UNIVERSITÉ CLAUDE BERNARD
LYON l
.
1.
FACULTE
DE
PHARMACIE
, .
,
présentée-et ~o~téhtle pu~liqtie~ent le 15 no~embre·19~2
pou~' obtenir le grade de
, .
DOCTEUR DE 3~~ne,CYCLE· PANS LES DISCIPLINES'
.
.
PHARMACEUTIQUES·(To~icologie).. .
par .."
. .
.
Çfébastien' ~•. Çl)AJY@
,
.
..
.. .. ..:..
:~.
...
.
...
...
...
10..
••
....
••
••
l , . ~
..JURY'
MM
CHAMBON
~rof~sseùr
J
......• ; . . . . . .. Président
PINATEL j prof~~.~eür·
'
~ • .
VALLON j Professeur.:
membres
ocooux J Professeur
" . · ..

UNIVERSITE cLAUDE BERNARD
LyoN Î
' ..
PRESiDENT DE l'UNiVERSITE
Professèur L. DÀVID
PREMiER VICE-PRESIDENT
ProfesseUr R. MORNEX
DEUXÎ8~È ViCE-PRESIDENt
Mâdamê A. vÂRÂGNAt
SECRETAIRE GENERÀL
Mônsièur F; MÂRIÀNi
UNîTES Di ENSEIGNEMENt ET DE RECHERCHE DE liUNiVERSITE
(Grange-Bianchê
Dirêctêur
Profès seUr ZECH Po
ProfesseUr MORNEX R;
MEDECINE
(À i ex is-Carrè i
OîrètteUr
(lyoh-Sud
Direttéur
Professeur NORMAND J;
(lyon-Nord
DirecteUr
DocteUr Iv1INÀIRE y;
(M.C.A.)
SÎàLOGIE HUMAINE
Directeur
Docteur REVILLARO J.P; (M.c.A.)
tECHNIQUES DE READÂPTÂTION
Directeur
Profès seUr MORGON À.
SCIENCES PHÂRMAcEutIQUES
Directeur
ProfessêUr BIZOllON CH.À:
SCiENCES ODONTOlOGIQUES
Dlrectëur
Prbfessëur PÀRRET J;
. INSTITUT REGIONÀl
D'EDUCÀTION PHYSIQUE ET
SPORtIVE
Di recteur
Monsieur MILlON Â.
MÂTHEMÂTIQUES
Directeur
ProfesseUr FLAMANT r(
PHYSIQUE
Di rectèur
Professëur DËLMÀU J
CHiMiE ET BIOcHIMIE
Dlrecteur
Mâdame VÀRÀGNÀT Â:
SCIENCES DE lA NATURE
Directeur
Profèsseur LEMOIGNE y~
SCiENCES PHYSIOLOGIQUES
Directeur
Mademoiselie lè Professeur WORSE J;F:
1. U. t. i
Di rèdèur
ProfesseUr VillE À:
Lü; t: N° 2
Directeur
MonsiéUr GÂllEt J (Directeur Ê.f-LS;À.M;)
OBSERVÀTOIRE
Directèur
MonsleUr MoNNET G (Àstronome Âdjoint)
PHYSIQUE NUCLEAIRE
-Directeur
Profésséur GUSÀKOW M.
MECÂNIQUE
Directeur
Mademoiséliè iè ProfesseUr CbMTE~BEllot G.

A MA FAMiLLE
~II\\ ~'lEfŒ
l'lA F'lL1E (MON COCO)
A MES BEAUX PARENTs
A TOUS MES AMIs

AU PRESIDENT DU JURY
Monsieur Îe ProfesseUr CHAMBoN
,.le voudr;üs rendre hommage à li'!. disponibilité sans faille et à li'!.
volonté dont VOIlS avez toujours fait Illon tre à mon égard, depuis que vous
m'avez élccuellli dans votre laboréitoire.
'lotre sympathie et vos conseils m'ont été précieux.

AUX MEMBRES DU JURY
Monsieur le Professeur riNATEL
Permettez-moi de vous exprimer ma sinc~re et ·tr~s repectueuse recon-
naissan~e pour la spontanéité avec laquelle vous avez accepté de bien vou-
loir JUGer ~p. travaiL
MonsIeur le Professeur VALLON_
Je vous remercie de liattention que vous avez bien voulu Ine témoigner
en rlCCp.Dtan t de .luF-,;el' ce travail •
.soyez assuré de mOIl profond respect.
Monsieur le ProfesseütODDO.UX
Je vous remercie de votre accueil toujours chaletireux.
Je suis heureux de vous compter parmi mes juges et je vous prie de
trouver ici le témoignage de ma profonde gratitude.

Madame CHAMBON
,j e vous
formule toute ma gra ti tude, hon seulement pour vos
conseils ~ui m'ont été très utiles, mais surtout pour le sentiment
(~e conïiance que vous avez manifesté à mon égard en me confiant des
reSl)ODGabili tés ;1.11 sein de votre équipe.

AU PERSONNEL bU LABORATOIRE
[V;erci :~ j'10l1e Di AHGEN'['RE dunt les travaux préliminaires mi ont
écl8.i.ré en partie dans la ré8.liséltion de ce travaiL
.] i adresse ma profonde reconnaissance à j'1mè DARCET;
~a p8.cticipation à la réalisation de ce travail m'a élpporté
UII
C::::Lin cOtl:3idérablc en temps.
Je remercie Mme MüHIN ].iour avoir contribué à la traduction
de cl'rtain:~ de mes textes.
i''les re;nerciements vont aussi à Helle vUITON pour sa sympàtlüe~

Il l A N
l
NT .. R 0 DUC T l d N •..•...•..•••.•••••••••••••••••••••.••••• ; ~ •••••••• 1
PRE MIE R E
P i\\ R T l E
PRO P RIE TES
b E S
À FLA -
TOXINES .................................................... ;
2
1- RAPPELS SUR LES t\\F1f,TOXINES Ni\\TURELLES ~ •••••••••••••••.••••••.•••••. ·3
I-i- HIST?RIQUE •.•.•.•••.•••...•••••.••••••••.•••••.••••••••• ~ ••••••• 3
1-2- PROPRIETES PHYSiCO-CHiMIQUES •••••••••••••••••••••••.•••••••••••• 3
1-3- ToxicITE DES AFLA.TOXINES •••••••••••••••••••• • .; •••••••••. ·······5
1-3-1- Toxicité é'.igu~·' ••••••••••••••••.•.••••••••••••.••.••••••••• ·5
1-3-2- Toxici té chronique··.· •••.•••••••••••••••••••••.•••••••••.••• 5
1-3-2-1- Propriétés cancérigènes de liaflatoxine Bi
5.
1-3-2-2- Pouvoir tératogéne ••.••••••••••••••••••••••••••••••••••. 6
1-3-2-3- Effet mùtagène •.•••••••••••••••• ; •.•••••••••••••••••••.• 6
II- METi\\BOLiSME ilEPATiQUE DE L'AFLÂTOxiNE Bl~·;· .. •

ô
7
III- ETUDE DE L'AFLATOXINE Ml


··i
;
;
l1
111-1- HISTORIqUE ••••••••••••..••• ~ •••••••••••••••••.•••••••••••.••••• 11
III-2- EXCRETION DE L'AFLATOXINE Mi DANS LE LAIT
;
11
111-3- STABILITE DE L'AFLATOXINE Mi DANS LE LAit ET LES PRODUITS
LAITIERS • . • . . • . • . . . . . . . • • . . • • . . • • • • ~~; •..•.•.•..•.•.••• ~ .... ~. 16
111-4- TOXICiTE DE L'AFLATOXINE Mi
;.•... ; .........•............ 16
111-5- ASPECTS LEGiSLATIFS SUR LA TENEUR EN AFLATOXINE Mi DANS LE
LAIT ET LES PRODUiTS LAITIERS
.•.•••••••••••••••••••••••••••••• 19
III-5-i- Lois françaises
•••••••••••••• ; ••••••••••.•••••••• ;. ~ •• ; ••• 19'
111-5 - 2- Lois américaines
~ .. ;.
"
~
~
19
111-5-3- Lois suisses
•••••••••••••••••••••••••••••• ; •••••••• : •••••• 20

D E U X l
E M E
P Â R T i E
R E F E R E N C E S
B l B L 1 0 -
G R fi P li l
Q U E S
S U R
L A
D È T E C t
t 0 N
E T
L E
D 0 S fi G E
D E
L
A F L fi T 0 X ± NE
M 1 ~. ~ ..... ,. ........ ~ ~ : .••... 21
1- INTRODUCTION •.•••••••••• ,..; ••••••• ~ ••• ~ ••. ~ • ~ •••••••••••••••••• " ; io ... 22
II - LES METHODES
PAR CCM •.•••..•••••.•••• ; ••• '•• ; • ~ •••••••••••••••• ~ •••• 22
III- LES METHODES PAR RPLC
~ .••••••••••• : ••••••• ;;;.; ••••••.••••.••.•••• 22
IV- REMARqUE
•.•..•••••••••.••..••.••.•.•.•......•••••••.•••••••.•.•••••• 22
T ROI S I E M E
pARTIE
TRAVAux
P ERS 0 N NE L S ... 26
1- CHOIX D'UNE METHODOLOGIE
•••.•••••••• ; ••••••••••••••.•••••••••• ; ••••• 27
1-1- CARACTERISATION DU PIC D'AFM1 •.• ; •••••••••••••••••.••.••••.• : •••• 27
1-2- LiMITE DE SENSIBILitE •. ; •••••••.••••.••.•••••••••••••••••••••••• 28
1-3- POUCENTAGE D'EXTRÂCTION OU RENDEMENT ;; •••••••••. ; •••.••••• ; •••••• 28
11- LES METHODES DE CCM •.•••••••.•••• ; .••••• ; •• ; •••••••••.•• ; •••••••••• 28
111- CHROMATOGP~PHiE LIQUIDE HAUTE PERFORMÀNCE A DETECTION FLUORI-
METRiqUE •••••••••••••••••••••••••••••••• ~ ••• ~ ~
~
)0
IIi-t- RAPPELS DE 1Â TECHNIQUE HPLC •• ; •• ;; •••• ; ••••••••••••• ; ••• ;; ••• ;30
Iri-l-1- Principe
~" .. ;
~
;
~
30
,
;.
~
.
111-1-2- Schémâ genéral
~ ~. ~ ••• ";. ~
~ ~ ~
30
nI-1-2-1-
.
,'
Sys tème de pompage ~ ~ •••• ~ ; • ~ ••• ~
~ ~ • " .. ~ ; • ~
30
rtI-1-2-2- Système JiinJecdon de iiÙhâiiHÜon
;:;;.;;; .. ;30
1II-1-2-3 - Colonne et phase StationnaÜe
;
;
31
iir-1-2-4- Solvant .~ .••..••••••••••••• ~ •• ~ ••.••••.•... ~ ••.•• ~~ ••• ~)2
ni-1-2-S- Syi:èmé de détection;.; ••••• ô •• ; ••• ;; •••••••• : •••• ; •••• 32

111-1-3- La spectrotiuorimétti~.~.; •• ·~·~~~~···········;~·········33
111-1-3-i- Rappels sur la fiuorescence ~~ .•....•••..•••. :., •.• ,.33
iil-i-3-2- Àspect pratiqué du spectroi1~~imètre
•..••• ;~: •.•.. :34
Ili-2- DOSAGE DE iiAFMi EN HPic PHÀSE iNVERSEE AVEC DE1ECTioN FLUORi-
HETRIQUE : TEc1HuQÜES biÈXTRÀCTION ET nÉ PURIFicATioN·····:····}7
IIÎ-2-1- in trocluc tian ..•...........• ,. ~
~
l. ;
; 37
III-2~2- Essais préiiminaires :.: .•. ~ ..• ; •.••• : ; .•.....• : :. ~ . : •... 37
lii-2-2~i- Extraction et purification dë iiAtMi sur cartouche
c i 8 se p Pak~ _
;
~ ~ ~
• •••• ; 37
111-2-2-2- Modification de la méthodè de purification •. : .•••. ·:39
ill~2-2-j- Modiiicàtion du solvant diéiution HPLC·······;·······39
111-2-2-4- Discussion •....•... :i ..•.• i ... ;.~; .. : .....•.•....... 40
ill-2-3- kétbodes dle~tractt6n bas~e~ ~ur i~ ~récipitatidn des
protéines dû iait : expériénces pérsonnellës····:,·······44
lil- 2-3-1- Application des techrtiquéi dié~traction ~xistànt駷44
±iI-2-3-1-1- Précipitation à 1i ac~tate de plomb .. ··.····;·· .44
ill-2-3-1-2- Précipitation aü suifâte de cadmium .~ ....•.... 45
III-2-3-1-3- Précipitation au méthanoi.· ~ ......•..•.•.••••.• 46
lil-2-3-1~4- vérification de la ~ureté des extraits obtênus· 46
111-2-4- Amélioration de la précipitation des protéines du lait ..• 46
ili-2-4-1- Cboix diurt nouvel agent ~r~cipit~nt •....•.• : ••....... 47
ili-2-4-i-1- te sulfate de iinc .;; •• ; .•. : .•..••••.• ; ..• ;.; .. 47
III-2-4-1-2- AcHort combinée du sulfâte de zinc et de là soude .4'
lîi-2-4-i-3- vériHcation dë cette noüvèiie tecbnique dë
précipitation ....• ; ,: .. ; •.• ; ....•..•... ;.; .••. ,49
111-2-4-1-4- Choix du volume des éch~nti1ions •.... : .• ··:.· •. 50
111-2-4-1-5- Etude du rendement diexttâction .•... :;·:,~:.···50
Ili-2-4-1-6- Descriptiori détaii1éé àe iâ ptésente méthode
cl' extrac tian........•. ~ ••... ~
~
., ...•. 51
IIi-3- DosAGE PROPREMENT DIT DE iiAFM1 .;:;.;; •.. ~:.~ .......•.•. i; .••.•. 54
111 -3-i - i il. t r 0 duc t ton .........;......:;..;....,..;. . . . . . • • . ; ; . • • • • • , . 54
Ili-3-2- Apparêii utilisé •.•...•..•••. : .•• : •• ; •. ;
~ ••.•.. ;::,; •• :.;54
111-3-3- Soivant dié1uti~n ......•.•• ;;.:.,.,;.;;
; .•• ;; ...•.••• 58

111-3-4- Rés~itatê obtenus .•..•.•.•..• ~ ••.•• ;.; ..•.•.... ; •..•••. ;.64
1II-3-L -i-
f
Détetmihàtion des picS;···;·;······················· .64
11IL3-4-2- Ca1cùi
;; .•••.••••..•.•.•..••.•.••. 64
111-3-4-3- Résultats obten~s en utiiisant les méthodes dÎextrac-
tion déjà existantes·· .. · · . · ; · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ~ .•.• 72
111-3-4-4- Résultats ohtenùs avec là présente méthode •.• ; ••••••• 72
111-3-4-5- Appiication de la nouveiie méthodè d'extractiori
à i' analyse de iaits et prodùits iai tiers provenant
d'un centre laitier iyonnàis
· .•• 74
111-3-4-5-1- Làits 1iqùides •••.• ;; ••..••.••..•.•••.•••••..•• 74
111-3-4-5-2- Fromage bleu···························;······· 75
111-3-4-6- Lait en poudre •.•••••••.••••••.•••.•.••.•.•.••.•••..• 15
111-3-5-1nf1uence de ia congélation et décongélation sur 1 i AFM1 ... 84
111-3-5-i- Influence de ia décongéiatiori sur ie rendement de
l'extraction
84
111-3-5-2- Influence de ia congéiation ~ûr la stabilité ••.....•. 85
111-3-5-2-1- Laits artificie1iement contaminés .•.•..•.•••••• 85
111-3-5-2-2- Laits naturellement èontaminés ..•....•...••.••• 85
IV DISCUSSION ET CRITIQUE DE LA METHODE.· •..• ; ••••..••..•.•.•...•.••.•.•. 88
CON C tus iON •.••••••.....••.....•.•.••.• ;.... ; .••.•....•...• ; .•••••• 90
B 1 B L 1 0 G R A PHI E •.•.••.••••••••••••.•••••• ; •.•••••.••••••••.•••• 92

1
1NfRODUCflON
L'intoxicRtion constat~e chez les dihdonneaux anglais en 1960
a donn~ liel] ~ de tr~s nombreux travaux dans toutes les disciplines
sur le probl~me des afiat~xines (AF). Quatre compos~s du groupe des
af1atoxi nes ont retenu l'attention des chercheurs : aflatoxines BI,
.K2, Gl et G2.
L'aflatoxine BI (APBl) a ~té reconnue plus toxique que :les aut~es.
Sa pr~sence dans les aliments des bovid~s pro~oque l'apparition diune
toxine dans le lait (milk toxin) et dans les urines; il s'agit de
l' a ['l;ü0xi ne Ml
(M'Ml) dont la toxicit~ serait voisine de celie de
:l'AfBl. Compte-tenu de la place pr~pond~ranteiqui occupent le lait et
les produits laitiers dans la ration alimentaire, en particulier infan-
tile, des r~Glementations nationales et internationales ont ~t~ ~laborées,
limitant la tenetir en afla~oxines de ces produits. Pour répondre ~ ces
exigences administratives et préserver la santé humaine, plusieurs
méthodes de dosa~e ont été mises au point dont la plus ancienne est la
chromatographie sur couche mince (CCM). La chromatographie liquide ~
haute performanoe (HPLC) tend de plus en plus à ia sBpplcinter au cours
de ces derni~res années. 'l'outes ces méthodes sont longues, onéreuses et
peu sensibles. Le but de notre travail est donc dÎapporter des amélio-
rations dans le dosage de cette aflatoxine
Dans un premier temps, nous essayerons de raccourcir l'~tape
d'extraction et de purification de l'AFf'oll grâce à une précipitation
importante des protéines du laiL
Dans un deuxi~me temps, nous tenterons diam~iiorer le solvant
d'élution IIl-'LC à partir des résultats obtenus avec le solvant de W1NTEH-
LIN.
En dernier lieu, nous étudierons liinfluence de la durée de la
conservation sur la
stabili té de 1 j AFML

2
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~ROPRI EtE S
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Af=lAfOXI N É~

I-R A P PEL S
S li R LE S
A FLA t 0 x i NES
NAT U R È L LES
Ii existe ac~ileliemen~ ~ne m~i~i~U~~ de mycotoxines (toxines
produitès par ies champignorismicroscdplquès oil moisissures) dori~ quatre
seùlement (Afia~oxines; Ochràtoxihes, Zéàrâiénoné et tricho~héc~nes)
retiennent iiat~en~ion de l'organisation mondiaie de là san~é poür ieurs
effets plùs oil moins néfas~es sur la santé humaine ët âriimaie.
Une place toUte particuiière ès~ accordée aux afiàtoxines
depuis les
intoxications constatées cbez les dindonneaux anglais en 1960;
1-1- HIsTORiqUE
isolé des grains d'arachide en i96i(52 )j le champignon pro-
ducteur des ~oxines â été identifié comme é~an~ iiASPERGILLUS FLAvbs
d'où le nom cl i AFL'\\TOXlNES (Aspergi iiüs f1av~s Tox:Î.ns) (20) . Ce terme nous
sembje impropre car une deuxi~me so0cbe sembie impliquée dans là produc-
~ion des toxines! Aspergiiius parasittcùs.
1-2- PROPRiETES PHYSICO-CHIMiqUES
Sùr pHs de 17 composés dénoinmé~ Aflàtoxiries; ie ~erme iiAfia-
toxines" si applique habi tue iiement aux qUahe composés produits par
Aspergflius Fiavus e~ pàrasiticùs ~ ce sorit ies aflitoxines Bi;d2; Gi et
G2 : B poùr ia fiùorescènce bleue (biue) ét G pour la fiuorescence verte
(green); iès indices i et 2 étant ceux de là mobilité chromatogràphiqûe
teiative. La teneur d~Aflitoxine ~1 daris le~ végétaux natureis est là ~iùs
élevée, sUivie de celie de l'Afiatoxine Gi; les Aflatoxines B2 et G2 étant
en
quanti té infime (44).
Les structutes
des Aflatoxines Bi èt Gi ont été détermiii.ées par
ASAO en 1963 (7) et celle de B2 et G2 par -êHÂNG (19) iÜHARTLEY (29) Fig i

FIai:
sTRUcrURË5,,, ')CHIMIQUË5
. .
.".'
,
..
" . . . "< ,;DES
,.'
.. ~
~
A~LArox'NE5.. NA1URËLLE~.
,
\\ .;
o
Ô
:~. j .
II.
JI
.....

1-3- TOXICITE DES AFLATOXINES
1-3-1- Toxicité aigu~
Les
études faites sur des canneton~ agés ditih jour (i6)montient
que l'Âfiatoxine Bl est deux fois
plùs toxiqùe que l'Àfiatoxine Gi, qtiatre
fois plus toxique que iiAfl~toxine B2 et 8 fois plus toxique qrie iiÀfla-
to:v:ine G2 comme liindique le tableau ci-dessoùs:
)
(
Aflatoxin~s
DL 50 (mg/Kg de poids corporei )
)
(-------------------:------------------------------------------------)
(
Bi
O,JO
)
(
)
(
Gl
0,78
)
(
)
(
B2
1, 70
)
(
)
(
c2
2,45
)
(
)
(
)
(
)
Tableau comraratif de la toxicité aiguk des Aflatoxines chez
des cannetons agés d un jour
(2p)
Liorgane cibie étant le foie (hépatit~i ~irrhose) on é pU noter
des cas de syndrome de Rye (encéphalopathie; dégénerescElOce gr.aisseuse) _
et de néphrotoxicité(S)
1-3-2- TOXICITE CHRONIQUE
La toxicité chronique de lÎAfiatoxine Bi s'est révéléé piùs im-
portante que celie des autres composés. Elie est cancérigène, térétogène
et mu tagène •
1-3-2-1- ~:~P:!~~~~_~~~~~~!~~~~~~~~-!~~~!~~~~!~:-~!
Les études de CARNAGHÀN (17)
et LANCASTER
(36) ont montré que ce
pouvoir cancérigène se manifest~ par l'ap~atition de tumeurs au niveau
hépatique. Il semble que tous les animaux d~expérimentation soi~rit sen~

sibles à cet effet. Une relation dose-réponse linéaire a été démontrée par
WOGAN (60).
(
)
( Taux d'AFBi
Dùrée du
Incidence
Tem~s diapparition
)
(
traitement
cancéreùse
de là première tumeùr
)
(
(fig/Kg à1i- {: ( seme.:lnes)
au niveau
(semaines)
)
men ;
(
du foie b
)
,
'
(
)
-------------:--------------:-----~-------:----------- -----------------
(
)
(
0
74-io9
o/is e
)
(
)
(
1
78-105
2/22
104
) ,
(
)
(
5
65-93
1/22
93
)
(
)
(
15
69-96
4/21d
96
)
(
)
(
50
7i-97
20/25 e
82
)
(
)
(
ioo
54-88
28/28 e
54
)
(
)
Tableau caractéristique de la dose-réponse de la cancé-
rogénécité de l'AFB1 chez le rat Fischer mSle~ (44)
a
In: WOGAN et ai (1974)
b
chez les animaux exposés (survie> 50 semaines)
c
Rat dont ia survie fut maximaie
d
Métastases pulmonaires chez 2 rats
e
li
ii
"
4 rats.
On remarque dans cette étude qùe le poùvoir cancérigène se mani-
feste aussi àu niveau pulmonaire.
.
Une étude ré~iisée sùr i i embryon de pouiet, (23) a montré que
l'Aflatoxine nI possède des propriétés térat<jgènès.Ces mêmes effets niont:
pas été observés chez la souris.
.
il se manifeste pàr des aberràtioris chromosomiques et une rupture
de l'A D N dans les cellùles végétales et animales (45) de même qùe pàr des
mutations génétiques (6i).

7
11- MET A BOL l
S M E
HEP A T l QUE
D E
L
A FLA TOX i N E
B 1
Plusieurs études effectuées in vivo et iri vitro montrent que
l'aflatoxine Bi donne naissance à des métabolites hydroxyiés(figure 2)
généralement dépourvtis de toxicité sauf liAflatoxine kt ( 14 ) ~. Ces
métabolites se retrouvent dans les fécès; les urines et le lait.
Plusieurs enzymes seraient impiiquées dans ce processus de
métaboiisme (44) :
- les enzymes microsomiales retenues par ia pitipart des auteurs, catalysent
les principales réactions métaboliques.
- la desbydi-ogénase cytoplasmique NADH-dépendante intervient dans laconversi<
de l'afiatoxine nl en afiatoxicol et en afiàtoxicol Hl en passant par li afla-
toxine QI •
Au cours de cette biotransformation; il se produit une acti-
vation métabolique conduisant à la formation d'un composé époxyde stipposé
~tre responsable des effets toxiques des aflatoxines, ce qui expiiquerait
les phénomènes de susceptibilité individueiie affirmés dans le tabieati I •
Les propriétés physico-chimiques de lÎâflatox{ne Bi sont repré-
sentées dans le tabieau 2.

FIG~ 2: ::
METAI30LI5ME: l-lEPATIQUE~
Mf
44**
DE' L~FLAlOXINE', 81'" (42, 44)
OC\\~
OH'
AfBl
~s~ , ".j
~,/.I\\ ~"'~
/~' ~,
(')
, ~,Uoso
Ti
..(C~
Toxicité "
J'~\\",;$'..,a::r:: _1_10
r
Mutagemctt,e.,
<;qçJ.
Cancerogemclte ,Q:;:
cf;'
EPOXYDE _ 2,.3
AFP
AfM·
l
(D.'
l,

• . 1
fA8LËAU,1 i

">,
" . " , . . ,
l

(
)
(
)
Espèce
DL 50 (mg/kg
Zone de là iésion hépadqùë
(
)
(
poids cotpore 1)
)
t
)
(
)
(
)
(
Poule t
0,025
)
(
)
(
(embryon)
)
(
)
(
Lapin
0;3
Médiane moyenne
)
(
)
(
Caneton
0,335
péri porta le
)
(
)
(
Chat
0,55
Péri pori:aie
)
(
)
(
Potc
0,62
Ceriti-ilobùlafre
)
(
)
(
Chien
0,5
1,0
CeritrHobùiaire
)
(
)
(
Mouton
1,0
Ceh tri lobùlaire
)
(
)
(
Cobaye
1,4
Centi- ilobuiaire
)
(
)
(
Babouin
2;0
CentrÎ!lobulàire
)
(
)
(
Rat mâle
7;2
Péripottaie
)
(
)
(
Hacaque
7;8
Cen tri i cbu i a He
)
(
ferne lle
)
(
)
(
)
Souds
9;0
(
)
(
Harns ter
10,2
)
(
)
(
Ratte
i7'9
,
Péri por ta le
)
(
)
(
)
TOXlctTE AIGUË. DE LV'At=13j (44)

TABLE'AU 2 :~
PROPRIETES A-IY5IQUES ET' CHIMIQUES DE. L'"AF§j ET' SES ,METABOLITES,
(
"
.
,
. ).
. . . .
.
. .
c~
.
(
Aflatox~nes
:
Formule
: Masse moléculaire'
: Point de fusion
: Absorption dans l'UV (fJ
: Emission
)
(
: moléculaire:
relative
: 0 ' C
:-------------.:--------------.:
fluorescente
)
(
: :
:
:
265 nm
:
360-362 nm.
:
(nm)
)
(-----------------,--_._--:------------_.:---_._---------_._----:---------------_.-:-------------:----_._-_.-----_.:-------------_._)
(
B l,Il'
: C17Hiz06:
312
:
268-269
:
12400
:
21800
:
425
)
(
: :
:
:
:
:
)
(
M l : C
H
0
:
328
:
299
:
14150
:
21250
:
425
)
17 12 7
(
b'
: : :
:
:
:
(357 nm)
:
)
(
P l : C16H1006:
298
:
>320
:
11200
:
15400
:
-- f
)
(
: :
:
:
(261' run)
:'
(362- nm)
:
)
(
: :
:
:.
:
:
)
(
Q 1
: C17Ht201':
328
:
- e·
:
11450
:
17500
:
_. r
)
(
: . :
:
:
(267 nm)
:.
(366 nm)
:
)
. . .
.
.
(
.
.
)
"

d '
.
.
(Aflatoxicol
: C17H1406:
314
:
230-234
:
10800
:
14100
:
425
)
(
: :
:
:
(261 nm)
:
(325 nm)
:
)
(
: :
:
:
:
:
)
a
coefficient d' a~o~~~olaire de' l' Aflatoxine- Bi d'après HODRICKS et al (1970) et. de- Ml d' après
STU13LEFIELD e t ~~y .(1.9.7-2.)
r~
t:s
b
~I(''''~ 1~~'~';:,\\.
' t ·
P représente-
prodl:li,ts' Rh'~21oliques de- la ° _. déméthylation' de- L Aflatoxine B ,
disso~us dans!1.e~mé\\~lol,
c : Composés
sauf pt qui L'a été dans l'éthanol. Les. données sur les coefficients-
,
I~
lm
/
q
.
d absorPtion.s~o.;1v,ants se, tr. où.v.ent dans les publications originales.
;oé)-"
1 u . .7 .:pli.
/". ~
If'
cl
d'ap'rès BUTLER. 1~9~,:)~\\'<1
e : non disponible.
f
: la fluorescence- violette- de" la. Mt et
la
fluorescence jaune-vert des P t et Q 1. sont· indiquées dans
les publications originales •.
Extrait de·Mycotoxines:O.M.S. (44)
.
'"'"
a

Ji
IrI - E T Ü b EDE
LiA FiA t 0 X r NE
Mi
rir-i HISTORIQÜE
ÀLLcROFT et Ai(i) constàterit qùiûrl iâit provenant dé vàcbés
nourries avec des aliments contamin~s en âfiatoxihés provoque des iésions
hépatiques chez des cannetofts. Là toxiné resporlsàbië a ~té identifiée
corrnne étant 1 i AflatoXine M il Hüktoxinii carac tériséê par une flùorescence
viole de (22 J.
L'Aflatoxine Mt est donc ün métabolite hydroxyié dé iiÀfla-
toxine Bl~12, 31, 39). En pius de sori
éiiminàtion dans le lait; éiié se
retrouve aussi clans les urines èt ies fèces dès ànimaux ayant consommés
des aliments contaminés (59,4}) ainsi que dans iès urines humaines (i3) .
iII-2- EXCRETION DE LÎAFLATOXINE Mi DANS tE LAIT
LiÀfiatoxine Mi sÎélimirie daris ie lait des bovidés lorsque
ceux-ci sont soumis à un régime aiimentaire contenant de l'Af1atoxine Bi.
si tous les auteurs sont unanimes sur ce point; Ü
subsiste néanmoins des
écarts diappréciatiori sur la teneur de ce métabolite .' tableau 3 j

Il existe une relation linéaite eritre la quantité dl~fl~-
toxine Bl ingérée quotidiennement et ie taux d'afiatoxine Mi secrétée dans
le lait (2, 51),fig.3.
L'éiimination dÎaflatoxine Mi dans lé lait atteindrait son
maximum 48 h après la première prise alimentaire; puis diminuerait pro-
gressivement pendant ies trois premiers jours qui suivent ie retour à
une alimentation normaie ( 3, 34 Y( figuré,4 ). Chez ia ·brëbis C43} "
apr&s liadministration uilique d'une dose d'aflatoxines,
la diminution
de liélimination est effectivement progressive ;màis ii apparait une
légère augmentation du taux avant sa négàtivatiori compi~te (fi~tité ~j~
cela s'expiiquerait par une iibération éventuèllé de liaflatoxine de son
site de fixation.
Remarque
liaflatoxine Bi sÎéiimine aussi dans le iait
mais en qUAntité infime (3; 4.3). •

TAI3LËAU 3 ••
(
)
(
Au
)
teur s
Pourcentage diafiatoxine Nt
(
)
(
excrétée
)
(
)
(
)
(
)
(
(3)
ALLCROF'"r
i968
0<35
,
)
(
)
(
(40) J'flASHI
1969
0;5 - j,9
)
(
)
(
(47) POLAN
1974
d - 0;3
)
(
),
(
(33 ) LAFON'r
1975
0,78
0,90
)
t
)
(
(34 ) LAFONT
1980
0,i4 - 0,95
)
(
i
)
(
(46 ) 'PA'l'TERSON
1980
i - 3,3
)
(
)
(
*
NEUMAN-KLEINPÀUL
1972
1,39
)
(
)
(
*-
HO\\-1ERSLAND
1973
0,43
)
(
)
(
* KIERMEIER
1973
0,86
)
(
)
(
~
KIERMEIER et
)
,
! ~
(
MuCKE
o .i8
)
:;
,
, ;"j
(
)
~l
.. l
(
)
i
*-
ENGEr, et
(
)
(
HAGEMEIS'rER
<: 0;6
)
(
)
(
)
(
)
,
." ",
..
.. Extrait dé Tbese FREMY (24) •
ËXcREflON bFAt=M1EN POURŒNtAGE
D~F131 INGEREE

FIG 3:
<lJ
..G
g 10
;>
<lJ
.......
., ~

• • • .

' : :
.,.;•.•• " , " .
l,"
'r••• ·
• .
' " .
r- r ," ,
10
2D
30
APport quotidien diAFBi ( mg )
RELATiON .. ENTRE l!'APPORT",QUOTlbIEN
D~FB~ ET LE TAUX RE5ULTANI ... D'AEMj
DANS. , LE LAit
.
DE VACI-IE
' , . .
" ,
.' ,., -DiAPRE5
,.,.f 'u.,' ,..•••.'"
.
" ' LÈS
"
' . ,
,_
DoNNEES EXPERIMENTALES PUBLIËES CM)
"e ·
'"
~
' . . .
••••
~.
'.'.t
..
;....
,
. '
'. • •""' ••• ·,·••..•. , . ·••. -.-'o._ •.•••.-.••·,··
~
~
~
~
",10'.'"
.'.

AFHi dans
le lai t
.. FI04 .
. ,
..,
·
01·
,
0,06
0,02
0,.
EXCRETioN.
ÎFwthW
"
' , " ' - j , - , - ' .
~,' ,...
DE
······û;' .",",.
L!
~.-., - \\....AFM"j.
t-
·'·.. ·""ç",,····....&6"!"· bANS
. >
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•• ,",
" ....., .•::. ..
LE LArt
··~i-·"'·~··.·· ..f·l••'<-DE
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.
VACt-IE

. APRESADMINlstRATlbN
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?M
lM'
b'UNE. D05t;..JJNIQU~J:3Q9, ...
....
NQJJ:'~~A~AtO-
....

15
AFIll dans. le lai t
(pg/mi)
riO, 5 :
0,2

,
0,08
0}06
0,04
0,02
0'01
,
--
0,008
0, 00
0.00
,
0·0
,
t,
,
0,001 B..-----.--.-·-~-3------4...........--5~ Jours
2
t l
Debut de
l'administration
EXCREtioN .DEI!AFt1:t;;;;;,b~!:>Ls.1Alt Dg
BRE1315 APRE5



,
' .
ADMINJ5TAATfON
• •


' .
' . .
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•••
..
"""
.·0
_oRALE
, .
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'
cY.UNEDQ.5,Ë"....UNIQUË "e.p~6f.~tQ~NES(1MG/K(j,
:360/ Cl ~.5t[~91._ 3.~loI?2,... 4°b92
.....,,! ft'"

MQtiiiii?
&ri
Me
UA
a.

i6
IiI-3 STÀBiLITE nE iiÀFLÂToxINE Mi DANS LÉ tAit ET tEs PRODUiTS
LAiTiERs ~
Les effets dè ia vàriàtion thermlqûë sur lè comportement de
liAfiàtoxine Mi sont résumés dàris le tâbléaü ci-dessous:
(
j
(
Auteurs
i
Type dé traiteméht
i
% de perte
)
(------------------:------------------ô--------------- :~--------~------t
( PURCHAS E' 1972
: Pasteurisation 62 C péndarit 3Ô mn:
33
)
(
')
°
)
(
(51
72 C pëndànt 45 sec
45
)
(------------------:------------------0---------------:---------~------t
(
Pastèuris~tion 63 C pêridarit 3Ufurt!
)
(
0
pas de pertë
)
(
77 e pendànt 16 sec
)
(
s'rOLOFF i 9 75
•- - - - - - - - - - - - - - - - - i:i - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - )
((53)'
. eongéiàtion (-18
C) âptès 120 j
45 % après un
)
ç
début dé dtmi- )
(
nution à partit)
(
du 68 e jour
)
(------------------:-----------------6----------------!------------~---)
(
eongéia. don <-:-ia C) âprès 120 j
87' % avec
ün
)
(
: début de dimi- )
( 1 9 7 3 '
: nution à partir)
MC KINNEY
.
(
: dù 68 e jour
)
( ( 41 )
:------------------o-----~---------:----------------)
(
Coriservatiori ~ 0 e peridirit 4-~ j: io %
)
{------------------:-----------------ë----------------:----------------)
(
KIElli"lEUER 1977
: eoniietvàtf.on à 5 e pendartt i~j j : ii - 25 %
)
(
(32)
)
(------------------:---~-------------------------~----:----------------)
~
0
POLZ,HOFER 1977
90 e pendant 3 - 30 firi
9 %
~
(
(48)
)
: ~
Iii-4 - TOXICITE DE L'AFLÀToxiNE Mi
t'Afiat@xine Ml est lé séüi métàboiitè hyclroxylé de l'Afla-
toxine Bi reconnùe toxiquè; Sa toxicité âigu~ âêtâit proche de céiie dë
iiÀflàtoxine Bl(50;60)mai~ avec1faiblé pouvoir ëàricérig~nè,(60) (t~Blêâu 4)
et mutagène (61) ~
~ . ;, '
z:
tes organes cibles sont iés m€mes
que céuX dé iiÀflatoxirté
L
~i. Chei ie~ truités; iiÀfiitoxihe Mi pro~oqtièriitùni d~g~riér~~cèn~i
cérorde ati ni~eaù dù foie; des nodtiies hypérplasiqties ~t des bé pàtomès(15).
/

TÀI3LËAU ,4 ••
(
")
)
( doses
espèce ânimaie
observàdons
)
( utilisées
uti Usée
(
)
(
)
(~--------------f----------i----------,)
, :
i toxicité
AFBl
12 pg/g.n~-:
carinetons de
~
aigCfe
mal:
pékin ag~s
lésions semblables
)
~ diaprès
:---------t------------i d'un j o ù r "
)
PURCHASE
.
(
AFMl
i6 ~i/anf- :
)
(
( 5 0 ) :
t
ma
~
:
t
(•.•..•••••.• : •••••.••• <•••••••••••• : ••••••• ~ ••••••••• •: •••••••••••••••••••••• )
(
toxicité
:
AFBi
;
25 pg/j
~
;
tùmeurS chez 9 rats)
(
c h r o n i q u e · ·
.
.
sur 9 après 53 sem- )
(
se Ion
;
aines
)
pendant:
(WOGAN
.
---
.
rat
:
)
(
. .
.
)
(
(60)
)
(
AFM1
5 jours
tumeurs chez un rat)
(
"
sur 29 après 160
)
(
semaines
)
(
)
tA13lEAU
~.
.
. •
COMPARATIF
- • . . -
, .
. . ' :
DE
. ,
. ,
,"
_ LA
' € "
·.'t.,....,....,1l-.1TOXIClfË
~I
" , .
, . - , " : , . .

0/'
.
-;. ....-"
DES
. . . . . .

~
\\~
AFB' Et M
iF'"
. 1,
," .,'. j

Comme pour liaflàtoxine Bi, il sembÎe exister une certaine relation
dose-réponse concernant Î'effet cancérigèrie chez Îa truite mâle; Îà
truite femelle donnant une réponse abberrànte. Mais, dans les deux cas,
L'aflatoxine Ml se montre moins cancérigène que Î'àfÎatoxine Bl(44} c.f.
tableau ci-dessous
(
)
(concentration
incidence tumoràle au niveau du foie chez les:
)
(
d'aflatoxine
)
i (pg/kg aliment ---------------------------------------------------- ~
(
mâles
feme lIes
)
(
.
)
(------------------;------------------------t----------------------------)
{
)
(
Mi
4
4/28 (14 io)
U/27 (48 io}
)
(
)
(
Ml
16
22n7 (81 io)
ii/14 (79 io)
)
(
Ml
32
24/25 (96 io)
13/14 (93 io)
)
(
~
(
Ml
64
2i/24 (88 %)
9/10 (90 %)
)
(
Bl
4
15/22 (68 %)
18/23 (78 io)
)
(
)
(
)
Hépatocancérogénicité de iiaflatoxine Mi pour Îa truite arc-en-ciei

111-5- ASPECTS LEGISLATiFS SUR LA TENEUR EN AFLATOXINE Ml DANS LE LAiT ET
LES PRODUiTS LAITIERS
Le lait et l~s produits iaitiers occJ~eht Urie place ~répundétarite aarts
la ratiori àilmentalre humaine et en particùiier irifariti1e ; cÎest poùt-
quoi des règiementations hationaieS et iriternàtloh~ies ont été éiabof6es;
permettant ainsi de préserver ia santé hUmàinè mais aussi- d'assainit les
échanges con@erciaUx;
III~5-i- Lois françaises
1976 ~ll).:
Teneur maximà1e d'aflatoxines (type non précisé) dans les aiiments
cli~tétiques et de régime dclienfance = 5 ~g/kg (5ppb) i
Aflatoxines dans les préparations de iactciséttim hyclrolyséei par
voie enzymatique; taJx maximal = 5 pg/kg (5ppb);
111-5-1-3- CommJnication de ia direction de la consommation et
,
"
jf)
,
.. '

~~-~~-~~p~~~~~~~-~~~-~~~~~~~.:_~~~;:!<:~_:§~~~~!_~~~~::~!P:~
Un arrêté en coJrs de pré~aration ftxetà là teneJr eh aflatoxine
,
"
~
Ml à
io ng/l00kaà.1 JUsqJ'ati 3i décembre 1982; ~tiis ce taux sera abàissé
à la demande des asse.1nblées dihygiène et de médednë il
4 hg/ioQ. Keai
à partit du iet janvier i983:
Valeurs énergétiques de qUelqJes iaits dû commerce
(6):
- Régilalt : isoo kj/1oo g ( :1 KJ :: 4;i8 cal.)
- Quick 1àit : 2090 KJ/ioo g
Lait demi~écrémé en poud~e
1840 Kj /ioo g
111-5-2- Lois américaines
La FDA iimite le taJx diAFMi à 0,5 pgii (0;5 pph) dans le' iàlt:
liquide(54) •

20
111-5-3- Lois suisses
Elles sont beaucoup plus ttgoure~ses et précises;
- Loi du 19 septembre i978 (58) :
taux 'r:i.mi tes : - 250 ng/kg (250 ppt) pour le fromage
- 50 hg/l (50 ppt) pout ~e lait
- la ng/kg (io ~pl) pour les aiimèht~
lac lés pout erifants.

21
1)
E U )(
1.
E
M
E
P A
R t l
R E F Ë R E NeE S B 1 B l 1 0-
G~APHIQUES SUR LA
DEr E C t ION
Ê t
L Ê DOs A-
i ,',
.

c
, .
"
" ,

C.
>',
•••• -
, " ,
, - . . .
"
, . ,
'"
~
c',
G EDE L A F.L A TOX 1 N E
M,

22
1- r N T R 0 D li C T iON
La chromatographie sur couche mince (CCM) est ia plus ancienne des
méthodes de dosage de iiAFMl en l'occurence ceiie de PoNS qui condnue
de faire l'objet de multipies améliorations. Àù coùrs de ces dernières
années, les méthodes de chromàtographie iiquide à haute performance(HPLC)
tendent Je plus en plus à lès supplanter ~ cau~e dé ièùt" ràpidit~; dè
ieur sensibilité et de leur spécificité. Toùtes cès méthodes ont en
commun des problèmes diextraction et de purification qùi font dièlies
des méthodes iongues et très couteuses, voiré peù sènsibles.
II- LES
MET H 0 DES
PAR
C C M
Tabieau 5 et 6
Toutes ces méthodes nécessitent un grând volume d'échantillon;
ce qui les rend inutilisables poùr des microdosages. Leur limite de
détection est élevée. Seule; la méthode de LAFONT sembie relativement
sensible mais très difficilement réalisablè:
III- LES
H ETH 0 DES :P A R
H P L è
Tableau 7
si la plupart d'entre elies ont réduit la iongueur de~ opéra-
tions, elles n'ont pu remédier à l'insuffisance de iâ sensibilité. En
plus, elles sont toutès confrontées au problème dé là maùvaise résolution
des pics d'AFMi.
IV- REM A R Q li E
Il existe des méthodes beaucoup plùs rapides dont la m~thode
de HOLADAY(30 } utilisant une mini-colonne téactivè: Malheureusement;
elle reste une simple méthode tapide de screéning à cause de sa iimite
de détection élevée: 0,2 pg/kg (0,2 ppb).

TABLE'AU 5' .... MET1~IODE5 CC M EXISTANTES
Agents précipitant
Solvant
Auteurs
Purification
Type de CCM
Limite de
des protéines
d'extraction
détec tion
Observations
Acétate de plomb
- Hexane + solu-
_. Necessi te une
+ hyflo-supercel
Acétone
tion salée (Nac 1)
1 dimension
0,1 - 0,2 pg/l
double filtration
PONS ,1973
ou célite 545
- colonne de
- liill ite de dé tec-
cellulose
tion élevée
(49)
Acétate de Plomb
0,1 pg/l (lait
_. nécessi té une
+ hYflo-superce~ou
liquide)
double filtration
STUBBLEFIELD,19 74
cé lite· 545
0,2 pg/Kg (froma-
- limite de· détec,..·
Acétone
1 dimension
NaC1. remp,lacé par
(Méthode de PONS
ge)
tion élevée.
+~oltitioft' eaturée
..
modifiée)
Hel
1 fIg/Kg (lait
desulfBte de so-·
poudre) .
dium'
(55)
visuelle : 0,02
- nécessite un
pg/Kg
grand volume;
TUINSTRA .1975
Sulfa.te de ca~m.ium
Chloroforme
Colonne de si li«:
2. dimensions
Densitométrie :
d'échantillon
.
4 ng/Kg
(60 ml) et un dé-
(59)
pot· de 50 pl.
Méthode AOAC 1.975
M E
T
H
0
D
E
D
E
S TUB
B
L
E
F
l
E.
L
D
(1 9 T
4 )
(4)
_. grand volume
GAUCH 1979'
Nac.l
d'échantillOn et·
(solution saturée)
Chloroforme
colonne de
densitométrie· :.
solvant
(27)
silice
2 dimensions
50 ppt·
~. dé lica t
1\\)
~

Of
'.
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......-1.~t··_~%···jO'" ~.' .'
. ".:"
r:"·'
TAI3LEAU 6: METHODES CC'M
SUITE
-
Agents précipi-
Solvant
Puri fica tion
Type de CCM
Limi te de
Auteurs
tant des protéi-
d'extraction
détec tion
Observation
nes
S'='U:BBLEFIELD,1979
NaCJ
(solution saturée)
Chloroforme
colonne silice
1 dimension
0,1 pg/kg
-
formation de
(O,lppb)
grumeaux surtout
(56)
,
avec le lait. en
poudr.e.
Méthode
AOAC 1980
M
E
T
H
0
D
E
D
E
S T II B
B
L
E
F
LE
L
D ( 1 9 7 4 )
(5)
- utilisation de de
colonnes donc ooB-
teux.
FUKAYAMA: 1980
Absorption sur
Mélange
colonne, de matrice
chlaroforme-
colonne de
1 dimension
0,3 ppb
_. grand vo lume: ~j
d'échantillon', '
.,bydrophilique
acétone
(9-1)
si lice
(26),
- l;i.mi te de- détec-'
,-
tion élevée,
Isopropanol +
Chloroforme
colonne d'alu-
-- grand vo lume
célite+
mine + silice
1 dimension
10 ng/Kg
d'échantillon
LAFOJ:.j-T\\ 1981
méthanol
(10 ppt)
- beaucoup de- sol-
vantS
(55)
-- laborieux,
1\\)
.:-,.

TABLEAU· 7' ~~ METl-\\ODE5 H PLC- EXISTANTES
Auteurs
Agent précipHdnt:
solvant
Purification
i Phase et 301-
ILimite de
des protéines
"d'extraction
,1
vant utilisés
détection
Observations
Passage direct sur colonne C 18 sep Pak puis
Méthode rapide mais li-
- phase inversé8
WINTERLIN
mite de détection éle-
(/-lC 18 Bondapak)
0,1 ppb
1979
extraction par Acetonitrile- - eau (30 - 70)
vée.
- Acétonitrile
Mauvaise séparation du
(62)
-eau (28 - 72).
pic Ml.
- sphérisorb
- double fil tra tion
-ons
- débit trop élevé
BEEEE
Méthode AOAC. 1975-.
- mélange acéto ..
0,3 ppb
(3,
2 ml/mn)
1980
nitrile-méthanol
- temps de rétention
(9 )
(3 -2)
20 i~ dans
élevé (20 mn)
l'eau
- limite de détection
élevée
- si lice
-limite de détection non
BLANC
Solvant ternaire
(eau-méthanol-
- nichlorométha
améliorée malgré l'uti-
1980
ch loro forme
colonne de
0,15 ppb
chloroforme)
ne-Mé thanol-eau
lisation d'une cuve rem-
silice
(96-3,6-0,4)
plie de silice (augmente
(10)
la sensibilité).
- Pas d' amé liora tion de'
- phase inverséei
cartouche de
FREMY·
. - - ~~
la sensibilité
--.
lichrosorb RP
si lice sep
18
1 0,1 ppb
1981
Hyflo-supercel
chloroforme
~. forte odeur d~ CHCL3
pak
- Mauvaise résolution du
- Acétonitrile-
(25)
pic Ml
eau(28-72)
Acétate de plomb
- phase inversée
- Pas d'amélioration
+ hyflosupercel ou
RP 18 muni d'unel
de la sensibilité
0,1 ppb
- Mauvaise résolution
GREGORY:
célite545
précolonne de
-
,
Acétone
colonne de
si lice
1981
+-sulfàte· d'ammo-
si lice
'- eau-acétonitri
nium
(28) ,.
le-méthanol
(66-25,2-8,8)
1\\)
V1

26
T
R O I
S I
É
ME
fi
A R t . 1
E:
T R A V A U X
PERS 0 N N ~ LS:
b () s AGE
DÊ L A FLA fOX 1N E·M:
DAN s L ELA 1t Ef lES li RO ~
OUltS LAÎTÎERS

i - C H 0 l X Di Ü N E MET H 0 Dot 0 G t E
Lors de ia mis~ üU ~oint djun~ ~~thode diinaiys~, on est idûvènt
confront~ à piUsietirs ~ossibiiités !
soit ~roc~der à une rlétectiort visueile; rapide et peU onéreuse
(Exempie CCM);
- soit utiliser des techniques de dosag~ précises, tr~s sensibies
mais iongues et cooteuses.
Dans ie câs d~ iiÀfiatoxine Ml dans le lait; ces deux types de
méthodes ne semblerit pas se diff~rencier au riiveàU de ia sensibiiité ni
celui
de l~ durée de~ opérations. Des detii c~~é~1 ii se pose ie problème
fondamental de liextractfori et de ia pUriffcàtiori d~ iiAfÎatoxinê Ml;
Notr~ expérimentation portera beaucoUp pius sûr lès méthodes
HPLC que 'sur les CCM. Ce choix comporterâ trois
~tàpes essentielles :
~ caractérisatiori dû pic d iÀFMl eri HPLC,
- détermination de ia ii~ite de détection;
détermiriatiori dû rendement diextràctiori:
I-i- CÀRÀCTERisATION bu pic DiÀFMl
Le~ conditioris diânâiyses é~~rit recipiies, ii suffit de d~tèrminir
diabord les pics dOs àu solvant pûr puis ceux dû même soivant coritenant
l'AFMi. La confirmation se fait pat comparaison des temps de rétenticin des
pics oU mieux encore par i'utiiisatiori de dilUtion croissarite dé la soiü-
tion d'AFMi; la surfac~ des pics diÀFMi diminuant ën m~mé temps qUe sa terieUr
dans ie soivant. Ori ~eut aussi réàiiser uri àjout : Une qùantit~ comnuë
d'Af}li est ajoutée à ùne soiùtion d'AtM1 de concentratiori
déterminéë. Ori
obtient alors liri pic unique dont la surfâce èst augmentée (iiaûgméntàtion tiéi
compte des ~hénomènes dediiùtion).

· ,
, !
28
1-2- LIMITÈ DE SENSiBILITE (Limite de détection)
Eiie détermine là concentration ia piùs faible d'ÀFMi détectable
en HPiC. Il sùffit pour ceia diinJecter des dilutions croissaritës de so-
iution dÎÀFMl. cette,iimite de détection doit ~trè égaie à 5 fois ie
bni:Li: de forid;
i-3- PoURCENTAGE biEXTRACTION oU RENDEMENT
Ii permet diévaiùèr les pertes âù cours de iÎopératiOri afin de
définir un facteùr dé correction pour le résuitàt final. Le rendement
dÎune méthode doit ~tre ie pius reprodùctible it ie ~i~s éievé ~~j~tbie.
Pour le déterminer; ii sUffit de procéder à dêâ àjouts dosés.
II - LES
MET H 0 DES
PAR
C C M
Plusieurs étûdes ont déjà été consacrées à iiétude comparative
des différentes méthodes de CCM et :ti en résulté diâprès FUKAYAMÀ: (26)
quÎil niy a pas de différence fondamentalè au hiveàû du rendemerit mais
au niveau du tèmpadëmanipùia:tion (tabieau ci-dessous). FREMY.(24)de son
c6té souiigne que ià technique de caM ëst pius où moiri~ fidèiè à ia limi-
te de détection de 0;1 ppb.
Etude comparative effectuée par FUKAYÀMA sur un échantilion de
0,1 ppb :
(
Dûrée de
)
(Méthodes
Rendemènt
iiàriaiyse/écbàrttii- )
~---------------------
(
ÀOAC i975
------=~-~---------- ----=~~-~~~~~~~------------- ~)
~--~~==:~~~-~==~~~~=~~
~ TUINSTRA i975
----~~~~-~-~~~------
85;6 ~ 12;1
-----~-~-=~-=-=-~------------~
3 H
- 3 il 30
~
(--------------------- ~-------------------:------------------~--~-------)
~ ::JTUBBLEFIELÏl i 979
86;3 + 8
2 il
~
(--------------------- -------------------- ~--~~---------------~:_:_----)
~ F'UK.AYAMA 1981
80;5 ~ .5,9
2 il
~
(
)
. ' l '
}.,

29
Expérience personnelle
Pour hotte parti nous noUs sommës contentés de la comparâison
des soivants. Notre iimite de détection la pius 6âsse (tableaU ci-dessous)
a été obtenuè avec le solvant de LAF'owr'(3sH 2 ng diÀFiü standai-d.
Résuitats obtenUs âvec les solwihts clê .LAFONT et STUBBLEFIELD:
(
)
( Fiuorescence en
Tèheur en AFMi staridârcl pour un dépot dè 20 pi
)
(
:---~-----:---------t-~~-~-----;--~-----;-------t-~--)
( uv 365 nm
: 0,1 ng
: 0,2 ng
:
0;5 hg
:
1 ng
:
2 rig : 5hg)
(-------------------:---------~---------~----~----~:-- ------:-------:----)
(
: : : :
~".)
(
Avant. mignii:ion
0
+
+ ; ,
+
: -t+
i+++ )
(
;
~
;
~
: )
( ------------------:---------:---------:----------:--------:-------:----)
( :
: : : : :
)
(
A
0
0
ci
0
+
+ )
( Après
)
(
. :
"
,
)
(
:----------~---------:---------:----------:--------:-- -----:----)
( inigra-
)
( tion
B O O
0
0
+
++ )
(
)
(
)
(
)
(
)
.
" " f
,
Légendes
À
sol vant recommànciJ pàr STUBBl,EFIED et utilisé par
. .i:."
.;0. . . . .
PONS(49) :
isopropanol- acétone - chloroforme
S
10
85
B
soivànt de tAFONT ;:
.
.
Ether Etbylique
èpicbi6rydrine - Héthàhbi - eaU
~;
90
6
j
i
o
pas de f1üorescence
+ fiUotescence doUteUse
+ : faibie f1uorescehce
++ : neHe fiuorescérice
.,
+++ : Fiuorescence ihtense
Remarque
1ri fiuorescenèe qUe noUs avoris observée était piüg
bleUe que vioiette,
cetté dêrrliète ayant été préconi-
sée par DE iONCE (22) i
., >

~o
III - C H ROM AT 0 G R A PHi E
L l Q,U iDE
A H A li TEP E R-
FOR MAN C E
A V E C
D ETE C;~ IoN
F L U 0 R l MET R i QUE i
111-1- RAPPEL DE LA TECHNIQUE HPLC
LiHPLC est une variàble des méthodes dé chromatographie
(Séparation des ~iéments d'un méiange en solütion pér migré~ion s~r ~n
support). Eile se caractérise par son éiüànt envoy~ so~s pression dans
ia colonne, cette dernière ~tant rempii~ diUne phase ~tattonnaire de tine
granulométrie. L~ phase stationnaire peut être modifiée ou non suivant
le
type èe rétention quÎelle fournit.
IIl-l-i- PRINCIPE
Une faible quantité de i'échantilion est lnject~e au sommet
d'une cotonne. La séparation des différents constituants de iiéchantilion
s'effectue dans la colonne grâce À. lienvoi sous pression diun soiv",nt
d'élution. La détecHon se réalise grâce à ta transformation de l"émission
d'une
fluorescence en un signai électr:iquecap~é au niveau d'un enregistreur
111-1-2- Stb~m8 général
figure 6
Il permet iienvoi de ia phase mobile dans ia 'phase stationnaire
(colonne). Le débit du solvant doit ~tre précis et constant dans ie
temps car il
conditionne ie temps de rétehtion des pics.
Pour notre étude, nous
avons udHsé ië modèle Kontroh : LC PÜIDp
4io dont la pression varie entre 0 et 400 bar~ avec Un
d~bit àilant de
o ,L .1 9, 9 ml lm n •
Elie conditionne la reproductibilité et ia fiabiiité de la mé-
thone. Piusieurs systèmes diinjection étant possihies; nous avons opté
pour une vanne à boucie type Rhéodyne di~n voiume de 20 pt. La vanne est'

~l
munie d'un levier sur iequel on applique un mouvement de va et vient
permettant d'in ject et iiéchantilion dans le doivant i
Sous le nom de colonne, on désigne habit~el1ement le contenant
(acier inoxydable) et le contenu (phase stadoima:Î.re).
Selon la nature de la phase, les constituants d'un même échantillon
pcu~cnt se séperer différemment.
Nature de
la phase stationnaire
Elle pennet (le distingller deux types d'HPLC
- HPLC
en phase normale
La phase stationnaire est polaire; ie solvant apolaire et le soluté
polaire.
tlPLC en phase inverse
Il s'agit diune modification dè la phase normale par greffage
d'une chafne hydtocarbonnée pour ia rendre ipol~ire. c'est iiinverse
de la précédente.
Dans le cadre de notre étude;
nous
avons
utilisé une colonne aux
caractéristiques suivantes
colonné
longueur
15 cm
diamètre intérieur c4;5 mm environ
fd Hé mé ta i lique de i - 2 pm
• Phase stationnaire :
iichrosorb RP ie (~hase inve~se) Type Metck
Granulométrie : 5 pm
Fonction greffée : chàtnê hydrocarbonriée en C 18

32
, '
iii-1-2-4- Solvant
' h
Son choix est fonctiori de là poiarité de ia phâse stationnaire
et de l'échantiilon; Ii doit ~tre pur et hori corrosif pour la phase
stationnaire. En cas de méiànge; il est important de respecter rigoureusement
les proportions dès différents réactifs afih diêvitèr ia modificàtion de
la polarité dont la vàriation se répercute sûr le temps de réterition~
Le débit du soivàht doit toujour~ ~tre ~bnsta~t dans ie temps~
Un dégazage parfait du solvant est riécessaire pour éviter des buiies d'àir
dans ià colorine.
Pour notre étude; nous àvons Utilisé uri mélange Acétonitrilé
méthanoi-eau (20 - 5 - 15) avec un débit de i mi/mn - les raisons de ce
choix seront expiiquées ultêrieûrement.
Tout système de détection doit perturber au minimum la sépàra-
tion effectuée sur ia coiorine. La celiule utilisée doit donc ~tre de
très faible volume (environ io pl).
Caràctéristiqùes d'ùn détecteur
- sensibilité où seuii de détection
On peut ià définir comme étant ûn signai égaie à 5 fois
le bruit de fond.
- bruit de fond
Il dépend de ia stabiiité dë Îâ pàrtié éiectroniquè dû
détecteur et des variations dû débit ët de là tempérâture de
ià phase mobile.
~~--_.
,.,,

- la linéarité
La réponse du détecteur varie linéairement avec la concen-_
tration dans des limites ~ ne pRS depasser.
Nous avons utilisé pour notre étude un détecteur spectro-
fluorimétrique Kontron.
111-1-3- La spectrofluorimétrie
111-1-3-1- ~~pp~!~_~~~_!~_!!~~~~~~~~~~:
La fluorescence est en général une émission de radiations
par un composé SOllS l'influence d'une radiation excitatrice déterminée.
Sous l'effet de la radiation excitatrice, l'électron (élec-
tron optique) d'une orbite d'un certain niveau énergétique (état fonda-
mental) passe à une orbite d'un niveau supérieur (état eicité). C'est
le retour de cet électron à son niveau énergétique de départ qui pro-
voque la fluorescence.
~~
Etat excité
J~
Abso rption
Fluo rescence
\\f
V
Etat
fondamental

111-1-3-2- ~~p~~~_p~~~!q~~_~~_~p~~~~~!!~~~!~~~~~~~~~~:~~)
La traversée de la solution à doser par une lumière mono-
chromatique entraine une fluorescence qui se traduit par un signal
électrique capté sur un enregistreur. Le rayonnement fluorescent est
émis dans toutes les directions. Une fraction déterminée de ce rayonne-
ment est recueillie selon un axe faisant un angle droit avec la lumière
excitatrice, la source de cette dernière étant une lampe au Xénon à
spectre continu (200 à 800 nm)Fig.7

55
FIG.6 :
levier d' injec tian

-+-_vanne cl' injec tian
bouc le 20 Id
serin8ue
colonne
t
pompe
réservoir de
solvélnt
récupéréltion du
solvant
~ enregistreur
1
1
i1
1
1
<
intégrélteur
5CI-IEMA GENE.RAL DE LJliPLC A
DETECTION FLUORIMETRIQUE
-.~KONTRON •.
- DM


;6
.

PRINCIPE DU 5PECTRO-
FLUORIMETRE KON _ _.
.xe
TRON
--- · =• ...
~L1
&wWw
TRAJET OPTIQUE
L3
\\L-_ _-----rv--------lt----E
C
53 LS
L4
Xe
Lamp@ aU xenon
L1.L2.L3.L4.LS L<?nhlles convergente.s
:>1.:>2. 53.54
Fentes
M
Miroir.
V, .02
Monochromateur.s
C
cellule
PM
photomu1tlplicateur~

;1
111-2- DOSAGE DE L'AFMl en HPLC PHASE INVERSEE A DETECTION FLUORIMETRIQUE
TECHNIQUES D"EXTRACTION ET DE PUiUFICATION :
111-2-1- Introduction
Nous avons remarqué au COurs de notre bref rappel, qu'aucune des
méthodes préconisées simples et rapides niest parvenue à résoudre le pro-
blème de la sensibilité et surtout de la résolution du pic AFM1. Au cours
de ce travail, nous t~cherons d'atteindre quatre objectifs essentiels
qui ont plus ou moins fait défaut aux méthodes de chromatographie liquide
haute performance déjà existantes
- Diminuer le temps d'analyse en éliminant ln purification ~ur
colonne chromatographique.
- Réduire le coût de l'analyse gr~ce à la diminution de la
quantité de solvants.
- Améliorer 18 sensibilité.
- Améliorer la résolution du pic d'AFM1.
111-7.-2- Essais préliminaires
Des tn'tV2.ux anterieurs réalisés au labor~.toj!re par B. D'ARGENTRE (21)
av~jent permis d'6tudier les cartouches de purification en prenan~ comme
hase la mcthode de WIN1~RLIN(62)utilisant une cartouche C
sep pak.
18
111-2-2-1- Extraction et purification de l'Afl11 sur cartouche C 18
~~p=~~~-----~------------------------------------------
Mode opératoire :
Prélavage de la cartouche par 5 ml eau puis 5 ml
acé toni tri le.
- Echantillon (10 ml lait + 25 ml eau) transféré
sur la cartouche"

)8
- Lavage avec 5 ml eau puis avec 20 ml acétonitrile à 10 %
dans l'eau.
- Elu tion de l' AFM1 par 4 ml acé toni tri le 30 70 dans l'eau.
- Injection
de l'éluat en HPLC aux conditions suivantes
• colonne
Lichrosorb RP 18, 5 pm
• solvant
acétonitrile 28 % dans l'eau
• spectrofluorimètre
AExitation = 365 nm
r
~
f\\.Emission.= filtre cut
off".
(>385nm)
Au cours des essais préliminaires effectués sur l'AFM1 dans l'eau,
il a été démontré que l'injection telle qu'elle de l'éluat (4 ml acétoni-
trile) ne permettait pa~ la détection de faible teneur d'Aflatoxine. Il
faut donc le concentrer, or l'Acétonitrile n'étant pas très fa~ile ~ évarnr~r,
i l a été rem!,la~é par le méthanol (jui est évaporé et repris par 200)11 de CP
r:!~mp sol v8.nt.
Des pertes ont été démontrées au niveau du lavage à l'acétonitrile
8 10 % dans l'eau. Il a donc fallu éliminer cette étape.
L'éluat méthanolique obtenu après omission du stade de lavage à
l'acétonitrile 10 % donne un chromatogramme où le pic d'AFM1 est masqué
par les pics d'impuretés. Ce résultat n'est pas modifié lorsqu'on rem-
place le méthanol par l'Acétonitrile à 30 %. DONC LA PERSISTANCE DES PICS
D'IMPURETES EST CERTAlNEHENT DUE AL' OHISSION DE LA PHASE DE LAVAGE A
L'ACETONITRlLE 10 %. Fig 8
En réincorporant l'acétonitrile dans le protocole mais seulement
à 5 % au lieu
de
10 %,
on s'aperçoit que non seulement il n'élue pas
l'Aflatoxine mais il n'élimine pas nOn plus les impuretés: LES LAVAGES
PARAISSENT DONC INEFFICACES POUR ELUER tES IMPURETES DU LAIT SANS ELUER
L'AFLATOXlNE.Fig 9 .

Applica tian de la mé thode de FREMY (25)
Il s'agit ici d'une cartouche de silice sep pak (phase normale).
Aprp.s extraction, le fiitrat est concentré puis transféré sur
la cartouche. Le lavage s'effectue avec de l'hexane (2ml) puis de l'ether
(2ml) avant l' é lution de l' AFMI par 3 lml de ch loroforme -
méthanol (9 + 1) .
Dans un premtér temps, la cartouche a été remplacée par une
pe U te co Ion ne de si 1 ice fabriquée pélY nos 80in3 (pipett.e pasteur + léline dp
verre + silice). Une solution chlorofonnique d'AFMl est transférée sur
la colonne et traitée selon le mode opératoire. Après injection en HPLC
rien n'a pu €tre
détecté, ni dans les deux solvants de lavage, ni dans
le solvant d'éluti6n : L'AFI'l1 N'A PAS ETE
RETENUE.
L'utilisation de véritahle cartouche de silice sep pak donne le
mê,~e résultat.
Les résult3ts obtenus avec ces systèmes d'extraction et de puri-
fication n'ayant pas été satisfaisants, il a fallu envisager d'autres
modi ficat jans.
111-2-2-3- Modification du solvant d'é1ution HPLC
B. D' AHG~;NTHE (21) a utiJ.isé le solvant de WINTERL1N (Acét.onHiïle 28 %
dans l'eau) mais il n'a pas été possible de séparer le pic
d'AFMI des
pj~s d'impllretés d'J lait, Il a donc fallu modifier la teneur en acétonitri-
le comme suit
- Acétonitrile 20 % dans l'eau avec un débit de 1 ml/mn
Le temps de rétention de l'AFM1 est très long
supérieur à
20 mn. Donc inutilisable.
- Acétonitrile 27 %
1 ml/mn
Amélioration insuffisante par rapport au solvant initial.

40
- Acétonitrlle 26 % 1 ml/mn
Le pic d'AFMl se sépare de ceux des impuretés du lait
mais le retour à la ligne de base reste mauvais.
- Acétonitrile 25 % 1 ml/mn
Il
permet une séparation acceptable du pic d'AFM1.
(:Pig 10)
1II-2-2-4~ Discussion
Si l'utilisation des cartouches de
purification n'a pu permettre
les résultats escomptés, c'est parceque l'extraction directe de l'Afla-
toxine par les solvants appropriés (méthanol, acétonitrile, chloroforme
etc ... ) n'est sans doute pas l~ bonne méthode d'autant plus qua le lait est
très riche en protéines et en lipides. Il f~udrait donc procéder autre-
ment en précipitant par exemple davanb.ge les pratp.ines du L:d t ou en uti U"':"
S2.nt
1):1
système de oelipidél tian.

HPLC:
Lichrosorb RP 18; 5 pm
Acetonitriie-eau
28
72
lm1/mn
sppctrnf]uorim~tre:
-ÂEx.: 365 hm
_AEm.: FÜtreiiCut ofi
(>3 8 5 nm)
Echantillon de lait
AFMl standard 100 pg/m1
ËxtRAC.TION,.. ~.5ANs LAVAGE"j~ .LACËTO,~
NITRILE 10~/b \\

42
FIG 9 t
.ll" •
.>fl·,
1
;
__ flo
HPte: -
Lichrosorb RP 18; 5 pm
Àcetonltriiè-eau ( 28- 72 )
i ml/ mn
Spectrofluorimètre:
).Ex.: 365nm"
;'Em.: Filtre"cut off"
(>385 nm)
Echantiiion de lait
ÂFMi standarà 100 pg/ml
EXTRACTiON. ÂPRES LAVAGE AL ACEfaNI ~.
TRILE 5%
.ET .PASSAOE ... SUR.. UNE.SECO.NDE
CARTOUCHE

HPLC:
Lichrosorb RP lB; 5 pm
Àcetonitriie-eau ( 25 - 75 )
i ml/ mn
speetrofluorlmètre!
AEx.: 365 nm
1 E
'
. '
I l '
Il
1\\
m.: Filtre eut off
(>385 nm)
ÂFMi
SOLVÀNT.l' MODIFI
' ' ' .
,
Ë
, : ,
::~ ACETÔNlrRILE
. '
,
.
' • • '
·,'·1· ..·..... .,,\\ . •~ . .( ~'"
."
.. ' . ,•...,":.-' .. /_ 2Sd
•..•.;
10
~""",.~" ... ,

44
111-2-3- METHODES b'EXTRÀCTION BASEES SUR LA PRECIPiTATION DES
PROTEINES DU LÂIT :
EXPERiENCES PERSONNELLES
Là plUpart des méthodes bibiiogrâpbiques(CCM,HPLC)ont utiiisé des
agents prédpitahi:s dont iiâcétate de piomb, ië suÜaté dè cadmium; lê
méthanoL
L'application rigoUreuse du protocole origlhài nécessli:~ht un
travaii iabort~ux, iong et codteux, noUs ~siàiètoh' dè râccourcit iè~
opérations afin de répondre à notre objeci:if.
a) précipitation directe
ioo mi iait + ib g hyfiosupercel oü céiii:e 545
+ 300 mi àcétone
+ 20 mi solution d'acétate dé plomb
On obtient un filtrat de coJleUr jaun~tre.
Fiitràt + 100 mi Bexànè pû1.§ àgitation à l'aide d'un mixeur.
Oh obtient unè solution ~isqUèuse ressembiant ~ du i~it !
IL EST IMPOSSIBLE DE SEPARER LÀ PHASE HEXANIQUE.
b) Appiication intégrale de ià méthode de PONS
100 mi làit
+ io g hyflosUpercei ou céiite 545
+ 300 mi acétonè
Agitâi:ion puis filtration
Prendre 275 ml
du filtrât
Àjouter 200 cii eàU clistiiiéê pull 20~i idiui:tori diicétitè
dè piomb~

45
Agiter, laisser fiocuier 5 mn.
Ajouter io g Hyflosupercei ou céiite
Mélanger; fiitrer.
On obtient un filtrat iimpide mais il n'y a pas eu de
vraie précipitation, ie résidu sur ie fiitre n'étarit COns-
titué que par de la célite ou hyfiosupercei.
Le iavage par i'hexarie n'entrarne pas diémuision maigré
iiagitation à liaide du mixeùr.
Remarque:
Ii est donc indispensabi~ diutiliser la procédure de
1:.1
PONS dans son intégralité (doubie filtration) malheureusement;
cela aiionge ie
temps d'extraction et nécessite beaucoup de
réactifs, donc coGteux.
Le m€me
résultat est obtenu avec les méthodes de
STUIJi3LEFIELD( 55)e t de GREGORY (28) .
III-2-3-1-2- Pré~ip2:..ta.!:.io;!. a~ s~lf~te_de_cadmi.:::m_: méthod!. d!.
TUINSTRA(59)
60 mi lait chauffé 15 mn dans l'eau bouiilante
+ 15 mi eau distiiiée
+ ib ml soiution de sulfate de càdmium 1d %
Mélanger, centrifuger.
Filtrer 100 ml dri surnageant sur pàpier fiitre; oh obtient un
filtrat Jàunitre~
Liàddition de iihexane donne un iiquide p~teux biancbttre ressem-
blant à celui obtenu avec l'acétàte de piomb~
IL EST ~IPOSSIBLE DE SEPARER LÀ PHASE HEXÂNIQUE.
L'application intégrale de la procédure de TlJINSTHA (omission
du lavage à 11 hexane) donne une masse graisseuse ou protéique'
à l'interface chloroforme-eau.

46
IiI-2-3-1-3- Précipitation au méthanol :
Elie niest pas plus efficace que les m~tbodes précédentes. ià
précipitation obtenue est faibie et donne un fiitràt opaiescent entraf-
nant une émulsion difficile ~ casser iors du lavage à ljhexane~
III-~3{-4- Vérification de ia pureté des extraits obtenus
Pour éviter l'émulsion provoqUée par le
lavage à i'bexâne, nous
avons pratiqué une double fiitration comme le préconisent les méthodes de
PONS , STUBBLEFIELD, et GREGORY. Les extraits chloroformiques obtenus ont
été évaporés puis repris par le méthanol pour €tre
injectés en HP1JC dans
les conditions suivantes
- colonne iichrosorb
RP 18; 5 pm
- solvant: acétonitrile 25 % i ml/mn
- spectrofluorimètre :
Aexcitation 365 nm
Aémission = Fil tre "eut off" (>385 nm)
Le chromatogramme obtenu montre une saturation de la colonne.Il::est
semblable à celui de ia fig 8. Ii sera aussi indiqué uiterieuremerit.
Le pic d'aflatoxine Mi est masqué par les impuretés du lait~ ii
se pose donc le problème de purification.
Les auteurs préconisent une purification sur coionne
chromato-
graphique, ce qui ailonge ia durée de i'opération et augmente le coat de
l'analyse.
IL FAUT DONC ESSAYER D'M1ELIORER LES METHODES DE PRECIPITATION
111-2-4- MŒLIORATION DE LA PRECIPITATioN DES PROTEINES DU LAiT
Des études biochimiques (38) ont ~oritré que ies sels neutres en
particulier les sels d'ions divàlents (Mg C1 2 ou (NH4)2S04) diminuent la
solubilité des protéines lorsqu'iis sont en concentration éievée dans le
milieu (force ionique augmentée); Lorsque cette force ionique est suffi-
samment élevée, la protéine peut €tre
presque complètement précipitéé :
c'est l'effet du reiargage ou " sa lting outil par oppositiion au iisalHrig in"
(dissoiution des protéines: cas de basse force tonique);

47
Ex
solubilité de
la
catbonyl hémoglobine:
0/6
Force ioniquE
1
2
( A. )
Effet diun sel neutre (K S0 ) stir la solubilité de la carbonyi
2
4
hémoglobine à son pH isoélectrique:
A basse force ionique,
la solubilité de la protéine
augmente (salting in).
A concentration en sels élevée, la solubilité de la
protéine diminue (salting out ou relargage) ~
En biochimie le sulfate diammonium est ùHUsé préférentiellement
pour le rclargage à cause de sa bonne soitibilité dans l'eau et de sa force
ionique élevée ()8) or son lÎ tiiisa tion dans ia technique de GREGORY (28)
n'a apporté aucune amélioràtion. Nous avons donc pensé utiliser lÎn agent
précipitant différent.
rlr-2-4-1-i- Le sulfate de zinc
ciest Ull sel neutre d'ion divaient clone
utilisable
en
principe d~ns le phénomène de relargage.

48
Pr~paration de la solution de sulfate de zinc !
Sulfate de zinc
.
crlstaI l ' '
Ise ('a 7 mo l 'ecu l es d ' )
eau
>pr'1 i::i 287
soit 28,7 g/lOO ml dÎeau. Mais nous avons uÜÜsé en définitive,
28 g pour 100 ml d'eau.
Expérience
- 1.0 ml lait + Ü; ml ea1l distillée
AdditioG de volumes croissants de solution de sultà~è de zinc
dans chaque échantillon.
Après agitation, on observe des préciptt~tions dans chaque
flacon. Ces précipit,1dons sont appàremment différentes -et leur
intensité semble proportionnelle ad volume de la solution de sulfate
de zinc a.10utée. Toutes ce-s précipitat:COTIS S'esont iéalisées au pH 4-5.
L'addition de lÎhexane au filttat provoque une émulsion difficile
à casser après cgitation à l'aide diun mixeur.
DONC I~ PRECIPITATION PAR LE SULFATE DE ZINC SEUL EST INSUF-
FISANTE MALGRE SON INTENSITE PLUS FORTE QÙE CELLE DES AGENTS PRECIPITANTS
DEJA ETUDIES. IL FAUT ALORS POURSUIVRE LA TENTATIVE DÎ N1ELIORATION.
III-2-4-1-2- Action combinée du sulfate de zinc et de la soude
.
Il semble que la plupart des prot~iries aièni ieur solubiiité
)
diminuée à leur point isoélectrique.
E~ : la ft globuline qui est une protéine du iait en présence de
NaGl a une solubilité minimaie au pH 5,2 - 5;3 (38) •
Nous avons alors tenté de jouer sur le pH du milieu en prena.nt comme
base la. technique classique de défécation utilisée dans le dosage de l'urée
sanl;uine et de la glycemie (7). Cette technique préconisait 1; emploi de
solu tians de suIfa te de zinc à lct% et de soude à 22 %, mais nous avons
modifié ces proportions pour répondre à la logique .del'équation suivante
znSo4-4- 2 NaOH

ZnS0
à 7 mol. d'eau ---'~j. FM ::: 287
4
_ _ _ _~~FM == 2 X 40
2 NaOH
Pour 100 ml il faut donc 8 g de soude en pastilles.
Les solutions finale~'sont les suivantes
solution de sulfate de zinc 28 % dans li eau
solution de soude 8 %dans l'eau
La détermination des proportions à utiliser nia pas été facile:
A volume ég~l, ces deux réactifs niappo~tent aucune amélioration.
Nons avons alors procédé par tatonnement ; et seule l'addition
de solution de sulfate de zinc (7 ml) et de solution de soude
(4 ml) a permis une plus forte précipitation (pH =4-5) et une
élimination des' risques d'émulsion lorsdù--iavage à l' hexane.
Cette méthode prometteuse doit maintenant être vérifiée.
III-2-4-1-3- VérificAtion de cette nouveiie technique de
préci pi ta tion
Après extrac tion de l'AFMI par cette méthode J i ' extrai t obtenu
doit être injecté en HPLC pour comparer le chromatogramme avec ceux des
H18t:lodes déjà étudiées.
io ml iait + 50 ng AFMi + i5 mi eaU
+ 7 ml soiùtion sulfate de zinc
+ 4 mi solution NaOH
Filtrai: iavé à iihexane (2 X 50 mi)
La phase hex~niqUe est élt~in~e.
l'AFMl est élué~ par 3 X 50 ~i de chioroforme (préférée au
méthé1nol parcequ i ii niest pas miscible à i r eau et Ü est faciiem~nt
évaporable);
Les phases ohleTb~o~œiques sont recùèiliies séparémment.
Après concentràtion et évaporation à sec; chaque fraction
est reprise par ioo pl de Méthanoi et injectée en HPLC dans les
mêmes condi tions que précédemment.
Résuitats
On obtient un chromatogràmme compàrabié à celui des èxtraits
purifiés sur cartouche C 18 sep ~~k, tf;fi~ io.page 4, .
.---.._'..-,~-

50
Les deux premières fractions contiennent iiAflàtoxine
Ml; lB troisième ne contenant pratiquement rien.
ON ARRIVE A AVOIR UN RESULTÀT ENCOuRAGEÀNT SANS
PURIFICÀTION SUR CARTOUCHE~
111-2-4-1-4-
Choix du volume de liéchantiiiori
Nous voUlons obtenir urie iimite de d~~~ction dienviron io p~t
donc io mi de lait devront contenir o,i fig d'ÀFMi •
.. ~--
0,1 hg d'Àflii ajoutée à ià mi cië
iid.t,""hTa pU €tre
détectée
après extraction bien que lès 3 phases chioroformiques aient été réUnies.
Nous avons donc doubié le volume de liéchantiilon de m€me
que
ceux des agents précipitàrits, les voiumes ci'hexàne èt de chloroforme niont
pas été modifiés. A~rès extraction, on obtient effectivement un pic ciiAFMi.
Remarque
Un trop grand voiume diéchantillon est difficilement maniable et
pose ie,pro6lème de purification.
ÎII-2-4-t-5- Etude du rendement d'extraction
20 ml lait + i ng AF~l
Lors du lavage du filtrat par iihexarie (2 ~ 50 ml) ià phàs~
hexaniqùè (supérieure) a été éliminée par écouiement àprès récupération
de là phase aqueuse :
Le rendement obtènu se situàit ehttê
50 et 60 %
CETTE
TECIiNIQUE PROVOQUE DONC DES PERTES IMPORTÂNTES.
Nous avOns alors précédé à ii~limiriâtiori de cètte phàse Hexaniqùe
sous trompe à vide; on évite ainsi i'écoUiemerit~ Les essais effectu~s
sur 4 échantiilons dans
ces conditions donnent tin rendement moyen de 81 %
ce qui sembie assez.satisfaisànt~ Ii se pose cependant ie probi~mé dé iâ
résolution insuffisante dû ~ic diÀFMi et dë ia saturatiori fréquenté dé ia
coionné.

51
11t-2-4-1-6- Description détâiiiéè de iâ présente métbodé
,
1
."

-d i"ë"xtractio~ -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Cette méthode est d'autant phÊ irit:érëssânte qüieiie nous sembiè
faciie; ~oins iongu~ (omission de la phdsê d~ pUrlficètiOri sUr c~ionh~
cbromatographique ou eartôûche). Contrairement aUx méthodes préexistarités,
elle associe donc à ia fois L'EXTRÀCT10N ET LÀ pukiFlcÀTioN; Eil~
èst
applicable à toUs ies produits iàitiers hormis là petite différènc~ aü
niveau de la préparàtion de liéchantiiion~
a) principe
Les protéines du lait oU produits laitiers sorit pré-
cipitées par le sUifate de zinc en présence de soude (Zn (OH)2).
Le filtrat ciair et iimpide obtenu est lavé à iihexane et iiÂFMi
est éluée par le chloroforme. i'éluat concentré et évaporé à
sec est repris par ie méthanol pour €tre
passé en HPLC phase
inversée (Licrosorb RP 18, ?pm) à detectlon fiuorimétriqùé
(Excitation 365 nrn, Emission 415 nm rempiacee par un filtre
"eut off" :A> )85 run).
b) Matériel et réactif utilisés
- Erlen à bouchon rodé
- ampoule à décanter 250 à 500 mi
bailon rodé 250 -mi
- broyeur (mixeur) : iiA cx
~ évaporateur rotatif
papier Whàtman nO i
Produits et réactifs
- sulfate de sodium anhydre
- solution clestilfate de Zinc (Merck)
28 g daris
ioo mi d'eau
- solution d'hydroxyde de sodium (Proiabo)
8 g
. "
, "
.'
,
dans 100 ml dieau
- hexane (Proiabo)
- chioroforme (Amiiabo)
- méthanoi (Merck)
- solution chloroformiquè d'ÀFMi standard 10 Pg/ffii (Sigffià)
:·-::::~-2.T-:~,:--
.-.."...~ .
':!' __
.
.
H
• •

c) Préparation de l'échantillon
- lait liquide: 20 ml + 30 ml eau. Agiter
lait: en poùdre
5 g de lait
100 ml d'eau
agiter
chauffer quelques minutes au bain-marie
pour blen dissoddr~.
- Fromage
5 g triturés dans un mortier pour ob tenir
une pâte homogène
ajouter une pe t i te qUand té d'ead tiède
au début (préparer âuparavant environ 90
mi d'eaù tiède dans urie pissette)
continuer la trituration pour bien dissoudre
la pâte dans l'eau.
rajouter uri peu dieau et continuer ~ méianger.
Si le mélange est homogène, rincer le pilon à
l~ide de l'eau de ia pissette en prenànt
soin de bien récupérer i'eau du rinçage dans
le mortier.
Verser le contenu du mortier dans un Erlen
pùis rincer ie mortier ~ liaide de l'eau de
la pissette.
Dès que l'échantiliori est entièrement récu-
péré, il faut lÎagiter vigoureusement puis
ie porter quelques minutes au bain-marié
pour préserver lihomogénéisation.
d) Extraction-purification
A l'échantillon préparé; ajoùtër i4mi de solution de
sulfate de zinc. Àgiter vigoureusement avant de rajouter 8 mi de
solution de soude. Agiter légèrement pour n~ pas casser la pré-
cipitation. Filtrer sur huchner à tràvers uri papier filtre What-
man nO 1 en prenant soin de bien làver le résidu.

53
Le filtrat obtenu doit €tre
CLAIR ET LIMPIDE; Laver le filtrat
avec 2 fois 50 mi dÎhexahe en agitant à chaqüë fois à l'aide
diun mixeur uitra-rapide pendant üné minute âvant de transférer
dans une ampoule à décanter. Laisser rëposer une minute püls
éliminer ia phasesûpérieure (héxàrié) sous trompe à vide.
Pour extraire l'aflatoxine Mii âjoùter 50 mi de chiorofotme.
Agiter Une minute à i'aidé du mixeur uitra-rapide; transvaser
dans l'ampoule à décanter (toujours là m~më) puis récupérer la
phase chioroformique (inférieJre) dàns Uri bàiion rodé dé 250 mi
par fiittation sur un iit de suif~tê de sodium anhydre. Recom-
mencer liopérâtion une seconde fois puis une troisième fois;
cette dernière partie servant de ririçage.
La phase chioroformique est ensûite concentrée sous vide à
environ 1 mi à i'aide d'un évaporateUr rotatif. L'extrait concen-
tré est transféré dans un petit fiacon en prenant soin de bièn
rincer ie balion avec 5 ml de chloroforme; Liextrait concentré
est évaporé à sec sous coùrant d'àzote; Le résidu sec repris par
100 pi de méthanol est prêt à l'injection en tiPLC.
L'OPERATION DURE 30 A 35 mn ~
/

54
111-3- DOSAGE PROPREMENT DIT DE L'ÀFMi
111-3-1- Introduction
Si la chromàtographie Üquide à haute performance apporte une
amélioration par
rapport à ia chromatographie sur couche mincetii subsiste
encore ie probième de la lenteur de iianàlyse pour les méthodes utiiisant
des colonnes de purification de m€me
que ie manqùe de sensibilité (en-
viron o,i ppb). Quant aux méthodes eeconnûes rapides par iiutiiisation
de cartouche de pûrification(25t 62)j elles p6~ent diune part le pro-
blème~de la résolution du pic d'AFMI et dja~tre pait ie problème de la
senai hiE té
La présente méthode se
caractérise par sà bonne sensibilité
et sa bonne résolution grâce au choix Judicieux du solvant d'élutiori
(phase mobile).
111-3-2- Appareil utilisé
L'appareil utilisé est du type Kontron aux caractéristiques
suivantes :
- iong~eurs d'onde
Elies ont é~é déterminées par nott~ a~pareil équipé d'ûn
système permettànt de tracer des spectres Fig il et 12
Les
valeurs obtenues sont les sûivantes
Longueur d'onde cliexcitation = 365 nm
Longueur dionde d'émission
415 nm mais cette
dernière a été remplacée par un filtre "eut off" qui détecte ia
fluorescence au delà de 385 nm. Ce dispositif permet diaugmenter ia
sensibilité en muitipliant la réponse du détecteur par j environ
par rapport à 415 nm(Fig 13)màis son inconvénient est la baisse
de la spécifici té •
- colonne de séparation (voir chapttre ili-i-2-3).

55
FIG11

,
....y, >',~
..l1.I,
-'" ••
:
FLuORES-
. CgNCg
365
300
344
.432 454 Aff
5PECfRE .. ttEXcITAtION,,,, DE.". ~àEM1;i ...EN.
,.
, " ' . , '.. '"'' . . l~UE
: gOLUTION.r..JylET':lANOL7d""_"~

FLtJORÈS~
56
·CENCE
415
300
340
420
SPEctRE, D'EMISSION,."bE,.. L!~,Ft~:t~ ...:,.E~.,
;'OLUtIO.N.. MËTI:-IANOLlgldg
i

57
F\\G13
a/l., " .;. ~". .. •• , ri .:
Solùtion standard di AFMl 100 ng/mi
l1PLe
Ucbrosorb RP 18 J 5 pm
Àcétorritrile-méthanol-eau (20-5-75) i mi/mn
Spectrofluortm~trei
J...Ex = 365 nm
-<Em = 415 DIlI
Attenuation = MEO/io/25
tnj
if mn
6 mn
Solution standard di AFMl ioo ng/ml
11 pte
M€mes
condi tions excepté .kEm = Filtre I1cu t off"
(>385 nm)
tRACES.
-
.
Ol3TËNUS
'
:.
.
AVEC~" .ETSANs.
. ~~ ,,'.,
"
- '. ,'. -
. FilTRE
" . ,
'.

58
IIi-3-3- soivant diélution
Au cours de son étude, B. Dt-ARGENTRE, (2~) li montré: que poUr permettre
la séparation du pic d'AFMi; le solvant de Winteriih devrait ~tre rame-
né à 25 % d'Acétonitriie dans lieau~ Nous avons Utilisé cette m~me
proportion pour tester lieffièacité de notre technique dÎextraction.
Ciest ainsi que noUs avons remarqUé ~ri coU~~ de iiétUde que le probl~me
de la sép~ration du pic d'AFMl h'était pàs suffisamment résoiu surtout
lorsqne la colonne avait servi un certairi nombre.:de fois. De plus; ia
colonne se saturait constamment d'où la nécessit~ dela'!lettoyer'auméthanol
toutes les 2 injections d'extrait de lait; ce qui rédUit ia performance
de la technique. La colonne devient même inutilisable après vlngt dosages
environ. Fig i4
Du fait que le méthanoi servait de soivani: de nettoyage, hous
avons pensé l'incorporer dans le solvant d'élution; c'est pourqUoi nous
avons diabord testé
le solvant de GREGORY (Acétonitr:i.le-méthanoi-eau :
25,2 - 8,8 - 66) (2B) qui nia àppohé aucune amélioration (Fig15 ~ Nous
avons alors modifiÉ les proportions des réactifs.
Cond:i. ti ons HPLC
colonne: lichrosorb RP 18; 5 pm
spectrofiuorimètre: 1 exci ta tion : 365 run
J. émission i Filtre. "cu t off"(>385 nrn)
solvant
à déterminer1
Après injection d'une solution stànclàtd d'AFMI (iO ug/ml); on
inje~te l'extrait de lait.
La composition du solvant
(lmi/mn) et ies résultats obtenus sont
indiqués dans le tableau cl-dessous

59
~..
,
, \\
1
.
.
Observations
i\\céton:t tri le Méi::hanai
eau
(mi)
(ml)
(ml)
cl i Ami
di Ami
ie
Pic
standard
pic
dans
lait •
1
,
\\
- bien séparé des
pics d'impùretés.
1
20
i
79
très aplâd
- l'écart ést d'en-
:
1
viron 3 mn
- i::r è s apiatt
i
- bien séporé
- écart environ :.'\\ mn
20
2
78
encore apiati
- apiati
- bonne sépara tion
- légère Élmé 1:i.ara-
tian
20
3
77
légère améHora-
tion
- écart env. 2,5 mn
- écart = 2,5 mn
- m:né 1:l.bré mai s la
surface du pic est
70
4
76
amé i:l.or.é
inférieure à celle
obtenue avec acéto-
nitri ie 25 io
;
Ecart = 2 mn
1
surface identi~ue à
'i,1
20
5
75
amélioré
celle obtenue avec
acétonHrUe 25 10
F:Î.g i6
\\ \\
,
"
r)
; . (
.
Nous retenons donc la dernière proportion. tiàcétonitrile utilisé
"
est un solvant, Caria Erba.

60
Hemarques :
- L;=J. détermination de la composition du solvan.t'.a été fricilitée prir l'uti-
lisrition d'un programmateur qui a permis un mélange instantané des differents
reactifs. Il fau t toutefois noter que le mélange acétoni trile/méthaDol
a été réalisé manuellement, le programmateur ne pouvant siadapter à plus
de deux réa~tifs difl·erents.
- L'augmentation du volume de méthanol a tendance à rapprocher le pic
d'A}~l de ceux des impuretés.

61
HPLC:
Lie h rosorb RP iS;5 pm
Àeetonitrile-e~u (25-75)
i mi/mn
Speetrofluorimètre:
-<Ex.: 365 nro
AEbi.: fil tre lieu t off"
(>385 nm)
MEDilO/25
Inj
7, mn
7mn
Lait liquide contenant
AFMi Ëttaridard la ng/ mi
50 PPT AFMi
tRAcES,>. 013tENUS• AVEC,
"
•. .;;.
LE"4~, SOLVANt
••
.
' . '
'
. •
,
-'
DE
4,,·,"'.,,'
.~
. -
W1NTËRLIN
l.,
'
,
MODIFIE.

-

,"


D.

62
1="10,15 :
HPtC:
Licbrosotb RP 18; 5pm
:Àce toni tri le -me thano1-eau
-25,2
8,8
66
. i mi/mn
Spectrofluorimètre:
hEx.: 365nm
AEm.: Filtre licut off"
(>385 nm)
MED/IO/25
inj
In]
6rnn 15
6 ftÜi 10
1
1
Lait liquide contenant
ÂFMi standard 10 ng/mi
50 PPT AFMl
TRACES OI3tENU~) AVËC
GREGORY

6)
FIG16 :
i"
. t,"
HPLC:
Llchtosorb RP ID; 5 pm
Acetonitriie-methanol-eau( 20-5-75 )
i mi/rim
Spectrofluorimètre:
~EX.:36S nm
km.: Filtre "cu t off" (>385 nm)
i-mbi io/ 25
lnj
li mn
,
llmn
Lait liquide contenani
AFMl standard io ng/ml
50 PPT
TRACËS,

Ol3TENUS
.~.,
.
,
•._, ,AVËC
• .
'_
NbTRE
"~''''''~'.".:
• . • . ,\\, .... : .••• ~ ••..
SOLVANT
';-\\:,.t.,
' .
'
• • • J . . . . . .
".~.-

111-3-4- Résultats obtenus
Sur le chromatogramme, les pics sont identifiés en fonction de leur
temps de rétention. Pour cela ii faut au préaiable, caractériser les pics
provellant du solvant pur utilisé pour la solution standard de m~me qu~
pour l'extrait sec. Ensuite, il faut injecter la soiution standard pour
déterminer le temps de rétention du pic recherché puis un écharitiiion témoin
non contaminé (ciest à dire ne contenànt pns le composé recherché).oL'échan-
tillon à doser est injecté iorsque toutes ces-conditions sont réunies.
Tl1~~-4-2~ Calcul
- La surface du pic obtenu est proportionnelle à la concentration du
p~oduit considéré.
u
l
s
HX L
"2
S
surface du pic
H
hauteur du pic
L
iargeur à ia mi-hauteür
La surface du pic se calcuie soit manueilemerit; soit à i'àide diün
intégra teu!".

65
Courbe dÎétalonnage
Préparation des differentes diiUtions
601ution-mère = solution chioroformique d'AFMi la ~g/ml
100 mi de 18 solution-mère + 900 inl de méthanoi
')
solution méthanolique d i AFMl i ~g/ml qui servira pour les
dilutions suivantes:
(
)
( solution de départ
voiume
volume de
ti tre obtenu
)
(
(ng/ml)
utiÜsé
inéthanol
ng/mi)
)
(
Uii)
ajouté (pl)
)
(
)
(
)
(
)
1000
ioo
900
100
(
)
(
100
500
500
50
)
(
)
50
500
500
25
(
)
(
25
500
500
12,5
)
(
)
12,5
500
500
6,25
(
)
(
)
Les surfaces obtenues en fane tian de ia concentration sont repré-
sentées cians le tableau ci-dessous et ies traçés correspondants sont
indiqués sur les figure s 17 à 21
(
)
( concentration
temps de
sLirfàce des
surfàce théorique
)
( eh Hl (ng/m 1)
rétention
pics (mm2)
(mÎn2)
)
(
)
(
)
(
ioo
12
.-
)
i 32
267,9
(
)
(
50
12'34
145 ,il
267,9/ 2 = i33, 95
)
(
25
)
i2'38
62;74
i)),95/2 = 66;96
(
)
i
(
12,5
i2' 37
23,92
66;96/2
33,49
)
(
)
6,25
12 Î 40
i If; ai
33;49/2 :::: 16;74
(
)
(
-~/
Observation :
Il niy a pas de difference fondamentale entre iès points de diiLition
et les'points théoriques. Cf fig.22

66
"
11 ~
,fiG .... ~ .
HPLC :'
L5chîosorb RP 18; 5pm
Àcetonitriie-methanol-eau
20
5
75
i rrii/mn
spectrofluorim~ire!
i..Ex.: 365 mn
AEm.: FÜ tre "cu t ofr'
(>385 nm)
t-~ CI
C: R L
= )
AF:EA ;~
RT
ri ~~ E A
1 '2 _ 32
2679~3i
99,
Dl y;:;
ST CF'
REJEct OFF
l'iV/t", i
AT Tr-J
16

67
FIG 18 :
HPLC: même que fig 17
':.\\
1",',1
(\\1
.,:..~
,......
IJI
r
-
i".
~
T YF"E
i:2.3f
'~q
14
REJECT

6e
FIG19 ·
HPLe
cf. fig 1 7
f ",
·...·1
1--
.-. A_
=
RT
-:-
. . :-. -
1
"'
,
-::.
25
-
.-, ;::.
F:EJECT
OFF
-
J.. "'::
AFMj STANDARD 25 NGLML

FIG 20 :
HPLC: cf . .f i g 1 7
".
l'...)
("•.1
~..~
CL.
C)

IJ"~
-. -. ,::, :::' G'i
--
-
-
-
-
37
77
H F
:~ ~ 8 ;:1 ,~
OL t/
8
f?EJECT
OFF
r-' V /.~ f"~
-i
~3 0
fiT T N
16

70
FIG 21 :
HPLC: cf. fig i 7
NO
CAL
_.. - -
=
AREA
~
: '..,.' :-' t:..
12
40
D L. 11;
9-
j'~'//H
"1
r::,~~j
F: E .] E C T
[1 F F
'.
: :'~
-.1- 6

ti
FIG
.~.•'.
.
"
22
.
'1
·d,
:

iob
,..
50
25
1~5
6,25
"
;
.
S,I
50
IbO
150~bô
250
(rriii1~
+- ~ Points obtenus avec les differentes diilitions.
Ji.: Points théoriques~
"
"
COURI3Ë,. D~ErALONNAG.E.
.,:
,
·1
"
Mi

72
111-3-4-3- Résultats obtenus en utiiisant les méthodes d'extraction
~~j~-~~~~~~~~~~
Au chapttre 111-2-3-1 nous avons essayé differentes méthodes d'extrac~
tian ; il ne nous a pas été possible de raccourcir les étapes des opé-
rations à cause des émulsions provoquées. Seule iiapplication intégrale
de la procédure des auteurs, a permis un iavage il ,l' hexane sans risqUe
d'émulsion, favorisant ainsi l'extraction théorique de l'aflatoxine Ml.
Les extraits obtenus n'ont pas été purifiés sur colonne chromatographique
ni sur cartouche de purification. En conséqUence; hous avons obser~é
que l'injection de ces extraits en HPLC avec un solvant diélution consti-
tué d'acétonitrile à 25 % dans l'eau, ne permettait pas ia séparation des
pics.
L'utilisation du nouveau solvant (acétonitrile-méthanol-eau :20-5-75)
ne permet pas nOn plus la séparation des pics. De plus, la colonne est
difficile à désaturer. cf. fig 23
La purification de l'extrait sur colonne chrornatographique est
donc indispensable dans ce cas précis : ce qui expiique encore une fois
l'insuffisance de la précipitation des protéines du lait. Il faut cepen-
dant rappeler que malgré la purification sur cartouche,B. D'ARGENTnE a dû
modifier le solvant de WINTERLIN pour par~ènir à la séparation du pic
d'AFMI. Les chromatogrammes obtenus par ies auteu~s eux-m~mes (WINTERLIN
et ETIEMY) ne sont pas très differents de ceux que nous obtenons en utilisant
notre méthode diextra~tion-puriftcation.Cètte ressemblance se situe au
niveau des pics diimpureté~ or, ces derniers ont bien utilisé des cartouches
de purification. cf.fig 24 et 25
111-3-4-4- ~~~~!~~È~_~~!~~~~_~~~~_!~_p~~~~~~~_~~~~~~~
Les conditions suivantes étant réunies: nouvelle méthode diextraction-
purification, solvant nouveaù (chapitres I1i-2-4 et 111-3-3), nous avons
opéré sur du lait liquide du commerce (Score U.H. T ~) contaminé ârtÜiciel-
lement par differents taux d iAFM1. Les essais préiiminaires n'ont pas révéié
la présence d'AFMi avant cette contamination. La décongéiation des laits
s'est effectué lentement
pout des raisons qUe noUs évoquerons uitérieurement.
Les résuitats obtenus sont indiqués dans le tableau suivant~

(
)
(
)
(
Echanti1ions
Numero
taux retrouvé
rencle-
rendement
)
(
contaminés
d'essài
ng/1
ment
moyen
%
~
(
:(Ecart type cal- )
(
artific:i.e1iement
%
·culé en utilisant)
(
:N;,.l).
\\
1
7
(
)
~
1
9,25
93
)
:(
2
10,18
i02
)
(
la ng/1
)
(
3
8,79
88
89r8± 10,2
)
(
(10 ppt)
)
(
4
7,4
74
)
(
:
5
: 9,17
: 9 2 :
)
~-------------------_:_----------~----------------~---------~-----------------~
: :
)
~
i
21,39
85
)
(
2
2i,22
85
)
(
25 ng/1
)
(
2 )
3
20,9
84
84,1\\ ± 0,5
)
( 5 ppt
)
(
4
21
84
)
(
5
2i
. 84
)
(
: :
: :
)
(~-------------------;-----------t----------------f-~-------:-----------------)
(
.
:
.
: '
)
(
1
38,66
77
)
(
)
(
2
39
78
)
(
5 a ng /1
3
40
80
)
(
80,2 ± 2,8
.
(
(50 ppt)
4
41,6
83
~
(
5
41 5
: -83
)
(
. ; ' ; :
)
~--------------------~-----------~-------~--------F--- ------;-----------------~
(
1
81,5
82
)
i
~
2
89
89
(
100 ng/1
(
3
80 ,9
81
83 ± 3,4
)
(100 ppt)
4
.
)
(
81,25
81
)
(
5
8 2 · 8 2
) ..
~~.
,
Les tracés corresponrlant.s y compris ce lui dù iait temoin sont indiqués
pur les figures 26 à 28.
Observations:
On constate une sensibilité et une bonne reproductibilité de ià methode
. -.
À 10 ppt; le pic rl AFMl devient difficilement detectabie. Cette valeur

74
peut alors ~tre considérée comme la limite de détection de la méthode. En
effet le hauteur du pic est égale à envirori 5 fois la lignè de base. Cette
limi te est ia plus faibie valèur obtenue en HPLC à notre connaissance.
111-3-4-5- ~pp!~~~~~~~_~~_!~_~~~~~~!~_~§~~~~~_~~~~~~~~~!~~_~_!~~~~!~~~_~:
!~~~~_~~_p~~~~~~~_t~!~!~:~_P:~~~~~~~_~~~~_~~~~Ë:_!~!~!~~_!~~~~~!~
D~s reception, ils ont été congelés. La décongélation siest ensuite
effectuée lentement, Lors de cette anaiyse nous utiiisions encore iiancien
solvant cl' élution HPLC (acétonitri le à 25 /0 dans i i eau) avec toutes les
~{ffjcultés que ceia comporte. Les résult~ts cibtènus sont les suivants:
(
)
(
NU"le ro de
Teneur' en
Numero de
Teneur en
)
(
l'échantillon
AI"I'll
(ng/l lait)
i i échantillon
AFHl (ng/i iait)
)
(
)
(
(
(
~
l
6/f, 68 ...
21
)
.(
(
2
8,5
72
)
(
J
23
67,61 Jic
)
(
j.
)
(
4
56,16
24
i2 ,5
)
(
)
5
:"8
25
46,4
(
)
(
6
9
26
)
(
7
72,62
)
'27
(
198,68-
)
(
8
28
)
(
9
29
ii ,âs
)
(
)
(
la
18,5
30
)
(
11
3i
1O,66
)
(
)
(
12
32
14,Bi
)
(
13
33
)
(
(
14
17,54
34
traces
)
)
(
15
B~ 77
35
22; 72
)
(
(
H
)
(
:
)
17
)
(
(
13
)
)
(
J 9
)
(
(
20
)
)
(
.. Taux>50 ng/i

75
Observations
Près de 11 % des lai ts reçus contiennent un taux d Î AFMI dépassant
le seui 1 toléré en Suisse; di nt des diff:Lcul tés everituelles dans ies
échanges commerciaux •
111-3-4-5-2- !r~m~g~ bleu
Nous avons rencontré de réeiles difficultés lors de i'analyse,
le solvant utilisé ne permettant pas là séparàtion du pic c\\iafiatoxiné
Mi (acétonitrile 75 % dans li eau ). Ainsi ies résuitats obtenus au début
nous semblaient douteux. Mais grâce à l'utilisation du nouveau solvant,
nOus avons pu, avec ie fromage bleu conservé ûne semaine aù réfrigérateur,
obtenir les résuitats suivants
numero
teneur AFMi
jJg/kg
i
0,9
2
0,65
Ces teneurs dépassent le seuil dÎAFMi i:oi~té in Suisse.Type de tracé cf.
f:Î.g.29
r.omme il a été indiqué au châpltre IIi-2-4-i-6,cette méthode est appli-
caple aU lalt en poudre. Nous n avons pu cependant réaliser des analyses en
série ~ cause de la difficulié de la coniaminaiion (homogénéisation difficile
à réaliser par rapport au lait liquide). Nous he pouvons alors qti;indiquer
le type de trac~ avec le lait en pOUdre. Fig.3D.

16
FIG
,
, 23
.. ·
, .
HPLC:
Lichrosorb RP 18; 5 pm
Acetonitrile-methanol-eau
20
5
75
J ml/mn
Spectrofluorlmètre!
AEx.: 565 nm
1 4'
i\\.
'F
um.:
.l l tre "eut 0 ff'
(> ~85 nm)
YiED/ 1 oj 25
,Ee il éÎn i: il.! on
,
AFMi stan-
dard. iOng/m:
EXTRACTION .,.sELoN.,LES.MËTI-1bDEs
' ' ' ,
. ' .
-.
,'.. ". DEJA
. . .
; .. ~..
.
E)(lstV-NttS,sV-NS .. PURIFICAtiON .,SUR ,COLbNNË

17
FIG 24 :
l-lPLC:
Lichrosorb RP 18; la pm
Acetonitrile-eau ( 28-72 )
2 ml/mn
Spectrofluorimètre
(Schoeffel)
AEx.: 360 -nm
AEm.~ Filtre~ut off u
(>389 nm)
o
Lait en poudre supplémenté en AFMl o,i ppb
CI-IROMATooRAMME f.",QI3tE,NU.. PÀR"FREMY
( extrait de la pubiication originale)(25)

78
FIG
~'", ,1 ~" . •
...2$ ~
llPLC:
pBondàpak cia + pre-
coibnne 30i40 ~Vydac
0'
Ace ton:i.i::tiÎe-eau (28- 72
2;5 ml/mn
Spectrofiuorim~tre!
(Modei 420 waters)
J.. Ex.: 365 nm
AEm.: environ
400 nm
,
,
()
t
o i
6
Lait liquide ne conteriant pas
Lait iiquide contenant 0;1 PPT
d' AFl-l1
AFMi
'. ,
, , , .
,. ~'
' . " " "
' .
. . , . ,
'"
.
"
. . <
"
CI-iROMAOGRAty1MES....",..,OI3TE~US ,",. PA8
WINTERLIN (extràit de ·la publication originéiie) (62)

79
FIG 26,:
,HPLC;
Lic1Jrosorb RP 18; 5 pm
Acetonitrile-methanol-eau 1 ml/[
20
5
75
Spectrofluorimètre:
AEz..: 365 mu
AEm.;
Filtre icut off"
(>385 nm)
!"1ED/l al? ':i
1.4'
12 '
6'
6'
1
i
Echéiul:iilon temoin
AFMi standar~ io ng/ml
MOIN
'
.
,
.
'
, , 0
"
LAlT ,LIQUIDE ,",.TE,
.. '

80
FIG
.
.'
. , 27
. .
~
HPLC: cf. fig 26
Inj
14'
12'
6'
i4;
12'
6'
,
.
i
. . ,
,
AFi:Ü s ta'ldanl 10 ng/ml
..LAITLI~Ulb,E .coNTE.NANT.10 Pt:I.AFM1
bd

f:"1.G>2~3
81
)

HPLe: cf. fig 26
6'
100 ppt
50 ppt
LAITS
, ' "
. '
.••• (
LIQUlbË~)
' . '
' . '
. "
,
......1 CONTENANt
. , . ,
. . . . . .

.•••• ~·.;'.,,.. •• ~.,,••• ,.l·...
50
tr.·.c..~ ... ,,'r1'ËT,1üOPPT
A , ' , "
_ _
'
., . . .
_ . . . . . ~•• ~ . . . .,.,'ÂFtv
. . . . <:Yl . . . '.'J;.\\,'.~

à2
FIG 29 :
l-lPLC:
L:lchrosorb RP18; ') pm
Aceto-metha-eaü (20-5-75)
1,lml/mn
Spectrofluorlm~tre:
jEx.: 365 nm
.A Em.: FÙ tre ,~u t- off"
(>38 5 nm)
MBn/10/2')
AFMI

FIG.30
11 FLC :
cf. fi g 29
Inj
LAn- EN. POUDRE (QUICK ..LÂlf, ), SUPPLËMEN1
EN AFtv11 10 PP,!.
i

84
111-)-5- Influence de
la congélation et décongélation sur l'AFM1
Nous ?vons constaté au cours de ce travail, q~e le système de
d~congéiation dli lait modifie ie rendemeh~ de i'extraction.
Deux laits ~rtificteiiement contaminés on~ été décongei~~ enti~re­
ment au hain-marie bo~iiiant. Les ~ésulta~s obtentis après extraction sont
indiqués sur ies tableaux ci-dessous :
Fchar. ti lIons
Numero
Reridement
Rendement
(AFMl ng/1 iait)
d'essai
eh %
moyen en '0
(...)
1
7i
2
68
50 ng
3
68
67,4 ± 2 t 6
(50 ppt)
4
66
5
64
1
73
2
68
100 ng
3
73
70,7% 2,6
(100 ppt)
4
5
69
_
: Ecart type ~alculé en utilisant N-l.
Observations :
Ce type de décongp.lation provoq~e ùh abaissement dienviron 12 % du
rendement ob~enù après une décongélation douce: ciest à dire une décongé-
lation à moitié a~ bain-marie bouiilant et poùrs~ite à la température
ambiante, ou bien une décongélation lente à 5° C (réfrigérate~r) mais
ce la nécessi te ril1sie~rs heuresd i attente;
iL EST INDISPENSABLE DE TENiR COMPTE DE CE SYSTEME DE DECONGEtÂTION
POUR EVITER TOUT RISQUE DE RESULTATSFÀUSSEMENT NEGÀTIFSQUI SERAIENT
FACHEUX LORS DÎUt\\TE EXPERTisE TOXICOLOGIQUE;

85
Plusieùrs données bibliographiques indiquent une diminùtion
de la teneur en AFMi lors' de la consommation dù Îait à - 18 ° C. Cette
diminution débuterait à partir dù68 eme joùr. Au cours de notre étude,
nOlis avons tenté cie vérifier cette hypothèse en opérant sur des Îaits
arti fie5.e llement et na ture iiement contaminés ~
1II-3-5-2-i- Laits artificiellement contaminés
Deux laits contaminés chacun à 50 et ioo ng/Î le 25/03/82
ont été dosés selon le calendrier indiqué aù tableau 8.
Les résuÎtats obtenus montrent une stabiiité de i'AFMl après
un mois de conservation suivie diune diminution de tette teneur d~envi­
ron 13% au bout de 90 jours.IL nous est cependant impossibÎe de préciser
le début de cette,dégradation. Nous pouvons par contre, rapprocher ce
résultat de la théorie cie S'I'UBBLEFIELD selon laqùelle une solution
chloroformique d'Ana ne peut se conserver au cieià de 3 mois (57)
111-3-5-2-2- Laits naturellement contaminés
Lors de l'analyse de laits liqu{desreçus diùn centre laitier
lyonnais, nous avons effectué des essais en doubie pour leséchantilldns
nO 4 et 8 qui ont été conservés par la suite à-18° C.
Lorsque nous avons observé la stabilité cie ii AFMl starldard
dans le lait après un mois de conservation, iinous ct sembié logique de
vérifier i'état de la toxine dans ces éch~n~ilions nO 4 et 8. Nous niavons
,
, '
, ,
°
pu malheureusement avoir les résultats de l'échantillon n
8 à cause
d'une erreur sùrvenue lors dù dosage. ies résultats obtenus après analyse
de l'échantillon nO 4 sont rassemblés dans le tabieaù sùivant :

86
(
)
~ Date de
Numero
Taux obtenu ng/l
moyenne
~
(l'anaiyse
diessai
(80 % de rendemen~)
(*»
(
)
(
)
(
)
(
1
44,9
- . i . . . )
(
28/01/82
'
47'ji:!: ),1
)
(
2
49,3
)
(-------------t----------~-----------------------t-----------------)
(
'
.
)
(
1
46,5
)
(
2
5i,5
)
~ 02/06/82
j
52,5
4B,S± ),3
~
(
4
~6; 8
)
(
5
45
)
(
)
(
)
'"
:
EC8Tt
type calr.ulé en utilisan t N-l.
Observations :
Contrairemen~ à ia con~amination at~ificieii~i nous observons ici;
une stabiHté indiscutable de i'ÂFlll, bieh qù~ la premÜre analyse ne soit
pas statistiquement interprétable (petit hOmbre d'èàsàis).
Ces résultats sont en contradic~ioh avec ceux de ia iittératûre
mais ii est possible que cèia soit da au mànque de précision des méthodes
CCM utiiisées par ces aûteurs.
Cette observàtion es~ d'au~ant pius lhteressante que iés ~chàhtiiions
de iait sorit obiigàtoirement corigei~s avant di€trè
anaiysés, à cause de
la longueur des op~rations.

87
-rAI3LËÀU g
(
)
(
Date d'analyse
Echantiilon
Numero
Taux retrouvé
moyenne)
(
cl i e s sai
ng / i
)
(
;
(.)
)
(
)
(
)
(
1
38,6
)
(
50ng/l
2
39
)
(
(50 ppi:)
3
40
40,1 ± 1,4
)
(
A
4
41,6
)
(
.
.
5
.
4 1 , 5 :
)
(30/03/82
o---------------t-----~-----f------------~----:----------------,
(
i
81 5
)
(
100 hg/l
2
89'
)
~
(iOO ppt)
3
80,9
82;9± ),4
~
B
4
81,2
(
5
:
8 2 :
)
(
:
: .
.
)
(------------------:---------------:-----------t-----------------~----------------)
(
1 i
:
3 9 , 3 :
)
(
2'
40
.
)
(
A
3 i
39,6
40,1 ± 1,2
)
(
4 i
42,1
)
(
5'
i
3 9 , 4 .
)
(04/05/82
:---------------~-----------7-----------------:----------------)
(
"
)
(
1 '
80,4'
)
(
2 i
83 , j
)
B
3'
78,5.
81,3 ± 3,2
(
4'
85,7
)
(
.5'

78 5 ,
)
(
.
.
. , .
)
( ------------------:---------------:-----------f-----------------~----------------
:
: .
.
)
(
l' ,
:
3 5 , 7 :
)
(
2';
32,7
)
(
A
3 ' ;
33 ,3
34 , 1 -+- 1; 4
)
(
{f"
35,7
)
(
5"

3 3 , 3 .
)
(28/06/82
:---------------t-----------:-----------------~----------------)
(
l"
:
6 1 - 6 :
)
(
7."
57'6
)
(
B
3 ' ,
64' 1
62 ± 3, 2
)
(
4' ;
64' 6
)
(
'
)
5' ;
(
)
(
)
... ~
Ecart type calculé en utilisant N-l.
STAl31L1TË DE LÂFM:1 bANS LAITS
ARTIFIC'ELLEMENT CONTAMiNES
,.

88
IV- DIS C U S S ION
E T
CRI T l Q iJ E
D E
L A
t1ETHODE
les techniques HPLC permettent diéviter les contraintes de la
chromatographie cotiche mince (délicatesse dti dép6t et de la révéiation,
nécessité. d'tin densit:om~tre pour les faibles quantités diaflatoxine
Ml).
La particularité de la présente méthode repose sur deux points
essentie ls :
1°) L'efficacité de la technique de précipitation des protéines
du lait.
Elle permet ainsi l'omission de la pbase de ptirification sur colonne
chromatograpbique contrairement aux méthodes déjà existantes. L'extrac-
tion de l'AFMI se réalise avec un seul solvant (CHCl))
; ceci est excellent
car cette toxine est présente en très faible quantité dans le lait. Un gain
considérable est alors réalisé en temps et en coGt (réduction de ia quan-
tité de solvants et de matériel).
2°) L'amélioration de la séparation dti pic d'AFMI que nous n'avons
point observé
avec les solvants diéiution déjà existants.
Bien qu'utilisant des cartouches de purification, les chromatogrammes obte-
,
nus par FREMY et \\o/ÜlTERLIN sont cOlilparables aux n6tres. La coionne est
réutilisable m€me
après tine cinquantaine de dosages, ati iieu diune vingt-
aine avec les autres tecbniques.
Cette méthode se caractérise aussi par sa simplicité, sa rapidité
et sa sensibilité.
C'est une métbode économique et polyvalente (adaptable à tous ies
produits laitiers).
A c6té de ces aVdntages non négiigeables, il existe un nombre
important de contraintes ou d'inconvénients
- il faut manipùier avec soin lors de la filtration du préci-
pité, de façon ~ obtenir un filtrat clair et iimpide indispensable poùr
éviter tout risque d'émulsion.
- le manipulateur doit utiliser le m€me
matériel depuis le
fUtrat jusqu'à l'extrait chloroformique (erlen, ampouie à décanter; agi-
tateur). ii doit opérer sous la hotte pour éviter l'inhalation des solvants

89
<.
(hexane, chloroforme) de inême èju':i..l do it iriânipüièr avec soin iâ solutiori
standard d' .ÀFNI.
- ia fin de ia c oncen t r a dori de i ie:kt:bi:l.l: doit être surve:i.i-
iée afin diéviter une évaporation ~ sec;
- ii f~ul: éviter la ~résence clebuiies di~ir'dan~ ia ~oionne
par un dégazage préaiabie du soivant diéiUtion mais àussi ~ar évi~l:ion
du pompage diair eri sUrveiiiant le niveau dû soivant dans le fiacori.
- ii faut aussi éviter i'as~irat:i.on diair dans là boucle
d'injection.
- comme ies autres techniques, la coionne a besoin di€trè
nettoyée mais, cette fois; toUs ies 5 à 6 dosages au iieu de 2.
- ie manque de spécificité dû filtré i' cUt off" pose un
problème certain à caUse de la compiexit~ de ia co~position du iait. On
peut aiors craindre des résuitats faussement positifs; Mais, on peut y
~emédier par addition d'AFMl standard à iiéchantilion. On notera alors,
soit une augmentation dû pic de départ; ce qùi éqûivaudrait à une confitma~
tion, soit_une persistance ou diminution du pic; doric résultat négatif.
Dans les deux cas, le raisonnement tiendra compte du facteur de dilution.
- La technique de décongéiation doit aussi être prise en
compte si l'on veut éviter des résultats fàussement positifs.
- ie coai: de i i appareii HPLCserâ corripensé par sa poiy-
valence.

90
CONCLUSION
Les aflatoxines en général, et liaflatoxine Ml en particulier,
constituent une menaçe pour la santé humaine, surtout dans les pays ,du
tiers-monde o~ les conditions climatiques favorisent leur developpement.
Les risques y sont d'autant plus élevés ~ue lialimentation n'est pas
controlée. 1] est donc judicieux et louable diutiliser tOUA les moyens
épidémiolorriques pour diminuer les risques de contamination directes ou
inrli l'ec tes :
Ils peuvent être atténués crâce à la surveillance des
récal tes.
Ils concernent plus particulièrement le lait et les
produits laitiers.
A notre connaissance; il est pratiquement impossible
de décont~niner un lait sans lui Bter sa valeur nutritive. Ciest ~our­
quoi les moyens de lutte contre la contamin8.tiondoivent s'effectuer
d'une part au niveau des aliments du bétail laitier, diautre part, au
niveau du lait avant sa consommation ou sa distribution. Cette dernière
reenmfllanda tion néces:ü te une technique d' analY:38 simple, r:1.pide, peu
()l'~rellse, fi.abl e et sensi.ble. Les méihodes HPLC semblent répondre à ces
critères, du moins en ce qui concerne cell~ que nous .proposons !
- Grâce à liutilisation d'un agent précipit~nt très
efficace, il n'a pas été nécessaire de purifier liextrait sur colonne
chromatographique, si bien qu'un seul solvant a suffi pour extraire
]IA~~l, ce qui est remarquable.
- La grande innovation apportée par cette méthode par
rA.pport aux techniques existantes, se situe au niveau de l'efficacité
de la précipitation des protéines du lait et de la bonne séparation du
pLC d'AFMI.

91
- La limite de détection observée (la ppt) est d'au-
tant plus interessante qu'il est possible de liabaisser plus encore par
l'utilisation d'une cuve remplie de silice (elle augmenterait la sensi-
bilité) (10,63, 64).
Comparativement à toute technique dianalyse, la préH
sente méthode n'est pas dénuée d'inconvénients qui nous paraissent mi~
neurs à coté des avantages.
Perspectives diavenir sur le plan analytigue
Avec le progrès technologique, on peu~ imaginer des modifica-
tion:=; ou améliorations considérables dans le dosage de li AH'1l en llPLC.
Déjà, l'utilisation diun programmateur permet un mélangt? instantané
des solvants d'élution (cas de plus d'un solvant). Elle pourrait ~tre
étendue à la sélection de la sortie des pics voire l'alternance du sbl-
va.nt de dosage avec celui du nettoyage de la colonne, ce qui serait in-
teressant pour un échantillon aussi complexe que le lait.
~i la cuve remplié de silice peut déjà améliorer la limite de
détection, il ne serait pas illusoire de penser que l'utilisation du
rayonnement Laser pourrait encore abaisser cette iimite de détection,
renrlant ainsi possible la détection de l'AiMl sous forme de traces.
L' AMELIOHA'l' [ON 'l'ECHNIQ,UE DE CE DOSAGE EN HPLC 'PEHl'lE'l' UNE DE-
l'E(;'['ION PLUS .FIlliCISE EN !VJEME TEt'1PS QU i UNE SIf1PLH'ICATION DE LA PHASE
!li EXTIÎAC'L'ION-PUHI FICATION.
CECI EII1'HAINERA UNE PREVEm'ION: PLUS EF'F'ICACE
j)f~;:) CÜI,jTA1·HNA'rTONS E'r PAH CONSEq,UEN'l', CON'l'RIl3UEHA A f'lIEUX GAHAN'rIR
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