UNIVERSIT~ CLAUDE-BERNARD - LYON 1
FACULT~ DE PHARMACIE
Année 1984
-
N° 223
TH~SE
présentée
à l'Université Claude-Bernard - Faculté de Pharmacie
et soutenue publiquement le 20 Décembre 1984
pour obtenir le grade de
DOCTEUR D'ETAT ES SCIENCES PHARMACEUTIQUES
par
Kouakou Luc Philippe KOUADIO
né le 26 Mai 1955
à ABIDJAN (Côte-d'Ivoire)
ANALYSE STRUCTURALE ET CONFORMATIONNELLE PAR RMN
ET DICHROISME CIRCULAIRE D'UNE HORMONE STEROlDIENNE
LORS DE LA PREPARATION D'UN ANTIGENE SPECIFIQUE
POUR LE DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE.
JURY:
Monsieur G. J. BENE .•................. Professeur Université de Genève
Madame C. CHAPELET-LETOURNEUX. Professeur Université Lyon 1
Monsieur J. CORNIAU
Assistant Biologiste des Hôpitaux
Monsieur M. DAUDON ......•.......... Professeur Université Lyon 1
Madame H. FILLION •................... Professeur Université Lyon 1
Madame M. PETIT-RAMEL ...........•• Maitre Assistante Université Lyon 1
Monsieur H. PINATEL ••.•............•. Professeur Université Lyon 1

---

UNIVERSITE
CLAUDE
BERNARD
LYON l
ADMINISTRATEUR PROVISOIRE
Professeur DUPUY
ADMINISTRATEURS PROVISOIRES ADJOINTS
Professeur R. MJRNEX
Professeur J. 0iANEL
SOCRETAIRE GENERAL
t-bnsieur F. MARIANI
UNITES D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE DE L'UNIVERSITE
(Grange-Blanche
Directeur
Professeur ZEX:H P.
(Alexis-Carrel
Directeur
Professeur MJRNEX R.
MEDEONE
(Lyon-Sud
Directeur
Professeur roRMAND J.
(Lyon-Nord
Directeur
Madame le Professeur P:rnEI'
BIQLCX;IE HUMAINE
Directeur
Professeur REVn..I.ARD J. P •
TEDiNIQUES DE READAPI'ATION
Directeur
Professeur MJRGON A.
~ PHARMACEUTIQUES
Directeur
Professeur BIZOUDN CH. A.
SCIEN:ES OOONIOICGIQUES
Directeur
Professeur !.ABE
IN5TI'roT RmIONAL DI EDUCATION
PHYSIQUE El' SPORl'IVE
Directeur
M:>nsieur MILIDN A.
MATHEMATIQUES
Directeur
Professeur FLAMANT M.
PHYSIQUE
Directeur
œIMIE Er BIOCHIMIE
Directeur
MadaIœ ~ A.
M.A.
SCIENCES DE IA NAnJRE
Directeur
Professeur Er..MI
SCIEN:ES PHYSIOI.CGIcm:s
Directeur
Madercoiselle le Professeur VDRBE
Directeur
Professeur VILLE A.
I.U.T. N° 2
Directeur
t-bnsieur GALLEr J. (Directeur ENSM-1)
OBSERVAroIRE
Directeur
M:>nsieur M)NNEl' G
(AstronoIœ Mjoint
PHYSIQUE NOCLEAIRE
Directeur
Professeur EL BAZ E.
Directeur
Professeur BATAILLE

---

A mes parents
• à mon grand-père OSSIENY Maurice KOUASSI
à tous mes frères et soeurs •
• à mon oncle Daniel et à
ma tante Jacqueline N'DA KONAN
A tous mes amis.
A tous mes frères et soeurs en CHRIST.
"Si le Seigneur n'édifie lui-mê'me la
demeure
c'est en vain que peinent ceux
J
qui la bâtissent. La pierre rejetée par
ceux qui bâtissaient est devenue la plus
précieuse des pierres d'angle.
Il est ma force et ma gloire) l'Eternel:
Il est devenu mon salut."
LA BIBLE: Psaumes 12?(126)) 118(11?).

---

AVANT - PROPOS
Nos recherches ont été effectuées aux laboratoires de
Chimie Physique Moléculaire et de Chimie Analytique Pharmaceutique
de l'Université Claude Bernard - LYON I. Avant d'en cormnencer
l'exposé qu'il nous soit permis de témoigner notre respectueuse
gratitude à Monsieur le· Professeur H. PINATEL qui a proposé l'orien-
tation de ces recherches. Nous lui sommes très reconnaissant de La
formation pluridisciplinaire que nous espèrons avoir acquise gr~ce
aux conseils judicieux qu'il n'a cessé de nous prodiguer.
Nous exprimons notre profonde gratitude à Madame le
Professeur c. CHAPELET-LETOURNEUX pour La fOY'f7lation scientifique en
R M N dont nous avons grac'ieusement bénéficié pendant trois ans dans
son Laboratoire. Sa disponibilité et sa rigueur scientifique nous ont
été très précieuses dans la direction de ce travail.
Il nous est particulièrement agréable de remercier
Madame M. PETIT-RAMEL, Mattre-Assistante, pour son étroite collabora-
tion dans la direction scientifique de notre travail. Nous lui sommes
reconnaissant pour l'enseignement fondamental reçu sur l'activité
optique et le dichro~sme circulaire.
Nous tenons à exprime).' notre vive gratitude à Monsieur
J. CORNIAU, Assistant biologiste des Hôpitaux, qui depuis 'longtemps
s'est intéressé aux radioimmunodosages des hormones stéro~diennes.
Nous lui sommes redevables de nous avoir permis de travailler sur
les produits qu'il a lui même synthétisés au laboratoire central de
Biologie de l'Hôpital de l'Antiquaille. Puisse ce travail rendre
hommage à votre profonde connaissance relative à la préparation des
antigènes stéro~diens.

---

Nous remercions également :
Monsieur le Professeur G.J. BENE qui a accepté de juger ce
travail. Nous avons apprécié non seulement sa haute compétence
scientifique mais aussi ses qualités humaines.
Madame le Professeur H. FILLION pour l'intérêt qu'elle
manifeste à nos travaux et l'accueil bienveillant qu'elle nous a toujours
réservé.
Monsieur le Professeur M. DAUDON pour avoir eu l'obligeance
de bien vouloir accepter de juger ce mémoire.
Nous aimerions associer à ces remerciements, Monsieur le
Professeur J. DELMAU, pour l'accueil, la documentation et la grande
liberté d'action dont nous avons joui au Centre de R M N de l'Université
Claude Bernard de LYON.
Monsieur le Professeur R. MALLEIN qui nous a permis de
réaliser une partie de ce travail au Laboratoire Central de Biologie
de l 'HrJpital de l'Antiquaille.
Monsieur PHAM;
de nous avoir ouvert son laboratoire au
Centre de Microanalyse du C.N.R.S.
Monsieur A. PAGELOT du Laboratoire d'Application de la
Société BRUKER SPECTROSPIN. Nous lui sommes très reconnaissant de la
diligence et de la bonne volonté dont il a fait preuve en nous offrant
gracieusement l'enregistrement de spectres proton à 400 Mffz de très
bonne qualité. Nous lui sommes redevable de l'aboutissement final de
ce mémoire.
Nos remerciements s'adressent aussi à tous ceux qui par leur
collaboration ont permis de mener à bien ce travail :

---

- Messieurs FENET et DUPLAN du Centre de R M N de
~'Université C~aude Bernard.
- Monsieur NARDIN du Centre d'Etudes Nuc~éaires de
Grenob~e (C.E.N.G.).
- Monsieur PETIOT du Centre de Microana~yse de So~aize.
- Madame MIANI , Centre de R M N Université C~aude Bernard.
- Madame H. KSA VRELOFFF , Laboratoire de Chimie Ana~ytique
de ~'U.E.R. de Phanmacie LYON I.
- Messieurs P. BERNARD et J.F. SABOT, Assistants au
Laboratoire de Chimie Ana~ytique de ~'U.E.R. de Pharmacie.
Nous remercions éga~ement Madame J. GAVA qui a assuré ~a
réa~isation matérie~~e de ce mémoire avec ~'aide précieuse de Madame
D. BOULOGNE. Nous ~eur sommes reconnaissant pour ~a compréhénsion et
~a genti~~esse qu'e~~es ont toujours manifestées à notre égard.

---

SOMMAIRE
Page
INTRODUCTION
2
CHAPITRE l : GENERALITES SUR LA RADIO IMMUNOLOGIE (RIA)
5
1.1 - Introduction .',..
6
1.2 - Principe du dosage RIA
•...••.••••••...••
8
1.2.1 - Tracé de la courbe:
= f(S)
••••••.
8
.
•
, •
,
0
1.2.2 - T1tre de 1 1mmunserum
••.•.••••.•.••
13
1.2.3 - Spécificité de l'anticorps ••......••
13
1.3 - Préparation des antigènes stéroïdiens .•.•..
15
1.4 - Préparation des stéroïdes substitués en 7 ..•
17
1.4.1 - Cas particulier de synthèse du dérivé
17
7 mercaptopropionique désoxycorticostérone
CHAPITRE II - RESULTATS ANTERIEURS ACQUIS EN RMN 1H SUR LES
19
STEROIDES.
II.1 - Introduction
20
II.2 - Méthode des incréments de substituants •...••.
20
II.3 - Méthodes physicochimiques utilisées pour aug-
23
menter la résolution des spectres RMN proton
des stéroïdes
.
II.3.1 - Utilisation des lanthanides agent de
23
déplacement chimique .•.•.•.••...•.•.••
II.3.2 - Deutération partielle spécifique ..•.•.
24

---

II.4 - Application de la RMN l H au suivi de la
synthèse des antigènes stéroidiens ••.•••••.
25
II.5 - Techniques d'attribution spécifiques •...•..
27
II.5.1 - Temps de relaxation spin-réseau .•...
27
II.5.2 - Effet Overhauser nucléaire (Effet NOE)
28
II.5.3 - Découplage différentiel
..•....•....•
29
II.5.4 - Spectroscopie 2D
.•...••..•.•.•.••..
29
..
CHAPITRE III - RESULTATS ANTERIEURS ACQUIS EN DICHROIMETRIE
SUR LES STEROIDES
.....................•...•..
35
111.1 - Introduction
.
36
111.2 - Applications du dichroisme circulaire à
l'étude des stéroides •.........•...••.•••
37
111.2.1 - Contrôle des réactions chimiques par
le dichroisme circulaire ...••.•....•
37
111.2.2 - Règle d'hélicité •••••.••.••••.•••..•
40
111.2.3 - La règle de l'octant
42
111.2.4 - Courbe normalisée
44
CHAPITRE IV
- ANALYSE EXPERIMENTALE PAR DICHROISME CIRCULAIRE
(DC) DES ETAPES DE LA SYNTHESE DE L'ANTIGENE (AG)
DE LA DESOXYCORT1COSTERONE (DOC) •••••..•••.•..•.
47
IV.l - Identification des chromophores
.
49
IV.Z - Etude de la conformation de la DOC
..•.•..•...
56

---

CHAPITRE V - ETUDE DU SPECTRE &MN PROTON DE LA DESOXYCOR-
TICOSTERONE (DOC)
.......•...•••.•.......•..•
57
V.l - Données bibliographiques concernant des
molécules de structure voisine •••..••••..•.
59
V.2 - Résultats
59
1 ,
d'
,
V 2
. . 1 - R M NHa une
~mens~on ..••...•••••.
59
V.2.2 - R M N bidimensionnelle .••••..•••.••..
65
V.2.3 - Spectres d'effets NOE différentiels
70
V.3 - Etude de la conformation de la DOC par RMN lH
74
CHAPITRE VI - ETUDE DES CONFORMATIONS RELATIVES DES COMPOSES :
7 MERCAPTOPROPIONIQUE DOC (V) ET DOC 7-BSA (VI)
77
VI.1 - Analyse structurale et conformationnelle par
RMN Haut champ de la 7 mercaptopropionique
DOC (V)
•..••...••..••••.•.•..•••..•..••••••
79
VI.1.1 - Etude comparative des spectres des
composés (1) et (V)
•.•••..•.•.•••••
79
VI.l.2 - Effets NOE différentiels •••.••••.•••
80
VI.2 - Analyse conformationnelle par dichroisme
circulaire des composés 7a mercaptopropio-
nique DOC (V) et DOC 7-BSA
•••.•••.•.•••
85
CONCLUSION GENERALE
91
BIBLIOGRAPHIE GENERALE •..•.•.......•...••••••.•..•.••..
95

---

ANNEXE l - SYNTHE SE CHIMIQUE DU DERIVE CONJUGUE DOC-BSA
103
l - Préparation du dérivé conjugué 7 mercaptopropionique
DOC-BSA
..........................................
104
1.1 - Préparation de la 4-6 pregnadiène 21 Acétate
3-20 diane
.
104
1.2 - Obtention du dérivé pregnène 4, 3-20 dione
21 Acétate, 7a mercaptopropionique •••.••..•••
105
1.3 - Hydrolyse de l'acétate en 21
105
1.4 - Purification par chromatographie en phase
liquide haute performance (HPLC)
•••..•...•
106
1.5 - Couplage du dérivé acide DOC 7 mercaptopropio-
nique à la sérum albumine bovine
•.•.••....•.
106
REFERENCES
109
ANNEXE II - TECHNIQUES EXPERIMENTALES ET DONNEES GENERALES SUR
L'ACTIvITE OPTIQUE ET LE DICHROISME CIRCULAIRE
111
II. 1 - Techniques expérimentales..................
112
II.2.1 - Lumière polarisée dans un plan et
origine de l'activité optique .••.
113
II.2.1.1 - Influence de la concentration .••
116
II.2.1.2 - Influence de la longueur d'onde ..
116
II.2.2 - Dispersion rotatoire optique •..••.•
117
II.2.2.1 - Dispersion rotatoire normale
117
II.2.2.2 - Dispersion rotatoire anormale
118
II. 2.3 - Dichroisme circulaire
119
II.2.4 - Instrumentation
...•.••••........•.
120
II.2.5 - Conditions nécessaires à l'existence
du dichroisme
.. • . . • . . . . • . • . • . • . . . .
124
II.2.5.1 - Chromophores optiquement actifs ...
124
II.2.5.1.1 - Chromophores naturellement asymé-
tr~ques ..••..•••••••......•••.•.
125

---

II.2.5.1.2 - Chromophores naturellement symétriques
126
II.2.6 - Paramètres importants en dichroisme
circulaire
127
II.2.6.1 - Rappel sur les transitions électroniques
127
II.2.6.2 - Influence des facteurs physiques solvant
et température
. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
129
REFERENCES
130
ANNEXE III - MATERIEL ET METHODES R M N UTILISES
133
III. 1 - Matériel
134
IlL" 1 - Préparation des échantillons
.•.••••.•
134
III. 1.2 - Enregistrement des spectres RMN 1D •.••
134
111.2 - Phénomène de la relaxation ••.•....•.•••.
135
111.2.1 - Temps de relaxation longitudinale T
ou
1
relaxation spin-réseau
•.•..•....•.•••
135
111.2.2 - Temps de relaxation transversale ou rela-
xation spin-spin
137
111.2.3 - Intérêt des temps de relaxation T
et T
138
1
2
111.2.3.1 - Interactions magnétiques dipolaires
138
111.2.3.2 - Intérêt des temps de relaxation sp1n-
réseau dans l'analyse spectrale ••••.••
140
111.2.3.3 - Mesures des temps de relaxation •••••• li
141
111.2.3.3.1 - Mesures de T
par la méthode de
2
CAR.R- PURCELL ••..••..••.•••..•.•..••
141
111.2.3.3.2 - Mesures de Tt par la méthode conven-
tionnelle
.
143
111.2.3.3.3 - Mesures de T
par la méthode du point
1
,
143
zero
.

---

111.2.4 - Techniques de double irradiation (DI)
145
1
1
III. 2.4.1 - Découplage bomonucléaire
H - H) ....
145
111.2.5 - Effet Overhauser nucléaire (NOE) •....
145
111.2.6 - R M N 2D
147
111.2.6.1 - Description classique de la 2D
148
111.2.6.1.1 - Acquisition du signal
148
111.2.6.1.2 - Traitement du signal
149
III. 2 .6.2 - Spectroscopie 2D (J - 0)
151
2 6 2 1
'
.
d
' 1 '
1
1
III. . . •
- Exper~ence
e corre at~on
H -
H
153
entre noyaux couplés par J scalaire •
111.2.6.3.1 - 2D
SECSY
153
REFERENCES
...................................................
156

---

EQUIVALENCE DES NOMS USUELS EMPLOYES
Cortisol
trihydroxy-llB , 17a , 21 dioxo 3,20 pregnène-4
Cortisone
dihydroxy 17 a, 21,
dioxo 3,20 pregnène 4
Désoxycorticostérone (DOC)
dioxo-3,20
hydroxy 21
pregnène 4
Médroxyprogestérone acétate
17a-Acétoxy-6a méthyl,
dioxo 3,20 prégnène 4.
Oestradiol
dihydroxy-3 , 17 B oestratriène
1,3-5
Oestrone
hydroxy 3 oxo-17 oestriène 1,3,5.
Prednisolone
trihydroxy 11 B, 17a 21; dioxo 3,20,
pregnadiène 1,4.
Prednisone
dihydroxy 17 a, 21 trioxo 3, 11, 20
pregnadiène 1,4.
Progestérone
dioxo-3,20 pregnène 4
Testostérone
oxo-3 hydroxy-17B
androstène-4

---

- 1 -
0-))
HO'-O~ '<.-l
Cholestérol t V 11\\
CH,OH
1
O:::(CO
O~A~~
...-
OélOll)'corciCOlCérone LI )
1
T
CorciCOlCérone (xiII)
11.a.h,drOll)'·pro"lCérone l ~ )
+
0)J::(
HO.....V:.)'
18-hydrolly.corcicOstérone ('!.!Y )
ù' a"drostilne·],17·dione l~)
O.atrOft. l)( VIII )
!
CH,OH
CHO
HO
to·
U)
O
o~oyJOH Il
O~ ~ ""
AldOllérone l 'C.:v,
,..1C00céron. ( ..JI)
Fig. l - Formation de divers stéroïdes à partir du cholestérol.
(Schéma simplifié où tous les intermédiaires ne sont
pas représentés).

---

- 2 -
INTRODUCTION
Les stéroîdes hormonaux [1] constituent chez les mammifères une
famille importante de molécules possédant comme structure un noyau penta-
perhydrophénantrène, comme le montre le schéma de la figure 1. Ces hormo-
nes intervenant dans différents métabolismes sont classées en cinq caté-
gories : oestrogènes, progestagènes, androgènes, glucorticoîdes, minéralo-
corticoîdes. Elles diffèrent essentiellement par le nombre et la position
de divers groupements fonctionnels (double liaison, hydroxyle, carbonyle,
méthyle, etc ••• ) situés sur le noyau pentaperhydrophénantrène.
Leur dosage dans les milieux biologiques [2],[3],[4] est réalisé
à l'aide de techniques par compétition dont la plus utilisée est actuelle-
ment [5]
la radioimmunologie (RIA). Cette technique utilise comme support
des anticorps (AC) qui doivent être spécifiques de la molécule à doser.
Les stéroîdes n'ayant pas d'activité antigénique propre (haptènes), il
est nécessaire pour obtenir un antigène (AG) de les coupler avec une
macromolécule type protéine (appelée "carrier") sans pour autant masquer
les groupements qui leur sont spécifiques [6]. Ces impératifs nous ont
conduit à greffer les stéroîdes sur la sérum albu.mine bovine
(BSA) par
l'intermédiaire d'un chaînon en position 7, cette position n'étant
jamais prise en compte pour différencier les stéroîdes les plus impor-
tants.
Les premières préparations d'antigènes [7] [8] [3] [4] étaient
essentiellement axées sur le couplage de l'haptène au "carrier" sans
qu'il y ait un suivi permanent de la spécificité de l'haptène au cours de
la synthèse bien que généralement un contrôle indirect soit possible
en fonction du taux de réaction croisée.
En ce qui nous concerne, l'objectif de ce travail est de
suivre dans toutes les étapes de la préparation de l'antigène la spéci-
ficité de l'haptène pour rassembler un maximum d'informations relatives

---

- 3 -
à sa structure et à sa conformation. Ceci doit nous permettre de voir
s'il y a ou non modification sc:ucturale et conformationnelle de l'hormone
stéroidienne au cours de la synthèse de l'AG.
Nous avons retenu la synthèse du dérivé conjugué 7 désoxycorti-
costérone (DOC-sérum albumine (BSA) et choisi deux techniques complémentai-
res d'analyse structurale, le dichroîsme circulaire (DC) et la résonance
magnétique nucléaire (RMN). La collection des nombreuses données expérimen-
tales que nous avons obtenues tant en RMN qu'en DC nous permettra de justi-
fier ce choix en même temps que de donner une appréciation sur les avantages
et inconvénients de chaque approche.
Lors de nos premières recherches bibliographiques nous avons
été frappés par le fait que le dischroisme circulaire n'avait été que
fort peu appliqué en immunoehimie bien que les phénomènes de la polarisa-
tion rotatoire directement liés aux dosages polarimétriques soient bien
connus en biochimie clinique. En effet,moins usuels sont les phénomènes
qui conjuguent à la fois la décomposition de la lumière polarisée et un
retard de propagation de l'une des vibrations droite ou gauche tels que
la dispersion rotatoire optique (ORD) et le dichroisme circulaire (DC).
Cependant il est certain que ces techniques élargissent le champ des
possibilités d'applications pharmaceutiques. Elles intéressent les
laboratoires de recherche qui les utilisent pour les contrôles de sépa-
ration et de pureté des produits et qui ,de plus en plus, leur demandent
des renseignements sur la structure, la conformation et la symétrie des
molécules. Elles intéressent enfin les laboratoires industriels auxquels
elles fournissent des méthodes de dosage extrêmement commodes et sûres
dont l'emploi est fondamental en industrie pharmaceutique.
Au delà de cet aspect essentiellement quantitatif le but de
nos recherches est d'utiliser conjointement les règles d'hélicité, les
valeurs de dichroisme normalisées et la règle de l'octant pour dégager
avec plus de certitudes les différentes phases conformationnelles de
notre synthèse.
En ce qui concerne la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
il est inutile de la présenter de façon exhaustive, l'essor [9]
qu'elle
connaît de nos jours témoigne de son intérêt dans la recherche fondamen-
tale appliquée. Signalons simplement que le caractère multiparamé-
trique [10J de cette technique, permet d'obtenir des informations dans

---

- 4 -
l'espace (déplacement chimique 8, effet NOE), dans le temps (temps de
corrélation T ) sur la structure, la géométrie des interactions et la
c
dynamique
01]
conformationnelle des biomolécules en solution.
L'exposé de notre travail comporte six chapitres:
- le premier résume les principes du dosage radioimmunologique et les
travaux antérieurs relatifs à la préparation des antigènes stéroidiens.
- Les chapitres II et III seront consacrés successivement aux données
antérieures acquises par les études des spectres &MN du proton et de
dichroisme circulaire des hormones stéroidiennes.
- C'est aux chapitres IV, V, VI, réservés à l'expérimentation que nous
traiterons respectivement les mesures dichroiques relatives aux princi-
pales étapes de la synthèse du dérivé conjugué DOC-B8A ; l'attribution
totale du spectre RM N proton de la DOC, et l'évolution de la conforma-
tion, quand on atteint la formation des composés 7 mercaptopropionique
DOC et DOC-B8A.

---

- 5 -
CHAPITRE I
GENERALITES SUR LA RADIOIMMUNOLOGIE (R I A)

---

- 6 -
1,1 - INTRODUCTION
En 1956, YALLOW et al. [12J [13J, en utilisant
l'insuline marquée à l'iode 131 (131 1 ) apportent la preuve de la présence
d'anticorps anti insuline chez certains diabétiques traités à l'insuline.
Dans les années 56 à 60, mettant à profit la réaction : insuline - anticorps
anti insuline, ils conçoivent une technique très sensible pour doser cette
hormone. La méthode s'étant révélée reproductible, elle a été appliquée
à l'ensemble des protéines et des petites molécules. Ainsi en 1959,
LIEBERMANN et al. [7 J [1:4] élaborent une méthode de préparation d' anti-
corps anti hormone stéroidienne. Cependant il a fallu attendre dix ans
plus tard pour que ABRAHAM et al [15J réalisent le premier radioimmunodo-
sage (RIA) d'une hormone stéroidienne. En plus des difficultés de préparation
des anticorps (AC) anti stéroides spécifiques, l'application de la RIA
aux stéroides a été retardée par le développement à cette époque [16J,
de l'analyse de ces hormones par la méthode de compétition avec une
protéine liante (competitive protein binding).
Le principe de cette technique [17J est basé sur
la compétition entre les formes marquée
et non marquée
du stéroïde
pour un nombre limité de sites liants de la protéine :
S + s* + p
s - p + s* - p
S
stéroïde non marqué
S*
stéroïde marqué
p
protéine
Le rapport
*
S /S*-p
mesuré par la distribution
de la radioactivité entre ces deux fractions obéit à la loi d'action de
masse et par comparaison avec une courbe standard, on peut évaluer une
quantité inconnue de S.
La précision et la sensibilité de cette méthode
dépendent de deux caractéristiques importantes :
- l'affinité qui peut se traduire par la valeur de la constante d'associa-
tion entre S et P. La valeur de cette constante doit être suffisamment
élevée pour permettre des liaisons mêmes à de faible concentration de S.

---

- 7 -
- La spécificité qui caractérise la propriété que possède la protéine
liante de ne
se lier à la limite qu'à un seul stéroide.
Les protéines liantes utilisées dans l'analyse par compétition
sont de deux sortes :
- les protéines de liaison et/ou de transport du plasma : elles sont sta-
bles et accessibles en grande quantité. Leur constante d'affinité est de
9
1
10
t mole- • On peut citer en exemple la CBG (Corticosteroide Binding
Globuline) ou transcortine, la SBP (Sex Binding Protein) ou protéine de
liaison de la testotérone. Mais ces protéines sont peu spcifiques d'un
composé particulier.
- Les protéines tissulaires ou récepteurs : elles se trouvent en faible
quantité
dans les organes cibles de l'action hormonale et sont relative-
11
1
ment peu stables: leur constante d'affinité est de l'ordre de 10
t mole- .
A cette catégorie appartiennent les récepteurs des hormones
stéroidiennes qu'elles soient oestrogènes, androgènes, progestagènes,
gluco ou minéralocorticoides. Toutefois la spécificité des récepteurs
n'est que relative aussi ce défaut est mis à profit dans les études phar-
macologiques d'analogues structuraux. Leur isolement et leur purification.
est par ailleurs complexe. Pour ces deux raisons ces protéines ne sont
pas actuellemertt utilisées pour le dosage des stéroïdes hormonaux.
L'idéal est de trouver pour chaque hormone une protéine de
haute affinité qui lui corresponde d'une façon univoque. En quelque sorte
il faut disposer d'une protéine à la mesure structurale de l'hormone.
L'immunologie répond à de telles exigences par l'intermédiaire des immuno-
globulines, protéines anticorps induites à partir d'antigènes formés
par liaison des stéroîdes à un support immunogène. Il est alors possible
de préparer une grande variété d'antigènes permettant de mettre en relief
de faibles différences structurales d'une molécule à l'autre.

---

- 8 -
1.2 - PRINCIPE DU DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE (R 1 A ).
Le principe du RIA repose sur deux lois physicochimiques
[18J,[19J, la loi d'action de masse et la loi de dilution isotopiques.
C'est une méthode d'analyse quantitative par compétition qui utilise comme
réactif spécifique un immunsérum (anticorps). Le stéroïde (S) à doser, mis
en cpntact avec l'immunsérum (AC) pendant la phase d'incubation, se fixe
sur les anticorps par des liaisons de faible énergie pour former un com-
plexe
S-AC
• Si le stéro~de est marqué le complexe sera également
marqué
S*-AC
On choisit des concentrations d'anticorps constants mais
insuffisantes pour lier tout l'antigène marqué
S*
de sorte qu'à l'équi-
libre de la réaction l'antigène marqué existe sous deux formes (figure 1.1)
- une forme liée réprésentée par le complexe radioactif
S* - AC
dont
l'activité est symbolisée par B {"bound" : radioactivité liée à l'AC)
une forme non liée constituée par l'antigène n'ayant pas réagi avec
l'anticorps, d'activité symbolisée par F.
La séparation de ces deux fractions [17J est une étape impor-
tante du RIA puisque la méthode employée doit être reproductible, donner
une séparation totale et ne pas "affecter" l'équilibre de la réaction.
Nous avons résumé les principales méthodes de séparation utilisées au
tableau 1. 1.
1.2.1 - TRACE DE LA COURBE ~
= f(S)
o
Paramè:tres et abréviations utiles
T
ou
"Total"
désigne la radioactivité totale du milieu d'incubation.
B
"Bound" désigne la radioactivité du complexe marqué
S* -AC
o
en l'absence de stéroïde non marqué.
B
"BQundll radioactivité du complexe
S*-AC
en présence de stéroïde
non marqué (stéroïde froid).

---

- 9 -
a
Ac
~\\\\\\ 80
s*
~+
Fe
@
r
~
:> @ + ~
b
*
,:::.
s
~
~(fJj)
.:::-
-
1
:> • ,
B1
~
:·~.::~l::...
~s,O
··.·t·
C9.F1
C
. s*
Jrt9~::',-:-
>.a..() ()."'.
.~::."':
1
~O
nf·
.. J. ..
B
.~
s2
80\\
. .
Fig. 1.1 - Principe général de la technique radioimmunologique.
La courbe d'étalonnage est établie à partir de" galeries de tubes
renfermant l'antigène constitué ici par le stéroîde (S) à diffé-
rentes concentrations connues (fig. 1.1a, 1.1b et 1.1c). L'intro-
duction de quantités croissantes d'antigène froid (S) entraîne une
réduction de la quantité de S* liée à l'AC d'activité B (B = B
quand S = 6) et une augmentation d'antigène libre dans le miligu
réactionnel.
B
diminue quand la concentration en antigène froid augmente.
Bo

---

- 10 -
Tableau 1.1
Adsorption de
*
S
libre
- charbon dextran
Précipitation de
*
S -AC
- S04 (NH }2 ' polyéthylène glycol
4
- anticorps (méthode du double anticorps)
Dialyse à l'équilibre
- mesure de S* AC et/ou S*
RIA en phase insoluble
- fixation covalente de S* AC sur :
• paroi intérieure des tubes (coated tubes)
• bille de verre
Filtration sur gel
- élution préferentielle et mesure de
*
S -AC
sur :
· séphadex
Tableau 1.1
Exemples de quelques méthodes de séparation des formes
liées
S* - AC
et non liées
S*.
L "
1
d
d"
. , B
f
.
d
1
eta onnage
u rapport
act~v~te ~
en
onct~on
e
a concentra-
o
tion en antigène froid (S) se fait de la façon suivante : on incube dans
dans un premier temps en l'absence de tout antigène froid
S
des quantités
connues de stéroide marqué (S*) et d'anticorps AC :
*
S
+
AC
-:>
<--
S* - AC + S*
Après séparation des fractions libres et liées on mesure le rapport
,
. . , B
d act~vLte ~ .
o
Au début de l'étalonnage, CS]
0 , on aura pratiquement un rapport
d'activité de 100 %.
Dans un premier temps on ajoute aux concentrations d'AC et de S*
précédemment définies un taux connu d'hormone stéroidienne non marquée 51'
comme les AC sont en quantité insuffisante par rapport aux stéroides, il
s'en suit une compétition entre
5* et 51 pour se lier à l'AC
AC
+ S1 + 5*<
:>
51 - AC + 5* - AC

---

-
tt -
Toute augmentation du taux de stéroîde froid dans le milieu
réactionnel a pour effet de réduire la quantité du complexe
AC - S*
Par conséquent la radioactivité B
du complexa s* -AC en présence de
t
S1 est inférieure à celle de B • Le rapport
~ est donc inférieur à
o
B
0
B
= 100 %.
o
On peut renouveler le même type d'expérience pour une quantité
d'antigène 52 supérieure à 5
: la radioactivité B
du complexe
5* -AC
t
2
en présence de 52 diminue encore par rapport à B
on aura :
1
B
<
<
Bo
on trace comme le montre la figure 1.2 une courbe d'étalonnage représen-
B
.
tant la variation du rapport
en fonction de concentrations connues
Bo
d'hormone froide. Pour connaître la concentration inconnue
5x
d'une
hormone stéroîdienne dans un milieu biologique : on incube un volume de
cet échantillon dans les mêmes conditions que précédemment, c'est-à-dire
avec des quantités de stéroîdes marqués et d'anticorps identiques et
B
l'on détermine le rapport
x
Par simple lecture sur la courbe
B
d'étalonnage on déduit la
0
valeur ~nconnue
5
.
x
La mise en oeuvre d'un tel principe nécessite qu'un certain
nombre de points méthodologiques soient résolus, en particulier il faut
- avoir préparé un anticorps spécifique de l'antigène à doser
- avoir marqué l'antigène par un radio isotope
- posséder une préparation de référence pour étalonner la technique.
Bien que tous ces points soient importants dans la mise en
oeuvre de la RI A des hormones stéroîdiennes, nous n'aborderons ici
que le problème très délicat de la synthèse de l'antigène (AG). Nous
rappelerons au préalable quelques généra-lttés sur la titration et les
méthodes d'appréciation de la spécificité de l'immunsérum.

---

-
12 -
B
-Bo
100
8 0
6 0
-
- -
-
- - - - - - -
- -
- -
- - - - _.
40
10
p.
125
7.8
500
S
Fig. 1.2 - Tracé de la courbe BB
: f(S)
: on détermine le rapport ~
o
Bo
pour l'échantillon inconnu S
traité dans les mêmes
x
conditions opératoires. Par simple lecture sur la courbe
d'étalonnage on déduit la valeur inconnue S .
x

---

-
13 -
1.2.2- TITRE DE L'IMMUNSERUM
On effectue une série d'incubation de l'immunsérum
à dilutions croissantes en présence d'une quantité constante de sté-
roïde radioactif. Le titre d'un antisérum (ou anticorps) est défini
comme étant la dilution qui permet environ 50 % de liaison
(fig. 1.3.)
d~ traceur radioactif et représente la dilution optimale en vue du
dosage radioimmunologique. Le titre est en relation avec la constante
9
10
-1
d'association des AC qui oscille entre 10
et 10
mole
et avec
la quantité de traceur incorporé dans l'haptène ou l'antigène.
1.2.3 - SPECIFICITE DE L'ANTICORPS
Courbe' standard : On effectue une série incubation avec des quantités cons-
12
tantes de stéroïde témoin non marqué, en général de 2 pg
(10-
g) à
500 p.g.
Réactions croisées: La spécificité de l'immunsérum est étudiée par l'in-
troduction de quantités croissantes de stéroïdes de structure voisine de
celle dont on veut doser (stéroîde témoin). La comparaison des courbes
obtenues (fig. 1.4) avec la courbe standard permet la mise en évidence
des réactions croisées (R C ) •
ABRAHAM [20J définit un terme de réactions croisées à 50 % de
capacité de liaison du traceur suivant
% de RC à 50 % de liaison· =!
100
Y
X et y étant les masses respectives du stéroîde témoin et l'hormone de
structure voisine, déplaçant 50 % du traceur radioactif.

---

-
14 -
lDD
• - ......"
\\ •\\ \\•\\\\,
\\
JO • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ,
" \\\\,
\\ \\ "," ......
titre
Fig. 1.3 - Détermination du ti tre de l' inununsérum.
~~
Bo
100 - ..
',.........
•
•
, ......
, ....
. ...
, ......
,
....
.
...
.............
'0
~
,--:"
.,
. "
·., .1 .-.
-.
- - __ •
·1 "1
•
1
----
.
l
"
•
l
'C..
·
.-........
:
.............._-
1
x
y
10
Fig. 1.4 - Courbe standard et mise en éviùence des réactions croisées.

---

- 15 -
..
1.3 - PREPARATION DES ANTIGENES STEROIDIENS
Depuis les travaux de MIDGLEY et NISWENDER [21J, on sait
que la spécificité des anticorps (AC) varie en fonction du site par
lequel le stéroïde est relié au "carrier", et que cette spécificité est
accrue quand le couplage est effectué en dehors des positions fonction-
nelles. Cette constatation se trouve bien illustrée par les travaux de
LINDER et al, [3J [4J sur deux antigènes de l'oestradiol (XI~) dont l'un
est lié à la sérum albumine bovine (BSA) en position 17, que nous désigne-
rons par XIX-17 BSA et l'autre en CG représenté par XIX-G-BSA (fig. 1.5 a)
les AC induits par la XIX-G-B5A se sont révélés plus spécifiques que ceux
issus de la XIX-17-BSA puisque ces derniers ont de fortes réactions croi-
sées avec l'oestrone (VIII). Ceci a conduit les auteurs [3J [21J
à fixer
les hormones stéroàiennes (haptène) sur la BSA en CG ou en C
afin de ne
ll
pas masquer les groupements fonctionnels. Aussi poursuivant ces mêmes tra-
vaux sur la progestérone (IX), ils ont synthétisé (fig. 1.5 b)
la
11 BSA-progestérone. Seuls les anticorps résultant de l'antigène IX-ll BSA
sont vraiment spécifiques de la progestérone. En effet les immunsérums dont
l'obtention a été stimulée par la IX-G-BSA ne reconnaissent pas les change-
ments au niveau du carbone 5 de l'haptène et réagissent indifféremment avec
les épimères Sa
pregnane 3-20 dione et SS pregnane 3-20 dione (fig. I.Sc) •
Ce manque de sélectivité au niveau Cs a été attribuée à la proximité de ce
carbone du site de liaison stéroïde-protéine. Cet "effet de proximité" est
éliminé lorsque la BSA est greffée à la progestérone en C
• Cependant
ll
l'approche par le C
n'est pas adéquate pour plusieurs hormones stéroï-
ll
diennes en particulier les minéralocorticoides comme la désoxycorticosté-
rone (DOC) dont les métabolites possèdent un groupement hydroxyle en cette
position. La considération de ce problème a conduit différents auteurs
"[17J [22J [GJ à réaliser les greffages en C
particulièrement intéressant
7
car ce carbone n'est jamais impliqué dans le métabolisme normal d'aucune
hormone, et se trouve de plus éloigné du site d'épimérisation en CS.
En dehors de cet aspect stéréospécifique, la nature du lien
entre le stéroïde et la protéine intervient également dans la spécificité
de l'anticorps dans la mesure où il permet de mieux dégager l'haptène de
l'encombrement structural du carrier. (Le rapport des poids moléculaires
respectifs est de l'ordre de 300/GO.000).

---

-
16 -
"
Oestrone (XVIII)
a
..'0
/
CH&.
"'cao
8SA-O""
Oestradiol (~lX)
6 BS'\\-oE'str.:1diol
XIX-17-BSA
b
o
rx - L1=l3SA-
C r
épimère 5a
épirnère 5,3
Fig. 1.5 - DérivJs conjugués de l'oestradiol et de la progestcirone.

---

- 17 -
1.4 - PREPARATION DES STEROIDES SUBSTITUES EN POSITION 7.
Les stéroïdes hormonaux naturels ne possèdent pas de sites réac-
tifs en C • Aussi les dérivés sont généralement préparés par des réactions
7
d'addition, de condensation et de substitution sur des intermédiaires
"activés" en cette position. Nous ne saurions aborder toutes les méthodes
et les réactions chimiques pour la préparation des stéroïdes substitués
en 7, de nombreux auteurs [17J,[6J,[22J traitent de ce problème. Aussi
ne retiendrons nous que les données essentielles concernant les méthodes
que nous avons nous mêmes employées.
1.4.1 - CAS PARTICULIER DE LA SYNTHESE DU DERIVE
7 MERCAPTOPR0PIONIQUE DESOXYCORTICOSTERONE.
Cette préparation s'effectue à partir des oxo 3 diènes
~ 4-6 DOC et ~ait appel à des réactions d'addition nucléophile 1-6. La faible
réactivité du système conjugué nécessite d'employer des agents nucléophiles
suffisamment réactifs.
En nous inspirant des travaux de WEISTEIN et al [6J,
nous avons utilisé comme agent nucléophile l'acide S mercaptopropionique
qui non seulement est un bon agent nucléophile mais offre aussi le double
avantage :
- de rallonger le chaînon de fixation de l'haptène au carrier
- de pouvoir former une liaison peptidique par sa fonction carboxyle avec
les résidus E amiaés de la lysine du carrier.
Pour garder un maximum d'homogénéité de l'objectif
de ce travail, nous ne décrirons qu'en annexe toutes les conditions expéri-
mentales relatives à cette préparation et les méthodes de purification des
différents dérivés obtenus lors de la synthèse du dérivé.conjugué en
7 DOC-BSA. Nous en signalerons ici simplement les principales étar>es qui se
trouvent résumées par la figure 1.6, dont les études par RMN et dichroïsme
circulaire constituent l'essentiel de notre sujet.

---

Fig. 1.6 - Schéma de la synth~se
de l'antigène de la DOC.
0
,
Il
,
...-.' -CH
.......-
ln IfI 'S
-.,1
Z
''c''t-0"::=0
1
CH~
•
o
G
DOC 21
'tate
ae
(II)
DOC (I)
1 0Il
ri'cII -0 0
t'c1l2-,,~o
......
1
Z
'c.~
~
iN!
CP
l...
0'
S"~~J'C••H
Ô4-6 DOC 21 acétate (III)
7 mercaptopropionique DOC 21 acétate (IV)
o
l
"
•
"cWl-0H
"
.~l"""'CHI-.
'1
H
0'
1
--CUI
o
'<lfl.....-c"N"-6~l
-C4'z
'c", -COOH
~
7 mercaptopropionique DOC
Doc-nSA (VI)

---

- 19 -
CHAPITRE II
RESULTATS ANTERIEURS ACQUIS EN RM N IH
..
SUR LES STEROIDES

---

- 20 -
II,1 - INTRODUCTION
Pour de nombreux composés organiques la R MN
permet généralement l'observation de tous les sites moléculaires. Dans
le cas des stéroïdes l'exploitation des spectres est si complexe que
même un traitement des données par ordinateur ne suffit pas à faire
l'attribution complète des différents protons de la molécule. Classique-
ment sur les spectres R M N du proton des stéroïdes (fig. II. 1.A) [23 J,
[24J,[25J, on distingue vers les champs forts (0 - 1 ppm du TMS) les
raies des méthyles caractérisées par l'intensité et la finesse des pics.
Aux environs des champs faibles résonnent les protons voisins d'un groupe
électronégatif (OH, F, Cl etc •• ) dont les déplacements chimiques sont en
général compris entre 3 et 5 ppm du TMS. Dans la zone des champs faibles
de 5 à 6 ppm, apparaissent les protons oléfiniques. Entre 1 et 2 ppm
on note des bandes mal résolues dues aux déplacements chimiques voisins
et aux couplages spin-spin intenses de la grande majorité des protons CH2
et CH du uoyau stéro-ide.
Pour un stéroïde dépourvu
de groupe électronégatif
et de protons oléfiniques comme l'andro~tane,
les seuls signaux discerna-
bles sur le spectre sont ceux des méthyles angulaires 18 et 19. Ces grou-
pements constituent donc les éléments essentiels de comparaison structu-
rale entre les différentes molécules de stéroïde. Ceci explique pourquoi
les premiers travaux sur la R M N du proton des stéroïdes, menés par
SHOOLERY et ROGERS [24J ont été axés principalement sur la mise au point
d'une méthode d'incrémentation associant à un substituant donné en une posi-
tion précise un effet spécifique sur le déplacement chimique des méthyles
angulaires.
II,2 - METHODE DES INCREMENTS DE SUBSTITUANTS
SHOO1ERY ET ROGERS [24J [26J ont montré que la
fréquence de résonance des méthyles angulaires dépend de la nature et de
l'orientation des substituants sur le squelette stéroïde. Ils ont démontré
aussi que les variations de leur fréquence de résonance induites par
différents groupements fonctionnels sont additives. Ainsi par exemple
l'apport d'un groupe oxo en C
de même que la création d'une double
3

---

- 21 -
c .
9
TMS
A
b
1h 1
dV. a
c
t
i
i
1
i
i
i
7
6
5
4
3
2
ppm
0
c
1
L.J L.,J 1
d
c:
b a
TMS
8
1
~ ........
e
9
h
,
1
7
6
5
4
3
2
ppm
0
1
Fig.
11.1
A
Spectre R:.2~ 'H du cholestérol [3ü l r~alisé à
100 :"lHz dans le CC1
. ;, :
repr~sente le spectre
4
du même composé enregistn: J
100 ~1Hz après addition
de
[Eu(DPM)3
(Pyr)'J J
C
Etalement de la zonë de résonance des méthyles de B.

---

- 22 -
liaison 5-6 déplacent le signal du méthyle 19 respectivement de 7 Hz
et de 5 Hz
vers les champs faibles (figure II.2). Cette théorie
des effets de substituants sur les méthyles angulaires se trouve
confirmée par l'enregistrement du spectre de l'androstène 5 one 3
dont le signal du méthyle 19 est déplacé d'environ 12 Hz
vers les
champs faibles.
5 Hz
12 Hz
F '~g. II • 2 - Add~t~v~te'
. L . L . L
des effets de subst~tuants
.L
sur les méthyles angulaires.
60 = Variation du déplacement chimique du méthyle 19 par rapport
à la fréquence de résonance du même groupement dans la molécule
non substituée de l'androstane.
Ce concept a été Gonsidérablement développé ~ar différents
auteurs
[26] et plus particulièrement par ZURCHER [27] [28J
qui à
partir des 260 stéroîdes de structure connue a pu établir les valeurs
des incréments de substituants pour les méthyles angulaires, induites

---

- 23 -
par des groupements fonctionnels situés à différents endroits du noyau
stéroidA.
Ainsi l'étude du spectre d'un stéroïde inconnu en comparai-
son avec des tables compilant toutes les données permet d'avoir des rensei-
gnements sur sa structure., Cependant pour que les résultats soient repro-
ductibles un certain nombre de conditions doivent être respectées :
- Enregistrement des spectres dans le deutérochloroforme (CdC1 ) avec
3
le !MS comme référence interne.
- les interactions soluté-soluté comme par exemple les liaisons hydrogène
intermoléculaires qui peuvent changer l'environnement d'une molécule
doivent être minimales et éventuellement constantes.
Les différents auteurs [24J,[26J,[28J n'ont pas trouvé une
grande influence de la concentration sur la résonance des méthyles.
II.3 - METHODES PHYSICO-CHIMIQUES UTILISEES POUR AUGMENTER
LA RESOLUT 1ON DES SPECTRES R~1 N PROTON DES STEROÏDES.
Nous venons de voir que la superposition de plusieurs bandes
de résonance des déplacements chimiques voisins constitue l'handicap
majeur dans l'interprétation des spectres RMN proton des stéroïdes.
Mais vu l'intérêt de ces molécules en biologie et en pharmacie, des
recherches ont été ~ntreprises pour essayer de résoudre ce problème. Nous
étudierons ici, deux approches qui ont connu de larges applications
dans la R M N des stéroïdes.
II.3.1 - UTILISATION DES LANTHANIDES AGENT DE
DEPLACEMENT CHIMIQUE.
c'est HINCKLEY [29J,[30J qui en 1969 publia les pre-
miers travaux sur le déplacement des signaux du cholestérol après addi-
tion de complexe paramagnétique dipyridinique du t~isdipivaloylméthyleuro­
pium (III), [Eu(DPr1)3 (Pyr)2 J. Il a constaté que les signaux pouvaient
être déplacés de 0,02 à 3,5 ppm vers les champs faibles, sans un élargis-

---

- 24 -
sement appréciable des bandes de résonance. Plus tard BRIGS J. et al [31]
ont montré que l'on pouvait aboutir aux mêmes résultats avec le trisdi-
pivaloylméthylpraséodyme (III) [Pr(DPM)3 J .
Ces composés paramagné-
tiques produisent des champs locaux capables de déplacer les raies de
résonance et ceci d'autant plus que les hydrogènes observés sont plus
proches du groupement susceptible de former une liaison avec le complexe.
L'examen détaillé de la figure IL 1.B montre que les protons les plus
déblindés par la formation de la liaison métallique sont les voisins du
groupement hydroxyle. Cette méthode a été surtout appliquée aux stéroî-
des possédant des groupements fonctionnels cêtoniques et/ou hydroxyliques
mais ne p-ermet que l'attribution d'un nombre rêduit de protons.
11.3.2 - DEUTERATION PARTIELLE SPECIFIQUE
La deutêration partielle [32J,[33] des composés étudiés
simplifie les spectres car le couplage entre protons et deutons est nettement
plus faible :
YD
=
= 0,154
de sorte que le couplage J
ne s'étend pas au-delà des protons en a
HD
du deutérium.
SAWAN et al [34] ont étudié les spectres du proton du cholestérol
5
du
2,2, 4,4,
6 cholestérol d
à 360 MHz en comparaison avec le
spectre RMN ~ (D) du composé deutéré enregistré à 15 MHz. ~~is ils n'ont
pu attribuer les déplacements chimiques des p,rotons des cycles A et B avec
beaucoup de certitude qu'en s'aidant aussi des techniques de double irra-
diation. Cette méthode est intêressante mais a l'inconvénient majeur
d'être onéreuse.

---

- 25 -
II.4 - APPLICATION DE LA RM N IH AU SUIVI DE LA SYNTHESE
DES ANTIGENES STEROIDIENS.
Du fait de la complexité des spectres RMN l H des stéroïdes, le
suivi de la synthèse des antigènes des hormones stéroïdiennes utilise
dans les premiers travaux d'analyse structurale [6],[17] les seules
résonances des méthyles angulaires dont les pics sont résolus même
à 60 MHz.
Récemment, D. DUVAL [17] a eu l'idée de faire basculer la
double liaison 4-5 en 5-6 afin d'identifier les dérivés 7 a et 7 13
d'après le structure de la résonance du proton vinylique H
alors bien
6
isolé sur le spectre. En effet le couplage
3JH -H
variant avec l'an-
gle dièdre ~ (figure II.3) suivant la loi de
6
7 Karplus on a :
> J H
H
6 -
7a
La bande de résonance vers les champs faibles sera donc plus étroite pour
l'épimère 7a carboxyméthyle que le 713 carboxyméthyle. Cette différence
disparaît évidemment lors de la dernière étape avant le greffage, lorsque
la double liaison revient en position 4-5 ; la seule caractéristique
marquante des deux épimères est alors le déplacement chimique des méthy-
les 18 et 19. Cette méthode quoiqu'astucieuse ne permet vraiment la
distinction sans ambiguité des épimères 7a et 713 que dans la mesure où
les déplacements chimiques des protons H
et H
auraient été préalable-
6
7
ment attribués; ce qui suppose dans un premier temps l'analyse complète
du spectre du stéroïde initial. De plus elle ne donne pas accès [17} à
l'identification de chaque configuration.
L'ensemble des travaux en RMN sur les stéroïdes a été historique-
ment [35] entravé par trois difficultés principales :
- La sensibilité : ce problème a été largement surmonté par la transfor-
mée de Fourier et par l'avènement des spectromètres haut champ.
- La résolution individuelle des bandes de résonance des protons : les
champs élevés sont d'une aide importante pour la clarté des spectres,
mais même à 400 MHz les spectres de
la plupart des stéroïdes et des
terpènes demeurent complexes et comportent plusieurs signaux surperpo-
sés.

---

- 2 t: -
"3 J".fHI' 1-'10 -
..co
~
la
Lt
2-
20
&(0
' 0
.&00 •••
Iho
,no
ct>)
~., == cf'H6
~H cf7'1~ 3::°
.A
-
H6
H
8')°
=
H7
Br
Br
ic-ig. 11.3 - Applic.:ltion de
La ré.:lction cie Llrplus
(.\\) ::
la (',:lractcrlsation
des .spimèrt's ï Ct c,nDoxyméti:yle et ; 3 carboxymL-tl1yl e stéroide.

---

- 27 -
Attribution : A cause des déplacements chimiques voisins, des nombreux
couplages spin-spin, l'attribution par la méthode classique basée sur
la comparaison,des spectres de composés de structure similaire est
quasiment impossible et de plus nécessite beaucoup de temps vu le
nombre important de protons à attribuer. A moins de faire appel à des
techniques spécifiques d'attribution l'analyse des spectres des stéroi-
des ne peut aller au-delà des protons méthyliques et oléfiniques.
II.5 - TECHNIQUES D'ATTRIBUTION SPECIFIQUES.
La R M N a connu dans le passé deux grandes innovations
[36J dont les applications en chimie organique sont immenses mais qU1
demeurent trop
souvent inexploitées. La première est l'avènement des
aimants supraconducteurs couplés avec des ordinateurs de contrôle qU1
a élargi les domaines d'application de
techniques classiques d'attri-
bution telles les mesures des effets Overhauser nucléaires (NOE) et
les couplages homonucléaires lR_1 R. La seconde a introduit plusieurs
variantes de la R M N a deux dimensions (la 2D) dont les pionniers [37J
[38J sont ERNST et FREEMAN.
HALL et SANDERS [36J proposent,à partir de ces innova-
tions, une stratégie générale pour l'analyse des spectres R M N proton
des produits naturels complexes tels que les stéroides. Cette stratégie
est basée sur les mesures' des temps de relaxation, les techniques de
double irradiation (découplage et effet NOE) et sur l'utilisation de
la RM N 2D qui permet de faire apparaître sur un seul spectre les
corrélations entre noyaux par couplage scalaire J ou par relaxation.
11.5.1 - TEMPS DE RELAXATION SPIN-RESEAU.
Il a éta établi [39J [40J [41J que pour des
molécules organique~ en solution, le mécanisme majeur de la relaxation
d'un proton est dû à l'interaction dipôle-dipôle entre protons voisins
dans l'espace. La vitesse de relaxation R
d'un proton l, résultant des
l
interactions avec les S protons voisins est donné par la relation (11.1)
(11.1)

---

- 28 -
avec
T
temps de corrélation rotationne11e
c
r .
: distance entre les protons l et S
1 S
Le temps de corrê1ation rotationne11e est pratiquement identique
pour tous les protons liés directement au squelette stéroide, R1 est
par conséquent le reflet de la distance entre l et S. Les protons méthi-
niques (CH) isolés par rapport aux CH .auront une vitesse de relaxation
2
plus faible que ces derniers. Il est alors possible à partir de l'enre-
gistrement de spectres partiellement relaxés de faire apparaître les
résonances des CH enfouies en général dans celles de CH .
2
II.5.2 -
EFFET OVERHAUSER NUCLEAIRE (EFFET NOE).
L'effet NOE [42J [36J est une conséquence du
mécanisme de relaxation. si plus d'un proton (S protons) relaxent le
spin l
les au~mentations du signal de l quand les S protons sont irradiés
séparément, sont fonction de rIS'
Fig. IL!! - :folécule du cyclohexane

---

- 29 -
Si l'on prend par exemple la molécule de cyclohexane (fig. II.4)
quand on irradie ~, le signal de HA (proton géminé) augmente de
32 - 50 %, les signaux de RB et H
(protons vicinaux) augmentent de
C
6 % et ceux de ~ et Pl)
(protons éloignés) de 1 - 3 % .
Que nous révèlent les mesures d'effet NOE?
Elles font apparaître des interactions spatiales à travers les
cycles. Les couplages scalaires entre protons séparés par une, deux ou
trois liaisons donnent les mêmes informations plus aisément, mais l'in-
térêt de cette méthode est de reconnaître des protons proches dans l'es-
pace mais séparés par plus de trois liaisons et donc non couplés; c'est
le cas des protons en position 1-3 diaxale. Dans l'exemple précédent les
protons ~ et ~ non couplés avec ~
pourront être attribués en raison
de leurs interactions 1-3 diaxales. Cependant pour que cette méthode
soit utile dans les attributions il faut arriver à mesurer les effets
NOE de l'ordre de 0,5 %. Les intégrales atteignent rarement cette préci-
sion, c'est pourquoi on a recours à la soustraction de spectres:
le
spectre irradié est soustrait du spectre témoin, sur le spectre différen-
tiel apparaissent les seules raies dont les intensités ont varié.
II.5.3 -
DECOUPLAGE DIFFERENTIEL
Etant dQnnée la superposition des bandes de réso-
nance sur les spectres des stéroides, la double irradiation classique
n'est d'aucune utilité pour l'attribution spécifique de chaque proton.
Par contre si un spectre découplé est soustrait d'un spectre témoin le
travail est facilité car seuls les protons qui subissent le découplage
apparaissent sur le spectre différentiel. C'est un puissant moyen de
détection des résonances dissimulées.
II.5.4 -
SPECTROSCOPIE 2D.
Un ensemble de spins S [43J est caractérisé par
un certain nombre de paramètres : déplacements chimiques, constantes de
couplage entre noyaux, temps de relaxation Tl et T
' effet NOE etc ...
2
La plupart du temps le chimiste n'est intéressé ou ne souhaite mesurer
à la fois qu'un nombre réduit de ces paramètres. Avec la venue d'appareils

---

- 30 -
à haut champ et l'intérêt des chimistes pour les molécules de plus en plus
complexes est apparue la R M N à deux dimensions
[44J [37]
(RMN 2D) dont le but est de faire apparaître dans une deuxième dimension
une information déjà existante àans le spectre à une dimension mais sous
une forme obscure: J, corrélation spin-spin etc
Dans une expérience de R MN 2D on fait varier deux paramètres
qu~ après traitement approprié donneront une surface dont les deux dimen-
sions sont des fréquences. Nous n'étudierons pas ici les techniques expé-
mentales basées sur des séquences d'impulsion [45J assez compliquées mais
qui ne posent en général pas de problèmes sérieux sur les spectromètres
modernes, car il existe des programmes bien établis permettant la mise en
oeuvre aisée des différentes expériences de 2D. Le lecteur intéressé pourra
se reporter au chapitre III de l'Annexe.
Cependant nous signalerons les
diverses informations dont on peut disposer à l'aide de la RM N 2D.
EXPERIENCE DE CORRELATION J -
Ô
Elle permet d'avoir des renseignements sur les déplacements
chimiques et les couplages sc~laires (J) sur deux axes séparés (fig. II.5.A).
Ainsi il est possible d'obtenir un spectre découplé renfermant seulement
des singulets aux déplacements chimiques des protons et d'examiner individuelle-
ment des massifs qui peuvént être superposés dans une expérience à une dimen-
sion. On peut de ce fait mesurer les constantes de couplage avec une préci-
sion de 0,1 Hz. La limite de la méthode est que les noyaux étudiés ne doi-
vent pas être fortement couplés, auquel cas [46J [47J il apparatt des raies
. supplémentaires.
E."<PERIENCE DE CORRELATION
1H - 1H ENTRE NOYAUX COUPLES
PAR J SCALAIRE.
Deux types d'expériences voisines peuvent être utilisées:
COSY (correlated spectroscopy) ou SECSY (spin echo correlated spectroscopy)
différentes par la présentation des résultats (fig. II.5.B).

---

-
31
-
A
.c ••• ",
B
_____...
~---- ..... -----~f.lC'"
~p"ct:e
nQrJl;~ t
...... Mt'
- - -, .I----~-'" •
Fig. II.5 - Spectre 2D de l'~ther ~thylique (CH -CH ü-CH -CH ) :
3
2
2
3
A
Spectre 2D (J-3) le triplet des méthyles et le quartet
des méthylènes sont présent~s sur un spectre à 3 dimensions.
La projection des multiplets sur un plan vertical donne des
singulets correspondant aux déplacements chimiques respectifs
de ces groupements.
B
Spectre de corrélation SECSY : le spectre normal apparaît
sur une ligne horizontale sous forme de taches qui dépendent
de la hauteur à laquelle on a coupé les raies. Les taches de
corrélation mettdnt en évidence les couplages apparaissent
sur une même diagonale à égale distance des noya 'x couplés
(66 = 1/2 (5
- SCH )'
CH2
3

---

- 32 -
SPECTRE
enregistré à la plus
haute résolution
possible
Attributions
directes
Mesures Rl
préliminaires
nécessaires aux
irradiations variées
/
\\.
2DJ
N.O.E.
Pour résoudre et
compter le maximum
Di ffêrenti el
àe signaux possibles
Découplage
différentiel
Fig. II.7 - Stratégie d'attribution des produits
naturels complexes définie par HALL et S&~ERS [36].

---

- 33 -
En conclusion de ce chapitre, nous donnerons la stratégie
établie par HALL et SANDERS [36 ] pour l'analyse complète des spectres
RMN proton de produits naturels complexes tels que les stéroîdes. Cette
stratégie (fig. II.6) dépend des moyens d'accès aux équipements modernes.
Dans l'ordre de difficulté croissante on a :
- Enregistrement des spectres partiellement relaxés (mesure de T ).
1
- Spectre de découplage différentiel.
- Spectre NOE différentiel.
- Spectres 2D.

---

- 35 -
CHAPITRE III
..
RESULTATS ANTERIEURS ACQUIS EN DICHROIMETRIE
..
SUR LES STEROIDES
1
t!1!.
1
1
t

---

- 36 -
111,1 - INTRODUCTION
La détermination d'une configuration absolue ou
relative a toujours été pour le chimiste organicien un problème impor-
tant notamment lors de la préparation de produits naturels complexes
par biosynthèse où ces considérations sont indispensables. Dans ce
domaine, la dispersion rotatoire optique (O.R.D) et surtout le dichroïsme
circulaire (D.C) semblent des techniques particulièrement appropriées
si l'on considère la rapidité avec laquelle les informations peuvent
être obtenues.
Nous n'aborderons pas dans ce chapitre les données
essentielles de l'activité optique et du dichroisme circulaire, le lec-
teur intéressé pourra se reporter à l'annexe II. Cependant nous rappelle-
rons brièvement les principales applications qui ont initié leur développe-
ment.

---

- 37 -
111.2 - APPLICATIONS DU DICHROISME CIRCULAIRE A L'ETUDE
DES STEROÏDES.
Pourquoi les premières études de dichroîmétrie ont-elles porté
sur l'importante classe des stéroîdes ?
La réponse à cette question est fort bien apportée
par VELLUZ
et al [48J [49J [50J qui soulignent les nombreuses possibilités quant aux
divers emplacements des fonctions et à leur incidence sur l'absorption
dichroîque.
On a souvent reproché aux mesures de pouvoir rotatoire dans le
visible et à celles de l'absorption ultraviolette de ne flournir pour les
mélanges qu'une valeur anonyme. Ainsi, les cortisones et les ~4 ceto-3-
stéroîdes montrent dans l'ultraviolet des spectres semblables avec courbe
en cloche dont le maximum est situé entre 238 et 242 nm. La dichroîmétrie
offre l'intérêt d'apporter une véritable preuve d'identité. Le spectre de
l'hydrocortisone (fig. III.1) présente le dichroisme négatif de la fonc-
tion ~4 céto-3 (système énone) vers 330 nm puis celui positif, du carbo-
nyle en 20 à 285 nm. L'introduction d'une cétone en 11-
(cortisone) dimi-
nue fortement les élongations négatives, tandis que la création d'une
seconde insaturation en 1-2 (prednisolone) fait en outre disparaître toute
structure fine dans cette zone. Enfin le dichroisme de la prednisolone,
avec double liaison en 1-2 et le carbonyle en 11 est totalement positif.
11'1.2.1
-
CONTROLE DES REACTIONS CHIMIQUES
PAR LE DICHR01SME CIRCULAIRE.
Dès 1961 LACAM et VIENNET [51J montrent que lors
de la réduction en tétrahydrofuranne de la fonction cétone en 11 d'un
stéroîde ne possédant pas d'autre chromophore, l'évolution de l'opération
peut être suivie directement en milieu réactionnel. Le produit rédùit
n'offrant plus aucun dichroïsme, on peut ainsi doser 0,2 % de composé
carbonyle en présence de 99,8 % de dérivé hydoxyle.
Sans multiplier les exemples, on peut toutefois
souligner les avantages d'une telle technique qui permet la réalisation
de dosage des stéroîdes ou de certaines préparations pharmaceutiques sans
qu'il soit nécessaire d'isoler le mélange actif du milieu réactionnel.

---

- 38 -
o
Il
J---,-'tH _OH
'OH
Z
hydrocortisone
prednisolone
~"
OH
cortisone
prednisone
.....
Il,dr.corhsn•
.
'fI~.iSlI...
C.rtis...
.'
1. :
, ~
.. .
".,. .
'~. ~..
\\~
.
\\~
• 5 ~l
':'".".-..•
,. ..
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.. .
"" .
-;..
..
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.
"',
o l----..:..--t-.--=:=::..:".:::'_::_::",,:;:.~~_.~:.~:;~::..~.:::_:_::__=::_~_.~r
........
-5
1. m,..
300
320
340
360
Fig. 111.1 -
Courbes d'absorption dichroique de trois
dérivés de la cortisone.

---

- 39 -
Les observations précédentes font essentiellement état des
possibilités du dichroïsme circulaire (DC)
dans le domaine de l'iden-
tification des stéroïdes et de leur dosage, mais l'apport extrêmement
important de cette technique aux travaux de synthèse stéréospécifique
en font un outil de choix pour l'étude des conformations et des struc-
tures moléculaires en solution. Bien que les premières déterminations
aient souvent fait appel à une démarche empirique, les corrélations
entre structure et le dichroïsme sont régies, selon la classe des
composés envisagés, par des règles particulières reliant l'effet Cotton
(EC) au caractère normalement chiral de la molécule.
Dans ce travail nous établirons l'essentiel de nos conclusions
à partir de l'utilisation complémentaire et non pas compétitive de deux
règles importantes: la règle d'hélicité et la règle de l'octant en
même temps que du concept de courbe normalisée. Aussi est-il bon de les
rappeler brièvement.

---

- 40 -
II 1 .2. 2 -REGLE D' H;E LIe 1TE
La règle d'hélicité [52] [53] lie la classe struc-
turale d'un composé contenant un chromophore donné au signe de l'effet
Cotton de chaque bande d'absorption dichroique. Son application à des
molécules de structures diverses lui confère suffisamment de généralité
pour faciliter l'identification de la structure et de la conformation
des composés optiquement actifs. Ainsi en ce qui concerne les cétones
ex 13 insaturées (0 = C - Ca = CS)
[54J [55J [56] [57J, class~ structurale de
la plupart des hormones stéroidiennes, la chiralité du système énone
a été reliée aux s~gnes des effets Cotton des transitions
II - )
*
II
et n - ) II*
(fig. III.2).
II
TI ~ II *
-;>
II *
230
< À < 260 nm
230
< À < 260 nm
Effet Cotton négatif
Effet Cotton positif
o~
'/:
"0
n -> II *
n -> TI
(À > 300)
(À > 300)
f
Effet Cotton positif
Effet Cotton négatif·()
~
C:::O
Fig. 111.2 - Règle d'hélicité liant à la chiralité d'une cétone a, S
insaturée aux signes des effets Cotton des transitions
n
n
->.. *
TT
et ,_
TT'~
->.t
.
TRANSITION
n ---) II* ET CONfORMATION
Dans cette bande les axa 3, ène 4 stéroides ayant
les cycles A/B trans, présentent une faible élongation négative vers
300 nm attribuée [53J [58] [59] à l'hélicité de l'énone. Des études
plus récentes [60] ont montré qu'une substitution en position 613

---

- 41 -
(ou position en yaxiale de l' énone) peut inverser le signe de l'effet
Cotton associé à cette transition. Ainsi les dérivés 2S méthyl et
6S
méthyl 3 one cholestène 4, bien qu'a~ant les cycles A/B trans ont une
élongation faiblement positive dans cette bande due à une aplatissement
du cycle A résultant de la compression de la faceS
de la molécule par
les méthyles.
TRANSITION
TI --> TI* ET CONFORMATION.
L'effet Cotton associé à cette transition est fortement posi-
tif vers 240 nm pour les oxo 3 ène 4 stéroïdes de conformation normale.
Les modifications structurales entraînant des inversions de signe de
l'effet Cotton ont été également signalées par
BURNET et al [60J avec
les dérivés substitués en 6S du cholestène 4 one 3.
En réalité les céto 3 stéroïdes a S insaturés présentent plus
de deux bandes d'absorption dichroïque. Mais seules les deux bandes de
plus faible énergie (À < 300 nm) et (230 nm < À < 260 n) sont les plus
étudiées car plus sensibles à l'hélicité de l'énone.
III ..2.3 -
LA REGLE DE L'OCTANT.
La règle de l'octant proposée par MOFFIT et al [61J
en 1961 permet de prévoir le signe de l'activité optique d'un groupe céto-
nique situé sur un squelette moléculaire rigide. Réciproquement, il devient
alors possible de déduire le signe de l'effet Cotton des composés à partir
de leur structure, leur configuration et leur conformation. Prenons l'exem-
ple [62J [63J de la cryclohexanone. Le composé considéré est orienté à
trois dimensions (fig. 111.3) mais au lieu de considérer les axes de
coordonnées, nous considérerons les trois plans orthogonaux dont les
intersections définissent les axes de coordonnées et nous orienterons la
molécule en respectant l'ordre suivant:
- le plan vertical (A) passe par le groupe carbonyle et le carbone nO 4
- l e plan horizontal (B) passe par le carbone nO 1 et la cyclohexanone
est inclinée de telle sorte qu'il passe aussi par les n° 2 et 6
(respectivement R2 et 12).

---

-
42-
J •
A
6
z
B
If
+
.
1
10
le
la
1
1
·
!-L3-4-R3-e-
·
.
1
'a
1
1
----'--
----r-}
·1,1
·
·
c
·
)
+
octants arriéres
""-Plan. C
Fig. 111.3 -
R~gle de l'octant appliquée~ la cycloheAanone. En A nous
avons la cyc~ohexanone et son diGgramme d'octant, et en B les trois
plans de symétrie du groupement cGrbonyle. La dét~rmination des signes
des e~fets Cotton en fonction de la position des substituants dans les
dif.férents octants est représentée en C.

---

- 43 -
- le plan (C) passe approximativement au milieu de la liaison
carbone-oxygène et perpendiculairement à celle~ci
- le point milieu de la liaison C ~O est l'origine de l'axe des coordon-
nées.
L'effet Cotton d'une molécule active dépend de l'octant
parmi les huit (huit octants obtenus par les divisions des plans
orthogonaux) dans lequel tombent ses substituants ou la majorité de ses
substituants. Par contre, il est très peu perturbé par les substituants
situés dans les plans orthogonaux eux-mêmes (plans A et B). Si la molé-
cules est observée comme dans la figure III.3, l'application de la
règle de l'octant conduit aux conclusions suivantes:
- les substituants équatoriaux en R2 et L2 ont une influence très faible
sur l'effet Cotton car ils sont contenus dans le plan (B).
- Les,substituants axiaux en R2 (quadrant inférieur droit) et tous les
substituants en L3 (quadrant supérieur gauche) ont une contribution
positive à l'effet Cotton.
- les substituants axiaux en L2 (quadrant inférieur gauche) et tous les
substituants en R3 (quadrant supérieur droit) apportent une contribu-
tion négative.
les substituants du carbone C4 n'ont aucune influence puisque situés
dans le plan (A).
Il faut souligner que cette règle illustrée par de nombreux
exemples [61J [64J est d'un emploi délicat du fait même de sa généralité.
La représentation tridimensionnelle n'est pas simplè à utiliser et lors-
que les smbstituants sont répartis dans les différents octants, le pro-
blème de l'importance de chaque contribution se pose alors avec acuité.
Compte tenu de la complexité des structures stéroidiques, il semble
raisonnable d'utiliser la règle de l'octant de préférence comme méthode
de recoupement que comme point de départ de discussion.

---

- 44 -
III.2.4 -
COURBE NORMALISEE
La courbe normalisée [48J [65J [66J d'un produit
est obtenue en divisant boutes les ordonnées d'un spectre par celle du
maximum principal. On trace ensuite pour une classe de substance ddnnée
la courbe obtenue en calculant longueur d'onde par longueur d'onde la
moyenne des ordonnées ainsi réduites pour chaque composé. Cette méthode
conjugue non seulement l'intensité et la position du maximum mais encore
la forme de la courbe. Elle permet aussi d'apprécier l'influence d'une
modification structurale sur un chromophore comme l'illustrent les
exemples suivants
- La figure 111.4 montre que le courbe normalisée [66J des oxo 3 stéroïdes
A/B trans est de signe positif et celle des oxo stéroïdes A/B ais négative
avec une légère inflexion.
On remarque,comme attendu,que l'intensité maximale
du
f::.E
de la série trans se situe à +1
et celle -du cis à -1·.
- L'inversion de signe ae manifeste aussi avec les trans et cis oxo 7 sté-
roïdes qui ont été étudiés par VELLUZ et al [48J ; le dichroïsme négatif
est observé avec la forme trans.
- Une série d'oxo 11 stéroïdes [48J a révélé un dichroïsme positif.
Cet ensemble de résultats a mené aux conclusions
suivantes
1 - On peut caractériser un groupement carbonyle d'un stéroïde par une
courbe de D C normalisée, qui n'est pratiquement pas affectée par la
présence de substituants non chromophores dans la molécule, pour autant
qu'ils ne se trouvent pas au voisinage immédiat de la cétone.
2 - Le signe du D C est particulièrement lié à la nature de la jonction
entre le cycle porteur du groupe cétonique et le ou les cycles adjacents
puisqu'une inversion au niveau du carbone 5 change le signe du dichroïsme
pour les carbonyles en 3. Le phénomène est moins net lorsque la fonction
cétone est liée aux cycles B et c. C'est le cas par exemple des oxo 6
stéroïdes cis et trans qui présentent tous les deux un dichroïsme négatif,
la seule différence étant un maximum supplémentaire pour la conformation
trans.

---

-
45 -
a
 Cm",]
3
250
300
350
...
b
!
-el
.! 0.5
2
-el
-1
•
J 0.5
-2 ~
-el
al
350
-3
-J
bJ
-J.
Fig. III,4. a
courbe dichrofque normalis~e d'un oxo 3 ayant les
cycles A/B trans.
b
courbe d~chrorque normalis~e d'un oxo 3 st~rorde avec
les cycles AIE cis.
Les tracés en tirets repr~sentent les courbes réelles des
mêmes composés.

---

- 46 -
3 - Bien que la courbe normalisée ait le même s1gne pour tous les com-
posés d'un groupe homogène [48J [66J les valeurs d'intensité
maximales
du ~€ peuvent être très différentes selon le composé. Il est donc diffi-
cile uniquement à partir du ~E de dégager des conclusions nettes sur la
nature et la position d'un substituant •
..
CAS PARTICULIER DES STEROIDES POSSEDANT
DEUX GROUPEMENTS CETONIQUES.
Pour les stéroides ayant plus d'un groupement cétonique
tels la prégnène 4 dione 3,21 (progestérone) ou l'androstène 4 dione 3,17,
on note la présence d'au moins deux absorptions dichroiques correspondant
.
*
aux trans1tions n --) TI • Dans ce cas la courbe normalisée précédente,
tracée point par point,peut aisément être remplacée par le rapport du ~E
de chaque transition secondaire sur le ~E de la transition principale. Ce
calcul restant pleinement significatif, nous exploiterons l'ensemble des
transitions n --) TI* pour dégager les modifications éventuelles survenues
dans l'environnement des cnromophores lors de la synthèse des antigènes
stéroidiens.

---

- 47 -
CHAPfTRE IV
"
ANALYSE EXPRIMENTALE PAR DICHROISME CIRCULAIRE (DC)
DES ETAPES DE LA SYNTHESE DE L'ANTIGENE (AG) DE LA
DESOXYCORTICOSTERONE (DOC)

---

- 48 -
Nous avons procédé, avant les analyses fondamentales par
RM N et D C, à un contrôle de routine de tous nos produits par spectro-
photométrie UV, chromatographie couche mince et une purification
poussée par chromatographie liquide H P L C. Tous ces résultats ont été
regroupés au chapitre matériel et méthode de l'Annexe 1.

---

- 49 -
IV.l - IDENTIFICATION DES CHROMOPHORES.
La désoxycorticostérone (DOC) composé (1) initial de
notre synthèse dont les principales étapes sont schématisées par la
figure 1.4, présente de par sa structure une analogie évidente avec
la progestérone (IX) dont les spectres dichroiques ont été étudiés
récemment [67J par BARRET et al. Nous avons vérifié dans un premier
temps la bonne concordance de nos spectres avec ceux de la référence
précédente (tableau IV.l). En ce qui concerne les spectres de la
DOC (1) et ceux de ses dérivés de synthèse présentés dans le tableau
IV.2, ils ont été réalisés dans des conditions expérimentales identi-
ques à celles du composé (LX).
La comparaison des tableaux IV.l et IV.2 fait apparaître
les points suivants :
1) En accord avec la règle d'hélicité, on note un effet Cotton (EC)
négatif dans la transition n --) rr* (À > 300 nm) et positif dans la
transition rr -) rrte (230 nm < À < 260 nm), donc une hélicité de type A
(fig. 111.2) pour les composés (1), (II) et (V).
2) Pour ces mêmes composés, l'effet Cotton toujours positif, relatif
à la deuxième transition n --) rr* vers 284 nm du groupement 20 oxo
ne concerne plus l'hélicité du système énone mais intervient dans le
calcul du dichroisme normalisé. Ce calcul révèle une valeur constante
(t;e:
'V - 0,30)
pour les composés (1), (II) et (IX), par contre elle
n
diminue de moitié (t;e:
= - 0, 15)
pour le composé (V) .
n
- Le composé diénone (III) présente une seule bande dichroique importante
vers 342 nm correspondant à la transition n --) rr*
L'ensemble de ces résultats conduit alors au tableau IV.3,
où sont mis en évidence trois chromophores distincts rencontrés au cours
de la synthèse
- le chromophore A pour l'énone
- le chromophore (A + B) pour la diénone
- le chromophore D pour le groupe 20 oxo.

---

- 50 -
Tab leau IV. 1
~,ransitions .
"
*
*
Composés -"'~~
n
> II
II
> TI
À
!:JE
6.E
À
6.E
6.E
max
n
max
n
(a)
325- nm
- 1,2
- 0,3
233 nm
+
8
+ 0,77
Progestérone
(Bib lio)
284 nm
+ 4
+ 1
214 nm
+ 10,3
+ 1
326 nm
- 1, 1
- 0,27
233 nm
+
9
+ 0,9
Progestérone
(exp)
286 mn
+ 4,1
+ 1
216 nm
+ 10
+ 1
(a) résultat de BARRET et al [67].

---

- 51 -
Tab leau IV. 2
~!r
*
*
n
:>
II
II
:>
II
Composés
;
1
max
6€
6€
max
6 €
6€
n
n
324 nm
- 1,27
- 0,28
233 nm
8,8
+ 0,9
DOC
(1)
286 nm
+ 4,4
+ 1
216 nm
+ 9
+ 1
324 nm
- 1,16
0,29
233 nm
+ 11, 1
+ 1
DOC
21 Acétate
(II)
286 nm
+ 4, 1
+ 1
216 nm
+ 8,6
+ 0,78
64- 6 DOC
276 nm
(*)
(*)
21 Acétate
342 nm
+ 6
+ 1
264 nm
(*)
( *)
(III)
205 nm
(*) :
(*)
DOC
7
324 nm
- 0,49
- 0,13
234 nm
+ 2,3
- 0,29
Mercaptopropio-
286 nm
+ 3,7
+ 1
216 nm
+ 7,8
+ 1
nique (V)
(*) maximum non atteint

---

- 52 -
Tableau IV.3
~ n >JI*
JI
> JI*
Chromophore
Chromophore A
À
!J.E (signe)
À
/5.E (s igne)
max
max
233 nm
+
):~6 324rim -
216 nm
+
276 nm
-
t& 342 nm +
264 nm
-
0<>8
205 nm
-
8.0
0
Il
~I:---R
284 nm
+
Pas d'absorption dans
D
<,J,.
cette zone

---

- 53 -
Ces chromophores nous semblent d'autant plus caractéristiques
que les valeurs des longueurs d'onde expérimentales des transitions
n --) TI* et
TI --) TI* se retrouvent en accord [59J [60J [68J avec celles
que nous avons notées dans la littérature. La qualité expérimentale des
bandes situées en dessous de 260 nm (transition TI --) TI*) étant nettement
inférieure à celles des bandes de plus grande longueur d'onde (transition
n --) TI*) il est préférable de ne considérer que cette dernière transi-
tion pour caractériser sans ambiguité les différents chromophores.
Les chromophores A et D sont mis en évidence en (1), (II) et
(V), tandis que (A+ B)
apparaît dans le composé (III). Si nous reprenons
le tableau synoptique de notre synthèse (fig. 1.4), il est important de
noter que la spécificité de chaque chromophore est liée aux deux étapes
essentielles de la préparation de l'antigène de la DOC:
- création d'une double liaison en 6-7 liée à la disparition des chromo-
phores A et D et de l'apparition du chromophore (A + B) •
- Addition en C
du chaînon de greffage (acide S mercaptopropionique),
7
procédant de l'échange ~nverse des chromophores qui se trouvent identi-
ques à ceux du composé initial (1).
En outre, la comparaison des spectres de la figure IV.1
fait ressortir un épaulement vers 273 nm commun aux composés (II) et
(IX), inexistant pour (1). Il semble donc possible de suivre l'acétyla-
tion en C
du composé (1) par simple examen de la bande dichroique
21
relative au chromophore D. Quant à l'apparition du système diénone en
(III) la modification importante du comportement dichroique peut être
interprétée, soit par l'obtention d'un composé structuralement très
différent de (1) et (II), hypothèse peu probable dans notre cas, soit
par la présence de la double liaison 6-7 qui rend le cycle B sensible-
ment coplanaire du cycle A [69J [70J par un effet de transmission
conformationnelle.
Nous venons de voir que le chromophore A caractérise aussi
bien le composé (1) que le dérivé (V) qui,couplé à la BSA constitue
l'antigène de la DOC (VI). Mais au-delà de la spécificité de chaque
chromophore, le dichroisme circulaire peut encore se révéler utile
quant à l'analyse conformationnelle du cycle A et par la même montrer
si la molécule (1) subit une modification structurale et conformation-
nelle importante lorsqu'on atteint l'antigène (VI).

---

(,a.
o
Il
c.1,
.......-c.- LIll
oIl
•
,.
' - l - /c.... "'-L'" Co - (JI,)
a
c
", ~IlL··"
~Irl-I'O
O~W~
DOC (1).
DOC 21 acétate (II)
progestérone (IX)
o
o
o
o
o
a
C"")
0\\
0\\
0\\
uÎ
c
C"")
C'~
C'l
C'~
0-1
Ul
~
'l'
III'
1
l,
'''Il
1.,
''',1
Fig. IV.l - Soectes dichroIques des composés DOC, ,DOC 21 acétate et progestérone entre 250 et 400 nm.
Les si~nes des EC sont positifs au dessus de la ligne de base et négatifs en dessous. On
voit bien l'analogie de structure en C
entre les composés II et IX mis en évidence par
21
l'énaulernent à 273 nm sur leurs bandes dichroIques.

---

- 55 -
\\•
H
CO;1[orm"tiol1 P de type i1orm;l1
-'::'cles '\\/') trans Jve"
A demi
'-]:;1 i se
B -':':Jisl'
Con[ormnLil.H1 q Je type
Ll1versé
c y c: ] es, \\ / Bei s .
Conform;ltilln ?
:
cycles ~/B trans
A
quasi plan
demi bate~1U.
Fig. IV.Z - Schéma des conformères P, Q et R.

---

- 56
-
IV.2 -
ETUDE DE LA CONFORMATION DE LA DOC.
Si l'on examine l'arrangement des cycles A et B, on peut
dégager trois conformations possibles P, Q et R, pour la molécule (1)
à l'aide des modèles
"Dreiding", (fig. IV.2). Pour la bande peu
intense (À> 300 nm) la conformation P présente un effet Cotton négatif
qui s'inverse lorsqu'on passe en Q. Ceci est en accord avec la règle
d'.hélicité et d'autres exemples [71] [67] rencontrés dans la littérature.
Quant à la bande d'absorption intense située vers 230 nm, l'effet Cotton
est respectivement positif et négatif pour P et Q, ce qU1 est vérifié
par la règle de l'octant. La conformation R où le cycle B est rendu
croisé (non alternance des signes des angles dièdres) par la substitu-
tion d'un méthyle en 6 S [72] [60] [67] donne un effet Cotton de même
signe que la conformation Q. La figure 111.2 montre rapidement l'analogie
de conformation entre le produit (1) et P.
: Tous ces résultats suggèrent que la structure de la DOC (1)
est conservée jusqu'à l'obtention du composé (V) dont la conformation
reste à préciser par des mesures complémentaires en R M N du proton.

---

- 57 -
CHAPITRE V
ETUDE DU SPECTRE R M N PROTON
DE LA DESOXYCORTICOSTERONE (D 0 C)

---

- 58 -
Il est important de signaler au lecteur que compte tenu
des difficultés de disposer en permanence d'un appareil RMN haute réso-
lution équipé d'ordinateur performant, nous n'avons pas suivi à la
lettre la stratégie d'attribution des stéroides préconisée par HALL et
SANDERS traitée au chapitre II. Néanmoins nous avons surmonté ce pro-
blème en rassemblant le plus de données possibles.

---

- 59 -
V,l - DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES CONCERNANT DES MOLECULES
DE STRUCTURE VOISINE,
Avant de présenter les résultats que nous avons obtenus et
leur interprétation, nous récapitulons dans le tableau V.1 les données
bibliographiques concernant des molécules voisines dont les structures
sont illustrées par la figure V.1. :
- la 1-déhydrotestotérone (}G~) et la 11 B-hydroxyprogestérone (XXI)
étudiées par HALL et SANDERS [36J [35J.
- la médroxyprogestérone acétate (XXII) dont le spectre a été attribué
par BARRET et al [67J.
- la progestérone deutérée en 15 ex et/ou 15 B (XXIII) étudiée par
NJAR et al [73J.
V,2 - RESULTATS
Le. tab leau V. 2 présente les dép lacements chimiques de la DOC
dans le deutérochloroforme (CDC1 ) et dans le mélange deutérochloroforme-
3
diméthylsulfoxyde
(DMSO). Les attributions ont été faites à partir d'une
série d'enregistrements de spectres à 350 MHz, RMN 2D SECSY à 250 MHz,
2D (J - 0) à 250 MHz, enfin enregistrements d'effets NOE à 400 Mz.
V.2.1 - R MN
1H
A UNE DIMENSION
On reconnaît aisément sur la figure V.2 les pics des
méthyles 18 et 19 respectivement à 0,66 ppm et 1,20 ppm dans le mélange
CDC1 -DMSO ; 0,70 et 1,20 ppm [24J [26J dans le CDC1
pur. Vers les
3
3
champs faibles à 5,67 [26J [27J résonne le proton éthylénique H .
4
Entre 4 et 4,50 ppm apparaît une structure de type AB due au méthylène
en position 21. Cet effet du second ordre résulte d'une hyperconjugai-
son [74J [75J [76J du méthylène avec le système 11 du carbonyle donc
d'une orientation symétrique de ce groupement [77J par rapport au plan
nodal TI. La valeur relativement élevée du couplage scalaire J
de
AB
l'ordre de 18 H
est en faveur de cette conformation, illustrée par la
z

---

- 60 -
figure V.3 dans laquelle les deux hydrogènes sont situés d'un même côté
par rapport à la liaison C - C.
A
1
):::::= 0
H
-1-1 ~
_
B
~~ (ifC_--O~
Fig. V.3 - Conformation de la chaîne latérale de la DOC. La projection
de Newman en C20 (A) illustre bien l'hyperconjugaison des
protons méthyleniques avec le système rr du carbonyle en (B).
Mises à part ces attributions, le spectre présente des mul-
tiplets du second ordre, mal résolus entre
et 2,50 ppm. En soustrayant
les protons que nous venons d'attribuer et l'hydroxyle en 21, on constate
que vingt protons sur les trente que possède la DOC (C
H
0 )
réson-
21
30
3
nent entre 1 et 2,50 ppm.
L'étalement du spectre sur une grande échelle et les inté-
grales ont permis de le décomp.oser en trois principales zones
- une zone située entre 0,66 et 1,20 ppm du TMS
qui comprend les pics
des méthyles angulaires et ceux de trois protons cycliques ; soit neuf
protons dans cette plage de déplacements chimiques d'après l'intégra~
tion. En nous référant au tableau V.l nous pouvons constater que H7a
Hg
et H
résonnent dans cet intervalle.
14

---

- 61 -
Me
011
\\\\
Il
déhydrotestostérone (XXVI)
Medroxyprogestérone Acétate (XXVII)
Ac.
Ac.
0---.....--
II B hydroxyprogestérone (XXIV)
D
D
I5
Q
progestérone (XXVIII)
CI. ,
15 IJ
o
DOC (1)
Fig. V.1 - Molécules de structure semblable de la DOC rencontrée dans
littérature [35] [36J [67J [73J .
A
= CH - C
C
3
1\\
a
D
M
= CH
e
3

---

TABLEAU V. 1
~
-
PROTON DU CYCLE
PROTONS-DU CYCLE B
PROTONS DU CYCLE C
PROTONS DU CYCLE D
C 0-t ~I:
,.o~ rC \\J' "
~ 0tl <. ,.0
"~ ~/ (' ~-P 1
1
6
6
17
r,h .lJ>
a.
13
2a.
213
,U
13
la.
7
8
9
Ua.
lIe
12a.
12
13
13 14
15'a.
15 13 16a. 16 13
J'('J' -
DEUX DOUBLES
l
DUT
LIAISONS AU
2 36
2 47
95
OH ENTRAINE DES VARIATIONS
1
1
LOI L96 L67 L04 Ln L68 L09 L87 01
NIVEAU DE CE
DES DEPLACEMENTS CHIMIQUES
IX
CYCLE
L'HYDROXYLE EN lIa INFLUE SUR
(J'\\
2 11 IH~ L84 2 18
LE DEPLACEMENT CHIMIQUE DES
L691~
N
1
2 35 2 47 2 23 2 43
2 43
1
1
1
1
L06 2
L11 1'7511,}}
17
1
X
PROTONS DU CYCLE
3 11PA
1,70 2 03
1
2 35 2 43
METHYLE EN 6a. MODIFIE LES LOI L67 L42 L95 L56
1
1
XI
DEPLACEMENTS CHIMIQUES
DE CE CYCLE.
-
NON
PROGESTERO~E
NON ATTRIBUE
1.,70 1 23
NON
ATTRIBUE
1
L5a.,13 2112
XH
---~----

---

- 63 -
Tableau V.2
Déplacements des protons de DOC à 1 % près dans le CDC1
et le mélange
3
de solvant CDC1
- DMSO.
3
Déplacements chimiques ppm
Déplacements chimiques ppm
PROTONS
PROTONS
SOLVANTS
SOLVANTS
CDC1
CDC1
-DHSO
-DMSO
3
3
CDCI,3
CDC1 3
H
1,72
(1,67)a
H
(1,60)a
1 ,58
1 a
12a
H
2,03
2,03
H
1,43
1,43
16
116
H
(2,27)
(2,27)a
H
(1,62)a
2a
1,58
12a
H
2,40
2,36
H
1,92
1,92
26
126
H
5,72
5,67
H
(1,19)
1, 19
4
14
H
2,29
2,29
H
1~ 77
(1,73)a
6a
15a
H
2,40
2,.39
H
1,33
1,30
66
156
,
H
1,06
1,06
H
1,69
1,30
7a
16a
H
1,86
1,86
H
2,20
2,16
7B
166
H
1,58
1,58
H
2,46
2,51
8
17
H
0,98
0,98
(CH3)18
0,70
0,66
9
(CH2)21
HA = 4,16
HA = 4, 12
(CH3) 19
1, 19
1,20
RB = 4,20
li"
= 4, 16
E
a: les valeurs entre parenthèses ont été estimées à + 0,02 ppm car la distinction
des déplacements chimiques respectifs tombe
-dans la limite de précision
des attributions, à cause des effets de second ordre et/ou des superpositions
des bandes de résonance.

---

(CH3)19
(CII )21
2
il9
H7a
f
J.
l
,
,
1
. ;1
(C1I
I~
1
3 18
JJ~\\_
",4
-
•.-----... 1...
.
,
. ...
..
--
~
o
cr-
0
0
lI\\
lI\\
lI\\
lI\\
0 : " ' "
\\0
N -
- . .
~
...
.
N
V'\\
V'l
ti'\\
~
• .;I
""
""
",Sa
Il '6a
H
II~,If': •
H
, 17.
na
J1/'1\\ b(( 2a
Il
~JVlMl! ~ IlrIO, '~16 "6
_ ..--J
-
i
1
l
l
i
i
-'
1
~
r
~
2.2
2.0
l.8
1.6
l . '
1.2
1.0
.8
.8
!)PIlI
Fig. V.2 - Spectre de la DOC enregistré à 400 MHz dans le CDC1)

---

- 65 -
- une bande de multiplets situés entre 1,20 et 2 ppm
dont l'intégration
révèle dix protons. A l'aide du tableau V.l nous situons dans cette
partie du spectre les bandes de résonance des protons suivants :
H8 ' H15o. ' H15B ' H16o. ' H11o. ' H11B ' H12o. ' H12B ' H1o. et H7B •
- une bande de multiplets entre 2,00 et 3,_QO ppm. Si l'on déduit le pic du
DMSO qui résonne vers 2,61 ppm, l'intégration fait apparaître sept
protons en accord avec le tableau V.1. qui situe les bandes de résonance
des protons H
' H
' H
' H
'
H
'
H
et H
dans cette par-
17
16B
6B
6o.
2B
2o.
1B
tie du spectre.
- Spectre partiellement relaxé
L'enregistrement du spectre partiellement relaxé [78J [35J [36J
après une impulsion non sélective de 180 0 suivie d'un temps d'attente
T = 0,35 s
a permis de faire l'attribution des protons H
, H
et H
•
17
7o.
9
Sur ce spectre (figure V.4), il apparaît que les protons qui résonnent
à 2,51 ppm et Op98 ppm ne sont pas encore relaxés contrairement aux autres
protons du squelette stéroîde. Il est aisé d'attribuer la bande de
résonance à 2,51 ppm au seul proton méthinique pouvant résonner à bas
champ : H
• Le multiplet 0,98 ppm peu résolu et incomplètement relaxé
17
à T = 0,35 s a été attribué à H
à cause de la structure de triplets
9
de doublets [36J bien reconnaissable sur le spectre normal à 400 MHz.
A 1,06 ppm résonne un proton vraisemblablement méthylénique car il apparaît
relaxé à T = 0,35 s. Nous l'attribuons à H
compte tenu des résultats
7o.
antérieurs
[35J de HALL et SANDERS.
V.2.2 - R M N BIDIMENSIONNELLE.
La faible résolution de nos spectres partiellement
relaxés à T = 0,35 s ne nous a pas permis d'observer à 2,51 ppm la
3
structure du triplet du proton H
résultant des couplages
J17-16B
17
et 3J
de l'ordre de 8R
, bien identifiée fort heureusement sur
17-160.
z
le spectre 2D J
(figure V.5). Deux taches de corrélation nettes sont
mises en évidence sur le spectre SECSY (figure V.6) entre 2,51 ppm et
la résonance des protons situés à 2,16 et 1,69 ppm, attribué~ respec-
tivement à H
et H
à l'aide des données du paragraphe V.l.
168
16o.

---

- 66 -
d
DM S0"-i
c
=
N
N
N
N
Fig. V.~ - Spectres partiellement relaxés de la DOC enregistrés
à 350 ~rnz dans le mélange CnC1 -mlS0.
3
a
spectre normal entre 2,49-2,89 ppm.
b
spectre partiellement relaxé de la même reg~on enregistré
à 0,35 s après une impulsion non sélective de 180°.
c
spectre normal entre 0,59 - 1,09 ppm.
d
spectre partiellement relaxé du même intervalle spectral
enregistré à 0,35 s après une impulsion non sélective de 180°.

---

H7{j
•
H
H
1a
6J3
..
•
HW
• ..
"'..
\\
cr-
-...J
o
H1713
H
C,C H -OH
Za
.~
zi
Fi~. v-5 _ Hultinlet< des protons les nlus résolus sur le spectre 2D - J de la DDC
dans
ef fectuée
le mélan~e
à 250
de
HHz
solvant CnCl} - D~1S0 .
• artefactes _ raies supplémentaires [46J [47J dues aux effets du second ordre.

---

- 68 -
ppm
r------.----------~J.
illI!
, 6
2,36
2,21
.•
2,07
1,93
1,79
1,65
1,51
1,36
./
1,22
o'
C!!),
,
........
1,08
"
.'
"
.•1''-
0,94
,..
,
.'
...'
0,80
0,66
6;:6\\"
0"
Fig. V.6 - Spectre partiel SECSY (spin echo correlated
spectroscopy) de la DOC e~registré à 250 MHz dans le
mélange CDC1 -DMSO.
3

---

- 69 -
Les couplagestgéminal~et vicinaux de la paire H
doivent
16
théoriquement faire ressortir les corrélations suivantes
H
(2
17
t 51 ppm)
H
(l
~------H16B(2t16 ppm)
16a
t 72 ppm) est corrélé
H15a
H15B
H
(2
17
t 51 ppm)
H
(2 t 16 ppm) est corrélé~
~ H
(1,72 ppm)
16B
16a
H15a
H 15B
Outre les corrélations avec le proton H
t on n'observe
17
en fait que deux taches de corrélation nettes.
H
(1,30 ppm)
15B
En nous référant aux travaux de NJAR et al [73J nous avons
attribué les déplacements chimiques 1t 30 ppm et 1t 7l ppm respectivement
à H
et H
. En effet si l'on admet que H
et H
résonnent
158
15a
15a
16a
pratiquement au même endroit t la corrélation entre H
et H
ne peut
15a
16a
être discernée sur le spectre SECSY vue la proximité de leur déplacement
chimique. Il est alors logique de penser que les corrélations H
- H
15a
168
et H
- H
se trouvent confondues. Cette hypothèse est confirmée
16a
168

---

- 70 -
par les corrélations entre le proton H
qui résonne à 1,19 ppm et la
14
paire H
; les couplages 3
' 3J14_15a ' 3J14_158
étant matérialisées
15
J14 _S
par les corrélations suivantes :
~1,30 ppm (H 158)
H
(1,19 ppm) corrélé
ppm (H
)
14
à - - - - - - : 1,73
15a
1,5S ppm (H )
S
Il est important de remarquer par ailleurs que la bande de résonance de
H
tombe pratiquement dans le pied de la raie du méthyle 19.
14
Ainsi à l'aide des spectres 2D (J - 0) et SECSY nous avons attribué
de proche en proche les protons du cycle D, à partir de H
jusqu'au proton
17
H
• Mais à ce niveau la 2D ne permet plus d'autres attributions sans ambi-
S
guité car les déplacements chimiques sont encore trop faibles même à
400 MHz. Il faut alors faire appel à des différences de spectres (découplage
différentiel ou effets NOE différentiels).
V.2.3 - SPECTRES D'EFFETS NOE DIFFERENT 1ELS.
Cette expérimentation est la clé de l'attribution de
la DOC, car elle permet d'écarter toute ambiguité sur les déplacements
chimiques. Les expériences ont été réalisées dans le deutérochloroforme
afin de comparer nos résultats avec ceux de HALL et SANDERS [35J [36J.
Les premiers spectres d'effets NOE différentiels ont été obtenus par irra-
diation des protons les plus accessibles : H ,
les méthyles lS et 19, les
4
résultats figurent au tableau V.3.
IRRADIATION DU PROTON H
.-
4
La seule amélioration visible après saturation du
proton éthylénique est un signal situé à 2,29 ppm attribué [35J [36J au
proton H
•
6a

---

- 71 -
Tableau V.3
Irradiations
Déplacement chimique ppm (2 %'
Attributions respectives
près) des raies d'intensité non
des déplacements
des protons
nulle sur les spectres d'e~fetNOE
différentiel effectués dans le
CDC1 3
H
2,29
H
4
6a
.
(CH
, H
; H
3)18
1,58 ; 1,43 ; 1,92
H8
l18
128
.
2,20 , 1,33
H
; H
l18
168
.
,
.
(CH
1,43
H
, (H
+ H
) ; H
;
3)19
1,58 ; 2,40 ; 1,33
8
68
28
158
H11
1,77 ; 0,98 ; 2,03
H
; H
; H
158
9
18
.,
.
,
.
H
1,92 ; 1,41
1,33 ; 1,86
H
H
; H
, H
8
128
l18
158
78
.
,
.
2,03 ; 0,98 ; 2,40 : 2,20
H
; H
H
, H
18
9
68
168
.
1,06 . ; 1,20
H
, H
7a
12
.
,
.
H
1,06 ; 1,72 ; 1,86
2,03
H
, H
6
9
; H'(a ; H78
18
2,45
(H
+ H
)
68
28
(H
)
2

---

- 72 -
IRRADIATION DU METHYLE 18
Seuls les protons H
et H
présentent simultanément des
8
118
effets NOE quand les deux méthyles angulaires sont irradiés séparément.
La position du H
se trouve ainsi confirmée à 1.58 ppm et H
placé
8
118
sans ambiguité à 1.43 ppm. L'irradiation du méthyle 18 bien isolé sur
le spectre nous donne la confirmation des déplacements chimiques des
protons H
• H
et situe celui du proton H
à 1,92 ppm. Le
168
158
128
proton H
a été localisé à 2.16 ppm sur les spectres 2D SECSY dans
168
le mélange CDCl
- DMSO et à 2.20 ppm sur le spectre NOE différentiel
3
dans le CDCl
pur. Nous constatons que l'effet du DMSO est très marqué
3
sur ce proton et également sur H
•
17
IRRADIATION DU METHYLE 19.
Comme nous l'avons signalé plus haut. le pied de la ra1e du
méthyle 19 se trouve confondu avec la bande de résonance de H
de sorte
14
que l'irradiation à 1.19 ppm doit toucher des protons situés dans des
zones très différentes du squelette stéroide
des modifications
apparaissent vers les champs faibles où résonnent ~es protons
proches du méthyle 19. et également vers les champs forts où résonnent
les protons voisins de H
• ce qui nous confirme les positions des pro-
14
tons H
• H • H
et H
• Cette expérience nous a permis de consta-
'58
9
17
15a
ter que H
et H
résonnent pratiquement au même endroit (1.70 -
15a
16a
1.73 ppm) dans le mélange de solvants CDCl
-DMSO alors qu'ils sont
3
bien séparés dans le CDCl
pur.
3
La comparaison des effets NOE dûs à l'irradiation de H
et
8
de ceux résultant de la saturation du méthyle 19 permet d'attribuer la
bande de résonance à 2.39 ppm au proton H
situé sensiblement à égale
68
distance de ce méthyle angulaire et de Ha'
Par ailleurs le spectre 2DJ
(fig. V.5) présente un multiplet à 2.36 ppm dont la structure est iden-
tique à celle du multiplet attribué par BARRET et al [67J à H
• Par
28
conséquent l'effet NOE enregistré vers 2.40 ppm après l'irradiation du
méthyle 19 correspond à la fois aux résonances de H
et H
. L'effet
6B
28
NOE apparaissant à 2.03 ppm est attribué au proton H'I8 en accord avec
les résultats [67J de BARRET et al.

---

- 73 -
IRRADIATION DU PROTON Ha
La saturation de H
est particulièrement intéressante car c'est
S
le seul proton situé à la fois au-dessus du plan moyen de la molécule
(face S) et à la jonction des cycles B et C. Ce proton constitue comme
les méthyles angulaires une "sonde" permettant d'explorer la "face S"
de la molécule. Il présente quatre couplages vicinaux avec H
' H
'
7a
7S
H et H
• De plus il est en relation 1-3 diaxiale avec les méthyles
9
14
et les protons H
,H
S et H
. Or tous ces protons mis à part H
6S
11
15S
7S
viennent d'être attribués, on peut par déduction penser que l'effet NOE
observé
à 1,S6 ppm après l'irradiation de H ' correspond au déplacement
S
chimique du proton H
• Ceci reste à confirmer par l'irradiation du
7S
proton H
•
6a
Par ailleurs quand on irradie Ha on voit d'autres effets NOE
se manifester à 2,03 ppm et 1,92 ppm correspondant respectivement à
H
et H
• En regardant les modèles (Dreideing stereomodels) on
1B
12S
constate que H
est spatialement proche de H
et de H
ce qui
11a
1S
12S
conduit à dire que H
résonne pratiquement à la même fréquence que H .
11a
S
3
3
Un retour au spectre 2D SECSY montre que les couplages
J
-
'
J11S-12S
11S 9
2J
sont matérialisés par les taches de corrélation suivantes :
11S -11a
(0,9S ppm)
H
(1,43 ppm) corrélé
(1,92 ppm)
11S
(1,60 ppm)
Mais on n'observe pas de tache de corrélation mettant en évidence le
3
. 1
. 1
.
.
couplage
J11S-î2a
pourtant grand car de type ax~a -ax~a . Ma~s s~
l'on regarde minutieusement la corrélation entre 0 = 1,40 ppm et
o = 1,5S ppm, on remarque qu'en fait, il y a deux types de taches inclu-
ses dans une grande donnant les corrélatiohs suivantes :
1,60 ppm
1,43 ppm (H
) corrélé
11S
1,5S ppm

---

- 74 -
Tous ces éléments nous amènent à faire l'hypothèse que Ha'
H
et H
lla
12a
résonnent dans l'intervalle de déplacement chimique compris entre
1,50 ppm et 1,65 ppm ; hypothèse corroborée par la double irradiation
sélective de H
et H
. En effet la double irradiation à 1,92 ppm
12B
llB
(H
) entraîne des modifications de structure importantes à 1,60 ppm,
12B
2
dues probablement à la suppression du couplage
J12a-12B de l'ordre [36J
de 12Hz • Le même type d'expérience sur H
(1,40 ppm) modifie de façon
llB
significative la bande située à 1,60 ppm à cause des couplages 2JllB-lla
3
et
JllB-12a
' tous deux égaux [67J à 13,5 Hz.
IRRADIATION DU PROTON H6a
Cette expérience confirme les déplacements chimiques du proton
H
à 1,86 ppm, H
à 2,39 ppm et H
à 1,06 ppm. Par ailleurs nous avons
7B
6B
7a
noté d'autres effets Overhauser nucléaires à 2,03 ppm
déjà attribués
à H
et à 1,72 ppm ; le seul proton pouvant résonner dans la même région
1B
que H
et donner un effet NOE sur H
est H
c'est pourquoi le déplace-
6a
1B
2a
ment chimique de 1,72 ppm est attribué à H
,
Cependant la structure des
la
triplets de doublets[67J caractéristique de H
a été observée à 1,68 ppm
la
sur les spectres 2D (J-8) réalisés dans le mélange de solvant CDCI -DMSO.
3
Le DMSO a donc effet de blindage marqué sur le proton H
•
la
1
Cette étude de la DOC par RMN
H ne saurait être complète
sans une analyse de la conformation de la molécule.
V.3 - ETUDE DE LA CONFORMATION DE LA DOC PAR RMN I H.
L'identification des conformations P, Q et R (fig. IV.2) peut
être faite en RM N par la mesure des constantes de couplage (J) ou par
des expériences d'effets NOE différentiels. L'accès aux constantes de
couplage étant très difficile vu
la complexité du spectre, c'est la
deuxième méthode que nous avons retenue pour l'étude de la conformation
de la DOC.
Le groupement méthyle 19 et le proton H constituent une vérita-
8
ble sonde pour l'identification des conformères P, Q et R. Le tableau
V.4 présente les protons susceptibles de donner un effet NOE quand H '
8
(CH3)19 et H sont irradiés séparément. La distinction essentielle
4

---

- 75 -
Tableau V.4
Irradiation
Ha
(CH3)19
H4
Conformères
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Protons des cycles A et B
ayant des
1
1
1
relations 1,3 diaxiales avec les protons
1
1
,
irradiés
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
H
, H
H
,H
H
7B
6B
H1B '
ZB
ZB
6a
P
(CH3) 19
Ha
H
, H
7B
6B
H1B ' H6B ' Ha
H6a
Q
.
(CH3) 19
R
H7B
H1B ' HZB ' Ha
H6B
!

---

- 76 -
entre ces conformères repose sur les protons H
H
et H
• Le méthyle
6B
28
6a
19 se trouve éloigné des protons H
dans le conformère Q et de H
28
68
dans le conformère R. Ces protons ne verront donc pas leur intensité
augmenter quand on irradie le méthyle 19. Par ailleurs l'irradiation
de H
augmente l'intensité de la bande de résonance de H
dans P et Q
4
6a
tandis que dans le conformère R c'est celle du proton H
qui est
68
augmentée.
Nos mesures faites à 400 MHz sur le DO C révèlent une augmen-
tation de l'intensité de H
après saturation de H
tandis que les pro-
6a
4
tons H
et H
donnent des effets NOE sensiblement identiques après
68
28
l'irradiation du méthyle 19 ce qui dé~ontre bien que la DO C est dans
la conformation de type normal (p) avec le cycle A demi-chaise et le
cycle B chaise, en accord avec les résultats obtenus en dichroimétrie.

---

- 77 -
CHAPITRE VI
ETUDE DES CONFORMATIONS RELATIVES DES COMPOSES
7 MERCAPTOPROPIONIQUE DOC (V) ET DOC 7-BSA (VI)

---

H11B
H
H
B
611 6B •
-S-eH -Cil;!
~~ H
Ha
H12a
H9
2
17
Il
Il
H
H
1176
128
lIa
14
__)tJ ~W.';,}\\J'\\)~/rti *'Jltt_"....._..l
r---'-- .---.,------------,.----.-,--- -,- ------~.---...---~---~--,.
" - -
2,a
2,6
2,4
2,2
2.0
1.8
1,6
1.4
1,2
1,0
o,a
0,6
-...J
ppD1
co
H
H
1Sll
611
H1611
Rn
1H211
"
~1l"8 lla
H
j\\
Il
A
9
1
li
11.
. l " f./\\
l"156 "711 11
-
"
JL_ __
.
{'~\\ bv1u~ ~lll~IJAl}lJJ~JiViUL
.- '
.~-----.----~
----.---- ',..---"- -_., ----···I-·---y~---,---..---""1--_,__-,-
,
i
•
1
,-----.,
~ '
i
,
•
6.0
s.o
4.U
:i.ll
2.U
1.0
f'PII
Fig. V.l - Spectres de la DOC (A) et de la 7 mercaptopropionique DOC (B) enregistrés à 400 ~ffiz
dans le mélange de solvants CDCl -DMSO.
3
* impuretés.

---

- 79 -
VI.I - ANALYSE STRUCTURALE ET CONFORMATIONNELLE PAR RMN
HAUT CHAMP DE LA 7 MERCAPTOPROPIONIQUE DOC (V).
Vl.1.1 -ETUDE COMPARATIVE DES SPECTRES DES COMPOSES
(1) ET (V).
La comparaison des spectres des composés (1) et (V),
(figvre VI.l) fait apparaître les observations suivantes:
(l)--Les bandes de résonance des protons H
et H
situés entre les pics
7a
9
des méthyles angulaires à champ fort sur le spectre de la DOC ne ressor-
tent plus dans cette zone sur le spectre du composé (V) : elles ont été
déplacées manifestement vers les champs faibles.
(2)- Sur le spectre du dérivé (V) les raies du proton H
ne sont plus
14
confondues avec le pic du méthyle 19 : c~ proton résonnerait vraisembla-
blement à champ bas dans la DOC 7 mercaptopropionique.
(3)-Des modifications de structure nettes sont observées dans les inter-
valles de déplacement chimique: 1,20-1,40 ppm ; 1,80-2,00 ppm ;
2,15-2,20 ppm.
(4)- Les structures et les déplacements chimiques de protons H
et H
1B
11B
sont identiques sur les deux spectres.
Les remarques (1) et (2) suggèrent une modification
dans l'environnement électronique des protons H
et Hg dans le composé
14
(V). Sur les modèles mo12culaires, on constate que seuls lés change-
ments électroniques au niveau des positions axiales 12, 8 et 7 sont
capables de déblinder simultanément H
et Hg. Cependant la remarque (4)
14
nous démontre qu'il n'y a pas de modification électronique en C
puisque
12
le déplacement chimique du proton H
est identique sur les deux spec-
11B
tres. Ces observations nous amènent à dire en première approximation que
le groupement acide mercaptopropionique est fixé sur la DOC en position
7a axiale. La conformation du composé (V) serait la même que celle du
produit initial (1) puisque l'on retrouve au niveau du cycle A les struc-
tures du proton H
identiques sur les deux spectres.
1B

---

- 80 -
Pour confirmer ces hypothèses nous avons effectué des
mesures d'effets NOE différentiels.
V.l.2 -
EFFETS NOE DIFFERENTIELS.
Irradiation H
: L'irradiation du proton éthylénique H crée un effet NOE
4
4
à 2,58 ppm (tableau VI.l) que nous attribuons
à H
. Il est aisé de cons-
6a
tater que le déplacement chimique de H
passe de 2,29 ppm dans la DOC
6
à 2,58 ppm dans le dérivé acide (V). Ce déplacement important est en
faveur de la position 7a (axiale) du groupement mercaptopropionique
(-S-CH -CH
-COOR). Cependant pour écarter toute ambiguité il est indis-
2
2
pensable de préciser les fréquences de résonance des protons voisins de
la position 7a c'est-à-dire H
' H
et H
•
8
7B
6B
L'Irradiation du méthyle 18
nous a permis d'observer comme attendu que
les déplacements chimiques des protons H
,
H
, H
et H
11B
15B
126
16B
(tableau VI.l) sont identiques à ceux de la DOC. Mais il faut signaler
qu'à la fréquence de résonance du proton H
(1,92 ppm) nous avons
12B
obtenu un effet NOE deux fois plus intense que les autres (figure. VI.2).
De plus l'allure du multiplet vers 1,92 ppm semble montrer la superposi-
tion d'une autre résonance avec celle de H
• Nous en déduisons que les
12B
effets NOE créés par l'irradiation du méthyle 18 sur les protons H
et
8
H
apparaissent dans la même zone de déplacement chimique. Ce qui
12B
explique les modifications structurales dans cette partie du spectre du
composé (V), que nous avons signalé plus haut.
Irradiation du méthyle 19 : la saturation de ce méthyle donne un effet
NOE à 1,88 ppm (figure VI. 2) ,dont l'intensité est' pratiquement la moitié
de celui créé par l'irradiation du méthyle 18 dans cette région. Ce qui
nous autorise à attribuer avec certitude le déplacement chimique de
1,88 ppm à H . Ceci est également un argument favorable à la position
8
7a axiale du groupement mercaptopropionique puisque le proton H
passe
8
de 1,58 ppm dans la DOC à 1,88 ppm dans le dérivé (V').
Les effets NOE à 2,03 et 2,36 ppm révèlent que les dépla-
cements chimiques respectifs des protons H
et H
sont inchangés. Ce
1B
2B
qui montre bien que le cycle A a la même conformation dans les composés

---

Protons irradiés
Déplacement chimique en ppm (2 % près)
Attributions respectives des
des raies d'intensité non nulle sur les
protons
spectres d'effet NOE.
H
2,58 : 2,75
4
H6a. ' méthylène du. gr~upe
mercaptoprop10n1que.
Méthyle 18
1,33 ; 1,43 ; 1,92
H1513 ; H11 13 ; (H
+ H
)
8
1213
2,16
H
(Xl
1613
Méthyle 19
1,88 ; 2,03 ; 2,36 ; 2,52 ; 1,43
H
; H
; H
; H
; H
8
l13
213
613
11B
H
.
, 1,66
9
1,60 ; 1,36
(H 12 a. + H11 a.) H14 ' Hl a.
H
; méthylène du groupe mer-
6a.
2, 16 ; 2,75
H713
captopropionique
H
2,35
H
613
213
H
1,36 ; l,GO; 1,71
17
H14 ; H12a. ; H16a.
Tableau VI. 1

---

-
82 -
B
o
I\\jl
~JI '1
A
~~Iil
jJkj~\\~AvhvJI~U'
c
. ~~
1
i
1
, .
1
i
t
1
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
2.0
1.0
PP"
j;"
_ 19.
VI.2 - Spectres d'effets ~OE diffé~entiels de la 7a mercaptopropionique DI
A
spectre normal entre 1 - 2 ppm.
B
spectre
d'effet XOE diff~rentiel
3pr~s irradiation du
rn~thyle 18. Entre 1,80 et :2 pppm on constate un effet NOE
d'intensit~ double dG à superposition des bandes de résonance
H.., et H'')(l.
-
I_P
C
~pectre normal entre 1 - 2 ppm.
D
Spectre différentiel d'effet ~OE
apr~s irradiation du
méthyle 19. A 1,88 ppm apparaît la seule résonance de H8
car H
est très éloigné du méthyle 19.
12B

---

- 83 -
(1) et (V). Nous avons signalé lors de l'analyse de la DOC une superpo-
sition des bandes de résonance des protons H
et H
. Sur le spectre
6S
2S
de la DOC mercaptopropionique (V) les structures de H
apparaissant
2S
mieux résolues, tendent à prouver que H
résonnerait à champ plus
6S
faible que dans la DOC. Cette observation est corroborée par l'effet
NOE créé par l'irradiation du méthyle 19 à 2,52 ppm attribué à H6S
Ce proton résonne pratiquement à la même fréquence queH
dont
17
l'environnement n'a pas été affecté par la fixation du chaînon mercap-
topropionique en 7a.
Irradiation du proton H
: Connaissant le déplacement chimique de H
6a
6a
nous l'avons irradié afin de déterminer celui de H
• Nous avons obtenu
7S
un effet NOE à 2,16 ppm, soit à la même fréquence de résonance que le
proton
H
qui est très éloigné du proton irradié. Nous en concluons
16S
que les bandes de résonance des protons H
et H
se superposent à
7S
16S
2,16 ppm. Ce qui explique d'ailleurs les modifications de structure
dans l'intervalle 2,15 -2,20 ppm précédemment signalées au paragraphe
VI.1.1. Par ailleurs l'irradiation du proton H
affecte un peu les
6a
protons voisins H
et H
' entra~nant des effets NOE à 1,38 ppm,
17
6S
1,60 ppm, 1,71 ppm, 2,35 ppm attribués respectivement à H
' H
,
14
12a
(H
+ H
) et H
•
15a
16a
2S
ATTRIBUTION DES PROTONS METHYLENIQUES DU GROUPEMENT MERCAPTOPROPIONIQUE.
L'enregistrement du spectre de l'acide S mercaptopropionique
(H-S-cH -cH -cOOH) à 80 MHz dans le mélange de solvant CDC1 -DMSO nous
2
2
3
a permis de constater que les méthylènes résonnent pratiquement à la
même fréquence, leur déplacement chimique est de 2,75 ppm. Sur le
tableau
VI.1 on remarque que les irradiations des protons H
et H
4
6a
créent des effets NOE, à 2,75 ppm dûs vraisemblablement à l'existence
d'une liaison hydrogène entre le carbonyle du cycle A et le groupement
carboxylique de l'acide mercaptopropionique, rapprochant par conséquent
les méthylènes des protons H
et H
(figure VI.3). Ceci expliquerait
4
6a
pourquoi l'irraùiation du méthyle 19 affecte également les bandes de
résonance situées à 2,75 ppm. En effet une des explications possibles
serait que la saturation de ce méthyle touche aussi le proton H9
(OR
~ 1,25 ppm)et ainsi modifie les résonances des méthylènes du
9

---

- 84 -
Fig. VI.3 - Structure et conformation de la 7
mercaptopropionique
désoxycorticostérone (V) d'après de les modèles
"Dreiding".
•
atomes de carbone
o atomes d'oxygène
•
atome de soufre

---

- 85 -
chaînon mercaptopropionique en position priviligiée par cette liaison
hydrogène.
L'ensemble de toutes ces données donne des informations sur
l'évolution de la structure et de la conformation de la DOC lorsqu'on
atteint au cours de la synthèse l'obtention du dérivé (V) :
- La structure moléculaire de la DOC (1) est conservée puisque l'on
retrouve tous les groupements fonctionnels qui lui sont caractéristiques
dans la 7a mercaptopropionique DOC (V).
- La conformation du produit (V) est identique à celle de la DOC car les
irradiations du méthyle 19 et du proton H mettent en évidence les mêmes
4
protons dans les deux composés.
Mais
afin de préciser les conformations relatives des composés 7a
mercaptopropionique DOC (V) et DOC 7-B8A (VI), nous avons complété ces
résultats par des mesures de dichroisme circulaire.
VI.2 - ANALYSE CONFORMATIONNELLE PAR DICHROïsME CIRCULAIRE
DES COMPOSES 7a MERCAPTOPROPIONIQUE DOC (V) ET
DOC 7-BSA.
L'étude dichroique comparative (tableau VL2) d~ ~a DOC (1), de la
progestérone (IX),de la 66 hydroxyprogestérone, et de la J
mercaptopro-
pionique désoxycorticostérone
(V)
révèle que le signe et la position
des bandes de transition relatives aux chromophores A et D (tableau IV.3)
sont identiques pour ces composés.Par contre, les amplitudes mesurées à
325 nm (n --) rr*) pour la 7a
mercaptopropionique DOC et la 66 hydroxy-
progestérone sont plus faibles, ce qui conduit à des valeurs dichroiques
normalisées réduites de moitié. Ces dernières, nous le rappelons sont
obtenues en divisant toutes les amplitudes des longueurs d'onde minimales
par celle du maximum principal. La substitution sur les positions 6 et 7
axiales, semble diminuer le gauchissement des cycles A et B par effet
de transmission conformationnelle [70}.entre ces mêmes cycles. Il est
intéressant de remarquer que la diminution du ~E
du dérivé (V) recoupe
n
les résultats obtenus en RMN sur la possibilité d'existence d'une liaison
hydrogène interne entre l'hydroxyle du groupement mercaptopropionique et

---

- 86 -
le carbonyle du cycle A. De même il semble bien admis que lorsque l'énone
n'est plus libre, l'intensité de sa transition caractéristique diminue.
Afin d'avoir une meilleure approche de la conformation des
cycles A et B lorsqu'on greffe la DOC sur la BSA en C
il est utile de
7
faire une comparaison entre les spectres dichroiques de la 7-BSA désoxy-
corticostérone (VI) et de ceux de la 11 BSA progestérone (IX-BSA) dont
les composés d'origine (1) et (IX) présentent une identité structurale
au niveau de ces cycles.
Les spectres de la BSA effectués dans différents solvants
et à différentes concentrations, ne présentent pas de transitions appré-
ciables dans le domaine de longueur d'onde considérée (250-400 nm).
Après greffage de la progestérone et de la désoxycorticostérone sur la
sérum albumine bovine, les nouveaux spectres ne mettent pas en évidence
la simple juxtaposition des bandes, mais au contraire, un effet d'inten-
sité, la position des transitions restant inchangée : ceci montre bien que
nous sorranes en présence d'une espèce "mixte" avec conservation ou non
de la structure, et c'est ce point que nous illustrerons à l'aide des
deux exemples suivants :
ETUDE COMPARATIVE DES CONJUGUES 11 BSA PROGESTERONE
ET 7 BSA DESOXYCORTICOSTERONE.
Sur le tableau VI.3, on retrouve dans le conjugué 11 BSA-proges-
térone les deux transitions correspondant aux chromophores D (20 oxo) et
A (énone) avec une valeur
dichroique normalisée (~E
= - 0,25) légèrement
n
inférieure à celle de la progestérone non greffée (~E
= - 0,29). La struc-
n
ture de la progestérone est donc conservée lorsque la fixation de l'hap-
tène au carrier (BSA) s'effectue en position 11. Par contre pour le dérivé
conjugué 7 BSA-DOC la transition correspondant à l'énone (chromophore A)
a disparu complètement et n'est plus détectable quelles que soient les
conditions expérimentales.
Les perturbations importantes des transitions de l'énone sont
liées à des modifications de son environnement, résultant vraisemblable-
ment de sa par.ticipation au greffage à la BSA après rupture de la liaison
carboxylique formée dans le dérivé intermédiaire (V).
En effet, s'il
n'y avait que la rupture de la liaison hydrogène'intramoléculaire
lors du couplage, nous retrouverions la bande négative (330 nm)
caractéristique de l'énone. Cette disparition totale confirme bien la

---

- 87 -
Tableau VI. 2
Transitions
n
>
TI: *
À
b.€
b.€
max
n
Composés
324 nm
- 1,27
- 0,28
DOC
(1)
286 nm
+ 4,4
+ 1
324 nm
- 0,49
- 0,13
DOC mercap-
topropionique
(VI)
286 nm
+ 3,7
+ 1
326 nm
- 1, 1
- 0,27
Progestérone
(IX)
286 nm
+ 4,1
+ 1
6a hydroxy-
326 nm
- 0,7
- 0, 15
progestérone
285 nm
+ 4,4
+ 1

---

- 88 -
Tableau VI.3
~~ n --> II*
Composés
Âmax . nm
~En
286
+ 1
DOC 7 mercapto-
propionique CV)
dans le méthanol
324
- 0,13
DOC 7 mercapto-
304
+ 1
propionique CV)
dans le dioxane
335
- 0,15
DOC 7 BSA dans
294
+ 1
du tampon phosphate
pH = 7,4
a
a
Progestérone
326
- 0,29
dans
:
1 partie dioxane
286
+ 1
2 parties eau
Progestérone 11 BSA
323
- 0,25
dans :
1 partie dioxane
285
+ 1
2 parties eau

---

- 89 -
présence de liaison hydrogène intermoléculaire DOC-BSA.
La désoxycorticostérone se trouve donc engagée avec la BSA par
deux liaisons
- une liaison peptidique - C - NH -
entre le carboxyle du groupe mercapto-
Il
o
propionique en position 7 et les résidus ~ aminés de la lysine,
une liaison hydrogène entre le
- C = 0
de l' énone avec soit les
hydrogènes provenant des groupes ~ aminés
H.... N -
de la lys ine soi t
avec les hydrogènes des liaisons
'd'
W'
C
N
C
pept~ ~ques
-
-
-
- CH
"
\\
H
0
De ce fait, l'ensemble de ces deux types de liaisons assure une
rigidité indispensable à l'obtention du conjugué DOC 7-BSA (VI). L'héli-
cité de l'énone étant liée à la conformation des cycles A et B, on com-
prend alors pourquoi les spectres dichroîques du composé (VI) sont diffé-
rents de ceux de la 11 BSA progestérone. En effet, celle-ci est couplée
à la BSA par l'intermédiaire du chaînon carboxyméthyl en 11 sur le cycle
C, n'ayant pas d'incidence sur la conformation de l'énone. Le couplage
entre l'haptène et le carrier par des liaisons situées au niveau des
cycles A et C semblent donc respecter la conformation du stéroîde.
A contràrio, la modification structurale observée après obtention du
conjugué DOC 7-BSA (VI), indique une diminution du gauchisss.ement des
cycles A et B encore plus importante que dans le cas du dérivé acide
7a mercaptopropionique DOC (V). Ces hypothèses sont d'ailleurs parfaite-
ment recoupées par les travaux de KURIYAMA et al.
[79J effectués sur une
série de dérivés 4 ène, 3, 20 dioxo prégnane substitués en 2 a, 2 B et
6 B.

---

- 91 -
CONCLUSION GENERALE
Dans le cadre du dosage radioimmunologique (RIA) d'une hormone
stéroidienne, l'interférence
d'autres molécules stéroides à toutes concen-
trations
oit être négligeable. Il est donc impératif de préparer un anti-
gène qui laisse en évidence toutes les caractéristiques tant conformation-
nelles que structurales de l'hormone stéroidienne. Aussi, l'analyse struc-
turale et conformationnelle de toutes les étapes de la synthèse de l'anti-
gène est un préalable indispensable à la caractérisation de la spécifici-
té antigénique. A
notre connaissance les seuls travaux [6] [17J effec-
tués dans cette optique ont été le suivi des principales étapes de la
synthèse par l'enregistrement des spectres RMN proton à 60 ou 80 MHz.
Les spectres des stéroïdes étant peu résolus à ces fréquences, ces tra-
vaux étaient essentiellement basés sur les variations des déplacements
chimiques des méthyles angulaires qui malheureusement ne permettent ni
de préciser sans ambiguité la position du couplage Haptène-earrier,
ni d'élucider les modifications conformationnelles éventuelles lors de
la synthèse. C'est pourquoi nous avons élaboré dans ce travail une méthode
de contrôle de la structure et de la conformation des stéroïdes lors de.
la synthèse de leur antigène. Cette méthode utilise conjointement la ~~
et le dichroïsme circulaire.
A partir d'une étude systématique des spectres dichroiques de
la DOC (1) et de ses dérivés intermédiaires, nous avons montré que le
dichroisme circulaire, du fait de sa sensibilité aux modifications struc-
turales et conformationnelles ainsi que de sa rapidité de la mise en
oeuvre, peut constituer une méthode fondamentale d'utilisation extrême-
ment aisée. Chaque étape de la synthèse est caractérisée par les chromo-
hores A, (A+ B)
et D que le dichroisme différencie parfaitement, puis-
que leurs transitions sont liées à des valeurs d'effet Cotton spécifi-
ques. Les mesures dichroïques nous ont permis de constater que la
structure de la DOC (1) est conservée jusqu'à l'obtention du dérivé
7 mercaptopropionique DOC (V). Ces résultats ont été complétés par

---

- 92 -
l'analyse des spectres: RMN proton haut champ des composés (P) et (V).
A cet effet nous avons dans un premier temps attribué tous les p!=otQns
de la DOC (1) à partir des enregistrements de spectres : partiellement
relaxés, RMN 2D (J - 0) et SECSY, et d'effets NOE différentiels. L'étude
comparative des spectres d'effet NOE différentisl de la DOC (1) et
7 mercaptopropionique DOC (V) nous a permis de préciser sans ambiguité
la position 7 axiale du chaînon de greffage. Nous avons en outre mis
en évidence dans le produit (V), l'existence d'une liaison hydrogène
intramoléculaire résultant d'une interaction entre le chaînon mercapto-
propionique en C
et le carbonyle du cycle A. Les valeurs dichroiques
7
normalisées (6E ) calculées pour le même composé (V) révèlent une diminu-
n
tion du 6E par rapport à la DOC d'un facteur 1/2. Ce qui semble prouver
un aplatissement du cycle A dans le composé V dû à l'existence de la liai-
son hydrogène intramoléculaire.
L'étude comparative des spectres dichroiques de la 11 BSA pro-
gestérone et la 7a BSA désoxycorticostérone (VI) met en évidence une iden-
tité conformationnelle entre la progestérone et son antigène. Aucontraire
l'on note dans la DOC une forte diminution du gauchissement des cycles
A et B lorsqu'elle est greffée sur la BSA. Par conséquent si la fixation
d'un chaînon de couplage en C ne masque pas les groupements fonctionnels
7
caractéristiques -de la DOC elle modifie par contre la conformation de
l'haptène au niveau des cycles A et B. L'incidence de la conformation dans
la spécificité antigénique n'est pas encore bien élucidée. Cependant nous
pensons
que le système énone des cycles A et B étant la partie la moins
encombrée de la plupart des molécules d'hormone stéroidienne et possédant
une certaine polarité constitue la zone où l'qctivité biologique est la plus
im~ortante. 11 est donc important non seulement de préserver les groupements
fonctionnels mais aussi de maintenir l'intégrité conformationnelle des
haptènes au niveau de ces mêmes cycles. C'est pourquoi nous proposons
dans la suite de ce travail une étude par la RMN du proton et le dichroisme
circulaire de la réaction anticorps anti hormone stéroidienne-hormone stéroi-
dienne, afin de dégager pour chaque stéroide les sites de reconnaissance
privilégiés des immunoglobulines sur les hormones en question.
Signalons par ailleurs que l'attribution du spectre RM N
proton de la désoxycorticostérone (DO C) que nous avons faite, a exigé
l'utilisation de spectromètres haute résolution (250 à 400 MHz) équipés

---

- 93 -
de systèmes informatiques ("Software" et "Hardware") autorisant la m!Ï.se
en oeuvre des expériences de ZD et d'effets NOE différentiels. Malheureu-
sement ces équipements ne sont pas encore largement disponibles dans la
plupart des centres universitaires ou de recherches. Cependant il est
important de savoir que l'étude structurale des stéroîdes en R M N du
proton est totalement réalisable et qu'il n'est plus nécessaire de tirer
des conclusions uniquement à partir des déplacements chimiques des méthy-
les angulaires. En accord avec HALL et SANDERS [35] nous pensons que la
RMN ZD n'est ~as
indispensable pour l'analyse des spectres complexes
comme celui de la DOC , et peut bien être remplacée par des expériences
de découplage différentiel donnant accès aux couplages scalaires (J) et
par les effets NOE différentiels établissant les corrélations entre pro-
tons couplés ou non.
La comparaison des spectres de molécules de structure voisine
est utile car elle donne une idée de la fréquence de résonance de chaque
proton, permettant par exemple l'attribution rapide des spectres partiel-
lement relaxés. Or ceux-ci sont facilement réalisables sur n'importe quel
spectromètre R M N à transformée de Fourier.
Il faut noter enfin que l'utilisation conjointe de la RMN
et du dichroisme circulaire donne des renseignements complémentaires
sur la structure et la conformation des hormones sbéroîdiennes avec un
prix de revient expérimental relativement faible.
Dans certains cas le dichroisme circulaire peut même éviter
l'étude complète de tous les composés intermédiaires par une technique
de R M N coûteuse.

---

- 95 -
BIBLIOGRAPHIE GENERALE
[1 J
WEIL J .R.
Biochimie Générale "Formation des autres stéroides"
HASSON 1979,
p'. 254-255.
[2J
ERLANGER B.F, BEISER S.M., BOREK F., EDEL F. and LIEBERMAN S.
in methods in immmunology and immunochemistry. Ed. WILLIAMS C.A.
and CHASE M.W.
Academie Press New York, 1967, 1., p. 148.
[3J
LINDER R.R.,
PERELE and DRIEDLANDER A.
in Research on steroids. Ed. INKELS F,TEIM M, CONTI C., KLOOPER A.,
and CASANOC , Pergamon Press Oxford, 1970, ~, 197.
[4J
LINDER R.R.,
PEUL E., FRIEDELANDER A. and SEITLEN A.
Steroids 1972 , ~, 357.
[5J
JEFFCOATE S.L.
"Progress in stéroids immunoassay" in proc of the symp.
in the
analysis of steroids. EGER RUNGARY 1981, 129-141.
[6J
WEINSTEIN A., LINDER R.R., FRIEDLANDER and BAUMINGER S., 1972.
Steroids, 20, 6, 789-812.
[7J
LIEBERMAN S., ERLANGER B.F., BEIZERS.M., AGATE F.J., 1959,
Steroid protein conjugates : their chemical immunochemical,
endocrinological properties. Rec. prog. horm. Res. ~, 165-200.
[8]
MIDGLEY A.R.Jr and NISw'ENDER G.D.
Steroid assay by proton protein binding. Ed. DICSFALUSY, Karolinska
Sjukhuset Stokholm 1970, p. 330.

---

- 96 -
[9J
LEVY G. and CRAIK D.J, 1981
Recent development in nuclear magnetic resonance spectroscopy.
Sei. ~, 291-299.
[10J
BERNARD M., CANIONI P., COZZONE P.J., 1983, Bioc. 65, 449-470.
[ 11]
BENE G. J •
Advances in electronics and electron physics. Academic Press 1979,
49, 87-131.
[12J
YALLOW R.S., BERSON A., 1959, Nature !l, 1648-1649.
[13J
CLAUSTRAT B., 1981, Cah. Med.~,
14,915-926.
[14J
CSERNUS V.,
Proc. of the sympa on the analysis of steroids.
Eger Hungary 1981, 171-177.
[15J
ABRAHAM G.E., J. Clin. endocrin.' 1969, 29 , 866.
[16J
MURPHY B'.E.?, 1967, J. Clin. end. 27,973-990.
[17J
DUVAL D., 1978, Thèse de Doctorat d'Etat ès Sciences Physiques,
Université de Nice.
[18]
BERSON S.A., YALLOW R.S., 1968, Clinica and Chimica Acta~, 51.
[ 19 J
ABRAHAM G. E •
Handbookof Radioimmunoassay. Ed. DEKER H. Inc. New-York 1978.
[20J
ABRAHAM G.E., ODELL W.D., EDWARDS R., PURDY J.M.
Steroids assay by protein binding in reproductive endocrinology.
Ed. DICZ FALLUZY. Genève, 1970, p. 332.
[21J
MIDGLEY A.R. Jr and NI5WENDER G.D.
nd
IISteroids assay by protein bindingll • 2
Karolinska symposium
on research methods in reproductive endocrinology. Ed. DICZFALLUZY
Genève 1970, p. 250.

---

- 97 -
[22]
BAUMINGER S., LINDER H.R., w~INSTEIN A.,
1973, Steroids, ~,
6, 847.
[23J
SHOOLERY J.N. and ROBERTS J.O., 1957, Rev. Sci. Inst., 28, 61.
[24J
SHOOLERY J.N. and ROBERTS M.T., 1958, J. Am. Chem. Soc., 5121.
[25J
BERNSTEIN H.J., POPLE J.A., SCHNEIDER W.G.
High Resolution Nuclear Magnetic Resonance. Mc Graw Hill Book
Company Inc. New-York, 1969, p. 201-207.
[26J
BHACCA N.S. and WILLIAMS D.H.
Application on NMR spectroscopy in organic chemistry. Holden day
1966, p. 13-40.
[27]
ZUCHER R.F., 1963, Helv. Chim. Acta 44, 1380.
[28]
ZUCHER R.F., 1963, Helv. Chim. Acta 46, 2054.
[29J
HINCKLEY C.C., 1969, J. Am.Chem. Soc. 2..!., 5160.
[3oJ
MANFRED K.
Struktur und absorptions spektroskopie organischer naturstoffe.
Steinkopff. DARMSTADT 1976, 183-187.
[31]
BRIGS J.,
1970, Chem. Commun. 749.
[32J
MANTSCH H.H., SAlTO and SMITH C.P.
Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. Eds EMSLEY
and SUTCLIFFE, Pergamon Elmsford, New-York 1977, ll, 4, 221-272.
[33J
PITNER T.P., EDWARDS W.B., BASSFIELD R.L. and WHIDBY.
1978, J. Am. Chem. Soc., 100, 246.
[34J
SAWAN S.P., JAMES T.L., GRUENKE L.D, CRAIG J.C.
1979, J. Magn. Res. 35, 409-413.

---

- 98 -
[35]
HALL L.D. and SANDERS J.K.M., 1981, J. Org. Chem., 46, 6,
1132-1138
[36]
HALL L.D. and SANDERS J.K.M., 1980, J. Am. Chem. Soc., 102, 8,
5703-5711.
[37J
AUE W.P., BARTHOLDI E.R., ERNST R.R.; 1976, J. Chem. phys. 64,
2229.
[38]
BODENHAUSER G., FREEM~ R.,
NIEDERMYER and TURNER D.L.
1977, J. Magn. Res. 26, 133.
[39]
FREEMAN R., HILL H.D.W., TOMLINSON B., HALL L.D., 1974, J. Chem. Phys.
~' 4466.
[40]' HALL L.D., WONG K.F., HULL W.E., STEVENS J.O., 1979, J. Chem.
Soc. Chem. Commun. 953.
[41]
NICOLAI N., SCHNEDE S., GIBBONS W.A., 1980, J. Amer. Soc. 102,
1513.
[42]
NOGGLE J.H., SCHIRMER R.E.
"The nuclear overhauser effectll • Academie Press New-York, 1971.
[43] LALLEMAND J.Y.
IIIntérêt de la RMN 20 par rapport à la RMN 1011
Conférence du G.E.R.M. VII Mars 1983.
[44] JEENER J., 1971, Ampère International summer school, Basko polje,
Yugoslavia.
[45] BAX A., 1982, II two dimensional NMR spectroscopy in liquids ll
Delft University Press.
[46] KUMAR A., 1978, J. Mag. Res. 30,
227.
[47] WIDER H., BAUMANN R., NAGAYfu~ K., ERNST R.R., WUTRICH
1981, J. Magn. Reson. 43,259.

---

- 99 -
[48] VELLUZ L. et LEGRAND M., 1961, Angev. Chem., ~, 603.
[49] VELLUZ L., LEGRAND M., VIENNET R., 1965, C.R. Acad. Sci., 261,
1687.
[50] VELLUZ L. et LEGRAND M., 1965, Angev. Chem., 77, 842.
[51] LACAM A. et VIENNET R., 1961, Bull. Soc. Chim. 1974.
[52] DJERASSI C., RECORDS E., BUNNENBERG, MISLOW K. and MOSCOWITZ
1962, J. Am. Chem. Soc. 84, 860.
[53] SNATZIΠG.,1973, in "Fundamental aspects and recent developments
in optical rotatory dispersion and circular dischroism".
Ed. CIARDELLI F. and
SALVADORI P., Heyden, London, p. 109-124.
[54] WHALLEY W.B., 1962, Chem. and Ind., p. 1024.
[55] SNATZKE G., 1965, Tetrahedron, ~, 413.
[56] SNATZKE G,
1965, Tetrahedron, ~, 421.
[57] S~ATZKE G., 1~65, Tetrahedron, ~, 439.
[58] NEDELEC L., TORELLI V., COSTEROUSSE G., DELAROFF V.
1977, Bull. Soc. Chim. France, N° 7-8, 671-675.
[59] GAWRONSKI J., LILJEFORS T., NORDEN B.
1979, J. Am. Chem. Soc., 101, (19), 5515-5522.
[60] BURNETT R.D., KIRK D.N.
1981, J. Chem. Soc. Perkin l, 1460-1468.
[61] MOFFIT W., WOODWARD R.B., MOSCOWITZ A., KLYNE W., DJERASSI C.
1961, J. Am. Chem. Soc. 83, 4013.
[62] DJERASSI C., 1960, "Optical rotatory dispersion applications to
organic chemistry". Mc Graw !Jill publ. New-York.

---

- 100 -
[63J
SNATZKE G., 1965, "Optical rotatory dispersion circular dichroism
in organic chemistry", p. 11. Ed. SNATZKE, publ. Heyden and Sons
London.
[64J
llJERASSI C., KLYNE W~
1962, Proc. Nat. Acad. Sei., V.S.A., 48,
1093.
[65J
LEGRAND M., LACAM A., VIENNET R.
1961, Bull. Soc. Chim. France, p. 792.
[66J
VELLUZ L., LEGRAND M., GROSJEAN M.
1965, "Optical circular dichroism, principles measurements and
applications", Verlag Chemie, Academie Press, p. 82-142.
[67J
BARRET M.W, FARRANT R.D., KIRK D.N., MERSH J.D., SANDERS K.M.,
DUAX W.L.
1982, J. Chem. Soc. Pzrkin II, 105-110.
[68J
KIRK D.N., KLYNE W., 1974, J. Chem. Soc. Perkin l, 1076-1102.
[69J
CRABBE P.
1965, "Optical rotatory dispersion and circular dichroism in
organic chemistry". Holden day publ. San Fr.ancisco, p. 224.
[70J
BUCOURT L., 1964, Bull. Soc. Chim. France, 2080-2092.
[71J
NEDELEC L., GASC J.C., DELAROFF V., BUCOURT R., NOMINE G.
1978, Tetrahedron, 34, 2729-2736.
[72J
TOTTY R.N., HL~EC J.
1971, J. Chem. Commun. 785-786.
[73J
NJAR V.C.O., ARUNACHALAM T., CAPSI E.
1983~ J. Org. Chem. 48,
1412-1414.
[ï4J
BARFIELD M. and GRANT D.M.
1963, J. Am. Chem. Soc., 85,
1899.

---

- 101 -
[75J
COLE W.G. and WILLIAMS D.H.
1968, J. Chem. Soc. (C), 1849.
[76J
JACKMAN L.M., STERNHELL, 1969,
"Applications of nuclear magnetic resonance spectroscopy in
organic chemistry". Pergam"on Press, Oxford, p. 270-275.
[77 J
CASY A.F., 1971, "p M R Spectroscopy in medicinal and biological
chemistry" Academie Press London and New-York, p. 169-273.
[78J
COLEBROOK L.D. and HALL L.D.
1980, Cano J. Chem. 38, 2016-2023.
[79J
KURIYAMA K., KONDO E., TORI K.
1963, Tetrahedron Letters , ~ .. p. 1485-1491.

---

- 103 -
ANNEXE l
SYNTHESE CHIMIQUE DU DERfVE CONJUGUE DOC-BSA

---

- 104 -
PREPARATION DU DERIVE CONJUGUE 7MERCAPTOPROPIONIQUE DOC-B5A
MATERIEL :
Le composé de départ de notre synthèse est la DOC 21 acétate
(II) de la Société STERALOIDS. Tous les réactifs utilisés au cours de
cette préparation proviennent de la Société MERCK.
1.1 - PREPARATION DE LA 4-6 PREGNADIENE 21 ACETATE
3-20 DIONE
Suivant la technique d'AGNELLO et LAUBACH [lJ on
chauffe à réflux pendant trois heures une solution de 10 g de DOC 21
acétate et 39,4 g de parachloranil dans 700 ml de tert butanol et
1,2 ml d'acide acétique. Après filtration on évapore à sec puis le
résidu est dissous dans 700 ml de chlciroforme et on procède à un
lavage par .:
- 3 ~ 70 ml
H2~
- 3 x 70 ml
NaQH
5 %
Le contrôle de la réaction se fait par sp€ctrophotométrie
U.V : on suit le passage
du À
de 240 nm à 283 nm (effet bathochrome
max
4 6
dû à la double liaison 6 - ) . Un contrôle plus poussé est effectué en
spectrométrie de masse.
Après évaoporation de la solution chloroformique le 'résidu
est recristallisé dans le mélange : - acétone
- éther de pétrole 40-60.

---

- 105 -
1·2 - OBTENTION DU DERIVE PREGNENE 4 3-20 DIONE
1
21 ACETATE 7 MERCAPTOPROPIONIQUE.
On chauffe à reflux pendant 20 heures une solution renfermant
1,5 g de dérivé 4-6 prégnadiène 21 acétate 3-20 dione, 500 ml de benzène
désséché, 4,1 ml de pipéridine et 4,1 ml d'acide Bmercaptopropionique.
L'évolution de la réaction est suivie par chromatographie sur couche.
ml.nce (c c m) avec comme phase fixe de la silice .(Silica"gel F 254) ,
la phase mobile est constituée de :
CHC1
90 %
3
CH 0H
10 %
3
La disparition de la double liaison 6-7 est suivie par modification
du spectre U.V.
passage de À
de 284 nm (effet hypsochrome).
max
Après 20 heures in évapore la solution organique et le résidu est repris
par 70 ml de chloroforme puis lavé par 20 ml d'eau et extrait par
3 x 20 ml de carbonate acide de sodium (NaHC0 ) saturé dans l'eau. On
3
acidifie par HCl 5N à 4°C. Le précipité obtenu est dés séché et recris-
tallisé dans le mélange méthanol/eau. La purification se fait par chro-
matographie sur colonne Sephadex L,H 20 ayant 40 cm de long et 1 cm de
diamètre dans une phase mobile constituée par :
- Benzène
80 ml
- Hexane
10 ml
- Ethanol
7 ml
on obtient environ 400 mg de dérivé acide DOC 21 acétate 7 mercaptopro-
pionique.
1~3 - HYDROLYSE DE L'ACETATE EN 21.
A 200 mg de dérivé acide (IV) on ajoute
- 400 ml de méthanol
5 ml de solution de carbonate acide de potassium (KHC0 ) 190 g/l
3
d'eau.
14,8 ml d'eau.
On chauffe 7 heures à 37°C. Puis on évapore sous vide et l'on fait une
reprise par 10 ml d'eau. Avant l'extraction par 50 ml de chloroforme

---

- 106 -
le pH est ajusté à 4 par de l'acide chlorhydrique 0,1 N. La fraction
ch10roformique est ensuite évaporée.
1.4 - PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
HAUTE PERFORMANCE (HPLC).
Avant le couplage à la BSA le composé (V) a subi une purifi-
cation poussée en HPLC sur une colonne semi préparative, PARTISIL
WHATMAN
mq 25/10 avec une phase mobile constituée par :
- 90 % chloroforme
- 10 % éthanol.
L'appareil utilisé SPECTRA PHYSICS SP 8000 a été équipé d'une
boucle d'injection de 1 ml type RHODYNE, avec une système de détection
permettant de travailler simultanément à des 10ngeurs d'onde variables:
Sur le chromatogramme obtenu la DOC 5 mercaptopropionique apparaît très
retenue (tr = 350 s) donc bien séparée des impuretés dont le constituant
.
.
1
1
4
A
- 6
0
pr1nc1pa
est
a
u
D C.
1.5 - COUPLAGE DU DERIVE ACIDE DOC 7 MERCAPTOPROPIONIQUE
A LA SERUM ALBUMINE BOVINE (BSA).
Solution A
Dans 1 ml de dioxane on ajoute 0,145 m.M. d'Haptène
et 28,4 mg de tri N buty1amine. On dissout par
ailleurs 22,4 ml d'isobuty1ch10rocarbonate dans
0,4 ml de dioxane que l'on ajoute à la solution
précédente. La température est mainten~e à 10°
pendant 20 Dm.
Solution B
20 mg de BSA est dissout dans 5 ml d'eau distillée.
On additionne 3,6 ml de dioxane et 0,2 ml de soude
normale (lN). La température est maintenue à 10°
pendant 30 Dm.

---

- 107 -
absorbance
--1~b"'-8--~--O-_--'3--1~-4--L._-------54-0---'---7-5""'"6--~>
T
8
.R.
Fig. 1.1 - Chromatogramme obtenu lors de la purification du
dérivé acide 7a mercaptopropionique DOC CV).
ordonnées
absorbance/division = 0,036
-. - . absorbance/division 0,055
Longueur· d'onde
276 - 286 nm
- • - 240 - 252 nm

---

- 108 -
R~action
Les solutions A et B sont mélangées sans agitation 45 mn
à 10°C. Puis addition de 0,99 ml de NaOR lN et l'on laisse
au repos pendant 3 heures. On procéde à une séparation de
la fraction protéique par dialyse contre l'eau distillée
pendant 12 heures.
SCHEMA DE LA REACTION
Stéroîde -
-
-
-
-COOR
"'Chaîne de couplage
R' - 0 - -
-
-
-
- -C -
Cl
isobuty1ch10rocarbonate
"o
1 milieu alcalin (tri Nbutylamine)
o
s ,
"d
tero~
e -
_ C ~
anhydride mixte
'01
. ,
C
R
-
0
- - - - - - -
-
~
(groupe e: aminé
1+R"~:2 des lysines)
o
U
Stéroide-
C -
NH -
BSA

---

- 109 -
REFERENCES
[1] AGNELLO J.E. and LAUBACH G.D., 1960, J. Am. Chem. Soc. 82,
4293-4299.

---

-
111 -
ANNEXE II
TECHNIQUES EXPERIMENTALES ET DONNEES GENERALES
..
SUR L'ACTIVITE OPTIQUE ET LE DICHROISME CIRCULAIRE

---

- 112 -
11.1 - TECHNIQUES EXPERIMENTALES
Les spectres dichroiques des composés (1), (II), (III)
et (IV) ont été effectués dans le méthanol avec des cellules HELLMA
de 0,1 et 1 cm de trajet optique pour une gamme de concentration de
1
0,5 - 0,75 mg x ml- • Ceux du conjugué DOC-BSA ont été réalisés à des
-1
concentrations de 1,5 et 2,5 mg x ml
dans un tampon phosphate pH = 7,4
dont la composition est la suivante
- Na
H P0 , 2H 0
1,78 g
2
4
2
- Na H
P0 , 2H 0
0,312 g
2
4
2
- NaCI
7,36 g
- Na N
1,00 g
3
- H 0
q s p
1.000 ml
2
L'appareil utilisé est dichrographe JOBIN-YVON type IV
(fig. II.7). Toutes les conformations énantiomères ont été déduites des
modèles de Dreiding qui permettent une meilleure visualisation de tous
les angles dièdres de liaison •

---

- 113 -
11.2.1- LUMIERE POLARISEE DANS UN PLAN ET
ORIGINE DE L'ACTIVITE OPTIQUE.
En chaque point [1J d'un rayon de lumière natu-
relle, oscillent un champ électrique et un champ magnétique qui vibrent
dans toutes les directions perpendiculaires entre elles et perpendicu-
laires à la direction de propagation du rayon. En ce qui concerne la
lumière polarisée rectiligne, le vecteur champ électrique Evibre dans
-+-
un même plan de vibration etle vecteur champ magnétique B se propage,
dans un plan perpendiculaire au précédent.
L'interaction du vecteur champ électrique avec
une substance possédant une activité optique peut être schématisée par
la figure II. 1.
-+-
Le vecteur E du rayon de lumière polarisée XY vibre dans le plan
ABD. Au point 0, la vibration est dirigée selon OE . Si en ce point 0,
le rayon lumineux traversant une substance transparente se retrouve dans
la direction OE' (plan C B D) on dit que la substance a fait tourner le
plan de polarisation de la lumière polarisée rectiligne d'un angle u.
Ce phénomène peut être
interprété [2J aisément, en considérant
que la lumière polarisée rectiligne correspondant à une radiation mono-
-+-
-+-
chromatique est composée de deux vibrations circulaires E
et E
possé-
G
-+-
D
dant une résultante E
(fig. II.2) qui se trouve toujours dans le même
plan si le faisceau lumineux
ne traverse que des milieux inactifs.

---

-
114 -
y
Fig. II.1 - Renrésentation schématique de la composante électrique
de la lumière nolarisée dans un plan et de la rotation
ontique. Le rayon lumineux est dirip,é de x vers y.

---

- 115 -
1
1
lé
....Er;
/;
\\Êc
1
\\
1
1
,
•
1
\\
1
1
\\
1
/
"
1
/
'-+ -,,;'/
Fig. II.2 - Composantes circulaires gauche et droite d'une lumière polarisée
rectiligne.
a - quand la lumière traverse un milieu inactif.
b -quand le faisceau lumineux passe à travers une substance active.
Si par contre, le faisceau traverse un milieu optiquement actif, les vibra-
tions gauche (E ) et droite (E ) présentent des vitesses différentes V et
g
d
g
V
reliées aux indices de réfraction n
et n
référencés par rapport au
d
g
d
vide par la relation :
c
v =
(11.1)
n
où c est la vitesse de la lumière.
Le retard d'une vibration par rapport à l'autre se traduit par
une déviation d'un angle Ct du plan dans lequel vibre le champ électrique
+
résultant E
par rapport à la direction initiale. La rotation Ct est donc
reliée :
- aux indices n
et n
donc à la substance optiquement active
d
g
- au trajet optique ~
- à la longueur d'onde À de la lumière utilisée.
Si Ct est exprimé en radians,
il est donné par
L'équation:
Ct = TI
(n
- n ) ~
(11.2)
À
g
d

---

-
116 -
11.2.1.1 -
INFLUENCE DE LA CONCENTRATION.
Lorsque les mesures de rotation se font sur des
solutions contenant un soluté optiquement actif de concentration variable
le première loi de BIOT [3J [4J est d'une importance fondamentale puisque
c'est sur elle que reposent tous les dosages po1arimétriques. L'angle a
est alors pour une longueur d'onde À proportionnel au trajet optique ~
et à la concentration de la solution C ; la constante de proportionnalité
est appelée pouvoir rotatoire spécifique et symbolisée par [aJ À
a
=
[aJ
~ C
(11.3)
À
Généralement [2J l'épaisseur ~ est exprimée en décimètres (dm) et la
concentration en gramme par mi11itre.
11.2.1.2 -
INFLUENCE DE LA LONGUEUR D'ONDE.
L'indice À dont le pouvoir rotatoire spécifique
est affecté indique que la va1~ur de ce dernier dépend de la longueur
d'onde. Cette influence [5J se traduit par la deuxième loi de BIOT:
k
...
(11.4)
2
À
Il est aisé d'en déduire l'intérêt des mesures à faible longueur d'onde
lorsqu'il est nécessaire d'accroître la précision. Si la raie n du sodium
reste la longueur d'onde type de référence du pouvoir rotatoire spécifique
[aJ
on opère de plus en plus avec des polarimètres photoélectriques
n
à
lampe à vapeur de mercure permettant d'atteindre le domaine du proche
ultraviolet.

---

- 117 -
II.2.2 - DISPERSION ROTATOIRE
En vertu des équations (11.3) et (11.4), l'angle de
rotation, en première approximation [2J [6J
pourra s'exprimer par la
relation :
(11.5)
La variation de l'activité optique en fonction de la longueur d'onde
constitue la courbe de dispersion rotatoire optique (Optical Rotatory
Dispersion: O.R.D.).
Il est important ici de faire la distinction entre les disper-
sions rotatoires normale et anormale.
II.2.2.1 - DISPERSION ROTATOIRE NORMALE.
c'est la dispersion rotatoire [7J observée
dans une "fenêtre" au minimum d'absorption, la courbe [aJ
= f (À) est de
À
nature hyperbolique.
(fig. II.3)
Fig. II.3 - Courbe de dispersion rotatoire normale.

---

- 118 -
11.2.2.2 -
DISPERSION ROTATOIRE NORMALE.
c'est la dispersion observée au voisinage
[8] d'une bande d'absorption ou d'un maximum d'absorption. Si dans le
domaine de longueurs d'onde envisagée, la susbtance possède un chromophore
absorbant, on observe un accroissement de a beaucoup plus rapide que ne
l'indique t4] [5] la loi de BIOT, précèdé ou suivi par une diminution
rapide. Le pouvoir rotatoire s'annule vers le centre de la bande d'absorp-
tion. C'est ce phénomène qui porte le non d'effet COTTON, (fig. II.4).
Dans le cas où le maximum se situe à une longueur d'onde supérieure à celle
du minimum, l'effet COTTON est dit positif. Il est négatif dans le cas
contraire où
À
< À.
max
m.l.n.
,
a
b
Fig. II.4 - Courbes de dispersion rotatoire anormales
a - effet cotton positif
b - effet cotton négatif
Si le spectre d'absorption relatif à une vibration circulaire présente
plusieurs bandes, on observe un effet Cotton multiple.

---

- 119 -
11.2.3- DICHROISME CIRCULAIRE
Nous avons vu au paragraphe II.1 que l'activité optique
est due à une différence de vitesse entre les composantes circulaires
EC et ED d'une lumière polarisée. Il est naturel de penser que dans un
milieu actif absorbant les deux vibrations circulaires se~ont différem-
ment absorbées. Ainsi quand une substance optiquement active [7J [9J [10J
[11J présente des bandes d'absorption dans le domaine spectral examiné,
-+
-+
les modules des vecteurs E
et E
ne sont plus égaux et leur résultante
-+
C
D
E n'oscille plus le long de la circonférence d'un cercle, mais décrit
une é11ipse comme le montre la figure II.5. Par conséquent, quand un
milieu actif est traversée par une lumière polarisée dans son domaine
1
1
1
1
/
/
/ /
-
-+
. ,
Fig. II.5 - Ellipse décrite par l'extrémité du vecteur E quand la 1um1ere
polarisée traverse un milieu actif dans son domaine d'absorption.
d'absorption non seulement le plan de polarisation tourne d'un angle a
mais la lumière résultante est é11iptiquement polarisée : on dit que le
milieu présente un dichroisme. L'absorption de la lumière par une substance
[2J correspond à l'apparition d'une couleur. Puisque dans le cas de la
lumière polarisée cette absorption est différente selon les deux vibra-
tions circulaires, on observe donc une différence de couleur. La substance

---

-
120 -
est donc devenue dichroïque. Il est possible de déterminer les coeffi-
cients d'extinction €d
et €g
des faisceaux droit et gauche et leur
différence, ~€,représente l'absorption dichroïque
~€ = €g
- €d
(11.6)
L'enregistrement de cette variation en fonction de la longueur d'onde
est analogue à un spectre d'absorption classqiue à la différence près
que le dichroïsme circulaire peut présenter des valeurs
né~atives ou
positives alors que l'absorption est toujours positive.
11.2.4 -
INSTRUMENTATION.
Dans ce chapitre, nous n'aborderons que l'instrumen-
tation relative au dichroisme circulaire, seule technique retenue pour
élucider les multiples problèmes posés par l'analyse structurale et
conformationnelle des molécules rencontrées au cours de ce travail.
Nous avons vu précédemment que le coefficient d'absorp-
tion moléculaire €
spectrophotométrique trouve, en dichroimétrie, ses
équivalents €g
et
€d
liées aux lumières gauche et droite. Ces dernières
valeurs sont très voisines mais seule la différence ~€ = €g
- €d
est
significative et l'absorption dichroique ~€
doit être considérée comme
une nouvelle caractéristique moléculaire, au même titre que ~€ en spec-
trophotométrie simple. Par analogie, nous pouvons définir une densité
optique dichroique
~ liée à ~€ par la relation suivante, où M est la
masse moléculaire du composé étudié, C sa concentration en solution
(g/~) et ~ l'épaisseur (cm) de la cuve
~€ =
(II. 7)

---

- 121 -
16
10
11
12
9
8
7
Fig. II.6 - Le dichrographe Roussel-Jouan: (1) source lumineuse;
(2) monochromateur ; (3) prisme de Rochon ; (4) cristal
de phosphate monoammonique ; (5) cuve ; (6) multiplicateur
d'électrons; (7,8) amplificateurs; (9) détecteur; (l0,
Il, 12) amplificateurs; (13) source d'énergie pour le
cristal oscillant; (14, 15) système de réglage de la
longueur d'onde et de la largeur de fente; (16) enregis-
treur automatique.

---

- 122 -
Dans le dispositif original de mesure construit par GROSJEAN
et LEGRAND en 1960 [12] (figure II.6) et appelé dichrographe, un faisceau
monochromatique polarisé rectilignement par un prisme de Rochon traverse
une lame de phosphate monoammonique taillée perpendiculairement à l'axe
optique. Ce cristal soumis à un champ électrique parallèle à l'axe,
devient birefringent (effet Pockel). En orientant convenahlement la
lame, et en lui appliquant un champ alternatif, on obtient à la sortie
un faisceau qui, au cours d'une période de la tension alternative, va
d'une polarisation circulaire droite à une polarisation circulaire
gauche et vice versa, en passant par toutes les lumières elliptiques
intermédiaires. Après avoir traversé la solution à examiner, le flux
sortant fournit aux bornes d'un photomultiplicateur une tension formée
d'une composante continue, reflétant l'absorption moyenne de la solution,
et d'une comosante alternative traduisant la différence d'absorption
entre les deux lumières polarisées. Ces renseignements sont pris en charge
par la partie purement électronique de l'installation. Le résultat final
est une courbe, tracée par l'appareil enregistreur, exprimant une quantité
proportionnelle à la différence entre les indices d'extinction relatifs
aux deux lumières circulaires en fonction de la longueur d'onde. Dans
certaines limites, l'élongation est pour chaque longueur d'onde directe-
ment proportionnelle à la concent~tion en solution du produit actif
selon une loi analogue à celle de Beer-Lambert. Un dosage sur le dichro-
graphe n'impose donc pas de connaître la différence de densité optique
vraie 60
le rapport des mesures d'élongation effectuées en mm ou cm
à la même À , sur la courbe-essai et la courbe d'étalonnage donnera
directement le rapport des concentrations. Une formule simple permet
par ailleurs, pour un composé donné, de calculer 6E à partir de ces
mesures, compte tenu de la concentration, de la masse moléculaire, du
trajet optique et des positions de réglage de l'appareil.
Par convention, on appellera maximums les valeurs absolues
les plus grandes des élongations
(6~)
et minimums les valeurs
absolues les plus petites, précisant ensuite le signe du dichroisme.
L'appareil" actuellement commercialisé, le dichrographe
"JOBIN-YVON IV" (fig. II. 7) couvre la gamme de longueur ci' onde comprise
entre 190 et 600 mm. L'absorption dichroique ~E obtenue en tenant compte

---

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N
W
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1
- ,1'-
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.. -~
.. ,\\
.,
~
.~_o;;-_
B
Fig. II.7 - Auto-Dichrograph JOB IN-YVON IV
A
microprocesseur
B
enregistreur
C
module optique

---

- 124 -
des paramètres de l'appareil s'exprime de la façon suivante
!1E =
(11.8)
où M = masse molaire.
C = concentration en g/~
d = amplitude dichroïque en mm lue sur le papier.
~ = trajet optique en cm.
S = sensibilité de l'appareil.
II.L.S -CONDITIONS NECESSAIRES A L'EXISTENCE DU
DICHROISME
11.2.5.1 - CHROMOPHORES OPTIQUEMENT ACTIFS.
Pour qu'une substance organique soit dichroi~uement
active [7J deux conditions sont nécessaires
1°) La molécule doit être asymétrique, donc présenter un pouvoir rota-
toire. Celui-ci peut être interprété [lJ comme résultant de l'interac-
tion entre les forces électriques d'un rayon lumineux atteignant une
molécule et les électrons de celle-ci. Si cette interaction est assez
forte, il se produit des perturbations dans la configuration électroni-
que de la molécule et au niveau du faisceau lumineux un changement de
-+
direction du vecteur du champ électrique E. L'effet produit par une
seule molécule est très faible, mais pour l'ensemble des molécules
il peut être suffisamment important et être mesuré par une rotation
notable de plan de polarisation de la lumière. Ainsi des molécules
comme le méthane (CH ) l'éthylène (CH
= CH ), l'acétone (CH - C -CH)
4
2
2
3
II
3
o
et le formaldéhyde (H
- CO) qui ont assez d'éléments de symétrie pour
2
que chacune soit identique à son image, ne font pas tourner le plan de
polarisation de la lumière
c'est parce que la symétrie de chacune
est telle que toute rotation optique dans une direction est annulée
par une rotation égale de sens opposé. Par contre, les molécules

---

-
125 -
dont les atomes sont disposés dans l'espace de telle sorte qu'elles
n'aient pas suffisamment de symétrie pour être superposables à 1enr
image dans un miroir auront un effet net sur la lumière incidente
polarisée, car la moyenne des interactions électromagnétiques est
alors différente de zéro ; de telles substances sont caractérisées
par leur activité optique. C'est le cas
'[13J par exemple de tous les
aminoacides à l'exception de la glycine.
2°) Au voisinage du centre d'asymétrie [7], en général en
Ci.
ou"
en S cette molécule doit comporter un chromophore. Il est bien évident
que ce terme désigne ici un groupement fonctionnel absorbant dans la
bande de longueurs d'onde explorée par le dichrographe c'est-à-dire
dans notre cas entre 200 et 600 mm.
Selon MOSCOW1TZ [14J on peut classer les chromophores
optiquement actifs en deux groupes extrêmes :
- les chromophores naturellement asymétriques
- les chromophores naturellement symétriques mais asymétriquement per-
turbés.
11.2.5.1.1
- CHROMOPHORES NATURELLEMENT ASYMETRfQUES
L'activité optique des composés de ce groupe [7J
est liée à la géométrie intrinsèque du chromophore. C'est le cas par
exemple [14J [5 ] de l'hexahe1icène 1.
1

---

- 126 -
Il n'y a pas d'éléments de symétrie dans cette molécule pouvant
inhiber une éventuelle activité optique sans posséder pour autant de
carbone asymétrique. L'ensemble de la molécule se comporte donc comme
un chromophore unique responsable de l'asymétrie nécessaire pour induire
l'activité optique.
II.2.5.2.2 -
CHROMOPHORES NATURELLEMENT SYMETRIQUES.
L'exemple type de cette classe de chromophore
est la fonction carbonyle CO. Pour un groupement CO isolé [16J [17J i1.y
a deux plans de symétrie de réflexion orthogonale et ce chromophore serait
optiquement inactif comme dans le cas du formaldéhyde. Cependant quand ce
chromophore est placé dans un environnement dissymétrique (exemple ter-
pènes ou stéroides), les transitions deviennent optiquement actives.
Ceci est dû au fait que la distribution électronique subit une perturba-
tion qU1 tend à détruire la symétrie initiale de la molécule et, par là
même, induire une activité optique.
Dans ce groupe l'activité optique est induite
dans le chromophore par son environnement contrairement au premier type
de chromophore ou l'activité lui est inhérente. C'est la raison pour
laquelle l'intensité de l'effet Cotton qui caractérise ce second groupe
sera souvent beaucoup plus faible que pour les composés appartenant au
second groupe.
Il convient de sou~igner ici que l'activité
optique du second groupe est caractérisé par la présence d'un (ou plu-
sieurs) atomes de carbone asymétrique dans le voisinage du chromophore.
Dans de telles substances, le chromophore intrinsèquement symétrique
peut servir de test pour explorer la géométrie de la molécule puisque
l'intensité du pouvoir rotatoire constitue un mode d'expression de
l'asymétrie de la molécule.

---

- 127 -
II.2.6 - PARAMETRES IMPORTANTS EN DICHROISME
CIRCULAIRE.
En spectrophotométrie U V visible un milieu est essen-
tiellement caractérisé par ses différentes transitions électroniques et
les
À
qui leur sont associées. En dichroimétrie, viennent s'ajouter
max
des paramètres liés à l'Effet Cotton (EC) caractérisant le signe et
l'amplitude dichroique (~€). Pour mieux situer les applications et les
interprétations du dichroisme circulaire, il nous a semblé utile de
rappeler brièvement les prinéipales transitions électroniques
II.2.6.1
- RAPPEL SUR LES TRANSITIONS
ELECTRONIQUES.
Une molécule organ1que [2J [18J peut contenir des
hétéroatomes possédant un (ou plusieurs) doublets électroniques libres
(dont les électrons ne participent à aucune liaison) : ceux-ci sont des
électrons s et p non hybridés dont les orbitales ont des axes perpendicu-
laires à celui de l'orbitale TI. L'exemple le plus simple est celui du
formaldéhyde (figure
II. 8 ) •
X'
x
,
1
•
......._----~_ ..'
Fig. rI.8 - Principales liaisons dans le formaldéhyde.

---

- 128 -
Dans cette molécule les liaisons C- H et C-0 sont assurées
par des électrons cr ,
la deuxième liaison C - 0 par les électrons TI des
orbitales atomiques 2p
du carbone et de l'oxygène. Dans l'état fonda-
x
mental le doublet libre
est situé au-dessous du niveau TI liant
tandis que le doublet
s~tué entre les niveaux TI et TI* (niveau
atomique pur) (figure
/ /
\\ 7r"
/
\\
/ /
\\
/
\\
/
\\
/ /
\\
- t - ( /
\\
p
\\
\\
x
\\
\\
\\
\\
\\
\\
,
\\
\\
\\\\,
1'-
I\\~
1
-+-1-+\\li- n
'-----r-
\\
/
Px
\\
/
,
/
'--tt-/1f
_1~I~n'sp
--rt- n'
1 W
z
CO
o
Fig. 11.9 - Diagramme d'orbitales moléculaires de H C = 0 réduit aux
2
seuls niveaux TI et non liants. Les niveaux cr liants non
représentés sont situés au-dessous de nsPz
Si l'on considère les électrons n , quatre transitions sont théoriquement
possibles: n' -)
*
TI;
n' -) cr*
n -) TI *
n -) cr* •
La transition la moins énergétique correspond à la transition n -) TI*
dont la longueur d'onde voisine 270-280 nm.
Ces tr~nsitions
n -) TI* nécessitent le passage d'un électron n
d'une orbitale Py
(ou éventuellement spz) sur une orbitale TI antiliante
avec un changement d'axe obligatoire.

---

- 129 -
Ainsi dans le cas du formaldéhyde on peut distinguer trois
transitions
0 - ) 0*
de longueur d'onde voisine de 130 nm
TI - ) TI*
de longueur d'onde voisine de 190 mu (bande K)
n - ) II*
de longueur d'onde vo~s~ne de 290 nm (bande R).
Seule la bande R peut être exploitable avec les spectromètres classiques.
Les transitions 0 - ) 0* et
II - ) II* donnent une bande d'absorption dans
un domaine de longueur d'onde peu accessible, le D.C. nous permet cepen-
dant de détecter des bandes situées aux environs de 200 nm.
IL 2.6.2 -
1NFLUENCE DE S FACTEURS PHY SI QUES
SOLVANT ET TEMPERATURE.
L'influence du solvant [19J n'est pas négligeable.
Ainsi, dans le cas du chromophore carbonyle, une augmentation de polarité
du solvant provoque un déplacement hypsochrome du maximum, une augmenta-
tion de l'intensité d'absorption et une perte de structure fine, comme en
témoignent les tracés obtenus avec la testotérone (fig. II.10).
Quant à la température [19J une variation de quelques
dégrés, telle qu'on peut l'enregistrer dans un laboratoire, n'a pas
d'influence sur le tracé des spectres et l'on comprend mieux, pourquoi le
dioxane (E = 2) est si souvent retenu.
o
o
0'\\
N
N
C"'l
._............
-+--_--<p...--_~
nm
- 0,5 .~
... \\
. \\"\\
. .
,
1
\\
".
\\
\\
/1
-
1
\\ '. \\
.',.
\\"
~ï-- dioxane
~
\\ ·""'l.~
'.
, . , . I J ......
éthanol
.. .~ .... -
- 1,5
chloroforme
tétrahydrofuranne
Fig. II.10 - Influence des solvants sur les bandes d'absorption
dichroique : exemple de la testostérone.

---

- 130 -
REFERENCES
[1J
ROBERTS J.O., CASERIO M.C., CONIA J.M.
1968,
"Chimie organique moderne", Paris Ediscience, p. 419-421.
[2J
HAMON M., PELLERIN F., GUERNET M., MAHUZIER G.
1980, "Abrégé de Chimie Analytique", Masson, p. 169-173.
[3J
BIOT J.B., 1831, Mem. Acad. Sc. 12, p. 39.
[4J
BRUHAT G., 1930, "Traité de pOlarimétrie". Editions de la Revue
d'Optique Théorique et Instrumentale PARIS, p. 194-196.
[5J
BIOT J .B., 1817, Mem. Acad. Sci. ~, p. 41.
[6J
SNATZKE G., 1965, "Optical rotatory dispersion and circular dichroism
in organic chemistry. Ed. SNATZKE pub. Heyden and Sons London.
[7]
CRABBE P., 1968, "Applications de la dispersion rotatoire optique et
du dichroisme circulaire en chimie organique".
Gauthier-Villars, Paris, p. 41.
[8J
COTTON A., 1896, Comptes rendus, 120, 989.
[9 J
VELLUZ· L., LEGRAND M. et GROSJEAN M., 1965.
"Optical" circular dichroism principles measurements and applications".
Verlag Chemie, Weiheim.
[10]
KAUZMANN W.J., WALTER J.E., EYRING H.
1940, Chem. Rev., 26,
339.
[11J
CALDWELL D.J. et EYRING H.
1963, Rev. modo phys. 35, 577.

---

- 131 -
[12J
GROSJEAN M., et LEGRAND M.
1960, C.R. Acad., Sei., 251, 2150.
[13J
WEIL J.H., 1979, Biochimie Générale, Masson, p. 7.
[14J
MOSCOWITZ A., 1960, dans DJERASSI C : Optical rotatory dispersion:
Applications to organic chemistry. Mac Graw Hill New-York.
[ 15 J MOSCOWITZ A., 1961, Tetrahedron ..!l, 48.
[16] MOSCOWITZ A., 1962, dans Advances in Chemical Physics. Ed. Prigogine.
Interscience publ. lue. vol .. II, p. 67.
[17J BERTHIER G., SERRE J •.
1966, dans Chemistry of the carbonyl group, édit. Patais.
Interscience publ. ltd Londres.
[18] LASZLO P., STANG P.J.
1972, "le chromophore carbonyle et les spectres U.V. de dispersion
rotatoire et de dichroisme circulaire" dans Spectroscopie Organique.
Hermann Collection Méthodes Paris, p. 129-134.

---

-
133 -
ANNEXE lU
MATERIEL ET METHODES R MNUTILISEES

---

- 134 -
111,1 - MATERIEL
III. 1. 1 - PREPARATION DES ECHANTILLONS.
Les échantillons, désoxycorticostérone et 7a mercapto-
propionique désoxycorticostérone, ont été préparés dans le mélange de
solvants :
- CDC1
0,4 ml
3
- DMSO
0,2 ml
pour une quantité de produit d'environ 10 mg.
III.l.2 -
ENREG l STREMENT DES SPECTRES
R M N lD
Les spectres partiellement relaxés ont été effectués à
température ambiante sans dégazage préalable. Les enregistrements ont été
faits au Centre de Microanalyse de SOLAIZE (C.N.R.S.) sur un CAMECA 350 MHz
Les effets NOE différentiels ont été enregistrés à WISSEMBOURG sur .un A.M.
400 MHz de la Société BRUKER.
Le spectre de l'acide B mercaptopropionique a été réa-
lisé sur spectromètre 80 MHz au Centre de RM N de l'Université Claude
Bernard.
R M N 2D
Toutes les expériences &~ bidimensionnelles ont été
effectuées à 250 MHz au Centre d'Etudes Nucléaires de GRENOBLE (C.E.N.G.)
L'évolution de l'intensité
des raies en fonction du
temps, après double irradiation (spectres partiellement relaxés) ainsi
que les mesures différentielles d'effet NOE ont été réalisées suivant le
protocole expérimental décrit par HALL et SANDERS [35J.

---

-
135 -
111.2 - PHENOMENE DE RELAXATION
111.2.1 -
TEMPS DE RELAXATION LONGITUDINALE Tl
OU RELAXATION SPIN-RESEAU.
En présence d'un champ magnétique externe Bo [lJ [2J
[3J les noyaux de spin l = 1/2 s'alignent de facon "parallèle" ou "anti
parallèle" à B
connne illustré sur la figure III. 1
o
z
M
J
Fig. 111.1 - Orientation classique des protons
en présence d'un champ magnétique externe B .
o
La tendance d'un noyau à s'aligner ·para11è.lement
au champ [lJ et à ,rester ainsi dans le niveau d'énergie le plus faible
est entravée par les mouvements thermiques qui tendent à rétablir une
distribution de population suivant la loi de Boltzmann
flE
= exp
(kT)'
(III. 1)

---

-
136 -
n
et n
étant respectivement le nombre de noyaux par unité de voluùe
+
dans les niveaux d'énergie faible et élevé.
Si initialement l'échantillon contenant le système de spins
en dehors d'un champ magnétique (figure 111.2) la différence d'énergie
entre les deux niveaux est nulle et les populations n+ et n
sont
égales.
(2)
_ _- - - - - - - - - n
; '
; '
/
B
.. 0
,
_ _0
; '
hv
yh B
o
o
l = 1/2
" """
(1)
1
,--------------
= + -
2
B f: 0
Fig. 111.2 - Niveaux d'énergie d'un spin l = 1/2.
Quand l'échantillon est placé dans un champ magnétique, la distribution
de Boltzmann ne s'établit pas instantanément mais avec une constante de
temps Tl appelée temps de relaxation spin-réseau caractérisant la vitesse
avec laquelle le système de spins entre en équilibre avec le milieu. Il
est
aussi désigné cormne étant le temps de relaxation longitudinal car
il caractérise la vitesse avec laquelle l'aimantation M tend vers sa
z
valeur d'équilibre M (figure 111.3). On tend vers zéro quand on coupe
•
. 0
le champ
"to
dMz =
(III, 2)
dt

---

- 137 -
J
-+
Fig. 111.3 - Composantes de l'aimantation macroscopique M
dans les trois directions de l'espace quand B ~ 0 ,
Mz
Mo
à l'équilibre.
III.2.2 - TEMPS DE RELAXATION TRANSVERSALE T2
OU RELAXATION SPIN-SPIN.
Si les différents spins d'un échantillon préces-
sent individuell~ment à la pulsation W
=
y B
' i l faut [1] [3J pour
o
o
avoir une aimantation macroscopique M
non nulle dans le plan horizon-
x,y
tal x, y, les mettre en phase. C'est le rôle du champ magnétique B
de
l
l'onde électromagnétique qui provoque la transition quand sa fréquence
est w ' Si l'on coupe brutalement B
(figure 111.4) les noyaux perdent
o
l
cet accord de phase initial avec une constante de temps T
telle que :
2
dM
~
(III. 3)
dt

---

- 138 -
-
M.I.
-...... "",,,
----~------"',
~:
Fig. 111.4 - Déphasage des spins dans le temps.
contribuent à la perte de phase donc la diminution de T
:
Z
- les inhomogénéités de champ qui font
précesser les noyaux à des vitesses
différentes.
les champs magnétiques locaux dûs à des dipôles voisins électroniques ou
nucléaires (interactions spin-spin)
le flip-flop des moments dûs à la relaxation spin-réseau.
Le résultat est un élargissement de la raie de la résonance
qui est inversement proportionnel à T •
(~v t- )
0<:.
Z
2
III.Z.3-INTERET DES TEMPS DE RELAXATION Tl
ET T Z
1II.2.3.1 - INTERACTIONS MAGNETIQUES
DIPOLAIRES
Le principal processus [1] [4] [5] qui conduit à
la relaxation spin-réseau implique un champ magnétique fluctuant dans
l'échantillon dû aux mouvements moléculaires. Ces champs fluctuants
peuvent être conçus comme renfermant des composantes de fréquence qui

---

- 139 -
peuvent interagir avec le spin nucléaire à la fréquence de Larmor.
L'efficacité de ce champ fluctuant dans la relaxation d'un noyau dépend
19
1
- de la grandeur des moments nucléaires (
F et
H sont les plus effi-
caces à entraîner la relaxation) et de la concentration.
- de la distance entre les noyaux.
- de la distribution de fréquence du mouvement (seules les composantes
du mouvement à la fréquence de Larmor du noyau voisin qui est efficace
dans la relaxation).
La théorie du mouvement brownien a été appliqué [3] [6]
à la relaxation par BLOEMBERGEN, PURCELL et POUND. Ils ont utilisé le
temps de corrélation T
qui mesure le temps au cours duquel deux noyaux
c
restent dans une orientation relative donnée. Pour la rotation molécu-
laire le temps de corrélation peut être défini comme étant le temps mis
par une molécule pour tourner sur elle-même d'un angle appréciable (soit
pratiquement 33°). Pour la translation le temps de corrélation est le
temps requis par la molécule pour parcourir une distance égale à son
diamètre. Le processus rotationnel est lié à une relaxation intramolé-
culaire, tandis que la translation est liée à la relaxation intermolé-
culaire. A partir d'un traitement de données BLOE~ffiERGEN, PURCELL et
POUND ont démontré les relations suivantes dans lesquelles Cl C
C
2
3
sont des constantes de proportionnalité
103 r-------:------~----_;.
Cl T c
=
(III. 4)
Tl
4rr2 \\}2
2
+
T
0
c
C
T
1
3
c
10-11-----~-----+--_r_--_j -
= C T
+
2
T
c
2 2
....u
2
1 + 4rr2\\}
T
0
.....!!?
1
J.:"
1
10-s~----_+-----i-~:__----_j
Fig. 111.5 - Représentation schéma-
1
1
T~
tique de la variation du temps de
l
" - - - - - 1
relaxation avec le temps de corré-
1
lation T
d'aprus BLOEMBERGEN et
al. [6] c
~
121TZlol 11
10-11
10-1
Tc _ _ (sec)

---

- '40 -
Pour un mouvement moléculaire rapide,
-'- » 2 II V
,l'équation IIL4 se
lC
0
réduit à
'
~ l
(IILS).
T,
c
Pour un mouvement moléculaire très lent, -'- « 2 II V
, l ' équa tion III. 4
l
0
c
devient
-' 0<._' (IIL6 ).
T,
lC
,
Un temps de corrélation
T
=---- conduit à la relaxation spin-réseau
c
2IIvo
la plus efficace, avec des valeurs
de T,
élevées pour l
plus court ou
c
plus long. Sur la figure 111.S on voit que T
coincide avec T
pour des
2
1
valeurs de l
petites, quand
l
augmente les interactions dipôle-dipôle
c
c
deviennent importantes entraînant l'élargissement des bandes de résonance
et des T
courts.
2
IIL2.3.2 - 1NTERÊT DES TEMPS DE RELAXAT ION
SPIN-RESEAU DANS L'ANALYSE SPECTRALE.
Nous venons de voir que le mécanisme majeur de
la relaxation d'un proton consiste en une interaction dipôle-dipôle [SJ
avec d'autres protons. La vitesse de relaxation [7J d'un proton l,' R (1)
1
résultant de ce type d'interaction avec S protons voisins est donnée par
l'équation:
(III.7)
l
temps de corrélation rotationnel
c
distance entre l et S.
Les temps de relaxation des protons peuvent donner directement des infor-
mations sur la géométrie des molécules, surtout celles des composés de
structure rigide dans lesquels tous les noyaux appartenant au squelette
ont le même l .
C'est le cas des stéroïdes où les protons rattachés au
c
"squelette" ont tous le même T
,
de sorte que leur vitesse de relaxa-
c
tion R
caractérise la distance qui les sépare des autres protons.
1
Ainsi les protons méthiniques (CH) se relaxent plus lentement que les
méthyléniques (CH ). Dans une expérience ud'inversion de spin" i l est
2
possible de sortir les pics des CH enfouis éventuellement en dessous des
bandes de résonance CH •
2

---

- 141 -
III.2.3.3 - MESURES DES TEMPS DE RELAXATION
Nous insisterons sur la technique dite "écho
de spin" et particulièrement la méthode de CARR et PURCELL [7]
dont i l
est important de bien comprendre le principe pour mieux appréhender les
oases de la R M N à deux dimensions (R M N 2D).
III. 2 .3.3.1 - MESURES DE T 2 PAR LA METHODE
DE CARR-PURCELL.
Pour simplifier la description du mouvement
de l'aimantation de cette expérience, on se place dans un référentiel tour-
-+
nant (x',y',z')autour du champ permanent B
à la fréquence \\)1
du champ
o
de radiofréquence appliqué El.
Initialement l'aimantation macroscopique
M_ est orientée suivant l'axe z (z = z' dans le référentiel tournant)
z
-+
parallèlement à B
. On applique un champ de R F,
B (t)
dans un plan
o
1
-+
normal à B
pendant un temps 1 tel que la résultante de l'aimantation
o
II
à l'équilibre Mo ' tourne de ~
autour de B
: c'est une impulsion de
1
2"
comme illustrée par la fig. III.6a. Du fait de l'inhomogénéité du champ
B
,les noyaux à différents endroits de l'échantillon vont avoir des
o
fréquences de Larmor différentes. Nous pouvons penser à un certain nombre
d'aimants m. provenant des différentes parties de l'échantillon. Après
~
l'impulsion de 90°, ces m. commencent à se disperser en éventail
l
(fig. III.6b) dans le plan x, y puisqu'ils précessent à des fréquences
différentes de celle du référentiel tournant. Il en résulte une décrois-
sance de
M
avec T . Après un temps 1 aussi court que possible pour
xy
2
atténuer les effets de diffusion, on applique une impulsion de 180° qui
entraîne les m. à se rassembler si bien qu'à un temps 21 les vecteurs m.
l
l
s'unissent en une forte aimantation dans la zone négative de y (fig.III.6c)
On attend de nouveau un temps 1, les spins se déplacent (fig. III.6d)
et à 31
on émet une deuxième impulsion de 180° qui met les spins en
phase
(fig. III.6e) puis au temps 41
on observe un écho positif
(fig. III. 60 .
En résumé on éme t les impulsions 1 aux
temps
31 , 51
etc .• (2k + 1)
et on observe des échos de spins qui
sont :
négatifs aux temps
21 , 61 , 101
etc ...
positifs aux temps
41
81 , etc ...

---

-
142 -
a
b
c•
---~~--....~-,.'
-"";'~~~~ff-,- , '
.1
\\
1
~ ... ~---
,~
....
1 ) '
,
t.
.........
. . ~~~
Echo négatif a 2.
impulsion
impulsion 'TT au temps ~
d
e
f
~
Il
a
•
,
impulsion ~ à 3.
Echo posi ti f a 4.
impulsion
""r
à S•• Etc .. ,
-.r
..,.
----___J
J\\
• Co
5t'
s't
I\\.'t
Fig. 111.6 - Mesure de T
par la méthode de CARR-PURCELL
[8J.
2

---

- '43 -
III.2.3.3.2 -
MESURES
DE T,
PAR LA METHODE
--------------
CONVENTIONNELLE
Les mesures de T, par la méthode classique
[8J
s'effectuent selon le procédé illustré sur la figure 111.7. On bas
cule l'aimantation M
de 180 0 (fig. III.7a) et on attend un certain
z
temps T variable de zéro à quelques T,
au cours duquel l'aimantation
diminue d'une certaine valeur (III.7b). Après un dernier renversement
de l'aimantation de 90 0 (fig. III.7c), on mesure la valeur initiale du
signal de F l D obtenu que l' tm porte sur un graphique en· fonction de t
(fig. III.7a). La courbe obtenue répond à l'équation:
_ t/ T,
M
(t) =
(, - 2 e
)
z
III.e
III.2.3.3.3 -
MESURES DE T,
PAR LA METHODE
DU POINT ZERO
Quoique précise la méthode précédente néces-
site énormément de temps. Récemment COLEBROOK et HALL [9J ont proposé
pour l'analyse qualitative une procédure simple et rapide, dans laquelle
les valeurs des vitesses de relaxation R, (R, =~) de chaque résonance
sont prises directement à partir de leur point zé~o par la relation
R, = 0,69/t
(III. 9) .
t est le temps d'attente en seconde nécessaire entre deux impulsions,
pour obtenir un spectre partiellement relaxé dans lequel la résonance
d'un proton particulier s'annule. L'avantage de la méthode du point zéro
est la rapidité d'interprétation du spectre, un simple examen des spec-
tres partiellement relaxé
permet d'accéder aux R,. Une estimation est
réalisable même avec des bandes de résonance superposées.
Cette méthode a l'avantage d'être rapide dans
certains cas, mais elle est peu précise. En effet elle n'est applicable
que lorsque l'on obtient vraiment des variations exponentielles de
l'aimantation au cours du temps.

---

~
•
•
Iiii.+- ....'.1.. 11'
.... ,,\\,
::>Ill<
.. ').
71""'-
1
....:L..
:
• 'f
,
1
,
,
~,
a:
"
Renversement qe l'aimantation par une impulsion TI. L'aimantation
impulsion
ft
décroît pendant le temps L
"2'
.i(ij
.
.
"\\.
- - - - - - - - - - - - - -
. .. ,_ .... --
. .
~
~
1
'"l:'
Courbe représentant les yaleurs initiales de la F.I.rr.
en fonction du temps
T
- "'t.
Fig. 111.7 - Mesure de T
par la méthode conventionnelle.
2

---

- 145 -
III.2.4 - TECHNIQUES DE DOUBLE
IRRADIATION
(DI)
III.2.4.1 - DECOUPLAGE HOMONUCLEAIRE
(l H .1 H )
Bien souvent on doit avoir recours à des méthodes
physiques ou chimiques permettant de simplifier les spectres pour en
rendre l'analyse possible.
L'une des techniques physiques majeures, est la
méthode de double irradiation (d.i) introduite par BLOCH [10] en 1954.
Elle consiste à irradier simultanément l'échantillon avec deux champs R.F.
différents. L'un des champs de R.F sert à réaliser la condition de réso-
nance, l'autre est ajusté de manière à saturer l'absorption des noyaux
couplés avec les noyaux dont on veut analyser la bande de résonance.
La saturation a pour effet de supprimer les couplages entre les deux
groupes de noyaux considéré~, il en résulte une simplification du spectre
"découplé".
La méthode est applicable [3] quand le déplacement
chimique est supérieur aux constantes de couplage (v
<5 "» J
système AX).
o
Elle devient difficilement exploitable quand les spectres présentent des
structures qui se superposent. C'est le cas des spectres des stéroîdes
[11] où la double irradiation classique est pratiquement sans intérêt et
constitue une perte de temps si l'on veut attribuer tous les protons par
cette méthode. Fort heureusement l'utilisation du contrôle par ordinateur
[11] a permis d'étendre considérablement l'exploitation de cette technique.
En effet cela a donné la possibilité de faire des spectres différentiels
de découplage obtenus en soustrayant du spectre témoin (spectre normal)
le spectre découplé (spectre ayant subi la DI). Seuls les protons couplés
au proton irradié apparaissent sur le spectre différentiel.
C'est un moyen puissant de détection des multiplets
enfouis.
III.2.5 - EFFET OVERHAUSER NUCLEAIRE
(N.O.E)
Considérons [1] un spin l ayant des interactions
dipôle-dipôle avec ses voisins. On appellera
B
: champ d'induction magnétique orienté selon Oz .
o

---

- 146 -
champ de radiofréquence considéré comme tournant dans le plan
(x,y) à la fréquence v
dans la même direction que les. noyaux
1
qui précessent autour de B .
o
B
second champ de R F tournant aussi dans le plan (x,y) dans la
2
même direction que B mais à la fréquence v
•
1
2
Si B
est choisi de façon à saturer partiellement la .
2
résonance de l mais insuffisant pour découpler l et S, on constate
une perturbation dans la distribution de BOLTZMANN de S, entraînant
une augmentation de l'intensité de sa résonance
L'intérêt de ce phénomène [11J dans l'analyse structurale
est liée au fait que les interactions dipôles-dipôles sont inversement
proportionnelles au cube de la distance entre les noyaux, de sorte que
les informations sur les distances entre protons peuvent être obtenues
dans les cas favorables. Ceci est illustré par le composé 1.
L'intensité de la bande de résonance. de ~ est augmentée
de :
- 32 % quand HA (proton géminal) est irradié.
6 % quand H
ou H
(prton vicinal) est irradié.
B
C
3 % seulement quand ~ ou ~ (proton en interaction 1-3 diaxiale
avec ~) est irradié.

---

-
147 -
Les interactions n~ses en évidence par effets NOE sont celles
où il existe une proximité spatiale sans couplage : par exemple les
protons en interactions 1-3 diaxiale. Cependant les calculs montrent
que ce genre d'effet NOE de l'ordre de 3 % est difficilement observable
en routine par les méthodes classiques. La spectroscopie de différence
d'effet NOE dans laquelle le spectre témoin (spectre normal) est soustrait
d'un spectre irradié de sorte qu'apparaissent sur le spectre ·différentiel
les seules résonances modifiées par effet NOE,
permet de mesurer les augmen-
tations d'intensité de 0,5 %. Des valeurs plus faibles peuvent être obte-
nues quand un ordinateur contrôle la fréquence de découplage, l'enregis-
trement simultané d'un témoin et plusieurs spectres irradiés. C'est donc
un moyen puissant d'analyse des spectres des molécules complexes comme les
stéroîdes.
III.2.6 -
R M N 2D
En général [12J dans toute expérience RMN 2D on peut
distinguer schématiquement 4 intervalles de temps (figure 111.8) =
- une période de préparation qui correspond simplement au temps nécessaire
pour atteindre l'équilibre thermique.
- Une période d'évolution (t 1)
au cours laquelle un champ de RF est
appliqué •
- Un temps de "mélange" (mixing time")qui n'est pas indispensable, et
qui correspond à des durées d'irradiations et des délais d'attente
précis.
- Un temps de détection (t ) qui est la période d'acquisition du signal.
2
Celui-ci est détecté comme une fonction de la variable temps (t ) avec
2
comme paramètre la durée. de la période d'évolution t .
1

---

--
-
148 -
1
1
Préparation
Evotluion
"Mixing"
Détection
1
1
1
1
1
1 •
• 1
1
1
1
•
1
1
'1'
Fig. III. 8 - Subdivision générale de l'axe des temps dans une
expérience RMN 2D.
III.2.6.1 -
DESCRIPTION CLASSIQUE DE LA 20.
11I.2.6.1.1-ACQUISITION DU SIGNAL.
Soit un un ensemble de spins nucléaires [12J
dans un champ magnétique homogène B • Dans cet exemple la période de pré-'
o
paration est longue comparativement au temps de relaxation longitudinale
Tl' A la fin de cette période, l'aimantation résultante est parallèle au
champB
(figure 111.9),
o
Fig. II.9 - (a) Schéma de l'expérience 2D discutée dans le texte
La période de "mixing" est ici absente.
(b) Pression de l'aimantation M
à la fréquence yB,
durant la période d'évoluti8n dans le plan (x, y)

---

- 149 -
Pendant t
un champ de RF est appliqué le long de l'axe des x
1
dans un référentiel tournant à la fréquence n
proche de la fréquence
R
de Larmor
yB
des spins nucléaires. Si l'on néglige les effets
o
d'''Off Resonance", l'aimantation tournera durant t
à la vitesse angu-
1
laire
n
= yB
autour de l'axe des x dans le plan y z . Après coupure
1
1
du champ B
,l'aimantation précesse à une fréquence
QZ =yB
- n
1
o
Z
autour de l'axe z dans le le référentiel tournant. En utilisant une
détection en quadrature (détection simultanée des composantes M , M
:x:
y
de l'aimantation transversale), le signal est donné par la relation:
M
sin
o
(III..10)
La décroissance de l'aimantation durant la période d'évolution
et de détection est caractérisée par les constantes de temps T (1) et
1
(Z)
TZ
III.Z.6.1.Z - TRAITEMENT DU SIGNAL
Théoriquement une expérience de R M N TF ZD [13J peut
être réalisée en une seule étape. Mais il s'est avéré utile en pratique
de faire deux séquences de transformations séparées à une dimension. Le
signal enregistré [14] S (tt' t ) subit une T F d'abord selon t
Z
z
(temps d'acquisition) puis selon t
(délai variable entre les impulsions).
1
Après traitement des paramètres (t ,t ) on obtient une surface
1
Z
dans l'espace t ,t
(figure 111.10). L'information n'apparaît qu'après
1
Z
les deux transformées de Fourier, d'où la nécessité de traiter toute la
surface. Ce traitement demande n.k TF
: nT F selon t
avec lecture et
1
stockage sur disque, puis retournement de la matrice de données et une
deuxième T F selon t~.
D'où la nécessité de disposer d'un ordinateur
...
performant.

---

- 150 -
A
----------------..,~ t.,z.
B
---------------~>
"'1.
c
5 (Y, 1)11. )
- - - - - - - - - - - - - - - - - y~
Fig. 111.10 - Traitement du signal d'une expérience RMN 2D
(A) signal non traité.
(B) traitement de S (t
t ) selon t
.
1
2
1

---

- 151 -
III.2.6.2 - SPECTROSCOPIE 2D
(J
-
ô)
Un ensemble de sp~ns S [14J est caractérisé par
un certain nombre de paramètres : ô , J,
Tl '
T
, effet NOE
etc ••
2
La plupart du temps le chimiste n'est intéressé ou ne souhaite mesurer
à la fois qu'un nombre réduit de ces paramètres. La séparation des
déplacements chimiques des constantes de couplage est une méthode de
choix qui facilite la tâche du chimiste.
Le principe de la 2D (J - 0) (figure III. n)
repose sur le fait que les échos de spin ne sont pas sensibles à des
variations de déplacement chimique [13J mais sont modulés par les
constantes de couplage J. Nous avons vu dans la méthode de CARR-PURCELL
qu'après une impulsion de 900~ les spins perd9.ient progressivement
leur phase dans le plan (x,y). L'impulsion de 180 0 non seulement les
remet en phase mais crée simultanément des échanges entre les compo-
santes de multiplet, de sorte que la précession se poursuit avec des

---

- 152 -
fréquences différentes (fréquences modulées par les J). Il en résulte
que le spectre 20 comporte dans la dimension F
(fréquence v ) unique-
1
1
ment l'information concernant les constantes de couplage:
Exemple d'un système AX couplé avec une constante de couplage J.
(figure 111.12).
t1
- -
0
--
/
1
~4 ·tl-
il,. .. '/~
1
-J
.Jl
1
1L
' JI:i
V~
Fig. 111.12 -
R M N 20-J - Cas d'un système AX.
Si l'échelle est la même dans les deux dimensions, les pics
de coordonnées (VA + J/2
J/2) et
(VA - J/2, + J/2) sont sur une pente
de 45° quelque soit vA' Une simple manipulation de la surface permet de
ramener cette pente à 90° (tilt de la matrice) on peut ainsi analyser
très en détail chaque massif qui apparaît comme ayant été pivoté de 90°
par rapport au spectre 10. On peut examiner individuellement des massifs
qui sont superposés dans une expérience 10 et mesurer des J avec une

---

- 153 -
précision supérieure à 0,1 Hz. La restriction de la méthode est que les
noyaux étudiés ne doivent pas être fortement couplés. Dans ce cas [15J
[16J il apparaît des raies supplémentaires.
II1.2.6.2 - EXPERIENCE DE CORRELATION
l H _l H
ENTRE NOYAUX COUPLES PAR UN COUPLAGE J
SCALAIRE.
Deux types d'expériences voisines peuvent être
utilisées, COSy (Correlated Spectroscopy) et SECSY (Spin Echo Correlated
Spectroscopy), différents par la présentation des résultats. (Figure 111.13)
II1. 2 •6 . 2 • 1 -
2.0 5 ECSY
Cette expérience nécessite deux impulsions de
90°. La première [14J crée des composantes d'aimantation transversales m.~
pour toutes les transitions permises. Durant la période de détection t 1
qui suit, chaque aimantation se trouve caractérisée par sa propre fréquence
de précession. La seconde impulsion de 90° ("mixing") entraîne des trans-
ferts d'aiœantation (matérialisés sur le spectre par des taches de corréla-
tion) parmi les transitions appartenant au même système de spins couplés.
Finalement pendant la période de détection on mesure les nouvelles fréquen-
ces de précession de chaque composante d'aimantatio~ mi' L'expé~ience est
répétée pour des valeurs de t
toujours équivalentes (t
= k ~t1 avec
1
1
k = 0, 1 •.•. k -1). '.Une TF 2D de la donnée de matrice S(t , t ) donne
1
2
le domaine de fréquence désiré sur le spectre. La figure 111.6 montre
l'étroite relation entre le SECSY et le COSY. Les deux techniques diffèrent
simplement par le moment à partir duquel démarre l'acquisition du signal
(figure III.13 a, et a') . Ceci conduit à deux types de données représentées
sur la figure 1;11. 13 par b et b', où 1
et
l '
3
et
3'
renferment
des valeurs identiques. Les spectres aussi renferment des informations
équivalentes.
La section par une ligne horizontale (parallèle à la ligne
de base) donne autant de taches que de raies, si la hauteur de coupe est
convenablement choisie. Ce qui permet d'éliminer le bruit de fond. Dans
l'exemple de la figure IlL 13 les spectres contiennent les seize taches
de corrélations du système AX.
Ces taches ont été obtenues en coupant

---

- 154 -
a
a'
~t1 +~12-
b
t1
~------~---------7
, "
·3
, "
,
,
/
/
/
/
/
t2
c
1
C
./J 1..
..-.
• • .1..
.
• • T
•
,
J&u
• •
:
•
_40-
• •
•
1 1
1 1
",,2
Fig. 111.13 - Comparaison de la 2D COSY (a,b,c) et 2D SECSY (a',b',c').
Le spectre normal apparaît sur une diagonale en c et sur une médiane
en c' sous forme de taches qu~ dépendent de la hauteur à laquelle
les raies différentes ont été coupées.

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- 155 -
les raies des multiplets apparaissant sur deux dimensions à des
hauteurs permettant de sélectionner les multiplets les plus intenses.

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- 156 -
REFERENCES
[ 1]
BECKER E. D.
1969, "High resolution NMR.. Theory and Chemical Applications".
Academie Press, New-York.
[2]
FARRAR T.C. and BECKER E.D.
"Pulse and Four ier transform NMR. : introduction to theory and
methods" • Academie Prass New-York and London.
[3]
BERNSTEIN H.J., POPLE J.A., SCHNEIDER W.G.
1969, "High resolution nuclear magnetic resonance"
Mc Graw Hill Company Inc. New-York.
[4]
ABRAGAM A.
1961, "The principles of nuclear magnetism". Oxford University press,
London and New York.
[5]
JACKMAN L.M., STERNHELL S.
1969 "Applications of nuclear magnetic resonance spectroscopy in
organic chemistry". Pergamon Press Oxfor, p. 238-241.
[6]
BLOEMBERGEN N., PURCELL E.M., POUND R.V.
1948, Phys. Rev. 2l, 679.
[7]
HALL L.D. and SANDERS J.K.M.
1980, J. Am. Chem. Soc. 102, 8, 2229.
[8]
a. CARR H.Y. and PURCELL E.M.
1954, Phys. Rev. 94,
630.
b. MALLET J.J., BONMARTIN A.
1981, J.
Biophys. et Méd. nucl.~,
2,67-68.

---

- 157 -
[9]
COLEBROOK L.D. and HALL L.D.
1980, Cano J. Chern. 58,
2016-2223.
[10]
BLOCH F., 1954, Phys. Rev. 2l, 944.
[11]
HALL L.D. and SANDERS J.K.M.
1981, J. Org. Chem. 46,
6, 1132-1138.
[12]
BAX A., 1982
I1Two dimensional NMR Spectroscopy l.n liquids l1 •
Delft University Press.
[13]
FREEMA."l R.
I1Introduction to dimensional NMR".
Conférence du G.E.R.M. VII (Groupement d'Etudes de Résonance
Magnétique)
Hars 1983.
[14]
LALLEMAND J.Y.
I1Intérêt de la R}lli à deux dimensions par rapport
à la RMN à une dimensionl1 •
Conférence du G.E.R.M. VII, Mars 1983.
[15]
KUMAR A.,
1978, J. Hagn. Reson. 30,
227.
..
[16]
WIDER G., BAUMANN R., NAGAYAMA, E&~ST R.R., WUTRICH K.K .•
1980, J. Magn. Réson. ~, 321.
[17]
NAGAYfu~ K., WUTRICH K.K. and ERNST R.R.
1979, Biochem. and Biophys. Res. Commun. 90, 1, 305-311.

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Association Corporative des Etudiants en Médecine de Lyon
8. avenue Rockefeller - 69373 LYON Cedex 08 - Tél. (7) 874.33.47

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