïdes. Elle serait dûe essentiellement à une inhibition
par les cytokinines (ou une stimulation
par le 2,4 0) de la biosynthèse du
lycopène [Skoog et Schmitz, 1979J.
- Relations avec les structures membranaires
Les cytokinines sont
impliquées dans la perméabilité membranaire. En
ce qui concerne
le phénomène de la sénescence, Dennis
et al., [1967J rap-
portent que les cytokinines exogènes favoriseraient souvent le phénomène de
la
sénescence dans
de jeunes
feuilles, par
leur hyperstimulation
de la
formation de la membrane chloroplastique.
En plus
de la diminution des
chlorophylles, l'intégrité membranaire
est un facteur important. Se basant sur l'incorporation de la [14CJ-leucine
dans des chloroplastes isolés,
Richmond et Lang [1957J rapportèrent que l'effet de la kinétine serait pour
une grande part, dû à l 'hydratation et à la perméabilité membranaire.
Travaillant sur ce même système, Thimann et al., [1971J soulignent le
fait que,
dans le
contrôle du phénomène
de la sénescence,
la production
d'enzymes à
l'extérieur du chloroplaste, serait le
facteur le plus impor-
tant. Plusieurs travaux suggèrent que cette actio~ serait due au contenu en
acides gras. Chez l 'OignoIT, Feng et Unger [1972J rapportent qu'une applica-
tion de
kinétine aux cellules épidermiques se traduit
par un effet haute-
ment significatif
sur la constante
de perméabilité, bien
que la pression
osmotique ne soit pas affectée. Ces auteurs ont suggéré quJun effet sur les
protéines membranaires pourrait être impliqué.
Selon Kull et Buxenstein [1974J, une application de la kinétine ou de
la zéatine, se traduit par une augmentation du contenu en acide linolénique
dans les feuilles de
Peuplier. Chez Impatiens, le même traitement foliaire
se traduit par une augmentation du contenu en acide palmitique.
Ils ont été tentés de suggérer que l'inhibition par la cytokinine de

---

Séverin AKE
17
la glucose-6-phosphate-isomerase
et de la
glucose-6-phosphate deshydrogé-
nase, restreindrait le
métabolisme du glucose en faveur de l'isomérisation
de l'UDP-glucose
en UDP-galactose. Ce
dernier, en retour,
stimulerait la
synthèse de l'acide linoléique des galactolipides.
En
rapport
avec la
préservation
des
structures membranaires,
le
calcium et
la cytokinine
auraient des
effets comparables.
Etudiant les
processus
de
maturation
des ovocytes
chez
l'étoile
de
mer, Dorée
et
Kishimoto [1980J rapportent l'importance du rôle joué par la l-meAde et ses
analogues structuraux
biologiquement actifs. Cette
honnone interagit avec
des récepteurs
spécifiques, localisés au
niveau de la
membrane plasmique
pour provoquer dans
le cytoplasme l'apparition du facteur inducteur (MFP).
Une
augmentation transitoire
de
la concentration
de
calcium libre
est
constatée à l'intérieur des ovocytes.
Quant
à savoir
si le
calcium joue
le rôle
de second
messager de
l 'hormone, entre
son impact membranaire
et l'apparition du
MFP cytoplas-
mique,
cela semble
peu
probable car
l'action
de la
l-meAde n'est
pas
empêchée par une microinjection intracellulaire d'EGTA.
D'autre
part le
calcium,
de même
que les
cytokinines, inhibe
la
synthèse
d'anthocyanes dans
certaines conditions.
La
prolifération des
tissus de feuilles chez le Chou "Chinese" est stimulée par le calcium aussi
bien que par la benzyladénine ou la kinétine [Ralph et al., 1976].
B.- ANALOGIES STRUCTURALES ET ACTIVITES
Les connaissances
actuelles acquises
sur les fonctions
des cytoki-
nines reposent
pour une part
importante sur l'utilisation
de cytokinines
synthétiques et de leurs analogues.
1. Les dérivés de l'adénine
L'activité cytokinine des produits naturels ou synthétiques est géné-
ralement
mesurée par
leur aptitude à
stimuler la
croissance cytokinine-
dépendante de cals
chez le Tabac ou ceux du
Soja, également dans d'autres
matériels biologiques
appropriés. Cette
stimulation est comparée
à celle
d'une cytôkinine
de référence,
comme la kinétine
ou l'isopentenyladénine

---

18
Analogues cytokinines/crGissance cellulaire
(Fig. 1,
page 19). Comme
il a été
fait mention dans
les paragraphes qui
précèdent, les
essais biologiques des
cytokinines sont variés
et ne sont
pas tous
adaptés, selon
que les
déterminations sont des
mesures quanti-
tatives
ou des
essais
de détection
et d'identification.
Pour ces
deux
derniers cas, les tests rapides seraient bien indiqués.
Il
est souhaitable que
l'évaluation des
activités-cytokinine rela-
tives des diverses subtances
soit fondée sur un essai biologique standard,
compte tenu
des différences
constatées d'un
type d'essai à
l'autre. Des
études comparatives des activités cytokinine de plusieurs séries de dérivés
de l'adénine et de leurs analogues, ont montré que leurs activités spécifi-
ques couvrent une large gamme de concentration, de huit ordres de grandeur,
c'est-à-dire de 10- 11 à 10- 3 M.
Chaîne latérale et position en N6
Les cytokinines
les plus actives comportent
une chaîne latérale qui
serait apparentée au groupe isopentenyl de l'i6-Ade, N6_(iJ 2-isopentenyl)-
adénine. Toute modification de la longueur de la chaîne latérale se traduit
par une
diminution importante de l'activité (environ
10 fois). La zéatine
6-(4,hydroxy-3,methyl-trans-2,butenylamino)purine
(t-io6Ade) est
la cyto-
kinine naturelle la plus
active potentiellement. La kinétine et la benzyl-
adénine (une cytokinine synthétique) comportent en position N6 une chaîne
latérale
avec un
cycle, respectivement furfuryle
ou benzyle.
Leur forte
activité cytokinine met bien en évidence l'importance de ces cycles.
Bien que la substitution ou
la saturation en rapport avec ces cycles
diminue l'activité, certains auteurs [Horgan et al., 1975; Kuraishi et al.,
1959J ont identifié la N6(hydroxybenzyl)adénine, l'un des constituants
impliqués dans la forte
activité cytokinine d'extraits de feuilles de Peu-
plier et la N6-(0-chlorobenzyl)adénine qui serait plus active que la bzlAde
dans le test de stimulation
de la division cellulaire des tissus foliaires
du Haricot.
Les uréido-purines
ont une activité cytokinine.
Elles présentent un
intérêt surtout à cause du groupement NH-CO-NH qui présente une analogie de
structure avec la diphenylurée
et ses dérivés. Ces structures présentent à
un
faible degré
une activité
de stimulation de
la croissance" [Bruce et
Zwar, 1956J. Leur intérêt est également dû à la présence de la N-(purine-6-
yI carbamoyl)thréonine, base adjacente à l 'anticodon de certains tRNA

---

Séverin AKE
19
O-c~
a
.
NH
\\N
H
6
Zéatine = io Adé
6
d' .
kinétine = N -furfuryla en~ne
k
N6_( 2-isopentenyl)adenine
Benzyladénine = bzlAdé
MOCH
H
2" /
C=C
CH /
'-CH
3
2
'"NH
ti>
N
HO
a}
HO OH
H
6 ( 2 .
1) d"
. 6
N -
-lsopenteny
a
HO
OH
enos~ne
l
Ad 0
6
Z23tine riboside = io Ado
Figure
1.- Formules structurales
de quelques
cytokinines, adénines
N6-substituées, dlaprès Laloue, [1980J.

---

'20
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
CIshikura et
al., 1969J. La
plus active d'entre les
uréidopurines est la
6,phenyl-uréidopurine qui a une activité
dix fois plus faible que celle de
la bz l Ade.
Noyau adénine et substitutions
Les cytokinines
naturelles peuvent se présenter
sous forme de ribo-
nucléosides
ou comme
des bases
libres. Dès lors,
la question
peut être
posée de
savoir si la composante riboside a une action favorisant l'acti-
vité.
6
L'analogue N -benzyl-amino,9-tetrahydrOpyranyl-purine (SD 8339) siest
montré moins actif que la bzlAde dans les essais biologiques avec le Tabac.
Fox et
al., [1971J rapportent que les
groupements 9-methylés sont rapide-
ment rnétabolisés.
En utilisant le
9-déaza,8-aza analogue de
la bzlAde et
ses dérivés méthylés et ribosylés, Hecht et al., [1971], ont montré qu'ils
avaient
une activité
cytokinine bien
définie,
quoique limitée;
d'où la
conclusion que la ribosylation de l'adénine n'est pas une condition requise
de l'activité cytokinine.
En ce
qui concerDÂ'--i~tè'grité de la structure de
l'adénine, plu-
sieurs travaux [Rog04,(ns,kâet al., '1"Q73
Hecht et al., 1975'; Sugiyama et
, .""
...
;.. \\
al., 1977],
Suggèrer~ ,~y_e ~~;~lg_..SUb'st}tut ion d'un atome de carbone ou d'un
quelconque des
atomé:s_ri:J~:.âZote d~)/D$yau purique, se traduit par une forte
décroissance
de
l'a~\\fi'v'ïté--CYto~i'nine des molécules. Toutefois, cette
acti vi té n' est j amai s a~î~l;e;;:~"\\"~\\':/
Certains
analogues sont
formés
par l'insertion
d'un noyau
benzyl
entre les noyaux pyrimidine et imidazole de i6Ade et de la bzlAde. Sprecker
et al.
[1976J, montrent que
malgré cette modification
drastique du noyau
adénine
en
un
noyau
tricyclique,
l'activité
cytokinine
n'est
pas
nécessairement perdue. Ces auteurs ont testé des séries de ces composés sur
des cultures de
tissus de Tabac. En comparaiSon avec
l 'i6Ade et la bzlAde
dont ils
sont issus, leur
activité est environ
100 fois plus
faible, en
terme de concentration minimale nécessaire.
Il ressort
donc de l'étude structurale,
en rapport avec l'activité,
que
les
molécules
cytokinine-actives
ne
possèdent
pas
une
propriété
structurale
ou
une réactivité
chimique
particulièrement responsable
de
leurs
activités
biologiques.
Il
apparaît
plutôt
que
les
propriétés
générales de ces molécules, leur taille, leur charge, et leur configuration

---

Séverin AKE
21
déterminent
leur
aptitude
a @tre
actives
dans un
système
biologique
sensible donné.
Une modification structurale
de la molécule peut affecter sévèrement
ou supprimer l'activité
biologique, mais l'effet résultant dlun changement
peut
@tre modifié
ou m@me contrebalancé
par des
changements structuraux
concomitants, dans
d'autres parties de
la molécule. Il ne
semble pas que
tel type de structure conditionne à elle seule l'activité cytokinine. C'est
finalement,
l'intégration
totale
des
propriétés
de
la
molécule
qui
détermine sa capacité a fonctionner comme une cytokinine.
1. Analogues antagonistes des cytokinines
Dans les
paragraphes précédents, nous faisions
allusion au fait que
les
modifications dans
le noyau
adénine entrainaient
une perte
plus ou
moins. grande de l'activité cytokinine. Toutefois, aucune n'était mentionnée
comme provoquant
une activité anticytokinine,
c'est-a-dire antagoniste de
l'effet des cytokinines.
Analogues de type pyrazolo[4,3-dJpyrimidine
Certaines
altérations
de la
portion
imidazole
du noyau
adénine,
combinées avec des modifications de la chaîne latérale en position N6 et
d~autres substitutions, notamment,
sur la position 9, ont permis d'aboutir
a des
molécules dont l'activité est antagoniste
de celle d'une cytokinine
[Skoog et
al., 1973; Hecht,
1978J. La première
anticytokinine effective,
fut
celle développée
par Hecht et
al., [1971J,
la 3-méthyl-7-(3-methyl-
butylamino) pyrazolo[4,3-dJpyrimidine.
Les pyrrolo,[2,3-dJpyrimidines
Dans
le but
de mieux
définir
les particularités
structurales qui
déterminent l'activité anticytokinine,
d'autres séries d'analogues ont été
synthétisés.
Les
plus actifs
sont les
2,methylthio-pyrrolo-7-deaza[2,3-dJ pyri-
midines, substituées en position
4, ou les analogues 7-déaza des 2,methyl-
thio-adénines, substituées en 6 [Skoog et al., (1975)J.
Une
comparaison avec
les pyrazolo[4,3-dJpyrimidines
qui présentent

---

22
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
d'ailleurs une
toxicité à
partir de 2 pM, montre que
les pyrrolo[2,3-dJ
pyrimidines présentent une
plus grande spécificité d'action en tant qu'an-
ticytokinine. Ces molécules inhibent la
croissance des cals de Tabac à des
concentrations supérieures à 20 fM sans manifester de toxicité évidente.
Dans des
essais d'organogénèse de
bourgeons sur des
cals de Tabac,
Skoog et
al., [1975J rapportent
que les anticytokinines
de type pyrrolo,
[2,3-dJ pyrimidines
présentent un effet
synergique en présence
de fortes
concentrations (20 ~M) de i6Ade. L'application
de 20 ~M i6Ade + O,OS à 6,6
uM de
l'antagoniste entraine la formation de
bourgeons. Au contraire, au-
cune différenciation
sous l'effet de l'anticytokinine
n'est observée dans
les témoins. Une conclusion possible qu'ils tirent de l'effet de dualité de
ces anticytokinines est que l'action des cytokinines dans la stimulation de
la croissance et dans la
formation de bourgeons s'exercerait sur des sites
différents.
~.
Autres structures douées d'activité\\cytokinine
D'autres molécules à
activité anticytokinine ont été testées. Celles
du
type
4-alkylamino-7-( ~-D-ribofuranosyl)pyrrolo[2,3-dJpyrimidines
[Iwamura
et al.,
1976J, inhibent
la
croissance des
cals de
Tabac mais
semblent être toxiques pour les tissus.
Citons également les
dérivés de la 4-aminopyrazolo,[3,4-d]pyrimidine
[Hecht et
al.·, 1975J
; leur action
inhibitrice serait générale,
mais ne
serait pas contrebalancée spécifiquement par les cytokinines.
Iwamura et al., [1975J ont synthétisé un analogue, la N-benzyl-N'-(4-
bromophényl)-urée.
Ce composé
exercerait une
inhibition
compétitive sur
l'activité de la bzlAde, et aussi sur les effets de la diphenylurée.
3. Phényl-Urées et dérivés du benzimidazole
Activités cytokinine des phenylurées et diphenylurées
Okamoto et al., [1972J étudièrent l'activité de certains hétérocycles
azotés,
qui n'ont
pas
de noyau
purique, mais
présentent toutefois
une
apparente analogie de structure chimique avec la bzAde ou la kinétine.
Ainsi,
les composés
tels
que le
S-benzylamino-2-méthyl-s-triazolo
[1,5-aJpyridine et le 4(7)-benzylamino benzimidazole, testés sur des cals

---

Séveri n AKE
23
HN~
N
~ N
Ho0
Série des 2-méthylthiopyrrolo(2.3-d)pyrimidines
~~substituéesou 2-méthylthio-7-déaza-adénine
OH OH
N"'-substituée.
Série des 7=ê-D-ribofuranosyl pyrrolo
(2.3-d)pyrimidines 4-substituées ou
~nzyltubercidine ou 7-déaza-adénosine
N -substituée.
/
HN~
Série des 3-méthylpyrazolo(4,3-d)pyrimidines
76substituées ou 8-aza-9-déaza-9-méthyladénine
N -substituée.
Série des 2-méthylpyrrolo(2.3-d)pyrimidines
46substituées ou 2-méthyl-7-déaza-adénine
N -substituée.
HN~
Série des 2-méthylthiopyrido(2,3-d)
pyrimidines 4-substituées.
Figure
2.-
Analogues structuraux
de
cytokinines
décrits dans
la
li ttérature
comme exerçant
une activité
anticytokinine,
d'après Laloue,
[1980J.
Pour chaque série, seul l'analogue le plus actif a été représenté.

---

24
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
de Tabac,
ont montré
une activité de
type cytokinine, bien
qu'elle soit
très faible (environ
1000 fois inférieure à celle de
la kinétine ou de la
bzlAde) .
En dehors
de ces
composés, des travaux
furent menés sur
les urées
substituées. Clest en 1956 que Steward
et Shantz ont démontré que la N,N'-
diphenyl-urée
avait une
activité stimulante
sur la
division cellulaire,
dans des cultures de tissus de carotte. Depuis lors, de nombreux dérivés de
l'urée ont été synthétisés
et testés dans des systèmes biologiques variés,
principalement
les cultures
de cals
de Tabac. Bruce
et Zwar
[1966J ont
testé environ
400 dérivés de l'urée.
Il ressort de ces
recherches que la
composante R-NH-CO-NH
(ou R peut être un phenyl
ou autre cycle, l'oxygène
pouvant
être substituée
par le soufre)
était importante
pour l'activité
biologique.
Bien
qu'environ
1000
fois
moins
active
que
l'i6Ade,
la
diphenylurée peut être utilisée
comme substituant des dérivés de l'adénine
pour assurer la croissance cytokinine-dépendante des cals de Tabac.
la diphenylurée
n'aurait aucune activité sur
la croissance des cals
de Soja
; son métabolite majeur, le
0- ~-D-glucoside [Burrows et leworthy
1976J ne semble
pas avoir une efficacité, ce qui
a suggéré à certains au-
teurs que la diphenyl-urée serait très vite métabolisée avant d'être effec-
tive. Burrows
[1976J a examiné
la possibilité que
la diphenylurée puisse
6
réagir
dans les
tissus avec l'adénine
pour former
la N -(phenyl )adénine
6
et/ou
la N -(Phenyl)-uréidopurine, deux
cytokinines assez
faibles, selon
l 'hypothèse formulée par Mc Donald
et al., 1971J. Burrows n'a pas obtenu de
résultat positif. Cette possibilité de réaction avec l'adénine, présente un
certain
intérêt si
l'on veut
faire une
comparaison avec
la 6-thréonyl-
carbamoylpurine. En effet,
ce nucléotide modifié de l'adénine existe natu-
rellement,
adjacent
à
l'extrémité-3'
de
l'anticodon de
certains
tARN
correspondant aux codons dont la première base est A.
Bien
que la
6-threonyl-uréidopurine soit
inactive dans
des essais
chez
le Tabac,
certains auteurs
[Skoog et
Schmitz, 1979J
suggèrent que
l'activité de
stimulation de la croissance des
dérivés de l'urée pourrait
être
dûe à
une exigence
du noyau cyclique
de l'adénine.
Toutefois, les
analogues,
6-benzoylamine et
6-furfuroyl-aminopurines n'ont
pratiquement
pas d'activité cytokinine.

---

Séverin AKE
25
Les N-phenyl-N ' (4-pyridyl)urées (Fig. 3, page 26)
Devant
cette
interrogation suscitée
par
les
relations entre
les
dérivés de l'urée et ceux des adénine N6-substituées, Isogai et al. [1980J,
firent plusieurs essais sur des cals de Tabac: ils conclurent que la DPU a
effectivement une activité de type cytokinine.
Prenant en
compte la structure de ces
diphenyl-urées, Isogai et al.
[1976J, synthétisèrent un
analogue de la bzlAde et de
la kinétine dont la
structure cyclique ne comporte pas de composante pyrimidique: la N,benzyl-
imidazole-4-carboxamiqe,
et des dérivés
d'amides aromatiques.
Seules les
formes anilides intermédiaires
dans les voies de synthèse, en l'occurrence
l 'imidazole carbo-anilide et l'acide isonicotinique (INA) montraient effec-
tivement une faible activité cytokinine.
Les résultats
ont permis
à Shudo et
al. [1980J, de
synthétiser un
composé dont la formule appartient à la fois aux urées aromatiques comme la
diphénylurée, et est un analogue de l'INA. Testés sur des cals de Tabac, la
N-phenyl-N'-(4-Pyridyl)urée (4PU), présente
une forte activité de stimula-
tion de la croissance.
LI introduction d'un atome de chlore en position -2 du pyridyl [Isogai
et
al., 1980J
permit
d'aboutir au
composé
de type
N-phenyl-N'(2,CI-4,
pyridyl)urée (4PU-30)
qui s'est montré très actif lui
aussi, dans la sti-
mulation de la croissance des cals de Tabac.
En marge
des structures de
type pyridyl-urées, Lee
et Chen [1982J,
étudiant les
mécanismes de tolérance à l'ozone,
montrèrent que le composé
N,[2-(2-oxo-1-imidazolidinyl)ethyIJ-N ' ,phenyl-urée (EDU)
possède une acti-
vité de
type cytokinine sur la sénescence
et la prolifération cellulaire.
Sur le
plan structural, ce composé comporte une
partie phenyl-urée et une
autre imidazole.
Ces deux structures
confèrent à l'EDU
des ressemblances
d'une part avec la kinétine et d'autre part avec le benzimidazole.
Benzimidazole et ses dérivés
Le benzimidazole
est
le composé
à partir duquel
sont synthétisés
toute une série de dérivés (Figure
4, page 27), dans lesquels sa structure
est conservée. Bien que le benzimidazole en lui-même n'ait pas été mention-
né
à notre
connaissance, comme ayant
des propriétés
fungitoxiques, cela
n'est pas le cas de ses dérivés. Nombreux sont ceux qui ont des usages

---

26
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
a - Diphenyl urée',
~ N- (4-pyridyl)-N'-phenyl urée
N- 2,Chloro-(4-pyridyl)~N'-phenyl
urée,
C
Cl
cJ - Thidiazuron (N-phenyl-N'-J,2,3-Thiadiazol-S-yl urée),
~ - [DU N-(2-(2-oxo-J-imidazolidimvl)ethyl)N'
Figure 3. Fonnules
structurales de quelques urées substituées douées
d'activité cytokinine, d'après Isogai et
al, [1981J: formules a, b, c, Mok
et.al. [1982J: fonnule d, Lee et Chen [1982J: fonnule e.

---

Séverin AKE
27
Benzimidazole
Methyl-I-butylcarbamoyl-2-benzimidazole (benomyl)
Methyl benzimidazol-2yl-carbamate
(Nethyl
5-(2-thienylcarbonyl)-benzimidazol-2-yl carbamate (nocodazole)
5,6-dicloro-I~-D-ribofuranosylbenzimidazole(DRB)
Figure 4. Formules structurales de quelques dérivés du benzimidazole.

---

28
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
phytopathologiques et
agronomiques comme fungicides,
acaricides, herbici-
des.
Il n'entre
pas dans
le
cadre de
notre travail
de développer
ces
propriétés.
Un des dérivés qui revient
le plus souvent dans les analyses biblio-
graphiques, en
rapport avec l'activité cytokinine
est le (methyl benzimi-
dazol-2-yl-carbamate (MBC)
qui serait le principe
fongicide essentiel des
fongicides dérivés du benzimidazole [Davidse, 1973J.
Activités de type cytokinine du benzimidazole et de ses dérivés.
Une autre propriété
importante du benzimidazole et d'un grand nombre
d'entre ses
dérivés, réside en
leurs effets physiologiques
de type cyto-
kinine, exercés chez les plantes.
En effet,
le benzimidazole, le
benomyl (Fig. 4, page
27)J, le MBC,
ont
un
effet
d'antisénescence [Samborky
et
al.,
1958; William,
1975;
Tripathi et
al., 1980J. En association avec
les gibberellines, ils lèvent
la
dormance [Thomas,
1974J.
Ils agissent
positivement dans
le test
de
synthès'e des beta-cyanines chez Amaranthus [Kahler'et Conrad, 1968J.
Etudiant l'effet antisénescent exercé
par le MBC sur les feuilles de
Choux (Brassica oleacera
var. capitata alba), Tripathi et Schlosser [1977J
rapportent son effet sur la rétention de la chlorophylle, des prot~ines, et
le fait qu'il stabiliserait
les structures membranaires. Le MBC est égale-
ment actif
comme une substance antisénescente dans
les cultures de proto-
plastes chez les
Dicotylédones comme chez l'es Monocotylédones [Tripathi et
Sc h10sser, 1977 J•
La formation
auxine-dépendante des racines adventives
au niveau des
pétioles chez le Chou, est inhibée par le MBC. L'inhibition serait maximale
à 3 jours puis diminuerait.
A partir
de tissus secondaires
de racines de
Carotte, cultivées en
milieu synthétique
contenant une auxine,
la croissance de cals
a pu être
obtenue avec
le MBC (jusqu'à
520 ~M), comme
avec le benzimidazole
ou la
kinétine [Tripathi et Sant Ram, 1982J. Des essais d'organogénèse de tige ou
de racine
à partir de ces
cals ont montré que le
carbendazim (MBC) et le
benzimidazole se sont montré plus organogènes que la kinétine.
Les mécanismes d'action ne sont pas encore élucidés. Le MBC exerce-t-
il son action
sur la division cellulaire en tant
que molécule entière
ou
par sa
conversion en benzimidazole?
Le BI,
bien qu'étant le composé-mère

---

Séverin AKE
29
pourrait provenir
également des
produits de
dégradation du MBC,
in vivo
[Meyer
et al.,
1974J.
Dans le
cadre
de la
premrere
hypothèse le
MBC
pourrait donner
un nucléotide dérivé
; dans le
second cas le
MBC serait
transformé
en
BI qui
pourrait
être la
base
d'un dérivé
nucléotidique
[Sehgal et al., 1976J.
Cas
du
5,6,dichloro- ~-D-ribofuranosyl
benzimidazole
(ORB)
Le ORB est un nucléoside
analogue du benzimidazole qui a surtout été
expérimenté dans les
systèmes animaux: insectes [Egyhazi, 1976J, mammifè-
res
[Kapoor et
Waygood, 1965J.
Clest une
substance antivirale
ayant un
effet inhibiteur sur la synthèse des RNA (hnRNA).
Le mode d'action de cette inhibition n1est pas bien élucidé; serait-
ce par blocage de
l'initiation [Egyhazi, 1976J, ou par terminaison précoce
des chaînes naissantes ? Cette seconde hypothèse repose sur des expériences
effectuées
avec des
cellules
IIHela ll infectées
par l'Adenovirus
[Skene,
1972J ou le virus SV-40 [Laub et al., 1980J, et également sur des essais de
transcription du gène de la ~-globine chez la souris.
Egyhazi et al.,
[1981] ont essayé de préciser l'effet
du ORB sur la
transcription des hnRNA dans les cellules de Chironomus tentans. Les résul-
tats ne
semblent pas être
en faveur d'une action
par terminaison précoce
des chaînes naissantes.
Le ORB (et le
ORB-triphosphate dans une proportion moindre), ont été
mentionnés également
comme inhibiteurs de la RNA
Polymerase II [Dreyer et
Hausen, 1978J dans des systèmes in
vitro. Mais, in vivo, le ORB a un effet
qui est rapidement réversible.
C - MODE D'ACTION DES CYTOKININES
1) L'incorporation dans les RNA
Les cytokinines d'origine
exogène peuvent être métabolisées jusqu'au
stade
leurs nucléotides
monophosphates
et dégradés
avec
perte de
leur
groupement N6_su bstituant,
et de
leur activité. Ses
résultats ressortent
des études sur le métabolisme in vivo de la [8- 14CJbenzyladénine, dans des
disques foliaires de Xanthium [Mc Calla
et al., 1962J, ce qui a suggéré le

---

30
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
fait de leur incorporation dans les acides nucléiques.
Des études
détaillées (Hall et al., 1967J, font
état de la possibi-
lité
d'un
contrôle
de la
synthèse
des
protéines
par les
cytokinines
intégrées dans
les tRNA. Ces
nucléotides hypermodifiés sont
localisés en
une position adjacente à 1lextrémité 3' de llanticodon.
Les cytokinines exogènes
sont aussi incorporées dans les autres RNA.
Le fait ressort de nombreux travaux récents utilisant la bzlAde ou l'i6Ade.
Bien
que la
synthèse par
le transfert du
groupement isopentenyle sur un
résidu adénosine
approprié d'un tRNA ait été montré
[Kline et al., 1969J,
les molécules
de cytokinine en
tant que telles sont
incorporées dans les
RNA
[Jouanneau et
al., [1984J,
Teyssendier
de la
Serve et
al., [1984J
montrèrent avec
des suspensions cellulaires
de Tabac cytokinine-dépendan-
tes,
que la
bzlAde
et l'isopentenyl-adénine
sont
incorporées de
façon
covalente dans
les RNA. La signification de
cette incorporation nlest pas
encore clairement établie.
2. Sites d'action
L'évidence d'une fixation spécifique des molécules de cytokinine à un
composant protéique des ribosomes a été montré notamment par les travaux de
Davies et Cocking [1967J
dans 1'étude de 1'effet antisénescent des cytoki-
nines sur
des disques
foliaires de
Xanthium. Il revient
à Fox
et Erion
[1980J d'avoir
précisé 1lexistence de deux types de
sites de fixation des
cytokinines sur
des ribosomes de
germes de Blé.
Un des sites
serait une
protéine à haute affinité
isolée et purifiée, la protéine soluble (CBF-1).
La fixation
apparaît être spécifique aux cytokinines
de formule
adénine-
N6-substituées. Toutefois, la fixation de la zéatine ne serait pas assurée
par
cette
protéine. Dans
aucun
cas,
il nly
a
de preuves
concluantes
montrant les rapports
de cès sites de fixation sur
les ribosomes avec les
différentes activités biologiques des cytokinines.
Une autre
protéine réceptrice des cytokinines,
de poids moléculaire
différent de
celui de
Fox et
Erion [1980J a
été isolée par
Takegami et
Yoshida [1977J. Mais sa faible affinité (Kd = 4.10- 5 M) fait douter de
son rôle
biologique de récepteur des
cytokinines. D'autres récepteurs ont
pu être
solubilisés par les
équipes de Fox [1978-1980J,
Sussman et Kende
[1978J. Chen et
al., [1980J ont isolé récemment une
protéine à très forte
affinité (~d = 9. 10-7 M) pour les cytokinines.

---

Séverin AKE
31
3. CONCLUSION
Ces
quelques
points
essentiels
sur
l'activité
des
cytokinines
montrent leur large spectre d'action.
La détermination des
évènements biochimiques primaires contrôlés par
les cytokinines demeure une préoccupation majeure. Les études de ses effets
biologiques au
niveau moléculaire indiquent
leur intervention qualitative
dans la synthèse protéique. Les investigations sur leur spécificité et leur
signification biologique doit
prendre en compte une meilleure connaissance
des réponses physiologiques elles-mêmes.
Dans l'étude de
ces réponses, les inhibiteurs spécifiques de l'acti-
vité des
cytokinines seront utiles,
entre autres, pour
tester les inter-
actions possibles entre les cytokinines et les sites qui seraient impliqués
dans l'expression de leur activité.
Les cytokinines
synthétiques et leurs divers
analogues ont beaucoup
contribué à l'acquisition
des connaissances sur leurs fonctions. Parmi ces
analogues structuraux, les
relations structure-activité entre les adénines
substituées en N6, les uréides et certains dérivés du benzimidazole ne sont
pas élucidées.
Une comparaison
des effets physiologiques dans
divers systèmes sen-
sibles
et
des
études par
approches
métaboliques
peuvent apporter
des
éléments de compréhension de leurs modes d'action.
Le travail
présenté dans ce mémoire constitue
une étude de quelques
analogues structuraux
de cytokinines. En rapport
avec l'aspect "structure
moléculaire" des composés chimiques utilisés et leurs activités, nous avons
distingué deux parties essentielles:
- La
première constitue une étude
de deux dérivés de
formule: (4-
pyridyl) phenyl-urées, le 4-PU et le 4-PU-30.
- La
seconde partie a trait à un
analoqgue dérivé du benzimidazole,
le 5,6,Dichloro ~-D-ribofuranosyl-benzimidazole (ORB).
Pour réaliser
nos expériences, nous
avons utilisé une
technique de
culture in vitro
de cellules végétales. Le matériel biologique auquel nous
nous sommes
adressé, présente
certaines particularités essentielles
; il
nous a
paru important
de préciser
les caractéristiques et
les modalités
d'utilisation de ce système.

---

---

Séverin AKE
33
CHAPITRE II
MAT E RI EL
BIO LOG 1 QUE
ET
METHODES
A.
MATERIEL BIOLOGIQUE
Le
matériel
biologique
utilisé
est
une
lignée
cellulaire
de
parenchyme
médullaire de
Tabac
(Nicotiana tabacum,
var. Wisconsin
38).
Cette lignée
19 a été
clônée par Jouanneau
et Tandeau de
Marsac [1969J.
Elle
est
sensible
aux cytokinines
exogènes
pour
la
croissance et
la
maturation du système plastidial. Le tableau II en donne la filiation.
TABLEAU II ORIGINE ET FILIATION DE LA LIGNEE CELLULAIRE 19
[Jouanneau. 1973)
ANNEE D'ISOLEME~~
1965
1966
1969
----------4.~
LIGNEE. . . . . . . . . . • . .• C
II ----....,...1
:~~--
~21
ORIGINE ....•.....• , .~1oelle de tabac
Mise en milieu
Sélection par
(W 38)
liquide à partir
clônage des
des cals de la
cellules isolées
lignée C
de la 1 ign~e II
B.
EXIGENCE EN CYTOKININE EXOGENE DE LA LIGNEE 19
1.- Stimulation de la croissance et de la chlorophyllogénèse
Au cours d'expériences
effectuées par Jouanneau et Tandeau de Marsac
[1972 bJ et ensuite par Laloue et al~, [1977J avec les suspensions de cette

---

34
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
lignée 19,
il a
été observé que
la sensibilité aux
cytokinines exogènes
pour
la croissance
demeure. Celle-ci
dépend
des conditions
de culture,
comme il
est indiqué
page 38
et fig. 6,
page 40. La
différenciation du
système chloroplastique des cellules de la lignée cellulaire 19 est soumise
a la même régulation [Axelos et Péaud-Leno~l, 1984J.
C - CULTURES ET METHODES
1.-Cultures de cals en milieu solide
Nos expérimentations
n'ont pas été effectuées
avec cette technique.
Toutefois,
elle a été utilisée
pour l'entretien
indéfini des
tissus de
diverses lignées cellulaires. En
milieu gélosé, la lignée 19 est maintenue
en croissance sous la forme de cals. Le milieu de culture utilisé est celui
de Murashige
et Skoog [1962J, légèrement
modifié. L'hydrolysat de caséine
est remplacé par la L-glutamine
(200 mg/l) et la concentration en thiamine
est portée a 0,4 mg/l [Linsmaier et Skoog, 1965J. Le tableau III page 35 et
36 donne la composition du
milieu permettant une croissance rapide de tis-
sus friables.
2.-Culture des suspensions cellulaires
Les mesures de sensibilité aux cytokinines ont été effectuées sur des
suspensions liquides
agitées et pas
sur des cultures de
tissus en milieu
gélosé. En effet, les cellules en suspension sont toutes en contact avec le
milieu, ce qui leur
permet d'avoir une meilleur accessibilité aux facteurs
hormonaux, aux autres constituants du milieu de culture et même aux paramè-
tres physiques de llenvironnement immédiat.
Milieu de culture liquide
Milieu de base
Le milieu
de base liquide dérive également de
celui de Murashige et
Skoog [1962J.
Sa composition est décrite
dans le tableau IV
page 37. Les
modifications apportées suivant Joua~neau [1973J, ont consisté en une

---

.Séverin
35
,,~;
J
AKE
TABLEAU 111.- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE GELOSES
[Murashige et Skoog, 1962J
SELS 111NERAUX
Solutions stock
Macro-éléments
mg/l
Sol. A
g/l
NH N0
1650
16,5
4
3
ICN0
1900
19,0
3
CaCi
2R -0
440
4,4
2
2
MgS0 4 7H °
370
3,7
2
P04
170
1,7
KH2
FeS0
7H O
27,8
4
2
NaZEDTA
34,3
Hicro-éléments
mg/l
Sol. B
g/l
MnS0
4H O
22,3
22,3
4
2
ZnS0
7H O
8,6
8,6
4
2
R B0
6,2
6,2
3
3
KI
0,83
0,83
Na M0
2H O
0,25
0,25
2
4
2
CUS0
5H O
0,025
0,025
4
2
CoC1
6H O
0,025
0,025
2
Z
Sol. C
g/l
FeS0
7H O
2,78
4
2
NaZEDTA
3,43

---

36
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
TABLEAU III, suite.- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE GELOSES
[Murashige et Skoog, 1962J
CONSTITUANTS ORGANIQUES
mg/l
Solutions stock g/1
Sol. D
Méso-inositol
100
10
Glycine
2
0,2
Sol. E
Acide nicotinique(HCL)
0,5
0,5
pyridoxine (HCL)
0,5
0,5
Sol. F
Thiamine (HCL)
0,4
0, 1
L-Glutamine
200
.Saccharose
30g/l
_Bacto agar
10g/1
SUBSTANCES DE CROISSANCE
2,4 D
0,37 flM
Kinétine
0,5
pM
- - - - 0 - - - -
Les milieux sont réalisés à partir de solutions-mères,par dilution
dans un litre:
stock A:IOOml ; stock B:lml ; stock C:IOml
stock D:IOml
s~ock E:lml ; stock F:4ml .Le pH de la solution est
ajusté à 5,7 avec KOR 0,1 N.
H 0 bidistillée:
q.s.p.f.
1000 ml.
2

---

Séverin AKE
37
TABLEAU IV.- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE LIQUIDES
[ Jouanneau, 1973J
SELS MINERAUX
Solutions stock
Mac.ro-éléments
mg/l
Sol. At
g/l
KN0
6550
65,5
3
CaC1 2H 0
440
4,4
2
2
MgS0
7H 0
440
4,4
4
2
-lΠP0
170
1, 7
2
4
FeS0
7H 0
278,5
4
2
Na EDTA
372,5
2
Micro-éléments'(idem tableau III)
Sol. B(idem tableau III)
Sol. C
FeSO~ 7H 0
2,78
2
Na EDTA
3,72
2
CONSTITUANTS ORGANIQUES
Méso-inositol + glycine
solutions stock :
Acide nicotinique + pyridoxine
(idem tableau III)
Thiamine
Hydrolysat de caséine
100 mg/l
Saccharose
6,84g/1
SUBSTANCES DE CROISSANCE
2,4 D
(lignée 19)
Kinétine
PREPARATION DU MILIEU
Milieu minéral :
30 ml stock At
0,3 ml stock B (tableau III)
2 ml stock C
"
ajuster à 800 ml à pH 5,7 (KOH 0,1 N)
Vitamines
la ml stock D (tab. III)
4 ml stock thiamine
1 ml"
(ac.nicotinique + pyridoxine)
100 mg hydrolysat de caséine
ajuster à 100 ml à pH 5,7 •
Saccharose
6,84 g sacch. + 1ml tampon phosphate
0,1 M pH 7 •
q.s.p.f.
1000 ml •

---

38
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
une dilution
de la solution saline
et du saccharose;
l'azote minéral du
milieu n'est
plus fourni sous forme de nitrate
d'ammonium mais de nitrate
de potassium.
Ce milieu se
caractérise également par sa
faible teneur en
ions phosphate, à cause de la
sensibilité des cellules de Tabac aux fortes
concentrations de ces ions, [Murashige
et Skoog, 1962J.
Les cul tures sont
agitées
et aérées
par translation
circulaire
horizontale sur
un "Plan
Schister"
(Agitateur horizontal,
Biolafitte, type
AS 850).
La fréquence
d'agitation est de 96 révolutions par minute. La température de la salle de
culture est de 26°C ± 1°C et l'éclairement de 2000 Lux est assuré par des
tubes fluorescents (Philips,"blanc Super").
Facteurs de croissance
Les facteurs
de croissance utilisés comprennent
une auxine, l'acide
2,4 dichlorophenoxy-acétique
et une
cytokinine de synthèse,
la kinétine.
Les
concentrations optimales
pour la
lignée 19
sont celles
données par
Jouanneau,
[1973] (voir
tableau IV, page
37). Ces
conditions permettent
d'avoir
une bonne
dissociation cellulaire, une
croissance rapide
et une
culture infinie
des cellules. Le facteur auxinique
est toujours ajouté au
milieu de culture; la kinétine est utilisée dans les milieux témoins.
Cultures d'entretien
Initiation des Suspensions
Il est
possible d'obtenir des suspensions
cellulaires, à partir des
cals maintenus en milieu gélosé, par
la mise en dissociation de 1 à 2 g de
tissu âgé
de 3 à 4 semaines. Un
volume de 100 ml de milieu
liquide est
ainsi ensemencé.
Au bout d'une période
de culture de 14
jours (1 cycle),
une suspension
cellulaire est obtenue, qui
sera repiquée en concentration
appropriée, après
élimination des gros massifs
cellulaires par filtration
sur tamis de nylon de 2 mm
environ de vide de maille. Après deux passages,
on obtient
des suspensions
cellulaires homogènes, en
quantité suffisante
pour les besoins de l'expérimentation.
Toutefois,
une initiation
des suspensions
cellulaires à
partir de
cals n'a
pas été systématiquement effectuée
à chaque expérimentation: les
suspensions
cellulaires
ont
pu
être
entretenues indéfiniment
par
des

---

Séverin AKE
39
repiquages périodiques comme il va être décrit.
Repiquages
Les suspensions cellulaires
sont entretenues par repiquage après une
période de 14 jours. Un volume convenable (35 ml) d'inoculum d'une culture-
mère en
phase stationnaire de
croissance est adjoint
a 350 ml
de milieu
d'entretien. Les
milieux d'entretien des cellules
contiennent une concen-
tration en kinétine 0,10 a
0, 15 ~M, soit 3 à 4 fois plus faible que celle
qui entraîne la croissance optimale.
Ambiance de culture
La culture des
suspensions s'est effectuée soit dans des erlenmeyers
de 1000 ml
(cultures d'entretien), soit
dans des erlens
de volume 500 ml
(essais des analogues), sur l'agitateur horizontal déjà décrit.
3. Techniques des cultures expérimentales
Contrôle de la suspension cellulaire
En vue d'obtenir une
suspension-mère (pied de cuve) fine et homogène
pour inoculer
les différents milieux expérimentaux
nous avons utilisé une
technique de sélection des massifs cellulaires de petite taille «
a 335 ~)
par calibrage
sur tamis de nylon. Le protocole
expérimental est donné sur
le
tableau V,
page 40.
L'appareillage
de filtration
(fig. 5,
page 42)
permet d'aboutir à cette fin.
Milieux de culture
Les milieux
de culture
ont été
préparés comme suit
à
partir de
solutions stocks de sels
minéraux, de vitamines, de saccharose en présence
de tampon phosphate 0,1 MpH
7,0; des dilutions appropriées ont été effec-
tuées séparément, à
pH 5,7 et réparties en aliquots.
Le mélange final des
aliquots est effectué après stérilisation par autoclavage a 120°C.

---

40
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
TABLEAU V
TABLEAU VI.
Protocole de sélection
Protocole de lavage
de massifs cellulaires de taille·
et d'incubation des cellules
limitée
Suspension cellulaire en début
Suspension cellulaire-mère
de phase stationnaire de
en phase stationnaire de croissance.
croissance
Volume = 400ml
~Les'massifs
Volume = 400ml
à)335 p sont éliminé-s
Filtration sur tamis de nylon
Filtration sur tamis de nylon
(335 p de vide de maille)
(50~)
+(950 x 3)ml milieu minéral
Rinçage avec du milieu minéral
Tamisage des massifs 335~
350ml (1)
t
~ Milieu usagé
Massifs 335 p retenus
sur filtre (50 p)
Re-suspension dans 2 volumes
t
de milieu( 1)
Re-suspension des cellules dans
un volume approprié de milieu
Incubation 2 à 3 heures
complet.
lLM_~_'
l Filtration sur tamis de nylon(50p)
s_e_e_n_c_u_l__
tu_r__
e
Rinçage avec (1)
~Milieu d'incubation
et de rinçage
Re-suspension dans un volume
approprié Cl)
Aliquote:mesure de la
densité cellulaire
Aliquotes pour inoculation des
mi lieux-tes ts •
(1) Milieu minéral (voir tableau IV )

---

Séverin AKE
41
Préparation des différents analogues structuraux
La kinétine
et le 2,4D
utilisés ont été
recristallisés une seconde
fois au
laboratoire. Les solutions-mères sont
préparées comme habituelle-
ment. Pour
une solution-mère de 250 fM, une quantité appropriée de soluté
est neutralisé
par 0,5 ml à 1 ml,
respectivement, de-HCI ou
KOH 0,1 N et
amené à 100 ml de volume final.
Les analogues
structuraux essayés, c'est-à-dire les
uréides, 4PU et
4PU-30 et,
d'autre part,
le DRB
ont été dissous
de la façon
suivante:
environ 7 mg de substance sont dissous dans 1 ml d'éthanol + 0,5 ml HCI 0,1
N, pour un volume final de
100 ml HZO. Les solutions-mères ainsi préparées
sont stérilisées par autoclavage puis diluées dans le milieu de culture.
Suspensions cellulaires pour l'ensemencement des milieux
expérimentaux.
L'expression de
la sensibilité des cellules
à la cytokinine, dépend
des conditions de cultures des suspensions-mères d'entretien, et d'ensemen-
cement. Pour avoir une meilleure sensibilité des suspensions cellulaires en
vue des essais sur les analogues de cytokinine, celles-ci ont été préparées
selon les modalités indiquées sur la figure 6 81, page 43.
Les
cellules subissent
un lavage
aseptique
en vue
d'éliminer les
cytokinines résiduelles,
de manière à avoir
une meilleure sensibilité aux
cytokinines exogènes.
Dans
certains cas,
les suspensions cellulaires
du même
clône sont
soit ensemencées
sans rinçage
(Fig. 6 B2,
p. 43), soit
les suspensions-
mères subisssent deux cycles de
culture en milieu de base, sans cytokinine
(Fig. 6 A), avant d'être ensemencées sans lavage, dans les milieux étudiés.
Ces dernières conditions
d'ensemencement sont réalisées en vue d'ob-
tenir des suspensions expérimentales peu sensibles aux cytokinines exogènes
pour la
multiplication cellulaire. Par cette
méthode, l'addition de cyto-
kinine se perçoit surtout comme stimulant la chlorophyllogénèse.
Les milieux
expérimentaux ont été
placés dans des
fioles d' Erlen-
meyer de 500 ml, à raison
de 200 ml de milieu de culture/flacon. Le milieu
peut être constitué selon l'expérimentation par :
- du milieu de base: 2,4 D comme seul facteur de croissance
- du milieu de base auquel la kinétine est ajoutée;

---

42
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
FIGURE 5.- Dispositif de filtration pour la sélection de massifs
cellulaires de taille réduite

---

.'J'
,
"
Séveri n AKE
43
1cycle de
culture
14 jours
t
10 jours
Ensemencement
t
14 jours
Kn
la jours
®
Protocole de lavage
Ensemencement
(tableau V)
sans lavage.
t
Ensemencement
FIGURE 6.- Méthodes de culture des suspensions-mères en relation avec
l'expression de la sensibilit€
aux cytokinines
(M. Axelos, communication personnelle)
A.- Suspension-mère K2-02: deux cycles en milieu de base (02) et deux
cycles en milieu contenant de la kinétine
B.- Suspension mère Kn : Cultures entretenues continuellement en
présence de kinétine excçène

---

44
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
- le milieu de base comportant un analogue, 4PU, 4PU-30, ou ORB
- la Kinétine et le ORB qui sont ajoutés au milieu de base.
4. Méthodes de mesure
Mesures de la croissance cellulaire
Pour effectuer
les mesures, chaque erlenmeyer
de culture est échan-
tillonné une seule fois dans le but d'éviter des perturbations de la crois-
sance, consécutives à des prélèvements répétés dans la même culture.
Pour mesurer la masse de matière fraîche, les suspensions cellulaires
sont collectées
sur un
entonnoir de verre
fritté (porosité 1)
de volume
approprié pour contenir toute une culture. Les cellules sont rincées avec 4
volumes d'une
solution minérale isotonique
(20 mM KCl
+ 5 mM
EDTA). Une
trompe à vide
est utilisée pour assurer un meilleur
essorage. La masse de
matière fraîche est déterminée
par la différence des masses de l'entonnoir
avant et après l 'opération.
La masse de matière sêche
est obtenue après séchage d'un aliquot des
cellules fraîches, à l'étuve à 60°C pendant trois jours.
Numération cellulaire
Malgré la bonne dissociation des suspensions cellulaires de la lignée
19, il est difficile
toutefois de faire une numération cellulaire directe-
ment sur hématimètre.
Les suspensions étant constituées de nombreux petits
massifs cellulaires
de taille inférieure
à 235 ~ (figure
7, page 46-47),
nous avons utilisé la technique décrite par Henshaw et al., [1966J. Un ali-
quot de la suspension cellulaire (10 ml) est dilué deux fois avec une solu-
tion d'oxyde
chromique. Après environ 12 h à
la température ambiante, les
cellules sont diluées puis comptées sur une cellule de Nageotte.
Dosage des chlorophylles
L'extraction des
chlorophylles est
faite sur
un aliquot de
1 9 de
matière fraîche dans de l'acétone à 80 % à aoc, dans l'obscurité. Après
broyage dans un homogénéiseur de Potter, l'extrait acétonique est centrifu-
gé pendant 10 mn à 8500xg ; l'absorption est mesurée à 649 nm et 605 nm. Un

---

Séverin AKE
45
spectre dans
le visible (400 -
700 nm) est tracé.
Les teneurs en chloro-
phylles sont données par la formule de VERNON [1960J:
chI a = 11,63 (0.0 665 nm) - 2,39 (0.0 649 nm)
chI b = 20,11 (0.0 649 nm) - 5,18 (0.0 665 nm).
Nous donnerons les teneurs soit en ~g/gMF ou en ~g/ml de suspension.
Significativité des expériences
Au cours
des expériences Qui suivent on remarquera
Que nous ne pré-
sentons qu'une
seule expérience sur
chaque document. En
réalité, il faut
tenir
compte du
fait que
chaque flacon de
culture n'est
employé qu'une
seule fois
pour identifier un point expérimental.
Ces expériences ont été
répétées au
moins deux fois;
celà ne suffit
pas pour fournir
une valeur
statistique. D'autre
part la durée de
la période de latence
de la crois-
sance,
avant le
début de
l'évolution comparée
des cellules
peut varier
sensiblement suivant
l'état des
cellules ensemencées. Par
conséquent, il
n'y a pas avantage à
calculer des moyennes. Cependant la position relative
des courbes cinétiques reste
la même au cours d'expériences successives et
nous pensons que nos conclusions restent valables.

---

46
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
Figure 7 A.- Cultures en Milieu liquide de cellules de Tabac
(N. tabacum. lignée 19);
à droite sur la photo, culture en début de verdissement
en présence de kinétine;
à gauche, culture de même age en l 'absence de cytokinine
Figure 7 B.- Microphotographie en contraste de phase de Quelques
massifs cellulaires d'une culture en phase stationnnaire de
croissance.
La préparation est faite dans une microchambre à lamelle et
solidifiée par de l'agarose à 2%.

---

Séverin AKE
47

---

---

Séverin AKE
49
CHAPITRE III
CROISSANCE ET CHLOROPHYLLOGENESE CYTOKININE-DEPENDANTE DE LA LIGNEE 19
A.- RESULTATS
1) Effet de dose
Les figures 8 et 9, pages 52 et 53
sont des exemples de cinétiques
de croissance et de chlorophyllogénèse, selon la concentration en kinétine.
Comme cela est observé a propos de la majorité des réponses biologiques aux
cytokinines, il
existe une gamme
de concentrations définies (0,1
a 1 ~M)
qui produisent
des réponses
biologiques. Les suspensions
cellulaires que
nous avons ensemencées a raison de
5 a 7,5 g MF/l expriment une bonne sen-
sibilité aux cytokinines.
La concentration optimale trouvée pour la crois-
sance et la chlorophyllogènese est d'environ 0,3 pM en kinétine.
Les courbes A et B, (fig. 8), ainsi que
celle de la figure 9, indi-
quent que 1Ion peut établir une relation linéaire positive entre le logari-
thme de
la concentration en
kinétine et la
matière fraîche ainsi
que la
teneur en chlorophylles,
produites. Dans nos expériences, cette proportio-
nalité s'observe
entre la concentration la plus faible
active (0, 1 ~M) et
la concentration optimale (0,3 pM) de kinétine.
A partir de
0,5 pM en
kinétine, les
effets biologiques
observés
commencent a être réduits et la
gamme de concentration supérieure
a 1 ~M
est léthale.
2) Evolution Cinétique des Cultures
La
figure 10,
page 54,
montre les cinétiques
de croissance
et de
chlorophyllogénèse des cellules de
la lignée 19. Les conditions de culture
sont spécifiées dans la légende.
-. Croissance
Les courbes représentatives
de l'évolution de la masse cellulaire et

---

50
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
du nombre de cellules (MF, MS,
N), ont une même pente. On note l'existence
d'une phase exponentielle de croissance jusqu'à
environ 9 à 10 jours et d'
une phase stationnaire.
La
phase exponentielle
correspond à
une
zone de
synthèse active.
Jouanneau [1973J
a montré que
durant cette phase, il
y a proportionalité
entre les
mesures de masse cellulaire et la
consommation de saccharose du
milieu: la phase stationnaire de croissance est la traduction d'une carence
en saccharose du milieu et non une carence en cytokinine exogène .
. -Teneur en chlorophylles
La figure
10, page 54 exprime
la variation de la
teneur en chloro-
phylles/ml de
suspension. Cette expression permet
d'apprécier la synthèse
globale de
chlorophylles a et b dans la culture. En
présence de kinétine
optimale (0,3 ~M), la synthèse de chlorophylles est exponentielle après une
période
de latence
de
3 jours.
Cette
synthèse se
poursuit même
après
l'arrêt de la croissance jusqu'au 15ème jour de culture. Il est à remarquer
que la chlorophylle
n'est pratiquement synthétisée que quand le saccharose
du milieu s'épuise.
Une autre
manière d'exprimer
la variation
de la teneur
en chloro-
phylles est
l'évaluation par
gramme de
MF. Un exemple
est donné
par la
courbe portée sur la fig. 10.
Cette cinétique ne présente pas la même évo-
lution.
A partir
du temps
0 de l'expérience,
la teneur
en chlorophylle
décroît en fonction du temps pour prendre une valeur minimale, puis augmen-
te de
nouveau durant la phase stationnaire
de croissance pour s'infléchir
en un plateau en fin de culture.
B.- CONCLUSION
La lignée cellulaire 19 en présence de 2,4D, réagit qualitativement à
l'apport d'une cytokinine exogène, comme cela est montré par la stimulation
de la division cellulaire et la chlorophyllogénèse. En l'absence de cytoki-
nine (fig. 8 page 52), une crQissance faible est
observée et la teneur en
chlorophylle est peu importante.
Dans ce test de sensibilité, comme dans les expériences suivantes, la
densité cellulaire initiale inoculée est comprise
entre 5 et 8 g de MF par
litre
(entre 15.
et
20.000 cellules/ml).
Quand cette
densité est
trop

---

Séverin AKE
51
faible, elle
ne suffit pas à satisfaire les
besoins en conditionnement du
milieu pour
rendre possible la croissance.
La densité cellulaire initiale
doit
être
bien
contrôlée
pour
permettre
une meilleure
réponse
à
la
cytokinine exogène.

---

52
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
1oo.........---------------------
A
o ..-.--',~---0..1--0....3 - - - - -.......----I3'---__I
18
5
01
03
3
o_--..'\\-
- . l......
- ' -_ _- ' -
...,j
FIGURE 8.- Evolution des masses cellulaires en fonction de la concentration
en kinétine dans
des suspensions de 10 j: ordonnées
A: masse de MF (g/l);
B masse de MS (gl1);
abscisses: [kinétineJ (fM), coordonnées semi-Iog.

---

Séverin AKE
53
0.8
0,2
o '--_-'\\~------I..------'------"""""---
'"
FIGURE 9.- Evolution de la teneur en chlorophylles en fonction
de la concentration de la kinétine dans des cultures de 10 jours
Abscisses: Concentration en kinétine (pM), coordonnées semi-Iog;
Ordonnées : fg chI a + b par litre de suspension

---

54
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
A
B-
C
•
. r - - - - - - - - - - - - - - , . - - - - - --------:~
E
•
--N
ChI/mi
4
200
a..----MF
MS
20
~hl/gM
40
15
4 ~_ _......L.
....L...._
.L..-_ _........J.
.....L...._ _-----J0,04
4
2
FIGURE 10.- Croissance et Chlorophyllogénèse des suspensions de cellules de
Tabac, (l ignée 19),
en présence
de k.inétine 0.3
pM. Abscisses :
temps en
jours; Ordonnées
A, courbe MF: matière fraîche (g/l) B, courbe MS, matière
sèche (g/l); C: courbe
N, numération des cellules (milliers/ml); D, courbe
ChI/ml: chlorophylles (fg/ml) E, courbe Chl/gMF: chlorophylles ~g/g MF).

---

Séverin AKE
55
CHAPITRE IV
ACTIVITES DE DEUX N-PHENYL-N'(4-PYRIDYL)UREES (4PU. 4PU-30)
SUR LA CROISSANCE ET LA DIFFERENCIATION CHLOROPLASTIQUE
A.- RESULTATS
1. Stimulation de la croissance
Comme il
est indiqué au
chapitre II. les
milieux expérimentaux ont
été ensemencés avec une suspension cellulaire en début de phase stationnai-
re (10 jours).
lavée avec du milieu minéral. Les
mesures de croissance et
de synthèse de chlorophylle en présence
de kinétine. 4PU ou 4PU-30 ont été
effectuées 10 jours après l'ensemencement.
Les suspensions de
cellules frafches. récoltées a partir des milieux
auxquels on
a ajouté du 4PU-30 apparaissent
nettement moins dissociées et
moins homogènes.
Le pipetage d'aliquots est rendu difficile
a cause de la
taille
des
massifs
cellulaires. Par
contre,
nous
n'avons noté
aucune
différence observable entre les effets du 4PU et de la kinétine, d'après ce
critère.
La figure 11, page 56, indique les effets de concentrations variables
de 4PU
et de
4PU-30, sur la
mesure de la
masse de matière
frafche. Cet
effet est comparé a celui de la kinétine dans les mêmes conditions.
L'évolution des
cultures en
présence de ces
deux uréides (8
et C)
traduit un effet de dose comparable
a celui de la kinétine. La stimulation
maximale
de la
croissance cytokinine-dépendante dans
les trois
cas, est
atteinte pour une concentration de l'ordre de 0,3 ~M. Toutefois, les effets
de dose de ces uréides (8
et C) ne sont pas en tous points superposables a
celui de la kinétine.
L'évolution
des cultures
en
présence des
uréides a concentration
optimale (0,3 ~M) , est
comparée à la
cinétique en présence
de kinétine
(figure
12.
page 57).
Il
en
ressort une
similitude
d'action avec
la
kinétine, d'après les mesures de matière frafche ou sèche.
Entre 3 et 8 jours
(phase exponentielle de
croissance), nous avons
toujours observé
un décalage dans
le temps, des
cinétiques de croissance
des
deux uréides,
plus particulièrement
celle du
4PU-30, par
rapport a
celle de la kinétine.

---

56
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
B
150
120
60
30
o-"",\\,~d';-1---;=;d~3-----~--~~~------T:;O:-----"'''
FIGURE 11.- Effet
réponses-doses du 4PU et du 4PU30
sur la croissance des
suspensions cellulaires de Tabac. comparativement a la kinétine.
Mesures dans des échantillons de cultures de 10 jours;
Courbe A : Kinétine, courbe B: 4PU-30, courbe C: 4-PU;
Ordonnées
masse de matière fraîche (g/l)
Abscisses : concentrations des cytokinines et analogues (pM)

---

Séverin AKE
57
1
B
A
C
80
o
•••• "If'
--JiII(""
_ ••••
40
. .....
o
3
6
9
12
n
5
4
3
'r•••.•••.•••• " v 0
.'
.. .
."
.......
2
o
3
6
9
12
FIGURE 12.-
Cinétique de croissance. suivant les
mesures de masse fraîche
(Courbes 1) ou de masse sèche (Courbes II) de cellules.
Ordonnées
MF ou MS, en 9/1
Abscisses. Durée de la culture en jours
Légende: 0 : témoin en
milieu de base (2-4 D seul facteur de croissance);
A:
kinétine; B
4PU-30;
C : 4PU
; concentrations
des cytokinines
et
an~logues, 0,3 pM.

---

58
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
2. Stimulation de la synthèse des chlorophylles
Effet de dose
L'évolution
des teneurs
en chlorophylle
a et b en fonction
de la
concentration en analogue (Tableau VII, page 59), est obtenue après extrac-
tion et
dosage des chlorophylles sur
des aliquots de chaque
culture à 10
jours.
En présence de 4PU ou
de 4PU-30, les cellules expriment une sensibi-
lité pour la synthèse
chlorophyllienne. La teneur en chlorophylle des cel-
lules récoltées
dans chaque condition, est comparable
à celle induite par
la kinétine, la zone optimale de
stimulation étant située entre 0,1 et 0,3
~M.
Au-delà, l'inhibition
de la chlorophyllogénèse cytokinine-dépendante
est faible, comparée à l 'inhibition de la croissance.
Cinétiques de chlorophyllogénèse
Les différents
milieux expérimentaux sont
additionnés d'analogue de
cytokinine, à
la concentration optimale
pour la croissance
(0,3 pM). Les
mesures
après le
temps 0 ont été
effectuées tous
les trois
jours. Les
cinétiques
de synthèse
des
chlorophylles en
fonction du
temps ont
une
évolution comparable mais ne sont pas identiques entre elles (fig. 13, page
56). La
chlorophyllogénèse 4PU-dépendante est tardive· comparée à celle en
présence de
kinétine. La teneur
en chlorophylle diffère
de près de
70 %
[fig. 13,
B et
CJ. Au
contraire, l leffet du
4PU-30 sur la
formation de
chlorophylle (courbe
B), est très
proche de celle obtenue
en présence de
kinétine. L'évolution des rapports chlorophylle a / chlorophylle b, mesurés
en fonction de la durée de culture, en présence de chacun des deux uréides,
ne présente aucune variation significative (Fig. 14, page 61).
3. Taux différentiels de synthèse
Les
taux différentiels
de synthèse
(figure 15,page
62), exprimant
l'évolution du
rapport entre la synthèse de
chorophylle et l'incrément de
la masse cellulaire, pendant un cycle de culture, font ressortir les effets
du 4PU et du 4PU-30 et de la kinétine sur la chlorophyllogénèse. Dans tous

---

Séverin AKE
59
TABLEAU VII.- Teneurs en chlorophylles de cultures de cellules
de la lignée
19 en fonction de la concentration en analogue de
cytokinine. 4PU ou 4PU-30. comparativement à la ~inétine.
Concentration (~)
o
0, 1
0,3
3
"KINETINE
18.7
39.5
47,5
18,9
20,7
Chlorophylles
4PU-30
(r
19,8
39,0
32,6
29,2
?
g /g MF)
4PU
19.6
22,6
28.2
27
?

---

60
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
4
3.5
3
2,5
2
1,5
.........•......•
Â
0 ~
......... -
.A,
. . .
3
6
9
15
FIGURE 13.- Cinétiques de Chlorophyllogénèse en présence des
analogues
4PU et 4PU-30. Courbes A. B. C. O. cf légende fig.10
Abscisses
temps en jours après l'ensemencement
Ordonnées
chlorophylles (fg 1 ml suspension)

---

w
1
II
m
45
ChI. a
Chl. a
37.5
30
Chl. a
2
ChI. b
15
....
Chl. b
1
\\
/
Chl. b
......0
/ '"
,-
~
"":-.....
1
"
1.
"
.....
,
--"'''''--0..
,,~
/
,
~ ~/'
1
,
......
/
........
.....
.--'
'"
' ...
~
.... -0-
--.-~'
,
1
,
,
o
3
6
9
12
0
. 6
3
9
12
0
3
6
FIGURE 14.- Evolution des Rapports ChI a / chI b en Fonction du Temps, dans
des Suspensions Cellulaires
en Présence d'Analogues de Cytokinines, 4PU et
4PU-30, Comparées A l'Evolution en Présence de Kinétine.
w
~
~
1 : Kinétine, II, 4PU, III, 4-PU-30
c
......
s-
abscisses: temps de culture en jours,
Q)
>
ordonnées : teneur en chI a ou b (~g / 9 MF)
-<lJ
V)

---

62
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
9
6
3
c
16
2 0
O..,.-----'-----~~~---~~---..L..-----~--......
~g MF
•o
•
•
+t
3
6
t (j ours) 15
FIGURE 15.- Evolution des taux différentiels de synthèse de
chlorophylle
Courbes A, B, C, 0, voir la légende de la fig. 11;
Abscisses : ~M Incrément de masse fraîche de la culture, après un
temps donné.
Ordonnées : ~Chl, Incréments, positifs ou négatifs, de la quantité
de chlorophylles dans les mêmes temps.

---

Séverin AKE
63
les cas, la
synthèse de chlorophylle est nulle ou
très faible au début de
la
culture
puis
s'accroit
progressivement.
En
fin de
culture
(phase
stationnaire), la
masse cellulaire
n1augmente plus, voire
diminue, alors
que les chlorophylles s'accumulent. Quantitativement, le 4PU a une activité
qui n'égale pas
celle du 4PU-30 ou de la
kinétine (fig. 15, courbe C): la
croissance sous lleffet
du 4PU est préférentiellement stimulée par rapport
à la synthèse des chlorophylles qui est faible et tardive.
B.- DISCUSSION
Les résultats
que nous
avons obtenus avec
ces pyridyl,phenyl-urées
sur la
croissance et la chlorophyllogénèse
des suspensions cellulaires de
la lignée 19, montrent leur analogie
d'action par rapport aux effets de la
kinétine, une adénine N6-substituée.
En effet, nous avons
montré que le 4PU-30 manifeste une potentialité
de stimulation de
la multiplication cellulaire et de la chlorophyllogénèse
qui
égale ou
même surpasse
légèrement celle de
la kinétine
(figure 11,
courbe B). Le 4PU a une
activité légèrement plus faible sur la chlorophyl-
logénèse.
Toutefois,
les
courbes
réponses-doses présentent
une
grande
similitude avec un optimum entre 0,1 et 0,3 ~M.
Les cinétiques en fonction
du temps indiquent un décalage de l'effet
de stimulation
(1 à
2 jours)
des uréides par
rapport à la
kinétine, au
cours de la phase exponentielle de
synthèse (figures 12 et 13, pages 57 et
60).
Ces
faits
peuvent
suggérer
que
des
réarrangements
moléculaires
surviendraient au
cours du métabolisme des molécules
de type uréide, pour
aboutir
à des
formes structurales
plus effectives
qui seraient
de type
adénine N6-substituée? Dans
l'état actuel de nos expériences, nous nlavons
pas abordé une
analyse du devenir métabolique de ces pyridyl,phényl-urées.
Toutefois, certaines données du métabolisme des cytokinines adénines N6_
substituées semblent être des éléments en faveur d'un tel mode d'action. En
effet, le clivage
de la chaîne latérale isoprénoïde de
la zéatine par une
cytokinine oxydase permet d'aboutir
à des structures de type uréide, "via"
l'adénine ou l'adenosine [Letham et al., 1980J.
Sur
un autre
plan,
une observation
des
structures chimiques
des
uréides et des adénines N6_ su bstituées, ne pemet pas à première vue de
leur trouver une grande identité. Cependant, des corrélations structurales

---

64
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
peuvent être établies [Isogai et al., 1981]. Ces auteurs aboutirent à cette
conclusion à partir de dégradations partielles de la benzyladénine.
Bien
qu'il y ait une
grande similitude
d'action des
uréides avec
celle de la kinétine, nous
avons noté certaines particularités: en effet,
la zone
optimale d'effet de
ces uréides forme
un plateau de 0,3
à 1 ~M,
l'effet de
la kinétine étant assez
localisé (0,3 ~M). Les
cellules ne se
dissocient pas
de manière identique en présence de
ces analogues. On peut
noter que le 4PU et le
4PU-3D, bien qu1ayant la ~ême structure de base (N-
phenyl-N' (-4-Pyridyl)urée)
et
exhibant
une
grande
activité
de
type
cytokinine, ne présentent pas les mêmes
effets entre eux, et par rapport à
la kinétine, surtout sur la synthèse de chlorophylles.
Ces observations sont corroborées
par le fait que les cytokinines de
structure adénine N6-substituées et les uréides, présentent des activités
biologiques similaires dans une grande variété de tissus et d'espèces végé-
tales
[Shudo
et Isogai,
1980J.
Toutefois,
dans certaines
utilisations
agronomiques, les
Uréides, notamment le 4PU30,
produisent certains effets
biologiques qui
n'ont pas la
même importance, ou même
différents de ceux
obtenus en présence d'adénines N6_su bstituées [ISOGAI, 1980J.
Cet ensemble
de faits suggère que
les uréides pourraient constituer
une autre classe de cytokinines. En raison des analogies des effets physio-
logiques des les adénines N6~substituées, et, d'autre part, des analogies
structurales possibles entre ces
deux types de structures, ces divers fac-
teurs de
croissance pourraient avoir
les mêmes sites
q'action, ainsi que
certains auteurs ont tenté de le montrer [Shudo et Isogai, 1981 J.
D'autre
part, nous
nous sommes
interrogés
sur les
différences d'
activité entre le
4PU et le 4PU-30. Il est
à noter que ces deux molécules
diffèrent
seulement par
un atome
de chlore
en position
2 sur
le noyau
pyridyl du
4PU-30 (fig.
3, page
26). L'activité de
ce dernier
est plus
importante que
celle du 4PU, surtout
pour stimuler la chlorophyllogénèse,
Ceci pourrait être lié à la
présence de l'atome de chlore: il y aurait une
plus grande perméabilité membranaire au 4PU-30.
Dans cette étude
nous n'avons pas abordé les transformations métabo-
liques de
ces substances. Toutefois,
l'ensemble de nos
obervations nlest
pas
en faveur
de
l 'hypothèse selon
laquelle
l'activité cytokinine
des
dérivés de l'urée serait dûe à des effets indirects sur le métabolisme des
cytokinines endogènes.

---

Séveri n AKE
65
CHAPITRE V
ACTIVITE DU 5,6,DICHLORO- ~-D-RIBOFURANOSYL-BENZIMIDAZOLE
(ORB)
EN PRESENCE ET EN L'ABSENCE DE KINETINE
A. RESULTATS
1. Introduction
Comme nous
en avons fa it
ment i on au Chap it re l,
page
28, certa i ns
dérivés du benzimidazole
possèdent, suivant la littérature,une activité de
type cytokinine.
Les mécanismes d'action de ces composés
ne sont pas élu-
cidés. Les hypothèses
de travail suggèrent une similarité structurale plus
ou moins grande
entre le benzimidazole et ses dérivés
et les adénines N6_
substituées (fig. 1, page 19 et figure 4, page 27).
Le ORB est un nucléoside
analogue du benzimidazole. Ce composé a des
propriétés
antivirales
et
de
nombreux
travaux
rapportent
son
effet
inhibiteur de
la transcription du RNA dans les
cellules animales [Laub et
al., 1980J.
Les effets
sur les
cellules végétales n'étaient
pas connus.
Nous
avons
étudié ces
effets
sur la
croissance
et la
différenciation
chloroplastique des suspensions cellulaires de Tabac (lignée 19).
2 - Plan expérimental
Comme
dans le
cas de
l'étude précédente
sur les
dérivés pyridyl-
phenyl-urées, nous
avons commencé par comparer
la croissance des cellules
en
présence de
cytokinine ou,
alternativement, en
présence de
ORB, par
rapport aux cultures témoins sans facteur de croissance autre que le 2,40.
Comme il a été expliqué, pour observer l'effet de cette substance sur
la croissance des cellules, nous
avons
ensemencé des cellules lavées avec
du milieu
neuf et convenablement
diluées de manière a obtenir une crois-
sance résiduelle
faible des cultures témoins et
une stimulation forte par
la ki néti ne.
Nous avons
ensuite essayé l'effet
du ORB sur les
cellules mises en
présence de
kinétine pour observer si dans ces
conditions, l'effet du ORB
était synergique
de celui des cytokinines, ou
au contraire inhibiteur, ou
simplement additif.

---

66
Analogues cytokinines/croissance cellules
Enfin, nous avons étudié
l'effet d'une échelle
de concentrations de
DRB sur
des cultures témoins
ou enrichies en
cytokinine. Les expériences
précédentes ont
donné des résultats que nous décrirons
par les mesures de
llenrichissement en matière sèche ou
fraîche ou du nombre de cellules pré-
sentes dans la culture.
Pour étudier l 'effet du DRB sur la chlorophyllogénèse, nous avons
procédé
comme dans
le cas
des dérivés
des pyridyl,phenyl-urées
et nous
avons opéré avec des cultures de
densité suffisante, non lavées: dans ces
conditions, toutes
les cultures croissent a la même
vitesse, avec ou sans
kinétine. Seul
leur contenu en chlorophylle change
en fonction de l'addi-
tion des facteurs de croissance.
3.- Effet du DRB sur la croissance des cultures de cellules de
tabac
Les cellules lavées
et convenablement diluées, transférées en milieu
de base, sont presque entièrement cytokinine-dépendantes pour la croissance
(fig .16 courbe 0, page 67).
La croissance des cellules en présence de DRB
seul (3 ~M)
ajouté au milieu de base, est
stimulée. Cette stimulation est
moyenne quand on
la compare a celle des cellules
en présence de kinétine
seule (fig. 16, courbes D et K).
Nous
avons recherché
les effets
réponses -doses, en
présence dl une
.
échelle de
concentrations de kinétine et d'une
concentration fixe de DRB,
et réciproquement, d'une échelle
de concentrations de DRB et d'une concen-
tration fixe de kinétine. Une
comparaison des mesures (tableau VIII, p. 69
et fig. 20, page 72) montre
que la kinétine stimule la croissance des cel-
lules jusqu1a
0,6 ~M, alors que le DRB
inhibe partiellement ou totalement
la stimulation
par la
kinétine de
cette croissance. Cette
inhibition en
pourcentage est
constante pour une concentration donnée
de DRB (même dans
la région de concentration supra-optimale de kinétine : 0,6 ~M) .
4 - Etude de l 1effet du DRB sur la chlorophyllogénèse :
Les cellules appartiennent toujours a la même lignée clonale 19. Dans
ces expériences, elles sont ensemencées
sans rinçage de manière a être peu
sensibles aux cytokinines exogènes pour la multiplication cellulaire.
(voir la suite du texte page 74)

---

Séverin AKE
67
600
K
400
200
o
o
3
6
9
12
15
FIGURE 16.- Activité du DRB
sur la cinétique de croissance des suspensions
cellulaires de Tabac.
Abscisses
durée de culture en jours
Ordonnées
: nombre de cellules en milliers / ml de suspension
Courbes 0:
milieu de base, D : milieu
de base + DRB 3 ~M,
K: milieu de
base + kinétine
0.1 J.1M, KD : milieu de base + kinétine 0.1 J-lM + DRB 3 ~M.
Les cellules
ont été lavées puis diluées
pour l'ensemencement suivant les
ir.cications du tableau VI, page 43

---

68
Analogues cytokinines/croissance cellules
FIGURE 17.- Récoltes de cellules
de Tabac cultivées avec ou sans cytokini-
ne, avec ou sans ORB.
NOTA: Les deux boites de Petri, identifiées par K 0,6 ~M + ORB 9 ~M et par
K 0,6 ~M + ORB 4 ~M, ont été posées sur la photographie dans l'ordre inver-
se de leur situation logique.

---

Séverin AKE
69
TABLEAU VII 1. -ACTIVITE DU
ORB ET
DE LA KINETINE
SUR LA
CROISSANCE DES
CELLULES DE TABAC EN SUSPENSION
Cultures de
10 jours;
les valeurs représentent
le nombre de
cellules en
milliers par ml de su~pension.
KINETINE (1-li'i)
o
DRB ().lM)
0
.204
581
670
645,
4
218
437
452
417
10
244
314,
339
232
TABLEAU
IX.-
ACTIVITE
DU ORB
ET DE
LA
KINETINESUR LA
SYNTHESE
DE·
CHLOROPHYLLES DANS LES SUSPENSIONS CELLULAIRES DE TABAC
Cultures de
10 jours; valeurs en
~g chlorophylle/ g MF.
Les cellules ont
été lavées avant ensemencement (cf figure 16, page 67)
KINETINE ( ]-lM )
o
0, 1
DRB ( JlM)
0
15,2
30,7
4
4,3
12,8
20,5
17,6
10
4,2
9,2
Il , 7
6,7
N B
Les cellules ont été lavées avant d'être
encemencées (voir figure 15 )

---

,70
Analogues cytokinines/croissance cellules
K
600
KD
~~-oD
/1
' i 0
1 1
/ 1
J
1
400
1
/
/
1
/
l
' 1
1
/
hiP
00
,-
/
/
v"'D"
~ .,......,/
à
3
6
9
12
15
FIGURE 18.- Activité du DRB sur la Croissance des Suspensions
Cellulaires de Tabac
Coordonnées et abréviations, cf fig. 16;
Conditions de Culture: Cellules-mères transférées pendant deux·
cycles en milieu de base puis ensemencées dans les milieux
de culture, sans lavage préalable, (cf fig; 6 A, page 45), dans les
conditions expérimentales de la figure 16

---

Séverin AKE
71
4
2
1,2
D
0.8
04
Q2.8
Q20
,0
/
0.1.2
/
/
/
/
/
"
,-
/
......, .....--- 8---
0.04L...--_~_ _-~-----!-----'----.l,.--_--I
o
3
6
9
12
15
FIGURE 19.- Activité du ORB sur les Cinétiques de Synthèse de
Chlorophylle dans les Suspensions Cellulaires de Tabac
Abscisses
durée de culture en jours,
Ordonnées: chlorophylles a + b en ~g / ml suspension (coord. semi-
log)
Conditions de culture de la figure 18; abréviations. cf. fig. 16

---

72
Analogues cytokinines/croissance cellules
A
Il
fi
o~,"",\\"~
----ll-1
l~O
B
0,5
__---'.\\-6---~.z------era-~/ilI'II-----11
0.1
10
FIGURE 20.-
Effet réponse-dose d'une
échelle de concentrations
de DRB en
pré"sence
ou en
absence de
diverses concentrations
de kinétine,
sur des
suspensions cellulaires de Tabac. Conditions expérimentales de la figure 18
(cellules ensemencées sans lavage préalable), abscisses [ORB] (~M);
ordonnées! carrés
noirs: sans kinétine;
carrés blancs: K 0,1 ~M; cercles
blancs: K 0,3 ~M; triangles blancs: K 0,6 rM.
A: milliers de cellules/ml;
B: chlorophylle totale (~g/ml)

---

Séverin AKE
73
K
f\\
1
\\
0,5
: \\
1
\\
1
\\
1 "
\\\\
/
\\
.
\\
1
\\
,
,
,
\\
KD:
\\..,''"\\
1
..,,
1
"
\\
1 \\
\\
.1 '""' \\
\\
/:···.. \\
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1 ....:
"...../'\\
D
1
1
1
1 ...-
".
'
,
\\
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...~....-....\\ '.
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,"
. ,
....
'
"\\ '
" \\
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1
t
J,
\\
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\\
"
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\\
/
\\ \\
'\\ \\
' / ,"'. ,
.,'
,,----"
....
'\\ \\
....::.:---------::.::=.::.:"""=."..,.......?.
". \\
0, l
400
500
600
700
FIGURE 21.- Spectres d'Absorption d'Extra!ts acétoniQues des
Cellules de Tabac; cultures de 9 jours.
Abscisses
longueur d'onde (nm)
Ordonnées
0.0.
Abréviations: cf. fig. 16.

---

'74
Analogues cytokinines/croissance cellules
Ainsi que nous
l'avons décrit au Chapitre II et
selon la fig. 6 B2,
page 45, les inocula proviennent soit
a.- d'une suspension cellulaire d'entretien cultivée pendant 10 jours
en présence de kinétine. Les cellules sont transférées directement dans les
milieux
expérimentaux, soit
12 g de matière
fraîche/litre de
milieu de
culture (30.000 cellules / ml).
b.- de cultures d'entretien
ayant effectué deux cycles de culture en
milieu de
base (fig. 6 A, page 45). Dans
ces conditions d'ensemencement,
l'addition de cytokinine b la culture est perçue uniquement comme stimulant
la chlorophyllogénèse et la différenciation plastidiale.
La figure 18 (page 70) montre
que les cellules ont une sensibilité à
la kinétine
pour la croissance,
fortement atténuée. On peut
noter que la
réponse au ORB pour la
croissance des cellules n'est pas significative par
rapport au
témoin (fig.
18 courbes
0 et 0).
Les mesures des
teneurs en
chlorophylle des cultures donnent les résultats suivants:
- La kinétine optimale ajoutée au milieu de base stimule fortement la
chlorophyllogénèse
(fig. 19,
page 71,
courbe K). Le
ORB seul
ajouté au
milieu de base stimule la synthèse chlorophyllienne environ au 1/3 de celle
produite par la kinétine (courbe 0).
- En présence
de kinétine, la réponse des cellules
au ORB n'est pas
significativement différente de celle du ORB seul (fig. 19, courbe KO).
- Chez les
cultures en milieu de base (courbe
0), on peut remarquer
qu'une synthèse chlorophyllienne est amorcée seulement après 10 jours.
Nous
avons
recherché les
effets
réponses/doses
d'une échelle
de
concentrations de kinétine plus
du ORB à concentration constante et, d'au-
tre
part, une
échelle de
concentrations de ORB
en présence
de kinétine
constante. Les mesures (tableau IX
page 69 et figure 20, page 72)indiquent
une stimulation de la chlorophyllogénèse par la kinétine. L'effet du ORB se
traduit par
une inhibition partielle ou totale
de cette stimulation kiné-
tine-dépendante. le
pourcentage d'inhibition reste
constant, à concentra-
tion constante de ORB.
5 - Recherche d'une action spécifique du DRBsur les synthèses de
chlorophylle a ou b
Nous avons cherché à savoir si le ORB avait une action spécifique sur
les chlorophylles a ou b. Nous avons effectué des mesures de l'absorption

---

Séverin AKE
75
dans le visible (400 nm à 700 nm) sur des extraits acétoniques de cellules,
à 9 jours de culture.
Comme cela ressort des
spectres d'absorption (fig.
21, p. 73),
le ORB ajouté au milieu de base
a un effet qui se traduit par
une absorption
faible (spectre 0).
Le spectre.diffère
cependant de celui
qu'on obtient
à partir des cellules
cultivées en milieu de
base (0). Les
densités optiques
mesurées sur des extrafts de
cellules cultivées en pré-
sence de kinétine
plus du ORB (spectre KD) sont
réduites de 50 %par rap-
port à celles des spectres
obtenus en présence de
kinétine seule. Aucune
singularité n'a été remarquée entre les deux
spectres, K et KD.
6.- Evaluation en pourcentage de l'activité du ORB
sur les critères de croissance et de chlorophyllogénèse
La figure 22, pages 76-77, représente l'ensemble des résultats précé-
dents. Les
pourcentages de stimulation
ou d'inhibition par
le ORB, après
diverses périodes
de culture
ont été
reportés. Les valeurs
absolues des
pourcentages changent
en fonction
du temps,
suivant la mesure
choisie:
matière fraîche (MF);
matière sèche (MS), le nombre de
cellules (N) ou la
teneur en
chlorophylle. Le maximum d'inhibition par le
ORB en présence de
kinétine, se situe
entre 9 et 11 jours de
culture. Malgré cette évolution
dans le temps, il apparaft nettement que le ORB est constamment stimulateur
en
absence de
kinétine
et constamment
inhibiteur en
présence de
cette
hormone.
B - DISCUSSION
Il ressort de nos résultats que
: l'effet du ORB ajouté au milieu de
culture de base se traduit par une stimulation moyenne de la multiplication
cellulaire
(fig. 16,
courbe 0).
Cet effet est
comparable à celui d'une
cytokinine potentiellement peu active.
Quand cet analogue du benzimidazole est ajouté aux cultures enrichies
en kinétine, son activité se traduit par une inhibition de l'activité cyto-
kinine
(fig. 16,
courbe
KD). Cet
effet s'exerce
indépendamment sur
la
stimulation de
la croissance ou
celle de la
chlorophyllogénèse, c'est-à-
dire sur
chaque mode d'expression de l'activité
cytokinine (figures 16 et
19). Dans
le cas où
les cellules sont
insensibles à la
kinétine pour la
croissance, la réponse au ORB n'est pas significative (fig. 18, page 70);

---

76
Analogues cytokinines!croissance cellules
FIGURE 22.- Evaluation en pourcentage de l'activité du ORB sur la
croissance et la synthèse de chlorophylle des suspensions
cellulaires de
Tabac.
abscisses
durée de culture en jours
ordonnées
valeurs
observées dans les cultures additionnées de ORB,
en pourcentage du témoin.
Les valeurs 100% représentent:
1.- soit
les mesures effectuées sur les cultures
en milieu de base,
prises
comme
contrôles
des
mesures
effectuées sur
les
cultures
additionnées de ORB seul (courbes D, points noirs)
2.-alternativement,
les
mesures
effectuées
sur
les
cultures
en
présence de
kinétine seule,
comme contrôles des
mesures effectuées
sur les cultures
en présence de kinétine + ORB
(courbes K D, points
blancs).
MF,
MS, N,
respectivement
masse fraîche,
masse
sèche, nombre
de
cellules, en coordonnées linéaires,
ChI, chlorophylle totale en coordonnées semi-log.

---

,
Séverin AKE
77
DJ/o
200%
MF
MS
.
0
180
180
16O
160
\\.40
\\40
120
120
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100%
...
. f )
p---D
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1
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.,
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1
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KD
Q
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60
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60
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15
3
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12
0%
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200%
l000~ .
N
800
Chi
80
600
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\\
\\
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,
\\
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\\
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\\
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\\
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\\
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\\
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KD
Q
1
/
........
"
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"
1
'0
"
1
"-
40
''Ü
20
0%
3
6
9
3
6
9
1.2
15
FIGURE 22

---

Analogues cytokinines/croissance cellules
on peut noter sur cette figure que le ORB n'a aucun effet sur la croissance
résiduelle des cellules témoins. L'ensemble de ces observations suggère que
le ORB inhibe
d'une manière spécifique l'activité des ctokinines exogènes.
Une
conclusion parallèle
est apportée par
les travaux
de Bianco-Colomas
(communication
personnelle), en
relation
avec la
biosynthèse des
beta-
cyanines stimulée par les cytokinines. Dans ce cas, le ORB n'inhiberait pas
la stimulation photochimique de beta-cyanines.
Les études cinétiques de la stimulation par le ORB seul ou de l'inhi-
bition
en présence
de cytokinine exogène
montrent des
valeurs variables
selon la période considérée
de la culture. Nous n'avons pas d'informations
précises sur
les raisons de ces variations.II
faudrait étudier plus avant
la pénétration de
la drogue et sa dégradation dans
les cellules, qui sont
probablement responsables,
en partie au moins,
de ces cinétiques. L'effet
positif du ORB
seul est en bon accord avec
les expériences de Tripathi et
Schlosser [1977J
sur l'effet cytokinine de
certains dérivés du benzimida-
zole. Dans notre cas, la stimulation observée est relativement modeste.
Les tableaux VIII et IX, page
69 font ressortir le fait que, même en
présence
de doses
élevées de
kinétine, l'inhibition
exercée par
le DRB
n'est
pas réversible
par addition
d'une
dose supérieure
de cytokinine,
comme dans
le cas d'une inhibition compétitive,
telle qu'elle est décrite
pour les antagonistes
de type 7-(pentylamino) et 7-(benzylamino)-3-methyl-
pyrazolo-
(4,3-d)pyrimidines [Grégorini
et Laloue,
1980J.
Les résultats
sont donc en faveur d'un effet inhibiteur non compétitif exercé par le ORB.
Il convient de donner à ce
terme un sens large puisqu'il s'agit de cinéti-
ques physiologiques et non d'interactions moléculaires.
Une telle
propriété devrait aider à
rechercher des protéines-récep-
teurs des cytokinines. Celles-ci
devraient lier, d'une part la kinétine ou
l'un de ses
analogues, d'autre part le ORB. Les
sites de liaison pour les
adénines N6-substituées et pour le DRB devraient être différents et inter-
agir négativement.
Nous avons fait d'autres
observations sur l'effet exercé par le ORB:
lorsque les
cellules non lavées
ne répondent pas aux
cytokinines pour la
croissance, elles ne répondent pas non plus au ORB (fig. 18). Au contraire,
la dépendance des cytokinines
et l'inhibition par le ORB apparaissent dans
le cas où les suspensions sont lavées (fig. 16). Ces observations suggèrent
qu'un
facteur
de
type "cytokinine ll
serait
él iminé
par
le lavage
des
suspensions
cellulaires. Une
telle situation peut
être comparée
à celle

---

Séverin AKE
79
décrite par
Wood et Braun [1967J,
étudiant le rôle de
la division cellu-
laire chez Vinca rosea.
Ils observèrent, après une application de kinétine
aux cellules
sensibles dans un milieu de
culture approprié, que celles-ci
synthétisent
des substances qui favorisent la division cellulaire. D'après
ces auteurs,
de tels facteurs
de division auraient
des propriétés physi-
ques,
un spectre
d'absorption et une
activité biologique
similaires aux
substances
biologiquement
actives produites
par
les cellules
tumorales
cytokinine-insensibles de la
même espèce végétale. La composition chimique
de ces
facteurs serait très
différente de celle
de la kinétine.
Wood et
Braun [1967J
ont conclu que
la kinétine pourrait agir
comme un inducteur
des
systèmes de
synthèse des
facteurs de
division cellulaire,
ou alors
qu'elle servirait, par d'autres voies indirectes, à stimuler la production
de substances naturelles stimulant la division des cellules normales.
L'hypothèse des substances
"induites" par l'activité des cytokinines
reste valable,
bien que la nature
chimique de ces substances
ne soit pas
précisée,
et que
nous
sachions aujourd'hui
que
les cellules
tumorales
fabriquent réellement des adénines N6-substituées [Scott et al., 1982;
Morris et al., 1982J.
En ce qui concerne le facteur de type "cytokinine" qui serait éliminé
par le
lavage des suspensions
cellulaires, aucune preuve
ne montre qu'il
pourrait être une adénine N6-substituée. Si tel était réellement le cas ,on
devrait s'attendre à observer un effet inhibiteur du ORB comme on l'observe
lorsqu'on rajoute
simultanément de la kinétine plus du
ORB à des cellules
lavées et
diluées. Ce raisonnement
est corroboré par
l'observation de la
chlorophyllogénèse: même quand les cellules ensemencées ne sont pas lavées,
une cytokinine exogène est nécessaire pour obtenir la différenciation plas-
tidiale. Dans ce cas aussi, l'effet de la cytokinine exogène est inhibé par
le ORB. Au contraire, la drogue a un léger effet stimulateur sur la chloro-
phyllogénèse des cellules non lavées en l'absence de cytokinine (fig. 20).
Tout ceci fait
penser que l'effet du lavage n'est
pas de diluer une
éventuelle cytokinine résiduelle.
Ces observations suggèrent
que les facteurs endogènes des tissus au-
tonomes qui possèdent une activité de cytokinine ne seraient pas identiques
ou même chimiquement apparentés aux dérivés naturels des adénines N6-subs-
tituées.

---

---

Séverin AKE
81
CON C LUS ION 5
G E N E R ALE 5
Les experlences
que nous
avons effectuées
sur la croissance
et la
chlorophyllogénèse
des
suspensions cellulaires
de
Tabac sensibles
aux
cytokinines ont abouti aux résultats que nous venons de discuter.
Nous avons
étudié l'effet cytokinine
des molécules de
type 4,pyri-
dyl-urée.
Les résultats
mettent
en évidence
que
le 4PU
et le
4PU-30
présentent une forte activité
cytokinine sur la croissance et la synthèse
chlorophyllienne dans
ce système biologique. L'efficacité
de ces moléc~­
les, comparée à celle de la kinétine amène à s'interroger sur la structure
chimique finalement
active dans
ces effets. Les
structures pyridyl-urée
agissent-elles en tant que telles
ou après modifications in vivo? Pour le
savoir, il faudrait étudier le devenir métabolique du 4PU et du 4PU-30. Il
faudrait pour
celà synthétiser ces molécules
avec un marquage radioactif
approprié. Après incorporation
de celles-ci, on pourrait peut-être carac-
tériser
les métabolites
qui en
dérivent,
en les
comparant à
ceux qui
résultent de
l'incorporation d'une cytokinine de
type adénine N6-substi-
tuée.
Concernant
le ORB,
dérivé du
benzimidazole, les
résultats exposés
font ressortir les
effets de cet analogue sur la
croissance et la diffé-
renciation plastidiale des cellules
de Tabac, en présence et en l'absence
de cytokinine exogène. Le fait que le ORB exerce une inhibition sur chaque
mode de
l'expression de l'activité hormonale de la
kinétine mais pas sur
la croissance autonome résiduelle des cellules, constitue une preuve de la
spécificité
de l'interaction
du DRB
avec les
cytokinines. L'inhibition
observée n'est pas de type compétitif: si celà se confirme, il faudrait en
conclure que
le DRB n'a
pas le même
site d'action que
les adénines N6~
substituées, au moins lorsque le DRB agit comme inhibiteur.
Ce type
d'inhibition pourrait être exploité pour
la recherche et la
discrimination des
récepteurs spécifiques
des cytokinines. Dans
ce cas,
l'utilisation de
molécules de
ORB marquées
serait très utile.
En effet
celà pourrait
apporter une
méthode de
recherche des modes
d'action des

---

, 82
Analogues cytokinines/croissance cellulaire
cytokinines.
En relation avec
la sensibilité cellulaire aux cytokinines exogènes,
les observations
que nous avons faites
suggèrent l'existence de facteurs
cellulaires qui
sont ORB-insensibles et
qui sont éliminés
par le lavage
des cellules en suspension. Ces facteurs endogènes possèderaient une acti-
vité cytokinine
dans les
lignées autonomes
mais ne seraient
pas néces-
6
sairement des
adénines N -substituées.
On devrait pouvoir
identifier de
tels facteurs endogènes qui diffusent dans le milieu de culture puisqu'ils
peuvent être éliminés par lavage.
Si cette hypothèse est
exacte, un milieu de culture conditionné pro-
venant d'une culture autonome (sans cytokinine exogène), en phase station-
naire
de croissance
pourrait supporter
la
croissance d'une
culture de
cellules
exigeantes en
cytokinine exogène, mais
sans présenter
la même
inhibition
par le
ORB. Cette amorce
d'une nouvelle
série expérimentale
serait une suite directe de nos résultats.
D'autre part, on cannait des cas
où l'activité du ORB sur les cellu-
les animales se traduit par le blocage de la transcription de certains ARN
messagers (cf
p. 29). Ce
fait peut être rapproché
des effets anti-cyto-
kinines mais rien ne permet
d'affirmer que dans les cellules végétales le
ORB ou certains fungicides
dérivés du benzimidazole auraient le même com-
portement: c'est là encore une voie expérimentale future.
Remarquons pour terminer que nous nlavons étudié que l'antagonisme du
ORB avec la
kinétine. Nous n'avons pas abordé l'effet
du ORB sur l'acti-
vité des cytokinines naturelles ni sur
les dérivés du type 4PU ou 4PU-30.
En ce
qu i concerne ces dern iers, 1 1observati on
d'un effet antagon i ste du
ORB serait utile pour avoir des informations sur le mécanisme d'action des
urées substituées, comparé à celui des adénines N6_ substituées.

---

Séverin AKE
83
1 NOE X
B 1 B L J. 0 G R A PHI QUE
ARMSTRONG DJ, KIM SG, MOK MC, MOK DWS
(1979)
Genetic· regulation of
rnetabo11sm
in Phaseolus
tissue
cultures. In: Metabolism and mole-
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Springer-Verlag
Berlin Heidlberg
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Effect of sorne growth regulators on bud
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66
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Effect of kinetin on
formation of red
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