ACADEMIE
DE
MONTPELLIER
UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC
THESE
présentée à l'Université des Sciences et Techniques du Languedoc
pour obtenir le grade de
DOCTEUR D'ETAT mention SCIENCES
CONTRIBUTION A L'ETUDE DU METABOLISME
DES UREIDES CHEZ LE SOJA (Glycine max (L)Merr.)
par
Mathias ZENGBE
soutenue le 24 Février 1984 devant la Commission d'Examen
JURY: Mme N. PARIS,
Présidente
Mr
E. JOLIVET
Mr
G. CAVALlË
Mr
M. OBATON,
Mr
L. SALSAC.

---

- l -
La réalisation de ce travail n'a été possible que grâce
à l'environnement scientifique et moral dont j'ai bénéficié au Labora-
toire des Symbiotes des Racines de MONTPELLIER (INRA). Je tiens donc à
témoigner toute ma gratitude à MM. SALSAC et OBATON. A mon arrivée à
MONTPELLIER, M. OBATON venait juste de s'y installer et le L:xboratoire
des Symbiotes des Racines était en pleine installation. Mais iZ n'a
pas hésité à m'accueillir et à suivre l'évolution de ce travail. Je
l'en remercie très sincèrement ainsi que de l'aide qu'il m'a toujours
apportée.
Monsieur SALSAC, Directeur du Laboratoire des Symbiotes
des Racines, s'est particulièrement intéressé à ce travail qu'il n'a
pas cessé de diriger et d'orienter malgré ses multiples occupations.
Ses encouragements et sa disponibilité à mon égard m'ont été d'un très
grand réconfort. C'est un immense honneur pour moi d'avoir travaillé
sous sa direction.
Mme PARIS a bien voulu juger ce travail et en présider
le jury. Je lui suis reconnaissant de cet honneur.
MM. JOLIVET et CAVALIE ont non seulement accepté de se
déplacer jusqu'à MONTPELLIER pour participer à mon jury, mais ils ont
été également chargés de la lourde tâche d'établir les rapports. Je
voudrais les remercier de tout coeur pour l'intérêt qu'ils portent à
ce travail, et leur présenter mes excuses pour l'envoi tardif du ma-
nuscrit.
Toute l'équipe du Laboratoire des Symbiotes m'a apporté
une aide et une amitié très précieuses sans lesquelles je n'aurais cer-
tainement pas réussi dans cette entreprise. Je voudrais donc lui témoi-
gner toute ma reconnaissance. Mes remerciements s'adressent à :
- Jean-Claude CLEYET-MAREL et à Jean-Jacques DREVON
qui ont souvent participé à l'élaboration des expériences et à la dis-
cussion des résultats,

---

- II -
- Hélène PAYRE, Pascal TILLARD et Georges VAlIJBIERVLIET
dont j'ai toujours apprécié l'aide et la bonne humeur,
- Christine ARGILLIER qui a participé à ce travail dans
le cadre de son DEA et m'a aidé dans la réalisation des graphiques,
- Claude PLASSARD, Daniel' MOUSAIN et Marc MENTION,
- Tous les stagiaires qui ont contribué à créer l'ambi-
ance propice à la réalisation d'un tel travail.
La mise en pages de ce mémoire a été réalisée par Pier-
rette GARCIA, Françoise BRODIN et Hélène PAYRE. Je leur suis profondé-
ment reconnaissant pour cette aide précieuse.
Ce travail a été en partie réalisé au laboratoire de Bio-
chimie et de Physiologie Végétale de l'ENSAM où j'ai pu bénéficier d'un
encadrement scientifique et matériel. Je remercie son Directeur, le Pro-
fesseur Claude GRIGNON pour ses conseils. Je remercie également Paul
ROBIN, Michel ROSSIGNOL, Jean-Claude DAVIDIAN, Hervé SENTENAC, Mme Deni-
se BLAYAC, Geneviève CONEJERO, Nico le GRIGNON, Remy GIBRAT.... qui se
sont montrés toujours disponibles quand leur aide ou leurs explications
m'étaient nécessaires.
Michel DELSENYa bien voulu m'accueillr pendant une se-
maine dans son laboratoire à PERPIGNAN pour m'initier à l'étude des aci-
des nucléiques. Je l'en remercie.
Je remercie la Direction et en particulier la Sous-Direc-
tion de l'ENSA d'ABIDJAN pour leur compréhension qui a rendu possible
mon absence de mon poste d'enseignant. Je remercie enfin tous mes collè-
gues de cette Ecole et mon amie Nancy NOLAN dont les encouragements et
le dévouement ne m'ont jamais fait défaut.
Mon séjour au sein des équipes du Laboratoire des Symbio-
tes des Racines et de celui de Biochimie et de P~ysiologie Végétale (LNRA-
ENSAM) m'a apporté un enrichissement considérable aussi bien sur le plan
scientifique qu'humain.

---

-1 II-
SOMMAIRE
Pages
Données bibliographiques......................
2
1 - Rappels sur le mécanisme de la réduction de l'azote
2
A - La nitrogénase
2
1 - Constitution
·........................
2
2 - Fonctionnement de la nitrogénase
3
B - Coût énergétique de la réduction de N2.................
7
II - Incorporation de l'azote fixé dans les molécules organiques
9
+
A - Assimilation de NH
9
4
B - Synthèse de l'asparagine et des autres acides aminés ..
12
C - Sources de carbone pour l'assimilation et le transport
de l' az ote
.
13
III - Transport et stockage de l'azote fixé chez les légùmineuses
14
A - Les légumineuses à amides
.
17
B - Cas des Phaseoleae : synthèse et métabolisme des uréi-
des.
.
.
19
1 - Biosynthèse des uréides
.
21
2 - Métabolisme des uréides da~~~1t~plante
.
28
~,,'JEet:;"',,-
3 - Importance et signifiqation-des~r~'\\deSchez les
Phaseo l eae
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r·1atériel et techniques
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veg e a
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.
35
A - Choix du matériel végétal
.
35
B - Cultures de légumineuses
.
35
1 - Ens erre
.
35
2 - Au champ et sur bacs
36

---

··IV-
C - Préparation des échantillons
36
1 - Prélèvement de la sève
36
2 - Préparation des échantillons d'organes
36
II - Dosage des composés azotés et des sucres totaux • . . . •....
36
A - Azote total et azote soluble
36
B - Uréi des
'
'. . . . .. . . . . . .
37
C - Aci des ami nés libres
37
D - Protéi nes
37
E - Nitrate
38
F - ARN
38
G - Sucres totaux
38
III - Mesure des activités enzymatiques
38
A - Ni trogénase
38
B - Xanthine déshydrogénase, uricase, allantoinase et allan-
toicase
38
C - PRPP synthétase
40
D - Ri bonucl éase
40
IV - Quelques preclslons sur la variabilité et l'expression
des résul tats
41
CHAPITRE l - Distribution des uréides et relation entre leur
formation et la fixation de N chez le Soja
43
2
l - Répartition des uréides chez le Soja
43
A - Concentration de l a sève en uréi des
43
B - Répartition des uréides dans les organes du soja
47
1 - Nodosités, racines, tige et feuilles
47
2 - Gousses
51
II - Relation entre la fixation de l'azote et les teneurs en
uréides du Soja
53
A - Variations des teneurs en uréides et de l'activité ni-
trogénase chez le soj a
'
'. . . . . . . ..
54
B - Relation entre l'activité nitrogénase et la synthèse
des uréi des
56

---

-V-
III - Conclusion
::
................................................... .. 64
'
CHAPITRE II
Les enzymes de la synthèse et de la dégradation des
uréi des
66
1 - Synthèse des purines
66
II - Catabolisme des bases puriques
68
A - Répartition des enzymes du métabolisme uréidique entre les
fractions de la nodosité
69
B - Activité XDH chez le Soja
70
C - Activité uricase
72
III - Dégradation des uréides
74
A - Dégradation des uréides dans les nodosités et les racines ..
74
B - Dégradation des uréides dans les tiges et les feuilles .....
76
1 - Allantoïnase
76
2 - Allantoicase
78
C - Dégradation des uréides dans l es gousses
78
IV - Conclusion.....................................................
82
CHAPITRE III
Influence des facteurs du milieu sur la synthèse des
uréi des chez le Soja
84
1 - Ef!~t de l 'obscurité sur la synthèse et la dégradation des
urel des
85
A - Effet de l'obscurité sur l'activité nitrogénase et les
teneurs en uréides de la plante
86
1 - Activité nitrogénase et sucres totaux des nodosités
86
2 - Teneurs en uréi des
88
B - Ef!~t de l 'obscurité sur les enzymes du métabolisme des
ureldes
90
1 - XDH, uricase et allantoinase de la nodosité
91
2 - Allantoïnase et allantoïcase de la tige et des feuilles
93

---

-VI-
II - Ef~et des ions NO; et NH; sur la synthèse des uréides chez le
SOJa ..• ..• • . • • . . . • • • . . • . . • . . • • • . • • . . . • •• . • . • • . . . • • • . . •• . • •• •• • • ••
95
A - Effet de NO; et NH; sur la nodulation, le développement et
l'activité fixatrice des plantes
98
B - Effet de NO; et NH; sur les teneurs des différents consti-
tuants azotés de la plante
100
1 - Azote uréidique de la sève
100
2 - Azote aminé et azote nitrique de la sève
108
3 - Teneurs en uréides des organes du Soja
108
4 - Evolution des proportions de l'azote uréidique et l'azote
aminé par rapport à l'azote total de la sève
112
C - Effet de NO; et NH; sur les activités des enzymes de la dé-
gradation des purines dans les nodosités
114
III - Conclusion
114
CHAPITRE IV : Influence de la légumineuse et de la souche de Rhizobium
sur la synthèse des uréides
118
l - Influence de la légumineuse
119
A - Evolution des activités nitrogénase et des teneurs en sucres
totaux des nodosités de soja et de pois
121
B - Métabolisme des uréides chez le soja et le pois
122
1 - Teneurs en uréides des plantes
123
2 - Enzymes du métabol isme des uréides
125
C - Teneurs en ARN et activité ribonucléase des nodosités de
soja et de pois
131
II - Influence de la souche de Rhizobium japonicum sur la production
d'uréides chez le Soja en présence ou non d1azote minéral
135
A - Nodulation, activité fixatrice et développement des plantes
associées à la souche G ..........•......................... 137
1
1 - Nodulation et développement des plantes
137
2 - Activité fixatrice des plantes
138

---

-VII-
B - Teneurs en uréides et en acides aminés des plantes nodulées
pa r G
141
1
1 - Concentration en N-uréides et N aminé de la sève
141
2 - Accumulation des uréides dans les organes du Soja
145
C - Enzymes du métabolisme des uréides dans les nodosités for-
mées pa r G1
;.............................
146
III - Conclusion..........................
148
Discussion...........................................................
150
Conclusion générale
163
Bibliographie
167
Annexe
IX

---

-VIII-
LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS
ADP, adénosine diphosphate ; AMP, adénosine-5 1 -monophosphate ; ARA, activité
réductrice d'acétylène; ARA spécifique, ARA par unité de poids de matière
fra'che ou de matière sèche des nodosités; ARN , acide ribonucléique;
ARNase, ribonucléase; ATP, adénosine triph6sphate ; EDTA, acide éthylène-
diaminetétracétique, sel dissodique ; F, floraison; Fd, ferrédoxine ;
FG, formation des gousses; Fld, flavodoxine ; GAR, glycinamide ribotide ;
GDH, glutamate déshydrogénase; GMP, guanosine-5 1 -monophosphate ; GOGAT,
glutamate synthase; GS, glutamine synthétase ; IMP, inosine-5 1 -monophosphate
MeFH , méthyltétrahydrofolate ; MF, matière fra'che ; MG, maturation des grai-
4
nes ;M.M., ,masse molaire; MS, matière sèche ; NAO+, nicotinamide adénine di-
nucléotide forme oxydée; NAOH, nicotinamide adénine dinucléotide, forme ré-
duite; NADP, nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, forme oxydée;
NADPH, NADP, forme réduite; PEP, phosphoénolpyruvate ;PGADH, phosphoglycé-
rate déshydrogénase; Pi, phosphate inorganique; Polyclar AT, polyvinylpyr-
rolidone insoluble; PRAT, phosphoribosylpyrophosphate a~idotransférase
PRPP, phosphoribosylpyrophosphate ; RG, remplissage des gousses; SHM, sé-
rine hydroxyméthylase ; TCA , acide trichloracétique ; TES, acide
[(tris [hydromymétyl]- métyl)-amino]-2~éthane sulfonique ; Tris, Tris (hydro-
xyméthyl)-aminométhane ; XOH, xanthine déshydrogénase; XMP, xanthosine-5 1 -mo-
nophosphate ; Y.E.M., yeast extract mannitol.

---

- 1
INTRODUCTION
Les uréides existent chez plusieurs végétaux et leur mé-
tabolisme est également réalisé par de nombreux microorganismes. Mais
chez les légumineuses de la tribu des Phaseoleae, ces composés apparais-
sent principalement au moment de l'installation des nodosités et de
l'activité fixatrice. L'azote nouvellement fixé est incorporé dans ces
molécules. Cette forme particulière du métabolisme de l'azote atmosphé-
rique par certaines légumineuses a reçu un regain d'intérêt depuis les
observations de t~ATSlI~1OTO et al (1977 a) avec 15N2 ·
L'étude de ces composés, en plus de pouvoir expliquer le
mécanisme général du métabolisme de l'azote chez les légumineuses, revêt
un intérêt agronomique certain: leur apparition chez une légumineuse
tirant son azote exclusivement de la fixation symbiotique, est liée à
l'activité nitrogénase des nodosités. Leur présence chez les légumineu-
ses qui en produisent pourrait donc servir d'indicateur de l'intensité
de la fixation chez ces dernières. C'est donc dans ce double but (une
meilleure compréhension du mécanisme de la synthèse des uréides et
l'intérêt agronomique que pourrait impliquer l'utilisation de ces com-
posés pour la mesure de l'activité nitrogénase) que ce travail a été
entrepris sur le Soja qui est de loin la légumineuse la plus étudiée,
en raison de son importance économique. Les résultats obtenus sur cette
légumineuse peuvent être étendus à d'autres légumineuses, également pro-
ductrices d'uréides. Ces résultats sont exposés dans les chapitres l, II,
III et IV de ce mémoire, après une première partie consacrée à une revue
bibliographique des travaux antérieurs sur le métabolisme des uréides.
La profusion de ces travaux depuis les dix dernières années explique
l'abondance de cette revue.
Le chapitre 1 traite de la répartition des uréides dans
la plante de Soja et de la relation entre la formation de ces composés et
l'activité nitrogénase. Le chapitre II est consacré à l'étude et à la dis-
tribution des enzymes impliquées dans la synthèse et la dégradation des
uréides. Dans les chapitres III et IV, nous avons étudié les conditions
de la formation des uréides chez une légumineusè.
Dans la dernière partie, les principaux points de nos
résultats sont repri~ dans une discussion et une conclusion générale.

---

- 2 -
DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
l - RAPPELS SUR LE MECANISME DE LA REDUCTION DE L'AZOTE
La fixation biologique de l'azote est une propriété de quel-
ques plantes superleures. Parmi celles-ci les légumineuses sont les plus
importantes au point de vue agronomique. Ces légumineuses qui appartien-
nent aux sous-familles des Papilionaceae, des Mimosaceae et des Caesalpi-
naceae doivent être associées en symbiose avec des microorganismes proca-
ryotes appartenant au groupe des Rhizobium. Cette symbiose se caractérise
par l 'apparition sur les racines de ces plantes de nodosités qui assurent
la fixation et la réduction de l'azote moléculaire grâce à la nitrogénase
présente dans le microsymbiote.
A - La nitrogénase
1 - Constituti on
Les premières nitrogénases qui ont été isolées sont celles
d'Azotobacter vinelandii (KELLY et al., 1967) et de Clostridium pasteuri-
anum (~IORTENSEN, 1966 ; 1'1ORTENSEN et al., 1967).
Chez les légumineuses, BERGERSEN et TURNER (1967) ont mon-
tré que la nitrogénase est localisée dans les bactéroïdes. Celle du Soja
a par la suite été isolée et purifiée par plusieurs auteurs dont KLUCAS
et al., (1968) et BERGERSEN et TURNER (1970). La structure de cette en-
zyme est la même chez tous les organismes fixateurs. Elle comporte deux
composants ou protéines séparables par chromatographie sur DEAE cellulo-
se. La première protéine, communément appelée composant l contient des
atomes de fer et de molybdène, alors que la deuxième protéines ou compo-
sant II ne contient que du fer.
Les masses molaires de ces deux protéines varient de 200.000
à 300.000 pour la première et de 50.000 à 70.000 pour la seconde.
Du point de vue de la nomenclature, le composant l a été
dés igné sous l es noms de molybdoferrédoxi ne (~1ORTENSEN et al., 1967),

---

- 3 -
azofermo (HARDY et BURNS, 1973) ou de nitrogénase (HAGEMAN et BURRIS,
1978). Le composant II est désigné par les termes de azoferrédoxine,
azofer ou nitrogénase réductase. La tendance actuelle est de désigner
les deux composants par les initiales des organismes dont est issue la
nitrogénase (EADY et al., 1972, POSTGATE, 1974 ; YATES, 1980). On a
ainsi CP1' CP2 ; AV1, AV2 ; AC1, AC2 ; KP1' KP2 et Rj1' Rj2 pour dési-
gner respectivement les composants 1 et II des nitrogénases de CZostri-
diwn pasteurianwn
Azotobacter vineZandii
Azotobacter ch:l'oococcwn
3
3
3
KZebsieZZa pnewnoniae
et Rhizobiwn japonicum.
La protéine 1 d'un système peut être combinée avec la pro-
té"ine II d'un autre système pour donner une nitrogénase IIhybride ll active
(EADY et POSTGATE, 1974).
Les deux protéines de la nitrogénase et notamment le compo-
sant II sont irréversiblement inactivées par l'oxygène. Une protection
de l'enzyme contre l'oxygène est donc nécessaire. Dans les manipulations
in vitro, 1'utilisation d'un puissant réducteur tel que le dithionite per-
met de piéger 1•oxygène dissous.
Chez les microorganismes aérobies le système de protection
contre l'oxygène est très complexe et peut aller de la présence de cellu-
les spécialisées, les hétérocystes des cyanobactéries à l'intense respi-
ra t i on des Azotobacter
(EADY et POSTGATE, 1974).
Dans les bactéroïdes des légumineuses cette protection est
assurée par une hémoprotéine à forte affinité pour l'oxygène, la leghémo-
globine. Ce pigment dont la couleur rouge est communément considérée com-
me l'indice de l'activité fixatrice est fonctionnel sous sa forme ferreuse,
seule capable de fixer l'oxygène (PUPP8, 1981).
2-Fonctionnement de la nitrogénase
a - Réduction de l'azote moléculaire
En exposant des nodules de Soja dans une atmosphère de 15 N2 ,
BERGERSEN avait montré dès 1965 que 90% de l'azote fixé se trouvait sous
forme de NH 3 une minute après le début de l'exposition. Il en déduisit

---

- 4 -
PHOTOSYNTHETAT
4ADP Mg ('A3)
2(Prot.Fe 2ATPMg)
Prot.MoFe
rpd.
ox.
2(ProUe 2ADPMg)
Proto Mo Fe
Olt.
réd.
4ATPMg(lC3)
4 Pi(x3)
METABOLISME
Figure- -l-Mécanisme de la réduction de l'azote moléculaire par la nitrogénase
des nodosités de Légumineuses.
Six transferts successifs d'électrons sont nécessaires pour obtenir
la réduction de N2 en NH3 (d'après ATKINS et RAINBIRD.19RP,J

---

- 5 -
donc que l'ammoniac est le premier produit stable de la réduction de 1~2
par la nitrogénase.
Le fonctionnement de la nitrogénase dans cette réduction est
schématisé par la figure 1 (ATKINS et RAINBIRD, 1982). La réaction géné-
rale de la formation de NH
peut s'écrire de la manière suivante:
3
8 e-; Ng+
N + 8H+ ------'---"'--------.
.. 2 Il'H
+ H
2
ATP
..
3
2
~
Si cette réaction exigeait d'abord le passage de l'azote de
la forme moléculaire N=N à la forme atomique 2N, une très forte dépense
énergétique initiale serait nécessaire car l'enthalpie libre correspon-
dant à la rupture de la triple liaison est très élevée (6Go = 219 Kcal).
En fait, la réduction est faiblement exergonique (6G
= -
o
6,4 Kcal) car
la formation spontanée des liaisons. N-H compense la forte dépense d'éner-
gie nécessaire à la rupture des liaisons de la molécule d'azote. La très
forte énergie de liaison de cette molécule est responsable de l'inertie
chimique de ce gaz, ce qui explique que très peu d'organismes vivants
peuvent réaliser la réduction de l'azote en ammoniac.
Au cours de cette réduction par la nitrogénase il y a trans-
fert de 8 électrons et 8 protons et hydrolyse de 4 ATP par paire d'élec-
trons alloués à la formation de NH . L'ATP intervient sous forme d'un
3
complexe ATP-Mg. Les électrons sont d'abord transférés au composant II,
puis au composant 1 et enfin au substrat. Un abaissement du potentiel
d'oxydoréduction et une modification de la conformation de la nitrogéna-
se sont nécessaires pour permettre ce transfert. Les deux composants de
la nitrogénase passent successivement de l'état réduit à l'état oxydé
et il faut trois transferts de deux électrons pour assurer la réduction
de N2 (Fi g. 1).
L'énergie (ATP) et le pouvoir réducteur, source d'électrons
et de protons sont fournis par le catabolisme respiratoire des photosyn-
thétats produits par la plante sous forme d'hydrates de carbone. Le
pouvoir réducteur peut être de différentes formes selon les organismes
et les conditions environnantes. Cependant, chez le Rhizobium, le système
réducteur est essentiellement constitué de NADPH
(WONG et al., 1971).
2

---

- 6 -
Le transfert des électrons entre le NADPH 2 et le composant II de la nitro-
génase est assuré par des transporteurs intermédiaires, la ferrédoxine
(Fd) et la flavodoxine (Fld).
b - Producti on d' hydrogène par la nitrogénase
Convne l'indique la figure 1, il ya en plus de la réduction
de N , une production d'hydrogène moléculaire par la nitrogénase. Cette
2
production d'hydrogène dite ATP-dépendante parce qu'elle n'a lieu qu'en
présence d'ATP, a été mise en évidence pour la première fois par HOCH et
al., (1957) sur des nodosités de Soja.
Cette compétition entre la réduction de N et celle des
2
protons dépend du flux d'électrons et des concentrations de ces substrats
(ATKINS et RAINBIRD, 1982). A faible flux d'électrons, la réduction de N2
serait déprimée.
Il existe cependant des microorganismes fixateurs et surtout
certaines souches de Rhizobium dites Hup+ (hydrogen uptake positive) ca-
pables, grâce à leurs hydrogénases membranaires, de recycler l'hydrogène
gazeux provenant de la réduction des protons. Ce recyclage permet de ré-
cupérer une partie de l'ATP utilisée dans cette réduction.
1/2 O2
H 2 - - -......
~ 2H+ + 2e-----::::OO""""l::O---+~ H 0
/"'Ç
2
ADP + Pi
ATP
Cette oxydation de l 'hydrogène par l 'hydrogénase pourrait
constituer un autre système de protection de la nitrogénase contre l'oxy-
gène (DIXON, 1972 ; EMERICH et al., 1979).
c - Autres substrats de la nitrogénase
Outre N et H+, la nitrogénase peut catalyser la réduction
2
d'un certain nombre de petites' molécules à triple liaison. Parmi ces mo-
lécules, l'acétylène (CH=CH) a fait l'objet d'une étude plus approfon-
die (DILWORTH, 1966). Sa réduction en éthylène, mesurée par la chromato-
graphie en phase gazeuse (HARDY et al., 1968) constitue actuellement la
méthode la plus courante pour déterminer l'activité nitrogénase.

---

- 7 -
B - Coût énergétique de la réduction de llazote
Les multiples fonctions, liées à la fixation de l'azote
réduction de l'azote moléculaire, émission de l'hydrogène, protection de
la nitrogénase contre l'oxygène, l'assimilation de N2 réduit, consti-
tuent les principales sources de dépenses énergétiques pour la nodosité.
De toutes ces fonctions, la réduction de N semble être la
2
réaction la plus coûteuse en énergie.
Sur le plan thermodynamique, si on considère la réduction
directe (N
+ 3H --'2 NH
2
2
3) l'enthalpie libre standard est de - 7,98 Kcal
par mole de N . Dans l 'hypothèse d'une formation de produits intermédiai-
2
res, la diimide et l 'hydrazine, seule la formation de la diimide nécessi-
te de l'énergie (+ 51 Kcal), la réduction de la diimide puis celle de
l'hydrazine
sont des réactions exergoniques qui libèrent plus, d'énergie
que n'en a consommé la formation de diimide ; la réaction globale est
donc exergonique.
Que la réduction de N2 comporte ou non des étapes intermé-
diaires, la réaction exige une forte dépense d'énergie, aussi bien dans
les procédés industriels que lors de la fixation biologique. La raison
en est certainement la stabilité de la triple liaison de la molécule
( Ll HO = + 226 Kca l ) .
Sur le plan biochimique cette réduction s'accompagne d'une
consommation d'ATP. Le nombre d'ATP nécessaire varie avec les conditions
environnantes (pH, température, proportions des composants l et II de
la nitrogénase). Dans les conditions générales, deux ATP sont hydrolysées
par électron transféré à l'enzyme pour réduire une mole de N .
2
Chez Clostridiwn, l a fourniture d' ATP, d' électrons et de
protons est assurée par les réactions phosphoroclastiques. Par contre,
chez Azotobacter ainsi que d'autres microorganismes fixateurs anaérobies,
l'ATP est fournie par la phosphorylation oxydative du glucose (LJONES,
1974) dont 0,55 à 0,75 moles sont consumées par mole de N "
2

---

- 8 -
.
Tableau l
Coût théorique de la réduction et de l'assimilation de N .
2
Ce coût moyen est estimé sur la base de PlO = 2 et ne tient
pas compte de la régénération de H , ni de la fixation du CO
2
2
par la PEP carboxylase
Equivalents - ATP
IVloles de glucose
par mole de N2
par mole de N2
Réduction de N2
18
0,75
Production de H2
6
0,25
Assimilation de NH:
7(a)
.0,85
Transport
5
0,14
Croissance et maintien
des nodosités
14,5
0,41
Croissance et maintien
des rad nes
43,5
1,23
Coût total
94
3,63
(a) Ce coût serait de 31 équivalents - ATP en cas de transport sous forme
d'asparagine
Tableau II
Consommation de carbone pour la réduction de N par quelques
2
légumineuses
Légumineuses
gC/gN
fixé
Références
Phaseolus vulgaris
6,1
MAHON, 1979
Glycine max
6,3
RYLE et al., 1979
Lupinus albus
6,6
LAYZELL et al., 19:
Vicia faba
6,7
MAHON, 1979
Vigna unguiculata
6,8
HERRIDGE et PATE,
6,8
RYLE et al., 1979
Pisum sativum
6,8
MAHON, 1977

---

-9 -
Les coûts approximatifs de la réduction de N et du transport
2
du NH+ sont résumés dans le tableau 1 (SCHUBERT et WOLK, 1982) .
.4
Cette consommation d'ATP et du glucose explique l'utilisa-
tion abondante des photosynthétats par les nodosités. HERRIDGE et PATE
(1977) ont estimé que pendant la phase de croissance de Vigna unguiculata,
24% du carbone provenant de la photosynthèse sont consacrés à la respira-
tion des nodosités et des racines alors 'que 17% seulement sont utilisés
pour la formation de matière sèche des graines. Les besoins en carbone
de la nodosité pendant la réduction de N2 ont été détermi~és chez plu-
sieurs légumineuses (tabl. II) ; chez Vigna unguiculata la consommation
du carbone par les racines nodulées est 61% plus élevée que celle par des
racines non nodulées ayant reçu du nitrate UlINCHIN et al., 1980). Ces·
auteurs observent donc une corrélation positive entre la respiration des
nodosités et la fixation de N ,
2
II - INCORPORATION DE L'AZOTE FIXE DANS LES MOLECULES ORGA-
NIQUES
+
A - Assimilation de NH 4
Les travaux de KENNEDY (1966) avec 15 N2 ainsi que ceux de
MEEK et al., (1978) et de SCHUBERT et COKER, III (1981) avec 13N2 ont
montré que la glutamine et le glutamate sont les premiers produits de
l'assimilation de NH~ dans les nodosités de légumineuses. Le NH~ formé
dans les bactéroïdes est d'abord libéré dans le cytosol (BERGERSEN et
TURNER, 1967).
Cette assimilation peut se faire par deux voies différentes
(MIFLIN et LEA, 1976) (fig. 2) :
- d'une part, la voie glutamate déshydrogénase - glutamine
synthétase (GDH - GS),
- et d1autre part, la voie glutamine synthétase - glutama-
te synthase (GS - GOGAT).
Deux formes distinctes de glutamate déshydrogénase (GDH,
EC. 1.4.1.3 ) ont été identifiées chez les végétaux supérieurs (STEWART
et al., 1980), une forme mitochondriale qui exige le NAD+ et une forme
chloroplastique à NADP. La NAD+ - GDH est présente dans tous les organes

---

~ 10 -
NH3
~
ADP.P;
NADP
01:
GLUTAMATE
'GLUTAM'NE
lIl/ Cétoglutarate
Fd réd. ou
NADPH
GLUTAMINE --_.....:=~~~---+ 2 GLUTAMATE
FigUI'e 2- Assimilation de NB +. Que le NB + provienne de l 'azote fixé~ de la réductio1
4
de N0 -
ou absorbé du milieu extérieur~ il est assimilé par les voies I et
3
II.
Iii voie I est catalysée par la glutamate déshydPogénase (1) et la
glutamine sythétase (2) et la voie II par la glutamine synthétase (2) et
la glutamate synthase (3).

---

- 11 -
des végétaux superleurs. Chacune des deux formes de GDH aurait un rôle
spécifique dans l'assimilation de NH~. La NADP-GDH assurerait la rôle
de l'assimilation alors que la NAD+ - GDH serait chargée de la désami-
nation du glutamate (STE~JARTet al., 1980).
La voie GDH avait été observée dans les nodosités de Soja
par APRISON et al., (1954) et d' Ornithopus sativus par KENNEDY (1966).
Dans les nodosités de légumineuses, la GDH serait loca-
li~ée aussi bien dans les bactéroïdes que dans le cytosol (BROWN et
DILWORTH, 1975), mais l'activité de la fraction cytosolique de l'enzyme
est beaucoup plus élevée (DUNN et KLUCAS, 1973).
La glutamine synthétase, GS (EC. 6.3.1.2 ) et la gluta-
mate synthase, GOGAT (EC. 1.4.7.1 ) sont surtout localisées dans le cy-
toso l des nodos ités (ROBERTSON et al., 1975 ; SCOTT et al., 1976
HERRIDGE etal., 1978 ; SEN et SCHULMANN, 1980 ; AWONAIKE et al., 1981);
les bactéroïdes contiennent aussi les deux enzymes, mais leurs activi-
tés sont toujours plus faibles que celles rencontrées dans le cytosol.
Chez le Lupin (ROBERTSON et al., 19.75 ; SCOTT et al., 1976) et le Soja
(SCHUBERT,l:98La),1Iactivité GS augmente dès l'initiation des nodosités.
Plus récemment, CULLIMORE et al., (1983) ont identifié
deux formes de GS dans les fractions cytosoliques des nodosités de Pha-
seolus vulgaris. Toutes ces observations montrent que les deux voies sont
opérationnelles chez les plantes. Mais on ignore dans quelles conditions
l'une ou l'autre des deux voies est prépondérante.
Chez les bactéries, il semble que l'assimilation de NH~
sleffectue essentiellement par la voie GDH dans les conditions d1abon-
dance du NH: et de déficit carboné (MIFLIN et LEA, 1976). Mais chez les
légumineuses, la nature de l'organe où a lieu l'assimilation pourrait
avoir une influence sur la voie d1assimilation quelle que soit l'origine
de NH: (N03, N2, NH~ exogène). D'ailleurs ATKINS et al., (1983) ont
observé une nette supériorité de la voie GS - GOGAT sur la voie GDH dans
les feuilles de lupin.

---

- 12 -
B - Synthèse de l'asparagine et des autres acides
aminés
La glutamine formée par la GS à partir du glutamate
(voir fig. 2) peut être transportée dans la sève des légumineuses où
elle représente 8 à 9% de l'azote chez Vicia (PATE et al., 1969), 13%
des acides aminés totaux chez le lupin (ROBERTSON et al., 1975) et 3,3%
de l'azote total chez le soja inoculé (t'lc CL URE et ISRAEL, 1979). La
glutamine peut aussi servir de substrat à la GOGAT (fig. 2). Mais elle
est surtout utilisée pour la synthèse de l'asparagine.
Après l'incorporation de NH~ dans les molécules de glu-
tamine et de glutamate, l'étape la plus importante dans l'assimilation
de l'azote chez les plantes est probablement celle de la formation de
l'aspartate,. Une transamination du glutamate avec l'oxaloacétate pro-
venant de l'action de la PEP carboxylase aboutit à la formation de l'as-
partate, catalysée par l 'aspartate aminotransférase (ou glutamate oxalo-
acétate transaminase, EC. 2.6.1.1 ). L'aspartate ainsi formé est le point
de départ de la synthèse de l'asparagine et de nombreux autres acides
aminés utilisés par la plante pour le transport et le stockage de l'azote.
L'asparagine est l'acide aminé le plus abondant de la
plante. Elle représente 70% des acides aminés de la sève de Lupin
(ROBERTSON et al., 1975) et environ, 64% des acides aminés de la sève de
Soja inoculé (STREETER, 1979).
L'asparagine synthétase (EC. 6.3.5.4.) a été mise en
évidence chez le Lupin (SCOTT et al., 1976 ; REYNOLDS et al., 1982 a)
et le Soja (FUJIHARA et YA~lAGUCHI, 1980 ; CHAN et KLUCAS, 1980 ; COKER
III et SCHUBERT, 1980 ; HUBER et STREETER, 1981 ; REYNOLDS et al., 1982b).
L'enzyme purifiée des nodosités de Soja a un Km de 0,84 mM pour l'aspar-
tate (HUBER et STREETER, 1981). Les activités de l'aspartate aminotrans-
férase et de l'asparagine synthétase sont élevées dans les nodosités de
légumineuses. Mais chez le Lupin, la synthèse de l'asparagine est 5 à 7
fois plus intense que dans les nodules de soja (REYNOLDS et al., 1982 a).
Dans les nodules de Lupin, l'activité de l'asparagine synthétase croit
parallèlement à celle de la glutamine synthétase pendant la phase végéta-
ti ve (SCOTT et al., 1976).

---

- 13 -
Outre l'asparagine, d1autres acides aminés dérivent de
l laspartate et par conséquent du glutamate par une série de réactions
enzymatiques aboutissant à la formation notamment de la thréonine, la
méthionine, la lysine et l'isoleucine.
Plusieurs autres acides aminés rencontrés chez les végé-
taux sont issus de diverses sources quant à l 'origine de leurs chaînes
carbonés, mais leur synthèse peut utiliser la glutamine ou l'asparagine
comme donneurs de groupements aminés (ATKINS et al., 1983).
C - Source de carbone pour l 'assimilation et le
transport de l'azote
Pour assurer la réduction de l'azote moléculaire et son
transfert vers la tige et les feuilles sous formes de composés organiques,
les légumineuses doivent utiliser de grandes quantités de carbone.
Nous avons déjà souligné l 1 importance de la consommation
du carbone dans le fonctionnement de la nodosité. Le rôle du carbone est
de fournir non seulement le pouvoir réducteur et l 'énergie à la nitrogé-
nase, mais également les squelettes carbonés indispensables à la synthèse
de molécules organiques pour le transport et le stockage de l 1 azote ré-
duit.
Le carbone utilisé par les plantes provient presque exclu-
sivement de la photosynthèse. Tous les facteurs qui favorisent ce mécanis-
me favorisent également la fixation biologique de l lazote et inversement.
A l'obscurité, il y a une diminution de la fixation, probablement par
manque de squelettes carbonés. Les produits de la photosynthèse consti-
tuent donc un facteur limitant pour le fonctionnement de la nitrogénase
et de llassimilation de l'azote réduit. Ces produits arrivent aux nodosi-
tés par le phloè"me essentiellement sous forme de saccharose (PATE et al.,
1979). Chez le Pois, ce sucre constitue 90% du carbone qui arrive aux
nodosités (PATE, 1966). STREETER (1980) trouve égal~ment le saccharose
comme sucre dominant dans les nodosités de Soja. SINGH et al.,(1980)
obtiennent des résultats similaires sur les nodosités de Sesbania grandi-
flora. D'autres hydrates de carbone tels que le glucose, le fructose,

---

- 14 -
le tréhalose, l'inosito1 et le pinito1 sont également présents dans les
nodosités de Soja, mais en quantités très faibles (STREETER, 1980).
Cette abondance de saccharose est liée à la présence d'une
invertase (EC. 3.2.1.26 ) dans le cytoso1 des nodosités (SINGH et al.,
1980). Le métabolisme du glucose et des autres hydrates de carbone est
donc probablement réalisé par la voie classique de la glycolyse dans le
cytoso1 puisque l'invertase et la fructose 1,6 - diphosphate a1do1ase
(EC. 4.1.2.13 ) seraient absentes des bactéroides (RAWSTHORNE et al.,
1980). Par contre, les enzymes du cycle des acides tricarboxy1iques ont
été mises en évidence dans des cultures de Rhizobium et dans les bactéro-
ides (STOVALL et COLE, 1978). Dans ces conditions, la nature exacte des
substrats énergétiques qui arrivent aux bactéroides reste hypothétique.
Cependant, il n'est pas exclu que des acides organiques participent à
cette fourniture d'énergie. BERGERSEN et TURNER (1967) ont montré que
la fixation de N2 par les bactéroides était accrue en présence de succi-
nate, de fuma rate et de pyruvate. D'autre part, selon WILCOCKSON et
WERNER (1979), l'utilisation simultanée d'un acide organique et d'un su-
cre en Cs comme sources de carbone lors de l'étude de la fixation par des
Rhizobium en culture libre, améliore la croissance de ces bactéries et
leur capacité fixatrice.
Une autre source de carbone importante pour le système
symbiotique est constituée par la fixation du CO 2. Le cytoso1 des nodosi-
tés de plusieurs légumineuses contiennent de fortes activités PEP carbo-
xylase (EC. 4.1.1.31 ) (LAYZELL et al., 1979). Chez le Soja, les quanti-
tés de CO~ fixé par les racines et les nodosités peuvent varier de 0,2 à
1,1 mg.h- .g-l de tissu (COKER, III et SCHUBERT, 1981).
Les nodosités contiennent également de fortes quantités
d'acide po1y-8-hydroxybutyrique utilisables par les légumineuses (WONG
et EVANS, 1971).
III - TRANSPORT ET STOCKAGE DE L'AZOTE FIXE CHEZ LES
LEGUMINEUSES
Après l'assimilation de NH~ en glutamine, étape du mé-
tabolisme azoté commune à toutes les plantes supérieures, le transport

---

15 -
Cam posés
Formules
C: N M.M.
NH2
1
CO
CO -
NH
Allantoïne
1.0
158,1
1
1
:: co
NH -
CH -
NH
NH2
NH2
1
1
CO
COOH
CO
1.0
~76,1
Ac.allantoïque
1
1
1
NH -
CH
-
NH
Arginine
,NH = T- NH-<CH2)3- TH-COOH 1.5
174,2
NH2
NH 2
Co-CH2- CH-COOH
Asparagine
2.0
150,1
1
1
NH2
NH2
Citrulline
NHrCO-NH-(CH2)rCH-COOH
2.0
175,2
1
NH2
CO-(CH2)2-eH-COOH
Glutamine
2.5 ~46, 2
1
1
NH2
NH2
CH2-(CH2~-CH-COOH
Ornithine
2.5 132,1
1
1
NH2
NH2
Méthylèneglutamine
CO-C- CH2 -CH-COOH
3.0
~58,1
1
Il
1
NH2 CH2
NH2
Ac.aspartique .
COOH-CH2-CH-COOH
4.0
133,1
1
N~
,
C~H-CH2-CH-COOH
Homàsérine
4.0
119,1
1
NH2
COOH -(CH2)2- CH-COOH
Ac.glutamique
5.0
147,1
1
NH2
Figure 3 - Principaux camposés organiques azotés utilisés par les plantes
pour,le transport de l'azote (d 'après PATE~ 1973 et JOLIVET et
MOSSE~ 1982~ modifié).

---

- 16 -
et la mise en réserve de l'azote sont assurés par une série de composés
organiques différents selon les plantes.
Ces composés formés dans les racines ou les nodosités,
selon les sites d'absorption ou de réduction de l'azote sont de poids
moléculaires relativement bas et voisins (fig. 3). Ils sont caractéri-
sés par leur forte teneur en azote. Leur nature et leurs proportions
dans la sève xylémique dépend de l'espèce végétale et du stade végéta-
tif. Les composés les plus abondants et les plus fréquemment rencontrés
dans la sève de la plupart des plantes sont l'asparagine, la glutamine,
l 'aspartate et le glutamate (BOLLARD, 1957).
D'autres composés, également riches en azote, prédomi-
nent chez certaines plantes, c'est le cas de la citrulline chez les Betu-
Zaceae (BOLLARD, 1959) ou de l 'allantoîne et de l'acide allantoique chez
les Aceraceae (BOLLARD, 1957) et les légumineuses. La méthylène-glutamine
se rencontre surtout chez l'arachide (FOWDEN, 1962). La canavanine a
également été observée chez certaines plantes et notamment chez le genre
CanavaZia (BOLLARD, 1959).
L'intérêt de ces composés pour le transport de l'azote
par la plante est dû à un faible rapport CIN (fig. 3), ce qui permet à
cette plante. de transporter le maximum d'azote avec une quantité minimale
de carbone.
Les composés utilisés pour ce transport et ce stockage
sont des produits proches de l'incorporation de l'ammonium: c'est le
cas évidemment de la glutamine et du glutamate, mais aussi de l'asparagi-
ne et de l 'aspartate, et même de l 'ornithine ou de la citrulline. En
outre, leur dégradation conduit à des molécules d'acide oxaloacétique,
d'acide
a-cétoglutarique qui sont des intermédiaires métaboliques impor-
tants facilement réutilisés par la cellule.
Chez les légumineuses en particulier, le transport de
l'azote est surtout assuré par les uréides, les acides aminés et les
amides dont l'asparagine et la glutamine. Le mécanisme du métabolisme
et la nature des composés impliqués dans le transport de l lazote chez
ces plantes ont permis de distinguer deux groupes de légumineuses :

---

- 17 -
- les légumineuses à amides (Trifolium, Vicieae ... )
transportent l'azote sous forme d'amides et d'acides aminés. On ne
rencontre dans leur sève que des traces d'uréides.
- les légumineuses à uréides (Phaseoleae ... ) utilisent
les uréides glyoxyliques (allantoine et acide allantoique) comme prin-
cipale forme de transport de l'azote. Les deux catégories de composés,
les uréides d'une part, les amides et les acides aminés d'autre part,
coexistent dans la sève des légumineuses, mais dans des proportions qui
varient avec l'espèce.
A - Les légumineuses à amides
Chez ces légumineuses, la forme principale de transport
et de stockage de l'azote est aussi l'acide aminé le plus abondant:
l'asparagine (PATE, 1962 ; PATE etal., 1969 ; ROBERTSON et al., 1975 ;
SCOTT et al., 1976 ; PATE et al., 1979 ; REYNOLDS et al., 1982 a).
Selon WIERINGA et BAKHUIS, 1957, la composition de la sève de ces plantes
varie avec l'espèce, l'âge et l'état de la symbiose. La teneur en aspara-
gine serait alors le r.eflet de l'efficacité de la symbiose. Mais cette
composition de la sève n'est pas tributaire des conditions de nutrition
azotée (ATKINS et al., 1979 ; PATE et al., 1980), contrairement aux cas
des Phaseo leae .
Ces plantes à amides, d'origine tempérée, présentent un
certain nombre de différences avec les plantes à uréides d'origine
tropicale.
Sur le plan anatomique, les cellules méristématiques
des nodosités de TrifoZieae et Vicieae· sont regroupées à l'apex, offrant
un méri stème' api ca l qui favori se le développement de la nodosi té dans le
sens de la longueur (SPRENT, 1980). Chez les Phaseoleae, par contre, ces
cellules entourent la nodosité et donnent un- méristème diffus dont le dé-
veloppement procure à l a nodosité une forme· arrondie ou ovale. La présence
de vacuoles dans les nodosités des plantes à amides (SPRENT, 1980) pour-
rait avoir une' signification dans le système du transport de ces légumi-
neuses, compte tenu du rôle de mise en réserve de ces organes.

---

- 18 -
~
;
-i:fructose
Z " , sucrose
-f
- - - - - - - - - - "phosphoenolpyruvate
m
glucose
\\autres acides
aminés
Figure 4 - Inoorporation de NB dans différents oomposés azotés, notamment Z'aspa-
3
ragine dans Zes nodosités d'une pZante à amides (Lupin) (~RGERSEN, 1982).
(1), gZutamine synthétase ;
(2), gZutamate synthase;
(3), aspartate amt.-
notransférase; (4), autres aminotransférases ;
(5), asparagine synthéta-
se; (6), gZutamate déshydrogénase; (?), phosphoénoZpyruvate carboxyZase.

---

- 19 -
Sur le plan enzymatique, nous avons déjà rappelé le mé-
canisme de la synthèse de l'asparagine. Cette voie d'assimilation de l'a-
zote, nettement prioritaire chez les légumineuses qui ne synthétisent pas
les uréides et chez la plupart des plantes supérieures, a été étudiée par
SCOTT et al., (1976) chez le lupin. Ces légumineuses sont caractérisées
par une forte activité asparagine synthétase dans leurs nodosités (SCOTT
et al., 1976 ; REYNOLDS et al., 1982 a) par rapport aux plantes à uréi-
des dont les nodosités contiennent plutôt les enzymes de la synthèse et
de la dégradation des purines (REYNOLDS et al., 1982 a, b ; ATKINS et
al., 1982 a;CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 1983).
Les différences anatomiques et enzymatiques observées
entre les nodosités des deux groupes de légumineuses constituent autant
de causes pour expliquer les différences entre les produits d'exporta-
tion de l'azote vers les parties supérieures de ces légumineuses. La
figure 4 (BERGERSEN, 1982) résume les voies d'incorporation de l'azote
réduit chez une plantes à amides (Lupin).
Nous rappellerons plus loin les avantages et les incon-
vénients des deux systèmes de transport.
B - Cas des Phaseoleae
synthèse et métabolisme
des uréides
Les uréides glyoxyliques : allantoïne (5-uréido-hydan-
toïne) et l'acide allantoïque (ac. diuréido acétique) sont les princi-
paux constituants azotés de la sève des Phaseoleae (Glycine~ Vigna~
Phaseolus).
Par opposition au cas général des composés organiques
de la plante qui proviennent généralement d'une synthèse directe, l'u-
tilisation des uréides comme forme de transport de l'azote réduit peut
apparaître comme une anomalie puisque ces composés résultent d'un mé-
tabolisme catabolique. Leur formation nécessite d'abord la synthèse
des purines et ensuite leur dégradation, ce qui implique l'intervention
d'un nombre élevé d'enzymes.

---

- 20 -
Chez le Soja (t-'!ATSU~10TO et al., 1976, ~1c CLURE et ISRAEL,
1979, STREETER, 1979, PATE et aL, 1980), le Vigna (HERRIDGE ,et al.~ 1978
PATE et al., 1980) et le Haricot (PATE, 1973 ; COOKSON et al., 1980),
ces composés représentent près de 80% de l'azote en solution dans la sève,
lorsque leur production est maximale.
Les uréides sont plus connus comme produits de dégradation
des purines chez les animaux. Mais chez les végétaux, après la découverte
de l 'allantoine dans les jeunes pousses de Platanus orientalis par SCHULZE
et BARBIERI en 1881 (voir BRUNEL, 1936), leur présence nia été établie
qu'après les travaux de FOSSE et ses collaborateurs. Dès 1926, FOSSE
découvre l'acide allantoïque et l 'allantoine chez Phaseolus vulgaris et
dans les feuilles d'Acer pseudoplatanus. Ces deux uréides furent ensuite
découverts dans de nombreuses légumineuses par ces mêmes auteurs (FOSSE
et al., 1930, 1931) et chez des plantes appartenant à diverses familles.
(BOLLARD, 1957, 1959 ; MOTHES, 1961 ; BUTLER et al., 1961). D'une maniè-
re générale, ces composés se rencontrent chez les Aceraceae~ Leguminoseae
et Boraginaceae. Les Protistes supérieurs comme les Fungi et principale-
ment les Basidiomycètes contiennent également des uréides (BRUNEL et
CAPELLE, 1947 ; BRUN EL et BRUNEL-CAPELLE, 1951). Plus récemment, d'au-
tres auteurs (BONGAERTS et VOGELS, 1976 ; TRIJBELS et VOGELS, 1966 ;
JANSEN et al., 1982) ont montré que les bactéries étaient également
capables de métaboliser les uréides.
Le rôle des uréides chez les plantes semble être .ex-
clusivement un rôle de transport et de stockage de l'azote. Dès 1938,
BRUNEL et ECHEVIN ont montré que_ces,,--composés constituent chez Acer
,y-'(é'f\\! SE!i4~
pseudoplatanus, une forme def'tr,ansport 'dè\\~ 'azote vers les inflores-
J1 .:,J / \\
~ l :~,
cences et les fruits. Ces o~skrvatCf"ons ont;.;.été confi rmées pl us tard
par BOLLARD (1957) ; MOTHE~ ~(1961)\\~\\ RdNi3THE et ~lOTHES (1962).
,~\\ \\' J,~
Malgrè ce rÔ~:~~J~~~ontes:~le des uréides dans le
transport de l'azote aussi bi~~Gn'ez les" légumineuses que chez de
nombreuses autres plantes, il a fallu attendre les travaux de cher-
cheurs japonais dans les années 70 pour révéler l'importance des
uréides dans le métabolisme de llazote chez les légumineuses et no-
tamment le Soja. L'incorporation de 15N3 à l 'allantoine'et l'acide
allantoique observée par MATSUMOTO et al., (1977 a) dans les nodosités

---

- 21 -
de Soja a été le point de départ d'une intense recherche sur le métabolis-
me des uréides chez les légumineuses et principalement les Phaseoleae t
recherche dont nous exposons ci-dessous les grandes lignes.
1- Biosynthèse des uréides
a - Les sites' de formation des uréides
KUSHIZAKI et al., (1964) et ISHIZUKA et al., (1970) avaient
déjà démontré l'importance de la nodulation dans la formation des uréides
chez le Soja. Beaucoup d'autres faits expérimentaux ont permis de confirmer
ces résultats et de mettre en évidence que les nodosités constituent le
siège principal de la synthèse de ces composés. L'utilisation de deux
variétés de Soja
A 62-1 nodulante et A 62-2 non nodulante (MATSUMOTO et
t
al., 1977 b) a permis de constater que seule la variété nodulante accumu-
le de fortes quantités d'uréides dans tous les organes, alors que ceux
de la variété non-nodulante n'en contenaient que des traces, même en
présence d'un apport de 50 mg de N - NO; par litre. Une plante issue, du
greffage de A 62-1 sur A 62-2 ne contenait que de faibles quantités
d'uréides, comparables à celles de la plante A 62-2 toute seule (MATSUMOTO
et al., 1978). La dénodulation des racines de A 62-1 se traduit par une
chute brusque de la concentration en uréides des différents organes
(MATSUMOTO et al., 1978). L'apport de NO; aux deux variétés provoque
également une diminution de la concentration des uréides dans les organes
de A 62-1 (MATSUMOTO et al., 1977 c). Cependant ce traitement n'affecte
pas celle de A 62-2 qui accumule par contre plus d'acides aminés.
Chez le Soja nodulé, le 15N2 fixé est davantage incorporé
dans les uréides des nodosités (MATSUMOTO et al., 1977 a). Seul, le Soja
nodulé par une souche efficiente contient de fortes quantités d'uréides
(ISRAEL et McCLURE, 1980). L'ammonium absorb~ par les racines ne serait
pas transformé en uréides, mais essentiellement en acides aminés (FUJIHARA
et al., 1977, FUJIHARA et YAMAGUCHI, 1978 a).
De tous les organes du Soja, seule la nodosité contient
à la fois la xanthine déshydrogénase NAD-dépendante (EC. 1.2.1.3.7 ) et de
fortes activités uricase (EC. 1.7.3.3 ) et allantoinase(EC. 3.5.2.5
(TAJIMA et YAMAMOTO, 1975 ; TAJIMA et al., 1977 ; SCHUBERT, 1981 a;
,
CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 198~ ; ZENGBE et SALSAC, 1983).

---

- 22 -
Malgré cette importance particulière de la nodosité dans
la synthèse des uréides, celle-ci peut avoir lieu dans d'autres organes
de Phaseoleae et chez des plantes autres que les légumineuses. Les varié-
tés de Soja non-nodulantes ou des plantes non inoculées contiennent des
traces d'uréides. Le Haricot non nodulé, mais cultivé en présence de NO;
ou de NH; contient également de fortes quantités d'uréides (THOMAS et al.~
1980 b).Les racines peuvent donc former des uréides, uniquement à partir
de NH~ ou NO;. De jeunes pousses de légumineuses, renferment des quanti-
tés appréciables d'allantoïne et diacide allantoïque, à un moment où la
nodulation nlest pas encore installée (FUJIHARA et YAMAGUCHI, 1978 b).
L'uricase et l 'allantoïnase sont présentes dans les ra-
I
cines et les autres organes du Soja (TAJIMA et al., 1977 ; ZENGBE et
SALSAC, 1983) et de Vigna (HERRIDGE et al., 1978). NGUYEN, (1973 a) et
NGUYEN et FEIERABEND (1978) ont trouvé respectivement la xanthine déshy-
drogénase dans les feuilles de Pharbitis nil Chois et de Pois. CHRISTENSEN
et JOCHIMSEN (1983) ont également trouvé une activité XDH dans les raci-
nes, les tiges et les feuilles de Soja et de Pois.
Chez les légumineuses à uréides, la nodosité constitue
certainement le principal siège de la synthèse des uréides. Mais la na-
ture exacte du rôle joué par cet organe reste néanmoins encore obscure,
malgrè la présence de nombreuses enzymes associées à la synthèse de ces
composés. S'agit-il d'une simple stimulation de la racine par les nodo-
sités (FUJIHARA et al., 1977) ou d'une caractéristique des nodosités de
Phaseoleae ?
D'ailleurs, HANKS et TOLBERT (1982) et HANKS et al.,
(1983) ont montré que les uréides sont produits par les protoplastes
des cellules non infectées des nodosités.
b- Origine purique des uréides chez les
légumineuses
La synthèse des uréides constitue une voie privilégiée
du métabolisme de l'azote fixé chez les légumineuses de la tribu des
Phaseoleae. Deux hypothèses ont souvent été avancées quant à leurs
origines dans les plantes :

---

- 23 -
- Les uréides pourraient être le résultat de la condensa-
tion directe de l'urée et du glyoxylate. f1ais une telle biosynthèse nia
jamais été observée chez les plantes et les différentes expériences
entreprises pour la mettre en évidence n'ont abouti qu'à des résultats
contradictoires (BOLLARD, 1959 ; KRUPKA et TOWERS, 1959 ; BUTLER et al.,
1961). La formation d'uréides à partir d'urée et d'acide glyoxylique
ni aura it été constatée que chez l es cham pi gnons Bas i di omycètes (BRUNEL
et BRUNEL-CAPELLE, 1951) ou dans les feuilles de bananiers (FREIBERG et al. ,1957)
- L'origine purique de l 'allantoîne et de 1'acide allan-
to~que a, par contre, été mise en évidence chez les plantes supérieures
dès 1933 par FOSSE et al. ,. Ell e fut ensui te observée chez le Soja
(ECHEVIN et BRUNEL, 1937), Acer saccharinum (BARNES, 1959), le Symphytum
(BUTLER et al., 1961) et le Pharbitis nil (I~GUYEN, 1980). Les enzymes
de ce catabolisme ont également été mises en évidence chez plusieurs
plantes (FOSSE et al., 1930, 1931 ; ORY et al., 1969 ; THEU1ER et
BEEVERS, 1971 ; NGUYEN, 1973 a) et notamment chez les légumineuses
(TAJIf~A et YAMAt'10TO, 1975 ; TAJH1A et al., 1977; HŒRIDGE et al., 1978
TRIPLETT et al., 1980 ; ~JOO et al., 1980 ; SCHUBERT, 1981 a; ATKIr4S et al. 3
1982 a; TRI PLETT et al., 1982 ; GURANOHSKI, 1982 ; CHRISTENSEN et JOCH I~1­
SEN, 1983). Une autre preuve de l'origine purique des uréides est appor-
tée par l'ut"ilisation de l'allopurinol [4-hydroxypyrazolo (3,4-d) pyri-
midine ] . L'addition au milieu de culture ou à la solution nutritive
de cet inhibiteur de la xanthine déshydrogénase rrovoque une diminution
de la teneur en uréides des plantules de soja de 96 heures "(FUJIHARA et
YAr~AGUCHI, (1978'b)ou la concentration en uréides de la sève de Vigna
(ATKINS et al. , 1980) et de Phaseolus non nodulé (THO~1AS et al., 1980 b).
Cette inhibition de la xanthine déshydrogénase slaccompagne d'une ac-
cumulation de la xanthine dans les nodosités de Vigna et dans les plan-
tules de soja.
Lorsque le soja nodulé fixe du 15 N2 , la proportion de
15 N dans l 'allantoine est plus élevée que celle rencontrée dans l'aci-
2
de allantoique. Ce dernier provient donc de la dégradation de l'allan-
toïne (~1ATSlIl\\10TO eta1., 1977 a).

---

- 24 -
c - Synthèse et ca tabo li sme des puri nes
La présence des uréides dans les plantes suppose au préa-
lable une biosynthèse de novo des purines puis leur catabolisme. Les dif-
férentes étapes de cette biosynthèse à parti r de Ci -D- ri bose-5-phosphate
sont bien connues (GREENBERG, 1951 ; FLASKS et LUKENS, 1953). Aussi bien
chez les animaux et les microorganismes que chez les plantes, elle aboutit
directement â la formation de l'acide inosinique (inosine-5'-monophosphate)
ou I1'~P.
Le métabolisme de l'azote fixé via les uréides commence
donc par l'incorporation dans le noyau purine de la glutamine (qui en
fournit les atomes N3 et N9), de l 'aspartate et de la glycine. Cette
incorporation est très éctive dans les nodosités des légumineuses â uréi-
des, en relation avec l'activité fixatrice et leur capacité â exporter
l'azote sous forme d'uréides (SCHUBERT, 1981 a,b; ATKINS etaL, 1982 a
REYNOLDS et al., 1982 a). Parmi les principales enzymes impliquées dans
la synthèse de l 'IMP, la phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) synthétase
(EC 2.7.6.1 ) et la phosphoribosylpyrophosphate amidotransférase (PRAT,
EC. 2.4.2.14 ) qui catalysent les deux premières étapes ont été les plus
~tudiées dans les nodosités (SCHUBERT et DESHONE, 1980 ; RAO et al., 1980
ATKINS et al., 1982 a ; BOLAND et al., 1982 ; REYNOLD et al., 1982 a ,b) .
La PRPP synthétase est essentiellement localisée dans la fraction soluble
alors que la PRAT serait répartie entre les fractions soluble et proplas-
tique des nodosités (BOLAND et al., 1982 ; SCHUBERT et BOLAND, 1982).
Le PRPP produit peut servir aussi bien à d'autres réac-
tions de phosphoribosyltransférases qu'à la synthèse directe des purines
(~1URRAY, 1971). Il existe cependant une bonne corrélation entre la réduc-
tion de N , la synthèse du PRPP dans les nodosités et la formation des
2
uréides (SCHUBERT, 1981 a). Pendant la phase active de la fixation, la
quantité de PRPP synthétisé est largement suffisante pour assurer l'incor-
poration de l'azote fixé dans les purines, même si l'instabilité de la
PRPP synthétase dans les extraits de nodosités (SCHUBERT, 1981 a) ne per-
met pas de rendre compte pendant les mesures in vitro de l'efficacité
réelle de l'enzyme.
La PRAT, considérée comme la première enzyme dans la bio~

---

- 25 -
synthèse directe de l'IMP est également très active chez les légumineuses
à uréides où son activité très précoce dans les nodosités confirme son
importance dans le métabolisme de l'azote fixé (REYNOLDS et al., 1982 b).
Selon RAO et al., (1980) cette enzyme présenterait plusieurs conformations:;
celle
purifiée
par ces auteurs dans le cytosol des nodosités de soja
utiliserait uniquement la L-glutamine et serait inhibée par les ribonu-
cléotides puriques et l'azasérine.
La glycine est également nécessaire à la synthèse du noyau
purine, ainsi que le CO2, l 'aspartate et le méthyltétrahydrofolate (MeFH )-
4
La phosphoglycérate déshydrogénase, PGADH (EC. 1.1.1.95), la première en-
zyme de la synthèse de la sérine, la sérine hydroxyméthylase, SHM (EC. 2.
1.2.1.) qui catalyse la synthèse de la glycine à partir de la sérine et
produit le MeFH
sont présentes dans les nodosités de Soja (BOLAND et
4
SCHUBERT, 1982 a ; REYNOLD et al., 1982 a,b). L'incorporation de la gly-
cine (BUTLER et al., 1961 ; ATKINS et al., 1980) et du CO
(BüLAND et
2
SCHUBERT, 1982 b) dans les uréides avait déjà été observée.
La synthèse de novo des purines constitue certainement
la principale source des uréides pendant la phase active de fixation de
l'azote moléculaire chez les Phaseoleae. Mais cette synthèse n'est pas
l'unique source de ces composés dans la plante, selon les stades végé-
tatifs. En effet, durant la germination, la forte hydrolyse des proté-
ines (BOLLARD, 1959) et des nucléoprotéines (DOTA et TAKATA, 1959) et
le catabolisme du "surplus de l'ARN de stockage" (FUJIHARA et YAMAGUCHI,
1978 b) peuvent être à l'origine des uréides.
Selon ANDERSON (1979)" il existe dans l'axe embryon-
naire du soja, en plus de la synthèse de novo, un autre site de synthè-
se de l'mp par le "Salvage pathVlay"(I)~ ~a participationaumétanisme
de régulation de la synthèse des uréides, des purines issues de ces
deux sites indépendants n'est pas exclue. La présence des uréides dans
les plantes reste cependant une conséquence directe du catabolisme des
purines. Les séquences du catabolisme de l 'IMP jusqu'au premier terme
des uréides et celles du métabolisme de ces derniers sont représentées
par la figure 5. L'hydrolyse du groupement phosphorique de l 'IMP est
(1) - Voie d'incorporation des bases puriques libres dans la molécule d']MP~

---

- 26 -
OH N
IMP
• INOSI NE
N:.i
~
CD
®
~
•
1
H- :-....
}H
N
t
N
H
J
@!
OH
1
J
~J-
HO~ l ':H X
1
Ni H
@
1
OH
1
N X
l
'\\ OH
1
HO~'N )- Ua
1
~H -
1
1
o H
NH21N>=o
1
2NH
o==l.N
N
Ali
3 +C02
l
1
H H
-
@
1
COOH
/®
NH2
NH
1
2
H2 N,C=O
C=O
2
@
1
J
+
1
H2N/
4
O=C
O=C
H
1
1
HN H
NH
~
Urée
' C /
Alla
-
1
COOH
Figure 5 - Synthèse et dégradation des uréides.
(1)~5'nucZéotidase (ou une phosprn
tase acide non spécifique; (2)~inosine nucZéosidase; (3)~xanthine dé-
shydrogénase;
(4)~ uricase; (5)~ aZZantoinase; (6)~ aZZantoicase ;
(?)~·uréase ; n1P~ inosine-5'-monophosphate ; Hx~ hypoxanthine ; X~
xanthine ; Ua~ acide urique ; AZZ~ aZZantoine ; AZZa~ acide aZZantoiquE
Ga~ acide gZyoxyZique.

---

- 27 -
est d'abord réalisée par une 51 nucléotidase (EC. 3.1.3.5 ) (MURRAY, 1971 ;
CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 1983) ou par une phosphatase acide non spécifi-
que (EC. 3.1.3.2 ) (GURANOWSKI, 1982). La transformation de l 'inosine en
hypoxanthine est assurée par une inosine nucléosidase (EC. 3.2.2.2 )
(GURANOWSKI, 1982) ou par une purine nucléoside phosphorylase (EC. 2.4.
2.1 ) (MURRAY, 1971). Le ribose issu de cette transformation peut être
réutilisé dans la synthèse du PRPP (CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 1983).
L'oxydation des purines (hypoxanthine, xanthine et aci-
de urique) en allantoïne est catalysée successivement par la xanthine
déshydrogénase, XDH (EC. 1.2.1.37) et l 'uricase (EC. 1.7.3.3 ). Les
deux dernières enzymes ont été particulièrement étudiées chez le Soja
(TAJI~lA et YAI"1AMOTO, 1975 ; TAJHlA et al., 1977 ; FUJIHARA et YAf'lAGUCHI,
1
1978 b ; TRIPLETT et al., 1980, 1982 ; SCHUBERT, 1981 a ; ZENGBE et
SALSAC, 1983) et le Vigna (HERRIDGE et al., 1978 ; ATKINSet al., 1980 ;
ATKINS, 1981).
Les deux formes de XDH, la 02-XOH (EC. 1.2.3.2 ) et la
NAO+ - XOH (EC. 1.2.1.37) ont été identifiées dans les feuilles de Pois
et de Haricot (NGUYEN et FEIERABEND, 1978) et dans les nodosités de So-
ja (TAJI~~ et YA~~MOTO, 1975 ; FUJIHARA et YAMAGUCHI, 1978 b), mais la
forme la plus opérationnelle dans les nodosités de Soja serait la NAD+-
XDH (TRIPLETT ~t al., 1980, 1982), ce qui serait conforme à l'hypothèse
selon laquelle le transport de l'azote sous forme d'uréides serait plus
économique. Elle présente donc une plus forte activité dans les nodosi-
tés où elle est surtout localisée.
L'uricase catalyse l'oxydation de l'acide urique en
allantoïne. Elle a été détectée dans tous les organes. Mais la fraction
nodulaire reste également la plus importante (TAJlMA et al., 1977 ;
1
HERRIDGE et al., 1978 ; ZENGBE et SALSAC, 1983). L'enzyme du nodule
serait différente de celle des radicelles ou des plantules qui exige
un cofacteur à faible
~asse molaire
(TAJlr~ et YAMAMOTO, 1975),
probablement la cadavérine (TAJlMA et al., 1983). Aucune activité uri-
case nia été détectée dans une culture pure de Rhizobium japonicum,
même en présence
d'ARN, de nucléotides ou d'acide urique (TAJIMA et
YA~1AMOTO, 1975). L'uricase est inhibée par des concentrations d'urate

---

- 28 -
superleures à 120 wM, le KCN et certains composés puriques (THEIMER et
BEEVER, 1971) et par le triton X-100 (HANKS et al., 1980).
L'IMP formé à partir de N fixé peut être dégradée direc-
2
tement pour produire l'allantoYne. Mais elle peut également servir de
précurseur à d'autres nucléotides puriques (XMP, GMP, AMP) et à des
acides nucléiques. Les extraits de nodosités de soja (TRIPLETT et al.,
1980) ou de Vigna (WOO et al., 1980 ; ATKINS, 1981) sont capables de
métaboliser ces composés en allantoïne, XMP et IMP étant dégradées plus
rapidement.
2 - Métabolisme des uréides dans la plante
a - Transport et distribution des uréides
dans la plante
Le rôle des uréides dans le transport et le stockage de
l'azote fixé est bien connu. Ces composés représentent près de 80% de
l'azote de la sève xylémique des Phaseoleae au moment où leur production
est la plus intense (floraison, début de la formation des gousses). A ce
moment, leur accumulation dans la plante est également maximale, mais
les proportions varient avec les-différentes parties de la plante. La
tige est alors l'organe qui accumule la plus forte quantité d'uréides
(MATSUMOTO etal., 1977 b). Dans les autres organes (racines, feuilles),
les concentrations en uréides restent très faibles par rapport à celle
de la tige.
Aussi bien la concentration en uréides de la sève que
les quantités dans les différents organes sont affectées par les condi-
tions de culture. L'apport de NO; ou l'absence de nodulation diminuent
les proportions de l'azote uréidique chez le Soja (MATSUMOTO et al.,
1977 c) et le Vigna (PATE et al., 1980).
Au début du remplissage des gousses on observe une ac-
cumulation des uréides dans ces organes et notamment dans les cosses
(THOMAS et SCHRADER, 1981 a), parallèlement à la diminution des teneurs
de ces composés dans les autres organes.

---

- 29 -
L'accumulation et surtout la disparition rapide des uré-
ides dans les différents organes de la plante au moment du remplissage
des gousses prouvent qu'il y a bien un transfert de ces composés vers la
graine. Chez le Lupin, le xylème transfèrerait l'asparagine au phloème
(ATKINS et al., 1975). Dans le cas du Soja, le même processus d'échanges
entre le xylème et le phloème permettrait d'alimenter les gousses en uré-
ides. (LAYZELL et LARUE, 1981 ).
b - Métabolisme de l 'allantoïne et de l'aci-
de a11 antoïque
Le métabolisme de l 'allantoïne et de l'acide allantoïque
permet à la plante de disposer de l'azote incorporé à ces molécules lors
de la synthèse des purines. Ce métabolisme est possible grâce à la pré-
sence de deux enzymes: l'allantoïnase (EC. 3.5.2.5 ) et l'allantoïcase
(EC. 3 5 3 4 ). Dès 1929, FOSSE et BRUNEL ont découvert que l 'acide al-
lantoïque est issu de l'allantoïne par l'action de l'allantoïnase. Celle-
ci fut ensuite observée chez plusieurs végétaux (FOSSE et al., 1929) et
chez les champignons (BRUNEL, 1931). L'allantoïcase a également été mise
en évi dence pour la premi ère foi s chez l es champi gnons (BRUNEL, 1936)
et dans de jeunes plantules de Soja hispida (ECHEVIN et BRUNEL, 1937)
Ces deux enzymes existent donc chez les plantes et les
microorganismes capables de métaboliser les uréides, mais chez les légu-
mineuses productrices d'uréides, leur localisation dans la plante semble
en relation étroite avec les sites d'utilisation de l'azote uréidique.
L'allantoïnase est répartie dans tous les organes du Soja (TAJIMA et
YAt·1AMOTO, 1975 ; TAJH1A et al., 1977) et de Vigna (HERRIDGE et al.,
1978). THOMAS et SCHRADER (1981 a) ont trouvé que l 'activité allanto;-
nase est maximale dans les feuilles pendant la formation et aucdébut du
remplissage des gousses de Glycine max. Dans les gousses elles-mêmes,
l 'activité des graines est 2 à 4 fois plus élevée
au 110è jour de cul-
ture que celle des cosses (HERRIDGE et al., 1978 ; THO~lAS et al., 1980 a
THOM\\S et SCHRADER, 1981 a). Au sein de la graine, l 1 embryon contient
3,5 fois plus d'activité allantoïnase que les cotylédons (THOMAS et
SCHRADER, 1981 a).

---

- 30 -
HANKS et aZ.,(1981 a) ont trouvé une activité allantoïnase
de l'ordre de 2,4I1f·j (min- 1.g-1MF) dans les plantules de Soja de 12 jours.
L'allantoïcase est de toutes les enzymes impliquées dans
le métabolisme des uréides celle qui a été la moins étudiée chez les vé-
gétaux supérieurs. Le mécanisme de transfert de l'azote de l'acide allan-
toïque aux acides aminés et aux protéines n'est donc pas bien élucidé. La
présence de l 'allantoïcase a été signalée dans les cotylédons de Arachis
hypogaea en germination (SINGH, 1968), dans les tiges et les feuilles de
PhaseoZus vuZgaris non nod-ulé (THO~lAS et al., 1979 a, 1980 b). Une nu-
trition artificielle des feuilles de PhaseoZus vuZgaris avec une solution
contenant de l 'allantoate induit l'activité allantoïcase dans ces organes
(THOMAS et aZ., 1979 a,b).
Chez le Soja nodulé, TAJIMA et YAMAMOTO (1975) et
TAJIMA et aZ., (1977) ont trouvé l'activité allantoïcase dans les parties
aériennes et notamment dans les feuilles.
La dégradation de l lallantoate comporterait au moins
deux étapes. Chez Pseudomonas acidovorans ouStreptoccocus aZZantoicus,
l'allantoate est d'abord dégradé~n une mole d'urée et une mole d'acide
uréidoglycolique par l'allantoîcase (allantoate amidinohydrolase, E.C.
3.5.3.4 ). L'acide uréidoglycolique est ensuite scindé en urée et en aci-
de glyoxylique par l'uréidoglycolase (allantoate amidohydrolase, E.C. 3.5.
3.9 ) (TRIJBELS et VOGELS, 1966).
L'enzyme trouvée par BRUNEL (1936) chez Sterigmatocystis
nigra hydrolyse l 'allantoate en deux moles d'urée et une mole d'acide
glyoxylique. A des pH neutres ou légèrement acides, l'acide allantoique
peut également subir une auto-dégradation (TRIJBELS et VOGELS, 1966 ;
TAJHlA e.t al., 1977). L'hydrolyse de l'allantoate en deux étapes serait
surtout évidente chez les microorganismes (TRIJBELS et VOGELS, 1966 ;
VOGELS et VAN DER DRIFT, 1976). Chez les plantes, le mécanisme exact de
la dégradation de l 'allantoate n'est pas encore élucidé. L'allantoïcase,
l 'uréidoglycolase et l 'uréase ont été trouvées en même temps dans les
feuilles de Soja (MATSUMOTO et al., 1982) où le métabolisme de l 'allan-
toate par la voie allantoïcase-uréase est la plus vraisemblable (BLEVINS
et aZ., 1982).

---

- 31 -
L'activité uréolytique est présente dans les graines
(PALACCO et HAVIER, 1979) mais également dans les feuilles de légumineu-
ses (BLEVINS et al., 1982 ; ~~TSUMOTO et al., 1982 ; KERR et al., 1983).
L'urée est donc certainement dégradée en ammoniac qui est ainsi assimilé
par la synthèse des acides aminés et des protéines (MIFLIN et LEA, 1977 ;
ATKINS et al., 1982 b).
L'acide glyoxylique serait à son tour, de nouveau réin-
tégré dans la synthèse des purines par l'intermédiaire de la glycine
(SCHLEE et REINBOTHE, 1963).
3 - Imoortance et siqnification des uréides
chez les Phaseoleae
a - Relation entre la fixation de l'azote
moléculaire et la synthèse des uréides
Les uréides existent également chez plusieurs familles
de plantes autres que les légumineuses (BOLLARD, 1957). Mais chez les
légumineuses de la tribu des Phaseoleae, l'utilisation de 15 N2 (t.1ATSUMO-
TO et al., 1977 a ; OHYAMA et KUMAZAWA, 1978) a montré que l'azote
nouvellement fixé est incorporé directement dans les molécules d'uréides
qui constituent les composés azotés les plus abondants dans la sève de
Soja (MATSUMOTO et al., 1977 b; STREETER, 1979) et de Vigna (HERRIDGE
ètal., 1978, PATE et al;, 1980) lorsque ces plantes portent des nodo-
sités fixatrices. Il existe une bonne corrélation entre la concentration
en uréi des de l a sève et l a masse ou le nombre de nodos ités (tk CLUn.E et
ISRAEL, 1979 ; ISRAEL et Mc CLURE, 1980 ; ATKINS et al., 1980). La teneur
en uréides de la plante parait donc liée à la quantité d'azote fixée. Le
dosage des uréides dans des extraits de plantes ou dans la sève pourrait
constituer un critère commode pour apprécier la capacité fixatrice d'une
association symbiotique légumineuse - Rhizobium.
La contribution de l'azote nitrique à la formation des
uréides est très faible (OHYAMA et al., 1981) et l'évolution de la te-
neur en uréides de la plante en présence de l'azote combiné est identique
à celle de llactivité nitrogénase des nodosités (PATE et al., 1980 ;
HERRIDGE, 1982 a).

---

- 32 -
p
~
-[fructose
-
. .
h
hoénolpyruvate
~~ ?------fA-+pos
.~
CO,
oxaloacétate
~+-+-t-+ glyoaalate
'o~~
l
ca
pool
Q
~Iutamine
ADP
~~NH3"
_
ATP
~d'acides aminés
NADH
_
4
N ;
cc
NAD ' /
Iq.
?
0<
::l
::
n
c
glutamate
:::'
5°
m
glutamate
,~ATP ribose
~
CD
A
CIl
SADP
CD
inosine • S_ monophosphate
!
NADH NAD
)
.-.--~ hypo.anthine.4----- inosine44----'
~
purines
aanthine
" - (IJ-+acide urique---[IJI---•• allantol'ne_C!J--...+acide allantoïque
~
NAD NADH
"----~-------,,~--- .... ~m
Figure 6- Incorporation de NH~ dans différents composés azotés, notamment les uréides
dans les nodosités CI. 'une plante à uréides (Soja) (BERGERSEN, 1982),
(1), glutamine synthétase; (2) glutamate synthase ;
(3), phosphoénolpy~~vate
carboxylase; (4), autres
aminotransférases; (5), xanthine déshydrogénase
(6), uricase;
(7), aUantoi.nase.
B
Alanine (3)
A
:--:'.:.:.:.:-:1
Aapartate (4)
:.:.:.:.:.:-: l
Glutamate (S)
: :.:.:.:.:-:-:-:--:1
Glutamine (2,5)
':·-·:·:-:1
1
Asparagine (2) i=-=-:l-..J
:.:.:.:~
1
o mithine (2,5) jo..:":"::~_--I
:-:.:.:-:-:-::1
1
Citrulline (2)
: :-:-:1
1
Arginine (1,5)
-:-:-.:1
1
. 1
IJ reides 11)
:-=1
. .
o
4
8
12 '16
.20 0
8
16
24
32
40
Cout de
synthèse
Cout
total
(Equivalents d' ATP)
Figure 7 - Coûts théoriques de la synthèse des principaux composés azotés
utilisés par les plantes pour le transport de l'azote (SCHUBERT,
1981), Les chiffres entre parenthèses représentent les rapports
ClN, Ces coûts en équivalents - AT? ont été estimés sur la base
de 1 NADE = 3 ATP. Le rectangle hachuré représente le coût par
N et le rectangle blanc, le coût par mole de composé. Les figures
A et B représentent respectivement les coûts de la synthèse biochi-
mique et les coûts totaux en tenant compte des squelettes carbonés,

---

- 33 -
Lè mécanisme de la formation des uréides chez le Soja est
résumé par la figure 6 (BERGERSEN, 1982).
b - Economie de carbone
Chez la plupart des plantes supérieures, le transport de
l'azote est assuré essentiellement par l'asparagine et la glutamine.
Chez les Phaseoleae, le choix des uréides COlTlllle principa-
le forme de transport de l'azote fixé reposerait sur la nécessité d'écono-
miser le carbone et serait par conséquent guidé par le rapport C/N.
En plus des différences observées entre les légumineuses
à uréides et les légumineuses à amides, au niveau des enzymes de la syn-
thèse des uréides (REYNOLDS et al., 1982 a, b ; CHRISTENSEN et JOCHIMSEN,
1983) ,ces deux groupes de plantes diffèrent également dans leur capacité
à utiliser le carbone.
Une comparaison entre le Vigna et le Lupin sur cette ca-
pacité (LAYZELL et al., 1979) montre que la consommation de carbone dans
le fonctionnement des nodosités est beaucoup plus élevée chez le Lupin
que chez le Vigna. Pourtant, les possibilités de récupération du carbone
sont limitées chez le Lupin. L'activité PEP carboxylase est plus forte
dans les nodosités et les racines de Vigna que dans celles de Lupin qui
produisent 3,1 moles de H2/mole N alors que ce taux n'est que de 0,02
2
chez le Vigna. (LAYZELL et al., 1979). Chez les Phaseoleae, la récupéra-
tion du glyoxylate issu de la dégradation de l'acide allantoïque pour
la synthèse de la glycine et des purines constitue une source supplémen-
taire de squelette carboné~
La plus grande solubilité de l'asparagine et de la glu-
tamine par rapport aux uréides (SPRENT, 1980) devrait permettre aux
légumineuses à amides de transporter plus d'azote réduit dans la sève
que les autres légumineuses.
D'après les considérations énergétiques, le transport
d'un atome d'azote sous forme d'uréides permettrait une économie de 6 à
9 ATP par rapport à l'asparagine et la glutamine respectivement (TRIPLETT
et al., 1980). La figure 7 montre le coût de la synthèse et de l'utili-
sation des différentes molécules organiques pour le transport de l'azote

---

- 34 -
Cette revue bibliographique met en évidence la complexité
du mécanisme de la formation des uréides chez les plantes en général et
les légumineuses en particulier. Chez ces dernières et notamment chez les
PhaseoZeae, l'étude des conditions du métabolisme de N2 sous forme d'uré-
ides mérite encore d'être approfondie, malgré les nombreux travaux qui y
ont déjà été consacrés, d'autant plus que ces composés pourraient servir
d'indice de l'activité fixatrice.

---

- 35 -
~ATERIEL ET TECHNIQUES
l - MATERIEL VEGETAL
A - Choix du matériel végétal
Les uréides sont une caractéristique des légumineuses de
la tribu des Phaseoleae : Glycine
Vigna
PhaseoLus. Au moment d'entre-
3
3
prendre ce travail, le Soja était la seule des trois plantes étudiée
dans la Laboratoire. Des semences de cultivars adaptés aux conditions
climatiques de la région étaient donc disponibles.
Parmi les légumineuses à amides, le Pois a egalement été
utilisé pour des études de comparaisons.
B - Culture de légumineuses
Pour des raisons expérimentales et selon les périodes,
les cultures ont été réalisées au champ ou en bacs et en serre. Les cul-
tivars AMSOY et HODGSON pour le Soja et AMINO pour le Pois ont été utili-
sés.
1 - En serre : des graines de Soja ou de Pois
désinfectées à llhypochlorite de calcium sont, soit mises d'abord à ger-
mer dans de la vermiculite stérile, puis transférées sur du sable stéri-
lisé, dans des pots en matière plastique de cinq litres, ou semées direc-
tement dans les pots. Elles sont inoculées avec des suspensions de Rhizo-
bium japonicum G ou G , respectivement 31 lb 138 et 31 lB 110 (USDA,
3
1
Beltsville, USA) pour le Soja et de Rhizobium leguminosarum, FH 34
(aimablement fourni par MM. LAGACHERIE et GIRAUD, INRA, DIJON) pour le
Pois. Les suspensions de Rhizobium sont préparées dans les milieux Y.E.M.
(VINCENT, 1971) et de BERGERSEN (1961) (voir annexe)
Les plantes, généralement cinq par pot"
sont arrosées
alternativement avec une solution nutritive sans azote (LEFEBVRE, commu-
nication personnelle ; MATSUt~OTO et aï., 1975, (voir annexe) et de l'eau
distillée à raison de 500 ml de solution et d'eau par jour et par pot.
Lorsque celà est nécessaire, un complément de lumière
est apporté aux plantes de 5h à 8h et de 18h à 20h, à l'aide de lampes

---

-
jO
-
à incandescence de 250 Wou de lampes OSRAM à décharge de 1000 W(200
u Einstein/m2/h). La température est alors maintenue à environ 17-18°C
la nuit et 30°C le jour.
2 - Au champ et sur bacs : le Soja inoculé avec
la souche G3 ,est semé après apport d'une fumure minérale phosphopotassi-
que. Les bacs de 1m3 sont remplis de terre et placés en plein air en
conditions naturelles. Certaines conditions particulières (apport d'azo-
te combiné) seront précisées dans les chapitres concernés.
c- Préparation des échantillons
1- Prélèvement de la sève
La sève est prélevée pendant une heure et toujours entre
11h et 13h, moment de la journée où l'exudation est maximale (PATE, 1962
Mc CLURE et al., 1980). La tige est sectionnée en dessous du bulbe cotylé-
donnaire (1 à 2 cm au dessus du niveau du sable ou du sol). La sève est
recueillie dans un petit tube de verre gradué, recourbé à la partie supé-
rieure, suivant la technique décrite par WIERINGA et BAKHUIS (1957).
Après la détermination des volumes, les échantillons sont conservés au
congélateur à -20°C.
2 - Prélèvement des échantillons d'organes
Trois à cinq plantes, suivant le no~bre de répétitions, pro-
venant d'un-même nombre de pots, sont utilisées pour chaque mesure. Les
nodosités, les racines, la tige et les feuilles développées de chaque
plante sont séparées. Les nodosités sont utilisées directement. Les
racines et la tige sont découpées en petits fragments. Les feuilles
sont mélangées, également découpées et homogénéisées. Les différents
or~anes sont conservés dans la glace pendant la durée du prélèvement. Les
échantillons, 0,1 g à 19 selon les organes sont ensuite transférés dans
l'azote liquide.
II - DOSAGE DES COMPOSES AZOTES ET DES SUCRES TOTAUX
A - Azote total et azote soluble
Le matériel végétal frais est soumis directement à la mi-
néralisation pour le dosage de l'azote total.

---

- 37 -
Les échantillons sont broyés dans 10 ml de tampon phospha-
te 0,05 M (pH 7,5) contenant 0,05 g de polyclar AT par gramme de tissu
(MATSUMOTO et al., 1977 b). Après filtration sur une couche de Villeda
Mop et centrifugation à 30.000 g pendant 30 minutes, une partie aliquote
du surnageant est utilisée pour le dosage de l'azote soluble après pré-
cipitation des protéines à l lacide trichloracétique à 20%. L'azote total
et l'azote soluble sont dosés par la méthode Kjeldahl. L'autre partie du
surnageant est utilisée pour le dosage des uréides, des acides aminés li-
bres, du nitrate ou des hydrates de carbone.
B - Uréides
Plusieurs méthodes de dosage des uréides ont été proposées
(YOUNG et CONWAY, 1942 ; VOGELS et VAN DER DRIFT, 1970 ; ABRAHAM et al.,
v
1976 ; BORCHERS, 1977 ; VRBAVSKI et al., 1978 ; HSU et SPANSWICK, 1981 ;
LARUE et al., 1981 ; PATERSON et al., 1982).
Celles de YOUNG et CONWAY (1942) et VOGELS et VAN DER
DRIFT (1970) ont été utilisées pour le dosage des uréides totaux et de l'aci-
de allantoïque. Basées sur la réaction de RIMINI, déjà employée par FOSSE
et HIEULLE (1924) pour le glyoxylate, elles permettent d'estimer à 520 nm,
l'intensité de la coloration du 1,5-diphénylformazan formé à partir du
glyoxylate de phénylhydrazone (MATSUI et al., 1965).
La sève est utilisée directement. Le dosage dans les tis-
sus végétaux est effectué sur les surnageants 30.000 x g obtenus comme
dans le dosage de l'azote soluble.
C - Acides aminés libres
Les- acides aminés libres 'sont dosés par la méthode à la
ninhydrine de YEMM et COCKING (1955). Les protéines de~ extraits 30.000 g
sont précipitées au préalable au TCA à 10%.
D - Protéines
Les protéines ont été dosées parla méth6de de LOWRY et
al., (1951) après précipiation également au TCA à 20%.

---

- 38 -
E - Nitrate
Le dosage du nitrate est effectué sur une chaîne automa-
tique. Après réduction du NO; sur une colonne de cadmium, le nitrite for-
mé est dosé par une réaction de diazotation (TREGER et LECORRE, 1975).
F - ARN
Les ARN des nodosités ont été extraits à 4°C avec le mé-
lange phénol-chloroforme et précipités avec de l'éthanol à - 20°C
(DELSENY, 1977). La densité optique à 260 nm de l'extrait d'ARN dans le
tampon glycocolle-soude (DELSENY, 1977) permet dlen déduire la concentra-
tion.
G - Sucres totaux
Les sucres totaux (sucres réducteurs + saccharose) ont
été dosés dans les mêmes surnageants que les uréides par la méthode de
LEVER (1972) après hydrolyse du saccharose avec HC] à chaud. Le tampon
de broyage a été utilisé comme témoin.
III - MESURE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES
A - Nitrogénase
L'activité nitrogénase des nodosités est mesurée par la
méthode de la réduction de l'acétylène (HARDY et al., 1968). Les mesures
au champ ou dans les bacs sont effectuées suivant la tenique in situ de
BALANDREAU et DOMt~ERGUES (1971). Pour les plantes cultivées en pots, la
réduction est réalisée dans des flacons à sérum de 600 ml sur des racines
excisées. Le système racinaire provenant d'une plante est introduit dans
le flacon. L'injection de C H
2 2 et l'incubation ont lieu à la température
du laboratoire.
B - Xanthine déshydrogénase, uricase, allantoïnase et
allantoïcase
Les activités de ces quatre enzymes ont été mesurées dans
des extraits préparés de façon identi~ue : les échantillons conservés dans

---

- 39 -
l'azote liquide, sont broyés à 4°C avec 5 ou la ml de tampon Tris HC1 0,1 M
(pH 7,5) contenant du dithiothréitol 1 mr~ et de l'EDTA 1 rnr~ (HERRIDGE et aZ.~
1978). Après filtration sur une couche de Villeda Mop, les extraits sont
centrifugés à 30.000 g pendant 30 minutes. Les surnageants sont utilisés
pour les mesures d'activités.
Pour les mesures des activités enzymatiques des bactérof~
des, l'extrait de nodosités filtré comme précédemment est d'abord centri-
fugé à 300 g pendant 3 min. pour éliminer les débris végétaux. Le surna-
geant est centrifugé de nouveau pendant 20 minutes à 30.000 g. Le culot
de bactéroldes est lavé deux fois avec 5 ml de tampon de broyage. remis
en suspension dans le même tampon et soumis à la sonication. La suspension
est enfin centrifugée à 30.000 g pendant 20 minutes et le surnageant est
utilisé pour les essais d'activité enzymatique.
1 - L'activité xanthine déshydrogénase est mesu-
rée par estimation à 340 nm et à 30°C du NADH produit pendant l'oxydation
de la xanthine ou de l 'hypoxanthine en présence de NAD+ (MULLER et MOLLER,
1969). Le milieu de réaction contient 1 ml d'une solution de xanthine 0,4
mM, 50 ~l de NAD+ 100 mM et 0,85 ml de tampon Tris-HC1, 0,1 M (pH 7,8)
pour 0,1 ml d'extrait enzymatique. Pour le même milieu réactionnel, il
est également possible de mesurer la formation d'acide urique à 292 nm
(FUJIHARA et YAMAGUCHI, 1978 b). Tous les réactifs sont préparés dans le
tampon Tris-HCl .
2 - L'activité uricase est déterminée par la
diminution de la concentration de l'acide urique dans le milieu d'incu-
bation à 292 nm, à pH 9 et à 30°C. (MULLER et MOLLER, 1969). Le volume
total de 3 ml contient 2,85 ml de tampon Tris:HCl 17,4 mr..1 (pH 9), 0,1
ml d'extrait enzymatique et 50 ~l de solution d'acide urique 6,25 mM.
3 - Les activités allantolnase et allantol-
case sont mesurées suivant la technique de LEE et ROUSH (1964), mais à
pH 7,5. Dans certaines mesures, une technique colorimétrique basée sur
celle employée par SINGH (1968) a été utilisée pour l'activité allantol-
case. Chaque mesure comporte alors trois milieux d'incubation A, B et C,
pour tenir compte de l'autodégradation de l'allantoate et des traces
de glyoxylate libre éventuellement contenues dans les extraits. Le mi-

---

- 40 -
lieu A contient 1,80 ml de tampon Tris-HCl 0,1 mM (pH 7,5), 50 ~l d'une
solution d'allantoate à 20 mg.ml- 1 et 0,2 ml d'extrait enzymatique. Le
milieu B contient 2 ml du même tampon et 50 ~l de la solution d1allan-
toate et le milieu C, 1,85 ml de tampon et 0,2 ml d'extrait. Le volume
total de chaque milieu est donc de 2,05 ml. Dans le milieu A, l'allan-
toate est ajouté pour démarrer la réaction. Après 15 minutes d'incuba-
tion la réaction est arrêtée en plongeant les tubes dans la glace. Le
glyoxylate contenu dans les milieux A, B et C est ensuite dosé par la
méthode de VOGELS et VAN DER DRIFT (1970). La densité optique due au
glyoxylate provenant de l'action de l 'allantoïcase est donc:
DO = DO
- (DO
A
B + DOC)
Les extraits de tissus de plantes de Soja ne renferment que des traces
de glyoxylate libre et l 'autodégradation de l 'al l antoate à pH 7,5 est
presque nulle.
C - PRPP synthétase
La PRPP synthétase catalyse la formation du PRPP à
partir du ribose 5-P et de l IATP en transférant le pyrophosphate termi-
nal (en position~) de l'ATP sur le carbone 1 du ribose 5-P (KHDRANA
et a l . , 1958). Nous avons donc utilisé, pour la mesure de l'activité
de cette enzyme, la méthode dite "de transfert du 32 p" (SHITZER.. 1969
SCHUBERT, 1981 a). L'ATP-or _32 p a été préparée selon la méthode de
GLYNN et CHAPPEL (1964) et les échanti 11 ons de nodosités ont été broyés
dans du TES 25 mM, pH 7,5. (SCHUBERT, 1981 a)
D - Ribonucléase
L'activité ARNase des nodosités a été déterminée par la
disparition en présence de l'extrait enzymatique de la radioactivité des
ARN de radis marqués à l'uridine 3H- 5 (DELSENY, 1977). Les ARN des plan-
tules de radis ont été extraits 24 heures après le marquage par le mélan-
ge phénol-chloroforme (DELSENY, 1977). Les extraits enzymatiques de nodo-
sités ont été préparés dans du Tris-HCl 0,1 MpH 7,5.

---

- 41 -
IV - QUELQUES PRECISIONS SUR LA VARIABILITE ET L'EXPRES-
SION DES RESULTATS
Tous les résultats exprimés dans ce travail sont les
valeurs moyennes de trois répétitions au moins. Lorsque plus de trois
répétitions ont été utilisées pour le calcul des moyennes, le nombre
est précisé dans la légende des figures ou des tableaux. Les variations
représentées sur certains tableaux ou figures sont les écarts-types des
moyennes. Ces variations, de l 'ordre de 10% en moyenne sont dues à la
variabilité entre les plantes, même si celles-ci proviennent des mêmes
lots. La variabilité entre les différentes expériences peut être attri-
buée à des conditions de culture auxquelles le Soja est très sensible.
Les teneurs ou les concentrations en uréides représentent les uréides
totaux (allantoine + acide allantoïque). Elles sont généralement expri-
mées en allantoine. Pour certains résultas, ces teneurs ou ces concen-
trations sont en azote uréiclique (allantoine : 35,4 %N, et acide allan-
toïque : 31,8 %N).

---

- 42 -
CHAPITRE 1
DISTRIBUTION DES UREIDES ET RELATION ENTRE LEUR FORMATION ET LA FIXATION DE
~2 CHEZ LE SOJA.
1 - REPARTITION DES UREIDES CHEZ LE SOJA
A - Concentration de la sève en uréides
B-
Répartition desuréid~s
dans les organes du Soja
1- NodoSités, racines, tige et feuilles
a. Teneurs en azote total et en azote sDluble
b. Teneurs en uréides
2- Gousses
II - RELATION ENTRE LA FIXATION DE L'AZOTE ET LES TENEURS EN UREIDES DU
SOJA.
A - Variatinns rles tenPlJrs en uréides et de l'activité
nitrogénase chez le Soja
B - Relation entre l'activité nitrogénase et la synthèse des
uréides
III - CONCLUSION

---

- 43 -
CHAPITRE l
DISTRIBUTION DES UREIDES ET RELATION ENTRE LEUR FORMATION ET LA FIXATION DE N2
CHEZ LE SOJA.
Les uréides glyoxyliques, al,lantoïne et acide allantoïque sont
présents chez plusieurs plantes supérieures dont les légumineuses de la tribu
des PhaseoLeae. Chez ces dernières, les uréides jouent un rôle clé dans le
métabolisme azoté. La fixation biologique de l'azote provoque un accroissement
de leur synthèse sans en être pour autant la cause directe. L'hypothèse de
l 'origine purique de ces composés a été prouvée, mais les conditions de leur
formation en relation avec l'assimilation de l'azote réduit restent encore
obscures.
Dans ce premier chapitre, nous exposons les résultats de l'é-
tude de la répartition des uréides dans les différentes parties du Soja en
liaison avec la teneur de la plante en azote total et soluble. Le lien entre
les concentrations en uréides de la sève et de la plante et les différents
paramètres de la fixation (ARA, nombre et masse des nodosités) est également
exposé.
Ces résultats proviennent d'expérimentations réalisées
dans des conditions différentes.
l - REPARTITION DES UREIDES CHEZ LE SOJA
A - Concentration de la sève en uréides
Au moment de la germination des graines de Soja, les teneurs en
uréides des plantules et des cotylédons sont élevées. Ces concentrations
sont maximales dans les cotylédons cinq jours après le semis, mais diminuent
très rapidement lors du flétrissement de ces organes (MATSUMOTO et aL.~
1977 b). L'abondance dans la sève des uréides issus de la fixation de l'azote
n'intervient donc vraiment qu'au moment 00 celle-ci devient effective,
c'est-à-dire deux à trois semaines après l'inoculation. Les uréides formés
dans les nodosités sont alors transférés par la sève xylémique vers les
parties supérieures de la plante. La figure 8 montre l'évolution de la
composition de la sève en ces composés chez deux variétés de Soja cultivées
en serre et au champ. Cette évolution est similaire. Les concentrations
maximales de 1·ordre de 2 à 4 mg d'uréides par ml de sève, soient 0,7 à 1,4 mg
d'azote uréidique, sont atteintes au début de la formation des gousses.

---

- 44 -
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60
80
100
Jours après
semis
Figure 8- Evolution de la concentration en urJides de la sève de Soja Amsoy en serre ( G
et Hodgson au champ (
° ).
Les sigles F~ FG~ RG et MG désignent respectivement ~e début de la floraison,
de la formation des gousses~ du remplissage des gousses et de la maturation
des graines.

---

- 45 -
A la fin du cycle végétatif, au mome~t de la sénescence des nodosités, une
nouvelle augmentation de la concentration, plus apparente dans la sève
d'Amsoy en serre est observée (fig. 8).
Chez le Soja recevant uniquement l'azote d'origine symbioti-
que l'azote de la sève est constitué presque exclusivement de l'azote
e
uréidique pendant la phase active de la fixation. Au 45
jour de culture,
par exemple, l lazote uréidique représente près de 95 %de l'azote total ~e
l a sève (tab 1. II l ) .
Tableau III
Proportions des différentes formes d'azote dans la sève du
Soja Hodgson au 45e jour de culture, en serre~ L'azote est
d'origine symbiotique uniquement.
-1
-1
-1
\\Jg.ml
IJg. h
. pl
% N total
N-uréidique
719,1 + 22,5
90,5 + 8,5
94,8
-
-
N· ami né
37,9 + 8,5
4,9 + 1,3
5,0
-
-
-
N-NO
1,8 ± 0,2
0,24± 0,08
0,2
3
A ce moment les acides aminés ne forment qu'une proportion très faible de
cet azote. Ces derniers composés, cependant, constitueraient la fraction
majeure de l'azote soluble au début, lorsque le transport sous forme d'uréides
est encore négligeable et à la fin de la culture lorsque celui-ci s'estompe
(SCHUBERT, 1981 a). La coocentration en azote uréidique de la sève ne dépas- .
sait jamais 1,5 mg, même au champ où les plantes étaient beaucoup plus
développées.
Les variations du flux de sève ne peuvent pas expliquer les
variations de concentration en uréides observées au cours de ces expérimen-
tations. Lors d'une autre expérience en serre, avec la variété Hodgson, les
débits et les concentrations de la sève en uréides ont été déterminés.
Pendant toute la durée de cette expérimentation, les volumes de sève ont
varié en moyenne de 0,05 à 0,5 ml par plante et par heure, par exemple
(fig. 9 A). Ce flux de sève est beaucoup plus faible que celui de 0,01 à 0,5 ml

---

- 46 -
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1
Z
Z
20
40
60
80
.
Jours apres semis
Figure 9- Variations du flux de sève (A) et de la concentration en N-uréides (B) pendant
le dévelgepement du Soja Hodgson. Les teneurs en N-uréides (B) sont exprimées
en JA-g.ml 1 ( •
) et JA.g. h-1.pZ-l (
0
J.

---

- 47 -
par plante et par minute indiqué par Mc CL URE et ISRAEL (1979) pour le Soja
Ransom en serre; mais il est comparable au taux d'exudation de 0,1 à 0,3 ml
par plante et par heure obtenu par STREETER (1979) pour le Soja Harosoy au
champ. De ces résultats, il découle que la concentration en uréides de la
sève est inversement proportionnelle au débit de celle-ci (fig. 9). Au cours
d'un cycle nycthéméral, Mc CL URE et al... (1980) avaient également observé
que le maximum d'exudation de la sève correspond au minimum de sa concentra-
tion en azote. La quantité d'uréides transportée par plante résulte du produit
du débit de sève par sa concentration. La variation de cette quantité, mesurée
par STREETER (1979) au cours d'un cycle végétatif du Soja, dans des conditions
pourtant différentes, rappelle celle que nous observons (fig. 9 B).
B - Répartition des uréides dans les organes du Soja
1- Nodosités, racinéS, tige et feuilles
L'azote fixé transporté par la sève xylémique sous forme d'uréi-
des s'accumule dans les différentes parties de la plante avant d'être transfé-
ré à la graine au moment de la formation de celle-ci. Cette accumulation est
très variable selon les organes.
n. Teneurs en azote totnl et en azote soluble
Les teneurs en azote total et azote soluble ont été déterminées
dans les différentes parties du Soja, en même temps que l'azote uréidique,
afin de préciser les proportions de cette dernière forme azotée par rapport
aux deux premières.
Les figures la et 12 représentent l 'évolution des teneurs en
azote total et en azote soluble. Les feuilles et les nodosités ont des teneurs
en azote total plus élevées que les tiges et les racines. Par contre, les
nodosités et les tiges contiennent le plus d'azote soluble (fig. 12). Ces
résultats montrent également la grande différence entre les teneurs en
azote total et en azote soluble des feuilles. La tige contient moins d'azote
total que la feuille, mais elle est l'organe le plus riche en azote soluble,
surtout au moment de la formation des gousses. Cette différence entre les
feuilles et la tige dans les teneurs en azote total et en azote soluble peut
s'expliquer par la différence des teneurs en protéines des deux organes. Les
pourcentages moyens d'azote soluble par rapport à l'azote total sur l'ensemble
du cycle végétatif sont donnés par le tableau IV ; ils sont respectivement
de 26,3 dans les nodosités, 43,5 dans les racines,-61,9 dans les tiges et
17,3 dans les feuilles.

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Jours
après . semis
Figure 11-
Pourcentages de N-uréides par
Figure 10-
Variations des teneurs en N totaZ
des nodosités (~), des
rapport à Z'azote soZubZe des
racines (e- -.), des tiges (O-O)
différents organes du Soja
et des feui Ues (O-~O) au cours de
nodosités (~), racines (.--.),
Za suZture du Soja (cv. Hodgson).
tiges (0-0) et feui Ues (O--O)
Les symboZes F, FG, RG ont Zes mêmes
significations que sur Za figure 8.

---

- 49 -
Tableau IV
Teneurs moyennes en azote total, azote soluble et pourcentages
de l'azote uréidique des différents organes du Soja Hodgson cul-
tivé en serre et inoculé avec G .
3
N - uréides
N - acide allantoïque
Parties de
N total
N soluble
N
N
N
N
N-
-1
la plante
(mg.g-l~F) (mg.g MF)
total
soluble
total
soluble
uréides
%
%
%
%
%
Nodosité
13,7
3,6
2,9
Il,4
2,0
7,5
67,5
Racine
2,0
0,9
1,5
3,8
1,0
2,3
66,8
Tige
5,1
3,2
29,0
47,4
21,0
33,9
72,3
Feuille
Il,8
2,0
3,0
19,1
2,2
12,8
74,4
b. Teneurs en uréides
La proportion d1uréides dans l'azote total est faible dans
tous les organes pendant toute la période de culture, à l'exception de la
tige. Elle augmente sensiblement dans les feuilles au début de la formation
des gousses. Dans la tige, cette proportion croît très rapidement dès les
premières mesures, mais reste inférieure à 50 %.
La part des uréides dans l'azote soluble varie au cours du
cycle végétatif dans la tige et également dans une moindre mesure dans les
autres organes (fig. Il). Elle varie très peu dans les nodosités et surtout
dans les racines, mais elle augmente dans la tige et les feuilles au moment
de l'apparition des premières gousses (44e jour). Elle représente alors
84,8 %dans la tige et 44,1 % dans les feuilles (fig. Il). A ce moment, la
concentration en uréides de la tige vaut 7 fois celle des nodosités, près de
3 fois celle des feuilles et plus de 100 fois celle des racines. Cette faible
accumulation des uréides dans les racines au moment où elle est maximale dans
la plante, montre que les racines participent relativement peu au métabolis-
me de ces composés. Il est reconnu que les uréides ne s'accumulent pas dans
les nodosités où ils sont synthétisés et leur teneur en ces substances est
toujours beaucoup
plus faible que celles rencontrées dans la tige et les
feuilles, mais peut atteindre plus de 20 fois celle des racines (fig. 12).
OHYAMA et al.~ (1981) signalent la formation des uréides dans les racines à
partir de N0i' Cette faculté se traduirait alors par des teneurs en uréides
plus élevées de ces organes qui.ne semblent donc pas jouer un grand rôle

---

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40
60
80
100
20
100
Temps (J.)
Figure 12- TeneuY's en azote soluble (--..) et /J-uréides (0-0) des organes
du Soja.
L'échelle de!! soluble et celle de N-uréides dans les
nodosités (Ah la tige (C) et les feuilles (-D) sont' identiques.
Les couY'bes B représentent l'azote so luble (éche lle de gauche)
et N-uréides (éche île de âroi te) dans la Y'acine.

---

- 51 -
dans la synthèse des uréides à partir de N2.
Sur l'ensemble du cycle végétatif, la proportion de l'azote
uréidique dans l'azote soluble reste également faible dans tous les organes
à l'exception de la tige où elle avoisine 50 %.
Ces résultats montrent que la tige est le principal organe
de mise en réserve de l'azote uréidique chez le Soja. Il est difficile de
déduire de ces résultats les mouvements de l'azote et les interconversions
des composés azotés dans la plante. Néanmoins, le fait que la fraction
uréidique de l'azote soluble ne représente en moyenne que 50 %sur l'ensemble
du cycle végétatif pourrait signifier, soit qu'une fraction similaire de
l'azote soluble est transportée et stockée sous des formes autres que uréidi-
que, probablement sous forme d'asparagine, soit qu'une partie de l'azote
uréidique transféré dans la tige a été hydrolysée.
Dans la tige, l'azote uréidique n'est pas réparti
uniformé-
ment. Des analyses effectuées sur des ti0es de Soja Hodgson de 51 jours
montrent que l'accumulation de l 'allantoîne et de l'acide allantoïque est
maximale dans le 7ème entre-noeud à partir de la base (fig. 13). itetentre-
noeud renferme à ce moment 1,5 mg d'uréides totaux par gramme de matière
fraîche, alors que le premier entre-noeud n'en renferme que 0,40. Selon SERRES,
(1982), ce maximum de concentration des uréides tend à se déplacer vers le
sommet de la tige lors de la maturation des graines.
2 - Gousses
L'azote uréidique transite par les feuilles et surtout par
la tige avant d'être transféré à la gousse. La diminution rapide des uréides
dans la tige ne peut correspondre qu'à un transfert de ces composés à la
gousse, puisqu'elle se produit parallèlement à une diminution de l'azote
soluble (fig. 12). Au 82ème jour de culture, la teneur en uréides des gousses
est élevée, à un moment où elle a notablement baissé dans la tige. Mais au
ème
92
jour, le taux de ces composés baisse aussi bien dans la tige que dans
les gousses. Ceci suggère que l'azote uréidique est utilisé pour la synthèse
des protéines de la graine. La richesse de la gousse en uréides au début de
sa formation avait également été constatée par MATSUMOTO et aZ.~ (1977 b) et
par THOMAS et SCHRADER (1981 a). Mais ces composés sont principalement locali-
sés dans les cosses (fig. 14). Celles-ci représentent 3_5._à 4~L%_du poids de
matière fraîche de la gousse entière, au moment de nos mesures, mais elles
contiennent la presque totalité de l'azote uréidique du fruit, soit 4 mg.g- l M.F.
C~tte teneur tombe à 0,87 dès le 104ème jour de culture, sans qu'on enre-

---

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2
3
4
5
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7
8
9
82
86
90
94
98
102
Entre - noeuds
Jours
après
semis
~re 14- Evolution des teneurs en uréides
Figure 13-
Teneurs en uréides totaux ( •
) et
totaux de la cosse ( •
) et de la
en acide aUan to'Îque ( 0)
des
graine (
0
)
(moyennes de 4 mesures)
entre-noeuds de Soja Hodgson de
51 jours cultivé en serre. Les résultats
sont les moyennes de ~ déterminations •

---

- 53 -
gistre une accumulation parallèle de ces substances dans la graine où la
diminution de leur taux est au contraire semblable à celle des cosses
(fig. 14). Cette disparition simultanée des uréides dans les enveloppes et
la graine pose le problème du site exact de leur dégradation au niveau de
la gousse. L'étude des activités allantoinase et allantoicase (CHAPITRE II)
dans la gousse nous permettra d'apporter des éléments de réponse à cette
question.
Dans tous les organes étudiés, l 'allantoine et l'acide
allantoique coexistent, mais ce dernier est toujours plus abondant et fournit
50 à 80 %de l'azote uréidique de tous les organes quelles que soient leurs
teneurs en uréides (tabl. IV).
II - RELATION ENTRE LA FIXATION DE L'AZOTE ET LES TENEURS
EN UREIDES DU SOJA.
Malgré l'intensité des recherches sur la fixation symbiotique,
il n'existe pas encore de méthode fiable pouvant permettre de mesurer avec
exactitude la part de l'azote de la plante qui provient effectivement de la
symbiose.
La technique de la réduction de l'acétylène ne donne qu'une
idée approximative de cette quantité d'azote. L'extrapolation à partir de
la quantité de C H réduite sous-estime probablement la capacité réelle de
2 2
la légumineuse à disposer de l'azote atmosphérique (MINCHINet al.,
1983).
Des études entreprises depuis quelques années sur le rôle des uréides chez
les légumineuses ont mis en évidence l'étroite relation entre la formation
de ces composés et l'azote d'origine symbiotique (HERRIDGEet al.,
1978
Mc CLURE et ISRAEL, 1979 ; McCLURE et al., 1980). Ces observations ont donc
conduit plusieurs auteurs à préconiser l'utilisation des concentrations en
uréides de la sève et des tissus végétaux comme une indication de la fixation
biologique de l'azote et par conséquent un critère de sélection des systèmes
symbiotiques (Mc CLURE et ISRAEL, 1980 ; PATTERSON et LARUE, 1981 ; Mc CLURE
et al.,
1980; HERRIDGE, 1982 a ; PATTERSON et LARUE, 1983 a,b). Mais cette
technique des uréides n'est pas exempte d'imperfections. Si chez le Soja la
fixation se traduit par la formation des uréides, l'inverse n'est pas toujours
vrai dans certaines conditions et chez certaines légumineuses, même à
uréides (THOMAS et al., 1980 b).
Pour préciser la nature de la relation entY'e ces deux méca-
nismes, nous avons essayé de mettre en parallèle l'évolution des concentra-

---

- 54 -
tions en uréides de la plante et celle de l'activité fixatrice des nodosités
de Soja, mesurée par la méthode de la réduction de l'acétylène. D'autres
paramètres, liés a cette activité (masse et nombre des nodosités ont également
été comparés aux taux d'uréides de la plante.
Une souche fixatrice G a été utilisée pour inoculer le Soja
3
Amsoy en serre et Hodgson au champ, de manière a ce que la fixation soit
directement en rapport avec la nodulation.
A - Variations des teneurs en uréides et de l'activité
nitrogénase chez le Soja
Les figures 15 et 16 représentent l'évolution des teneurs en
uréides de la sève et de la tige et celle de l'activité nitrogénase des
nodosités, respectivement en serre et au champ.
La concentration en uréides de la sève augmente fortement dès
que la fixation devient effective. Pendant la phase ascendante de végétation,·
les deux phénomènes évoluent parallèlement, mais la concentration maximale
des uréides est atteinte dès le début de la formation des gousses.
Elle
baisse ensuite régulièrement alors que l'activité fixatrice continue a augmen-
ter. Elle remonte de nouveau a la maturation des gousses, lorsque l'activité
fixatrice baisse a son tour.
Cette évolution, beaucoup plus nette dans le cas des cultures
en serre (fig. 15) s'observe également au champ où les conditions de milieu
sont pourtant bien différentes. L'étude de la répartition des uréides chez
le Soja dans les différents organes a montré que l'accumulation maximale
de ces substances intervient généralement au début de la formation des gousses,
ème
entre le 40ème et le 50
jour pour le Soja en serre. Au cours de l'expé-
rience avec Hodgson au champ (fig. 16), le dosage des uréides a été effectué
dans le premier entre-noeud. L'évolution de la teneur en uréides de cette
portion de la tige est différente de celle des teneurs de la tige entière ou
de la sève. Cette teneur est très faible pendant toute la période végétative,
mais augmente rapidement pour atteindre le maximum pendant le remplissage
ème
des gousses, au moment où se produit le 2
pic de la concentration dans la
sève. La faible teneur de cette partie de la tige (fig. 13), en particulier
et le rôle de stockage dévolu a la tige en général, peuvent expliquer cette
évolution qui diffère également de celle de l'ARA.
La différence entre l'évolution de l'ARA et celle des concen-
trations en uréides de la sève ou de la tige pourrait provenir du fait de

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100
Jours
après
semis
Figure 15-
Variations de l'activité nitrogénase
Figure 16- Activité nitrogénase (
. ) et concentrations
( • ) et des concentrations en
en uréides dans la sève (
•
) et la
uréides de la sève ( . ) du Soja Amsoy
tige ( 0) du soja Hogdson au cheurrp.
cultivé en serre.
Les mesures d'uréides dans la tige ont été
effectuées sur la portion entre le bulbe
cotylédonnaire et la première
feuille
trifoliée ou ramification. Tous les points
représentent une moyenne de 5 mesures.

---

- 56 -
l'expression de l'ARA par plante et par heure. Nous avons déjà preclse que
les concentrations en uréides de la sève évoluent indépendamment des fluctua-
tions du débit de celle-ci. Le taux d'exportation des uréides par la plante,
c'est-à-dire la quantité de ces composés transportée par plante et par heure
varie d'une manière également différente de l 'activité fixatrice (fig. 9 b.)
Il ne permet donc pas de traduire mieux que la concentration de la sève, la
relation entre la quantité de N fixée et la faculté de synthèse des uréides
2
par la plante.
Les nodosités constituent le facteur limitant de la présence
des uréides chez les légumineuses à uréides. Malgré les difficultés pour
récupérer toutes les nodosités lors des cultures de légumineuses au champ,
le nombre et la masse de ces organes chez Je Soja cultivé au champ et en
serre varient parallèlement à la concentration de la sève en uréides comme
le montre la figure 17 chez le Soja Amsoy.
B - Relation-entre l 'activiténitrogénase et la synthèse
des uréides
Les résultats précédents suggèrent qulil existe bien une
relation étroite entre la formation des uréides et la fixation de N chez
2
le Soja. L'incorporation de N dans les molécules d'uréides relève d'un
2
mécanisme connu. Mais il parait actuellement difficile de maîtriser tous les
facteurs qui en régulent chaque étape. Les relations entre les concentrations
en uréides et l'ARA d'une part, sont traduites par les figures 18 et 19,
et d'autre part,celles entre les uréides et le nombre ou la masse des
nodosités par les figures 20, 21 et 22. Ces figures qui représentent les
'concentrations d'uréides dans la sève de deux variétés de Soja en serre et
au champ, en fonction de différents paramètres montrent que l'accumulation
de ces substances dans la plante n'est pas toujours proportionnelle à
l'activité nitrogénase des nodosités, ni au nombre ou à la masse de ces
organes.
La proportionnalité n'existe entre les uréides et l'ARA que
pendant la phase végétative des plantes, comme l'indique le tableau V des
coefficients de corrélation linéaire. Pendant cette période de la culture
les teneurs en uréides de la sève et de la tige sont bien corrélées tant
avec l'activité réductrice de l'acétylène qu'avec la nodulation. Même les
valeurs de ces coefficients relatives à la tige où-les taux d'uréides sont
pourtant bas à ce stade sont satisfaisantes. La corrélation négative entre

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Figure 17- Evolution de la concentration en ~œéides ( •
) et
dv. nombre de nodosités ( 0
) chez le Soja Amsoy
en serre.

---

- 58 -
les teneurs en uréides et l'ARA spécifique vient du fait que celle-ci diminue
constamment durant la période de fixation (OBATON et al., 1982). Mc CLURE et
al., (1980) observent une bonne corrélation entre l'azote d'origine symbioti-
que et les concentrations en uréides de la sève du Soja Ranson pendant les
50 premiers jours de culture également. Cette bonne corrélation n1est cepen-
dant pas une preuve que l lazote des uréides provient obligatoirement de la
fixation symbiotique; en effet pendant cette période tous les paramètres liés
à la fixation (nombre et masse des nodosités, masse de la plante ... ) augmen-
tent simultanément et la corrélation que nous observons durant cette phase
peut n'être qu'indirecte.
Tableau V
Coefficients de corrélation entre les teneurs en uréides de la
sève et de la tige et différents paramètres lors de la culture
du Soja. Les valeurs relatives à Amsoy et Hodgson ont été obtenues
ème
ème
ème
ème
respectivement du 21
au 63
jours et du 26
au 75
jours
(ARA, activité réductrice d'acétylène; ARA spécifique, ARA par
unité de poids de matière sèche des nodosités ).
(a,
Pc::O,Ol; b, Pc:O,02; d, P>0,10
AMSOY (serre)
HODGSON (champ)
Sève
Sève
Tige
ARA (pmo l . pl -1 . h-1)
0,91 (a)
0,87 (a)
0,71 (b)
ARA spécifique(~mol.mg-1)
- 0,48 (d)
- 0,78 (a)
- 0,66 (b)
MS d'une plante(mg)
0,96 (a)
0,81 (a)
0,88 (a)
MS des nodosités (mg.pl-1)
0,99 (a)
0,80 (a)
0,82 (a)
Nombre de nodosités (pl-1)
0,96 (a)
0,83 (a)
0,78 (a)
Lorsqu'on considère toute la période de culture, au lieu de se
limiter à la première phase du développement, la corrélation entre l'ARA et
les teneurs en uréides devient très faible; les valeurs des coefficients
qui sont proches dans les deux expériences passent de 0,91 à 0,46 pour Amsoy
ère
en serre et de 0,87 à 0,42 pour Hodgson au champ (tabl. VI, 1
colonne).
Par contre, entre les teneurs en uréides et le nombre ou la masse des nodo-
sités la corrélation reste bonne et les valeurs des coefficients encore
élevées restent significatives ( P < 0,01
ou 0,02). Lorsque les uréides sont
évaluées en quantités par plante et par heure, la corrélation entre ces

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r'1: (JLll'C
18-
Evolution de la C01wentl'ation de;;
dans la sève en fonction de l'activitE!
uréides dans la sève en j'onction de
nitrogénascechez le Soja Hodgson au champs
l'ac ti vi té ni trogénase chez le Soja
e
e
(26 e au 113
jours de culture).
Les
Amsoy cultivé en serre (21
au 10S
jour:;
équations de la courbe (1) et de la droite
de culture).Les équations de la courbe (1)
(2) sont: Y1 = 1)23lnx _. 1)92 et
et de la dro'" i.e (2) son tr'e spec (;1~Vell/(: il t :
Y2 = 0)046 x + 0)71
!/1 = 0)29 ln..,,' + 0)49 et Y2 = O)O~;iI ;r: + (I)Of

---

- GO -
quantités et l'ARA n'existe plus et les coefficients très faibles deviennent
négatifs pour le nombre et la masse des nodosités. Sur l'ensemble de la
période de culture, la corrélation entre la teneur en uréides de la tige
et l'ARA est également mauvaise.
Tableau VI:
Valeurs des coefficients de corrélation entre la concentration
en uréides de la sève (mg.ml- 1) et les paramètres de l'activité
fixatrice chez le Soja. Ces valeurs ont été calculées sur
la base de 13 mesures pour Amsoy entre le 21ème et le 105ème
jours et de 17 pour Hodgson entre le 26ème et le 113ème jours
de culture.
(a, P< 0,01 ; b, P >0,02 ; c, P >0,05 et d, P >0,1).
2
3
Y = a + bx
Y = a + blnx
Y = a + bx + cx
+ dx
AMSOY(en serre)
-1
-1
ARA (~mol .pl
.h
)
0,46
(d)
0,69
(a)
0,71
(a)
MS ~odosités (mg.pl-1)
0,69
(a)
0,90
(a)
0,82
(a)
N~nodositéS (.pl-1)
0,62
(b)
0,80
(a)
0,82
(a)
HOGDSON (au champ)
-1
-1
ARA (~mol.pl
.h
)
0,42
(c)
0,70
(a)
0,73
(a)
MS nodosités (mg.pl-1)
0,85
(a)
0,90
(a)
0,92
(a)
1
NB ,nodos i tés (. P1- )
0,84
(a)
0,91
(a)
0,93
(a)
Cette premlere interprétation suggère que la relation entre
l'accumulation des uréides dans la plante et l'activité fixatrice des nodo-
sités n'est pas une relation linéaire. Dans l'association Rhizobium-légumineuse,
même si la fixation biologique est a 1'origine de la synthèse des uréides,
les quantités de ces substances véhiculées par la sève, pas plus que celles
accumulées dans la plante, ne sont proportionnelles a la quantité d'azote
fixée pendant la même période surtout lorsque cette dernière atteint des
valeurs élevées (fig. 18 et 19).
Au cours de toutes les experlences où les teneurs en uréides
de la plante ont été déterminées en même temps que l'activité réductrice de
l'acétylène des nodosités, la linéarité entre les deux mécanismes n'existe

---

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300
400
400
800
1200
1600
MS des nodosités (mg. pl_1)
Figure 20-
Evolution de la concentration
Figure 21- Evolution de la concen-
des uréides dans la sève en
tration des uréides dans
fonction de la masse de matière
la sève en fonction de la
sèche des nodosités chez le Soja
masse de matière sèche des
Amsoy en serre (21 e au 105e jours
nodosités chez le Soja Hodgson
de culture).
au champ (26e au 113e jours
y 1 = 03 32 lnx - 0 52
3
de culture).
Y2 = 0 0026 x + 0 48
y 1= 0 95 lnx -
3
3.3 85
3
3
Y2= 0 0017 x + 0.3 83
3

---

- 62 -
que pour de faibles valeurs de ltactivité fixatrice. Indépendamment de
l'augmentation de la concentration en uréidffiobservée en fin de cycle lors de la
plupart des cultures, les quantités de ces composés, réellement attribuables
à la fixation biologique dépendent pourtant, comme cette dernière, des condi-
tions de culture. Au moment de la production maximale des uréides chez le Soja,
les valeurs obtenues en serre et au champ peuvent varier du simple au double.
Le même type de relation existe entre les concentrations en uréides de la sève
et le nombre ou la masse des nodosités. Lorsque les valeurs de ces deux para-
mètres de la nodulation augmentent, la fraction urédique de l'azote de la
sève, loin d'augmenter proportionnellement, semble tendre également vers un
plateau, comme le confirment les figures 20, 21, et 22. Nous avons tenté, à
partir de ces résultats, d'établir d'autres formules pouvant mieux traduire
les types de liaison entre les teneurs en uréides et l'activité fixatrice
des plantes. Nous avons pour cela recherché une relation fonctionnelle don-
nant le meilleur ajustement, par la méthode des moindres carrés, entre les
points expérimentaux et les courbes théoriques. Les régressions logarithmi-
que
et cubique ont donc été utilisées. Ces deux régresssions, caractérisées
par des coefficients de corrélation plus élevés (tabl. VI) révèlent plus
de précisions que la simple relation linéaire. Cependant, seules les courbes
correspondant à la régression logarithmique sont représentées sur les
figures 18, 19, 20, 21 et 22, en plus de la droite de la régression linéafre.
Elles semblent bien indiquer la tendance de l'évolution des concentrations
d1uréides dans
la sève en fonction de l'activité fixatrice et des paramè-
tres liés à cette activité. La régression cubique (y = a + bx + cx2 + dx3)
n'apporte pas plus d'amélioration que la régression logarithmique; ses
coefficients de corrélation ne sont que très légèrement plus élevés et ses
courbes sont très voisines de celles de cette dernière régression. Les
équations de ces courbes montrent en effet que les valeurs du coefficient
de régression d sont toujours négatives et celles de c très faibles, variant
de 10-8 à 10-6 .
Tous les coefficients de corrélation des deux régressions sont
significatifs pour p~ 0,01 (tabl. VI) et traduisent mieux la relation entre
les teneurs en uréides et l'activité fixatrice d'une part, et d'autre part
entre ces teneurs et la nodulation. Dans tous les cas, et quel que soit le
type de régression utilisé, la corrélation entre les teneurs en uréides et la
nodulation est toujours plus forte que celle entre ces teneurs et l'activité
nitrogénase. D'ailleurs, l'évolution de cette dernière en fonction du nombre
et du poids de matière sèche des nodosités est similaire à celle que nous
observons pour les concentrations d'uréides de la sève en fonction des mêmes
paramètres et llactivité nitrogénase."

---

- 63 -
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160
240
320
Nombre de nodosités par pl.
Figure 22- Evolution de la concentration en
uréides de la sève en fonction du
nombre des nodosités chez le Soja
e
e
Hogdson au champ (26
au 113
jours
de cu l ture) .
y] -
]~25 lnx - 3~93
lie? = o~ 0091x -1- O~ 6'1

---

- 64 -
III - CONCLUSION
Les uréides synthétisés dans les nodosités du Soja sont véhi-
culés par la sève vers les parties aériennes où ils s'accumulent. Mais cette
accumulation n'est pas uniforme dans tous les organe~. Les concentrations
dans la tige sont beaucoup plus élevées pendant tout le développement de la
plante.
A la maturation des graines tout l'azote uréidique des orga~
nes et notamment de la tige est drainé vers la gousse où il est retrouvé
principalement au niveau des cosses. La tige pourrait être considérée tout
simplement comme le réservoir central où arrivent et s'accumulent les uréides
avant leur répartition dans les différents organes en fonction des besoins de
ces derniers et du mouvement de l'azote dans la plante. Pendant tout le cycle
végétatif, les uréides représentent à peine la moitié de l'azote soluble
total contenu dans la tige, malgré une concentration maximale de près de 85 %
au début de la formation des gousses. La participation des autres composés
azotés, notamment les acides aminés et les amides au transport de l'azote fixé
nlest donc pas négligeable. De ce fait, les proportions d'uréides varient
consta~lent en fonction du stade végétatif. Cette fluctuation des teneurs en
uréides du Soja affecte les liens entre le processus de formation de ces
molécules et l'activité fixatrice de l'azote.
L'analyse des résultats obtenus dans des conditions différen-
tes et sur des cultivars différents montre que la corrélation entre la syn-
thèse des uréides et la nodulation est beaucoup plus étroite que celle entre
cette synthèse et l'activité nitrogénase des nodosités.
Il n'existe donc pas
deproportionnalitê entre le mécanisme de la formation des uréides et celui de
l'assimilation de l'azote fixé. Cette absence de proportionnalité entre les
deux mécanismes est confirmée par les résultats de l'ajustement des données à
différentes formes de régressions. Elle est probablement due à la localisation
au sein des la nodosité, des enzymes de la synthèse des uréides (chap. II).

---

- 65 -
CHAPITRE II
LES ENZYMES DE LA SYNTHESE ET DE LA DEGRADATION DES UREIDES
l - SYNTHESE DES PURINES
II - CATABOLISME DES BASES PURIQUES
A - Répartition des enzymes du métabolisme uréidique entre
les fractions de la nodosité
B - Activité XDH chez le Soja
C - Activité uricase
III - DEGRADATION DES UREIDES
A - Dégradation des uréides dans les nodosités et les racines
B - DéQradation des uréides dans la ti~e et les feuilles
1 - A11 antoïnase
2 - A11 antoïcase
C - Dégradation_ des uréides dans les gousses
IV - CONCLUSION

---

- 66 -
CHAP !T,RE II
LES ENZYMES DE LA SYNTHESE ET DE LA DEGRADATION DES UREIDES
La formation des uréides dans les nodosités des légumineuses
à partir de N nécessite d'abord la synthèse, puis la dégradation des purines.
2
Cette synthèse comporte plusieurs étapes dont les principales
sont constituées par la formation et l'amination du PRPP. La dégradation des
purines en général et de l'IMP en particulier fait appel à l'intervention de
plusieurs enzymes. Le produit final de ce catabolisme dépend des organismes.
Chez le Soja, où ces composés sont dégradés jusqu'à l'allantoïne et l'acide
allantoïque, la XDH, l'uricase et 1'allantoïnase jouent un rôle fondamental,
l'allantoïcase étant l'enzyme finale de cette chaîne de dégradation.
Dans les nodosités de cette légumineuse productrice d'uréides,
nous avons étudié l'activité PRPP synthétase pour la synthèse des purines
et dans tous les organes de la plante, pour la dégradation de celles-ci,
les activités XDH, uricase, allantoïnase·et allantoïcase. Nous distinguerons
donc dans ce chapitre, la synthèse des purines, leur dégradation et le méta-
bolisme des uréides.
1 - SYNTHESE DES PURINES
Dans les germes de blé, KAPOOR et WAYGOOD (1962) ont observé
que l'asparagine était le principal donneur du groupement amide pour la for-
mation de la glycinamide ribotide (GAR), l'un des principaux composés inter-
médiaires dans la synthèse des purines.
Dans les nodosités de Soja et de Vigna, par contre, le grou-
pement aminé est apporté en grande partie par la glutamine et dans une faible
proportion par l'ammonium et l'asparagine (ATKINS et a~., 1982 a). La forma-
tion du PRPP nécessaire à l'incorporation de ~a glutamine est très intense
chez les deux légumineuses.
La figure 23 indique l'évolution et le niveau de l'activité
de la PRPP synthétase dans la fraction soluble des nodosités de Soja. Au
ème
30
jour, cette activité est déjà élevée, mais elle atteint rapidement
sa valeur maximale dès le 44ème jour, bien avant celle de la fixation.
Elle correspond au stade de la production maximale des uréides chez des plan-

---

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20
40
60
80'
100
Jours
après semis
Figure 23- Activité PRPP synthétase dans la
FigUY'e~- Activité XDH des nodosités de
fraction soluble des nodosités du
Soja.
L'échelle de gauche (e)
Soja Hodgson (Moyennes de deux
reDrésente l'activité Dar
expériences de trois mesures
gramrae de nodosités et' celle
chacune).
de dr>oi te ( 0
) par mg de
protéines.

---

- 68 -
t~cultivées dans des conditions similaires. Cependant, elle baisse rapide-
ème
ment alors que la fixation est très intense et au 65
jour l'activité n'est
1
plus que de 65 nmol .min- 1.g- MF. Cette diminution précoce de l'activité
PRPP synthétase par rapport à l'activité nitrogénase contraste avec le rôle
de cette enzyme dans l'incorporation de N fixé dans la molécule d'IMP,
2
considérée pourtant comme la voie prioritaire de l'assimilation de la gluta-
mine issue de la fixation chez les légumineuses à uréides. SCHUBERT (1981 a)
estime que la quantité de PRPP formée dans les nodosités pendant la phase
active de l'activité fixatrice, serait suffisante pour absorber tout le flux
de N fixé par ces organes; Ceci para't vrai dans nos conditions ~'expérimenta­
2
eme
tion, mais uniquement jusqu'à l'activité maximale de l'enzyme (44
jour).
1
A ce stade, par exemple, à une activité de la PRPP synthétase de 188,4 nmol.min- .
g-l M.F., soit 4,5 ~mol .h-~ p,-l (pour 0,40 g de nodosités par plante) cor-
respond 1,02 ~mol de C H par plante et par heure; ce qui équivaut à 4,5 ~mol
2 4
de PRPP pour 0,5 ~mol de NH4+ formées par heure et par plante sur la base
+
de 2 C H pour 1 NH
(SCHUBERT, 1981 a). Le rapport de 9 entre le taux de
2 4
4
synthèse du PRPP et l'azote fixé est très supérieur au chiffre de 2 obtenu
par SCHUBERT (1981 a). Ceci est dû à la faible activité nitrogénase mesurée
dans nos conditions expérimentales à cette date. La quantité de PRPP produite
est par conséquent largement suffisante dans ce cas pour incorporer l'azote
fixé puisque la synthèse d'une mole d'IMP nécessite deux moles de glutamine,
soient 4 NH 4+.
Au cours de cette experlence, des mesures d'activité PRPP syn-
thétase n'ont pas été effectuées au-delà du 65ème jour de culture. La baisse
ème
progressive de cette activité ob~ervée après le 44
jour correspond bien
à une diminution simultanée de la teneur en uréides de la plante, mais n'est
plus en rapport avec l'augmentation de l'activité fixatrice.
II - CATABOLISME DES BASES PURIQUES
Nous avons rappelé précédemment les différentes séquences pos-
sibles de la dégradation jusqu'aux uréides, de 1'IMP, composé central des
purines. D'autres nucléotides formés à partir de 1 'IMP (XMP, GMP, AMP) sont
également dégradés en uréides par les extraits de nodosités (ATKINS, 1981).
SHELP et ATKINS (1983) viennent d'ailleurs de mettre en évidence une activi-
té inosine monophosphate oxidoréductase, EC. 1. 21. 14 ( IMP--.XMP) dans
les nodosités de Vigna. Mais quelles que soient les différentes voies de
métabolisme de 1'IMP, les seules bases issues du catabolisme des purines sont

---

- 69 -
l'hypoxanthine
la xanthine
l 'acide urique et l'allantoine
le premier
t
t
t
terme des uréides. L'oxydation de ces composés donnera l'acide allantoique
dont la dégradation
à son tour
aboutira à la libération de NH
t
t
4+ sous forme
d'urée.
L'étude de l'oxydation de l'hypoxanthine
la xanthine et
t
l'acide urique respectivement par la XOH et l 'uricase dans les différents
organes des plantes de Soja
est l 'objet de ce paragraphe. L'allantoinase et
t
l 'allantoicase qui dégradent les uréides seront étudiées au paragraphe III
de ce chapitre dans le cadre de la dégradation de ces molécules.
La distribution de ces différentes enzymes chez le Soja
permettra de situer et d'expliquer l'importance des uréides comme formes de
transport de l'azote fixé pendant le cycle végétatif du Soja.
A - Répartition des enzymes du métabolisme uréidique
entre les fractions de la nodosité
Les uréides sont synthétisés dans les nodosités qui résul-
tent de l'association entre la plante et le Rhizobium. Pour connaître la
part de chacun de ces deux partenaires dans la synthèse et le métabolisme
de ces composés
nous avons d'abord déterminé les niveaux d'activité de la
t
XOH
l'uricase
l'allantoinase et l'allantoicase dans les bactéroides et
t
t
dans la fraction soluble des nodosités.
Tableau VII : Activités des enzymes du métabolisme uréidique dans les frac-
1
tions de nodosités de Soja de 45 jours (nmol.min- .g- 1MF).
Enzymes
Fraction soluble
Bactéroides
XOH
85 t 1 ± 11 t7
non détectée
Uri case
1 630 O + 120 O
t
t
11 t 8 ± 4t O
Allantoïnase
770 O ± 25 7
87 2 ± 9 1
t
t
t
t
A11 antoicase
non détectée
non détectée
Selon les résultats du tableau VII
la XOH
l 'uricase et
t
t
l'allantoïnase se rencontrent principalement dans la fraction soluble des

---

- 70 -
nodosités. Des activités uricase et all·antoTnase a peine équivalentes au
dixième de celles rencontrées dans la fraction soluble sont présentes dans
ème
les bactéroTdes 00 l~ XDH nia pu être détectée au 45
jour de culture.
La nodosité est dépourvue d'allantoTcase. Celle-ci nia été observée ni
dans les bactéroTdes, ni dans la fraction soluble.
Dans leurs travaux préliminaires sur la répartition de ces
enzymes chez le Soja, TAJIMA et YAMAMOTO (1975) et TAJIMA et aZ.~ (1977)
n'avai~nt pas non plus détecté l 'allantoTcase dans la nodosité de Soja, mais
avaient associé l'uricase aux bactéroldes et la XDH a une ~fraction nucléaire "
qui n'a pas été définie .• D'autres études ultérieures sur la localisation de
ces enzymes avec la centrifugation en gradient de densité de saccharose
(HANKS et aZ.~ 1981 ; BOLAND et al.~ 1982.)
ont montré que la PRPP synthétase
est localisée dans le cytosol, la synthèse des purines dans les proplastes et
l 'oxydation de ces dernières jusqulau stade diacide urique également dans
le cytosol. Selon ces mêmes études, l 'uricase et l 'allantoTnase seraient
situées respectivement dans les peroxisomes et le réticulum endoplasmique.
Par ailleurs, l 'utilisation de la même technique de centrifugation différen-
tielle a permis a HANKS et al.~ (1983) de distinguer les cellules infectées
des cellules non infectées de la nodosité. Ces dernières seraient le siège
des activités uricase et allantoTnase.
La technique de séparation que nous avons utilisée (centri-
fugation a 30.000 g pendant 30 minutes) permet certes d'isoler les bactéroT-
des, mais pas les différents organites qui sont donc inclus dans la fraction
soluble.
B - Activité XDH chez le Soja
De tous les organes du Soja étudiés, seule la nodosité conte-
nait une activité XDH détectable. La figure 24 indique l 'évolution de celle-ci
pendant le cycle du Soja. Elle est relativement faible au début de la cul-
ture 00 elle présente un léger pic a la floraison. Après une baisse momenta-
née, elle remonte considérablement pendant la période du remplissage des
gousses où elle atteint son maximum. L'activité spécifique de la XDH est
faible pendant toute la péri~de de culture. Le rôle de cette enzyme nlest
pas pour autant moins déterminant dans
la formation des uréides dans les
nodules. Chez les légumineuses, l'activité XDH avait
déja été observée dans
les feuilles de Pois et de Haricot (NGUYEN et FEIERABEND, 1978). CHRISTENSEN
et JOCHIMSEN (1983) viennent de signaler dans les feuilles et la tige de
Soja une activité XDH ; mais cette activité très faible de l 'ordre de

---

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Jours
après semis
Figure 25-
Activité uri case des nodositjs (. . .) .. des racines (O-O) ..de la ticre (~-_.~) et
des feuilles (Â__ Â). Pour les fifi7-œeS A (nmol.rrrin- 1.go l MF) et B"(nmol.min:":'1 .
••
mg""l protéines.. les ".dc,'l,elles de gauche représentent l'activité dans les
nodosités et celles (~e d1'oite les activités dans les racines .. la tige et les
feui lles).

---

- 72 -
0,1 à 0,2 nmol.min- 1.mg- 1 de protéines peut être considérée comme insignifian-
te par rapport à l'activité des nodosités.
C - Activité uri case
L'uricase peut être considérée comme l'enzyme la plus impor-
tante dans la synthèse des uréides. Son action directement responsable de
l'accumulation de ces composés chez les légumineuses distingue ces plantes
des autres organismes chez lesquels la formation d'acide urique est la der-
nière étape de la dégradation des purines.
Contrairement à la XDH, 1'uricase est présente dans tous les
organes du Soja. L'activité par gramme de matière fraîche et l'activité spé-
cifique dans les différents organes sont illustrées respectivement par les
figures 25 A et 25 B.
L'activité des nodosités n'est pas comparable à celle des
autres organes. Les valeurs d'acide urique formé sont de l'ordre de 3 000 nmol.
min- 1.g- 1MF dans les nodosités dès le 37ème jour alors qu'elles n'excèdent
jamais 30 nmol dans les racines, la tige et les feuilles (fig. 25 A). L'acti-
vité dans les feuilles est bien plus élevée que celle de la tige et des
racines. Elle présente un maximum à la floraison, mais après une diminution
rapide au remplissage des gousses elle remonte très fortement à la maturation
pour se maintenir à un niveau aussi élevé que celui atteint à la floraison
(fig. 25 A). L'activité spécifique des feuilles, par contre, est beaucoup
-
plus faible (fig. 25 B) en raison de la forte proportion de l'azote protéini-
que de ces organes. Dans les nodosités l'activité reste élevée au cours d'une
grande partie du cycle du Soja, malgré quelques fluctuations de l'activité
spécifique.
L'uricase des nodosités est très stable (fig. 26). Dix jours
après le broyage., l'enzyme des extraits de nodosités
conservés à 4°C garde
encore près de 80 %de son activité.
La constante de Michaelis (km) de 1 'uricase pour l'urate a
également été déterminée dans des extraits de nodosités de Soja. Une valeur
de 21, 4 ~M a été obtenue pour l'enzyme des nodosités de 45 jours (fig. 27).
THEIMER et BEEVER (1971) ont obtenu un km de 7,4 ~M pour 1 'uricase des
glyoxysomes d'endosperme de Ricinùs communis. MAHLER (1970) observe un km de
4
1.10-
M pour BaciZZus fastidiosus et 1 'uricase de Chaos ·chaos possèderait
5
4
deux valeurs de km (3,7 x 10-
et 1,4 x 10-
M) pour l'urate (MULLER et

---

- 73 -
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~
Temps
Figure 26- Stabilité de l'activité uricase des nodosités de Soja
de 45 jo~Ys.
Les extraits de nodosités obtenus selon
la méthode de broyage décrite dans "[Jétizodes et Techniques"
ont été conservés à 4°C.
(moyennes de 4 répétitions
:. éccœts-types).

---

- 74 -
M~LLER, 1969). En ce qui concerne l'affinité pour l'acide urique de l'uricase
des nodosités de légumineuses, TAJIMA et YAMAMOTO (1975) ont indiqué une
valeur de km de 8,1 ~M pour les nodosités de Soja. Par ailleurs, ,le Km
de 1'uricase des nodosités de Vigna est de 28 ~M pour l'oxygène dissous
(WOO
et al.~1981) et 18 ~M pour l'urate (RAINBIRD et ATKINS, 1981).
Notre valeur de 21,4 ~M pour 1'uricase des nodosités de Soja
a été obtenue avec des extraits bruts, sans purification préalable de
l'enzyme. Les basses pressions d'oxygène diminuent la formation des uréides
(OHYAMA et KUMAZAWA, 1981). Au cours de nos mesures de l'activité uri case
in vitro
l'oxygène n'était pas limitant. La valeur du Km obtenue dans nos
3
conditions expérimentales indique donc que dans cet état 1'uricase à une
affinité relativement faible pour l'urate. Cette faible affinité pourrait
expliquer les fortes activités de cette enzyme dans les nodosités où l'acti-
vité XDH est relativement faible par rapport aux autres enzymes.
L'uricase des racines de Soja serait différente de celle
des nodosités (TAJIMA et YAMAMOTO, 1975; TAJIMA et al.~ 1977). Elle serait
plus active en présence de cadavérine (TAJIMA et al.~ 1983). Nos mesures
d'activité uricase dans les racines, effectuées pourtant dans les mêmes
conditions que dans les autres organes du Soja montrent que l'enzyme des
racines est moins active que celle des nodosités, mais elle est aussi active
que l'enzyme de la tige et des feuilles (fig. 25).
III - DEGRADATION DES UREIDES
La dégradation de 1'allantoïne et l'acide allantoïque, res-
pectivement par 1'allantoTnase et l'allantoïcase, s'effectue à plusieurs
niveaux dans la plante. Elle commence dans les nodosités et s'achève dans
la tige, les feuilles et les gousses. Cette dégradation est d'autant plus
importante dans le métabolisme des uréides qu'elle permet à la plante de ré-
cupérer l'azote uréidique qui, sans cette phase serait sans doute inutilisa-
ble.
A- Dégradation des uréides dans les nodosités et les
racines
Des deux enzymes qui interviennent dans la dégradation des
uréides, seule 1'allantoïnase a été détectée dans les nodosités et les racines.
Mais l'activité allantoïnase dans les racines, sans être négligeable, est
très faible par rapport à celle des nodosités (fig: 28) ou elle est presque
équivalente à l'activité uricase. L'activité spécifique dans les nodosités

---

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de Z 'uricase
J
des nodosités de Soja au 4s ème jour de culture
par la méthode de Lineweaver
J
et Burk.
La vi tes se V es t exprimée en Il/lIO l ri' acide uy>iquc dégradé
par mùm I;e
et par' mg de protéines.

---

- 76 -
(fig. 28 B) est élevée uniquement au moment de la floraison et de l'appari-
,tion des premières gousses. L'activité par gramme de nodosités, par contre,
reste élevée pendant tout le cycle végétatif(fig.28).Ces résultats confir-
ment de nouveau le rôle des nodosités dans le métabolisme uréidique et
montrent que la majeure partie de l 'allantoTne est dég~adée dans les par-
ties souterraines du Soja. Mais cette dégradation dans laquelle la partici-
pation des racines est très faible n'arrive pas à son terme. La forte
activité allantoTnase des nodosités associée à l'absence d'allantoTcase
aussi bien dans les nodos~tés que dans les racines permet donc au Soja de
transporter 60 à 80 % de l'azote uréidique sous forme d'acide allantoTque
dans la sève xylémique.
B- Dégradation des uréides dans les tiges et les feuilles
Dans la partie souterraine du Soja, la dégradation de
l 'allantoTne s'arrête au stade d'acide allantolque. Dans la tige et les
feuilles, par contre, cette dégradation peut se poursuivre jusqu'à l'acide
glyoxylique et l'urée. En effet, l 'allantoTnase et l 'allantoTcase sont
présentes dans ces organes.
1 - AllantoTnase
L'uricase et l 'allantoTnase sont, parmi les enzymes de la
dégradation des purines, les seules rencontrées dans tous les organes du
Soja. L'activité allantoïnase dans la tige est aussi élevée que celle des
nodosités (fig. 28 A). Dans les feuilles, l'activité a été mesurée dans
l'ensemble des feuilles développées d'une plante. L'activité y est plus
faible que dans la tige à la floraison. Mais à la maturation, les activités
dans la tige et les feuilles sont comparables. L'activité spécifique dans
la feuille est très faible, de même ordre de grandeur que celle de la
racine.
La figure 29 représente les valeurs de l'activité allantoi-
nase dans les entre-noeuds de la tige de Soja de 51 jours. Ces valeurs
ne sont pas significativement différentes, contrairement aux gradients de
concentration d'uréides observés dans les entre-noeuds des mêmes plantes
(fig. 13). Les pétioles contiennent également de fortes activités allantoT-
nase, comme l'ont observé THOMAS et SCHRADER (1981 a). Nos résultats identi-
ques à ceux'de ces auteurs, montrent que dans la partie aérienne du Soja,
la dégradation de l 'allantoine est réalisée princ1palement dans la tige.
2 - Allantoicase
Bien que les uréides dans les plantes de Soja et de Vigna

---

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100
Jours après semis
l'igure 28- Activité Aîlanto'Înase dans les nôdosités (_)~ la racine
(o-o)~ la tige (b.--b.) et les feuilles (A ••A). Les faibles
:J.ctivités spo?cifiques (.mg- 1 protéines) des racines et des
feui l Les ne scmt pas }?eprésentées SUl' la fiq~œe B.

---

- 78 -
. soient en grande partie sous forme diacide allantoique, très peu d'études
ont été consacrées à 1'allantoicase chez ces légumineuses. La plupart
des travaux sur 1'assimilation des uréides se sont limités à l'allantoinase
(ORY et al.~ 1969 ; ANGELO et ORY, 1970 ; THOMAS et SCHRADER, 1981 a).
SINGH (1968) a étudié 1'allantoicase des plantules d'Arachis hypogeae et
THOMAS et al.~ (1980 b) 1'allntoicase des tiges et feuilles de Phaseolus
vulgaris non nodulé. Quant au Soja, TAJIMA et YAMAMOTO (1975) ont détecté
cette enzyme dans la partie aérienne et MATSUMOTO et al.~ (1982) ont observé
des activités allantoicase et uréidoglycolase dans les feuilles.
A l 'exception des gousses que nous considérons comme le
site principal de la dégradation des uréides et dont nous parlerons plus
loin, 1'allantoicase a été détectée uniquement dans la tige et les feuilles
(fig. 30). L'activité dans les feuilles est plus importante que celle dans
la tige, exactement à l'inverse de l'allantoinase. Cette observation prouve-
rait que la dégradation de l'allantoine est plus intense dans la tige et
celle de 1'acide allantoique dans les feuilles à la floraison où ces acti-
vités sont maximales.
Aussi bien dans la tige que dans les feuilles, l'activité
spécifique (fig. 30 B) n'est pas élevée. Mais compte tenu de la masse de
matière fra'che de ces organes et notamment des feuilles, l 'allantoicase de
la plante est certainement suffisante, d'autant plus qu'une grànde partie
des uréides ,est
hydrolysée dans les gousses.
C- Dégradation des uréides dans les gousses
Nous avons montré précédemment qu'il y a une accumulation
1
des uréides dans la gousse et notamment dans les cosses (ZENGBE et al.,
1982). Malgré une très forte hydrolyse de 1'allantoine déjà dans les nodosités
et la présence d'allantoinase et dlallantoicase dans les tiges et les
feuilles, une proportion importante d'uréides est transférée dans les gousses,
probablement par le biais du phloème. Cette concentration de ces composés,
très forte au début de la formation des graines, diminue cependant très
rapidement (fig. 13, chap. 1).
L'accumulation des uréides dans les gousses a également été
observé par MATSUMOTO et al.~ (1977 b) ; THOMAS et SCHRADER (1981 a), et
SERRES (1983). La présence de l 'allantoinase a été mise en évidence dans
les gousses de Vigna (HERRIDGE et aZ.~ 1978) et de Soja (THOMAS et al.~
1980 a; THOMAS et SCHRADER, 1981 a). Cependant il y a très peu de données
bibliographiques sur le métaboljsme de l lacide allantoique dans les parties

---

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---

- 80 -
1
aériennes du Soja (TAJIMA et YAMAMOTO, 1975 ; TAJIMA et al.
1977 ; ZENGBE
3
et SALSAC, 1983). Aucune de ces données ne fait mention de 11 hydrolyse de
l'acide allantoïque dans les gousses. Les uréides accumulés principalement
dans les cosses de la gousse à la maturation des grianes sont également
constitués en grande partie d1 acide allantoïque, comme dans les autres
organes. L'hydrolyse de cet acide nécessite donc l'intervention de l'allan-
toïcase. Le but de cette partie de notre travail est de préciser le rôle
de chaque constituant de la gousse (cosse et graine) dans 1'hydrolyse de
1lallantoïne et 1lacide allantoïque dans cet organe. Nous avons donc procédé
à la mesure des activités allantoïnase et allantoïcase dans la cosse et la
graine à différents stades du développement. Les résultats de ces investiga-
ème
tions sont consignés dans le tableau VIII. Au 84
jour, lorsque le remplis-
sage des gousses commence à peine, l'accumulation des uréides dans ces
organes est déjà maximale. La cosse contient alors près de 4 mg d'uréides
par gramme de matière fraîche contre 0,2 mg pour la graine. Cependant, les
activités allantoïnase et allantoicase sont environ deux fois plus élevées
dans la graine à ce stade. Au 91ème jour, les activités allantoïnases dans
la cosse et la graine n'ont pas varié et sont toujours
dans le même rapport,
mais celles de 1'allantoïcase dans ces deux parties ont déjà diminué et se
ème
trouvent à un niveau presque identique. Au dernier prélèvement, 111
jour,
1lactivité allantoïnase a baissé de 47 % dans la graine et seulement de
27 % dans la cosse. L'activité allantoïcase dans les deux parties a également
de nouveau baissé, par rapport à 1lactivité lors du premier prélèvement
ème
(84
jour). Dans llensemble, la diminution des activités de ces deux enzy-
mes est toujours plus importante dans la graine. Ces résultats montrent
néanmoins que 1'hydrolyse des uréides de la gousse est réalisée en grande
partie dans la graine. Celle-ci contient les plus fortes activités allantoïna-
se et allantoïcase au moment où nous décelons une accumulation maximale
des uréides dans la gousse alors qu'elle ne renferme qu'une proportion
très infime de ces substances. Il est donc fort probable, comme le suggèrent
ces résultats, qui une fraction importante d'uréides sous forme d'allantoïne
et diacide allanto'que soit transférée et hydrolysée dans la graine.

---

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Jours apres semis
Figure 30-
Evo ~u tion de ~'acti vi té a ~ Z-an tofcase clans ~a tige ( 6
)
et ~es feuil~es ( •
) de Soja.
L'activité ca~cu~éc
SUI'
~a base du coefficient d' eJ:tinction mo~aire de
1~ 7· 104. ;.;:-1. cm-1 est exprimée en 0'Zyox)dat"e de phényZ.-
hydI'azone formé.

---

- 82 -
Tableau VIII
Activités allantoinase et allantoicase dans la gousse de
Soja. Les plantes de Soja de la variété Hodgson ont été
cultivées dans des pots de sable en serre et nlont reçu
que la solution nutritive sans azote.
Age des
Allantoinase
All ant~icase
plantes
(nmol.min-1.g- 1 MF)
(nmol.min- ,9-1 MF)
Cosse
Gral ne
Cosse
Graine
(jours)
84
354,0 :t 92,5
628,5 :t 48,8
10,7 :t 2,8
20,3 :t 1,2
91
322,3 :t 25,0
627,4 :t 36,6
9,0 :t 3,0
13,2 :t 1,5
104
348,0 :t 90,0
341,0 + 67,0
2,5 + 0,6
1,7 :t 0,3
-
111
258,0 + 63,0
332,0 :t 45,0
2,9 + 0,9
2,7 + 0,2
-
-
-
IV - Conclusion
L'incorporation de la glutamine dans le noyau purique au
niveau des nodosités est concrétisée par la présence de la PRPP synthétase
dans ces organes où les fortes activités XDH et uri case confirment la
transformation des purines en uréides. Dans ces nodosités, la dégradation
des purines serait réalisée essentiellement dans la fraction soluble. La XDH
nia pas été détectée dans les bactéroides qui contiennent néanmoins de très
faibles activités uricase et allantoinase. La XDH n'a été détectée que dans
les nodosités, l'uricase et 1'allantoinase dans tous les organes du Soja
et l'allantoicase exclusivement dans les organes aériens. De toutes les en-
zymes de la dégradation
des bases puriques, observées dans les nodosités,
1'uricase présente la plus forte activité. L'allantoine est en partie dégradée
dans les nodosités qui contiennent une forte activité allantoïnase. Mais la
dégradation de l'acide allantoique n'est possible que dans les parties aérien-
nes. De la tige et des feuilles, ces dernières participent plus intensément
à 1'hydrolyse de l'acide allantoique, d'abord à cause de leur plus forte
activité allantoïcase et ensuite en raison de leur masse de matière fraîche
plus importante. Malgré les activités allantoinase et allantoicase de la
tige et des feuilles, 1'hydrolyse des uréides se poursuit dans la gousse dont
les deux parties, cosse et graine, contiennent ces enzyme~. Cependant, le
métabolisme des uréides dans la gousse se produirait principalement dans la
grai ne.

---

- 83 -
CHAP ITRE III
INFLUENCE DES FACTEURS DU MILIEU SUR LA SYNTHESE DES UREIDES CHEZ LE SOJA.
l - EFFET DE L'OBSCURITE SUR LA SYNTHESE ET LA DEGRADATION
DES UREIDES
A - Effet de l'obscurité sur l'activité nitrogénase et les
teneurs en uréides de la plante
1 - Activité nitrogénase et sucres totaux des nodosités
2 - Teneurs en uréides.
a. Concentration de la sève
b. Accumulation des uréides dans la tige et les
feui 11 es
B - Effet de l'obscurité sur les enzymes du métabolisme
des uréides
1 - XDH, uricase et allantoinase de la nodosité
2 - Allantoinase et allantoicase de la tige et des
feuilles
-
+
II - EFFET DES IONS N0 3 ET NH4 SUR LA SYNTHESE ET)~A DEGRADATION
DES UREIDES
-
+
A - Effet de N0 3 et NH4 sur la nodulatjon, le développe-
ment et l'activité fixatrice des plantes
-
+
B - Effet de N0
et NH
sur les concentrations des
3
4
différents constituants azotés de la plante
1 - Azote uréidique de la sève
2 - Azote aminé et azote nitrique de la sève
3 - Teneurs en uréides des organes du Soja
4 - Evolution des proportions de l'azote uréidique
et l'azote aminé par rapport à l'azote total de
l a sève
-
+
C - Effet de N0
et NH
3
4 sur les activités des enzymes
de la déqradation des purines dans les nodosités
II l - CONCLUS ION

---

- 84 -
CHAP ITRE III
INFLUENCE DES FACTEURS DU MILIEU SUR LA SYNTHESE DES URE IDES CHEZ LE SOJA
La fixation de l'azote moléculaire par les légumineuses
suppose l'installation des nodosités et le bon fonctionnement de la nitro-
génase.
Ce fonctionnement a des exigences énergétiques élevées gene-
ralement satisfaites par l'approvisionnement des nodosités en photosynthétats.
La photosynthèse étant sous la dépendance de l'intensité lumineuse, celle-
ci peut donc constituer un facteur limitant puisque la fixation et la
photosynthèse sont étroi tement corrélées (BETLENFALVAY et PHILLIPS, 1977 ;
JATIMLIANSKY .fffàJ'._~~ 1982). L'effet de cette i ntens i té l umi neuse sur l' ac-
tivité fixatrice est très variable suivant les légumineuses. L'obscurité
inhibe complètement l'activité fixatrice de Pisum sativum après une soixan-
taine d'heures; ce temps est de 5 jours pour Lupinus angustifoZius (GERSON
et al ... 1978). Chez le Soja de 25 jours, une seule journée à l'obscurité
suffit pour réduire l'activité nitrogénase de 50 % et les concentr!tions
en ATP et en saccharose des nodosités de 70 et 60 % respectivement
(CHING et al. .. 1975).
Dans la nutrition azotée des légumineuses, l'azote d'origine
symbiotique ne peut suffire à lui seul à couvrir les besoins de ces plantes
(RIGAUD, 1975). Dans la pratique culturale, une dose "starter" d'azote
minéral, généralement apportée au semis, est indispensable. D'ailleurs,
l'apport de N0 - ou NH
3
4+, à de faibles doses à la culture de légumineuses
est bénéfique. Dans ces conditions, le N0 - favorise le développement des
3
racines et stimule la nodulation (THIBODEAU et JAWORSKI, 1975) et le NH +
4
améliore la photosynthèse et par conséquent la fixation (BETLENFALVAY et
al ... 1978). Cependant, il est bien connu qu'à des concentrations plus éle-
vées, ces ions exercent une action inhibitrice sur la formation des nedosités
et leur activité fixatrice (RIGAUD, 1976 ; GIBSON et PAGAN, 1977 ; MANHART
et WONG, 1980 ; STREETER, 1982). Le mécanisme d'inhibition de la nitrogénase
par le N0 3- peut s'expliquer vraisemblablement par la formation d'un complexe
stable entre la leghémoglobine et le N0 - provenant de la réduction du
2
nitrate (RIGAUD et PUPPO, 1977) ou par l'action directe d~ cet ion sur l'en-
zyme elle-même (TRINCHANT et RIGAUD, 1980). La première des deux explica-
tions suppose obligatoirement l'existence d'une nitrate réductase dans les

---

- 85 -
nodosités de tous les systèmes symbiotiques sensibles au nitrate.
La synthèse des uréides dans les nodosités est étroitement
liée à l 'activité nitrogénase puisque llazote d10rigine symbiotique est
utilisée par la plante pour la formation de ces molécules. Il faut donc
s'attendre pour une association Rhizobium-légumineuse donnée t à ce que les
facteurs du milieu aient les mêmes effets sur l'activité fixatrice de la plan-
te et sur sa capacité à transporter l'azote sous forme d'uréides
puisque
t
la formation de ces derniers suppose au préalable l'incorporation de l'azote
fixé dans les molécules de purines.
Parmi ces facteurs
nous avons retenu llobscurité et la
t
nutrition nitrique et ammoniacale: la lumière conditionne la synthèse des
hydrates de carbone dans les feuilles et leur fourniture aux nodosités
les ions N0 - et NH + ont une action directe sur l'activité nitrogénase.
3
4
Pour l'étude de ces deux facteurs que nous considérons
comme majeurs pour le fonctionnement de la nitrogénase et la synthèse des
uréides t les autres conditions indispensables à la culture du Soja et notam-
ment les conditions nutritionnelles
étaient remplies. Les plantes à uréides
sont généralement d'origine tropicale. L'abondance des uréides par rapport
à d'autres composés azotés dans la sève xylémique de ces plantes .est cer-
tainement liée à cette origine. L'étude de l'effet de la température sur la
formation des uréides aurait donc pu fournir d'autres éléments indispensables
à la compréhension du mécanisme de leur synthèse. Mais une telle étude n'a
pas été possible dans nos conditions de travail.
1 - Effet de l 'obscurité sur la synthèse et la dégradation
des uréides
Les plantes utilisées tout au long de ce travail ont été
généralement cultivées en serre
en plein champ ou dans des bacs de terre
t
en plein air. Une légère modification de ces conditions de culture a donc
été nécessaire pour cette étude.
Des plantes de Soja Hodgson inoculées avec la souche effi-
ciente G3t d1abord cultivées en serre t sont transférées dans une chambre
climatisée où les conditions étaient les suivantes: jour de 14 heures à
25°( et 20.000 lux et nuit de 10 heures à 18°(. L'hygrométrie se situait
autour de 75 %. Les premiers prélèvements ont été effectués 20 heures après
le transfert des plantes et correspondent au jour O. Une partie des plantes

---

- 86 -
a été alors immédiatement mise à l'obscurité. Des prélèvements ont été effec-
tués tous les jours à la même heure pendant quatre jours au cours desquels
le~ deux groupes de plantes ont reçu alternativement de la solution nutri-
tive et de l'eau distillée. Les résultats exposés ci-après sont les moyennes
des résultats de deux expériences comportant chacune trois répétitions.
A - Effet de l'obscurité sur l'activité nitrogénase
et les teneurs en uréides de la plante
1 - Activité nitrogénase et sucres totaux des
nodosités
La teneur en hydrates de carbone totaux des nodosités des
plantes maintenues à la lumière augmente significativement dès le premier
jour; mais pendant les trois derniers jours, son augmentation est beaucoup
plus lente (fig. 31 F). Chez les plantes mises à l'obscurité, la teneur
de ces composés ne varie pas jusqu'au 3ème jour de traitement où elle diminue
très légèrement par rapport à la concentration initiale dont elle représente
encore près de 75 %. Après 4 jours les nodosités de ces plantes contiennent
encore environ 3 mg de sucres totaux par gra~ne de matière fraîche.
Cependant, l'effet de l'obscurité sur l'activité fixatrice
de ces mêmes nodosités est très nette. Un jour après le début du traitement,
le taux de réduction de l'acétylène n'est plus que de 50 % de la valeur ini-
tiale ; ce taux diminue ensuite régulièrement pour atteindre une valeur mini-
male de l 'ordre de 1 200 nmol.h- 1.pl-l au 4ème jour (fig. 31 A). Cette dimi-
nution de l'activité fixatrice par manque de lumière est semblable à celle
obtenue par CHING et aZ.~ (1975) pour la variété de Soja Chippewa de 25 jours.
Dans le cas des plantes laissées à la lumière, cette activité a doubl~ au
ème
4
jour. Chez ces plantes, la phase de la fixation intense s'est donc
poursuivie malgré leur transfert .dans des conditions légèrement différentes
de celles où elles ont été cultivées au préalable.
Au cours de ce traitement, l'activité nitrogénase des plantes
à la lumière évolue d'une manière parfaitement semblable à l'augmentation
de la teneur en sucres totaux dans les nodosités de ces plantes (fig. 31 A et
F). Par contre, chez les plantes mises à l'obscurité, ces deux paramètres
ne semblent pas être affectés de la même manière par l ·obscurité. Après un
jour à l'obscurité, la diminution de l'activité nitrogénase est de 50 %,
alors que la concentration des sucres totaux dans les nodosités n'a subi

---

- 87 -
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les teneu~s en N-1.Lréides de la sève (B C), de la tige (D),
J
c:es feuil:es (è) et sur la ten.eur' en. hyd.:!'ates de carbone des n.odosités (F,
Des plan~es de 38 jov~s cultivées en serre ont été tr.xr.sférées dans une
chambre climatisée 0,( une ?CU'tie de ce iles-ci a été mise à Z. 1obscuri té.
:"es résul':;c:;s sor:t les m.oyqnnes de CÙ3'.,~· ~'ü-2riences cO.'7'rportaY!t chaC7,me
~rois ~éD4~itions.

---

; .
- 88 -
aucune modification notabJe. Au dernier jour de traitement, l'activité
nitrogénase a baissé de 75 %, mais la diminution de la teneur en hydrates
de carbone des nodosités ne représente que 39 %. Il est bien vrai que ces
pourcentages ne représentent que les valeurs initiales de ces deux para-
mètres. Mais, même par rapport aux plantes-témoins maintenues a la lumière,
l'effet de l'obscurité n'est pas identique sur les deux paramètres. Après
4 jours à l'obscurité, l'activité nitrogénase est de 14 % de celle des
plantes-témoins, mais les sucres totaux représentent encore près de 36 %
au même stade du traitement (fig. 31 A et F). L'inhibition de l'activité
nitrogénase par l'obscurité ne semble donc pas être en liaison directe, dans
ce cas, avec la quantité d'hydrates de carbone présente dans les nodosités.
Il ne s'agit pas évidemment de remettre en cause le lien entre l'assimilation
de N et la fourniture de substrats carbonés, lien déjà bien établi ; mais on
2
peut se demander si cette forte diminution de l'activité nitrogénase obser-
vée ici ne peut pas être attribuée davantage a la nature de ces substrats
et a leur disponibilité a l'intérieur même des bactéroides. Dans cette ex-
périence, les sucres totaux ont été dosés uniquement dans la fraction so-
luble des nodosités (surnageant 30.000 g). Leur concentration ne varie pas
beaucoup sous l'influence de l'obscurité. L'évolution de l'activité nitro-
génase est certainement plus fonction de la concentration des sucres dans
les bactéroïdes que de celle de ces composés dans la fraction soluble qui
est d'origine uniquement végétale.
A la lumière, l'activité nitrogénase a augmenté de 80 % a la
fin du traitement. Parallèlement, la concentration des hydrates de carbone
dans les nodosités a augmenté de 72 %. Tout se passe donc comme si un seuil
minimum de la concentration des substrats carbonés était nécessaire dans
les nodosités pour permettre la réduction de l'azote par les bactéroïdes.
2 - Teneurs en uréides
L'effet de l'obscurité sur les teneurs en uréides se manifeste
différemment selon qu'il s'agit de la concentration de ces substances dans la
sève ou de leur accumulation dans les organes.
a. Concentration de la sève
L'obscurité abaisse considérablement le taux d'uréides de
la sève. L'inhibition de l'activité nitrogénase observée précédemment, par
manque de fourniture de substrats carbonés aux nodosités,·s'est donc réper-
cutée directement sur la synthèse des uréides. Chez les plantes a l 'obscu-

---

- 89 -
rité, la concentration diminue parallèlement â la diminution de l'activité
nitrogénase (fig. 31 B). Les quantités transportées par heure et par plante
diminuent également en fonction de la durée du traitement (fig. 31 C), mais
beaucoup plus fortement que la concentration puisque l'obscurité provoque
aussi une diminution du flux de sève qui est approximativement trois fois
plus faible que celui des plantes-témoins. Après 4 jours â l'obscurité, la
concentration des uréides dans la sève représente environ 16 %de la con-
tration initiale et 22 %de celle de la sève des témoins (fig. 31 B). Dans
le cas des quantités transportées par heure et par plante, ces pourcentages
sont de 5 %et 7 % (fig. 31 C). Chez les plantes-témoins, le transfert dans
la chambre climatisée n'a pas affecté. l'activité fixatrice qui s'est au
contraire accrue (fig. 31 A). Par cont~e, le taux d'uréides dans la sève
de ces plantes a légèrement baissé tant au niveau de la concentration qu'au
niveau des quantités transportées. Cette diminution qui ne peut s'expliquer
que par le changement des conditions de culture et notamment de la tempéra-
ture puisque la production d'uréides est généralement croissante â cette
période, se situe autour de 30 % pour le premier cas et de 24 % pour le
second. L'effet de l'obscurité sur les activités nitrogénase et de synthèse
des uréides est surtout intense durant le premier jour de traitement. Ces
deux mécanismes sont réduits d'environ 50 %après un jour d'exposition des
plantes â l'obscurité. Ces résultats confirment une fois de plus que l'azote
réduit d'origine symbiotique, dans les nodosités de Soja ,conduit â la bio-
synthèse des purines et des uréides.
b. Accumulation des uréides dans la tige et
les feuilles
Les figures 31 D et E montrent l'évolution des teneurs en
uréides de la tige et des feuilles de Soja de 38 jours â l'obscurité et â
la lumière. Alors que la mise des plantes â l'obscurité fait baisser considé-
rablement la concentration de ces substances dans la sève, leurs quantités
dans la tige et les feuilles augmentent. Dans la tige des plantes a l'obscu-
rité les teneurs en uréides sont légèrement supérieures â celles observées
chez les plantes-témoins pendant les deux premiers jours ; mais les va-
leurs relatives aux deux groupes de plantes sont très voisines et augmentent
au cours de cette période (fig. 31 0). Dans les feuilles, l'accumulation
des uréides est fortement stimulée par l'obscurité (fig. 31 E). La quantité
d'uréides dans ces organes a doublé
â la fin de la période de traitement
au moment où la fixation et la synthèse des uréides se trouvent â des niveaux
très bas.

---

- 90 -
L'accumulation des uréides dans les feuilles sous l'effet de
l'obscurité avait été constatée chez Phaseolus (MOTHES, 1961). Les feuilles
d'Acer negundo dépourvues de chlorophylle accumulent également de grandes
quantités d'uréides (ECHEVIN et al.~ 1940). Les uréides sont produits dans
les nodosités et s'accumulent généralement dans les parties aériennes de
la plante. L'augmentation de leurs teneurs dans ces organes sous l'influence
d'un facteur qui pourtant inhibe la fixation de l'azote et leur synthèse
dans les nodosités prouve que leur métabolisme dans les parties aériennes
n'est pas sous la dépendance des mêmes facteurs que leur synthèse. Il parait
donc tout à fait logique que les quantités de ces composés accumulées dans
les tiges et les feuilles ne puissent par servir d'indicateurs de l'activité
fixatrice de la plante. Ces quantités dépendent non seulement des besoins de
la plante, mais également des facteurs qui régulent le fonctionnement de
1 'allantoïnase et l 'allantoïcase qui catalysent leur dégradation.
S - Effet de l'obscurité
sur les enzymes du métabolisme
des uréides
Puisque la mise à l'obscurité des plantes inhibe l'activité
nitrogénase en raison du déficit carboné, on était en droit de suspecter
une inhibition concomitante de la synthèse des uréides par manque de molé-
cules de glutamine pour la biosytnhèse des purines. Les résultats que nous
avons exposés précédemment (paragraphe A de ce chapitre) ont permis de
vérifier ce lien entre la fixation symbiotique et le transport de l'azote
sous forme d'uréides. Quant au métabolisme de ces composés dans la plante,
rien ne permettait de prévoir un effet de l'obscurité, dans un sens ou dans
l'autre, sur le fonctionnement des enzymes qui catalysent ce mécanisme, c'est-
à-dire
la XDH, l'uricase, l 'allantoïnase et l'allantoïcase. HARTMANN et
GEISSLER (1973) avaient étudié l'influence de l'intensité lumineuse sur la
dégradation des purines chez Funaria hygrometrica L. et l'activité stimulante
de l'obscurité sur la XDH avait été observée dans les feuilles de Pharbitis
nil (NGUYEN, 1973 b ; 1980). HARTMANN et ARNOLD (1974) avaient également
indiqué un effet inhibiteur de 1'obscurité sur l'allantoïcase, effet qui
cesserait en présence d'ATP ou d'ATP et de glucose.
Chez le Soja, nous avons étudié l'influence de l'obscurité
sur les enzymes du métabolisme des uréides, mais en dissociant le mécanisme
de la formation de ces substances dans les nodosités de celui du métabolisme
proprement dit dans les organes aériens (tige et feuilles).

---

91 -
1 - XDH, uricase et allantoinase de la nodosité'
Les nodosités des plantes utilisées pour l'étude de l'effet de
l'obscurité sur l'activité nitrogénase et les teneurs en uréides ont été
récoltées en même temps que les autres échantillons. Il s'agissait donc éga-
lement de plantes de 38 jours. La figure 32 donne le résultat de cette étude
qui montre que ni la XDH, ni l 'uri case ne sont vraiment affectées par l 'obscu-
rité. Dans le cas de la XDH, l'activité des plantes A la lumière présente
des valeurs sensiblement supérieures pendant les deux premiers jours. Mais
sur toute la période de traitement, une différence significative entre les
deux groupes de plantes n'apparaît qu'aux 1er et 3ème jours (fig. 32 A)
pendant lesquels l'effet de l'obscurité se caractérise différemment: le
premier jour c'est l'activité XDH des plantes A la lumière qui est plus éle-
ème
vée ; au 3
jour, l'inverse se produit et l'obscurité semble plutôt stimu-
ler cette activité. Il parait donc difficile de donner une interprétation
précise, dans ce cas, A l'action de l'obscurité sur l'activité de cette
enzyme. Dans le cas d'une expérience de 24 heures, par exemple, on aurait
conclu facilement A une action inhibitrice de l'obscurité. Mais, malgré
l'augmentation passagère de l'activité des plantes A la lumière, celle
des plantes A l'obscurité n'est pas très différente, après un jour, de
l'activité de l'ensemble des plantes, 20 heures après leur transfert dans la
ème
chambre climatisée, mais avant la mise A l'obscurité. Au 3
jour, elle
atteint même une valeur 1,5 fois plus élevée que celle des plantes A la
lumière. Chez Pharbitis nil, NGUYEN (1973 b) a observé une augmentation de
l'activité XDH des feuilles après 20 heures d'obscurité. On peut donc penserque
la XDH des nOOosités
de Soja réagi t di fféremment de l'enzyme des feui 11 es
de Pharbitis nil, puisqu'après 4 jours A l'obscurité, nous n'avons pas obser-
vé une modification notable de l'activité de cette enzyme chez le Soja.
Quant A l'uricase, les deux lots de plantes utilisées au
cours de cette expérience ont un niveau d'activité semblable (fig. 32 B).
Cette activité augmente après le premier jour et tend A s'élever dans les
plantes A l'obscurité vers la fin de l'expérience. Cependant, sur l'ensem-
ble des 4 jours aucune différence significative n'a été observée entre les
valeurs du même prélèvement.
La sensibilité de l 'allantoinase A l'effet de l'obscurité
diffère de celle de la XDH et de l'uricase, bien que ces enzymes étudiées
ici soient toutes localisées dans les nodosités, c'est-A-dire généralement

---

- 92 -
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°
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1
2
3
4
Jours de traitement
Figv.:pe 32- Effet de Z' obscurité ( • ) et de .
la lwniè2'e ( '0 ) sur les acti vi tés
XDH (A)~ uricase (B) et allantofnase (C)
dans les nodosités de Soja de 38 jours
(moyennes de deux expériences de trois
répétitions chacune).

---

- 93 -
a l'obscurité dans les conditions normales de culture. Après le premier jour
pendant lequel les activités allantoînase des deux séries de plantes sont
semblables, celle des plantes a l'obscurité diminue pendant les deux jours
suivants, par rapport a l'activité de la série-témoin (fig. 32 C) qui
ème
diminue également au 4
jour.
2 - Allantoînase et allantoîcase de la tige et
des feuilles
L'étude de l'effet de l'obscurité sur la synthèse des uréides
concernait initialement les enzymes de la nodosité. Mais la forte accumula-
tion des uréides dans la tige et les feuilles des plantes mises a l'obscu-
rité (paragraphe I) nous a conduit a étudier l'effet de ce traitement sur
le fonctionnement dans ces organes, des enzymes directement impliquées dans
le métabolisme de ces composés au niveau de la partie aérienne de la plante.
Nous avons donc dû utiliser des lots de plantes d'une autre culture de
48 jours. Ces plantes ont été mises dans les mêmes conditions que précédem-
ment et les prélèvements effectués de la même manière. L'activité allantoî-
case a été mesurée par la technique colorimétrique décrite dans "MATERIEL
et TECHNIQUES". Pour les deux enzymes, les mesures ont été faites avant
la mise d'une partie des plantes a l'obscurité, ensuite les trois jours
-suivants pour l'allantoïnase et les 1er et 3ème jours de traitement pour
l'allantoîcase. Les tableaux IX et X indiquent l'action de l'obscurité sur
les activités allantoïnase et allantoïcase respectivement. Le fonctionnement
des deux enzymes est nettement perturbé par la mise des plantes a l'obscuri-
té. Dans la tige et les feuilles, les activités ne sont pas significative-
ment différentes et les taux d'inhibition pour les deux enzymes (de l'ordre de
40 a 50 %) sont très voisins dans les deux types d'organes.
L'accumulation des uréides dans la plante est généralement
considérée comme une conséquence directe d'un déficit carboné
(MOTHES,
1961). Dans ces expériences, les plantes étant soumises a l'effet de l'ob-
scurité, il y a obligatoirement interruption de l'approvisionnement des
nodosités- en hydrates de carbone et par conséquent diminution ou arrêt de
la fixation de l'azote. Le transport sous forme d'uréides est censé consom-
mer moins de carbone que les autres composés azotés utilisés a cet effet.
Mais l'azote est nécessaire pour la constitution des molécules d'uréides.
Le déficit carboné qui inhibe la fixation
de l'azote ne peut qu'affecter
toutes les formes de transport de l'azote dont évidemment les uréides. Au

---

- 94 -
cours de ces mesures, nous avons effectivement enregistré dans la sève du
Soja une forte diminution de la concentration en uréides, ainsi que les
quantités transportées par heure et par plante, parallèlement à la dimi-
nution de l'activité fixatrice sous l'influence de l'obscurité. Si une
augmentation de la teneur en uréides devait se produire à la suite de la
mise à l'obscurité, elle ne devrait se manifester que pendant les premières
heures à l'obscurité lorsque tout l'azote des nodosités n'est pas encore
épuisé. Nos premières mesures ont été effectuées 24 heures après la mise
à l'obscurité; elles ne pouvaient donc pas déceler une telle augmentation.
Une augmentation de la teneur en uréides pourrait se produire à l'obscurité,
mais pro~ablement en présence d'une source azotée exogène (NH + par exemple)
4
et pendant un temps limité. L'accumulation des uréides que nous observons
dans la tige et les feuilles au cours de ces expériences ne saurait donc
être attribuée au déficit carboné. La seule explication plausible de cette
augmentation des teneurs en uréides de la tige et surtout des feuilles ne
peut être que l'inhibition des enzymes du métabolisme uréidique, allantoï-
nase et allantoïcase dans ces organes. Il nous parait évident que la XDH
et l 'uri case essentiellement localisées dans les nodosités soient insensi-
bles à l'obscurité alors que l 'allantoïnase et l 'allantoïcase de la tige
et des feuilles sont affectées par un manque de lumière. Cependant, nous
avons observé une inhibition de l 'allantoïnase de la nodosité à partir du
deuxième jour à l'obscurité. Le fonctionnement de l 'allantoïnase et surtout
de l 'allantoïcase pourrait être stimulé par la lumière et donc par la pho-
tosynthèse. Nous avons observé que dans la tige qui est moins bien approvison-
née que les feuilles en produits de la photosynthèse, le taux d'inhibition
de ces deux enzymes par l'obscurité est beaucoup plus élevé. Selon HARTMANN
et ARNOLD (1974), l'addition de substrats énergétiques tels que l 'ATP ou
l'ATP et le glucose au milieu d'incubation rétablirait l'activité allantoï-
case inhibée par l'obscurité. Nous ignorons le lien entre le fonctionnement
de l 'allantoïnase et l'allantoïcase et la photosynthèse. Leur inhibition
par l'obscurité ne s'explique pas obligatoirement par un manque de substrats
énergétiques: la dégradation de l 'allantoïne et de l'acide allantoïque par
ces deux enzymes ne nécessite pas de tels substrats, pour l:e~r ~fonctionnernent
mais leur régulation dans les organes
par contre, peut dépendre de
l'éclairement.

---

- 95
Tableau:, IX
Effet de l'obscurité sur l'activité a11antoïnase de la tige
et des feuilles de Soja de 48 jours. Des plantes d'abord
cultivées en serre ont été transférées dans une chambre cli-
matisée (L, lumière et 0, obscurité).
Tige
Feui 11 es
Jours
L
°
L
0
°
436,0 + 14,0
362,7
+ 15,1
-
-
1
394,0 + 8,8
276,0 ~ 26,6
362,3~ 26,6
351,0 + 11,1
-
-
2
388,3 + 28,6
280,7 + 31,2
358,2 + 36,4
260,5 + 34,5
-
-
-
-
3
391,5 + 35,5
248,2 + 29,1
389,5 + 51,2
241,5 + 27,2
-
-
-
-
Tableau:;~ X
Effet de l'obscurité sur l'activité a11antoicase de la tige
et des feuilles de Soja de 48 jours (L, lumière et 0, obscurité).
Tige
Feui 11 es
Jours
L
°
L
°
°
15,9 + 2,7
17,1 + 3,1
-
-
1
16,8 ± 2,9
11,8 ± 0,6
18,6 ± 1,4
13,8 ~ 2,8
3
15,2 + 4,5
8,7 + 1,7
16, 2 ~ 2,0
10,1 ~ 0,7
-
-
II - Effet des ions N0 - et NH + sur la synthèse des uréides
3
4
chez le Soja
La production d'uréides est sous la dépendance des condi-
tions de nutrition azotée: l'apport de nitrate la déprime généralement
et réduit l'accumulation de ces composés dans la plante, vraisemblablement
à cause de l'inhibition de la nitrogénase (MATSUMOTO et al., 1977 c).

---

- 96 -
EXPERIENCE A Une seule dose d1azote est apportée dès le début de la
culture.
omM
_______ N0 -
3
[
J
3,6 mM
SOJA HODGSON
inoculé avec G
'
3
~
OmM (NO)
NH +
4
[ 3,6 mM (N )
50
EXPERIENCE B L'azote est apporté a partir du 42ème jour de culture
(pendant 3 jours)
0 mM
1
-
2,5 -
N0
~ 3
5
7,5 -
SOJA HOOGSON ]
10
nodulé par G3 ~
0 mM
1
2,5 -
NH +
4
5
7,5 -
10
La mesure de l'activité nitrogénase et les prélèvements
d'échantillons ont été effectués 45 jours après le semis dans les
expériences A et B

---

- 97 -
Pourtant, le NH + provenant de la réduction du N0
4
3- pourrait participer à
la synthèse des uréides puisque la nitrate réductase est présente dans les
bactéroïdes (KENNEDY et aZ.~ 1975) et dans les racines (RADIN, 1978 ; CRAFTS-
rr~t'nNER et HARPER,19D~).Les racines de Soja peuvent en effet produire de
faibles quantités d'uréides à partir du N0i
(OHYAMA et KUMAZAWA, 1979 ;
OHYAMA et aZ.~ 1981). THOMAS et aZ. (1980 b) ont obtenu une production de
fortes quantités d'uréides chez le Haricot non nodulé, mais alimenté avec
une solution nutritive contenant de l'ammonium. FUJIHARA et YAMAGUCHI (1981)
ont observé la synthèse de l'acide allantoïque à partir de 15 NH3 par la
fraction soluble des nodosités de Soja. Enfin FUJIHARA et aZ.~
(1977) ont
observé une augmentation de la teneur en uréides des feuilles de Soja ayant re-
çu une nutrition ammonja~ale_ alors qu'au cours de cette même expérience,
l'ammonium inhibe fortement l'activité nitrogénase. Toutes ces observations
suggèrent que les conditions de production des uréides par les légumineuses
sont très diverses. Il est donc possible que le NH + exogène ou le NH + pro-
4
4
venant de la réduction du NO~
par les organes souterrains soient également
utilisés par la plante pour la synthèse des uréides. L'utilisation du NH +
4
ou du N0 - dans la solution nutritive du Soja peut par conséquent permettre
3
de constater leur effet sur la formation des uréides et leur participation
à la synthèse de ces composés. Les résultats de cette étude ont été obtenus
au cours de deux expériences A et B sur le Soja Hodgson. Les protocoles de
ces expériences sont donnés par le schéma ci-contre. Au cours de l'expé-
rience A, des plantes inoculées avec la souche G et disposées
3
à la serre sont
réparties en deux groupes. Un groupe reçoit une solution nutritive sans
azote et l'autre groupe la même solution nutritive contenant 50 mg d'azote
sous forme de KN0 3 ou NH4Cl dès la germination. Au cours de l'expérience B,
les plantes sont préparées de la même manière que précédemment, mais elles
reçoivent de la solution nutritive sans azote jusqu'au 42ème jour à partir
duquel les groupes sont constitués. Cinq doses d'azote ( 1 - 2,5 - 5 - 7,5
et la mM) sont alors apportées dans la solution nutritive pendant trois
jours. Les échantillons de sève et d'organes sont prélevés au 45ème jour
dans les deux expériences. L'activité nitrogénase a été mesurée au moment
des prélèvements. Dans l'expérience A, l'apport dès le début de la culture
permet d'observer l'effet de l'azote minéral sur la nodulation et le dévelop-
pement des plantes. Dans ll expérience B, par contre, l'azote est apporté
ème
au 42
jour lorsque la nodulation est déjà installée.

---

- 98 -
A - Effet de NOj et NH + sur la nodulation, le dévelop-
4
pement et l'activité fixatrice des plantes
Dans l'expérience B, 1 lazote apporté seulement après 42 jours
et pendant trois jours nia eu aucun effet sur la nodulation. Le nombre et
la masse des nodosités par plante nlont donc pas été modifiés par l'apport
d1azote minéral, même à la concentration de 10 mM. De même, le développe-
ment des plantes n'a subi aucune influence de l'apport très bref d1azote.
Dans l'expérience A, par contre, ce développement est affecté par 3,6 mM
d'azote apportées aux plantes dès le début de la culture. Les ions N0
et
3
NH + augmentent très fortement les poids
de matière sèche des plantes pour-
4
tant associées à une souche fixatrice (tabl. XI). Ce résultat montre que
l'azote fixé n'a pas été suffisant pour assurer le plein développement des
plantes. L'influence de ces composés n'a pas été très concluante sur la no-
dulation. Le N0 - est généralement connu pour inhiber la nodulation. En
3
présence de 50 mg d1azote nitrique, nous n'avons pas observé d'effet dépres-
sif sur la nodulation. Le nombre de nodosités par plante passe au contraire
de 26,0:: 3,1 pour la plante-témoin à 36,0 ~ 4,3. Avec l'ion NH4+, une légère
diminution du nombre de nodosités a été observée chez les plantes ayant reçu
la nutrition a~~oniacale(tabl. XI). Les poids de matière sèche des nodosités
+
-
n'ont guère varié par suite de l'apport de NH4 ou de N03 . Dans une étude
semblable sur l'influence du nitrate, STREETER (1982) n'observe un effet si-
gnificatif de cette forme de nutrition azotée sur la nodulation, qu'à une
concentration d'azote nitrique deux fois supérieure à celle que nous avons
util i sée.
Bien que les concentrations de 50 mg N.l- 1 ne modifient pas
de façon notable la masse des nodosités, elles diminuent très fortement
l'activité fixatrice. Dans l'expérience A, cette activité est réduite de
57,4 % en présence de'N0 - et de 62,8 %en présence de NH + (tabl. XI).
3
4
Dans 1 lexpérience B où plusieurs doses de ces composés ont été utilisés,
cette réduction augmente proportionnellement à la dose d1azote minéral
(fig. 33 A). Pour la plus forte concentration, 10 mM, ces taux d'inhibition
.
-
+
sont respectlvement de 86,5 % et 69,3 % pour le N0
et le NH
Malgré un
3
4
apport tardif d'azote dans la deuxième expérience et pendant un temps
relativement court l'effet de la nutrition azotée sur l'activité nitrogénase
est presque;se~blable dans les deux expériences, pour les mêmes doses d'azote
nitrique ou ammoniacal ; cependant dans la deuxième expérience, contrairement
à la première, l'effet du N0 - est plus prononcé que celui de NH + pour toutes
3
4
les concentrations des deux ions.

---

-99 -
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o
2
4
6
8
10
o
2
4
6
8
10
N03 ou NH4 (mM)
Figure 33- Influence de différentes doses de NOi
(
0
)
et NHt:.+
( •
) sur l'activité
nitrogénase (A)~ les concentrations en uréides (R)~ -le f1L~ de sève (C) et
les quantités d'uréides (D). Des pUxntes de Sqja nodulées par la souche G3
et cultivées en serre Ont reçu à partir du 42 eme jov..r~ dif.;~érentes doses
d'azote combiné sous forme de KNO
ou de NH Cl. Les r.1eSW."es sont effectuées
Z
4
après 3 jours de traitements (experience B);

---

- 100 -
Tableau XI
Influence de l'azote minéra~ sur llactivité fixatrice et les
paramètres liés au développement du Soja. KN0 3 et NH4Cl sont
apportés à raison de 50 mgN.l- 1 de solution nutritive dès le
début de la culture du Soja Hogdson inoculé avec G . Les mesures
3
ont été effectuées 45 jours après le semis (expérience A).
Paramètres
NO -
NH +
3
4
NO
N50
NO
N50
-1
-1
C H (nmol.h
.pl
)
4044
1724
2001
745
2 4
Nombre de nodosités(.pl-1)
26
36
42
31
MS de nodosités (mg.pl-1)
138
133
117
127
MS de plantes (mg.pl-1)
1789
2949
418
2450
-
+
B - Effet de N0 3 ~NH4 sur les teneurs des différents
constituants azotés de la plante
Il a été rapporté par plusieurs auteurs (Mc CLURE et ISRAEL,
1979 ; ISRAEL et Mc CLURE, 1980) que l'apport d'azote exogène fait baisser
le taux d'uréides au profit des autres ,composés azotés dont l'asparagine
notamment. Dans cette étude, en plus des uréides, certains de ces composés
dont les concentrations sont suceptibles de varier sous l'influence d'une
source exogène d'azote ont également été dosés dans la sève. Il s'agit
essentiellement d'acides aminés et du nitrate. Les amides n'ont pas été dosées
spécialement et les acides aminés estimés ici comprennent aussi bien les
acides aminés libres que les composés apparentés.
1 - Azote uréidique de la sève
La diminution de l'activité nitrogénase observée précédemment
par l'apport de N0 - ou NH
3
4+ aux plantes est accompagnée d'une diminution
dans la sève de celles-ci, des concentrations en uréides totaux (fig. 33 B,
tabl. XIII et XIV). Dans l'expérience A, les taux de diminution de l'activité
fixatrice et de la production des uréides dans la sève sont semblables en
présence de N0 -. Lorsque l'azote exogène est sous forme de NH
3
+, l'inhibition
4
de la synthèse des uréides est plus faible que celle de la nitrogénase
(tab 1. XII) .

---

- 101 -
.
•
.
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1
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1
3
5
1
3
5
C2 H4 (umol.h-1.PI-1)
tlJ
t
t1
-
..Il ..... U'I
~
e -
Cùw
~
U'I
NO§ (mM)
NH 4(mM )
Figure 34-
Relation entre les concentrations en uréides de la sève et l'activité nitrogé-
nase du Soja de 45 jours en présence de doses croissantes de NO;
(A) ou
de NH + (B). L'azote a été apporté comme décrit à la figure 33
(expérience B).
4
Les équations des droites A et B sont respectivement: Y
=118~9x -2~8
A
(r =O~97) et YB = 81~9 x + 113~6 (r =O~88).
A
B

---

- 102 -
Tableau XII
Taux d'inhibition de l'activité nitrogénase et de la production
des uréides par le N0 - et le NH + chez le Soja nodulé par la
3
4
souche G . Dans l'expérience A, 3,6 mM de N-N0 - ou N-NH +
3
3
4
ont été apportées dès le début de la culture. Dans l'expérien-
ce B, le taux d1inhibition est dû à 10 mM de ces composés
ème
apportées à partir du 42
jour pendant 3 jours. Dans les
ème
deux expériences les mesures ont été faites au 45
jour.
L'activité nitrogénase et N-uréides sont respectivement en
-1
-1
-1
~mo l . h
. pl
et IJ g. ml.
N0
NH +
3
4
Mécanismes
A
B
A
B
Nitrogénase
57,4
86,5
62,8
69,3
Uréides
57,5
75,1
46,5
60,5
Dans l'expérience B, la forte concentration de l'azote miné-
ral explique les plus forts taux d'inhibition des deux mécanismes (tabl. XII).
Mais pour les deux composés azotés utilisés, l'inhibition de la synthèse des
uréides est généralement moins prononcée que celle de la nitrogénase. En
présence de doses croissantes de N0
ou de NH
3
4+ l'azote uréidique de la
sève diminue progressivement, en même temps que l'activité réductrice de
l'acétylène (fig. 33 A et B). Il résulte donc de cette diminution simultanée
de l'activité nitrogénase et des concentrations en uréides de la sève,
une bonne corrélation entre les deux phénomènes (fig. 34 A et B). La figu-
re 34 montre nettement aussi que les effets des doses 5 - 7,5 et 10 mM
aussi bien sur la fixation biologique que sur la formation des uréides
sont,semblable~ pour chacun des deux composés. Dans chaque cas, en effet,
la comparaison des valeurs moyennes correspondant à ces doses prouve que
ces effets ne sont significativement différents, ni sur l'activité fixa-
trice, ni sur les concentrations en uréides de la sève. Dans le cas de
NH4+, en outre, les valeurs de l'activité nitrogénase pour les doses
o et 1 mM ne sont pas non plus significativement différentes. Cette dernière
concentration stimule même légèrement par rapport aux plantes-témoins,
l'activité nitrogénase (fig. 33 A), conformément à l 'hypothèse d'un effet
bénéfique des faibles doses des ions N0 - et NH + sur cette activité
3
4
(THIBODEAU et JAWORSKI, 1975 ; BETLENFALVAY et QL~ 1978)'.

---

- 103 -
Tableau XIII
Effet de N-N0
sur les concentrations des composés azotés de
3
la sève des plantes de Soja de 45 jours. Une dose de 3,6 mM
d'azote a éte apportée dans la solution nutritive dès le dé-
but de la culture (expérience A).
concentrations
Taux d'exportation
-1
-1
-1
(~g.ml
)
(~g.h
.pl
)
+
+
N-u réi des
484,3 ~ 17,6
206,0 - 20,1
62,4 +
- 12,2
22,7 - 12,1
+
N aminé
58, 1 ~
+
12,2
33,5 - 7 ,4
7 ,6 +- 1,6
4,0 - 0,9
N- NO-
+
3,7 ~ 0,5
15,9 - 2,7
0,5 +
- 0,1
1,6 +
- 0,23
3

---

- 104 -
TABLEAU XIV
+
Effet de N-NH
sur les concentrations des composés azotés
4
dans la sève de Soja de 45 jours. L'azote nitrique n'a pas
+
été détecté dans la sève des plantes en présence de NH
.
4
(Expérience A)
Concentrations
Taux dlexportation
(~g.ml-l)
,
(~g.h-1 pl-1)
N-uréides
380,0 + 17,9
203,2 ~ 2,1
48,1 + 18,1
44,9 ~ 9,9
N-aminé
16,0 + 2,5
69,6 ~11,3
1,9 + 0,3
15,0 ~ 0,7
N-N03
Dans l'utilisation par la plante de l'azote fixé, il importe
de prendre davantage en compte les quantités de cet élément transférées
vers les parties aériennes. La fixation biologique, elle-même, est généralement
exprimée en quantité de C H ou de N réduite par plante et par heure. Quel-
2 2
2
le que soit la nature des composés utilisés par la plante pour le transport
de l'azote, les quantités qui quittent les nodosités et les racines dépendent
de deux facteurs: le flux de sève qui transite par le xylème et la concentra-
tion en azote de cette sève. Les fluctuations de ces deux facteurs détermine-
ront donc les quantités d'azote dont pourra disposer la plante. Dans le mé-
tabolisme de l'azote fixé sous forme d'uréides, la nutrition nitrique ou am-
moniacale inhibe très fortement la fixation biologique et par conséquent,
la formation des uréides. La concentration de ces derniers dans la sève sien
trouve donc fortement réduite. Mais cette diminution de la concentration
des uréides en cas d'apport d'azote exogène est compensée par une augmenta-
tion du flux de sève (fig. 33 C). Les quantités d'uréides transportées par
heure et par plante et qui découlent de la concentration et du volume de
sève diminuent donc moins que la concentration, selon la forme d'azote exo-
gène apporté. Au cours de l'expérience B, dans les séries de plantes ayant
reçu différentes doses de N0
l'augmentation du flux de sève est faible
3
(fig. 33 C), par comparaison à la forte inhibition de l 'activité nitrogénase
et de la formation des uréides. Dans ce cas, la compensation est nulle et
les quantités d'uréides transportées baissent (fig. 33 D)' parallèlement à
la diminution de la concentration de ces molécules dans la sève. Comme la

---

- 105 -
concentration, ces quantités restent alors inversement proportionnelles à la
dose d'azote nitrique, conformément aux résultats d'HERRIDGE (1982 a,b).
Par contre en présence de NH4~' les mêmes doses provoquent chez le Soja, une
augmentation très nette du flux de sève (fig. 33 C) et les quantités d'azote
transférées par plante et par heure dans ces conditions, vers les parties
aériennes, restent constantes (fig. 33 D), malgré la baisse de l'activité
nitrogénase et de la concentration des uréides dans la sève. On retrouve le
même résultat dans l'expérience A où une seule dose d'azote a été apportée
aux plantes. Dans cette expérience, 3,6 mM de N-N0 - ou N-NH
3
4+ diminuent
également la concentration des uréides; mais la quantité transportée ne
diminue que chez les plantes nourries avec le N0 -. (tabl. XIII et XIV).
3
-1
-1
+
Celle-ci passe de 62,4 à 22,7 ~g.h
.pl
(tabl. XIII). Avec le NH4 ' cette
quantité ne varie pratiquement pas (tabl. XIV).
L'ensemble de ces résultats montre qu'en présence d'azote exogène
sous forme nitrique ou ammoniacale, l'activité réductrice de l'acétylène et
la teneur en uréides de la sève du xylème diminuent simultanément. Mais lors-
qu'il s'agit des quantités transportées, les résultats varient suivant la
nature de la nutrition azotée. Dans nos expériences, ces quantités restent
constantes en présence de doses croissantes d'azote ammoniacal. Ce maintien
à un niveau constant du taux d'exportation des uréides peut être attribué,
soit à l'incorporation de NH4+ exogène dans les molécules d'uréides soit
tout simplement à l'augmentation du flux de sève; mais il peut aussi être
dû à l'effet conjugué de ces deux facteurs. Il a déjà été prouvé, par l'uti-
lisation de 15NH4+ o~ 15N03- que ces deux formes d'azote entrent dans les
molécules d'uréides lorsqu'elles sont fournies de l'extérieur. La formation
des uréides à partir de N0 - est sûrement localisée dans les nodosités,
3
vraisemblablement à partir du NH
produit par une nitrate et une nitrite
3
réductase localisées dans ces organes. La synthèse en quantité notable
dans la racine semble peu probable à cause de l'absence d'activité XDH
(chapitre II).
+
-
Cette éventualité de l'incorporation de NH
ou du N0
dans
4
3
les molécules d'uréides, explique le taux constant des quantités d'uréides
exportées observé dans ces expériences en présence de différentes doses de
NH4+ ; l'augmentation des volumes de sève dans ces conditions, explique
alors la diminution de la concentration. Ces quantités sont les produits
des volumes par les concentrations. Comme le montre le tableau XV, lorsqu'on
multiplie les taux d'augmentation des volumes de sève par les taux de diminu-

---

- fŒ6-
tion des concentrations en uréides de cette sève, pour les différentes doses
+
de N-NH 4 ' les valeurs obtenues sont semblables. Cette constance de ces valel1r:s
pourrait donc être à l'origine de celle des quantités d'uréides transportées
vers les organes aériens. Cette interprétation n'exclut pas cependant la
participation de l'ammonium du milieu extérieur ou p_~.c:l~enant de la réduction
du N0 - à la synthèse des uréides. La diminution de la concentration en uréi--
3
des de la sève et l'accroissement simultané du flux d'exudation signifient
que malgré l'inhibition de l'activité nitrogénase par le NH4+, une même
quantité d'uréides est formée dans les nodosi~és et tout simplement diluée
dans un plus grand volume de sève. De plus, aussi bien en présence de NH 4+
que de N0 -, la diminution des concentrations en uréides dans la sève a tou-
3
jours été plus faible que celle de l'activité nitrogénase.
Tableau XV : Taux d'augmentation du flux de sève et de diminution de la
conce~tration en présence de différentes doses de NH + (P re-
4
présente le produit A X D).
Concentrations
Flux de sève
Concentration de la
de NH 4+
(% du témoin)
sève en 'uréides
P
(% du témoin)
A
D
a
100
100
10 000
1
158
68
la 744
2,5
214
50
la 700
5
268
39
la 452
7,5
243
40
9 720
la
256
40
10 240
Si l'accroissement du flux de sève.rlans le cas de la nutri-
tion ammoniacale s'avère être un phénomène général, celà permettrait au
Soja cultivé en présence ou non de 1lion NH + de transporter les mêmes
4
quantités d'azote sous forme d'uréides. Cependant, les résultats de la fi-
gure 33 C font apparaître les limites de cette augmentation du flux de
sève. Les volumes correspondant à 5, 7,5 et la mM de NH + sont très voisins,
4
comme nous l'avons déjà montré pour l' acti vi té ni trogénase et les taux d' ure,i··
des de la sève (fig. 34).

---

- 107 -
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4
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8
10
o
2
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6
8
10
Figure 35- Variations des co~~entrations de N-aminé (A) et N-NO~- (B) dans la
sève du Soja de 45 jours, en présence de N0'i
( 0
) ' et IlH +
( . ).
Différentes doses de NO~ - et NH + sous fon':?es ,de YJ10 et l!~4Cl
4
3
respectivement, sont ap~ortées a partir du 42 eme jour, à des plantes
nodu Zées par la souche G3 (expérience B).

---

- 108 -
2 - Azote aminé et azote nitrique de la sève
Dans l'expérience A, en présence de N0 -, nous avons observé
3
une légère diminution de la teneur en acides aminés de la sève et évidemment
de la quantité transportée par heure et par plante (tabl. XIII), mais la
fraction nitrique est ~ultipliée par 4. Chez les plantes ayant reçu la so-
lution nutritive contenant de l'ammonium, la concentration en acides aminés
a augmenté de 337,5 % (tabl. XIV). Dans ce,casl'azote nitrique nIa pas
été détecté dans la sève, ce qui indique que la nitrication était proba-
blement nulle dans les pots de culture.
Les concentrations en azote aminé et en azote nitrique
augmentent considérablement dans la sève lorsque le N0 - ou le NH + sont
3
4
fournis aux plantes. Mais la prépondérance de l'une ou l'autre forme azotée
dépend de la nature de la nutrition azotée. Lorsque plusieurs concentrations
de NH +
4 sont utilisées (expérience B), le taux d'azote aminé augmente très
fortement, mais llaugmentation de cette forme d'azote nlest que très légère
en présence des mêmes doses de N0 - (fig. 35 A). On obtient le résultat inverse
3
pour l'azote nitrique de la sève (fig. 35 B). Ces résultats prouvent donc
que dans ces expériences les acides aminés véhiculés par la sève xylémique
sont formés en grande partie à partir de NH4 absorbé du milieu extérieur et
dans une moindre proportion de NH4+ provenant de la fixation de N2 et de la ré-
duction de N0 -, cette dernière étant négligeable dans les parties souterrai-
3
nes des plantes.
3 - Teneurs en uréides des organes
Tableau XVI
Effet de N0 - et NH +' .sur l'accumulation des uréides dans les
3
4
différents organes de Soja au 45e jour. 3,6 mM de N-N0 - et
3
N- NH4+ sont apportées aux plantes dès la germination. Les
teneurs sont Ug N-uréides.g- 1 MF (expérience A)
. Organes
NO
N0
'NH +
3
4
Nodosité
297,1 : 36,5
246,3 : 21,6
320,1 + 54,8
-
Raci ne
55,1 : 11 ,2
36,1 +
7,8
53,1 + 12,6
-
-
Feui 11 e
160,8 : 20,6
160,5 +
9,8
139,5 + 33,9
-
-

---

- 109 -
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4
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10
N03 ou NH4 (mM)
?(w
3ô- Variations r3.es teneu.rs en ;;-w·,jir3.es de :a tige (A) et des feuilles
re
(3)
du Soja de 45 jours en présence de doses croissantes de JO:;
( 0
)
e:"
de NH tJ + (
•
)
(expérience B).
U

---

- 110 -
Les uréides ont été dosés dans les nodosités, les racines
et les feuilles au cours de la première expérience (A) (tabl. XVI),dans
la tige et les feuilles lors de l'expérience B (fig. 36 A et B). La nutri-
tion nitrique par l'apport de 3,6 mM de N0 - diminue très légèrement la
3
quantité d'uréides dans les nodosités, mais leur teneur dans ces organes
ne varie presque pas en présence de NH4+ ; la 'même variation s'observe dans
les racines. Dans les feuilles, ce taux n'est pas modifié par l'apport d'azote
combiné (tabl. XVI). Dans l'expérience B, compte tenu des coefficients de
variation des mesures, les différentes doses d'azote, aussi bien sous la
forme ammonia~ale que nitrique n'ont qu'une influence peu significative sur
les teneurs en uréides des tiges ou des feuilles (fig. 36 A et B) ; seule la
plus forte dose d'ammonium (10 meq.l-1) a nettement diminué la teneur en
uréides. Cèpendant aucune explication physiologique évidente ne permet d'in-
terpréter de façon plausible l'écart entre les doses comprises entre 2,5 et
7,5 meq.l-1 et la dose 10 meq.l-1 : nous en déduisons que la baisse pour
ce point est très vraisemblablement fortuite. La constance des teneurs en
uréides est encore plus nette dans les feuilles.FUJIHARA et aZ., (1977)
avaient, également observé une augmentation des teneurs en azote uréidique
des feuilles de Soja en apportant 100 ppm de N-NH + sous forme de (NH4)2S04
4
après cinq semaines de culture. Dans les nodosités de cette même légumi-
neuse, 100 mg de N-N0 - par litre, n'ont pas eu d'effet important sur l'ac-
3
cumulation des uréides (STREETER, 1981 ; STREETER, 1982). Au vu de ces
résultats, il semble que les teneurs en uréides des organes aériens, feuil-
les ou tiges soient un mauvais indicateur de la production de ces uréides
dans les nodosités et par conséquent de la fixation symbiotique. En effet,
l'accumulation est, par définition même, un phénomène cumulatif; une même
quantité d'uréides pourra être accumulée à partir d'un flux plus faible en
provenance des racines si cette accumulation, comme cela est possible, se fait
dans un compartiment où ces moléculès échappent à l'hydrolyse: la vacuole par
exemple. Or les quantités d'uréides présentes dans les tiges sont de l'or-
dre de 15 à 20 ~mol .g-lMF (expérience B), C'est-à-dire, une concentration
de 20 micromolaires. Compte-tenu des volumes
respectifs des vacuoles
et du cytoplasme dans les cellules végétales adultes, il est tout à fait
plausible qu'une partie importante des uréides soit stockée dans le compar-
timent vacuolaire.
Comme l'obscurité, l'apport d'azote combiné, diminue donc
la fixation symbiotique, mais ces deux facteurs dü milieu n'agissent pas
de la même manière sur l'accumulation des uréides dans les organes aériens.

---

- 111 -
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Z
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~
1,5
3
4,5
6
C2 H4 (~mol.hJ. PIJ)
"'<:'02'';::
37- VarÙd;ions ies concentY'ations en azote soluble (A)~ des quantités d'azote
soluble (B) et des pY'opoY'tions de N-uY'éides et N-azniné (C) en fonction des
doses de N0 -
(
0
)
et NB + ( •
)
(expéY'ienc:e A). La Y'elation entY'e les
3
pY'opoY'tions de N-uY'éides e~ l'activité fixatY'ice et celle entY'e les pY'opoY'tions
de N-aminé et cette activité~poUY' les deux tY'aitements NO - et NH4 + Y'éunis
sont tY'aduites Y'espectivement paT' les couY'bes (1) et (2) ~'équatiôns:
i'} = 27~3ln..x + 46~4 (Y'1= O~95) et i'2 = -9~1 lr.x + 26~7 (Y'2 = O~5ô).

---

- 112 -
A l'obscurité, en effet, on observe une augmentation des teneurs en uréides
des organes aériens, surtout des feuilles, alors que ces teneurs sont peu
modifiées par la fourniture d'azote
à la plante. Cette différence est dûe
sans doute à l'inhibition des activités allantoinase et allantoicase des
feuilles maintenues à l 'obscurité (tabl. IX et X) ..
Ces constations rappellent l'observation que nous avons faite
précédemment à propos de l'estimation de la capacité fixatrice d'une asso-
ciation symbiotique à partir des quantités d'uréides accumulées dans les
1
organes aerlens et notamment dans la tige (ZENGBE et aZ., 1983). Les quan-
tités d'uréides rencontrées dans la tige proviennent en grande partie de l'a-
zote fixé, mais leur accumulation dans cet organe n'étant pas sous la dé-
pendance des mêmes facteurs que la fixation biologique, ces quantités peuvent
juste permettre d'affirmer qu'une association est fixatrice, mais pas d'es-
timer le degré exact de cette fixation.
4 - Evolution des proportions de l'azote uréidique et
de l'azote aminé par rapport à l'azote total de la
sève.
L'azote total de la sève est constituée par la somme de
N-uréidique, N-aminé et N-N0 -. Sa concentration est indiquée par la figu-
3
re 37 A. Cette concentration décroît en fonction des différentes doses de
N0 - ou de NH
3
4+ du milieu, à cause de la forte diminution de l'azote uréidi-
que. L'accroissement des concentrations en N-aminé et N-N0 - lors de la nu-
3
trition ammoniacale ou nitrique n'est pas suffisant pour compenser la baisse
dans ces conditions de nutrition azotée, des teneurs en uréides qui représen-
tenet la fraction la plus importante de l'azote soluble. Quant à la quantité
d'azote soluble transportée par heure et par plante .(fig. 37 B), elle croît
légèrement en présence de NH4+ dont l'apport aux plantes augmente sensible-
ment les taux de N-aminé et même permet l'apparition d'un peu d'azote nitrique
(voir fig. 35 B) tout en maintenant constant celui de l'azote uréidique.
L'apport de N0 - dans la solution nutritive par contre, diminue la quantité
3
d'azote soluble transportée par la sève (fig. 37 B). Mais pour 10 mM de
N-N0 -, cette quantité augmente nettement pour atteindre une valeur très
3
proche de celle de la série des plantes sans azote exogène; cette dernière
augmentation de la quantité d'azote soluble provient sans doute de l'accroisse-
ment de la quantité d'uréides à cette concentration (voir fig. 33 D). Dans
la tige, une augmentation semblable de la teneur en uréides a été observée
également à la concentration de 10 mM de N-N0 - (fig. 36 A).
3

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Figure J8- Effet de NOJ- et NH: sur les activités XDH (A)" uricase (B) et aUantoinase
(C) de la fraction soluble des nodosités de Soja. Les plantes de Soja HQgdson
nodulées par G3 reçoivent 3" 6 mM de N-N0'J· sous fOY'l71e de KNO ou de NH; sous
forme de NH4Cl dès le début de la culture. Les mesures ont é~é effectuees 45
jours après le semis (expérience A). Les rectangles blancs représentent les
activités par gramme de nodosités (échelle de gauche) et ceux hachurés les
activités par mg de protéines (échelle de droite).

---

- 114 -
Sur la figure 37 C, nous avons représenté les proportions de
l'azote uréidique et de l'azote aminé par rapport à l'azote soluble total
de la sève pour les traitements N0 - et NH + réunis, en fonction des valeurs
3
4
de l'activité nitrogénase obtenues dans ces conditions. Pour des doses
décroissantes d'azote exogène, l'activité fixatrice croît évidemment et
la part des uréides dans l'azote total tend asymptotiquement vers 100 %.
Parallèlement, la fraction aminée de cet azote, élevée pour les fortes
concentrations d'azote minéral diminue ave~ la diminution de l'apport exo-
gène et par conséquent l'augmentation de la fixation.
C - Effet de N0 - et de NH + sur les activités des enzymes de
3
4
la dégradation des purines dans les nodosités.
La XDH, 1 'uricase et l'allantoïnase étaient concernées par
cette étude de l'influence de la nutrition nitrique et ammoniacale. Les
résultats de l'effet de cette forme de nutrition sur les activités de ces
enzymes dans la nodosité sont représentés par les figures 38 (expérience A)
et 39 (expérience B). Aucune modification vraiment significative de ces
activités n'a été apportée par le N0 - ou le NH + au cours des deux expérien-
3
4
ces. Les valeurs des activités en fonction des doses d'azote combiné présen-
tent des fluctuations dont le caractère aléatoire est vraisemblable.
III - CONCLUSION
La mise à l'obscurité et l'apport d'azote minéral ont un ef-
fet comparable sur l'activité nitrogénase des nodosités et en partie sur
leur capacité à synthétiser les uréides. L'apport de N0 :
comme l'absence
3
de lumière diminue simultanément ces deux activités. L'effet inhibiteur de la
synthèse des uréides par ces deux derniers trattements est sans aucun doute
une conséquence directe de l'inhibition de l'activité fixatrice.
A l'obscurité, l'activité fixatrice des plantes diminue,
mais dans les nodosités les teneurs en hydrates de carbone sont encore éle-
vées, bien qu'on enregistre leur accroissement chez les plantes-témoins.
Cette inactivation de l'activité nitrogénase se répercute sur la synthèse des
uréides dont la concentration dans la sève diminue en même temps que les
quantités transportées par heure et par plante. Par contre, dans la tige
et surtout les feuilles des plantes mises à l'obscurité, le taux d'uréides
augmente très sensiblement. Nous avons attribué cette augmentation à l'inhi-
bition des enzymes du métabolisme uréidique : 1 'al~antoïnase et l'allantoî-
case. Les activités de ces deux enzymes sont nettement réduites dans la tige

---

- 115 -
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Figure 39- Effet de N0;S- ( 0
) et NH +
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les activites XDH (A)~ uriëase (B)~ et
allantoinase (C) des nodosités de Soja
de 45 jours. Différentes doses de N03 et
NH + ont été apportées pendant trois jours
4
à partir du 42ème jmœ de culture
(expérience B)

---

- 116 -
et les feuilles à l'obscurité, alors que ce traitement nia aucun effet sur les
activités XDH et uricase des nodosités. L'allantoïnase des nodosités s'est
également révélée sensible à l'action de l'obscurité.
La nutrition nitrique ou ammoniacale diminue aussi conjointe-
ment l'activité fixatrice ~t les concentrations des uréides dans la sève.
Mais l'apport de N03~' ou NH + augmente le taux d'exudation des plantes.
4
Dans la nutrition ammoniacale notamment, cette exudation est beaucoup plus
importante. Il s'en suit un maintien à un niveau constant des quantités d'uréi-
des transportées vers les parties aériennes des plantes: le NH 4+ du milieu
extérieur a donc été incorporé dans les uréides et vraisemblablement aussi
celui provenant de là réduction de N0 - dans les nodosités.
3
Dans les conditions de nutrition nitrique ou ammoniacale,
les teneurs en azote aminé augmentent très fortement dans la sève. D'après
les résultats de nos expériences cet azote aminé est formé essentiellement
à partir de NH + exogène. Ni le N0 -, ni le NH + n'affectent réellement les
4
3
4
activités des enzymes de la nodosité.

---

- 117 -
CHAPITRE IV
INFLUENCE DE LA LEGUMINEUSE ET DE LA SOUCHE DE RHIZOBIUM SUR LA SYNTHESE
DES UREIDES
l - INFLUENCE DE· LA LEGUMINEUSE
A - Evolution des activités nitrogénase et des teneurs
en sucres totaux des nodosités de Soja et de Pois.
B - Métabolisme des uréides chez le Soja et le Pois
1 - Teneurs en uréides des plantes
2 - Enzymes du métabolisme des uréides
a. PRPP synthétase
b. XDH, uricase et allantoïnase
c. Une caractéristique fondamentale des plantes à
amides: la présence d'une activité allantoïcase
dans les nodosités et les racines.
C - Teneurs en ARN et activité ribonucléase des nodosités
de Soja et de Pois
II - INFLUENCE DE LA SOUCHE DE RHIZOBIUM JAPONICUM SUR LA
PRODUCTION D'UREIDES CHEZ LE SOJA EN PRESENCE OU NON
D'AZOTE MINERAL.
A - Nodulation, activité fixatrice et développement
des plantes associées à la souche G1.
1 - Nodulation et développement des plantes
2 - Activité fixatrice des plantes
a. Expérience A
b. Expérience B
B - Teneurs en uréides et en acides aminés des plantes
nodulées par G ,
1
1 - Concentration en N-uréides et N-aminé de la sève
2 - Accumulation des uréides dans les organes du Soja
C - Enzymes du métabolisme des uréides dans les nodo-
sités formées par G ,
1
III - CONCLUSION

---

- 118 -
CHAPITRE IV
INFLUENCE DE LA LEGUMINEUSE ET DE LA SOUCHE DE RHIZOBIUM SUR LA SYNTHESE DES
UREIDES
Le lien entre la fixation de l'azote et la synthèse des uréides
dans les nodosités a été mis en évidence lors des études précédentes chez
le Soja associé a une souche efficiente. Dans une telle association, une fixation
intense se traduit toujours par une forte accumulation des uréides dans
la plante. Mais dans beaucoup de cas, aussi bien chez le Soja que chez
d'autres légumineuses de la tribu des PhaseoZeae, comme chez d1autres plan-
tes n'appartenant même pas a la famille des légumineuses, il est constamment
observé une accumulation d'uréides dans la plante sans que cette accumulation
ne corresponde a une fixation de N •
2
Par ailleurs, les légumineuses dites a amides (Vicieae,
TrifoZieae ... ) fixent d'appréciables quantités d'azote atmosphérique
qui ne sont pas transportées sous forme d'uréides, mais plutôt sous forme
d'acides aminés et d'amides. L'asparagine est alors le composé le plus abon-
dant de la sève xylémique.
Chez les légumineuses' productrices d'uréides, la nodulation
joue un rôle particulièrement important dans la formation de ces composés.
Il ne peut s'agir d'une simple conséquence indirecte de la fixation puisque
la relation entre les teneurs en uréides du Soja et de la nodulation est
beaucoup plus étroite que celle entre ces teneurs et la fixation biologique
elle-même. Les principales enzymes indispensables a la synthèse des uréides
sont localisées dans les nodosités.
Après l'étude de quelques facteurs, susceptibles d'influencer
la synthèse des uréides chez le Soja par leur action directe sur l'activité
fixatrice (obscurité, nutrition nitrique et ammoniacale), nous envisageons
d'étudier dans ce dernier chapitre d'autres facteurs également liés a la
synthèse des uréides; ce sont:
- l'espèce de légumineuse: une légumineuse a amides a été
étudiée afin de pouvoir comparer son mécanisme de synthèse des uréides a
celui du Soja.
- la souche de Rhizobium japonicum:
nous avons utilisé
une souche de Rhizobium très peu efficiente pour i~oculer. le Soja, en
présence ou non d'une source exogène d'azote. Il s'agissait de savoir si
le Soja nodulé par une souche peu fixatrice était capable d'accumuler

---

- 119 -
-
+
autant d'uréides en présence de N0
ou de NH
qu'une association fixatrice.
3
4
Les teneurs en ARN et l'activité ribonucléase des nodosi-
tés constituent un facteur également important dans la formation des uréi-
des dans la plante: il aurait donc pu être traité comme un troisième
facteur dans ce chapitre car il permet d'expliquer l'origine des uréides
à certains stades végétatifs de la plante. Nous avons préféré le traiter
avec le facteur "espèce de légumineuse" car les teneurs en ARN et surtout
l'activité ARNase des nodosités de Pois et de Soja sont aussi l'une des
causes de la différence entre ces deux légumineuses.
1 - INFLUENCE DE LA LEGUMINEUSE
Le mécanisme de l'incorporation de l'azote fixé a été éluci-
dé chez une plante à amides, le Lupin, par SCOTT et al., (1976). A partir
du N , il
2
Y a d'abord formation de la glutamine, comme chez toutes les au-
tres légumineuses, puis de l 'aspartate et enfin de l'asparagine. Chez le
Soja et le Vigna, le même mécanisme de la synthèse et de la dégradation
des purines est impliqué dans la formation des uréides (FUJIHARA et YAMAGU-
CHI, 1978 b, ATKINS et al., 1980). La différence de comportement des deux
groupes de légumineuses dans le métabolisme de N a été attribuée:
2
à une
moindre activité des enzymes de la synthèse des uréides chez les plantes
à amides (REYNOLDS et al., 1982 a ; CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 1983).
Nous avons donc étudié chez le Soja et le Pois le mécanisme
de synthèse des uréides par les nodosités, en regard de l'activité fixa-
trice de ces plantes. Le degré d'incorporation de N dans les molécules de
2
purines, grâce à l'activité PRPP synthétase, aeté mesurée dans leurs nodosités
dont les teneurs en hydrates de carbone ont également été déterminées.
Des plantes de Soja (cv. HODGSON) et de Pois (cv. AMINO) ont donc été
inoculées avec les souches spécifiques et cultivées en serre dans des pots
de sable. Elles ont été arrosées régulièrement avec de l'eau distillée et
la solution nutritive sans azote. Les mesures ont commencé·30 jours après
le semis. L'activité allantoïcase a été mesurée dans les nodosités et les
racines de la Féverole, autre plante à amides cultivée dans les mêmes
condi ti ons.
Les teneurs en ARN et l'activité ribonucléase des nodosités
des deux groupes de plantes rendent également compt~ de la .capacité de
ces organes à synthétiser et à hydrolyser les acides nucléiques.

---

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Activité nitrogénase (A)~
activité nitrogénase spécifique (B)
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totaux (C) des nodosités de Soja
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Jours après semis

---

- 121 -
A - Evolution des activités nitrogénase et des teneurs
en sucres totaux des nodosités de Soja et de Pois
Pendant la période des mesures, les plantes de Soja étaient en
phase de développement et leur niveau d'activité nitrogénase était en plei-
ne ascencion (fig. 40 A). Chez le Pois, par contre, dès le 30ème jour de
culture, l'activité nitrogénase semble avoir atteint son maximum. Elle
n'augmente plus et après des valeurs constantes lors des trois premières
mesures, elle diminue progressivment (fig. 40 A). Pendant cette période,
les valeurs des activités nitrogénase des nodosités des deux plantes ont
sensiblement les mêmes intensités. L'activité nitrogénase du Soja ne se.dis-
ème
tingue réellement de celle du Pois qu'à partir du 44
jour (fig. 40 A).
D'autres résultats obtenus sur ces deux plantes indiquent qu'à ce stade,
les activités nitrogénase sont identiques (ARGILLIER et aL., 1984). Au
1
1
cours de cette même période, l'activité spécifique des nodosités (h- .g- MF)
ème
reste élevée chez les deux plantes (fig. 40 B). Au 30
jour, elle est
même environ 4 fois plus forte chez le Pois que chez le Soja. Mais comme
l'activité totale par plante, cette activité spécifique diminue progressi-
vement dans les nodosités de Pois pendant que celle des nodosités de Soja
augmente (fig. 40 B). Parallèlement, la masse de matière fraîche des nodo-
sités de Soja croît en fonction du stade végétatif, mais celle des nodosi-
tés de Pois, environ quatre fois moindre, décroît (tabl. XVII).
Tableau VII - Evolution de la masse de matière fraîche des nodosités de
Soja et de Pois (mg.pl-1). Les résultats représentent les
moyennes (! écarts-types) de trois déterminations.
Age des plantes
Soja
Pois
(jours)
30
300 +
50
140 + 10
-
-
37
330 +
50
220 + 40
-
-
44
400 + 60
170 + 30
-
-
51
550 + 100
150 + 30
-
58
480 + 70
100 + 40
-

---

- 122 -
Dans ces organes, et notamment dans ceux du Pois, la teneur
en hydrates de carbone totaux évolue inversement à l'activité nitrogénase
totale ou spécifique (fig. 40C). Malgré une diminution de ces activités,
les quantités de sucres totaux dans les nodosités de Pois augmentent beau-
coup plus fortement que dans celle de Soja dont la capacité fixatrice est
encore intense. Les masses de matière fraîche des nodosités, plus faibles
chez le Pois, pourraient être à l ·origine de cette.différence entre les
deux légumineuses quant à la teneur de leurs nodosités en hydrates de
carbone. Mais cette différence pourrait également provenir de la différen-
ce dans l lévolution des activités nitrogénase de ces plantes. Lors des
trois premières mesures, ces activités sont presque ~emblables chez les
deux légumineuses. Il en est de même pour les quantités de sucres totaux
ème
des nodosités. A partir du 44
jour, lorsque l'activité nitrogénase du
Soja augmente brusquement, la diminution de celle du Pois s'accentue, am-
plifiant ainsi l'écart entre les deux activités. En même temps, dans les
nodosités de Pois, la diminution de l'activité nitrogénase coïncide avec
une brusque augmentation des quantités d1hydrates de carbone. Dans les
nodosités de Soja, à la brusque augmentation de l'activité nitrogénase
après la troisième mesure, ne correspond pas une variation très sensible
des teneurs en hydratesde carbone (fig. 40 A et C). Ces observati~ns
su~gèrent qu'à ces stades de développement, les nodosités des deux légumi-
neuses reçoivent des parties aériennes, des quantités similaires de sucres.
la diminution de l'activité fixatrice, donc une moindre utilisation de ces
composés, serait responsable de l 1 augmentation de leur teneur chez le
Pois. Aux stades de développement, au moins durant les 50 premiers jours,
au cours desquels nos mesures ont été effectuées, la base des tiges et les
premières feuilles de Pois Amino que nous avons utilisé, contrairement aux
plantes de Soja, sont déjà presque désséchées. Mais le reste de la partie
aérienne des plantes est encore bien vert avec d'abondantes feuilles bien
développées. Au niveau de la partie souterraine, les nodosités sont en voie
de dégénérescence, comme le montre la diminution de leur masse (tabl. XVII).
Malgré cet état des plantes de Pois, l'approvisionnement des nodosités en
photosynthétats serait donc encore assuré et l'augmentation des teneurs en
ces substrats énergétiques ne serait que le çorollaire de la diminution de
llactivité nitrogénase, diminution qui ne serait donc pas due à un déficit
carboné.
B - Métabolisme des uréides chez le Pois et le Soja
Chez le Soja et le Vigna
l'azote fixé est directement trans-
3

---

- 123 -
formé en uréides. Chez le Pois, pour des raisons que nous avons rappelées
précédemment, l lazote fixé est métabolisé suivant une autre voie. Mais
ce comportement différent dans l'assimilation de l'azote atmosphérique
n'exclut pas chez le Pois, la présence d'un mécanisme de synthèse des
uréides, de même qulil existe chez les légumineuses à uréides une voie dif-
férente de celle des uréides pour incorporer l'azote sous forme d1aspara-
gi ne.
1 - Teneurs en uréides des plantes
Au cours de cette étude, les uréides nlont pu être dosés
que dans les tiges des deux légumineuses. La structure de la tige des plan-
tes de Soja se prête beaucoup plus aisément à la technique de prélèvement
de sève que nous avons utilisée au cours de ce travail. Les plantes de Pois,
par contre, ont une tige creuse, généralement désséchée à partir d1un cer-
tain stade de développement. Les essais de prélèvement de sève effectués
sur ces tiges nlont donc pas donné de résultats fructueux.
Le transport de l'azote sous forme d'acides aminés ou
diamides et sous forme d'uréides respectivement par le Pois et le Soja a
d'abord été confirmé lors d'une première culture de ces deux légumineuses.
Au cours de celle-ci les acides aminés et les uréides totaux ont été dosés
dans les tiges, 30 jours après le semis. A ce stade, la production d'uréi-
des chez le Soja n'est pas encore maximale, mais déjà, la fraction uréi-
dique de l 1 azote contenu dans la tige de cette légumineuse est majoritaire
par rapport à la fraction am"inée (tabl. XVIII).ilnyers~ïnenf,_dans l~_'tige
du Pois, cette dernière forme d1azote est dominante. Le phénomène se confirme
du moins pour les teneurs en uréides totaux des tiges lorsqu'on suit l'évo-
lution de ces teneurs pendant une grande partie du cycle végétatif des deux
plantes (fig. 41 A) : pendant tout ce cycle, les teneurs en uréides des ti-
ges de Pois sont généralement très faibles, comparées à celles des tiges de
Soja, et le rapport entre les teneurs des tiges des deux légumineuses varie
ème
ème
de 28 (au 30
jour) à 102 (au 44
jour). Cette différence considérable
entre les teneurs en uréides des tiges de ces deux légumineuses, notamment
ème
au 44
jour ne peut être attribuée à la différence de la capacité fixatri-
ce des deux légumineuses. A ce stade, la teneur en uréides des tiges du
Soja est maximale, mais la fixation de l'azote n'est presqu'à son début et
s'accroît beaucoup ultérieurement. L'activité fixatrice du Soja n'est
alors que 1,6 fois supérieure à celle du Pois. Ce_n'est qu'au 58e jour 00
nous avons arrêté les mesures de l'activité nitrogénase, lorsque cette der-

---

- 124 -
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(3) de SOJCi ( •
) e tde Pois (
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Les 7)mOié{?.';~ Hodgson pov.:r le Soja
et Amino pOLœ Ze ?ois~ ontité cultivées ~m_ .serre.

---

- 125 -
nière est à son niveau maximum chez le Soja et minimum chez le Pois, que le
rapport entre les activités fixatrices .des deux plantes correspond à celui
de leurs teneurs en uréides.
Tableau XVIII: Teneurs en uréides et en acides aminés des tiges de Soja
et de Pois de 30 jours.
Légumineuses
N aminé
N-uréides
N-uréides
(mg.g- 1MF)
mg.g-1 MF)
N aminé
Pois
0,141
0,012
0,085
Soja
0,011
0,445
40,454
2 - Enzymes du métabolisme des uréides
La synthèse des uréides à partir du N2 ou de la glutamine
comporte plusieurs étapes. Une différence entre deux associations dans
llaccumulation de ces composés, comme celle que nous observons entre le Pois
et le Soja, pourrait s'expliquer par la différence dans la capacité à incor-
porer N aux purines et
2
à dégrader ces derniers. Les activités PRPP synthéta-
se, XDH, uricase et allantoinase ont donc été mesurées dans les nodosités
des deux légumineuses.
a. PRPP synthétase
Les activités PRPP synthétase et PRAT qui commandent les pre-
mières étapes de la synthèse des purines à partir de la glutamine sont très
élevées dans les nodosités de Vigna et de Soja, comparées aux activités des
nodosités de Pois (ATKINS et al., 1982 a ; REYNOLDS et al., 1982 a). Par
contre, chez le Pois et les autres légumineuses à amides llasparagine synthé-
tase est plus active dans les nodosités (SCOTT et al., 1976 ; REYNOLDS et al.,
1982 a).
Nous avons suivi l'évolution de 1(activité PRPP synthétase
dans les nodosités de Soja au cours d'un cycle de développement (chap. II).
Cette activité est certes légèrement inférieure à celle indiquée par SCHUBERT
(1981 a) et par REYNOLDS et al., (1982 a). Mais la comparaison de cette acti-
vité à celle des nodosités de Pois, cultivé en même temps et dans les mêmes
conditions (fig. 41 B) montre très nettement chez les plantes à amides,
une moindre activité de la PRPP synthétase.
Comme l'activité fixatrice et
les teneurs en uréides de la tige, 1'activité PRPP synthétase des nodosités
de Pois diminue lors des différentes mesures. Le rapport entre les activités

---

- 126 -
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Jours après
semis
Figure 42 - Activités XDH (A)" u:t'icase (B) et allantoinase (C)
des nodosi tés de Soja ( • ) et de Pois ( 0 ). L' éche=b-
le de droi te de la figu:t'e B concerne uniquemen t l' acti-
vité u:t'icase des nodosités de Pois.

---

- 127 -
ème
des nodosités des deux légumineuses est de l 'ordre de 6 au 30
jour, mais
passe à 19 au 65 ème jour. L'actlvité des nodosités de Pois est alors in-
signifiante alors que celle des nodosités de Soja, malgré une relative di-
ème
minution après un maximum au 44
jour, reste encore élevée.
La différence entre les activités PRPP synthétase des deux
légumineuses est beaucoup moins importante que celle entre les teneurs en
uréides, mais elle explique en partie la très faible accumulation de ces
substances par les plantes de Pois au moment où elles sont encore capables
de fixer des quantités de N comparables
2
à celles fixées par les nodosités
de Soja.
b. XDH, uricase et allantoïnase
Ces trois enzymes, à l'origine de la production de l'allan-
toine et de l 'acide allantoïque existent également chez le Pois.
Les activités XDH et allantoïnase des nodosités des deux
plantes sont très voisines et ne sont sans doute pas responsables de la
grande différence entre les deux plantes quant à leurs teneurs en uréides.
Les activités XDH et allantoïnase des nodosités de Soja ne sont que 1,4 et
1,8 fois supérieures à celles des nodosités de Pois même au moment où
l'accumulation des uréides est maximale dans les plantes de Soja (fig. 42).
Par contre, l 'activité uri case des nodosités de Soja est 24 fois plus éle-
vée que celle des nodosités de Pois à ce stade. Comme à ce moment les uréi-
des proviennent majoritairement de la fixation de N , on peut penser que
2
l'action de cette dernière enzyme peut être l lune des étapes limitantes dans
la formation des uréides chez les plantes à amides. Dans une comparaison sem~
blable entre le Soja et le Pois pour la capacité de synthèse des uréides,
CHRISTENSEN et aZ.~ (1983) avaient observé des différences similaires à
celles que nous avons constatées pour les activités XDH et uricase. Entre
le Soja et le Lupin, les rapports des activités de ces deux enzymes sont
beaucoup plus variables (REYNOLDS et aZ.~ 1982 a).
, c. Une caractéristique fondamentale des plantes à
amides: la présence d'une activité allantoïcase dans les nodosités et les
racines.
Chez les légumineuses à uréides et précisément chez le Soja,
l lactivité allantoicase nia jamais été détectée dans les parties souterrai-
~
nes (TAJlMA et YAMAMOTO, 1975 ; TAJIMA et aZ.~ 1977 ; ZENGBE et SALSAC,
1983). Cette enzyme serait donc localisée exclusivement dans la tige, les
feuilles et les gousses de ces .légumineuses. Cela suppose donc un transfert
obligatoire des uréides vers ces parties aériennes. Chez les plantes à

---

- 128 -
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Jours
après semis
Figure 43- Activi~~ a~~antoicase des nodosit~s (A)
et des l'Gcines (B) de Pois ( 0
)
et de
FéveroZ,e ( •
).

---

- 129 -
amides qui synthétisent préférentiellement de l'asparagine pour le transport
de l'azote, les mécanismes de la synthèse des purines et des uréides sont
beaucoup moins actifs que ceux des plantes à uréides. Mais parmi les diffé-
rentes étapes de la synthèse de ces composés que nous avons étudiées, seu-
les les activités PRPP synthétase et uri case pourraient constituer des
étapes limitantes dans l'élaboration des uréides chez
les plantes à amides.
Les différences observées entre le Pois et·le Soja au niveau des autres
étapes et surtout au niveau de la fixation de l'azote peuvent être compara-
bles aux écarts entre deux plantes productrices d'uréides .. Cependant, si
les faibles activités PRPP synthétase et uri case des nodosités sont capables
de freiner la formation des uréides chez le Pois, cette action limitée de
ces deux enzymes ne suffit pas elle seule, à expliquer l'énorme différence
entre les teneurs en uréides des plantes de Soja et de Pois, même si, comme
nous l'avons déjà fait observer, l'accumulation des uréides dans les organes
et notamment les organes aériens ne peut pas constituer le meilleur critère
d'une intense activité de la synthèse uréidique de la nodosité. L'une des
principales raisons de la différence entre les plantes à uréides et les plan-
tes à amides pourrait donc résider dans la présence de l 'allantoicase au
niveau des organes souterrains de ces dernières. En effet, dans les nodosi-
tés et les racines de Pois, nous avons détecté une activité allantoicase
(fig. 43). Chez la Féverole, autre légumineuse à amides, cette activité est
également présente. Dans les deux cas, l'activité des racines est inférieure
à celle des nodosités (fig. 43 B) et pour tous les organes, l'activité chez
la Féverole est plus élevée que chez le Pois (fig. 43). Ces activités, rap-
portées à l'unité de matière fraîche, sont du même ordre de grandeur que celles
1
mesurées précédemment dans les feuilles de Soja (ZENGBE et SALSAC, 1983).
Comme les feuilles, l'ensemble des nodosités et des racines représente une
masse importante. Cette activité qui évidemment paraît faible en regard des
activités uricase et allantoinase est sans doute suffisante pour hydrolyser
l'acide allantoïque produit et contribuer ainsi à diminuer très fortement
la .fraction uréidique de l'azote des plantes à amides, constituée aussi à
près de 60 % d'acide allantoique.
Quel avantage les plantes peuvent-elles tirer d'une synthèse
et d'une dégradation des uréides dans les nodosités ? L~ NH4+ ainsi libéré
doit être à nouveau incorporé dans un squelette carboné pour être ensuite
transporté sous forme d'asparagine. Si notre interprétation est exacte,
l'absence presque totale d'uréides chez le Pois et la Féverole serait une

---

- 130 -
conséquence de la présence d'allantoïcase dans les nodosités; ceci implique
que les bases puriques, ainsi que l 'allantoïne et l 'acide allantorque qui
en dérivent, sont également synthétisés àans les légumineuses à amides:
ceci est effectivement suggéré par la présence dans les nodosités de ces
plantes des enzymes nécessaires. La présence de cette ·voie particulière
d'incorporation de l 'ammonium pourrait être une caractéristique du métabo-
lisme particulier du tissu nodulaire, comme la synthèse des opines dans les
tissus de Crown gallo Lors de nos mesures chez le Pois qui n'ont commencé
qu'au 30ème jour de culture, l'activité fixatrice est en diminution constante,
ainsi que les principales activités liées à la synthèse des uréides. Ceci
suggère que la synthèse de ces substances à partir de N décroissait égale-
2
ment dans les nodosités. Pourtant, l'activité allantoïcase des nodosités
et des racines présentait non seulement des valeurs élevées, mais elle
était en augmentation. Comme nous le verrons dans le paragraphe suivant, les
nodosités de Pois contiennent des quantités notables d'ARN et l 'activité ARNase,
bien qu'en diminution, était à un niveau encore élevé. L'allantoïcase
détectée dans les organes souterrains et notamment dans les nodosités du
Pois et de la Féverole pourrait donc être destinée presqu'exclusivement à la
récupération de l'azote contenu dans les uréides issu de la dégradation des
ARN. Les uréides provenant de la dégradation des acides nucléiques constitu-
tifs des tissus végétaux et essentiellement des nodosités, lors de la sénescen-
ce de ces dernières sont certainement catabolisés d'abord en NH + par la plan-
4
te que celle-ci soit à uréides ou à amides. Ce n'est que le site de cette dé-
gradation qui diffèrerait selon les légumineuses. Or nous avons vu précé-
demment que les nodosités de Pois étaient plus .riches en sucres totaux que
celles de Soja (fig. 40 Cl. Il para,t donc plausible que cette plante dégrade
.l.'acide allantoïque et incorpore l'ammonium qui ~n résulte dans des squelet-
tes carbonés au niveau des nodosités où elle dispose de glucides.
Chez le Soja et les autres légumineuses à uréides, que ces
uréides proviennent des acides nucléiques ou directement de l'azote fixé,
cette dégradation et cette incorporation de NH + sont réalisées d~ns les
4
organes aériens, au voisinage des sites de synthèse des substrats carbonés.
Pour les plantes à amides, la présence d'allantoïcase dans
les nodosités et les racines ne pourrait donc pas être considérée comme une
simple anomalie qui consisterait à synthétiser les uréides et à les dégra-
der immédiatement sur place. L'existence de l 'ens~mble des enzymes de syn-
thèse et de dégradation des purines serait une caractéristique habituelle des

---

- 131 -
nodosités quelle que soit la plante qui· les porte. Les deux types de légumi-
neuses ne se distingueraient que par l'intensité de ce métabolisme parti-
culier et surtout par le fait que les plantes a uréides ne pourraient effec-
tuer l 'hydrolyse de l'acide allantoïque qua dans les parties aériennes.
C - Teneurs en ARN et activité ribonucléase des
nodosités de Soja et de Pois
Les uréides rencontrés chez les végétaux ne proviennent pas
uniquement de la fixation symbiotique puisque des plantes
autres que des
légumineuses en contiennent (TRACEY, 1955 ; BOLLARD, 1957). Chez ces der-
nières, la fixation biologique ne contribue
majoritairement a la formation
des uréides que pendant la phase de fixation active. Pendant le cycle végé-
tatif de ces plantes il peut y avoir un intense métabolisme uréidique indépendam-
ment de l'activité fixatrice. Dans les graines de légumineuses en germina-
tion, ce métabolisme est particulièrement actif (SINGH, 1968 ; FUJIHARA et
YAMAGUCHI, 1978 b). Chez le Soja particulièrement, nous avons observé en
fin de cycle une forte remontée de la concentration des uréides dans la
sève lorsque la fixation de N est devenue presque insignifiante. Ce dernier
2
phénomène a également été signalé par SCHUBERT (1981 a). Dans les axes em-
bryonnaires de graines de Soja, ANDERSON (1979) a observé une synthèse de l'IMP
a partir de bases puriques libres par le "Salvage pathway". Ces bases qui
peuvent être fournies par le milieu extérieur ou provenir de la dégrada-
tion des acides nucléiques de la plante sont réutilisés pour la synthèse de
l 'IMP dont la dégradation a son tour donnera des uréides, mais elles peuvent
aussi être dégradées directement en uréides.
Nous avons voulu préciser le taux d'acides n~clêiques des fractions
solubles des nodosités de Pois et de Soja. Mais nos dosages se sont limités
aux ARN de ces fractions puisque dans les tissus végétaux, l'ADN ne repré-
sente que 15 %environ de l'ensemble des acides nucléiques (DELSENY, 1977 ;
GOMES FILHO et al.~ 1983). La capacité d'hydrolyse de ces ARN dans les nodo-
sités des deux légumineuses a également été déterminée par la mesure de
l'activité ribonucléase. Les ARN de plantules de radis marqués a l'uridine 3H- 5
et extraits par le mélange phénol-chloroforme (voir il Matériel et Techni-
ques") sont mis a incuber avec les extraits de nodosités prélevées pendant
le cycle végétatif. A la fin de l'incubation, une fraction aliquote du mi-
lieu réactif est précipitée au TCA. Le précipité est récupéré sur un filtre
Millipore de 0,4 ~M et le comptage de la radioactivité est effectuée en

---

- 132 -
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30
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Jours
après
semis
Figure 44- Teneurs en ARN (A) et activité ribonucléase (B)
des nodosités de Soja ( •
) et de Pois ( 0
).
L'activité ARNase est mesurée par la disparition.
de la radioactivité des ARW de radis marqués
à l'uridine 3H-5 (lJA-ci correspond à 50)A.g d'ARN).

---

- 133 -
scintillation liquide (DELSENY et al., 1976). La disparition de la radio-
activité ainsi mesurée nous a permis de déterminer l 'activité ARNase des
extraits de nodosités tout au long du cycle végétatif du Pois et du Soja.
D'après les résultats de la figure 44, il apparaît que
pendant les trots premières déterminations, les nodosités de Pois et
celles de Soja renferment presque les mêmes quantités d'ARN. Les teneurs
augmentent ensuite plus fortement dans les nodosités de Soja. Dans les
ème
nodosités de Pois, la diminution s'amorce dès le 60
jour et se poursuit
ème
jusqu'a la fin des mesures au 86
jour. Les taux d'ARN dans les nodosi-
tés de Soja ne diminuent quia partir du 79 ème jour.
L'activité ribonucléase est presque la même dans les deux
types de nodosités au
ème
30
jour, mais celle du Pois diminue ensuite pendant
ème
que chez le Soja elle augmente pour atteindre sa valeur maxiamle au 44
jour.
ème
Vers la fin du cycle, exactement a partir du 65
jour, l 'activité des
nodosités de Soja augmente de nouveau et se maintient au même niveau jusqu1a
la fin de nos mesures au 86ème jour. Ce résultat confirme bien la possibilité
d'hydrolyse des acides nucléiques pendant le développement du Soja; cette
hydrolyse contribue certainement a la formation des uréides dans la plante,
bien qu'il ne soit pas possible, d'après ces données, de déterminer le
degré de cette contribution. La forte activité ARNase des nodosités et sur-
ème
tout le niveau élevé de cette activité au 86
jour de culture permettent
d'expliquer l'accroissement des concentrations en uréides de la sève du
Soja lors de la dégénérescence des nodosités, lorsque l'activité fixatrice
de ces dernières est devenue très faible. Cependant, dans cette expérience
où les uréides ont été dosés uniquement dans les tiges, la forte activité
ARNase ne s'est pas traduite par une augmentation sensible des teneurs
en uréides chez le Soja et encore moins chez le Pois. Dans nos observations
précédentes, l'accroissement du taux d'uréides chez le Soja, accroissement
que nous avons attribué a. l 'hydrolyse des acides nucléiques, est important
surtout au niveau des concentrations de ces substances dans la sève. Tous
les résultats que nous avons exposés antérieurement montrent en effet que
ces concentrations sont en relation directe avec le degré de formatiqn des
uréides dans la nodosité.
Chez le Pois, dont la diminution de la masse des nodosités
est la conséquence probable de la sénescence de ces organes, l'hydrolyse
des ARN ne semble pas
augmenter les teneurs en uréides de la plante, ce
qui est en accord avec l 'hypothêse· ~Iune dégradation complète de ces

---

- 134 -
substances dans les organes souterrains. Le éycle végétatif du Soja peut s'é-
tendre bien au-delà de 90 jours, selon les conditions de culture; nous
.
1 1
~
d
86 ème .
.
d
estlmons que
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e nos mesures au
Jour ne nous a pas permlS
e,
nous rendre compte réellement de 1'hydrolyse des acides nucléiques. L'évolu-
tion de la masse de matière fraîche des nodosités chez cette légumineuse
ème
jusqu'au 58
jour (tabl. XVII) montre que cette masse est en augmentation,
contrairement à celle des nodosités du Pois. La phase active de dégénéres-
cence des nodosités n'était probablement pas encore atteinte chez le Soja.
ème
Il eut donc été judicieux d'étendre les mesures bien au-delà du 86
jour.
Il sera donc indispensable pour étayer ces premières observations de suivre
l'évolution des teneurs en ARN et de l'activité ribonucléase jusqu'au sta-
de ültime de la dégénérescence des nodosités.
Aussi bien chez le Soja que chez le Pois, la dégradation
des acides nucléiques des nodosités sénescentes peut donc bien être à
l'origine de l'élaboration des uréides, mais l'effet de c~tte dégradation
n'est peut-être réellement perceptible que sur les concentrations de ces
composés dans la sève. Cependant, il existe entre les deux plantes, tant
au niveau des teneurs en ARN des nodosités que de leur activité ribonuclé-
ase, une nette différence qui est sans doute un facteur supplémentaire de
la disproportion des teneurs en uréides.
Au cours de la fixation de N , il existe simultanément une
2
synthèse des uréides et de l'asparagine dans les nodosités du Soja comme
dans celles du Pois (REYNOLDS et aZ.~ 1982 a). On ne connaît pas les
facteurs qui orientent la glutamine vers la synthèse de l'asparagine ou
vers celle des purines et des uréides. Les nombreux travaux consacrés à cette
question comme nos propres observations indiquent que les intensités de
la fixation, similaires chez les deux légumineuses que nous avons étu-
diées, ne peuvent être une explication des différences des taux d'uréides.
Les activités enzymatiques conduisant à la formation de ces molécules
sont plus faibles dans les nodosités du Pois que dans celles du Soja, mais
ces différences ne sont significatives que pour la PRPP synthétase et
1'uricase et elles sont beaucoup moins importantes que les écarts des
taux d'uréides dans les tiges des deux plantes comparées. En outre, comme
nous l'avons signalé antérieurement, l'accumulation des uréides dans un organe
au cuurs d'une lon~ue période, n'est pas forcément un reflet fidèle de l'intensi-

---

- 135 -
té de leur biosynthèse: les différences de cette intensité peuvent être
encore plus accentuées que celles de l'accumulation. Enfin, les teneurs en
sucres des nodosités de Pois, au moins dans nos conditions expérimentales,
étaient plus élevées que chez le Soja; elles ne sont donc pas une cause
de la faible biosynthèse des uréides, d'autant plus 9lle la synth~se d~_l laspara-
gine exige plus d'atomes de carbone par atome d'azote. Par conséquent, la
présence de 1'allantoïcase dans les nodosités et dans les racines des
légumineuses à amides et son absence dans le cas des légumineuses à uréi-
des nous para't être une des causes majeures de la différence
entre ces
deux types de plantes. La prépondérance des uréides, qui à certaines pé-
riodes peuvent représenter près de 90 % de 1(azote de la sève chez le
Soja, pourrait être la conséquence des fortes activités PRPP synthétase
et uri case et du fait que l'asparagine, contrairement à l'acide allantoï-
que peut être métabolisé et incorporé dans les protéines des organes souter-
rains. L'utilisation du 15 N2 permettra de confirmer la ~alidité de ces
hypothèses.
II - INFLUENCE DE LA SOUCHE DE RHIZOBIUM JAPONICUM SUR
LA PRODUCTION D'UREIDES CHEZ LE SOJA EN PRESENCE OU
NON D'AZOTE MINERAL
Dans la synthèse des uréides par les légumineuses qui produi-
sent de fortes quantités de ces substances, les rôles respectifs de la
nodulation et de l'activité nitrogénase proprement dite sont encore dif-
ficiles à discerner. Comme dans l'activité fixatrice, elle-même, la bacté-
rie et la plante contribuent mutuellement à la formation des uréides.
L'azote est fourni par la bactérie qui en a assuré la réduction; les en-
zymes responsables du métabolisme des uréides sont des protéines de la plan-
te-hôte (TRIPLETT et al., 1980 ; HANKS et al., 1981 b ; BOLAND et al., 1982).
Cette symbiose entre la plante et la bactérie pour l'élaboration des uréi-
des explique qu'aucun des deux partenaires ne soit capable de fabriquer à
lui seul ses substances. Une plante de Soja ou de Vigna dépourvue 'de
nodosités ne peut produire des uréides ou n'en produit que de faibles
quantités. De même, une souche de Rhizobium qui produit des uréides en
association avec la plante n'est pas apte, en culture libre de synthétiser
ces molécules (TAJIMAet YAMAMOTO, 1975) (1)
(1) Plusieurs essais entrepris également dans ce sens au cours de ce tra-
vail en utilisant différents composés puriques comme sources d'azote à
la place du glutamate du milieu Bergersen, ont donné des résultats con-
tradictoires.

---

-136-
EXPERIENCE A
Une seule dose est apportée dès le dé~ut de la culture.
.
_ [ a
(NO)
_ _ _ _ _ _ tJ03
SOJA HODGSmJ
]_
."
.
3,6 mM(N 50 )
inoculé avec BI
[
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(NO)
.
4
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3,6 rrlvl(N
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50
EXPERIENCE B
L'azote est apporté à partir du 42ème jour de culture
pendant 3 jours.
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N0
5
3
7,5
-
LO
SOJA HODGSON ]
1
mM
nodulé par G1
2,5
-
, - - - - - - - - - - - NH +
5
4
7,5
-
la
La mesure de l'activité nitrogénase et les prélèvements d'échantillons
ème
ont été effectués le 45
jour de culture dans les deux expériences.

---

- 137 -
Dans cette association, le rôle de la bactérie étant d'ap-
porter de l'azote réduit, on peut penser que des plantes généralement pro-
ductrices d'uréides comme le Soja ou le Niébé, pourvues de nodosités peu
ou non efficientes, puissent former en présence d'azote réduit exogène
(NH +), des quantités d'uréides comparables
4
à celles produites par une as-
sociation efficiente. De plus, la nitrate réductase étant généralement
présente dans les bactéroïdes (KENNEDY et aZ.~ 1975), et dans les tissus
nodulaires, de telles associations non efficientes doivent également pou-
voir former des uréides à partir de N0 - du milieu.
3
Dans cet esprit, nous avons inoculé le Soja avec une sou-
che peu fixatrice G (mutant spontané de la souche 31 lB 100, USDA.
1
Beltsville, USA) en présence ou non de N0 - ou NH +. Les plantes ont été
3
4
cultivées en même temps et dans les mêmes conditions que celles nodulées
par G et utilisées pour étudier l'effet de N0 - et de NH + sur la synthèse
3
3
4
des uréides chez une association fixatrice (chapitre III, paragraphe II).
Les plantes nodulées par G1 proviennent donc également de deux expériences
A et B, dont les protocoles sont donnés par le schéma ci-contre. Dans
l'expérience A, 50 mg (3,6 mM) d'azote sous forme de KN0
ou NH Cl ont
3
4
été apportés par litre de solution nutritive aux plantes dès la germina-
tion. Dans l'expérience B, des plantes inoculées avec G ont été cultivées
1
en.présence de 1 mM d'azote (N0 - ou NH
3
+) depuis la germination jusqu'au
4
eme
42
jour, à partir duquel différentes doses de N-N0 - ou N-NH + ~1-2,5-5­
3
4
eme
7,5 et 10 mM) ont été apportées aux plantes pendant 3 jours. Au 45
jour,
dans les deux expériences, la mesure de l'activité nitrogénase a été effec-
tuée et les échantillons de sève et d'organes prélevés. Il s'agit dans cet-
te étude de comparer la production d'uréides par une association Soja-Rhizo-
bium peu efficiente à celle d'une association efficiente avec la même
plante. Les résultats du chapitre III, paragraphe II,nous serviront donc de
base de comparaison. Certains de ses résultats seront donc reproduits de
nouveau dans ce paragraphe, en regard de ceux relatifs aux plantes nodu-
lées par G .
1
A - Nodulation, activité fixatrice et développement
des plantes associées à la souche G1
1 - Nodulation et développement des plantes
L'inoculation du Soja avec la souche peu fixatrice G entraî-
1
ne une nodulation normale et les nombres de nodositésforrrÙ;~es par cette
souche sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus habituellement sur

---

- 138 -
le Soja avec une souche fixatrice. Ces ,nombres de nodosités ne sont pas de
plus, affectés par l'apport de 3,6 mM d'azote minéral depuis le semis et
encore moins par les différentes doses d'azote apportées pendant trois
jours lors de l'expérience B. Quant aux poids de matière sèche, ils sont
généralement deux à trois fois plus faibles que ceux des nodosités de la
souche fixatrice G , mais ils sont sensiblement augmentés
par le NH
3
4+.
Par rapport à la souche G , les nodosités de G sont petites et d'aspect
3
1
rougeâtre. Le tableau XIX donne les valeurs des principales caractéristiques
des plantes de Soja nodulées par G , avec ou sans fourniture
d'azote combi-
1
Dé sous forme de nitrate ou d'ammonium, pendant la première culture (A).
D'après ces résultats, le développement des plantes est fortement affecté
à la fois par l'apport d'azote combiné et par la souche peu fixatrice G .
1
L'ammonium et le nitrate augmentent significativement et d'une manière
semblable, la masse de matière sèche produite. Cette stimulation du dévelop-
pement par l'apport d'azote combiné a également été observée même chez
les plantes nodulées par la souche fixatrice G . Mais en présence de la
3
souche peu fixatrice, le développement des plantes est plus faible que
celui des plantes associées à une souche fixatrice G , malgré l'apport
3
aux deux groupes de plantes d'une même quantité d'azote largement suffisan-
te pour permettre une croissance normale.
2 - Activité fixatrice des plantes
a. Expérience A
En l'absence de tout azote exogène, l'activité fixatrice des
plantes nodulées par G est environ dix fois plus faible que celle des
1
plante~ associées à la souche fixatrice G dans les deux traitements N0
3
3
et NH
puisqu'au cours de cette expérience chacun des deux traitements
4
avait un témoin sans azote. L'apport de 3,6 mM de N-N0 - diminue cette
3
activité. Mais cette diminution n'est que de 30 %alors qu1elle est de
57 %dans les mêmes conditions chez les plantes associées à G . Dans le
3
traitement NH4+, l'activité de ces dernières est. inhibée de 63 %, mais ce
composé semble plutôt stimuler l'activité fixatrice des nodosités de G1
(tabl. XIX). Contrairement à la souche fixatrice, la faible activité de
G n'est pas significativement modifiée par l'apport d'une dose de l'ordre
1
de 3,6 mM de N-N0 - ou
de N-NH
3
+, même si cette dose a été apportée
4
quotidiennement pendant 45 jours (tabl. XIX). L'augmentation de cette fai-
ble activité par l'apport de NH + n'est qu'appare~te. Elle est due au fait
4

---

- 139 -
que le développement des nodosités à été favorisé par l'apport de cet ion
leur masse de matière sèche voisine de 50 mg par plante dans les tois au-
tres traitements est de 73,7 mg dans ce cas (tabl. XIX). Mais les valeurs
des activités spécifiques (par unité de poids de matière sèche des nodo-
sités) n'ont pas augmenté. Par contre, la différence entre l'activité des
nodosités de G et celle des nodosités de G n'est pas due à une différence
1
3
de poids de matière sèche de ces organes. Les activités specifiques sont
également très diff~rentes.
rab l eau XIX
Infl uence de l'azote mi néra 1 sur 11 acti vi té fi xa tri ce et 1es
paramètres liés au développement du Soja inoculé avec une sou-
che à capacité fixatrice faible, G N-M0 - et N-NH +, respec-
1
3
4
ti vement sous forme de KN0
et de NH Cl, sont apportés dès 1e
3
4
début de la culture à raison de 50 mg dlazote par litre de
solution nutritive (expérience A).
NO -
NH +
3
4
N50
N50
NO
N
-N- X 100
- X 100
50
NO
N
1
50
0
NO
-1
-1
C2H 4 (nmo 1. h
. pl)
346,0
245,0
70,8
285,0
389,0
136,5
Nombre de nodosités( .p1- 1)
41,0
37,0
90,2
47,7
54,0
113,2
MS des nodosités (mg.pl-l)
44,7
54,8
122,6
49,1
73,7
150,1
MS des
-1
plantes (mg.pl
)
429,5
1333,4
310,5
380,6
1156,0
303,7
b. Expérience B
Plusieurs doses ont été apportées à des plantes qui ont reçu
depuis le début de la culture, un minimum d1azote (1 mM) pour leur permettre
un minimum de développement. Il n'existe donc pas de plantes-témoins sans
azote dans cette expérience. Au moment de l lapport des différentes doses
d'azote minéral (42ème jour) la nodulation était déjà bien installée. Il
paraît donc normal que cet apport tardif niait pas eu d'effet dépressif
sur la nodulation, comme nous l'avor.s précisé antérieurement, même à la
concentration de 10 mM. Ceper.dant il a affecté l'activité fixatîice des

---

- 140 -
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1
10
Z
Z
1
0,1
0,3
0,5
0,1
0,3
0,5
C 2 H4 (JJmol. h-: pl-1)
FigUI'e 45- Effet de NOi ( 0
) et de NH +
( •
) su,r l'activité nit-.i'ogénase (A)~
4
les concentrations en uréides de ùx sève (B) et sur les relations
entre l'activité nitrogénase et les teneurs en uréides dans les
traitements N0 -
(C) et NH!
(D) chez le Soja Hodgson nodulé par G
3
l
(expérience B). Les équations des droites C et D sont respectivement
Y
= 43~5 x + 17~3 (r =O~91) et Yd = 7? x + 11~7 (rd'=O~64)
c
c

---

- 141 -
plantes dans les deux traitements (N0 - et NH +) dont les effets três dif-
3
4
férents (fig. 45 A) sont néanmoins moins marqués que sur la souche fixa-
trice G . A la fin des traitements et
3
à la plus forte concentration d'azote
minéral (10 mM), par exemple, le N0 - et le NH + ont en effet diminué
3
4
l'activité fixatrice de 83 %et 48 % respectivement, par rapport aux plan-
tes n'ayant reçu que 1 mM d'azote (fig. 45 A).
B - Teneurs des plantes en uréides et en acides aminés
,
Le Soja nodulé par la souche peu fixatrice G a une activi-
1
té três réduite qui ne représente que le dixième de l'activité normale
d'une association fixatrice. Cette faible capacité fixatrice se traduit
par une faible synthêse des uréides dont les concentrations dans la sêve dimi~
nuent également lorsque les plantes sont soumises à une nutrition nitri-
que ou ammoniacale.
1 - Concentrations en N-uréides et N aminé de
la sève
En l'absence de tout azote combiné, les plantes nodulées
par la souche G transportent environ 10
1
à 18 fois moins d'azote uréidi-
que que les plantes associées à la souche G (fig. 46 A et B). L'apport
3
d'azote nitrique ou ammoniacal diminue sensiblement les concentrations en
uréides .de la sêve (fig. 45 B ; fig. 46 B). Lorsque plusieurs doses d'a-
zote minéral sont fournies aux plantes, comme dans l'expérience B, ces
concentrations diminuent proportionnellement à la dose d'azote (fig. 45 B)
et la diminution simultanée de l'activité fixatrice et de ces concentra-
tions entraîne une bonne corrélation entre les deux paramètres malgré
leurs faibles valeurs (fig. 45 C et D). Dans ces mêmes conditions, les
quantités transportées par plante et par heure varient également, mais
différemment des concentrations dans la sève. Lorsque les plantes ont reçu
une seule dose d'azote minéral, ces quantités ont diminué en présence de
N0 -, mais augmenté sous l'influence de NH + (fig. 46 B). En apportant plu-
3
4
-
+
sieurs doses de N0
ou de NH
' on observe de nouveau une nette augmen-
3
4
tation des quantités transportées en présence de NH4+, tandis qu'avec le
N0 - la variation· est plus faible (fig. 47 B). Cet accroissement des
3
quantités transportées est dû, comme nous l'avons expliqué p~ur l'associa-
tion Soja-G ,
3 à une plus grande exudation des plantes dans les deux trai-
tements N0 3 et NH + (fig. 47 A). L'augmentation du taux.d'exudation é-
4
tant beaucoup plus forte que la diminution des concentrations, il résulte
de l'apport des deux ions, un accroissement des quantités d'uréides trans-

---

- 142 -
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NH,4
N03
NH4,
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Figure

---

- 143 -
portées par l~s plantes. La fraction uréidique de l'azote de la plante étant
en général incorporée de préférence dans les gousses, l'augmentation de
cette fraction peut représenter un aspect bénéfique de 1 rapport d'azote
minéral et notamment de 1 lion NH +.
4
Les concentrations d'acides aminés dans la sève des plantes
nodulées par G sont comparables
1
à celles de la sève des plantes associées
à G , en l'absence d'azote exogène (tabl. XX). L'apport de NH
3
4+ provoque
chez les plantes fixatrices, une plus forte augmentation de cette fraction
aminée. En présence de N0 -, les proportions d'acides aminés restent iden-
3
tiques dans la sève des plantes des deux associations. Il existe cependant
entre les deux groupes de plantes et au niveau des taux d'exportation de
l'azote aminé, une différence quantitative qui peut être attribuée à la moindre
quantité de sève transportée par les plantes associées à la souche G .
1
Les plantes inoculées avec l'une ou l'autre des deux souches transportent
donc des quantités comparables diacides aminés dans un volume donné;le flux de
sève exudé par les plantes est en effet proportionnel à leur développement.
Tableau XX
-
+
Effet de N0
et NH
sur les concentrations en N aminé de
3
4
la sève de Soja Hogdson inoculé avec la souche G (expérience A).
1
Sources d'azote
Concentration
Taux d'exportation
-1
-1
-1
(~g.ml
)
(~g.h
.pl
)
NO
N50
NO
N50
N0
77,6 + 11,5
49,2 ± 5,6
6,9 + 1,0
4,8 ± 0,6
3
-
-
NH +
36,8 +
3,6
74,0 ±17,9
1,6 + 0,7
8,5 + 1,1
4
-
-
-
Les fractions uréidique
et aminée
de l'azote soluble
de la sève sont donc variables suivant la souche bactérienne et la source
d'azote combiné. Le nitrate et l'ammonium diminuent les concentrations
de l'azote uréidique de la sève des plantes quelle que soit la souche à
laquelle celles-ci sont associées, Le nitrate n'apporte pas de modification
notable de la fraction aminée chez les plantes associées à G , alors qu'il
1
l'augmente légèrement chez les plantes nodulées pdr G , L'ammonium par
3
contre, accroît les concentrations de N aminé dans la sève des plantes

---

- 144 -
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(e-e) et
Cl
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-100
d'exu~ation (A)~ les quantités
en
d'uréides (B) et les teneurs
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en uréides de la tige (C) de3
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1
1
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plantes de Soja nodulées par
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..- ........ -
la souche Cl (expérience B).
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Z
1
3
5
7
9
NO"3 ou NH 4. (mM)

---

- 145 -
inoculées avec les deux souches.
En l'absence de tout composé azoté, la presque totalité de
l lazote soluble de la sève de l lassociation fixatrice est constituée de
l'azote uréidique. Chez les plantes en association avec G , il Y a une
1
répartition sensiblement égale de l'azote soluble entre les fractions
aminée et uréidique.
2 - Accumulation des uréides dans les organes
du Soja nodulé par G .
1
Le tableau XXI donne le-résultat du dosage des uréides dans
les nodosités, les racines et les feuilles des plantes nodulées par G ,
1
lors de la première expérience (A). Pendant la deuxième expérience, ces
composés nlont été dosés que dans la tige
et les feuilles. La figure 47 C
traduit leur accumulation dans la tige en fonction des différentes doses
de N0 - et de NH +
3
4
L'accumulation des uréides a toujours été plus faible dans
les organes des plantes nodulées par G , par comparaison avec les plantes
1
associées a G . Cette différence entre les deux associations est plus im-
3
portante au niveau des teneurs des nodosités (tabl. XVI et XXI). L'ali-
mentation nitrique entraîne une diminution des teneurs en uréides des organes
Cette dimi~uii~n est fonti~n de la richesse préalable dei organ~s-en
uréides. Dans la tige (fig. 47 C), l'apport de cet ion n'a pas modifié la
teneur en uréides, malgré les doses croissantes apportées au cours de ce
traitement. La nutrition ammoniacale a eu plutôt un effet inverse de
celui de N0 -. Avec cette forme de nutrition, on observe une augmentation des
3
quantités d'ùtéides des nodosités et des racines lors de l'expérience A
(tabl. XXI) ainsi que 'de la tige pendant l'expérience B (fig. 47 C).
Dans les feuilles, l'ammonium a eu peu d'influence sur les
teneurs en uréides lorsque 3,6 mM ont été apportées aux plantes (tabl. XXI).
Lors de la seconde expérience (résultat non représenté), une augmentation
sensible des teneurs a été obtenue dans ces organes, conformément aux
observations de FUJIHARA et al., 1977), mais aux doses de 7,5 et la mM de
+
NH
•
4

---

- 146 -
-
+
Tableau XXI
Effet de N0
et NH . sur l'accumulation des uréides dans
3
4
les différents organes du Soja inoculé avec la souche G1.
N-N0 - et N-NH +, à raison de 50 mg.l- 1 sont apportés
dès
3
4
le début de la culture (expérience A). Les teneurs sont
eu ~g N-uréides g-lMF ).
-
NO
N0
NH +
Organes
3
4
Nodosité
83,3 + 8,6
51,2 + 13,1
123,8 ~ 12,0 .
-
Racine
15,2 + 2,1
9,8 + 1,5
27,3 + 6,8
-
-
Feuille
116,8 + 5,9
66,4 + 4,9
94,5 + 26,2
-
-
-
C - Enzymes du métabolisme des uréides dans les
nodosités formées par G .
1
Il s'agissait d'étudier l'induction de la synthèse des uréi-
des par la souche G ; seules les activités XDH, uricase et allantoinase
1
des nodosités ont donc été mesurées. Ces activités ont été comparées récem-
1
l11e~.)~·.à.celles des nodosités formées par G3 (ZENGBE et aZ.~ 1983). Celles
d~ la:XDH et de 1 'uricase sont environ deux fois moins élevées dans les
nodosités de G . La différence des masses des nodosités que nous avons déja
1
signalée ne peut pas être à l'origine de cette différence dans ces activités
XDH et uricase car les activités spécifiques fmg- 1 de protéines) sont, elles
aussi significativement différentes. L'activit~ PRPP synthétase nia pas
été mesurée dans les nodosités; vraisemblablement elle devrait être beau-
coup plus faible dans les nodosités formées par G . En effet les concen-
1
trations d'uréides dans la sève des plantes nodulées par G sont environ
1
10 fois plus faibles que celles de l'association très fixatrice, or les
activités XDH et uricase ne sont, elles, que deux fois plus faibles. Cela
suggère donc que la fourniture des substrats aux enzymes de la synthèse
des uréides est le princiapl facteur limitant de leur formation.
Les activités allantoinase des nodosités de G et G sont
3
1
équivalentes (fig. 48 A), malgré les différences entre les activités XDH
et uricase. Ceci pourrait expliquer la prépondérance de l'acide allantoi-
que dans la sève des plantes associées à G (fig. 48 B).
1
Au cours de cette étude, 1'allantoicase nIa été décelée
que dans les racines des plantes nodulées par G . Cette activité de l'or-
1

---

- 147 -
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.Figure 48- Activité aZZantoinase (A) et proportions d'acide aZZantoique (B)
chez des pZantes de Soja associées aux souches G3 et G en présence
7
ou non de NO.~ ou de NBt (expérience A). Les rectangZ~s en pointiUés
(A) représentent Z'éche~Ze de droite.

---

- 148 -
dre de celle que nous avons mesurée antérieurement dans les feuilles du
Soja fixateur, peut accentuer la différence entre les deux associations,
en contribuant à l 'hydrolyse des faibles quantités d'acide allantoïque.
La nutrition nitrique ou ammoniacale n'a pas apporté de
modifications significatives de ces activités enzymatiques, même, lorsque
des doses croissantes de N0 - ou de NH + ont été apportées aux plantes.
3
4
Les deux souches de RhizobiUm
japonicum~ G et G
3
, utili-
1
sées au cours de ce travail nodulent normalement le Soja, mais elles n'en-
traînent pas pour autant les mêmes productions d'uréides. Seule, l'asso-
ciation efficiente Soja-G
fournit une quantité importante de ces substan-
3
ces. Malgré une nodulation convenable,les plantes inoculées avec G ne
1
produisent que très peu d'uréides, même lorsqu1elles reçoivent de l'ammonium
exogène, à cause probablement d'une déficience du métabolisme des purines.
On pourrait attribuer la faible production d'uréides par la souche G dans
1
les traitements sans azote à une insuffisance de la formation d'ammonium
due à la faible activité fixatrice des nodosités de cette souche. En présen-
ce de N0 -, l'activité nitrate réductase des bactéroïdes de ces nodosités
3
pourrait être déficiente. Mais ces explications ne sont plus valables lorsque
l'ammonium est fourni directement aux nodosités par la solution nutritive.
Il n'y a aucune raison à priori, pour que la pénétration de NH4+ dans les
nodosités soit modifiée par la souche bactérienne. Les racines et les nodo-
sités des plantes associées à G ou G absorbent et incorporent certainement
3
1
l'ammonium de façon tout à fait identique puisque les concentrations en
azote aminé des sèves sont très
comparables chez les deux associations
symbiotiques. Puisque la production d'uréides reste toujours insignifiante
chez le Soja nodulé par la souche peu fixatrice, l'insuffisance de la synthè-
se des purines est l'explication la plus simple de ces observations.
Le niveau d'activité des enzymes responsables de la dégra-
dation des purines dépendrait donc très fortement de la souche de
Rhizobium associée à la plante-hôte, comme le suggèrent les différences
d'activité spécifiques observées entre les associations des deux souches
G3 et G avec le Soja.
1
III CONCLUSION
Cette comparaison entre le Soja nodulé par la souche fixatri-
ce G3 et le Pois d1une part, et d'autre part entre deux systèmes symbio-
tiques de capacités fixatrices très différentes permet de faire un rappro-

---

- 149 -
chement entre les plantes à amides et le Soja nodulé par une souche
peu
fixatrice. Une des différences entre le Soja, nodulé par une souche fixatri-
ce, donc producteur d'uréides, et ces deux associations qui n'en produi-
sent que très peu, est la plus faible activité de l'équipement enzymatique res-
ponsable de la synthèse et du catabolisme des purines. Dans le cas du Pois
et des autres légumineuses à amides, la fixation biologique est aussi effica-
ce que chez les plantes à uréides. Le transport de l'azote sous forme d'as-
paragine ou sous forme d'uréides est vraisemblablement une caractéristique
génétique comme l'absence ou la présence de l 'allantoicase dans les nodosi-
tés. Par contre chez le Soja, la souche bactérienne présente dans les nodo-
sités commande non seulement l'activité fixatrice mais aussi le niveau
d'activité des enzymes de la biosynthèse des uréides: la bactérie aurait
donc une influence sur la formation de certaines protéines dans les cellules
de la plante-hôte. Il est connu que les bactéroides induisent la formation
de protéines appelées nodulines qui sont donc une conséquence de la sym-
bi ose (VERMA et al. ~ 1983).
Les teneurs en ARN des nodosités de Soja et de Pois sont
élevées. Mais l'activité ribonucléase des nodosités est plus forte chez le
Soja pendant tout le cycle de développement. L'hydrolyse des acides nu-
cléiques, certainement plus intense lors de la sénescence des nodosités, peut
aussi se produire pendant la période normale du développement du Soja.

---

- 150 -
DISCUSSIor~
Dans l'exposé de nos résul tats, nous avons donné une con-
clusion brève a la fin de chaque chapitre pour faire ressortir les prin-
cipaux points. Dans cette partie, nous nous proposons de discuter cer-
tains résultats, en fonction de l'importance et du rôle des uréides dans
le métabo li sme de l'azote fi xé chez les l égumi neuses .
Chez les végétaux supérieurs, l'azote est généralement
assimilé sous forme d'acides aminés ou d'amides. Ceci reste vrai pour la
majorité des légumineuses. lîais chez celles de la tribu des Phaseoleae
représentées par le Soja, le Vigna et le Haricot ... ), les acides aminés
ne représentent qu'une fraction minoritaire de l'azote soluble de la
sève constitué presque exclusivement d'uréides glyoxyliques, allantoïne
et acide allantoïque, lorsque la fixation de N est importante. Ces com-
Z
posés ont également été observés chez plusieurs familles, mais, c'est
chez les légumineuses qui en produisent que leur étude a été plus ap-
profondie.
l - LEGUMINEUSES A URE IDES ET LEGUMINEUSES A AMIDES
Le rapport entre les teneurs en uréides des plantes de
Soja et celles des plantes de Pois, par exemple peut atteindre des va-
leurs voisines de 100 lorsque la production d'uréides est maximale chez
le Soja. Cette énorme différence entre ces deux groupes de plantes avait
été attribuée a la différence des niveaux d'activités des enzymes de la
biosynthèse et de la dégradation des purines (REYNOLDS et al., 1982 a;
Aspartate
Asparag ine
t - - - -.... Glutamine
r - - - - - w Ureides
" ' - - - '

---

- 151 -
CHRISTENSEN et JOCHIMSEN, 1983). Chez les légumineuses à amides, cette ca-
pacité de synthétiser des purines ne représenterait que 0,1 à 0,5% de cel-
le des plantes à uréides (ATKINS et al., 1982 a). Cela implique une incor-
poration préférentielle dans la molécule d'IMP, de la glutamine issue de
N chez les légumineuses à uréides dont les nodosités contiennent égale-
2
ment de plus fortes activités XDH, uricase et allantoïnase. Les différen-
ces que nous avons observées entre ces deux groupes de plantes au niveau
de l'incorporation de la glutamine d'abord, et ensuite de la dégradation
des bases puriques notamment, ne permettent pas d'expliquer à elles seu-
les, la très grande disparité entre les deux voies d'incorporation de
l'ammoniac. Le Soja et le Pois fixent des quantités presque équivalentes
de N dans les conditions similaires; or l'activité PRPP synthétase des
2
nodosités du Pois n'est que 10 fois plus faible que celle des nodosités
de Soja au 44e jour, alors que les quantités d'uréides accumulées dans
les tiges sont environ 100 fois plus faibles~ à un stade où l'activité
fixatrice du Pois, qui avait probablement atteint son maximum plus tôt
que celle du Soja, est en décroissance. Des trois autres enzymes, XDH,
uri case et allantoïnase, dont les activités ont également été mesurées,
seule l'uricase a une activité 24 fois plus élevée dans les nodosités
de Soja que dans celles du Pois. Ce résultat, semblable à celui de
CHRISTENSEN et JOCHIMSEN (1983) prouverait que l'activité uricase est
l'une des principales étapes limitantes dans la dégradation des purines
chez les plantes à amides, puisque nous n'avons pas mesuré toutes les
activités des enzymes qui catalysent les étapes de la synthèse des pu-
rines et de leur dégradation.
Deux autres différences observées au cours de ce travail,
entre les plantes à uréides et celles à amides, nous parraissent aussi
fondamentales que les niveaux d'activités des enzymes de la biosynthèse
et du catabolisme des purines:
T. L'allantoïcase qui dégrade la forme prédominante des
uréides, l'acide allantoïque, n'a été détectée que dans les nodosités et
les racines des plantes à amides. Chez ces plantes, non seulement la syn-
thèse des uréides serait limitée en raison de l'incorporation d'une part
moins importante de la glutamine dans les purines, mais les uréides formés
seraient en plus dégradés sur place par l 'allantoïcase dont la présence ou
l'absence dans les organes souterrains des légumineuses seraient alors un

---

- 152 -
facteur essentiel pour déterminer la forme de transport de l'azote fixé.
L'adjonction d'une voie de synthèse et de dégradation des
+
purines, parallèlement â la voie d'incorporation de NH
dans l'asparagine,
4
exige la présence de nombreuses enzymes et une consommation d'énergie
dont une partie seulement est récupérée au moment de la formation des
uréides. Nénamoins, nous avons constaté que les nodosités du Pois, mal-
grè cette dépense énergétique supplémentaire, avaient des teneurs en su-
cres plus élevées que celles du Soja: l'approvisionnement énergétique
de la nitrogénase ne semble donc pas affecté. D'autres travaux indiquent
d'ailleurs que la consommation de carbone dans le fonctionnement des
nodosités est plus élevée chez une plante â amides que chez une pl?nte
â uréides (LAYZELL et al., 1979).
2. L'activité ribonucléase des nodosités de Soja est plus
forte que celle des nodosités du Pois. Cette moindre activité chez le
Pois entrainerait une hydrolyse moins intense des acides nucléiques des
nodosités, source de bases azotées dont la dégradation peut contribuer
â la formation des uréides.
La structure des nodosités décrite par SPRENT {1980) peut
aussi être liée â la différence entre les deux groupes de plantes.
L'ensemble de ces facteurs, plus que l 'un dieux pris iso-
lément, explique la différence entre les deux types de plantes en ce qui
concerne le mode de transport de l'azote fixé. On ignore cependant quel-
les sont les conditions évolutives qui ont conduit a cette différencia-
tian: la faible solubilité des uréides â basse température a été par-
fois avancée comme la cause de leur absence chez les légumineuses tem-
pérées.
Le niveau des capacités enzymatiques est un élément de
raisonnement pour expliquer les différences entre légumineuses â uréides
et légumineuses â amides. Cependant, nous ne savons pas si, in vivo, les
enzymes concernées fonctionnent effectivement â leurs vitesses maximales
leurs activités réelles, dans les tissus, peuvent être très inférieures
â leurs capacités. Par contre l'absence d1une activité allantoïcase dé-
tectable dans les nodosités des plantes â uréides est bien une preuve
que ces nodosités ne peuvent pas dégrader l'acide allantoïque ; celui-
ci est ainsi disponible pour la translocation vers les parties aérien-

---

- 153 -
nes, seules capables, dans ces conditions, de récupérer pour la synthèse.
des acides aminés l lazote réduit qu'il contient. Inversement, la présen-
ce de cette enzyme dans les nodosités et les racines des plantes à ami-
des (et avec une capacité aussi élevée que celles des organes qui hydro-
lysent activement l 'acide allantoïque) permet de co~prendre l 1 absence
quasi totale des uréides dans la sève de ces plantes.
II - SYNTHESE DES UREIDES ET EVOLUTION DE LEURS TENEURS
AU COURS DU DEVELOPPEMENT DU SOJA
Chez le Soja nodulé par une souche fixatrice, la synthèse
des uréides est particulièrement intense. Cette biosynthèse qui se pro-
duit dans les nodosités implique le catabolisme des purines (FUJIHARA
et YAMAGUCHI, 1978 b ; ATKINS et al., 1980). Les enzymes responsables
de ce catabolisme sont donc localisées dans les nodosités, au sein
desquelles TAJI~~ et YAMAMOTO (1975) et TAJIMA et al., (1977) avaient
d'abord associé la XDH à la "fraction nucléaire " , l 'uricase aux bacté-
roïdes, et conclu à la localisation de la synthèse des uréides dans les
bactéroïdes (TAJIMA et al., 1977). Nos résultats,ainsi que beaucoup
d'autres, (TRIPLETT et al., 1980 ; HANKS et al., 1981 b ; BOLAND et al.,
1982) révèlent nettement que la synthèse des uréides a lieu dans la
fraction soluble des nodosités. Ces résultats sont confirmés par le
fait que le NH~ formé dans les bactéroïdes à partir de N2 est libéré
dans le cytosol (BERGERSEN et TURNER, 1967) avant d'être assimilé sous
forme de glutamine. Il paraîtrait donc peu vraisemblable que l'incorpo-
ration de la glutamine dans la molécule d'IMP et la dégradation de cel-
le-ci se produisent dans les bactéroïdes.
Parmi les enzymes du catabolisme purique, nous avons étu-
dié la XDH, l'uricase et l 'allantoïnase dans les nodosités du Soja. La
présence dans la partie souterraine et notamment dans les nodosités de
l 'allantoïnase qui dégrade le premier terme des uréides, l'allantoïne,
explique que les uréides transportés par la sève xylémique du Soja et
accumulés dans les organes aériens soient constitués en grande partie
diacide allantoïque.

---

- 154 -
1. Evolution des concentrations de la sève et des teneurs
de la plante en uréides.
Si l 'allantoïnase existe dans les nodosités, nos résultats
ont confirmé que l'allantoïcase est totalement absente de ces organes. Les
uréides ne sont donc entièrement dégradés que dans les parties aériennes
de la plante où ils s'accumulent également. Pendant le développement du
Soja, leurs concentrations dans la sève et leurs teneurs dans la plante
augmentent avec l'âge de la plante et l 'activité fixatrice. Il en est de
même des quantités de ces substances transportées par heure et par plante.
Mais cet accroissement en fonction de l'activité nitrogénase est limité.
Dans la plupart des expériences réalisées au cours de ce travail, ces
concentrations, ces teneurs, et ces quantités d'uréides atteignent leurs
valeurs maximales entre les 40e et 50e jours de culture, au moment de la
floraison, suivant les conditions de culture. Elles baissent ensuite pen-
dant que l'activité nitrogénase continue à croître (fig. 15 et 16, chap.
1). De même, en fin de cycle, les concentrations en uréides de la sève
augmentent de nouveau alors que la fixation biologique est devenue né-
gligeable. Cette augmentation qui ne semble avoir aucun rapport avec les
variations du flux de sève suggère que les uréides présents dans la sève
à ce stade pourraient provenir de la dégradation des acides nucléiques à
la sénescence des nodosités. Cette possibilité a également été avancée
par SCHUBERT (1981 a). A l'appui de cette hypothèse, les quantités d'ARN
et surtout l'activité ribonucléase des nodosités de Soja sont plus éle-
vées que celles des nodosités de Pois. L'augmentation de l'activité ribo-
nucléase chez le Soja, également en fin de cycle, est un argument supplé-
mentaire en faveur de cette origine possible des uréides, même si elle
ne se traduit pas par une augmentation parallèle des teneurs de la tige
en ces substances. Les nodosités de Soja, jusqu'à leur sénescence, renfer-
ment également de fortes quantités d'azote. Dans l'une des expériences
que nous avons réali~ée sur cette plante, la teneur en azote total des
nodosités se situe encore autour de la mg.g- 1MF au 96e jour de culture.
Au moment du vieillissement de ces nodosités, il est donc tout à fait
possible que cet azote soit remobilisé au profit des gousses, également
sous forme d'uréides. Ces observations attestent que les uréides rencon-
trés dans les plantes de Soja ne sont pas tous issus de l'azote fixé.
-
Leur présence chez des plantes autres que des légumineuses (TRACEY 1955,
BOLLARD, 1957) corrobore cette hypothèse.

---

- 155 -
2. Effet de l'apport de l'azote exogène sur les taux d'uré-
ides de la plante.
Chez le Soja cultivé en l'absence de tout azote exogène,
la majeure partie de l'azote fixé est métabolisée sous forme d'uréides
après l'installation des nodosités: les autres composés azotés représen-
tent une fraction minime de l'azote soluble. Lorsque la plante reçoit de
l'azote exogène, l'inhibition de l'activité fixatrice qui en résulte pro-
voque également une diminution de la concentration en uréides de la sève
ou dans les différents organes du Soja (MATSUMOTO et al., 1977 b ; Mc
CLURE et ISRAEL, 1979 ). Dans les expériences de ces auteurs, l'azote,
uniquement sous forme NO;, a été apporté depuis le début de la culture
et la réduction des teneurs en uréides a été alors attribuée à une inhi-
bition de la nodulation. Même lorsque l'azote est apporté durant la cul-
ture, à un moment où les nodosités sont déjà installées, il y a inhibi-
tion de la synthèse des uréides dont les concentrations dans la sève
diminuent (chapitre III, paragraphe II) : cette diminution des concen-
trations, parallèle
à celle de l'activité fixatrice est fonction des
doses d'azote apportées et de la nature du composé azoté, comme nous
l'avons indiqué dans le chapitre III, paragraphe II. L'azote, sous forme
de NH: ne diminue que l 'activité fixatrice et les concentrations en uré-
ides de la sève; par contre, les quantités d'uréides transportées par
heure et par plante restent constantes (fig. 33 D) et, dans les organes
les taux d'uréides sont constants dans la tige et augmentent même dans
les feuilles. Ce phénomène est beaucoup plus acdentué chez le Soja as-
socié à une souche peu fixatrice. Chez une telle association, l'apport
de NH: augmente les quantités transportées (fig. 47 B) mais également
les taux de ces composés dans la tige (fig. 47 C). Le maintien à un
niveau constant où l'augmentation des quantités d'uréides transportées
peuvent s'expliquer par une plus forte exudation, mais cela prouve que
le NH: exogène est également utilisé pour la synthèse des uréides.
Les résultats de THOMAS et a~, (1980 b) qui ont détecté
chez le Haricot non nodulé, mais cultivé en présence de NH:, des quanti-
tés d'uréides de l'opdre de celles trouvées chez le Soja, confirment
nos observations. Comme dans l'expérience de ces auteurs, les plantes
étaient dépourvues de nodosités, siège de la synthèse 'des uréides, il
est probable que les enzymes responsables de ce mécanisme aient été in-

---

- 156 -
duites chez le Haricot par l'apport de l'ammonium. La formation des
uréides, même chez les légumineuses de la tribu des PhaseoZeae, ne
peut donc être considérée comme résultant exclusivement de l'activité
nitrogénase des nodosités.
+
Lorsque la fixation biologique est la seule source d'azo-
te, le NH
est formé uniquement dans les nodosités. Par conséquent,
4
presque tout l'azote réduit est transféré sous forme d'uréides. Mais en
alimentation ammoniacale, une partie de NH~ absorbé par les nodosités
peut donner des uréides dont les quantités sont alors similaires à
celles obtenues lors de la fixation symbiotique, si celle-ci n'est pas
limitante ; mais la sève contient aussi des acides aminés provenant de
l'assimilation de NH~ dans les racines. Même en alimentation nitrique,
le NH~ ' issu de la réduction de NO;, peut aussi donner des uréides
dans les nodosités, pourvu que cette réduction soit suffisamment inten-
se. En alimentation nitrique ou ammoniacale, les taux de diminution des
concentrations de la sève en uréides sont toujours plus faibles que les
taux de diminution de l'activité fixatrice (ch. III, paragraphe lIB).
III - UTILISATION DES TENEURS EN UREIDES POUR EVALUER
L'ACTIVITE FIXATRICE
Chez le Soja, l'azote moléculaire est majoritairement
assimilé sous forme d'uréides. Dans le cas d'une association fixatrice
Soja-Rhizobium,qui ne tire son azote que de l'activité nitrogénase, la
synthèse de ces composés n'est vraiment effective qu'à l'installation
des nodosités; de ce fait, elle est en liaison directe avec l'activité
fixatrice de la plante. Il existe par conséquent,pendant le développe-
ment de la plante, une bonne corrélation entre la production d'uréides
et les paramètres habituellement corrélés de façon positive à la fixa-
tion biologique, notamment entre les teneurs de la plante et l'activité
nitrogénase et entre ces teneurs et le nombre ou la masse des nodosités
(voir par exemple chap. l, tabl. V). L'idée majeure, depuis la mise en
évidence de l'incorporation du 15 N2 dans les uréides (MATSUMOTO et aZ.,
1977 a), est d'exploiter cette propriété pour l'évaluation de l'activi-
té fixatrice, en raison de la facilité et de la sensibilité de la tech-
nique de dosage des uréides (YOUNG et CONWAY, 1942). Pourtant, d'autres

---

- 157 -
paramètres, plus faciles à déterminer (nombre et poids des nodosités,
masse de la plante etc ... ), sont également bien corrélés à l'activité
fixatrice pendant le développement du Soja. L'avantage des uréides ré-
side dans le fait que ces composés peuvent être l'émanation directe de
l'azote fixé, à certains stades du développement du Soja. Cependant,
plusieurs faits expérimentaux montrent la difficulté d'établir une cor-
rélation qui puisse traduire le plus fidèlement possible le lien entre
les deux mécanismes, quelles que soient les conditions de culture du
Soja :
1. La corrélation entre l'activité fixatrice et les
teneurs de la plante ou les concentrations de la sève en uréides n'exis-
te que pendant la phase végétative qui, dans nos conditions de culture,
n'a jamais été au-delà du 50e jour. A partir de ce stade, aussi bien les
teneurs de la plante que les concentrations de la sève baissent généra-
lement, même lorsque l'activité fixatrice continue à croître. Il sien
suit donc très souvent un déphasage prononcé entre la production maxi-
male d'uréides et l'activité fixatrice maximale.
2. Il Y a souvent, lors du cycle végétatif du Soja, une
production d'uréides en dehors des périodes de fixation, notamment en
fin de cycle pendant le vieillissement des nodosités. Nous avons suggé-
ré, pour expliquer cette production indépendante de la fixation, l'hy-
drolyse des acides nucléiques ou la remobilisation de l'azote des nodo-
sités.
Pour ces deux raisons, la corrélation entre l'activité
nitrogénase et les teneurs de la plante en uréides n'est vérifiée que
pendant des périodes déterminées. Il importe donc d~ choisir un moment
précis pendant la culture du Soja pour établir cette corrélation.
Pour l'évolution des concentrations ou des quantités.
dans la sève, en fonction des paramètres de la fixation (activité ni-
trogénase, nombre et masse des nodosités), nous avons proposé la ré-
gression logarithmique si on considère l'ensemble de la période de
fixation et de production d'uréides d'un système symbiotique (chap. I,
tabl. VI).

---

- 158 -
3. La relation entre activité fixatrice et taux d'uréides
dans la sève ou dans les tissus est influencée par certains facteurs du
milieu. Ainsi, la privation de lumière ou une forte absorption d'ammo-
nium exogène conduisent à la diminution de la fixation et des concentra-
tions en uréides de la sève, mais dans ces deux cas, les raisons en sont
très différentes. A l'obscurité, la baisse de la production d'ammonium
par les bactéroïdes est la cause directe de cette diminution; en ali-
mentation ammoniacale, c'est l'augmentation du débit de seve qui conduit
à la dilution des uréides et non l'insuffisance de leur synthèse.
Plusieurs auteurs ont suggéré l'utilisation des teneurs
en uréides de ces organes pour estimer l'intensité de la fixation
(PATTERSON et LARUE, 1981 ; HERRIDGE, 1982 a, b ; BERKUM et SLOGER, 1983
PATTERSON et LARUE, 1983 a, b). Mais d'après nos observations, seules les
concentrations de ces substances dans la sève semblent évoluer de façon
identique à l'activité fixatrice sous l'influence des facteurs du milieu
et des conditions de nutrition azotée, même si cette évolution est due
à des causes différentes. Ces concentrations pourraient donc constituer
le meilleur critère pour comparer l'activité fixatrice et la synthèse
des uréi des comme l' ava ient déjà proposé Mc CLURE et al., 1980).
La relation entre taux d'uréides et intensité de la fi-
xation symbiotique n'est pas simple si la production de ces uréides,
comme le suggèrent certaines des données de ce travail, peuvent avoir
une onglne autre que l'azote fixé. HERRIDGE (1982 bl, et PATTERSON et
LARUE (1983 b), ont suggéré d'utiliser la corrélation entre la fixation
symbiotique et le rapport N-uréides/N-uréides + N-NO; pour évaluer l'in-
tensité de la fixation d'une association. Néanmoins, ce rapport ne tient
pas compte de la production d'acides aminés synthétisés dans les racines
à partir de l'ammonium absorbé ou provenant de la réduction du nitrate.
A partir des données de l'expérience du chapitre IV (comparaison des sou-
ches G et G
3
1), nous avons porté les valeurs du rapport N-uréides/N-uré-
ides + ~ aminé + N-NO; en fonction des activités nitrogénases (mesurées
par l'A.R.A.) (fig. 49). Pour les deux souches G1 et G3, ce rapport di-
minue en fonction des doses d'azote combiné du milieu, mais les valeurs
expérimentales permettent de calculer deux droites de régression de pen-
tes très différentes pour les deux souches G1 et G3. Ces données appel-

---

- 159 -
100
•
lM
0
Z
1
••
Z
•
en
+
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~
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6
C2H4 (umo!. h~ PIJ)
FigL~o~- Evolution de la fraction uréidique de l'azote soluble total
en fonction des activités fixatrices des plantes de Soja
associées au:c souches G1 ( Â
)
et G3 ( •
) lors de l'apport
de différentes doses de IVOi
et NB:
• Pour chaque souche
les valeurs des traitements NO;
et NB 4+ sont réunies.
Les équations des dl~oites 1 (G7)~ 2 (G.) sont respectivement
Yl = 39 x + 15~6 (rl= O~61) et- Y2 = 9~~ x + 43~8 (r2= O~gO).

---

- 160 -
lent deux remarques
- en absence d'azote combiné, la proportion de l'azote
uréidique tend évidemment vers 100%, ce qui traduit la prépondérance
de l'incorporation de l'azote fixé dans ces molécules.
- même avec une activité·fixatrice très réduite, la part
de l'azote uréidique reste importante: l'extrapolation de la droite
de régression correspondant à G en particulier, suggère qu'en l'absen-
3
ce de toute fixation, une part importante de l'azote exogène, exportée
vers les parties aériennes, est métabolisée dans les nodosités et incor-
poré dans les uréides.
Enfin, le rapport N-uréides/N-uréides + N aminé + N-NO;
est effectivement corrélé à l'activité fixatrice: il permettrait donc
de distinguer les associations fixatrices de celles qui le sont peu. Il
n'est pas certain qu'il permette de classer les premières les unes par
rapport aux autres, car lorsque la fixation est la seule source d'azote
pour la plante, ce rapport est pratiquement égal à 100%, quelle que
soit l'intensité de cette fixation qui peut atteindre des valeurs plus
élevées que celles que nous avons mesurées ici.
L'étude des conditions de formation des uréides chez
le Soja permet certes de mieux comprendre le mécanisme du métabolisme
de N et d'envisager l'utilisation éventuelle de ces composés pour ap-
2
précier l'intensité de la fixation chez cette plante. Cependant, leur
abondance uniquement chez certaines légumineuses qui ne semblent pas
être nécessairement les plus déficitaires en carbone ne s'explique pas.
Le transport de l'azote symbiotique sous forme d'uréides
est généralement considéré comme une forme économique en raison du nom-
bre faible d'atomes de carbone utilisé par atome d'azote transporté.
En regard de la plupart des composés utilisés par les plantes pour le
transport de l'azote réduit (fig. 3), cette faculté des légumineuses
à uréides constitue un avantage, compte-tenu des dépen~es énergétiques
engendrées par le fonctionnement des nodosités et la réduction de N .
2

---

- 161 -
La synthèse d'une molécule d'asparagine entraîne l 'hydro-
lyse de 7 ATP ; celle d'une molécule d'allantoîne n'en exige que 2 en
tenant compte de la formation de deux molécules de NADH dans la voie
classique de biosynthèse (fig. 7) ; ainsi l'incorporation d'un atome
d'azote réduit exige 3,5 ATP dans le premier cas et 0,5 dans le second
(SCHUBERT, 1981 a). Mais alors que l'asparagine peut être utilisée di-
rectement pour la synthèse des protéines', l'acide allantoique doit être
dégradé dans les parties aériennes. Le NH; ainsi libéré par l'action de
l 'al l antoicase et de l'uréase est certainement réincorporé dans les aci-
des aminés. Cette réincorporation, qui se fait vraisemblablement par la
voie GS - GOGAT, correspond à 5 ATP au moins. L'activité PEP carboxyla-
se est élevée dans les nodosités des plantes à uréides où' la fixation
du CO2 est plus intense que celle des nodosités de plantes à amides
(LAYZELL et al., 1979 ; COKER III et SCHUBERT, 1981). Chez le Soja,
l 'oxaloacétate formé à partir du CO
fixé peut servir de squelette car-
2
boné pour la synthèse de l 'aspartate et de l'asparagine (PETERSON et
EVANS, 1979). Mais il peut aussi conduire à la synthèse du malate. Ce
dernier semble plus abondant dans la sève des plantes à uréides (PATE
et al., 1981) dont il peut élever le rapport C/N.
On pourrait ajouter les coûts éventuels de la synthèse
des nombreuses enzymes impliquées dans la synthèse des uréides; ceci
est vrai aussi pour l'asparagine. Ainsi, le bénéfice énergétique du
transport sous forme d'uréides n'est pas évident. On peut donc se de-
mander quel est l'avantage évolutif du transport de l'azote fixé sous
cette forme. Celui-ci pourrait être une adaptation aux conditions du
milieu: la différence de solubilité entre l'asparagine et les uréides
(SPRENT, 1980) ne permet aux plantes d'accumuler de fortes quantités
d'uréides qu'à des températures élevées. La faible solubilité des uré-
ides peut limiter les quantités de ces composés transportés par les
légumineuses des climats tempérés.
L'acide allantoîque, le composé le plus abondant des
uréides dans la sève des légumineuses, est une molécule à groupement
carboxyle. Il peut donc jouer le rôle d'anion d'accompagnement des
cations; d'après FREIBERG et STEWARD (1960), une déficience en potas-
sium entraînerait plutôt une accumulation d'allantoine au lieu d'acide

---

- 162 -
allantoïque dans les feuilles de bananier; mais, une déficience en
phosphore provoque aussi une accumulation de l 'allantoïne. Les légumineu-
ses à uréides seraient donc apparues surtout dans les zones tropicales à
sols pauvres.
Enfin, l'explication suivante peut être avancée (GRIGNON,
ENSA-INRA, MONTPELLIER, communication per.sonnelle) : l'impossibilité de
dégradation des uréides dans les organes souterrains serait un excellent
moyen pour les plantes à uréides d'affecter l'azote provenant de la fi-
xation au développement des parties aériennes, et par conséquent à la
formation des gousses. Cet avantage évolutif serait moins une économie
d'énergie qu'une façon d'attribuer obligatoirement l'azote fixé à la
nutrition azotée de la graine. Cette interprétation souligne l'intérêt
pour les plantes à uréides d'être dépourvues d'allantoîcase dans les
racines et les nodosités.
Dans ces conditions, la sélection humaine recherchant la
production des graines, aurait pu simultanément favoriser les espèces
où le transport de l'azote fixé se fait sous forme d'acide allantoîque.

---

- 163 -
CONCLUSION GENERALE
Chez les légumineuses de la tribu des PhaseoZeae(GZycine
max., PhaseoZus vuZgaris., Vigna unguicuZata ••• ), 11 azote fixé parles no-
dosités est métabolisé essentiellement sous forme d'uréides. La formation
de ces composés est une conséquence de la biosynthèse a partir de la glu-
tamine puis de la dégradation des purines. Cette synthèse est une carac-
téristique du tissu nodulaire qui contient les enzymes respondables de
ce métabolisme. Elle dépend de la nature de la symbiose, et par consé-
quent de la souche bactérienne. Elle dépend également, comme l'activité
fixatrice elle-même, des conditions du milieu et de la nutrition azotée.
Mais ce n'est pas uniquement l lazote fixé qui peut produire des uréides.
Dans certaines conditions, le NH; et le NO~ absorbés a partir du milieu
extérieur par les nodosités peuvent participer a la synthèse des uréides,
bien qu'ils inhibent très fortement l'activité fixatrice. L'importance
de cette utilisation du NO; et de NH; exogène est fonction de la capa-
cité fixatrice de la souche de Rhizobium japonicum chez le Soja.
Pendant le cycle du Soja, exemple de plantes à uréides
étudié au
cours de ce travail, les uréides ne proviennent pas toujours
directement de l'activité fixatrice. Les teneurs élevées en ARN et la
forte activité ribonucléase des nodosités suggèrent que l 1 hydrolyse des
acides nucléiques et le catabolisme des bases azotées ainsi libérées
peuvent produire des uréides, non seulement en fin de cycle où les
concentrations de ses substances augmentent dans la sève, mais également
pendant toute la période de culture.
La dégradation des uréides commence dans les nodosités
a cause de la présence d'une forte activité allantoinase. Mais le cata-
bolisme complet de ces composés n'est achevé que dans les organes aériens
de la plante qui ont la particularité dlêtre les seuls a renfermer l'al-
lantoïcase. Dans ce métabolisme, assuré en partie par les feuilles et
dans une moindre mesure par la tige, la gousse joue un rôle particulier.
Au moment de sa formation, la presque totalité des uréides y est trans-
férée et immédiatement dégradée, grâce a l 1 allantoinase et "allantoïca-
se contenues aussi bien dans les cosses que dans la graine elle-même.

---

- 164 -
La différence entre les plantes à uréides et les plantes
à amides, comme celle entre les associations Soja-G
et Soja-G
3
, provient
1
d'une moindre activité de synthèse et de dégradation des purines chez
les plantes à amides et l'association Soja-G . Mais la différence entre
1
les plantes à uréides et les plantes à amides ne peut s'expliquer entiè-
rement, ni par une différence dans l'activité fixatrice, ni uniquement
par une différence des activités enzymatiques de biosynthèse. Elle pour-
rait être liée également à la présence d1une activité allantoïcase dans
les nodosités et les racines des plantes à amides. Cette localisation de
llallantoicase peut permettre d'expliquer l'absence quasi totale des uré-
ides dans les plantes à amides dont les nodosités renferment pourtant des
activités XDH et uri case suffisamment élevées pour produire des quantités
notables de ces substances.
Les nodosités des plantes à amides peuvent contenir plus
de glucides que celles du Soja, comme nous l lavons constaté chez le
Pois au cours de ce travail. Mais les données dont nous disposons sur le
métabolisme de l'asparagine et des uréides ne permettent pas d'affirmer
que la synthèse et la dégradation de ces derniers constituent un avantage
énergétique certain pour les plantes productrices d'uréides.
La relation entre la synthèse des uréides et l'activité
fixatrice est effective; mais la proportionnalité entre ces deux méca-
nismes n'est pas certaine. Une bonne corrélation n'existe vraiment entre
la production d'uréides et l'activité nitrogénase chez une association
symbiotique que pour de faibles quantités d'azote fixé. De tous les pa-
ramètres de la synthèse de ces composés (concentrations, quantités
transportées, accumulation dans les organes), seules les concentrations
semblent répondre de la même manière que l'activité fixatrice à llinflu-
ence des facteurs extérieurs et des conditions de nutrition azotée. Mais
comme elles ne lui sont pas toujours proportionnelles, elles ne permet-
traient que de distinguer une association peu fixatrice d'une association
fixatrice.
Elles permettraient de constituer des "classes ou des groupes
d'associations symbiotiques" en fonction de leurs capacités fixatrices.
Au sein d'associations symbiotiques fixatrices, les faibles variations
des taux d'uréides ne permettent pas d'évaluer l'intensité de la réduc-
tion de N2 et par conséquent de différencier ces associations. Dans ce

---

.......
O'l
U'l
N2
1
NH3
Adénylosuccinate ~.
_
1
1M P
~ Ac. xanthylique
Ac. adtYliQue
1
~Xanthosine-5'-H.P
XMP
,
'!
Inosine
Xanthosine .~--_ Ac. guaniligue
)
Adénosine - 5'-M.P)
(
IGuanosine- 5' - M.P
AMP
t'
J
\\
GMP
Hypoxanthine
AN
GUanosi~!
. /
AN
~
AMP
- - - - 1
/ .
GMt
~
~ Adénine
Adénosine
l.
Guanosme
!
Guanme
Figure 50-
Les voies possibles de la synthèse des uréides. Les traits gras indiquent la voie considérée comme prépondérante
pendant la période de fixation intense chez les légL~ineuses à uréides. IMP {acide inosinique ou inosine-5JM.P.J
est le composé centrai du métabolisme des purines.

---

- 166 -
dernier cas, la relation entre fixation et synthèse des uréides est
plus qualitative que quantitative.
A la lumière des travaux sur le métabolisme des purines,
on peut retenir le schéma ci-après (fig. 50) pour la synthèse des uréides,
notamment chez les légumineuses.

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\\ . :\\
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lata (L.) Walp). Plant Physiol.\\~6t~ 735-739//,~
\\.
"-
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\\
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•
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{'
\\
.souche de Rhizobiwn et de 11 azote sur l a synthèse des uréides chez le
\\ ~oja. Physiol. Vég., 22 (sous presse).
i f
-

---

-IX-
ANNEXE
l - Milieux de culture pour Rhizobium
A - Milieu de BERGERSEN (1961)
Composition pour un litre
FeC'3
0,02 9
CaC1
0,04 Il
2
Na HP0 ·12 H 0
0,45 Il
2
4
2
l"1gS04. 7 H20
0,1
Il
l\\1annito l
10
Il
Glutamate de Na
1,1
Il
Biotine
250 ~g
Thiamine
100 ~g
Eau permutée
1000 ml
B - y E M (Yeast extract mannitol) (VINCENT, 1971)
Composition globale pour un litre
K HP0
0,5 9
2
4
t~gS04·7 H
0,2 Il
20
CaC0
0,1 Il
3
NaC1
0,2 Il
2
Mannitol
10
Il
Eau de levure
200 ml
H 0 qsp
1000 ml
2
Le pH est ajusté à 7. Dans la réalisation pratique du milieu
YEM, il est souvent d'usage de préparer une solution minérale concentrée
10 fois (sans mannitol, ni eau de levure)
à partir de laquelle la so-
lution finale est réalisée.

---

-x-
,
II - Solutions nutritives (Légumineuses)
!,.
A - Solution de LEFEBVRE (sans azote)
a - Solutions-mères (g.l-l)
',:
K HP0
2
4
580,6
MgS04
246,5
CaC1 2
443,6
K S0
87,6
2
4
Versénate de fer
(sequestrène)
16,6
Citrate de fer
60
b - Solution d'oligoéléments (9.1-1)
H B0
2
3
3
MnS0 4·H20
1,8
ZnS0 ·7H 0
0,2
4
2
CuS04·5H20
0,08
Na2t~o04 .2H
0,25
20
Co(N03)2· 6H20
1 microcristal
c - Préparation de la solution finale (quantités pour
10 litres
K HP0
2,4 ml
2
4
~lgS04
8
/1
CaC1
5
Il
2
K S0
8
"
2
4
Versénate de fer
10
"
Citrate de fer
2,5 "
Solutiond'oligoéléments (b)
10
"
Le pH est ajusté à 6,5 si nécessaire
Le citrate de fer est utilisé au début-de la ~ulture. Il est
ensuite remplacé par le versénate après l 'installation de la nodulation.

---

-XI-
B - Solution nutritive de ~~TSUMOTO et al., (1975)
-1
KHl04
22 mg. l
KCL
155
Il
fv1gS0 ·7H O
250
Il
4
2
CaC1 ·2H
2
2O
215
Il
l~nS04·H20
1
Il
ZIlSO4' 7H 2O
0,25
Il
CuS04·5H2O
0,25
Il
H B0
0,25
Il
3 3
Na 2t1004' 2H2O
0,05
Il
NaFe EDTA
30
Il

---

QUICKPRINT
Rue du Belvédère' (par Ave Paul Rimbaud)
34100 MONTPELLIER· TEL:J67} 63.32.05

---

- - -
- - - -
CONTRIBUTION A L'ETUDE DU METABOLISME
DES UBEIDES CHEZ LE SOJA
(Glycine max
(L} Merr.)
Thèse présentée par Mathias ZENGBE
ERR A T A
P.
II, avant dernier paragraphe,
l i r e :
" en particulier Id
Sous-Direc~ion des Etudes de l'ENSA d'Abidjan"
P.
i7, pre~ière ligne,
lire
:
~ Trifoliea~ "
Po
23, 2è pa+"agraphe, 18è ligne,
lire :
Il
CATKINSet al.,
19b 0 a) Il •
P.
24,
le paràgraphe,
4è ligne, lire
"FLASKS et LUKENS, 1963 ,II
P.
24, 2è paragraphe, 4è ligne,
lire
Il
active Il
P.
25, 2 è paragraphe,
8è ligne,
lire
Il
ATKINS
et al.,
1980 a
P.
27, 2è pa.Lagraphe, 7?; ligne, ligne :
Il
ATKINS
et al., :980 a
"
P.
31', 24~ ligne, lire
"ATKINS
et al., J980b".
P.
32, dans la légende .:le la f~gu:::-~, 7, l i r e :
Il
SCHUBERT, 1981 a "
P. 80, 4è ligne,
l i r e :
"graines ".
,
P.
84, 21è ligne, lire
"RIGAUD, 1976 Il
P.
112; 24è ligne, lire
Il
représentent ".
l?
119, 17è figne. lire
:
Il ATKINS
et al.,
1980 a
"
?
121, lirè :
" Tableau XVII
(au lieu de VII).
P.
127,
25è ligne. l i r e :
" CHRI8T3NSEN et JOCHIMSEN,
(1983).
P.
135, 2è paragr:.tphe, avant-dernière ligr.e, lire
"àsy:ithétis:>cr
ces molécules"
P. 153 , 12è ligne " lire : " ATKINS
et al. , 1980 a " .
P.
167,
7È référence bibliogr?l.phique, lire
Il
1980 b "
P. 168, 4è
"
"
, lire
Il
1980 a
"

---

1984
1
ZENGBE Mathias
UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC (MONTPELLIER II)
RESU~~E
Les Phaséolées, contrairemen~ aux aut:es légumineuses
métabolisent N sous forme d'uréides: allantoTne et acide allantoT-
Z
que. Les conditions de formation de ces composés ont été étudiées chez
le Soja et la relation entre leur formation et la fixation de N pré-
Z
cisée. Il n'existe pas de proportionnalité entre les deux mécanismes
car les uréides rencontrés chez le Soja peuvent provenir de sources
azotées autres que 'l'azote moléculaire. Le NH: ou le NO; absorbés du
milieu extérieur par les nodosités peuvent également participer à la
synthèse de ces molécules. De plus, l 'obscurité qui inhibe l'activité
nitrogénase, affecte également l~ concentration de ~es composés dans
la sève et les ~uantités transportées par la plante. Mais ce traite-
ment accroit leur accumulation dans la tige et surtout dans les feuil-
. les par suite d'une inhibition des activités allantoTnase et allantoT-
case. La différence entre le Soja et les légumineuses quine produi-
sent pas d'uréides est due au fait que ces dernières sont caractéri-
sées par une moindre capacité de synthèse et de dégradation des pu-
rines, une plus faible hydrolyse des acides nucléiques et sans doute
la présence d'allantoTcase dans les nodosités et les racines.
MOTS CLES
Uréides, allantoïne, acide allantoïque, Phaséolées, Soja
Pois, nodosités~ purines,' activitésenzymatique~.

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