"-:..
THE5E
présentée
à ( Université de CAEN
"
pour l'obt~ntion du
e
DOCTORAT' DE 3
CYCLE, spécialité BIOLOGIE
par
,
N'takpé
MANGUE
Sujet:
Contribution à l'étude de la régulation de la synthèse
de progestérone dans le corps jaune de vache. Mécanisme
d'activation de la cholestérol estérase.
r~~~O-i\\I-S-EI-l'~-~A=r-"""'R""1C=A"'"l''''''N''''''E'''''''''lj'=-M=-';'''''~G''''~=A'''''C-H''''iid
1
POlm t'ENS!:~GNEMc;~TSUP~R;ELm 1
, c. A. i\\lL E. S. -
OU/~G,L\\DOUGOU !
!Arrivée ·;0,4, JUR ·1995· ..... 1
1Enl'~gistre, sous n° .# 0'1' 0"0' 3· '
soutenue le
12
Juin 1981 devant la CommISS·10A-é·~xameA=-'·~--
MM.
P. LEYMARIE
PRESIDENT
E M. CHAMBAZ!
P LUBET
EXAMINATEURS
P. SILBERZAHN

---

UNIVERSITE DE CAEN
UNITE d'ENSEIGNEMENT et de RECHERCHE
des SCIENCES de la VIE et du COMPORTEMENT
14032 CAEN CEDEX
ANNEE UNIVERSITAIRE 1980 -
1981
===============================
Monsieur d'ALCHE
Professeur Physiologie animale
Monsieur BEAUVOIS
Professeur Psychologie
Monsieur BINET
Professeur Physiologie végétale
Monsieur BOIVINET
Professeur Physiologie animale
Monsieur BOULET
Professeur Psychophysiologie
Monsieur BOUTIBONNES
Professeur Microbiologie
Mademoiselle D&~EUSY
Professeur Biologie animale
Monsieur DOGUET
Professeur Biologie végétale
Monsieur DORE
Professeur Géologie
Monsieur DREVILLON
Professeur Psychologie
Madame GAYRAL
Professeur Botanique
Monsieur KAUFFMANN
Professeur Physiologie bactérienne
Monsieur LANTEAUME
Professeur Géologie
Monsieur LARSONNEUR
Professeur Géologie
Monsieur LUBET
Professeur Zoologie
Monsieur MABBOUX-STROMBERG
Professeur Physique cosmique
~J\\onsieur NOVEL
Professeur Microbiologie
lJ\\onsieur PAREYN
Professeur Géologie
Monsieur PONS
Professeur Physique appliquée
Monsieur PRUNUS
Professeur Zoologie
Monsieur SIGNORET
Professeur Embryologie
Monsieur SAUSSEY
Professeur Zoologie
Monsieur SILBERZAHN
Professeur Biochimie
Monsieur STREIFF
Professeur Psychophysiologie

---

CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA REGULATION DE hl'., SYNTHE SE DE
PROGESTERONE DANS LE CORPS JAUNE DE VACHE. MECANISME D'AC-
TIVATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE.

---

Ce travail a été effectué au laboratoire de biochimie de l'U.E.R. de
Médecine de CAEN,
sous la direction du Professeur P. LEYMARIE.
Je tiens à lui exprimer ma reconnaissance d'une part pour l'aide
effective qu'il m'a apportée tout au long de cette étude, et d'autre part
pour l'honneur qu'il me fait de présider mon jury de thèse.
Ma reconnaissance va aussi à Madame TAHIRI, Professeur à l'Université
Nationale de COTE D'IVOIRE, pour ses conseils et encouragements fort utiles;
au Professeur P. LUBET pour son attention toute particulière durant mon séjour
en FRANCE.
Je remercie sincèrement les Professeurs CHAMBAZ, LUBET, SILBERZAHN
qui ont accepté de juger ce travail.
J'exprime ma profonde reconnaissance à Monsieur J.M. DARBON, assistant,
qui a guidé avec soins mes premiers pas en biochimie,
sans oublier son aide
tout au long de cette étude.
J'adresse mes vifs remerciements à Madame J. URSELY, assistante,
Mademoiselle T. MARIE,
secrétaire, et à l'ensemble du personnel du laboratoire
d'hormonologie du C.H.R. de CAEN, pour l'aide qu'ils m'ont apportée.

---

A
ma famille

---

ABREVIATIONS
============
ACTH
Hormone adreno corticotrope
ADP
Adénosine diphosphate
AMPc
Adénosine mono9hosphate -
3' ,5' cyclique
db - AMPc
Dibutyryl adénosine monophosphate -
3' ,5' cyclique
ATP
Adénosine triphosphate
ATPase
Adénosine triphosphatase
BSA
Albumine sérique bovine
++
Ca
Ions calcium
Col
Collaborateurs
DEAE
Diethylaminoéthyl
EDTA
Acide éthylène diamine tetra acétique
FSH
Hormone folliculo stimulante
GTP
Guanosine trinhosnhate
HCG
Gonadotrophine chorionique humaine
HSPI
Inhibiteur de la nrotéine kinase AMPc dépendante
LH
Hormone lutéotrone
++
Mg
Ions magnésium
PK AMPc-D
Protéine kinase AMPc-dépendante
PMSG
Gonadotrophine de serum de jument gestante
SEH
Sterol ester hydrolase ou cholestérol estérase
TCA
Acide trichloracétique.

---

SOM MAI R E
===============
INTRODUCTION
============
Rappels bibliographiques
; . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Situation du projet de recherche.
14
Plan de travail eX9érimental
15
MATERIEL ET BETHODES
====================
A - Produits chimiques et matériel de laboratoire
17
B - Méthodes
1 -
Synthèse de l'oléate de cholestérol tritié . . . . ~......
19
2 - Obtention du cytosol
21
3 - Purification de la cholestérol estérase
22
4 - Détermination du poids moléculaire de la cholestérol
estérase
24
5 - Préparation
de la phosphata se lutéale
24
6 - Mesure des protéines
25
7 - Dosage de la cholestérol estérase
25
8 - Activation et inactivation de la cholestérol estérase.
26
9 - Mesure de l'activité histone kinase
27
10 - Mesure de l'activité caséine kinase
28
11 - Mesure de l'activité phosphorylase kinase
.
28
12 - Dosage de la,Dhosnhatase :,:R~~C~f<r.r~~~
.
29
RESULTATS ET DISCUSSION
A
\\-~~
=======================
\\ ~ \\~
~: !
Chaoi tre l
- MISE AU POINT DU DOSAGE DE~'LA CHOLESTEROL-t ESTERASE ET
ACTIVATION DE L' ENZYME NOJ\\PU~I'F..lEE_/<"v" /
"<...
':,
e«"Y/
.
. 'fi en! )\\.\\9/
A - Mise au ~oint du dosage de la cholestérol estérase
1 - Mesure de l'activité stérol ester hydrolase en fonction
du temps d'incubation
.
32
2 -
Influence de la concentration de la SEH pancréatique sur
l ' acti vi té enzymatique
.
32
B - Activation de
la cholesterol estérase non Durifiée
1 - Vérification de l'activation "in vitro" de l'enzyme SEH
par un mécanisme de phosphorylation
.
35
2 -
Recherche de conditions d'activation optimale de
l'enzyme
.
37
3 -
Recherche d'implication de PK Ampc-dépendante dans
l'activation de la cholestérol estérase
.
44

---

Chapitre II - ACTIVATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE PARTIELLR~ENT
PURIFIEE
A - Puri~ication de la cholestérol estérase
-
Protocoles expérimentaux
.
51
2 -
Résultats
51
3 - Remarques
56
4 - Evaluation du poids moléculaire de la cholestérol
estérase
.
57
B - Activation de la cholestérol estérase et recherche d'activités
protéines kinases
1 -
Implication de kinases dans l'activation de la SEH par
ATP
.
59
2 -
Recherche d'implication de la PK AMPc-dépendante dans
l'activation de la stérol ester hydrolase partiellement
purifiée
.
61
3 -
Recherche d'activités protéines kinases associées à la
SEH partiellement purifiée
.
63
4 - Discussion
.
66
5 - Tentative d'identification de la PK AMPc-indépendante
aSSOClee à la cholestérol estérase partiellement
pur i fiée
~
.
67
Conclusion
.
75
Chapitre III - TRAITEMENT DE LA CHOLESTEROL ESTERA SE PARTIELLEMENT
PURIFIEE PAR DIVERSES PHOSPHATATES
A - Par une phosphata se alcaline commerciale
77
B -
Par des phosphatases lutéales bovines
.
80
1 -
Purification de la phosphata se l
.
80
2 - Traitement de la cholestérol estérase par la phospha-
tase l
.
82
RESUME ET CONCLUSION GENERALE
84
=============================
BIBLIOGRAPHIE ...........................................................................................................
87
=============

---

-
1 -
l N T R 0 DUC T ION

---

- 2 -
1 - Présentation du tissu étudié
Le corps jaune ou corps progestati: est une glande endocrine à durée de
vie limitée.
Il est formé,
après rupture du :ollicule de DE GRAAF, par trans:or-
mation des cellules de la granulosa et de la thèque interne. Ces cellules envahis-
sent alors l'espace qu'occupaient l'ovocyte et l'antrum folliculai!e.
Elles
subissent des modifications morphologiques et physiologiques, se vascularisent
on parle alors de cellules luteinisées.
Chez la vache,
la formation et le :onctionnement du cor~s progestatif
sont principalement sous le contrôle de l'hormone antéhypophysaire LH. La glande
lutéale atteint sa taille maximale
(20 à 25 mm de diamètre pour un poids de 4 à 6
grammes) vers le 10ème jour puis elle commence à regresser vers le 15ème jour
suivant l'ovulation en l'absence de ~écondation et de gestation.
Rappelons que le cycle oestrien de la vache dure environ 22 jours. La
durée de vie du corps jaune est prolongée après fécondation de l'ovule. Pour
permettre
le maintien de la gestation,
le corps jaune doit rester fonctionnel
durant les 210 premiers jours qui suivent l'ovulation. ta gestation dure environ
280 jours.
Contrairement à la glande lutéale humaine qui synthétise 7 stéroides
(SAVARD 1965)',
le corps progestatif
de vache produit seulement la progestérone et
en faible quantité la 20)1 dihydroprogestérone.
La progestérone prépare l'utérus pour l'implantation de l'oeuf, elle
assure ensuite le maintien de la gestation.
Histologiquement,
le corps jaune est constitué de deux types cellulaires
les grandes cellules
(30 à 50 rm de diamètre) qui proviendraient des cellules de la
granulosa et les petites cellules
(15 à 20 fID) dont l'origine res~ encore mal
connue. La gonadotrophine hypophysaire LH (ou lutropine)
stimule la biosynthèse de
progestérone dans les deux types de cellules. Les petites sont beaucouD olus sensi-
bles que les grandes à l'action de l'hormone luteinisante
(LH)
(J. URSELYet
P. LEYMARIE,
1979 et J. URSELY,
thèse 1980).

---

- 3 -
Dans cette étude, nous avons utilisé des cor~s jaunes prélevés sur des
vaches gravides à un moment quelconque de la gestation et congelés dans les
abattoirs de la localité, environ 30 minutes après la mort de l'animal.
2 - Voie de biosynthèse de la ~rogestérone dans le corps jaune de vache
Dans le tissu lutéal comme dans les autres organes stéroidogènes,
la
progestérone est synthétisée principalement à ~artir du cholestérol plasmatique
provenant lui-même de la biosynthèse héoatique et de l'alimentation. Le cholestérol
stéroidogène peut être également synthétisé dans le corps jaune à partir de l'acéta
te, mais ce cholestérol produit "in situ",
jouerait un rôle mineur
(D.T. ARHSTRONG
1968). Le cholestérol utilisable pour la synthèse de ~rogestérone est mis en réserv
dans les gouttelettes lipidiques sous forme estérifiée
(L. CLAESSON,
1954 ; D.T.
ARMSTRONG,
1968 i GARREN et Col.,
1971). La participation du cholestérol associé
aux structures membranaires à la stéroidogenèse serait négligeable d'après D.T.
ARMSTRONG
(1968)
puis BOYD et Col.
(1973).
Les différentes étapes de la biosynthèse de la progestérone et de la
20 fJ dihydroprogesté:r'one"
sont présentées dans la nlanche A.
Les enzymes de clivage de la chaine latérale du cholestérol
(hydroxylases
et desmolases)
sont localisées dans les mitochondries, celles qui sont responsables
de la transformation de pregnènolone en progestérone
(Hydroxy -
stéroide - dehydro-
génase et isomerase)
sont associées aux microsomes
(E.E. BAULIEU). Cependant DIHINO
en 1978, a démontré que la lutéinisation confère aux mitochondries la capacité de
convertir la prégnènolone en progestérone. De ce fait,
i l existe dans le corps
jaune deux sites de production de la progestérone
(mitochondries et réticulum endo-
plasmatiquesî.Les hydroxylases catalysent la fixation du groupe hydroxyl
(OH)
sur
les carbones en position 22 et 20 de la molécule de cholestérol, préparant en
quelque sorte
la coupure de la chaîne latérale. Celle-ci est assurée par la 20-22
des;;lolase.
La 3 f3 hydroxystéroide oxydoreductase ou 3~ hydroxy-stéroide dehydrogenase
(HSD)
oxyde en cetone la fonction alcool en 3 et le 6. ~A 4 -3
axa
stéroide
isomérase déplace la double liaison de la position 5-6 en 4-5
(E.E.
BAULIEU).

---

- 4 -
CHOLESTEROL
Cholestérol
2q..hydroxylase
20Cf,22-0IHYOROXYCHOLESTEROL
Cholestérol
•22-hydroxylase
20~-HYOROXYCHOLESTEROL
20-22 Desmolase
5
LS-PREGNENOLONE"
20B- OIHYOROPROGESTERONE
C")
-
..
(J
208 Hydroxy ..
déhyd rogénase
PROGESTERONE
PLANCHE A - Voies de biosynthèse des stéroides dans le corps jaune de vache
D'après la planche du Dr G.E. ABRAHAM, publiée dans "Research in
Reproduction", Vol.
3 , n° 5
(1971).

---

- 5 -
3 -
Role lutéotrope de LH
MASON et Col. ont montré en 1961 nuis 1962 que l'hormone lutéinisante et
la gonadotrophine chorionique h.umaine
(HCG)
stimulent la synthèse de progestérone
dans des tranches incubées de corps jaune de vache. Cet
e=fet stéroïdogénique est
soécifique à ces deux hormones gonadotropes puisque la prolactine,
l'ACTH (MASON et
Col.,
1962)
l'hormone de croissance
(SAV~RD, 1965) n'ont aucune action sur la
synthèse "in vitro" de progestérone par la glande lutéale. L'hormone antéhypophysai-
re FSH stimulerait la production de progestérone dans la limite de sa contamination
oar LH
(N. MASON et Col.,
1964).
Deouis cette démonstration,
les recherches ont été dirigées ve~les deux
voies suivantes :
1°)
le site d'action de LH
2°)
le mode d'action de LH.
4 - Site d'action de LH dans la voie de biosynthèse de la nrogestérone
Les travaux de ICHII et Col
(1963)
; KORITZ et HALL
(1965)
; HALL et YOUNG
(1968)
dans le corps jaune bovin démontrent clairement que la lutronine
(LH)
exerce
son action stéroidogenique au niveau de la conversion du cholestérol en oregnenolone.
Cette réaction
appelée réaction de clivage de la chaine latérale du cholestérol se
déroule dans les mitochondries
(ICHII et Col .. ,
1963
; HALL et KORITZ,
1963
; KORITZ
et HALL,
1965 ; HALL et YOUNG,
1968
; YAGO et Col.,
1967). Ces résultats confirment
ceux trouvés plus tôt dans la surrénale par HALKERSTON et Col.,
1961
; KORITZ et
HALL, (1964)et plus tard dans le testicule par M.DROSDOWSKY et Col. (1965) ;
.L'hormone gonadotrope LH oourrait stimuler
la synthèse de progestérone au niveau
- de l'accroissement du taux du cholestérol libre
- du transport de ce substrat dans les mitochondries
- de la conversion du cholestérol en prégnènolone.
a) Accroissement du substrat cholestérol
Le cholestérol stocké dans les tissus stéroidogènes sous forme d'esters
représenterait la principale source du précurseur des hormones stéroides
chez la
ratte,
la lapine,
la vache
(D.T. AR~1STRONG, 1968 ; GARPEN,
1968 ; BOYD et Col., 1973)
Il est donc raisonnable d'imaginer la possibilité d'un contrôle de LH sur la stéroi-
dogenèse à ce niveau.
LH accroîtrait alors le substrat en activant l'hydrolyse des
esters de cholestérol par l'intermédiaire de la cholestérol estérase ou stérol
ester hydrolase.
L. CLAESSON a rapoorté en 1954 une diminution. du taux de cholestérol
estérifié chez des lapines pseudogestantes traitées par la PMSG (la PMSG est une
gonadotrophine à activité LH et FSH) .

---

- 6 -
"In vivo" LH stimule l'activité cholestérol estérase dans les ovaires lutéinisés
de rattes. L'hypophysectomie ou l'administration d'un serum anti-LH prévient cette
activation. Cette inhibition de l'activité cholestérol estérase est suivie d'une
chute de la production de progestérone et de 20~dihydroprogestérone (BEHRMAN et
Col.,
1969, 1972 a et b). BEHRMAN et Col.
(1970)
ont montré d'autre part que
l'aminoglutethimide phosphate
(AGP), inhibiteur de la transformation du cholestérol
en prégnènolone ne bloque pas l'hydrolyse des esters du cholestérol dans les ovaires
lutéinisés de rattes. Par contre, dans le même tissu, FLINT et Col.
(1973), ont
montré une inhibition de la stéroidogénèse mais aussi de l'hydrolyse des esters de
cholestérol par l'AGP ou la cyclohéximide. Selon les travaux de ces derniers auteurs
LH n'activerait pas directement la stérol ester hydrolase dans son effet stéroido-
génique chez la ratte.
Chez la brebis, CAFFREY et Col.
(1979)
ont présenté un parallélisme entre
activation par LH de la cholestérol estérase et la synthèse de progestérone sur des
tranches incubées de corps jaune.
"In vivo", cette bonne corrélation n'est observée
que durant la première phase du cycle
(2 -
14ème jours après l'accouplement). Durant
la phase de régression du corps progestatif,
l'activité SEH continue de monter
tandis que le taux de progestérone baisse.
Il n'existe pas, non plus, de parallè-
lisme entre activation de l'activité cholestérol estérase et 9roduction de proges-
térone en début de gestation. La lutropine
(ou LH)
stimulerait également l'activité
SEH dans les cellules de Leydig
(MOYLE et Col.,
1973).
La majorité des études concernant la cholestérol estérase ont été faites
sur la surrénale.
"In vivo",
l'ACTH stimule l'hydrolyse des esters du cholestérol dans ce
tissu. Le stress provoqué par l'anesthésie stimule en accroissant le taux d'ACTH
circulant,
l'activité cholestérol estérase surrénalienne
(TRZECIAK et BOYD,
1973).
La cyclohéximide, inhibiteur de la synthèse protéique, qui bloque l'acti-
vation de la stéroidogénèse induite par l'ACTH ne bloque pas cet effet particulier
de l'hormone corticotrope
(DAVIS et GARREN,
1966). L'activation de l'hydrolyse des
esters de cholestérol n'est donc pas une conséquence de l'utilisation accrue du
cholestérol libre pour la stéroidogénèse, cette activation est plutôt un effet
direct de l'hormone sur la SEH.

---

- 7 -
Des études plus récentes de VAHOUNY et Col.
(1978), sur des suspensions
cellulaires montrent une stimulation de l'activité cholestérol estérase par l'ACTH.
J. MOORE et Col. (1967), ont démontré que l'hydrolyse des esters de
cholestérol dans la surrénale concernent essentiellement les esters polyinsaturés
de cholestérol.
b)
Transoort du cholestérol
-----~------------------
Un autre niveau de contrôle de la stéroidogénèse par l'hormone gonadotro-
oe LH pourrait être la mobilisation du cholestérol libéré par hydrolyse des esters
de cholestérol par la SEH. La conversion du cholestérol en pregnènolone s'opère
dans les mitochondries, organites qui s'avèrent incapables d'accumuler ce précur-
seur
(MOYLE et Col.,
1973). D'autre part, la cycloheximide qui bloque l'e~=et
stéroidogénique de l'ACTH au niveau de la surrenale n'affecte pas l'hydrolyse des
esters de cholestérol.L'inhibiteurde~synthèse protéique augmente la quantité de
cholestérol libre dans les gouttelettes lipidiques du cytoplasme et non dans les
mitochondries
(GARREN et Col.
1971). De ce fait
, un transporteur du cholestérol
à partir des gouttelettes lipidiques dans les mitochondries est indispensable Dour
réoondre à une stimulation de la stéroidogénèse par les hormones antéhypophysaires
LH ou ACTH dans leurs tissus cibles respectifs. GA~~N et Col.
(1971), pensent que
la cycloheximide
inhiberait
la transformation du cholestérol en prégnènolone en
bloquant la synthèse d'une proteine regulatrice de transport du cholestérol qui le
transfère
des gouttelettes lipidiques cytoplasmiques aux mitochondries. Une protei-
ne liant le cholestérol et activant la réaction de clivage de sa chaîne latérale a
été décrite par KHAN et UNGAR
(1973)
dans les cellules corticales de la surrénale.
Néanmoins l'ACTH n'augmente pas la concentration de cette proteine.
roi
La lutropine pourrait exercer son effet stéroidogénique en accroissant
ou en activant l'un des composés du comÇLexe enzymatique responsable de la transfor-
mation du cholestérol en pregnènolone : ce qui aurait pour conséauence la stimula-
tion de la cououre de la chaîne latérale du cholestérol. Une telle hYDothèse est
en parfait accord avec les travaux de ICHII et Col.
(1963), puis HALL et Col. (1968)
5 - Mécanisme biochimique d'action de LH
rôle médiateur de l'AMP cyclique
(N1Pc)
Comme d'autres hormones
(ACTH, FSH, TSH, etc ... ) l'hormone lutéinisante
ne pénètre pas à l'intérieur de la cellule où elle Droduit son effet ohysiologique,
mais se lie à un récepteur situé à la face externe de la cellule et agit par
l'intermédiaire d'un messager intracellulaire.

---

- 8 -
La lutropine provoque une augmentation du taux de l'k~Pc intracellulaire
(MARSH,
1966) et une stimulation de l'incorporation de l'adenine tritié dans le
nucléotide cyclique
(GOLDSTEIN et ~ffiRSH, 1973).
Depuis les travaux de MARSH et Col.
( 1976); et de BARSE (1976), l'A'1Pc est
considéré comme le médiateur de LH dans la stéroidogénèse du corps jaune puisqu'il
repond à tous les critères définis par SUTHERLAND et Col.
(1968)
1)
- LH augmente le taux intracellulaire de l'~~Pc
2)
- LH stimule la synthèse de l'AHPc de façon spécifique dans le corps
jaune
3)
- L'AMPc
mime
l'action de l'hormone lutéinisante.
La théophylline et l'imidazole modulent cette action respectivement en in-
hibant et en stimulant m~hosphodiesterase (PDE) oui est elle-même responsable
de la dégradation de l'k~Pc.
Comme l ' a
bien montré ~ffiRSH
(1970)
l'augmentation du taux de
l'AMPc intracellulaire par LH est due à l'activation de l'adenyl cyclase. Elle n'est
donc Das le fait d'une inhibition de la PDE. L'adenyl cyclase et les récepteurs de
LH ont été localisés dans la membrane
plasmique respectivement par SIDHU et Col.
(1975)
et MENON et Col.
(1974).
Les concentrations de l'k~Pc exogène
nécessaire
à la stimulation maxi-
male de la stéroidogénèse
(stimulation correspondante à une dose saturante de LE)
dans les tranches de corps jaune sont très élevées. Ce fait serait dû à une destruc-
tion rapide de .ce nucléotide cyclique par la PDE puisque son dérivé,
le db-AMPC,
plus résistant est 20 fois plus actif.
La montée du taux d'AMPc endogène sous l'effet de LH précède l'augmenta-
tion de la synthèse de Drogestérone. Lorsque l'on étudie "in vitro" la régulation
par LH de la stéroidogénèse dans les tranches de tissu lutéal, on observe une
corrélation entre la montée de l'AMPc et celle de la progestérone aux doses élevées
de LH (200 et 2000 ng/ml). Par contre, aux zaibles concentrations de LH
(10 ou
20 ng/ml)
on observe une augmentation sensible de la oroduction de progestérone sans
détecter une élévation du taux d'N1Pc
(MARSE et Col.
1976). Cependant l'activité
proteine kinase N1Pc dépendante est nettement stimulée pour 10 ng/ml de LH
(LING et
MARSH,
1977). Il Y aurait donc augmentation du taux d'k~Pc à cette dose de LH mais
cette augmentation serait trop ~aible pour être détectée par le dosage direct de
l'AMPc. Cet incrément d'N1Pc serait par ~ontre suffisant Dour stimuler la stéroi-
dogénèse.

---

- 9 -
L'absence de corrélation
entre élévation du taux d'~MPc intracellulaire
et l'activation de la stéroidogénèse aux ~aibles doses d'hormone a été observée
dans d'autres tissus stéroidogènes. Cette discordance a été levée grâce aux travaux
de
SALA
et Col.
sur des cellules isolées de la surrénale en 1979. Ces auteurs
ont démontré l'existence d'une corrélation entre l'augmentation du taGX d'AM?c et la
12
-10
production de corticostérone aux ~aibles doses d'ACTH (10 -
à 10
r1). En outre
la faible augmentation de la liaison de l'AMPC à son récepteur est accompagnée
d'une stimulation de la stéroidogénèse.
L'N1Pc serait donc bien le médiateur intracellulaire de LH dans la
stéroi.dogénèse luté ale .
6 - Mécanisme d'action de l ' M1Pc.
L'action de l'AMPc pourrait consister en une activation de proteines
kinases N1Pc dépendantes. La mise en évidence de ces enzymes dans le corps progesta-
tif bovin
(MENON et Col.,
1973
; GOLDSTEIN et ~ffiRSH, 1973)
et leur activation spéci-
fique par la lutropine ou l'N1Pc
(DA-qBON et Col.,
1976) ont conduit à la proposition
de l'intervention des proteines kinases A.'1Pc dépendantes
(PK AHPc-D)
dans l'action
de l'M1Pc. Cette hypothèse est rendue vrai-semblable par le fait que dans les tissus où
le mécanisme d'action de l ' A.lVlPc a été élucidé,
les PK N1Pc-D ont été étroitement
associées à l'action du nucléotide cyclique. Tel est le cas de l'effet qlycogenoly-
tique de l'adrénaline dans le tissu hépatique
(RALL et Col.,
1957 ;BIRNHAUN et Col.,
1977) ou musculaire
(POSNER et Col.,
1965 ; SODERLING et Col.,
1970), du glucagon,
dans le foie
(RALL et Col.,
1965 ; SUDILOVSKY et Col.,
1974)
et de l'effet lipoly-
tique de l'adrénaline dans le tissu adipeux
(SODERLING et Col.,
1973).
Les proteines kinases catalysent la fixation du groupe phosphoryl terminal
d'un nucléotide triphosphate, généralement l'ATP sur les résidus serine ou thréo-
nine d'un substrat protéique. Ces réactions nécessitent la présence d'ions divalents
le plus souvent les ions magnesiwn
U1g ++).
Les phosphoprotéines phosphatases assu-
rent une grande labilité des groupes phosphoryl fixés aux protéines. Le système
ATP-asique ainsi constitué assure la régulation de nombreuses fonctions
cellulaires.,
Proteine +
ATP PK
)
Proteine - (PO
)
+
Mgt.
4
ADP

---

-
10 -
Il existe deux grandes familles de Droteines kinases
-
"In Vitro",
les Dremières jJréfèrent les 1?roteines acides comme la caséine,
la
Dhosvitine. Elle sont actives en absence d'A~1Pc d'où le nom de jJroteines kinases
M~Pc Indépendantes.
-
Les secondes utilisent de préférence "in vitro" les substrats basiques tels la
Drotamine et les histones. Elles sont activées par l'M~Pc d'où l'appelation de
proteines kinases F01Pc Dépendantes. Elles étaient autrefois appelées phosphoryla-
ses kinase-kinases parce que la phosphorylase kinase est l'un de leurs Dremiers
substrats naturels connus.
Les proteines kinases W~Pc Dépendantes ont une grande spécificité de substrat.
Elles ne phosphoryleraient la caséine commerciale que dans la limite de sa
contamination Dar les histones
(NIMMO et COEHN,
1978).
Les proteines kinases M1Pc dépendantes sont constituées de deux sous-
unités régulatrices
(R ) et deux sous-unités catalytiques
(C ). Sous sa forme
2
2
complexée,
l'enzyme est inactive. Dans les tissus non stimulés,
les protéines kinasffi
M1Pc dépendantes sont essentiellement sous la forme d'holoenzyme R
C . Nous savons
2
2
maintenant grâce aux travaux de nombreux auteurs sur différents tissus que l'~~Pc
dissocie l'holoenzyme en se liant à la sous-unité régulatrice
(R)
---~) R
-
(AMPc) 2 + 2 C
2
.~
Ce sont les sous-unités catalytiques
(C)
ainSi«lig~jrées_qUi~ç~~talYsent les réactions
de phosphorylation évoquœs plus haut.
? c
\\t<;.~
/.J
~_; .~(
0 '
)
thermos~able Dr~:éiqUe~'(HSPI)
L'existence d'un inhibiteur
de-Droteines
'\\:''.- ' , - ~- ,):C:
kinases M1Pc cléDendantesa été:- démontrée par- t'7ALSH~êt CbI. dar-is le muscle squeletti-
-
"" -th
.1::,:#
·'f)l7rSupè(~
que de lapin et oar DARBON en 1977 dans le corps jauDË=""de:o:-ra vache. Cet inhibiteur
se lie de façon spécifique à la sous-unité catalytique des oroteines kinases ~~Pc
dépendantes empêchant celle-ci de phosphoryler leurs substrats jJrotéiques.
L'activation des proteines kinases N1Pc dépendantes constituerait donc le
principal mécanisme par lequel pourrait s'exprimer l'information ajJportée à la
cellule par l ' hormone gonadotrooe
et transmise par l ' M1Pc.
Les études de phosphorylations de proteines cytosoliques entreprises dans
notre laboratoire
(DARBON et Col.,
1980)
sur les cellules isolées du corps jaune
de vache confortent cette hypothèse.
L'hormone lutéinisante et le dibutyryl N1Pc
stimulent de façon spécifique la jJhosphorylation de certaines protéines cytosoliqueso

---

-
Il -
Cette phosphorylation est accompagnée d'une augmentation du taux d'~~Pc intracellu-
laire
(dans le cas de LH)
et d'une augmentation de la production de progestérone.
b)
~ôle des proteines kinases ~~Pc dépendantes dans la stéroidogénèse
---------~------------------------------------~---~---~-----------
Si l'on admet que l ' ~-,\\1Pc est bien le second messager dans la stimulation
de la stéroidogénèse lutéale,
i l est nécessaire d'examiner son mode d'action au
niveau des 3 sites possibles d'action de LH envisagés plus haut.
b-1)
Au niveau de l'hydrolyse des esters de cholestérol
En 1979, C. ÉISGAIER et Col. ont montré une activation de la stérol ester
hydrolase par un système faisant intervenir les PK N~Pc dépendantes dans le corps
progestatif de vache. D'autre part, un ~arallélisme entre activation de la
SEH et la production de nroqestérone a été observé par CAFFREY et Col.
(1979),
sur
des tranches de tissu lutéal ovin, incubées en présence de l ' AI'1Pc.
Ces résultats concordent avec ceux obtenus dans la surrénale
(N.H.
TRZECIAK_ et BOYD,
1974 i S. r-]ALLAT et Col.,
1976 i G. J.
BECKETT et BOYD, 1977
RAY~.C.PITTMAN et Col. ,1977
NAGHSHINEH et Col.
1978)
et dans les tissus adipeux
RAY C. PITTr1AN et COl.,1975 et J.C.
KHOO et CoL,
1976)
où les proteines kinases
N1Pc dépendantes sont indis~ensables pour activer la cholestérol estérase partielle-
ment purifiée. L'inhibiteur protéique thermostable de PK . Ar1Pc-D inhibe par ailleurs
cette activation.
L'activation de la stérol ester hydrolase dans le corps jaune, la surré-
nale ou les tissus adipeux serait donc semblable au mécanisme d'activation de la
lipase dans les adipocytes où l'intervention des .t?rotéines ~~Pc dépendantes a été
démontrée
(J.D. CORBIN et CoL, 1970 i J.K. HUTTUNEN et CoL,
1970 et 1971
i
SANTHANA~ et Col.,
1971).
Par contre GOLSTEIN et ~ARSH, (1973)
étudiant le cor.t?s jaune de vache,
n'ont pas montré d'activation de la cholestérol estérase, brute ou très partielle-
ment .t?urifiée, par l'~~Pc seul ou associé à la Drotéine kinase W1Pc dépendante.
b-2)
Au niveau du transport du cholestérol
L'hypothèse d'une régulation de la stéroidogénèse par l'intervention des
proteines kinases A~1Pc dépendantes n'est oas incompatible avec l'existence d'un
système de régulation de la stéroidogénèse mettant en jeu une .t?rotéine de transport
du cholestérol permettant de transférer celui-ci des gouttelettes lipidiques du
cytoplasme aux mitochondries. Nous ne possédons néanmoins pas d'argument pour étayer
cette hypothèse.

---

-
12 -
b-3)
Au niveau de la conversion du cholestérol en orégnènolone
Les étuàes "in vitro" de CARON et Col.
(1975)
renforcent la possibilité
d'une régulation à ce niveau. Ces chercheurs ont reconstitué un co~olexe enzymati-
que capable de couper la chaine latérale du cholestérol et comorenant le cytochrome
P 450 de corps jaune bovin et l'adrenodoxine réductase provenant de la surrénale
bovine. Ce système enzymatique qui transforme le cholestérol en prégnènolone est
légèrement activé par la PK AMPc déoendante en présence d'ATP. La prot~ine kinase
N1PC dépendante phosphorylerait le cytochrome P 450. Cette étude ayant été effectuée
sur un système enzymatique reconstitué,une con~irmation sur la cellule intacte sti-
mulée par LH dans le corps jaune ou l'ACTH dans la surrénale semble nécessaire.
Des résultats contraires ont été rapportés par HOF~AN et Col.
(1978), à la
suite d'un travail similaire sur le tissu surrénalien.
Ces chercheurs ont étudié la conversion du cholestérol en prégnènolone par
un extrait mitochondrial en présence de la sous-unité catalytique très purifiée
de proteine
kinase
AMPc dépendante.
Il n'y aurait pas de stimulation de la
conversion du cholestérol en prégnènolone aux faibles taux d'incorporation de 32 p
dans le système enzymatique.
Pour ces auteurs l'ACTH n'activerait pas la stéroidogé-
nèse par phosphorylation de l'un des composés du complexe enzymatique responsable
de la transformation du cholestérol en prégnènolone.
La planche B illustre les connaissances et les hypothèses sur le mécanisme
biochimique d'action de l'hormone lutéinisante sur le coros jaune en général et en
particulier chez la vache.

---

-
13 -
CELLULE
LUTEALE
Membrane
P'asmique
\\
R S: PK AM Pc-O
2
ATP
Inactive
Gouttelette Lipidigue.
2C: PK AMPc-O
_ _
/~
oct;v.
/
\\
\\
Mitochondrie
Enzymes
Cholestérol
•
Prègnenolone
deCI;V/
Progestérone
Prègnenolone
/
Progesterone
- - -...~ Voies métaboliques
biochimiques
.....,..--_.Transport d'une substance à travers
les membranes d'une cellule
~ -... Effets possibles de l'AMPc sur
le processus stéroïdogénique
PLANCHE B -
Schéma hypothétique du mécanisme biochimique d'action de LH dans
le corps jaune bovin.

---

-
14 -
SITUATION DU PROJET DE RECHERCHE
============~===================
Nous nous sommes pro90sés dans ce travail d'étudier le wécanisme d'acti-
vation de la cholestérol estérase du tissu lutéal par un système de phos9~orylation
faisant intervenir la protéine kinase dépendante de l'N1P cyclique.
Nous avons choisi comme modèle expérimental le tissu lutéal de vache
gravide.

---

-
15 -
PLAN DU TRAVAIL EXPERI!1ENTAL
============================
L'activité cholestérol estérase a été évaluée par la mesure du cholestérol
tritié libéré à partir de l'oléate de cholestérol marqué. Ce substrat n'étant pas
disponible dans le commerce, nous avons débuté nos travaux par la synthèse de
l'oléate de cholestérol tritié.
La mise au ~oint du dosage de la cholestérol estérase a été effectuée en
utilisant tout d'abord l'enzyme provenant de pancréas bovin
et disponible dans le
commerce.
Ce travail préliminaire terminé, nous avons entre~ris l'étude de l'acti-
vation de l'enzyme lutéale ~résente dans le cytosol. Cette étude comporte :
-
la vérification "in vitro" de l'activation de la cholestérol estérase
par un mécanisme de phosphorylation,
-
la détermination des conditions d'activation optimale de l'enzyme,
/
- la recherche d'une implication de protéine kinase N1Pc dépendante dans
l'activation de la stérol ester hydrolase.
L'absence d'inhibition par l'inhibiteur protéique s?écifique de PK N1Pc-D
(HSPI) de l'activation par phosphorylation de l'enzyme SEH, dans nos conditions
expérimentales, nous a conduit à postuler l'intervention d'une protéine kinase
~~Pc indéoendante dans le mécanisme d'activation de la cholestérol estérase. Nous
avons alors entrepris la purification de l'enzyme SEH. Cette étude constitue la
seconde partie de notre travail. La préparation partiellement purifiée de cholesté-
rol estérase était pratiquement débarassée de toute contamination par la protéine
kinase ~~Pc dépentante et gardait cenendant toute sa capacité d'être activée par
.~ t
simple pré incubation en présence d'~~Pc-Mg
. La ?résence dans cette préoaration
de SEH d'une caséine kinase co-purifiée avec l'enzyme nous
a
suggéré la possibi-
lité d'une intervention de cette protéine kinase indépendante de l'AMP cyclique
dans le mécanisme d'activation ?ar phosphorylation de l'enzyme.
Pour tenter de mettre en évidence une régulation ?ossible de cette protéiœ
kinase AM~indépendante oar la protéine kinace AMPc dépendante, activable par LH
dans le tissu lutéal, nous avons ensuite cherché à obtenir une inhibition du phéno-
mène d'activation par phosphorylation de la SEH en soumettant la oréoaration de
cholestérol estérase à l'action de diverses phosphatases. Cette dernière étude
constitue la troisième partie de notre travail.

---

-
16 -
/
MAT E RIE L
E T
MET H 0 DES
=======================================

---

-
17 -
A - PRODUITS CHIMIQUES ET MATERIEL DE LABORATOIRE
==~=========~================================
Origine Commerciale
PROTEINES :
Histone type II A
SIGMA
Caséine
SIGMA
Ki t
de protéines
PHARMACIA
Protéine kinase AMPc-dépendante de muscle de lapin
SIGMA
Inhibiteur de protéine kinase AMPc-dépendante
(HSPI)
de muscle de laDin ou de coeur de boeuf
SIGMA
Phosphorylase b
SIGMA
- phosphorylase kinase
SIGMA
- phosphatase alcaline
SIGMA
Albumine sérique bovine
(BSA)
SIGMA
L'inhibiteur de caséine kinase type G (CKGI)
nous a été aimablement donné par
le professeur E.M. CHAMBAZ. Nous le prions de bien vouloir trouver ici nos
sincères remerciements.
NUCLEOTIDES :
/
ATP
SIGMA
GTP
SIGMA
AMPc
SIGMA
PRODUITS RADIOACTIFS :
[lG(, 2rf,.(n)] _3H-cholestérol
. N1ERSHN1
ATP- l
_ 32p
. N1ERSHN1
CHROMATOGRAPHIE :
DEAE-cellulose DE 52
\\'lliATMAN
Hydroxyapatite Bio-gel HT
LABORATOIRE BIO-RAD
Sephadex G 25, G 200
PHARl'1ACIA
Alumine
SIGHA
Colonnes
PHARMACIA
Plaques pour CCH GF 254
MERCK
AUTRES PRODUITS
:
Cholestérol
PROLABO
Oléate de cholestérol
SIGMA
Mercaptoéthanol
MERCK
Dithiothreitol
SIGMA
.
d
++
Aceta te
e Hg
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. MERCK
++
Chlorure de MG
"
MERCK

---

-
18 -
Soude
MERCK
Acide acétique
. . . . • . . . . . . . • • . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . • . • • MERCK
TCA • . . . • • • . • . • • . • . • . • . . . • . . . • . . • • . . • . • . . • • • . . . . . . . • . • • • • MERCK
Réactif de folin
. • • . • . . • . . . . . • . . . . . . • . . . . . . • . . • . • . . • . • . . MERCK
Léci thine
• . . • • . . . . • . . • • • • . • . • • . . • . • . • . ~ . . . . . . . . • . . . • . • .•
SIGMA
Taurocholate
. . . . . . • . . . • . . . . . . . . . • . • . . • . . . • . . . . . • . . . . . • . .
NUTRITIONAL BIOCHR1v1I-
CALS CORPORATION
HK
P 04 et H K P 04
. • . . . . . • . . . • . • . . . . • . . • • . . . . • . . . . . . . . . • MERCK
2
2
Tris
(hydroxymethyl)
aminomethane
. . • • . . • . . . • . . . • . • • . • • . .
MERCK
Dig i tonine
. • • . . . • . . . . . . . . . . . • . • • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . .
SIGMA
NaF
• . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . • . • • • . . • . . . • . . . . . . . . . . • • . • • . MERCK
Théophylline
. . . . . • . • • . . . . . . • . . • • • • • • . • . . • . . . . . • • . . • . • . . . MERCK
Chlorure de calcium
• . . . • . . . . . . . . . • . • • • • . . • . . . . • . • . . • . . . • MERCK
Azide de sodium
. . . . . . . . . • • . . . . . • . . • . . • . . • . . : . . . . . . . . . . . . MERCK
Chlorure de sodium
MERCK
Sulfate d'ammonium
MERCK
Imidazole. • . . • . . . . . . . . • . • . . . . . . . • . . • . . . . . . • • . . . • . . . . • . . . .
SIGt1A
/
Saccharose . • • • • • . . • . . . . • . . . . • . . • . . . . • . . . . . . . . • . • • . . • . • • . MERCK
Membrane de dialyse
. . . . . . . . . • . . . . . • • . • . . . . . . . . . . • • . . . . . .
POLYLABO
Liquide de scintillation
(OSC)
AMERS HAM
EAU DISTILLEE POUR TAMPON
. . . . . • . • • . . . • . • . • . . . • . . . . • . . . • • • • • • .
BIOSEDRA
SOLVANTS
• . • • . . . . • . . . . . . . • . . . . . . • • . . . • . . • • . • . . . . . . . • . . . • . • . . • • MERCK ou PROLABO
ou CARLO ERBA.

---

-
19 -
B -~ŒTHODES
============
1 -
SYNTHE SE DE L'OLEATE DE CHOLESTEROL TRITIE
Nous avons synthétisé et purifié l'oléate de cholestérol marqué selon la
méthode décrite par Daniel DEYKIN et DE r'1ITT S. GOODMAN en 1962.
a)
-
Principe
L'acide
oléique préalablement activé en chlorure d'acide réagit avec la
fonction alcool en C
du cholestérol pour donner un ester
= l'oléate de cholestérol.
3
[3 1
H
cholestérol + chlorure d 'oléate ~ oléate de [3Hl-cholestérol + Hcl
La fixation par la pyridine, de l'acide chlorhydrique libéré permet à la
réaction de s'opérer dans un seul sens.
/
L'oléate de cholestérol formé est extrait à l'éther de pétrole, lavé, puis
purifié sur colonne d'alumine.
b)
- Milieu réactionnel
Dans un tube à col rodé, nous avons d'abord dissout du cholestérol froid
('::!
14,25 pmoles)
dans du benzène avant d'ajouter 1 mci
de
Ga.(, 20( (n)3ri] -choles-
térol
(~ 23,25 nmoles). Après évaporation sous azote, le résidu sec est repris par
800 pl de pyridine. La réaction est amorcée par l'addition de 36,lmg
(~40 pl) de
chlorure d'oléate
(~
120 pmole). La réaction se poursuit sous azote à
55°C pendant
3 heures.
La réaction est stoppée par abaissement de la tem~érature. Pour cela, le
milieu réactionnel est laissé à 4°C oendant 16 heures environ.
c)
-
Extraction
Le lendemain,
la pyridine est évaporée sous azote. On ajoute un peu d'eau
au résidu sec.
L'oléate de cholestérol et le cholestérol n'ayant pas réagi sont
extraits 3 fois à l'éther de pétrole. Les phases étherées sont transférées dans une
ampoule à décanter, lavées 2 fois successivement par Hcl
(0,5 M)
NaOH (0,1 M) dans
de l'éthanol 50 % et de l'eau. La phase étherée ainsi lavée est évaporée sous azote
et reprise par 2 ml d'éther de pétrole.

---

-
20 -
d)
-
Puri~ication de l'oléate de cholestérol tritié sur gel d'alumine
On mélange dans un "Erlen" à col rodé la g d'alumine et 300 pl d'eau.
Après hydratation de l'alumine, on y ajoute de l'éther de pétrole. La colonne est
ensuite montée dans une pipette graduée de la ml sur 1 hauteur de 4,5 cm environ.
L'extrait étheré en solution dans 2 ml d'éther de pétrole est alors
déposé sur la colonne. L'oléate de cholestérol est d'abord élué par 12 ml d'un
mélange
(volume à volume)
benzène/éther de pétrole.
Le cholestérol libre
(n'ayant pas réagi)
est ensuite élué par la ml d'un
mélange
(volume à volume)
acétone/éther éthylique.
Les fractions contenant l'oléate de cholestérol marqué sont rassemblées
et évaporées sous azote.
Le résidu sec est repris par du benzène. La pureté de
l'oléate de cholestérol synthétisé est vérifiée par chromatographie en couche mince
comme indiqué ci-dessous.
/
e)
- Chromatographie sur couche mince de silice
200 pg de cholestérol froid et 200 pg d'oléate de cholestérol froid sont
dissouts séparément dans deux tubes à col rodé par 200 fi d'acétone.
100 pl sont prélevés de chaque tube et mélangés dans un troisième tube.
On ajoute à ce mélange ~
la pl d'oléate de cholestérol synthétisé. Les trois
échantillons ainsi constitués
(cholestérol froid
; oléate de cholestérol froid
cholestérol froid + oléate de cholestérol froid + oléate de cholestérol marqué) sont
déposés séparément sur 3 plaques de silice.
Les plaques sont ensuite trans~érées dans une cuve contenant environ
100 ml du mélange de solvants suivants: hexane, ether ethylique, acide acétique
(90/10/1) .
A la fin de la première migration, les plaques sont retirées de la cuve
et séchées pendant environ 1 heure.
Les plaques sont transférées ensuite dans la cuve contenant le mélange
de solvants suivants: hexane,
ether éthylique, acide acétique
(75/25/2).
A la fin de la deuxième migration, les plaques sont à nouveau séchées et
les plages de cholestérol et d'oléate de cholestérol sont révélées à la vapeur
d'iode.
La plaque sur laquelle a été déposée le mélange de cholestérol et de son
ester est grattée à l'endroit correspond au cholestérol d'une part et à l'oléate de
cholestérol d'autre part. La silice grattée est mise en suspension dans 1 ml
d'éthanol.

---

- 21 -
Après agitation et centrifugation,
100 pl du surnageant sont prélevés
et la radioactivité est évaluée dans chaque cas.
Seul la plage correspondant à l'oléate de cholestérol renferme de la
radioactivité. La fraction de l'oléate de cholestérol marqué est donc excemote de
cholestérol libre.
L'oléate de cholestérol synthétisé est alors stocké au réfrigérateur et
peut être conservé jusqu'à 6 mois, au-delà de cette date,
l'ester de cholestérol
doit être à nouveau purifié sur colonne d'alumine hydratée.
2 - OBTENTION DU CYTOSOL DES CELLULES LUTEALES
a)
- Récolte du tissu
Les ovaires de vaches gravides sont collectés dans les abattoirs de la
localité environ 30 minutes après la mort de l'animal.
Ils sont congelés sur plé\\ce
dans une enceinte thermostatée contenant de la glace carbonique. Les gonades femel-
les ainsi récoltées sont ramenées au laboratoire où elles sont stockées à -
20°C
jusqu'à la dissection. A cette température, elles peuvent être conservées au-delà
de 3 à 6 mois.
b)
-
Dissection
Les ovaires préalablement décongelés sont disséquésrà 4°C dans du liquide
physiologique. Les corps jaunes, découpés en quartiers,
sont débarassés de leur
enveloppe conjonctive, pes~s et emincés aux ciseaux.
c)
-
Homogénéisation -
Le tissu lutéal est broyé à O°C par un homogénéisateur
(Potter )
dans' l'un des tam1.?0ns ci-dessous
(1 g de tissu pour 3 m~ de tam1?on)
- Tampon A
Tris 10 ITLIVJ,
PH 7,4, Glycerol 10 %, 11ercajJtoéthanol 6 mM
- Tampon B
phosphate de potassium 100 ITLIVJ PH 7,4,
azide de sodium
0,02 % et 3-6 mM
de mercaptoéthanol
- Tampon C: phosphate de potassium 100 mM PH 7,4 ; aziàe de sodium 0,02 %
1 m!-1 de di thiothrei tol avec ou sans 250 m!-1 de sacharose.
d)
- Ce~trifugation
L'homogénat est centrifugé à 4°C pendant 30 minutes à 18.000.g avec une
centrifugeuse MSE "High speed 18". Après élimination de la couche lipidique qui
flotte à la surface et du culot,
le surnageant est ensuite soumis à une ultracentri-
fugation à 4°C pendant 1 l'Eure .à1ü5.000.g dans une centrifugeuse MSE "Super speed 65".
Le surnageant 105.000.g
(S105,g
) à nouveau débarassé du culot et de la couche
lipidique est appelé cytosol. Il représente la fraction soluble de la cellule
débarassée de tous les organites intracellulaires.

---

- 22 -
3 -
PURIFICATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE
a)
-
Sephadex G 25
a-1)
~~~~~~~~~~~_~~_2~~
Le sephadex G 25 en suspension dans du tampon phosphate de potassium
10 ~1 est placé dans un bain-marie d'eau bouillante pendant 2 heures.
Après une nuit à 4°C,
la colonne
(Pharmacia
:
2,6 x 40 cm)
est remplie sur
une hauteur de 30 cm environ,
lavée avec le tampon D (Tampon D : phosphate de potas-
sium 10 mM
PH 7,4
; 3 mM de mercaptoéthanol ou 1 mM de dithiothreitol).
a-2)
Elution de la colonne
Après introduction dans la colonne d'un volume de la solution protéique
inférieure à 40 ml,
les protéines sont éluées avec le tampon D.
b)
-
Préci?itation au sulfate d'ammonium
Le cytosol est d'abord additionné à 4°C de sulfate d'ammonium jusqu'à la
concentration de 25 % (poids/volume).
30 minutes après la dissolution du sulfate
d'ammonium,
i l est centrifugé à 10.000.g durant 10 minutes. Le culot est éliminé et
le surnageant est additionné à nouveau de sulfate d'ammonium jusqu'à la concentra-
tion de 60 %. 30 minutes après la dissolution du sulfate d'ammonium,
la solution
protéique est à nouveau centrifugée à 10.000.g durant 10 minutes. Le culot est remis
en solution dans le tampon D et la solution protéique est filtrée sur gel de sepha-
dex G 25 afin de séparer protéines et sels.
c)
-
Chromatographie sur DEAE-cellulose
c-1)
~~~2~~~~~~~_~~_~~_~~~~~~~
La DEAE-cellulose prégonflée
(DE 52)
est mise en suspension dans le cons-
tituant acide du tampon phosphate de potassium ajusté à PH 4,2. La résine est
dégazée sous agitation douce à
l'aide d'une trompe à vide. Le PH est ensuite réajus-
té à 7,4 avec le constituant basique du tampon phosphate de potassium.
Après élimination des fines
(nuage de petites particules dans le surna-
geant) ,la résiné est comp~ctée dans une colonne (Pharmacia 2,5 x 40 cm)
sur une
hauteur de 25 à 30 cm. La colonne est lavée avec le tampon phosphate de potassium
10 mM PH 7,4 jusqu'à ce que le PH à
l'entrée et la sortie de la colonne soit le
même.

---

- 23 -
c-2)
Elution des protéines
~
------------~--------
Environ 30 ml d'une solution protéique sont déposés dans la colonne oui
est ensuite lavée avec le tampon D. L'élution des protéines retenues par la résine
est effectuée par un gradient de concentration linéaire de tampon phosphate de
potassium PH 7,4
(10 à 500 ~~, volume 700 ml)
à un débit de 30 à 60 ml/ho
Les fractions renfermant l'activité cholestérol estérase sont rassemblées
et leur volume est réduit sur membrane: M1ICON Pt1 10.
d)
-
Hydroxyapatite
d-1)
~~~e~~~~~~~_~~_~~_~~~~~~~
Le gel Blb~ RAD HT est lavé 3 fois avec le tampon phosphate de potassium
10 mM PH 7,4.
Une colonne pharmacia
(2,6 x 40 cm)
est remplie sur une hauteur d'environ
35 cm avec le gel d'hydroxyapatite. La colonne est ensuite lavée avec le même tampon
jusqu'à ce que le PH à l'entrée et ~.la sortie soit le même.
Environ 30 ml d'une solution protéique sont introduits dans la colonne.
Après lavage de la colonne par le tampon D,
les protéines retenues sont éluées par
un gradient de concentration linéaire. àetampon phosphate de potassium PH 7,4
(10 à 500 mM, volume 700 ml)
à un débit de 20 à 45 ml/ho
Les fractions protéiques ayant une activité stérol ester hydrolase sont
rassemblées et précipitées ensuite au sulfate d'ammonium 70 % (Poids/volume)
oendant
30 minutes.Après centrifugation à 10.000.g pendant 10 mIT, le culot est remis en
solution dans le tampon D,
la solution protéique est ensuite soumise à une filtra-
tion sur gel de sephadex G 25.
e)
-
Sephadex G 200
e-1)
~~~2~~~~~~~_~~_~~~
Le sephadex G 200 en suspension dans du tampon phosphate de potassium
10 mM PH 7,4 est
placé dans un bain-marie d'eau bouillante durant 5 heures.
Après une nuit à 4°C,
la colonne
(Pharmacia 2,6 x 40 cm)
est remolie sur une hau-
teur de 30 cm à un débit de 15 ml/ho
0,5 ml d'une solution de bleu dextran à 1 % est passée dans la colonne
pour vérifier l'homgénéité du l i t et déterminer le volume mort de la colonne.
e-2i Elution
4 ml de la solution protéique concentrée sont introduits dans la colonne
et les protéines sont éluées à un débit de 10 ml/h avec le tampon D, les fractions
contenant l'activité cholestérol estérase sont réunies,
concentrées sur membrane
~MICON P~ 10.

---

- 24 -
4 - ETALONNAGE DE LA COLONNE DE SEPHADEX G 200
4 à 10 mg de protéines dont le PM est connu
(ribonucléase A, chymotrypsino·
gène A, ovalbumine, albumine sérique bovine
(BSA) , aldolase, catalase, ferritine)
sont déposés séparément sur
la colonne et les protéines sont éluées avec le
tampon D à un débit de 10 ml/ho
La droite représentant la variation des volumes àe rétention en~onction
du logarithme de la ma~emoléculaire est tracée sur un papier millimétré (Semi-log)
à partir des données expérimentales.
5 - PREPARATION DE LA PHOSPHATASE LUTEALE
Nous avons préparé la phosphatase l
selon la méthodologie décrite par
H. BRANDT et Col. pour la ohosphorylase phosphatase de foie de lapin.
Les corps jaunespréparés comme dans le paragraphe 2b du même chapitre
sont homogénéisés dans le tampon E (Tris 10 mM PH 7,2, glycérol 10 % et 0,5 ~~
de dithiothreitol) .
L'homogénat est centrifugé à 4°C pendant 30 minutes à 18.000.g '(dans le
MSE High Speed 18). Culot et couche lipidique sont éliminés. Le surnageant 18.000.g
C!
(~18.g)
constitue la source brute de phosphata se I.
a)
- Précipitation à
l'acide acétique 1 N
Le PH du surnageant 18.000.g est ajusté à 5,8 avec une solution normale
d'acide acétique. Après 15 minutes d'agitation à 4°C, la solution protéique est
centrifugée à 10.000.g pendant 10 minutes. Le culot est éliminé et le PH du surna-
geant est réajusté à 7,2 avec du Tris 2M.
b)
- Précipitation au sulfate d'ammonium à 4°C
Le sulfate d'ammonium est ajouté au surnageant de l'étape précédente
jusqu'à la concentration de 40 % (Poids/volume)
et laissé en agitation nendant 30
minutes. Après centrifugation à 10.OOO.g ~endant 10 minutes, le culot est éliminé
et le surnageant est à nouveau additionné de sulfate d'ammonium jusqu'à la concen-
tration de 70 %. Après centrifugation, le culot est remis en solution dans du
tampon Tris 20 mM contenant 1 ~1 de Mg c1 .
2
c)
-
Précipitation à l'éthanol à 4°C
Les protéines sont précipitées par addition de 5 volumes d'éthanol 95°.
Le mélange est centrifugé immédiatement pendant 4 minutes à 5.000.g. Les protéines
non dénaturées sont solubilisées par homogénéisation 2 fois successives du culot
dans le tampon E. La solution protéique obtenue et les aliquots des étapes précéden-
tes sont dialysés pendant une nuit contre
le tampon E.

---

- 25 -
6 - MESURE DES PROTEINES
Conformément à la méthode de LO~ffiY.
7 - DOSAGE DE LA CHOLESTEROL ESTERASE
a)
- Principe du dosage
~3 ]
L'activité cholestérol estérase est évaluée par la mesure du lH -choles-
térol libéré à partir de l'oléate de cholestérol selon le schéma suivant:
8 H]
L
cholestérol-oléate
SEH ~ \\!H] cholestérol + acide oléique.
Le cholestérol libéré est 9récipité à la digitonine et la radioactivité
est ensuite évaluée.
b)
- Milieu réactionnel
-
50 pl de cholestérol oléate froid
(180 jll1 par tube de dosage)
100 pl d'oléate de cholestérol marqué au tritium
(250.000 cpm par tube
de dosage)
-
10Dpl de lécithine
(4 ~~ par tube de dosage)
sont évaporés sous azote.
Le résidu sec est repris par 3 ml de tampon taurocholate
(phosphate de potassium 20 mM PH 7,4
; BSA 0,2 %
taurocholate 10 mM). Le substrat
ainsi constitué est d'abord émulsionné au Pot ter
puis incubé à 37°C pen-
dant 15 minutes pour stabiliser les émulsions.
100 pl de l'émulsion sont ajoutés à
100 pl de la solution protéique dont
on veut tester l'activité. La réaction, amorcée par l'addition du substrat à l'en-
zyme se poursuit pendant 1 heure à 37°C.
c)
- Précipitation des protéines par un mélange acétone/éthanol
La réaction est arrêtée Dar addition de 4 ml d'un mélange acétone/éthanol
(volume à volume)
contenant du cholestérol froid
(18,6 mg de cholestérol froid pour
200 ml du mélange acétone/éthanol) .
Le cholestérol froid rajouté sert d'entraineur pour le cholestérol libéré
durant la réaction enzymatique.
Les tubes sont agités au vort~ ?uis laissés à 4°C pendant 30 minutes.
Ils sont ensuite centrifugés pendant 20 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée
(JOUAN 95 K). Les culots sont éliminés.

---

- 26 -
d)
-
Précipitation du cholestérol à la digitonine
200 mg de digitonine sont dissouts dans la ml d'eau. On y ajoute le même
volume d'éthanol absolu.
500 pl de ce mélange sont ajoutés au surnageant.
Les tubes sont agités pendant quelques secondes au vortex et laissés au
renos à 4°c pendant au moins une heure.
Ils sont ensuite centrifugés pendant 20
minutes à 3.700 tours par minute.
e)
- Lavage du culot
Le surnageant est éliminé. Le culot est ensuite lavé successivement par
4 ml d'un mélange acétone/ether éthylique
(volume à volume) et 4 m:l d'éther éthyliaue
pu~.Après le dernier lavage, le culot est séché et remis en solution dans 0,5 ml de
méthanol, puis transféré dans une fiole de comptage. en verre. On y ajoute la ml de
liquide de scintillation pour les solvants organiques
(OCS).
On mesure alors la quantité de cholestérol libéré par mesure de la radioac
tivité en scintillation liquide.
Un tube dans lequel 100 pl de tampon phosphate de potassium
(au
lieu de
la solution d'enzyme)
sont ajoutés au substrat sert de contrôle
(blanc).
8 -
ACTIVATION ET
INACTIVATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE
a)
- Activation
La préparation d'enzyme est préincubée à 37°C en présence d'ATP
(1 à 2 mM)
5
de ~1g t+
(2,5 à 5 mM)
et si nécessaire d' A..~Pc (5
10-
M)
et de PK AMPc Dépendante
(la à 100 Fg). L'activation est arrêtée 15 minutes nlus tard par addition d'EDTA
à la concentration finale
de la ~~.
L'EDTA compiexe
les ions Mg~~
, inhibant par conséquent la phosphoryla-
tion possible des protéines.
b)
-
Inactivation de l'enzyme
1
La préparation de SEH est préincubée avec diverses phosphatases suivant
les temps indiqués
(20 minutes et 6 heures)
avant ou après activation par l'ATP -
MgH
A la fin des préincubations, la réaction
d'inactivation
est stoppée par
addition d'EDTA à la concentration finale de la mM.
L'activité cholestérol
estérase est mesurée après activation ou inactiva-
tion selon le protocole décrit ci-dessus.

---

- 27 -
9 - MESURE DE L'ACTIVITE HISTONE-KINASE
,\\
1/
La méthodologie adoptée pour
le dosage des histone-kinases est la même aue celle
utilisée par DARBON dans sa thèse
(1977).
a)
-Principe
L'activité histone-kinase est mesurée par le transfert du groupe phos-
phoryl,
situé en position ~de l'ATP sur le substrat histone de thymus de veau.
PK
Histone
+
ATP
Mg~
Histone - (:P0 )
+
ADP
4
Après incubation du milieu réactionnel,
l'histone phosphorylée est
9récipitée au TCA (acide trichloracétique)
lavée et la radioactivité est évalu/e
par scintillation liquide.
b)
- Milieu réactionnel
Nous avons utilisé un milieu réactionnel d'un volume total de 200 pl
constitué 9ar un tampon glycéro-phosphate
PH 6,5,
50 mM et contenant:
-
50 fi de la solution protéique dont on veut tester l'activité
-
1 mg/ml d'histone
- la m~ de NaF et 2 mM de théonhylline
- la mM de Mg++
0,1 mM d'ATP froid et 500.000 corn d'ATP ~_ 32 p
-
si nécessaire de l'AMPc à la concentration de 5 pM est ajouté.
La réaction est amorcée par l'addition du comolexe ATP _ ~g~4
c)
- Précipitation des protéines au TCA
Après la minutes d'incubation à 37°C, les orotéines sont 9récipitées Dar
2 ml de TCA 10%.
200 Fi d'une solution de BSA à 0,63 % sont ajoutés dans chaque tube oour
servir d'entraineur pour les protéines.
Les tubes sont agités quelques secondes au vortex puis laissés au repos
à 4°C pendant 30 minutes.
Les tubes sont ensuite centrifugés pendant la minutes à 3.000 tours/minute
à 4°C. Le culot est neutralisé par 100 pl d'une solution normale de soude. On oréci-
pite à nouveau les protéines par 2 ml de TCA à la %.
Après agitation,les tubes sont laissés au repos à 4°C pendant 15 minutes.
Les tubes sont à nouveau centrifugés. On répète 3 fois cette ooération
dite de lavage des culots afin d'éliminer tout l'AT~ ~32p nui n'a pas réagi.
Au troisième lavage,
le culot est repris par 100 ri de soude 1 N, la
/
solution protéique est transférée dans une fiole de comptage en verre.
On y rajoute la ml d'eau et la radioactivité est évaluée par scintillation

---

-
28 -
la - ~ESURE DE L'ACTIVITE CASEINE KINASE
a)
- Principe
(voir histone-kinase )
Ici,
le substrat histone est remolacé par la caséine.
b)
- ~ilieu réactionnel
Nous avons utilisé le milieu réactionnel déèrit oar
BINGHAM et FARREL en
1974.
Le volume final de 200 pl contient :
-
la solution protéique dont on veut tester l'activité
-
3 mg/ml de caséine
+
32
- la mil1 de Hg-+-
,0,1 mM d' ATP froid et 500. 000 cpm d' ATP?:!
P
-
si nécessaire, de l'N1Pc à la concentration de 5 pM est ajouté
Le tout dans un tampon Tris-Hcl PH 7,6
100 mM.
La réaction, amorcée par l'addition du complexe ATP-Mg++
se poursuit à 30°C pen-
dant 20 minutes.
c)
- Précipitation des protéines et lavage du culot
voir dosage histone-kinase
11 - DOSAGE DE LA PHOSPHORYLASE KINASE
a)
- Principe
\\\\
,"
Le principe du dosage est le même que celui des histone-kinases. La
phosphorylase b se substitue au substrat histone.
b)
- Milieu réactionnel
Nous avons utilisé le milieu réactionnel décrit par
KUNIYASU SAKAI
et Col.
(1979). Ce milieu de 250 pl contient:
-
la solution protéique dont on veut tester l'activité
-
0,15 mg de phosphorylase b
- la m...M de Mg+4- , 0,1 mH d'ATP froid et 500.000 corn d'ATP Y32 p
Le tout dans un tampon Tris PH 8,5,40 mM contenant 0,2 mM de ca++
l
et 16 mM de NaF.
La réaction s'opère à 37°C pendant 30 minutes.
N.B.
Toutes les mesures d'activité ont été effectuées en double.

---

- 29 -
c)
- Précipitation et lavage des protéines
A la fin de l'incubation, les protéines sont précipitées oar 2 ml de TCA
à 10 % et lavées 3 fois suivant le protocole décrit pour le dosage des histone-
kinases.
La quantité de protéine phosphorylée
(phosphorylase a)
est évaluée par
mesure de la radioactivité par scintillation liquide.
12 - MESURE DE L'ACTIVITE PHOSPHATASE l
Nous avons dosé la phosphatase
(I)
selon la méthode décrite par
HENG-CHUN LI et Col.
(1979)
pour les phosphatas es acide et alcaline du coeur de
chien.
a)
-
Principe
La mesure de l'activité phosphatase est basée sur la capacité des phospha-
tases à hydrolyser le P-nitrophényl-phosphate
en milieu acide ou alcalin. Le
P-nitrophenol libéré est jaune en solution alcaline.
La densité colorimétrique est mesurée à 410 nm.
b)
- Dosage
Nous avons utilisé un milieu réactionnel de 500 r l contenant :
-
20 mM de P-nitrophenyl-phosphate
en solution dans du tampon chlorure
d'imidazole 50 mM PH 7,2 contenant 0,5 mM de dithiothréitol
-
la solution protéique dont on veut tester l'activité phosphorylase
-
le milieu réactionnel est incubé à 30°C pendant 10 minutes.
-
après addition de 500 pl d'une solution molaire de Na
co , la densité
2
3
optique du' mélange est mesurée à 410 :I1.'TI.
-
un tube dans lequel la solution protéique a été omise sert de blanc.
Une unité de phosphata se l
est définie comme la quantité d'enzvme capable de libérer
une nanomole de P-nitrophenol par minute
(le coefficient d'extinction pour l'anion-
4
-1
P-nitrophenolate est de 1,75 x 10
M
).

---

- 30 -
RES U L T A T S
E T
DIS eus S ION
=============================================

---

-
31 -
CHA P I T R E l
MISE au POINT du DOSAGE de la CHOLESTEROL ESTERASE
et ACTIVATION de l'ENZYME NON PURIFIEE

---

- 32 -
A - MISE AU POINT DU DOSAGE DE L' ENZY~1E CHOLESTEROL ESTERASE
==============================~=======================
======
Ce travail a été effectué sur la cholestérol estérase provenant èu
pancréas bovin
et dis~onible dans le commerce. Son PH d'activité optimale se
situe au voisinage de 7,4. Nous avons étudié successivement l'influence du temps
d'incubation et de la concentration d'enzyme sur la libération du cholestérol
marqué au tritium.
1 - MESURE DE L'ACTIVITE SEH EN FONCTION DU TEMPS D'INCUBATION
(Fig. 1)
Des quantités égales d'enzyme
ont été incubées en présence d'oléate de
cholestérol tritié comme substrat (conformément au paragraphe 7 de "~éthodes")
durant des périodes de temps variant de 5 à 70 minutes.
La figure 1 représente le résultat de cette étude.
Le taux de cholestérol libéré est pratiquement linéaire en fonction du temos.
Nous avons fixé pour la suite de nos travaux la durée d'incubation à 60
minutes, ce temps d'incubation relativement long devrait nous ~ermettre de doser
de très faibles activités enzymatiques.
2 - INFLUENCE DE LA CONCENTRATION D'ENZYME SEH SUR LE TAUX DE CHOLESTEROL LIBERE
(Fig. 2)
Les quantités croissantes de cholestérol estérase commerciale ont été
incubées durant une heure en présence du substrat (oléate de cholestérol tritié) .
La quantité de cholestérol libéré est proportionnelle à la concentration d'enzyme
(F ig.
2).
Un résultat identique a été obtenu ultérieurement en utilisant des
préparations d'enzyme d'origine lutéale.
Le substrat n'est donc pas facteur limitant dans ces deux expériences
puisque la courbe représentant l'activité cholestérol estérase en fonction du temps
d'incubation d'une part et de la concentration d'enzyme d'autre part, n'atteint pas
un plateau au terme de l'incubation.

---

- 33 -
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Temps d . incubation (minutes)
Fig.
1 -
Influence du temps d'incubation sur l'activité de la SEH pancréatique
Concentration d'enzyme
: ~ 5 )lg/tube
Conditions de mesure
Matériel et Méthodes,
sauf le tampon d'incubation
phosphate:
0,1 M et le substrat : oléate de cholestérol:
2,6 mM.

---

- 34 -
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Concentration Protéique
Fig.
2 -
Influence de la concentration de SEH pancréatique sur l'activité
enzymatique
_ Concentration d'enzyme: C = 50 pg/ml
- Conditions de mesure: Matériel et Méthodes,
sauf le tamoon d'incu-
bation' phosphate:
0,1 M et le substrat: oléate de cholestérol:
2,6 mM.

---

- 35 -
Les conditions de
dosage de la stérol ester hydrolase étant définies,
nous avons procédé à l'activation de l'enzyme lutéale et à l'étude de quelques
paramètres pouvant influer sur cette activation.
B - ACTIVATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE NON PURIFIEE
======================================================
Les données de la littérature rappelées en introduction suggèrent l'exis-
tence d'une activation de la stérol ester hydrolase par des orotéines kinases &~Pc
dépendantes. Pour activer l'enzyme, nous nous placerons dans des conditions où
l'enzyme pourrait être phosphoryléepar ces protéines kinases AMPc dépendantes.
Puisque l'existence de protéines kinases ÀMPc dépendantes a été démontrée dans le
cytosol de corps jaune de
vache,
i l devrait suffire pour cela d'ajouter de l'ATP,
du Mg++
et éventuellement de l'AMPc au cytosol.
1 - VERIFICATION DE L'ACTIVATION "IN VITRO" DE LA CHOLESTEROL ESTERASE PAR MECA-
NISME DE PHOSPHORYLATION
(Fig. 3)
Le ·cytosol brut préparé dans du tampon Tris-Hel 10 ~1 PH 7,4 a été
pré incubé avec ou sans: ATP + Mg++;
ATP + M~i+ AMPc
AMPc.
La figure 3 montre une activation de l'enzyme de l'ordre de
25%. Cette
activation est faible mais reproductible d'une expérience à l'autre. L'addition
de complexe ATP-Mg est suffisante pour obtenir une activation maximale de la choles-
térol estérase.
L'association de l'&~Pc à ce comolexe ne stimule pas davantage
l'enzyme.
Il faut noter ici que dans de rares expériences,
l'association de l'N1Pc
à l'ATP - Mg++
a augmenté légèrement le degré d'activation de l'enzyme.
Isolément
ce nucléotide cyclique n'a aucun effet stimulateur sur la cholestérol estérase.
L'activation de la cholestérol estérase que l'on observe peut être attribuée
soit à la phosphorylation de l'enzyme elle-même, soit à la phosphorylation d'un
substrat pouvant activer la stérol ester hydrolase.
Le fait que l'AMPc ne module pas cette activation n'exclut pas la oossibi-
lité d'une intervention de protéines kinases AMPc dépendantes dans le mécanisme
d'activation de la cholestérol estérase.
Il se pourrait en effet qu'il
y ait dans
le cytosol des sous-unités catalytiques libres de protéines kinases AMPc dépendantes
capables d'activer à elles seules l'enzyme en présence de l'ATP et du Mg~
L'activation de l'enzyme par le complexe ATP-Mg rT
seul pourrait également
s'expliquer par l'implication de protéines kinases AMPc Indépendantes dans le méca-
nisme d'activation de la stérol ester hydrolase. Une intervention simultanée des

---

- 36 -
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Fig.
3 - Activation de la SEH lutéale par un système de phosphorylation
- Conditions d'activation:
ATP
0,5 mM
Mg++
1,7 mM
AMPc
3 x 10- 5 M
- Conditions de mesure de l'activité SEH : Matériel et Méthodes,
sauf le tampon d'incubation,phosphate 0,10 M.

---

- 37 -
deux types de protéines kinases
(la seconde étant activée par la oremière comme
dans le cas de la phosphorylase kinase)
reste également une hypothèse envisageable.
Nous avons ensuite recherché les conditions d'activation optimale
de l'enzyme.
2 -
RECHERCHE DES CONDITIONS D'ACTIVATION OPTIMALE DE L'ENZYME SEH
a)
-
Influence du temos d'incubation
(Fig. 4)
Nous avons vérifié que le temos d'incubation choisi pour la mesure de
l'activité enzymatique de la SEH non activée était encore valable ap~ès activation
de l'enzyme par l'ATP-Mg++
(Fig. 4).
Nous n'avons noté aucun changement,
le taux de cholestérol libéré reste
pratiquement proportionnel au temps d'incubation durant au moins 60 minutes.
b)
-
Influence des concentrations d'enzyme
(Fig.
5)
Des concentrations croissantes d'enzyme ont été préincubées avec ou sans
ATP-Mg~t;
ATP-Mg~t
+ AMPc. Cette activation est suivie de la mesure de l'activité
cholestérol estérase
(Fig.
5).
Le facteur de stimulation observé est indépendant de la concentration
d'enzyme.
Ces deux expériences montrent que le substrat ne constitue pas un facteur
limitant dans le dosage de la cholestérol estérase même aorès activation de l'enzyme
car le taux de cholestérol libéré reste pro90rtionnel au temos d'incubation d'une
part et à la concentration d'enzyme d'autre ?art.
c)
-
Influence de la concentration en substrat
L'activité de l'enzyme SEH (activée ou non activée)
a été mesurée en
présence de concentration croissante de substrat (oléate de cholestérol marqué) .
Nous avons choisi la représentation de LINE1'ŒAVER et BURK oui donne
graphiquement la constante de MICHA~LIS (Fig. 6).
L'activation de l'enzyme se traduit oas une diminution de la constante
de MICHAELIS qui passe de 69 à 55 pmoles/litre. Elle correspondond donc à une aug-
mentation de l'affinité de l'enzyme pour son substrat.
Tout au lon~ de notre étude, nous utiliserons des concentrations de
substrat d'environ 180 pM. Cette concentration correspond à un état de saturation
de l'enzyme pour le substrat de l'ordre de 80 rour cent.

---

- 38 -
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. u
iY:
~
60
30
45
1 5
Temps
d'incubation
(minutes 1
Fig. 4 -
Influence du temps
d'incubation sur l'activité SEH lutéale avant
et après activation
- Conditions d'activation
ATP
1
mM
Mg++
2,5 mM
AMPc
10- 5 M.
- Conditions de mesure de l'activité
Matériel et Méthodes,
sauf
le tampon d' incubation phosphate 0,1 r1.
"

---

- 39 -
C
C
4
Concentration Protéique
Fig: 5 - Influence de la concentration de
la SEH avant et après activation
- Concentration d'enzyme: C = 820 fg/tube
- Conditions d'activation:
ATP
1
~~
t1a ++
2 , 5 mM
A~Pc
10- 5 M.
- Conditions de mesure de l'activité SEH : Matériel et Méthodes,
sauf le tampon d'incubation 9hosphate 0,1 M.

---

- 40 -
•
Km =
-6
69·10
M
}
$
•
-10
-
SEH non activée
.1:
8.1.10
mOles/h
~
..'CI,g... 3
iu
-8
.1
2
~
'$.
-20
-15
-10
-5
5
10
15
20
25
30
-3
1/0léate
de Chole.têrol
t M- 1.
•
10
LI
6
Km = 55. 10
M
}
-
SE" .......
max- 9.2. 10
0
V
-10 mole. h
Fig.
6 - Mesure des Km de la SEH lutéale pour le substrat oléate de cholestérol.
vitesse de libération du cholestérol en fonction de la concentration
du substrat.
-
Conditiàns d'activation
ATP
1
mM
++
Mg
2,5 mM
A.MPc
10- 5 M
- Conditions de mesure de l'activité SEH : Matériel et Méthodes,
sauf le tampon d'incubation phosphate de potassium 0,1 M.

---

- 41 -
d)
-
Influence du temps de pré incubation
(Fig.
7)
Le cytosol a été préincubé durant 5,
10,
15 et 20 minutes en présence ou
en absence des cofacteurs cités ci-dessus avant la mesure de l'activité cholestérol
estérase.
La figure 7 montre que l'activation est·· maximale à 5 minutes, aussi avons
nous limité le temps de pré incubation à
15 minutes pour la suite de nos travaux.
Ce temps d'activation a été choisi par différents auteurs pour l'étude
~
°
q
de diverses cholestérol estérase :
C.
BISGAIER et Col.
(1979)
pour le corps jaune
bovin, CAFFREY et Col.
(1979)
pour le corps jaune ovin, BECKETT et BOYDo (1977)
pour
le cortex surrénalien et par RAY C. PITTMAN et Col.
(1975)
pour le tissu adipeux.
e)
-
Influence du tampon d'incubation
L'activité de l'enzyme SEH, préalablement activée dans du tampon Tris-Hel
10 mM en présence des différents cofacteurs, est mesurée soit dans un mélange de
tampon
Tris-HellO mM - Phosphate de potassium 100 ~~, PH 7,4 soit dans le Tris
10 mM, PH 7,4.
L'activité de base et l'actOivité anrès stimulation sqnt fortement
diminuées en présence du tampon phosphate. Le degré de stimulation reste sensible-
ment le même:
16 % et 18 % respectivement en présence et en absence du tampon
phosphate
(Fig. 8).
Cette inhibition par le tampon phosphate de l'activité enzymatique est
vraisemblablement due aux ions K+
présents dans ce tampon car une inhibition par
les ions Na+
et K+
de l'activité cholestérol estérase microsomale de foie de rat
a été rapportée par NEELON et LACK en 1977.
Nous avons conservé le tampon phosphate de potassium comme tampon d'incu-
bation mais abaissé sa concentration jusqu'à 15 mM pour la suite de nos travaux
(chapitres II et III). Dans ces conditions l'effet inhibiteur est minime.
f)
-
Influence de la dialyse du cytosol sur l'activation de l'enzyme
(Fig. 8)
L'influence de la dialyse sur l'activation de l'enzyme SEH a été étudiée
simultanément pour les deux milieux d'incubation.
Le cytosol a été dialysé toute
une nuit contre 3 fois le tampon Tris-HellO mM, PH 7,4.
Nous observons deux faits
:
1°) La dialyse augmente le facteur de stimulation de l'enzyme par l'ATP
++
Mg
Il est probable que ce phénomène est attribuable à l'élimination d'ATP et lou
++
du Mg
au cours de la dialyse,
ce qui a pour conséquence d'abaisser l'activité de
base de l'enzyme.

---

- 42 -
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3
MO
...-%
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en
2
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5
10
15
20
Temps de
Préincubation (minutes)
Fig.
7 -
Influence du temps de pré incubation de l'enzyme en présence des différents
cofacteurs et nucléotides.
- Conditions d'activation:
ATP
1
mM
++
Mg
2,5 mt1
AHPc
10- 5 M.
- Conditions de mesure : Matériel et Méthodes,
sauf le tamoon d'incubation
phosphate 0,1 M
-
colonne claire
contrôle
-
colonne grisée
stimulée.

---

- 43 -
nd
non
dialysé
30-
nd
d
d
dialysé
-
D
Controle
-50
-
E
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a.
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Activé
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A
B
Tampon Phosphate
Tampon Tris
Fig. 8 -
Influence du milieu d'incubation sur la mesure de l'activité SEH avant
et après activation de l'enzyme dialysé ou non.
- Conditions d'activation:
ATP
1
mM
++
Mg
2,5 m!1
N-1Pc
10- 5 M
- Conditions de mesure: Matériel et Méthodes,
sauf le tampon d'incubation
A - Mélange de tampons
: phosphate de potassium 100 ~1 et Tris-Hel la mM
PH 7,4
B - Tris-Hel la mM, PH 7,4.

---

- 44 -
2°) L'activité de l'enzyme activée est abaissée après dialyse. Cela peut
s'expliquer soit par l'élimination de petites molécules indispensables pour une
activité optimale de l'enzyme,
soit par une dénaturation partielle de celle-ci au
cours de la dialyse.
3 -
RECHERCHE D'UNE IMPLICATION DE LA PROTEINE KINASE AMPc DEPENDANTE DANS L'ACTI-
VATION DE L'ENZYME SEH
a)
-L'activation de la SEH est-elle supprimée en présence d'un inhibiteur
spécifique de la protéine kinase &~PC dépendante ?
Il existe une préparation commerciale de l'inhibiteur protéique, thermo-
stable de la protéine kinase N1Pc dépendante. Cet inhibiteur provenant du muscle de
lapin inhibe la protéine kinase AMPc dépendante du corps jaune de vache
(DARBON,
1977, thèse). Nous avons ajouté dans le milieu d'activation de l'enzyme le HSPI à
des concentrations croissantes.
La figure 9 montre que, contrairement à notre attente,
l'inhibiteur
spécifique de protéine kinase &~PC dépendante ne diminue en rien le degré
d'acti-
vation de la cholestérol estérase.
b)
- La SEH peut-elle être activée de façon plus importante en présence
d'un excès de protéine kinase AMPc dépendante?
Il existe également dans le commerce plusieurs préparations de protéine
kinase AMPc dépendante, capables de stimuler la cholestérol estérase de la surréna-
le ou des tissus adipeux. Nous avons utilisé celle qui provient du muscle de lapin.
Nous avons pré incubé le cytosol dialysé en présence d'ATP - Mg t + , de
l'AMPc et de la protéine kinase N1PC dépendante.
L'addition de l'AMPc et de la protéine kinase AMPc dépendante a~ complexe
ATP - Mgt+
ne produit pas d'activation supplémentaire de l'enzyme
(Fig.
10).
Ces deux résultats confirment ceux de GOLDSTEIN et MARSH
(1973)
obtenus
sur le corps jaune de vache. Ces chercheurs n'ont pas pu montrer une activation de la
stérol ester hydrolase, brute ou très partiellement purifiée, par l'AMPc seul ou
associé à la protéine kinase AMPc dépendante en présence d'ATP.
Une autre tentative! du même type 1 effectuée par
BEHRMAN
et Col.
(1969)
s'est avérée négative dans les ovaires lutéinisés de rattes alors que l'activation
"in vivo" de la stérol ester hydrolase par LH a pu être démontrée par ces mêmes
auteurs.
Cependant, C.
BISGAIER et Col.
(1979)
ont rapporté une activation de
l'enzyme SEH du corps progestatif de vache par un mécanisme faisant intervenir
l'AMPc et les protéines N1Pc dépendantes. L'addition du nucléotide cyclique produit
une activation plus importante que celle obtenue en préincubant l'enzyme avec le
seul complexe ATP - Mg+~
. Au cours de ces expériences, l'inhibiteur protéique

---

- 45 -
15
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12,5
25
50
100
HS.P.I
("'9 )
Fig.
9 - Effet de l'inhibiteur spécifiaue des PK ~~Pc-dépendantes
sur l'activation
de la 5EH lutéale.
- Conditions d'activation
= ATP
1
mM
++
M
- g
2,5 mM
AMPc
10-5 M
HSPI
12,5 à 100 pg (origine muscle sque-
lettique de lapin).
- Conditions de mesure
Matériel et méthodes,
sauf le tampon d'incubation:
Tris-HellO mM
c=:.J "Contrôle"
"ATP_ + Mg ++ ~, AMPc"
++
"ATP + Mg
+ HSPI"

---

-
46 -
15
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...
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~
Fig.
10 -
Effet de la protéine kinase ~~Pc-dépendante du muscle squelettique de
lapin sur l'activation de la SEH lutéale.
- Conditions d'activation
ATP
1
mM
++
Mg
2,5 mM
A.MPc
10- 5 M
PK A.MPc-D
10 pg
- Conditions de mesure
Matériel et méthodes, sauf le tampon d'incubation
Tris-Rel 10 mM
o "Contrôle"
~ "ATP + Mg++"
W§ "AMPc
- -
~ "ATP - Mg ++ + PK"+ AMPc

---

-
47 -
thermostable,
spécifique des protéines kinases,kMPc dépendantes a réduit de 70 %
l'activation de la cholestérol estérase.
D'autre part,
CAFFREY et Col.
(1979),
étudiant le corps jaune ovin, ont
montré que l'N1Pc activait la cholestérol estérase en présence d'ATP - Mgr+
Cette action de l'kMPc était potentialisée 9ar le méthyl isobutyl
xanthine
U1IX),
inhibiteur de la phosphodiesterase
(PDE). Rappelons que la PDE dégrade le ] ' ,5'-kMPC
(N1Pc)
en 5' -AMP.
Nous n'avons pas pu confirmer ces deux résultats dans nos travaux où ni
le HSPI ni la théophylline
(autre inhibiteur de la PDE)
n'a d'effet sur l'activa-
tion de notre préparation d'enzyme.
Si l'on analyse les travaux évoqués de CAFFREY et Col., on constate
qu'aux faibles concentrations d' ATP
(0,3 m~1) et du ~1g++( 1 mH) le methyl isobutyl
xanthine n'accroit pas l'activation de l'enzyme en présence de 10 ~1 d'kMPc. La
oréincubation du cytosol avec 3 ~M
d'
ATP et 10 mM de Mg++
ne stimule pas
l'enzyme mais au contraire inhibe de 50 % l'activité de l'enzyme par rapport au
contrôle. Ce n'est qu'à cette concentration d'ATP et de Mg++ qu'apparaît l'effet
modulateur du MIX en présence d'AMPc. L'augmentation du degré d'activation de la
cholestérol estérase par le MIX observ~nar
ces auteurs pourrait donc se situer
à un autre niveau que celui de l'inhibition de la phosphodiesterase.
La stimulation de l'activité stérol ester hydrolase du cytosol Dar l'kMPc
associé au complexe ATP - Mgf~
a été rapportée également dans le cas de la surré-
nale(NAGHSHINEHet Col.,1974 ; TRZECIAK et BOYD,
1974 ;BECKETT et BOYD,
1977 : RAY C.
PITTMAN et Col.,
1977) et du tissu adipeux
(RAY C.
PITTMAN et col., 1975).
c)
- Discussion
Comment expliquer, dans l'hypothèse d'une régulation de l'activité stérol
ester hydrolase par LH, notre incapacité d'une part à inhiber Dar le HSPI,
l'acti-
vation de la préparation brute d'enzyme et d'autre part l'absence d'ef~et de l'M1Pc
lorsque l'on l'introduit dans le milieu de préincubation en présence d'ATP - ~gT+
avec ou sans protéine
kinase
AMPc dépendante
?
Une première hypothèse pourrait être qu'il existe dans notre préparation
d'enzyme,
une grande abondance de sous-unités catalytiques libres de protéine
kinase N1Pc dépendante . Ces sous-unités catalytiques libres de protéine kinase
M1Pc dépendante produirait une activation maximale de l'enzyme en présence d'ATP -
Mg+~
De ce fait,
l'kMP cyclique seul ou associé à la ~rotéine kinase AMPc-D
exogène ne donnerait pas une activation supplémentaire à celle obtenue en Dréincu-
bant l'enzyme en présence d'ATP - Mg+1 (voie 1 olanche C).
Aux concentrations utilisées
(12,5 à
100 pg),
le HSPI serait inefficace
parce que les sous-unités catalytiques libres de protéine kinase N1Pc dépendante
seraient en excès.

---

-
48 -
Des études ultérieures exposées plus loin nous ont montré que cette
hypothèse est à rejeter car l'on obtient des résultats similaires en utilisant une
préparation d'HSPI plus active
(provenant du coeur de boeuf)
dans des conditions
où elÈ inhibe complètement l'activité protéine kinase N1Pc dépendante de notre
préparation de SEH.
Une deuxième interprétation possible de ces résultats serait que la
protéine kinase k~Pc dépendante n'active pas directement l'enzyme SEH mais active
une protéine kinase N1Pc indépendante qUi contrôle elle-même la cholestérol estérase
(voie 2 planche C). Un système de ce type a été décrit dans le foie et le muscle
pour la régulation de l'enzyme phosphorylase.
Une troisième hypothèse, peu vraisemblable i l est vrai, doit être envisa-
gée car elle est compatible avec nos premiers résultats expérimentaux: celle d'une
activation directe de la cholestérol estérase par l'ATP qui agirait en se liant à
l'enzyme où à une protéine activatrice et ne mettrait donc Das en jeu une quelconque
Drotéine kinase
(voie 4 planche C) .
Enfin, i l n'est pas inconcevable que l'enzyme soit susceptible d'être
activée par une protéine kinase totalement indéDendante de l'N1PC, mais cette
activation sortirait alors du cadre du mécanisme d'action de l'hormone gonadotrope
LH.
Ces quatre hypothèses sont illustrées Dar la planche C.
Les investigations réalisées ultérieurement ont Dour but d'explorer ces
différentes hypothèses.
Nous avons tout d'abord entrepris une purification partielle de l'enzyme
SEH, purification qui s'est révélée délicate étant donné la fragilité apparente
de cette protéine. Les préparations d'enzyme partiellement purifiée ont DU cependant
être soumises à un certain nombre de tests.

---

- 49 -
ATP
SEH
(
4
activée
SEH
ATP
3
PK AMPc-lnd
ADP
SEH- P
ISEH activée)
Re
2 2
PK AMPc-D
inactive
PLANCHE C - Différentes interprétations possibles de l'activation de la cholestérol
++
estérase en présence d'ATP-Mg
1 -
Activation directe par une protéine kinase AMPc-dépendante
2 - Activation indirecte par une protéine kinase N1Pc-dépendante
3 - Activation par une protéine kinase totalement indépendante de
l'AMPc
++
4 - Mécanisme d'activation par ATP-Mg
sans rapport avec une
phosphorylation.

---

- 50 -
CHA P I T R E
II
ACTIVATION de la CHOLESTEROL ESTERASE
PARTIELLEMENT PURIFIEE

---

-
51 -
A - PURIFICATION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE
:=======~==================~===============
1 - PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
Nous avons tenter de purifier l'enzyme SEH en utilisant successivement
4 techniques classiques de fractionnements des protéines
basées respectivement
sur la purification par élévation de la concentration saline
(sulfate d'ammonium),
la chromatographie sur échangeurs d'anions
(DEAE - cellulose), la chromatographie
par adsorption
(hydroxyapatite)
et la chromatographie par filtration sur gel
(sephadex G 200).
Ces quatre techniques ont été combinées entre elles selon différents
protocoles pour constituer 3 méthodologies de purification.
Protocole A
Ce protocole comporte dans l'ordre:
-
une chromatographie sur DEAE - cellulose
- une filtration sur sephadex G 200
- une chromatographie sur hydroxyapatite
Protocole B
La chromatographie sur DEAE - cellulose est omise au profit d'une préci-
pitation des protéines au sulfate d'ammonium. Cette méthodologie comprend dans
l'ordre:
- une précipitation au sulfate d'ammonium
- une chromatographie sur hydroxyapatite
- une chromatographie sur sephadex G 200
Protocole C
Il comprend dans l'ordre:
- une précipitation au sulfate d'ammonium
- une chromatographie sur DEAE -
cellulose
- une chromatographie sur hydroxyapatite.
2 - RESULTATS
Nous donnerons seulement en détail les résultats obtenus en utilisant le
protocole C, car comme nous le verrons plus loin,
les protocoles A et B se sont
révélés moins efficaces pour purifier l'enzyme SEH.

---

- 52 -
a)
- Précipitation au sulfate d'ammonium
Les protéines qui précipitent à 4°C entre 25 et 60 % de sulfate d'&:~onium
(90ids/volume)
sont redissoutes après centrifugation dans le tamoon D. La solution
protéique est ensuite soumise à une filtration sur gel de sephadex G 25
(afin de
séparer protéines et sel d'ammonium)
puis concentr~sui membrane AMICON PM 10.
b)
- Chromatogra9hie sur DEAE - cellulose
(Fig.
11)
La majeure partie de l'activité cholestérol estérase se retrouve dans
les protéines non retenues par l'échangeur d'anions. Cette activité enzymatique
constitue le Pic l
(tube 10 - 16 sur le graphique de la fig.
11).
Un deuxième Pic d'activité stérol ester hydrolase
(Pic II)
est élué oar le
gradient de concentration continue du tampon
phosohatede potassium aux environs
de 0,15 M (tubes 12 à 24
aDrès le début du gradient. voir fig.
11). Ce second
Pic d'activité
SEH représente moins de 9 % de l'activité SEH totale récuoérée
à la sortie de la colonne.
Le Pic II est beaucoup moins stimulé que le Pic l
en présence du système
ATP - Hg + AMPc + protéine kinase N1Pc dépendante.
Les fractions corres90ndant au Pic II de cholestérol esteraseont donc été
éliminées.
c)
- Chromatographie sur hydroxya9atite
(Fig.
12)
La chromatographie,
sur hydroxyapatite du Pic l de SEH issu
de l'étage
DEAE - cellulose, conduit à l'élution d'un ,Pic principal d'activité cholestérol
estérase aux environs de 0,26 M (tubes 26 -
53
aorès le début du gradient
Fig. 12)
La figure 12 montre une activité résiduelle trainante qui donne
l'im9res-
sion qu'il existe plus d'une entité moléculaire de cholestérol estérase cytosolique
dans le corps jaune de la vache; ou bien qu'il existe une dégradation 9artielle
de la même enzyme. Malheureusement cette activité résiduelle est labile. Elle
disparain
après passage sur sephadex G 25. Nous n'avons donc pas pu l'étudier.
La filtration sur gel de sephadex G 200, de préparation d'enzyme SEH
obtenue par chromatographie hydroxyapatite entraine une oerte de plus de 95 % de
l'activité cholestérol esterase introduite.
Le Tableau l présente le bilan de purification de la cholestérol esterase
par chacun des 3 protocoles experimentaux.

---

-
51 -
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40
50
Numero
des
Fractions
(ml)
Fig.
11 -
Profil d'élution sur DEAE-cellulose de l'activité SEH du corDS jaune
de vache.
-
35 ml de la solution protéique
(8,6 mg/ml)
obtenus après précipitation
des protéines par le sulfate d'ammonium 25 à 60 % (P/V)
sont déposés
sur la colonne de DEAE-cellulose
(2,5 x 30 cm) .
- Après lavage.de la colonne par le tampon D (120 ml/h), les protéines
retenues sont éluées par un gradient linéaire de concentration du tam-
pon phosphate de potassium 10 à 500 mM à un débit de 60 ml/ho
Des
fractions de 10 ml sont recueillies et l'activité SEH est mesurée.
Conditions de mesure
: Matériel et Méthodes.

---

- 54 -
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Numero
des
Fractions
Fig.
12 -
Profil d'élution sur hydroxyaoatite de l'activité SEH lutéale.
-
27 ml de la solution protéique
(7,3 mg/ml)
obtenus a~rès concentration
des fractions correspondant au PIC l
issu de la DEAE-cellulose, sont
déposés sur la colonne d'hydroxyapatite
(2,6 x 30 cm) .
- Après la,vage de la colonne par le tampon D, l' acti vi té SEH est éluée
par un gradient_linéaire de concentration de ce tampon:
10 à 500 ~M.
- Des fractions de 10 ml sont recueillies toutes les 30 minutes et
l'activité SEH est mesurée.
Conditions de mesure: Matériel et Méthodes.

---

- 55 -
Prot~ines
Activité SEH
Activité
Récupération
totales
totale
en 9; d'·activi-
spécifique il.
(ug)
(cpm)
té totale
Sephadex G 25
798
11 321 600
14 200
100 %
.:x:
:.J
DEAE - cellulose
126
1.371.500
10.900
12 %
...:l
0
g
ti
Sephadex G 200
90
798.700
a:
8.900
7 %
il<
Hydroxyapatite
18
450.000
25.000
4 %
Sephadex G 25
1.816
20.964.000
11.500
100 %
l:Q
Sulfate d' ammonium
653
18.360.000
28.100
87 %
\\I.l
...:l
0
U
0
ti
Hydroxyapatite
195
7.320.000
35.500
35 %
a:
il<
Sephadex G 200
25
1.234.000
49.400
6 %
Sephadex G 25
801
13.156.500
16.400
100 %
u
Sulfate d' ammonium
424
10.214.400
24.100
81 %
\\I.l
...:l
0
U
0
E-<
DEAE - cellulose
69
2.062.900
29.900
19 %
0
~
0...
. Hydroxyapatite
25
1.526.700
60.000
16 %
TABLEAU l
- Purification de la cholestérol estérase suivant les 3 Protocoles
expérimentaux
A,
B, C
- Condition de mesure : Matériel et méthodes
: B 7
~ l'activité spécifique est exprimée en cpm par mg dE protéines et par heure.

---

- 56 -
3 -
REMARQUES
1 t1) On note une
perte
très importante de l'activité cholestérol esterase
après les 3 étapes de purification. Cette perte d'activité enzymatique déDasse 80 %
dans tous les cas. C'est principalement l'éta~e de chromatogra~hie sur DEAE -
cellulose qui est responsable de cette perte d'activité. Celle-ci ~ourrait être
due soit à une perte d'éléments protéiques indispensables à une pleine activité
de l'enzyme,
soit à une dénaturation partielle de la cholestérol estérase au cours
de la purification.
L'enzyme partiellement purifiée est relativement stable à 4°C car à cette
température,
elle ne perd que 35 % environ de son activité en un mois. Durant la
même période,
l'activité enzymatique baisse de plus de 90 % dans la préparation
brute
(cytosol). Ce fait peut s'expliquer par l'élimination d'enzymes protéolyti-
ques
(protéases)
au cours de la Durification.
La congélation et décongélation inactivent presque totalement l'enzyme.
Ce traitement lui fait perdre en effet plus de 90 % de son activité.
2 Q )
Si l'on dialyse la préparation enzymatique contre du tampon phosphate de
potassium 10 mM PH 7,4, pendant une nuit,
i l n'est plus possible ensuite de purifier
l'enzyme par chromatographie sur DEAE -
cellulose ou hydroxyapatite, car dans ces
conditions/l'activité enzymatique n'est pas retrouvée à
la sortie de l'une ou
l'autre colonne.
Ces deux dernières observations ont été également faites à propos de la
cholestérol estérase de pancréas de rat par DE WITT GOODMAN
(1969). Cet auteur
rapportait aussi que l'enzyme perdait son
activité après lyophilisation.
3°) Le dosage ultérieur de l'activité histone kinase
et caséine kinase
dans
les différentes préparations enzymatiques révèle qu'au terme de la purification,
la
préparation d'enzyme est pratiquement excempte d'histone kinase
dans le protocole
A et C contrairement à la méthodologie B dans laquelle cholestérol estérase et
histone kinase
sont copurifiées. En revanche dans tous les cas,
l'activité caséine
kinase
reste associée à. l'enzyme SEH.
La chromatographie sur DEAE -
cellulose constitue à cet égard l'étape clé
de notre purification. Le Drotocole C a été retenu ~our la suite de nos études
car i l donne la meilleure récupération
(16 %)
et élimine les histone kinases de nos
préparations d'enzymes.

---

- 57 -
4 - EVALUATION DU POIDS MOLECULAIRE (PM) DE LA SEH SUR GEL DE SEPHADEX G 200
Le PM de la cholestérol estérase a été évalué par mesure du volume
d'élution au cours d'une filtration sur sephadex G 200. Le profil
d'élution de
l'activité enzymatique est représenté dans la figure 13 A.
Le poids moléculaire, déterminé graphiquement en utilisant la courbe
d'étalonnage correspondant à la colonne de sephadex (Fig. 13 B) est d'environ
60.000 ! 5.000
Cette masse moléculaire oeut être comparée à celle d'autres préparations
de stérol ester hydrolase mesurée par différents auteurs :
- 65.000 à 69.000 pour l'enzyme du suc pancréatique de rat (HYDN et Col.,
1971.)
- 41.000 pour la cholestérol estérase de la surrénale bovine (BECKETT et
BOYD, 1977)
SO.OOO pour la SEH du pancréas de oorc U10NSEN et Col., 1977).
Dans notre laboratoire, nous avons pu étudier la phosphorylation sous
l'action de LH d'un certain nombre de protéines cytosoliques dont nous avons
déterminé la masse moléculaire a?rès migration électrophorétique en gel polyacrila-
mide SDS. L'une d'entre elle possède un poids moléculaire de 65.000 (DARBON et Col.,
19S0) .

---

- 53 -
A
5
._a
2
10
b _
E
~
1U'
Il.
2
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III
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2
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GI
U
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D
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Q
o
t
~
1cf
1,,/ i
175
SO
100
120
140
160
Volume d'Elution
(ml)
Volume d"Elutlon lmlt
Fig.
13 - A)
Filtration sursephadex G 200 d'une fraction enrichie de SEH lutéale.
-
20 mg d'enzyme SEH partiellement purifiée, en solution dans 4 ml de
tampon D, sont introduits dans la colonne
(2,6 x 30 cm)
et élués par le
même tampon
(l0 ml/hl .
Des fractions de 5 ml sont recueillies et l'activité SEH est mesurée.
Conditions de mesure
Matériel et méthodes.
B)
Evaluation du poids moléculaire de la stérol ester hydrolase du corDS
jaune de vache.
La colonne de sephadex G 200 a été étalonnée par la mesure du volume de
rétention des protéines de masse moléculaire connue.
a.
ferritine
:
440.000
e. ovalbumine
43.000
b. catalase
232.000
f.
chymotrypsinogène A: 25.000
c. aldolase
158.000
g. ribinucléase A:
13.700
d. albumine sérique bovine : 67.000

---

- 59 -
B - ACTIVATION DE L'ENZYME PARTIELLEMENT PURIFIEE ET RECHERCHE D'ACTIVITE
=========================================================================
PROTEINE
KINASE
================
1 -
IMPLICATION DE KINASES DANS L'ACTIVATION DE LA SEH PAR L'ATP
(Fig.
14)
Après purification de l'enzyme, nous avons voulu éliminer l'hypothèse,
évoquée dans le chapitre l, paragraphe B3, d'une improbable activation de la stérol
ester hydrolase par simple liaison de l'ATP à l'enzyme sans intervention de
protéines kinases.
Rappelons que les ions Mg+·
sont indispensables à l'activité des ~rotéi­
nes kinases. Leur élimination par l'EDTA, devrait donc logiquement em~êcher l'acti-
vation de la SEH si les protéines kinases y sont impliquées et ne devrait pas
l'affecter au contraire si l'activation était due à une simple liaison de l'ATP
à l'enzyme.
Pour cela, nous avons dialysé l'enzyme partiellement purifiée
(~raction
obtenue après passage sur DEAE - cellulose)
contre du tampon phosphate de potassium
contenant 10 ~~ d'EDTA pendant 48 heures. Nous avons ensuite préincubé l'enzyme
dialyseecontre l'EDTA soit en présence d'ATP soit en présence d'ATP associé à des
concentrations croissantes de Mg+~
(5,10 ,
20 mM).
La figure 14 montre le résultat de cette étude.
En absence du Mg ti
,
l'ATP n'a aucun effet activateur sur la cholestérol
estérase partiellement purifiée. A concentration fixe d'ATP,
l'activation de
l'enzyme est Mg t + dépendante. L'activation atteint 230 % avec 20 mM de Mg
Cette étude démontre la nécessité des ions Mg·~
dans la stimulation de la
stérol ester hydrolase.
Puisque l'ATP ne stimule pas l'enzyme SEH oar simple liaisonr
l'activation de la préparation brute ou partiellement purifiée de SEH par sa pré-
incubation avec l'ATP-Mq++
est très vraisemblablement la conséquence d'une ohos-
phorylation par des protémeskinases AMPc dépendantes ou indépéndantes.
a) Après dialyse contre le tampon phosphate de potassium contenant l'F.DTA,
l'activ~
té de base de l'enzyme est beaucoup plus faible que si l'on dialyse l'échantillon
contre le tampon phosphate de potassium seul. Ce fait est difficile à_ interpréter

---

- 60 -
li)
200
c
.-Q)..Q..Co
Q)
~
tn
{EC1.
(J
( ' l '
0
100
-::t
J.&.I
en
'4)
..>..(J
~
o
5
10
20
Mg (mM)
A
B
c
Fig.
14 ~ Dialyse de la SEH lutéale contre l'EDTA : suppre~sion de l'activation.
-
Conditions d'activation et de mesure
= Matériel et Méthodes.
A)
Fraction DEAE-cellulose passée sur sephadex G 25.
B) Fraction DEAE-cellulose passée sur sephadex G 25 puis dialysée contre
un tampon phosphate de potassium 10 mM, PH 7,4 pendant environ 48 h.
C)
Fraction DEAE-Cellulose passée sur sephadex G 25 puis dialysée contre
un tampon phosphate de potassium 10 mM, PH 7,4 contenant 10 mM d'EDTA
pendant 48 h.
L'enzyme a été préincubée ensuite en absence
(c===J)
ou en présence
""
~
++
d'ATP-Mg
( ~)
;
(ATP 2 mM ; Mg
5 mM dans A et B)

---

- 61 -
et pourrait peut-être s'expliquer par une plus grande efficacité de la dialyse en
présence de l'EDTA ?
b)
En comparant les contrôlffi,dialysé et non dialysé, nous retrouvons
le phénomène déjà signalé dans le chapitre l, paragraphe B2-f
: c'est à dire une
baisse de l'activité de base et de l'activité stimulée après dialyse et une aug-
mentation du facteur de stimulation.
2 - RECHERCHE D'UNE IMPLICATION DE LA PROTEINE KINASE AMPc DEPENDANTE DANS L'ACTIVA-
TION DE LA CHOLESTEROL ESTERASE PARTIELLEMENT PURIFIEE
L'activation par ATP - Mg++
de l'enzyme en présence ou en l'absence de
protéine kinase k~Pc dépendante et lou de son inhibiteur spécifique a été entreprise
dans les différentes préparations enzymatiques.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II.
On observe que
a)
l'ATP - Mg~t
produit une stimulation de l'enzyme partiellement ouri-
fiée,
stimulation d'amplitude très comparable à celle obtenue en utilisant une
préparation brute de SEH. Ceci indique que l'enzyme
(protéine kinase)
responsable
de la phosphorylation de la cholestérol estérase a été copurifiée avec la cholesté-
rol estérase elle-même.
b)
Lorsque l'on pré incube l'enzyme partiellement purifiée en présence
d'ATP - Mg~~ d'k~Pc et de protéine kinase N1Pc dépendante, on observe une stimula-
tion très peu différente de celle obtenue en pré incubant l'enzyme SEH en présence
d'ATP - Mg+~ seul. Ces résultats, très semblables à,ceux obtenus à partir de
l'enzyme SEH non purifiée indiquent que malgré la purification, i l n'est pas
possible de démontrer, dans nos conditions expérimentales,
l'implication d'une
protéine kinase AMPc dépendante dans l'activation de la cholestérol estérase.
c)
La présence de l'inhibiteur protéique,
spécifique des protéines kinases
AMPc dépendantes
(HSPI)
n'empêche pas l'activation de l'enzyme SEH oar l'ATP - Mg·+
Ce résultat semble indiquer que l'activation de l'enzyme n'est oas contrôlée
directement par des sous-unités catalytiques libres de protéines kinases AMPc déoen-
dantes.
(Nous verrons plus loin que dans nos conditions expérimentales, le HSPI
inhibe complètement l'activité orotéine kinase k~Pc dépendante de notre préparation
enzymatique) .

---

++
++
++
++
ATP + Mg + AMPc
ATP + Mg
+ AMPc
CONTROLE
ATP + Mg
ATP + Mg
+ AMPc
+ PK
+ HSPI
Activité SEH
Activité SEH
ST
Activité SEH
ST
Activité SEI!
ST
Activité SEI!
ST
S
16.200 :!:
400
24.600 :!:
500
52%
105.g
.....
Sephadex G 25
40.500 :!:
700
68 . 300 :!: 4. 100
68%
0
l::
Précipitation au
~
+
+
u
sulfate d'ammo-
54.800 -
4.500
80.000 -
600
46%
Z
~
niwn
H
~
~
Il<
X
DEAE -
cellulose
110.300
170.000 :!: 1.900
54%
194.000 :!:
500
76%
~
Hydroxyapatite
89.700 :!: 6.700
159.000 :!:
100
77%
165.000 :!: 800
84%
159.000:!: Il.400
76%
184.000 :!:
100
105%
N
\\0
S 105.g
32.100 :!:
200
48.900
52%
N
Sephadex G 25
31.400 :!:
900
72.700
31%
0
l::
~
Précipitation au
u
sulfate d'alTllTIo-
106.000 :!:
400
200.000 :!: 3.600
87%
15H niwn
~
'-
~
Il<
X
DEAE -
cellulose
124.00Q :!: 3.600
215.000
74%
235.000 :!:
7.800
90%
227 . 000 :!: 1.000
83%
~
Hydroxyapatite
50.100 :!: 4.900
104.000 :!: 5.500
07.%
10.1 .000 :!:
1.900
101 %
106.000 :!: 5.100
12%
TABLEAU II
Activation de la cholestérol estéraselutéale partiellement purifiée
- Conditions de mesure : Matériel et méthodes : B 8 et 7
-
L'activité SEH est exprimée en cpm par mg de protéine et par heure
-
ST = stimulation exprimée en pourcentage de stimulation par rap~ort au contrôle
- ATP :
2 mM ; MgTt:
5 mM ; AMPc :
50 V~l ; PK : 25 ug de solide ; HSPI : 50 ug de protéine
-
Les expériences n° 1 et 2
ont été effectuées sur deux préparations différentes d'enzyme
SEH.

---

- 63 -
Les résultats de nos études diffèrent sensiblement de ceux des travaux
effectués par d'autres auteurs sur différents tissus. D'une part TRZECIAK et
BOYD
(1977), PITTMAN et Col.
(1977), NAGHSHlNEH et Col.
(1978) dans le cortex
surrénalien et d'autre part RAY C.: PITTMAN et Cot~_C~975)J.C. KHOO et Col.
(1976)
dans le tissu adipeux ont montré la nécessité d'une présence de la protéinË kinase
AMPc dépendante pour l'activation d'une préparation partiellement purifiée de
cholestérol estérase.
3 -
RECHERCHE D'ACTIVITE PROTEINE
KINASE
ASSOCIEE
A LA SEH PARTIELL~1ENT
PURIFIEE
Nos résultats sur l'activation de la cholestérol estérase 9artiellement
purifiée démontrent que la kinase directement responsable de l'activation de
l'enzyme SEHa été copurifiée avec l'enzyme SEH. Pour tenter de préciser la nature
de cette kinase, nous avons entrepris la mesure des activités protéines kinases AMPc
dépendantes et indépendantes aux différents stades de purification de la cholestérol
estérase.
Le tableau III montre l'évolution, au cours de la purification de l'enzy-
me SEH, des activités"histone kinase" et"caséine kinase".
On constate que l'activité histone kinase est éliminée à plus de 98 % dès
le stade DEAE - cellulose. Par contre l'activité caséine kinase reste associée à
l'enzyme SEH tout au longde la purification.
Afin de savoir si l'activité histone kinase
et l'activité caséine kinase
mesurées sont dépendantes ou indépendantes de l'N~Pc, nous avons rajouté l'AMPc
et jou le HSPI dans le milieu réactionnel.
Dans les préparations où l'activité histone kinase
a été décelée
(stades
avant la chromatographie sur DEAE - cellulose),
l'A~Pc augmente de 100 à 200 %
l'activité histone kinase. L'inhibiteur spécifique des protéines kinases AMPc dépen-
dantes inhibe complètement l'activité histone kinase induite par l'~~Pc. Il n'a
pratiquement aucun effet sur l'activité histone kinase de base
(activité histone
kinase
mesurée en l'absence de l'AMPc)
(Fig.
15 A) .
Il est donc clair que l'activité histone kinase mesurée en l'absence
d'AMPc représente essentiellement
l'activité de _?rotéines kinases A~Pc indépendantes
acceptant l'histone comme substrat. En revanche,
l'activité histone kinase
libérée
par l'AMPc représente bien l'activité de sous-unités catalytiques de protéines
kinases AMPc dépendantes.

---

- 64 -
ACTIVITE PROTEINE KINASE
32I'
:
incorporé
(cpm)/mg de protéines/ minute
Précipitation
Sephadex G 25
au sulfate
DEAE - cellulose
Hydroxyapatite
d'ammonium
Cil
+
+
+
+
U'l
- AMPc
9.900 -
10
8.200 -
50
12,5 - 10
196 -
2
<l;
Z
H
~1
Cil
Z
0
E-<
U'l
H
+
+
+
+
+ AMPc.
27.400 - 50
20.300 -
300
12,5 -
1
294 - 6
::r:
.
+
+
+
+
Cil
- AMPc
1.000 - 30
950 - 30
500
- 50
620 - 20
U'l
<l;
Z
H
~1Cil
Z
H
Cil
U'l
+
+
+
+
<l;
+ AMPc
1.000 -
10
950 -
10
490
- 10
610 -
10
u
TABLEAU III - Activïtés histone-kinase
et
caséine-kinase
aux différents stades
de la purification de la cholestérol estérase
- Conditions de mesure
Matériel et méthodes B 9 et 10
32
L' activité protéine kinase
est exprimée en cpm de
P incorporé
par minute et par mg de protéines.

---

- 65 -
l:
l:
~
ë
~
...
...
0
0
..
..
Q, 20
Q,
B
a.J
5
QI
't'
't'
C)
C)
~
ë
E
Q,
E'4
Q,
(J
(J
('t').
0
.-
C'16
-
a.J
a.J
III
3
cu
en
l:
cu
.-
l:
.-
~ 10
~
a.J
QI
l:
.5
0
2
...
"G)
en
en
cu
~
(,,)
.4)
"G)
...
....-
>
>
...
...
(J
(J
.ct
ct
c::m
c..
1
I I
X
XX
Fig.
15 - Action de l'inhibiteur spécifique des PK AMPc-D sur les activités
protéines kinases associées à la préparation d'enzyme.
- Conditions de mesure
: Matériel et Méthodes.
-
La préparation d'enzyme a été préincubée dans les conditions suivantes
-C::::::J Il - AMPc"
:::::::::~: " - AMPc + HSPI"
..............
~" + AMPc"
BI " + AMPc + HSPI"
HSPI : 50 pg de protéines
origine coeur de boeuf.
l
-
Fraction sulfate d'ammonium
II - Fraction DEAE-cellulose
A)
activité histone kinase
B)
activité caséine kinase

---

- 66 -
Ni l'AMPc, ni le HSPI n'affecte l'activité caséine kinase
(Fig 15 B).
Cette activité représente donc l'activité protéine
kinase AMPc indépendante.
4 - DISCUSSION
Si l'on admet que l'activité protéine
kinase
M1Pc dépendante
a été
éliminée de nos préparations partiellement purifiées d'enzyme SEH (fractions DEAE -
cellulose ou hydroxyapatite),
l'activation de ces préparations, observée
en
présence seulement d'ATP - Mg++ ne peut être due qu'à laphosphorylation Dar des
protéines kinases AMPc indépendantes
(caséine kinase
par exemple)
de la stérol
ester hydrolase ou d'un substrat protéique activant l'enzyme elle-même.
L'intervention de protéines kinases AMPc indépendantes dans le mécanisme
d'activation de l'enzyme SEH peut s'expliquer par deux hypothèses:
1)
Par un mécanisme d'activation de la SEH proche de celui de l'activation
de la phosphorylase b décrit par SODERLING et Col. en 1970, dans le tissu musculaire-
Cette possibilité représentée par la voie 2 dans la planche C a été déjà évoquée
dans le chapitre l, paragraphes Bl et B2.
Cette hypothèse s~~ble la plus vraisemblable car elle tient compte de
l'intervention de protéines kinases AMPc dépendantes dans le mécanisme d'activation
de la cholestérol estérase observée par BISGAIER et Col. dans le corDS jaune de
vache et par CAFFREY et Col. dans le tissu lutéal ovin.
Dans le cas de cette hypothèse,
notre incapacité à augmenter le degré
d'activation de l'enzyme SEH oar l'addition de protéine kinase ~MPc dépendante,
pourrait s'expliquer par
a - une inefficatité sur nos préparations de SEH de l'enzyme protéine
kinase AMPc dépendante en raison d'une spécifité d'espèce. Nous ne
connaissons néanmoins pas de cas où une grande spécificité de protéine
kinase AMPc dépendante ait été décrite "in vitro",
b -
le manque d'un maillon intermédiaire indispensable pour l'activation
de la protéine kinase AMPc indépendante par la protéine kinase AMPc
dépendante, maillon qui aurait été éliminé au cours de la purification
de la stérol ester hydrolase,
c -
le fait que la ~rotéine kinase AMPc indépendante copurifiée avec
l'enzyme SEH et qui serait responsable de son activation en présence
d'ATP - Mg++ soit déjà complètement activée.
2)
Une activation de la cholestérol estérase par une protéine kinase
totalement indépendante de l'N1Pc, comme Dar exemple l'une des caséine kinases de

---

- 67 -
type G (CKG) décrites par le groupe de E.M. CHkMBAZ
(1977). Une telle hypothèse bien
que tout à fait compatible avec nos résultats,
semble peu vraisemblable car l'acti-
vation de la chol~stérol estérase sortirait alors du cadre de la régulation de
l'enzyme par l'hormone gonadotrope LH.
5 - TENTATIVE D'IDENTIFICATION DE LA PROTEINE KINASE AMPc INDEPEND~~E
ASSOCIEE A LA
STEROL ESTER HYDROLASE PARTIELLE!·1ENT PURIFIEE
Afin d'explorer la possibilité d'une activation de la cholestérol estérase
par un mécanisme de type de la phosphorylase b, nous avons voulu savoir si la
protéine kinase AMPc indépendante copurifiée avec la SEH était une phosphorylase
kinase car l'on sait que LH stimule la phosphorylase kinase dans le tissu lutéal
bovin (MARSH et SAVARD,
1964)~ Nous avons ainsi étudié l'effet de la phosphorylase
kinase exogène sur l'activation de la cholestérol estérase et recherché l'activité
de cette kinase dans nos préparations partiellement ourifiées d'enzyme.
a)
- Recherche d'une implication de la ohosohorylase kinase dans
l'activation de la SEH
La figure 16 montre une activation de la SEH par la phosphorylase kinase
exogène associée à l'ATP - Mg+~ .
La présence de la phosphorylase kinase produit une stimulation légèrement
supérieure à celle obtenue avec l'ATP - Mg+t seul. Ce surcroît d'activation n'est
pas observé en l'absence du Ca++ .
L'accroissement du degré de stimulation de
la cholestérol estérase par la
phosphorylase kinase exogène(sï cette stimulation supplémentaire n'est pas artefac-
tuelle ) pourrait être due à la phosphorylation de l'enzyme SEH par cette kinase.
La phosphorylase kinase est une protéine kinase N1Pc indépendante activa-
ble soit par les protéines kinases AMPc dépendantes,
soit par autophosphorylation
en présence d'ATP,
soit par protéolyse limitée
(NIMMO et COHEN,
1978).
Peut-on alors conclure que la phosphorylase kinase est impliquée dans le
mécanisme d'activation de la SEH ? La phosphorylase kinase existe-t-elle dans nos
préparations d'enzyme?
Pour répondre à cette dernière question, nous avons mesuré l'activité
phosphorylase kinase dans le cytosol et dans la fraction obtenue anrès chromatogra-
phie sur hydroxyapatite, en mesurant la phosphorylation par l'.ATP- ~ 32p de la phos-
phorylase b.
Le tableau 5 montre que seul de cytosol renferme cette activité kinase
particulière
qui est au contraire éliminée dans les préparations partiellement
purifiées de SEH.

---

- 68 -
15
10
E
Q.
Co)
XX
MO
-::tw
CI)
-G)
5
..>..Co)
c(
Fig.
16 - Effet de la phosphorylase kinase sur l'activation de la SEH.
- Conditions d'activation et de mesure: Matériel et Méthodes.
++
- phosphorylase kinase
(1 : 16 unités d'enzyme ; Ca
0,2 mM)
et
(II
: 22 unités d'enzyme; Ca++ 1 mM).
++
- ATP
(2 mM)
;
Mg
(5 mM) .
L' enzyme a été princubée en absence
(r==J)
ou en présence
++
"ATP-Mg
"
"ATP-Mg++ + phosphorylase kinase + Ca++"
N.B. Les expériences l
et II ont été effectuées sur deux préparations différentes
d'enzyme.

---

- 69 -
ACTIVITE PHOSPHORYLASE KINASE :
32p incorporé
(cpm) par mg de protéine et par minute
SEPHADEX G 25
HYDROXYAPATITE
+
+
190 -
20
4 -
1
TABLEAU IV - Disparition de l'activité phosnhorylase kinase contaminante au-GG~
au cours de la purification de la cholestérol estérase lutéale
- Conditions de mesure
Matériel et méthode B 11.

---

-
70 -
D'autre part l'ion Ca++
,indispensable à l'activation de la phosphorylase
kinase n'a pas d'effet significatif sur l'activation de la cholestérol estérase
partiellement purifiée,
seul ou associé à la protéine kinase ~1Pc dépendante de
muscle de lapin
(Fig.
17).
Au vu de ces deux derniers résultats, une intervention
de la phosphory-
lase kinase dans le mécanisme d'activation de la cholestérol estérase devient
improbable.
b)
-
La caséine kinase associée à la SEH est-elle une CKG ?
La protéine kinase AMPc indépendante associée à la SEH dans nos prépara-
tions partiellement purifiées est une caséine kinase. Est-elle la même que celle
décrite par l'équipe du Professeur CHAMBAZ en 1977 dans le cortex surrénalien ?
Rappelons que cette activité caséine kinase
est constituée de 4 formes
d'enzymes
(C. COCHET,
D. JOB; F.
PIROLLET et E.M. CHAMBAZ,
1978 et 1980) qui se
regroupent en 2 types suivant leurs propriétés catalytiques et leu~caractéristiques
physico-chimiques
-
l'une utilisant exclusivement l'ATP comme donneur de phosphate est
appelée caséine kinase type A (CK1\\) .
-
l'autre acceptant l'ATP ou le GTP comme donneur de phosphate est appelée
caséine kinase type G (CKG).
Par ailleurs,
en 1979, dans le même tissu, JOB D., COCHET C, PIROLLET F;
et CHAMBAZ E.M. ont mis en évidence un inhibiteur protéique thermostable, spécifique
de la CKG. Cet inhibiteur protéique est appelé caséine kinase type G-Inhibiteur
(CKGI) .
Nous nous sommes demandés si la caséine kinase associée à nos préparations
partiellement purifiées pouvait être la CKG. Nous avons pour cela étudié l'activa-
tion de la SEH en présence du GTP d'une part et testé l'activité inhibitrice du CKGI
sur l'activation de la cholestérol estérase puis sur
l'activité caséine kinase
d'autre part.
b -
1)
~~!~~~!~~~_~~_~~_~~~~~~!~~~~_~~!~~~~~_~~~_~~~_:_~2~_i~
~~~_!~_~~
La fraction
hydroxyapatite de SEH est préincubée durant 15 minutes en
présence d'ATP - Mgt~ou de GTP - Mg+4
La figure 18 A montre que l'activatj.on de l'enzyme par le GTP -
Mgt~est
du même ordre que celle obtenue avec l'ATP -
Mg+~.
Ce résultat démontre que la caséine kinase responsable de l'activation de
la cholestérol estérase utilise l'ATP ou le GTP comme donneur de phosphate.

---

-
71 -
A
..200
Q
..Q,
li)
"C
'"
~
B
E
Q,
CJ
Mô
-:z:100
LU
en
'4)
...->.-...CJce
Fig.
17 - Action des ions calcium sur l'activation de la SEH.
- Conditions d'activation et de mesure
Matériel et Méthodes.
- L'enzyme a été préincubée en absence
(c===J) ou en présence de
++
"ATP-t·1g
"
++
., ATP-Mg
+ PK + AMPc"
++
++
"ATP-Mg
+ AMPc + Ca
"
•
++
++
"ATP-Mg
+ AMPc + PK -{- Ca
"
++
-5
++
ATP
(2 mM)
Mg
(5 mM)
;
PK (20 pg)
; AMPc
(5.10
)
Ca
(1 mM) •
N.B. Les expériences A et B ont été effectuées sur deux oréDarations di~férentes
d'enzymes.

---

- 72 -
A
B
8
6
%
w
CI)
4
'GJ
..>
2
Fig. 18 - Implication d'une caséine-kinase G dans le mécanisme d'activation de la
SEH lutéale.
Les exper~ences A et B ont été effectuées sur des préparations différentes
d'enzymes mais les conditions d'activation et de mesure sont identiques
(Matériel et Méthodes) .
Activation de la SEH par le GTP
B)
Effet de l'inhibiteur "CKGI" sur l'activa-
tion de la SEH
L'enzyme a été préincubée en absence (c===J)
L'enzyme a été préincubée en absence{c===J)
ou en présence de :
où en présence de :
- ++
++
"ATP-r-1g
"
"ATP-Mg
"
++
"GTP-Mg++"
"ATP-Mg
+ CKGI"
++
ATP (2 II1.1>.1)
Mg
(5 mM)
CKGI
dilution finale 1/70.

---

- 73 -
Nous avons alors testé la CKGI sur l'activation de la SEH et l'activité
caséine kinase de la pré9aration partiellement purifiée d'enzyme.
b -
2)
~~~~~_~~_~~_~~~!_~~~_~~_2~~~~~~~~~~_~~~~~~~~~~~~~_~~~~~~~~_~~~~~~~
La préparation de cholestérol estérase
(fraction hydroxyapatite)
a été
préincubée en présence d'ATP - Mg~i et de
CKGI pendant 15 minutes avant la
détermination de l'activité cholestérol estérase.
La figure 18 B montre que la CKGI n'a aucun effet inhibiteur sur l'acti-
vation de la cholestérol estérase.
L'activité caséine kinase de la préparation a été mesurée en présence
de la CKGI
(tableau V
). L'inhibiteur spécifique de la CKG ne diminue en rien
l'activité caséine kinase responsable de l'activation de nos préparations partielle-
ment purifiées d'enzyme.
La· caséine kinase associée à nos préparations partiellement purifiées
d'enzyme SEH et susceptible de l'activer est donc différente de la CKG décrite dans
le cortex surrénalien.

---

- 74 -
32
ACTIVITE CASEINE KINASE :
p
incorporée
(cpm) /mg de protéin~s/minute
CKGI
CKGI
CKGI
Contrôle
1/5.000
1/1.000
1/200
+
+
+
+
DEAE - cellulose
610 -
10
580 -
20
600 -
10
600 -
10
+
+
+
+
Hydroxyapatite
470 -
60
470 -
20
460 -
20
440 -
20
TABLEAU V - Action de l'inhibiteur de la caselne kinase type G sur l'activité caséine
kinase associée à. notre préparation d'enzyme
- Conditions de mesure : Matériel et méthodes B 10
-
L'inhibiteur utilisé à la dilution de 1/5.000 ; 1/1.000 et 1/200 est
ajouté au milieu réactionnel.

---

- 75 -
CONCLUSION
L'importante perte d'activité constatée au cours des 3 étaoes de la
purification de la cholestérol estérase ne nous a pas permis de poursuivre celle-ci
plus avant. Néanmoins,
la préparation partiellement purifiée qui a été obtenue
était débarrassée de toute activité protéine kinase AMPc dépendante et des autres
histones kinases présentes dans le cytosol.
L'enzyme SEH partiellement purifiée conserve cependant sa capacité d'être
activée par incubation en présence d'ATP - Mg~~
. Cette activation est bien Mg~+
dépendante.
La contamination de notre préparation de cholestérol estérase par une
caséine kinase
(protéine kinase AMPc indépendante)
suggère que l'activation de
l'enzyme SEH en présence d'ATP - Mg++ pourrait être le fait de cette caséine kinase.
Nos résultats n'excluent pas cependant la possibilité d'une intervention
de protéine kinase AMPc dépendante dans le mécanisme physiologique d'activation
de la cholestérol estérase. Nos résultats suggèrent par contre la médiation d'une
protéine kinase AMPc indépendante dans l'activation de la stérol ester hydrolase
par la protéine kinase AMPc dépendante dans la régulation de l'enzyme SEH par LH.
L'incapacité de la .~rotéine kinase AMPc dépendante exogène à accroître le
degré de stimulation de l'enzyme SEH suggère que la protéine kinase AMPc indépendan-
te qui active directement la cholestérol estérase est déjà activée dans notre
préparation.
Nous nous proposons maintenant de traiter notre préparation d'enzyme SEH
par diverses phosphatases afin de désactiver soit la protéine kinase kMPc indépen-
dante,
soit la cholestérol estérase elle-même, soit enfin les deux enzymes à la
fois. Ce traitement devrait alors rendre la préparation d'enzyme plus stimulable et
sensible à la protéine kinase AMPc dépendante.

---

- 76 -
CHA P I T R E
III
=====================
TRAITEMENT de la CHOLESTEROL ESTERASE PARTIELLEHENT
PURIFIEE par DIVERSES PHOSPHATASES
---------~------------------------

---

-
77 -
A -
PAR UNE PHOSPHATASE ALCALINE
================================
BECKETT et BOYD
(1977)
puis NAGHSHINEH et Col.
(1978)
ont montré l'action
d'unephosphatase alcaline sur la cholestérol estérase de la surrénale bovine. La
pré incubation de la préparation brute d'enzyme avec la phosphatase alcaline et le
Mgt~ diminuait l'activité de base de la stérol ester hydrolase et augmentait son
degré de stimulation.
Nous réaliserons ce test sur notre préparation partiellement purifiée
d'enzyme.
La préparation d'enzyme obtenue après chromatographie sur DEAE - cellulose
a été préincubée durant 6 heures en présence du Mg~· et d'une phosphata se alcaline
provenant du placenta de vache et disponible dans-le commerce. La préparation d'en-
zyme SEH
traitée à la phosphatase est ensuite activée par l'ATP - Mg+1ou le
système protéine kinase AMPc dépendante
(Fig.
19).
a)
L'activité cholestérol estérase de base demeure pratiquement inchangée.
L'activité enzymatique après stimulation, n'est pas augmentée par le traitement à la
phosphatase alcaline, bien au contraire,
elle diminue/de ce fait le degré de stimu-
lation de l'enzyme est abaissé.
b)
L' ATP - Mg~t produit une activation maximale de l'enzyme comme dans
les deux premières parties de ce travail.
c)
Ni la protéine kinase ~~Pc dépendante, ni son inhibiteur protéique
spécifique n'affecte l'activation de la cholestérol estérase après son exposition à
la phosphata se alcaline d'origine placentaire.
Discussion
Ces résultats s'exoliquent vraisemblablement par une incapacité de la
phosphata se alcaline à inactiver
la caséine kinase responsable de l'activation
de la cholestérol estérase.
Une deuxième interprétation deces résultats, peu probable i l est vrai,
dans le cadre d'une régulation de la cholestérol estérase par LE, serait que la protéine
kinase AMPc indépendante qui active directement l'enzyme SEH n'est pas régulée par
phosphorylation comme suggérée dans l'hypothèse evoquée ci-dessus.

---

- 78 -
A
B
20
E
l:1.
(,)
('1')0
--
:z:
YI
tA
oG)
..> 10
..(,)
ca:
Fig. 19 - Effet de la phosphatase alcaline placentaire sur l'activation de la SEH.
- Conditions de mesure de l'activité SEH : Matériel et Méthodes.
L'enzyme a été préincubée en absence
(r==\\)
ou en présence de
++
"ATP-Mg
"
++
"ATP-Mg
+ AMPc + PK"
lB "ATP-Mg++ + HSPI"
++
-5
ATP
(2 mH)
Mg
(5 mM)
;
AMPc
(5.10
M)
PK AHPc-D
(20 f g )
HSPI
(50 pg : origine coeur de boeuf) .
A ..
Avant traitement oar la phosphatase
B - Après traitement par la phosphatase.

---

-
79 -
Le traitement par la même phosphatase de la SEH activée
(résultat non
présenté) montre que cette phos9hatase est également incapable d'inactiver
l'enzyme SEH.
Ainsi, nous avons voulu soumettre notre préparation d'enzyme cholestérol
estérase à des phosphatases d'origine lutéale.

---

- 80 -
B -
PAR DES PHOSPHATASES DE CORPS JAUNES DE VACHE
=================================================
E.Y.C. LEE et Col. ont décrit, en 1980, une phosphorylase phosphatase peu
spécifique, capable de déphosphoryler la phosphorylase a,
le glycogène synthetase
et d'autres protéines phosphorylées par des protéines kinases dépendantes de l'AMP
cyclique. Elle est peu active sur le P-nitrophenylphosphate.
Son PH d'activité
optimale est voisin de 7. Partiellement purifiée, la phosphorylase phosphatase est
associée à une phosphatase alcaline dont le PH d'activité optimale se situe entre
8 et 9. Cette dernière est plus active sur le P-nitrophenylphosphate que sur la
phosphorylase a.
Ce couple de phosphatas es a été décrit dans le foie de lapin
(E.Y.C. LEE
et Col. 1980, KHANDWAL et Col.
1979) dans le muscle cardiaque de chien
(HENG-CHUN LI
et Col.
1979) et dans le muscle squelettique de lapin
(E.Y.C. LEE et Col.
1980).
Nous avons recherché ce complexe de phosphatases ou plutôt la phosphoryla-
se phosphatase dans le tissu lutéal bovin puis soumis la préparation de cholestérol
estérase à son action.
Pour plus de commodité, nous avons choisi de mesurer l'activité phospha-
tase en présence de P-nitrophenylphosphate.
Une unité enzymatique sera définie comme étant la quantité d'enzyme capa-
ble de libérer une nanomole de
P-Nitrophenol par minute.
Cette activité enzymatique sera appelée phosphatase
l
(ou phos-
phatase lutéale) .
1 -
PURIFICATION DE
LA PHOSPHATASE l
Après dialyse,
les protéines issues de l'étape "précipitation à l'éthanol"
sont soumises à une chromatographie sur DEAE -
cellulose.
Les protéines retenues
sur la colonne sont éluées par un gradient de concentration discontinue de tampon
Tris - phosphate de potassium. L'activité
phosphatase
l
est éluée avec le tampon
phosphate
50 ~1. Les fractions contenant cette activité sont réunies et
stockées à
20°C après passage sur colonne de sephadex G 25.
Le bilan de la purification est donné dans le tableau VI.
La phosphata se l
est purifiée environ 14 fois.

---

- 81
-
Protéines
Activité
Récupération
Activité
totales
totale
en % d'activi-
spécifique
(en mg)
(en unités)
té totale
Surnageant 18 OOO.g
1.245
10.950
8,8
100 %
Surnageant
1.054
10.330
9,8
100 %
Acide acétique
Précipitation au
sulfate d'ammonium
171
2.530
14,8
23 %
Précipitation à
39
1.990
51
18 %
l'éthanol
DEAE - cellulose
6
750
125
7 %
TABLEAU VI -
Purification de la phosphatase l du corps jaune bovin
- Conditions de mesure: Matériel et méthodes B 12
-
L'activité spécifique est exprimée en unités d'enzyme/mg de protéines.
Une unité est définie comme la quantité d'enzyme capable de libérer
1 nanomole de P-Nitrophénol par minute à partir du substrat P-Nitrophényl
phosphate.

---

- 82 -
2 -
TRAI~1ENT DE LA CHOLESTEROL ESTERA SE PAR LA PHOSPHATASE l
a)
- Action de la phosphatase l
sur la cholestérol estérase activée
(Fig.
20 A)
La préparation partiellement purifiée de cholestérol estérase
(fraction
DEAE - cellulose), préalablement activée par ATP - Mg~~ est soumise ensuite au
traitement par la phosphatase lutéale pendant 20 minutes.
La figure 20 A montre que la phosphatase l du corps jaune de vache
n.'.inactive pas la cholestérol estérase du même tissu.
Cette absence
d'inactivation
n'est pas due à un phénomène d'activation
concommittante de l'enzyme par phosphorylation car elle persiste en présence
d'ATP_ase.
b)
- Activation de la cholestérol estérase partiellement?urifiée. trai~e
par la phosphatase l
Dans une deuxième expérience, nous avons voulu savoir si la phosphatase l
étai t
en mesure de...désacti ver la caséine kinase responsable de l ' acti vation de la
stérol ester hydrolase. Dans ce but, nous avons préincubé ensemble les deux prépara-
tions d'enzyme
(phosphatase l et cholestérol estérase)
pendant 20 minutes à 30°C
avant d'ajouter dans un deuxième temps l'ATP - Mg~~ dans le milieu réactionnel pour
activer la cholestérol estérase
(Fig.
20 B) .
Les résultats obtenus sont difficiles à interpréter.
Nous obtenons bien une meilleure stimùlation de la stérol ester hydrolase
après traitement par la phosphatase l, mais cette élévation du degré de stimulation
de la SEH ne résulte pas d'une baisse de l'activité de base de l'enzyme (contrôle)
qui augmente très légèrement.
Ce résultat pourrait peut-être
s'expliquer par l'existence dans la prépa-
ration de phosphatase l, d'un facteur qui favoriserait l'activation de la cholesté~~·
roi estérase.
Si l'on rajoute le HSPI dans le milieu de préincubation en même temps que
la phosphatase lutéale, on n'observe pas de diminution significative de la stimula-
tion supplémentaire obtenue. De ce fait,
une activation de la caséine kinase par une
protéine kinase AMPc dépendante pouvant se trouver dans la préparation de phospha-
tase l
semble exclue.

---

- 83 -
200
...
ln
B
Q)
A
c
.-
oQ)
~
C)
..Q,
Q)
~
O'l
~ë
.......
.......
Q,
.......
.......
.......
Co)
100
.......
.......
('t').
.
.
.......
0
...-
.......
.......
.......
.......
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.......
1.&.1
~.;mm:
.......
.......
fi)
.......
........
~~
1:!iI······
........
.......
.......
.......
~
.
.......
.......
~
::::::: .-:.:.:.:.:
>
.-...
::::::: :::::::::::
::::::: .:.:.:.:.:.
Co)
::::::: :::::::::::
et
::E:::: :::::::::::
::::Ë;; :::::::::::
Fig.
20 - Traitement de la SEH partiellement purifiée par la phosphatase lutéale
(Phosphatase I)
- Conditions de mesure: Matériel et Méthodes.
A - Effet de la phosphatase lutéale sur la SEH préalablement activée par l'addition:
E3
++
"contrôle"
:::::::::::- "ATP-Mg
+ Phosphata se l''
• ++
++
"ATP-Mg
"
BI "ATP-Mg
+ Phosphatase 1.+ ATPase"
(phosphatase l et ATPase ont été rajoutées 15
minutes plus tard) .
B - Activation de la SEH traitée préalablement par la phosphatase lutéale.
........
:mm~ "Phosphatase l''
........
::::::::~ "Phosphatase l + ATP-Mg++"
~
++
~ "Phosphatase l
+ HSPI + ATP-~1g
"
++
(ATP-Mg
a été ralouté 20 minutes plus tard).
++
ATP
(2 mM)
; Mg
(5 mM )
Phosphata se l
(18,5 unités)
HSPI
(50 pg
origine du
coeur de boeuf).

---

- 84 -
RESUME ET CONCLUSION GENERALE
=============================
Nous avons d'abord vérifié que la cholestérol estérase brute du cytosol
est activée par incubation en présence d'ATP - Mg~~
L'inhibiteur protéique,
spécifique des protéines kinases AMPc dépendantes
n'affecte pas cette activation.
La purification partielle de l'enzyme SEH a permis d'éliminer pratiquement
de notre préparation les protéines kinases AMPc dépendantes. Cependant celle-ci
a conservé intégralement sa caDacité d'être activée en présence d'ATP - Mg~~ .
Nous avons montré que cette activation est dépendante du Mg++ et qu'il
s'agit donc vraisemblablement d'un mécanisme de phosphorylation.
La présence de caséine kinase(s) dont l'activité est AMPc indépendante
dans notre préparation partiellement purifiée de cholestérol estérase suggère
l'implication de cette protéine kinase AMPc indépendante dans le mécanisme d'activa-
tion de l'enzyme étudiée.
L'addition de protéine kinase AMPc dépendante, provenant du muscle de
lapin n'accroit pas le degré de stimulation de la cholestérol estérase en présence'
d'ATP - Mg+~
Nos résultats n'exluent pas la possibilité d'une intervention de protéine
kinase AMPc dépendante dans le mécanisme physiologique d'activation de la cholesté-
rol estérase, implication déjà rapportée par d'autres auteurs sur divers tissus
stéroidogènes et notamment le corps jaune de vache. Par contre,
les résultats de
notre étude suggèrent que l'activation de la cholestérol estérase n'est pas sous le
contrôle direct d'une protéine kinase M1Pc dépendante. L'incapacité de la protéine
kinase AMPc dépendante exogène à augmenter le degré d'activation de l'enzyme SEH
suppose soit une activation déjà maximale de la protéine kinase AMPc indépendante
qui contrôle directement la stimulation de la SEH soit l'absence d'un maillon
int~rmédiaire, indispensable à l'activation de la protéine kinase AMPc indépendante
par la protéine kinase k~Pc dépendante. Cependant le traitement de la cholestérol
estérase par diverses phosphatases n'a pas apporté de preuves à cette hypothèse.
Notre incapacité à démontrer un contrôle indirect par une protéine kinase
AMPc déDendante de la stimulation de la cholestérol estérase renforce paradoxalement
la possibilité d'une activation de l'enzyme SEH par une protéine kinase totalement

---

- 85 -
indépendante
de l'AMP cyclique. Néanmoins cette hy?othèse demeure très peu
vraisemblable car elle sort du cadre de la régulation par l'hormone antéhypophysaire
LH de la cholestérol estérase
(planche D) .

---

- 86 -
PK AMPc-lnd
inactive
ATP
S H
- -..... )
M g++
ATP
ATP
ADP
1
PK AMPç-lnd
oct;.o
~
2
PK AMPc-lnd
PK AMPc-D
"
2e
active
L.---~ R -(AMPc)
ADP
AD P
2
2
AMPc _ _1_-4"~
SEH- P
(SEH activée 1
R C
2 2
PK AMPc-D
inactive
PLANCHE D -
Hypothèses retenues DOur expliquer l'activation de la SEH par
l'ATP-Mg++ dans nos conditions expérimentales
- Activation indirecte par une protéine kinase AMPc-dépendante
2 - Activation par une protéine kinase totalement indéoendante
de l'AMPc.

---

- 87 -
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"Par délibération de son Conseil, en date du 10 novembre 1970,
l'Université n'entend donner aucune approbation ni improbation aux
ooinions émises dans les thèses ou mémoires. Ces opinions doivent être
considérées comme propres à leurs auteurs".

---

Vu,
le PRESIDENT DE JURY
CAEN,
le
Vu,
le DIRECTEUR de l'U.E.R.
CAEN, le
Vu et PEID1IS d'IMPRIMER en référence de la
délibération du
Conseil de l'Université en date du 14 décembre 1973.
LE PRESIDENT
CAEN,
le
M. ROBBA

---