N° d'ordre: 1002
UNIVERSITË DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE LILLE 1
MËMOIRE
DOCTEUR DE TRO'8IËME CYCLE
option Biochimie
par
BIFIDIGÈNES- PRÉSENTS DANS LE LAIT MATERNEL
soutenu
le 15 Novembre 1982 devant la commission d'examen
MM. les Professeurs: J. MONTREUIL, Président
G. SPIK, Rapporteur
G. STRECKER, Rapporteur
J. MIZON
C. ROMOND
;
.
,
Ce travail a été réalisé dans le Laboratoire de Biochimie de la Faculté
de Pharmacie de LILLE, sous la direction du Professeur J. MIZON ; avec la collabo-
ration du Laboratoire de Bactériologie du Professeur C. ROMaND du même établis-
sement et du Laboratoire de Chimie Biologique de l'Université de LILLE 1. du Profes-
senT.J. MONTREUIL.
Il a bénéficié d'une aide de l'O. M. S. sous forme de bourse qui m'a
été attribuée (numéro d'imputation: AF /IVC/PTR/099/RB/81), ce qui nous a permis
de réaliser ce travail. Nous adressons à cet organisme nos vifs remerciements.
MADAME F. ERB, Professeur de Toxicologie à la Faculté de
Pharmacie de Lille, co-promotrice de cette thèse.
J'ai été très sensible à l'attention particulière
qu'elle prête à mes problèmes, durant toute ma
formation de 3ème cycle.
Sans elle, ce travail n'aurait jamais pu être réa-
lisé.
Les mots me manquent pour lui témoigner toute ma
reconnaissance. Qu'il ~e soit permis de lui adres-
ser ma profonde gratitude un très grand respect et
surtout mes vifs remerciements.
A LA MEMOIRE DE MON PERE,
Trop tôt disparu, il n'aura pas la joie de connaître cette thèse
que sa vie de travail et de sacrifice m'a permis d'entreprendre.
En hommage à son courage et son honnêteté.
A MA MERE,
Avec toute mon aff~ction et ma profonde reconnaissance.
A MA FEMME MARIE-AGNES,
Qu'elle trouve dans ce travail, l'expression de mon amour ..
Que le bonheur guide to".iours notre c.hemin.
A .MES ENFANTS,
Avec toute ma tendresse.
A MON PRESIDENT DE JURY,
- Monsieur le Professeur J. MONTREUIL
• Professeur titulaire de la chaire de chimie biologique à
l'Université des Sciences et Techniques de LILLE 1. ;
• Chef du Service de Biochimie cellulaire à l'Institut de
Recherches sur le cancer de LILLE.
qui m'a fait le très grand honneur d'accepter de
présider le jury de cette thèse.
L'étendue de vos connaissances et la haute qualité de
votre enseignement m'ont attiré vers la Biochimie.
Veuillez trouver dans ce modeste travail, l'hommage
de mon profond respect et de ma très grande admi-
ration.
- Mademoiselle le Professeur G. SPIK,
. Professeur de chimie biologique à l'Université des Sciences
Techniques de LILLE 1. ;
. Attachée de Recherche au C. N. R. S.
Qui m'a fait le très grand honneur de sièger parmi
mes juges.
Pendant plusieurs années, j'ai eu le privilège d'ap-
précier la haute qualité de votre enseignement.
En jugeant ce modeste travail, veuillez vous montrer
indulgente et soyez assurée de ma très vive recon-
naissance et de mon profond respect.
- Monsieur G. STECKER,
• Maître de Recherche au C.N.R.S., du Laboratoire de chimie
biologique de l'Université des Sciences et Techniques de LILLE.
Je vous exprime toute ma reconnaissance pour m'avoir
apporté votre concours et fait bénéficier de votre
compétence scientifique en discutant et corrigeant
ce travail.
Que ce mémoire soit l'occasion pour moi de vous
formuler ma profonde gratitude et mes vifs
remerciements.
- Mmsieur le Professeur J. MIZON,
• Professeur de Biochimie à la Faculté de Pharmacie de LILLE
(Université de LILLE II).
Je vous suis très reconnaissant de m'avoir guidé
pendant deux ans et fait partager votre enthousiasme
pour la Recherche.
Votre aide toujours bienveillante et votre disponibilité
permanente ont permis la réalisation de cette thèse.
Sous votre direction, j'ai appris la rigueur et la
méthode si nécessaires en matière de Recherche.
Qu'il me soit permis de vous formuler dans ce
modeste écrit, mes vifs remerciements et ma très
grande admiration.
- Monsieur le Professeur C. ROMaND,
• Professeur de Bactériologie et Viro logie à la Faculté de Pharmacie
de LILLE (Université de LILLE II).
Vous m'avez fait l'honneur de guider, dans le cadre
de votre laboratoire, la partie bactériologique de ce
travail.
En plusieurs circonstances, vous avez comblé mes
lacunes et redressé mes erreurs.
Permettez moi de vous témoigner ici mon profond
!
respect et ma très profonde gratitude.
\\\\\\,
Avec ce travail, je tiens à formuler mes plus vifs remerciements
- à tous les membres du Laboratoire de Biochimie de la Faculté
de Pharmacie de LILLE pour leur accueil et aide toujours
bienveillants, particulièrement B.
Malika et surtout Madame
C.
Mizon qui, en plusieurs circonstances a bien voulu me
proposer son service.
- à tous les membres du Laboratoire de Bactériologie de la
Faculté de Pharmacie de LILLE,
en particulier :
feu Mademoiselle Bernadette
et Madame Neut C., pour leur immense contribution à la réali-
sation de ce travail.
-
au personnel du Lactarium de l'Institut Pasteur de LILLE,
pour nous avoir fourni le lait maternel.
à Madame Cordier, pour avoir accepté Sl gentiment de dacty-
lographier cette thèse.
GENERA LITES.
INTRODUCTION.
1
CHAPITRE 1. : MISE AU POINT SUR LA FLORE FECALE BIFIDE.
5
A) - ~~!~E!~!~~t~g~~~_<!~l~Jl~~J~E~l~_<!~E.?~!!~~~on :
6
H/ - Nature de la flore fécale du nourrisson alimenté au lait maternel ;
2°/ - Nature de la flore fécale du nourrisson élevé au lait de vache;
3°/ - Conclusion.
B) - ~!~~~_t:i~l~~~q~~.9~_~~_~~f!~~~:
9
1. Classification.
9
II. Identification:
10
1°/ - MorIhologie
2°/ - Caractéristiques physiologiques et biochimiques:
a) - Physiologie ;
b) - Besoins nutritionnels;
c) - Caractères biochimiques.
III. Recherche du B. bifidum dans les selles du nourrisson:
15
1°/ - Milieux de culture
2°/ - Mode opératoire:
a) - Préservation des Bifidobactérium ;
b) - Technique de recherche du B. b. utilisée; par NEUT,
ROMOND et BEERENS.
C) - ~p!~~~~t!~~_<!~~._.?!~i.9~~_<!~~~l~iE~~~~iE-_~~_~~~~~~~-_~~ :
17
10/ - Implantation naturelle;
2°/ - Implantation artificielle;
3°/ - Conclusim.
19
D) - ~~~i!~<:~t.!~~_~~1~J.!~E~J~~~.!~_~~·_.?.!~i~~~_~~~.!~~~~~.!I~~_ ~~E-.?~!!.!~~~~ :
10/ - Rôle présumé de B. bifidum :
a) - Emploi thérapeutique de B. b.
b) - Action préventive de la flore à B. b.
2°/ - Controverses autour de la question de B. b.
3°/ - Mécanisme d'action de B. bifidum :
a) - Par la production d'acides, il serait antagoniste de la flore
de putréfaction;
b) - Rôle métabolique de B. bifidum.
4°/ - Pourquoi persévérer dans l'exploration de la flore bifide dont le
rôle est encore très contesté.
E) - Conclusion.
25
CHAPITRE II.
: CONNAISSANCES ACTUELLES SUR LES FACTEURS BIFIDIGENES. 26
27
27
I. Méthode en milieu liquide :
27
1°/ - Méthode de GYORGY et Coll.
2°/ - Méthode de BEZKOROVA INY
II. Méthode en milieu solide de ROMOND, NEUT, et BEERENS.
31
14
I. Le lactose ;
34
II. Le lactulose ;
35
III. Le facteur bifidus l de GYORGY :
36
18 /
-
Mise en évidence;
2°/ - Relation structure et activité ;
3°/ - Mode d'action ;
4°/ - Les oligosaccharides du lait maternel:
a) - Les oligosaccharides neutres;
b) - Les oligosaccharides acides:
0<.) - relation des oligosides neutres avec les substances de
groupes sanguins.
c) - Les glycoprotéines et glycopeptides du lait de femme.
5°/ - Awlication clinique du facteur de GYOR GY.
IV. - Autres composés pourvus d'activité bifidigène :
56
1°/ - Facteur bifidus II de RA YNA UD
a) - Etude de la nature chimique du BF II
D) - Conclusions.
-----------
60
CHA PITRE III.
: TRA VA UX PERSONNELS.
61
A) - Introduction.
62
62
1.. - Etudes préliminaires
62
II. - Fractionnement du lait maternel:
63
1°/ - Précipitation de la caséine :
a) - Mode opératoire
b) - Résultats.
2°/ - Fractionnemment au sulfate d'ammonium:
a) - Mode orérato ire
b) - Résultats.
3°/ - Précipitation à l'acide perchlorique:
a) - Mode opératoire
b) - Résultats.
III. - Etude de la fraction active du lait maternel:
70
1°/ - Concentration:
a) - Ultrafiltration;
b) - Lyophilisation
2°/ - Traitement par la chaleur
3"1 - Hydrolyse acide
4al - Conclusion.
IV. - Chromatographie par gel filtration de la fraction active de lait de femme.
74
1al - Gel filtration sur biogel P6 :.
a) - Mode opératoire
b) - Résultats.
2 al - Gel filtration sur biogel P2
a) - Mode opératoire;
b) - Résultats.
V. - Fractionnement de la fraction active FA du lait maternel par chromatographie
77
sur résine échangeuse d'ions.
1al - Chromatographie sur résine échangeuse de cations, Dowex
50 x 8, forme acide:
a) - Mode opératoire;
b) - Résultats
2 al - Chromatcgraphie sur résine échangeuse d'anions Dowex 1 x 8,
forme acétate:
a) - Mode opératoire
b) - Résultats.
VI. - Conclusion.
82
C) - ~!~~~_<!~l~~c:tl~~t~_~~fl~~~~r:~.9~_~~!~~~~i-?~_~~_.9~_~}!_<!~!~~~~_~~~}~_~~~~~~~r:c_~
84
~~~_~~~c:l:~~~.!P~~~~~~r:t_~~J~.~r:~~~l~i.9.?~~~!~~~~IE-_ :
1al - Mode opératoire
2 al - Résultats.
87
I. - Définition du motif structural bifidigène :
87
a) - Etude de l'activité bifidigène des oligosides du lait de femme de
,
structure connue:
1°1 - Mode opératoire;
2°/ - Résultats.
b) - Dégradation ménagée du lacto-N-tétraose :
1°/ - Hydrolyse acide partielle
2°/ - Désacétylation par hydrzzinolyse :
a. Réduction par BH K
4
b. Désacétylation
c. Résultats.
II. - Recherche du motif structural bifidigène dans la fraction FAde lait
lfn
humain:
1°/ - Détermination de la composition en oses par chromatographie
en phase gazeuse :
a. Merle opératoire
b. Résultats.
2°/ - Réduction du produit FA pour BH4K
3°/ - Hydrolyse acide ménagée :
a. Avec l'acide trifluoroacétique ;
b. Avec l'acide sulfurique.
48 / - Conclusion.
CONC LUSIONS.
107
APPENDICE TBCHNIQUE
110
BIBLIOGRAPHIE
118
A B R E V I A T I O N S
U T I L I S E E S
~=~======================~===~
~====================
GLUCIDES
gal
: galactose
glc
: glucose
Fuc
: fucose
Man
: mannose
glcN
: glucosamine
ManNAC
: N-acétyl Mannosamine
glcNAC
: N-acétyl glucosamlne
NANA
: Acide N -acétyl neuraminique
NeuAC
: Acide neuraminique
ACIDES AMINES
Val
: valine
Asn
: asparagine
gIn
: glutamine
-@
: radical phosphate.
1
1 N T R 0 DUC T 1 0 I~
2
Il a été établi par l'observation clinique que les nourrissons alimentés
au sein souffrent moins de troubles digestifs, de diarrhées infectieuses et ont
un moindre taux de morta lité et de morbidité que les nouveau-nés élevés au lait
de vache ou aux laits artificiels. Les études statistiques de GYORGY (49) sont à
cet égard démonstratives.
Il apparaît que le mécanisme protecteur est très complexe et fait inter-
venir essentiellement:
- des facteurs chimiques dont les plus importants paraissent être les
immunoglobulines A de sécrétion (IgAs), la lactotransferrine et le
lysozyme;
- des facteurs microbiens représentés par l'esrèce Bifidobactérium bifidum,
spécifique des selles de nourrissons a llmentés au lait maternel
13EERENS, ROMOND et NEUT (5).
Ces deux types de facteurs semblent d'ailleurs agir en étroite association.
le but de ce trava il est d'étudier les facteurs bifidigènes contenus dans
le lait de femme qui favorisent spécifiquement la croissance de n. bifidum. En
leur absence, cette souche est incapable de se développer.
l a connaissance de leur nature chimique pourrait permettre de comprendre
le rôle exact joué par la flore bifide et conduire éventuellement à leur pré-
paration par synthèse chimique ou par voie microbiologique, afin de lutter efficace-
ment contre les diarrhées infectieuses des nourrissons si redoutables en bas âge.
Après avoir fait le point des nombreux travaux qui sont parus sur cette
question, nous nous sommes attachés à isoler à partir du lait humain, une fraction
contenant l'essentiel de son activité biologique. Celle-ci a été ensuite purifiée à
l'aide des techniques classiques de chromatographie de gel filtration et d'échange
d'ions. Enfin, nous avons cherché à préciser la nature chimique du motif structural
responsable de cette activité biologique.
:::::-=-=-=-=-=
MORTALITE PAR
TYPE D'ALIMENTATION
NOMBRE DE CAS
MORTALITE p. 1000
MORBIDITE p. 1000
MORBIDITE p. 100
- Sun.
971
10, '2
223,4
4,6
- M<-xte.
1441
25,7
464,2
5, 5
- AJz:UfJ.-uelie.
854
57,3
573, 7
10,0
TABLEAU 1.
Tau.x de. motLb"i.ciJ.é et de. moJLtaLUé c.he.z lu e.n.6ant6 n.o~ au. -6 e.-tn. ou. tLe.c.e.vant W1e. ai.{.me.ntet:0i.on.
mixte. ou. att.t.{.fJ.-ue.lle. (GYORGY P. cité raft. MONTREUIL J. -94-).
w
4
G E N E R ALI TES
5
CHA PIT RE Il NISE AU POINT SUR LA FLORE FECALE BIFIDE
6
A. - Caractéristiques de la flore fécale du nourrisson.
le tube digestif du nouveau-né, stérile à la naissance, est envahi en quelques
jours par des espèces microbiennes variées. On peut distinguer parmi celles-ci:
- des germes potentiellement pathogènes;
- des germes saprophytes dont certains sont bénéfiques pour l'hôte. Parmi
ces derniers, Bifidobactérium bifidum (B. b.) semble jouer un rôle parti-
culièrement intéressant pour le nourrisson.
1-/ - Nature de la flore fécale du nourrisson alimenté au lait maternel:
l es selles des enfants nourris au sein présentent un aspect granuleux,
une odeur aigrelette, un pH acide (4,8 à 5,2) caractéristique
NETMANN et Coll.
(100).
Ceci est sans doute en rapport avec la composition particulière de la flore fé-
cale de ces derniers qui est formée à 90% par B. bifidum l EVESQUE
(80).
Ceci
avait été mis en évidence par les travaux de NEJMANN et Coll., SMTTH et Coll. (136,
137), TISSIEF (144, 145) et plus récemment par ROMaND, BEERENS et NEUT (126)
1
8
qui trouvent un nombre de l'ordre de 10 0 par gramme de selles contre 10 bactéries
par gramme de matières fécales pour les Entérobactériaceae.
Toutefois, le B. b. perd sa prédominance dans les selles dès que l'on
passe à l'allaitement mixte ou au lait de vache, au profit des Entérobactériaceae
(ROMaND, BEERENS, NEUT et MONTREUIl
(126),
avec un taux de 1010 E. coli
par gramme de selles, alors que le nombre des B. bifidum devient mineur. Quant
au pH des selles, il se situe à des valeurs proches de celles de l'adulte pH 6,5,
BULLEN et WTLLTS (19). Selon LEVESQUE (81), quand le lait de femme représente
1/3 ou 1/4 de la ration alimentaire de l'enfant, le B.b. disparaît. les derniers
auteurs pensent que les B. b. ne sont pas responsables des conditions particulières
de l'intestin des nourrissons élevés au sein, mais que c'est le tube digestif qui offre
un biotope tel qu'il se produit une sélection ,des Bifidobactérium. Us suggèrent que
le taux élevé du lactose, la faible teneur en protéines et le pouvoir tampon inférieur
7
du lait maternel donnent des conditions plus favorables au développement des
Bifidobactérium. Au contraire, les autres bactéries sont plus ou moins inhibées
par la teneur élevée en lactotransferrine ainsi que par la présence d'anticorps
spécifiques (lgA s).
LEVESQUE J., A ICARDT P. et GA UTIER (79) confirment que la bonne
adaptation du métabolisme du lait de femme au tube digestif du nourrisson est
responsable de la flore bifide.
2°/ - Nature de la flore fécale du nourrisson alimenté au lait de vache:
L'alimentation artificielle ou le lait de vache amène une diversification
de la flore intestinale chez le nouveau -né.
Les selles prennent un aspect caractéristique proche de celles de l'adulte.
Elles sont d'une consistance ferme avec une odeur putride et un pH compris entre
6, Oet 7,0 (NEUT et Coll.
(98).
J'examen microbiologique révèle un nombre
élevé:
6
8
- d'Entérobactéries 10 à 10 cellules par gramme de selles
7
9
- d'Entérocoques: 10 à 10 bactéries par gramme de selles
7
8
- d'A naérobies gram négatifs : 10 à 10 bactéries/g de se Iles.
De temps à autre, Bactéroïdes et Clostridium apparaissent favorisant l'alca-
linisation du milieu et la putréfaction TASSOVATZ et KOTSTTCH
(138).
Les
Bifidobactérium sont également présents, mais à un taux inférieur à celui de l'en-
fant nourri maternellement. Ils représentent en moyenne 1 %de la flore totale.
Dans ces conditions, on est en droit de se demander si le lait de vache
s'oppose à la multiplication des Bifidobactérium. Beaucoup d'auteurs l'admettent
et attribuent ce fait à la richesse en calcium et à la richesse en protéines du lait
de vache. TORNARElll et Coll. (147) trouvent que les graisses du lait de vache
sont aussi un élément inhibiteur des B. b .•
Pour confirmer cette affirmation, LEVESQUE (80, 81) a rapporté les
conclusions des travaux faits par GYORGY aux Etats Unis et qui portent sur le rôle
des lipides présents dans le lait de vache. Ce dernier remplace dans le lait de vache,
ses graisses par des huiles végétales riches en acides gras non saturés: acide
linoléique et acide linolénique.
8
Et selon l EVESQUE, les laits ainsi obtenus auraient permis une implantation
du B. b. comparable à celle de l'allaitement maternel. Mais,de l'aveu de ce dernier,
ces laits ne semblent pas d'une innocuité absolue. Comme par ailleurs, le métabolisme
du lait de vache est incomplet dans le tube digestif du nourrisson d'après LEVESQU8,
il est possible que toutes ses qualités bifidigènes ne s'expriment pas dans ces
conditions.
3"; - Conclusion:
n ressort donc de cette opposition entre les deux types d'allaitement que:
- le Bifide se multiplie jusqu'à devenir l 'hôte prédominant des selles en cas
d'allaitement maternel;
- l'allaitement a rtificiel ou mixte empêche son développement.
Il reste à savoir si cette différence influe sur la bonne santé du nourrisson.
9
B. - Etude biologique du Bifidobactérium bifidum :
T. - Classification:
Depuis 1899, la terminologie de ce genre a subi plusieurs modi-
fications. Elles ont d'abord été confondues avec les Bactéroïdes, puis ensuite avec
les lactobacillus, ce qui explique les nombreuses terminologies que l'on trouve dans
la littérature
- Bacillus bifidus Communis (TISSTER, 1900) ;
- Bactéroïdes bifidus (CASTEIlANI et CHALMERS, 1919)
- l actobacillus bifidus (KUI P et R ETTGER, 1924)
- Bifidobactérium bifidum (ORlA-JENSEN, 1924).
les Bifidobactéries sont désormais regroupées dans un genre
propre intitulé : "Bifidobactériumli, du latin Bifidus = divisé et du grec : baktérion =
baton.
Ce genre comprend 11 espèces parmi 'lesquelles: B. bifidum,
B. ado lescentis 1 B. longum, B. infantis sont celles que l'on trouve souvent dans les
selles d'enfants ou d'adultes. B. bifidum est l'espèce spécifique des selles des
nourrissons alimentés au lait de femme. l a souche type de cette dernière est celle
de TISSTER (ou souche Ti) qui est entretenue en collection. Mais elle présente quel-
ques réactions bien particulières du fait de ses conditions de conservation.
Quant à B. bifidus,variété Pennsylvanicus (var Penn) c'est une
sruche mutante, particulière de B. bifidum. Elle a été isolée pour la première fois
par GYORGY et Coll. (44) à partir des selles d'enfants ou de sécrétions vaginales
de femmes enceintes.
les Bifidobactérium représentent un groupe homogène, individualisé
par leur pourcentage de guanine-cytosine qui est de 60,1 : 0, 33% contre moins de 50%
prur les Iactobacillus SCARDOVI et Coll.
(128, 129).
10
II. - Identification
Elle repose slir les caractères suivants
18 / - Morphologie:
B. bifidum est un bâtonnet asporulé, immobile, acilié gram-positif
ayant une longueur de2 à 5 }Jm, une épaisseur de 0,5 ,.am à 0,7 um PREVOT
(117).
Il est soit isolé, soit groupé en paire ou bien en amas. Ses contours sont irréguliers,
ondulés avec des extrémités soit effilées, soit renflées en massue ou souvent bifur-
1
quées.
Son polymorphisme prononcé a donné lieu à la description de diffé-
rentes formes: fines, épaisses, bifides, en "Y" ou en "V" qui dépendent des conditions
culturales et nutritionnelles. HAYWARD et Coll. (164) ont observé que si les cultures
de B. b. sont répétées, on note moins de polymorphisme avec prédominance de la
forme en bâtonnet.
Les colonies présentent des formes variées.; on y distingue trois types
R, S, M. Elles ont un centre jaunâtre d'aspect porcelainé, visible à l'examenr.du tube
par transparence sur fond éclairé (89)~. ~~f!fr:C;~~'ractère, elles se différencient des
colonies lenticulaires et régulièreS/~~\\~~dôn;;;;Î:il';~~bacilleet l'entérocoque en
gélose profonde. BEERENS, GERNHD.et GUI!lrlA U,ME~.. (4) pensent que l'aspect morpho-
Ij~.
~/.:t·
lcgique des B. b. n'est pas toujours\\J~.ractéristiqUe.9lf' grouIE. le seul intérêt de la
\\' ~
/ 0 /
morphologie, selon ces auteurs, réslct:e. dalYs-la. différenciation entre Bifidobactérium
'.t)€~
et Actinomycès. En
aucun cas, les premiei's ne donnent de croissance mycélienne,
alors que les seconds le font.
2·/ - Caractéristiques physiologiques et biochimiques:
a) - Physiologie:
===========
B. bifidum est anaérobie strict. Certaines souches sont microaé-
rophiles et d'autres peuvent devenir anaérobies facultatives. Il n'est pas considéré
comme pathogène. Sa température optima de croissance est de 378 C ; le pH optimum
de multiplication se situe entre 5,5 et 5,9 TASSOVATZ et Coll.
(139).
NE UT , ROMOND et BEERENS (98) considèrent l'espèce B. b. comme un groupe
nutritionnel homogène. Ils ont observé en effet pour les souches de ce groupe, un
11
comportement identique au cours d'une étude des besoins nutritionnels de celles-ci.
JAMES A. et Coll. (59) et RAYNAUD (118) ne sont pas de cet avis. Pour eux,
l'espèce B. bifidum doit être considérée comme hétérogène, comprenant divers
types nutritionnels et divers types sérologiques.
les souches appartenant à l'espèce B. bifidum présentent une
certaine tendance à la mutation. Une de ces mutations conduit à la perte du carac-
tère anaérobie strict et simultanément à une modification morphologique et anti-
génique. NORRIS, FLANDFES, TORNARElIY et GYORGY (106) proposent d'appeler
cette variante aérobie et dépourvue de ramification: "Lactobacillus parabifidus".
b)- Besoins nutritionnels:
====================
On peut observer dans le genre Bifidobactérium, comme dans
beaucoup d'autres, des variations plus ou moins importantes dans les besoins
nutritionnels, des souches distinctes rattachables à la même espèce par leurs
caractères généraux.
Différents biotypes ont été séparés au sein du groupe
Bifidobactérium, en fonction de leurs besoins nutritionnels NEUT et Coll. (98).
BERGEY (6)
et,
plus particulièrement, en fonction de la nature des sucres
ferments (TABLEAU 2). Il ressort de l'étude faite par HASSINEN et Coll. (54) sur
les besoins minima de cette espèce que :
- les vitamines indispensables au développement dé B. bifidum sont: la
biotine et la pantothénate de calcium ;
- les purines et pyrimidines ne sont pas essentielles ;
- le seul amino-acide indispensable est la cystéine. Celle-ci peut être
remplacée par la cystine. Mais, elle ne peut pas l'être par la méthionine,
ni par l 'homocystéine ;
- les besoins azotés peuvent être couverts par la cystéine et un sel
d'ammonium.
1
1
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E S P E CES
! AILabino.6e. ! XyR..O.6e. 1 R<-bO.6e.! Ce.11.obio.6e. 1 Lac;to.6e. 1 ManiU-toR.. 1 Ma..Uo.6e. \\ Sac.c.hMO.6e.
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- B. Bi 6idum
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- ou. +
(ORLA-JENSEN,
1924)
- B. in6~
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(REUTER 1963 e.t 1977)
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- B. R..ongum
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(REtIrER,
7963)
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1
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- B. bILe.ve.
1
J
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(REtIrER,
796 3)
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,
(REtIrER,
1963)
1
1
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1
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1
1
1
1
TABLEAU
2
CMac;tèILe.J.J biocJUnu..que.J.J de.J.J e.J.Jpèc.e.J.J du ge.nILe. BiMdobac;tétU.um.
NEtIr, ROMONV e.t BEERENS (97) j BERGEY, 7974 (6).
"'"'
~
13
c) - Caractères biochimiques:
=======================
La question a été étudiée en 1957 par BEER ENS, GERARD et
GUILLAUME (4), puis par PREVOT (117) en 1961.
Ces travaux révèlent:
- l'absence de catalase, de réduction des nitrates, de production d'Indole,
de fermentation du glycérol ;
- le lait est rapidement et complètement coagulé, mais sans formation de
gaz;
- les protéines coagulées ne sont pas attaquées
- l'eau peptonée est troublée;
- la gélatine n'est pas liquéfiée;
- il Y a fermentation du glucose, du lactose, du lévulose et du galactose avec
forte acidification du milieu.
Plusieurs auteurs
MAYEB et MOSER
(98),
MA LYOTTE et
BA UER ('83)
ont signalé la variabilité des autres caractères de fermentations
sucrées, en particulier pour l'arabinose, le saccharose, le xylose et le mannitol
(TABI EAU 2).
La fermentation du mannitol est un caractère qui permet de
présumer de l'origine buccale de la souche de B. bifidum. Par contre, l'absence
de fermentation de cet alcoo 1 reste l'apanage de la majorité des souches fécales
BEERENS (4).
On peut se demander s'il s'agit d'un caractère adaptatif à un
habitat déterminé ou d'un caractère propre à une variété de l'espèce ? GVILLA UME,
BEERENS et OSTEUX ont signalé en 1956 que seul l'acide acétique se forme au
cours de la fermentation du glucose par B. b.
Ce type fermentaire particulier
a été confirmé en 1957 par BEERENS et Coll., puis en 1961 par PREVOT. Mais
ce dernier ajoute qu'il se forme aussi de l'acide lactique dans le rapport: trois
parties d'acide acétique pour une partie d'acide lactique et de petites quantités
d'acides formique et succinique.
Pour KUHN et TEDMANN (66), la fermentation du glucose se
fait par voie glycolytique pour conduire à la formation des acides lactique et acétique.
En 1967, la voie de la fermentation des hexoses a été élucidée par VRIES et
STOUTHAMER (153) et en 1976 par 1 AUER et KANDLER (76) par dosage des produits
14
formés après fermentation du glucose 14C - 1. Ces auteurs pensent que la
fructose-6@phosphokétolase est l'enzyme principale de cette voie métabolique.
Celle-ci a été découverte par SCHRAMM et Coll. (133) dans une bactérie aérobie,
Acétobacter xylinum, ensuite mise en évidence dans l euconostoc mésentéroïdes.
l,es différentes étapes de cette voie de fermentation peuvent se résumer de la
façon suivante : les hexoses sont d'abord transformés en fructose-6@qui est
ensuite coupé par une phosphokétolàse pour former l'érythrose-4@et l'acétYl@.
L'érythrose-4®et le fructose-6@donnent naissance à deux molécules de
pentose-®gr§ce à l'action d'une transaldolase et d'une transkétolase.
le xylulose-5®formé est alors coupé par la phosp~okétolaseen acétyl ® et
3@glycéraldéhyde. le dernier composé se transforme finalement en pyruvate
qui est, soit réduit en lactate, soit transformé en acétate et formiate probablement
grâce à une réaction de phosphorylation. Les prcduits formés en définitive sont
les acides acétique et lactique dans le rapport 1,5/1,0 selon MATTEUZZI (87).
L'existence de toutes ces réactions biochimiques chez B. bifidum démontre la
richesse et la complexité de l'équipement enzymatique dontdispose celui-cl.
Cela confirme la thèse défendue en 1971 par MONTREUIL (94), en 1977 par
BEZKOROVA TNY (10) et en 1978 par FONTA INE (28, 29, 30), qui avaient déjà
signalé la présence d'une multitude d'enzymes dans cette bactérie.
15
TH. - Recherche du B. bifidum dans les selles de nourrisson:
101 - Milieux de culture:
l a recherche du B. bifidum dans les selles de nourrisson a repris un
intérêt nouveau depuis les travaux consacrés par divers auteurs aux régimes
- bifidigènes artificiels (88) et milieux de culture.
TTSSIER en 1900, utilise avec succès la gélose Veillon ordinaire
pour l'isolement du B. bifidum.
Divers milieux synthétiques simples ont été proposés par la suite
par VON PLûTHO(152), HASSINEN (54), PETUELY et LYNA U (113). RA YNA UD et
l EVESQUE pensent que ces milieux ne peuvent âtre d'un emploi général. En effet,
ils ne permettent d'isoler que des souches de Bifidobactérium à besoins minima,
qui ne constituent qu'une faible proportion de la flore du nouveau-né. le milieu
TORNARELLI-NORRIS (146) a fourni de bons résultats aux chercheurs américains
qui ont pu isoler de nombreuses souches à partir des selles denourrissons au sein.
Appliqué à la recherche du B. bifidum dans les sécrétions vaginales où ce germe
n'est pas l'élément prédominant de la flore, il a permis à HA RFISSON et al. (52)
d'isoler le B. bifidum. Le milieu de NORRIS-TORNAREI Il par addition de lait
huma in ou d'autres sources de facteurs bifidigènes favorise l 'iso letmnt de la souche
Penn.
Pour isoler le B. bifidum à partir des selles, RA YNA UD recommande
le milieu de BLA UROCK (16, 17). Cependant, NORRIS et al. (106) le trouvant peu
efficace, ont cherché à l'améliorer par des additions diverses: jus de fruit, jus de
végétaux,. lait maternel.
Mais aucune de ces combinaisons ne leur est apparue satisfaisante,
et ils ont proposé une formu le modifiée de ce milieu en fixant le taux de cystine
à un niveau (2,5 à 10 mg/l) plus bas que celui qui est utilisé par BLA UROCK (100 mg/l).
Le milieu ainsi obtenu se révèle de beaucoup le plus efficace affirment
ces auteurs.
Lorsqu'on s'adresse à une source riche en B. bifidum comme
les selles de nourrissons au sein, RA YNA UD recommande le milieu de B lA UROCK
modifié.
Si le B. b. est plus rare dans le matériel étudié: selles d'enfants
16
à régimes faiblement bifidigènes, selles d'adultes, sécrétions vaginales, on a intérêt
à ajouter de l'acide sorbique neutralisé, au taux final de 0,12% pour améliorer sa
sélectivité.
2-/ - Mode opératoire (97, 98, 99) :
a) - Préservation des Bifidobactérium :
==========~================~===
La fragilité du B. b. et l'anaérobiose indispensable pour son
développement rendent nécessaires cert~ines précaut~ons de prélèvements. En
effet, sa mise en culture impose:
- de la rapidité dans les manipulations, afin d'éviter tout contact prolongé
du germe avec l'oxygène ;
- l'utilisation des jarres hermétiques permet d'obtenir l'anaérobiose
nécessaire grâce au système gaspack, petites pochettes contenant 2
comprimés: l'un de bicarbonate de sodium et de l'acide tartrique, l'autre
de l 'hydrure de bore, dégageant en présence d'eau, soit du CO
ou de
2
l'hydrogène.
De l'aluminate de palladium, jouant un rôle catalyseur,
est incorporé au couvercle de la jarre.
t
Les selles sont prélevées, soit par écouvillonnage rectal, soit
immédiatement après leur émission sur langes stériles. Elles sont en général con-
servées en jarre anaérobie, et depuis peu de temps, par culturette.
\\1
Les culturettes sont fabriquées par Marion ScientUïc Corporation,
il
USA. Les prélèvements sont examinés et mis en culture dans les six heures qui suivent.
Après des dilutions faites dans du Ringer Cvstéiné, ils sont ensemencés sur du milieu
v. L. solide additionné de sang de cheval. Après 5 jours d'incubation à 378C, en
anaérobiose, les Bifidobactérium sont isolés et identifiés en fonction de leur morpho-
logie, des caractéristiques biochimiques décrites selon BER GEY. Les souches isolées
sont conservées sous forme congelée à -20-C dans un milieu Rosenow cystéiné et
paraffiné.
17
C. - Tmplantation du B. b. dans l'intestin du nourrisson.
De nombreuses questions sont évoquées au sujet de la colonisation de l'intestin
du nourrisson par le B.b.
Tout d'abord, d'où vient le Bifide?
Comment les premiers germes s'implantent-ils chez le nouveau -né?
A quel âge se fait cette implantation? et dans quelles proportions se fait-
elle?
Autant de questions qui attendent une réponse pour mieux comprendre le
mystère qui se développe autour de la question du B. b.
1-/ - Tmplantation naturelle:
Tl apparaît incontestable que le B. b. fait partie de la flore vaginale et
qu'il s'implante chez le nourrisson dès le premier jour de sa naissance, au plus tard
le troisième jour dans les cas d'accouchement par les voies naturelles; plus
irrégulièrement et tardivement après césarienne (RIESS cité par MAYER). Ces
faits sont à rapprocher des constatations de BLA UROCK (17) qui affirme que
90% des femmes examinées par lui présentent le B. b. dans les sécrétions vaginales.
D'après cet auteur, il est probable que dans les maternités, les mains des infirmières
et des accouchées soient l'un des modes de diffusion de B. b. MAYER et MOSER (88)
ont montré sa présence 30 fois sur 11 0 échantillons de lait de femme et dans le
colostrum avant toute tétée, donc sans contamination possible par la bouche de
l'enfant.
1 es mêmes auteurs admettent sa présence dans la glande mammaire.
Toutes ces constatations viennent donc confirmer les travaux de
HOWE et HATCH en 1919, HALLet PREVOT en 1937, cités par BEERENS et Coll. (4)
qui rapportent que l'intestin du nourrisson n'est pas le seul habitat du B. b. En effet
ces chercheurs affirment l'avoir trouvé dans les caries dentaires.
Quoiqu'il en soit, le B. b. est présent dès les premières selles du
nouveau-né LEVESQUE (81).
Mais d'après TASSOVATZ et al. (139), le Bifide ne se maintient que
si l'enfant est en équilibre parfait. Car, disent-ils, le moindre dérèglement:
diarrhées, infections le fait disparaître des selles; et une flore ordinaire contenant
des E. coli, entérocoques ... etc.pullule à sa place.
18
TASSOVATZ et KRAGOUYEVTTCH pensent qUe l'implantation naturelle
du B. bifidum passe obligatoirement par le maintien de l'enfant au sein ou par la
prise quotidienne de lait de femme frais non pasteurisé, à la dose minima de 400
grammes.
2°/ - Tmplantation artificielle du Bifide chez le nouveau-né:
Flle fut réalisée d'abord par TTSSn:'R, à l'aide d'une culture fraîche
de B. bifidum prise per os.
LEVESQUE, AICARDI et GA UTIER (79) ont utilisé par la suite du
B. b. lyophilisé. ns pensent que l'implantation artificielle du Bifide est plus faci-
lement réalisable à l 'aide d,~ cette dernière préparation. En utilisant une culture
de B. b. lyophilisé, ces chercheurs ont réussi à obtenir une implantation du
B. bifidum chez des enfants nourris au lait de vache.
Pour qu'il y ait une implantation suffisante, ils préconisent
d'administrer 10 millions de germes (cultures de bifidum lyophilisé) par jour, avec
des régimes non bifidigènes.
Nous avons obtenu disent-ils, grâce à cette méthode, en deux ou
trois jours, chez des nourrissons bien portants, des implantations de 40 à 70%
de bifidum qui persistaient après arrêt de l'administration. Mais, selon eux, il ne
faut pas donner de trop fortes doses de cultures lyophilisées. Bn effet, une dose
de l'ordre de 100 millions de germes par jour provoque de brusques diarrhées
qui vont à l'encontre du résultat cherché.
Mais une telle pratique reste critiquable, dans la mesure où :
- d'une part il n'existe aucune corrélation qui lie l'implantation du
B. bifidum et la quantité de germes lyophilisés administrée.
D'ailleurs, on ne peut pas attribuer totalement l'apparition de la
flore bifide dans les matières fécales du nouveau-né au seul fait
d'administrer une culture de B. b. lyophilisée. En effet, les enfants
nourris au lait de vache présentent quand même un nombre non
négligeable de B. b. dans leurs selles;
- d'autre part, le problème qui se pose est celui de la définition de la
dose limite de B. b. à ne pas dépasser. F:'n effet, si l'on tient compte
de l'extrême fragilité de la flore bifide à la moindre perturbation de
l'organisme du petit enfant, la définition d'un tel seun doit prendre
19
en compte l'état physiologique de chaque patient, et surtout sa
tolérance au régime proposé.
3°1 - Conclusion:
Tl est donc admis par tous que le B. bifidum existe chez le nouveau-
né dès les premiers jours de sa naissance. Et, il est possible de l'implanter dans
les selles de celui-ci s'il en est absent, en administrant des cultures de B. b. pourvu
que ce soit à des doses modérées. Mais, le germe ne se maintiendra que si l'enfant
est en bonne santé.
D. - Signification de la flore fécale à B. bifidum dominant chez le nouveau-né.
Que signifie cette prédominance de B. b. quand le nouveau-né est allaité
par sa mère?
On peut se demander si la flore bifide est à l'origine de la plus grande
résistance aux troubles digestifs du nourrisson élevé au lait maternel par rapport
à ceux qui sont nourris au lait de vache? Selon les statistiques de GYORGY (49), les
enfants au sein présentent une morbidité et une mortalité plus faibles.
1el - Rôle présumé du B. b. dans l'intestin:
a) - Emploi thérapeutique du Bifide:
==========================~=
D'après les constatations faites par TISSIER en 1900 chez les
nourrissons au sein, la flore bifide s'oppose au développement des autres germes.
Elle joue par conséquent un rôle de protection de l'intestin contre l'action des bac-
téries pathogènes.
Pour confirmer ses observations, TISSIER (142) tente en 1905
un traitement des infections intestinales chez des nourrissons par modification de la
flore bactérienne. D'après cet auteur, les infections intestinales du petit enfant,
étant dues essentiellement à l'action des bactéries putréfiantes, le processus putride
peut être arrêté en favorisant dans le tube digestif, le développement des bactéries
acidophiles, analogues à celles de la flore fécale du nourrisson normal. Pour arriver
à ce résultat, il fait administrer aux patients une culture pure de l actobacillus ou
20
d'un mélange de cette eSIBce avec B. b., quand ceux-ci sont absents de l'intestin.
En produisant des acides, ces derniers inhibent l'action des germes putréfiants et
leur degré de développement s'ajustera aux conditions de pH du milieu pour main-
"
tenir son acidité. Ceci étant complété par un régime riche en hydrates de carbone,
ne contenant qu'une infime quantité de substances protéiques.
La régression en
quelques jours des troubles digestifs et de la fétidité des selles, la restauration en
deux ou trois mois de la flore intestinale, ont confirmé son hypothèse. Parallèlement
à ses recherches, TISSIER étudie le phénomène de putréfaction. Cette étude lui
permet de distinguer dans les selles (144, 145) :
- une flore permanente dont les germes saccharolytiques, parmi lesquels
on cite B. bifidum,ont un rôle inhibiteur vis-à-vis des germes patho-
gènes grâce à une fermentation acétique ;
- une flore accessoire, labile,à laquelle participeraient les germes de
putréfaction et dont il démontre la variabilité en fonction de l'alimentation.
TASSOVATZ et KRA GOUYEVITCH (139), reprenant les expé-
riences faites par TISSIER, réalisent le traitement de l'entéro-colite aiguë bactérienne
chez le nouveau-né par ingestion de cUltur~"îW6~eede B. bifidum,
L'expérience Cliniq~~~';~,rs,se limite aux cas d'entéro-
l
" 4
\\
r-~
colite aiguë de gravité moyenne, comf?r~a~u&~~~ge~.entde l'état général d'intensité
modérée, avec émission de selles d'as~eet ~~\\t·i~,led'une entérite. Comme agent
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~ ~
sans addition d'aucune préparation médicamenteuse, ni antibiotique,ni vitaminique. Ce
traitement a permis d'obtenir)affirment-ils,chez les patients, une amélioration
rapide des selles, suivie bientôt de guérison.
Des résultats analogues auraient été également obtenus avec des
enfants allaités au lait de vache et atteints de diarrhées infectieuses.
b) - Action préventive de la flore à B. bifidum :
==================~=====~===========~~
Dans le but de confirmer l 'hypothèse de TJSSIER d'un rôle
protecteur du B.b., TASSOVATZetKOTSJCHen1961 (138) démontrent que la flore
21
fécale à B. b. parvient à réaliser chez le nouveau-né une protection naturelle efficace
contre les E. colf pathogènes.
Tl est particulièrement remarquable que ces travaux plus
récents viennent confirmer les résultats originaux obtenus par TTSSTER, il ya
plus de 70 ans. Pour étayer leur démonstration, TASSOVATZ et KOTSICH ont
étudié sur des nourrissons, en milieu hospitalier, des cas d'infection endémique
par les colibacilles (0
B ) avec présence constante durant six mois de porteurs
111
4
de germes parmi les enfants, et apparition périodique de cas d'entéro-colites
aiguës.
La disparition des porteurs de germes et l'assainissement
du milieu hospitalier furent réalisés affirment-ils d'une façon durable, gr~ce
au développement de la flore intestinale à B. b.
Cette flore fut obtenue par l'allai-
tement au sein exclusif ou bien par l'allaitement avec du lait de femme frais, non
pasteurisé, donné immédiatement après traite aseptique.
Quant à MATA et URRUTIA (86), ils ont étudié des cas
d'infection par des E. coli entéropathogènes chez des enfants nourris au sein,
en milieu rural, au Guatemala. Les auteurs n'ont trouvé aucune infection à
E. coli chez les patients. Tls en ont conclu que c'est la prédominance des Bifides
dans les matières fécales de ces enfants qui est responsable de la résistance de
ces derniers à l'infection par les E. coli entéropathogènes.
De même en 1969, MATA et al. (86) parviennent à la même
conclusion, en travaillant sur des cas d'infection de Shigella au Guatemala. Sur
209 enfants étudiés par ces chercheurs, 109 sont soumis à l'allaitement maternel
dont 4 seulement ont eu une infection par Shigella avec diarrhées graves.
MAYER (88) de son côté, a mis en évidence en 1965, l'inhi-
bition de virus entériques par les Bifides. Ceci a été confirmé par TASSOVATZ
et lŒAGOUYEVTTCH en 1964 et par HAENEI (53) en 1970.
2-/ - Controverses autour de la question du Bifide:
Malgré toutes les preuves concrètes et évidentes apportées par
TISSŒR et bien d'autres, tout le monde ne partage pas la thèse défendue par
ceux-ci.
En effet, certaines constatations cliniques faites par PETUEI Y et
22
Coll. (113, 114) et par l EVESQUE (SO, Sl) sont contraires à celle-ci. Il s'agit
de l'instabilité de la flore bifide lors de diverses affections. Un simple trouble
digestif ou bien une infection parentérale sans gravité ont, semble-t-il pour effet
la disparition du B. bifidum et sa substitution par une flore mixte de putréfaction
(Bactéroïdes, Clostridium ••• etc). Tl y a tout de même, dans cette fragilité de
l'équilibre bifide de l'intestin, quelque chose d'étonnant et qui est préj udiciable
au rôle présumé d'agent de protection de ce germe. Pour LEVESQUE, il n'y a
pas de parallélisme entre la présence ou l'absence du Bifide et la survenue ou
non d'accidents sévères, de troubles digestifs chez le petit enfant. Dans ces
conditions, ce qui protège le nourrisson contre la maladie ne serait pas un principe
bifidigène. WAGNER et STAn (154) à ce sujet restent plutôt prudents dans les con-
clusions de leurs travaux sur le comportement des souris germfree en présence
d'une culture bactérienne contenant des B. b. et des Salmonella typhimurium.
Ces auteurs ont observé que si l'on administre le mélange de ces deux germes
à des souris germfree, le Bifide disparaît de l'intestin des animaux après 14 jours
d'expérience. Mais la question est de savoir si l'on peut imputer la disparition
des B. b. de l'intestin à un effet inhibiteur exercé par les Salmonelles ou bien à des
conditions peu favorables au développement des Bifides offertes par l'intestin des
souris.
Devant cette énigme, les auteurs pensent que de tels résultats ne
sont pas assez concluants pour attribuer au B. b. un rôle protecteur de l'intestin
contre l'action des bactéries pathogènes.
Si le Bifide s'avoue vaincu avec une telle facilité et disparaît
ainsi au moindre fléchissement de l'organisme, est-il vraiment un acteur?
N'est-il pas simplement un élément utile à la croissance, un témoin de la bonne
santé de l'enfant?
L'ensemble des auteurs allemands paratt admettre que B. b. est
au premier rang des bacilles utiles.
Pour METCHNIKOFF (174), la flore acidifiante est un gage de
bonne santé. l'usage des laits fermentés, yoghourts est le témoin d'une longue
tradition à ce sujet.
23
Si B. b. n'est pas seulement un témoin de bonne santé du tractus
digestif, par quels mécanismes participe-t-il activement à sa défense?
38 / - Mécanisme d'action du B. bifidum.
, a) - Par la production d'acides variés, il serait antagmiste
=~=================================~=============
de la flore de putréfaction.
========================
Tout un groupe d'auteurs, PREVOT et RAYNAUD (116),
ORI A-JENSEN (109) ainsi que MA NC TA UX (85) ont constaté que,dans leurs études
expérimentales, la flore à B. b. détermine in vitro l'apparition des acides lactique
et acétique ainsi que des acides ~propionique, formique et butyrique. Cette produc-
tion d'acide, en abaissant le pH des matières fécales de l'enfant au sein à 4,
inhibe le développement des autres germes intestinaux, tels que: les Klebsiella,
les Salmonellae, les Shigellae, les Staphylocoques. Tous ces germes disparaissent
déjà à pH 4,6.
Par contre, B. b. subsiste bien que son pH optimal de croissance
soit de 5,5. WJlIIS et Coll. (155) pensent que l'accumulation d'acide acétique est
un facteur important de prévention de la prolifération intestinale d'Entérobacteriaceae.
NETMANN, LA VERGUE et MA NC lA UX (100) rapportent que cet antagonisme biologique
entre flore naturelle à B. b. d'une part, et de tous les autres germes intestinaux,
saprophytes, pathogènes d'autre part est fondé sur les changements de pH du milieu
intestinal ainsi que sur l'appauvrissement de ce milieu en substances nutritives.
Pour DELBOVE, FRISEr l et GYORGY cités par NEIMANN et Coll. (100), cet
antagonisme est surtout basé sur l'utilisation du milieu nutritif. Chez le petit
enfant nourri maternellement, la croissance de B. b. étant favorisée par le
"Bifidus factor", les autres germes restent privés de leurs éléments nutritifs
et finissent par disparaltre.
Malheureusement, cette action reste négligeable in vitro
par suite de la déroutante fragilité du B. b. qui amène sa disparition à la moindre
agression de l'organisme.
24
b) - Rôle métabolique de B. bifidum.
=============================
D'après les recherches faites par l EVESQUE en 1959 et par
TASSOVATZ et Coll. en 1961, le B.b. est un agent de synthèse des vitamines
BI ' B2 et K.
Ceci a été confirmé en 1965 par NETMANN et Coll. Ces
derniers constatent que la forte acidification du milieu intestinal, du fait de la
synthèse d'une multitude d'acldes par B. b. favorise l'assimiiation du calcium
imisé, des vitamines liposolubles, une absorption accrue des lipides et une épargne
protidique.
48 / - Pourquoi persévérer dans l'exploration de la flore bifide dont le
rôle est encore très contesté?
Compte-tenu des controverses qui se déveloPIBnt autour du rôle
exact du B. b.
Quel intérêt y a-t-il à essayer de l'implanter dans l'intestin de l'enfant?
Parce que le Bifide est au minimum un critère de bonne santé et un
témoin d'équilibre nutritionnel de l'enfant.
Et que, par ailleurs, la découverte d'un facteur nécessaire à la crois-
sance in vitro d'un microbe peut équivaloir à la découverte d'un facteur nutritionnel
pour l'homme. Un certain nombre de vitamines (B
' acide folique) ont ainsi été
12
identifiées.
Si le Bifide en soi n'a pas d'action visible sur la santé du nouveau-
né, peut-être les facteurs bifidigènes en ont-ils une, située à un autre niveau,
jusqu'ici cachée, que l'on découvrira peut-être un jour.
25
E. - Conclusion:
L'alimentation au sein assure l'hygiène du nourrisson sur le plan de la
flore intestinale.
Toutefois, le problème reste entier quant à savoir si les germes de
B. bifidum interviennent directement en inhibant la prolifération des bactéries
pathogènes, ou s'ils sont simplement le reflet d'un état satisfaisant de l'intestin,
et donc de bonne santé du nourrisson.
26
CHA PIT RE II, - CONNAISSANCES ACTUELLES SUR LES
FACTEURS BIFIDIGENES
27
A. - INTRODUCTION.
Différents facteurs favorisant la croissance du B. b. ont été trouvés non
seulement dans le lait humain, mais aussi dans de nombreuses substances biologiques.
Depuis l'époque des premiers travaux menés par TISSIER, il nous a semblé intéressant
de passer en revue les principales méthodes de caractérisation de ces facteurs.
B. - METHODES DE MISE EN EVIDENCE.
I. - Méthode en milieu liquide:
Elle fut d'abord décrite par GYORGY et al. (46), puis reprise par
RAYNAUD et BIZZINI (122), BEZKOROVAINY et TOPOUZIAN (13).
le principe de la méthode consiste à inclure le composé à tester
dans le milieu de culture bactérienne préalablement stérilisé à l'autoclave. On y
incorpore ensuite l'inoculum standardisé, préparé à partir de la souche delh
bifidum. L'incubation se fait à 38·C pendant 5 jours en anaérobiose. GYORGY,
NORRJS et ROSE (44) grâce à cette méthode, évaluent la vitesse de croissance
bactérienne par titration des acides formés dans le milieu de culture. la figure 1
représente la variation de la croissance bactérienne en fonction du logarithme des
quantités de lait humain requises pour obtenir cette croissance. Les essais s<;:>nt
faits simultanément sur le lait de femme écrémé et celui de vache.
Cette étude a permis à GYORGY, JEANIOZ et ZU LIKEN (50) de
définir par la suite l'unité de facteur bifidigène comme étant: la quantité de
composé qui, ajoutée à un milieu déterminé, donne une croissance égale à celle
que permet une certaine quantité de substance étalon. L'étalon choisi est le lait
maternel qui, à la dose de 0,06 ml par tube, donne la moitié environ de la crois-
~.
sance optimale possible pour le milieu considéré. RAYNAUD et BJZZINI (121, 122) se
sont intéressés également à la question de dosage de l'activité des facteurs de crois-
sance en milieu liquide. Et, reprenant la méthode décrite par GYORGY, ils démontrent
28
ac.A..-de
0,1 N (en. m€.)
8
6
4
2
Log (Q.:té fad éCJtémé]
o
0,005
0,01
0,02
0,05
FIGURE 1
Reph.é.6en..:taUon. g/tapruque de fa v..{;teMe de c./toA....6.6an.c.e
bac..:téttA...en.n.e (expttA...mée en. ac.A...dA....:té) en. 6on.c..:tA...on. du fogaJtA..-:thme
de fa qua.n.;tU:é de 6ac..:teutt de CJtoA....6.6an.c.e (44).
NaOH 0,1 N (en. mf)
2
o
5
10
15
Fac..:teutt de c./tOA....6.6 an.c.e
BF2 (en.llg).
FIGURE 2
Relation. eY1..:t!te fa c./toA....6.6an.c.e de B.b. e.:t fa quan..:tA....:té de
nac..:teutt de CJtoA....6.6an.c.e A..-Y1..:t!todui..:te daM fe m<..üeu (122).
29
l'existence d'une proportionnalité entre la croissance bactérienne, exprimée en
acidité et la quantité de facteur de croissance purifié (exprimée en microgramme),
incorporé au milieu de culture (Fig. 2).
Avec des préparations non purifiées de facteurs de croissance, la
courbe se partage en deux parties (Fig. 3).
Au-delà d'une certaine quantité de facteur ajoutée, la pente de la courbe
change. Celle-ci ne peut plus alors être extrapolée à une droite passant par l'origine.
Les auteurs expliquent cela par le fait que les préparations impures peuvent contenir
des substances inhibitrices qui, soit bloquent la croissance bactérienne, soit modifient
la relation entre la croissance et l'acidité finale. Cela peut vouloir dire aussi que les
préparations utilisées contiennent probablement plusieurs facteurs de croissance qui
sont utilisés l'un après l'autre suivant l'affinité que la bactérie manifeste pour chacun'
de ces facteurs.
RA YNA UD attire l'attention sur la standardisation de l'inoculum qui selon
lui, est un détail technique important, qui doit être respecté rigoureusement, comme
dans la plupart des déterminations de facteurs de croissance. Avec un inoculum trop
fort, il apporte une quantité incontrôlée de facteurs de croissance.
S'il est trop faible, on obtient des résultats irréguliers.
Contrairement au procédé de GYORGY et Coll. où l'incubation dure
5 jours, BEZKOROVA INY et TOPOUZlAN (13) préconisent une incubation à 3741C
pendant 18 heures.
Ces derniers chercheurs font une représentation graphique réciproque
des résultats obtenus (Fig. 4) par analogie avec la représentation graphique de
LINEWEAVER et BURK. Dans ces conditions, la variation de la croissance bactérienne
en fonction de la quantité des facteurs bifidigènes est représentée par une droite.
Ceci permet de déterminer pour chaque facteur de croissance, une constante K 1/2 MGA,
analogue à la constante de MICHA ELIS- MENTEN(Km). Celle-ci est définie comme
étant la quantité de facteurs permettant d'obtenir une croissance demi-maximum
30
NaOH 0,1 N [en ml)
1,5
1,0
0,5
facJ:euJt de c.tto..L6-6anc.e
(BF2 )
5
la
15
20
FIGURE 3
Rdcttion erWte fa CJtoAA-6anc.e bacJ:éJz.ienne cd fa
quaJ'l.-tUé de 6acJ:euJt de CJtoAA-6anc.e bJtLLt ajoLLtée
au mJ.ieu de CJ.J.UuJte
GYORGY cd CoU.
(44).
B (LcU.t de vame 1
Lw humain
L~ de vac.he (en ml)
15
la
la
15
20
25
-v
FIGURE 4
RepJté-6 entdton gJtapru.que de f.a CJtoAA-6anc.e de fa -6ouc.he
Penn.
(expJz.imée en unité) en 6onc.tion de fa quantité de
6a cJ:eWt.6 de CJtoAA-6anc.e ; une unité ut déM-rUe en nU..Lti..-
équivaf.ent.o de NaOH ,JteqUÂ..M.J.J pouJt :tJ.;Vr.eJt f' aude pJtodtU.t
pM fa bac.tétUe pOUft 5 mi de. m..i1A:.e.u de c.lLUuJte. Lu 6ac.-
teWt.6 de CJto..L6.6anc.e é.tant ie filM:. humcUn ou fe fcUt de
vac.he
BEZKOROVAINY. cd CoU.
(73).
31
JI. - Méthode de diffusion en milieu solide:
18 / - Principe:
Elle a été décrite par ROMOND, BEEHENS, NEUT et CATTEA U (165).
La méthode fait appel à une culture jeune de B. bifidum qu'on incorpore au milieu de
culture qui est le milieu de GARCHES gélosé (119) réparti dans des boites de Pétri.
Les solutions des produits à tester à différentes concentrations sont stérilisées par
passage sur filtre millipore (45 ~m). Des disques de papier stériles sont ensuite
imprégnés de ces différentes solutions, puis déposés sur le milieu gélosé. Les essais
sont incubés en atmosphère anaérobie à 37-C pendant 5 jours. La lecture des résultats
se fait par appréciation de l'anneau de culture bactérienne se développant autour des
disques. Il est possible de mesurer le diamètre de cet anneau pour comparer l'effet
du même composé sur différentes souches de Bifidobactérium. L'activité bifidigène
s'exprime par la dernière dilution positive.
Cependant, on reproche à cette méthode de dosage d'être semi-
quantitative, ce qui limite considérablement son emploi pour déterminer l'activité
biologique relative de plusieurs dérivés.
Il convient de noter également l'importance de la diffusion
dans le milieu des composés à étudier. En effet, lorsque ceux-ci diffusent peu
dans le milieu gélosé, la zone de croissance aura un faible diamètre. On serait
alors tenté de conclure à une activité relativement faible, alors qu'en fait un
produit très actif sur la croissance bactérienne peut mal diffuser dans le milieu
de culture pour diverses raisons:
. raisons d'ordre technique: gélose ma 1 coulée, milieu non homogène;
. raisons propres au composé à étudier; il peut s'agir de produits de haut
poids moléculaire ou de composés visqueux ayant une vitesse de diffusion
pratiquement nulle dans la gélose.
32
2°/ - Avantages de la méthode de diffusion en milieu solide:
C'est une méthode simple. Elle permet de tester plusieurs composés
dans une même boite de Pétri et dans les mêmes conditions opératoires; ceci e~t
pratiquement impossible à réaliser avec la méthode en milieu liquide qui demande
l'utilisation d'un tube à essai par chaque composé à étudier.
C'est une technique d'une grande utilité pour étudier in-vitro
l'influence sur la flore intestinale, des substrats susceptibles de jouer un rôle de
facteurs de croissance microbienne.
l'utilisation des boites de Pétri évite de faire des témoins pour
chaque dosage. Le fond de la boite sert de témoin négatif dans cette méthode en
milieu solide.
Il s'agit donc d'une méthode économique qui nécessite l'emploi
de très peu de milieu de culture.
Elle fait appel au milieu de GARCHES qui est un milieu minimum,
nécessaire pour l'étude des facteurs de croissance. Compte-tenu de ses nombreux
avantages, nous avons choisi celle-ci pour la mise en évidence de l'activité biologique
des préparations de lait de femme. le mode opératoire de la méthode de diffusion
est décrit dans l'appendice technique.
In. - Méthode in-vivo:
Plusieurs auteurs, en particulier WAGNER et STAR (154) pensent que
l'idéal est de réaliser les essais de mise en évidence de l'activité des composés
reconnus comme facteurs bifidigènes dans des conditions proches de celles qu'offre
l'intestih du nouveau-né. Mais le rôle de barrière à l'égard des bactéries pathogènes
exercé par la flore du tube digestif huma in ne peut naturellement pas être étudié
expérimentalement chez l'homme (26).
Dans ce cas, le recours au modèle animal s'impœe.
Ceci permettrait non seulement une meilleure approche des mécanismes
physiologiques, mais cela aurait également l'avantage. de rendre les résultats moins
dépendants de la souche bactérienne. En effet, les tests in vitro
font appel à des souches
33
-qui au fur et à mesure des repiquages peuvent voir leurs propriétés modifiées. Pour
cela, l'équire de DUCl UZEA U propose la souris gnotoxénique comme modèle animal.
Quant à WAGNER et STAR (154), ils ont étudié le comportement des
souris germfree en présence d'une culture de B. bifidum dans le but de l'implanter
chez ces animaux et d'étudier le rôle protecteur de l'intestin, attribué à celui-ci. De
l'avis des auteurs, les résultats sont décevants puisque la bactérie disparaît du
milieu après 14 jours d'expérience.
Cette disparition s'explique peut-être par l'énorme différence existant
entre le contenu intestinàl du nourrisson et celui de la souris germfree. Ce dernier
ne réunissant pas toutes les conditions physiologiques requises pour la croissance de
B. b., celui-ci finit par disparaître du milieu intestinal de l'animal test.
34
C. - ETUDE DES FACTEURS BIFIDIGENES.
Vers 1900, on commence à soupçonner la présence de facteurs bifidigènes
spécifiques, responsables de la croissance de B. bifidum dans le lait de femme.
Dès 1926, SCHONFELD (132) démontre la présence d'un facteur de croissance
pour B. b. dans la fraction non protéique du petit lait, à côté du lactose. Il n'est de
nature ni minérale. ni protidique, ni lipidique. Divers composés ont été considérés
par la suite comme facteurs de croissance pour B. b.
1. - le lactose:
De nombreux auteurs ont attribué au lactose la propriété de favoriser
la prolifération de B. bifidum. Cela confirme une notion établie en 1938 par MA l YOTH
(83) qui attribue la propriété du lait maternel de stimuler la croissance de B. b. à sa
richesse en lactose. Mais très rapidement, les avis divergent sur la quantité de lactose
nécessaire pour obtenir cette activité. MANCIA UX et Coll. (85) testant différentes pré-
parations dont le taux de lactose varie de 3 à 12% ne trouve une flore gram-positif
qu'avec ce dernier taux.
B ESSA U (7) estime que les 62 g de lactose pa r litre de lait de femme sont
suffisants pour obtenir une flore appréciable. Certains auteurs comme MA LYOTH attri-
buent l'activité biologique du lactose à son anomère ~ • Mals, ce dernier n'a jamais
pu fournir des preuves démonstratives pour soutenir cette affirmation.
Quant à PETUElY (113) et MAYER (88.89), ils ne trouvent aucune
action bifidigène pour le lactose. ni pour son isomère ~ .
Cette contradiction a été également confirmée par MONTR EUIL (94) qui
doute du maintien de l'une ou l'autre forme anomérique du lactose jusqu'au moment
de son absorption par l'intestin du nourrisson.
LEVESQUE (80, 81) de son côté, observe un faible pouvoir bifidigène
avec du lait de vache enrichi au lactose, mais indépendamment de la forme ~ du
lactose. Pour ce chercheur, l'action bifidigène constatée n'est due qu'à un dextrine-
maltose s!Écial ajouté au lait au cours de ses expérimentations réalisées en 1959 sur
du lait de vache enrichi de lactose (1.8%).
le dextrine-ma ltose spécial est obtenu grâce à l'action fermentative
d'A spergillus orizae.
35
II. - le lactulose de PETUELY :
..
Reprenant les idées de SCHüNFEI D sur l'existence d'une substance
fonctionnelle dans le lait de femme, PETUEL y (113, 11.4) tente de préciser la
structure chimique de cette substance et à quelle fraction du lait de femme appartenait-
elle? Et traitant d'une manière semi-industrielle de grandes quantités de lait de femme,
il a pu démontrer que, ni le dégraissage par centrifugation et l'extraction des graisses
à l'éther, ni l'élimination du lactose par cristallisation fractionnée ne diminuent sensi-
blement le pouvoir biologique du lait. A ce stade, les préparations de lait ne contiennent
plus que des sels minéraux, de faibles traces de lactose et des 0 ligosaccharides.
L'élimination ultérieure des sels minéraux et l'extraction des sucres
par chromatographie sur colonne de cellulose permettent à PETUEI y d'attribuer
l'effet bifidigène du lait étudié à un dérivé de lactose, le ~ galactosidofructose ou
(),.-1 .4
lactulose : Gal K
'
) fru.
Il s'agit d'un composé thermolabile, analogue aux vitamines. Son effet
est étroitement dépendant de certaines conditions intrinsèques de l'organisme du nour-
risson qui le rendent plrfois inopérant.
la démonstration de PETUELY est partagée en 1965, par NElMANN et
Coll. (100). Ces derniers affirment que si l'on ajoute le lactulose dans les proportions
de 1 à 1,5 g par Kg de poids et par jour, à un régime quelconque, le lactulose produit
une pullulation de B. bifidum en un à quatre jours, à condition que ce régime comporte
un rapport lactose -albumine égal ou supérieur à 2,6. Dans le but de défendre son
hypothèse par des preuves concrètes, PETUEL y a expérimenté son "Bifidus Factor"
chez plus de 300 nourrissons avec, dans tous les cas, une excellente tolérance, des
selles dont l'aspect se rapproche des selles d'enfants nourris au sein. D'autres résul-
tats ont été obtenus par différents auteurs, en particulier MAYER et Coll. (88), ont
expérimenté un lait en poudre enrichi en lactulose. Ils ont cmstaté une modification de
la flore intestinale dans le sens de celle des enfants au sein, avec augymntation du pour-
centage de B. b. dans les selles et baisse du pH. Les mêmes auteurs trouvent que le
produit étudié occasionne dans tous les cas une croissance pondérale satisfaisante, mais
exerce toutefois une certaine action laxative.
36
Cependant, le lactulose, de l'aveu même de son auteur, n'existe pas à
l'état libre dans le lait maternel et il est inactif in vitro sur la croissance de B. b. ,;
c'est pourquoi RAYNA UD (118), RAYNA UD et BIZZINI (121) lui dénient le nom de
facteur bifidigène. PETUEL y explique le pouvoir bifidigène de ce sucre par sa résis-
tance à la dégradation par les lactases du tube digestif supérieure à celle du lactose.
Selon lui, le lactulose arrive ainsi en forte quantité au niveau du côlon, où B. b. peut
l'utiliser pour sa croissance.
III. - le facteu r bifidus de GYOR GY :
1DI - Mise en évidence du facteur bifidus
GYORGY, KUHN, NORRIS, CATHARINE et ZILLIKEN (44, 46)
isolent en 1954 une souche mutante de B. b., le Bifidus, variété Pennsylvaniens
(var. Penn) ayant la propriété de ne proliférer qu'en présence de lait maternel.
Ceci leur permet d'aborder l'étude des facteurs bifidigènes dans de meilleures con-
ditions.
Ces auteurs, à la suite d'une longue série de recherches, parviennent
à la conclusion que le maintien du Bifide dans les selles du nourrisson élevé au sein est
dû à la présence dans le lait de femme d'un facteur de croissance
spécial qu'ils
appellent "Bifidus Facteur" et qui est dénommé par RAYNA UD "Facteur Bifidus 1 de
GYORGY" : FBI. l'activité biologique de celui-ci persiste après chauffage à l'auto--
clave (44).
Poursuivant leurs travaux (47), ils démontrent que le gynolactose
de POIONOVSKI et LESPA GNOI est le support de l'activité bifidus factor du lait de
femme.
KUHN, GYORGY et Coll. (33) observent que les oligosaccha rides
non azotés du lait humain ne possèdent pas d'activité B. bifidus var. Penn. tandis que
les oligosaccharides azotés sont des facteurs de croissance pour cette souche in vitro.
Une étude comparative faite en 1954 sur l'activité bifidigène des
différents laits de mammifères révèle que (45) le cdostrum humain est plus actif,
suivi par le colostrum de rate, puis viennent le lait maternel et celui de rate. Le
lait de chatte a été trouvé très actif, suivi par celui de l ':ine, chien, singe et lapin.
Le lait des ruminants: vache, mouton et chèvre s'est révélé faiblement actif.
37
Par contre, GYORGY, KUHN et zn LIKEN trouvent une concentration
appréciable de facteur de croissance bifidus dans le colostrum de vache. Celui-ci
contient 10 fois plus de facteur de croissance que le lait de vache.
GYORGY voit dans la haute teneur du colostrum humain en facteur
bifidus var. Penn. un élément susceptible d'expliquer la rapide implantation de B. b.
dans l'intestin du nouveau-né. Et le lait humain doit à la présence d 'oligosaccharides
azotés de posséder l'activité B. bifidus var. Penn. la plus élevée.
On comprend donc l'acharnement des chercheurs à déterminer la
constitution chimique des oligosaccharides du lait de femme.
2°/ - Relation structure et activité:
Seule une bonne connaissance de la structure des oligosides du lait
maternel permettra d'établir une relation entre la structure et leur activité bifidigène
et peut-être de mieux comprendre leur mode d'action.
En suivant la vitesse avec laquelle ils dialysent, GYORGY et Coll.
(46) démontrent que les facteurs de croissance B. b. var. Penn. contenus dans le lait
de femme et l~ colostrum ne sont pas des éléments homogènes quant à leur masse molé-
culaire. Les facteurs actifs en effet peuvent être séparés en une fraction dialysable re-
présentant 40 à 75% de l'activité totale des constituants actifs du lait de femme, et une
,-,
! fraction non dialysable correspondant à 25 à 60% de l'activité totale.
Dans le but de
déterminer la structure chimique nécessaire il l'activité biologique des facteurs bifidi-
gènes, GYORGY et Coll. (33) traitent de grandes quantités de lait humain par chroma-
tographie sur colonne de charbon-celite, suivie d'une chromatographie sur papier.
Ils obtiennent dans ces conditions, des fractions très actives de lait contenant: la
D-glucosamine, le l -fucose, le D-glucose et le D-galactose. Plus tard, en étudiant
l'activité microbiologique de composés analogues simples des oligo et polysaccharides
azotés du lait humain, ROSE, KUHN, ZIILIKEN et GYORGY (127) constatent que les
0( et ~ methyl N-acetyl D-glucosamine présentent des propriétés intéressantes.
En effet, le ~ -méthyl- N-acétyl- D-glucosaminide est actif comme
facteur de croissance de B. bifidum var. Penn. Par contre, l'anomèreo{ est inactif.
38
KUHN et KIRSCHENLOHR (69) avaient isolé auparavant, à partir du
méconium, un disaccharide dont le comportement physique s'avère identique à celui ob-
tenu à partir de la mucine de porc.
C'est un fait très remarquable que d'aboutir au même composé tout
en travaillant sur des substances biologiques aussi différentes que le lait humain, le
'méconium et la mucine gastrique de porc. Cela peut s'expliquer par la présence de la
N-acétyl-D-glucosamine dans la structure des oligosaccharides contenus dans ces
composés naturels.
L'ensemble des résultats précédents donne à penser que la glc NAC
joue un rôle essentiel pour l'activité bifidigène. Cependant la glc NAC à l'état libre
présente une activité beaucoup plus faible qu'à l'état combiné RA YNA UD (118).
3e/ - Mode d'action :
O'BRIEN, GLICK et ZILlIKEN (107) étudient en 1959 la destinée
de la glc NAC dans la bactérie B. b. var. Penn, compte-tenu de son intérêt bio logique.
Ils utilisent pour cela le 0\\~-méthYI-N-acétyl-glYC08aminides(14C-1)qu
lils introduisent
dans le milieu de culture de la bactérie comme facteur de croissance.
l 'étud(:l électrophorétique de l'acide muramique extrait de la paroi
bactérienne après 25 minutes de culture a permis de constater que le ~ glycoside
marqué s'incorpore dans cet acide qui est le précurseur de la muréine. D'où l'impor-
tance de la glc NAC dans la biosynthèse de la paroi bactérienne.
Une explication biochimique de l'incorporation de la glc NA C dans
la paroi bactérienne est apportée par LAMBERT et ZILLIKEN (74). Pour eux, la
souche Penn. n'est pas capable de produire une quantité suffisante de glcNAC à
partir de son anabolisme pour l'utiliser dans la synthèse de sa paroi cellulaire. Elle
doit pour cela recourir à des sources extérieures pour satisfaire ses besoins en
hexosaminé. Et la grande activité bifidigène des ~ glycosides peut s'expliquer par
la p-ésence d'une phosphorylase hypothétique qui convertit le ~ glycoside en N-ac~tyl
D-glucosamine-1-phosphate. La glc NAC libre au contraire doit être d'abord phos-
phorylée en position 6 par une kinase à Mg dont on connaît la présence dans les extraits
bruts de la souche Penn. pour être convertie ensuite en dérivé 1-phosphate.
LA MB ERT et Z ILLIKEN ont alors cherché à obtenir par synthèse
d'autres dérivés de la glucosamine dont ils ont déterminé l'activité bifidigène.
39
Si l'on met en présence les deux anomères, l' o\\-glucoside exalte
l'activité du
~-glucoside. Cet effet exercé par l' O\\-glucoside disparaît quand le
~ méthyl-N-acétyl-D-glucosaminide est remplacé par ses homologues supérieurs,
~ -éthyl ou propyl-N-acétyl-D-glucosaminides avec facteur de croissance bifidus.
Les mêmes auteurs constatent d'autre part que l'hydrolyse
enzymatique du ~ glycoside:par des extraits bruts d'enzyme de B. b. (var. Penn.) est
inhibée en présence de~-glycoside. Ce dernier composé par contre n'est pas hydrolysé.
Ceci confirme l'existence de ~ glycosidase et l'absence d' 0( -glycosidase signalées
par ces auteurs. Pour eux, l'inhibition de l 'hydrolyse du ~-glycoSide le garde intacte.
Ce qui préserve son activité bifidigène.
Toutes ces constatations incitent ZILLIKEN, ROSE, BRA UN et
GYORGY (159) à s'iQtéresser davantage aux homologues supérieurs alkylés des
N-acétylsO{ et ~-D-glucosaminideset à les préparer par synthèse chimique. Les
anomères 0( et ~ ainsi obtenus sont séparés sur colonne decharbon-célite. Les
dérivés ~ sont actifs sur la croissance de la souche Penn. alors que les anomères
0( se montrent inactifs.
,(Le tableau 3) rapporte le titre en facteur bifidus l de divers
glycosides naturels ou de synthèse (118, 147, 159). Ces résultats viennent donc con-
firmer les observations faites auparavant par les mêmes auteurs sur l'activité des
~ et ~ glycœides.
TORNARELII et Coll. (147) isolent par la suite, à partir de la
mucine de porc, par hydrolyse douce un disaccharide formé de galactose et N-acétyl-
D-gllcosamine, et qui se révèle hautement actif comme facteur de croissance de la
souche Penn.
C'est finalement ZILLIKEN et son équipe (163) qui parachèvent
un an plus tard, l'identification du disaccharide isolé de la mucine de porc, comme
étant le 4-0 ~-D-Galactopyranosyl-N-acétyl-D-glucosamine
(Figure 5).
Les mêmes chercheurs ont synthétisé par la suite, à partir du lactose et de la N-
acétyl-D-glucosamine, en présence d'enzyme extraite de Penn, un disaccharide qui
a été trouvé identique à celui de la mucine de porc.
40
C 0 M P 0 S E S
:
(*)UNITÉ
(EN MG)
4-0-~-V galactopy~ano~yl-N-aeétyl-V-glueo~~ne
0,06
[
3-0-~-V
"
"
"
1,50
6-0-~-V
"
"
"
0,90
N N'-diaeêtyl-ehitob~o~e
1,2-2,2
0( -alkyl-N-aeétyl-V-glueM~Mdu
~naetiû~
~-méthyl-N-aeétyl-V-glueo~amiMde
0,1-0,2
~-éthyl
"
"
0,04-0,06
~-n p~opyl
"
"
0,04-0,06
p-~op~opyl
"
"
0,09
~-n butyl
"
"
0,065
~-beuzyl
"
"
0,095
~-phênyl
"
"
0,05
TABLEAU 3
T~e en ûacteM b~Md~ 1 de diveM oügo~aeeh~du obteH~ pM
~ yn.th è6 e ehùH.q ue (45, 14 7) .
(l) UNITE = qu~é de ~ub~tanee quA., ajoutée à un rrU.lieu de eultMe, donne une
e~o~~anee égale à eeUe que pvunet une e~Mne quan:U.té de ~ub~tanee
étalon.
41
o
HO
NH-CO-CH 3
4-0~-galaetopy~ano~yt-N-acétyt-V-gtuco~amine (163)
(N-acétyt Laeto~amine).
42
1\\
\\
, \\
1
\\
, \\
J
\\
(1)
,
1
,
1
1
\\
.",(Z)
1
\\
/ '
.",
J
\\
J
\\
1
-
1
/
H
R
FIGURE 6
Activité de ~o~~ance d~ homo{ogu~ de {a N-acy{-l-V-
g{uco~a.m<.ne e;t d~ détU..vé-6 de {' Méthane, d apJLè~
1
LAMBERT e;t
ZILLIKEN (74).
( 1)
(détU..vé~ de {a N-acy{-l-V-g{uco~a.m<.ne)
NH-CO-R
(détU..vé-6 de {'UfLéthane)
(Z)
43
Les résultats de leurs études révèlent d'une part une très grande
activité biologique pour les dérivés suivants: la N-Carboéthoxy-D-glucosamine,
la N-benzoyl-D-glucosamine et la f-' -éthyl-N-acétyl-D-glucosamine ; d'autre part,
une augmentation régulière de l'activité de croissance si le groupement acétyl est
remplacé par ses homologues supérieurs, (flEure 6), à partir du chaînon propionyl.
Les auteurs expliquent ces résultats par une pénétration plus facile des facteurs de
croissance dans la bactérie. Pour eux, plus la chaîne aliphatique est longue, plus
les composés sont hydrophobes, et mieux ils passent à travers la membrane cellu-
laire, du fait de leur caractère lipophile.
4°/ - Oligosaccharides du lait de femme:
Il ne faut toutefois pas perdre de vue que l'élément naturel qui fait
croître B. b. chez le nourrisson est essentiellement le lait maternel. Ce sont surtout,
les pltientes recherches de KUHN, MONTREUIL, KOBATA et GRIMMONPREZ (39,
41,42,65) qui ont permis de mieux connaître la structure des oligosaccharides du
lait humain. Ils peuvent être classés en deux groupes: les oligœides neutres et les
oligœides acides.
a) - ~~~=~Lip~~;~~~;!l~~~=r;~~!~~=:
On distingue les oligosaccharides neutres azotés et les non
azotés suivant qu'ils contiennent ou non de la glè NAC (40).
Les schémas généraux des structures de ces composés sont précisés
dans les tableaux 4 et 5.
n convient de noter que tous ces sucres du lait humain sont constitués
essentiellement en proportions variées de : D-glucose, D-galactose, L-fucose et
N-acétyl-glucosamine GRIMMONPREZ et MONTREUIL (39).
Par cmtre, ils ne
renferment pas de mannose, ni de galactosamine dans leur structure. Il est remar-
quable de constater non seulement que tous ces oligosides possèdent dans leur molécule
un résidu de lactose en position terminale, mais aussi que le reste de leur molécule
est formé soit d'une unité de la N-acétyl lactosamine, soit de la N-acétyl-isolacto-
samine, soit de la répétition de ces deux oligosaccharides.
44
NOM E N C LAT URE
S TRU CT URE
-----------------
1°/ OLIGOSACCHARIDES NON AZOTÉS
Ga.l f - 1 ,4
LACTOSE
)
gle.
2'-FUCOSIDO-LACTOSE
Gal fi - 1 ,4 ) gle.
la< - 1, 2
Fue.
(3-1,4
3-FUCOSIDO-LACTOSE
Gal
)
gle.
jO<-l.J
Fue.
LACTO-DIFUCOTÉTRAOSE
Ga.l t? - 1 , 4 ) gle.
j"-1,2
i ~- 1,3
Fue.
Fue.
"2'-FUCOSIDO, 3' -GALACTOSIDO-
Ga O a-1,3
)
{3-1
4
.(.. 1:
-
G a l ' )
9 l e.
LACTOSE
T0(-1,2
Fu
2°/ OLIGOSACCHARIDES AZOTÉS
LACTO-N-TÉTRAOSE
LACTO-N-NÉOTÉTRAOSE
LACTO-N-HEXAOSE
TABLEAU 4
StJtU&Wtu du oüg 0.6 ae.e.haJt..i.du du lcvLt de tlemme, d' ap!Lù
GRIMMONPREZ e;t MONTREUIL (38, 39,42), KOBATA et CoU.
[65).
45
1 NOM
E N C LAT URE
S TRU C T URE
2°/ OLIGOSACCHARIDES AZOTÉS (SUITE)
LACTO-N-NÉOHEXAOSE
LACTO-N-FUCOPENTAOSE l,
lACTO-N-FUCOPENTAOSE II,
gafê-1,3Igl~NAC~-1,3)gal~-1,4Igl~
jo< -1.4
Fu~
·LACTO-N-FUCOPENTAOSE Ill,
13-1
LACTO-N-DIFUCOHEXAOSE 1.
3
13-1 3
{3-1 4
gal
1
) gl~NAC
, ) gal
1
) gl~
/0< - 1 , 2
jo(- 11 4
Fu~
Fu~
LACTO-N-DIFUCOHEXAOSE II.
galê-1,3)9l~NACB-1 ,3)9al~-1 ,4)gl~
10(-1 , 4
10<-1,4
Fu~
Fu~
TABLEAU 5
s.vwc;tUJte. deA olig 0-6 a~~haJUdeA YLe.u.tJLeA du laJ;t mateJl.YLe.l, d' apJtè-6
GRIMMONPREZ e.t MONTREUIL (38, 39, 42), KOBATA e.t Cott. (65)
46
Dans le cas des structures linéaires, le reste de la molécule est
lié au lactose en position ~ -1,3. Pour les structures ramifiées, ce sont surtout des
liaisons~-1,3 et ~1,6 qui rattachent les branches au résidu de lactose.
A cause de cette particularité de la présence d'un reste de lactose
dans chaque oside, MONTREUIL et MULLET cités pn GRIMMONPREZ (41) formulent
l'hypothèse qu'il existe une relation métabolique entre les osides du gynolactose et
le lactose. En particulier, l'examen des formules des fucœido-lactoses et du lacto-
difucotétraose montre que le passage de ces sucres au lactose peut s'effectuer sous
l'action des fucosidases. Ces auteurs ont émis cette hypcthèse par suite d'une étude
faite en 1960 sur l'évolution des oligosides du lait de femme au cours de la lactation.
Ils ont observé en effet, que le taux de lactose et de gynolactose varient en sens inverse.
En outre, la quantité de fucosido-lactoses et de lactodifuco-tétraose, très élevée dans
le colostrum, décroît rapidement tandis que les taux du lactose et des polyosides
supérieurs augmentent dans le lait définitif.
Seuls les oligosaccharides cmtenant de la glc NA C sont actifs
commé facteur bifidus 1. Les oligosides neutres apportés par le lait maternel cons-
tituent donc une des sauces naturelles de facteur bifidus 1 selon RAYNA UD.
Pour GRIMMONPREZ (41), l'activité B. b. var. Penn contenue
dans le lait de femme, est associée essentiellement au motif structural de la
N-acétyl-lactosamine. Ainsi s'expliquerait que le lacto-N-néotétraose possède une
activité de croissance B. bifidus supérieure à celle du lacto-N -tétraose. Car, le
premier possède contrairement au second, un reste de N-acétyl-lactosamine
1 a présence d'acide sialique dans le lait de femme a été
démontrée par HOOVER, BRAUN et GYORGY (56) et par zur IKEN, BRAUN et
GYORGY (162) qui l'appellent acide gynaminique. C'est KUHN et BROSSMER (70)
qui ont identifié ultérieurement cet acide comme étant l'acide N-acétyl neuraminique.
47
Ces résultats conduisent à l'isolement de nombreux sialosides de
lait maternel. C'est ainsi qu'en 1962, KUHN et GA UHE (71) isolent de ce lait deux
formes combinées de l'A NAN et du lactose dénommées 3' et 6 '-lactaminyl-Iactose,
puis trois pentaoses acides (TA BLEA U 6).
Plus récemment, GRIMMONPREZ et MONTREUIL (39) isolent
six nouveaux oligosides acides en appliquant l'électrophorèse préparative sur papier
à l'adialysable de la fraction 89 du lait maternel.
l'application des méthodes d'acétolyse, d'hydrolyse partielle,
d'oxydation périodique, de perméthylatton et des hydrolyses enzymatiques a permis à
ces derniers chercheurs de proposer, le schéma de structure suivant pour l'oligo-
side 6 ou dilactaminyl-Iacto-N -tétraose (figure 7).
D'une manière générale, tous les oligosaccharides du gynolactose
sont des produits de substitution du lacto-N -tétraose ou du lacto-N -néotétraose par du
fucose ou de l'ANAN; ou plus rarement par une chalne de lactosamine, créant ainsi
une structure ramifiée. l'équipe de KOBATA (65) a joué
un rôle essentiel pour
l'isolement et l'étude de la structure de ces oligosides. En 1974, GYORGY, JEANLOZ,
NICOLA l et ZILLIKEN (50) en travaillant sur la fraction non dialysable du lait de femme,
par chromatographie sur colonne de DEA E sephadex aboutissent aux mêmes résultats
pour dire que la structure de base des oligosaccharides de haut poids moléculaire est
formée des unités de lacto-N -tétraose ou de lacto-N -néotétraose.
Les mêmes auteurs ont étudié l'activité biologique de ces sucres
acides. Et ils constatent que ceux-ci ne favorisent pas la croissance de la souche Penn.
Ils ne deviennent des facteurs de croissance microbienne qu'après avoir été traités
par de la Neuraaminidase de vibrio Comma, donc après élimination des acides sialiques.
On obtient le m~me résultat lorsque l'acide sialique est éliminé par hydrolyse acide
douce.
Ces résultats démontrent que les acides siaUques liés à la chalne
oligosidique exercent un effet protecteur contre la dégradation de ces composés par
B. bifidum var. Penn,
En outre, ceci permet de supposer que Penn. ne possède pas la
neuraminidase capable de couper la liaison osidique qui lie l'acide sialique à la chalne
48
1
NOMENCLATURE DE KUHN
STRUCTURE
,
l3 - 1 4
3'-LACTAMINYL-LACTOSE
9 al
l
1
9l c.
1
i0<-2,3
ANAN
(3 - 1 4
6'-LACTAMINYL-LACTOSE
gal
1
)
9l c.
i~-2,6
ANAN
{3-13
(3-13
t3-14
X-LACTAMINYL-LACTO-N-
9 al
1
) 9 l c. NAC
'
) 9 al
'
) 9l c.
TETRAOSE (PENTAOSE A)
i ~-2,3
ANAN
Z-LACTAMINYL-LACTO-N-
9 al f3 - 11 3 J 9l c. NA Cê- 11 3 ) 9 a.f: f3 - 1, 4 l 9l c.
TÉTRAOSE (PENTOSE B)
i 0(-2,6
1
ANAN
:.ê- 1
X-LACTAMINYL-LACTO-N-NÉOTÉ-
4
13-1
3
~-1 4
gaI:
1
1gla.NAC
'
) gaI:
' ) glc.
TRAOSE (PENTOSE C)
i~-2,6
ANAN
TABLEAU 6
Sbtu.c.:tUJLe. dM oligoJ.>ac.c.haJUdM audM du. la.i.t humcU..YL d'apltù
KUHN et GAUHE (11).
49
HO
C
2
HO
HO
HO
FIGURE 7
Vitactaminyt-taQto-N-tétnao~e
GRIMMONPREZ et MONTREUI L
(38, 40, 41).
R = CH -
CO (adtyt)
3
50
oligosidique. Dans ces conditions, le microorganisme est incapable de libérer les
résidus de N-ac~tyl-glucosamine pour l'utiliser dans la synthèse de sa paroi bacté-
rienne. NICOl AI et zn LIKEN (103) avaient déjà fait des observations analogues
en 1972. En effet, ils ont constaté à l'époque que le pouvoir bifidigène des oligosac-
charides contenant l'ANAN était multiplié par 50, après hydrolyse à la Neuraminidase
de Vibrio cholérae. Ensuite, les mêmes auteurs ont montré en 1972, puis en 1974
chez B. bifidus var. Penn l'existence d'une neuraminidase spécifique de la liaison
(2-3)
qui lie l'ANAN à la chalne oligosidique. Cependant ces liaisons dans le cas
des oligosaccharides du lait humain sont essentiellement de type (2-6).
Ce qui
expliquerait la résistance de ceux-ci à la neuraminidase.
O() !!~~tiOD-_des_0ligoside..§_~!!tre~~y~c_~~.§i~~s.!.l!-ns~~Q~g!:...0.!:1I!~_
~anguir.g;_:
Plusieurs auteurs, en particulier WATKINS et MORGAN (166),
KOBATA et GINSBURG (167) dont les travaux ont été rapportés par GBIMMONPREZ
(40) ont démontré que certains oligosides du lait de femme possèdent les propriétés
de facteurs de groupes sanguins Lewis (Le) : le lacto-difuco-tétraose et le lacto-
b
N-difuco-hexaose I, par exemple, présentent une activité de groupe sanguin Le .
Tandis que le lacto-N-fucopentaose II et plus faiblement, le lacto-N-difucohexaose II
possèdent une activité Laa. Pour GRIMMONPREZ, l'activité de ces oligosaccharides
est due à leur structure similaire à la copule glucidique terminale des substances
de groupes sanguins. Tous ces composés contiennent du fucose dans leur structure.
Et sa fixation sur les
oses
du lait et les composés de groupes sanguins nécessite
{l'intervention d'une même fucosyl transférase spécifique. Les auteurs expliquent
également ces inter-relations par le fait que les enzymes responsables de la bio-
synthèse des substances de groupes sanguins sont les mêmes que ceux qui participent
à la formation des oligosaccharides du lait humain.
, 51
Il est intéressant de rapprocher ces résultats à ceux qui ont été
obtenus récemment àpropos de l'urine humaine. En effet, celle-ci est riche en
oligosaccharides dont certains sont identiques à ceux du lait maternel, STRECKER
(168), STRECKER et MONTREUIl (169).
D'après les auteurs, leur présence est fonction également
du groupe sanguin. Mais il est difficile de rattacher le métabolisme des oligo-
saccharides du lait de femme à celui des antigènes de groupes sanguins, car ces
derniers ne renferment pas de glucose dans leur structure (40). Pour GRIMMONPREZ,
l'activité des oligosaccharides du lait est due probablement à de simples analogies de
structures avec celles des substances de groupes sanguins.
c) - ~~~=~~c;~~~~l~~~=~=~Jbc;~~l~~~=~t;,l~~=~~!~~~~ :
Une activité de facteur de croissance pour B. bifidum var. Penn.
peut être retrouvée dans d'autres composants du lait de femme qua les oligœaccharides
précédemment cités. Les premières études menées par HIRANO et Coll. (55) ont
permis l'isolement à partir du colostrum humain de glycopeptides et de glycoprotéines
(poids moléculaire compris entre 1900 et 18 000) présentant une activité bifidigène
sur la souche Penn. comme sur celle de TISSJER.
Par la suite, l'équipe de BEZKOROVA INY s'est également penchée
sur la question des glycoprotéines du colostrum et du lait humain. Ainsi, en 1973,
une glycoprotéine acide (p. m. 31 200) a été isolée du colostrum (105). Elle contient
,27% de galactose, 21,7% d'hexosamine, 8% de fucose et 11% d'acide sialique.
En 1974, à partir de la même fraction colostrale, six autres glyco-
protéines (de p. m. variant entre 26 600 et 35 000) ont été isolées (102). Elles con-
tiennent toutes de la glcNAC et présentent toutes une activité biologique qui semble
proportionnelle à la teneur globale en oses.
De même en 1976, les mêmes auteurs
décrivent deux glycoprotéines (9) du lait de femme. 1. 'une est proche de l 'orosomucolde
du sérum humain; l'autre étant sp§cifique du lait maternel. Cette dernière peut être
rapprochée des glycoprotéines précédemment isolées du colostrum par son poids
moléculaire voisin de 30 000 et par sa copule glucidique qui représente 70% de la
molécule et dont la composition est semblable. Mais elle en diffère par sa composition
en amino-acides.
52
Elle est également active sur la croissance de la souche Penn.
l'activité bifidigène de la caséine a également été étudiée.
Ce sont KEHAGIAS, JAO et HANSEN (63) qui ont abordé les premiers cette question.
En travaillant sur la caséine bovine, ils ont isolé en 1977, à partir de celle-ci, une
fraction pauvre en sucres, et très riche en amino-acides qui stimule la croissance
de la souche Penn. au même degré que la glcNAC. Mais, ces derniers n'ont jamais
réussi à bien définir ce composé actif de la caséine bovine. Ils ont simplement rapporté
que l'activité retrouvée est due en fait à des produits d 'hydrolyse de la K caséine.
Reprenant le problème de la caséine, BEZKOROVA INY, GROHLICH
et NICHOLS (11) observent en 1979 que la caséine humaine possède peu ou pas d'activité
de croissance Penn. Cependant, quand elle est digérée par des enzymes protéolytiques,
elle devient un facteur de croissance pour cette souche bactérienne.
D'après BEZKOROVATNY et Coll. la digestion de la caséine par
la chymotrypsine est préférable à celle par la trypsine. Puisque le premier enzyme
conduit à une digestion comp.ète, alors que le second donne naissance à un taux élevé
de produits insolubles.
Cette constatation laisse supposer que les facteurs actifs de la
caséine ne sont pas ou sont peu' accessibles aux micro-organismes intestinaux du
nourrisson. Ils ne le deviennent qu'après digestion enzymatique du matériel biologique.
la question est de savoir s'il existe dans le système gastro-
intestinal du nouveau-né, des enzymes protéolytiques capables de digérer la caséine
afin de libérer tous ses facteurs actifs. Pour cela, il serait intéressant de rechercher
la Jl"êsence de tels enzymes chez le nourrisson.
Pour appuyer sa démonstration, l'équipe de BEZKOROVA INCY (11)
entreprend un fractionnement par gel filtration de la caséine digérée au préalable par
la chymotrypsine. Elle obtient dans ces conditions en 1979, une fraction glycopolypepti-
dique, très riche en oses.
L'étude des propriétés chimiques et biologiques de celle-ci, et la
détermination de la masse moléculaire faite par chromatographie sur colonne de
biorad P 300 et de Séphadex G 200 ont permis aux auteurs de découvrir l'analogie
53
éxistant entre le matériel glycopo lypeptidique isolé du lait définitif en 1976 et le
composé obtenu 3 ans plus ta rd à partir de la caséine humaine.
Les deux composés ont un poids moléculaire de l'ordre de 30 000.
On retrouve les mêmes oses dans leur structure, notamment: du galactose, de la
N-acétyl-glucosamine, de la galactosamine, du fucose et de l'acide sialique. l"es
amino-acides qui prédominent restent les mêmes dans les deux cas. En outre, ils
stimulent tous deux et au même degré, la croissance de Penn. D'après les autéurs,
bien qu'il existe des différences quantitatives, par exemple dans la valeur du rapport
glucosamine/galactosamine, il est possible de supposer que la fraction glycopolypep-
tidique isolée précédemment du lait proviennent en partie ou en totalité de la caséine
digérée par des enzymes protéolytiques présents dans le lait ou plus précisément de la
K caséine, seul composant des caséines contenant des oses.
En 1981, BERKOROVAINY et TOPOUZIAN (12, 13) reprennent
l'étude des caséines humaines et bovines. Et ils retrouvent cette fois une faible
activité pour la caséine humaine. Celle-ci est retrouvée dans la copule glucidique
séparée par ~ élimination. Cette dernière a été fractionnée par gel filtration, puis
par chromatographie échangeuse d'ions. L'activité bifidigène des différentes prépa-
rations ainsi obtenues est proportionnelle à leur teneur en hexosamines. Il est inté-
-ressant de noter que la caséine résiduelle après ~ élimination de 90% des oses.
présente une activité inhibitrice vis-à-vis de la croissance bactérienne. Il s'agit
(
d'une inhibition compétitive que les auteurs expliquent en supposant l'existence de sites
,
de fixation spécifiques à la surface de la bactérie test.
A ce niveau, la caséine débarassée de ses sucres, peut entrer
en compétition réversible avec les facteurs de croissance bactérienne présents dans
le lait. Ce qui démontre indiscutablement que l'activité des facteurs bifidigènes est
inhérente aux unités ol1.gosaccharidiques contenues dans le lait et la caséine humains.
l'importance du rôle de la copule glucidique est confirmée par le fait que la caséine
bovine ne présente pas d'activité bifidigène. En effet, selon FOURNET et Coll. (170),
la copule glucidique de la K caséine de vache ne contient pas de glcNAC.
54
En guise de conclusion, BEZKOROVA INY et Coll. attribuent'
en définitive à la caséine humaine, une double fonction:
- celle de fournir les amino-acides essentiels et de satisfaire les besoins
énergétiques du nourrisson ;
- celle de mettre à la disposition du tout petit, les substances stimulatrices de
la croissance du B. bifidum var. Penn. Celle-ci apporte ainsi une contribution
appréciable à la protection de l'enfant contre les désordres intestinaux.
5°/ - Applications cliniques du facteur de GYORGY :
Von E. WALCH (171) a pu expérimenter cliniquement en 1956, le facteur
bifidigène de GYORGY.
Ce chercheur a constaté qu'une addition de 400 mg d'un mélange
d'oligosaccharides extraits du lait de femme dans 100 ml de lait de vache, exalte
considérablement la croissance de Penn. L'effet peut atteindre un degré comparable
à ce que l'on obtient avec l'allaitement au sein.
l'auteur a par ailleurs testé l'influence sur l'organisme humain du
~-éthYI-N-acétyl-D-glucosaminide dénommé (N 180), composé de synthèse très
actif sur la croissance de la souche Penn.
Pour cela, il donne à des nourrissons dont la mère ne peut pas allaiter:
50 g de lait de vache demi-écrémé
50 g du composé N180 ;
5 g de saccharose
Bouillie à 6% de flocon d'avoine.
Pendant la phase d'observation, ce dernier constate que parmi les
nourrissons étudiés, un certain nombre présentent toujours une flore intestinale à
prédominance B. bifidum. A côté de ceux-ci, un deuxième groupe présente pendant
ce temps un taux relativement faible de B. b. Ce qui lui permet de dire que les diverses
souches de B. bifidum réagissent différemment en présence du composé N 180.
55
Il a observé également qu'une augmentation de la dose du produit N180
se traduit par une augmentation du pourcentage de B. b. dans la flore fécale des patients.
Il démontre donc ainsi le pouvoir stimulant du composé IX'écédemment décrit.
Un essai analogue réalisé à partir du "lait Humana" lui a permis d'obtenir
des résultats nettement meilleurs que les précédents puisqu'il obtient avec la même
dose de 50 mg du produit N180 pour 100 g de lait Humana, une flore fécale composée
à 90% de B. b.
Pour WALCH V. E. tous ces résultats méritent encore un examen critique
par des pédiatres. Pour le moment, ils démontrent tout simplement, qu'il est encore
possible de progresser dans la maternisation du lait de vache.
Il convient de noter que ces résultats ont été obtenus par simple exam,m
de frottis sur lame des selles de nourrissons après coloration par la méthode de Gram.
Et cette technique de recherche n'offre aucune garantie bactériologique et conduit
souvent à des erreurs (120).
En effet, à l'examen microscopique, on a tendance à considérer comme
B. bifidum toutes les bactéries en forme de b:ttonnets grarri-positifs avec un aspect
bleu. Or toutes les bactéries gram-positifs ne sont pas des B. b. Si l'enfant est
élevé au sein, il y a concordance entre l'aspect des lames et celui de la flore fécale,
mais celle-ci n'est ni absolue ni régulière.
Par contre, si le taux de B. b. est faible dans le milieu, cas des nouveaux-
nés alimentés au biberon, les cultures contiennent surtout des colibacilles gram-
négatifs. Et les quelques B. b. qui y sont présents peuvent être eux-mêmes partiellement
gram-négatifs par vieillissement.
Donc ces résultats doivent être examinés avec beaucoup de réserve et
méritent une confirmation par culture sur un milieu approprié.
D'autres essais cliniques ont été faits en 1960 par LEVESQUE, JONET
et RAYNA UD qui utilisent des quantités relativement élevées de glcNAC de l'ordre de
500 mg par jour.
Le principe de leur expérience consiste à sélectionner dans une pouponnière
quatre à huit nourrissons ne contenant pas de B. b. décelable dans leurs selles avant le
début de l'expérience.
56
La recherche des B. b. est effectuée par culture sur milieu BIA UROCK
additionné d'acide sorbique.
Les auteurs rapportent que
- l'administration du facteur de GYORGY, sous forme de glcNAC a fait
apparaltre le B. b. dans les selles. L'arrêt de l'administration régulière
de ce composé provoque la disparition du germe.
Des essais cliniques ont été également réalisés par la firme GA l LIA,
en utilisant du lait complémenté en mucine gastrique solubilisée de porc.
Afin de faciliter la digestion de la mucine de porc, la firme GA LI lA
utilise ce produit sous forme partiellement hydrolysée qu'elle incorpore à l'alimen-
tation des enfants.
Il ressort de cette étude que les enfants ayant reçu l'aliment complémenté
en mucine gastrique de porc, présentent une augmentation appréciable du taux de
B. bifidum dans leur flore fécale. Donc, ce résultat confirme ce que l'équipe de
GYORGY avait déjà trouvé en 1954. La commercialisation de ce lait ne semble
cependant pas avoir été poursuivie.
IV. - ~_~t!~~_~~~I:~~~~~~~~~_~~~c:t!~~t~_~~f2~~!f.~~~ :
1°/ - Facteur bifidus II de RAYNA UD :
Plusieurs auteurs, en particulier RAYNAUD (118, 119), RAYNAUD et
BIZZINI (122) démontrent qu'il existe un autre facteur qui est nécessaire pour la
croissance des souches habituelles de lactobacillus bifidus de la flore fécale de
l'enfant.
Les oligosaccharides azotés, selon eux, n'agissent en effet que sur la
souche Penn. , mutant qui a perdu la capacité de synthétiser la glucosamine.
RAYNA UD et BIZZINI ont dénommé ce deuxième facteur de croissance
microbienne "facteur bifidus II'' ou "BFII". Il s'agit d'une substance de nature peptidique
qui prend naissance sous l'influence des protéases agissant sur diverses protéines,
en particulier la caséine du lait de vache et présente les propriétés suivantes :
-elle est un facteur de croissance essentiel pour la majorité des
57
souches de B. bifidum que l'on peut isoler à partir des selles de
nourrissons élevés au sein, en particulier pour la souche de TISSIER
- ce composé est différent du facteur bifidus 1 de GYOR GY et de la
strepogénine qui est un ensemble de peptides qui exercent un effet
stimulant sur la croissance de certaines bactéries comme les lacto-
bacilles et les streptocoques ;
- ce deuxième facteur provoque en deux ou trois jours l'apparition d'une
flore bifide prédominante chez les nourrissons qui ne présentent pas de
B. b. décelables dans leurs selles, lorsqu'on l'ajoute à un régime
artificiel ordinaire non bifidigène.
L'auteur définit l'unité du BF II, comme étant la plus faible quantité
de ce facteur qui dans les conditions indiquées donne une croissance correspondant
à une acidité totale de l ml d'acide 0, IN.
a) - ~~~~~:::~~l~:::~~~~~~~~l~J~~=~~=~r:::~t:
Dans le but de trouver des sources naturelles pourvues d'activité
comme BF II, RAYNA UD détermine le titre en BF n de divers produits biologiques.
Le tableau nO 7 . donne les résultats obtenus.
Il révèle que les sources naturelles sont en fait très pauvres en
BF II. Les hydrolysats enzymatiques de protéine sont les seuls produits riches en
ce facteur de croissance. Mais, RA YNA UD trouve que leurs titres sont très va riables.
D'où la nécessité, avant d'entreprendre une étude de la nature chimique du composé
actif, de trouver une source commerciale facilement accessible d'une part et de
rechercher par ailleurs les conditions d'hydrolyse protéasique les plus favorables pour
isoler ce facteur.
Ce double objectif inc ite les auteurs à étudier l'effet d'un grand
nombre de protéases: trypsine, papa1ne, pronase. Elles font toutes apparaître par
digestion de la caséine, des taux élevés de facteur bifidus n. Cela leur a permis de
sélectionner deux types d 'hydrolysats de caséine. Le premier est obtenu avec des
58
S UBS TAN CES
TITRES (EN UNITÉ/G)
- Lait humain d~ métang~
1 à 20 u./ 9
- Lait humain :tJLaité pM .e.a. papcün~
20 à 100 'u./g
1 à 250 u./9
- Tttyp.6-i..n~
85 u./ 9
- Pa.pcün~
100 u./g
500 à 100 u./g
20 à 660 u./g
- V-i..gu,tion papain-<..qu.~ d~ 6o-i..~ d~ v~au.,
2 500 u./g
- CMUn~ bttut~
-i..nac.tiv~!
50 u./g)
- HydttotY-6 a;t d~ C.M Un~ pM :
· ta papcün~
800 u./g
· ta p~p-6-i..n~
500 u./g
· ta :tJLYp-6Ù/'~
500 u./g
TABLEAU 7
T-<..:tJL~ ~n 6ae-t~u.tt b-i..MdU-6 II d~ d-<..veJU:>~ -6u.b-6tanc.~ d'apttè-6
RAYNAUV (118).
Un-i..té = ptU-6 6aibt~ qu.antité d~ BF II qu.-<.. donn~ u.n~ eno-i..-6-6anc.~
c.oltlt~pondant à u.n~ ac.-<..d-<..té totat~ de Imt d'ac.-<..de N/I0
59
broyats de muqueuse de porc; le deuxième avec la pronase. Ils font alors un fraction-
nement des deux hydrdysats de caséine à 11aide de diverses techniques chromatogra-
Ihiques. Ils obtiennent en définitive deux fractions avec un rendement faible en facteur
bifidus II. De l'aveu de RA YNA UD, les fractions obtenues sont encore très hétérogènes.
si bien que la nature chimique exacte du BF II reste toujours à préciser. Cela démontre
que les facteurs de croissance de nature peptidique constituent un groupe encore mal
connu.
60
D. - CONCLUSION.
Il serait intéressant de comprendre le mécanisme d'action des facteurs
bifidigènes. Dans le cas des composés de nature peptidique (facteur de RAYNA UD,
glycoprotéines du colostrum et de la caséine) ceci paraît très difficile, du fait que
la structure de ces composés reste encore très mal connue.
Quant à la glcNAC et ses dérivés, les travaux de O'BRIEN, GLICK et
ZILLIKEN (107, lOS), de LAMBERT, SAlTO
et VEERKAMP (75), de
VEERKAMP (173) ont montré que l'activité de l 'hexosamine est due à sa parti-
cipation à la biosynthèse de l 'acide muramique~ composé de base de la paroi
bactérienne. Ainsi, la nécessité pour B. bifidum d'un apport extérieur de la glcNAC
reste mal expiquée. Il en est de même pour la différence d'activité bifidigène de
l'hexosamine libre et de ses formes combinées naturelles (oligosaccharides) ou de
synthèse. Ce dernier fait qui donne toute son importance à l'apport de la glcNAC sous
far me d 'oligosaccharides présents dans le lait maternel découlerait selon LA MBERT
et ZILLIKEN (74) de l'existence d'une phosphorylase hypothétique permettant l'obten-
tion de la glcNAC 1® forme directement utilisable par B. bifidum.
61
CHA PIT RE III. - TRAVAUX PERSONNELS
62
A. - INTRODUCTION.
La réalisation de ce travail a été rendue possible en partie grâce aux travaux
de recherches entrepris depuis quelques années d'abord par BEERENS sur la toxo-
némie des Bifidobactérium, puis par ROMOND, NE UT et BEER ENS sur la composition
de la flore intestinale des nourrissons élevés au sein ou au lait artificiel.
A partir d'une étude réalisée sur les selles de 50 enfants dont 39 étaient nourris
artificiellement et 11 recevaient du lait maternel, ils montrent que dans le cas de
l'alimentation au lait de femme, la souche B. bifidum reste prédominant dans les selles
puisqu'elle représente 72% des souches isolées. Par contre, lorsqu'on s'adresse à
l'alimentation artifioielle, le taux de B.b. n'est plus que de 13% et la souche B. longum
devient majoritaire avec un taux de 60% de la flore fécale totale. L'espèce B. infantis
étant également bien représentée avec une valeur de 18%. Pour l'équipe de ROMOND,
les bactéries isolées des selles de nourrissons peuvent être réparties en deux groupes:
un premier qui comprend les espèces longum et infantis dont la croissance est favorisée
par l'alimentation artificielle. Un deuxième groupe formé par l'espèce B. bifidum qui
est favorisée exclusivement par le lait maternel.
Les auteurs concluent donc à l'existence probable de facteurs spécifiques
dans le lait de femme, ayant la propriété de stimuler la croissance du B. b.
B. - PREPARATION DE LA FRACTION ACTIVE DU LAIT MATERNEL.
1. - ~~~<!~~.P!~]~~~~~~~~~ :
Disposant d'un test microbiologique de mise en évidence de l'activité
bifidigène, nous avons appliqué au lait maternel, différentes méthodes classiques
de préparation et de fractionnement, dans le but d'isoler et concentrer à partir de
celui-ci, les composants responsables de son activité biologique.
Le lait de femme fourni par le lactarium de l'Institut Pasteur de Lille
est un lait de mélange provenant de plusieurs donneuses.
63
Ce lait a fait l'objet de plusieurs essais de centrifugation. Et, nous avons
constaté que la centrifugation à une vitesse de l'ordre de 15 000 t/mn à 4"C pendant une
heure permettait d'obtenir un lait écrémé, plus clair, qui garde toute son activité
1
bifidigène. Dans ces conditions tous les échantillons de lait ont été systématiquement
délipidés avant utilisation.
II. - Fractionnement du lait maternel:
1-/ - Précipitation de la caséine
La caséine est précipitée selon la méthode de DUNN, par
abaissement du pH au voisinage de son point isoélectrique pHi = 4,6 à l'aide d'acide
chlorhydrique NilO, suivie d'une centrifugation à 4-C pendant une heure à 15 000 t/mn.
Le lactosérum surnageant est ajusté à pH7 par addition de
soude, NaOHN. Tandis que la caséine précipitée est redissoute dans un volume de
tampon phosphate 0,1 M pH7 égal au 1/7è du volume de lait utilisé.
Nous constatons que la précipitation de la caséine n'altère
pas l'activité bifidigène du lait de départ, puisqu'on la retrouve après précipitation
de celle-ci dans le lactosérum
(TABLEA U 8).
On peut aussi noter la présence d'une activité biologique dans
la caséine pour les souches de B. bifidum testées: AA 2/2 et B 536. Mais celle-ci
reste faible, puisque à la dilution du 1/5, l'activité dispara1t déj à. Cela confirme les
résultats obtenus par BEZKOROVAINY et Collaborateurs qui ont trouvé également de
l'activité bifidigène, dans les fractions de caséine humaine.
Compo-6é
E-6pèce B. b~6~dum
E-6pèce B. to~gum
B. ~~6aYlÜ.-6
é;tu~é
AA 2/2
Pe~~.
B536
Na.n:te-6
Lo~g CoU
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U
TABLEAU
8
ailivdé b~otog~que du tac.to-6éJWm e.t de .ta.. cMé~~e humM~e -6W1.. ta cJto~Ma.nce de 8 -6ouche-6 de
B~6~dobac.té~um appah.te~a~ aux e-6pèce-6 : b~6~dum, to~gum e.t ~~6aYlÜ.-6.
(L'ailivdé b~otog~que é.ta~ ~ep~é-6eniée p~ ta denniè~e dil~o~ pO-6~ve).
C"J
..,.
65
2°/ - Fractionnement au sulfate d'ammonium:
Le lactosérum est fractionné par addition de sulfate d'ammonium
sec, avec agitation constante à 4°C pendant une heure.
l es trois fractions précipitant respectivement à 33%, 50%, 75%
de saturation en sulfate d'ammonium, sont recueillies par centrifugation pendant une
heure à 15 000 t/mn. Les précipités obtenus Pl, P2, P3 sont redissous dans du
tampon phosphate 0,1 M pH7. Les solutions qui en résultent et le surna&,eant final
"83" sont dialysées en boudins de cellophane, une nuit ~ 4-C contre de l'eau, puis,
contre du tampon phosphate pendant une journée. Elles sont ensuite concentrées par
ultrafiltration à l'aide de membranes Annicon type UM
pour obtenir un volume égal
10
au 1/10è du volume de lactosérum de départ. La figure 8 illustre le schéma de frac-
tionnement du lactosérum que nous avons appliqué.
Une étude de l'activité biologique a été faite sur les différentes
fractions.
Le tableau n8 9 révèle la présence d'une faible activité bio logique
dans les précipités Pl et P2 ; par contre, elle est beaucoup plus awarente dans le
P3 avec toutes les souches de Bifidobactérium même avec celles qui sont retrouvées
chez les nourrissons alimentés au lait de vache. Quant au surnageant final "83", il
semble ne favoriser que la croissance des souches AA 2/2 et B 536 appartenant à
B. bifidum, spécifique des nourrissons élevés au sein, puisque le test microbiologique
est négatif sur les autres souches.
Il convient de noter l'existence de petites différences dans les
résultats d'un essai à l'autre.
Cela est dû, sans doute, aux difficultés de reproductibilité du
test bactériologique. En effet, si la souche est mal activée, elle réagit difficilement
en présence des facteurs. Néanmoins, l'essentiel des résultats reste reproductible
d'un essai à l'autre.
Notons également la faible réactivité de la souche Penn. vis-à-vis
de ces facteurs de croissance.
66
Lac;toJ.Jétw.m pH 7
ame..né à 33% de.. .oa;tuJUtt,lon
e..n J.Ju1.ûCLte.. d' ammonium
FilVLCLt 51
ame..né à 50% de.. J.J~on
e..n J.Ju1.ûCLte.. d'ammonium
t----------~ pttécJ.pdé Pz
Fil.tJtCLt 5 Z
ame..né à 75% de.. J.Ja;tUlta.;t{.on
e..n J.Ju1.ûCLte.. d'ammonium
pttécJ.pdé P3
F-LUJc.CLt 53
FIGURE 8
5ehéma de.. ûttac.;t{.onne..me..Yl.t du fac;toJ.JéttLtm au J.Ju1.6CLte.. d' ammolULtm.
E~pèc.e B. bifri-dum
E~pèc.e B. longum
B. in 6a.rz.ü6
AA 2/2
B 536
Penn·
Na.n;t~
Long. c.oU
LMa.3
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TIf
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100
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Pl
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PZ
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+ pWt
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175
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P3
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+ pWt
+ pM
E
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10
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S3
+ 1
+ 1
+pWt
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-
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-
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100
100
TABLEAU N°9
Ac;t-i.v,ué biologique d~ 6Jtac;t-i.o~ obtenu~ pM 6/lac;t-i.onnement du laU mate.!lne.t au /.) u1.6ate dl ammonium
Pl, PZ, P3 p!léc.-i.pLté~ obtenU/.) à 33% - 50% - 15% de ~atWtat-i.on en S04INH4)2 i S3 ~ ~Wtnagea.n;t 6ina!.
HuU /.)ouc.h~ !lépaJL.t,L~ en 3 ~pèc.~ 1Bifri-dum, longum, in6anfu) ont été t~té~.
(j)
-::J
68
3°/ - Précipitation à l'acide perchlorique
a) - ~<;~~;>~~!;1~~~~ :
De l'acide perchlorique pur est ajouté au lait de femme écrémé,
jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de 0,6 N. On laisse sous agitation
constante à 4°C pendant une heure. La solution obtenue est ensuite centrifugée à
15 000 t/mn pendant une heure.
Le précipité formé est remis en suspension dans du tampon
phosphate pH7. Le surnageant limpide est neutralisé par de la potasse, KOH 2N.
On laisse précipiter le perchlorate de potassium à 4°C pendant
une nuit. Celui-ci est alors éliminé par décantation. Le surnageant final, dénommé
"Sf" est concentré par ultrafiltration à l'aide de membrane amicon UM 10.
Les résultats du traitement du lait humain par l'acide perchlorique
nous permettent de faire deux constatations :
- le facteur spécifique qui facilite la croissance de la souche AA 2/2 se
retrouve dans le surnageant de précipitation perchlorique. Il filtre à
travers la membrane UM10 ; il correspond donc au facteur précédemment
décrit, et restant dans le surnageant après fractionnement au sulfate
d'ammonium (TABLEAU 10) j
- cependant, on retrouve une certaine activité vis-à-vis d'autres souches
n'appartenant pas à l'espèce B. b.
On peut donc penser que l'acide perchlorique précipite certains
facteurs précipitables par le sulfate d'ammonium qui sont non spécifiques des souches
B. b. et qui sont en partie dénaturés par le traitement perchlorique.
Des résultats
similaires ont été obtenus par précipitation alcoolique du lactosérum.
~
l::I
B. biQ-i.dum
~
B. ton.gum
B. in. 0an:tÂ.A
~'~ AA 2/2
B 536
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TABLEAU 10 - Ac.:tA..vUé biQ-i.Mgè.n.e.. de!.> Mo 6éJte..n..te..-o 6Jtac.:tA..on6 obte..n.ue..-o pM 6JtaC:Üon.n.e..me..YLt à t' aude.. pe..Jtc.h.toJUque.. 0)
co
0,6 N du tait de.. 6e..mme...
L'ac.;û.vaé. de.. 6ac.te..uJt.6 de.. c.Jto-u.6anc.e.. a été étuMée.. .6UJt g .6ouc.he..-o ftépMtie..f.> e..n. 3 e!.>pè.c.e..-o (biQ-i.dwn,
ton.gwn, in.6an.ti.6 ) •
70
III. - Etude de la fraction active du lait maternel:
Les résultats précédemment rapportés montrent qu'un facteur de croissance
pour l'espèce B. bifidum se retrouve dans le surnageant après précipitation par le sul-
fate d'ammonium ou l'acide perchlorique.
Ce dernier procédé, d'utilisation plus aisée, a donc été retenu et une étude
plus approfondie des propriétés de la fraction ainsi obtenue (Sf) a été entreprise.
10/ - Concentration:
Dans le but de concentrer le Sf, différents types de membranes
amicon ont été essayés: UM 10, DM5, UM2 et UM 05 dont les limites de rétention
se situent respectivement à 10 000, 5 000, 1 000 et 500 daltons. Grâce à celles-ci,
les essais sont concentrés au 1/3 du volume de Sf de départ.
D'après les résultats obt enus (TA BLEA U 11), nous constatons
une diminution relative de l'activité bifidigène du filtrat à partir de la membrane DM5.
Celle-ci disparatt totalement quand on utilise la membrane UM05.
Dans ces conditions, on peut penser que la fraction active est très
hétérogène et que la masse moléculaire des composés actifs s'échelonne entre 500 et
10 000. Cependant, la technique d'ultrafiltration n'est pas utilisable pour concentrer
nos préparations, du fait des nombreux inconvénients qu'elle présente. En effet,
le volume des cellules ne permet pas de travailler sur de grandes quantités de fractions
de lait. Elle impose des heures d'attente pour obtenir la concentration voulue. Le
nettoyage des cellules et des membranes demande un temps relativement long.
Ces difficultés nous ont donc contraint à essayer d'autres moyens
de concentration, comme la lyophilisation et l'évaporation rotative sous pression
réduite.
SOUCHES
S3
Ultna6~o~/UM 10
U~a6~atio~/VM S U~a6~atio~/UM 2
U~a6~o~/UM05
SoL c.o~c.e.rWz..é.
F-<-U!tat
SoL c.o~c..
F-<-U!tat
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SoL c.o~c..
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AA 2/2
+1
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TABLEAU li -
Co~c.e.l'Wta;üo~ du. S6 (-6u.Jmage.ant Mnaf du. 6Jtactio~~e.me.YLt au. SO4(NH 4) 2 ) pM uli:JtaM"UJr.a.tio~
-6UJt me.mbJtane.-6 : UMI0, VM5, UM2, UMOS.
-.:]
1--'
72
Quelques essais ont été réalisés à partir du Sf de précipitation
perchlorique. Le résidu obtenu est difficile à remettre en solution, malgré l'addi-
tion d'un faible volume d'éthanol. La suspension est alors centrifugée à 4 000 t/mn
pendant 10 minutes. Le culot et le surnageant sont testés bactériologiquement.
..
Les résultats obtenus montrent que l'activité de croissance
microbienne observée dans le Sf se trouve répartie dans le surnageant et le culot.
Les difficultés rencontrées pour la remise en solution ne semblent
pas dues à la présence de graisses, puisque l'extraction du Sf par les mélanges
alcool/éther, éthanol/chloroforme et par l 'hexane n'entraine pas de quantité
mesurable de produit dans la phase organique.
En définitive, la méthode de concentration que nous avons retenue
est l'évaporation sous pression réduite, puisqu'elle permet de concentrer en peu de
temp3, nos préparations à volonté et sans perdre leur activité biologique.
2°/ - Traitement par la chaleur:
Les travaux de BEERENS, ROMOND et NEUT (5) avaient déjà montré la
thermostabilité des facteurs bifidigènes dans le lait de femme.
Nous avons voulu vérifier que nos préparations présentaient également
les mêmes caractéristiques. Effectiv'ement, celles-ci gardent leur activité après
chauffage à 60°C/1heure, 1000C/1heure, 120°C/40 minutes, 120°C/1heure.
3°/ - Hydrolyse acide:
Etant donné cette stabilité particulière à la chaleur, nous avons cherché
à préciser la nature chimique des facteurs de croissance en testant leur acido-
stabilité. Ceci a été étudié de la manière suivante
Essai 1 :
=======
Du Sf est chauffé à reflux pendant 15 heures à 100°C, en présence d'acide
chlorhydrique 6 N.
Le mélange est ensuite évaporé à sec, repris par un faible volume d'eau,
puis évaporé à sec à nouveau. l.e résidu est fina lement repris dans.l 'eau
et neutralisé pour être testé bactériologiquement.
Parallèlement, un témoin a été préparé par neutralisation immédiate de
l'acide chlorhydrique.
73
Essai 2 :
=======
D'autres essais ont été réalisés en chauffant le Sf à 100·C pendant 2
heures en présence d'acide chlorhydrique N et NilO. Les solutions
sont ensuite neutralisées par addition de soude. Des témoins ont été
préparés parallèlement comme décrit plus haut.
Les différents essais font l'objet d'un test d'activité microbienne. Il
en ressort que dans les hydrolysats chlorhydriques 6 N et N, l'activité
biologique est totalement détruite puisque les deux essais se montrent
inactifs sur la souche AA 2/2, sauf dans les témoins.
Par contre, dans 1'hydrolysat NilO, une faible activité a été détectée.
Ceci s'explique peut être par le fait qu là cette concentration d'acide,
les facteurs actifs sont partiellement dégradés.
4·1 - Conclusion:
A ce stade de notre travail, nous pouvons dire que les facteurs bifidigènes,
responsables de l'activité bio logique du lait de femme, peuvent être retrouvés dans
une fraction non précipitable par le sulfate d'ammonium à 75% de saturation, par
l'alcool à 80%, par l'acide perchlorique 0,6 N. Bien que cette dernière méthode soit
moins spécifique pour préparer la fraction de lait active sur la croissance de
B. bifidum, nous l'avons quand même retenue compte-tenu des nombreux avantages
qu'elle présente par rapport au fractionnement au sulfate d'ammonium.
- En effet, elle permet d'obtenir la préparation de lait en quelques heures,
ce qui est pratiquement impossible avec la première méthode;
- d'autre part, l'élimination du perchlorate de potassium est très aisée.
On évite donc ici toute la phase de dialyse, qui est nécessaire dans le
cas du fractionnement au sulfate d'ammonium pour éliminer les sels
- enfin, la méthode à l'acide perchlorique fait appel à du lait délipidé,
alors que la première comme la précipitation alcoolique exigent l'uti-
lisation du lactosérum qu'il faut d'abord préparer.
Les résultats de l'étude préliminaire de la fraction active ainsi obtenue
à partir du lait humain ont montré que: celle-ci garde son activité après lyophilisation
ou après concentration par évaporation sous pression réduite ; qu'elle présente une
74
stabilité remarquable à la chaleur; que par contre, elle est totalement dénaturée par
hydrolyse acide ménagée.
Ces caractéristiques nous permettent de formuler l 'hypothèse que
les facteurs actifs du lait de femme peuvent être de nature glucidique.
Mais la préparation de lait reste encore très hétérogène. Nous avons
alors jugé nécessaire de la purifier, en appliquant les techniques classiques de
gel filtration sur colonne de gel de polyacrylamide.
femme:
1°/ - Gel filtration sur biogel P6
La fraction (Sf), obtenue par précipitation perchlorique est neutra-
lisée à ph7, puis concentrée au 1/5ème de son volume initial.
Elle est déposée en 3 fois, à raison de 15 ml par dépôt sur une
colonne, type pharmacia K26 (55 x 2,6 cm) de biogel P6 (100 - 200 mesh).
L'élution
se fait avecdutamponTBIS-HCl 0,05 M, pH7. L'éluat est recueilli par fractions de
7,5 ml en 20 minutes sur un collecteur de fractions.
L'absorbance des différents composés est lue à 254 nm. Les
oses
ont été dosés dans les différentes fractions recueillies par la méthode à
l 'oreinol sulfurique en flux continu.
En fonction des résultats du test bactériologique, les fractions
'actives récupérées lors des 3 gel filtrations sont réunies et concentrées à 1°ml
soit 1/25ème du volume de lait dont on est parti.
Le profil d'élution des différents composés est représenté sur
la figure n° 9. Les fractions bifidigènes sont éluées entre le 10ème et le 34ème tube,
donc dans l,me zone assez large, ce qui démontre leur hétérogénéité. Ces résultats
viennent donc confirmer ceux que nous avons obtenus par ultrafiltration du Sf per-
chlorique, et qui nous ont permis de dire que la masse moléculaire des facteurs
L]ù 2 ~4 11111
Vù ~20 11111
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-++++++++++++++ +++.+++--
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Numb~e de
6,acLiutl6
FIGURE 9
Ch'tomatoglW.phie 6UIL ~olorme (55 .t 2,5 cm) de b.iugef. P6 liDO - 200 meûd dll 6Wl11ageant 6L/lai (S61,
obtelJu pM 6'tClc.ti.ormernetlt du laLt mate/Illei. à l' aci..de pe!l.chl.oüque 0,6 N et /leu.t!l.a1i..~é pM la potaMe 2 M
---1
ol:>.
Vépôt ; 15 fII1 ; é(lUmt ; tampot! viM HCl 0.05 M plf7 ; débd : 23 ml/ heUILe.
0-
EI1 u!l.durmée6 : ab60!l.bwlce à 254 111/1 e-t Vù llIe6wlée à 510 Y1111 ap!l.è.~ Itéac.tiotl à l'olLcùwl 6ul6U!l.Lque.
~.
{IJ
" - 0 - 0
;
di..aglLa.JIIme d'élu..ti.oll
. - - - . - - . ; ltepélLage de-6 06e-6 à l'oltculol 6ui6U1tÂque
+++++ : ac..tLv.i...lé b.i6Ldigètle 6/1.'1. .ta ~ollclte AA 2/2 de l'upèce. B. bL6.idwn.
75
bifidigènes était comprise entre 500 et 10 000. Notons également la coïncidence re-
marquable entre la présence des sucres et la zone de localisation des composés
actifs élués. La fraction majeure des
oses
correspond certainement au lactose
qui ne paraît pas supporter l'essentiel de l'activité biologique.
Pœr parfaire l'élimination de ce dernier et des composés de
faible masse moléculaire, une deuxième chromatographie par gel filtration sur
colonne de biogel P2 a été réalisée.
2°/ - Gel filtration sur biogel P2
a) - ~=o=<L~~t~~;>l;:~ :
La préparation précédemment obtenue (10 ml) est déposée en
3 fois sur une colonne (90 x 1,5 cm) de biogel P2 (100 - 200 mesh ).
L'élution se fait avec de l'eau bidistillée.
L'éluat est collecté par fraction de 5,5 ml en 15 minutes.
L'absorbance des composés est lue à 280 nm.
Comme dans le cas précédent, un repérage des sucres et un test
d'activité microbiologique sont effectués.
b) - ~~~~l~~t~=:
Les facteurs de croissance pour AA 2/2 sont ici présents dans une
zone assez restreinte (figure 10) qui va du 10è au 18è tube et qui coïncide avec les
fractions riches en sucres.
Cependant, cette préparation reste encore très hétérogène. Nous
avons alors pensé qu'il serait intéressant d'appliquer d'autres moyens de purification
tels que la chromatographie sur résines échangeuses d'ions.
Ceci aura l'avantage de nous permettre de connaître la charge
des différents composés actifs sur la croissance de B. bifidum. Pour cela, nous
avons utilisé deux types de résines:
- une résine échangeuse de cations Dowex 50 x 8
- et une résine échangeuse d'anions Dowex 1 x 8.
DO 25.J
-++++++++++-
11111
VO 520 IIJII
Il
1
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1,0
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1
1
1
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1
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5
10
15
20
25
30
35
NombJze. de.
Fttac-tiol1.~
FIGURE 10
c/tttoll1MogttapfUe. ~U!l. cotonlte.
(90 x 1,5 cm) de. htoge.t P2 (100 - 200 m~lt) de. ta 6·'Lacuon aàtve de.
ia..d mCLte.ttne.t pttéCLiabte.men..t pUJU 6-tée. '-' tVl. dIt b.i.oge.f P6
---J
Vépô.t = 3 mi ; é.tuan.t : eau du.tLUée, déb.i..t 22 mf/he.U!l.e.
m
0 - 0 - 0
;
d.tagttamme. d'éÙd"<'on
• - - • - . : tte.péttage. de.6 o~ ~
+ -t -r+
: adi-vdi!. b.i.6-tcü.gèl1e. é.tlld.tée. ~U!l. ta ~ouche AA 2/2 de t'~pèce. B. b.i.6-tdum.
77
V. - Chromatographie sur résines échangeuses d'ions:
1°/ - Résines échangeuses de cations, Dowex 50 x 8 (200 - 400mesh ),
forme acide.
Nous avons déposé 5 ml de la préparation obtenue précédemment,
sur une colonne (15 x 1 cm) contenant la résine Dowex 50 x 8 (200 - 400 mesh), forme
acide. Les produits non fixés sur la résine sont élués avec de l'eau distillée 3 x 10 ml.
Ceux qui sont retenus sont déplacés par de l'ammoniaque 2 N.
Les éluats sont évaporés à sec et repris par 5 ml d'eau distillée.
Dans les mêmes conditions opératoires, on réalise un témoin en traitant 5 ml de
produit par de l'ammoniaque pour ajuster la concentration à 2 N. La solution obtenue
est également évaporée à sec, puis repris par 5 ml d'eau distillée.
Les résultats du test bactériologique montrent que les facteurs
de croissance bactérienne se retrouvent uniquement dans la fraction éluée avec l'eau
et dans le témoin. Cela signifie que les produits actifs ne sont pas retenus par la
résine et qu'ils ne sont donc pas chargés positivement dans les conditions utilisées.
Du fait que l'activité ne disparaît pas après traitement à l'ammoniaque, il semble
bien qu'aucun produit actif n'ai été retenu par la résine.
L'échantillon actif de lait de femme ainsi obtenu après purification
sur résine Dowex 50 x 8 est défini comme étant la fraction (FA).
Des dosages à la ninhydrine ont été réalisés avant et après passage
de la préparation delait sur Dowex 50 x 8. Les résultats obtenus montrent une forte
diminution des chromogènes correspondants.
Quant à l'activité biologique observée initialement, elle reste
pratiquement au même niveau avant et après purification sur résine cationique. Ce
résultat démontre que les composés actifs contenus dans le produit FA ne sont sans
doute pas de nature peptidique puisque la rétention des peptides par la Dowex 50 x 8 ne
s'accompagne pas d'une baisse notable de l'activité bifidigène dans la fraction de lait
humain.
78
2°/ - Fractionnement de FA sur résine échangeuse d'anions Dowex
1 x 8 (200 - 400 mesh), forme acétate:
a) - ~<;~~~Jl~!~1~ir;,,~:
La fraction FA a été soumise à un fractionnement sur Dowex 1 x 8
(200 - 400 mesh), forme acétate. Cette méthode a déjà été appliquée en 1975 par
GRIMMONPREZ et MONTREUIL (42) à l'adialysable de la fraction 89 du lait de femme.
Ce qui leur a permis d'obtenir 4 sous-fractions à partir de ce produit.
Le fractionnement se déroule selon le procédé suivant:
- sur une colonne (50 x 2 cm) contenant la Dowex 1 x 8, sont déposés
5 ID l de la pré pa ration FA.
L'élution avec l'eau distillée fournit une fraction FI.
Le déplacement des composés fixés sur la colonne est réalisé
par le passage successif de tampon acétate de pyridine pH 5,5 de molarité 0,01 M -
o, 05 M, 0, 15 M.
L'éluat est fractionné en fonction des résultats du repérage des
oses
à l 'orcinol sulfurique. Après lyophilisation, les résidus sont repris par un
faible volume d'eau.
Les différentes solutions ainsi obtenues font l 'obj et d'un
test bactériologique, d'un dosage de sucres et d'une analyse électrophorétique sur
papier Whatman 3 MM dans les conditions suivantes :
- tampon de migration: pyridine/acide acétique / eau (3/1/387)
voltage 7v / cm ; durée de l'électrophorèse = 16 heures.
Révèlation par le réactif à l'oxalate d'aniline.
b) - ~~~~l~~~ :
La chromatographie sur colonne de Dowex 1 x 8 de la fraction FA per-
met d'isoler 7 sous-fractions (figures ll,12)avecdesteneurs variables en oses neutres
(TARLEA U 12). Les produits de la fraction FI sont formés de composés neutres,
non retenus par
la résine.
TAl1PON ACETA'l'E DE PYHIDINE
pli 5,5
D 520 nun
'l'AMPON ,0 ; 01 o,'M
EAU
0,05 M
'l'AMPON' 0',1 5 ~l'"
"'-../
............
" - / '
/ "
.---:-....
;>' .......
F.1
1
F.2
1
1
F.5
1,5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1.0
1
1
F.7
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,5
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
F.4
1
1
1
1
1
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
FIGURE
11
- Nombre de fractions
FIGURE
11
C{~om~to9napf~ie ~un
--J
colonne (50 x 2 cm) de Vowex 7 x 8 (200 - 400 m~h, 6o~e acét~e) de la 6naction
1.0
active FA (5 ml) du lMt de 6emme. L' élut-i.oH d~ compo~é.~ H
6aa pM du ~pOH acét~e de pljA-i.r:Li.Hl'. pH5, 5
à d-t66énente6 cOHcentn~oM : 0,07 M - 0,05 M - 0,75 M.
En ab~c.(,Me6
: nombne de 6naetio~ de 5,5 ml necuueLi~.
EH ondomtée-6 : de~.ité op.tiQlte me6unée a 520 nm apnè~ néaetioH à l' Munol M ti 6wLiQue.
FA
Fi
F2
F3
F4
F5.
F6
F7
~ O
·
·
•
1
•
1
1
o
$
o
o
0
o
JJJO
o
rrO
o
;;0 o
FIGURE 12,-
Ue.cJ:Jz.ophoJtù e.
0
-6 uJ!. pap,i.e.Jt Wha.,tman 11 3 deA -6 OM - oJtaWO/1-6 0 bte.l1ue.-6 pM c.hJtoma.,togJtapfUe. -6 uJt c.olol1l1e.
de. Vowex 1 x 8, ooJtme ac.éta.,te. de. la oJtawon FA du l~ de 6e.mme. r à V : c.on6~ua~ éle.cJ:Jz.o-
phoJté.,tique.-6 de. .ta oJtawol1 awve. FA du lait de. 6emme.
COl1ditiO/1-6 de l'é.lecJ:Jz.ophoJtùe. : tampol1 : PyJtidil1e/ac.ide ac.é.,tique. /eau : 3/1/387 , pH5,4
Rév~latiol1 p~~ le. Jtéaw6 à l'exafute d'ani.~l1e.
(Xl
o
81
SOUS- FRACTIONS
TENEUR EN OSES
ACTIVITE BIFIVIGENE
NEUTRES (e.n g/l)
SUR LA SOUCHE AA 2/2
F1
24,46
+ 1
-
500
F2
3,09
+ 1
100
F3
2, 1
+ 1
20
F4
0,64
+ 1
20
F5
2,5
+ 1
20
F6
1,57
+ 1
20
FT
1, 34
+ 1
100
TABLEAU 12
Ac.livilé biMcügène. du cü66étte.I1:te.!.> !.>o~-6ttac.liort!.> obte.nuu
pM cJUl.Omatogttaprue. !.>UIt c.olonne. de. VOWEX 1 X 8 (200-400
muh), 6oltme. ac.étate. de. la 61tac.tion FA du lad de. 6e.mme.
/~UIt la. c.ttoi/.>UU'lc.e. de. la /~ouc.he. AA .2/2 (13. b,i.Mdum), !.>péuMque
de.!.> !.> e.Uu de. noUltlti!.>!.> ort!.> alime.l1:té!.> au lad de. 6e.mme..
82
Ils représentent la majeure partie des sucres élués. FI correspond
au constituant électrophorétique 1.
Une rétention aêcrue des autres composés glucidiques sur la colonne
de résine se traduit par une diminution de leur mobilité électrophorétique.
Les fractions F2, F3 et 1"7 correspondent aux composants II, III
et V de l'électrophorégramme. F5 et F6 migrant pratiquement au même niveau repré-
sentent le composant IV. Quant à la sous-fraction F4, elle est en concentration très
faible pour être visible au niveau du mélange de départ.
Le comportement électrophorétique des produits élués confirme donc
la qualité du fractionnement réalisé.
L'étude de l'activité biologique des sous-fractions montre que les
facteurs de croissance pour B. bifidum sont répartis dans toutes celles-ci. Ramené
à une même concentration en sucres, le niveau d'activité bifidigène exprimé par la plus
faible dilution active est approximativement le même pour chacune des sous-fractions.
Les facteurs bifidigènes sont donc formés à la fois par des molécules
chargées négativement et par des dérivés neutres.
VI. - Conclusion:
La chromatograIhie par gel filtration nous a permis non seulement de
Pllrifier la préparation de lait de femme (Sf) obtenue par précipitation perchlorique,
mais aussi de mettre en évidence 1l1étérogénéité des facteurs de croissance micro-
b~enne contenus dans celle-ci. La position de ces éléments actifs coïncide sur le
diagramme d'élution avec celle des fractions riches en oses.
Le passage sur la résine Dowex 50 x 8 du produit résultant de la chroma-
tographie de gel filtration révèle que les facteurs bifidigènes ne correspondent proba-
blement pas à des substances peptidiques. Cette hypothèse se trouve vérifiée par le
fractionnement du produit FA effectué grâce à l'application de la méthode de chroma-
tographie sur résine Dowex I x 8 forme acétate, spécifique des sucres. Ceci confirme
l 'hypothèse de la nature oligosaccharidique des éléments actifs du lait humain formulée
auparavant.
83
Avant d'aborder une étude structurale des composés responsables de l'activité
biologique de la préparation FA de lait de femrre, il serait intéressant de connaître
le comportement des souches bactériennes autres que B. b. , mais appartenant au même
genre Bificiobactérium vis-à-vis de celle-ci.
84
C. - ETUDE DE L'ACTIVITE BIFIDIGENE DE LA FRACTION FA DE LAIT
MATERNEL SUR LA CROISSANCE DES SOUCHES APPARTENANT
AU GENRE BIFIDOBACTERIUM.
1°/ - Mode opératoire:
L'étude a. été réalisée à pa rtir de la fraction FA de lait de femme
préparée suivant le procédé décrit précédemment et dont on connaît l'activité biologique
sur la souche AA 2/2. Les essais ont été effectués sur 43 souches réparties en trois
espèces différentes appartenant au genre Bifidobactérium :
- 30 souches de B. bifidum ;
-
7 souches de B. longum ;
-
6 souches de B. infantis.
Elles proviennent toutes soit d'isolements récents des selles de
nourrissons élevés au sein ou au lait maternisé, soit de la collection du laboratoire
de bactériologie de la Faculté de Pha rmacie de Lille. Le choix a été fait en fonction
de leur taxonomie et surtout ce sont les trois espèces que l'on rencontre dans les selles
des nouveau-nés. Nous avons retenu un nombre plus important de l'espèce B. bifidum
puisque les travaux antérieurs de ROMOND, NEUT et BEERENS (97, 98, 126) ont déjà
montré l'absence d'activité du lait maternel pasteurisé sur les espèces B. longum
et B. infantis. Toutes les souches ëhoisies sont conservées à -18°C dans un milieu de
Rosenow.
Avant tout essai, on procède d'abord à une vérification de l'identité
et de la pureté de chaque souche selon les critères d'identification retenus par
BEERENS, ROMOND et NEUT.
La méthode utilisée pour faire cette étude est la même que celle
pratiquée pour la mise en évidence de l'activité bifidigène des différentes préparations
de lait.
2°/ - Résultats:
Nous constatons d'après les résultats rassemblés dans le tableau 13
que la croissance de toutes les souches' appartenant à l'espèce B. bifidum est activée,
85
~ 43 Muchru.. bacté~eYlY1ru.. appM-teYlaYlt.
Aetivité b~olog~que de la 6~aetio~
cJ
I~ au 9eM<? B~ Mdo bac.té.~um
FA de lait hwnaùl.
-<)
\\..LJ
1e~ ru..J.J~
2Vne ru..J.J~
- - - - - - - - -
----------
- AA 6/5, 150, 154
+ 1
+ 1
600
800
- AA 2/2, AA 2/8, AA 5/4
+ 1
+ 1
500
500
- AA 8/7
+ 1
+ 1
400
400
- B. b~6· VM. a.
+ 1
+ 1
250
250
~ - AA 4/1, AA 4/9, B 609, B 536, B 601
+ 1
+ 1
'1j
'-.2
' 0
200
200
'-.2
..0
- 88, 158, B 594
+ 1
+ 1
100
100
ÇQ
-
1, 30, 85, 91 , 125, 148
+ 1
+ 1
50
50
- AA 3/9, 36, 58
+ 1
+ 1
20
20
-
PertVl.,
AA J/ Il , 12
+ 1
+ 1
TG
TG
,
- AA 1/6, B 5J8
+ pM
+ pM
~
~ - B NaYl.tru.., LMa3, B. lOYlg, 22
~
~ - BN20, A 4/4, B~6. 7/4
--------------------------------------- r------------------- r------------------
~ - B 596, C6, B. ~Yl6. S 2
~- B. b~eve, B~6. J, 25
~
'-.2
TABLEAU 13
Etude du compoueme.Ylt dru.. Muchru.. bac.té.~eYlYlru.. ~é.p~ru..
eYl 3 ru..pècru.. (b~6~dwn, lOYlgwn, ~Yl6a~) appM-te~ant au
ge~e B~6~dobac.té.~um.
L'aetivité b~olo9~que étaYlt. ~ep~é.J.JeYl.té.e pM la d~~è~e
~~Oyl pOJ.J~ve.
AA 2/2, J.Jouche ~pé.uMque dru.. J.Jelie,,6 de YlO~J.JOYlJ.J aLUne.Ylt.éJ.J
au lait de 6emme.
85 bis
RESULTAT DU TEST DE DOSAGE DE L'ACTIVITE BIFIDIGENE SUR LES SOUCHES AA ?/2 et B 536
-----------------------------------------------------------------------------------
86
alors que celle des souches faisant partie des espèces B. longum et B. infantisest
pratiquement nulle, en présence de la préparation FA. Cela signifie que seules, les
premières souches bactériennes y trouvent leurs facteurs de croissance. Ceci
démontre bien dans l'ensemble que l'espèce B. bifidum est homogène et se distingue
nettement des autres espèces (longum et infantis). Ce qui confirme les résultats
obtenus en 1981 par NEUT, ROMOND et BEERENS (97, 98) qui sont parvenus àla
même conclusion en identifiant les bifidobactérium en foncti01 de leurs besoins
nutritionne Is.
Néanmoins, nous observons une petite différence de comportement
des souches de B.b. en présence de FA. En effet, 22 souches sur 30 de B.b. présentent
une croissance jusqu'aux dilutions comprises entre 1/50 et 1/600 du produit à tester.
A côté de celles-ci se trouve un deuxième groupe dont la croissance disparaît déjà à
la dilution du 1/20. Cette petite différence oblige d'ailleurs ROMOND et Collaborateurs
à empl~er plutôt le terme de ''homogénéité relative" de l'espèce B. bifidum.
Parmi ces dernières, la souche Penn., bien qu'elle soit de l'espèce B. bifidum ne
réagit que faiblement à la fraction de lait obtenue. Ceci s'explique peut-être par le
fait qu'il s'agit d'une souche maintenue longtemps en collection.
La fraction FA apparaît donc contenir les facteurs de croissance
de l'ensemble des souches de l'espèce B. bifidum, spécifiques des enfants nourris au
sein. Une étude structurale de ces derniers a donc été entreprise.
87
D. - ETUDE STRUCTURALE DE LA FRACTION FA DU LAIT DE FEMME.
I. - !?~!~~i!~c:r:.9~_~c:t~~!:~~~~~~l_~~f~~~!i~~~•
. "Ce travail a été rendu possible grâce au concours du Laboratoire
de Chimie Biologique dirigé par le Professeur J. MONTREUIL (LILLE 1) qui s'est
attaché depuis longtemps à l'étude des composants du lait de femme".
Cette étude a été abordée de deux manières différentes-:
- Par l'étude de l'activité bifidigène des oses et oligosides de
structure connue. En effet, l'ensemble de nos résultats démontrant la nature
oligosaccharidique des facteurs de croissance, nous avons testé l'activité biologique
des oligosaccharides isolés du lait de femme.
Celle-ci a ensuite été étendue à d'autres dérivés structuralement
apparentés.
- Par dégradation ménagée du lacto- N-tétraose et de la fraction
FA du lait humain.
1°/ - Etude de l'activité bifidigène des oligosaccharides de structure
connue.
a) - ~<;d=c;;>:r~,;~~~~~c; :
Les sucres utilisés dans nos expérimentations nous ont été
fournis par le Laboratoire de Chimie Biologique (Professeur J. MONTREUIL) de
l'Université de LILLE I.
La plupart ont été isolés du lait de femme et des urines
humaines.
Chaque échantillon de sucre est repris par un faible volume
d'eau distillée pour obtenir une concentration voisine de 5g/1. L'activité biologique
des différentes solutions de sucre est ensuite étudiée sur la croissance des souches
AA 2/2 et Penn., appartenant à l'espèce B. bifidum et L Ma3 à l'espèce longum.
30 oligcsaccharides (dont 9 provenant
du lait de femme) ont été étudiés.
88
b) - ~!~~l~at~ :
Les résultats rassemblés dans les (tableaux 14, 15) montrent,
que parmi les 9 sucres du lait de femme qui ont été étudiés, 6 sont utilisés comme
facteurs de croissance pour la souche AA 2/2.
Cette activité des sucres est faible puisqu'elle excède rarement la .
dilution du 1/10.
Il est à noter que les 6 oligosaccharides stimulant la croissance
de AA 2/2 sont des composés azotés. Ils contiennent tous de la glcNAC dans leur
structure.
Au contraire, les oses inactifs ne contiennent pas de glcNAC. C'est
le cas des oligosides l, 2, 3.
Cette constatation rejoint les résultats obtenus pour la souche
Penn. par GYORGY et Collaborateurs (44, 45, 46) en 1954. Le lacto-N -tétraose
(LNT), oligoside 4 présente une activité du même ordre que celle de ses dérivés
fucosylés, sialidés ou de composé plus complexe comme l 'oligosaccharide 9.
La souche AA 2/2 semble donc disposer d'un équipement enzy-
matique très complet, notamment de fucosidases spécifiques des liaisons (1-J' 2)
et (1~ 4), et de neuraminidases spécifiques des liaisons (2-:, 3) et (~ 6) lui
permettant d'utiliser au mieux les oligosaccharides 7, 8, 9. CeCi confirme les résul-
tats de NICOLA l et ZILLIKEN (103) qui ont trouvé en 1972, des quantités importantes
de fucosidases, de ~ galactosidase et de la N-acétyl glucosaminidase dans la souche
Penn.
La glcNAC à l'état pur présente une activité biologique non négligeable.
Mais àpoids égal, elle est environ 10 fois moins active que les composés 13, 1~, 15 qui
la contiennent. Si l'on se rapporte à la quantité de glcNAC présente, la différence est
encore plus importante. Elle se montre faiblement active quand elle est, soit sous forme
de mélange avec le galactose, soit sous forme de dimère comme le chitobiose. Donc
l'activité est bien fonction de la présence du galactose associé à la glcNAC par une
liaison covalente (Tableau 16).
Le disaccharide 14 ayant la glcNAC en position terminale réductrice
se révèle légèrement plus actif que le composé 16 de même composition, mais compor-
tant le galactose en position réductrice.
89
STRUCTURE DES OLIGOSACCHARIDES DU LAIT DE
ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR
FEMME
LA SOUCHE AA 2/2
1- Lac..:to.6 e.. : gal. 13- 1, 4) g.tc.
3-Lac..:to-dl6uc.o-~étAao.6e.. : gal.~)g.tc.
jo(-1,2 10<-1,3
Fuc.
Fuc.
+ 1
+ 1
Ta
10
5-Lac..:to-N-6uc.ope..ntao.6e.. l :
gal. ê- 1,3) g.tc.NAC ê-l,3)gal.~) g.tc.
t
+ 1
+ 1
10
10
0( -1,2
Fuc.
6-Lac..:to-N-6uc.ope..ntao.6e.. II :
gal. 13- 1, 3) g.tc.NAC~) gal. ~) g.tc.
+ 1
+ 1
jol-I,4
10
100
Fuc.
TABLEAU
14
Ac.:Uvdé b-i6-f-dlgène.. de...6 ougMac.c.haJUde...6 -i.6o.té..6 du .tad
huma-in (.t' ac.tivilé Ua.n:t Jte..pJté.6e..ntée.. pM .ta dVl.J'l.-ièJte.. dilution
PO.6-itive..) •
AA 2/2 : .6ouc.he.. app~e..nant à .t'e...6pèc.e.. B. b-i6-idum, .6péci6ique..
de...6 .6 e..Ue...6 de...6 e..n 6a.n:t.6 nouJtJt-i.6 au .tad de.. 6e..mme.. .
90
STRUCTURE DES OLIGOSACCHARIDES DU LAIT DE
ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR
FEMME [SUITE)
LA SOUCHE AA 2/2
1e.!l eJ.J .6 ai
2ème. eJ.J.6 ai
r-Laeto-N-di6u~ohe.xao.6e.l :
gat~)gf~NAC~)gal~)gf~
+ 1
+ 1
i
TIJ
10
0( -1,2
je( -1,4
.
Fu~
Fu~
8- D--uJ..aly aaeto - N- té:tJta0.6 e :
galê-l,3)gf~Adê-l,3)gatê-l,4)gf~
+ 1
+ 1
Ta
TG
fo(-2,3
10(-2,6
Ne.ùAC
Ne.uAC
9-SJ..alyf6u~o.6yffaeto-N-he.xao.6e.
l
:
Fu~
tll'-I,4
9a!~19tcNAC~
.. ..;>
gal~)gf~
+ 1
+ 1
9~i9f~Ac<:1
TIf
Ta
·,0(-2,3
Ne.uAC
TABLEAU
15
Etude. de. f'ae:tiv.{.:té bJ..ofogJ..que. deJ.J of.{.go.6a~~ha!lJ..deJ.J du fait
de. 6e.mme..
91
STRUCTURE DES OSES ET OLIGOSACCHARIDES DE
ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR
STRUCTURE PROCHE DE CELLE DU LAIT DE FEMME.
LA SOUCHE AA 2/2
10-N-a~étyl glu~o~an~ne : gl~ NAC
+ pUlL
+ 1
TG
Il-NN'-~a~étyl-ch~obio~e
:
~
gl~NAC
')gl~NAC
+ pUlL
+ pUlL
12- mélange : gl~AC + gal
+ pUlL
+ pUlL
13-N-a~étyl la~o~~ne : 9alli:..!...Li) gl~ AC
+ 1
+ 1
Ta
Ta
14-N-a~étyl ~ola~o~~ne
gCLt(3- 1, 3) gl~AC
+ 1
+ 1
:
100
Ta
15-
:
gl~AC~)gal
+ 1
+ 1
Ta
TG
16-
:
gl~AC~)gal
+ 1
+ pUlL
10
.
TABLEAU 16
AUiv~é biologique du o~u et ot<.go~a~~hatUdu de ~tu~UlLe
p~o~he de ~etle du lait de 6emme.
(l'aUivité ut ~ep~é~entée p~ la de~è~e dilution po~itive).
92
Bien que la méthode de dosage ne nous permette pas de faire une
estimation précise de l'activité de facteur de croissance, nous pouvons dire que la
N-acétyl-isolactosamine (isolac N-AC), disaccharide 14 présente une activité
légèrement supérieure à celle de la Lac NA C, disaccharide 13. Ceci est en désaccord
avec RAYNA UD qui, rapportant des résultats obtenus dans la littérature, conclue à une
activité plus grande pourla Lac NA C.
Partant de ces résultats, nous avons étudié l'activité d'autres oses
et oligosaccharides structuralement apparentés à ceux du lait de femme (Tableaux 17,18,19).
Nous constatons que: ni l'acide sialique, nlla N-acétyl mannosamine (Man NAC), ni la N-
Asparaginyl N-Acétyl lactosamine ne sont utilisés comme facteurs de
croissance par B. bifidum. Donc, la présence de l'Asparagine bloque l'utilisation de
la glcNAC. Quant aux fucosides 22 et 23, l'absence de glcNAC dans leur structure
explique leur activité nulle sur AA 2/2 ; celle-ci ne peut être remplacée par la gaINA C.
Ceci vient apporter une preuve supplémentaire de l'importance de la présence de la glcNAC
dans la structure des composés actifs.
L 'hypothèse de l'existence probable de neuraminidases spécifiques
des liaisons (2---.. 6) semble se confirmer du fait de l'activité positive que présentent
les oligosaccharides 26 et 27 sur la souche AA 2/2.
Cette dernière souche se distingue donc de la var. Penn. pour laquelle
une activité réduite vis-à-vis de la liaison (2---+ 6) a été signalée par NICOlA l et
ZILLIKEN (103).
AA 2/2 possède donc un équipement enzymatique plus complet que
Penn. , puisqu'elle est capable d'utiliser l'ensemble des sialyloligosaccharides du lait
maternel.
Les composés 25, 26, 27, bien que d'origine différente, stimulent
taIS la croissance de B. bifidum pratiquement au même niveau. Ce comportement
identique s'explique certainement par la présence du même motif structural dans la
molécule de ces trois produits. Contrairement à l'oligoside 21,où l'Asp. bloque l'uti-
lisation de la glc NAC, la présence du restepeptidique formé de Asn, gIn, val
n'empêche pas la bactérie d'utiliser la glucosamine contenue dans la structure du
glycopeptide 27.
93
OSES ET OLIGOSACCHARIVES VE STRUCTURE PROCHE
ACTIVITE BIOLOGIQUE
VE CELLE VU LAIT VE FEMME
SUR LA SOUCHE AA 2/2
1e.Jt e..6 -6 cU
2è e..6-6cU
---------
--------
19 - Aude. -6iiliq ue.
-
-
20 - N-aeétyl manno-6am{ne. : Man NAC
-
-
21 _
9ai~)9lcNAC~)ASN
:
-
-
22 ._
: gamA~- l, 3) gai
-
-
jO<-7'2
Fue
23_
:
gamA~- 1, 3) gai~) gle
-
-
i o{-7,210<-I'3
Fue
Fue
glcNAC
jO<-7'2
24 - glc.NA ~
' l Man . ~
gleNAC ~~an~)gleNACB-l,4)gleNAC
-
-
9!cNAC~ ~~-1'6
~
Man
~i
gleNAc
.13- 1, 6
gleNAC
TABLEAU 17
Ad.ivdé biologique. de..6 mono-6aeehaJt.-tde..6 et ougo-6ide..6
pJtove.vlant d' au;tJte..6 -6 ub-6tan ee.-6 biologique..6.
21, 22, 23, oV!.t été .-t-6olé-6 à paJt:tiA de..6 UJL,[ne..6 hwncUne..6
24 pJtovie.nt de. l'ovomueo~de..
94
OLIGOSACCHARIDES DE STRUCTURE PROCHE DE CELLE
ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR
DU LAIT DE FEMME (Suite)
LA SOUCHE AA 212
; 25-
1
+ 1
+1
10
10
26 -
NeuAo~-2t6)9al~)gf~NAC~)Man~
~~J9tdJAC + 1
+ 1
NeuA~-2'6Jgat~J9tONAeB-l,2J~
TO
10
+ 1
TIf
TABLEAU 18
- A~,tivLté biMcLlgèVle de.6 oügo/.)a~~hcvU.de.6 ~ofé/.) à paJLUJt
de.6 MiVle.6 humaiVle.6 : 25 e;t 26
e;t de fa /.) éJto.:tJta.n.6 6eJUU.Vle
27
95
OLIGOSACCHARIDES PRESENTS DANS LES URINES HUMAINES ET
ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR
AYANT UNE ACTIVITE DE GROUPES SANGUINS
AA 212
1e.JL e/.J MU
n e/.JUU
---------
--------
28
ga1NAt~) ga.l~·-1, 3) gfc.NACcC- 1, 3) gai
-
-
fO<-1,2
r0(-1,4
Fuc.
Fuc.
~
I-Lu
gatNAC~-1,3jgaf~-1,3)gfc.NAC~-1,3)gaf~-l,4)gfc.
~S
-
-
29
:>. 0
~Ç<:
~
CI)
\\..W \\.U
i0(-l,2 r 0(-1,4
0 0
H
Fuc.
Fuc.
Ç<:Lu
~I-
::CH
U:::>
UH
~I-
Cl)U
o~
~
30
gatNAC«-1,3)g~~-1,4)gfc.NAGS-1,3)gafB-1,4)gfc.
-
-
H Lu
- J : Z
0:::J
i
r
i
0(.- l , 2
0(- l ,4
0( - l ,3
Fuc.
Fuc.
Fuc.
Lu
:z
:::J
gaio{-l, 3) ga.l6- 1,4
-
-
31
j gfc.
1-
~ro
:>.
~Lu
Îo(-I'2
ç::"..
~ -1,2
CI):::J
Lu 0
Fuc.
Fuc.
OÇ<:
H~
Ç<:
~I..U
::cO
Cl
32
9~·1,3 )g~S-1,3Jgfc.NAC~)gaf~)gfc.
-
-
Cl Lu
~I-
Cl)H
0:::>
,
~,....:.
HI-
i0(-1,2
-J Cl
o~
i C<-l 4
FUc.
FUc.
TABLEAU 19
A~vité b~ofog~que. de/.J o~go~ac.c.haJLide/.J ~ofé~ à paJLtiJL
d~~ ~Yle/.J hUmMYle/.J.
96
Dans ces conditions, il n'est pas étonnant qu'une activité bifidigène
ait été mise en évidence pour des glycoprotéines telles que l'orosomucoïde qui com-
porte des copules glucidiques analogues, dans leur structure.
Le composé 24, dérivé de l 'ovomucoïde n'est pas utilisé par
B. bifidum comme facteur de croissance, contrairement au résultat attendu, ceci
apparaît surprenant, compte-tenu de la richesse de ce composé eri glcNA C.
L 'hypothèse d'un encombrement stérique qui empêcherait les
enzymes spécifiques d'agir est envisageable.
De même, compte-tenu de la taille du composé 24, il est possible
qu'il ne puisse pas pénétrer dans la bactérie et ainsi être utilisé.
Les oligosaccharides 28, 29, 30 dont les structures sont apparentées
à celles des substances de groupe A bien que possédant de la glcNA C, ne stimulent pas
la croissance de B. bifidum. Cela s'explique sans doute par la présence de la N-acétyl-
galactosamine (gal N-AC), fixée en oH, 3 qui empêche l'utilisation de la glcNAC.
On peut donc supposer que B. b. ne possède pas l' ()(. galactosaminidase nécessaire.
De même, l'activité nulle des oligosides 31 et 32 de structure proche de celle des
substances de groupe B s'explique par l'absence de 0<. galactosidase chez B. bifidum.
Quant à la souche Penn. elle réagissait faiblement vis-à-vis
des différents ccmposés au début de nos essais. Mais, par la suite, elle s'est
comportée de la même façon que la souche AA 2/2. Cette différence de comportement
est due au fait que celle-ci demande un temps d'activation assez long qui s'explique
par son entretien pendant longtemps en collection.
La souche LMa3 par contre, ne trouve aucun facteur de croissance
parmi tous les oligosides étudiés, ce qui confirme la différence existant entre l'espèce
longum et l'espèce B. bifidum au point de vue besoins nutritionnels.
97
1"/ - Hydrolyse acide partielle:
Le lacto-N -tétraose est non seulement l'un des oligosides les plus
actifs du lait de femme, mais il représente également le motif structural de base de tous
les comJX)sés actifs.
ZOO mg de INT ont été hydrolysés par HZSO 4 0,5 n à 100°C pendant 10
minutes. I es traces d'acide sont éliminées par passage de l 'hydrolysat sur ~ne
colonne (20 x 2 cn) de Dowex 1 x 8 (100 - ZOO mesh). I e produit obtenu est élué par
l'eau. Après évaporation sous pression réduite, le résidu, repris par un faible
volume d'eau, est soumis à une chromatographie préparative sur papier Whatmann 3
dans un système solvant:
acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau: (5/5/1/3)
pendant une nuit. Réalisée dans ces conditions, l'hydrolyse partielle du I acto-N-
tétraose conduit essentiellement à l'obtention d'un mélange d 'oligosaccharides repré-
sentés par trois disaccharides: 1, 2, 3 dont le lactose et la N-acétyl isolactosamine et
par deux trisaccharides : 4,5. Ceux-ci ont été identifiés par leur vitesse de migration
relative (figure 13).
le test d'activité bifidigène réalisé
(TABLEAU 20) à partir des produits
obtenus révèle que les composés 1,2,4,5 sont utilisés comme facteurs de croissance
pour AA 2/2. Il appara1t que les produits actifs contiennent tous de la glcNAC.
Compte-tenu de la labilité des oses réducteurs en présence d'hydrazine,
la désacétylation nécessite une réduction préalable du LNT par le BR K
4
a) - Réduction du LNT :
===:============
Elle a {Dur but de transformer en glucitol le glucose en position terminale
réductrice. 50 mg de LNT sont d'abord dissous dans 200 ml d'eau distillée,
puis traités par 100 mg de BR4K. l,a réaction se déroule à la température
ambiante pendant Z heures. l'excès de BR 4K est neutralisé par addition de
résine Dowex 50 x 8.
I e filtrat et les eaux de rinçage sont éva{Drés à siccité. le résidu sec est
98
T A B T
...... j,....
.1 .' 1
, '
,
I _ _ .:~.--·,.
,
, l '
•
t386
0 0 5
00 4
FI GU RE 13 - ChJtomMogJtaprue .6LUt pap-i-eJt Wha.tman. 3 de f' hydltofy.6M
.6uf6uJt-i.que paJtt-i.ef [H S04
0,5 N 700°C pen.dant 75
Z
rrU.n.lLte.6 ) du Lac;to-N-tétJtao.6e.
S Y.6tème .6 ofvan.t : PytUd-tn.e/ acétMe d' éthyfe/ aude
acét-lque/eau : (5/5/7/3), Jtévèfat-ton. paft fe Jtéac.t-i.6
à f' oxalMe d' ~n.e
DuJtée de. fa chJtomMogJtaprue : 76 heuJte.6
T = méfan.ge de Lac, Gal et Gfc.
TYPE DE REACTION
STRUCTURES DES OLIGOSACCHARIDES ETUDIES
R6 c.a.!c.uié pM
ACTIVITE BIFIDIGENE
tlappoJU. au ga-
SUR AA 2/2
facXMe.
- Lauo-N-tétM.0-6e. (LNT)
6- gctt< - 7, 3) gfC.NAC~) ga.! Œ- 7,4) gfc.
+
7
TG
- Oligo~ac.c.haAide.6 obte.~~6 pM
7- gaf~-l, 3) gfc.NAC
0,85
+ p~'1..
hydJtofy~ e. pa.J!...Ûe.lie.
2- gfc.NAC~ )gaf
0,66
+ pU.A
(H2S 0
0, 5 M, 700
4
0 C pe.~da.nt
3- gaf~)gfc.
0,60
-
70 mi.~.) du UJT
4- gal~-l,3)gfc.NAGf-7,3)gaf
0,39
+ pM
13- 7 3
~- 7 4
5- gfc.NAC-----')gaf~)gfc.
0,30
+ p~'1..
- LNT tléduZt pM BH K
33- gaf~)
4
gfc.NAC13- 7, 3,ea.!~) gfcU:of
+
7
TG
- LNT dé~ac.étyfé pM hydJtazy-
34- gaf13 - 1, 3) gfc.N
13- 7, 3) gaf13- 7,4) gfc. uof
--
~ofy~e.
TABLEAU 20
-
Etude. de. f'ac.tiv~té b~6~digt~e. d~ hydJtofy~~ de. LNT, du LNT tléduti, du LNT dé~ac.étyfé pM f'hydtlaz~~e..
Baué~e.-t~t : AA 2/2 de. f'~ptc.e. B. b~6~dum.
~
~
100
repris par du méthanol de manière D. distiller les sels de borate formés,
puis remis en solution dans un faible volume d'eau pour être lyophilisé.
le LNT réduit est traité par de l 'hydrazine anhydre (1 ml/50 mg)
jusqu'à disso lution complète du produit. La solution est chauffée à 100°C
pendant 24 heures. Elle est ensuite évaporée sous pression réduite en
présence de toluène. le résidu est repris par un faible volume d'eau,
puis déposé sur une colonne (90 x 1,5 cm) de biogel P2 (100 - 200 mesh).
L'élutim se fait par l'eau. Les différentes fractions smt réunies,
concentrées et lyophilisées en fonction du résultat de la chrbmatographie
sur couche mince dont elles font l'objet. Celle-ci se fait sur une plaque
de gel de silice (sans indicateur de fluorescence) dans un système solvant:
butanol/acide acétique/eau: (2/1/1).
Les produits sont révélés par le réactif à l'orcinol sulfurique selon le
procédé suivant: 200 mg d'orcinol sont dissrns dans 100 ml de H SO4 20%,
2
arrès pulvérisation, la plaque est chauffée à 100GC pendant 10 minutes.
L'activité de facteur de croissance de LNT, observée initialement,
reste inchangée avant et arrès réduction par le BH K. Cela signifie que
4
le glucose en position terminale réductrice n'a aucune influence sur l'acti-
vité biologique du LNT. Par contre, cette activité disparatt totalement
quand le LNT est désacétylé. Ceci laisse à penser que l'hexosamine est
utilisée comme un facteur de croissance, sous forme N substituée.
lA MBERT et ZIllIKEN (74) ont montré que la substitution de la fonction
amine par des groupements divers (éthyl, méthyl, n propyl, n but yI, phényl,
carboéthoxy etc.) pouvait conduire à l'obtention de dérivés parfois très
actifs.
101
II. - RECHERCHE DU MOTIF STRUCTURAL ACTIF DANS LA FRACTION FA
EXTRAITE DU lAIT DE FEMME.
Elle a été déterminée après méthanolyse et trifluoroacétylation par chroma-
,
tographie en phase gazeuse. le mode opératoire est décrit dans l'appendice technique.
L'étude des méthylglycosides trifluoroacétylés nous a permis de constater que: la
fraction FA du lait maternel est constituée: de galactose, de glucose, de fucose,de N-acétyl
glucosamine et d'acide N-acétyl neura minique (Tableau 21) et (Figure 14). L'étude
des rapports molaires montre la prédominance du ga lactose en quantité presque double
de celle du glucose ou de la glcNAC. La composition en monosaccharides se rapproche
donc de celle de nombreux oligosaccharides décrits par GRIMMONPR E Z et MONTR EUIl
(39, 42)récemment revus par KOBATA et Coll. (65). Celle-ci fait surtout penser à ceux
du groupe du l acto- N -tétraose, ou Lacto- N-néotétraose.
Le pourcentage du fucose permet de penser que la fraction FAde lait contient
un mélange d'oligosaccharides non fucosylés, mono et difucosylés. Il est probable donc
que la fraction isolée soit essentiellement constituée de tétra, de penta et d'exasaccha-
rides.
2"'/ - Réduction du produit FA par BH K
4
A 3 ml de la fraction active FA de lait humain, contenant 70 g/l de sucres
totaux, ajouter un excès de BH4 (environ 75 mg). La réaction se fait à la température
ordinaire pendant 2 heures. Comme précédemment l'excès de borohydrure de potas-
sium est neutralisé par de la résine Dowex 50 x 8. le filtrat évaporé a siccité en
présence de méthanol, est repris par 3 ml d'eau pour être lyophilisé.
l'activité de facteurs de croissance a été réalisée à partir du produit
final, remis en solution dans 3 ml d'eau distillée (TABI BA U 22). Celle-ci permet
de dire que les facteurs de croissance pour B. bifidum persistent après traitement
de la fraction FA de lait de femme par le BH K. Ce résultat confirme celui qui a
4
été obtenu à pntir du l acto- N-tétraose.
ci. ~a{
ol. Gic
.1
Gic. NAC 0( + Il
1
TJti 6
1
l
+--.------- .---- -
il
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1\\
\\
~
\\
i
nJ
\\
ri~ J\\ i\\"
,"'\\..... --
I~II ~\\,L
f-'
o
FIGURE -14-: ChJtollULtogltaphi.e en phit6e gaz"-Me de-6 mé-thljf. giljc.o<lidN W6luoJtoac.étljié-6 obtetlM pM mé.th{l/lOilj~e et
N
ai.6luOltoac.étljlcttiotl de la. 61lacûOYl FA du iaU mate!tYIe-f..
10
COYldU<.ot!<l opéJtCltO-Ute-6 : C.OlOtlYlN de <I.i..lic.oYle OV Z10, <leYl~.i.b.ili-té : 10-
x 8
tempéJta..tU!le pJtogJtanrmée de 100°C à ZZO°C à Jta...i.<lOtl de ZOC/nul, déb.i.t de gaz vec.teUJt
(azote 1 7,5 me/mit.
RAPPORTS MOLAIRES
COMPOSITION CENTESIMALE
-----------------
-----------------------
Gal
Gie.
Fue.
G.tc.NAC
NANA
0.6 e...6 ne..uX,'te...6
o.6am-tne..,!>
ae-i..de...6
.6ia.L{.q Ue...6
1,6
1
0,62
0,83
0,21
10 %
20 %'
5 %
TABLEAU 21: CompO.6.i.üon e.e..n:té-6imale. eX Jta.ppo/tt6 mo.tWe...6 e.n mon0.6ae.e.haJUde...6 de.. .ta 6Jtac.-üon ac.-üve. FA du
R..aLt de. 6e.mme. .
~
o
w
ELIMINATION SELECTIVE VE L'ACIVE SIALIQUE
REVUCTION VU PROVUIT FA PAR LE BH 4K
ET VU FUCOSE PAR H S0
0,05
2
M
4
E~_~~~~!_~y~q~y~~
f~_~e~~_~y~q~y~~
FA avant ~éduction f~_~e~~_~~~~~q~
------------------
+ 1
+ 1
+ 1
+ 1
50
50
100
100
TABLEAU 22
Hy~oly~e acide ménagée p~ H S0
0,05 M
K
2 4
à 100°C pendant 40 mn et ~éduction p~ BH4
de la 6~~on active FA du lait de 6emme.
L'activ~é b~olog~que de~ p~od~Lt6 a é~é é~udtée ~~ la ~ou~he AA 2/2 de l'~pè~e B.b~6~dwm.
f--'
o
~
105
Elle a été réalisée à partir de la fraction FA (70g/1 de sucres totaux) du
lait de femm-e selon les procédés suivants:
a) - Avec H SO4 0,05 M
2
=======e==========
Elle a pour but de couper spécifiquement les liaisons sialosyl et fucosyl.
Le produit FA (5ml) est traité par 10 ml de H SO4 0,05 M à 100·C pendant 40 minutes.
2
les traces d'acide sont éliminées par passage du mélange sur de la résine Dowex
1 x B. l 'éluat est ensuite concentré à 5 ml.
l'étude de l'activité biologique (TABI EA U 22) réalisée avant et après
défucosylation et désialidation, révèle que les facteurs de croissance pour B. bifidum
initialement observés persistent avec la même intensité dans le produit FA.
b) - Avec l'acide trifluoroacétique N
-----------------------------
-----------------------------
Traiter 2 ml de la fraction FA de lait par 11,5 ml d'eau distillée et 1,5 ml
d'acide trifluoroacétique (concentration finale en acide N).
le mélange est chauffé à reflux à BO·C pendant 30 minutes. La sdution
est ensuite évaporée sous pression réduite en présence d'éthanol. Le résidu obtenu
est repris par 2 ml d'eau distillée. L'hydrolysat est purifié par passage sur une
colonne de biogel P2 (100 - 200 mesh) avec élution par l'eau. Le repérage des compo-
sés glucidiques se fait à l'orcinol sulfurique (figure 15).
Le test bactériologique réalisé à partir des deux fractions obtenues du
produit FA montre que la sous-fraction FI reste fortement active sur la souche AA 2/2
Celle-ci contient les oligosaccharides défucosylés et désialidés, élués en premier et
qui sont utilisés comme facteurs de croissance.
Quant à la fraction FIl, elle contient probablement des résidus de mono-
saccharides, sortant en dernier et qui ne sont pas des facteurs de croissance pour
AA 2/2.
105 bis
c
Cl-.
CD
-'-Ë
-.- -- .----...9..'...
cr,
:._.~,;,
o
. 0 0
. 0 _
'fi
--·0 -------S.~... __
.."
c
w
-----=-Ç";
..
• . .* - . • •
W
FIG UR E
l5
Repé.wge d~~ C'~ e~ l'leut!t'''~ pM f.a mé.thode à e.' O.'tc..lrtO.e. .~ Ue.6LU1.lCiue en 6.tux COI1.ÜHU.
Con~~on6 opé.'lato~e~ : tempé~~'te : 100°C, e~'tegi~~'tement de e.a den6ité op~~que
à 520 nm.
(9 - 17) et n~a~on FIl
(18 - 21).
106
4°
- Conclusion:
la détermination des rapports molaires des monœaccharides indique que les
oligosaccharides contenus dans la fraction FA sont surtout des dérivés plus ou moins
fucosylés et sialidés du INT. Il s'agit donc de composés dont le poids moléculaire
minimum est proche de 760, ce qui correspond au résultat attendu compte-tenu de leur
cern portement en gel filtration.
Les résultats précédents font également apparattre que la défucosylation,
la désialidation et la réduction du produit FA par le BH K nI! conduisent pas à une
4
disparition de l'activité biologique. Ces observations sont donc en parfait accord avec
les résultats obtenus auparavant à partir des oligosides de structure connue.
C'est donc bien la présence de la glcNA C au sein du motif structura l de base
des oligosaccharides présents dans le lait de femme qui est responsab le de l'activité
favorable de ces derniers sur la croissance des B. bifidum.
107
CON C LUS ION
lOS
Le but de notre travail est l'étude des facteurs contenus dans le lait humain
ayant la propriété de favoriser spécifiquement la croissance de B. bifidum,
L'application au lait humain des méthodes classiques de fractionnement a
permis d'obtenir une fraction (FA) contenant l'essentiel des facteurs actifs. Celle-ci
est non précipitable par le sulfate d'ammonium à 75% de saturation, par l'alcool à
80% ou par l'acide perchlorique 0,6 N. Elle se caractérise par sa résistance remar-
quable à la chaleur et sa sensibilité à l'hydrolyse acide ménagée, ce qui nous a permis
de présumer de la nature glucidique des composés actifs présents dans le lait de
femme.
La purification de ceux-ci par gel filtration, suivi d'un repérage des oses à
l'orcinol sulfurique révèle l'hétérogénéité des composés actifs dont les masses molé-
culaires s'échelonnent entre 500 et 10 000.
Une étude microbiologique entreprise alors montre que seules les souches
bactériennes proches qe B. bifidum, spécifiques des selles de nourrissons alimentés
au sein utilisent ces composés comme facteurs de croissance. Ceci démontre bien
la s[.écificité du produit isolé à partir du lait de femme et permet de démontrer
l 'homogénéité de l'espèce B. bifidum au sein du groupe des Bifidobactérium. La souche
Penn. bien qu'elle soit de l'espèce B. bifidum, manifeste un comportement légèrement
en retrait par rapport à l'ensemble des autres souches appartenant à l'espèce B. b.
Cela peut s'expliquer par le fait que celle-ci a été longtemps entretenue en collection.
Une étude plus approfondie de la fraction active (FA) montre que celle-ci est
très hétérogène et qu'elle est constituée à la fois de dérivés neutres et acides présentant
tous une activité bifidigène qui semble équivalente sur la bactérie test.
Dans un premier temps, l'étude du motif structural responsable de l'activité
bio logique a été abordée en testant l'activité de facteurs de croissance d 'oligosaccha-
rides connus isolés du lait de femme, du méconium ou d'autres milieux biologiques.
Il en ressort que seuls les oses et oligosaccharides renfermant de la glcNAC dans leur
structure ont la propriété de favoriser la croissance de B. b.
.lV;'
Ces résultats nous permettent de rronoser un schéma oénéral du motif
structural de base rour tous les comrosés naturels possédant un pouvoir bifi-
digène
; - - - _ 0
(N-acétyl-~lucosaminide)
= Radicaux
NH-CO-CH 3
Ensuite, par dégradation ménaqée (hydrplyse partielle, désacétylation)
du lacto-N-tétraose pris comme modèle de comrosé actif, il a été possible de
confirmer le rôle essentiel joué rar la glcNAC.
Enfin, la détermination de la composition en monosaccharides de la frac-
tion (FA) isolée à partir du lait maternel, démontre bien que son activité
bifidi9ène est due à la présence des oligosaccharides arpare~tés au lacto-N-tétraose
qui s'y trouve concentrés.
IL est très remarquable de constater que le rôle
de la ~lcNAC, déjà mis
en évidence par GYORGY, e~ travaillant sur la souche Penn. se confirme 24 ans après
Sur AA 2/'2:, rroche de celle-ci.
Nos travaux permettent de démontrer également qu'en réalité c'est la crois-
sance de
toutes les souches arnartenant à l'espèce B. bifidum
qui se trouve
stimulée par les oligosaccharides azotés apnartenant au gynolactose.
L'ensemble de ces résultats aboutit A 'I"e meilleure connaissance de la
nature des facteurs bifidigènes ; celle-ci rourrait permettre de mieux compren-
dre leur rôle et l'influence de la flore bifide sur le bien-être des nourrissons.
Oe telles recherches seraient facilitées par la mise au point de méthodes chi-
miques ou biologiques pour la rroduction de ces facteurs en quantité suffisante
pour nermettre de suivre leur effet in vivo chez l'animal et peut-être même à
plus long terme chez le nouveau-né.
110
A P PEN DIe E
TEe H N l QUE
111
1. - Préparation de l'échantillon de lait ~aternel.
II. - Méthode de mise en évidence de l'activité bifidigène.
1°/ - Mode opératoire
2°/ - Milieux de culture utilisés
a) - milieu coeur-cervelle cystéiné
b) - solution Ringer cystéinée
c) - milieu de Garches.
IIJ. - Préparation des biogels P6 et P2 (100- 200 mesh).
IV. - Préparation des résines Dowex 50 x 8 et Dowex 1 x 8.
10/ - Dowex 50 x8, forme acide
2°/ - Dowex 1 x 8, forme, formiate.
V. - Chromatographie sur colonne de résines Dowex 1 x 8, forme acétate.
1°/ - Régénération de la résine
2°/ - Préparation des tampons acétate de pyridine.
VI. - Méthodes d'identification et dosage
des oses.
1°/ - Méthode de Dubois
2°/ - Méthcrle à l 'orcinol sulfurique
3°/ - Méthode par chranatographie en 'phase gazeuse.
112
Sont rassemblés dans cet appendice technique, les différentes méthodes
utilisées au cours de l'exécution de ce travail.
1. - PREPARATION DU LAIT MATERNEL.
Le lait maternel utilisé nous est fourni par le lactérium de l'Institut
Pasteur de, Lille. C'est un lait de mélange provenant de plusieurs donneuses.
Les différents échantillons de lait sont d'abord dégraissés par centri-
fugation à 15,000 t/mn à -:,4·C pendant 1 heure, puis rassemblés pour constituer
un poo l de lait.
Le mélange est ensuite réparti dans des flacons de 125ml pour être
conservé à l'état congelé à -25·C.
Il. - METHODES DE MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE BJDIDIGENE.
1°/ - Merle opératoire:
--------------
l a souche de B. bifidum, conservée à l'état congelé dans un milieu de
Rosencw, est repiquée dans le même milieu régénéré.
Elle est ensemencée dans 100 ml de bouillon cœur-cervelle cystéiné
à partir de 16 ml d'une préculture dans le m,ême milieu. L'incubation se fait à 37°C
pendant 48 heures.
On centrifuge 50 ml de cette culture (4 000 t/mn pendant 15 mn) et 1e culot
est lavé avec une solution de Ringer cystéinée afin d'éliminer toute trace de facteurs
de croissance.
Après centrifugation, le culot microbien est mis en suspension dans 10 ml
de milieu de garches liquide.
la densité optique de la suspension de B. bifidum est ajustée entre 1,0
et 1,5 par dilution avec du milieu de garches. 5 ml de cette suspension est ensuite
homogénéisée dans 100 ml'de milieu dergarches gélosé. le mélange est coulé dans
113
d~s bottes de Pétri. Ondépose sur chaque boîte ainsi préparée, des disques de papier
filtre stériles imprégnés de 10 pl du produit à analyser.
Vincubation se fait à 37DC pendant 5 jours, en atmos{hère anaérobie dans
des jarres "B. B. L. Gaspak". Une substance dont l'activité est positive stimule la
croissance bactérienne autour du disque.
2"/ - Milieux de culture:
a) - Milieu coeur-cervelle cystéiné (en g/l) :
- bouillon coeur cervelle
37 g
- extrait d~ levure
5 g
- chlorhydrate de cystéine
0,5 g
Compléter l~ tout à 1 litre avec de l'eau distillée. le milieu est
ensuite ajusté à pH7 et stérilisé à l'autoclave à 120"C pendant 15 minutes.
b) - Solution de Ringer cystéinée (en g/l) :
- NaCI
2,25 g
- KCI
1,015 g
- CaCl
0,12 g
2
- NaC0
0,05 g
3
Complét~r le milieu à 1 litre avec de l'eau distillée Pour être stérilisé
à l'autoclave à 120·C pendant 20 minutes.
c) - Milie~' de Garches (en g/l):
- Asparagine
5 g
- lactose
lOg
- Acétate de sodium 3,66 g
- SO 4MG, 7H 0
0,50 g
2
, - Na HPO4,12 H 0 2,33 g
2
2
- KH PO4
0,90 g
2
- Cystine
0,20 g
- Vitam in free
casaminoacid
10 g
114
- Solution de P.A.B. 1 ml (100 ml de P.A.B. dans 100 ml d'eau distillée)
- Solution vitaminée
1 ml (1 mg de biotine + 100 mg de pantothénate de
calcium dans 100 ml d'eau distillée).
Compléter le tout à 1 l avec de l'eau distillée. Les ingrédients sont dissous
'par chauffage. le pH est ajusté à 6,4 et stérilisé à 108"C IBndant 30 minutes.
Le milieu est solidifié par addition de 10 g d'agar/l.
III. - PREPARATION DES BIOGELS P6 et P2.
Peser 50 g de gel P6, les dissoudre progressivement dans 800 ml de
tampon tris 0,05 M. On laisse gonfler le gel une nuit à + 4°C. Eliminer une partie
du surnageant puis dégazer le gel dans une fiole à essorer avant le remplissage de la
colonne.
Afin d'éviter le développement des algues dans les colonnes, il est utile
de nettoyer celles-ci par une solution d'amnnnium quaternaire à 1"/0"
la préparation du biogel P2 se fait dans l'eau distillée suivant le même
mode opératoire que précédemment.
IV. - PREPARATION DES RESINES DOWEX 50 x 8 et DOWEX 1 x 8.
y
Avant leur emploi, les échangeurs d'ions sont traités selon le merle opé-
ratoire suivant: rincer les' résines plusieurs fois à l'eau pour éliminer les déchets •. '
1"/ - la Dowex 50 x 8,
échangeuse de cations e'st utilisée sous sa forme acide. On traite pour cela
la résine par 11 ou 2 l de HCl 2 N par agitation continue pendant 2 heures, suivie
d'un lavage soigneux à l'eau distillée, jusqu'à ce que le pH du liquide effluent attei-
gne 5. La cmservation se fait dans l'eau.
115
2°1 - :La Dowex 1 x 8,
--------------
échangeuse d'anions est utilisée pour la forme formiate. l a résine est
d'abord traitée par un volume de NaOH N et. maintenue sous agitation cmstante
pendant 2 H,' suivie de plusieurs lavages à l'eau. l a résine est ensuite mise sous la
forme formiate par passage d'un volume d'acide formique N•. Enfin, un lavage soigneux
à l'eau distillée amène le pH de l'effluent à la neutralité.
v. - CHROMATOGRAPHIE SUR RESINES ECHANGEUSES D'ANIONS DOWEX 1 x 8,
FORME ACETATE.
La résine, Dowex 1 x 8 (200 - 400 mesh) est d'abord rincée plusieurs'
fois à l'eau distillée. Elle est ensuite traitée avec de l'acide chlorhydrique 2N. L'excès
d'acide est éliminé par plusieurs lavages à l'eau distillée.
La résine est mise sous forme acétate par traitement avec une solution
d'acétate de sodium 2 M. L'excès d'acétate de sodium est éliminé comme précédemment
par lavage à l'eau distillée.
2"1 - ~!!.p~!~!~~r:.9~.?_~~IE.PEE-~_~~~~~t~!~_<!~.PY!2~~r:~.P!!.-?.!-?_~~_IE~1~:~t!~
0, 01 M - 0, 05 M - 0,15 M
------------------------
Tampcn 0,01 M pH 5,5
Introduire dans une fiole jaugée d'un litre, 0,01 molell d'acide acétique
pur, soit 0,6 ml d'acide acétique.
y ajouter de l'eau distillée, puis ajuster le pH à 5,5 avec de la pyridine et
compléter à un litre avec l'eau distillée.
Tampon 0,05 M et 0,15 M pH 5,5
Suivant le même mode opératoire que précédemment, les tampons acétate
de pyridine de concentrations 0,05 M et 0,15 M ont été ~galement préparés.
116
VI. - METHODES D'IDENTIFICATION ET DOSAGE DES MONOSACCHARIDES.
1~/ - Méthcde Dubois
Traiter dans un tube à hémolyse en verre 0,2 ml du produit FA pour 0,1 ml
de phénol 5% et 1 ml de H SO 4 concentré. Après agitation, laisser la réaction se
2
dérouler pendant 15 mn.
Dans les mêmes conditions opératoires, traiter 0,2 ml d'eau distillée
comme témoin.
2°/ - Méthode à l'orcinol sulfurique
Les oses neutres sont dosés par la méthode à, l 'orcinol sulfurique de
TILLEMANS et PHIlIPPI (140), KESLER (174).
L 'orcinol donne avec les oses, en milieu sulfurique et à chaud (100eC)
une coloration'brun-orangé. Le dosage se fait à 510 nm en prenant le galactose
(200 mg/l)comme témoin.
Préparation du réactif à l'orcinol :
Mettre dans une fiol~ jaugée d'un litre, 1,6 g d 'orcinol (dihydroxy 3,5
toluène), y ajouter 97,3 ml d'eau distillée et 2,7 ml de H SO 4 pur, agiter le mélange
2
jusqu'à dissolution et complèter à un litre avec H SO 4 66%. Conserver le réactif dans
2
un flacon brun à + 4·C.
A 1 ml de l.'éluat de colonne P2 (5,3 g/l de sucres totaux), ajouter comme
témoin 1 ml d'une solution de mésoip.ositol (100 Jlg/ml), lyophiliser le mélange pendant
une nuit, puis sécher sous-vide en présence de P 205 à 50°C pour éliminer toute trace
d'eau.
le résidu obtenu est méthanolysé par 1,5 ml de méthanol chlorhydrique
0,5 N à SO°C pendant 24 heures. l es composés ainsi transformés en dérivés
méthyl-glucœides sont ensuite traités :par 200 pl d'acide trifluoroacétique par chauf-
fage à 100GC dans un bain de sable, ce qui permet d'obtenir des dérivés méthyglycosides
trifluoroacétylés (volatifs).
117
Les derniers produits obtenus sont analysés dans les conditims suivantes
B 1 B LlO G R A PHI E
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UNIVERSITÉ DES SCIENCES
THËSE DE : Doctorat de 3ème Cycle
NO D'ORDRE: 1002
ET TECHN lOUES DE LI LLE
DISCIPLINE: BIOCHIMIE
NOM DU CANDIDAT: Seka ASSY
JU RY : Président
J. MONTREUI L
Rapporteur: G. SPIK
G. STRECKER
J. MIZOI\\J
C. ROMaND
TITRE DE LA THËSE :
CONTRIBUTION A L'ÉTUDE DES FACTEURS BIFIDIG~NES
PRÉSENTS DANS LE LAIT MATERNEL.
MOTS-CLEFS: Lait maternel, facteurs bifidigènes. Bifidigènes (facteurs), structure chimique
Bifidobactérium bifidum.
RÉSUMÉ
L'action bénéfique du lait maternel sur le nourrisson est bien connue. On sait, en particulier, que les
nouveau -nés allaités par leur mère souffrent moins de troubles digestifs et de diarrhées infectieuses. Il est reconnu,
par tous, que le mécanisme protecteur est très complexe et fait intervenir des facteurs bifidigènes présents dans le lait
de femme et ayant la propriété de favoriser la croissance de la souche de Bifidobacterium bifidum spécifique des
enfants nourris maternellement. Celle-ci serait alors à l'origine de la résistance' relative de ces derniers aux diarrhées
infectieuses.
Par application des méthodes biochimiques usuelles de fractionnement (précipitation, chromatographie
de gel, filtration et d'échanges d'ions), nous sommes parvenus à isoler et à purifier une fraction de lait maternel conte-
nant l'essenciel de son activité biologique. Celle-ci est caractérisée par sa spécificité sur la croissance de B. bifidium, sa
résistance remarquable à la chaleur, sa labilité en présence d'acide et son faible poids moléculaire compris entre 500
et 10000.
Ces résultats nous permettent de présumer de la nature glucidique des facteurs bifidigènes.présents dans
le lait de femme. L'étude structurale de ceux-ci a été abordée de deux manières:
-
Dans un premier temps, l'activité bifidigène d'oligosaccharides connus isolés du lait de femme et
d'autres milieux biologiques a été déterminée. Celle-ci est retrouvée pour tous les composés contenant
de la glcNAC.
- Dans un deuxième temps, par dégradation ménagée du lacto-N-tétraose pris comme modèle de compo-
sé actif et par la détermination des rapports molaires et de la composition en monosaccharaides de la
"J
fraction de lait isolée, nous avons mis en évidence le motif structural responsable de l'activité bifidi-
gène du lait maternel.
Soutenance prévue le 15 Novembre 1982 à l'Université de LI LLE 1
Bâtiment Chimie Enseignement Amphithéâtre François