,
....
MEMOIRE DE LA' tH~s~.·
\\.
poUR L'OBTENTioN
DOCTEUR ès SCîENcES
MM.
ÀI
EUZAS
Président
t i HELtNE
Pi LE HENAFF
Mi LENG
ExaminateUts
M@11œ Yi MoULt
M,
Gi sAtNt-RUr-
\\

---

'.
l
à feu mon père,
à ma mère,
à DeLphine,
à Jeanne-Marie GLwadys,
à mes frères et soeurs

---

I l
REMERe1 EMHITS
Lu tJta.va.u.x qu...i. 60nt l'obje;t de ce.t;te thè.f.Je ont été Ilé~u au
Centlte de 8,i..ophy~ique Moléc.ui.lUJle du C.N.R.S. à. OltléaYl.6. Qu'a me hOU pe!l-
m-W d'exp!l.-Une!l iu ma Jtupec.tueLL6e gJtO..t,{;tude à. Moft6ie.uJt C. HELENE, Pllo6e.Mewt
au Mu..6 eum No.-tio nal q' Hihto iIt e Na.twz. ef.f. e à. Pa.JLi6 po LLIl l' ac.Cil eU qu' am' a
IlUe!lvé. au f.o.bo!La.toilte e;t pOLLll avoilt ac.cepté de c.Jt...,(;tiqUe!l c.u tJta.va.u.x.
Que Mono.(eWt NICOLAU, Mn ~uc.C.U.6ewt à. .e.a Viltec.tion du. Ce.ntJte de
Biophy~ique Moléc.uf.a.-<.Jte, qui m'a pV!..1rli.6 d' Y poUMu...i.vlle mu Ilec.he!lc.hu,
tItouve i u l'expJtu~,wn de. ma Jtec.onn.a..iManc.e.
J' a.dJtUf.J e mu Jtupec..tueux Jteme!lueme.n.t6 à. MademoiheU.e. Y. MOULE, de
,
f..'ln.o.t{;tu;t de Rec.he!lc.hu Scie..nt.iMquu ~U!I. f..e c.anc.e!l à. Villeju...i.6, à. Me..MieUM
lu PJt.06UM.U!L6 A. BUZAS e;t P. LE HENAFF qu...i. m'on 6o..i.t f..'honne.uJt de ~'intéJtM­
~ e!l à. c.e :tJta.vail e;t d' ac.c. e. pte!l de pa.t'v"tiupe!l au j WtU•
Que. MOM,{,euJ"l LENG, V.-Utec..te.wl ~ue..n..tiMque du. gtwupe VI du Cen.tJte. de
B..<...ophyô,{,que Moléc.uLu:!Le., au ôU/1 duquel u. Mn:t eM,e.c.:tJ..J.éJ.> c.e..J.> tJta.vaux., tJtouve
i u l' e.x.pJtuô,wn de. ma gJto..nde JU2.c.onn.a..iMaI'lCe pOLLll !.lon appui C.OYL6.tant e;t ôu
c.o ~ eili éc.f..a...Utéo •
Je. v0 udJto..ih ex ptUmCJt ma pJtO 60 nd e. e;t ~ irtc.êJt e gJtaLi.:t.ude. à. Mo noiewz.
G. SAHIT -RUF qui m'a c.on6ié le ~uje...t de thè~e e;t I16~Wté me.6 pttemie..M paJ.I efa.no
.e.a Jtec.he!lc.he. Je n' oubu~'t.O..,l j~ f.Je.6 pltéue.ux. C.OMeili, Mn dévoueme..n..t e;t
~e.6 e..ncoUJto..geme.nto JtépUéA. Qu'il en ~oil vivement Jte.me!lué.
A Feu MOMie.lL!l le Pllo6e.6J.>e.lL!l F. PONCELET, di.6pcvw ~ubileme..n..t alorL.6
que ~e déve.f.oppa.(t c.e :tJta.vail, je dédie une pe..YL6ée. é.mue. C'ut g~c.e à. une
c.of...ta..boJto..tion 6JtUc.tue.u.6eave.c. .60/1 équipe du LaboJt1U:o.-Ute. de Toxic.ologie e;t
de. BJtoma;tologie à. l' UnivVL6ilé c.a.thoLi.que. de Louvain qu'une pa.!'r-Ü.e. de c.e
tJta vail a pu we Jt é0.f....<:.6 ée. . Je. Jt em eJLU e to ut pa.!l.lic.uüêJtem e..n..t h e.6 c.ou.o.bo -
Jto..te.uJt.6, Me..Mie.uJt.6 de MEESTER e;t N'GOY.
Je .:tie..M égo..f.ement à. Jteme!lue!l tOlL.6 mu c.oUègue.6 du LaboJta..to.-Ute
poUJt le1l!t dévoue.me..n.t à mon égo..Jtd e...t tout ~èJte.me.nt E. HEBERT e;t R.
RHAMOUNI.
En6in, j' e.xpJU..me. mc..6 v,{,6J.> llen1e!luemv~ au Com-dé du Lobte;t de f..a.
Ligue Na.tiol1o..f.e. c.ontJte f.e Canc.e!l e.t au Com-dé d' OJtf.éan~ de. f..a. Fond.ation poLLll
f.a. Re.c.he!lche Médù.al e FJto..nça.i.6 e. rOM .e' aide 6..i.nmluèJte qu' i l i ont bien voufu
\\
m'ac.c.ollde!l.
.
Me!lu à. Madame G. PAQUIN cd. à MM. A. VALERa e;t J.C. CHAVIGNY poM
lewt aide. e66ic.ac.e dM.6 .e.a rléali.6o...:tion :te.c.Wque de ce mémobte..

---

III
/
SOM MAI R E
Abréviations
-1NTRODUCT 1ON . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . • . . . . . • . • . . . . . . . . . . . . . .
2
- Principaux facteurs de risques de cancer
. . . . . . . . . •, . . . . . . . .
4
-
La cancérogénèse chimique. . . . . . . . . . . . . . • . . • . . . . . . . . . . . . .
10
- Les agents chimiques cancérogènes
20
Les altérations structurales du DNA et leurs conséquences
28
- Objectifs et motivations de nos recherches
31
- Bibliographie
. . . . . . . . • . . . . . . . . • . . . . . . . • . '!.P,' • • • • • • • • • ••
34
C MN/"'-~-
~\\l-\\
c G~,
PREMI ÈRE PARTIE
LA CHIMIE DU DIPYRlt$~\\:;2.' -d]
Hp 1 9 A !IJ.!~E S \\ '{l
IMIDAZOLE ET DE SES \\Bl:-R+'V-r:-~··''"~······
42
• .. • • • • • • • .. .. • • • • • • • \\~'\\
-
Introduction
• ~~ -f);- .~Ji'
• 0"· . • . . . • ..
4.3
"''';-8
~.§<
.
~*gr.eml;ll'l\\ -
~..,-
CHAPITRE
l
: Synthèse et propriétés de
"amino-3 imi-
dazo[1,2-a]pyridine et dérivés
.
45
i
-
CHAPITRE
II
:
Synthèse du dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]
imidazole et de ses dérivés
.
5 1
1/ Préparation de Glu-P-l et de Glu-P-2
.
51
2/ Création de l 'hétérocycle 4-méthylé . . . . . . . . . • . . . . . . . . .
5 1
3/ Nitration de l 'hétérocycle 10
.
53
4/ Arnination des composés Il
57
5/ Action de l'acétylacétone sur les précurseurs
57
6/ Action de l'acétylacétate d'éthyle
59
7/ Condensation du précurseur sur l'éthoxyméthylènemalonate
d'éthyle
62
\\
8/ Formation des amino-4 dipyrido-imidazole
68
9/ Préparation des amino-4 dipyrido-imidazole
68
10/ Préparation de l'hétérocycle non substitué
69
a l Réaction de Skraup
.
69
bl Réduction deshalogénante des dérivés chlorés
.
7 1
cl Action de CuS04 sur les hydrazines
• . . . . . . • . . . . . . . . .
72
11/ Partie expérimentale
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

---

IV
. CHAPITRE III
: Etude physico-chimique des dêrivês du
dipyrido[L2·a:3 I ,2'·d]im1dazolé
88
3.1. Généralités
.. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
88
/
3.2. Etude de la R.M.N
..
89
3.3. Etude infra-rouge
. . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . • . • . . • • . . .
110
3.4. Etude en spectrométrie de fluorescence
132
3.5. Etude en spectrométrie de masse du dipyrido[1,2-aI3' ,2'-dJ
,
imidazole et de certains de ses dérivés
. . . • • . . • • . • . •
133
3.6. Etude de la fragmentation électronique de l'acide L-g1uta-
mique
145
3.7. Etude U.v.
151
- BIBLIOGRAPHIE
153
DEUXI~ME PARTIE : ~TUDE DE LA MUTAG~NICIT~ DES D~RIV~S
DU DIPYRIDO[1,2-a:3 ' ,2'-d]lMIDAZOLE ET DE LEURS EFFETS
BIOCHIMIQUES SUR LE SYST~ME HYDROXYLASIQUE CHEZ LE RAT 159
Introduction
160
- CHAPITRE 1 : Etude de la mutagénicité des dérivés du
dipyrido[1,2-a:3 ' ,2'-d]imidazole
161
- CHAPITRE Il : Effets biochimiques sur le système
hydroxylase chez le rat
174
TROISI~ME PARTIE: INTERACTION DES DNAS ET DE LEURS
MONOMÈRES AVEC LE N,N-ACÉTOXYAC~TYLAMINO-3,
DIM~THYL-
4,6, DIPYRIDO[1,2-a:3' ,2'-d]IMIDAZOLE
183
- Introduction
183
- CHAPITRE 1 : Interaction du DNA et de ses monomères
avec le N,N-acétoxyacétylamino-3. diméthyl-4 dipyrido
[1,2-a:3' .2'-d]imidazole, structures et propriétés
des adduits
184
- CHAPITRE II : Etudes conformationnelles de DNAS naturels
et synthétiques modifiés par le dérivé NAcOAGlu-P-3 ....,210
CONCLUSION
242
, 1

---

]
. 1
1 NT R0 DUC T ION
Le travail faisant l'objet du présent mémoire'
a été réalisé en partie dans le cadre d'un
contrat du PIREN : ATP Santé et Environnement.

---

3
décès par an aux Etats-Unis) tandiB que le cancer de l'estomac tend a r~9re9­
ser dans plusieurs régions du globe.
Ces variations du risque cancérogène sont dues, non pas tellement à
des facteurs liés ê la géographie, mais plutôt è 18 nature de l'environnement
et au mode de vie.
Des exemples assez précis permettent de conforter cette hypothèse
- En premier lieu, on a relevé que l'incidence des différentes formes du ca~CLr
chez les populations migrantes se rapprochait dans le temps, assez rapide-
ment, de celles de la population de leur pays d'adoption: c'est le cas des
japonais ayant immigré aux Etats~Unis (Hawaï ou la Californie notamment)
dont les taux relatifs de localisations cancérigènes s'éloignent de ceux
de japonais restés au Japon, pour se rapprocher de ceux des américains, ceci
d'autant plus que leur implantation remonte à plus de deux générations (2).
Cette évolution du risque du cancer met en évidence la prépondérance des
facteurs d'environnement, le matériel génétique n'ayant pas évolué en dehors
~
des cas de métissage, peu fréquents du reste.
Le cas des Mormons et des Adventistes du Septième Jour abonde dans le même
sens. Les Mormons et les Adventistes du Septième Jour ont aux Etats-Unis
une fréquence du cancer beaucoup moins marquée que celle de l'ensemble de
la population américaine. Cette différence est surtout évidente pour les
cancers de localisations liées à la consommation du tabac, de l'alcool, de
la viande ainsi que des habitudes sexuelles, tout au moins en ce qui concer-
ne les deux dernières causes pour les Adventistes du Septième Jour
ces
derniers ont huit fois moins de cancers des poumons, de la bouche, du larynx
et de l'oesophagé
quant aux Mormons, leur taux de cancer pulmonaire ne
représente que 38 % du taux du reste de la population américaine. Ces diffé-
rences notables sont dues aux habitudes diététiques de ces deux groupes
1 . [
qui, en plus, ont pour préceptes de ne pas fu~er, boire d'alcocl, de thé
ou de café.
Ainsi donc, s'il est montré que le milieu et le mode de vie ont une
,1
incidence non négligeable sur ia fréquence et la nature des affections tumo-
!
ràles
on peut classer les facteurs de risque du cancer en trois grandes
t

---

4
catégories: les facteurs ~'ordre professionnel, les fecteurs ~a8 ê la pollu-
tion de l'environnement, les facteurs ~'ori9ine alimentaire.
Facteurs d'ordre professionnel
Malgré la sévérité des mesures de prévention qui sont de mise dans les
entreprises industrielles des pays développés, on admet que 5 à 20 \\ des
cancers sont encore imputables à des facteurs professionnels.
Or, il est avéré que les causes des cancers professionnels sont essen-
tiellement dues à l'exposition à des produits chimiques.
C'est du reste à la suite d'une observation due au chirurgien anglais
Percevall pott,en 1775, qui nota que le cancer du scrotum se rencontrait plus
fréquemment chez les ramoneurs et que l'agent causal pouvait bien être la
suie, que la cancérogénèse chimique devait prendre son essor, un siècle et
demi plus tard, avec les expériences de Cook et Kennaw,ay (3, 4) qui mirent
en évidence la présence d'hydrocarbures aromatiques, notamment le méthyl-2ü
Colanthrène, et leur pouvoir hautement cancérogène, dans les goudrons de
houille.
Il est bien connu que les travailleurs de l'industrie chimique, notam-
ment ceux ayant affaire aux matières colorantes, au goudron de houille, aux
dérivés chlorés, présentent un taux de cancérisation plus élevé que le reste
de la population. Il en serait de même pour ceux travaillant dans l'industrie
du nickel ou de l'amiante. On a pu, du reste, établir toute une liste d'agents
chimiques, de nature minérale ou organiqu~, à potentialité cancérogène, uti-
lisés dans l'industrie (5). Ces observations ont permis d'édicter des règles
de prévention et de sécurité dont la mise en pratique a vu une nette régression
de l'incidence du cancer dans les milieux professionnels (6, 7), ce qui est
la meilleure démonstration de la nocivité des produits incriminés.

---

5
/
Les poiiuants de j'environnement
Ils sont êgalement de nature chimique et sont de plusieurs ordres :
ceux qui polluent l'atmosphère (notamment des 9randes villes et des régions
industrielles) et qui proviennent des gaz d'échappement des moteurs A combus-
tion ou des effluents gazeux des usines, ce sont en particulier des complexes
organiques ou inorganiques mal définis, mais dont on sait qu'ils contiennent
en abondance de nombreux hydrocarbures aromatiques cancérogènes, ceux qui
polluent le sol et l'eau et qui proviennent en particulier des fertilisants
et des pesticides utilisés dans l'agriculture (nitrates, nitrosamines,
dérivés chlorés, etc ... ). Il faut y ajouter certains produiLs d'usage courant
dans notre vie moderne (les produits à base de PCV par exemple dont la cancéro-'
génicité- a été maintenant prouvée). En outre, la pollution due aux fumées
de tabac (8 tonnes par jour pour deux millions d'habitants (8)), bien que
rentrant dans le cadre d'une auto-pollution dont les effets nocifs sont
désormais
reconnus par tout le monde, ajoute à l'ampleur des problèmes posés
par la dégradation du milieu dans lequel nous vivons et des dangers potentiel?
qui en résultent pour l'homme.
Cependant, la part que prennent dans la genèse des diverses formes
de cancer, les facteurs de pollution
autres que la fumée de cigarette, reste
encore assez mal cernée. Ce que l'on sait c'est qu'en dehors du cancer, la
pollution peu~ être responsable de diverses autres maladies : météhémoglobinie
chez les enfants (à cause des nitrates se trouvant habituellement dans l'eau
de boisson), maladies pulmonaires chroniques, bronchites, asthme, retards de
croissance osseuse, etc ... et, de ce fait, est d'un coût élevé rien que sur
le plan de la santé publique.
Les facteurs alimentaires
(habitudes alimentaires, nature des aliments, mode de cuisson, méthodes
technologiques de fabrication, de stockage, de conservation et de distribution)
constituent sans doute les risques les plus courants. Les composés mutagènes
et/ou cancérogènes fréquents dans notre alimentation peuvent être classés en
trois grandes catégories :

---

-
\\
1
, 1
1°) Le~~ub~.ta.ncu nAtwte.Uu telles la cyc&sine de la graine ~e cycad, le
capsalcine contenue dans certaines vari~tés de piment et certains flevonoldes
mutagènes d'origine végétale. Mais ce sont surtout les mycotoxines qui ont
attiré l'attention avec notamment la découverte de l'aflatoxine Bl, toxine
fabriquée par une moisissure (Aspergillus flavus) parasitant les aliments
stockés en conditions d'humidité et de chaleur et qui serait responsable de
la grande fréquence des cancers primitifs du foie observée dans les pays
chauds, en Afrique notamment.
2°) Leh ad~6~ ~~eh : Le jaune de beurre Ou p-dimethylamino-azoben-
zène utilisé pendant longtemps comme coloran~ alimentaire fut le premier
additif dont l'activité cancérogène a été démontrée (9). Par la suite,
d'autres composés chimiques utilisés dans la conservation des aliments se
révélèrent comme mutagènes ou cancérogènes; c'est le cas du (furyl-2)-2
(nitro-S furyl)-3 acryl-amide plus connu sous le nom de AF-2 qui induit le
carcinome de l'estomac (10) et de certains pesticides et fongicides utilisés
pour la protection des fruits et légumes.
3°) Let. pMdu.i;t.6 ltuLLtta.n1. de- la e.u.-ill.60Yl ou de. la 6abtUc.Ovti.oYl de c.eJLta)Jt!J
alim~, de découverte récente, constituent
aujourd'hui le groupe qui foca-
lise le plus l'attention des chercheurs et des nutritionnistes. Il s'agit en
effet de produits fortement génotoxiques, inconnus encore il y a 10 ans, et
dont notre alimentation quotidienne à base de viande, de poisson, de céréales
ou même de certains légumes peut être facilement souillée. Ces produits se
forment au cours de la combustion incomplète de tels aliments.
On savait depuis longtemps que la pyrolyse de certains végétaux tel
le tabac conduisait à des composés multiples tels que des hydrocarbures
aromatiques et substances hétérocycliques dont certains sont mutagènes, voire
cancérogènes. Une revue récente a révélé que plus de 2 200 composés avaient
été décelés dans la fumée de tabac (11) provenant non seulement de la' décompo-
sition et de la transformation de la nicotine et des alcaloides présents
naturellement dans le tabac, mais aussi des fertilisants, pesticides et
autres produits chimiques utilisés dans la culture de cette plante.

---

7
Maie la dêcouverte la plus spectaculaire ou tout eu moins la plus
inqul~tante date de 1977, quand Sugimura et Bon équipe, suspectant l'existence
possible d'une certaine corrélation entre la fréquence des cancers de l'es-
tomac au Japon et la consommation du poisson, eurent l'idée de soumettre'!
des tests de mutagénititécertains extraits de sardine grillée qui se révé-
lèrent fortement mutagènes (12). Sur leur lancée, ils soumirent systémati-
quement diverses protéines
(13) et plusieurs acides aminés (14) à la pyrolyse
et leurs pyrolysats montrèrent également, selon le cas', une activité mutagène
plus ou moins grande
(83).
Dans le même temps, en Amérique, Commoner et al.
(15) mettaient en
évidence la formation de produits mutagènes au cours de la cuisson, dans
différentes conditions, de la viande de boeuf. Une activité mutagène a été
également décelée dans les hamburgers (15,
16) et lès frites
(17) ou certains
produits céréaliers après cuisson lIB).
Plusieurs des composés responsables de la mutagénicité, notamment des
pyrolysats d'acides aminés, ont été isolés et identifiés (19). Le tableau 1
donne la structure des produits actuellement connus, leur origine ainsi que
les substances alimeptaires dans lesquelles ils ont été décelés.
La plupart de ces composés ont une mutagénicité supérieure à celle
des cancérogènes typiques: aflatoxine BI, benzoLa)pyrène, 4 NQO, N,N-dime-
thylnitrosamine (19, 20).
Trp-P-1 et Trp-P-2 induisent des abérrations chromosomales dans les
cellules humaines ~n culture
(21) et leur hépatocancérogénicité chez la
souris a été démontrée (22).
Les dérivés de l'acide glutamique Glu-P-1 et Glu-P-2 induisent des
transformations morphologiques chez les cellules d'embryon de hamster (23)
et sont également hépatocancérogènes chez la souris (19) et provoquent la
formation de sarcomes hémangioendothélium dans le dos entre les omoplates
(19,
20). Il a été récemment trouvé que ces composés pouvaient aussi induire
des tumeurs du cerveau, du colon,
des glandes zymbales (19)
et de divers
autres organes chez le rat (84).

---

TABLEAU 1
Structures des mutagènes isolês des pyrolysats d'acides aminés ou de protéines
Formule
source
existent dans
sardines grl116es
pyrolysats de
T.rp-P-1
gluten
N~
pyrolysats de
globuline
tryptophane
albumine
poulet cuit
Trp-P-2
sprats grillés
N~
~
Aue
~NAN~NH2
('~ ----(N't-NH2
sardines grillées
YN~
pyrolysats de l'acide
seiches roties
Glu-P-1
L-glutamique
, Me
pyrolysats de caséine
~ ":JCrN"N~
~ I~
N
Glu-P-2
pyrolysats de
phenylalanine
·Phe-P-1

---

9
TABLEAU 1 (suite)
Formule
source
existent dans
,
\\
--------------------------------_.--- ---------------------- ----,---------------------
pyrolysats de lysine
Lys-P-1
pyrolysats
d'ornithine
Orn-P-1
poissons grillés
le
IQ
MeIQ
JH2
viande de boeuf frite
NJ:À
M~JgJ Me
MeIQx

---

la
Le découverte de ces différents produits génotoxiques élargit le-
domaine d'étude de la cancérogénèse chimique en y introduisant un nouveau
champ d'investigation, celui de la "cancérogénèse alimentaire".
Le problème fondamental de la cancérogénèse est d'ordre étiologique.
Il s'agit de faire la lumière sur "Les processus biochimiques décLenchés au
sein d'une popuLation ceLLuLaire normaLe par La présence de moLécuLes cancé-
rogènes; et à La suite desqueLs iL apparaît, après une Latence pLus ou moins
Longue, les premiers éLéments de La popuLation ceLLuLaire néoplasique, dont
La croissance n'obéit pas aux Limitations contenues dans Le pLan généraL de
L' organi smell' pour emprunter une définition due
au
regretté
Professeur Bun-Hoi
(24). Depuis et tout particulièrement~;âû-,~\\,c0ursdes 15
~t""""'" c ~
dernières années, des recherches faites un peu pa~tQ~~~~~~0nde, et dans
~~.
\\ -;-~\\
.notre propre groupe, ont permis de serrer de prèsi~a qyelst~on e~>di'apporter
v
-_.:2_1\\11 E
l ri
.
_~'::r:
quelque lueur sur la nature des processus fondamen~
.. aux. En VUE:/ae~/bien situer
'/.''''\\
_~ /,
~V
notre travail, nous avons pensé utile de consacrer~~(è_b~~_a.\\.~~.,~&~~~~~sur l'état
actuel de la cancérogénèse chimique.
~
LA CANCÉROGÉNÈSE CHIMIQUE
Le problème fondamental du cancer, en dehors de toute considération
d'ordre médical ou thérapeutique, est celui de l'appréhension des phénomènes
physiologiques ou biochimiques .qui précèdent et entourent le déclenchement
du processus de turnorisation. En d'autres termes, i l s'agit de comprendre
pourquoi et comment une cellule de l'organisme devient tout d'un coup anor-
male, acquiert des propriétés phénotypiques qui lui font perdre son aptitude'
à respecter les règles d'une croissance équilibrée.
Quels sont donc les évènements qui peuvent provoque~ le dérèg~~ment
de cette formidable machine que constitue l'org~isme animal et humain?
Au fil du temps, plusieurs tentatives d'explication ont été faites
qui ont été pour la plupart démenties par les faits.
Trois théories s'en sont dégagées et ont focalisé l'attention des
chercheurs, chimistes, biochimistes, biologistes et cancérologues, au cours
des 30 ou 40 dernières années. Selon ces théories, dont chacune, prise dans
son concept absolu, pouvait être considérée comme excluant les deux autres,
le phénomène de cancérisation serait dû à
:

---

11
- des'mutations somatiques,
- l'action de virus,
- une différenciation cellulaire défectueuse.
Depuis les expériences de Temin et de Baltimore (25) ,on sait que
les virus oncongènes provoquent des altérations structurales du DNA, en
sorte que la théorie virale n'est plus incompatible avec celle de la muta-
tion somatique. Quant à la théorie de la différenciation défectueuse, il
n'est pas difficile d'admettre, à la lumière des nombreux travaux de ces
dernières années, qu'elle est la conséquence de certaines lésions dans la
structure moléculaire du DNA.
Si bien que l'on peut, aujourd'hui, intégrer ces trois théories en
une seule en épousant l'hypothèse de Potter (26) selon laquelle le cancer
serait dû à une différenciation cellulaire défectueuse résultant d'altéra-
tions dans la structure du DNA, c'est-à-dire soit de mutations somatiques,
soit de modifications virales du génome.
t1écan; sme de l à cancérogénèse
La théorie mutationnelle de Boverie (27) énoncée en 1917, l'une des
plus vieilles, se trouve renforcée par le fait que les produits cancérogènes
se fixent sur le DNA et les modi fient.
De nos jours, il est largement admis. en effet, que les évènements
primaires du cancer seraient dûs à des mutations somatiques, lesquelles
mutations seraient la conséquence des dommages provoqués par des agents
cancérogènes dans certaines macromolécules, en particulier le DNA porteur
de l'information génétique.
Cette théorie mutationnelle adaptée par Ames et collaborateurs (28)
constitue la base de leur test. Un mécanisme de la cancérogénèse chimique
a été proposf par les Miller (29),
basé sur cette observation et résumé
dans le schéma 1.

---

agent direct
Précancérogène
métabolisation
1
ultime cancérogène
(électrophUe)
liaison covalente avec le DNA
liaison avec acide nucléique ou
-(entrainant mutations)
protéines
(pas de mutation)
effet
!
l
~
'V
génétique
effet épigénétique
/
~
changement de l'ex-
sélection de cellules
pression génomique
tumorales latentes
Néoplasie
Schéma 1 - Mécanismes possibles de la cancérogénèse chimique (29)
. ,

---

;"'~'It'"lro:rv 't"
13
';!'i~~y••e
\\
",,!~~~~~...:I1),.
Selon cette théorie un canoêrc.têne ,oh1miquœ serait une espèce
".:-,-,-
électrophile capable de se fixer B~r lêe sites nuclêophiles ~u DNA 1 cepen-
dant il convient de souligner que le aeul pouvoir mutagène ne justifie pas
qu'un composé chimique soit cancérogène, ainsi c5e nombreux agents acylants
ne présentent pas cette potentia11tf, malgré leur fort pouvoir mutagène (30).
En outre, des substances non é1ectroph11es peuvent être c50uées des propriétés
cancérogènes, c'est le cas de l'amiante dOnt les fibres présentent à leur
surface une majorité de sites nucléoph11es.
Toutefois, sur le plan mécanistique, en faisant abstraction des ef-
fets de type épigénétique, le postulat d'une interaction entre entités
électrophiles et sites nucléophi1es du DNA constitue une bonne hypothèse de
travail en l'état actuel de la recherche sur la cancérogénèse chimique dans
la mesure où la fixation du cancérogène sur l'acide nucléique entraine
un changement local dans la structure de ce dernier se traduisant par une
perturbation du déroulement du programme génétique.
Nous laissons délibérément de côté les effets épigénétiques que
pourraient exercer le cancérogène sur la cellule, car ils n'entrainent aucune
mutation sinon un changement dans l'expression génomique de la cellule dont
le ou les mécanismes restent encore inconnus.

---

- ,
'
14
Méthodes d'approche
Diverses techniques ont mis en évidence le fait que les agents
cancérogènes se fixent sur le
DNAet d'autres macromolécules cellulaires.
La théorie mutationnelle de Boverie présente le phénomène de cancé-
risation comme une conséquence d'une mutation somatique qui n'affecte que
les cellules de l'organisme hon sexuelles. L'une des propriétés des tissus
cancéreux étant une division anarchique de la cellule, on comprend dès lors
qu'une mutation affectant le ou les gènes qui contrôlent la division cellu-
laire puisse être décisive pour l'avenir des cellules de l'organisme.
La mutation apparaît ainsi comme indispensable à l'apparition et
au développement du cancer. On peut faire trois remarques mettant en évi-
dence la thèse selon laquelle certains évènements primaires à
l'apparition
du cancer sont des mutations
:
1) Dans la plupart des cas, toutes les cellules d'une tumeur ont une origine
commune, soit une cellule de départ dont le matériel génétique a été
modifié.
2) Dans le cas de Xeroderma pigrnentosUID, les individus atteints sont sujets
à des cancers cutanés induits par la lumière,
faute de pouvoir réparer les
dommages causés au DNA par les rayons U.V.
i
la persistance de lésions
induites sur le DNA cellulaire par l'exposition au soleil serait directe-
ment responsable du développement du cancer.
3) La majorité des cancérogènes provoquent des mutations chez les bactéries.
La bonne corrélation qui a été établie entre pouvoir cancérogène
et activité mutagène, a permis de mettre au point des tests mutagènes très
fiables
(28)
; ainsi la détection des produits mutagènes, qui par défi-
nition lèsent le nNA~ constitue un excellent test pour suspecter une activité
cancérogène
(31).

---

lS
De nos jours, il existe plusieurs tests de mutagénicité dont le
plus connu est celui d'Ames
(32).
Ce test consiste à déterminer l'activité mutagène d'un composé
chimique sur une bactérie, Salmonella Typhimurium, qui porte une mutation
his-. Ce mutant ne peut proliférer qu'en présence d'histidine qu'il est
incapable de synthétiser. Au contact d'un produit mutagène, la souche, dont
le g~ne n'est que masqué, va redevenir capable de synthétiser l'histidine
et va se développer. Le taux de reversion, ordinairement très bas, peut
augmenter considérablement lorsque les bactéries his
sont exposées à des
agents mûtagènes
; le taux peut être mesuré puisque seules les colonies
revertantes pourront croître sur un milieu minimal.
Act~uation - mUo..boWatio/1
Dans le cas défini par le test d'Ames,
la plupart des mutagènes et
cancérogènes sont inactifs tels quels et nécessitent une métabolisation
préalable pour devenir actifs
; aussi doit-on ajouter des enzymes de métabo-
lisation sous forme de microsomes hépatiques capables d'activer in vitro
les produits à tester .
.Cette observation suggère que ces composés sont modifiés avant de
se fixer sur le DNA : c'est l'activation métabolique; c'est ainsi que les
Miller introduisent le concept général selon lequel le produit résultant
de l'activation métabolique d'un c~ncérogène serait un produit fortement
électrophile, capable de réagir sur les sites nucléophiles du DNA. En effet,
après l'entrée du précancérogène dans la cellule, cette dernière va tenter
de l'éliminer en le transformant en substance hydrosoluble, seule
éliminable par voie biliaire ou urinaire ; mais cette détoxification peut
fonctionner d'une manière néfaste pour la cellule dans le reticulum endo-
plasmique, site principal de métabolisation d'une grande variété des molé-
cules étrangères liposolubles où sont localisées différentes enzymes
(époxydes hydrases,
flavoprotéines, amines oxydases et tout particulièrement
cytochromes P 450).
Ces enzymes provoquent l'o~'dation des précancérogènes ou intermé-
diaires, appelés cancérogènes proximaux, lesquels évoluent soit en métabo-
lites inactifs qui sont excrétés, soit en métabolites actifs, les cancérogènes
ultimes, ,de courte durée de vie,
très toxiques, pouvant tuer la cellule ou
la transformer en se combinant aux macromolécules cellulaires.

---

16
Toui les tissus sont dotés d'enzymes de détoxification, cependant
la sensibilité d'un tissu vis-à-vis d'un cancérogène est fonction de sa
disposition enzymatique, d'où la notion d'organe-cible.
Ac..t.<:.on .6U)l. .te VNA et c.oMéquence!.l génétiQue..6
L'importance des interactions entre les substances chimiques et le
DNA a été démontrée par des études portant sur des mutants bactériens.
L'étude de ces mutants a permis la mise en évidence des mécanismes dans les
-
bactéries normales pour lesquelles le DNA endommagé par les différents agents
peut être réparé
(33).
Un mécanisme, présenté par Devoret (34)
et modifié par Chevrette
(35),
pOur décrire la séquence des évènements cellulaires suite à l'introduction
des lésions dans le DNA cellulaire, est résumé dans le schéma 2.
D'après ce schéma, une première réparation s'efféctue dès que le
DNA est endommagé;
il s'agit pour la cellule d'enlever la portion du brin
du DNA lésé et de la remplacer par une nouvelle: c'est le mécanisme de
réparation par excision et resynthèse.
Ce processus permet d'éliminer les dimer5de pyrimidines en plus
de certaines autres lésions du DNA Comme celles causées par la mitomycine C
(36). Cette réparation comprend plusieurs étapes et suivant le type de dom-
mages causés, di verses enzymes entrent en jeu (endonucleases spécifiques "
N-glycolysases). Les divers produits d'addition de cancérogènes sur le DNA
ne sont pas tous excisés à la même vitesse. On a là,
un processus fidèle,
qui protège la cellule, ne conduisant pas à des mutations.
Toujours selon ce modèle, des lésions résiduelles peuvent subsister
et bloquer la fourche de réplication, mettant en danger la survie de la
cellule; deux solutions s'offrent alors à la bactérie:
a)
Le DNA polymérase saute la région-lésion et réinitie la réplication plus
loin; il se crée ainsi une brèche post-réplicative à la suite de quoi
i l peut se produire un échange de matériel génétique entre le DNA fils
et le DNA père. Ainsi la brèche ne se trouve plus en face d'une lésion

---

évènements cellulaires
Bgents
phénomênes
observés
responsables
clivage du
répresseur
1 induction
... lysogénique
Ultravi6let
réparation
arrêt non
\\
du prophage
L
immédiate
programmé
activation et
lésions
lési.on
8Jpoo
induction de la
1 du DNA
IJ>.
résiduelle
protéine rec A
de la
réplication
du DNA
....
Aflatoxine B
-J
1
excision
/ / fr,paration~
survie
recombinaison
augmentée
cellulaire
(mécanismes
li>
à établir)
1 mutagénêse
inhibition de la
filamentation
division cellulaire
cellulaire
Schéma 2 - Séquence des évènements cellulaires faisa~t suite à l'apparition
des lésions dans le DNA(d'après Chevrette (35))

---

. /
18
et sera complètement comblée ./ c'est la réparation post-réplicative par
recombinaison (33, 38). La lésion, elle, sera réparée par le mécanisme
d'excision et resynthèse.
b) Le blocage de la fourche de réplication peut donner naissance à un signal
de détresse qui va induire le système dit SOS (39).
Un autre mécanisme de réponse aux effets des cancérogènes a été mis
en évidence (39)
; ce phénomène connu sous le nom de réponse adaptative,
fait apparaItre la résistance accrue aux doses plus fortes d'agents alky-
lants .chez les cellules d'E. Coli incubée3 aupèravant dans un milieu conte-
nant de faibles concentrations du cancérogène. Les cellules deviennent moins
sensibles aux effets toxiques et mutagènes (40). Les études portant sur
des mutants montrent que l'adaptation mutagène et celle due aux effets
toxiques seraient sous des contrôles génétiques différents et implique-
raient différentes enzymes de réparation (41).
En résumé, on peut dire que, si aujourd'hui on admet qùe les cancers
sont le résultat d'un ensemble d'évènements dont beaucoup sont encore peu
connus, il est à peu près sûr que le DNA du chromosome reste la cible pri-
vilégiée des agents cancérogènes. Dans cette hypothèse, la transformation
d'une cellule normale en cellule cancéreuse se déroule en 2 étapes essen-
tielles : l'initiation suivie d'une promotion (42).
L'~n intervient au niveau du DNA et peut aboutir à une ou plusieurs
mutations réversibles. Selon l'hypoL~èse d'un modèle moléculaire, émise
par Dulbecco (43), le processus de cancérogénèse débute par des altérations
structurales (mutations ou transpositions de quelques gènes survenant au
hasard). Ces atteintes du DNA entrainent des modifications structurales
des différentes parties du génome, provoquant, selon la zone du DNA
touchée, l'activation et l'expression d'un "gène du cancer" qui était
auparavant latent, entrainant la synthèse d'une protéine spécifique qui
modifie ainsi l'activité normale de la cellule et aboutit à la perte
de tout contrôle de la cellule vis à vis de son environnement
(44).

---

initialement défini par Miller (45) :
en badigeonnant la peau de la souris par le DMBA (dimethylbenzathracêne),"
on n'observe pas d'apparition de tumeuœcancéreuses
;
pour que ces
dernières apparaissent, il faut, après administration du cancérogène,
traiter la peau, chroniquement, â l'huile de croton qui contient une
substance active puissamment promotrice, ,le TPA (12-0 tétradécanoyl
phorbol-13-acétate).
Il en va de même quant A la réponse de l'acétylarnino-
fluorène en présence du phénobarbital pour l'apparition d'une tumeur
hépatique.
Les promoteurs utilisés en cancérogénèse expérimentale sont de
structures chimiques très variées ; on peut cependant citer :
\\
des composés à propriétés peroxydantes, tels l'eau oxygénée, les pero-
xydes, les peracides et peresters ;
- des phénols ainsi que leurs dérivés, pyrocatechol, pyrogallol.
Une même substance pourrait avoir à la fois des fonctions d'initia-
tion et de promotion
De ce fait, pour être cancérogène, un produit devrait être non
seulement mutagène, mais disposer aussi d'une action promotrice
(46)
ainsi des mutagènes puissants tels que l'azide de sodium ou l'hydroxylamine
ne sont pas cancérogènes; à l'inverse, certaines substances promotrices
peuvent être cancérigènes sans être mutagènes, c'est le cas de produits
minéraux tels l'amiante, l'arsenic, etc.
Tout ceci montre que les produits dits cancérogènes seront de
structures très variées.

---

20
,
1
les agents ch1m1ques cancêrogênes
Ces produits ne nécessitent pas une métabolisation pour manifester
leurs effets biologiques. Les éléments métalliques sont électrophiles
sous leurs formes ioniques, ce qui leur permet de réagir avec les groupe-
ments phosphates des acides nucléiques et d'inhiber un grand nombre
d'enzymes.
( .
Parmi les métaux et leurs
sels provoquant une transformation
des cellules d'embryon d'hamster, on peut citer l'astate, le beryllium
le chrome, le_nickel ainsi que l'amiante
.
etÎl'~~~).
~
~
<§"
"7"
~
(c~\\
Plusieurs dérivés contenant des élémertt
~é~~~l~qu'es~ nt mutagènes
~::,~) ;:;;
chez les micro-organismes et provoquent des~' il;:ésions ch20§' iques dans '
.~\\.
lb
".
~
~"
des organismes supérieurs
(48). L'implantationrsous-e ~~e chez l'animal
de disques ou de fines pellicules de métaux soi~â~i~d~te nature peut
provoquer l'apparition de sarcomes
(49). Cette cancérisation serait due
plus à la structure physique de l'implant qu'à sa nature chimique, semble-
t-il.
Le..o c-ompo.6U oJtganique..o
Le concept selon lequel le cancérogène ultime serait une entité élec~
trophile
pouvant réagir avec des sites nucléophiles
dans la cellule
a permis de dégager une unité dans la grande diversité chimique des cancé-
rogènes organiques.
Les agents se répartissent en deux groupes
* Ceux dont la structure chimique permet d'agir directemen~camme par
exemple les agents alkylants:
ce sont des molécules dont la réaction
avec le DNA se traduit par la fixation d'un groupement alkyle.

---

1
\\
21
On peut citer dans ce 9roupe 1
,.CH)
Methyln1tro~our~e
O-N-N\\
'
C-NH 2
Il
o
."cH)
MNNE
N methyl N'Nitron1troso
OcN-N
H
,
"
C-N
guanidine
Il
'
NH
NO
* Ceux qui ont besoin d'une biotransformation engendrant ainsi des espèces
réactives. Dans ce groupe, on retrouve les hydrocarbures,
les composés
naturels tels l'aflatoxine Bl et les amines aromatiques ou hétérocycliques.
Les hydrocarbures aromatiques
La mise en évidence du rôle des hydrocarbures dans la formation du
cancer fut prouvée par Cook ; celui-ci constata que dans le cas du cancer
du scrotum observé chez les ramoneurs, c'etait le benzo(a]pyrène qui en était
responsable.
De nos jours, un nombre important de travaux sur le métabolisme des
hydrocarbures aromatiques et sur leur mode de fixation a permis d'élucider
leur mode d'action
(50).
Le schéma 3 résume le métabolisme du benzo[a]pyrène.
Le mécanisme de la fixation sur le DNA fait intervenir un carbocation
sur l'atome du carbone la, un mécanisme proposé par Bulbert. (51) dans
lequel le groupe
OB
en position 7 et qui se trouve en cis par rapport
au groupe époXY9-l0 jouerait un rôle décisif en formant une liaison hydro-
gène favorisant l'ouverture de l'époxy pour cr~un carbonium en C
, lequel
l0
carbonium réagit sur un groupe de NB
des bases de DNA par une réaction du
2
type 5N .
l

---

Schêma 3 - Mêtabolisme du benzo[a]pyrêne
9
monooxyr,él.as"
8
...,
époxyt,ydrês~
OH
OH
. .....
OH
anti
.
1
OH
OH G
G

---

' . \\
1
Les autres hydrocarbures polycycliques rê&91ra1ent selon le même
schéma 1 c'est le cas par exemple du méthyl-7 benzota]anthracêne oU,~u
chrysêne. Il en serait de même de leurs analogues hêtêrocycllques comme
par exemple les benzo et dibenzocarbazoles présents dans les goudrons
de fumée de tabac, les goudrons de houille et comme polluants de l'atmos-
phère des grandes villes .
. Les amines aromatiques
Ce groupe a été largement étudié et continue par ailleurs de l'être.
L'exemple type est l'acétylamino-2 fluorène
(AAF) qui ft fait l'objet de,
très nOrnDreuses études. L'un des dérivés actifs de AAF serait l'hydroxylamine
N-OHAAF. Ce métabolite est capable d'attaquer la double hélice de l'ADN
dans le foie du rat. Deux types d'adduits ont été identifiés, l'un prove-
nant de-la fixation de NOHAAF sur l'atome de carbone en S de la guanine
et constitue le produit majeur, environ SO % (52). L'adduit mineur résulte
de la fixation sur le NH
en position 2 de la guanine. Des modèles molécu-
2
laires montrent une intercalation du noyau
AF dans la double hélice du
DNA, provoquant une dénaturation localisée pour l'adduit en CS' tandis que
la fixation sur le NH
se ferait à l'extérieur dans le petit sillon de la
2
double hélice.
Les études faites par Lang (53) avec des érythrocytes
de poulet
suggèrent que l'AAF ne se lie pas au hasard le long de la chaîne d'ADN
il semblerait que les adduits se forment
surtout dans les régions
internucléosomales (54). Bend et coll.
(55) ont montré que l'AAF se lie
à des régions spécifiques sur ~_4Q ; ces résultats indiquent que la région
de contrôle qui, sous certaines conditions, se retrouve dépourvue de
nucléosomes, serait plus susceptible d'être atTaquée par l'AAr que le reste
du génome viral.
Le schéma 4 montre les différentes voies empruntées par un précan-
/
cérogène une fois daDs l'organisme (56).
Il peut être tout simplement excrété grâce à des mécanismes de
détoxification, ou être activé, converti par une ou plusieurs étapes en

---

24
voiee respiratoires
!)(cr~tion -
L . u r i n e s
' " excrétions foecales
éiét.ox i f i ca t1 on
/
détoxification
précancérogêne
9énot~e
activation
~électrOPhileréactif
ou radical cation
DNA modifié
élimination
1
réparation
réplication
\\promotion
i
de la
croissance
~
DNA réparé
mutation
néoplasie
Schéma 4 - Les différentes voies possibles empruntées
par un précancérogène dans l ·organisme (56)

---

25
réaçtif électroph1le. Ce ~ern1er sera ensu1te é11m1né ~e l'organ1sme
(~étoxification, réaction avec ~e8 nuc140philes non cr1tiques)
1
il peut.
réagir avec l'ADN ou ~'autreB c1bles critiques pour la cancérogénèse.
La format1on ~e l'e5p~ce réactive serait accidentelle dans le pro-
cessus de ~étoxification (57)
c'est l'êtape d'activation qui s'avère
importante dans la cancérogénèse des amines aromatiques en particulier.
Réactions observées dans l'activation des amines
Cramer et coll.
(58)
ont mis en évidence la présence de NOHAAF sous
forme d'acide O-glucuronique
dans les urines des rats ayant été traités
par de l'AAF.
D'autres métabolites
N-hydroxylés
furent
mis
en évidence dans les urines sous formes conjuguées, se décomposant rapi-
dement dans les solutions acides (58)
i
la quantité de produits excrétés
varie avec l'espèce,
la souche et le sexe
(59).
Les Miller
(60) observent
que cette première réaction est catalysée par les oxydases à fonction
mixte
(OFM) et requiert la présence de l'oxydoréductase NaDPB cytochrome C.
Le système d'enzymes localisées dans le reticulum endoplasmique (58) com-
prend
- l'oxydoréductase NaDPH cytochrome C
- la phosphatidyl cholinoestérase
- le cytochrome P 450.
Le cytochrome P 450 agit comme système d'oxydases terminales (61).
Les OFM activent l'oxygène moléculaire qui convertit l'amine en produits
oxydés ou hydroxylés.
La formation du dérivé N-hydroxylé
des amines aromatiques catalysée
par le système OFM est une réaction d'activation i les dérivés hydroxylés
sont plus cancérogènes et plus mutagènes que les amines dont elles dérivent.
La conjugaison des arylhydroxyl~ines ou des dérivés N-acétylés donne des
dérivés glucuroniques ou sulfatés (62) qui sont, en général, des produits

---

2&
de d~toxlflcatlon
cepen~ant, les conjugués N-glucuronlques excrétés-~an6
la bile ou dans, lesreins,seraient une forme de transport des amines aro-
matiques_cancérogènes (S6). Ces conjugués
peuvent
libérer Un ion aryl-
nitrénium de façon enzymatique dans le colon ou ê fâible pH dans la vessie (63)
Quant aux sulfates esters, ils sont très électrophiles et seraient
1
impliqués dans l'action des amines au niveau du foie, l'enzyme responsable,
la sulfotransférase étant absente dans les autres tissus (64).
Les peroxydases permettent la formation d'un radical libre nitroxyde
ce dernier conduit par dismutation au composé nitrosé et à l'acyl-acétoxy-
arylamine
(65). On observe aussi la formation du cation arylnitrenium.
L'acétylation (66) des arylamines hydroxylés, observée d'abord chez
le rat (67), est catalysée par l'enzyme arylamine N-acétyltransférase en
présence de l'acétyJcoenzyme A (68).
La désacétylation se fait par la désacétylase i cette réaction serait
un processus d'activation desarylarninesN-acétylés N-hydroxylés dans les
tissus extrahépatiques (69).
- Une autre réaction catalysée par N-,O-acétyltransferase conduit, à partir
du N,N-hydroxyacétylarylamine au N-acétoxyarylamine ("67), composé fort
instable de sorte qu'on l'isole souvent lié aux nucléophiles cellulaires,
méthionine ou guanine
.(68,
69). Cette réaction de transacétylation
constitue l'une des voies d'activation les plus importantes si l'on consi-
dère que l'enzyme responsable se trouve dans
un nombre varié de tissus (66).

---

Ar -
NO Z
réduc I;ases
•
H
/
H
N-Hydroxylase
Lr-N~BJ
/
./
~
- - - - - - - - -.....
Ar-N ,
A r - N ,
OH
H
Arylnitrenium
N-Hydroxylarylamine
ion
f
Deacétylasel [N-Acétyltransférase
iDéa-cetylase
H
/
Ar-N,OCOCH
/COCH
3
3
N-Hydroxylase
/ COCH]
Ar-N'H
---------~ll>
Ar-N
N-Acétoxyarylamine
"OH
Sulfotrans
/COCR 3
Arylacétamide
N-Hydroxyarylacétamide
Ar-N"-
"J
OSO]8
-.]
Sulfate ester
Peroxidase
/COCH]
+
HZO Z
---. [Ar_(=O~
Aryl amidon ium
~Ar-N,OCOCH]
N-Acylacétoxyarylamine
ion
/
J
t COCH] Dismutase
Ar-N 'O·
er-:'nJ
Radical
Aryln~trénium
intermédiaire
ion
Schéma 5
Métabolisation des amines aromatiques
'"

---

28
. Les composés n1tT~B
Signalons enfin que l'étu~e des n1troaryl~et de leurs dérivés
pren~ de plus en plus d'importance. Ils ont été ~étectés dans les gaz
d'échappement des automobiles
(70).
;
Plusieurs composés nitro-aromatiques sont mutagènes et cancérogènes
en expérimentation animale
(71). Les nitroaren8Ssont métabolisés par le
foie et la flore intestinale en nitrosoarènespuis en dérivés N-hydroxylés
(72)
; ces réactions sont aussi observées in vitro. Les réactions de méta-
bolisations font intervenir plusieurs nitroréductases.
'.
les altérations structurales du DNA et leurs conséquences
Nous avons "vu que le processus d'initiation du cancer est généralement
la conséquence de modifications conformationnelles induites dans le DNA
par la, fixation du cancérogène entrainant des erreurs de lecture de la
part des enzymes chargées de la réparation et/ou de la réplication de la
macromolécule. L'une des questions qui ont le plus suscité l'intérét des
chercheurs en cancérogénèse chimique demeure celle de connaître la nature
des lésions, c'est-à-dire des modifications chimiques du DNA à la suite
de l'agression de l'agent cancérogène.
Plusieurs méthodes d'approche ont été utilisées in vivo et in vitro
détermination de la structure des adduits et de la répartition"des sites
du DNA impliqués, étude de la structure primaire et secondaire du DNA modifié,
étude physico-chimique des propriétés du DNA modifié par spectrométrie
d'absorption, résonance magnétique nucléaire, dichroïsme circulaire,
étude immunologique à l'aide d'anticorps anti DNA modifié, étude des confor-
mations B et Z du DNA et de la transition B ~ Z.
La fixation
du cancérogène sur le
DNA
peut entraîner un
certain nombre de conséquences importantes tant sur le plan chimique que
biologique :
- modification des propriétés de l'acide nucléique,

---

29'
- diminution de 'sa stabilité locale,
- déformation de la structure en double hélice par suite de la contrainte
exercée par la présence des substrats cancérogènes,
- perturbation séquentielle pouvant s'étendre à plusieurs paires de bases.
L'étude physicochimique des propriétés du DNA-modifié par l'AAF et
ses dérivés fluorés et iodés en position 7 8 conduit Fuchs et Danne à pro-
poser un modèle "d'insertion-dénaturation" (73) et Weinstein et
Grunberger
(74, 75)
le modèle de
"déplacement de base".
La substi-
tution de la guanine en c-8 par le
noyau AAF, provoquerait la rotation
de la base ainsi impliquée autour de la liaison glucosidique N-C qui passe-
rait de la conformation anti à la conformation ~. Le noyau fluorénique
prendrait ainsi la place de la guanine en s'insérant entre les plateaux
de la double hélice,
en
rejetant à l'extérieur le noyau de la guanine.
Dans le cas du DNA-AAIF, la grosseur de l'atome d'iode provoquerait
une gène stérique, empêchant ainsi le noyau iodofluorène de s'introduire
à l'intérieur de la double hélice. Celui-ci resterait alors le long du
squelette phosphodiester sans induire de désorganisation structurelle
majeùre dans la macromolécule. C'est le modèle de fixation externe de
Fuchs (73).
Enfin, dans le cas de la fixation sur le NB2-2 de la guanine, le
noyau fluorénique s'étendrait à l'extérieur de la double hélice dans le
petit sillon du DNA, sans provoquer de distorsion, selon le modèle molé-
culaire construit par Krick (68).
1
Bien que certains résultats semblent conforter ces différents modèles
(études physicochiroiques, étude du déroulement du n-DNA-AAF par le formal-
déhyde, action de l'endonucléase 51 d'Aspergillus oryzae)
(76), certaines
questions restent posées quant aux conséquences du devenir de la cellule
altérée par le cancérogène qui mettent en doute la validité des modèles
proposés quand on sait, par exemple, que dans le cas du N-oHAF, cancérogène
aussi puissant que son dérivé acétoxylé, le noyau
AF introduit une pertur-
bation beaucoup moins importante dans le DNA que le noyau
AAF (77, 78).
Il semblerait d'ailleurs que l'insertion du noyau
AF au sein de la double
hélice serait moins complète que dans le cas de AAF.

---

3U
D'autres modèles sont donc probables, dont certains ont été postulés
par différents auteurs (76, 78, 79). En particulier, les travaux de Sage
et Leng (80) sur les anticorps anti-DNA-AAF et anti-DN~-AAIF les ont conduit
à formuler l'hypothèse de l'existence d'un équilibre entre les deux confor-
mations anti et ~ des substrats d-Guo-AArF'est-à-dire entre les positions
intérieures et extérieures du noyau fluorénique.
Par ailleurs, en utilisant un DNA modèle, le poly(dG-dC)-poly (dG-dC),_
modifié par AAF, ces chercheurs ont montré que le polynucléotide modifié se
trouvait sous la forme Z (80). Ce dernier point est particulièrement impor-
tant. Car, de toute évidence, l'existence de séquences en forme Z, dans
le DNA naturel, qui a été démontrée en ce qui concerne les chromosomes
polyténiques de larves de Drosophila melanogaster
(81), ouvre des perspec-
tives nouvelles à la cancérogénèse chimique.

---

31
OBJECTIFS ET MOTIVATIONS DE NOS RECHERCHES
Dans le cadre des recherches de notre laboratoire sur la cancérogénèse
chimique, nous avons pensé qu'il serait intéressant d'entreprendre, en parallèle
ou plutôt dans le prolongement des travaux effectués sur l'amino-2 fluorène,
cancérogène typique, une étude approfondie sur les nouvelles amines hétérocy-
cliques mutagènes découvertes dans les produits de cuisson de certainsalirnents
ou dans les pyrolysats de certains acides aminés.
Notre ch0ix s'est porté sur les dérivés de pyrolyse de l'acide gluta-
mique pour plusieurs raisons
Tout d'abor~en raison de la très grande mutacancérogénicité de Glu-P-l'
et de Glu-P-2 et plus simplement du pyrolysat de l'acide glutamique qui pourrait
bien contenir d'autres composés dérivés du noyau dipyridylimidazolique qui,
forme le substrat porteur de la fonction amine de Glu-P-l et Glu-P-2. L'acide
glutamique constitue un acide aminé que l'on rencontre dans toutes les protéines
et substances alimentaires d'origine animale ou végétale. Il entre, en outre,
dans la composition de plusieurs médicaments et est utilisé comme additif ali-
mentaire. La connaissance approfondie de la structure et des propriétés des,
produits qui peuvent se former au cours de sa combustion incomplète présente
un intérêt capital pour les sciences de l'environnement et la toxicologie ali-
mentaire.
En deuxième lieu, ces amines hétérocycliques, qui offrent quelque parenté
structurale avec l'amino-2 fluorène dont on peut considérer qu'elles sont des
isostères azotés, nous ont par~ constituer des modèles intéressants pour éclairer
~2
H H
R
Me
Glu-P-l
Amino-2 fluorène
Glu-P-3
R = H
Glu-P-2
nouveau produit de
synthèse

---

32
un problème important non encore résolu relatif à la compréhension du (ou des)
mécanismes d'action des amines cancérogènes au niveau moléculaire J l'expé-
rience montre qu'il y a une variation non négligeable dans la nature des bases
attaquées ou des sites d'une même base et dans la proportion relative des
adduits qui se forment dans le cas de"la guanine quand on considère l'action
des amines dérivées du fluorène, du naphtalène, du phénanthrène ou du biphényle,
P9urtant structurellement apparentées. Il a aussi
été démontré au laboratoire
qu'il y avait une nette différence d'activité vis à vis du DNA et de ses mono-
mères entre le N-ACO AAF et ses dérivés alkylés, le N-ACO Et-AAF et le N-ACO
ButAAF ainsi que dans les propriétés physico-chimiques du DNA modifié par ces
cancérogènes
(82).
Tout se passe donc comme s'il y avait une spécificfté
d'action de chaque cancérogène donné qui dépendrait en grande partie de la
structure (électronique ou géométrique) du substrat porteur de la fonction
active. On peut se demander dès lors dans le cas des dérivés de l'acide glu-
tamique quelle peut être l'influence des azotes intracycliques sur les pro-
priétés mutacancérogènes de ces composés, dans quelle mesure la présence de
la fonction amine est nécessaire à l'apparition du pouvoir mutagène et, dans
l'affirmative, si les interactions avec les acides nucléiques et leurs consé-
quences obéissent aux mêmes règles mécanistiques que pour les amines aroma-
tiques.
Ces différentes considérations nous ont amenés à entreprendre la
synthèse chimique de toute une série de dérivés de l'hétérocycle de base,
le dipyrido [1,2-a:3'2'-d]imidazole et d'en déterminer les propriétés muta-
gènes. Parmi ces composés nous avons retenu celui qui nous a paru le plus
intéressant sur le plan de la mutacancérogénèse, le Glu-P-3 pour une étude de
ses interactions avec le DNA et une tentative de mise au point de tests
immunologiques pouvant permettre d'une part de suivre le devenir de ces
cancérogènes chez l'animal et éventuellement chez l'homme, et d'autre part
de détecter leur présence éventuelle dans certaines préparations alimentaires.
Notre travail comporte donc
trois parties
Une ~e c~jgue qui a nécessité un important travail de mise au point
des méthodes d'accès à ces composés, de vérification de leurs structUres
et de mesure de leurs propriétés physico-chimiques. Il est à signaler que

---

33
le noyau dipyrido-imidazo11que est un hétérocycle nouveau et il nous a
paru que l'étude de cette famille pouvait être une contribution intéressante
au développement de la chimie hétérocyclique des composés azotés.
- Une pa~e biologique comportant deux chapitres :
1° L'étude comparative de la mutagénicité des différents composés synthé-
tisés réalisée en collaboration avec l'équipe de feu le Professeur
Poncelet à Bruxelles.
2° L'étude de leurs effets biochimiques sur le système microsomal hépatique
-.:
chez le rat dont le rôle fondamental dans l'activation des substances
cancérogènes est bien connu.
Une pa,~e biophy~~ue consistant dans l'étude des interactions du métabo-
lite supposé de Glu-P-3
(le diacétate analogue au N-ACO AAF)
avec le, DNA
et des modifications structurales induites dans l'édifice moléculaire de
cet acide nucléique par la fixation des motifs Glu-P-] sur la macromolécule.

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PRE MIE RE PAR T 1 E
LA CH l MIE DU DI PYR l DO [1 ,2 - a ; 3 l ,2 1 - dJ
IMIDAZOLE ET DE SES DÉRIVÉS
,.

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43
INTRODUCTION
Si seuls le Glu-P-l et le Glu-P-2 ont pu être isolés et caractérisés du
pyrolysat de l'acide glutamique, il existe probablement bien d'autres produits
à côté de ces deux constituants fondamentaux. Nous avons, du reste, pu nous en
rendre compte avec N'Goy et de Meester (1) en mettant en évidence, à côté de
Glu-P-l et de Glu-P-2 deux autres produits doués d'un pouvoir mutagène bien
plus élevé gue celui de Glu-P-l. L'identification de la structure de ces deux
produits n'a pas encore été totalement résolue, mais nous pouvons d'ores et
déjà postuler, à l'aide des données physico-chimiques que nous avons enregis-
trées, que ces produits sont des dérivés du dipyrido [1,2-a:3' ,2'-i]
1
imidazole.
De plus, une étude approfondie de la fragmentation sous l'impact
électronique dans le spectrographe de masse de l'acide glutamique nous a permis
de déceler la formation probable d'une autre amine, le Glu-P-3 ou un isomère,
comm~ nous le verrons plus loin.
L'hétérocycle est nouveau et présente, en conséquence, un intérêt consi-
dérable pour la chimie fondamentale tant sur le plan théorique que sur le plan
pratique. Il faut ajouter que l'on ignort pour l'insëant le ou les mécanismeCs) de
formation d'un tel noyau au cours de la p)Tolyse de l'acide glutamique ou lors de
la combustion de certains aliments meme si certains faits laissent prés~~er qu'il
s'agit d'un mécanisme radicalaire. Il n'est pas sans intérêt de noter, enfin, que
le rendement en Glu-P-l et Glu-P-2 Cde l'ordre de quelques p.p.m., après les
diverses étapes de purification) par pyrolyse de l'acide L-glutamique, reste
très faible.
Ces différentes observations nous ont incités à entreprendre une étude -
chimique approfondie impliquant :
- la recherche de modes d'accès pratiques à l'hétérocycle lui-même et à
certains
de ses 'dérivés, fonctionnels ou non, pouvant avoir un intérêt sur
le plan théorique et pratique ;
- l'étude de leurs propriétés physicochimiques, notamment en spectrométrie
d'absorption, de R.M.N. et de masse.

---

44
i
1
Sur le plan de la synthèse chimique, nou~ avons mis à profit la propriété
de certaines 'amines aromatiques ou hétérocycles de réagir avec certains (3-dice-
tones, f3-cétoesters ou leurs dérivés,
ou
.encore
avec
esters f> -insaturés
pour donner des intermédiaires de substitution nucléophiles qui peuvent être
facilement cyclisés dans certaines conditions.
Nous avons utilisé comme précurseurs l'amino-3 imidazo[1,2-~pyridine~
et ses dérivés méthylés en différentes positions.
Cette amine n'existe pas dans le commerce et il nous a fallu mettre au
point une méThode d'accès pratique à ce composé et ses dérivés qui constituent
nos matières premières de départ.
Nous traiterons dans un premier chapitre de la préparation d~s
précurseurs, dans un
deuxième
chapitre
de la synthèse et de l'éTude des pro-
priétés chimiques des dérivés du dipyrido[1,2-a:3'2'-~imidazole et dans un
troisième chapitre des propriétés physico-chimiques des composés de cette
famille.
Nota
Ce travail a donné lieu à un article préliminaire paru dans J. Heterocy-
clic chem. 1981, ~, 1565 sous le titre : Mutagenic heterocyclic nitrogen
compounds related to protein pyrolysates. 1. Derivatives of dipyrido
[1,2-a:3' ,2'-d] imidazole.

---

\\
CHAPITRE 1
SYNTHE SE ET PROPRIETES DE
L'AMINO-3 IMIDAZO[1,2-aJPYRIDINE ET DERIVES
L'imidazo[1,2-a]pyridine et différents de ses dérivés ont fait l'objet
de nornbreuse~ ét~des en raison notamment de la parenté structurale du noyau
avec l'indole (2, 5) et de leur intérêt sur le plan pharmacologique. L'hété-
rocycle lui-même ains~ que divers de ses dérivés nitrés présentent, en effet,
une activité antibactérienne notable (6). D'autres de ses dérivés, en parti-.
culier ceux portant une fonction nitrile, acétonitrile, amide ou carboxylique
ont été étudiés pour leurs propriétés analgésiques, anti-inflammatoirés,
anti-pYY'étiques ou comme relaxants musculaires (7).
Sur le plan fondamental, Paudler et al. (8) ont déterminé la réparti-
tion de la densité électronique à l'intérieur du noyau par la méthode. HMO
et ont établi que la position 3 constituait le siLe pY'ivilégié de substi-
tution électrophile. En outre, plusieurs travaux ont été consacrés à l'étude
en résonance magnétique nucléaire de certains imidazo[1,2-aJ pyridines (3~ 8,
9) .
Cepëndant, il existe peu de données dans la littÉrature concernant
l'amino-3 imidazo~,2-aJpyridine, en dehors d'un article de Bristow et al.
(10) qui décrit son acétamide obtenu incidemment au cours d'un travail consacré
au pjl'idylaminoacétonitrile et d'une étude
d'Almirante et al. (11) qui
l'ont obtenu par réduction, par le zinc en milieu acétique, du dérivé nitré
correspondant. Cette réaction semble peu reproductible, d'après nos propres
essais et c'est sans doute ce qui explique, au moins en partie, que l'amine
1 ait été jusqu'à présent peu exploitée, malgré l'intérêt qu'elle présente
comme point de départ pO:jr l'obtention de nombreux dérivés à potentialité
thérapeutique et phytosanitaire.

---

Pawdler et al. (8) ont bien
de leur côté
essayé la réduction du
t
t
dfiriv€
nitré
mais ils n'ont obtenu qu'une huile (alors que l'amine est
t
normalement un composé solide) qu'ils ont transformée en acétamide.
Dans un premier temps, nous avons voulu employer la procédure décrite
dans le schéma 1 pour accéder à cette amine.
Schéma 1
Le principe de la synthèse de l'hétérocycle ;:, consiste en une conden-
sation de l'amino-2 pyridine ou de ses dérivés avec un composé a-halogèné,
le chloroou le bromoacétaldéhyde (ou leurs acétals) suivie d'une cyclisation
de l'imine intermédiaire 3 selon le procédé décrit par Pawdler et al. (B.b).
~
L'hétéroeyele 4 peut être facilement nitré par l'action de l'acide nitrique
,......
(d' = 1,33) ou d'un mélange d'acide sulfurique conéentré et de nitrate de
potassium à froid. Il peut être également bromé par action du brome dans de
la soude ou de la N-bromosueeinimide (NBS).
Nos tentatives de réduction du dérivÉ nitrÉ S, soit par les couples
""'-
Sn/Hel, Fe/Hel, Zn/CH3C02H'
, Zn/NaOH, soit par hydrogénation sous pression,

---

4 1
soit encore par l'hydrate d'hydrazine en pr~sence de Ni Raney se sont r~vé-
l~es peu fructueuses avec des rendements ne d&passant pas 10 , dans le
meilleur des cas. Un essai d'amination ~ partir du d&riv~ bromf 6 par actio~
"V
,
de l'ammoniac anhydre sur le composé 6 dans le phénol à l'~bullition penda~t
,...,
2 heures, selon la méthode décrite par Hauser et Reynolds (12) n'a pas
donné de meilleur r~sultat : nous avons r~cupéré en fin de r~action le pro-
duit de d~part inchangé.
Une tentative d'acétylation du noyau (comme voie possible d'accessio~
à l'amine) par action du chlorure d'acétyle en présence d'AIC13 dans le
chlorure de méthylène anhydre s'est r~vélée infructueuse, même en chauffant
l~ mélange réactionnEl.
Le deuxième schéma que nous avons imaginé, inspiré du travail de
Bristo...' (10) devait comporter trois ~tapes :
~~NH2
Hel
R
~jJ
~u NoOH
1
.-..1'
Schéma 2
En fait, nous nous sommes aperçus que le dérivé 7 n'était autre que
......,
la forme tautomère ouverte de l'amine l que nous recherchions, comme en
attestent les mesures spectrométriques en RMN et en infrarouge. En particulie~,
1 o.R=H
-, b, R=5Me
-1, c, R= 7Me
..1 d, R=8 Me

---

48
-1
on peut noter l'absence de bande vers 2250 cm
dans le spectre Ir
des composés la, le, rd, caractéristique
des fonctions nitriles; seul
r J
,.....
' "
l
le composé lb présente une telle bande à 2248 cm- .
Il est à noter que Bristow et al. (10) avaient déjà observé une
prépondérance de la forme cyclique tautomère chez le dérivé acétylé du
pyridoarninoacétonitrile-2 àinsi que chez le produit de benzylation de ce
dernier. Sur le plan pratique, nous avons modifié sensiblement la méthode
de Bristow en opérant 'en milieu aqueux en présence du composé d'addition
préformé du formaldéhyde avec le bisulfite de sodium, ce qui nous a permis
d'augmenter de façon significative le rendement.
Partie expérimentale
Les matières premières : amino-2 p)Tidine et ses dérivés méthylés,
composé bisulfi tique du formaldéhyde pr·oviennent de chez Aldrich.
Les
mesures de RMN ont été faites sur un appareil Varian A 50 dans le chloro,
forme deutérié avec du T.M.S. comme référence interne. Les spectres l.R.
ont été enregistrés sur UTI appareil Perkin Elmer 457 sur pastille de KBR.
Les composés 4, 5 et 6 .du scn~m2 i avaient été déjà décrits dans
r " "
,.J
la liTtérature (5, 7, il).
Préparation de l'imidazo[1,2-a]pyridine 1 a
~-.:..!:..:::..~---=.~~_ _---.:..._ _--=......:.....::..._-=-~
r-.-
On ajoute l'arnino-2 p)Tidine (1,5 mole) à une solution du complexe
bisulfitique de sodium et de formaldéhyde (1,5 mole dans 375 ml d'eau)
chauffée à 95°C au bain d'huile. Tout en agitant on continue à chauffer
le mélange pendant 90 minutes puis on ajoute au milieu réactionnel une
solution de cyanure de sodium (3 moles dans 300 ml d'eau) et on chauffe
encore 3 heures. Après refroidissement, on essore le précipité formé - qui
contient en grande partie le sulfite de sodium (Na2 S03) - et lave abon-
damment le précipité avec du~hloroforrne, et la phase chloroformique est
récupérée, séchée sur CaC12 et chassée au rotavapeur.
/

---

49
Le r~sidu obtenu recristallise dans le benz~ne en donnant des cris-
taux jaunes.
Les homologues lb et lc ont ~t~ préparés suivant la même technique.
,....,
"""-
Le d~rivé Id a été obtenu par simple recristallation de l'acétate d'éthyle
,...,
du précipité réactionnel (apr~s lavage préalable à l'eau de celui-ci).
Les caractéristiques de ces produits sont données dans les tableaux
1 et 2.

---

50
TABLEAU 1
Caractéristiques physiques des amino-3 pyrido-imidazoLes
Composé
Formule
Rendement
p.r.
I.R.
---------- ------------ --------------- ------------------- ---------------------
1 a
C H N
60
124 - 125
v
::
3320
7 7 3
NH2
1 b
C
::
3380
8HgN3
gO
98 - 100
VNH2
1 c
C
::
3350
8HgN3
55
129 - 131
vNH2
1 d
C8HgN3
35
liquide
v
::
2210
E
::
170-172°C
C=N
12 ITUTJ
a
R :: H
b
R :: 8CH 3
c
R :: 7CH 3
d
R :: 5CH 3
TABLEAU 2
DépLacements chimiques en RMN (6,
*
ppm)**
Composés
H
H
H
H
H
NH
2
5
6
7
8
2
--------- ----------- ----------- ----------- ----------- ----------- -----------
1 a
7,05 (s)
7,85 (d)
6,6 (T)
6,92 (T)
7,35 (d)
3,0 (s)
J :: 8 cps
T
::
v
8 cps
J :: 8 cps
l b
7,90 (d)
6,6 (T)
6,80 (d)
7,2_5 ( s)
éCH_ :: 2,3
3,1 (s)
J
::
8 cps
J :: 8 cps
J :: 8 cps
j
1 c
7,62 (s)
8,45 (d)
7,12 (d)
-
7,75 (d)
3,7 (s)
*
s:: singulet ; d :: doublet
**
le spectre de Id montre la présence d'un signal à 4,25 ppm (d) significatif de
la présence d'Un groupement métryylène.

---

51
CHAPITRE Il
SYNTHESE DU DIPYRIDo[1,2-a:3',2'-d]
IMIDAZOLE ET DE SES DERIVES
Les méthodes de synthèse que nous avons mises en oeuvre sont résumées
dans les schémas 3, 4 et S.
1/ Préparation de GLu-P-1 et de GLu-P-2
Le pr·Écurseur la et son dérivé méthylé là condensés avec le chloro-2
acrylonitrile selon la méthode rapportée par Takeda et al. (13), avec quel-
ques modifications, nous ont fourni les amines Glu-P-2 9a et Glu-P-l 9b avec
,....,
......
un rendement de l'ordre de 30 à 40 %. Contrairement à Takeda, nous avons
pu isoler ces composés sous forme de bases libres et constater qu'ils
étaient assez stables lorsqu'ils étaient conservés 2 froid (vers 5° C) et
à l'abri de la lumière; il en sera de même du reste pour les autres amines
synthétisées au cours de ce travail.
2/ Création de L'hétérocycLe 4-méthylé
La condensation de l'amine 1 avec la méthylvinylcétone nous a condûit
,....,
à l'hétérocycle méthylé en position 4. La méthylvinylcétone réagit' sur les
amines selon la réaction de
Doebner et Miller (14) en milieu acide pour
donner des rnéthy1-4 quinoléines. Campbell et Schaffner (15) ont montré
qu'on pouvait améliorer de façon sensible les rendements en opérant en
présence d'un agent oxydant et d'un agent de condensation dans des condi-
tions douces de température et d'acidité moyenne. Nous avo~s utilisé le
chlo~ure ferrique comme agent oxydant et le chlorure de zinc comme agent
de condensation. Le schéma 6 résume le processus réactionnel.

---

52
NH2
-aN:) MeCOCH=CH2
R
1
~
~
~N
1. IMecocH2coMe
H ~e
R f~----rr- N-C=CHCOMe
~..j
N
14
r - '
a,R = H
b R =8 - Me
1
C, R = 7 - Me
d J R =5 - Me
Me
12 , R1::: H
13 , R1= COMe
a,R = H
b R =
1
6 -Me
c
R =7 -Me
1
d R =
1
9 -Me
Schéma 3

---

53
Schéma 6
L' ét,ude comparative des spectres de RMN des composés 10 ainsi
obtenus nous a permis de caractériser les signaux propres aux différentes
positions du noyau. Le tableau 7 montre les déplacements chimiques des
protons et leurs constanTes de couplage. On peut noter le déblindage assez
importanT des protons 2 et 9 eu ortho des azotes intracycliques comparable
à ce qu'on observe dans le cas de la pyridine (16).
Les spectres U.V. du
composé
monométhylé
10a (fig. 1) dans
- ' )
l'éthanol pur (-)
et dans un mélange éthanol + Hel 10 L M ( ... ) mettent
en évidence le caractère basique du noyau dipyrido-imidazol~.
3/ Nitration de l'hétérocycle 10
........
L'action de l'acide nitrique concentré (ô : 1,49) sur les composés
10 nous a conduit à des dérivés mononitrés auxquels nous avons attribué
la structure 11 par référence à la nitration de la pyridine (17) et de
~
celle du 3H rnéthyl-3 irnidazo G,5-bJ pyridine (18). Ces niTrations ont lieu
en position méta de l'azote pyridinique, le plus accessible pour ce genre
de substitution électrophile ;ceci est renforcé par la présence du groupe-
ment méthyle en position 4 qui oriente la dite substitution en ortho.
Les données de RMN (voir tableau 7) justifient, par ailleurs, la
structure postulée. En effet, le proton H2 du noyau présente dans le
,
(

---

Fi~ure 1 : spectre u.v. du méthyl-4 dipyridylll,2-a:3' ,2'-d]
im,dazole dans l'éthanol pur (- )et dans un mélange EtOH +
Hel 10-2 H (---)
\\ ,
1
1,,
\\J
\\
lllII
o
\\
\\ ,,
4
\\\\
,''''
, .. '
,
,_
1
\\
, "','
,
'",,\\
" "
lJ1
\\,'
,
r
,
,
,
•
1
,
••
\\
,
1
,
8
,
,
1
,..
"
,
8
,
'w'
g
3.5
1
1
g
•,,
1,,
\\
\\ ,,
200
250
300
·350
nm
400,

---

spectre un signal sous forme de singulet ayant subi un léger déplacement
vers les champs faibles caractéristiques de la présence du groupement
N0
en position ortho (15) du groupement méthyle.
2
L'utilisation de l'acide nitrique concentré à chaud sans solvant
est une technique fort drastique à laquelle nous avons eu recours en der-
nier ressort après ~voir essayé sans succès toute la panoplie des techni-
ques classiques de nitration (action de l'acide nitrique fumant ou à
d = 1,33 en présence d'acide sulfurique. d'acide ou d'anhydride acétique.
action du tétroxyde d'azote dans le chloroforme). Ces tentatives infruc-
tueuses laissent à penser que le noyau dipyrido-imidazole est faiblement
réactif et se prête mal à la substitutioD électrophile. Une tentative de
bromation directe du noyau par action du brome ou de la N-bromosuccimide
dans les conditions utilisées pour l'imidazo[1.2-a] pyridine s'est révélée
négative, ce qui renforce notre point de vue.
Il est à noter que la nitration dans les conditions que nous avons
utilisées n'affecte pas le cycle B du noyau ainsi que l'attestent les don-
nées de la RMN.
Il est possible que la présence de trois hétéroatomes provoque une
forte délocalisation électronique à l'intÉrieur du noyau comme cela se
produit dans la plupart des hétérocycles azotés (19). Cet hétérocycle est
formé par la fusion du noyau imidazo~.2-aJ pyridine et de celui de la
pyridine. On sait que dans le cas du premier. la position réactive privi-
légiée est la position 3. Il en résulte que dans le cas du noyau tricycli~
1
que. le noyau actif A se comportera dans une certaine mesure comme la
pyridine. C'est-à-dire. si l'on se réfère à la théorie d'activation déve-
loppée. notamment par Ingold (20), et à ce que l'on sait de la réactivité
de la pyridine (19). on aura un noyau assez désactivé vis à vis des subs- ,
titutions électrophiles, qui. dans tous les cas. se feront préférentielle-
ment en position 3.

---

'.
11 est à noter, par ailleurs, que la nitration du 3!i-imidazo G,5-bJ
pyridine, qui est une autre séquence du noyau ] 0, se fait égale;;,ent en
,....-
position méta de l'azote pyridinique, comme l'ont montré Bystr'o': et Yutilov
(18) .
3H
imidazo G,5-b] pyridine
Le calcul de la répartition des densités électroniques dëDS le
noyau de la pyridine (28) montre d'ailleurs qu'en dehors de l'ezote, c'est
le carbone 3 qui est le plus riche en électrons TI.
En fait, le noyau pyridinique est totalement inactif vis 2. V1S de
certaines substitutions électrophiles classiques comme l'acylatioD ou la
carboxylation (19) et ne se prête que difficilement à l'halogéDë~ion ou
à la nitration. Dans ce àernier cas, c'est la position 3 qui SE Trouve
impliquée avec des r.endements paU\\TeS dûs à la protonation de l'ëzote (19).
La nitration du dipyrido-imidazole la, dans les conditions utilisées,
""""'
.
se fëit avec
un bien meilleur· rendement (~ 45 % , alors que d~n3 le cas
de la pyridine les rendements ne dépassent pas 15 % dans le meilleur des
cas). Cela
est
dû vraisemblablement aux effets d'hyperconjugêison et
inductifs du groupement méthyle en position 4 qui accroissent lê réactivité
du carbone en ortho, c'est-à-dire en position 3.

---

57
~I Amination des composés J2
La réduction d~s composés nitrés 11 par l'hydrate d'hydrazine en
-
présence de nickel Rôney dans l'éthanol au reflux se fait assez facilement
et nous a condùit avec des rendements de l'ordre de 50 à 60 % aux amines
12, lesquelles ont pu être transformées aisément en leurs acétamides 13
r ' J
par action à chaud de l'anhydride acétique. La pureté et la structure de
ces produits ont été vérifiées en chromatographie sur plaque de gel de
silice, en RMN et en spectrométrie d'absorption I.R.
51 Action de L'acétyLacétone sur Le précurseur 1
Ltacétylacétone, comme la plupart des 8-dicetones, se condense aisé-
ment avec les amines aromatiques pour donner un anile ou une cétimine qui
peut subir une rÉaction de cyclodeshydratation pour conduire à des dérivés
pol)~éthylés de la quinolÉine. Cette rÉaction résumÉe dans le schÉma 7 est
connue sous le nom de rÉaction de Beyer-Càmbes (21).
o~ ..... Me
"c
1
CH2
1
C=O
~e
Me
Rù-N .......---')(~~H_22-~-0-~-
Me
Schéma 7

---

N
~
:rNH2
R"
1
- a
~
~ME .1 N ~OCH2COOEt
o,R: H
0 , R:H
N:J(NH'CH
-aN:JNH'C-Me
b,R:5CH
R
"
R I "
b,R:5CH
3
~::-..
C-COOEt
::::-...
~
CH
3
- a
c,R:7CH
N I N
1
c, R:7CH3
3
- -
1
c=o
c=o
d,R: 8CH
15
19
3
1
---
1
d, R:8 CH3
6
0
CIl
o
16
0
-
Et
Et
tJ1
:r
çO
~.
3
QI
R~~_::JÇlN~
_é"~-WN-...;:Me
.r-
~
R~
1
0
1
0
POCIV
N
COOEt
N
/ :
16
OH
20
l OH
R~~~ yN~
- INOOH
---
POC'3
~N~COOEt
~2
CI
~f)I--(N~
R~~-::JClN-...;:R1 R1:H or Me
R ~NYCOOH
~
~
N
0 , R:H
; R1:H
12
lJL
CI
b, R:6-Me; R1:H
OH~2
/POCI3
c.R:7-Me; R1:H
d, R:9-Me; R1=H
R~~-::JQ"N-...;:
e. R=H
; R1=CH3
~
.ô
r, R =6-Me; R
N
1=CH3
g. R=7-Me ; R~ =CH3
18
OH
- - '
h,.R=8-Me; R1 =CH3 ,

---

/
59
Si- la première étape ne pose généralement pas de pr~bJème, il n'en
est
pas toujours de même de l'étape de cyclisation ; assez souvent, sous
l'action combinée de l'acide sulfurique couramment utilisé comme agent
de cyclodéshydratation et de la chaleur; la cétimine se trouve dégradée
et transformée en résine (22, 23) ou, au mieux, transformée en quinoléine
sulfonée sur l'homocycle (23, 24). Saint-Ruf et al. (25) ont montré qu'on
pouvait éviter la plupart de ces inconvénients en utilisant l'acide poly-
.
,
phosphorique (P.P.A.) comme agent de cyclodéshydratation et ont pu obtenir
de cette façon, avec de bons rendements, plusieurs quinoléines polycycliques.
Dans notre cas, l'action de l'acétylacétone sur l'amine 1 nous a
~
conduit, avec un bon rendement, à l'anile 14, mais malheureusement, nous
~
n'avons pu réaliser la cyclisation de Beyer-Combes.
Quel que soit l'agent de cyclodéshydratation utilisé, l'acide sulfu-
rique, l'acide polyphosphorique, une solution acétique de Hel gêzeux
- utilisée également en cerèèins cas (26) -, ou même certains acides de
Lewis comme le chlorure de zinc fondu, l'anile s'hydrolyse pour régénérer
l'amino-pyridine. Cet insuccès doit être attribué à la fragilité de la
molécule d'anile ou de cétimine 14 qui ne résiste pas aux conditions pour
le moins drastiqu~s de cette réaction acido-basique. Nous avons là un
nouvel exemple des limites de la réaction de Beyer-Combes, qui, toutes
choses égales d'ailleurs, dépend en grande partie du substrat porteur de
la fonction amine.
6/ Action de l'acétylacétate d'éthyle
L'action de l'acé~ylacétate d'éthyle sur les amines 1 peut théori-
quement conduire aux différents produits montrés dans le schéma 8.

---

60
1
Schéma 8
H
H
RaN:JN-C=C-C=Nt1)-~
1
1
1
1
R
~
~
OH
CH3
~,ô
N
N
n

---

61
Un nombre considérable d'analogues de ces différents produits ont
été décrits dans la littérature •. obtenus par réaction de
ArNH
sur l'acétyi-
2
acétate d'éthyle dans des conditions variées.
L'expérience a montré que dans les conditions réactionnelles assez
douces utilisées en présence de Driérite (Ca S0 ) ou de HCl(27. 28), nous
2
4
n'avons obtenu que le crotonate 19 identifié à la fois par l'analyse de son
spectre de RMN et par les caractéristiques physico-chimiques de son produit
de cyclisation 20 (schéma 4). Contrairement à ce que nous avons vu plus haut
-
concernant les composés 14. cette cyclisation s'effectue aisément dans le
~
Dowtherm A selon la réaction de Conrad
- Limpach (29). La facilité avec
laquelle cette réaction s'effectue alors que nous n'avons pu réaliser la
cyclisation de Beyer - Combes peut ëtre vraisemblablement imputée à la fonc- '
tion ester qui peut générer de façon relativement simple et rapide de l'alcool
éthylique, produit assez volatil dans les conditions de l'expérimentation
(schéma 9).
Schéma 9
Dans le cas de la réact ion de Beyer' - Combes, la formation de l'eau,
produit peu volatil. est plus ardue. ce qui explique que l'action de l'agent
deshydratant acide a lieu de préférence au niveau du groupement anile,pro-
voquant ainsi une rupture hydrolytique.
Il faut noter que le test au perchlorure de fer. appliqué au produit
obten~, donne une coloration rouge brique caractéristique de la fonction
~
énol, ce qui' confirme bien que le produît de cyclisation possède la structure
20 et non la structure cétonique 30 (schémas 4 et 8).

---

/
62
,
71 Condensation du précurseur avec l'éthoxyméthylène malonate d'éthyLe (EMME)'
(voir igalement le schima 4)
G-
O
Il
H
H,,+~ ;:. -OEt
H0 H
....C02Et
Ar-NC1 ~ c. ç
-~JI' ArN-C=C
+ EtOS
8
bEt .. 'C-OEt
~
' C02Et
Il
1
0
37
1-:'
1
H H
"C02 Et
,. Ar-N-C=C
EtOH
+
' C0 2 Et
15
"-
-
"- "'- " "'-~
... RÛ
~
::--...N
0
16
38
--
Schéma 10
On sait depuis longtemps que l'éthoxyrnéthylène malonate d'éthyle
peut réagir aisément avec l'aniline pour donner un anilinométhylène malo-
nate qui peut ~tre converti en acide hydroxy-4 quinoléine carboxylique-3
par cyclisation thermique suivie de saponification (30, 31). Cette r~action

---

63
r
e ~té ~tendue à ] 'amino-pyridine (32, 33), l'amino-thiazoJp et l'amino-2
•
1
bl'n::.imiùo7.,u)c
(34 ,3~) avec quelques veriantes. Nous avons pu l'appliquer',
~ans problème, aux amines 1 qui nous ont fourni les crotonates 1S, lesquels
l'''V
"'-'
ont été cycJisés par chauffage dans le Dowtherm en hydroxylesters 15. Ces
,....,
derniers conduisent par saponification en présence de la souje aux acide?
carboxyliques correspondants 17.
,....,
Le schéma la montre le mécanisme réactionnel ~is en jeu. Dans un
p:'emier temps l'attaque nucléophile de la fonction amine se porte de préfé~
~:lce sur le carbone en B, fortement insaturé du fai t du déplacement des
c~arges électroniques: on obtient ainsi par élimination d'une molécule
è'~thanol) l'entité 37 qui perd rapidement un proton H pour donner le
,.....
c~~~tonate IS. Après réarrangement des différentes liaisons et perte d'une
" - J
~:~velle molécule d'éthanol, sous l'action de la chaleur, ce dernier conduit,
~~~S un deu>:ième temps) au produit de cyclisation 16. Il est a remarquer
,...,.,
ç~~ le COffi?~sé 16 peut exister également sous sa forme tautomère 38, mais
~
\\
~
~'_"":::z::'e le Go_-:-.tre le test du perchlorure de fer, seule la forme lé, semble
~3~ster, C~ qui d'ailleurs est confirmé par les mesures physico-chimiques,
::.:..:-::-==mment e-.-: RMN et I.R.
Le~ aciàes hydroxy-4 dipyrido fi ,2-a: 3'2 ' -dl imidazole carboxyliques-3
-
-
-- s~~t lE~~~ssauts à plus d'un titre: il n'esT pas impossible, par exemple,
~~ de tel5 produits ou leurs dérivés se forment au cours de la pyTolysede
~-~=ide glc-::-2.~mique; ~e qui justifie des recherches sur les propriétés phy-
~-chimiç~es (en tant que produits de référence pour une analyse poussée
\\
.::.==: produi-::oc de pyrolysat de l'acide glutamique) et biologiques. Comme nous
~~ y aLt~-\\~ions, ces composés se sont révélés sans effet mutagène dans
--
~st d'~s. Ceci est d'importance, car leur structure laisse présager
--iDes ~~priétés pharmacologiques potentielles qui pourraient être éven-
-, = - -, emen~ ~'r'loi té es . Ces composés ont été retenus, notamrne;,t p2.r le
.~ ~ onal \\' - ,c:er Ins"ti tute" de Bethesda par un screening anticancéreux. On
~~~ për ='=Bple, que les dérivés de
l'hydroxy-4 quinoléine carboxylique-3
..s:::::==
capat - =~ d'inhiber de façon sélective l' act ivi té de certaines enzymes
' h - , -
la l=
_ate deshydrogénase) la maléate deshydrogénase et autres dont
-= ~Ve2.L ~~ particulièrement élevé dans les membranes néoplasiques des
::::::::::":"--Ses àE =:ertaines tumeurs solides (37).

---

&4
Il nous faut, ici, ouvrir une parenthèse à propos des crotonetes
interrn~dieires 15. Ces compos~s comportent une chaine amino-rn~thyl~ne
malonate
-
d'€thyle
qui pose des probl~mes sur le plan structural,que nous
avons tâché de r€soudre
par RMN.
H
\\
Ar - NH 'ï C =
1
a
b
La molécule s'organise autour d'une double liaison éthylénique avec
des carbones sP2 porteurs en 1 de deux groupements carboxyéthyles et en 2'
d'une fonction amine secondaire reliée elle-même au noyau dipyrido-imidazole.
Il en résulte que la configuration de la molécule et ses propriétés physico-
chimiques seront étroitement dépendantes de la conjugaison des effets élec-
troniques le long de la chaine.
Les spectres de RMN des différents crotonates 15 montrent dans tous
,....,
les cas des faits intéressants.
* En premier lieu, le signal du proton NH apparait sous forme de doublet
vers les champs faibles aux environs de 11,5 ppm, laissant penser qu'il
s'agit d'un H lié, ce qui est bien le cas, comme nous le verrons plus
loin, le doublet disparaissant pour faire place à un singulet élargi
en présence d'eau lourde.
* Le proton méthinique en a du NH apparait également fort déblindé et
résone sous forme de doublet centré vers 8,05 ppm, dont le couplage est
le même que celui du NH (J ~ 12 cps).
Ce fort déplacement vers les champs faibles est courant chez les
protons oléfiniquesdont le carbone porteur est relié à un azote (48).
Du reste le déplacement chimique du CH méthinique
peut être cal~
culé avec une bonne approximation en utilisant la relation empirique de
Matter et al. (49).

---

07·
NiRaney
21
KOH
•
+
Ç:J)
N"
R1
R I ·
:::--.
~
N
40
CI
..--
24 R2=H
---
1
26 R2=COMe
.....--
a, R = H
; R1 = H
b, R =6 - Me ; R =
1
H
C , R =7 - Me; R1 =H
d, R = 9 - Me i R1 = H
e , R = H
R1 = CH3
r,R = 6 -Me i R1 =CH,)
9 R =7 - Me ; R1 =CH,)
1
h,R=9-Me i R1=CH3
Schéma 5

---

6B
IJ Y a d'abord E'stérification du groupement hydroxyle avec formation
d'un intermédiaire dichlorophosphorique et libération d'acide chlorhydrique,
dans une deuxième étape, l'ion chlorure provenant de l'ionisation du Hel
attaque le carbone porteur de la fonction ester, cette réaction nucl~ophne
~tant suivie,d'un réarrangement électronique et libération d'acide dichlo-
rophosphoreux.
L'action du POC1 , dans les mêmes conditions, sur les hydroxyesters
3
16 nous a conduits aux dérivés chlorés correspondants 42.
Les dérivés chlorés du type 21 constituent des intermédiaires de
,....,
synthèse intéressants, un de nos objectifs étant leur utilisation pour
accéder aux dérivés aminés en position 4 corr~spondant par aminolyse.
Malheureusement, tout comme dans le cas du bromo-3 imidazo [1,2-aJ pyridine,
,
signalé dans la première partie, l'action directe de l'ammoniac gazeux sur
ces composés s'est révélée inopérante. Nous sommes parvenus à nos fins en
utilisant une autre méthode.
91 Préparation des amino-4 dipyrido-imidazoLes 24 (schéma 5)
,-.....
Le schéma 5 montre le processus réactionnel mis en jeu. L'action de
l'hydraté d'hydrazine au reflux sur les dérivés chlorés 21 conduit,avec de'
bons rendements, aux hydrazines22. Ces derniers ont été --
oxydés en azides 23
--
~
~ action de nitrite de sodium dans de l'acide acétique dilué à DOC. Cette
rېction
de nitrosation puis de réarrangement e~ azide se fait avec un meil-
le~ rendement que par un déplacement nucléophile de l'atome de chlore à
~tir des composés chlorés 21 au moyen de l'azoture de sodium NaN;. La
" -
,
~
S~Jcture de ces acides a été vérifiée par l'examen de leur spectre d'absorp~
"t::'::,::} dans l'infra-rouge, Gui révèlent une forte bande de vibrations asymé-
-1
~~ques vers 2150 - 2155 Cm
, caractéristique des groupements azides (38).
EO~e a été confirmée par la RMN.
La réduction des azides en amines primaires se fait généralement
pa= action de tétrahydroalurninate de lithium (LiAIH 4 ) (39) en présence de

---

b9
\\
nickel, de platine ou de charbon palladi~ (40) ou encore par l'action du
chlorure de vanadium Il (41).
Ces différentes méthodes sont coûteuses et comportent quelques
inconvénients, en particulier le clivage possible de certains hétérocycles
fragiles. Une autre méthode plus douce due à Stanovnik et al. (42) met en
oeuvre une réaction de transfert d'un diazoïque en groupement amine par
action de l'hydrogène sulfuré H S. Cette méthode appliquée à nos azides~,
2
avec une légère modification, nous a conduit avec de bons rendements aux
1
amines 24 désirées. Ces produits ont étÉ recristallisés dans le benzène et
,...,
nous n'avons pas observÉ de contamination par le soufre.
Les amines 24 comme leurs analogues 12 ont été transformés en/acé-
~
~
tamides correspondants 26 et 13 par action de l'anhydride acétique à chaud.
,...,
,...,
10/ Préparation de L'hétérocycLe non substitué 25 (schéma 5)
1"'-'
a) Réaction de Skraup
La méthode la plus directe pour accéder à l'hétérocycle non porteur
d'un substituant sur le cycle A (formule 25) consiste sans doute à faire
,.....,
agir le glycérol sur le précurseur 1 en présence d'acide sulfurique concen-
tré et d'iode selon la réaction de -
Skraup (43). Il s'agit, en fait, d'une
réaction assez complexe. Il y aurait, dans un premier temps, formation
d'acroléine à partir du glycérol sous l'action de l'acide sulfurique,
puis condensation de cet aldéhyde sur la fonction amine, selon la réaction
de MichaËl (addition nucléophile catalysée par l'acide sulfurique) pour
donner du B-arylaminopropionaldéhyde qui peut exister également sous là
forme énolique a (schéma 12). Cet intermédiaire subit ensuite à chaud une
cyclodeshydratation acidocatalysée qui le transforme en dihydroquinoléine
qui est à son tour oxydée, par l'iode, en quinoléine. D'autres oxydants
peuvent être utilisés: la nitrobenzène, l'acide ~-nitrosulfurique,
l'anhydride arsénique (43).
Le schéma 12 montre le processus simplifié de la réaction.

---

70
)
c(t)
H<t)H
~
H
NH
CH
' - . . . '1/
CH2
i)
N
r·· 2 (tH •
• r~
'0·
. .
..
H
:H~
N
N
0 -H2 0 -:ff20
ca
<'1
-
r)
0
Schéma 12
Cette réaction appliquée aux amino-3-imidazole-pyridines 1 s'est
.....,
révélée peu commode, et ne nous a fourni le dipyrido-imidazole cherché
qu'avec de très faibles rendements, ne dépassant pas 5 %. Des résines qui
se forment (et cette réaction de résinification est violente), nous avons
pu isoler de l'amino-2 p)Tidine dans la proportion de 5Z % environ par
rapport à l'amine de départ 1. Nous pensons donc, que dans les conditions
.....,
de la réaction utilisées, l'acide sulfurique réagit préférentiellement
avec l'amine en provoquant une dégradation de celle-ci suivie d'une poly-
mérisation des fragments formés. L'existence de l'amine sous fome d'un
équilibre tautomère
forme ouverte~forme cyclique, dont nous avons
parlé dans la première partie, conforte cette hypothèse. On notera qu'on
avait déjà obtenu un résultat identique er. essayant de cycliser l'anile
par l'acide sulfurique dans la réaction de Beyer - Combes.
La structure de l'amino-2 pyridine obtenue a été vérifiée par
RMN et IR. Celle de l'hétérocycle 25 a été déterminée par RMN et spectro-
,.....,
métrie de masse.

---

71
b) Réduction
deshalogénante des dérivés chlorés 21
-
Les chloroquinoléines subissent généralement assez facilement
l'hydrogénolyse basique en présence de Ni Raney (44, 45) pour fournir
les quinoléines correspondantes avec
perte de l'atome de chlore.
Cette réaction appliquée aux dérivés chlorés 21 nous a conduit,
,....,
à notre grande surprise, à un mélange de deux produits, le premier
deshalogéné mais totalement hydrogéné sur le cycle B 39 et son analogue
" -
chloré en 40,comme en attestent l'analyse centésimale, la RMN et la spec-
trométrie de masse. Nous avons pu séparer ces produits par CCM.
N
R1
-0:
~ N
'-"::
KOH
R
1
~
~
""
N; Roney
21
CI
. - J
Schéma 13
Le spectre de RMN du composé 39 montre, en effet, dans la région
""'
aliphatique, trois séries de signaux respectivement à 2,15 , 3,10 et 4,15
ppm d'intensité 4,2,2 que nous avons pu attribuer aisément aux méthylènes
\\
en C7 et C8 pour la première, en C6 pour la deuxième et Cg pour la der-
nière par comparaison avec les spectres des produits deshydrogénés; les
différents signaux des protons H2 (0 = 8,25 ppm), H3 (6 ~ 7,1 ppm) et
H4 (6 = 7,85 ppm) étant, par ailleurs, parfaitement identifiables par
comparaison avec le spectre de produit 25 (R = RI = H) obtenu selon une
,.....
méthode que nous décrivons plus loin et notamment par leurs constantes
de couplage. Le spectre de masse de 39 nous a fourni un pic de masse
,..."
(M+ ~ 173) correspondant bien à la masse moléculaire du produit tétra-
hydrogéné. Celui du 40 donne une masse M+ =
(207 et 209) qui montre bien
l'existence d'un atome de Cl dans la molécule.

---

Dans les menu,';; COJidj,ljollG, JE' camp0S{ m~thyJ6 2] (R
: Me) nous
_
J
,
s fourni le composÉ' tétT'ùhydrof,l-IIl- 39
,...., (R} :: Me) et Bon déri vf chl oré ~.
Cette hydrogénaI i on est, 'de prime abord, surprenante, et la lit té-
rature n'en signale pas d'autre cas, à notre connaissance. Il est ~ cons-
tater que cette r€action
d'hydrog&nol~se deshalog~nante s'effectue sans
doute par l'apport extérieur d'hydrogène, à la différence des réactions
de réduction utilisant le Ni Raney qui impliquent l'apport d'H
gazeux
2
ou encore la formation in situ d'H
à l'aide d'un précurseur comme l'hydra-
2
te d'hydrazine par exemple (47). Dans le cas de la deshalogénation, les
petites quantités d'hydrogène nécessaires sont, en principe, apportées
par le Ni Raney*.Il est aussi possible que dans les conditions de la
réaction, le Ni Raney réagisse avec l!hydroxyde de potassium provoquant la
libération d'hydrogène et formation d'aluminate de potassium ainsi que
Ni libre (réf. : cf. L.r. rieser and M. rieser in "Reagents for organic
synthesis", Ed. John Wiley and Sons, New-York (1967), P. 719).
Cela peut expliquer que l'hydrogénolyse ne s'arrête pas au simple rempla-
cement de l'atome de chlore, mais affecte également le noyau. Cela nous
.. /
parait d'autant plus vraisemblable que Buu-Hai et al. (47) ont montre que
la réaction d'hydrogénolyse deshalogénante était d'autant plus efficace et
rapide que le composé à 'réduire était polaire ; ce qui est le cas du hoyau
dip)Tido-imidazole.
c) Action du sulfate de cuivre sur les hydrazines 22
Finalement, nous avons pu accéder à l'hétérocycle 25 avec un bon
~
rendement (z 60 %) en chauffant tout simplement à l'ébullition pendant 'une
heure une solution de l'hydrazine 22 avec une solution de sulfate de cui-
~
vre. Cette réaction fort commode d'élimination d'un groupement hydrazinique
fait intervenir un processus d'oxydo-réduction selon le schéma ci-dessous
/'
CUS0
+ Ar
- NH - NH
----~) Ar H + Cu + N 2 +2~+ SO~-
4
2
~
Cependant, elle n'a pas connu jusqu'ici de développement.
* cf. par exemple G.R. Pettit in Organic Reactions. Ed. R. Adams, John
Wiley and Sons, New-York (1962), vol. 12, p. 356.

---

TABLEAU 3
Fusion
Rendement
Calculé (en 't,)
Trouvé (en %)
Désignation
Formule brute
(en OC)
(en %)
C
H
N
C
H
ri
9 a
C
H
N
18505 - 186°5
35
65,20
4,38
30,42
65,18
4,30
30,60
10
8
4
9 b
Cu H
N
218 - 220
27
66,66
5,08
28,26-
66,40
5,02
'28,41
10
4
9 c
Cu H
N
201 - 202
30
66,66
5,08
28,26
66,57
5,06
28,30
10
4
~
10 a
Cu H
N
150 - 151
48
72,U
4,95
22,93
72 ,13
5,00
22,75
9
3
-
...,J
10 b
C
HU N
90 - 90°5
35
73,08
5,62
21 ,30
73,U
5,60
21,18
w
12
3
10 c
C
151°5
40
73,08
5,62
21,30
73,06
5,61
21,40
12 HU N3
10 d
C
HU N
150
38
73,08
5,62
21 ,30
73,07
5,61
21,32
12
3
11 a
Cu H8 N4 02
250
48
57,89
3,51
24,56
58,01
3,50
2 u ,60
,
U b
C12 H10 N 02
276
32
59,55
4,13
23,14
59,63
4,16
23,20
4
U
c
C12 H
N
02
240
45
59,55
4,13
23,14
59,60
4,10
23,20
10
4
12 a
Cu H
233
50
66,66
5,08
28,26
66,70
5,20
28,10
10 N4
12 b
C12 H,J.2 N1+
21.~5
80
67,99
5,70
26,40
67,87
5,72
26,40

---

TABLEAU 3 (suite)
Fusion
Rendement
Calculé (en 't)
Trouvé (en tJ
Désignation
Formule brute
(en OC)
(en %)
C
H
N
C
H
N
12 c
C
H
N
198
60
67,90
5,70
26,40
67,90
5,72
26,39
12
12
4
13 a
C
H
N
0
235
80
65,27
4,60
,
23 ,1.~3
65,31
ll.,58
23,15
13
ll
4
13 b
C
H
N 0
240
60
66,40
5,14
22 ,13
66,10
5,13
22,10
14
13
4
,
13 c
C
H
Nl.( 0
235
85
66 ,1.~0
5,1 11
22,13
56,35
5,12
22 ,09
14
13
14 a
C
H
N
0
101
70
66,56
6,00
19,1l.1
.66,50
5,89
19,43
12
l3
3
-J:
14 b
C
H
N
a
96
45
68,04
6,54
18,32
68,00
6,50
18,35
13
15
3
14 c
C
H
N
0
115
65
68 ,Ol~
6,54
18,32
58,02
6,51
18,30
13
15
3
14 d
C
H
N
0
112
30
68,04
5,54
18,32
68,05
6,56
18,29
l3
15
3
15 a
C
H
N
0
142
90
59,35
5,64
13,85
59,60
5,70
13 ,80
15
17
3
4
,
15 b
C
H
N
0
132
65
60,55
6,04
13,24
60,50
6,00
13 ,50
16
19
3
4
15 c
C
H
N
0
148
89
60,55
6,04
13,24
60,60
6,00
13 ,20
16
19
3
4
..
-
15 ct
C
H
N
0
149
58
60,55
6,04
13,24
60,40
6,10
13 ,10
16
19
3
4
.J

---

TABLEAU 3 (suite)
-
Fusion
Rendement
CalcuÜ (en 't)
Trouvé (e'n 't,)
Désignation
Formule brute
-
(en OC)
(en 't)
H
H
C
H
N
C
16 a
228
59
60,70
4,31
16,33
60,49
4,36
16,50
16 b
172
l~6
61,98
4,83
15,48
61,90
4,90
15,40
16 c
215
76
61,98
4,83
15,48
61,83
5,10
15,45
17 a
> 350
89
57,65
3,08
18,33
57,70
3
18,10
17b
> 350
85
59,26
3,73
17,28
59,30
3,75
17 ,20
-.J
(J1
17 c
> 350
90
59,21
3,73
17,28
59,24
3,80
' 17,10
18 a
282°5
95
6[1,82
3,81
22,69
64,70
3,90
22 ,80
18 b
284°5
97
63,32
4,55
21,09
63,10
4,70
21
18 c
286°5
93
63,32
4,55
21 ,Og
63,20
4,50
21
19 a
115
76
58,40
5,30
16,99
58,20
5,21
16,87
19 b
115
64
59,70
5,74
16,08
59,73
5,73
16,07
-
19 c
112
76
5 g, 70
5,74
16,08
.59,71
5,74
16
,
lÇl <1
111 "17 "3 'J2
J G?
311
~; q .70
S,7i1
J G, on
~~, (1 • r. ''1
5,70
H,.10
" ,

---

" - - -
-----
funjon
Rendement
crJJ.culé (en %)
Trouvé (en 't)
nh 19nfl 11IlIl 1 l''lmnulo Drute
1
(en OC)
(en %)
C
H
N
C
H
H
20 a
CH Hg N
0
1
299
98
63,32
4,55
21,09
63,10
u,70
21
3
20 b
C
H
N
0
2'+5
80
67,76
5,20
19,70
67,60
5,10
19,80
12
9
3
20 c
C
H
N
0
302°5
91
57,76
5,20
19,70
67,70
5,20
19,70
12
9
3
20 d
C
H
N
0
1
306
70
57,76
5,20
19,70
67,70
5,30
19,50
12
9
3
21 a
C
H
N
Cl
1
176°5
87
58,98
2,97
20,63
58,80
2,90
20,50
10
6
3
2lb
Cu H
N
Cl
1
169
75
60,70
3,70
19,31
60,60
3,70'
19,10
-.J
8
3
0'
21 c
C
Ha N
Cl
1
186
88
60,70
3,70
19,31
60,60
3,70
19,30
11
3
21e
C
H
N
Cl
1
141
90
60,70
3,70
19,31
60,50
3,BO
19,30
11
8
3
21 f
C
H
N
Cl
1
159
74
62,21
4,35
18, III
62
4,50
" 18
12
10
3
21 g
C
H
N
Cl
1
207
76
62,21
4,35
18,14
62,10
4,30
18,70
12
10
3
21 h
C
H
N
Cl
1
76
62,21
4,35
18,14
62,25
4,uO
18,10
12
199°5
IO
3
\\
22 a
CIO H
1
212
76
60,29
4,55
35,14
60,10
4,70
35,10
9 N5
-
22 b
C
H
N
1
192
68
61,66
5,6 l1
32,6°
61,50
5,70
~2,60
1
J.J.
11.
5
, -

---

TABLEAU 3 (suite)
,
Fusion
Rendement
Calculé (en 't;)
Trouvé (en \\)
Désignation
Formule brute
(en OC)
(en %)
0
C
H
N
C
H
N
22 c
C
H
N
249
7S
61,65
S,54
32,59
51,70
5,55
32,70
11
11
S
22 e
C
H
N
23S
82
51,55
S,54
32,59
51,70
5,70
32,65
11
11
S
,
22 f
C
HU N
53,42
S,75
30,82
-
-
-
12
S
22 g
C
HU N
239
80
63,42
5,75
30,82
63,50
5,70
30.70
12
S
1
23 a
C
H
N
155
95
57,71
2,88
39,98
57,50
2;80
40,10
10
5
5
-
23 b
C
H
N
58,92
3,50
37,48
-
-
-
-J
11
8
5
-J
23 c
C
H
N
154
89
58,92
3,50
37,48
58,95
3,52
3 7 ,50
11
8
5
23 e
C
H
N
151
99
58,92
3,50
37,48
58,90
3,61
37,45
11
8
6
23 f
C
H
N
60,50
4,23
35,27
-
-
-
12
10
5
23 g
C
152
90
50,50
4,23
35,27
50,50
4,22
35,26
12 HIa N5
24 a
C
H
N
206
75
55,20
4,38
30,42
65,18
4,37
30,43
10
8
4
-
1
24 b
C
203
85
56,56
5,08
28,26
66,60
5,06
28,25
11 HIa N4
-
\\
24 c
C
H
N
203
82
65,66
5,08
28,26
66,57
5,08
28,27
11
10
4
-
, ,

---

TABLEAU 3 (suite)
fusion
l~e'1c1ement
Calculé (en %)
Trouvé (en 'fi)
Désignation
Formul.e brute
(en OC)
(en %)
C
H
N
C
H
N
2'~ e
Cu H10 Nil
207
77
66,66
5,08
28,25 _
66,59
5,10
28,30
24 f
C
H
N
67,90
5,70
26,40
12
12
4
24 g
C
H
N
213
84
67,90
5,70
26,40
57,95
5,72
26,40
12
12
4
25 a
CIO H
129
61
70,99
4,17
28,8 4
70,98
4,17
28,90
7 N3
25 b
Cu H
U7
77
72,11
4,95
22,93
71,99
4,98
22,92
9 N3
-.J
CD
25 c
Cu Hg N
148
84
72, U
4,95
22,93
72 ,06
4,96
22 ,91
3
25 e
Cu Hg N
141+
70
72,11
4,95
22,C13
72,15
4,95
22 ,88
3
25 g
C
HU N
14 11
55
73,08
5,62
21,30
73,07
5,60
21,32
12
3
26 a
C
H
N
a
215
70
-
-
-
-
-
-
12
9
4
25 b
C
HU N
13
4 0
-
-
-
-
-
-
26 c
C
HU N
13
4 0
218
72
-
-
-
-
-
-
26 e
C
HU N
0
226
75
-
-
-
-
-
-
13
4

---

Fusion
Rendement
Calculé (en %)
Trouvé (en 't,)
Désignation
Formule brute
(en OC)
(en %)
C
H
N
C
H
N
26 f
C
H.l
N
a
195
65
6ft ,I~O
5,13
22,13
66,17
5,19
,21,98
14
3
4
39 a
CIO H
123
-
69,36
6,36
24,27
69,~0
6,30
2~ ,15
ll N3
39 f
CH H
-
-
-
-
-
-
-
-
15 N3
40 e
Cn H
N
Cl
137
25
59,06
6,26
18,79
59,10
6,25
18,56
14
3
41 a
Cn Hg N a
98
78
60,80
4,52
21, la
60,76
4,54
20,89
3
-.J
<CI
\\
,
,
\\
-
·Jn~"I)(i w:..... ·_ ,~

---

80
PARTIE EXPERIMENTALE
Le tableau 3 donne les caractéristiques physiques des différents
produits préparés selon les techniques
d~crites ci-dessous .
• Synthèse des composés
On met dans un tricol 12 g d'amino-3 imidazo[1,2-aJpyridine, 100 ml
de CH Cl
anhydre et 19,35 de ch1oroacrymnitri1e. On y ajoute par petites
2
2
portions le chlorure d'aluminium. Puis on chauffe le mélange dans un bain
d'huile à 1000C pendant 48 heures. Après refroidissement, on chasse le
solvant sous vide,
ajoute de l'eau dans le résidu obtenu, fait une
première extraction au benzène,
basifie la phase acqueuse avec de la
soude 20 %• puis
une deuxième extraction à l'acétate d'éthyle ; on
évapore ensuite le solvant organique sous vide et chromatographie le résidu
sur une colonne d'alumine neutre en utilisant le mélange chlorure de méthy-
lène-hexane comme éluant. On obtient ainsi des microcristaux qui recristal-
lisent du benzène.
Re~dement : 2,5 g.
Fa = 184 - 185°C.
~(CHC13/acétone : 90/10) = 0,20
~. (acétate d'éthyle)
0,15
* Synthèse des composés 10
'"
Dans un Tricol muni d'un refrigérant, d'une ampoule à brome et d'un
thermomètre, on met 0,0625 mole d'amino-3 imidazo [1,2-aJ pyridine, 0,1
mole de chlorure de fer (FeCI , 6 H 0), 0,007 mole de chlorure de zinc et
3
2
50 ml d'éthanol. Le mélange eST chauffé dans un bain d'huile. Quand la
température atteint 65 0C, on ajoute goutte à goutte 0,05 mole de méthylvinyl
cétone. ~ température intérieure ne doit pas dépasser 70 0C. On porte
ensuite le mélange réactionnel au reflux pendant 12 heures. Après refroi-
dissement, on réduit la quantité de solvant sous vide au rotovapor puis
on basifie le résidu avec la soude à 25 %. On chasse ensuite à sec,

---

81
, \\.
recu~ille le rfsidu et on fait une extraction au soxhlet a~ec de l'hexane.
Lf· produit recristallise dE') 'hexane sous forme de microcristaux de couleur
jaune .
• Nitration des composés 10 ~ 11
~
,-v
Dans un erlen de 100 cc, on dissout:> g de composés 10 dans 20 cc
"'"
d'acide acétique, puis on ajoute 20 cc d'acide nitrique fumant, et on chauffe
le mélange réactionnel à 100-110°C pendant 2 heures. Après refroidissement,
on verse le mélange dans de la glace et neutralise avec la soude jusqü'à
pH 4-5 ~ il se forme un précipité jaune qui recristallise dans l'éthanol
ou dans l'acide acécique.
* Préparation des composés 12
,......
On porte au reflux pendant 90 mn un mélange de 0,013 mole du produit
nitré li Gans
120 cc d'éthanol,
100 mg
de Ni Raney et 0,039 mole
r-J
d'hydrate d'hydrazine. On filtre à chaud le Ni Raney et évapore le solvant
l'amine ainsi obtenue recristallise du benzène.
* Préparation des composés 13 et 26
'"V
roJ
On porte au reflux pendant une heure dans 20 cc d'anhydride acétique,
1 g d'amine 12 ou 24 ; on refroidit, verse dans la glace et on neutralise
...-.J
,........
avec de la soude. On extrait par la suite l'acétamide formé par du chloro-
forme. Après avoir séché sur CaC1
et chassé le solvant, on obtient un
2
résidu qui recristallise du benzène en donnant des cristaux incolores.
* Condensation des amines 1 avec l'acétylacétone 14
cv
r..-
On chauffe dans un bain d'huile à llüOC un mélange équimoJ é -
culaire d'amino-3 imidazo [1,2-aJ pyridine et d'acétylacétone pendant 3
heures., Après refroidissement, on obtient un mélange visqueux que l'on

---

82'
recristallise avec du cycJohexane pour donner des m~crDcristaux jaunes.
* Preparation des crotonates 19 seLon La reaction de Comrad-Limpach
~
. Méthode a
On porte au reflux pendant 24 heures une solution d'éthanol contenant
35 g de Drierite (Ca 50
anhydre). 5 g de amino-imidazo [1,2-aJ pyridine.
2
4
4.88 g d'acétyl-acétate
d'éthyle; après refroidissement. on filtre le,
solide. chasse le solvant et reprend avec de l'hexane ~ chaud le résidu. ce"
qui donne de jolies aiguilles incolores fondant à 115°C.
Rendement : 65 %.
. Méthode b
Dans un dessicateur contenant du H 50
concentré. on place un bé~h~r
2
4
contenant 100 g d'amine, 98 g d'acéTylacéTate d'éthyle et quelques gouttes
d'Hel. Après une semaine,on extrait au s0xhleè avec de l'hexane le résidu
formé.
On obtient ainsi 140 g de produi t fondënt à 115°C.
Rendement : 76 %.
* Cyclisation des crotonates 19 ~ 20
,...,
~
Dans 300 ml de dowtherrn A ou de diphényl éther
bouillant, on ajoute
100 g de crotonate et chauffe pendant une demi-heure; en refroidissant,
on obtient un précipité, qu'on essore, lave abondamment avec de l'éther.
Après avoir bien séché, on obtient alnSl 80 g de dérivé 20, soit avec
rv
un rendement de 98 %.
* Préparation des dérivés 15
-
On porte au reflux pendant une demi-heure 15 g d'amine et 30 g
,
d'éthoxyrnéthylène
malonate d'éthyle; on refroidit, ajoute de l'éthanol,

---

83
\\
porte au reflux. filtre à chaud t on obtient ainsi arrvs refroidissement
30.IJ g des micro-cristaux sous forme df! pT'i!;mC'~. incoJC'T'C'S.
Soit un rendement de 90 %.
* La cyclisation du crotonate 1S ~ 16
,....
.....,
Elle se fait de la meme manière que pour les composés 20 .
.......,
* Saponification des composés 16 ~ 17
""
,..,
On porte au reflux 15 g des composés 16 dans 11JO cc d'éthanol + 100
,
~
cc de NaOH à 30 % pendant 12 heures. Après avoir refroidi, on neutralise
avec du Hel jusqu'à pH 4-5 ; le précipité obtenu est essoré, lavé abondam-
ment avec de l'eau puis à l'éther et recristallisé de l'acide acétique
aqueux. On ob~ient des paillettes incolores avec un rendement de 82 %.
* Decarboxylation des composés 17 ~ 18
~
'"
Dans un sublimateur muni d'un réfrigérant, on chauffe sous vi~e d~
12 mn de mercure 3 g d'acide; on obtient ainsi 2,3 g de produiT décar-
boxvlé.
* Obtention des dérivés chlorés 21
,.....J
A partir de 2,5 g d'hydroxy-4 dipyrido [1,2-a:3' ,2'-dJ imiàazole
et 50 g de POC1
fraichement distillé, on fait un reflux de 4 heures ..
3
Après avoir refroidi, on verse par petites quantités dans de la glace le
mélange réactionnel. On neutralise avec l'ammoniaque à 7 % jusqu'à pH 7,
on essore le précipité et recristallise dans du cyclohexane ; on obtien~
2,4 g d'aiguilles blanches. Du filtrat on fait 2 extractions avec 100 cc
de chloroforme ; après
séchage
sur CaC1
0n chasse le solvant et obtient
2
un résidu qui recristallise dans le cyclohexane en donnant 0,2 g du même
pràduit, ce qui fait un rendement global de 95 % environ.

---

, 84
* Synthèse des hydrezino-4 dipyrido [1,2-a:3',2'-d] 1midazole 22
~
On porte au"reflux jusqu'~ dissolution compl~te 5 g de d~riv€
chlor~ plus 25 ml d'hydrate d'hydrazine; on chauffe encore trente
minutes; on laisse refroidir puis on ajoute 90 cc d'eau. essore le
pr~cipité formé, lave avec du benz~ne chaud et, après avoir séch~, on
recristallise dans l'eau; on obtient ainsi 3,7 g de microcristaux
incolores, soit un rendement de 76 %.
* Synthèse de l'azido-4 dipyrido [1,2-a:3',2'-d] imidazole 23
\\
~
On refroidit à oDe une solution contenant 5 ml d'AcOH, 50 ml
d'H a et 4 g d'hydrazine 22 et on ajoute par petites portions une solu-
2
~
Lion de 2,3 g de nitrite de soài~~ dans 5 ml d'eau
on laisse reposer
5 minutes, on essore le soliàe et le recristallise de l'éthanol sous
forme de microcristaux beiges.
Rendement : 88 %.
* Passage à l'amine 24
~
, Dans un ballon tricol contenant 3,7 g d'azide dans 50 cc d'éthanol
bouillant, on fait passer un courant de H S pendant 40 minutes. On refroi-
2
dit et essore le précipité, chasse le solvant et recristallise le résidu
de benzène. On obtient ainsi 2,55 g de poudre jaune fondant à 206°C, soit
un rendement de 75 %.

---

85
* Action de Ni Roen milieu potassique sur les dérivés 21
Dans un
erlen, on ajoute une solution de L' g de KOH dans L'O cc
d'éthanol, 2 g de dérivé chloré et 2 g Ni Rafle)'
et on laisse agi ter pendaj;~
2 heures à température ambiante.
On filtrE' le Ni Raney, chasse lE' sol-
vant,
ajoute 30 cc d'H 0, extrait par CH C1
2
2
2, lave la phase organique
avec 2 fois 30 cc d'H 0 et chasse le solvant. Le résidu est repris
2
à chaud dans de l'hexane : on obtient ainsi des microcristaux fondant
à I2S - 127 0 C.
L'étude en C.C.M. montre
deux taches. On sépare l~ mélai,ge
sur colonne d'alumine en utilisant comme éluant l'acétate d'éthyle
on
obtient ainsi deux produits
- le premier, liquide, avec un~ = 0,32 ; éluant : acétate d'éthyle;,
le deuxième, recristallisant dans de l'hexane, fondant à 137°S C
Rf =
0,52 ; éluant : acétate d'éthyle.
Ce deuxième produit correspond au dérivé 40e, tandis qu~ le premier
"'-J
correspond au dérivé 3ge.
~
Les structures de ces deux produits ont été identifiées grace à la
RMN et à la spectrométrie de masse.
- 3ge
,...."
spectre de masse
m = lS7 M+
m = 1SS M+ - HCN
e
e
RMN 1H : ô (ppm)
: 7,2 (d, 1J1, H3 , J -
= 9 cps) ; 7,86 (d, IH, H ,
3 4
4
J -
= 9 cps) ; 2,15 (m, 4H. H et H
) ;
3 4
7
s ) ; 3,10 (m, 2H, H6
4,15 (m, 2H, H ) ; 2,6 (S, 3H, CH ).
9
3
- 40e
rv
spectre de masse
~ = 222 M+ . ~ = 193 M+ - HCN
e
'
e
RMN 1H : 6 (ppm) : 7,3 (S, 1H, H ) ; 2,15 (m, 4H, H et H )
3
7
S
3,10 (m, 2H, H ) ; 4,15 (m, 2H, Hg) ; 2,55 (S, 3H, CH ).
6
3
T
,

---

.86
* Slntnèse de L'hétérocycle
Nous avons utilisé deux' méthodes
Méthode a
L'utilisation de cette méthode consiste en l'élimination du groupement
NH-NH
par du CUS0 ,
2
4
On dissout 1 'hydrazine (10 g) dans 12 g d'ACOH + 108 cc d ' H 0. A
2
cette solution on ajoute 240 ml d'une solution à 10 % de CaS0 , 5 H 0 et
4
2
on chauffe à l'ébullition pendant une heure. La solution refroidie est
neutralisée par NaOH ; on recueille le précipité et le traite à chaud par
du CHC1
; on chass; le solvant et obtient ainsi un résidu qui recristallise
3
dans de l'hexane en donnant 5,4 g de microcristaux jaunes, soit un rendement
de 51 %, Le filtrat alcalin
est
extrait avec 2 fois 250 cc de CHC1
;
3
après avoir séché et chassé le solvant, on obtient, après recristallisation.
du résidu par l 'hexane 1,5 g, ce qui nous donne un rendement global de
l'ordre de 78 %.
r = 129 - 130.
Méthode b
PrÉparation de l'hétérocycle par la méthode de Skraup.
On dissout dans 50 cc d' H S0
refroidi à OOC 13,3 g d'amine·J.:, et on '
2
4
y ajoute 0,49 g de 1
et 4,9 g de glycérol, puis on chauffe au bain d'huile
2
pendant 3 heures à 170°C. Après refroidissement, on verse le mélange réac-
tionnel dans la glace, neutralise
avec du NH 0H jusqu'à pH très basique,
4
essore ,le précipité obtenu et le traite par CH C1
ainsi que la phase liquide.
2
2
Après avoir chassé le solvant, on obtient 5 g de résidu que lIon distille'
sous vide. On recueille deux fractions:
- Eb
= 67°C
4,5 g d'amino pyridine identifié par ses caractéristiques
12 mm
physico-chimiques
- Eb
= 170°C
0,5 g d'hétérocycle qui recristallise de l'hexane en
12 mm
donnant 0,45 g.
r = 129 - 130.
On notera qu'on n'observe aucune dépression du point de fusion du
mélange de ce produit avec ceiui préparé par la méthode à l'hydrazine.

---

87.
* Synth~se des composés 4'
"'V
On porte au reflux pendant deux heures, 1,5 g de dérivé chloré
21a dans une solution de méthanolate de sodium préparée à partir de
,....,
0,23 g de sodium dans 25 cc de méthanol. Après refroidissemen~, on éva-
pore le solvant et recristallise le résidu dans l'hexane. On obtient
ainsi 1,1 g de microcristaux incolores. fondant à 98° C.
Soit un rendement =
79 %.

---

88
, '
CHAPITRE III
ETUDE PHYSICO-CHIMIQUE DES DERIVES
DU DIPYRIDO[1,2-a:3' ,2'-d]IMIDAZOLE
\\
3.1. GENERALITES
Cette étude nous a permis d'identifier l'ensemble des produits
,
\\
synthétisés.
Il existe dans la littérature, des données concernant un
nombre suffisant d'analogues structuraux des précurseurs possibles déjà
analysés en Résonance Magnétique Nucléaire. Ceci nous a permis d'identifier-
les différents protons des intermédiaires de synthèse et, par la suite, des
différents dipyrido [1 ,2-a: 3' ,2'-dJ imidazoles.
L'Infra-Rouge, sans permettre une détermination de structure aussi
,
rigoureuse que la R.M.N., montre, toutefois, chez les dipyrido[1,2-a:3' ,~'-dJ
imidazole, une grande similitude des bandes d'absorption indépendamment
des variations imputables aux substitutions du noyau. En particulier, cette
méthode d'absorption s'est révélée utile quand nous avons eu à identifier
des composés contenant des groupements NH , eN, N
ou
C=o.
2
3
L'étude par la spectrométrie ultraviolette ne manque pas d'intérêt
car on observe pour ces molécules une absorption entre 330 et 400 nm.
L'absorption à ces longueurs d'onde nous a été, en particulier, fort utile
pour l'étude du DNA modifié par Glu-P-3.

---

89 1
La spectrom~tr1e de mass~ ne manque pas non plus d'1nt~r~t car cette
dernière a mis en ~vidence les modes les plus plausible.;de fragmentation de
,nos composes
et la possibilité d'utiliser cette technique comme m~thode
d'analyse.
Le dipyrido [1,2-a,3' ,2'-dJ imidazole donne des solutions \\rès
fluorescentes; cette propriété. comme on le verra par ,la suite, s~ révèle
très intéressante car elle permet la détection de très faibles doses de ces
,
.
,
d
d
0- 9 ... 10- 10
composes
en
solutlon
de l or re
e l
a
mole.
3.2. ETUDE DE LA R.M.N.
Nous avons pu étudier un bon nombre de nos structures grace à la
R.M.N. En effet, les spectres' de substances que nous avons isolées pré-
sentent des massifs aromatiques "suffisamment éclatés" (effets de blin-
dage - déblindage importants) pour permettre une interprétation non
ambigue dans la plupart des cas.
Des études antérieures effectuées par divers auteurs (3, 8, 12)
nous ont grandement facilité la tâche.
A partir de ces travaux des prévisions ont pu être faites quant
aux déplacements relatifs des signaux des protons. Elles se sont révélées
plutôt satisfaisantes.
Les spectres ont été enregistrés pour la plupart dans le chloro-
forme deuteré , avec le TMS comme référence interne sur un appareil Hitachi
Perkin Elmer R 24 B de 60 MHz.
Etude des différents intermédiaires synthétisés
- Spectres des aniles dérivés de l'acétylacétone
L'examen des spectres des produits de condensation de l'amino-3
1
pyridine sur l' acétylacétone permet de montrer que la réact ion s" arrête

---

90
à une monocondensation. En outre, le compos& de condensation ainsi obtenu
a la forme énole préférentielle A et non
la
forme
cétonique e corres-
pondante.
En effet, dans tous les spectres examinés apparaît aux champs
faibles vers 12 ppm un signal d'intensit~ l typique d'un groupement OH
et vers 5,3 à 5,4 ppm, sous forme de singulet d'intensité l caractéristique
du proton méthynique C.
Le tableau 4 nous donne les déplacements chimiques des différents
protons des aniles obtenus et la figure 2 nous montre un exemple de
spectre enregistré.
TABLEAU 4
H
H
H
H
J-l
2
5
6
7
Hg
H
Hb
Bd
a
c
14a
7,60
7,95 *
6,90*
7,25 *
7,60 *
12,10
1,80
. 5,40
2,18
(S)
(D)
(T)
(T)
(D)
(S)
(S)
(S)
(S)
ocH
=
14c
7,30
7,85
6,74
3
7,30
11 ,80
1,80
5,38
2,15
(S)
(D)
(D)
2,3(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
écB
=
14d
7,40
7,80
6,78
7,01
3
12
1,80
5,40
2,15
(S)
(D)
(D)
(S)
2,6(S)
(S)
(S)
(S)
* couplage méta: 0,5 cps
al~:1N~/Med
R
1
1
S : singulet ; D : doublet
T
triplet
7 ~
~
2
~CHc
8
N
......C.......
1 OH
Me
a
b

---

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START OF SWEEI?
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END OF SWEEF
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1 1 1 1 1 1 1
l
,
1 1 1 l
,
1 1 l , 1 1 1 1 1
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10
9
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7
6 , ,
5
4
3
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1
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SPECTRUM AMPL.
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_
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END OF SWEEP
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---

92
- Spectres des crotonates dérivés de l'acétylacétate d'éthyle
On obtient ici aussi des produits de monocondensation qui existent,
comme nous l'avons dit plus haut, sous la forme tautomère 19a.
~
L'examen de ces spectres montre à
6 = 9,9 ppm un pic d'intensité relative 1 typique d'un groupement
NH
et à
/.
6 = 4,85 - 4,84 ppm un pic d'intensité relative 1 caractéristique du
proton méthynique B.
Le tableau 5 nous donne les déplacements chimiques de différents
protons descrotonates synthétisés et la Figure 3 nous montre un exemple
de spectre enregistré.
TABLEAU 5
H
H
H
H
H
H
H
H
1 H
,
H
2
5
6
7
8
a
b
c
d
e
f - - -
*
*
*
*
ocH b =
19a
7,'4
7,95
6,80
7,20
7,60
9,90
3
4,85
4,20
1,28
(S)
(D)
(T)
(T)
(D)
(S)
1,.70(S)
(S)
Q
(T)
6cH =
ocH b=
/
7,35
6,90
7,18
7,45
9,90
3
19d
2,§0
4,84
4,20
1,70
1,27
(S)
(S)
(D)
(T)
(D)
(S)
(S)
(S)
Q
(T)
19c
7,35
7,85
6,80
(6cH )7
7,33 *
9,80
b
3
6cH 3 =
4,84
4,18
1,28
(S)
(D)
= 2,38
1,68(S)
(D)
(S)
(S)
(S)
(S)
Q
(T)
ocH =
7,41
ocH b=
7,80
6,80
7,18
3
19b
2,6~
9,85
4,85
4,20·
1,70
1,28
(S)
(D)
(T)
(S)
(S)
(S)
(S)
Q
(T)
-
S : singulet ; D : doublet
T
triplet
Q
quadruplet
* couplage méta = 0,5 cps

---

94
J 1-6 =J 6 -7 =J 7 - 8 =7Cp'
J _.=9cps
d
- Spectre des crotonates issus de l'éthoxyméthylène
malonate
d'éthyle (EMME)
Nous avons discuté plus haut des différentes formes possibles. Le
tableàu 6 donne les différentes valeurs des déplacements chimiques observées
et la figure 4 donne un exemple du spectre enregistré.
TABLEAU 6
2
5
6
7
8
a
b
c ou c'
d ou d'
1
*
*
*
*
1
15a
7,47
7,90
6,75
7,15
7,50
10,80
8,50
2 x Q
2 x T
(S)
(D)
(T)
(T)
(D)
(D)
(D)
4 ,3~\\ OU 4 ,~5 1,35 ou 1,43 '
oeH
=
15b
7,45
3
6,90
7,05
7,40
11
8,05
4,35 ou 4,25 1,35 (2 x T)
(S)
2,85(S)
(D)
(T)
(D)
(D)
(D)
(2 x Q)
ou 1,43
ocH
=
15e
/
7,47
7,80
6,70
3
7,33
10,50
8,10
4,25 ou 4,30 1,36 ou 1,42
1
(S)
(D)
(D)
2,3(S)
, (S)
(D)
(D)
Quintuplet
Quadruplet
ocH
=
15d
7,57
7,85
6,80
6,95
3
10,60
8,10
4,30 ou 4,35
1,35 ou 1,41
(S)
(D)
(D)
(D)
2,6(S)
(D)
(D)
Quintuplet
Quadruplet
J ab = 12 cps
S
singulet
D
doublet
J cd = 8 cps
T
triplet
J
_
5- 6 = J 7 8 = J 6- 7 = 7 cps
Q
quadruplet
couplage méta : J
J
- J
= 0,5 cps
5- 7
6
8
valeur de c ou Cl et d ou d' du spectre de 15a en présence du HA =
c ou Cl
4,28 (Q) ; d ou dl : 1~38 (T)

---

.....
START OF SWEEP
20ppm
10ppm
Sppm
1
_...__ :...!.,
2ppm
Cl
lJ
1ppm
..
l!
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O.Sppm
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1
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~
d
U
:>
~
ppm (6)
10
9
SPECTRUM AMPL..-1S.Q_ _
SWEEP TI ME __.
.5
min
SAMPLE:
REMARKS:
$
~
OPERATOR
_
< ..
, H t - t
.
FIL TER ....
.__ D rQ'l.......__.. _- _non
~
SWEEP WIDTH
_ A."'_
......
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ppm or
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.
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../""'-1\\1
; .
~
(##'j ,
P.F POWEP. ..._..-..~IP._s.._ ... mG
END OF SWEEf'.
~pm or Hz
SOLVENT:
C]c.9-.:!,
'1: ~"
C°-tO/l_CHt:.......S~EC:tRU~Ll\\JO. _..__._ ...

---

95
,
,
ï11
Etude des différents dipyrido [1,2-a:3',2'-d] imidazole
Spectres des d~riv~s issus de la condensation du prfcurseur Sur
la m~thyl vinyl cft one
L'étude des spectres de ces composés montre que les protons du cycle
pyridinique participent au système ABX. La comparaison de ces tompos~s
(notamment en ce qui concerne les valeurs des constantes de couplage et les
recoupements sur les signaux des diff~rents compos~s) avec les déplacem~nts
chimiques des protons du noyau imidazo [1 ~ 2-aJ pyridine étudiés plus haut,'
nous a permis de caractériser les signaux propres aux noyaux. On pourra
noter que les protons en position 2 et 9 qui sont en ortho d'un azote intra-
cyclique sont g~néralement assez déblindés comme dans le cas du noyau simple
de la pyridine.
Le tableau 7 nous donne les déplacements chimiques des protons de
9 composés étudiés~
les figures 5 eL 5' donDant 2 des spectres enregistrés.
- Etude des 'spectres des amino 2 dipyrido [1~2-a:3',2'-dJ i~idazole
Les spectres de ces composés ont pratiquement les memes signaux que
l'hétérocycle simple ; cependant~ le groupement amina en 2 exerce un fort
effet de blindage sur le proton H3 qui~ de ce fait, se déplace vers les
chru~ps forts de 0,8 à l ppm.
- Analyse du spectre de Glu-P-2 (Figure 5)

---

97
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---

TABLEAU 7
Tous les spectres sont faits dans CDC1
sauf +
3
~9i-
6 : déplacement chimique en ppm
J
: couplage en cps
-
gna-
nature
nature
nature
nature
é8
68
68)
68
68
~87 nature
nature
nature
tian
68
J
_
2
9
du
du
4
du '
6
du
. du
8
du
du
J 2_)
J)_4
Jf,_7
J 7 - B
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signal
signal
signal
signal
signal
signal
signal
,
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4,
3
S
6,78
D
8,03
D
7,50
D*
7,35
T*
6 , Fjll
T*
8,60
D*
-
9
7
7
7
9 b
0CH~=
9 c
4,65
S
6,80
D
7,95
D
7,112
S
2, 0
T
6,75
T
8,60
D
-
9
-
7
7
oCH 3=
la a
8,24
D
7,2C
0
2,75
S
7,55
0
7,35
T
6,78
T
8,65
D
4
-
7
7
7
\\0
oCH3=
éCH
CD
3 =
10 b
8,32
D
7,2C
D
S
S
7,20
Ù
6,72
T
8,62
D
4
-
-
7
7
2,80
2,65
éCH3=
oCH3=
10 c
8,25
D
7,3e
D
S
7,45
S
S
6,80
D
8,65
D
5
-
-
-
7
2,80
2,47
éCH =
éCH3=
S
7,45
D
la d
8,30
D
7,20
D
7,30
T
6,70
D
S
5
-
7
7
-
2Jo
2,35
U a
8,21
S
-
-
oCH3=
S
7,61
D
7,54
T
5,94
T
8,75
D
-
-
7
7
7
3,21
oCH3=
l l b
8,21
• S
-
-
oCH3=
S
S
7,58
D
6,88
T
8,68
D
-
-
-
7
7
2,88
2,7
Nature du signal : S ... singulet
o :II doublet
T :II triplet
Q ... quadruplet
M - multiplet
.. couplage méta,: 0,5 cps

---

TABLEAU 7 (suite)
Dési-
cS
: déplacement chimique en ppm
-
J
: couplage en cps
gna-
nature
nature
nature
nature
nature
nature
nature
cSH
6H
6H
lion
~B2
cSH)
cSH
6H
_
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6
7
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du
du
du
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J~_7
J
7 8
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signal
signal
signal
signal
signal
signal
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S
-
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S
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s
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S
6,84
0
8,55
0
-
-
-
-
7
-
-
2,83
2,50
NH2
éCH =
12 a
8,2
S
S
3
S
7,62
0
7,50
T
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T
8,78
0
-
-
7
7
0
4,53
2,95
NH =
oCH3=
ôCH3=
12 b
8,2
S
2
S
S
7,35
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5,92
T
8,77
D
-
-
7
7
q
2,85
2,62
4,53
+
NH2=
CH 3 =
CH3=
12 c
6,5
S
S
5,95
2,50
S
7,20
S
S
5,55
0
8,30
0
-
-
-
-
8
2,32
<0
<0
16 a
8,9
S
* *
7,60
D
7,51
T
5,95
T
8.80
0
-
-
7
7
-
6CH3=
16 b
8,9
S
* *
S
7,32
0
6,92
T
8,75
0
-
-
-
7
7
7,82
6CH 3 =
16 c
8,86
S
* *
7,6
S
S
5,90
0
8,50
0
-
-
-
-
0
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*
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-
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T
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0
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7
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*
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• 0
7,42
D
-
-
S
7,30
0
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T
0
4
-
-
7
7
2,68
Nature du signal : S "" singulet
-
o ... doublet
** CO CH CH
2
2
3
T ll:I triplet
éCH
= 1,28
3
Q '" qu~druplet
\\
=
M • multiplet
éCH
4,15
2
+
spectre dans OMS a
1
'*
l
cou~lage m~ta : 0,5 cps
1

---

---

TABLEAU 7 (suite)
- ~si-
é : déplacement chimique en ppm
3
: couplage en cps
,
qna-
nature
nature
nature
nature
nature
natu~e
nature
tlon .
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68
68)
6H
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J _
J _
J
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du
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J 3- 4
6 7
7 8
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signal
signal
signal
signal
signal
signal
signal
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ÔCH3=
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D
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D
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-
-
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T
6,70
T
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D
-
-
7
7
7
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5,30
éCH3=
6NH2=
cSCH3=
-
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S
6,49
S
S
7,35
S
S
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D
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-
-
7
2,56
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*
*
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-
7
-
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ôCH3=
25 c
8,42
D
7,42
Q
8,21
D
7,38
S
S
6,70
D
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D
5
9
-
-
7
2,41
ôCH3=
*
*
*
*
25 e
S
7,33
Q
8,10
D
7,56
0
7,35
T
6,82
T
8,78
D
-
9
7
7
7
2,73
' oCH 3=
ôCH3=
-
-
25 g
S
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0
8
D
7,30
S
S
6,66
D
8,5 4
0
-
9
7
2,70
2,32
.
Nature du signal : S m singulet
o ID doublet
T ID triplet
Q cs quadruplet.
1
M· "" mul tiplet
* couplage méta: J = 0,5 cps
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303
Le sp~ctr~ de RMN de cette amine se décompose' comme suit
- Un doublet d'intensitf 1 centré sur 6,78 ppm correspondant au proton H3
en ortho de NH (qui exer'ce un effet de blindage)
couplé avec le proton
2
H4. J _
: 9 cps.
3 4
- Un doublet d'intensité 1 centré sur 8,03 ppm, signal du proton H4 (en
meta de NH
et en paJ'a de l'azote intracyclique)
assez
déblindé à
2
cause de l'effet· para de l'azote intracyclique (J 4 - 3 = 9 cps),
- Un quadruplet d'intensité 1 centré
sur 7,35 ppm correspondant au proton
H6 couplé au proton H7 (J _
= 7 cps) et subissant un couplage meta avec
6 7
le proton H8 (J -
= 0,5 cps).
6 8
Un sextuplet d'intensité 1 centré
à 7,60 ppm correspondant au proton H7
couplé aux protons 6 et 8 d'une part (J7- 6 = J
=
7-
7 cps) et d'autre
8
part au p~oton 9 (J 7- 9 = 0,5 cps).
- Un sextuplet d'intensité l centré
à 6,84 ppm dû au proton HB couplé avec
C>
les protons H9 et H7 d'~ne part (J e- = J~_7 = 7 cps) et avec le proton
9
H6 (J e- = 0,5 cps).
6
- Un quadruplet d 1 intensité 1 attribuable au proton Hg avec un couplage
ortho J _
de 7 cps et un couplage meta J _
de 0,5.
9 B
9 7
Enfin, un singulet d'intensité 2 dû
au groupement NH , à 4,53 ppm qui
2
disparait par addition de D 0.
2
- Spectre des nitro-3 méthyl-4 dipyrido [1,2-a:3' ,2'-d] imidazole
9
R8~~-
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Figure 7
6
N
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Ces spêctres pr€sentent
tous
à 8,70 ppm un singulet d'intensit~ ] attribuable au proton 2,
- entre 7,80 et 3,21 ppm un singulet d'intensité 3 dû
au
proton du
groupement CH 3 en 4.
Quant aux autres protons, on retrouve plus ou moins les mêmes
déplacements chimiques et couplages par rapport à ce que nous avons dit plus
l
,
haut sur le dipyrido [1, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole.
- Spectre de l'amino-3 méthyl-4 dipyrido [l,2-a:3',7'-d] imidazole
9
Analyse de
R~~­
~
6
N
figure 8
12 , R1 = H
--à 8,2 ppm, un singulet d'intensité 1 dû
au proton H2
- à 2,53 ppm, un singulet d'intensité 3 dû
aux protons du groupement méthyle
en position 6
- à 2,85 ppm, un singulet Ô'intensité 3 dû aux protons CH
en position 4.
3
- Les autres déplacements sont plus ou moins ceux observés pour les noyaux
étudiés plus haut.
- Etude des azido-4 et amino-4 .dipyrido [1,2-a:3' ,2'-d] imidazole
(Figures 9 et 91 )
Nous retrouvons, hormis le proton H3, pratiquement les memes dépla-
cemenLS chimiques. Le proton H3 est soumis à un fort effet de blindage, et
son
signal
se
trouve
déplacé
vers les champs forts d'environ 1 ppm.
On pourra noter que pour les composés ayant le groupement méthyle en 2,
cet effet est davantage renforcé.

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110
- [tudt, des c!J]orw 4 dipyridû [1,2-a:3',I'-dJ imidaw]~
<figure 10)
Pour ces composés. les déplacements chimiques et les couplages
restent assez semblables à ceux observés pour l'hétérocycle.
3.3. ETUDE INFRA-ROUGE
Les spectres d'absorption dans l'I.R. examinés dans ce travail,
nous ont permis d'une part de recouper certains résultats obtenus par
d'autres techniques spectrales (R.M.N., spectrométrie de masse), mais aussi
et surtout nous ont été d'un précieux recours quand ces derniers se mon-
traient parfois peu révélateurs.
Nous n'avons pas tenté de dépouiller intégralement les spectres.
Cependant, à la lumière des tebles d'identification spectrométrique (16),
par comparaison avec les spectres des cycles pyridinE , imidazole et
benzimidazole (51) qui composent les différents noyaux étudiés, ainsi qu'en
tenant compte de certains phénomènes, à savoir :
l'existence de liaisons hydrogènes qui peuvent causer des changements dans
le comportement vibrationnel du noyau,
- la nature et la position de substituants qui peuvent causer des variations
des bandes en position et en intensité,
nous avons pu attribuer en première analyse quelques bandes dues aux princi-
pales vibrations
C = C, N
H, C = N, C - N, C - H.
Tous ces spectres ont été exécutés sur un appareil Perkin Elmer 297
en pastille de KBr.
- Etude du spectre de l'hétérocycle
R = H ou CH 3
RI = H ou CH 3
R
= H ou CH
2
3

---

L'examen montre dans tous les spectres 6 s&ries de bandes principales':
-1
a) vers 3JOO et
3040 cm
correspondant aux vibrations d'allongement de
la liaison C - H du noyau sP2
1
b) 2950 - 2920 cm-
vibration d'allongement C - H des groupements méthyles
-1
c) 1&45
1620 cm
vibration d'allongement C = C conjugué
d) 1500
-1
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C
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= C et C = N (caractéristiques des
cycles pyridiniques)
-1
e) 1380 - 1270 cm
vibration d'allongement C - N
-1
f)
1235 - 1160 cm
vibration de déformation C - H (cycle).
On peut ainsi distinguer 4 régions
Les CH sP2 (aromatiques et hétéroaromatiques) sortent entre 3120 -
-1
3040 cm
. Ce sont des bandes de faible intensité. Les bandes de vibration
-1
Ct...' ~
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l'état d'hybridation sP3 sortent vers 2950 - 2920 cm
Les bandes de vibration des liaisons du cycle (C = C et C = N)
1
sorêent vers 1545 - 1530, 1600, 1520 - 1490 cm-
(double bande). Ces
3 séries de bandes ont à peu près la même intensité, la bande sortant à
1
1600 cm-
étant dans tous les cas assez fine.
Dans cette région, on retrouve des bandes aux alentours de 1400 -
1290 correspondant aux
vibrations de valence C - N,
vibrations de déformation C - H sP3 symétrique à 1400, bande intense de
vibration asymétrique C - H.
Plusieurs bandes apparaissent dans cette région (variable selon la
position des méthyles sur le noyau) attribuables surtout aux
vibrations de déformation de la liaison C - H dans le plan et hors du plan.

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Schéma 14

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114
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Entre 900 et 700 cm
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tiques de la structurepolynucl~aireconsidérée. c'est aussi la zone carac-
téristique des positions de substitutions des noyaux ar'omatiques et hétérv-'
aromatiques.
Nous observons des pics
les différents
~
pour
composes
-1
-1
-1
-1
-1
25 a
BOO cm
, 790 cm
, 765 cm
750 cm
(assez intense), 730 cm
-1
-1
-1
-1
25 c
BOO cm
, 790 cm
770 cm
, 735 cm
-1
-1
-1
-1
25 b
770 cm
750 cm
(assez intense), 735 cm
720 cm
-1
-1
-1
-1
25 e
800 cm
, 790 cm
770 cm
(assez intense) , 735 cm
-1
-1
-1
25 g
810 cm
, 790 cm
, 765 cm
La structure de dipyrido [1,2-a:3' ,2 1 -dJ imidazole est bien carac-
térisée dans cette zone par le composé 25 a, car ce dernier ne comporte pas de'
""
substitution. On retrouve dans les autres composés 25 les mêmes bandes avec
"'"
quelques légers déplacements et quelques variations d'intensité des bandes
selon les substitutions.
Dans ce qui suit, nous étudierons dt autres dérivés de dipyrido [1, 2-ë.:'
3',2'-dJ imidazole tout en mettant l'accent sur les différentes substitutions
fonctionnelles en négligeant les vibrations propres au noyau.
- Spectre des amino - dipyrido [1,2-a:3' ,2'-d1 imidazole
Les figures 12 et 13 montrent les spectres de deux des composés de
cette famille. L'analyse de ces spectres donne les bandes suivantes:
-1
3340 -
3180 cm
vibration d'allongement N - H (amine primaire)
1650 (intense)
vibr'ation de déformation N
H
vibration de valence - C = N
vibraTion d'allongement - C = C - conjugué
1600 - 1590
vibration de valence - C = C
1500

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SCHEMA 15
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170
• 134(1 (ilJ1('11~.c)
vibrù1.ion dE' valence C - N.
Cn dehors de ces vibrations caract~ristiques d~s amines primaires,
il faudrait ajûuter les différentes vibrations propres au noyau dipyrido
[1,2-a:3' ,?'-d] imidazole.
Le schéma 15 donne les principales bandes des vibrations observées
de Ces amines.
Il faut noter que la position de la fonctio~ amine (en 2, 3 ou 4)
n'a pas d'influencL sur la nature des spectres.
- Snectre àe nitro-3 di
1,2-a:3' ,2'-d
imidazole
L'analyse des spectres donn~ plusieurs s~ries de bandes, en dehors
des bandes propres aux noyaux.
Nous avons relevé pour ces derniers quelques bandes propres aux d~rivés
nitrés,en particulier 2 séries de bandes assez intenses:
-1
1490 et 1330 cm ~ pour 11 a
1490 et 1330
pour 11 b
1490 et 1332
pour 11 c.
La figure 14 montre les diff~rentes vibrations observées.
Spectre de azido-3 diDyrido [l, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole
(Figure 15)
Ces composés se caract~risent par une forte bande de vibration dê
-1
valence azothydpure aux alentours de 2100 cm
et unedeuxième moins intense
-1
aux alentours de 1300 cm
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Schéma 16

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- Spe.ctre de l 'hydroxy-4 dipyrido [1, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole
(figure 16)
Le spectre de l'hydroxy-4 dipyrido-imidazole présente une bande assez
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lar[~ entre 3200 - 2500 cm
• qUl montre
len que
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forme énole comme nous l'avi0ns caract~risée par yoie chimique.
Cette bande d'absorption correspond à la vibration de valence des
OH libres des composés chelatés. A cette très large bande, on peut
associer deux autres bandes
,
- }
- une première a 1330 cm
, la plus intense pour les composés 20 e, corres-
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pondant à la vibration de déformation de OH ;
-1
une deuxième à 1230 cm
, attribuable à la vibration de valence de C - o.
- Spectre dES chloro-4 dipyrido D, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole s
(figure 17)
Les spectres des dérivés chlorés présentent entre 800 - 600 cm- 1 des
bandes assez prononcées et aux alentours de 1500 - 1540 cm- 1 Wle bande très
intense non observée dans le cas de l' hétérocycle non substitué par un grou-.
pement fonctionnel.
La littérature (52) rapporte que la liaison C - Cl, en plus de sa
1
vibration fondamentale 700 - 800 cm-
est caractérisée ,par la vibration harmo-
nique 2v sortant vers 1500 - 1560.
- Etude des carbethoxy-3 hydroxy-4 dipyrido D-, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole s
Nous allons étudier deux composés, le 15 a et le 15 c. Ces
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deux composés donnent deux réponses différentes dans le test au perchlo-

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Schéma 17

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Schéma 18

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change pas de coloration.
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Nous avons observe et attribué les bandes suivantes
Composé 15 a (Figure 18)
1
entre 3500 - 3500 cm-
une bande faible due à la. vibration de valence OH
libre
-1
entre 3200 - 2500 cm
une bande large moyenne attribuable à la vibration
des
OH chelatés
1700 cm-l, vibration de valence C = 0, de l'ester
1350 cm-l, vibration de déformation 0 - H
11 190 cm-l, vibration de valence C - 0 (C - OH)
1300 cm-l, vibration de valence C - 0 (ester 0 - C H ).
2 5
Composé 16 c (Figure 19)
-1
3250 cm
une bande attribuable à la vibration de valence NH amidique
seconàa,ire liée
-1
1690 cm
vibration de valence C = 0 de l'ester
-1
1550 cm
(en comparant avec son homologue 16 a), cette bande devient la
plus intense; voir les spectres. Nous avons attribué cette absorption à
la vibration de valence du carbonyle ylactame en plus de la vibration
C = C, C = N de l'hétérocycle.
-1
On note d'autre part que la bande intense observée à 1350 cm
dans le cas du composé 16 a a disparu .
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Spectre de carbéthoxy-3 chloro-4 dipyriào[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
Dans le spectre de ce composé dérivé de 16 a, on observe la dispa-
~
rition des bandes dues aux liaisons OH, tandis que les bandes dues aux
vibrations C - Cl apparaissent en particulier à :
-1
1450 cm
, attribuables au 2 v C - Cl harmoniques
-1
750 cm
: V C - Cl

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132
- Etude des comro~~~ 22 (figure 20)
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-1
Ces produits présentent une forte absorption entre 3400 et 3200 cm
attribuable aux vibrations de valence N - H; l'absorption la plus intense
-1
s'observe à 1600 cm
t
correspondant en plus des vibrations de valence C = C,
C = Nt à la vibration de déformation de N - H.
- Etude des composés 40 (Figure 21)
'"V
L'étude I.R. de ces composés confirme la structure que nous avons détero-
minée grâce à la RMN et à la spectrométrie de masse. En particulier, à 2900 -,
-1
2800 cm
, apparaissent une suite de bandes plus ou moins intenses attribuables
facilement aux vibrations de valence symétrique et as symétrique de C -H sP3
des méthylènes. En outre, on note la disparition de la banqe à 1650 attri-
buable au cycle aromatique imidazo[1,2-a]pyridine.
3.4. ETUDE EN SPECTR~ETRIE DE FLUORESCENCE
Les dérivés du dipyrido [l, 2-a: 3' ,2 '-d] imidazole sont fortement
fluorescents, comme nous l'avons dit, et c'est une propriété du noyau. Comme le
montre des mesures effectuées à 20°C sür un appareil Farrand Mark l spectrofluo-
rimeTer pour quatre composés différents: l'hétérocycle non substitué 25, l'nIlJ~"0'
"'-'
4 àipyrido [l, 2-a: 3' ,2'-dJ imidazole 24, Glu-P-2 et Glu-P-3 en solution
"'"'v
éthanolique. Pour une excitation à 350 nm, les spectres enregistrés ~ntre\\
200 et 700 nm montrent pour chacun des produits un intense pic d'émission
centré sur 457 - 462 nm.

---

133
3.5. ETUDE EN SPECTROMETRIE DE MASSE DU DIPYRIDO [1/2-a:3'/2'-SÙIMIDAZOLE ET DE
CERTAINS DE SES DERIVES
La spectrom~trie de masse, branche relativement nouvelle de lB
physico-chimie organique, constitue un outil privilégié pour l'analyse, la
détection et la quantification (ses limites peuvent atteindre le pico-
gramme dans certains cas) de certains composés organiques. Elle peut appor-
ter en outre d'utiles renseignements sur la stabilité de certaines molécules
qui peuvent être sensibles à la chaleur, à la lumière, voire à la biodégra-
dation.
Il nous a paru intéressant d'étudier le comportement du noyau
dipyrido-imidazole et de ses dérivés sous l'impact électronique dans le
spectrographe de masse, dans l'espoir notamment d'en tirer des renseignements,
pouvant être codifiés en vue d'une utilisation simple et rapide de cette
technique physico-chimique comme méthode d'identification et de dosage des
dérivés de p)~olyse de l'acide glutamique.
Par ailleurs, on sait, depuis les travaux de Saint-Ruf et al. (53,
54), sur la thermolyse des aldazines aromatiques ou hétérocycliques, qu'il
existe souvent un parallélisme remarquable entre la thermodécomposition de
certaines molécules organiques et la fragmentation que peuvent subir ces
mêmes molécules sous les effets de l'impact électronique dans le spectro-
graphe de masse. Nous nous sommes donc demandés dans qUélle mesure l'élec-
tronolyse de l'acide glutamique pouvait donner lieu, dans certaines condi-
tions, grâce en particulier à certains réarrangements chimiques, à des
espèces d'ions identifiables soit aux produits de décomposition thermique de
ceT acide, soit aux fragments caractéristiques des spectres de masse de ces'
produits. Cette étude nous a paru d'autant plus intér~ssante qu'elle pouvait
nous apporter au surplus d'utiles renseignements en vue d'un essai d'établis~
sement d'UTI mécanisme plausible de formation du Glu-P-} et de ses analogues,
problème qui, pour l'instant, reste encore entier.
Nous avons donc étudié la
décomposition électronolytique de l'acide
, glutamique - les résultats seront exposés à la fin de ce sous-chapitre -
à côté de celle de 6 composés qui nous ont paru les plus représentatifs ,sur
le plan de la motivation de cette étude: l'hétérocycle non substitué 25 a,
,...."
son dérivé diméthylé en 4,6 25 f, Glu-P-2
9 et Glu-P-3, le dérivé nitré 11 a
~
~
,....",
et l'acétamide 26 f.
~

---

134
Les spec~res ont étf réalises à l 'Universi1é d'Orléans " sur un
appareil Ribermag R 10-10 équipé pour travailler en impact électronique <II:)
à 70 eV et en ionisation chimique avec désorptioll (D/C1) et doté d'un sys-
tème informatique SIDAR permettant le traitement et ] 'acquisition simulta~é~,
des données. L'étude a 'té faite par introduction directe des 6chantillons'
(LID) dans la source (à une température de l'ordre de 100°C) et en ionisa-
tion par lE. Nous avons retenu pour chaque composé le spectre correspondant
,
l
d
d "
.
d
-
d ' .
.
.
a
a moyenne
es
onnees acqUlses
ans une meme zone
lonlsatlon ** .
3.5.1. Oipyrido [1,2-a:3',2'-d]imidazole
Le tableau 8 montre les principaux pics relatifs à la fragmentation
de ce composé avec leurs intensités relatives et pour certains la nature des
ions formés. Pour la-clarté de l'analyse nous n'avons retenu que les pics
d'intensité relative supérieure ~ 5 %. D'un cSté, le spectre de ce ~omposé
apparaît relativement simple avec pour pic de base le pic de masse, ce quiest
le.signe·dlune certaine stabili"tÉ sous l'impact électronique, et de l'autre 1.8e
fragmentation se rapprochant de celle des héTÉrocycles azotés (55). A partir
de l'ion parent, il y a perte de HCN avec formation de l'ion mie 142 qui,
à son tour, perd du HCN pour donner le fragment mie 115. En dehors de ces
deux ions dont l'abondance est relativement faible (17,8 et 10,2 % respec-
tivement), il faut noter deux autres pics Très intenses: le premier ~ mie
78 (1% = 73',9) qui correspond vraisemblablement à l'ion pyridinium [C H NJ+
5 4
formé à la suite d'une série de fragmentations de l'ion parent; cet ion
pyridinium perd, en dernier ressort, ~ nouveau du HCN pour donner le troi-
sième pic en importance (mie 51 ;1%
= 59,6) qui correspond à l'ion ionisé
CH = C - C = tH .
2
Etant donné la présence des 3 atomes è'azotes dans l'hétérocycle,
il est difficile de donner avec certitude un schéma de fragmentation. Néan-
moins, en nous basant sur certaines données de la littérature (56, 57), le
schéma lsnous parait assez plausible.
* Nous remercions vivement M. Kéravis~ ingénieur~ pour son concours techni~ue.
** On observe généralement des variations quantitatives de l'importance des
divers pics en fonction du temps~ mais pas de changements sensibles en ce
qui concerne la nature des fragments.

---

135
TABLEAU 8
Pics significatifs observés dans le spectre de masse du dipyrido-imidazole ZSa
""-'
Int. rel.
mie
%
Constitution probable de l'ion
du pic de base
~--------------------------------------------
+
170
18,9
M· + 1
169
100
M:
ion molf~ulaire (pic de base)
168
+
8,7
M'
-
l
143
8,3
142
+
17 ,8
M· - 27
perte de HCN
115
+
10,2
M' - 54
pe~:e de 2 HCN
1,04
5,5
103
7,2
79
8,8
+
pyridine
78
73,3
77
5,9
76
10,9
64
10,3
52
26,2
51
59,6

---

· 1%
SCHEMA 19
-2 HCN
1
+e
~~---(N~ -HCN (lN ·
--n
~..
-HCN ..
~ ~Pl.I~+
)0
N~
N
mie 169
mie 142
mie 115
@~
mIe 78
mie 103
,
/
I-HCN
1
+
1
CH=C-C=CH 2
mie 51

---

137
3.5.2. Oimethyl-4,6-dipyrido [1,2-a:3',2'-d] imidazole
Le spectre de ce compos~ indique un mode de fragmentation similaire
à celui du compos~ précédent. On constate, en effet, én premier lieu la
perte de HCN à partir de l'ion mol~culaire pour donner l'ion à mie 169
(la perte de 2 HCN se fait également mais l'ion correspondant est moins
abondant que pour l'hétérocycle non substitu~). En deuxième lieu, on peut
constater la formation transitoire de l'ion m~thyl-pyridinium (mie 92, l %
= 17,5) qui a son tour perd du HCN pour donner l'ion d'ouverture à mie 65
)
(1 % = 20,6). Il est à signaler, tout comme dans le spectre du composé non
substitu~, la pr~sence de l'ion pyridium mie 78 et de son d~riv~ à mie 51.
Toutefois, il faut noter que la perte d'un m~thyle à partir de l'ion parent
(mie 182 ; l % = 6,3) reste faible tandis que la pérte de 2 Me semble tout à
fait hypoth~tique. La faible intensit~ des diff~rents pics par rapport au pic
parent (pic de base) semble indiquer par ailleurs que la présence des
méthyles stabilise plus ou moins la mol~cule vis à vis de l'impact élec-
tronicue. Ceci est d'ailleurs confort~ par la présence d'un ion de double
2+
charge M
(mie 98 ; l % = 3,1).
TABLEAU 9
Décomposition électronolytique de 25f
~
1
mie
Int. Rel.
Nature des ions
+
198
12,7
M' + H
197
100
Mt
196
41,6
Mt - H
182
6,3
Mt - 15 (perte de Me)
159
5,2
Mt - [HeNH]
+
167
0,8
M' - 30 (perte de 2 Me ? )
142
1,2
M: - 2 HCN
98
3,1
M2+
,
+
93
5,7
Me Py·
+
92
17 ,5
Me Py
75
6,7
Py+
+
65
20,6
Me Py
- HCN
,
51
8,6
[Py+ - HCN] + H
Me Py = méthyl-pyridine
Py = pvridine

---

138
3.5.3. Amino-2 dipyrido Q,2-a:3',2'-d] imidazoLe (GLu-P-2)
Le spectre de Glu-P-2 est un peu plus complexe par suite de la
présence de la fonction amine et donne lieu à divers réarrangements.
Néanmoins t l'analyse du spectre (tableau 10) montre t à première vue, les
principaux fragments correspondant à la fragmentation du noyau examiné
plus haut t à savoir les ions procédant de la perte de HCN et de 2HCN à
partir de l'ion moléculaire (mie 157 et mie 129) d'une part et d'autre
+
part les ions pyridine (mie 79)t pyridinium (mie 78) et CuH~
(mie 51).
. ~
En outre, d'autres fragments d'intensité relativement importante apparais-
sent, dûs à la présence du groupement NH . Il en est ainsi du pic de base
2
à mie 55 correspondant à la formule brute C H N ; nous avons attribué +.
4 5
la structure ouverte tautomère CH
= C - CH - NH
t~ CH = CH - CH = NH
2
2
2
à ce fragment qui se forme à partir de l'ion moléculaire à la suite d'une
série de fragmentations accompagnées de réarrangements via l'ion neutre
dihydro-indole (mie 69, l % = 90,5). Mais la structure CH 2 = CH - N = CH2
est également possible si l'on se réfère au mode de décomposition du
tétrahydroindole(5S). Ces deux fragments (mie 55 et 69) sont intéressants,
car, comme nous le verrons plus loin, on les retrouve dans le spectre de
fragmentation de l'acide L-glutamique au dessus de 100°C.
Le spectre présente d'autres fragments dont le schéma 20 montre
pour certains la structure et les modes de formation les plus plausibles.
Enfin, il ne semble pas qu'il y ait perte directe de NH
à partir de l'ion
2
moléculaire.
3.5.4. Amino-3 diméthyl-4,6-dipyrido D,2-a:3',2'-d]imidazole (GLu-P-3)
Outre la présence de deux groupements méthyles sur les positions
4,6 du noyau, Glu-P-3 se différencie de Glu-P-2 par la position de la
fonction amine; celle-ci occupe la position 3 dans Glu-P-3 alors qu'elle
occupe la position 2 dans l'homologue non méthylé. Ces différences ne se
reflètent pas de façon importante dans les spectres de masse de ces deux
composés, bien que la présence des méthyles ait tendance à rendre plus

---

139
.TABLEAU 10
Fragmentation de Glu-P-2 (principaux pics>
mie
Int. Rel.
Nature des ions
------ ------------- -------------------------------------------------
185
15
Mt + H
184
85,7
Mt
157
10,7
Mt - HCN
155
8,4
M: - QiCN + H]
144
11,8
Mt - [HCN + CH;J
+
129
12,4
M' - [2HCN + H]
105
12,8
Mt - Py
101
10,1
129 - HCN
97
72 ,9
95
50
Py - NH
+ H ?
2
93
23,7
M2 + 1
84
50,9
,
83
73,2
* +
79
91
Py'
+
78
39,4
Py
59
90,5
C H N (dihydro
indole)
4 7
5E
25
57
41
indole
+.
-r
55
100
CH
NH i t
2 = C = CH -
...- CH 2 = CH - CH = NH
2
54
19,2
+
51
12,8
CH - C - C - CH 2
* Py
pyridine

---

140
SCHEMA
20
+0
NH
a~N
+
(11
-HCN.
N
mie 129
Ac~
+0
+
N
o
N
-~) o~ -HCN. C H;
4
~
.
m/e79
m/e78
mIe 51
H
H
N
o
6
+H2.
+.
-~~ (C3 HsN)
m/e67
m/e69
mIe 55

---

141
stable la molécule de Glu-P-3 sous l'impact électronique comme nous
l'avons déjà vu pour le composé diméthylé non porteur d'un groupement
fonctionnel. On retrouve, en effet, dans le spectre de masse de Glu-P-3,
comme le montre le tableau 11, des fragments similaires à ceux rencontrés
dans le spectre de G1u-P-2 avec des intensités relativement équivalentes
dans la plupart des cas. On note ainsi la présence des ions correspondants
,
~
~
~
~
~.
~
~
~.
a M· - HCN, M· - HCNH, M· - 2 HCN, à Me Py, Me Py, (Me Py - HCN), Py "
Py~ et (Py~- HCN). Il semble donc que les dérivés aminés du dipyrido-
imidazole obéissent à un mode de fragmentation tout à fait spécifique
indépendant de la position de la fonction amine.
3.5.5. N-acétyLamino~2 diméthyL-4,6-pyrido D,2-a:3'~2'-~ imidazoLe
Le spectre de cet acétamide a été réalisé sur un échantillon pur,
vérifié par CCM. Deux faits marquants, dans ce spectre relativement
simple, sont à signaler: la présence d'un pic à mie 296 (1 % = 6,6)
qui correspondrait à un ion diacétylé, formé vraisemblablement par
réarrangement à partir de l'ion moléculaire; en deuxième lieu, la
perte de CH CO à partir de l'ion parent pour donner un pic à mie 212
2
(pic de base) correspondant à la formation de l'ion neutre Glu-P-3. A
partir de ce fragment la décomposition électronolytique est en gros
semblable à celle de Glu-P-3 comme le montre le tableau 12.
3.5.6. Nitro-3 diméthyl-4,5-dipyrido
I1,2-a:3',2'-d] imidazoLe
Ce composé, dont le spectre est analysé dans le tableau 13,
suit en premier lieu le mode de fragmentation des dérivés nitrés aroma-
• 1
tiques (58) en perdant du NO et du N0
pour donner les ions mie 212
2
(1 % = 24,5) et mie 196 (1 % = 55) correspondant à deux des 6 pics
principaux. L'ion mie 196 est ionisé en un fragment neutre diméthyl-4,6-
dipyTido [1,2-a:3' ,2'-d] imidazole ArH (mie 197) qui subit dès lors le
mode de décomposition que nous avons déjà décrit dans le tableau 9.
A remarquer, toutefois, que le pic de base est ici le pic à mie 92
correspondant à l'ion méthyl-PYTidinium.

---

142
-TABLEAU 11
Fregmentat10n de Glu·p-3 (princ1p9ux pics)
mie
Int. Rel.
Nature des ions
------ ----------- --------------------------------------------------
213
18,5
212
100
211
20,3
197
13
M! - 15
perte de Me ou de (NH ?)
196
Il,3
M: - 16
(perte de NH
?)
2
185
5,3
Mt - HCN
184
9,2
M: - HC~H
172
+
17 ,9
M· -
(CN + CH )
2
157
4,4
184 - HCN
149
24,2
106
10,2
97
17
+.
0,"
29,3
""
Me Py
92
41,9
Me Py+
91
14,2
81
22,9
+.
79
9,7
Py
78
13,3
Py+
69
66,9
67
25,7
65
34,45
92 - HCN ~ C H;J+
5
+.
55
55,6
C H N
3 S
51
10,7
+
C H
4 3

---

, ,
143
TABLEAU '2
Principaux pics dans le spectre de l'acéty'lamino-3-dimethyl-4,6-
di py r i do [1, 2-a : 3' , 2 '-dJ i mi duo le
mie
lnt. Rél.
Nature des ions
------ ---------- --------------------------------------------------
~·.,.COCH3
296
5,5
[Mt - 1] + COCH
Ar -
3
... COCH 3
+
255
4.5
M' + H
254
27,8
M~
238
3,5
Mt
H
- 0
....
Ar - N = CH - CH
• 2
+
213
16
212
100
M: - CH CO .... Ar NH~:
2
211
91
Ar - NH' (perte de COCH )
3
+
196
2,8
perte de CH -N = C = 0
+
3 H
184
7
212 - HCNH
172
5,6
212 - (CN + CH )
2
93
21,5
Me p/'
+
92
51,5
ME Py
78
4,3
p/
59
4,7
57
3,4
56
8,1
55
21 ,8
55
6,8
51
3
Ar = diméthyl-4,6-dipyrido-imidazo1yl

---

J44
TABLEAU 13
Fragmentation du Nitro-3 dim~thyl-4,6-d;pyr;dol,,2-a:31,2'-dlimidazole
mIe
Int. Rel.
Nature des ions
------ -----------
,
------------------------------------------------
+
243
16,1
M' + H
242
55
Mt
225
5
M: - 16
perte de 0
212
24,5
Mt - NO
197
10,8
ArHlt
+
(M,
_ N0 2 ) + H
+
195
52
Ar
CM: - NO )
2
,
,
195
12,6
194
5,8
184
5,6
180
5,5
170
11,8
+
159
14,9
Ar
- HCN
158
5
157
5,6
155
6,9
155
5,5
142
4,5
ArH+· - 2HCN
+.
93
9
Me Py
92
100
Me Py+
91
13,9
55
81,5
51
16,5

---

145"
L'examen des spectres de masse de six compos~s que nous venons
de d;'crire montre des similitudes frappantes en ce qui concerne 1.E'ur com-
portement sous l~mpact €lectronique
dans le spectrographe de masse.
Trois faits qui semblent spécifiques à la fragmentation des dérivés
du dipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole ont été mis en évidence
1°) Laformation à partir de l'ion parent de deux ions correspondant à la
perte d'une et de deux molécules de HCN.
+
2°) La formation d'un ion p)Tidiurn (mie 78) et d'un ion mie 51 (C H
)
4 3
provenant de la décomposition de l'ion pyridinuim avec perte de HCN.
Dans le cas des dérivés méthylés, il se forme, outre ces deux ions,
deux autres fragments correspondant à un ion méthyl-pyridinium
(mie 92) à un ion (mie 65) provenant de la perte de HCN à partir de
ce dernier.
3°) ~c formation, dans le cas des dérivés portant une fonction amine,
d'un ion (mie 69) ayant probablement la structure du dihydro-2,3
indole et d'un autre (mie 55) provenant de la décomposition du pre-
mier avec perte de CH .
2
Ces constatations laissent entrevoir la possibilité d'utiliser
la spectrométrie de masse comme méthode de détection et d'identification
, .
des dérivés de pyrolyse de l'acide glutamique dans certains mélanges
et notamment des préparations alimentaires.
3.6. ETUDE DE LA FRAGMENTATION ELECTRONIQUE DE L'ACIDE L-GLUTAMIQUE
Nous avons effectué cette étude sous impact électronique, par
introduction directe et dans un gradient de température compris entre
60 et 400°C.
A faible température (83°C) (conditions suffisamment douçes
pour éviter tout phénomène de thermolyse*), le spectre de masse de
* Le point de déCompoBition de l'acide glutamique est de 247 - 249°C
/
(cf.
Merck lnàe:r:).

---

146 .
l'acide L-glutamique est fort 5impl~ (tableau 14) et ne pr~sente'que
quatre pics pr'incipaux corrt,:::::pDTldar;t à une fragmentation bien définie.
Oh trouve ainsi le pic de base à mie lu? qui est le pic de masse. Les
trois autres pics se forment à partir de l'ion parent par perte de CO
(pic à mie 119, l % = 51,3), de COL (pic à mie 93, l % = 53,3) et de
[CO + CO;J (pic à mie 65, l % = 44,3). Cette fragmentation implique
évidemment des réarrangements du type de Mc Lafferty avec des transferts
intramoléculaires d'hydrogène et d'ions OH
qui expliquent la relative
stabilité des ions formés.
A des températures élevées, mem~ se situant en dessous du point
de décomposition de l'acide glutarrliqiJ€,
on observe une nette évolution
du spectre qui devient plus complexe avec des pics plus nombreux corres-
TABLEAU 14
ELectronoLyse de L'acide gLutamique à faibLe température (83 0 C)
mie
Int. Rel.
Nature des ions
... ------- -------------- ----------------------------------------------
148
23,2
-t
147
100
M·
146
35,6
120
6,4
-t
119
51,3
M' - CO
118
3,4
94
4,3
-t
93
53,3
tJi·
- CO 2
92
5,7
66
19,3
-t
65
44,3
M- -
[CO + c0 1
2
64
15,5
51
12,7
/
/

---

147
pondant à de multiples fragments, différents dans leur quasi t0taJit~
de ceux observés dans le spectre simple de l'acide glutamique examiné
plus haut et dont certains ont des masses supérieures à la masse du
composé parent (Mt mie 147 dont le pic correspondant présent dans tous,
les spectres examinés est toujours en très faible proportion), La for-
mation de tels fragments procède de phénomènes complexes qui ne sont
pas sans rappeler les phénomènes observés au cours de la thermolyse de
l'acide glutamique et qui ne peuvent s'expliquer que par l'intervention
de divers réarrangements moléculaires. De tels réarrangements sous
l'impact électronique ne sont pas rares et o~t fait l'objet de plusieurs
rapports (59, 63). Cependant, il faut noter - et ceci parait très géné-
ral et fort intéressant - qu'à partir ,de 133°, pour des températures
se situant au dessous ou au dessus de 249° (point de décomposition de
l'acide glutamique) les nombreux spectres que nous avons enregistrés
présentent pratiquement les mêmes principaux fragments avec seulement
des variations quantitatives de l'importance des pics correspondants.
LE têbleau 15
montre ces principaux pics et une comparaison de leurs
intensités respectives pour 5 spectres différents que nous avons pris
à titre d'exemples dans une gamme de température comprise entre 150 et
350°C.
Plusieurs remarques sont à faire
- La première est que l'on ne retrouve pas dans ces spectres les pics
observés dans le spectre réalisé à faible température ou si on les
retrouve, ce n'est que dans de très faibles proportions. Ainsi, le
pic de masse (à mie 147) qui est prépondérant, comme nous l'avons vu
dans le tableau 14, ne dépasse pas en général 6 à 7 % du pic de base.
- Le pic de base correspond, en général, à un fragment de masse mie =
55, sauf pour le spectre A dont le pic de base est à mie 69. Ce pic
est également très important dans la plupart des cinq autres spectres
- à l'exception de E - à côté d'un fragment de masse mie = 83 dont
l'intensité varie, selon les spectres, de 49 à 93 %. Il est intéressant
de noter que les deux importants pics à mie 69 et mie 55 qui sont
absents dans le spectre "ordinaire" de l'acide glutamique, sont carac-

---

TABLEA.U 'S
Comparaison des principaux pics observés dans les spectres de l'acide gluta-
mique dans un gradient de température de '50 à 400°C
,
*
mie
Int. Rel.
A(l33OC)
B(l95OC)
cC 219°C) D(317°C) r(322°C)
r< 343°C) pyrolysat
~------- --------- -------- --------- -------- --------- --------- -----------
213
2,3
3
4,7
3,9
4,9
2,4
0,3
199
1,5
3
4,1
3,7
2,1
2,4
0,5
185
3,1
4,3
5,3
5,4
3,1
4,2
0,5
171
2,9
4,5
5
5,1
5,5
5 ,5
0,3
149
11 ,3
5,4
5,2
5,3
5,3
4,6
0,2
147
3
4
4,2
6,7
6,7
4,2
a
137
6
5,2
6, l
5,3
1,2
4,4
0,2
129
7,1
12,3
19
11 ,8
11
14,6
3,9
111
13
23
21 ,5
21,1
10,5
19,5
4,9
97
53,2
62,3
44,3
55,6
16,1
32,1
,
,1
4
84
32,4
36,1
100
52,8
30,5
33,5
100
83
63,1
55,2
49,4
93,7
93,2
88,3
12,5
69
100
74,7
53,3
75,8
5
46,5
4 , II,
55
68,2
100
100
100
100
100
15,6
1 •
51
1,9
6,8
9,8
8,8
17,7
16,1
0,8
/ '
* A, B, C, D, r, F correspondent aux différents spectres enregistrés. Les
chiffres entre parenthèses indiquent les températures de passage aL! moment
de l'enregistrement.

---

149
t~rist iques, comme nous l'avoTls pl us haut, de la fragmentation des
dérivés aminés du dipyrido-imidazole et correspondent à des fragments
que nous avons caractérisés comme répondant aux formules C4H7Nt (mie 69)
+•
et C H N
(mie 55) (voir par exemple le tableau 10 et le sch~ma 2).
3 3
En troisième lieu, on constate dans les spectres des pics (de faibles
importances (2 à'5 %) mais dont l'existence est réelle) correspondant aux
,
masses mie 213, 199, 185 et 171. Or, ces masses sont les masses moléculai-
res ionisées (Mt + 1) de Glu-P-3 (mie 213), Glu-P-1 (mie 199), Glu-P-2
(mie 185) et du noyau non substitué (mie 171). Il ne peut s'agir d'une
simple coincidence, d'autant plus que comme nous venons de le voir,
l'existence de deux importants pics à mie 69 et 55 et aussi d'un autre
moins important à mie 51 laissent préjuger de la dégradation de telles
molécules. Il en résulte qu'il y a bien formation transitoire des déri-
vés dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazoliques cités plus haut, qui se décom-
posent assez rapidement sous l'effet de l'impact électronique.
- Enfin, les autres pics relevés dans les spectres, notamment ceux
'd'intensité relativement importante à mie 129, 111, 97, 84 ou 83,
correspondent vraisemblablement à des fragments résultant de l'élec-
tronolyse de ces différents produits y compris de l'acide glutamique
accompagnée d'interactions et de réarrangements intra et intermolécu-
laires intervenant au niveau de certains ions très fugaces.
En vue de c~mpléter nos informations, nous avons enregistré éga-'
lement le spectre de masse du pyrolysat de l'acide glutamique chauffé
*
'
préalablement au bec bunsen vers 40üoC pendant 5 min . . En règle générale,
nous avons obtenu une fragmentation moins prononcée que dans le cas de
l'acide glutamique avec un seul pic important à mie 84** . En tout état
1 )
de cause, nous avons retrouvé dans le spectre du pyrolysat (dernière
colonne du tableau 15) les mêmes pics que dans les spectres A, B, C, D,
E ou F bien que l'intensité relative des ions correspondants fusse beau~
coup plus faible. Cett~ constatation renforce les observations faites plus
* Le pyrolysat ainsi obtenu est dissous dans du THF avant d'être introduit
dans le spectrographe de m2sse.
** Cet ion, présent également dans les spectres A à F, constitue l'un des
fragments principaux de l'électronolY8e de Glu-P-2 (I := 51 S ; voir
tableau 10).
'

---

150
h~ut si l'on admet que l'6chantilloTI de pyrolysat introduit dans le
sppctrographe est lui-m~me compos~ ~'un m€lange
de diverses mo]fcuJes
(dues à la thermolyse de l'acide glutamique) observées dans les spectres _
(A à r) fort labiles sous l'impact électronique.
En résumé, l'analyse de plusieurs spectres de l'acide glutamique
réalisée sous l'impact électronique dans un gradient de température de
60 è 400 o C, nous a permis de mettre en évidence la formation à partir de
l3ü o C d'ions révélant l'existence transitoire du dipyrido~,2-a:3' ,2'-dJ
imidazole et des trois amines Glu-P-l, Glu-P-2 et Glu-P-3 (ou un isomère).
La formaTion de ces produits procède de phénomènes complexes - qu'on ne
peut, en toute logique, imputer à la thermolyse étant donné qu'ils ont
lieu à des températures relativement basses - mettant en jeu l'interven-
.
tio" de réactions et de réarrangements moléculaires des ions provenant
de lé décomposition de l'acide glutamique sous les effets de l'impact
électronique à partir d'une certaine température.
Le spectre de masse du pyTolysat de l'acide glutamique, bien
que moins accentué, montre les mêmes fragments.
\\
On avait déjà pu isoler les deux amines Glu-P-l et Glu-P-2 par
voie chimique du pyTOlysat de l'acide glutamique. Notre étude en spec-
trométrie de masse nous a permis de montrer qu'à côté de ces deux compo-
sés, il se forme probablement l'hétérocycle non subSTitué ainsi qu'une
troisième ~~ine qui peut être un isomère de Glu-P-3 ou Glu-P-3 lui-même.

---

151
3.7. ETUDE U.V.
Il ne semble pas que cette méthode puisse apporter de conclusions
décisives pour la détermination de la structure d'un dérivé dipyrido[1,2-a:
3' ,2'-d]imidazole. Le spectre change beaucoup avec la possibilité de conju-
gaison des substituants avec le noyau. Cependant, dans le cas des amino-6ipy-
rido[1,2-a~3',2'-d]imidazole,trois faits ont retenu notre attention en ~€a­
lisant les spectres de quatre composés :
- le composé 25a, le dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imid?zole utilisé comme référênce
,......,
et 3 amines substituées différemment, à saVOlr
- amino-2 dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
9a
~
- amino-3 diméthyl-4,5[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
12c
,.....,
amino-4 dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
24c.
,.....,
\\
La figure 22 montre les spectres U.V. des Guatre produits enregistrés
entre 230 nm et 450 mIl sur Cary 15.
Les quatre spectres présentent trois régions distinctes correspondant
aux b~~des K, B et R.
* La premlere allant de 230 nID à 280 nm, de forte absorption due aux transi-
tions TI -+- TI*. Les E sont supérieurs à 10 000.
On observe :
E 235 = 17 000
pour 25a
~
E: 250 = 13 121 pour 24a
~
E: 255 = 13 592 pour 9a
,....,.
E: 255 = 17 500
pour 12c.
,....,
On remarque que la substitution d'un hydrogène par un groupement amino
conduit à un effet batochrome, ce déplacement est plus important pour les
subs~itutions en meta et en ortho de l'azote 1 qu'en para.

---

• La deuxi ème allant de 280 nnl à 32 nnl duc à lB bande B t 011 observe un
déplacement hyperchrome pour les amines par,rappDrt au composé 256. Le
,,-....,
plus grand déplacement ét ant obtenu l~rsque la' subst i t ution se -faï t en
meta et en ortho de l'azote 1.
On observe :
E. 300 = 1 796
t 1837 =
1 837
pour 25a
,.....,
E: 398 = 2 500
t 315
= 2 375
pour 24a
~
E: 300 = 4 070
C 315
= 3 496
pour
9a
,...,
E: 300 = 5 550
c 315 = 4 922
pour 12c
........
*
* La troisième bande due aux transitions n + TI (bande R) allant de 300 nm
à 430 nm.
Dans cette région on observe un léger déplacement hypsochrome et
bathochrome sur le spectre du 24a par rapport au 25a et un fort effet
..-..-
r--
hyperchrome et bathochrome.
On observe
E
= 3 250
341
t: 358 =
3 920
pour 25a
" ' - J
E 343 = 3 107
E 355 = 2 845
pour 24a
,......"
E
= 5 845
355
E: 370
= 5 875
pour 12c
,.....,
(370 =
5 850
E:
= 5 880
pour 9a.
380
"""-

---

\\
, 154
BIBLIOGRAPHIE
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28. C.R. Hauser and G. Hauser, J. Org. Chem., 1950,1228.
29. M. Conrad and L. Limpach, Ber, 1887, 106, 1536, ibid, 1894, 24, 2990.

---

30. Cf. S. Colje9, J.K. Thomson et Y.J. Wilson, J. Chem. Soc., 1936, 956.
31. R.C. GOulO anO W.A. Jacobs, J. Amer. Chern. Soc., 1948, 893.
32. R. Adams et I.J. Pachiter, J. Amer. Chern. Soc., 1952, 74, 5491.
1
33. C.R. Lappin, J. Amer. Chern. Soc.,
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34. C.F.H. Allen, H.R. Beilfuss, D.M. Burness, G.A. Reynolds, J.F. Tinker et
J.A. Van Allan, J. Org. Chern.,
1959, 24, 779.
35. D.W. Dunwell et D. Evans, J. Chern. Soc., 1971, 1615
ibid, 1973, 1588.
36. G. saint-Ruf et Th. Silou, J. Het. Chern., 1979, ~, 1021.
37. K.J. Shah et E.A. Coots, J. Med. Chern., 1977, 20, 1001.
38. Cf. L.J. Bellamy "The Infra-reà spectra of eornplex molecules", Metheun and
Co Ltd, 1960, 271.
39. C. Grundmann in "Methoden der Organichen chernic", 4ème édition, E. Muller
Ed, vol. 1013, Stuttgart, 1965, 822.
40. E.J. Corey, K.C. Nicolaou, R.D. Balason, Y. Maehida, Synthesis, 1975, 590.
41. Tse-Lok, M. Henniger, G.A. Olah, S)~thesis. 1976, 815.
42. B. Stanovnik, M. Tisler, Tetrahedron, 1961, ~i 387 ; A. Kovaeie, B. Stanovnik,
M. Tisler, J. Ret. Chem., 1968, ~, 357 ; B. Stanovnik, M. Tisler, S. Polane,
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43. R.M.P'. Manske et Kulka in"Organic Reactions", vol. VII, J. Wiley and sons,
Ine, London, 1953, 59.
/
44. G. Berti, Gaz. Chim. Ital., 1957, 87, 707.
45. J.C~ Perche et G. Saint-Ruf, J. Ret. Chern., 1974, ~, 93.

---

157
.\\
46. N.P. Buu-Hol, N. Doo ~uong et N. Van Bac, Bull. Soc. Chim. ~e France, 19&3,
2442.
47. Cf. F. Fieser and M. Fieser in "Reagents for organie synthesis", Ed. J.
Wi1ey and sons, Ine. New-York, London, Sydney, 1967, 723-731.
48. Cf. M.L. Martin et G.J. Martil "Manuel de résonance magnétique nucléaire",
1
p. 50, Ed. Azoulay, Paris,
19~1.
49. A.E. Matter, C. Pascual, E. Pretsch, A. Pross, W. Simon et S. Steranell,
Tetrahedron, 1969, ~, 691.
50. Cf. P. Laszlo et P.J. Stany in "Spectroscopie organique", Ed. Thermann,
Par i s, 1972.
51. D.J. Rabiger et M.M. Joullié, J. Org. Chern., 1964, ~, 476.
52. J. Elguero, A. Fruchier, R. Jacquier, Bull. Soc. Chim.,1960, 2076.
53. N.P. Buu-Roi et G. Saint-Ruf, Bull. Soc. Chim., 1968, 661; Ibid, 1968,
2489
Ibid, 1970,343,1861,3945.
54. G. Saint-Ruf et L. Christiams, Bull. Soc. Chim., 1972, 4375.
55. ·J.M. Rice, G.O. Dudek et M. Barber, J. Amer. Chem. Soc., 1965, 87, 4569.
56. G. Spiteller in "Advances in heterocyclic chemistry", Ed. A.R. Katrizky,
Academie Press, New-York, 1966, vol. 7, 301-375.
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John Wiley, London.
5B. R.M. Silverstein in "Identification spectrométrique des composés organiques",
Ed. Masson et Cie Gauthier-Villars, Paris, 1968, 17-65.
59. S.E. Scheppele, R.D. Gribsby, E.D. Mitchell, D.W. Miller et C.G.R. Waller,
J.' Jlmer. Chem. Soc., 1968, 90,
3521.

---

158
&0. Y.W. Mc Lafferty, Anal. Chem., 2959,11, 82 , 2962, li, 26 , "Maas BpeC-
trometry of organic ions", Academie Press, New-York, 1963.
&1. B.R. Wesbter, Chem. Commun., 1966, 124.
62. N.P. Buu-HoI et G. Saint-Ruf, Bull. Soc. chim., 1970, 1861.
63. N.P. Buu-Hoi et G. Saint-Ruf, Bull. Soc. Chim., 1970, 3945.
r
\\
r

---

159
DEUX 1 E ME PAR T 1 E
tTUDE DE LA MUTAGtNICITt DES
DÉ R1VÉS DU D1PYR1DO [1 , 2- a : 3 ,2
dJ 1MID AZ0LE
l
1 -
ET DE LEURS EFFETS BIOCHIMIQUES SUR LE
SYSTËME HYDROXYLASIQUE CHEZ LE RAT

---

1&0
INTRODUCTION
En vue de mieux cerner l'action biologique du dipyrido[1,2-a:
3' ,2'-d]imidazole'et de ses dérivés et d'essayer d'établir urie relation
entre la structure moléculaire de cette famille de composés et leurs
effets biocides, nous les avons soumis à deux sortes de tests biologiques'
- le test d'Arnes qui est une méthode pratique et courante pour la mesure
du pouvoir mutagène des composés chimiques ;
l'étuàe de l'action de certains de ces dérivés sur la biosynthèse des
enzymes microsomales liées au système hydroxylasique chez le rat.

---

1&1
CHAPITRE l
ETUDE DE LA MUTAGENICITE DES DERIVES
OU DIPYRIDO[1,2-a:3' ,2'-dJ IMIDA20LE
Nous avons vu que les extraits de pyrolysat de l'acide glutamique
présentaient une importante activité mutagène, en particulier vis-à-vis
de la souche TA 98 de S. typhimuriurn. Les deux amines isolées de ce pyro-
lysat, Glu-P-1 et Glu-P-2 étaient trouvées, quant à elles, fortement muta-
gènes. Toutefois, l'activité de Glu-P-1 (qui ne diffère de Glu-P-2 que par
la présence d'un méthyle en position 5)est de 20 fois supérieure à celle
de son homologue Glu-P-2. En outre~ il a été montré qu'en faisant varier
la position du méthyle sur les différents sommets du noyau, on obtenëit
des variations importantes du pouvoir mutagène (K. Takeda, K. Shudo, T.
Okarnoto, M. Nagao, K. Wakabayashi et T. Sugimura, Carcinogenesis 1980, ~'
889). Des observations similaires ont été rapportées concernant les déri-
vés du Trp-P-l (amino-3 dimethyl-l,4 pyrido [4, 3-bJ indole) isolé du pyro-
lysat du tryptophane (J.M. Pezuto, P.P. Lau, Y. Luh, P.D. Moore, G.N.
1
Wogau et S.M. Hecht, Froc. Natl. Acad. Sci. 1980,22, 1427).
Ces observations sont d'importance car non seulement elles mettent
en exergue les relations qui peuvent exister entre la structure chimique
et les propriétés biologiques, mais elles soulèvent le problème important,'
non encore résolu, du mécanisme d'action des produits mutagènes. Et si
l'on admet, comme le plus plausible, le concept de la mutation somatique
comme point de départ du processus de cancérisation, il reste à connaitre
quels sont les facteurs qui influent sur la réactivité des métabolites
sur les acides nucléiques.
Dans cette perspective nous avons étudié, en collaboration avec
le laboratoire de feu le Professeur Poncelet à Bruxelles, les propriétés
mutagènes du dipyrido [1.2-a: 3' .2' -dJ imidazole et de différents de ces
dérivés portant ou non un groupement fonctionnel. 31 composés ont été testés.

---

,'1&2
Nous,avons utilis€
le méthode, maintenant classique, d'Ames qui
consiste à évaluer le pouvoir mutagène d'un composé sur des bactéries
en prfsence ou en absence d'un systAme activateur (gfn~ralement une
préparation rnicrosornale de foie de rats ayant été prétraités par un
inducteur tel que l'arochlor 1254). On utilise une souche de bactérie
Salmonella typhirnurium porteuse d'une mutation his -. c'est -à-dire 'inca-
pable de se d~velopper dans un milieu de culture ne comportant pas de
t
l'histidine alors que les souches normales dites sauvages à his
sont
capables de synthétiser l' histidine dont elles ont besoin ,à partir des
éléments contenus dans le milieu. La présence dans ce milieu d'un composé
mutagène d~clenche chez les bactéries à his
une série de mutations les
/
t
'
transformant en bactéries à his
que l'on nomme révertantes.On peut alors
quantifier la fréquence des r~v~rsions en fonction de la dose du produit
testé, en dénombrant le nombre de bactéries révertantes.
Nous avons utilisé dans ce travail six souches différentes de
bactéries :
les souches TA 98, TA 1537 et TA 1538 sensibles aux agents de type
frameshift, lesquels agissent généralement,par intercalation
- les souches TA 100, TA 1530 et TA 1535 sensibles aux agents substituants
des paires de bases de l'ADN.
En vue d'affiner nos informations sur l'activité mutagène des
produits testés, ce travail a été complété par une étude de l'induction
de l'échange des chromatides soeurs dans des lymphocytes humaines.
Les résultats sont exposés dans l'article qui suit, publié dans
Mutation Research :
- Mutagenicity of several derivatives of dipyrido[1,2-a:3' ,2 1 -èQ
imidazoles.
Il ressort, de ces résultats que

---

163
1) L'hétérocycle lui-même dipyrido-imidazole es1 dépourvu d'activit~ muta-
g~ne quelle que soit la souche de Salmonella utilisée. Il en est de
même pour ses dérivG~ chlorés ou méthylés ou portant une fonction hydro-
xyle ou m~m~ acétamide.
2) Par contre, les dérivés aminés et nitrés se sont révélés fortement muta-
g~nes m~me à de tr~s faibles doses. Il faut noter toutefois que les
compos~s dont la fonction amine se trouve en position 4 sont tr~s
faiblement actifs par rapport à ceux dont la fonction est portée en
position 2 ou 3. Du point de vue relation structure activité, la posi-
tion sur le noyau du groupement "porteur" de l'activité parait donc
importante.
3) La présence d'un groupement méthyle en position 4 augmente l'activité
mutagène: ainsi le dérivé 4 méthyle de l'amino-3 dipyrido[1,2-a:3' ,2'-dJ
imidazole est beaucoup plus actif que l'amine parente; lorsqu'on ajoute
un méthyle supplémenteire en position 7, l'activité reste toujours élevée
mai~ il n'y a pas de variation sensible par rapport au dérivé monométhylé .
en position 4.
4) Le dérivé N-hydroxylé de l'amino-3 méthyl-4 dipyrido[1,2-a:3',2'-d]
imidazole s'est révélé le composé le plus mUTagène parmi les composés
testés. Sa mutagénicité se manifeste meme en l'absence de système
activateur S9 mix. Pa~ contre, lorsqu'on transforme cette hydroxylamine
d .
"
d
A
N"OAc (
d '
. d " "
1 "
en
lacetate correspon ant
r- 'Ac
pro ult conSl ere comme
e meta-
bolite ultime sur le plan de la cancérogénèse chimique) l'activité di-
minue et nécessite pour se manifester la présence de 59 mix. Ces résul-
tats laissent penser que la N-hydroxylationde la fonction amine
constitue une étape essentielle dans l'apparition des propriétés muta-
gènes et que l'hydroxylamine constitue - du moins sur le plan de la
mutagénèse - le métabolite ultime.
5) Les résultats montrent, par ailleurs, que les composés testés exercent
principalement une activité de ty~e frarneshift, les souches les plus
sensibles étant les souches TA 98, TA 1538 et TA 1537. Cependant, il
est intéressant de noter que les composés les plus actifs exercent leur

---

activité 'gaIement vis-à-vis des Bouches TA 100 et TA 1535 sensibles
à la substitution des paires de bases.
6) Enfin, il faut signaler que les essais d'induction d'échange des chro-
,
matides soeurs ont fourni des résultats peu significatifs qui ne cor-
rèlent que faiblement les résultats obtenus avec le test d'Ames.

---

165
Mil/a/ion Rruareh. 136 (1984) B-31
23
EI~"ier
MTR 008~b
Mutagenicity of severa] derivatives of dipyrido[1 ,2-a:2',3'-d)imidazoles
',.
K.N'Goy 1, C. de Meester 1, D. Pairon 2, L. Fabry 2, B. Loukakou 3.• , C.N'Zouzi 3.• ,
G. Saint-Ruf 3.~, M. Mercier 1 and F. Poncelet 1...
.
•
1 LDbora/ory of Toxic%?,... -
UCL 71.37, AvrnllF Emmanllr/ MOllnirr, 71, 1200 BrwsrlJ. •' Mammalian GrneliC'J LDl>oral0r."
Drparrmrnl of RadlOtn%gy. CEN.· S. CI<.. Mol (Be/gillm), and J Crnlrr dr BlophYJi({llr Mo/i'cII/aire, C.N.R.S., 1 A, Avrnlle dr la
RrchrrdtF Scirn/ijiqllr, 45045 OrljanJ, CUrx (France)
(Received 1 June 1983)
(Re"i~ion received 1 November 1983)
IAccepted 4 November 1983)
Summal)'
Different derivatives of dipyrido/l,2-a:2'J'-d]irnidazoles have been investigated. as mutagens for
Salmonella lyphimurium. The nature of different substitution groups and their positiorn on the base ring
innuenced markedly the mutagenicity of these compounds. From this structure/effect relationship study, it
was demonstrated that the 2 and 3 positions were of special interest. The 3-N-hydroxylated compound was '
the most active mutagen tested. We also observed that the frequenùy found frarneshift mutagens were
responsible for base-pair substitution. Metabolic activation by liver S9 mix increased the reversion rateS of
the strains tested. The SCE a~says correlated poorly with the Salmonella/microsome mutagenicity test.
For many years, specifie attention has been
the
presence of
fortified
rat
liver. postmiter
focussed on the quality of heat-processed food-
chondrial fraction (Kosuge et al., 1978).
stuffs. Several studies haveshown that mutagens
Potent mutagens have been isolated from pyrer
were formed in mixtures of amino acids or prer
Iysates of L-tryptophan (Nagao ét al., 1977c;
teins treated at high temperature or by pyrolysis
Sugimura et al., 1977; Kosuge et al., 1978) and
(Nagao et al., 1977~b; Matsumoto et al.. 1977).
D,L-glutarnic acid (yarnarnoto et al., 1978; Takeda
On the ot~er hand, mutagens distinguishable from
et al., 1980) and were identified as arninery-carbcr
polycyclic aromatic hydrocarbons have been de-
line derivatives, Trp-P-l and Trp-P-2, and aminer "
tected in cooked foods such as meat. bakery and
dipyridoimidazole derivatives, Glu-P-l and Glu-P-
cerea1s (Pariza et al., 1977, 1979; Commoner et al.,
2, respectively. Furthermore, 2-arniner5-phenyl-
1978; Dolara et al., 1979). Mutagenic activities
p.yridine has been identified in pyrolysates of D,L-
have been observed in pyrolysates of many amino
phenylalanine (Sugimura et al., 1977) and a
acids. especially in those of tryptophan, omithine,
carbazole derivative, Lys-P-l, bas been isolated
glutamic acid, serine, lysine and creatine. Sorne
from pyrolysates of lysine (Wakabayashi et aL,'
ex tracts of these pyrolysates were highly active
1978). Two amino-a-earbolines bave been isolated
towards Salmonella lyphimurium strain TA98 in
in pyrolysates of soybean globulin (Yoshida et aL,
1978) and Glu-P-2 has been isolated from casein
• Pre1iminary results were pr~nted al the 3rd International
pyrolysate (Yamaguchi et aL, 1979). Trp-P-1 and
Conference on
Em;ronmental
Mutagem. Tok)'o Con·
Trp-P-2 have been synthesiz.ed (Akirnoto et al.~
ferena. 21-24 Seplember 1981.
•• Thi~ paper is dedicaled to the memory of Professor F.
1977).
Poncelcl.
These compounds exert mutagenic activity ter
. 0165-12,J8/&4/S03.00 (l 19&4 Eh.cv;er Science Publishen B.V,

---

, J bb
wards the S.
ryphimuriwm
stralO~ sensilive 10
Moleculaire. CNRS, Orlèans, France (Saint·Ruf et
frameshift mUlagens in the presence of fortified
a\\.. ] 98 1),
liver postmitochondrial
fractions, Trp- p.)
and
SROI. 4-11minodipyridolJ.2-D:)',2'o4 ]imidazole
Trp-P-2 produce celliransformalion in cullures of
5R02, 4-Bmino- 7·melhyldipyridoll.2.g:3' .3'·d ~mldll:wlt
hamster embryo cells and sister-chromatid e,,·
5R03, 4-11mino-2.mrlhyldipyridolJ.2.g:3'.2'o4 ~mida:wle
change (SCE) in cultures of hum an Jymphobla~l~
5R04, 4-omino-2,7-dimethyldipyridol 1.2·a: J'.2'04 limidawle
(Takayarna et al., 1977), Trp-P-1 produces malig·
5RO~, 4-acelamido-7-methyldipyridoll.2-a:3'.2'o4)imidawle
5R06.4-Bcelamido-2-methyldipyridoll.2-a:3',2'o4)imidalole
nanl cell transformation in hamster embryo celh
5R07,
4-8celamido-2.7.dimelhyldlpyrido(l.2-g:3'.2'.d ).m-
(Takayarna el a\\., 1978)
Trp-P-l, Trp-P-2 and
idawle
Glu-P-l produce sister-chromatid exchang,es in hu·
5R08. dipyridolJ ,2-0:3'.2' -d limidazole (ba~ ring)
man Iymphoblasts in vitro (Tohda el al.. 1980).
5R09. 7·melhyldipyridol J .2·a:3'.2'o4)imidazole
Glu-P-] induces cell transformation in culture~ of
SR 10, 2-melhyldipyridol !.2-a: 3'.2'04 )imidazole
SR Il. 4-chlorodipyridol 1.2·a:3'.2'.d )imidazole
hamster embryocells (Takayama et al.. 1979)
SR 12. 4-chloro-7·melhyldipyridol 1.2'0: )'.2'-d ~midawle
In the presence of rat l.iver microsomaJ frac-
SR 13, 4-chlom·t>-melhyldipyrido{ 1.2-o:3'.2'-d~midalOle
tions, Glu-P-l reacted with DNA by covalent bin-
SR 14. 4-chloro-2-methyldipyrido{ 1.2-D:)',1'-d )imidawle
ding of guanine 10 C-8 (Hashimoto et al.. 1979).
SR 15, 4-chloro-2,7.dimethyldipyridol1.2-D:3'.2'o4 )imidalole .
and modified the DNA structure by non-covalent
SR 16. 4-chloro-2.6-dimethyldipyridol1.2-o: )'.2'o4[imidazole
SR 17. 4-chloro-2.9.dimelhyldlpyridol1.2-o:3',2'o4 )imidaz.ole
intercalation between base pairs (lnamura et al..
SR 18, 4-hydrox)'-7.methyldipyridol J .2'0:3',2'-d)imidawle
1980). An active metabol.ile of Glu-P-l reacting
SR 19. 4-hydroxy-6·méthyldipyridoll,2-a3'.2'-d)imidarole
~
with DNA has been identified (Hashimoto et aL.
SR20. 4-hy'droxy.2.methy1dipyridol1.2-a:3',2'04 )imidawle
1980),
SR21. 4-hydroxy-2. 7-dimethyldipyridol 1.2-0:3',2'-d )lmidawle
SR22. 2·aminodipyridol1.2-a:)',2'04 )imidawle (Glu-P-2)
The mutagenic activity of tryplophan pyro-
SR23. 4-methyl·)-nitrodipyrido{ l ,2-0:)'.2'04 ]imidazoJe
Iysates towards lung cells has been demonstrated
SR24. 4.7-dimethyl-)-nitrodipyridoll.2-u.3' )'04 jimidazole
following i.p, injection of basic extracts (lnui el al.,
SR2~. )·amin04methyldipyrido{l,2.a:)',1'-d)imidawle
1980),
SR26. J-&nÙnC>->4, 7-dimethyldipyridoll.2..q:)')'04 ~midawle
These basic extracts and Trp-P-2 are hepato-
SR27. J-acelamid04melhyldipyridol1.2-D:)'.2'-d ]iinidawle
carcinogenic for rats (Matsukura et aL 1981a;
SR28.
3-acetamido-4.7 -dimelhyldipyridol J .2-0 :3'.2' -d pm·
idawle
Hosaka el al., 1981); Trp-P-l and Trp-P-2 are
SR29, J-arninodipyrid0{ 1,2-0:3',2'04 }imiduole
hepatocarcinogenic for ~ce (Matsukura et al"
SR3û. 3-N-hydroxy-4-methyldipyridol1.2..q: 3'.1'o4}imidazolr
1981b), females being more sensitive than male~
SR 31.
3-1'/, N -diacetoxy-4-methyldipyridoll ,2·a: 3',2'·d )im·
(Matsukura et al., 1981a,b; Hosaka et al., 1981),
idazoJe
A synergistic effect could result from the pres-
The cherruca) structure of the base ring is as
ence of Trp-P-l and ioniz.i.ng radiation (Borek and
f01l0ws:
Ong. 1981).
,
In the present study, Glu-P-l, Glu-P-2 and
various derivatives of dipyrido{l,2-a:3',2'-dJim-
idawle have been compared for their mutagenic
activily, the aim of this study being to gain a
better understanding of the role played by differ-
ent groups at different positions on the same base
ring,
AIl these derivatives were lept in the dark
under nitrogen and al low temperalure until use.
Materi2k and metbods
Solutions in ethanol or dimethy) sulfoxide (DMSO)
were prepared immediate)y before use. The purity
Chemicals
of these compounds was checked by thin-layer
An commercial products were of the pures!
chromalography on silica gel plates. Ail corn-
grade avàilabJe, The fo1Jowing compounds were
pounds
migrated
as
single
spots with
pure
synthesiz.ed
in 1 the
Centre
de
Biophysique
methanol as solven\\.

---

157
2S
Animais
(Ham. 1963). 5-BrdU (10 p.g/ml) was added al the
Adult male Wistar rats (200- 250 g) were fed a
initiation time. After 48 h, dilutions (10 ",1) of
lllandard diei. Rats were inj~ted intraperitoneally
5ubstrate in DMSO were added. In the presence of
(dose: SOO mg!lg body weight) with Aroclor 1254
59 mix, the cells were incubated, for 2 h only, in
diluted in corn oil (200 mg/ml) 5 days prior to
medium containing 59 mix (final dilution 1/20)
sacrifice.
and the test compound. Wilh Glu·P·2, additional
Salmonella typhimurium strains TA98, TAI 00.'
experiments were performed usïng various. dura-
TA1530, TA1535. TA1537 and TA1538 were ob·
tions of incubation: 20 min, 60 l11in and 5 h.
tained through the courtes)' of ProL B.N. Ames.
Afterwards, the cells were centrifuged at 900 rpm
for 5 min, washed twice with fresh medium and
Metabolic octivoting system
finally suspended in medium with BrdU for an
The postmitochondriaJ fraclions (59) were ob·
additional incubation time of 22 h. 3 h before
tained from 3 pooled raI Iiver~. the homogenale (3
harvesl, colchicine solution (}O- 5 M) (l ml/cul-
ml of 0.15 M KCl/g wet liver) of which was
ture) was added to accumulate metaphase cells.
centrifuged as described (Ames et al.. 1975). Prep-
After trealment with KCI (0.075 M), the cells were
aration of the 59 mix was performed according to
fixed in methanol-aeetic acid (3: 1), spread on
Ames et al. (1975) by adding MgCI] (8 p. moles/ml
slides and stained by a technique derived from
mix). KCI (33 p.moles/ml mix). sodium phosphale
thal of Perry and Wolff (1974).
(100 p.moles/ml mix). glucose 6-phosphate (5
Arter treat~enl with Hoechsl 33528 dissolved \\
p.moles/ml mix) and NADP- (4 p.moles/ml mix).
in phosphale buffer for 10 min, the slides were' ,
59 mi:\\ contained 100 p.1 59/ml mix.
rin~ed and expo~ed to Iight for 24 h. They were
then transferred into a solution of sodium citrate
Mutagenicity asso)'s
for 30 min at 65°C and stained with Giemsa (5i)
Tests were perforrned ln triplicate by m.lXlng
for JO min. Cyclophosphamide (10- 4 M) was used
substrate
dilutions
(0.1
ml/plate),
2-7 X lO~
as a' positive control and DM50 as a negative one.
bacteria from an overnight culture in nUlrient broth
(Difco) per plate,
±59 mix (0.5 ml/plate) in
ResuJts
histidine-biotin-supplemented
top
agar
(2
ml/plate). This was then layered on minimal glu·
Mutagenicity as50ys with Salmonella typhimurium
cOse agar (Vogel-Bonner E medium) in p~tri dis-
(1) No significant mutagenic effec;J.s were de-
hes. The plates were incubated for 48 h at 37°C in
tected at any tested levels, in any experimentaJ
the dari; and the numbers of his+ revertant col-
conditions, towards any strains of S. typhimur;um
onies/plate counted.
with the following derivatives: SR05, SRJO, SRI L
The to~city of the substrate was evaluated by
SR12, SR13, SR14, SRI5, SR16, 5RlS, SR20 and
determining the bacterial survival: the procedures
SR2L
were similar except that the number of bacteria
(2) Direcl and S9 mutagenic activity are pre-
"
was lower (lOb-fold dilution), and the top agar was
sented in Tables 1-3 in whieh derivatives are listed
poured onto nutnent agar. The characteristics of
following the nature of the substitution groups and
the strains and the activity of the 59 liver fraction
their positions on the base ring. AlI derivatives
were tested following the reeommendations of
were tested al the following doses: 0.1,1.0,10,100
Ames et al. (1975) and de Serres and 5helby
and 1000 p.g/plate. Only the doses at which posi-
(1979).
tive results were observed are presented, in the
tables. Reversion values that were at least twice
Sister-chromatid exchange
the spontaneous reversion rate are italic as positive
Human lymphocytes from 1 healthy female
effects in the tables.
donor were used. 5amples (0.5 ml) of whole blood
Toxic effects such as a lowering of the bacterial
were incubated at 37°C for 72 h in 5 ml of Ham's
background lawn was observed only at concentra-
FlO medium supplemented with 10% bovine serum,
tions of 1000 p.g/plate (SR22, SR29 and SROl).
phytohemagglutinin and streptomycin-penicillin
The base ring (SROS) was mutagenic only at high

---

158
26
concentrations 0000 /olg/plsle). wherea5 ils arnino
compound (SR25) was much more aClive Ihan the
derivatives were detected al 0.1 /olg/plale. These
parent compound (SR29) (Table 1). The mulagen-
compounds were mutagenic in the presence of the
icily of the 4.7-dimethyi derivative (SR26) was
metabolic acli va tion mix 1ure (S9 mix) excepl for
quile similar 10 thal of the 4-methylated derivative
SR01. The 4-methyl derivative of the 3-amino
(SR25). The 4·melhyl derivalive of the 3·acelamido
TABLE 1
DIRECT AND INDIRECT MUTAGENIC ACTIVln' OF 3·AMINODIPYRIDOIMlDAZOLES AND DERIVATIVES
Compound
Con~nlralion
Numhcr of Iù~' rcvenanl colonie~/plale'
("g/plale)
TAl00
TA9f:
TAI53g
- 59
.. 59
-59
.. 59
- 59
.. S9
5R08
0
B4
100
12
28
11
24
100
197
92
10
36
8
35
1000
172
86
19
105
6
100
SR29
0
220
85
18
27
Il
20
0.1
215
110
15
95
8
70
1.0
165
260
16
540
10
51]
10
180
]7
10
SR25
0
2li
143
36
18
15
34
0.01
198
ISO
32
217
20
281
0.1
220
563
28
1600
28
1600
1.0
209
:> 2 (}(J()
30
:> 2000
23
:> 3 ()IJ(j
10
228
(T)
35
(f)
29
(T)
SR26
0
19J
143
23
18
20
36
0.01
220
130
18
108
15
295
0.1
213
295
13
:> 2000
18
:> 3000
1.0
190
:> 2000
27
:> 3000
20
:> 3000
10
182
(T)
75
:> 3000
75
(T)
SR27
0
107
100
24
43
17
37
0.1
120
Ils
33
60
13
70
1.0
Ils
218
20
~35
14
480
10
130
:> 2000
16
2 ()(JO
16
2000
SR28
0
IS8
166
18
36
12
13
0.01
138
100
10
36
22
~4
0.1
180
120
19
85
12
52
1.0
183
140
10
225
9
400
10
21S
535
17
:> 2000
11
:> 2000
5R30
0
101
IS6
15
19
16
20
0.001
97
93
13
70
11
98
0.01
92
120
13
~OO
7
580
0.1
100
:> 2000
30
:> 2000
41
:> 2000
1.0
162
(Tl
300
:> 3000
800
:> 2000
SR31
0
81
82
22
24
10
14
0.1
87
108
2f:
63
6
84
10
95
:> J 000
29
:> 2000
8
:> 2000
100
100
:> 1 ()()(I
125
:> 1000
115
:> 2000
Mean values of as!HlY~ performcd in lriplicale .
• Daia in Îlalics are 6igniricanll)' dirferenl from Ihe 6ponlaneou~ reversion raIe' Ali compound~ ,.,ere diluled ""ilh absolule clhanol.
(T) refen 10 ,i~ible IOxic errecl~.

---

169
TABLE 2
DIRECI AND INDIRECï MUTAGENle- ACT/VIn' OF 4-AM/NODIPYRIDOIMIDAZOLE.S AND DERIVATIVES
Compound
Con~nlr8lion
Numbtr or hib· re-vertanl colonieb/plalt •
(pg/pIAle)
TA100
TA98
TAI538
-sv
~ 59
- 59
~ 59
- 59
~ 59
"
SROI
0
160
90
23
40
16
25
0.1
176
105
18
40
23
30
1.0
151
110
18
4~
18
31
10
172
120
21
54
20
43
100
170
175
20
440
17
230
SROJ
0
120
130
33
37
15
26
10
115
128
23
50
20
43
100
119
1'78
21
143
23
10.\\
SR02
0
168
125
22
23
19
19
10
135
19(\\
18
87
J7
78
100
114
250
160
728
170
380
SR04
0
135
129
24
39
22
39
10
125
19(\\
23
90
14
55
100
114
229
4(1
J19
21
292
SR06
0
165
97
14
25
7
23
10
170
94
24
31
11
22
100
90
135
40
20
26
(T)
SR07
0
91
92
12
29
'7
19
10
80
61
21
11
4()
7
100
85
72
14
15
8
15
Mean valu~ of Ilssays per/ormed in IripliCille.
• OaLa in ilillies are significanuy different From the sponlilneous re-version rilles. Ail compound, were diluted wilh Ilbsolule elhanoI.
(T) re/ers 10 visible loxie erfeclS.
compound (SR27) as weIl as the 4,7-dimethyl de-
(SR06) revealed a very weak direct mutagenie ae- i
rivative (SR28) were potent mutagens, in the pres-
tivity as did the 2,7-dimethyl derivative (SR07).
ence of S9 oùx. The N-hydroxylated 4-methyl
No increase in reversion rates was observed with
compound (SR30) was the most active mutagen
these compounds in the presence of S9 OÙX, on
tesled. Substitution of the hydroxyl group by 2
any of the strains tested.
acelyl functions (SR3l) decreased these effects
The data of Table 3 reveal a very low mutagen-
markedly.
icity of the base ring when it is substituted by.a
Compared to the data given for SROl, the val-
melhyl group in· position 7 (SR09) only. The
ues shown in Table 2 demonstrale that, in the
2-methylated compound (SRlO) was complete!y-'
presence of S9 OÙX, substitution decreased the
inactive. The presence of a hydroxyl group in
mutagenicity when the methyl group was at posi-
position 4 simultaneously with a methyl group in 7.
tion 2 (SR03), whereas the mUlagenicity increased
(SRl8), 2 (SR20) or 2,7 positions (SR2l) yie!ded
when methylation was at position 7 (SR02). The
inactive compounds. When the same hydroxylated
2,7.dimethyl derivative of the same 4-amino com-
derivative is methylated .in position 6 (SRl9) low
pound (SR04) had a mutagenic activity compara-
mutagenic effects were observed.
ble to the parent compound (SROl). Whereas the
The two 3-nitro compounds tested revea.Jed
4-acetamido derivative (SROS) was completely de-
c10sely related mutagenie effects, independent of
void of mutagenic activity, the 2-methyl derivative
the methyl substitution in the 7 (SR24) or 4 (SR23)

---

, 170
TABLE 3
DIRECT AND INDIRECT MUTAGENIC ACTIVIn' OF MISCE.LLANEOUS DIPYRlDOI MIDAZOLE.S (2·AMINO. 3.NITRO.
4-CHLORO AND 4.HYDROXY)
Compound
Concenlration
Num~r or lU.' r~eTlanl colonie~/plale·
( /li/plaIe)
TAlOO
TA9~
TAI538
- 59
.. 59
- 59
.. 59
- 59
.. 59
5R22
0
187
134
26
25
12
27
0.1 '
170
269
30
108
22
70
1.0
1~
840
20
585
13
118
10
220
> 3000
32
> 3000
lb
> J {)()(I ,
SR23
0
192
Ibb
27
30
9
30
0.01
198
115
17
4(,
31
57
0.1
220
Il _~
56
250
87
]31
1.0
1000
> ]000
550
> 2{)()(;
650
> 2000
ID
> 2000
> ]000
> ]000
> }OOO
1 (}()O
> UXXi
SR24
0
99
101
27
30
8
20
0,1
179
350
58
260
66
238
1.0
> ](X)O
> }OOO
150
> 2 ()()(I
781
> 2{)()(I
JO
> 2 {)()(l
> 2 ()()(I
> ]000
(T)
545
> 20()(J.
SR17
0
150
70
lb
32
8
14
100
145
72
16
70
12
28
1000
150
70
22
90
37
(Tl
SRI9
0
86
110
14
24
13
18
100
101
119
10
19
8
18
1000
109
127
12
17
7
12
Mean value; or a~say~ perronned in triplicate wilh compound~ diluled in abwlute elhanol (SR12. SR17) or DMSO (SRI9. SR23.
SR24).
• Dal2 in i18lic~ are significanlly dirrerenl from the sponlanemu reversion raIes. Ali compound~ were diluled 'l"ilh abwlule eths.nol.
(T) rden; 10 visible to>ùc effecls.
position. From the 4-chloro derivatives lesled, only
SR14, SR15, SR26 and SR31) are also active on
the 2,3-àimethyl-substiluted compound was a fairly
the base-pair-substitution-sensitive strain TAI 535
weak mutagen (SRI7). The other 4-chloro deriva·
and even more lowards TAl00. Melabolic activa-
tives lested were: the 4-chloro base ring (SRll),
tion is usually needed to reveaJ the mutagenic
the 4-chloro, 7-methylated (SRI2), 6-methylated
activities and it can he observed thal the doses
(SR13),
2-methylated (SRI4),
2,7-dimethylated
detecled are generally )ower in the presence of S9.
(SR15) or 2,6-dimethylated (SR16). None of them
nwe This seems to indicale that the mutagenic
showed mutagenic activity at concentrations be-
activity of these compounds is associaled with
tween 10 and 1000 Ilg/plale.
different metabolic pathways.
Considering the strains tesled, il appears thal
the compounds investigated are main!y active by
Induclion of seEs in human lymphocytes
frameshifl mutagenesis. TA98 and TA1538 are
As expected. cyclophosphamide in the presence
frequenlly the most sensitive strains, whereas
of melabolic mUture increased (P < 0.01; Sludent
TA1537 was 'a1so reverted by sorne compounds
test) the SeEs above the values observed in the
(e.g. SROl, SR02, SR03" SR04, SR25, SR26, SR27.
controls (Table 4). The yield of SCEs was slightly
SR28, SR30 and SR31), mainly in lhe presence of
higher in the ceUs treated with Glu-P-2 chi~ny in
S9 rnix.
the presence of S9 rnix. Prolongation up to 5 h of
The mosl mUlagenic compounds (e.g. SR23.
the incubation tirne wilh Glu-P-2 enhanced the

---

,
]7]
29
TABLE.
gens. mainly for strains T A98 and TA 1538. {
sn.,) INOUCEO IN HUMAN LYMPHOCYTES BY Glu·P·2
Substitution of the base ring (SR08) by amino
IN THE. PRESENCE AND IN THE ABSENc"E OF RAT
groups al the 2 or 3 position (SR22. SR25, SR26,
L1\\'ER HOMOGENATE (59 MIX) (~ cells uamined pel
SR29) increases markedly the mutagenic effects
treal~nl)
compared 10 position 4 (SROl, S~02, SR03, SR04).
When the 3·amino derivative (SR29) is further
Trealmenl
Concentration
Incubation
SCE.J./celJ
substituted in positions 4 or 4,7 by methyl groups
li' moles)
lime (h)
(SR25. SR26). the mutagenicity is increased. This
Walt S9mlA
finding is similar to the conclusions published by
OMSO
2
6.,4
Cyc:lophosphamide
JO' •
2
20.1\\4
Takeda
et
al.
(1980) on
2-ammodipyrido{1,2-
Glu·P,2
JO- •
2
,,68
o:3',2'-dJimidaiole (Glu-P-2) substituted by methyl
JO' 5
2
8.9~
groups at positions 4 and 6.
JO' •
2
10.24
10' )
The importance of position 3 is also noted with
2
10,~
reactive groups other than the 3-amino derivatives
K'u!K>u; 59 miA
(SR2S. SR26); e.g. the 3-nitro (SR23. SR24), the.
OMSO
24
7.68
3-acetamido (SR27. SR28), the 3-N-hydroxylated
Cyc:lophosphamidc
JO' •
24
8.,6
(SR30) and the 3-N. N-diacetyl derivative (SR3])
Glu·P·2
JO' ~
24
7.12
\\0"
24
9.sD
are slrong mutagens. ln contrast, resulls from test-
JO' )
24
9.90
ing these other compounds seem to imply that
positions 4. 6 and 7 are not very important for
SCE frequency by as much as 12.42/ceIL The celb
mutagenicity. The fact that the 3-N-hydroxylated
treated with the SR25 compound did not show
compound (SR30) is the most potent mutagen
any difference in the mean number of SeEs per
tested. even wjthout S9 mix as melabolic activator"
cell. whereas in the presence of the liver homog-
is consistent with the hypothesis that the proxi-
enate a slight increase, similar to that obtained
mate
forms
or
these
amino
compo'unds
are
with Glu·P·2. was observed for the highest doses.
hydroxylamines, as aiready observed for Glu-P-2
11 must be pointed out. however. that the SCE
(1aleda et al., 1980; Hashimoto et al., 1980). This·
data are based on observations perforrned on hu-
conclusion is aiso supported 'by the assays with
man lymphoc)1es from one individual only. Fur·
mono (SR27) and diacetyl (SR31) derivatives of
thermore the inerease observed in the yield of SCE
SR30 which are much less mutagenic than the
remains lower than the doubling of the basal
hydroxylated compound (SRJO).
frequenc)' generally considered as demonstrative
Whereas the resuhs of experimenls wilh the S.
(Sandberg, 1982). The biologicaJ significa.nce of
I}phimurium test system did not correlate with the'
this small enhancement of SCE frequeney appears.
SCE assays on Glu-P-2 and SR25, it seems most
therefore, questionable.
probable that the various compounds tested ael by
different mutagenic mechanisms. This is illustrated
Discussion
by the very active nitro derivatives (SR23, SR24)
that are revealed as potent direct mutagens to-.
Glu-P-l and Glu-P-2 may be considered as
wards ail the strains tested.
isosteric amines of the carcinogen 2-aminonuorene,
the lauer sometimes being generated during the
ACKnowledgements
pyrolysis process. Consequently. these compounds
and
various derivatives of dipyrido{1.2-o: 3'.2'-
This work was supported by a grant' from the
djimidazole have been synthesized (Saint-Ruf et
Ministry of Public Heallh-lnstitut d'Hygiène el-
al.. 1981) to provide a beuer understanding of the
d'Epidémiologie (Director: Prof. Dr. A. Laron-
biological and mutagenic activities of lhis family
taine).
of compounds.
We are indebted to Prof. A. Léonard (Mam-
The data presented reveal that most of the
malian Genetics Laboratory, C.E.N.·S.C.K .. Mol)
synthesized compounds lested are indirect muta-
for eritical reading of the manuscript.

---

172
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YafNlmNo. T .. K. Tsuji. T. Kosuge, T. OkamOl". K Shudo. K.
mun .. 83. 91 ~- 920.
Taleds. 'l'. lil8\\.:a. K. Yamaguchi. Y. Se,n".' Yahagi. M.

---

17l.4
CHAPITRE II
EFFET BIOCHIMIQUE SUR LE SYSTEME
HYDROXYLASIQUE CHEZ LE RAT
Une approche possible dans la compr~hension du m~canisme d'action
des agents mutagènes ou cancérogènes consiste à étudier leur comportemen~­
vis-à-vis du système hydroxylasique chez l'animal. Ce système joue un rôle
important dans le métabolisme et la détoxification des composés exogènes
par hydroxylation.
L'oxydation de la fonction amine se fait par l'intermédiaire du
système d'oxydases à fonction mixte localisée dans le reticulum endoplas-
mique (S.S. Thorgevison, D.D. Jollow, H.A. Sasame, 1. Green et J.R.
Mitchell, Molecular pharm. 1973, ~, 398 ; E. Hara, K. Kawajiri, O. Gotch
et Y. Tagashira, Cancer Res., 1981,41, 1981). Ces auteurs ont montré- le
rôle du cytochrome P 450 dans la métabolisation de l'ac~rylamino-2 fluo-
rène. Kiese (M. Kiese, Pharmacol. Rev., 1966, ~, 1091) a dressé une
liste assez détaillée des amines et amides aromatiques qui sont N-oxydés
in vitro par les microsomes du foie de différentes espèces animales ; tan-
dis
que Enomoto (M. Enomoto et K. Sato, Life Sei., 1967,88) mettait
en évidence l'induction de la N-oxydation des amines par les microsomes
de foie humain. L'activation des amines peut se résumer par le schéma
suivant
..... R
AR - N - R
'M
Ar - N ... OH
microsomes + 02 + NaDPH
Le système monooxygenase P 450 joue un rôle clé dans le contr$le
et le métabolisme des drogues à l'intérieur des cellules. Le cytochrome

---

175
"
P 4S0 a pour effe1 d'introduire dans la structure des substarlces exog~ne5
des groupements hydroxylés pour les rendre plus hydrophiles et par con-
séquent plus facilement éliminables ; c'est donc avant tout un rôle
détoy.if icateur.
Mais il arrive que certains composés de transformation soient
eux-mêmes plus nocifs pour l'organisme que les produits de départ.
C'est le cas des composés mutagènes ou cancérogènes (hydrocar-'
bures~ ~nines) qui ne doivent leur activité indésirable qu'à leur inter-
action avec le cytochrome P 450 et le système monooxygénase à fonction
mi>:te dont découle leur transformation en espèces électrophiles capables
de réagir avec les macromolécules cellulaires.
L'une des caractéristiques du système monooxygénases dépenàantes,
àu cytochrome P 450 est son inductibilité : certaines substances appelées
inducteurs peuvent~ en effet~ stimuler leur propre transforma:ion méta-
bolique ou exalter le métabolisme d'autres composés qui ne leur sont
pas apparentés chimiquement. Ceci se fait par une augmentation de la
bios)~thèse protéique. D'autres substances peuvent, au contraire, inhiber
ceTTe biosy~thèse et transformer les propriéTés biochimiques du cytochrome
P 4)0 eT des enz)~es dépendantes. On comprend~ dès lors, que l'effet
inducteur ou inhibiteur de tel ou tel produit exogène sur le système
hydro~ylasique hépatique jouera un rôle important dans le devenir de
ce produit dans l'organisme. Plusieurs auteurs (D. Mansay, Biochimie,
1978,~, 969 ; T.A. Connors et al., Bioch. Pharmacol., 1974, ~, 115)
ont montré l'importance de ce phénomène en cancérogénèse chimique.
Nous avons consacré un deuxième chapitre de la deuxième partie
de ce mémoire à l'étude des effets biochimiques de nos composés sur le
cytochrome hépatique P 450 chez le rat et sur deux systèmes enzymatiques
qui en dépendent :
- la zoxazolamine hydroxylase (Z-h-ase) et
- la diméthyl nitrosamine déméthylase (DMN-dase).
Les résultats sont exposés dans l'article lIBiochernical effects
of sorne derivatives of dipyrido[1.2-a:3'.2'-d]imidazole related to protein
pyrolysates on rat liver microsornes ll paru dans Carcinogenesis.

---

176
Eiiet exerc~ sur le taux du cytochrome P-45D
Les animaux traités sont examinés sous anesthésie 24 heures après
le traitement, leurs foies prélevés, pesés, homogénéisés par centrifugat,Ïon.
On utilise la fractio~ mitochondriale. Le cytochrome P-450 est mesuré selon
la technique de Mc Lean en mesurant l'intensité du pic de
l'homogenat à
450 nm. Les résultats sont exprimés en nanomoles par g de foie frais.
Les résultats montrent que les composés étudiés se divisent en
deux groupes :
a) Ceux qui induisent la biosynthèse du cytochrome P 4S0 : ce sont les composés
non fonctionnels ou porteurs d'une fonction amine en position 4.
b) Ceux qui inhibent la formation du cytochrome P 4S0, ce sont les composés
porteurs d'une foncTion ali,ine en position 2 ou 3 et les dérjvés nitrés
correspondants.
Effet sur la biosynthèse dela zoxazolamine hydroxylase
La zoxazolamine ou arnino-2 chloro-S benzoxazole est un composé
qui avait été conçu comme relaxant des muscles
squelettiques et comme uri-
cosurique.
Il a la propriété de provoquer chez le rat une paralysie, totale
1 à 2 minutes après son injection par voie intrapéritoniale. La zoxazolamine
hydroxylase est l'enzyme qui intervient pour detoxifier le produit par
hydroxylation du noyau benzénique. Certains composés ont la faculté d'in-
duire la biosynthèse de cette enzyme, d'autres, au contraire, de l'inhiber.
On a là un moyen fort commode de mesurer l'effet de ces produits sur ce
système enzymatique.
Les fats sont prétraités par les produits à tester; 24 heures
après, ils reçoivent une dose de zoxazolamine et il suffit de mesurer la
durée de la paralysie par rapport à un lot témoin qui n'a reçu que'de la
zoxazol~ine. L'activité inductrice sera d'autant plus grande que la durée
de la paralysie sera plus courte par rapport aux témoins, et, inversement,

---

177
plus cette durée sera longue plus l'effet inhibiteur sera grand.
Les résultats obtenus sont ceux déjà observés pour la biosynthèse
de cytochrome P-450. à savoir que les produits testés se divisent en deux
groupes :
- Ceux qui exercent un effet inducteur, ce sont les produits non fonctio-
nalisés ou porteurs d'une fonction amine en position 4.
- Ceux qui sont inhibiteurs, les amino-3 dipyrido
imidazoles et leurs
dérivés nitrés ainsi que le Glu-P-2.
L'effet sur La di~éthyL nitrosamine deméthyLase
Cet effet s'exerce en sens contraire des deux premiers
Le Glu-P-2, l'amino-3 dipyrido
imidazole ainsi oue ses dérivés DiTrés
sonT inducteurs de la DMN-ase.
- Les autres composés, sont répresseurs de l'enzywe.
En résumé, cetTe étude a montré que les çomposés se divisaient
en deux groupes :
1°) Ceux qui répriment le cytochrome P-4Sü et inhibent la zoxazolamine
hydroxylase. Ils induisent la DMN-d-ase : ce sont le Glu-P-2 et les
composés porteurs d'une fonction amine ou nitro en position 3.
2°) Ceux qui exercent des effets inverses : induction du cytochrorne P-4Sü
eL de la zoxazolamine
hydroxylase et répression de la DMN-d-ase.
Le cytochrome hépatique P-4S0 et les monooxygénases qui en dépen-
dent interviennen~ dans la détoxification des substances exogènes. On peut
présumer que l'action toxique sera d'autant plus grande que un composé
, sera capable de réprimer la production ou le travail du cytochrome P-4S0.

---

178
L'étude de la mutagénicité des dérivés du dipyridoU.2-a:3' .2'-d]
imidazole a montr' que les dfrivfs non porteu~s de groupements fonctionnels
étaient pratiquement d'pourvus d'activité mutagène. de même que les dfrivés
4-amino et4-acétarnido
sont très faiblement mutagènes. tandis que le Glu-P-2,
les amino-3 et nitro-3 dipyrido imidazoles sont des puissants mutagènes.
Il découle de cette étude une certaine corrélation entre effets biochimiques
sur le système hydroxylasique chez le rat et pouvoirs mutagènes vis-à-vis
des bactéries.

---

179
BiOchemlcal effects or some derl\\'Blj"es of dipyrldo[ 1,2-8:3:2' -dJlmid-
azole related to proteln pyrolysates on rat U"er mlcrosomes
G.Sainl·Ruf, B.Loukakou Ilnd
in rat Iiver: the zoxazolamine hydroxylasc, 8 typical micro-
Do Pbuoc Hllen (ckocœsed)l,2
somal oxidative enzyme, and the dimethylnitrosamine-N-
demethylasc (DMN-d-ase)*, the enzyme thal metab61im the
Cellrt dt Bioph)'liiQur MolmJlairt. CNRS. lA. AYr. lk la Red~c~
ScientifIQue. F--tS04S Orlcan~ Cede... and 'INSERM. Unilt Si. BP 14.
dangerous alkyl nilrosamines. It is weil known that the micro-
F·31320 Vigourl Auzil. Franct
somal mixed function oxidase system, cenlered on cyto-
'Thi~ papeT is dedicalrd 10 his mnnor).
chrome P-450 plays a basic role in the metabolism of exo-
~eral deriv"tins of dlpyrido[ J,2-11:3' ,2 , ~ ]imidarolr re·
genous produets in animal organism and in mULagenic and
tated to protein p)'rol)"SStes hal't been studied for lheir effects
carcinogenic process (19 - 23). Using differenl mol ecu Iar
on the P450 system of hepatic parenchyma end Iwo depen-
forms of purified C}1ochrome P-4SO Ishii et ~/. (24) repor'lCd
dmt monoxidase eflZ)mes, zoxazolamlne hydrox)'lasr and di·
thal the mUlagenicily of Glu-P-I and Glu-P-2 to S. ryphi-
meth)1nitrosamine-N«methylase (DMN~-ase). We lound
murium TA 98 was efficiently cataliysed by this enzymalic
that the cOmpounds aU1 bf divided Inlo two groups. The firsl
system.
group consists of compounds whieh Inhiblt the production of
ln the present study we have examined the action of 16'
cytochrome P450 and zoxazolamine h)'droxylase end induœ
derivatives relaled 10 Glu-P-2 on the P-450 monooxygenase
~ formation of DMN~-tie;these compounds are known to
system and we round that this aClion was dependent on thé
he powerful mutagens. The compounds of the second group,
structure of the tesled molecules.
....
non-mutagens or weaJ. mutagens, have an opposite l'ffect:
the)' induœ the bios)"nthesis of C)·tochrome P-450 and zox-
Materials and methods
azolamine bydroxylase and repress the production of DMN-
Figurt 1 show!- the differenl product~ sludied. Wt have de!.CTibed rhcir
d-e.se. These findings are of interest sinee It is known that Cff-
preparation e1sewh~e (17 J.
tain of the studied compounds can be found in human food.
Zoxazolamine (2·amino·5~hJorobenzoxazole) and dimethylnilrosamine
W~t purcha<;ed from K&J\\ (New York).
Male Sprague·Dawle-· raIs, weighing belwterJ 100 and J30 g. ""~t obtained
from Iffa-Crrdo (France) and maintainrd on a 22"io casein die! containing
Introduction
high leveb of \\/illllTlim (25,26) for 7 -10 da~ beforr each experimenl.
Particular attention has been drawn recently, on the fmding
Effects on zoxazolamine hvdroxylasc aetivit \\' were deLermined as desaibed
17) Brown el III. (26) or Co~ney ~l III.. (27,is). based on the duralion of
lhat mutagens were formed in the charred parts of cooked
paralysis induced by zoxazolamine in rats treatrd or not (commis) ...irh leS!
foods such as meat, flSh, bakeT)' and cereals (1-7) or in
compolllXh 1lIe compound.' were injeclrd i.p. al a dOS( of 10 mglkg in soIu·
pyrolysis of sorne
proteins, and
amino acids
(7 - 13).
lion in dimethyl sulfoxide (control!. receivcd OI'Ù)' so!venl). Twenl)'·four hour5
Moreover, it has been demonstrated that the mutagenic com-
af~ treaL'nent with the test compounds, zoxazolamine dissolvrd in 1 N HO
and Mtonic saline Cl :3. \\':v) ""as injectrd i.p. 81 a dosr of (;fJ mglkg. Under
pounds isolated from amino-acid pyrolysates had the struc-
Ihcse conditions, total paralysis occurs after 1-2 min. Ils duration was 000".'
ture of new heterocyclic amines. Two highly mutagenic
minrd by the interva! belween the ansel of paraIysis and the moment wlien !he
amines were identified in pyrolysates of L-glutamine acid:
ral5 recovered their righting reflex. The decrease or increa.se of this duration is
2-amino-6-methyldipyrido[1 ,2-a:3' ,2' -d]imidazole
(l)
and
an expression of zoxazolamine hydroX)1asc' acli\\/ity,
2-arninodipyrido[ 1,2-a:3 ' ,2' -d]imidazole
(2),
respectively,
DMN-d-asc aetÎ\\ity was delermined as des..--ribed by ArrO!> ~l III. and
Venkalesan el 11/. (29.30) ""ith the folJowing modifICations: !he fraction used
designated as Glu-P-I and Glu-P-2 (JO). These amines, also
for the enzyme assay ""as the 10 (X() g Sllpematanl (pœl-rnitochondrial frac-
fonned in the combustion of casein (14) and squid (15), cause
lion) and the reaclton was slopped by adding 2 ml of IQGi. trichloroacetic acid
the transformation of embryo cells of hamster in virro (l6).
1 h laler. ResullS art apressed a~ nmol of formaJdehyde produœd peT heur
ln recent papers, we have reported the chemical synthesis
and peT g fresh weight of Ii\\'er or peT mg of prolein.
Ral5 wet'(' sacriflCed by decapilation 24 h after the adminisu-ation of the
of various derivatives of the new nitragen heterocyclic
compounds. üven werr acised. weighrd and SlOred on ice for the immediate
dipyrido[ l ,2-a:3' ,2' ~]imidazole likely to be fonned during
deterrnination of C)1ochrome P-45û. DMN-d~ actÎ\\ity and protein contenl.
the pyrolysis of L-glUlamic acid<ontaining proleïns (17) and
The prOiein concenlration in the posunitochondriaJ supemaranl "'3.5 det~·
their
mutagenicity
towards
Salmonella ryphimurium in
mined ""ith Ihe method of Lowrv ~l 01. (31). CVlochrome P-45û W3.\\ assaved
presence and absence of microsomes (lB,42). This class of
as described 17)' MacLean and' Day (32) and' ilS concentration in a liver
homogenate ""'3.5 calculaled from the intensit)' of the absorbanœ pea~ at
oompounds is, furthermore, strueturaUy and biochemically
450 nm. Result~ are apress.ed 3.\\ nmol cytochrome per g fresh weight of Iiver.
interesting, especiaDy for sludies of chemical carcinogenesis
since the amine derivatives may be considered as isosteric
Results and discussion
nilrogen<ontaining compounds of amîno-2-fluorene, a weIJ
Effecrs on cyrochrome P-450
known carcinogen.
. ln
The effects of Glu-P2 and derivatives on rat liver microsoma!
order to broaden the sludy of the biochemical effect5 of
P-450 reported in Table J show thal these products. can be
this family and to understand their mode of aClion we looked
divided into IwO groups: (i) compounds 2-5 bearing an
for possible effects of sorne derivatives on the hepatic cyto-
amino function or nitro group in position 2 or 3 repress the
chrome P-450 and IWO d~pendenl microsomal hydroxylases
. biosynthesis of hepatic cytochrome P-450. The repression is
particuJarly significant for the Iwo amino<ompounds 2 and
• AbbreviatiolU: DMN-d~. dimethylnitrosamine·N-dc:mcthylasc.
3, the mosl powerful mutagens (18). (u) In contras1, the ?ther
@ I~l Press Ud., Oxford. EngIand.
20,5

---

lAD
C-Sslnl.)lur. B.l.ouhko" And 0.",110. HW"
llblr n. Enecll on r0lUl701aminc hydrolut"
Compound-
Duralion or para·
". or indue·
p
t~l~ ln min
lion + or
1 R. Mg «(;1.,,- P')
•
1'- H
Inhibilion -
~ RoM «(j,I.. -P21
9
"_,",--6
~ AoMo"
Conlroll
1'76 •
62 (6)
"
R 0 ~·9
1
2A~ â BI (6)
- 39.20
<0.01
3
2JO • 76 (6)
- Xl.611
<0.01
4
190 •
'9 (6)
- 7.'S
>O.~
RO:;()..
5
214 •
7S (6)
- 21.59
<0.01
MIl
6
143 '*' )8 (6)
+ 18.75
<O.~
3 A.~,R"M
12 A 0 ~ ,R, 0 ~ • H
(,
A.~.RoH
13 A""Kz,R,o~.R2oH
7
93 :t 33 (6)
+ 47."
<0.01
~ A. N02.R"Mo
"
A&~.R,.H.~. Mo
6 A. NHCOC~.R.M
U Aa""2.R,.RpMo
•
108 '*' 33 (6)
+ )8.63
<0.01
9
103 :t. 49 (6)
+ 41.47
<0.01
,
AoNHCOCH;,.RoMo
16 A.ftHCOC~.R,.Mct,R2"H
17 AIlNHCOCH;"R,.R2"Mo
10
99 :t. 4S (6)
~ 43.75
<0.01
Fla.
11
40 :t 10 (6)
1. SITUClure. of compou.Il(h sludied.
~ 77.27
<0.01
12
167 :t. 60 (6)
-+
S.II
>0.05
13
153 ± 39 (6)
+ 13.07
<0.05
Tablr 1. Effcm of dipyridcHmidazok dm\\'alives on hepatic cytochrome
p~SO'
14
1Il :t 36 (6)
+ 36.93
0.05> p >0.01
15
102 ± 28 (6)
+ 42.04
<0.01
Compounds
nM/g liver
iii. of reprcs·
p
16
1\\7 ± 42(6)
+ 33.S2
<0.01
sion - or
induction +
17
82 ± 35 (6)
+ S3.41
<0.001
Controls
JO.52 ± 3.5 (6)
°For explanation sec fOOlnOie. of Table 1.
2
20.24 ± 2.5 (6)
- 3~.68
<0.01
Effects of zoxazolamine hydroxylase biosynthesis
3
20.55 ± 3.6 (6)
- 32.67
<0.01
The effeets of tested compounds on this parameter were
4
27.80 ± 4.3 (6)
-
8.91
<0.05
determined in vivo. This is a rapid assay which furnishes a .
5
21.76 ± 2.8 (6)
- 211.70
<0.01
fairly exact determination of the action of exogenous sub-
6
36.64 ± 4.0 (5)
-+ 20.05
<0.05
stances and drugs fmduction or inhibition) on this enzyme
7
40.32 ± 3.8 (5)
+ 32.11
<0.01
system. The validity of the method is based on the resuhs ob-
1
33.35 ± 5.1 (6)
+
9.92
>0.05
tained by Conne)' el al. and Arcos et al. (28.29), who
demonstrated a close parallelism between the increased levels
9
36.38 ± 50S (6)
+ 19.20
0.05 > p > 0.01
of wxazolamine hydroxyla.se in vitro in liver homogenates
JO
39.21 ± 4.7 (6)
+ 28.47
<0.01
and the deereased duration of paralysis, and vice-versa.
Il
46.52 ± 6.2 (6)
+ 52.42
<0.01
An additional advantage of the paralysis test is the
12
32.38 ± 3.9 (6)
+
6.09
>0.05
possibility of estimating the total quantity of indudble zm:-
13
34.00 ± 4.1 (6)
+ 11.40
>0.05
azolamine hydroxyla.se present in the body. It is known tha(
14
36.81 ± 4.4 (6)
+ 20.82
0.05 > p > 0.01
detoxifying oxidative enzymes, such as the above or benzo-
pyrene hydroxylase, exisl in a wide variety of tissues other
15
36.62 ± 4.4 (6)
-+ 19.98
0.05> p >0.01
than liver (33).
16
39.88 ± 4.1 (5)
-+ 30.67
<0.01
A5 fQr the action on c)'lochrome P-450 the studied com-
17
42.90 ± 4.5 (5)
+ 40.56
<0.01
pound5 form 1WO groups: (i) those which inhibit the biosyn-
thesis of the enzyme: compounds 2 - 5; [ri) the others which,
"The numbe'!; of co\\UITUl 2 n:prèsenl the a~ ",ith their standard de\\'ia·
in contrast, exert an inductive effeet on this synthesis.
tiOn followed by the number of rats in parenthesis. CoIulTUl 3 shows the
pcTœnlase of repression ( - ) or induction ( + ) calculaled in relation 10 con·
A5 shown in Table Il, the non-functional heterocyclic com-
trois. p is the probabilil)' issucd from the Studenl 't' le.l. Any p value
pound ] 1 is the most powerful inducer while Glu-P-2 2
> 0.05 is consideree! al IlOn~rlC3m. Comrols are the arumals nol
diminishes notably the action of the enzyme.
lrealed b)' the lesl compounœ..
Ir is interesting to note the similarity of the series of tested
compounds in their action on eytochrome P-450 and on the
compounds 6- 17 increase significantly the levels of cyto-
enzyme that detoxifies zoxoazolamine in rat. There is a fairly
chrome P-45D in comparison with controls except for 8, ]2
good correlation between cytochrome P-450 repression and
and 13 which are only slight inducers.
the inhibitive action on zoxazolamine hydroxyla.se in pan,
' 1
It is remarkable that the repression exerted by the former
and the cytochrome P-450 induction and the induc1ive effeel
group is very important for the mos! mutagenic compounds
on zoxazolamine hydroxlyase on the other hand.
of the series, Glu-Pl arld ÎLs homolog 3. On the other hand,
Effects on DMN~-ase
the 4-amino<ompounds 12-15, the N-acetylated com-
pounds 6, 7, 16 and 17, weak mulagens (18) as weil as the
The results (Table III) show that the inverse phenom.enon
non-mutagenic heterocydic compounds stimulate weil the
would he observed in this case. The compounds 2 - 5 exert a
production of cytochrome P-45D.
considerable inductive effeel (for example Glu-P-2 provokes
206

---

181
Teb6r UI. Err~l.
fecl5 of the dipyridoll,2-a J' ,2' -d}imidazole derlvatlva are
on dirnrlh)'\\nilloWlminr:N-clrlTlt'lh)'la5t'
Ilronsly dependem on lheir molen.Jar .tructure and that
CornflOund~
nH HC'HO/n/rn,
lin. of indue·
p
lhere 15 8 relalion ~Iween lhose effcet~ and the mUIQBt1Uc
pllllrim
lion .. 01
proptrtle. of lhe tesled compounds.
reptNion -
Control.
88.73
AcknowWaemen15
Il
15.82 (6)
2
278.70 • 61.90 (6)
.. 214
<0.01
We would Ukr 10 IhDnk Dr. M .Lmi for hi. int.erest in thii Itudy and critical
reading of Iht manuscripl and Dr. M.SpodheirTJ·Maurizol for helpful diIaa-
3
~1.98 :l 59.92 (~}
.. 184
<0.01
aiOIU.
•
168.04
..
Il 26.23 (6)
89.4
<0.01
5
171.37
..
Il 29.)0 (6)
93.19
.<0.01
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6
83.14 :. I).JO (5)
6.29
0.05
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3.48
>0.05
CallCl'f UI/ .. 7. 6.l#J.
U
8314 :l 16.10 (6)
6.3
-0.05
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14
n.m * 12.91 (6)
- 12.21
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429-430.
15
66.49 Il 1251 (6)
- 25.06
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5. Spingam.N.E.. Kasai.H .• Vuolo.L.L.. Nishimura.S .• Yarnaizumi.Z.,
16
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2:
10.74 (5)
-
19.23
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mUlagem in cooked foods. 1". Isolation of a potall mutagen from bed.
17
39.87 * 1.17 (5)
- 55.66
<0.001
Cancer UI/ .. 9. ITI-/83.
1
6. Dolara.P .. Commoner.B .. Vilhayathil.A .. Cuca.G., Tuley,E.• Mad}'-
"'Set foolnole:. of Table J.
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formation of mUlagens in healed beef slod and cooked ground bed.
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MUlol. Rl5 .. 60. 231-237.
7. Nagao.H., Honda.M, Scino.Y., Yahagi,T. and Sugimura.T. (l977a),
duced) while the second group repress the action of DMN-<I-
Mulagenicilie:. of smoke condrnsales and the charred surfaœ or flSh mcal.
&se except for the amine 12 whose action is non-significanl.
eonœf ut/., 2. 221-226 (1 977b), Mutagenicities of prolein pyroIysato.
Il should he noted that the inductive effeet exrned on
Cancer UI/., 2, 335-J40.
DMN-<I-ase was much more intense than the repression ex-
8. Kosuge,T.,
Tsuji,K.,
Wakabayashi.K..
OUmeoto,T..
Shudo.K.,
lilala.Y., ltai,A .. Sugimura.T., Kawachi.T .. Napo,M., Yahagi.T. and
erted on cytochrome P450 and zoxazolamine hydroxylase;
Senio, Y. (1978), lsolatièm and StruClurt sludÎC'!o of mutagmic principIes in
inversely the repression of DMN-d-ase was weaker than the
amino acid pyrolysales. Chem. Pfwrm. Bull., 116, 6JJ~19.
inductive effect exerted on zoxazolamine hydroxylase.
9. Sugimura.T.. Ka....achi.T .. Nagao,M .. Yahagi.T .• Scino,Y., Okamoto.T_,
Arcos and co-workers have claimed that the compounds
Shudo,K.., K.osuge." .• Tsuji.K., Wakabayashi.K.• Iilaka.Y. and ltai.,A.
(1977). Mutagenic principle (5) in trypIophan and phenylalanine ~
that 'indure synthesis of microsomal cytochrome P450, and
produets. Proc. Jap. Acad.• 53. S8-61.
'
drug
metabolism,
have
the
property
of
'repressing'
10. Yamamoto.T.• Tsuji.K., Kosuge.T .• OkamolO.T.• ~udo,K., Takeda,K.,
demethylation of dimethylnitrosamine (30,34). Moreover
Ima.Y., Yamaguchi.K., Seino.Y .• Yahagi.T.. Nagao,M., Sugimura,T.
. several workers have sho\\\\TI the opposite parallelism between
(1978). Isolation and SlruClurt delmninalion of mutagenic substances in
zoxazolarnine hydrm;y1ase andDMN-<I-ase in their response
L~Ulamic acid p}To)ysale. Proc. Jap. Acad., 54, 248-2S0.
1I. Wakabayashi.K..
Tsuji.K..
Kosuge.T.,
Takedo,K.,
Yamaguc:hi,K.•
to administration of many drugs (35,36). The mechanism
Shudo,K., Litaka.Y .. m.arnOlo,T .• Yahagi.T .. Nagao,M. and Sugi-
which explaim these effeets, however, is not yet elucidated.
mura.T. (1978). Isolation and structure delermination of a mutagmic
ln contrast, Gangolli el al. (37 - 40) have postula~ed that
subslan<% in L-Iysine p}Tolysale, Proc. Jap. Aœd., 54. 569-571.
the biodegradation of dimethylnitrosamine in rat liver is nOl
12. Yoshida.D .. Malsumolo,T .. Yoshirnura.R. and Matousaki,T. (1978),
Mutagenicily of amino-o<arbolines in
solely mediated by themicrosomal mixed function oxidase
P}TOIysis prOduets of soybean
globulin, Biochem. Biophys. Res. Commun., 13.915-920.
system but il is possible that an N-oxidative step is involved in
13. Sugimura,T. and Nagao.M. (1979). Mutagenic factors in cooked food.
its metabülism. They have suggested that a microsomal amine
CRC Oil. Rn'. Toxicol .. B. 189-209.
.
oxidase would he responsible for this form of DMN-
14. Yamaguchi.K .. Zenda.M .• Shudo.K .. Kosuge.T .• Okamoto,T. and Sugi-
degradation; thus, in this respect, the N-oxidation reaction
mura.T. (1979). Presrnœ of 2-amino-dipyridoll ,2-a:3' .2' ~}imidazole in .
casein pyrolysale. Gonn. 111. 849-850.
could explain the differences between the results of the action
15. Yamagachi.K..
Shudo.K..
OkarnOlo.T.
and Sugimura,T.
(t980),
of test
compounds
on
DMN-<I-ase and
zoxazolamine
/ , '
Prescnœ of 2-aminodipyrido[ 1.2-a:3· ,2' -dlimidazole in ordinariIy broikd
hydroxylase. However, this hypothesis seems unsatisfactory
CUllleftsh, Gann, 71. 743-744.
because it disagrees with the experiments and the results of
16. TakaYllma.S., Hirala ....a.T .• Tahna.M .• Ka""'lldIi,T. and Sugimura,T.
Arcos el 01. (25,29,35), Venkatesan el 01. (30,34,36), McLean·
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aàd pyrolysis prodUCl, Toxicol. Lert., 4, 281-284.
el 01. <'32) Or Argus et al. (41) who showed the major role of
17. Sainl·Ruf.G .. Loukakou,B. and N·Zouzi.C. (1981), Mutagenic hetertr
hepatic
DMN-<I-ase
in
the
metabolism
of
the
alkyl
cydic nilrogen compounds relaled 10 prolein pyrolysates. 1. ~ derïv-
nitrosamines. The damage provoked by chemicals that cause
ativcs of dipyrido[I.2-a:3· ,2·-d)imidazole:.. J. Heteroeydic Otnn .• lB.
ceD .injury has been anribuled to their activation by the
1565-1569_
18. N'Goy.K .• de Mtesler .c.. Pairon.D., Loul::akou.B., N'Zouzi.C.• Sainl-
microsomal mixed function oxidase system. On the other
Ruf.G .. Mercic-.M. and Ponœ\\eI.F. (1983). Muta,micity or ~
hand, the action of these enzymes is essential to detoxify
derivatives of dipyrido[J.2-a:3· ,2·-d)imidazole. in preparation.
sorne foreign compounds. Il is interesting to note thatthe ef-
19. Ncbert,D.W. and Jtmen.N.M. (1979). The Ah locus: smetic regulation
207

---

382
CI.SainI·RDr, D.I.ollbllltu and D.Pb_ HItft
or Ihf rnrIlboHlm or C11l'dnOGllN, d~ and othe! eI1vironmmlal
41. ,\\rJu~.M.J- .. Vahc,R.1"
VmkoINln,N. Bun·HoT.N.P. and Arcad.
chemlcab b)' C)'lochromt P-45o.med!alcd monoo~srnua. CRe 0'11.
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1r0fl porphyrim: rtk-'ancr IO'pIwmac:oIoay and 101lIcolos)', BiCKhnr/;"
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208

---

.~~'t'fc'.~~~~:.,. - ...
<>-:~~it~;, , -
T ROI SIE ME PARTIE
INTERACTION DES DNAS ET DE LEURS MONOMËRES
AVEC LE N-N-ACtTOXYACtTYLAMINO-3 DIMËTHYL-4.6
DIPYRIDO[l ,2-a: 3 1 ,2 1 -d] IMIDAZOLE (N-N-AcO-AGlu~P~3)
~.t.:~.:.--:"".·._.~.:"'.;S;'~:·>· '-',;,.;"
~ -- -r
;;.'~.~~.~c·.·'·._·
'~~~.,
- '
-'--" ~
' - '
'!i.\\~~~;,:,.~.

---

]83
INTRODUCTION
Nous avons vu dans la deuxième partie de ce mémoire que les amines
subissent une transformation pour donner des dérivés hydroxylés. Aujourd'hui,
on admet largement que la cancérogénicité des amines dépend de leur conver-
sion en hydroxylamines ou métabolites proximaux (J.A. Miller et E. Miller,
Advanced cancer research, 1953, ~, 340). Ces hydroxylamines subissent en-
suite une métabolisation enzymatique qui les transforme en sulfate ester
et N-N-acétoxyacétylamines, composés très réactifs appelés cancérogènes
ultimes. La dernière étape de ce métabolisme conduit à un composé,électro-
phile, l'ion nitr~nium ou le carbocation qui réagit avec les sites nucléo-
philes du DNA comme cela a pu être mis en évidence avec l'acétoxyacétyl-
aminofluorène (AcO-AAr) à la fois in vivo et in vitro.
En vue d' essayer de comp"éndr'e le mode d' ",ction des dérivés de
pyràlyse de l'acide glutamique vis à vis du DNA, nous avons synthétisé le
métabolite supposé de l'amino-3 diméthyl-4,6 dipjTido[1,2-a:3' ,2'-d] imida-
zole (Glu-P-3), amine qui s'est révélée le plus fortement mutagène parmi
les produits testés selon le technioue d'Ames. Nous avons ainsi obtenu
le dérivé N,N-acétoxyacéty16de cette amine, le N-AcO-AGlu-P-3 dont nous
avons étudié les interactions avec le DNA natif et le DNA dénaturé et
leurs monomères. Nous avons, en outre, étudié les altérations induites
dans la conformation et les propriétés physicochimiques de la macromolécule
modifiée par le substrat AGlu-P-3. Nous avons ainsi pu établir une compa-
raison entre le mode et les conséquences de la fixation de Glu-P-3 sur le
DNA avec ceuX de Glu-P-l rapportés par Hashimoto et al. en 1982 et ceux
bien connus de l'AAr.

---

184
CHAPITRE 1
INTERACTION DU DNA ET DE SES MONOMERES AVEC LE
N-N-ACETOXYACETYLAMINO-3 DIMETHYL-4.6 DIPYRIDO[l,2-a:3' .2'-d]
IMIDAZOLE (N,N-AcO-AGlu-P-3) : STRUCTURES ET PROPRIETES DES ADDUITS
Le schéma ci-dessous montre les différentes voies empruntées pour
l'obtention du métabolite N,N-AcO-AGlu-P-3.
Çt:1
ÇtN::JC)N-....;:
,
1
H
~
~N
~
NOH
Me
Me
l
'1-
Me
Me
42
-'"
Ace\\
NOH
1
Ac
- - - - ---_._---- _.-._._.- --.-
Nous avons appliqué la synthèse décrite par Westra (Westra et al.,
Carcinogenesis, 1981, ~, 355) pour obtenir le dérivé ~. On fait une réduc-
tion partielle du dérivé lIb par action de l'hydrate d'hydrazine en présence
du charbon palladié
""
suivie d'une acétylation en présence de chlorure d'acé-
tyle. Le dérivé monoacétylé 43 traité en milieu sodique par l'anhydride acé-,
tique conduit au
'"
N,N-acétoxyacétyl~3 diméthyl-4,6 dip)Tido[1,2-a:3' ,2'-d]
imidazole 44 (AcO-AGlu-P-3).
-

---

185
Les études des interactions du DNA et de ses mon~~res avec
AcO-AGlu-P-3 ont fait l'objet d'une publication sl:lumise a "Carcinogenesis"
"Reaction of DNA with the mutagenic 3-N,N-acétoxyacétylamino-4,G diméthyl-
dipyrido[1,2-a:3' ,2'-dJimidazole (N-AcO-AGlu-P-3) related to glutamic acid
pyrolysates"
B. Loukakou, E. Hebert, G. Saint-Ruf, and M. Leng.
Dans cette publication, nous montrons que
le métabolite AcO-AGlu-P-3 se fixe sur- le C 8 de la guanine aussi bien sur
les monomères que dans le DNA
l'action de sels de cobalt et du zinc entraine la desacétylation de
AGlu-dGuo
en donnant la GludGuo
- l'étude de la stabilité thermique eT de l'hydrolyse enzymatique par l'eD-
donucléase Sl montre que le substraT AGlu-P-3 provoque
une forte dénè-
turation locale des séquences du DNA impliquées dans la fixation covalente
du mutagène. Cette destabilisation est le reflet d'une intercalation du
motif AGlu-P-3
entre les paires de bases de même nature que ce qui avai:
été observé pour le nDNA modifié par l'AAr (insertion - dénaturation ou
déplacement de paires de bases'.

---

186
Reaction of DNA with the mutag@nic 3-N,N-acetoxyacetylamino-4,6-
di methyld i pyr i do [,,2-8: 3' ,2' -dJ 1mi duo Le CN-AcO-AG l u-P-3)
related to glutamic acid pyrolysstes
B. Loukakou, E. Hebert, G. Saint-Ruf
and M. Leng
Centre de Biophysique MoLëcula,re, CNRS,
1A, Ave. de la Recherche Scientifique,
F-45D45 Orleans Cedex, France

---

187.
ABBREVIATIONS
Glu-P-l
2-amino-6-methyldipyrido [1,2-a:3' ,2'-d] imidazole.
Glu-P-2
2-aminodipyrido [1,2-a:3' ,2'-d] irnidazole.
Glu-P-3 : 3-amino-4,6-dimethyldipyrido [1,2-a:3',2'-d] imidazole.
A-Glu-P-3 : 3-N-acetylamino-4,6-dimethyldipyrido [1, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole.
N-AcO-AGlu-P-3 : 3,N,N-acetoxyacetylamino-4,5-dimethyldipYTido [1,2-a:3',2'
-d] imidazole.
N-AcO-Glu-P-1
2-N-acetoxyamino-6-methyldipyrido [1, 2-a: 3' ,2' -d] imidazole~
dGuo-AGlu-P-3 : N-(deoxyguanosin-8-yl)-3-N-acetylamino-4,6-dimethylctipyrido
[l, 2-a: 3 ' ,2' -d] irnidazole.
Guo-AGlu-P-3 : N-(guanosin-B-yl)-3-N-acetyle.mÜJo-4,6-dimethyldipyrido
[l, 2-a: 3' ,2' -ct] imidazole.
Gua-AGlu-P-3 : N(B-guanylyl)-3-N-acetylamino-4,6-dimethyldipyrido
l},2-e.:3' ,2'-d] imiàazole
dGMP-AGlu-P-3 : N-(deoxyguanosin-B-yl-5' monophosphate)-3-N-acetylamino-4,6-
dimethyldipyrido [1,2-a:3',2'-d] imidazole.
nDNA
native DNA.
dDNA
: denatured DNA.
DNA-AGlu-P-3 : DNA bearing covalently bound AGlu-P-3 residues.
AAr
N-acetyl-2-arninofluorene.
N-AcO-AAF : N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene.
DNA-AAr : DNA bearing covalently bound
AAr residues.

---

188
ABSTRACT
3-amino-4,b-dimethyldipyrido [l,2-a:3' ,2'-dJ imidazole (Glu-P-3), an
analog amine of the potent mutacarcinogen Glu-P-1 isolated from a glutamic
acid pyrolysate, has been chemically synthesized. Glu-P-3 was found much more
mutagenic than. Glu-P-l to S. typhimurium TA 98 and TA 100 with 5-9 mix.
3-N,N-acetoxyacetylami~o-4,6-dimethyldipyrido[1,2-a:3',2'-~ imidazole
(N-AcO-AGlu-P-3),a possible metabolite of Glu-P-3, binds convalently to the
C-8 position of guanine residues in DNA. The binding induces large conforma-
tional ch2nges of the.macromolecule.

---

189
INTRODUCTION
It has been shown recently that mutagens can be formed in the charred
parts of cooked foods (meat. fish. bakery. cereals (1 -
7) or in the pyroly-
sis of proteins
and amino acids (7 -
13). Someof the active pyrolysis corn-
pounds were isolated and their structure identified as new heterocyclic ami-
nes (8 • 15). Two highly mutagenic amines were found in L-g1ut~ùic acid
pyro1ysates : 2-amino-6-~ethy1dipyrido [1,2-a:3' ,2'-dJ imidazole l, and 2-
aminodipyrido [1,/-a:3' ,2'-d] imidazo1e 2, respective1y called Glu-P-1 and
G1u-P-2 (10). These amines were also identified in the combustion products of
casein (14) and dried squid (15). They cause the morpho1ogical transformation
of embrYG-cells
of hamster in vitro (16).
Glu-P-l was found to be carci-
nogenic in both mice and rats. In rats, it induces astrocytomas in the brain,
tUffiors of the zymbal gland, hepatocarcinomas, colon tumors and acinar cell
hyperplasia in the pancreas (17 , 18).
Moreover,a recent study of Hashirnoto and al.(19) has shown that Glu-P-l
and/or its metabolically aCêive fo~m react with DNA in vitpo and in vivo by
covalent tinding to C-B of guanine. The structure of the main adduct was
identified as 2-(B-Guanylyl)&ùino-5-rnethyldipyrido [1,2-a:3' ,2'-dJ imidazole
(Gua-Glu-P-l) 6. By use of 5'-end labelled DNA and sequence analysing gel elec-
trophorisis these authors showed that the guanine residues in G-C clusTer like
regions were modified more frequently in Glu-P-l-modified DNA (20).
These compounds are structurally and biochemically interesting in che-
mical mutagenesis and carcinogenesis since on one hana trle amine derivatives
present structural similarities with the well know carcinogen 2-amino-fluorene
and on the other hand they can be found in daily fooas.
Our intercst for mutagenic and/or carcinogenic amines and their in-
teraction with nucleic acids led us to broaden the study of several dipyrido
[1,2-a:3' ,2'-d] imidazole derivatives likely to be forrned during the pyroly-

---

Y'N-{Ny NH2
~N~
çN--rît'-11
'" l::NYNH2
R
Me
Me
1 R =Me (Glu-P-1)
3 Glu- P-3
2 R = H (G 1u - P -2 )
H
N
ÇtN~'
N
N-O-COCH
O-COCH3
ON=cr
l "
3
~
<D
:::-...
~
~
1
:::-...
~
h
o
N
N
N
M
'COCH3
Me
e
4
5
o
CH3
HN)(J(N>-~40~/N
' / N~Î' 'Y ~
~O
1
r;1-"":::
Y
~~
N~
/.~
Çt N
t'JH
::.-...
~u)v HN 1 ~
H N
1'1
N
N
2
j
N
N
NH
HO"::' CH,.,
Me
Me
Me
2
I/·~-"O..............
1\\'1
1/
7
6
1-1
OH
Char~ 1

---

i 9 J
sis of L-glutamic- acid, containinf. pr'otcins. ln recents papers, we have repor-
ted the chemical synthesis of various derivatlves of dipyrido (1,2-&:3' ,2'-dQ
irnidazole ring (21) and their mutagenicity towards SaZmonelZa typhimurium
in presence and absence of microsomes (22). Moreove~we found that sorne of
these compounds were potent inducers or inhibitors of hepatic rnicrosornal
enzymes and that these biochemical effects were strongly
dependent on the
rnolecular structure of the tested compounds (23).
The covalent binding of carcino[enic and/or mutagenic amines
by the incermediate ~f their active metabolices with the
DNA of the target ce Il plays.animportant role in the expression of mutagene-
sis and in the process of tumorisation (24 , 20). There are controverses
about of the existence of a real correlation between carcinogenicity and rnu-
tagenicity (27 - 28), but the results of many studies support the concept of
somatic mutation as the basis of carcinogenesis (24 , 28 , 29). Nevertheless,
the diversity of the modifications induced in DNA by the covalent binding of
the exogen residues creates sorne difficulties for establishing a coherent
explanatior, of the mode of action, in particular for the amines (26 , 30).
In order to obtain new informations
in relationship
with
molecular structure, we studied the behaviour of 3-N,N-acetoxyace-
tylamino~4,6-dimethyldipyrido[1,2-a:3' ,2'-d] imidazole (N-AcO-AGlu-P-3) 4
a presurned metabolite of 3-arnino-4,6-dimethyldipyrido [1,2-a:3' ,2'~ imida-
zole 3 (designated as Glu-P-3 by reference to Glu-P-l and Glu-P-2), the most
potent mutagen among aIl tested compounds in the heterocyclic ring dipyrido-
imidazole family.
In the present paper we report the mutagenic properties of Glu-P-3
towards SaZmoneZLa typhimurium (TA 98 and TA 100) and the results of the study
of interaction of itsmetabolite N-AcO-AGlu-P-3 with DNA and its constituents.

---

19,
1
_
MATERIALS AND METHODS
Chem1cBls
Guo. dGuo. GMP. dGMP and calf thymus DNA (type J) were purchased
trom sigma. 5'-~-dguo was obtained from Amersham t
2-amino-3 methylpy-
ridineand other chemicals reagent grade wer~ purchas~à from Merck-Schuchardt
or Aldrich. 51 endonuclease from A8pe~gilluc Orizae
Pl nuclease trom Peni-
t
cillium ~~t~ium, DNAse
land alkaline phosphatase were purchassed from Boeh-
ringer. TLC was carried out onsilicagel plates F 254 (Merck)t 0t25 mm tick-
ness (1 mm for preparatives plates),. Chromatograms were developped with
acetic acid : water :N-butanol, 22 : 100 : 50, v/v/v (system 1), isopropancl:
ammoniac 25 %t2 : 1, v/v (system II) and methyl'alcohol (MeOH)
water:
Triethylarnine acetate (TEAC), 1 : 4 : 1, v/v/v (system III).
4,6 dimethyldipy~ido[1~2-a:J'~2'-dJ imidazole was prepareà according to the
procedure used for its homolog 4-monomethyle previously described (21) from
3-arnino-8-rnethylimidazo ~,2-aJ pyridine anà methylvinyl ketone in the pre-
sence of ferric chloride hexahydrate and anhydrous zinc chloride in ethanol ,.
recrystallisation in hexane yielded pale yellow prisms, m.p. 15~,yield (35 %).
TLC in AcOEt. RF = 0.51.
4,6 dimethyl-J-nitrodipyridO g,2-a:3'~2'-dJ imidazole
Obtained by nitration of the above dirnethyl-cornpound with nitric
acid (d, 1.49) upon heating for 2 hours. Recrystallisation from ethanol to
give yellow needles. rn.p. 275°C yield (30 %).
J-amino-4,6-dimethyLdipyrido [1,2-a:J',2'-d] imidazole (Glu-P-3)
Glu-P-3 was prepared by reduction of the corresponding nitro-compound -
by action of 98 % hydrazine hydrate in the presence of Raney nickel. Upon
'filtration of the nickel and evaporation of the solve.nt,the amine was purified'

---

193
/
by recrystallisatioTi trom ben;:.enp as pale yellow rnicroprisms. M.p. 2469C
_
yield (80 \\).
uv (Et OH) À
• nm ~ 2:' O. 290, 315, 370
max
1H NMR (CDCl )
6 2,7 (5, 6-Me), 2,86 (5, 4-M~), 6,9 (t, J: 7H .8-H),
3
z.
7,26 (d, J = 7 H , 7-H), 8,26 (S, 2-H), 8,7 (d, J = 7 H ,9-H).
z
z
Anal. calcuiated for C12H12N4 ; C, 67. 9 ; H, 5. 7 ; N, 26. 4.
round
C, 67. 9 ; H, 5. 8 ; N, 26. 3
(N-AcO A Glu-P-3)
To a solution of nitro-compound (1 g) ln THF (100 ml) were added 5 %
palladium on activated carbon (100 mg) and dropwise a solution of 98 % hydra-
zine hydrate (1 ml) under magnetic stirring for about 15 mn at room tempera-
ture. Wh~J all the nitro-co~pounè W2S transformed into hydroxy-
lamine (verification by TLC), the palladium charcool was filtered and the
solvent evaporated in vacuo until beginning precipitation of the 3-(hydPoxy-
TLC in AcOEt, Rf = 0.33.
The latter compound can be storred for 48 hours at - 20°C in vacuo
over sul:furic acid.
uv in etbanol À
255,300,315, 360nm.
max
The ,hydroxylamine is very ûnstable in the light at room Temperature andit lS
readily axized to azoxy derivative.
Ta a solution of the above crude hydroxylamine in THF (50 ml) and
triethylamine (L 5 ml) was added a solution of acetyl chloride fresh~y recti-
fied (4 ml) in THF (25 ml) under magnetic stirring for 30 mn ; the resulting
mixture was, then, poured into a saturated solution of NaHC0
(200 ml) and
3

---

194
-extracted '",i th ethyl acetate (~OO nl1). TIl(' orgBTJÏ c 1ayeT' WBC E'vaporated 'in
t)QC'WO
et 30°C and the residue recrystall i zed frorn HpxaTJ!:I. Yielded 3-N-aoetIlZ-
(
hlidroxllarnino-416-dimethlildiplirido [112-a:3'12'-d] imidazoZe (N-OH-AGlu-P-3)
as yellow microprisms. m. p.
: 193(". TLC in AcOLt, Rf = 0.25. UV (.MeOH) À max
1
260, 270, 305, 340, 355, 370nm.A260/A350 = 2.1.
i.r. y CO : 1680 cm- .
Treatment of N-OH-AGlu-P-3 (0.5 g) disso1ved,in 20 ml of NaOH 0.5 N
by 1.5 ml of acetic anhydride under nitrogen for 5 mn yielded, after filtra-
'tion of the precipited and washing with hexane, N-AcOAGlu- P-3
as pale yellow
prisms, m.p. 114°C. TLC on silicagel with chloroform-acetone (96 : 10, v/v),
~ = 0.34 with AcOEt, RF = 0.41. Ana1ysis for C16H1603N4' calculated : C,
+
(61.5 ; H, 5.2 ; N, 17.9 ; found ; C, 61·6 ; H, 5·1 ; N, 17·7 ; M. 312. U.v.
spectrum in ethano~, À
: 255, 265, 305, 340,355, 370. A260/A350 : 3.2.
max
Hl NMR (CH-:1 ) : 2.26 (S, 3H, O-COg~ ), 2.33 (S,- 3H, COMt: ),2.63 (S, 3H,
3
6-Me), 2.8 (S, 3H, 4-Me), 6.7 (t, J = 7 Hz, 8-H), 7.16 (d, J = 7 Hz, 7-H),
7.56 (S, 2-H), 8.4 (d, J = 7 Hz, 9-H).
N-(deoxyguanosin-B-yl)-3-N-acetylamino-4, 6-dimethyldipyrido [1" 2-a:3'" 2 '-dJ
imidazo~e (d GuO-AGlu-P-3)
A solution of 60 mg of dGuO in water (15 ml) was mixed with a solu-
-tion of 60 mg of N-AcO-AGlu-P-3 in 1 ml of dirnethylformarnide (DMF) ; the
mixture was stirred for 3 hours at 37°C unàer nitrogen in the dark. After
cooling, ethanol (10 ml) and water (30 ml) were added and the mixture extrac-
ted with chloroforme (30 ml) three tirnes. The water layer was concentrated
in vacuo and brought
onto a column of Sephadex LH-20 (25 x 2,5 cm) and elu-
ted with water.The l~fluorescent fractions were coneentrated in vacuo _and
lyophylised. Finally pure d GuO-AGlu-P-3 was bbtained by t.l.e. separation
on silieagel with isopropanol : ammoniac 25 % (2 : 1, v/v) system II as
1
eluant. Ry = 0.75; Er system 1 = 0.45, RF system III = 0.70). Yield 12 mg
(12 %). u.v. spectrum in water
À max
265, 336, 350, 365. A265/A360 = 3.3.

---

195
300 Hz 1/1 RMN(DMSOd 6) : 2.0~ (S, 2H, 2,'-CH ), 2.15 (S, 3H, CO Me), 2.&
2
(S, 3H, &-Me), 2.77 (s, 3H, ~-Me), 3.7 (s, 2H, S'-CH ), 3.9 (s, 3'-H),. 4.4
2
(s, 4'-H), 5.1 (s, S'-OH), 5.25 (s, 3'-OH), 6.3 (s, l'-H), 6.5 (s, l'-H),
6.5 (s, NH ), 7 (t, J = 7 Hz, 8-H), 7.45 (d, J : 7 Hz, 7-H), 7.65 (s, 2-H),
2
8. 55 (d, 9 -H ), 10.95 (s, NH).
Labelled
5,_3H GuO-AGZu-P-3 (specifie radioaetivity 5700 cpm/~g was prepa-
red via the same way from
5H,_3H GuO. U.v. (in water)
À
(c) 260 nm
max
(25600) 350 nm (7700).
N-deoxyguar.osin-B-"yZ)-3-amir'1O-4 ~ 6-dimethyZdipyrido [l~ 2-a: 3' ~ 2'-d] imidazoZe
(d GuO-Glu-P-3)
a) A solution of 3 mg of the above d GuO-AGlu-P-3 in 1 ml of 0.1 M NaOH was
\\ '
heated at 40°C for 10 min., then carefully neutralized with dilute HCI.
After freezing, the mixture was liophylizeè.
The pure compound was obtâi-
ned by TLC (system 1). RF : 0.36.
3
U.v. spectrum (Buffer : 5 x 10-
M Na citrate, 0.1 ~M EDTA
pH 7.5) Àmax
277, 355 nm.
I H NMR (300 Hz in ME: SO-d5) 2.05 (m, 2H, 2' -CH ) 2.5 (S, 3H, 4-CH ) ,
2
, 2 '
3
2.7 (S, 3H, 5-CH ), 4.3 (S, 2H, S'-CH)
4.4 (S, lH, 3' -H) , 4.5 (S, IH,
3
2 '
4' -H) , 5.25 (S, lB , 3' -OH) , 5.55 (S, 1H, 5' -OH) , 6.25 (S, 1H, l' -H) , 5.35
(S, 2H, NH
of guanine), 5.9 (S, 1H, 8-H), 7.3 (S, lH, 7-H), 7.9 (S, lB,
2
2-H), 8.6 (S~ lH, 9-H), 9.6 (S, lH, 3-NH), 10.5 (S, 1H, NH of guanine).
1
b) The same compound was obtained by incubation at 37°C for 30 mn of a solu-
tion of 3 mg of d GuO-AGIu-P-3 in 1 ml of
0.1 M ZnS0
in Bis-Tris buffer,
4
pH 7.6.
c) Deacetylation of dguo-AGlu-P-3 was also obtained in the same conditions
with a solution of 0.1 M ZnC1
or CoC1
in Bis-Tris buffer, pH ~ 7.5.
2
2

---

196
N- (guano~iM-B-yZ)-J-N-ac["t+ 7.œnÙ1(l-4, 6-dimeihyZdiPlIrido- [l, 2-a: 3',2'-d J
imidaaole (Guo-AGlu-P-3) was obtained in the same way.giving white micro-
prisms. 11- : 0.78 in the system 1 t 0.44 in the system II • 0.68 in the sys-
tem III. U.v. spectrum' in water
Àmax
N-(deoxyguanosin-B-yL-5'monophospateJ-3-N-aaetyZamino-4,6-dimethy Ldipyrido
[l,2-a:3'~2'-dJ imidaeoLe (dGMP-AGlu-P-3)
A solution of dGMP disodiurn salt dihydrate (65 mg) in la ml of 2 mM
sodium citrate buffer (pH 7) and 60 mg of N-AcO-AGlu-P-3 dissolved in 1 ml
of DMf was incubated at 37°C for 3 hours under nitrogen and magnetic stirring.
,
After cooling, sodium citrate buffer (20 ml) was added and the reaction mix-
ture extracted three times with 30 ml portions of chloroform. The water layer
,
was concentrated ~n vacuo and chromatographied on DEAE cellulose (Bio-Rad)
with, as eluant, a linear gradient of 0.05 M to 0.5 M aJnmoniurn hydrogen car'DO-
nate. The fractions containing pure dGM?-AGlu-P-3 (checked by TIc) w~re con-
centradeà, ran through a Sephadex G-1S column and lîoph~lized. dGMP-AGlu-P-3
was obtained as
colorless microprisms. Rf = 0.17 in the system l, 0.19 (sys-
tem II), 0.57 (SYSTem III). U.v. absorption À
:
265, 315, 335, 350, 365 nm;
max
nDNA -A Gl.u-P-3
nDNA modified by the active rnetabolite was prepared by incubating in
the dark at 37°C for 3 bours under nitrogen of a solution of purified native
DNA (4 mg) in 2 mM sodium citr2te, 10 rn~! NaCl (pH 7.3) and N-AcO-AGlu-
P-3 dissolved in ethanol (ethanol : buffer, 1:10, v/v) according to the
procedure used for DNA-AAF (21). Samples were incubated with various amounts
of N-AcO-AGlu-P-3 for constar,t DNA concentration in order to get DNA samples
with different degrees of modification.

---

197
dDNA-AG~~-P-J was prepared by direct reaction of N-AcO-AGlu-P-3 and
denatu-
red DNA or by thermal denaturation of nDNA-AGlu-P-3.
Modified DNA hydrolysis end adducts determination
Hodified DNA in solution of citrate buffer was exhaustively dialyzed
against 5 mM Bis-Tris base. 0.1 mM EDTA (pH 7.4) buffer and denatured by
heating at 100°C for 10 mn and then rapidly cooled in ice. The solution of
DNA was made 10 mM in MgC1
and DNase-I (1 mg for 10 mg of DNA) was added.
2
After incubation at 37°C for 2 hours. the solution was made 10 mM in ZnS04
and the pH ajusted to 5.3 by addition of diluted HCl. Then, Nuclease Pl
(30 ~g) was added and the incubation contJnued 2 hours, after which the pH
was readjusted to 7.0 by addition of 1 M Tris HCl buffer. Finally the mixTure
was treateà with alkaline phosphatase (50 ~g) for 2 hours at 37°C. Aliquot
solutio~ were then injected into a Waters associates HPLC equipped wiTh
TWO M-SOOO A pumps,
a U. 6K in je ctor, a 450 u.v. detector and 5 ~m Lichrospher
Merck PY-18 column (30 cm x 4.6 mm).
The adducts were eluted with water : methanol
ammoniac 25 % (59
40 : 1, v/v/v) as solvent over a 30 mn period as flow rate 1.2 ml/mn and
monitored at 260 nm.
Digestion of DNA-AGlu-P-3 with nuclease 5,
Hydrolysis by nuclease Sl from Aspergillus oryzae was perforrned
according to the following procedure (37) : DNA was dissolved in 30 mM sodium
acetate buffer pH 4.6, 1 mM ZnS0 , 50 mM NaCl and 5 % glycerol.
This solu-
4
4
tion was incubated at 37°C in the presence of nuclease SI (1.5 x 10
U of
SI for 0.1 mg of DNA) during 30 min.

---

198
Mutagenesis essay
The assay was carried out B6 described in our recent paper (22) .in
the Laboratory of toxicology, UCL, Brussels, Belgium (N'Goy K., de Meester
C. et al.). 5-9 fractions were obtained from adult male wistar rats (200
250 g) treated with Arochlor 1254. Tests were perforrned in triplicate by
mixing
Glu-P-3 or derivatives, 5-9 mix and bacteria (SaZmoneZLa typhimu-
rium TA 98 and TA 100) from overnight culture in nutrient broth in histidine-
biotin supplemented top agar. The plates were incubated for 48 hours at 37°C \\
in the dark and number of revertant colonies was counted.
Instrumentation
Ultraviolet absorption were measured on a Cary 210 ·spectrophotometer
1
and
H NM"F:. spectra were recorded at 300 MHz on a Brucker AM 300 WB. Chemical
shifts are reported in ppm relative to Me 5i as an internal standard.
4
Mass spectrometry were performed with a Ribermag MS R 10-10, a qua-
dripole apparatus equipped with a single ion source working under Electron
impact ionization or desorption chemical ionization by differential vacuum
pumping and with dual dise data acquisition and processing SIDAR computer.
Ionizing potential was 70 eV.
HPLC analysis were carried ouf on a Waters Associates Apparatus
high performance as described above.
RESULTS
Mutagenic properties of Glu-P-3
Mutagenicity of Glu-P-l, Glu-P-2 and Glu-P-3 towards S. typhimurium
TA 98 and TA 100 1s shown in Fig. 1. The results surrunarized in Table 1 show

---

199
'that Glu-P-3 1s the strongest mutagen. However, as Glu-P-l and Glu-P-L, this
compound requ1res metabo11c activation before to exert 1ts mutagenic effects
in our experiment conditions.
TABLE 1
Mutagenicities of Glu-P-1, Glu-P-2 and Glu-P-3•
specific activity (Revertants/~)
Compounds
TA 98
TA lOG
GIu-P-l
18 600
4 250
GIu-P-2
1 000
800
GIu-P-3
47 500
10 030
,
* The compounds were tested at four doses (in triplicate) with S9 rrix.
\\
Reaction of N-AcO-AGlu-P-3 with d guanosine
We
consider N-AcO-AGIu-P-3 as a model compound of thE ultimate
rnetabolite of GIu-P-3 by analogy to the N-AcO-AAF, accepted as a valid model
cornpo~~d of the metabolite of 2-acetarnidofluorene (24,25). This hypothesis is
consistent with the fact that N-AcO-AGIu-P-3 is mutagenic towards S. tbphi-
murium TA 98 in the absence of microsomes S9 rnix (àata to be publi5~ed) and
binds to DNA in vitro by direct reaction.
N-AcO-AGIu-P-3 reacts with dguo, in the same conditio~5 that N-
AcO-AAr, LO yield a major adduct as verified by tIc and high perfor2~nce Iiquid
chromatography (Fig. 2). The structure of this adduct was iàentifieè as
N-(deoxy-guanosin-8-yl)-3-N-acetylarnino-4,6-dimethyl [1,2-a:3' ,2'-ëj imiàazole
(dGuo-AGlu-P-3) from the following results :
i) Mass spectral analysis (Table 2) is
consistent with a dguo-AGlu-P-3

---

,200'
SODOOr---------..---,
a
b
1
i
,
1
1
i
40000
1000C
~ 30000
o
c..
""----
li>
.....
C
o
L
(.,
~ 200GC!-
5000
L
+lI>
I
10000.
x
o
0.5
1
Fig. 1 : Dose reponse curves of rnutagenici ty
of Glu-P-1 (~-), Glu-P-2
(x-x) and Glu-P-3 (0-0) with 59 towards TA 98 (a), TA 100 (b).

---

- ,
20J
0.1
i -., .-
i
.
O.D
,
1
1
.
i
!
.
1
1
•
,
1
1
.
i
1
,
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Il
f
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,1
U
,-..
.
- 1
1
E
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1
N
• 1
1
: '
1
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Q)
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l
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L
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\\
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/ , " .
1
<J:
,
,'i
\\
.~
-------,.
.
1
,._._._.-._._._._._.
5
10
15
20
Elution
time (min)
Fig. 2 : hplc profiles of : Guo-AGlu-P-3 (--), dGuo-AGlu-P-3 (- - -) and
1
1
1
:
enzymatic hydrolyzate of nDNA-AGlu-P-3 (-.-) modified at 5 %.after enzymatic
hydrolysis.

---

20,
under plectron impact, as witnessed by the ~eaknes5 of the relative
Bbundance of the molecular ion <7 \\< 1). The fragmentation pattern of
the molecule i5 domineted by the 106s of glycosidyl bond from the mole-
cular ion to lead to the ionized ion Gua-AGlu-P-3 (mIe 404, 1% ~3.4)
which, in turn, loses [cHaco1 to give the neutral ion Gua-Glu-P-3. Elimi-
nation of 'guanin seq\\.lence trom thi5 latter ion undergoes the fragment
Glu-P-3, which is the base peak. The peak with mIe 239 (C
H
0 N ) can
13 10
4
be attributed to the formation of dipyrido-imidazolyl isocyanate. 1t is
interesting to note that the second major peak (mIe 119, 1% 98.7) corrèS-
ponds to the ionized fragment deoxyribose.
TABLE 2
High resolution mass spectral data for dGuo-AGlu-P-3
1
1 (a)
_9,(b)
m e
l 0
Elemental formula
Assignrnent
519
0.13
M:
C24H2S0SN9
1
404
83.4
C19H1702N9
Gua-AGlu-p-31-: + 1
352
64.S
C17H1S02Ng
Gua-Glu-P-3' t
2S5
81
C H 0 N
14 14
4
~ 404 -Gua
[AGlu-P-3] t
(c)
239
23.4
C
H 0 N
Ar-N=CO' -:
13 10
4
213
' 1üû
~+
C12H13N4
Glu-P-3
+ 1
212
50.4
C
H N
Glu-p-31 t
12
12 4
119
98.7
CSH ll03
d-ribosè1 +
,
(a) onlyrnajor fragments with 1% > 20 % and mIe> 100 are listed except for
Mt
(b) 1%
relative intensities
(c) Ar
4,5-dimethyl [1 ,2-a: 3' ,2' -d J dipyridoimidazolyl sequence.

---

203
ii) Analysis of proton n.m.r. data at 300 Mz. The spcctrum
is
shown in rig. 3. Assignments are
made by comperison with spectre of
AG1u-P-3 (data not shown), deoxyguanosiœ·and a1so with spectra previous1y
reported for (deoxyguanosin-S-y1)-N-acetyl-2-aminof1uorene (31). The
chemical shifts and coup1ing pattern of the aromatic region revea1
the absence of H-S proton of guany1 ring which indicates
that the carbon in position 8 is the site of substitution. This asser-
tion is supported by the disappearance of the signa1s (s) at 6 : 6.5 ppm
(NH-2 guanine) and (s) at 6 = 10.9 ppm (NH-l guanine) after exchange in
D 0. The protons H-2, H-7, H-8 and H-9 of the dipyrido-imidazo1e ring
2
are easi1y identified in the spectrurn. The assignment of guanosy1 pro-
tons is based on the similarity between the chemica1 shifts and that of_
spectra of deoxyguanosine and d-guo-AAF.
Thus, these differenc dèta are uniquely consistent with the
structure
resulting of covëlent binding of AGlu-P-3 residue to the C-S
"'..
position of guanine.
The structure of Guo-AGlu-P-3 and dGMP-AGlu-P-3 were deduced by ana-
logy with that of d7Guo-AGlu-P-3. The three ,compound~
have,
in parti-
cular, an identical u.v. spectrum.
We have observed that d-guo-AGlu-P-3 was very unstable upon incuba-
ting at 37°C
for less 30 mn in solution of D.1M znS04 or in 0.1 M CoC12
in Bis-Tris
buffer,pH 6.7. A deacetylated product dguo-Glu-P-3 was
formed. Deacetylation was proved by comparison of mass spectra analysis
+
(M' 476), NMR and ultraviolE~ absorption data between This derivative
and an authentic dguo-Glu-F-2 obtained by alkaline hydr91ysis on 0.1 M
NaOn, a classical method of deacetylation (30, 34). Fig. 4 shows the u.v.
spectra of dguo-Glu-P-3 obtairJed by alkaline treatment or by action of
ZnS0 4 as compared to that dgwo-A-Glu-P-3. It can be noted characteristic'

---

204
'-CH3
6-CH3
MSO
o
CH3-~-
1::~i
i:l"
i
,,1
' 1
Il'l~
.
'w
' 1
l'; , .
'v
V, '\\
l
" .
-~~I;.:
r i ' : _
L..----1-.;::--...l...----:-JI--;:--.i.---"t';:;----'--~'r;---'--;f.I~--'-~'i'\\--L-~I~--L-___iI\\:)--L-~I~.....l....,7i1 -'--;t'-'-M'~J--_
11.0
100
9.0
ao
ZO
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
00
PPM
Fig. 3 : 300 Mz I HNMR spectrum of dGuo-AGlu-P-3. The solvent WâS d
dimethyl-
' 1
6
sulfoxide ; the signaIs were expressed as ppm from tetramethylsiIane.

---

205
differences betweeTI the absor'pt~on epectra in the range fr'om 300 to 3~0 nm.
Reaction of N-AcO-AGlu-P-3 with DNA
Structure of the modified DNA
In the conditions described in Materials and Methods, the metabolite
of Glu-P-3, N-AcO-AGlu-P-3 binds covalently to native or denatured DNA.
Evidences of covalent binding of mutagenic residue to the C-8 guanine base
of DNA was established by HPLC and spectroscopie study in ultraviolet absorp-
tion.
Enzymatic hydrolysis of modified DNA followed by HPLC analysis
ITig. 2)shows that only one main adduct is formed in the reaction in vitro
of N-AcO-AGlu-P-3 with native DNA. The peak in the chromatogram elutes at
the same Yime (13 mn 18 s) that dguo-A-Glu-P-3.
Moreover the absorptionspectrum (310 - 400 nm) of the fractions of
hydrolyzate of DNA-AGlu-P-3 eluted at 13 mn lB s is similar to th2t dguo-
AGlu-P-3 (not showTJ).
The extent of
DNA modification was calculated, using the molecular
extinction coefficients of guo-AGlu-P-3
E
nrn = 7700 and
nm = 25 650.
350
E 260
Fig. 5 presents, in insert, the variation of the ratio A260lA350 nm as a
function of degree of nDNA modification.

---

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250
300
350
400
wovelength
(nm)
Fig. 4 : Ultraviolèt spectra of dGuo-AGlu-P-3 (- - -), dGuo-Glu-P-3 obtained by alkali treatment of acetyl
derivative in 0.1 M NaOH at 40°C or dGuo-Glu-P-3 after incubation of acetyl derivative in 0.1 M ZnS04 at 370C
for 30 mn (-), 5mM citrate buffer, 10 -2 M NaCl, 0.1 M EDTA (pH 7.5) .
.._----- ~--..~. --..- --" _. -------~.. _. "-"-~-'-'--,.- '-'-"'~--' '---'--.-- -..-

---

207 '
/
Ultrav10let ebsorpt1on spectre and thermal stabil1ty
The u.v: absorption spectrum of nDNA-AGlu-P-3 looks like that of
dGMP-AGlu-P-3 near 350 nm at 2üoC. As the temperature is increased, a hyper-
chromie effect is observed in this region and at 260 nm (fig. 5).
The thermal stability of modified DNA has been followed by Uv absorp-
tion. The melting curves of modified DNAs look like that of
the unmodified
samples (not shown) ,
but one observes a linear decrease of Tm as a function
of the percentage of bound AGlu-P-3 residues (the slope is - 295 C/percent
of modified bases). Fig. 5 presents the variation of the melting tempera-
turesat 250 nm as a function of the degree of modification.
Action of 5" endonuclease (Aspergillus oryzaeJ
In order to broaden our informations on the conformational chang~s
induced in DNA by the AGlu-P-3 residues,endonuclease Sl digestion of samples
of nDNA-AGlu-P-3 was performed. The results (Fig. 7) show that the hydrolysis
is highly dependent on the degree of modification increasing WiTh The amount -
of bound AGlu-P-3 residues. However, even at high percentages of bound
AGlu-P-3 residues (15 %), the modified DNA is less hydrolyzed than unmodifieè
denatured DNA.
/
DISCUSSION
Pyrolysis of L-glutamic acid leads to the formation of products
hightly mutagens as Glu-P-l and Glu-P-2. In view to understand their mode
of action in :the org?nism, we have synthe-sized a new aminedesignated as
Glu~P-3 ana log ta Glu-P-l and, consequently, capable tO be formed during

---

20B
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220
250
300
350
400
\\Navelength (nm)
Fig. 5 : Ultraviolet spectra of a) dGMP-AGlu-P-3 (1.3 x 10-6 M AGlu-P-3),
b) nDNA-AGlu-P-3 at 9.5 %
( - ) 20°C, (- - -) BOoc. ln sert ~
standard determination of percent age of modified bases in calf thymus
nDNA-AGlu-P-3. Buffer 2 x lO-3 M Na citrate~10-2 ~ NaCl, 10-~ M EDTA (pH 7.3)~

---

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10
20
30
Time(mn)
%
Fig. 6 : Melting temperatures of n-DNA-AGlu-F-3 as
Fig. 7 : Hydrolysis of DNA samples by SI endonuclease
a function of the percentage of modified bases.
from Aspergi[[us oryzae. Hyperchromicity at 260 nm as
Buffer 2 x 10- 3 M Na citrate, 10- 2 M NaCl, 10-4
a function of time : dONA (+-+), nDNA (0-0), nONA-AGlu-
EDTA (pH 7.3).
P-3 modified at 1 % (8-0), at 5 % (A-4), at 9 ~ ~-m).
DNA preparations were ,incubated at 37°C with nuclease
SI as described in Materials and Methods.
~---------_.:.-------:

---

.. '
210
the thermal decomposition of L-glutamic acid conteining proteine.
We have tested t~e mutagenic activity of this compound tOlJal'ds S.
typhimurium
and showed that it was
more mutagen than Glu-P-l and was
one of the most mutagen chemicals known up to day. However, as Glu-P-l,
Glu-P-3 is not directly mutagen and needs the presence of fortified rat liver
postmitochondrial fractions.
Glu-P-3 does not react in vitro with DNA. We have synthesized its
possible active metabolite, N-AcO-AGlu-P-3 and shown
that this compound
reacts with DNA by covalent binding to C8 of guanine residues.
N-AcO-AAf, a final metabolite of
2-acetamino-
fluorene, reacts with nDNA to yield two main identified adducts : C-8 adduct
(~ 84 %), N-2 adduct (~ 16 %) (33, 34) and eventually other unidentified
products (34).O~the othe'hand, Kadlubar et al. (35) have established that
the metabolite of a-naphthylamine attaks only the 0-6 position of guanine
in vivo and in vitro while the more carcinogenic 8-isomer, N-hydroxy-2-naph-
. !
thylamine binds to C-8 and NH -2 of guanine and to N-6 of adenine. These
2
findings suggest that the nature of the ring bearing the amine function
plays a no
negligible role in the orientation of the fixation of carcinogen
residue on the macromolecule and its resulting effects. Thus, it seemed ta
us of interest to establish the mode of action of the mutagen N-AcO-AGlu-P-3
on DNA. It has been found from experiments performed in vivo with Glu-P-l and
in vitro with the supposed metabolite N-AcO-Glu-P-l 5 that modification of
'\\,
DNA by Glu-P-l occurs on guanine residues (19, 20).
We show, in-this work, that the reaction of N-AcO-Glu-P~3 with DNA '
leads mainly to the formation of one adduct as verified by high-performance'
liquïd chromatography after enzymatic hydrolysis of the modified DNA. This
adduct has been identified by mass spectroscopy and n.m.r. as the guanyl
C-8-addition compound 7.
'\\,

---

21J
'This result. in agreement with those obtained with Glu-P-J and
aminofluorene derivatives. supports the hypothesis, that the C-B position of
guanine is the main site of attack on DNA by these mutagenic atid/or carci-
nogenic amines as postulated particularly by Muzino (35) and Scribner et
al.
(41).
It can to be noticed that our experiments have shown that N-AcO-
AGlu-P-3 was much more active than N-AcO-Glu-P-1. the postulated metabolite
for Glu-P-1 (19. 20). In identical conditions. the amount of Glu-P-1 bound
to DNA was estimated to be roughly one molecule per 500 nucleotides (19)
while we deterrnined for the same quantity of N-AcO-AGlu-P-3, the degree of
-
DNA modification was about one mole cule of A-Glu-P-3 per 20 nucleotides.
These results, in correlation with the higher mutagenic activity of Glu-P-3
might be attributed to the electronic effects exerced on the nitrenium ion
forrned from N-AcO-AGlu-P-3, both by the methyl group in ortho and the ring
nitrogen in meta positions of the NH
function.
2
During the investigation, we found that the N-acetyl bound to the
modified nucleoside dguo-AGlu-P-3 was sensible to the action of the caTions
Zn++ and Co++. Heating at 37°C of the modified nucleoside in buffer solutions
of ZnS0
or CoC1
was found to cause quantitative release of acetyl group
4
2
to yield dguo-Glu-P-3. However, in similar conditions, no release of acetyl
groups was observed with modified DNA. 1t has been shown that about 70 per
cent of modified DNA by in vivo action of 2-acetamidofluorene was in a dea-
cetyled forrn (42). Since sorne inorganic oligoelements as Fe, Zn, etc. are
presents in animal organism, it may be possible that such cations could be
partly responsible of this in vivo deacylation.
The binding of AGlu-P-3 residues to DNA induces large conformation
changes. Native DNA is not digested by endonuclease 51' enzyme which acts
specifically on single stranded DNA. On the other hand, nDNA-AGlu-P-3 is

---

LIL
'1
rapidly digested by. the enzyme. This results suggests that there are sorne
open regions in the modified DNA. AGlu-P-3 residues decrease the thermal
stability of DNA. The melting temperature decrease value is 2°6 per l \\ modi-
fied nucleotide residue. 1t is not yet possible to describe these conforma-
tionel changes. However. the se preliminary results suggest that AGlu-P-3
and AAr residues behave similarly. i.e. the residues intereact with the
bases inducing a local denaturation (insertion - denaturation or base dis-
placement model) (32. 38).
In conclusion. our work has shown that Glu-P-3, an amine related to
protein pyrolysate derivatives, is a powerful mutagen. It reacts with DNA,
leads to a C-S adducts and induces modifications in the physico-chemical
properties of the macromolecule . A detailed study of this modified DNA by
circular dichroism and fluorescence will be published elsewhere.
Glu-P-3 was found more mutagen than Glu-P-l towards S. typhimurium
and its metabolite N-AcO-Glu-P-3 more active towards DNA as compareà to the
supposed metabolite of Glu-P-l. This higher activity
cari be the result both
of the privileged position holded by the amino group and of a higher electro-
phiticity of the metabolite due to an inductive effect and hyperconjugaison
of the methyl group in ortho of NH ., Takeda et al. (39) have found that the
2
mutagenicity of Glu-P-2 is significantly modified by the presence and the
position of a methyl group. Similar findings have been established by Hecht
et al. (40) for several N-oxidized derivatives of aniline and 4-aminobiphenYl.
In order to take into account the enhancing effect of the o-methyl group,
Hecht et al. considered the possibility that the o-methyl group is metaboli-
cally oxidized to O-hydroxymethyl and that the oxygen atome of the latter
makes easier the formation of a nitrenium ion from the neighboring hydroxy-
lamino group via anchimeric assistance. This hypothesis is of interest but
appears unlikely.

---

Since Glu-P-3 belongsto a family of cempounds which can be tormed
in daily foods. the results of our experiments as well as those of Hashimoto
et al. (19. 20) point out the necessity to dispose a convenient method for
exact quantification of these chemicals in foods and/or to follow their fate
in animal or human organisms. Study in this demain is currently in progress
in our laboratory.
Acknowledgements
We are indebted to Dr C. de Meester and ta K. N'Goy for the Mutage-
nesis essay. This work has been partly supported by La Ligue Nationale Contre
le Cancer and the Fondation'pour la Recherche Médicale Française.

---

214
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---

219
CHAPITRE II
ETUDES CONFORMATIONNELLES DE DNAS NATURELS ET
SYNTHETIQUES MODIFIES PAR LE DERIVE NAcOAGlu-P-3
Dpns le précédent chapitre, nous avons étudié les interactions
du DNA avec le métabolite N-AcO-AGlu-P-3 ; nous avons pu constater que
les régions de DNA modifiées sont fortement destabilisées. Etant donné
qu'une corrélation semble exister entre les changements conforrnationnels
induits dans le DNA modifié et l'initiation du processus de cancérisation
(fuch et al. Febs letters, 1971, ~' 205 ; ib. Febs letters, ,1973, ~' 295
ib, Biochemistry, 1974, 13, 4435), il nous a paru important d'essayer de
préciser la géométrie du DNA modifié par AcO-AGlu-P-3.
Nous avons donc modifié trois polynucléotides de sy~thèse :
poly(dG-dC).poly(dG-dC), poly(dA-dC).poly(dG-dT), poly dG.poly dC ainsi que
du DNA de thymus de veau in vitro pour étudier l'accessibilité des substratos
AGlu-P-3 au sein de ces macromolécules par spectrofluorimétrie et par
dichroisme circulaire.
Dans la première partie de ce travail, nous avons déjà signalé
que les dérivés du dipyrido[1,2-a:3',2'-dlimidazole donnent des solutions
fluorescentes. Cette propriété nous a paru intéressante à exploiter dans
la mesure où il est bien connu que certains composés, appelés inhibiteurs
de fluorescence tel que l'iodure de potassium, diminuent le rendement
quantique des molécules fluorescentes.
Deux types d'inhibitions peuvent intervenir: une inhibition
statique conduisant à un complexe non fluorescent entre l'inhibiteur et le
fluorophore et une inhibition dynamique résultant d'un choc entre ées deux
molécules.
La part exacte de ces deux processus est difficile à différencier.

---

no
1 \\
Néanmoins, on peut consiMTer eTI première approximation Qu'ils reflhent
tous les deux le degré d'accessibilité du fluorophore vis-à-vis de l'in-
hibiteur.
Les trois réactions suivantes associées avec leurs constantes
de vitesse décrivent la désactivation d'une molécule fluorophore excitée
en présence et absence de l'inhibiteur (KI)
TI
T + h-v
KI
(1)
Tii
T
k
(2)
2
T-
T + (KI)
K
(3)
3
Le rendement quantique en l'absence de l'inhibiteur
F
=
o
=
(4)
OÙ L
=,la durée de vie de la fluorescence émise.
o
Le rendement quantique en présence de l'inhibiteur
(5 )
= constante de Stern-Volmer.
Si la molécule possède n fluorophores, l'approximation la plus
simple est de considérer tous les fluorophores comme indépendants et ab-
sorbant
de façon équivalente. Bien que les rendements quantiques soient
variables, on peut admettre que chaque fluorophore suit la loi de Stern-
Volmer (S.S. Lehrer, Biochemistry, 1971, la, 3254). Les rendements quan-
,
tiques du système en absence et présence de l'inhibiteur sont donnés par
L F .
L F.
F .
01.
1.
1
01.
F
=
et
F =
=
o
TI
n
n
r 1 + K
[IK]
Qi
où la somme L est prise sur les n fluorophores.

---

nJ
La différence r
- r devient alors
0
1
r
r
ol
02
br : r - r =
(r
-
t
r
t
...
0
n
01
1 t K m<1
02 - 1 t KQ2tm
J
Q1
r . K
[IK)
!
Ol
Qi
I:
1
:
n
1 t K
[ IK]
Qi
F
r .
o
Ol
et i l vient
br =
"-
ou
f.
=
l
r o
si le polymère possède m fluorophores accessibles avec la meme valeur de KQ
et n-m fluorophores accessibles~ on obtient
Fo
l
l
br =
+
=
f
où f
[f.
sommé sur m est
a
l
a
la fraction maximum de fluorescence accessible~ en portant F fAr en fonction
o
de lf[IK]~ l'ordonnée à l'origine permet d'obtenir f
et le rapport entre
a
l'ordonnée à l'origine et la pente permet .d'obtenir K
: constante d'inhi-
Q
bition efficace.
L'ensemble de ces résultats est exposé dans l'article
"Conformational changes induced in DNA by the in vitro reaction with the
mutagenic amine : 3-N~N-acetoxyacetylamino-4~6-dimethyldipyrido[1~2-a:3'~
2'-d]imidazole"
E. Hébert~ B. Loukakou, G. Saint-Ruf and M. Leng
soumis à "Nucleic Acid Research".
Les études faites sur les poly(dG-dC)AAF en dichroisme circulaire et
en immunochimie ont montré qu'en faible force ionique ce polymère modifié
est en forme B où les noyaux AAF sont partiellement insérés dans la double
hélice
du DNA, tandis qu'en force ionique élevée
le poly(dG-dC)-AAF adopte

---

222
un~ conformation semblable ~ la forme Z 'oQ les noyaux AAr sont ~ 1'ext~rieur
de la double hélice (voir thèse dIt. Sage, Orléans, 1981). Notre étude en
fluorescence et en dichroisme circulaire donne un résultat semblable quant
au poly(dG-dC)AGlu-P-3. On peut d'ores et déjà noter un parallélisme entre
le dosage immunochimique et l'étude de l'accessibilité du substrat mutagène
dans le polymère par spectrofluorimétrie. En outre, nous observons un
comportement similaire pour le poly(dA-dC).poly(dG-dT)AGlu-P-3. Ce résultat
est d'importance, car on retrouve dans le DNA naturel plusieurs séquences 1
du t}Te poly(dA-dC).poly(dG-dT) alors que la séquence poly(dG-dC)(dG-dC)
est plutôt une séquence rare.
Les substr'ats AGlu-P-3 stabilisent la conformation Z de poly(dG-
.
dC).poly(dG-dC). L'étude de J'extinction de fluorescence par l'iodure-de
potassium suggère que les substrats AGlu-P-3 sont à l'extérieur de la
double hélice en force ionique élevée.
En étudiant le poly(dG).poly(dC)AGlu-P-3 qui est en forme B,
l'dccessibilité du substrat est de 50 % à faible force ionique, identique
à ce qui a été observé par rapport aux deux autres polynucléotides modifiés
étudiés plus haut; ce résultat laisse penser que l'insertion ou la position
du motif AGlu-P-3 n'est pas fonction de la séquence des bases du DNA.
On pourra ajouter que le poly(dG-dC).(dG-dC)AGlu-P-3 et le
poly(dA-dC).(dG-dT)AGlu-P-3 sont en forme Z quand le taux de modification
augmente; à 20% de modification le poly(dG-dC).(dG-dC) est entièrement
sous forme Z.
,
/
\\
-

---

· '
223
Conformational cha~e8 induced in DNA by the in vitro reaction vith the muta-
Benie amine
3-N~N-8cetoxyacetylamino-4,6-dimethyldipyrido (1,2-8 : 3',2'-d)
1midazole
Erie B€bert,
Bernafd Loukakou, Germain Saint-Ru! and Marc Leng
~~
Centre de Biophysique Moléculaire. C.N.R.S .• lA, avenue de la Recherche Scien-
tifique, 45G45 Orlêans Cédex, (France).
-1.

---

224
) '
r
Abbrev1at ions
1
1
1
J
elu-p-3 1 3-am1no-4,6 cUmethylcU.pyr1doO ,2... :3 '2 '-4) biduole.
i l'
~-AcO-A-Clu-P-3 1 3-N,N-acetoXYQe&tylQm1no-4,6-d1methyld1pytldo(1.2-8:3'2'-~) .
,
.!
:Lm1dazole.
: 'l
...
,
A-elu-P-3 : 3-N-acotylam1no-4,6-dtmethyld1pyr1do (1,2-8:3'2'-d) 1mlda!ole . .
.
,
...
dGMP-A-elu-P-3 : R-(deoxyguanos1n-8-yl-S'mDDOpho8phate)-3-N-8cetylamlno-4.6~ • 1
~ .01
r-
0.
dbJethyld1pyrldo Cl ,2-a:3 ',2 '-4) biduole.
':
2
~I
,
1
DDNA
native DNA.
1
1
,
dDNA
denatured DNA.
,
,
DNA-A-Glu-P-3 : DNA that has re.aeted wlth N-AcO-A-elu-P-3.
~
poly(dG-d~)-A-Clu-P-3 :- poly(dC-dC).poly(dG-dC) tbat·ïlB.s-·reaêtêcf wÙh-N-AcO--
A-Glu-P-3.
poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-elu-P-3 : poly(dA-dC).poly(dG-dT) that bas reacted
vith N-AcO-A~lu-P-3.
poly(dG) .poly (dC)-A-Clu-P-3 : ,poly(dG) .poly(dC) that has reacted with N-AcO-
A-Glu-P-3.
AAF : N-acetyl-2-aminofluorene.
Guo-AAF
N-(guanosin-8-yl)-2-N-acetylam1nofluorene.
" ' - - - - . - -
DRA-AAr
DNA that bas reacted with N-acetoxy-N-acetyl-2-aminofluorene.
1
l
,
l'
1
1
1
;

---

'\\
) 1
1.
, . -
1
\\
l
'
1
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~.
1
1
,
- ~,
.. , r.
p
. . . .
"J
&! 1
c..
j
1
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-l
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1
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1
1
1 - . : - - : '
_ _
, _ _
- -'-
l'~ .. "
ABSTRACT
.- . .,
.- -
The conformation of synthetic or natural DNAs modified 10 vitro by
covalent binding of N-AcO-A-Glu-P-3 was investigated by fluorescence and cir-
cular dichrolsm~ In aIl cases, substitution occurs mainly on the Cs of guanine
residues. In modified poly(dG-dC).poly(dG-dC) or poly(dA-dC).poly(dG-dT) in B
conformation, A-Glu-P-3 residues interact strongly vith the bases whereas in Z
conformation these residues are largely exposed to the solvent and interact
veakly vith the bases. A-Glu-P-3 and N-acetyl-2-aminofluorene (AAF) residues'
are equally efficient to induce the B-Z transition of poly(dG-dC).poly(dG-dC)
and of poly(dA-dC).poly(dG-dT). Modifications of poly(dG).poly(dC) and calf
thymus DNA indicate strong interactions between A-Glu-P-3 and the bases.
INTRODUCTION
Recent studies have shown that mutagenic compounds are formed'in the
charred parts of cooked food such as meat, fish, bakery and cereals (1-7) and
1
in pyrolysis of amino acids and proteins (7-13). Two new highly mutagenic he-
1
terocyclic amines have been ident1fied in pyro,lysate of L-glutamic acid : 2-
1
.
amtn~6-methyldipyr1do (l,2-a:3',2'-d) imidazole and 2-aminodipyr1do (1,2-a:3',
2'-d) imidazole. respectively named Glu-P-l and Glu-P-2 (10).
We have recently reported that a re1ated compound: 3-amino-4,6 d1-
methyldipyrido (l,2-a:3',2'-d) imidazole, named Glu-P-3 is even more mutag~nic
tban Glu-P-l and Glu-P-2 (14). In vitro Glu-P-3 does not bind to DNA but a'sup-
posed metabolite N-acetoxy-N-acetyl-Gl~-P-3binds to DNA and deoxyguanosine.
It 1s known that aIl the carcinogens bind covalently to DNA and it is
generally assumed that this covalent binding 15 important in cancer process
(15). In this paper, we report some results on the conforma tional changes in-
duced by the covalent binding of A-Glu-P-3 residues to natural and syntheti~
polynucleotides. There are already numerous studies on the conformation of nu-
- ... eleic acids mod1fied by carcinogens. Nevertheless, it seemed to us of interest
.
~.

---

226
----~ t~bettêr eberacter1R8 the blndlna of thls new heterocyclic A~1ne to D~8nd--:
1
l _
to compare vlth the vell·known carC1ftogeD acetyl-2-om1nofluorene. Clu-P-3 and
1
•
2-am1nofluoreDe show 91gnlflc&Dt etructural s1m1lar1t1es • formules of -the two
i
comp0Un4e are
:
~-:1Y~2
(
CH)
CH)
2-aminofluorene
Glu-P-3
Horeover. Glu-P-3 18 fluorescent in normal eond 1t 10ns .-This- off ers·
8
new possib1lity to locate the Glu-p-3 residues vith respect to the bases re-
8idues. ln parallel, a study of the modified DNAs bas been performed by cir-
cular dichrolsm.
MATERIALS AND METRODS
-
3-N-acetoxy-N-acetylamin0-4,6 dimetbyldipyrido (l,2-a:3',2'-d) imi-
da~ole (N-AcO-A-Glu-P-3) and 3-N(2'deoxyguanosin-8-yl-5'monophosphate), N-ace-
tylamino-4,6 dimetbyl dipyrido(1,2-a:3',2'-d) imiclazole (dGMP-A-Clu-P-3) vere
prepared as already deseribed (14). Poly(dG-dC).poly(dG-dC), poly(dA-dC).poly
(dG-dT) and poly(dG).poly(dC)were bought from P.L. Biochemicals and calf thy-
mus DRA (Type 1) from Sigma. Potassium iodlde (KI) ls obtained from Merck.
The reaetion between calf t~ymus DRA and N-AcO-A-Glu-P-3 vas perfor-
med as already described (14). Denaturated samples were obtained.by heating·
~NA-A-Glu-P-3 st 100°C during 15'· mnand then by rapid cooling in iee. The re-
.
1
action between synthetic polynucleotid.es and N-AcO-A-Glu-P-3 was performed ac-
eording to the following procedure : polynucleotide (100~g) was dissolved in
500 ~l of 1 mM phosphate buffer pH 7.3 and 5 ~l of a dimethylformamide solution
of N-AcO-A-Glu-p-3 vas added (the rati~ of earcinogen to phosphate vas 1). Âf-;
ter incubation at 37°C for 2 houts, the solution was treated twice with phenol
and tben exhaustively dialyzed against i mM phosphate buffer, 0.1 mM EDTA
pH 7.3. The percentage of modified bases vas deduced from the ultraviolet ab-
.
;
8orption 62ectra (14). We w1ll wr1te DNA-A-Glu-P-3 (0.10) for a modified sample,
1
bavtng 10 % mod1fied bases. Enzymatic bydrolysis was performed as described in
ref. 14 and rad1oimmunoassays have been already described (35).
i
lostrumentation
1
Ultraviolet spectra vere re~orded on a Cary 210 8pectrophotometer~
,_. _
_ .
.•.
..
_ ........•._ . - - : - - - - - - - - - - - - - -
.,.-1

---

227
---~ Iclrcu!âr d1ëhroIsm spectre on a kousser:JouBn ÀUlo-dIëhrogrep~MarkIV. Flüo~:
,
1
i
~-
resceoce meoGurements'vere performed vith 8
..
'srrand Mark 1 spectro!luor1meter" .
"
~,
The circular d1chro!sm resultl are 81ven ln AA end not ln ~ Mil cm-l becau~e j
~
; .
..
1
1
..
elu-p-3 and Ducleot1de rosidues can part1clpate to the CD slgnal.
,
;...J
1
'"
lESULTS
1
1
1
Nature of the adducts
1
,
1
Several syntbetic polynucleotides
poly(dG-dC) .'poly(dG-dC)
poly
1
!(dC).poly(dC), poly(dA-dC).poly(dG-dT) and calf thymus DNA have been reacted
1
i
vith N-AcO-A-Glu-P-3. After removal of the unbound metabolite, the samples vere
1
digested by DNAse l and Pl nuclease as previously described (14) and then ana~
, -
lyzed by HPLC. In thes~ conditions, only, one adduct.result ing
..-. : .
tution on the Cs of deoxyguanosine was detected •
Fluorescence
Glu-P-3 and 80me of its derivatives are high1y fluorescent. In fi-
gure 1 are drawn the absorption and the fluorescence spectra of dGMP-A-Glu-P~3
and of nDNA-A-Glu-P-3 (0.05) in low salt conditions. Above 310 nm the absorp-
tion spectra are similar in shape.
The fluorescence spectra have also a similar shape with a maximum at
- ' - - - .
415 Dm, but the fluorescence intensities IF are different. A-Glu-P-3 residues
are about thirty times more fluorescent when bound to DNA than to dGMP. The'
"
.
fluorescence intensity is almost the same for A-Glu-P-3 residues bound to poly
(dG-dC).poly(dG-dC), poly(dA-dC).poly(dG-dT), poly(dG).poly(dC) or nDNA. On the
other band, IF of dGMP-A-Glu-P-3 is very sensitive to the nature of the medium.
IF is much larger in ethanol (almost 10 times) than in water (not shown).
· ,
The fluorescence intensity of dGMP-A-Glu-P-3, nDNA-A-Glu-P-3 and poly
•
1
(dG).poly(dC)-A-Glu-P-3 is independant of salt concentration up to 4 M NaCl. l~
depends strongly upon salt concentration when A-Glu-P-3 residues are bound to :
poly(dG-dC) .poly(dG-dC) or_ poly(dA-dC) .poly (dG-dT)., In both cases, tbere is:a':
•
1
transition occurtng in a cooperative manner, the midpoints of which are respec~
tlvely1,4 M and 0.8 M for poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.05) and for poly(dA-dC) • .
poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) (figure 2):.
:
1
!
1
These results strongly suggest that the location of A-Glu-P-3 resi- '
i
i
dues depends upon salt concentration in some polynucleotides but not in a11 ·o{
1
them.
! l'
the location of A-Glu-P-3 residues can be better determined by a study
of the accessibility of tbese residues to ions which are known to quench fluo-
rescence.
i '1
1
l
---,,--- ." .._-,-,--,-----_._---~-----------
t:

---

228
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1
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CD
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Cl
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c
. \\
.
1
~.
\\
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1
.
,
.
\\
.
:
1
'.~ i
.:/
" " '.
y.
.".:..
300
3~O
400
4~O
Wovelength (nm)
Tigure 1 - left : ~bsorption spectra of nDNA-A-Glu-P-3 (0.05) (---) and dGl,œ-A-
Clu-P-3 (--) A-Glu~P-3 concentration: 3xlO-5 M ; right : fluorescence'spectra
of dGMP-A-Glu-P-3 (--.--) (sensitivity : 0.1) and nDNA-A-Glu-P-3 (0.05) ( .••.• )
(sensitivity : 1) A-Glu-P-3 concentration: 3xlo-7 Mt Àexc 350 om. Solvent 2 mM
citrate buffer pH 7.3, 10 mM NaCl, 0.1 iii'! EDTA.

---

, ,229
Î
ï
-1
o
+1
Log [NoCI]
•
1
1
!
Figure 2 : Fluorescence intensity percentage at 415 nm as a function of NaCi
concentration: (A) poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) ; (B) poly(dG-dC)-
A-Glu-P-3 (0.05) ; (C) poly(dG).poly(dC)-A-Glu-P-3 (0.065) ; (D) nDNA-A-Glu-P-3
(0.05) ; (E) dGMP-A-Glu-P-3. Solvent : 1 mM phosphate buffer pH 7.3~ 0.1 mM
,EDTA
~exc 350
temperature 25°C A-Glu-P-) concentration: 3xlO-
M.
t
Dm t

---

230
~ c::
U- one AElSUDles· proporl10;n8TI.t)' betweenfluorescenci .1nt8nsity Anf
~
. qU4nt~ yield of fluorescence, the quench1ng of • fluorophor 1. expresse4 b~
. '. -
the Stem-Volmer law
: 1
.... .',
! 1
:
.1
' -
Wherê '0 abd F are the fluorescence lntens1t1es 1n absence of ln preeence of
-
::
~uencherD e the concentration of 'quencher and lq the Stern-Volmer constant.;
-
..
1
Our purpose 1& to cbaracterize A-Glu-P-3 residues bound to natural
»NA ln wh1eh the accessibil1ty of the fluorophor might depend upon the base
,
.
eomposltion. The analysis of the quenching of an heterogenous system can be
doue ua1ng a modif1ed form of the Stern-Volmer law as originally proposed by
::--.- Lehrer (16) : Fol t:.F 1:1 llFa + IIFa ~c where fJ.F BI Fo-F with the same sign1fica-
.
m
tion 88 ~bove for F
/-0 Fi summed over the m accessible
A
• •
o and F and where Fa ra
fluorophors ls the fractionsl maximum accessible fluorescence (Fi being the
•
1
fractionsl fluorescence of the fluorophor i).
~e experiments were performed in presence of IK, 1- being known to '
be an effective fluorescence quencher.
ln figure 3 are shown the variations of Fo/Ar as a function of the
,
inverse of IX concentration. The value of Fo/Ar at infinite IK concentration i5
equal to IIFa, Fa being the fractional maximum accessible fluorescence. In the
esse of dGKP-A~lu-P-3, Fa a 1 and thus the fluorophor is completely accessible
,
\\
to the quencber. It 1s less accessible in denaturated DNA and still less in na-
tlve DRA (fig. 3A).
1
On tbe other band, the influence of the percentage of base modified
t.
in Dative 'calf thymus DNA bas been examined and we found that Fa values remain
~be same vbatever i8 the level of modification in the range 0.01~0.11 (not
sbawn) •.
POly(dG-dC)-A-Glu-P-3, poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (figure 3,
Band C) and. poly(dQ.poly(dC)-A-Glu-P-3 (not shown) i? low salt behave as nDR~;
ln all tbe cases, Fa = 1/2. ln bigh salt conditions, Fa is still equal to 1/2
for modified nDNA and poly(dG).poly(dC) but is equal to 1 and 0.9 for modified
-
.
poly(dG-dC).poly(âG-dC) and poly(dA-dC).poly(dG-dT) respectively.
The values of Fa and of the Stern-Volmer constant Kq are reportedin
1
tbe table 1.'
1
,
1
1
i
Circular dichrolsm
1
1
It 18 well known that poly(dG-dC).poly(dG-dC) has the B conformation
ln 0.1 M NaCl and the Z conformation in 4 M NaCl (17, 18, 19). The cooperative
-
~ - 'transition of poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.05) detected by fluorescence suggested
---_. ..
__
.._-_.- ....
.._._----------------_. -. -..

---

231
~ A
8
c
Ar.,
ligure 3 : Modified Stern-Volmer plot of the quenching of A-Glu-P-3 fluores-
cence by iod1de : A. nDNA-A-Glu-P-3 (0.11) (A >. dDNA-A-Glu-P-3 (0.11) (0 ),
dGMP-A-Glu-P-3 (1:] ) in (NaCl + KI) 0.5 li .
B. poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.05) in (NaCl -+ KI) 0.2 M (iii ), 2.5 M' (A )
C. poly(dA-dC) .poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) in (NaCl + KI) 0.2 M (Cl ) 1
2 H ( m ) Solvent : 1 mM phosphate buffer pH 7.3, 0.1 ~~ EDTA} À
350 Dm
exc
1 em 415 om. Temperature 25°C, A-Glu-P-3 concentration: 3xlO- 'M.
sail concenlralïal
Substrale
Fa
KQ-(~t )
(M)
nDNA-A-Clu-P- 3 (0.01)
O.S
0.S2
J.8
nONA-A-CIu-P-J (O.OS)
O.S
0.S2
6.3
nON A - A - CI u- P- J (O. 11)
O.S
0.S2
6.1
dONA-A- Clu-P- 3 (0.11)
O.S
0.67
6.6
dCMP-A- Clu-P- 3
O.S
1
6.1
poly(dC-dC)-A-Clu-P-3 (O.OS)
0.2
0.5
9.1
poly(dC-dC )-A' Clu-P- 3 (0.05)
2.5
1
8
poly(dA-dC).poly(ÙG-dT)-A-Clu-P-3 (0.12)
0.2
0.5
Il.6
poly(dA-dC) .polytdC-dT)-A-CIu-P-3 (0.12)
2
0.9
Il.2
,
poly(dC) .poly(dC) -A, Clu·P- 3 (0.065)
0.2
0.5
10
Table' 1 : Quenching of A-Clu-P- 3 fluore5Cence by lodide At 250C

---

e:--~) ibat luch " 8-% tnns1t1on oleo occured with this mod1f1ed polynucleotide &u-..,'·
-'....
the ealt toncutntioD 'lias increaoed. Thh has been confirmee! by circuar d~-I'
.:. :
chrotam.
: 1 1
,
1
l
, - :
".
•
4
~
.
ln fleure 4A Are shown the CD opectra of poly(dG-dC).poly(dG-dC) 1n
rlov and h1Ih Galt conditions. They are 1n good agreement vith those aireedy
.
.
1
1
reported
l
(19).
l, "
1
•
!
t'be CD spectrum of poly (dG-dC)-A-Glu-P-3 1n low salt presente 8 po- .
.
, '
"-..
~itive banc! vith 8 maximum at 275 Ml and then a negative band centered at 25.0 RD.
,(flB. 4B). ln 1.8 MNaCi, the epectrum looks l1ke the spectrum of poly(dG-dC).
poly(dG-dC) iD Z conformation. The variation of ÂA290 as a function of salt
.--=-_ .. -.' eODeentration shows that the transition occurs according to a cooperative pro-
_
_
cess and the midpo1ot of the transition is at 1.4 M (inset of figure 4B). The .
-
-
midpo1ot of the transition de pends upon the amount of bound A-Glu-P-3. As jud-
ge~ by CD, poly(dG-dC).A-Glu-P-3 (0.20) is in the Z conformation in 0.1 M NaCI
(DOt show).
ln figure 5 are shown the spectra of poly(dA-dC).poly(dG-dT) and of
poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) in low and high salt conditions. The
CD spectra of ~he unmodified polynucleotide are almost the same, with a first
pos~tive band centered at 275 Dm and then a negative band centered at 240 Dm
(fis. SA). In low salt conditions, the CD spectrum of the,modified polynucleo-
tide looks 11ke that of the unmodified polynucleotide.
;
\\
1
•
On the other band, 10 1.1 M NaCI, the CD spectrum presents a !irst
negative band centered at 295 Dm, theo a positive band centereà at 263 Dm and
tben a negative band (fig. SB). This spectrum presents large similarities with
tbat of poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 in 1.8 M NaCI (fig. 4B).
i i
. .
ID the inset of fig. SB the variation of ÂA290 as a function of salt
eoneentratlon shows tbat the midpoint of the cooperative transition occurs at
'0.8 H.
Finally in fig. 6 are shown the spectra of modified poly(dG) .poly
(dC)-A-Glu-P-3 in low and high salt conditions. There are some variations 'in
the spectra as the salt concentration is increased, but they
are smaller than
those observed vith the alternated polymers.
Badio~~oassays
.
The affinity of antibodies against Z-DNA towards the modified poly
(dA-dC).poly(dG-dT) was.studied by =adioimmunoassays.
.
The tracer was [3H] poly(dG-br5dC) .poly(dG-br5dC). As shown in fig. ?'
in 1.1 M NaCI, the poly(dA-dC).pol~G-dT)-A-Glu-P-3(O.12)interacts ~ith the
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233
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290
320
260
290
320
À{nm)
Figure 4 : Circular ditbroism spectra : (A) poly(dG-dC).poly(dG-dC) in 1 mM
phosphate buffer pH 7.3,0.1 mM EDTA ( - ) , in 3 M NaCl, 0.1 DM EDTA (---) ;
(B) poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.05), in 1 mM phosphate bufferpH 7.3, 0.1 1Ill'l: EDTA
(_._), in 1.8 M ~aCl, 0.1 mM EDTA (---)0 Inset :AA290 x 105 as a function of
,BaCl concentration of poly(dG-dC).poly(dG-dC) (-0-), poly(dG-dC)-A-Glu-P-3
(OoOS) ( - ) . Tbe absorbance at 260 nm vas 0.4 ; temperature 25 D C.

---

234
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320
260
290
320
"( f'\\m)
ligure 5 : Circular dichrolsm spectra : (A) poly(dA-dC).poly(dG-dT) in 1 mM
phosphate buffer pH 7.3, 0.1 mM EDTA ( - ), in 1.9 M NaCl, 0.1 m..'i EDTA (__ )
(B) poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) in 1 mM phosphate buffer pH 7.3.
0.1 mM EnTA (_.~). in 1.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA (---). Inset : AA290 x 105 as 8
function of NaCl concentration of poly(dA-dC).(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12). The
~bsorbance at 260 nm vas 0.4 ; temperature 25°C.
.
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.

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290
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260
290
320
À(nm)
Figure 6 : Circular dichrolsm spectra
(A) poly(dG).poly(dC) in 1 mM 'phosphate
buffer pH = 7.3,0.1 mM EDTA ( - ) , in 1.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA (---) ; (B)
poly(dG).poly(dC)-A-Glu-P-3 (0.065) in 1 mM phosphate buffer pH = 7.3, 0.1 mM
EnTA (--), in 2 M NaCl, 0.1 mM EnTA ( - ) . The absorbance at 260 Dm was 0.4 :
temperature 25°C.

---

230
,
, ;
i
zo-~-al- 50
l
Z
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-8
-6
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log
(CO.MPETITOR]
Figure 7 : Inhibition of tracer-antibody binding by poly(dA~dC).poly(dG-dT)-A­
Glu-P-3 (0.12) in competitive RLA. Tracer [3Hl poly(dG-brSdC).poly(dG-brSdC),
c • 3 x 10-7 M. Ant iserum dilution 1/1000. In";ibHors (A) poly(dG-brSdC). poly
(dG-b~dC), (0) poly(dA-dC).poly(dG-dTJ-A-Glu-P-3 (0.12). Solvent 1.1 M NaCl,
1 mM phosphate buffer pB 6.5, 0.1 mM EDTA. Temperature 4°C.

---

\\~"'_~~fl~" .
1;~~~2a7
..,.;:~-'t,-,t~h:
------) ant1bod1tB to Z-DNA. lt 11 recogn119d to a les. extenl than.poly(dG-br 5dC).poly
.;
(dG-br 5dC) • about 50 t1mcs mOIG poly(ü-4C) .poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.l2) than.
poly(dG-br 5dC) .poly(dG-br5dC) are DDcalBlu'Y to set SO 1 1nhib1tion.
l !
.. -,
,
1
DISCUSSION
:
;
1. .
!
•
We have studied by fluoreac@nce and circuler dichrolsm the conforma-
~ional changes induced by the b1nd~ of 3-N-acetylamino-4.6 dimethyldipyr1do
(1.2-8:3'.2'-d) 1midazole (A-Clu-'-~) raaldues to the Ca of guanine res1dues
1
1
t...:..
-.
10 natursl and oynthetic nucleic acide (Glu-P-3 18 related to the mutagenic'
~ompoundB Glu-P-l and Glu-P-2 formedin the pyrolysis of glutamic acid).
The fluorescence emission Ipectrum of dGMP-A-Glu-P-3 presents a ma-
ximum at 415 Dm. The fluorescence in~ensltydepends upon the nature of the me-
dium, being much larger in ethanol than in vater. In low salt conditions, the
fluorescence 1nten8ity of several mo4ified polynucleotides ·poly{dG-dC).poly
(dG-dC), poly{dA-dC).poly(dG-dT), poly(dG).poly(dC) and DNA 1s about the same
and larger than that of dGMP-A-Glu-P-3 in vater. This suggests tha t A-Glu-P-3
residue bound to DNA and synthet1c polynucleotides 18 DOt totally 1n contact
vith water but rather interact vith the base residues which provide an hydro-
phobie environment.
The study of poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 gives atrong support to this hy-
pothesis. Poly(dG-dC).poly(dG-dC) bas the B conformation 1n low salt concen-
tration and the Z conformation in b.1gh salt concentration (l7 ,18). The CD
spectra of poly(dG-dC).poly(dG-dC) and poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 1n 1 mM phosphate
on one hand and in 3 M NaCI on the other band are similar. As-judged by circu-
.
.
.
lar dichroIsm, poly(dG-dC)-A-Glu-P-3 adopts the Z conformation in high lonic
strength. The B-Z transition of the modified polymer 1s cooperative and occurs
at lower salt concentration than tbat of t~e unmod1fied polymer. The binding
of A-Glu-P-3 residues to poly(dG-dC).poly(dG-dC) stabilizes the Z conformation
(a poly{dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.20) 18 in the Z conformation in O.lM NaCI, not , '
shown). '
1
1
'rbe B form-Z form transiti9n of poly{dG-dC)-A-Glu-P-3 (0.05) can be
followed by fluorescence. The fluoreScence intensity IF ie larger in 0.1 M .
than in 3 M NaCl. This 18 DOt due to "11 direct interaction between NaCl an,d A-
Glu-P-3 residues since in the same ~t range, IF of dGMP-A-Glu-P-3 is almost
constant. IF of.poly{dG-dC)-A-Glu-P-:) (O.OS) decreases sharply near 1 M (mid-
point of the transit10n 1.4 M).
The value of midpoint of the transition is in good agreement with
,'-
,
-= :.'
that determined by CD experiments. -.~ the . interactions between A-Glu-P-3
-
'f~:':
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~..')
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the B conf orme t ion. This 15 conf inDed by the determ1ns t ion of the tracts,oMi
~ Ü
lM1daum accuslble n,uoreseence. Experimente Are performed in presonce' of 1-.,
:: ... ~.)
r. L','" c.. 1- •.,uenches the fluorescence "hen 1t 18 1n cloDe contact vith the fluorophor.
The results are analYled vIth a modified form of the Stern-Volmer law (16). 'The
,U.near plot of .0'Q versus 1/0-) (figure 3) suggeste that each fluorophor '18
,
eubject to a Dt61lar degree of fluorescence quenching. On the other band the
,
,
degree of quenChlng depends upon the conformation of the polynucleotide. About
'50 % of A-Glu-P-3 fluorescence is sccessible for quenching by iodide when. A~ :
l
,
Clu-P-3 res1dues àre bound to poly(dG-dC).poly(dG-dC) in the B conformation and
- - - 10~_I~hen bound to poly(dG-dC) .poly(dG-dÇ) .iD th~_ Z__confor~tlo_n (or_;.o }GMP).-
It ean be noted that the values of the quench1ng constants are almost indepen-
.J
.0.
-
dent of salt coocentration.
!bus our conclusion from CD and fluorescence exper1ments ls that A-
•
Clu-P-3 residues Bre largely exposed to the solvent and do not interact (or 10-
teract weakly) vitb the base residues when bound to poly(dG-dC).poly(dG-dC) in
tbe Z conformation. On the other hand, these residues interact strongly with
the base residues and sre ooly partially exposed to the solvent when bound to
/
.-
-.
poly(dG-dC).poly(dG-dC) in the B conformation.
CD and fluorescence experiments were also performed vith modified
poly(dA-dC).poly(dG-dT) and poly(dG).poly(dC).
The bebaviour of poly(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 resembles that of
1
Paly(dG-dC)-A-Glu-P-3. In low ionic strength the CD spectrum presents a first
Posl~ive band cemtered at 275 Dm and then a negative band centered at 240 Dm.
About 50 %of A-clu-P-3 residues fluorescence is accessible for quenching by
lodlde. As the i.onic strength is increased, a cooperative transition occurs~
The œidpoint of ~he transition determined by CD and fluorescence are in good
agreement. In h~h ionicstrength, about 90 % of A-Glu-P-3 residues fluores-
cence 18 accessible for quencbing by iodide. The CD spectrum presents a first
negative band centered at 295 Dm and then a positive band centered at 263 Dm.
This part of the spectrum Idoks like the one of poly(dG-dC).poly(dG-dC) tri the
Z conformation and thus suggests that the modified polymer bas the Z conforma-
tion. This assumption is confirmed by the radioimmunoassays data which clearly
.
.
.
-
iDdicate tbat p01y(dA-dC).poly(dG-dT)-A-Glu-P-3 (0.12) is recognized by the an-
.
tibodies to Z-DRA. Thus, the A-Glu-P-3 residues bound to poly(dG-dC).poly(dG-
-.
dC) and to poly{dA-dC).poly(dG-dT) behaves similarly when the polymers have on
one hand the B conformation and on the other band the Z conformation.
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..__ .. __ ...
.
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ID 4.S H NaCl, the B-Z transition of 11neer poly(dA-dC) .po1y(dG-dT) ,
i
1
dOQS Dot occur Whi1e poly(dC-dC).poly(dC-dC) ~a the Z conformat1on. A-C1u-~-3,
rea1duee atabi1i&e the 2 fora of poly(dC-dC).poly(dG-dC) and poly(dA-dC).poly
,
;
f
~
(dG-dT). lt iD intereat11\\a to compa( re the efhcta of A-clu-P-3 and AAF res1-:!
~ ·I~.
dues. Both resldues bound to poly dG-dC).poly(dG-dC) behave 81m1larly (th1s'
-
'.
1
1
-
i
, ~rk end reI erences 20-22 0 31). On the other band t A-Glu-P-3 eeems to b~ mo~e 1
~.~
efficient than AAr realduea to stabll1ze poly(4A-dC) .poly (dG-dT) in the Z C~D-'
,.
,.
fot1llEltion (23).
i.1 ,i::. r-
As far a8 concerning the modified poly(dG).poly(dC), the fluoresc~nce
intens1ty rema1ns constant in the range 1 mM-2 M NeCl and about 50 % of A-Clu-
,
P-3 residues fluorescence 1s accessible for quenching by iodide 8S for the pre-
viously tnvest1gated polymers in low ionic strength. These results 1ndicate
again that A-Clu-P-3 residues interact vith the bases residue5. CD spectra
vb1ch are not drast1cSlly cbanged for modifieà poly(dG).poly(dC) with respect
to unmodif1ed sample. even on increasing the 10nic strength suggest that modi-
fication by A-Clu-P-3 does DOt induce the B-Z transition of poly(dG).poly(dC).
The behaviour of nDNA-A-Glu-P-3 resembles that of modified synthetic
polynucleotides in the B conformation. About 50% of A-Glu-P-3 residues fluo-
_
' - - . _ ..
rescence 15 accessible for quenching by 1odide. This value i5 independen~ of
the level of modification (in the range 0.01-0.11). There are no changes in
the fluorescence inten8ity in the range 1 mM-2 M NaCl. These results sugges~
that A-Glu-P-3 tesidues interact strongly vith the base residues
and that the
,
~ccessibility to the quencher 15 not sensitive to the base composition. The;A-,
Clu-P-3 residues are more exposed in denaturated DNA. About 63 %of the fluo- 1t
•
1
:
rescence 15 accessible for quenching by iodide.
:
\\
Up to th1s point, we have to compare the conformational changes in- 1
duced by the binding.of A-Glu-P-3 and AAF residues to nucleic acids in B con-
formation. In vitro, AAF ls ma1nly bound to tbe Ca of guanine residue (2q).
The solution stud1es show that AAF mod1fied DNA of random sequences adopts a
conformation named insertion-denaturation (2S-i7) or base-displacement model
'(28-30). In th1s conformation, the carc1nogen is stacked vith the adj acent
base and the guanine is sm and outside of the double helix. "''hen the carcino-
gen i6 bound to poly(dG-dC).poly(dG-dC) or to poly(dA-dC).poly(dG-dT) it stabi-
11z~s tbe Z conformat1oU(2o-23). The guanine are syn, paired w1th cytosine and
1t 15 assumed that the AAF residues are outside the double hclix (26-31). Mlni- ,
mized semi-empir1cal po~ential energy calculations for AAF adducts vith dCpdG
- .-
i
1
bave yielded molecular news of the adduct conformation (31,32).
1 1
_.... _.-.-_.. _-._... -. - ''' __ ." -_.
.'_:1

---

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- - ) 1
The uxperlmenttl here reported on modH led nuc1elc fjcld. ln low ionlc
1
1
strength and thoD8 in reference (14) relative co the ,thermal etabllity of nDNA-.
:: ~.: '.' A-Clu-P-3 Bnd the h)'drol)'sis b)' Sl nuc1eau are in agreement vith the In8er~ :
•
tion-denaturetlon or base-d1splacement modela. The fluorescence quench1ng b~ "
lodlde Ind1cates that the A-Clu-P-3 residues are not complet el)' tnside the 1 •
l 1
~ouble bellx but partIall)' exposed to the BoIvent. This,cen exp1a1D, in the, 1
case of AAF, the recognitIon of DRA-AAr b)' the snti Cuo-AAF antibodies (33,34'.
:
j
1
On the other hand, A-Glu-P-3 residues stabilize the Z conformation
:
;
1
•
1
of pol)'(dG-dC).pol)'(dG-dC) and poly(dA-dC).poly(dG-dT). The fluorescence quen-
.
'
1
•
ching by Iodide demonstrates that A-Clu-P-3 res1dues are outside of the double
,
1
belix.
-_.
_
-
-
-
-
-
-
~ i
1
1
A recent paper in the case of AAF modified DNA underlines the pos-
sible role of Z-DNA in mutational hotspots (36). Because of the s1mi1ar con-
formationsl changes induced by hAF and A-Glu-P-3 residues, we are 1nterested
10 establishing the DNA b1nding spectrum of A-Glu-P-3. Work 18 10 progress to
determine such 8 spectrum.
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~3. Poirier. M.C., Yuspa, S.R., Weinstein, l.B. and Blobstein, S. (1977) Na-
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,
:
'1
"
,1i
i
:
.. -_._------'. ----- - -- --_. -------_.,---------------------

---

242
CON C LUS ION

---

243
CONCLUSJON
"OUlt theolUu aILe. the. rn.UiMM .(n
wh-tch we. ~ e.e. OUM etvu"
C. HUdetbeJtgeJt
Notre travail rentre dans le cadre des recherches développées au
laboratoire depuis plusieurs années sur la cancérogénèse et la mutagénèse
chimiques. L'objectif de ces recherches est d'essayer de comprendre les
mécanismes qui sont à l'origine du déclenchement du processus de cancéri~
sation à la suite de l'agression de l'organisme par un composé chimique
exogène.
Or, parmi les composés xénobiotiques auxquels l'organisme animal
ou humain peut être exposé, des découvertes récentes ont montré qu'un
certain nombre pouvaient se trouver dans notre alimentation quotidienne.
Le problème de la cancérogénèse alimentaire prend dès lors une dimension
~ouvelle d'autant plus importante que les produits incriminés ne relèvent
ni de la catégorie des additifs alimentaires, ni de celle des mycot?xines
- dont la formation est toujours accidentelle donc évitable - mais d'une
suite de réactions chimiques impliquant les propres nutriments de certains
produits alimentaires dans les conditions de préparation et de stockage
des aliments utilisés depuis des siècles.
Il est évident que la forte mutagénicité de tels produits sou-
lève un triple problème , à la fois
- sur le plan des études épidémiologiques,
- sur celui de la génotoxité alimentaire,
- sur celui de la recherche d'une politique prophylactique de prévention,
des maladies imputables à l'alimentation.

---

Nous avons ~ que l'hypothèse qui semble le mieux expliquer pour-
quoi et comment une population cellulaire, saine, cesse tout d'un coup
d'obéir aux règles normales de développement pour donner lieu à un pro-
cessus de tumorisation est celle dite des mutations somatiques. En
d'autres termes, l'intrusion d'un composé chimique au niveau des macro-
molécules biologiques et en particulier de l'acide dtsoxyribonucléique,
porteur de l'information génétique, provoquerait chez cette dernière
des lésions telles que les enzymes chargées de la reconnaissance de la
réparation et de la réplication des cellules se trouvent dans l'incapa-
cité d'effectuer normalement leur travail. Dès lors intervient l'étape
dite d'initiation'du processus tumorigène.
A ce niveau, se pose un problème, non encore résolu pour la com-
préhension de cette étape, c'est la nature des relations qui existent
entre les défauts induits dans la double hélice du DNA et la structure
du composé chimique effecteur. Une meilleure approche de ce problème
ne pourrait que clarifier celui de la corr~lation entre mutag~nicité et
cancérogénicité.
A cet égard, les dérivés du dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
reliés au p)~olysat de l'acide glutamique retiennent particulièrement
l'attèntion pour des raisons à la fois:
- d'ordre étiologique: ces composés fortement génotoxiques peuvent se
former au cours de la combustion incomplète de l'acide glutamique
largement répillldu dans la plupart des aliments que nous conso~~ons
- d'ordre chimique: le noyau dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole est un
hétérocycle azoté nouveau dont le mode de formation, l'étude des pro-
priétés physico-chimiques et des relations structures / activités
biologiques comportent, nous a-t'il semblé, un incontestable intérêt
sur le plan de la chimie hétérocyclique et sur celui des Sciences de
l'environnement.
Dans une première partie de notre étude consacrée à la chimie
de ces composés, nous avons mis au point diverses méthodes d'accès au
noyau dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole et à ses dérivés fonctionnels

---

245
1
, 1
/
ou non dont nous avons synthétist plus d'unE' quarantaine. Ces coniPOSt's
obtenus ont fait l'objet d'une étude physico-chimique poussée. en RMN
et en spectrométrie d'absorption notamment. qui nous a permis de déter-
miner sans ambiguité leur structure moléculaire. En outre. une étude
en spectrométrie de masse de six d'entre eux. choisis en raison de leurs
structures moléculaires. nous a permis de montrer que ces composés
obéissaient à des règles très strictes de fragmentation sous l'impact
électronique pouvant être mises à profit pour les identifier en utili-
\\ sant cette technique. Nous avons ainsi pu mettre en évidence, la pré-
sence de Glu-P-l. Glu-P-2, de Glu-P-3 (ou d'un isomère) et du noyau
\\
dipyrido-imidazole dans le pyrolysat de l'acide L-glutamique d'une part
'et dans les produits de fragmentation à différentes températures sous
l'impact électronique de cet acide. Il est apparu ainsi des similitudes
fort intéressantes entre les deux modes de décomposition de l'acide
glutamique: l'électronolyse et la thermolyse, ce qui conforte l'hypo-
thèse de l'intervention de réactions de nature radicalaire dens le mode
de formation des dérivés de type Glu-P-2.
Sur le plan biochimique, nous avons étudié la mutagénicité des
composés synthétisés, les effets biologiques de certains d'entre eux
sur le système hydroxylasique à fonction mixte chez le rat et l'inter-
act ion avec -le DNA àu métabolite actif de Glu-P-3.
L'étude de mutagénicité, menée selon la technique d'Arnes sur
différentes souches de Salmonella typhimurium, en présence et en absence
de système métabolique activateur, a permis de noter plusieurs faits
intéressants :
a) L'hétérocycle lui-même est dépourvu d'effet mutagène. Ce qui laisse
penser que le mécanisme d'action des dérivés aminés ou nitrÉs (les
plus fortement mutagènes) n'implique pas la formation d'un intermé-
diaire époxyde comme dans le cas des hydrocarbures aromatiques ou
de certains hétérocycles apparentés.
b) La nature des différents substituants et leur position sur le noyau
influencent fortement l'activité mutagène. Ainsi, lorsque la fonction

---

amine est en positi"on 4. le composf CUT'l'cspondallt est peu ou pas
mutagène. Par contre. l'activité augTT,entE' fortement lorsque l'amine
est en position 3 surtout si la position 4 est occupée par un grou-
pement méthyle. Il est possible que la présence du groupement méthyle
en ortho de l'amine tend à renforcer le caractère électrophile 'de l'ion
nitrénium ; il est encore plus probatle qu'en masquant la position 4
il diminue nettement les possibilités de dégradation de l'espèce
active intermédiaire en produit 4-hydroxylé inactif.
c) Le dérivé 3-N-hydroxylé s'est montré le plus actif parmi les composés
testés. Cette mutagénicité se manifeste en l'absence de système ac-
tivateur, ce qui conforte l'hypothèsé que la N-hydroxylation constitue
une étape essentielle dans l'apparition des propriétés mutagènes.
d) Les résultats obtenus sur les différé~tes souches de S. Typhimurium
utilisées laissent apparaître que les composés testés exerceraient
surtout un effet mutagène de type frame-shift, c'est~2-dire par
substitution sur les paires de bases du DNA. Toutefois, le fait que
Glu-P-2 et tout particulièrement les dérivés 3-aminés se soient montrés
actifs sur toutes les souches employées laisse penser que ces amines
agissent également par insertion à l'intérieur de la double hélice,
provoquant ainsi des déformations locales et des lésions plus ou moins
importantes. Cette obse~vation est en accord avec les résultats que
nous avons obtenus dans l'étude des inter'actions du N-AcO-AGlu-P-3
avec leDNA. Elle conforte l 'hypothèse de Scribner et al. (J .D.
Scribner, S.R. fisk et N.K. Scribner, Chem. Biol. Interactions, 1979,
~, 11) sur le mécanisme d'actions des amines aromatiques cancérogènes.
Un autre volet de notre travail a été consacré à l'étude compa-
rative de 15 des composés que nous avons synthétisés sur le système
hydroxylasique à fonction mixte chez le rat. On sait que ce système
joue dans l'organisme un rôle extrêmement important dans le métabolisme
des substances exogènes soit - et c'est le cas général - en les détoxi-
fiant par hydroxylation et en facilitant leur élimination, seit, au
contraire, en les transformant en métabolites actifs capables de s\\atta-
quer aux macromolécules cellulaires. C'est le cas àes mutagènes et

---

2147
cancérogènes chimiques
hydrocarbures et amines aromatiques notamment.
Nous avons €tudi€.
en particulier, les effets biochimiques de
nos composés sur le cytochrome hépatique P-4S0 chez le rat et sur deux
systèmes enzymatiques dépendants : la zoxazolamine hydroxylase et la
diméthylnitrosamine démethylase. Nous avons trouvé que les composés
ayant fait l'objet de cette étude se divisaient en deux groupes:
1) Ceux qui répriment le cytochrome P-4S0 et inhibent la biosynthèse de
la zoxazolamine hydroxylase, induisent par contre la production de
*
"
,
DMN-d-ase . Ce sont les composes les plus fortement mutageTles : ceux
porteurs d'une fonction amine en position 2 ou 3 ou d'un groupement
nitré en ces mêmes positions.
2) Ceux qui produisent des effets inverses : induction du cytochrome
P-4S0 et de la zoxazolamine hydroxylase et répression de DMN-d-ase.
Ce sont les composés peu ou pas mutagènes tels que l 'hétér'ûcycle
lui-même et ses dérivés non fonctionnels.
Cette corrélation entre effets biochimiques sur le système hydro-
a
xylasique et pouvoirs mutagènes est intéressante à signaler. Elle montre
la complexité des phénomènes biochimiques qui induisent l'activation
métabolique de certains composés prémutagènes ou précancérogènes.
En particulier, le métabolisme des amines et des amides aroma-
tiques (ou hétérocycliques) implique plusieurs sortes de réactions
dont l'importance relative peut varier d'un tissu à l'autre Comme
d'une espèce animale à l'autre mais aussi, dans une certaine mesure,
avec la nature même du substrat porteur de la fonction amine ou amide.
On observe, en général, des réactions dites de phase l (N- et C-hydroxy-
,
lations, réduction, isomérisation), des réactions de phase II comme la
glucuroconjugaison, la sulfoconjugaison ou l'acétylation.
La N-hydroxylation semble être l'étape primaire nécessaire,
sinon suffisante, pour l'induction de la mutation. La forte activité
* DMN-d-ase
dim~thyLnitroBamine déméthyLase

---

248
mutagène en l'absence de système activateur enregistrée avec les hyd~o­
xylamines ftudifes au cour~ de ce travail conforte cette hypothèse.
Cependant, les hydroxylamiDes ne sont pas les mftabolites ulti~es
elles doivent être activées en intermédiaires électrophiles susceptibles
de réagir avec les acides nucléiques et/ou les protéines.
La concentration du métabolite actif au niveau des macromolécules
biologiques et, par conséquent, l'intensité de son interaction avec ces
macromolécules dépendront pour une grande part de l'importance relative
des différentes voies métaboliques (activation, détoxication, inactiva-
tion). D'où le rôle capital des enzymes hépatiques et de leurs inter-
actions avec les substances xénobiotiques.
Le troisième volet,biophysique,de notre travail a porté sur
l'étude des interactions du N-AcO-AGlu-P-3 avec le DNA et ses monomères
et àes modifications induites dans les propriétés physico-chimiques de
la macromolécule par la fixêtio~ du substrat mutacancérogène.
Le N-AcO-AGlu-P-3 est le métabolite actif supposé de Glu-P-3.
Ce dernier produit s'est révélé le plus actif de la série sur le plan
de la mutagénicité. C'est du reste, l'un àes composés de synthèse les
plus mutagènes qui soient actuellement connus.
Nous avons montré que le N-AcO-AGlu-P-3 réagissait avec la d-
~J~îosine pour donner le N-(déoxyguanosinyl-B)-N acétyl-amino-3 diméthyl-
4,6 dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole (dguo-AGlu-P-3). La structure de
ce dérivé a été déterminée sans ambiguité en combinant l'analyse en RMN
et en spectrométrie de masse.
Nous avons découvert, au cours de ce travail, que le dguo-AGlu-
P-3 était sensible, dans certaines conditions, à l'action de certains
.
++
++
++
d .
. ,
d
catlons Zn
, Co
, Fe
et per alt son groupement acetyle pour
onner
quantitativement
la dguo-Glu-P-3. Cette découverte est d'impor-
t~îce car elle peut apporter indirectement un début de réponse à une
question non encore résolue, à savoir pourquoi la majeure partie (70 %)
des adduits qui se forment sur le DNA par action in vivo de l'acétamido-2
.fluorène est sous forme désacétylée.

---

249
Le N-AcO-AGlu-P-3 réagit également in vitro aussi bien avec le
DNA nat if, que le DNA dénaturé pour donner aprh hydrolyse erlzymatique
un adduit principal - du moins dans les conditions d'expérimentation
ou de mise en €vidence
que nous avons utilisées - que nous avons carac-
térisé comme étant l'adduit en C-8, c'est-à-dire la dguo-AGlu-P-3. Nos
résurtats sont en accord avec ceux obtenus par Hashimoto et al. (Y.
Hashimoto, K. Shudo et T. Okamoto, J. Amer. Chem. Soc., 1982, 104,7636)
qui ont montré que le métabolite actif de Glu-P-1 se fixait in vivo comme
in vitro sur le CB de la guanine. Deux différences importantes sont
toutefois à signaler :
1) Ces auteurs ont trouvé que l'adduit formé était le produit désacétylé,
le dguo-Glu-P-l. Ce qui les a amenés à postuler que le métabolite
actif de Glu-P-1 était le monoacétate N-AcO-Glu-P-l. Ils D'ont pas,
toutefois, pu isoler ni caractériser ce produit.
2) En deuxième lieu notre métabolite s'est révélé beaucoup plus actif
(environ 25 fois) que le métabolite supposé de,Glu-P-1.
On peut inférer, comme Hashimoto et al. semblent l'admettre eux-
mêmes que la plus faible activité du métabolite de Glu-P-1 et le fait
que le diacétate dérivé de Glu-P-l n'ait pu être obtenu, soient imputa-
bles à la possibilité d'existence d'une tautomérie amine .... > imine chez
Glu-P-1 en solution avec un déplacement de l'équilibre vers la forme
imine b. Ce qui ne peut être le cas chez Glu-P-3.
H
~~-:c:rNNH
~ 1 h
N
Par ailleurs, la plus forte activité de N-AcO-AGlu-P-3 peut
être attribuée aux effets électroniques conjugués exercés sur l'ion
nitrénium ultime à la fois par le groupe méthyle en ortho de la fonction

---

,
" ,
250
(
amine et par l '.azotE' intracyclique en méta de cette m3me fonction.
Ln tout état de cause, le comportement du N-AcO-AGlu-P-3
vis-à-vis du DNA s'apparente à l'action gén~rale 'des amines cancérogènes
aromatiques.
Le fait que Glu-P-3, comme Glu-P-l, semble agir de manière spé-
cifique sur le C B de la guanine dans le DNA est d'importance si l'on
se réfère à la démonstration récente de Scribner et al. (J.D. Scribner,
N.K. Scribner, G. Kaponen, Chem. Biol. Interactions, 1982, 40, 27),.
mettant en évidence le rôle manifeste des adduits arylarnino-8 guanine
dans le processus de cancérogénèse.
De nombreuses études avaient déjà suggéré l'importance de tels
adduits. En particulier, il a été montré que la fixation du cancérogène
AAr sur le C 8 de la guanosine dans le DNA modifié in vitro provoquait
une déstabilisation de la conformation anti du nucléoside en faveur de
la conformation syn. Le noyau du fluorène se trouverait inséré plus ou
moins profondémem. au sein de la double hélice, à la place de la guanine
rejetée à l'extérieur, provoquant localement une zone de distorsion dans
la macromolécule. C'est le modèle d'insertion-dénaturation de Fuchs et
Daune ou de déplacement de base de Grunberger et Weinstein.
De leur côté, sur la base des résultats de leurs travaux en
immunochimie, Leng et al. CE. Sage, R.P.P. Fuchs et M. Leng, BiochÎmestry,
1979, ~' 1328) ont proposé un modèle dynamique constitué par un équi-
libre entre les deu>: conformations anti et ~ des motifs d-guo-AAF (C8),
ce qui implique la possibilité pour le noyau de fluorène de se trouver
aussi bien à l'extérieur qu'à l'intérieur de la double hélice. Ce qui
n'est pas contradictqire avec le modèle d'insertion-dénaturation. Par
ailleurs, cette équipe (M. Leng et E. Sage, J. Supramol. Struct. and
1
Cell. Chem., 1981, ~' 171 ; E. Sage et M. Leng, Nucleic Acids Res., 1981,
9, 1241) a montré que l'AAr fixé sur le poly (dG-de) induit un changement
important de la conformation du polynucléotide par une transition de la
fo~e B vers la forme Z. Dans le poly (dG-dC)-AAF, les noyaux fluorène
se trouveraient répartis de façon aléatoire avec une alternance forme B ~

---

25]
fonne Z des régions du polymèT'e. Ce qui a ameTl~ ces auteurs à postuler'
l' hypothèse que sur le plall sth.(·ochirrd que la fixat ion du motif, AAr sur
le Cede la guanine dans le DNA peut induire deux modèles différents
suivant la nature ~es bases adjacentes au site de fixation : un modèle
dans lequel le noyau de fluorène se trouve inséré dans la double hélice
(forme B dénaturée). un autre dans lequel le cancérigène reste à l'exté-
rieur sans provoquer de dénaturation locale (forme Z native).
Quoi qu'il en soit l'importance de l'attaque du DNA en C-8 de
la guanine par le cancérogène est bien établie. Et il est admis que
la fixation covalente du substrat xénobiotique sur ce site crée dans
la macromolécule cible des lésions plus ou moins stables, parfois irré-
versibles, et transmissibles à la descendance cellulaire (H.C. Pitat et
A.E. Senica, Biochim. Biophys. Acta, 1980, 505, 191) transformant celle-
ci en cellules initiées ouvrant la voie au processus de cancérisation.
L'étude spectroscopique dans l'ultraviolet et notamment de la
stabilité thermique du n-DNA modifié par le substrat A'Glu-P-3 a montré
que ce mutagène provoquait une forte dénaturation locale des séquences
du DNA impliquées dans la fixation covalente du mutagène. Cette déstabi-
lisation est le reflet d'une intercalation du motif A-Glu-P-3 entre les
paires de bases àu DNA de même nature que ce qui avait été observé pour
le n-DNA modifié par l'AAr (insertion-dénaturation ou déplacement de
base). Toutefois, il faut noter que la pente de la courbe donnant la
variation du Tm du nDNA-AGlu-P-3 en fonction du degré de modification
des bases du DNA est de l'ordre de - 2,5° C alors que dans le cas du
DNA-AAr cette pente est de l'ordre de - 1,15° C (R. ruchs et N. Daune,
Febs Lett., 1973, 34, 295). Cette importante différence (z 1,4° C pour
1 \\ de bases modifiées en faveur de A-Glu-P-3) peut être l'indice d'une
plus grande désorganisation locale de la part du noyau Glu-P-3 si l'on
admet que la contribution intrinsèque de AGlu-P-3 dans l'abaissement
du Tm dans le nDNA-AGlu-P-3 n'est pas différente de celle de AAr dans
nDNA-AAF.
L'étude de l'hydrolyse enzymatique du n-DNA modifié par le
substrat AGlu-P-3 par l'endonucléase SI semble abonder dans ce sens.

---

~52
On sait que cette enzyme n'attaque Que le ?NA en simple brin dont il
. pP0voque une véritable digestion, c'est-à-dire la coupure de la maCro-
molécule en différents fragments de poids mol~culaires plus ou moins
faibles. Cette digestion est une fonction du temps. L'endonucléase SI
a également la propriété d'exciser les r'gions du DNA dénaturées par
fixation covalente d'un noyau canc'rog~ne et il a ~té montré que la ciné-
tique d'excision dans un tel cas pouvait être considérée comme propor-
tionnelle à l'importance de la déformation induite dans la double hélice
CR. Fuchs
Nature
1975
257, 151 ; E. Krick, C.E. Spelt, Cancer Letters~
t
t
t
1979,2, 147).
Nous avons constaté au cours de ce travail, que le n-DNA-AGlu-
P-3 était rapidement hydrolysé par l'endonucléase S1 et que l'hydrolyse
était d'autant plus rapide que le taux de modificatïon du DNA endommagé
était plus grand. Ces résultats, en accord avec les observations faites
co~cernant la stabilité thermique du n-DNA-AGlu-P-3
confirment l'existence au
t
sein de la macromolécule modifiée de zones de plus ou moins grande "ouver-
tu..~e" provoquée par l'insertion du motif AGlu-P-3.
L'importance de l'intercalation, en ce qui concerne Glu-P-l et
Glu-P-2 avait été déjà signalée par ~lmamur~ et al. (M. Imamura et al. t
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 96, 611 ; Ibid 1980, 97,968).
SelorJ ces auteurs l' intercalation du noyau Glu-P-1 ou Glu-P-2 entre les
pai~es de bases GpC du DNA serait essentielle pour qu'il y ait fixation
covalente et apparition des propriétés mutagènes.
Il, est bien évident que la conformation du complexe d'intercala-
tion et les modifications qui en résultent des propriétés biochimiques
et physicochimiques du DNA seront à la base des évènements biologiques
qui conduiront soit à une réparation "fidèle", soit à des réparations
"fautives", étape première du processus de différenciation cellulaire.
Il n'est peut-être pas sans intérêt de noter que sur le plan
S~ùctural et stéréochimique la molécule de Glu-P-2 possède une certaine
p~'enté avec la molécule de guanine cqmme le montre le schéma suivant :
..."'..
. ~

---

253
OH
Glu-P-2
Guanine
Cette parenté de structure pourrait expliquer la facilité avec
laquelle cette molécule et ses homologues ou isomères peuvent s'insérer
dans le DNA à la place de la guanine, agissant en quelque sorte à la
manière des "antimétabolites". Lès déformations induites seraient le
fait d'une part de la grosseur du noyau dipyrido-imidazole (trois cycles
au lieu de deux) et de la présence, du moins dans le cas de AGlu-P-3,
du groupement acétyle.
Dans le but d'apporter des informations supplémentaires sur les
moèifications conformationnelles induites par la fixation du noyau
AGlu-P-3 en relation avec le polymorphisme du DNA, nous avons fait une
étude en dichroisme circulaire et spectrométrie de fluorescence sur des
DNAs naturels et des DNA s synthétiques modifiés par le cancérogène.
Deux résultats essentiels ont pu être dégagés de cette étude
- En faible force ionique, le DNA-AGlu-P-3, le poly(dG-dC)AGlu-P-3, le
poly(dA-dC)poly(dG-dT)AGlu-P-3, le poly (dG)~C)-AGlu-P-3 sont sous forme
B, les motifs AGlu-P-3 sont partiellement insérés à l'intérieur de la
double hélice du DNA et interréagissent avec les bases, l'insertion
et la position du motif AGlu-P-3 n'étant pas du reste fonction de la
séquencè des bases du
polynucléotide.
-1
- En force ionique élevée, le poly(dG-dC)AGlu-P-3, le poly(dA-dC)(dG-dT)
1
AGlu-P-3 sont dans la conformation Z, les noyaux guanine ont la confor-
mation syn et sont appariés avec les cytosines complémentaires qu~ eux,
ont une conformation anti. Les noyaux AGlu-P-3 sont en dehors de la

---

, '
\\
•
1
double hélice et donc ais6ment accessibles à l'inhibiteur de fluores-
cence. On peut noter aussi que la fixation de AGlu-P-3 sur le poly-
mère stabilise la forme Z Bussi bien dans le poly(dG-dC)AGlu-P-3
que dans le poly(dA-dC)poly(dG-dT)AGlu-P-3. Dans le cas de ce dernier
polymère, cette séquence est Bssez fréquente dans le DNA naturel;
ceci souli~ne l'importance, du polymorphisme conformationnel des acides
nucléiques vis-à-vis des évènements moléculaires pouvant conduire à
un phénomène 4e cancérisation et/ou de mutation.
En résumé, ce travail nous a permis d'apporter notre contribution
sur plusieur~plans dans un domaine qui touche de près les problèmes'de
santé et d'environnement
Sur le plan de la chimie organique, nous avons contribué à la connais-
sance d'une nouvelle famille de composés hétérocycliques en utilisant
toute la panoplie des procédés de synthèses organiques, des méthodes
physicochimiques modernes de détermination de structure, d'identifica-
tion et d'analyse. Plus d'une quarantaine de composés nouveaux dérivés'du
dipyrido[1,2-a:3',2'-d]imidazole ont été ainsi synthétisés et étudiés.
- Sur le plan biologique, nous avons étudié d'une part la mutagénicité
de ces différents composés sur différentes souches de Salmonella
typhimurium selon le test d'Ames, et d'autre part leurs effets bio-
chimiques sur le système hydroxylasique à fonction mixte chez le rat.
Nous àvons mis en évidence des relations intéressantes entre la struc-
ture moléculaire des composés de cette famille et leurs propriétés
biologiques. Nous avons montré notamment que la présence d'une fonction
amine ou d'un groupement nitro était nécessaire à l'apparition de la
propriété mutagène. Nous avons constaté, en outre, qu'il y avait une
relation étroite et inverse - dont l'explication n'est pas simple -
entre propriétés mutagènes et effets biochimiques sur le cytochrome
p 450 chez le rat des produits étudiés.
- Sur le plan de la cancérogénèse chimique
L'étude de l'hydrolyse enzymatique du nDNA modifié par N-AcO-Glu-
P-3 et l'étude de détermination des adduits en HPLC e~ RMN, ont mis en
évidence que le N-AcO~AGlu-P-3, le métabolisme supposé de l'une des
amines les plus mutagènes 'de la famille étudiée, se fixe de manière

---

255
covaJclJ1t' sur 1(' Ce de~ noyaux guardne du DNA. Cette fixatioll s'sccomV3 -
gne d'urIe insertion du substrat AGlu-P-3 à J' int~rieur de la doubl'(>
ht'Jicc:J la placE' dl' la molécule d~ guanine avec de::" interactions d'cn,-
piJement du noyau dipyrido-imidazole avec les bases adjacentes comme dans
le cas du DNA modifié par AAr;
les
résultats observés par l'{tude
de la stabilité thermique et l'étude de l'endonucléase Sl sur du nDNA
modifié sont significatifs à cet égard.
L'étude réalisée en dichroisme circulaire et spectrofluorimétrie
\\
,
montre que le substrat AGlu-P-3 a un comportement semblable a celui
de l'acétylaminofluorène t à savoir t la réaction sur le poly(dG-dC)
poly(dG-dC)t poly(dA-dC)poly(dG-dT) conduit à une. insertion partielle
qu substrat AGlu-P-3 dans la double hélice t en faible force ionique,
la macromolécule conservant là conformation B, mais aussi à une impor-
tante stabilisation de la forme Z à force ionique élevée, ou en cas de
fort taux de modification, le substrat AGlu-P-3 se trouvant alors
rejété vers l'extérieur.
Il est important de souligner à la lumière de ces résultats qu'u~
composé mutagène susceptible de se former au cours de la cuisson de
certains aliments se comporte
à
quelques différences près comme un
cancérogène connu vis-à-vis notamment du polymorphisme conformationnel
du DNA.
...
...
...
La cancérogénèse chimique constitue, nous l'avons vu, un problème
complexe. Le développement du processus de tumorisation dépend de facteurs
multiples qui sont loin d'être cernés en totalité. En dehors des facteurs
d'ordre interne biochimiques et pathologiques (activation métabolique,
détoxification, attaque des macromolécules biologiques par l'agent élec-
trophile, réparation fautive ou non réparation, réplication de la cellule
transformée, etc ... ) qui concourent à l'initiation, à la promotion puis
au développement de la formation néoplasique, il y a aussi des facteurs
d'ordre externe à l'organisme. Ces facteurs qui relèvent de l'étiologie
/
du cancer touchent aussi bien notre mode de vie, les habitudes sociales
ou religieuses, notre alimentation, l'hygiène corporelle que les risques
d'ordre professionnel ou environnemental, voire les stress auxquels nous
expose la vie moderne. La pollution est sans doute actuellement le facteur

---

25&
auquel le public semble ëtre le m1eux sensibilisé. Mais il s'ag1t d'un
terme vague qui'ne recouvre pas toujours une réalité bien concrète.
L'autopolluti~n du fumeur par exemple est universellement répandue,
malgré le caractère fortement dissuasif des risques confirmés de l'abus
de tabac. Les risques canc~rogènes par voie alimentaire sont, ,par contre,
moins bien cern~s - et demeurent, en grande partie, insoupçonnés - même
si depuis longtemps il est admis que bon nombre de cancers peuvent être
imputés aux modes d'alimentation ou à certains produits alimentaires.
Certains auteurs (cf. par exemple P.M. Newberne, J. Amer. College of
Toxicology, 1983, l, 269) affirment volontiers qu'à côté d~ tabac,
l'alimentation au sens large du terme, est probablement le plus complexe
et peut-être le plus significatif des facteurs qui influencent l'appari-
tion du cancer chez l'homme.
Dans cette optique, la découverte de la formation de produits
génotoxiques tels que ceux faisant l'objet du présent travail (ou encore
ceux découverts dans la pyrolyse du tryptophane, l'amino-3 diméthyl-l,4
5B-pyrido[4,3-b]indole, Trp-P-l et l'amino-3 méthyl-l 5B pyrido[4,3-b]
indole, Trp-P-2 ou _dans la sardine grillée, l'amino-2 méthyl-3 imidazo
[4,5-f]quinoléine IQ et l'amino-2 diméthyl-3,4 imidazo[4,5-f]quinoléine,
MeIQ ou encore dans du beefteak l'amino-2 diméthyl-3,8 irnidazo[4,5~f]
quinoxaline MeIQx, cf. T. Sugimura, Cancer, 1982, 49, 1970)~ tous haute-
ment mutagènes, ouvre un nouveau champ d'investigation dans le domaine
déjà vaste des agents causals du cancer et des maladies néoplasiques.
Si la formation de ces produits (et d'autres que nous n'avons
pas cités) a été mise en évidence sans conteste, leurs structures carac-
térisées et leurs effets biocides démontrés, ils soulèvent d'autres pro-
blèmes non encore résolus. En particulier, nous ne connaissons pas encore
leur mode de formation et c'est là un problème majeur pour l'établissement
de mesures prophylactiques indispensables.
Parmi les mécanismes éventuels pouvant présider à la formation
de ces produits mutagènes deux d'entre eux nous paraissent
les plus
probables :
* ~oir également la publication récente de M. Jaegerstad et al., Mut.
Res., 1984, 126 (3),239. -

---

257
- Un m~canisme de nature radicalaire dans l~ car. des pyrolyses ou des
cuissons l haute temp€rature.
Les acides emin€c
tels que l'acide gluta-
mique, subiraient sous l'action de la chaleur une dissociation homoly-
tique conduisant à divers radicaux libres. Il y aurait ensuite inter-
actions entre ceux-ci ou avec des molécules provenant de la dégradation,
de l'acide amin€
pour conduire à différents composés stables dont les
amines hét€rocycliques
mutagènes qui ont hé identifiées. Les réactions
de réarrangements que nous avons mises en évidence au cours de l'élec-
tronolyse de l'acide glutamique confortent une telle h)~othèse.
Un deuxième mécanisme possible pouvant avoir lieu à plus faible tempé-
rature relève de la réaction dite de brunissement de Maillard. La
réaction de Maillard, très utilisée depuis une vingtaine d'années dans
l'industrie alimentaire pour la coloration de certains aliments et la
création d'aromes-like est une réaction fort complexe (G. Vernin et al.,
L'Actualité chimique, 1983, 7). Elle consiste dans la réaction de con-
densation d'un acide aminé avec un sucre réducteur suivie d'une trans-
position d'Amadori de la glycosylamine (ou de l'aldosylamine') formée.
Il en résulte une suite de réactions conduisant à de très nombreux
produits dont certains sont fortement soupçonnés d'être cancérogènes
(R. Oeste, Biol. Med. (Stockholm) 1981 (2) 34). Très rapide' à 1500 C,
cette réaction a lieu également à la température ambiante (20 0 à 37 0 C)
au bout 'de quelques jours. Compte tenu de la présence dans de nombreux
aliments, outre d'acides aminés tels que le tryptophane ou l'acide
glutamique, de sucres réducteurs, il est fort possible que la réaction
de Maillard ait lieu au cours de la cuisson de ces aliments, ,voire au
cours de leur stockage dans des conditions de température suffisantes.
Un autre problème qui nous parait tout aussi important sur le plan
de la génotoxicité et de la cancérogénèse alimentaire, est la mise au point
d'Une ou de-méthodes commodes et efficaces pour la détection et le dosage
des composés mutagènes de la famille de Glu-P (ou des autres séries
signalées plus haut) dans certaines préparations alimentaires ou pour
permettre de localiser ou de suivre de tels produits (ou leurs métaboli-
tes) dans l'organisme animal ou humain. Il n'existe pas, en effet, en
dehors de la chromatographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de

---

258
masse dont nous avons montré, dans ce travaiJ, les possibilités d'emploi,
de m'thodes standard et pratiques pour la d€termination
quantitative- de
ces mutagènes ou leur caractérisation dans certains milieux biologi~ues
ou dans certains mélanges. Un des objectifs que nous nous €tions
fix€s
est la mise au point d'une telle m€thode
grâce aux techniques immuno-
logiques. L'idée est basée sur la pr€paration
et l'utilisation d'anti-
corps'capables de reconnaître le noyau dipyrido[1,2-a:3' ,2'-d]imidazole
(en ce qui concerne les composés reliés au pyrolysat de l'acide gluta-
mique) et/ou certaines macromolécules modifiées par ce substrat. Ce
volet immunologique vient d'être commencé et constitue l'un des aspects
de cette étude sur la cancérogénèse alimentaire qui seront poursuivis
dans le ,laboratoire.
Nous voudrions pour terminer noter que la q~antité de "mutacan-
cérogènes" qui se forment au cours de la cuisson des aliments reste
extrêmement faibles: 13 ng de Trp-P-l par gramme de sardine grillée,
280 ng de Glu-P-2 par gramme de seiche bouillie par exemple. Mais d'un
autre côté, si pour la plupart des effets biologiques des composés chi-
miques (cas des médicaments par exemple) on peut admettre l'existence
1
d'un seuil en de ça duquel les doses sont sans effet, il est hasardeux
en matière de cancérogénèse chimique d'introduire la notion de seuil.
D'une part parce que
l'action biologique initiale se situe au niveau
moléculaire et revêt un aspect plus qualitatif que quantitatif (la
suite des évènements dépendant comme nous l'avons vu de la nature des
lésions induites) et d'autre part, s'agissant de produits absorbés de
façon régulière, il peut y avoir un effet cumulatif tendant à atteindre
le seuil de concentration nocive (si l'on retient la notion de seuil)
dans la mesure où la vitesse d'élimination demeure inférieure à celle
de l'absorption. En outre, l'une des propriétés des substances cancé-
rogènes est l'aptitude à la sommation des effets (R. Truhaut, Chimie
& Ind. Génie chim., 1972, 105, 239). Il a été en effet démontré que
la manifestation de l'activité des composés cancérogènes serait fonc-
tion de la somme totale des doses absorbées quels que soient leur
fractionnement dans le temps et le jeu des éliminations naturelles.
Il y a persistance de l'effet même après la disparition de la substance
qui en est responsable. En sorte que, une substance cancérogène demeure

---

259
toujours dangereuse même absorbée ~ des doses très minimes si l'absorption
se déroule sur une période suffisamment longue pour lui permettre de
manifester'sa nocivité. C'est le cas des produits mutagènes qui souillent
notre alimentation et de nombre d'autres produits que nous sommes amen~s
à consommer régulièrement (café, thé, alcools, tabac, etc .•. ).
Mais, comment prévenir de tels risques quand manger et boire
demeurent des fonctions naturelles au même titre que respirer ?
Faut-il mettre en pratique, comme le recommande Sugimura (Cancer,
1982, 49, 1970) les douze préceptes suivants et comment s'y astreind~e ?
111. Keep your diet ~ell ba~ced, in terms of both taste and nutrition.
2. Do no.t e~t the .SaIne foods repe~ted~y ana.t~;i~~!!:~:_";lSO exercice
3. ::::~o:x::s:;::n:a:::g~aIne med~cat~on o~r~!lfo::~pe,r~o~,:
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4. Avoid drinking too much alcohol.
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6. Take optimal daily doses of vitamins A, C ~E~Include a rnoderate'
amount of fibrous food ("roughage") in YOW" diet.
?
Avoid excessive intake of salt y food and do not àrink ~oo hot water,
tea or coffee.
/
8. Avoid eating too many burnt parts of food, such as you find in cha:P-
coal-gri2Zed meat and fish.
9. Avoid moLdy food ~hich is not intentionally moldy, such as cheese.
10. Avoid excessive exposure to the sun.
11. Avoid overwork so that you do not lower your resistance to disease. ~
12. Bathe or showe1' frequent.1-y." -
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L'amino-~-~€ihyi-~di~~rldotl;2-~:3~.2i-dl'l~{d~zoiè(~lq-~-~)'~f son homologue non ~~thylé
(Glu~P 2) sont deux'compos€s,fcirtement
mutagènés'quise forment au cours,de la ,pyrolyse de l'acide
glutam que et de: la combustiol'incompl~tè'de divers alinients (poissons"molluscjues, c~r€ales,etc.).
Ces 'am nes. se sont r€v€Hes,
,par ailleurs ,canc€rogènes
vis à vis de ~iff€rents organes 'dans l'ex-,
~€r{mentation anim~le, En:~ue'de ~ontribuer'à ~ne meiileure connaissan~e.delanaturede dès pro~ ,
duits et du rôle exact qu'ils peuvent jouer sur le plan. de la g~notoxicité alimentaire,' nous 'avons
,
~ntrepris une fitude sur les dériv€s
du dipyridotlj2-a:3' ,2'-d]imidaiolei heter6cycle encore n6uvea~
dans lalitterature', Cëtte'€tude
cOl\\lporte trois parties:
"
- Une p~rti€ chimique co'nsaàee à l~ mi~~ au point des 'methodes'd'a6c~sà differeri'ts'd€r'iv€s
de' cèt
hét€rocycle
et à l'étude, de leurs propriet~s physico-çhimiques, , Nous avons' ainsi' prépar~ ùne qu~­
rantaine de compos€s,U'h€terocycle
lui:-m~me,ses,dériv€s méthyl€s
éndiff€rentes
positions,
,:
, am,ines, nitr€s
1
hydroxylés, carboxyliques; hydra;dniques, etc. )en recourant, à ,differer\\tès, tech-: '
'niques de synthèse 'classiques ou 6ri~in~les. La purification, l'ide~t~fication structurale,
l'étude des propri€tés
phySico-chimiques ont été réalisé,es 'grâce ,aux techniques modernes d'analyse",
,notamment'ia' chromatographie liquide,à,haute résolution, là R.M.N.'efila spectrométrie 'de masse.,
'
Cette derniète technique nous a permis de 'montrer qu'il ~avait de gràndes similitudes ent~e ,la
,
'~her~olyse de:l'acide,ilutamiq~e et'so~'électron61yse, sous ,l'impact 'électrorii~ue dans, le ~pectro­
graphe de 'mass'eet' qu'en,plus eiie pouvaït constituer une méthode pratique ,pouf d€èeler:
et iden-
tifier 'des' dérivés dipyrido- imidàzoliqùes dans certains 'mélanges' organiques.
La deuxième partie i 'b~610giqüe dans '~:on'e~sembl~,p~rti's~; l' hude des~~~p'~i€t€S mutagèries' de~:;
compos's synthétisés ef de leur action biochimique sur,le système mon6oxyg~nase à fonction m~xte,
lié au cytochrome hépatique P 450. Cette'€tude
nous a permis de montrer'd'une 'part que pouvo1rs
mutagènes et effets biochimiques, sur le' système microsomal €taient
fortement dépendants de la ,
~tructure d~s pr6duits:test€s
et q~'il y avait d'autre,part, dans le ~isprecis des produits
'
étuq:;i'~~une nette corrélatipn - liée à la structure mol~culaire - entre ces deux catégories de
prop~'i~''s ~iologiques.
,' .. ,
.
0
. '
"
'
" ,
"
: : '
'
~,
L.t,troisièm~ partie, biophysique, trài te' des 'interàctions du DNA (et ,de ses mono~ères) ',av,ec ,le,
N-AcO-AGiu-~-3 - métabolite supposé d~ Glu~P-3 - et des modifications strticturales induites dans,
la macrd~ol'cul~ par la fixation covalen~e du motit AGlu-P-3.,Glu-P~3 ou amino-3 diméthyl-4~6 ~
~ipy~ido[l,~-~:3" ,2'-dfimtd~zole est lecompos~ le plus mutag~ne p~rmi les,compos€s
testés. C'est
l'un des compos€s
les plus 'mutagènes actuellement connus. Il ne r€agit
pas lui-même irivitro avec
le ,DNA mais! son'métabolite'r€agit
cov~lentement ave'c ce "dernier p'our donner principalement des
addui tE: e~ C8 des guanine,s', Ceci a €té
d€montré,
par HPLC,. RHN, spectr~m€trie de: masse aprèshydro~
lyse enzymatique.
La fi~~ticin du ~r€sidu" mutag~ne sur le DNA provoque ~u ni~eau~des s~quences
touchées des altérations structurales avec insertion du motif AGlu-P-3 entre les doubles hélices.
L'€tude
~n spectrométrie de fluorescenci et en dichroism~ 'line~ire~ ~ohti€ que cette ins~rtion
a Heu surtout en faible forcei6nique; 'la macromolécule ,conservant la conformation B. En 'forte,,'
forc~ ionique, il y a ~ne transition de.là forme B vers la fo~me Z : l~ "r€~idu" AGlu-P-3, se'
trnuve alors rejeté ve'r~ l'e'xt€rieur.,
" , ' , '
,
. •'
','
, , '
,
L'intérêt de c'~ travail sur l'~' pl~n de la ca,~cérof~én~~e ';alimèntàire" ~st, discuté en con-
ciusion.
,
...
MOï-S-CÜ~
"
"
~~~c€r6~~~~~~ chimiq~e
\\
Mutagénèse, : ' "
:. " :,:.: .}
Mutagène, ",,:
"
1
C~nchàg~nê
..~.
Mutacancérogène
,
,Produits ~€not6xlques
... ' ,
'. ~ "
'.", .
Acide glu,;tamique, '
',-
Pyrolyse' " , , ' ,
Thermolyse
Electron61ys~,
,
'
D€rivés
du' dipyridd[ j;2~ir: J', 2' ':dj imidaz61e
Glu-~~l, Glu-P-2; Glu~P-3'
'
'. ,
Synthèse ,èhimiq'ue "
:
Mutà~énicité et test'd'Âme~ •
Systè~e ~on60~Y8€nàse 1',t6nction mix~~
Cytochromè'P 450
,
'
'
~ozax61amine, hydroxylase,
.
Dim€thylnitrosamine
dim€thylase
r;-o- :---~~'~~-'f:--;
Intera~tio~s, DNA ~ agents cancérogèn~s
'DNA modifi€
par AGlu-P-3
,:
~,:,,:
Alt€ratidh~du,D~A ~odit!é. ,',
~
Cohformation structurale du DNA
0
torme B, for~èZ:,
, "
, '
\\, "
Canc€ro'g~nJsè àlimentàirè et action propl'\\ylact.l.que
'---------
,
.
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---