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.
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
U.E.R. DE PHARMACIE

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1
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POUR LE DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE
PR~SENT~E ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE 16 JUIN 1982
PAR
KOUADIO KOUAKOU Luc PHILIPPE
N~ LE 26 MAI 1955
AABIDJAN
APPLICATION DE LA R.M.N. 1H ET 13C
A L'ETUDE DES CALCULS BILIAIRES
DOSAGE DU CHOLESTEROL
PAR R.M.'N. 1H
JURY
MR. H. PINATEL
PROFESSEUR
MME C. CHAPELET - LETOURNEUX PROFESSEUR
MR B. PETIGNY ASSISTANT BIOLOGISTE DES HÔPITAUX

A mes parents:
· à mon grand-père OSSIENY Maurice KOUASSI
· à tous mes frères et soeurs.
· à mon oncle Dan ie l et à
ma tan te ] acq ue line N' DA KONAN
A tous mes amis:
• Guillaume DAKOUR 1
• Sébastien et Patricia DANO
A tous ceux qui. de près ou de loin m'ont
apporté leurs soutiens dans mes études.

AVANT PROPOS
Ce
travail
a
été
réalisé
à
partir
d'une
idée
originale
du
professeur
PINATEL,
qui
depuis
longtemps
s'est
intéressé
aux
appl ica-
tions
de
la
spectroscopie
de
Résonance
Magnétique
nucléa ire
(RMN)
dans les sciences biologiques et pharmaceutiques.
Je
voudrais
lui
exprimer
ma
profonde
reconnaissance
du
choix
de ce sujet pour ma thèse d' exercice.
La
réalisation
expérimentale
de
ce
travail
a
été
faite
avec
le
concours
de
Madame
CHAPELET
LETOURNEUX,
professeur
de
chimie
physique
à
l'UNiversité
CLAUDE
BERNARD
Lyon
1.
Son
expérience
dans
cette
technique
et
sa
rigueur
scientifique
ont
été
un
rempart
efficace.
Puisse
ce
tra va il
rendre
hommage
à
la
disponibilité que vous avez eue pour me transmettre vos connaissances!
Je
remercie
Monsieur
PETIGNY
assistant
biologiste
des
hopitaux,
de
l'accueil
aimable
qu'il
a
manifesté
à
mon
égard
lors
de
ma
visite
des
laboratoires
d'analyses
de
l'hopital
Antiquaille.
Sa
connaissance
parfaite
des
composés
principaux
des
calculs
biliaires
et urinaires a été utile dans ce travail.
Puissions
nous
tous
ensemble
oeuvrer
encore
positivement
sur ce chemin de la conaissance scientifique!

- 1 -
INTRODUCTION
Des
rayons
X
aux
ondes
radio,
la
plupart
des
régions
du
domaine
des
radiations
électromagnétiques
ont
trouvé
une
application
pratique
à
l'étude
des
molécules
principalement
par
les spectroscopies d'absorption.
Dans
tous
les
cas,
le
principe
fondamental
est
le
même:
il
s'agit
d'absorption
d'énergie
bien
que
les
mécanismes
soient
pa rfois
différents,
l' énergie
requise
pour
une
transition
entre
deux
états
fondamental
et
excité
est
reliée
à
la
fréquence
de
la radiation qui en est la cause par la relation:
E h "
Etat excité
;JJ_
h"
Etat fondamental
h est la constante de PLACK
V la fréquence de la radiation incidente.
L'analyse
structurale
et
fonctionnelle
fait
appel
de
plus
en
plus
à
des
méthodes
physiques,
parmi
elles
les
spectroscopies

- 2 -
ont une place de choix.
La spectroscopie ultra violette et visible qui est principalement
une spectroscopie électronique ne donne qu'une information" limitée.
La
spectroscopie
infra
rouge
(et
Raman)
fait
appel
aux
modes
de
vibrations
et
de
rotations
de
la
molécule
et
renseigne
surtout sur les types de groupements.
La
spectroscopie
de
micro
ondes
d'excitation
rotationnelle
renseigne
sur
les
longueurs
de
liaisons
et
les
angles
de
liaisons
(BRAZIER,
PEGON,
PINATEL,
1976 a).
La
spectroscopie
de
résonnance
magnétique
nucléa ire
(R. M. N)
qui,
primitivement
dévolue
à
l'étude
fondamentale
des
atomes,
est
devenue
l'une
des
plus
puissantes
méthodes
d'investigations
sur
la
structure
d'un
corps
(PLAT,
1971
a).
Elle
a
pris
en
quelques
années
un
développement
considérable
dans
tous
les
domaines de la chimie et en particulier en pharmacie .

Longtemps
considéré
comITe
un
outil
de
luxe,
réservé
à
la
recherche,
très
onéreux,
nécéssitant
des
salles
spécialement
équipées,
le
spectromètre
de
R.M.N.
a
évolué
en
fonction
des
demandes,
et
l'on
dispose
actuellement
d'appareillage
repondant
à
deu x critères:
l'utilisation
routinière
et
la
manipulation
par
des
non-spécialistes
avec
un
prix
d' acha t
ne
dépassant
pas celui d'un spectromètre infra rouge (l.R.)
ou u.v de
très grande qualité.
-
La
recherche
fondamentale,
notamment
dans
l'étude
des macromolécules naturelles ou synthétiques.
Dans
l'étude
du
médicament,
la
R. M. N.
présente
trois
axes
d'intérêt:
-
En chimie thérapeutique:
l'étude structurale et confor-
mationnelle des médicaments,
particulièrement ceux d'origi-
ne naturelle.
-
En
pharmacologie:
l'étude
des
protéines
et
de l'interac-
tion du médicament avec celles-çi.
-
En
chimie
analytique:
le
dosage
de
principes
actifs

3 -
dans
les
préparations
pharmaceutiques.
(PLAT,
1971b)
Autre domaine Imagerie R.M.N.
Cette
énumération
des
méthodes
modernes
d'analyse
serait
incomplète
sans
citer
la
spectrométrie
de
masse
qui
est
de
plus
en
plus
couplée
avec
d'autres
techniques
d'analyse
(exemple:
chromatographie et 1.R.).
A
l' heu re
actue Ile,
l'analyse
d' une
structure
moléculaire
se
fait
principalement
par
u.v.
visibl~,
R.M.N.,
l.R.
et
speactro-
mètre
de
masse
qui
sont
les
méthodes
fondamentales
et
doivent
entrer
tant
dans
la
pratique
courante
que
dans
l'enseignement.
(BRAZIER,
PEGON,
PINATEL,
1976b)
Dans
ce
travail,
nous
proposerons
une
ana lyse
des
calculs
biliaires
par
la
technique
de
Résonance
magnétique
nucléa ire
et
surtout
une
méthode
de
routine
d' identifica tion
et
dosage
du taux de cholestérol dans les calculs par cette même technique.
POur
mieux
apprehender
les
renseignements
uti les
que
la
R. M. N.
peut
fournir
sur
ces
composés
biologiques,
nous
ferons
un
rappel
des
principes
généraux
de
la
R.M. N.
du
proton
et du 13C , avant d'entrer dans le vif de notre sujet.

- 4 -
CHAPITRE 1
PRINCIPES GENERAUX DE LA R.M.N.
La
R.M.N.
est
une
techn iq ue
spectroscopiq ue
app lica b le
aux
noya ux
possédant
un
spin
(1)
non
nul.
Les
noyaux
de
masse
et de numéro atomique
pairs
ne
vérifieront
pas
cette
propriété.
Le tableau
çi-dessous
relie
1
aux
caractéristiques
du
noyau
(numéro
atomique
Z
et
nombre
de
masse
A)
(FREYMAN
et AL
1969a)
(BERNSTEIN et AL 1969a)
A
Z
1
Pa ir
Pair
0
Pair
lmpa ir
1 .2
Impair
Pair ou impair
1/2.3/2.
.... , ...
1
Tableau 1-1
1.1. Effet Zeeman nucléaire.
Une
image
classique
du
spin
est
donnée par
la
rotation
d'une
particule
chargée
autour
d'un
axe
passant
par
son centre
Un
tel
mouvement
est
défini
par
son
moment
cinétique
ou
moment
-)
de Spin
l'
de composantes
lx,
Iy,
lz.
Du point de vue quantique (le

5 -
seul
correct) ,
le
moment
cinétique
de
spin
est
tota lement
défini
par
son
module
et
la
va leur
d'une
seule
de
ses
composantes
disons 1
. Les va leurs de la composante
2
l
sont
Z
quantifiées
et de la forme:
::: m"ti
FREYMAN
et
al
1969b)
Le nombre pouvant prendre toutes les valeurs 1,1-1 ... 1-2 ... 1+1,
-1
~
Le module de 1 est aussi quantifié et vaut:
-..
1
1 1 ::: 1\\
1= Nombre quantique de spin caractéristique du noyau considéré.
1
1
1,
Il%- ::: 1/2/,
1
14
31p ::: 1/2
N
Pour
une
valeur
de
il
Y
a
21
+
1
valeurs
de
m
soit
21
+
états
de
spin
de
même
énérgie
pour
un
noyau
isolé
mais
d'énergies
différentes
lorsque
le
système
est
plongé
dans
un champ d'induction
magnétiq ue --
8 0
En
e ffel,
au
moment
' '
cinetique ' ' '
est 1 '
associe
un
moment
.....
- )
magnétique /
= YI
qui
lui
est colinéaire,
le facteur de propor-
tionnalité
r est appelé le rapport gyromagnétique.
- ' )
L'existence
de
ce
moment
magnétique
nucléaire 1
se
traduit
par
une
énergie d' interaction
avec
le champ
magnétique
d'induction
- >
c'est
l'effet
Zeeman.
Soit
O~ la direction de
Bo
. L'énergie
d'interaction est:
~
->
E m
- r . 130
E
- ir 13
m
z
0
Cette
énergie
d'interaction
est
fonction
de
la
valeur
du
nombre
quantique
m
et
proportionnelle
à
l'intensité
du
champ
8 0
,
L'écart entre deux niveaux d'énergie consécutifs m et m+1
est:
Une
expérience
de
R.M.N.
consiste
à provoquer des transitions
entre deux niveaux Zeeman consécutifs:
Il
y
aura
transition
si
on
dispose
d'un
rayonnement
de

- 6 -
fréquence
Vo
tel que:
Ou encore
W o = 2 1( Jo
~ 8
c'est la condition de la résonance.
0
Ces
relations
sont
en
accord
a vec
la
théorie
classique
c'est
pourquoi
on
parle
à
propos
de
Wo
et
V de fréquence
de précession de LARMOR.
L' absorption
de
rayonnement
élect romagnétiq ue
provoque
des
transitions.
A
la
différence
de
spectroscopie
optique,
on
est
ici
maître
de
la
fréquence
d'absorption
Vo , il suffit d'agir
sur l'intensité B
du champ appliqué.
o
Exemp le:
Dans
un
champ
8
de
14092
GAUSS
(l,409
Tesla)
0
le noyau d'hydrogène résonne à 60 MHZ
1.2. Conditions d'observation d'un signal d'absorption.
Cas d'un spin
l
1/2. Exemple: le proton.
1.2.1.
Intensité du signal.
( z \\
_1
l''W\\:
1
1-
I::~ 11
1
hU ~ '6 1. 13
o
0
f'I"l- +A-t \\
- -
,,
(-1)
"""= +-:!.
~=o
t
8
~ 0
0
_
't 1-17°
Si
1
= 300°1<
/li'
-!)
_ 1 0
Si
(0 ::" Go M'n~ ..,
Dans
les
conditions
ordinaires
de
température
(300 0 K)
dans
le
domaine
de
fréquence
de
la
R.M.N.
(de
20
à
250
MHz)
l'émission
spontanée
est
négligeable
devant
l'émission
stimulée
par
l'onde
électromagnétique
de
sorte
que
l'état
du
système
de
spins
nucléaires
résulte
du
bilan
tenant
compte de la probabilité
de transitions par absorption et par émission induite.

- 7 -
L' intensi té
d'une
transition
1 ----~) 2
est
proportionnelle
au
nombre
d'espèces
passant
de
l'état
1
à
l'état
2
pendant
l'unité de temps:
Soit
n-;i
le
nombre
de
spins
tels
que
m
+1/2
par
unité
de
volume
ou
population
de
niveau,,!,
n
la
population
du
niveau 2
l
L'émission spontanée étant négligeable,
les seuls processus de
transition sont l'absorption et l'émission induite.
L'absborption
se
traduit
par
une
diminution
n-;!
telle
que
cl/ll\\.-[
cl~t = _ 13-1. 'hj ;;;.
clc
cft
Cette
variation
est
proportionnelle
à
la
population
du
niveau
de
dépa rt
n~ et à la densité d'énergie différentielle /J = clfJ
r
-cff}
éta nt
l'énergie
par
unité
de
volume
du
faisceau
de
l'onde
électromagnétiq ue
L'emission
induite
correspond
à
une
retombée
des
spins
excités
du
niveau
2
vers
le
niveau
1
sous
l'influence
de
l'onde
hJo
elle suit une loi semblable à
l'absorption:
dt
Les coefficients d'absorption et d' emission in dui te B
et B
sont
12
21
égaux en
R. M. N.
Les
deux
mécanismes
se
superposent
et
le
bilan
s'obtient
en
faisant
la
somme
des
deux
relations,
la
variation
totale de population des deux niveaux s'écrit:
dn1
-
- -
dt
L'ensemble
de
ces
deux
seuls
processus
conduit
à
un
état
sta tionna ire
n 1
n 2 où
les
deux
niveaux
sont
également
peuplés
et dans
lequel
il
ne
peut
plus
y
avoir
d'absorption,
l'intensité
du signal s'annule.
Heureusement,
il
existe
un
autre
processus
de
retour
à
l' éq u i libre
à
la
température
considérée
(équilibre
thermique
n2
h V
o
,
de BOLTZMANN
~ = exp (~- KT- J
Quand
la
Jistribution
d'équilibre
est
perturbée
elle
tend
à
revenir
à
l'état
stationnaire
ainsi
défini
par
échange
d'énergie

- 8 -
non
radia tif
entre
le
système
de
spins
et
le
milieu
dans
lequel
ils
baignent.
Ce
processus
est
connu
sous
le
nom
de
relaxation
spin-réseau
(ou
spin
milieu)
il
est
caractérisé
par
un
temps
de
relaxation Tl
(constante de temps retour à l'équilibre)
Soit n la différence de population entre les deux niveaux.
'1'''['''''
n= nI
-
n2
prend la valeur no
dans l'état d'équi-
~
libre thermique.
L'évolution
de
retour
à
l'équilibre
thermique
en
l'absence
d'excitation suit la loi exponentielle en fonction
du temps:
t
n -
no
= C exp - - -
Tl
L'observation
du
signal
est
conditionnée,
outre
son
intensité,
pa r
la
la rgeur de la bande.
1.2.2.
Largeur de bande.
L'élargissement des bandes dépend de plusieurs facteurs:
-1
de l'incertitude
,6E sur les niveaux d'énergie
LlE . Dt
h
~t étant la durée de vie du niveau d'énergie. Une analyse précise
montre que
J.::::.t est proportionnel à Tl
de sorte queDV= l!(2T
)
I
-2
Des interactions entre spins
Les interactions
entre
spins
limitent
aussi
la
durée
de
vie
dans
un
état
de
spin,
ce
facteur
est
ca ractérisé
par
un
temps
de
relaxation
T
temps
de
relaxation
spin-spin
qui
est
différent
2
de T
et gouverne la largeur de la raie
T2 < Tt
-1
Dans
le
cas
des
liquides,
le
mouvement
Brownien
affa ib li t
considérablement
les
interactions
dipolaires
par
effet
de
moyenne,
il
en
résulte
une
durée
de
vie
beaucoup
pl us
grande
des
états
de spin et par suite T
est de l'ordre de grandeur de Tl
Z
Pour l'eau à
température ordinaire T2 ~
Tl ~ 2s.
Ces
valeurs
peuvent
varier
sensiblement
d'un
liquide
à
l'autre
et
ête
fortement
diminuées
en
présence
d'autres
phénomènes
accroissant
la
largeur
du
signal
(par
exemple
la
présence
d'ions

- 9 -
paramagnétiques dans le milieu comme nous le verrons plus loin)
-3
Cause
instrumentale:
l'inhomogénéité
du
champ
magnétique
B
entraîne
des
fluctuations
de
la
fréquence
de
résonance
et
un
élargissement
des
raies
d'absorption.
(BERNSTEIN
et
al
1969b)
(FREYMAN,SOUTIF.
1969cl
1.3. Instrumentation R.M.N.
La
technique
consiste
à
déterminer
le
pourcentage
d'énergie
absorbé;
cependant,
dans
le
but
d'augmenter
la
sensibilité
de
la
détection,
il
faudrait
qu'il
Y
ait
le
plus
possible
de
noyaux
ayant leur spin dans le niveau d'énergie le plus faible.
Cet
objectif
peut
être
atteint
soit
en
abaissant
la
température
ou
en
augmentant
le
champ
magnétique,
soit
en
agissant
simulta-
nement sur ces deux paramètres.
Mais
il
y
a
des
limites
d'ordre
technologique
à
la
variation
de ces paramètres.
(CHANG,
COLLEGE,
1971)
1.3.1. Composition de base d'un spectromètre R.M.N.
Les
ca ractéristiq ues
de
base
d'un
spectromètre
R.M.N.
sont:
une source de radio- fréquence.
u ne bobine receptrice
un champ magnétique
un enregistreur ou un oscilloscope
La
figu re
n °I.lmontre le diagramme schéma tiq ue d'un spectromè-
tre R. M. N.
Le
tube
renfermant
l'échantillon
est
placé
entre
les
pôles
d'un aimant puissant.
Le
champ
de
la
radio-fréquence
est
produit
par
une
bobine
associée
à
l'oscillateur
de
radio-fréquence.
La
bobine détectrice
est
à
angle
droit
de
la
direction
du
champ
magnétique
et
de
la bobine du transmetteur.
La
transition
du
moment
magnétique
nucléaire
induit
une
force
électromotrice
dans
la
bobine
détectrice
qui
est
amplifiée
et affichée dans l'enregistreur ou dans l'oscilloscope.

(4 )
(1)
(5 )
~
(
,"
!r
;."
"oiV
(1)
Alimentation
de
l'electroaimant
(2)
Générateur de balayage
'-'
1 -
L...J
1..-1
(3 )
recepteur
du
signal
de
Radio-
fréquence
,
(4 )
aimant
1
(5 )
Oscillateur
(générateur
d'onde
®
éleâromagnétiq y.e)
(2 )
0
v-
(3)
....
cr
X
y
Figure 1.1
Diagramme de BLOCH
Montrant un spectromètre RMN équipé d'un électro-aimant
,

-
II -
Le
relevé
d'un
spectre
s'effectue
au
moyen
d'un
balayage
soit
en
champ
soit
en
fréquence.
Il
semble
à
l' heure
actuelle
que le balayage en fréquence soit le plus adopté.
Un
asservissement
entre
ce
balayage
et
un
enregistreur
fa it
correspondre
une
valeur
bien
déterminée
de
l'induction
à
l'abcisse d'un point du diagramme.
La
vitesse
de
balayage
joue
un
rôle
important
dans
l'aspect
du
signal
observé
quand
la
condition de résonnance est réalisée.
Les
spectres
sont
enregistrés
dans
les
conditions
de
balayage
lent
(ce
qui
suppose
le
temps
de
traversée
de
la
bande
nettement
supérieur au temps de relaxation)
Sur
les
appareils
modernes,
il
y
a
un
asservissement champ-
fréquence
(système
LOCK).
Une
variation
accidentelle
du
champ
entraîne
une
variation
proportionnelle
de
la
fréquence
qui
en
minimIse les effets.
Une
turbiij\\(>
pE rmet
de
fa ire
tourner la
tube
contenant l' échan-
tillon afin de minimiser les inhomogénéités du champ magnétique.
1.3.2. Accessoires
1.3.2.l.
lntégrateur.
Il
permet,
à
partir
d'un
spectre
en
mode
d'absorption,
l'obtention
d'un
enregistrement

les
hauteurs
des
différents
paliers sont directement proportionnelles
au
nombre
de
noyaux
mis en jeu dans chaque signal de résonnance.
1.3.2.2. Température variable.
Lorsq ue
la
température
de
l'échantillon
décroit,
les
intensités
des
raies
de
résonnance
augmentent
en
fonction
de
l'accroissement
des
différences
de
population
entre
les
différents
niveaux
d'enre-
gistrement.
D'autre
part,
un
certain
nombre
de
phénomènes
dépendent
de
la
température:
rotations
génées
par
encombrement
stérique,
vitesse des réactions d'échange .....
(BERNSTEIN et al 1969d

12 -
1.3.2.3. Découpleur de spin.
Le
découplage
de
spin
s'effectue
au
moyen
d'une
modulation
annexe.
IL
peut
s'effectuer
soit
en
balayage
de
champ
soit
en
balayage de fréquence.
Ce
dernier
procédé
rendu
possible
par
l'utilisation
d'un
système
à
stabilisation
interne,
présente
l'avantage
de
détecter
en
un
seul
passage
tous
les
couplages
avec
le
groupement
saturé.
(
FREYMAN et al 1969d)

- 13 -
1.4. Etude des spectres.
Nous
nous
interessons
ici
uniquement
aux
spectres
de
haute
résolution
c'est
à
dire
effectués
sur
des
échantillons
liquide
ou gazeux.
(RMN -
HR)
Trois facteurs important caractérisent les spectres de RMN:
position des bandes (déplacement chimique)
structure des bandes
(constante de couplage)
intensité des bandes qui est proportionnelle au nombre de
noyaux qui résonnent.
1.4.1. Déplacements chimiques.
La
fréquence
Vo étant fixe, la résonnance se produit quand
le champ exercé sur le noyau atteint la valeur Bo
telle que:
MAis
ce
champ
B
diffère
du
champ
B
appliqué
et
lui
est
o
proportionnel
avec
un
coefficient
a- (appelé
constante
d'écran)
tel que:
Bo
(-1 + ~)
c=
8 (l -
tr
)
soit B #-
130
car
(T"" #'
-1 0- G
On
COilçoit
que
la
valeur·
du
champ
B
à
appliquer
pour
trouver
la
condition
de
résonnance
soit
différente
suivant
le
type
de
noyaux
présent
dans
la molécule:
elle
dépend
de l'environ-
nement
chimique
de
ces
noyaux,
c'est
à dire de
la charge électro-
nique
au
voisinage
d'un
noyau
(en
RMN
du
proton,
les
hydrogènes
méthyliques
ne
résonnent
pas
au
même
endroit
que
les
hydrogènes
méthyléniques,
vinyliques ... )
Pour mesurer le déplacement chimique, on utilise une référence
qui
fournit
un
signal
pour
la
valeur
Br du
champ
appliqué
la
différence
Bi
Bx
pour
les
noyaux
i
est
une
mesure
de
leur
déplacement chimique.
= (~o (-1 t 51) -
Bo ( --1 +C)r )
= (~- ~,.) 130
Soit
1
-
6
grandeur sans dimension.
1<5l - ~ 1 := 'b..(""'0

- 14 -
Si
on
balaye
en
fréquence,
le
champ
est
fixe.
Appelons
le 8 0
Le champ vu par le noyau Il
est Br
Br = BoO - 0;
Pour le noyau i
Bi
Bi= Bo (l - ~ )
J,
)5
f2>r
W r = ({ t3Jr
= 271
Wl = ~ 13~
J
~
ft.
=
B..,i.
~:;r
J1 - J.r =
.,.f -+ ~ )
(~
Jo
- GX )
O.i ..10-6" Hz..
A 60 L~Hz
l'ensemble
des
fréquences
est
situé
dans
un
intervalle
de 1000 11 z
La
substance
de
référence
peut
être
interne
(en
solution
dans
l'échantillon)
ou
externe
contenue
dans
un
capillaire
plongeant dans l'échantillon).
Un référence interne souvent utilisée est le TMS Si
(CH )4
tous
3
ses
protons
étant
équivalents
il
donne
une
seule
raie
fine
intense
située
du
côté
des
champs
forts
(extrème
droite
des
spectres
de
RMN)
insoluble
dans
l'eau
il
doit
être
utilisé
en
reférence
externe er. mi lieu aqueux.
Sur
les
appareils
actuellement
utilisés,
le
balayage
est
suffisamment
linéaire
pour
que
l'échelle
des
spectres
soit
graduée
linéairement en ppm ou en Hertz.
(BERNSTEIN,
POPLE, SCHNEIDER ..
1969d)
1.4.2. Structure des bandes. Couplage spin -
spin.
Un
type
donné
de
protons
peut
donner naissance non pas
seulement à une raie mais à
une bande de résonnance
possédant une
structure.
Cette
structure
nous
donnera
des
informations
très
précieuses
sur l'environnement des protons responsables du signaL
Exemple:
la molécu le C~
- CH
-
COOH
2
possède
trois
types
de
protons
différents
C~
,CH
et COOH
2
donc en principe,
trois raies de déplacements chimiq ues différents.

- 15 -
Les
raies
de
CH 3
et
de
CH 2
présentent
une
structure
caractérisée par la
distance
constante entre
les
raies
des multiplets:
c'est
la
constante
de
couplage.
Cette
distance
est
indépendante
de
la
valeur
de
la
fréquence
Vo appliquée kO'1trairement à la
distance Jo 0 entre deux bandes).
.2
3
3
Les
intensités
des
raies
du
spectre
de
premier
ordre
sont
données par le développement du binome (a + b
)n ou
plus simplernent
en utilisant le triangle de Pascal
(BRAZIER.
PEGON.
PINATEL.1976c)
1
1
2
3
3
1
4 6
4
1
Les
systèmes
les
plus
fréquemment
rencontrés
sont
résumés
dans le tableau n°
1.2.

- 16 -
f} L L u IZ f
cft{
Ste c f 'fe-
~ ~
..d. -.J.
3
3
_1J1~. ÎL
Vx ~--------,U)----,
4
b
_--I-Î_lU Î
~ ~
L{ ---J...---U'-----
r
-
lt
zo
_....a..:--Itilit :
~ ·
v.~" '---'"-------U----
VJt
Tableau 1.2.

- 17 -
1.4.2.1. Classification des spectres.
défin i tions:
Noyaux chimiquement.
équivalents:
ILs
ont
le
même
déplacement
chimique,
on
les
désigne
par
la
même
lettre de
l'alphabet
(noyaux
isochrones)
Noyaux
magnétiquement
équiva lents;
Ce
sont
des
noyaux
chimiquement
couplés
de
la
même
façon
avec
un
noyau
donné
quelconque
d'un
autre
groupe
de
noya·ux
chimiquement
équivalents:
2 noyaux magnétiquement équivalents sont notés AZ
2 noyaux non-magnétiquement équivalents sont désignés AA'.
Soit deux noyaux de déplacement chimiques g différents et cou-
p lés
avec
une constante
J si J.J~ >/
J
on les notera respectivement
A et
X (SA~I 'JAX: Système AX) Si 1 /V
ou»VoS,
on les appellera
A et
[3
(système AB)
Si
trois noya ux
tels
que
tous
les
8Jo >? J on les a ppelera
système AMX.
Sytème AmXn ou A M
X
: ce sont des systèmes dont tous les
n
n
noyaux
A sont
magnétiquement équivalent et
les
noyaux
magnétique-
ment équivalents entre eux.
~MX
3
déplacements
chimiques
et
3
constantes
de
couplage seulement avec:
JAM
~<
AM
JAX
<<.
AX
JMX
<C-
MX
1.4.3.
Intensités des bandes.
L'intensité
d'une
bande
est
égale
à
l'aire
délimitée
par
la
ligne
de
base et
la
raie d' absorption
du
spectre.
Cette
intensité
est
proportion ne Ile
au
nombre
de
protons
qui
résonnent,
il
s'agit

18 -
là de l'intensité totale des multiplets s' il Y a
des couplages
dans la molécule.
En
généra l,
les
spectrographes
commercialisés
disposent
d'un
système
d'intégration
qui
permet
de
mesurer
di rectement
l'intensité des raies.
Bien
souvent
les
spectres
présentent
des
structures
qui
s'enchevètrent
de
sorte
que
la
mesure
des
intensités
devient
difficilement
exploitable
(nous
verrons
plus
loin
des
exemples
sur les spectres des steroides biliaires)_
Ainsi
se
terminent
les
généralités
sur
la
R. M. N.
du
proton,
nous
aborderons
au
prochain
chapitre
les
particularités
de
la
R.M.N.
du 13C par rapport à celle du proton.
Ma is en conclusion de ces généralités, on peut donner le schéma
de la détermination de la structure d'un composé par la R.M.N.:
Détermination des déplacements chimiques et comparaison a-
vec un tableau de déplacement chimique de référence.
Détermination
de
la structure des raies (calcul des cons-
tantes de couplage et comparaison avec un tableau de cons-
tantes de couplage référence).
Détermina tion des intensités des mu ltip lets ou singulet pour
avoir une indication du nombre de protons qui résonnent.
(BERNSTEIN et al
.. 196ge)
1.5 Particularités de la RMN du l3C .
1.5.1.
Introduction.
Mis a
part les problèmes d'ordre pratique,
la RMN du l3C est
la
technique
potentielle
qui
conviendrait
le
plus
à
l'étude
des
systèmes organiques.
Les avantages de la RMN du l3C résident dans la possibilité
d'observer
directement
les
squelettes
de
la
molécule
organique,
les
groupements
non-liés
aux
protons
(exemples: carbonyles
nitriles)
et aussi l'examen direct des sites de réaction.
Les
spectres
de
la
plupart
des
protons
sont
caractérisés
par
des
couplages
spin
-
spin
intensifs
conduisants
à
des
élargis-
sements
des
bandes
de
résonnance.
Dans
la
RMN
du
13 C,
ce
même
problème
est
facilement
controlable
et
le
couplage
spin

- 19 -
-
spin n'est pas habituellement présent.
(NELSON
...
1972a)
Sensibilité:
Tableau comparatif des propriétés nucléaires 1H et 13C .
1H
13 C
r::oment magnétiqUj en
2,793
0,702
magnétons nucléa ires
rapport gyromagnétique cr
4
3
2,675 . 10
6,723 . 10
Spin
1/2
1/2
Abondance naturelle
100%
1, Il %
sensibilité relative
1
0,016
à champ constand
Fréquence de résonance
BO = 1,4! T
60 MHz
15,1 MHz
= 1,E7 T
79,6 MHz
20 MHz
= 2.35 T
100 MHz
25,2 MHz
Tableau 1.3.
Le plus
abondant
des
isotopes
du
carbone
est
le
12 C
qui
ne possède malheureusement pas de spin nucléaire.
L'isotope
13C a un spin 1
1/2 comme l' hydrogène; cependant
l'abondance
naturelle
du
13 C est
1,1%.
Cette
abondance
naturelle
est
trop
faible
pour
que
l'on
observe
les
interactions
spin
spin
l3C -
13C dans les composés non-enrichis dans cet isotope
Le
rapport
gyromagnétique
du
13 C
est
environ
le
quart
de
celui
de
1 H
6
Puisque
la
sensibilité
d' un
noyau
dans
une
expérience
de
RMN
est
proportionnelle
au
cube
de
0'
le
qc donne (1/4)3 soit 1/64 du signal du proton.
L'abondance
isotopique
faible
et
le
rapport
gyromagnétique

- 20
faible
entraînent
une
diminution
de
la
sensibilité
de
la
résonnance
13
du
C
par
un
facteur
de
6000
par
rapport
au
proton.
Il
faut
donc recourir à une technique plus sensible que la
RMN
à
ondes
continues
utilisée
pour
l'hydrogène:
c'est
la
RMN
à
onde
pulsée
et tranformée de Fourier.
1.5.2.1. Principe de la spectrométrie de Fourier.
La
fa ib lesse
de
la
techn iq ue
de. RMN
à
onde
continue
vient
du
fait
qu'à
chaque
instant
au
cours
du
balayage,
on
n'observe
qu'une
seule
fréquence;
La
prise
d'un
spectre
n'est
donc
pas
instantanée. Si de plus l'intensité du signal est très faible,
il faut
accumuler
les
signaux
c'est
à
dire
repasser
un
grand
nombre
de
fois
sur
le
même
intervalle
de
fréquence
afin
de
voir
le
signal
émerger
du
bruit
de
fond,
technique
utilisée
en
RMN
du
proton
pour
des
échantillons
peu
solubles
ou
lorsqu'on
dispose
de
peu
d' échant ilIon.
L' accumu la tion
peut
nécéssiter
plusieurs
heures
sans permettre d'atteindre les signaux d'absorption du 13 C.
Exci tation par impulsion: La technique consiste à perturber simul-
tanement
tous
les
spins
à
l'aide
d'une
série
d'impulsions
de
radio-fréquence.
Au
lieu
de
suivre
l'évolution
de
l'aimantation
en
fonction
de
la
fréquence,
on
l'étudie
en
fonction
du
temps.
On
peu
démontrer
que
la
réponse
du
système
de
spins
a
une
impulsion
de
radio-fréquence
proche
de
la
résonnance,
contient
la même information que celle obtenue par balayage classique.
La
relation
mathématique
entre
le
domaine
de
fréquence
et le doma ine de temps est la transformée
de Fourier.
La
réponse
du
système
de
spins
s'appelle
signal
de précession
libre
("free induction decay,
F. 1. D. l.
"
Ce
signal
correspond
à
une
superposition
des
fréquences
de précessions individuelles des divers spins et est donc complexe.
Son amplitude décroit de façon exponentielle avec une constante
de
temps
qui
est
de
l'ordre
du
temps
de
relaxation
transversale
effectif 1 2
Pour
augmenter
le
rapport
signal!
bruit
autant. que
possible
les
processus
d'excitation
et
de
reception
du
signal
sont
exécutés
de
manière
répétitive
et
l'information
résultante
stockée
et
addi-
tionnée
chaque
fois
dans
la
mémoire
d'un
ordinateur.
(NELSON
1972bl
(VARJ AN
. 1976al

-
21 -
1.5.3. Paramètres dominants en RMN du
13 C
1. 5.3.1. Déplacement chimique.
Sa
détermination
est
identique
à
celle
de
la
RMN
du
proton:
variation
du
& en fonction de l'environnement électronique de
chaq ue
type
de
13 C
(voir
tableau
de
déplacement
chimique
du
13 C .)
1.5.3.2. Constante de couplage]
, ·
13
13
coup 1age h omonuc l ea He
C -
C
Ce
type
de
couplage
n'est
pas
observé
pour
des
raisons
que
nous
avons
signalées
plus
haut
(abondance
naturelle
faible)
Par
conséquent,
la
probabilité
d'avoir
deux
atomes
de
13 C voisins
est
négligeable.
Utilisant
les
techniques
d'enrichissement
isotopique
on
peut
cependant
mesurer
les
grandeurs
typiques
des
couplages
]UC _ 13
pour établir l'enchainement des carbones.
C
C
1
h "
l ' ·
13C
1H
oup age
eteronuc ealre
-
Ce
couplage
est
un
phénomène
dominant
en
RMN
13C ; il
complique les spectres
et une bonne partie de l'information
n'est
plus lisible à peu d'exceptions près.
Pour cette raison,
tous les spectres de routine sont enregistrés
avec
découplage
complet
des
protons
(découplage
à
modulation
par bruit),
on observe ainsi un singulet pour chaque carbone.
Les couplages 13C -
H cO:l.tiennent quand même beaucoup d
'in-
formation structurale.
(VARlAN.
1976b)
Exemple:
1JcH reflète l'amplitude des angles H-C-H:
1
H
0 Cl
H
/"'.~
0 '\\-1
A
PI
H
]CI! (l-l~)
125
123
128
136
161
Tableau 1.4.

-
22 -
13
Les couplages
C -
H à longue distancef ]CH'
n == 2,3,4)
sont
particulièrement
riches
en
information
en
série
aromatique

leur
analyse
permet
d'établir
le
mode
de
substitution.
Mais
l'anlyse
peut
être
difficile
parce
que
l'on
obtient
fréquemment
des spectres fortement coup lés.
1.5.3.3.
Relaxation et N.O.E.
(Nuclear Overhauser effect)
Tl
est
la
constante
qui
caractérise
le
retour
des
spins
exc i tés
à
l'équilibre
thermique.
Des
valeurs
typiques
en
RMN
13C des molécules organiques varient entre 10 -3
et 10 2 secondes.
Si
dans
une
expérience
de
RMN
pulsée,
l'intervalle
entre
les
impulsions
est
inférieur
à
5 Tl
une
saturation
partielle
des
signaux
en
résulte.
Ce
phénomène
permet
de
mesurer
facilement
Tl
individuel de tous les
carbones
dans
une
molécule.
De
plus
les
intensités
sont
altérés
par le
découplage
des protons.
L' irradia-
tion
forte
modifie
la
population
des
niveaux
d'énergies
de
protons
et par le mécanisme de relaxation dipolaire les spins
13C sont redis-
tribués
selon
un
processus
qui
ne
suit
pas
la
loi
de
BOL TZMAN.
Ce
phénomène
conduit
à
des
intensités
augmentées
d'un
facteur
de
1 à
3 dépendant
de
la
géométrie
moléculaire
(proximité
des protons)
et de la nature du mécanisme de relaxation.
(NELSON ...
1972c)
Conclusion:
Méthode
rapide:
en
une
seconde
on
peut
prendre
en
spectre
d'où
l'intérêt
en cinétique.
Haute
sensibilité:
liée
au
fa it
que
l'on
peut
accumuler
les informations durant des heures voire des journées.
Problèmes:
Ces
prob lèmes
tournent
essentiellement
autour
de
la
relaxation
qui
peut
être
des
sources
d'erreur
en
analyse
quantitative.

- 23 -
JH• H·
JII• II·
~
~
System
System
Full
Typicul
Full
Typicul
Ran~c
R;lnge
H
H)C=e<H'
0-25
10-15
0-12
7-10
)C<H'
)CH-CH<}
0-8
-7
)C=e<11'
12-18
14--16
H
Cil,
CIl'j"
rom: .
b Il
-7
H
CH,
rolatlon
CH)
)CH-C-CH-(
(H
0
Qc" J...II• 6-10 Il
)CII'--.
5-7
-6
JH• H-
0-3
2
1
:
1
H"
JH• H··,
0-1
H'"
1
(II
)C=CH-CH-(
4--10
5-7
=C
0-3·5
2
H'
1
)C=CII -CH'=C(
613
I(}--IJ
- CH=C- nl'(
o 3 O·,'i 2
)CII - CH'O
0-3
2
'"
1
1
/
/CII-C=C-CII'" 0·2
C=CH-CH'O
5-11
7
)CH-C=\\H'
:! 3
:!.,'i
Valeurs des constantes de couplage J
, dans quelques sytèmes simples.
HH
Tableau I.S.

no
'00
.
180
160
\\40
120
100
BO
60
20
o
:c-O
110'"","
li
;c-O
Alden <'?fI
!
1
1
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Auh
1
!
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:C. S
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,
HI"'"'W!FDft\\oI\\IC'
-1
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1
1
'C-C:
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::c. c.:.
Kc11f'»",m..IIO(I
-
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- oC! le ,.....'...".,1
1
·O~
,
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-
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1
-
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1
1
1
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le 11ft...,.,
1
1
1
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1
1
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1
1
1
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1
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1
-
1
·CM~..C~ l e _ "
1
1
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-OO-'O~
1
1
1
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1
1
1
1
1
1
-QI.- s~
-1
1
1
-~-IWI
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1
Il-c-ff
,
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",C-o...
1
1
~.
1
1
;
,
H c·"~
!
1
N,e- S-
I
1
1
- 1
N.C-NII
1
1
1
... C"': ... ·CH1 11111......
1
1
1
-......-,.~"... ..,
1
1
1
Il
1
1
,-
f
1
1
............1......"
ICH,I"O
cs,
Cf,é.JOH
C~H,
cf',eooH
; CCI, 1
cHe.: :: '·0",.," CH;OH O"'SO ICH, ':CO!
1
1
22':.
100
IBO
160
,AO
110
100
80
60
40
'J
Déplacements chimiques de 13C (Référence interne = TIfS, la rale du ms
est prise comme origine).
Tableau 1.6.

- 25
CHAPITRE 11
ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES DES CALCULS BILIAIRES
Il.
1.
Introduction.
Les
constituants
principaux
de
la
bi le
humaine
et
ceux de certains mamifères sont de deux types:
Les pigments biliaires.
Les acides et sels
(sels de ces acides) biliaires
Les
pigments
biliares
dérivent
du
catabolisme
de
l' hémoglo-
bine.
Comme
leur
nom
l'indique,
les
hémoglobines sont
constituées
d'un groupement prosthétique:
l'hème
(4%) et d'une partie protéique:
la globine.
L' hème
comporte
une
molécule
de
protoporphyrine
et
un
a tome de fer.
Le groupement porphyrinique reste stable pendant toute la vie
de
l'hématie
(4
mois
environ).
Puis
l'hémoglobine
est
dégradée
principalement
dans
la
rate,
jusqu'au
stade
bilirubine
(figure
] I-})
laquelle
est
ensuite
transportée
dans
le
foie

elle
est
conjuguée
avec
l'acide
glucuronique
avant d'être _iéliminée
par
la
voie
bi lia ire
jusque
dans
l'intestin.
Lorsque
l'élimination
de
la
bile
est
empechée
par
un
obstacle
(calcul
par
exemple)
les
constituants
de
la
bile
refluent
dans
le
sang,
en
particulier

- 26 -
le
dérivé
glucurono-conjugué
de
la
bilirubine
qui
peut
alors
passer dans
les
urines.
Mais
lorsque la
bile se déverse normalement
dans
l'intestin,
c'est

qu'aboutit
la
bilirubine
qui
subit
alors
sous
l'influence
des
bactéries
intestinales
et
de
leurs
enzymes
une nouvelle série de transformation.
Celle-ci
vont
aboutir
à
la
formation
d'urobilinogène,
puis
d' urobi line et stercobi line.
Ces
deux
derniers
produits
sont
excrétés
par
les
matières
fécales auxquelles elles conférent leur coloration.
Qua nt
à
l' urobi linogène
et
stercobilir:wgène,
ils
sont
en
partie
réabsorbés
par
la
muqueuse
intestinale
et
retournent
au foie:
c'est le cycle entero-hépathique des pigments biliaires.
(WEIL,1979)
Les acides biliaires se rencontrent dans la bile des mamifères
combinés
à
des
acides
aminés:on
dénomme ces combinai-
sons
acides
biliaires
conjugués.
Les
acides
aminés
entrant
dans
ces
combinaisons
sont
le glycocolle pour les
acides
glycocho-
ligues
et
la
taurine,
dérivé
de
l'oxydation
de
la
cysteine
pour
les acides taurocholiques.
Cette
conjugaison
se
fait
sous
forme
de
liaison
amide
entre
le
groupement
NH
de
l'acide
aminé
et
le
carboxyle
des
acides biliaires.
Les
acides
biliaires
entrant
dans
la
composition
de
la
plupart
des
acides
biliaires
conjugués
sont
au
nombre
de
4:
l'acide cholig ue,
l'acide
désoxycholiq ue,
l'acide chenodesoxycholiq ue
et
l'acide
lithocholiq ue,
dé ri vé
d' un
même
sterol,
le
cholesterol,
dont
ils
possèdent
la
structure
nucléaire,
cyclopentanoperhydro-
phénanthrénique,
mais
différent
les
uns
des
autres
par le nombre
de fonction alcool secondaire sur les noyaux (figure II.2).
Dans
la
bile
humaine,
on
trouve
environ
trois
fois
plus
de
dérivés
cholig ues
que
de
dé ri vés
désoxycholiques,
également
trois
fois
plus
de
dérivés conjugués glycholiques
que
de
conjugués
taurocholiques.
Quant
aux
acides
lithocholiques,
ils sont en
trés faible
proportion chez l' homme.

- 27 -
\\' ')' f1,/, V6P.PIAlO- 6t~
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-
28 -
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(~IJc. )
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)
Figure 11.2.

-
29 -
11.2. Classification et composition des calculs biliaires.
Comme
nous
l'avons
signa lé
plus
haut,
l'élimination
de
la
bile
peut
être
entravée
par
un
calcul,
et
ceci
est
à
l'origine
de
certc1l.Ïims
troub les
pathologiques
(ichétere
par
retention
par
exemp le) .
Les
calculs
biliaires
humains
apparaissent
dans
une
diversité
de
formes,
de
tailles,
de
structures
(cristalline
ou
amorphe)
et de couleurs
(blanchâtre,
jaunâtre,
marron ou noir).
Morphologiquement,
ils
sont classés en:
calculs
de cholestérol,
calculs mixtes ou calculs pigmentaires
(ZILM et aL .. , 1980).
La
dimension
des
calculs
biliaires
peut
aller
d'une
tête
d'épingle
à
un
oeuf
de
poule,
mais
la
taille
n'est
pas
in fluencée
pa r
la
composition
ch imiq ue.
Les
constituants
les
plus fréquemment
rencontrés sont:
Le cholestérol:
Le
calcul
de
cholestérol
est
souvent
unique,
lisse,
ovulaire,
jaune
cl 'or
à
la
cbupe,
il
est
léger et
flottant
"entre
deux eaux" .
La
structure
est
cristalline,
d'allure
radiaire.
Le
calcium
Il 'y
existe
quà
l'état
de
traces,
d'où
sa
transparence
radiologique.
La
fréquence s'établit autour de 15% du total des lithiases.
L'association de bilirubinate de calcium et de cholestérol.
Ces
calculs
mixtes
sont
en
général
multiples, polyédique
à
facettes,
plus
durs
que
les
précédents,
ils
sont
formés
de
couches
concentriques
de
bi lirubina te
de
calcium
et
de
cholestérol
et
ont
au
centre
un
noyau
plus
foncé
ou
une
cavité
dans
laquelle
on
trouve
un
magma
brunâtre,
formé
de
cholestérol
et
de
sels
bi lia res.
Contenant
50%
de
calcium,
ils
sont
ha bi tuellement opaques
aux rayons X.
Ce sont les plus fréquents:
82% des cas.
Les pigments.
Les
calculs
pigmentaires
sont
le
résultat
de
l'hémolyse,
leur
aspect
est
muriforme,
ils
sont
très
durs,
lourds,
leur
coupe
est Homogène.

- 30 -
Du carbonate de chaux.
Ces
calculs
sont
souvent
formés
de
grains
fins,
véritable
sable
biliaire,
ils
sont
très
denses,
lourds
riches
en
ca kium,
opaques
aux
rayons
X.
ILs
apparaissent
dans
des
vésicules
exclues et
lorsque
le
malade
est
en
position
debout,
ils se déposent
dans le fond de la vésicule dont ils dessinent les contours.
Des agrégats fiables de pigments et de cholestérol.
Véritable
boue
biliaire
que
l'on
rencontre
dans
certaines
stases
plus
ou
moins
infectée
de
la
voie
biliaire
principale.
(DIESNlS,
1978)
Le
bilirubinate
de
calcium
est
le
constituant rna,jeur
des
ca lculs
de
pigment;
mais
des
études
dnt
montré
que
jusqu à
1
20%
des
calculs
pigmentaires
contiennent
de
la
bilirubine
sous
d'autre forme.

- 31 -
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..
i
'.
1
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i,
.~I • ~

1.'
~
','
":,
" ...
_
...
_
...
..-._---
Coupe transversale d'un calcul biliaire
..'
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,
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,
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""1 '.1.
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... <.f:-, •••.
NI
Vue latérale du même calcul biliaire

- 32 -
P~INCIPAUX COMPOSES RETROUVES DANS tES LITHIASES (SERVOZ 1979)
COMPOSES MINERAUX
Dénomination chimique
Formule
Dénomination
Minéralogique
Oxalate je Calcium monohyjraté (Cl )
Ca (COO) 2 H 0
Whewe 11 i te
2
Oxalate je Calcium jihyjraté (C )
Ca (COO)2 (H 0)2
Whejjellite
2
2
Phosphate ammoniaco-magnésien
Mg NH
P0 , 6H 0
Struvite
4
4
2
Hyjrogéno phosphate je calcium
Ca HOP , 2H o
Brushite
4
2
Hyjroxy apatite
CalO (P0
Hyjroxy apatite
4)6 (OH)12
Carbonate apatite
CalO (P0 ,C0 )6 (OH, C0 )2
Carbonate apatite
4
3
3
Phosphate tricalcique
Ca (P0 )2
Wi tlocki te
4
Carbonate je calcium
Ca C0
Calcite ou Aragonite
3
Sulfate je calcium
Ca S04' 2 H 0
Gypse
2
COMPOSES ORGANIQUES
AcHe urique
Cs H 03 N
4
4
Cystine
(-S - CH
- CH(NH ) - COOH)2
2
2
Urate aciJe j'ammonium
NH
Cs H 03 N ' H 0
4
3
4
2
Cholesterol
Na Cs H 03 N ,H 0
3
4
2
Protéines
Variées
Tableau 11.1

11.3. Origine
Les
risques
d'avoir
un
calcul
pigmentaire
augmentent
avec
l'age.
L'effet
du
régime
alimentaire
dans
la
formation
de
ces
calculs
est
incertain
chez
l'homme.
Cependant,
des
chiens
de
poids
normal
(normal
pound
dogs)
soumis
à
un
régime
alimentaire
normal
mais
riche
en
hydrate
de
carbone,
pauvre
en
protéine
additionné
de
cholestérol
produisent
régulièrement
des
calculs
pigmentaires noirs.
Ces cal culs
contiennent
de
la
bilirubine
libre,
du
cholestérol
et des traces de prophyrines.
Toutefois,
ils
sont
a':l0rphes
et
40%
à
60%
du
calcul
est
insoluble
dans
les
acides
et
dans
les
solvants
organiques.
Recem-
ment,
un
constituant
isolé
d'un
calcul
pigmentaire
humain
semble
identique
à
cette
matière
noire
insoluble
mis
en
évidence
dans
les calculs canins.
On
trouve
cette
matière
en
quantité
variable
dans
les
calculs
de
pigments
humains
et
peut
atteindre
70%
de
leur
poids.
Les
éléments
qui
la
constituent
ne
sont
pas
encore
connus.
Un
type
similaire
de
calculs
pigmentaires
apparaît
naturel-
lement
chez
14%
des
chiens
(local
dogs)
et
dans
les
colonies
randomnisées
de
"beagles
dogs"
maintenues pour des études radiobio-
logique.
(ZlLM et al
... ,
1980)
Il.4. Méthodes d'analyses.
On
conna it
l'importance
de
la
détermination
de
la composition
chimique
des
calculs
urinaires
ainsi
que
celle
de
la
connaissance
exacte
des
rapports
quantitatifs
des
différents
éléments
dont
ils
sont
constitués.
Au
moyen
de
ces
données,
il
est
possible
d'a rriver
à
la
découverte
des
facteurs
étiologiques
provoquant
la
naissance
des
calculs
(du
moins
ceux
qui
sont
connus
actuel-
lement).
Par
la
découverte
de
ces
facteurs
étiologiques,
nous
pouvons
parfois
éviter
la
reformation
des
calculs
dans
le
cas
d'élimination
par
voie
normale,
et
les
récidives
dans
le
cas
d'ablation chirurgicale.
Les méthodes d'examen
utilisées sont:
La combustion du calcul.
L'analyse chimique
L'analyse
microscopique
au
microscope
stéréospécifique

- 34 -
ou polarisant.
L'analyse radiographique.
L'analyse spectroscopique (infra-rouge)
La
méthode
radiographique
a
l'avantage
d'une
part
de
n'exiger
qu'une
petite
quantité
du
matériel à
examiner;
et
d'autre
part
de
procurer
un
document
radiographique
qui
demeure
et
constitue
une
méthode
comparative
parfaite.
Cependant,
la
durée
de reception
d
d'appréciation
des
radiographies
est
relativement
grande et ceci constitue en désavantage essentiel pour le médecin.
La
présence
d'un
fa ible
pourcentage
d'un
élément
dans
la
préparation
ne
permet
pas
sa
mise en
évidence.
Enfin,
l'organi-
sation et le fonctionnement d'un laboratoire élémentaire de radiologie
exigent
des
dépenses
importantes
et
un
peresonnel
relativement
spécia lisé.
L'analyse
chimique
donne
des
renseignemen ts
clairs
et
précis
sur
les
éléments
du
ca lcul
et
également
sur
la
quantité
de ceux-ci.
La
spectrophométrie
infra-rouge
présente
essentiellement
deux avantages par rapport à la méthode chimique:
IL
suffit
de
1
à
2
mg
de
matériel
pour
obtenir
un
résultat;
Ceci
est
particulièrement
interessant
dans
le
cas
des
calculs
très
petits
ou
lorsqu'il
est
nécéssaire
d'analyser
les
différentes zones
d'un calcul hétérogène.
La
méthode
physique
indique
avec
plus
de
précision
le constituant
principal
du calcul et elle permet d'évaluer grossière-
ment
les
proportions
relatives
des
autres
constituants.
Par
voie
chimique.
il
est
difficile
d'obtenir
ce
type
.d'information
car
les réactions colorées utilisées ont des sensibilités différentes.
La
RMN
peut
constituer
une
autre
méthode
physique
interes-
sante
pour
l'analyse
des
calculs
biliaires.
Nous
essayerons
de le montrer à travers cet exposé.

- 35 -
CHAPITRE 111
ANALYSES QUALITATIVES des CALCULS BILIAIRES par RMN 1H
IlL}. Préparations des échantillons.
111.1.2. Les solvants
Les
différents
auteurs
qui
ont
travaillé
sur
les
stéroides
ont
dans
la
grande
majorité,
utilisé
le
DMSO
Ce
solvant
convient
pratiquement
pour
solubiliser
tous
les
sté roides
n' ayant
pas
de
fonction
acide
carboxylique,
comme
le
cholestérol
ou
la cortisone.
La
concen tra t ion
optimum
se
situe
au
voisinage
de
O,5M
solution.
Une
telle
solution
est
obtenue
en
dissolvant
50
à
75mg
de
stéroides
(en
fonction
du
poids
moléculaire)
dans
0,5
ml
de
ùeutero- chloroforme.
(SHOOLERY et al
1958)
Un
grand
nombre
de
stéroides
sont
solubles
dans
ces
condi-
tions;
et
si
l'on
prépare
des
dérivés
acetylés
d'autres
stéroides
insolubles
dans
le
on
arrive
à
les
solubiliser
dans
ce solvant.
Pour
dissoudre
des
stéroides
acides,
un
certain
nombre
de
solvants
polaires
ont
été
utilisés
en
mélange
ou
à
l'état
pur
par
les
différents
auteurs.
Les
principaux
sont:
le
méthanol
deuteré,
le
DMSO
(dimethyl sulfaxyde) deuteré,
et l'eau lourde -D 0
2
Les
acides
biliaires
ne
sont
pas
très
solubles
dans
l'eau,
ils
donnent
des
solutions
colloidales
résultant
de
la
formation

- 36 -
de micelles.
Exemple:
le
déoxycholique
de
sodium
forme
un
tétramère
dans l'eau à PH. 8,2.
(FUNG et aL .•. 1976)
le méthanol: c'est un bon
solvant
des
acides
biliaires.
Mais
donne
Un pic
à
3
et
4
ppm
(3,35 ppm),
donc,
risque d'interférence.
SMALL,
PENKET
et
CHAPMAN
ont
étudié
cinq
acides
biliaires
dans le méthanol.
Ils
signalent
que
le
mélange
en
proportion
10:
l
+
(
v/v
est
nécéssaire
pour
augmenter
la
solubilité
des
acides
cholanique
et
lithocholique
dans
le
méthanol
deuteré.
(SMALL et al. .. 1969)
Le
solvant
que
nous
avons
retenu
après
quelques
essais
de
solubilité
est
le
DMso.
11 permet de dissoudre tous
les
acides
biliaires.
On
peut
utiliser
le
mélange
CD C3-DMSO (8:1 (v /v) )
( Pf<ANA B
et al ... 1978a ) .
Nos
essais
de
solubilité
des
acides
biliaires
dans
le mélange
d'une part et dans le DMSO pur d'autre part, ne nous
démontrent
pas
une
quelconque
exaltation
de
la
solubilité
de
ces
acides
dans
le

C1
Ce
dernier
peut
cependant
éviter
3
d'utiliser
trop
de DMSO
(on
le
verra
par
la
suite le DMSO modifie
les
déplacements
chimiques
des
composés
qui
y
sont
dissous)
pour
avoir
une
dilution
convenable
de
l'échantillon
et
surtout
une hauteur de solution suffisante dans les tubes de RMN.
Le mélange DMSO -
CD C1
permet d'extraire tous les composés
3
stéroidiques des calculs: cholestérol et acides biliaires.
En
pratique,
nous
n'avons
pas
réussi
à
dissoudre
60
mg
d'acide
biliaire
dans
0,5
ml
du
mélange
CDCS- DMSO (8:1
par
simple
agitation
manuelle
ou
par
agitation
magnétique.
IL
serait peut-être possible de le
faire avec un appareil à ultra-sons
NOus
avons
pu
dissoudre
les
60
mg
d'acide
avec
approxima-
tivement 0,4 ml de DMSO plus 0,1 ml de CD C13
L'augmenta tion
de
la
température
ne
modifie
pratiquement
pas
la
solubilité
des
acides
biliaires
dans
le
CD C1
NOus
3
avons donc travaillé à température ordinaire.
Il!. 1.3. Quantité d'échantillon.
Si
le
prélèvement
a
été
effectué
au
centre
du
calcul
(90%
de
cholesterol),
on
peut
se placer
dans
les
mêmes
conditions

- 37 -
que
pour
les
étalons,
c'est
à
dire
40
à
60
mg
d'échantillon
pour avoir un bon spectre.
(bonne hauteur intégrale) .
Si
l'échantillon
est
constitué
par
la
coque
(pauvre
en
cholesterol)
il fa ut environ 100 mg.
Remarques:
En accumulant on peut diminuer la quantité d'échantillon.
Par
la
méthode
des
ajouts
connus,
on
peut
aussi
réduire
la quantité d'échantillon.
Tous
les
calculs
biliaires
analysés
proviennent du
laboratoire
du professeur MAlLEIN à l'hopital de l'Antiquaille.
Le
cholesterol
et
acides
biliaires
de
synthèse
proviennent
de la société SIGMA (Chemica 1 company)
11 1.2.
--------------""--"--"'"'"'----------------------
résonnance des acides biliaires et du cholesterol.
Le
tableau 111.1. présente les différentes bandes de résonance
des
acides
biliaires
et
du
cholesterol
effectué
par
les
différents
auteurs qui ont travaillé sur ce sujet.
Nous
n'entrerons
pas
dans les détails,
nous donnerons
simple-
ment
quelques
indications
qui
ont
permis
à
ces
auteurs
d'aboutir
à leurs conclusions.
111.2.1.
Attribution
des
bandes
de
résonnances
des
méthyles.
En
général,
quand
on
a
affaire
à
des
molécules
simples,
on
arrive
facilement
à
attribuer
les
bandes
de
résonnance
aux
noyaux
responsables,
à
partir
de
la
formule
brute
ou
développée
en
s'aidant
des
tables
de
déplacements chimiques et
des
constants
de
couplage
(nous
verrons
plus
loin
un
exemple
avec
l'acide
glycoche:lodesoxycholique) •
Quand
il
s'agit
de
molécules
complexes
comme
les
stéroides,
cette méthode
ne
suffit
pas.
On
peut
alors
procéder à
des
modifica-
tions
locales
de
l'environnement chimique
des
différents groupements
de
la
molécule
pour
voir
les
conséquences
sur
le
spectre.
Exemple:
la
fixation
d'un
hydroxyle
ou
une
fonction
cetone
au
voisinage
d'un
des
méthyles
en
C 18
oU
C 19
des
stéroides
entraine
un
déplacement
du
pic
de
ce
méthyle
vers
les
champs
faibles.

- 39 -
C' es t
le
cas
par
exemple
de
l'acide
glycochenodesoxycholiq ue
et de l'acide choliq ue.
(voir spectres
IIl-l et Il 1-3)
Néanmoins,
nous
avons
ajouté
de
l'acide trifluoracétique
dans
du
cholesterol
additioné
d'une
goutte
de
DMSO
pour
voir
le déplacement du OH potté par le C3
(ConfÈre ~ectre IlI.S.C)
On constate 1 es modifications suivantes:
C
----- Ha
13
OH e
Une
modification
sensible
de
la
structure
du
proton
Ha
(3,5 ppm)
Une
diminution
de
l'intensité
de
ce
pic
d'un
facteur
voisin
de
l/2.Ce
qui
semble
indiquer
que
le
proton
de
l'hydroxyle
résonne
dans
les
conditions
expérimentales
citées
plus
haut
dans
la
même zone que le proton Ha.
Pour
l'acide
choliq ue
nous
avons
constaté
une
légère
modi-
fication
d'un
pic
a
1,75
ppm
(zone
de
l'empreinte
digitale)
après
l'addition
de
Cf3 COOH
les
pics
des
OH
se
situeraient entre
1
et
2.5
ppm
dans
les
conditions
expérimentales
définies
plus
haut.
Le
tableau
Il1.2.
résume
l'a ttribu tion
des
pics
de
nos
stéroides
de
synthèses,
établie
par
comparaison
avec
le
tableau II.
111.3. RESULTATS ET ANALYSES QUALITATIVES.
111.3.1. Comparaison des tàbleaux Il1.l et Il1.2.
On
peut
schématiquement
diviser
le
spectre
des
stéroides
biliaires en deux parties:
• La bande des méthyles et méthylènes
• La bande des protons voisins d'un groupement hydroxyle.
1Il. 3 .1.1.
Les méthyles.
Ils
sont
situés
dans
les
champs
forts
entre
0
et
1
ppm.
Au
nombre
de
trois
pour
les
acides,
et
cinq
pour
le
cholestérol.

Tableau III.1.
PROTONS
COCA
UCDA
AC
AL
AOC
Acide
CHOL
Caractères
cholàntque
du pic
C
- 1\\3
0,64;0,67*-0,68
0,66
*0,70 - 0,71
D,57 - 0,68
0,70 *
0,67 - 0,68
0,67
singulet
18
C
- 1\\3
0,88; 0,90*-0,92
0,95
*0,92 - 0,94
0,93
0,92
0,93 - 0,94
1
singulet
21
C
0,94;0,92
0,92
*0,95 - 1,01
0,93
*0,92 - 1
0,93 - 0,95
0,90
joublet
21 - " 3
C
- 1\\3
26
0,87
joublet
C
0,87
joublet
27 - " 3
C - 1\\
3,38; 3,50*
3,45
*3,45 - 3,50
3,50 - 3,50
3,50 - 3,55
3,50
large
3
C -
l='-
01\\
o
3
C - Il
5,35
large
-
6
01\\
Cl _ Il
3,78;*3,77;3,88
3,45
*3,85
large
7
j ' 011
C
- Il
*4
*3,95
large
12
C
*8,10 - 2,15
*2,20
23 - " 2
2,20
*2,15 - 2,20
2,20 - 2,25
1
C24 OO11
*4,74
4,70
?
4,85
?
* -Q\\ 110 + 'CO Cl ..
pas je signe *: CO Cl + oHSO ou CO Cl pur
3
~

- 41 -
Proiuits étalons
PRODUITS DE SYNTHESE
1 Hentification
jes pics
AC
AL
AGC
ADC
CHOL
C
- H
0,63*ppm
0,67*
0,61*
0,63*
0,69*
18
3
0,68*
- H
0,86*ppm
C(l9)
0,94*
0,84*
0,88*
1,01*
3
i*
C( 21) - H
0,98*ppm
0,94*
0,97*
0,93+1,01
0,96
3
joublet
Joublet
joublet
2
0,91*
0,97*ppm
Joublet
H
2,25*ppm
2,22*ppm
2,31
C(2J)
2
2,25*
..,
H
3,51*
C
3,3*ppm
3,58*
3,32*
3,55*
J
j,JJ*
.....
OH
H
/ '
3,60*ppm
3,71*
CO)_ OH
OH
C(l2}_
3.87*ppm
3,95*
H
-_
...
.. ~
Pics non attribués
1,25*
1,55
3,77-3,85
7,25
H
0,84
C(26')
J
H
0,83*
C(i7)
3
~(6) =C
5,35
5,J5*
H
Tableau 111.2
Solvant = DMSO - CD Cl3
[J a 5
des i g A e 5
~':
..
Solvant CD C1
pur.
3

- 42 -
Le
méthyle
C 18 est le
plus
blindé,
il
donne
un
pic
fin
distinct des autres en 0,60 et 0,70 ppm.
Les
méthyles
en
C19 et
C 21 résonnent
entre
0,80
et
1
ppm.
Le
méthyle
en
C21 donne
un dt>ulll1.~'t
résultant
du
couplage
avec
l'hydrog~ne du carbone C20.
En
général,
on
arrive
à
distinguer
ces
deux
méthyles
sauf
dans
les
acides
lithocholiques
et
ursodésoxycholiques

ils résonnent au même endroit.
Dans
tous
les
autres
acides,
le
-C 21
-H 3
résonne
à
un
champ plus faible que le C19-H3
Cet
ordre
est
inversé
dans
le
cholestérol.
Les
méthyles
C26
et
C 27 présents
seulement
dans
le
cholestérol
résonnent
entre
0,80
et
0,90
ppm.
ILs
donnent
un
doublet
qui
résultent
du
couplage avec l' hydrog~ne en
-c 5
-H.
2
Il 1. 3.1. 2.
Les protons voisins d' un OH.
ACIDE CHOLIQUE
Les
protons
voisins
d'un
hydroxyle et
portés
par
un carbone
du
cycle
donnent
naissance
à
des
bandes
reconnaissables
sur
le spectre,
caractérisées par leur position et leur forme.
1-
Déplacement chimique.
En
général,
les
hydroxyles
en
position
axiale
(Ha)
résonnent
comparativement
aux
hydrog~nes
en
position
équatoriale
(He)
vers
les
champs
forts.
Les
déplacements
chimiques
des
Ha
en ppm)
sont inférieurs à ceux des He

- 43 -
2-
Forme de la bande d'absorption.
La
constante
de
couplage
J HH'
est
liée
à
la
valeur
de l'angle dièdre par les relations de KARPLUS.
Ha,~
.) --
,
10
JHH
J60~
~He
H'a..
10
140160
'/)
De
nombreux
autres
facteurs
ayant
une
influence
sur
3 J III1'on a une idée approximative des variations de 3 J HH' en lais-
sant tomber la constante 0,28.
Forme des pics:
JXa Ha grand
X
pic Xa large
JXa Ile
petit
y
JYe He petit
pic Ye
moins large que Xa.
JYe Ha petit
En
fonction
de
toutes
les
données,
on
peut
essayer
de

-
44 -
déterminer
les
positions
des
hydrogènes
voisins
d'un
hydroxyle
dans les différents acides biliaires.
Exemple
des
acides
chenodesoxycholique
(ACDC)
et
urso-
desoxyle
(AUDC).
Ces
deux
acides
sont
des
épimères.
NOus
ne
représenterons
que les positions différentes des cycles:
He
H~
1
He--L--
A
,2..
He
)1
AUDe
1-
0 Ho
He
Configurations stéréochimiques des CDCH et UDCA.
en
pointillé
les
liaisons
allant
derrière
le
plan
de
la
feuille de papier.
en
trait
plein,
les
liaisons
venant
du
plan
constitué
par la feuille.
Le
proton
porté
par
le
carbone
C 7
dans
le
CDCA
donne un signal plus ou moins fin à 3,78 ppm qu'on peut expliquer
en
se
basant
sur
la
relation
de
KARPLUS.
Cet
hydrogène
subit
un
coup lage
spin
spin
relativement
petit.
Dans
AUDC,
le
proton du C (
) est fortement couplé avec les protons axiaux en C
7
6
et Cg-
Les protons en C (
) et C (
) sont axiaux et ayant approxi-
3
7
mativement le même encombrement stérique,
sont blindés de façon i-
dentique si bien que leurs positions de résonnances coincident pra-
tiquement ~ 3,45 ppm.

45 -
respectivement équatorial et axial.
Le C3 (f3) -
H résonne pratique-
ment
au
même
endroit
que
dans
l'
AUDC.
(
S ~
3,38
ppm);
tandis
que
le
H
C'7
est
déplacé
vers
les
champs
faibles
(S =
3,78 ppm).
(PRANAB et al ... 1978b)
En
fonction
de
toutes
ces
données,
on
peut
essayer
de
déterminer
les
positions
des
hydrogènes
voisins
d'un
hydroxyle
dans les autres stéroides biliaires.
Tous
les
stéroides
biliaires
figurant
sur
le
tableau
111.2
ont
en
C 3
un
H
axial
et
l'OH
équatorial,
comme
dans
ACDC
et
AUDC.
Le
déplacement
chimique
et
la
structure
de
la
raie
du
proton
H(~) sont
pratiquement
les
mêmes
dans
tous
les spectres.
(confère spectres nO
Il 1.1 à 1l 1.5)
Sachant
que
les
acides cholique desoxycholique,
chenodesoxy-
cholique,
glycochenodesoxycholique
et
lithocholique
dérivent
d' un
même
stérol;
on
peut
en
comparant
les
spectres
tirer
les
conclusions sui vantes:
ACIDE LITHOCHOLIQUE
{
H
axial
C
-
3 _
OH
équatorial
H
axial
C
. -
3 "-
,\\C 1DE T)ESOXYCHOL IQUE
OH
équatorial
C
- - oH axial
12
1
H
équatorial
C-H
axial
3
'OH
équatorial
ACIDE CHENODESOXYCHOLIQUE
C - - OH axial
7
1
H
éq ua toria l
axial
C -
H
3 '\\. OH
équatorial
C - - OH axial
7
1
ACIDE CHaL IQUE
H
équatorial
C
OH axial
1 2 - -
1
H
équatorial

- 46 -
111.3.1.3.
1den tifica tions
des
acides
biliaires
et
cholestérol
de synthèse.
L'un
des
objectifs
de
ce
travail
étant
l'identification
du
cholestérol
dans
les
calculs
biliaires,
nous
l'avons
fait
par
rapport
aux
acides
biliaires,
les
seuls
composés
qu'on
retrouve
dans
les
calculs
dont
la
structure
soit
comparable
à celle du cholestérol.
Bien
que
des
quantités
d'acides
biliaires
soient
relativement
faibles
in
vivo,
nous
allons
pour
être
un
peu
rigoureux
supposé
théoriquement
que
tous
les
stéroides
des
calculs
(cholestérol
et
acides
biliaires)
soient
dans
les
mêmes
proportions
cela
nous
permettra
d'identifier
(en
supposant
que
les
'quantités
d'échantillons
sont
suffisantes
pour
enregistrer
le
spectre)
le cholestérol avec plus de rigueur.
Une
telle
expérience
est
réalisable
in
vitro
en
enregistrant
les
spectres
à
partir
de
quantités égales
de cholestérol et d'acides
bilia ires contenus dans un mélange de DMSO -
CDQ3.
On peut aussi faire passer les spectres des étalons enregistrés
séparement
dans
un
ordinateur
qui
nous
donnera
un
spectre
globa 1 résultant.
Mais
il
était
plus
facile
de
supperposer
simplement
les
spectres
des
acides
biliaires
et
ceux
du
cholestérol
et
d'en
déterminer les différences.
C' est
ce
que
nous
avons
fait
et
nous
avons
abouti
aux
conclusions sui vantes:
Le
spectre
du
cholestérol
se
distingue
facilement
de ceux des acides biliaires par la présence:
Du
pic
du
proton
en
C
,qui,
à
cause
de
la
liaison
6
éthylénique
se
trouve
déplacé
vers
les
champs
faibles
(5,35
ppm)
de
quatre
pics
fins
intenses
situés
vers
les
champs
forts caractéristiques des méthyles.
Dans les acides biliaires il y a
au
plus
deux
à
trois
pics
fins
et
intenses
vers
les
champs
forts.
Acide
cholique:
on
le
distingue
des
autres
par
des
bandes
de
résonnance
des
trois
protons
vo~sins d'un
groupement

47 -
hydroxyle au niveau des
3,
7 et 12.
Acide lithocholique et
ursodesoxycholique
C-H
axial
Acide lithocholique
3
'OH équatorial
c ....· H axial
Acide ursodesoxycholique
3... OH é::Iuat oria1
C
- - OH axial
7
1
H
é<\\latorial
Ces
protons
résonnent
de
la
même
façon
(même
structure
des pics) et au même endroit (vers 3,50 ppm)
Si
l'on
veut
distinguer
les
acides
ursodesoxycholique
et
lithocholique,
on
mesure
les
intensités
des
pics
de ces protons
sur
les
spectres.
Dans
l'acide
ursodesoxycholique
il
y
a
deux
protons
qui
résonnent
vers
3,50
ppm
tandis
que
dans
l'acide
lithocholique un seul proton résonne à cet endroit.
1AUDC =
2 x 1 {ithochol ique à 3,50 ppm
à 3,50 ppm
Si
les
échantillons
ont
été
préparés
et
enregistrés
dans
les mêmes conditions.
L' "empreinte digitale" entre 1 et 2, , ppm il y a un ensemble
de
pics
mal
résolus
qu'on
attribue
à
plusieurs
couplages
spin
-
spin intenses et aux faibles déplacements chimiques des nombreux
protons
du
cycle
stéroi"diques
qu'on
ne
peut
pas
distinguer
les uns des autres avec les appareils de R.M.N. classiques.
Cette
zone
est
couramment
appelée
"empreinte
digitale"
car
la
structure
est
caractéristique
de
chaque
stéroi"de
et
peut
permerttre de distinguer les stéréoi"des biliaires entre eux.
C' est
le
cas
par
exemple
des
acides
désoxycholique
et
chenodesoxycholique qui ont les caractéristiques suivantes:

-
48 -
. / H axial
C3
"OH
Eq ua toria 1
Acide désoxycholique
C
--OH axial
12
1
H
équatorial
/
H
axial
C(3) --- OH axial
Acide chenodesoxycholique
C(7) --OH axial
1
H
équatorial
Ces
protons
ont
des
déplacements
chimiques
identiques
et
les
structures
des
pics
sont
pratiquement
les
mêmes.
Seule
l'empreinte
digitale
peut
permettre
une
identification
des
spectres.
(Voir spectres 111.2 et 111.3.)
Détermina tion
des
pics
non
attribués
dans
l'acide
glycoche-
nodesoxycholiq ue.
(AGCDC)
Sur
le
tableau
111.2
nous
avons
noté
un
certain
nombre
'~\\e
pics
de
l'acide glycochenodesoxycholique
que
nous
n'avons
pas trouvé dans la bibliographie.
Ce sont les pics à
1,25 ppm
3,75 ppm
7,25 ppm
en C
la structure de l'AGCDC est
24
( '
-0
N -
CH
-
COOH
~.-
,
2
O/'"
H
Sur
le
tableau
des
déplacements
chimiques,
nous
avons
les
protons
méthylènes
voisins
d'un
azote
CH
N
vers
2
2,50 à 3,80 ppm.
De
plus
à
3,75 ppm
nous
avons
un
doublet
dont
la
constante
de
couplage
calculée
est
pratiquement
5
Hz
or
la
constante
de couplage entre les protons vicinaux est situé entre 5 - 9 Hz
Voir tableau n° 1.5.

- 49 -
Remarque:
Nous travaillons avec un appareil de 80 MHz
1 ppm correspond à 40 mm
déplacement du signal en Hertz
ppm
fréquence en Hz spectromètre
De
cette
équation,
nous
tirons
2 Hz correspondent à 1 mm.
Le
méthylène
du
groupe
NH
- CH 2
serait
responsable
du
pic
à
3,75
ppm.
Le
doublet
résulte
du
couplage
avec
le
proton
porté
par l'azote.
Ce
dernier
serait
responsable
du
pic
à
7,25
ppm
à
cause
de
sa
structure
(on
a
pratiquement
un
triplet
à
la
suite
du
couplage
avec le CH voisin)
et
de
son
déplacement
2
chimique (à l'extrème gauche du spectre) vers les champs faibles.
111.3.2.
Utilisation
d'un
agent
de
déplacement
chimique
(Shift reagent)
De
nombreux
métaux
terres
rares
par
exemple
l'europium
Eu,
le
praséodyme
Pr
sont
paramagnétiques
(déblindage
des
noyaux
voisins)
et
dans
certains
complexes
de f3 dicetone peuvent
fournir
des
champs
magnétiques
locaux
utilisables
dans
les
expériences
de
RMN.
Le
complexe
Eu(DPM)
DPM
(dipivaloyle)
méthyle)
peut
être
par
exemple
dissous
dans
une
solution
de
CHcl3
Oll
Ccl 4
d'un
alcool
et
observé
en
RMN.
L'alcool
peut
alors
se
complexer
avec
Eu
<DPM)
par
le
groupe
OH
et
le
champ local crée
par l'ion
Eu
dilate le spectre par augmentation
des
déplacements
chimiques
entre
les
différ-ents
groupes
de
protons.
En
l'absence
de
variation
angulaire
le
déplacement
des
raies
diminue
comme
l'inverse
du
cube
de
la
distance
au
métal
\\
( 1/ 3
1 ·
,0
C
Eu'
""'"
~ CH
Y""
CH
0 - - C __
/"
3
C -- CH
'"
3
CH 3
3
Concentration molaire = 0,29 de Eu
(DPM)J
Nous
avons
essayé
de
simplifier
les
spectres
des
stéroïdes

- 50 -
avec
l'Eu
(DPM)

Nos
essais ont été
faits
sur l'acide lithocho-
lique:
Acide lithocholique
62 mg dans 0,4 ml DMSO
+
°,2 ml CDcl3
Eu
( DPM)
: 50 mg
Les
modifications
sont
minimes
par
rapport
au
spectre
d'origine
(voir spectre 111.4 a et b)
:
OH
Modification de la structure du pic des OH ( C
et COOH )
3
Léger
déplacement
du
pic
du
DMSO
vers
les
champs
faibles.
II 1.3.3.
Identification
du
cholestérol
dans
les
acides
biliaires.
Sur
le
tableau
111.3
figure
l'attribution
des
pics
des
spectres de deux calculs biliaires:
(spectres 111.6 a et b):
E
calcul
vésiculaire
(coque)
1,4% (p/p
) dans
un
mélange
2
DMSO - CDcl3
E
: calcul vésicualire 1,4% dans CDcl
pur,'
2
3
Les
calculs
ont
été
broyés
dans
un
mortier
pour
obtenir
des poudres homogènes.
Deux
fractions
de
E 2
ont
été
préparées
respectivement
dans
les
CD CL
pur
et
dans
le
mélange
DMSO
-
CDcl3
afin
de
3
voir
l'influence
du
DMSO
sur
les
spectres. Comme
on
pouvait
s' y
attendre,
le
DMSO
déplace
les
signaux
vers
les
champs
forts.
Par
comparaison
avec
les
spectres
des
produits de
synthèse,
on
arrive
à
identifier
facilement
les
pics
du
cholesterol.
A
première
vue,
le
cholestérol
est
le
composé
prépondérant
dans
ces
calculs
biliaires
(confère
spectre
111.6).
Seul
le
dosage
nous permettra d'en avoir la certitude.
Il Y a
un certain nombre de composés non-identifiés:
spectre
de
E
(E
dans CDC13 ) :.un picàO,75
ppm
vers
la zone de résonnance des méthyles.
• 4,20 ppm
vers la
zone
des
méthines
(l'intégrale
confirme
qu'il
s'agit
d'un
seul

51 -
proton.
Spectre
E
(E
dans CD cl - DMSO)
.·-\\.t~pic à 1,27 ppm
Z
2
3
(méthylène ou méthines)
• unpic à 1,57 ppm
(méthylène 0 u méthines)
Etant
donnée
la
pluralité
des
composés
présents
en
plus
ou
moins
faibles
proportions
dans
les
calculs,
il
serait
difficile
de les identifier.
En
conclusion,
on
peut
dire
que
le
spectre
RMN
dl un
calcul
biliaire
peut
nous
renseigner
à
première
vue
sur
~
présence
ou
non
de
cholestérol eLs 1 i l ~st
relativement
important
dans le calcul.

- 52 -
Tableau 111-3
1
Echantillons
E
: calcul yeso
1
2
= 1,46%
1 E2
1
Ildentifica tions
dans CDel 3
1
dans CDclJ
pur
1
1 des
pics
+ DMSO
filtre
1
1
1
C 08r H 3
0,66 ppm
0,66 ppm
1
-
1
C
) -
U9
H 3
0,98 ppm
1
ppm
1
0,88 d
bl
0,88
C 21 - H 3
doublet 1
0,92 o~
et
0,93
C
-
H
?
23
2
C
- H
0,81 ppm
0,81
26
3
C 27 -
H
0,81 ppm
0,81
3
..-H
C(3)
3,18 ppm
3,50
C6 - C
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- 67 -
CHAPITRE IV
ANALystS QUANTITATIVES DES CALCULS BILIAIRES PAR RMN.
IV.1. Principes de l'analyse quantitative.
L'application
de
la
RMN
du
proton
à
l'analyse
quantitative
repose
sur
le
fait
que
la
surface
limitée
par
un
signal
de
résonnance
est
directement
proportionnelle
aux
nombres
de
protons
responsables
de
ce
signal.
L'exactitude
dépend
des
conditions
opératoires déterminées par l'appareil de mesure.
Quelques
uns
de
ces
facteurs
sont
énumérés
ci-dessous
(CASY 1971 d)
(1)
Le
rapport
signal
bruit
doit
être
le
plus
élevé
possible
pour
assurer
que
la
contribution
du
bruit
de
fond
au
tracé
de
l'intégra le
est
négligeable.
Un
spectromètre
sensible
doit
être utilisé,
et des solutions d'échantillons assez concentrées.
(Il)
Opérer en mode non-sa turante.
Conséquence
de
la
saturation:
la
diminution
de
la
différence
de
population
entre
les
niveaux
d'énergie
elevée
et
bas
pendant
le
balayage
conduit
à
des
petites
surfaces
de
pics
qui
sont
des sources d'erreur.
L'importance
de
la
réduction
varie
d'un
signal
à
l'autre.
Des corrections
peuvent être appliquées,
si
les
temps
de
relaxation
Tl et T2 de chaque signal sont connus.
Mais
en
général,
éviter
la
saturation,
est
le
moyen
le

- 68 -
plus
'satisfaisant
d' aboutir
à
des
bons
résultats.
Ce
but
peut
être
atteint
par
le
choix
du
niveau de puissance de RF (Hl)
et de la vitesse de balayage ( ~~)
Une faible puissance Hl et
dH
une grande valeur ( - - - ) minimise les effets néfastes de la saturation
dt
sur
les
intégrales.
Mais
le
rapport
signal
bruit
est
perturbé
dans ces conditions si bien qu'un compromis doit être choisi.
(lI 1)
L'utilisation
de
balayage
rapide
permet
un
grand
nombre
de
mesures
indépendantes
les
unes
des
autres.
Ceci
permet
de
faire
une
analyse
statistique
pour
avoir
une
indication
sur la précision des mesures.
(IV)
Il
faut
un
bon
ajustement
entre
le
zéro
de
la
ligne
de
base et le contrôle de la phase de RF.
(V)
Il
faut
bien
entendu
un
champ
magnétique
homogène
et
une parfaite rotation du tube porte-échantillon.
En
plus
des
facteurs
liés
aux
conditions
opératoires
que
nous
venons
de
citer,
certaines
exigences
en
rapport
avec
la
nature du ou des composés à doser sont nécéssaires.
Le composé à doser doit produire des signaux caractéristiques
qui
permettent
de
l'identifier
dans
un
mélange
comprenant
même
des
substances
de
structure
très
voisine;
on
pourra
alors
comparer les surfaces de ces signaux soit entre elles afin d'établir
les
teneurs
relatives
soit
à
celle
d'un
signal
d'un
composé
de
référence
adéquat
introduit
en
quantité
connue
pour
établir
la teneur absolue.
L avantage est
1
multiple:
Le dosage est spérifique
II
est
possible
de
se
dispenser
d'une
séparation
préalable.
Cependant,
les
quantités
de
substances
requises
sont
rela ti vement
élevées
par
rapport
au
dosage
u.v
par
exemple.
Mais
un
palliatif
couteux
réside
en
l'utilisation
d'un
accumulateur
de
spectres,
permettant
le
dosage
sur
des
prises
d' essa i inférieurs au mg.
Si
la
teneur
du
composé
dans
le
mélange
est
faible,
la
précision
ne
dépasse
pas
10%,
si
la
concentration
est
supérieure,

- 69 -
la précision peut atteindre 1,5%.
Remarque:
Quelques
fois,
la
structure
du
spectre
ne
permet
pas
l'intégra.tion
correcte
des
surfaces.
Dans
ce
cas,
on
a
recours
à
la
mesure
des
hauteurs
des
pics
respectifs,
à
la
condition
expresse
que
les
pics
comparés
soient
comparables,
c'est
à
dire,
que
les
protons
qu'ils
représentent
aient
un
temps
de
relaxation
identique,
sinon,
la
relaxation
modifiant
la
largeur
des
pics,
les
hauteurs
ne
sont
plus
comparables
bien
que
les
aires le demeurent.
IV.2. Résultats - discussion
D'après
l'analyse
qualitative
que
nous
avons
faite
au
chapitre
précédent,
le
cholestérol
se
distingue
essentiellement
des
acides
biliaires
par
la
présence
sur
le
spectre
du
signal
à
5,35
ppm
du
proton
porté
par
le
carbone
6.
Ce
signal
peut
servir à doser le cholestérol.
IV.2.1. Choix d'un standard interne.
PRANAB
et
YAKUB
ont
utilisé
comme
standard
interne
l'acide
miÙéique
pour
le
dosage
de
l'ACDC
et
l' AUDC.
Ils
ont
utilisé
des
concentrations
voisines
de
20
mg
en
acide
maléique.
Le
signal
de
cet
acide
se
trouve
entre
6 et
7
ppm,
loin
des zones de résonnance des stéroïdes biliaires.
11
ne
nous
a
pas
été
facile
d'obtenir
de
l'acide
maléique
pur.
Le
standard
que
nous
avons
utilisé
est
constitué
par
un
mélange d'isomères cis et trans de l'acide éthylène
dioïque.
COOH,
COOH
H \\
COOH
" C = C /
C===C/
H/
"'--H
.,,/
COOI-I
"-H
Acide maléique
Acide fumarique
2 Moles
1 Mole
3
3

- 70 -
Nous
avons
vérifié l'homogénéité de ce
produit
par l'enregis-
trement du spectre RMN
(Voir spectre IV.1)
Nous
avons
considéré
l'ensemble
comme
un
seul
standard
de
référence.
Mais
on
pouvait
aussi,
connaissant
les
proportions
molaires
de
ces
isomères
ne
prendre
que
l'un
des
deux.
Quelque
soit la voie
adoptée,
il
n' y
a
pas
de
problème
d'interprétations.
IV.2.2. Méthodes des ajouts connus.
En
général,
cette
méthode
consiste
à
ajouter
à
l'échantillon
(ici
calcul
biliaire)
des
quantités
connues
du
composé
à
doser
(cholestérol)
et
l'on
mesure
à
chaque
fois
l'intensité
du
signal
utilisé.
L'avantage de cette méthode est quelle permet:
D' augmenter
le
signal
du
proton
en
C 6
relativement
petit pour avoir plus de précisions sur les mesures de l'intégrale.
De réduire les prises d' essa is.
De
faire
un
étalonnage
qui
peut
assurer
la
validité
de la méthode de dosage.
IV.2.3.
Résultats et discussions.
Nous
avons
dosé
les
taux
de
cholesterol
de
deux
calculs
biliaires
dont
les
analyses
qualitatives
et
quantitatives
ont
été
préalablement
faites
par
chroma tographie
en
phase
gazeuse.
Nous les avons appelés E 3
et E 4
E 3
Calcul biliaire (coque)
E
Calcul vésiculaire.
4
1V. 2.3.1.
Dosage du cholestérol dans E 3
Le dosage a été fait à partir des prises d'essais suivantes:
E
= 39;9 mg
3
Standard interne
14,7 mg
DMSO : 0,2 ml
CD C1
: 0,4 ml
3
A près
dissolution,
homogénéisation
et
filtration
de
la
solution sur la laine de verre,
nous avons enregistré le spectre.

-
71 -
Soit 1S
l'intensité du standard et 1CH celle du cholestérol.
lCH
est
proportionnel
au
nombre
de
protons
par unité
de
volume.
Il
y
a
un
proton
éthylénique
par
molécule
de
cholestérol
et
deux protons éthyléniques par molécule de stàndard.
Soit z la masse de cholestérol cherchée et
x la masse de standard utilisée.
z
protons; 386 étant la masse molaire du cholesterol
386
2 x
protons;
116,17 étant la masse molaire de standard.
116,17
z
116,17
z
ou encore
k
386
2x
x
k
constante de proportionnalité.
Une
bonne
estimation
du
taux
de
cholesterol est conditionnée
essentiellement
par
la
précision
sur
le
rapport
_l_(t!
Le
pic
IS
du
standard
donne
une
bonne
hauteur
d' intégrale
dans
les
conditions
de
concentration
mentionnées
ci-dessus.
Le
problème
se
pose au
niveau
de
la
hauteur d'intégrale
du
proton éthylénique
du
cholesterol,
qui
est
faible
par
rapport
à
celle
du
standard
et des protons méthyléniques du cycle stéroïdique.
Ce
problème
peut
être
résolu
en
amplifiant
la
sensibilité
du
système
d'intégration;
mais
nos
expériences
nous
ont
montré
que
cette
amplification
ne
nous
apportait
pas
plus
de
précision
qu 1 en
travaillant
avec
un
système
d' intégration
non-amplifié.
11
fallait
donc
nécéssairement
une
prise
d'essai
importante
en calcul pour un bon dosage du cholestérol.
C'est
ce
que
nous
avons
fait
avec
E 3

nous
nous
sommes
placés
dans
des
conditions
de
concentration
telle
que
la
hauteur
de
l'intégrale
du
proton
en
C6
soit
facilement
appréciable sans une grande amplification du système d' intégration.
Nous avons mesuré
:
0,216

- 72 -
Z
386. 14, 7 x 0, 216 = 21, 10
58,035
100 • 21,10
Sait
53%
39,9
Soit 53% de cholesterol.
IV.2.3.2.
Dosage du cholesterol dans E 4
L'un
de
nos
objectifs
dans
cette
analyse
quantitative
est
d' arriver
à
doser
le
cholesterol
à
partir
de
ptis€'
d' éssai
de calcul biliaire relativement faible.
Vu les difficultés mentionnées
au
paragraphe
précédent,
deux
procédés
peuvent
être utilisés
:
l' accumulation
des
signaux,
ou
l'enrichissement
artificiel
dU
calcul en cholesterol.
Ici
l'accumulation
des
signaux
ne
s'impose
pas,
étant
donné
que
le
pic
du
proton
C 6
émerge
bien
du
bruit
de
fond
de
l'appareil
pour
les
concentrations
de
20
mg
/
cm 3
Nous
a vons
alors
opté
pour
la
méthode
des
ajouts connus
de cholesterol
dans l'échantillon à doser.
La
prise
d'essai
du
calcul
E 4
a
été
réduite
d'un
facteur
1/2 environ par rapport à E3
E
21,9 mg
4
standard
20,3 mg
DMSO
0,2 ml
DC cl
0,4 ml
3
Un premier spectre a été enregistré sans apport de cholestérol
ensuite,
nous
avons
procédé
à
3
ajouts
successifs
de
10
mg
lCH
et
chaque
fois,
le
rapport
a
été
mesuré.
Voit
tableau
--[-$"-
IV.1.

- 73 -
ECHANTILLONS E
.
leH/I
4
s
21,9rrg de E
Dans
4
20,~ mg de standa·rd
0,6
3
cm
solution
0,115
1er ajout
q1
qo + 10,4 mg
de cholesterol
Dans
3
,
étalon
0,6 cm so 1utlon
0,125
,.'-~-----
2è ajout
q .~
q1 + 10,6 mg
Dans
de cholesterol
0,6 cm3 solution
0,275
éta Ion
3è ajout
q3
q2 + 14 mg
Dans
de cholesterol
0,6 cm 3 solution
0,402
étalon
Les
ajouts
doivent
être
dans
le
domaine
de
sensibil Hé
(80 MHz. 1
de
l'appareil.
La
sensibilité
de
notre
appareil
H
3
BRUKERo est de l'ordre de 10 mg pour 0,5 cm
solution.)
Le
taux
de
cholesterol
dosé
dans
le
calcul
à
partir
du
premier spectre est:
z
20,3
. 386
135 • 0,115
15,5 mg
58,035
100 • 15,50
Soi t
70% de cholesterol
21,9
ICH
Nous
avons
réa lisé
la
représenta tian
graphique
-----
en
d S
fonction des ajouts de cholesterol de synthèse,
dans 0,6 cm 3 de solu-
tian échantillon.
(confère graphe V.l.)

- 74 -
En
extrapollant,
on
peut
déterminer
graphiquement
la
1
d
lCH
,
l'
. .
C I l '
cl
'
va eur
u
rapport
-----
a
ongIne.
e
e-Cl
correspon
a
la concentration initialeI%e cholestérol dans le calcul(
).
0,100 soit, 61,4% de cholesterol, c'est à dire un é-
cart de 15% entre les deux résultats.
IV.Z.3.3. Conclusion
Nos
résultats
sont
du
même
ordre
de
grandeur
que
ceux
trouvés en chromatographie en phase gazeuse.
Bien
sûr,
nous
n'allons
pas
conclure
après
cette
première
analyse
quantitative
du
cholesterol
dans
les
calculs
biliaires
que
la
méthode
soit
au
point.
Néanmoins,
ce
travail
peut
servir
de
prémices
à
des
travaux
ultérieurs
sur
un
grand
nombre
d'échantillons
d'origines
plus
variées.
Nous
dirons
simplement
que
la
spectroscopie
de
RMN 1H
peut
constituer
une
méthode
de
dosage
du
cholestérol
dans
les
calculs
biliaires
en
routine.
Elle
n'a certes 'pas
la
précision
des
autres
méthodes
(chromato-
graphie
par
exemple)
mais
elle
a
l' avantage
de
son
extrème
rapidité,
et
de
sa
spécificité
(dosage
sans
séparation
des cons ti-
tuants) .

- 75 -
GRAPHIQUE IV.I ET SPECTRES IV.I à IV.5

1
.
l CH";'
_ .
.. :; l'
-_. -_o.._-
__ • __ ...... ,_:··_L_.
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'Ordonnées- 40 mm .:........:- O~-10­
Abscisses 4 mm' -:...:- 1 mg
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0.100.
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- 83 -
CHAPITRE V
ANALYSES QUALITATIVES DES CALCULS BiLIAIRES PAR RMN 13 C
V.1. Etude bibliographique des stéréoides en RMN 13 C •
V.1.1.
Introduction
La
a
eu
de
larges
applications
dans
les
études
conformationnelles et
stucturales
des
stéroides,
quoique
bien
souvent
les
raies
les
plus
facilement
attribuables
soient
les
méthyles.
La
RMN
13 C
présente
l'avantage
d' une
grande
sensibilité
des
déplacements
chimiques
des
13 C
aux
variations
structurales;
de
plus,
chaque
atome
de carbone
du
squelette ou de
tout groupe-
ment
lié
à
la
molécule
peut
être
examiné
individuellement.
(HANS et a l . . .
1969)
La
plupart
des
spectres
de
stéroides
trouvés
dans
la
littérature
ont
été faits
par transformée de
Fourier avec découpla-
ge
complet
des
protons
par
bruit.
La
concentration
de
stéroides
nécéssaire dépend en partie des dimensions du tube contenant l'échan-
tillon.
Généralement,
il
faut
20
à
300
mg
de
produit
pour
faire
des
solutions
de
l'ordre
0,1
0,6
M
dans
des
tubes
de
5 à
12
mm
de diamètre.
Les
microsondes
utilisant des
tubes capillaires
peuvent
permettrent
·de
réaliser
de
bons
spectres
à
partir
de
1
mg
d'échantillon
dans
la
ml' de
solvant.
Mais
il
faut· noter
que
le
découplage
complet
du
proton
entraine
une
perte
d' infor-
mation
spectrale
qui
pourrait
être
utile
pour
l'attribution
des

- 84 -
raies.
Cette
information est
retrouvée grâce
au découplage
partiel.
Dans
ce
cas,
l'effet
N.0. E.
est
affaibli
et
par
conséquent
le rapport signal - bruit.
(STOHERS et al 1977 al.
Les
préparations
ont
été
faites
en
général
dans
le
COC 1
avec
d'autres
solvants· comme
la
pyridine
ou
le
DMSO
si
3
la solubilité dans le CCoCL~
est faible.
En
général,
les
~ 13C sont peu sensibles aux variations
de
température.
C'est
ainsi
que
pour
le
5 ~
cholestane
3
one
en
solution
dans
CD t13
le
signal
du
carbonyle
est
déplacé
de
0,3
ppm
vers
les
champs
forts
lorsque
la
température
varie
de lOoK entre 303 0 et 323K
(STOHERS et al 1977 b)
V.1.2. Méthodes d'attributions
11
existe
une
grande
diversité
de
méthodes
d'attributions
des signaux en RMN
13C .
On peut les diviser en deux groupes:
Les méthodes physique et
Les méthodes chimiques
Nous ne citerons que les principales.
V.1. 2.1. Méthodes physiques.
Découplage en
"OFF
résonance"
(découplage partiel)
Dans
cette
technique
les
spectres
sont
découplés
par
une
seule
fréquence
de
l'ordre
de
plusieurs
centaines
de
Hertz
à
coté
de
la
zone
de
résonnance
des
protons.
Les
spectres
découplés
dans
ces
conditions
ont
été
plus
utiles.
Il
n'existe
plus
de
' d
1 3 ' d .
couplage
a
longue
istance.
Les
couplages
C-H
sont
re Ults
à
20-40
Hz,
tout
en
conservant
des
effets
Overhauser
favorables
pour exalter l'intensité des signaux. Sur les spectres des stéroides,
du
fait
du
nombre
important
des
raies,
le
découplage
par
"Off
résonance"
ne
donne
habituellement
ni
de
doublets
ni
de
triplets
et
quartets
dus
aux
méthynes,
méthylènes
et
méthyles
qui sont observables dans les molécules moins complexes.
La
distinction
des
carbones
méthyliques
et
méthyléniques
entre
eux,
se
fera
souvent
grâce
à
l'absence
du
signal
dans
la
zone
de
résonance
du
méthyne
sur
le
spectre ,~' ùff resonance" ~ ~
et
la
conservation
du
signal
des
carbones
méthyliques
dans

- 85 -
L~ur zone de résonance.
Un
autre
intérêt
de
ce
type
de
découplage
est
qu 1 il
permet
de
connaitre
directement
le
nombre
de
carbones
présents
dans
l'échantillon
quand
les
carbones
de
la
molécule
ne
sont
pas
symétriques. comme par exemple ceux des stéroides.
Marquage isotopique
Plusieurs
exemples
dans
la
littérature
ont
démontré
l'utilité
du
marquage
isotopique
dans
l'attribution
des
signaux
des
stéroides.
Le marquage deutéré est le plus utilisé.
Quand
le
deutérium
est
lié
à
un
carbone,
l'absorption
de
ce
dernier
devient
un
triplet,
à
cause
du
couplage 13C-~ D
et
des
raies
qui
présentent
un
élargissement
quadrupolaire

au
deuterium.
Il
y
a
une
diminution
significative
du
rapport
S/B (SIN)
V.l.2.2. Méthodes chimiques
Agents de déplacements chimique
L'utilisation
des
lanthanides
peut
être
utile
en
particulier
quand
un
seul
substituant
polaire
est
présent
ou
si
l'agent
de
déplacement
est
coordiné
en
majorité
avec
un
seul
des
substi-
tuants
présents.
Ytterbium,
europium.
praséodyme
ont
été
utilisés
avec succ~s dans l'analyse des stéroides.
Les
deux
premiers
déplacent
vers
les
champs
faibles
et
le
dernier
vers
champs
élevés.
Le
déplacement
induit
par
le
lanthamide
est
d'autant
plus
important
que
le
carbone
est
près
du site complexé.
le
greffage
de
divers
substituants
sur
la
molécule
est aussi utilisé.
Les
influences
des
substituants
dépendent
du
degré
de
substitution
du
carbone
considéré.
Pour
un
substituant
polaire
donné
les
carbones
quaternaires
sont
moins
affectés
que
les
méthynes, ceux-..:i sont peu dép lacés par rapport aux méthylènes.
C'est
en
utilisant
les
méthodes
que
nous
venons
de
citer

- 86 -
et
d'autres
non
mentionnées
ici
que
HANS
et
al
(1969)
et
SrOHER
et
al
(1977)
ont
attribué
les
raies
de
résonance
du
cholesterol
et
des
acides
biliaires
avec
une
grande
certitude.
Le
tableau
V.l. présente ces attributions.
V.2.
Résultats et discussions.
V.2.1.
Le solvant
Nous
avons
utlisé
le
mélange
CDCL
--DMSO
pour
dissoudre
3
environ
200
mg
de
calcul
E
(Avec
2ml
CDCL,3
plus
1 ml
DMSO).
3
Comme
nous
l'avons
signalé
au
chapitre
III,
ce
mélange
permet
de
dissoudre
la
plupart
des
constituants
des
calculs
biliaires.
Mais
ce
mélange
rend
difficile
les
interprétations
des
spectres
I l
des
calculs,
à
cause
des
interférences
entre
les
zones
de
résonances
du
DMSO
et
certains
carbones
du
cycle
stéroidique,
(voir
spectre
V.2.)
difficulté
qui
n'apparaît
pas
en RM~: fl-l.
Le
DMSO
donne
un
heptuplet
situé
entre
37
et
42
ppm,
zone
de
résonance
des
carbones C I , C24' C16 et C 13. L'apparition
de
ce
multiplet
de
sept
raies
équidistantes
d'intensité
relative
1.3,6.7,6.3,1,
s'explique
aisément;
en
effet,
le
deuterium
possède
un
spin
1
par
suite,
comme
l'indique
le
tableau
V.3.,
trois deuteriums équivallents ont un spin total tel que
:
MI
= +3,
+2,
+1,0,
avec
des
probabilités
relatives
respecti-
vement égales à 1,3,6,7.
Dyméthyl Sulfoxyde deutéré

- 87 -
1
ETATS DE 0
MI
(0)
POIDS
13
quanj
e résonne
1
1
1
3
1
1
1
1
0
2
1
0
1
2
3
0
1
1
2
1
0
0
1
0
1
0
1
0
0
1
1
6
1
-1
1
1
1
1
-1
1
-1
1
1
1
0
0
0
0
1
-1
0
0
7
1
0
-1
0
-1
0
1
0
-1
1
0
0
0
1
-1
0
0
-1
1
0
Tableau V.3.
Etats de spin des noyaux de denterium d' un groupe CD3

- 88 -
Les déplacements chimiques figurent sur le tableau V.2.
Le CDCL3
donne
trois raies d'égale intensité situées générale-
ment
entre
75
et
80
ppm.
Ces
raies
n'interfèrent
pas
avec
celles
des
C des stéroides des calculs biliaires.
Sur
le
spectre
V.2.
nous
avons
trois
pics
équidistants
situés
à
79,5
ppm,
78,2
ppm
et
76,9
ppm,
soit
un
écart
de
1,3 ppm correspondant
à 32,7 Hz,
la
valeur]
= 31,7 Hz déduite
du couplage]
= 206 Hz dans CHel
confirme cette attribution.
] CD
0, 154 x ] CH = 31, 7 .
Pour
éviter
ces
interférences,
on
peut
remplacer
le
DMSO
par le méthanol deutéré.
V.2.2. Analyses.
A
partir
du
tableau
V.1.,
on
peut
mettre
en
évidence
les
renseignements
apportés
par
les
spectres
RMN
13 C
des
stéroides par rapport à la
RMN
1H.
Les avantages sont:
Une
distribution
nette
des
fonctions
alcool
et
acide
carboxyl ique.
Une
mise
en
évidence
spécifique
des
carbones
éthyléni-
q ues. Ces
renseignements
privilégiés
vont
nous
permettre
de
faire aisément les identifications.
V.2.2.1.
Identification du cholestérol.
Le
cholesterol
n'a
pas
de
fonction
acide
carboxylique
en S4
caractéristique des acides biliaires.
Les carbones carboxyli-
ques
ont
un
déplacement
chimique
situé
en
général
entre 165
et
185
ppm.
Le
C 24
du
cholesterol est
méthylénique,
son deplace-
ment
chimique
est
par
conséquent
vers
les
champs
plus
forts
(39
ppm).
La
présence
ou
l'absence
des
raies
de
résonance
des
carbones
carboxyliques
est
un
facteur
de
distinction
du
cholesterol par rapport aux acides biliaires. MAis malheureusement,
la
mise
en
évidence
de
ces
carbones
n' est
pas
facile;
en
effet
si
l'on
ne
prend
pas
de
précautions,
le
signal
d' un
carbonyle
ne
sera
pas
observé
du
fait
du
temps
de
relaxation
relativement
long.

'1
ProJuits
1 :5olVants 1
P
°tO
j'
13 C
,1
OS1 10ns
e s , en ppm
R
utilisés 1
1
1
1
1
1
~ 1
1
1
1
1
1 Cl
C2 1 C3 1 C4 1 C5
1
C6
1 C7
ClO
C11
C12
C13
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
D 0
:lit hoc 0l i que 1 C 3a
1 35, 61 3a, 4 1 71, 81 36,5 1 42 , 51
27• 5 126. 7136 • 1 14 a•6134 •8121 •1 14 a•5 : 43 •a1
1
1
1
1
1
1
1
1
r
AciJe chéno- 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
I lI l1
1Je s 0xych0 l ique 1 CD 3a0
135 , 8 131, a1 71 , 41 39, 7 1 42 , 1 1 35 , 4 167, 8139 •913 3•3135 •512 1• 1 39. 9 43. a1
,1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Acde choli que!C0
1
0o
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
35,7/30,6/71,6/39.6/ 42.0/ 35.1[68,0139.9126.7135,1128,5172,5146,81
.__~I-
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
i
i
i
i
i
i
1
Cholestérol
ICo Cl 3
137,4131,8171,9142,51130,91121,8132,1132.1150,3136,6121,1 39,8,42,3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
i
i
1
i
i
1
1
Cholestérol
Pyriüne
37,7 32, 1171,0143,21141,71120,91 32,3132. 1150.4136,7121 .3128.4142.41
1
1
1
1
l
,
1
1
1
1
'""'3
1
Positions
13
,,:. jes
C
en ppm
(suite)
Pl
1
1
0'
.......
1
1
rD
T Solvant s
1
1
1
1
1
1
1
Pl
Projuits
C
C
m
C
C
C
C
c::
1
14
15
1..0
16
17
18
19
C20 1 c211 Cn ' C231 C241 C251 C261 C
utilisés
271
1
1
1
1
1
1
1
1
<:
1
.
1
1
1
1
1
1
1
......
Ac de
C0 00
56,7 24,4 28,4 56,5
11 ,8
23,2
3
35 • 6118, 1 131 , 213 1• 1 ~74, 51
1
lithOCholique
1
1
1
1
1
.
1
j
,
1
1
1
1
1
1-
1
1
1
1
1
1
1
I l
1
1
I I I
1
IAciJe chéno- !
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
IJésoxycholique! C0
00
150,9124.0128,5156,31 11,91 23,0135.8118,3131,2131.1~76,61
1
3
1
1
1
1
1
1
1
1
AciJe C h o l i q u e \\1
1
1
1
ICholesterol
Ico C1
156,8124,3128,3156.21 11,91
3
19,41 35,8118,8136.2123,9139.5128, aln .6122.81
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Cholesterol
Pyri Jine
56,9 24,4140,00 56:4\\ 11,9\\ 19.5i
1
1
1
1
1
1
1
1

Tableau V.2.
Attribution des signaux
13C d'un calcul biliaire
Positions jes carbones (en pp.) ju cholesterol jans le calcul biliaire
Carbones
attribués
Cl
C
C
C
C
C
C
C
C
C
2
3
4
Cs
C6
7
8
9
10
CL
C12
13
14
je Cl à C14 .
37
31,3
70,3
41,9 140,9
120,4
31,5 31,5
49,7
36,2
20.7
27,9
41,4
56,3
Numéro ju signal
sur le spectre
19
24
6
11
1
2
23
23
9
20
31
25
12
7
Positions jes carbones (en pp.) ju cholesterol ju calcul
Carbones
attribués
je C à C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
15
27
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
24
39,4
55,7
11,6, 19,1
35,3
18,5 35,8 23,4
39,1
27,6
22,4
22,6
'-D
o
Numéro ju si9nal
sur le spectre
27
15
8
34
32
22
33
\\21
28
16
26
30
29
1
SOLVANT
Positions jes signaux je résonance ju solvant en pp.
DMSO
42,1
41,4
40,6
39,8
38,9
38,1
37,01
CD Cl 3
79,5:
78,2
76,9

- 91 -
L'atout
majeur
de
l' idenfication
du
cholesterol
réside
dans
la
mise
en
évidence
des
carbones
éthyléniques
-Cs
et
C,
Ils
résonnent
respectivement
à
140 et 120 ppm.
La différence
entre leurs déplacements chimiques est lié à leur degréde substitution.
Le
C 5
est
quaternaire
donc
moins
blindé
que
son
homologue
C6
tertiaire.
V.2.2.2.
Identification des acides biliaires.
Nous
avons
dit
plus
haut
que
les
acides biliaires différents
les
uns
des
autres
par
le
nombre
d' hydroxyles
présents
sur
le cycle stéroidique,
au niveau des carbones 3, 7 et 12.
La
reconnaissance
de
ces
carbones
donne
une
identification
quasi
sure
de
ces
acides.
Ils
ont
des
déplacements
chimiques
situés entre 65 et 75 ppm
(confère Tableau V.I.)
L'acide
cholique
donne
trois
traits
caractéristiques
des
carbones 3, 7 et 12.
Le
chenodesoxycholique
présente
deux
signaux
dont
l'un
à
67
ppm

au
C7
et
l'autre
à
71
ppm
du
au
carbone
C 3
Le
dernier
signal
est
le
seul
que
donne
le
lithocolique
car il n'a qu'un seul hydroxyle sur le cycle.
V.2.2.3.
Identification du cholesterol dans le calcul biliaire.
Le
tableau
V.2.
présente
les
attributions
des
signaux
13 C
du
calcul
~3
obtenu
en
comparant
avec
les
données
du
tableau
V.I.
Un
certain
nombre
d'éléments
nous
permettent
de
dire
que
ce
calcul
est
essentiellement
constitué
de
cholestérol:
La
présence
significative
des
raies oés
carbones éthylé-
niques Cs et C 6 ·
L'ex is tence
d' un
signal
unique
dans
la
zone
des
carbones
possédant
des
fonctions
alcools.
Le
seul
acide
biliaire
ayant
une
fonction
alcool
unique
en
C3
comme
le
cholesterol
est
le l,ithocholique. Or,nous
savons
que
cet
acide
est
en
quantité
faible dans la bile humaine.
Le nombre de carbones.
N;:'11S
avons
35
pics
sur
le
spectre
V.2.
Si
nous
soustrayons
les pics du solvants et du T .M.S,
il reste 24 pics.

- 92 -
(7
raies
DMSO
et
3
raies
CDel3
+
1
raie
TMS -
11
pics
35 ~ Il
=
24 pics.)
Sachant
que
le
C 7
et
le
C 8
du
cholestérol
résonnent
au
même
endroit ctâns le CD Cl 3 et que le~r càrbohés:C et C 13 ont des
1
raies
qui
interfèrent
avec
celles
du
DMSO,
nous
retrouvons
les 27 carbones du cholesterol.
Nous
avons
ainsi
une
confirmation
des
résultats
obtenus
en
RMN
1H
lors
du
dosage
du
cholesterol
dans
le
calcul
E
Nous
avons
trouvé
environ
60%
de
cholesterol,
ainsi
que
1"3
nous
l' avons
montré
en
RMN
1 H, la RMN
C
con fi rme
que
les
les
acides
biliaires
sont
en
quantité
négligeable.
L'absence
des
carbones
portant hydroxyliques et carboxylique
nous
suggère
que
les
acides
biliaires
sont
en
quantité
non
appréciable
en
E
.
3

- 93 -
SPECTRES V.l à V.2

EXPERI\\1E~TAL
:\\SSIGY'1E~TS
PARA~1ETERS
0
/1
tl
11.9
rt~
36.4
Instr.
XL-100
b
18.9
~.
36.7
'Iode
FT
r
19.5
p
37.7
,
Time
5.3 min
q~i/éH3
" 21.3 q 39.7
Sol\\'.
pyridine d
p
22.6
r
40.0
r
s
Conc.
19/2ml SON
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22.8
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t
43.2
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24.4
u
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"
CH 3
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S.E. Time Constant .4 sec
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1
28.1
V
56.4
j
28.4
IV
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k • 32.1
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180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
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•.1

CONCLUSIONS
Conclusions générales
La
RMN
du
proton
peut
constituer
une
bonne
technique
de
routine
pour
l'identification
et
le
dosage
du
cholesterol
dans les calculs biliaires.
une
identifica tion
rapi~e
du
cholesterol
est
obtenue
grâce
à
la
présence
du
signal
à
5,35
ppm
caractéristique
du
proton
porté
par
le
carbone
6.
Une
bande
trés
caractéristique
située
entre
1
et
2,5
ppm
ou
"empreinte
digitale"
ainsi
que
la
position
relative
des
pics
méthyliques
confirme
sans
ambiguité
cette
identification.
Une
bonne
estimation
du
taux
de
cholesterol
dans
les
calculs
biliaires
peut
être
obtenue
par
l'intégration
du
signal
du
proton
en
C 6
l'addition
dans
l'échantillon
de cholesterol connu augmente la fiabilité des résultats.
La
RMN
du
carbone
13
donne
des
spectres tr:s
bien
résolus
et
permet
ainsi
une
étude
plus
détaillée
des
acides
biliaires
et
du
cholesterol.
Les
renseignements
qu'on
en
tire
peuvent
compléter les
études en
RMN
du
proton; mais ell e est plus difficilement
utilisable
en
routine
en
raison
de
la
faible
abondance
isotopique
du
carbone
13,
rendant
l'utilisation
de
la
transformée
de
Fourier
nécéssaire.

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Etude
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l' analyse
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Table des matières
INTRODUCTION
1
CHAPITRE 1
: Principes généraux de la RMN
4
1.1.
Effet ZEEMAN nucléa ire
4
1.2. Conditions d'observation d'un signal
6
6
1.2.1.
Intensité du signal
8
1.2.2. Largeur de bande
1.3.
lnstrumantation RMN
9
1.3.1. Composition de base d'un spectromètre RMN
9
11
1.3.2. Accessoires
1.3.2.1.
Intégrateur
11
1.3.2.2. Température variable
11
1.3.2.3. Découpleur de spin
12
1.4. Etude des spectres
13
1.4.1. Déplacement chimique
13
1.4.2. Structure des bandes de couplage spin-spin
14
1.4.2.1. Classification des spectres
17
1.4.3.
Intensité des bandes
17
1.5. Particumarités de la RMN 13 C .
18
1.5.1.
1ntroduction
18
1.5.2. Principe de spectrométrie de FOURIER
20
1.5.3. Paramètres dominants en RMN
13 C.
21
1.5.3.1. Déplacement chimique
21
1.5.3.2 Constante de couplage
21
1.5.3.3.
Relaxation et "nuclear Overhauser Effect" (NOE)
21
CHAP ITRE Il.: Etudes bibliographiques des calculs biliaires
25
Il.1.
Introduction
25
11.2. Classification et composition des calculs biliaires
29
Il.3. Origine
33
11.4. Méthodes d' analyses
34
·.:::HAP ITRE Ill: Analyses qualitatives des calculs biliaires
par RMN I H.
35
11 1.1. Preparation des échantillons
35
Ill. 1.2. Les solvants
35
111.1.3. Quantité d'échantillon
36
Il 1.2.
Résumé
bibliographique
des
attributions
des
bandes
de résonance des acides biliaires et cholesterol.
37

111.2.1. Attribution des bandes de résonances des méthyles
37
111.2.2. Mise en évidence des hydroxyles
38
111.3. Résultats et analyses qualitatives
39
111.3.1. Comparaison des tableaux n0111.I. et noIl1.2
39
111.3.1.1.
La bande des léthyles
39
111.3.1.2.
La bande des protons voisins d'un hydroxyle
41
:11.3.1.3. Identification des acides biliaires et cholesterol
46
Il1.3.2. Utilisation d'un agent de déplacement chimique
49
(shift reagent)
Il1.3.3.
Identification du cholesterol dans les calculs biliaires
50
:::HAPlTRE IV: Analyses quantitatives des calculs
biliaires par RMN 1 H
67
IV.I. Principe
67
IV.2.
Resultat et discussions
69
V.2.1. Choix d'un standard interne
69
V.2.2. Méthode des ajouts connus
70
IV.2.3. Enregistrement et analyses des spectres
70
IV.2.3.1. Dosage du cholesterol en E
70
3
IV.2.3.2.
Dosage du. cholesterol en E 4
72
IV.2.3.3. Discussion
74
CHAPITRE
V:
Analyses
qualitatives
des
calculs
biliaires
par RMN 13C •
83
V.1
Introduction
83
V.I.2. Méthodes d'attribution
83
'1.1.2.1. Méthodes physiques
84
V.1.2.2. Méthodes chimiques
85
V. 2. Résultats et discussions
86
V.2.1. Le solvant
86
V.2.2. Analyses
88
V.2.2.1.
Identification du cholesterol
88
V.2.2.2.
Identification des acides biliaires
91
If .2.2.3.
Identificationdu cholesterol dans le calcul biliaire
91
CONCLUSIONS
BI BUOGRAPHI E

Centre Régional des COOPératives Etudiantes
C E R C 0 0 P E
8 Rue Volney 69 008 LYON -
Tel.
874-89-08