UN IIIERS ITE PAR 1S-SUD
UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE DES SCIENCES
PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
ANNEE: 1984-1985
Série DOCTORAT n·4
THESE
présentée
A L'UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE
DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES ET BIOLOGIQUES
DE L'UNIVERSITE PARIS-SUD
Pour l'obtention du grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE PARIS-SUD
MENTION SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
D8Qui MONNET
Titre de la thèse:
MODULATION DE LR 6LYCOSYLATION DE L'e;{1-6LYCOPRDTEINE
ACIDE DE ART. EFFET DE LR 0-6RLRCTOSRMINE ET
DU PHENOBRRBITRL
soutenue le 4 Septembre 1985
Jury: Président: Monsieur le Professeur J. AGNERAY
Membres : Monsieur le Professeur R ENGLER
Monsieur le Professeur B. FOURNET
rapporteur
Madame le Professeur G. DURAND
rapporteur

---

A Monsieur le Professeur J. AGNERAY,
qui m'a accueilli dans son laboratoire
et me fait l'honneur d'accepter la
présidence de cette thèse. En témoi-
gnage de l'assurance de fidèle atta-
chement et profond respect.
A Madame le Professeur G. DURAND,
qui m'a inspiré le sujet de cette thèse
et en a toujours suivi la réalisation
avec beaucoup d'intérêt et de bien-
veillance. En témoignage de toute ma
reconnaissance et de mon respectueux
attachement.
A Monsieur le Professeur B. FOURNET,
qui a maintes reprises, après m'avoir
accueilli dans son laboratoire, m'a
fait bénéficier de ses larges connais-
sances dans le domaine de l'analyse
de structure des oligosaccharides et
qui a bien voulu faire partie du jury
qu'il trouve ici l'expression de ma
bien vive gratitude.
A Monsieur le Professeur R. ENGLER,
qui m'a fait l'honneur de bien vouloir
juger cette thèse, je l'en remercie
vivement.

---

A Madame le Professeur J. FEGER,
qui m'a donné de si nombreuses marques
d'intérêt et dont j'ai tant apprécié
le profond savoir. En témoignage de
très vive reconnaissance et respec-
tueuse affection.
A Monsieur le Professeur D. DURAND,
pour l'intérêt et le soutien qu'il m'a
apporté dans la réalisation de ce
travail, je l'assure de ma profonde
et bien respectueuse gratitude.
A Monsieur D. BlOU,
qui m'a initié aux méthodes immunochimi-
ques et chromatographiques. Avec ma
profonde reconnaissance à laquelle
s'ajoutent des liens de profonde amitié
qui ont pris naissance au cours de ce
travail.
A Monsieur P.
CARDON,
avec qui une partie de ce travail a été
réalisée. Sa compétence dans l'analyse
des glycannes et sa bonne humeur m'ont
été infiniment précieuses.

---

J'adresse mes sincères remerciements à
Monsieur J. DAVY,
pour son soutien dans l'interprétation
des résultats et qui a su mettre en
valeur les photographies de ce travail.
Monsieur le Professeur J.R. DIDRY,
pour les conseils qu'il m'a donnés pour
l'interprétation statistique des résul-
tats.
Monsieur R. COUDERC,
pour l'aide qu'il m'a apportée dans la
réalisation de l'électrophorèse en
gel de polyacrylamide.
-
A tous mes collègues et amis du Laboratoire de Biochimie
leur gentillesse, les services rendus
quotidiennement m'ont aidé bien des
fois à surmonter les moments de décou-
ragement.
A Madame J. BARTOLI,
qu'elle trouve ici mes sincères remer-
ciements pour la dactylographie de
cette thèse.

---

A ma femme,
en témoignage de mon amour. Je la remer-
cie pour tous les sacrifices qu'elle a
dû accepter pour me permettre de réa-
liser ce travail.
A mes beaux-parents,
A mes parents,
à qui je dois tout.
A tous mes frères et soeurs,
A mes fils,
A mon oncle et ma tante,
A mon frère Blaise et ma belle soeur Lili
en reconnaissance de leur constant et
affectueux soutien.
A tous mes amls.

---

TABLE DES MATIERES
Pages
INTRODUCTION
l
1. RAPPEL DE LA STRUCTURE DES GLYCOPROTEINES
2
II. BIOSYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES DE TYPE N-OSIDYL
5
III. HETEROGENEITE DE LA CHAINE GLYCANNIQUE DES
GLYCOPROTEINES
18
IV. HEPATITE EXPERIMENTALE A LA GALACTOSAMINE CHEZ LE RAT
23
V. L'INDUCTION PAR LE PHENOBARBITAL ET SES CONSEQUENCES
26
MATERIEL ET TECHNIQUES UTILISES
28
A. TECHNIQUES D'INDUCTION
29
B. TECHNIQUES DE DOSAGES IMMUNOCHIMIQUES
31
C. TECHNIQUES D1IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE
CONCANAVALINE A (CIAE CON A)
39
D. PREPARATION DES IMMUNSERUMS
43
E. PURIFICATION DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
45
F. APPROCHE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE
L' a
ACIDE DE RAT
61
1-GLYCOPROTEINE
RESULTATS
69
1. EFFET DES DIVERS PRODUITS SUR LA SYNTHESE PROTEIQUE
CHEZ LE RAT
69
A. Effet de la galactosamine sur les concentrations
des protéines sériques
71

---

B. Incidence du
traitement par le phénobarbital
sur les valeurs sériques des protéines spécifiques
73
et totales de Rat
C. Cinétique d'apparition des protéines sériques sous
l'effet conjugué du PB et de l'essence de térébenthine
75
II. ETUDE DE L'HETEROGENEITE DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE DE
RAT. ETUDE DIRECTE SUR SERUM
81
A. Modification du degré de sialylation
82
B. Microhétérogénéité en position interne par immuno-
affinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
(CIAE Con A)
84
1) Hétérogénéité de l'al-GPA de Rat Normal
84
II) Altération de l'al-GPA en CIAE-Con A sous
l'effet de divers produits
88
III. ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE L'al-GLYCO-
PROTEINE ACIDE DE RATS NORMAUX ET TRAITES PAR LE
PHENOBARBITAL
99
A. Etude de la copule glycannique de l'al-glycoprotéine
acide de rats normaux et traités au pnénobarbital
100
B. Etude de la copule glycannique de l'al-GPA RPBS CMI
et RPBS CM2
113
DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION
119
BIBLIOGRAPHIE
128

---

A B R E V lAT ION S
JJg
microgramme
mg
milligramme
9
gramme
kg
kilogramme
,ul
micro litre
ml
millilitre
l
litre
mm
millimètre
cm
centimètre
s
seconde
min
minute
h
heure
J
jour
E. T.
essence de térébenthine
GaIN
galactosamine
PB
phénobarbital
Gal
galactose
Man
mannose
Fuc
fucose
GleNAc
N-acétylglucosamine
N-AN
acide N-acétylneuraminique
ASAT
asparagine aminotransférase
ALAT
alanine aminotransférase
GnT r
N-acétylglucosaminyltransférase l
GnT II
N-acétylglucosaminyltransférase II
GnT III
N-acétylglucosaminyltransférase III
GnT IV
N-acétylglucosaminyltransférase IV
GnT V
N-acétylglucosaminyltransférase V
Gal T
galactosyltransférase
CIAE
immunoaffinoélectrophorèse croisée
Con A
Concanavaline A
IDR
immunodiffusion radiale

---

EIDm
électroimmunodiffusion monodimensionnelle
EIDb
électroimmunodiffusion bidimensionnelle
1.5.
immunsérum
Ag
antigène
Ac
anticorps
B5A
sérumalbumine bovine
al-GPA
al-glycoprotéine acide
CaCI
chlorure de calcium
Z
MgCI
chlorure de magnésium
Z
MnCI
chlorure de manganèse
Z
P.E.G.
polyéthylène glycol
CMc
carboxyméthyl cellulose
DEAE
diéthylaminoéthyl
C.P.G.
chromatographie en phase gazeuse
HPLC
chromatographie liquide à haute pression
R.E.L.
réticulum endoplasmique lisse
R.E.R.
réticulum endoplasmique rugueux
G
Golgi
ARNm
acide ribonucléique messager
Asn
asparagine
5er
sérine
Thr
thréonine
UTP
uridine tri-phosphate
UDP
uridine di-phosphate
UMP
uridine mono-phosphate
Glc-I-P
glucose-I-phosphate
GaIN-I-P
galactosamine-I-phosphate
HDL
high density lipoproteins
LDL
low density lipoproteins
VLDL
very low density lipoproteins
RMN
résonance magnétique nucléaire
al -CPA RN
al -glycoprotéine acide de rat normal
al-CPA RPB
al -glycoprotéine acide de rat traité par le phéno-
barbital

---

TABLE DES FIGURES
Pages
1 - Liaisons entre r~sidus aminoacyls,et osidyls dans
les glycoprot~ines
2
2 - Noyau pentasaccharidique ou "core" des N-glycoprot~ines
s~riques
3
3 - Exemples des 3 classes majeures du type "Asn-oligo-
saccharide"
4
4 - Structure du dolichol pyrophosphate
5
5 - Structure du pr~curseur "lipide-oligosaccharide" des
N-glycoprot~ines
5
6 - Sch~ma de biosynthèse des glycoprot~ines s~riques
6
7 - Niveau d'action des glycosidases
8
8 - Poin$d'action des N~ac~tylglucosaminyltransf~rasessur le
"pentamannosyl"
10
9 - Structure des chaînes glycanniques de l'al-glycoprot~ine
acide humaine
17
10 - Structure de la chaine glycannique de l'ovalbumine du
groupe III
19
Il - al-gl~coprot~ine acide humaine --N sites de glyco-
sylatlon ; ---- 2 ponts di sulfure
19
12 - M~tabolisme de la galactosamine dans le foie
24
13 - Courbe d'~talonnage de la d~termination de la d~sia-
lylation de l'al-GPA de rat
37
14 - Immuno~lectrophorèse en quinconce
38
15 - Plaque de gel d'agarose de la 1ère ~lectrophorèse
41
16 - Plaque de gel d1·agarose de la 2ème
Iect rophor èse
42
é
17 - Electroimmunodiffusion bidimensionnelle de Laurell
de s~rum de rat contre l'immuns~rum de lapin anti-
al-glycoprot~ine acide de rat
44
18 - Immuno~lectrophorèse de s~rum de rat normal et de
s~rum de rat inflamm~ contre l'immuns~rum pr~par~
44

---

19 - Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions exclues
ou éluées lors d'une chromatographie sur DEAE trisacryl
51
20 - Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions éluées
ou retenues lors d'une chromatographie sur CM 52
52
21 - Immunoaffinoélectraphorèse croisée en Con A de sérum
et de lla1-GPA isolée
contre un immunsérum de lapin
anti-a
GPA de ra~.
53
l-
22 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A des produits
de la 3ème préparation contre un immunsérum anti al-GPA
de rat
54
23 - Immunoélectrophorèse selon Grabar de l'al-glycoprotéine
acide (a -GPA 10 g/l) purifiée contre un immun sérum de
lapin anti-protéines sériques surchargé en anti-al-GPA
de rat
58
24 - Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des glycosides
66
25 - Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des méthyl-
glycosides
67
26 - Effet de la D-galactosamine sur les taux sériques de
lIaI-glycoprotéine acide,des protéines totales et
sur l'activité alanine aminotransférase
72
27 - Effet du phénobarbital sur la concentration sérique
de l'al-glycoprotéine acide
74
28 - Cinétique d'apparition de l'al-glycoprotéine acide
en fonction du temps après inJection du phénobarbital
et de la solution de NaCl 0,15 M
76
29 - Evolution de la concentration sérique en albumine
après traitement par le phénobarbital (PB) et par
l'essence de térébenthine (ET)
77
30 - Evolution de la concentration sérique en al-glyco-
protéine acide (a -GPA) après traitement par le
phénobarbital (PBJ et par l'essence de térébenthine (ET)
79
31 - Effet cumulé de l'association phénobarbital (PB) et
essence de térébenthine (ET) sur la concentration sérique
de l'al-glycoprotéine acide (al-GPA)
80
32 - Modification dans le degré de sialylation de l'a -
glycoprotéine acide et l'activité sérique de l'alanine
aminotransférase
après injection de D-galactosamine
chez le rat
83
33 - Hétérogénéité de l'a -glycoprotéine acide de Rat en
immunoaffinoélectrop~orèse croisée en Concanavaline A
(CIAE Con A)
86

---

34 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'al-glycoprotéine acide de rat traité à la D-
galactosamine
90
35 - Effet de la galactosamine sur le degré d'hyposialylation
de l'al-glycoprotéine acide et sur le rapport RI des
isotypes 1/2+3+4 calculé après immunoaffinoélectropho-
rèse croisée en Concanavaline A
91
36 - Modification des différents isotypes de l'al-glyco-
protéine acide de rat en immunoaffinoélectrophorèse
croisée en Concanavaline A
93
37 - Cinétique de variation des valeurs relatives des dif-
férents isotypes de l'al-glycoprotéine acide consécu-
tives au traitement par le phénobarbital
94
38 - Effet de l'essence de térébenthine sur l'évolution des
isotypes de l'al-glycoprotéine sérique lors de l'analyse
en immunoaffinoelectrophorèse croisée en Concanavaline A
96
39 - Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'al-glycoprotéine acide de rat traité par l'ensemble
phénobarbital (PB) et essence de térébenthine (ET)
97
40 - Analyse des oligosaccharides de l'al-GPA RN
en chromatographie sur AX 10
107
41 - Analyse des oligosaccharides de 1!a1-GPA RPB
en chromatographie sur AX 10
108

---

TABLE DES TABLEAUX
Pages
l - Types de liaisons galactosyles dans les glycoprotéines
12
II~ Types de liaisons sialosyles dans les glycoprotéines
13
III. Types de liaisons fucosyles dans les glycoprotéines
15
IV. Caractères physico-chimiques de l'al-glycoprotéine
acide de rat
46
V. Mode de détermination des rapports molaires en mono-
saccharides par chromatographie en phase gazeuse
68
VI. Concentrations sériques en al-glycoprotéine acide,
albumine et protides totaux chez le Rat Sprague-
Dawley normal
70
VII. Valeurs de l'al-glycoprotéine acide dans les sérums dilués
84
VIII. Effet de concentrations croissantes en Concanavaline A
sur les valeurs relatives des isotypes de l'al-glyco-
protéine acide
87
IX. Distribution des proportions relatives des 4 isotypes de
IraI-glycoprotéine acide de rat normal
87
X. Proportions des isotypes l, 2, 3 et 4 et rapport RI des
isotypes 1/2+3+4 calculés après une immunoaffinoélectro-
phorèse croisée en Concanavaline A de l'al-glycoprotéine
acide de rat traité par la D-galactosamine
89
XI. Rapport molaire des monosaccharides présents dans l'a l-
glycoprotéine acide de rat après méthanolyse et tri-
fluoroacétylation
101
XII. Composition en monosaccharides de l'al-glycoprotéine
acide de rat
101
XIII. Comparaison de la composition en sucres de l'al-glyco-
protéine acide de rat rapportée par divers auteurs
102
XIV. Nombre de résidus dans la protéine
104
XV. Temps de rétention et ordre de sortie des dérivés glycan-
niques sur Micro-Pak AX 10
105
XVI. Composition en sucres des fractions obtenues par chro-
matographie semi-préparative des oligosaccharides libérés
par hydrazinolyse
109

---

XVII. Proportion des diverses fractions oligosaccharidiques
d'al-GPA RN et d'al-GPA RPB s~par~es sur AX 10
III
XVIII. Pourcentage de chaque fraction par rapport à la glyco-
prot~ine totale
112
XIX. Composition molaire en mono~accharides
114
XX. Composit~on en monosaccharides des fractions al-GPA
RPBS CMI et al-GPA RPBS CM2
114
XXI. Composition molaire en monosaccharides des d~riv~s de
l'a1-GPA RPBS CMI et de l'al-GPA RPBS CM2 après AX 10
116
XXII. Proportion des diverses fractions oligosaccharidiques
après AX 10
117
XXIII. Teneur des diff~rentes fractions dans la glycoprot~ine
117

---

l
l N T R 0 DUC T ION
L'al-glycoprotéine acide (al-GPA) ou orosomucoïde est une glyco-
protéine présente dans le plasma des mammifères. Elle se distingue des
autres glycoprotéines sériques par l'importance de sa copule glycannique,
sa richesse en résidus sialyls, ce qui lui confère des propriétés physico-
chimiques particulières. C'est aussi l'une des molécules les plus étudiées
sur le plan de la structure.
Deux grands types d'hétérogénéités ont été mis en évidence, selon
qu'elles affectent la copule peptidique ou la copule glycannique.
Les premières correspondent a des variants dûs à la substitution
de résidus aminoacyls mis en évidence par analyse en gel d'amidon à pH 5 ou
par clivage au bromure de cyanogène SUIVI d'une digestion trypsique (Schmid
1975, 9S). La cause en apparaît d'ordre génétique. Nous n'aborderons pas
leur étude.
Le second type d'hétérogénéité concerne la chaîne glycanne et
correspond a ce qui a été appelé des "microhétérogénéités" (Schmid,
1975,98 ).
De plus en plus il semble que certains états pathologiques soient
corrélés avec des variations relatives dans ces microhétérogénéités. Or,
de nombreux exemples ont montré que structure et propriétés physiologiques
sont étroitement reliées. Bien que l'on connaisse mal à l'heure actuelle le
rôle de l' al-GPA, on peut espérer que la mise en évidence d'anomalies de
structure de la chaine glycanne contribuera
à mettre en évidence son rôle
exact.
C'est la raison pour laquelle nous avons utilisé deux modèles
de pathologie animale induisant au niveau de l'al-GPA des modifications
de la structure glycannique que nous avons étudiées.
En préambule il semble nécessaire de rappeler les étapes de la
synthèse des chaînes glycannes des glycoprotéines.

---

2
I. RAPPEL DE LA STRUCTURE DES GLYCOPROTEINES
De nombreuses protéines d'eucaryotes sont glycosylées. Le
méc?nisme de glycosylation est complexe et a survécu à l'évolution, de
la levure à l'homme. L'effort d'une cellule pour glycosyler les protéines
est substantiel. Cependant, les connaissances actuelles sur le rôle bio-
logique des chain es glycanniques des glycoprotéines sont limitées.
Kornfeld (198Z, S~ ) et Montreuil (1980, ri ) ont proposé de classer les
glycoprotéines en 2 groupes:
- les glycoprotéines-N-glycosylées
- les glycoprotéines-O-glycosylées
. Dans les N-glycosyl-protéines, la liaison osidique s'établit
entre le groupe NH
en y d'une asparagine de la copule polypeptidique et
2
l'hydroxyle ~émiacétalique S d'un 2-acétamido 2-désoxy D-glucose (N-acétyl-
glucosamine) (fig.la).
~l H- CO - CH2 - CH - COOH
1
NH 2
a)
R
~H - CH - COOH
b)
1
NH 2
Figure 1
Liaisons entre résidus arninoacyls et osidyls dans les glycoprotéines
a) liaison H-osidique entre un résiduasparaginyl et un résidu S-H-
acétylglucosaminyl des protéines N-glycosylees
b) liaison O-osidique entre un résidu aminoacyl (R = H, sérine
R = CH
thréonine) et un résidu S-N-acétylgalactosaminyl des
3,
protéines O-glycosylées.

---

3
. Les O-glycosyl-protéines sont caractérisées par une liaison
covalente entre la fonction alcool primaire ou secondaire d'un résidu
aminoacyl.(sérine ou thréonine) et un reste osidyl (fig.lb).
Cette étude portera uniquement sur le groupe N-glycosylé quJ
est lui-même divisé en 3 classes. On y retrouve toujours un noyau commun
pentasaccharidique interne: le "core" (fig.2).
FiQure 2
Noyau pentasaccharidique ou "core" des N-glycoprotéines sériques
c'est un manno-tri-osido-di-N-acétylchitobiose lié à un résidu as-
paraginyl. l, 2, 3, 4, 4' : numérotations conventionnelles des oses
et osamines.
La figure 3 indique la composition chimique de chacune des 3
classes
riche en mannose, complexe et hybride.
- Dans le type riche en mannose ou oligomannosidique, le penta-
saccharide de base est substitué uniquement par des résidus mannosyls.
- Le type complexe porte sur les restes mannosyls du "core" des
groupements N-acétyllactosaminyls.
Le type hybride est constitué d'un mélange des deux restes
mannosyl et N-acétyllactosaminyl.
Bien qu'hétérogènes dans leur structure, ces 3 types dérivent
d'un seul et unique précurseur: "lipide-sucres" (Harpaz et Schachter
1980,43
; Tabas et Kornfeld 1978,t09 ). Dans les conditions physiologiques
normales, on ne trouve le plus souvent qu 1 une seule classe d' oligosaccharides
dans une molécule donnée. Il existe des exceptions à cette règle. Ainsi
pour les IgM, trois résidus asparaginyls
sont substitués par une chaîne de
type complexe alors que les 2 autres le sont par une chaine oligomanno-
sidique (Putnam
et al, 1973, S6 ).
Ce mode de distribution est mal expliqué, il semblerait que la
configuration de la protéine et la localisation de l'oligosaccharide sur
le polypeptide influent sur l'extension du processus de biosynthèse.

---

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SA
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GleNAc
GleNAc
1
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J
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_____ - - - - 1 - - - - - - - - - -
Asn
Asn
Asn
Complexe
Hybride
Oligomannosidique
Figure 3 : Exemples des 3 classes majeures du type "Asn-oUgosaccharide"
emprunté à (Kornf el d , 1982, 53 ).
.$:"

---

5
II. BIOSYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES DE TYPE N-OSIDYL
La biosynthèse des glycoprotéines de type N-osidyl se fait en
4 étapes
a) Synthèse d'oligosaccharide riche en restes mannosyls et
glucosyls sur un intermédiaire dolicholpyrophosphate (fig.4).
CH3
~H3
CH -t = CH - CH
= CH-CH
3
2 [-CH2-C
2-
Fiaure 4 : Structure du dolichol pyrophosphate: n = 12 à 21
~
b) Transfert de l'oligosaccharide (fig,5) du lipide sur l'accep-
teur protéique.
Gle
a 1,2 ~
Gle
cr 1,3.
Glc
a 1,3 t
Man
"Man
Man
c r.z t
a 1,2 1
! 0: 1,2
T
T
Man
Man
Man
c i.z ]
(;.1,3\\
/al,ô
Man
Man
al~
Al,6
Man
1i31,4
GleNAc
~ .G 1,4
GleNAc
1
p
1
•
p
1
Dolichol
Figure 5
Structure du précurseur "lipide-oligosaccharide" des
N-glycoprotéines : c'est un tétra décasaccharide lié
au dolichol pyrophosphate. Son transfert exige la pré-
sencè du résidu di-N-acétylchitobiosyl et surtout des
résidus glucosyls de l'extrémité non réductrice.
Emprunté à Kornfeld (1982, 53 ).

---

6
c) Action de glycosidases sur l'oligosaccharide lié sur la
protéine (glucosidases et mannosidases). Les résidus glycosyls et manno-
syls sont libérés progressivement à partir de l'extrémité terminale non
réductrice.
d) Elongation de l'oligosaccharide par action séquentielle de
glycosyltransférases spécifiques.
II.1. SITES SUBCELLULAIRES DE LA GLYCOSYLATION
La glycosylation a lieu dans la cellule (fig.6). L~s sucres
proches de la liaison glycanne-protéine (Man et GlcNAc internes) sont
incorporés
dans le
réticulum endoplasmique rugueux (R.E.R.) alors
que les restes osidyls de l'extrémité non réductrice (GlcNAc externes, Gal,
Fuc et N-AN) sont incorporés dans les saccules golgiens (G). (Schachter et al,
1982,93
j
Schachter, 1984,95
).
~
v.>
•·•
\\
\\
. ·
\\
.
MP
\\
\\
\\
\\
\\
•
\\
Figure 6
Schéma de biosynthèse des glycoprotéines sériques : les glyco-
protéines sont représentées par les lignes discontinues. Les
peptides naissants sont assemblés au niveau du réticulum ru-
gueux. Lors de leur cheminement dans les systèmes membranaires, les
peptides sont glycosylés et ensuite sécrétés dans le milieu extra-
cellulaire. Abréviations : RER, réticulum endoplasmique rugueux
REL, réticulum endoplasmique lisse j G, Golgi j VS, vésicule de
sécrétion j HP, membrane plasmique; Tn, Tl, T2, T3, glycosyl-
transférases. Tn pouvant désigner la glycosyltransférase participant
au transfert du "core" tandis que Tl, T2 et T3 représenteraient
respectivement les sialyl _, galactosyl et N-acétylglucosaminyl-
transférases intervenant dans la synthèse de l'extrémité non réduc-
trice. Emprunté à Bennett et al (1974,11. ).

---

7
La glycosylation s'effectue par action catalytique d'enzymes
membranaires des canalicules,
les glycosyltransférases, au fur et à
mesure du cheminement des chaines peptidiques dans le système RER-C.
Lorsque les sialyls et fucosyltransférases ont ag~ il y a formation de
vésicules,puis,après pinocytose,les glycoprotéines destinées à la sécré-
tion dans le milieu extracellulaire sont libérées (Bennett et al 1974,11 ).
II.2. PREASSEMBLACE ET TRANSFERT D'OLICOSACCHARIDE A PARTIR D'UN DERIVE
DOLICHOL PYROPHOSPHATE
L'hypothèse actuelle retenue est qu'il existe un précurseur
commun, le tétradécasaccharide-lipide (fig.5) pour toutes les chaînes
N-glycosidyles. Utilisant la tunicamycine qui inhibe la fixation de Clc
NAc sur le dolicholpyrophosphate, Lehle et Tanner (1976,5'+ ), Struck et Lennarz
(1977,106 )ont montré une absence totale de chaine glycannique sur une
molécule normalement glycosylée. Les enzymes intervenant sont membranaires
et la glycosylation apparaît avoir lieu principalement dans le RER.
Behrens et al (1973, 10 ) et Parodi et al (1972, '32. ) furent les
premiers à rapporter le transfert d'oligosaccharides. La séquence de liai-
son peptidique est toujours Asn-x-S~r/Thr où x représente un acide aminé
quelconque. Cette séquence, bien qu'existant sur la protéine, ne conduit
pas toujours à une glycosylation. L'enzyme de transfert serait présent dans
le RER (Khalkhali et t~arshall, 1975,51 ). Le t r ansâer t exige le résidu di-
tJ-acétylchitobiosyl et les résidus glucosyls de l'extrémité non réductrice
II.3. DECLYCOSYLATION DES GLYCOPEPTIDES NAISSANT
LES GLYCOSIDASES (fig.7)
Le transfert du tétradécaoligosaccharide ClcNAc
sur la
2Man9Glc 3
protéine est suivi d'une déglycosylation catalysée par des glycosidases
spécifiques: glucosidases et mannosidases.

---

8
Glc
J.. 1-2 glucosidase -----7> cr 1,2 t
l
Glc
--"i cr 1,3 t
~ 1-3 glucosidase ~.'
Glc
Ir---:-, CI 1,:3~
Man
Man
Man
J.. -Mannosidase I
'p œt.z t
CI 1,2 ~ <0
~CI1,2 ~ c\\ -Mannosidase I
~
Man
Man
Man
CI 1,2 t
CIl,3\\<- ICI1,6~"\\-Mannosidase II
Man
Man
CIl~
~1,6
Man
H31,4
GlcNAc
t131,4
GleNAc
,
,
1
Asn
Figure 7
Niveau d'action des glycosidases ; ce transfert du t~tra
d~casaccharide sur le r~sidu asparaginyl est suivi d'une
d~glycosylation séquentielle catalysée par des enzymes spé-
cifiques. Emprunté à Kornfeld (1982,53).
II.3.1. ~~~_2~~~~~~~~~~:_:_~~~!?2_2~~~~:~~~:~_!_~!_~~~!~2
2~~~~~~~~~~_!!'
Deux formes sont connues et présentent une haute spécificitéd'action
sur le glycanne riche en mannose. Elles peuvent être purifiées sur des
critères physicochimiques par filtration sur gel ou sur échangeurs d'ions
(Grinna et Rabbins, 1979,39 ). Les glucosidases l et II agiraient vraisembla-
blement sur l'oligosaccharide branché sur le peptide, clivant respectivement
les résidus glucosyls en position
~1,2
et
al,3 • Ces 2 enzymes se trou-
vent localisées dans le RER. Leur localisation est compatible avec le site
de biosynthèse des glycopeptides précurseurs. La déglucosylation débuterait
immédiatement après le transfert du tétradécasaccharide sur le peptide
(Elting et al 1980, '31 ).
II.3.2. Mannosidases
On en distingue deux types

---

9
. La mannosidase l
L1étape suivante est la conversion de l'oligosaccharide déglu-
cosylé GlcNAc
Man
en une unité "pent amannosy.e" par clivage des 4 résidus
2
9
mannosyls liés en
al,2 . La coupure est catalysée par la mannosidase 1 .
• La mannosidase II
Elle ne peut agir qu'après la
GlcNAc transférase l (GnTI) c'est
à dire l'enzyme qui, comme nous le verrons, initie la formation de la première
antenne. Elle catalyse alors l'hydrolyse des liaisonsmannosyles a1-3 et
al-6 du Han al-6 du "core" interne. Il semble par contre qu 1 après action des
GnT III et IV, la mannosidase II ne puisse plus agir.
Les études séquentielles de Tabas et Kornfeld (1979,1~U) et de Harpaz
et Schachter (1980, ~3 ) ont montré que ces 2 activités se trouvent localisées
dans les membranes de Golgi.
II.4. LES N-ACETYL GLUCOSAMlh"'LTRANSFERASES (GnT) (fig.8)
Nous ne parlerons que des GnT à l'origine des structures bi, tri,
ou tétraantennées des N-glycoprotéines. En effet, il pourrait exister jus-
qu'à 14 types de liaisons glucosaminylesdans les différents types de glycannes
tud'i és jusqu'à ce jour (Beyer et al, 1981, ~.:, ). Sur 7 Gn T susceptibles d' in-
è
tervenir dans la formation des antennes,
4 ont été identifiées et partiel-
lement caractérisées (Schachter et al, 1982, jJ.J ; Schachter, 1984,95 ).
II.4.1. ~:~~~!~~_2~~~~:~~~~~~!~~~~!~~~:~_!_~~_~~!!
(Oppenheimer et Hill, 1981, ft ; Harpaz et Schachter 1980,43)
C'est une transférase bien étudiée. Elle initie l'élongation de
la structure du "core" des oligosaccharides du type N-acétyl lactosaminyl en
catalysant la fixation de GlcNAc en position
61,2
sur le mannose en
al,3
du "core". Son substrat physiologique est la structure pentamannosyle Glc
NAc
t'Ians (Tabas et Kornfeld, 1978,109 ; Li et Kornfeld, 1978,59 i. Son
2
absence se traduit par une accumulation de
Glc ~IAc2 Ma~ dans des cellules
ovariennes de hamster mutées. On obtient alors une structure riche en mannose
sur laquelle les processus ultérieurs de glycosylation ne peuvent pas avoir
lieu.

---

10
Mannosidase II
GnT III
/ 1
\\
M~~3\\ I~~'~
GnT l - - Man
..... \\
Man
GnT JJ
al~
A16
/
.
Man
•
GnT IV
&~~4
GleNAc
&~1.4
GleNAc
1
Peptide-~sn-peptide
Figure 8
Points d'action des
N-acétylglucosaminyltransférases sur le
"pentamannosyl" : la GnT r initie l'élon2ation de la chaine
glycannique. La GnTI I et la GnT I V controlent le processus
de biosynthèse après action de la (al,3) et (al,6) mannosidase II.
L'activité de ces 3 dernières enzymes est bloquée par la GnT I I I
/ R1-:"'A---"'"
~~~$:;;~
L 1} \\lê~~
/3 le
~:~,
,
, :,., (~/I,1 Fr
l>'j
II.4.2. N-acetyl glucosaminyltransfev.~syII ou,~T Ir
----------------------------~~~::'
Le composé issu de l'action de la manno~'1dase Iel'?~~i le substrat
~
de la GnT II (Narasimhan et al, 1977,13 ). La GnT II contrôle la formation
de la deuxième antenne en catalysant la fixation de
QlcNAc en position
131,2
du Man en
a l , 6
du "core". La GnT II ne peut pas agir en l'absence de
la GNT 1.
Cette enzyme catalyse la fixation d'une Glc NAc en ~1-4 du t~an
lié en 6 du core, à condition qu'il y ait eu action préalable de la GnT 1.
Si par contre la GnT III agit avant ou plus rapidement que la mannosidase II,
on obtient une chaine intercalaire de type hybride comme dans l'ovalbumine.
(fig. 10) .te produit des GnTII et IV peut être aussi substrat de ia GnT III, ce qui

---

11
conduit à des structures intercalaires bi et triantennées. Il semble qu'aucun
processus d'élongation n'ait lieu sur ce résidu GleNAc lié en 81-4. Il
faut enfin noter que ce reste
GleNAc diminue l'affinité de la concanavaline A
pour les restes mannosyls de structures biantennées intercalaires (Schachter et
al 1982, SI.3 ; Narasimhan et al, 1981, f 4- ).
II.4.4. N-acétyl glucosaminyltransférase IV et GnT V
-------------------------------------------
La GnT IV (Gleeson et Schachter, 1983,36 ) catalyse la liaison
GleNAc 81-4 sur le Man al-3 du pentasaccharide, ce qui amorce la formation
de la 3ème antenne. Une GnT catalysant la liaison GleNAc 81-6 sur le Man
a 1-6 a été identifiée par son activité de transfert (Cummings et al,
1982,26
Yamashita et al, 1985,~Z4 ). Elle correspondrait à la GnT V selon
la numérotation de Schachter.
II.5. GALACTOSYLTRANSFERASES (Paquet et al, 1984,~1
Blanken et al, 1984,15
Généralement, dans les N-glycoprotéines sériques, le Gal appara!t
en un seul endroit sur les glycannes de type "Asn- GleNAc", en position
pénultième de l'extrémité non réductrice des N-glycoprotéines. Le transfert du
Gal à partir de l' UDP Gal conduit à la formation d'un résidu N-acéty l Lactosarnfn-
terminal. Il existerait cependant d'autres galactosyltransférases (Tableau 1).
La plus étudiée est la galactosyltransférase formant la liaison
81,4
N-acétyl lactosaminyle (Beyer et al, 1981, ~~ ).
II.6. SIALYLTRANSFERASES
L'acide sialique est généralement lié en position terminale des
glycoprotéines. Au moins 9 types de liaisons sialosyles sont possibles. Les
liaisons les plus rencontrées sont de type N-AN a2,6 Gal et N-AN a2,3 Gal
(Paulson et al, 1977, $3 ). (Tableau II).
Paulson et al (1978, S4 ) puis Van Den Eijnden et al (1980, JH 1--:-) J
examinant la sialylation d'asialoglycoprotéines sériques in vitro ont montré
que l'incorporation du N-At~ se fait selon un mode biphasique et préférentiel-
lement sur la branche portant le Man en al,3.

---

12
TABLEAU l
TYPES DE LIAISONS GALACTOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Galactose-N-acétylglucosamine
Galactose-N-acétylgalactosamine
a
b
GalSl,4 GlcNAc-
GalSl,3 GaHJAc-
GalSl, J Gl.cNAc-
Ga1Sl,6 GaINAc-
GalSl,6 GlcNAc-
Galal,3 GaINAc-
Galactose-galactose
a
Galal,3 Gal-
GaISI,3 Gal-
GaISI,6 Gal-
a) enzymes purifiées et caractérisées
b)
activité identifiée dans les tissus

---

13
TABLEAU II
TYPES DE LIAISONS SIALOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Acide Sialique-galactose
a
Siaa2,6 ,GaISI,4 GlcNAc_
b
Siaa2,3 GaISI,4 GlcNAc-
a
Siaa2,3 GaISI,3 GaiNAc-
Siaa2,4 GaISI,4 GaINAc-
Siaa2,4 GaISI,3 GlcNAc-
Acide sialique-N-acêtylgalactosamine
a
Siaa2,6 GalNAca-
Acide sialique-N-acêtylglucosamine
Siaa2,4 GlcNAc-
Siaa2,6 GlcNAc-
Acide sialique-acide sialique
b
Siaa2,8 Sida2
a) sialyltransfêrases purifiées
b)sialyltransfêrases connues

---

14
II.7. FUCOSYLTRANSFERASES
La fucosylation intervient à la dernière étape de la biosynthèse.
Bien qu'il y ait sept types de liaison fucosy~Tableau III), très peu de
fucosyltransférases ont été isolées.
La fucosyltransférase catalysant la liaison
al,6
sur la
GlcNAc
du reste N-acétyl lactosaminyl est la plus répandue (Wilson et al, 1976"120;
Longmore et Schachter, 1980,60 ). Son substrat est le composé issu de
l'action de la mannosidase II. Cependant, elle peut intervenir en plusieurs
points du schéma de synthèse (Schachter et al, 1982,93). Cependant, la fuco-
syltransférase ne peut agir s'il y a eu action préalable de la GnT III ou de
la galactosyltransférase.
Selon Prieels et al (1981,S5), une seule transférase établirait
les liaisons
al,4
etal,3
du Fuc sur le résidu N-acétyl lactosaminyl
des antennes et la fucosylation en
al,3
de la
GlcNAc des antennes inter-
dirait la sialylation en position terminale (paulson et al, 1978,~4).
II.8. MANNOSYLTRANSFERASES
Elles conduisent à la formation du type simple riche en mannose
des organismes inférieurs.
II.9. CONCLUSION
La génération des oligosaccharides est de type séquentiel. Pour
les trois types/tous les résidus Glc et certains Man sont séquentiellement
clivés de l'oligosaccharide de départ après son transfert sur l'asparagine
du peptide.
Dans le cas des types complexe et hybride, la GnT 1 donne l'ordre
d'élongation de la chaine glycannique, la GnT II et la GnT IV contrôlent le
processus d'élongation alors que la GnT III intervient en limitant le nombre
d'antennes. Les sucres terminaux (Gal, Fuc, N-AN) sont transférés sur la
chaine glycannique en formation pendant ou juste avant la sécrétion des
protéines. Dans le cas de l'al-glycoprotéine acide (al-GPA) humaine sécrétée/

---

15
TABLEAU III
TYPES DE LIAISONS FUCOSYLES DANS LES GLYCOPROTEINES
Fucose-ga1actose
Fucose-N-acétylglucosamine
a
a
Fucal,2 GaIB-
Fucal,4 (GaIBI.3) GlcNAcB-
a
Fuca1,6 Ga1B-
Fuca1,3 (GaIBI,4) GlcNAcB-
b
Fuca1,3 Ga1B-
Fucal,6 (R-G1cNAcBI,4) GlcNAcB-
Fucose-fucose
Fucal,3
Fuc
a) Fucosyltransférases largement purifiées
b) Activité identifiée dans les tissus

---

16
ce schéma de biosynthèse aboutit à la formation de structures complexes
bi, tri et tétraantennées comme l'indique la figure 9
(Yoshima et al, 1981,
/125
Fournet et al, 1978,33 i.
Si la GnT III agit avant la mannosidase JI on obtient une structure
hybride semblable à celle de l'ovalbumine (fig.lO.) (J. Montreuil, 1980,1-1 ).
L'information gouvernant la synthèse des types oligomannosidique
est complexe et mal définie puisque certaines protéines possèdent les deux
types de structure (Sefton, 1977,99 ; Kehryet al, 1979,4-g; Putnam et al,
1973,g6).
Cependant, on peut bien penser que cette information pourrait être
vraisemblablement présente dans le microenvironnement déterminé par la
protéine (structures secondaire, tertiaire et quaternaire).
Les glycosyltransférases sont intégrées dans les structures mem-
branaires de la cellule. Elles sont généralement localisées dans le Golgi
(Feischer,1981,32 ; Bretz et al, 1980,2.0). Cependant, Sturgess et al, 1973,10T
signalent une localisation des fucosyltransférases au niveau de la membrane
plasmique.Nous rediscuterons plus précisément de ces localisations dans la
discussion.
Au cours de divers états inflammatoires ou de certains processus
terminaux, ces enzymes: galactosyl, sial yI et fucosyltransférases, peuvent
être libérés dans le milieu extra-cellulaire (Kaplan et al, 198), ~6 ).

---

Gal Bl,4 GleNAc ~Han
Cll 6
17
~ Han Bl,4 GleNAc Bl,4 GlctjAe~A5n
A
Gal Bl,4 GleNAc Bl,2 Han ~,3
Gal Bl,4 GleNAc Bl,2 Man
l 6
" M a n Bl,4 GleNAc Bl,4 GleNAc ~ Asn
B
Gal Bl,4 GleNAc Bl,2 Man ~,3
Gal Bl,4 GleNAc ~
Gal Bl,4 CleNAe Bl,2 Man
l 6
~Han Bl,4 GleNAe~CleNAe~sn
BF
Bl,4 Gl NA
Bl,2 M
~
Gal - -
e
e - -
an""""""- l 3
Bl,4
~
Cl ,
C a l _ GleNAc
Bl,4
1 Cll,3
Fue
Cal Bl,4 GleNAc ~6
Cal Bl,4 CleNAe ~ Man Cll,6
BI 4
BI 4
BI
--.......:... Man_ _
'
CleNAe _ ' _ CleNAe -
Asn
C
Gal Bl,4 CleNAe~Man ~,3
Cal Bl,4 GleNAc ~
Cal ~GlcNAe
Bl,6
~Man
Cal Bl,4 GleNAc
Cll,6
~ Man Bl,4 CleNAe Bl,4 GleNAc ~sn
CF
Gal Bl,4 CleNAe Bl,2 Man~,3 - -
Gal ~ CleNAe~,4
1ol , 3
Fue
Cal Bl,4 GleNAe~,6
Cal Bl,4 CleNAe Bl,2 Man
- -
- - -
Cll 6
Fue~1,3
~ Man Bl,4 CleNAe ~4 CleNAe ~ Asn
0
Gal Bl,4 GleNAc 61,2 Man ~,3
Fue~1.3
/
Gal Sl,4 GleNAe/ Bl,l+
Gal 61,4 GleNAc Bl,3 Gal Bl,4 GleNA~1,6
Ma~Cll,6
Gal 61,4 GleNAe/Bl,2
Man Bl,4 CleNAe 81,4 GleNAc Sl-N
E
Gal Bl,4 CleNAe ~
ICll, 3
Bl,1. Man
Cal Bl,4 CleNAe ~,l+-
Cal Bl,4 GleNAc
Bl,6
-
'-.....
Man Cll,6
Gal Bl,4 CleNAe Bl,3 Gal Bl,4 GleNAe/Bl,f'Man Bl,4 GleNAc Bl,4 CleNAe BI-N
G
1
Gal Bl,4 GleNAe:::--.
e l , 3
61,2 Man
Gal~GleNAe~l,4-
Figure 9
Structures des chaînes glycanniques de l'al-glycoprotéine acide humaine.
A, B, BF, C et CF : structures selon Fournet et al (1978,33), D, E et
G : nouvelles chaînes glycanniques tétraantenn~es proposées par Yoshima
et al U981,12S) ; les r e s t e s s i a lv l s sorvt mois.

---

18
III. HETEROGENEITE DE LA CHAINE GLYCANNIQUE DES GLYCOPROTEINES
L'hétérogénéité de la structure glycannique résulterait des
modifications co ou post-traductionnelles qui peuvent se porter au moins
à trois niveaux :
a) sur le nombre de chaines
b) sur le degré de ramification des chaînes
c) sur la nature du reste odisyl en position terminale
111.1. VARIATION DU NOMBRE DE CHAINES
L'analyse des séquences des acides aminés de nombreuses glyco-
protéines et les études de la glycosylation in vitro ont montré que le
tripeptide de séquence Asn-X-Thr;Ser représente le "signal" de glycosy-
lation.
L'ovalbumine possède deux sites potentiels de glycosylation -AsnZ93-
Leu- Thr- et Asn311 -Leu-Ser-, Cette protéine, synthétisée in vivo, n r est
glycosylée qu'au niveau du résidu acide aminé Z93 ; dénaturée ou en petits
fragments" elle peut l'être également in vitro sur le résidu Asn311,
Récemment, Yamashita
et al (1983,123) ont montré que les molé-
cules des ~-glutamyltrarspeptidases(~-GT)purifiées à partir des cellules
d'hépatome de rat, avaient quatre fois plus de chaînes "Asn-oligosaccha-
rides"que celles du foie normal. L'enzyme du foie a quatre chaînes glycan-
niques alors que celle de l'hépatome en aurait 12.
Le même type de modification a été observé au niveau de l'al-GPA
humaine. En effet, l'al~GPA humaine possède 5 sites potentiels de glyco-
sylation tous situés sur la partie N-terminale de la molécule (fig.li)
(Schml d e.t al, 1973,'31 ). Cependant, à partir d'un extrait de f'oI es métastasiques
Chandrasekaran et al(1984,~3 ) ont isolé et purifié 2 formes d'al-GPA

---

19
GlcNAc
l
Man
(Sl,2)
- , (al, 3 / ) t~an
Man
' " M
(al, 6)
an
< ,
~al,6)
Man --~--_ GlcNAc
(al,3)
(Sl,4)
1
R
Figure 10
Structure de la chaine glycannique de l'ovalbumine du
groupe III : la présence de la GlcNAc sur le Man en S
du "core" bloque l'activité de la (al,3) (al,6) mannosidase,
par conséquent l'élongation de la branche portée par le Man
en (al,6). SI 4
SI
(R = GlcNAc
'
GlcNAc-_Asn)
N
5
1
15
38
N
54
N
164
1
,
1
7'5 ,72
N
N
Figure 11
al-glycoprotéine acide humaine (Schmid et al, 1973,g~).
___ N sites de glycosylation
---- 2 ponts disulfure.

---

20
humaine. La forme légère de 37.000 daltons ne comprendrait que 3 à 4
chaînes glycanniques par molécule alors que la forme lourde de 45.000
en contiendrait 5 à 6.
Ces variations du nombre de chaînes suggèrent qu'une partie
des séquences Asn-X-ThrjSer du polypeptide serait dissimulée dans les plis
de la chaîne polypeptidique et deviendrait ainsi inaccessible aux enzymes
dans certaines conditions.
111.2. MODIFICATIONS PORTANT SUR LE DEGRE DE RAMIFICATION
La Concanavaline A (Con A) est une lectine qui reconnaît spéci-
fiquement dans une glycoprotéine les restes mannopyranosyls.
L'interaction entre la Con A et la glycoprotéine dépend toutefois
de l'accessibilité des restes mannosyls. Lorsque la c~aine glycannique est
If i
(s t
t
bi
t
' )
l
t
peu raml lee
s ruc ure
lan ennee,
es res es
4AfRl,/~
Lb l
é
m~Ao~~ s~~~~ccessl
es
et lient la Con A. A l'inverse, les restes mann0~~~es forme~~tétra-
,
,
,
~"':1 t,.:·......"q JlA
·r·)
antennees sont masques a la Con A et aucune int~raction~n~se p~0duit. Il
\\\\ -: \\
<.
GA
existe entre ces deux extrêmes des formes interm~~9~al"r.e.s qur sQr~ partiel-
lement reconnues par la Con A.
~~~e
~~~
tnenls'.lÇl9
Par chromatographie sur Con A Sepharose, il a=~f~ possible de
separer ces différentes formes et de mettre en évidence, par une étude
structurale complète des chaînes glycannes, l'aspect multiantenné des
formes non retenues par la Con A et le caractère biantenné des formes
retenues (Krusius et al 1976,54 ; Bayard et al, 1983,9
)"
La proportion entre ces différentes chaînes
et leur nature peuvent être
modifiées au cours de certaines pathologies.
Dans l' al-GPA de métastases hépatiques, les formes bi, tri et
tétraantennées représentent respectivement 20, 50 et 30 % (Chandrasekaran
et al, 1984,23 ). Dans la gamma GT isolée d'hépatome de rat, il apparaît
à c3té des chaînes de type N-acétyllactosaminyl, des chaînes oligomannosyles
alors que la gamma GT isolée de foies sains n'est constituée que de chaînes
dl! type N-acétyllactosaminyl (Yamashita et al, 1983,~23).

---

21
A côté de ces études de structure qui nécessitent au préalable
la purification de la glycoprotéine, une méthode d'immunoaffinoélectro-
phorèse en Con A a été développée par B0g-Hansen et al (1975,~6 ).
Elle permet d'établir pour une glycoprotéine donnée la proportion des
différentes formes antennées. Ainsi, au cours de la grossesse ou lors d'un
\\
traitement par les oestrogènes, on observe une augmentation de la concen-
tration plasmatique de llal-GPA portant principale~~nt sur les formes tri
et tétraantennées (Wells et al 1981,~1g ; Raynes 1982, SS ). A l'inverse,
au cours de la phase aiguë de l'inflammation, l'augmentation de la concen-
tration plasmatique en a1-GPA porte essentiellement sur la forme biantennée
(Nicollet et al, 1981,~5 ). D'autres glycoprotéines plasmatiques ont été
étudiées par ce protocole analytique. Chez les sujets cirrhotiques, Spik
et al (1983,104) ont montré que la structure glycannique de la transferrine
était modifiée avec, en particulier, apparition d'une forme non retenue par
la Con A.
111.3. MODIFICATIONS DU RESTE OSIDYL EN POSITION TERMINALE
Ce troisième type de modification constitue la microhétérogénéité
périphérique caractérisée par la présence ou non d'un résidu fucosyl sur le
résidu GlcNAc le plus externe de la copule glycannique, et d'un résidu sialyl
en position terminale.
En chromatographiant l'al-GPA sur une DEAE cellulose, Schmid et
al (1962,gé ) ont obtenu 9 fractions de"composition en acides aminés très
voisines. Le polymorphisme est donc dû à des variations au niveau des unités
polysaccharidiques. Schmid et ses collaborateurs constatent en effet que le
pourcentage d'oses neutres diminue de la première à la dernière fraction,
tandis que le pourcentage de restes sialyls augmente.
Divers auteurs remarquent plus tard que, lorsque la
force ionique augmente, les fractions contiennent de moins en moins de
résidus fucosyls et de plus en plus de résidus sialyls. Ceci est en accord
avec les travaux de Paulson et al (1978, 8~ ) qui démontrèrent que la

---

22
sialylation et la fucosylation de l'al-GPA sont mutuellement exclues. Des
études récentes ont toutefois montré la coexistence de ces 2 restes osidyls
sur une même antenne de l'al-GPA isolée de métastases hépatiques
(Chandrasekaran et al 1984,23).
Dans diverses atteintes pathologiques et en particulier en
pathologie hépatique, une hyposialylation des glycoprotéines plasmatiques
a été mise en évidence. Har sbal I et al (1978,66
), Arima (1979,2,
ont montré qu'au cours des atteintes hépatiques, il y avait accumulation
de matériel hyposialylé sans en préciser la nature.
Stibler et al (1979,A05 ) mettent ~n évidence un variant hyposialylé de
la transferrine lors d'une imprégnation éthylique aiguë. Plus récemment,
dans notre laboratoire, et par un protocole original, il a été montré que
plusieurs glycoprotéines pouvaient être hyposialylées au cours des cirrhoses.
Les résultats les plus significatifs sont obtenus avec l'al-GPA. Plus
l'insuffisance hépatocellulaire est grave, plus la probabilité d'une hypo-
sialylation de l'al-GPA est grande (Bordas et al, 1981,1~ ~ Serbource-Goguel
et al, 1983,-100).
Beaucoup de ces données ont été acquises chez l'homme. Pour
rechercher l'origine de ces altérations, il est préférable d'avoir un modèle
animal. Deux modèles ont été choisis: des rats traités à la galactosamine
et au phénobarbital. Comme nous le verrons ci-dessous, ces 2 molécules
entraînent des modifications morphologiques des organelles cellulaires et
en particulier du réticulum endoplasmique. On pouvait donc espérer des
modifications dans la synthèse des chaînes glycanniques des glycoprotéines
de sécrétion.

---

23
IV. HEPATITE EXPERIMENTALE A LA GALACTOSAMINE CHEZ LE RAT
IV.l. METABOLISME DE LA GALACTOSAMINE (GaIN) (figure 12)(Decker et Keppler,
1972,21- )
Aprês injection, la GaIN suit la voie du m~tabolisme du Gal. La
formation de la GalN-lP est catalys~e par la galactokinase. Il y a ensuite
formation d'UDP GaIN grâce à l'UDP uridyl transférase suivie de la conversion
en UDP GleN par l'UDP Gal-4' -ep lmer a se , Ce mécaru sme entraine une accumulation
d'UDP GalNAc et d'UDP GleNAc suivie d'un d~ficit important et prolongé en
UDP Glc, UDP Gal, UTP, UDP et UMP (Reynolds et Reutter, 1973, ~9 ) et vraissembl
blement en nucléotides
sucres, synth~tisés à partir de ces derniers composés.
IV.2. CONSEQUENCES IMMEDIATES
L'injection isolée de la GaIN est suivie dês les premiers jours
d'une augmentation du taux s~rique des transaminases (SGOT ou ASAT et SGPT ou
ALAT) et de la bilirubine. En microscopie électronique, le réticulum endo-
plasmique rugueux (R.E.R.) apparait r~duit, dilat~ et pauvre en ribosomes
alors que le r~ticulum endoplasmique lisse (R.E.L.) pr~sente une hypertrophie
gén~ralisée (Decker et Keppler, 197212r). La production puis l'accumulation
des UDP hexosamines dans le foie provoquent :
a) un déficit en uridylates avec pour consequence une diminution
de la synthêse d'ARN
b) une synthêse accrue d'un polysaccharide basique: l'amino-
glycogêne qui s'aggrège aux ribosomes et au r~ticulum endo-
plasmique (Meszarœ et al, 1976, 61 ; Mandl et al, 1982, 65 ).
Toutefois, ces altérations cliniques et biologiques peuvent se
manifester à des degr~s variables suivant le protocole d'intoxication
- si le protocole consiste en une seule injection, certains symp-
t6mes peuvent n'appara!tre que transitoirement. Par contre des injections rép~~
tées de GaIN provoquent une hépatite progressive puis chronique conduisant
a une cirrhose au bout de 6 mois.
- dans des conditions de renouvellement rapide des constituants
cellulaires, on note une certaine résistance à la GaIN; la toxicit~ est
plus faible. Ce phénomène est observé au cours de la croissance rapide

---

24
des hépatocytes chez les animaux nouveau-nes et après une hépatectomie
partielle.
- l'administration d'uridine ou d'orotate couplée à des injections
répétées de GaiN entraîne une adaptation du foie à l'intoxication. Dans ces
conditions, la biosynthèse d'uridylates est plus active. Il en résulte une
diminution moins prononcee et/ou prolongée en UTP et UDP Glc (Decker et al,
1971,2~ ).
GalN
Orotate
1
galactokinase
l
l
GalN-l-P
OP Glc <-UTP ~ ~ IMP
UDP Glc
uridyltransférase
Il~'>G1C_l_P
UDP GaUl
UDP Gal
II
'" -épimérase
<'
UDP GlcN _ _--+) UDP GlcNAc
UDP GaUIAc
7"
Figure 12
Métabolisme de la galactosamine dans le foie (Decker & Keppler,1972,
GalN-l-P : ~-D-galactosamine-l-phosphate ; UDP GlcN : uridine
diphosphate glucosamine ; UDP Glc~lAc : uridine di-phosphate N-
acétyl glucosamine ; UMP : uridylate ; UTP : uridine tri-phos-
phate ; UDP Glc : uridine di-phosphate glucose.

---

25
IV.3. ACTION SUR LA SYNTHESE PROTEIQUE
Deux mécanismes simultanés et indépendants entraînent une inhibi-
tion de la synthèse protéique.
a) diminution du taux de synthèse d'ARN due au déficit en UTP
b) inhibition d'incorporation d'acides aminés dans les peptides
naissant du fait de l'aggrégation du R.E.R. et des ribosomes
par l'aminoglycogène (Mandl et al, 1979,64 ). Ainsi lestmvaux
de Sawamura et al (1981,9Z) ont révélé qu'après injection d'une
seule dose (900 mg/kg de poids) la GaIN provoque une insuffisance
hépatocellulaire grave entra!nant une diminution marquée de la
concentration sérique en protéines. La teneur des microsomes en
protéines dont le récepteur des asialoglycoprotéines est égale-
ment diminuée.
IV.4 .. CONSEQUENCES PREVISIBLES DE L'INDUCTION A LA GALACTOSAMINE (GalNAc)
L'orientation préférentielle de certains substrats (mono-nucléo-
tides) vers le métabolisme de la GaIN et l'accumulation de divers produits
de ce métabolisme peuvent avoir d'autres conséquences que celles déjà décrites
et toucher la biosynthèse des protéines. Plusieurs remarques peuvent être
faites:
- l'aggrégation de l'aminoglycogène avec le réticulum endoplasmique
peut limiter les étapes métaboliques de cet organite. L'action des glycosyl-
transférases membranaires peut être partiellement ralentie. La synthèse et
le turn over de ces enzymes peuvent être aussi altérés. L'altération au
niveau des glycoprotéines sériques serait double:
a) diminution de la synthèse de la copule peptidique
b) défaut de glycosylation
- par suite du déficit en UDP Glc et UDP Gal, il n'est pas exclu
qu'il y ait un déficit intracellulaire en certains nucléotides-sucres,
substrats des glycosyltransférases. Ceci peut conduire à la formation de
chaînes glycanniques incomplètes.
par contre, la disponibilité accrue en UDP GlcNAc à la suite du
métabolisme de la GaIN pourrait favoriser son incorporation et augmenter
la proportion des chaînes de structure du type complexe tri ou tétraantennée.

---

26
V. L' INDUCTION PAR LE PHENOBARBITAL ET SES CONSEQUENCES
Le phênobarbital (PB) est un hypnotique capable d'induire la
synthèse d'une grande variêtê d'enzymes hêpatiques dont le système des
mono-oxygênases, la glutathiontransfêrase et l'UDP-glucuronyltransfêrase
(Griffin et al, 1984,68 ; Tavoloni et al, 1983,11i). Cénér-a l.emerit ,
l'induction par le PB s'accompagne de l'augmentation du mêtabolisme d'une
variêtê de substances soit endogènes tels que les acides gras, les stêroïdes ..
soit exogènes comme les mêdicaments, les pesticides et les hydrocarbures
(Conney, 1967,2,5).
Le PB reste a l'heure actuelle un produit largement êtudiê pour
son remarquable pouvoir d'induction des enzymes du système mono-oxygênasique.
Très peu d'êtudes portent sur la biosynthèse des protêines et glycoprotêines
clrculantes.
Cependant, après un traitement au PB, on note des modifications
ultrastructurales dans le rêticulum endoplasmique comparables à celles
observêes lors de la phase aiguë de rêaction à une blessure : augmentation
du R.E.R. avec une polymêrisation accrue des ribosomes (Orrenius et al,
1965,1~ ; Turchen et al, 1977,~~; ). Ces modifications sont suivies d'une
induction de diverses enzymes qui se trouvent la plupart liêes ou associêes
au R.E.
Prenons comme exemple d'enzyme, l'UDP glucuronyltransférase qui
assure le transfert d'un reste osidyl (glucuronyl) sur un récepteur adequat
(bilirubine, paranitrophênol ... ) selon la rêaction
UDP glucuronate + Accepteur-OH ----~~glucurono conjuguê + UDP
Cette enzyme a une faible activitê chez le nouveau-ne prêmaturê
il en rêsulte parfois un dêfaut de conjugaison de la bilirubine avec appa-
rition d'un ictère. Le PB a un tel pouvoir d'induction de synthèse de cette
enzyme qu'il est utilisê en thêrapeutique pour lutter contre l'accumulation
de la bilirubine libre en favorisant sa conjugaison et par là même arrêter
l'ictère.
D'autre part, lors de la blessure, l'hypertrophie du R.E. est
suivie d'une synthèse accrue de glycosyltransfêrases (Turchen et al, 1977,~13)
et de glycoprotêines comme l'ŒI-GPA.

---

27
Qulen est-il au cours de llinduction par le PB de la synthèse
protéique et en particulier des glycoprotéines dont la glycosylation est
assurée par les glycosyltransférases au cours de leur cheminement à travers
le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi?
Nous nous proposons, dans ce travail, d'étudier par des techniques
analytiques les microhétérogénéités éventuelles de la chaine glycannique des
glycoprotéines.
- Nous avons retenu une glycoprotéine: l'al-glycoprotéine acide
dont nous avons préparé l'immunsérum monospécifique
- Nous avons retenu 2 protocoles d'analyse:
a) étude de la sialylation par un protocole immunochimique
basée sur la détermination sérique de liaI-glycoprotéine acide par immuno-
diffusion radiale et électroimmunodiffusion monodimensionnelle. Ceci cons-
titue l'hétérogénéité mineure ou en position terminale.
b) étude de l'hétérogénéité majeure ou degré de. ramification
des chaînes glycanniques en immunoaffinoélectrophorèse croisée utilisant
la Concanavaline A dans la première dimension.
- Dans la dernière partie; nous présenterons les premIers 'éléments
de structùre des glycannes de l'al-GPA isolés de rats normaux et traités par
le PB.

---

28
MATERIEL ET TECHNIQUES
UTILISES

---

29
A.- TECHNIQUES D' INDUCTION
1) ANIHAUX
Nous avons utilisé des rats mâles de race SPRAGUE DAWLEY pesant
entre 250 et 300 g. Les animaux sont nourris pendant toute la durée du trai-
tement et boivent de l'eau potable.
2) INDUCTEURS
. Phénobarbital sodique Sigma
Chlorhydrate de galactosamine Herk
. Essence de térébenthine Onyx
3) HEPATITE EXPERIHENTALE A LA GALACTOSAHINE
(Sawamura et al 1981, 9~ )
Les animaux ont reçu,
par voie intrapéritonéale, une
injection unique d'une solution de galactosamine (GaIN) à raison de 900 mg/kg
de poids corporel. A cette dose,la GaIN est susceptible de provoquer une
souffrance hépatocellulaire grave et réversible (Decker et Keppler 1972,21 ).
4) INDUCTION AU PHENOBARBITAL-Na
Le traitement est pratiqué selon un procédé voisin de ceux de
Williams et al (1979,119 ) et de Ohlsson et Jergil (1977,76 ). Des rats
mâles ont reçu, par voie intrapéritonéale,6 injections d'une solution de
phénobarbital (PB) (40 mg/ml dlune solution de NaCl 0,15 M) a la dose de
40 mg/kg de poids corporel. Les injections sont faites toutes les 12 heures
aux mêmes heures.
5) INFLAHMATION A L'ESSENCE DE TEREBENTHINE
l ml d'essence de térébenthine (E.T.) est injecté par voie sous-

---

30
cutanée dans l'aire scapulaire.
6) TRAITEMENT AU PB PUIS A L'E.T.
L'induction est effectuée en deux étapes. Les rats ont ete d'abord
traités au PB (cf. protocole induction au PB) pendant 3 jours, puis au 4ème
jour ils ont reçu chacun une injection unique d'E.T.
7) RECUEIL DU SERUM
Un premier prélèvement est effectué sur tous les rats avant
les traitements. Nous avons ensuite pratiqué un prélèvement quotidien
(toujours à la même heure) de 0,5 ml par ponction intracardiaque:
- à partir de la 12ème heure après la dernière injection de PB
- 24 heures après l'injection de la GalN ou de l'E.T.
Il faut noter que lorsque les traitements au PB et à l'E.T.
sont associés, les prélèvements débutent à partir du 3ème jour de trai-
tement au PB suivant le schéma ci-dessous.
*
*
*
*
J °
J l
J 2
J 3
J 4
J 5
,
1
1
1
1
1
-----------
~
t1,1
1
t t t t t
~
J i , J 2, J 3 .....•. Jours (24 heures)
* Prélèvements effectués apres une légère anesthésie a l'éther
t 6 injections de PB par intervalle de 12 heures
~ Injection unique d'E.T. au 4ème jour

---

31
8) ANIMAUX TEMOINS
Parallèlement, nous avons prepare deux séries de rats témoins
- Première série
Les animaux ont reçu une solution de NaCl 0,15 M sous un volume
identique à celui dans lequel ont été dissou s
la GalN ou le PB.
Des prélèvements intracardiaques sous anesthésie à l'éther sont
réalisés selon le protocole ci-dessus.
Deuxième série
Les animaux n'ont reçu ni produit, ni solution de NaCl 0,15 M.
Ils ont simplement été prélevés aux temps indiqués après anes-
thésie. Cette série a été faite dans le but de voir le seul effet
de l'anesthésie et de la ponction intra-cardiaque.
B,- TECHNIQUES DE roSAGES IrIU\\'1UNOCHIMIQUES
1) REACTIFS
- Plaque plastique: Gel Bond TM film 10,2 cm X 16 m X 0,1 mm,
Marine ColloIds (Flobio France), découpé aux dimensions choisies
avant emploi.
Tampon Véronal pH 8,6 Force ionique 0,05
VéronaL
1,6 g
Véronal sodé
8,24 g
Azide de sodium
200 mg
Eau distillée q.s.p
2000 ml
- Gel d'agarose : solution d'indubiose A
(Industrie Biologique
37
Française: IBF) à l p.cent dans le tampon Véronal pH 8,6, obtenue
par dissolution à chaud dans un bain marie bouillant. Le gel est
ensuite réparti dans des tubes en verre et conserve a +4°C.

---

32
- Immunsérums (1.5.)
J.S. de lapin anti-protéines totales de rat inflammé fourni par
D. Biou
1.5. de lapin monospécifique anti-al-glycoprotéine acide de rat
1.5. de lapin monospécifique anti-albumine de rat.
La préparation des immunsérums est décrite au paragraphe D.
- Colorant: bleu brillant de Coomassie G250 Serva (Tébu S.A. France)
à 0,5 p.cent
Bleu brillant de Coomassie
.
5 g
Acide acétique pur
. 100 ml
Ethanol à 96°
. 450 ml
Eau distillée
. 450 ml
- Décolorant
Ethanol à 96°
450 ml
Acide acétique pur
100 ml
Eau distillée
450 ml
2) IMMUNODIFFUSI0N RADIALE
(Mancini et al 1965,63
).
2.1.- Principe
Dérivant des travaux de Ouchterlony (1958,19
) et de Oudin
(1952,80 ), l'immunodiffusion radiale (IDR) est une méthode quantitative
très utilisée à l'heure actuelle. Elle est basée sur la formation d'un
complexe antigène-anticorps (Ag-Ac). Celui-ci se forme entre un Ag diffusant
radialement à partir d'un puits de dépôt et un Ac inclus dans un gel d'agarose
à un certain pourcentage.

---

33
2.2. - Expression mathématigue (Mancini et al 1965,63)
L'analyse des différents paramètres après diffusion complète
permet d'établir la relation reliant la surface de l'anneau de précipi-
tation a la quantité d'Ag déposée.
2
2
4 VAg
o
CAg + d
=
PTIhT
ou VAg
Volume d'Ag déposé (}Jl)
CAg
Concentration d'Ag (g/lOO ml)
P
Pourcentage d'J.S. dans le gel
h
hauteur du gel (mm)
0
Diamètre du cercle de précipitation (mm)
d
diamètre du puits de dépôt
La droite d'étalonnage 02 = f (CAg) permet de déterminer la
concentration en Ag d'une solution inconnue.
2.3. Technique
Sur une plaque plastique 10 X 10 cm préalablement dégraissée a
l'éthanol nous coulons 15 ml de gel liquéfié
contenant 3 à 4~5 p.cent
J'LS.
Après refroidissement du gel des puits sont creuses et nous
y
déposons 5 pl de sérum à doser. Le maintien des plaques 48 heures à
température ambiante et en chambre humide, permet d'atteindre l'équilibre
de diffusion.
2.4. Révélation et lecture de la plaque
Après diffusion, la plaque est séchée par deux compressions
successives de 5 minutes sous du papier filtre puis lavée 2 fois 15 minutes
par une solution de NaCl 0,15 M et enfin séchée quelques heures à l'étuve à
37°C.

---

34
La plaque est ensuite colorée par la solution de bleu de coomassie pendant
15 mn puis décolorée par passages successifs dans des bains de décolorant.
- La lecture est effectuée en mesurant les diamètres des cercles
de précipitation au 1/10° de millimètre. Nous portons alors sur une courbe
d'étalonnage le carré des diamètres en fonction de la concentration d'une
gamme standard.
3) ELECTROIMMUNOOIFFUSION MONOOIMENSIONNELLE DE LAURELL (1966,56
)(EIOm)
3.1.Principe
C'est une technique de dosage des protéines plus rapide et plus
sensible que l'IOR. Deux phénomènes interviennent:
Migration électrophorétique des protéines a pH 8,6 dans un gel
d'agarose.
Formation d'un complexe insoluble entre une protéine antigénique
et l'Ac spécifique correspondant incorporé dans le gel.
Au cours de sa migration, l'Ag diffuse latéralement et est neu-
tralisé par l'Ac. Il en résulte la formation d'un cône dont le sommet se
redissout par apport d'Ag. A l'équilibre de migration et de diffusion la
surface du pic de précipitation est proportionnelle à la quantité d'Ag déposée.
3.2. Technique
Sur une plaque de gel d'agarose 10 X 10 X 0,15 cm contenant
2 à 3 p. cent d'I.S, des puits de 2 mm de dinmètre sont pratiqués tous les
3 mm. La plaque est ensuite transférée sur un support de migration réfrigéré.
Le contact avec le tampon véronal pH 8,6 des compartiments anodique et
cathodique est assuré par 5 épaisseurs de papier Whatman N°l (10 X 10 cm).
L'Ag est ensuite déposé sous une prise d'essai de 5 fl sous faible voltage
(2,5 V/cm) pour éviter sa diffusion latérale. La migration est effectuée
sous 10 V/cm pendant 4 heures.

---

35
3.3. Révélation (cf. § 2.4) et lecture de la plaque
En fin de migration, il en résulte un pic de précipitation,
stable, dont la surface, c'est-à-dire la hauteur du pic, est proportion-
nelle a la quantité d'Ag déposée. Nous mesurons donc la distancE: (en mm) com-
prise entre le centre du puits et le sommet du pic. Une gamme étalon dé-
posee sous le même volume et ayant migré sur la même plaque permet d'obtenir
la concentration antigénique de la prise d'essai après lecture de la hauteur
du pic correspondant. La relation h = f (CAg) est de type linéaire où :
h = hauteur du pic (mm)
CAg = concentration de l'antigène (mg/l)
4) PRINCIPE DE LA SOUS-EVALUATION (S.E.) (Biou et al 1984, 'I~
Les courbes reliant la désialylation de diverses glycoprotéines
humaines: al-CPA, al-antitrypsine (Bordas et al, 1982,19 ) hémopexine et
Cl-inactivateur (Serbouce-Coguel et al 1984,~c1 ) à la sous-évaluation
obtenue en EIDm par rapport à l'IDR avaient préalablement été établies. Le
protocole a donc été transposé à l' al-CPA de rat en tenant compte des
caractéristiques phy~ico-chimiques.
A 2,5 mg d' al-CPA native dans 5 ml de tampon acétate, 235 ~mol
pH 5,50, NaCl 705 ~mol, CaC1
42 ~mol, est ajoutée la neuraminidase (E.C
2
3.2.1.18) de Vibrio cholerae (200 mU/mg de protéine). Au cours de l'incu-
bation menée à 37°C et à des intervalles de temps allant de ° à 120 min
diverses aliquotes sont prélevées puis neutralisées par une solution de glycine-
soude
0,05 mmol/l, pH 9, EDTA 18 mmol/l. La teneur en acide sialique
libéré est alors dosée par la méthode de Warren (1959,~115) et l' al-CPA
par IDR et EIDm après dilution adéquate. Il apparait qu'en fonction du
temps d'incubation le traitement de l' al-CPA native par la neuraminidase
conduit à une libération progressive d'acide sialique allant jusqu'à 60 %
du taux initial.
Nous notons également que les concentrations en al-CPA des di-
verses aliquotes, déterminées par IDR restent constantes alors qu'elles
diminuent progressivement au cours de leur évaluation en EIDm. La sous-

---

36
évaluation par l'EIDm relative à l'IDR est fonction du pourcentage d'acide
sialique libéré dans le milieu réactionnel. La courbe reliant le pourcen-
tage de désialylation au pourcentage de sous-évaluation est représentée sur
la figure 13 .
Compte tenu des coefficients de variation des deux méthodes
(IDR et EIDm) une sous-évaluation ~ 5 % ou une désialylation ~ 12 %
doit être considérée comme non significative (Biou et al 1984,~~ ). Ainsi
lors de la mise en évidence d'une sous-évaluation en EIDm par rapport à
l'IDR de la concentration en al-GPA d'un sérum, nous parlerons d'hypo-
sialylation de façon à ne pas préjuger du mécanisme présidant à ce défaut
de sialylation : défaut de synthèse ou désialylation dans le milieu circu-
lant. D'autre part, la découverte d'une concentration plus élevée en EIDm
par rapport à l'IDR pourrait aller dans le sens d'une hypersialylation.
Toutefois, aucune relation entre ces deux paramètres n'a pu être établie.
L'équation de la droite y = 1,42 + 0,86 x est obtenue par regres-
sion orthogonale; x représente le degré d'hyposialylation et y le degré
de sous-évaluation (Biou et al 1984, ;\\4- ). L'équation établie pour l' a l -GPA
humaine est y = 25,6 + 0,42 x (Bordas, 1981,-i1 ). Il apparait que pour
,
2.E:." S
.
' .
l
'
l
un meme degre de deslalylatlon de ces deux glycoprotelnes
a sous-eva uation
obtenue avec l' a l -GPA de rat est plus faible que celle mesurée pour l' a 1-
GPA humaine. Cette différence peut être dûe a des variations dans la compo-
sition tant en acides aminés qu'en sucres.
La teneur de l' a I-GPA en restes sialyls est plus faible chez le
rat (9 p.cent) que chez l'homme (12 p.cent). Ils interviennent donc moins
dans la charge électrique globale de l' a I-GPA de rat.
La composition en acides aminés chargés à pH 8,6 et surtout
l'existence d'acides aminés très chargés à la partie C terminale de la chaine
peptidique de l' al-GPA de rat, non retrouvée dans celle de l'homme, atténuant
l'effet de l' hyposialy lation (Ricca et Taylor, 1981, '30) .
5) IMMUNOELECTRODIFFUSION EN QUINCONCE
5.1. Principe
L'immunoélectrophorèse en quinconce est une méthode très sensible,

---

3i
50
40
~
30
:::;
....
<
~
-'
<:
>
UJ
20
1
<fl
~
0
<fl
10
10
20
30
40
50
60
70
OESIALYLATION (1)
Figure 13
Courbe d'étalonnage de la détermination de la
désialylation de l' Ci. l -GPA de rat obtenue par
régression linéaire.
y = 1,42 + 0,86 x
ou y = sous-évaluation
x = désialylation

---

38
semi-quantitative, surtout utilisée pour suivre une ou plusieurs pro-
téines au cours d'une purification.
La première étape consiste en une diffusion des différentes
protéines
dans un gel sans T.S., la deuxième étant une migration élec-
trophorétique dans un gel contenant un immun sérum anti-protéines totales
ou monospécifique. Si l'immunsérum est polyvalent, plusieurs protéines
peuvent être identifiées et une impureté détectée. La révélation par un
immun sérum spécifique permet de déceler
la protéine dans les différentes
aliquotes d'un éluat et de procéder à leur regroupement.
5.2. Technique (figure 14)
Dans un gel d'agarose sans T.S. (fig.14a) nous pratiquons des
puits disposés en quinconce dans lesquels nous déposons les échantillons
à analyser. Ceux-ci sont mis à diffuser pendant 90 minutes dans une chambre
humide à température ambiante. Puis, nous prenons une bande 3 X 10 cm du
gel précédent, correspondant à la zone de diffusion protéique. Nous la
transférons a l'extrémité cathodique d'une nouvelle plaque d'une solution
d'agarose à l p.cent contenant un T.S. (Fig.14b) de lapin anti-protéines
totales ou anti-al-GPA de rat. iJne tension de 2,5 V/cm est appliquée pen-
dant 18 heures.
5.3. Révélation (cf. § 6.2.4)
o
0
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
8
®
Figure 14: Tmmunoélectrophorèse en quinconce. a) gel de diffusion,
b) gel contenant un J.S. an ti-protéines totales ou monospécifique.

---

(.- TECHNIQUE D'Irvvv1UI'lO-AFFINOELECTROPHORESE CROISEE ((lAD EN
CONCANAVALINE A
1. REACTIFS
- Plaque plastique (cf.§ B.l)
- Tampon tris-véronal pH 8,6 (Wells et al 1981,11S )
Tris
72 mM
8,7 9 ( Pt·1 = 121)
Véronal
24 mM
4,4 9 (PM = 184)
. Lactate de calcium
0,4mM
0,12 9 (PM = 308)
Azide de sodium
0,2mM
0,01 9 (PM = 65)
Eau distillée q.s.p.
1000 ml
- Gel d'agarose à l p.cent dans le tampon tris-véronal. Agarose
type II (Sigma, France) (pour préparation - voir § B.l)
- Le
méthyl a-D-glucopyrannoside (Sigma, France)
_ polyéthylène glycol (PEG) poids moléculaire 6000 (Prolabo, France)
_ Lectine: Concanavaline A (Con A) Lot nO 649 (IBF, France).
La Con A (50 g/l) extemporanément dissoute dans une solution de
CaC1
MgC1
et HnC1
à l mM respectivement est utilisée à la
2,
2
2
concentration finale de 150 ~g/cm2 dans le gel de la première
1
électrophorèse.
_ Colorant et décolorant (cf. § B.l)
2. PRINCIPE DE LA CIAE-Con A
L'immunoélectrophorèse bidimensionnelle (EIDb) décrite par
Laurell (1965,55
) puis Weeke
(1973, k\\6) est une technique
faisant intervenir 2 migrations successives dans un champ électrique.
- Li première est une électrophorèse de zone dans un gel
dépourvu d'I.S.
la deuxième, perpendiculaire à la première est une immuno-
électrodiffusion dans un gel contenant 1'1.5. spécifique de
la protéine à étudier.

---

40
En 1975 B~g-Hansen et al (-\\6 ) ont introduit la CIAE qui
apporte quelques modifications de llEIDb.
1-
a) La CIAE fait intervenir la Con A dans la première électro-
phorèse. En effet, la Con A est une lectine qui, par interaction bio-
spécifique, se lie aux résidus mannopyrannosyls des glycannes. Son affinité
pour ces sucres d'une part, la teneur et/ou l'accessibilité de ceux-ci
d'autre part conduisent à la séparation de différentes formes glycoprotéiques.
b) La présence d'a-méthyl D gluco
ou mannopyranroside favorise
la dissociation des complexes glycoprotéine-Con A et permet une meilleure
identi fication des formes les plus retenues par la Con A. LI immunsérum mono-
spécifique permet une révélation des différentes formes de l'a
GPA.
l-
3) TECHNIQUE
Nous procédons a deux électrophorèses successives.
3.1. Première électrophorèse
La plaque de la première migration (10 X 10 cm) comporte deux
parties (fig. 15).
La partie a (6 X 10 X 0,2 cm) est recouverte de gel d'agarose
à l p.cent contenant de la Con A préalablement dissoute dans
une solution de CaC1
lmM, MgC1
lmM et MnC1
lmM. Nous pratiquons
2
2
2
dans ce gel des puits distants de l cm et à 1,5 cm de la cathode.
15 ~l de sérum dilué à 100 mg/l d'al-GPA sont déposés.
- La deuxième partie b
(4 X 10 X 0,2 cm) est recouverte de gel
de référence (gel d'agarose sans Con A). Un mélange de sérum-
albumine (BSA) (Sigma) et de bleu de bromophénol déposé dans
ce gel permet de suivre la migration.
La migration électrophorétique est réalisée sous une tension de
10 V/cm pendant 90 à 120 mm dans le tampon tris-véronal pH 8,6.

---

41
1
1
1
1
1
1
1
1
1
a
b
1
1
1
1
1
1
1
1
1
"~
G~ "~ "~ "~
1
1
pl
p2
1
1
p3
p4
p5
1
1
G
Figure 15: Plaque de gel d'agarose de la 1ère électrophorèse
a : gel d'agarose avec Con A
b
gel d'agarose sans Con A
pl, p2, p3 et p4 : puits de dépôt des échdntillons
p5 : puits de dépôt de la B5A colorée au bleu
3.2. Deuxième électrophorèse (fig, 16)
Le gel a de la première dimension est découpé en bandes de
1,5 X la cm transférées sur des plaques de la X la cm divisées en 3 parties
_ la bande a la X 1,5 X U,2 cm de la première électropho-
rèse est placée à 2,5 cm du bord cathodique de la plaque.
- le quart de la plaque d du côté de la cathode (la X 2,5 X 0,2 cm)
est recouverte de gel de référence.
- les 3/5 de la plaque c la X 6 XO,12 cm sont recouverts par un
gel d'agarose à ~ p.cent contenant l'J.5. de lapin anti-Œl-CPA
de rat à l ~l/cmL, le méthyl a-O glucopyrannoside à 4 p.cent
compétiteur de la Con A et le PEC à 2 p.cent (P/V).
La migration électrophorétique est de 18 heures sous 2,5 V/cm.

---

42
+
c
Cl)
r.fl
,Cl)
1-<
0
s:
0-
0
1-<
.jJ
Ü
Cl)
.-t
'Cl)
a·
Cl)
0
E
,Cl)
N
d
-----------------~> +
1ère électrophorèse
Figure 16 : Plaque de gel d'agarose de la 2ème électrophorèse.
a
: gel 10 X 10 X 0,2 cm de la 1ère électrophorèse
c
gel 10 X 6 X 0,12 cm contenant l'Ac et le
méthylglucopyrannoside + PEG
d
gel 10 X 2,5 X 0,2 cm de référence sans Con A
4) REVELATION (cf. § B.2.4.) LECTURE DES PLAQUES
La surface de chaque pic est mesuree par planimétrie (plani-
mètre A ott Kemplen Bayern). Elle est ensuite comparée à la surface
totale des pics.
5) CONSEQUENCES PRATIQUES
La CIAE est d'abord qualitative puis quantitative a condition

---

43
de déposer dans les puits une quantité connue de glycoprotéine.
Elle permet d'identifier les sous-populations de l'al-GPA
l '
sérique selon leur affinité pour la Con A et de suivre les modifications
et/ou les altérations des glycannes au cours du traitement.
D,- PREPARATION DES IMMUNSERUMS CI,S,)
1) ANTI GENES
- albumine de rat
- al-glycoprotéine acide de rat
2) IMMUNISATION
(Biou et al 1984,1~
Nous utilisons des lapins de la race "NEO ZELANDAIS" (Jf f a-Cr-edo ) •
Le protocole est le suivant: 250 microgrammes d'albumine ou de
al-glycoprotéine acide de rat désialylée sont dissous
dans 2 ml d'une
émulsion de NaCl 0,15 M et d'adjuvant complet de Freund (v/v) puis injectés
par voie sous-cutanée chez le lapin a raison de 0,25 ml dans chaque patte
arrière et de 10 injections de 0,15 ml dans la peau du dos. Nous effectuons
ensuite un rappel au 30ème jour à 50 p.cent de la première dose injectée.
Au maximum de la réponse, le sang est prélevé par ponction intra-cardiaque
tous les 15 jours. L'immunsérum est conservé en présence d'azide de sodium
à l p.mille et de glycérol à 10 p.cent.
3) CONTROLE DE LA MONOSPECIFICITE DE L'I.S.
Ceci est réalisé par la technique de Laurell bidimensionnelle
(1965,55
) et par immunoélectrophorèse. Le pic et l'arc uniques observés
respectivement sur les figures 17 et 18 confirment la monospécificité de
1'1.5. obtenu.

---

44
4. CALCUL DU TITRE DE L'l.S.
Nous avons appliqué la méthode de Mancini et al (1965,63 ).
Le titre est exprimé en milligramme d'antigène neutralisé par millilitre
d'immunsérum.
T = mg Ag/mIlS
Figure17
Electroimmunodiffusion bidimensionnelle de Laurell de sérum
de rat contre l'immunsérum de lapin anti-al-glycoprotéine
acide de rat.
""0
",. ,
"'0
Figure 18
lmmunoélectrophorèse de sérum de rat normal (1) et de sérum
de rat inflammé (2) contre l'immunsérum préparé (3).

---

45
E.- PURIFICATION DE LA~l-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
1
l
INTRODUCTION
L'al-glycoprotéine acide (al-GPA) présente dans le serum de rat
normal fait partie du groupe des protéines de la "phase aiguë" dont la
concentration sérique augmente dans les processus inflammatoires et neo-
plasiques.
Les différentes techniques de préparation exploitent toutes à l'heure
actuelle son caractère acide. En effet, son point isoélectrique (pl) très
bas 2,95 (Jamieson et al 1972,44 ) permet de la séparer des autres protéines
du sérum après précipitation au sulfate d'ammonium suivie du
passage du
surnageant sur des résines échangeuses d'ions (Kawasaki et al 1966,~~ ;
Yoshima et al 1981,-1,2,5).
Dans ce chapitre, nous présentons la préparation de l'al-GPA par
chromatographie sur deux supports échangeurs d'ions à partir de serum de
rats normaux et traités au phénobarbital et par chromatographie d'immuno-
affinité à partir de la protéine partiellement isolée.
L'al-GPA se distingue des autres protéines par sa forte teneur en
sucres
(25 à 34 %),
un pl bas lié à sa richesse en résidus
sialyls dont la proportion conditionne sa mobilité électrophorétique. La
protéine native à pH 8,6 présente une mobilité al sur acétate de cellulose.
Sa masse moléculaire estimée à environ 40.000 dépend de la technique utilisée.
1) ISOLEMENT DE L'al-GPA PAR ECHANGE D'IONS
1.1. Principe de l'échange d'ions
Un échangeur d'ions est constitué d'une matrice insoluble sur
laquelle sont fixés des groupes chargés à caractère acide ou basique dont
la neutralité électrique est assurée par des contre-ions. Ceux-ci peuvent

---

46
TABLEAU IV : CARACTERES PHYSICO-CHItHQUES
DE L'ŒI-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT
Kawasaki
Jamieson
Charlwood
Shibata
et al
et al
et al
et al
(1966,4-8)
(1972,44)
(1976,2lt)
(1977 ,-102)
Pt~
35.000
43.000
43.000
79.000
S 1%
3,30
3,12
3,16
20
pl
2,95
lcm
~ l %
4,16
280 nm
Composition de la copule glycannique (p.cent)
Hexoses
15,3
14,4
10,5
13,1
(Gal,Han)
Hexosamine
8,3
9,5
7,3
6,7
Acide
10,0
10,2
5,0
7,6"
sialique
Fucose
0,4
0,3

---

47
être réversiblement échangés avec des molécules protéiques ionisées de
meme signe apportées par la phase mobile. En effet, la somme algébrique
des charges portées par une protéine constitue sa charge nette. Celle-ci
varie essentiellement en fonction du pH et de la concentration en ions du
milieu.
Nous avons exploité ces deux facteurs (pH et concentration en
ions) et purifié l'al-GPA par deux chromatographies successives sur échan-
geurs d'ions.
A pH 3,7 l'al-GPA est théoriquement seule à se fixer sur une
diéthylaminoéthyl-trisacryl (échangeur anionique). Au même pH elle est
totalement exclue d'une carboxyméthylcellulose alors que les autres pro-
téines sont retenues. A chaque étape les protéines fixées sur l'un ou
l'autre échangeur sont
élevées
par augmentation de la force ionique
de la phase mobile.
1.2. Matériel et réactifs
n
Diéthylaminoéthyl-trisacryl
DEAEJ LKB
Carboxyméthyl cellulose
CM 52 Whatman
- Pompe minipuls Gilson
- Collecteur de fractions
: les produits en sortie de
colonne sont recueillis dans un collecteur ISCO modèle 120
(Roucaire France).
_ Module optique: la densité optique (DO) de l'effluent est
mesurée à 280 nm par passage dans un détecteur U.V. modèle
UA6 ISCO Roucaire.
_ Enregistreur "Absorbance monitor model UA5" couplé au module
optique
- Gradient mixer LKB
- Colonnes 1,6 X 40 cm Pharmacia France
Tampon
Tl
Tampon acétate 0,01 H pH 3,7
Acétate de ~ja , 3H
.......... 0,1496 g
2O
Acide acétique (d=l ,04) ..•..•. 0,53 ml
Eau distillée q.s.p ..•........ 1000 ml

---

48
T
Tampon acétate 0,1 [,1 pH
2
3,7
Acétate de Na, 3H
...........
2O
l,52 g
Acide acétique ................ 5,33 ml
Eau distillée q.s.p .......... _. 1000 ml
T
Tampon acétate l M pH 3,7
3
Acétate de Na, 3H
16,04 g
20............
Acide acétique
53,29 g
Eau distillée q.s.p
1000 ml
- Echantillons : trois lots de serum de rats mâles Sprague-
Dawley ont été destinés à la préparation de l'ŒI-GPA.
a) "Pool" de serums de 25 rats normaux ou RH
b) "Pool" de serums de 10 rats traités au phénobarbital ou RPB
c) "Pool" de serums sélectionnés de 17 rats traités au phéno-
barbital ou RPBS. Le sérum de chaque rat de ce lot a été
séparément étudié. Ainsi, le "pool" RPBS est constitué de
sérums dont la teneur en ŒI-GPA est supérieure ou égale à
500 mg/1.
Pour chaque échantillon, le sang est recueilli par ponction dans
l'aorte abdominale après anesthésie au Nembutal R. Lorsque les rats sont
traités par le phénobarbital, le prélèvement est effectué 3 jours après la
dernière injection, c'est-à-dire lorsque la concentration en~-GPA est
maximale.
1.3. Mode opératoire
Les échantillons sont successivement dialysés contre de l'eau
distillée, les tampons T
T
puis contre le tampon de chromatographie Tl'
3,
2
Lors des dialyses, le précipité formé est éliminé par centrifugation. Ce
précipité constitué essentiellement d'euglobulines apparaît dès la dialyse
en eau distillée. Ces opérations de dialyse permettent d'éliminer des
substances susceptibles de précipiter au cours des chromatographies et
donc, d'entraver l'élution.

---

49
65 à 70 ml d'échantillon dialysé contenant 20 à 50 mg d'al-GPA
sont introduits sur la colonne de 30 ml de DEAT sous un débit de 30 ml h- l.
La colonne est ensuite lavée par le tampon Tl' Les protéines non fixées
sont recueillies en une seule fraction. L'élution des protéines retenues
telle que l'al-GPA est effectuée par un gradient de NaCl ° à l M de
10 mM/cm de pente dans le tampon Tl (ac~tate 0,01 M pH 3,7) et l'al-GPA
est habituellement éluée à 0,15 M de NaCl.
La fraction éluée, après dialyse contre le tampon Tl' est déposée
sur la colonne de 34 ml de CM 52. L'exclusion et l'élution sont effectuées
comme décrites précédemment.
1.4. Analyses qualitatives et quantitatives des préparations
Les pics correspondant aux exclus et aux éluats sont dialysés,
concentrés par diafiltration contre de l'eau distillée puis lyophilisés.
Des études immunochimiques sont réalisées sur des aliquotes de
chacune des fractions :
1°) Pour mettre en évidence les contaminants éventuels, deux méthodes
sont retenues: l'immunoélectrophorèse selon Grabar etBurtin,
(1964,~f) et l'immunoélectrophorèse en quinconce. L'immunsérum
utilisé est un immunsérum de lapin anti-protéines sériques de rat.
Une électrophorèse en quinconce est réalisée simultanément en pre-
sence d'un immun sérum anti-al-GPA de rat.
2°) Pour déterminer la concentration en al-GPA des préparations. Les
méthodes de Mancini et al (1965, 63)(IDR) et de Laurell (1966,56 )
(EID) sont effectuées. L'immunsérum est un immun sérum de lapin anti-
al-GPA de rat.
3°) Pour déterminer les différentes sous-populations de l'al-GPA.
Une immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A est
réalisée.

---

50
L'analyse des deux préparations RN et RPB montre que
L'al-GPA est retenue sur la DEAET puis éluée par le gradient
NaCl.(Fig~19).
Sur la CM 52 l'al-GPA est exclusivement contenue dans l'exclu.
(Fig.20).
En immunoaffinoélectrophorèse croisée,le profil des produits
purifiés est strictement identique à celui du sérum correspondant.(Fig.2D.
Cependant, après sélection des sérums des rats traités par le phéno-
barbital (RPBS), la préparative menée dans les mêmes conditions indique la
présence de l'al-GPA dans l'exclu et dans l'éluat de la CM 52. Le compor-
tement en Con A-immunoaffinoélectrophorèse montre curieusement des sous-
populations d'al-GPA non retenue RPBS CMl et retenue RPBS CM2 respectivement
dans l'exclu et dans l'éluat. Toutefois, les deux profils associés
sont
superposables à celui du sérum initial (Fig.22) .L'analyse immunochimique
révèle une fraction exclue: RPBS CMl pure tandis que la fraction éluée de
la CM52 : RPBS CM2 présente des contaminantsmajeurs que nous avons éliminés
par chromatographie d'immunoaffinité.
2) ISOLEMENT DE L'al-GPA PAR IMMUtlOAFFINITE A PARTIR DE LA FRACTION
RPBS CM2
2.1. Matériel et réactifs
_ Sépharose 4BCNBr Pharmacia
- Colonne 12 X l cm IBF
- Tampon de chromatographie: Borate 0,125 M pH 8,3, NaCl 0,5 M
Acide orthoborique (PM 61,83)
61,8 9
Tétraborate di-sodique (PM 381)lOH 20 ..•.... 95,4 9
tlaCl
290,6 g
Eau distillée q.s.p
10 litres

---

51
j
a
b
1
'-
f'.
1
~.
t
•
,
10
_~ !
f
10
. 0 G 0 0 0 0 0 0 ' O
s,
0
0
Q 0
C 0
0 0
~J.~ 1
(;0~J~()01:'501~ o 0 0 Cl Ci U C' Ci r', ,-' 1
,
1
5
9
15
19 i,
1
Figure 19
Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions exclues
et éluées lors d'une chromatographie sur DEAE trisacryl.
puits l
échantillon de départ
puits 2-9
: fractions exclues
puits 10-19 : fractions éluées
Les immunoélectrophorèses en quinconce des fractions collectées
contre
a) un immunsérum monospécifique anti ŒI-GPA de rat
b) un immunsérum anti-protéines totales de rat
montrent que l' ŒI-GPA est totalement retenue sur la DEAET. Elle est ensuite
totalement éluée au début du gradient (0,15 mole/l) mais généralement avec
d'autres protéines.

---

52
1
1
l...,
a
b
\\.
-
1
-
1
,7
....
j
'-
'A'
1
5
15
23
,
5
do 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0
o 0 0
OOOOOOOnol')O
O' 0
0
10
Figure 20
Immunoélectrophorèse en quinconce des fractions éluées et
retenues lors d'une chromatographie sur CM 52.
puits l
pool de l'éluat DEAET contenant l' ŒI-GPA
puits 2 à 9
fractions exclues
puits 10
pool des fractions exclues concentré
puits Il à 23
fractions éluées
L'analyse des diverses fractions contre un immunsérum anti-
protéines totales (fig. b) et contre un anti - ŒI-GPA (fig.
a) montre
que la protéine est totalement et isolément exclue de la CM 52 (fig. b,
puits 2 à 9).

---

53
b
a '
4
4
1
/,..,.~ .
"
Figure 21
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A de s rumï a)
é
et de l' al-GPA isolée(b)contre un immunsérum de
lapin anti- al-GPA de rat.
Après purification, l'al-GPA est toujours constituée
des 4 isotypes dans des proportions identiques à celles calculées
lors de l'étude du plasma. 1,2,3 et 4 représentent les différents
isotypes de l'al-CPA.

---

54
4
a
b
c
Figure 22
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A des produits
de la 3ème préparation contre un immunsérum anti-al-GPA de rat.
La fraction exclue de la CM RPBS CMl c) est constituée de 3
pics (l, 2, 3) plus ou moins retenus par la Con A alors que la fraction
éluée par le gradient RPBS CM2 est totalement retenue en l seul pic b) (4).
Les deux images b) et c) regroupées sont similaires à celle du
pool de départ RPBS a) constituée de 4 pics (l, 2, 3 et 4).

---

55
- Tampon d'élution : glycine HCl 0,2 M pH 2,6
Glycine (PM 75,07) ....•.•.•..••• 15,1 g
Eau distillée q.s.p ...•..•.•.... 1 litre
HC 1 q. s • p . • • . . . • . • . . . . . . . . • . . . .• pH 2, 6
- Solution de neutralisation de l'éluat
phosphate di potassique
1 H pH 8-9
K HP0
(PM 228,23) .......•....•• 228,23 g
2
4
Eau distillée q.s.p .•....•...... 1 litre
- Solution de neutralisation du support
phosphate dipotassique
0,2 M pH 8-9
- Anticorps anti-ŒI-GPA monospécifiques : ces anticorps sont
préparés par immunoaffinité à partir d'un immun sérum de lapin
anti ŒI-GPA de rat sur Sépharose-ŒI-GPA. Le protocole de cou-
plage de 24 mg d'ŒI-GPA sur 16 ml de Sépharose CNBr et les
conditions de réalisation de la chromatographie sont identiques
à celles décrites dans le protocole ci-dessous.
- Echantillon: RPBS CM2 lyophilisé. C'est la fraction retenue
sur la CM 52 lorsque les sérums des rats traités par le phéno-
barbital ont été sélectionnés.
2.2. Préparation du support d'affinité Sépharose-anti ŒI-GPA
Le Sépharose CNBr, 3 g, est préalablement gonflé en milieu
chlorhydrique ImM pendant 15 mn. La protéine, 16 mg d'Tg
monospécifique
anti Œl-GPA en solution dans le tampon borate 0,125 M pH 8,3, est mise à
,.
t :
coupler sur le support sous agitation rotative à +4°C pendant 24 heures.
Les groupements réactifs résiduels sont ensuite bloqués par une solution
d'éthanolamine lM pH 8 pendant 2 heures à température ambiante. L'immuno-
adsorbant est enfin alternativement lavé par un tampon acétate 0,1 M pH 4
et le tampon borate.

---

56
2.3. Chromatographie
Mode opératoire
10 ml d'immunoadsorbant sont introduits dans une colonne 12 X l cm
puis tassés et équilibrés dans le tampon borate a 40 ml h- l.
L'échantillon, 6 mg, dissousdans 6 ml du même tampon est intro-
l
duit sur le support à 6 ml h-
a température ambiante du laboratoire.
La colonne est alors abondamment lavée par le tampon de chromatographie
l
à 32 ml h-
à +4°C jusqu'à retour de la ~.o. mesurée à 280 nm à la ligne de
base.
L'élution de l'al-GPA fixée est effectuée par le tampon glycine
HCl 0,2 M pH 2,6. L'immunoadsorbant et l'éluat sont immédiatement et res-
pectivement neutralisés par le phosphate dipotassique 0,2 M et l t~.

---

57
BILAN DE LA PURIFICATION - DISCUSSION
-------------------------------------
Quatre produits ont été obtenus:
l - al-GPA/RN : al-glycoprotéine acide purifiée a partir du pool
de sérums de rats normaux.
2 - al-GPA/RPB : al-glycoprotéine acide isolée du pool de serums
de rats traités par le phénobarbital (80 mg/j/kg de poids corporel)
Ces deux derniers produits sont issus du "pool" de sérums sélec-
tionnés (RPBS) après le traitement des rats par le phénobarbital.
Chaque sérum de ce "pool" contient au moins 500 mg/l d' al-GPA.
- al-GPA/RPBS-CM
est la fraction d' a
GPA non retenue
I
l-
sur la CM-cellulose. Elle contient le 1/4 de l' al-GPA présentE
dans le pool RPBS initial.
- a
représente la fraction d' al-GPA (les 3/4 du pool)
l-GPA/RPBS-CM 2
éluée de la CM-cellulose avec des impuretés qui sont ensuite
éliminées par une chromatographie d'immunoaffinité.
Les techniques d'isolement utilisées nous ont conduit à l'obtention
d'une glycoprotéine pure selon l'immunoélectrophorèse en quinconce (fig.20)
et les techniques citées ci-dessous.
L'immunoélectrophorèse, selon la technique de Grabar et Burtin
(1964,31
de l~{l-GPA à 10 g/l des diverses préparatives contre un immun-
sérum de lapin anti-protéines sériques de rat ne montre qu'un seul arc (Fig.23) .
. L'électrophorèse en gel de polyacrylamide (10 %) en présence
de sodium dodécyl-sulfate montre une bande homogène.
Le poids moléculaire
de l'al-GPA/RN et de llal-GPA/RPB est
respectivement de 43.000 et 45.000
daltons.

---

58 .
i
, ~l/
:
li
,.
. ~
;
1
.!1,
1
i
1
i
i
0
0
0
0
0
. 1
1
1
2
ri 3
4
~
~t
;
.
v~
.
,.~
r
Figure 23
Immunoélectrophorèse selon Grabar de l'al-glycoprotéine acide
(al-GPA 10 g/l) purifiée contre un immun sérum de lapin anti-
protéines sériques surchargé en anti- al-GPA de rat.
l :al-GPA/RN ; 2 : al-GPA/RPB;
3: al-GPA/RPBS-CM I
4 : a
et 5 : al-GPA de rat purifiée dans notre
l-GPA/RPBS-CM 2
laboratoire.

---

59
- A part le pool de serums de rats sélectionnés (RPBS) dont
les produits purifiés RPBS-CM
et RPBS-CM
présentent des profils dif-
l
2
férents en CIAE Con A (figure 22 Cf b ), l'analyse des deux autres pro-
duits (Œl-GPA/RN et Œl-GPA/RPB) ne montre aucune modification des sous-
populations de l'Œl-GPA au cours des diverses étapes d'isolement.
- D'autre part, la concentration de l'Œl-GPA des divers pools
de serums de départ et de l'Œl-GPA en solution après isolement ont été
dosés en IDR et en EIDm. Le degré de sialylation est ensuite discuté dans
le schéma suivant :
· Situation dans le serum (avant purification)
IDR(mg/1)
EIDm(mg/1)
Œl-GPA/RN
201
212
sialylation normale
Œl-GPA/RPB
531
561
· Situation apres purification (Œl-GPA purifiée en solution)
IDR (mg/ 1)
EIDm(mg/1)
Œl-GPA/RN
243
263
sialylation normale
Œl-GPA/RPB
321
327
Deux produits sont issus de l'Œl-GPA/RPBS.
· Situation dans le serum
IDR(mg/1)
EIDm (mg/ 1)
al-GPA/RPBS
814
814
sialylation normale
· Situation apres purification
IDR(mg/1)
EIDm(mg/1)
Œl-GPA/RPBS-CM
547
sialylation normale
l
499
Œ
468
l-GPA/RPBS-CM2
402
~~e~~~~!~!~!~~~
i
Quel que soit le "pool" de serums de départ le taux de sialylation
est normal
ii Dans les deux premleres préparations (al-GPA/RN etŒl-GPA/RPB) à
l'issue de la purification nous n'avons noté aucune différence

---

60
significative entre l'IDR et l'EIDm dans les limites de la
précision des deux techniques (c'est-à-dire 12 p.cent d'hypo-
sialylation). Nous avons déjà discuté de ce point précédemment
(§ 4 Matériel & Méthodes). Au cours des différentes étapes mises
en oeuvre, les liaisons sialosyles fragiles ne sont pas rompues
et la sialylation reste normale.
iii Dans la dernière préparative, il y a deux produits
L'al-GPA/RPBS-CM
est normalement sialylée
I
Pour l'a
et c'est la première fois au cours
l-GPA/RPBS-CM2,
de notre étude préparative, nous montrons une sous-évaluation
en EIDm de l'ordre de 14 p.cent, c'est-à-dire une hyposialyla-
tion de l'ordre de 20 p.cent.
Il ne s'agit pas d'une désialylation extemporanée qui intervien-
drait lors de la purification puisque, dans les préparations précédentes,
aucune désialylation n'a été détectée. Il s'agit donc d'un défaut de sialy-
lation de l'al-GPA présente dans le "pool" de sérums soigneusement sélectionné~
Il faut toutefois admettre que cette hyposialylation n'est pas détectée sur
ce "pool". L'explication suivante peut être avancée: sur la base des teneurs
en ~ -GPA, cette fraction constitue les 314 du "pool" et est donc partiellement
diluée par la fraction RPBS-CM
dont la sialylation est normale. L'hyposia-
I
lylation de l'al-GPA de ce "pool" ne serait plus que de 15 \\\\J. Nous serions
alors dans des zones d'hyposialylation que notre protocole peut tout juste
apprécier.
Cette hyposialylation entraine une augmentation du point isoionique
et la fixation de cette fraction à pH 3,70 sur carboxymethylcellulose, ce qui
ne s'était pas produit lors de la purification de l'al-GPA à partir de serums
non sélectionnés. L'analyse de la composition molaire en oses des glycannes
de cette fraction confirmera d'ailleurs son caractère moins acide.

---

61
F. - APPROCHE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE L/~l-GLYCOPROTEINE
ACIDE DE RAT
1)
PREPARATION DES OLIGOSACCHARIDES
L'hydrazinolyse est une étape très souvent utilisée pour l'étude
des glycannes des glycoprotéines. Elle permet le clivage de la liaison N-
glycosylaminyle. Dans une étape ultérieure, les groupements aminés libres
sont N-réacétylés et les oligosaccharides résultant sont réduits par le
borohydrure de potassium.
Nous avons appliqué cette technique à l'isolement des oligosaccha-
rides de l'al-GPA purifiée à partir de RN, RPB, RPBS-CM
et RPBS-CM
définis
l
2
dans le chapitre E
de la partie matériel et méthodes.
1.1 Hydrazinolyse (Bayard et Fournet 1976, ~
A l'aide d'une pipette Pasteur, l'hydrazine Pierc~est introduite
dans un tube en verre type Sovirel R contenant la glycoprotéine lyophilisée
(1 ml pour 6 à 10 mg de glycoprotéine). Le produit est ensuite porté à
lOSoC pendant 24 heures.
A ce moment, il est repris par du toluène et
évaporé au rotavapor à +300C. L'excès d'hydrazine est piégé par une solution
d'acide sulfurique. Le résidu est repris par un volume d'eau et les oligo-
saccharides sont précipités par 10 volumes d'éthanol durant une nuit à -20°C.
1.2 N-réacétylation
Après précipitation à l'éthanol, le précipité est redissous par
une solution saturée de bicarbonate (2 ml pour 2 mg de glycannes) et l'anhy-
dride acétique est ajouté toutes les 20 min pendant 2 heures par aliquotes
de 10 fl pour 3 mg de glycannes. (agiter le tube à chaque addition d'anhydride
acétique).
1.3 Réduction par le borohydrure de potassium
Le milieu réactionnel est amené à pH 9-10 par de la soude normale
et le borohydrure de potassium est ajouté à raison de l mg/mg de glycanne.

---

62
Au bout de 2 heures, la réaction est arrêtée par addition de Dowex
50 X 8 (H+ 200-400 mesh), (Biorad). La solution est filtrée sur laine
de verre et évaporée à sec par du méthanol distillé. Enfin, le résidu
est repris dans un minimum d'eau pure et les sels sont éliminés par chro-
matographie sur Biogel P2.
1.4 Dessalage apres hydrazinolyse, N-acétylation et réduction
Le déssalage est effectué par chromatographie sur une colonne
de Biogel P2. Il est pratiqué en vue d'éliminer les borates et acétates
susceptibles d'intervenir dans les opérations ultérieures.
Colonne
fabrication artisanale 2 X 20 cm support Biogel P2 (Biorad)
Eluant
eau pure, solution d'acide acétique 0,05 %
Echantillons : hydrazinolysats
Pompe LC 5A SHIMADZU (Touzart et Matignon)
2
Pression maximale affichée 50 kg/cm
Pression de travail : 20 kg/cm 2
Boucle d'injection: volume total 500 ~l
Spectrophotométrie, Uvicord
2138 (LKB)
0,5U de 0.0. pleine échelle
Longueur d'onde 206 nm
Enregistreur monocanal 2210 (LKB)
Sensibilité 0,1 V
Déroulement du papier lmm/min.
2)
SEPARATION DES OLIGOSACCHARIDES PAR ECHANGE D'IONS
2.1 Principe
500 à 1500 pg de glycannes obtenus suivant le protocole décrit
ci-dessus sont chromatographiés sur un échangeur d'anions (silicate-amine
quaternaire). Les oligosaccharides sont séparés en fonction de leurs charges
acides par un gradient phosphate de potassium 0,5 M pH 5,2.

---

63
2.2
HPLC ~changeuse d'ions sur une colonne Micro-Pak-AXIO
(Baenziger et Natowicz, 1981, ~
Le micro-Pak AXIO est un support ~changeur d'anions. Il permet
de separer les oligosaccharides selon leur teneur en r~sidus sialyls. Les oligo
saccharides neutres sont totalement exclus du support tandis que les tétra-
sialyls fortement retenus seront élués par le gradient phosphate en dernière
position.
Colonne 0,4 X 40 cm
support Micro-Pak AXIO ~changeur
d'anions (Varian)
. Pompe: Spectra
Physics SP 8750 munie d'une boucle d'injection
de volume total de 500 ~l
2
Pression maximale affich~e 200 kg/cm
Débit l ml/min
Système d~livreur de solvants (eau et tampon phosphate) micro-
processoris~ - Spectra Physics SP 8700.
Programmation du gradient d'élution :
temps (min)
eau (%)
tampon phosphate 0,5 M pH 5,2 (%)
0
100
0
8
100
0
15
97,5
2,5
25
97,5
2,5
35
95
5
45
95
5
80
60
40
Détecteur UV modèle 8400 (Spectra Physics)
longueur d'onde 206 nm
. Intégrateur-enregistreur informatisé modèle 4.100 (Spectra Physics
2.3
D~ssalage par HPLC sur une colonne Aquagel
Ce déssalage permet d'éliminer les phosphates contenus dans
les pics d'~lution après HPLC sur micro-Pak AXIO.

---

64
Support: Aquagel P2 10 ~m (équivalent P6);
Polymer Laboratories Ohio USA (Touzart et Matignon)
• Pompe LC 5A Shimadzu
2
Pression maximale 200 kg/cm
2
Pression de travail 80 kg/cm
Boucle d'injection: volume maximum 500 ~l
Débit 0,2 ml/min
Cellule UV UVICORDS 2138 LKB
À 206 nm
Enregistreur A 25 (Varian)
sensibilité 100 mV
déroulement du papier 0,5 mm/min
3)
IDENTIFICATION ET COMPOSITION DES FRACTIONS SEPAREES SUR
ECHANGEUR D'IONS
Les diverses fractions apres fractionnement sur AXIO et
déssalage sur Aquagel sont méthanolysées puis analysées en chromato-
graphie en phase gazeuse (CPG).
3.1 t~éthanolyse-trimèthylsilylation
(Kamerling et al 1975, ItS )
Environ 20 pg de glycannes et 4 ~g de mannitol sont méthanolysés
par 500 ~l de méthanol chlorhydrique 0,5 N pendant 24 heures à 80°C. Après
addition de l mg de carbonate d'argent puis de 20 ~l d'anhydride acétique
le tube est placé à l'obscurité pendant 24 heures. Le produit est séché à
l'azote après deux extractions des corps gras a l'heptane anhydre. Les
monosaccharides sont ensuite silylés par 100 fI d'un mélange: bis-(triméthyl-
silyl) tri-fluoroacétamide/pyridine distillée (volume à volume).
3.2 t~éthanolyse-trifluoroacétylation
(Zanetta et al 1972,126 ) .

---

65
300 à 700 ~g de glycannes ou glycoprotéines sont méthanolysés
en présence de 30 à 50 ~g de mésoinositol pendant 24 heures à 800C. Le
produit est ensuite évaporé sous azote puis trifluoroacétylé par 200 ~l
d'un mélange anhydride trifluoroacétique/dichlorométhane au bain de sable
à 150 0C 2 fois 5 min.
3.3
Analyse en chromatographie en phase gazeuse (CPC)
. Sur colonne OV 210
Les méthylglucosides trifluoroacétylés sont analysés en CPC
sur une colonne de verre (0,3 X 300 cm) remplie de silicone OV 210 a 5 %
sur varaport 30 "mesh" 80-100, température programmée de 100 à 220 0C a
raison de 2°C/min, sous un débit de gaz vecteur (azote) de 10 ml/min .
. Sur colonne capillaire CP Sil. 5CS (25 X 0,22 mm)
Les glycosyls triméthylsilylés sont analysés en CPC sur un ap-
pareil type Cirdel 300 muni d'un injecteur évaporateur en verre et d'un
détecteur à ionisation de flamme couplé à un intégrateur Spectra Physics
4100, température programmee de 120 à 240 0C à raison de 2°C/min, sous une
pression d'entrée de 0,6 bar d'hélium.
Les figures 24 & 25
indiquent respectivement les tracés de
l'analyse quantitative des sucres. Le mode de calcul des rapports molaires
des différents monosaccharides est représenté dans le tableau V.

---

Han
Glc
Hannitol
GlcNAc
G~c
Gal
il-AN
11ar
Gal
.a
~JJJJLJlli1J~UUlJlJ\\JJlA
,lA-
u~~_
Figure 24:
Chro~atographie en phase gazeuse.(CPG)
des glycosides triméthylsilylés sur une colonne capillaire 5il.SCB
0\\
0\\

---

--r 1--1----1--1---1
~~---'-'r--'---
- - - 1 - " " 1 "
1
j
\\ ,
--- -. ------. - - - - ' - - - ' - - 1 - 1 - - 1 - - 1 - - - - 1 - - - 1 - - 1 - . - - . - - - - --,- -----1---'--,----_, --
. _
-- '~-AI
----,---------,----.-------~I-lHb~ositlG~I--I_+ 1 1 1 I-j---I--l---~---
-------.---.-------L-I-I-I..:.......--L.:.:..-'----C-I
.l __ I
l--_I_. __ I-:.... . _
.,------1__.__
. Hal
-1-. _ _ .. -
1 ..
1 _ .
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_ _ _ _ t
_ _
' - - _ _ I _ U .• --.,I _ _ , _
- ..------j-J-
1
1
1-11-1
1 11-\\-----1
1
1
1
1
1 11-+-1-1----+
1
.---- •• ,-
\\
--- --------..--·.--••--.------,--1II--I--~
1
\\--.-----,--
1 --
"II-Gal
. . .
-·---·----l-----+--{---.----r-II-f
1
_lit
1
1
1
__ l-j-----r--t-I--t--I
1
1--/-------
-
-~----,--._-. ---I- _ _I - _ I _ - I - - l - l - J _ 1 _ - t - 1 -11----tirrr
---._-.-.----.-- -
Mal.
--
. __ . __ ..
----
---
of '
G- -
;
C~J~~I=I--·I·r·T~I·~I-rl-III~1
-
- l - - f - - 1----1-
~ !--[l~j-----I---r=--~l-
Figure 2S
Chromatographie en phase gazeuse (CPG) des méthylglycosides
trifJuoroacétylés sur une colonne av 210
0'.
' l

---

68
TABLEAU V
MODE DE
::lETERMINATION DES RAPPOfr.'S ~LAI RES EN MONOSACCHARIDES
PAR CHRO~TOGRAPHIE
~ ?~SE GAZEUSE
'~l-GPA DE RAT 965 pg
Hasse! méthanolyser (Quantité de ~onosaccharides totaux 1<5 à <50 y)
:
- Quant1t~ de Illéthanol/HCl 0.5 N. de lIlét..'lanol/HCl 1,5 N (l)
(Concentrations 1 p.
1 000)
- Quantit~ de m~soinositol ! introduire :
50 ~g.
- Délipidation : ~ - non
Noms
ruc
Gal
Man
Glc
Gal!:AC GlcNAc
NANA
NGNA
Mésoinositol
Hasse moléculaire
164
180
180
160
<21
221
309
325
Rautpur P.. l!es pics (cm)
0,5
7,5
12,1
8,S
9,2
10,2
H. Etalon
0,75
0,78
0,87
0,48
0,48
H. temoln
M'Honosaccharldes
0,~5 10,735
1,18
0,86
0,9
R. témoin
H. lIlOnosaccharides
0,066
0,94
1,36
1,5
1,88
M. témoin
--
Masses ~ (\\.Ig)
3,3
47
68
90
94
Noobre de :nicromoles
0,02
0,26
0,36
0,4
0,3
Rapports lIlOlaires
0,15
2
3
3,1
2,4
So~es des :nasses
0,9 % 15,5 % 22,5 %
30 %
31 %
et. rourcent.aqe
Rapport oses/csamines
i<a;porc oses/acides sialiques
G.L.C.
H : Hauteur; M : masse; témoin: mésoinositol
M. Fuc
0,05
H.monosaccharide
ExpIe
0,066
11. témoin
0,75
H.Monosaccharides
H. temoin
M. temoin
H. Etalon
H. temoin
Masse Fuc (~g) = 0,066 X M.Témoin
0,066 X 50
"'9 = 3,3 rg
(1) selon la nature des produits volatils.

---

RESULTATS

---

69
I.
EFFET DE DIVERS PRODUITS SUR LA
SYNTHESE PROTEIQUE CHEZ LE RAT

---

70
Dans cette première partie nous avons consacré notre étude
à l'évolution de la concentration de certaines protéines sériques:
l' Œl-glycoprotéine acide (ŒI-GPA), l'albumine et les protides totaux,
après traitement de rats mâles Sprague-Dawley (250-300 g) par la galacto-
samine (GalN), le phénobarbital (PB) et l'essence de térébenthine (E.T.).
Les concentrations en ŒI-GPA et albumine ont été dosées par des
méthodes immunochimiques (IDR et EIDm) utilisant les immunsérums dont nous
avons décrit la préparation dans le chapitre matériel et méthodes. L'étalon-
nage est réalisé avec un pool de sérums dont la teneur en ŒI-GPA et albumine
est établie par mesure comparative
avec la protéine standard préalablement
purifiée. Pour apprécier les retentissements éventuels que pourraient avoir
les divers produits sur la concentration de l'ensemble des protéines de
sécrétion, nous avons dosé les protides totaux par la méthode de Lowry.
Les valeurs obtenues chez des rats normaux sont représentés dans
le tableau VI.
TABLEAU VI
Concentrations sériques en Œl-glycoprotéine acide (ŒI-GPA),
albumine et protides totaux chez le Rat Sprague-Dawley normal
ŒI-GPA*
albumine*
protides totaux
mg/l (~ +ET)
g/l (~ +ET)
g/l (~ + ET)
182 + 44
27 + 3
68 + 4
n = 25
n = 25
n = 11
* valeurs déterminées en immunodiffusion radiale simple.

---

71
A.- EFFET DE LA GALACTOSAMINE CGALN) SUR LES CONCENTRATIONS DES
PROTEINES SERIQUES
(Monnet et al, 1985a, 69 )
Les premiers essais ont consisté en une injection de doses
variables de GaIN à des rats
600, 900 et 1350 mg/kg de poids corporel.
Les résultats ont montré que quelle que soit la dose, les variations des
paramètres biologiques cités ci-dessoussont identiques et la mortalité,
la même. La dose de 900 mg/kg a été retenue comme l'avaient d'ailleurs fait
d'autres auteurs (Sawamura et al 1981,92 ).
Les variations séquentielles de la concentration des diverses
protéines sériques ont été examinées durant 9 jours après injection unique
de D-GalN (900 mg/kg de poids corporel).
Parallèlement, des rats ponctionnés apres anesthésie à l'éther
ont servi de témoins. Seule la concentration en ŒI-GPA, chez ces témoins,
montre une légère augmentation dès le Zème jour pour rester constante durant
toute la période d'étude.
Après traitement a la GaIN, tout d'abord l'activitéde l'alanine
aminotransaminase (ALAT) puis les concentrations en ŒI-GPA, albumine et
protides totaux ont été mesurées de manière à apprécier l'importance de
la cytolyse et de la déficience hépatocellulaire. Apparemment la cytolyse
est le premier phénomène observé puisque l'activité ALAT croit rapidement
et atteint une valeur maximale à J
bien que ce maximum soit variable d'un
Z
animal à l'autre. Cette activité décroit progressivement pour atteindre la
valeur initiale à J
ou J
(fig.Z6). La concentration en albumine n'est que
4
5
légèremen~ mooltlée.
Les concentrations en ŒI-GPA et en protid~s totaux subissent
une diminution et atteignent une valeur minimale respectivement de 55 %
et 19 % entre J
et J . Le retour à la valeur de base est beaucoup plus
Z
3
lent. Nous avons tenu compte de l'effet positif de l'anesthésie et de la
ponction cardiaque observé chez les témoins pour calculer l'effet propre
de la GaIN chez les rats traités. La variation des fractions protéiques
des rats GaIN comparées à celles des rats témoins est représentée sur la
figure 26.

---

72
80
...-1
'il
600
'..-1
r60
0
~
'..-1
X
C
•..-1
:::::1
'il
X
~
0
:::::1
'il
~
~
(f)
V
:::::1
'il
"'0
•..-1
~
~
....
0
....
0
o,
40
400
0.
0.
'il
....
....
'il
0.
V
en
!
'il
<!:
~
c
c,
V
<..:l
1
U
....
...-120
200
:::::1
~
0
c,
l
O'-----,---~-__.--_.,.--.__-___.--....;..--.,....__-__._I
l
2
3
4
5
6
7
8
9
Jours
Figure 26
Effet de la D-galactosamine (900 mg/kg de poids corporel)
sur les taux sériques de l'~l-glycoprotéine acide (n = 5)
*-*,des protéines totales (n = 5)0-0 et sur l'activitéalanine
aminotransférase ~

---

73
B.- INCIDENCE DU TRAITEMENT PAR LE PHENOBARBITAL (PB) SUR LES VALEURS
SERIQUES DES PROTEINES SPECIFIQUES ET TOTALES CHEZ LE RAT
1) EFFET DE LA DOSE DU PB SUR LE TAUX SERIQUE DE L'al-GPA
L'évolution de la concentration de l'al-GPA en fonction de la
dose du PB a été d'abord étudiée. Nous avons, à cet effet, constitué 5
lots de 8 rats. Chaque lot est traité pendant 3 jours soit par une solution
de NaCl 0,15 M soit par le PB à des doses variant de 40 à 130 mg/kg/j. Un
dosage quotidien de la concentration sérique de l'al-GPA est alors effectué
à partir de la derniêre injection (cf. § Matériel & Méthodes).
Quelle que soit la dose du PB, la concentration maximale en
al-GPA est atteinte à J , c'est-à-dire 3 jours aprês la derniêre injection.
6
Ce sont ces valeurs présentées dans la figure 27 qui ont été comparees pour
apprécier l'effet du PB en fonction de la dose administrée. Il apparaît
qu'à une dose de 80 mg/kg/j, l'effet du PB est maximal. Cette dose a donc
été retenue pour les études ultérieures.
Au cours de ces essais préliminaires, nous avons effectué un
dosage du PB sérique par méthode immunoenzymatique sur TOX ABBOT (Lu-Steffes
et al 1982,61 ). Les résultats obtenus montrent que,3 jours aprês la
dernière injection du PB, la concentration sérique en PB est négligeable
0,1 mg/l) alors qu'elle était de 26,3 : 1,Omg/1 (m: s.m, n = 5) quelques
heures apres le traitement. Ceci montre que le PB a une sorte d'effet
"retard" sur la concentration plasmatique en al -GPA qui doit résulter de la
mise en jeu d'un certain nombre d'étapes métaboliques intracellulaires plus
ou moins longues à s'établir.
2) CINETIQUE D'APPARITION DES PROTEINES SERIQUES
L'étude est menee sur des rats traités pendant 3 jours soit par
le PB (80 mg/kg/j ; i.p.), soit par une solution de NaCl 0,15 t1. Des prélè-
vements de sang suivis de dosage des protéines sont effectués pendant 8
jours et ce à partir du 3ême jour.

---

74
Taux sérique
~l-GPA mg/l
4500
1000
500
o
40
80
100
130
Phénobarbital
mg/kg/j
Figure 27
Effet du phénobarbital sur la concentration sérique de l'ql-
glycoprotéine acide. Chaque point représenté la moyenne des
valeurs obtenues sur 8 rats, 3 jours après la dernière injection

---

75
Dans les deux séries, la concentration sérique en ŒI-GPA évolue
en fonction du temps selon une courbe biphasique (figure 28).
Dans le groupe des rats traités par le PB, le taux sérique de
l'ŒI-GPA atteint un maximum 3 jours après la dernière injection: 1115 +
189 mg/l (m + s.m.), ce qui représente une augmentation d'environ 6 fois
par rapport a la valeur mesurée avant le traitement. Chez les témoins
(rats traités par la solution de NaCl 0,15 ~1) le maximum est à J
: 536 +
2
50 mg/l (m : s.m), le facteur de multiplication est d'environ 3. L'effet
propre du PB est donc multiplié par 3 en moyenne. Dans les deux groupes
nous notons ensuite une décroissance sans toutefois un retour à la valeur
initiale.
Les concentrations sériques en albumine et en protides totaux
ne présentent aucune variation significative quel que soit le groupe étudié
(figure 29 ).
C,- CINETIQUE D'APPARITION DES PROTEINES SERIQUES SOUS L'EFFET CONJUGUE
DU PB ET DE L'ESSENCE DE TEREBENTHINE (ET)
L'augmentation de la concentration en ŒI-GPA sous l'effet du PB
est a rapprocher de celle déjà observée au cours de la réponse inflammatoire.
Nous avons voulu comparer les effets du PB à ceux de l'ET et de l'ensemble
PB + ET.
1) EFFET DE L'ESSENCE DE TEREBENTHINE
Au préalable, nous avons étudié l'effet d'une seule injection
d'ET avec en parallèle une série d'animaux témoins uniquement ponctionnés
après anesthésie à l'éther. Dans cette série témoin, seule la concentration
en ŒI-GPA présente une légère augmentation dès le 2ème jour en se maintenant
ultérieurement au même niveau. Par contre, lorsque les rats reçoivent une
injection d'ET, il s'ensuit une nette augmentation de la concentration de
l' ŒI-GPA dès le 1er jour avec un maximum à J
: 3264
2
+ 167 mg/l
(m + s.m.)
soit 19 fois le taux initial.

---

76
mg/!
1500
1000
o
2
3
4
5
6
7
s
9
10
JOURS
Figure 28
Cinétique d'apparition de l'dl-Glycoprotéine acide
en fonction du temps après injection du phénobarbital
80 mg/kg/j (*'-*
n = 4) et de la solution de NaCl 0,15 t~
( - - .
n = 3).

---

77
l
.j PB (n " 4)
~ PB , ET (n 3)
1,
L ET (n " 5)
91 L
40
=
-
=> 30
<
20
JO
J3
J4
J5
J6
J7
J8
J9
J10
JOURS
Eu.1ë.
,
!
1
!
!
1
JO
J 1
J2
) 3
J4
J5
)6
Figure 29
Evolution de la concentration sérique en albumine
après traitement par le phénobarbital (PB) et par
l'essence de térébenthine (ET).
La concentration en albumine est déterminée par immuno-
diffusion radiale:
traitement par le PB (80 mg/kg/j) ; *----*
injection d'ET; 0-0
trôite8ent par les 2 produits. La concentration
en albumine à JO est de 27 ~ 3 g/l (m ~ ET ; n = 25).

---

78
La concentration en sérumalbumine évolue en sens inverse, la
diminution est maximale à J
(39 %) (figure 29) alors que la concentration
3
en protéines totales ne présente aucune variation significative.
2) EFFET CONJUGUE DU PB ET DE L'ET
L'effet de l'association (PB + ET) est étudié au cours d'un
protocole bien précis: traitement par le PB pendant 3 jours puis injection
d'ET au 4ème jour de façon à avoir au même jour l'effet maximum de chacun
de ces produits. Dans ces conditions, le dosage quotidien de la concentration
sérique de l'ŒI-GPA montre une forte augmentation. Le maximum 4257 ~ 114 mg/l
(m + s.m.) à J
est d'environ 22 fois le taux de départ.
6
La concentration en sérumalbumine comme dans le traitement par
l'ET diminue avec un maximum à J
de 40 % (figure 29). Le taux des protéines
7
totales reste inchangé durant toute la période d'étude.
Il a été constaté que les injections successives intrapéritonéales
de solution de NaCl 0,15 M ainsi que les ponctions cardiaques précédées d'une
anesthésie à l'éther entraînaient une augmentation de la concentration en
ŒI-GPA. L'effet réel du PB, de l'ET et de l'association est dOQC apprécié
et discuté sur les valeurs obtenues après avoir soustrait de la concentration
mesurée chez les rats traités)celle évaluée chez les rats témoins correspon-
dants (figure 30 ) .
Dans les groupes l (PB) et II (ET), la concentration maximale en
ŒI-GPA
579 + 40 mg/l, 3053 ~ 167 mg/l (m + s.m.), est atteinte respecti-
vement à J
et J
Dans le groupe III (PB + ET) on note que la teneur maxi-
6
2•
male en ŒI-GPA obtenue 6 jours après le début du traitement par le PB ou 2
jours après l'injection de l'ET est de 3721 + 124 mg/l (m + s.m.).
L'effet du traitement mixte (PB + ET) est compare à la somme
des effets des deux traitements séparés (PB et ET) (figure 31 ) .
a) Quantitativement les deux effets sont équivalents (aires des
courbes non significativement différentes)
b) Les valeurs obtenues jour par jour ne sont pas significativement
différentes (test t)
c) Les variations observées de jour à jour peuvent être expliquées
uniquement par les variations aléatoires (test du carré moyen des
différences successives) (101)).
d) L'entrelacement des 2 courbes confirme les observations précé-
dentes.

---

79
r
r PB (n = 4)
?
-)J PB, ET (n = 6)
r
t ET(n=5)
mg/L
3000
2000
<l:::
CL
c..:J
1
r-I
(j
'000
r
Jo
J3
J5
J6
J7
J9
J10
JOURS
fn.Te. '
!
!
!
!
!
jo
j1
j 2
j3
j4
J5
j6
Figure 30
Evolution de la concentration sérique en"l-glycoprotéine
acide (~+-GPA) après traitement par le phenobarbital (PB)
et par l essence de térébenthine (E.T.)
La concentration en ~ -GPA est déterminée par immuno-
diffusion radiale. -
traitement par le PB (80 mg/kg/j) ; *-if in-
jection de l'E.T. : ~ traitement par les 2 produits. Les concen-
trations en"l-GPA sont calculées en soustrayant des concentrations
obtenues au cours des traitements celles obtenues dans les groupes
témoins correspondants (ponctions cardiaques suivies ou non d'injec-
tions intrapéritonéales d'une solution de NaCl 0,15 l~). La concentra-
tion en~l-GPA à JO est de 182 : 44 mg/l (m : ET ; n = 25).

---

80
r
mg/l
PB et r .r ,
associés (n=G)
PB et E.T.
~ (n=4 à 5)
3000
g:
2000
Cl
1
.....;
(j
1000
o
l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Jours
Figure 31
Effet cumulé de l'association phénobarbital (PB) et essence
de térébenthine (E.T.) sur la concentration sérique de l'~l­
glycoprotéine acide (~l-GPA).
---.
Effet des deux produits conjugués
~ Somme des effets des deux produits pris isolément.
Les barres représentent l'écart type de la moyenne.
Calcul de l'écart type d'une différence "d" (a-b) ou d'une
somme "s" (a-b) : [)2 d
= ria + ~b
s

---

81
\\
II.
ETUDE DE L'HETEROGENEITE DE L'~l-GLYCOPROTEINE
==============================================
~l-GPA) DE RAT
===============
ETUDE DIRECTE SUR SERUM

---

82
Puisque nous avons pu montrer des différences de la concentration
sérique en Œl-GPA, nous avons poursuivi ce travail par l'étude des variations
susceptibles d'intervenir au niveau de la copule glycannique.
Soit à l'extrémité non réductrice de la partie glycannique en
recherchant une hypo ou une hypersialylation,
- Soit dans la répartition des différentes sous-populations ou
isotypes en immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A.
A.- MODIFICATION DU DEGRE DE SIALYLATION
L'hétérogénéité mineure ou en position terminale est recherchée par
un dosage systématique de l'Œl-GPA sérique en IOR et EIOm chez les rats traités
par la GalN et par le PB. La sous-évaluation est calculée et la fraction
hyposialylée est ensuite déterminée à partir de la courbe standard préala-
blement établie (§ 4 Matériel et Méthodes).
· Quel que soit le groupe de rats témoins étudiés, aucune différence
significative entre les valeurs obtenues en TOR et en EIOm n'est observée.
Il n'y a donc pas de modification du degré de sialylation de l'ŒI-GPA à la
suite des simples ponctions cardiaques et des anesthésies.
· Lorsque les animaux sont traités par la GalN, l'ŒI-GPA présente
une légère hyposialylation à J , le maximum est atteint à J • Du fait de la
2
4
susceptibilité individuelle,l'hyposialylation est plus ou moins prononcée,
c'est-à-dire entre 17 % et 30 % selon les animaux. Toutefois, le taux maximal
apparait généralement lors de la décroissance de l'activité ALAT (Monnet et al
1985,
69). La figure32 montre l'évolution type chez le rat. A J
l'ŒI-GPA
6
apparait de nouveau sialylée.
· Chez les rats traités par le PB, l'étude séquentielle de la
fraction sialylée ne montre aucune altération. Cependant, à J , jour où la
6
concentration sérique en ŒI-GPA est maximale, la concentration mesurée par
EIOm est régulièrement plus élevée que celle obtenue en IOR. Nous pourrions
donc envisager une légère hypersialylation de la glycoprotéine.

---

83
1-' ALAT (UI!L)
*-* fraction hyposialylée (%)
0,32
900
0,27
600
0,22
300
0,17
°
l
2
3
4
5
6
7
8
9
Figure 32
Modification dans le degré de sialylation de l'~l-glycoprotéine
acide (~) et l'activité sérique de l'alanine aminotransfé-
rase (ALAT) (~) après injection de D-galactosamine (900 mg/kg)
chez le ra t ,

---

84
Pour conclure sur ce point, les conditions de dosage de
,
'.
l'al-GPA par EIDm et IDR ont été légèrement modifiées de façon a ce
que les mêmes dilutions de sérum puissent être utilisées dans les
deux techniques. Dans ces conditions, comme l'indique le tableau VII, aucune
différence significative n'est observée entre les deux méthodes. Les
légères variations observées précédemment dans les concentrations en
al-GPA étaient le reflet de petites erreurs de dilution.
Aucune variation du degré de sialylation de l'al-GPA n'est
observée au cours du traitement par le PB de cette série expérimentale.
TABLEAU VII
VALEURS DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE DANS LES SERUMS DILUES
Sérums
IDR
EIDm
IDR-EIDM
IDR-EIDm X 100
H.S.*
dilués
(mg/1)
(mg/l )
(mg/l )
IDR
l
52
53
l
2
il)
2
45
47,5
2,5
5
>
.~
.j...l
3
47,5
50
2,5
5
n:l
Ü
.~
4
52
57
5
10
....
.~
c:
5
45
47,5
2,5
5
01
.~
~,
6
41
43
2
5
c:
0
c:
* H.S. : hypersialylation
~
Les concentrations en al-GPA sont dosées
sur la meme dilution
simultanément en IDR et en EIDm.
B.- MICROHETEROGENEITE EN POSITION INTERNE PAR IMMUNOAFFINOELECTROPHORESE
CROISEE EN CONCANAVALINE A (CIAE CON A)
J. HETEROGENEITE DE L'al-GPA DE RAT NORMAL
L'électroimmunodiffusion bidimensionnelle de serum humain
(sans Con A dans la première dimension) contre un immun sérum de lapin

---

85
anti-al-GPA présente un pic de précipitation homogène. Quand la Con A
est introduite dans le gel de la première dimension, le précipité est
composé de 4 fractions protéiques reflétant probablement des degrés
variables d'interaction et/ou un différent nombre de sites de liaison
biospécifique entre la lectine et Ital-GPA humaine
(Hansen et al,
1984,4'
).
La Con A est immobile dans les conditions expérimentales. Elle
reconnait les résidus a-D mannopyrannosyls dans une glycoprotéine sérique.
L'apparition de plusieurs pics en CIAE Con A à partir d'un antigène unique
est donc le reflet d'une hétérogénéité de la copule glycannique.
Chez le rat, peu d'études ont été consacrées au comportement des
glycoprotéines en CIAE Con A. Nous avons par conséquent appliqué cette
technique à l'étude de l'al-GPA de Rat et étudié les modifications éven-
tuelles dans les traitements réalisés.
1) Détermination de la concentration idéale en Con A dans le
gel de la première dimension
Dans un premier temps, nous avons effectué un dépôt d'une
quanti té constante d' al-GPA pour des concentrations croissantes en Con A. Il appa-
rait que,pour des concentrations en Con A supérieures ou égales à 150 ~g/cm2
soit 0,75 g/l dans le gel de la première électrophorèse, nous obtenons des
profils identiques et reproductibles constitués de 4 pics (figure 33,
tableau VIII.
2) Comme il faut des conditions extrêmement rigoureuses pour
déterminer quantitativement les proportions des différents isotypes, nous
avons défini les conditions suivantes:
- les serums sont d'abord dilués dans une solution de NaCl 0,15 H
à 100 mg/l d'al-GPA et nous en déposons 15 ~l par puits (1,5 ~g d'ŒI-GPA).
- Nous avons utilisé la même concentration d'immunsérum (1 ~1/cm2
ou 8 ~l/ml) dans le gel de la deuxième électrophorèse.
- La même concentration en Con A : 150 ~g/cm2 est introduite
chaque fois dans le gel de la première dimension.
Les proportions relatives des quatre pics ou isotypes de l'al-GPA
de rats normaux calculées par planimétrie sont représentées dans le tableauIX.

---

86
-~..
,itk~~,,~-;:;;;.~.0~Wi~~~'iWo'''''~~''~''''"
.~'
- . .
! '"..
r- a
I
l-':;:\\?:~t'
"
Figure 33
Hétérogénéité de l'~l-glycoprotéine acide (~l-GPA) de Rat en
immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A (CIAE Con A).
Effet de la concentration de la Con A dans la première électropho-
rèse sur le profil protéique plaques 1-3.
2)
2)
(l)
: Con A 0,5 g/l (l00 pg/cm
- (2)
: 0,75 g/1 (150 pg/cm
- (3) : l g/l
2)
(200 pg/cm
dans le gel, 15 ~l d'un sérum à 0,1 g/l d'~l-GPA par dépôt.
Première migration de 90-100 min à 7,5-10 V/cm. Deuxième migration de 18 h sous
2,5 V/cm dans un gel contenant un immun sérum de lapin anti-l(l-GPA (8 pl/ml ou
l ~1/cm2), (titre = 0,3 mg/ml) ; du polyéthylèneglycol 6000 (2 p.cent) et du
méthy l 0( -D-glucopyranoside (4 p. cent) •

---

87
TABLEAU VIII
EFFET DE CONCENTRATIONS CROISSANTES EN CONCANAVALINE A SUR LES
VALEURS RELATIVES DES ISOTYPES DE L1a
ACIDE
l-GLYCOPROTEINE
l
2
3
4
Isotype
Isotype
Isotype
Isotype
non
faiblement
moyennement
retenu
retenu
retenu
retenu
(%)
(%)
(%)
(% )
Con A
2
100 pg/cm
15
25
32
28
Con A
2
150 pg/cm
15
24
22
39
Con A
2
200 rg/cm
15,5
23
23
38,5
Les valeurs sont issues de 3 plaques qui ont migré simultanément.
Les tracés correspondants sont présentés dans la figure 33.
TABLEAU IX
DISTRIBUTION DES PROPORTIONS RELATIVES DES 4 ISOTYPES DE L'a l-
GLYCOPROTEINE ACIDE DE RAT NORMAL
Isotypes
l
2
3
4
Valeurs
relatives
18 + 4
25 + 3
18 + 3
39 + 6
0,22 + 0,02
0,62 + 0,06
(%)
Les valeurs sont calculées par planimétrie et représentent la moyenne
déterminée sur le sérum de 30 animaux (~ + écart type)
RI = 1/2 + 3 + 4
R
= 4/1 + 2 + 3
2

---

88
II. ALTERATION DE L' a1-GPA DE RAT EN CIAE - CON A SOUS
L'EFFET DE DIVERS PRODUITS
1) Distribution des 4 isotypes de rats témoins
L'étude est réalisée sur les rats témoins ayant subi le maximum
de manipulations: injections de solution de NaCl 0,15 M pendant 3 jours
suivies de ponctions cardiaques quotidiennes après anesthésie à l'éther.
L'analyse en CIAE Con A (figure36 a) ne montre aucune variation
significative des 4 isotypes de l'al-GPA bien que le taux sérique de celle-
ci soit élevé. Les modifications dans les proportions relatives des dif-
férents isotypes comme nous le verrons plus loin, sont bien consécutives
au produit injecté.
2) Effet de la GalN sur les fractions de l'al-GPA
(Monnet et al 1985, 69).
Les profils protéiques ont été examinés pendant 9 jours après
une injection isolée de GalN (900 mg/kg). Les proportions relatives des
divers isotypes après estimation de l'aire délimitée par les lignes de
précipitation sont présentées dans le tableau
X . Sur la figure 34
les amplitudes des isotypes l, 2 et 4 sont nettement altérées tandis que
la modification de l'isotype 3 est moins prononcée.
Les variations des isotypes se manifestent par paire; la diminution
des
fractions retenues 3 et 4 s'accompagne d'une augmentation des fraètions non
retenues l et 2. Remarquons qu'en fin d'étude (J6 à J9) les fractions l et
2 restent augmentées alors que la fraction 4 est diminuée.
Les modifications du profil immunoélectrophorétique de l'al-GPA
des rats traités par la GalN se présentent en 3 phases dont deux sont
identiques (figure35 ).
Pendant la première phase, à J
nous assistons à une croissance
2,
maximale des isotypes non liés à la Con A contrebalancée par une décrois-
sance relative de l'isotype retenu par la Con A. Pendant la même période,
le rapport R des isotypes 1/2+3+4 atteint son maximum et l'al-GPA ne pre~
l
sente qu'une légère hyposialylation. Ces modifications reflètent sans doute

---

89
TABLEAU X
Proportions des isotypes l, 2, 3 et 4 et rapport RI des isotypes 1/2+3+4
calculés après une immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'al-glycoprotéine acide de rat traité par la D-galactosamine (900 mg/kg)
~
1
1
2
3
4
R=
1
2+3+4
JOURS
-------------- ---------- ----------- ----------- ----------- -------------
JO
17.5
24
20
39
0.21
JI
26.5
25.5
16
32
0.36
J
39.5
27.5
10
23
0.65
2
J
20
19
15
46
0.25
3
J
21
29
21
29
0.26
4
j
J
27.5
30.5
22
20
0.38
5
J
34.5
31
12
23
0.52
6
J
31.5
30.5
13 .5
24.5
0.46
7
J 8
30
33
16
21
0.43
J 9
33
31
15
21
0,49

---

1
='1,1,
fi t
!ylM.4AQU.·
',_o!
;"'1!r
·mwe '
Figure 34
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A
de l'~l-glycoprotéine acide de rat traité à la D-galactosamine
(900 mg/kg),
JO : avant injection ; J
J
J
J
et J
jours suivant
2,
3,
4,
6
9
l'injection.
l, 2, 3 et 4 représentent les fractions
liées ou non à la Con A.

---

91
0,80
IHI Rapport des isotypes
e-e Fraction hyposialy1ée
. RI = -=--"l=--:-_
de l'a l -GPA
2+3+4
0,60
0,27
0,40
0,22
0,20
0,17
a
l
2
3
4
5
6
7
8
Jours
Figure 35
Effet de la galactosamine (900 mg/kg de poids corporel)
sur le degré d'hyposialylation de l'~l-glycoprotéine
acide ~
et sur le rapport RI des isotypes 1/2+3+4
~calculé après une immunoaffinoélectrophorèse croisée
en Concanavaline A.

---

92
un état transitoire consécutif à une accumulation d'UDP-N-acétylglucosamines,
substrats nécessaires à la synthèse de structures complexes hautement
branchées non reconnues par la Con A.
La deuxième phase est courte (1 à 2 jours). Elle est caractérisée
par un retour total du profil de l'ŒI-GPA en CIAE Con A vers les valeurs
initiales avec par contre une hyposialylation-maximale. Il apparaît que les
chaînes oligosaccharidiques ne sont pas totalement terminées. Nous pouvons
suggérer que ce défaut partiel de sialylation est peut-être dûe à une di-
minution de la teneur en accepteurs susceptibles de recevoir les restes
sialyls, c'est-à-dire portant des restes galactosyls situés en position
terminale des glycannes. Une diminution progressive de la teneur intracel-
lulaire en UDP galactose entraînerait un déficit progressif en résidus
galactosyls et de ce fait en résidus sialyls.
Dans la troisième phase, le profil de l'ŒI-GPA en CIAE Con A
est identique à celui de la première phase. A la fin de cette période,
le rapport des isotypes 1/2+3+4 reste augmenté pendant que la sialylation
redevient normale. La persistance de l'évolution des isotypes non liés à
la Con A reflèterait une altération des organelles intracellulaires et
l'installation d'une insuffisance hépatocellulaire.Nous reviendrons plus en
détail sur ces hypothèses au cours de la discussion générale.
3) Modification.~u profil de l'Œ1-GPA après traitement au PB
(Monnet et al 1985, 'lD ).
Comme dans le traitement par la GaIN, l'ŒI-GPA des rats traités
par le PB présente des isotypes dont les proportions relatives varient en
fonction du temps (figure 36 b ) .
En réalité, trois isotypes subissent une modification importante.
Sur la figure 37 nous notons en effet une variation biphasique des valeurs
relatives des fractions de l' ŒI-GPA non retenue (isotype 1), faiblement
retenue (isotype 2) et de la fraction fortement retenue (isotype 4).
Les valeurs de la fraction moyennement retenue (isotype 3)
restent pratiquement inchangées au cours des 10 jours d'étude.

---

93
a
b
."
,
~,,;:
2
1
4
/"\\
3
jo
1---
/'
t '
, , ~ \\
.
>
1ka
/\\
1 \\ .
f~'
'$
.,~
f". ~ 1'\\
'~
.<>\\
~\\
.
Figure 36
Modification des différents isotypes de lr~l-glycoprotéine
acide de rat en immunoaffinoélectrophorèse croisée en
Concanavaline A.
(a)
apres traitement par une solution de NaCl 0,15 M
( b )
apres traitement par le phénobarbital.
JO avant le traitement - J
à J
après le traitement.
3
I O

---

94
4
1+2+3
1,5
60
/ \\
50
/
\\
1,2~
-
1
\\
?P.
,*
\\
Q)
-
Vl
/
\\
Q.
40
>.
...,
/
.-- -~\\
0
Vl
\\
'''';
_*1
Vl
*-
\\
Q)
"t:l
30
./'
\\
Vl
, /
Q)
./'
\\
>
'''';
...,
l'tl
,...;
Q)
I:-l
20
,5(
Vl
I:-l
~
Q)
,...;
l'tl.
>
10
0 . . .-
. . .- -. . .-
. . .- -.....- - - - -.....- -.....- - - -.......-
.........
l
2
3
4
5
6
7
a
9
10
Figure 37
Cinétique de variation des valeurs relatives 'des différents
isotypes de l'~l-glycoprotéine acide consécutives au traitement
par le phénobarbital.
()-() Fraction l anodique non retenue
.... Fractions 2et 3modérément retenues
~ Fraction 4 cathodique fortement retenue
~... rapport R = 4
2
1+2+3

---

95
~'isotype 4 présente une nette augmentation quelques jours après l'arrêt
du traitement et atteint un maximum à J • La période d'augmentation de
6
ses valeurs correspond simultanément à une diminution des valeurs de
l'isotype l avec un taux minimal à J • Nous avons préféré dans cette étude
6
exploiter le rapport R
= 4/1t2t3. Il atteint une valeur maximale à J
2
6
(figure 37 ) •
4) Le traitement par l' E. T. par l'association PB, E. T. et leurs
,
consequences
4.1 EFFET DE L' E•T.
Lorsque les rats sont traités à l'E.T. les modifications sont
beaucoup plus spectaculaires. Seul l.tisotype 4 fortement retenu persiste
et présente une forte augmentation. Les autres, l, 2 et 3, tendent à
disparaître avec des délimitations peu précises, ce qui rend impossible
la détermination des proportions par planimétrie. La figure 38 montre l'évo-
lution typique des isotypes. 24 heures après l'injection du produit, nous
notons une disparition quasi totale de la forme non retenue (isotype 1);
ce profil type reste identique tout au long de l'étude.
4.2 EFFET DES DEUX PRODUITS ASSOCIES (PB -E.T.)
L'association PB et E.T. (cf. § 6 de Matériel et Méthodes)
conduit dans un premier temps à une diminution progressive des fractions
l et 2 et à une augmentation de la fraction 4. Ceci est dû à l'effet
propre du PB. L'injection de l'E.T. entraîne dès J
la disparition des
5
isotypes l, 2 et 3 et l'augmentation de l'isotype 4 (Fig. 39).

---

96
1
1
4
~:;tt~~
1
",
1.
Figure 38·
Effet de l'essence de térébenthine sur l'évolution des
isotypes de l'~l-glycoprotéine sérique lors de l'analyse en
immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A.
JO avant et JI à J 4 après l'injection

---

97
Figure 39
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Concanavaline A de
lr~l-glycoprotéine acide de rat traité par l'ensemble
phénobarbital (PB) et essence de térébenthine (E.T.).
JO : avant traitement - J
J
: après traitement par le PB -
3,
4
J
à J
: jours suivant l'injection du PB puis de l'E.T.
5
7
LIE.T. est injectée à J •
4

---

98
Nous venons de mettre en ~vidence que chez le rat, la GaIN et le PB
provoquent respectivement une diminution et une augmentation de la concen-
tration s~rique de l'al-GPA. Une telle situation r~sulterait de la diminu-
tion ou de l'~l~vation proportionnelle du taux de synthèsp dans le foie,
bien d~montr~e par divers auteurs (Macintyre et al, 1985,5Z ).
Après un traitement par la GaIN et le PB, des modifications dans
la composition des chaînes glycanniques sont aussi mises en ~vidence. Si
nous assimilons l'isotype fortement retenu par la Con A à une structure
riche en résidus mannosyls ou en résidus mannosyls accessibles (diantennée),
à l'inverse l'isotype non retenu aura des structures dont les restes man-
nosyls sont peu ou inaccessibles (structures N-acétyllactosaminy~s tetra
antennées).Nous pouvons donner diverses interpr~tations aux modifications
observ~es. Limitons-nous aux r~sultats obtenus avec le PB.
1) Des études r~centes indiquent que le précurseur intrah~patique
de l'al-GPA chez le rat est plus riche en r~sidus mannosyls que la glyco-
protéine mature sérique. D'autre part, ce precurseur montre une haute
affinité pour la Con A ~agashima et al, 1980,12 ).
Ce comportement laisse croire que par la suite de l'augmenta-
tion de la synthèse caus~e par le PB voire l'E.T., le processus de glyco-
sylation du précurseur de la cellule h~patique pourrait être acc~l~r~.
Ainsi, des interm~diaires de ce processus seraient s~cr~t~s dans le sang
constituant les formes d'al-GPA fortement li~es à la Con A.
2) Nous pourrions proposer une autre explication.
L'al-GPA au moins chez l'homme, pr~sente une hét~ro~én~it~ rlans la
composition des chaînes glycanniques (Fournet et al 1978,33
). Si cette
hétérogénéité existe chez le rat, la réponse au PB pourrait se traduire
par une stimulation préférentielle de la synthèse de formes fortement
retenues par la Con A.
La seule façon d'apporter une preuve a ces considérations est d'éta-
blir la structure de l'al-GPA ainsi modifiée.
Nous avons limité notre étude structurale à l'aj-GPA de rats traités
par le PB en la comparant à celle de rats t~moins.

---

99
III
ETUDE STRUCTURALE DES OLIGOSACCHARIDES DE
L/~l-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RATS NORMAUX
ET TRAITES PAR LE PHENOBARBITAL

---

100
A,- ETUDE DE LA COPULE GLYCANNIQUE DE L/~J-GLYCOPROTEINE ACIDE DE RATS
l'JORMAUX ET TRAITES PAR LE PHENOBARBITAL
1) COMPOSITION CHIMIQUE EN SUCRES
Environ 400 à 700 pg d'al-GPA (RN et RPB) purifiée comme décrit
précédemment (cf. § isolement) sont directement méthanolysés. Les mono-
saccharides en résultant sont trifluoroacétylés et dosés en chromatographie
en phase gazeuse (CPG) sur une colonne en verre remplie de silicone OV 210
(cf.chapitre F, § 3 de la partie "Hat èr Lel et techniques".)
Les rapports molaires des sucres sont ensuite calculés sur la
base de 3 résidus mannosyls par chaine glycannique (tableau XI). La compo-
.
sition molaire est la même pour les 2 préparations (al-GPA RN et al-GPA RPB),
d'autre part, il semble que les structures di et triantennées soient pré-
dominantes. L'augmentation de l'isotype fortement retenu par la Con A lors
de la CIAE Con A n'est donc pas dûe à la présence d'al-GPA ayant conservé des
structures oligomannosidiques.
Si nous examinons les pourcentages de chaque monosaccharide de
l'al-GPA RPB, nous notons une nette augmentation par rapport à ceux de
l'al-GPA RN (tableau XII). Le taux des sucres totaux calculé
par rapport
à la glycoprotéine totale est respectivement de 26 p.cent et 31,7 p.cent
pour l'al-GPA RN et l'al-GPA RPB. Cette différence explique la légère dif-
férence observée lors de la détermination de la masse moléculaire apparente en
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate
Dans la littérature, l'al-GPA de rat contient entre 21 et 37 p.cent
de sucres totaux. Toutefois, quand nous examinons les valeurs des divers
auteurs rapportées dans le tableauXIII, nous pouvons remarquer que cette
dispersion dépend énormément du traitement préalable subi par l'animal.
Chez le rat normal (RN), malgré la valeur rapportée par Kawasaki et al
(1966, ~B ,) qui trouvent une teneur en sucres de 34 p.cent, l'al-GPA contient
en moyenne 25 p.cent de sucres totaux (Weimer et Winzler, 1955, iI1~; Sarcione,
1963,91 ; et Charlwood et al, 1976, ·2.~). Cette valeur est en accord avec
notre résultat: 26 p.cent.

---

101
TABLEAU XI
RAPPORT MOLAIRE DES MONOSACCHARIDES PRESENTS DANS L~-GLYCOPROTEINE
ACIDE DE RAT APRES METHANOLYSE ET TRJfLUOROACETYLATION
Monosaccharid es (mol/mol de glycanne)
Souche d'al-GPA
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
a::
RN
0,28
2,36
3
3,6
3
RPB
0,26
2,30
3
3,6
2,9
Fuc = fucose - Gal = galactose - Man = mannose - GleNAc = N-acétyl-
glucosamine - N-AN= acide N-acétylneuraminique.
a : calculé sur la base de 3 résidus Man par mol de glycanne
TABLEAU XII
COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES DE L'al-GLYCOPROTEINE ACIDE
DE RAT
Monosaccharides (g/100 9 d 1a l-GPA).
Fuc
Gal
Man
GleNAc
tJ-AN
Total
al-GPA R~l
0,4
4
5
7,5
9
26
al-GPA RPB
0,51
4,9
6,4
9,4
10,5
31,7

---

TABLEAU XIII
-
COMPARAISON DE LA COMPOSITION EN SUCRES DE L'ŒI-GLYCOPROTEINE ACIDE (ŒI-GPA) DE RAT
RAPPORTEE PAR DIVERS AUTEURS
Honoaacchar ides
(91100 9 d'u1-GPA
)
Hexose
Hexo sarai ne
N-AN
FUC
TOTAL
RAT
t1an+Gal
GleNAc
Wei mer et Winzler 1955
9,9
6,4
5,1
-
21 ,4
Normal
Sarcione 1963
9,9
6,4
5,7
-
22
Normal
Kawasaki et al 1966
15,3
8,3
10
0,4
34
Normal
Jamieson et al 1972
14,4
9,5
10,2
-
34,1
Inflammé ET*
Charlwood et al 1976
10,5
7,3
5
-
22,8
Normal
Shibata et al 1977
13,1
6,7
7,6
0,3
27,7
Inflammé ET*
Nagashima et al 1980
14,9
12,4
10,1
-
37,4
Inflammé ET*
cette étude
9
7,5
9
0,4
26
Normal
cette étude
11,3
9,4
10,5
0,5
31,7
Phénobarbital
cette étude
12
9,3
9,7
0,3
31,3
Inflammé ET*
Man
mannose - Gal : galactose - GleNAc
N-acétylglucosamine - N-AN
acide N-acétylneuraminique
*ET
essence de térébenthine
f-'
o
N

---

103
Lorsque la glycoprotéine est purifiée à partir de serum de
rats inflammés à l'essence de térébenthine (Œl-GPA ET)~les taux des
sucres totaux et des hexoses (Man + Gal) sont par contre supérieurs.
La teneur moyenne en sucres totaux (33 p.cent) de l'Œl-GPA isolée par
Jamieson et al (1972,44 ), Shibata et al (1977,A02) et Nagashima et
al (1980,1~
est presque identique à celle que nous trouvons pour
l'Œl-GPA des rats traités par le phénobarbital et par l'essence de téré-
benthine (tableau XIII).
Il apparaît donc que l'Œl-GPA RPB et l'Œl-GPA ET présentent
quelques caractéristiques communes puisque l'Œl-GPA ET que nous avons
parallèlement purifiée a 31,3 p.cent de sucres. D'autre part, le profil
de l'Œl-GPA ET en CIAE Con A est caractérisé par une augmentation des
isotypes fortement liés à la Con A. Ce comportement est retrouvé avec
l'Œl-GPA RPB (Monnet et al 1985,
10).
Les résultats exprimés en mole de résidus osidyls par mole
de glycoprotéine permettent d'envisager le nombre de chaînes glycan-
niques par molécule (tableauXIV). Par exemple, l'Œl-GPA RPB a 15,90
résidus mannosyls/mole de glycoprotéine alors que l'Œl-GPA RN en ren-
ferme 11,97/mole de glycoprotéine. Si nous considérons qu'il y a 3 résidus
mannosyls par chaîne glycannique, il y aurait 5 glycannes par mole d'Œl-
GPA RPB et 4 par mole d'Œl-GPA RN. Nagashima et al (1980,12) suggèrent eux
aussi la présence de 5 chaînes complexes pour l'Œl-GPA isolée du sérum
de rats traités par l'essence de térébenthine. Ces résultats sont obtenus
par déduction de données expérimentales et non par analyse directe.
Cependant, ils paraissent plausibles puisque Ricca et Taylor en 1981 (90)}
en étudiant la structure de l' ARNm de l'Œl-GPA de rat.ont mis en évidence
6 sites potentiels de N-glycosylation.
Le même type de variation a déjà été rapporté dans deux cas :
i
le nombre de chaines Asn-oligosaccharidiques des y-glutaminyl-
transpeptidases du foie de rat normal est passé de 4 dans le
foie normal à 12 dans les cel1ules d' hépatome (Yamashi ta & al, 198
-12,) •
ii A partir d'un extrait de métastases hépatiques humaines,
Chandrasekaran et al en 1984 (23) isolent deux formes d'Œl-GPA
l'une comprenant 3 à 4 chaines glycanniques, l'autre contenant
5 à 6 chaînes. L'Œl-GPA chez l'homme sain contient 5 sites
potentiels et 5 chaines Asn-oligosaccharidiques.

---

104
TABLEAU XIV
NOMBRE DE RESIDUS DANS LA PROTEINE
t·lonosaccharides ( mol/mol d' "i -G~A )
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
cxl-GPA RN
1,07
9,46
11,97
14,40
12,33
(3,99) b
cxl-GPA RPB
1,39
12,14
15,90
19,08
15,38
(5,30)b
a
Poids moléculaire de l' cxl-GPA RN et de l' cxl-GPA RPB estimés
a 43.000 et 45.000 respectivement.
b
Nombre de chaînes glycanniques, calculé sur la base de 3 résidus
mannosyls par chaine glycannique.

---

105
Dans le but de préciser l'origine des différences observées
entre l'Œl-GPA RN et l'Œl-GPA RPB dans leur profil CIAE Con A, nous avons
poursuivi notre recherche en effectuant une séparation des oligosaccharides
en fonction de leur caractère acide sur une résine échangeuse d'anions.
2)
PREPARATION DE SIALYLGLYCANNES D'~l-GPA RN ET Œl-GPA RPB 'PAR
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PRESSION (HPLC) SUR MICRO-PAK AX10
Du fait de la presence d'acide N-acétylneuraminique, les glycannes
peuvent être séparés selon leur charge par chromatographie sur une résine
échangeuse d'anions, le Micro-Pak AX10 (40 X 0,4 cm). La désorption des
glycannes du support est effectuée en 80 min par un gradient phosphate
0,5 M pH 5,2, allant de 0 à 40 % délivré grâce à un microprocesseur. La
programmation du gradient est donné dans le paragraphe II de la partie
"Techniques". Dans ces conditions, on obtient habituellement 5 fractions dont
l'ordre de sortie est dressé dans le tableau XVci-dessous :
TABLEAU XV
TEMPS DE RETENTION ET ORDRE DE SORTIE DES DERIVES GLYCANNIQUES SUR
MICRO-PAK AX10 (40 X 0,4 cm)
Oligosaccharides
Temps (min)
Tampon phosphate (%)
Eau
l Neutres
5
0
100
2 Monosialyls
20-25
2,5
97,5
3 Disialyls
30-35
4
96
4 Trisialyls
40-45
5
95
5 tétrasialyls
50-60
10-30
90-70
Nous avons appliqué ce schéma à l'analyse de nos produits.
Ainsi 3 a 5 mg d'Œl-GPA RN et d'Œl-GPA RPB sont soumis à une hydrazi-
nolyse. Les oligosaccharides en résultant sont re-N-acétylés, réduits par
le borohydrure, puis dessalés par filtration sur une colonne de Biogel P2.
Les glycannes ainsi obtenus sont ensuite séparés sur le Micro-Pak AX10.

---

106
Les produits en sortie de colonne sont suivis à 206 nm grace
a un détecteur UV modèle 8400 (Spectra Physics). Sur la figure 40, le tracé
de l'Œl-GPA RN montre 5 fractions distinctes (Fl à F5) dont la répartition
reflète le degré d'interaction des oligosaccharides avec le support.
Le tracé de l'Œl-GPA RPB présente plusieurs pics que nous avons
regroupes en 5 fractions en fonction de leur temps de rétention (figure 41),
D'autre part, il faut noter que la révélation des sucres sur plaques im-
prégnées de réactif à l'orcinol-sulfurique (Merck) ne montre aucune pro-
portionnalité entre l'importance de la surface des pics et la quantité de
sucre dans les fractions.
Composition et rapport molaire des fractions après analyse en CPG
Après avoir éliminé les phosphates sur Biogel P2, chaque fraction
est soumise à une méthanolyse-triméthylsilylation puis dosée en CPG. Les
rapports molaires des monosaccharides des diverses fractions sont présentés
dans le tableau XVI.
1) ~l-GPA RN
L'analyse des fractions issues de l'Œl-GPA RN conduit aux
résultats suivants: les fractions Fl, F2, F3, F4 et F5 sont composées
d'oligosaccharides respectivement neutres, mono, di, tri et tétrasialylés.
Les fractions Fl, F2 et F3 ont essentiellement une structure diantennée tandi~
que F4 et F5 sont essentiellement tri et tétraantennées.
2) ~l-GPA RPB
Les fractions de l'Œl-GPA RPB présentent les memes compositions
a savoir: les fractions Fl, F2.et F3 sont respectivement des oligosaccha-
rides neutres, mono et disialylés et diantennés. La fraction F4 est tri-
sialylée et triantennée. La 5ème fraction (F5) dont le temps d'élution
correspond à celui des dérivés tétrasialyls, apparaît en fait de manière
inattendue, constituée d'oligosaccharides trisialylés et essentiellement
triantennés.

---

Tampon phosphate
40 1/
0,5 H pH 5,2
/
(%)
/
/
30
F5
f3
F2
F4
/
~..,oN
Fi
..
10
Lj~
..0
/
..".- - - -
-
'"
o
'"..0<
-
_. - - - ----
. --
10
zo
JO
40
50
60
70
Figure 40 : Analyse des oligosaccharides de 11 ŒI-GPA RN sur résine échangeuse d'anions
Micro-Pak AX la (40 x 0,4 c~).
Dans le texte, Fl à F5 : fractions oligosaccharidiques séparées
en fonction de leur charge.
......
o
'-.l

---

Tampon phosphate
fJ
40
0,5 M pH 5,2
/
(\\II)
/
f5
/
/
/
f2
/
30
E
f4
/
C
'"
o
'"
;;-
:::l
~
c:
fI
20
'".D
...
o
/
~K
/
/
/
10
/
,/
- -,
..... .."."....... - - -
~- -
- - - -.- .....
<
•
-
«
!
!
•
C
10
20
30
40
50
6U
70
Figure 41: Analyse des olIgosaccharides de l' ~l-GPA RPB sur r~sine ~changeuse d'anions
Micro-Pak AX 10 (40 X 0,4 cm).
FI ~ F5 : fractIons oligosaccharidiques s~par~es en fonctlon •.e leur charge
f-'
o
CD

---

TABLEAU XVI
COHPOSITION EN SUCRES DES FRACTIONS OBTENUES PAR CHROMATOGRAPHIE SEMI-PREPARATIVE DES OLIGOSACCHARIDES
LIBERES PAR HYDRAZINOLYSE
RAPPORT MOLAIRE DES MONOSACCHARIDES
Fuc
Gal
Han
GleNAc
N-AN
Cil-GPA RN
nd
2
3
0,75
FI
°
Cil-GPA RPB
nd
0,46
3
2
°
Cil-GPA RN
nd
2,16
3
2,5
1,4
.-e- .............. _ . _ .
F2
Cil-GPA RPB
nd
2,10
3
2,2
0,8
/
N-AN-. - . - .
N-AN - . - . - .
F3
Cil-GPA RN
nd
1,6
3
3,3
1,6
<, +-.-.
Cil-GPA RPB
nd
2,08
3
3,4
2,0
/
N-AN-.-.- •
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
N-AN - . - . - .
F4 Cil-GPA RN
nd
2,6
3
4, l
2,6
<,
N-AN -.-.-....•.__ . - . - .
Cil-GPA RPB
nd
2,7
3
3,6
2,92
N-AN - . - .--
F5
Cil-GPA RN
nd
3,6
3
4,25
3,7
Cil-GPA RPB
nd
2,6
3
4
3
- . GleNAc
-+Man
-.Gal
FI à F5 : fractions l à 5
nd : non détectable
1-'
o
'>D

---

110
L'absence d'un résidu GlcHAc que nous observons dans les rapports
molaires des fractions, résulte de la destruction du résidu GlcHAc du point
d'attache (GlcHAc-Asn) lors de l'hydrazinolyse. Il faut aussi noter que le
résidu fucosyl bien que présent, n'est pas significativement détecté au
cours des mesures.
Les proportions de chacune des fractions des deux produits
calculées à partir du poids de glycannes
soumis a la séparation, sont
données dans le tableau XVII.Les oligosaccharides neutres de l'al-GPA RN
ne représentent qu'une proportion négligeable du total: 1,3 p.cent,
comme l'ont montré Yoshima et al (1981,125), tandis que leur taux dans
l'al-GPA RPB est significativement élevé: 12,2 p.cent. Les proportions
des mono et disialyls de l'al-GPA RH et de l'al-GPA RPB sont presque iden-
tiques. Si nous assimilons la fraction F5de l'al-GPA RPB à des oligosaccha-
rides triantennés, trisialylés, le fait le plus remarquable est l'absence
quasi totale des dérivés tétraantennés, tétrasialylés, et la forte propor-
tion des dérivés trisialyls dans l'al-GPA RPB (46,8 p.cent contre 25,5
p.cent dans l'al-GPA RH).
Les proportions relatives des 4 ou 5 types de glycannes sont
ensuite exprimées par rapport à la glycoprotéine totale (tableau XVIII); nous
avons tenu compte de la teneur en sucres qui est plus élevée pour l'al-GPA RPE
que pour l'al-GPA RH. Les résultats ont pu ainsi être comparés à ceux obtenus
au cours des études immunochimiques effectuées directement sur le sérum.
i
Alors que nous n'avions pas détecté d'hyposialylation de
l'al-GPA sur les sérums de rats traités par le phénobarbital,
nous mettons en évidence dans cette étude d'analyse des gly-
cannes une augmentation de Il p.cent des oligosaccharides neutre~
pour l'al-GPA RPB. Cette valeur se situe à la limite de la
. sensibilité de notre protocole de mesure de l'hyposialylation.
ii Le rapport des fractions diantennées sur les fractions tri
et tétraantennées est de 0,9 pour l'al-GPA RH et 1,14 pour
l'al-GPA RPB. Il apparaît donc un décalage vers les structures
moins branchées qui de plus ne sont pas totalement sialylées.
En CIAE Con A le rapport de l'isotype retenu par la Con A sur
les isotypes peu ou pas retenus (1+2+3) est de 0,64 pour
l'al-GPA RH et 0,88 pour l'al-GPA RPB. Il apparaît donc que,

---

TABLEAU XVII
PROPORTION DES DIVERSES FRACTIONS OLIGOSACCHARIDIQUES D'ŒI-GPA RN ET D'ŒI-GPA RPB SEPAREES SUR AXIO
ŒI-GPA RN
ŒI-GPA RPB
Nombre de
Nombre de
Caractère
Pourcentage*
Caractère
Pourcentage*
branches
branches
FI
neutre
2
1,3
neutre
2
12,2
F2
monosialyl
2
9
monosialyl
2
8,2
F3
disialyl
2
37,2
disialyl
2
32,8
F4
trisialyl
3
25,5
trisialyl
3
30,6
F5
tétrasialyl
4
27
trisialyl
3
16,2
* pourcentage estimé à partir du poids total d'oligosaccharides soumis à la séparation
t -
t -
t -

---

112
TABLEAU XVIII
POURCENTAGE DE CHAQUE FRACTION PAR RAPPORT A LA GLYCOPROTEINE TOTALE
Ct - GPA RN
- GPA RPB
1
Ct 1
FI
neutre
0,34
3,86
F2
monosialyl
2,34
2,60
F3
disialyl
9,67
10,39
F4
trisialyl
6,63
14,83
F5
tétrasialyl
7,02
°
R3*
0,9
1,14
* R3
rapport diantenne/tri + tétraantennes

---

113
ce qui est détecté en CIAE Con A ne correspond pas exactement
aux structures envisagées. Le comportement en ClAE Con A des
diantenn;s n'est pas homogène. L'isotype 3 renferme certainement
des diantenn;s, ce qui entraîne une sous-estimation dans l'éva-
luation de ce type d'antenne lors
de la CIAE.
B.- ETUDE DE LA COPULE GLYCANNIOUE DE L'a]-GPA RPBS cMl ET RPBS cM2
Dans cette partie nous analysons les structures des fractions
al-GPA RPBS-CM
et al-GPA RPBS-CM
obtenues sur CM-cellulose après sélection
l
2
des sérums de rats traités par le phénobarbital sur la base de la concentra-
tion plasmatique en al-GPA) 500 mg/l.
al-GPA RPBS-CM
représente la population non retenue sur CM-
l
cellulose constituée d'isotypes peu et non liés par la Con A.
al-GPA RPBS-CM
représente la population retenue sur la CM-
2
cellulose, purifiée ensuite par chromatographie d'immunoaffinité. En
ClAE Con A elle est sous la forme d'un pic unique (fi~ 22 b). La quantité
d'al-GPA dans cette fraction correspond à 3 fois celle de la fraction
RPBS-O\\ .
1) ANALYSE EN CPG ET COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDES
Le dosage et la détermination des rapports molaires des sucres
ont été menes comme il a été décrit précédemment dans le § Al).
Nous constatons que les deux produits présentent des rapports
molaires totalement différents (tableau XIX). La fraction al-GPA RPBS-CM l
présente une composition molaire en sucres proche de celle des structures
triantennées et tétrasialylées, tandis que celle de l'al-GPA RPBS-CM
se
2
rapproche des glycannes diantennés monosialylées.
La composition pondérale en sucres des 2 fractions est rapportée
dans le tableau XX
. Alors que le taux de sucres totaux n'est pas très
différent: 36,2 p.cent pour l'al-GPA RPBS CM
contre 30,2 % pour l'al-GPA
l
RPBS-CM
la teneur en résidus sialyls est fortement diminuée dans
2,
l'al-GPA RPBS-CM 2·

---

114
TABLEAU XIX
COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDFS
DES FRACTIONS a
RPBS-CMI et a1-GPA RPBS-CM2
1-GPA
Monosaccharides (mol/mol de glycanne)
Fuc
Gal
Man
GleNAc
N-AN
al-GPA RPBS-CM
0,18
2,78
3
3,79
3,69
I
al-GPA RPBS-CM
nd*
2,10
3
2,75
1,06
2
TABLEAU XX
COMPOSITION EN MONOSACCHARIDES DES FRACTIONS al-GPA RPBS-Ct~l ET
al-GPA RPBS-CM 2
Monosaccharides (g/lOO 9 d'a I-GPA)
Fuc
Gal
Man
GldMc
TOTAL
al-GPA RPBS-CM
0,46
5,89
6,15
9,61
14,10
36,2
I
al-GPA RPBS-CM
nd*
6,70
9,79
9,92
3,75
30,2
2
*nd
valeur non détectable

---

115
2 ) ANALYSE DES DIFFERENTES CLASSES OBTENUES APRES SEPARATIO~1
DES DEUX PRODUITS SUR AX 10
La séparation semi-préparative sur Micro-Pak AX10 suivie de
l'analyse en CPG (voir chap.A & 2
des diverses espèces ou dérivés
conduisent aux résultats suivants
5 dérivés (Dl à 05) sont obtenus (tableau XXI). Le dérivé Dl
existe mais quantitativement l'analyse en CPG n'est pas interprétable.
Nous pouvons simplement dire qu'il n'y a pas de résidus sialyls et qu'il
s'agit donc d'une fraction neutre.
02 est monosialylé : la teneur en Gal est en faveur d'une
structure triantenn~e alors que celle de la GleNAc est favorable à une
structure biantenn~e. Il est donc probable que ce d~rivé soit impur tout
en contenant surtout des diantennes.
L'~tude des d~riv~s 03, 04 et 05 montre une teneur en r~sidus
sialyls plus ~lev~e que ne le laisse pr~voir le nombre de r~sidus.galac­
tosyls. S'agit-il d'une r~alit~ ou d'une erreur analytique?
Nous consid~rerons donc essentiellement le nombre de r~sidus
Gal. 03 serait diantenn~, 04 et 05 triantenn~s. Nous retrouvons le phéno-
mene observé pour l'al-GPA RPB à savoir l'absence quasi totale de glycannes
de structure tétraantenn~e.
Les d~rivés neutres (Dl) dans le tableau XXII représentent environ
17 p.cent du poids total des oligosaccharides, soit 6,4 p.cent de la
glycoprot~ine, compte tenu de sa teneur en sucres totaux de 36,2 p.cent
(tableauXXIID.Ce taux de 6,4 p.cent n'est pas d~tectable par notre protocole
d'hyposialylation et effectivement nous n'avions pas mis en évidence une
hyposialylation.
Rappelons que c'est cette fraction qui augmente lors du trai-
tement par le phénobarbital et qui a donc retenu le plus notre attention.

---

TABLEAU XXI
COMPOSITION MOLAIRE EN MONOSACCHARIDES DES DERIVES DE L'al-GPA RPBS-CM
ET
I
DE~al-GPA RPBS-CM 2
APRES AX 10
Monosaccharides
(mol/mol d'oligosaccharide)
Fuc
Gal
Man
GleNAc
~I ..~N
a - GPA RPBS-CM
1
I
Dl
al-GPA RPBS-CM
nd
1,96
3
2,5
o
2
al -GPA RPBS-C!\\
0,33
2,66
3
3,31
1,11
02
al-GPA RPBS-CM
nd
2,1
3
2,75
1,07
2
a -GPA RPBS-Ol
0,10
2,10
3
3,52
2,84
1
1
03
al-GPA RPBS-CM
nd
2,25
3
3
2,10
2
al-GPA RPBS-CM
0,15
2,60
3
3,89
3,55
I
04
al-GPA RPBS-CM2
al -GPA RPBS-Ct\\
0,14
2,69
3
4,6
5,49
05
a
GPA RPBS-CM
l-
2
l -
r--
0'\\
nd = valeur non détectable - Dl à 05 = dérivés obtenus sur AX 10

---

117
TABLEAU XXII
PROPORTION DES DIVERSES FRACTIONS OLIGOSACCHARIDIQUES APRES AX10
Pds
Fractions
Pds total d'oligosaccharide
(( -GPA RPBS-CH
((l- GPA RPBS-CI'1
1
1
2
Dl
17,6
42
02
5,4
42
03
26,1
16
04
31,3
0
05
19,5
0
TABLEAU XXIII
TENEUR DES DIFFERENTES FRACTIONS DANS LA GLYCOPROTEINE
Poids
Fraction
- - - - - - - - X 100
Poids glycoprotéine
Dl
6,37
12,68
02
1,95
12,68
03
9,45
4,83
04
11,33
0
05
7,06
0

---

118
3 dérivés Dl, 02 et 03 sont obtenus. L'analyse de ceux-ci
montre clairement que ce sont respectivement des oligosaccharides neutres,
mono et disialylés de structures complexes diantennées (tableau XXD. Le
pourcentage de chaque dérivé est rapporté dans le tableauXXIJ l. Sachant que
la population al-GPA RPBS-CM
renferme 30,2 p.cent de sucres totaux, la
2
teneur de chacun des dérivés séparés sur AXIO dans la glycoprotéine peut
être recalculée. Ceci nous donne 12,68 p.cent de neutres (01), 12,68 p.cent
de monosialyls (02) et 4,83 p.cent de disialyls (03). L'hyposialylation
de cette population~-GPA RPBS-CM
est importante compte tenu du pourcentage
2
des dérivés neutres et monosialyls. Elle avait déjà été détectée par notre
protocole immunochimique qui avait conduit à une hyposialylation de 20 p.
cent. Il apparaît donc que le fait d'avoir sélectionné les animaux dans leur
réponse au phénobarbital se traduise par une augmentation de la teneur
en oligosaccharides neutres.
A la suite de cette étude, nous pouvons affirmer que chez le
rat, le traitement par le phénobarbital provoque une élévation de la
teneur en restes osidyls de l'al-GPA. Il y a probablement une augmentation
du nombre de chaînes glycanniques bien que les techniques utilisées ne nous
aient pas permis de déterminer véritablement le nombre de liaisons Asn-
oligosaccharidiques.
D'autre part, l'al-GPA de rat traité par le phénobarbital
possède des chaînes glycanniques de type ~l-acétyllactosaminyl moins
branchées et incomplètes (présence d'oligosaccharides neutres et mono-
sialylés). Ces structures moins branchées sont formées aux dépens de
structures tétraantennées. Ces résultats sont largement confirmés lors
de l'étude de la fraction~-GPA RPBS-CM
qui se traduit par une absence
l
totale d'oligosaccharides tétraantennés et par une augmentation impor-
tante de glycannes diantennés à caractère ne'ltre.

---

DISCUSSION GENERALE
ET CONCLUSION

---

119
Notre travail a eu essentiellement pour objectif la mise au
point de modèles expérimentaux permettant d'étudier les variations de
structures des glycannes de l'al-GPA. Nous avons toutefois étudié si-
multanément les variations de sa concentration plasmatique par rapport
à celles de la concentration en protides totaux et en albumine.
Nous avons choisi deux types de substances qui, d'après les
données de la littérature,
sont
susceptibles d'avoir des effets opposés
la GaIN conduisant à une insuffisance hépatocellulaire et le PB inducteur
puissant des enzymes hépatiques. Le PB a été étudié seul ou en association
avec l'essence de térébenthine.
Les résultats analytiques sont examinés et commentés au long
des chapitres précédents. Dans cette discussion générale, nos résultats
seront confrontés aux données existant dans la littérature en tenant
compte d'une part du métabolisme des glycoprotéines et d'autre part, des
modifications du métabolisme hépatique provoquées par ces substances.
Nous traiterons d'abord des effets de la GaIN pour aborder plus longuement
et en dernier lieu l'action du PB.
Plusieurs phénomènes ont lieu lors de l'injection de la GaIN.
La plupart d'entre-eux sont bien étudiés et sont la conséquence de la
dépression sélective d'uridylates du fait de leur participation au méta-
bolisme de la GaIN (Decker et Keppler, 1972,21 ). Il en résulte un
développement rapide d'une insuffisance hépatocellulaire sévère comparable
à l'hépatite virale humaine (Decker et al, 1971,2B ).
Bien que nous n'ayons abordé dans ce travail chez le rat que
l'étude des protéines totales sériques et de 2 protéines spécifiques
al-GPA et albumine, nos résultats font apparaitre clairement que la
synthèse protéique est affectée. La diminution de la concentration plas-
matique en al-GPA est la plus spectaculaire (55 p.cent à J3), celle de
la concentration en albumine et en protides totaux est plus modérée.

---

120
L'effondrement des taux des protéines plasmatiques et intra-
hépatiques est globalement retrouvé par tous les auteurs, quelle que
soit la dose de GalN injectée. (Monier et Wagle, 1971, E8
Mandl et al,
1979, 64 ; Sawamura et al, 1981,92. j Handl et al, 1982,65
). flous ne
reprendrons que quelques études: celles de Bauer et al (1974,6
), de
Sawamura et al (1981, 92. ) et de Sirowej et al (1980,103 ).
A côté d'une diminution de l'incorporation de leucine radio-
marquée dans les protéines plasmatiques, Bauer et al (1974, 6
) notent
également une diminution de la vitesse de sécrétion de l'ensemble des
glycoprotéines plasmatiques. Ils montrent aussi que la fraction albuminique
présente dans le Golgi est diminuée de moitié.
D'autres altérations importantes sont aussi rapportées par
Sawamura et al (1981,92 ). L'injection de la GalN (900 mg/kg de poids
corporel) s'est accompagnée d'une diminution marquée du taux des protéines
sériques et surtout des protéines microsomales comme le cytochrome P 450.
Les holoprotéines et les glycoprotéines ne sont pas les seuls
éléments dont la concentration plasmatique est modifiée. La teneur en
a-lipoprotéines est aussi diminuée à l'électrophorèse en gel d'agarose
(Sirowej et al, 1980,103). En gel de polyacrylamide,les C-apoprotéines
dans les VLDL et HDL sont les plus atteintes.
Toutes ces modifications sont dues bien sur à un déficit en
uraciles nucléotides mais aussi à la formation d'un polysaccharide
basique, l'aminoglycogène qui précipite in situ le réticulum endoplasmique
et les ribosomes. (Mandl et al, 1979,64
j
t1andl et al, 1982,65 ).
Dans la littérature, très peu d'informations portent sur la partie
glycannique et ses modifications au cours du traitement par la GalN. Au
cours de notre étude, nous avons observé une hyposialylation et une aug-
mentation des isotypes d' al-GPA non ou peu retenus par la Con A.
La diminution de la teneur en restes sialyls aussi bien que
celle des autres résidus osidyls a été observée par Kiss et al (1981,5Z )
dans les lipoprotéines des classes VLDL et LDL. S'agit-il d'une diminution
de la teneur des seuls résidus sialyls ou est-ce un phénomène plus général
touchant les autres résidus osidyls ? Dans l'état actuel de nos travaux,
il est impossible de le dire. Toutefois, d'après les résultats de Bauer
et al (1974, 6
) nous pouvons suggérer que l'hyposialylation est liée

---

121
au fait que l'accepteur susceptible de recevoir le résidu sialyl sous
l'action d'une sialyltransférase est inadéquat ou en concentration in-
suffisante. Nous pouvons trouver deux raisons à cela. i) Lors d'études
in vitro l'activité de la galactosyltransférase est partiellement inhibée
par les métabolites de la GaIN qui s'accumulent lors de l'intoxication.
ii) La galactosyltransférase est capable de transfére~à un pourcentage
certes faible, la galactosamine au lieu du. gal sur l'accepteur endogène.
Il en résulte vraisemblablement une diminution de l'incorporation du reste
galactosyl dans les glycoprotéines d'où un appauvrissement ultérieur en
résidu sial yI en position terminale.
Nous pourrions donc admettre que l'hyposialylation de l' al-GPA
est un phénomène secondaire consécutif a un trouble de synthèse situé
plus en "amont". L'étude des isotypes en CIAE Con A va dans ce sens.
De plus, la présence de matériel désialylé a été mise en
évidence par Sawamura et al (1981,92 ) . Leur protocole utilisé est
di fférent du nôtre, mais a conduit
~
aux memes résultats. Ces auteurs ont
mesuré la quantité d'asialoglycoprotéines sériques par une technique
d'inhibition. A une concentration de récepteur d'Ashwell (membrane plas-
matique hépatique) est ajouté un volume déterminé de sérum de rat dialysé.
Après incubation optimale, un exces d' 125 1 asialoorosomucoïde est in-
troduit dans le milieu réactionnel. La radioactivité fixée est d'autant plus
faible que le sérum étudié est plus riche en asialoglycoprotéines. Ils ont,
par ailleurs, signalé une diminution de synthèse du récepteur hépatique
d'épuration des asialoglycoprotéines (Ashwell et MoreIl, 1974,3
).
L'analyse des variations séquentielles des structures glycanniques
en CIAE Con A sous l'effet de la GaIN nous a montré 3 phases.
La première est caractérisée pendant les 3 premiers jours par
une élévation des isotypes peu ou pas retenus. Deux explications peuvent
être avancées
1) Il est montré que lors de l'administration de la GaIN, les
uraciles nucléotides sont bloqués par une forte concentration non physio-
logique de GaIN à partir de laquelle se forment des UDP-hexosamines et
N-acétylhexosamines (KeppLer et al, 1970,50 ). Dans ces conditions, la
cellule hépatique se trouverait en présence d'une forte teneur en UDP-
GlcNAc, substrats potentiels des GnT responsables du degré de branchement
des glycoprotéines du type complexe (Schachter, 1984,95 ). Nous rappelons

---

122
que plus le nombre d'antennes est élevé, moins la glycoprotéine est
reconnue par la Con A ; et inversement, moins les résidus mannosyls du core
sont encombrés, plus elle est reconnue (Krusius et al, 1976,5~ ; Bayard
et Kerckaert, 1980, ~
). Nous pouvons donc suggérer que, lors de cette
première phase, il y ait synthèse accrue de molécules dl al-GPA hautement
branchées.
2) Par ailleurs, il est rapporté par les travaux de Bauer et al
(1974, 6
) que la galactosyltransférase (GalT) dans le Golgi est inhibée
par les métabolites de la GaIN. Le transfert accru de résidus GleNAc grace
à l'action des GnT pourrait d'autant mieux se faire que le transfert du
reste Gal peut être partiellement bloqué. En effet, toute fixation de
résidu Gal sur une branche de glycanne
interdit toute possibilité d'action
des GnT sur les autres antennes (sur les autres restes Man) (Schachter
et al, 1983, 94 ). En d' autres termes, dans notre situation, une diminution
ou inhibition de la galactosylation peut correspondre ou provoquer une
augmentation du degré de branchement des glycannes.
Il est à noter qu'une structure complexe di-antennée reconnue
par la Con A ne l'est plus lorsqu'elle porte un résidu GleNAc sur le
résidu Man en S du core (Schachter et al, 1982,9:5
et Bayard et al, 1983,9
ce qui entrainerait aussi une augmentation de l'isotype non retenu.
Entre J3 et J4, le profil de l'eX. I-GPA en CIAE Con As' est
caractérisé par un retour vers les valeurs de base. Cette période correspond
à la deuxième phase. Nous rappelons que c'est à cette deuxième phase très
courte que nous avons observé une hyposialylation maximale.
La dernière phase ressemble à la première, mais l'élévation des
isotypes peu ou pas retenus demeure à la fin de notre période d'étude. Les
mécanismes à l'origine sont sûrement différents de ceux de la première
phase. D'autres points de contrôle de la glycosylation peuvent être
modifiés après l'hépatite à la GaIN. Citons l'effet de la séquence poly-
peptidique sur la spécificité des transférases, la distribution des trans-
férases le long du système endomembranaire, la compartimentation et la
disponibilité des substrats (Dunphy et Rothman, 1983,30 ; Schachter et
al, 1983,94 ; Barthelson et Roth, 1985,5
). Il serait difficile de
comparer nos résultats à ceux d'autres auteurs~qu'aucune étude de
structure n'a été réalisée au-delà de 5 jours. Toutefois, selon Lesch

---

123
et al (1970,5S ))la restauration des modifications ultrastructurales
du foie ne survient qu'au bout de 7 à 12 jours. La persistance de l'élé-
vation des formes non liées à la Con A entre J5 et J9 pourrait donc indi-
quer une affection chronique du foie. Ces résultats sont comparables à
ceux obtenus dans la cirrhose alcoolique et dans l'hépatite virale où
les formes de transferrine non liées à la Con A ont été retrouvées (Spik et
al, 1983,\\04).
Lorsque les rats sont traités par le PB, il s'ensuit une
augmentation significative de la concentration plasmatique en ŒI-GPA
sans variation de la concentration en protides totaux et en albumine.
L'effet du PB a surtout été étudié sur les enzymes du métabo-
lisme des médicaments (Conney, 1967,25 ; Williams et al, 1979,1~9 ;
Yacobi et al, 1977a, 1Z1). Son rôle dans le métabolisme des protéines
intrahépatiques et des protéines de sécrétion a déjà été étudié par divers
auteurs. L'interprétation des résultats est parfois délicate. Les proto-
coles sont souvent
très différents: protocole in vivo aigu ou chro-
nique (Kato et al, 1965,44
; Yacobi et al, 1977b,All), étude sur coupes
de foie, hépatocytes isolés ou fractions subcellulaires (Tuma et al, 1978,
-112.; Ragnotti et Aletti, 1978, gr ; Cajone et Bernelli-Zazzera, 1984,42 ).
Le plus souvent, le métabolisme protéique est apprécié après incorporation
d'acides aminés radiomarqués dans les peptides naissants, par la mesure
de la radioactivité contenue dans le précipité trichloroacétique. Il arrive
parfois que certaines protéines, comme l'albumine, soient dosées spécifi-
quement. L'absence de variation de la concentration sérique en albumine
que nous avons observée a déjà été rapportée par Yacobi et al (1977a,1 Z{)
et Brinkschulte et Breyer-Pfaff (1982, ~1 ), tout comme l'absence de
modification de la teneur en séromucoide acido-soluble (Brinkschulte et
Breyer-Pfaff, 1982,21 ). L'ŒI-GPA, bien que constituant majeur de cette
fraction, est loin d'être la seule, il nous est donc difficile de comparer
nos valeurs à celles des séromucoïdes.
D'autre part, divers auteurs ont montré que, sous l'effet du PB,
il Y avait une augmentation de la synthèse des protéines du R.E. précédée
d'un accroissement de la transcription (Glazer et Sartorelli, 1972,3~ ;
Ragnotti et Aletti, 1978, 8"f ; Hardwick et al, 1983, \\+2 ). Ce phénomène
s'accompagne d'une hypertrophie du foie et d'une élévation dunombre de

---

124
polyribosomes associés au R.E. Tuma et al (1978,~,~~ ) ont étudié un
effet immédiat aigu (100 mg de PB/kg en une seule injection), de plus
leur étude est faite 12 heures après le traitement. Ce temps est trop
court puisque c'est seulement 16 à 18 heures après des administrations
répétées de PB qu'on note une activité transcriptionnelle positive
(Hardwick et al, 1983,42 ). Ce n'est aussi qu'après un temps de latence
de 48 à 72 heures que des variations d'activités enzymatiques ou d'effets
pharmacologiques sont observés. C'est ainsi qu'à J6, c'est-à-dire 3 jours
après la dernière injection du PB, alors que la concentration plasmatique
en al-GPA a atteint son maximum, le PB n'est détectable qu'à l'état de
trace.
Le PB comme l'essence de térébenthine sont des produits inducteurs
qui provoquent des modifications ultrastructurales du R.E. Ces modifications
sont suivies d'une augmentation du R.E. avec une polymérisation accrue des
ribosomes (Orrenius et al,196S, 18 ; Turchen et al, 1977, A13). Puisque
l' al-GPA est une protéine majeure de l'inflammation chez le rat (Jamieson
et al, 1972,44) nous avons associé le PB à l'essence de térébenthine et
observé un effet additif de leurs effets sur la concentration plasmatique
de l'al-GPA. Le PB n'altère donc en rien l'effet de l'essence de térébenthine
sur la synthèse et la sécrétion de l'al-GPA.
Il est maintenant prouvé que l'essence de térébenthine agit
essentiellement en induisant la synthèse de l'ARN messager de l'al-GPA
(Diarra-Mehrpour et al, 1985,~9 ). Nous ne pouvons pas avancer encore un
tel mécanisme pour expliquer cet effet PB. C'est toutefois une hypothèse
raisonnable de travail puisqu'il a été parfaitement démontré que le PB
induit la synthèse de formes moléculaires bien déterminées de cytochrome
P-4S0 avec accumulation des ARN messagers correspondants.
L'étude analytique en CIAE Con A puis l'analyse de structure
de l'al-GPA de rats traités par le PB présentent les résultats suivants
- augmentation en sucres totaux, orientation des chaines glycan-
niques vers des structures moins ramifiées et incomplètes. Le fait le plus
marquant est la disparition des glycannes tétraantennés que l'on retrouve dans
l'al-GPA de rat normal. Il reste toujours difficile de conclure sur le nombre
de résidus sialyls élevé par rapport au nombre d'antennes dans les isotypes
peu ou pas retenus. Yoshima et al (1981,~~S ) ont identifié 2 restes sialyls

---

125
sur une antenne du fait de la sequence GalBl-3 GleNAc. Par ailleurs,
Bernard et al (1984,1L
) ont rapporté la présence de 2 restes sialyls sur
une même antenne.
Si nous considérons l'effet inducteur du PB, nous pouvons
suggerer que les altérations des structures glycanniques surviennent
essentiellement lors du processus de glycosylation et non lors de la
phase de dégradation. Ces altérations n'ont pas lieu sur la partie interne
des oligosaccharides qui est remarquablement invariable d'une N-glycosyl-
protéine à une autre.
Quels sont les systèmes enzymatiques qui ont pu alors échapper
au contrôle ?
1) Les activités GnTI et mannosidasique II (Harpaz et Schachter,
1980,4-;
; Allen et al, 1984,1
ne peuvent pas être mises en cause. Ce
qui est certain c'est qu'il n'y a pas de diminution de ces activités
puisque nous n'avons pas identifié de structures oligomannosidique et
de type mixte.
2) L'activité de la GnT nI catalysant la fixation d'un résidu
GleNAc intercalaire sur le résidu Man en S du core (Narasimhan et al,
1981, "14 ) ne s'exprime ni dans l'ul-GPA RN ni dans l' ul-GPA RPB.
3) Du fait de l'absence des structures tétraantennées dans
l'ul-GPA de rat traité par le PB, nous pouvons admettre que l'activité
GnT V initiant la 4ème antenne est inhibée ou inexistante.
4) Puisque les structures bi et triantennées sont augmentées
on pourrait penser que l'activité de la GnT II et de la GnT IV catalysant
respectivement leur formation (Narasimhan et al, 1977,13 ; Gleeson et
al, 1982,35 ) sont élevées. En fait, i l parait plus logique de baser
notre discussion sur la comparaison de l'activité des Gn~ et celle de la
galactosyltransférase. Nous rappelons que tout transfert d'un résidu Gal
sur une antenne en cours de synthèse bloque toute fixation ultérieure d'un
reste GleNAc sur les résidus Man du "core". Par conséquent, il nous semble
que c'est à ce niveau que se situe l'effet du PB. En effet, une plus grande
'efficacité dans la fixation du résidu Gal limiterait le transfert du

---

126
GleNAc en 61.4 sur le Man al.3 (augmentation des diantennes), ou inhi-
berait totalement l'action de la GnT V en 61.6 sur le Man al.6 (absence de
tétraantennes et augmentation des triantennes).
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer
l'efficacité de la galactosyltransférase par rapport à celle des GnTs.
i
Nous pouvons tout simplement admettre qu'il y a eu induction
spécifique de l'activité
galactosyltransférasique qui est dès lors
augmentée par rapport à celles des GnTs.
ii Le cheminement de la glycoprotéine dans les compartiments
intracellulaires peut être accéléré de telle façon que les enzymes loca-
lisées dans des organelles bien déterminées ne peuvent pas agir au maximum.
En d'autres termes, la glycoprotéine pourrait quitter rapidement le Golgi-
cis sans l'action maximale des GnTs qui y sont localisées. La galactosyl-
transférase et les sial yI transférases (partiellement) peuvent ensuite agir
sur les structures moins branchées. Récemment, Macintyre et al (1985,62 )
ont bien montré qu'au cours de la réponse inflammatoire, il y a augmentation
de la vitesse de la sécrétion de la protéine C-réactive. Si un tel méca-
nisme a lieu lors du traitement par le PB, le séjour intracellulaire de
l' al-GPA serait écourté et elle serait sécrétée avec des structures
glycanniques moins ramifiées et incomplètes.
iii La disponibilité des glycosyltransférases dans des zones
spécifiques des lobules hépatiques (zones périportale et centrolobulaire)
peut être incriminée dans les modifications. Certains isotypes pourraient
être synthétisés dans une zone cellulaire spécifique.
Supposons que les cellules centrolobulaires aient une activité
en GleNAc Ts plus élevée que celle en galactosyltransférase. L'activité
de la galactosyltransférase pourrait être augmentée par le PB dont on sait
qu'il induit préférentiellement les enzymes de la zone centrolobulaire
(Gumucio et al, 1978, ~O ). Il en résulterait une inhibition partielle ou
totale des GleNAc Ts et donc une sécrétion accrue de glycannes moins
antennés. La détermination de l'activité de certaines glycosyltransférases
serait intéressante. Il est toutefois indispensable de mieux préciser la
structure des glycannes par des études en RMN.

---

127
En tout dernier lieu, nous voudrions insister sur l'intérêt
prédictif des techniques immunochimiques directement applicables sur
serum.
En ce qui concerne le protocole d'évaluation de l'hyposialy-
lation, nous avons fixé une limite d'interprétation qui, au vu
des
résultats, est trop stricte. Nous pourrions en fait établir 3 zones
une zone de sialylation normale correspondant à une sous-évaluation en
EID par rapport à l'IDR comprise entre a et
5 %, une 2ème zone de sous-
évaluation comprise entre 5 et la % pour laquelle l'hyposialylation,
quoique faible, doit être prise en considération, une 3ème zone située
au-delà de 10 % avec une hyposialylation nette, largement confirmée par
la détermination de la teneur en restes sialyls de l'ŒI-GPA RPBS CM2.
- La CIAE Con A réalisée sur sérum nous apporte des résultats
mieux cernés sur le plan quantitatif. L'évolution des valeurs relatives
de chaque isotypeou des rapports RI et R2 est plus précise. Dans le
modèle PB, il apparait que l'accroissement dans la proportion de l'isotype
fortement retenu est bien dû à une augmentation dans la proportion des
glycannes diantennés. Cependant, le rapport R2 (isotypes ~/1+2+3) apparait
plus faible lorsqu'il est comparé au rapport R3 diantennes/tri et (ou)
tétraantennes déterminé lors de l'étude des glycannes de l' ŒI-GPA purifiée
. Chaque isotype identifié en CIAE Con A ne correspond pas à une
structure glycannique bien déterminée. Toutefois, l'intérêt diagnostic
(Wells et al, 1981, ~~g; Nicollet et al,1981, 15 ) et prédictif de cette
technique n'en demeure pas moins vrai.
Avec ces 2 protocoles immunochimiques applicables à toute
glycoprotéine dans la mesure où nous disposons de l'immunsérum corres-
pondant, nous disposons d'un outil extrêmement précieux pour détecter
des altérations de structure des glycannes d'une glycoprotéine.

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Journal of Immunological Methods, 74 (1984) 267-271
267
Elsevier
HM 03263
An Immunochemical Procedure to Evaluate the
Degree of Desialylation of lX -Acid Glycoprotein in
1
Rat Serum
Daniel Biou, Dagui Monnet, Françoise Millet, Jeanne Feger and
Geneviève Durand
Centre d'Etudes Pharmaceutiques et Biologiques, (Université Paris-Sud), Département de Biochimie
Générale, Rue Jean - Baptiste Clément, 92290 Chatenay - Malabry, France
(Reeeived 2 April 1984, accepted 24 July 1984)
When radial immunodiffusion (RIO) and e1ectroimmunodiffusion (EIO) were used for the determina-
tion of rat Ql-acid g1ycoprotein (Ql-AGP) a significant discrepancy in the results was encountered
depending on the degree of sialylation. When Q\\-AGP was desialylated. the amounts estimated by EIO'
were much lower than those actually present as assayed by the RIO method.
The relationship between the percentage of desialylation of Q\\-AGP and the percentage of its
underestimation by EIO relative to RIO was determined and a calibration curve was plotted to evaluate
the degree of desialylation of rat Q.-AGP.
When compared to other procedures (rat membrane inhibition assay and isoelectrofocusing), the
proposed method was easier to perform and allowed the specifie evaluation of the degree of undersialyla-
tion of the glycoprotein.
Key words: Q/-acid glycoprotein - rat serum - desialylation - electroimmunodiffusion
Introduction
• Recently we have shown (Bordas et al., 1981) that the removal of terminal sialic
acid of the carbohydrate chains of human uj-acid glycoprotein (uj-AGP) leads to an
underestimation of its quantification by the rocket electroimmunodiffusion method
(EID) of Laurell (1966) but does not influence the results obtained by the radial
immunodiffusion method (RID) of Mancini et al. (1965).
Underestimation by EID is a consequence of decreased electrophoretic mobility
and the latter is inversely related to the sialic acid content. Thus with the same
",
antigen concentrations, rockets obtained with native uj-AGP were sharp and high,
whereas those obtained with the asialo uj-AGP appeared low and broad.
The purpose of the present work was to establish a calibration curve for
evaluating the degree of desialylation of rat u1-AGP.
0022-1759/84/$03.00 «'J 1984 Elsevier Science Publishers B.V.

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268
Materials and Methods
Reagents
A37 indubiose, and DEAE Trisacryl, were obtained from Industrie Biologique
Française, Villeneuve la Garenne, France, 6000 polyethylene glycol, CM 52-cel-
lulose, neurarninidase, Freund's complete and incomplete adjuvants were purchased
from Fluka, Whatrnan, Behringwerke and Difco, respectively.
Preparation of rat arAGP
Rat al-AGP was isolated from the serum of adult male rats (Sprague-Dawley) by
chromatography on DEAE-Trisacryl and CM 52 cellulose columns according to the
procedure of Shibata et al. (1977). The hornogeneity of the protein was established
by sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel. Its antigenic purity and identity were
established by immunoelectrophoresis and immunodiffusion using a solution of
purified a\\-AGP (40 g/I) and an tisera against a
and rat serum proteins. The
1-AGP
sialic acid content was 7.9%.
Preparation of anti-rat a,-AGP serum
Antiserum against rat a
was prepared in rabbits (Fauve de Bourgogne) by
1-AGP
administering 2 ml of an emulsion v/v (1: 1) of desialylated aj-AGP (200 /lg) with
Freund's complete adjuvant. A 250 ,ul aliquot was injected intradermally into each
of the two back footpads and the rest subcutaneously into 10 sites along the back.
When the antibody titer was sufficiently high, animaIs were bled of 20 ml twice a
month and this was repeated 3 or even 4 times. When the level of antibody dropped,
animaIs were boosted according to the procedure noted above and bled 7-10 days
later.
Rabbit antiserum was stored at - 20 0 C with 1% sodium azide (wIv) and 10%
glycerol (v/v). The antibody titer measured with the reverse RID method according
to the procedure of Becker (1969) and Durand et al. (1976) was 0.170 mg aj-AGP/ml
antiserum.
Partial enzymatic desialylation of arAGP (Bordas et al., 1981)
a\\-AGP (2.35 mg) was incubated with 235 urnol sodium acetate buffer pH 5.50,
705 ,umol NaCl, 42 ,umol csci, and 390 mU neuraminidase (EC 3.2.1.18) derived
from Vibrio cholerae (variety Comma) in a volume of 4.7 ml at 37 0 C. At times
ranging from 3 to 120 min, aliquots were withdrawn in order to de termine' released
sialic acid and to assay a
by RID and EID after appropriate dilution with
1-AGP
0.05 rnmolyl glycine-NaOH buffer pH 9, containing 18 rnmolyl EDTA.
Determination of a,-AGP by radial immunodiffusion (RID)
Aliquots (4 ,ul) of native and partially sialylated a
samples were applied to
1-AGP
1% A37 indubiose gel containing 4.5% antiserum to rat a
and diffusion was
1-AGP
allowed to take place for 48 h. Theareas of the circular immunoprecipitates
visualized by Coomassie blue, expressed as diameter squared, were plotted as a
function of pure native a
concentration (ranging from 80 to 200 rngy'l) to
1-AGP
provide a standard curve.

---

269
The intra- and inter-day standard deviations of the method for an a1-AGP
concentration of 240 mgy! were 10 mgy! and 11.5 rngyl, respectively.
Determination of arAGP by e/ectroimmunodiffusion (EID)
Appropriately diluted aliquots (5 }-LI) of solutions of native and partially sialylated
a1-AGP were subjected to electrophoresis at 8.5 V/cm for 4 h in 1% A37 indubiose
gel (electroendosmosis = - 0.17) containing 4% (wIv) 6000 polyethylene glycol and
3.5% antiserum to rat aj-AGP. The calibration curve was obtained by plotting the
height of the rockets, as a function of pure native a1-AGP concentration (ranging
from 15 to 75 mgyl). The intra- and inter-day standard deviations of the method
were 5.8 mgy! and 9.7 mgyl, respectively for an a\\-AGP concentration of 240 mgyl.
Sia/ic acid determination
Sialic acid was estimated by the thiobarbituric assay of Warren (1959).
Results and Discussion
Treatment of native a\\-AGP with neuraminidase for various periods of time
resulted in a graduaI removal of up to 60% of the sialic acid initially present. As
desialylation progressed, samples withdrawn from the incubation mixture showed
decreasing evaluation of aj-AGP concentration by EID. The unchanged results
obtained by RID indicate that the phenomenon was not due to any alteration in
a1-AGP antigenicity, but to a decreased electrophoretic mobility. Therefore the EID
method will lead to an underestimation of partially desialylated a1-AGP when
results are estimated with the aid of a calibration curve based on native a1-AGP.
The relationship between the percentage desialylation of al-AGP and the per-
50
z
a
~.
40
~>=
<J)
..
u.J
30
CI:
u.J
Cl
Z
::;)
20
u-
a
~ 10
/
~ ::>~;~./
la
20
30
40
50
60
70
("1.) OF
DESIALYLATION OFo<,AGP
Fig. 1. Experimental calibration curve for determination of the degree of desialylation of rat aj-acid
glycoprorein. Percent age of underestimation of a\\-AGP by EID relative to RID as a function of the
percentage of sialic acid released by neuraminidase.

---

270
centage underestimation by EID relative to RID is shown in Fig. 1. In this system
the relationship between the underestimation in EID and desialylation was highly
significant (r = 0.960; P ~ 0.001, Spearman's rank correlation). The smoothing
technic applied to the experimental values leads to an empirical curve. Therefore, to
define the residual variability of our method, two lines were drawn from each side of
the median line which included 66% of the experimental values. This degree of
dispersion is a consequence of three variables (released sialic acid, and the lX1-AGP
determinations by both EID and RID) required to set up the calibration curve.
The lower experimental point of the calibration curve for underestimation by EID
was about 2%. Taking the standard deviations of EID and RID into account,
however, we propose 5% as the lower threshold for underestimation. The corre-
sponding threshold for the desialylation assay was about 10.5%. Therefore, a
percentage of desialylation of up to 10.5% should be considered normal.
A more convenient linear approximation could be obtained by orthogonal regres-
sion (Fig. 2). The straight line calculated, the equation of which is y = 1.42 + O.86x,
allows an easier estimation of the degree of desialylation x from the degree of
underestimation y.
Compared to the rat membrane inhibition assay (Van Lenten and Ashwell, 1972;
Marshall et al., 1974) which needs radiolabeled asialoglycoprotein and measures the
whole desialylated material, our procedure is easier to perform and allows the
evaluation ofthe degree of undersialylation of the glycoprotein studied. Compared
to isoelectrofocusing (Stibler et al., 1979) our method is both quantitative and more
sensitive.
A correlation between the underestimation by EID relative to RID and the
percentage of desialylation has now been established for four sialoglycoproteins:
lX1-AGP, lX1-antitrypsin (Bordas et al., 1982), hemopexin and Cj-inactivator
(Serbource-Goguel et al., 1984). Thus the presence of desialylated a1-AGP (and to
a lesser extent lX -an titryp sin) correlated weIl with the severity of hepatoceIlular
1
damage (Serbource-Goguel et al., 1983). The use of this procedure to evaluate the
50
Z
40
g
!:a
::::!:
Bi 30
u.J
Cl:
u.J
~ 20
~
u..
a
~ la
la
20
30
40
50
60
70
('l.) Of DESIALYLATION Of oc 1 AGP
Fig. 2. Calibration curve for the determination of the degree of desialylation of rai a\\-acid glycoprotein
obtained by orthogonal regression.

---

271
desialylation of aj-AGP in pathological rat models could help provide a better
understanding of the mechanisms which lead to the desialylation of glycoproteins.
..
Acknowledgements
This work was supported by le Centre National de la Recherche Scientifique,
France, ERA 396. The authors wish to acknowledge J. Davy for his assistance with
the data analysis.
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Offprint from
Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry
Walter de Gruyter -
Berlin -
New York

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Monnet, D. Durand. Biou, Féger and G. Durand: a:,-Acid glycoprotein in D-galactosamine-induced liver injury
249
J. Clin. Chem. Clin. Biochem.
Vol. 23, 1985. pp. 249 - 253
. D-Galactosamine-lnduced Liver lnjury:
A Rat Model to Study the Heterogeneity of the Oligosaccharide Chains
of œ.-Acid Glycoprotein
By D. Monnet
Laboratoire de Biochimie, Université Paris-Sud, Chatenay-Malabry, France
D. Durand
Laboratoire d'Endocrinologie, U. E. R. des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Paris, France
D. Biou, J. Féger and G. Durand
Laboratoire de Biochimie, Université Paris-Sud, Chatenay-Malabry, France
(Received July 17/November 16. 1984)
Summary: The effect of D-galactosamine on the structure of the glycan moiety of Cï\\-acid glycoprotein was
studied throughout a nine da ys experiment. It was shown that:
. l ) D-galactosamine led to an alteration of the Concanavalin A crossed immunoelectrophoresis pattern and
to a decreased sialic acid content of Cït-acid glycoprotein.
2) The undersialylation of Cït-acid glycoprotein was not linked to a change in the relative ratio of various
Concanavalin A forms.
3) At the end of the experiment (9 days after galactosamine injection), the Concanavalin A non-reactive
forms of Cïl-acid glycoprotein remained elevated whereas alanine transaminase activity, total protein and
œ-acid glycoprotein had returned to a control level.
D-galactosamine-treated rats seem to be a suitable model for the study of the very fast cyciic modulations
of the synthesis of the glycan moiety of glycoproteins.
D-Galaktosamin-bedingte Leberschâdigung:
Ein Ratten-Modell zum Studium der Heterogenitdt der Oligosaccharidketten von'J.I-saurem Glykoprotein
Zusammenfassung: Wâhrend eines neun Tage dauernden Experiments wurde der Einfluû von D-Galaktosamin
auf die Struktur des Glykananteils von Cït-saurem Glykoprotein untersucht. Es wird gezeigt, daf
1. D-Galaktosamin zu einer Verànderung des Bildes der Concanavalin A-Kreuz-Immunelektrophorese und
zu einem verringerten Sialinsâuregehalt von Cïl-saurem Glykoprotein führt:
2. die geringere Sialylierung von Cï\\-saurem Glykoprotein nicht mit einer Ànderung des Verhâltnisses der
verschiedenen mit Concanavalin A reagierenden Formen verbunden war;
3. am Schlu13 des Experiments neun Tage nach Injektion von D-Galaktosamin die nicht mit Concanavalin
A reagierenden Formen von Cït-Saurem Glykoprotein erhôht bleiben, wahrend die katalytische Konzentra-
tion von Alaninaminotransferase sowie die Gesamtkonzentration von Protein und Cïl-saurem Glykoprotein
auf die bei Kontrollen beobachteten Werte zurückgekehrt war.
Mit D-Galaktosamin behandelte Ratten scheinen ein geeignetes Modell zum Studium der sehr schnellen
zyklischen Modulationen der Synthese des Glykananteils von Glykoproteinen zu sein.
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 23. 1985/ No. 4

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250
Monnet, D. Durand, Biou, Féger and G. Durand: at-Acid glycoprotein in D-galactosamine-induced liver injury
Introduction
Results were found to be within the normal range when the
underevaluation by electroimmunodiffusion was below 5%
Several laboratories have recently reported that the
which corresponded to less than 10% of undersialylation.
glycan moiety of plasma glycoproteins can be altered
Crossed immunoaffinity electrophoresis
ln various pathological conditions (1). These mod-
ifications were concerned with either the non-re-
Crossed immunoaffinity electrophoresis was carried out essen-
tially as described by Beg Hansen et al. (9), using buffer pH 8.7
ducing terminal carbohydrate of the oligosaccharide
containing 72 mrnol/l Tris, 24 rnrnol/l barbital, 0.4 mrnol/l
moiety (sialic acid or fucose) or the degree of oligo-
calcium lactate, 0.2 rnmol/l sodium azide. Concanavalin A
saccharide branching (two, three or tetraantennary
(50 g/l) was dissolved in a solution containing 1 rnrnol/l each
of MgCI
and CaCl
structures). Undersialylated glycoproteins have been
2 , MnCl 2
2 and
was added to the first di-
mension gel to give ! 50 Jlg/cm2 The second dimension gel
found in plasma from patients with liver damage
contained 40 g/l a-D-methylglucopyranoside.
(2-4) whereas the inflammatory process was as-
The gel (10 g/I agarose) was poured at a depth of 1.2 mm. A
sociated with the synthesis of poorly branched al-
sample volume of 15 Jll of diluted rat sera containing 1.5 ug of
a,-acid glycoprotein was used. The first dimension was run at
acid glycoprotein (5). However the functional sig-
10 V/cm for 90 min and the second at 2.5 V/cm for 18 h. After
nificance of these
minor and major glycan he-
drying and staining, peak areas were quantified by planimetrie
terogeneities remains obscure.
evaluation.
A Concanavalin A crossed immunoaffinity electrophoresis of
In this report, we study concomitantly the sialylation
at-acid glycoprotein from control sera exhibited four peaks.
and the degree of oligosaccharide branching of al-
Component 1 was the least reactive or unreactive with Con-
canavalin A, components 2 and 3 were weakly reactive and
acid glycoprotein in D-galactosamine-treated rats.
component 4 was the most reactive. The relative proportions
The variations in glycoprotein sialylation were meas-
ofcomponents 1,2,3 and 4 were 18 ± 4, 25 ± 3, 18 ± 3,39 ± 6
ured with an immunochemical procedure, previously
(m ± SO), respectively. The ratio 1/2 + 3 + 4 was 0.12.
.
reported in human (6, 7) and rat (8). al-Acid gly-
coprotein and the degree of branching was indirectly
determined by evaluating the relative ratios of various
Results
Concanavalin A-reactive forms identified by Con-
The sequential changes in rat serum were examined
canavalin A crossed immunoaffinity electrophoresis
during 9 days (01-09) after a single intraperitoneal
(9).
injection
of D-galactosamine
(900 mg/kg).
First
alanine transaminase activity and total protein, serum
albumin and at-acid glycoprotein levels were meas-
Materials and Methods
ured in order to appreciate the leakage of the plasma
Treatment of rats
membrane and hepatocellular deficiency. The alanine
Male Sprague-Dawley rats (300 g) had free access to a standard
transaminase activity increased rapidly and reached
rat diet and water throughout the experirnent.
a maximum value at D2. Then the activity decreased
On the first day at 9 a. m. they were anesthetized and blood
gradually to reach control values at D4 or D5 (fig. 1).
samples were taken by intracardiac puncture before they were
Total protein and at-acid glycoprotein levels reached
injected intraperitoneally with D-galactosamine (900 mg/ kg
body weight). Subsequently for nine days intracardiac blood
a minimum value at D 2 but their levels returned
samples were ta ken every day after ether anesthesia. After
more slowly to control values (fig. 1). Serum albumin
centrifugation, serum was decanted and frozen at - 20 cc.
level was only slightly modified.
Control serum samples were prepared every day during nine
da ys by similarly withdrawing blood from D-galactosamine-
untreated, ether-anesthetized rats.
Changes in the percentage of undersialylation of serum
The alanine transaminase (EC 2.6.1.2) activity was expressed
(J.I-acid glycoprotein
in international units and serum protein level was determined
by a Lowry micromethod (10). A1bumin and a t-acid gly-
A sm ail proportion of undersialylated al-acid gly-
coprotein concentrations were measured by the radial irn-
munodiffusion rnethod of
coprotein was found in serum at D2 with a maximum
Mancini (1J). Antisera against rat
albumin and rat at-acid glycoprotein were prepared in our
at D4. But at D6, at-acid glycoprotein was fully
laboratory.
sialylated (fig. 2).
Determination of the percentage of undersialylation of (].t-acid
glycoprotein
Changes in the pattern of Concanavalin A crossed
Serum a,-acid glycoprotein was first measured by two im-
immunoaffinity electrophoresis of serum aç-acid gly-
munological methods: the Mancini radial immunodiffusion (II)
coprotein
and the Laurell electroimmunodiffusion (12). The percentage
of a,-acid glycoprotein underevaluation by electroimmuno-
For
D-galactosamine-treated
rats
the
pattern
diffusion relative to radial immunodiffusion was calculated.
of a,-acid glycoprotein in Concanavalin A cross-
Undersialylation was then deterrnined
using previous es-
tabiished standard curves of the relation between under-
ed
immunoaffinity
electrophoresis
was
modified
evaluation and undersialylation of a,-acid glycoprotein (8).
throughout nine days (fig. 2 and 3). The amplitudes
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 23. 1985 / No. 4

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Monnet, D. Durand, Biou, Féger and G. Durand: (X,-Acid glycoprotein in D-galaclOsamine-induced liver injury
251
c:..uc:0u
800
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Q.
0
u
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c
...
c:
,;;
ëQ.
l
200
ë
c:
o
a
4
5
t [dl
Fig. 1. Tirne-dependence of the effect of D-galactosamine (900
mg/kg body weight) throughout a nine days experiment
on the alanine transaminase activity (e-e: one typ-
ical experirnent) and on total protein (II-II: m ± 5D
from 5 separate experiments) and (X,-acid glycoprotein
(.Â.-.Â.: m ± 5D from 5 separa te experiments) levels,
compared to control rats.
0.80
Fig. 3. Concanavalin A crossed immunoaffinity electrophoresis
of Ill-acid glycoprotein from a rat treated with D-ga-
c:
lactosamine (900 mg/kg body weight). Component 1 is
'0;
the least reactive with Concanavalin A, components 2
::
Q.
and 3 are weakly reactive and component 4 is the most
0
reactive.
60
0.27 ~
C>
DO
_12 0.
= days before injection, D2, D3, D4, D6 and D9 =
U
da ys following injection. l , 2, 3 and 4 represent the
0
subpopuJations of glycoproteins which are unreactive
'"
i
"'"'cw
·and reactive with Concanavalin A.
Q.
'"w
.'2. 0.40
0.22 ~
e
?:-
.s
"'"'
..
c
'"
'"
C>-
'"
of peaks 1, 3 and 4 were dramatically aitered, whereas
l
ë
c:
~
the modification of peak 2 was less pronounced.
a17~
.
::
u-
Peak 1 reached a maximum at 02, returned ta con-
trol values at 04, reached again a maximum at 06
r and remained elevated at the end of the experiment
whereas peaks 2, 3 and 4 showed opposite variations.
a
4
5
t {dl
Fig. 2. Time-dependence of the effect of D-galactosamine (900
Discussion
mg/kg body weight) throughout a nine days experi-
ment on the undersialylation of Ilt-acid glycoprotein
Many events occur at the injection of D-galac-
( . - e ) and on the ratio of peaks 1/(2 + 3 + 4)
(II-II) caJculated after a Concanavalin A crossed
tosamine. Most of them are weil documented and are
irnmunoaffinity electrophoresis of (XI-acid glycoprotein.
the consequence of the selective trapping of uridylate
J. Clin. Chern. Clin. Biochern. / Vol. 23, 1985/ No. 4

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252
Monnet, D. Durand, Biou, Féger and G. Durand: êIl-Acid glycoprotein in D-galactosamine-induced liver injury
in order to metabolize galactosamine (13). An in-
acetylglucosamine to the ~-linked mannose residue
• crease of UDP-N-acetyl-hexosamines and
N-ace-
of the oligosaccharide core (5).
tylneuraminate with a concomitant drop of UTP,
The second phase was short (one or two da ys) and
UDP, UMP, UDP-galactose and UDP-glucose is first
characterized by a complete return of the Con-
observed. But despite a stimulation of uridylate bio-
canavalin A pattern to control values and a maximum
synthesis, a second series of perturbations occurs and
undersialysation of Cil-acid glycoprotein. This sug-
a decrease in RNA and protein synthesis together
gests that the oligosaccharide chains were partially
with the synthesis of aminoglycogen are observed.
uncompleted, which could be due either to the pre-
, Later it seems that microsomal enzymatic acitvities
sence of an inadequate substrate for sialyl transferase,
decrease. Little information is available about the
as a consequence of a loss of UDlë-galactose, or to
synthesis of the
oligosaccharide moiety
of gly-
a partial impairment of sorne glycosyl transferases.
coprotein, which is uracil-dependent (14). An in-
Recently, Sawamura et al. have also evidenced an
hibition of polypeptide synthesis as well as an alter-
accumulation of desialylated material into the circul-
ation of glycosylation process cou Id be expected.
ation of D-galactosamine-treated rats, with exactly
Due to its high carbohydrate content, Cil-acid gly-
the same sequential changes (16).
coprotein was chosen to study the effects of D-ga-
In the third phase, the Concanavalin A crossed im-
lactosamine on glycoprotein synthesis. Its plasma
munoaffinity electrophoresis profile of Ci,-acid gly-
level, the percentage of its undersialylation and the
coprotein was similar to the first one. Moreover at
heterogeneity of its oligosaccharide chains were deter-
the end of the experiment, the increase in the ratio
mined.
of peaks 1/2 + 3 + 4 persisted while total and
Firstly, it appears that cytolysis and hepatocellular
specifie proteins returned to control values. These
deficiency began at the same time but liver damage
results could be compared to those obtained in
persisted longer. The level of Ci,-acid glycoprotein was
patients with alcoholic cirrhosis where Concanavalin
dramatically decreased whereas serum albumin level
A unreactive forms of transferrin have been found
was only slightly modified.
(17). This peak increase correlates with the decrease
of transferrin level. The persistence of an elevated
Secondly, when considering structural changes of the
proportion of Concanavalin A unreactive forms of
glycan
moiety
of Cil-acid glycoprotein,
we dis-
Ci,-acid glycoprotein could indicate chronic liver
tinguished three phases.
damage.
During the first phase, at 02, a maximum increase of
An alteration of the asialoorosomucoid binding ca-
Concanavalin A unreactive components which were
pacity by liver could not be excluded, since a
counterbalanced by a marked relative decrease of
decreased asialoorosomucoid binding has been found
Concanavalin A reactive components was observed.
in by-passed rats with hepatocellular damage (18).
At the same time, the level of Ci,-acid glycoprotein
reached a minimum and its sialic acid content was
The most striking point was the very fast variations
not significantly modified. Both peptidic and oligo-
in the relative ratios of four subpopulations of Cil-
saccharidic moieties of Cil-acid glycoprotein were
acid glycoprotein. The first modifications could be
altered, showing that its synthesis was impaired at
due to an increase of sorne specifie enzyme activities
the level of transcription and then at the co- and
following on a rush of UDP-N-acetylgalactosamine.
post-translational steps. The rapid increase of Con-
The latter ones could retlect liver damage.
canavalin A unreactive forms of Cil-acid glycoprotein
could be due to the formation of hybrid or bisected
corn piex oligosaccharide which poorly interacts with
Concanavalin A. A very large pool of UDP-N-
Acknowledgments
acetylglucosamine is formed sorne hours after the D-
This work was supported by the Centre National de la Re-
galactosamine injection and can serve as a source of
cherche Scientifique -
ERA n" 396. We thank Christin Scott-
donor
mate rial
for
attaching
a
bisecting
N-
Thomas for correcting this paper.
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 23. 1985 i No. 4

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Monnet, D. 'Durand, Biou, Féger and G. Durand: <x1-Acid glycoprotein in D-galactosamine-induced liver injury
253
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Centre d'Etudes Pharmaceutiques
et Biologiques
Univ. Paris Sud
Tour D 4 -
1er Etage
Rue Jean-Baptiste Clément
F-92290 Chatenay-Malabry
. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 23. 1985 / No. 4

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C. R. Acad. Sc. Paris, t, 301, Série III, n° 5, 1985
151
BIOCHIMIE GÉNÉRALE. -
Modifications des structures glycanniques de î orosomu-
coïde de Rat provoquées par un traitement par le phénobarbital. Note de Dagui Monnet,
Jeanne Feger, Daniel Biou, Jean Agneray et Geneviève Durand, présentée par René
Truhaut.
Chez le Rat, un traitement de 3 jours au phénobarbital (80 mg/kg de poids corporel/jour) entraîne une
augmentation de la teneur plasmatique en orosomucoïde avec modification de sa structure glycannique.
L'immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A de l'orosomucoïde révèle une augmentation des formes de
structure glycannique simple, fortement retenues par la Con A, accompagnée d'une diminution des formes non
retenues ou faiblement retenues de structure plus complexe.
GENERAL
BIO CHEMISTRY.
-
Alterations
in
the
oligosaccharide
structure of
orosomucoid
in
phenobarbital-treated Rats.
The administration of phenobarbital (80 mg/kg body weight for 3 days) increased the plasma orosomucoid level
with dramatic alterations in the relative proportions of heteroglycans.
A crossed immunoaffinoelectrophoresis
witn Con A revealed an increase of strongly reactive fractions with a concomitant decrease of non and weakly
reactive fractions.
L'orosomucoïde ou cxt-Glycoprotéine acide (cx(-GPA), l'une des glycoprotéines les plus
importantes du plasma, présente des caractéristiques particulières. L'orosomucoïde est
une protéine comportant une forte proportion de glycannes (30% chez le Rat, 40% chez
l'Homme), sa teneur élevée en acide N-acétylneuraminique (8 % chez le Rat, 12% chez
l'Homme) lui confère un point iso-ionique bas. C'est aussi l'une des protéines dont le
taux plasmatique croît le plus au cours des processus inflammatoires. Toutefois, son rôle
physiologique est encore mal connu ([1], [2]).
Parmi les différents modèles expérimentaux retenus pour étudier la régulation de sa
synthèse et de sa sécrétion, le plus couramment utilisé est celui de la réponse inflammatoire
à une injection d'essence de térébenthine. Cependant, ce modèle est loin d'être admis par
tous car l'agression est brutale et la réponse implique la mise en jeu de nombreux éléments
de régulation, rendant difficile l'obtention d'un effet modulé.
Dans cette Note, nous proposons d'évaluer un modèle reposant sur l'utilisation du
phénobarbital (PB) dont l'effet sur l'activité des enzymes du métabolisme des médicaments
est parfaitement contrôlé. Il agit directement au niveau hépatique en modulant l'expres-
sion génique de ces enzymes [4] et en favorisant l'aggrégation des polyribosomes [5] où
elles sont synthétisées avant de pénétrer dans le réticulum endoplasmique. Il n'était pas
exclu que le PB puisse moduler la synthèse de I'orosomucoïde qui a lieu, pour la partie
peptidique, dans les polyribosomes et, pour la partie glycannique, dans le réticulum
endoplasmique et l'appareil de Golgi.
MATÉRIEL ET MÉTHODES. -
Animaux. -
Des Rats mâles Sprague-Dawley de 200-250 g reçoivent deu~ fois
par jour une injection intrapéritonéale d'une solution saline de PB sodique à 40 mg/ml. La quantité administrée
à chaque injection est de 40 mg/kg de poids corporel. Le traitement est de 3 jours.
Les Rats témoins reçoivent selon le même protocole des injections d'une solution de NaCI 0,15 M.
Un prélèvement .sanguin est effectué par ponction cardiaque sous anesthésie à l'éther avant tout traitement
puis toutes les 24 h, de J 3 à J 10.
La teneur en protéines totales est évaluée par la méthode de Lowry [6]. Les concentrations plasmatiques en
albumine et orosomucoïde sont déterminées par la méthode d'irnmunodiffusion radiale de Mancini [7] grâce
aux immunsérums monospécifiques préparés dans notre laboratoire.
Chez les Rats témoins et avant tout traitement, les concentrations en protéines totales, albumine et orosomu-
coïde sont respectivement de 68 ±4 g/l, 26,6 ±3 g/l et 182 ±44 mg/I (ni ± ET, n = 23).
0249-6313/85/03010151
li 2.00 © Académie des Sciences
C. R., 1985, 2" Semestre (T. 301)
Série III -
13

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152
C. R. Acad. Sc. Paris, t. 301, Série III, n° 5, 1985
Étude de
orosomucoîde en immunoaffinoélectrophorèse croisée en présence de Concanavaline A (Con A). -
î
L'électrophorèse est réalisée selon le protocole établi par Bog Hansen dans un gel d'agarose à 1% et de 1 mm
d'épaisseur [8]. Une première migration électrophorétique du sérum (15 l.tl contenant 1,5 ug d'orosomucoïde)
est réalisée dans un gel contenant la Con A (1,5 mg/2 ml) pendant 60 mn sous un voltage de 10 V/cm. La
seconde migration électrophorétique perpendiculaire à la première est réalisée pendant 18 h sous un voltage de
2,5 V/cm dans un gel (8 ml) contenant J'immunsérum anti-orosomucoïde de Rat
(58 ul) et l'a-D-
méthylglucopyranoside (280 mg).
L'orosomucoïde se subdivise alors en quatre sous-populations chez les Rats témoins et avant tout traitement.
Leurs proportions relatives de la fraction 1 anodique à la fraction IV cathodique sont respectivement de 18± 4,
25±3, 18±3 et 39±6 (m±ET, n=23).
RÉSULTATS. -
Évaluation de concentrations plasmatiques des protéines totales et spécifi-
ques. - Chez les Rats traités au PB et chez les Rats témoins, aucune variation significative
de la concentration plasmatique en protéines totales et en albumine n'est observée. Par
contre, dans ces deux séries d'animaux, la concentration plasmatique en orosornucoïde
évolue en fonction du temps selon une courbe biphasique (fig. 1). Nous avons tenu
compte de l'effet des injections intrapéritonéales de NaCI 0,15 M sur la concentration
plasmatique en, orosomucoïde pour apprécier l'effet propre du PB. Nous observons que
ce n'est qu'à J 5 que cette concentration augmente de façon significative pour devenir
maximale à J 6 (579 ±40 mg, m±ET, n = 6). Nous notons ensuite une décroissance sans
toutefois un retour à la valeur initiale à J 10.
Évaluation des différentes fractions obtenues en immunoaffinoélectrophorèse croisée en
Con A. -' La Con A est une lectine capable de reconnaître les résidus mannopyranosyls
d'une glycoprotéine mais à des degrés divers, en fonction de leur accessibilité.
Lors de l'électrophorèse, la présence de Con A dans la première dimension amène le
fractionnement de I'orosornucoïde en quatre sous-populations que la présence d'anticorps
spécifiques dans la seconde dimension permet ensuite de révéler.
La fraction la plus anodique (fraction 1) est celle qui, non retenue par la Con A,
présente la structure glycannique la plus complexe (chaînes tri ou tétraantennées). La
EXPLICATIONS DE LA PLANCHE
Fig. 1. -
Évolution de la concentration plasmatique en orosomucoïde après traitement par le phénobarbital
(PB). La concentration en orosomucoïde est déterminée par immunodiffusion radiale: *, après traitement
de 3 jours au PB (80 mg/kg poids corporel/jour; . , après traitement de 3 jours par une solution de NaCI
0,15 M. La concentration en orosomucoïde à 10 est 182 ± 44 mg/l (m ± ET, n = 23).
Fig.
1. -
Kinetics of changes in plasma orosomucoid content after injection of phenobarbital (PB).
The
orosomucoid content was measured by the radial immunodiffusion.
*, after a 3 days treatment by PB (80
mg/kg body weight-day); . , after a 3 days treatment by 0.15 M NaCI.
The orosomucoid level at day 0 was
182±4 mglL (m±ET, n=23).
Fig. 2. -
Effet du phénobarbital sur les proportions relatives des formes d'orosomucoïde retenues et non
retenues par la Con A. *, fraction 1 anodique non retenue; •
Ù, fractions II et III modérément retenues;
0, fraction IV cathodique fortement retenue (nombre d'expériences n= 6).
Fig. 2. -
Time-dependence of the effect of phenobarbital (PB) throughout a ten days experiment on the relative
proportions of Con A reactive and unreactive forms of orosomucoid.
*, Peak 1 unreactive; •
Ù, Peaks Il
and III weakly reactive and 0, Peak IV highly reactive (number of experiments n=6).
Fig. 3. -
Immunoaffinoélectrophorèse croisée en Con A de l'orosomucoïde. (a) plasmas prélevés chez un Rat
témoin; (b) plasmas prélevés chez un Rat traité au PB aux jours 0, 3, 4, 6, 8. 10.
Fig. 3. -
Con A-crossed immunoajfinoelectrophoresis of orosomucoid.
(a) plasmas withdrawn from one control
rat; (b) plasmas withdrawn from one phenobarbital-treated rat at days 0, 3, 4, 6, 8. 10.

---

PLANCHE I/PLATE 1
DAGUI MONNET
OROSOI1UCO IDE
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a
b
Fig. 3

---

C. R. Acad. Sc. Paris, t. 301, Série III, n° 5, 1985
155
fraction la plus retenue (fraction IV) est constituée de chaînes glycanniques simples
biantennées. Les fractions de mobilité intermédiaire plus ou moins retenues par la Con
A sont constituées de molécules renfermant des chaînes glycanniques d'hétérogénéité
variable.
Dans la figure 2 est tracée l'évolution des quatre sous-populations de J 3 à J 10. Aucune
variation significative de la teneur relative en fraction III n'est observée. Les trois autres
fractions évoluent selon une courbe biphasique avec augmentation puis diminution de la
fraction IV et variation en sens inverse des fractions 1 et II. De plus, nous pouvons noter
que ces variations atteignent une amplitude maximale à J 6 et disparaissent à J 10.
Quelques tracés électrophorétiques de ces sous-populations d'orosomucoïde sont repro-
duits dans la figure 3. Chez les Rats témoins, le profil immunoélectrophorétique de
l'orosomucoïde reste remarquablement constant au cours du temps.
DISCUSSION. -
Bien que nous n'ayions abordé dans cette expérimentation préliminaire
chez le Rat, que l'étude de deux protéines spécifiques, il apparaît nettement que le PB
(80 mg/kg de poids corporel pendant 3 jours) n'entraîne pas un effet univoque sur la
concentration des protéines plasmatiques, comme le laissaient envisager les protocoles
basés sur la mesure de l'incorporation d'acides aminés ou d'oses radiomarqués dans les
protéines ([9], [10]). Grâce à des méthodes immunochimiques spécifiques, nous avons mis
en évidence une augmentation nette de la concentration plasmatique en orosomucoïde
qui, au maximum de l'effet, est égale à trois fois le taux de base ([10], [11], [12]).
Par contre, la concentration en albumine, protéine majeure du plasma, ne montre
aucune variation, ce que d'autres auteurs avaient déjà observé ([11], [12], [13]).
Le deuxième fait original que nous rapportons a trait à la partie glycannique. Deux
points sont à noter: 1° les variations qualitatives portant sur la proportion des différentes
sous-populations d'orosomucoïde sont plus précoce que les variations de sa concentration
globale; 2° on note, simultanément à une diminution des fractions peu ou pas retenues,
une augmentation de 80 % de la fraction fortement liée dont les glycannes seraient, selon
Bayard et Kerckaert [14] de type biantenné. Des travaux récents ont montré qu'en
physiopathologie humaine, à des variations de concentration en glycoprotéines, s'ajou-
taient des variations dans les proportions des différentes sous-populations. Nous pouvons
schématiquement distinguer deux situations. La première observée au cours de l'insuffi-
sance hépatocellulaire, se caractérise par une augmentation de la fraction non retenue
[15]. La deuxième apparaît au cours des processus inflammatoires et s'accompagne à
l'inverse et comme ci-dessus, d'une augmentation de la fracrion retenue ([16], [17]).
Les variations ainsi observées dans le plasma peuvent résulter d'une altération soit de
la synthèse, soit du catabolisme de l'orosomucoïde. Une diminution de l'épuration
plasmatique de l'orosomucoïde portant sélectivement sur les molécules de structure
glycannique biantennée est peu vraisemblable. Une augmentation de la synthèse globale
avec un déséquilibre dans l'activité de certaines glycosyltransférases serait l'hypothèse la
plus vraisemblable [18].
Inducteur puissant de l'activité glucuronyltransférasique, le PB ne peut-il pas induire
d'autres glycosyltransférases qui déterminent la structure des chaînes glycanniques des
glycoprotéines?
Les auteurs remercient J. Davy pour la réalisation des documents photographiques.
Remise le 29 avril 1985.

---

156
C. R. Acad. Sc. Paris, t, 301, Série III, n° 5, 1985
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Laboratoire de Biochimie, U.A.-C.N.R.S. n° 622, U.E.R. des Sciences pharmaceuciques et biologiques,
rue Jean-Baptise Clémenr, 92290 Chacenay-Malabry.

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. Résumé
Les incidences, chez le rat, de l'effet inducteur
du phénobarbital (PB) ~t de l'effet toxique hépatique de
la D-galactosamine (GaIN) sur la concentration ~lasmatique
de· l' al~glycoprotéine acide (cil-GPA) et surtout au'
niveau de la structure glycannique sont analysées. Ces
deux produits ont des effets pratiquement opposés sur
l' al~GPA,tant sur la concentration plasmatique que sur
les proportions relatives des différents isotypes en immuno-
affino~lectrophorèse croisée en concanavaline A (CIAE con A).
D'autre part la GaIN diminue le degré de sialylation et on
observe après traitement par le PB une augmentation des
structures glycanniques moins ramifiées (diantennées et
triantennées) et incompl~tes (neutres) de la glycoprotéine.
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Mots clés
al-GPA / Concentration plasmatique / Isotopes /
Structure glycanni~ue./ PB / GaIN / Rat.
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