UNIVUSll1 DE ULLE D
fA.CVll1 DE PHA.D4AOE
THtsE
pour )'obtetaOOD du cade cie
DOC'fEUll D'ETAT EN PHARMACIE
) r i a . par
Etienne-Abbé YAPO
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Application de la Chromatographie d9Adsorption au Dosage
des Œstrogènes Urinaires en fin de Grossesse
!yaJuatioD critiqur dr la mhbode propolh
Soutenue le 30 Septembre 1977
roIY
WM. la Pr!,lrucW'1 C. lISEItTl. PrlsidcDt
1. CU1~CPŒT
1. II.IZOR
~.oC. CAIDI
M. Je DonNr
... UCADOT
LILLE
1977
U~IVER5ITE DE LILLE II
FACULTE
DE
PHARmACIE
THE5E
pour l'obtention du grade de
DOCTEUR D'ETAT EN
PHARMACIE
présentée par
Etienne-Abbé YAPO
APPLICATION DE LA CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION AU DOSAGE
DES OESTROGENES URINIARES EN FIN DE GROSSESSE
Evaluation critique de la méthode proposée.
Soutenue le 3D Septembre 1977
JURY
mm. les Professeurs
G.8ISERTE, Président
E.CUINGNET
J.mIZON
J-C.CAZIN
M. le Docteur
A.RACAOOT
LILLE 1977
· mon maItre et Président de
Jury,
monsieur le Professeur G.BI5ERTE,
Professeur de Biochimie Pathologique à la Faculté
de
médecine de LILLE
Directeur de l'InstitLt de Recherches sur le Cancer
de LILLE
Directeur de l'Unité de Recherches Ultrastructurales
et biochimiques sur les cellules normales et
cancéreuses (IN5ERm U.124)
qui m'a fait le très grand honneur
d'accepter de présider le
jury de
cette thèse.
L'étendue de vos connaissances
et la haute qualité de votre ensei-
gnement ont largement contribué à
orienter mon choix vers les disci-
plines biologiques.
Veuillez trouver dans ce modeste
travail,
l'hommage de mon profond
respect et de ma très grande admi-
ration.
~ ~es Juges,
monsieur le Professeur E.CUINGNET,
Professeur de Chimie CénÉrale à la Faculté dE
Pharmacie de
LILLE
Président du Conseil
de l'UnIversité du Droit et
ce la Santé de LILLE Il
Qui m'a fait le très grand honneur
de siéger parmi mes
Juges.
Votre pédagogie et vos conseils
justifient la fidélité de mon atta-
chement.
Je réclame toute votre indulgence
et vous prie de trouver dans cet ou-
vrage un faible témoignage de ma très
profonde gratitude.
Monsieur le Professeur J.mIZDN,
Professeur de Chimie Biologique à la Faculté de
Pharmacie de LILLE
La clarté de votre enseignement
m'a attiré vers la Biochimie.
Auprès de vous,
j'ai appris la
rigueur et la méthode mais aussi le
souci perpétuel de communiquer la
connaissance à l'élève.
Votre aide
toujours bienveillante,
vos encoura-
gements et votre disponibilité per-
manente ont permis la réalisation
de ce travail.
Ne trouvant pas les mots pour vous
remercier,
je vous prie simplement de
croire en me très vive gratitude, en
mon profond respect et en ma très
grande admiration.
monsieur le Professeur J-C.CAZIN,
Professeur de Pharmacodynaffiie à la Faculté de
Pharmacie de LILLE
En plusieurs circonstances,
vous
avez bien voulu me prodiguer votre
aide.
Vous avez également accepté de
siéger parmi mes
juges.
En jugeant ce modeste travail,
veuillez vous montrer indulgent et
soyez assuré de ma très vive recon-
naissance et de mon profond attache-
ment.
A ma rem~e Suzanne,
Qu'elle trouve dans ce travail,
l'expression
de mon amour.
Que bonheur et harmonie guident
toujours notre chemin.
A mes Enfants,
Ave~ toute ma tendresse
A mes Parents,
Avec l'assurance de
ma reconnaissance,
particu-
lièrement à
:
ma mère,
Madame YAPO-A5S1 Kl551
madeleine,
la mémoire de
feu mon Père,
monsieur maurice YAPO
mon Cousin,
monsieur A5S1 Hubert et sa famille
la m~moire de feu mon rrère,
Désiré-Yapi YAPO
A mes Beaux-Parents,
En témoignage de mon affection
A mes
Amis.
A mon Cousin,
monsieur le Professeur B.BEDA et madame,
Qu'ils veuillent trouver d8ns cet
ouvrage,
l'hommage de ma très profon-
de gratitude,
l'expression de mon in-
défectible attachement et le fruit de
tant d'effo~ts généreusement consentis
à mon encrolt •..
merci
J'ai été très sensible à l'accueil sympathique et
bienveillant :
- de l'ensemble des collaborateurs du Docte~r A.RACADOT
- du service de Chimie minérale de la Faculté de Pharmacie
de monsieur le Professeur J.BERTRAND
- du service de Chimie Générale de la Faculté de Pharmacie
de monsieur le Professeur E.CUINGNET
Je tiens à leur exprimer ici mes sincères remerciements,
en particulier à
madame m.VAN-pOUCKE
madame mASSE
monsieur TARTAR
monsieur C.FOURNIER
Je tiens ég21ement à remercier tous les membres du
Laboratoire de
Biochimie de la Faculté de Pharmacie pour leur
aide toujowrs bienveillante,
particulièrement
monsieur le Professeur agrégé J-C.FRUCHART
madame I.LE5IEUR
madame
G.VANHOUTTE
et surtout,
madame c.mIZDN
Madame V.CLAVEY
et mademoiselle T.ERNOUT
pour qui les mots me manquent pour exprimer toute ma gratitude.
monsieur le Docteur JAUmAIN
et le Personnel des maternités R.SALENGRO et du Pavillon Olivier
ont,
sans négliger leur peine, collecté avec bienveillance,
urines
de grossesse et résultats qui ont servi de matières premières à
l'élaboration de ce travail.
Que cet ouvrage me permette d'exprimer à tous mes
très vifs
remerciements.
monsieur le Docteur A.RACADOT,
Chef du Laboratoire de Clinique médicale et
Enjocrinologique
Chef de Travaux en
Biochimie à la Faculté de
~édeci~e de LILLE
C'est gràce à vous que
j'ai pu
assimiler les techniques complexes
de dosages hormonaux existants.
L'équipe que vous animez a bien
voulu m'intégrer et m'initier genti-
ment et dans la bonne humeur.
La cha-
leur de votre accueil m'a rendu moins
pénible le dépaysement et la solitude.
De plus,
vous avez personnellement
eu l'obligeance de me faire bénéficier
de votre savoir et V8US n'avez pas hé-
sité à me sacrifier volontiers de
votre temps.
Permettez-moi de vous remercier
tout particulièrement ce soir de votre
compréhension et votre sympathie bien-
veillante.
- -: -
REVUE GENERALE
- 2 -
INTRODUCTIO~
Chez la femme,
les oestrogènes
(hormones stéroîdes phéno-
Li qu e s ) sont secrétés par l'ovaire
(1,2,3,4),
l'unité foeto-pla-
centaire (1,2,5,6)
et,
accessoirement,
rar les glandes cortico-
surrénales.
Ils
jouent un
rôle capital dans le déroulement du cycle
menstrue~ et le maintien de
la gestation.
Catabolisés principa-
lement dans le foie,
ils sont excrétés en
particulier par la
voie rénale.
Leur détermination urinaire
(ou plasmatique)
revêt
un grand intérêt pour l'exploration biologique de la forction
ovarienne
(â,6)
et pour celle de l'unité foeto-placentaire
(1,5,
7,5-16).
Ainsi,
il est Établi que pendant la dernière moitié de la
grossesse
(le dernier trimestre notamment),
ce dosage permet
d'apprécier la vitalité foeto-placentaire,
ce qui est particuliè-
rement important devant une menace d'accouchement prématuré,
au
cours des grossesses dites "à haut risque" et en cas de gestation
prolongée;
le résultat constitue un élément précieux dont s'ins-
pire l'attitude médicale ultérieure en cas d'une évolution diffi-
cile de la grossesse.
De plus, cette détermination permet éven-
tuellement de confirmer une grossesse débutante
(1,5)
; elle peut
j
-
contrib~er à préciser l'étiologie de certaines menaces d'avor-
tE~ents précoces et à la corriger éventuellement et enfin,
elle
peut intervenir dans le diagnostic de la môle hydatiforme et
des choriocarcinomes
(1).
Le dosage,
à l'origine effectué par des méthodes biologi-
ques,
ne l'est plus actuellement que par des procédés chimiques,
chromatographiques ou isotopiques ; le nombre impressionnant de
~Éthodes proposées traduit à lui seul l'intérêt, mais aussi la
dlfficulté de ce dcsage.
Les techniques chimiques décrites,
notamment pour les oes-
trogènes urinaires de fin de grosse~se ont connu une oertalne
évolution.
Pendant un moment,
les mêmes méthodes,
à
une étape de
purification près,
étaient utilisées pour déterminer les oestro-
gènes urinaires de cycle menstruel et de grossesse (17,18,19)
elles sont longues et nécessitent deux à trois
jours pour une
courte sÉrie de dosages.
Devant l'urgence obstétricale que constituent la menace ~
prématurlté,
la souffrance foetale,
la mort
foetale in utero,
de
no~~re~x auteurs parmi lesquels BROWN et CDYLE (20), COa[L5~ANN
(21),
DAKEY et coll.
(22)
et SCHDLLER et coll.
(23)
ont proposé
des méthodes plus rapides,
mais celles-ci,
longues d'au moins
une journée,
restent très contraignantes.
ITTRICH
(24,25),
grâce à un ingénieux procédé de purifica-
tion du chromophore de KOBER en fin de dosage,
puis d'autres au-
teurs
(26,27,28)
ont élaboré des techniques colorimétriques et
fluorimétriques dites "oirectes", donc très rapides
(environ
2h3D)
mais Qui,
manifestement,
comportent de nombreuses causes
- ~ -
d'erreur et qui,
par conséquent,
manquent de fiabilité.
Les méthodes dites "avec purification sans hydrolyse"
(29-34) ne sont pas moins controversées.
Quant à la chromato-
graphie en phase gazeuse (35-43)
et la radiométrie (44),
elles
restent encore peu accessibles pour de nombreux laboratoires de
~iolcgie clinique.
Pêr~i ces méthodes,
nous nous sommes particulièrement in-
téressés à celles comportant
une phase chromatographiyue unique
de purification des oestrogènes urinaires sur colonne de résine
neutre Amberlite XAD-2 (32-34)
; ces méthodes qui se termiGent
par la détermination calorimétrique (32)
ou
fluorimétrique
(33)
ou per _~romato~raphie en phase gazeuse (34)
des oestrogènes
élués~sont simples et séduisantes;
mais elles n'ont pas connu
une large diffusion en raison d'un certain manque de reproducti-
bilité.
L'objet de ce travail
a été l'étude des conditions opti-
males de cette phase de purification chrometoçraphique des oes-
trogènes conjugués SJr des petites colonnes de résine XAG-L.
Puis,
aux produits de l'éluat mÉthanolique ainsi obtenu,
nous avons appliqué la réaction calorimétrique de
KDBER, selon
le procédé d'ITTRICH
(24,25).
On obtient ainsi une méthode qui,
sans investiSSEment meté-
r:el important,
sans qualification technique particulière et dans
ces délais suffisamment rapides,
permet d'obtenir des réSultats
fiables.
La méthode ainsi élaborée a ensuite été comparée à d'autres
c~ -
~e~~niques déJ2 testées et publiées (23,24,3~).
Il nous a semblé,
de plus,
intéressant de replacer ce t~a-
Ja1l dans le cadre général de la physiologie de l'ova1re et ae
.a gestation pour mieux dégager l'intérêt du
dosage et l'c~por-
:unité d'une
telle mise au
point technique.
- 6 -
CHA~ITR[
l
RAPPELS HISTOP~YSIOLOGIOUES
A - STRuCTURE DE L'OVAIRE DE LA FEmmE hJULTE (4,7)
L'ovcir~ se présente com~e une glande ovoïde mesurant
en-
virc n 3 c~ ~s long,
1,5 c~ de
large et 1 cm d'épaisseur.
Celui-
ci est entouré par une tunique fibreuse blanchâtre appelée albu-
ginée ; au centre se trouve la médulla,
infiltrée de vaisseaux
sanguins.
Entre l'albuginÉE et la médullc,
la partie corticèle ou
stro~a contient essentlellement des follicules
à clfférents ste-
des de développement,
des corps jaunes actifs et régressifs et
des cellules intersticielles.
Le follicule ·ovarien en cours de maturation constitue
l'unité fonctionnelle ce la glande adulte;
i l
compreÎld un ovo-
cyte entouré de deux couches tissulaires:
- la pluS interne,
constituée de cellules granulalres,
est
appelée granulosa.
- l -
-
~a COGcr,,,
e x t e r re ,
o n omrr e thèque.
se compose d'une c o uc h e
é
é
cellulaire interne,
la thèque interne,
et d'une envelGcpe fi-
breuse externe,
la thèque externe
(Fig.I)
A chaque structure histologique ainsi décrite correspono
une fonction physiologique particulière dont les deux plus im-
~Drtantes sont
- l'ovulaticn qui correspond à la libération de l 'ovocyte ~ur,
Céncmmé
Dvule. C'est un phénomène cyclique.
- les secrétions endocrines des oestrogènes et de la ~rc;es
tércne,
secrétions dans lesquelles la granLlos? et 12 thè~~e in-
terne sont impliquées.
-8-
f t . mur
memb.
pellucide
.tilma
fol.. De Graaf _...-
lranulola
albugiMe
theque
fol.
fol. en
croissance
jaune
follicule
Primaire
Fi 9. l
Histologie
de
l'ovaire
de
la femme
(Turner
C.D.
'966,
General
Endornnotaqv.
(Ph,ladef phil)
- ~ -
~ - DlSCRI~TIO~ ET ~SPECT
ENDOCRINOLOGIQUE DU CYCLE OV~RIEN
l
- Le cycle ovarien
(7)
Le cycle ovarien comporte trois Etades successifs:
une
ph~se de maturation
folliculaire,
la ponte ovulaire et la for-
mation du corps
jaune
.
Au cours de la croissance folliculaire,
on
obSer\\/B
(Fig.I)
que
:
- les cellules épithéliales de la granulosa prolifèrent Et
leur amas se creuse d'une antre folliculaire:
antrum.
-
la taille même du
follicule et de l'ovocyte s'accroît et
celui-ci,
entouré de la membrane pellucide,
se trouve progressi-
vement refoulé à la périphérie du
follicule où il forme une ex-
croissance.
- la thèque s'épaissit,
notamment la thèque interne qui se-
crète un liquide folliculaire qui s'accumule dans l'an:rum j
à
l'inverse de la granulosa,
la thèque interne reçoit des
vais-
seaux capillaires sanguins et lymphatiques.
Le follicule mOr prend le nom de
follicule
vésiculaire Du -
follicule
de DE GRAAF;
en réalité,
de nombreux follicules pri-
maires entament simultanément leur maturation
seul,
l'un d'eux
y parvient tandis
que les autres s'arrêtent à des stades divers,
puis dégénèrent:
c'est l'etrésie folliculaire.
-
10 -
:ette maturatic' du follicule de DE
GRAAF,
qui 2 débuté
prem~er jour du cycle menstruel, s'étale sur 12 à 14 Jours,
l'issue desquels le follicule apparaît bien visible à la sur-
lce de l'ovaire où il fait
saillie;
il n'est
recouvert que
une mince enveloppe: le stigma. A ce stade,
la thèque interne
atteint son développement maximal ;
elle est responsable de la
3crÉtion des oestrogènes
(oestradiol-17 0 et oestrone)
do-t la
~oduction est à son apogée aux environs du 14ème Jour du cycle
anstruel.
Environ 14 jours avant les règles appelées menstruation,
e stigma mal vascularisé devient le siège d'un infarctus et se
ompt ; ~e follicult (désormais appelé ovule) est recueilli par
es franges tubulai.es : c'est l'ovulation.
Après l'ovulation,
les cellules de la granulosa et de la
hèque interne prolifèrent et
remplissent progressivement la ca-
ité antrale infiltrée par les vaisseaux capillaires thécaux
lonnant le corps jaune ou corpus luteum qui a toutes les carac-
:éristiques d'une glande à sécrétion interne. Les structures d'o-
-igine granulaire sécrètent la progestérone,
tandis que celles
j'origine thécale sécrètent les oestrogènes.
En l'absence ae fécondation,
le corps
jaune subsiste une
dizaine de
jours,
puis il est envahi par du
tissu conjonctivo-
graisseux pour donner le corpus albicans qui perd brutalement
ses propriétés sécrétoires,
24 à 48 heures avant la menstruation.
.N. B.. ~
l, O'loc;te. •
-
11
-
Il
- LE déterrJ'is~p hormonal du cycle menstruel
(4,7)
La
régulation du cycle menstruel normal met en
jeu des
partenaires hormonaux d'origine ovarienne,
hypophysaire,
hypo-
thelamique,
le système nerveux central et des tissus périphé-
r i qu e s cibles.
Les interactions des sécrétions hormonales mettent en
jeu des rétro-contrôles nÉgatifs et positifs qui réalisent ce
que CHA~8AZ (45) appelle le Gonadostat et dont les stéroïdes
gonadiques constituent le centre
; les tissus cibles sont péri-
phériques
(utérus,
vagin,
glandes mammaires)
et centraux
(sys-
tème nerveux central,
hypothalamus,
hypophyse).
C'est
ainsi que
l'hypophysectomie chirurgicale ou pathologique
(syndrome de
SHEEHAN)
supprime le cycle ovarien,
et l'on observe l'atrophie
progressive des ovaires et du tractus génital lié à la suppres-
sion subséquente de la sécrétion des hormones stéroIdiennes.
Deux grands mécanismes de rétro-contrôle régulent cette
sécrétion stéroidienne (Fig.II)
Il
est lié au taux plasmatique des oestrogènes et acces-
soirement de la progestérone dont les variations sont percepti-
bles par l'hypothalamus.
Ainsi,
à la fin d'un cycle ovarien chez
la femme
normale,
on observe une chute brutale des sécrétions
oestrogéniques et progestatives,
liée à le désintégration du
corps
jaune.
Ceci induit l'augmentation de la sécrétion par
-12-
environnement externe
_tra
"rpothalamique
......
-
h
.- - - - - - ypothalamus
~I ~\\. - - - - :-. --FSH,LH RF
(
.
\\- - - - - - -antehypophy se
1
E
1
FSH
1ft1
e
LH
o
-.'El•
-C
ovaire
G
i _______ ~-----{ C8Strogenes
progesterone
tractus genital
Rg.
Il
-
Contrôle .de la fonction
ovarienne.
D'après
Harris
G.W.
and
Naftalin
F.
dans
Biochemistry
of
stéroids
de
H.L.J.
Makin
Ed. 1975 p.
254.
-
13 -
'hypothalamus d'un facteur de libération,
appelé lHRH.
Cette neurohormone parvient, par l'intermediaire du sys-
ème parte hypothalamo-hypophysaire, à l'antéhypophyse où elle
ngendre à san tour une élévation de la synthèse de la Follicle-
timulating hormon (F5H)
et de la luteinizing hormon (LH)
par
es cellules basophiles.
la F5H produite agit sur la croissance folliculaire dans
a première moitié du cycle menstruel,
tandis que la lH inter-
ient en stimulant la sécrétion des oestrogènes.
Ceux-ci, en activant eux aussi la croissance folliculaire,
ontribuent à augmenter leur propre sécrétion.
lorsque le taux d'oestrogènes atteint un seuil sanguin dé-
.erminé, i l provoque l'inhibition de la sécrétion de
la F5H (ré-
.ro-contrôle négatif)
et la stimulation de celle de la lH
(rétro-
;ontrôle positif) conduisant au
pic pré-ovulatoire de celle-ci
lers le 14ème jour du cycle ; le rapport entre les deux hormones
lypophysaires (F5H et lH)
atteint alors un niveau déterminé qui
jéclenche l'ovulation.
Après l'ovulation,
la lH,
dont la production se trouve à
,on apogée, provoque la transformation du
follicule rompu en
:orps jaune,
relance la sécrétion des oestrogènes et déclenche
:elle de la progestérone.
Ces sécrétions stéroïdiennes déterminent à leur tour une
Jaisse de la sécrétion de la lH qui conditionne la désintégra-
ion ultérieure du corpus luteum.
la figure III exprime l'aspect quantitatif des hormones
insi décrit~9 au cours du cycle menstruel.
14
Oci
1
0
~
CL
-E
~
li
~1
e
e
-CI
• c
•
•
Cc
..-.
o.
20
~
-
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..
•.,..
0
12
~
IL
10
•i
1
JOU RS
Flg.llI Concentrations- des
hormones
dans
le
sang
lU
cours
du
cvcle
menstruel,
D'après
Speroff
L.
and
Vandeviele
R. L.
in
Biochemistry
of
steroids
by
Makin
p.
252.
-
~5 -
Le mécanisme court est lié à la sensibilité directe des
Jyaux hypothalamiques, aux variations sanguines des stimulines
~té-hypophysaires, notamment de la r5H.
-
16 -
C - NOTIONS DE PHYSIOLOGIE ENDOCRINE DE LA GESTATION (1,5,7)
Quand l'ovule est fécondé,
ce qui survient dans les 12 à
?~ heures suivant l'ovulation, l'oeuf formé migre vers la mu-
qweuse utérine en vue de
son implantation. Dès avant cette im-
plantation, l'oeuf se différencie en une masse centrale qui re-
présente le futur bouton embryonnaire et en une couche périp~é
rique qui donnera le trophoblaste.
Au moment de la nidation,
le trophoblaste est déjà cons-
titué ;
il se compose alors
- d'une couche profonde,
le cytotrophoblaste, constitué de
grandes cellules claires, dites de LANGHANS.
- d'~ne couche superficielle, le syncytiotrophoblaste,
faite
de larges cellules à noyaux multiples.
Au cours de la 4ème semaine de gestation,
le trophoblaste
donne avec la caduque (aire utérine infiltrée par les villosités
syncytiales)
le placenta qui comporte ainsi une partie foetale
et une partie mêternelle,
tandis que parallèlement, le bouton
embryonnaire suit sa propre évolution •••
~n dehors de ses fonctions essentielles d'échanges foeto-
maternels et de barrière de
protection, le placenta,
par sa
composante foetale,
représente une glande endocrine mixte qui
sera responsable de la sécrétion de plusieurs hormones.
-
17 -
Endocrinologiquement,
on distingue deux phases au cours
de la grossesse : la phase ovarienne et la phase foeto-pla-
centaire.
l - La phase ovarienne
Environ 9 jours après la nidation,
le cytotrophoblaste
sécréte l'hormone gonadotrophine chorionique (HeC)
do~t la pro-
duction maximale se situe entre les Sème et 10ème semaines de
la gestation (Fig.IV). Sa mise en evidence dans le sérum ou,plus
communément, dans les urines de la femme gestante est à la base
de nombreux tests de grossesse.
L'hormone HeC est une glycoprotéine antigénique dont le
poids moléculaire (
30.000)
et la structure (2 subunités ~ et~)
sont apparentés aux stimulines hypophysaires précédemment décri-
tes. Douée d'une action comparable à la LH,
elle assure le déve-
loppement du corps jaune qui devient permanent et prend alors le
nom de corps jaune gestatif ;
lequel va pouvoir continuer à sé-
créter, en quantités accrues,
les oestrogènes et les progestatifs
indispensables au maintien de la grossesse.
II - La phase foeto-placentaire
Entre les 6ème et 10ème semaines de la gestation, période
critique pendant laquelle on enregistre de nombreux avortements,
les cellules du corps jeune gestetif invo1uent,
les cellules
18
Il.
IV -
Concentrations
moyennes en
HCG au
COU"
de
la
Grossesse
normale,
déter·
minées . . .
L'augmentation
du
poids de "utérus de
ratte
courbe
1
l'Hyperhémie ovarienne chez la ratte
courbe
2
La fixation
du
complément
courbe
3
L'inhibition de
l'hémaglutinltion
courbe
4
O'lPrès Barth
R. (1971)
in
Biochemistry of Stéroids
by
Makin
p.
264.
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C
5 ;f
u
:z:
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2 ~f.'
semaines
- 19 -
yncytiales placentaires, envahissantes, deviennent prédomina n-
es aux dépens 'des cellules de LANGHANS et commencent leur sé-
rétion stéroIdienne.
Après 10 semaines, l'ovaire est devenu presque inutile et
'ovariectomie n'interrompt plus la grossesse: c'est la phase
oeta-placentaire au cours de laquelle la sécrétion de l'hormone
CG diminue progressivement.
L'élaboration des oestrogènes et des progestatifs,
néces-
aires au maintien de la gestation, est entièrement réalisé par
e syncytiotrophoblaste en collaboration avec le foetus
(1,2,S).
ette sécrétion stéroldienne ne semble plus être stimulée par la
CG, mais plutôt liée à la maturité du foetus.
La sécrétion de la progestérone surtout semble indispensa-
le à la poursuite de la grossesse puisque l'effondrement de la
écrétion oastrogénique à ce stade de la gestation,
tel celui
encontré au cours du déficit en sulfatase placentaire (anomalie
étabolique rare, caractérisée en 1969)(46) ne semble pas avoir
e conséquence clinique (47).
A partir de la 1Sème semaine de gestation, une autre hor-
one, la prolactine placentaire (HPL ou HCS) est progressivement
écrétée par le syncytiotrophoblaste. De structure comparable à
~ 'hormone de croissance (5TH), elle présente, en dehors de son
iction mammotrope et lactogénique, des propriétés physiologiques
1
timileires à le 5TH, mais de moindre intensité.
1
On pense que le HPL pourreit contribuer à stimuler le crois-
-
20
-
sance foetele.
A l'inverse de
la
HeG qui rend compte de la vi-
talité placentaire pendant la phase ovarienne de la grossesse,
la HPL est le reflet de ce fonctionnement placentaire au cours
de cette seconde phase.
Au cours de la grossesse biologiquement et clinique~ent
normale,
les sécrétions d'oestrogènes et de progestérone pro-
gressent massivement
jusqu'à environ 8 semaines du terme où
l'on observe un fléchissement
isolé de
celle de la progestérone.
Cette modification du rapport oestrogènes
à terme serait
progestérone
l'une des causes déclenchantes du travail, compte tenu des pro-
priétés stimulantes des oestrogènes,
et inhibitrices de la pro-
gestérone sur le muscle utérin.
-
21
-
CHAPITRE II
LES OESTROGENES
A - RAPPEL HISTORIQUE
~es oestrogènes ont été parmi les premières hormones sté-
roïdes découvertes.
('est en
1929 que BUTENANDT et DOISY isolent
l'~estrone des urines de femmes enceintes.
L'année suivante, mARRIAN isole à son tour l'~estricl ; et
une dizaine d'années plus tard,
HAUrmANN,
le 17~~estradicl.
En dehors de ces trois principaux oestrogènes,
communé~8nt
dénommés "oestrogènes classiques",
de nombreux autres composés,
dont l'épi-oestriol,
l'oestétrol,
métabolites des précédents,
ont été identifiés plus tard.
- u -
B - DEFINITION BIOCHImIQUE ET NomENCLATURE DES OESTROGENES
les oestrogènes naturels sont des molécules qui dérivent
du noyau tétracyclique oestra-triène,
qui provient lui-~ême de
l'oestrane à 16 atomes de carbone.
Ils sont caractérisés par
- l'existence d'une fonction phénol en C
sur le cycle A
3
- l'absence de chaine latérale en C17
- la présence en C'7 et,
éventuellement,
en C1~_~'une fonction
oxygénée (soit cétonique,
sait alcoolique).
Les caractéristiques structurales des principaux phénol-
stéroïdes sant rassemblées dans le tableau l
et leurs nomencla-
:ures dans le tableau II
(3).
HO
,
~
Oestrane
~ 1,3,5(10)Oestratriène
Oestrone
OH
OH
OH
~
HO
HO
HO
Oestradiol 17~
Oestriol
Oestétrol
TABLEAU l
Quelques structures essentielles
TABL[AU
Il
Nom commun
Ahréviation
Nomenclature systématique
Oestrone
0 1
3-hydroxy
01-3-S(10)oestra-triène-17 one
16 oC. OH-oestrone
3, 16aldihydroxy Ô1-3-S(10)oestra-triène-17 one
Oestradiol 17 ,;\\
0 1 1
~1-3-S(10)oestra-triène-3-17 diol
16-céto-oestradiol
17~
3,17 ~dihydroxy ô1-3-S(10)oestra-triène-16 one
Oestriol
0
III
n 1- 3 - 5 ( 10) oe s t r a - tri è ne - 3 -16 .,( - 17 ~ rio l
16 ~pi-oestriol
"
3-16 ~ -17i\\triol
Oestétrol
Il
3 - 15 -< - 1 6-<'- 17 ~
t~trol
NI
w
Nomenclature et abrévidtion des principaux oestrogènes
- 24 -
C - LE mETA8DLISmE DES OESTROGENES
Chez la femme
en activité génitale,
l'essentiel des oes-
trogènes provient, comme nous venons de le voir,
de l'ovaire,
puis de l'unité foeto-placentaire.
Accessoirement,
les glandes
cortico-surrénales et certains tissus périphériques peuvent
produire des oestrogènes;
mais les quantités formées ne
sem-
blent
jouer un rôle appréciable qu'après la ménopause.
Nous décrirons successivement la biosynthèse,
le catabo-
lisme et la régulation du métabolisme des oestrogènes chez la
femme,
au cours du cycle menstruel et de la grossesse.
l
- Biosynthèse des oestrogènes (2-5,48)
Le cholestérol qui
représente le précurseur de l'ensemble
des hormones stéroïdes est,
soit synthétisé in situ dans l'orga-
ne producteur,
sait apporté par les lipoprotéines du sang circu-
lant.
Quel que soit ce tissu producteur,
les voies anaboliques
restent très voisines;
ainsi,
à partir du cholestérol.
trois
grandes étapes peuvent être distinguées.
conformément au schéma
suivant (fig.V).
- 25 -
R
H
~o
R = OH
ou = 0
And r 0 g è 'Î e s
Cholestérol
~5 Prégnènolone
CH 3
C
C
27
2 1
HO
Oestrogènes C18
R
= 0 ou -OH
1
R2 = H ou OH
Figure V
Schéma général de la biosynthèse des oestrogÈnes
La conversion du cholestérol enAS prégnènolone est assu-
rée par un ensemble d'enzymes présents dans les mitochondries (3,
49) •
- 21 -
Interviennent :
- une 20~hydroxylase ([,) et une 22 E.hydroxylase qui exigent
du NADPH et de l'oxygène moléculaire. L'ordre dans lequel se dé-
roulent ces deux réactions est indifférent.
- une 20-22 desmolase qui rompt la liaison entre les atomes
de carbone 20 et 22, fragilisée par les hydroxylations précéden-
tes du cholestérol en dihydroxy-cholestérol.
OH
HO
Cholestérol
""",--_av('
20 0(.-22 ~ diOH
Cholestérol
o
[,
= 20a( hydroxylase
HO
[2 = 22~ hydroxylase 1
A 5 Prégnènolone
[3 = 20-22 desmolase 1
figure VI
Synthèse de la Prégnènolone
- 27 -
b - ~~=~~~~~~;;=g;;=~~g;2~~~;;=~=g~;~~;=g;=è~=~~=~;~~~~
nolone (Fig.VII)(2-4,49)
: : : = : :
Cette étape consiste en l'élimination du chaînon latéral
et en une modification touchant les cycles A et B de la ôS pré-
gnènolone. Selon l'ordre dans lequel s'effectuent les réactions
nécess2ires, on distingue respectivement la voie des A 4 et celle
des AS.
Les enzymes catalysant cette étape de synthèse appartiennent
à la fraction soluble microsomique et sont les mêmes
dans les deux
v o i e s •
La voie desA4
Elle débute par l'oxydation du groupement hydroxyle en C3'
-::e qui entraîne par déplacement de la double liaison A 5-6 en D. 4-S.
Interviennent simul tanément une 3 ~ hydroxydéhydrogénase à NADH
(E
et une isomérase (E
qui transforment ainsi le ilS prégnèno-
1)
2)
lone en progestérone.
Après la 17~ hydroxylation de la progestérone en présence
de NADPH et d'oxygène moléculaire
(E
la voie desA4 s'achève
3),
Dar la rupture du chaînon latéral sous l'action d'une 17-20 des-
~olase aussi appelée lyase (E 4).
Une 17 Ç),hydroxystéroId deshydrogénese (ES) permet d'obtenir
par une réaction de
réduction réversible, de la testostérone à
Partir de la A 4 androstène-dione.
-
28 -
l:i 5· Prégnènolone
65 Prégnène-3 20-dion~
Progestèrone
ou P5
1
-0
H-
7" -=:::::; ~ 0
,- - - _. - _. 0
NAD
NADH.H·
HO
17~OH Prégnènolone
17~OH Progestèrone
o
lE~
oW-/
E2 >
DéhYJroÉ2i2nJrostérone
t:. 5-Androstène-dione
Df1A(C 1S)
E1 = :3 r.> hydroxy-déshydrogénase
E" = lsor.Érase
L
E
17
3 =
al.
h y d r o x y La s e
E
Desrr:olase
Te s t o s t é r o n e (C
4
=
1 9)
ES = 17 ~hydroxyst€roîd-déshydrogénase
ou 17 ~hydroxysterold-oxydo-réductase
rleURE VII
Les voies A4 ( - )
et 65 ( - )
de la biosynthèse des androgènes (C
)
1 9
-
29 -
La voie des li 5
La seule différence per rapport à la voie précédemment
décrite,
est que la 3 ~hydroxydéshydrogénase ([1) et l'isomé-
rese ([2)
n'interviennent plus au début mais à la fin de la
chaine de réactions impliquées dans cette étape de synthèse.
Ainsi, sous l'action de le 17-.< hydroxylase ([3) et de la
17-20 desmolase ([4)'
on aboutit à la déhydroépiandrostérone qui
sera ensuite transformée en 64 endrostène-dione.
La conversion des androgènes en oestrogènes se caractérise
par l'élimination du groupement méthyle en C
des androgènes,
1 9
suivie de l'aromatisation du noyau A.
Cette synthèse s'effectue à partir de le à4 androstène-
diane et de la testostérone, ce qui suppose le conversion préa-
lable des tJ.. 5 androgènes comme la déhydroépiandrostérone (Of-lA) en
A 4 androstène-dione
(,6 4 A-O).
Elle commence par la 19-hydroxy-
lation de ces 44 androgènes,
catalysée par une 19-hydroxylase
([1) à NADPH et en présence d'oxygène moléculaire.
Dès lors, la
suite des réactions est très discutée;
toutefois,
d'après les
mécanismes d'aromat:sation récemment rapportés par plusieurs au-
teurs (3,4,49),
il semble que les 19-hydroxy A4 androgènes obte-
nus sont ensuite oxydés,
sous l'action d'une oxydase (E
en
2),
leurs 19-oxodérivés, puis vraisemblablement en leurs 19-carboxy-
dérivés.
-
30 -
Enfin, intervient l'élimination,
soit d'une molécule
d'aldéhyde formique,
soit d'acide formique,
conduisant à l'aro-
matisation du cycle A avec transformation du groupement cétoni-
que en C
en une fonction phénol.
3
En partant de la testostérone et de la ~4 androstène-dione,
on obtient respectivement le 17 Boestradiol et l'oestrone. Une
17 f> hydroxystéroIde-déshydrogénase (E)
permet de transformer
l 1 0 est rad i 0 l
1 7 ~ e n 0 est r 0 n e e t i n v13 r sem e nt.
Une 1 6 ... h Yd r 0 x ylas e (E 5)'
a b s i3 n t e dan s lep lac e n ta,
pe r met
. d an s l'ovaire l'obtention d'oestrogènes 16 Cl( hydroxylés comme
l' oestriol et le 16 ot hydroxy-oestrone respectivement à partir de
l'oestradiol et de l'oestrone (Fig.JIll).
En fait,
l'activité de
cette 16 e(hydroxylase ovarienne serait très faible.
Dans le placenta, les précurseurs de cette synthèse sont
leA4 androstène-dione mais surtout le 16al OH androstène-dione,
issus d'une conversion locale de la déhydroépiandrostène et de
s on '1601. OH dérivé,
d'origine f o e t e I e .
Les produits sont l'oestrone et la 16ciOh-oestrone qui se-
ront en grande partie transformés Lespectivement en oestradiol 17
et en oestriol sous l'action de la 17 ~hydroxystéroîde déshydro-
. génase.
-
31
-
HO
AS-androgènes
~~: 3~OH-déshydrogénase
O~
Isomérase
NADPH + H+
d4-androgènes
J
2
+
O
E
= 19-hydroxylase
1
NADP + H20
H
19-0H-déshYdrogénas~
.
/
19-0x~-64-andrOgènes
19-0H 64-androgènes
E•• = oxygenase
.J
/
CHO
19-oxoâ1 (2) ,4(5)a ndrogènes
OH
formique
soit
soit
HO
oestrone
oestradiol
17ih
Il''U OH
...... OH
160/... OH-oestrone
oestriol
[4
= 17-0H-déshydrogénase
ES = 16.t. -hydroxylase ovarienne
fIGURE VIII
Conversion des androgènes en oestrogènes dans l'ovaire et le placenta.
-
3~ -
d -
e;~;~~;=~~;~~~~~~;;;=g~=~~=~~2~~~~Q~~~=g~Q~=é~2~~~;;
(2-4)
1) Pendant la phase folliculaire du cycle menstruel, l'ovaire
sécrète exclusivement des oestrogènes.
RYAN et SmITH (48) ont, en 1961, montré effectivement, à
partir de tissu ovarien hyperfolliculaire (obtenu par stimula-
tion par l'hormone gonadotrophine chorionique) que la sécrétion
folliculaire chez la femme,
à partir de l'acétate et de la pro-
gestérone marqués,
est essentiellement oestrogénique.
Puis, RYAN et PETRO (50), PATWARDAN et LANTHIER (51), en
incubant ces mêmes précurseurs marqués avec des cellules isolées
de thèque interne et de granulosa, ont confirmé en raison des
métabolites obtenus que, seules les cellules thécales sont pour-
vues de l'équipement enzymatique complet, nécessaire à cette
synthèse; et ce, essentiellement par la voie des ~5, les cellu-
les granuleuses étant pauvres en enzymes d'aromatisation.
Toute la progestérone produite dans les cellules thÉcales
Par la voie des ~4, sert de précurseur pour la synthèse des oes-
trogènes.
Par contre,
d~ns la granulosa, ces auteurs ont observé que
la synthèse emprunte la voie desA4 et s'arrête aux dérivés de
la progestérone;
mais la granulosa qui n'est pas vascularisée
ne peut sécréter sa production de progestérone dans le torrent
sanguin (52).
- 33 -
~u niveau du stroma ovarien,
on observe une synthèse sté-
roidienne qui se fait
par les voiesA4 etA5,
à partir de l'acé-
tate marquée. Cette synthèse est le fait des cellules intersti-
tielles, probablement dérivées de cellules thécales (2).
La voie des A4,
prépondérante,
aboutit à une très forte
production d'androgènes
(~4 androstène-dione essentiellement).
Ceux-ci gagnent en partie les cellules thécales par voie san-
guine pour
être aromatisés en phénolstéroides ; le reste con-
tribue à la production des stéroïdes androgènes retrouvés chez
la femme.
2)
Pendant la phase lutéale du cycle menstruel, l'ovaire sécrète
des oestrogènes,
mais aussi de la progestérone.
SAVARD
(53), par incubation d'acétate et de prégnènolone
marqués en présence de tissu lutéal bovin,
a démontré la réalité
de cette biosynthèse lutéale qui s'effectue essentiellement par
la voie desL44.
Cette sécrétion mixte s'explicue p2r la structure vascula-
risée du corps jaune, constitué à la
fois
de cellules thécales
et de cellules granuleuses.
3)
Au cou r s d e l a pOh a seo var i e n rj e d e l a 9 r 0 s ses se,
l a s y n t h è s e
stéroidienne qui aboutit à la sécrétion progressivement crois-
sante de progestérone et d'oestrogènes,
s'effectue dans le corps
jaune gestatif, dans les mêmes conditions que dans le corps jau-
ne cyclique.
- 34 -
Au cours de cette phase foeto-placentaire,
c'est le syncy-
tiotrophoblaste qui élabore la progestérone par la voie des~4,
tandis qu'il doit collaborer avec le foetus pour synthétiser les
oestrogènes (1-3,5,16,54,55). Cette double synthèse se fait stric-
tement à partir du cholestérol maternel car le placenta,
bien
qu'équipé des enzymes nécessaires,
n'élabore pas CE précurseur
in situ à partir de l'acétate (5).
La nécessité de la participation foetale à la synthèse des
oestrogènes s'explique par l'abse~ce de 17-20 desmolcse dans le
placenta; ce sont les surrénales foetales,
par ailleurs riches
en sulfokinase, qui viennent combler cette lacune placentaire,
par leur 17-20 desmolase.
En outre, l'abondance dans le foie foetal de~5 androgènes
hydroxyl2ses microsomiques (essentiellement la 16~hydroxylase
et accessoirement la
15~ hydroxylase ... ) Explique l'8boutisse~ent
de cette synthèse à des oestrogènes polyhydroxylés,
notamment
l'oestriol et l'oestétrol.
Toutes ces données,
ajoutées à la richesse du syncytiotro-
ohoblaste placentaire en arylsulfatase,
permettent de schématiser
ainsi cette synthèse stéroïdienne
(1,2,5).
Le cholestérol parvient au placenta et au foetus.
Dans le
-
35 -
m RE
ACE!ATE
CHOLESTEROL
________~__~
~~ô5-Prégnènolone-S04
Ô 5-Prégnènolone
surrénales! Surrénales
17 .. OH
•••••••• progesJérone __________+-__~Progestérone
Prégnènolone-S0 4
"..
"..
DHA ...
_
__ .DHA-S0
"
4
Surrénales
1
.1
~ Foie
"
1
"
"
16-<OH-DHA ~=F==~=====16aOH-DHA-S04
1
....
"..
~
f
1 6.i OH 64
A.D.
*
*
"
~
;
1
Testostérone ~4-A.D..
-----+---+--A4-A.D.
..
,
,
:
1
1 1 611( 0 H- °l
..
1
..•
1
•
1
:
1
......
OI I I - S04
"
..
OIV-50
{
4
1 6c{ 0 H- 0 l l 1 7 \\\\- 50 4
PLACENTA
FOETUS
FIGURE IX
Biosynthèse des hormones oestro-progestatives par l'unité foeto-
placentaire (
)
voie neutre de KIRCHNER et coll.)
- 36 -
placenta, le cholestérol est transformé en â5 prégnènolone qui
est,en grande partie,convertie en progestérone libre.
La production journalière de celle-ci, principal gesta-
gène synthétisé par le placenta, a été estimée à environ 250 mg
en fin de gestation;
d'autres dérivés, aussi actifs meis moins
abondants,
telle la 20-dihydroprogestérone, l'accompagnent.
La progestérone produite est libérée à la fois dans les
circulations maternelle et foetale.
La quantité de progestérone ainsi parvenue au foetus est
en partie transformée en Ô4 androstène~dione par la 17-20 desmo-
lase surrénalienne. Cette ~ 4 androstène-dione retourne au placen-
ta où elle est aromatisée en oestrone et en oestradiol-17~; par
contre, i l n'y a pas de 160l. hydroxylase placentaire pour trans-
former localement l'oestrone et l'oestradiol respectivement en
16a(OH oestrone et en oestriol.
Ces derniers stéroïdes,
16o(hydroxylés,
ne se forment es-
sentiellement qu'à partir du sulfate de la prégnènolone.
Celle-ci est en partie synthétisée, puis sulfatée pBr les
surrénales foetales à partir du cholestérol maternel;
l'autre
partie,qui provien~ du placenta,est sulfatée dans les tissus
foetaux.
La mRjeure partie de ce pool de sulfate de prégnènolone
est d'abord transformée en sulfate de déhydroépiandrostérone qui
est presque quanti tati vement 1601.. hydroxylée dans le foie.
37
Le sulfate de 160/. OH-déhydroépiandrostérone ainsi formé
peut aussi être synthétisé dans les surrénales, en quantité
rT'oindre, à partir du sulfate de A 5 prégnènolone.
L'ensemble du sulfate de 16 -OH-dihydroépiandrostérone
retourne au placenta ainsi qu'une quantité plus faible je ce
sulfate de dfhydroépiandrostérone,
y sont hydrolysés so~s l'2c-
tion d'une sulfatase, puis convertis en
16 a(OH/J.4 androstène-
dione et en fj 4 androstène-dione qui sont alors aromatisés en
16::i/.OH-oestrone et en oestrone.
Une 17 ~OH-stéroIde déshydrogénase plac~ntaire permet en-
fin leur passage respectivement en oestriol
(voie neutre de
KIRCHNER et coll.)(54) et en oestradiol.
Il faut,
en outre, si-
gnaler la formation possible d'épioestriol,
en raison de l'exis-
tence d'une 16 ol-hydroxylase hépatic;ue foetale.
Enfin, une partie de l'oestrone et de l'oestradiol pla-
centaire repasse chez le foetus,
y est sulfatée,
puis hydroxy-
lée dans le foie,
notamment en position 16O<et (ou)
150l.;
on
cbtient alors des sulfates d'oestriol,
de 16 ~OH-cestronE,
c'cestétrol ... , qui seront fInalement débarrassÉs ce ~E~, ;rou-
~~re~t sulfate par la su!fatase place~taire (Fig. IX,.
- 38 -
II - Catabolisme des oestrogènes (3,56)
Le catabolisme des oestrogènes,
très complexe, ne se
traduit pas par une réduction du noyau aromatique. Certains
auteurs,
par administration de composés marqués in vivo,
a-
vaient conclu que le noyau tétracyclique n'était pas ouvert
au cours de la dégradation des oestrogènes car ils n'avaient
pas observé d'exhalaison pulmonaire de
gaz carbonique marqué.
Cette thèse est actuellement très discutée car d'autres
chercheurs ont observé que 80 p.100 de
la radioactivité ainsi
administrée sont récupérés dans les urines; dont 20 p.100 seule-
ment sous forme de phénol stéroïdes ! Les autres 20 p.100 qui
n'ont pas été récupérés dans les urines semblent correspondre
au pourcentage éliminé par les matières fécales selon ADLERCREUTZ
et LUUKKAINEN (57);
ces catabolites subissent,
en effet, une
grande excrétion biliaire résultant d'un important cycle entéro-
hépatique.
Cuoi aw'il en s~it, ~n C8 ~wi ccncerne la fr2:ti:n Ex:ré-
tée sous forme d'oestrogènes,
le catabolisme correspond à la dé-
gradation des oestrogènes actifs (oestrone,
oestradiol)
en des
dérivés moins actifs,
plus hydrosolubles,
en vue de leur élimi-
nation ; catalysé par des enzymes hépatiques de la fraction so-
luble,
ce catabolisme se caractérise par (Fig.X)
- la réduction eventuelle du groupement cétonique en C17,
lorsqu'il existe,
par une 17~hydroxystéroIde déhydrogénase.
- 39 -
OH
1
ou
OX 0)
OH ou
"<, OH ou OXO
HO
\\
Î « OH
OH ou OXO
Figure X
Catabolisme des phénol stéroïdes
- l'hydroxylation en C
avec méthylation subséquente eventuel-
2
le, très efficace dans le foie foetal. Ces deux hydroxydérivés
semblent favoriser la croissance foetale.
- la formation de nouvelles fonctions hydroxyles en C4~ , C6~ ,
C7'" ,
C14 ~, C15:l1C. '. C1 6 "" et i\\' C1 8' e n pré sen c e de c 0 e n z ymes à
NADPH et d'oxygène moléculaire.
- l'éventuelle déméthylation des méthoxydérivés et la forma-
tion d'époxydes, surtout dans le cas des oestrogènes polyhydro-
xylés.
- 40 -
Interviennent enfin les processus de glycuroconjugaison
(en 16~ ou (et) en 3~), de sulfoconjugaison des catabolites,
catalysés par des enzymes hépatiques. Les catabolites 16 ~ hy-
droxylés (oestriol,
16l:11 OH-oestrone, oestétrol) sont éliminés,
essentiellement 16 ~ glycuroc onjugués.
Ainsi, pendant la grossesse, l'oestrone et l'oestradiol
du compartiment maternel sont en partie réhydroxylés dans le
foie en oestriol dont l'ensemble est excrété essentiellement
sous forme 16 ol glycuroconjuguée ; tout le reste est éliminé gl,'-
curoconjugué ou sulfoconjugué au niveau de la fonction phénol.
Pour les oestrogènes 16tl(. hydroxylés comme l'oestriol, une
double conjugaison en C
et en C16~ peut ~tre observée.
3
Notons que pendant la phase ovarienne de la grossesse et
le cycle menstruel,
l'oestriol provient essentiellement du cata-
bolisme périphérique (hépatique) de l'oestrone et de l'oestra-
diol ; il n'est un produit de sécrétion appréciable que pendant
la phase faeto-placentaire de la gestation. Ces conSIdérations
conduisent à iï,terpréter la sécrétion massive d'oestriol dans
les deux derniers trimestres de la grossesse comm~ un début de
catabolisme permettant au foetus de se protéger d'une i~prégna
tion massive d'oestrogènes trop actifs.
Les phénolstéroides,
ainsi catBbolisés et conjugués, de-
viennent alors plus hyjrosolu~les et peuvent être excrétés par
le rein. Le tableau III,
inspiré de nombreux auteurs (1,16,58),
donne une indication sur les pourcentages des catabolites li-
-
41
-
bres et conjugu~s dans l'urine de la femme.
%moyen dans les urines
Urine
Urine
de
cycle
de
menstruel
grossesse
Oestrogènes libres
0,5 à 1%
c 0,5%
Oestrogènes glycuroconjugués totaux 94,5 à 95,5%
90 à 94%
Oestriol 16 c(glycuroconjugués
58 à 75%
Oestriol 3 glycuroconjugués
13
à 36%
Oestrogènes 3 sulfoconjugués
4 à 4,5%
5 à 10%
Oestriol 3 sulfate,16 glycuronide
5
à 12%
TABLEAU III
Pourcentage des principaux oestrogènes libres et conjugués dans
l'urine de la femme
(1,16,58)
c~ peut remarquer que,
mclgré l'importance métcbclique des
dérivÉs sulfates chez le foetus,
on retrouve dans l'ur:ne une
grande majorité de dérivés glycuroconjugués (> 90 p.100) par les
tissus maternels. Ceci peut être expliqué par l'activité impor-
tante de la sulfatase placentaire.
Il est aussi intéressant de
noter l'absence d'enzymes de conjugaison et la pauvreté en enzy-
mes d'hydroxylations dans le placenta.
- 42 -
III - Régulation de la biosynthèse des oestrogènes
La régulation de la sécrétion des oestrogènes a été par-
tiellement évoquée lors de l'étude hormonale du cycle ovarien
et de la grossesse.
(chapitre 1)
La biosynthèse des stéroïdes, et en particulier des oes-
trogènes, comporte des facteurs d'inhibition mé~abDlique, essen-
tiellement localisés dans l'étape mitochondriale ; en effet, la
prégnènolone ainsi que le 20~ OH cholestérol inhibent la trans-
formation du cholestérol en AS prégnènolone. D'autre part, le
passage même de la prégnènolone dans la fraction cytosolique à
travers la membrane mitochondriale en vue de sa conversion ulté-
rieure en progestérone ou en déhydroépiandrostérone, peut être
co~sidéré comme un facteur limitant de cette biosynthèse.
Enfin,
ê
étÉ ÉVQc~ée, à un degré bien ~oindre, lé rétro-
inhi~ition de cette stéroïdogénèse par la progestérone et les
androgènes.
A~ cours du cycle menstruel et de la gestation,
la syn-
thèse des hormones stéroïdes, et en particulier des oestrogènes,
est stimulée per l'hormone lutéinisante entéhypophysaire (LH),
-
43 -
puis par l'hormone gonadotrophine d'origine placentaire (HeC).
En effet, i l rassort de nombreux travaux que ces hormones
accroissent :
- la conversion de l'acétate et du mévalonate en cholestérol
- la production de NAOPH
la transformation mitochondriale du cholestérol enA5 prégnè-
nolone, en présence d'acide ascorbique.
- et, par conséquent, la production de progestérone et d'oes-
trogènes.
Le mode d'action de la LH a été étudié par divers auteurs.
Comme d'autres stimulines antéhypophysaires (ACTH), elle agit
par l'intermédiaire de l'AMP cyclique. Ce dernier stimule la sté-
roïdogénèse par un mécanisme qui ne semble pas être définitive-
ment élucidé (Fig.XI).
On avait d'abord rapporté cette stimulation à la seule hy-
perproduction de NADPH,
nécessaire aux étapes d'hydroxylations
(Fig.XI-1). Cette hypothèse n'a pas été confirméE.
Puis,
l'utilisation d'inhibiteurs tels l'actinomycine (in-
hibiteur de la transcription) et la puromycine (inhibiteur de la
synthèse protéique)
a permis de conclure que la lH agit au niveau
de la synthèse de pTotéines spécifiques sur des ARN messagers
~
•
préexistants (rig.XI-2).
D'autre part, ces stimulines,
en modifiant la perméabilité
de la membrane mitochondriale des cellules stéroïdoformatrices,
facilitent la sortie de la prégnànolone dans le fraction soluble
microsomale.
LH,ACTH,HCG
activation de la
phosphorylase
ATP
l ~ Mlllr.... CD
activation ·de
l'adénylcyclase
voie des Pentoses
Clycogène --+ Clucose-6-phosphate
T
,- 2 NADPH.~
2 NADP
activation de
(2)
protéine kinase
J
PhosphorylAlion
Protéines spécifiques ~ activation
des ribosomes
(enzymes)
de le
synthèse proté~que
stéroIdogénèsB
Figure XI
~
c-
lü~ CJ 1J La t ion de la b I 0 S y n t. h è s e des 0 est r 0 q è ne s
- 45 -
Nctons enfin que l'ACTH,
dans le cadre de l'ensemble
de le stéroïdogénèse,
intervient comme la LH,
en induisant
12 synthèse de protéines spécifiques, nécessaires à la sté-
roïdcgénèse •••.
-
46 -
c - mODE D'ACTION ET ACTIONS PHYSIOLOGIQUES DES OESTRO:ENES
- mode d'action des oestrogènes
(3,4,50)
Les oestrogènes sont des hormones,
par consécuent des
substances douées d'une gr2nde activité biologique,
se mani-
fest~nt au niveau d'organes ciDles périphériques (utérus, va-
gin),
du systène nerveux central
ou de Ifhypothala~~s. Le mÉ-
ca~isme de cette activité implique la prÉsence,dans les cel-
l~les cibles,
de
récepteurs cytoplës~iques capables de
recon-
naître et de fixer
l'oestrogène actif.
L'hormone,
portée Jusqu'aux cellules cibles par la Sex-
stÉroid Binding Protein
(SBP)
et
(au)
par la sérum-albumine,
pÉnètre dans le cytoplasme par un mécanisme ~ui demeure mal
Certains autEurs Év=:~e~t Ur transfert passif per diffu-
Slon si~ple tandis que pour d'autres,
i l
s'agirait d'un trans-
fert
actif nécessit.ant une protéine vectrice cytoscliq~e. Dans
ce dernier cas,
qui
semble prévaloir actuellement,
la péné-
tration de l'oestrogène serait favorisée par sa plus grande af-
finité pour cette protéine
vectrice par rapDort à la SBP et à
la séru~-albumine.
-
t..
D~ 8~~Et généralement que,
dans le cytoplasme, l'hor~crE
est prIse en charge par un récepteur protéique de poids ~olécu-
lalre élevé
(6
5). Celui-ci
comporte un site "accepteur" Cê-
~ablE de reconnaître l'oestrogène.
Le c omp e xe "récepteur c y t o s o Li qo e oe s t r o
ï
c
ç
è
o e " migre en-
suite, après modifIcation,
dans le noyau où i l
est reconnu et
ca~té pêr un accepteur protéique nucléaire,
de nature non his-
tone.
Il agit en stimulant la transcriptior de l'acide désoxy-
ribonucléique
(ADN).
L'actio~ hormonale s'exprime alors par la sti~ulctior de
la synthèse de protéines spécifiques
(Fiç.XII).
Il -
Actions physiclogicues des oEstrcoères
(2,4,5,7)
Pendant la grossesse,
notamment au cours du premier tri-
mestre,
les oestrogènes sont nécessaires,
en synergie avec la
rr co e st ferons,
la
Er, dehors de la grossesse,
les oestrGçè~ES sent ~êSCcn-
sa~lEs du développement de l'appareil
reçroducteur féminin.
En
prévisio~ de la nidation,
les phénolstéroIdes,
en
augmentant
lé sinthÈse des prctéines
du muscle utérin (effet anabolisant),
crcvc~uent l'hy~erp12sie de l'endomÈtre (Test d'ASTWOOC).
Ils êssurent la kératin~sation des assises cellulaires
~~ va91G (Test d'ALLEN Et COISY)
et lES oestrogènes dits fai-
bles, co~me l'oestriol, agissent sur le col utérin en induisant
48
Tr-O
o ...
";loboli~ périPhérique
Fig.
XII
-
Mode
d'action
des oestrogènes
Re
Récepteur
Cytosolique.
Rn
Récepteur
Cytosolique
modifié.
P.n.h.
Protéine
non histone.
-
â9
-
ure sécrétion muqueuse locale:
la glaire cervicale.
En outre, les phénol stéroïdes provoquent l'appar:tic n des
cêractères sexuels secondaires chez la femme.
A côté de ces actions
(avent et pendant la grossesse),
les
oestrogènes possèdent d'autres propriétés de type métaboli~ue ;
ils interviennent dans le renouvellement cutêné,
l~ crcissênce
du systèm3 pileux,
la calCIfication des cartilages épipnysaires,
le cataoolisme glucidique.
En raison de leur action hypocholestérolémiante,
les oes-
trogènes ont été considérés comme responsables de
la ~oindre in-
cidence de l'athéromatose chez la femme,
avant la ménopêuse.
Enfin,
outre leur effet anabolisant,
ils provoquent la
réterticn du sodiu r ,
du calcium et du phosphore.
-
50 -
( - PROrIl uRINAIRE DES OESTROGENES CHEZ LA rEm~E
Au cours du cycle menstruel,
les oestrogènes sont eYcré-
tés dans les urines de la femme,
dans un rapport
oestriol
oestrone + oestradiol
inférieur à 1, l'oestriol n'excédant pas 40 p.100 tie l'ensemble
de ces phénol stéroïdes.
On évalue en moyenne cette excrétion à
(7,58)
-
15 pg par 24
heures pendant la phase folliculaire
- 40 ~g par 24 heures ~u mcment o~ se produit le pic oestrc-
génique préovulatoire.
- 30 ~g par 24 heures pendant la phase lutéale.
Pendant la grossesse,
l'élinin8tlon urinaire des oestro-
gènes augmente d'aborc lentement,
puis massivement, les périobes
d'Excrétion lente et massivE correspondant res~ectivement aux
Deux phases ovarien~e et foeto-placentaire de la gestation (fig.XIII:
Da~s les urines,
l'oestriol est le métabolite le plus abondant
i l
représente,
en
fin de grossesse,
près de 95 p.100 des trois
principaux oestrogènes (1,7,16,61,62) contre seulement 40 p.100
BU
cours du cycle menstruel.
Ainsi,
le rapport
-51-
•
..
.o."
........ : ... '
. '
.... ' ..
..
.. .. ..
3
..
' .
.
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..
c
22
30
semaines d'aménorrhée
Fit. XMl -
Courbes moy.... ft ..... •
r-nrioliurie al cours •
la
• a11111
cr.... SchoIIer ft Coll. ca).
L.I. : UmitI ........
M.
: Ccu1II rrtIO',
.
LJ,N : UIIIitI inHrieurI ...... ditt •
.M
.
L.I.e : Limitl inf*ieure c:riticIue al .III:J8
il
Y •
~
...
~
- 52 -
oestriol
oestrone + oestradiol
s'élève et atteint 10 en fin de gestation, reflétant un coef-
ficient de multiplication avoisinant 1000 pour l'oestriol, con-
tre environ 100 pour l'oestrone et l'oestradiol.
A ce stade de la grossesse, l'unité foeto-placentaire sé-
crète 100 à 300 mg d'oestrogènes par jour, chez la femme norma-
le. Si, comme nous l'avons vu précedemment, il reste difficile
de savoir précisément la proportion des oestrogènes excrétés par
rapport à la quantité ainsi produite,
on observe cependant:
- non seulement une évolution parallèle des concentrations
urinaires et plasmatiques avec une corrélation r = 0,72 d'après
SCHDLLER et coll.
(8),
- mais aussi, et surtout,
une excellente corrélation entre
l'oestriolurie et la croissance foetale (5,8)
; en ce qui con-
cerne la prégnandiolurie (5),
la corrélation n'est bonne qu'a-
vec le développement placentaire.
Certains auteurs,
comme 8ELING (64)
ont aussi établi une
relation linéaire entre l'oestriolurie et le poids foetal.
D'autre part,
JAYLE
(5,58),
puis de nombreux auteurs,
n'ont observé aucune différence sur la signification sémiologi-
que de l'oestriolurie et de
l'oestrogénurie totale en fin de
gestation. En effet,
l'oestriol constituant 90 à 95 p.100 des
oestrogènes totaux, il est évident que toute variation appré-
ciable de l'excrétion de l'oestriol se répercute également sur
-
53 -
celle des oestrogènes totaux.
Ce sont ces considérations qui ont justifié et justifient
encore l'utilisation isolée ou non de l'oestrogénurie totale
ou de l'oestriolurie pour la surveillance biologique de la gros-
sesse.
Signalons enfin que l'oestétrolurie, l'oestriolémie et
l'oestriol amniotique ont la même valeur sémiologique que l'oes-
triolurie mais leur évaluation est encore plus difficile.
- 54 -
CHAPITRE III
INTERET DE LA DETERmINATION DES OESTROGENES URINAIRES AU
COURS DE LA GROSSESSE
Etant donnée l'importance biologique des oestrogènes,
leur
dosage présente,en clinique,
un intérêt rrajeur,
tant dans le ca-
dre de
l'endocrinologie générale,
pour caractériser les dysfonc-
tionnements possibles de
différentes glandes productrices (ovai-
res,
testicules,
surrénales)(4,6),
que dans celui de l'obstétri-
que pour la surveillance biologique de la grossesse (1,5,7,8-16).
Notre travail et donc notre exposé se lirritent à cette dernière
orientation.
Les dosages,
pour des raisons évidentes de commodité tech-
nique se sont d'abord limités à ceux des oestrogènes urinaires.
Plus récemment,
les méthodes par radioi~munologie et par radio-
compétition protéique (65-70),
en particulier,
ont permis d'a-
border avec plus de facilité les dosages plasmatiques des oes-
trogènes.
Notre but étant de mettre BU point une méthode simple de
-
55 -
dosage des oestrogènes urinaires de
fin de grossesse, c'est
surtout sur l'intérêt de cette exploration que l'accent sera
mis.
Deux périodes seront à considérer
le premier et les
deux derniers trimestres de la grossesse.
A - LA PERIODE DU PREmIER TRImESTRE
Comme nous venons de le voir,
on observe au cours des six
pre~ières semaines de la gestation,
une augmentation certaine
de la concentration des oestrogènes dans l'urine et dans le
sang.
Leur détermination urinaire peut permettre de confirmer
une présomption de grossesse (58).
En fait,
l'on préfère à ce stade,
procéder à la recherche
plus significative et plus simple de
l'HeC pour établir le diag-
nostic de la grossesse.
Le dosage des oestrogènes ne s'impose que dons les évolu-
tions pathologiques du premier trimestre de la gestation.
- S6 -
l - Les menaces d'avortement
(1,5)
Certains auteurs
(1,71)
estiment,
ou rapportent,
que
30 p.100, sinon 80 p.100 des ovules fécondés seraient perdus
du fait d'anomalies génétiques léthales.
Il en résulterait
que les avortements sont assez rarement provoqués par un défi-
cit hormonal.
D'autres, comme GELLE et coll.(72)
observent au contraire,
à la suite de
JAYLE
(5) que la plupart des avortements sont en
rapport avec une déficience hormonale qui est le plus fréque~
ment oestrogénique. Dans ce cas,
il est difficile de savoii
s'ils sont le reflet d'une insuffisance sécrétoire primitive
ou s'ils sont secondaires à la déficience générale de l'unité
foeto-placentaire.
Quoi qu'il en soit,
avant la 8ème semaine de gestation,
les oestrogènes totaux et le prégnandiol urinaires,
dosés avant
et sous stimulation par l'HeG (épreuve de JAYLE) permettent de
dÉceler l'insuffisance du [crps
jawne gestatif ; cette insuffI-
sance sécrétoire peut être globale,
souvent oestrogénique,
rare-
ment lutéinique dissociée.
Cela peut permettre alors,
en corrigeant sans délai cette
déficience stéroidienne par la thérapeutique substitutive adé-
quate, de prévanir l'avortement.
Vers la fin du premier trimestre (entre les 8ème et 13ème
semaines), période au cours de laquelle l'activité endocrine du
-
57
-
syncytiotrophoblaste se substitue à celle du corps jaune ges-
tatif,
on enregistre de nombreux avortements;
des informations
sur les capacités sécrétoires des différents compartiments peu-
vent être obtenus par des dosages hormonaux.
Ainsi,
une insuffisance de l'excrétion de l'oestriol et
l'oestétrol reflète l'hypofonctionnement de l'unité foeto-pla-
centaire intégrée,
de même que l'abaissement du rapport
0111
01 + 011
au dessous de
1,5 ou 1.
Notons par ailleurs que la progestéronémie et la prégnan-
diolurie reflètent l'état fonctionnel du corps
jaune gestatif,
puis du syncytiotrophoblaste,
tandis que l'HCG traduit celui du
cytotrophoblaste.
Ainsi,
différents types de profils hormonaux peuvent être
observés au cours de l'exploration biologique des avortements
endocriniens (1,73)
du premier trimestre,
parmi lesquels le pro-
fil hypo-oestrogénique semble être le plus fréquent.
A côté de ces avorterrents e~docriniens et généti~~es, il
convient de signaler l'existence d'a.ortements de causes méca-
niques telle l'incompétence cervicale, l'irritation post-inflam-
matoire et infectieux du col et de l'endomètre utérins qui se
caractérisent par un tableau hormonal normal.
- 58 -
II - La mort de l'oeuf in utéro
Au cours du premier trimestre, caractérisé par le fonc-
tionnement maximum du cytotrophoblaste, le diagnostic de la
mort de l'oeuf in utero est fondé sur la détermination plus ai-
sée et plus rapide de l'HCG.
Ainsi, entre les 8ème et 12ème se-
maines de la gestation, une excrétion urinaire de la HCG au des-
sous de 900 u.I/24 heures signe la mort de l'oeuf.
Néanmoins,
il est possible d'envisager vers la fin du tri-
mestre, la détermination de l'oestriol urinaire dont la chute
est plus précoce en cas de mort de l'embryon (1,16)
; dans ces
conditions, en effet, l'oestriolurie devient inférieure au 1/10e
de la moyenne admise au moment du dosage.
On peut sensibiliser cette détermination par l'utilisation
- soit du rapport
0111
qui,
en cas de mort de l'embryon,
DI + 011
s'éffronde au dessous de 1,5.
- soit le coefficien: DI
+
011
x 100,
proposÉe par l'Ecole
0111
Lyonnaise. Celui-ci, normalement inférieur à 10, devient supé-
rieur à 60 en cas d'atteinte foetale.
-
59 -
B - LA PERIODE DES 2ème ET 3ème TRImESTRES
Pendant cette période, nous avons vu que le taux de l'HCC
n'est plus représentatif de la viabilité de l'unité foeto-pla-
centaire. C'est la sécrétion oestrogénique qui alors,
présente
le plus d'intér~t. En effet, plusieurs auteurs (5,8,64) ont é-
tudié la relation entre celle-ci et le développement foetêl
ils ont pu établir une bonne corrélation entre l'oestriolurie
et le poids foetal,
notamment au-delà de la 29ème semaine de la
grossesse.
Ainsi,
une oestriolurie de 20 à 30 mg par 24 heures
correspondrait à un foetus de 2,5 à 4 kg
un taux très élevé
(supérieur à 40 mg) évoquerait un gros foetus
(poids supérieur
à 4 kg)
ou une gemellarité ; à l'inverse,
un taux très faible,
traduit une hypotrophie foetale sinon la mort in utero,
souvent
consécutive à une souffrance foetale plus ou moins sévère.
Par conséquent, nous essaierons de dégager l'intérêt de
l'oestrogénurie totale ou de l'oestriolurie dans les cas:
- de souffrance foetale et de mort in utero
- de la prématurité
- et de la grossesse prolongée.
-
60 -
1 - La souffrance et la mort foetale in utero (9)
Au cours de cette période, notamment du dernier trimestre,
de nombreuses grossesses dites "à haut risque" connaissent une
évolution difficile ; les circonstances étiologiques qui la font
redouter et qui, par conséquent,
obligent à instituer une sur-
veillance foetale accrue, peuvent se résumer ainsi :
les antécédents d'échecs obstétricaux concernant l'enfant
mort foetale in utero, mort néo-natale, avortements répétés,
prématurités.
- les antécédents pathologiques maternels de la grossesse et
de l'accouchement: toxémie gravidique, pré-éclampsie, iso-immu-
niSction Rhésus (ou ABD), accouchements dystociques, métrorra-
gies graves et récidivantes.
- les pathologies médicales maternelles associées à le gros-
sesse en cours: cardiopathies, hypertensicn artérielle,
néphro-
pathie, diabète, rhumatisme,
anÉ~ies et autres hémopathies,
to-
xémie gravidique et pré-éclampsie, les infections, notamment les
hépatites (10), les septicémies et l'infection cervico-vaginale.
En ce qui concerne les infections,
il faut citer la rubéole, la
toxoplasmose et les rikkettsioses,
la cytomégalovirose qui peu-
vent être à l'origine de dysmaturité et de malformation foetaiesi
et les septicémies néo-natales.
- les grossesses tardives (risques d'aberrations chromosomi-
ques) et les grossesses induites thérapeutiquement (soit eu clo-
-
61 -
mifène, soit à l'association HmG + HCG)
- enfin, les mauvaises insertions placentaires et certaines
malformations foetales primitives (agénésies Burrénaliennes (74),
anencéphalies (75), hydrocéphalies, spina-bifida) dont le diag-
nostic de certitude peut être fait par des techniques échogra-
phiques,
souvent avec l'aide de la biologie ; ainsi,
l' t)(. foeto-
protéine amniotique permettrait de réaliser par son taux anor-
malement élevé, le dépistage précoce de la spina-bifida et de
l'anencéphalie (76).
Dans tous les cas,
une surveillance foetale s'impose au
cours de laquelle le dosage de l'oestriolurie est capital. Le
rythme des déterminations doit tenir compte de l'état clinique
et du fait qu'un dosage isolé n'a de
valeur que de dépistage
et pour les 48 heures à venir.
Il est donc important de répé-
ter les dosages pour suivre l'évolution générale de la sécré-
tion oestrogénique. Si des dosages hebdomadaires conviennent
pour des évolutions cliniques et biologiques favorables
(oes-
triolurie >12 mg/24 heures au cours du dernier trimestre),
dans de nombreux cas,
des dosages quotidiens ou toutes les 48
heures peuvent s'avérer nécessaires.
Afin d'être efficacement
in ter pré t ab les, c e s- dos age s do ive nt ê t r e réa lis é 5 par lem ê me
laboratoire, par la même technique, plutôt rapide, et, de
pré-
férence,
sur la diurèse des 24 heures. L'utilisation du rapport
oestriol
(m9)/cr~atinine (g),introduit par DICKE~ et coll. (77) ,
pourrait permettre d'éliminer toute dispersion de résultats
liés à un défaut de recueil des ur:~es.
- 62 -
Enfin, faut-il savoir qu'il existe des variations indi-
viduelles normales de l'oestriolurie ; ainsi, une chute
n'est
interprétable que si elle persiste au moins 2 à 3 jours de
suite et qu'elle excède de 30 à 40 p.100 la moyenne des 3 der-
niers dosages (9,63,78).
De nombreux auteurs (9,13,63,79,80)
ont essayé de dsli-
miter une zone dite "subnormale"
de l'excrétion de l'oestriol
qui correspondrait aux cas où la souffrance foetale est quasi
certaine. Cette excrétion serait de l'ordre de 7 à 12 mg par
24 heures au voisinage du terme de la gestation.
C'est dans cette zone que plusieurs auteurs préconisent
une surveillance aussi complète que possible de la fin de la
grossesse et du travail au moment de l'accouchement. Lorsque
l'oestriolurie est inférieure à 1 mg/24 heures avant la 33ème
semaine de gestation, elle signe la mort du foetus (13,79).
Au
delà des 33 premières semaines, les observations de nombreux
auteurs
(8,9,12,13,14,79,80)
indiquent qu'une oestriolurie in-
férieure à 4 ou 5 mg par 24 heures signe la mort du foetus.
BJORD (11), BROWN et CDYLE (15), HUSHINSKY et CHI (81),
,puis récemment BARR AT et HUSSENOT (9), en rapportant l'oestrio-
lurie à des situations cliniques précises, soulignent l'intérêt
capital de cette constante biologique pour la surveillance du
dernier tiers des grossesses à haut risque.
-
63 -
vasculorénaux
=============
Au cours des syndromes vasculorénaux (toxémie, pré-
éclampsie, hypertension artérielle) les risques de mortalité
péri et néonatale sont élevés et de nombreux auteurs s'accor-
dent à reconnaitre que lorsque l'oestriolurie est inférieure
à
12 mg/24 heures,
au voisinage du terme de la gestation, ou
marquée par des chutes brutales, elle traduit une souffrance
foetale clinique effective,
bien que l'hypo-oestriolurie soit
en partie le fait d'une diminution de la clairance de l'oes-
triol au cours de ces syndromes, l'oestriolémie étant élevée.
( 82) .
15,79)
L'association d'une grossesse à cette affection pose le
problème de la conduite thérapeutique,
toujours difficile à
maitriser. Pour éviter les complications, tant chez la mère
que chez le foetus
(mort foetale subite in utero),
i l
faut
pouvoir écourter ces grossesses; ce qui n'est pas sans dan-
ger quand on cannait les risques de mortalité néo-natale due
à la prématurité. Pour de nombreux auteurs,
l'oestriolurie est
un procédé de choix pour surveiller ces grossesses jusqu'à ma-
turité foetele suffisante. Certains ont cependant observé
•
-
64 -
qu'une mort foetale subite peut survenir pour un taux normal
ou subnormal de l'oestriolurie. En fait,
BARRAT et HUSSENOT
(9) pensent que si l'oestriolurie est normale,
i l
n'y a pas
de risque, mais qu'il faut pratiquer des dosages rapprochés,
la chute pouvant être brutale; par contre, lorsque l'oestrio-
lurie est subnormale (7 à 12 mg/24h),
il existe une souffrance
foetale chronique, souvent associée à un syndrome v2sculorénal
fruste. C'est surtout dans ce cas qu'il faut envisager l'in-
t"erruption de la grossesse dès que le foetus est viable.
c
-
!~~~~~~=g~=~~2~~~~~2!~~~~=~~=~2~~~=g~=!~~Q~2~g~~~~~
~~~~=~g~;~g
Dans l'incompatibilité Rhésus, l'intérêt de l'oestriolu-
rie n'est réel que lorsqu'il est associé au dosage de la bili-
rubine amniotique.
BARRAT et HUSSENDT (9) concluent à la suite de PANIEL et
CHAVIGNIE (83)
que :
- lorsque l'oestriolurie est basse (~7 mg) et la bilirubine
amniotique élevée, l'issue est fatale quel que soit le traite-
ment car l'anasarque est étaJlie.
- lorsque l'oestriolurie est subnormale (7 à 12 mg/24h)
et
la bilirubine élevée, i l y a souffrance foetale,
mais pas enco-
re d'anasarque foetale.
- 65 -
- lor.qu'on ob•• rv. une chute de l'oeetriolurie qui était
nor~le ou .ubnorael., elle .ig"e le d4t'rioretion foetele eé-
v~re ; sl le bilirubine amniotique est eussi ~levée, alors il
•• t
trop terd pour tenter le tren.fusion de aeng in utero.
- epr•• tren.rueion 1n ut.rD, l'oestriolurie devrait être
<.
pr'coni'" pour eulvre l"volution de l"tet foetal:
une chu-
te d'environ 20 p.100 dens les 48 heures sera normelement ob-
.erv'., con.'~u.nt. eu traumetisme poet-trensfusionnel, mais on
doit voir l'o.striolurie se relever (pronostic positif) ; si la
bei . . . pe~i.te o~ si elle survient epr•• une petite phase d'aug-
a.ntetion, .11. doit Atre con.id~r~B comme un signe d'alar~e.
Co. . . pour 1. dieb'te et le dy.~eturité, on interrompre la gros-
••••e d•• que le 8eturlt' foetele sere jugée .uff~sante (compte
tenu de l'oestriolurie, de l'âge foetal, et également du rap-
port l'ci thine/.phingom,éline ••. )
Dans certains ces, au cours des syndromes vasculoréneux,
du diabète, des incompatibilités Rhésus, l'oestriolurie est in-
,férieure à la normale;
il s'agit alors soit de petits foetus,
soi t de .ouffrence ·foetele chronique.
En fait, ces hypotrophies qui sont elors le traduction
d'une souffrence foetale plus ou moins sévère, peuvent être ob-
•• rv'e eu •• i eu cour. de .el'otaetions prieitives greves et
- 66 -
dans de nombreuses affections de la mère
- cardiopathies, h~mopathies
- femmes à ant~c~dents marqu~s par des troubles d'infertili-
tés, des avortements répétés,
des accouchements prématurés et
de mort foetale in utero.
En conclusion, on peut dire que la dysmaturité est souvent
la conséquence d'une souffrance foetale;
la surveillance régu-
lière de l'oestriolurie permet de pousser ces grossesses jusqu'à
maturité suffisante.
L'oestriolurie ne permet ni de les prévoir, ni d'en pré-
ciser l'étiologie (décollement placentaire normalement ou bas
inséré). Elle permet, par contre, d'apprécier l'importance de
la souffrance foetale induite par ce décollement placentaire
qui aura dégradé le bon fonctionnement de l'unité foeto-placen-
taire, ce qui peut être déterminant pour l'attitude médicale
ultérieure.
-
67 -
Il - Oestriolurie et prématurité
L'oestriolurie ne permet pas de prévoir un accouchement
prématuré, notamment lorsque celui-ci ast de cause mécanique
(incompétence cervicale, infection cervico-vaginale). Dans le
second cas, c'est l'irritation inflammatoire du canal endocer-
vical et du pôle inférieur de l'oeuf qui déclenchent. par voie
reflexe,
la contractibilité utérine intempestive et l'Expul-
sion foetale (84).
Par contre, pour les dysmatures qui naissent prématuré-
ment et spontanément, une souffrance foetale est souvent en
cause et la surveillance de l'oestriolurie est essentielle
dans la décision thérapeutique (9,79).
5i l'oestriolurie est normale,
on peut alors retarder ~é
dicalement l'interruption de la grossesse.
- 5i,au contraire, l'oestriolurie est faible,
i l
est préfé-
rable de laisser l'accouchement prématuré se récliser naturel-
lement car il y a souffrance foetale chronique.
I I I
-
Les grossesses prolonçées (1,9,12,79)
Il Y a grossesse prolongée si celle-ci se poursuit au-
delà des 265 jours habituels. Souvent, c'est l'incertitude sur
le début de la gestation qui pose celle de son terme.
Dans ces ces, il se pose le problème de l'appréciation
- 68 -
de la souffrance foetele,
provoquée par un placenta trop vieil-
lissant, de plus en plus inepte à assurer ses fonctions de bar-
rière de protection contre des substances toxiques susceptibles
d'atteindre le foetus/et ses activités sécrétoires.
De nombreux auteurs dont [CHI et COHEN (80),
GREENE et
coll.
(12) préconisent d'attendre, lorsque le courbe d'excré-
tion urinaire de l'oestriol est normale (supérieure à 12 mg/
24h) le déclenchement naturel du travail; dans ce cas, le nou-
veau-né présente à la naissance des signes caractéristiques de
post-maturité: grande taille,
amaigrissement, desquamation cu-
ta,ée. Si l'oestriolurie est comprise entre 7 et 12 mg/24h,
il
faut déclencher le travail et recourir à la césarienne quand
elle est inférieure à 7 mg/24h (12).
-
69 -
[ - LE CAS PARTICULIER DE LA mÔLE HYDATIfORmE ET DES
CHORIOCARCINomES (1)
l - La môle hydatiforme
['est une maladie primitive du trophoblaste qui présente
des aberrations chromosomiques.
Elle se caractérise biologiquement par l'augmentation mas-
sive de l'HCG dans le sang et les urines (1 à 5.000.000 U.I/l
dans les urines), une prolactinémie nulle mais aussi par une hy-
pooestrogénurie liée à la souffrance, sinon à la mort d'un foe-
tus étouffé et en voie de lyse. Le dosage des oestrogènes inter-
vient donc dans l'établissement du diagnostic. En ce qui concer-
ne la surveillance biologique post-chirurgicale, c'est le dosage
de l'HeC qui permet de suivre la guérison.
II - Les choriocarcinomes
Les choriocarcinomes placentaires sont des tumeurs tropho-
blastiques malignes, secondaires à une grossesse môlaire,
ecto-
pique ou normale.
Ils se locelisent, le plus souvent, dans la sphère pelvien-
ne et se cerect~risent per une s~cr~tion importente meis releti-
- 70 -
vement modérée de la HCG (500 U.I/l), sauf en cas de métasta-
ses. Cette sécrétion contraste avec un tableau stéroIdien
presque nul puisqu'il n'y a pas de foetus.
Quant eux choriocarcinomes dits "primitifs" qui sont
des tumeurs cancéreuses à localisation gonadique, pulmonaire,
ils sécrètent des quantités massives d'une hormone qui ressem-
ble à l'HCG mais qui présente une légère différence antigénique.
Dans ce cas aLssi, le tableau stéro!dien est négligeable
du fait de l'absence de foetus.
Cependant, sous l'influence de la stimulation anormale et
persistant~ de cette HCG cancéreuse ou môlaire, les sécrétions
d'oestrogènes et de progestérone finissent par être supérieures
à celles pouvant être produites par des ovaires normaux.
Dans
le cas des grossesses môlaires, des études récentes (85)
ten-
dent, en effet, à prouver que la production des stéroides est
d'origine syncjtiale et non ovarienne.
Aussi, les dosages de l'oestriol ou de l'estétrol, l'un
essentiellement et l'autre strictement d'origine foetale,
sont-
ils très indiqués car les résultats sont en rapport avec l'ab-
sence d'unité foeto-placentaire.
Comme pour la môle, la surveillance post-chirurgicale ne
sera effectuée que par le dosage de l'HCG.
-
71 -
o - CONCLUSION
Ainsi, ressort-il de cette ~tude que le dosage des oes-
trogènes totaux urinaires ou de l'oestriol constitue un test
biologique de choix pour la surveillence des grossesses nor-
males, pathologiques et prolongées. Les dosages de l'oestriol
ou l'oestétrol peuvent contribuer à l'établissement du diag-
nostic de la môle et des choriocarcinomes.
Cependant,
il faut se souvenir du rare mais possible dé-
ficit en sulfateee placentaire (46),
responsable d'une sécré-
tion oestrogénique très basse par l'unité foeto-placentaire
il n'en résulte aucune conséquence clinique (47).
- 72 -
CHAPITRE IV
LES METHODES DE DOSAGE DES OESTROGENES URINAIRES PENDANT
LA GROSSESSE
Une revue de la littérature montre que de nombreuses mé-
thodes ont été proposées pour le dosage des oestrogènes uri-
naires au cours de la grossesse. Cette abondance de techniques
reflète, non seulement l'intérêt particulier des résultats re-
cherchés, mais aussi et surtout la difficulté de cette évalua-
tion.
Nous ne reviendrons ni sur les méthodes polarographiques,
ni sur celles liées à l'absorption du noyau A des phénolsté-
roïdes dans' l'U.V.,
ni sur les méthodes biologiques,
désormais
historiques,
fondées sur:
- l'appréciation de l'action kératinisante des oestrogènes
sur la muqueuse utérine de souris femelles impubères ou ova-
riectomisées (Test d'ALLEN et DOISY).
- l'induction d'une augmentation pondérale de l'utérus de
rates impubères ou ovariectomisées (Test d'A5TWOOD).
La plupart des techniques ectuelles du dosege comportent
- 73 -
une hydrolyse lib~rant les oestrogènes de leurs formes glycuro-
et sulfo-conjugu~Bs, pr~sentes dans l'urine.
De la sorte, les ph~nolstéroïdes deviennent extractibles
par des solvants organiques ou par voie chromatographique, ce
qui permet leur purification, puis leur dosage. De ce fait, la
m~thodologie classique comporte quatre temps essentiels:
- le prélèvement des urines et leur conservation éventuelle
- l'hydrolyse
- l'extraction,
la purification et l'isolement éventuel de
l'oestriol.
- la détermination quantitative.
A - LE PRELEVEMENT
Il constitue une étape importante de l'analyse.
Il consis-
te à recueillir toute la diurèse des 24 heures, le contrôle de
l'intégralité du recueil des urines étant possible par l'évalua-
tion de la créatininurie.
Celle-ci, rel~tivement constante, est estim~e à 18-20 mg
par kilogr~mme de poids corporel et par 24 heures chez la femme.
Dans le ces d'~n recueil isol~, la cr~atininurie doit être com-
prise entre 0,70 et 1,40 9 par 24 heures.
S'il s'agit de recueils quotidiens successifs, SCHOLLER
- 74 -
et coll.
(78) indiquent que les variations normales de deux
créatininuries consécutives n'excèdent pas 10 p.100 dans 63
p.100 des cas, et que le rapport
(
_ créatininurie jour + 1 )
r -
créatininurie jour
est compris entre 70 et 140 p.100 dans plus de 95 p.1DD des
cas.
De nombreux auteurs
(
78,86), à la suite de DICKEY
(77) préconisent d'exprimer les résultats du dosage des oestro-
gènes par rapport au gramme de créatinine urinaire, ce qui au-
rait l'avantage de
réduire l'incidence des prélèvements incom-
plets.
SCHOLLER et coll.
(63)
ont observé que l'usage de ce
oestriol
t
r app o r
a t i n i
n'améliore pas les résultats de manière si-
ê
crea lnlne
gnificative, ce qui pourrait être la conséquence du prélèvement
correct de leurs échantillons urinaires.
En ce qui concerne la durée du recueil,
plusieurs moda-
lités ont été proposées. Le recueil de 48 heures, préconisé par
KLOPPER (87), en
1964, n'a pas été adopté, car i l est manifes-
tement trop long. Devant le caractère urgent que revêt le dosa-
ge en fin de grossesse, plusieurs auteurs ont cherché à écour-
ter la durée du recueil.
KLDPPER (87), lui-même, a essayé de montrer qu'un recueil
de 2 heures, effectué dans certaines conditions standards, don-
ne des résultats fiables.
-
7S -
En fait,
nombreux sont les chercheurs qui ont préconisé
sans succès les recueils de 2,
4, 6, 8 heures et dont les é-
checs, liés à une trop longue dispersion des résultats, sont
rapportés par SCHOLLER et coll.
(78).
Récemment, BIEZINSKY et mILLNER (88) semblent avoir mon-
tré la possibilité de se contenter des urines du matin, sens
préciser l'heure de la dernière miction précédant la période
correspondant au recueil des urines. Les résultats dB dosages
consécutifs,rapportés au litre ou à le créatinine,seraient
moins fluctuants qu'avec la diurèse des 24 heures et ce, aussi
bien au cours des grossesses normales que dans les grossesses
dites !là haut risque".
La corréaltion donnée par les deux types de prélèvements
serait: r = 0,88, les résultats des urines du matin étant lé-
gèrement plus élevés.
Enfin, SCHOLLER et coll.
(78) rapportent récemment que
l'excrétion nocturne de
12 heures est légèrement supérieure à
celle des 24 heures
(rapport de corrélation:
r = 0,98).
Il ressort de tous ces travaux que c'est le prélèvement
sur 24 heures qui fait encore l'unanimité, les autres étant
caractérisés par une trop longue dispersion des résultats;
on
n'utilisera le recueil nocturne des 12 heures que pour des cas
exceptionnellement urgents (63).
Si le dosage doit être exceptionnellement différé, il
est nécesaeire de prélever les urines sur un conservateur anti-
-
76 -
septique comme le merthiolate de sodium (merseptyl), l'azide
de sodium, le butanol, le thymol, le chloroforme ••• , puis de
les conserver
- soit à -20°C pendant plusieurs mois
- soit en chambre froide
(+4°C), après une brève stérilisa-
tion de 10 minutes au bain-marie bouillant ou après lyophilisa-
tion
- soit en chambre froide.
Notons qu'après trois mois de con-
servation de cette manière (à +4°C), nous n'avons pas constaté
de variations significatives de la concentration des oestrogènes
en ce qui nous concerne, ceux-ci étant relativement stables en
milieu urinaire,
en dehors de toute pullulation microbienne.
SCHOLLER et coll.
(23) pensent même qu'un séjour de 15
jours,à la température du laboratoire,
n'est pas préjudiciable
à condition que les urines soient stockées dans des flacons
plastiques opaques, en présence d'antiseptiques.
Enfin,
il convient de savoir que certaines drogues comme
l'Ampicilline diminueraient
(89)
la sécrétion des oestrogènes;
que la phénolphtaléine (89)
intervient pour diminuer l'intensi-
té de la coloration obtenue par la réaction de KOBER, quel que
soit le mode d'hydrolyse adopté;
que la méthénamine, le for-
maldéhyde et la mandélamine,qui sont des antiseptiques urinaires,
affectent le dosage en provoquant la destruction des oestrogènes
au moment de l'hydrolyse minérale (89,90).
Il faut donc tenir
compte de ces interférences possibles pour l'interprétation des
résultats.
- 77 -
B - L'HYDROLYSE
L'hydrolyse des oestrogènes conjugu~s peut être réalisée
de deux façons :
- l'hydrolyse acide ou min~rale
- l'hydrolyse enzymatique
l
- L'hydrolyse minérale (5S)
Elle conserverait encore de nombreux partisans en raison
de son faible prix de revient et de sa rapidité. Les conditions
optimales d'hydrolyse des deux esters sont très différentes
ainsi, les esters-sulfates sont quantitativement hydrolysés
dans des conditions où les glycuronides sont parfaitement sta-
bles. Aussi, est-on obligé, afin que la réaction soit quantita-
tive, d'élever la concentration en acide (Hel 7,2N) si l'on
procède à la température du laboratoire,
soit de chauffer à ébul-
lition à reflux pendant une heure en présence d'environ 15 p.100
(v/v) d'acide chlorhydrique fumant
(densité: 1,19).
BROWN et coll~ (91), en opérant sous pression et à 120°C,
réduisent le temps de chauffage à 15 minutes.
L'acide sulfurique, à molarité identique, présente la mê-
me efficacité que l'acide chlorhydrique. D'autres acides plus
faibles, comme l'scide aminonaphtolsulfonique ont ~té utilis~s.
- 78 -
Quelle que soit la nature de l'acide, ce mode d'hydrolyse
présente un grave inconvénient: c'est la dégr~dation de 15 à
30 p.100 des oestrogènes avec production d'une grande quantité
d'impuretés dont i l est difficile de se débarrasser.
Cette perte peut atteindre 75 p.100 pour les urines ri-
ches en sucre (glucose, lactose, fructose,
saccharose) ou con-
tenant certaines substances comme le formaldéhyde,
la méthéna-
mine, la mandélamine (89,90).
En ce qui concerne les sucres, plusieurs auteurs dont
SCHINDLER et coll.
(90) suggèrent de les éliminer avant l'hy-
drolyse par un traitement au borohydrure de sodium, ce qui sup-
pose leur recherche préalable. D'après les mêmes auteurs (89,
90), l'augmentation de la densité urinairE
diminue le rende-
ment de l'hydrolyse minérale.
L'addition de réducteurs de protection ou celle de l'aci-
de après le début de l'ébullition de l'urine n'améliorent pas
le rendement de manière significative, même pour les urines
normales.
Semble plus intéressante l'hydrolyse sur une partie ali-
quote des urines préalablement diluées au dixième (BROWN)
mais cela oblige à travailler avec de trop grands volumes uri-
naires, ce qui favorise les émulsions lors de l'extraction or-
ganique des phénolstéroIdes libérés.
Ainsi, l'hydrolyse acide favorise une dégradation impor-
tante des oestrogènes, même en dehors des cas particuliers d'u-
- 79 -
ines mélituriques ou contenant certains médicaments, ce qui
Jmpromet de façon non négligeable l'analyse subséquente.
Aussi, beaucoup d'auteurs préfèrent l'hydrolyse enzyma-
ique.
1 - L'hydrolyse enzymatigue (58)
C'est à la suite des observations initiales de COHEN et
ARRIAN (1935), puis de PATTERSON (1937)
que l'hydrolyse des
sters de stéroides par les ~glycuronidases et les arylsulfa-
ases a été adoptée.
Aujourd'hui, plusieurs préparations enzymatiques diffé-
ant par leurs conditions optimales d'action sont utilisables.
es extraits enzymatiques de ~glycuronidase proviennent, soit
le bactéries (certaines espèces de E.Coli), soit de suc diges-
:if d'escargots (Hélix Pomatia, Patella Vulgata ••• ), soit de
'oie de boeuf. L'activité ;lycuronidasique est titrée en unités
"ishman.
Le tableau IV résume les conditions optimales d'action de
~uelques-unes de ces ~glycuronidases • Parmi ces extraits enzy-
latiques, le plus utilisé est le suc d'Hélix Pomatia, purifié
)ar JARRIGE et qui contient à la fois une ~glycuronidase et une
srylsulfatase. JAYLE et ADESSI (92,93), puis SCHDLLER (23),
JAN DE CALCEYDE et coll.
(40), GOTELLI et coll.
(42) en ont vul-
.
~eris' l'usage respectivement à 56°C pendent une heure et à 62°C
- 80 -
pendant 27 minutes, détruisant ainsi l'un des ergume~ts essen-
tiels en faveur de l'hydrolyse minérale: se rapidité.
Il suf-
fit d'élever le concentration en enzymes dans le milieu réac-
tionnel.
Unités
Origine de la
Fishman
par
pH
Température
Durée
~glycuronidase
ml d'urine
f>glycuronidese hépa-
750
4,7
47 DC
16 à 24h
tique de boeuf
~glycuronidase bac -
150
6,2
37°C
16 à 24h
térienne
~glycuronidase de suc
750 à 1.000
5,2
37 DC
16 à 24h
d'Hélix Pomatia
5.000
5,2
56 DC
1h
15.000
5,2
60 à 62 DC
27 à 30mm
TABLEAU IV
Conditions optimales d'action des principales glycuronidases
Une hydrolyse enzymatique rapide, à la température du la-
boratoire ou à 37 DC· serait possible avec certaines glycuronida-
ses bactériennes. Néanmoins, dans une récente étude comparative
GRAEF et coll.
(94) montrent que le suc d'Hélix Pomatia est l'e-
gent le plus indiqué pour le dosage des oestrogènes.
Un autre avantage du suc d'H'lix Pomatia sur les autres
- 81 -
glycuronidasss est qu'il permet, gréce e S8 frection erylsulfe-
tase, un~ hydrolyse plus quantitetive sans solvolyse essociée.
Cet avantage semble présenter-psu d'intérêt dans les cas qui
nous préoccupent puisque les glycuronides constituent 90 à
95 p.100 des phénolstéroIdes conjugués urinaires.
Par rapport à l'hydrolyse acide, l'hydrolyse enzymatique
présente les avantages suivants
- le rendement est plus élevé de 18 à 46 p.100 (58)
- la libération de pigments interférents est moindre
- ·enfin, les mono et disaccharides, les aldéhydes urinaires
n'interfèrent pas.
Par contre, les enzymes sont des produits onéreux et fra-
giles, ce qui nécessite, en principe, un contrôle régulier de
leur activité. D'autre part, les produits de l'hydrolyse enzy-
matique et des inhibiteurs contenus en quantités variables dans
léS urines sont susceptibles de diminuer le rendement de la ré-
action.
- 82 -
C - L'EXTRACTION ET LA PURIfICATION
Selon le degré de pureté ~écessité per le spécificité
de le méthode utilisée (colorimétrie, fluorimétrie ou chroma-
togrephie en phase gazeuse ••• ), selon la concentration proba-
ble des oestrogènes dans l'urine et selon la sélectivité re-
cherchée (dosege de l'oestriol ou des oestrogènes totaux), il
est possible d'envisager différents protocoles opératoires.
Ceux~ci sont basés généralement sur les solubilités par-
ticulières des oestrogènes ou sur leurs propriétés chromato-
graphiques.
l
-
L'extraction organigue
L'extraction organique est le procédé le plus employé
pour l'extraction des oestrogènes de l'hydrolysat urinaire.
Le choix du solvant organique est déterminé par le coef-
ficient de partage K des phénolstéroïdes libres entre ce sol-
vant et la phase aqueuse
où CE et Cs sont respectivement les concentrations d'oestrogè-
nes à l'équilibre dans l'eeu et dens le solvsnt.
Un solvent est d'Butant plus efficBce que le constante
- 83 -
K est faible ~ volume égal d'eeu et de solvant orgenique.
D'autre pert, pour une valeur donnée de K, le quentité d'oes-
trogènes extraits est d'autant plus élevée que le rapport des
volumes de solvant et de phase aqueuse est lui-mime plus grand.
Enfin, pour un m~me volume de solvant, l'extraction est
d'autant plus quantitative que le nombre d'extractions est éle-
vé ; en fait,
on se contente souvent de procéder à une seule
extraction par 2 à 10 volumes de solvant.
Le solvant idéal ne doit pas donner d'émulsion;
il doit
~tre très volatil, atoxique. sélectif, c'est-à-dire qu'il ne
doit pas entraîner d'lmpureté.
Un tel solvart idéal n'existe pas et l'on se contente gé-
néralement de l'éther ~thylique. 8ien qu'ENGEL (95) ait montré
que l'extraction par l'éther ~thylique doit
être effectuée à
pH 9-9,5 pour qu'elle soit absolument quantitative, en pratique,
on se contente de la réaliser directement sur l'hydrolysat qui
est toujours plus ou moins acide.
L'acétate d'éthyle qui entraîne beaucoup d'impuretés est
relativement difficile à évapo~Er et surtout, il ne permettrait
pas.une extraction quantitative des oestrogènes libres. Néan-
moins,
il présente un avantage qui est celui d'extraire presque
quantitativement les oestrogènes conjugués, directement à par-
tir de l'urinE
cette propriété a été 'mise à profit par ROURKE
et coll.
(29), puis GRANNIS et DICKEY (31) dans leurs méthodes
respectives.
- 84 -
Les solvants chlorés entraînent trop facilement la for-
~tion d'émulsions, ce qui est un facteur d'imprécision de
'analyse ou d'alourdissement de la technique par une étape
Jpplémentaire de centrifugation.
Le mélange éther-éthanol (4v/1v), préconisé par JAYLE ('9,
3) pour extraire simultanément les phénolstéroïdes et le pré-
landiol, aurait tendance à former des époxydes qui perturbent
ltérieurement la réaction colorée.
1 - Les procédés de purification non chromatographigue
La fonction phénol libre des oestrogènes (caractère acide)
st susceptible d'être saponifiée par une base co~me la soude;
n obtient ainsi des phénates qui sont hydrosolubles.
D'autre part, cette fonction phénol, en présence d'une
ubstance comme le sulfate de méthyle, donne, par transméthyla-
ion, un éther qui est soluble dans les solvants organiques.
Ces deux dernières propriétés, ajoutées à la différence
le polarité qui existe entre les oestrogènes, constituent les
iléments de base de ces procédés de leur purification.
D'une manière générale, l'extrait organique précédemment
Jbtenu, est levé avec une solution tampon de carbonate à pH
10,5 et de force ionique élevée, dite de BROWN (17,23). Celle-
:i élimine la plupart des acides organiques tout en préservent
1•• phénolstéroIdes pour lesquels elle n'est pas suffisamment
- 15 -
basique pour entraîner la selificetion.
L'9xtrait est ensuite soumis à une purification complé-
mentaire plus ou moins poussée selon les cas.
Ainsi, en fin de grossesse,
de nombreux auteurs ont mon-
tré la possibilité de réaliser facilement la séparation de
l'oestriol de l'ensemble des autres stéroïdes et en particulier
des autres oestrogènes.
C'est le système de BACHmAN et PETTIT (1941) qui est le
plus utilisé : il consiste à extraire par la soude décinormale.
saturée par 20 p.100 de chlorure de sodium (poids/volume) l'oes-
triol de la phase éthérée;
dans ces conditions, les autres oes-
trogènes moins polaires ainsi que les autres stéroïdes restent
dans la phase orga~ique tandis que l'oestriol, plus polaire,
passe en phase aqueuse alcaline. Bien que ne permettant pas une
extraction absolument quantitative et sélective de l'oestriol,
ce procédé de purification est à la base de nombreuses méthodes
de dosage de l'oestriolurie (23) de fin de grossesse.
Dans certains cas,
le résidu d'évaporation de l'extrait
organique est repris par de l'eau et du benzène (18)
ou par de
l'eau et un mélange benzène-éther de pétrole (1v/1v)(17,43)
dans ces conditions, seul l'oestriol, plus polaire que l'oes-
trone et l'oestradiol, passe en phase aqueuse.
Les méthodes plus anciennes, mises au point surtout pour
le dosage des oestrogènes en dehors de la grossesse, demandent
- 86 -
une purification plus poussée, notemment en reison de leur plus
feible concentration dans l'urine; différents procédés ont été
préconisés en vue de cette purification, notamment :
- la saponification de BAULD (18)
; elle consiste en l'extrac-
tion des phénolstéroIdes totaux de la phase organique (éther
éthylique) par la soude normale, suivie d'une ébullition à re-
flux pendant 30 minutes.
Après refroidissement et neutralisation,
les oestrogènes,libérés de leurs sels, sont repris par l'éther
éthylique, tandis que les impuretés restent en phase aqueuse.
JAYLE et coll.
(19,58) ont adapté ce procédé à leur méthode de
détermination des oestrogènes urinaires de cycle et de début de
grossesse.
- la méthylatian de BROWN (17)
; la fraction oestriol et la
fraction oestrone-oestradiol, prÉalablement séparées par parta-
ge de phase (benzène-éther de pétrole/eau),
sont soumises à une
réaction de transméthylation. Les éthers méthyliques obtenus
sant ensuite extraits par l'éther éthylique tandis que les im-
puretés restent dans la phase aqueuse réactionnelle. C'est l'in-
génieuse méthode de purification par inversion de phase de BROWN.
De réalisation peu commode, ce procédé est aussi très peu utilisé.
III - Les procédés de purification chramatographigue
Dans certains ces, l'extraction des oestrogènes et (ou)
leur fractionnement peuvent être effectués psr voie chromatogra-
phique.
-
87 -
Il s'egit g~n~ralement de chromatographie d'adsorption:
les oestrogànes sont alors adsorb~s sur le support utilisé. En
gén~ral, on opàre sur colonne. Ainsi:
- BROWN (17) purifie séparément sur une colonne d'alumine
(type BROCKmANN II-III) les fractions oestriol et oestrone-
oestradiol préalablement méthylées.
- BAULD (18) parvient, en opérant sur célite, à purifier
les mêmes fractions et à séparer finalement l'oestrone de l'oes-
tradiol.
- de nombreux auteurs,
ITTRICH (24)
en particulier,
ont réussi
à fractionner les oestrogènes totaux préalablement purifiés grâce
à l'utilisation d'une colonne d'alumine désactivée.
L'élution
fractionnée est alors,
en général, effectuée par du benz~ne con-
tenant des quantités croissantes d'éthanol.
- l'usage de Séphadex LH20 a été préconisé (96)
notamment
pour fractionner les oestrogènes préalablement hydrolysés et pu-
rifiés.
- plus récemment, 5HACKELTON et coll.
(97), puis COTElLI et
coll. (42), sur Amberlite neutre XAD-2,
ont extrait les oestro-
gènes totaux de l'hydrolysat urinaire. La Séphadex G15 a été
aussi utilis~e dans les mêmes conditions (98).
- comme pour la Séphadex (64),les oestrogènes conjugués sont
aussi adsorbés ainsi que de nombreux autres stérol des conjugués
(97,99) sur l'Amberlite XAD-2 ; aussi, certains auteurs (100)
ont fait de cette extraction des phénolstéro!des conjugu~s par
- 86 -
le résine XAD-2,
un procédé de pré-purificetion avent l'hydro-
lyse, dans le but d'éliminer les substances urinaires suscep-
tibles d'inhiber les glycuronidases et les sulfatases. D'au-
tres auteurs comme OSAWA et SLAUNWHITE (32), LEE et HAHNEL (33),
8ECKLOff et coll.
(34), sur résine XAD-2, purifient par cette
unique opération, les oestrogènes conjugués directement à par-
tir de l'urine et pratiquent le dosage sur l'éluat.
Des résines enioniques ont été aussi utilisées pour ex-
traire les oe&trogènes libres à partir de l'hydrolysat (41,101)
ou pour extraire les oestrogènes conjugués de l'urinë (102,103)
ou pour fractionner ces derniers (104).
Le principe de la fixation ionique des oestrogènes sur
ces résines s'expl~que par le caractère acide de la fonction
phénol libre (cas des oestrogènes hydrolysés) et (ou) par la
présence de radicaux de conjugaison, tel le glycuronate, qui
sont susceptibles de développer des charges négatives dans les
conditions utilisées.
- I l -
D - PRINCIPES DE LA DETERMINATION QUANTITATIVE DES
OESTROGENES
Actuellement la colorimétrie et la fluorimétrie consti-
tuent les principales modalités du dosage des oestrogènes. La
chromatographie en phase gazeuse est aussi très utilisée. Les
essais avec la chromatoqraphie en phase liquide seraient satis-
faisants mais l'usage de cette méthode reste encore du domaine
de la recherche. Quant aux méthodes radio-isotopiques, plutôt
proposées pour le dosage des oestrogènes plasmatiques, elles
sont peu utilisées pour les déterminations urinaires.
1 - La réaction de KOBE~ (58,105)
C'est
en 1931 que KOBER (106) a découvert que les oestro-
g~nes donnent naissance à une coloration rose très sensible par
- chauffage en milieu sulfurique concentré
- refroidisse~ent et dilution aquEuse
- nouveau chauffage
A l'issue de.la première étape de chauffage, il se forme
pour chaque phénolstéroide un composé jeune fluorescent qui est
converti en un colorant rose fluorescent dans la seconde étape
de chauffage.
Cette réaction est spécifique des phénolstéroides (58,105,
- 90 -
107,108) et exige
- la fonction ph~nolique en C3
- l'intégrité du noyau 0 et la pr~s8nce en C
d'un groupe-
17
ment cétonique ou d'une fonction hydroxyle libre. De plus, on
constate qu'alors que le 16 céto-oestradiol et les
16 hydroxy-
oestrones se colorent par la réaction de KOBER, le 16 céto-oes-
trone et le 2 méthoxy-oestrone ne le font pas. L'estérification
des phénolstéroldes, du moins en C
et en C
n'empiche pas le
3
1 6
développement de la coloration de KOBER puisque l'hydrolyse
s'effectue au cours de la réaction de KOBER. Ainsi, les oestro-
gènes libres et conjugués donnent, à molarité égale, une colo-
ration équivalente. Cette propriété chromogénique des oestro-
gènes conjugués,
découverte en 1958 par ITTRICH (24),est à la
base de nombreuses méthodes de dosage :
- les méthodes dites avec purification sans hydrolyse
- les méthodes directes.
En fait, de nombreuses modalités pratiques de la réaction
de KOBER ont été proposées. On en distingue essentiellement
quatre :
- la réaction selon BROWN, inspirée de le réaction initiale
de K08ER et qui comporte deux étapes de chauffage à 100 cC (17,
23), ou à 12~C(91), séparées par une courte phase de refroi-
dissement et de dilution
j
le chauffage à 120 0 (
permet de r~
duire considérablement la durée de la réaction (2 fois 5 minu-
tes pour l'oestriol).
- 9' -
- la réaction selon JAYLE et coll. (19,58) qui ont modifié
celle de BROWN en développant le coloration à froid par l'ad-
dition de nitrate de sodium apr~s la premiàreétepe de chauf-
fage. Cette réaction est actuellement abandonnée.
- la réaction selon ITTRICH
(24) qui procède par un chauf-
fage continu de 40 minutes à 100°C pendant lequel la colora-
tion se développe.(HAHNEL et JONES (109) préfèrent chauffer
pendant 45 minutes)
- enfin, la réaction en deux étapes de BROWN et coll.
(91)
à 120°C a été légèrer.ent modifiée par d'autres auteurs, notam-
ment OSAWA et SLAUNWHITE
(32). Ces auteurs, s'inspirant du pro-
cédé d'ITTRICH (24),
ont proposé un protocole de coloration
plus simple en opérant en une seule étape de 10 minutes à 120°C.
BROWN (110), puis NOCKE
(111) ont étudié plusieurs fac-
teurs qui influencent la coloration de K08ER ; c'est ainsi que
BROWN a constaté,à la suite de KDBER lui-même et de
VENNING,
que la première étape de chauffage dans la réaction initiale de
KOBER,
implique la présence d'un réducteur; i l a ainsi amélio-
ré le développement de la coloration en introduisant l'hydro-
quinone dans le réactif de KOBER. Par contre, la seconde étape
de chauffage nécessite un oxydant qui est le dérivé d'oxydation
du réducteur préalablement introduit. Il en est de même dans les
réactions à une seule étape.
Avec ITTRICH (24), BROWN et NOCKE
ont aussi montré que la concentration en acide sulfurique du mi-
lieu réactionnel, les temps de chauffage optime et l'intensité
- 92 -
de la coloration obtenue sont variables avec la neture de
l'oestrogène.
ITTRICH (24) propose en 1958, un ingénieux procédé d'ul-
time purification du chromophore de KOBER formé;
il consiste
à extraire celui-ci par une solution de paranitrophénol à 2
p.100 dans le tétrabromure d'acétylène ou le dichloroéthane
(plus toxique) ou plus communément le chloroforme (cependant
plus volatil).
BRADSCHAW (112)
a légèrement modifié le procédé d'ITTRICH
en remplaçant le paranitrophénol par l'acide trichloracétique.
Sur le plan pratique, cela consiste à remplacer l'eau de
dilution du chromophore,
après le procédé de coloration en une
étape d'ITTRICH ou de BROWN par l'acide trichloracétique 2N. Ce
procédé, repris par HAHNEL et JONES (109) permet d'éliminer le
paranitrophénol tout en améliorant la stabilité du chromophore
et son extractibilité par le chloroforme ou le tétrechloréthane.
L'extraction du chromaphore améliore la spécificité de la réac-
tion de KOBER et exalte la sensibilité qui se trouve ainsi mul-
tipliée par 20 par rapport à la réaction selon BROWN (17). La
coloration évolue dans le temps. En amenant la concentration de
l'acide sulfurique entre 55 et 57 p.10D au moment de la colora-
tion (2ème phase de la réaction selon KDBER et BROWN) ou immé-
diatement après l'arrêt de la réaction (coloration en une éta-
pe de cheuffage) par dilution aqueuse ou trichloracétique, on
stabilise la coloretion ; d'autre part, le chromophore eat een-
- 93 -
sinle à la lumière; en opérant dans des tubes larges dénommés
"tubes de KOBER" et à l'obscurité, on réduit les cons~quen:es
dE cette photosensibilité (S8).
OLIVER et coll.
(1 13) pensent Que certains cations mono-
valents et divalents inhibent le développement de cette co:ora-
tion dont le caractère photosensible serait lié à la variation
re3 +
du rapport ----2
dans le milieu réactionnel.
re +
La coloration rose fluorescente obtenue peut être évaluée
par spectrophotométrie ou par fluorimétrie, par raDport à un
étalon qui a été traité dans les mêmes conditions.
Pour les urines de grossesse, l'étalon utilisé est géné-
ralement l'oestriol qui est ~8 ~~~posa"I ~3jeur des oestrogènes
excrétés par le rei~.
La mesure de l'absorption peut être réalisée soit direc-
tement sur le produit de la réaction de KDBER, soit après ou-
rification du chromophore obtenu par extraction selon les pro-
cédés d'ITTRICH (24,25) ou HAHNEL et JONES (109).
Dans ce dernier cas, le maximum d'absorption du spectre
est déplacé de S1Snm à 538,Snm (24,10S,109).
PDur augmenter la spécificité de la lecture, on applique
la correction d'ALLEN, en lisant successivement l'absorbence
eux environs de
:
- 472nm, 515nm,
552nm dens le premier ces (17,23)
- 500nm, 538,5nm, 577nm dans le second css (24,109)
D'autres auteurs,
pour éviter cette interférence des
chromophores parasites, avaient préconisé la lecture de l'ab-
sorbance avant et après l'extinction de la coloration de KDBER
par de l'eau oxygénée, par de l'acétone ou par chauffage; cet-
te pratique est actuellement abandonnée.
En colorimétrie, la sensibilité de la réaction de KDBER
est de l'ordre du ~g d'oestrogène.
b -
~~~~~~~~~~~=g;=~~=;~~;~~2~=!!~2;~~~~;~~~~=g~=~g~~~
(58,105)
Les oestrogènes, à l'état natif, sont fluorescents, mais
.- ......_. ",--'. -'~".'
cette fluorescence est faible et n'est pas utilisée en pratique,
hormis dans la méthode rapide décrite par BRAmHALL et BRITTEN
(114).
D'autre part,
les oestrogènes traités à chaud par un aci-
de fort
(acide sulfurique ou acide phosphorique)
donnent nais-
sance à des composés fluorescents (excitation à 45Dnm, émission
à 48Dnm). Cette proprieté est à la base des toutes premières
méthodes fluorimétriques aujourd'hui abandonnées.
Actuellernent, c'est le produit de la réaction de KOBER,
généralement extrait selon les procédés d'ITTRICH ou de HAHNEL
et JONES, qui est à la base de la plupart des méthodes fluori-
- 1. -
métriques utilisées ; en effet, le chromophore de KOBER, sou-
mis à un faisceau d'excitation (maximum è 535nm) émet une
fluorescence dont le spectre est caractérisé par un maximum à
SSOnm.
Cette proximité des maxima d'excitation et d'émission de
la fluorescence, constitue un risque important de contamina-
tion de la lumière émise par le rayonnement incident ; ~our ob-
vier à cet inconvénient,
seuls devraient être utilisés pour le
dosage,
des appareils munis de systèmes à haut pouvoir de réso-
lution (type monochro~ateur). De nombreux auteurs (26,27,92,93)
préfèrent réaliser la lecture fluorimétrique à une longueur
d'onde plus éloignée et donc, en denors du maximum de la fluo-
rescence. D'autres facteurs sont susceptibles de modifier le
résultat des mesures;
ces causes d'erreur sont de plusieurs or-
dres
- l'absorption partielle de la fluorescence va affecter les
résultats par défaut;
cela se produit quand la solution mesurée
contient des impuretés absorbant une partie de la fluorescencE
émise.
- l'inhibition de la fluorescence ou "quenching" ; elle peut
être provoquée par .des collisions, avec transfert d'énergie en-
tre des molécules d'oestrogènes excitées et des molécules étran-
gères (impuretés) ou entre les molécules d'oestrogènes elles-
mêmes, à très forte concentration.
Il faut donc veiller è travailler sur une solution puri-
fiée autent que possible et dont la concentration en oestrogè-
..
-
-
nes soit telle que la fluorescence émise lui soit proportion-
nelle ; d'après ADE551 et JAYLE (92,93),
il semble que cette
dernière condition soit réunie quand on opère entre 10 et 60
ng d'oestrogènes
pour d'autres, cette marge s'étend entre
30 et 500 ng.
Enfin,
des oxydants présents dans le milieu ré~ctionnel
suppriment la fluorescence émise par les oestrogènes;
d'où la
nécessité d'une vaisselle particulièrement adaptée, exempte de
tout détergent,
mélange sulfochromique DU d'acide ni~rique ré-
siduels. Certains auteurs ont tenté,
en vain, de mettre à pro-
fit ce phénomène par la lecture fluorimétrique avant et après
l'extinction de la fluorescence pour améliorer la spécificité
du dosage des phénulstérDîdes.
Ainsi,
dans le cadre du dosage des oestrogènes, la fluo-
rimétrie apparaît comme un principe de mesure délicat ; infé-
rieure à la colorimétrie par sa spécificité, elle ne lui est
supérieure que par sa sensibilité 20 à 100 fois plus élevée.
Par conséquent, la fluorimétrie devrait,
en principe, être
moins préconisée pour doser les oestrogènes urinaires de fin
de grossesse (leur concentration étant suffisament élevée)
;
elle
devrait plutôt être utilisée pour réaliser des dosages
d'oestrogènes urinaires au cours du cycle menstruel ou pour
les déterminations dans le plasma.
-
97 -
Il - la réaction calorimétrique de VEE et JACKSON
Devant les difficultés rencontrées pour automatiser cer-
taines étapes du dosage des oestrogènes per la réèction de KOBER
(notamment, l'extraction du chromophore), et soucieux de prop~
ser une méthode adaptée à de grandes séries de josages,
VEE et
JACKSON (115)
ont proposé une autre réaction colorimétrique.
Celle-ci est donnée en milieu oxydant par le couplage des
phénols,
des arylamines et d'autres composés avec la 3-méthyle-
2-benzothiazolinone ~ydrazone (m8TH) (Fig.XIV).
Le ferricyanur p ,
en milieu alcalin, autrefois utilisÉ com-
me oxydant,
a été remplacé par le sulfate d'ammonium cérique en
milieu acide:
cette modalité permet d'~~éiiorer la sensibllité
de la réactio~ dont le produit présente un spectre à 2 maxi~e
respectivement vers 430nm et 530nm.
En pratique,
on commence par séparer soit les phénolsté-
roides totaux urinaires de fin de grossesse selon COHEN (3e)
par précipitaticn ~u sulfate d'ammonium, soit l'oestriol d'a-
près le système de 8gCHmAN et PETTIT à la soude décinormale ...
les extraits, ensuite soumis à la réaction colorée donne-
raient des résultats en bonne corrélation avec ceux obtenus par
fluorimétrie (r = 0,96) et par la chromatographie en phase ga-
zeuse (r = 0,94).
D'autre part, l'automatisation des étapes colorimétrique
et de mesure (à 530nm) permettrait d'effectuer 50 déterminations
- .8 -
à l'heure,
après que les extraits ont été manuellement prépa-
rés. Toutefois, la méthode encore récente (1976) n'a fait l'ob-
jet d'aucune critique que celle des auteurs qui évoquent l'in-
terférence des phénols, des arylamines, ce qui nécessite une
purification très poussée.
OH
OH
,
N-NH~L
+
Oestriol
Sulfate d'ammonium cérique
milieu acide H+
R
R
FIGURE XIV
Réaction colorimétrique des oestrogènes de YEE et JACKSON
(115)
- 99 -
III - la chro~atographie en phase gazeuse
les oestrogènes, préalablement hydrolysés et purifiés,
sont généralement tr?nsfcrmés en dérivés pl~s f2cilement va-
pcrisables à la chaleur ~a= acétylation ~~ par trlêÉ:hy~syli
lat:o'l.
Cett9 estérific~tion a aUSSI ~~~~ ~L: ~e neutraliser les
phénolstéroïdes ; notons cpcendant l '9x~stence de rares mÉtho-
des da~s l8sque~_e5 l'es~érificatl~n n'est pas preconisée.
l'azote es~ la phase ~oDile co~m~~ément u:i~isé~ ; dans
tous les cas,
~ette ~hasE mobi~~ çê:puse tJi~ être, comme le
support et la phas~ stationnaire. élec::~~~~~e~t inerte et
thermostable juscc'~ 300°C.
Comme phase stationnaire,
on s'adresse généralement à des
dérivés siliconés
type méthylsilicone
OV,,5E30
- type phénylsilicone
av,?
Cette phase stationnaire liquide doit être capable de so-
lubiliser les oestrogènes ou leurs dérivés dosés.
En matière de supports, dans le cas des colonnes pleines,
ce sont les terres à diatomées, type Chromosorb W (HP), préala-
blement traitées qui sont utilisées car elles sont électrique-
ment plus inertes que le téflon. Ces colonnes dites "pleines",
de 2 à 3 m de long, sont constituées d'un tuba métallique ou
-
, 00 -
de verre, rempli par le support qui est lui-même imbib~ de la
phase liquide dite "stationnaire".
Des colonnes dites "capillaires", d'usage plus récent,
peuvent être aussi préconisées pour ces dosages; ces :olonnes,
constituées par un fin tuyau métallique ou en verre d'environ
20 m (ou plus), contiennent la phase stationnaire; elles sont
caractérisées par l'absence d'utilisation de support et surtout
par un pouvoir de résolution très important.
Dans tous les cas, c'est l'affinité variable des diffé-
rents phénolstéroïdes pour la phase stationnaire, liée à leur
solubilité différente dans celle-ci qui permet leur fraction-
nement. Les oestrogènes,
ainsi séparés, sont successivement dé-
tectés,
puis enregistrés sous forme de pics; ce sont des dé-
tecteurs à ionisation de flamme qui sont généralement util:sés
la sensibilité des méthodes est alors de l'ordre du ng d'oestro-
gène. Celle-ci peut être améliorée par l'utilisation d'un dé-
tecteur à capture d'~lectrons.
Les pics obtenus sont identifiés par rapport à un étalon
interne à la gamme étalon et aux
dosages (ex. épicoprostanol).
Celui-ci permet, en outre,
de définir le coefficient de réponse
de l'appareil pour chacun des oestrogènes dosés.
Ce coefficient de réponse est variable avec les conditions
du dosage, notamment avec la nature du support, de la phase sta-
tionnaire ; d'où la nécessité de le déterminer pendant chaque
dosage.
- 1G1 -
Ainsi, le chrometogrephie en phese gezeuse, très sensi-
ble, permet de r~eli8er le dosage 8~lectif de nombreux oestro-
gènes; à l'heure actuelle, c'est la seule façon de déterminer
l'oestétrol, dosage dont l'intérêt a été démontré dans certai-
nes circonstances (choriocarcinomes, toxémie, isoimmunisation
Rhésu~)(39). Néanmoins, la chromatographie en phase gazeuse
est relativement peu spécifique et une longue purification des
oestrogènes préalablement hydrolysés est, en principe, néces-
saire (116); ce Qui allonge la méthode de dosage. De plus,
chaque détermination nécessite en moyenne 10 minutes au niveau
de l'enregistrement chromatographique ; cependant, l'utilisa-
tion de colonnes capillaires,
grâce à leur pouvoir de résolu-
tion particulièrement élevé, permettrait de limiter les étapes
de purification et,ainsi,
de simplifier les méthodes (116).
D'après SCHOLLER et coll.
(116), la chromatographie en
phase gazeuse est devenue,
sinon la méthode de référence, du
moins la méthode de contrôle du dosage de l'oestriolurie en
fin
ce grossesse.
IV - Principes des méthodes radiométrigues
Pr op osé,
d' abor d pou r I e s hormones pept i di Que s entigéni-
Ques, ce principe de dosage, introduit par YAllOW et BERSON,
s'est ~tendu aux hormones stéroïdes et aux oestrogènes en per-
ticulier.
Cette extension est bes~e sur deux feits
d'ebord, les
-
102 -
phénolstéro!des peuvent être antigéniques par fixation préala-
ble à une protéine, ce qui permet l'obtention d'anticorps spé-
cifiques.
D'autre part,
il existe des molécules,
telles la protéine
transporteuse des stéroïdes sexuels (SBP),
qui sont capables de
fixer les oestrogènes avec une grande affinité. Le principe de
la méthode peut être résumé ainsi:
à un mélange,
dans des pro-
portions adéquates d'anticorps anti-oestrogènes ou de SBP et
d'oestrogènes me~qués, on ajoute l'échantillon contenant le ou
les oestrogènes froids à doser.
A l'équilibre,
l'anticorps ou la SBP a fixé en présence
de ce dernier une proportion d'oestrogènes marqués inférieure
à ce qu'elle est en son absence (soit 100 p.100)
; en effet,
les oestrogènes froids,
entrés en compétition avec les phénol-
stéroïdes marqués,
ont occupé une partie des sites de fixation
de la SBP ou de l'anticorps.
La radioactivité fixée est d'autant plus faible que l'é-
ch~ntillon à doser contient plus d'oestrogènes froids.
Il suf-
fit alors de séparEr le complexe protéine-stéroïde des stéroi-
des libres (en général par gel-filtration, per adsorption sur
charbon actif ou per précipitation immunologique) et de mesu-
rer : soit la radioactivité du complexe ou radioactivité liée,
soit celle des oestrogènes non liés.
Connaissant ainsi la radioactivité en absence et en pré-
sence des oestrogènes froids,
on en déduit la concentration de
-
'03 -
ceux-ci.
En effet,
on observe que la concentration en oestro-
gènes froids et le rapport
radioactivité du complexe (anticorps-stéroïdes)
radioactivité totale
obéissent à une relation non linéaire de type hyperbolique qui
devient linéaire par changement d'unité
(Fig.XV).
En pratique, cette catégorie de méthodes est très onéreu-
se et exige un encadrement technique de
haut niveau.
D'usage strictement réglementé,
elle est utilisée essen-
tiellement pour des déterminations plasmatiques (65,70). Néan-
moins,
pour les oestrogènes urinaires de fin de grossesse,
il
existe quelques méthodes dont celles de CURPIDE et coll.
(67)
et de DAVIS et LORIAUX
(44).
La dernière technique utilise un
immun-sérum de lapin anti-oestrogènes conjugués totaux et dose
par conséquent l'oestriol,
l'oestradiol et l'oestrone;
la dé-
termination qui s'effectue directement sur une dilution urinai-
re donne,
selon les auteurs,
des résultats plus élevés,
de l'or-
dre de 200 p.100 par rapport à ceux de la méthode chimique de
référence de BROWN (17).
-104-
-~-•..--..
•-
-•"Do
-
,.
D
•
50
~ltr09.".(I) en PB
FIg. XV -
Courbes
d'étalonnage.
Radio·activité
totale
. Radio-activité en
absence d'oestrogène froid.
Radio-activite
liée
. Radio·act.vite de
la fraction
d'œstrogène
liee
suivant
le complexe
Ag-
-
AC.
R~io-activite liée
Radio·activit~ liée
( lu)
~
Radio-activité toule
-
105 -
E - PRINCIPALES APPLICATIONS mETHODOLOGIQUES
En pratique, on n'utilise généralement que la réaction
de KDBER ou la chromatographie en phase gazeuse pour la déter-
mination des oestrogènes urinaires de
fin de grossesse. Ce sant
donc les pri~cipales applications de ces principes que nous en-
visagerons dans cette étude.
Quatre grands gtoupes de méthodes peuvent être distingués,
selon le degré de purification des oestrogènes urinaires et la
sélectivité de dosage recherchée :
- les méthodes longues,
de type traditionnel
- les méthodes que nous qualifierons de "semi-rapides"
- les méthodes rapides, comportant une phase de purification
sans hydrolyse
- et enfin, les méthodes directes ne comportant aucune phase
de purification.
le tableau VI relate les étapes principales de ces diffé-
rents groupes de méthodes de dosage de l'oestriolurie ou de
l'oestrogénurie totale de fin de grossesse.
Ces méthodes se terminent par une mesure
- Boit calorimétrique, effectuée sur le chromophore de KOBER
non extrait (17,18,23,31) ou extrait selon les procédés d'ITTRICH
(24,25) ou HAHNEL et JONES (32,98).
- 10' _
-
, 06' -
Purificetion
lIesure
NeOH ,,6~-chrom/elumine
Benzène-ether p'trole/eeu Colorimétrie
ChromBto/elumine
Benzène-ether pétrole/ei!lu Colorimétrie
Seponif.-chrom/c'lite
Benzène/eeu
Colorimé.rie
Soude normele
Colorimétrie
NaOH 1,6%-chrom/elumine 8enzl:lne-ether p'trole/eau Chrom.phase gezeu38
------------""""""'!~------------t__---------.---
NaOH
·-(chrom/elumin~
•
Colorimétrie
Colorim. DU fluori~.
Benzène-Hexane/N-aOH 10N
Colorimétrie
( A)
Chrom.phase gazeus2
Chrom.ohase gazeu~~
Colorimétrie
Soude 8% (p/v)
Chrom.phase gazeuse
Soude décinormele
Colorim. ou fluori0.
fluorimétrie
Benzène/NeOH N
Chrom.phese gazeus~
Chrom.phesB gazeus0
Chrom. phase gezeuE1'~
Color, Fluor, C.P.G
Ether pétrole/NBOH 2,5N
Chrom.phase gazeu!u
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _4-
-+Colorimétrie
. 0 . . . . . . ~
Colcrimétrie
Colorimétrie
Colorimétrie
Colorimétrie
fluorimétrie
Colorimétrie
Colorimétrie
Colorim. ou fluori~.
rluorim'trie
f'luorim'trie
f'luori",'tri.
fluori.ttri.
• - fecultetif •• lon 1•• ce ••
du dosege d•• o•• trogtn•• urineire. d. fin de gro •••••••
-
107 -
- soit fluorim~trique, r~alis~e sur le chromophore de
KOBER,
g~néralement extrait (24-2B,33)
- soit par chromatographie en phase gazeuse (35-43,101)
l - Les méthodes "longues"
Ces m~thodes regroupent toutes les principales phases
classiques du dosage des oestrogènes, à savoir :
- l'hydrolyse acide (17,18,21)
ou enzymatique (19,35)
- l'extraction éthérée, g~nérelement suivie du lavage par
la solution tampon pH 10,5, dite de BROWN.
- la poursuite de la purification, soit par une simple ex-
traction sodée des phénolstéroides (19,58),
soit par la saponi-
fication de BAULD (18),
éventuellement compl~t~e par le passa-
ge sur une colonne chromatographique (17,18,20) de l'oestriol
préalablement séparé.
Ainsi, dans les méthodes de BROWN (17) et COBELSmANN (21),
l'oestriol est méthylé,
puis purifié sur une colonne d'alumine
désactivée de type II oU III ; BAULD (18) termine cette purifi-
cation de l'oestriol sur une colonne de c~lite.
- la s~paration'de l'oestriol est g~n~ralement effectuée par
partage de phase (benzène-ether de pétrole/eeu)(17,20,21). On
observe toutefois que dans la m~thode propos~e par JAYLE et coll.
(19,58), l'oestriol n'est pas isol~e, le dosage portent sur les
oestrogènes totaux.
- 108 -
- et enfin, le mesure colorim~trique (17-21,58), fluorimé-
trique ou exceptionnellement par chromatographie en phase ga-
zeuse (35). Ainsi, ces m~thodes, g~n~ralement conçues à la
fois pour la d~termination des oestrogènes urinaires en dehors
et pendant la grossesse (17-19,58) comportent de nombreuses
~tapes et une bonne technicité du personnel est requise pour
en obtenir des résultats fiables;
il semble, en effet,
très
difficile d'obtenir une récupération correcte, bien que les
auteurs, plus exercés à utiliser leurs méthodes, affichent un
pourcentage de récupération de 83 à 90 p.100 selon les cas.
C'est pourquoi GOBELsmANN (21) introduit des isotopes radio-
actifs Gans l'urine, ce qui lui permet de corriger les pertes
ce procédé a l'inconvénient d'alourdir davantage des méthodes
qui sont déjà très complexes. Longues de 2 à 3 jours et d'uti-
lisation difficile, elles ne sont donc pas adaptées aux dosages
des oestrogènes urinaires de fin de grossesse.
II - Les méthodes "sEmi-rapides"
Compte tenu du caractère urgent du dosage des oestrogènes
urinaires de fin de grossesse, de nombreuses méthodes dites
naemi-rapides" ont été proposées.
Elles sont toutes caractéri-
sées par une hydrolyse acide (20,22,24,35-38) ou enzymatique
(rapide)(23,40,42,92,93,98,101
), une extraction organique
ou (et) chromatographique (42,98,101).
Certeines se terminent per une estimetion colorimétrique
- 109 -
(22
fluorim~trique (101) ou par chromatographie en
8,35,101),
phase gazeuse (36,40) souvent apr~s le lavage de l'extrait or-
ganique par la solution tampon de 8ROW~.
D'autres se poursuivent, après le lavage carbonaté, par
une extraction sodée des oestrogènes tctaux et s'achèvent, com-
me les préc~dentes par une mesure colorim~trique (20,22 A,24),
fluorimétrique (24,92,93) ou par chromatographie en phase ga-
zeuse (36,42,98).
Enfin, SCHOLLER et coll.
(23) remplace l'extraction sodée
des oestrogènes totaux par celle de l'oestriol par la soude dé-
cinormale.
Dans la méthode semi-automatique (hydrolyse acide à l'ex-
térieur de l'appareillage)
de BARNARD et LOGAN (119), la sépa-
ration de l'oestriol s'effectue par partage (benzène - éther de
pétrole/eau) et la mesure par fluorimétrie sur le chromophore
de KOBER extrait selon ITTRICH.
Dans l'ensemble, ces méthodes dites "semi-rapides" demeu-
rent longues et contraignantes; elles n'exigent pas moins de 5
heures pour de très courtes séries de dosages.
-
110-
III - Les méthodes Bvec purification sans hydrolyse
Elles correspondent à une série de méthodes, plus rapides
q~e les précédentes (2h3o à Ah selon les cas), qui comportent
une phase caractéristique de purification sans hydrolyse préa-
leble. On distingue trois types de purification:
- COHEN (30) purifie les oestrogènes conjugués par extrac-
tion sur un précipité par le sulfate d'ammonium. Une mesure co-
lorimétrique termine le dosage.
- ROURKE et coll.
(29), puis GRANNIS et DICKEY (31) procèdent,
"quant à eux, à une extraction des oestrogènes conjugués urinai-
res par l'acétate d'éthyle en milieu acide saturé de chlorure de
sodium. Le dosag~ s'achève par l'appréciation colorimétrique du
chromophore de K08ER brut (31)
ou extrait (29).
- enfin, de nombreux auteurs pratiquent cette purification
par l'extraction des oestrogènes urinaires sur une colonne chro-
matographique de Séphadex C10 ou C1S (117)
ou de résine neutre
Amberlite XAD-2 (32,33,34). La réaction de ~D8ER, effectuée sur
l'éluet, se pr~te à une mesure colorimétrique (32,117), fluori-
mét r i que (33); 14 me2lure par ch r omat og r aph i e en phase gaz eu se (34)
.
[~t po~ible j
dans cette dernière méthode,
il semble que l'hydrolyse des oes-
trogènes conjugués survient au moment de la triméthylsylilation.
Ce groupe de méthodes a été très critiqué; le glucose et
de nombreux autres composés n'interfèreraient pes dans tous les
cas. mais le méthode de COHEN (~O) serait peu fiable car le pour-
- ", -
centege de récupération est trop fluctuent (40 à Ba P.,OO)
(32) ; la méthode souffrirait d'autre part d'inexactitude
puisque la récupération observée par d'autres auteurs (34)
n'excéderait pes 50 p.100.
L'extraction par l'acétate d'éthyle dans les méthodes
de ROURKE et coll.
(29),
GRANNIS et OICKEY (31) pourrait être
incomplète et entraîner des chromogènes interférents.
Les méthodes dérivées de l'usage de la résine XAO-2 ont
été critiquées pour un certain manque de précision et leurs ré-
.sultats trop élevés ('15'!.
IV - L~s méthodes "directes"
Cette catégorie de méthodes essentiellement représentée
par celle d'ITTRICH (24,25) se propose de réduire les interfé-
rences sur le réaction de KOBER par une forte dilution de l'u-
rine (26,27,28) et se base sur l'efficacité de l'extraction pu-
rificatrice du chromophore. Très rapides,
elles ne comportent
ni hyd:olyse, ni extraction, ni purification préalable à l'éxé-
cution de la réaction de KOBER. Celle-ci est effectuée directe-
ment sur une dilutron plus ou moins importante de l'urine ou
sur le résidu d'évaporation d'une aliquote; le chromophore ob-
tenu est purifié par extraction organique selon les procédés
d'ITTRICH (24,25) ou de HAHNEL et JONES (108).
Une lecture coloriméttique (24,25) ou fluorimétrique (24~
-
112 -
28,118) termine le dosage.
HAINSWORTH et HALL (118), puis
LEVER et coll.
(120) ont propos~ une version automatis~e de
la m~thode directe d'ITTRICH ; la première se termine par une
m~sure fluorim~trique ; la seconde, colorim~trique, comporte
une l~gère modification car le chromophore n'est pas extrait,
mais simplement dilu~ par un mélange aqueux (chloral, acide
trichloracétique 2N).
Ces méthodes ont été très controversées, notamment celle
d'ITTRICH~ Pour certains auteurs (121,122), la méthode d'ITTRICH
peut être utilisée dans certaines conditions, notamment lorsque
l'urine contient au moins 8 à 10 mg d'oestrogènes par litre.
Pour les autres,
les résultats obtenus avec ces méthodes direc-
tes ne sont pas fiables;
ceux-ci sont:
- soit trop élevés (116),
du fait de la présence de chromo-
phores ou de fluorophores parasites.
- soit trop faibles,
du fait de l'interférence du glucose et
de nombreuses substances médicamenteuses qui inhibent la réac-
tion de KDBER.
-
113 -
CONCLUSION
L'abondance des méthodes de dosage proposées pour les
oestrogènes s'explique par l'intérêt des résultats obtenus et
les difficultés rencontrées au cours des dosages. le choix
d'une technique, dans ces conditions, dépend de plusieurs fac-
teurs
la méthode doit être simple et adaptée à la concentra-
tion en oestrogènes du milieu biologique à explorer.
Ainsi,
JAYLE préconise trois modalités liées à la co,centration des
oestrogènes dans sa méthode de dosage des phé101stéroïdes uri-
naires selon la période envisagée: cycle menstruel,
début ou
fin de grossesse. Les méthodes fluorimétriques et calorimétri-
ques exigeant l'hydrolyse et une purification très poussée ne
devraient être indiquées que pour la détermination des milieux
pauvres en oestrogènes (plasma, urines de cycle chez la femme).
En ce qui concerne la "seconde moitié" de la grossesse, la no-
tian de rapidité vient s'ajouter aux facteurs précités, compte
tenu des circonstances cliniques dans lesquelles l'examen bio-
logique est généralement demandé; en effet, nous avons vu qu'à
côté de le souffrance foetale primaire, de nOMbreuses affections
de la m~r8 peuvent induire une souffrance foetele secondeire
plus ou .oins grsve. Une conneissence repide de le rdponse biolo-
gique est souhaitée pour savoir s'il y e souffrance foetele ef-
-
114 -
'tctive ou non et,
dans l'affirmative,
pour en apprécier sa
iévérité. Celle-ci,
en dehors de l'âge du foetus,
est l'élé-
lent qui détermine l'attitude médicale ultérieure.
Dans ces conditions.
le dosage plasmatique semble être
'idéal puisque le prélèvement peut être immédiatement effec-
uÉ, évitant la collecte des urines des 24 heures ou de 12
leur es ; d'autre part,
les méthodes radiométriques,
très spé-
ifiques,
peuvent permettre d'effectuer des déterminations ra-
,ides (environ 3 heures).
Cependant, malgré les possibilités actuellement offertes
,ar les méthodes radioisotopiques,
la détermination plasmatique
este peu utilisée pour une série de
raisons
- d'Bbord,
le taux plasmatique
faible
des oestrogènes fait
lue les biologistes redoutent.sa détermination et préfèrent cel-
e du teux urinaire qui a toujours donné une corrélation satis-
aisante avec les données cliniques,
notamment lorsqu'on suit
es variations de
l'excrétion
jour après
jour (1,8,9)
sinon
ous les deux jours.
- d'autre part, la manipulation d'isotopes radioactifs est
l'un usage strictement réglementé,
réservé à quelques lebora-
oire6 spécialisés:
- quant à la fluorimétrie,
moins spécifique que la colori-
létrie,
aIle exige,
en principe, une purification plus poussée
lui allonge énormément un dosage qui se veut rapide.
- enfin, le notion de velidité du prélèvement sanguin ins-
entené reste discutée, notamment eu cours des syndromes vas-
-
115 -
cula-rénaux souvent caractérisés par une dissociation entre
l'oestrogénurie et l'oestr.ogénémie.(B2)
En ce qui concerne les déterminations urinaires, doit-
on préférer le dosage spécifique de l'oestriol ou celui des
oestrogènes totaux ?
Dans l'esprit de nombreux cliniciens, la faveur irait à
l'oestriol. En fait,
en début de gestation, la fraction oestro-
ne-oestradiol d'origine ovarienne est au moins aussi intéres-
sante sémiologiquement que la fraction oestriol ; la détermina-
tion de l'oestriol et de l~oestétrol n'est vraiment indispensa-
ble que pour le diagnostic de certaines affections comme les
choriocarcinomes au cours desquels l'absence foetale doit abso-
lument être confirmée par la très faible teneur relative du pre-
mier
(
50 P.100) et l'absence du second.
Pendant le dernier trimestre de la grossesse, l'oestriol
urinaire représente environ 90 p.100 des oestrogènes totaux ex-
crétés.
Il est donc évident qu'une baisse importante de l'oes-
triolurie se répercute sur le chiffre de l'oestrogénurie totale,
ce qui confère à ces deux dosages la même signification sémiolo-
gique (1,5,58).
Or, la détermination de l'oestriolurie nécessite l'usage
de méthodes plus longues, plus complexes, car elles impliquent
nécessairement une étape d'hydrolyse,
puis de purification de
l'extrait organique et enfin, une étape de fractionnement,
en
général Belon le système de 8ACKMAN et PETTIT en vue d'une colo-
-
116 -
rimétrie ou une fluorimétrje finales,
ou par chromatographie
en phase gazeuse.
Ces techniques sont donc longues et se prêtent difficile-
ment à la détermination d'une importante série d'urines comme
c'est souvent le cas dans un service de maternité; de plus, la
chromatographie en phase gazeuse nécessite l'usage d'un appareil·
lage sophistiqué.
C'est pourquoi, compte tenu de l'identique valeur sémiolo-
gique de l'oestriol et des oestrogènes totaux urinaires à la fin
de la gestation, nous avons choisi d'élaborer une méthode de do-
sage des phénolstéroïdes totaux pour laquelle la rapidité et la
praticabilité sont des facteurs aussi primordiaux que ceux de la
fiabilité;
les étapes classiques d'hydrolyse,
d'extraction or-
ganique, de purification qui allongent les méthodes et compromet-
tent leur justesse par des pertes inévitables sont supprimées.
Notre choix s'est donc porté sur la mise au point d'une
méthode calorimétrique utilisant une purification des oestrogè-
nes conjugués urinaires sur la résine neutre Amberlite XAD-2.
Nous avons, dans un premier temps,
essayé de déterminer
les conditions optimales d'utilisation de la résine,
en vue
d'une purification suffisante des oestrogènes conjugués urinai-
res de façon à obtenir leur élution quantitative et reproduc-
tible.
Nous avons ensuite appliqué à cet éluat oestrogénique la
modalité de coloration de KOBER modifiée per ITTRltH (24).
-
117 -
Après avoir é~fini lps ceractéristiQ~es de le méthode ainsi
élaborée, nous avons comparé les résultats à ceux obtenus avec
trois méthodes types, prises comme modèles de méthodes semi-
rapides (23~ avec purification sans hydrolyse (31~ et directes
(24).
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131
-
PARTIE EXPERImENTALE
- '32 -
INTRODUCTION
Dans la première partie de ce travail,
il a été rappelé
l'intérêt de la détermination de l'oestriolurie comme indice de
viabilité de l'unité foeto-placentaire
; de même,
nous avons
rappelé que les notions d'oestriolurie et d'oestrogénurie tota-
le ont la même signific.ation sémiologique lorsque ces détermina-
tiDns sont effectuées en fin de grossesse.
Les méthodes de dosage actuellement utilisées pour ces dé-
terminations ont été décrites.
Parmi ces méthodes,
nous avons choisi de nous intéresser
particulièrement à celles comportant une phase de pDrification
par la résine neutre Amberlite XAD-2,
sans hydrolyse préalable
des oestrogènes conjugués (1,2,3).
Ces techniques sont inspirées des travaux de aRADLOW (4)
qui,
pour la première fois,
en '968,
utilisa l'Amberlite XAD-2
pour extraire et concentrer les stéroïdes conjugués urinaires.
Dans ces méthodes qui nous ont séduit par leur simplicité
et leur rapidité,
la purification des oestrogènes urinaires s'ef-
fectue uniquement par adsorption chromatographique sur colonne
de résine XAD-2,
suivie d'une élution per un solvant organique
-
133 -
polaire (alcool éthylique,
méthanol ••• ). Sur une eliquote de
l'éluat,
les auteurs pratiquent la réaction de KDBER,
suivie
d'une lecture colorimétrique (1) ou fluorimétrique
(2)(ta-
bleau 1).
En pratique,
ces méthodes qui donnent des résultats rela-
tivement élevés par rapport à ceux obtenus avec les techniques
classiquement utilisées
(1,5)
n'ont apparemment pas connu de
succès,
peut-être en raison d'un certain manque de reproductibi-
lité (5)
que nous-même avons relevé au cours de nos essais pré-
liminaires;
OSAWA et SLAUNWHITE (1)
font,
eux-mêmes,
état d'un
pourcentage de récupération assez fluctuant puisqu'il varie de
75 à 95 p.100. De plus,
la phase colorimétrique du dosage selon
la modalité d'ITTRICH
(6),
appliquée à l'éluat ne saurait être
impliquée dans ce manque de reproductibilité car i l s'agit d'une
réaction dont la valeur est établie et reconnue.
Il nous est ap-
paru,
par conséquent,
que ce manque de fiabilité devait être liÉ
2 U~é connaissance insuffisante des conditions optimales d'u:il:-
52tion de 12
rÉsine XAD-2.
Celle-ci,
cependant,
sem~le avcir
trouvé de nombreuses applications dans
-
les dosages sanguins et urinaires de divers autres stéroïdes
(7-10),
de médicaments
(11-14),
d'acides biliaires (15,16),
des
métabolites du tryptophane
(17).
- le fractionnement de nucléotides,
de nucléosides,
de bases
puriques et d'anions acides
•.•
(18)
De nature polystyrénique,
l'Amberlite XAD-2 est une résine
Purification des oestrogènes
conjugués urinaires
Principe du dosaga
Auteurs
appliqu~ à une
Adsorption sur
Solvant
Lavage
aliquote de l'~luat
colonne de résine
d'élution
R6action de KOBER
OSAWA-SLAUNWHITE
( 1 )
XAD-2
Eau
Ethanol 30%
idans l'eau
(Colorim~trie)
L rE-HAHNEL
(2)
XAO-2
Eau
méthanol
R~action de KOBER
(rluorim~trie)
Chromatographie en
BECKLOrr et coll.
( 3)
XAO-2
Eau
méthanol
phase gazeuse après
triméthylsylilation
TABLEAU l
.....
~
Quelques m~thodes utilisant ur18 purification des oestrogènes urinaires par l'Amberlite XAD-2.
~
-
135 -
neutre,
granulaire,
poreuse,
insoluble dans l'eau et les sol-
vants organiques. Elle est douée d'une très forte capacité d'ad-
sorption vis-à-vis de molécules solubles dans l'eau, mais pré-
sentant un caractère hydrophobe ; ces substances organiques,
généralement constituées par des acides et des bases faibles,
se fixeraient sur la résine par l'intermédiaire de leur struc-
ture hydrophobe tandis que leur partie hydrophile serait tournÉe
vers le milieu aqueux.
Cette adsorption mettrait en jeu des liaisons VAN der WAALS,
des liaisons hydrogènes et des interactions "dipole-dipole" (13,
18,19)
; elle serait favorisée par la présence de faible concen-
tration de sel
(chlorure de potassium <0, 1N) par un phénomène
de relargage (20,21)
; en
fait,
dans une publication récente,
PIETRZYK et CHU (19)
rapportent que cette influence des sels
n'est significative que pour les solutés ionisés,
tels les dé-
rivés sulfoniques.
La rétention des solutés par la résine XAD-2 est aussi na-
turellement influencée par le pH du milieu,
l'ionisation des sub-
stances s'accompagnant d'une diminution de leur adsorption (1,
17-21).
Ainsi,
l'adsorption des solutés acides (tels les phénolsté-
roides) est plus forte et plus quantitative lorsque celle-ci
s'effectue en milieu acide;
leur fixation par la résine est a-
lors favorisée par le fait qu'ils se présentent à pH acide sous
leur forme neutre (non ionisée).
-
136 -
En milieu alcalin,
les acides organiques faibles ayant
tendance à s'ioniser,
leur adsorption devient alors quantita-
tivement et qualitativement plus faible.
A l'inverse,
la fixation des bases faibles par la résine
XAD-2,
est forte en milieu alcalin (soluté sous forme neutre)
et plus faible en milieu acide (soluté sous forme ionisée).
L'adsorption est encore influencée par la nature du solu-
té (19).
Ainsi,
celui-ci sera d'autant plus solidement fixé par
la résine qu'il est plus apolaire.
Les substituants de ces solutés modifient aussi l'adsorp-
tion (19)
; certains groupements
(tels -CH
-Cl,
-Br,
-N0
fa-
3,
2)
voriseraient l'adsorption du soluté corresoondant,tandis que
d'autres
(tels les groupements -NH
-OCH
-CHO,
-OH)
la di~i
2,
3,
nueraient.
L'adsorption,
enfin,
diminue en présence de solvant orga-
nique (19)
; cet effet dont l'importance est liée à la nature
et à la concentration du solvant organique est utilisée pour
É~uer les substances adsorbées sur la résine.
Ces solvants,
que l'on devrait choisir plus apolaire que
les solutés à éluer,
libèrent ceux-ci en se substituant à eux
au niveau de la résine.
Par ordre d'efficacité croissante,
on aurait en ce qui con-
cerne quelques solvants purs
acétone> dioxane ~ éthanol 7 mé-
thanol. Toutefois,
dans le cas particulier du fractionnement des
-
137 -
nucléotides,
des nucléosides,
des bases puriques ••• , réalisé
par ZAIKA (18),
c'est l'eau et des solutions aqueuses de faible
force ionique qui ont été utilisés comme solvant d'élution.
Dans ce cas, la désorption serait plutôt liée au caractère d'io-
nisation des différents solutés.
Il nous a donc semblé qu'à la suite de ces travaux (1,4,
18-20)
relatifs aux propriétés de le résine XAD-2,
des recher-
ches pourraient être entreprises afin de préciser les conditions
optimales de son utilisation dans le cadre du dosage des oestro-
gènes urinaires. C'est à cela que nous nous sommes attachés en
étudiant notamment le comportement sur la résine XAD-2,
de l'oes-
triol et du 16~glycuronide d'oestriol, catabolite urinaire ma-
jeur représentant 60 à 75 p.100 des oestrogènes excrétés par le
rein (22). Le procédé chromatographique,
ainsi élaboré,
nous a
permis en appliquant à l'ensemble de l'éluat, la réaction de
KDBER selon la modalité d'ITTRICH
(6),
suivie de
l'extraction
du chro~ophore d'après le même auteur (6,23) de dÉcrire une mé-
thode simple et rapide pour le dosage des oestrogènes urinaires
en fin de grossesse.
Dans un second temps,
des résultats obtenus evec la métho-
de ainsi décrite o~t été discutés sur le plan de leur fiabilité
puis comparés à ceux donnés par d'autres techniques déjà établies
(6,24,25) •
-
138 -
CHAPITRE 1
mISE AU POINT DE LA METHODE
Nous avons étudié tout d'abord le comportement des phénol-
stéroïdes vis-à-vis de la résine XAD-2 ; ceci a été effectué à
l'aide de solutions d'oestrogènes purs par chromatographie sur
colonne.
Tout au long de ce travail,
les colonnes utilisées sont
identiques;
elles contiennent environ 1,5 ml de résine
(corres-
pondant à environ 0,4 g de résine sèche) (Fig.I).
La résine,
pré-
alablement purifiée
(cf Description de la méthode)
n'a servi
qu'une fois
au cours de l'élaboration de la méthode afin d'écar-
~er toute source d~erreurs possibles,
due à une régénération in-
suffisante de la résine.
Dans l'p.nsemble,
chaque type d'essais rapporté a été répé-
té 3 à 6 fois selon les cas,
quelquefois plus.
NDtre méthode ex-
cluant l'hydrolyse des oestrogènes conjugués présents dans l'uri-
-139-
~- - - - - - -.----
.... -......-
-
-
-
-
-
-
-
- -reservo i r
0,50..
4- - -
t,
-resine(1.5ml)
1
1
..... ..
'
:.
1
.. ", .. : .
......
:?, (.1ft
......
1
1
.~::.'.: .:
1
~ ..
-----_.~ - - - - - - - - - - - - -fi ltre
r~ -
-
•.1
- - - --
~ ~
~
~- -
-- _ _ _ _ _ - _ tu bu 1ure
.I-~ - - - - - - - - - - - Pince
-- - -
-
- -
-
- - tube de kober
r1g.
1 -
.Schéma de
montage de Iii
colonne
de
resine.
-
140 -
ne, c'est surtout le comportement de ces derniers vis-à-vis
de la résine Qu'il nous est apparu indispensable de connaître.
mais, dans l'impossibilité matérielle de disposer de
l'ensemble des phénolstéroIdes conjugués urinaires, nous avons
choisi de réaliser cette étude avec le 16~glycuronide d'oes-
triol, celui-ci constituent 60 à 75 p.100 des phénolstéroides
urinaires en fin de grossesse (22).
Le comportement de l'oestriol libre, qui,
pour des rai-
sons économiques évidentes, sert d'étalon de routine,
a été pa-
rallèlement testé.
Ainsi,
unt été successivement étudiés
- l'adsorption des oestrogènes par la résine XAD-2
- les conditions optimales de l'élution
- le mécanisme d'action du sel
- l'influence de la quantité d'oestrogènes déposés sur le
pourcentage de récupération
- l'influence du volume de solution d'oestrogènes déposé sur
la colonne,et diverses autres conditions susceptibles de modi-
fier,
soit le comportement des oestrogènes vis-à-vis de la rési-
ne,
soit de gêner le développement de leur coloration par la
réaction de KDBER
- le degré de pureté des oestrogènes ainsi isolés de l'urine
- le choix de la dilution de l'urine de grossesse au moment
des dosages
- l'efficacité d'un nouveau procédé de régénération de la
résine
-
141 -
A - ETUDE DE LA fIXATION PAR LA RESINE DES OESTROGENES
DEPOSES
Le but de cette étude est essentiellement d3 nous assu-
rer que
:
- les oestrogènes déposés sur chaque colonne sont quantita-
tivement fixés par la résine
- le lavage de la résine, nécessaire pour la purification,
n'entraîne aucune perte éventuelle d'oestrogènes.
l -
ExpÉ~imentation
Elle est réalisée à l'aide d'oestriol et de
16«glycuroni-
de d'oestriol en solutions dans l'eau et dans l'urine. La force
ionique de ces solutions est ajustée par addition de chlorure
de sodium à des valeurs variables.
=========
10 ~g d'oestriol sont déposés dans un volume de 1 ml au
sommet de chaque colonne, selon les indications précisées dans
le tableau II.
L'eau de lavage résultant de l'adsorption est recueillie
au bas de chaque colonne. Chacune de ces colonnes est ensuite
lavée par 8 ml d'eau ou d'eau physiologique (tableau II)
qui
1
modes opératoires
Composition des solutions d'r1Pstrioi déposées
Solution de lavage
10 \\> 9
pour
1 ml
1
[au
8 ml
d'eau
2
Eau physiologique
8 ml
d'eau
3
[uu s a l ie ~
100 g/l
de
rJaCl
8
ml
d'eau
4
Urine pure
8
ml d'eau
S
Urine diluée au -*- par dfc! l'eau salée à
8
ml d'eau
200 g/l
de NaCl
6
Urine di l Ul~ e au ! par de l ' fJ a u physiologique
8
ml d'eau
7
[au o h y s in Lo q i qu a
8
ml d'eau physiologique
8
Urine dillJrJe au ! par de l'eau physiologique
8 ml
d'eau physiologique
TABLEAU
II
-"
~
Etude des eaux de lavage dt~ la résine résultant du ml de solution d'oestrogènes déposée
l'V
8t des 8 ml de solution de lavage.
-
143 -
sont récoltés par fraction de 3,3 et 2 ml. L'ensemble de ces
fractions d'eau de lavage est évaporé à sec en présence de
1 ml de solution éthanolique d'hydroquinone à 2 p.100 : la
réaction de KOBER est ensuite effectuée sur chaque résidu se-
lon la modalité d'ITTRICH (6).
Après la mesure de l'absorbance
du chromophore, les résultats montrent que,
quelles que soient
les modalités du dépôt (milieu aqueux ou urinaire de force io-
nique variable) et du lavage (par l'eau ou l'eau physiologique),
aucune perte n'est constatée.
Comme avec l'oestriol,
10 \\Jg de 16dglycuronide d'oestriol
sant déposés par calonne: dans les mêmes conditions, aucun rési-
du d'oestro~ènes n'est observé:
- ni dans l'eau de lavage résultent du dépôt
- ni dans les 8 ml d'eau ou d'eau physiologique préconisés
peur le lêvage su~plément8ire de la résine.
c - Essai n03
==========
Enfin, dans ~e but d'éprouver la capacité d'ads~rption de
la résine, 20, 50,
75 et 100 ~g d'oestriol sont déposés (dans
1 ml d'eau physiologique) sur de nouvelles colonnes de résine.
Comme précédemment, les résidus issus des eaux de lavage sont
soumis à la réaction de KOBER.
Jusqu'à 75 ~g d'oestriol déposé,
- 14' -
aucune perte d'oestrogène n'est enregistrée du fait d'une é-
ventuelle saturation de la résine.
Avec 100 ~g d'oestriol déposé, les résultats indiquent
l'existence d'une perte moyenne de 0,6 p.100, ce qui semble né-
gligeable,
mais surtout permet d'estimer que l'adsorption reste
quantitative lorsqu'on dépose 100 Vg d'oestriol sur 0,4 g de ré-
sine, soit environ 250 Ug par gramme.
II - Discussion
Il ressort de catte étude que la résine Amberlite XAD-2
est douép d'ure grande ~apaclté d'adsorption vis-à-vis de l'oes-
triol at de son dérivé 16 o:l/. glycuro-conjugué.
Cette observétion confirme celles de nombreux auteurs par-
mi lesquels BRADLOW (4),
OSAWA et SLAUNWHITE (1),
GRIESER et
PIETRZYK (20). Le dosage colorimétrique utilisé nécessitant un
dépôt de 1 à 10 ~g d'équivalent-oestriol dans le cadre de notre
~éthode, i~ semble que l'on est à l'a8ri de
tOût ris~ue de satû-
ratio~ de la résine ; mÊ~e en tenant compte de l'existence, dans
les urines de grossesse,
d'autres substances parallèlement ad-
sorbées (les autres stéroïdes notamment)(4).
D'autre part, on observe que l'adsorption est indépendan-
te de la force ionique et qu'elle est équivalente en milieu uri-
naire ou aqueux, du moins lorsque les oestrogènes sont déposés
sur la résine, dans les limites de concentration définies ci-
-
145 -
dessus (soit 1 à 10}Jg d'équivalent-oestriol).
Par ailleurs,
le lavage supplémentaire par 3, 6 et 8 ml
d'eau ou d'eau physiologique n'entraine aucune désorption des
oestrogènes adsorbés sur la résine,
alors que certaines impu-
retés présentes dans les urines et susceptibles d'inhiber le
développement de la réaction de KOBER sont éliminées par ce
lavage.
Ainsi,
mATSUI et coll.
(26)
ont observé,
après avoir dé-
posé du chlorure de sodium et de l'urée dans des colonnes de
résine XAD-2, qu'un lavage insuffisant provoque la souillure
de l'éluat par des substa~ces minérales et organiques (ici le
sel et l'urée).
Aussi,
afin d'obtenir un degré de purification
élevé, nous avons choisi de porter le volume de la solution de
lavage à 8 ml (soit 8 fois le volume de solution d'oestrogènes
déposée),
alors que la plupart des auteurs ayant utilisé la ré-
sine XAD-2 pour le dosage et la purification des stéroïdes (oes-
trogènes en particulier; (1-4,27-29)
ne préconisent que l'er:çloi
de
'
à 2 volumes d'eau à cet effet.
mATSUI et coll.
(26)
ayant par ailleurs rapporté qu'un la-
vage important entraîne une perte de certains stéroïdes sulfo-
conjugués et biconjugués,
nous avons déposé sur des colonnes dé
résine XAD-2 (à défaut d'oestriol 3-sulfoconjugué,
d'oestriol 3-
sulfo-16al glycuroconjugué et d'oestriol 3 ~16 o-diglycuroconju-
gué) des urines de grossesse diluées,
ces urines étant suscep-
tibles d'apporter l'ensemble de ces formes conjuguées.
-
146 -
Nous n'avons pas observé de perte significative (~1 p.100)
entraînée par le lavage par 8 ml d'eau ou d'eau physiologique.
Il est possible que ce résultat s'explique par la faible quan-
tité d'oestrogènes ainsi déposée (1 à 10 ~g d'équivalent-oes-
triol) et par la proportion relativement faible des oestrogènes
sulfo et diconjugués.
Quoi qu'il en soit, il semble possible de conclure que le
lavage, indispensable à l'obtention d'une bonne purification, ne
conduit en aucun cas à des résultats, par défaut,
quel que soit
le volume de solutions aqueuses utilisé.
- 147 -
B - ETUDE DE L'ELUTION
L'adsorption étant quantitative et la réaction de KOBER
fiable,
l'élution constitue par conséquent,
l'étape dont dépend
le plus la qualité de notre méthode. L'ayant voulue la plus
quantitative et la plus reproductible possible,
nous avons en-
trepris l'étude systématique de l'élution des phénolstéroïdes
adsorbés sur la résine XAD-2 en choisissant d'emblée comme sol-
vant le méthanol
(2,4,12-14,16,17,26,28,29)
aussi efficace que
l'éthanel
(4,7)
et plus drastique que l'éthanol ,à 30 p.100 (1,27).
l - Le cas de l'oestriol libre
10 ~g d'oestriol libre sont déposés sur chaque colonne de
résine selon les modalités définies dans le tableau III.
A l'is-
s~e cu laJage,
l'oestriGl est élué par B ml de méthanol que l'on
récolte par fractions de
2,1,1,1,1,2 ml.
Chaque fraction est en-
suite évaporée en présence d'1
ml de solution éthanolique d'hy-
droquinone à 2 p.100 et l'oestriol de chaque résidu,
soumis à la
réaction de coloration selon la modalité d'ITTRICH.
Les résultats montrent que:
l'élution est presque quantitative avec 3 ml de méthanol;
elle est en effet de l'ordre de 92,5 p.100 ~ 3 lorsque l'oestriol
modes
op
r a t o i res
Cnrrl pl'
é
é; i t i o n
des solutiolls cJ'oestriol
déposées
Solution de lavage
!"iur
chaque colonnn
( 1U tJg/rnl)
1
1
ml
J'eau
8
ml
d'eau
2
1
ml
d'urine pure d'enfants .(5 ans
8
ml
d'eBu
3
1
ml
d'urine d'enfant diluée au .J.. par de
8
ml
d'eau physiologique
2
l ' l~ ,1 LI physiologique
TABLEAU III
modalités op!;r~toires pour l'étude de l'élution de l'oestriol libre
-Jo
~
(TJ
-
149 -
est déposé sur la colonne en solution dans l'eau.
- elle est de 84,5 p.100 ~ 3,5 quand l'oestriol est déposé
en solution dans l'urine pure ou diluée par de l'eau.
-
avec 5 ml de méthanol,
la récupération excède les 95 p.100
dans tous les ces et l'on peut alors estimer que l'élution est
quantitative. La figure II résume les résultats obtenus.
I l · · Le cas du 16o<.glycuronide d'oestriol
COri' l' P
pou r I ' a e ~o tri al,
1 0 ~ 9 d e
16 0. g l Yc u r 0 nid e d' 0 est rio l
sont déposés en solution dans l'eau,
dans l'urine pure et d2ns
l'urine préalablement diluée au ~ par de l'eau, sur une série de
colonnes.
Après le ~dvage de la résine par 8 ml d'eau et l'élu-
tian par 5 ml de méthanol,
le dosage colorimétrique de l'oestro-
gène dans l'éluat montre que la récupération e s t :
- quasi nulle lorsque le 16 -:J. glycuronide d'oestricl est o c os
é
é
- de 64,4 p.100 :: 4,5 lorsque le 16 Dl glycuronide o t o e e t r i o I
es~ déposé en
solution dans l'urine pure.
- erfin,
de 55 p.100 :!: 8 lorsque le 160( glycuronide d'oestriol
est déposé en solution dans la même urine préalablement diluée
au ,
par l'eau.
Nous étant assurés que l'adsorption est absolument quanti-
tative dans tous les cas
(l'étude des eaux de levage n'a révélé
-150-
1
'*
90
E:
0
~
80
=
...
~
e,
:;,
0
u
~
...
2
4
6
8
methanol
en
ml
Ftg. Il
-
Etude
de
l'élution
de I'oestriol.
L'éluat a été
récolté
par
fractions
de 2-1-1-1-2ml, et
l'oestriol
de
chaque fraction
a été dosé.
les
résultats
cumulas ont donné
les courbes suivantes
•
•
.. -
Courbe
obtenue
après
dépôt en
solution
dans
l'eau
puis lavage par
de
"eau
-0
•
0 -
Courbe obtenue
après dépôt en
solution
dans
l'urine
nature
ou
diluée au
'/2
par
t'eau
physiologique,
puis
lavage
par
l'eau
physiologique
-
151
-
aucune perte du 16olg1ycuronide d'oestriol),
il nous est ap-
paru qu'un composant de l'urine modifie le comportement du
161,){ glycuronide
d'oestriol vis-à-vis de la résine.'
L'influence de la force ionique a donc été testée,
para-
llèlement à celle de l'urée.
Ainsi,
10..,g de 16o/..g.lycuronide
d'oestriol sont déposés sur de nouvelles colonnes dans des mi-
mieux aqueux et urinaires de force ionique variable et da"s de
l'eau surchargée à 20 g par litre d'urée.
Le lavage est,
lui aussi,
réalisé par de l'eau ou des so-
'lutic,s de compositions ioniques variées (NaCl,
KCl ou HC1), o u
~?: l'eau surchargée en urée.
Les résultats issus du dosage de
_ 'oest~L~ene aorès son élutlon globale ~ar 5 ml de méthanol (ta-
~leaL :11) mo~tren: que l? orésence de c~lorure de sodium ou de
pot as!" i ume 5 t i n r' ~ S::J e n S ab l e '
l';; l Li t i 0 r .•
Il résultp de
l'ensemble de
ces essais que les conditions
d'une élution optimale exigent que
(tableau IV)
- le 1E~ glycuronide d'oEstricl so:t déposé sur la rÉsine e~
. solution dans l'eau physiologique
(Cë~S le CêS des Lr:ne5. Cl~U
tion s'il y a lieu par de l'eau physiologique).
- l e l a vag e d e 1.8 rés i ne,
a p r è s l ' 8 d sor p t ion d LJ 1 6 Q, 9 l yeu r 0 -
nide d'oestriol,
soit effectué avec de l'eau physiologique. Dans
ce :as, le renjement de
l'élution est voisin de 95 p.100.
On observe par ailleurs que :
- l'urée,
employée seule,
ne favorise pas l'élution du ~6 ""-
Composition des solutions de
1~
Pourcentage de
r~cupération
Solution de
lavage
~ glycuronide d'oestriol déposé
après
élution par 5 ml
de
(8 ml)
par colonne
(10 ~g pour 1 ml)
m~thanol
1
1
-
+
Eau
Eau
6,9 p.100 -
2
+
Eeu contenant 20 g/l
d'urée
Eau contenant
20g/1
1 ,5 p.100 -
0,5
urée
+
Eau physiologique
Eau
29,3 p.100 -
20
+
Eau contenant
50g/1
de NaCl
Eau
44
p.100 -
11
[eu contenant 75g/1
de NaCl
+
Eau
73
p.100 -
3
[eu contenant
100 g/l
de NaCl
Eau
89,5
+
p.100 -
5,5
+
Eeu
Eau physiolugique
90
p.100 -
2
[au physiologique
Eau physiologique
96
+
p.100 -
3
+
[au contenant
10g/1 KCl
Solution KCl
à
10g/1
94,5 p.100 -
3,5
+
Acide chlorhydrique N/40
Acide chlorhydrique N/40
90
p.100 -
9
+
Urine diluée au ,
par l'eau
Eau
55
p.100 -
8
+
Urine pure
Eau
84,4 p.100 -
4,5
+
Urine ajustée à
100g/1
de
NBCl
par
Eau
87
p.100 -
8,5
dil.
au ,
par de
l'eau à
200g/1
+
Urine diluée au ,
par l'eau physiol
Eau physiologique
93,5 p.100 -
3
+
~
Eeu physiologique
(sur
résine con-
Eau physiologique
93,5 p.100 -
3,1
(J1
servée dans l'eau physiologique)
'"
+
Solution
aqueuse à
100g/1
dp
NaCl
Eau physiologique
90
p.10U -
1
TA8LEAU
IV
MDdelit~s d'étude de l'éluLion globale du 16~ glycuronide d'oestriol par 5 ml de m~thanol
-
153 -
glycurQnide d'oestriol.
- lorsque le 16~glycuronide d'oestriol est adsorbé sur le
résine à partir d'une solution aqueuse pure,
une élution pres-
que quantitative par les 5 ml de méthanol devient possible
(9D~) si le lavage de la colonne est effectué par de l'eau phy-
siologique (8 ml).
- la conservation préalable de la résine dans l'eau physiolo-
gique n'améliore pas les rendements de l'élution réalisée par la
modalité optimale définie ci-dessus; on obtient en effet,
dans
+
+
ce cas, un rendement de 93 p.100 -
3,1 contre 96 p.100 - 3 pour
la modalité optimale.
- en outre,
on note paradoxalement que le dépôt sur la résine
du 1b~ glycuronide d'oestriol en solution dans l'acide chlorhy-
drique dilué (N/40)
suivi du lavage par la même solution permet-
tent au méthanol
(5 ml) d'assurer environ 90 p.100 :
9 de désorp-
tion et ce,
bien que les oestrogènes (solutés faiblement acides)
s'adsorbent plus fortement en milieu acide (1,17-21).
- enfin, la nature du cation ne semble pas revêtir une grande
importance puisqu'une solution de chlorure de potassium (10 9/1)
permet d'obtenir les mêmes résultats qu'avec l'eau physiologique.
En opérant dans certaines conditions précédemment définies,
nous avons entrepris pour le 16«glycuronide d'oestriol, l'étude
de l'élution fractionnée.
les résultats cumulés obtenus indiquent
(Fig.III) en ce qui concerne les modalités optimales que:
e/.----e.
o
, / '
/.~"..o
90
__o
0
.~
80
70
80
'j0
40
30
20
tO
2
4
8
8·
10
methanol
en ml
f1
Fit III
-
ttude de
l'tlutlon du
18'1( ,Iycuronlde d'oeitriol.
(Muau r6coltél comml pour l'OIItrlolt,
Cour'" d'.lutlon du 1.1( glycuronido d'Mltrlol len milieux lqueUIU.
Courbet d'''utlon du 1'et tlYcuronlde d'oeetrlol _.
mllliu urlnalr•••
- - 6 - & - : cHp6t·en eolution dllf'll 1'1-' phYllologlque. Lav.
par
l'iau' phyliologlque;
•
... : d6p6t en JOlutlon urinaire netl" OU cl......
pet de l'leu physiOlogique.
Uv. ,. ...
l'eau phyllologlq....
~. d'p6t en eolution dans l'iau contenMt 100g dl NlICl/I
l l v . par de l'sau.
ocr: d'P6t en JOlutlon dent l'urine
•
1001 .. N,cl/l , . dlludonl
,.,
A
6 - · d'pôt en IOlutlon dlnl l'Ilu. Lav... par de l'leu.
de l'eau ..1. .; l . . ..... ... l'
.
- 155 -
les trois premiers ml de m~thanol assurent le d~sorption
d'au moins 83 p.100 du 16. glycuronide d'oestriol lorsque ce-
lui-ci est dépos~ sur les colonnes en milieu aqueux ou urinaire.
- les cinq premiers ml en éluent, en moyenne, 96 P.100 :
3
et 93,5 p.100 : 3 respectivement selon que le dépôt a été effec-
tué en milieu aqueux (eau physiologique) ou urinaire (urine di-
luée par l'eau physiologique).
III -
Discussion
t
Comme solvant d'élution,
nous avons d'emblée opté pour le
méthanol dont l'efficacité est reconnue (2,4,12-14,16,17,26,28,
29) .
D'autres solvants,parmi lesquels l'éthanol, le n-butanol,
ont été aussi utilisés avec succès d'abord par BRADLOW (4), puis
par de nombreux autres auteurs (1,19).
D'autre part,
OSAWA et SLAUNWHITE (1) semblent avoir uti-
lisé avec satisfaction l'éthanol à 30 p.100 ; ce solvant serait
capable d'éluer sélectivement les phénolstéroIdes conjugués (75
à 95 p.100 de récupération)
aux dépens des oestrogènes libres
(6 p.100 d'élution) et d'autres stéroïdes conjugués tels les
glycuronidas de testostérone (40 p.100 d'élution).
Nous n'avons pas retenu ce dernier solvant car nous lui
avons préf~ré l'utilisation d'un solvant plus drastique permet-
tant d'obtenir une élution plutet quantitative et constante,
- 156 -
que sélective. D'ailleurs, OSAWA et SLAUNWHITE reconnaissent
eux-mêmes que la spécificité de leur méthode n'est liée qu'à
celle de la réaction de KOBER.
C'est ainsi que notre choix s'est porté sur le méthanol
après avoir cependant vérifié que l'éthanol à 30 p.10D est in-
capable d'assurer la désorption du 16~glycuronide d
iol
lorsque celui-ci est déposé sur la résine en solution dans
l'aau et en l'absence de tout lavage par de l'eau salée.
En ce qui concerne le volume optimum de méthanol nécéssai-
re à l'élution, celui de 5 ml a été adopté dans les conditions
o~:imales définies et ce,
pour les raisons suivantes:
- 3 ml de méthanol ne permettent pas d'obtenir une élution
quantitative du 16~glycuronide d'oestriol
: en moyenne 78 p.100
= 2,4 et 85 p.100 = 2 d'élution lorsque l'adsorption est réali-
sée respectivement à partir d'une solution urinaire ou d'eau
physiologique.
- avec 5 ml de méthanol,
l'élution varie respectivement de 90,:
à 95,5 p.100 et de
93 à 99 p.100 dans les deux cas précités.
Nous avons jugé une telle élution suffisamment quantitative
car les 7 ou 8 ml de méthanol qui nous auraient permis d'obtenir
les 100 p.100 de désorption auraient constitué un réel handicap
pour notre méthode au niveau de l'évaporation.
D'ailleurs, dans l'ensemble des méthodes de dosage des oes-
trogènes utilisant la ~ésine XAD-2 (1,2,3) l'élution n'est effec-
tuée que per 1 ou 2 volumes de solvent par rapport eu volume d'u-
-
157 -
rine déposé.
l'étude même de l'élution a révélé la nécéssité d'une
certaine concentration de sel (NaCl, KCl ••• ) sur la résine à
l'issue du lavage.
Cela nous a conduit à préconiser pour cette technique la
dilution des urines et le lavage par l'eau physiologique. Cette
dilution des urines de grossesse par l'eau physiologique a pour
objectif, non pas de prévenir les erreurs consécutives à l'uti-
lisation d'urines de faible force ionique, mais surtout de se si
tuer dans la gamme de sensibilité de notre méthode, celle-ci de-
mandant la présence de 1 à 10 ~g d'équivalent-oestriol dans la
prise d'essai. le plus important, en fait,
c'est le lavage par
8 ml d'eau physiologique, celui-ci paraissant suffisant pour per-
mettre une élution presque quantitative du 16 ~ glycuronide d'oes-
triol. D'autre part, il ne semble pas nécéssaire de conserver la
résine en milieu salé car le rendement à l'élution n'est pas amé-
lioré dans ces conditions.
Après la mise en évidence de l'influence du sel sur l'élu-
tion du 16~glycuronide d'oestriol, nous avons vérifié l'exis-
tence éventuelle d'une influence du chlorure de sodium sur la dé-
sorption de l'oestfiol libre par le méthanol
les résultats ob-
tenus en présence du sel se superposent à ceux précédemment trou-
vés (en absence de sel).
Toutefois, il semble que la présence du chlorure de sodium
réduit sensiblement la dispersion du pourcentage de l'élution,
-
158 -
améliorant ainsi la r~p~tabllit~ des dosages portant sur l'oe5-
triol libre.
L'effet du sel que nous venons d'exposer ne nous pareit
pas avoir ~t~ signalé au pr~alable. Ceci peut s'expliquer par
le fait que le plupart des auteurs (1,2,3,27) ayant utilisé
l'Amberlite XAD-2 pour le dosage des oestrogènes conjugués dé-
posent sur le résine une aliquote pure (non diluée) des urines
de grossesse; le lavage est ensuite effectué par 1 ou 2 volu-
mes d'eau seulement (contre 8 volumes d'eau physiologique dans
notre méthode). Dans ces conditions,
il per~iste vreisemblable-
ment sur la résine une certaine quantité r~siduelle des sels ap-
portés par l'urine, donc variable selon les cas et qui permet
d'assurer l'élution d'une certaine proportion des oestrogènes ad-
sorbés.
C'est ainsi qu'après avoir surchargé en 16~glycuronide
d'oestriol des urines pures ou préalablement diluées au ,
par de
l'eau,
nous avons obtenu respectivement,
après l'élution par 5
+
ml de méthanol:
B4,4 p.100 et 55 p.100 - 8 de récupération;
le
lavage ayant été effectué par 8 ml d'eau.
Il semble très significatif de noter la similitude qui
existe entre les 84,4 p.100 de récupération obtenus avec l'urine
pure et le pourcentage moyen de récupération affiché par OSAWA
et SLAUNWHITE (1)
: 82,9 p.100 (75 à 95 p.100).
On comprend alors la raison essentielle du manque de fi8-
bilit~ de ces m~thodes si le pourcentage de r'cup~ration semble
-
159 -
lié è la teneur en sel des urines traitées et au volume d'eau
utilisé pour le lavage.
D'autre part, certains auteurs (30) ont effectué en batch,
l'étude du pourcentage de récupération à l'élution avec l'oes-
triol libre dont le comportement est peu modifié par la force
ionique du milieu; d'autres auteurs,
parmi lesquels OSAWA et
SLAUNWHITE (1) notamment, ont réalisé cette étude à l'aide de
la form~ sodée du 16~glycuronide d'oestriol (marqué) en sur-
charge dans une urine de grossesse; dans de telles conditions,
après le lavage de la résine par un volume d'eau (après dép6t
d'un volume d'urine), il subsiste une certaine quantité de sel
sur la colonne de résine qui permet d'obtenir un certain pour-
centage d'élution.
Nous n'avons pas étudié de manière particulière l'influ-
ence du débit de la colonne de résine XAD-2 au cours des diver-
ses phases de la chromatographie;
en effet,
avec l'Amberlite
XAD-2, de nombreux travaux ont été consacrés à cette étude du
débit et l'on admet communément que celui-ci peut varier de 0,1
à 2 ml/minute selon la taille des colonnes utilisées dans le
cadre du dosage des stéroides et des drogues (1,2,7,14,27,28).
OSAWA et SLAUNWHITE ont montré que seul le débit au cours
de llélution peut influer sur les résultats;
un débit trop ra-
pide (>2 ml/mn) étant susceptible d'entraîner une désorption
non quantitative (1).
Nos propres observations confirment celles de ces der~ier8
auteurs en ce qui concerne les débits de lavage; par contre,
- '60 -
nous n'avons observé aucune incidence de la vitesse de l'élu-
tion (jusqu'à environ 3 ml/mn) sur les résultats probablement
parce que :
- le méthanol, préconisé comme solvent d'élution dans notre
méthode, est plus drastique que l'éthanol à 30 p.100 utilisé
par OSAWA et SLAUNWHITE.
- le volume de méthanol utilisé (5 ml) est relativement im-
portant par rapport au volume de résine (1,5 ml). Cependant,
soucieux de travailler dans des conditions reproductibles, nous
avons utilisé des débits constants que nous avons fixés en nous
inspirant des données bibliographiques précédemment décrites et
de nos propres observations
- nous avons ainsi adopté un débit relativement lent de 0,3
ml par minute au COLrs de l'adsorption afin que celle-ci soit
absolument quantitative. Une telle vitesse ne ralentit pas exa-
gérement la méthode compte tenu du volume déposé qui n'est que
de 1 ml.
- par contre, compte tenu du volume relativement important
du solvant d'élution, nous avons réalisé la désorption à la vi-
tesse de 1 ml/mn, ceci afin d'éviter d'allonger une méthode qui
se veut rapide. Ce sont d'ailleurs ces mêmes considérations qui
nous ont conduit à accélérer davantage le débit (3 ml/mn) d'un
lavage relativement abondant et qui ne comporte aucun risque de
perte d'oestrogènes pour la méthode.
-
161 -
C - ETUDE DU MECANISME D'ACTION DU SEL
En vue d'expliquer le mécanisme d'ection du sel sur la
désorption de 16~ glycuronide d'oestriol,
nous avons pensé que
la résine pouvait porter des charges positives susceptibles de
contracter avec le groupement carboxylique du 16 «glycuronate
d'oestriol des liaisons supplémentaires de type électrostatique
Celles-ci renforceraient alors les liaisons de type hydrophobe"
empêchant l'élution de ce composé par le méthanol en l'absence
de sel.
En présence de sel en concentration adéquate, les ions ap-
portés (Cl-, Na+ oU K+) diminueraient les interactions électros-
tatiques, favorisant ainsi l'élution.
Pour mettre en evidence l'éventuel caract~re d'échangeur
d'anions de la résine Amberlite XAD-2,
une suspension de cette
réSine a été titrée,
son pH et sa conductibilité ont été mesu-
rés parallèlement à la suspension d'une résine anionique (OEAE
Cellex D, de capacité 0,67 mEq/g) prise comme témoin.
la mesure du pH de le suspension de résine XAD-2 prête à
l'emploi (1 g de résine sèche dans 40 ml d'eau bidistillée) qui
a été effectuée a confirmé le caractère neutre de l'Amberlite
XAD-2; parallèlement, l'échangeur d'anions pris coMMe référence
a donné dans les mêmes conditions: pH 8,7.
- 162 -
Les essais de titretion, sn pr4sence de rouge de m~thyle
ont aussi confirm~ le cerlctàre neutre de l'Amberlite XAD-2
puisqu'ils ont donn~ les r4sultets suivants:
- 11 sUlpension de r~.ine XAD-2 (1 9 dans 40 ml d'eau bidis-
till'e fre!chs) est neutralis'" par une seule goutte de soude
0,099N.
- dens les mêmes conditions, 3,3 ml d'acide sulfurique 0,1N
ont ,t, n'c'sseires pour neutraliser la r'sine anionique de r~
f'rence.
Les mesures de conductibilit' des suspension de la résine
XAD-2 et de la r'sine anionique DEAE-Cellex D, ont donn~ les ré-
sultets consign~s dans le tableau V. On note, en ce qui concerne
l'Amberlite XAD-2 l'existence d'une conductibilité faible mais
apparemment non négligeable puisqu'elle est sup'rieure au 1/5e
1)
de celle de le r'sine anionique de r'f'rence (52 Scm-
et qu'el-
le est nettement plus 'levée que celle de l'eau bidistill~e (2,1
Scm- 1). Comme pour le résine enionique, cette conductibilit~
diminue eu fil des levages
enfin, dans les deJx cas, une agi-
tation est nécéssaire pour décrocher les 'l'ments conducteurs
des r'sines rendant ainsi les surnegesnts plus conducteurs.
Discussion
L'existence d'une certaine rétention saline par la r4sine
XAD-2 semble probeble j
on peut citer en faveur de cette hypo-
TA8LEAU V
Etude compHrée des conductibilités des résines [ellex 0 (DEAE anionique)
et Amberlite XAD-2 (neutre)
CONDUCTl8ILITE
19 de résine en suspension dans llO ml La suspeneion de résine précédente est
Nombre
d'eau bidistillée. mesure de lac un-
décantée,
puis reprise per 40 ml d'eau
d'essais
ductibilité après AqitcJtion
bidistillée.
mesure
avant agitetion
eprès egitation
Résine enianique
-1
3
52
Scm
2,50 Scm- 1
11,50Scm- 1
Cellex 0
Résine neutre
3
-1
11,50 Scm
2,35 Scm- 1
3,80 Scm- 1
AmbBrllte XAD-2
-1
Eeu bidi.tl11éB
3
2, 1 Scm
"
REmARQUES
1 - Les conductibilités lues ont été corrigées en tenant compte de la constante de cel-
lule (C = 0,84).
.
2 - La résine enionique a été mise en suspension sans lavage préalable
; tendis que le
résine XAD-2 a été préalablement purifiée comme c'est
indiqué BU chapitre "Prépa-
....
ration de la résine".
(J\\
l..rl
- 164 -
thèse, les observations de ZAIKA (18) et de mATSUI et coll.(26)
- le premier auteur rapporte le difficulté è éliminer la soudi
qui persiste sur la résine après l'usage de celle-ci comme sol-
vant d'élution dans le fractionnement des nucléotides, des nu-
cléosides, des bases puriques ••• sur colonne d'Amberlite XAD-2.
- quant à mATSUI et coll.
(26),
ils ont observé, après avoir
déposé 100 mg de chlorure de sodium sur une colonne de résine
XAD-2 (7ox2cm) ensuite levée par 200 ml d'eau,
que l'éluat (per
400 ml de méthanol) contient encore 4 p.100 de sel.
En ce qui concerne les essais tendant à mettre en évidence
des charges ioniques eu sein de la résine XAD-2,
les résultats
obtenus semblent peu probants.
Ainsi, les mesures de pH et per
titration ont plutôt confirmé le caractère neutre de la résine
XAD-2.
Cependant, une certaine conductibilité
a été détectée
dans la solution qui se trouve eu contact de la résine ; celle-
ci pourrait être due à la libération- par l'Amberlite XAD-2 des
composés ionisés assez fortement liés pour ne pas avoir été éli-
minés au cours des lavages précédents (phase de purification de
la résine,
voir Description de la méthode).
On peut donc supposer qu'il existe au sein de la résine
des charges ionisées ; celles-ci pourraient être des impuretés
ioniques piégées entre les mailles de la résine en cours de po-
lymérisation ; d'après CANTWELL (31)
qui e récemment observé
- 165 -
cette propri'té cationique de l'Amberlite XAD-2, ces charges
proviendraient de groupements amines.
CANTWELL, en introduisant des ions ammonium dans le mé-
thanol pr'conisé comme solvant, parvient ainsi à r'duire le
volume de rétention de certains
solut's ionisés tràs fortement
adsorbés par la résine, ce qui semble justifier son observation
ainsi qus celle de ZAIKA.
Enfin,
dans une publication récente, PUON et CANTWELL (32)
semblent avoir réussi, par des mesures de titration potentiomé-
trique de solutions d'acides forts et de bases fortes en pré-
sence et en absence de résine XAD-2, à mettre en évidence une
faible quantité de charges positives et négatives ~ur celle-ci.
La résine serait ainsi susceptible de fixer un peu moins de
4
2.'0-
mmole
d'anions OH
par gramme,
alors que dans notre mé-
thode, la quantité de glycuronide d'oestrogànes déposé sur cha-
-s
que colonne n'excède pas 6.10
mmole par gramme.
La présence de charges positives, même en quantité probe-
blement aussi faible, pourrait expliquer le comportement du 16 ~
glycuronide d'oestriol, conformément à l'hypothèse que nous a-
vons émise. En faveur de cette hypothèse, on peut en outre no-
ter que certains auteurs ont déjà préconisé l'usage du sel
(NaCl) dans leurs méthodes respectives,
sans proposer d'expli-
cation. Ainsi,
OSAWA et SLAUNWHITE (,) conservent le résine
dans une solution de chlorure de sodium;
toutefois, le résine
est abondamment lavée avant son utilisation. D'autres auteurs,
-
1bb -
tels ALEMANY et coll.
(7), dans le cadre de la purification
par voie chromatographique des 17 OH-st~roIdes pr~alablement
hydrolys~s, pr~conisent, sans explication, le lavage des sté-
roIdes adsorbés sur la résine par de l'eau physiologique.
Cela dit, expliquer la forte adsorption des 16~glycuro
ni de d'oestriol en l'absence de sel par la présence de charges
positives sur l'Amberlite XAD-2 cadre mal avec les observations
d'autres auteurs.
Ainsi, nous avons vu précédemment que la présence de char-
ges sur les solutés diminue leur adsorption sur la résine XAD-2,
ce qui explique d'ailleurs, l'influence du pH sur l'adsorption
des solutés fortement ionisables.
Enfin,
nombreux sont les auteurs (4,8,26,28) qui ne sem-
blent pas avoir éprouvé une quelconque difficulté à éluer les
autres types de stéroides glycuroconjugués et même les phénol-
stéroIdes glycuroconjugués ; dans ce dernier cas, les causes
qui ont empêché les auteurs de constater l'influence du sel ont
été évoquées précédem~ent.
On peut encore citer l'utilisation satisfaisante de l'Am-
berlite XAD-2 (en colonne ou en batch) pour l'extraction des a-
cides biliaires plasmatiques, composés qui sont aussi caractéri-
sés par un groypement carboxylique.
D'autres faits peuvent être évoqués qui accentuent le ca-
ractère particulier de cette r~sine Amberlite XAD-2
- einsi, on observe que, lorsque le levage"de le r~sine est
- 167 -
effectué par 8 ml d'eau,pour obtenir une r~cupération voisine de
84 p.100 qui est celle correspondant au dépôt de glycuronide
d'oestriol en solution dans l'urine, il faut urie quantité de sel
très importante (~100 g/l) quand ce même glycuronide d'oestriol
est diesous dans l'eau.
Il semble donc que l'urine contienne d'autres composés sus-
ceptibles de potentialiser l'action du sel. L'urée ne semble pas
être un de ces composés, car elle ne favorise pas l'élution du
16«glycuronide lors~u'elle est employée seule ou associée au
sel; cette dernière observation ayant été faite lors de l'étude
de l'influence du taux de l'urée sur la récupération des oestro-
gènes (voir plus loin).
- d'autres auteurs,
tels RADEmAKER et coll.(9) pour expliquer
les difficultés quelquefois éprouvées pour extraire les 17 céto-
stéroïdes urinaires conjugués et hydrolysés sur colonne de rési-
ne XAD-2, évoquent la qualité variable des différents lots de
résine et le degré de purification avant leur utilisation.
En conclusion de cette étude,
si l'explication du compor-
tement particulier du glycuronide d'oestriol reste discutable,
l'essentiel/dans l'optique de ce travail,est d'être parvenu à
obtenir une purification satisfaisante des oestrogènes conjugués
urinaires ainsi qu'une récupération quantitative et reproducti-
ble.
-
168 -
D - ETUDE DE L'INFLUENCE DE LA QUANTITE D'OESTROGENES DEPOSES
SUR LE POURCENTAGE DE RECUPERATION
Nous avons défini les conditions opti~31es POL-
tion
de l'oestriol et du 16~glycuronide d'oestriol à la dose ~e 10
~g déposés dans 1 ml.
Nous avons voulu vérifier que le pourcen-
tage de récupération reste le même, à des doses variawles d'oes-
trogènes déposés.
1 - Cas de l'oestriol libre
Le tableau VI indique les deux modes opératoires et les
résultats obtenus.
mode
Composition des
~. o u r c en t aç e de
Solution de lavage
opératoire solutions d'cestriol
récupération
1
4,6,10 ",g dans
+
1 ml
8 ml d'eau physiol.
98% - 2,1
d'eau physiologique
+
2
2,3',5,8,10 ~g dans
8 ml d'eau physiol.
96,5% - 4,56
1 ml d'urine préala-
blement dilué au t
par l'eau physiol.
TABLEAU VI
modes d'étude de la linéarité de la récupération
L'élution est réalisée par 5 ml de méthanol, puis l'oestriol eet
dosé par la réaction colorimétrique de KOBER,d'après ITTRICH (6)
-
159 -
On constate, après l'élution globale par 5 ml de méthe-
nol, le dépôt et le lavage ayant été conduits dans les condi-
tians optimales, que la récupération est constante et linéaire
(Fig.IV)
; elle ne dépend donc pas de la quantité d'oestriol
déposé et elle est égale à :
+
- 98 p.100 - 2,1 lorsque l'adsorption est réalisée à partir
de l'eau physiologique
+
- 96,5 p.100 - 4,56 lorsque celle-ci est effectuée à partir
d'une urine surchargée en oestriol.
II - Cas du 16o(glycuronide d'oestriol
Comme pour l'oestriol, la linéarité de la récupération a
été déterminée sur cinq points (dépôts variables entre 1 à 15 ~g
de 16d.glycuronide d'oestriol)
d'après les deux modalités sui-
vantes :
1 - L'urine, préalablement surchargée en
16« glycuronide
d'oestriol (30 ~g/~l) est ajustée à environ 100 9/f de chlorure
de sodium par des dilutions adéquates à l'aide d'eau salée à
200 g/l,
puis à 100 g/l de NeCl. Le lavage est effectué par de
l'eau (8 ml)
2 - L'urine,
surchargée comme précédemment, est ensuite
diluée par l'eau physiologique; le lavage est réalisé par de
l'eau physiologique (8 ml).
Les résultats obtenus après l'élution per 5 ml de méthanol,
-170 -
-
1)
...1)
ca.
~
CJ
1)
...
e......ln
!
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
œ s tri 0 1
a j 0 u t e ( jIg)
Fig. IV -
etude de la linéarité du
pourcentage de récupération de J'oestriol
après élutlon
par
Sml de
méthanol.
----e
. -
Oestriol déposé en solution dans
l'nu physiologique.
Uvlge
par
l'eau
physiologique.
- A - A -
OestrioJ
déposé
en solution urinaire di'''' au
1/2 pIlr de 1'....
. physiologique.
l.aqge .... •
1'...,
physiotogique.
- '7' -
puis le dosage de l'oestrogène (fig.V) permettent d'observer
une excellente linéarité dans la modalité "2" (modalité optimale)
avec un pourcentage moyen de récupération de 93,5 p.,OO !
3.
Dans le modalité "'", on observe une linéarité moins sa-
tisfaisante puisque la récupération est plus élevée aux faibles
concentrations de 16~glycuronide d'oestriol déposé; la récupé-
+
ration moyenne est alors de 87 p.'OO - 8,5.
Nous avons évidemment préféré la seconde modalité dans le
cadre de l'élaboration de la méthode.
III - Discussion
Cette étude confirme que la conduite de la chromatographie
en milieu "eau physiologique"
est la plus efficace ; elle montre
surtout qu'en milieu urinaire, les 93,5 p.'OO :
3 de récupéra-
tian trouvés ne dépendent pas de la qLantité de 16 ~glycuronide
d'oestriol introduit sur chaque colonne. Un tel pourcentage de
récupération seffible satisfaisant, notamment si on le co~pare à
celui donné par d'autres auteurs,
tels OSAWA et SLAUNWHITE
(1)
82,9 p.100 en moyenne (75 à 95 p.'OO), LEE et HAHN EL
(2)
:
85,9 ~ 5,7 p.,OO.
..,
!
A
•CL::1U1)..
--
-o....etI
!."'C
1)
"'C
.-Co..::1
U
>
-0)
lS'
CD
-
16« glycuronide d'œstriol ajoute (pg)
fig.
V -
~tude de la line.itti de Il récupération du 16 Q( glycuronide d'oestriol en
mitieu
urineire
Ce'ution/5 ml
métNnol)
---A- ,
Dip6t en solution
urinaire
di".. ...
........l---
1/2 p8I" •
1'-.. physiologique.
Uv. pet" l'au physiologique.
~f}.- Dép6t en solution urinaire diluee ... 1/2 ~ de l'Mu . . . ~ 200g de
NI CIII. Uvege pltr
de l'eau.
-
173 -
E - ETUDE DE L'INfLUENCE DU VOLumE DE SOLUTIONS D'OESTROGENES
DEPOSE
Voulant savoir si la méthode de dosage des oestrogènes
proposée ici,et dont la sensibilité globale est fonction de cel-
le de la réaction de KDBER , peut être adaptée au dosage d'oes-
trogénuries très faibles,
nous avons essayé d'utiliser la gran-
de cepacitéde concentration des oestrogènes sur la résine ;
pour cela, nous avons vérifié qu'en déposant la même quantité
de soluté dans un volume variable, l'élution reste quantitative.
Les expériences suivantes ont donc été réalisées :
- Des quantités constantes d'oestriol ont été déposées dans
des volumes croissants,
soit d'urines diluées à l'eau physiolo-
•
gique, soit d'eau physiologique.
6 ou 10 ~g d'oestriol ont été
ainsi déposés dans 1,3 et 5 ml de solution.
Après lavage à l'eau
physiologique, l'oestriol est élué par 5 ml de méthanol, puis
dosé.
Les pourcentages de récupération obtenus (en moyenne 97
p.10D ~ 3 et 93 p.100 : 4,5 respectivement en milieu aqueux et
urinaire) n9 diffèrent pas sensiblement de ceux donnés par le
dépôt de l'oestriol dans 1 ml de solution.
- Dans les mêmes conditions, le '6~glycuronide d'oestriol e
-
174 -
aussi donné des résultats très voisins de ceux précédemment
obtenus par dépôt dans 1 ml de solution, soit 95 p.100 :
3
et 92 p.100 :
4 de récupération respectivement en milieu a-
queux et urinaire.
Il semble donc possible de conclure que le volume dans
lequel les oestrogènes sont dépos~s sur la colonne n'interfè-
rent pas sur la récupération,du moins dans les limites préco-
nisées dans nos essais (1 à 5 volumes).
La conséquence de cette observation est appréciable car
elle donne à penser que la méthode peut ~tre ~tendue au dosage
des 0 est r 0 gè n e sur i n a ; r e s d e l a pre mi ère moi t i é de l a g r 0 s ses se,
[mime de cycle.
Dans ce dernier cas, une évaluation fluorimétrique serait plus
indiquée comme l'ont fait LEE et HAHNEL (2)
dans le cadre des
urines de fin de grossesse.
D'ailleurs, CHU et coll.
(27) ont déjà exploité cette ca-
pacité de concentration de l'Amberlite XAD-2 pour doser les oes-
trogènes urinaires de cycle; dans cette méthode, les oestrogènes
urinaires sont d'aborj extraits et concentrés sur colonne de ré-
sine XAD-2, hydrolysés par voie enzymatique, puis à nouveau pu-
rifiés sur colonne de résine XAD-2.
Une évaluation par chromato-
graphie en phase gazeuse termine le dosage.
-
175 -
f - INfLUENCE DE fACTEURS OIVERS
les urines émises par les femmes gestantes, notamment
au cours du dernier trimestre, peuvent présenter des particu-
larités susceptibles, soit d'interférer sur la phase de puri-
fication chromatographique des oestrogènes, soit de gêner le
développement de la réaction de KDBER.
Nous nous sommes interessés à l'influence
- du pH urinaire. En cas d'infection génito-urinaire, les
urines peuvent, en effet, être très alcalines, surtout si le
dosage est différé.
- des protéines urinaires : leur présence dans les urines
résulte généralement d'affections cardiovasculeires, d'affec-
tions rénales, de la toxémie gravidique ou de l'éclampsie.
- du glucose urinaire au cours des syndromes diabétiques.
- de la concentration de l'urée.
1 - Etude de l'influence du pH
Pour cette étude, ~ne urine de fin de grossesse qui a été
diluée par de l'eau physiologique sert de source d'oestrogènes.
Une aliquote de cette dilution sert de témoin: pH 6,5. La même
urine a été ejustée respectivement à pH 4,55 et '0,5, soit per
- 176 -
de l'acide acétique 10N et de la soude N, soit par des solu-
tions tampons. Nous avons utilisé à cet effet
- Le solution tampon 2m, pH 4,55, préparée par mélange de
100 ml d'acide acétique 10N avec 46 ml de soude 10N, puis le
volume final est complété à 500 ml par de l'eau.
- La solution tampon de BROWN, pH 10,50. Elle est préparée
par l'addition de 150 ml de soude SN à 1 litre de solution de
bicarbonate de sodium à 8 g pour 100 ml dans l'eau. Après ad-
sorption des oestrogènes (dépôt de 1 ml de chaque dilution)
sur les colonnes de résine,
puis levage par B ml d'eau physio-
logique,
on élue par 5 ml de méthanol. Les résultats issus du
dosage des oestrogènes élués permettent les conclusions sui-
vantes
= Le pH n'exerce aucune influence sur la récupération des
oestrogènes déposés qui est de 102 p.100 ~ 3 par rapport à la
dilution urinaire témoin (pH 6,5) lorsque l'acidification et
l'elcalinisation sont réalisées par l'addition de soude N ou
par l'acide acétique 10N.
= Par contre,
en milieu tamponné,
on obtient par rapport
à la dilution urinaire témoin,
une récupération relative de
96 p.100 ~ 7 et 44 p.100 ~9, respectivement aux pH 4,55 et
10,50.
D'autre part, dans ces conditions, les résultats sont ca-
ractérisés par une mauvaise répétebilité, surtout à pH 10,5.
Dans ce dernier cas, en effet,
l'hydroquinone ajouté ~ l'éluet
- 177 -
est visiblement d~truite au moment de le reprise du r~sidu
d'~vapor8tion par l'eau bidistill~e en vue de le coloration;
ceci est la conséquence d'une alc81init~ résiduelle de l'éluat
sup~rieure à pH 9, en d~pit du lavage de la colonne par 8 ml
d'eau physiologique eprès la phase d'adsorption. C'est donc la
destruction de l'hydroquinone nécessaire à le protection des oes-
trogènes pendant l'évaporation et surtout pendant le développe-
ment de la coloration de KD8ER qui explique la perte importante
d'oestrogènes observée (44 p.1DD de récupération).
En milieu non tamponné, le lavage préconisé suffit à éli-
miner les ions excédentaires, ramenant le pH entre 5 et 8 (pH
des dernières gouttes de solution préconisée pour le lavage),
ce qui explique qu'aucune interférence du pH n'est constatée.
Ces conclusions semblent s'opposer en partie à celles
d'DSAWA et SLAUNWHITE
(1) qui avaient observé l'existence d'une
certaine perte au cours de l'adsorption des oestrogènes par la
résine lorsque ceux-ci sont déposés en solution alcaline, pH >7.
Pour ces auteurs, leurs observations reposent sur l'in-
fluence classique du pH sur l'adsorption des solutés acides fai-
bles, tels les oestrogènes. En ce qui nous concerne, les résul-
tats obtenus excluent toute perte possible eu niveau de l'adsorp-
tion ; la perte ne peut être provoquée que par une alcalinité
résiduelle de l'éluat supérieure à pH 9, ce qui ne se produit
que pour des urines exceptionnellement tamponnées,
au moment du
développement de la réaction de KDBER.
- 176 -
Par conséquent, compte tenu de l'@fficacité ~e l'importent
volume d'eeu physiologique préconisée pour le lavage dans notre
méthode (8 volumes d'eau physiologique per repport eu volume de
solutio~d'oestrogènes déposé), on obtient un éluet dont le pH est
voisin de 7 iar l'urine est relativement peu tamponnée. Il sem-
ble que les pertes à la récupération observées par OSAWA et
SLAUNWHITE (1), dans le cas des ur ires alcalines, soient plut6t
dues à un lavage insuffisant de la résine (1 volume d'eau seule-
ment par rapport au volume d'urine déposée) qu'à un défaut d'ad-
sorption des oestrogènes.
Quoi qu'il en
soit,
en ce qui concerne notre rréthode,
on
peut dire que le pH urinaire n'exerce aucune influence sur le
résultat du dosage des oestrogènes, dans les conditions de puri-
fication précédemment décrites.
II - Etude de l'influence de la protéinurie
Des aliquotes d'une même solution urinaire de
16~ glycuro-
nide d'oestriol ont été surchargées respectivement à 0, 5 et 20
g/l d'albumine bovine (Poviet Producten N.V.
Amsterjem). 1 ml de
ces solutions est déposé sur des colonnes de résine XAD-2.
Après l'adsorption, puis le levage de la résine par 8 ml
d'eau physiologique, l'élution est effectuée par 5 ml de métha-
nol. Les résultats du dosage du 16~glycuronide d'oestriol élué
indiquent que, Quelle que soit l'importance de l~elbuminurie, on
obtient 100 p.100 de récupération per rapport à le solution uri-
-
179 -
naire t~moin (0 g/l d'elbumine).
Il n'y a. par cons~Quent, aucune interférence de la pro-
t~inurie Bur les résultats du dosage des oestrogènes, les pro-
téines urinaires étant d'ailleurs éliminées eu cours de la pha-
8e de purification chromatographique (1).
III - Etude de l'influence de la glucosurie
Comme pour l'étude du pH,
une urine de fin de grossesse ne
contenant pas de glucose a été utilisée pour effectuer cette re-
cherche. L'urine est d'abord ajustée à O. 30, 60 et 120 g/l de
glucose au moyen de dilutions adéquates par des solutions aqueu-
ses glucosées contenant, en outre. 9 g par litre de chlorure de
sodium.
Après la purification chromatographique dans les conditions
optimales et le dosage des oestrogènes élués, on observe que:
- jusqu'à 60 g/l de glucosurie, la récupération des oestrogè-
+
nes déposés sur les colonnes de résine est de 97 p.10Q - 1 par
rapport à l'aliquote urinaire témoin (ne contenant pas de glu-
case).
- avec 120 g/l de glucosurie, ce pourcentage de récupération
baisse sensiblement au niveau de 90 p.100. en raison de la pré-
sence d'un résidu de glucose dans l'éluat méthanolique ; il est
bien connu que le glucose interfère lors du développement de la
réaction de KOBER.
-
180 -
On peut dire, que dans les limites habituelles des glu-
cosuries pathologiques «60 g/l), le glucose qui n'est pas
adsorbé sur la résine du
fait de son caractère hydrophile, est
éliminé presque quantitativement au cours de la phase de puri-
fication chromatographique, ce qui explique l'absence d'inter-
férence de telles glucosuries sur les résultats.
Des glucosuries aussi élevées que 120 g/l étant plutôt
exceptionnelles, il semble possible d'affirmer à la suite de
nombreux auteurs (1,27) que la glucosurie n'interfère pas sur
les résultats du dosage des oestrogènes par la mét~~de proposée.
IV - Etude de l'influence de l'urée sur la récupération des oes-
gènes déposés sur la résine
Nous avons déjà vu lors de l'étude de l'élution que l'urée
ne gène pas l'adsorption du 16 ~glycuronide d'oestriol sur la ré-
sine mais, à elle seule,
n'en favorise pas la désorption par le
méthanol. Nous avons cependant voulu vérifier si, en présence de
sel,
le taux de l'urée n'influe pas sur les résultats du dosage
des oestrogènes par la méthode que nous proposons.
Cette étude a été effectuée à la fois sur le 16~glycuro
nide d'oestriol en solution dans l'eau physiologique et sur des
oestrogènes urinaires de grossesse déposés sur les colonnes de
résine. Les modes opératoires ainsi que les résultats obtenus
sont indiqués dans le tableau VII.
- 1S1 -
mode
Composition des solu-
Solution de
Pourcentage de
opératoire
tions d'oestrogènes
lavage(S ml)
récupération
..
1
10 ~g de 16 -"glycuro-
Eau physiologique
98% - 1
(TéfTloin)
nide d'oestriol dans
1ml eau physiologique
..
2
10 ~g de 16 eLglycuro-
Eau physiologique
92% - 3
nide d'oestriol dans
1ml eau physiologique
contenant 20 g/l urée
..
·3
10 ~g de 1601. glycuro-
Eau physiologique
93,35% - 5
nide d'oestriol dans
1ml eau physiologique
contenant 40 g/l urée
-
1 '
1ml urine v. diluée
Eau physiologique
4,20 \\.Ig +- 0,1
au 1/4 par de l'eau
physiologique.
+
2 '
1ml urine V. diluée
Eau physiologique
4,401Jg - 0,04
au 1/4 par de l'eau
physiologique conte-
nant 20 g/l d'urée
+
3 '
1ml urine V. diluée
Eau physiologique
4,10 t-lg - 0,15
au 1/4 par de l'eau
physiologique conte-
nant 40 g/l d'urée
TABLEAU VII
Etude de l'influence du leux de l'urée sur la récupération des oes-
trogènes • l'élution est réalisée par 5 ml de mêthenol et les oes-
trogènes dosés par le réaction colorimétrique de KDSER, selon le
modalité d'IT1RICH.
- 182 -
On observe eussi bien en milieu "eau physiologique"
qu'en milieu urinaire que le concentration en ur~e des solutions
d'oestrogènes d~po6~es n'affecte'
- ni l'adsorption de ces derniers sur la r~sine puisque la
récupération est quantitative et ~oisine des 100 p.100 dans tous
les cas.
- n: la phase d'~lution comme nous l'avons observé précédem-
~EGt ; d'ailleurs, à ce stade de la purification chromatographi-
Gue,
l'urée se~ait qU2ntitativement éliminée dans les eaux de
lavage (1,27).
Il
faut cependant signaler que MATSUI et coll.
(26) ont
recemment montré que 23 p.100 des 100 mg d'urée dépos~s sur des
.~~onnes de résine XAD-2 (70x2cm) sont retrouvés dans l'éluat
I~ar ",GO ml de méthanol) après le lavage par 200 ml d'eau. Dans
ce cas, les résultats obtenus au cours de cette étude confirme-
raient par ailleurs que le résidu d'urée dans l'éluat ne gène
pas le développement de la coloration de KDBER.
Il semble possible de conclure à l'absence totale d'lnflu-
Ence du taux d'urée sur le dosage des oestrogènes urinaires par
les méthodes utilisant la résine Amberlite XAO-2.
-
183 -
G - ETUDE DU DEGRE DE PURETE DES OESTROGENES URINAIRES PURIrIES
PAR LA RESINE XAD-2
L'objet de cette étude a été d'éprouver le degré de pure-
té des oestrogènes conjugués urinaires, obtenu par l'unique pha-
se de purification chromatographique sur la résine XAD-2. A cet
effet, les absorbances du chromophore extrait selon le procédé
d'ITTRICH, puis les spectres enregistrés, ont été comparés lors-
que l'oestriol 16 ~glycuroconjugué provenait
- d'une solution éthanolique (témoins)
- d'une urine diluée au 1/3 par de l'eau physiologique et sur-
chargée en 16"'glycuronide d'oestriol.
Celle-ci est
:
soit directement soumise à la réaction de KD8ER
c'est la
méthode directe d'ITTRICH.
- soit soumise è 12 purification Dar chromatographie sur co-
lonne de résine XAD-2
; cette purification a été effectuée dans
les conditions optimales préalablement définies.
Afin de rendre les résultats absolument comparables, les
dosages par les deux types de méthodes (en l'absence ou en pré-
sence de purification) ont été réalisés à partir d'une même
quantité de 16 ~glycuronide d'oestriol dissoute dans le même mi-
lieu.
- 184 -
On observe evec la méthode directe d'ITTRICH (tableau VIII)
une importante diminution de l'absorbance au maximum d'adsorption
(à 538,Snm) par rapport à celles données par
les témoins et par
la méthode proposée.
0.0
[L 0
0.0
D.Oc *
500nm
53E,5nm
577nm
0,102
0,363
0,001
0,312
Standard = 8 vg de 16d-gly-
0,105
0,369
0,000
0,318
curonide d'oestriol
0,095
0,363
0,000
0,315
8 '"' 9 de
16.,1. glycuronide
0, 135
0,374
0,035
0,289
d'oestriol urinaire puri-
0,130
0,370
0,040
0,295
fié sur résine XAD-2
0,140
0,371
0,030
0,286
8 ~ 9 de 16al glycuronide
0, 151
0,260
0,041
0,165
d'oestriol directement dosé
0, 155
0,266
0,050
0,164
par la méthode d'ITTRICH
0,145
0,265
0,045
0,170
*
0.0 500
0.0
= 0.0 538,5
+
0.0 577
c
2
TABLEAU VIII
Absorbances mesurées au spectrophotométre Jobin-Yvon avant
l'enregistrement des spectres
De plus, les absorbances de la ligne de base à 500 nm et
à 577 nm sont relativement plus élevées dans cette méthode di-
recte d'ITTRICH.
Ceci semble traduire le présence dans l'urine d'impuretés
susceptibles d'inhiber le développement de la coloration, mais
-
185 -
aussi de chromogènes interférents.
Par contre, les valeurs obtenues par le 16~glycuronide
d'oestriol témoin et pour celui purifié sur colonne de résine
XAD-2, sont très proches ; de même, les spectres obtenus dans
ces deux cas sont très voisins (fig.VI). Ceci reflète l'excel-
lent degré de purification obtenu par la méthode proposée.
. l i '
03
1
1
02 ~
0.1
G)
(J
e
ca
0.4
J:l
-
0
Ut
J:l
ca
0.3
0.2
450
500
538,5
577
600
longueur d'onde en
nm
FIg. VI
-
Spectres d'absorption
des
produits de
la reaction de
Kober
selon
Ittrich.
1 _ sur
8
JJ g de 16 CI( glycuronide d'oestriol en solution dans l'éthanol
(s~ndard)
2 - sur 8
~ 9 de 160( glycuronide d'oestriol en lOIution uriMire, purifiée
pilr la résine
XAD·2.
- 187 -
H - ETUDE DE LA REGENERATION DE LA RESINE
Dans un souci d'ordre économique, la longévité de la ré-
sine a été testée.
Certains auteurs (4,28) ont, à cet effet, préconisé de
régénérer les colonnes de résine par un simple lavage à l'eau
ce procédé s'est révélé insatisfaisant dans nos mains en c~ qui
concerne les oestrogènes.
Plus habituellement, d'autres Buteurs (1,12,13) ont régé-
néré la colonne de résine souilléerpar lavage à l'aide de 3 à 5
volumes d'un solvant organique (méthanol, éthanol, acétone), sui-
vi d'un abondant rinçage à l'eau (environ 10 ~olumes d'eau).
Avec ce second procédé, cependant relativement plus effi-
cace que le précédent, nous n'avons réussi à régénérer la résine
de manière satisfaisante qu'une seule fois
les régénérations
ultérieures nous ont paru insuffisantes comme en témoignent les
résultats consignés dans le tableau IX. On observe,
en effet,
qu'après la 2ème régénération de la résine (3ème usage de la
résine)
- le dosage d'une même urine de fin de grossesse V. donne
une concentration excédenteir~ de l'ordre de 30 p.100 par rap-
port à celle obtenue lors des deux premiàres utilisations de
la résine (soit environ 34.000 Yg/24h).
Dusages d'unb même urine de
Equivalent en oestriol du
fin de grussesse
V.
(résul-
blanc-résine obtenu par dé-
tats en py d'oeslriol/24h)
pôt d'1ml d'urine d'enfant
diluée au 1/4
35.000 }
33.600
o Vg
Résine XAD-2
:
1er usage
32.100
33. 'J 2 5
33.600
~O.Oc moyenne = 0,012 ! 0,004)
34.000
R~sine XAD-2
:
2ème usage
36.000 }
32.500
0,3 \\.19
(c'est-à-dire après une
34.000
34.113
régénération)
33.950
0.0
moyenne = 0,020 ! 0,005)
c
34.115
1
39.600
Résine XAD-2
:
3ème usage
42.600
1 , 20 ~ g
(apr~B deux régénérations
42.000
43.717
consécutives)
46.200
(D.O
moyenne = 0,080 + 0,03)
45.900
c
46.000
TABLEAU
IX
Etude de la rég6néralion de la résine par
la méthode d'OSAWA et SLAUNWHITE
(1)
Q.
œ
On observe que le blanc-résine est inférieur à
la limite de détection (établie plus loin)
eu cours des deux premiers uS8yes consécutifs de
la résine.
Au 3ème usage
(2ème régéné-
retion),
le blanc-résine s'élève à
1,20 ~g en équivalent-oestriol, ce qui donne environ
7.200 tJg/24 heures en s u u p n a ar i t. 1'3 diurèse à
1.500 ml/24 heures,
comme pour
l'urine
V.
-
189 -
- de plus, le blanc-résine obtenu par dépôt de 1 ml d'urine
d'enfant préalablement diluée au 1/4 par de l'eau physiologi-
que (le concentration propre de cette dilution urinaire est in-
détectable par notre méthode) donne une absorbance corrigée
moyenne de 0,080 !
0,030 ; celle-ci est supérieure à la limite
de détection établie plus loin (0,022 en ebsorbance corrigée)
et son équivalence en concentration d'oestriol s'élève à 1,2 pg
en moyenne, ce qui donnerait, en supposant la diurèse égale à
1500 ml comme pour l'urine V.,
une concentration voisine de
7200 ~g par 24 heures pour le blanc-résine.
:1 est intéressant de noter qu'une telle concentration
correspond aux 30 p.100 d'excédent d'oestrogènes trouvés avec
l'urine V.
C'est ainsi que,
nos expériences précédentes ayant montré
que le chlorure de sodium favorise la désorption des oestrogènes
conjugués adsorbés sur la résine XAD-2, nous avons établi le
protocole de régÉnération suivant :
- 12 rÉsine souillée est recueillie dans un bécher. en y a-
joute 1,5 à 2 volumes d'eau physiologique et on agite 2 minutes.
Une agitation magnétique douce peut être préconisée à cet effet.
- après décantation de l'eau physiologique, la résine est re-
prise par 2 à 3 volumes de méthanol;
après 2 à 3 minutes d'agi-
tation, le méthanol est éliminé à SQn tour, puis la résine est
abondamment rincée per 3 fois 3 volumes d'eau afin d'éliminer
....
toute trace résiduelle de méthanol.
-
190 -
L'efficecit~ de cette m'thode est ~prouv'e en utilisent
la r'sine native ou r'g~n'rée pour purifier, puis doser des
aliquotes d'une même solution de 16~glycuronide d'oestriol
urineire. La figure VII rend compte des pourcenteges de r'cu-
pération einsi obtenus (dans les conditions chromatographiques
optimales) à l'issue de cinq régénérations consécutives de la
même résine (soit 93,4 p.100 en moyenne). On observe qu'en dé-
pit d'une légère coloration jaune de la résine,
son efficacité
est conservée au fil des régénérations. Nous n'suons pas pour-
suivi nos essais au delà de six utilisations consécutives de
la résine.
,
1
100
90
#.
80
e
o
..ca..•a.:;:,u•..
1
2
3
4
5
8
Nombre d 'usages consecutifs de la resine
regeneree au fUI ut a mesure
-•
-
Fig.
Vit
- Etude
de
la
régénération
de
la
résine
1
Correspond
au
pourcentage
de
récupération
obtenu
lors
de
la
1ère
utilisation
de
la
résine;
2
à
6
-
Correspondent
aUM
pourcentages
de
récupération
obtenus
après
5
régénérations
consécutives
par
notre
procédé.
La
régénération
a
été
éprouvée
dans
tous
les
cas
sur
la
même
dilution
ou
1/2 d'un
pool
urinaire
par
dA l'eau
physio
I.......puis surchargée à 6 1-1, par ml de 16ICglycuronido d'oestriol (dépôt : 1 ml).
Elution
par
6
ml
de
méthanol
après
lavage
par
l'eau
phvsiologique.
-
192 -
1 - CHOIX DE LA DILUTION INITIALE DE L'URINE DE GROSSESSE
AU momENT DES DOSAGES
Afin de limiter au maximum le nombre des étapes de la
méthode,
nous nous sommes proposés d'effectuer la réaction de
la coloration sur l'ensemble de l'éluat résultant de la phase
de purification chromatographique sur la résine XAD-2.
Ceci exige une dilution adéquate de l'urine de grossesse
afin de ramener la concentration des oestrogènes entre 1 et 10~g
d'équivalent-oestriol par millilitre de dilution,
zone de con-
centration dans laquelle les lois de BEER et LAmBERT sont res-
pectées et où les densités optiques obtenues sont alors inférieu-
res à 1,00 (de nombreux spectrophotométres n'étant pas adaptés à
la lecture correcte de densité optique supérieure à l'unité).
En nous référant surtout ~ l'oestrogénurie (ou à l'oestrio-
lurie)
moyenne normêlement admise en fonction de l'âge de la
grossesse (22,33-37),
et plus accessoirement aux résultats d'une
trentaine d'oestrogénuri~s déterminées par notre méthode (Fig.VIII.
il semble possible d'envisager,
à titre indicatif et pour une
diurèse moyenne de 1 litre,
les dilutions urinaires suivantes
-
jusqu'à 29 semaines:
dilution au
1/2 par l'eau physiolo-
gique
- entre les 30e et 35e semaines
dilution au '/3 par l'eau
physiologique
100
45
.r.
..
~I'
N
00-
m30 0
::4
e
. .
G)
'0 20 00-
...
t
...fit
!-
e
,. 10--
V'
,if
.-:2
0-
W
~
-
-
Periodes de grossesses
1
Fig.
VII'
-
Excrétion
urinaire
moyenne
des
oestrogènes
par
période
de
,.
grolselse.
~
W
1
1
Période
de
26
à
29
semaines
(2
urines)
2
Période
Ife
30
à
35
semaines
(12
urines)
3
Période
> 35 semaines
(16
urines)
- '94 -
- eu delà de le 35e semeine
dilution eu 1/4 par l'eau
physiologique.
Nous avons, par ailleurs,
vérifié, eussi bien avec des
chromophores donnés par des solutions étalons d'oestrogènes
qu'avec des chromophores obtenus eprès purification chromato-
graphique, que, entre 10 et 15 ~g d'équivalent-oestriol, les
résultats obéissent encore aux lois de BEER-LAmBERT (0,2 à
20 ~g d'oestriol d'après ITTRICH lui-même) ; en outre, une di-
. lution instantanée au 1/2 par la solution chloroformique de pa-
renitrophénol à 2 P.100 (la solution d'extraction du chromophore)
permet d'obtenir des absorbances corrigées égales à la moitié
de celles données par la lecture de la coloration non diluée.
Par conséquent, lorsque la coloration de KOBER est très
intense du fait d'une dilution initiale inadéquate et que l'on
ne dispose pas d'un spectrophotométre permettent de lire correc-
tement les absorbances supérieures à l'unité, il suffit de pro-
céder à la dilution mentionnée ci-dessus et d'en tenir compte
dans l'expression des résultats.
-
195 -
J - DESCRIPTION DE LA mETHODE
Il ressort des résultats donnés par l'étude de la phase
chromatographique que, dans les conditions optimales définies
- l'adsorption des cestrog~nes déposés sur la résine est
Quantitative
- l'élution par 5 ml de méthanol est quantitative
- ni le pH, ni les protéinuries, ni la glucosurie, ni la con-
centration de l'urée n'interfèrent sur les résultats des dosages.
D'autre part,
sans avoir repris l'étude de la réaction
d'ITTRICH dont la valeur est reconnue,
nous avons cependant tenu
à vérifier la linéarité de
la coloration obtenue avec l'oestriol
et le 16 ~glycuronide d'oestriol en solution éthanolique (entre
les limites de 1 à 10 ~g d'équivalent-oestriol)(Fig.IX).
Par ailleurs,
i l
a été montré la oossibilité de remplacer
l'éthanol absolu par le méthanol dans la préparation des solutions
étalons d'o8striol à 10 ~g/ml (Fig.X).
Enfin, il a été vérifié, à la suite d'QSAWA et SLAUNWHITE
(1) notamment, que l'oestriol et son dérivé 16 wglycuroconjugué
ont un rendement calorimétrique équivalent à molarité égale
(Fig.XI).
L'ensemble de ces résultats nous permet de proposer la
méthode suivante.
CD
•Ct---00u
•uc:
ca
..a
-0en.a O.
CI:
f
Œstr i 01
en
l-I9
Fig.
IX
-
3 courbes étalons
réalisées
en
inter-série avec
de
I'oestriol
un
solution dans
l'éthanol
absolu
(10
....'/mlt
selon
Ittrich'6~haque point correspond à la moyenne de
2 déterminations.
- 197 -
G)
G)
0)
~
~
0
u
0,
G)
u
eca
SJ
~
0en
SJ
0,2
c(
4
8
Œstriol
en
~g
Fig. X -
Comparaison de 2 courbes étalons réalisées
à
partir de solution-fille d'oestriol
..a 10 ~/ml dans
-
l'éthanol
- 0 - - 0 -
-
le
rMtNnol
- ..-
- 1" -
Q)
Q)
en
~
~
0
u
0-
G)
o
e
CO
.J:J
~
0
ri)
.J:J
C
4
12
14
Oestrogenes en
1.19
Fig. XI -
Etude
comparée des
pouvoirs chromogéniques de
l'oestrone
(
0 - 0 - )
du
16.glyc. d'oestriol
l - d - - â - l et de
"oestriol
f - - ' - - ' - l . selon Il
reaction
d'Ittrich
(6),
à
pilrtir
de
solutions éthanoliques.
r
1 :
0111/01
~ 90~
r2
: Gtyc.
0111/01
=55% ; r3 : glyc. a 111/0111 '=' &O'D, ce qui est très
wotJin du repport correspondant des P.M. : ~.
-
199 -
1 - Principe
les oestrogènes conjugués urinaires, directement purifiés
sur une colonne de r~sine Amberlite XAD-2, sont élués et colorés
per le r~ection de KOBER, selon le modalité d'ITTRICH (6). Le
chromophore obtenu est extrait par une solution chloroformique
de paranitrophénol à 2 p.100 (p/v), puis évalué au spectrophoto-
métre par rapport à une gamme étalon d'oestriol.
Il - Réactifs et matériels
- Eau physiologique : eau désionisée contenant 9 grammes de
chlorure de sodium par litre
- Solution éthanolique d'hydroquinone (merck) à 2 grammes pour
100 ml d'éthanol. Se conserve 5 jours à +4°C.
- Solutions stock d'oestriol,
d1oestrone,
de 16 œglycuronide
d'oestriol
(Sigma). Chaque solution contient un de ces phénolstÉ-
roides à la concentration de 1 mg/ml dans l'éthanol absolu (merck).
Elles se conservent plusieurs mois à +4°C.
Les solutions de travail à 10 ~g/ml dans l'éthanol (ou le
méthanol)
doivent être préparées extemporanément au moment de cha-
que dosage;
elles ne peuvent être conservées pendant plus d'une
journée à +4°C.
- Acide sulfurique concentré (Merck)
-
200 -
- Solution chloroformique (CHC1
'
RP) de peranitrophénol
3
(merck) à -2 gremmes pour 100 ml ; elle est préparée 10 à 15
minutes avent le terme de la réaction de KOBER, puis conservée
en bain de glece.
b - Matériels
=========
- Résine neutre Amberlite XAD-2, 300 à 1000P (Serva)
- Colonnes en matière plastique Bio-Rad (6xO,5cm), munies
d'un embout plastique et d'une pince pour régler le débit (Fig.I)
- La réaction de KOBER est effectuée dans des pots ronds
communément appelés "tubes de KOBER", munis de bouchons rodés
les tubes étant plongés dans un bain-marie bouillant (100 c e ) ,
muni d'un couvercle.
L'évaporation est réalisée à température constante (soce)
sous courant d'air obtenu à l'aide d'un compresseur et d'un sys-
tème de bouchons rodés à double tubulure pour distribuer l'air
produit dans les tubes de KOBER.
- Un Vortex-Génie a été utilisé pour l'agitation au moment de
l'extraction des chromophores obtenus,
par la solutio; chloro-
formique de paranitrophénol.
- Les absorbances ont été mesurées sur un spectrophotométre
Jobin-Yvon (type maroe) et les spectres enregistrés sur un spec-
trophotométre double faisceau Jobin-Yvon
(Duospac).
- 201 -
III - mode opératoire
La diurèse des 24 heures est prélevée sur quelques centi-
grammes ( - 2 cg) d' azide de sodium.
b - Dilution de l'urine
-------------------
La dilution de l'urine de grossesse est effectuee par de
l'eau physiologique en fonction de la concentration présumée de
l'oestrogénurie , celle-ci dépendant de l'âge de la grossesse
(du moins au cours de la gestation normale). S'il s'agit d'une
première détermination, on peut, à titre indicatif, procéder de
la manière suivante :
dilution au 1/2
grossesse de 20 à 29 semaines
dilution au 1/3
grossesse de 30 à 35 semaines
dilution au 1/4
grossesse Elu-delà de 35 a ama i n e s
1) - Préparation des colonnes
- ~uE..if..i~ation d~ La_r~sine : La résine est d'abord mise à
gonfler dans 2 à 3 volumes d'eau pendant une nuit à +4 D( .
Ensui-
te, elle est lavée successivement par :
• 3 fois 3 volumes d'eau (jusqu'à élimination des fines perti-
cules).
-
202 -
• 1 volume de méthanol
• 3 fois 3 volumes d'eau
Une agitation magnétique douce est effectuée lors de cha-
que lavage. A l'issue de la dernière décantation, la résine est
reprise par 1 à 2 volumes d'eau, puis conservée à +4°C dans un
récipient bouché.
- Préparation des colonnes: Des petites colonnes en matière
- - - - - - - - - - - -
plastique, insolubles dans les solvants organiques (type Bio-Rad)
ont été utilisées au cours de nos essais. Un système de tuyau
plastique résistant au méthanol, muni d'une pince, permet de ré-
gler le débit des colonnes.
On commence par distribuer environ 1 ml d'eau par colonne,
on y introduit ensuite 1,5 ml environ de résine.
Après élimina-
tion de l'excédent d'eau par écoulement, un film aqueux doit
protéger le résine contre la déssication à l ' a i r ; les colonnes
sont ainsi prêtes à l'emploi.
2)
Extraction chromatographigue des oestrogènes urinaires
- ~d~oEPliQn_d~s_o~slrQgin~s_s~r_l~ Lé2i~e : 1 ml de l'urine
diluée est introduit lentement (contre la paroi)
au sommet de la
colonne de résine; chaque dilution urinaire est ainsi traitée
en double. Le débit des colonnes est réglé à environ 0,3 ml/mn
(temps optimum
2 à 3 mn).
- ~a~ase_:
8 ml d'eau physiologique sont introduits sur cha-
que colonne, lentement contre la paroi. Le débit est réglé à
environ 3 ml/mn (temps optimum: 3 mn).
-
203 -
_ llutio~ : Exactement 5 ml de méthanol sont déposés jéli-
catement au-dessus de lë résine, les tubes de KOBER ayant été
préalablement disposés au
bas des colonnes pour récolter l'é-
luat. Le débit est porté à 1 ml/mn environ (temps optimum
5 mn).
Elle porte simultanément sur les éluats et les solutions
étalons d'oestriol.
1)
Courbe étalon
On prépare en double plusieurs tubes de
KOBER contenant 2,
4,
6, B,
10 ~g d'oestriol, ceci à l'aide d'une solution éthano-
li~ue (ou méthanolique) d'oestriol à 10 ~g/ml, préparée Extem-
poranément à partir d'une solution stock à 1 mg/ml
(conservée
à +4°C).
Ces tubes sont complétés à 5 ml par du méthanol.
En prati-
que, compte tenu de la linéarité de la ga~me étalon,
un SEul
Goint
(par ex.
5 ~g),effectuée au moins en double, suffit.
2)
Evaporation
Dans chacun des tubes "dosages" et "étalons",
1 ml de
solu-
tion éthanolique d'hydroquinone à 2 g p.10D ml est ajouté.
Au cours de l'élution de la résine,
quelques gouttes de
l'éluat peuvent être déposées sur la paroi des tubes de KDBER
il faut prendre soin de les récupérer au moment de l'addition de
- 204 -
la solution éthanolique d'hydroquinone à 2 p.100.
Les tubes sont ensuite portés à l'évaporation à BOcC sous
courant d'air (compresseur) ou d'azote.
3) Coloration
Les résidus d'évaporation sont dissous dans 0,4 ml d'eau
bidistillée fraîche,
puis additionnés de 0,74 ml d'acide sulfu-
rique concentré. Les tubes, hermétiquement bouchés, sont portés
40 minutes exactement au bain-marie bouillant à 100°C à l'obscu-
=ité. Agiter à la 2ème et à la Sème minute de chauffage et une
3ème fois au milieu de l'ébullition.
Désormais, toutes les opérations ultérieures doivent être
conduites à l'abri de la lumière vive.
Le chromophore rose de KoBER obtenu à l'issue de la réac-
tion de coloration est refroidi dans un bain de glace. Au bout
de 3 minutes, ajouter 1,5 ml d'eau bidistillée fraîche, préala-
blement refroidie dans-le même bain de glace.
Après mélange, ajouter 2,5 ml d'une solution chloroformi-
que de paranitrophénol à 2 p.100, préparée depuis environ 15 mi-
nutes et refroidie dans le bain de glace. Agiter pendant 30 se-
condes au Vortex-Génie, à la vitesse maximale.
Après transvase-
ment des contenus de chaque tube de KOBER dans des tubes adé-
quats, ceux-ci sont centrifugés pendent 4 à S minutes, è 2.500
tours/minute.
- 2U5 -
Les surnageants aqueux sont rapidement d~cant~s et les
ebsorbances de~ phases organiques sont lues aussitôt à 500,
538,5 et 577 nm eu spectrophotométre,
les tubes étant toujours
plongés dans le bein de glace, à demi-obscurité.
La coloration est stable environ 1 heure dans ces condi-
tions.
IV - Résultats
La récupération par notre méthode étant quantitative et
le blanc-résine négligeable, nous ne préconisons aucune correc-
tian des résultats.
Il suffit donc de calculer l'absorbance (densité optique)
corrigée en appliquant la correction d'ALLEN, puis da comparer
les résultats obtenus avec ceux de la gemme étalon, en tenant
compte de la dilution (1!d) et de la diurèse (0 en ml).
D • 0 5 0 0 ri m + D. 057 7 n m
D.O corrigée = D.OS<R 5
.... w 1
nm
2
Ainsi, à l'aide de la moyenne des absorbances corrigées
d'un seul point étalon a ~g (a = 5 ou 10 ~g d'oestriol) réalisé
en triple ou en double,
on établit la formule suivante
a ~g x D.D
moyenne-dosage
c
Dosage en ~g!24h =
x
0.0
moyenne-étalon
d x 0
c
a ~g x 0.0
moyenne-dosage
c
.
Dosage en
rnrrl24h =
0.0 -moyenne-étalon
c
2e~corre8pond8nt eu poids moléculaire de l'oe8triol.
-
206 -
CHAPITRE II
ETUDE DES CRlTERES DE QUALITE DE LA mETHODE
A - INTRODUCTION
Afin de choisir une technique analytique,et pour mieux
interpréter les résultats obtenus à l'aide de cette méthode,
le biologiste doit connaître les qualités fondamentales de
celle-ci (38,39).
En autre, le biologiste doit être en mesure de préciser
aux cliniciens quel est le degré de confiance qui peut être
attribué aux résultats.
Il est, par conséquent, indispensable d'associer à toute
méthode d'analyse un certain nombre de critères objectifs, dits
de fiabilité, qui permettent de juger de le qualité de celle-ci.
Nous essayerons de montrer quels sant les critères de fia-
bilit~ de le méthode d~crite, puis nous terminerons en ~voq~ent
brièvement quelques espect. de se preticBbilit~.
- 207 -
B - ETUDE DE LA FIABILITE DE LA mETHDDE
Les principaux critères de fiabilité d'une méthode sont,
essentiellement, la fidélité, la justesse, la limite de détec-
tion et le spécificité.
- Le fidélité correspond à l'étude de la dispersion des ré-
sultats de plusieurs dosages d'un même échantillon, par la même
méthode,et ce, dans des conditions bien déterninées •
. Les notions de répétabilité et de reproductibilité per-
mettent d'évaluer la fidélité.
Il convient de signaler que la
Société Française de 8iologie Clinique a proposé le terme
"précision" comme synonyme de la notion de fidélité, ceci pour
se conformer aux termes anglais et allemand correspondants à la
fidélité.
Une telle décision prête quelque peu à confusion car pour
de nombreux biologistes et pour l'Afnor, le terme de précision
doit regrouper à la fois la fidélité,
l'exactitude et la sensi-
bilité de la méthode.
- La justesse (ou exactitude) correspond à l'accord existant
entre la moyenne de plusieurs valeurs mesurées par la méthode
et la valeur vraie,
rarement disponible. Des expériences de sur-
charge ou d'addition permettant d'évaluer, soit le pourcentage
de récupération de la méthode, soit des critàres statistiques,
telle la droite de régression de y en x (y = valeur vraie, x =
- 208 -
valeur mesurée) sont réalisées pour apprécier la justesse (39);
la comparaison des résultats obtenus par la méthode à ceux
d'autres méthodes établies prises en "référence" peut itre aus-
si préconisée.
- La limite de détection ou seuil de sensibilité est la plus
petite valeur de le grandeur à mesurer qui puisse l'être effec-
tivement.
- Les critères fonctionnels,
telles la sélectivité et,notamment
la spécificité : ce dernier critère est caractérisé par la facul-
té d'une méthode de ne permettre que le dosage d'une substance
donnée (ou d'un groupe de substances) pour laquelle elle est pré-
vue et conçue, sans interférences d'autres composés présents
dans le milieu biologique à traiter.
La spécificité d'une méthode est donc en relation avec le
degré de purification des produits dosés, leur nature et la réac-
tion préconisée pour la mesure; elle est sauvent en relation in-
verse avec la simplicité de la technique.
l - Etude de la fidélité
Pour cette étude de la fidélité de la méthode proposée,
nous avons choisi BU hasard deux urines de fin de grossesse ;
l'une d'elles (urine L) a servi à l'étude de la répétabilité
intrasérie (10 dosages pratiqués simultanément) et l'autre à
celle de la répétabilité intersérie intralaboretoire. Cette se-
conde urine V. e fait l'objet de 12 dosages consécutifs à l'side
- 209 -
de fractions congel~es de la même urine, dans un intervalle
de 10 semaines, et par le même manipulateur.
Les r~sultats obtenus, qui obéissent à une distribution
normale (tablea~ X), révèlent que le r~pétabilité intras~rie
est notamment caractérisée par un coeffi~ient de variation
égal à 2,6 p.100 et pour un risque inférieur à 1 p.100, la moyen-
ne des résultats trouvés varie dans les limites suivantes:
m:; 27.533 ~g/24h : 737
Pour la répétabilité intersérie, le coefficient de varia-
tion trouvé est 7 p.100, avec une moyenne
m :; 33.625 ~g/24h : 2.127
pou r lem ê mer i s que i n f é rie u r à 1 p. 10(1 •
Il n'a pas été possible, dans le cadre de cette thèse, de
réaliser, ni l'étude d'une reproductibilité intralaboratoire
portant sur un nombre plus important de déterminations, ni l'é-
tude de la reproductibilité inter-laboratoire.
Il - Etude de la
justesse DU exactitude
L'urine étant un milieu biologique particulièrement com-
plexe dans sa composition en oestrogènes, des étalons primaires
ne sont pas disponibles dans le cadre de la détermination de
l'oestrogénurie totale. Pour évaluer la justesse de la méthode,
nous avons, par cons~quent, dû faire appel:
,
1
1
1
1
1
1
-
R~péteblllté
Nombre de
moyenne
Ecart-type
lr:arL
~
la
Coafficient de
Lee limites de Variatllln
Intresdrie
mesures
mo y c n o e
1
variation
de le moyenne pour un
1 [ ' . -
que ~1% sont données par
le relation :
(urlne L.)
_
+
r--
n
. m : ~mi G'=J (rn-mi) 2 G;
G"
C.V,: 1no Ci"
--
m-t.\\'lm
n
n-1
= vrr 1
1!f
(t: 3,25 pour ddl = n-1-")
1
r
1
1
1
- -
10
27. 533)Jg
118
227
2,6%
27.533 ~/2~h ! 737
/24h
Rép.Heblllté
lntereérle
1
1
1
1
1
1
-
+
~
(urine V.)
1
1
m -
t .
m
n
1
-m
1 ()
1
<J'm
1
c. V
(t: 3,11 pour ddl = 11 )
--
12
1 33.625Jl91
2.371
1
684
1
7%
1
33.625 !: 2.127 )UJ/2'H.
TABLEAU X
'"
- '
o
Etude de la fidélité de la méthode décrite
Le ddl
(degré de liberté)
est égal à n-1.
Pour un
risque et un ddl donnés,
le table des t
de
5TUDENT-f15HER indique la valeur correspondante du t.
- 211 -
-
è l'appréciation de la récupération après eurcharQ8 en
16 ~glycuronide d'oestriol (catebolite le plus représentatif
des phénolstéroIdes urinaires en fin de grossesse) d'urines
dont la concentration propre en oestrogènes est indétectable
par la méthode proposée.
- à la détermination d'une urine de contrôle lyophilisée
(étalon secondaire Searle)
; cette urine étalon a été parallè-
lement dosée par la méthode colorimétrique de SCHOLLER et coll.
(24) qui détermine spécifiquement la fraction oestriol et la
technique de GRANNIS et DICKEY (25) qui, comme la méthode pro-
posée, évalue les oestrogènes -totaux p e r la réaction colorimétri-
que de KOBER.
- aux dosages comparés de 3 urines de fin de grossesse,choi-
sies au hasard , par la méthode proposée ainsi que par celles de
SCHOLLER et coll.
(24), de GRANNIS et DICKEY (25) et par chro-
matographie en phase gazeuse selon ADESSI et JAYLE (40).
L'étude du pourcentage de récupération obtenu avec des sur-
charges de 10 ~g d'oestriol ou de son dérivé 16oC.glycuroconjugué
en milieu aqueux ou urinaire donne, dans les conditions optimales
définies,
les rés~ltats suivants:
- oestriol en solution dans l'eau physiologique: 98% + 2,1
- oestriol en surcharge dans l'urine d'enfant: 95,5% + 4,56
- 15oC.glycuronide d'oes-triol dans l'eau physiologique: 96% :
3
- 212 -
- 16 ~glycuronide d'oestriol en surcharge dans
l'urine d'enfant:
93,5% + 3
L'oestriol (90 p.100 des oestrogènes urinaires de fin de
grossesse) étant pour 90 à 95 p.100 sous forme glycuroconjuguée
et notre méthode excluant l'hydrolyse, c'est donc la récupéra-
tion du glycuronide d'oestriol en milieu urinaire qui se rap-
proche le plus des conditions réelles des dosages.
Dans ce dernier cas, l'étude de la récupération qui a por-
té sur des taux d'oestrogènes conjugués compris entre 1 et 15 ~g
(zone correspondant en équivalent-oestriol à la gamme d'étalon-
nage préconisée:
1 à 10 ~g) a donné les résultats qui sont ré-
sumés dans la figure V (page 172)
; il en résulte que le pour-
rentage de récupération est linéaire, reproductible et égal à
+
93,5 p.100 - 3. On note,
de plus, que le blanc-résine est très
faible et négligeable (voir "Etude de la limite da détection).
Le tableau XI rend compte des résultats obtenus. Pour une
meilleure interprétation de ces résultats, nous signelons que
ceux donnés par les méthodes de GRANNIS et OICKEY (25), SCHOLLER
et coll.
(24) tiennent compte des pourcentages de récupération
indiqués par les auteurs respectifs :
- 83,5 p.100 de récupération pour GRANNIS et OICKEY
- 87 p.100 de récupération pour SCHOLLER et coll.
méthode chromatographi-
méthode de
méthode de
méthode
l
êlaborlc
quo nn
phase q e z nu s e
SCHoLLER
GRANNIS & DICKEY
(XAD-2)
d'ADLSSI
et JAYLE
(40)
et coll.(24)
(25)
Urine lyophilisée "SEAHLE"
14,00
14,34
moyenne "SEARLE"=12,5",g/ml
8,40 }
14,48
13,95
14 .... g
8,05
8,05
15 JJg
LimiteR:
11 à
14 Vg/ml
, 4,65
1
13,95
en oestrog~nes totaux
7,70
15,92 )
14,00
01
750
35.800 }
urine de gr08se9se 1
31.035} 30.B62
38.263} 38.650
36.300
36.000
(en ... g/24h)
34. BSO
{
011
3.100
30.700
39.072
36.102
01 Il
:
31.000
35.799
01
2.100
Urine de grossesse II
3302B5}
3.700
24.830} 25.100
37.150) 37.400
(en ""g/24h)
31. 400 {
01 1
33.316
33.300
25.371
37.650
aIl 1
:
28.600
33.299
01
2.000
6.839 }
15.050 }
Urine de grossBssB III
5.667
6.250
13.440\\
13.740
14.9BO
15.120
(en ..,g/24h)
15.400 {
011
2.400
6.064
14.040 5
15.330
011 1 :
12.800
6.430
TABLEAU XI
'"......
Doseges comparés d'uno urine de contrôle et de 3 urines de gr09ge98a par 4
LoI
muLhudos dont celle par la
résine XAD-2
- 214 -
Il en est de même pour le technique per chromatographie
en phase gazeuse d'ADESSI et JAYLE dans lequelle un standard
interne, introduit dans le gemme étalon et dans les échantillons
au moment de l'extraction organique des oestrogènes, permet de
déterminer la récupération et le coefficient de réponse du chro-
matographe et de corriger les résultRts obtenus en conséquence ;
on remarquera cependant que la phase d'hydrolyse échappe à cette
correction.
Il n'y a pas eu de correction des résultats donnés par no-
tre méthode (dont le pourcentage de récupération est de 93,5
p.100 :
3. Cela dit, on observe que
- avec l'urine de contrôle, notre méthode donne des résultats
répétables et situés à la limite supérieure de ceux indiqués par
le fabricant
(11
à
14 ~g/ml). La méthode de GRANNIS et DICKEY
donne un résultat moyen légàrement supérieur (15 ~g/ml), tandis
que l'on obtient avec celle de SCHOLLER et coll. qui dose spé-
cifiquement l'oestriol
: 8,05 ~g/ml en moyenne.
- avec les urines de grossesse l,Il et III, les résultats ex-
primés en oestrogènes totaux (Dl + 0
+
0111)
sont du même or-
1 1
dre de grandeur pour les différentes techniques utilisées; tou-
tefois, les résultats de la méthode XAD-2 s'intercalent entre
ceux de la méthode par chromatographie en phase gazeuse d'ADESSI
et JAYLE et ceux de la technique calorimétrique de GRANNIS et
DICKEY, légàrement plus élevés, en duhors du cas de l'urine III
pour laquelle le résultat selon SCHOLLER peraIt inexplicable.
- 215 -
On note par ailleurs, avec intérêt, que le méthode
d'ADESSI et JAYLE confirme le pourcentage de l'oestriol urinai-
re de fin de grosse~se indiqué par d'autres auteurs (22,41,42)
(environ 90 P.100),
soit respectivement
urine l
92 p.100 d'oestriol
urine Il
91 p.100 d'oestriol
urine III
85 p.100 d'oestriol
III - Etude de la limite de détection ou seuil de sensibilité
Bien que la limite de détection ne constitue pas un élé-
ment critique pour notre méthode, compte tenu de la teneur éle-
vée en oestrogènes des urines de fin de gro~sesse et de la prise
d'essai préconisée, nous avons cependant tenu à la déterminer.
Pour ce faire,
9 urines d'enfants et d'hommes,dont la con-
centration propre en oestrogènes est à priori indétectable par
la méthode proposée, sont diluées systématiquement au demi par
de l'eau physiologique; cette dilution s'explique par le fait
que la méthode décrite exige une quantité d'oestrogènes déposée
par prise d'essai urinaire comprise entre 1 et 10 ~g d'équiva-
lent-oestriol, ce qui suppose une certaine dilution des urines
de grossesse qui varie du demi au quart, sinon davantage (voir
chapitre I, paragraphe J).
Ensuite,
1 ml de chaque dilution est d~posée sur une colon-
ne de résine XAD-2, en inter-série. Après le levage de le colonne,
puis l'~lution per ~ ml de méthenol, les éluets sont dos~s
par repport à une gemme étalon d'oestriol.
A partir de l'ensemble des r~sultBts obtenus après 9 do-
seges consécutifs (non simultanés) avec 9 urines différentes,
la limite de détection est déterminée (tableau XII)
; celle-ci
est estimée à
- 0,022 en absorbence corrigée
- D,3D ~g d'équivalent-oestriol en concentration
Ainsi, toute valeur trouvée supérieure à 0,30 ~g d'oes-
triol à l'issue d'un dosage doit être considérée comme non nul-
le.
En fait,
dans les conditions de dosage définies dans notre
méthode,
les urines de fin de grossesse donnent des valeurs net-
tement supérieures à cette limite.
On note que les coefficients de variation déterminés sont
relativement élevés (de l'ordre de 25 p.100). Cela n'est pas sur-
prenant, mais s'explique par le fait que cette étude a été volon-
tairement effectuée à partir de 9 urines différentes,
et, de sur-
croît dosées en inter-série.
La moyenne des résultats ainsi obtenue perait être plus re-
présentative de la diversit~ des ~chantillons urinaires qui se-
ront traités en routine par la méthode, que celle résultant d'une
même urine traitée en intra-série.
Nombre
mOYElnne
EcarL-type
EcarL à la
Coefficient de
Limite de
Blancs-dosages
d'essais
-
moyenne
variation
d~tection
m
n
cr'
if;
-
CV
m + 3b
Absorbance corrig~e
9
0,0126
0,003
0,001
25%
0,02~
Concentration C en
~g d'~quivalent-
9
0,157
0,046
0,015
29%
0,30
oestriol
TABLEAU XII
Détermination des limite et poydoir de détection de la méthode décrite.
I\\J
.....
.......
-
216 -
Le Ip~cificit~ de le m~thode propol'e lit celle de le
réection de KOBER, aensibilil~e per le purificetion chrometo-
Qrephique dei oeltrogànea conjuQud. urineirel et per l'extrec-
tion du chromophore aelon ITTRICH (6,23). Noua n'evons pes re-
pris cette ~tude qui e ~t~ effectu~e de meniàre exheustive per
de nombreux euteur., notemment mARLOW (en 1950), ~ONES et HAHNEL
(43), KlmURA et coll. (44), KlmURA et mIURA (45)
.••
-
219 -
C - DISCUSSION
Il ressort de l'étude des critères de fiabilité de la mé-
thode décrite que ces derniers sont au moins aussi bons que
ceux des techniques que nous avons choisies comme références,
conformément au tableau XIII.
En ce qui concerne la justesse (exactitude), la méthode
~Érrite donne un pour~entage de récupération (égal à 93,5
p.100 ~ 3) qui Est très voisin de celui obtenu par ADESSI et
JA~LE (92,9 p.100) ; ceci explique la similitude des résultats
exprimés en oestrogènes totaux,
obtenus à l'aide de ces deux
méthodes.
La méthode proposée semble relativement plus exacte que
celles de GRANNIS et DICKEY,
puis de SCHOLLER et coll. dont les
pourcentages moyens de récupération sont respectivement:
83,5
~. -00 et 87 p.100.
Sur lé plan de lé fIdélité,
les méthDdes utiliséES semblent
équivalentes puisque les coefficients moyens de variation sont
inférieurs à 3,6 p.100,
hormis la méthode de GRANNIS et DICKEY
pour laquelle cette constante n'a pas été indiquée par les au-
teurs.
La limite de détection trouvée pour la méthode proposée
est identique à la limite de détection quantitfftive indiquée
par SCHOLLER et c~ll. (39), soit 0,3 ~g. Ce seuil de sensibili-
O1(;thode da
lYIéthodt:l de
lYIé t ho da de
méthode proposée
sr:HULLEH &: coll.
d'A{JlSSI
&:
JAYLE
GRANN15 &: DICKEY
(XAD-2)
(24)
(40)
(25)
pourcenta~e de récu-
1)7%
92,9~
...
83,5%
93,5 - 3%
péret ion
justesse)
(82,1
à
89,7%)
(89 à 9710)
3~ pour les taux
Coefficient de varia-
2,5%
d'oestriolurie
3,60%
tion (fidélité)
supériours à
10 mg/l
en intre-série
qualitative
:
0,09 Vg
Limite de détection en
.
0,3 ~g
équivelent-08striol
q u ari t ] t a t.Lv e
. 0,30 "'9
TABLEAU XIII
Comparaison des critères de fiabilité des quatre méthodes
l'I.J
l'I.J
a
- 221 -
té,
qui n'est pas un élément critique de ce type de méthode,
n'a été indiqué, ni par ADESSI et JAYLE (40), ni par GRANNIS
et DICKEY (25).
En ce qui concerne la méthode proposée, il
est intéressant de souligner que le seuil de sensibilité ainsi
obtenu (0,022 en absorbance corrigée et 0,30 ~g en équivalent-
oestriol) est très proche de celui trouvé par OSAWA et SLAUNWHITE
(1) dans des conditions similaires (absorbance corrigée = 0,020 ;
concentration en équivalent-oestriol : 0,4 ~g).
Enfin,
en ce qui concerne la spécificité, elle est celle
de la réaction de KOBER,
améliorée par le procédé d'ultime pu-
rification du chromophore selon ITTRICH (5,23), mais aussi par
12 phase chromatographique de purification des oestrogènes con-
jugués urinaires.
Par conséquent,
i l
résulte de cette étude des critères de
fiabilité de la méthode décrite,
que celle-ci est précise puis-
qu'elle est juste, fidèle et spécifique.
- 222 -
o - ETUDE DE LA PRATICABILITE
Nous avons cherché à proposer une méthode calorimétrique
simple qui puisse être utilisée même dans des laboratoires mo-
8estes comme on en trouve dans certains centres hospitaliers
en Côte d'Ivoire.
La méthode décrite comporte essentiellement deux étapes:
celle de la purification directe des oestrogènes conjugués uri-
naires,
et celle de la réaction calorimétrique de KDBER,
effec-
tuée selon ITTRICH.
L'étape de l'hydrolyse notamment est évitée, ce qui cons-
titue un avantage considérable, compte tenu des inconvénients
liés à cette hydrolyse.
La suppression de ces étapes délicates et
(ou)
contrai-
gnantes n'est préjudiciable,
ni à la fiabilité de la méthode
proposée,
ni à la signification clinique des déterminations.
Dans ces conditions,
la technique est alune simplicité telle,
qu'elle permet à un personnel,
même peu expérimenté,
d'en obte-
nir des résultats fiables dans des délais rapides.
Ainsi,
trois
heures seulement suffisent à un seul technicien pour réaliser
15 à 17 déterminations, ce qui correspond aux dosages simulta-
nés de 6 à 7 urines,
effectués en double avec un étalonnage
c~nstitué d'un point et réalisé en triple.
Le méthode,
dans ces conditions, ne nécessite qu'une colon-
- 223 -
ne et un spectrophoto~étre de bonne Qualité.
Il est évident que des laboratoires disposant de ressour-
ces particulières en matériel peuvent augmenter considérable-
ment la cadence des dosages ; la phase de purification ainsi
simplifiée devient facilement automatisable (28). De plus, on
peut envisager, à la suite de BARNARD et LOGAN (46), HAINSWORTH
et HALL (47), CONAILL et mUIR (48), PENTTILA et coll.
(t9), une
automatisation de l'étape calorimétrique et de la lecture des
absorbances (ou de la fluorescence)
des chromophores extraits.
Ainsi, PENTTILA et coll.
(49) qui ont automatisé la méthode co-
lOTimétrique de ROURKE et coll.
(50)
parviendraient,
dans ces
conditio~s. à effectuer environ 100 dosages par jour et par un
seul technicien.
D'autre part, étant donnée l'urgence des décisions à pren-
dre, le fait de pouvoir obtenir des résultats fiables dans des
délais aussi rapides (3 heures) prend une importance toute par-
ticulière.
Enfi~, l'interprétation clinique des résultats est gén~ra-
lement fonction de l'évolution de l'c2strogénurie dont la déter-
mination doit être répétée fréquemment
(toutes les 48 ou 24 heu-
res selon les cas) et pendant des périodes souvent longues (plu-
sieurs semaines).
Sur le plan économique, le méthode proposée semble donc
avantageuse du fait de la consommation faible de réactifs due,
-
en particulier, à la simplification de la méthodologie. De plus,
la résine est réutilisable plusieurs fois.
Il semble donc pos-
- 224 -
sible d'affirmer que la méthode proposée est caractérisée par
une excellente praticabilité.
- 225 -
CHAPITRE III
comPARAISON DES mETHDDE5
A - INTRODUCTION
Les critères de
fiabilité de la méthode élaborée ayant
{té étB~lis, nous avons entrepris de la comparer à d'autres tech-
~iques déjà testées,
prises en référence.
Habituellement,
cette comparaison est effectuée (39)
:
-
soit par la détermination statistique des paramètres de la
droite de régression
y
= ax
+
b.
Dans cette formule:
x
et y
correspondent aux deux méthodes
:o~parÉes.
:
la pente
a ,
qui doit être voisine de :
1,
reflète l'erreur relative inhérente à l'une des deux méthodes
par rapport à l'autre;
elle correspond pratiquement au pourcen-
tage de récupération de la méthode
y
par rapport à la méthode
K,
après déduction de l'erreur systématique
constante,
repr§-
sentée par l'ordonnée à l'origine
b.
Celle-ci doit être voisine
de zéro.
- 226 -
-soit par la détermination du coefficient de corrélation r
.
Cette constante stastistique,
qui est le critère de comparaison
le plus utilisé,
est donné par la relation
:
~(xi - x) (yi - y)
r
=
V~(xi - x)2(yi _ y)t=
o~
x
et y
sont les moyennes correspondant aux valeurs
xi
Et
yi,
obtenues à la suite du dosage de
ni
échantillons per les
deux méthode
x
et
y . Cependant, ce coefficient ne reflète
pas la nature de la liaison qui
existe entre les deux méthodes
comparées et qui pourrait être fortuite.
La détermination du test
t
relatif à ce coefficient de
corrélation
\\ J:T------
y!-(n - 2)
t
=
2
1
r
permet d'éprouver le degré de liaison existant entre les deux mé-
thodes.
A cet effet,
on
détermine si le
t
calculé est supérieur
ou non à celui donnÉ par la table de STUDENT-FISMER DOG" ~~ ris:u~
conné et pour le nOGbre de degré dE li~ertÉ égel à
n -
2.
-
soit par l'étude des différences
di = yi -
xi
où
yi
et
xi
sont les résultats des dosages de
ni échantillons,
respecti-
vernent à l'aide des méthodes comparées
y
et
x.
La moyenne des différences (0) est déterminée ainsi que
l'écart-type
(~) et la variance (Cd2) correspondants; le test
t
.calculé
(t =
d
\\In)
G'd
- 227 -
•
~Ermet de dire si la'moyenne des différences
d
diffère 5igni-
ficativement oe zéro, ce qui permet de savoir s'il existe un
biais entre les résultats donnés par les deux méthodes.
L'inconvénient de ce procédé est qu'il ne permet pas de
s~~~ir la n~ture du biais éventuellement observé qui peut être
le
falt
d'une erreur systématique constante ou
(et) proportion-
nelle.
yi
- soit par l'étude des rapports
• L'étude de la distri-
xi
bution de ces rapports permettrait d'apprécier l'étendue des er-
r s u r s
relatives d'une des deux méthodes
(soit
x)
par rapport- à
l'autre
(soit
y).
La
théorie non gaussienne ce cette distribution est très
omclrxe, ce qui li~ite l'utilisation de cette méthode de compa-
yi
r a i s or,
De plus,
le rapport -
serait influencé par les erreurs
xi
systématiques et aléatoires dans des proportions difficiles ~
ar.a l vs e r .
C?~s le C2cre ~e catte ~tudE, neus nous sommes li~ltés ~
la détermination stastistique des paramètres de la relat~on struc-
turale linéaire
(dr~ite de régression) et du coefficient de cor-
rélation entre la méthode proposÉe (x)
et trois autres méthodes
choisies en référence
(y).
- 226 -
B - CHOIX DES METHODES DE " REFERENCE ~
La méthode décrite se classe parmi celles dites rapides
et comportant une phase de purification sans hydrolyse,
définies
dans le première partie de ce travail.
Il nous a semblé intéressant de la comparer
-
à
une méthode semi-rapide,
de type classique telle celle de
SCHDLLER et coll.
(24)
- à une autre méthode rapide comportant elle aussi une phase
unique De purification sans hydrolyse:
méthode de GRANNIS et
OICKEY
(25)
- et à la méthode directe d'ITTRICH (6)
l - La méthode de SCHDLLER et coll.(24)
Cette technioue a été choisie permi les méthodes de type
~lassi~ue, caf elle est très éprouvée;
d'autre part,
cette mé-
thode qui ne dose que l'oestriol devrait, à priori,
donner des
résultats comparables à ceux de la technique proposée, puisque
l'oestriol,
nous l'avons vu,
constitue 90 à 95 p.1DD des oestro-
gènes totaux urinaires en fin de grossesse.
Décrite dans l'Appendice technique,
nous en rappelons ce-
p~ndant le principe ; celui-ci consiste en la détermlnation spé-
- 229 -
cifique de la fraction oestriol urinaire par la r~action colo-
rimétrique de KD8ER, après des étapes préalables d'hydrolyse
enzymatique rapide,
d'extraction organique, de purification
et de séparation de l'oestriol par la soude décinormale.
I l -
La méthode de GRANN15 et DICKEY (25)
Dans cette méthode (voir Appendice technique), les oestro-
gènes conjugués urinaires sont directement extraits par l'acéta-
te d'éthyle en milieu acidifié et saturé par du chlorure de so-
dium. Sur une aliquote de l'extrait, la réaction
colorimétrique
de KOBER est pratiquée selon le procédé d'ITTRICH, mais sans ex-
traction organique du chromophore obtenu.
III - La méthode directe d'ITTRICH (6)
La coloration de KD8ER est développée selon ITTRICH, direc-
tement sur les oestrogènes contenus dans 0,4 ml d'une dilution
aqueuse préalable de l'urine de grossesse (voir Appendice tech-
nique). Nous avons préféré cette modalité à la seconde qui con-
siste à effectuer la réaction de KD8ER sur les oestrogènes du
résidu d'évaporation de 0,1 ml d'urine .••
Cette méthode a ses adeptes (51,52) et ses détracteurs
(53,54). Son choix, dans cette étude, a eu pour but essentiel,
de mettre en évidence l'intérêt de la purification chromatogra-
phique dans la technique proposée, puisqu'eu delà de cette phase,
les deux méthodes se confondent.
- 230 -
C - LA comPARAISON DE LA METHODE ELABOREE AUX TROIS METHODES
DE "REFERENCE" CHOISIES
La méthode décrite,
ainsi que les trois techniques préci-
t
tées,
ont servi aux dosages des oestrogènes de 3D urines de gros-
sesse âgées de 26 à 42 semaines et dans lesquelles le pH, le glu-
cose, les protéines, les corps cétoniques, les sels et pigments
biliaires, la densité ont été recherchés,
et la créatinine, dé-
terninée pour contrôler la validité des recueils.
Sur chaque urine,
les dosages des oestrogènes par les qua-
tre méthodes ont été réalisées en double et pendant le même se-
maine;
à cet effet,
les urines ont été conservées à +4°C. C'est
l a r', 0 yen n e des de u x rés u l t a t sai n s i
0 b te nus
a ve c cha c und e s é cha n-
tillons dosés qui e été utilisée pour les calculs statistiques
ultérieurs.
Il convient de rappeler, Dour une bonne interprétation des
conclusions st8stis:i~ues, que les résultats des dosages effec-
tués avec les trois méthodes "de référence" tiennent compte des
pourcentages de récupération indiqués par les auteurs
- 87 p.100 pour SCHOLL ER et coll.
(24)
- 83,5 p.10D pour GRANNIS et DICKEY (25)
- 85,7 p.1DO pour ITTRICH (6)
Nous n'avons pas jugé utile de corriger les résultets don-
nés par notre m4thode dont le r'cupération eat pratiquement Quen-
titative : 93,5 p.100 = 3.
-
231
-
Ainsi,
pour chaque méthode de "réf~renceH (y), nous avons
établi, par rapport à la méthode décrite (x), le coefficient de
corrélation
r, le test
t
et la droite de régression de
y
en
x
•
Le tableau XIV et les figures XII et XIII rendent compte
des résultats de cette étude statistique.
En biologie clinique, les coefficients de corr~lation
0,914 et 0,940 obtenus avec notre méthode par rapport aux tech-
niques respectives de SCHOLLER et coll.
(24) et de GRANNI5 et
DICKEY (25),
peuvent être jugés satisfaisants.
On observe que c'est avec la méthode d'ITTRICH (6) que la
cDrrÉlation (r = 0,704) est la moins bonne.
Les tests
t calculés, ont été trouvés supérieurs à la li-
~ite de
3,674 indiquée par la table de 5TUDENT-FI5HER, pour le
nombre de degrés de liberté (ddl = n - 2 = 30 - 2 = 28) égal à 28
et pour un risque inférieur à 1 pour mille, ce qui signifie que
le
risque d'une absence de corrélation est inférieur à 1 ~our
mille
(ce qui est très faible)
et que les coefficients de :orré-
lation trouvés expriment bien des relations liées et donc non
fortuites.
En ce qui concerne les nuages de corrélation, l'examen de
la figure XII indique une plus grande dispersion des points fi-
guratifs dans le cas de la méthode d'ITTRICH (6)
;
avec les mé-
thodes de SCHOLLER et coll.
(24),
puis de CRANNIS et DICKEY (25),
les points des nuages de corrélation respectifs sont plus regrou-
pés.
Coefficient de
Test t
Pente de le Droi-
Ordonn~e à
formule de la
corrélation
te de r~gression l'origine de
Droite de
r 2(nï
t=V
l l
a !. G:
la Droite de
r~gression
~()(i-iiix)(yi-my)
r~gression
1 - r
acy
y=
ax.
+ b
illE THOO[ 5 :
r=
,
V~(Xi-m)()2(Yi-my)2
a = r . u-;
h
.
x
= a. iiix ..t!f
ty=a(x-m
y
x)
+ myl
a= ~()(-m)()(y-my)
~()(_m)()2
SCHOLLER-coll.(=y)
0,914
'J
0,733 !: 0,125
-439
y=
0,733x -
439
XAO-2 (=x)
GRANNI5-0ICKEY(=y)
0,940
111 , 6
0,834!: 0,119
5.650
y=
0,B34x + 5.650
XAD-2 (=.x)
ITTRICH (=y)
0,7011
S, 2/~
0,794 !. 0,302
2.905
y=
0,79/ix + 2.905
XAD-2 (=x)
TABLEAU XIV
Comparaison des trois méthodes choisies à la mélhode XAD-2
M~thode SCHOllER et coll.(24)
m
= 19.220~g/24h
m~thode ITTRICH (0)
m
y
y = 24.236~g/24h
"-'
l,.I
Méthode GRANN15-DICKEY (25)
my = 2B.020~g/24h
méthode XAO-2
my = 26.B25~g/24h
"-'
Ces moyennes n'ont aucune valeur spécifique, mais entrent dans la détermination des constantes r,t,a
- Le nombre
n = 30
,
/
-
,
>-
,
,
-oC~Ec.Q)ë5u
~
~
.!!
o
s:
~
meth.
XAD-2 en mg 24h( X)
10
20
30
40
50
,
50 ->-
•
Fiy. XII -
Poinls
figuratifs
des
nuages
do
corrélation
-oC
donnés
par
la
méthode décrite
par
rapport
~
aUII
3
méthodes
choisie.
en
référence
;
le.
E
résultats
obtenus
avec
les
30
urines
de
c
Q)
30
grossesse
dosées.
sont exprim4. en
mg
>-
Q)
d'équivalent
oestriol
pitt'
24h.
~
.~
"'0
~
•w
(/)
Col
Col
'Ë
J
l!
lotO)
,
,
,
meth. XAD-2 en mg 24h( X)
10
30
50
- 214-
-
>-
-~..fi'
0
E
c
••U
c
!
.!
!.
~
i
10
30
50
-
met h. XAD-2 on mg 24h( X )
FtII. XIII
-
Droites de régreuton
- - - - rMthode de SchoIIer et coll.
(24)/rnéth. XAD·2 décri1e
_____ mtthode de G,..",is . Dicby (2S)/m6ttl. )(AO·2 décrite
_ 1
. - m6thode
directe d'Ittrich
(61/méth. XAD-2 cMcrite
les """Itau IOC1t exprimes en mg d'équivalent oestrioli24h.
-
235
-
L'examen des droites de régression (fig.XIII) montre que
+
la pente de 0,834 -
0,'19 obtenue avec la méthode de GRANNIS et
DICKEY, assez proche de l'unité,
en confirme l'excellente cor-
rélation avec notre méthode. La valeur de cette pente (0,834)
semble confirmer le pourcentage de récupération de la méthode
de GRANN15 et OICKEY (83,5 P.100) par rapport à notre technique
dont la récupération est pratiquement quantitative:
93,5 ~ 3%).
Gn observe, néanmoins,
que l'ordonnée à l'origine relativement
élevée (b = 5.650 ~g) traduit une erreur systématique constante
inhérente à l'une des deux méthodes comparées,
correspondant
proba~lement à celle de GRANNIS et OICKEY.
Av~c la m~thode de
SCHDLLER et coll.,
la pente,qui est
+
0,733 - 0,125,
est aussi satisfaisante,
surtout si l'on consi-
dère que cette technique dose spécifiquement l'oestriol (0111)'
alors que la n6tre,
détermine les oestrogènes totaux (Dl + 0
+
1 1
0111)
; l'ordonnée à l'origine (b = -439) de cette droite de ré-
gresslcrl est pratiquemEnt négligeable.
Ln
CE
~ui concerne 10 mÉthcde
b'ITTnICH,
elle donne avec
_d
nê~rE. une droite de régression dont la pente (a = 0,794 +
0,302) est très variable;
ceci reflète une erreur releti~e im-
portante liée à la technique d'ITTRICH et qui se traduit par le
pourcentage de récupération très variable obtenu avec celle-ci,
par rapport à notre méthode,
ce qui confirme la grande disper-
sion des points figuratifs du nuage de corrélation,
Ainsi que
le moins bon coefficient de corrélation (r = 0,704). L'erreur
- 236 -
5ysté~atique caract~risée par l'ordonnée à l'origine est aussi
relativement importante puisqu'elle s'élève à 2.905 ~g.
Par ailleurs,
au cours de cette étude de comparaison, il
a été observé, comme lors de la mise au point de la méthode pro-
posée,
que ni le pH,
ni le glucose, ni les protéines,
ni les sels
et pigments éventuellement caractérisés dans certaines urines, ni
leur densité, n'ont semblé exercer une quelconque interférence
sur la méthode élaborée.
A l'inverse,
nous avons constaté que,
bien plus que la glucosurie,
le pH urinaire supérieur à 9,
est
néfaste pour la méthode directe d'ITTRICH,
du fait
de la destruc-
tian de l'hydroquinone par l'alcalinité.
Des pertes de
5D à 70 p.100 par rapport
aux résultats don~és
par les méthodes à la résine XAD-2 et de GRANNIS et DICKEY, ont
été enregistrées dans ces conditions.
Cette grande interférence de l'alcalinité explique,
en par-
riE.
la plus grande dispersion des points de nuage de cDrrélation
et le plus faible coeffIcient de corrélation obtenus BVEe la mé-
lhcde d'ITTRICH par rapport à la méthode décrite.
- 237 -
D - DISCUSSION
Il convient de signaler que, dans nos essais préliminai-
res, nows n'avons pas réussi à atteindre d~s pourcentages de ré-
cupéretion aussi élevés que ceux indiqués par SCHOLLER et coll.
(87 p.100 de récupération) et par ITTRICH (85,7 p.100).
En ce qui concerne la méthode directe d'ITTRICH (6), nos
pourcentages de récupération
(70 à 75 p.100 en moyenne) confir-
ment ceux de plusieurs auteurs (51,53); cette différence affecte
probablement l'établissement de la droite de régréssion, ce qui
~e tr2dult par les résultats relativement plus faibles donnés
par la méthode d'ITTRICH par rapport à la méthode proposée. D'au-
tre part,
la méthode d'ITTRICH a été déjà critiquée (53,54) et
la moins bonne corrélation qu'elle a donnée par rapport à la tech-
nique décrite ne constitue pas une surprise;
au contraire, cela
confirme l'efficacité de la phase de purification chromatographi-
que des oestrogènes crinaires par la résine XAD-2.
De mÊme,
avec la méthode de SCHOLLER et coll.
(24), nos pour-
centages de récupération se sont situés entre 73 et 80 p.100 au
cours de nos essais préliminaires. Cette observation permet de
comprendre, en partie,
la discordance existant entre le pourcen-
tage d'oestriol des urines de fin de grossesse (environ 90 à 95%)
et la valeur relativement faible,
tirée de la droite de régression
donnée par la méthode de SCHOLLER et coLl. par rapport à la tech-
nique proposée qui, elle, dose les oestrogênes totaux (eoit envi-
- 238 -
ron 73,5 p.100 d'oestriol, compte tenu de le valeur de le pente
de cette droite de régression).
Il semble que notre méthode, échappent eux inévitables
pertes occasionnées par les diverses phases d'hydrolyse, d'ex-
traction organique des oestrogènes libérés,
de purification et
de séparation de la fraction oestriol comme dans les techniques
classiques de type SCHDLLER et coll.
(24), soit relativement plus
exacte; ce qui explique, en partie, les résultats relativement
élevés obtenus par d'autres auteurs tels OSAWA et SLAUNWHITE (1),
dans des conditions similaires. L'écart observé ne semble donc
pas refléter une erreur par excès 'de la part de la technique pro-
posée, mais il traduirait plutôt une exactitude meilleure.
En pratique,
un tel écart n'a d'ailleurs que peu de consé-
quences puisque ce sont les variations de l'excrétion de l'oes-
trogénurie jour après jour (ou toutes les 48 heures) qu'il impor-
te de considérer (1,22,36,37).
Enfin,
on note que la méthode de CRANNI5 et DICKEY (25),
b~sn qu'ellE soit relativement moins exacte que la technique dé-
crite si l'on tient compte de son pourcentage ce récupération
(83,5 p.100),
donne des résultats paradoxalement plus élevés;
ceci est probablement dû à la souillure du chromophore par des
composés interférents, ce qui serait la conséquence de l'absence
d'extraction de la coloration originellement préconisée par
ROURKE et coll.
(50).
En réalité, l'erreur dans ce ces aussi étent systématique
ronstente , l'écart observé n'est pes préjudicieble à le tech-
- 239 -
iique de GRANNIS et DICKEY pour la raison évoquée ci-dessus.
D'ailleurs, cette méthode nous est apparue très séduisante,
du fait de sa rapidité et de son excellente praticabilité.
En conclusion, il semble permis de dire que l'étude de
comparaison est satisfaisante car les résultats de la méthode
proposée sont en accord evec ceux des méthodes de GRANNIS et
DICKEY (25) et de SCHDLLER et coll.
(24). La moins bonne cor-
rélation observée par rapport à la technique directe d'ITTRICH
(6) ne
fait que confirmer l'utilité et l'efficacité de la puri-
fication des oestrogènes urinaires sur colonne de résine XAD-2.
-
240 -
CONCLUSION GENERALE
-
241
-
Placés devant le choix d'une méthode de dosage des oes-
trogènes urinaires de fin de grossesse,
nous avons
fait
une re-
vue générale des techniques actuellement utilisées à cet effet.
Nous nous sommes particulièrement intéressés à celles
comportant une phase unique de purification chromatographique
sur résine Amberlite XAD-2,
des phénol stéroïdes conjugués.
En effet,
ces techniques nous ont séduit par leur relative
simpliclté et par leur rapidité;
la purification se faisant sur
une colonne chromatographique,
la récupération est moins fonc-
tion de la technicité du personnel,
à la différence d'autres mé-
thodes utilisant les extractions organiques (24,25,40).
Les premiers travaux relatifs à la chromatographie des
oestrogènes urinaires conjugués sur colonne de résine XAD-2,
ayênt montré un défaut de
reproductibilité,
nous nous sommes
attachés à perfectionner cette phase de purification;
ce qui
nous a permis, lors de l'étude des conditions optimales de sa
réalisation,
de mettre en évidence l'influence primordiale du
sel sur l'élution du
16 ~glycuronide d'oestriol à partir de la
résine XAD-2,
et probablement,de l'ensemble des oestrogènes
glycuroconjugués.
A l'issue de cette étude du comportement des oestrogènes
- 242 -
vis-à-vis de le résine Amberlite XAD-2, nous avons cherché à
pro~oser une méthode précise, simple en vue du dosage des phé-
nolstéroides urinaires de
fin de grossesse et qui .de plu~ puis-
se être utilisée par des laboratoires aux ressources modestes,
comme on en trouve dans les pays en voie de développement.
Nous y sommes parvenus en appliquant aux oestrogènes ainsi
purifiés la réaction colorimétrique de KDBER selon ITTRICH (6) ;
en effet, la méthode aiRsi décrite est précise, ses critères de
fiabilité s'étant révélés très satisfaisants.
Elle est de réalisation simple et surtout elle n'exige,
~aur le pErsonnel,
aucune technicité particulièrement poussée
lJmme c'en est le cas pour les méthodes radiométriques,
fluori-
métriques, par chromatographie en phase gazeuse, voire même pour
certaines techniques colorimétriques (24).
Sa rapidité ( 3 heures pour déterminer 6 à 7 urines en dou-
ble) est un facteur essentiel à considérer quand on se rappelle
le contexte clinique dans lequel ces analyses biologiques sont
demandées.
De plus,
aucune interférence n'a été caractérisée.
La comparaison de cette méthode à celle éprouvée de SCHOLLER
et coLl
(24) s'est révélée satisfaisante, de même qu'avec celle de
GRANNIS et DICKEY
(25)
; quant à la comparaison avec la méthode
directe d'ITTRICH (6),
elle a confirmé,
après le résultat d'une
étude antérieure, l'opportunité et l'efficacité de la phase de
purification des oestrogènes urinaires sur résine XAD-2.
Il semble donc que la méthode ainsi élaborée puisse rendre
- 243 -
des services appréciables,
du moins aussi longtemps que l'oes-
triolurie ou l'oestrogénurie totale demeureront l'indice bio-
logique le plus utilisé pour la surveillance de l'unité foeto-
placentaire en fin de grossesse.
-
244 -
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35 - SCHOLLER R., SOLDAT m.c., AVIGDOR R.,
(1973)
Path-Biol., 11, 375-383
36 - SCHDLLER R., AURIC F., ALBRIGES C.H., DELPOZO D.,
(1974)
Rev.Franç.Gynec., ~, 429-438
37 -
BARRAT J., HU55ENOT D.,
(1974)
Rev.Franç.Gynec., 69, 439-452
38 - Travaux et Recommandations des Commissions de la Soc.Franç.
Biol.Clin. (1975)
Ann.Biol.Clin., dl, 51-60
39 - SCHOLLER R.,
(1977)
Contrôle de qualité en Hormonologie.5teroIdes Uri-
naires - Ed.SEPE , Paris
- 248 -
~O - ADESSI C., COUTTE Ch., CHRISTEFr N.I., JAYLE M.F., (1973)
Ann.Biol.Clin., 11, 495-500
41 - CASSmER O., (1959)
Acte Endos., 66, suppl.45
42 - SmITH O.W., (1966)
Acta Endoc.(Kbh), suppl.104
43 - JONES H.A., HAHNEL R.,
(1969)
Sterolds, 13, 693-710
44 - KlMURA m., KAWATA m., AKIYAmA K., HARITA K., mIURA T., (1973)
Chem.Pherm.Bull., 11, 1720-1726
45 - KImURA m., mIURA T.,
(1976)
Chem.Pharm.Bull., l!, 181-185
46 - BARNARD ID.P., LOGAN R.W.,
(1970)
Clin.Chim.Acta, 12, 401-409
47 - HAINSWORTH I.R., HALL P.E.,
(1971)
Clin.Chim.Acta, ~, 201-208
49 - CONAILL D.Ua., mUIR G.G., (1968)
Clin.Chem., l!, 1010-1022
49 - PtNTTILA l.m., JDKELA H., PUHAKAINEN E., NUmmI S.,
RANTAWEN T., VIITALA A.J., (1977)
J.Clin.Chem.Clin.B1ochem., ~, 271-274
-
249 -
50 -
ROURKE J.E., mARSHALL L.o.,
SHELLEY T .E.,
(1968)
Amer.J.Obstet.Gynec., lQg,
331-335
51 - BREUER H.,
GERTZ J.,
(1960)
Clin.Chim.Acte, ~, 544-551
52 - H08KIRK R., NILSEN m. (1962)
J.~lin.Endoc.metet)., 22, 134-140
53 - LUTzmANN L.,
WURTERLE A.,
(1960)
Clin.Chim.Acta, ~r 727-731
54 -
SCHOLLER R.,
GRENNIER J.,
fORTIN m., CARTON m.,
(1974)
Rev.frenç.Gynec.,
69,
403-413
- 250 -
APPENDICE TECHNIQUE
TABLE DES mATIERES
REVUE GENERALE
Pages
INTRODUCTION
...
.
2
CHAPITRE l
RAPPELS HISTOPHYSIOLOGIQUES
6
A • Structure de l'ovaire de la femme adulte
6
B • Description et aspect endocrinologique du cycle
ovarien
. . . . . . . . . . . • . . • . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . .
9
l
Le cycle ovarien
9
I l
Le déterminisme hormonal du cycle menstruel
11
1 - Le mécanisme dit "long"
11
2 - Le mécanisme court
..................
1S
C • Notions de physiologie endocrine de la g~station
16
l
La phase ovarienne
17
II
La phase foeto-placentaire
17
CHAPITRE II
LES OESTROGENES
A • Rappel historique
21
8 . Définition biochimique et nomenclature des oes-
trogènes
. .. . . ..
..
. . . • • . . • . • . . . . . .
22
C • Le métabolisme des oestrogènes
............... 24
1
Biosynt~pse des oestrogènes
.............. 24
. a - la formation de la li 5 pr~gnènolone
25
b - la synthèse des androgènes è partir de
la AS prégnènolone
•••••••••••••••••••
27
- la voie des â4
.....................
27
- La voie des
s
.....................
ë
29
c - La conversion des androgènes en oestro-
g~nes
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
29
d - Aspects particuliers de la biosynthèse
dans l'ovaire
32
1)
pendant la phase folliculaire du cy-
cle m e n s t r u e l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
2)
pendant le phase lutéale du cycle
rrenstruel
. . • . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . .
33
3) au cours de la phase ovarienne de la
gros sesse
• . . . . . • . . • • . . . . . . • • • • • . • .
33
e - Aspects particuliers de la biosynthèse
par l'unité foeto-placentaire
••.••••.
~4
Il
Catabolisme des oestrogènes
38
III Régulation de la biosynthèse des oestrogènes
42
a - La régulation métabolique
42
b - La rÉgulation hormonale
D • mode d'action et actions physiologiques des oes-
trogènes
. .. . .. .. .. .. .. .
•. ..
.
46
r
mode d'action des oestrogènes
............
46
Il
Actions physiologiques des oestrogènes
47
E • Profil urinaire des oestrogènes chez le femme
50
(l..jPPITRE III
INTERET DE LA DETERmINATION DES OESTROGENES URINAIRES
AU COURS DE LA GROSSESSE
••••••••••••.••••••••••••
54
A • La période du premier trimestre
..............
55
l
Les menaces d'avortement
56
II
La mort de l'oeuf in utero
58
B • La période des 2ème et 3ème trimestres
59
l
Le souffrance et la mort foetale in utero
60
a -
Intérêt de l'oestriolurie au cours des
syndromes vasculorénaux
••••••••.••••.
63
b -
Intérêt de l'oestriolurie en cas de dia-
bète
. • . . . . • . . . • . . • . . . . . . . • . . . . . . . . . . .
63
c -
Intérêt de l'oestriolurie au cours de
l'incompatibilité Rhésus
••••••••••.••
64
d - Dysmaturité et souffrance foetale
65
e - métrorragies du 3ème trimestre et souf-
france foetale
••••.•••.....•........•
66
II
Oestriolurie et prématurité
67
III Les grossesses prolongées
67
C • Le cas particulier de la môle hydatiforme et des
choriocarcinomes
69
l
La môle hydatiforme
69
II
Les choriocarcinomes
.....................
69
o . Conclusion
...................................
71
CHAPITRE IV
LES mETHODES DE DOSAGE DES OESTROGENES URINAIRES
PENDANT LA GROSSESSE
•••.•••••••••••••••••••••••••
72
A • Le prélèvement
............................... 73
B • L'hydrolyse
................................. . 77
1
L'hydrolyse minérale
..................... 77
II
L'hydrolyse enzymatique
.................. 79
C • L'extraction et la purification
82
l
L'extraction organique
.......... ......... 82
II
Les· procédés de purification non chromato-
graphi que
• •• • • • • • . . . . • • . • . • • • • • • . • . • • • . • •
84
111 Les procédés de purification chromatogra-
phi que
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
86
D • Principes de la détermination quantitative des
oest rogènes
• •• • . • . . . . • • . . . . . . . • . . . . • . . • • . • . • .
89
l
La réaction de KOBER
.....................
89
a - Utilisation de la réaction colorimétri-
que de KOBE R
. • • • . . • . • • • • . • . . . . • . • . . • •
93
b -
Utilisation de la réaction fluorimétri-
que ce KOSE R
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
II
La réaction calorimétrique de YEE et JACKSON
97
III La chromatographie en phase gazeuse
99
IV
Principes des méthodes rediométriques
101
E • Principales applications méthodologiques
..... 105
1
Les méthodes "longues"
... ....... ......... 107
II
Les méthodes "semi-rapides"
.............. 108
III Les méthodes avec purification sans hydrolyse 110
IV
Les méthodes "directes"
............... ..
~
111
CONCLUSION
................................. ...... 113
BIBLIOGRAPHIE DE LA REVUE GENERALE
.............. 118
PARTIE EXPERImENTALE
Pages
INTRODUCTION
.....................................-... 132
CHAPITRE l
mISE AU POINT DE lA mETHDDE
138
A . Etude de la fixation par la résine des oestrogé-
nes dép osés
• • • • • • • • • • • . • • • . • . • • . • • • • • • • • • • • • •
141
l
Expérimentation
141
a - Essai n01
............................ 141
b -
Essai n02
143
c - Essai n03
............................ 143
II
Discussion
·.............................. 144
B • Etude de l'élution
........................... 147
1
Le cas de l'oestriol libre
147
II
Le cas du 16~glycuronide d'oestriol
149
III Discussion
·
. 155
C • Etude du mécanisme d'actio~ du sel
........... 161
Discussion
• • • • • • • • • • • • • • •
"~it,~ "• • • • • • • • • • • • • • • • • •
162
D • Etude de l'influence de la quantrfè'""d'oestrogènes
déposés sur le pourcentage de récupération
168
l
Cas de l'oestriol libre
.................. 168
Il
Cas du 16 ~glycuronide d'oestriol
169
I I I Di8cussion
·.............................. 171
E . Etude de l'influence du volume de solutions
d'oestrogènes déposé
......................... 173
r . Influence de facteurs divers
............ ..... 175
1
Etude de l'influence du pH
... .... .... .... 175
II
Etude de l'influence de la protéinurie
178
III Etude de l'influence de la glucosurie
179
IV
Etude de l'influence de l'urée sur la récupé-
ration des oestrogènes déposés sur le résine
180
G • Etude du degré de pureté des oestrogènes urinaires
purifiés par la résine XAD-2
• ••••••••.•• •••••
183
H • Etude de la régénération de la résine
187
l
. Choix de la dilution initiale de l'urine de gros-
sesse au moment des dosages
••.••••.•.••••••••
192
J
• Description de la méthode
195
1
Principe
199
II
Réactifs et matériels
199
a - Réactifs
............................. 199
b - matériels
200
III mode opératoire
...........................
201
a -
Prélèvement de l'urine
201
b
-
Dilution de l'urine
201
c - Chromatographie
......... ....... ...... 201
1) Préparation des colonnes
....
.
-
201
2)
Extraction chromatographique des oes-
trogènes urinaires
••••••••.•••••••
202
d - Réaction de coloration
. . .. ........ ... 203
1) Courbe étalon
.... .... .... . .. .. .. .. 203
2) Evaporation
....................... 203
3) Coloration
.... . ..... ... ... ........ 204
e - Extraction de la coloration et lecture
204
IV
Résultats
............................... 205
('";A;JITRE II
ETUDE DES CRITERES DE QUALITE DE LA METHODE
A • Introduction
.................................. 206
B • Etude de la fiabilité de la méthode
·
. 2G7
1
Etude de la fidélité
..................... 208
1 1
Etude de la justesse ou exactitude
....... 209
a - Etude du pourcentage de récupération
211
b - Dosages comparés de l'urine de contrôle
et des trois urines de grossesse
•••••
212
III Etude de la limite de détection ou seuil de
sensibil i té
•.•.••..••••.•• a.a • • • • • •• • • • • • •
215
.V
Etude de la spécificité de la méthode
218
C . Discussion
................................... 219
D . Etude de la praticabilité
222
CHAPITRE III
comPARAISON DES mETHODES
A . Introduction
.. ... ............. ............... 225
8 . Choix des méthodes de "référence"
............ 228
1
La méthode de SCHOLLER et coll.
·......... 228
II
La méthode de GRANNIS et DICKEY
·......... 229
III La méthode directe d'ITTRICH
............. 229
C . La comperaison de la méthode éleborée aux trois
méthodes de "référence" choisies
•••••••••...•
230
D . Discussion
................................... 237
CONCLUSION GENERALE
.................................. 240
BIBLIOGRAPHIE
.................. ................ ...... 244
A~PENDICE TECHNI~JE
Pages
Q
•
PREL[VE~ENT ET CONSERVATION DES URINES DE GROSSESSE
251
8 . LA mETHOOE DIRECTE D'ITTRICH
..... ......••..• ••.•.•
252
l
Princ i pa
. . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . .
252
II
Réactifs et ~atériels
••• •••••••••••.•....•.•.•
252
a -
Réactifs
~.........................
252
b. -
matériels
. ..
. . ..
..
.
.
253
III
;~.ode opératoire
253
1V
R~sult ats
. • • . . • . . • . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . .
255
C • LA mETHODE DE SCHOLLER ET COLL ••••••••••••....•.•••
256
1
Princ ipe
•••••••••••.•.••••.•.•••••••..•.•••.••
256
1 l
Réact i fs et matér iel s
.•.•.•.••.•....•.••....•.
256
a - Réac tif s par t i cul ie r s
. . . . . . . . . . • . . . . . . . . . .
256
b - Autres réactifs et matériels
.
257
III mode opérat ai re
• • • . . • . . . • . • • • • . . • . . • . . . . . . . . • .
257
a -
Hydrolyse r api de
•••••••.••••••.•••••••••..
257
b - Ext ract ion
.•••......•.•••.•.••••..••.•.•••
257
c - Séparation de l'oestriol
••••••.•••.••.••••
258
d - Ré-extraction éthérée
••.••••••••••••••••••
258
e - Coloration
...................... . .... .....
258
IV
Rl§sultets
.....................................
259
-
251
-
Sont rassemblées dans cet Appendice technique, les diffé-
rentes méthodes utilisées au cours de l'éxécution de ce travail.
La méthode élaborée, précédemment décrite dans la seconde
partie de ce travail,
ne sera pas ré-exposée ici.
A - PRELEVEmENT ET CONSERVATION DES URINES DE GROSSESSE
Les diurèses des 24 heures ont été prélevées sur quelques
centigrammes d'azide de sodium (~2 cg),dans des bocaux en matiè-
re plastique.
Leur conservation a été réalisée à +4°C
; seule, l'urine V.
qui a servi à l'étude de la reproductibilité inter-série a été
fractionnée et conservée congelée à -20°C.
- 252 -
B - LA-METHODE DIRECTE D'ITTRICH (6)
1 - Principe
Les oestrogènes conjugués urinaires sont directement dé-
terminés par la réaction calorimétrique de KOBER,
portant sur
0,4 ml d'une dilution préalable de l'urine de fin de grossesse
par de l'eau.
Il
-
~éac·tifs et matériels
Tous les produits chimiques utilisés sont de qualité merck,
hormis les stéroïdes qui ont été fournis par Sigma.
- Solution-stock d'oestriol ou de 16 CIC. glycuronide d'oestriol
ou d'oestrone à 1 mg/ml dans l'éthanol absolu.
Ces solutions stcck se conservent plusieurs mois à .4°(.
Les solutions étalons, dites de "travail" à 10 \\-log/ml sont pré-
parées extemporanément car elles ne se conservent pas plus de
12 heures à +4°C.
- Solution éthanolique d'hydroquinone à 2 grammes pour 100 ml
elle se conserve 5 jours à +4°C.
- Solution chloroformique de parenitrophénol à 2 grammes pour
100 ml ; elle doit être pré~~r'e extemporanément, environ 15 mi-
o • LA mETHODE DE GRANNIS ET DICKEY
••••••••••••••••••
260
1
Pr inc ipe
. . . . . . . . . . . . . . • . . . . • . . . . . • . . . . . . . . . . .
260
II
Réactifs et Matériels
••••••••••••••••••••••••
260
III
mode opératoire
.
260
a - Préparation de l'échantillon
•••••••••••••
260
b -
Extraction des oestrogènes
•••••••••••••••
261
c -
Coloration
.
261
IV
Résultats
....................................
262
E • LA mETHDDE PAR CHRomATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
D'ADESSI ET JAVLE
••••••••••••••••••••••••••••••••
262
- 253 -
nutes event le terme de le r'ection de KOBER et cons.rv'e dens
un bein de glece.
L"veporetion est r'elisée ~ température constente (50 oe )
sous courant d'eir obtenu à l'eide d'un compresseur et d'un sys-
r
tème de bouchons à double tubulure pour distribuer l'air produit
dans les tubes de KDBER.
La réaction de KOBER est effectuée dans des pots ronds (en
verre Pyrex) dits "tubes de KDBER", munis de bouchons rodés; un
bain-marie (10DoC),comportant un couvercle, e 'té utilisé à cet
effet.
Un agitateur (Vortex-Génie) a été employé au moment de l'ex-
tract~on organique du chromophore de KDBER.
Enfin, les absorbances ont été lues sur un spectrophotomé-
tre Jobin-yvon (Type Maroc) dans des cuves de verre de trajet
optique : Icm.
III - mode op~retoire
1 ml de le solution éthanolique d'hydroquinone ~ 2 p.100
est évaporé sous courent d'air à sooe, ~ l'aide du système d'éve-
poration pré-d~crit.
5imultenément, une gamme ételon, constitu'. per 2, 4, 6, 8
- 254 -
éthanolique d'oestriol à 10 Vg/ml) est aussi ~v8por~e en pr~
sence de 1 ml de la solution ~thanolique d'hydroquinone à 2 p.
100.
- Les résidus des tubes "dosages" sont repris par 0,4 ml
d'urine de fin de grossesse pr~~lablement dilu~e par de l'eau
(dilution 1/3 à 1/39).
Les r~sidus des tubes "~talons" sont repris par 0,4 ml
d'eau bidistillée.
- A l'ensemble de ces tubes, préalablement plongés dans de
l'eau froide,
ajouter: 0,74 ml d'acide sulfurique concentré.
- Après mélange, les tubes sont portés au bain-marie bouil-
lant à 100 0C pendant 40 minutes. Agiter aux 2e,
Se et 20e minu-
te du chauffage.
Toutes les opérations ultérieures sont conduites à l'abri
de la lumière vive.
- Les tubes sont refroidis pendant 3 minutes dans un bain de
glace.
Ajouter 1,5 ml d'eau bidistillée fraîche,
préalablement
refroidie dans le bain de glace et mélanger.
Au bout de 3 minutes,
ajouter 2,5 ml de la solution chlo-
roformique de paranitrophénol à 2 p.100 (plv).
Agiter chaque
tube pendant 30 secondes (VorteK). Centrifuger 4 à 5 minutes à
2.500 tours/mn.
Décanter la phase aqueuse et lire les absorbances au spec-
trophotométre à 500, 538,5, 577nm contre la solution chlorofor-
mique de paranitrophénol.
- 255 -
IV - Résultats
L'absorbance corrigée des dosages
0.0500 + 0.0 577
O.Oc
= 0.0 538,5 -
2
est comparée à celles données par le gemme étalon. Les résul-
tets tenent compte de la prise d'éssai, de la dilution de l'u-
rine, de la diurèse et du pourcentage de récupération affiché
par l'auteur (85,7 p.100), sont exprimés en ~g/!4heures.
N.B: Dans sa méthode originelle,
ITTRICH préconise l'addition
par tube de 20 mg d'hydroquinone à mesurer par pesée. Nous avons
remplacé cette pratique peu commode par l'introduction des 20 mg
d'hydroquinone dans 1 ml d'une solution éthanolique à 2 grammes
pour 100 ml, suivie de l'évaporation de l'éthanql.
Ce procédé,
nettement moins astreignant, donne les mêmes
résultats que celui d'ITTRICH.
- 256 -
C - LA mETHODE DE SCHOLLER ET COLL. (24)
l - Principe
Après hydrolyse enzymatique rapide des oestrogènes uri-
naires,
extraction des phénolstéroides libres par l'éther éthy-
lique, puis leur purification, la fraction oestriol est séparée
par la soude décinormale,
et enfin, dosée par la réaction de
KoBER, selon la modalité de BROWN.
Il - Réactifs et Matériels
- Suc
d'Hélix Pomatia standardisé (Industrie Biologique Fran-
çaise).
- Solution tampon acétate, pH 4,55 : 100 ml d'acide acétique
10:~ sont d'abord mélangés à 45 ml de soude 10N ;
l'enSE~Jle est
ensuite complété à 500 ml par de l'eau désionisée.
Le titre de
~ette solution tampon (2M) sera.porté à O,2M par dilution extem-
poranée au moment de l'hydrolyse enzymatique.
- Solution tampon,
pH 10,50 de BROWN: 150 ml de soude SN sont
additionnés à 1 litre d'une solution de bicarbonate de sodium à
B ~r8mmes pour 100 ml dans l'eau désionisée.
- Ether éthylique RP,
exempt de peroxydes.
- 257 -
- Solution de Rouge de Ph~nol : dissoudre 0,1 gramme de Rou-
ge de Ph~nol dans un mélange de 20 ml d'eau et de 5,70 ml de
soude 0,05N. Compl~ter à 500 ml par de l'eau d~sionis~e.
- R~sctif de KOBER : il correspond à de l'acide sulfurique
13m dans lequel sont dissous 2 grammes d'hydroquinone pour
100 ml. Bonne conservation è l'obscurité, è la température am-
biante.
Voir "Méthode d'ITTRICH"
III - Mode opératoire
A 1 ml d'urine des 24 heures,
ajoLter 2 ml de tamDon acé-
tate D,2M,
pH 4,55, contenant 25nDD u.r de glycuronidese (scit
une ampoule de Suc d'Hélix Pomatia standardisée dans 9 ~l du
tampon acétate dilué 0,2m).
Placer le mélange,
bouché, pendant 27 minutes è 62°C.
L'hydrolysat est refroidi et les oestrogènes libérés sont
extraits par 10 ml d'éther éthylique.
L'extreit éthéré est ensuite levé per 3 ml de tempon de
BROWN.
- 258 -
Le phase ~th~r~e est extraite 3 fois per 5 ml de soude
décinormale contenant 20 grammes de chlorure de sodium pour
100 ml.
L'extrait sodique obtenu est plong~ dans un bain-marie à
80 0 e, pendant 10 minutes pour éliminer le 16dOH-oestrone. Après
refroidissement,
il est neutralisé par quelques gouttes d'acide
acétique 10N en présence d'une goutte de rouge de phénol.
La ré-extraction de l'oestriol est réalisée par 20 ml
d'éther éthylique. Le nouvel extrait est lavé 2 fois par 3 ml
d'eau, séché sur du sulfate de sodium anhydre et évaporé à sec
sous vide.
e - Coloration
==========
LE résidu d'évaporation est repris en plusieurs fois par
exactement 2 ml d'éthanol. Deux aliquotes (v) de cette solution
éthanolique,calculées en fonction de la concentration présumée
en oestrogènes (donc en fonction de l'âge de la grossesse),
sont
évaporées (à sooe) dans 2 tubes de KOBER, en présence de 0,1 ml
d'une solution éthanolique d'hydroquinone à 4 gremmes pour 100 -1.
Parallèlement, sont évaporés dans les mêmes conditions,
0,2 ml, 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml et 1 ml d'une solution ~talon
- 259 -
d'oestriol è 10 ~g/ml dans l'~thenol ebsolu (gamme étalon) ed-
ditionnée de la même quantité d'hydroquinone. Un blanc, ne con-
tenant que la solution d'hydroquinone,
est traité de la même
manière.
Chaque résidu sec est repris par 1,4 ml d'acide sulfurique
13m, contenant 2 g d'hydroquinone pour 100 ml (réactif de KOBER).
Porter les tubes 30 mn au bain-marie bouillant (100°C) à
l'obscurité, avec deux agitations au cours des 5 premières minu-
tes et une 3ème en cours d'ébullition.
Après refroidissement en bain de glace,
ajouter rapidement
0,6 ml d'eau bidistillée fraîche et chauffer à nouveau pendant
15 minutes à 100°C.
Lire les absorbances des chromophores refroidis en bain de
glace à 472, 512 et 552nm contre le blanc réactif traité dans les
mêmes conditions.
IV - Résultats
Ils sont déterminés par la comparaison des absorbances cor-
rigées des tubes dosages (O.Oc
: 0.0512
0.0 472 + 0·°552 ) avec
2
celles données par la gamme étalon.
Ils tiennent compte de la pri-
se d'essai initiale (1 ml)
du volume des aliquotes d'extrait étha-
nolique utilisées (v),de la diurèse et du pourcentage de récupéra-
tian indiqué par les auteurs:
87 p.100.
Ils sont exprimés en ~g/24 heures.
-
260 -
D - L~ METHODE D[ GAANNIS ET DICKEY (25)
1 - Principe
Les oestrogènes conjugués urinaires sont directement ex-
traits par l'acétate d'éthyle en milieu acide et saturé de c~lo
rure de sodium, puis soumis à la réaction de KOBEA,
selon la
modalité d'ITTRICH.
Il - Réactifs et matériels
-
Acétate d'éthyle RP
Acide chlorhydrique N
bonne conservation à +4°C
- Chlorure de sodium RP
- Réactif de KOBER : ce réactif est obtenu par dissolution de
2 grammes d'hydroquinone dans 100 ml d'acide sulfurique à 68 pour
100 dans l'eau
(v/v).
Il se conserve à l'obscurité à la tempéra-
ture a~biante.
- Pour le complément de
réactifs et les matériels utilisés, se
référer à la description de la méthode directe d'ITTRICH.
III - mode opératoire
Déterminer la densité de l'urine et la remener,
si besoin
est, eux environs de 1.010 par dilution equeuse.
- 261
-
Dans un tube (tube de K08ER), mettre
- 2 ml d'urine pure ou d'urine diluée
- 2 ml d'acide chlorhydrique N
- 2 grammes de chlorure de sodium
mélanger et ajouter exactement 3 ml d~acétate d'éthyle.
Agiter vigoureusement pendant 30 secondes (Vortex-Génie), puis
centrifuger 5 minutes à 3.500 tours/minute.
(Jouan,
modèle K.62)
c
-
Ç9±QE~~!Q~_
-----------
Dans des tubes oe KOBER,
transférer 0,5 ml de l'extrait
oestrogénique (acétate d'éthyle surnageant)
; préparer simultané-
ment un blanc-réactif (0 ~g d'oestriol) et 2 standards contenant
5 et 10 J.J9 d'oestriol à l'aide de la solution éthanolique à 10 J-lg/
ml.
Ajouter 0,2 ml d'une solution éthanolique d'hydroquinone à
2 9 pour 100 ml dans chaque tube.
Evaporer le contenu de chaque tube de KOBER à 50 0 e à l'aide
du procédé précéaemment décrit.
Reprendre les résidus par 2 ml
du réactif de KOBER correspondant.
Les tubes sont portés au bain-marie bouillant (100 o e ) pen-
dant 40 mn ; 3 agitations sont effectuées aux 2e et Se minutes,
puis au milieu du temps de chauffage.
Les chromophores obtenus sont portés eu bain de glace (ou
d'eau froide) et 1,7 ml d'eau bidistillée froide sont ajoutés.
- 262-
mélanger et 11re les ebsorbences à 472, 514 et 556 nm con-
tre le blanc-réactif.
IV - Résultats
Comme dans les cas précédents, les résultats sont déter-
minés par rapport aux standards (absorbances corrigées).
Ils
tiennent compte de la dilution éventuelle de l'urine, de la pri-
se d'tissai urinaire (2 ml),
du volume d'extrait organique utilisé
(0,5 ml), de le diurèse (en ml) et du pourcentage de récupération
indiqué par les auteurs:
R = 83,5 p.,OO.
E - LA mETHODE PAR CHROmATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (40)
d'ADE55r ET JAYLE
Les dosages par chromatographie en phase gazeuse ont été
effectués dans le laboratoire du Dr RACADDT,
service de médecine
du
Professeur LINC~[TTE (C.H.U, Lille), sur un chromatoçraphe à
détec~eur à ionisation de
flamme,
équipé d'un intégrateur, d'une
colonne de 2 m remplie d'OV, à ,
p.'OO sur chromosorb W.H.P.
(Hewlett Packard,
type 5830 A).
Les conditions chromatographiques ont été les suivantes
- Débit d'azote: 20 à 25 ml/minute
- Température injecteur
240 0C
- Température détecteur
255°C
- Température du four : 230°C
- Volume de mélange réactionnel injecté dans l'appareil: 10 ~l
- 263 -
La méthode est celle décrite par ADE551 et JAYLE (19),
légèrement modifiée. Nécessitant 1 ml d'urine de grossesse de
plus de 15 semaines, elle suppose :
- une hydrolyse enzymatique rapide d'une heure à 55°C
- une extraction des oestrogènes totaux libérés par un mélan-
~e
acétate d'éthyle/hexane/éthanol, 7/2/1, v/v.
Après l'évaporation de cet extrait organique, il est possi-
ble de séparer la fraction oestriol par partition : benzène/éther
de pétrole/eau, 1/1/2, v/v
cette opération a été omise dans le
cadre de nos déterminations.
- la triméthylsylilation des oestrogènes simultanément à celle
d'une gamme étalon d'oestriol.
- et enfin, l'injection dans le chromatographe.
Un standard interne (épicoprostanol), introduit dans la
gamme et dans le dosage eu moment de l'extraction organique des
oestrogènes, permet de déterminsr le coefficient de réponse de
l'appareil et de corriger les résultats obtenus en conséquence.