·~.-.
\\ \\
UNIVERSITE
DE
REIMS
1I1I
" . "•• II
"
".ff
.
UNITE
D'ENSEIGNEMENT
ET
DE
RECHERCHES
DE
PHARMACIE
•••
ETUDE
BlOCH IMIQUE
DES
GLYCOPROTE INES
MEMBRANAIRES
DES
CELLULES
CANCEREUSES
CULTIVEES
IN
VITRO
ANALYSES
ELECTROPHORETIQUES
ET
PERSPECTIVES
le
30 NOVEMBRE 1981
JURY :
Professeur J.C. JARDILLIER,
Président
Professeur J. AGNERAY,
Professeur J.P. BOREL,
Examinateurs
Professeur A. DESPLACES.

---

A MON PERE,
Ce travaLL est Le tLen et représente ma modeste
et faLbLe contrLbutLon
au souLagement de tes
peLnes. Tu as su me faLre découvrLr et aLmer
Les scLences natureLLes. Toute ton exLstence
a
été au servLce des tLens, et j'entends encore
tes mots:
IIALLez Le pLus LoLn possLbLe dans vos
études, et surtout soyez justes, honnêtes et
Lntègres, avec vous-mêmes, votre entouraqe et
avec. tou t ce que vous en treprenez Il.
Je t'en remercLe.
A MA MERE,
Pour ton dévouement de tous Les Lnstants, tes
prLêres, et surtout pour L'amour dont tu nous
entoures, reçoLs LcL toute mon affectLon et
,
L'assurance, que je seraL tpujours pres de toL.

---

•
ABIGAELE,
FRANCO ISE,
La route est encore Longue et pavée d'embûches,
mals je sals que nous tlendrons bon, car "L'arbre
de La douceur et de La vle ne peut produLre que
La douceur et La vLe".
Vous êtes !Aol et je suls Vous.

---

A MES JUGES,
Vous me faLtes L'honneur de juger ce travaLL.
D'avance je récLame votre LnduLqence, et je
vous en remercLe vLve~ent.

---

A MES BEAUX-PARENTS,
A MA NOUVELLE FAMILLE,
A TOUS LES MIENS,
Toute mon affection.
A TOUS MES AMIS, et en particulier à
- Eliane
- Dominique (Chevassut)
- Dominique (Sivrière)
- Félix
- Nadine
- Phi lippe
- Raymond
En témoignage de mon amitié et de mon affection.
A MARTINE et MICHELE
Avec mes remerciements et en témoignage de mon
amit i é.
.
"
.,

---

A MES BEAUX-PARENTS,
A MA NOUVELLE FAMILLE,
A TOUS LES MIENS,
Toute mon affection.
A TOUS MES AMIS, et en particuLier à
ELiane
- Dominique (Chevassut)
- Dominique (Sivrière)
- FéLix
Nadine
- PhiLippe
- Raymond
En témoignage de mon amitié et de mon affection.
A MARTINE et MICHELE
Avec mes remerciements et en témoignage de mon
amitié.

---

A MARYLENE,
Sans quL ce t~avaLL ne se~aLt pas ce Qu'LL est.
Mon affectLon et ma ~econnaLssance
La pLus p~ofonde.
A CAR PEN T1ER, Y., DES 0 1ZE, B., J EANNES Sm~, P., KOU AMOU 0 , J.,
TRENTESSAUX,
Pou~ Leu~ coLLabo~atLon
scLentLfLque et technLque.
En témoLqnage de mon amLtLé.
A MARIE-CLAIRE,
CHRISTINE,
CHRISTIANE,
DIDIER,
RAYMOND,
Pou~ Leu~ a Ld e.
En témoLqnooe de mon omLtLé.

---

l
SOMMAIRE
INTRODUCTION ET PRESENTATION GENERALE ••••••••••••••••
p.
1
PREMIERE PARTIE : ETUDE THEORIQUE ET GENERALITES.
-
GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATION
MALIGNE.
l
-
Introduction ••••••••••••••••••••••••••
P.
5
II
Place des çlycoprotéines ••••••••••••••
p.
10
III -
Rôle biologique des ~lycoprotéines••••
p.
19
IV -
Pertu~ba~on3 1es glycoprotéines ••••••
p.
23
membranaires liées à la transformation
maligne.
V -
Méthodes d'approche •••••••••••••••••••
P.
39
VI -
Conclusion ••••••••••••••••••••••••••••
p.
42
DEUXIErlfE PARTIE : MATERIELS TECHNIQUES ET HE'IHODOLOGIES.
l
-
Produits chimiques ••••••••••••••••••••
p.
44
II -
Matériels cellulaires •••••••••••••••••
p.
45
III -
Récolte des constituants membranaires.
p.
46
3.1. -
Trypsina tion •••••••••••••••••••
p.
47
3.2. -
Marqua~e des g,lycoprotéines ••••
p.
51
3.2.1. -
narquage métabolique •••••••
p.
51
3.2.2. - Marquage externe •••••••••••
p.
52
3.3. -
Trypsination suivie d'un •••••••
p.
58
marquage ex terne·
3.4. - Dosage des protéines •••••••••••
p.
58
IV -
Techniques d'électrophorèse •••••••••••
p.
63
4.1. -
Introduction •••••••••••••••••••
p.
63
4.2. -
Electrophorèse en gel ••••••••••
p.
72
de polyacrilamide-sodium
dodecyl sulfate (ACRY/SDS).
4.3. -
Isoel~ctrofocalisation (I.E.F.)
p.
90
4.4. -
Electrophorèse bidimensionnelle
p. 102
V -
Méthodes de révélation ••••••••••••••••
p.
107
5.1. -
Méthodes chimiques •••••••••••••
p. 107
5.2. -
Méthodes utilisant des •••••••••
p. 114
radioéléments.
5.3. -
Ouantification •••••••••••••••••
p .. 117
VI -
Techniques de conservation ••••••••••••
p. 119
6.1. -
En milieu liquide ••••••••••••••
p. 119
6.2. -
Sur support solide •••••••••••••
p.
119
TROISIF.rΠPAR TIE : RESULTATS EXPERlJiIENTAUX.
l -
rUses au point sur des sérum de.......
p. 124
veau foetal.

---

II
II -
Glycoprotéines de membrane ••••••••••••
p.
133
2.1.
Approche pénérale ••••••••••••••
p.
133
2 • 2 •
L1210 •••••• 0 •••• 0 •••••••••••• 0 •
p.
133
2.3.
1<562 ••••• ;••••••••••••••••••••••
p. 165
III -
Applications pharmacolo~iques•••••••••
p. 179
3.1.
Introduction •••••••••••••••••••
p. 179
3.2.
Descriotfon des droRues ••••••••
P. 179
(rIfTX-RA) .:
3.3.
Action dJ méthotréxate sur •••••
p. 180
les ~lycdprotéines membranaires
de L1210.
3.4. -
Action du RA 233 •••••••••••••••
p.
184
IV - Différenciation !et K562 •••••••••••••••
p. 190
4 1.
Introduction ••••••••••••••••
p. 190
0
o • •
4.2. -
Inductiori de la synthèse •••••••
p. 191
d'hémoçlobine en présence
d 'h'
.
emlne oj
4.3.
- Variation des glycoprotéines •••
po 195
membranaires au cours de
l' induc tion par l' hémine.
V -
Applications cl{niques ••••••••••••••••
p. 199
i
QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION niTERPRETATION.
l
-
Techniaues-Méthddolo~ies •••••• o •••• o•• Po 206
1.1
·Trypsination.~ •••••• o••• o ••••••
p. 206
0
1 2. -
r-1arquagemétabolique
0
0
• •
0
• • • • •
0
•
Po
208
1 3. -
Marquage :externe •••••••••••••••
0
P. 213
II -
Ré sul ta ts ••••• 0 .i • 0 ••• 0 •• 0 ••••••••• 0 • 0 •
P. 215
2.1.
L1210 •••••••• o ••••••••• o •••••••
P. 215
2 • 2.
-
K5 6 2
p. 219
0
• •
0
0: • • • • • 0
• • • • • • • • • • • • • • • •
2.3
p. 223
0
-
Effecteuns pharmacologiqueso •••
2.3.1
L1210 -
HTX ••••••••••••••••
p. 223
0
2.3.2.
L1210 -
RA •• o ••••••••••••••
P.
226
2 3.3.
K562- Différenciation ••••
0
0
P. 227
CINQUIEME PARTIE: CONCLUSION G~NERALE.o ••••••• o •••• o.
p
232
BIBLIOGRAPHIE ••••••••' •••••••••••••••• o •••••
P. 235

---

INTRODUCTION ET
PRESENTATION GENERALE
La membrane
plasmique des
cellules
tumorales
est
de-
venue un des
champs d'investigation
les
plus fertiles
où se
rencontrent
de
nombreuses
et diverses
disciplines
de
la
Biologie.
L'intérêt
que
suscite
cette membrane cellulaire
ne cesse de
grandir pour
plusieurs
raisons
Une des
principales
raisons
est due
"au comportement
soc i al"
des
ce Il u les:
en
e f f et,
plu sie urs
au te urs
(82, 8~ 201) .
pensent
que
les
interactions
normales
des
cellules
entre-
elles
sont directement
liées
à
leur surface membranaire.
En outre,
le déséquilibre constant
de
l'hom~ostasie tissu-
laire dans
les
cancers,
provient
certainement,
d'une "dévia-
t ion"
des
f 0 n c t ion s
me mb ra n air es.
-
De
nombreux
travaux commencent maintenant à
proposer
la membrane,
aussi
bien
en
tant
que premier site d'action
des
drogues
en
chimiothérapie,
que
cible en
immunothérapie.
On
peut donc
espérer que
l'élucidation des
anomalies
de
la
membrane
des
cellules
tumorales apportera
de
nouvelles
stra-
tégies
thérapeutiques
dans
cette
lutte contre
le cancer.
C'est donc dans
ce canevas de
recherche
que
se
situe
le travail
qui
va être
présenté.
Nous
pensons
comme
beaucoup
d'autres,
qu'une approche
moléculaire des
phénomènes de transformation
néoplasique
passe
nécessairement
par
l'acquisition d'une bonne technique
de
base
pour
la
séparation
et
l'identification des
consti-
tuants membranaires.

---

2
C'est dahs cet esp~it que nous avons essayé dans ce
travail,
de mettre au
point et d'exploiter des techniques
de séparatirlw èt de·réVélation des
protéines·et glycopro-
téines membranaires des cellules L 1210 et
K 562 cultivées
"in vitro".
Nous avons choisi
l'électrophorèse en gel de polya-
crylamide avec toutes
ses variantes
(Isoélectrofocalisa-
tion,
électrophorèse en gel d'acrylamide,
électrophorÀse
bidimensionnelle) .
La prépondérance de cette technique aussi bien ana-
lytique que préparative,
dans
la
littérature
(17,31,42,
44,141,142
),
est directement
liée à
son excellent
pouvoir de résolution.
-Nous avons donc
utilisé cette technique pour frac-
tionner
les
constituants membranaires
(glycoprotéines)
des cellules L 1210 et
K 562,
et pour étudier l'action
d'effecteurs exogènes
(drogues anticancéreuses)
sur ces
mêmes constituants membranaires.
Le travail
se présente comme suit
-
Oans
la
première partie consacrée aux généralités,
nous
rappelons
l'importance des
glycoconjugués dans
l'or-
ganisation de
la membrane cellulaire,
et
les rôles multi-
ples
joués par ces constituants membranaires.
Nous décri-
vons
ensuite
les désordres caractéristiques de
la trans-
formation maligne,
et
les différentes
techniques d'appro-
che mises
en oeuvre pour mieux comprendre ces mécanismes
complexes.
-
La sesonde partie,
qui
représente
l'ossature même
de ce travail
est
la plus
longue.

---

3
En
effet,
nous
avons
porté
toute
notre
attention
sur
les
aspects
et
les
détails
pratiques
des
techniques
d'élec-
trophorèse
et
de
révélation.
Oans
cette
partie,
nous
regroupons
toutes
les
métho-
des
que
nous
utilisons.
Les
techniques
que
nous
avons mises
au
point ou
que
nous
avons
modifiées
sont
décrites
en
dé-
tail
avec
les
considérations
qui
nous
ont
guidés
dans
ce
travail.
Pour
les
autres
techniques,
nous
donnons
les
élé-
ments
pratiques
nécessaires
ainsi
que
les
références
de
base.
Cette
partie
pourra
paraître
au
lecteur fastidieuse,
sinon
ennuyeuse
par
ses
détails;
nous
nous
en
excusons
d'a-
vance
car face
è
la
"paillasse",
du
~oins en
ce qui
concer-
ne
l'électrorhorèse,
la
qualité des
résultats
dépend
étroi-
tement
du
"petit détail
technique".
-
Oans
la
p3rtie
expérimentale,
nous
exposons
nos
résultats
comme
suit
1- La
mise
au
ooint
technique
sur du
sérum de
veau
foetal.
2-
~'étuue des
~lycoprotéines membranaires
des
cellules
L 1210
et
K 562.
3-
Les
applications
pharmacologiques,
c'est-è-diru
l'étude
de
l'effet
des
drogues
sur ces
glycopro-
téines.
4-
L_3S
problèr1es
de
la
différenciatioll
et
de
la
1<'
562.
5-
L'application
clinique
de
ces
techniques
fonda-
~enta18s è
l'étude
de
myélomes.
Chaque
fois
oue
cela
sera
nécessaire,
nous
indiquerofls
le
chapitre
de
lA
partie
technique
00
le
lecteur
pourra
trou-
ver
les
indications
de
technologie
qui
nous
ont
permis
d'é-
tablir
nos
résultats.

---

4
-
Dans
la quatrième
partie,
nous
exposons
les
inter-
prétations et
les
discussions qu'entrainent
nos
résultats.
-
Dans
la cinquième partie qui
est
la conclusion
générale,
nous
proposons
une suite du travail.

---

5
PRE MIE R E
PAR T l
E
ETUDE THEORIQUE
et
GENERALITES.

---

6
GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATION MALIGNE
l
- INTRODUCTION
La
membrane
qui
entoure
une
cellule vivante
est
plus
qu'une
simple
enveloppe ou
qu'une
barrière.
En
effet,
non
seulement
elle définit
les
limites
de
la cellule mais
elle
contribue
également
à maintenir une différence
entre
le mi-
lieu
intérieur de
la
cellule
et
l'extérieur
(10).
De
plus,
la
cellule,
élément
de
base
des
organismes
pluri-
cellulaires,
ne
vit
pas
isolément.
Les
cellules
sont
en
effet
capables de
s'associer en
tissus,
de
se
reconnaitre
entre elles,
de
se défendre con-
tre des
agresseurs
tels
que
les
virus.
Ce
sont
là des mani-
festations
d'une
"vie
sociale"
qui
implique
une participa-
tion
de
la
surface
cellulaire,
car
c'est
par
leur surface
que
les
cellules
vont
être
en
relation
avec
le milieu
ex-
térieur.
La
sur+~ce cellulaire
va
donc
jouer un
rôle
primordial
dans
les
interactions
entre
cellules
et
dans
les
réponses
de
ces cellules
à des
agents
extérieurs
tels que certaines
drogues,
des
hormones.
des
antigènes,
des
toxines
ou
des
agents
infectieux.
Ces
interactions
entre
cellules
sont
primordiales
dans
l~s
phénomènes
de
régulation
de
la
croissance
cellulaire
1 Il r'
' 1
. '
Les
cellules
cancéreuses
se caractérisent
par ce qu'on
appelle
la
perte de
l'inhibition
de
contact,
se multiplient
de
façon
anarchique
et
sont
capables d'envahir d'autres
tissus
par métastase
1,~!
3 7 ).

---

7
Dans
un
excellent
schéma,
ROBBINS
ET
NICOLSON
(15l)
( Fig .
ont
rassemblé
toutes
les
perturbations
"possibles"
au
niveau
de
la membrane cellulaire.
On
peut
résumer
les
principales
d'entre
elles
de
la
façon
suivante:
-diminution de, l'adhésivité cellulaire,
-abolition du
contrôle de
la multiplication cellulair
-perturbation de
la
perméabilité membranaire,
-apparition de
nouveaux antigènes membranaires,
(ou
perte d'antigènes),
-altérations
biochimiques
au
niveau des
glycocon-
jugués membranaires.
La
nature
chimique des
sites
de
reconnaissance
exis-
tants
à
la
surface cellulaire
et
responsables
de
la commu-
nication
intercellulaire
est
maintenant connue:
les
sucres
présents
à
la
surface des
cellules
vont
jouer un
rôle
im-
portant
dans
leur vie
sociale.
Deux types
de molécules
présentes
à
la
surface cellulaire
et
renfermant
des
sucres
serviront
de
signaux de
reconnais-
sance:
il
s'agit
de
lipides
ou
de
protéines
de
la membrane,
substitués
par un
certain
nombre
de
résidus
de
sucres.
On
les désigne
sous
les
noms
de glycolipides
et de glyco-
protéines
ou
plus
généralement
sous
le terme de
glycocon-
jugués.
Ces molécules
sont
en
contact avec
le milieu extra-
cellulaire et
sont
ainsi
accessibles
aux molécules
exogènes.
Les
sucres
constituant
la
partie glucidique de
ces
glycoconjugués
sont
au
nombre de
6ou7
il
s'agit
du
glu-
cose,
du
galactose,
du mannose,
du
fucose,
de
la
N-acétyl-
glucosamine,
de
la
N-acétyl-galactosamine et
de
l'acide
sialique
Il
apparait
donc
que
le
nombre des
com-
binaisons
possibles de ces
différents
sucre est
considéra-
ble et
peut constituer un
des
facteurs
conférant
à
la
sur-
face
d'une
cellule
sa
spécificité
(3J)

---

8
de surface
modifiées
nouveaux antigènes
d'antigènes
fluidité membranaire
mod ifi ée
perte ou modification
des glycolipides
perte ou modification
des glycoprotéines.
perrnéabili té
phagocytose ou endocytose
modifiées
transport
adhésitivité et inhibition ne
contact de mouvement modifiées
FIG.
1 -
PRINCIPALES MODIFICATIONS AFFECTANT LA CELLULE
APRES TRANSFORMATION MALIGNE SELON ROBBINS ET
NICOLSON
(15-::),

---

9
Des altérations au
niveau de
ces
glycoconjugués
se
traduiraient
par
une
incapacité de
la cellule cancéreuse
1Q
à
répondre aux facteurs
de
régulation externe
(1
) .
Avant
d'aborder
le
problème de ces
altérations,
et
principalement celles
qui
concernent
les
glycoprotéines,
i l
est
nécessaire
d'introduire
les
théories
et
les modè-
les qui
cherchent
à
expliquer
l'organisation et
le com-
portement dynamique de
la membrane.

---

i n
II
PLACE DES GLYCOPROTEINES DANS L'ORGANISATION DE
LA
~EMBRANE
CELLULAIRE:
~'.1. -
Org~I_sation de
la
membrane
L e 5
me mb r a Il I=; s p I a 5 mi que 5
d,!
dive r 5 e s
cellules
a n j : ! a --
les
0 n t
p U
ê t r e
j:3 0 l é e s
dan.s
u n
[; t a t
d e
pur- e t é : : a t i s f aL, El ri 1: •
Elle5
renfarment
50
è
70%
de
pro~éine5, 30 ~
50%
de
lipides,
et
',eulement
2
à
10%
cie
5uc;es,
constitLan~-5 des glycoccnju-
gU'3S.
fJ n
5 CI i t
q 1J 8
l a
rT e m br a :1 13
d e s LI l' fa cee '" t
d~" 1/ m é t [' i q u c
e t : ] u <3
sa
f ace
e x I~ e r n e
est
cil i mi (' u l,: IT, 8 Il t
et
f' [; ri [ t i 'J il Il El 11 -
mie :-1 t
IJ i f f é r en t e
Cl!
sa
fa C e
:i I-l ter r - 8
(1 -, -) : .
: ,J li j
cl' éJ b C! rd
c,:
q 1 j 13
SIN Gr R 2 t
:1iI CJ LS ~l ~
êJ P P éc; l ] '0, rd.
l e :=. p r C! -
t é :L l' 8 S
CJ LI
1 2 S
g l YI: CJ .:J ,- [J -~ el il e ,;
i n t (, g r 3 les.
q ij i
S IJ rie
des
rn [ l E!
qu:'
:j 8 -: [- Lis 8 n t
l .".
c,.
in t ,0, r a (' t j 0 Il:3
h 'j ci [' iJ r: Il I_j J ,-" se,: i :' .- cl ri t
cJ éJ ri s I e
C éJ :,.
c'':
c ,0, 5
P ~ (1 t (; i l, e '.]
i , Li
g l l' C :J -

---

1 1
Rés .dus
glycanniqU85
Intéracticn avec
.. ~
p
~
'"
...
... '-.... '"'
.
l ~ ~
e lem e n t 5
e x l. ,.c; r:
\\
1du "glycocalyx "
\\•
Gly,:::cl:;Jide
2
\\
\\
"-'"
p:iOëÉ~r,e
......
lipidioue
11
1
k_.Systèrne
r
Contractile
1
i
F J'. '"
2 ..
~.'J '-,' L<, ,r.· " ,'l,
I~.I 'f·.·.'.
c·.,,, LI L" '1' L' ,0 E
,', ~ "
,,, .. r';" -' .. [- c
r, ~
1
"""
l
",
.
• : ,
L, " ..:J
" "
'1 i:! r: (, !V ~,~
LJ i::. S
C [ L 'e
1.:: Sil, i ; =:'1 ALE:::
S '= 1 0 i'~
r~ l 1: 0 l '.: fJ ~j
(
1 7 ii ) .

---

12
ROTHr1A~J el:
LE~JARD (15 0 )
proposent
d'ailleurs
une
dis-
tinction
entre
!Jeux
types
dr~
protéines
intégrales:
(Fig. <)
Les
ectoprotéines,
glycoprotéines
fortément
hydro-
philes,
localisées
sur
la
face
externe
de
la
cellule.
A
cette
classe
appartiendraient
la
glycophorine,
glycoproté-
i n e
ma jeu r e
d u
g lob u 1 e r 0 LI g e
e t
les
a Il t i (2: è n e s
d 1 il i s toc 0 mp éJ -
t i b i l i t é .
Les
end~protéines, prottines
in~égrales associées
à
la
face
cytop'"JSmiquE
de
lêl
IflE,mbrane.
D'autre~; protéin,:ls
Oll
gJ'jcoprotéines
men:!Jrana1res
in ter Ci gis s 8 n taI/ e c
l a I ' É g ion
P [J l él ire
dt! 5
mo l écu les
l i pi di -
que s
E! t
pou r r en::
ê t r e
dis soc j. é l~ E;
ci e
l a
m''3 mb r ,3 n e
par
r.: lj G -
mentation
de
la
Force
ionique!
ou
du
pH
du
milieu:
i l
s'a-
git
,jes
cCJnstit,Jants
extrin!~èquE?5 ou
püriphÉ-riques
de
Ir]
membrane,
en
particulier
des
protéines
du
système
contrac
t i l e
de
la
cellljle
I l , " s t
do Il C
i mp [1 r t 'J n!:
cl e
il0 ter
C; LI El
t QI.: s
l 8 seo n s t i -
t LI an t~,
Glu c ici i q IJ c; s
des
sI Y CCl COll ~i LI gué s
mc~ III br ê na ire s
" [1 il t
s i tué s
sur
l a
f ,1 C 8
'0 >: tel' ne,
CJ n
f ë! i S <3 Il t
c,· 0 j EC t i Ci n
c! e ri',
l 8
miliell
extra-ceilulaire.
r e
ô c tue Ile
e~, t.
l a g I YC Ci P r CJ:~ (; il: F:
rn a j fc, U [' e
d e I a
ri. Q rli b r a l, e
[1 u
g lob U :'. e
r Cl LI g e ,
': g a ] e mE? fi t
a l' [J C!] ':. é!
[~l Y c Cl P il IJ r j 1 e
(F i g. cf) •
e Ile
j" e il f (~ r m'"
<1 3 Î
r 0;; s i (j u s
.j'a C j cl e s
a ln i ri [',)
e t e s l
-::: r Èi s r i chu
en
s LI cre s
(6 G~;
!.' ,., V j r 0 ri).
L d
G 1 :; c; Cl :J h c' l'i ri 8.
C CJ minE
V r 6 i se cr. b 1 a -
blem811t
Ip.s
éJut:'ss
glyccjJf'iJt:éiIH:s
in~n"b[''''nailesJ est
UllB
mo-
cul e
c: s t e 0 n Co t. i': LJ é e
cl 1 él c.: i (] 1'- E;
a rri '., é s,
P CJ lE' r 8 s e t
e s 1:
rie h co.
en
r85:Ldus
de
Sll;.~r8::,.

---

=CT:JP~OTEI~!ES
FACE CYTOPLASMIQUE
( b )
ri;.:3
-
~ =S P J S :::: - ::: ~,~,
oc" I\\~ S
~ il,
r", Er'Î =P.,~ :~ E J:: S :: CT 0 PRO ï E l :~ ES

---

1 4
Double
couc~e
l i P i d i Q 7
CDDH
Chaine
protéique
Phase
cytoplasmique
Glvcannes
Fig.
4
- SCHEMA fVJDNTRANT
L' INTEGR,l\\TIDN DE LA
GLYCOPHORINE DANS LA MEMBRANE DU
GLOBULE ROUGE SELON MARCHESI
ET COL.
(1~7).

---

1 5
Cette
région
hydrophile
est
externe.
Puis,
l'on
l' e n cori t re
une
s RCI u e n c e
d e
2 3 a cid e sam i nés
à
car a c t ère
hydropllobe
qui
pcrmut
à
la glycophor:ine :de
s'ancrer dan~;
la
double
couche
lipidique
hydrophobe de
la
membrane.
Enfin,
la
réGion
carboxylique
terminale
est
également
ri-
che
en
acides
aminés
polaires
et
émerge
de
la
face
cyto-
plasmique
de
la
membrane.
La
région
NH2-t~rminale externe pqssède deux
types
de
chaînes
glycanniqu8s
Les
unes
constituées
d'acide
sialique,
de
galacto-
se
et
de
N-acétyl-galactosamine,
sont
liées
à
la
partie
protéique
par
l'intermédiaire d'une
liaison o-glycosidique
entre
un
résidu
de
N-acétyl-galactosami~e et
un
résidu
de
sérine
ou
de
thréonine.
Les
Butres,
constituées
d'acide
sialique,
de
fucose,
de
mannose,
de
galactose,
et
de
N-acétyl-glucosamine
sont
liées
~
la
partie
protéique
par
l'intermédiaire de
liaisons
N-glycosidiqu8s
entre
un
résidu
de
N-acétyl-glucosamine et
u n rés j. d u (j 1 a spa l' agi. ne.
l l
Y Cl IJ ra i t
qui n z e
cha î n e s
rJ u
t YP e
D- glu cos id i que
pour
une
chaine
de
type N-glucosidique
par molécule
ue
8; l Y c 0 p h 0 l' i n e
( 'j :'.
1? ':J,
1 2 7 J •
Bien
que
très
variables
dans
leur
composition,
les
chaînes
glycannes
des
glycoprotéines
se
classent
assez
facilement
par
un
certain
nombre
de
structures
typiques
Dans
les
glycoprotéines
à
liaison
N-osidyle,
on
trOll"
ve
constamm(~nt. la structure générale schématisée
(r::ig. 5
J.
Dans
]a
partie centrale de
]a molécule
à
partir
de
la
liai-
son
N-osidy]e.
on
tr·ouve
deux
résidus
de fi N-acétyJ -gJUCU"
samine,
et
trois
résidus
de mannose
pour
former
un
penta-
saccharide
ramifié.

---

1 6
Dans certains
cas,
sur les
mannoses
de
ce
pentasaccharide
de base,
viennent
se greffer un
nombre variable de chaînes
composées
de galactosylfi 1-4-1'J-acétylglycosaminyl.
Enfin,
un certain
nombre de
résidus
sialyls ou
fucosyls
représentent
l'extrêmité
non
réductrice de
ces chaînes gly-
cannes.
Ces
structures
sont dites
de
type
"N-acétyllactosa-
minyl".
Dans d'autres
cas,
le
pentasaccharide central
est
substitué par un' nombre
variable
de chaînes mannosidyles
plus ou moins
longues.
Ces
substances
sont dites
de
type
"oligomannosyl"
(135,121)'
(Fig. 6.) ..
Dans
ces deux
types
de
structure,
les différences
entre gly-
coprotéines
portent
surtout
sur
le
nombre,
sur la
position et
sur la
longueur des
substituants
sur le
pentasaccharide de
base.
Les mêmes
types
se
rencontrent
dans
les glycoprotéines
sériques.
Parmi
les
structures à
liaisons
O-osidyles.
les glyco-
protéines de groupe sanguin présentent
également
une
struc-
ture
typique
(Fig. 7
).
Chaque groupe
sanguin
peut
se carac-
tériser par un
résidu glycannique:
par exemple,
le groupe A
correspond
à
une chaine glycannique avec
un
N-acétylgalacto-
samine~-1-3 supplémentaire sur le galactose terminal. Dans
l e g r 0 u p e B,
0 n
t r 0 U v e à
l a mê ITJ e
pla c e
u n gal a c t 0 s e
(1 R 1 , ? '1 (1 ) •
La
différence
héréditaire entre
les
individus
des groupes A
et
B correspond à
la
présence chez
les
premiers d'une
N-acétyl-
galactosaminyl-transférase et chez
les
seconds d'une galacto-
syl-transférase.
La
séquence de
très
nombreux
oligasaccharides de
l'u-
rine
normale ou
de
sujets déficients
en diverses glycosidases
a
été établie
(~75,17~. Ces oligosaccharides correspondent au
produit
de
dégradation partielle des
glycoprotéines,
et
pra-
tiquement
toutes
les
structures
correspondent à
des
fragments
provenant des modèles
généraux
décrits
plus
haut.

---

· 1 7
'_0
t}:.
Fig.
5 - STRUCTURE DE TYPE N-ACETYl-lACTOSAMINE
SELON MONTREUIL
(135).
Fig.
6
-
STRUCTURE DE TYPE OlIGOMANNOSIOE.
NANA
Acide Sialique
FUC
Fucose
Gal
Galactose
GleNAC
N-acétyl
glucosamine
Man
Mannose
Asn
Asparagine

---

CHAINE DE
GROUPE
CHAINE DE
GROUPE
TYP E l
SANGUIN
TYPE II
SANGUIN
Gal (?;(;!-.-.~) .,..GLcNAC-R
Gal
(3(;!--+4) ..GLcNAC-R
Fuc
F uc
(I\\(~~l)t
(
)
(3
.l~~
~(A-'~\\
@>CA.--> 4)
al
.. GLcNAC-R
0
al
lPGLcNAC-R
0
Fuc
Fuc
o("'>t
d-- (A-+~)
GalNAC o((A~~)
al
(3(.~~~)
JJ>-'
...GLcNAC-R
A
GalNAC o({h~~al
(3(A."+u) ~GLcNAC-R
A
Fuc
Fuc
ol("'\\
ol(A-+l)~
Gal "'(..(~3\\~,
al
(3(.A_3) ~LcNAC-R
(3(-t _4)
B
Ga l d(A~;) Ga l
.. GLcNAC-R
B
...
Fig.
7 -
DETERMINANTS GLUCIDIQUES DES ANTIGENES DE GROUPE SANGUIN A B 0 SELON HUGGES
(82
J.
-"
CD

---

1 9
III
-
ROLE BIOLOGIQUE DES
GLYCOCONJUGUES
DE
LA MEMBRANE
CELLULAIRE
:
La
présence à
la
périphérie d'une molécule de
structu-
res
spécifiques,
dont
les
positions
relatives
sont
con-
ditionnées
par
le type de
structure
glycannique,
peut
être
à
l'origine d'activité
biologique tout
comme
la
position
relative de quelques
résidus
aminoacyls dans
une
structure
tertiaire de
protéines
réalise
le centre
actif
d'une enzy-
me et
crée
l'activité enzymatique
( 4
).
End' a u t r e s t e r mes,
les
0 ses
peu v e ri t
se r vi r
deI e t -
tres dans
un
vocabulaire
biologique où
les mots
se
forment
en
faisant
varier
la nature des
oses
présents,
la
position
et
la configuration
0<. ou ft des liaisons glucosidiques
la
présence
ou
l'absence
de
chaines
latérales
(1S7).
3.1
Antigénicité des
g:ycoconjuguéy
de
la
surface
cellulaire:
La
présence sur
la
surface
externe d'une
hématie de
glycoconjugués
de
groupe sanguin offre
au
système
immuni-
taire
un
moyen
de
reconnaitre
le
"non
soi"
(,~
).
A_
la surface
des
globult"s
rouges
se
trouvent des
gly-
coconjugués,
déterminants des
groupes
sanguins
A,
B,
0
(2-='C,
Il
s'agit essentIellement de
glycolipides
portant des
sé-
qUE! n ces
g l Yc a n n i que s
car a c -c é ris t i que s
d' u n g r 0 u p e
don né.
Cep end a nt,
l 8 S
g l Yc 0 pro t é i Il es
deI a m8 mb j'a n e d e I ' hé mat i e
semblent comport'3r également
des déterminants antigéniques
du
système A,
B,
0
( 181).
La glycophorine,
et
plus
particulièrement
les
chaines
gly-
canniques
de
type
O-glycosidique,
serait
responsable
de
l'expressiGn
de
l'antigènicité. MN.
Les
antigènes
d'~istocompatibilité constItuant
le système
HLA chez
l'homme sont des
glycoprot~lne~ membranaires (17R
conférant
aux
tissus
de
chaquH
indi\\ljdLJ
.Oa propre
spécifi-
cité.

---

20
3.2.-
Rôle de
récepteurs
Des
glycoprotéines
telles
que
la glycophorine,
qui
traversent
toute
la
membrane,
semblent
être
impliquées
dans
le
transfert
d'une
information
reçue
à
la
surface cel-
lulaire vers
le cytoplasme.
Ainsi,
des
récepteurs
de
l'insuline ont
été
isolés
à
partir de
membranes
plasmiques
d'hépatocytes
ou
de
cel-
lules
adipeuses
(90
).
Il
s'agit
de
glycoprotéines
intégra-
les,
selon
la
nomenclature de
SINGER et
NICDLSON,
qui
ne
peuvent
être
extraites
qu'après
solubilisation
de
la
mem-
brane
par des
détergents.
Lorsqu'on détruit
la
partie gly-
cannique de
ces
molécules
par digestion
enzymatique,
leur
capacité à
fixer
l'insuline est
abolie.
De
même,
Id
neuraminidase
abolit
la
production de
sté r D ï des
par
les
cel Iules
a d r é n 0 c.o.r-l.i cal 8 s
s t i mu l é 13
par
..... ; ,-' " ' .. ':·r~"'''''",
l ' hormone
adrénocorticotropiqu·.~'>~ÀC·TH:-':/f"~6). Cela démon-
.... ~---.
.."
t r e l a
n a t ure
g]. y
ie,
C 0 pro t 8 i n i q t,j ~/~ 13
c 13
c ê:~: t e u l'ho r mon al.
, f ,-.., "
\\ >'
! :
' . '
f\\
f.'l r-
.
\\
: ;
Parmi
ces
glYCOprotéin~~\\~~p1:j~l~k;~il faut encore
<. \\.
,Yi!
c i ter
1 e r é cep t eu l'me mb l'an air e/ d,zA S H.W-E '-0l;:""/( 1 2 J:
i l s 1 agi t
",:"r 1"
• S').'5<';-;-·
d'une glycoprotéine
présente
dà"r-i~~~~g~mémbrane plasmique
des
hépatocytes,
capable de
fixer
des
glycoprotéines
d'o-
rigine
sérique,
telles
que
l'orosomucoïde
ou
la
céruléo-
plasmine,
partiellement
dégradées.
Ces
glycoprotéines
sont
ensuite endocytées
par
la cellule
hépatique et
complètement
catabolisées
au
niveau
des
lysosomes.
En effet,
la
céruléo-
plasmine marquée
au
64 CU , désialidée et injectée en intra-
veineux
au
Rat
est
très
rapidement
éliminée de
la circula-
tion
sanguine par
le foie
et
on
retrouve
le
64 CU au niveau
de~3 lysosomes
(69 ).

---

Cette clairance
rapide
d'une
glycoprotéine sérique
désialidée
a
été confirmée
pour
l'orosomucoide,
la
fétuine,
l'haptoglobine,
la macroglobulineoC.2'
la gonadotrophine
chorionique et
la
F.S.H.
mais
non
pour
la
transferrine.
De
plus,
il
s'agit d'un
phénomène actif
saturable:
une forte
concentration en glycoprotéines
désialidées
peut
inhiber
la clairance d'une autre
glycoprotéine désialidée
( 137
Les
glycannes
privées de
l'acide
sialique
présen-
tent
un
galactose
terminal,
et
c'est
ce
résidu
saccharidi-
que qui
est
reconnu
par
un
récepteur membranaire.
Cette
"Hépatic-Binding-Protein"
(HBP)
a
été
isolée
à
partir
des
membranes
plasmiques
d'hépatocytes
de
Lapin.
C'est
une
glycoprotéine de
type N-acétyllactosamine
(13.
BD.
100).
Par
le même processus,
ce
récepteur membranaire serait
également capable
de
reconnaître
les
globules
rouges
et
les
lymphocytes
circulants
§gés,
permettant ainsi,
leur
élimi-
nation.
En
fait,
ce
récepteur reconnait
des
résidus
de
galac-
tose
démasqués
sur ces
glycoprotéines
ou
des
cellules
~gées.
Mais,
curieusement,
si
on
soumet ce
récepteur à
l'ac-
tion
d'une
neuraminidasB,
cette glycoprotéine
réceptrice
n'est
plus capable
de
reconnaître
les
glycoprotéines
sé-
riques
désialidées
( 1 3 , 8 0
l,
d'où
l'importance de
l'a-
cide
sialique souvent
terminal
sur
les
chaînes
glycanniques.
Un
système
du
même
type
permet
l'excrétion puis
la
réabsorp-
tion
intracellulaire des
enzymes
lysosomales
de
nature gly-
coprotéique.

---

22
3.3.-
Rôle dans
les
phénomènes
d'adhésion intercellu-
laire
De nombreux
auteurs
ont pu
isoler à
partir de
milieux
de culture de divers
types
cellulaires,
des
macromolécules
de
nature
glycoprotéinique ayant
pour origine la
surface
cellulaire.
Ces glycoprotéines
purifiées
sont capables d'in-
duire
la
réassociation de
cellules
préalablement
dispersées
( 70) ,
Ainsi,
Mc
CLAY
et
MOSONA
(131)
ont
réussi
à
isoler
à
partir de
cellules de
la rétine
une glycoprotéine de
masse moléculaire de
50.000 daltons
qui
semble intervenir
dans
ces
phénomènes
d'adhésion
intercellulaire.
Ces
gly-
coprotéines auraient
les
mêmes
propriétés que certaines
protéines
ou
glycoprotéines d'origine diverses appelées
lectines,
capables de
reconnaitre
spécifiquement
certains
sucres
présents à
la surface cellulaire et
capables de
provoquer
l'agglutination des
diverses
cellules
(1j6).
On voit donc
le
rôle
important
joué par ces
glyco-
protéines
de
surface dans
le contrôle de
la
"sociabilité"
des
cellules.

---

23
IV -
PERTURBATIONS DES
GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES
LIEES
A LA TRANSfORMATION
MALIGNE
Les
glycoprotéines
localisées à
la
surface
de
la cel-
lule animale
jouent
un
rôle
important dans
les activités
biologiques
de
cette surface,
comme par exemple
le
transfert
actif à
travers
la membrane
(154
l,
l'inhibition de
contact
de mouvement décrit par ABERCROMBIE et HEAYSMAN
2
l,
le
rejet
des
greffes
et
la suppression
des
facteurs
antigéni-
ques
(93
l.
-
En
outre,
le fait
que
la surface
de
la cellule
soit
riche en
hydrates
de
carbone,
et
que
la
plupart des
glyco-
protéines
soient
localisées
dans des
sites
tels
qu'elles
sont directement
en contact avec
le milieu extracellulaire,
a
incité de
nombreux
travaux
à
s'orienter vers
les modifi-
cations que subissent
ces glycoprotéines,
au
cours
de
la
transformation
maligne,
et
par conséquent
les
différentes
altérations des
activités
biologiques
liées à
la
présence
de ces mêmes
glycoprotéines.
On
sait que
la contamination par un
virus
ou
la
trans-
formation
tumorale
entrainent des modifications de
la com-
position des
glycoprotéines de
membrane
21);
or,
au même
moment,
les
cellules
perdent
un
certains
nombres
de
proprié-
tés
(comme par exemple:
l'inhibition de
contact . . . )
De
nombreux
rapports
ont
été faits
sur
l'augmentation
ou
la diminution
(et
parfois disparitionl
de
polypeptides
spécifiques,
associées
à
la
transformation des
fibroblastes
(86,
140,
191,
153).

---

24
4.1
-
Protéoglycannes
et glycoprotéines de
la matrice
extracellulaire
Les
protéoglycannes
(acides
hyaluroniques,
chondroi-
tines
sulfates,
héparan
sulfate)
font
partie du
glycocalyx
ou
" cell
coat",
sorte de
matrice extra-cellulaire
pauvre en
lipides mais très riches en sucres.De
nombreux
auteurs
ont décrit
les
variations
du
taux de
certains
protéoglycannes
associés
à
la transformation.
Ainsi,
de
nombreuses
cellules
transfor-
mées
par des
virus,
synthétisent plus d'acide
hyaluronique
que
les cellules
normales mais
semblent
synthétiser moins
d e
pro t é 0 g l yc a n n e s
sul fat e 3
( 1 6 2 ).
Cep end a n t
une
g é n é raI i -
sation
reste délicate,
car
les
résultats expérimentaux
sont
souvent
très
hétérogènes
et
trop
peu
de
systèmes
cellulaires
ont été
étudiés.
-Il
semble également que
la biosynthèse du
collagène,
autre constituant de
cette matrice extra-cellulaire,
soit
diminuée
après
transformation
45 ) .
- Eni 9 7 3,
d i Il ers
g rOll p e s d e r e che r che déc r i v ai e n t
simultanément ~
la
surface
de
fibroblastes
en culture
une
glycoprotéine de
haut poids moléculaire
(210
-
270.000 dal-
ton s
s 8 l 0 Il
l e p roc é d é d e
d é t e c t ion
u t il:; s é),
t r è s
sen s i b l e
aux
protéases et disparaissant
après
transformation.
Il
s'agit de
l'antigène de
surface du
fibroblaste
( S FA)
( 1 ~<) ),
de
J a
gal a ct 0 pro t é i ri e a
de
HA K0 MOR l
de
la LETS
protéine
(large external
transformation
sen-
sitive
proteinl
de HYNES
~7
l,
de
la
protéine
de
sur-
face
ceLlulaire
(CSF')
de
YAMADA
( 21.4),
ou
du facteur
Z
deR 0 BBl NS
(
1:=i 51 .
Inutes
ces
glycoprotéines
possédaient des
caractéris-
t i que sel) rn mu Il es,
c' i n s i
r j ' ail leu r s
q u p d ' a u t r e s
g l Yc 0 pro t é i -
nes
plasmatiqu3s,
d'oG
la suggestion faite
en
1976 par
le
g r 0 u p e f :i Il l a 1-1 d ais
cl e
F< U0 S '- AHTIde
l 3 S
r éi s sem b 1er sou s I e
nom de
fibroller:tir es
-d:J
latin nfibra' (fibre)
et "nectere"(lier)

---

25
Ce
sont donc
des
protéines
capables
de
se
lier.
de
s'associer à
des
protéines fibreuses.
Au
niveau
des mem-
branes cellulaires.
cette fibronectine
est
un autre
élé-
ment
du glycocalyx.
La
structure
(fig.
et
les
propriétés de
ces
fibronectines
ont
fait
l'objet de deux
revues
récentes
101,
?1?-
Cette glycoprotéine qui
existe chez
la cellule
nor-
male.
est
largement diminuée ou
disparait
chez
la cellule
transformée
;~C, 140, l(H, 154, 85
C'est
une
glycoprotéine de
haut
poids moléculaire,
(210
-
270.000
daltons),
trouvée dans
le sang et
les
tissus des
vertébrés,
et dans
les cultures cellulaires adhérentes
-L.'utilisation d'anticorps
antifibronectine fluores-
cents a
permis
de montrer que cette fibronectine constituait
à
la
surface des
fibroblastes
en
culture
un réseau
complexe
de
fibrilles
et d'agrégats
particulièrement
abondants aux
points de
contact
entre deux
cellules ou entre
la
surface
?1'l
cellulaire et
le
substrat
..
'-) l
d'oL
l'hypothèse d'un
rôle
important
joué par ces glycoprotéines dans
les
phéno-
mènes d'adhésion
intercellulaire ou d'adhésion au
substrat
dans
le cas
de cellules
en
culture.
Le point de
départ de
l'intérêt
porté à
ces
protéines 8St
l'observation d'une
diminution de
la quantité de
fibronectine
associée à
la
surface cellulaire des
cellules
transformées
par un virus oncogène ou
par un cancérigène chimique.
Cependant,
il
faut
noter qu'il
existe de
nombreuses
excep-
tions
à
cette
règle.
et YAI'1ADA et
DL DEN
( 212)
ont
noté que
sur 89
espèces de
cellules
transformées.
12
ne
présentaient
pas
cette diminution du
taux de fibronectine.

---

26
~A[a"'[GfO
Yr
ln
lys
A
_
COOli
1
5
1
S
.~ COOH
B
/ - 1
\\ f""ll( ,
1
1
......c>"
F j g.
G,
--
seri 1': r'! A U t ..è, T .~ LI C~. 1 J R [
0 E L 1\\
F~: f\\ R0 NEC T [ 1\\1 E
A -
SE LI Ir·'
'v A'-1 [R l
( J. :'1 ) .
El
-
': E Lli [\\1
(A '1/\\ 0 fi
(? 12 ) •

---

27
De même,
le
pouvoir oncogène d'une
lignée
cellulaire
ne
semble
pas
lié de
façon
absolue
à
son
taux
de
fibronectine
membranaire,
c'est-à-dire qu'une cellule
possédant
peu
de
fibronectine
n'est
pas
forcément
oncogène.
Par contre,
à
cet-
te diminution du
taux
de fibronectine,
serait
plutôt associée
la
tendance
qu'ont
les
cellules
transformées
à métastaser
( 30
).
Cette observation semble compatible avec
un
rôle im-
portant
de ces
fibronectines
dans
les
phénomènes
d'adhésion
ce Il u lai r e
( 120, 1 0 1,
? 12,
':;~),
:? (,
-Cette fibronectine
présente d'ailleurs
une
grande af-
finité
pour le collagène
natif,
l' héparine
et
les
surfaces
cel luI air e s
( ;'1 n , 1 Cl:1J,
e t
l ' i n cap a c i t é des
cel luI e s t ra n s for -
mées
à
synthétiser ou
à
lier
la
fibronectine
est
parallèle
(du moins
dans
cQrtains
systèmes)
à
l'incapacité de
ces mê-
mes
cellules à
synthétiser ou
à
lier
le
collagène
et
les
protéoglycannes
( 1()1 )
-Cette glycoprotéine adhésive,
de
haut
poids moléculaire
jouerait
un
rôle
important dans
l'adhésion cellulaire,
les
fonctions
du
système
réticulo-endothélial
et
la différencia-
tion embryonnaire
( ?l? ).
En effet,
l'addition de
LETS
protéine
purifiée dans
un mi-
lieu
contenant des
cellules
transformées,
entraine
l'adhé-
sion des cellules
entre-elles
et
le
regain de fibres
d'ac-
tine
?~).
Elle
s'attache aux
cellules
en un
réseau
fibril-
laire et
ce
lien est
plus
important avec
les
cellules
norma-
les
qu'avec
les
cellules
transformées
00).
En
conclusion,
cette fibronectine
semble être une gly-
coprotéine
jouant un
rôle
important dans
les
interactions
cellule-cellule ou
les
interactions
cellule-substrat dans
le cas des
cellules
en
culture.
Sa disparition
de la surfa-
ce des
cellules
transformées
serait due
à
une diminution au

---

28
niveau
de
la
biosynthèse de mRNA
spécifique de cette
protéine
:2
),
ou
à
une dégradation
par
les
protéases,
en
particulier
par
la
plasmine
présente
à
la
surface des
cellules
transfor-
mées ou
encore à
une diminution
du
nombre
de
récepteurs mem-
branaires
pour cette glycoprotéine,
ces
récepteurs
pouvant
être du
collagène ou
ses
précurseurs associés
à
la membrane
de
surface;
cette disparition
peut
également être
la consé-
quence d'une glycosylation
imcomplète de
la
protéine
lors de
la
biosynthèse.
On
sait
en effet
que cette forme
de
fibronec-
tine
incomplète
est
très
sensible à
l'action des
protéases
( 145 ) .
Si
l'absence
de
cette fibronectine,
ne
semble
pas
re-
présenter
un marqueur absolu
de
transformation maligne,
il
faut
cependant
remarquer que dans
tous
les
nombreux articles
qui
traitent
de
la
LETS
glycoprotéine,
les
auteurs
sont
una-
nimes
sur
le fait
que
sa
disparition ou
sa
diminution
est
un
phénomène
lié
à
la
transformation.
4.2.-
Modifications
affectant
les
glycopeptides mem-
branaires
Les
travaux
de WARREN
et
al.
en
1978
ont
bien démontré
que
les
glycopeptides
du
type
N-glycosidique,
obtenus
après
"protéolyse",
ont
toujours
une
masse moléculaire moyenne,
légèrement
supérieure à
celles des
cellules
normales
(MM 4500
pour
les
cellules
cancéreuses:
3700
pour
les
cellules
normales)
lorsqu'on
les analyse
en
chromatographie de
tamisage molécu-
laire
( :::?Ol ).
Cette différence disparait
lorsque
les
glyco-
peptides
des
cellules
transformées
sont
préalablement soumis
à
l'action d'une
neuraminidase
ou
d'une
hydrolyse acide ména-
gée.
Donc,
l'hypersialylation des
glycoprotéines membranaires
semble
être
un
facteur
constant dans
la
cellule
transformée
(in vivo
et
in vitro)
quel
que
soit
le
type
cellulaire
étudié
et
l'agent
transformant.

---

29
Il
faut
é8alement
signaler que
les glycopeptides
prépa-
rés
à
partir de
noyaux, des mitochondries,des lysosomes et du
ré-
ticulum endoplasmique
des cellules
transformées,
présentent
tous cette
hypersialylation
?3).
Une autre
étude
récente
lqO)
des
comportements
chromatographiques des glycopeptides
isolés
à
partir de
24
glycoprotéines membranaires
différentes
de cellules
normales
et
transformées
montre que dans
vingt
glycoprotéines
isolées
de
cellules
transformées,
on
retrouve
ces glycopeptides
de
plus
grande masse moléculaire.
On
les
retrouve
également chez
des
cellules
non
trans-
formées
en mitose
(196
);cependant VAN
BEEK
[194
a
mon-
tré qu'ils
étaient absents
de
la
surface des
lymphocytes
nor-
maux,
de
lymphoblastes
prelevés
à
des malades
atteints de
mo-
nonucléose
infectieuse et
surtout de
lymphocytes
normaux
sti-
mulés
par
les phytoagglutinines
(ou
lectines),
alors
qu'ils
son t
pré sen t s
~" (l :;)
à
l a s Ij r f ace
deI e u c 0 c Ytes
hum a i n s
pré-
leucémiques
ou
prélevés
à
un
stade
précoce
de
la maladie.
Il
semble
surtout
très
important
de
noter qu'il
existe une
relation
très
étroite
entre
la
présence de ce
type de glyco-
peptides à
la
surface d'une
cellule
et
son pouvoir oncogène
1 q r"
G3)
et
selon VAN BEE K
:- :"i !:,) ,
leu r
r e che r che,
à
la
surface
des
lymphocytes
humains aurait ainsi
valeur de diag-
nostic.
Les
résultats
semblent également
prouver que
cette
altération des
structures glycanniques
des glycoprotéines
de
la membrane
représente
bien
une modification
fondamen-
tale
primaire associée
à
la
transformation maligne.
Oans
d'autres
expériences,
l'utilisation de ces
glycopeptides
dés i a l y lés a
p e r mis
à
WARR E ~J
(:c u:~ ) d e
met t r e e n é v ide n c e
chez
les
cellules
transformées
une
sialyltransférase capa-
ble
de
transférer activement
de
l'acide
sialique à
partir
du CMP-acide
sialique
sur ces
glycopeptides désialylés.

---

30
Quelques
exceptions
ê
cette
règle
ont
cependant
été
décrites
.17),
mais
dans
ce
cas,
l'oncogénicité
d[~s cellules ne sem-
ble
pas
avoir
été
établie avec
certitude.
Ces
glycopeptides
de
grande
t a i l l e
lenv.4500
daltons)
ainsi
que
leurs
hCJrnologues
"norrnaux"
(env.
3/00
daltons)
re-
présentent
en
fait,
des
populations
très
hét0rogènes
pouvant
être
sous-fractionnées
rlar
chromatographie
d'échange
d'ions,
par
électrophorèse
à
halJt
voltage
ou
paf'
chrc,matographie
d'a f fin i t é s u r
div 8 r 3 e s
colon n e s
d E:
l,~ c: tin f~ s i n sol u b il i sée s
40 ).
Ces
g l Yc 0 ppp t:i a e s
p ù s S f: der aie n t
ai n si
P lu~)
cJ e
br an che~:; ex-
ter ne s
que
les
g l Y c 0 pep i ide s
d e
cel l u 1:: ~,
n [) r n: ale s.
0 GAT A
1/1.3)
a
d' ai lleur's,
SUI'
la
basl3
du
C[J!llportenent
de
ce~; gly-
co pep t ide s
sur
co] 0 ri ne
cl e
S 8 P ha d e x
[.
~j:l
e t c t: rom a t 0 g ra phi e
d' affi ni té. sur concélnavali-!e A ,
avant
et
après
action
d'exogly-
cos i d a ses,
p ['op 0 s É!
l a s c h é ma
d e s t rue t J r e
r t: pré sen t é
par
la
figure
'l.
A c [j t é
de
CEl S
:~ l y c: 0 pep t i d [~ s
r~·· g.l Ycos j d j q LJ es,
u n au t r e
t y p e
d e s t f LJ (; tu l'e
g l Ycar, n i que
est
r:: l" é ~>:: n t
fi
J a
:> u l'fa c e
cel-
luI air e.
l l
~,' a g :L t
d I~
g J Yc 0 pro t [~ i n e s
p ,:' s s é cl a rit
des
g l YL: a n n e s
ê
lia i son
(j - g l YC 0 é; i d i qu':
e n t r e
li n
rés i ,j u
d [,
~I - a ,~ é t Yl
g ü lac t 0 -
sam in e
et
II n
rés i cl u
rJ e
é. é l'in e
0 IJ
th r I~! 0 '·1 in e J
liaison
tri!3
la!.li]e
,"n
'Ililieu
alcalin.
CI3S
strLJ!~tures unt été
mises
en
évidence:':lu
ni.eau
de
la
g.lYI;.'pllorire,
glycopr'otéine
majeur" de
J d
rTIerntJI,:;nl~
dl.,
globule
:-cugn
(lB? ),
'3t
CODHJGTDN
et
Coll.
o ri t
i s 0 ] é,
à
pal' t Lr
d n
cel] u 1 es
as ci t i que s
TA 3 Ha,
une
g l Yc Cl pro t i~ i Cl ":
qu' i l s
a p p n l J,:, n t
{, P i g] :1 c a n i ne,
t l'Ès
ri che
en
g J Yc a n n e é,
l L P. s
0 - g l Yc 0 ~; i d i q lJ El rfl e Il t
SI. r
l a
p r' 0 tÉ, i ne.
6 H A V f, IJ A I~ 0 rI r'J
1 ç~ ]
su g g 8 r [~,
que
l:J
P r' é é: e fi ,; e
sur
] a
par-
t i e
pep t id j q l! 8
cl e
ri 0 rrl b r u x
g l YC cl n Il e s
li·? l Y[: 0 ~: i cJ Lque s
s i a l y lés.
pro t è g E' rai t
C 8 l ] El - c i d e l ' a c t i 0 ! 1
d 8 S
P:J t é éJ S f: s,
d' 0 Ù
l 8 U r
r e -
lative
grorllJe
taiJ lu

---

31
Branches
Pentasaccharide de
base
1.- _
_
_
_
_
_ _
_ _
_
__
_
_
_
...
~
Fig.
~\\
-
'3 CHE '''1 A D [
sn JeT Il R E [] E.:· G'1. '( C!~I P EF TI 0 ES IJ E

---

32
Bien que ces
structures aient
été
retrouvées à
la surface de
nombreuses cellules
normales
(40,
46,
13:-J ),
elles semblent
être plus abondantes à
la surface des cellules cancéreuses,
en particulier au
niveau
des
tumeurs ascitiques
( 33, 199
).
Co mm e
l e s u g g ère SAN FOR 0
(163).
l'a bon dan ce de ces g l Yc 0 pro -
téines O-glycosidiques,
à
la
surface de
la cellule cancéreuse
masquerait certains antigènes de surface,
en particulier
certains antigènes d'histocompatibilité.
BRAI'1WELL et HARRIS
(22
),
utilisant,
récemment
une
.;echnique de fusion
cellulaire
(
20~
entre diverses cellules
tumorales et
normales,
ont
permis de
suivre
les caractères
restant associés de façon
spécifique à
la transformation ma-
ligne.
Ces caractères doivent exister chez
la cellule tumorale
d'origine,
disparaître chez des cellules
hybrides,
et
réappa-
raître chez
les
sous-populations cellulaires présentant un
pouvoir oncogène.
Gr~ce à
cette technique,
BRAMWELL et HARRIS
constatent que
la
seule modification associée à
la transfor-
mation maligne,
touche une glycoprotéine membranaire,
ayant
une masse moléculaire de
l'ordre de 100.000 daltons et
un
point
isoélectrique égal
à
4,0.
Cette glycoprotéine,
chez les
cellules transformées,
fixe
plus de concanavaline A et moins
de
lectine
de germe de blé
(W.G.A.)
que
la même glycopro-
téine présente chez des cellules
normales.
Sur cette base,
les
auteurs concluent à
une glycosylation anormale de cette glyco-
protéine 100.000 K et
établissent
une
relation entre
le récep-
teur insulinique
isolé par le groupe de CUATRECASAS
(qO
qui
possède une masse moléculaire de 135.000 K et
un point
isoélectrique égal
à
4 et qui fixe
également à la fois
la
concanavaline A et
la
lectine de germe de
blé
(W.G.A.).
BRAMWELL et HARRIS
(
22 ) émettent
l' hypothèse qu'une
anomalie
structurale au
niveau
de ce récepteur serait respon-
sable de
la
perte des mécanismes de
régulation de
la crois-
sance caractérisant
la cellule maligne.

---

33
4.3.- Autres altérations de surface où sont impliquées
les glycoprotéines membranaires
4.3.1.- REACTIVITE
AUX LECTINES.
On sait que
la
contamination
par
un virus ou
la
trans-
formation
tumorale
entrainent des modifications
de
la composi-
tion des glycoprotéines de membrane
(201;
140, 4,
21);
or.
parallèlement.
les
cellules
perdent
un certain
nombre de pro-
priétés
comme.
par
exemple.
l'adhésion
sur des
substrats.
et
l'inhibition de contact.
La
concanavaline A (Lectine)
ajoutée
au milieu de culture
peut
rétablir
l'inhibition de
contact
(~, 165, 166).Par ailleurs.
les
cellules
transformées
sont
agglutinées
par certaines
lectines à
des
concentrations
beau-
~oup plus faibles
que
les
cellules
normales.
C'est
cette observation de AUB
14 ) qui fut
le point
de départ
de
toutes
les
recherches
actuelles
sur les
lectines
-Les
lectines
sont des
(glyco)
protéines que
l'on a
d'a-
bord
extraites des
végétaux.
mais
on
en
trouve un
peu
partout:
dans
les
extraits de
cellules animales.
des
champignons.
des
levures
(165,
160, 116)·
Ces
lectines
possèdent
la
propri-
été de
se
lier spécifiquement à
des
sites
récepteurs
de
la
membrane cellulaire.
Et.
l'interaction de
ces
lectines avec
les
cellules.
dans
plusieurs
cas
peut être
inhibée spécifique-
ment
par de
simples
sucres
(165,lG6
).
Ceci
prouve donc
que
les
lectines
se lient
spécifiquement à
des
saccharides
présents
à
la
surface de
la
cellule
(165 ).
Les
lectines
se
li8nt aussi
aux mono
et oligosaccherides
et
elles
précipitent
spécifiquement
les
polysaccharides
et
les
glycoprotéines.
Cette
précipitation
est aussi
inhibée par
l'addition de
sucres
(lG~, 91
).

---

-L'agglutination des
cellules
par certaines
lectines
est
plus forte
chez des cellules
transformées
par des
virus
oncogènes,
par des agents chimiques
carcinogènes ou
trans-
formées
spontanément,
que chez
les cellules
normales.
(
140, 14,
165, 166
).
Ces faits
renforcent
l'idée que
la
surface des cellules
transformées diffère de celle des
cellules
normales,
et
en
particulier au
niveau de
la
répartition des
glycoprotéines.
En effet,
les analyses
chimiques,
ont démontré
la
nature gly-
coprotéinique des
récepteurs qui
contiennent des
sucres
neu-
tres,de
l'acide sialique,
et de
la glucosamine
(91
).
La microscopie
électronique a
été utilisée pour loca-
liser
les
récepteurs de
lectines,
et
pour déterminer leur
répartition,
et
leur
relative mobilité,
à
la
surface des
cellules
transformées
et
normales
(140 ).
NICDLSDN
(lLlO )
avec de
la concanavaline A marquée à
la ferritine,
a démontré que comparativement aux
récepteurs
de concanavaline A des
cellules
3T3 qui
sont plus
dispersés
les
récepteurs de
concanavaline A à
la surface des cellules
SV 3T3 ont
une distribution
plus
regroupée.
MICHAEL
INBAR
et
LED SACHS
(P8
) ont démontré que
environ 85% des
sites
liant
de
la concanavaline A,
sont
exposé~
à
la
surface des
membranes des cellules
transformées alors
que ces mêmes
sites
sont comme
"voilés"
chez
la cellule nor-
male.
Les changements dans
les
mécanismes
de
régulation cel-
lulaire associés
à
la
transformation,
résulteraient
de changement de structure de
la
surface membranaire
qui"dé'Joilerait"
ses sites
récepteurs
chez des cellules trans-
formées

---

35
Comme
nous
venons de
le décrire.
l'augmentation de
l'agglutinabilité chez
la
cellule transformée.
n'est
pas
due à
une augmentation
du
nombre des
sites
récepteurs
pour
la
lectine:
ceux
sont
présents en
nombre
sensiblement
égal
à
la surface des cellules
normales
et
transformées.
Par
contre.
il
existe
une
plus
grande mobilité de ces
sites chez
la cellule transformée.
Ces
résultats
ainsi
que d'autres
sem-
blent
reflèter une
plus
grande fluidité
de
la membrane can-
céreuse par
rapport
à
la membrane
normale
105, 1Gb ).
Il
faut
cependant
noter que
l'enthousiasme provoqué
par
la
découverte des
lectines
a
un
peu
diminué.
On s'est
rendu compte en
effet
qu'il
était
extrèmement dif-
ficile
d'identifier
les modifications de
la
structure de
la
surface cellulaire
pendant
la
transformation des
cellules
normales
en
cellules malignes.
En outre.
l'augmentation de
l'agglutination par
les
lectines,
n'est
pas
une
propriété
commune à
toutes
les cellules malignes.
Malgré ces aléas,
l'utilisation des
lectines
représente
une
technique
précieuse
pour
l'étude de
la structure des
glyco-
protéines de membrane.
4.3.2.-
Glycoprotéines et antigènes de
surface
L'apparition de
nouveaux antigènes
associés
à
la
transformation maligne
est
un
phénomène
important.
car ces
antigènes
peuvent
permettre in vivo
à
la cellule maligne
d'échapper à
l~
surveillance du
système immunitaire
(75
).
Ces
néoantigènes
présenteraient des
structures différentes.
des
spécificités antigéniques
nouvelles.
des
localisations
différentes.
dES
mobilités .variables
et des
rôles différents
dans
les
phénomènes de
rejet
(l~O ).

---

36
Ces
antigènes
peuvent
être
des
antigènes embryonnaires
tel
l'antigène
carcinoembryonnaire
(C.E.A.)
de
nature glyco-
protéinique,
qui
réapparait
à
la
surface des cellules
tumo-
rales
du
colon
( j e ) .
et aussi de nombreuses autres tumeurs.
Les
antigènes
nouveaux
(néoantigènes)
spécifiques aux
transplantation,
apparaissent à
la
surface
des
cellules
trans-
formées
par des
virus
oncogènes
ou
des
cancérigènes chimiques.
Ce
sont
les
T.S.T.A.
(Tumor
spécifie
transplantation antigen)
ou
encore
appelés
T.A.T.A.
(Tumor associated
transplantation
antigens) .
L'immunogénicité
de
ces
néoantigènes,
en
particulier
des
T.S.T.A.
induits
par
les
virus
oncogènes
a
fait
l'objet
de
nombreux
travaux,
en
particulier ceux
de
KURTH et
BAUER
( lir)).
La
propriété
la
plus
importante de
ces
T .S. T .A.
sem-
ble être
leur
rôle
dans
la
protection d'hôtes
syngéniques
contre
la
prolifération
tumorale:
des
animaux
immunisés par
ces
antigènes
sont
ainsi
capables
de
rejeter
une
tumeur trans-
plantée
renfermant
cet
antigène.
Un autre
exemple
du
mode d'action
de ces
T.S.T.A.
nous
est
donné
par
]a
régression,
chez
le
~hat,
des
tumeurs
indui-
tes
par
l'inoc~lation du
virus du
sarcome félin
(FeSV)
et
par
la
résistance
naturelle de
ces
animaux au
lymphosarcome
induit
par
le
virus
de
la
leucémie féline
(FeLV).
Cette résis-
tance
est
liée
à
la
présence
dans
la membrane d'un antigène
appelé
F.O.C.M.A.
(Feline
Oncornavirus associated
cell
mem-
b r a n e a n t i g e,,)
(," ::'
).
Cet
a n t i g è n e est
den a t ure g l Yc 0 pro -
téinique
et
possède
une
masse
moléculaire de
65.000 daltons.
D'autres 1.S.T.A.
ont
été caractérisés:
en
particulier
une
glycoprotéine,
de
masse
moléculaire 100.000,
présente
à
la
surface
des
cellules
de
Poulet
infectées
par
le virus
du
sJrcome
de ROUS

---

37
De
toutes
ces
observations
qui
sont
loin
d'être
exhaus-
tives,
il
apparait
que
les
processus
tumoraux,
sont
caracté-
risés
aussi
par
l'apparition
de
nouveaux antigènes,
ou
l'élé-
vation d'antigènes
déjà
préexistants à
la
surface cellulaire;
et
ces
observations
sont
en accord
avec
les modifications
observées
au
niveau
des
glycoprotéines,
lors
de
la
transfor-
mation maligne.
4.3.3.-
Problème
de
l'acide
sialique
La
pl~part
des
cellules
en
culture,
contiennent
un
taux
important
d'acide
sialique
étroitement
lié aux glycopro-
téines
et
localisé
en
priorité
sur
la
surface membranaire
( GSt
2 O':)
).
Par suite,
de
l'intérêt que
représente
la membrane des
cel-
lules,
dans
le
processus
de
transformation,
de
nombreux
tra-
vaux
ont
été effectués
sur
les modifications
de
l'acide sia-
lique
et
des
sialoglycoprotéines
après
la
transformation.
De
tous
~es
travaux,
il
ressort
u~e discordance
encore
inexplicable
en
ce
qui
co~cerne les
variations
de
l'acide
sialique.
En
effet.
DHTA et
coll.
(1968)
( 144
),
ont
observé
que
les
cellules
3T3
ou
BHK
transformées
par un
virus onco-
gène,
contiennent
moins
d'acide
sialique que
leurs
homologues
non
transformées.
Ca
résultat
est
en
accord avec
les
obser-
vations
de
GRIMES
(1973)
[71
qui
trouve
qUE
les
cellules
en culture
transformées
par un
virus
contiennent généralement
moins
de
sialyJtransférase5
que
les
cellules
non
transformées.
Par ·:lilleurs.
f:AL/~L1T et
CDll.
trouvent que
les
cellu-
les
cJ E-l S
tu me LI r ~i
ci' hé pat 0 m8
deR a t i n d LI i tes
par
le
rH ami no a Z 0 .-
b e ri Z ~ [18,
con ~~ i e n [1 f-l r1 t
plu s
d' a cid e
s i a l i que que
les
cel l LI les
n 0 r mol les
d e
T 0 j. e
cJ e
Rat.
\\j AI~
BEE K e t
[: 0 J. l . ( :i. SI 2)
() n t
cor r 0 -
bo['f~
une
expér ic·:r1ce
préalable de INARREN
et
Coll( 2'02)

---

38
dans
laquelle,
les cellules
transformées
in
vitro
en culture,
possédaient
une
fraction
glycoprotéinique
plus
riche
en acide
sialique que
les
cellules
normales.
Dans
une
série d'expérien-
ces
sur
les
glycolipides
des cellules
normales
et cancéreuses,
de
nombreux auteurs
ont observé,
chez
la cellule transformée,
de
nombreux
exemples de délétion
en acide
sialique dans
la
f r a c t ion g l Yc a n n i que
(73. 74. 136)
Il
est
tentant
de
relier
les
modifications de
l'acide
sialique,
des
sialoglycoprotéines
et
des
sialyltransféreses
avec
le
stade
néoplasique
des
cellules
en culture,
mais
les discordances
dans
les
résultats
ds
nombreuses
expériences
doivent
prévenir de
conclusions
trop
hatives.
Ain s i
do 1-, c,
les
var i a t ion sen cl cid e
s i al i que
n' a p par a i ci -
sent
pas
comme
une
propriété générale du
stade
néoplasique
(140
).

---

39
v - QUELQUES METHODES D'APPROCHE
Une
bonne connaissance de
la
nature,
de
la réactivité
biologique,
voire de
la
structure chimique des
glycoprotéines
impliquées dans
les
interactions cellule-cellule et
cellule-
substrat,
devrait être la base de
toute approche rationnelle,
dans
l'investigation des
phénomènes
biologiques complexes,
tels
l'inhibition de contact,
la
reconnaissance
tissulaire,
le
rejet de greffe et
les métastases.
De
nombreuses méthodes
d'extraction
et d'études des
glycoprotéines de
membrane ont
été proposées abondamment
dans
la
littérature.
Mais chacune d'entre
elles
possédait
ses
limites.
La
fraction
"membrane de
surface"
obtenue.
varie
en fonction
de
la
technique
utilisée,
à
cause des
contamina-
tions
possibles
par
les autres
fractions
subcellulaires,
et
des
pertes des
constituants
membranaires.
Il
est donc
important d'utiliser différentes
techniques
de fractionnement
basées
sur différents
principes.
Pour éviter
les
problèmes de fractionnement
de membrane,
certains auteurs
ont
utilisé,
des
techniques
différentes pour
définir,
et
localiser des
glycoprotéines de membrane.
Une des
méthodes
utilisées,
pour déterminer
les
variations dans
la
com-
position des
glycopeptides,
est de
soumettre les cellules à
l'action
non-lytique
des
protéases
et
ensuite d'analyser
les
glycopeptides
extraits.
En
effet,
il
a
été fréquemment obser-
vé,
que les
glycopeptides
extraits des
membranes
des
cellules
transformées
étaient
de
plus
"grande
taille"
que
leurs
homo-
logues
normaux
(201,86,193,202)

---

40
C'est ainsi
donc
que entre autres
exemples,
la trypsine
a
été utilisée pour extraire les
glycoprotéines
porteurs d'an-
t i g è ne s p é ci fi que Mou
N deI a
sur f ace
d' é r y t h roc y tes
(36, 185)
KDRNFELD S.
et
KORNFELD R.
ont
trypsinisé des
érythro-
cytes intacts
pour extraire
des
glycoprotéines comportant
des
sites actifs
récepteurs
de
la
phytohémagglutinine
(106,107)
BUCK
et Coll.
ont
étudié des
glycoprotéines
extraites
par
la
trypsine
des
cellules
en culture et
poussant
en pla-
ques
(24)
CDDINGTON
et Coll.
ont
extrait
par
la
trypsine
des
glycoprotéines de
la
surface de
cellules d'ascite d'adenocar-
cinome mammaire de TA3.
Ils ont montré que
l'utilisation
d'incubations
courtes avec
la
trypsine TPCK,
dans
laquelle
l'activité chymotrypsique
est
inhibée,
permettait
d'extraire
des
glycoprotéines
de
composition
et de
longueurs différentes
(32,172,33)
D'autres méthodes
d'approche qui
ont
été utilisées
pour l'étude des
(glycol
protéines
de membrane
peuvent
être
résumées
de façon
suivante
1-Digestion par des
protéases
et glycosidases,
avec
l'hypothèse que
les
enzymes
étant des
macromolécules,
ne tra-
versent
pas
la double couche
lipidique de
la membrane.
2-Méthodes
d'extraction
chimique par le
lithium
di i 0 dos al i cyl a t e
(L l S l e t
1 e ph é n 0 l
(64 1 9 9)
3-
Méthodes de marquage externe,
comme
par exemple
l'iodinatiorl catalysée par
la
lactoperoxidase
(129,148)
ou
l'oxydation
par la galactose-oxydase suivie d'une réduc-
t ion par 1 [3
lJ 0 r 0 h Ydru l ' e t rit i é
(53, 57]

---

41
4-Des
techniques
immunologiques,
comme
l'immunofluo-
rescence de cellules en culture ou
fixées,
et
l'immunopréci-
pitation.
5-Des méthodes
de marquage métabolique,
par incorpo-
ration de
sucres
radioactifs
(glucose,
fucose,
glucosamine . . . J.
Toutes ces méthodes
citées plus
haut,
aboutissent
à
un dénominateur commun,
qui
est
l'analyse des molécules
iso-
lées ou marquées
par
l'électrophorèse en
gel
de
polyacrylamide
en
présence de
sodium dodecylsulfate
(S.O.S. J.
Cette
techni-
que avec
toutes
ses variantes
(Isoélectrofocalisation,
élec-
trophorèse
bidimensionnelle)
est
actuellement
très
utilisée
comme méthode analytique
car elle possède
un
excellent pouvoir de
résolution.

---

42
VI
-
CONCLUSION
La
transformation maligne
d'une cellule s'accompagne
de
troubles
profonds
au
niveau
de
sa membrane
plasmique
Ces
troubles
affectent
la
physiologie cellulaire:
perte de
l'inhibition de contact,
adhésivité
réduite,
apparition d'an-
tigènes
nouveaux,
augmentation de
la fluidité membranaire.
A ces
troubles
fonctionnels
de
la membrane sont asso-
ciées
de
nombreuses
altérations
structurales
touchant
les
glycoconjugués membranaires
protéoglycannes,
glycolipides
et glycoprstéines
Un
problème
important est de
savoir quelles
sont parmi
ces modifications
structurales
et fonctionnelles
de
la mem-
brane,
la
ou
les modifications
associées
de
façon
irréfutable
à
la
transforrnation r;',aligne,
c'est à
dire
à
la
propriété
acquise
par UI18 cellule dl?
se multiplier indéfiniment
sans
contrôle et
d'être fortemGnt
oncogène.
L'utili~ation de
techniques
lourdes
telles
qua
l'isole-
ment
des
mutants cellulaires,
ou
la
création d'hybrides
pro-
d u i t spa r
+u s ~L 0 n cel l u 1 air e , sem b ] e p 8 r met t r e der é p 0 n d r e ij
ce
premier
prublème.
Ainsi,
l'isolement
d'une cellule
ne
possédant
~as l'enzyme capable d'acétyler la glucosamine-6-
pr,osphate
149
),
absence.
se
traduisant
par une
biosynthèse
altérée d~s glycoprotéines,
a
permis de
démontrer que cette
CEllule,
~ion que
possédant
des
caractéristiques
de
cellules
melir,nes.
Il'e!,:
pas oncogène.
De plus.
l'addition au milieu de
c Le l t ure d a r'J - il C é t y 1 glu cos cl min e r é t a b l i t
t 0 u tes ces
f 0 net ion s
alté,~ées.

---

43
De même,
l'étude des
propriétés
restant associées
à
la
transformation maligne,
étudiée
selon la
technique de fusion
cellulaire de HARRIS
(22
semble permettre
l'élimination
de certaines caractéristiques
retenues
jusqu'ici comme mar-
queurs
tumoraux;
en particulier,
la
vitesse de croissance des
cellules,
leur capacité de
se multiplier sur milieux gélosés,
l'inhibition de contact,
la
production d'enzyme activateur
de
plasminogène et
l'organisation du
système contractile ne
semblent pas
représenter des marqueurs
spécifiques du
stade
néoplasique
(175,205).
Selon BRAMWELL
et HARRIS
( 22
),
la
seule anomalie,
donc
le
seul
indicateur de malignité serait
la
glycosylation modi-
fiée
d'une seule glycoprotéine membranaire de 100.000 daltons.
Selon WARREN et VAN
BEEK
(201,195
),
la seule anomalie
associée de façon
permanente au
pouvoir oncogène des
cellules
malignes
se situe au
niveau
de certaines
structures glycanni-
ques
N-glycosidiques
des glycoprotéines membranaires.
C'est donc
au
vue
de
l'importance des glycoprotéines
de membrane dans
la
transformation maligne,
que
nous
avons
essayé dans
ce travail
de mettre au
point
et
d'exploiter des
techniques de séparation
(principalement
électrophorèse)
et de
révélation des
(glyco)
protéines membranaires,
appli-
quées
à
l'étude des
cellules
L 1210
et
K 562 cultivées
in-
vitro.

---

DEUXIEME PARTIE
MATERIELS TECHNIQUES ET METHODOLOGIES

---

44
1 -
PRODUITS ChI~IOUES.
-
Acrylamide
(MERCK/SIGMA)
-
Ampholines
(LKE)
-
Ampholines-Pag-Plate
(LK8)
-
Bis-Acrylamide
(N.N'~éth~16n-Diacrylamid) (MERCK)
-
Bleu de
Brcmophenol
(SIGMA)
-
Bleu
dE [cGmassie R 250
(SIGMA)
'<
-
Boro~vdrure dB K/Na-~H
(K~B4/
Na
HB n ) (CEA)
-
Dimethyl Sulfoxyds
(DMSO)
(MERCK)
-
Di P h {~ ri y I ? - 5 G x êJ Z CJ l 8
( F PO)
( MER C K )
-
Ether-Mono-P
(TETFiA~ETHY-1.1.3.3. BUTYL)
Phénylioue cie Pclyetr:ylène glycol
(TRITON >:
1CO)
(MERCK~
-
L.Fuccse 14 C [L,)
(CEA)
-
Galactose Oxydase El
11.3.9.
(SI[jf''1P\\~
-
O r; l
.
1 4 C
(L'I)
('
.~
ucosamlne
'
CEP, )
-
Glycércl
qectep~r (PROLARO)
-
Inhibiteur de Trypsine
(SETI)
(SIGMA)
-
Mercentc-2-Ethanol
(PROLABO)
-
M~taperiod6te
dG
Sodium
(ME~CK)
-
Neura~iniGaSB
[Vibric-Cholér§a)
(KOCK-LICHT)
-
Non i d et
NP - 4 0
(F 1_ U ~.i\\ )
-
Persulfate d'Ammonium
(ME~CK)
-
Sodium Dor:iéc~il Sulfate
(SDS~
(SIr,MA)
-
TRIS-Base:
Tris
(Hydroxvméthyl)
Aminométhane
(MERCK)
-
T EIV] E0
(~J. ~l • ~; • N.
Té t r a n' é n y 1 - Eth Yl 2> n e [j i él min e )
( M F r~ U', ~
-
Try~sin8
-TPeK
(WORTHINGTON)
-
UrÉ!8 RP
(~,IGnfl,)

---

45
II
-
MATERIEL CELLULAIRE.
Au
cours
de
ce
travail,
nous
avons
utilisé
2 souches
cellulaires
cultivées
IN VITRO.
2.1.
La
L1210lyt:
C'est
une
leucémie murine
induite par
administration
de
3-~éthyl cholantrène à des souris DBA/2.
J:;:l:j..
2.2.
La
K562
:
Elle est
obtenue à
partir du
liquide
pleural
d'un
patient
3tteint d'une
leucémie myéloide chronique
en crise
blastique. ( 123)
Elle a
été décrite
comme
un stade
précoce de dif-
férenciation
de
la
lignée granulocytaire (104)
mais
à
la
suite des
travaux
de i\\NDERSON (9)
et
RUTHERFORD/( 160)
elle s'est
révélée être
une
lignée
érythroleucémique.
2.3.
CULTURES.
Ces
souches
cellulaires
sont
entretenues en
suspension
dans
le ~ilieu de
EACLE
DULBECCO
(GIBCD)
additionné
de
:
'10
~ de
sérum de
veau
foétal
(GIBCO)
-
500 000
unités/L
de péniciline
(SPECIA)
-
40 mg/L
de streptomycine
(SARBACH)
-
3 mg/L
de
fungizone
(SQUIBB)
-
50 mg/L
de
kanamycine
(THERAPLIX)
r
lyt
Don du
p
ZAGURY,
Faculté des Sciences Universi-
taire Pierre,
Marie Curie,
PARIS
ct
Don du
0
C8PPEY,
Institut Curie,
PARIS.

---

46
Les
cultures
sont
effectuées
en
flacons
de ROUX,
2
de
75
ou 150 cm
Les
volumes
de milieu
de
culture
utilisées,
sont
respectivement de
30
et
80 ml.
Les
cellules
sont
incubées
~
une
concentration de
100 OOrr~~ur les K562 et 200 ooo/ml pour les L121o,
dans
une atmosphère saturée en
humidité,
contenant
5
~ de C
(Etuvg NAPCOl
et
è
37°[.
O2
Ces deux souches
sont
des modèles
expérimentaux
intéressants
en
raison de
leur cycle de division
rapide:
2 è
2,5
divisions
pour
la souche L1210,
et
1 division
pour
la
souche
K562 par 24
heures.
2.4.
NUMERATIONS.
Elles
sont
effectuées
au microscope
~ contraste de
phase avec des
hématimètres
de MALASSEZ.
Les
cellules
vivantes
sont
réfringentes.
Celles qui
sont
rondes
et
de
la
même
taille,
mais
non
réfringen-
tes,
sont
comptées
comme cellules mortes.
Les
numé.rations
sont aussi
faites
è
l'aide d'un
compteur de cellules
(HYCELl.
Cet
appareil
a
l'avan-
tage d'une grande
reproductibilité;
cependant,
il
n'indique pas
le
nombre de
cellules mortes.
Pour
apprécier
la
létalité,
nous
effectuons
une numération
è
la
cellule de MALASSFZ.
III
-
RECOLTE DES CONSTITUANTS MEMBRANAIRES.
Notre
but
étant d'isoler puis
d'étudier des
(glycol
protéines
(ou des
fragments
de
(glycol
protéines)
de me~-
brane,
avant
ou aprss
action des
drogues,
nous
avons
abor-
dé
le problème de
plusieurs
façons

---

47
-
Trypsination douce
(4°C)
de
la membrane cellulaire
et
analyse du
trypsinat.
-
Marquage métabolique
"In Situ"
par
la
glucosamine
ou
le fucose marqué
au
14 C ,
et
ensuite trypsination douce
-
Marquage externe des
glycoprotéines,
et
étude du
lysat
cellulaire après
centrifugation.
-
Trypsination douce,
et marquage
externe du
trypsinat.
Toutes
ces méthodes
d'approche
sont
résumées
dans
le
schéma général
de
la
Fig.l0.
3.1.
TRYPSINATIDN.
L'attaque de
la membrane de
cellules
par des
enzymes
protéolytiques
nous a
semblé
au
début,
la méthode
la
plus
logiqu~ Dour en
libérer
les
glycoprotéines.
CDDINGTDN et
JEANLOZ
(32),
ont
en
effet,
démontré
qu'une
incubation de courte durée
n'avait
pas d'effet
sur
la viabilité des
cellules TA3
Ha
lorsqu'elles
sont
incubées
avec
une trypsine modifiée
pour éliminer
l'activité chymotrypsine,
à
une concentration de 12 à
1 8
rg/ml
et
à
4°C
pendant
20 minutes.
La
trypsine
est
une
endopeptidase
spécifique
qui
hydrolyse
les
liaisons amides,
esters
ou
peptidiques
impliquant
le carboxyle de
la
L-arginine ou
de
la
L- lysine.
Nous
nous
sommes
donc
inspirés de
la méthode de
CDDINGTDN
(32)
que
nous
avons modifiée
selon
le
protocole suivant
qui
est
résumé
dans
le schéma
de
la Fig. 11.

---

48
GLNH2,FUC
~TeRo C_E_L_L_U_L_E_s~
~MARQUAGE
1L.-_ _
_ _I_TT_Re_ _---,..
14
3
1 .
.
METABOLIQUE
C , H
r---'------ ----:;
j
:
NEURAMINIDASE
(-), ~.-- -
-
- - -
-
- .....- -
- - -
-
- - - ï
1
L---
-----
1
1
T
Tl
Il--------,
OX
1
NaI04
~
GALACTOSE
1
OXYDASE
1
~
1
RED
~
TRYPSINATION DOUCE
1
Â.
0°C/30'
TPCK
:
50 ~I/ml
,
LYSE DES CELLULES
~
l
. . . • . . · · E n O S A G E -
TRYPSIN.l\\T.
..
- - - - - - -
-----_.
1 \\\\ PROTEINES-1-/-1----....J
,
1
Cm1PTAGE
,
/
,
/
~
r
r - - - - - - - --'"------1
1
1
: CHRO~ffiTOGRAPHIE
i
1
1
1
1
L
D~ A..fEIliI_T,f:
.. :
1
y
~I ANALYSE ELECTROPHORETIQUE
lie
IEF,
ACRY/SDS,
BIDIM
,
METHODES DE REVELATION
_ _ _
~oomassie AUTOI~DIOGRAPHI~.~
Bi.
de
'COMPTAGE
Fig. 10 -
SCHEMA GENERAL DES METHODES D' APPROCHE POUR L' ETUDE DES
GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES.

---

49
PROTOCOLE.
-
Centrifuger
la suspension cellulaire dans
des
tubes
coniques
(30 mlJ
à
400
g
(~ 1000 rpmJ
pendant
1 0 mn.
-
Laver
les
culots
2 à
3 fois
par du
tampon Tris
PH 7,4,
et
rassembler dans
des
tubes
à
hémolyse
ou
des
tubes
coniques.
-
Centrifuger
le
"pool"
cellulaire à
1000 rpm
pendant
10 mn.
-
Relaver
par du
tampon,
compléter ~
5 ~l,
prélever
une
partie aliquote pour une
numération cellulaire.
-
Centrifuger à
1000 rpm pendant
10 mn.
-
Reprendre
le culot
par
le
tampon Tris
QSP 1 ml
6
pour 50
x 10
cellules
et
transférer
le
tout
à
DoC
dans
la glace
pilée fondante.
-
Ajouter
la
trYPsine1y!..:
50
~·11/~1 d'une
solution
~
7e
~f': /ml
(c.a.d.
4 rnU/ml
de
suspension cellulaireJ.
-
Agiter
en continu
pendant
30 mn
à
DOC.
-
Ajouter
l'inhibiteur trypsique S.B.T.I.
(soybeôn
trypsin
inhibitorJ
à
raison de
50
~l/ml dlune.
solution
~ ~n8
~~/~l
-
Ajouter
3 ml
de
tampon
phosphate PH 7,2
(P.B.S.J
goutte
à
goutte
en agitant
au VORTEX.
Centrifuroer
à
froid
(o°CJ
à
400
x g pendant
10 ~n.
-
Recueillir
le surnageant
(trypsinatJ.
-
Dialyser contre de
l'eau distillée
et
congeler.
-
Lycphiliser.
~: TRYPSINE-TPCK (WORTHINGTONJ dont l'activité chy-
motrypsique a
été
inhibée
par
la
L (1-Tosylamido-2-
phénylj
Ethyléhloro~éthyl kétone
ou
TPCK.

---

50
SUSPENSION CELLULAIRE
centrifugationl,
400 g [1000 rpm x 10 mnl
Surnageant
....._---------------'~
Culot
(à
jeter)
+
Remise en
suspension et
lavage
2 à
3 x par 'RIS
(pH 7,4)
--------1
NUM ERA TI 0 N...
t
Centrifugation
1000 r1m x 10 mn
Cl..JtoT
surn'ageant
(à
jeter)
6
TRIS
OS.
1 ml/50
x 10
cellules
l
(dans
la glace)
+
r
TRYPSINE
(50
~l/ml de suspension cellulaire d'une
solution
à
70
pg/ml
= 4 mU/ml)
agitation
30
mn dans
la
glace
,
+
S.B.T.I.
(50
~l/ml d'une solution à
200
pg/ml
+
~
P.B.S.
(3
ml
de
tampon
ohosphate
pH
7 , 4 )
1
Centrilugation à froid
10nn rpm x 10 mn
. . . . . . - - - _ 1 - · _ - - - - - - - - - - - - ,
+
,
CULOT
SURNAGEANT
[TRYPSINAT r
(à
jeter)
DIALYSE/eau distillée
~
ADI.A.LYSAT
.-------~
LOWRY
LYOPHILISATION
(20
à
50
~l)
t
dosage protéines
1 LYOPHILISAT l
I__~Repris par tamoon adequat
,
ANALYSE
ELECTRoPHORETIQUE ET REVELATION
Fig. 11
-
SCHEMA DE LA TRYPSINATION.

---

51
3.2.
MARQUAGE DES
GLYCOPROTEINES.
3.2.1.
MAR~IUAGE METABOLIQUE.
Une méthode
utile
d'identification
des
glycopro-
téines
est
représentée
par
le marquage
spécifique
résult~nt de
l'incorporation
par
les
cellules
de
pré c urs e u rs rad i 0 ma r q u é s
(14 C_ slucosamine
1 4
ou
C-
fucose) .
Nous
avons
utilisé
comme
précurseur
-
La
glucosamine qui
est
un
précurseur spécifique
de
la
N-acétylglucosamine,
de
la
N-acétylgalacto-
samine
et
de
l'acide
sialique
(101,114)
qui
sont
incorrprés
dans
19s glyccprotéines.
-
Le L-fucose
qui
est
un
sucre
terminal
de
la
chaine
glycannique
et
qui
a
été
largement
uti-
lisé
pour
l'étude de
la
biosynthèse des
glycopro-
téines
chez
les
cellules
eucaryotes
(94,113,134
En outre
des
études
ont montré
que
le
fucose
n'est
jamais métabolisé
ou
converti
en
d'autres
sucres.
mais
cu'il
est
ircorporê.
inchangé
sous
forme
de
r~sidus fucoeyls
dans
les
glycoorotéins2
94
)
.
)
INCUBATION.
Les
cellules
sont
cultivées
en
suspension,
en
1 4
présence
de 1-5 microcuries
Iml
de 0-
C-
gluco-
samine ou
L-
14 C_ fucose.
Les
glycoprotéines
radiomarquées
sont
étudièe5
au
bout
de
24
heures
selon
la
technique de
trypsi-
nation décrite
plus
haut.

---

52
3.2.2.
MARQUAGE EXTERNE DE GLYCOPROTEINES.
3.2.2.1.
oEFINITIIJN.
L'analyse des
glycoprotéines de
surface,
a
été
r~cemment facilitée par la "méthode de marquage
externe"
qui
introduit
des
éléments
radioactifs
spécifiques,
dans
les
fragments
oligosacchari-
diques
des
glycoprotéines
et
glycolipides
exposés
à
la
surface cellulaire.
Les
techniques
de marquage
galactose oxydase-
3
3
NaB H
et
périodate
-
NaB H
sont
relativement
4
4
aisées
à
utiliser,
car elles
nécessitent
peu de
cellules,
et
il
n'est
pas
nécessaire d'isoler
la membrane cellulaire
pour
étudier
les
glyco-
conjugués
53,57 )
Cette technique
a été
employée avec
succès
pour
l'analyse des
glycoprotéines
de
surface de
nom-
breux
types
cellulaires
(54,55,58)
Par exemple,
chez
les
fibroblastes
normaux,
la
fibronectine
(galactoprotéine al
est
fortement
marquée
par
la méthode
à
la galactose
oxydase
3
NaB H ,
tandis
que
les
fibroblastes
transformés
4
n'incorporent
pas
de
radioactivité
au
niveau
de
la
fibronectine
( 27,83 ).
3.2.2.2.
P~INCIPES.
1
3.2.2.2.1.
GALACTOSE oXyoASE-BOROHyoRURE
(GAO-KB H l.
4
-
wuand
des
cellules
intactes,
sont
traitées
par
la galactose
oxydase,
les
résidus
terminaux
de
galactose
ou
de
N-acétyl
galactosamine de
la
chaîne des
glycoprotéines
de membrane,
sont
oxydés
au
niveau
du
carbone
6
en
l'aldéhyde cor-
respondant
(55)
(Fig.12) •

---

53
A
CHOH
Galactose
a
Oxydase
OR
t
n
0
H
OH CHa
GALACF)~E
OR
8orohydrur8
H
OH
H
OH
B
0
COH
1°4
1
HÇOH
JI'
H C~OH
H
OR
Pêriodate
H
OH
H
A.CIIJE S!ALIOUE
H
CH CO
3
'f'3orohydrure
OH
H
OH
AC.
C7
HEPTULOSDNIQUE
R,A.c:;:rJ MARr;JUE
",
II AL:" ' i r, c: f" - f J X-l", 8 " h 4
*
r L ~,J.! i- fj T P ,Ii., C:' l [lA, c.: T l i

---

54
La masse moléculaire de
la
galactose oxydase
(75000d.)
empêche
la
pénétration de
l'enzyme dans
la
cellule.
Donc
seuls
les
glycoconjugués
exposés
à
la
surface cellulaire
sont oxydés.
-
A cause de
la
présence fréquente
de
l'acide
sialique,
lié aux
résidus
galactosyl,
un
trai-
tement
préalable des
cellules
par
la
neurami-
nidase
(qui désialide
les
ch~lnes glycanniques)
permet
d'obtenir
une oxydation
efficace
(54).
Les
cellules
sont
ensuite
lavées,
et
les
aldé-
hydes
formés
sont
réduits
par
le
borohydrure
3
tritié
(Na/KB
H )
pour redonner
le sucre de
4
départ
[Fig.12).
REMARQUE.
A ch3que marquage effectué,
nous
réalisons
sur un
lot
de
cellules
un
témoin
borohydrure
tritié
seul,
car ce dernier peut
provoquer la
réduction
de
liaisons
insaturées de certains
glycolipides
( 53 / 57).
Et
ce
témoin
perMet
de
vérifier
les marquages
aspécifiques.
3.2.2.2.2.
PERIDDATE-BDRDHYDRU~E.
Sous
l'action de
faibles
concentrations
en
periodate
[0.1- 2mM)
à
DoC,
et
pendant
des
temps
d'incubation
très
courts
[10
mn),
les acides
sialiques des
chaines
glycanniques
sont
préfé-
rentiellement
et
spécifiquement
oxydés.
Il
se forme
un
radical
aldéhydique qui
est
ensuite réduit
par
le
borohydrure tritié
pour
former
un
acide
heptulosonique
(acide 5 acéta-
mido
3,5
-
didéoxy-l-
arabino
-
2 -
heptuloso-
nique)
ou
un acide octulosonique
(54,82)
selon
le
schéma
de
la
Fig. 12 •

---

3
-
Ce
tra1temBnt
par
le
per1odate-B
H
peut-être
4
précédé
par
l'act1on
de
la
neuram1nidase
qu1
démasquerait
d'autres
acides
s1a11ques
de
la
chaine
glycanniq~e, et
qu1
pourront
è
leur
tour
être
oxydés.
3.2.2.3,
REf\\CTH:i.
-
Tar'pon
PBS
(OUi_BECCO)
PH
=
7,4
-
CaCl.)
100
mg/l
-
K Cl
200
mg/l
-
K H
P (l 6.
200
mg/l
?
-
Mr,r',
61-1
0
100
mg/l
. r ..J ~
--:~ ,
2
-
Na C l
BODO
mg/l
F' 0 l.
1150
mg/l
-
Gal a c t. 0 S 8
() >: y Ci e] S e
(E C . 1 1 3 9 • )
Typ"
\\}
(Sr::;I"IA)
1\\ 0
Repre~dre
le
fle~on de
galactose
oXJdase
(150
U]
::J al'
1, 0 Li 0
rD l
[J e
;) BS e t
ré par t 1 r
dan.'
1 3
tub~; s
(ec)
iUL/TubE:
1 , 5!J
U / Tub e ).
0 n u L lis e
4]~I L
5
U)
par
[);'vr:Jtion.
Donc
un
tube
ciécollge:.é
.3 e r t
à
=' D X Yri G t : Ij n~; .
-
I\\J 8 u rd T 1 nid cl s " ' " X
V 1 b l' 10
c ho l é r a e
1
i<, CJ c: K- L :: G HT ) •
Las 0 lut 1 0 r
f) r, 2. " l'; a t 1 que
(2 5 0 0
U / ml)
8 s t
r é J cl l' t 1 e
::J a r a I i [1 u 0 t e ~;
L fo'
1 [) tt-l
(2 5
U)
dan s
E: S
tub 3 ~j
.=PP:=:\\mOC:~F •
Chaqu r:!
tube
(!{e·:
19Edé
sert
ij
2
tra11 ElmE,nts.
S
tt:. / T r c 1'. P 'C, '; l t = 1 2 , 5 U/ Tl' a 1 t e m.'· ri t ) .
+
+
3
-
[3 [J l' 0 ri y d l' l! r f)
C 1:
Na
/ K
(
NaB
H
ou
4
,
3
\\J 0 u s a If c n sui. i l i ',e
aIt e l' n a t 1 v e men t
u
rj aB' -i ,L,
'JU
du
l'::']H ..
LE
lorohydrure
de
pota.:E,ium
se~lblE:
'i
,3 \\/ 0 i. l'
l.J I! e
fT e:. j .L '. J r e s t a b i 11 té
que
s
ri
ho ['10 ICi f. i..J:
30dr:.

---

56
Ce
radio-élément
nous
est
fourni
par
les dépar-
tements
des
radioéléments
du
C.E.A.SACLAY.
-
Activité
totale
5 mCI;,I''I!Tlnoule
-
Activité
spécifique
20
CI;~mole
Chaque ampoule
est
reprise
par 1 ml
de
NaOH
0,01
N et
est
répartie dans
10
tubes
par fraction
de
100 ~l
0,5 mCi)
qui
sont
immédiatement
congélés.
tube décongelé
sert
à
une
réduction
réduction.
-
Feriodate
(NaI04)
(MERCK).
Nous
préparons de
façon
extemporanée
une
solution
mère
0,1
M dans
du
tampon PBS.
10
~l
de
cette
solution
sont ajoutés dans
le
milieu
réactionnel
pour obtenir
une concentra-
tion
finale
de
1mM.
-
Tampon
d8
lyse.
-
Triton X 100
_
S BT l
250
-
P BS
QSP
3.2.2.4.
MODE OPERATOIRE.
3
3.2.2.4.1.
GALACTOSE OXYDASE-KB H .
4
-
Pour chaque
expérience de marquage nous
utili-
sons
un
nombre
total
de
cellules
variant
de
6
20
à
50
x 10
cellules.
-
Les cellules
sont
lavées
3 fois
par du P.B.S.
et
remises
en
suspension dans
1 ml
de P.B.S.
-
Dans
la
plupart
des
cas,
5 ~l
de
neuramini-
dase
et
40 ~l de galactose oxydase sont ajoutés

---

57
3
à
la
suspension cellulaire
(expérience
N+
GAo+
H).
Pôêfois
seule
la
galactose oxydasE
est
ajoutée
3
au
milieu
(E.xp. 6-r
H).
-
Les
cellules
sont
ensuite
incubées
à
37°C
p8ndant
30
minutes.
relavées
3
fois
par du
PBS
e~
remises
en
suspension
dans
0,5
ml
de PBS.
3
-
Ensuite
0.5
mei de
KB
H
contenus
dans
100 pl
4
d l~
I\\J a 0 HO, 0 1
rJ,
son t
ajoutés
au
milieu
et
la
suspension cellulaire
est
incubée
à
température
élrrbiante
(sous
la
hotte)
pendant
30
mn.
-
Les
cellules
sont
relavée3
3
fois
par du
PBS.
et
le
culot
cellulaire est
repris
Dar
0.2-0,5
ml
de
tampon
lyse
à
OOC
pendant
15
m~.
-
Le
lysat
cellulaire est
c~ntrifugé à
2000 rpm
p 8 r1 dan t
5 - 1 0
;,~ n e t
l e s u r n age a n t e s t
r ecu e i IIi .
Pprès
avoir
prélevé des
aliquots
ca 10 ~l pour
le
compta2e
et
le
dosage
des
protéines,
le
:C' L' l' n age a nt
est
con gel é
e t
s e r a s 0 u 71 i s
à
des
E&parations
électrophorétiques
ultérieures.
3
::. ;).2.4.2.
PERIOOATE
-
KB H
- - - - - - ' - - - - - 4
- ~o à 50 x ~~6 cellules sont mises en suspension
d ë r1 s
ml
de
PBS.
-
Ajouter 10
~l
d'une
solution de métaperio-
oele de
sodium pour obtenir
une
co~centration
fir:ale
de
1 mITlo:'./l.
-
La
suspgnsion
est
incubée
dans
l~
glace pen-
d 6 r; t
1 0 mn e t
à
l ' 0 b s c uri té.
-
Arrêter
l'action
du
perio1ate
pa~ du
glycérol
[:.1
rnmol/l
de
P:3S).
-
Les
cellules
soot
ensuite
lavées
3
fois
par
du
PBS
et
resus~endues dans
0.5
ml
de PBS.
-
La
réduction
ESt
réalisée
par
O,S
~Ci de

---

58
3
KB H
et
les
cellules
sont
traitées de
la
4
même façon
que dans
le marquage à
la
galactose-
3
oxydase-KB H .
4
REMARQUE.
-
A chaque étape du marquage
il
est
nécessaire
de vérifier
l'état des
cellules
e~ microscope
-
Ce
type de marquage
est
résumé dans
le
schéma
de
la
Fig.13
3.3.
TRYPSINATION DOUCE SUIVIE D'UN MARQUAGE
EXTERNE DES
GLYCOPROTEINES.
Pour diversifier
nos
techniques
d'approche,
car
chacune d'entre elles
possède
ses avantages
et
ses
inconvénients
cf
.
Ch.
Discussion),
nous
avons mis
au
point,
en outre,
une méthode d'étude
qui
est
l'amalgame des
techniques
citées
plus
haut.
Elle consiste
en
une
trypsination douce
à
DOC
suivie de
la
technique de marquage
externe des
3
glycoprotéines ~galactose-OXYdaSe-KB3H4 (G+ H),
3
3
neuraminidaSe-galactose-OXYdaSe-KB H
(N+G+
H),
4
3
3
periodate-KB H
(P+
Hl.
4
Chacune des
étapes
techniques,
ayant
été vue
en
détail
dans
les
chapitres correspondants,
nous
avons
résumé
la
technique de
trypsination-marquage
externe dans
le schéma
de
la Fig. 14 .
3.4.
DOS.~GE DES
PROTEINES.
Le dosage
des
protéines
est
effectué selon
la
méthode de
LOI.JRY
(122).

---

59
CELLULES
6
20-50x10
Lavage 3 x 5 mn ptS. PH 7,4
2000'RPM.
,
BOROHYDRURE FROID
CULOT
1 mM en conc.
fi.
repris par 1 ml de PBS
(O°C si PERIODATE)
1
1
,
11
,
r- - - - - -'- - - - - - - ---
1
;
1
NEURAMINIDASE
(12,5 U) 1
1
1
:
30 mnl 37 0 C
:
.,~------- - - - -- ----- ---{
OXYDAT O
GALACTOSE OXYDASE
METAPERIODATE DE Na
o
(5 U)
10 mnl 0 0 1 OBSCURITE
30 mnl 37 0 C
1 mM en
Co
FINALE
Lavage 3 x 5 mn PBS.
L.-----t~
2000 RPM.
t
CULOT
0,5 mL de PBS.
+
+
BOROHYDRURE Na 1 K
0,5 mci
30 mnl T O LABO
..
Lavage 3,x 5 mn
,
LYSE
CULOT
CELLULAIRE
0,2 - 0,5 ml de TPON LYSE
5 -
15 mnl 0 0
+.
3000 RPM/ 10 mn
1
Culot
....... . . . - - - - - - V
..
SURN1-'_GEANT
300 _. 400 ~L
ANALYSE
CO
l
---......
MPTAGE
DOS.
DES PROTEINES
ANALYSES ELECTROPHORETIQUES
REVELATION
( FLUOROGRAPHIE)
Fig.13
-
SCHEMA DU MARQUAGE EXTERNE DES GLYCOPROTEINES DE MEMBRANES.

---

60
CELLULES
r---------------,
1
1
1
1
r.f.
1
TRYPSINATION
1
1
1
Ch.
1
DOUCE
1
1
1
1
1
TrypsinatO
1
OOC/30-40mn
1
1
1
----------------~ j
1 SURNAGEANT
~
Dialyse /PBS/EAU/24-48H
l
Dosage des
-
(LOI-JRY)
Protéines
1
r------------------~---------------------ï
cf
.
Ch. ----. 1 MARQUAGE EXTERNE sur 1 ml DE SURNAGEANT 1
1
3 3 3
1
o
r1 a r q.
Ex t .
1
N + G +
H
G +
H,
P +
H,
1
l
'
1
~--_-------------------------------------4
Comptage
(Scintillation
Liquide)
SEPARATION ELECTROPHORETIQUE
REVELATION
FLUOROGRAPHIE
() Après
chaque traitement,
dialyser
exhaustivement contre
du PBS
et
ensuite contre de
l'eau distillée.
Fig. 14
-
TRYPSI NA T ION [] 0 UCES UIV l E D' UN MA RQUA GEE XTER NE.

---

61
3.4.1.
PRINCIPE.
La
solution de
protéines
est
dosée
à
la
fois
par son
pouvoir
biurétogène
(CUS0
en milieu
4
alcalin)
et
par
le
pouvoir
réducteur des
restes
tyrosyls
et
tryptophyls
sur
le
réactif phospho-
tungsto-molybdique de FQLIN-CIDCALTEU.
3.4.2.
REACTIFS.
-
Une
solution d'albumine bovine
(SIGMA)
A une concentration de 1 mg/ml
est
utilisée
pour
préparer
une
gamme d'étalonnage de 10
à
60 pg/ml.
-
Solution de
travail.
Elle est
préparée
par mélange
extemporané des
solutions A et
B suivantes,
dans
le
rapport
10/1
v/V) .
-
S 0 lu t i 0 Il
A
20 g
Tartrate de
Na
et
K,
4H 0
5
g
2
H 0
QSP
1000 ml
2
-
Solution
B
CLJ.S0
,
5H;;0
0,1
g
4
H 0 QSP
1000 ml
2
-
Réactif de
FOLIN-CIOCALTEU~
A utiliser
pur,
non
dilué.
3.4.3.
MODE OPERATOIRE.
Ajouter
2 ml
d8
solution de
travail
à
l'échantillon

---

(;2
(10-100 ~l).
Agiter
vigoureusement
et
laisS8!'
repo"er.
Après
1D mn.
ajouter
0.1
ml
de
réactif de
FOLIN et
CIOCALTEU.
agiter
énergiquement
et
lire
~
72D
n m
au
bllut
de
3[J
nln
passées
à
l'obscurité.
Les
résultats
sont
exprimés
en microgrammes
par
millilitre.
puis
ramenés
au
volume
de
l'échantil-
lon.

---

63
IV
-
TECHNIQUES
D'ELECTROPHORESE.
4.1.
INTRODUCTION.
"Lorsqu'une solution
renfermant
des
particules
chargées
est
soumise à
l'action d'un
champ élec-
trique,
on assiste
à
un
déplacement
de
certains
éléments
contenus dans
la
solution.
La
vitesse
et
l'ampleur des mouvements
dépendent
de
la
taille
et
de
la
charge des
particules
présentes".
Les
lois
régissant
ces
migrations
sont décrites
par
les
théories
électrocinétiques,
élaborées
en
1880
et
1881
par
l'Allemand
H.
VON HELMHOLTZ.
Différentes
techniques
d'analyse des
solutions
aqueuses
furent
élaborées
en
utilisant.
les
pro-
priétés
des
particules
chargées.
RegrQupées
sous
le
nom générique
d'ELECTROPHORESE
ou
d'IONOPHORESE,
elles
ne
devinrent
véritablement
opérationnelles
qu'
en 1931,
après
la
thèse
de
doctorat
du
biochimiste
Suédois ARNE
TISELIUS
qui
en définit
préci-
sément
18s modalités.
Poursuivant
ses
travaux,
A.
TISELIUS
perfectionna
l'électrophorèse
[Electrophorèse
Libre,
de Frontière
ou
en Veine
Liquide)
et
parvint
ainsi
à
séparer
18s
protéines
du
plasma
sanguin
juste avant
la
s8conde guerre mondiale.
Il
reçut,
en 1948,
le
Prix
Nobel
de
chimie
pour
ses
recherches
dans
ce
domain8.
Depuis
l'électrophorèse
libre,
a
été
largement
supplantéepar d'autres
formes
d'électrophorèse
dites
de
ZONE
(les
composés
se
séparent
en
zones)

---

64
qui
sont
beaucoup
plus
simples,
ont
des
pouvoirs
de
résolution
plus
élevés
et
sont
réalisables
avec
de
plus
petits
échantillons.
Dans
l'électrophorèse de
zone,
la
solution
de
particules
(protéines)
à
séparer est
immobilisée
dans
une matrice ou
support
solide,
matériel
poreux
hydraté
qui
possède
une
rigidité mécanique
élimi-
nant
les
anomalies
dues
à
la
convection ou
à
la
vibration.
Les
plus
largement
utilisés
de
ces
supports
ont
été
le
papier filtre
et
les
bandes
d'acétate de
cel-
lulose
maintEna~t.
Des
résolutions
électrophorétiques
beaucoup
plus
élevées
sont
obtenues
quand
le
support
ou
la
matrice
peuvent
retarder ou
exclure
des modécules
protéiques
selon
leur taille moléculaire.
Dans
ce
but
des
gels
d'amidon
et
principalement
d'acry-
lamide sont
habituellement
et
de
plus
en
plus
utilisés.
En
effet,
au cours
d'une
électrophorèse en
veine
liquide ou
sur papier,
les
particules
sont
séparées
essentiellement
en
fonction
de
leur charge
et,
la
nature du milieu
intervient
peu
dans
le
processus
de
séparation.
Un
gel,
par
contre,
crée des
forces
de friction
très
élevées
et
participe donc
activement
à
la
séparation des
particules.
L'utilisation d'un
tel
système
permet
d'une
part
de
réduire
les
phénomènes
de
diffusion
et
d'autre
part
de
séparer
les
parti-
cules
en
fonction
non
seulement de
leurs
charges

---

65
mais
aussi de
leur
taille.
De
plus
l'importance
relative
de
ces
deux
paramètre
peut-être modifiée.
4.1.1.
SEPARATION SUR
GEL
DE POLYACRYLAMIDE.
4.1.1.1.
DEFINITION.
Parmi
les
differents
types
de
gels.
le
polya-
crylamide constitue
dans
la
plupart
des
cas
le meilleur support.
En
effet,
l'utilisation
de
cette
substance
inerte
et
très
stable vis
à
vis
des
variations
de
température
(182)
permet
de
contrôler avec
précision
la
taille
des
pores
du
gel
qui
fonctionne
ainsi
comme
un
véritable
"tamis"
vis
à
vis
des modécules
à
séparer.
L'électrophorèse
en
gel
fut
décrite
en 1955
par SMITHIES
173
)
qui
prenait
comme
support
le
gel
d'amidon.
De grands
progrès
ont
pu
être
réalisés
lorsque ORNSTEIN et
DAVIS(146,
37)
ont
proposé
le gel
de
polyacrylamide de
polymères
formés
à
partir de
produits
chimiques
que
l'on
peut
obtenir à
un degré de
puretÉ
élevé.
Oepuis
ces
travaux on distingue
en
théorie
deux systèmes
de
fractionnement
Les"systèmes
continus"
dans
lesquels
la
nature
et
le
pH du
tampon
sont
identiques dans
18s
différents
compartiments
de
l'appareil,
et

---

66
les"systèmes
discontinus"
constitués
de
deux
types
de
gels
superposés
1)-
"Un
gel
de
concentration"
dans
lequel
existe
un
gradient
de
voltage
et
de
pH au
niveau
de
l'échantillon
et
qui
permet
ainsi
de
concentrer
celui-ci
en
une
fine
zone
de
départ.
2)-
"Un gel
de
séparation".
plus
concentré en
acrylamide.
et
de
pH plus
élevé
dans
lequel
les
modécules
se
trouvent
séparées
essentiellement
en
fonction
de
leur taille.
En
toute
rigueur.
le
terme
d'électrophorèse
"en disque"
doit
être
réservé aux
systèmes
discontinus
(37, 186).
Néanmoins
en
pratique.
on
emploie souvent
ce
ter8e
pour désigner
les
deux
types
d'électropho-
rèse.
En
ce
qui
concerne
l'appareillage
on
distingue
deux
techniques
l'électrophorèse
en
plaques
et
l'électrophorèse
en
tubes.
le verre
ou
le
plastique
pouvant
être utilisés
dans
les
deux
cas.
Le verre
permet d'obtenir
un meilleur refroi-
dissement
alors
que
le
plastique
présente
l'avan-
tage de
ne
pas
adhérer au
gel
ce
qui
permet
de
le
manipuler
plus
facilement.
Dans
les
deux
cas.
l'électrophorèse verticale
donne de meilleurs
résultats
que l'électrophorèse
horizontale
( cf
Ch.
Résultat
discussions).
Le
choix
de
l'une
ou
l'autre technique est
par-
fois
conditionné
par
la
nature du
problème à
résoudre
et
est
aussi
souvent
fonction
des
pré-
fèrences
personnelles.

---

67
LE GEL
DE POLYACRYLAMIDE
Le
gel
de
polyacrylamide
est
le résultat
d'une
poly~érisation du monomère
l'acrylamide avec
une
réticulation
due
à
la
présence
du
comonomère
le
bisacrylamide.
On
prépare
le
gel
à
partir de
ces
deux monomères
l'acrylamide qui
est
une
petite modécule
organique
se
terminant
par
un
groupe amide
(-CDNH
)
et
le
2
bisacrylamide qui
comporte deux monomères
acryla-
mides
liés
par
leur groupement
amide.
Les
monomères
sont dissous
dans
l'eau.
puis
on
ajoute à
la solu-
tion
deux
substances
supplémentaires
pour
induire
une
réaction de
polymérisation
en
chaîne.
Ces
catalyseurs
sont
le
persulfate d'ammonium,
et
une modécule organique,
le
tétramétyl
éthylène
diamine
(TEMED).
Après
la
première étape de
polymérisation.
où
le
persulfate d'am~onium réagit
avec
le TEMED.
celui-
ci
possède
un
électron de
valence
non apparié.
Le T~MED ainsi activé
se
combine alors
avec
un
monomère acrylamide
ou
bisacrylamide
dans
ce
procéssus,
l'électron
non
apparié
est
transféré
à
l'unité acrylamide.
laquelle
est alors
activée.
Un autre monomère
s'y attache
et
est activé
à son
tour.
Le polymère continue à
croître
jusqu'à ce
que
le
stock de monomères
soit
épuisé.
le
centre
actif
se déplaçant
continuellement
à
l'extrémité
libre
de
la
chaîne.
Si
la
solution
contenait
seulement
des
monomères
acrylamides.
la
chaîne
serait
toujours
linéaire
et
sans
ramifications
en
revanche.
une modécule dB
bisacrylamide
peut
appartenir à
deux
chaînes
et
les
relier de
façon
permanente.

---

68, ;
Le
polyacrylamide
croit
ainsi
en
un
réseau
imbriqué
de
boucles
et
de
branches
plus
ou
moins
anastomosées
en
fonction
de
la
quantité
en
bisacrylamide
(Fig .15
J.
On
définit
généralement
par
concentration
en
acrylamide
(TJ
la
somme
des
concentrations
en
acrylamide
et
bisacrylamide.
Elle
s'exprime
en
pourcentage
a
+
b
T
x
100
m
a
quantité
d'acrylamide
(g)
b
quantité
de
bisacrylamide
(gJ
m
volume
du
tampon
(ml)
b
On
définit
par ailleurs
c
x 100
a
+
b
La
quantité
de
bis
par rapport
à
la
quantité
totale
en
acrylamide
+
bis.
Le
gel
d'acrylamide
est
une matière
inerte et
neutre.
Il
n'y a
pas
de
phénomènes
d'électro-
endosmose
ni
d'interaction
entre molécules
à
séparer et
le
support.
Ceci
a
été
avancé
pour
expliouer
l'obtention
de
bandes
étroites
et
symétriques,
l'asymétrie
d'une
bande
permet
donc
de
suspecter
une
hétérogénéité
dans
sa
composition.
La
séparation des
protéines
est
uniquement
basée
sur
un
effet
de
"crible".
La
possibilité
pour des
molécules
de
passer à
travers
un
tel
"tamis"
dépend
d'une
part
de
la
taille
et
de
la
forme
des
pores
de
ce
tamis,
et
d'autre
part

---

69
Tt TRAMt THYL t THYL~ NE
ACRYLAMIOE
BISACRYLAMIOE
OIAMINE ITEMEOI
CJ
II1II
==
HJC
H
H
CHJ
H
H
,
1
1
/
,
N-C-C-N
C=C-H
'C=C-H
/
1
l
,
/
1
/
1
HJC
H
H
CHJ
H
C
H
C
-'/ ,
o
NH2
cY 'N-H
+
1
( NH.12 (50,)2
H- C-H
1
PERSULFATE O"AMMONIUM
o
N-H
~ /
H
C
,
1
C=c-H
+
tLECTRON,
H
H
HJC
H
H
/
,
1
1
NON-APPARlt
1
1
H
N-C-C • - - - - - - - - C = C
/
1
1
1
1
HJC
H
N
H
C
,
/
-'/ ,
HJC
CH,CJo
o
NH2
HJC
H
H
H
H
H
H
,
1
1
1
1
1
1
N - C - C - C - C 0 - - - - - - - - - - - - C =C
/
1
1
1
1
1
1
HJC
H
N
H
,C
H
C
/ ,
i j '
-'/,
HJC
HJC 0
NH2
c:::J-ti!!I:!l.
0
N -
H
1
H-C-H
1
o
N-H
H
~/
HJC
H H H H H H
,
1
,
1
1
1
1
1
1
C=C -H
N - C - C - C - C - C - C .
/
/
1
1
1
1
1
1
H
HJC
H
N
H
C
H
C
/ ,
-'/,
-'/,
HJC
H,C 0
NH2 0
N -
H
1
H-C-H
1
o
N- H
H
~C/
,
1
C-C-H
/
H
Fig.15
-
Structure
et
Polymérisation
(type
vinyle)
du
gel
de
Polyacrylamide
selon
TANAKA
(182
J.

---

70
de
la
taille
et
de
la
configuration
spatiale
des molécules
la
taille
c'est-à-dire
la masse
moléculaire
paraissant
être
le facteur
le plus
important.
Pour une
structure
spatials
donnée,
on
considère
que
la mobilité
est
inversement
proportionnelle
a u log 1 0 deI a ma a s e.m 0 l É: cul air e
(2 06 207) .
1
Nous
verrons
qu'il
y a certains amendements
à
apporter à
cette
notion.
Le
diamètre des
pores
dépend
essentiellement
de
la
concentration totale
en acrylamide
(T),
la
concentration
en bis
n'in-
tervenant
que pour
une
faible
part.
Le gel
de
polyacrylamide
présente une
certaine
élasticité car
l'on
constate qu'au
cours
de
l'électrophorèse,
des molécules
de
diamètre
su-
périeur à
celui des
pores
pénètrent
dans
le gel.
On peut donc supposer qu'il
a une certaine
"ouver-
ture"
des
pores
au
cours
de
la migration.
Ce
phénomène d'élasticité
a
été
rendu
responsable
par
ailleurs
de
l'absence de
diffusion,
après
arrêt
de
l'électrophorèse,
les
pores
se ressérant
sur
les molécules.
4.1.1.2.PRII\\JCIPES.
-
Le pouvoir de séparation dans
un
tel
système
repose sur
un
double
principe
+
séparation par électrophorèse,
+
et
effet de
tamisage
des molécules.
Les
forces
de
friction
dépendent
du
rapport
entre
la
dimension
de
la molécule
et
le
diamètre
des
pores
du
gel.
Ouand
le
diamètre apparent
de
la molécule
est
petit
par rapport
à
celui des
pores
du gel,
la

---

71
résistance
de
freinage
est
faible
quand
le
diamètre
est
voisin
de
celui
des
pores,
elle
devient
pratiquement
infinie.
Or,
pour
un
gel
à
7,5 ~,
le
diamètre
des
pores
est
d'environ
o
50 A ( 186 )
et
l'on
connait
le
diamètre
et
la
longueur de
la
plupart
des
pro-
téines.
Pour séparer
les molécules,
on
peut
jouer sur
deux
paramètres
+
la
porosité
du
gel,
+
le
tampon
dont
l'ajustage
du
pH permet
de
modifier
la
charge
des
molécules
à
séparer.
-
L'effet
de
tamisage
des
molécules
est
valorisé
par
l'emploi
d'un
gel
à
gradient
continu
de
concentration.
Ainsi,
les
protéines
migrent
pro-
gressivement
des
pores
les
plus
larges
vers
les
por8S
de
plus
en
plus
petits.
L'électrophorèse aide
ainsi
la
migration.
~ais
la
séparation
terminée,
les
molécules
se
trouvent
arrêtées
au
niveau des
pores
dont
la
taille
cor-
respond
à
leur dimension moléculaire.
SLATER
( 171 )
proposa
le
premier
ce
pro-
cédé
de neilleurs
résolution
dans
la
sépdration
des
protéines.
Il
faisait
polymériser,
entre deux
plaques
de
verre,
un
gel
de
polyacrylamide dont
la
concentration
suivait
une
progression
linéaire
entre 5
et 20 %.
MARGOLIS
et
KENRICK
128
utilisent
une
conc9ntration
de gel
croissant
de
4 à
20 % ou
de
4 à
24
% et décrivent
un
procédé
de
prépara-
tion
du
gradient
de
concentration
de
gel.

---

72
Pour
notre
part,
nous
avons
choisi de
travailler
en
gradient
d'acrylamide avec
différents
interval-
les
de
concentration
selon
la
nature du
problème
à
résoudre.
4.2.
ELECTROPHORESE
EN GEL
DE POLYACRYLAMIOE -
SODIUM
OODECYL
-
SULFATE
(ACRY /SOS).
4.2,j.
OEFI~JITION.
De
nombreuses
protéines
sont
oligomériques
et
contien-
nent
plus d'une
chaîne polypeptidique.
Grâce à
une
variante de
l'électrophorèse
en
gel
de
polyacrylamide,
appelée
électrophorèse en
polyacrylamide -
SOS,
une
protéine oligomérique peut-être dinociée
en
sous-unités
et
la masse moléculaire de ses
sous-unités
déterminée
( 206, 207 ) .
Les
protéines
à
séparer sont
traitées
avec
un
détergent,
le sodium dodécyl-sulfate
(SOS)
qui
les
dissocie
en
sous-unités
et
déroule
complètement
chaque chaîne
polypeptidique
pour former
un
complexe entre
le poly-
peptide
et
le SOS.
Dans
ce complexe,
la
chaîne poly-
peptidique est
recouverte
d'une
couche de mo!êculs5
de
SOS,
dont
les
chaînes
hydrocarbonées
sont
solidement
liées
par des
liaisons
hydrophobes
à
la
chaine
poly-
peptidique
;
ainsi,
les
groupements
(sulfate)
chargés
(-)
du détergent
sont
exposés au milieu aqueux.
Dans
ces
complexes
existe
un
rapport
constant entre SOS
et
protéines
(environ 1,4
:
en
poids).
Ces
complexes
ne diffèrent
donc
que
par
leur masse.
Ouand
une
proté-
ine monomérique
traitée
par
le SOS
est
soumise à
une
électrop~orèse dans un gel contenant du SOS, sa vitesse
de migration
n'est
fonction
que de
la masse de
l'en-
semble polypeptide-SOS.

---

73
Pour
calibrer
le
gel,
des
protéines 6talons
de masse moléculaire connue sont
soumises au même
processus.
C'est
sur
la
base de
ce
principe
largement décrit
et
utilisé,
depuis
les
premières
publications
faites
par SHAPIRO
et Coll.
en 1967
[164
),
!~EBER et
OSBORN en 1969
[ 206
),
LAEMI'1LI
en
1970
111
J.
que
nous
avons
choisi de
travailler.
4.2.2.
TECHNIQUES.
l),u
début"
nous
avons
essayé
la rrise
au
point de
cette
technique
avec
du matériel
déjà
préexistant
au
laboratoire.
C'est-à-dire
des
cassettes
de
gel
de
oolyacrylamide déj~ orêtes
~
l'emploie
[cassetes PAA
4/30
de
chez PHARMACIA).
Cette mise au
point
s'est
avérée
peu
concluante
cf
.
Ch.
Résultats
Discussion}.
Nous
nous
sommes
donc
inspirés
d'autres méthodes,
qui
consistaient
en
la
préparation des
gels
et
au montage
des
plaques,
sur
place au
laboratoire.
4.2.2.1.
TECHNIQUE COMMERCIALE
Electrophor~se
sur gel
de
oolyacrylamide,
gradient de
4 ~
30
SOS
0,2
';,
PH
=
7,4
(PA.A
4/30).
4.2.2.1.1.
PL,A,DUES
Dt VERRE.
Nous
avons
utilisé
des
Dlaques
de verre
de
gel
dont
le
gradient
va
de
4 à
30
';
[PAA
4/l0),
et
elles
sont
délivrées
toutes
prêtes
dans
le com-
merce
[PHARMACIA).
Le
gel
est
emDrisonné
entre
deux
plaqUES
de
verre
garantissant
une
épaisseur

---

74
uniforme
de
4,9
mm.
Leur
dimension
est
de
82
x 82 mm.
Elles
sont
limitées
latéralement
par de
petites
baguettes
de
caoutchouc maintenues
par de
l'adhésif.
4.2.2.1.2.
REACTIFS.
TRIS
0,04fVJ
Acétate de Sodium ..
0,02 M,pH
7,4
E D TA
.
2
mM
S
D S • • • • • • • • • • • • •
o, 2
;
TRIS
-
HeL
.
10 mM,
pH 8,0
E D T A.
m"1
S
D S . . .
2 , 5
PMercapto E ·i::h~nol. ..
5
4.2.2.1.3.PREPARATION ET
DEPOT DES
ECHANTILLONS.
Les
échantillons
sont
solubilisés dans
le
tampon
échantillon,
et
chauffés
pendant 15 mn à
BO°C
ou
3 mn
à
100°C.
Après
voir ajouté
quelques
gouttes
de
saccharosa ou
da glyc6rol
des
dépots
p
de, 10 à
30 fI
(en
fonction
de
la
concentration
en
protéines),
sont
effectués
à
la micropipette
directement
à
la
surface
du
gel.
4.2.2.1.4.
MIGRATION ELECTROPHORETIOUE.
Les
cassettes
de
gel
"PAA
4/30 gradient
gel"

---

75
sont
"démoulées"
et
les
gels
sont
déposés
sur
un MULTIPHDR
2117
LKB,
alimenté
par
le généra-
teur
LKB type
3371
C,
Des
bandes découpées
dans
du
papier filtre
sont
appliquées
à
chaque
bord
du
gel,
et assurent
le
contact
entre
le
gel
et
le tampon
d'électropho-
rèse.
Après
une
préélectrophorèse à
70 volts pendant
une
heure,
les
échantillons
sont
déposés
du
côté du
pôle
négatif
(côté
du
gel
le moins
con-
centré)
et
l'électrophorèse
est
conduite à
150 volts
pendant
2 heures
30 minutes.
4.2.2.1.5.
REMARQUES.
Il
est
à
noter que
les
kits
PHAR~ACIA (PAA 4/30)
n'ont
pas
été
utilisés
dans
les
conditions
ores-
cri tes
par
le
fabricant.
C'est-à-dire,
l ' u t i l i -
sation d'une
cuve
à
électrophorèse verticale
adaotée aux
cassettes,
d'un
appareil
Dour
déco-
lorer
les
gels
(par
plectrophère),
et
d'un
des-
sècheur
De plaques.
Tous
ces accessoires
prove-
nant du
même
fabricant
cité
plus
haut.
Les
techniques
de
fixation,
coloration,
décolo-
ration
des
plaques
seront
vues
olus
en
détail
dans
le
chapitre qui
leurs
est
consacré
(cf"
Ch. Révélation),
car
gUEl.
que
soit
le
tyr:e d'p-
l e c t r 0 0 h è:: se,
0 n
r e t r 0 u v e
d e
plu sen
plu s,
les
mêMes
procédés
de
révélation.

---

76
4.2.2.2.
TECHNIQUE
ADOPTEE.
Nous
avons
suivi
et
~odifié la
technique
pro-
posée
en
premier
nar
LAEMMLI
(111]
qui
elle
même
était
une
Modification
des
systèmes
décrits
par
ORNSTEIN
(146)
et
DAVIS
(37
J.
Elle
consiste
en
une
électrophorèse
en
système
discontinu
et
en
présence
de
S O S .
4.2.2.2.1.
FORMULE
DES
REACTIFS.
TRIS
-
Bi:l!:',p • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
Glycine
.
S O S
.
°,1
G l y c é r o l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
Oc;
( P IV ]
f->. M 8'" r. a IJ t 0- Eth i3 n <:1 1. • • . . • • . • • • • •.
5
Oc;
(V IV)
SOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . •
2,3
TR l S
-
H rl
.
0,0625
M pH 6,8
C
= ACRY-STOCK
:
Acrylamide
29,2
B i s a c r y l a m i d e . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,8
Eau
Distillée
Q.S.P
100
ml
TR l S
-
H rl
.
0,5
fVJ
pH
6,8 .l:i-
SOS
.
0,4
\\

---

77
TRIS
-
Hel . . .
1 , 5
M pH
B,B li-
S D S •••••••.
0,4
';
10
~ dans
de
l'eau distillée.
Cette
solution doit-être
préparée
toutes
les
semaines
et
conservée à
4°C
à
l'abri
de
la
lumière.
~ 0,1
;
(PlV)
dans
de
l'eau
distillée.
H
Solution de
fixation
~ ét ha n 0 1
.
150
ml
Eau Distillée
.
350 ml
Acide Sulfosalicyque.
17,25 g
Acide Trichloroacétique . . . .
57,50 g
0,1
';
de
Bleu
de coomassie R 250
dans
100 ml
de solution de
décoloration
J.
J
"Solution de décoloration
Ethanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . •
500
ml
Ac i de Ac é t i qu e
.
1 60
ml
Eau
distillée
Q.S.P
2000
ml
JfTE~EO
:
ê
utiliser
non
dilué.
li-:
A conserver à
4°C.
li- li-:
Ces
formules
ne
sont
données
qu'à t i tre
indicatif,
car elles
peuvent
varier comme
nous
le verrons
dans
le"chapitre Révélation':

---

78
4.2.2.2.2.
MATERIEL.
Nous avons
utilisé
un
appareil
classique
pour
électrophorèse
en
plaque verticale
179
).
Nous
avons
modifié
et
fait
construire
cet
ap-
pareil
par
les
Usines
PLASTIMARNE.
La
cuve a
été modifiée
de
telle
sorte
que
nous
puissions
utiliser des
plaques
de
hauteur
différente
(Réservoir du
haut
mobile),
et
faire
migrer
simultanément
deux
plaques
d'acrylamide
Fig.16
).
La
présence d'un
joint en
plastique,
sur
le
pourtour de
l'encoche
du
réservoir du
haut
as-
sure
l'étanchéité.
En
effet,
les
plaques
de
verre viennent
écraser
le
joint,
et
nous
évite
l'adjonction d'agarose,
comme dans
les
appareil-
lages
de
type
classique.
Les
plaques
de
verre
utilisées
pour couler
les
gels
d'acrylamide ont
été
découp8es
p~r les Ets.
PONSINET selon
nos
indications,
et
les
dimensions
suivantes
(Fig. 17
).
-
Plaque
avant
160
x 180 x 5 mm,
avec
une encoche profonde de
30
mm
et
longue de 140
ou
138
mm
en
fonction
du
type
d'électrophorèse
(10
ou
20).
Dans
le
cas
d'une
plaque
servant
à
une
séparation
en
double dimension
20),
l'encoche de
la
plaque

---

79
A
B
Fi".
16 -
A
APPAREIL !-\\ F:LECTROPI~onESE
En PLAnUE VEHTIC:ALE.
S
?RESE-,;TATIOiI CEJ.JEHALE DFS APPAHEILLP.{'-ES
U'llILHiES.

---

80
_ 5
'T, rTi
4-- --_._..
4-- •••.. -.
+
r - - -
,
+
1
,
m~t
1-~O
rr,['",
1
,
1
4-- - - - - - - - - •. _....
1
+
..1
1
1 5 C,
g
1 !) n ;r,rfl
:'1"'\\ rn
,n"
1
1
1
1
1
1
1
1
1
,
1
1
1
,,
1
,
- - -
-
--;0.-
----- -- --~
.....---- - -
1 60
,"rfl
rn r"1
1 CJ
rr, 'T,
dl IlE. ;::: .
4- - - - .
4-····~
r - - -
r - -
Î 4Ci
r;l rT
Rise.'-,u
4 - - - - - - - - - - - - - . 1
4-
- - - - I-~ - Jro. .!.z.ZZ!!!2=2!l!!'I!==I!'1l!!l=zo!
..
( 4 S 0 :
1
1
1
1
[
1 "il
cri ;ri
1
1
1
1
1
t
~ - _.1 6 iJ
fTl cr, - -
-
-
- -~
;\\
D l G " I~ cc
.e,' / d n t
(P., C: iJ r: S fJ C)
-
1
fj ]
o
[) ]~ l; .1-- j l
t, t Cl C 5 j t i [, fi l , B rrl E ri t d El l a 1 ''': r E r) 5 U c l Cl ;- r.: rr, S :--,

---

81
avant
est
biseautée à
45°.
[comme
nous
le verrons
plus
loin
le biseau
n'est
pas
toujours
nécessaire,
(cf. Ch.
Discussion).
-
Plaque arrière
160
x 180 x 5 mm.
.
l:f
-
P elgnes
à
12
dents
1 30
x 1,5 mm
à
16
dents
à
"1
dent"
1 0
x 1, 5 mm
-
Intercalaires l:f.
180 x 10
x 1,5
mm
3
-
Générateurs.
Nous
avons
utilisé
deux
types
de
redresseur
-
Le
générateur LKB type
3371
C.
-
Le
générateur SEBIA
GD
2200
la
tension
est
règlable de
0 à
2000
volts
de
façon
continue,
le débit
de
0 à
200
mA
et
la
puissance maximum est
de 100 VA..
L'appareil
peut
fonctionner
en
tension
stabilisée,
en
courant
stabilisé ou
en
puissance constante.
Dans
tous
les
cas,
les
paramètres
non
stabilisés
·peuvent
être
limités
à
une
valeur déterminée
par
l'utilisateur.
l:f Les peignes et les intercalaires sont en plexiglas
et
sont
fournis
par PLASTIMARNE
[Epernay)
ou
ASSISTA.I\\ICE
LABO
[Orsay).

---

82
4.2.2.2.3.
~ODE QPERATOIRE.
Les
Dlaques
propres ~ sont assemblées (Fig.
18
après
disposition
des
"intercalaires".
et
mainte-
nues
solidement
en
place
par des
pinces'
Pour
obtenir
une
bonne
étanchéité
du
"moule"
ainsi
réalisé.
nous
procédons
de
plusieurs
façons
-
Soit.
comme
il
est
décrit
dans
la
littérature.
en
coulant
de
l'agarose
chaude
è
1ou2
~
tout
autour du
moule.
De
façon
empirique.
nous
nous
sommes
rendus
compte.
que
pour que
ce
procèdé
soit
efficace
il
est
nécessaire
et même
conseil-
lé.
d'aménager
lors
de
la
pose
des
intercalaires.
une
~8tite riEole
sur
le
pourtour
du moule.
dans
laque~le l'agarose
sera
coulée
-
Soit.
comme
nous
procèdons
le
plus
souvent.
en
coulant
directement.
et
raoidement
environ
2 ml
d'aç;:lrose.
dans
le
fond
du
moule.
L'agarose
s'in-
filtre
dans
les
fissures.
et
elle
se
solidifie en
l'esp~ce de
~
2 mn
Dans
Le
cas.
les
précautions
~
prendre.
sont
de
travailler
rapidement.
et
de
veiller
~
ce
que
la
surface
sur
laquelle
repose
le moule
soit
bien
plane.
~ Les plaques sont nettoyées de façon classique comme
pour
la
verrer~e de
Laboratoire.
c'est-à-dire
avec
un
détergent
et
r~ncées ~
l'eau
distillée.

---

83
Pistor',
.... ---_ ..
r---l
( no u r
I~ rCl [1 i E "t
e >. :J ,J r '0 r: LiE l J
. -.._... i
.
l.
1
!
\\
I I
. /
\\...
..- }L·~~):=~=·.-J::,,::'::=::::===~ll~.'.
A
.~
éj." l. F::
'3! l' i ~:: r e
riEnt"
i
\\
f\\(~arOSfé
+
G l
,1 1 lE!
P""tq'iE
-' "
.. Gco l
Cl' i\\ [: f=, '.
c
8
13
" ,'~ c y ;' C; 'j C; 'J ') U r
1 r, r le
LI.

---

84
Des
solutions de
gel
en
concentration uniforme
d'acrylamide
pouvent
être coulées.
Pour
notre
part,
les meilleures
résolutions
(cf Ch.
résul-
tats-discussions)
ont
été obtenues,
après
sépa-
ration dans
des
gradients
de gel
de
polyacrylamide.
Les
solutions
et
les
proportions
des
composants
du
gel
sont
données
dans
le tableau ci-dessous.
GEL DE
GELS DE RESOLUTION
CONCENTRATION
5% L
7,5% L
10% L
16% D
4,5%
au distillée
11 ,67 ml
10 ml
8,37 ml
12 ml
~olution C
3,35 ml
5 ml
6,60 ml
10,BO m
3 ml
::iolution E
5
ml
5 ml
5
ml
5
m
(pH B,8)
Solution 0
5 ml
(pH 6,8)
Glycérol
4,20 m
à 75 %
TEMED
10
~ l
'1 0 ~ l
10
~l 10
fJ
5 ~ l
..
Persulfate
50
~ l
50 ~l
50
IJ l 50
P
50 ~l
d' NH4+
Volumes
20
ml
20 ml
20
ml
20
m
20 ml
~
Le TEMEDet surtout le persulfate d'ammonium doivent être
toujours ajoutés en dernier.
L = Solution "légère"
D Solution "dense" contenant du glycérol.

---

85
Nous
avons
utilisé
des
gammes
variées
de
8radient
A titre
d'exemple.
nous
citerons
les
gradients
5 -1 6
7 • 5 - '1 E
~
et
10-16
;
que
nous
avons
18
plus
souvent
employés.
Le
dispositif
utilisé
pour
la
réalisation
de
ces
gradients
Est
rG~r~senté d6ns
la Fi~.
18 •
Il
s'agit
d'un
formateur
de
gradient
(vol.
30
ml
de
chez
PLASTIMARNE).
Deux
chambres
l
et
I I
sont
A~
cummu
nication
par
un
mince
canal
inférieur muni
d'un
robinet
~
deux
voies.
La
chambre I I
communique
avec
l'extérieur
par
un
canal
étroit
et
contient
un
tJarre.3u
méJco;nétique
c'est
la
chambre
de
m~-
lanEe.
Les
volumes
~
utiliser
sont
déterminés
par
la
dimAnsion
du
gal
et
la
forme
du
gradien~ (exoo-
nentiel
~u
linéaire1.
Four
un
~81
dB
dimension
1 1 0
x 1 4 0
X
'1. 5
fT) ITI
".
Gra d i el t e x p 0 n 8 Il t i e l
on
utilise
8
rn l
d e 3 Cl J. LI .-
- - - - - - - - - - - - - - - - - - . _ -
tion
dense
(0)
et
16
ml
de
solution
légère
(~J.
Les
8
ml
de
solution
dense
sont
transvasés
I:J ans
la
chamb0e
de
mélange.
qui
est
aussitôt
obturée
par
un
piston.
de
façon
è
maintenir
le
volume
constant.
Le
rob i n ,~t
s? p a r:Hl t
les
de u x cha mb r es
est
0 u 'i e" t
de
façon
~
chasser
l ' a i r
contenu
dans
le
cana~ dB
cornmunic~tion
et
à
permettre
le
remolissage
de
ca n ë l
p j '
} a
s ,0 l ut i r. n I a
p l us
d en se.
L es
1 E ri, l.
ci e
sol u tL Cl n
1 [~ g è r f,
: 0 n t
:Tl 0 n tés
dan s
l 2
C Cl am b r e l •
l'32itation
est
mis2
en
route.
st
la
connection
avec
l'extérieur
est
faite.
La
soluticn
de
gB1
est
cou1 6 e
30
?ond
des
plaoues
avec
un
débit
car
un
r'o:Jinet
de
3
ml/cr, n.
La
scdutil;rl
est
ver '; :-: ~j
j U :3 qu' ~1
,-, n v i r 0 n
3
cm
d u
bas
ci e
l a
f 8 r' le,

---

85 bi s
-
Gradient
linéaire
dans
ce
cas
on
utilise
- - - - - - - - - - - - - - - - -
12 ml
de
solution
"dense"
(0)
et
13 ml
de
solution
"légère"
[L).
Nous
procèdons
de
la même façon
que
précèdemment.
mais
sans
obturer
la
chambre
de mélange.
Le gel
de résolution
est
ensuite,
recouvert
par
un mince film d'eau
ou
par de
l'isobutanol
satu-
rée en
eau,
et
laissé à
polymériser à
température
ambiante.
(environ 1 heure).
Après
la
polymérisation,
qui
est marquée
par
lê formation
d'un
interface
eau/isobutanol,
le
mince film
est
aspiré,
et
la
surface du gel
qui
doit-être
bien
plane
est rincée abondamment
à
l'eau distillée.
La
solution de
gel
de
concentration est alors
coulée
[environ 5 ml)
et
le
"peigne"
nécessaire
à
la formation
des
puits
de
dépot
est
introduit
tout
doucement
en évitant
d'emprisonner des
bul-
les
d'air.
La
polymérisation
a
lieu au
bout d e i
30 mm environ.-,
Après
la
polymérisation du 'gel
de concentration,
la
plaque peut-être
immédiatement
soumise à
élec-
trophère,
ou alors être conservée dans
une enceinte
humide
[réfrigération 4°C)
pendant
au moins
2 se~
maines
avant
d'être
utilisée.
Nous
préfèrons
couler
le gel
de
résolution,
la veille de
son
utilisation.
De
nombreuses
méthodes de préparation des
échan-

---

86
tillons.
sont
valables
dans
ce
genre
d'électro-
phorèse
207
l.
Elles
ont
en
commun.
le
fait
de
travailler
en milieu
dénaturant.
par
l'introduction
du mercaptoéthanol
qui
rompt
les
ponts
disulfures
des
protéines.
Les
protéines
dissoutes
dans
le
tampon
échantillon
doivent-être
immédiatement
soumises
à
électro-
phorèse.
Nous
utilisons
des
échantillons,
qui
ont
été
déssalés
et
lyophilisés.
Les
lyophilisats
sont
repris
par
le
tampon
échantillon
(solution
Bl
à
une
concentration
finale
variant
de
2 à
5 mg/ml.
Les
échantillons
sont
incubés
à
100 o [
pendant
2 à
3 minutes.
Pour
les
protéines fragiles,il
est
préférable de
les
incuber à
37°[ pendant
3 h.
Après
l'incubation,
agiter
les
solutions au
VORTEX,
et
ajouter 5 à
10
pl
de
solution
de
Bleu de b romophénol
à
1
L
en
guise
de marqueur
de
front.
"L'intercalaire" du
bas
et
le
"peigne"
sont
retirés
et
les
plaques
de
verre
sont montées
dans
l'appareil
à
électrophorèse,
en
veillant
à
ce
que
le
contact
entre
les
plaques
et
le
joint d'étanchéité
soit
parfait.
Les
réservoirs
sont
remplis
par
le
tampon
d'électrophorèse
(so-
lution A,
environ
500
mll
en
évitant
d'emprison-
ner des
bulles
sous
le gel
dans
la
cuve du
bas.

---

87
Les
solutions
d'échantillon
sont
déposées
dans
les puits
à
l'aide d'une
seringue
HAMILTON.
Les
volumes
à
appliquer
sont
fonction
de
la
concen-
tration
en
protéine,
et
de
la
quantité
de
radio-
activité présente dans
le cas
des
gels
qui
seront
soumis
à
autoradiographie ou
à
une
fluorographie.
En
général,
nous
déposons
des
volumes
variant de
10
~ 30
~l
(50
à
150
~g/5oo0 à 10000 cpm).
La
connection
entre
les
électrodes et
le généra-
teur est
effectuée
(Pôle
négatif
en
haut)
et
l'é-
lectrophorèse est
conduite à
30 mA/gel
(ampérage
constant)
jusqu'à ce
que
le front
de migration
(matérialisé par
le
Bleu
de bromophénol)
atteigne
le
bas
de
la
plaque
(environ
3 heures).
Si
le
voltage
n'est
pas
stabilisé,
il
oscille entre 90
et 180 volts.
5 -
Fixation
-
Coloration
-
Décoloration.
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Après
l'arrêt
de
l'électrophorèse,
le gel
est
démoulé
avec
précaution.
Le
gel
de concentration
et
le
joint d'agarose sont découpés
à
l'aide
d'un
scalp81,Après avoir réalisé une
entaille
en
bas
et
à
droite
du
gel,
celui-ci
est
transféré,
en prenant
soin de
le tenir
par
le
côté
le plus
concentré
(bas du
gel),
dans
une
cuvette conte-
nant
le fixateur
et
le
colorant.
Les
techniques
de
fixation
coloration
et décolora-
tion
seront
vues
en
détail
plus
loin dans
le
chapitre
consacré à
cet
e~fet
(Ch.
Révélation).

---

88
4.2.2.2'4'
RESULTATS
ET
EXPLDITATIDI\\J.
-
Après
coloration
et
décoloration,
les
fractions
protéiques apparaissent
sous
forme
de fines
ban-
des
colorées,
dont
le
nombre
et
l'intensité dé-
pendent
de
la
nature
et
de
la
concentration
de
l'échantillon
à
analyser.
-
L'exploitation
première
de
cette
technique est
la
dstermination
des
masses
moléculaires
relati-
ves
des
différentes
fractions
orotéiques.
En
effet ,
SHAPIRO
et
Co l 1.
[164
ont
démontré
qu'il
existait
une
relation
linéaire
entre
le
loga-
rithme
de
la
masse
moléculaire
et
la
mobilité
électrophorétique de
chaque
chaIne
polypeptidique
[expsrience
faite
sur 11
protéines),
lorsque des
protéines
sont
séparées
dans
un
gel
de
polyacry-
lamide
--
SOS.
La
F,énéralisation de
ce
principe
par \\<JEBER
et
QSBDRN
(206),
laisse
apparaître
que par cette
technique,
les masses moléculaires
oes
polypep-
tide
peuvent
être
déterminées
avec
une
précision
de
plus
ou moins
10
~o •
Nous
proc§dons
à
la
détermination
des
masses
moléculaires de
la
façon
suivante
Lors
de
toute migration
électrophorétique,
des
protéin8s
étalons
de masse moléculaire
connue
sont
traitées
de
la même
façon
que
les
échantillons
é
analyser.
Nous
disposons
de deux
"Kits"dont
les
comD~sitions sont
les
suivantes

---

89
-
Etalons
de
haute masse
moléculaire
(PHAR~ACIA)
Thyroglobulin~.
330
000
Ferritine
220
000
Albu-nine.
67
000
Catalase.
60
000
Lactate
deshydrogénase
36
000
Ferritine
............
1 8
500
Phosphorylase
B.
9 4
000
Albumine . . .
67
000
Ovalbumine.
43
000
Anhydrase
carbonique.
30
000
Inhibiteur
de
trypsine.
20
1 00
Lactalbumine . . . . . . . . . . .
1 4
400
~ans un
premier
temps,
on
déter~ine la
mobilité
relative
des
protéines
étalons
(=
Rf).
Distance de
migration
Rf
Hauteur
du
front
de
migration
ou
avec
plus
de
précision
Distance
de
mi~ration
Rf
Lon~ueur de
gel
apr8s
décoloration
LCJllgueur
avant
coloration
x
Hauteur
du
front
Dans
un
deuxième
temps,
nous
reportons
sur
un
papier
semi-logarithmique
en
ordonnée
coordonnées
logarithmiques)
les
masses
moléculaires,
et
en
abscisse
les
"Rf".

---

90
Une
fois
la
droite d'étalonnage
établie,
on mesure
les
distances
de
migration
des
polypeptides
de
masse moléculaire
inconnue
et
on
calcule
leurs
Rf.
en
se
reportant
à
la
droite
d'étalonnage,
on
détermine
la
masse
moléculaire
inconnue.
Lors
de
la
mesure
des
distances
de
migration,
nous
prenons
comme
point
de
repère
le milieu
de
la
bande
à
déterminer.
4.3.
L'ISOELECTROFOCALI5ATION
(I.E.F.).
4.3.1.
DEFINITIDN.
Le
processus
d'électrophorèse,
peut-être
le
plus
ingénieux
et
le
plus
efficace
pour
séparer
les
protéines,
est
la focalisation
isoélectrique ou
électrofocalisation.
En
effet,
depuis
les
travaux
de
SVE'JSSON
1 8 0 ) ,
et
de VESTEBERG
197
qui
ont
défini
les
principes
généraux
des
gradients
"naturgls"
de
pH,
cette
technique
est
devenue
une
méthodg
de
séparation
des
plus
utilisées-
L'I.E.F.
peut-être
réalisé
sur différents
supports
(liquide,
ap;arose,
sephadex,
acrylamide),
en
plaque
horizontale,
ou
en
tube
vertical.
4.3.2.
PRI',ICI;:JE.
Si
on
applique
un
courant
électrique
continu
à
un
milieu
non
soumis
3 des
courants
de
convection,
et
contenant
des
substances
ampholytes
(c'est-à-dire
possédant
en même
temps
des
charges
positives
et
négatives)
de
masse moléculaire
faible,
il
en
résulte
la
formation
d'un
gradient
de
oH.

---

91
En même
temps,
les
substances
ampholytes
(ou
ampho-
tères)
de masse moléculaire
élevée
(par exemple
les
protéines)
migrent
jusqu'à ce
qu'elles
aient
atteint
la
zone de
pH égale à
leur
pH iso&lectrique.
A ce moment
leurs
charges électriques
sont
nulles
et
elles
ne migrent
plus.
Cette ~éthode permet
donc
de
séparer
les
protéines
exclusivement
en
fonction
de
leur pH
isoélectrique.
Les
ampholytes
porteurs,
utilisés
sont
des mélanges
d'un grand
nombre
d'acides
polycarboxyliques
et
de
polyamines
la
récartitio~ des
groupes
aminés et
carboxyliques
dans
la molécule définit
le
pH
iso-
électrique de
chaque ampholyte.
On
utilise
donc
toujours
un mélange de
produits
qui
recouvrent
ainsi
tout
un
intervalle de
pH.
et
permet-
tent
de
ce fait
la
réalisation
d'un
gradient.
4.3.3.
I.E.F.
sur plaque
commerciale
(LKB).
Nous
avons
utilisé
les
"ampholines PAG
plates"
pH 3,5
-
9,5
prêtes
à
l'emploi.
Ce sont
des
gels
de
polyacrylamide
prêts
à
l'emploi
contenant
l'ampholine
porteuse d'ampholytes
pour
l'électro-
focalisation
analytique.
Chaque Amoholine PAG
plate est
dotée
de
son propre
film
support
en
plastique.
Il
est
possible d'analyser
24-28
échantillons
en
une
seule fois
sur une
~laque
entière
ou
bien
de découper
la
quantité
nécessaire
pour analyser
un
plus
petit
nombre d'échantillons
et
de
conserver
le
reste
pour
la
prochaine manipu-
lation.

---

92
4.3.3.1.
~ATERIEL.
L'électrofocalisation
est
réalisée à
l'aide
du ~ultiphor LKB 2117
dont
les
différentes
parties
sont
schématisées
dans
la Fig. 19
L'alimentation électrique
est assurée
par
le
générateur
LKB type
3371
C.
4.3.3.2.
REACTIFS.
H3P04
1
~
(Anode)
l\\JaoH
1 ~
(Cathode)
solution
de
fixation
&olution
de
coloration
cf.
Ch.
Révélation
Solution de
décoloration
4.3.3.3.
MODE OPERATOIRE.
L'échantillon
peut-être
déposé
à
n'importe
quel
endroit du
gel.
Il
suffit
de
plonger un
papier
applicateur d'échantillon
(petits carrés
de
papier filtre)
dans
la
solution
échantillon
et
de
l'étaler sur
le
gel.
L'échantillon
peut-être déposé
sous
forme
de
gouttelettes
à
l'aide d'une seringue
HA~ILToN
(5
)
20~1)
directe~ent à
la
surface du
gel.
Les ~êches d'électrodes
sont
tremoées
dans des

---

93
A
8
Fig.19-
SCHEMA
OU
IYJULTIPH[IR
LKB
2117.
A
I.E.F.
dans
le
sens
de
la
largeur
(10
cm)
et
2
fils
de
platine
(anode
et
cèt~ode)
1
supoort
des
~lectrodes et
c~~vercle du gel
5
plaque
de
gel
de
polyacrylamide
(1~m d'épaisseur)
6
réfrigération
7
cable
de
connection au
générateur
B
couvercle
de
sécurité
B
1. E. F .
dans
le
sens
de
la
longueur
(24 cm)
3 et
4
bandes
de
papier
filtre
(anode
et
cathode)
9
et
1 0
fils
de
platine
(anode
et
cathode)

---

94
solutions
d'électrolytes
(H P0
1MG.
et
3
4
NaOH 1MB)
et
posées
le
long du
gel.
Pour obtenir
un
champ
électrique
uniforme.
les
électrodes
en
platine
sont maintenues
parallèles
sur
le
couvercle d'électrofocali-
sation
qui
maintient
également
une
humidité
constante
à
la
surface du
gel.
Après
la mise
en
route
de
la
réfrigération.
l'électrophorèse
est
conduite selon
le pro-
tocole
suivant
o
200
1 0
340
20
540
3,l
900
40
111 0
58
11 50
68
11 80
70
11 80
80
11 80
91]
1 1 80
La
s~paration
est
donc
effectuée
en
1
heure
et
30 minutes.
4 -
Fixation.
coloration.
décoloration.
Après
l'arrêt
de
l'r.E.F .•
les
plaques
sont
fixées.
colorées.
et
décolorées
selon
les
méthodes
que
nous
exposerons
dans
le
chapitre
"Révélation".

---

95
4.3.3.4.
DETERMINATION DU
pH AMPHDLINE.
Il
faut
connaître avec
précision
le
gradient
de rH contenu dans
le gel
pour déterminer exac-
tement
les
pHi.
et
pour comparer
les
différentes
bandes
de
protéines.
Avec
l'électrode de
surface
(LKB)
nous mesurons
directement
les
pH à
la
surface du
gel
sans
le
retirer
de
la
plaque
réfrigérante.
immédiatement
après
la
focalisation
et
à
température égale à
celle de
la migration.
Les
parties actives
de
la microélectrode ont
un
diamètre
de
3 mm seu-
lement.
ce qui
permet
de mesurer
le pH à des
intervalles
de
quelques millimètres.
4.3.4.
ELECTRDFDCALISATIDN VERTICALE
EN TUBE.
Si
l'électrofocalisation
en plaque offre de nombreux
avantages
et
notamment.
celui
de
pouvoir faire
migrer
simultanément
de
nombreux
échantillons
sur
la même
plaque;
son
utilisation
comme 1ère dimension.
dans
une électrophorèse
bidimensionnelle soulève de
nom-
breux
problèmes
( c f . Résultat
Discussion).
Nous
avons
donc
choisi
l'I.E.F.
en
tube
qui
est
certes
plus
longue.
quant
à
sa
réalisation.
mais
qui
est
beaucoup
plus maniable.
Les
protocoles
de D'FARRELL
(141)
de M'lES
et
NIKAIDD
( 6
J.
et
de RIGHETTI
et DRYSDALE (151,
152
J.
nous
ont
guidé
dans
la mise au
point
et
la
réalisation
de
cette
technique.

---

96
4.3.4.1.
REACTIFS.
Ur é 8 ••••••••••••••
9 ,5
M
NP
40 . . . . . . . . . . . . .
2
\\.0
(P /V)
~
\\.D
pH
1,
5
-
6
7
Ampholines . . . . . . . .
2
1;
0,4
~
-
D
pH 3
1 0
,8Mercapto
éthanol
5
\\.D
Acrylamide . . . . . • . .
28,38
~
(P/V)
Bisacrylamide . . . , .
1 1 62
;
M
Solution stock de
Nonidet P40
:
NP4D
, ..
1 0
40
~
(P/V)
H PO 4' • • • • • • • • • • •
0,0:l
M
3
Na 0 H• . . . . . . . • . . . •
0,02 M
Ur é e • • • • • • . • . • • • •
9
M
Ampholines • . . . . . •
\\.D

---

97
4.3.4.2.
APPAREILLAGE.
L'I.E.F.
est réalisé dans
un appareil classique
pour électrophorèse en tube vertical
: cet ap-
pareil a été modifié par RIGHETTI et DRYSDALE
(lS1)
pour obtenir une réfrigération suffisante,
et
l'utilisation de petits volumes d'électrolytes
(Fig.
20
).
Nous
utilisons
un appareil
similaire
(BUCHLER
INSTRUMENT]
composé de deux compartiments dont
celui du
bas est réfrigéré par une circulation
d'eau
(Fig. 21 ).
4.3.4.3.
MODE OPERATOIRE.
Les solutions de gel sont coulées dans des
"cannas de verre"
(130
mm x 2,5 mm de diamètre
intérieur).
Les
tubes sont
hermétiquement bou-
chés en bas
par du ~arafilm~ et disposés verti-
calement sur portoir plan.
-
Pour préparer 10 ml de solution de gel
(envi-
ron
0,5
ml par tube), mettre dans Un Erlen de
50
ml
:
Urée. . . . . . . . . . . . . . . .
5 ,5
g
Solution L . . . . . . . . . . . .
1 ,33
ml
1\\1 P
40 •.• . . . . . . . . . . . . . .
2
ml
.+
H 0 .•
2
•
•
Il
•
• • • • • • • • • • • • • 1
1 .97
ml
Ampholine
( 5
- 7) ••• ..
0,4
ml
Ampholine
( 3
- 10) ... . o, 1
ml

---

98
Fig.20 -
Appareil
pour
électrophorèse
en
tube
selon
RIGHETTI
et
ORYSOALE
(151,152
)
-
Compartiment
cathodique - - - - - - -
2
-
Enceinte
refrigérée
_
3
-
Tub e s
d e
gel
d' l . E . F . - -
-
_
4
-
C0 mpar t i men t a n 0 d i que - _ _
-- -
Fig.21
-
Appareil
commercial
(BUCHLER
INSTRU~ENT)
--
--
1
Electrodes-
2
-
Rés e r v 0 i r
ca t ho d i que - -
- - - - - - - -
3
-
Tubes
d'I.E.F.
_
-~---- - - - - -
4
-
Réservoir
anodique~ -------
----

---

99
-
Dissoudre
l'urée
par
agitation
douce
à
37°[.
- Ajouter
T Er1 ED
7
iJ.l
\\
persulfate
d'NH
+
1 0
~l ( 1 0 S)
4
et
mélanger
rapidement.
-
Après
addition
du
persulfate
d'ammonium,
la
solution
de
gel
est
immédiatement
coulée
dans
les
tubes.
La
solution
est
coulée
3
l'aide
d'une
seringue
sur
laquelle
a
été
adaptée
un
fin
capillaire.
Les
tubes
sont
remplis
(en
évitant
de
faire
des
bulles)
jusqu'~ environ
1
cm
du
bord
supérieur.
-
Recouvrir
délicatement
le gel
d'un mince
film
d'eau
et
laisser
la
polymérisation
complète
du
gel
s'effectuer
pendant
1
heure.
-
Après
la
oolymérisation
complète du
gel
(inter-
face
eau/gel
visible
et
bien
net),
aspirer
tou-
jours
délicatement
l'eau,
et
recouvrir
les
gels
par
20
à
25
(LI
de
solution
K,
qui
sont
à
leur
tour
recouverts
par
un
peu
d'eau.
-
Laisser
équilibrer
pendant
1
heure.
2
-
~~~~_~~_e!~~~_~~~_~~~~~_~~_~!~~~~~­
l2t2Q!::§~§'
-
Après
avoir
retiré
le
parafilm
(extrémité des
tubes),
les
tubes
sont
disposés
dans
l'apoareil
à
électrophorèse
de
telle
sorte
que
la
hauteur
maxi~um des
gels
soit
contenue
dans
la
chambre
de
réfrigération.
LEls
emplacements
non
occupés
sont
oblit~rés soit
par des
bouchons
(en
plastique)
ou
par des
tubes
de
verre.

---

100
-
La
chambre
inférieure
de
l'appareil
est
complètement
remplie
par
la
solution
0
(H P0
).
3
4
La
solution
au-dessus
des
gels
est
aspirée
et
remplacée
par
20
~l
de
solution
K,
eux-mêmes
recouverts
par
la
solution
P
(NaoH).
-
Pré-électrophorèse
200
volts ..
15 minutes
300
volts ..
30 minutes
400
volts ..
30
minutes
Après
la
pré-électrophorèse,
la
solution
Pest
rejetée,
et
le
liquide
recouvrant
les
gels
est
aspiré.
-
Les
échantillons
(lyophylisés)
sont
repris
par
la
solution
K,
et
des
dépots
de
10
à
50
~l
sont
effectués
à
l'aide
d'une
seringue
HAMILTON.
Une
goutte
de
Bleu
de
Bromaphénol
est
ajoutée
dans
chacun
des
dépôts
ainsi
réalisé.
-
Les
échantillons
sont
recouverts
par 10
~l
de
solution
Q,
eux-mêmes
recouverts
oar
la
solu-
tion
P.
-
Le
réservoir
du
haut
est
~
nouveau
rempli
par
la
solution
P,
et
la
connection
électrique
est
effectuée
(cathode
en
haut
et
Anode
en
bas).
-
L'électrophorèse
est
réalisée
pendant
14
heures
à
400
volts
ou
18
heures
à
300
volts
et
la
focalisation
est
cornplètée
par
une
heure
:3
800
volts.

---

1 01
-
Ce
protocole
d'électrophorèse
peut-être
varié
sans
que
la
qualité
des
gels
soit affectée.
Mais
néanmoins
le
produit
du
voltage
et
du
temps
[en
heure),
doit-être
supérieur
à
5000
et
inférieur
à
10000 volts
heures
pour
des
gels
de
cette di-
mension,
tandis
que
le
voltage
d'électrophorèse
doit-être
au maximum
égal
à
400
volts
(141,142
).
La
focalisatior
achevée
(anneau
jaune
en
bas),
les
gels
sont
aussitôt
démoulés
après
avoir
décollé
délicatement
les
extrémités
du
gel
avec
une
~iguil18 fine,
le5
gels
sont
expulsés
par
pression
lente
et
continue
à
l'aide d'une
serin-
gue
spéciale
[20
ml).
Les
gels
démoulés
seront
traités
des
façons
sui-
vantes
-
Fixes
et
colorés
(cf.
[: h.
Révélation)
-
Equilibrés
(dans
la
solution
B)
en
vue
d'une
seconde
dimension
( c f .
Ch.
Bidimensionnelle)
-
Equilibres
et
congelés
(pour
2 D.
ultérieure)
-
Montés
directement
sur
une
seconde
dimen-
sion
sans
traitement
préalable.
4.1.4.4.
RESULTATS
ET EXPLOITATIONS.
-
Aorès
la
coloration-décoloration,
les
protéines
apparaissent
sous
forme
de
disques
dont
l'inten-
sité
de
coloration
est
Çonction
de
la
concentration.
A l'extrémité
acide
du
gel
appara~t toujours
une
bande
jaune
bisn
nette,
qui
est
due
à
la
disso-
ciation
du
Blgu
de
Bromoohénol
(bleu
en
zone
basi-
que
et
iaune
en
zone
acide).

---

102
Cette bande
jaune,
revêt
toute son
importance,
quand
on
pense,
aux difficultés qu'il
y
a
à
reconnaître
les
extrémités du
gel,
quand
il
est
démoulé.
Cette bande
jaune,
nous
sert
donc
comme
"indicateur de
l'extrémité acide"
point
de repère
important,
pour
l~ séparation
ultérieure en électrophorèse bidimensionnelle
(2
[J).
-
En ce qui
concerne
la détermination du
~ra­
dient
de
pH,
l'utilisation d'électrode de surface
(cf.
tech.
commerciale)
étant
impossible,
nous
procèdons
de
la façon
suivante
Lors de toutes
les
expériences,
deux
"gels con-
trôles"
ou
"boudins
blancs"
sont
"isoélectro-
focalisés"
pour
la
détermination des
pH.
Après
l'électrofocôlisation,
ces
gels sont
dé-
COUP9S
en
sections
de 5mm,
qui
sont disposées
individuellement
dans
des
flacons
contenant
2 ml
d'eau distillée
(dégazée)
ou d'urée 9,2 M (pré-
parés
extemporanément).
Ces
flacons
sont
bouchés
et agités
pendant
5 ou 10 minutes
(141,142
)
ou
2 heures
147
À
température ambiante.
Les
~H sont alors mesurés à
l'aide d'un pHmètre,
et
une
courbe d'étalonnage
est
tracée avec en
ordonnée
les
pH mesurés
et
en
abscisse,
les
sec-
tions
en millimètres.
4.4.L'ELECTRDPHORESE
BIQIMENSIDNNELLE.
4.4.1.
Définition.
Dans
l'étude
électrophorétique de
la
structure
des
protp-ines,
l'étape
suivante qui

---

103
s'impose
est
le
coupla~e des
différentes
techniques
que
nous
venons
de
décrire.
Nous
avons
donc
utilisé
l'électrophorèse
bidimen-
sionnelle.
avec
en
première
dimension
la
sépara-
tion
des
protéines
en
fonction
de
leurs
pHi
(I.E.F.
en
tube)
et
en
seconde
dimension.
leur
séparation
en
fonction
de
leur masse moléculaire
(ACRY-SOS
en
plaque
verticale).
Cette
technique
hautement
résolutive.
est
de
plus
en
plu s u t i lis é e
(17, 3 1( 16, 7 8,
21 1 ) •
Elle
permet
d'attribuer
simult~n6m8nt à une pr~téine
donnée,
son
pnint
isoélectrinue
et
sa masse mnl~cu­
laire.
Elle
est
bas~e
essentiellement
sur
les
travaux
de
IJ ' FAR REL L
( 14 1 );
Arvl ES e t
1\\] ICA l 0 0
6
).
L'adaptation
et
les
modifications
que
nous
y
avons
apDort~es. ont
déj3
~té décrites
dans
un
travail
préicérlerit
(35).
d
La
première
dimension
est
ef+ectuée
enrtube
( cf.
Ch.
Electrofocalisation
verticale
en
tube).
et
la
seconde
dimension
est
réalisé
en
olaque
verticale
( cf.
Ch . .A,CRY /SOS
technique
adoptée),
avec
dif-
férents
gradients
de
gels
de
polyacrylamide
(10-16
,
7.5-16
5 -15
, . 5-20 ;, 5-25 ; ) J et l'utilisation
parfois
de
gels
homog~nes en
concentration
(7.5
10
;.12.5
';).
4.4.3.
~OOE OPERATOIRE.
Elle
est
identique
~
la
technique
décrite plus
haut
(cf.
Ch.
ACRY/SnS).
~
la
seule différence
suivante

---

104
Le
gel
da
concentration
est
coulé
jusou'~ la
base
de
la
fente
biseautée
et
dans
un
coin
on
i nt r 0 d u i t
l e " pei g n e
à
u nad a nt"
pou l~
d 'n é na l! e r
un
' f -
pu l
lequel
seront
déposés
des
ét~lons
L
,
de
masse
moléculaire.
l_ a s
gal s
d' l • E • F.
qui
s e rOll t
sou mis
Fi
u n 8
,-1 (3 L! :< i ème
dimension.
sont
démoulés
dans
un
tube
à
essai
con-
tenant
environ
10
ml
de
solution
B [cont~nent du
S.O.S.
et
du
~erc3ptDét~a~ol
auxquels
on
~1Dute
quelques
gouttes
de
Aleu
de
6romophénol.
Les
sels
sont
ainsi
a.~ i tés
'3
t 8 mp é rat ure
arl Dia n t e
pendant
au
moins
30
minutes
de
meilleurs
résul-
tats
sont
obtenus
lorsque
l'agitation
d~r8 aL!
moins
~z
heures.
Aorès
ce
temos
d'équilibration,
les
gel~ p~uv8nt
('; t r e
d ire c t 8 'Tl E, r: t
SOU en i S
l
LI 'l e
d eux i è rl e
,j i m·: :1 S ion ,
ou
être
congelés
tel
quel
pour
une
s~paratinn
u l t ér i e LI r 8 •
3 -
Transfert
de
la
1ère
dimension
SUI
la
2 ème
d i ITI e ri S ion .
-
Après
l'équ:ilibratior;,
le
gel
d'I.l:.!'.
8':1:
étalé
sur
une
feuille
de
plastique
rigide.
-
0,5
ml
d'a~arose ~
2
~
dans
la
solution
S,
sont
cou l É; s
da rl s
l co
ri go 1 e
am é n a g é eau - d 8 :; sus
d,
g ,0 1 de
.) ,
._ 8 r~ e
-
Le" b (J u d i ri"
d' l . E . F.
8 S t
t r éJI 2 f é r r!
r él 'J ide 1·1 f'! rit
d a l' s
l a
f E' nt'?,
a t
Fi
n li LJ V eau
0, 5 rn l
ci 1 éJ fi .:0 r [J .-: le?
S (J n t
cou]~s
par-dessus.

---

105
-
L'agarose
se
gélifie
très
rapidement,
et
main-
tient
en
place
la
1ère dimension'
Les
plaques
de
verre
sont montées
dans
l'appareil
à
électrophorèse
(PLASTI~ARNE).
Les
cuves
sont
remplies
par
le
tampon
A et
l'élec-
trophorèse
est
conduite
à
30
ou
40 mA/olaque
(ampérase
constant),
jusqu'à
ce
que
le
front
de
migration
attei~ne le
bas
de
la
plaque
(environ
4 heures).
-
Pour matérialiser
le
front
de migration,
de
nom-
breux
auteurs
de
la
littérature,
ajoutent
quelques
gouttes
de
Bleu de
Bromophénol
~
0,1
;
dans
le
réservoir
du
haut.
Nous
préférons
équilibrer
nos
1ères.dimensions
en
présence de
quelques
gouttes
de
Bleu
de
Bromophénol.
Le
"boudin"
avant
son
transfert
sur
la
28me
dimen-
sion
est
donc
légèrement
coloré
en
Bleu,
et
nous
obtenons
Binsi
dans
]a
2è~e migration,
un
front
plus
ho~og~ne et plus
fidÀle
à
la
vitesse
de
migra-
tion.
-
Lors
du
transfert
de
la
1ère dimension,
il
est
préfèrable
de
disooser
le
bout
basique
du
gel
(pauvre
en
orot~ines) contre
le
Duit
orévu
pour
le
dépôt
des
étalons
de
masse
moléculaire.

---

106
-
Le
"boudin"
peut-être
disposé
en
contact
étroit
avec
le
gel
de
concentration,
et
ensuite
seulement
être
recouvert
par
1 ml
d'agarose
à
2
;
dans
la
solution
B.
4.4.4.
RESULTATS ET EXPLOITATION.
-
Après
la
révélation
des
plaques
(cf.
Ch. Révélation],
une
multitude
de
taches
apparaissent
avec
des
ré-
partitions
plus
ou
moins
homogènes
(en
fonction
des
ampholines
utilisÉes],
sur
toute
la
surface
du
gel.
Bien
ou'il
n'existe
aucune
corrélation
entre
la
charge
d'une
protéine
et
sa
masse
moléculaire,
le
nombre
maxi.
des
taches
qu'on
paut
révéler
en
théorie
est
égal
au
produit
des
bandes
mises
en
évidence
par
chacur-)e
des
dimensions
utilisées
toutes
seules
59 ,
141,
142
] .
En
oratique,
et
en
fonction
de
la
techni~ue d'ex-
traction
des
protéines,
utilisée
nous
nous
trouvons
en
présence
de
200
è
300
taches
de
polypeptides
( c f .
Résultats-Discussion].
-
Pour
individualiser
ces
taches,
nous
avons
établi.
un
système
de
"q;rille
de
lecture".
Les
coordonnées
de
cette
grille
sont
en
abscisse,
les
PHi
déterminés.
et
en
ordonnée
les masses
moléculaires
étalons.
Cha~ue tache
s'insère
donc
dans
une
case
délimitée
par
la
grille,
et
00
on
peut
lui
attribuer,
et
son
point
isoélectriqu8
et
sa
masse
moléculaire.

---

1 07
v - METHODES QE REVELATION.
Le
choix
de
la méthode
de
révélation
dépend
naturellement
du
but
de
l'expérience
et
de
la
nature
chimique
(orotéique
ou
~lycoprotéiau8) des comoosants à révéler,
5.1.
METHODES
CHIMIQUES.
5.1.1.
REVELATIof\\1
GENER.A.LE
DES
PROTEINES
PAR
LE
gLEU
DE
COOMASSIE.
Nous
avons
choisi
le
Bleu
de
Coomassie
è
cause
de
son
extrème
sensibilité
vis
~
vis
des
protéines.
Nous
avons
utilisé
plusieurs méthodes
de
coloration
et
décoloration,
lar~ement décrites
dans
la
l i t -
térature.
lJ.. Méthode 1
selon Il! EBER
e t
0 S 90 R f\\1
[207).
-
Solution
de
coloration.
Bleu
de
Coomassie R 250 ..
2,5
mg
Mé t ha n 0 1
.
5 [J 0
ml
Acide Acétique . . .
70
ml
Eau
Distillée Q.S.P.
10CI[J
ml
-
Solution
de
décoloration.
Mé t han 0 l . . . . . . . . . . . . . . . .
400
ml
Acide Acétique..........
7[J
ml
Eau
Distillée Ci.S.P
1000
ml
Après
l'électrophorpse.
les
~els
sont
immergés
dans
la
solution
de
coloration
(les
"boudins"
d'I.E.F.
sont
démoulés
dans
des
tubes
à
essai
contenant
déjà
le
colorant.
et
les
plaques
dans
des
bacs
~
coloration).
pendant
3 heures
sOUs
agitation.

---

108
Les
gels
sont
ensuite
décolorés
par
la
solution
de
décoloration.
avec
des
changements
répétés
de
la
solution
jusqu'à
ce
que
le
fond
des
plaques
soit
transparent
(environ
6 à
12
heures).
~ Méthode 2
selon VESTEBERG
(198)
~EIS~JE~ et Coll. (150).
Dans
cette
technique
qui
présente
plusieurs
va-
riantes,
les
fixations
et
les
colorations
sont
effectuées
à
60°
C.
Les
solutions
et
les
variantes
sont
exposées
dans
le
tableau
de
la
Fig. 22
•
-
Oans
les
variantes
A et
E,
il
est
préférable
de
dissoudre
le
Bleu
de
Coomassie,
d'abord
dans
le méthanol.
-
Dans
les
protocoles
B,C
et 0,
dissoudre
d'abord
le
Bleu
de
Coomassie
(G
250)
dans
environ
800 ml
d'eau,
et
ajouter
l'acide
perchlorique
~outte ~
goutte
en
agitant
vigoureusement
la
solution.
-
Il
est
~
noter
que
la
variante
B est
très
raoide,
car elle ne
nécessite
OAS
de
temos
da
j 6 coloration
J
et
dans
cette
procèdure,
pour
éviter que
les
bandes
ne
s'estompent
trop
rapide~ent, immerger
les
gels
dans
la
solution
de
coloration
à
1
;
dans
de
l'eau
distillée.
J1. "1éthode 3
selon
LAEM:Yï!~I
(111).
-
Les
gels
sont
immédiatement
fixés
et
colorés
pendant
20
minutes
dans
une
solution
de
Bleu
de
Coomassie
à
0,1
;
dans
50
d'acide
trichloro-
acétique.
-
Ils
sont
ensuite
décolorés
par
agitations
répé-
tées
dans
de
l'acide
acétique
à
7
", .

---

109
VARIAI\\JTES
r - -
1
1
SOlUT Iû i~ [JE FIXATION
A
B
C
0
E
1
'~
Ac.
Trichloroacétique
[ g )
-
147
1 47
147
-
1
Ac.
Sulfosalicylique
[ g )
-
44
44
44
-
Eau
[m l )
-
910
910
910
-
Temps
d'incubation
en mn
30
:30
J LI
t----'--f--
SOLUTION DE COLORATION
1
1
1
1
1
Coomassie
-
Bleu de
G 250
[ g J
-
0,4
0,4
IJ.4
1
1
Bleu
Coomassie R 250
[ g )
0,9
-
-
-
0,9
de
1
Trichloroacétique
[ g )
32
-
-
-
32
Ac.
[ g )
107
-
-
-
1 n 7
Ac.
Sulfosalicylique
-
-
-
39
-
Urée
[g)
[ rn l )
268
-
-
-
268
frlf~thanol
E'au
[m l )
664
970
970
932
664
-
3D
30
29
-
li c .
Perchlorique
[ 70
>
, F' IV ml)
Temps
d'irlcubation
en mn
:30
30
30
3D
:'\\0
SOLUTION DE DECOLO~ATION
1
Ac.
Acstioue
[m 1)
50
-
50
50
80
Ethanol
[ ml J
70
-
70
70
255
Ethylacétete
(m 1)
'100
-
1 00
1 00
-
Eau
[m 1)
780
-
780
780
665
--f------
i
1
Temps
total
en
Heure s
6H3o
1
7 -24
5-23
24-48
48
H
1
Fig.22
Tableau
des
différentes
procèdures
de
la
méthode
2.

---

110
~ Méthode
4
Note
d'aoplication
LKB
250
(117:,.
-
Solution
de
fixation.
Ac.
Sulfosalicylique ..
1 7 ,5
g
Ac.
Trichloroacétiau8.
57.5
g
r1éthanol
.
150
ml
Eau
distillée 8.S.P.
500
Ml
-
Solution
de
coloration.
0.115
g
de
Bleu
de
Coomassie
dans
100 ml
de
solution de
décoloration.
-
Solution
de
décoloration.
Eth a n 0 l . . . . . . .
500 ml
Ac.
Acétique ..
1 60
ml
Eau
distillée Q.S.P.
2000 Illl
Les
gels
sont
incubés
dans
la
solution
de
coloration
toute
une
nuit,
et
décolorés
par
changement
répétés
de
la
solution
d8
décoloration.
-
Chacune
de
ces
méthodes
de
coloration donnant
de
bons
résultats,
nous
les
avons
utilisées
alter-
nativement
sans
altération
dans
la
reproductibilité
des
e x ri é rie n c es
le
choix
de
l'une
ou
l'autre de
ces
techniques
étant
surtout
conditionné
oar
le
temps
qui
nous
est
imparti.
-
Les
~els décolorés
avec
les
protéines
apperais-
sant
e~
Bleu,
sont
photographiés
et
traités
en
vue
d'une
conservattor1
(cf
Ch.
Technique
cons~rvation).

---

1 1 1
5 . ') . ;:.
R EVE LAT l 0 ~J
0 ES
GLye 0 p RCl TEl NES •
L fi
t (ê! c h n i que
,j e
col 0 r él t ion
cJ E-! S
g lys 0 p r CI t é i ne:;
est
cel18
décrits
par
FAIRBANKS
44
techn::que
al:
P.A.S.
(Pg,iodic-Acid-Scl1iff).
':; .i . 2 . 1
R E il, CTIF S .
Solution
de
fixation.
fI é -;..:. han 0 J. • • • • • • • • • • .. • •
1 58
ml
~c.
Su~fosalicyliqu8.
1 7 , ;'5
'J
6
AC.
Trichloro,3c~;tique.
5 7 , ~;
a
",
tau
[Jist·lll~~e
.
35D
ml
F3:srosanil1~a
[FUSCHINE
GURR)
+
:/'!.',=j~liSLJlfi~:(?
cJ;,>
~,Ja
/K
1
r
1
C 0 fi C e n t r ,S • • • • • • • • • • •
ml
,~. r;,: t El r
~: 1J ~o:i u l ,3 U
c h él n g 8 mg rl i:
d 8
t e i n te.
[h~rbon 3ct1f
.
U, 2
G
;. i l t r E r
S i) lut ion
i ,n col 0 :' ~~ ) ,
--
' i >: e r
l 8 3
;:, <0) l~,
cJ;, "1 5
l a
:i C 111 t i 0 ri
(! 8
fi>' =j t :L 0 n
:Jp,ndant
'~c
'J,n"
,-
l'ince)":J
l'2fl!.i
eJ:Lc:cill IJc
2
)<'
1(1 G:n.
J3in
(J'Hf'],
,°1
1
dans
l ' a c i d e
aC:F:ti'~1ue à
"
Cj r!
l'n,~
2'
L O C
El t
,j
l ' Cl b s c uri t {~ .
l ' ? ci 1,1
dis t i l l 2 E-,
, U '1 qu',~
c: e
q!j' i l n ' y
p l IJ~;
cJ CCl
::' r r:: c :i p i t §
,3 'J ,_ C
'AgNO]

---

1 1 2
- Ajouter
le réactif de SCHIFF
50 mn
à
4°
C
et
à
l'obscurité.
-
Rincer avec du
Na
S 0
à
1
~.
3 à
4 fois
et
2 2 5
conserver dans
cette
solution ou
dans
le SCHIFF.
5.1.2.3.
GELS
CONTENANT OU S.O.S.
Les
difficultés
de
coloration des
gels
contenant
du S.O.S .•
avec
la méthode
ci-dessus.
nous ont
contraint
à
modifier
celle-ci de
la
façon
sui-
vante
-
Fixer
les
gels
pendant
24
heures.
dans
la
so-
lution de
fixation
sous
agitation.
et
en renou-
velant
3 à
4 fois
la
solution.
-
Laver abondamment
à
l'eau
du
robinet.
en
continu.
et
vérifier
la
diminution
du
sodium au
photomètre
de
flamme
(vérification de
l'élimination du S.O.S.).
-
Oxydation
par
HI0
à
1
~ dans
l'acide acétique
4
à
7
~ pendant 1 heure à
l'obscurité.
-
Laver
à
l'eau
du
robinet
en
continu
pendant
48
heures
et
continuer avec de
l'eau
distillée
jusqu'à ce qu'il
n'y
ait
plus
de pré~iDiLé des
eaux
de
rinçage
par
l'AgN0
.
3
-
Ajouter
le réactif de SCHIFF.
1
heure à
l'obs-
curité
et
à
4°
C.
-
Laver
3 à
4 fois
par
Na
S 0
à 1
~ dans
Hcl
2 2 5
0.1
N et
conserver dans
cette
solution ou
dans
le
réactif de SCHIFF.
Après
ces
traitements.
les
glycoprotéines appa-
raissent
colorées
en
rouge-orangé.

---

1 13
5.1.3.
REVELATIol\\J SIMULTANEE DES
PROTEINES
ET
DES
GLYCOPROTEINES
EN ACRY/S.D.S.
: COLORATION
AU
" STAINS-ALL"
( SA"~h.
La
technique
utilisée
est
celle décrite par
L.E.
KING
Jr.
et M.
MoRRISol\\J
(119).
Fixation des
gels
dans
l'isopropanol
10-25
~o •
-
Lavage
intensif avec de
l'isopropanol
à
25
~
18
-
36
heures.
On
peut
chauffer à
56°
C pendant
1
-
2
heures
pour éliminer
le S.O.S.
(bien
élimi-
ner
le S.O.S.
car des
traces
supérieures
à
0,001
P811v'8nt
inhiber
la
coloration).
-
Coloration
:
-
Solution mère
SA
0, 1
;
( P IV)
dan s
For-
rnamide.
-
Solution de coloration:
Solution mère.
..
2,5
ml
Formamide.
· .
. .
1 0
ml
Isopropanol. ·
. . . . . 50
ml
TR IS .. . . . . . . ·. . .
. .
1 5
mM
Ajuster
le
pH à
8,5
Coloration 12-18 heures à
l'obscurité.
-
Décoloration dans
l'isopropanol
à
10
;,
18-
36
heures
à
l'obscurité.
Les
protéines
apparaissent
colorées
en
rouge,
et
les
glycoprotéines
en
bleu
(si
elles contiennent
au moins
10-100
ng d'acide
sialique) .
•
SA
1
-
ETHYL
-
2 -
3 -
1
-
ETHYLNAPHToL
(1,2
d)
THIAZoLINE -
2 -
YLIoENE -
2 METHYLPRoPENYL
-
NAPHTO
(1,2
d
-
BRolVIURE DE THIAZoDIUI"I)
(KODAK) .

---

114
5.2.
METHODES
UTILISANT DES
RADIOELEMENTS.
Devant
les difficultés de
détection
des
glycopro-
téines
par
les
procédés de
coloration chimiques
( c f .
Ch. Résultats discussion),
nous
avons mis
au
point et
adopté
les
techniques d'autoradiographie
et de
fluorographie
décrites
par SONNER
et LASKEY
(20,112).
5.2.1.
AUTORADIOGRAPHIE-FLUOROGRAPHIE.
Les
radioisotopes
que
nous avons
utilisés
sont
le carbone 14
(14 C )
et
le
tritium
(3 H).
Les
deux
isotQoes
sont
émetteurs de
particules ~,
avec
14
. .
d
5730
'
pour
19
C,
une demle-vle
e
.
annees et
une
énergie maximum
(I: max ) de 156 KeV,
et
pour
le
3 H,
une demie-vie de 12 années
et
une Bnax de 18.6 KeV.
5.2.1.1.
PRINCIPES.
Les
particules ~ émises
par des radioisotopes
sont
capables d'impressionner
une
émulsion
pho-
tographique
lorsque
leur
Emax est suffisante.
14
Lorsque
des
gels
d'acrylamide contenant du
C
sont mis
en
contact avec
un
film
sensible aux
rayons
X,
les
particules @ émises impressionnent
directement
l'émulsion
photographique:
dans
ce
cas
il
s'agit
d' AUTORADIOGRAPHI5
Dans
le cas
3
du
H,
la
trop
faible
énergie
(E max : 18,6 KeV)
des
oarticules ~,
ne
permet
pas
une
imoression
satisfaisante des
films,
lorsqu'ils
sont mis
directement
en
contact.
Par contre,
la converBion
des
particules ~ en
photons
lumineux,
par
l'intermédiaire d'un
li-
quide
scintillant
(PPO),
permet
d'obtenir
une

---

1 15
impression
satisfaisante des
films
dans
ce
cas
il
s'agit
d'
AUTORADIOGRAPHIE
EN SCINTIL-
LATION ou FLUORoGR~pHIE.
Pour
notre part,
quel
que soit
le
type
de
radioélément
présent
dans
les
gels
(14 C ou 3 H),
nous
procédons
~
une
fluorograpnie,
ce çci
nous
pernet
de
racourcir
le
temps
de contact.
5.2.1.2.
REACTIFS.
-
oiméthyl Sulfoxyde
(D.~.S.o.) pur
-
Diphényl
2-5
oxazole
(PPO)
à
20
;
(P/P)
ou
à
22,2
;
(P/V)
dans
du D.M.S.O.
5.2.1.3.
MODE OPERATOIRE.
-
Juste
aorès
l'électrophorèse ou après
la
décoloration,
tremper
le
gel
dans
environ
20 fois
son volume
en
D.M.S.o.
pur
(1er bain)
30 mn.
2 -
2ème
bain
de D.M.S.o.
pur,
30 mn.
3 -
Tremper
le gel
dans
4 volumes
de P.P.O.
à
20
;
(P/P)
dans D.M.S.o.
pendant
une
nuit
ou
3 h e lJ r e s
a u
'Tl i ni fTl u m .
4 -
Tremper
le
gel
dans
un
bain à
50
;
d'eau
et
50
;
de D.M.S.o.
pendant
environ
10 mn.
5 -
Immerger
le gel
dans
de
l'eau
pure pendant
heure.
6 -
Dessécher
le
gel
sous
vide
( voir"technique
de
conservation").

---

'116
7 -
Mettre
le film
en
contact
et
placer
le
tout
è
-
20°
C ou
-
70°
C (voir
"~ise en contact").
5.2.1.4.
MISE
EN CONTACT.
Nous
avons
testé
différent
films
è
RX,
et
nous
utilisons
couramment
le"X-OMAT-R"
de
chez
KODAK.
La mise
en contact
étroit
du
gel
et
du
film
s'opère dans
un
système de
presse.
- !~~_~l~~~~~
le gel
desséché
sur
un
support
solide
(WHATMAN 3),
et
le film
sont
pris
en
"sandwich"
entre deux
plaques
de verre
épaisses
(découpées
à
la dimension
du
gel),
et mainte-
nus
solidement
en
place
par du
sparadrap
Le
tout
est
emballé dans
une
feuille
d'alumi-
nium,
puis
dans
un
cache
noir,
lui même
emballé
è
nouveau
dans
de
l'aluminium.
-
~~~~_~~~~~~~
Le
gel
et
le film
sont maintenus
étroitement
en
contact
dans
une
"cassette spéciale
film
radiologique"
(COMPAGNIE GENERALE DE
RADIOLOGIE)
13
x 18 cm,
munie d'écrans
renfor-
9ateurs
(Micron
5,13 x 18
CGR).
Le
tout
est
emballé dans
2 ou
3 feuilles
d'aluminium.
Les
systè~es de
contact
ainsi
formés,
sont
entreposés
~ -
20°
C ou
-
70°
C.
Les délais
d'expDsition
pour obtenir des
fluorogrammes
corrects
varient
de
3 à
GO
jours,
en fonction
de
la
nature
du
radioélément,
et
de
la
quan-
tité
de
radioactivitR déposée.
Toutes
ces manipulations
peuvent
être effectuées
en éclairage
inactinique.
Pour des
raisons
de
définition
de
l'image
(Résultats-Discussion)
nous
avons
choisi d'opérer
dans
le
Œ~!~_~~~~!~t.

---

117
5.2.1.5.
REVELATION.
Après
les
délais
d'exposition,
les
films
sont
révélés
comme
en
photographie classique
à
20°
C.
1
-
Révélateur
(KODAK
LX
24)
5
mn
2 -
Bain d'arrêt
[Ac.
Acétique 1
~/H20)
30
sec.
3 -
Fixateur
(KODAK AL
4)
1 0 mn
4 -
Lavage
abondant
à
l'eau
du
robinet
20
à
~o mn.
5 -
Séchage à
température
ambiante.
-
Les
deux
premières
étapes
sont
effectuées
dans
l'obscurité
la
plus
complète.
A partir
de
la
3ème
étape,
on
allume
la
lampe
inacti-
nique
(orange),
et
le
film
n'est
exposé
à
la
lumière du
jour,
qu'après
un
premier rinçage
à
l'eau
(10 mn).
-
Lors
des
manipulations,
il
faut
éviter de
toucher
la
surface du
film
avec
les
doigts.
Il
faut
le prendre
toujours
par
les
extrémités.
-
Après
la
révélation
du
film,
le
gel
peut-être
reexposé
à
nouveau
(voir
"mise
en
contact"),
si
l'on
estime
que
la
définition
de
l'image
n'est
Das
suffisante.
5.3.
QUANTIFICATION.
5.3.1.
DETECTION DE
LA RADIOACJIVITE.
Après
électroDhorèse
et
décoloration,
les
gels
décoUDPS
en
sections
fines
~
l'aide
d'un
scalpel

---

lU
( Les
"boudins"
d'I.E.F.
en
section
de 5 mm,
les
plaques
en
sections de
10
x 5 mm).
Les
sections
de
gel
sont
traitées
des
façons
suivantes
-
Introduire
les
sections
de
gels
dans
des
fioles
et
les
traiter
suivant
l'un
ou
l'autre
des
procédés
suivants
a
-
Ajouter 1 ml
de Soluène
350
(PACKARD)
et
laisser dissoudre
à
50°
C,
puis ajouter
le mélan-
ge scintillant
(5
ml).
b -
Dissoudre
les
gels
dans
1,5
ml
d'ammoniaque
à
10
;
et
ajouter
le mélange
scintillant.
Les
préparations
en milieu alcalin
(Soluène,
Ammoniaque)
ont
tendance
à
donner de
la
chimi-
luminescence.
Pour
l'éviter ou
la
réduire,
neu-
tralissr
par 0,1
ml
d'Hel
1
N,
ou
bien
utiliser
un mélange
scintillant
comme
le Dimilune
(PACKARD)
bien adapté
aux
échantillons
basiques
(169
).
2
-
Dissoudre
les
gels
à
37°
C dans
un mélange
(1
ml)
constitué
par 19
volumes
de
H 0
à
30
2
2
et
volume
d'ammoniaque
à
BB
~o •
Ajouter
ensuite
le
liquide
scintillant
(5 ml)
( 1 1 2
).
-
Le 'Tl é l a n g e
sei nt i lIa nt
est
l e " REA 0 Y- S 0 1_ V EP "
de
chez
BECK,I'1,l\\N.
-
La
radioactivité
est
déterminée par passags
dans
un
compteur à
scintillateur
liquide type
SL
400~
INTERTECHNIOUE.
5.3.2.
ENREGISTREMENT
DENSITOMETRIOUE.
Des
essais
de
quantification
ont
été
réalisés
par

---

119
passage des
gels
décolorés,
desséchés
sur
un
support
transparent
(voir
"technique de
conservation")
ou
des
fluorogrammes
sur
un
densitomètre
(CELLDMATIC
2
SEBIAJ.
VI
-
TECHNIOUES DE CONSERVATION.
Les
besoins
d'exploitation
ultérieure des
gels
d'acryla-
mide
nécessitent
des
méthodes
de conservation
bien
adap-
tées
à
la
nat~re du
gel.
6.1.
CONSERV~TION EN MILIEU LIQUIDE.
Les gels
en
tube
(I.E.F.)
après décoloration
suf-
fisante,
sont
introduits
dans
des
tubes
en
verre
(150
x 5 mm de diamètre
intérieur),
contenant de
l'eau pure
ou
du
glycérol
à
3 ou
10
~o •
Les
tubes
sont
bouchés
aux
deux
extrémités
et
le
gel
peut
être conservé ainsi
plusieurs mois
sans
altération
de
la
coloration.
6.2.
CONSERVATION SUR SUPPORT SOLIDE.
La
nécessité
d'avoir des
gels
bien
secs,
lors
des
techniques
d'AUT~RADIDGRAPHIE et
de FLUOROGRAPHIE,
nous a
poussé
~
rechercher des
techniques
de
sécha-
ge
[qui
sont
en même
temps
des
techniques
de
con-
servation) .
6.2.1.
METHODE
LI<B
(117
).
*
Apr~s la décoloration, le gel (en plaque) est
immerf,é
pendant
1 heure
dans
la
solution
de
con-
servation
qui
est
du
glycérol
à
10
; dans
la
solu-
tion
de
décoloration
(voir méthodes
de Révélatioll
méthode
4).

---

1 20
-
Poser
le gel
sur
une
plaque
de
verre
et
le
laisser
sécher à
température
ambiante
pendant
une
nuit,
ou
pendant
3 à
5
heures
à
50°
C.
Le
gel
doit
présenter alors
une
surface
collante.
-
Prendre
une
feuille
de
plastique,
et
l'appli-
quer sur
la surface
collante du
gel,
en
évitant
toute
bulle d'air entre
le
plastique et
le
gel,
à
l'aide
d'un
rouleau
de
caoutchouc
(tels
ceux
utilisés
en
photographie).
~ Le sel est immergé dans une solution de gly-
eérol
à
3
( V IV ) ,
et
déposé
sur
une
plaque
de
verre
entre deux
feuilles
de cellophane.
La
pla-
que
est mise à
40°
C (étuve)
pendant
1
nuit.
Les
feuilles
de
cellophane
sont
retirées
le
len-
demain,
et
on
obtient
un
film
dracrylamide
rigide.
Les
procédp.s
que
nous
venons
de décrire sont
très
bien
adaptés
à
des
gels
en
plaque,
très
fins
en
épaisseur
(type
LKB
"PAG
PLATE").
L'application de ces méthodes,
à
des
gels
plus
épais
1ue
nous
préparons
nous
mêmes
(type
gels
d'AC~Y/SDS, 1,5 mm
d'épaisseur),
nous
a
conduit
à
des
déconvenues.
En
effet,
les
gels
rigidifiés
par
le
glycérol,
craouent,
se
recroquevillent
et
deviennent
complètement
inutilisables.
6.2.2.
~ETHODE MISE AU
POINT AU
LABORATOIRE.
Par cette
technique,
le gel
sans
traitement
pré-
alable
est
désséché
sous
vide,
dans
un
sac
en
plastique,
et
sur un
support
solide
(WHATMAN 3 ~M
ou
CELLOPHANE).
L'ooération
de
séchage dure
entre
et
2 heures.

---

1 21
6.2.2.1.
MATERIEL.
-
Rouleau
de
plastique
(souple)
-
Soude-sac
(CALOR)
Papier WHATMAN
3
-
Feuille de Cellophane
-
Trompe
à
vide
-
Support
rigide
poreux
(150
x 150 x 20 mm)
-
Sèche-cheveux
(CALOR)
6.2.2.2.
PROTOCOLE.
-
A l'aide du
soude-sac,
réaliser
une
enceinte
en
plastique
(300
x 300 mm)
ouverte sur
un
côté.
2 -
Réaliser sur
une
face
de
l'enceinte,
une
petite entaille,
par
laquelle
sera
introduit
un -embout
en
plastique rigide dirigé
vers
l'ex-
térieur.
3 -
Disposer
le gel
sur
une
pile
(environ 10-20
feuilles)
de
papier WHAT~AN 3
(150
x15D mm)
et
ajuster
la
pile
sur
le
suoport
rigide
poreux.
Si
l'on
veut
obtenir un
gel
sur support
trans-
parent,
la première feuille
de
papier,
en
con-
tact
avec
le gel,
sera
enveloppée dans
2 feuilles
de Cellophane
(mouillées
au
préalable
et
bien
te n d U2 S ) •
4 -
Introduire délicatement
le
support
rigide
dans
l'enceinte en
plastique
et
souder l'extré-
mité
béante.
5 -
Poser
le
tout
sur
un
support,
et
brancher
la
trompe
à
vide
sur
l'embout
en
plastique
(Fig. 23).

---

122
. ~ SECHE-CHEVEUX
Enceinte
en
Plastique
souple
GEL
Pile de Papier
h/H,I'lTMA N 3
Support Rigide
Poreux
Embout
en
Vide Poussé
Plastique rigide
(vers
trompe à
vide)
Fig.23 -
SCHE~A
OU SECHAGE DES GELS D'ACRYLAMIDE
EN PLAqUE.

---

1 2 3
6 -
Mettre
en
route
le
vide
(le
plastique
s'écrase
contre
le gel),
et
chauffer
la
surface du
gel
à
l'aide d'un
sèche-cheveux disposé
à
environ
20 cm
au-dessus.
7 -
Vérifier
l'absence de
fuite
(sifflements)
et
laisser sécher pendant
1 à
2 heures.
On
peut
lais-
ser aussi
le
gel
se déssécher ô
temoérature du
laboratoire
toute
une
nuit
(sans
sèche-cheveux).
8 -
Arrêter
le
séchage
lorsque
le gel
et
la
pre-
,
mière feuille
de
WHATMAN ou
de
Cellophane,
ne
font
qu'un.
C'est-g-dire
lorsqu'on
passe
la main
sur
la
surface du
gel,
on doit
sentir
une
surface
plane,
uniforme
et
sans
aspérités
sur
les
bords.
-
Les
gels
traités
par
le P.P.O.
en vue d'une
autoradiographie,
ne
nécessitent
pas
de
précau-
tions
particulières.
En
effet,
la
présence de
P.P.O.
rigidifie
le
gel
qui
se déssèche très
bien.
-
Par contre,
pour des
gels
classiques
non
traités,
l'on
devra
vérifier
que
les
bords
sont
réguliers
car
la moindre
fissure
sur
l'un
des
bords,
se
transforme
lors
du
sécha~e, en véritable réseau
de
failles
qui
parcourt
tout
le gel,
et
le fait
éclater.
6.2.2.3.
RESULTATS.
Les
gels
traités
ainsi
se
présentent
sous
forme
de
film
très
fins,
montés
sur
un
support
solide
(WHAT~AN ou CELLOPHANE).
Ils
peuvent
se conserver
indé-finiment.

---

TRDISIEME PARTIE
R~SULTATS EXPERI~ENTAUX

---

124
l
-
MISES AU POINT TECHNIQUES SUR DU SERUM DE VEAU
FOETAL
(S.V.F.l.
Nous
avons
choisi
le
sérum de veau
foetal
(SEROMED-BIOPROl
à
cause de
sa
richesse
en
protéines,
et
de
la
facilité
d'approvisionnement.
1.1.
-
UTILISATION DE PLAQUES COMMERCIALES.
1 . 1 . 1.
-
1. E . F.
0 ES. V . F.
( Am ph 0 lin e sPA G-P lat e LKB1 •
e
Le S.V.F.dilué au
1/5
est
utilisé comme échantillon
et
des
dépôts
de
15
à
20
l
sont
effectués
sur les
papiers filtres.Après
électrophorèse,
la
révélation
au
Bleu de Coomassie
nous montre une multitude de
bandes
inégalement
réparties avec
une forte
concen-
tration
dans
les
zones
de pH de
4 à
6
(Fig. 24
donnant
lieu
à
une
interprétation difficile.
L'utilisation de
concentrations moins élevées en
protéines
dans
les
dépôts,
nous
donne
toujours
le
même
profil
électrophorêtique avec
une
disparition
des
bandes
qui
s'étalent
entre
les
zones de
pH de
5
à
7.
Cette technique présente
un
avantage certain,
qui
est
celui de
la rapidité d'exécution
(1
h 3ol,
très
aooréciable
en
biochimie clinique.
Mais
le
tout
est
de savoir si
la
rapidité d'exécution
d'une technique doit
primer sur
la
qualité d'in-
terprétation
des
résultats.

---

125
pH
4 .2
5.6
6.7
8.00
8 .5
9.2
Dépôts
pH
Fiç.r,.
24 -
I.E.F. DU S.V.P.
(l/S)
SUn. N1PHOLINES
(3,5-9,5)
PAG PLATE
L.K.B.

---

126
1.1.2.
-
PREMIERS
ESSAIS
DE DOUBLE DIMENSION.
Les
premiers
essais
de
séparation
en
double
di-
mension
utilisant
en
1ère dimension
l'I.E.F.
(PAG-Plate
LKE)
et
en
2éme dimension
l'ACRY/SDS
(PAA
4/30
PHARMACIA),
nous
ont
donné des
résultats
plus
que décevants.
En
effet,
la séparation
du
S.V.F.
selon
la
première
technique
de double
di-
mension
((.hOf.Mél-hode,)nous
donne
3 grosses
taches
ininterprétables
(Fig.25
)
et
de
nombreuses
trai-
nées.
Il
est
à
noter aussi
que
la
décoloration du
gel
PAA
4/30 est
extrêmement
longue
(2 semaines).
Ces
résultats
peu encourageants
nous ont
poussé
à
rechercher des
méthodes
de
séparation plus
per-
formantes.
1.2.
-
UTILISATION DE GELS
COULES
EN LABORATOIRE.
1.2.1.
-
I.E.F.
EN TUBE.
L'isoélectrofocalisation
en
tube
nous a
donné de
meilleurs
résultats.
quart
à
la
séparation des
protéines
et
à
la
reproductibilité
de
la méthode.
les m8mes
conditions
de
séparation
(voir matériels
et méthodes)
étant
bien
entendu
respectées.
En
effet.
la
séparation des
différents
constituants
du S.V.F.
nous
donne
4 groupes
de
protéines
dont
les
pHi
approximatifs
sont
les
suivants
- 1er groupe : de 7,00 à 6.40 :
3 bandes
2ème groupe
de
6.30
à
5.60
10
bandes
- 3ème groupe
de
5.50 à
5.30
5 bandes
-
4ème
groupe
de
5.20 à
4,80
1 0 bandes
(voir Fig. 26 ) .

---

127
------t
".".
;
FiQ.
25
1er ESSAI de
l
SEPARATION en
double di~ension
du S.V.F.
,',
l
,: , ,," J 'C-
.~.
,
/1 • .'1'
P' r
l
i 1
Fip,.
26
1. E. F. en tube
:, . ~,( .
du S.V.F. et colo-
ration Dar le B.C.
.... l
.. •\\
l . S (j
41
8..
pli
Fir"':.
27
I.E.F. comoaratif
du S.A.B.
, S.V.f.
et S.H.
Coloration Dar le
n.c.

---

1 28
1.2.2.
-
DETERMINATION DU
pHi.
Un des
problèmes
sur
lequel
nous
avons
longuement
discuté
est
celui
de
la
détermination
précise des
pHi
selon
la méthode
décrite
(Matériels
et
méthodes).
En
effet,
les
fractions
du
S.V.F.
(groupe
2)
ayant
la
même mobilité
électrophorétique que
les
fractions
de
sérum-albu~ine bovine cristallisée
(SIGMA)
ont
des
pHi
nettement
supérieurs
à
ceux
rencontrés
dans
.
la
l i t t 6 rature ou
la
sérum_albumine a
un oH,
de
4. 9
1 1 5
(Fic:>;. 27).
La
sérum albumine
bovine
pure
cristallisée sou~ise
à
l'électrofocalisation en
tube,
révèle après
co-
loration
au
Bleu
de Coomassie,
5
bandes
dont
les
pHi
sont
respectivement
de
5.8
-
5.8
-
5,75
-
5,45
-
5,40.
La
bande majeure
en
intensité
de
coloration
se
trouve
dans
la
zone
de
pHi
5 • 8 n .
Il
est
donc
difficile
de
faire
une
détermination
précise du
gradient
de
pHi
à
cause
de
la
forte
concentration
en
urée
~
10
M)
qui
entraîne
de
grandes
variations
dans
les
pHi
des
protéines
(141)
,
( Fig. 2 B, 29,
COLe r b e!l CE
0 H
).
Ces
variations
peu-
vent
aller
jusqu'à 1 unité
de
pH.
La mesure
du
~radiEnt de pH au
pôle acide du
gel
est moins
précise.
à
cause
de
la
diffusion
de
l'urée
hors
du
gel
et
à cause
de
la
forte
influence de
l'urée
sur
le oka
des
groupements
carboxyliques
(19).
Par
contre
l'introduction
d'une
solution d'acide
aspartique
0,05
M + acide
glutamique
0,05
M dans
la
préparation des
~els,
entraîne
une
stabilisation
du
gradient
de
pH
(147)
mais
n'entraîne pas
d'amé-
lioration
sensible
de
la
résolution
mais
au
contraire

---

12 9
pH
7
6
5
4
o
2
4
6
8
10
12
Cm
Fi~.2 8 - Courbe "1oyenne de néter"lination du Gr"!dient
de
OH
(I.E.F.
en
Tube)
A~PH1LI~ES :
pH
5
-
0-0 '1esures effectuées dans l'eau distillée.
............
"1 ''; 5 U r F. s
e f f e c t u P e 5
dan 5
l ' ur 6 ~
q', 2
IYI
~
hal.t
ou
"gel"
est
~
~Bcc~le.

---

130
pH
9
8
7
6
5
4
o
2
4
6
8
10
12
cm
Fig.29 -
CDURB~ MnYE~~E DU GRADIENT DE pH
(I.E.F.
TU~El
-
AMPHlLI~ES
:
pH
0,5
-
1n
- ~ESURES
EFFECTUEES
DANS
L'EAU
DISTILLEE.

---

1 3 1
un
tassement
des
bandes,
(35)
En dépit
de
ces désagréments,
il
est
clair que
le
pouvoir de
résolution
de
la
technique d'I.E.F.
en
tube
est
nettement
supérieur à
celui obtenu
avec
le
Kit
LKB
(PAG-Plate AMPHOLINE),
tout au moins
en
ce oui
concerne
la
séparation du
S.V.F.
Nous
ne
parlerons
donc dans
l'exposé,
que
de
"point
isoélectriques
apparents".
1.2.3.
-
SEPARATION EN DOUBLE DIMENSION.
Alors
1ue
la
séparation du S.V.F.
en électrophorèse
unidi~ensionnelle en
gel
d'acrylamide
et
en
pré-
sence de
SOS,
n'apporte
que
peu
de
renseignements
3 5 )
la
séparation
en
double
dimension,
ré-
vèle
une multitude
de
taches
(Fig.30 ) dont
l'in-
terprp.t~tion devient,
à
la
limite,
extrêmement
difficile.
Une approche
a été faite
par
l'établissement d'une
grille de
lecture
(Matériels
et
Méthodes).
1.2.4.
-
ESSAIS
Of DETERMINATION C1UANTITATIVE DES
PROTEINES
APRES
I.E.F.
EN TUBE.
Des
essais
de
détermination quantitative ont
été
effectués
par
passage des
gels
sur
un densitomètre
(CELLOMATIC
2 SE8IA).
On
retrouve
biEn
les
4 groupes
de
bandes décrites
précédemment,
mais
l'appareil
ne détecte pas
les
bandes
rapprochées
[ 3 5 ) .
Pour un
rendement
optimal,
il
faudrait
des
gels
parfaite~ent d~colorés et
un
densitomètre
~
réso-
lution plus
fine.

---

132
Etalons de PM
1. E. F. -----~)
!
S.D. s.
l
--
--
-- - -
--"r:IIP_-
-
-
---.-
". ~-.=-"":;':::':-.-="_ ..._ " " ' : " : " . , - -
I--------
~
_J'I/
-
Fi·~.
20
Electrophorèse bidi~ensionnelle
du S.V.F., selon la ~éthode adoptée (141)
~radient d'Acry : 10-16 ~
-
coloration par le B.C.

---

133
II
-
GLYCOPROTEINES
DE MEMBRANE.
2.1.
-
APPROCHE GENERALE.
Avant
d'entreprendre
l'étude
de
l'action des
effecteurs
exogènes
sur
la membrane
plasmique,il
était
nécessaire
et
primordiale de
localiser
les
(glyco)protéines
à
la
surface de
cette même membrane.
Ces déterminations,
comme nous
le verrons
seront
variables,
en fonction
du
système
d'approche
utilisé
(trypsinat
ou
lysat cel-
lulaire] .
C'est
dans
cette ootioue
que nous
avons essay?' d'obtenir
le
profil
général
des
(~lyco)protéines de membranes,
des
cellules
L121D
et
K562,
en
fonction
des
différen-
tes
mRthodes
d'aoproche
(trypsinat
ou
lysat
cellulaire)
et
des
diverses
techniques
de
sRparation
et
de
révéla-
tion
(I.E.F.,
ACRY/SDS,
9idimensionnelle).
:~.2.
-
L121 rJ.
2.2.1- S~PARATIOI'J OU
TRYPSINAT ME"1BRANI\\IRE OES
CELLULES
L121D PAR
I.E.F.
EN TU8E.
-
L'I.E.F.
est
réalisée selon
la
technique décrite
plus
haut
(Ch.
Matériel,
Technioue
et
~éthodolo~ie).
-
Après
la
reprise
du
trypsinat
lyophilisé
par
le
tampon
échantillon
(solution
K)
des
déoôts
de
10 ~
15
~l
(soit
environ 100 ~g de orotéines)
sont
ef-
fectués
au-dessus
des
gels.
-
Après
la
séparation
électrophorétique
et
coloration
par
le
Bleu de Coomassie
(cf.
Ch.
Révélation),
le
trypsinat
de
L1210
révèle
de
façon
reproductible( 35
une
série de
bandes.
Ces
handes
sont
au
nombre
de
32
(Fig. 31
~vec des
n~i aonarents
qui
varient
de
4,80.3
7,10.

---

134
. ._•..__.---_.-
P Hi
7 , 1 n
2
7 , 013
i - - · - - · -
3
7 ,1J5
4
7 , on
5
6 , 139
.~
6
6 , 8n
7
6 , 713
--_.
R
6 , 72
-
-._ .... - - ......
:'1
6, 65
- - - ----*
- - - - - _ ...
1 IJ
Fi , Sil
1 1
"
6 , 5 11
1 2
"
f3 , 55
- - - ---
1 l
6 .50
- - - -- - --
1 4
6 , 40,
~:1..~._.
1 5
6 , 40
- - - - - - - -
1 6
"
5 ,q 0
1 7
5 ,q n
-- _. - - _.
- - .. - ... - -
1 !3
5 , 135
1 q
5 , SR
20
,
"
5
C....
.B6
21
5 , 130,
- - " . .
-._-
~')
L'. '..
5 ,q n
21
5 , 70
- " - - -
.-
24
5 , 6 ri
- - - ---
-
- - -- --
25
5 , 45
26
S , /n
27
5 , ;;n
211
5 , 1 r;
- - .
2q
4 ,90
_. - -- - - --".
3n
4
,0,
,
R
__'1:-
~.;t.. .;;a.:.-
11
4 , AS
+
"'~
'/.
4 , 13 [}
Fi~.31
-
I.E.~.
DU
T~YPSINAT
DE
L121n.

---

134 bis
1
21
1
~ .. _.. ~. ... __ . __ . L_UIO._ LE.F._. ~ __ __ _ __ ._. _._._ .. __ ._
~
1
1
f
1
Re.
Il
1
pH = 7.10 ~ 4,80
1
. ---·t··· -.-----
---- --- .------.- -- _o. -- ...- --..-.
20
--
1
1
1
1
I~
l. .-........ - .- --.
1
1
19
i
~41
1 2
30
1
i
~
12J3
~ .
i
-.
!-
Il
1
. 1
. \\ 5 6
V
1~
14.15
l!'vl~ 17.18
1
7.8
1
\\
.
fJ i
1
\\
r
1
\\
1
~2 (
1
\\ r~1
J \\ \\ (
i
1
\\
1
-
\\
1
1
V
1
1
i
S11 /
iJ
1
1
~V
1
FIG
31 bis
iiii.1

---

13 5
Les
bandes majeures
(intensité
de
coloration
au
B C)
sont
les
bandes
nO
1 , 8 , 1 3 , 1 4 , 1 5 , 2 3 , 2 4 , 2 5 , 2 6 .
29,
32 ayant
deS
p~i apparents
de
7,10
-
6,72
-
6,50
-
6,48
-
6,40
-
5,70
-
5,60
-
5,45
-
4,90
-
4,80
(Fig.31).
On
remarque
que
dans
un
tel
système de
séparation,
la majorité
des
protéines
se
focalise
dans
une
zone
acide vericnt
de
6,72
à
4,80.
2.2.2.
-
SEPARATION
EN GEL
O'ACRYLA~IOE/SOS.
Les
électrophorèses
sont
conduites
selon
les
pro-
tocoles
déjà
décrits
(~atériels Techriques 8t Mé-
thodologies) .
Pour avoir des
résolutions
plus
fines
nous
avons
utilisé
différents
gradients
de
gel
d'acrylamide
les
plus
usités
étant
les
5-15
"o ,
7,5-15
';,
10-15
2.2.2.1.
-
PROFIL
DU
TRYPSINAT APRES
COLORATION
AU
BLEU
DE COOMASSIE.
Le orofil
électrophorétique du
tryosinat
de
L121D
révèle
plus d'une
cinquantaine de
bandes
polypeptidiques
(Fio;.32. 33).
L'utilisation d'étalons
de masses moléculaires
connues
(KITS
PHARMACIA)
nous
a
permis d'attri-
buer une
masse moléculaire
apparente
(voir ré-
sultat
et
exploitations Ch.
ACRY-SOS)
~
chacune
de
ces fractions
polypeptidiques.
L'étude
comparative
de
cinq
gels,
résumée
dans
le
tableau
de Fig.34
révèle
3 groupes
de
po-
lypeptides

---

136
B
A
Fir'.
32
Trypsinat de
L1210 - ACI~Y/S.D.S.
7,5-15 S;
Coloration par le
B.C.
~94
A
dépôt de 150 ::J
B :
"
"100
~
~
AWi",43
M
,."
§
..-30
.. 20
-14
E:'JFŒGlS TRE':El'f'l'
D EHS l 'rOi TE 'rH IOUF.
(C~LLO~hTIC-2-SEBIP
+
~
1
,
j
1
1
1
\\~
1
{\\

---

P20
li
CJ:l
-
l'
.0
L 1210
j.!Front
~
P 30
C")
l;
~
,
TRYP. SENSIBUE
' l
P42
i
(ACRY) B. C.
1
!
i
i·
, !
1
i
P 37
[
'28.
1
1
1 4.
r
1
~
i
. ~\\:
l'
P 68
i
1
,
94. !
,
,
t
P27
P 19
il
67.
,.
• 1
A.
1
j!
,.
1
! ;
Il
1
1 \\
!;
1
1
,
~
CJ:l
4 3.
f:
!
1
.-
i
:\\
.D
i
1
30 •
1
i 1
C")
1
1
1
\\
1
,
C")
4
1
1
\\
1
!1
A
/ \\
,
1
. el)
.-
,
1
u..
i.
1 \\
i
1
, \\
,
!
,
,:!
1
i
, N
!:j
1
Iv
~ ;
,
1
1
li
1
1
.
v
1
1
1
\\
,
1
\\
P84
\\
!
\\
i
1
l,
r
\\
1
!
\\
i
i
! ~
1
i
1
; 1
1
, "
\\
1
\\, i\\i!\\
1
\\
1
\\i
1
1
1
\\ ~ !
~~ 1
i\\ :
·'1
i :
\\
)
'l"
. . . .
P9Q1
1
\\
\\
iJ'
Vi
\\ 1
~..!
\\"\\ , v
~
1\\ (\\-I:{I(\\
;V!0vJ\\,., 1J
\\,... '.
'1; ;
.'
,
i
1
I,
\\
1
~
V\\.--;
\\:
\\
;~
l '
VL'\\,."~,
'
,. fi
{\\ li,
'.; "
. 1\\
' ~' 'v
'J
'l,fIrrV\\fI.J!
\\!
\\
.
i'~
!: IV
.J \\
~ ~.f\\"'I;
.~ ,\\
" Il fI /
f-\\jrv-...,..: ~flJ
v\\.I'Iv,f' '.
-;
\\.r.~' 'v Jj'
-3
MM x 10
= ~
__-
-----J

---

137
N°
M• M.
AP-
N°
1'1. M •
AP-
BANDES
PARENTES
B
C
BA 1\\10 ES
PAREI\\JTES
B C
( x
10- 3 J
( x
10- 3 )
1
21 0
+
32
61
+
-
2
180
+
33
60
+
-
3
1 70
+
34
57
+
-
4
1 60
+
35
53
2 +
-
5
155
+
36
52
2 +
-
6
140
+
37
49
2 +
-
7
1 35
+
38
47
+
-
8
130
+
39
45
+
-
9
128
+
-
40
42
3
+
1 0
1 25
+
41
41
+
1 1
1 23
+
42
3g
+
1 2
1 20
+
43
38
+
1 3
11 7
+
44
37
3
+
1 4
11 0
+
45
36
+
1 5
1 00
2
+
46
34
+
1 6
96
2
+
47
3;;
3 +
1 7
g4
2 +
48
31
3 +
1 8
'J
9fJ
)
+
49
3[1
3
<-
1 9
84
3
+
50
28
+
20
81
3
+
51
27
2 +
21
' )
80
+
52
25
+
22
78
2
+
53
24
+
23
76
+
54
23,5
+
24
75
+
55
22,5
+
25
74
+
56
21 , 5
+
26
73
+
57
20
2 +
27
68
3
+
58
1 9 , 5
2 +
28
67
2 +
59
1 9
2 +
28
65
+
60
1 8
+
30
64
+
61
1 5
+
31
62
+
62
1 4
+
Fig.34
-
TABLEAU
DES
M.M.
MOYENNES
DES
CONSTITUANTS
DU
TRYPSINAT
DE
L121D.
INTENSITE
DE COLORATION AU
BLEU
DE COOMASSIE
(B
C).

---

138
-
Le 1er groupe
constitué de
protéines de
haute
masse moléculaire
(210 000
à
128 000
daltons)
est
plus
ou moins
+
-
(-)
colore
par le BC
et
parfois
non
détectable.
-
Le
2ème groupe
constitué
des
~.M.
de 125 000
à
110 000
daltons
est
faiblement
coloré
par
+
le f=\\C
(-).
-
Le
3ème groupe
de
polypeptides dont
les M.M.
varient
de 100 000
À 14
000
daltons
est
tou-
jours détectable
par
le RC,
et
oeut-être
sub-
divisé
en
sous-~roupes d'intensité
de
colora-
tion
variable
(3+,
2+
ou
+).
De ces
groupes
de
protéines,
il
ressort
inva-
riablement
quel
que
soit
le type de ~radient
utilisé,
q protéines majeures
(3+)
dont
les M.M.
sont
de 90 000,84
000,R1
000,
6R
000,
42
000,
37
000,
32
000,
31
000,
et
30
000 daltons.
Ce
pro~il
au
BC
ne reorésente
qu'un
asoect
~ua­
litatif de
la
répartition
des
chaines
polvoep-
tidi1ues
extraites de
la membrane
par
la
trypsine.
Nous
avons
essayé
de
quantifier
ces
bandes
oar
lecture
sur
un
densitomètre
(Fi~. 33
) classique
(CELLm"ATIC- SEBIA).
Nous
nous
sommes
heurtés
3 des
problèmes
dus
au
pouvoir de
résolution
trop moyen
du
densito~ètre.
En
effet,
la multiplicité
des
bandes obtenues
par ACRY/SDS
nécessite pour
leur
intégration
quantitative des
lecteurs
de
~el
olus
oerformants.

---

1 3 9
2.2.2.2.
-
PROFIL OU TRYPSINAT APRES MARQUAGE
METABOLIQUE.
Les
résultats
peu
encourageants
de
détermination
des
glycoprotéines
Dar
la méthode
de
coloration
au
P.A.S.
et
au S.A.
nous
ont
conduit à
recher-
cher des
techniques
basées
sur
l'utilisation
de
radioéléments.
La
première approche
de
caractérisation
des
glycoprotéines,
s'est
donc
effectuée par marquage
1 4
1 4
métabolique
au
C -
GlcNH
ou au
C-fucose,
2
suivi d'une
trypsination
douce.
(~atériels Tech-
ninU8S
et
M~thorlnlo~ies).
Après
révélation
par autoradiographie,
le
profil
électrophorétique
laisse apparaître
un
nombre de
bandes
et
un
marqua~e plus
intense avec
la GlcNH 2
qu'avec
le Fucose.
(Fig. 35).
Nous
avons
mis
en
évidence 12 fractions
~lyco­
protéiniques
dont
les
M.M.
vont
de 140
000
à
28
000 daltons.
Ces
12
fractions
incorporent
1 4
toutes
de
la
C -
G1 cNH
avec
des
intensités de
2
marquage
différentes
[Fig. 36).
De ces
~lycoprotéines extraites
par
la
trypsine,
6 fr~ctions
ressortent
nettement
sur
l'autoradio-
gramme
par
leur
richesse
en GlcNH
(3+).
2
Ces
~lycoprotéines ont
une M.M.
de 120 000,
60
000,
56
OOQ,
47
000,
32
000
et
28
000
daltons.
Les
fractions
135
000,
120
000,
60
000,
56
000,
47
800,
32
000
et
28
000
présentent
à
la
~ois
dans
leur
structure,
de
la
glucosamine et
du
Fucose
(cf.
Fig. 36)
Il
est
à
noter que
les
glycoprotéines
60
000,
56
000
et
surtout
47
000
révèlent
une
intensité
de ~arquage équivalente
en
glucosamine
et
en
Fucose
(2+
ou
3+).

---

140
A B
c 0
E
Tr:rDsinat de LJ)IO
ft
'
,
.pres ~araun-c netRholique
A
Lysat cellulaire
1 L1(' '" l
. r
~._I•.,
n; 12
n
14
-
Trypsinat
220
C-:fucose
C
Il
14C ~l l'
-1.T
n1 2
D
Idem B
(C)O
x
::'
E
Idenî C
(C) 0
x 2
94
60
43
30
20
A
B
ACRY
==
5-20%
A ::::
14
Trypsinat::::
C-fuc.
B =
Il
::::
14C GlnH2
94
67
. 43
30
..
20
1

---

141
- - - -
N°
MASSf
J
fV] [j LEe ULP, IRE
14C-GlcNH
14 C-fucose
APPARENTE
2
1
1
GP
14[I.OOD
+ +
2
GP 135.000
+ +
+
3
GP
120.000
+ + +
+
4
GP
90.000
+
5
GP
77.000
+
6
GP
68.00C',
+
7
GP
60.['00
+ + +
+ +
B
GP
56. rlOCi
+ + +
+ +
9
GP
52. DOC!
+ +
1 0
GP
47.000
+ + +
+ + +
1 1
GP
32.00n
+ + +
+
~_2 LGp 29.00[J
+ + +
+
_ _
Fig.
36
-
Tableau
des
M.M.
Moyennes
des
constituar,tE
du
Tryosjnat
de
L1210 après
"1arouage Métabolique.
GP
= Glycoprotéines.

---

142
On
remarquera
aussi
par comparaison
avec
le
profil
Bleu de Coomassie,
que
plus
la
oartie
glycamique est
importante
(G l cNH
+ ou Fuc
+)
2
et moins
les fractions
sont détectables par
+
le BC
(- ou
+)
de
façon
générale.
Il
existe cependant des
exceptions
comme par
exemple
la fraction
32
nno qui est fortement
marquée
~
la G1 cNH
(3
+),
faiblement
au
Fucose
2
+
et
fortement
colorée au
BC
(3
+).
2.2.2.3.
-
MARQUAGE
EXTERNE OES GLYCOPROTEINES.
Les
tehniques
fines
de
GAHMBE~G et
HAKOMORI
[53.57)
nous ont
permis d'aborder,
l'identifica-
tion
des
glycoprotéines membranaires
sous
un
autre aspect.
En
effet,
comme
nous
l'avons décrit
plus
~aut
(cf.
Matériels.
Techniques 8t Mét~odclog15s) les
3
glvcoprotéines
sont mar~uées in
situ
(N+G+
H.
G +
3H
ou P +
3H)
e t
'
enSUl t e
le
lysat
cellulaire
est
soumis
~
l'lélectrophor~se. et
révélé
par
fluoro~raphie.
Donc,
dans
l'exposé ~ui va
suivre,
il
aooaraitra
r~rement des
profils
Bleu
de
Coomassie,
car
nous
opérons
sur des
lysats cellulaires où
toutes
les
nrotéines
cellulaires
sont
présentes.
1
-
I~CORPORATION
DE RADIOACTIVITE.
L'incorporation
de
la
radioactivité
dépend
du
traitement
par
la
galactose oxydase.
Le
trai-
tement
préalable des
cellules
par
la
neuramini-
dase,
multiplie cette
incorporation
par un
fac-
teur de
2 .~
3
(Fig. 37)
c..a r
0 n
lib pre
de
nOuveaux résidus
r-~lactosyls accessibles ~
la
galactose oxydase.

---

TYPE CELLULAIRE ET
corn/ ~P.; PROTEINE
TRAITEMENT
J
EXP.
1
EXP.
2
EXP.3
EXP.
4
EXP.
5
L1 21 0 + N + G + 3 H
800
1362,3
1347,75
1314,21
1056,89
L1 21 0 + G + 3 H
250
640,28
657,30
796,51
662,33
.
L1210
+ P + 3 H
1453,88
1556,21
1661,71
-
-
L1 71 0 + 3 H
289,70
438,71
280,30
302,20
440,13
Fig.37 -
TABLEAU OU MARQUAGE
EXTERNE DES CELLULES
L121o.
N
+ G + 3 H
NEURAMINIDASE
+ GALACTOSE OXYDASE
+BOROHYDRURE TRITIE.
1
G +
H
GALACTOSE OXYDASE
+ BOROHYDRURE TRITIE.
P + 3 H
PERIODATE
+ BOROHYDRURE TRITIE.
3 H
CELLULES TEMOIN TRAITEES UNIOUEMENT
PAR
LE BOROHYDRURE TRITIE.
~
CA)

---

144
Aprés
l'action
du
periodate,
la
radioactivité
incorporée,
est
supérieure
à
celle
obtenue
après
action
de
la
neuraminidase
plus
la
galac-
tose
oxydase
(Fig. 31
J.
Et
sans
traitement
enzy~atique, on
observe
oue
les
cellules
incor-
porent
une
certaine
ouantité
de
radioactivité
en
présence
de
borohydrure
t r i t i é
seul.
2 -
FLUOROGRAMME DES
GLYCOPRnTEINES
APRES
'3
G 3
N+G+
H et
+ H.
Sur
la me~brane de
la
cellule
L1210,
nous
avons
mis
en
évidence
22
glycoprotéines
nettement
3
marquées
après
traitement
N+G+
H
(Fig. 3839
J.
,
Les
~lycoprotéines majeures
(]+J
ont
une masse
moléculaire
de
86000,
80000,
760nO,
7nOOO,
54000,
50000
et
23000
daltons.
Ces
glycoprotéines
sont
faiblement
ou
presque
3
pas
marquées
après
traitement
G+
H.
3
3 -
FLU~ROGRAMME APRES P+ H.
L'action
du
periodate
révèle
20
~lycoprotéines
1
[ Fig;.
40! 40
parmi
lesquelles
5 sont majeures,
ce
s~nt
les
~lycoprotéines
86000,
68000,
54000,
4600']
et
31["lOO.
On
observe aussi
que
les
~lycoprot§ines ont
des
M.M.
infprieures
à
celles
des
glycoDrotéines
3
révélées
aprps
traitement
N+G+
H.
Ce ~arouage
Dar
le
periodate
révèle
une
richesse
des
glyco-
protéines
en
radicaux
sialyls.
Dans
toutes
les
expériences
effectupes,
on
ob-
serve
une
incorporation
de
radioactivité
dans
3
les
cellules
traitées
uniquement
par
Na/K8 H4.

---

14 5
A
8
C
0
, -,
3 30
..... 20
~
T'arquag;e ex terne des .--;. p.
de 1210
ft.
n + '" + H
=
\\:-
3
67
'1 = '::'e
H
~
4
C
4
= G + \\-iF-I
60
4
4
ACHY =
7t5-15~;
*' 4
4
4
4
36
4
18 'j
v v
X
1
-3
A
B
o
E
_1l'lIIIIl-1VPJ~···....~•• ".,- ~" •. ,.'
ACRY = 5-15%
"
6Î
A = rJ + G + ')H
-:J.
C = r; + '-'rI
60
3Lj
D = G +
E
Te 3'1
=
r
36
18.:5
V~.
1
-- '..
lU - J

---

1 4 6
MASSES MOLECULAIRES
3
3
3
APPARENTES
N + G +
H
G +
H
Te
H
( x
1 0 '-3)
GP
1 35
2 +
-
GP
1 25
2 +
-
GP
120
2 +
+
GP
105
2 +
+
GP
96
2 +
-
GP
90
2 +
+
GP
86
3 +
+
GP
80
3 +
+
GP
76
3 +
+
GP
70
3 +
+
GP
62
+
+
GP
60
+
+
GP
54
3 +
-
GP
50
3 +
-
GP
48
3 +
3
+
3
+
GP
45
3
+
3
+
3 +
GP
36
2 +
+
GP
3Cl
+
+
GP
26
+
+
GP
23
3
+
-
GP
20
2 +
-
Fig.39 -
TABLEAU DES M.M.
MOYENNES DES GLYCOPROTEINES
MEMBRANAIRES DE L1210 APRES MARQUAGE EXTERNE
Te 3 H : TEMOIN BOROHyoRURE SEUL.

---

147
1" - 3
')4
94
- 1
.•~
1
_ 1
67
67
~""I"-
.
"1;0·0.<1•
4]
43
, .. '.'
'x~ ::
-
31
" :,..,...''.
:::0
-
2.
20
.0li;l&
14
.....
1. ..
Fi,:> • 40
L 1210 = P + 3"II
((auche = f3.C.
droi te = fluororrarr.me
ACRY
= 7,5-157:;
A
c
D
-~
MMX
F' i r~. 41
:
L 1210
1() - 3
'~arouaR;e a;pécifioue
A = p2
+ 3)-J
B
"1
+ r; + 31-
J,
,J
C
('
3°
=
94
.:1
+
1
l'
3
D = Te
H
68
ACHY = 7,5-15 (!f,
7 Jours a - ~oor.
30
20
14

---

148
MASS ES MOLECULAIRES
3
APPARENTES
P +
H
BC
( x 1 0 - .j )
GP 97
+
+
GP 96
+
+
GP 90
+
+
GP
eE
2
+
2
+
GP
68
3
+
2
+
GP
fJ3
+
+
GP
60
+
+
GP :: 4
l
+
2
+
GP 50
+
+
GP
49
+
+
GP
46
2
+
2
+
+
GP
4 ~l
+
+
GP
40
+
GP
31
2
+
+
GP
28
+
2
+
GP
26
GP
2:1
+
+
GP
23
+
1
+
GP
21
7
+
1
+
L:-~~
2
+
- - - -
Fig.40:
TAfO'Ll,AU DE'3 l''.M.
J\\PF'M'UJTES DES GLYCOPROTEINES
MEMBRANAIPES DE L121D APRES ~AROUAGE
EXTERNE
AU PERIOOATE
(F'
+
~'H).
BC
: INTENSITE DE CCLDRATIDN AU BLEU DE COOMASSIE.

---

149
Ce marquage
asoécifique
porte sur
des
fractions
de
48000
et
45000
daltons
(Fig. 39
et
sur
des
fractions
probablement
lipidioues
qui
se
confondent
avec
le
front
de miqration.
-
.,
On
retrouve
toujours
les
fractions
48000
et
45000
qui
sont
fortement
marquées
aorÀs
traite-
3
3
ment
N+G+
H.
G+
H ou
3 H.
Ce marquage
aspécifique
est ~oins intense après trAitement p+3 H• en
effet.
la
fraction
45000
n'existe
plus
et
la
fraction
48000
est
faiblement
perceptible.
(Fig. 41).
2.2.2.4.
-
~AROUAGE
EXTERNF DU
TRYPSINAT.
Fort
de
la
technique du marquage
externe.
nous
avons
dans
une
série d'expériences.
soumis
les
cellules
L1210
à
une
tryosination
douce
(cf.
Ch.
Tryosination).
suivie
du marqua~e externe
3
du
trypsinat
obtenu
pôr
la ~6thode N+G+
H et
3
G+
H.
Le
profil
radioactif du
tryosinat
sché~atisé
dans
la
Fig.
42
43
~ontre une
incorpo-
1
ration
de
radioactivité
très
forte
quand
le
trypsinat
est
traité
par
la
neuraminidase plus
galactose
oxvdase.
Ce
qui
laisse
supposer
que
les
fractions
déta-
chées
de
la ~embrane sont
tràs
riches
en
acide
sialique.
~ais
néanmoins.
le
nombre de
fractions
glycoorotéiniques
extraites
Dar
la
tryosine est
inférieur
ô
celui
obtenu
lorsqu'on ~arque direc-
tement
les
cellules
in
situ.
En
effet.
sur
le
fluorogramme
du
trypsinat.
nous
avons
mis
en
évidence
8 glyconrotfines
dont
les
' 0
•
'"1
son t
de
1 '35 00 O.
1;/ fl [lO n.
9 [1000;
6 8000.
6 [l" n n •
30n O'],
20fll""l
et
19rJrin.

---

1 5 0
·A
B
/Il
94
67
43
30
."'1
20
,... " 1
f;'i~.
42
Marqua~e Externe
du Try~sinat de L 1210
3
A = N + r; +
H
3
R = G +
Il

---

1 5 1
dpm
67.
3),
)(
94.
43.
..
20. 14.
-3
v ,
10.3
v
v
v
.. MM x 10
3.
l~ P 20
2.
1.
v v
'------1- - 4 - - - - -
--+---+--+---+---+---.---I-------1I--~f_____t-__+-_+I-~
sect ions
1
5
7
9
11
13
cm
0--0
, Co:',
f,
'(
~
: Ï\\~ A T L Î / Î l'
+
G
+
H
-
C<
e-----e
T ;) 'i le cc
L,
,
"
l "~iI r
1 .!- 1 ' ,
H

---

152
Il
est
intéressant de
noter que
ces mêmes
gly-
3
coprotéines marquÉes
par
la
N+G+
H,
sont
aussi
mises
en
évidence après marquage métabolique
suivi
d'une
trypsiration
douce
(cf.
Fig. 44
).
Les
glycoprotéines 135000,120000,
60000
et
30000
qui
sont
des
fractions
majeures
après mar-
cuage ~étabGliqu8. sont
aussi
des
fractions
pré-
dominantes
lorsoue
le
trypsinat
de me~brane est
3
marqué
par la méthode
N+G+
H.
Cette observation
laisse donc
supposer.
que
les
glycoprotéines ont
des
structures
~lyc6nniques ramifiées
et
finies
car elles
contiennent de
la
glucosamine
(~-acétyl
glucosamine) du
fucose.
Gu
galactose
(N-acétyl
galactos3~ine) 8t des 9cides sialiques.
La glycoprotéine 60000.
comporte dans
sa
struc-
ture,
une
partie
peptidioue
importante
(BC
3+),
de
la
glucosamine
[1+),
du
fucose
(2+)
et
des
restes
galactosyls
liés
~ des
restes
sialyls
[ 3 + ) •
Le
fucose
et
l'acide
sialique qui
sont
des
sucres
terminaux,
se
trouvent
simultanément,
en
intensi_
té
importante dans
la
glyccorotéine
60000.
On
p8ut
conc
penser que
cette
glyco~rot8ine
60nG~,
possède
une
structure
complexe
et
très
ramifiée.
Les
glycoprotéines mises
en évidence dans
le
trypsinat
sc nt
très
peu marqu~es par
le m~thode
3
G+
H,
à
l'exception des
glycoprotéines
68000,
30ncr,
20000
et
19000,
qui
~rés8ntent tans
leur
structure ces
restes
galactosyls
libres,
et des
restes
galactosyls
liés à
des
restes
sialyls.

---

1 5 3
M. M.
x10- 3
BC
14C-GLcNH
1 4
3
C-LFucose
N+ G+ G
3
2
G+
H
+
GP
135
-
2+
+
+
-
GP 120
+
3+
+
+
-
GP
90
+
+
-
2+
-
GP
68
3+
+
-
3+
2+
GP
60
3+
3+
2+
3+
-
GP
30
3+
3+
+
2+
+
GP
20
3+
-
-
2+
+
GP
1 9
3+
-
-
2+
+
Fig.44 -
TABLEAU CUMULATIF DES GP
D~ L1210 EXTRAITES
PAR LA TRYPSINE APRES DIFFERENTS MARQUAGES.

---

154
2.2.3.
-
SEPARATION BIDIMENSICNNELLE.
Pour accroître
notre capital
d'informetion
sur
la
structure des
(glycoJprotéines de membrane,
nouS
avons
sssôyé
de
correler
les
cHi
et
les M.M.
par électroohorèse
bidimensionnelle.
Après
des
dépôts
de
100 à 300
~g de
protéines
dans
la 1ère dimension
(cf.
I.E.F.
en
tutsJ,
les
protéines
sent
soumises
è une
2à,me
séparation en
ACRY/SDS
(cf.
~atériels Techniques
et MéthoGologiesJ.
2.2.3.1.
-
CARTE BIDIMENSIONNELLE DU TRYPSINAT
APRES
COLORATION AU
BC.
La
s§paration
du
trypsinat membranaire de
cel-
lules
L121Q,
après coloration
par
le
9C
nous
~et en
pr~sence de
très
nombreuses
fractions
peptidinues,
dont
la
description
et
la classi-
fication
deviennent
très
difficiles.
(Fig. 4 5).
L'établissement
d'une
grille de
lecture
nOGS
permet
08
constater
qUE
la majorité
des
prct~ines
se rpparti[sent
dans
des
zones
de
pHi
de
4,7
à
7,0f],
et
de l'l.M.
de 94000 à
14000
(Fig.
45
J.
L'étude
comparative de
olusieurs
gels nous
a
per~is
de mettre
en
évidence
plus de
200
taches
détectables
par
le
BC.
De cette multitude
de
taches,
il
ressort
inva-
riablement
quel
que
soit
la
quantité
de
protéines
déposées
dans
la 1ère dimension,
les
protéines
majeures
suivantes
-
I
pHi
6, 7 -
6, B ,
~ . M.
68000
1
K
pHi
5 , 6 -
6 , 1 ,
M. M.
90000
1
- R
pHi
4, 7
5 , 6 ,
"1. M.
60000
1

---

155
7 • 1
7 . n
6 . fJ
6. 7
6. 1
5 . 6
4. 7
A
c
o
• E
1
F
G -
- - - '-ri- -
T
l
- - r j - . - - .:~-... -'-L ------
l
' ' ' " ' ' -1 1
1
J '
68
- - - ......
1
-
---~~~--
-1- -- - - - - , -
- - - - -
- - -
•
..
-
1-- -
1-
1.'.
--p. ·
1'18
N-t tJ
' 0
[J
.R'
. . . , . '
__ •
' -
' l l .
1 . _
J..:.,~..
::.'\\
Jo -
.... -
-?"._ •. '.
..
1
.. _
_1
...... -
_
....... _ _ .l...
_
,~A.'
1.
_
___ .. __ - - - - - - - ' l I t l - . __
' .
_.J
I_~ __
43
-
1
_
1
pa - - ~
C
_
S
-
1
1.-.
-,
u -
.. 1 v#
_
~_.,.
. . . .
1
L~-1 ~_
a . ~
. 1
'" -
~
'"
r
-
.. "
-
- ,
1
,
_
1
-
. ,
. .
J.-
1 " '10 .: 1-::"--
:
30
- • •-.a;;
-
=--
•
- 1 - _ _ . .. :
-
L - -
-t
-
-
-
-
~I-
_ _~ "'-4
-
r
'L
- :
~ ~ :-Zb
1 ~
_
1
Zd
'l
1
1
_
, . : -
. ,
~
..
,
1
1
,-
1
-.... I~
1
,
1
- -~-
- .....
1
1
1
,-.....
-,---- ..-
.-.
..
ZB
-. Zf . .., z!?; 1 Zh
1
:~
...
~-
_ _
______ :
~
J_
1
...J
-
_
14
--, - -
- -
I
1
•
1
1
1
,
-3
1
"'1"1x1G
1
1
1
7 . 1
7 • fJ
6.8
6.7
6 .1
5 . 6
4.7
.4 5
-

---

1 56
M
pHi
7 , 1
M. M.
56000
1
- P
pHi
6 , 1
6, 7 ,
M. M.
47000
1
Zq
= pHi
6 , 7
6 , 8 ,
M. M.
20000
1
Il
est
à
noter que
dans
les
cases
W et
X,
se
répartit
un
ensemble de
protéines
acides,
dont
les
pHi
sont
compris
entre
4,7
et
6,1,
et
les
M.M.
entre
43000
et
30000
daltons.
Il
est
indéniable,
que
cette
technique apporte
beau COUD
plus
de
renseignements,
que
chacune
des
dimensions
séparées.
En
effet,
si
on
consi-
d ère
les
pro t é i n e s
Wl '
W2'
W3'
\\>J 4'
e Ile s
s e
focalisent
(1ère 0)
au même
pHi,
alors
qu'elles
ont
des
M.M.
différentes
(20).
De même
les
pro-
téines
N ,
N ,
N
qui
ont
la même rv'J.M.,
ont
des
1
2
3
pHi
différents.
La
richesse
de
la
double
dimension,
en
fait
paradoxalement
toute
sa
difficulté
d'interpré-
tation.
2.2.3.2.
-
PROFIL
BIDIMENSIONNEL OU TRYPSINAT
APRES MARQUAGE METABOLIQUE.
1 4
Apr~s
~arquage métabolique au
C -
GLcNH
,
2
1 4 C-L-+uc0se, le fluorogramme révèle un profil
pauvre
en
glycoprotéines.
Nous
avons mis
en
évi-
dence
7 à
B glycoprotéines dont
la majorité
se
situe dans
des
zones
de
pHi
de
4,7
à
5,6
(Fi~.46/47)
GP
F
;JHi
5 , 6 -
6 , 1 ,
M. M.
135000
-1
GP
F
pHi
4, 7 -
5 , 6 ,
M. r'1.
120000
1
GP
L
pHi
4 , 7
5 , 6 ,
M. r'1.
goooo
1
-
GP
R
pHi
-
4, 7 - 5 , 6 , M • M.
60000
1
- GP X
oHi
4, 7 -
5 , 6 ,
M. r'1.
47000
1

---

1 5 7
7 • 1
7 .0
6.8
6 . 7
6. 1
5 . 6
4 • 7
pH
1
A
9
i.
1
F
Qi
:. . ',
1
1
1
1
_ _ .1 _ _
-
94
- - - - - - - - - - - - - - - _.... -
- - - . - ----,------
1
-
G
H
1.
K
~ ~
ca
.
l
'1.
1
_ _ .t_
1
-
-
... 1 _ _
6'3
I\\j
;.::
43
_ .. _---_.-
- - - - -
1
S
T
1 J
'i
"1
xII;
30
-
-
-
-
-1-
- -
1
- -
~
Y
1
l
7
,_ é3
Zb
le
-i\\-
,
.'1.
1
1
.
20
1
~
- - - - ,-
- -
1
lB
lf
Z~
1 7h
7'
_ l
7 '
1
~.l
1
1
1
1 4
-- - -
-1-
- -
- I -
I
-
-
- 1 -
-3
ï
1
1
"1"1x10
,.
•
7 • 1
7 .0
6. B
6. 7
6. 1
5 .6
4. 7
Ge '
~.t;
.'
,1

---

158
7 • 1
7
. n
f3 • P-
6. 7
6 . 1
5 . S
4
-;
1
pH
1
9
C
1
'J
E
F
B
-,
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1......
,
1
1
1
..
q4
-
_l_
'
.2
- ___ J __
-
J _
- - '-
- .,_
-
1
1
1
r
:i
l
1
r<-
I
LJ
1
1
-
....'.
1
1
1
L
68
- - - - - - -- -
- -
- ,-
1
-
- "j
1
1'1
!~
1:.)
F
CJ
R
1
1
1
1
J~
1
1
,
1
"
- -
,
43
,- - - - - -
-
- -
1
1
1
.::
1
,-,
1
1
~-
1
1
1
1
1
1
30
- - - .
_L
- - - -
-
1
- ., -
-
1
- - - - - -
1
Y
Z
1
Za
Zb
Ze
Zd
1
1
1
,
,
1
2LJ
- - - -
- -
-,-
-I-
,- -
- - - .-
1
Ze
Z.,:-
1
Z~
1 Zh
l i
7 .
... J
1
1
1 4
1
1
- - - - -
- - - - -
,
- - - - -
-
1
- - - -
1
1
1
,
-3
,
!"IMx10
1
7 . 1
7 . 0
6 . '1
6 . 7
6 . 1
5 . 6
4 . 71
-' .47

---

1 5 9
Les
~lvconrot6ines A
(oHt
7.nn.~.M. 14nnnn,
1
et
Zd
(oHi.
4,7
-
5.6.
M.~.
28000)
ne
sont
1
mises
en
évidence
qu'après marquage métabolique
1 4
au
C -
GlcNH
.
2
Cette approche de
révélation
bidimensionnelle
des
glycoprotéines
est ardue et
nécessite
une
lon~ue incubation
(environ
2 à
3 mois
de
contact
à
80°)
pour avoir des
taches.
pas
toujours
inter-
prétables
(cf.
Ch.
Discussion).
2.2.3.3.
-
PROFIL
BIDI~ENSIDNNEL APRES
MARQUAGE
l
3
EXTERI\\IE.
(N+G+
H -
G+
H).
Apr~s un
marquage externe
par
les méthodes
déjà
décrites
(~atériels Techniques et Méthodologies)
le
lysat
cellulaire après
centrifugation
est
sou-
mis
à
une
électrophor~se bidimensionnelle avec
des
dépôts
dans
la 1ère 0
(I.E.F.
tubes)
de
l'or-
dre
de 100 à
300
~g de protéines/10~000 à
200000
cpm.
Le
p!'ofil
~31eu de Coomassie
(Fig.48 )
qui
révèle
toutes
les
protéines
nous
sert
de
témoin
de
bonne
répartition.
Après
2 mois
d'exposition
à-70°
C.
le fluoro-
gra~me
(Fig.49
)
ne
révèle
que très
peu de
taches
dont
la majorité
se
situe dans
les
zones
de
pH
4.7
à
6,B
et
de M.M.
94000
à
43000
daltons.
D'apros
la
nomenclature
que
nous
avons
adootée.
les
taches majeures
sont
les
suivantes

---

160
•
7 • 1
7.0
6.FJ
6. 7
6 • 1
5 . 6
4. 7
oH
,
-
9
fJ
r
F
....
1
1
1
~
1
-1
4bJo ~
'"
-=:::::.
1
94
-;. ClIlIIJoo"'" -
-
-
-
- , -
--1 o. c;J 1 ~
C7
l
< ,.:'
1 014
c::::>
"'1'"
1
1
- /-
68
-1-,.. -
0 1 ·
1 ~
~
1
(
-
co
•
p
o
•
'0
o
--- 11"
- '-
43
1
1o.,
s
f IJ
1
o
1
-
30
- - - ~
- - 1 - -
7
1
7b
L~
1
1
1
1
1
20
Ze
1 ~a-
1 7 F
1
Zn
1 2',
__ L
1
J
1 4
-'
-
1
1
1
"1l'1x1G
,
i
•
-,
,
S .6
4 • 7
1
•
6 • 1
1
7 •
5.8
6. 7
. 48
-

---

161
7 . 1
7 • n
6 • B
6.7
6. 1
5.6
4. 7
ph
9
l:
1)
1
'~1 L:
- 1 -
-
-
-,- - - - =...1.- -
1
',J
n
1
l
.c:::r
4
k',
1 -
1
1-
1
.t C=t-'
----.,
1
1
c;;
- ,- - - - - - -:=-=---=-_1 _ - - - - -
1
1
'1
1
~J
r-J
--=:~
1
4 d R
1
6
~
~
1
RF"
1
1
~ -:,
1
,
1
1
4
~-
-cCIf1
-
~
"1
T
1
Il
\\1
x
1
1
_ ...J _
1
1
-
-
-,
- - -
y
1
Z
1
1 7 c
Za
Zb
Zd
1
1
1
- 1
-,-
- - - -
Ze
Zf
Za,
Zl,
, Z i
Z i
1
-
_
_
1 _ _
1
1
7 • Î
7 . 0
il . B
D.7
5 . 6
4. 7
.. 49
-

---

1 6 2
GP M
pHi
~ , F\\
- 7 , n , "'l. M • f=;rnnr
1
r,p
1"1
pHi
7 , 0 ,
fvl.M.
54000
2
GP
0
pHi
6, 7 - 6, B , M. f'Il.
48000
1
GP
S 1
pHi
7 , 0 -
7 , 1 ,
fvl. M.
45000
La
~lycoDrotéine f'Il
(ou
N
)
se
sépare
en
une
1
1
tache
allon~ée qui
recouvre
plusieurs
zones
de
pHi.
Après
action
de
la
neuraminidase,
et
1
mois
d'exposition
à
-70 0
C,
le
fluorogramme
est
plus
riche
en
taches.
Elles
se
répartissent
pour
un
premier ~roupe dans
les
zones
pHi
5,6
-
6,8,
M.M.
94000,
30000,
et
pour
un
deuxième
groupe
dans
les
zones
pHi
7
-
7,1,
M.M.
6BOOO,
41000.
On
assiste
aussi
à
une
altération
dans
les
pHi
des
slycoorotéines.
En
effet,
les
glycoprotéines
qui
apparaissent
sous
forme
allongée
aorès
G +
lH,
se
retrouvent
sous
forme
circulaire
dans
la
plupart
des
cas.
La
glycoprotéine
la
plus
représentative
de
ce
phénomène,
est
la
GP
f'Il
,
qui
après
marquage
1
G +
3 H se situe dans
les
zones
pHi
6,8
-
7,1,
alors
qu'après
N +
G +
3 H ,
elle
se
situe
à
pHià
7 , 1 •
f'Ilalgré
ces
aléas
inéran~s à
la
tecQnique même
de marqua8e
(N
+
G +
3 H)
nous
avons
réussi,
par
comoaraison
avec
des
profils
monodimensionnels
(ACRY/SDS)
à
attribuer
des
M.M.
et
pHi
aoparents
aux
glycoprotéines
ainsi
révélées.
Les
glycoorotéines
Majeures
que
l'on
retrouve
fré~uemment avec
des
positions
constantes
sont
les
suivantes

---

163
ï . 1
6 . P,
6, 7
6 • 1
5 , fi
4, 7
A
9
L
o
E
F
-'-
94
l_
H
l
l"'"t
1
:;r.,.
1
cs::: , --:;a;::::::'î
68
- -.- - - - -Id 'i
1
~~F
&...
~4.
1 ~~t
ft \\1lI> ..
- ' -
1
-l
' -
1
.GE:>1-,~
. l e 1
1
..
5,
~
. . . . .
Ilb'
...1
i ,
43
- -,--
\\-
'j
~
1 -;-
:J
'/
x
1
1
~
1
~
6>
1
1
_ 2 . -
30
-,-
- - -
1
1 !:l
z
lb
Ze
Zd
1
1
20
- _ l -
I
- ,
:1l'1x1 Il
7 • 1
7 .' [1
6 " P,
5'.6
4 ,"7
. 50
-

---

164
-
GP
pHi
6 , 1
-
GP
pHi
6, 1
6,7,
M. M.
86000
-
GP
pHi
6, 1 ,
fVI. M.
80000
-
GP
pHi
6, 7
R , 13,
M. M •
76non
-
GP
pHi
5 , 6
6,1,
M.i'J.
63000
-
GP
pHi
7 , 0
7 , 1,
M. M .
60000
-
GP
pHi
7,0,
fVI. M•
54000
-
GP
pHi
7 , 0
7 , 1,
M. M •
50000
-
GP
oHi
6 , 7
6,13,
M. M.
4BOOO
-
GP
pHi
7 , 0
7,1,
l''LM.
45000
-
GP
fJHi
5 , 6
6,1,
M. i'1 .
41000
-
GP
pHi
6 , 7
6,8,
fV1.M.
36000
-
GP
pHi
6, 7
6,13,
M.fVI.
31000
Cefluorogramme
bidimensionnel
( Fig.5 0
)
nous
permet
de mettre
en évidence
une
hétérogénéité
dans
les
glycoprotéines majeures.
En
effet,
la
glycoprotéine
68000
qui apparaissait
en
une
forte
bande
homogène,
après
séparation monodi-
mensinnnelle
(ACRY/SOS)
se
répartit,
en
2
taches
bien
distinctes
sur
le
fluoro~ramme bidimension-
nel,
avec
la même fV1.fV1.
et
des
pHi différents
GP
02
= pHi
= 6,7
-
6,8,
M.M.
68000,
GP
P
=
1
pHi
=
7,0,
M.M.
68000).
Il
en
est
de même
pour
les
GP
02
(pHI
= 5,6
-
6,1,
fV1.M.
63000
et GP
04
=
pHi
=
5,6,
i'1.M.
63000).
On
note aussi
que
le marquage aspécifique déjè
rencontré
(fluorogramme monodimensionnel)
porte
sur des
composés
à
pHi
bien
distincts
:
GP M
(pHi
7,0
-
7,1,
M.M.
450(0)
et GP
0
4
1
(pHi
= 6,7
-
6,8,
M.f'1.
48000).

---

165
2.3.
-
K562.
2.3.1.
-
MAROUAGE
EXTERNE DES
GLYCOPROTEINES
i'1EM8RANAI~ES .
Sur la
cellule K562
d'origine
humaine,
nous
avons
basé
essentiellement.
notre
étude
sur des
sépara-
tions
en ACRY/SoS.
Les
cellules
sont
au
préalable
marquées
in
situ
par
la méthode
N + G +
3 H 1
G +
3 H.
et
les
glycoprotéines
sont
révélées
par
fluorograohie
[cf.
Méthodes
Révélation).
2.3.1.1.
-
INCORPORATION DE RADIOACTIVITE.
Après
comptage de
parties
aliquotes,
les
résultats
montrent
que
l'incorporation
de
radioactivité dé-
pend
du
traitement
par la
galactose oxydase.
Le
prétraitement
des
cellules
par la
neuraminidase
[N
+
G +
3 H) augmente cette incorporation de radio-
activité totale
dans
des
oroportions
lé~prement
supérieures
au
traitement
G +
3 H (Fig.51).
Cette différence
se
confirme
lorsqu'on
ptablit
le
profil
radioactif
après
section du
gel
d'acryla-
mide
(Fig.52).
2.3.1.2.
-
PROFIL
ELECTRoPHoRETIOUE APRES
3
3
MARQUAGE
N + G +
H /
G +
H.
Le
fluorogramme
(N
+
G +
~H) après électroohorèse
sur
~el
constant
à
10
~.
montre
une
simulitude
frapoante
entre
le
profil
des
K562.
et
des
Ery-
throcytes
normaux
(Fig 53).
En
effet.
on
retrouve
dans
les
2 profils,3 bandes
fortement
marquées
qui
ont
des M.M.
approximatives
de 85000,
54000 et
40000 daltons.

---

TYP E CELLULAIRE ET
cnm / ~g
PROTEINE
TRAITEMENT
EXP.
1
EXP.
2
EXP.
3
EXP.
4
EXP.
5
EXP.
6
3
K562
+
N + . G +
H
9112
gn1,46
902,99
940,21
846,83
859,48
3
K562
+
G +
H
741. f1:'i
736,75
72Cl,84
687,41
6Q7,19
635,33
- + -
Fig. 51 -
TABLEAU OU MARQUAGE
EXTE~NE
DES CELLULES
K562.
3
N + G +
H
NEURAMINIDASE
+
GALACTOSE OXYDASE
+
BOROHYDRURE TRITIE.
l
G
+
H
GALACTOSE OXYDASE
+
BOROHYDRURE TRITIE.
(J')
(J')

---

2-
CP"
1<
10
-
16 7
220
'4
51
43
30
20
14
I----J -- __'- - _,__ - j - _ J_ - _ J - Y- ----~I'll'l )( 10- 3
5
4
3
2
1
o
2
4
6
8
10
12
14
S,ct ion. du
C,l
en
c",
Fig. 52 -
PRr]F'IL
RAOHJACTIF
DES
GLYCOPRfJj-EI~~ES DE f~,S62
APRES
MAR~UAGE EXTERNE.
*-*
3
<5'32
+
N
+
G
+
H.
3
G
+
H.
~'
.
.JI!'.
,"
f. é'"
"fi
7
",;- i
,j;

---

168
Fig.
53
MarquageExterne des G.P. de K 562
et des Erythrocytes (GR)
A B C
o
- - Cll'bilD!5JD
ACRY/SOS = 10 %
PAS
3
1
A, C
GR
=
= N+G+ H
3
B, D
= K 562 = N+G+ H
';,
,]
PAS2
a b c
d
r
ACRY-SDS = 5-15 %
A,C
= K 562 = rI + G + 3i-{
-94
B,D
3
= K 562 = G +
H
- 68
o
.' 30
~.20
.. ,14

---

U'j
.....
.0
tx:l
ASP44
ASP53
Cl)
GP 85
K 562
MARQUAGE
EXTERNE
DES GP
ro u g e =
N + G + 3H
G~9
3
bleu
=
G +
H
GP ~
GP
37.39
66.62
U'j
.-
1
GP 29
.0
GP 115
., 1
M
If)
/;)J)
.GP34
1
.
1
1
.)
CoL.,
1
, VI 1
A'
.
1 \\1
Front
!1
1
1 1
,
i
lJ\\jJ V
F
\\
.
\\
Î ~j\\
\\
r_
,
\\
- ' . J -
\\
r-
;
._ '0*.-
\\..
'~/'
'
~"
'
r
~_~-.~J
\\ , , / \\
r F
\\'
\\
/ '
-~-_../
\\.
.~.
,
"-.,..r~-.--._\\ "
M Mi X 10-3
\\
~
A Â Â.
AA
Â
L
30
Â.
36
43
•
..
60 67
94
~
220
•

---

169
Dans
le cas des
Erythrocytes.
par comparaison
avec
les
travaux
de
la
littérature
(44,126)
la
bande
85000
correspond
à
la bande PAS
(44
1
ou
glycophorine A.
(dimère)
qui
est
la
glycopro-
téine majeure
de
l'érythrocyte.
La
bande
40000
correspond à
la
bande PAS
( 44
)
qui
est vrai-
2
semblablement
le monomère
de
glycophorine A.
Ces
simulitudes observées.
nous
avons
essayé
d'a+finer
le
profil
des
glycoprotéines
de
K562
en
les
séparant
dans
un
gradient
d'acrylamide
de
5
à
15
;.
Après marquage
N + G + 3 H .
la
K562
révèle ô
sa
surface
21
bandes
radiomarquées
dont
les
M.M.
calculées.
vont
de
260
à
16.000.
Parmi
ces
bandes
on
compte
8
bandes d'intensité
majeure
(3+
ou
2+.
Fig. 54).
Ce
sont
les
bandes
115000
(2+),
85000
(3+),53000
(3+),
49000
(2+).
44000
(3+).
39000
(2+).
37000
(2+)
et
29000
(2+).
Apr~s marquage à la G + 3 H seules apparaissent
de
f3çon
nette
(3+
ou
2+)
les
bandes
53000
(3+).
49000
(2+);
44000
(3+).
39000
(2+),
37000
(2+)
et
29000
(2+).
(Fig. 53).
Les
bandes
53000
et
44000
sont
considérées
co~me
des marquages
aspécifiques.
puisqu'on
les
retrou-
ve
toujours
en
l'absence
de
tout
traite~ent en-
zymatique.
c'est-à-dire en
présence de
borohy-
drure
tritié
seul.
Contrairement
au
profil
dans
un
gel
à
10
~o •
la
bande
40000
(PAS
)
n'existe
plus
dans
un
gradient
2
(5-1S
;)
plus
résoluti+.
mais
nous
avons mis
en
évidence
2
bandes
d'intensité moyenne avec
des
~.~.
de
39000
et
37000.

---

170
M. M.
APPARENTES
1
-3
3
3
( x 1 0
)
N +
G +
H
G +
H
+
GP
260
-
-
+
GP
230
-
-
+
GP
21 0
-
-
+
GP 1 60
-
-
GP 11 5
2 +
-
GP
90
+
-
+
GP
85
'3
+
-
+
GP
78
+
-
+
GP
72
+
-
+
GP
66
+
-
+
GP
62
+
-
GP
5 '3
3 +
3
+
GP
49
2 +
2 +
GP
44
3 +
3
+
GP
39
2 +
2 +
GP
37
2 +
2 +
GP
34
+
+
GP
29
2 +
2 +
+
+
GP
22,5
-
-
+
+
GP
21
-
-
+
+
GP
1 6
-
-
Fig. 54 -
TABLEAU
DES M.M.
MOYENNES DES
GLYCOPROTEINES
DE K562 APRES MARQUAGE EXTERNE.

---

1 7 1
Par
comparaison
avec
le
profil
des
Erythrocytes
la
hande
85000
correspond
au
dimère
de
la
gly-
coprotéine A,
et
les
bandes
39000
et
37000 aux
monomères.
2.3.2.
TRYPSINAT
DE ME~BRANE
DE
K562.
2.3.2.1.
-
PROFIL
BLEU
DE
COOMASSIE APRES
ACRY !SDS.
Aor8s
action
de
la
try~sine dans
les
conditions
déj~ décrites
(cf.
Ch.
Tryosination)
le
tryo-
sinat
de
meMbrane
est
soumis
~
une
séparation
électrophorétique
en ACRY!SDS
(5-15
5).
Le
profil
Bleu
de
Coomassie
qui
ne
révèle
que
les
protéines,
met
en
évidence
une
soixantaine
de
bandes
plus
ou moins
colorées.
Les
masses
moléculaires
des
fragments
protéiques
détachés
oar
la
trypsine
vont
de
190
à
15000
daltons.
Dans
le
tableau
représenté
dans
la
Fig.55,
on
peut
subdiviser ces
bandes
en
3 groupes
d'in-
tensité
de
coloration
variable.
Le 1er groupe
constitué
de
protéines
de
M.M.
variant
de
190 8 132000
daltons
est
très
fai-
+
blement
coloré
par
le
BC
(-).
Le
2éMe
~rouoe qui
recouvre
les
protéines
de
130
à
1Q8000 daltons
est
faiblement
coloré
par
le
RC
(+).
Le
3eme
groupe
qui
va
de
105
à
15000 daltons,
est
toujours
détectable
par
le
BC,
et
rév81e
des
bandes
d'intensité majeures
(3+
ou
2+).

---

1 7 2
--
l'J 0
M. M.
N°
M. M.
1
BA l'JO ES
APPARENTES
B C
BA NO ES
APPARENTES
B C
( x 10 -3)
( x 1 0 - 3 )
1
190
31
61
+
+
+
2
1 80
32
5g
+
-
+
3
170
33
56,5
3
+
-
+
4
160
34
54
3
+
-
+
5
150
35
52
+
-
+
6
140
+
36
50
-
+
7
135
37
48
-
+
+
8
132
38
47
3
+
-
9
130
39
43
3 +
+
1 0
128
40
40
+
+
+
1 1
1 25
41
39
1
+
12
11 5
+
42
37
+
1 3
11 0
+
43
36
+
1 4
1 0 P,
44
34
+
+
1 5
1 05
2 +
45
32,5
3
+
1 6
1 00
2 +
46
29
3
+
1 7
96
2
47
27 , 5
3
+
+
1 8
95
48
26
3
+
+
1 9
94
+
49
24
2 +
20
92
2
50
23
2 +
+
21
56
3
+
51
22
+
22
82
52
21 ,5
+
+
2'3
80
53
20
+
+
24
77
2 +
54
19
2 +
25
76
2
55
1 8
2 +
+
26
73
56
1 7 ,5
+
+
27
70
+
57
1 7
+
28
69
2 +
58
1 5 , 5
+
29
67
59
1 5
+
+
30
65
+
Fig.55 -
TABLEAU
DES
M.M.
MQYENNES
DES
CONSTITUANTS
O~~TEICUES ~U
-R~cI~AT DE
K562.
INTENSITE DE COLORATION AU
ALEU
DE COOMASSIE
(B
C).

---

1 73
MM
X
10- 3
_
94
A
- -
.
.
67
43
.....
30
,
l -
e
P.
1
~,-,. '''!'à'
.... ,.;..wr,
1.·
20
,
:'-~i; ..(
~
':.'
i-~.·~·
" - -
<< '-.~
'"; ..
:
..
"
~ .. ",
14
bD
......... ':
B
... \\
l'.
Fip-.
56
Trypsinat de 1-<: 562
(ACRY:
5-15%)
A = Coloration au B.C.
D
Enre~istrement densitom~trinue
(CELLOMATIC -SEBIA)

---

174
Les
bandes
d'intensité majeure
(3+).
qui
ont
étp.
confirmpes
par
un
enregistrement
densitométrique
(Fig. 56
)
ont
des 1'1.1'1.
approximatives
de
86000.
56000.
54000.
47000.
43000.
32000.
29000.
28000
et
26000
daltons.
3
2.3.2.2.
-
FLUOROGRAMME APRES
MARQUAGE
N+G+
H /
3
G+
H ET SEPARATION
EN ACRY/SDS.
Nous
avons
mis
en
évidence
les
glycoprotéines
présentes
dans
le
trypsinat.
par
la méthode
de
trypsination
douce
suivie
d'un
marquage
externe
3
3
par
N + G +
H ou
G +
H (cf.
Matériels.
Techni-
ques
et
~éthodes).
Le
fluorogramme
révèle
une
trentaine
de
bandes
:3
aussi
bien marquées
après
traitement
N +
G +
H
que
G + 3 H à
l'exception
de
3 bandes.
(Fig.57
).
Les
1'1.1'1.
déterminées.
montrent
qu'on
retrouve
des
bandes
intensément
marquées
(3+)
aussi
bien
dans
les
fragments
de
hautes
M.M ..
que
dans
les
fragments
de
basses M.M.
(Fig. 58 ).
La
bande
72000
(GP
72)
domine
le
profil
par
son
intensité
de
marquage
(4+)
aussi
bien
après
3
3
N + G +
H que
G +
H.
On
peut
donc
supposer que
sa
structure
gl~cannique contient
aussi
bien
de
nombreux
résidus
~alactosyls liés
~ des
résidus
sialyls.
~ue des
nombreux
résidus
galactosyls
libres.
Cette
bande
semble
correspondre
au
dimère
de
la
glycophorine A (PAS,).
que
nous
avons
trouvé
à
85000 daltons
lorsque
les
cellules
K562
sont
marquées
directement
in
situ
(cf.
Marquage
Externe).
Les
bandes
6400Cl
(GP
64)
et
52000
(GP
52)
ne
sont
mises
en
évidence
qu'uniquement
après
traitement
N + S
+ 3 H.
Leur
structure
glycannique
doit
com~
porter en
majorité
des
résidus
galactosyls
liés
à
des
restes
sialyls.

---

175
A
B
c
D
""'il(
94
......
,'b,
~
-<C 67
Gp64 ~ ,..'
,t ~ Gp57
.-
- 1;.
., fi'
~,'
"<!( 3 0
1;.
•
-<lii( L~ 0
-<il!( , 4
MM
X
10 - 3
Fig.
57
i\\1arquac;e Externe du Trypsinat de
K562
3
A,C
= N + G +
rI
3
B,D
= G +
H
ACHY -SDS
=
5-16%

---

c.Il
ASP ...
GP54
K 562
.D
44
U'l
,
t -
~
GP72
GP
DE
LA
MARQ.
EXT.
DES
y
SENSIBLE
FRACTION
TRYP.
GP64
rouge
G + 3 H
V
3
~I
(1
\\
Il
1\\
".
bleu
N+G +
H
li
li1,
1\\
'\\
li
, \\
\\
i\\
i \\
i
~ '1
1
1
1
( II
1
1
\\
1
1
1
~ ~
:\\
r,
c.Il
1 :
, \\
l
,
.-
GP 34
'il:
i :
!':
\\
i '
.D
1: 1
1
. '
,
!
J!
....
~
\\i
),
1:
G~57)
;."
,
i'
"
1 \\1
\\ /
1
U'l
0Jj
.-
1
Front
u..
1
\\
'w!
ii
'
[
1
G P40
I~1
i
l
1
11·
1
~,\\i\\
i
i \\
\\
r,
. \\
i ·
" ,'..
:
\\
.
f\\ f\\
\\ l
"
1
1
.'
"
..
1
\\
~j\\ 1\\
\\
1 \\
\\1
\\ 1:\\
f\\
1
\\ )
\\
\\j
\\
J
\\'1
\\ r,
1
\\
\\
i
'
\\
l'.
1 \\
/"\\.
.....~j .i
\\ ,'"
\\."
.
,
1
v \\
\\..)
''''',,'
""'-'\\
'
",."
\\
!
\\
0
i
\\
,.
\\
:
\\.. ....,-,
--~"
"'-"', /'
/\\ '
_'- .'
\\,. ,.' ..f'.
, .
. \\
\\...
/ )
\\
.
'
, .... ~../
Â
A
A
A
_3
\\\\
Â
Â.
94
~ M.M.xlO
.
67
30
43
14
20

---

17 6
M.M.
APPARENTES
1
-3
3
3
N
G
H
G +
H
( x 1 0
J
+
+
GP 125
+
+
GP 120
+
+
GP
11 5
2
+
2
+
GP
108
2
+
2
+
GP 100
2
+
2
+
GP
96
3
+
3
+
GP
85
?
+
"
+
GP
79
2
+
2
+
GP
72
4
+
4
+
GP
64
3
+
-
GP
60
+
+
GP
57
-
2
+
GP
54
+
-
+
GP
52
l
+
-
GP
Sr)
7
+
2
+
1
GP
46
l
+
3
+
1
GP
41 , 5
+
-
GP
41
+
+
GP
40
l
+
3
+
GP
33
+
-
GP
35
+
+
GP
34
2
+
2
+
GP
31
+
+
GP
29
+
+
GP
28
+
+
GP
22
+
+
GP
21 , 5
;;'
+
2
+
GP
20
+
+
GP
1 9 , 5
+
+
GP
1 8, 5
2
+
2
+
Fig. 58 -
TABLEAU
DES
M.M.
M'HENNES
["JES
r::'-:'L=P~TIEINES
DU
TRYPS=~JT
DE
K562
APRES
~ARQUAGE EXTE~NE.

---

177
La
GP
57,
n'apparaît
qu'après
traitement
G +
3 H
et
elle
est
totalement
inexistante après
action
de
la
neuraminidase
(N
+
G +
3 HJ ,
ce
qui
suppose
une
structure ou
une
réactivité
particulière de
ce
glycanne
(cf.
Ch.
DiscussionJ.
Le marquage
aspécifique
porte
sur
une
fraction
de M.M.
46000
daltons
(GP
46J.
2.3.2.3.
-
SEPARATION 8IDIMENSIDNNELLE.
La
carte
(BCJ
bidimensionnelle
du
trypsinat
révèle
environ
200
taches
détectables.
Elles
se
répartissent
pour
un
premier ensemble,
dans
les
zones
de
pHi
4,7
À
6,8,
et
de
M.M.
Q4000
3
19000 daltons,
et
pour
un
2ème
ense~ble dans
les
zones
pHi
7,0
3
7,1,
et
de
M.M.
100000 è
lOOO']
daltons.
Les
taches
majeures
de
ce
profil
sché~atisé
dans
la
fiq,.59
sont
les
suivantes
d'après
la
no-
~enclature adoptée
0
(pHi
= 6,7
-
6,8,
M.M.
1
6QnooJ,
P
(oHi
= 6,7,
'''1.M.
670[]0],
02
(pHi
=
1
6,7
-
6,8,
M.M.
3g000J,
U
(pHi
=
6,7
-
6,8,
2
M • r1.
3 7 0 0 [] J •
On
re~arqu8
~ussi
que
dans
les
intervalles
de
pHi
6,1
à
6,8,
se
focalisE
la
majorité
des
protéines
avec
des
M.M.
variant
de
94000
à
20000
daltons.

---

•
'78
7.1
7.[1
u . "
C.
6.~
5.6
4.7
"".
L -
.......
....
L·
L'_ _.......
pH
1
._
F
!.-
~
I -
-' -
!-._~- --- :-" J..., _. -t
-!..--_1
.
,
_1 _
_
_ _ , _
-
- -
- • . - : -
-. r
-
["i
....
'-1--~~1
.
)
.)
,;
..... - - - 1
-1
•
-;.,J
•
L
~I
..
- 4 -1
--~
4 )
.. -= -=
-~- ... - ---.- -
f"'.
::r--- -
·r·
t: u_
1 V"
, \\.....
-x. _
- ,
1
1 '-
l
'"
---.. -
1-;:..
--'
I......J:
__
~_
1
-1-
--- -- - - - - - - - ~ - --.:-....7
L. Zô7-
• ZL)
Ze
1
Ze
1--
"L
1
-
1
,
1
~.:-..
1
1
-
I_<:"~~~ -
2rJ
-
C> r-'~ -
1
-
7e
ç;
/ h
.i i
1 7.1
1
_1 _
1 4
-'
-1
1
-. fT)
Z l
1 Z n
1
Z 0
Z D
T i~ Y '-)3 :;: f\\I/', T
ij c
K5 6 2
-
C[j :.. 'J P A. r l fj ~~ f, LJ
9
c.:.

---

179
III
-
APPLICATIONS
PHARMACOLOGIQUES.
3.1.
-
INTRODUCTION.
Nous
avons
utilisé,
les
techniques
électrophoréti-
ques
comme moyen d'étude de
l'action d'effecteurs
exogènes
sur
les
(glyco)protéines
de membrane.
En
effet,
à
la
suite des
travaux
effectués
dans
le
laboratoire,
sur
l'action de médicaments
anticancé-
reux
sur
le ~étabolisme énergétique de
la cellule
1.:.1210,
(26,188,109
),
nous
avons
basé
essentiellement
notre
étude
sur cette
lignée
c811ulaire.
Les
drogues
que
nous
avons
utilisées
sont
le
METHOTREXATE
(MTX)
et
le RA
233.
3.2.
-
DESCPIPTIONS
DES DROGUES.
3.2.1.
-
LE METHOTREXATE
(MTX).
Le Méthotréxate
est
un
antimitotique
utilisé
comme
anta~oniste de
l'acide folique
dans
le
traitement
des
leucémies
ly~phordes argues.
Ce produit
qui
présente
aussi
un
spectre d'action
plus
large,
ap-
partient
à
la famille
des
dérivés
ptérorques
et
répond
à
la formule
développée
suivante
Acide
ptéroyl-gluta~ique OH
H
Acide Folique
Acide amino
4,
~éthyl 10,
'1éthotréxate
Ptéroyl
gluta~ique.

---

180
Il
agit
au
niveau
de
la
dihydrofolate
réductase
en
inhibant
celle-ci
et
empêchant
ainsi
la
ré-
duction
du
dihydrofolate
en
tétrahydrofolate.
La
synthèse
d'ADN
se
trouve
bloquée
par
inhibi-
tion
de
la
biosynthèse
de
thymidine monophosphate
à
partir
de
desoxy-uridine monophosphate
(Fig.60).
Les
effets
du ~TX sont
antagonisés
par
la
thvmi-
dine
exogène avec
l'adénosine,
l'inosine,
l'hy-
poxanthine ou
par
l'acide
folinique
(183).
3.2.2.
-
LE RA
233.
(BDEHRINGER
INGELHEPlJ.
Ce
produit
de
structure
pyrimido-pyrimidique
(voisine du
dipyridamole),
est
prDposé
comme
antim~t~stati1ue. Certains de ses ~f­
fets
sur
les
cellules
cancéreuses
ont
dé1à
été
décrits
60
sans
que
le mode
d'action
précis
ait
été
fSlucidé.
3.3.
-
ACTION OU
MTX
SUR
LES
(GLYCO)PROTEINES
MEMB~ANAIRES DE
L121o.
3.3.1.
-
CONDITIONS
DE MISE
EN CULTU~E.
Les
cellules
sont
incubées
(~atériels, Technioues
5
et
Mpthodolor,ies)
~
raison
de
2 x Hl
cell./ml,
-8
en
prpsence
de ~TX à une
C )0
d'ertviron 1n
mol/l.
Elles
sont
récoltées
au
bout
de
24
heures.
Pour
l'étude
des
ohénom~nes membranaires
les
doses
de MTX
que
nous
avons
utilisées
sont
des
doses
voi-
B
sines
de
la 0150
(1,5
x 10- mol/l)
mais
inférieures
-B
à
la en 10
(1
x
10
"loI/l},
(25).
9
8
Elles
se
situent
donc
entre
10-
et
10-
mol/l.

---

1 8 1
dUMP
~
TH Y iY1 lU Y L1\\ l' r:
S y N·r H E TA S E
+
THY.
eXQ.
METHYLENE
, ,
(
FH4-
FH Z
G
AClDE
FOLINIQUE
MTX
Fig.50 -
~ECA~ISME
D'ACTIO~
ou ~TX.
FH
TétrahydrofolatB.
4
FH
oihvdro+olate.
2
TH Y ex 0
=
Th \\1 mi d i n e
ex 0 g è ne.
dUMP
oésoxy
uridine
monophosphate.
dTMP
oésoxy
thymidine
monophosohate.

---

182
3.3.2.
-
ACTION SUR
LES
PROTEINES ME~BRANAIRES.
3.3.2.1.
-
I.E.F.
(TUBE).
Après
trypsination
(cf.
Ch.
Trypsination)
des
membranes.
les
trypsinats
témoins
et
traités
sont
soumis
à
une
isoélectrofocalisation.
La
coloration
par
le
BC
révèle
des modifications
qualitatives
quant
au
profil
des
cellules
témoins
et
traitées.
En
effet.
les
cellules
soumises
au MTX
présen-
tent
dans
leur profil.
une duplication
de
la
bande
15
(pHi
= 6.4)
en
faisant
apparaître
une
nouvelle
bande
15
(pHi
=
6.2).
Parallèlement.
on
assiste à
une
atténuation
de
la
bande
16
(pHi
= 5.9)
(cf.
Fig. 61).
3,3,2,2,
-
ACRY/SDS.
Après
séparation
du
trypsinat
en ACRY/SDS
et
coloration
par
le
BC.
les
différences
entre
témoin
et
traité
sont
plus
nombreuses.
Au
delà
des
protéines
de
100000 daltons
de M.M.
on
observe
des
modifications
qui
sont
variables.
Par
contre.
la modification
la
plus
nette
et
la
plus
constante
est
l'intensification d'une
bande
de
53000 daltons
de ~.M ..
Cette
bande
à
53000
est
très
+aiblement
colorée ou
parfois
inexistan-
te
chez
les
cellules
témoins.
(Fig.62).

---

183
.. . ll(l
,__1
/---------
1
b . 20
15
5.80
15
16
15 '
16
5.30
-
-~-
- - - -
4.80
pH
Témoin
~1.T.X.
membrane
Fiq;.
61
L 1210 + i.TTX
I.E.F.
en tube
A
8
c
D
Fig.
62
MM x
10 - 3
L 1210 + è1TX
ACHY-SOS
-
(5-15%)
~
..
100
~'" 94
A,C = Te
67
B,D
r-1'IX
. , 5 3
-
43
-
2"0
-
20
14
"

---

184
3.3.3.
-
ACTION SUR
LES
GLYCOPROTEINES.
Les
études
ont
été
effectuées
en ACRYISDS après
marquage ~8tabolique ~
la 14 C GLcNH
(donc
étude
2
dut r :1 psi n a t)
0 u
a p r 8 s
ma r qua g e
e x ter n eau
0 e rio -
3 3 )
date
+ KB
H
[P
+ H
.
4
Le
profil
après
marquage métabolique
ne
présente
aucune différence
aopréciable.
En
effet,
on
ob-
serve
un ~arquage intense dans
les
témoins
et
les
traités,
dans
la
zone
de M.M.
allant
de 94000
à
43000.
[Fig.
63
).
,
P
3
Apr8s
marqu~ge externe
au
+
H,
qui
porte
sur
les
résidus
sialyls
terminaux,
le
profil
des
cel-
lules
traitées
révèle
par rapoort
aux
cellules
témoins,
3 bandes
supplémentaires ayant
des M.M.
de 105000,
100000
et
45000
daltons.
3.4.
-
ACTIDN OU RA
233 SUR
LES
[GLYCO)PROTEINES.
3.4.1.
-
"1ISE
EN CULTURE.
Apr~s
5
24
heures
de culture
(2
x 10 cell./ml)
en
présence
ou
en
absence de RA
233,
les
cellules
sont
récoltées
par centrifugation
et
ramenées
~
.
6
une
concentratIon
de
5Qx10
cell./ml.
Elles
sont
ensuite
soumises à
une
trypsination
douce
(cf.
Trypsination),
et
le
trypsinat
[dialysé et
lyo-
phi lis f, )
est
soumis
fJ
des
séparations
électronho-
-4
réti1ues.
Les
doses
de Ri\\,
233
(10
['101/1)
uti-
lisées
sont
voisines
de
la DI
50
( '2 , 5
x 10- 4 mol/l)
mais
inférieurs
à
la DL
1 0
[ 2
x 1 0 - 4 molill ·

---

185
A
B
Fig.
63
Action du MTX
sur les GP.
A = Te
r'''Iarquage
métabolique
B = MTX
à la
14 C-GlnH2
ACHY/SDS = 5-15~;
30
20
14
. "c
T(.
1'"\\,... llt<.l?)
.....
"'. ~
A
B
c
D
MM
X
'10 -
3
~araua7e Externe
3
au P +
H
94
A,C = Te
B,D = ITTX
67
ACRy/SDS = 5-15%
43
30
20 .,

---

186
3.4.2.
- PR~TEINES
LIBEREES.
Avant
les
sép3rations
électrophorétiques.
nous
évaluons
toujours
la
quantité
des
protéines
ex-
traites
par
la
trypsine
(LOWRY).
La
quantité
des
~rotéines
~g)
est
ramenée
au
nombre
de
cellules
(en
million).
Dans
le
cas
des
exoériences
effectuées
avec
le
RA
233.
la
quantité
de
protéines
extraite
par
la
trypsine
est
3
à
4 fois
supp.rieure
dans
les
trypsinats
de
cellules
traitées
Que
dans
les
trypsinats
de
cellules
té-
moins.
Ces
déterminations
effectuées
sur
6 exoé-
riences
sont
rÉsumÉes
dans
le
tableau
ci-dessous
---
Protéines
'?n
~g/10
CELLULES
_- \\' ::J
1
EXP.
2
EXP.
3
EXP.
4
EXP.
5
EXP,
6
. , ; -
f e
~ , 31
2. S 6
1 .46
0,93
1 , 1 3
1 .46
:;: , (1
+
'10,
-, . 5
S • ~ 6
7. 42
2.88
3.28
1 .59
- - -
~ig.64 - fABl.EAU UE VARIATION DES PRO
,
TEIUES APRES
l~AITEMENT PAR LE RA ET TRYPSINATIDN.

---

18 7
3.4.3.
-
SEPARATION
EN ACRY!SDS.
Après
des
dépôts
équivalents
en
protéines
[150
~g)
dans
les
témoins
et
les
traités,
les
trypsinats
sont
soumis
à
une
séparation monodimensionnelle
en
ACRY!SDS.
La
coloration
par
le
BC
révèle
un
profil
bien
particulier.
En
effet,
comparativement
aux
témoins,
les
cellules
traitées
au
RA
233
présentent
dans
leur profil,
une
augmentation
générale
des
produits
de
faible
~.M.
<40000 daltons.
Parallèlement,
on
assiste
à
une
variation
quanti-
tative
[en
intensité
de
coloration)
de
certains
constituants
de
M.M.
voisine
de
70000
daltons.
1
[ F i g . 6 4 ) .
3.4.4.
-
SEPARATION
BIDIMENSIONNELLE.
Après
focalisation
en
tube
[I.E.F.),
les
trypsinats
témoins
et
traités]
sont
soumis
~
une
seconde
sépa-
ration
e~ ACRY!SDS.
La
carte
bidi~ensionnelle [BC]
établit,
accentue
et
précise
les
différences
déjô
observées
entre
témoins
et
traités.
Les
différences
apprpciables
portent
sur
les
pHi
des
3
taches
majeures
Gue
nous
avons
Qualifiées
de
1
[oHi
=
6,7
-
6,8,
M.M.
6ôOQO],
1
M
[pHi
=
7,1,
M.M.
5601JO)
et
P1
[p~i
=
6,1
-
6,7,
1
M.M.
47QOn]
[cf.
Profil
Bidimensionnel
du
trypsinat
de
L1210)
En
effet,
ce5
taches
qui
apparaissent
bien
nettes
dans
les
témoins,
exhibent
des
taches
supplémentai-
res
adiacentes,
rie
~ême M.M.
mais
de
pHi
légère~ent
différents
[Fig. 65).

---

188
a
b
67
60
36
18
Fi<:1~.
64'
L 1210 + RA
SEPARATION en ACRY/SDS
Coloration ~ar le BoC.
A =
Te
B = RA

---

188 bis
,dJJJ
,.w.r'
fi..
r'
Il
•
\\ft.
'.
~'I'
•
'.40 , -
sos
, IEF li!>
'-
Fip:.
65
SEP IÜtATIO~J BID IIVlENSIONNELLE
après action du RA 233

---

189
La
superposition des
profils
bidimensionnels
BC
3
3
et
N + G +
H (cf.
BIDl
L1210
-
N + G +
H),
ré-
vèle que
les modifications
observées,
portent
sur des
constituants majeures
qui
sont de
nature
glycoprotéinique.
En
effet,
la
tache
1
correspond
1
à
la GP
1
(pHi
= 6,7 -
6,8,
M.M.
76000),
~1
à
la
1
GP M
(pHi
=
7 -
7,1,
~.~.
60000)
et
P
à
la GP
1
1
P
(pHi
=
6,1
-
6,7,
"1.M.
45000).
4
Ce
phénomène
semble être
général
puisque de
nom-
breuses
taches
sur
le
profil
traité
sont
dédoublées
mais
de façon
moins
précise.

---

189
La
superposition
des
profils
oidimensionnels
BC
3
3
et
N + G +
H (cf.
BIDI
L1210
-
N +
G +
H),
ré-
vèle
que
les modifications
observées,
portent
sur
des
constituants majeures
qui
sont
de
nature
glycoprotéinique.
En
effet,
la
tache
1
correspond
1
à
la
GP
1
(pHi
=
6,7
-
6,8,
M.M.
76000),
i'1
à
la
1
1
GP M
(pHi
=
7 -
7,1,
1'1.i'1.
60000)
et
P
à
la GP
1
1
P
(pHi
=
6,1
-
6,7,1111.1'1.45000).
4
Ce
phénomène semble
être
général
puisque
de
nom-
breuses
taches
sur
le
profil
traité
sont
dédoublées
mais
de
façon
moins
précise.

---

190
IV
-
DIFFERENCIATION ET
K562.
4.1.
-
INTRODUCTION.
Les
érythroleucémies
sont
utilisées
dans
de
nombreux
travaux
comme moyen
d'étude
des
mécanismes
de
contrô-
le de
la différenciation
cellulaire
La
lignée K562,
obtenue à
partir du
liquide pleural
d'un
patient
atteint
d'une
leucémie myelofde
chro-
nique
en crise blastique
( 123)
a été décrite
comme
un
stade précoce de
différenciation
de
la
l i -
gnée
granuloytaire
(104).
"1ais
À
la
suite des
travaux
de .t\\NDERSSON
(
9
)
et
RUTHERFORD
( 160 ),
elle
s'est
révélée
être une
lignée
érythroleucémique.
En
particulier,
ces
cellules
con-
tiennent
dans
leur membrane de
la
glycophorine et
de
la
srectrine
( 9 5 ) .
De
plus,
en
présence d'agents
différenciants
comme
l'Hémine et
le
Butyrate,
elles
synthétisent
de
l'hé-
moglobine de
type
embryonnaire et
foetale
(5).
Alors
qu~
ce modèle de différenciation
est
utilisé
comme
un moyen
d'étude de
la
régularisation
de
la
biosynthp.se de
l'hémoglobine,
aucune
recherche
n'a
été entreprise sur
l'incidence au
niveau
des
glyco-
protéines membranaires
d'un
tel
processus de
diffé-
renciation.
Nous
avons
donc essayé dans
ce
travail
préliminaire
de
:
-
déterminer
les
conditions
ootimales
d' inid'Jction
de
la
synthèse d'hémoglobine par
l'hémine pour
la
lignée
K562 dont
nous
disposons.
Nous
suivons
la
synthèse d'hémoglobine
par spectrophotométrie qua-
litative
et
quantitative.

---

1 9 1
-
Suivre
le
profil
des
~lycoprotéines de membrane au
cours
de
l'induction
en
présence de
différentes
doses
d'hémine.
Ce
profil
est
établi après
marqua-
3
3
ge externe
(N+G+
H /
G+
H)
et
séparation
par élec-
trophorèse
en ACRY/SDS.
4.2.
-
INDUCTION DE
LA
SYNTHESE D'HE~OGLOBINE EN
PRESENCE D'HEMINE.
4.2.1.
-
CULTURE CELLULAIRE.
Les
cellules
K562
sont
~aintenues en
culture
dans
le ~ilieu de
EAGLE DULBECC~
comme
il
B
été
déj~ décrit
[cf.
Matériels,
~éthodes, ~éthodologies).
Pour
l'étude
de
l'induction
d'hémoglobine,
les
cellules
sont
récoltées
en
phase
de
croissance
exp 0 n e n t ie l 1 Ret
a jus t é e s
à
une
con c e n t rat ion
d e
4
5 x 10
cellules/ml
dans
du milieu
neuf additionné
de
l'agent
inducteur
en
l'occurence
l 'hemine.
(Type I,
BOVINE SIGI'1A).
La
solution d'hémine
est
préparée
selon
la
mé-
thode de RUTHERFORD
1 6 1 )
13 mg d'hpmine
sont
dissouts
dans
0,2 ~l de
NaOH
0,5
M et
0,5
ml
de
Tris
(pH
7,81
0,5
M qu'on ajuste
à
un
volume
final
de 5 ml
avec de
l'eau
distillée.
Pour
l'induction,
l'hémine
est
utilisée à
une
concentration
finale
de 12,5
~~ ou
50 ~~.
4.2.2.
-
CONTENU
EN HEMOGLOBINE.
Après
la
culture
en
présence d'hémine,
les
cellules
sont
récoltées
par centrifugation
à
faible
vitesse,
et
lavées
3 fois
par du
PBS
(pH
7,21
froid.

---

192
Le
culot
cellulaire
est
remis
en
suspension dans
de
l'eau distillée
à
une
concentration finale
de
6
5 'x 1 0
cel luI es lm l .
Après
15 minutes
dans
la
glace,
le
lysat
cellu-
laire
est
centrifugé
(5000rpm,
15 minutes)
et
le
surnageant
est
filtré
(filtre millipore
O,22p).
La
présence d . hémoglobine
dans
le
surnageant
est
déterminée
par
l'établissement
du
spectre
d'absorption
dans
le
visible
( 160 J.
4.2.3.
- .RESULTATS.
Nous
avons
confirmé
la
présence d'hémoglobine
par
l'identification d'une absorption maximum
à
415,
540,
576 nm,
absorption
qui
varie
à
417,
537
et
568
nm après
traitement
par
l'oxy-
de de
carEJone.
(Fig. 66).
Toujours
par la même
technique,
et
à
415
nm,
nous
avons
q~antifié
la
synthèse d'hémoglo-
bine
pendant
4 jours
(cf.
Fig.
67
A
).
Alors
que
les
cellules
traitées
par
l'hémine
( 1 2, 5
M)
ont
un
taux
d'hémoglobine
qui varie
de 1,8 pg/cellule
('!jour de
culture)
à
4,5
pgl
cellule
(4jours),
les
cellules
témoins
ont
un
taux d'hémoglobine
qui
est
inférieur à
1
pgl
cellule.
Ces
résultats
qui
confirment
l'induction de
la
synthèse d'hémoglobine
par
l'hémine
sont
en
parfait
accord
avec
ceux de DEAN et
Coll. ( 38).
En effet,
ces
derniers
ont montré
une accumu-
lation d'hémoglobine
dans
les
K562
en
présence
d'hémine 10
~M,
20~M et 30pM
(cf.
Fig.67B).

---

193
0.0,
. ~--'--"--'--Î
1 ~
A:ti4+Jlli! !m
l
1
B l
!1
:': . 1
J
:.
1
~.:
i
i.tm!T.
i ri:' ;-j
: :
; ;·;"1 j l
! '11
;-, l- ; 1
:
~ 1.1 l..
; . . i . i r!
~:
:: :,
J
•
-
t
1 .~ .. ; : 1" ~.:-.; ~
-~­
A
0, yhtmoglob 1n
1
1
1
.1; i':::: i ~ ~.
B Me1hemoQIOb,n
l
1
~ - - .. ,"
-,' '" +-"
._-
:
,
•
J
--
~-,-
1
C
Cyonmelhrmoglob,n
J
1
1
1
,
iï
\\
\\
\\
\\
\\
\\ ,
02
0.1
A
.:.
.
......._-
:-::~:;--~:-'-'7.,:-:-~:-::-~~--=---,"
0.0
'-:c'._
••.....,
•••-'.
••_••_.----1
700
Fig.66
- SPECTRE D'ABSORPTION DE L'HEMOGLOBINE.
A
LYSAT CELLULAIRE DE K5E2 APRES 4 JOURS
D'INDUCTION PAR L'HEMINE 12.5
~M.
8
SPECTRE DE L'HEMOGLOBINE SELON FRIEND.(
48

---

, 194
o
Hb.
P91cell.
A
5
4
:3
2
°----0_--~oTé
3
4
Tps.( joorsJ
Fig.
67 -
Détermination
quantitative
de
l'hémoglobine.
A
He
K552
+
Hémine 12.5
p-M
6
Te
K562 Têmoins
5
-'"()
...Cl
B
Selon DEAN
4
8,t
Coll.
38
)
0-
--
~
C
K562
+
He
30 ~ r1
..0
0
3
~
K562
+
He
20 p M
0
0
E
-0
K562
+
He 1 0 ~ M
Cl
2
:I:
-0
K562 Témoins
1
2
3
~
Timo ln culture (doya)
3
DO
[en 1/1000)
x
0.13
x
10
Hb
en pg/cell.
Nbre de
cell.
en fVlillion·s

---

195
4.3
-
VARIATION DES GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES
AU CQURS
DE L'INDUCTION PAR
L'HEMINE.
4.3.1.
-
EFFETS PRECOCES.
Par élsctrophorèse en ACRY/SDS.
et après
révéla-
tion
fluorographique
(Méthode-Révélation)
nous
avons
établi
le
profil des
glycoprotéines de mem-
brane aprss
1
jour d'induction
en
présence d'hé-
mine
50
f i'i.
Le
fluorogramme
(Fig.
68)
après
la
détermi-
nation des M.M ..
révèle
une
glycoprotéine majeure
(4+
Fig.
69)
fortement
marquée
après traitement
3
N+G+
H.
Cette glycoprotéine de
130000 daltons de
M.M.
est
totalement
inexistante dans
les
profils
témoins.
Par contre
les
bandes
49000.39000 et
37000.
faiblement
marquées
ou
inexistantes
après
1
jour d'induction,
sont
parfaitement mises
er.
pvi-
dence dans
les
témoins
(Fig.68,
69).
Ce
profil
électrophorétique est
confirmé
lorsq'on
établit
la
courbe de
radioactivité
après
découpage
de gel
en
section de
0.5
cm
et comptage
en
scintil-
lation
liquide
(Fig.
70).
4.3.2.
-
EFFETS
TIIRDIFS.
Le
profil
des
glycoprotéines a
été
réalisé
après
4 jours d'induction
en
présence d'hémine 12.5
~M.
Alors
que
la
production
d'hé~oglobine est maxiMale
(4.5
PIS/cell.
Fio;.67A),
la
distribution
des
glyco-
protéines
est
rigoureusement
la même
que dans
les
témoins
( Fi9' 68)
aussi
bien après marquage
3
l
N+G+
H que
G+-H.

---

19 6
~
8
C
D
le
<>.'
A
8
C
0
E
.\\
fi
ll>'il
\\!
.
j
~
~
&'
94-
-~4
.. - ""1-:
t_
i8
68 -
.; ; ,~H
ft
<fi!!!JP
.."
...
•
.....
-
CllI>
43_
..
& '-. a
1\\>
-,
-- - ~~
1:r:,~;.
3@
Il>
,jt">
,:,.\\"
- ..
30_
2UJ
_,.ffl'
'ô~
1Il 1Ml)t
Gllii
~~
~ ~1\\1
10 -3
·1
)
1
, ' ;
10 .... 3
S'""
~'_L_____~Jj
Fip-.
68
Variation des GP de K 562 au cours
de l'induction par l!hémine.
Gauche
ACRY-SDS
5-15%
Droi te
ACRY-SDS
8°1
/0:)
3
A
He'
24 Heures ( 5 Op j'i1)
N + r, +
H
3~"
B
He'
4 Jours
( 12 , 5~JY: ) : N + G +
H
C
He
4 Jours
(12 ,5~r-1) :
G
3I-{
+
3
D
Te
N + r;. +
H
,.,
E
Te
G + °11

---

1 9
3
3
M. M.
APPARENTES
~J
+
G +
H
G +
H
( x 1 0 - 3)
He 1
He4
Te4
He4
T84
+
+
+
GP
260
-
-
-
-
-
+
+
+
GP
230
-
-
-
-
-
+
+
+
GP
210
-
-
-
-
-
+
G?
190
-
-
-
-
-
+
+
+
GP 160
-
-
-
-
-
GP 130
4 +
-
-
-
-
GP 11 5
+
2 +
2 +
-
-
GP
90
+
+
+
-
-
+
+
GP
85
Cl
+
3
+
3 +
-
-
'-'
+
+
GP
78
+
+
+
-
-
+
+
GP
72
+
...
+
-
-
+
+
GP
66
+
+
+
-
-
+
+
GP
62
+
+
+
-
-
GP
53
3
+
3 +
3
+
3
+
3 +
GP
49
+
2 +
2 +
2 +
2 +
GP
44
2
+
2 +
2 +
2 +
2 +
GP
39
-
2 +
2 +
2 +
2 +
GP
37
-
2 +
2 +
2 +
2
+
1
GP
34
...
+
+
+
+
GP
29
2 +
2 +
2 +
2 +
2 +
+
+
+
+
+
GP
22,5
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
GP
21
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
GP
1 6
-
-
-
-
-
Fig.59 -
TABLEAU DES MODIFICATIONS DES GLYCnPROTEINES
DE MEMBRANE
DE LA
K562 APRES TRAITEMENT
PAR L'HEMINE
He1
K562 TRAITEES PENOANT
24 H.
He4
K562 TRAITEES PENQANT
4 JOURS.
Te4
K562 TEMOINS.

---

198
cpm
li _2
10
67.
43.
30.
r14.
__ V __ 1
'
,
, -'---------~HM )(10- 3
Fig.70 -
PROFIL RADIOACTIF DES GLYCOPROTEINES DE K562
APRES TRAITEMENT PAR L'HEMINE ET MARQUAGE EXTERNE.
*-*
K51J2
:3
+-
HFi1PJE
(1
j C' (J r)-
'"
~I "'" G "'"
H.
(4
3
1ours)
N +
G
+-
tL
@-.@
" K56? TEMOIN
3
N +-
G +
H.

---

199
4.3.3.
-
REMARQUES.
Il
est
ô
noter que
la
glycoprotéine
B5000 qui
est
vraisemblablement
le
di~ère de
la
glycophorine
A.
par comparaison avec
les
travaux de GAHMEERG
st
ANoERSJN
( 9 , 9 5 )
est
toujours
r::;résente
à
la
surface
quels
que
sOient
les
effets
étudiés
(précoces
ou
tardifs).
Dans
des
systèmes
peu
résolutifs
(gel
à
B ~o •
cf.
Fig.
6 8 )
le
glyco~rotéine 130000 daltons
qui
apparait
lors
des
effets
précoces.
pourrait
être confondue avec
la
GP
115000 alors
qu'elles
sort
nettement
distinctes
dans
Ln
gredient plus ré-
solutif
(5-15
~ par exemple).
v - APPLICATIONS CLINIQUES ~ ELECTROPHORESE
BIDIMENSIONNELLE DES
PROTEI~ES
SERIQUES
ETUOE O'UN MYELOME A IgA.
5.1.
-
I~TROOUCTION.
Après
ces
études
fondamentales.
il
nous
a
paru
inté-
ressant
d'appliquer
les
performances
des
différents
systR~es de
séparation aux
protéines
sériques.
Contrairement
à certains
ëluteurs
(124/ 125
)
qui
étudient
les
protéines
sériques
en milieu
non
déna-
turant.
nous
avons
choisi d'opérer
selon
les
techni-
ques
d'électrophorèse
déjà
décrites
(ACRY/SoS.
bidi-
mensionnelle)
;
c'est-à-dire
en
présence d'urée
10M.
SOS
0.4
~.
et
de
~ ~ercaptoéthanol 5
~o •
Ce
choix a
été motivé
par
le
fait
que
nous
désirions
mettre
en
évidence
simultanément
les
différents
com-
posants
[chaînes
lourdes
et
chaînes
légères)
d'im-
munoglobulines
de ~alades atteints
de myelome.
Nous
rapportons
ici
les
premiers
résultats
obtenus
en
illustrant
l'intérêt
de
cette technique
électro-
phorétique.
par
la
présentation
du
cas
d'un malade
atteint
d'un myelome
à
IgA
type
~ .

---

200
5.2.
-
DESCRIPTION ET PREPARATION DES
ECHANTILLONS.
5.2.1.
-
DESC,~IPTION.
-
Le
tsmoin
utilisé
est
un
mélange
de
20
sérums
provenant
de
donneurs
apparemment
sains
et
ayant
chacun
un
profil
électroDhor~tique normal.
-
Le
sérum
du
patient
étudié.
présente
une
hypsr-
gammaglobulinsmie
avec
une
bande monoclonale
importante
è
l'électrophorèse
de
zone
sur
acétate
de
céllulose.
L'immunoélectrophorèse
de
ce
sérum.
révèle
une
diminution
des
arcs
IgG.
IgM
et
des
chaines
K.
Les
arcs
des
IgA et des
chaînes
lé~ères
À sont
aug~entps et
défor~és, signant
une
oaraorotéiné-
mie
IgA
de
tvpe
,'.
( F i fi .
7 1 A ) .
1 •
5.2.2.
-
PREPARATION DES
ECHANTILLONS.
-
A,eRY /SOS.
L_ e
"p 0 0 1"
s é rio u e
t é moi n.
e t
l e s é r u m é t u d i é ,
sont
dilués
au
1/20ème dans
du
tampon
échantil-
lon
[solutir'r'
5).
Les
échantillons
sont
chauffés
2 minutes
è
100 0
C
et
des
[Jépôts
de
10
et
20
~
sont
effectués
dans
les
Duits.
-
ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE.
Les
sérums
sont
dilués
au
1/2Dème dans
le
tampon
é cha n t i l Ion
(s (] lut i il n
K!
8 t
des
dép Ô t s
de
30
fI
sont
éf~ectués dans
la
1?re ~imension (I.E.F.
tube)
Pour
la
1ère dimension.
nous
avons
utilisé
2 gammes
d'al";lpholir,8s
-
un
mélan~8 oH 3,5
-
10
+
pH
5
-
10.
-
une
gamme
olus
large
pH
3,5
-
10.

---

,."
201
5 . 3 . - RESULTATS.
5 . 3 . 1.
-
1; CRY /S DS
(7, 5
-
1 6
S).
L'électrophorèse monodimensionnelle
en
gradient
d'ACRY/SOS,
fait
apparaitre
dans
l'échantillon
myelomateux
deux
bandes
nettement
accentuées
après
coloration
au
BC
(Fig.
7 1 8 ) .
Les
masses
molécu-
laires
apparentes
de
ces
deux
protéines,
sont
res-
oectivement
de
61000
et
24008.
Ces
bandes
accentuées
correspondent
donc
vraisemblablement
aux
chaînes
lourdes
(~.~. 63000) des IgA,
et
aux
chaînes
lé-
gères
(~.M. 22000).
5.3.2.
-
BIDIMENSIONNELLE.
Après
révélation
(au
BC),
la
carte
électrophoré-
tique
du
sérum
témoin
(Fig;.
72
est
en
accord
avec
celle
obtenue
par ANDERSON
et
ANDERSON
7
dans
leur
étude
bidimensionnelle
des
protéines
plasmatiques.
L'analyse
du
sérum myelomateux,
révèle
dans
la
zone
des
chaînes
lourdes,
une
série de
taches
for-
tement
colorées,
ayant
la
même M.M.
apparente
(M.M.
61000)
mais
des
oHi
variant
de
5,6
i'J
6,2
(Fig. 73
).
Les
résultats
indiqués
dans
la
Fig
74
confirment
cette
hétérogénéité
des
chaînes ~
L'utilisation
d'un
gradient
de
pH
élargi
(3,5
-
10)
vers
les
zones
alcalines
permet
de
visualiser
une
tache
importante
au
niveau
des
chaînes
légères
(M.M.
24080)
avec
un
pHi
supérieur ou
égal
à
8,5.

---

19G
T
A
igA
M
19M
:T
k
M
~
T
T
M
- 9467
B
..-. 43
30
!ef! .. ".
__ ~
..
---_.~
-- 20
Fig,
71
A
I~1UNOELECTROPHORESE
T = Témoin sain
M = Malade
B
ACRY - SDS
7,5-10 0 1
70
T = Témoin
M = I\\lalade

---

203
ie[
a
b
\\
sd s
94
-="
67
43
,.-
..
-
30
~"""'d·.E
....,..~ ..~
.-
20
---::
-
serum
')
_Acldk
80,000
83.000
".000
.41.000
plasma
4:2.000
~e Ion
Ande rson
(7 )
.
.
1" UCIIl'(J4ol.l1r1
23.000
..
8'g)~O
~~
•
0
~ M.I."OCIClII••'<IloI.I.
17,000
o
0
01
C>
13.000
' - - - - - - - - - - - - - _
__
.. _-_ ....
....
Fiq.
72
Electrophorèse Bidimensionnelle
..J

---

204
ief
~
sds
l'
~
4 4
'"
;.06" .
serum
myelomateux
1
1
1
1
Fic.
73
clectrophorèse Bidlmensionnelle
1
1ère D
:
N,1PHOL1NF:! :
PH
3,5-10
1

---

205
5 • 4 - REM AR QUE S •
L ' e x a men
de
plu sie urs
f ra ct ion n e nit s
é l e c t r 0 p h 0 r é -
tiques a
confirmé
que
les
chaînes
lourdes
apparais-
sent
sous
forme
de taches multiples.
démontrant
ainsi
l<hétérogénéité des
chaînes ~ des protéines
monoclonales.
Cette
hRtérogénéité
ne
peut
pas
être
révélée par
les autres mAthodes
électrophorétiques.
et
elle
ne
porte que
sur
la
charge des molécules.
Il
est
vraisemblable que ceci
est
dO
è
une différen-
ce
de
sialylation
des
copules
glycanniques
comme
cela a
déjà
été
évoquA
pour
d'autres
problèmes (124,125,
133, 62)
Pour confirmer cette différence
de
sialylation,
nous
avons
entrepris
une
série d'expé
iences dont
voici
les
tout
premiers
résultats.
Après
traitement
du
séru~ myelom
la
neu-
raminidase
(12,5
U/24
heures),
l
multiples
apparues
dans
la
région
des
chaînes ~ changent de
conformation.
En
effet,
le
nombr
de taches
se
réduit,
et
elles
semblent
se
regrouper
e~ une tache unique.
(Fig.74).
1
Des
études
plus
fines
sont
en
co~rs sur diverses
paraprotéinémies et
paraprotéinu~ies. pour savoir
si
cette
hétérogénéité de
taches Iréflêts rêsllement
une
hétérogénéité
des
fractions
"monoclonales".
Dans
ce cas,
il
est
vraisemblable que
cette
hétéro-
généité proviendrait
des
chaînes
glycanniques.

---

205 Bis
te·
\\1
'. ~ '.
.. ,
--.. -i
ri
""
,.......
••
•
,.
..,.
.
(
Fi;-r.
74
Electrophorèse Bidimensionnelle
après trai temen t Dar la T'Jeurqminidase

---

QUATRIEME PARTIE
DISCUSSION -
INTERPRETATION

---

206
1 -
TECHNIQUES-METHODOLOGIES.
1.1.
-
TRYPSINATION.
Aborder
l'étude
des
glycoprotéines
de membrane
par
une
digestion
trypsique
douce
à
4°
C représente
une
approche
séduisante.
car
les
cellules
restent
viables(34)
En
fait,
c'est
une
technique
qui
quant
à
sa
réali-
sation
pose
beaucoup de
problèmes.
Elle
nécessite
d'pnorme
quantité
de
cellules
au
départ
(100
à
6
600
x 10
cellules),
avec
un
rendement
en
protéines
6
~g/10
cellules)
faible
et
très
aléatoire.
Ouand
on observe
le
tableau de
la Fig.
7 5
,
aucune
corrélation
n'est
possible
d'une
exoérience
~
l'au-
tre,
entre
le
nombre de
cellules
et
la
quantité
de
protpine
extraite
par
la
trypsine.
Les mêmes
condi-
tions
d'extraction
étant
respectées,
les
quantités
de
protéines
e~traites varient
pnormément d'une
ex-
périence à
l'autre.
Du
tableau
de
la
Fi~. 75
si on
exclut
les
valeurs
supérieures
à
10
tJg/106 cellules(dues
certainement
à
des
contaminants
intracellulaires)
il
n'en
est
pas
moins
vr3i
que
le
rendement
en
protéines
est
tr~s faible.
Ce rendement
très
faible
semble être
inérant
à
la
technique,
quand on
se
réfère
aux
résultats
obtenus
par CODINGTON et
JENLOZ
3 2
34
).
A partir de
9
10
cellules,
par
la même
technique
appliquée à
des
cellules
cancéreuses vivantes
d'ascite TA3-Ha,
ils
obtiennent
des
rendements
qui
varient
de 1,3 à
6
2,6
tJf;/10
ceilules.
On
voit
donc
toute
la
difficulté
qu'il
y a
à
carac-
tériser
les
résidus
glycônniques,
quand on
pense
~
la
composition
de
la membrane où
on retrouve
environ

---

207
CELLULES
PROTEINES
TOTALES
PROTEINES ~g/MILLION
( x 1 0
6 )
APRES
TRYPSINATo
DE
CELLULES
(
tJ- g )
300
1 6 B
0,56
150
260
1 , 73
600
6900
11, 50
400
702
1 , 75
420
1 B9 0
4,50
3BO
50D
1 , 31
200
B77 , 5
4,38
44
2100
47,72
400
960
2,40
152
243
1 , 59
180
725
4,02
200
420
2,10
20D
:28
2,64
200
576
2,88
44
11 :3 0
25,68
55
3280
59,63
86
840
9 ,76
86
300
3,48
100
645
6,45
100
225
2,25
60
445,3
7,42
150
219 ,6
1 , 46
1
350
1008,6
2,88
250
233,7
0,93
400
7540
1 q , 9 7
450
8 9 70
19 ,93
Fig.75
-
TABLEAU
DE
LA
QUANTITE
DE
PROTEINES
EXTRAITES
DES
MEMBRANES
DE
L1210
APRES TRYPSINATION.

---

208
52
~ de orotéines,
40
~ de
lipides
et
8
~ de sucres.
Dans
les
8
~ de sucres,
7
~ sont
liés
à
des
lipides
(glycolipide),
et
il
ne
reste
qu'1
~
qui
entre
dans
la
composition
des
glycoprotéines (115).
De surcroît
GAH!"IBERG
(53
a montré
qu'après
tryp-
sination
des
erythrocytes,
plus
de
50
~ de glyco-
protéines demeuraient
attachées
à
la membrane.
Il
émet
donc
l'hypothèse
que
la
partie
protéique de
certaines
glycoprotéines.
est
profondément
ancrée
dans
la membrane,
et
se trouve ainsi
protégée
par
les
résidus
glycanniques
de
l'action
des
enzymes.
En
fait,
par cette méthode
que
nous avons
utilisée
au
début.
nous
n'avons
qu'une
vue
partielle
de
l'en-
semble des
glycoprotéines
de membrane.
Après
trypsination
nous
n'analysons
donc
par
élec-
trophorèse
que
des
glyconrotéines
ou
fragments
de
glycoprot~ines ~tryosino sensibles~.
1.2.
-
MlI,ROUAGE r<JETABOLIQUE.
Pour révéler
(aorès
~lectrophorèse et autoradio-
graphie)
les
glycoprotéines
dans
la
fraction
"tryp-
sino
sensibles".
nous
avons
utilisé
l'incorporation
dans
les
glycoorotéines
de
2 précurseurs
radiomar-
qués
la
glucosamine
et
le
fucose.
La
glucosamine
et
le
fucose
ont
été
choisis
parce-
qu'ils
sont
2 constituants
des
glycoprotéines
qui
ne
se
situent
pas
au même
endroit.
La
glUcosamine
est
à
la
fois
un
précurseur de
la
N-acétyl-glucosamine qui
s'incorpore dans
le
corps
de
la molécule,
et
de
l'acide
sialique qui
consti-
tue
avec
le
fucose
les
2 seules
extré~ités en
prin-
cipe
possibles
des
glycoprotéines
[
114
).

---

209
l-ASCORBATE
-21 H 11
.. H101
l-xylulose
0
NAD
l-gulonate
NAUH t
l
l~ INOSITOL
~
COl
NADPH
xylitol
o
NADPt
D-gluc~ronate ~ UDP-1()-sa,acturonate
ATP
I!
NAD
UDP-L-iduronate
PENTOSES---.... D-pentose-5-P
/
,~
o-glucuronale-I-P ~
NAD
NADP r
~ COl
o-GALACTOSE
UDP-u-glucuronate
+l Z
t
6-P-gluconate
NAD{P)ç...C0
W
2
ATP / "
1
ATP
UDP-o-xylose - -
• ~
7
t/,o
a-D-galactose-I-P ~ UDP(a)-o-galactose
2NAD
g:
K
o-GLU.5.0NATE
NAOPt
1
8
/-2IHI
NAD
~
Il-D-GLUCOSE
Il-D-glucopyranose-6-P
Cl
1
ATP
t
-. :
•
1
gl
IP
UTP
ô
'-D-GL\\C~::'H
~D-g ",Dpy"",~·6-P ~ o-~ r\\~
u DP~)~gl",D~
~
\\
An'
• ADP-ta)-D-glucose - - - - - + i ~
SOR nnOL
dTTP
dTDP-(a)-D-glucose
t3
(0
dTDP~4-keto-6-
g
D-mannoseZATP
D-MANNOSE
/1'1)
/
------...
deoxy-o-glucose a
"
o-FRUCTOSE
AT!' • D-fruct0se-6-P •
D-mannose-I-P
tNAO(PJH
<
l
\\ATP
ATP
~ ~Ulamine ~GTP dTDP-l-rhamnose'
§
\\
NAn~ N~
~ GDP-o-mannose
~
D-fructose-I-Pt
n-fructose- 1,6-diP mannitol-P' n-o-glucosamine-6-P
t
::;
J
t
l
GDP-J-ketofucose
22
.celyl CoA
1
MANNITOL
~NAD(P)H
0
o-glyceral- ATP
u-glyceral-
N-acetylclucos-
GDP-l-f:Jcose
~
dehyde
=-- dehyde-J-P
amine-6-P
UDP-N-acetylmuramic acid'
/
J
8
ATP
t
f P-<:nolp)'ru'.'e
,
N-acctylglucos- ~ UDP-N-acetyl-o-
:J
dlhydroxyacetone-P...
amine-I-P
glucosamme
0
~DP-~etYI-
~ ~
D-GLUCOSAMIr-:E
1 o-galactosamine
CIl
N-acetyl-D-mannosamine-6-P
8
NADH
~ P-enolpyru\\oa(('
~
N-acet)'lneurarninic (sialic) acid-9-P
Cl
H,Q ~
crI'
CMP-N-acetyl
sialic aci<l ~ neuraminic acid
GLYCEROL~ a-glycerol-P _.-----------..;CT:;.:,.:P-------
.. CDP-gl~,cerol
Fig.76
INTERCONVERSION
DES
SUCRES

---

210
L'incorporation
de
cette osamine
rend
ainsi
compte
de
la
synthRse
globale
des
glycoprotéines
et
aussi,
mais
à
un
degré
moindre des
glycolipides.
Il
faut
signaler que
le
glucose
serait même
préférable
dans
ce
sens,
malheureusement
au
contraire de
la
glucosamine,
il
se
retrouve
dans
de
nombreux
autres
constituants
cellulaires
(Fig.76).
Le L-fucose
est
incorporé
non
métabolisé
(94)
comme
sucre
ter~in~l des
glvcorrot~ines et des
glycolipides
(113,189).
De
façon
~énéral~, l'interpr~tation et
le
calcul
des ~.M.
des
glycoprot~ines Htrvosin~ sensibles"
après
électrophorèse
(ACRY/SDS),
posent
des
problè-
mes.
La
révélation
après marquage
à
la
GLcNH
donne
2
des
trainées
radioactives
difficilement
interpré
tables
(Fig. 77
).
La
qualité
des
s~parations électrophorétiques
n'est
pas
en
cause,
puisque
les
profils
"BC" montrent
des
séparations
parfaites.
Cette
observation
soulève
deux
questions
-
La
fraction
"trvosino
sensibles"
est-elle
conta-
minée
par des
protéines
du SVF
ayant
fixée
de
la
radioactivité?
-
Existe-t-il
une
radioactivité
aâsorbée
sur
les
membranes
?
En
effet,
tant
pour
le
fucose
que
pour
la gluco-
samine,
les
travaux de CARPENTIER
(25)
ont
démontré
qu'une
certaine
radioactivit 6
6tait adsorbée
sur
les
protéines
du SVF
en
présence ou
en
l'absence
de cellules.
Cette adsorotion
a d'ailleurs
été
décrite
par
KASPAR
et
KALTENBACH
( 98
).
Cette
adsorption
sur
les
protéines
du
SVF,
n'explique
pas
à
elle
seule,
cette
trainée
qu'on
observe sur
les
autoradiogrammes.
car
les
cellules
sont
exhaus-
tivement
lavées
pendant
les
étapes
de
trypsination.

---

2 11
A
B
-C
0
94
67
43
30
20
14
MM x
10 - 3
Fi~. 77 : Trypsinat ~e L 1210
aprôs maraua~e mêtaboli~ue
A,C = 14C - GlnH 2
14
P,D =
C - fucose

---

,
212
De
plus,
on n'observe
ce
ph~r.omène qu'avec
la gluco-
samine.
En
fait,
l'explication
la
plus
satisfai-
sante serait
l'existence d'une adsorption
de
radio-
activit~ directement
sur
les membranes.
En effet,
il
ne faut
pas
écarter
la
possibilité
d'une
liaison
de
glucosamine
éventuellement
poly-
mérisée avec
les membranes
cellulaires
comme
l'ont
décrit
TERRY
et
ZUPNIK
184
J.
Dans
ce cas,
un
grand
nombre
de
cellules
présent
dans
le milieu,
pourrait
entrainer
une
quantité
plus
importante de
glucosamine
liée à
la membrane.
En
fait,
dans
une
telle
voie
d'approche des
glyco-
protéines,
le
fucose
serait
le marqueur
de choix
puisqu'il
est
incorporé
no~ métabolisé,
et
il
pré-
sente
un
flux
métabolique constant
(25J.
Mais
hélas,
il
se
trouve
être
un
sucre
terminal
sur
les
chaînes
glycanniques,
mais
de
façon
inconstante.
La
f.ai-
blEsse
du
marquage
qu'on observe
avec
le fucose
contrairement
à
la
glucosamine,
Dourrait
s'expliquer
par
une
augmentation
de
la
taille
de
la
fraction
glycannique.
Cette augmentation
pourrait-être due,
soit
à
des
chaînes
glycanniques
de
plus
grande
longueur,
soit
~
des
chaînes
plus
ramifiées,
toutes
les
ramifications
n'étant
pas
nécessairement
ter-
minées.
( 103
).
Cette epproche
des
glycoprotéines
de membrane,
souf-
fre
de
plusieurs
faiblesses
-
Faiblesse due
à
la
tec~nique de trypsination qui
nécessite
un
grand
nombre
de
cellules,
et
qui
n'est
pas
constante d'une
expérience
à
l'eutre.
-
Faiblesse due aussi
au
cAoix
du
traceur
radioac-
t i f ,
dont
l'utilisation
nécessite
beaucoup
ce
précautions
pour éviter des
artéfacts
dûs
essen-
tiellement
à
des
~hénomènes d'adsorption
et
de
contamination.

---

213
Et
par
cette méthode.
nous
n'étudions
par électro-
phorèse que Des
glycoprotéines
~trypsin 0
sensibles~.
Nous
n'avons
donc qu'une
vue
partielle
de
l'ensemble
des
glycoprct~ines De membrane.
Nous
avons
donc
recherché d'autres ~éthodes d'ap-
proche qui
nous
donneraient
une
vue
globale.
notqm-
ment
les ffiéthodes
de marquage ~
la
galactose
oxydase.
1.3.
-
MARC)U,l'lGE
EX1ERNE.
Par cette rrétrode.
nous
avons
abordé
l'étude
des
glycoorotéines de membrane.
sous
un
autre
angle.
Par ce biais.
nous
analysons
la
structure profonde
et
totale
des
glycoprotéines
puisque
les
glycann85
sont marqués
in
situ.
et
les
glycoprotéines
sont
li-
bérées
dans
le milieu
par
lyse
cellulaire.
Cette mnthode
à
la galactose oxydase
est
largement
utilisée dans
l'étude
des
molécules
de
surface de
différents
types
cellulaire5
(8) 174) 58).
Cette méthode
est
spécifique de
la
surface cellulaire.
puisque
la
galactose oxydase qui
a
une M.M.
de
75000
daltons.
apparemment
ne
traverse
pas
la membrane
olasmique des
cellules vivantes
( 57).
Ouand
elle
est associée
à
un
~r~tr'aitement par
la
neura-
minidase.
les résidus
galactosyls
liés
à
de5
restes
sialyls
sont
aisément ~is
en
évidence.
~ais néammoins.
comme
nous
le verrons
plus
bas
(Discussion Résultatsl.
le fait
de
retirer
l'acide
sialique
peut entrainer des
modifications
comme
le souligne i'lNDERSSfJN
( 8).
Cela
peut
af~8cter ~'organisation des ~lycoprotéin~5 ~ l~
surface cellulaire.
et
se
traduire
nar
la
réduction
des mobilit6s
électroDhor~tiques.
Sans
traitement
par
la neuraminidase.
les
glycoprotéi-
nes
sont
en
général
très
feiblement
marquées.

---

2 14
Cette observation
indique
dans
les
sD~ches cellulai-
res
que
nous
avens
étudiées,
que
la ~ajorité des
gly-
coprotéines
marquées,
contiennent
dans
leur
etruc-
ture
en
avant
dernière
position,
dee
r~sidus galac-
tosyls/N acetyl
galactosaminyls
liés
3 des
acides
sialiques
terminaux.
En
l'absence
de
galactose
oxydase,
et
en
présence
De ooronydure
t r i t i é
seul,
une
certaine quantité de
radioactivité
était
incorporée
dars
les
protéines
57
531-__ 54
).
1
Nous
avons
retrouvé
ce merqua~e asopcifique dans
les
2 souches
cellulaires
étudiées.
Sur
la
L121D
le
marquage
porte sur
des
fractions
48000
et
45000 daltons
chez
la
K552
cette
iGcorooration
aspécifique
a
lieu
dans
les
fractions
51000 et
44000.
ANDERSS~~ et
GAHMBERG
o , 5 8
cnt
d'ail-
leurs
retrouvé
ce ~arquage asoécifique
sur
une frac-
tion
57~on daltons
dans
leur étude
des
r,lvcoDrotéines
de membrane
oe cellules
lvmphoIdes murines
ou
humaines.
Ils
émettent
l'hypoth~se ou'un
tel
~arquage aspéci-
fique,
serait
dû
à
la
formation
de
bases
de schiff
entre
l'aldhéhyce
et
la
fonction
amine
d'une
enzyme
conteGant
du
pyrido~al phospnate.
en
sait
par ailleurs,
que
des
enzymes
telles
l'orntthine
d~carboxylase sent
fortement
activées
dans
les
cellules
malignes
1 3 8
).
Dans
cette technique
~e ~arquage, il
est
dOGC
toujours
nécessaire
d'inclure
ur
let
de
cellules
té~oins uni-
quement
marquées
au
bcrchydrure
t r i t i é .
Nous
avone
donc acoptr
cette
techrique
de marquage,
parce
qu'~lle ~st
spécifioue des
glycoprotéines
de
sur~ace, et
elle
r.P.
nécessite
que très
peu
de
cellules
6
au
départ.
(20
è
50
x 10
cellules).

---

215
II
-
RESUL TATS.
2.1.
-
L121D.
3
3
3
2.1.1.
-
GLYCOPROTEINES
TOTALES
(N+G+
H/G+
H/P+
H).
Sur
la membrane
de
la cellule L1210,
nous
avons
mis
en
évidence
22 glycoprotéines
dont
les majeures
(86
000,
BD
000,
76
000,
54
000,
50
000,
23
000
daltons)
sont
fortement
marquées
après
traitement
:1
3
N+G+
H,
et
faiblement
révélées
après
G+
H.
Ces
résultats
démontrent
que
la majorité
des
glyco-
protéines
de
surface de
la
cellule
L1210 sont
ter-
minées par
des
résidus
sialyls
liès
à
des
restes
galactosyls
en
position pénultième.
A côté de
ces
structures coexistent des chaînes
glycannioues
à
galactosyl
terminal
puisqu'on ob-
3
serve un
léger marquage après
G+
H.
3
3
Le
traitement
par N+G+
H/G+
H révèle
l'absence de
galactosyls
libres
(terminaux)
dans
les
glycopro-
téines majeures.
En fait,
toutes
les
glycoprotRines
Mises
en
évidence
À
la
surface de
la cellule L1210,
présentent
dans
leur
structure,
de
nombreuses
chaî~
nes
glycanniques
terminées
par des
résidus
sialyls.
Cette
richesse en acide
sialique,
expliquerait
le
nombre
restreint
(six)
de
glycopro~pines mises en
évidence
par CHEN et
CANELLAKIS
( 28, 29)
sur
la membrane
de
L1210.
Ils
ont
en
effet,
utilisé
un
maroua~e
3
externe
uniquem~nt à la G+ H qui ne révèle
que
les
galactosyls
libres.
3
Par
le marquage
au
periodate
(P+
H),
qui
ne révèle
que
les
restes
sialyls
nous
avons
confirmé
la pré-
sence de glycoprotéines
riches
en
radicaux
sialyls.

---

216
3
Mais
comparativement au
marqua~e ~ la N+G+ H. les
3
M.M.
déterminées
après P+
H sont
inférieures aux
3
M.M.
calculées après
N+G+
H.
En
effet.
lorsque
3
les
cellules
sont marquées
par
la
N+G+
H.
les M.M.
calculées
vont
de 135
000
~
2~
000
daltons.
tandis
3
que
par
le P+
H.
elles
vont
de 97
000
à
19
000
daltons
( cf.
Fig.4040"').
J
Cette observation met
en
évidence
une
des
limites
3
du
marqua~e à 1\\J+G+ H. De nomhreux auteurs
3 1 ,
1 3 3 •
8
soulignent
leNcomportement anormal"
des
glycoprotéines
lors
de
leurs
séparations
en
ACRY/SDS.
En
effet.
la
désialydation
entraîne
des
modifications
dans
la
charge
totale des
glvcooro-
téines
donc
par
la même occasion
une
diminution
de
leur mobilité
électrophorétique.
Cette diminu-
tion de mobilité.
entraine
donc
des
erreurs
par
excès
lors
de
la
détermination
des
M.M.
On
voit
donc
t0ute
la
difficulté
qu'il
y a
à
déterminer
avec
précision
les M.M.
des
glvcoprotéines
après
séparation
en ACRY/SDS.
En
fait.
les M.M.
calculées
ne
représentent
que des
M.M.
apoarentes.
Les
altérations
structurales
des
glycoprotéines.
3
aorès
marquage
à
la
~+G+
H.
sont
fortement
mises
en
évidence
lorsque
les
glycoprotéines
sont
sou-
mises
à
une
électrophorèse bidimensionnelle.
En
effet.
les
glycoprotéines
qui
apparaissaient
,
,
3
sous
forme
allongee
apres
G+
H.
se
retrouvent
sous
forme
circulaire.
et
dans
des
zones
de oH
plus
basioue après
action
de
la
neuraminidase.
La
glycoprotéine
la
plus
reorésentative
de
ce
phéno-
3
mène
est
la
GP
M
(60
000)
qui
après
marquage G+
H
1
se situe dans
les
zones
oHi
6.B
-
7.1
(Fi~.4950)'
3
"'
alors
qu'après
N+G+
H.
elle se situe dans
des
zones
de
pHi
~ 7.1. Cette GP M
est
très
riche
en
rési-
1
dus
sialyls.
puisqu'elle
est
fortement
marquée après
3
N+G+
H (ACRY/SDS).
Le
traitement
I=ar
la
neurarrinidase
fer ait
don c dis par e î t r e l a m,'(roh été r 0 g é n é i t é d ' li n E
glycoprotéine
si
elle est
due
à
divers
degrés
de
sialylation.

---

217
Mc
GREGOR
et
CLEr'IETSDN
(
133
),
utilisant
la même
3
3
technique
(N+G+
H/G+
H/Bidimensionnelle)
à
propos
des
glycoprotéines
de membrane de
plaquettes
san-
guines,
ont
mis
en
évidence
des
altérations
dras-
tiques
dans
les
pHi
des
glycoprotéines
après
mar-
3
quage
N+G+
H.
Malgré ces
aléas
inérants
à
la
technique même de
marquage,
l'électrophorèse
bidimensionnelle met
en
évidence
lrhétérog~néité des
glycoprotéines
membra-
na ires
de
L1210.
En
effet,
les GP
68
000,
GP
63 000,
qui
apoaraissaient
majeures
[3+)
et
homogènes
après
ACRY/SJS,
se
répartissent
en
des
taches
bien
dis-
tinctes,
sur
le
fluorogramme
bidimensionnelle,
ayant
la même ~.M.
et
des
pHi
différents.
Cette
h~térogénéité mise
en
évidence
serait
due
à
des
dif+érences
dans
la
partie
glycannique,
ou
à
des
variations
dans
la
séquence
peptidique
des gly-
coprotéines
(133,
62
).
Cependant,
de
grandes
précautions doivent-être
prises
quant
à
l'interprétation
de
tels
résultats,
quand
on
pense
aux
effets
possibles
que
peut
avoir
3
3
la
technioue de
marouage
[N+G+
H/G+
Hl
sur
les
pHi
et
les
M.~.
des
glycoprotéines.
Contrairement
à
HOURANI
et
Coll.
79
qui
n'ont
en
évidence
que
4 glycoprotéines
(84
000,
63
000,
44
000
et
33 000)
3 la
surface de
la
L1210
Dar
les
méthodes
de
coloration
au
PAS,
nous
avons
révélé
plus d'une
vingtaine
de
glycoprotéines
~
la
surface
3
de
cette même
cellule
(ACRY /SOS+N+G+
H).
La
forte
incorporation de
radioactivité obtenue
3
après
traitement
par
la
neuraminidase
(N+G+
H)
ou
"1
par
le periodate
(P+~H) semble
indiquer que
la ma-
joritp
des
constituants membranaires
sont
de
nature
glycoDrotéinique.

---

218
Cette observation
est
un
accord
avec
les
tests
d'inhibition
d'agglutination
par
les
lectines.
En
effet,
HOURANI
(
7 9
),
JANSON et
BURGER
(
92,
9 1
)
ont
démontré
que
les
extraits membranaires
(GP)
de
L121o,
inhibent
leur agglutination
par
la
concanavaline A
l'agglutinine de germe de
blé
et
par
l'agglutinine
de
lentille
Cette variété
d'interaction
avec
les
lectines
rend
compte de
l'hétérogénéité dans
la
structure des
glycoprotéines
présentes
à
la
surface de
la membrane.
2.1.2.
-
GLYCOPROTEINES
"TRYPSINO
SENSIBLES".
Si
la
trypsine détache
de
nombreuses
fractions
pro-
téiques
(cf.
Profil
BC/ACRY/SOS),
en
fait,
très
peu
de
ces
fractions
sont
de
nature glycoprotéinique.
En
effet,
après
marquage métabolique,
nous
n'avons
mis
en
évidence
qu'une dizaine
de
glycopeptides.
Ces glycoprotéines
contiennent
toutes
de
la
gluco-
samine,
ce
qui
est
comoatible avec
la
position qu'oc-
cupe cette
osamine
dans
le
"corps"
des
glycoprotéi-
nes
(
1 3 5
).
La
fraction
"trypsino
sensibles"
regrouoe aussi
bien
des
fragments
de
hautes
~.M. (140
à
128 000)
~ue des
fragments
de
basses M.M.
(§O
000
à
28000 qaltonsl.
Mais
il
est
vraisemblable
comme
l'ont
souligné COOINGTON et
JENLOZ
( 32
) que
ces
différents
fragments
pourraient
provenir de
glyco-
protéines
de ~.M.
encore plus
élevées.
3
3
Le marquage
externe
(N+G+
H/G+
H)
du
trypsinat
recoupe
le marquage métabolique
(14 C GINH
fuc)
puisqu'
2
on
retrouve
des
glycopeptides
de 135
000,
120
000,
90000,
68000,
60000
et
30000.
Les fractions
135,
120,
60
et
3D
000
qui
sont
des
fractions
Majeures
après marouage métabolique,
sont aussi des
fractions
prédomi~antes lorsque
le
trypsinat
est marqué
par
3
la
N+G+
H.

---

219
Cette observation
laisse donc
supposer que
ces
glycoprotéines ont des
structures
glycanniques
ramifiées
et
finies
car elles
contiennent
de
la
glucosamine
N-acetyl
glucosamine,
du
fucose,
du
galactose!N-acetyl
galactosamine
et
des
acides
sia-
liques.
La
GP
GO
000,
comporte dans
sa
structure,
une
partie
peptidique
imoortante
(BC
3+),
de
la
glucosamine
(3+)
du
fucose
(2+)
et
des
restes
galactosyls
liés
3
à
des
restes
sialyls
(N+G+
H = 3+).
Le
fucose
et
l'acide
sialique
qui
sont
des
sucres
terminaux,
se
trouvent
simultanément
en
intensité
importante dans
cette GP
GO
000.
On
peut
donc
penser que
cette GP
GO
000
possède des
struc~ures glycanniques complexes très ramifiées avec
3
de
nombreyx
résidus
sialvls
(G+
H =
- ) .
Les
GP
G8
nOD
et GP
GO
000
pourrAient-être rapprochées
des
transporteurs
du ~TX
(G700J
et
G3000)
mis
en évi-
dence
par ~c CQRMICK et FREISHEIM
(132)
à
la
surface
de
la
L1211 mais
par des
techniques
différentes.
La mise
en
évidence de
radicaux
sialyls
dans
les
glycoprotéines
"tryosino
sensibles",
permet
de
noter
que
la
orésence d'acide
sialique,
n'inhibe
pas
com-
plètement
l'attaque de
la
chaine
peptidique par
la
trypsine,
comme
l'avaient
observé GOTTSCHALK et
FAZEKAS de St GROTH
(68
oour
les
~lycoprotéines
isolées
du
plasma ou
de
sécrétion.
2.2
-
K562.
3
3
2.2.1.
-
GLYCOPROTEINES TOTALES
(N+G+
H/G+
H).
3
Aprqs
marquage
externe
(N+G+
H)
les glycoorotéines
de
la
surface des
cellules
K562,
présentent
après
ACRY/SQS,
des
similitudes frappantes
avec
les
~lvco­
protéines
des
érythrocytes
normaux
(cf.
Fig. 53
).

---

220
Cette
similitude a
d'ailleurs
été décrite
par
plu-
sieurs
auteurs
(9,95).
Nous
avons
donc
retrou-
vé dans
les
deux
profils
(ACRY
= 10
6)
3 bandes
3
fortement
marquées
[N+G+
H)
avec des
~.M. approxi-
matives
de
85
000,
54
000 et
40
000 daltons.
La
bande 54 000
correspond~nt à
un
marquage aspécifi-
que,
les
bandes
85
O~O et
40
000 correspondent
res-
pectivement
au
dimère
(PAS
et
au monomère
(PAS
)
1
2
de
la
glycophorine A,
qui
est
la
glycoprotéine ma-
jeure de
l'érythrocyte
normal.
Cette dimérisation
quiest
un
caractère
spécifique
des
protéines
érythrocytaires,
a
été mise
en
évi-
dence
par MARTON et
GARVIN
[ 130
).
Le profil
des
,
G
'1
K562 apres
N+~+
H est
un
accord avec
les
résultats
de ANDERSON et
GAHMBERG
(
9
)
qui
ont mis
en
évidence
sur
la
K562,
trois
bandes ma-
jeures
avec
des M.M.
de
105,
85
et
42
000 daltons,
les
bandes
85
et
42
000
correspondant
respective-
ment
au dimère
et au monomère
de
la
~lycophorine A.
Lorsqu'on
affine
le
profil
des
glycoprotéines
par
s é par a t ion
dan sun
g rad i e n t
d' ACRY
[ 5 - 15 0J" ),
l e
fluoro 5 ramme révèle 21 bandes radiomarquées dont
les M.M.
vont
de
26CJ
à
16
000
(cf.
Fig. 53/54).
En
fait , i l
est
vraisemblable
que
ces
21
bôndes
ne
représentent
pas
des
entités
individuelles.
Certaines
d'entre
elles
seraient
le
résultat
de
diffusion
de
bandes majeures.
JOKINEN
et
GAHMBERG
( 95
) ont
d'ailleurs
noté
que
la
glycophorine A donnait
en
ACRY/SDS
une
bande
large et
diffuse.
Nous
avons
aussi
observé ce
phénomène,
puisque autour de
la
bande
85
000,
sur
le fluorogramme
existe
une
zone
diffuse où
ont
été mises
en
évidence
les
bandes
90
000,
78
000 et
72
000
qui
peuvent
être assimilées
à
des
diffusions
de
dimère
de
glycophorine A.

---

221
Ce
phéno~8ne expliquerait
la
disoarition de
la
GP
40
000 mise en
évidence
dans
un
gel
à
10
et
l'apparition des
GP
39
000
et
37
000
(monomèreJ
dans
un
gradient
5-15
~.
Lorsqu'on analyse
le fluorogramme
sur un
densi-
tomètre
performant
type
UVICON 810 ou
820
(KONTRONJ
le
profil
devient
simple
et
compatible
avec
les
résultats
de ANDERSSON et
Coll.
9
J •
En
effet,
on
retrouve
les
pics majeures
à
115
000,
85
000,
53
000,
49
000,
44
000,
(39-37
OOOJ,
et
29
000
daltons.
Les
pics
53
000
et
44
000
étant
des marquages
aspécifiques
puisqu'on
les
retrouve
en
l'absence de
tout
traitement
enzymatique.
Compte
tenu des
+ 10
~ d'erreurs
inérants
à
la
méthode de
détermination
des
~.M.
selon
WEBER
et
OSBDRN
(206),
la
GP
11J5
de ANDERSSON et
Coll.
(9 J
corresDond
vraisemblablement
à
la
GP
115
000 que
nous
avons
mise
en
évidence.
Les
glycoorotéines
mises
en
évidence
à
la
surface
de
la
K562
sont
trà.s
riches
en
acide
sialique,
puisqu'elles
ne
sont
presque pas
marquées
après
.
3
traltement
G+
H 3
l'exception
des
GP
49
000,
(39-37
OOOJ
et
2g
000,
qui
doivent
contenir
dans
leur structure
des
chaînes
glycanniques
à
galac-
tosyl
terminal,
et
des
chaînes
à
sialyl
terminal.
2.2.2.
-
GLYCDPROTEINES
»TRYPSINO
SENSIBLES».
Le marquage
externe du
trypsinat
de
K562 après
ACRY/SOS
révèle
une
trentaine de
bandes
aussi
3
3
bien marquées
après
traitement
N+G+
H que G+
H.
'f Fig.
5 7
).
Cam par a t ive men t a u
pro fil
des
le; l y c 0 -
protéi~es
totales
après
marquage
externe,
il
est
vraise~blable que
les
nombreuses
fractions
obtenues
proviennent
du
clivage
de
glycoprotéines
plus
lon-
gues
en
de
petits
fragments
Deptidiques
porteurs
de
chaînes
glycanniques

---

222
A côté
de
ces
fragments
glycoprotéiniques,
une
bande
estimée
à
72
000
daltons
domine
le
profil
électrophorétique
par
son
intensité
de
marquage
3
3
aussi
~ien après
N+G+
H que G+
H.
Cette
bande
par
son
comportement
électrophorétique
(Diffusion)
et
son marquage
intense,
correspond
vraisemblablement
au
di~ère de
la
glycophorine A.
Cette
glycophorine
exposée
à
la
surface
membranaire
peut-être
détachée
par
la
trypsine
1 27
) et
sa
M.M.
est
réduite.
3
3
Le
marquage
équivalent
aDr~s N+G+ H que G+ H pour-
rait
s'expliquer
par
le
fait
que
les fragments
glycoprotéiniques,
une
fois
détachés
de
la
membrane,
sont
moins
sujets
au
problème d'encombrement
stéri-
que.
Ce
qui
rend
les
galactosyls
libres
plus
acces-
sibles
au
marquage.
Les
GP
64
et
GP
54
ne
sont
uni-
que~ent marquées
qu'apr8s
action
de
la
neuraminidase
(Fig. 57
).
Elles
ne
contiennent
dans
leur
structure
que
des
chaînes
~lycanniques 3 sialvl terminal lié
à
un
~ésidu ~alactosyl.
3
La
GP
57
n'apparait
qu'après
traitement
G+
H et
elle
est
totalement
inexistante
apr8s
action
de
la
neura~inidase. Ce
comportement
anormal
s'exolique,
si
on
considère
que
les
acides
sialiques
ne
sont
pas
tous
sensibles
aux
neuraminidases
bactériennes
( 62 ) •
En
e~~et,
ROSEMBERG
et SCHENGRUND
157
)
ont
dé-
montré
que
les
glycoconju~ués où
la
~-acetylgalac­
tosamine
est
liée
en
position
4 à
un
galactose
qui
porte
un
acide
sialilue
en
position
3,
présentent
une
grande
résistance
à
l'action des
neuraminidases.
Ils
émettent
l'hypothèse
que
le
N-acetylgalactosa-
mine
pourrait
agir
comme
un
inhibiteur
compétitif
des
sialidases.
On
peut
donc
penser
que
la
GP
57
D c; :; 'ë ses
j -:: c,:;
:=::3
st:'"' U c t urs
d 8 S
0; l Y c ô " r; S S
à
,~ - a c s t \\1 l -
. -' - .,... =-
- - - - -
- -
- =- .

---

223
3
L'action
négative du
traitement
par
la
N+G+
H,
pourrait
s'expliquer par
l'inhibition
compétitive
due
à
la
N-acetylgalactosamine,
ou
par
la
substi-
tion
du
radical
N-acetyl
de
l'acide
sialique,
qui
entrainerait
une rRsistance
à
l'action de
la
neu-
raminidase de vibrio
cholerae.
(157
).
2.3 -
EFFECTEURS PHARMACOLOGIQUES.
2.3.1.
-
L1210
-
MTX.
A des
doses
non
létales,
le MTX
altère
les profils
électrophorétiques
de
la fraction
»trypsino
sensi-
ble»
des membranes
de
L1210.
Par
I.E.F.
et
colora-
tion
au
BC,
nous
avons mis
en évidence
la duplica-
tion
d'une
bande majeure
(bande 15
= pHi = 6,4) en
faisant
apparaître
une
nouvelle bande
(15')
avec
un
pHi
= 6,2 et parallèlement on assiste à une at-
ténuation
de
la bande 16
(pHi
= 5,9).
Par corrélation avec
le
profil
bidimensionnel
(Fig. 45
),
cette bande 15
correspond à
la
tache
P
qui
se situe dans
les
zones
de
pHi
8,1
à
6,7 et
1
de M.M.
47
000.
Cette observation devient
signifi-
cative quand
on observe
le profil
des membranes
témoins
et
traitées après ACRY/SOS.
Dans
les
tout
premiers
travaux
que
nous
avons
entrepris
35
),
nous
avons mis
en évidence
l'augmentation
nette de
2 protéines membranaires
après
traitement
par
le MTX.
Les
M.M.
de
ces
pro-
téines
ont
été estimées à
47
000 et
39
000.
Par
la
suite
la
seule modification associée de
façon
ir-
réfutable au
traitement
par
le MTX
est
l'augmenta-
tion
d'une
protéine membranaire
estimée à
53 000
daltons
apr8s
coloration
au
BC.

---

224
Le marquage
par
le
periodate
(p+3 H) qui révèle
les
résidus
sialyls
met
en
évidence
dans
le fluo-
rogramme
des
cellules
traitées,
3 glycoprotéines
supplémentaires
ayant
des
M.M.
estimées
à
105
000,
100
000
et
45
000.
Compte
tenu
de
l'approximation
(MM
~ 10 ~) de la méthode de détermination des
M.M.
selon
WEBER
et
OSBORN
(206),
les
bandes
47
000,
53
000
et
45
000
correspondent
vraisembla-
blement
à
la
même
glycoprotéine.
A côté
des
glyco-
protéines> 100
000
daltons
dont
la
présence ou
l'absence
est
souvent
variable,
les
modifications
majeures
s'opèrent
toujours
quel
que
soit
le
type
de
gradient
dans
les
zones
43
000
à
67
000
daltons
(étalons
de
M.M.).
Cette
zone
de
M.M.
prend
toute
son
importance
au
regard
des
travaux
de Mc
CORMICK
et
FREISHEIN
(132).
Ils
ont
en
effet,
mis
en
évidence
à
la
surface de
la
L1210,
3 polypeptides
capables
de
se
lier au
MTX.
Ces
polypeptides
ont
une
M.M.
estimée
à
67
000,
63
000,
56
000
et
seraient
des
sous
unités
d'une
protéine complexe
avec
une
M.~. >à 100 000 daltons.
Par ailleurs,
on
sait
que
le MJX
pénètre dans
la
cellule
par
un
phénomène
de
transport
( 67
).
Ces
modifications
observées
dans
les
profils
élec-
trophorétiques
des
Elycoprotéines
sont
à
rapprocher
des
travaux
effectués
au
sein du
laboratoire,
notam-
ment
sur
le
métabolisme
énergétique
de
la
cellule
L1210
(188,25,108).
Ces
travaux
ont
en
effet,
montré
que
le ~TX provoque
une
élévation
de
la
con-
sommation
du
~lucose, n'altère
pas
le
transport
du
glucose
et
inhibe
la
resoiration mitochondriale.
La
glycolyse
et
la modification
des
glycoprotéines
de
me~brane représentent
deux
phénomènes
qui
peuvent
être
reliés
ne
serait-ce
que,
parce
que
le
trans-
port
du
?lucose
à
l'intRrieur
de
la
cellule
est
as-
suré
par
un
transporteur
qui
n'est
autre
qu'une
glycoorotéine.

---

225
Un
autre
lien
a
été montré
par SHIU
et
Coll.
( 168 1
qui
ont
observé dans
des
fibroblastes
d'embryon
de
poulet
transformés
par
le
virus
du
sarcome de ROUS
(RSV1.
l'augmentation
de
2 protéines membranaires
parallèlement
à
la
consommation
du
glucose.
En
fait.
l'augmentation de
ces
protéines
n'est
pas
une
con-
séquence de
la
transformation mais
est
consécutive
à
la
chute
rapide
de
la
concentration de
glucose
dans
le milieu
de
culture.
On
peut
relier aussi
cette modification
des
~lycoprotéines à
l'action
inhibitrice du
MTX
sur
la
respiration mitochondriale
car de
nombreuses
relations
ont
été démontrées
entre
l'intensité du
métabolisme aérobie ou
le fonctionne-
ment
ries
mitochondries
et
les
constituants
de mem-
brane des
cellules
transformées
(210).
Cette apparition
de glycoprotéines.
mise
en
évidence
aprRs
séparations
électrophorétiques
est
certes qua-
litative.
mais
néanmoins
elle est
en accords
avec
les
trôvaux
de CARPENTIER
25
1 sur
le métabolisme
des
glycoprotéines.
En
effet,
ces
travaux ont
montré
qu'en
présence de
MTX,
l'incorporation de
~lucosamine et
de fucose
radiomarqués
dans
les macromolécules
intracellulaires
par
l'acide
phosphotungstique
(indice
de
biosynthèse des
glycoorotéines).
est
augmentée.
D'autres
approches
de
l'influence d'antimitotiques
en
général
et
du MTX
en particulier,
sur
la membrane
plasmique ont
été
rapportées.
HWANG
et SARTORELLI
84
ont
décrit
une augmentation
du
taux d'ag-
glutination.
induit
par des
lectines
de cellules de
sarcone 1AO
par
60
~mol/l de MTX
pendant
2 heures.
HOFFMANN
et
Coll.
77
ont
observé
par microscooie
électronique
~
balaya~e. une oerte de microvillosités
B
6 heures
après
l'administration de
5 x 10-
molll
de
MTX
à
des
lymphocytes
stimulés
par
la
phytohémag-
glutinine.

---

226
Toutes
ces
observations
renforcent
l'idée que
les
modifications membranaires
que
nou,
avons
obtenues
en
présence de MTX
ne
sont
point artéfactuales.
Mais
néanmoins
pour correler plus
étroitement
les
profils
MTX
et
Témoins,
il
serait
judicieux de
disposer
d'un
témoin
lui aussi
en
phase S
témoin
bloqup
en phase S par un
procédé
non
chimique),
car
le MTX bloque
les
cellules
en
phase S et
l'on
sait
que
les
structures membranaires
varient
au
cours
du
cycle
cellulôire
(61)
2.3.2.
-
L121D
-
~A.
Par électrophorèse et après
action
du RA
233,
nous
avons mis
en
évidence des modifications
profondes
entre
le
profil
des
protéines membranaires
des
cel-
lules
témoins
et
des
cellules
traitées.
Contrairement
au MTX,
le RA
233 semble affecter
les
protéines membranaires
d'une
façon
générale et
non
ponctuelle.
En
effet,
les
séparatio~ en ACRY!SDS
après
coloration au
BC
révèle
une
intensification
générale des
bandes
de
faible
M.M.
Ces modifications
entre
cellules
témoins
et
traitées
sont
accentuées
quand
les
protéines membranaires
sont
séparées
par
électrophorèse bidimensionnelle.
En
effet,
la
carte
bidimensionnelle des
cellules
traitées.
exhibe des
taches
dédoublées
à
la
place
des
constituants ma-
jeures
(GP
1
,
GP
M ,
GP
P4)
qui
sont
de
nature
1
1
glycoprotéinique.
Ce
phénomène
semble être général
puisque de
nombreuses
taches
sur
le profil
traité
sont d8doublées mais
de
façon
moins
précise.
Ces
profils
font
penser à
une adsorotion
de
la
drogue
à
la
surface membranaire.
Cette
hypothèse
ne
peut
pas
être
retenue,
puisqu'un
simple
lava~e
des
cellules
fait
disoaraître
les
effets
biologi-
ques
du
RA
233,
et
avant
trypsination
les
cellules
sont
exhaustivement
lavées.

---

227
On
oeut
nlutôt
8nvisa~er nue
la
~?13 induit
une
désorganisation
de
la
structure
ou
de
la
cohpsion
des
glycoprotéines
membrenaires,
~ui serait
aussi
responsable
de
l'augmentation
du
taux
de
protéines
"trypsino
sensibles"
et
qui
se
traduit
aussi
par
une
inhibition
non
co~pétitive des
transporteurs
me~branaires. Cette
idée
est
renforcée
par
le
fait
que
le RA
213
est
un
puissant
antiagrégant
plaquet-
taire
(6,
105)
et
on
sait
que
les
glycoprotéines
~embranai"es n~rticipent active~ent à
l'agrégation
des
pla~uettEs sanguines
( 162).
Cette désor-
ganisation
des
glycoprot~ines est
appuyée
par
les
résult~ts des
tests
d'agglutinabilité
par
les
lec-
tines.
En
effet,
TRETESSAUX
188
a
montré
que
l'agglutinabilité
des
cellules
L121D
par
la
conca-
navaline A est
retardée
et
ralentie
nar
le RA
211.
Par
ailleurs
HWA~G et
Coll.
( 84
)
ont
montré
que
c e r t a i n e :3
Co r 0 gue s i n d Li i sen t
[j e~,
e l t é rat ion s
a uni -
veau
des
glvcoorotpines
d8
~e~brane des
cellules
cancéreuses,
oui
présentent
alors
des
réactivités
différentes
vis-3-vis
des
lectines.
Ces
~odifica­
tions
structurales
au
niveau
de
la
membrane
se
trouvent
aussi
confirmées
par
l'étude
en microsco-
pie
électronique
de
balayage.
La
membrane
des
cellules
traitées
Dar
le RA
233,
prr?sente
un
aspect
en
"choux-fleur"
(Fig.
78
).
La
su"face
cellulaire
est
beaucoup
plus
cre'lossée,
et
on
observe
des
protubérances
massives
et
irré-
gulières
de
telles
inages
ne
s'observent
que dans
des
cellules
en
souffrance.
Par exemple
des
aspects
du
même
genre
ont
été
publiés
avec
des
cellules
cancéreuses
attaquées
nar
des
cellules
immunitaires.
(215,72).
2.3.3.
-
K562
-
DIFFERENCIATION.
Dans
ce
trav~il Dréliminaire
sur
la
différenciation,
nous
avons
d'abord
vérifié
que
la
lignée
K562
dont
nous
disoosons,
répond
bien
aux
critères
de
la
lignée
érythroIde
retenus
par
ANDERSSON
et
GAHMBERG
9
) .

---

227bis
ACTION
DU
RA 233
SUR
L'AG G LUTINABI LITE
DES
L 1210
par
LA
CON _ A
0.0. A 546 nm
1300
1200
, v
1100
'(
V
,.'(
'(
1000
" V
900
5
10
1 5
20
temps
en
mn
Dé croissance
de
la
densité
optique
au
Ci
cours
du
temps
à
37c.
_ _ 8
L 1210
témoin
*-*
L 1210
+ RA
0_0
L 1210
+ con A
y-,
L 1210
+ RA + con A

---

228
A
B
FiF..
78
A = L 1210
Témoin
B
L 1210 + RA 233.

---

229
Ces
critères
sont
notam~ent la
présence de
glyco-
phorine A qui
est
spécifique
de
la
surface
des
érythrocytes
humains
(44,9,95 / 127),
et
la
synthèse
d'hémoglobine
embryonnaire
et
foetale
en
présence
d'agent
inducteur
tel
que
l'hélTline
160
) .
Dans
ce
nouveau
canevas
de
recherche,
les
études
électrophorétiques
entreprises,
n'ont
visé
qu'à
mettre
en
évidence
les
chaînes
de
globine
après
induction
de
la
syr,thèse d'hémoglobine
(160.J5,15J.
Nous
avons
donc
montré,
après
avoir
établi
le
pro-
fil
général
des
glycoorotéines
de
membrane,
que
la
souche
K562
dont
nous
disposons
sécrète de
large
quantité
d'hémoglobine
en
présence
d'hémine
(12,5 ~~
ou
50
rJM).
Cette
hémoglobine
a
été
qualifiée
et
quantifiée
par
l'étab~issement du spectre d'absorp-
tion dans
le
visible
(Fig.66,
67).
Le
sujet
de-
vient
~rometteur quand
on
établit
le
orofil
des
glycoprotéines
de
membrane
au
cours
de
l'induction.
Pour
étudier
les
variations
précoces,
nous
nous
sommes
placés
dans
des
conditions
telles
que
la
cellule
synthétise
de
l~rges quantités
d'hémoglo-
bine
(1- 4,5 pg/cell.) au bout de 24 heures. Nous
avons
donc
incubé
les
cellules
en
présence
d'hémine
50 ~M.
Les
effets
tardifs
ont
été
étudiés
après
4 jours
d'incubation
en
présence
d'hémine
12,5
~~.
Après
24
heures
de
culture
en
orésence d'hémine
50
p~,
le
fluorogralTIme
révèle
une
glycoprotéine
hypersialidée
dont
la
M.M.
a
été
estilTlée
3
130
O~O daltons.
Par
contre
les
GP
49
000,
(GP
37-
39
000)
sont
inexistantes.
~près 4 jours de culture
en
présence
d'hémine
12,5
~M,
alors
Que
la
produc-
tion
d'hémoglobine
est
lTIaxilTIale
(4,5
~g/cell.) la
distribution
des
glycoprotéines
est
rigoureusement
la même
que
dans
les
témoins.
Le
dimère
de
la
glyco-
phorins A (GP
85
000)
est
toujours
présente
quel que
soit
le
type
d'effet
étudié
(précoce
ou
tardi~)
alors
que
le
monomère
(GP
37-3q
000)
est
absent
dans
les
effets
précoces.

---

230
Cette observation
est
encourageante quand
on
se
réfère aux
travaux de GAHMBERG
et ANDERSSDN
( 52
J.
Ils
ont
en
effet,
démontré
qu'en
plus
de
sa
pr~­
sence à
la
surface
de
l'érythrocyte,
la
glycorho-
rine A était
aussi
présente
dans
les
premières
étapes
de
l'érythropoiese
(51/52
J.
Ils
ont
aussi
montré
que la
glycophorine A était
déjà
présente
à
la
surface des
normoblastes
basophiles,
indiquant
ainsi
~ue son
expression
à
la
surface membranaire
précédait
le départ
de
la
synthèse
d'hémoglobine
détectable
52
).
Ils
ont
aussi
montré
que
les
cellules
leucé~iques blastiques,
exprimaient
les
deux
formes
de
~lyconhorine A (dim~re ou monomère)
dans
certains
cas,
et
dans
d'autres
cas,
seule
la
forme
dimérique
était
exprimée
à
la
surface.
Mais
néanmoins,
la
corrélation
entre
ces
différences
et
le degré
de
différenciation
reste
à
prouver
(
11
J.
L'apparition
de
la GP
j10
000,
dans
les
effets
oré-
coces,
pourrait
s'expliquer au
regard
des
travaux
de
HQFFMAN et Coll.
76
J.
Ils
ont
en
effet,
rrlon-
tré
que
des
concentrations
d'hémine
variant
de
50
à
100
pM entrainent, une augmentation de l'activité
des
enzymes
responsables
de
la
synthèse
de
l'hème,
et
surtout
une augmentation
de
l'expression
des
marqueurs
de
surface
des
cellules
érythroides
em-
bryonnaires
et
foetales.
DEAN et Coll.
38
J ont
montré
par ailleurs,
que
l'accumulatton
d'h~~oglo­
bine
lors
de
l'induction
par des
faibles
concentra-
tions
d'hémine
(12,5
~M par exemple),
est
réversible
et
ne
s'accompa~ne pas
d'une différenciation
termi-
nale.
Cette observation
pourrait
expliquer
les
profils
identiques
des
glycoprotéines,
que
nous
obtenons
entre cellules
induites
par 12,5
~M d'hémine
et
cellules
témoins.

---

23 1
Toutes
ces
expériences
préliminaires.
nous
encou-
ragent
à
rechercher
par
les
techniques
électropho-
rétiques
des
nouveaux
critères
de
différenciation
qui
pourraient
être
des
glycoprotéines
de
surface.
Les
travaux de
KENJI
et
Coll.
1 0 2
nous
confor-
tent
d~ns
ce
sens.
En
effet.
sur
les
cellules
de
leucé~ie myeloide de souris
(~1)' en présence d'a-
gents
inducteurs
de
différenciation.
ils
ont mis
en
évidence
une
GP
180
000
qui
n'est
présente
qu'à
la
surface
des
granulocytes
et
des
macrophages.
Or.
on
sait
que
cette
souche M
peut
se
différencier
1
en
granulocyte
et
en
macrophage
sous
l'action d'a-
gents
inducteurs
102 ).
Cette
expérience certes
encore
isolée.
apporte
l'espoir que
des
a~ents
inducteurs
de différenciation
peuvent
"normaliser"
les
glycoprotéines
de
membrane
des
cellules
cancé-
reuses
et
leur
faire
perdre ainsi
leurs
principales
Dropri~tés de malignité.

---

CINQUIEME PARTIE
CONCLUSION
GENERALE

---

232
Le
but
de
ce
travail
était
de
nous
doter
d'une
bonne
technique
de
fractionnement
et
de
révélation
des
glyco-
protéines
de membrane
des
cellules
cancéreuses
cultivées
in
vitro.
En
effet.
dans
un
travail
précédent
35
nous
avons
adapté
et
mis
au
point
des
techniques
électro-
phorétiques.
notamment
l'isoélectrofocalisation
(en
tube).
l'ACRY/SDS
et
l'électrophorèse bidimensionnelle qui
couple
les
deux
techniques
précédentes.
Nous
nous
sommes
heurtés
à
d'énormes
problèmes
dans
la
révélation
des
glycoprotéines.
Nous
utili~ons alors des
techniques
de
coloration
au P.A.S.
et
au S.A.
Nous
nous
sommes
donc
tournés
vers
des
techni-
ques
de
révélation
utilisant
des
radioéléments.
Nous
avons
donc
adapté
et
mis
au
point
les
techniques
de marquage
externe
à
la
galactose
oxydase
de
GAHMBERG
et
HAKDMDRI
57
et
les
techniques
de
révélation
par auto-
radiographie
ou
fluorographie
de
BONEY
et
LASKEY
2 0 ) .
Nous
nous
sommes
donc attardés
sur
les
petits
détails
tech-
niques
et
oratiques
que
nécessitent
les
électrophorpses
et
les
procédés
de
révélation.
Car
nous
nous
sommes
rendus
compte
que
la
Dualité
des
résultats
était
étroitement
liée
au
"petit
détail
technique"
comme par
exe~ple le séchage
parfait
des
gels
d'acrylamide,
sans
lequel
aucune
fluoro-
graphie
n'est
possible.
Par ces
différents
procédés.
nous
avons
établi
le
profil
général
des
glycoprotéines
de membrane des
cellules
L121D
et
K562.
Parallèlement.
nous
avons
montré
que
des
effecteurs
exogènes
(~TX-~A) oouvaient entrainer des modifications
des
glycoprotéines
de memhrane.
Ces
résultats
certes
qua-
litatifs
demandent
à
être
aporonfondis
afin
de pouvoir en
déterminer
le
retentissement
biologique.
et
voir
si
cet
effet
de
produits
anticancpreux
reorésente
un
épiphénomène
ou
au
contraire
s ' i l
est
~ossible de tirer parti de cette

---

2 33
~ction pour
essayer de
sélectionnar d~autres drogues
anti-
cancéreuses actives
sur
les
glycoprotéines
de membranes.
Car aux
troubles
fonctionnels
de
la membrane des
cellules
cancéreuses
sont
associées
de
profondes altérations
des
glycoprotéines membranaires.
Et
selon
WARREN et VAN
BEEK
(201,1951
la
seule anomalie associée
de façon
permanente au
pouvoir oncogène
des
cellules malignes
se
situe au
niveau
de
certaines
structures
glycanniques
N-glycosidiques
des
glycoprotéines membrônaires.
Avec
la
K562
qui
est
une
lignée
humaine,
nous
avons
abordé
le problème
de
la
place
des
glycoprotéines
de mem-
brane dans
les
phénomènes
de différenciation.
Les
résultats
exposés
dans
ce
travail
ne
représentent
qu'un
"coup de
sonde" 'dans
ce
nouvel
axe de
recherche.
En
effet,
avec
l'hémine utilisé
comme modèle tyoe
d'agent
inducteur
de
différenciation.
nous
avons
montré
que
la
souche
K562 dont
noUs
disposons.
synthétise de
l'hémoglobine.
Parallèlement
on
observe des
modifications
dans
le
profil
des
glycopro-
téines.
Des
travaux
sont
en
cours
pour affiner
le modèle
d'étude
et
pour essayer de
s~lectionner des
drogues
anti-
cancéreuses,
qui
en
plus
de
leur
impact
sur
185
glycooro-
téines
membranaires,
aurôient
des
effets
différenciants.
Car WARREN et
BUCK
2001
pensent
que
si
une drogue
pou-
rait
"normaliser"
les
glycoprotéines membranaires,
elle
"normaliserait" ainsi
les
cellules
cancéreuses.
Cette
nouvelle approche
de
l'action
des
mpdicaments
anticancéreux
est
réconfortante
pour
l'esorit,
car on
ne
chercherait
plus
~
tuer
la
cellule mais
à
la
rendre
" no r mal e"
~T
'
c "
par
la on
éviterait
les
limites
actuelles de
la chimiothéraoie,
dues
aux
effets
cytotoxiques
vis-à-vis
des
cellules
normales
de
l'organisme.

---

BIBLIOGRAPHIE

---

235
1 -
ABERCROMBIE M., AMBROSE J.E.
The surface properties of cancer cells
a review.
Cancer Res., 1962, 2~, 525.
2 - ABERCROMBIE M., HEAYSMAN J.E.M.
Observations on the social behavior of cells in tissue
culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts
in relation to their mutual contacts.
Exp. Cell. Res., 1953'2' 111.
3 -
ADAMS S.L., SOBEL M.E., HOWARD B.H., OLDEN K.,
YAMADA K.M., DE CROMBRUGGHE B., PASTAN I.
Levels of translatable mRNAs for cell surface protein,
collagen precursors and two membrane proteins are altered
in Rous Sarcoma Virus-tra~sformed chick embryo fibroblasts.
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, 74,
3399.
4 - AGNERAY, J.
Glycoprotéines:
structures et activités biologiques.
Rencontre biologique, 1977, Expansion Scientifique,
Paris, Edi t.
5 -
ALTER, B.P o and GOFF, S.C.
Electrophoretic separation of human embryonic globin
demonstrates.
",.', -Thalassemia" in humam leukemia cell line K562.
Biochem. Biophys. Res o Commun., 1980, ~, 843.
6 -
AMES, G.F.L., and NIKAIDO, Ko
Two-dimensional gel &lectrophoresis of membrane proteins o
Biochemistry, 1976, 15, 616.
7 - ANDERSON, L. and ANDERSON, N.G.
High resolution two-dimensional electrophoresis of human
plasma proteins.
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 1977, 74, 5421.
8 - ANDERSSON,
L.C.
and GAHMBERG, CoG.
Surface glycoproteins of human white blood cellso Analysis
by surface labelling.
Blood, 1978, 52, 57.
9 - ANDERSSON, L.C.,NILSON, K., GAHMBERG, C.G.
K562 -
A human erythroleukemic cell line.
Int. Jo Cancer, 1979, 23, 143.
10 - ANDERSSON, L.c., WASASTJERNA, C. and GAHMBERG, C.G.
Different surface glycoprotein patterns on human T-, B-
and leukemic-Iymphocytes.
Int. J. Cancer, 1976, 11, 40 0

---

236
:
11 -
ANDERSSON, L.C., GAHMBERG, C.G.,
TEERENHOVI, L.
and
VUOPIO, P.
Glycophorin A, as a cell surface marker of early
erythroid differen t: .:~.tion in acute leukemia.
Int. J. Cancer, 1979, 23,717.
12 -
ASHWELL G., MORELL A.G.
The role of surface carbohydrates in the hepatic
recognition and transport of circulating glycoproteins.
In, Advances in Enzymology, MEISTER A., WILEY J.,
N.Y. Academie Press, 1974, 41, 99.
13 -
ASHWELL G., MORELL A.G.
Membrane glycoproteins and recoRnition phenomena.
T.LB.S., 1977, ~, 76.
14 -
AUB. J.C., SANFORD B.H., COTE M.N.
Studies on the reactivity of tumor and normal cells to
a wheat germ agglutinine
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1965, 54, 396.
15 -
BENZ, E.J., MURNANE, M.J., TONKONOW, B.L.
EmbryomiC-fetal erythroid characteristics of a humam
leukemic cell line.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, 77, 3509.
16 -
BHAKDI, S., KNUFERMANN, H.
and WALLACH, D.F.H.
Separation of EDTA-Extractable erythrocyte membrane
protein by isoelectric-focusing linked to electrophoresis
in sodium dodecyl sulfate.
Biochim. Biophys. Acta •• 1974, 345, 448.
17 -
BHAKDI,S., KNUFERMANN, H. and WALLACH, D.F.H.
Separation of hydrophobic membrane proteins by isoelectri-
focusing linked to sodium dodecyl sulfate gel electro-
phoresis.
In :
Progress in isoelectric-focusing and isotachopho-
resis, Ed. P.G. RIGHETTI, 1975, 281.
18 -
BHAVANANDAN V.P., DAVIDSON E.A.
Characteristics of a mucin type sialoglycopeptide produced
by B16 mouse melanoma cells.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 70, 139.
19 -
BOBB, D., and HOFSTEE, B.M.J.
Gel ~soelectric-focusing for following the successive
carbamylations of amino-groups in chymotrypsinogen A.
Anal. Biochem., 1971, 40, 209.
20 -
BONNER, W.M., and LASKEY, R.A.
A film detection method for tritiumlabelled proteins and
nucleic acids in polyacrylamide gels.
Eur. J. Biochem., 1974, 46, 83.

---

237
21 -
BOSSMANN, H.B.
Biosynthesis of glycoproteins in normal and oncogene virus
transformed cells.
In : MONTREUIL J.
: Methodologie de la structure et du
métabolisme des glycoconjugués.
Acte du colloque international nO 221 du CNRS, Villeneuve
d'Ascq, 20-27 juin 1973, Vol.
II, 909-920, Edit. CNRS PARIS.
22 -
BRAMWELL M.E., HARRIS H.
An abnormal membrane Blycoprotein associated with malignancy
in a wide ranRe of different tumours.
Proc. R. Soc. Lond. Biol., 1978, 201, 87.
23 -
BUCK C.A., FUHRER J.P., SOSLAU G., WARREN L.
Membrane glycopeptides from subcellular fractions of control
and virus-transformed cells.
J.Biol. Chem., 1974, 249, 1541.
24 -
BUCK, CoA.
GLICK,M.C.
and WARREN, L.
1I
A comparative study of glycoproteins from the surface of
control and ROUS sarcoma virus transformed cells.
Biochemistry, 1970, ~' 4567.
25 -
CARPENTIER, Y.
Utilisation de la cellule L1210 en culture comme modèle
de mesure de flux métaboliques. Application à l'étude de
drogues anticancéreuses.
Thèse, Doct.
3ême cycle, Pharm., REIMS 1981.
26 - CARPENTIER, Y., KOUAMOUO, J., DESOIZE, B. and JARDILLIER,J.C.
Relation-ship between glycolysis and prolifération of L1210
cells in .vitro : effect of a new pharmacological effector :
RA-233.
Biochemical Pharmacolo~y, 1980, 29, 2690.
27 -
CARTER, W.G., FUKUDA, M., LINGWOOD, C., HAKOMORI, S.I.
Chemical composition, gross structure, and organization of
transformation sensitive glycoproteins.
N.Y. Acad. Sei., 1978, 75, 160.
28 - CHEN, K.Y., KRAMER, R.H., and CANELLAKIS, E.S.
Isolation and characterization of surface glycoproteins
from L1210, P-388 and Hela cells.
Biochim. Biophys. Acta, 1978, 507, 107.
29 - CHEN, K. Y., TSAI, C. M., and CANELLAKIS, E. S.
Comparison of physical and immunological properties of
plasma membranes of two mouse leukemia cell lines, P-388
and L1210.
Cancer Research, 1975, 35, 2403.

---

238
30 - CHEN, LoB., BURRIDGE, D., MURRAY, Ao , WALSH, M.L.,
COPPLE, C.D., BUSHNELL, A., Mc DOUGALL, J.K., GALLIMORE, ~.H.
Modulation cf cell surface glycocalyx. Studies on large
external transformation. Sensitive proteine
In, Annals of the N.Y. Academy of Sciences, 1975, 312, 366.
31 -
CLEMENSTON, KoJ., CAPITANIO, A. and LUSHER, E.F.
High resolution two-dimensional gel electrophoresis of
the proteins and glycoproteins of human blood platelets
and platelet membranes.
Biochim o Biophys. Acta 1979, 553, 11 0
32 -
CODINGTON, J.F., SANFORD, B.H. and JEANLOZ, R.W.
Glycoprotein coat of the TA3 celle
l -
Removal of carbohydrate and protein material from
viable cells.
J.
Natl. Cancer Inst., 1970, 45, 637.
33 -
CODINGTON, J.F., SANFORD, B.H., JEANLOZ, R.W.
Isolation and partial characterization of a sialic acid
containing glycoprotein fraction.
Biochemistry, 1972, !!' 2559.
34 -
CODINGTON, J.F.,
TUTTLE, B. and JEANLOZ, R.W.
Methods for the removal,
isolation and characterization
of glycoprotein fragments from the TA3 tumor cell surface.
Actes du Colloque International nO
221 du C.N.R.S.,
Villeneuve d'Ascq, 20-27 juin 1973, Vol. II,
793-801,
Ed. CoN.R.S., PARIS.
35 -
COMOE, L.
Etude électrophorétique des protéines membranaires des
cellules L1210 cultivées in vitro.
D.E.A., Pharm., Paris, 1979.
36 -
COOK, G.M.W.
A sialomucopeptide liberated by trypsin from the human
erythrocyte.
Nature, 1960, 188, 1011.
37 - DAVIS, B.J.
Disc electrophoresis : method and application to humans
serum proteins.
Ann. NoY. Ac ad. Sci., 1964, 121, 404 0
38 - DEAN, A., ERARD, F., SCHNEIDER, A.B., SCHNEIDER, A.N.
Induction of hemoglobin accumulation in human K562 cells
by hemin is reversible.
Science, 1981, 212, 459.
39 - DEBRAY, H.
Les glycoconjugués de la membrane des cellules normales
et cancéreuses.
Bull. Cancer (Paris), 1979, 66, 353.

---

23 9
40 - DEBRAY, H., MONTREUIL, J.
Isolation and characterization of surface glycopeptides
from adult rat hepatocytes in an established line.
Biochimie, 1978, 60, 697.
41 -
EMMELOT, P.
Biochemical properties of normal and neoplasic ce Il
surface : a review.
Euro J. Cancer, 1973, ~, 319.
42 -
EPSTEIN, H.F. and WOLF, J.A.
Peptide mapping of contractile proteins :
two-dimensional
analysis of cyanogen bromide fragments on polycrylamide
gel.
Anal. Biochem., 1976, 76, 157.
43 -
ESSEX, M.
Horizontally and vertically transmitted oncornaviruses
of cats o
In, Advances in Cancer Research,
KLEIN, G., WEINHOUSE, S., N.Y. Academie Press, 1975, ~, 319.
44 -
FAIRBANKS, G., STECK, T.L.
and WALLACH, D.F.H.
Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the
human erythrocyte membrane.
Biochemistry, 1971, 10, 2606.
45 -
FAULK, W.P., CONOCHE, L.B.,
TEMPLE, A., PAPAMICHAIL, M.
Immunobiology of membrane-bound collagen on mouse
fibroblasts.
Nature (Lond.), 1975, 256, 123.
46 -
FINNE, J.
Structure of the O-glycosidically linked carbohydrate
units of rat brain glycoproteins.
Biochim. Biophys. Acta, 1975, ~, 317.
47 -
FISH~~N, P.H., BRADY, R.O., AARONSON, S.A.
A comparison of membrane glycoconjugates
from mou se cells
transformed by murine and primate RNA sarcoma viruses.
Biochemistry, 1976, 15, 201.
48 -
FRIEND, C., SHER, W., HOLLAND, J.G. and SATO,
T.
Hemoglobin synthesis in murine virus-induced leukemic
cells in vitro:
stimulation of erythroid differentiation
by dimethyl sulfoxide.
Proc. Natl. Acad. Sei., 1971, 68,
378.
49 -
FUKUDA, r-l.
K562 human leukaemic cells express fetal type (i)
anti.p:en
on different glycoproteins from circulating erythrocytes.
Nature, 1980, 285, 405.
50 -
FURTHMAYR, H.
Structural analysis of a membrane glycoprotein
glycophorin A.
J. Supramol. struct., 1977,2, 121.

---

240
51 - GAHMBERG, C.G. and ANDERSSON, L.C.
K562-A Human leukemia cell line with erythroid features.
Seminars in Hematology, 1981, 18,
72.
52 -
GAHMBERG, C.G., JOKINEN, M., and ANDERSSON, L.C.
Expression of the major sialoglycoprotein (glycophorin)
on erythroid cells in human Bone Marrow.
Blood, 1978, 52, 379.
53 -
GAHMBERG, C.G.
External labelin~ of human erythrocyte glycoproteins.
Studies with galactose oxidase and fluorography.
J. Biol. Chem., 1976, 251, 510.
54 -
GAHMBERG, C.G., ANDERSSON,
L.C.
Selective radioactive labeling of cell surface sialo-
glycoproteins by periodate-tritiated borohydride.
J. Biol. Chem., 1977, 252, 5888.
55 -
GAHMBERG, C.G. P and ANDERSSON, L.C.
Identification and characterization of normal and malignant
human blood leukocytes by surface glycoprotein patterns.
N.Y. Acad. Sci., 1978,
75, 240.
56 -
GAHMBERG, C.G., HAKOf'.lORI, S.
Altered growth behavior of malignant cells associated
with changes in externally labeled glycoprotein and
glycolipid.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1973, 70, 3329.
57 -
GAHMBERG, C.G., and HAKOMORI, S.I.
External labeling of cell surface galactose and galacto-
samine in glycolipid and glycoprotein of human erythrocytes.
J.
Biol. Chem., 1973, 248, 4311.
58 -
GAHMBERG, C.G., HAYRY, P., ANDERSSON, L.C.
Characterization of surface glycoproteins of mouse
lymphoid cells.
J. Celle Biol., 1976, 68, 642.
59 - GARRELS, J.I.
Computer-analysed two-dimensional gel electrophoresis
of proteins.
T.I.B.S., 1980, Nov., 281.
60 - GASTPAR, H.
Inhibition of cancer ce Il stickiness by anticoagulants,
fibrinolytic drugs and pyrimido-pyrimidine derivatives.
Hemat. Rev., 1972, ~, 1.
61 -
GERNER, E.W., GLICK, M.C., and WARREN, L.
Membranes of animal cells.
V -
Biosynthesis of the surface membrane during the cell
cycle.
J. Celle Physiol., 1969,
75, 275.

---

241
62 -
GLENNEY, J.R., and WALBORG,
E.F. Jr.
Accessibility of olasma membrane sialoglycoconjurrates
of Novikoff tumor cells to exor;enous neuraminidase and
proteases.
Biochim. Biophys. Acta, 1980, 599, 493.
63 -
GLICK, C.A., RABIJ\\lOVlITZ, Z., SACHS, L.
Surface membrane glycopeptides corrolated with tumori-
genesis.
Biochemistry, 1973, 12, 4864.
64 - GLICK, r1.C.
Isolation and characterization of surface membrane
glycoproteins from mammalian cells.
In : Methods in membrane biology, 1973, ~' 157.
65 - GLICK, M.C., COT-1STOCK, C.A., COHEN, r.1.A., and WARREN, L.
Membranes of animal
cells.
VIII - Distribution of sialic acid, hexosamines, and
sialidase in L Celle
Biochim. Biophys. Acta, 1971, 233, 247.
66 -
GOLD, P., GOLD, r-1., FREEMAN, S. O.
Cellular location of carcino-embryonic antigens of the
human digestive system.
Cancer Res., 1968, ~' 1331.
67 -
GOLDMAN,
I.D.
The characteristics of the membrane transport of Amethop-
terin and the naturally occuring folates.
N.Y. Acad. Sci., 1971, 186, 400.
68 -
GOTTSCHALK, A., FAZEKAS de st GROTH, S.
On the relation ship be~leen the indicator profile and
prosthetic group of mucoproteins inhibitory for influenza
virus heamagglutinin.
Biochem. Biophys. Acta, 1960, 43, 513.
69 -
GREGORIADIS, G., MORELL, A.G., STERNLIEB, I.,
SCHEINBERG,
I.H.
Catabolism of desialylated ceruloplasmin in liver.
J. Biol. Chem., 1970, 245, 5833.
70 -
GREIG, R.G., JONES, M.N.
Mechanisms of intercellular adhesion.
Biosystems, 1977, ~' 43.
71 -
GRIMES, W.J.
Glycosyltransferase and sialic acid levels of normal
and transformed cells.
Biochemistry, 1973, ~' 990.
72 - GRH1T-1, E.A.
and BONAVIDA, B.
Studies on the induction and expression of T-cell-midiate
immuni ty.
VI -
Heterogeneity of lytic efficiency exhibited by
isolated cytotoxic T-lymphocutes prepared from hiqhly
enriched populations of effector-target cell conju?ates.
J.
Immunol., 1977, 119, 1041.

---

242
73 - HAKOMORI, S.I.
structures and organization of cell surface glycolipids.
Dependency on ce Il ~rowth and malignant transformation.
Biochim. Biophys. Acta, 1975, 417, 55.
74 - HAKOMORI, S. 1., and rmRAKAMI, W. T.
Glycolipids of hamster fibroblasts and derived malignant
transformed cell lines.
Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S., 1968, 59, 254.
75 - HERBEMAN, R.B.
Immuno,r;enici ty of tumor anti~ens.
Biochim. Biophys. Acta,
1977, 473, 93.
76 - HOFFHAN, R.,
l BR AI-lIJ'.'l, N., MURNANE, r·T.J., DIAMOND, A.,
FORGET,
B.G., LEVERE, R.D.
Hernin control of hene biosynthesis and catabolism in a
human leukemia cell line.
Blood, 1980, 56, 567.
77 - HOFFMANN, C.C., MOORE, X.C.,
SHIH, C.Y., BLAKLEY, R.L.
Scanning electron microscopy of human lymphocytes during
transformation and subsequent treatment with methotrexate.
J. Celle SCi., 1977, 28, 151.
78 - HORST, M.N.,
and ROBERTS, f'1.
Analysis of polypeptide turnover rates in chinese hamster
ovary cell plasma membranes using two-dimensional electro-
phoresis.
J. Biol. Chem., 1979, 25, 5000.
79 - HOURANI, B.T., CHACE, l'J.H.,
and PINCUS, J.H.
Pasma membrane glycoproteins from nucleated cells.
l -
Preparative techniques for isolation and partial
characterization of a membrane glycoprotein extract
from L1210, cells with lectin receptor activity.
Biochim.
Biophys. Acta, 1973, 328, 520.
80 - HUDGIN, R.C., PRICER, W.E., ASHWELL, G., STOCKERT, R.J.,
MORELL, A.G.
The isolation and properties of a rabbit liver binding
protein specific for asialoglycoproteins.
J. Biol. Chem., 1974, 249,
5536.
81 -
HUGHES, R.C.
Glvconroteins as components of cellular membranes.
Prog.
in Biophysics and ~olecular Biology, 1973, 26, 191.
82 - HUGHES, R.C.
The complex carbohydrates of mammalian cell surfaces and
their bioloBical roles.
Essays Biochem., 1975, !!, 1.

---

243
83 - HUGHES, R.C., and NAIRN, R.
Labeling, solubilization, and peptide mapping o~ ~ibroblast
sur~ace glycoprotein o
N.Y. Acad o SCi., 1978, 75, 192 0
84 - ffivANG, KoM., SARTORELLI, A.C.
Use o~ plant lectin-induced agglutination to detect alte-
rations in sur~ace architecture o~ sarcoma 180 caused by
antineoplasic ag,ents.
Biochem o Pharmacol., 1975, 24, 1149 0
85 -
HYNES, RoD., DESTREE, AoT., MAUTIJER, V.M., and lU, A.
Synthesis, secretion and attachment o~ LETS glycoprotein
in normal and trans~ormed cells.
J. Supramol. Struct o , 1977, 2, 397.
86 -
HYNES, R.O.
Cell sur~ace proteins and malignant trans~ormation.
Biochim. Biophys. Acta, 1976, ~, 73.
87 - I-IYNES, R00., BYE, J. 1,1.
Density and cell cycle dependence o~ ce Il sur~ace proteins
in hamster ~ibroblasts.
Cell., 1974, ~, 113.
88 -
UmAR,
j,l., SACH S ,
L.
Structural di~~erence in sites on the sur~ace membrane
o~ normal and trans~ormed cells.
Nature, 1969, 223,
710.
89 -
lU, A., and J-lYNES, R.O.
E~~ects on LETS ~lycoprotein on cell mobilityo
Cell, 1978, .!1, 439.
90 -
JACOBS, So, SHECHTER, Y., BISSEL, K., CUATRECASAS, Po
Puri~ication and properties o~ insulin receptors ~rom rat
li ver membrane.
Biochem.
Biophys. Res. Commun, 1977, 77, 981.
91 - J A.l\\JSONS, V. K0
and BURGER, T'I.
Isolation and characterization o~ agglutinin receptor sites.
II -
Isolation and partial puri~ication o~ a sur~ace mem-
brane receptor ~or wheat germ agglutinino
Biochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 127.
92 - JANSONS, V.K., SAKAl/[OTO, C.K .. , and BURGER, T'T.H.
Isolation and characterization o~ agglutinin receptor sites.
III -
Studies on the interaction with other lectins.
Biochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 1360.
93 - JEANLOZ, RoI" .. , CODINGTON, J.F.
and SANFORD, B.H.
Cell sur~ace glycoproteins o~ two sublines o~ the TA 3
tumor.
Jo Natl. Cancer Inst o , 1973, 51, 585 ..
94 -
JOHNSEN, S. and STOKKE,
T.
Hela cell plasma membranes.
III -
Incorporation o~ (3H) ~ucose into plasma membrane
glycoproteins during the cell cycle ..
ExptL CelL Res., 1977, 109, 53.
~

---

244
95 -
JOKlNEN, fit., GAHfiTBERG, C.G., AJ\\IDERSSON, L.C.
Biosynthesis of the major human red cell sialo~lyco­
protein,
glycophorin A in a continuous cell line.
Nature,
1979, 279, 604.
96 -
JUSTISZ, M., LLOSA, P.
Glycoproteins as hormones and as enzymes.
In :
GOTTSCHALK A.
Edi t.
ELSEVIER,
Amsterdam,
1972, Part B, 1019.
97 -
KALANT, H., t10NS, H.
and GUTTI1AN, H.
Sialic acid content of normal rat liver and of DAB-
induced hepatoma.
Cano J. Physiol. Pharmacol., 1964, 42, 25.
98 -
KASPAR, D.H., KALTENBACI-I, J.B.
Incorporation of glucosamine-3H into extracellular
globulin by Ehrlich ascites tumor cells.
Experimental and molecular pathology, 1975, 23,
500.
99 -
KATMAH, R.H., IolHIZLER, R.J.
and JOHSOlJ, C.A.
Preparation of an inhibitor of viral hemagplutination
from human erythrocytes.
J.
Exptl o !1ed., 1961, 113, 37.
100 -
KN'IASAKI,
T., ASHvlELL, G.
Carbohydrate structure of 81ycopeptides isolated from
hepatic membrane bindinp, protein specifie for asialo-
rrlycopro te ins.
J. Biol.
Chem., 1976, 251,
5992.
101 -
'!...A\\'JASAKI,
T., and YAT1ASHH!A,
1.
!1etabolic s tud ie s of Rat l i ver pl asma membrane usi n,r, D-
(I-14C)
glucosamine.
Biochim.
Biophys. Acta, 1971, 225, 234.
102 -
KENJI,
S.,
TmnDA, 111., HOZmn, n.
Differentiation-associated chanpesin membrane proteins of
mouse myeloid leukenia cells.
Biochim.
Biophys. Acta, 1979, 587, 169.
103 -
T\\H', Y.S., ':!HITEI-lEAD, J.S.,
and PERDOMO, Jo
Glycoproteins of cultured epithelial cells from human
colonie adenocarcinoma and fetal intestine.
Eur. J.
Cancer, 1979,1:2,725.
104 -
KLEIN,
E., BEN-BASSAT, H., NEUMANN, H.,
RALPH,
P.,
ZEUTHEN, J., POLLIACK, A., VANKY, F.
Properties of the K562 cell line, derived from a patient
with chronic-myeloid leukemia.
Int. J.
Cancer, 1976, 18,421.
105 -
KOCH, H.
j'·10pidamol :
a
tumor cell aggregation inhibi tor.
In, Pharmacy international, Elasvier/North-Holland
Biomedical Press, 1981,25.

---

245
106 -
KORNFELD, S.
The nature of cell surface receptor site for lens culinaris
phytohemagglutinin.
J.Biol. Chem., 1971, 246, 6581.
107 -
KORNFELD, S., and KORNFELD, R.
Solubilization and partial characterization of a phyto-
hemagglutinin receptor site from human erythrocytes.
Proc. Natl. Sei., 1969, 63, 1439.
108 -
KOUN~OUO, J.
Effet du methotrexate sur le metabolisme énergétique de
la cellule L1210 in vitro.
Thèse, Dct 3ème cycle, Pharm., Reims, 1980.
109 -
KOUAMOUO, J., CARPENTIER, Y., DESOIZE, B., and
JARDILLIER, J.C.
Methotrexate-induced alterations of aerobic metabolism
and biosynthesis of glycoconjugates in L1210 cells.
In, Drug Measurement and Drug Efferts in Laboratory
Health Science. SIEST G.
and YOUNG D.S. Edit., KARGER p 1980.
110 - KURTH, R., BAUER, H.
Avian RNA tumor viruses. A model for studying tumor
associated cell surface alterations.
Biochim.
Biophys. Acta, 1975, 417, 1.
111 -
LAEf1MLI, U.K.
Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriopha~e T4.
Nature, 1970, 227, 680.
112 -
LASKEY, R.A., and MILLS, A.D.
Quantitative film detection of 3H and 14C in polycrylamide
gel by fluorographie.
Eur. Jo Biochem., 1975,
56, 335.
113 -
LAZO, J .S., H\\'IANG, K.T',1.
and SARTORELLI, R.C.
Inhibition of L-fucose incorporation into glycoprotein of
sarcoma 180 ascites cells by 6-Thiop,uanine o
Cancer Research, 1977, 37, 4250.
114 -
LEBLOND, C.P., BENNETT, G.
Biogenesis of glycoproteins as show by radioautographyo
J. Histochem o Cytochem., 1979, 27, 1185.
115 -
LENHINGER, A.L.
Biochimie.
Edit. Française, FLN~MARION, 1977 0
116 -
LIS, Ho, SHARON, N.
The biochemistry of plant lectins.
In, Annual Review of Biochemistry, SNELL E.E. Palo ALTO,
Annual Reviews Inc, 1973, 42, 541.

---

246
117 -
LKB : Application note 250, Déc.
1977.
118 -
LLOYD p C.W.
Sialic acid and the social behaviouz of celle
Biol. Rev.,
1975,
50,
325.
119 -
LLOYD, E. KGf Jr.
and rTORRISON, IIt.
The visualization of human erythrocyte membrane proteins
and glycoproteins in SDS-Polyacrylamide gels employinp, a
single staininq procedure.
Analytical Biochemistry, 1976, 2l, 223.
120 -
LODISH, H. et ROTHTtltN, J.
L'assemblap,e des memhranes cellulaires.
Pour la Science, 1979, !Z' 22.
121 -
LOUISOT p p.
Biochimie structurale.
l
-
Glucides.
Simep Edi tions,
Lyon, 1976, 123.
122 -
LO'.·TRY,
O.H., ROSENBROUGH, N.J., FARR, A.L.,
and RANDALL,
R.J.
Pro teins measurement with the folin phenol reagent.
J. Biol. Chem., 1951, 193, 265.
123 -
LOZZIO, C.B.,
LOZZIO, B.B.
Human chronic myelo~enous leukemia cell line with positive
Philadelphia chromosome.
Blood, 1975, 45,
321.
124 -
i1ArJABE,
T.,
TACHI,
K., KOJIHA,
K.
and OKUYAHA,
T.
Two-Dimensional electrophoresis of plasma pro teins without
denaturing agents.
J.
Biochem.,
1979, 85,
649.
125 -
!',TANABE,
T.,
TAKAHASHI, N., KOJIHA, K.,
SHINODA,
T., and
OKUYAJ.1A,
T.
~~o-Dimensional electrophoresis of immunoglobulin myeloma
proteins in the absence of denaturinr; ar;ents.
J.
BiochemGf
1980, 87, 451.
126 -
HARCHESI, V. T., FUHTHTlAYR, H.,
Torn TA , rTe
The red cell membrane.
Annual Review of Biochemistry, 1976, 45, 667.
127 -
T,IARCHESI, V.T.,
TILLACK,
T.l:i., JACKSor;, R.L.,
SEGREST, J.p.,
~COTT, R.E.
Chemical characterization and surface orientation of the
major alycoprotein of the human erythrocyte membrane.
Proc.
NatL Acarl.
Sel.
U.S.A.,
1972, 69,1445.
128 -
TTARr;.OLIS, J.,
;:E;m.ICiC,
K. (;.
Elec trophoresi s in poly acry lamide concen tra tion rtrad ien t.
Biochem.
Biophys. Res.
C;omrnun., 1967, 27, 68.

---

247
129 -
J'v1ARKvlELL, f1.A.K.,
and FOX, C.F.
Surface-Specifie Iodination of membrane proteins of viruses
and eucaryotic cells usin~ 1, 3, 4, 6, Tetrachloro-3
6
-
diphenyl-~lycoluril.
Biochemistry, 1978, ~' 4807.
130 -
f-1ARTOf.T,
L.S.G.,
and ~&~.vnT, J.E.
Subunit structure of the major human erythrocyte plyco-
protein : depolyrnerization by heating ghosts with sodium
dodecyl sulfate.
Biochem.
Biophys. Res.
Commun., 1973, ~' 1457.
131 -
~c CLAY, D.R., ~OSCONA, A.A.
Purification of the specifie cell-aRp,regatinr: factor from
embryonic neural retina cells.
Exp. Celle
Res., 1974, 87, 438.
132 - Mc CORMICK, J.L, SUSTEN, S.S., RADER, J.I.
and
FREISHED.1, J.H.
Studies of a methotrexate binding protein fraction from
L1210 lymphocyte plasma membrane.
Eur. J. Cancer, 1979, 12, 1377.
133 -
Mc GREGOR, J.L., CLEMETSON, K.J.,
JAMES, E., LUSHER, E.F.,
and DECHAVANNE, r·1.
Characterization of human blood platelet membrane proteins
and glycoprote ins by the ir isoe lec tric point (p 1)
and
apparent molecular weiBht usinr: two-dimensional electro-
phoresis and surface-Iabellinr: techniques.
Biochim. Biophys. Acta, 1980,
599, 473.
134 -
MILENKOVIC, A.G., RACH!·1F.LER, r1.,
and JOHNSON,
T.C.
Grouth and metabolism of fucosylated plasma-membrane
glycoproteins in mouse neuroblastoma N2a cells.
Biochem. J., 1978, 176, 695.
135 -
MONTREUIL, J.
Recent data on the structure of the carbohydrate moiety
of glycoproteins. f·1etabolic and biological implications.
Pure and Applied Chemistry, 1975, 42, 431.
136 -
f\\WRA,
P. T., CUMAR, F .A.
and BRADY, R. O.
A common biochemical change in SV 40 and polyoma virus
transformed mouse cells coupled to control of cellrsrowth
in culture.
Virology,
1971, 46, 60.
137 -
MOflELL, A.G., GREGORIATIS, G.,
SCHEINBERG,
I.H.,
HIC!C!·1AN, J., ASHi'JELL, G.
The role of sialic acid in determining the survival of
glycoproteins in the circulation.
J.
Biol. Chem., 1971, 246, 1461.

---

248
138 -
r,WRRIS, D.R., and FILLINGN-Œ, R.H.
Re~ulation of amino acid decarboxylation.
Ann. Re v.
Bio che m., 19 74, 43,
303.
139 -
NE1:!T'TA1\\T, R.A., GLOCKl\\,JER, 1:!."!., UHLErŒRUCK, G.
Immuno-chemical detection of the Thomsen-Friedenreich
Antiq:en
(T-an tigen)
on the pif' lymphocyte plasma membrane.
Eur. J.
Biochem., lCJ76, ~,
373.
140 -
NICOLSON, G.L.
Trans-~embrane control of the receptors on normal and
tumor cells.
II -
Surface chan~es associated with transformation and
malignancy.
Biochim. Biophys. Acta"
1976, 458,1.
141 -
O'FARRELL, P.H.
Hir::h resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.
J.
BioL Chem., 1975, 250, 4007.
142 -
O'FARRELL, P.F!.,
and 0' FARRELL, P.Z.
Two-dimensional polyacrylamide [",:el electrophoretic
fractionation.
In methods in cell biolopy :
chromatin and chromosomal
research.
Academie Press ~.Y.
G.S.
STEIN, J.L., STEIN EDITORS 1975, 407.
143 -
OGATA, S.I., MURAMATSU, J., KOBATA, A.
New structural characteristic of the lar~e ~lycopeptides
from transformed cells.
:'Jature (Lond.), 1976, 259,580.
144 -
OHTA, N., PARDEE, A.B., T'1c AUSLAi\\J, B.R., and BURGER, iT.TT.
Sialic acid contents and controls of normal and controls
of normal and malignant cells.
Biochim. Biophys. Acta,
1968, 158, 98.
145 -
OLDEN, K., PRATT, R.;:., YM1ADA, K.rT.
Role of carbohydrates in protein secretion and turnover :
effects of tunicaw-ycin
on the major cell surface glycopro-
tein of chick embryo fibroblasts.
Cell, 1978, 13, 461.
146 -
ORNSTEIN, 1.
Dise electrophoresis.
Ann. N.Y. Acad. SeL, 1964, 121,321.
147 -
PE~A, S.D.J., MILLS, G., and HUGHES, R.C.
~~o-dimensional electrophoresis of surface plycoproteins
of normal BH/( cells and ricin resistant mutants.
Biochim. Biophys. Acta 1979, 550, 100.
148 - PHILLIPS, D.R.
and HORRISOn,
i-f.
EXDosed protein on the intact human ervthrocyte.
Diochemistry,lQ71, 10, 1766.

---

249
149 -
POUYSSEGUR, J., WILLINGHAH, f:1.,
PAS TAN , I.
Role of ce Il surface carbohydrates and pro teins in cell
behavior :
studies on the biochemical reversion of an
N-acetyl-,r;lucosamine deficient fibroblast mutant.
Proc.
Natl. Acad.
SeL U.S.A., 1977, 74,243.
150 -
REISNER, A.H., NEMES, P.,
BUCHOLTZ, C.
The use of coomassie brilliant blue G250 perchloric acid
solution for stainins in electrophoresis and isoelectric
focusinp: on polyacr\\rlamide ReIs.
Anal.
Biochem.,
1975, 64,
509.
151 -
RIGHETTI, p.G., DRYSDALE, J.W.
Isoelectric focusinr in polyacrylanide ~els.
Biochem.
Biophys. Acta, 1971, 236, 17.
152 -
RIGliET'I'[,
p.r.. DHYSDALE, J .1,1.
l
smal-SCr le fractionation of proteins and nucleic acids
by isoe ectric focusinr in polycrylamide çel.
Ann. il.Y. Acad.
SeL, 1973, 209, 163.
153 -
ROBBINS,
J.C., NICOLSON, G.L.
Surfaces of nornal and transformed cells.
In Biolo~V of tumours : surfaces inmunolo~y and conparative
pathology.
M.Y., Plenum Pluhishing Corporation, 1975, 1, 3.
154 -
ROBB pTS, J. C., and rHCOLSmI, r.. L.
Surfaces of normal an~ transformed cells.
In : Cancer 4, 1975. A comprehensive Treatise. Plenu~
Press. N.Y.
and Londo~.
\\,
i
155 -
ROBRINS~ P.W., WICKUS, G.G., GRA~JTON, P.E., GAFFNEY, B.J.
HIRSCHBERG, C.B., FUCllS, P.,
BLUf:TI3ERG,
p.r,~.
The chick fibroblast cell surface after transformation by
ROUS Sarcoma Virus.
In, co Id sprinq harbor symposia on quantitative biology.
N.Y., Cbld Sprin~ Harbor Laboratory, 1974, 39, 1173.
156 -
ROHRSCHl'JEIDER, L.R., KURTH, R.,
BAUER, H.
Biochemical characterization of tumor-specific cell surface
anti~ens on avian oncornavirus transformed cells.
virolopy, 1975, 66, 481-
157 -
ROSPJBERG, A., and SCl-lENGRUND, C. L.
SIALIDASES.
In, Biolo~ical roles of sialic acid Edit. Ey A. ROSENBERG
and C.L. SCHErlr.RUND, Plenum Press. N.Y.,
Lond.,
1976, CH 10, 195.
158,- RO:THHAN, J.E.,
LE1'JARD,
J.
Membrane asymmetry.
The nature of membrane asymmetry
provides clues to the puzzle of how membranes are assemhled.
Science, 1977, 195, 743.

---

250
159 -
RUOSLAHTI, E., VAHERI, A., KUUSELA, P., LINDER, E.
Fibroblast surface antigen :
a new serum proteine
Biochim. Biophys. Acta, 1973, 322, 352.
160 -
RUTHERFORD, T.R., CLEGG, J.B., WEATHERALL, D.J.
K562 human leukaemic cells synthesize embryonic haemo-
globin in response to haemin.
Nature, 1979, 280, 164.
161 -
RUTHERFORD, T.R., and WEATHERALL, D.J.
Deficient heme synthesis as the cause of noninducibility
of hemoglobin sunthesis in a Friend erythroleukemia cell
line.
Cell., 1979, 16, 415,
162 -
SAlTO, H., UZMAN, B.G.
Production and secretion of chondroitin sulfates and
dermatan sulfate by established mammalian cell lines.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, 43,
723.
163 -
SANFORD, B.H., CODINGTON, J.F., JEANLOZ, R.W., PALMER, r.D.
Transplantability and antigenicity two sublines of the TA 3
tumor.
J.
Immunol., 1973, 110, 1233.
164 -
SHAPIRO, A.L., VINUELA, E., and MAIZEL, J. V. Jr.
Molecular weight estimation of polypeptide chains by
electrophoresis in SDS-polyacrylamide gel.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, 28, 815.
165 -
SHARON, N.
Lectins = Cell-a~glutinating and sugar specifie proteins.
Sciences, 1972, 177, 949.
166 -
SHARON, N.
Lectins.
Scientific American, 1977, 236, 108.
167 -
SHARON, N.
Les glucides.
Pour la science, 1981, 39, 12.
168 -
SHIU, R.P.C., POUYSSEGUR, J., PASTAN, I.
Glucose depletion accounts for the induction of two
transformation sersitive membrane proteins in ROUS
Sarcoma virus-transformed chick embryo fibroblasts.
Proc. Natl. Acad. Sei., 1977, 74,
3840.
169 - SIMONET, G.,
ORlA, M.
Les mesures de radioactivité à l'aide de compteur à
scintillateur liquide.
Edit. EYROLLES, 1977, PP.
157-179.

---

251
170 -
SINGER, S.J., NICOLSON, G.L.
The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.
Science, 1972, 175, 720.
171 -
SLATER, G.G.
Pore-limit electrophoresis on a gradient of nolyacrylamide
gel.
Anal.
Biochem., 1968, 24, 215.
172 -
SLAYTER, H.S., and CODINGTON, J.F.
Size and confiRuration of glycoprotein fragments cleaved
from tumor ce Ils by proteolysis.
J.
Biol. Chem., 1973, 248,
3405.
173 -
SMITHIES, O.
Zone electrophoresis in starch ReIs : group variations
in the serum proteins of normal human adults.
Biochem., J., 1955, ~' 629.
174 -
STECK,
T.L., DM/SON, G.
Topographical distribution of complex carbohydrates in the
erythrocyte membrane.
J.
Biol. Chem., 1974, 249, 2135.
175 -
STRAUS, D. S., JONASSON, J., HARRIS, H.
Growth in vitro or tumor cell X fibroblast hybrids in wich
malignancy is suppressed.
J. CelI. SeL, 1977, 25,73.
176 -
STRECKER
G.,
FOURNET, B.,
BOunUELET, S., [\\WN'TREUIL,J.,
Q
DHONDT, J.H.,
FARRIAUX,
J.P.
Etude chimique des mannosides urinaires excrétRs au cours
de la mannosidose.
Biocnimie, 1976, 5S, 579.
177 -
STRECKER, G.,
TRENTE SAUX-CHAUVET, C., POITAU, A.,
rlONTREUIL, J.
Etude des oli~osnccharides riches en fucose présents dans
les urines de su,i e ts sains et [:lé l i turiques de groupes AB
et O.
Biochimie, 1976, 58, 805.
1713 - STROTHi'.IGER, J. L., CRESShTELL, ? , GREY, H., ~nJITPHIŒYS, Ti. F.. ,
f{ANN,
D., >1c CUNf:, J.,
PAHIlAi1, P., ROBB,
H.,
SANDEHSOl i ,A.n.,
S?RINGER,
T.A.,
~ERHO~ST, C.,
TURNER, ~.J.
Transplant Rev.,
1974, 21,
126.
179 -
STUDIER,
F.H.
Analysis of bacteriophaue T7 larly RirAS and nroteins on
slah crel.
J.
iToI.
THol., F)'73,
79, 237.

---

252
180 -
SVENSSON, H.
Isoelectric fractionation.
Analysis and characterization of ampholytes in natural
pH r'Tadients.
l
-
The differential equation of solute concentrations
at a steady state and its solution for simple cases.
Acta.
Chem. Scand., 1961, 12, 325.
181 -
TAKASAKIS, S., YN~ASHITA, K., KORATA, A.
The sugar chain structures of ABO blood group active
glycoproteins obtained from human erythrocyte membrane.
J. Biol. Chem., 1978, 253, 6086.
182 -
TANAKA, T.
Les gels.
Pour la Science, 1981, 41, 62.
183 -
TATTERSALL, H.H.N., JACKSOl'J, R.C., JACKSON, S.T.~:1., and
HARRAP, KoR.
Factors determining cell sensitivity to methotrexate :
studies of folate and deoxyribonucleoside triphosphate
pooling five mammalian cell lines.
Europ. J. Cancer, 1974, 10, 819.
184 -
TERRY,
T.M., ZUPNIK, J.S.
Weak association of glucosamine containing polymer with
the Acholeplasma laidlawii membrane.
Biochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 144.
185 -
THOr''IAS, D.B. and HINZLER, R.J.
Oligosaccharides from A-active sialoglycopeptides of
human ery throcyte.
Biochem. Biophys. Res.
Corn., 1969, 35, 811.
186 -
TIOLLAIS, P., GALIBERT, F., LEPETIT, A., AUGER, f-1.A.
L'électrophorèse des acides ribonucleiques en gel de
polyacrylamide.
Biochimie, 1972, 54, 339.
187 -
TOMITA, M., MARCHESI, V.T.
Amino acid sequence and olip,osaccharide attachment sites
of human erythrocyte p,lycophorin.
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1975, 72,2964 •
. ,
188 -
TRENTESAUX, C., CŒIfOE,
L., KOUAMOUO, J., JARDILLIER, J.C.
Action d'une drogue anticancéreuse sur les protéines
membranaires et les mécanismes transporteurs de thymidine,
d'uridine et de 2-désoxyglucose chez la cellule L1210
cultivée.
Regard sur la Biochimie, 1980, ~' 54.
189 -
TU, S.H., NORDOUIST, R.E., GRIFFIl'J, N.J.
Membrane changes in hela cells srown vith cortisol.
Biochim. Biophys. Acta, 1972, 290, 92.

---

253
190 -
TUSZINSKI, G.P., B~<ER, S.R., FUHRER, J.P., BUCK, C.A.,
WARREN,
L.
Glycopeptides derived from individual membrane glyco-
proteins from control and ROUS Sarcoma virus-transformed
hamster fibrohlasts.
J.
Biol. Chem., 1978, 253, 6092.
191 -
VAHERI,
A.,
and rrOSHER, D.L
High molecular wei~ht, cell surface associated glyco-
protein (Fibronectin)
lost in malignant transformation.
Biochim.
Biophys. Acta,
1978, ~' 1.
192 - VAI~ER, H., and BUSSEL, A.
Altered platelet surface plycoproteins in chronic myeloid .
leukemia.
Int. J.
Cancer, 1977, 19, 143.
193 - VN:J BEEK, H.P.,
Sf'ŒTS,
L.A.,
and Ef'T11ELOT, P.
~
Increased sialic acid density in surface rrlycoprotein of
transformed and malirrnant cells-A rreneral phenomenon ?
Can ce r
Res., 1 9 73 ,
33, 29 13 •
194 - VAN BEEK, \\'l.P., SfTETS, L.A.,
ET·1T.1ELOT, p.
Chanq:ed surfac~ o:lycoprotein as a marker of malir~nancy
in human leukemic cells.
Nature (Lond.),
1975, 253, 457.
195 - VAN BEEK, \\:J.P.,
STTETS, L.A.,
E>1i'ŒLOT, P.,
ROOZENDAAL, )'~.J.,
REHREi'IDT, H.
Early recop:nition of hurnan leuker11ia by cell surface
glycoprotein chan~es.
Leukemia Res., 1978, ~, 163.
196 -
VAN NEST, G.A., GRIMES, W.J.
A comparison of membrane components of normal and trans-
formed BALB/C cells.
Biochemistry, 1977, ~' 2902.
197 - VESTEBERG,
O.
Synthesis and isoelectric fractionation of carrier
ampholytes.
Acta Chem.
Scand., 1969, 23,
2653.
198 -
VESTERBERG, O.
Isoelectrkfocusinp: of proteins in polyacrylamide p:els.
Biochim.
Biophys. Acta, 1972, 257~ 11.
199 - HALBORG, E.F.J.R.,
DAVIS, E.T~., GILLJAT,1, E.D., ST-TITH, D.L
Cellular membranes and tumor cell behavior.
Baltimore, \\1illiams and viilkins Company,
1975, 337.
200 - WARREN,
L., BUCK, C.A.
The membrane r,lycoproteins of the malip,nant cella
Clin.
Biochem., 1980, 13, 191.

---

254
1
.'
201 -
WARREN,
L., BUCK, C.A.,
and TUSZYNSKI, G.P.
Glycopeptides changes and malisnant transformation.
A possible role for carbohydrate in malignant behaviour.
Biochim. Biophys. Acta, 1978, 516, 97.
202 -
WARREN,
L., FUHRER, J.P.,
and BUCK, C.A.
Surface glycoproteins of normal and transformed cells :
A difference determined by sialic acid and a prowth-depen-
dent sialyl transferase.
Proc.NatL Acad., SeL U.S.
1972,
69,
1838.
203 -
WARREN,
L.,
Fm~RER, J.P., BUCK,C.A.
Surface r:;lycoproteins of cells before and élfter trans-
formation by onco~enic viruses.
Fed. ?roc., 1973,
32,
80.
204 -
V1ATKINS, l'I. 1..7.
Blood ~roup specifie substances.
In : GOTTSCHALK, A.,
Edit.
Elsevier, Amsterdan,
1972,
Part B,
P30.
205 -
vlATT, F.H., HARRIS, II., OSBORrj, H., v!EnER, K.
The distrihution of actin cab les and microtuhules in
hybrids be"btreen mali(Tnant and non-malir:nant cells allcJ
in tumours derived from them.
J. Celle SeL,
FJ78,
~?, 419.
206 -
HEBER, J(.,
and 0::180R1'), n.
The reliahili ty of molecular weio:ht determinations bv
dodecvl sulfate-oolvacrylamide ~el electrophoresis.
J.
Biol. Che~., 196~, 244, 4406.
207 -
WEBER,
!:., PPPlrèLF., J.H., and OSBORN, 1.;.
1 -
~easurement of molecular weights by electrophoresis
on SDS-Acrylamide (1el.
In : Pethods in Enzymoloçry, 1970, XXVI,
3.
208 -
HEHJSTIUN, D.R., TTAR8H, J.B., r;.LICK, TiJ.C.,
and
WARREN,
L.
T~emhranes of animal eells.
VI -
The (Tlycolipids of the L cell and its surface nemhrane.
J. BioL Chem.,
1970,
245,
32R.
209 -
'.HENER, F., KLEIN,
G., HARRIS, H.
The analysis of malipnancy hy cell fusion.
III -
Hyhrids between diploid fibroblasts and other tumour
cells.
J. CelL Sei., 1971, ~, 681.
210 -
WILKIE, D., E~ILSON, V., FVA~S, I.ll.
Mi tochondria in oneor:enesi s • the lance t, 1975, 27,
697.

---

255
211 -
\\'1U, B.C., SPOHN, V/.H., and BUSH, H.
Two-dimensional ~el electrophoresis of cytosol phospho-
proteins of novikoff hepatoma and regenating liver.
Cancer Research, 1979, ~, 116.
212 - YArtlADA, K.H., OLDEN, K.
Fibronectins : Adhesive glycoproteins of cell surface
and blood.
Nature (Lond.), 1978, 275, 1 79.
,
.
213 - YAI·1ADA, K.r'.1., and POUYSSEGUR, J.
/:::
'\\\\
Cell surface 9,lycoproteins and malignanti~rahst6rmation~
~~I~~»"
Biochimie, 1978, 60, 1221.
::r. .-,
/
.~'
'\\"."~J,f
214 - YAMADA. K.H •• WESTON. J.A.
Isolation of a major cell surface glycoprot~iDn~~~furv
......c'-"~
fibroblasts.
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1974, 71,
3492.
215 -
ZAGURY, D., BERNARD, J., JEANNESSOl\\J, P., THIERNESSE, N.,
and CEROTTINI, C.
Studies on the mechanism of T cells-mediated lysis at
the single effector cell level.
l
-
Kinetie analysis of lethal hits and.tarp.:et cell lysis
in multicellular conju~ates.
J. IMMUNOL., 1979, 123, 1604.

---