RI:PU8L1QUE DE COTE D'IVOIRE
NO D'ORDRE -13 -
UNION· DISCIPLINE· TRAVAIL
MINISTERE DE L'~DUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
~,t.,: .:: i'
-
..... L
...
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~'/UC,~OL; "
. ...... -., -.
THE5E
présentée
A LA FACULTE DES SCIENCES DE l'UNIVERSITE D'ABIDJAN
pour obtenir le grade de
OOCTEUR O·ETAT ES-SCIENCES PHYSIQUES
par
Alphonse KAMENAN
Ma ftre-Assistant
SUJET DE THESE
PURIFICATION ET ETUDES PHYSICO - CHIMIQUES
DE TROIS PHOSPHATASES ACIDES
DE DIOSCOREA CAYENENSIS ROTUNDATA
Soutenue le 24 Mai 1984 devant la Commission d'Examen
Président :
M.
B.
TOUR~
Professeur il .. Faculté des Sciences
Reeteur de l'Université d'Abidjan
M. J. H.
WEIL
Professeur il l'Université Louis Pasteur
de Stresboul'l
Examinateurs :
M.
B.
COLAS
Professeur il .. Faculté des Sciences de Nantes
M.
J.
DIOPOH
Professeur il la Faculté des Sciences d'Abidjan
M.
D.
AIDARA
Manre de Conférences il la Faculté des Sciences
d'Abidjan
A VANT
PROPOS
- - - - - - - - - - 0
- - - - - - - - - - - - -
Ce travai~ a été effectué au Laboratoi'l'e de Biochimie
de lA Facul'/;é des Sciences d'ABIDJAN.
Mais il n'aurait pas pu voi'l' te JOU'l' p~ns la gronde
contribut1:on du P'l'ofesseu'l' Jacques DIOPOH, DirecteUr' du Dépa'l'te-
ment de Biochimie. sa géné'l'osité, sa haute aompétence et son
enthoue'iasme débo'l'dant au tr'avail ont efJ 'icacement con't'l'ibué à
la 'l'éalisation de cette thèse.
Monsieu'l' le P'l'ofesseu'l' TaURE BAKARY, ReoteU'l' de l'Uni-
ve'l'sité d'Abidjan nous fait le grand honneu'l' d'accepte'l' de p'l'éside'l'
ce Jury. C'est POU'l' nous une j~ie aujou'l'd'hui de pouvoi'l' lui exp'l'i-
me'l' nos sincè'l'es 'l'eme'l'ci~ments POU'l' sa cont'l'ibution multifo'l'me à La
réalisation de ce travail.
Qu'i~ nous soit pe'l'mis de reme'l'aie'l' tout particuliè'l'ement
Monsieu'l' le P'l'ofesseu'l' Berna'l'd COLAS de l'Université de Nantes de
s'être inte'l'essé à ce t'l'avail dès les premières heures de sa gesta-·
tian. n a su nOU3 faire profiter de son ardeUr' au travail et de
sa compétence durant les quelques années que nous avons passées
ensenibZe à ABIDJAN. Nous le remercn:ons infiniment d'avoir faciUté
Z'achèvement de ce travail.
C'est avec générosi~é que le P'l'ofesseur J.H. WEIL de
Strasbourg nous a fait prOfiter de sa haute et vaste compétenoe
scientifique. Nous tenons en le remerciant ici, l'assurer de toute
notre profonde gratitude et de notre respectueuse reoonnaissance.
Monsiew' Ai'dam Daouda, Ml-ttre de Conférences à la
Faculté des Scienées d'ABIDJAN a bien voulu s'interesser à notre
travail. lbintes fois, il a su nous faire bénéficier 1.e ses précieu:r:
oonseils et de ses fecondes suggestions pour mener à b'2:en' Z'immunisa-
tion de nos aniTTrlu:t:. n a su nous faire partager son dynamisme
exenpZai'l'e. Qu~il soit assUr'é de notre pLus vive reconnaissance.
Le ProfesseU1:' Joseph ATTIAS de Rouen a dir'igé nos
premiers pas en enzymologie et nous Cl proposé le su.iet de cette
thèse, alors qu'il était Directeur du Département de Tiochimie à
ABIDJAN.
Nous lui devons d'avoir su nous persuader d'étudier les
enzymes de l'ignamt alors que nos pl'éoccupations de l'époque
étaient portées vers "la recherche de "la 'lxlriab-z:7,ité génétique des
protéines du l~Z.
Nous tenons à remercier Monsieur le Plofesseur Michel
LAZDUNSKI du Centre de Biochimie de Nice et Monsieur le Professeur'
,] .RLCARD du Centre de Biochùme et de Biol.ogie MoUculail'e de
~hrseilZe de Zeurs conseils.
La collaboration des autres menibres du Laborato'lre nous
a été d'u.n appoY"/; appréciable tout au long de ce travail. N07-~8
r'emerc'ions par>ticulièrement Mldame D.HOUVET Na'Ître-assist.an·/;e de
B1:ochinrie de son aide eff'ieace.
Nous sornmes très heureux de remercier Monsieur OULAI M.
Joseph qui a su avec gentillesse apporter une a1:de spontanée et
désin·terel3sée à la dactylographie de ce memoir'e à un moment où
les problèmes d'électricité se posaient avec acuité.
A
MA
FEMME
A
MES
ENFANTS
A
MES
PARENTS
A TOUS LES MIENS
SOM MAI
R E
Pages
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I ; Distribution des phosphatases acides dahs
quelques Dioscoreacées..........................
5
1. Introduc~ion .•...........•.•..........................
5
2. Matériels et ailéthodes •.••.••••••••••••••...••••.•••••••
6
2.1. Matériels
2.1.1. Matériel végétal .......•.................. ,
6
2.1.2. Produits chimiques
6
2.2. f1éthodes
2.2.1. Extraction et détermination des activités •........
7
2.2.1.1. Introduction
2.2.1.2. Extraction des phosphatases cytoplasmiques •.....
7
2.2.1.3. Extraction des phosphatases membranaires .•.•....
8
2.2.1.4. Détermination de l'activité enzymatique.........
9
2.2.2. Dosage des protéi nes. • . . • . . • . . . . . . . •• . • . . . . . . • . . •.
9
3.. Rés u1ta t s . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. 10
4. Discussion
15
CHAPITRE
II: PURIFICATION DI UNE PHOSPHATASE ACIDE CYTOPLAS-
MIQUE ET DE DEUX PHOSPHATASES ACIDES MEMBRA-
NAIRES DE DIOSCOREA'CAYENENSISROTUNDATA
1. Introduction
'
17
2. ~latériel et méthodes •..•.•......•..••......•..•.•.....• 18
Pages
2.1. Préparation des colonnes et tecnniques :hromato-
graphiques. '. .. .. .. .... .... .... .. .. .. .. .. .. .... .. .. .. .. .... .. .. .. .. .... .. .. .. .. .. .. ... .. ..
18
2.2. Techniques électrophorétiques......................
19
2.3. Préparation des extraits bruts
2.3.1. Extrait brut cytoplasmique.......................
20
2.3.2. Extrait brut membranaire.........................
21
3. Résultats.
3.1. Purification de l'extrait cytoplasmique............
21
3.2. Purification de l'extrait membranaire........ .•.••
29
4. Discuss~on .•..
38
CI~APITRE
I I I : PROPRiETES MOLECULAIRES ET CINETIqUES.........
40
1.. Introduction..................................................................................
40
2. Propriétés moléculaires..............................
41
2.1. Composition en acides aminés.......................
41
2.2. Analyse de la fraction glucidique.
42
2.3. Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence
de S.. 0.. S.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
44
2.4. Poids moléculaires apparents par gel filtration....
45
2.5. Résultats
2.5.1. Composition en acides aminés.....................
46
2.5.2. Composition chimique de la fraction glucidique •...
50
2.5.3. Détermination des poids moléculaires
51
2.6. Discussion
56
lOlO
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
3. Propriétés cinétiques..................................................................
59
3.1. Influence
du pH
59
Pagf's
3.2. Influence de la température .•...••.•..•.••.••.••.
61
3.3. Spécificité de substrat..........................
65
3.4. Détermination des KM .....•............ ~
67
3.5. Discussion
,..............
71
CHAPITRE
IV. ACTION DE QUELQUES EFFECTEURS SUR L'ACTIVITE
DES ENZYMES (A) -(B) et (C)
1. Introduction
".........
73
2. Action des ions métalliques •.•.•..•.•.••••••..•.•.•
73
2.1. Introduction
"
"'
73
2•2. Ré sul ta t s
74
3. Action de quelques réactifs de marquage chimiq'"e...
76
3.~. Acti~n des réactifs spécifiques jes thiols •.••••.. 77
3.1.1. Action du DTNB
77
3. 1.2. Ac t i on du pHMB.................................. 81
3.1.3. Action de la NEM
83
3.2. Action dJautres réactifs spécifiques de
groupements fonctionnels ••..••.•.....•..•.••••.••• 85
3.2 . 1. Ac t i on du NA l • . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . • . . . . . . . . . . .. 85
3.2.2. Action de llacide diazosulfanilique ••..••••.••.• 88
4. Discussion
91
CHAPITRE ~ ETUDE IMMUNOLOGIQUE DES PHOSPHATASES ACIDES
(A) (B) et (C)................................... 94
1. Introduction
94
"
.
"2. Point de nos connaissancés .........•...•......•..... 96
3. Matériels et méthodes ••..•......••.•.•.•.•••..•..... 99
Pages
4. Résultats .•. ......................................... 106
5. Discussion
.
114
CONCLUSIONS GENERALES. ....................................... 115
BIBLIOGRAPHIE •.••.•..•..•.•
.............................. 121
ABREVIATIONS
/"
ADP
= Adenosine-5 1 -di phosphate
AMP
= Adénosine-5'-monophosphate
ATP
= Adénosine-SI-triphosphate
A.N.S.= Acide-1-amino-2-naphtol-4-sulfonique
CM-Sephadex-C-50 ~ Carboxymethyl-Sephadex C-50
OEAE A50 = Oiéthyle(2-hydroxypropyle) amtnoéthyle A 50
DTNB
= Acide dinitro-2,2 1 -dithio-5,5 1 -dibenzoique
EDTA
• Ethylène diamine tétra-acétate
mM
= mi 11 i mo1e
MOP
= Muramyl-dipeptide
min
= minutes
NAI
= N-acétyl--imidazol e
NEM
= N-éthylrnaléimide
.EHMB
= parahydroxymercuribenzoate de sr1ium
~NPP
= paranitrophenylphosphate
.ENp
= paranitrophenol
SOS
= Sodium dodécyle sulfate
TRIS
= Tris hydroxyméthylaminométhane
~g
~ microgramme
~~
= microlitre
- 1 -
1 NT R0 DUC T ION
GENERALE
- - - - - - - ~ -.- -
La Côte d'!voire a décidé ces dernières années de
sl-;ngdger résolument délns la bJtaille de l'autosuffisance alimen-
ta i re:-:.
Pour que cette noble bataille soit gagnée, il faut que
le pays slassure non seulement une meilleure maitrise des techni-
ques de production intensive de nos denrées alimentaires, mais
aussi et surtout qu'il soit capable de proposer aux producteurs
des techniques de conservation rentables.
Ceci est d'autant plus nécessaire, que le potentiel
alimentail"e de notre pays repose en très ~It'ande partie, sur l'uti-
lisation des tubercules tels que le manioc et l'igname dont la
production intensive a toujours été freinee par de réelles diffi-
cul tés de conservation après la récolte. Ces difficultés se soldent
dans le cas de l'igname par exemple par des pertes pouvdnt attein-
dre 25 %de la ~roduction totale.
Les raisons de ces pertes sont essentiellement de deux
oY'dres : il y a dl ()\\)ord le facteur envil"onnementa l qui se traduit
par une agression intense des tubercules par un certain nombre de
déprédateurs~allant des micro-organismes (bactéries, virus, cham-
pignons) [1-3 Jaux rongeurs [41; il ya ensuite le facteur méta-
bolique dont l'ampleur tient au fait que ces tubercules sont
.../ ...
- 2 -
presque essentiellement glucidiques (80 - 85 % du poids sec). La
mobilisation de ces glucides lors de la germination,est un phéno-
mène néfaste puisqu'il se traduit par une perte importante de
poids des tubercules après récolte.
En ce qui concerne les facteurs de dégradation dùs à
l'environnement du tubercule, des efforts louables
ont été faits
et continuent de se faire à trdvers l'utilisation des pesticides
et autres produits chimiques pour enrayer l'action des dépréda-
teurs an;n~ux et végétaux.
Le facteur métabolique est par contre très peu étudié.
Il est cependant aisé de penser que la maîtrise de ce facteur à
travers la connaissance des enzymes du métabolisme glucidique et
leur implication dans la levée de dormance, peut permettre de
retarder le processus de la germination et ce faisant, de prolonger
la période de conservation des tubercules.
Clest dans cet esprit que notre Laboratoire dans le
cadre du programme de recherches sur la conservation de l'igname,
a entrepris depu'is quelques années l'étude des enzymes glycolyti-
ques de 11 'j gname.
Deux modes de dégradation enzymatique de l'amidon sont
connus depui s longtemps chez l es pl antes amyl acées {5-6] . Il
s'agit d'une part, des réactions de phosphorolyse sous l'influence
des phosphorylases et d'autre part de processus d'hydrolyse faisant
- 3 -
intervenir différents types d'amylases.
Les phosphoryla~es ont été détectées en quantités
appréciables dans tous les cultiv~ de Dioscorea cayenensis
rotundata [7] , alors que
les amylases ont été trouvées en
quantités prépondérantes dans les cultivars de Oioscotéà éScu-
lenta (7-9] • Il est donc aisé d'envisager l 'hypothèse que le
processus enzymatique de dégradation de l'amidon, prédominant chez
Oioscoreacayenensis rotundata est un processus phosphorolytique.
Les amylases et les phosphorylases font actuellement
l'objet d'une étude approfondiedans notre Laboratoire.
En ce qui concerne l'action des phosphorylases, le pro-
blème de l'apport du phosphate inorganique indispensable est un
problème fondamental que pourrait résoudre la présence dans ces
tubercules de phosphatases acides dont l'étude fera 1 'objet du
présent travail.
L'importance et le rôle des phosphatases acides végétales
(E.C. 3.1.3.2.)
ont été largement soulignés par plusieurs auteurs
les phosphatases acides interviendraient non seulement dans
l 'hydrolyse des monoesters phosphoriques [10-15J • mais aussi dans
le transport du groupement phosphate [16-18] et dans l'absorption
des solutés au niveau des parois cellulaires [14.17. 19-?3] .
Le rôlf' des phosphatases acides dalls la germination des
semences de blé a été rapporté par Bianchetti et Sartil'ana [24] 'qui
observent une forte activité phosphatasique chez l'embryon. Cette
- 4 -
augmentation de l'activité phosphatasique est régulée par la
teneur en phosphate inorganique des tissus. Selon' ~iurray et Collier "[15]
l'élevation passagère de l'activité phosphatasique acide des
pois reflète un mécanisme d'hydrolyse des esters phosphorylés
et la restitution du phosphate inorganique à l'embryon.
Pour mieux cerner~uelques aspects de l'importance
des phosphatases acides dans le métabolisme du phosphate au
niveau des tubercules d1igname, nous avons pensé qu·une étude
approfondie de ces enzymes était indispensable.
Ceci d'autant plus, qu1à notre connaissance, très peu
d'études ont été consacrées aux phLsphatases acide~ des tuber-
cules amylacés.
Le plan de notre travail sera le suivant :
Après avoir étudié la distribution des phosphatases
acides dans quelques Dioscoreacées de Côte d'Ivoire,nous décril'ons
la purification des différentes phosphatases acides à partir des
variétés qui en sont les plus riches.
Nous étudierons ensuite les propriétés physico-chimiques,
moléculaires et irnmunologiques des dHférentes phosphatases afin
dlen cerner les facteurs qui pourraient être mis à profit dans
l'interprétation du rôle métabolique de c~s enzymes.
- 5 -
CHA PIT REl
DISTRIBUTION DES PHOSPHATASES ACIDES DANS QUELQUESDIOSCOREACËES
DE CÔTE D'IVOIRE.
1 - INTRODUCTION
La consommation de l ligname en Côte d'Ivoire slétend sur
plusieurs variétés qui sont plus ou moins appréciées suivant les
régions.
La connaissance de la distribution des enzymes du métabo-
lisme glucidique au niveau de ces variétés, est absolument indis-
pensable si l'on veut maftriser les facteurs métaboliques de dégra-
dation des tubercu~es après la récolte, chez les vari~tés les plus
appréciées.
- 6 -
Le présent chapitre a donc pour but, de rendre compte
de la distribution des phosphatases acides au niveau des diffé-
rentes variétés et aussi d'examiner leur éventuelle évolution
au cours de la période de conservation des tubercules après la
rJcolte.
2 - MATERIELS ET METHODES
2.1. ~1ATERIELS
2.;.1. MATERIEL VEGETAL
Les échantillons d'ignames proviennent du champ expéri-
menta l du Pr. TOURE BAKARY et sont conservés à l a tempéra ture du
Laboratoire (22°C). Ce sont des tubercules d'environ 1 kg, fournis
1
à notre Laboratoire environ 10 jours après la récolte.
2.1.2. PRODUITS CHIMIQUES
a) - Substrats synthétiques : Mis à part le paranitro-
1
penylphosphate provenant de la 50ciété FLUKA AG, tous les substrats
1
synthétiques utilisés pour la détermination des activités enzyma-
tiques sont des produits SIGMA.
1
b) - ~utres produits : Les gels de polyacrylall1ide sont
préparés avec des produits Pharmacia. Le bleu de coomassie (bleu
briilant R) et le diazc-bleu sont fournis par SIGMA.
D'une façon générale, tous les autres produits utilisés
sont des composés purs pour anal~se.
- 7 -
[
2.2. METHODES
fi1î:
2.2.1. EXTRACTION ET DETERMINATION DES ACTIVITES
r
PHOSPHATASIQUES.
1
~
2.2.1.1. INTRODUCTION
Parmi les nombreux enzymes connus des végétaux
supérieurs, un certain nombre d'entre eux existent à la fois dans
le cytoplasme et aussi dans les Inembranes squelettiques des cellules.
Certains auteurs comme Bieleski [18], Ashford et
Mac Cully [25] , ont trouvé l a même phosphata se ac i de dans le com-
i
partiment cytoplasmique et sur les membranes cellulaires d'orange
et de mafs. Pour d'autres auteurs tels Catesson et Coll [26] ou
1
Holcomb et Coll [27], les phosphatases acides des végétaux sont
aussi localisées dans les
p~roxysomes qui, comme on le sait, sont
des particules cytoplasmiques.
1
Quant à Hasegawa et Col1-:-[14l~,-ils ont-mis en évidence des
f
phosphatases acides cytoplasmiques et membranaires dans les mêmes
i
,
cellules ce racine de blé.
Il était donc intéressant d'utiliser des techniques
appropriées permettant l'extraction des phosphatases acides conte-
nues dans le cytoplasme et celles liées aux débris membranaires.
2.2.1.2. EXTRACTION DES PHOSPHJHASES ACIDES
CYTOPLASMIQUES.
Pour extraire les phosphatases acides cytoplasmiques,
il suffit de faire éclater les cellules, soit par broyage, soit par
1
- 8 -
macération aqueuse des tissus en définissart la molarité et le
pH du milieu. Se basant sur ce principe d'extraction t plusieurs
auteurs ont extrait et étudié des phosphatases acides cytoplas-
m'iques de patate douce [28 - 31] t de racines de riz [23] , de
seigle [32 - 33 ~, de racines et grains de maïs [34 - 37 '] , de
feu i 11 es de tabac [38] etc.:.
Pour l'extraction des phosphatases acides cytoplas-
miques des cul tivars de Dioscoréacées étudiée;, des tranches de
100 9 sont prélevées sur toute la longueur du tubercule épluché
puis broyéés dans 100 ml de tampon acétate 0,05 MpH 5,0 pendant
2 min dans un broyeur T~rmix AG. Le broyat est ensuite centri-
fugé pendant 15 min à 20.000 x g b 4°C. Le surnageant est ramené
à chaque fois à un volume standard de 120 ml avec le tampon
acétate Ot05 M pH 5tO et est utilisé pour la détermination des
activités enzymatiques. Le culot qui contient les débris mem-
branaires est utilisé pour l 'extraction des phosphatases acides
membranaires.
2.2.1.3. EXTRACTIO~ ors PHOSPHATASES ACIDES
;·lEMBRANAI RES
L'extraction des phosphatases acides liées aux
débris membranaires est effectuée selon 'la technique de Hasega\\'laet Coll
[14:1 . Le culot est lavé trois fois avec de l'eau distillée puis
mis en suspension dans le tampon acétate contenant 0,2 %de Triton
X-100, un détergent non ionique, pour laver les débris cellulaires.
- 9 -
Les débris sont ensuite relavés à l'eau distillée puis remis en
suspension dans environ 50 ml de NaC1 0,8 Mpuis incubésà 4°C
pendant 12 heures et centrifugésà 4°C pendant 15 min à 20.000 x g.
Le surnageant est dialysé contre le tampon acétate 0,05 MpH 5,0.
Il est utilisé comme extrait brut de pho~phatases acides membra-
naires extractibles.
2.2.1.4. DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
E11 e est déterm"j née selon 1a méthode de
GAREN et Levintha1 [39] en présence de p-nitropheny1phosphate.
Le p-nitropheno1 libéré est dosé co10rimétriquement. L'enzyme
est ajouté à 2,0 ml de substrat 0,005 Mdans du tampon acétate
0,05 MpH 5,0 et incubé à 37°C. La réaction est arrêtée par
addition de 2,0 ml de Na OH lN. L'activité des phosphatases acides
non exiract'ib1es du résidu est déterminée selon la méthode de
Stafford et Bravinder-Bree [40] , qui consiste à mettre en suspen-
sion une quantité déterminée du résidu dans le tampon de dosage
(tampon acétate 0,1 MpH 5.0), puis de doser l'activité enzymatique
de la façon habituelle.
Sauf indication contraire, une unité enzymatique est
défoinie comme la quantité d'enzyme qui hydrolyse hl mole de subs-
tract par minute à 37°C dans des conditions expérimentales précisées.
1
2.2.2. DOSAGE DES PROTEINES
1
Les protéines sont dosées suivant le stade de la purifi-
1
cation P?r la méthode du biuret [41] ou par la méthode de LO\\'lry et
,
coll [42] avec comme protéine étalon, la serum-albumine bovine.
1
f
- 10 -
3 - RESULTATS
La distribution d~s phosphatases acides cytoplasmiques
1
dans quelques Dioscoreacées de Côte d'Ivoire est présentée dans
le tableau 1. Les teneurs des activités phosphatasiques des
extraits cytoplasmiques (tableau 1) montrent bien que tous les
cultivars étudiés contiennent des phosphatases acides cytoplasmi-
Q4es
mais que leurs taux sont très variables d'une espèce a un
autre. Ainsi, l'espèce D. cayenensis rotundata contient 3 à 4 fois
plus
d'enzyme cytoplasmique que Dioscorea alata et 4 à 5 fois plus
que Dioscorea esculenta.
Les 8 cultivars de D. cayenensis rotundata étudiés ont
en effet des teneurs en ~hosphatases acides cytoplasmiques allant
de 26 à 48 unités par millilitre d'extrait, alors que chez les
cultivars de D.alata, on trouve des valeurs de 10 à 12 unités par
millilitre d'extrait. En ce qui concerne les cultivars de D.escu-
~nta, ils présentent les taux d'activités phosphatasiques les plus
faibles mais uniformément répartis.
Contrai\\ement a ce qui se passe chez d'autres enzymes de
tubercules amyla.eés[:'1,43] , le~ activités phosphatasiques cytoplas-
miques diminuent avec le temps de conservation dans tous les culti-
vars d'igname étudiés (tableau 2).
r1
1
1
- 11 -
Cette diminution observée chez toutes les espèces
varie d'un cultivars ~ un autre. On note une diminution de
1
l'activité enzymatique après 2 mois de conservation d'environ
!
10 % et une diminuJ.. ion d'activité encore plus importante après
5 mois de conservation. On remarque dans le tableau 2, que le
cultivar
D.cayenensis var kponan par exemple, passe de 48
unités/ml d'activités phosphatasiques à la réco:te à 43 unités/ml
après 2 mois et 35 unités/ml après 5 mois de conservation, et que
le cultivar
D.cayenensis var Siara perd plus de 40 % de l'acti-
vité phosphatasique cytoplasmique après 5 mois, alors que
D. catenensis var Descplé ne perd qu'environ 20 %de ses activités
phQsphatasiques cytoplasmiques.
Cette diminution de l'activi té phosphatasique cytoplas-
mique semble être compensée par une augmentation des activités
phosph~tasiques liées aux débris membranaires.
En effet, ainsi que l'indique le tableau 3, l'activité
phosphatasique membranaire extractible, passe de 14 unités à la
récolte à 20 unités aprps 2 mois de conservation et 25 unités
après 5 mois de conservation. L'activité phosphatasique membra-
naire non extractible augmente également avec le temps de conser-
vation, en passant de 31 unités à la récolte à 34 unités après
2 mois et 36 unités après 5 mois.
1
,
r
1
- 12 -
TABLEAU 1
IENEUR EN PHOSPHATASES ACIDES CYTOPLASMIQUES
(U = Unités enzymatiques)
Dioscorea cayenensis-
U/ml
Protéines (mg/ml)
Activité
'rotundata
spéc :fique
(U/mg)
Kponan
48
2,4
20
Gnanrio
32
2
16
Kroupa
30
2
15,3
*
Desoplé
28
1,9
15,1
Tinguéré
27
1,94
14,6
Dangarigué
26,8
1,92
14,2
Dicahi
26.5
1.6~
14.2
Siara
26
1,84
14,1
Diocorea alata
Florido
12
1,85
6,5
Bt'azo-Fuerté
11 ,6
1,9
6,10
* Oouokokoré
10
1,6
6,3
Namassou
10
1,6
6,2
Ticangangbo
10
1,6
6,2
Oioscorea esculenta
1
8,4
1,87
4,5
8,8
2,0
4,4
8,2
1,90
4,3
N"6
8,2
1,80
4,5
8,1
2, 1
4,2
8,1
2,3
4, 1
8,0
2, 1
4,0.
* Noms locaux de cultivars d1ignames.
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TABLEAU 2 : EVOLUTION DES ACTIVITES PHOSPHATASIQUES CYTOPLASMIQUES AU COURS DE 5 MOIS DE CONSERVATION.
(U = Unités enzymatiques)
(a.sp. = activités spécifiques)
1
1
A la récol te
après 2 mois
après 5 mois
CULTI VARS
U/ml Protéines
a.sp
Ulml
Protéines
a.sp
U/ml
Protéines
a.sp
(mg/ml)
U/mg
(mg/ml)
U/mg
(mg/ml
U/mg
-
Dioscorea
cayenensls
rotundata
Kponan
48
2t4
20 t1 .
43
2,7
15,9
35
2,9
12
~
Gnanrio
32
2 .
16,0
28
2,5
11 ,2
25
3
8;3
*
Kroupa
30
2
15,0
27
2,7
10,0
23
2,8
8,2
Desoplé
28
1t9
14,7
25 t2
2t4
10,5
22
2,7
8,1
Tinguéré
27
1,94
13,9
23
2,1
10,9
20
2,6
7,7
Dangarigué
26,8
1,92
14 tO
22
2,1
10 t4
19
2,4
7,9
Dicahi
26,5
1,85
14,3
21
2,0
10,5
19
2,4
7,9
Siâra
26
1,84
14,1
20
2,1
9,5
15
2,2
6,8
1
1
1
* Noms locaux de cultivars d'ignames.
TABLEAU 3 : REPARTITION ET EVOLUTION DE L'ACTIVITE PHOSPHATASIQUE ACIDE DANS LE TUBERCULE DE D.CAYENENSIS
ROTUNDATA VAR ~PONAN AU COURS DE 5 MOIS DE CONSERVATION.
A 1a récolte
après 2 mois
après 5 mois
-
lAC{~)ité
a.sp
Activité
a.sp
Activité
a.sp
(U/mg)
(U)
(U/mg)
(U)
(U/mg)
--=-.J
Phosphatase acide cytoplasmique
48
20±O,5
43
15,9±O,4
35
12±0,?
c;;T
.--f
extractible
14
25±O,2
20
20±0,2
25
17±O,2
Phosphatase acide
1
{
1
membranaire
non extrac-
1
31
17±O,3
34
16±0,2
36
'16±O,3
tible
1
1
U = Unités enzymatiques
a.sp = Activités spécifiques
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- 15 -
4 - DISCU::;SION
Les phosphatases acides sont distribuées en quantités
1
plus ou moins importantes selon les espèces de Dioscoreacées
étudiées.
Toutefois les cultivars qui contiennent les taux de
phosphatases acides les plus importants, semblent être ceux de
l'espèce D. cayenensis rotundata, espèce qui est la plus appré-
ciée en Côte d'Ivoire.
Alors que d'une façon générale, le taux de protéines
augmente avec le temps de conservation des tubercules, on remarque
ici une diminution de l 'activité phosphatasiq~e acide cytoplas-
mique. Cette diminution se fait au profit d'une augmentation des
phosphatases acides membranaires~confirmant ainsi l'hypothèse
déjà émise par Diopoh et Kamenan [7] . On peut penser en consé-
quence, que les phénomènes métaboliques dans lesquels les phospha-
tases acides sont impliquées au cours de la période de conserva-
tion, et plus particulièrement au moment de la levée de dormance
seront essentiellement des phénomènes membranaires.
Il faut noter que les différents cultivars dans 1eque1s
le taux de phosphatases acides est élevé, sont ceux dans lesquels
une importante activité phosphorylasique est aussi décelée [7].
Cette situation sera it en faveur de 11 hypothèse, que les phospha-
tases pourraient être des fournisseurs de phosphate inorganique,
- 16 -
pour le fonctionnement des phosphorylases au cours des réactions
cataboliques des glucides.
Compte tenu de cette répartit~on des rhosphatases dans
les cultivars d'ignames, et vu l'importance de ces enzynEs dans
les réactions métaboliques au cours de la conservation des tuber-
cules[7-9,45-46], il devenait donc indispensable d'entreprendre
leur purification afin de définir leurs propriétés physicochimi-
ques, qui pourraient être rattachées à cette répartition. Le
!
!
chapitre suivant fera 1'objet de cette écude.
. 1
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- 17 -
CHA PIT RE II
PURIFICATION D'UNE PHOSPHATASE ACIDE CYTOPLASMIQUE ET DE DEUX
PHOSPHATASES ACIDES ~~RANAIRES DE DIOSCOREA CAYENENSIS-ROTUNDATA.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 - INTRODUCTION
De nombreuses études ont été déjà consacrées à des
phosphatases acides d'origine végétale. Ce sont essentiellement
des études de phosphatases en provenance de graines [34J de
racines [23,32-33] et de feuilles [38]
Cependant, très peu d'études ont porté sur les phospha-
tases acides des tubercules amylacés. On peut citer les travaux
dlAlvarez [12] , de Hsu et
coll [13] , de Kubicz et coll [21-22]
sur la pomme de terre et les travaux de Uehara et coll sur la
patate douce [28-31] • La plupart de ces études portent d1ailleurs
- 18 -
sur des phosphatases acides cytoplasmiques partiellement puri-
fiées. A notre con~aissance, aucune étude approfondie des phos-
phatases acides de l'igname nia enLore été publiée. Cptte lacune
pourrait être liée d'une façon générale, aux difficultés de
purification des protéines de tubercules de Dioscoréacées. Ces
difficultés sont liées à l'existence dans ces tubercules de
substances formant des complexes v~squeux avec les protéines et
rendant mal aisé l lisolement de ces Jernières [4~ •
Par ailleurs, dans l 1abondante littérature concernant
les phosphatases acides végétales, il a été souvent question de
phosphatases aci des liées aux débri s membrana ires [48-55] ; ma i s
à notre connaissance, aucune purification complète n'en a été
faite. C'est compte tenu de ces différents facteurs, que nous
entreprenons ici la purification complète des phosphatases acides
cytoplasmiques et membranaires mises en évidence dans des tuber-
cules de Q.cayenensis rotundata au chapitre précédent, afin de
m'jeux cerner leurs propriétés physicochimiques, éléments essen-
tiels à la compréhension de leur rôle physiologique.
2 - MATERIELS ET METHODES
2.1. PREPARATICN DES COLONNES ET TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES.
Le CM-Sephadex C-50, le DEAE-Sephadex A-50 ainsi que
les gels de Sephadex G-200 et G-25 sont préparés d'après les indi-
cations du fabricant (Pharmacia, UPPSALA, Suède).
Les filtrations sur G-200 sont effectuées dans des
- 19 -
colonnes de 2,6 x 85 cm et les chromatographies sur DEAE-Sephadex
A-50 et CM-Sephadex C-50 dans des colonnes de 4,7 x 30 cm.
2.2. TECHNIQUES ELECTROPHORETIQUES SELON ORNSTEIN [5GJ
ET DAVIS [57J.
a) - Solution (a)
Tampon Tris-glyC"ine 0,1 MpH 8,5.
b) - Solution (b)
30 9 d'acrylamide sont melangés à 0,8 g
N NI-méthylène bisacr.ylamide dans GO ml d'eau distillée
dans un flacun brun. Le volume final est porté à 100 ml
avec de l'eau distillée.
c) - Solution (c) : 30 mg de ferricyanure de potassium sont
dissous dans 100 ml d'eau distillée.
d) - Solution (d) : 480 mg de persulfate d'an~onium sont
dissous dans 100 ml d'eau distillée.
2.2.1. CONDITIONS D'ELECTROPHORESE.
On prépare un mélange à partir des volumes égaux des
solutions a, b, c, et d. La solution obtenue est dégazée sous
vide, répartie dans les tubes de polymérisation. La polymérisa-
tion est effectuée après 1 heure environ. On fait des dépots de
30 à 50 ~l de solution enzymatique. La migration est faite à 3 mA
par gel sous une tension d'environ 180 volts.
t
r
i
1
- 2')·-
1
!
2.2.2. REVELATIONS DES DEPOTS.
f
- La révélation des protéines a été réalisée par le
1
j
bleu de Coomassie (Blue R).
fi
!
- La révélation spécifique des acthités enzymatiques
1
i
1
a été réa l i sée selon l a méthode de Pea rse L58] • LI hydro lyse du
1
2-naphtylphosphate de sodium 0,002 Men tampon acétate 0,1 M
f
f
RH 5,0 libère le 2-naphtol qui forme avec le diazo blue B (Fluka)
f
,1
(1,5 mg ml- 1}un sel de diazonium rouge insobuble.
!11
i
- La révélation spécifique des glycoprotéines a été
t'
. 1
réalisée selon la méthode de Zaccharius et coll [59] . Les gels
1
1
sont successivement i~mergés 30 min dans de l lacide trichloracé-
!l'1)t
tique à 12,5 %, puis 50 min dans de l 'acide periodique 1 % préparé
f
dans de l lacide acétique 3 %,ensuite 50 min dans la fuchsine et
t
!
f
30 minutes dans du bisulfite de sodium 0,5 %. Les gels sont abon-
f
~
damment rincés à l leau distillée avant chaque immersion.
1
!
rf
2.3. PF[PAPATIONDES EXTRAITS BRUTS.
J
!.
2.3.1. ~XTRAIT BRUT CYTOPLASMIQUE
1
!
L'extrait brut cytoplasmique de phosphatase acide, est
obtenu selon les principes évoqués précédemment au chapitre I.
1
1
4009 d'igname pelée sont broyés en présence de 400 ml de
tampon acétate 0,05 MpH 5,0 pendant 2 min. Après centrifugation à
1
4°C pendant 15 min à 20.000 x g, le surnageant est utilisé comme
1
t
f
extrait cytoplasmique. Le culot est utili~é pour l 'extraction des
if
phosphatases acides membr~naires.
1
1
1
1tr[l[
- 21 -
2.3.2. EXTRAIT BRUT MEMBRANAIRE.
Le culot précédent est lavé 3 fois avec de l'eau distillée,
en suspension dans le tampon acétate contenant 0,2 %
de Tritîn X-100 jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'activité phospha-
tasique dans le filtrat. Le culot est relavé à l'eau dist"illée
puis remis en suspension dans environ 300 ml d'une solution de
NaCl 0,8 Met incubé à 4°C pendant 12 h.
Après centrifugation à 4°C pendant 1~ min à 20.000 x g.
le surnageant est récupéré et utilisé comme extrait brut membra-
na i reaprè.s:;~fla}yse':éon'tre du~.tamplin:acét'ate.,O:,O!f:~':pH 5,0 •
. '~.' . - - ~
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-
-
3 - RESULTATS
3.1. PURIFICATION DE L'EXTRAIT CYTOPLASMIQUE.
Nous avons arlopté le protocole suivant
3.1.1. Fractionnement par le sulfate d'ammonium
3.1.2. Filtration sur colonne de Sephadex G-25
3.1.3. Chromatographie sur CM-Sephadex C-50
3.1.4. Filtration sur colonne de Sephadex G-200.
A 500 ml d'extrait brut cytoplasmique on ajoute lente-
ment sous agitation mécanique à O°C, du sulfate d'anunonium selon la
technique de Dawson et coll [600 jusqu'à 50 %de saturation soit
291 g/l. La suspension obtenue est maintenue à 4°C pendant 30 min
- 22
puis c2ntrifugé 15 min à 20.000 x g. Le précipité formé est éli-
miné et~.la concentration en sulfate d'ammonium du surnageant est
portée à 70 % de saturation par addition de 1?5 9 de sulfate
d'ammonium par litre de surnageant. Après 30 minutes de repos à
O°C, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 20.000
x g. Le précipité obtenue est dissous dans un volume de tampon
acétate 0,05 MpH 5,0 de manière à obtenir une concentration
finale de protéine d'environ 15 mg par ml. La solution obtenue
est dialysée à froid contre le même tampon. A la fin de cette
étape on récupère environ 64 % de l'activité phosphatasique de
départ avec élimination de plus de la moitié des protéines.
A ce stade de la purification, la solution est colorée
en brun. La filtration sur une colonne (3 x 35 cm) de Sephadex
G-25 permet de retenir cette coloration brune et d'éliminer la
majeure partie de ces substances visqueuses, ce qui fait éviter
le colmatage des colonnes dans la suite de la purification. On
récupère dans ces conditions plus de 90 %de l'activité enzymatique
introduite avec un facteur de dilution de 1,4.
La solution précédente traitée par le Sephadex G-25 est
chromatographiée sur une colonne de CM-Sephadex C-SO (4,7 x 30 cm)
équilibrée avec le tampon acétate 0,05 MpH S,O. La colonne est
éluée dans un premier temps par environ 800 ml du même tampon, puis
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50
100
150
200
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG. 1 :
Chromatographie sur CM-Sephadex C-50 après fractionnement par le le sulfate
d'ammonium et filtration sur Sephadex G-25.
100 ml de préparation enzymatique contenant 576 mg de protéines sont déposés
sur une colonne de 4,7 X 30 cm équilibrée en tampon aœtate 0,05M pH 5,0.
Après passage de 800 ml de tampon, l'élution est réalisée au moyen d'un gradient
linéaire en NaCI de 0- 0,5 M
Volume des fractions: 15 ml ; débit 90 ml/h
Activité enzymatique --e--e--e--; protéines --*--*--*--
- 24 -
par application d'un gradient linéaire 0 - 0.5 Mde NaCl dans
4 litres du même tampon. Cette étape chromatographique permet
de séparer 2 pics possédant chi'\\cun une acti vité phosphat(lSiqua.
Le premier pic. élué avec le tampon de lavage. possède une faible
activité phosphatasique et nlest pas conserve. Le deuxième pic
contenant la plus grande partie de l'activité phosphatasique
(Fig.1) est éluée pour une ~oncentration en NaCl de 0,17 M. Les
fractions de ce pic sont rassemblées et utilisées pour les étapes
ultérieures de la purification.
Cette chromatographie permet dlobtenir. une préparation
enzymatique purifiée 20 fois. avec une activité spécifique de
400 U/mg (Tableau: 4) et un rendement de 14 %. l'électrophorèse
en gel de polyacrylamide montre deux bandes protéiques.dont une
seule possède une activité phosphatasique. Nous avons donc rechro-
matographié les fractions actives sur CM-Sephadex C-50.
Rechromatographie sur CM-Sephadex C-50.
Les fractions actives rassemblées sont dialysées contre
le tampon acétate 0,05 MpH 5,0 puis rechromatographiées sur CM-
Sephadex C-50 (Fig.2) et nous obtenons sur les fractions actives
rassemblées une activité spécifique de 800 U/mg et un rendement de
10 %. Mais l 'électrophorèse en gel de polyacrylamide révèle, une
bande protéique intense active et une autre bande fine non active.
Nous -avons donc procédé à une filtration des fractions actives rassem-
blées, sur G-200 afin d'améliorer la purHication.
-25-
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50
100
150
200
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG.2 :
Rechromatographie sur CM-Sephadex C-50. Les fractions actives du 1er CM-
Sephadex sont rassemblées, dialysées contre le tampon acétate 0,05 M pH 5,0
puis déposées sur une colonne 4,7 X 30 cm équilibrée par le même tampon.
Après passage de 800 ml de tampon, l'élution est réalisée au moyen d'un gradient
linéaire en NaCI 0- 0,5 M.
Volume des fractions: 15 ml ; débit 90 ml/h.
Activité enzymatique --e--e--e-- ; protéines --:-*--*--*--
- 26 -
Les fraction.
activ~s précédentes rassemblées, sont
concentrées par filtration sur membranes SELECTRON L1LTRA-GAINES
UH 1CO (DASSEL. W. Germany), puis chromatographiées sur colonne
de Sephadex G-200 (2,6 x 85 cm) équilibrée avec le tampon acétate
O~05 MpH 5,0 contenant O,1'M de NaCl. L1élut.ion est effectuée
avec le même tampon. La figure 3 donne le profil d'élution.
L'activité spécifique est constante, dans chaque fraction de
l 'unique pic protéique contenant les activités phosphatasiques.
L'électrophot'èse en gel de polyacrylamide 7,5 %montre une seule
bande protéique active. Cette préparation enzymatique est
conservée à 4°C jusqu1à son utilisation. Elle sera désignée
phosphatase acide (A).
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60
70
80
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG. 3:
Filtretion lur Sephldex G-200 apr. CM-Sephadex C-50
L. frictions actives apr61 CM-Sephadex C-60 sont raaembl'" et concentrfts
par filtl'ltlon sur membrane SELECTRON ULTRA-Gainei UH 100 (DASSEL Ger-
minY) et d'Po.... sur colonne de Sephadex G-200 (2,8 X 86 cm) ~ulllb"e par
le tampon dtlte 0,06 M pH 6,0 contlnant 0,1 M de NICI et "ua par le marne
tampon.
Volume d. fl'letlol'll : 4 ml ; cWbit 8 ml/h.
Aetivl. enzymetlque : --e--e-- ; pro.i~ --.--.--.
~:"""'j"·""''''''"'~·''~·''"''·~',,o:..'~''"'c:':'';;'''''''''''''''''''''''''"'''''''_''''''';~_'·~~~'''"''li<'.l.\\il<""""...,,,,,,~·~~ .......·.~...........,,...,,,,,,,,,~~;..~••,;i"~"'~',jl
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Tableau 4 : BILAN DE PURIFICATION DE LA PHOSPHATASE ACIDE CYTOPLASMIQUE (PH0SPHATASE A)
Etapes de purification
Activité
Protéines
Activité
Fact~ur de
Rendement
totaie (U)
(mg)
spécifique
purification
(%)
U/mg
Extrait brut
25.500
1.275
20
1
100
Cytoplasmique
-
1
50-70 % (NH4)2S04
16.500
660
25
1,2
64
co
Sephadex G
N
25
15.000
576
26
1,3
58
-
Sephadex CM-C-50
3.500
8,8
400
20
14
Sephadex CM-C-50
2.500
3, 1
800
40
10
1
1
Sephadex G-200
1~
1, 1
1.400
70
6
1
1
- 29 -
1
1
3.2. PURIFICATION DE L'EXTRAIT MEMBRANAIRE.
1
Nous avons adopté le protocole suivant
1
3.2.1. Fractionnement pat le sulfate d'~mmonium
1
3.2.2. Filtration sur colonne de Sephadex G-2S
!
3.2.3. Chromatographie sur Cr~-Sephadex C-SO
t
1
~
3.2.4. Chromatographie sur DEAE-Sephadex A
f
SO
l,
3.2.5. Filtration sur colonne de Sephadex G-200
1
1
3.2.1. E~~~!iQQQ~~~Q!_e~r_l~_~~lf~!~_9:~~~QQi~~
(mèrne méthode que précédemment au 3. 1.1. )
1
1
it1
NOlis avons utilisé les mêmes méthodes que pOLIr la
purification de l'extrait cytoplasmique. Les résultats obtenus
sont peu différents de ceux de la préparation enzymatique cytoplas-
mique.
1
~
3.2.3. çh[Q~~!Q9r~ebi~_~~r_Ç~:~~eb~9~~_Ç:~Q
!
1
•
Les chromatographies sur CM-Sephadex C-SO utilisées
!
1
ont été réalisées dens les mêmes conditions expérimentales que
1
f
p:~écedemlllent au 3.1.3. L'élution de la préparation enzymatique
!
1
membranaire montre deux pics il.lportants de protéines dont un seul
!,
~
renferme une activité phosphatasique.
t!
Le pic actif (Fig.4) est élué quand la concentration en
1
1
NaCl atteint 0,31 M. Nous récupérons environs 41 %des activités
1
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0,25
0,6
0,4
0,2
50
100
150
200
300
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG.4 :
Chromatographie sur CM-Sephadex C-50 aprés fractionnement par le sulfate
d'ammonium et filtration sur G-25.
100 ml de solution enzymatique contenant 430 mg de protéines sont déposés sur
une colonne de 4,7 X 30 cm équilibrée en tampon acétate 0,05 M pH 5,0.
Aprés passage de 800 ml de tampon, l'élution est réalisée au moyen d'un gradient
linéaire en NaCI de 0- 0,5 M.
Volume des fractions: 15 ml ; débit 90 ml/h.
Activité enzymatique --e-_e-- ; protéines -*-*-
- 31 -
totales de départ avec un facteur de purification de 10
(Tableau: 5).
Les fractions actives précédentes sont rassemblées et
dialysées contre le tampon Tris-HCl 0,02 MpH 7,5 puis chromato-
graphiées sur DEAE-Sephadex A-50 équilibré avec le même tampon.
La colonne est dlabord lavée avec 800 ml du même tam-
pon, puis éluée par application Jl un gradient linéaire 0 - 0,5 M
de NaCl dans 4 litres de tampon.
La figure 5 donne le profil dlélution qui montre deux
pics protéiques contenant chacun une activité phosphatasique impor-
tante. Le premier pic (Pic 1) est élué quand la concentration en
NaCl atteint 0,22 Met le second pic (Pic II) quand celle-ci atteint
0,24 M.
A ce stade de la purification les activités spécifiques
des fractions rassemblées du pic l et du pic II sont respectivement
de 365 U/mg et 310 U/mg et les rendements respectifs sont de 13 %
et 9 %. (Tableau 5).
3.2.5. Eil~r!!i2Q_!~r_~212nn~_~!_§!e~!~!~_§:gQQ
Les fractions du pic l et du pic II sont respective-
ment rassemblées puis concentrées par filtration sur membrane
StLECTRON ULTRA-GAINES UH 100 (DASSEL.W. Germany) et chromatogra-
phiées sur colonne G-200 (2,6 y 85 cm) de la façon habituelle.
-32-
0,1
20-
~
-1
c:
c:
i-
-~
0
E-
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N
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3
1
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0,05
°/2
\\•\\\\
o..L.
.MG~
..:.\\...:..{-_....L-_
100
150
200
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG.& :
Chromatographie sur DEAE-5ephadex A 50 après chromatograhie sur CM-
Sephadex C-50.
160 ml de solution enzymatique dialysée contre le tampon Tris-Hel 0,02 M pH
7,5 contenant 38 mg de protéines sont déposés sur une colonne de 4,7 X 30 cm
équilibrée par le même tampon.
Après passage de 800 ml du même tampon, l'élution est réalisée au moyen d'un
gradient linéaire en NeCl de 0-0,5 M.
Volume des fractions : 15 ml ; débit 90 ml/h ; activité enzymatique
-
protéines ---*--*--
l
i
- 33 -
1
J
f1
On obtient dans chacun des cas un pic protéique unique auquel
est associéeune activité phosphatasique, avec une activité spé-
1
cifique constante tout au long du pic (Fig.6 et 7).
Les électrophorèses en gel de polyacrylamide 7,5 %
i
montrent une seule bande de protéine pour chacune des deux pré-
t
parations. Les préparations enzymatiques obtenues se,'ont respec-
f
f
tivement désigné~s phosphatase acide (B) à partir du pic 1 et
1
~i
phosphatase acide (C) à partir du pic II. Celles-ci sont conser-
1
!
vées à 4°C jusqu'à leur utilisation.
1
1
t
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20
20
50
75
100
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG. 8 :
Filtration sur Sephadex G-200 aprts DEAE-s.phadex A50
Le pic
1 du DEAE A50 concentré par filtration sur membrane SELECTRON
ULTRA-Gaines (UH 100 DASSEL Germany) est d6pos6sur la colonne 2,8 X 86 cm
6quilibr6e par le tampon adtate 0,06 M pH 6,0 contenant 0,1 M de NeCl et 61u6
par le mime tampon.
Volume des fractions: 4 ml ; d6bit 8 ml/h
Aetivit6 enzymatique --e--e--e-- ; prot6ines - - . - . - . -
•
-35-
40
40
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20
20
50
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100
NOMBRE DE FRACTIONS
FIG. 7 :
Filtration sur Sephadex G-2oo apm DEAE-5ephadex A 50
Le pic Il du DEAE A 50 concentré par filtration sur membrane SELECTRON
ULTRA-Gaines (UH 100 DASSEL Germany) est d'po. sur la colonne 2,6 X 85 cm
6quilibr6e par le tampon ac6tate 0,05 M pH 5,0 contenant 0,1 M de NaCI et 61u'
par le même tampon.
Volume des fractions : 4 ml ; d'bit 8 ml/h
Activité enzymatique --e--e-- ; protéines __e __e __e __
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_ ~ , ~...........~
Tableau
5
BILAN DE PURIFICATION DE DEUX PHOSPHATAS ES ACIDES MEMBRANAIRES (ENZYMES B et C)
IEtapes de purification
Activité
Protéines
Activité ..
Facteur de
r Rendement
totale (U)
(mg)
speclflque
pUrlflcatlon
t%)
U/mg
Extrait brut membranaire
11.000
1.000
11
1
100
50-70 % (NH4)2S04
7.700
48 1
16
1,4
70
Sephadex G-25
7.000
430
16,2
1,47
63
1.0
("1')
CM-Sephadex C-50
4.500
38,7
116
10
41
Pic 1
1.400
3,8
365
33
13
DEAE-Sephadex A50
Pic II
1.000
2,2
310
28
9
Sephadex G200 du Pic 1
750
0,62
1.200
109
6,8
Sephadex G200 du Pic II
650
0,59
1.100
100
5~9
-37 -
ENZYME (A)
ENZYME (B)
ENZYME (C)
FIG.8 :
eLECTROPHORESE EN' GEL DE POLYACRYLAMIDE
a,. b, et c,
révélation de l'activité enzymatique
a2. b2 et c2
coloration des glucides
a3. b3 et c3
coloration des protéines
- 38 -
4 - DISCUSSION.
Les méthodes de purification des protéines enzymatiques
sont très diverses. Elles comportent généralement des techniques
de précipitation fractionnée, de chromatographie échangeuse
d'ions et de filtration moléclllaiy'e sur gel.
En utilisant ces différentes techniques agencées sur
5 étapes nous avons pu obtenir trois préparations enzymatiques
pures ainsi que.le montre leur homogenéité à l'électrophorèse
(Figure 8).
La phosphatase acide cytoplasmique (A) a été purifiée
70 fois avec un rendement je 6 %. Quant aux phosphatases acides
membranuires (B) et (C), elles ont été purifiées 100 fois environ,
avec des rendements respectifs de 6,8 %et 5,9 % (Tableau 5).
Les rendements obtenus ici dans le cas de D. cayenensis
rotundata sont nettement meilleurs que la plupart de ceux cités à
propos de phosphatases d'origines diverses. Les différents résul-
tats portent d'ailleurs presque tous sur des phosphatases acides
partiellement purifiées. Ainsi Igaue et coll [23] ort rapporté des
rendements de 1 % et 2,40 % après purification partielle de phos-
phatases de riz, et Crasnier et coll [61] un rendement de 4,6 %
après purification de phosphatase acide de cellules de sycomore et
Uehara et coll [31] un rendement de 5,2 % sur des phosphatases
acides de patate douce.
-,39 -
Ce travail représente la première purification complète
de phosphatases acides cytoplasmiques et membranaires de tubercules
dl igname.
- 40 -
CHA PIT RE
III
PROPRIÉTÉS r1JLÉcULAIRES ET CINÉTIQUES
1 - INTRODUCTION
La
pureté relativement satisfaisante res protéines enzy-
matiques décrites dans le chapitre précédent nous permet d1aborder
llétude de leurs propriétés moléculaire:. et cinétiques afin de
mieux mettre en exergue les caractéristiques particulières de
chacun des enzyn~s. En ce qui concerne les propriétés moléculaires,
nous analyserons successivement la composition en acides aminés
des trois phosphatases acides purifiées et la constitution de
o
leurs fractions glucidiques, puis nous aborderons la détermination.
des poids moléculaires. Pour les propriétés cinétiques, nous
étudierons 1 linfluence du pH, de la température sur l lactivité des
trois phosphatases, et 1 laction de ces dernières sur différents
substrats.
- 4.L
2. PROPRIETES MOLECULAIRES.
2.1. COMPOSITION EN ACIDES AMINES *
La compostion en aminoacides a été déterminée selon la
méthode de Moore [62] à partir des résultats obtenus après trois
types d'hydrolyse : hydrolyse. chlorhydrique totale, hydrolyse chlorhydri-
que précédée d'une oxydation performique pour le dosage de la
cystéine et de la méthionine, hydrolyse par l 'acide méthane sulfo-
nique pour le dosage du tryptophahe.
Les échantillons à analyser sont préalablement dialysés
contre de l'acide acétique 5 %_(v/v), puis séchés par évaporation
sous vide.
a) - Hydrolyse chlorhydrique totale.
La protéine est hydrolysée en tube scellé sous azote à
110°C pendant 24 h par de l 'acide chlorhydrique distillé 5,7 N
contenant du B-mercaptoéthanol 0,02 % (v/v) et du phenol pour pro-
téger les résidus de tyrosine. Les hydrolysats sont séchés sous
vide, remis en suspension dans un tampon citrate de sodium 0,2 M
pH 2,2 puis analysés à l laide d'un autoanalyseur DURRUM D500.
b) - Hydrolyse chlorhydrique après oxyd!tion performique.
La cystéine et la méthionine so~t respectivement dosées
sous forme diacide cystéique et de méthionine sulfone, après
______ i;;
.--_~-- .. --~<.~~~~'!:'l,,:~"P~.~~~.~~-------- - ------ -- _io.-
_
* L1ahalyse des acides aminés a été effectuée a.l 'I.B:M.C. de Stras-
bourg par le Professeur COLAS que nous remerClons vlVement.
- 42 -
oxycatJ('n p~rf("rmique de la rrol.élne se:JI1 f-1oore l62J . La pro
téine dissoute dans un volume ~inimum diacide formiqu~ est in~ubée
pendant 3 h à - 10°C dans un mélange de 10 y~de méthanol et de
?OO ~ldlune solution d'acide performique et d'eau oxygenée préparée
1 h avant son utilisation (1 volume H202 + 9 volumes de HCOOH~.
Après lyophilisation, l Ihyqrolyse chlorhydrique et l'analyse sont
menées comme ci-dessus.
c) - Hydrolyse par l lacide méthane sulfonique.
A cause de son instabilité à l 'hydrolyse chlorhydrique,
le tryptophane est dosé selon la méthode de Liu et Chang [63J:
la protéine est hydrolysée en tube scellé sous azote pendant 10 h
à 110°C par 50 ~dlune solution diacide méthane sulfonique 3 N
contenant 0,2 % de tryptamine. L'hydrolysat, avant d'être analysé,
est dilué par 100 ~de tampon citrate de sodium 0,2 MpH 2,2.
2.2. ANALYSE DE LA FRACTION GLUCIDIQUE.
Les méthodes d'études électrophorétiques des glycopro-
téines ont été décrites par Zacharius et coll [59 J et par Segrest
et coll [6~ . Les méthodes colorimétriques de microdosage des
glucides ont été l 'objet d'une étude détaillée faite par Montreuil
et Spik et rapportée dans trois monographies [65-67 J •
a) - Dosage des oses neutres
Le dosage des oses neutres a été effectué par la méthode
au phénol-sulfurique de Dubois et coll [68] modifié par Drapron et
Guil bot [69 J . Cette méthode peut être appl iquée directement à une
- 43 -
estimation de la quantité totale d'hexoses neutres. Sous l'action
à chaud de l 'acide sulf~rique concentré, les sucres se dégradent
pour donner des dérivés du furfJ~a·. Condensés aver lp phénol,
ces dérivés conduisent à des chromophores (colorati~n orangée).
et sont dosés à 492 nm.
Ce procédé permet de doser essentiellement le galactose,
le mannose, le glucose et le fructose. la contribution de ces
sucres à la coloration varie d'un composé à l'au~re. le galactose
a été utilisé comme'référence •.
b) - Dosàge des acides sialiques
le dosage a été effectué suivant la technique de Werner
et Odin [70} • Cette nrethode permet de doser directement les acides
sialiques conjugués.
les acides sialiques, sous l'action de réactifs acides
appropriés sont rapidement désacétylés et décarboxylés en 2-désoxy-
4-amino-octose qui subit ensuite une dégradation plus poussée et
donne un chromogène qui, se condensant avec la diphénylamine, donne
un dérivé de coloration bleu-violacé présentant un maximum d'absorp-
tion à 530 nm.
Une solution étalon d'acide N-acét:ylneuraminique est
utilisée comme référence.
c) - Dosage des osamines
'l'hydrolyse des glycoprotéines a été effectuée par HCl
4N dans un bain-marie à 100°C pendant 4 heures. les osamines ont
- 44 -
été dosées par l a méthode dl El son et Morgqn [ 71 ] .
les osamines sont acétylés en milieu alcalin et à chaud
par l'acétylacétone. Ce traitement conduit à la formation de chro-
mogènes (2-méthyl'pyrole et 2-méthyl-3-acétyl pyrole) qui se con-
densent à chaud avec le réactif 1'Ehrlic" (1.6 g d~ diméthylami-
nobenzaldéhyde dans 30 ml d'HCl concentré et 30 ml d'éthanol) pour
donner un dérivé rose-violet. l'analyse colorimétrique est faite
à 520 nm après un repos de 30 minutes à l'obscurité. On utilise
la galactosamine comme composé 'sta.ldard.
2.3. ElECTROPHORESE'EN'GEl DE POlYACRYLAMIDE EN PRESENCE DE S.O.S.
les électrophorèses en présence de dodécyle sulfate de
sodium (S.O.S.) sont effectuées selon la méthode de Weber et
Osborn [72] avec des gels à 5 %et 7,5 %en acrylamide préparés
en tampon phosphate de sodium 0,1 MpH 7,2 contenant 0,1 %de S.O.S.
les solutions de protéines dans le tampon acétate 0,05 M
pH 5,0 sont diluées avec un volume identique de tampon phosphate
de sodium 0,02 MpH 7,0 contenant 2 % de S.O.S. et 2 % de mercapto-
éthanol. Elles sont ensuite chauffées 5 min dans un bain-marie à
'100°C. Le rapport en poids S.D.S./Protéine est toujours supérieur
à 3.
Des protéines de poids moléculaires connus sont utilisées
comme marqueurs et traitées de la même faç~n : ce sont: le cyto-
chromee (P.M. 12.400), la trypsine (P.M. 23.000), le lactate déshy-
drogénase monomère (P.M. 35.000), l'ovalbumine (P.M. 43.000), la
- 45 -
s~rum~albumine bovine monomère (P.M. 68.000), la's~rum-albumine
bovine
"
dimère (P.M. 1~6.000). Des parties aliquotes contenant
environ 40 ~g de protéine sont déposées sur chaque gel avec 5 ~
de mercaptoéthano l, 10 li. de bleu de brC?mophéno l (1 %CI \\ et une goutte
de glycérol. Les électrophorèses sont effectuées à température
ambiante (22°C) avec une intensité constante de 8 mA par tube'de
0,6 x 6 rm. Le ta~pon phosphate dL ~odium ~.1 MpH 7,2 ~ontenant
0.1 %de S.O.S. est utilisé comme tampon d'électrophorèse et rerou-
velé plusieurs fois au cours de l,lexpérience afin de maintenir le
pH constant. L1électrophorèse est arrêtée iorsque le bleu de bromo-
phenol atteint le bas du gel.
Après l'électrophorèse, les gels sont colorés pendant une
nuit au bleu de coomassie brillant R (625 mg de bleu brillant R
dilués dans un mélange contenant 227 ml de méthanol à 50 %et
13 ml diacide acétique glacial). La décoloration des gels est
ensuite réalisée par diffusion en immergeant les gels dans une
solution de méthanol-acide acétique-eau, en proportions de 5:1:5
(v/v/v).
2•.4. POIDS MOLECULAIRES APPARENTS EN GEL FILTRATION
Le poids moléculaire apparent de chaque enzyme a été
estimé par filtration à travers une colonne de Sephadex G200
(2.6 x 85 cm)équilibrée avec un tampon acétate 0.05 MpH 5.0 conte-
nant 0,1 MNaCl. L'étalonnage de la colonne est réalisé avec des
protéines connues: le cytochrome C (P.M. 12.400). l 'ovalbumine
- 46 -
,
(P.M. 43.000), la serum-albumine bovine (P.M. 68.000), le lactate
déshydrùgénase (P.M. 135.000) et la catalase de foie de cheval
(P.M. 225.000). Les enzymes sont décélés par leur activité et les
protéines sont répérées dans les éluats par leur absorption à
280 nm. Le volume d'élution du bleu Dextran 2000 (Pharmacia) donne
la mesure du volume mort (Vo). Les résultats sont exploités selon
la méthode dlAndrews [73] .
2.5. RrSULTATS
2.5.1. COMPOSITION EN ACI:ES AMINES.
Nous rapportons dans le tableüu 6 la composition en
acides aminés de la phosphata se acide cytoplasmique (A) et des
phosphatases acides me~branaires (8) et (C), que nous comparons
à celle de la phosphatase acide de patate douce donnée par Uehara
et coll [29] .
Dans le tableau 7, nous avons noté la contribution de
quelques groupes diacides aminés à la composition globale des
enzymes (A) (8) et (C) et en particulier le rapport résidus polaires
sur résidus apolaires. On sait que ce rapport peut donner une idée
de la géométrie d1une molécule protéique.
On considère généra1ement comme résidus polaires, les
résidus des acides aminés suivants: Asx, Glx, Lys, Arg, Thr et comme
résidus apolaires, ceux de Val, Leu, Ile, Met, Pro et Phe.
Le calcul du rapport des résidus polaires/résidus apolaires
donne des valeurs de 1,37 pour l 1 enzyme (A), 1,44 pour l 1 enzyme (B)
- 47 -
et de 1,68 pour l'enzyme (C).
Ainsi qu'on peut le remarquer dans le tableau 6, la
phosphatase acide cytoplasmique se distingue nettement des deux
phosphatases 'acides membranaires principalement par le contenu
en acides aminés dicarboxyliques (et amides), basiques, soufrés
et aromatiques.
En effet, l laspartate et le glutamate ont des taux res-
pectifs de 102 et 103 résidus par mole de phos)hatase cytoplasmique,
en tenant compte des ~mides respectives. Au niveau des enzymes
membranaires, ces taux sont pour le groupe aspartate respective-
lI~ent dE:: 37 ~t 56 résidus par mole de phosphatase acide (B) et (\\:)"
et pour le groupe glutamate, r~spectivement de 63 et 76 résidus par
mole de ces mêmes enzymes. Quant aux amino-acides soufrés, ils sont
en faibles proportions surtout dans les phosphatases membranaires.
On compte en effet 14 cystéines et 11 méthionines dans l'enzyme
cytoplasmique, alors que ces résidus sont au nombre de 6 pour chacun
des enzymes'membranaires.
Les taux des amino-acides aromatiques et basiques sont
généralement deux fois plus élevés chez l'enzyme cytoplasmique (A)
que chez les enzymes membranaires (B) et (C), sauf pour le trypto-
phane dont le taux est environ 5 fois plJS élevé dans la phospha-
tase A que dans l'enzyme B.
Quand on compare les phosphatases acides (A~, (B) et (C)
à la phosphatase de la patate douce, on remarque une similitude
d1ensemble entre celle-ci et l 1 enzyme cytoplasmique (A), sauf pour
- 48 -
Tableau 6
COMPOSITION EN ACIDES AMINES *
Phosphatase
Phosphatase
Phosphatase
Phosphatase
acide de
acide A
acide B
acide C
patate douce
(1)
Asx
102
57
55
98
Thr
53
29
36
62,1
Ser
80
46
108
70;5
Glx
103
63
76
73,2.
Pro
43
22
22
60,5
Gly
101
51
106
69
Al
61
34
54
39,9
Val
51
28
26
64,7
1/2 Cys
14
6
6
2,4
Met
11
6
6
19
Ile
33
18
19
39,5
Leu
68
40
32
59,1
Tyr
32
17
17
76,4
Phe
43
22
16
41,2
His
18
11
16
39
Lys
48
25
23
35,8
Arg
36
22
14
44
Trp
10
4
10
29,7
Nombre de
915
501
642
924
rés i dus
P.M.
98.000
55.000
65.000
105.000
* Rés·idus par mole d'enzyme
(1) D'après UEHARA et coll [29] .
Tableau 7 : CONTRIBUTION DE CERTAINS GROUFES ~ LA COMPOSITION GLOBAlE EN
ACIDES AMINES
Poucentage par rapport au nombre total de résidus
-
Phosphatase
Phosphatase
Phosphata se
Phosphatase
2
acide (A)
acide (8)
acide (C)
aci de de
patate douce
Groupes diacides Aminés
(1)
Acides + amides -
Asx
24
20,4
18,5
19,8
22,4
Glx
1
Basiques : Lys + Arg + His
1 11 ,1 1 11,5
8,2
12,9
13,5
1
1
C"
..:r
Aromatiques: Tyr + Trp + Phe
10,6
8,6
6,7
15,9
3
Hydroxylés : Ser + Thr
14,5
15
22,4
14,5
13, 1
1
,
1
Autres hy~rophobes :
Leu + Ile + Val + Phe + Met
22,5
22, 1
15,4
24,2
20,2
(i) Dlaprès UEHAkA et coll [29l
(2) Valeurs moyennes calculées par Dayhoff et coll [74] à p~rtir de 314 protéines connues
- 50 -
les taux de cystéine, et des aminoacides aromatiques. Le taux de
cystéine est plus élevé chez la phosphatase (A) de ll;gname (7 fois
plus) alors que le taux dlamino-acides aromatiques est plus impor-
tant.chez l'enzyme de la patate douce (environ 1,5 à 2 fois plus
de résidus de tyrosine et de tlyptophane).
2.5.2. COMPOSITION CHIMIQUE DE LA FRACTION GLUCIDJQUE
Les résultats rassemblés dans le tableau 8 montrent que
les enzymes (A) (8) et (C) contiennent des hexoses et des hexosa-
mines, mais ne renferment pas diacide sialique.
On remarque aussi que les hexoses sont en proportions
pl us impot"tantes que les hexosamines dans chacun des enzymes.
Si lIon compare la composition globale en hexoses et
hexosamines des enzymes (A) (8) et (C), on rem~rque que la fraction
glucidique de la phosphatase acide cytoplasmique (A) est légèrement
plus importante (12 % ) que celle des phosphatases acides membra-
nair~s (q) et (C) qui contiennent respec~ivement 10 et 11 %d'h~xoses
et hexosamines.
- 51 -
Tableau 8
CO~POSITION DE LA FRACTION GLUCIDIQUE
COMPOSITION ( % POIDS)
SUCRES
Enzyme.A
Enzyme B
Enzyme C
Hexoses
7.2
6.5
7.0
.
Hexosamines
4.5
3.5
4
.
Acides sialiques
0
0
0
-
!
2.5.3. DETERMINATION DES POIDS MOLECULAIRES
a) Détermination par filtration sur gel
Nous avons estimé les poids moléculaires dans les condi-
tions définies par Andrews [73-75-76]
en prenant des protéines de
poids moléculaires connus comme référence. Les résultats de cette
étude sont rassemblés dans la figure 9.
Les poids moléculaires apparents obtenus sont de 98.000 ±
2.000 pour la phosphatase acide cytoplasmique (A), 55.000 ± 2.000
pour llenzyme (B) et 65.000 ± 2.000 pour l 1enzyme (C).
b) Détermination du poids moléculaire par électrophorèse
sur gel de polyacrylumide en présence de S.O.S. (sodium
dodécyle sulfite).
La figure 10 indique les valeurs des poids moléculaires
obtenus en présence de S.O.S. en gel de polyacrylamide 5 %et 7,5 %.
- 52 -
Les poids moléculaires calculés dans les deux cas
selon les indications de Weber et Osborn [72] sent de 87.000 ±
3.000 pour la phosphata se acide cytoplasmique (A), 50.000 ± 3.000
pOU1~ la phosphatase acide membranaire {B~ et 56.000 ± 3.000 pour
l'enzyme membranaire (C).
Il faut noter que ces valeurs ne sont pas très diffé-
rentes de celles obtenues par gel
filtration.
A titre de comparaison nous avons rassemblé dans le
tableau 9 les poids moléculaires de phosphatases acides d'origines
végétales diverses. Ces poids moléculaires o~t été obtenus par des
méthodes différentes et se situent entre 28.000 et 171.500.
Les déterminations en présence de S.D.S. montrent bien
que certaines de ces phùsphatases sont des protéines oligomériques.
-53-
3
z
1
1
4,1
5,1
...
IDI····
9:
Détermination des poids moléculaires des phosphatases acides (A) (8) et (C) par
filtration sur Sephadex G. 200
L'étalonnage de la colonne a été effectué avec les protéines suivantes :
1)
Cytochrome c (P.M. 12.4(0) ;
2)
Ovalbumine (P.M. 43.0(0) ;
3)
Serum-Albumine bovine (P .M. 68.0(0) ;
4)
Lactate deshydrogenase (P.M. 135.000) ;
5)
Catalase (P.M. 225.000).
-54-
log P.M
Il
5,0
4,5
4,0
1
2
3
4
(Cm)
MOBILlTI:
FIG. 10 :
Détermination des poids moléculaires des phosphatases acides
(A) (8) et (C) par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 5 % (trait II) et 7,5 %
(trait 1) en présence de SOS.
Tous les échantillons ont été traités comme indiqué précédemment.
La mobilité électrophoretique de chaque protéine est calculée suivant les indica-
tions de Weber et Osborn (72). Les marqueurs utilisés sont:
1)
Cytochrome c : (P.M. 12.400)
2)
Trypsine (P.M. 23.000)
3)
Lactate deshydrogenase monomère (P .M. 35.0001
4)
Ovalbumine (P.M. 43.000)
5)
Serum-albumine bovine monomère (P.M. 68.0001.
6)
Serum-albumine bovine dimère (P.M. 136.000)
Tableau 9 : POIDS MOLECULAIRES DE QUELQUES PHOSPHATAS ES ACIDES
1
Origine de l'enzyme
Methodes utilisées
Poids rn01éculaires
Patate douce
[ 29]
G 200
105.000
- -
Pomme de terre [21]
G 1'J0
96.000
Electrophorèse-SDS
46.000
i
Culture in vitro de cellules de
sycomore [61]
G 150
100.000
Ln
Cellules de riz cultivées in vitro [23]
G 150
65.000 - 100.000 - 150.JOO
Ln
Electrophorèse-SDS
63.000 -
51.000 -
66.000
Racines de riz [14]
G 200
55.000 - 100.000 - 150.000 - 96.000
Electrophorèse-SDS
28.000 -
65.000 -
63.000 - 64.000
Racines de pin d'A12p [78]
3el de Sephacryl S-200
59.000
Ult roge l Ac - 34
67.000 - 171.500
\\
Tubercules d'ignames [46]
G 200
(B) 55.000 -
65.000(C) - 98.000 (A)
Electrophorèse-SDS
50.000 (B) - 56.000 (C) - 87.000 (A)
- 56 -
2.6. DISCUSSION
Ce qui i~essort plus particulièrement de l'étude de la
composition en acides-aminés des trois phosphatases purifiées,
c'est la nette différence d'ensemble qui se dégage entre l'enzyme
cytoplasmique (A) et les deux autres phosphatases membranaires,
surtout au niveau des amino-acides dicarbox:'liques, basiques,
soufl"és et aromatiques. Par ailleurs, bien que les deux enzymes
membranaires aient une composition globale en amino-acides rela-
tivement similaire, ils se distinguent
aussi nettement l'un de
l'autre par les taux de sérine et glycine.
Le rapport résidus polaires/résidus apolaires est rela-
tivement plus élevé chez les enzymes membranaires (B) et (C) que
chez l'enzyme cytoplasmique (A). Ceci milite en faveur d'une con-
formation beaucoup plus compacte chez l'enzyme cytoplasmique, du
fait de la possibilité d'un plus grand nombre de liaisons hydro-
phobes dUes.à la plus grande richesse en résidus apolaires. La plus
grande richesse des enzyn~s membranaires en résidus polaires pour-
rait être reliée au fait que ces résidus permettent probablement le
maintien de ces enzymes par des liaisons diverses sur les parois
membranaires.
La contribution de certains résidus à la composition
globale en amino-acides des trois phosphatases a été comparéeà la
contribution moyenne de ces groupements calculée par "Da{hoff et
coll [74] à partir de 314 prot~ines connues. Cette comparaison fait
- 57 -
apparaître nettement 'une contribution importante, nettement au-
dessus de la moyenne des résidus acides et amides à la composi-
tion globale des phosphatases (A) et (B) et des amino-acides
hydroxylés à celle de la phosphatase (C). Il apparaît par ailleurs
une nette similitude au niveau des enzymes (A; et (B) dans la
contribution des amino-acides basiques, hydroxy1és et hydrophobes.
Il faut noter aussi que les taux de contribution des
différents amino-acides à la composition g~obale en amino-acides
de la phosphatase acide de patate douce sont sensiblement égaux
aux moyennes calculées par Dayhoff [74] .
La détermination des poids moléculaires des protéines
par filtration sur gel, bien que très pratique dans sa conception
soulève souvent quelques réserves, surtout dans le cas des glyco-
protéines. En effet, dans ces cas, l'importante dilatation par
hydratation de la fraction glucidique conduit à des molécules
pouvant avoir des poids moléculaires apparents trop élevés. Il
faut noter par ailleurs que des interactions gef-glycoprotéines
peuvent retarder l'élution de ces molécules et conduire alors à
des poids moléculaires a~parents trop faibles. Cependant, selon les
'estimations de Gibbons [77J , des résultats satisfaisants sont
obtenus dans le cas des glycoprotéines dont la copule glucidique ne
dépasse pas 10 %. Dans le cas des phosphatases acides (A), (Bj et
(C), l -importance de la fraction glucidique se situe entre 10 et
12 %. Les poids moléculaires déterminés selon cette technique de
gel filtration doivent par conséquent être considérés comme des poids
- 58 -
mol~culaires apparents, méritant d'être estimés par d'autres
techniques. C'est ce que nous avons voulu faire en utilisant la
technique de détermination par électrophorèse en gel de polyacry-
lamide en présence de S.O.S. Cette méthode nlest pas non plus
sans inconvénient dans le cas des glycoprotéines dont les inte-
ractions avec le gel de polycrylamide, peuvent faire varier aussi
la mobilité électrophorétique des protéines, et conduire à des
poids moléculaires apparents élevés.
En tenant compte de ces facteurs, on peut dire que les
poids moléculaires obtenus par cette méthodp ne sont pas sensible-
ment différents de ceux estimés par gel filtration. Ce qu'on peut
surtout retenir de cette détermination en présence de S.O.S., c'est
que les trois phosphatases purifiées ne semblent pas 'être des pro-
téines oligomériques.
- 59 -
3. PROPRIETES CINETIQUES
3.1. INFLUENCE DU PH
Les variations de pH ont un effet soit au niveau de
l'enzyme, soit au niveau d~ substrat. Au niveau de l'enzyme, il
peut y avoir des modifications du degré d'ionisation de certains
groupements fonctionnels dont la charge est nécessaire, soit à la
formation du complexe enzyme'ubstrat, soit au maintien de la con-
formation tridimensionnelle native de la protéine enzymatique. Au
niveau du substrat, il peut y avoir aussi un changement dans le
degré d'ionisation pouvant empêcher la formation du complexe enzyme-
substrat. Il existe donc pour chaque protéine enlymatique, une
zone de pH de stabilité de la conformation native et un pH optimum
pour la transformation enzymatique d'un ~'Jbstrat dans un milieu de
composition donnée.
3.1.1. STABILITE EN FONCTION DU PH
Vétude de la stabil ité des rréparations enzymatiques en
fonction du pH a été réalisée entre pH 2,3 et pH 8,8 dans diffé-
rents tampons
tampon glycine-Hel 0.1 M (pH 2,3 - 2,9), acétate
1
0,1 M(pH 3,6 - 5,4), Tris-maleate 0,1 M (pH 5,7 - 8,8).
Le domaine de stabilité dans l'échelle des pH est lég're-
ment moins étendu pour l'enzyme (C) que pour les enzymes (A) et (B).
Après une heure, à 37~C, aux différents pH indiqués, (Tableau 10)
les enzymes (A) et (B) sont stables entre pH 3 et pH 8, alors que
l'enzyme (C)l'est entre pH 4 et 8.
- 60 -
Tableau 10
INFLUENCE DU pH SUR LA'STABILITE DES
ENZYMES (A) (B)'et (C)
pH
ENZYME A
ENZYME B
ENZYME C 1
2,5
40
44
39
3,0
99
100
88
4,0
100
100
100
5,0
100
100
100
5,5
100
100
100
6,0
100
100
100
7,0
100
100
100
8,0
97
100
85
8,5
89
82
79
J
\\
Les préparations enzymatiques (A) (B) et (C) sont diluées 10
fois dans les tampons au différents pH indiqués à 37°C. Au bout d'une heure,
,
des parties aliquotes sont prelevées ~t diluées 10 fois dans un tampon acé-
tate 0,1 MpH 5,0. Les activités résiduelles sont déterminées selon la
méthode habituelle [39] et exprimées en pourcentage de l'activité maximale.
- 61 -
3.1.2. PH OPTIMUM
Le pH optimum d'action û~s trois préparations enzymrti-
ques (A) (B) et (C) a été étudié dans les diffél'ents tampons pré-
cités entre pH 2,3 et 8. Le pH optimum varie de 4,5 à 5,2 : il est
de 5,0 pour l'enzyme (A), 4,5 pour l'enzyme (B) et 5,2 pour l'en-
zyme (C).
3.1.3. PH OPTIMUM EN FONCTION DES SUBSTRATS
Nous avons étudié la variation de l 'activit~ de l'enzyme
en fonction du pH avec trois substrats différents : le paranitro-
phenylphosphate, 1'adé'nosine-5 1 -monophosphate et le S-'laphtylphos-
phate, en dosant le phosphate libéré, par la méthode de Fiske et
Subbarow [89].
La figure 11 montre dans le cas de l'enzyme (A) que le
pH optimum de la phosphatase acide cytoplasmique demeure toujours
égal à 5,0 avec les trois substrats utilisés. Ainsi, la nature du
substrat n'affecte pas l'influence du pH sur l'activité de l'enzyme
(A), il en est de même pour les enzymes (B) et (C).
3.2. INFLUENCE DE LA TEMPERATURE
Dans le cas des réactions enzymatiques, cette influence
est double. On observe d'abord un ac~roissement de la vitesse de
réaction a faible température, généralement entre o~ ct 40·C. Cet
effet est reversible. Au delà de certaines températures, il se pro-
duit une dénaturatlon thermique de l'enzyme, résultant de la rupture
des liaisons non covalentes qui provoque'
la désagrégation des struc-
tures secondaires, tertiaires et quaternaires de l'enzyme. Cette
i
1
1
!
-62-
1
1
1
1
1
1
i11
1
0,7
à
/ \\
QG
1 \\
A
V\\
1
\\
0,4
\\
0..2
o
3
4
5
6
7
8
PH
FIG. 11 :
etude du pH optimum de l'enzyme (A) avec trois substrats différents. Le lMgr6
d'hydrolyse des substrats a été déterminé par le dosage du phosphate inorgranique
selon la méthode de Fiske et Subbarow (89)
- . - . - Rnaphtylphosphate
-*-* - paranitrophenylphosphate
..:. _ • _ Idénosine - 6' - (monophosphate)
-63-
100
~U:••_r-~
~~~
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-
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-
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LU
1-
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'*
C
\\~~~......
0
'l6
'*
30
40
50
60
70
TEMPeRATURE (OC)
FIG. 12:
Stabilid thermique
Les préparations enzymatiques (A), (B) et (C) sont incutMies pendant 20 minutes li
différentes tempéretures comprises entre 3()0 et 7rP C. On rem'" la solution li la
tempéreture ambiante (220 C) puis on dose "activité résiduelle li 370 c.
._~ _ ~ _ enzyme (A)
_*_* _ enzyme (B)
_ . _ . _
enzyme (C)
-64-
100
-ae-W..J t
..J
1\\ '"
W
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~
Q
-
tn
~
w
Œ
50
.
w
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...
~
-
>
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-...
~~
0
oc(
~.
~.
~~
~~*
~-yt~-
:
0
.
•
•
....
0
20
40
60
70
minutes
FIG. 13:
CiMtique de d6l8ctivlltion • eoo c
Les préparations enzymatiques (A) (B) et (C), sont respectivement incubées è 6()0 ~
puis toutes le. 6 minutes on dose l'activité résiduelle d'une partie aliquote ramenée
è la température ambiante (220 C)
_ ~_ • . enzyme (A)
_*_*_enzyme (B)
_ . _ . _ enzyme (C)
- ~5 -
dénaturation, généralement. irreversible intervient selon les enzymes,
entre 45°C et 100°C, le plus souvent entre 55°C et 65°C. De rares
enzymes résistent quelques minutes à 100°C.
La thermostabilité des préparations enzymatiques a été
déterminée en incubant les solutions d'enzymes (h), (B) et (C) pendant
20 minutes à différentes températures comprises entre 30 et 70°C comme
l'indique la figure 12. Après chauffage, la solution est refroidie
rapidement et l'activité résiduelle est déterminée dans les conditions
habituelles [39]. Nous avons d'autre part incubé les mêmes préparations
enzymatiques à 60°C et suivi l'évolution des activités enzymatiques
pendant 60 minutes comme l'indique la figure 13.
Au dela de 20 minutes toutes les préparations enzymatiques
sont pratiquement désactivées.
3.3. SPECIFICITE DE SUBSTRAT.
Les Phosphatases acides (E.C.3.1.3.2.) d'origine végétale ont
une spécificité très large et agissent sur une grande variété de composés.
C'est une des caractéristiques essentielles de la plupart des phospha-
tases citées dans la littérature [79-87] • Elles sont capables d'hydro-
lyser des composés variés c)ntenant des liaisons de types P-O-C, P-O-P,
P~S-C, P-F et P-N à l'exclusion de la liaison phosphonate P-C [88].
Le manque de spécificité pour la partie non phosphorylée
du substrat est contrebalancé par une spécificité stricte pour le
résidu phosphoryl. Les phosphodiesters et triesters ne sont
pas
- 66 -
hydrolysés, de même ~ue les esters du type
Ainsi, il apparaît que seul le groupement phosphoryl en
position terminale est hydrolysé par les phosphatases.
C'est dans ce contexte que nous avons étudié l'action
des trois phosphatases purifiées sur un certain nombre de subs-
trats synthétiques et naturel.~ .
l.'activité enzymatique est testée sur les différents
substrats, tous à la concentration de 0,005 M. Le degré d'hydrolyse
des substrats est déterminé par le dosage du phosphate inorganique
libér~ selon la méthode de Fiske et Subbarow [8~ . Dans cette
méthode, on réalise la
formation
d1un compiexe phosphomolybdique
qui, réduit par lIA.N.S. (acide 1-amino-2-naphtol 4-sulfonique) donne
une coloration bleue dont on détermine la densité optique à 700 nm.
Ce dosage est très sens'ible et permet de doser jusqu'à
100 ~g de phosphore sous ferme de phosphate. Les résultats consignés
dans le tableau 11 mont~ent que la phOfph~ta•• • '1d. cytoplafm1quo
(A) et les phosphatases acides membranaires (8) et (C) hydrolysent
tous les trois, de façon très importante et par ordre décroissant,
le B naphtylphosphate, l ladenosine-5'-monophosphate et l'adenosine-5'-
diphosphate. Les deux enzymes membranaires (8) et {cl sont nettement
- 67 -
1
plus actifs sur les adenosines-5 1 -mono et di-phosphates que la
phosphatase acide cytoplasmique (A).
A1Jrs que lp~ enzym~s membranalres hydrolysent lladenu-
sine-5 1 -triphosphate, l 1enzyme cytoplasmique nia aucur. effet sur
ce substrat. La phosphatase acide (B) hydrolyse dans l'ordre
,
décroissant l'adenosine-5 1 -monophosphate, le 8-naphtylphosphate,
1
le fructose-1-6-bisphosphate, l 'adenosine-5 1 -triphosphate, le
ribose-5-phosphate, l 'a-naphtyl phosphate , le fructose-6-phosphate,
le glucose-6-phosphate et le glucose-1-phosphate. Quant à l'enzyme
(C), il hydrolyse les mêmes substrats dans le même ordre excepté
sa faible action sur le fructose-6-phosphate et le ribose-5-phos-
phate.
3.4. DETERMINATION DES KM
Nous avons déterminé à partir de la représen~ation de
Lineweaver et Burk [90] , les valeurs de KM pour deux substrats
(le paranitrophenylphosphate et le 8-naphtylphosphate) des trois
phosphatases acides (A)(B) et (C) comme indiqué au tableau 12. La
rep!ésentation de Lineweaver et Burk [90] à la figure 14 montre
l'allure des droites obtenues dans le cas du par~nitrophenylphos
phate,des trois enzymes (A) (8) et (c).
- 68 -
Tableau 11
SPECIFICITE DE SUBSTRAT
SUBSTRATS
Enzyme
Enzyme
Enzyme
A
B
C
1. Paranitrophenylpho~phate
100
100
100
-
2. Jlucose-1-phosphate
a
10
12
.
3. Glucose-6-phosphate
a
12
13
4. Fructose-1-6-bisphosphate
('
50
50
5. Fructose-6-phosphate
a
30
25
~
ù.
Ribose-5-phosphate
15
50
29
7. Adenosine-5 1 -triphosphate
a
50
25
8. Adenosine-5 1 -diphosphate
44
66
64
9. Adenosine-5'-monophosphate
52
100
110
10. 3-phospho-glyceraldéhyde
53
25
30
diethylacetal
11. ~ -Glycerophosphate
a
30
30
12. B -Glycerophosphate
a
14
15
13. Phenylphosphate
37
a
a
14. ~ -Naphtylphosphate
50
47
45
15. Acide-3-phosphoglycérique
a
a
14
16. O-phospho-D~L-serine
4
a
a
17. B-Naphtylphosphate
116
80
100
Les essais sont réalisés a 37°C dans un tampon acétate 0,1 M
pH 5,0 pendant 30 minutes. Les substrats sont a la concentration de
0,005 M. Le phosphate inorganique est dosé selon la méthode de Fiske
et Subbarow [ 89 ] • Nous avans pri s pour 1')0 % l 1act i vjté obtenue avec
le PNPP.
-69-
-1
U mn
150
1
v
100
50
o
0.2
CA
0,6
0,8
1
1
mM-'
S
FIG. 14 :
Influence de la concentration en substrat sur la vitesse d'hydrolyse.
Représentation de Lineweaver et Burk (90)
.L = f (1) pente = JS.M
V
S
VM
(A)
= droite obtenue avec l'enzyme (A)
(B)
=
droite obtenue avec l'enzyme (B)
(C)
=
droite obtenue avec l'enzyme (C)
- 70 -
Tableau 12
VALEURS DE KM POUR DEUX 3UBSTRATS DETERMINES
SELON LA REPRESENTATION'DE LINEWEAVER ET
BURK -[90]
SUBSTRATS
Enzyme
Enzyme
Enzyme
(A)
(B)
(C)
1
o - Naphtylphos-
phate
-3
-3
-3
0,8.10
M
1,2.10
~1
1,5.10
~1
Paranitrophenyl-
phosphate
-3
3, 10-3
-3
2,9.10
~1
M
3,4.10
M
L ____
- 71 -
3.S.DISCUSSION
Les trois phosphatases étudiées se révèlent pratique-
ment semblables dans leur comportement vis-A-vis des variations
de pH et de température.
Elles ont en effet les mêmes degrés de stabilité dans
des zones relativement larges de pH et de température. Elles sont
aus~i card~térisées par des pH Jptima dlaction variant très peu
d'un enzyme A un autre et probab:ement aussi d'un substrat A un
autre, si on s'en tient aux cas du pNPP, du S-naphtylphosphate et
de lIAMP.
L'étude de la spécificité de substrat nous a permis par
contre de mettre en évidence une nette différence fonctionnelle et
probablement d'importance physiologique, entre l'enzyme cytoplasmique
CA) d'une part et les enzymes membranaires (B) et (C) d'autre part.
En effet, la phosphatase acide cytoplasmqiue nia pratiquement aucune
action sur les sucres phosphorylés, mise A part une faible action
sur le ribose-5-phosphate.
Par contre les enzymes membranaires (B) et (C) hydrolysent
de façon plus ou moins importante tous les sucres phosph~rylés
étudiés. Si 1 'on considère uniquement les substrats naturels, on
remarque que les trois phosphatases étudiées hydrolysent très bien
les adénosines-5'-mono et diphosphates ; les enzymes membranaires
se distinguant par une action beaucoup plus importante que celle de
11enzyme cytoplasmique. Les enzymes olembranaires sont par ailleurs
- 72 -
les seuls à hydrolyser l 'ATP à un degré plus important, surtout
dans le cas de l lenzy~e (8).
Cette action plus accrue des phosphatases membraraires
sur les sucres phosphorylés et sur les adenosines phosphates a
probablement une signification physiologique. On peut penser en
.
effet que le métabolisme du phosphate au niveau des sucres phos-
phorylés est un phénomène essentiellement transmembranaire. A ce
niveau, il est possible aussi q~e les adenosines phosphates jouent
un rôle de substr~ts fournisseurs de phosphates dans les réactions
de phosphol"olyse et de phospho"'ylation,et aussi de fournisseurs
d'énergie nécessaire dans les phénomènes de transprrt transme;.lbra-
naire du phosphate, dans lesquels les phosphatases membranaires
pourraient être impliquées.
- ~ -
CHA PIT RE IV
ACTION DE QUELQUES EFFECTEURSSUR'L'ACTIVITË DES ENZYMES (A)(B) ET (C)
1 - INTRODUCTION
Les chapitres précédents nous ont permis d'analyser un cer-
tain nombre de caractéristiques moléculaires et cinétiques qui mettent
déjà en lumière de nombreux points de différences entre les tr0is phos-,
phatases acides (A) (8) et (C). L'étude de l'action des effecteurs que
nous abordons dans ce chapitre a pour objet d'apporter non seulement
d'autres éléments de comparaison, mais aussi et surtout de dégager
quelques particularités fonctionnelles des trois enzymes.
2 - ACTION DES IONS METALLIQUES
2.1. INTRODUCTION
La fixation des ions métalliques aux protéines enzymatiques
se traduit le plus souvent, par un effet activateur qui est la
- 74 -
conséquence d'une stabil~sation de la ccnformation native de ce~
protéines.
Cette fixation dépend d'un certain nombre de facteurs
tels que la nature, llaccessibilité et l'état d'ionisation des
groupements récepteurs.
Des effets inhi~iteurs ~euvent aussi ëtre souvent asso-
ciés à la fixation des ions métalliques surtout dans les cas de
fixations reversibles.
Dans ce cas, l'inhibition du processus catalytique est
due soit à la fixation de l'ion sur un rés'idu essentiel, soit à un
changement conformationnel de la protéine enzymatique, inappropri~
à la fixation du substrat au centre actif.
2.2. RESULTATS.
L'effet de quelques ions métalliques sur l'activité des
trois phosphatases acides (A) (B) et (C) est indiqué dans le tableau
13. L'effet inhibiteur du Ca 2+ sur les phosphatases (B) et (C) est
moins important que dans le cas de la phosphatas~ acide cytoplas-
mique (A). En effet, alors que l'enzyme cytoplasmique est inhibé à
84 %, on trouve une inhibition de 50 à 30 %pour les enzymes (B) et
(C) respectivement. Comme pOlir la phosphatase acide cytoplasmique,lfI'5ione,
K+,
Na+ et
Ba2+, nlont pas une influence significative sur
les activités des phosphatases acides membranaires, alors que le
Mg2+ et le Cu 2+ présentent quant à
~ux des effets activateurs très
- 75 -
Tableau 13
ACTION DES IONS M5TALLIQUES'SUR LES ENZYMES
(A) (B) et (C).
]Concentration (10- 2M)
Enzyme A
Enzyme B
Enzyme C
1
Contrôle
100
100
100
K+
94
100
105
2+
Ca
15
50
70
Na +
72
69
'95 -
Ba 2+
103
89
89
Mg 2+
202
209
195
Zn 2+
100
110
105
f--
Hl+
11
10
13
-
Cu 2+
125
130
119
EDTA
47
30
31
_.
MJ+
20
30
19
Les solutions d'ions métalliques sont préparées dans un
tampon acétate 0,1 Met éventuellement ajustées à pH 5,0 L'activité
enzymatique est déterminée de la façon habituelle [39] et exprimée
en pourcentage de l'activité en l'absence d'effecteurs.
- 76 -
importants. L1action du Cu 2+ est toutefois moins importante que
celle du Mg2+ sur les trois enzymes. Le H~2+ et le molybdène ont
pratiquement les mêmes effets inh"ibiteurs sur les tro"is préparation,
enzymatiques (A)(B) et (C). Ces effets sont très importants dans
2
le cas du Hg + et du molybdène. En effet les inhibitions consta-
tées sont d'environ 70 à 80 % pour ces trois ~nzymes.
3 - ACTION DE QUELQUES REACTIFS DE
. . .
. .
.
MARQUAGE 'CHIMIQUE
L'utilisation des réactifs de marquage spécifique des
groupements fonctionnels, a rendu de grands services, dans l'étude
des conformations spatiales des protéines en général et dans
l lélucidation du centre actif d'un grand nombre de protéines
enzymatiques [91-95] .
Le site actif des protéines enzymatiques est constitué
par un certain nombre de résidus dlamino acides qui, bien que
souvent assez éloignés les uns des autres dans la structure primaire,
se retrouvent très proches dan~ une conformation tridimentionnelle
bien définie.
Ces résidus jouent leur rôle catalytique en intervenant
soit dans des mécanismes de répartition électronique entre l'enzyme
et le substrat, soit dans la fixat;on du substrat ou d'autres
cofacteurs indispensables.
La détermination de ces résidus est par conséquent d'un
intérêt primordial dans la compréhension des mécanismes fonctionnels
des enzymes.
- 77 -
3.1. ACTION DES REACTIFS SPECIFIQUES DES TH:OLS
Dans les protéinrs enzymatiques, les résidus thiols
jouent très souvent un rôle essentiel dans l'activité catalytique.
Ce rôle peut être facilement mis en évidence par une subs-
titution sélective de ces groupements à 1laide de réactifs spécifi-
ques tels que llacide dinitro-2,2 1 -dithio-5,5'-dibenzoique (DTNB),
le parahydroxymercuribenzoate ~e sodium (pHMB) et la N-éthylmaléi-
mide (NEM).
En ce qui concerne les phosphatases, la participation des
groupements SH au mécanisme réactionnel a été signalé par certains
auteurs [95-96]
alors que des résuïtats contradictoires ont été
mentionnés par d'autres [97,99 ].
Il nous adonc paru intéressant d'étudier le rôle de ces
groupements dans les phosphatases acides isolées de tuberculps dp
D. r.ayp.nénsi~ rotunrlata.
3.1.1. ACTION DE L'ACIDE DINITRO-2,2'-DITHIO-5,5'-DIBENZOIQUE
(DTNB)
- - -
a)
Mode d'action du DTNB
A pH neutre, ou légèrement alcalin, l'acide dinitro-2,2 1 -
dithio-5,5 1 -dibenzoïque ~éagit avec la fonction - SH selon un méca-
nisme de transdisulfuration pour libérer un carboxynitrothiophenate.
Le dosage de ce chromophcre (êM412 = 14.600) permet de
quantifier la substitution des grouppmen:s SH.
- 78 -
COO-
COO-
00
Oc
coo
l
1
~N-r~
~N02
9 -
-
qN_(JL
'/" N02
VS_S-V
PROT-SH -
1
1
+
~
-S-PROT + ~
-
DTNB
carboxynitrothiophenate
(jaune)
b) DOSAGE DE~GROUPEMENTS SH DANS LES :NZYMES (A)(B) et (C)
Le dosage des groupements SH a ~té effectué selon la
technique d'Ellman [98] . On- incube 30 J..Lld'une solution enzymatique,
(40 - 50 ~g de protéines ml-~, dans 2,94 ml de tampon Tris-HCl
0,1 MpH 7,5 contenant de l'urée 6 ~1. 00 ajoute ensuite 30 lfl.d'une
solution de DTNB 10-2M.
Après 10 min à la température ambiante (22°C), on mesure
1a densit~ optique à 412 nm contre une solution témoin ne contenant
pas d'enzyme.
c) INFLUENCE DU DTNB SUR L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
On incube 1,8 ml d'une solution enzymatique de concentra-
tion 50 ~g de protéines ml-1, en présence de 0,2 ml de DTNB 10-3M
dans le Tris-HCl 0,1 MpH 7,5. Toutes les 5 min, on prélève une
partie aliquote et on détermine l'activité enzymatique en dosant
le phosphate libéré, par la méthode de Fiske et Subbarow[89].
d) EFFET PROTECTEUR DU PARANITROPHENOL CONTRE L'ACnON DU DTNB
On incube 1 ml d'une solution enzymatique(50 ~g de pro-
téines par m~, en présence de 1 ml d'une solution de pananitrophenoi
0,01 M. On prélève 1,8 ml du melange enzyme-paranitro~henol
puis on
y ajoute 0,2 ml d'une solution de DTNB 10-2M. On détermine ensuite
- 79 -
Tableau 14
INFLUENCE OU OTNB SUR L'ACTIVITE ENZYMA-
TIQUE AU COURS DU'TEMPS
Temps (min)
O'
51
10 1
15 1
20'
25 1
60'
1
Enzyme (A)
100
61
52
29
11
8
7
Enzyme (B)
100
68
49
30
19
9
6
Enzyme (C)
100
64
46
25
17
7
6
L'activité enzymatique est exprimée en pourcen-
tage de 1 lactivité obtenue sans OTNB.
- 80 -
Tabl eau 15
INFLUENCE DU PARANITROPHEr:OL SUR LI ACTION
INHIBITRICE DU DTNB.
Temps (min)
O'
S'
10'
15 •
20 1
60'
-
Enzyme (A)
100
99
100
100
100
100
Enzyme (B)
100
100
98
9];
99
100
-
Enzyme (c)
100
100
100
99
98
100
-
L'activité enzymatique après incubation de l'enzyme
en présence du nitrophenol (pNP) puis du DTNB, est exprimée en
% d'activité enzymatique sans pNP et sans DTNB
- 81 -
périodiquement l'activité enzymatique.
e) RESULTATS
Le dosage des groupements SH par le DTNB donne les
valeurs de 13 groupements SH par mole de phosphata se acide (A) et
de 5 groupements SH par mole d1enzyme pour les deux phosphatases
membranaires (B) et (C).
L'influence du DT~B sur l'activité des enzymes (A) (B)
et (C) est résumée dans le tableau 14. On remarque que l'activité
des trois phosphatases est fortement inhibée par ce réactif:
après seulement 5 min d'incubatlon, l'inhibition varie entre 30
et 40 % pour atteindre presque 100 % après 30 min.
Ainsi que l'indique le Tableau 15, l'activité des trois
phosphatases est protégée presque à 100 % par le paranitrophenol
contre l'action du DTNB.
3.1.2. ACTION DU PARAHYDROXYMERCURIBENZOATE DE SODIUM (pHMB)
a) Mode d'action du pHM~
OH-Hg
1
0.......
_~ )-coo:"'
....,
1
+ PROT-SH-H
PftOT-S:"Hg
_
20
+
1
COO-
pHMB
- 82 -
Tableau
16
INFLUENCE DU PHMB SUR L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
Temps (min)
01
5'
10'
15 1
20 1
60'
Enzyme (A)
100
95
94
94
93
94
Enzyme (B)
100
97
96
97
96
97
Enzyme (C)
100
96
94
95
94
94
Llactivité enzymatique est exprimée en %de l'activité
sans pHMB.
- 83 -
La liaison -S-Hg- est une liaison stable mais elle est
reversible en présence d'un excès de mercaptan tel que le mercap-
toéthanol ou la cystéine.
b) Influence du pHMB sur l lactivité enzymatique
Différentes concentrations de parahydroxymercuribenzoate
4
de sodium 10-2Mà 10- Msont incubées en tampon Tris-m~léate 0,1 M
pH 6,5 en présence d l enzYl11e(50 119 de protéines/ml} à des temps
variables. On prélève ensuite une partie aliquote et on détermine
l lactivité enzymatique résiduelle, soit en dosant le phosphate inor-
ganique libéré en présence de paranitrophenylphosphate par la méthode
de Fiske et Subbarow [89], soit en mesurant la densité optique du
paranitrophenol selon la méthode de Garen et Levinthal [39 J.
c) Résultats.
Les résultats de l'action du pHMB sur les trois phospha-
tases (A) (B) et (C) sont indiqués dans le tableau 16. On note que
contrairement au DTNB, ce réactif, sans doute le plus spécifique
des groupements SH nia aucune action sur llactivité des trois enzymes,
même à des concentrations beaucoup plus élevées que celles indiquées.
3.1.3. ACTION DE LA N-ETHYLMALEIMIDE (NEM)
a) Mode d'action de la N-éthylmaleimide
o
o
\\1
( '_<:'H.-
( I\\._C H.
pft 0 T-S -
;N
2
PROT-SH
+
1 1
11
o
o
NEM
.. 84 -
Tableau 17
INFLUENCE DE LA N-ETHYLMALEIMIDE SUR
LIACTIVITE ENZYMATIQUE
Temps (min)
O'
51 1
10'
15 1
20 1
60 1
Enzyme (A)
100
97
97
96
96
97
Enzyme (B)
100
98
94
97
96
97 -
1
Enzyme (C)
100
96
96
95
97
96
L'activité enzymatique est exprimée en %de l'activité
sans la NEM.
- 85 -
b) Influence de la N-éthylmaléimiqe sur l'activité enzymatique
Différentes concentrations de N-éthYlmaléirn~2.10-1 Mà
2.10-3 M) sont incubées en tampon Tris-maléate 0,1 MpH 6,5 en
présence d'enzyme de concentration 50 ~g de protéines/ml (V/V).
L'influence de la N-éthylmaléirnd3sur l'activité enzyma-
tique est déterminée par le dosage de l'activité enzymatique selon
l a méthode de Garen et Levi ntha l [39] ou selon l a méthode de Fi s ke
et Subbarow [89].
c) Résultats.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 17.
Aux différentes concentrations utilisées, la
NEM n'a aucun effet
sur les trois phosphatases (A) (8) et (C).
3.2. ACTION D'AUTRES REACTIFS SPECIFIQUES DE GROUPEMENTS FONCTIONNELS
Après avoir étudié l'action des réactifs spécifiques des
groupements thiols sur les ~rois phosphatases (A) (8) et (C) et
dégagé certaines caractéristiques particulières, nous allons voir
l'influence d'autres réactifs non spécifiques des thiols sur ces
enzymes.
3.2.1. ACTION OU N-acé~ylimidazole
{NAl}
L'acétylation des protéines enzymatiques se fait essen-
tiellement au niveau des résidus d'aminoacides tels que les résidus
lysyl,cystêinyl
et tyrosyl avec des réactifs dont les plus
- 86 -
utilisés sont l lanhydride acétique et le N-acétjlimidazole. Ces
réactifs ne présentent généralement aucune spécificité stricte
vis-à-vis de chacun des résidus mentionnés. Cependant, dans des
conditions de pH proche de la neutrdlité, le N-acétylimidazole
présente une plus grande spécificité pour les th~Jls et les résidus
tyrosyl s.
Par ailleurs du fait de l'instabilité dans certaines
conditions de l lacétyltyrosine, le résidu tyrosyl peut être facile-
ment caractérisé après action du N-acétylimidazole.
a) Mode d1action
~:] +R -( )-OH
1
, tyrosine
O~C'C~3
acétyl tyrosine
imidazole
NA!
b) Influence du N-acétylimidazole sur les enzymes (A)(B) et(C)
On met à incuber 0,1 ml d'une solution de N1acétylimidazole
0,05 Mdans du tampon barbital 0,05 Mph 7,5 avec 0,1 ml d'une solution
enzymatique de concentration environ 50 119 de protéines/ml et 0,8 ml
du même tampon barbital 0,05 MpH 7,5.
On prélève périodiquement 0,1 ml du mélange obtenu qu'on
ajoute à 2 ml de tampon acétate 0,1 MpH 5,0 contenant du
- 87 -
Tableau 18
INFLUENCE OU N-ACETYLIMIDAZ0LE SUR L'ACTIVITE
PHOSPHATASIQUE
1 Temps (min)
,
0'
30'
60'
1
90'
-1
Enzyme (A)
100
138
165
168
Enzyme (B)
100
152
175
1678
1
,
10r)
102
L
Enzyme (C)
101
99
1
L1activité enzymatique est exprimée en pourcentage
dl activité en l'absence qe "N-acéty1 imidazo1 e.
- 88 -
paranitrophenylphosphate 0,01 t~ et on incube à'37°C.
On mesure en~uite le degré d'hydrolyse soit par le
dosage du paranitropl.enol libéré [39J après 10 min d'incubation
soit par ie dosage selrn la mé~hode de Fiske ~t Subbarow [8~ du
phosphate inorganique libéré.
c) Résul tats.
L'examen du t;:ableau 18 montre que l'action du N-ê),cétyl i-
mfdazole se traduit par une activation sensible des enzymes (A) et
,
(B), alors que l'activité de la phosphatase acide (C) reste prati-
quement inchangée.
En effet, après 30 minutes d'incubation en présence de
N-acétylimidazole les activités initiales des enzymes (A) et (B)
augmentent respectivement de 40 %et 50 % pour atteindre des valeurs
respectives de 65 %et 75 % après une heure d'incubation.
3.2.2. ACTION DE L'ACIDE DIAZOSULFANILIQUE
a) Prépar~tion du réactif
L'acide diazosulfanilique a été obtenu selon la méthode
de Barnard et Stein [100]. A une suspension de 1,73 9 (0,01 M)
d'acide sulfanilique (SIGMA) dans 20 ml d'eau contenant 10~ c(HCl •
on ajoute goutte à goutte. à froid (0° à 2°C) une solution
aqueuse
de 1 g (0,01 M) de nitrite de sodium (M~).Le précipité obtenu à
la fin de la réaction est lavé plusieurs fois avec de l'acide
- 89 -
chlorhydrique 0,1 N puis séché au dessicateur sur KOH et CaC1 •
2
Le diazoïque est ainsi prêt à l'utilisation.
b) Essais de diazotation
On incube 0,1 ml d'une solution enzymatique{50 ~g de
protéines/ml) en jJrésence deD,1 nll de réactif à l'acid~ diazo-
sulfanilique (110 mg diacide diazosulfanilique dans 1 ml de
NaHC0
0,1 %). On y ajoute ensuite 0,8 ml de tampon Tris-HCl
3
0,1 MpH 7,0, puis on détermine pér"iodiquement l'activité enzy-
matique.
c) Résultats
Les résultats consignés dans le Tableau 19 indiquent
clairement que l'acide diazosulfanilique inhoibe très fortement les
trois phosphatases (A) (B) et (c).
En effet, dans les conditions util isées, les tro'is enzymes
sont inhibés jusqu'à 100 % après seulement 10 min. d'incubation.
- 90 -
Tableau
19: INFWENCE [E L'ACIDE DIAZOSULFANILIQUE SUR
L' ACTIV!TE [ES ENZYMES (A) (B) et (C).
.~.-
Temps (min)
A'
2'
51
10 1
Enzyme (A)
100
54
15
a
Enzyme (B)
100
60
14
a
Enzyme (C)
100
67
13
a
L'activité enzymatique est exprimée en %de
l'activité sans ll ac ide diazosulfani1ique.
- 91 -
4. DI~CUSSION
Ce qui ressort principalement de l'étude de l'action
des ions métalliques sur les trois phosphatases acides purifiées
c'est l'important effet activateur du Mg2+ observé au niveau des
trois enzymes. Cet effet activateur et l'action inhibitrice observée
avec un complexant métallique tel que l'acide éthylène diamine tétra-
acétique (EDTA). pourrait militer en faveur de la nature métallopro-
té)que des trois phosphatases.
Il convient aussi de noter l'action inhibitrice du Ca2+
dont l'importance au niveau de l'enzyme cytoplasmique (84 %d'inhi-
bition), permet de mettre en évidence une nette différence, entre
ce dernier et l es deux autres enzymes membranai res (B) et (C), au
niveau desquels cette inhibition nlest que de 50 %et 30 %.
Ainsi que cela avait été noté d'une façon générale au
niveau de la composition en acides aminés des trois phosphatases,
on remarque du point de vue des teneurs en groupements SH, une
nette différence entre la phosphatase acid~ cytoplasmique (A)
(13 groupements SH) et les phosphatases acides membranaires (B) et
(C) (5 groupements SH pour chaque enzyme).
Les groupements thiols des trois phosphatases ont un
comportement réactionnel vis-à-vis du DTNB très différent par
rapport au comportement vis-à-vis du pHMB et de la NEM. Alors que
- 92 -
le DTNB inhibe presque totalement les trois enzymes, le pHMB et
la NEM nlont aucune action. Ceci semble assez surprenant d priori,
..
quand on sait qulil y a trè~ peu de différences de réactivité
entre ces trois réactifs dont la spécificité vis-à-vis des thiols
est la plus stricte possible.
On peut expliquer .cette situation, en pensant que les
groupements SH essentiels des trois phosphatases ne sont pas
suffisamment réactifs, pour subir des substitutions directes de
type internroléculaire. Dans ce contexte, l'action du DTNB pourrait
s'expliquer par un~ fixation spécifique préalable au sein du centre
actif, qui faciliterait alors s~ réaction sur les groupements SH
essentiels.
Compte tenu de la structure de la molécule du DTNB, cette
fixation spécifique peut se concevoir comme le résultat de la forma-
tion d'un complexe de transfert de charge entre un résidu donn~ur du
centre actif et l 'un des noyaux nitrophenylés (pauvre en électrons)
du DTNB.
Cette interprétation semble être corroborée par le fait
que le paranitrophenol empêche l'action inhibitrice du DTNB. Le
paranitrophenol peut en effet, entrer en compétition avec le DTNB
pour la formation d'un complexe spécifiql1e de transfert de charge.
L'action activatrice du N-acétylimidazole (NAI1)sur les
phosphatases (A) et (B) est problablement due à l'acétylation d'un
ou plusieurs résidus tyrosyls. Le fait que cette activation ne se
retrouve pas au niveau de la phosphatase acide (C) montre qu'il
- 93 -
existe sans doute une certaine différence conformationnelle entre
C?t enzymp.
et 1es deux autres phosphatases acides (A) et (B).
En ce qui concerne llacide diazosulfanil ique, il conduit
à une forte inhibition de l'activité des trois phosphatases. Cette
inhibition est certaineme~t due à la diazotation d'un ou plusieurs
.. '
résidus histidyls essentiels. La participation des résidus histidyls
à 1lactivité des phosphatases a été déjà signalée dans beaucoup de
phosphatases. Il semble
que le résidu imidazole interviendrait
dans la fixation du substrat en complexant le groupement phosphate [101 J.
- 94 -
ETUDE It~OLOGIQUE DES PHOSPHATASES ACIDES (A) (B) ET (C),
1 - 1NTRODUCTI ON
L1injection A un animal d'un antigène (protéine ou autre
molécule organique) fait appara,tre dans son sérum sanguin des
molécules protéiques spécifiques de défense appelée~ anticorps. Ce-
sont des immunoglobulines qui peuvent se combiner spécifiquement
A l 'antigène qui a provoqué leur formation pour constituer un
complexe antigène-anticorps.
L'étude de cette réaction antigène-antlcorps dans diffé-
rentes espèces animales a fourni de nombreuses conclusions impor-
tantes [102-109] :
- La première est que chaque type de protéine provenant d'une
même espèce, provoque la formation d'anticorps qui lui est
- 95 -
spécifique. Ainsi, quand un lapin reçoit une injection d'hémoglo-
bine de cheval, les anticorps formés ne précipiteront que l 'hémo-
globine de cheval, à l lexclusion de toute autre.
- La seconde est que l 'homologie fonctionnelle de certaines
protéines au niveau d'espèces différentes ne se retrouve pas dans
leur cLmportement immunologique. Ainsi, des hémoglobines qui ont
la même fonction dans différentes espèces de vertébrés sont immu-
nologiquement différentes.
Des anticorps ;;roduits par le lapin après immunisation
avec l 'hémoglobine de cheval par exemple, réagissent essentielle-
ment avec l 'hémoglobine de cheval dans la réaction de précipita-
tion et fort peu avec les hémoglobines d'autres vertébrés.
Les protéines homologues d'espèces proches sont immuno-
logiquement plus rapprochées que celles d'espèces éloignées. Ainsi
les anticorp,rproduits par le lapin contre l'Ilémoglobine de cheval
réagissent surtout avec l 'hémoglobine d'espèces proches du cheval
tel que le zèbre, mais très peu ou pas du tout avec les hémog~o
bines de rongeurs, ou d1oiseaux.
Après l'étude des propriétés moléculaires et cinétiques
et après avoir examiné l'influence de quelques réactifs chimiQues
sur les trois phosphatases acides plArif1ées, il nous a semb1é
indiqué d'étudier leurs propriétés immunologiques afin d'en dégager
d'autres éléments de comparaison. Ce chapitre slarticulera autour
des points suivants :
- 96 -
-
Point de nos connaissances
-
Matériel~et méthodes
-
Résultats et discussion.
2. POINT DE NOS CONNAISSANCES
2.1. SUBSTANCES ANTIG~NIQUES.
Un très grand nombre de macromolécules peuvent se com-
porter comme des antigènes, en principe toutes les protéines, la
plupart des polysaccharides, des lipoprotéines, des nucléoprotéines,
ainsi que des petites molécules si elles sont convenablement
couplées A des protéines. ~u A de5 polypeptides synthétiques
[llO-U5].
Les protéines sont les meilleurs antigènes naturels. Leurs
propriétés antigéniques sont déterminées dans une large mesure par
leurs structures secondaires, tertiaires et quaternaires, en un mot
par leur conformation native. Si cette conformation est modifiée,
il en résulte des protéines denaturées de spécificité antigénique
différente. Il importe donc de veiller a ce que les antigènes qu'on
injecte a un animal ne subissent pas de modifications dénaturartes
au cours de cette opération.
2.2. lES~.bEïERMINÀtrrS OU SITES ANTIGENIQUES
La spécificité antigénique est cette propriété que possède
un antigène déterminé de se combiner préférentiellement avec llanti-
corps dont il a lui même suscité la formation. L'affinité, étant par
- 97 -
définition mutuel~ , appartient aussi bien à l'antigène qu'à
l'anticorps.
Cette spécificité antigénique est 0' iée à la conforma-
tion tridimensionnelle d'éléments structur~ux à la surface de
l'antigène. Ces éléments sont appelés déterminants ou sites anti-
géniques. Ceux-ci réagissent .él ectivement
,spécifiquement et par
complémentarité avec le site combinant de l'anticol1JS homologue. Une
molécule antigénique comp~rte habituellement plusieurs déterminants
antigéniques, mais il existe des molécules dites monospécifiques
qui ne portent qJ1un seul type de déterminants.
Le nombre de déterminants, qu'ils soient identiques ou
différents, détermine le nombre de molécules d'anticorps capables
de se combiner à une molécule antigénique. Des déterminants anti-
géniques identiques ou légèrement différents peuvent être pat'tés
par des molécules antigéniques d'origines différentes [116-117].
De ce fait, des anticorps peuvent se combiner à des molécules anti-
géniques autre que celles qui leur ont donné naissance: il s'agit
alors de réactions croisées.
2.3. LES ANTICORPS.
Les anticorps sont des globulines synthétisées dans un
oryanisme vivant sous 1 'influellce d1une stimulation antigénique et
qui se retrouvent surtout dans le plasma, mais aussi dans d'autres
liquides et tissus biologiques. Ces molécules protéiques possèdent
des sites réactifs leur permettant de se combiner spécifiquement
avec les déterminants artigéniques portés par les molécules des
- 98 -
antigènes qui ont provoqué leur synthèse. L'analyse chimique ne
révèle que très peu de différences entre les immunoglobulines et
les autres globulines sériques.
Les anticorps se particularisent uniquement par leur
aptitude a se combiner aux antigènes. Le si~e de combinaison de
l'anticorps avec le détermi.lant antigénique homologue est donc
l lélément de la molécule qui lui confère sa particularité fonc-
tionnell e.
2.4. REACTIONS ANTIGENE - ANTICORPS.
La combinaison spécifique de l'anticorps avec llantigène
représente le p~énomène fondamental de l'immunologie. Cette inte~
action stéréospécifique est la con$équence de la complémentarité
conformationnelle entre les sites de combinaison de l'anticorps et
les déterminants antigéniques de l'antigène.
Cette complémentarité est déterminée par la séquence en
acides aminés des parties variables des chaînes constituant le site
anticorps.
Les liaisons impliquées dans la formation du complexe
antigène -ant.icorps sont des liaisons généralement faibles parmi
lesquelles on distingue, des liaisons ioniques, dues à l'attraction
entre atomes ou groupements chimiques porteurs de charges électriques
de signes opposés, des liaisons hydrogèn~et des forces de Van der
~Iaals [118] •
- 99 -
3. MATERIELS ET METHODES
3.1. LES LAPINS
Les lapins utilisés dans cette étude ont été fournis
par le Laboratoire de Physiologie animale. Ces lapins pèsent 2 kgs
au début de l'expér"ience et atteignent
un poids d 'environ 5 kgs
en fin d'expérience. Ils sont maintenus en CJge au cours de :
l'expérience et sont nourri~ régulièrement de granulées enrichies
de vitamines.
3.2. LES ADJUVANTS
~
Ce sont des substances souvent utilisées pour accroitre
1
et prolonger le stimulus antigenique, en formant des dépôts à
partir desquel s l'antigène est lentement libéré et en favorisant
la mise en contact de l'antigène avec un plus grand nombre de
cellules compétentes [119-121] . Cette action des adjuvants est
liée à la présence des sels minéraux insolubles tel que le phos-
phate d'aluminium ou de calcium qui retardent l'élimination des
antigènes et favorisent la formation d'un granulome riche en
cellules tels les lymphocytes, les plasmocytes [122-124] .
3.3. L'ADJUVANT DE FREUND.
Des adjuvants hui1eu~ non util isables chez. 11 hoJm'le lont
très couramment employés dans l 'expérimentation sur les animaux.
Ainsi l'adjuvant de Freund complet est un mélange ~omposé d'huile
de pat'affine, de mycobactéries tuées et d'un agent mouillant
(Tween 80). L'antigène, présenté en solution aqueusé est émulslonné
- 100. -
dans ce mélange. Un tel mélange injecté rar voie intrbmusculaire,
intradermique ou sous-cutanée, provoque une synthèse prolongée
d'anticorps.
Le mCme mélange dépourvu de mycobactéries est appelé
adjuvant de Freund incomplet. L'huile de paraffine retarde
l'élimination de l'antigène; les n~cobactéries, par leurs cires
provoquent un afflux et une'multiplication des cellules compé-
tentes [ 119] , ce qui justifie l'administration 'l'anatoxines
diphtériques et tétaniques avec l 'hydrate d'aluminium (vaccins)
[ 120 ] •
3.4. LE MOP (MURAMYL-DIPEPTIDE)
Il a été démontré récemment qu'une molécule de synthèse,
la N-acétyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP pour Muramyl-
Dipeptide), représente la structure minimale active pouvant rem-
pl acer les myclibactéries dans l'adjuvant compl et de Freund [106-107].
De plus, le MDP, contrairement aux mycobactéries, est
capable d'augmenter la réponse immunitaire lorsqu'il est admi-
nistré 3vec les divers antigènes en absence d'émulsion à base
d'huile minérale [107-109] • On sait également qul.il est non
immunogène et non toxiq~e et qulil exerce son activité adjuvante
même slil est administré par voie buccale [124] •
- 101 -
3.5. LES ANTIGENES INJECTES.
L' immuni sation a été faite ave\\.. les préparations enzy-
matiques purifiées (A) (13) et (C). Nous avons constitué trois
lots de lapins: les lots (a) (b) et (c), des lots de jeux lapins
chacun. Puis nl)us avons injecté l'enzyme (A) aux lapins du lot
(a), 'l'enzyme (8) aux lapins du lot (b) et l'enzyme (C) aux
lapins du lot (c).
3.5.1. INJECTION DES ANTIGENES
La technique d'immunisation que nous avons appli-
quée [104] , nous a permis d'obtenir un antisérum à partir
d'environ 750 ~g de protéine pure injectée en 5 fois à un lapin
dans les conditions suivantes
A environ 150 ~g de protéines préalablement dialysées
contre du tampon phosphate de potassium 0,01 MpH 7,0 et 0,15 M
de NaCl, sont ajoutés un volume égal de MDP, (Muramyl Dipeptide)
l'adjuvant util isé (r~DP Pasteur, Institut Pasteur France), et
une dose de vaccin TETRACOQ (Institut MERIEUX France). Ce mélange
(environ 2 ml) est injecté à l'animal par voie sous-cutanée en
cinq sites paravertébraux. Toutes l~s quatre semaines, des rappels
sont effectués dans des conditions similaires sur la moitié du dos
non utilisée la fois précédente.
Les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de
l'oreille 10 jours environ après la 3ème série d'injection. Le
sang, environ 40 ml est recueilli par la veine marginale de
l 'oreille du lapin dans un tube à essai où il est laissé coaguler
-102 -
3 à 8 heures à 1a température ambiante (température du Labora-
toire 22°C). Ces conditions sont suffisantes pour obtenir une
coagulation convenable du caillot sanguin. Le sérum est recu-
pél~é par aspiration avec une seringue, puis centrifugé à 4°C
15 min. à 30.000 x g. Ce s~rum est alors utilisable et peut
être conservé dans un tube soit à 4°C en présence d'azQture de
sodium (0,1 % PlV), soit co~gelé à -40°C.
3.6. IMMUNODIFFUSION
L1ummunodiffusion a été réalisée selon la méthode de
Uriel et coll [125] sur des lames de vert~e (7,6 x 2,5 cm), conve-
nablement dégraissées et disposées sur un plan horizontal ; on
coule 4 ml d'une solution à 1 % d'agarose (PlV) dans le tampon
de solubilisation des enzymes (tampon acétate 0,05 MpH 5,0).
Après la prise en masse de llagarose, trois séries de
12 pu"its (figure 15) y sont réalisés à l laide d'un système de
percée emporte-pièce. Les séries de puis (1) et (3) sont remplis
de solution enzymatique de différentes concentrations. La série
de PlJits n° (2) est rempl ie dl inunuseruJ1l et los lames sont pl aLées
en chambre humide à la température du Laboratoire pendant 48
heures au moins. Au bout de ce temps, les lames sont ol.Jservées
en éclairage sur fond noir. Les arcs de précipitation peuvent
déjà appara~tre.
1
f
-103-
(1) • • • • • • • • • • • •
(2).
..
•
\\1 ,t \\!J \\~. ,t • .. • •
(3) • • • • • • • • • • • •
i
1
1
FIG. 1& :
1
PLAQUE DE GEL D'AGAROSE
!
L. prfplrationl .nzymatiques sont d6p01_ dMI 1. puits dei *i.. nO (1) at
nO (3) • dei dilutions diff....ntel comme l'indique 1. tabteeu 20
1
L'lmmum6rum est cNpoe6 da.. 1. puits de la *i. nO (2). L. arcs de lriclpita-
tion sont Indiqué autour d.. puits d. la *1. nO (2) contenant 1. anticorps.
L.. lames sont color'.. 1.10n la technique de GRABAR (126) d*:rit. pr6c6-
1
demment.
r
1
1
i
t
1
1
!
- 104 -
3.7. COLORATION DES LAMES SELON LA METHODE DE GRABAR [126]
La solution de coloration est préparée en mélangeant:
9 de vert de lissamine,
90 ml de méthanol,
20 ml diacide acétique,
90 ml d1eau distillée.
Les lames sont ensuite colorées par immersion dans
cette solution pendant 5 min. La décoloration est faite par lavage
à l'acide acét"i4Ue 10 %. On laisse sécher à la température ambiante;
les arcs de pt'écipitcttions restent colorés en vert de l issamine.
3.8. IMMUNO-ELECTROPHORESE.
Nous avons utilisé la technique d'irnmuno-électrophorèse
en une dimension sur gel d'agarose décrite initialement par
Laurell
[127], puis modifiÉ::e par Axel son ~t coll
[128]. 10 ml
d'agarose (Bio-rad, low mr) à 1 % (P/V) dans un tampon Tris
0,0375 M-glycine 0,1 M (pH 8,7) renfermant 0,8 % d'émulfogène
B 720 (GAF, France) sont coulés sur une plaque de verre de 10 x
c
10 cm. Dans une fénêtre de 8 x 6 cm découpée dans le gel d'agarose
est coulé un nouveau gel d'agarose identique au précédent mais
,
contenant l'immu:1 serum à tester. Les préparations antigéniques
à étudier sont alors déposées comme 1e montre '1 a figure 16 dans
des puits de quelques millimètres de diamètre. L'électt'ophorèse
est effectuée sous une tension de 1 V/cm pendant 18 h dans un
tampon identique au tampon du gel, mais sans émulfogène. La plaque
est alors trempée 24 heures dans du tampon phosphate 0,01 M
-105-
~ Fenêtre renter·
~ mant l'antiserum
1
1!
Pic d'immuno·
o
~ précipitation
t
V
~/ ccrockets»
w
f\\
(\\ f\\ tf\\
<D
0
0
0
0
0
Dépots antigènes
Sch6rna g6n6ral d·un. plaque d·immuno-4lectropho....
FIG. 18 :
- 106 -
contenant du Nac1 0,15 Mpuis pendant 24 h dans de l'eau dis-
tillée, séchée et colorée pendant 1J min. avec une solution- de
bleu de Coomassie à 0,25 % (P/V). Après aéco1oration par immer-
sion de la plaque dans un mélange acide acétique-méthano1-eau
(1 : 4 : 5, v:v:v), les précipités antigène - anticorps appa-
raissent sous forme de pics ou "roc kets".
4. RESULTATS.
Il est connu que les réactions d'agglutination antigène-
anticorps nlont lieu que si les proportions relatives dlantigènes
et d'anticorps se trouvent dans un rapport optimum. S'il y a par
exemple un excès d'antigènes ou d'anticorps, la réaction d'agglu-
tination n'a pas lieu. Le tableau 20 indique en effet que les
préparations enzymatiques (A) (B) et (C) donnent des réactions
nettement positives lorqu ' e11es sont introduites à ries dilutions
allant de 1/8 à 1/32 de leur concentration initiale.
Il faut noter aussi que les immunsérums obtenus avec
les 3 lots de lapins utilisés ont tous précipité en présence de
leur antigène. On peut donc dire que les trois phosphatases acides
(A) (B) et (C) sont tous immunogènes.
4.1. IMMUNO-INACTIVATION DES ENZYMES
La capacité d'un anticorps d'inhiber , 'activité bio1o-
gique de son antigène a été testée dans le cas des enzymes (A) (B)
et (C). Nous avons en effet examiné les activités résiduelles des
phosphatases acides (A) (B) et (C) après leur incubation pendant
-107 -
Dilution
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-
~024 2041;
1
2
4
8
16
32
64 128 256 512
Enzyme(A)
-
+
+
++
++
++
++
+
+
+
-
-
+
+
+
Enzyme(B)
-
+
+
++
++
++
++
+
+
+
-
-
+
+
+
Enzyme(C)
-
-
+
++
++
++
+
+
+
-
-
-
+
+
+
Tableau 20 :
RECHERCHE .~E DILUTIONS OPTIMALES PAR LES RJ:ACTIONS
ANTIGENE - ANTICORPS.
Les réactions de précipitation indiquées à la figure 15 sont résumées dans ce tab-
leau. Le signe (-) indique qu'il n'y a pas eu de précipitation. L'importance des
arcs de précipitation est indiquée par le nombre de signe (+).
- 108 -
2 heures à 4°C avec des concentrations croissantes d'immunsérum.
La figure 17 qui rassemble les résultats obtenus indique
clairement que l'activité enzymatique décroit rapidement avec
l'augmentation de la cOY'centration d'immunsérum pour atteindre l.rl
palier. La combinaison antigène - anticorps est donc ici un phénonrene
inhibiteur pour les trois enzymes (A) (B) et (C).
Dans ce cas, on peut dire que le site actif des enzymes
fait partie des déterminants antigéniques ou bien est masqué par
la formation du complexe antigène - anticorps.
4.2. REACTIONS IMMUNOLOGIQUES CROISEES.
A llexamen des figures 18 à 21) il ressort que lc's ant-i-
corps anti -enzyme (8) précipitent aussi bien les enzymes (B) que (A)
et que inversement les anticorps anti-enzyme (A) précipitent non
seulement l'enzyme (A) mais aussi l'enzyme (B).
On constate que ni l' immunsérum (A), ni 1 1 immunsérum (B)
ne précipite l'enzyme (C) qui n lest précipité uniquement que par
l'anticorps anti -enzyme (C).
On peut donc penser qulil y a Uli ou plusieuts détermi-
nants antigéniques communs aux enzymes (A) et (8) et que l'enzyme
(C) n'aurait aucune similitude antigénique avec les deux autres
enzymes (A) et (B).
Par ailleurs, la figure 20 montre que certaines popula-
tions d'anticorps de l'immunsérulll (.I:\\) ne reconnaissent pas la phos-
phatase acide (8).
-109-
100
50
-z0-~-m-:::tZ
-..Q
~
- O,
20
40
60
80
100 .LII
FIG. 17 :
IMMUNQ-INHIBITION
Une partie aliquote d'enzyme est mise li incuber avec de l'immunsérum (10 li
100 ul) pendant deux heures li 40 C. On dose ensuite l'activité enzymatique
après la réaction antigène - anticorps selon la méthode habituelle (39).
Les courbes représentent les pourcentages d'inhibition enzymatique.
_ . _ . _ enzyme (A)
_ . _ . .
enzyme (B)
_*__ *. enzyme (C).
- 110-
FIG. 18 :
IMMUNOELECTROPHO RE8E
Réactions immunologiques croisées avec l'immunsérum (A) et les enzymes (A)
(B) et (Cl.
A
dépot d'enzyme (A)
B
dépot d'enzyme (B)
C
dépot d'enzyme (C).
AA =
précipité obtenu avec l'enzyme (A) et l'immunsérum A
AB =
précipité obtenu avec l'enzyme (B) et l'immunsérum A
AC =
pas de précipité.
- 111 -
FIG. 19 :
IMMUNOElECTROPHORESE
Réactions immunologiques croisées avec J'immunsérum (B) et les enzymes (A)
(B) et (C).
A
dépot d'enzyme A
B
dépot d'enzyme B
C
dépot d'enzyme C.
BA
précipité obtenu avec l'enzyme (A) et l'immunsérum B
BB
précipité obtenu avec l'enzyme (B) et ('immunsérum B
BC
pas de précipité.
- 112-
FIG. 20 :
IMMUNOELECTROPHORESE.
Réactions immunologiques croisées en "tandem" avec l'immunsérum A.
Pour cette étude en "tandem", on laisse les dépots diffuser 2 à 4 heures avant
l'électrophorèse.
A, B et C sont des dépots d'enzyme (A) (B) et (Cl.
AA, AB, AB et AA sont des précipités obtenus avec "immunsérum A.
- 113-
FIG.21
IMMUNOELECTROPHORESE
Rr.!.-tr:tIO/lS IrnmUflolot)lljues
Illl
es '1 'Itlili '11
<Ive
j',rnrrlLII1,C,lirll B.
Pmu relie p.tude
nI, 1 el. c1.1' rs dlffusel 2 À 4 !leur. avallll'plectroplicJlese.
A. B t~t C sont rif'S dl~I'Ot5 c1'enzymes
BA, BB, BB et BA unt de prCCII)'
s nillenus i1ve
1 ImrnunS(~llill1 B.
- 114 -
5. DISCUSSION - :nNrLUSION
Les trois phosphatases acides (A) (B) et (C) dont les
différences de propriétés ont été mises en évidence danSles cha-
pitres précédents, ont induit la synthèse d'anticorps dont l'étude
confirme une nette différence de comportement entre l 'enzyme (C~
et les deux autres enzymes (A) et (8).
En effet, l lexamen des électrophorégrammes montre que
les phosphatases acides (A) et (B) ne sont pas précipitées par
l limmunsérum (C). On peut par conséquent dire qulil existe une
différence de structlJre entre l'enzyme (C) d'une par et les
enzymes (A) et (B) d'autre part, ne serait-ce qu1au niveau des
sites antigéniques, ainsi que le confirme llimmunoélectrophorèse
en "tandem" (Figi.lres 20 et 21) qui fait apparaître que llenzyme (C)
ne reconnaît pas les mêmes populations d'anticorps que les enzymes
(A) et (B).
Les l~éactions immunologiques croisées entre les enzymes
(A) et (B) (figures 18 et 19) montrent que l'antisérum (A) précipite
non seulement la phosphatase acide (A) mais également la phospha-
tase acide (8). De même, l'antisérum (B) précipite les enzymes (A)
et (B).
On peut ainsi conclure que ces deux enzymes ont des déter-
minants antigéniques communs. Cette conclusion est aussi renforcée
par 11 immunoélectrophol'èse en "tandem" (figures 20 et 21) qui montrent
effectivement par llaspect des pics en dos de chameau que les enzymes
(A) et (B) reconnaissent des populations commu~es d'anticorps.
- 115 -
CON C LUS ION S
G E N E R ALE S
L'objectif de cette étude était de situer l'importance
du rôle physiologique de certains enzymes glycolytiques au cous
de la conservation dellign~me apr~~ la récolte. En effet, il a
été constaté que les pertes interverant.au cour~ de la conserva-
tion des tubercules d'ignames étaient en grande partie d'origine
métabolique. donc physiologique.
C'est dans ce contexte que nous avons étudié d'abord la
distribution des phosphatases acides dans quelques Diocoreacées
de Côte d'Ivoire.
- La première remarque qui ressort de cette distribution est
la grande richesse en phosphatases acides des cultivars de l'espèce
D.cayenensis rotundata comparativement aux autres espèces étudiées.
- La seconde remarque est que les taux de protéines augmentent
au cours de la conservation alors que l'activité phosphatasique
acide cytoplasmique diminue. Cette diminution se fait au profit
d1une augmentation des phosphatases acides membranaires.
Ce comportement des phosphatases acides cytoplasmiques
et membranaires fait donc penser que les phénomènes physiologiques
dans lesquels les phosphatases acides sont impliquées au cours de
la conservation pourraient être des phénomènes membranaires.
- 116 -
- La troisième remarque est que les cultivars d'ignames, riches
en phosphatases acides le sont
aussi en phosphor/lases, ce qui
accrédite l lidée que les phosphatases acides pourraient être des
fournisseurs de phosphutes inorganiques pour le fonctionnement
des phosphorylases au cours des réactions cataboliques des glucides.
Compte tenu ae cette importance des phosphltases acièes
que nous venons d'évoquer, ilapparai,~it indispensable d'entreprendre
leur purification et de définir leurs prupriétés qui pourraient
nous éclairer sur leurs rôles physinlogiques.
Nous avons donc purifié une phosphata se acide cytoplas-
mique (A) et deux pl10sphatases acides membranaires (B) et (C)
jusqu'à homogénéité électrophorétique avec des rendements relati-
vement acceptables pour ces trois enzymes.
La pureté de ces enzymes nous a permis d'étudier leurs
propriétés moléculaires et cinétiques. L'analyse de la composition
en acides aminés fait ressortir une nette différence d'ensemble
entre l 1 enzyme cytoplasmique (A) et les enzymes membranaires (B)
et (C), surtout au niveau des aminoacictes dicarboxyliques, basiques,
soufrés et aromatiques.
Par ailleurs, bien que les deux enzymes membranaires (8)
et (C) aient beaucoup de similitude du point de vue de la composi-
tion en acides aminés, ils se distinguent nettement l'un de llilutre·
par les taux de sérine et de glycine.
La contribution de certains rési~us à la composition
globale en amine acides des trois phosphatases a été compar~e & la
- 117 -
contribution moyenne calculée par Dayhoff et Coll [74] et fait
apparaître une contribution importante des résidus acides et
amides à la composition globale des phosphatases acides (A) et
(B) et aussi une contribution notable des acides aminés hydroxylés
chez l'enzyme (C). Cette étude de la contribution des groupements
d'acides aminés fait apparaître une nette similitude entre les
enzymes (A) et (8) au niveau dl:s aininoacides basiques
hydroxylés
l
et hydrophobes.
La détermination des poids moléculaires des trois enzymes
par gel filtration et par électrophorèse en gel de polyacrylamide
en présence de S.D.S., nous permet de dire que les trois phosp;la-
tases (A) (8) et (C) ne semblent pas être des protéines oligomé-
riques.
L'influence du pH et de la température n'a pas été un fac-
teur de différenciation des trois phosphatases. En effet, les
'trois enzymes sont stables dans les mêmes gammes de pH et de
température.
Par contre, l'étude de la spécificité de substrat nous
a permis de mettre en évidence une nette différence fOilctionnelle,
probablement dl importance physiologique, entre l 1 enzyme cytoplas-
mique (A) d'une part et les enzymes (B) et (C) d'autre part. En
effet, la phosphata se acide cytoplasmique nia pratiquement aucune
action SUl" les sucres phosphorylés, mise à part une faible action
sur le ribose-5-phosphate. Par contre les enzymes membranaires (8)
et (C) hydrolysent de façon plus ou moins importante tous les
- 118 -
sucres phosphorylés étudiés. Soi lion considère uniquement les
substrats naturels, on remarque que les trois phosphatases ét~diés
hydrolysent très bien les adenosines-5lmono et di phosphates ; les
enzymes membranaires se distinguant par une action beaucoup plus
importante que celle de l lenzyme cytoplasmique. Les enzymes mem-
branaires sont par ailleurs les seuls à hydrolyser l'ATP SUt'tout
dans le cas de llenz"me (B).
J
Cette ac~ion plus accrue des phosphatases membranaires
1
sur les sucres phosp~.orylés et- sur les adenosines phosphates a
1
probablement une significatioll physiologique. On peut penser en
!l
effet que le métabolisme du phosphate eu niveau des sucres phos-
!
phorylés est un phénomène membranaire. A ce niveau il est possible
que les ad~nosines ph"sphates jouent un rôle de substrats four-
nisseurs de phosphates dans les réactions de phosphorolyse et de
phosphorylation et aussi de fournisseurs d'énel~gie nécessaire aux
,
phenomènes de transport transmel1lbranaire du phosphate dans lesquels
les phosphatases membranaires pourraient êre impliquées.
L'étude de l 'action de différents effecteurs sur
l'activité des trois enzymes fait ressortir deux faits essentiels
En ce qui concerne les ions métalliques, on constate ici, un
effet activateur du Mg 2+ contrairement à ce qu'on rencontre généra-
lement chez les phosphatases.
Cet effet activateur, associé à l'action inhibitrice de
l 'EDTA militerait en faveur de la nature métalloprotêiqu~ des trois
phospha ta ses.
- 119 -
- En ce qui concerne les réactifs de marquage chimique, il
est intéressant de signaler que le DTNB inhibe les trois enzymes
alors que les autres réa~cifs specifiques des thiols étudiés que
sont le pHMB et la NEM n'ont aucun effet sur ces enzymes. Ceci
est probablement da à un positionnement spécifique du DTNB (com~
plexe de transport de charge) au voisinage des groupements SH qui
sont sans doute peu réactifs.
L'action du N-acétyl-imidazole milite en faveur d'un
probable rôle de r~sidus tyrosyls dans le contrôle des activités
des phosphatases (A) et (B). La diazotation des trois phosphatases
indique qu'elles contiennent au moins chacune un résidu histicyl
essentiel.
,Enfin~ l'étude immunologique des trois phosphatases
révèle une nette différence de comportement entre l'enzyme (C) et
les deux autres enzymes (A) et (B). Seuls les el,zymes (A) et (B)
reconnaissent en commun certaines populations d'anticorps. Ils ont
donc dans ce cas des déterminants antigéniques communs qu'on ne
l'etrouve pas sur l'enzyme (C).
Par ailleurs, les propriétés moléculaires et l'action
sur les différents substrats permettent d'écarter l 'hypothèse que
les enzymes (A) et (B) pourraient être une même entité moléculaire.
Les résultats obtenus au cours de ce travail nous per-
mettent d'envisager d'intéressantes perspectives de recherche
Au cours de ce travail, nous avons émis l 'hypothèse que
les phosphatases acides pourraient être irnpl'iquées dans la
- 120 -
fourniture de phosphates lors des réactions de phosphoro1yse de
l'amidon dans certaines variétés d'ignames. Cette hypothèse basée
sur 1a présence s'imultanée des phosphory1 ases et des phosphatases
dans ces variétés d'igname mérite d'être vérifiée.
Si cette hypothèse était.vérifiée, il n'y a aucun doute
qu'on puisse envisager un mécanisme de régulation de l'activité
phosphory1asique en se prévalant du fait que certains sels miné-
raux (pouvant être facilement inclus dans les sols de culture),
inhibent les activités phosphatasiques. Cet aspect du problème
est très important surtout quand on sait que la présence simul-
tanée dans le même tubercule des deux enzymes de dégradation de
l'amidon (amylase et phosphory1ase) est un facteur défavorable
à une bonne conservation de ce tubercule [n . Du ~ait de la loca-
lisation membranaire de certaines phosphatases étudiées, il n'est
pas exclu que ces enzymes jouent au niveau des tubercules d'ignames
un rôle de transporteur de phosprate du milieu environnant (sol) vers
les centres métaboliques du tuberc~le. Il est 1ussi probable que
l'action de ces phosphatases sur des sucres et autres composés phos-
phory1és dans des tubercules récoltés, ne se fasse uniquement dans
ce cas, que pour palier à un déficit èn phosphates inorganiques. Ce
sont là autant de points à éclaircir.
Enfin, la distribution des phosphatases acides dans les
cultivars d'ignames pourrait constituer pour les généticiens un
outil de différenciation variétale.
- 121 -
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