Série
C
N° d'Ordre
577
N° de Série
213
THE S E
présentée devant
L'UNIVERSITE DE RENNES
U.E.R. des Sciences Biologiques
pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR EN 3ème CYCLE
Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire
par
BENIE Tanon
Sujet de Thèse: EI1JDE DES CARACTERISTIQUES DE LA LIAISON DU 5a-ANDROSTANE-3/3,
17a-DIOL et du 17a-OESTRADIOL AU RECEPTEUR HYPOPHYSAIRE DES OESIROGENES CHEZ LE
RAT DE LA NAISSANCE A L'AGE ADULTE.
Soutenue le 23 Octobre 1979 devant la Commission d'Examen
M.
JaJAN
Président
M.
PELLETIER
)
)
M.
RAULT
) Examinateurs
MIe SN-fPEREZ
)
MIe
)
TIHEULANT

---

UNIVERSITE DE RENNES
U.E.R. "SCIENCES ET PHILOSOPHIE"
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GEOLOGI E
.
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ZOOLOGIE
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M. MAN 1EY Jacques
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Mme U RVOY J. née Le Masson
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PERSONNELS C.N.R.S.
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inscrits sur la LAMC
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ZOOLOGIE
Mme GAUTI ER Annie née Hien
ANTHROPOLOGIE
M. GIOT Pierre-Roland
M. BRIARD Jacques

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A mon épouse
Ames parents

---

Je tiens à exprimer mes remerciements à Monsieur le
Professeur JOUAN, Mademoiselle le docteur SAMPEREZ, Monsieur le docteur
PELLETIER et Monsieur le Professeur RAULT, pour avoir accepté de partici-
per au jury de cette thèse.
Mademoiselle le docteur M.L. THIEULANT, a bien voulu
assurer la direction des recherches qui sont à l'origine de ce travail,
son encadrement, ses conseils ont guidé son cheminement. Puisse-t-elle
trouver ici le témoignage de ma reconnaissance.
A tous les autres membres et au personnel du labora-
toire de Neurobiologie Moléculaire (A et B), j'adresse mes sincères re-
merciements pour l'amitié et le dévouement.

---

SOM MAI R E
INTRODUCTION GENERALE
l
1ère Partie - Etude de l'évolution de la liaison du 5 Cl -Androstane
6
3 S -17 B -diol et du 17 S -Oestradiol au récepteur oes-
trogène dans l 'hypophyse antérieure du rat mâle (cas-
tré ou non). Mesure des sites libres.
Introduction
7
1 - Matériel et méthodes
7
1-1 - Pureté des hormones radioactives_
7
1.2. - Animaux
9
1.3. - Préparation et incubation du cytosol
9
1.4. - Séparation hormone liée - hormone libre
10
1.5. - Influence de l' Cl -f'oetonro té ine sur les mesures des
10
sites de liaison du 36 -Adiol et de l'oestradiol au
récepteur oestrogène,chez les jeunes rats
1-6. - Expression des résultats.
11
II - Résultats
14
II.1. - Pureté des hormones radioactives
14
II .2. - Influence de li Cl-foetolJrotéine sur les nesures des
15
sites de liaison du 3 S -Adi ol et du 17 S -Oestradiol
II.3. - Evolution du nombre de sites du récepteur et de la
17
constante d'association du 3 S -Adiol chez le rat
mâle.
19
II.4. - Influence de la castration sur l'évolution du nombre
de sites de liaison et de la constante d'association
du 3 S -Adiol chez le rat mâle.
11.5. - Evolution du nombre de sites de liaison et de la cons- 24
tante d'association du 3 S -Adiol chez le rat femelle.
II.6. - Evolution du nombre de sites de liaison et de la cons- 24
tante d'association du 17 S -Oestradiol chez le rat
mâle.
III - D;scu~~;on des résultats et conclus;ors.
26

---

2ème Partie - Mise au point et application d'une technique d'échan-
32
ge pour la mesure des sites de liaison totaux (libres
et occupés) du 3 8-Adiol et du 178 -Oestradiol au
récepteur oestrogène, dans l 'hypophyse antérieure du
rat mAle.
Introduction
33
A - La technique d'échange et son application à l'étude
35
de la liaison du 3 8-Adiol au récepteur oestrogène
chez le rat mâle.
l - Mise au point de la technique d'échange.
35
1.1. - Matériel et méthodes.
35
a) Traitement du cytosol
35
b) Expériences préliminaires.
35
a) Adsorption de la radioactivité libre par le
36
charbon dextran-gélatine en fonction du temps
de contact.
8) Influence du traitement par le charbon dextran-
36
gélatine et de l'ultrafiltration sur le taux
des protéines cytosoliques.
36
c) Etude de la cinétique d'échange
37
d) Etudes métaboliques
a.) Extraction de 1 'hormone liée et de l'hormone
37
l tbr e
6 ) Ana lyses chromatographiques.
37
- Séparation des diols (3aet 3 8-Adiol) des
autres métabolites.
- Séparation des 3 a et 3 8 -Ad i ol .
37
38
i
'Y) Révé lat i ons et comptag es
1
c) Vérification de la spécificité de la liaison du
38
J
i
3 8 -Adi
l
01 au récepteur oestrogène, après échange
1.2. - Résultats
39
1
a) Cinétique d'adsorption de la radioactivité libre
39
!
par le charbon dextran-gélatine.
1
1
-
1
b) In:F)~e~ce du_ traitè"l2.:ît !1a_~ le charbon dextr-an-çé-
39
~
l~.~1..e et de l ul tr afi l tr-att on sur le taux des pro-
1
1
telnes cytosoli~ues.
îJ
1

---

1stf!1
1
c) Conditions d'échange
42
1
3H
i
d) Métabolisme du 3 8-Adiol-
en fonction de la
42
durée et de la température d'échange.
1
e) Spécificité de la liaison, après échange.
44
!,!
II - Application de la technique d'échange à l'étude du "récep-
45
1
teur cytosolique"du 3 8 -Adiol.
1
,
II.1. - Protocble expérimental
45
!
!
1
II.2. - Résultats
47
!;
II.3.
Discussion des résultats
49
1
!
B - Mise au point d'une technique d'échange et application à l'étu-
53
1
1
de de la liaison du 17 8-0estradiol au récepteur oestrogène
chez le rat mâle.
1
l - Mise au point de la technique
53
1.1. - Matériel et méthodes
53
a() Expérience préliminaire: influence du charbon
53
dextran-gélatine et de l'ultrafiltration sur la
liaison du 17 ~Oestradiol à O°C à son récepteur.
i
,
54
!
b ) Cinétiques d'échange.
!
a ) Dans le tampon phosphate
1
!
i
8 ) Importance de la présaturation avec 1'hormone
froide.
1
y )
Dans le tampon Tris-EDTA-Dithiothreitol-Bacitra-
cine (TEDB).
1
c) Influence de la nature du tampon sur la liaison du
55
1
178 -Oestradiol à son récepteur à O°C
3H
d) ~·1étabolisme du 176 -Oestradiol-
en fonction de la
55
1
durée et de la température d'échange.
1
1.2. - Résultats.
55
a) I nfl uence du traite ",lent par 1e charbon dextran-gé 1a-55
t ine et de l'ultrafiltration du 17 S -oestradiol ~ --
1
sr.n r6centeur À 0-C.
1
~) Conditions d'échange dans le tampon phosphate et
dans le tampon TEDB.
l1
c) I nfl uence de 1a nature du tampon sur 1a 1i ai son du
60
17 B-Oestradi 01 à son récepteur à 00 C.
1
1j

---

3H
d ) Métabolisme du 17 a -Oestradiol-
60
II - Application de la technique d'échange! l'étude des sites
62
totaux (libres et occupés) du 17 a-Oestradiol au récepteur
oestrogène chez le rat mâle.
II.1. - Protocole expérimental
62
II.2.
Résultats
64
II.3.
Discussion des résultats et conclusions.
66
III - Conclusions.
67
Conclusions générales.
70

---

ABREVIATIONS ET SYMBOLES UTILISES DANS LE TEXTE
B
"bound"; hormone liée
B
liaison non spécifique
ns
B
liaison spécifique
S
B
liaison totale (=liaison spécifique + non spécifique)
t
Cf
se conférer à
Cm
centimètre
cp
corps polaires
DCC.
"dextran coated charcoa l
dpm
désintégration par minute
DNA
acide dexosyribonucléique
El
Oestrone
E
17 8 -Oestradiol
2
E
Oestriol
3
F
front
fmoles/mg
femtomoles par milligramme
FSH
hormone folliculo-stimulante
KA
constante d'association
KD
constante de dissociation
3
honnone radioactive tritiée
H
Lf-:
honnone lutéinisante
LH-RH
hormone favori sant la sécréti on de LH
M
Molaire. (=molarité)
ml
millilitre
fi
nombre de sites de liaison
nm
nanomètre
o
origine
r
constante de corrélation
SAB
sérum albumine
Stéroïde"froid": stéroïde non radioactif
T
testotérone
U
"Unbound"; hormone libre
U.V.
ultraviolets
64.
64 androsténedione
III
microlitre (= 10-6 litre).

---

INTRODUCTION GENERALE

---

2
Il est bien établi à l'heure actuelle, que l'interaction
des hormones sexuelles' avec des récepteurs protéiques spêc i.f i.ques intracellu-
laires est un évènement clé dans' le mécanisme d'action de ces hormones sur
les tissus
cibles. Au niveau cellulaire, l'hormone stéroïde, après pénétra-
tion dans la cellule, se lie à un récepteur cytoplasmique pour former un
complexe hormone-récepteur qui est transféré au noyau et agit sur le matériel
génétique de la cellule (O'MALLEY, 1974; JENSEN, 1972; GORSKI, 1976).
L'importance des récepteurs est démontrée, dans les
cancers mammaires humains (où la présence de récepteurs des oe3trogènes et
de la progestérone est un test important dans la sélection des cancers en
vue d'une thérapeutique endocrinienne
:McGUlRE, 1975) et dans le syndrome
du "testicule féminisartt" (où le faible taux de récepteurs hypophysaires des
androgènes entraîne une "insensibilité" des organes' secondaires aux andro-
gènes et un non développement des tissus sexuels androgènes dépendant chez
le rat
:NAESS, 1976). Ce dernier exemple confirme bien le fait que les ré-
cepteurs jouent un rôle essentiel, dans l'action des hormones stéroïdes
sur l'hypophyse et sur le système nerveux central du rat.
Des récepteurs ont été caractérisés, dans le cytoso1
hypophysaire du rat mâle, pour l'oestradiol (KORACR, 1974 ; KAT0 , 1975;
VREEBURG, 1975) et pour les androgènes, testostér~ne e.t; son principal méta-
bolite, 5 a - DRT (JOUAN et coll, 1971 et 1975 ; KORACR, 1974 : VREEBURG,
1975). La testostérone et la 5 a - DRT étant également métabo1isées dans

---

3
l'hypophyse en Sa -And ros tane - 3 a , J7 a
-diol (3 a -Adiol) (JOUAN et Coll,
1973) et en 5 a -And ro s tane - 3 a , 17
a -d i.o l
(3
a -Adiol) BERTRAND, 1975);
KAO, 1977), des récepteurs' ont été également r êche rchês pour ces stéroïdes.
Ces recherches ont été négatives pour le 3 CI -Adiol (JOUAN
et coll., 1976) mais positives pour le 3 a -Adiol) (JOUAN et Coll, 1977).
L'affinité du 3 a-Adiol pour son récepteur est relativement faible (~=1,9 x
8M)
10-
quand elle est comparée à celle du récepteur de l'oestradiol et des
androgènes. De plus, la protéîne liant le 3 a -Adiol a un nombre de sites
de liaison très supérieur (n = 87
fmoles/mg de protéînes pour des rats de
36-38 jours) à celui observé, pour des animaux du même âge, pour les andro-
i
!.
gènes (n = 12 - 15
fmoles/mg de protéînes). Si les oestrogènes (I7 S -Oes-
!
tradiol, diéthfl~ilbestrol) sont plus compétitifs que le 3 a -Adiol lui même
1
pour sa propre liaison, le 3
a-Adiol par contre est un faible compétiteur
pour la liaison du 17
a-oestradiol. Dans les deux cas, les androgènes sont
de très faibles compétiteurs. Cette analogie
. de stéréospécificité entre
la liaison du 3
8 -Adiol et celle du 17
8 -Oestradiol et d'autres données
expérimentales, ont permis de conclure que le 3
a -Adiol n'a pas de récep-
teur cytoplasmique propre, mais se lie à celui des oestrogènes (JOUAN et Coll,
1979, soumis à
publication). Il faut noter, toutefois, que ces résultats
ne permettent pas d'établir si le 3
B-Adiol et l'oestradiol interagissent
avec le récepteur oestrogène aux mêmes sites ou à des sites voisins. L'in-
teraction du 3
a -Adiol avec le récepteur cytoplasmique hypophysaire des
oestrogènes revêt une importance primordiale en raison du rôle des oestro-
gènes, dans la régulation des gonadotrophines hypophysaires, dans la matu-
ration sexuelle postnatale chez la rate (SMITH, 1968).
L'intérêt de l'étude de la liaison du 3 8 -Adiol tient
auss~ à d'autre~ faits:
- dans le tissu ovarien de la rate prépubère, la FSB
induit une réaction d'épimérisation du 3 CI -Adiol en 3 8 -Adiol alors que
cette réaction ne se produit pas chez la rate adulte (SPINGER et ECKSTEIN,
1971) •
- dans l'hypophyse et la prostate, on observe une aug-
mentation de la formation du 3 B -Adiol à partir de la testostérone au

---

1
4
t
moment de la puberté (J. BERTRAND et coll, 1~75),
Plusieurs études indiquent une activité biologique im-
portante pour ce stéroïde :
- le 3 (l -Adiol maintient l 'hypertrophie de l'épi thé-
lium et stimule l'activité sécrétoire de la pros't.a t e du rat en culture
(ROBEL, 1971).
- Le 3 ~
-Adiol est capable de maintenir aussi bien la
spermatogenèse que le poids des glandes accessoires chez les rats hypophy-
sectomisés (NAZIR Ahmrcti, 1978).
- Le 3 r;
-Adiol, inJjecté à des rates innnatures, est
capable d'induire une puberté précoce (ECKSTEIN, 1974).
- Les résultats de l'action du 3 ~ - Adiol sur les
i
!
gonadotrophines hypophysaires (LH et FSH) sont assez contradictoires.Cer-
!
tains auteurs (KAO, 1975;EEBTEIN, 1977) ont montré que cet androgène est
i
susceptible de modifier les taux
plasmatiques de ces deux stimulines,
1
tandis que d'autres (VERJANS, 1977; ELDRIDGE, 1974) ont constaté qu'il est
1
sans effet sur la sécrétion de la LH et de la FSH. Des expériences préliminaires
1
dans notre laboratoire suggèrent que pendant la périfus ion des hypophyses, le 3 r -
Adiol est capable de modifier la réponse de l'hypophyse au LH-RH en inhibant la
libération de LH (RAULT et coll, sous presse 1979).
1
i
Toutes ces données expérimentales et en particulier la
1
liaison du 3 r -Adiol au récepteur hypophysaire des oestrogènes et le rôle
du 3
p -Adiol dans la puberté chez la rate, nous ont conduiŒà entreprendre
1
une étude ontogénique comparative des caractéristiques de liaison du 3 ~ -
Adiol et du 17 (' -Oestradiol au récepteur des oestrogènes de la naissance
à l'âge adulte. Nous avons essayé de relier les variations de ces caracté-
1
ristiques avec le développement et la maturation sexuelle chez le rat mâle.
1
l
Nous avons particulièrement étudié, comme caractéristiques de liaison, les
1
variations de la constante
d' affinité et du nombre de sites de liaison
j
des deux hormones au récepteur oestrogène.

---

5
La prés-ence d' 04
-foetoprotéîne dans le sérum des jeunes
rats (RAYNAUD, 197]; BONNIE, 1978) noua a condui~à vérifier l'éventuelle con-
tamination de nos mesures par cette protéine,
1
La présence d'hormones endogènes occupant uue partie des
1
sites récepteurs dans le tis-su hypophysaire ne permettant de mesurer par la
f
méthode directe (incubation à QOC) que les sites de liaison libres, nous avons été
conduits à mettre au point des techniques d'échanges pour le 3 ~ - Adiol et
pour le 17 p -Oestradiol afin d'évaluer les sites totaux (libres et occupés).
Il convient de préciser que cette étude a été effectuée
sur le cytosol hypophysaire.

---

6
1ère
PAR T l E
Etude de l'évolution de la liaison du 5 cl
-andr os ta ne
3 i->
, 17
(3
-diol (3 r- -Adiol) et du 17 P -Oestradiol au récepteur oestro-
gène dans l'hypophyse antérieure du rat mâle (castré ou non). Mesure des
sites libres.
i1
l
1
!
1
i
1
1
1
jl
i
1
{
1
tifj
!
J
~

---

7
INTRODUCTION
Dans. cette première partie de notre étude, nous avons
essayé de mesurer les sites de liaison Li.bres du 3 ~ -Adiol et du ]7 ~ -Oes-
tradiol dans le cytosol hypophysaire du rat mâle, en fonction de l'âge. Nous
avons également effectué quelques expériences avec des animaux castrés, en
particulier pour les r ats adultes.
Les travaux suggérant un rôle du 3 r -Adiol dans le
déclenchement de la puberté ayant été effectués chez les rates (SPRINGER
et ECKSTEIN, 1971 ; ECKSTEIN, 1974), i l nous a paru intéressant d'étudier
parallèlement l'évolution de la liaison du 3 ~ -Adiol chez la rate afin
d'établir une comparaison.
Dans le sérum des jeunes rats, la présence d' C\\ -
foeto-
protéine liant l'oestradiol
a été signalée par plusieurs auteurs (J.RAYNAUD,
1971 ; BONNIE, ]978). Nous avons par conséquent étudié sur gradient de sac-
charose 5 - 20 % la liaison du 3 ~ -Adiol et du J7 r -Oestradiol par les pro-
téines sanguines.
l - MATERIEL ET METHODES
1-] - Pureté des hormones radioactives
a) le 5 0( -andros tane - 3 f-' - 17 (3 -diol - ],2 }H
1
Au cours de cette étude, nous avons utilisé plusieurs
j
solutions radioactives d'activité spécif~uevariant de 40 à 46 Ci/mmole.
1
l
Nous avons utilisé la même hormone pour une étude complète de la naissance
î1
à l'âge adulte.
~
1
1
Les hormones radioactives, 3 ~ -Adiol - ],2 !H, sont
1
1

---

fournies par le centre radiochinique Amers.ham. La solution radioactive (1 mCi/
nnnole) , initialément . livrée en milieu benzène.... thano I (9/]) est d i Luês avec
ê
le même solvant. Des fractions a l i.quo t es sont évaporées' avant chaque expérien-
ce.
3R,
La pureté radiochiroique du 3 (?> -Adiol - 1,2-
est ré-
gulièrement vérifiée par chromatographie sur papier à JO°C, dans le système
de solvanœ de KOCHAKIAN et STIDWORTHY
(1952): benzène-cyclohexane) saturé
en propylène glycol (100 : 100 : 25, V/V/V). C,e mélange, préparé deux heures
avant la migration, est équilibré une heure à température ordinaire et une
heure à 30° C.Le papier Whatman, n° 2, découpé en bandelettes de 2,5 cm de
largeur et 49 cm de longueur, est impreigné, une heure avant la migration)
par un mélange propanediol-méthanol (70 : 70, V/V) et séché entre des feuil-
les de papier filtre.Nous avons déposé quelques minutes avant la migration
5
~l
d'une solution de ~ r -AdioL - 1,2 _3H.diluéeau I/I000è et 5
~l
d'une solution de testostérone et d'androsténedione (5 mg /ml de méthanol)
sur chaque bandelette comme étalons internes. La durée de la chromatographie
est de 6 ou 17 heures, à 30° C selon le degré de séparation recherché. A la
fin de la migration, les étalons internes et le front du solvant sont détec-
tés à l'U.V.
(250
-nm). Chaque bande est découpée centimètre par centimètre.
Chaque fragment est ensuite introduit dans une fiole de comptage avec 5 ml
de solvant papier (PPO : 5mg ; diméthylPopop : 0,1 g; Toluène q.s.p. 1000 ml)
et compté dans un compteur à scintillation "1 Socap 300 "
b) Le 17 ~ -Oestradiol - 6 7 _3H
-----------------------~-----
Nous avons utilisé les solutions de 17 ~ -Oestradiol -
3H.
6,7-
L'activité spécifique varie
de 58 à 60 Ci/mmole.
La pureté
radiochimique du 17 ~ -Oestradiol, est véri-
fiéepar chromatographie sur plaque d'alumine fluorescente (30 g Oxyde d'alumi-
1
nium PF 254 + 366 (Type E) dans 30 ml d'eau distillée) dans le système de
t
solvants benzène-éthanol (20 : 1, V/V) (C.DRKER, J 970).5 ~l d'une solution de
1
17 ~ -Oestradiol - 6,7 _3H di Luês au J/IOOOe et 5 l'l d'une solution d'oes-
triol, de 17 ~ -Oestradiol et d'oestrone (5mg/ml
de méthanol) sont déposés
sur laplaque comme étalons internes. A la fin de la migration, les étalons
1
1
1

---

9
internes et le front sont repérés aux ultraviolets 254 et 366 nm. La plaque
est découpée 1/2 centimètre par 1/2 centimètre. Chaque fragment est introdut
dans une fiole de comptage, addtionné de 0,5 de méthanol et de 5 ml de liqui-
de scintillant, "Ready Solv" (BECKMAN)
1-2 - Animaux
Nous avons utilisé pour toutes nos expériences, des
rats mâles et femelles de souche "Wistar", provenant de l'élevage Janvier
(53 - Le Genest) âgés de ]4 à ]00 jours normaux ou castrés. La castration
est effectuée par
voie péritonéale, sous anesthésie à l'éther éthylique.
Ces rats ont été sacrifiés 3, 8, ou 14 jours après l'orchidectQmie.
Les rats sont sacrifiés par décapitation sans anesthésie.
Les hypophyses antérieures sont rapidèment prélevées,
sont rin~ées dans une solution glacée de Nacl 9 %oet homogénéisées à froid
dans une solution de tampon phosphate 0,05 M à ph 7,4 (NaHP0
12 H
: 13,
4,
20
42 g ; KH
P0
: ],70 g ; eau distillée q.s.p.
1000 ml). Après centrifuga-
2
4
tion de l'homogénat à 600 xg, le surnageant est soumis à une centrifugation
à lOS 000 x g, pendant une heure, dans un rotor SW65 ('ultracentrifugeuse
Beckman). Le cytosol obtenu est dosé par la méthode de LOWRY et coll (1951)
et dilué avec du tampon phosphate 0,05M froid afin dobtenir une concentra-
tion finale en protéines de 2,9 mg/ml de cytosol.
Des parties aliquotes de cytosol dilœ sont incubées à
3H
O°C, à l'équilibre (3 heures) en présence de concentratio~de 3 ~ -Adiol-
variant de 9 x 10-IOM à 2 x I07 M ou de 17 ~ -Oestradiol _3H variant de
4 x 10-IOM à 3,9 -8M. Des expériences témoins sont effectuées dans les mêmes
conditions en utilisant l'hormone radioactive en solution dans le tampon phosphate
0,05 M .
Les solutions radioactives sont préparées de telle sorte

---

la
que le taux d'alcool dans le milieu d'incubatipn
n'excède pas 0,3 %.
Des prélèvements de 5
1"1 de milieu s'ont effectués afin
de déterminer la quantité totale d'hormone radioactive (T) présente dans le
milieu d'incubation,
Afin d'évaluer la contamination due à la présence d'~
foetoprotélne dans le cytoso1 des jeunes rats (15, 22 et 30 jours), cer~
taines incubations ont été réalisées en présence de 17 Î"'
-Oestradio1- 3H
et d'un excès de DES (100 fois la concentration d'hormone radioactive). En
effet, il a été démontré que le DES ne se lie pas à 1'04 -foetoprotéine
(Raynaud, 1971 ; McEWEN, 1975 et 1977 ; WESTLEY, 1976).
A la fin de la période d'incubation, le récepteur et son
ligand sont précipités par addition au cytoso1 d'un volume égal d'une solu-
tion de sulfate de protamine à 1,5 mg/ml d'eau distillée. Le mélange est
agité, puis maintenu à O°C pendant 15 minutes. Les différents échantillons
sont
ensuite
déposés sur des filtres en fibres de verre, "Whatman GF/C"
de 2,5èm de diamètre. Les filtres sont lavés sous un vide léger, par une
solution de tampon phosphate 0,05 M froid (3 x 15 ml). Les témoins sont
traités
de la même façon. La radioactivité absorbée par le filtre est
gesurée par comptage dans du liquide de Bray (PPO : 4 mg ; diméthy1Popop
200 mg ; Naphtalène: 60 g ; méthanol: 100 ml ; éthylène glycol: 20 ml
dioxane q.s.p. 1000 ml).
1-5 - Influence de l' ~ -foetoprotélne sur les mesures
des sites de liaison du 3 ~ -Adio1 et du 17 ~
-Oestradiol au récepteur
~
oestrogène chez les jeunes rats.
j
j
1
"
350
~1 de sérum de rats mâles de 15 jours, dilué à
-1
1
8 - la mg de protéines
par ml avec du tampon Tris-Ec1,pfJ. 7,5 (EDTA : 0,0015M;
l
dithiothréito1 : 0,00 la M ; Tris: 0,01 M
glycéro1: la %
ph 7,5 avec
du Hc1) sont incubés en présence soit de 3 ~ -Adio1 _3H (1,2 x 10-8M) soit
1
3H
de 17î-'-Oestradioi_
(1,4 x 10-8M) seul ou avec 100 fois plus de stéroides,"froid"
pendant 3 heures.

---

1 1
Les. différents es:sais. sont résumés. ci-dessous.
Sérum + 3 ('J -Adiol- 3H
Sérum + 3 (> -Adiol-:- 3a + 3 ~ -Ad i oI "froid"
Sérum + 3 ~ -Adiol -?H + DES
Sérum +17 ~ -Oestradiol _-3H
Sérum +]7 ~ -Oestradiol ;..3H +]7 Il -Oestradiol "froid"
Sérum +] 7 f.> -Oes.tradiol _'3 H +
3
p -Adiol "froid"
A la fin du temps' d'incubation, les différents milieux
sont traités par un culot 2000 x g de D.c.c. provenant de la centrifugation
d'un volume égal d'une suspension de D.c.c.
(dextran : 0,05 g ;
charbon: Q,5 g: tampon TrisHcl-glycérol q.s.p; 1000 ml). Le mélange est
maintenu pendant 15 minutes à O°C, afin d'éliminer l'excès d'hormone libre,
puis centrifugé à 2000 x g. Les surnageants sont déposés sur des gradients
desaccharose linéaires (5-20 %) préparés dans une solution tampon Tris-Hcl-
glycérol. L 'ul tracentrifugation es t réalisée à 20 OOOxg dans un roto'r SW65
pendant 16 heures. Des fractions du gradient (6 gouttes) sont collectées
au moyen d'un fractionneur de gradient (ISCO) et les protéines sont analy-
sées à 280 nm au moyen d'un analyseur U.V.
(ISCO). 350 ,.ul d'une solution de
sérum albumine (10 mg/ml, centrifugés parallèlement aux essais sur un gra-
dient servent de référence pour la détermination des constantes de sédimen-
tation.(MARTIN et
MiES, 1961).
Les fractions de gradient collectées sont comptées après
addition de 0,5 ml d'eau distillée et 10 ml de liquide scintillant "Insta-
gel" (Beckman).
La liaison ho rmone-rr êcep t eur est non ccva.Lante et reversi-
ble. Une telle interaction qui obéit à la loi d'action de masse est assimi-
lée à celle d'un système Michaëlien. Ellera~~elle la première partie d'une
réaction enzymatique dans laquelle les sites de liaison sont supposés indé-
pendants. La concentration de ligand lié à l'équilibre (B), est fonction
de la concentration de ligand libre (U), de la constante d'association ~n­
trinsèque (KA) et de la concentration d~ sites de liaison (N).

---

12
(N)
x
(U)
B
=
(l)
(U)
N étant le produit de la concentration de la proté~ne
liante (P) et du nombre de sites de liaison par molécule de protéine, n
n x (R)
N
=
La représentation directe de la loi d'action de masse
(B en fonction de U)
est une hyperbole asymptotique à (B) maximum qui
es t
égal à (N).
On peut définir la concentration permettant la demi-sa-
turation comme
étan~ le ~
La représentation de Scatchard
(1949), la plus utilisée,
utilise l'équation (1) sous une forme différente
B/U = KA ((N) - (B))
Après représentation schématique, on obtient K.n. par
intersection de la droite avec l'axe ~s ordonnées et N par intersection
avec l'axe desa2èisses . D'où on obtient:
K.n
et ~ =
N
S'i1rrya que des sites spécifiques, la représentation
de Scatchard (1949) est une droite. Dans ce cas, nous pouvons évaluer
N et K.n après analyse de régression linéaire.
L'équation de la droite est
y
ax + b
où x et y représente\\nt les coordonnées de chaque point par rapport aux
axes.
a est le coefficient angulaire de la droite
b, caractérise l'ordonnée à l'origine (b = y pour x
0)

---

13
N
~ xy
( i x) x
(! y)
a :
2
2
N ~ x
_
(
f: x)
N étant le nomlire de valeurs de x et de y.
h:tI.
' ( x
a - - ·
N
N
r (Coefficient de corrélation): a
Le coefficient de corrélation, r, peut varier entre - 1
et + 1. Plus i l se rapproche de l'unité, plus. la droite obtenue est fiable.
Lorsque la représentation de Scatchard (1949) fait ap-
paraître plusieurs catégories de sites de liaison, c'est-à-dire des sites
spécifiques et des sites non spécifiques, nous avons eu recours à la métho-
de graphique de Rosenthal (1967) pour évaluer N et K.n.
Du point de vue statistique, lorsque nous obtenons aQ
moins deux valeurs pour un même type d'expérience, nous
calculons le moyen
terme arithmétique (MT). Il est obtenu en divisant la somme des valeurs
individuelles (X) par le nombre des observations (N). Soit:
{X
MT (x) :
N
A chaque fois que nous avons obtenu trois ou plusieurs
valeurs pour la même expérience, nous avons calculé en plus du moyen terme
arithmétique (MT) la déviation standard (Sm) du moyen terme. C'est une ap-
préciation de l'exactitude avec laquelle le moyen terme est déterminé.
'iii
J 1/2
Sm :
N (N-1 )
Dans certains cas, au lieu de faire plusieurs ~~périences
pour le même âge, nous avons préféré faire davantage d'expériences avec des
âges plus rapprochés.

---

14
II - RESULTATS
11-] - Pureté des hormones radioactives.
Les chromatographies des solutions de 3
~ - Adiol -
1,2
'3H dans le système de solvants Ko chaki an (952) et celles du 17('>-
Oestradiol - 6,7
3H dans le système de solvant b enzê ne-cé t.hano L (20 r l ,
V/V) CORKER, ]970) montrent que les hormones radioactives utilisées ont
un degré de pureté satisfant (figure ]). L'absence de métabolisme de ces
deux
hormones au cours des incubations en présence de cytosol, a égale-
ment été vérifiée (JOUAN et coll, 1979).
®
dpm
@
dpm
-3
98%
,.....,
xIa
3
x16
97'l
,.-,
4
3·
2
1.5
o
F
J
l
~--- ....
.. - - ~cm
"-.....lI
...
...,.1
----_
f3.Adiol
a-Ad101
.....
cm
Figure 1 - Chromatographie des hormones radioactives :
A) - 3 ~ -Adiol 3H : séparation sur papier Wathman dans le système
de Kochakian et coll, à 30°C pendant 17 heures.
1
b) - ]7 ~ -Oestradiol-3H~ Séparation sur couche mince d'alumine
1
1
fluorescente dans le système de solvants benzène-éthanol (20;1,
1
V/V)
i
En ordonnées : radioactivité en dpm par cm
1
En ahscisses migration des stéroïdes en cm
La position des stéroides témoins est indiquée en pointillés.

---

15
11-2 - Influence de l'~ - foetoprotêitie sur les mesures
des sites de liaison du 3 (!l -Adiol et du J7
~ -Oestradiol, chez les
jeunes rats'.
Les résultats des expériences d'ultracentrifugation des
sérums sont présentés' dans' la figure 2 et s.on t comparés après calcul d'un
pourcentage de diminution.
Après incubation de sérum en présence de 3
f.> -Adiol' 3H
ou de 17 ~ -Oestradiol 3H, on observe sur gradient de saccharose 5-20 %
un picde radioactivi té de cons tante de sédimentation 4, 6·~. La présence
d'un excès de 17 r> -Oestradiol "froid" diminue de 50 % le pi c
de 17~ -
Oestradiol
3H. Par contre l'addition d'un excès de 3 r
-Adiol "froid"
n'affecte pas ce pic. Quant au pic de 3 (? -Adiol 3H, il est faiblement
diminué (13 %) par le 3
~
-Adiol et non par le DES "froid".
Nous avons m~s en évidence, dans le sérum des jeunes
rats de 15 jours, des protéInes, de constante de sédimentation 4,E p , qui
lient spécifiquement le 17~ -Oestradiol et aspécifiquement le 3 ~
-Adiol
et l' oes tradiol. Le 3 ~
-Adiol es t un faible compétiteur pour la liaison
du 17 ~
-Oestradiol à la protéine spécifique. On peut caractériser la pro-
téine spécifique comme étant l' ~
-foetoprotélne, la protéine non spéci-
fique comme étant le
sérum albumine. Les résultats observés montrent que
l' 0( foe toprotélne présente dans le sérum des jeunes rats a uœ faib le
affinité pour te ('-Adiol
(RAYNAUD, 1971
Chantal
LAURENT, 1975;
McEl~N, 1975 et 1977).
Ces résultats peuvent faire craindre une contamination
de nos mesures chez les jeunes rats. Nous avons essayé d'y remédier en
faisant des mesures parallèles avec du DES "froid" afin de ne mesurer que
la liaison du 17 ~
-Oestradiol au récepteur. De plus les protéines san-
guines, 2A~ et
~ -foetoprotéïne rne sont pas précipitables par le sulfate
de protamine ~IPP~ 1976). Ce dernier argument n'exclue cependant pas
la liaison 17 ('J -Oestradiol - 0<. foetoprotélne dans le milieu. De plus,
les hypophYses, au moment du prélèvement, sont très soigneusement lavées
par une solution Nacl 9 %4pour limiter au maximum la contamination sanguine.

---

16
i _
r =-0,99
10M
N =4,01.10-
"=137 hnoleSlmg
de proteines
8".-1
KA: 1,14.10 IVI
2
B
(dpm
2
di
3
®
2.5
5
xH55
U(dpm)
Figure 3 - Représentation selon la loi d'action de masse (Ben fonction de U
et
selon Scat chard (B/U en fonction de B) (A) de la liaison du 3(3 -Adiol
dans le cytosol d'hypophyses de rats.
A) - En abscisses: B = concentration molaire du stéroïde lié aux pro-
téines cytosoliques
En ordonnées:
B/U = rapport des concentrations des stéroïdes liés
et libres.
B) -En abscissesbormone libre (U) dans le milieu expr~mee en dpm
- En ordonnées: hormone liée (B) dans le milieu exprimée en dpm.

---

17
_3
B5A
B5A
dpm.10
V
dpm.16
V
_
3H-ESTRAOIOL
---.3H-B-OIOL
10
100
0-0
• DES
"
" +~
t:r-..t>.
• B-CIOL
"
.. B-OIOL
50
50
1
10
20
10
20
FRACTIONS
FRACTIONS
Figure 2 - Ultracentrifugation sur gradients linéaires de saccharose
5-20 % de sérums de rats mâles de 15 jours~ incubés
en présence de 17(!J E~ _3H ou de 3 ~ -Adiol
H seuls ou avec
un excès d'hormone
froide" et traités au DCC.
- En ordonnées : dpm 1 fraction
- En abstisses: nO des fractions.
II - 3 - Evolution du nombre de sites de liaison et
de la constante d'association du 3 ~ -Adiol chez le rat mâle.
Après incubation du cytosol hypophysaire en présence
de concentrations croissantes de 3 ç, -Adiol
3H et détermination de la
quantité d'hormone liée, on constate la présence d'une liaison satura-
ble (figure 3-B). Les résultats exprimés selon Scatchard
(1949) (figure
3-A) montrent la présence d'un seul type de liaison et permettent de
déterminer le nombre de sites de liaison du 3 ~ -Adiol par mg de pro-
téines (ou de DNA) et la constante d'association de l'hormone. Ces dé-
terminations effectuées sur des hypophyses de rats d'âge variable, mon-
trent la présence d'une liaison saturable dans tous les cas sauf pour
les rats normaux adultes, à partir de 75 jours (les sites étant peut être
masqués par l'hormone endogène ).
Pour les rats normaux, le nombre de sites, exprimés
par mg de protéines, augmente régulièrement de 15 jours
à 37 jours,
varie peu entre 37 et 42 jours, puis décroît rapidement et devient indé-
tectable à 75 jours (Tableau 1 et figure 4-B). Lorsque les résultats sont

---

co
~
ldM-1
®
2
~ . . .
1
1
1
1
1
1
----.
1
, -
, - -
10
30
50
70
100
AGE (JOURS)
1)
(x 10-
~
®
c
ëii
010
"-
Cl.
Q)
"0
C>
E
ID 5
~....
10
30
50
70
90
AGE (JOURS)
Figure 4 - Etude de la liaison du 30 -Adiol dans le cytosol d'hypophyses de rats
mâles, en fonction de l'âge
A - Variations de la constante d'association KA
B - Variation du nombre de sites de liaison

---

19
exprimés par mg de DNA (en se référant à des courbes de dosage de DNA
préalablement
t ab.l i es par Valotaire (] 9:75) ils sont similaires mais il
é
y a une augmentation plus marquée du nombre de sites à 42 jours (Tableau 1).
Les. valeurs des constantes d'association obtenues sont
représentées sur la figure 3-A et dans le tableau J. Pour les rats
nor-
maux
on constate une valeur de KA assez élevée à J5 jours (KA = 1,5 x
8
I
10
M- ) qui décro!t à partir de 23 jours et reste constante ensuite.
8M-J.
Elle est voisine pour toute cette période de 0,5 x J0
TABLEAU 1
Evolution du nombre de sites de liaison et de la cons-
tante d'association du 3 (b
-Adiol dans le cytosol d'hypophyses de rats
mâles normaux en fonction de l'âge.
Ages (jours)
15
23
30
37
42
57
75
Caractéristiques
n (fmoles/mg de protéines
33
56
64
87
93
57
ND
-]2
n
10
moles/mg de DN/I..) 0,5]
l ,0
1,74
2,7
1,63
KA ( x 108 M-1 )
1,5
0,45
0,61
0,52
0,56
0,48
Chaque résultat est la moyenne de 2 ou 3 essais
N.D.
: non détectable
II - 4 - Influence de la castration sur l'évolution du
nombre de sites de liaison et de la constante d'association de 3 P -Adiol
chez le rat.mâlé.
J
La liaison du 3 (} -Adiol _
H au cytosol hypophysaire de
rats normaux adultes n'étant pas détectable, nous avons effectué la même
expérience avec des animaux castrés afin de déterminer le rôle de l'hor-
mone endogène.

---

20
1
j
1
ln
1
Q.l
c
1
1
Q.l
1
-0
1
....
RATS
RATS CASTRES
Q.
1
(1)
NORMAUX/
1
"0120
1
CJ'l
1
E
.......
1
(J)
1
Q.l
1
o 80
1
1
E
'+-
1
1
1
1
1
40
1
1
1
1
1
1
3 jours
8jours
14 jours
Figure 5 - Evolution du nombre de sites de liaison du
3 0 -Adiol au récepteur cytosolique des oes-
trogènes, en fonction du délai de castration ...
Comparaison avec les mesures des sites libres,
effectuées chez les rats adultes normaux.

---

21
TABLEAU 2
Evolution du nomère de sites et de la constante d'association
du 3 ~ -Adiol dans le cytosol d 'hypophyses de rats adultes de
75 jours en fonction du délai
de castration.
Durée de la castration
(jours')
3
8
14
n (fmoles/mg de protéines)
52
79
120
KA (x 108 M -1)
0,9
1 ,6
l , l
D'après les résultats du tableau 2 on constate que, pour
des rats de 75 jours' castrés, le nombre de sites de liaison s'accroît en
fonction du délai de castration. Après 14 jours de castration, le nombre
de sites obtenu est supérieur à celui observé chez les rats de 42 jours
(cf tableau 1).
La moyenne de la constante d'association obtenue après
8
-]
castration est de 1,2 x 10
M
. Cette valeur est proche de celle des rats
normaux de 15 jours. Si l'on tient compte de la stabilité de la constante
d'association entre 23 et 57 jours, on peut penser qu'il y a une augmentation.
!
1i

---

N
N
'KA
108M- i
10
®
....----,-~==;:~~~=_:___:;;:~--,--]~---,,--~~,;--
1
l
' 7 0
90
~
1 -
1'0
3b
1
50
AGe:(JOURS)
'".~
®
~a.
~01100
E
-<Il
. Cl)
ë
.É 50
1
l
,
1
1
1
1
1
1
l
'
10
30
5 0 1 0 , .
)~O
-
AGE l JOURS
Figure 6 -
Evolution du nombre de sites de liaison CB) et de la constante
d'association CA) du 3 ~ -Adiol au récepteur oestrogène dans le
cytosol 'dhypophyses antérieures de rats femelles en fonction de l'âge.

---

23
A
B
U
r , _0,87
-leM
N::4,56.10
n=154 fmolesz mg de
Protéines
0.5
2
4
B
- 5
2
U(dpm )
xl0
Figure 7 - Représentation selon la loi d'action de masse (B en fonction de U (B)
et selon Scatchard B/u en fonction de B(A) de la liaison du 17 p -Oes-
tradiol dans le cytosol d'hypophyses de rats.

---

24
II - 5-Evolution du nombre de sites de liaison et de la
constante d'association du 3 ~ -Adiol chez le rat
femelle.
Comme le montrent la figure 6 - B et le tableau 3, le
nombre de si tes de liaison du 3 ~ -Adiol au récepteur
oestrogène dans le
cytosol hypophysaire de rates normales est à peu près identique a celui du
cytosol hypophysaire du rat mâle. L'évolution en fonction de l'âge est la
même que chez le rat mâle avec un accroissement important du nombre de
sites (120 : 9 fmoles/mg de protéin~ entre 35 et 42 jours. Par contre,
chez la femelle
adulte normale, le nombre de sites reste détectable au
moins jusqu'à 100 jours.
L'évolution de la constante d'association, aux erreurs
expérimentales près, est à peu près identique à celle observée chez le rat
mâle (Tableau 3 et figure 6-A).
TABLEAU 3
Evolution du nombre de sites de liaison et de la constante d'association du
3 ~ -Adiol dans le cytosol d'hypophyses de rats femelles en fonction de l'âge.
Ages (jours)
15
23
30
35
37
42
44
57
75
100
Caractéristiques
+
n (fmoles/mg de
31
43-5
75
105
120:9 96
85
68
66
56
pro t ê i.nes )
8
I
KA (x 10
M- )
8,2
2,8 1,45
1,25
J ,0 1, J
J ,5
2, J
2,5
2,2
II - 6 - Evolution du nombre de sites de liaison et de la
constante d'association du J 7 ~ -Oestradiol chez le rat mâle.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4 et la fi-
gure 8.
Le nombre de sites de liaison, exprimé en mg de protéin~,
augmente de 14 à 23 jours, atteint un maximum entre 22 et 30 jours, puis

---

~
(~
U")
lo1rl
N
6
•
3
90
10
i
i
,
50
.
AGE (jours)
300
~c:.ee200
C-
CI)
"0
Cl
.ê 100
~E
,
1
-
i
i
1
i
1
90
1
1
i
70
30
10
50
AGE (jours)
Figure 8 -
Evolution du nombre de sites de liaison CB) et de la constante d'association CA)
du 17 P -Oestradiol au récepteur oestrogène dans le cytosol d'hypophyses antérieures
de rats mâles, en fonction de l'âge.

---

26
décroît jusqu'à 57 jours pour devenir stah1e ensuite entre 75 et 100 jours.
La congtante d'asgociation croît de 14 à 22 jours, puis
varie peu jusqu'à 60 jours. Elle augmente à nouveau pour finalement se sta-
9
1
biliser à une valeur voisine de 6 x 10
M- •
On remarque qu'à la fois les valeurs du nombre de sites
de liaison et la constante d'association sont supérieures à celles obtenues
pour le 3 ~ -Adio1 pour les mêmes âges. Il faut noter aussi que le maximum
de sites de liaison se situe à des périodes différentes pour les deux hor-
mones : 22 à 30 jours pour le 17 ~ -Oestradiol ; 37 à 42 jours pour le 3(> -
Adio1. L'évolution de la constante d'association est également différente.
TABLEAU 4
Evolution du nombre de sites de liaison et de la constante d'association
du 17~
-Oestradiol dans le cytoso1 d'hypophyses de rats mâles en fonction
de l'âge.
S
1
14
22
JO
J7
4J
59
75
\\00
Car ac tér.is ti que.
1
10
B
(10-
1'1 )
J ,40
5,79
fi,I2
t
B
(10- 101'1 )
J, OJ
5,64
5,79
S
...
...
...
...
n (fmoles/mg de
... 12
252
229 - 11
184 - 10
172 - 12
169 - 12
197
284
2<J1j -
protéines)
...
...
...
9H
KA (x10
-1)
J,98:':~26
Cl ~ 79
fi,O
1,29
4,67
4,JR- O,IJ
4,1
4,92- 0,8
7,7 -
- - - -
- - - -
III - DISCUSSION DES RESULTATS ET CONCLUSIONS
Dans cette première partie du travail, nous avons étudié
l'évolution du nombre des sites de liaison libres, mesurables à O°C du
3 () -Adio1 et du 17 (.>
-Oestradiol, au récepteur des oestrogènes et la cons-
tante d'association de ces deux hormones, en fonction de l'âge chez le rat
mâle et femelle.

---

27
L'ensemble de nos résultats fait apparaître
1°) La présence, dans le cytosol d'hypophyses de rats fe-
melles, d'une liaison
saturable du 3 ~ -Adiol pour tous les âges étudiés.
Il a été montré
préalablement que cette liaison se fait au récepteur oes-
trogène (JOUAN et coll, 1979). Le nombre de sites de liaison du 3 ~ -Adiol
atteint un maximum à 37 jours, puis diminue et reste ensuite constant entre
60 et 100 jours. Quant à la constante d'association, elle est très élevée
à 15 jours (8,2 x 108M- I ) , diminue à partir de cette période jusqu'à 37
jours, puis augmente légèrement pour se stabiliser entre 60 et 100 jours.
Il faut noter l'augmentation très importante du nombre de
sites de liaison du 3 ~ -Adiol entre 34 et 38 jours, période correspondant
au déclenchement de la puberté chez la femelle, selon
ECKSTEIN (1974) et
W.W. MOORS (1965/66). Ces résultats sont à rapporcher de ceux de ECKSTEIN
(1974) qui a montré un rôle du 3 ~ -Adiol dans le déclenchement de la puber-
té chez les r ata.s, En effet après injection sous-cutanée de 3 ~ -Adiol (100 mg/
jour) à des rates: immatures
de
:22 à 26
j our s , ECKSTEIN constate chez ces
animaux une ouverture vaginale précoce.
2°) La présence, comme chez la femelle, d'une liaison
saturable du 3 ~
-Adiol dans le cytosol d'hypophyses antérieures de rats
mâles, âgés de 15 à 60 jours. Par contre chez les rats adultes, à partir de
75 jours, il n'y a pas de liaison du 3 ~ -Adiol détectable par la méthode
utilisée, donc pas de sites libres. ~e point sera discuté ultérieurement.
L'ensemble de ces résultats permet de constater, comme chez la femelle,
une augmentation du nombre de sites de liaison du 3 ~
-Adiol au moment de
la puberté. Cette augmentation est réelle puisque, après expression des
résultats par mg de DNA, il n'y a pas de modification importante de l'évolu-
tion du nombre de sites de liaison. Nos résultats sont à rapprocher de ceux
de BERTRAND et coll (1974) qui ont montré, in vitro, une transformation
optimale de la testostérone en 3 ('> -Adiol à 42 jours dans l'hypophyse et
la prostate, mais pas dans le cerveau et l'hypothalamus.
Quant à l'évolution de la constante d'association du 3~
Adiol au récepteur oestrogène hypophysaire, elle est, aux erreurs expéri-
mentales près, identique à celle observée chez la rate. Cela montre que les

---

28
résultats obtenus pour les animaux des deux sexes sont comparables entre
eux.
3°) L'impossibilité de détecter des sites de liaison libres
pour le 3 ~
-Adiol dans le cytosol hypophysaire des rats adultes à partir
de 75 jours nous a conduits à faire une étude avec des animaux castrés. Les
résultats indiquant que les sites de liaison du 3~ -Adiol au récepteur oes-
trogène sont occupés par de l'hormone endogène. En effet, après un délai de
castration de 3 jours, il est à nouveau possible de détecter des sites de
liaison non mesurables chez l'animal adulte normal. Il y a une augmentation
du nombre de sites jusqu'à 14 jours de castration. VALOTAlRE (1975) a montré
que le poids de l'hypophyse et le taux de DNA varient peu pendant cette pé-
riode de castration. Le délai nécessaire pour "vider" les sites de liaison
nous apparaît comme particulièrement long. L'origine testiculaire du 3 ~
Adiol, démontrée par CURTIS
: CHUBB (1975) peut cependant expliquer l'aug-
mentation du nombre de sites de liaison. GROVER et ODELL ( 1975) notent une
liaison maximale de la DHT dans la prostate après 9 à 36 heures de castra-
tion et concluent que cette augmentation est due à la disparition de l'hor-
mone endogène des sites de liaison. BARL3Y et coll (1975) observent les
mêmes résultats dans l'hypophyse de rats mâles adultes Qi les sites de
liaison de la DRT, non détectables chez l'animal normal, deviennent mesurables
après 3 Jours de castration. Cette augmentation du nombre de sites de liai-
son du 3 ~
-Adiol paraît d'autant plus paradoxale que cette hormone se lie
au récepteur cytosolique des oestrogènes (JOUAN et coll, soumis à publica-
tion, ROCHEFORT, sous presse 1979). En effet M.L. TRIEULANT et J. PELLETIER
(1979) sur l'hypophyse de bélier, KORACR (1975), VREEBURG (1975) sur l'hy-
pophyse du rat mâle ont montré l'absence de variation des sites de liaison
de l'oestradiol après castration.
On constate également après castration, une augmentation de l'affinité du
3 (3
-Adiol pour "son récepteur". Le KA a dans ce cas la même valeur que celui
des animaux de 15 jours.GREENSTEIN (1979) fait la même observation pour la
liaison de la 5~ - DRT dans la prostate ventrale de rats castrés. Pour cet
auteur, cette modification serait le reflet d'un changement dans le taux des
stéroïdes endogènes du cytosol qui interfererait pendant l'essaiJou d'une
modification de la sensibilité du récepteur pour l'hormone.
4°) La présence dans le sérum de jeunes rats d'~ -foeto-
protéine et de sérum albumine pouvait faire craindre une contamination impor-
tante des cytosols. Nos résultats sont en accord avec ceux de Chantal
LAURENT (1975) montrant une forte affinité du 17~ -Oestradiol et une faible

---

29
affinité du 3 ~
-Adio1 et du DES pour l' ~ -foetoprotéine. Différentes
précautions expérimentales ont tendu à limiter la contamination sanguine
lavages des hypophyses, mesures de liaisons en présence de DES. De plus
RAYNAUD et coll (1977) ont montré que la concentration d'~ - foetoprotéine
plasmatique, très élevée chez le foetus, décroît exponentiellement et n'est
plus détectable à partir de 29 jours. Or, l'ontogénie du nombre de sites
de liaison du 3 ~ -Adio1 comme celle du 17 ~ -Oestradiol varie en sens in-
verse de celle de l' ~ -foetoprotéine. De plus l' ~ -foetoprotéine comme
la sérum albumine ne sont pas précipitab1es par le sulfate de protamine
(LIPP~JU~, 1976). L'ensemble de ces données nous fait penser que la contami-
nation des cytoso1s par les protéines sanguines est faible.
Ces divers résultats posent le problème du rôle du 3 ~ -
Adio1. Dans le cas de nos expériences, l'augmentation au moment de la puber-
té, puis la stabilité, ou la diminution du nombre de sites de liaison, ten-
dent à démontrer que le 3 ~
-Adio1 jouerait un rôle au moment de la puber-
té, puis disparaîtrait ou verrait sa concentration diminuée après la puberté.
En effet chez la femelle, ECKSTEIN (1974) a montré que l'ovaire de la rate
immature produit du 3 ~ et du 3~
-Adio1, conjugués qui sont présents dans
la circulation périphérique aux concentrations de 100ng/m1 et plus et dis-
paraîtraient après la puberté. D'autre part, PODESTA (1974) a montré que
les Adio1s (3 ~
et 3~
) augmentent à partir de 15 jours, atteignent un
maximum vers 20 jours et restent élevés jusqu'à 35 jours puis diminuent
à 45 jours; à partir de cette date, les taux restent faibles. Des dosages
de 3 ~ -Adio1 dans le plasma des rats utilisés pour les expériences reportées
ici, sont en cours de réalisation. Ils devraient permettre d'effectuer un
parallélisme entre l'évolution des sites de liaison dans le cytoso1 hypophy-
saire et les variations de l'hormone dans le sang.
5°) La présence d'une liaison saturable du 17~ -Oestra-
diol dans le cytoso1 d'hypophyses de rats mâles pour tous les âges étudiés.
Cette liaison atteint un maximum entre 22 et 30 jours, puis diminue et se
stabilise entre 57 et 100 jours après la naissance. L'évolution de la cons-
tante d'association à peu près la même que celle du nombre de sites de liai-
son. Les mesures du nombre de sites de liaison et de la constante d'associa-
tion, du 17 ~
-Oestradiol sont nettement supérieures à celles obtenues pour
le 3 ~
-Adio1 aux même âges. Cela provient du degré d'affinité différente
des deux hormones pour le récepteur oestrogène (JOUAN et coll, soumis à
publication).

---

30
Nous n'avons pas étudié l'ontogénie de la liaison du 17t1 -
Oestradiol dans le cytoso1 hypophysaire de la rate. Mais une étude a été
effectuée par SPONA et coll (1977) sur le cy to so l hypophysaîre de la rate.
Ces auteurs observent une première augmentation de nombre de sites de liai-
son aux environs de 30 jours, puis un accroissement régulier jusqu'à 100
jours. On observe donc, comme pour le 3 ~
-Adio1, une augmentation impor-
tante du nombre de sites de liaison du 17~ -Oestradiol au même moment chez
le mâle et chez la femelle. Mais' cette augmentation se situe à des périodes
différentes pour les deux hormones: 22 à 30 jours pour l'oestradiol, 35 à
42 jours pour le 3 ~ -Adio1. L'augmentation importante de la liaison du
17 ~ -Oestradiol entre 22 et 30 jours serait due au rôle de 1'~
-foetopro-
téine qui, avant 28 jours retiendrait l'oestradiol circulant dans le cornp&r-
timent sanguin (McEWEN, 1975 ; RAYNAUD, 1977). Par contre, lorsque le taux
plasmatique d'oestradiol augmente au moment de la puberté (W.W. MOORE, 1965/
66 ; PARKER, 1976), 1'~ -foetoprotéine, presque inexistante dans le sang,
ne retient plus l'oestradiol, qui peut être "capté" par le récepteur cyto-
plasmique. Il s'en suit une diminution importante du nombre de sites libres
du récepteur comme le montrent nos travaux et ceux de RAYNAUD (1977) et
PARKER (1976). D'autre part,cet accroissement du nombre de sites de liaison
et de la constante d'association aUX environs de 21 jours pourrait expliquer
le fait que la période critique de sensibilité de l'hypophyse de rat au
feedback positif du 17 ~ -Oestradiol se situe à 21 jours (PUIG-DURAN, 1977).
Du point de vue intérêt, à part son rôle dans la régulation
des gonadotrophines (KERCRET, 1978) l'oestradiol a, chez le rat, un rôle
dans le déclenchement de la puberté (RAMIREZ et SAt~T~ , 1965~ SMITH et
DAVIDSON, 1968). Ces auteurs ont montré que l'administration sous-cutanée
où l'implantation cérébrale d'oestradiol avance la date de la puberté d'une
semaine. De leur côté, PARKER et MAHESH (1977), ont montré que l'injection
de dthYdroépiandrostérone (DRA) induit une puberté précoce chez la rate
immature. Pour ces auteurs, la conversion de la DRA en oestrogène est la clé
du mécanisme d'induction de cette puberté car ils constatent, après injection
de DRA, une augmentation de la sécrétion d'oestrogènes sanguins et l'épuise-
ment des récepteurs cytoplasmiques hypophysaires des oestrogènes.
Cette importance des oestrogènes et du 3 ~ -Adio1 (ECKSTEIN,
1974 ~
RAMIP~Zet SAVYER., 1965 ; SMITH et DAVIDSON, 1968)da~s le déclenche-
ment de la puberté chez la rate et la liaison du 3 P
-Adio1 au récepteur cy-

---

31
toplasmique hypophysaire des oestrogènes chez le rat mâle (JOUAN et coll,
soumis à publication), ont motivé ce travail de l'étude comparée de l'évo-
lution
des caractéristiques de liaison du 3 P -Adiol et du 17 ('> -Oestradiol
au récepteur cytosolique des oestrogènes, en fonction de l'âge,
afin d'éta-
blir un rôle éventuel du 3 ~ -Adiol dans la puberté chez le rat mâle.
Les résultats de nos expériences indiquent, aussi bien
chez le mâle que chez la femelle, un maximum de sites de liaison du 3 r; -
Adiol au moment de la puberté. Cette constat ion pose le problème du rôle du
3 ~ -Adiol chez le mâle. Les résultats de l'effet de cet androgène sur les
gonàdotrophines hypophysaires (LH et FSH) sont assez contradictoires. Cer-
tains ont montré que le 3 ~ -Adiol est susceptible de modifier les taux
plasmatiques de ces deux stimulines (KAO, 1975 ;E1'SI'EIN, 1977) tandis que
d'autres ont constaté qu'il est sans effet sur la sécrétion de la LH et de
la FSH (VERJANS, 1977"
ELDRIDGE, 1974,). Tout rece,IIIment
RAULT et coll
(1979
sous presse) ont montré que le 3 ~ -Adiol a un effet inhibiteur sur
la libération de la tH chez les rats de 36-38 jours. Il est & remarquer
qu'à cette période se situe le maximum de la liaison du 3~ -Adiol dans
l'hypophyse de la femelle. On serait tenter de penser que cette sensibilité
de l'hypophyse au 3~ -Adiol serait due au taux important de sites de liai-
son de cette hormone. La question que l'on peut se poser est de savoir si
l'augmentation importante du nombre de sites de liaison du 3 ~ -Adiol aux
approches de la puberté ne joue pas un quelconque rôle dans la chute de la
LH hypophysaire, constatée au moment de la puberté normale tABHSETWA& 1970;
McCANN, 1974) ou de la puberté induite par l'oestradiol (McCANN, 1974).
Malgré ce rôle que pourrait jouer le 3 ~ -Adiol par l'in-
termédiaire du récepteur cytoplasmique hypophysaire des oestrogènes, il
convient, cependant, d'être extrêmement prudent dans l'établissement d'une
relation de nOs travaux avec le déclenchement de la puberté car non seule-
ment d'autres hormones sexuelles, telle que la 5- -DRT, peuvent interagir avec
le récepteur cytoplasmique des oestrogènes, le transloquer au noyau et provo-
quer l'effet physiologique de type oestrogène (KORACR et coll, 1975
ROCHEFORT,
1976
PORTMAN et coll, 1977 ; WATSON et coll, 1977) mais il est bien connu
qu'aux approches de la puberté l'activité métabolique des autres organes \\Testi-
cules, foie, etc ... ) augmen~ considérablement.

---

32
2ème
PAR T l E
Mise au point et application d'une technique d'échange
pour la mesure des sites de liaison totaux (libres et occupés) du 3~-Adiol
et du 17 ~ -Oestradiol au récepteur oestrogène, dans l'hypophyse antérieure
du rat mâle.

---

33
INTRODUCTION
Dans la première partie de notre étude, nous avons utilisé
une méthode directe de détermination des sites de liaison, à O°C. Cette mé-
thode ne permet pas de déterminer la concentration totale de sites de liai-
son (libres et occupés) mais seulement ceux inoccupés au moment où s'effec-
tuent les mesures. Cette limitation de la méthode directe, nous a conduits
à utiliser une autre méthode, la technique d'échange, qui permet de détermi-
ner les sites totaux (libres et occupés). Il est particulièrement int~res­
sant d'appliquer cette méthode pour mesurer la liaison du 3 ~ -Adio1 chez
les rats mâles normaux adultes. Par la technique de mesure directe, il n'y
avait pas de sites libres mesurables. Après castration, des sites de liai-
son pouvaient être mesurer en quantité croissante parallèlement au délai de
castration. Si cette différence est due à la libération progressive de sites
de liaison par l'hormone 'e~dogène, l'application de la technique d'échange
devrait permettre d'obtenir le même résultat.
Le principe général de cette méthode implique un "échange"
de l'hormone endogène contre le ligand marqué. L'instabilité des protéines
réceptrices oblige à saturer préalablement celles-ci par de l'hormone
"froide". Il faut donc séparer les complexes hormones-récepteur de l'hormone
non fixée (froide ou endogène)et ensuite effectuer l'échange par une concen-
tation suffisante d'hormone radioactive, à une température et pendant un
temps variables selon l'affinité de l'hormone à échanger.Dans ces conditions,
la fraction endogène devenue "minoritaire" ne dilue pas de façon significa-
tive le ligand radioactif et on peut mesurer les sites totaux. Sinon des
corrections de l'activité spécifique
de l'hormone radioactive sont néces-
saires (KATZENELLENBOGEN, 1973).
Une telle méthode a été déve1opp~ pour la mesure de sites
de liaison de l'oestradiol (ANDERSON, 1972 : KATZENELLENBOGEN, 1973) de la
progestérone (CLARK, ]974 ; VU HAl, 1978) et de la 5 ~ -DHT (P. DAVIES, ]977).
Cette méthode a surtout été appliquée à la mesure des sites de liaison nu-
cléaires.

---

34
Nous avons, dans cette deuxième partie de notre travail,
essayé de mettre au point une technique d'échange pour la mesure des sites
totaux du 3 ~ -Adiol et du 17 f.>
-Oestradiol afin de poursuivre la compa-
raison commencée dans la première partie.

---

35
A - LA TECHNIQUE D'ECHANGE ET SON APPLICATION A L'ETUDE
DE LA LIAISON DU 3 ~ -ADIOL AU RECEPTEUR OESTROGENE
CHEZ LE MALE.
l - 1 - Matériel et méthodes
a) Traitements du cytosol
Le cytosol es-t préparé de la même manière que dans la pre-
mière partie (cf. 1ère partie). La concentration protéique du cytosol est
d'abord estimée par mesure de l'absorbance à 260 et 280 nm (LAYNE, 1957).
Plus tard, après l'ultrafiltration, elle est vérifiée par le méthode de
LOWRY et coll (195].) à l'aide d'une solution de sérum albumine standard
(50rrg/l). Le cytosol ainsi dilué est préalablement incubé avec de l'hormone
"froidé"(concentration saturante) à O°C et à l'équilibre. A la fin de l'incu-
bation, l'excès d'hormone libre est éliminé
par
traitement avec un culot
de charbon dextran-gélatine.
Pour cela un volume égal à celui du cytosol de suspension de charbon dextran-
gélatine (charbon "Lavêt : 0,5 g ; dextran : 0,05 g ; gélatine: 0,05 g pour
100 ml) est centrifugé à 2000 x g. Le culot obtenu est lavé avec du tampon
et recentrifugé (CIDLOWSKY, 1978). Ceci dans le but d'éliminer le maximum
de particules microscopiques de charbon. C'est ce deuxième culot qui est
mis en contact avec le cytosol pendant
20 minutes à O°C. Pour la même
raison, la poudre de charbon utilisée dans la préparation de la suspension
de charbon-dextran-gélatine a été préalablement lavée (8 fois à l'eau dis-
tillée et 2 fois à l'alcool absolu (MERK). Après centrifugation, le cytosol
est décanté. Malgré 1es précautions précédentes, différents essais ont montré
qu'après traitement par la suspension de charbon dextran-gélatine et centri
fugation, le cytosol contient encore des particules microscopiques de char-

---

36
bon capables de fixer la radioactivité de façon importante. Afin d'éviter
cela, le cytosol obtenu après: centrifugation est passé sur filtre millipore
HAWP 0,45 m~ . Le cytosol ainsi obtenu, est incubé avec 1 'hormone radioactive·
La liaison est mesurée par précipitation au sulfate de protamine et comptée
(cf. première partie).
b) Expériences préliminaires :
~) Adsorption de la radioactivité libre par le charbon
dextran-gélatine en fonction du temps de contact.
Le cytosol préparé dans le tampon phosphate 0,05 M dilué,
est incubé à O°C et à l'équilibre (3 heures) avec 2,4 x lo-Ek de 313 -Adiol-
3H• A la fin de l'incubation, le milieu d'incubation est traité par un culot
de charbon dextran-gélatine. Des prélèvements de 100
~l du milieu sont
faits à des intervalles réguliers. Après 10 minutes de centrifugation à
2000 x g,
10
~l du surnageant sont comptés pour déterminer la radioacti-
vité non encore adsorbée par le charbon dextran-gélatine.
p) Influence du traitement charbon dextran-gélatine et
de l'ultrafiltration sur le taux de protéines cytoso-
liques.
Le cytosol préparé dans le tampon phosphate 0,05 M est
dilué et m~s en contact pendant 20 minutes (temps de contact choisi) avec
le culot 2000 x g de charbon dextran-gélatine. Après 10 minutes de centrifu-
gation à 2000 x g, une fraction du surnageant est utiliséepour le dosage des
protéines et l'autre est passée sur filtre Millipore HAWP 0,45
m~ sous un
vide partiel avant d'être dosée.
c) Etude de la cinétique d'échange
Le cytosol préparé dans le tampon phosphate 0,05M, est
dilué, et préalablement incubé avec du 3 ~ -Adiol "froid" (3 x 10-8M) à O°C
et à l'équilibre (2 heures). A la fin de l'incubation, l'excès d'hormone
libre est éliminé par traitement au charbon dextran-gélatine. Après centri-
fugation, le cytosol est décanté puis ultrafiltré. Le cytosol ainsi obtenu
3H
est incubé en présence de 3 P
-Adiol-
(1,2 x 10-Sk), à différentes tempé

---

37
ratures et pendant des temps variables. Des prélèvements de 100 ~l sont
faits à intervalles réguliers et la liaison est mesurée dans chaque fraction
par précipitation au sulfate de protamine (cf. première partie).
d) Etudes métaboliques
~) Extraction de l'hormone liée et de l'hormone libre
En fonction des résultats obtenus pour les différentes
températures
nous avons procédé à une vérification du métabolisme du 3 (!:l
-
3H
Adiol-
au cours des incubations. Pour ce faire, le cytosol ayant subi
tous les traitements (préincubation, traitement au charbon, ultrafiltration)
3H
est incubé avec du 3r.-Adiol-
(1,2 x 10-SM), à 100 e et à l'équilibre
(17 heures). A la fin de l'incubation, le milieu est précipité par le sul-
fate de protamine. La séparation hormone liée-hormone libre s'opère par
centrifugation à 2000 x g pendant 15 minutes. Le culot représentant l'hor-
mone liée et le surnageant, l'hormone libre, sont extraits
par 2 ml d'acé-
tate d'éthyle. Le mélange est fortement agité et mis à reposer quelques
minutes. La phase aqueuse est ensuite décantée et l'extraction est recommen-
cée deux ou trois fois. Les phases organiques recueillies sont ensuite éva-
porées à sec et reprises par de 'l'alcool absolu (Merk). Les solutions obte-
nues seront testées par chromatographies.
~) Analyses chromatographiques
- Séparation des diols (3 ~ et 3 ~
-Adiol) des autres
métabolites.
5
rI de chaque solution obtenue précédemment sont préle-
vés' et comptés
afin d'évaluer la radioactivité totale et déterminer la
quantité de solution à déposer sur le chromatogramme. Les stéroïdes extraits,
plus des étalons internes (testostérone et androsténedione) sont séparés par
chromatographie sur couches minces de gel de silice (Plasti~rolle Kieselgel
60 F
Merk). La chromatographie est effect~ée dans le système de solvants
254,
benzène-éthanol (9 : l, V/V (Morfin, 1977).
- Séparation 3-- et 3 (>
-Adiol
Les solutions d 'hormone liée et libre, plus du 3_
et du
3 ~ -Adiol "froids'; sont chromatographiés sur papier Whatman n° 2, à ao?c,

---

38
pendant 17 heures. dans. le système de solvants de
Kochakian et Stidworthy
(1952) comme décrit dans la première partie.
,) Revélations et comptages
Après chaque chromatographie, les stéroides témoins sont
repérés aux u.v. ou
par
coloration afin de déterminer la position des
composés radioactifs.
Les androgènes à fonction cét9nique (Testostérone, DRT et
androsténedione) forment, avec le 1,3 dinitrobenzène (2,5 % dans l'éthanol)
en milieu alcalin (KüR à 14 % dans l'éthanol),un pigment violacé instable.
Quant aux Adiols (30<. et 3~ ), ils sont revélés par une
solution d'acide phosphomolybdique à 4 % dans l'alcool absolu et chauffage
à 40°C.
Après développement, les chromatogrammes en plaque sont
découpés 1/2 cm par 1/2 cm. Chaque 1/2 cm est compté dans 0,5 ml de métha-
nol purifié (Merk) plus 5 ml de liquide
scintillant, "Ready Solv"
(Beckman). Les bandelettes de papier sont déeou~ées; cm par cm qui sont
comptés dans 5 ml de solvant papier (cf. 1ère partie).
e) Vérification de la spécificité de la liaison du 3~
-
Adiol à son "récepteur", après échange.
En fonction des courbes obtenues pour les différentes
températures, deux possibilités peuvent être retenues : incubée le cytosol
à 10 ou 15°C pendant 6 ou 17 heures. Quelques expériences effectuées à 10°C
ont montré qu'il n'y avait pas de différence de liaison entre 6 et 17 heures
d'incubation. D'où le choix de 17 heures (par commodité). Avant d'établir
les conditions définitives d'incubation, il est nécessaire de vérifier la
part de la liaison non spécifique. Pour cela, nous avons saturé le cytosol
par du 3 r
-Adiol "froid", éliminé l'excès d'hormone froide par le charbon
dextran-gélatine, puis incubé le cytosol avec du 3 ~ -Adiol _3R (1,2 x 10-8M)
en présence ou non d'un excès de 100 fois de 3 Î-'
-Adiol "froid", à O°C ou
à 10°C
pendant 17 heures. L'hormone liée est mesurée par précipitation au
sulfate de protamine (cf première partie).

---

39
l - 2 - RESULTATS
a) Cinétique d'adsorption de la radioactivité libre par
le charbon dextran-gélatine.
Comme le montre la figure 9, la radioactivité libre, non
encore adsorbée par le charbon dextran-gélatine. diminue rapidement jusqu'à
20 minutes, puis reste presque constante par la suite.
Nous' avons choisi pour toutes nos expériences d'échange
un temps de contact de 20 minutes entre le cytosol et le charbon dextran-
gélatine.
s
x16
~2
:.Q
E
Q.
"
60
minutes
120
Figure 9 - Cinétique d'adsorption de la radioactivité libre par le charbon
dextran-gélatine.
- En ordonnées
dpm libres dans le milieu
- En abscisses : temps en minutes.
b) Influence du traitement au charbon dextran-gélatine
et de l'ultrafiltration sur le taux de protéines cytoso-
ligues.
Les résultats sont exprimés en pourcentage de perte. Ils
sont présentés dans le tableau 4.

---

40
TABLEAU 4
Influence du traitement au charbon dextran-gé1atine et de
l'ultrafiltration sur le taux des protéines cytoso1iques.
Perte moyenne
Cytoso1 A
Cytoso1 B
Cytoso1 C
(%)
+
+
+
cytoso1 de départ ( 1)
35,7-1,0
20,55-2,37
43,45-0,58
( '(og/5 /ù)
.cy t oso L traité au
+
charbon/20 min.
(2 )
34,69-3,(
19,59!0
42,78!0
( "g/5 f1)
% de perte par rap-
+
port à (1)
2,83
4,91
1,54
3,09- I;7
Cytoso1 u1trafi1tré(3)
31 , 16!~5
17,02!0
38,23!O5
% de perte par rap-
+
10, 17
12,91
10,63
Il,24-1,47
port à (2)
% de perte totale
+
(charbon u1trafi1-
12,71
17,19
12,17
13,97-2',81
tration)
Comme le montre le tableau 4, nous avons une perte totale
en protéines comprise entre Il et 17 %. Il semble que la perte due à l'ul-
trafiltration (11,24!1,47 %) est plus importante que celle due au charbon
, .
+
dextran-gé1atine (3,09-1,7 %).
Il convient, cependant, d'être très prudent car ce résul-
tat n'a qu'une valeur très indicative. Son expression en "fourchette" a
toute son importance compte-tenu du fait que la valeur trouvée à l'étape
de l'ultrafiltration varie d'une expérience à l'autre en fonction de la
pression de filtration. Ce qu'il convient de retenir de cette expérience,
c'est que le charbon dextran-gé1atine, pour le temps de contact choisi,
n'aBsorbe pratiquement pas les protéines cytoso1iques, donc pas 1.e récepteur,
ce qui sera démontré ultérieurement pour l'ultrafiltration.

---

-::r
dpm
-3
xl0
o
3
it.
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-----~------~------- ~-::-.•
--~-
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•
/ /
0
.' .r:>
Oc
,i .r.>
10
20
heures
Figure la - Cinétique d'échange du 3r -Adiol en fonction de la températur~8
- Le cytosol est présaturé à O°C pendant 2 heures avec 3 x la
M de
3(3-Adiol "froid", traité au DCC et ultrafiltré. Il est ensuite in~ubé
à différentes tJmpératures et à des temps variables avec (1,2 x la 8 M)
de 3 P -Adiol - H. La radioactivité liée est mesurée par le sulfate de
protamine.
- En ordonnées : hormone liée
- En abscisses: temps

---

42
c) Conditions d'échange
Les résultats sont présentés dans la figure la.
A la et 15°C, le plateau est atteint après 5-6 heures
d'incubation et se maintient plus de 24 heures. La liaison est identique
pour ces deux températures au niveau du plateau.
A 5°C, le plateau est atteint après 6 heures d'incubation
et reste constant'plus de 25 heures.
A DoC, le plateau est atteint après 7 heures d'incubation
et reste constant plus de 25 heures. Pour ces deux dernières températures
(5 et DOC), la liaison au plateau est inférieure à celle observée à la-15°C.
Nous avons choisi pour toutes nos expériences d'échange
la température de 10° C et une durée d'incubation de 17 heures.
d) Métabolisme du 3 (' -Adiol _3H en fonction de la durée
et de la température d'échange.
Les fractions, hormone liée et hormone libre, obtenues
après incubation du cytosol à 10° C pendant 17 heures sont chromatographiées
sur couches minces de gel de silice dans le système de solvants benzène-
éthanol (9 : l, V/VI) (Morfin, 1977). Les résultats montrent que la radio-
activité se situe principalement au niveau des Adiols (3 ~ et 3 ~
). Le 3~ -
3H
Adiol-
représente 95 % de la radioactivité du chromatogramme de l'hormone
liée et 93 % de celle de l'hormone libre.
La chromatographie sur papier Whatman, nO 2, pendant 17
heures dans le système de solvants de Kochakian etSTIDrlORT:RY (1952) permet
de séparer le 3 ~
-Adiol et le 3 ~
-Adiol et montre l'absence de trans-
formation du 3 r->
"-Adiol- 3H en 3 co<.
-Adiol au cours de l'incubation à
10° C pendant 17 heures. Le 3 ~
-Adiol représente 97 % de la radioactivité
de l'hormone liée et 95 % de celle de l'hormone libre.

---

43
910~
.....
n
®
@
dpm
52000
dpm
93%
JI
r--,
xio3
Il
l '
xlë?
23000
Il
n
Il
21000.
Î l
Il
1
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9
9
3
3
0
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F
1
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.. - J
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B·Adioi T
~ cm
cp B.Adiol
T
LÎ4
Cm
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2
2
97%
r"'l
o
o
!
l
""""'-ol
L... .....
r...-~
'--J
B·Adiol
a-Adiol Cm
cm
B·Adiol
a-Adiol
T
Figure 11 - Chromatographies des fractions liées et libres extraites après incubation
du cytosol à 10°C pendant 17 heures:
- séparation des stéroïdes de la fraction libre (A), de la fraction liée (B)
surcouchffiminces de gel de silice dans le système de solvants benzène-étha-
no 1 ( 9 : 1 ; VIV /)
- séparation du 30. et du 30 -Adiol de la fraction libre (C), de la fraction
liée(D) par chromatographie sur papier ~TIatman dans le système de solvants de
Kochakian, à 30°C, pendant 17 heures.
- La position des stéroïdes témoins est indiquée en pointillées.

---

44
Les résultats sont présentés dans la figure 11.
e) Spécifité de la liaison, après échange.
Les résultats sont présentés dans la figure 12.
Après mesure de la liaison, on constate que, après 17
heures d'incubation, la liaisun spécifique (B ) à 1DoC est supérieure à
S
celle obtenue à DOC. Il en est de même pour la liaison non spécifique
(B NS ). La part de la liaison non spécifique est relativement faible à
DOC (14 %) et à 1DoC (18 %) comparée à la liaison totale (spécifique +
non spécifique). La
liaison spécifique (B
mesurée après échange à 1DoC,
S)
représente les sites de liaison libres et occupés~. Celle mesurée à DOC
..
représente les sites de liaison libres. La différence nous donne les sites
spécifiques occupés, mesurables par échange.
10°c
O°C
(lO°c-O°c)
-,-
dpm
3000 .
_....
-
-r-
-
r--,
~
1
1
I-
1000
1
1
Bns
• I 1
T
-L
-
~
1
Figure 12 - Spécificité de l'augmentation de la liaison du 3 ~ -Adiol à
"son récepteur", après échange à 1DoC et à DOC.
Comme le prouvent les résultats ci-dessus, les conditions
optimales pour obtenir l'échange complet du 3 ~
-Adiol "froid" impliquent
une incubation du cytosol à 1DoC pendant 17 heures en présence de concentra-

---

45
3
t i ons saturantes de 3 ~
-Adiol_ H. Les différentes étapes de cette techni-
que sont donc :
- présaturation des sites par de l'hormone "froide" (con-
centration saturante)
- traitement au charbon dextran-gélatine pendant 20 m~nu­
tes à O°C.
- ultrafiltration du cytosol
incubation du cytosol à 10°C pendant 17 heures, en pré-
sence de 3 ~
-Adiol~3H.
précipitation du complexe hormone - récepteur par le sul-
fate de protamine.
NOTE: Les expériences montrent que même à 10°C, la liaison non spécifique
représente une part assez faible de la liaison totale du 3 (3
-Adio1. Afin
de limiter le coût de chaque expérience, seule la liaison totale sera déter-
minée dans la suite des expériences.
II - APPLICATION DE LA TECHNIQUE D'ECHANGE A L'ETUDE DU RECEPTEUR CYTOSOLIQUE
DU 3 l'
-ADIOL
II - 1 - PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Des rats mâles normaux de 30, 42, 60 et 75 jours, ont été
utilisés.
SCHEMA DU PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Cytosol préparé dans le tampon phosphate 0,05 M
l
Dilution du cytosol à 2,9 mg/ml après mesure à
1 'u. V. (260 et 280 nm )
l
Préincubation à O°C / 2heures avec du 3 f.> -Adiol
"froid" (concentration = 2 ~)
l
Traitement du cytosol au charbon dextran-gélatine
(élimination de l'excés d'hormone libre)
!

---

\\0
-4"
1
B 1
~)
A
xllOt ,
r=-<>,86
. N'1,29.10 1oM
n, 78 fmoleslmg
de proteines
5-1
~\\
~A,39.10AM-'
SIOlOM
•
B
B«(j1pm)
xlëf
~
10
•
5
xl~
U(do.rn)
Figure 13 - Représentation selon la loi id'action de masse (B en fonction de U (B) et
selon Scatchard (B/U en fonction de B) de la liaison du 3 ('
-Adiol dans
le cytosol d'hypophyses de rats mâles, après échange.

---

47
~
Ultrafiltration (filtre Milipore HAWP 0,45 m~
)
(dosage des protéines par la méthode de LO~Y)
l
Incubation 2u cytosol en présen~rOde concentEation§
3 ~ -Adiol
H variant de 9 x la
M à 2 x la 7M pen-
dant 17 heures, à lO·C.
j
Mesure de la liaison par précipitation au sulfate de
protamine.
Pour toutes les expériences d'échange, la concentration
finale en alcool du milieu d'incubation est de 0,7 %.
II - 2 - RESULTATS
Comme dans la première partie, les résultats obtenus après
échange sont représentés selon l'application directe de la loi d'action de
masse, dite courbe de saturation, et selon Scatchard (1949). Cette dernière
représentation permet de définir le nombre de sites de liaison par mg de pro-
téines et la constante d'association de l'hormone. Un exemple est présenté
dans la figure 13.
Les résultats pour des iges variables sont présentés dans
le tableau 6 et la figure 14.
Alors que dans la mise au point de la technique d'échange
nous avons montré que l'augmentation de la liaison mesurée à 10°C par rap-
port à O°C n'est pas dœà une augmentation de la liaison non spécifique qui
reste relativement faible (18 %) à 10°C, il ne nous a pas été possible, pour
des raisons techniques, de l'évaluer pour chaque cas. Il faut remarquer, ce-
pendant, que la part de la liaison non spécifique à 10° C (18 %) n'est pas
très différente de celle mesurée à 0° C (14%), et à concentration saturante
dans les deux cas.
Malgré cela, l'ensemble des résultats nous permet de cons-
tater l'existence d'une liaison saturable du 3 8
-Adiol dans le cytosol
hypophysaire du rat mile, même chez les rats adultes de 75 jours pour les-
quels une telle liaison n'a pas pu être mise en évidence par mesure directe
(figure 14). De plus, l'on constate, pour ces rats, que le nombre de sites

---

48
4
l
.
2
l
30
50
70
80
AGE (jours)
fIsaf
Co
1
g 1
E lC01
.....
'
_--0......
_..0-
...........
en
.J]
, 0 '
...... <,
ê
.... 0 .....
-
50
<,
Q/
1
<,
Li
:Q
i
i
i
10
30
50
70
80
AGE (jours)
Figure 14 -
Evolution du nombre de sites de liaison (B) et de la constante d'associa-
tion (A) du 3 r
-Adiol au récepteur oestrogène après échange dans le
cytosol d'hypophyses de rats mâles en fonction de l'âge.
- En t~it plein: nombre de sites de liaison obtenu après application de la
technique d'échange (= sites totaux)
- En pointillés: nombre de sites de liaison libres.

---

49
+
de liaison du 3 ~ ..-.Adiol mesuré après échange (J 09-8 fmoles/mg de protéines)
est, aux erreurs expérimentale~ prèa, égal à celui mesuré à O°C après 14
jours de castration. Ces résultats montrent donc que les sites de liaison
étaient occupés par l'hormone endogène (figure 15).
Pour tous les âges étudiés, nous avons une augmentation
moyenne de 45 % du nombre de sites de liaison du 3 r; -Adiol par rapport aux
mesures directes' effectuées à O°C, mais l'allure générale de la courbe n'est
pas modifiée. Le nombre de s-i t es de liaison atteint un maximum vers 42 jours
puis diminue jusqu'à 60 jours' et se stabilise entre 60 et 75 jours.
Quant à la constante d'association, elle varie très peu
7
-1
au cours de l'échange. Elle a une valeur voisine de
4
.10
M
, qui n'est
8
pas très différente de celle mesurée à O°C pour les mêmes âges (KA=0,5 x 10
M- 1) •
TABLEAU 6
Evolution du nombre de sites de liaison et de la constante d'association du
3 ~ -Adiol au récepteur oestrogène dans le cytosol hypophysaire du rat mâle
après échange en fonction de l'âge.
Ages (jours)
30
42
60
75
Caractéristiques
+
+
n (fmoles/mg de pro-
117,5-3,5
162,2-10,2
108
109:8
teines)
% d'augmentation par
rapport aux mesures
45,5
42,6
47,2
à O°C
1)
+
+
K
(107M-
+
3,9-0,42
2,34-0,8
4,39
4,45-1,76
A
+
Le pourcentage d'augmentation moyen est de 45,12-2,3 %
par rapport aux mesures di r ec tas effectués à O°C pour les rats âgés de 30 à
60 jours. Pour les rats âgés de 75 jours la liaison non détectable par la
méthode de mesure directe devient égale
à celle des rats de 60 jours.
II - 3 - DISCUSSION DES RESULTATS
Nous avons mis au point les conditions optimales permettant

---

o
li")
m
1
c
l
"ë)
1
Ë
RATS
1
RATS CASTRES
lECHANGE à 10°C
a.
Q,)
NORMAUX 1
"0120
1
Cl
1
T
E
1
.L
........
1
CI)
1
~
1
080
.E
1
1
1
1
1
40
1
1
1
1
1
1
1
3 jours
8jours
14 jours
Bt
Figure 15_-
Evolution du nombre de sites du 3 (3
-Adiol au récepteur cytosolique des
oestrogènes, dans l'hypophyse des rats adultes de 75 jours
-
Mesures de sites libres : rats normaux
Mesures de sites libres : en fonction du délai de castration
-
Mesures de sites totaux après échange : rats normaux.

---

51
l'échange complet du 3 ~ -Ad i o I "froid" contre 1 'hormone radioactive. Les
principales. étapes' de cet échange s.ont ~
- une présaturation des sites de liaison avec l'hormone
"froide" à concentration saturante.
- l'élimination de l'excès d'hormone libre par traitement
au charbon dextran-gélatine pendant 20 minutes, suiviede l'ultrafiltration
du cytosol et d'une incubation à 10°C pendant 17 heures, avec l'hormone
radioactive.
Nous avons vérifié que le traitement au charbon dextran-
gélatine et l'ultrafiltration n'entraîn~nt
pas une perte trop importante
de.
protéines cytosoliqu~ On ignore, cependant à cette étape, si la perte
est sélective ou non, c'est-à-dire si elle ne concerne que les protéines
réceptrices ou l'ensemble des protéines du cytosol. Cela sera vérifié dans
la partie concernant l'échange du 17 ~ -Oestradiol. La température de 10°C
est suffisante pour effectuer l'échange ce qui est prouvé par les résultats
comparables obtenus après échange et après castration. Cette température
de 10°C peut paraître faible mais elle est fonction de l'affinité de l'hor-
mone (exemple l'échange de la progestérone se fait à O°C (Vu Hai, 1978).
Dans' l'application de cette technique il ne nous a pas été
possible d'évaluer la part de la liaison non spécifique pour chaque cas,
bien que cela ait. été vérifié au cours de la mise au point. Cette liaison
non spécifique parait un peu plus importante à O°C : 18 % contre 14 %. Il
est à remarquer que la liaison non spécifique n'a pas été mesurée à O°C
non plus. Les résultats sont donc comparables entre eux. L'application de
la technique d'échange nous permet de mesurer un nombre de sites de liaison
du 3~ -Adiol plus important qu'à OoC.
Si l'allure générale de la courbe de l'évolution de la
liaison de 3 ~ -Adiol au récepteur oestrogène ne subit pas de grands change-
ments pour les animaux de 30 à 42 jours par rapport à celle observée à O°C,
elle est par contre modifiée pour ceux de 42 à 75 jours. En effet à partir
de 42 jours, le nombre de sites de liaison diminue jusqu'à 60 jours pu~s se
stabilise entre 60 et 75 jours. Il faut noter que l'on observe toujours
après échange, comme par mesure directe, une
augmentation importante du nombre

---

52
de sites de liaison du 3 r-a -Adiol aux environs de 42 jours.
Le nombre de si t es de liaison du 3 (' -Adiol après échange
est égal à celui obtenu à O°C après un délai de castration de 14 jours. Dans
les deux cas, on a donc libéré les sites de Li a i son de l 'hormone endogène.
La constante d'association ne subit pratiquement pas de
variation au cours de l'échange et est égale à celle mesurée à O°C pour
les mêmes· âges.

---

53
B - MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE D'ECHANGE ET APPLICATION
A L'ETUDE DE LA LIAISON DU 17~-OESTRADIOL AU RECEPTEUR
OESTROGENE CHEZ LE RAT MALE.
l - Mise au point de la technique
La technique générale définie pour l'échange du 3 ~ -Adiol
(traitement au charbon, ultrafiltration) est également utilisée pour le 17~
Oestradiol (cf paragraphe A). Quelques modifications seront cependant néces-
saires.
l - 1 - Matériel et méthodes
a) ~!E§Ei~gS~_EE§li~ig~ire : influence du traitement
par le charbon dextran-gélatine et de l'ultrafiltration sur la liaison du
17 ~ -Oestradiol à O°C.
Cette expérience a été réalis~afin de déterminer une perte
éventuelle de récepteur par ces traitements.
Le cytosol, préparé dans le tampon phosphate 0,05 M, est
dilué et divisé en deux parties. Une partie est mise en contact avec le
charbon dextran-gélatine pendant 20 minutes à O°C, puis passée sur filtre
nillipore HAWP 0,45 m~ . Les deux fractions sont ensuite incubées à l'équi-
libre (7 heures) à O°C avec des concentrations croissantes de l7~ -Oestra-
3H
diol-
(8,5 x 10-10M - 3,80 x 10-8M). La liaison est mesurée par précipi-
tation au sulfate de protamine (cf. première partie). Les témoins sont trai-
tés de la même façon. Les protéines sont dosées à chaque étape.

---

54
h) Cinétiques d'échange
cl) dans le tampon phosJ)hate 0,05 M.
Le cytosol dilué est incubé à l'équilibre (1-2 heures),
à O°C, avec 4 x 10-10M (concentration correspondant à 3 ~) de 17 ~ -Oes-
tradiol "froid". Le cytosol est traité au charbon dextran-gélatine et ultra-
fil tré counne décrit précédement. Il est ensui te i.ncub
en présence de 17
ê
~ -Ei
3H (5 x 10-IOM) a différentes températures (O°C, 15°C, 25°C et 37°C) et
pendant des temps variables. Des prélèvements de 50
~l du milieu d'incuba-
tion sont faits à intervalles réguliers et la liaison est mesurée dans cha-
que fraction par précipitation au sulfate de
protamine. Les témoins sans
cytosol subissènt les mêmes traitements.
Une seconde étude cinétique a été réalisée dans les mêmes
conditions que la première afin de la compléter. Mais l'âge des rats utilisés
étant différent
de ceux de la première expérience, nous avons présaturé
les sites de Ü-;ison avec 6 x 10-IOM de 17 ro -Oestradiol "froid" et incubé
avec 9 x 10-IOM de 17 ~ -Oestradiol
3H à 20 et 25°C.
r) Importance de la présaturation avec l'hormone "froide"
Cette expérience a pour but de montrer l'importance de la
présaturation pour la stabilité des sites récepteurs au cours des incuba-
tions et pour définir des conditions d'échange suffisantes.
Elle a été faite dans les mêmes conditions que les précé-
dentes mais sans présaturation avec 1 'hormone "froide". Néanmoins I.e cytosol
subit tous les autres traitements définis pour l'échange. Il est ensuite incu-
bé avec du 17 ~ -Oestradiol _3 H (7,6 x 10 -IOM) à différentes températures
et à des temps variables. La liaison est mesurée par précipitation au sulfate
de protamine.
fl dans le tampon Tris-EDTA-dithiothreitol)~acitracine
(TEDB) .
Les hypophyses sont abondamment lavées avec une solution
de Nacl 9 %opuis broyées dans le tampon TEDB (Tris: 10rnM, EDTA : 0,0015 M;
dithiothreitol : ImM, bacitracine : 0,5 mM ; eau distillée qv s vp . 1000 ml ;

---

55
ph 7,5). Le cytosol est présaturé avec 8 x 10-IOM de 17(3 -Oestradiol "froid"
et incubé
18 ou 20°C avec 1,2 x 10-9M de 170 -Oestradiol_3 H: . Ces deux
à .
températures ont été choisies en fonction des cinétiques établies dans le
tampon phosphate. La liaison est mesurée par précipitation au sulfate de
protamine.
c) Influence de la nature du tampon sur la liaison du
17 ~ -Oestradiol à son récepteur à O°C.
Le but de cette expérience est de vérifier que les résultats
qui seront obtenus avec le tampon TEDB sont comparables à ceux obtenus dans
le tampon phosphate 0,05 M. Une telle vérification s'impose dans la mesure
où nous serons amenés à changer de tampon pour la suite de notre travail.
Deux lots identiques d'hypophyses abondamment lavées dans
une solution de Nacl 9 %osont broyés
dans le tampon TEDB ou dans le tampon
phosphate 0,05 M. Les cytosols sont dilués à 2,9
mg/ml et sont incubés en
3H
présence de 17 r; -Oestradio1
(9 x 10-10M), à l'équilibreO-heures) et à
O°C. La liaison est mesurée par précipitation au sulfate de protamine.
d) Métabolisme du 17 ~ -Oes tradid en fonction de la
durée et de la température d'échange.
En fonction des courbes obtenues pour les différentes
températures, nous avons recherché un éventuel métabolisme du 17 ~ -Oestra-
diol au cours des incubations.
Les stéroides liés et libres, extraits par l'acétate
d'éthyle (cf paragraphe A) sont séparés par chromatographie sur
couche
mince d"alumine (30 gr. d'oxyde d'aluminium 60 PF 254 + 366 (type E) Merk
dans 30 ml d'eau distillée) préalablement activée. La chromatographie est
effectuée dans le système de solvants benzène-éthanol (20 : l, V/V/)(Corker,
1970).
(Cf. paragraphe A).
1 - 2 - RESULTATS
a) Influence du traitement par le charbon dextran-gélatine
et de l'ultrafiltration sur la liaison du 17~ -Oestradiol à son récepteur à
O°C.

---

56
Les résultats sont représentés selon la méthode directe
de la loi d'action de masse (B en fonction de U) (figure 15)
La différence apparente observée dans le B maximum des
deux courbes est due à la perte en protéines du cytosol traité. En effet,
nous avons les mêmes résultats dans les deux cas si l'on multiplie le B
maximum du cytosol traité par + 18,6 % (pourcentage de perte de protéines)
ou si l'on exprime les résultats par mg de protéines.
Nous avons un nombre de sites de liaison du 17~ -Oestra-
diol de 193,5 fmoleslmg de protéines pour le cytosol non traité et 192,3
fmoleslmg de protéines pour le cytosol traité.
La constante d'association est la même dans les deux cas.
Elle est de 3,2 x I09M-I.
B( pm}
xl03
4
--------------------
,
... 0'" ~~----------~--------
2
2
xl c5's
U(dpm}
Figure ]6
Influence du traitement au charbon dextran gélatine et de l'ultra-
filtration sur la liaison du 17 ~ -Oestratiol à O°C.
en trait plein, la courbe de saturation B en fonction de U du
cytosol non traité.
- en pointillés : la courbe de saturation du cytosol ayant subi
le traitement charbon dextran-gélatine et l'ultrafiltration.

---

57
dpm
xiêl
A
3
~
\\
. _ . _ _ .-!!-15°C
\\
.
.
- - - - - - - - -
6
'.---.~
_
• •
25C
• •
Q
~,
•
_-....e-
-;-O°C
• /
" 0
-..:- __ -0- _ - - 37_0~_
- ----------
.
.....
/
_ - - - - -
0
.J:l----cr
-0----0---
o
â
/ /
---
/
/
10
20
heures
B
...... - .... ,
2
J'/
• :..-:~-------­
,,,,,~...............
20'(;
.......... --0--_ ---------------------~------- -"-25't:
10
20
heures
Figure 17 - Cinétiques d'échange du 17 ~ -Oestradiol dans le tampon phos-
phate 0,05 M
-la
- Le cytosol présaturé (avec 4 x la
M de 17 r' -Oestradiol
"froid")est préincubé à O°C pendant 1-2 heures, est traité au DCC
et ultrafiltré avant d'être incubé à différentes températ~res
et à des temps variables en présence de 17 r -Oestradiol- H
-1 o..
(5 x la
~M.)
-la
- le cytosol es t présaturé avec § 10 la
M de 17 (3 -Oestra~iol
"froid" et incubé aVE c
9 x la
M de 17
-Oestradiol - H à
20 et 25°C, pendant des temps variables
- en ordonnées : hormone liée
- en r.abs c i.s se s : temps en heures.

---

58
h) Conditions d'échange dans le tampon phosphate et dans
le tampon TEDB.
En ce qui concerne Les cytosols préparés dans le tampon
phosphate et présaturés avec l'hormone "froide" (figure l7), les conditions
d'équilibre sont très précaires. En effet à 20 et 25°C le plateau ne se
maintient pas longtemps. Cette instabilité est encore plus accentuée à37°C.
A O°C et l5°C, les max~ma
sont inférieurs
à ceux de 20
et 25°C. Il aurait fallu poursuivre plus longtemps l'incubation à 15 et O°C
pour atteindre le niveau du plateau de 25°C.
L'instabilité de la liaison du 17 r-> -Oestradiol dans le
tampon phosphate est encore plus marquée lorsque les sites récepteurs ne
sont
pas préalablement saturés. Cette dégradation des sites récepteurs est
fonction de la température et du temps (figure 18). Il est à remarquer
qu'à O°C il n'y a pas de dégradation et le plateau est atteint après 6 heures
d'incubation, et se maintient au delà de 20 heures.
En ra~son de l'instabilité de la liaison, des essais ont
été effectués dans le tampon TEDB.. La température de 20°C a été choisie en
fonction des résultats observés sur le tampon phosphate. Deux expériences
ont été réalisées (figure 19) :
- à 20°C, le plateau est atteint après 2-3 heures d'incuba-
tion, se maintient jusqu'à 20 heures, puis diminue lentement.
- à 18°C, le plateau est atteint en 3-4 heures d'incuba-
tion, se maintient jusqu'à 22 heures et diminue lentement.
Pour ces deux températures, la liaison est la même au
plateau. Nous avons choisi pour toutes nos expériences d'échange de 17~ -
Oestradiol, une température de 20° C et une durée d'incubation de 3 h 30.

---

59
dp~
xlO
-----------------------OOc
..... .... ....-
•
...... ........ ........ .... -.;.
........
.... -- ....0_
10
•\\
.. .. - - - - - - - - -
'""\\
-.;-20°C
\\ , , ............-.---'-._.-.-.-. ~. -.-.-"-.-._----._--------.
51\\..
- - -....-----.
25°
-
C
"--
_::_
~::i
---37't
10
20
heures
Figure 18 -
Cinétique d'échange du 17p
-Oestradiol dans le tampon phosphate
0,05 M
Le cytosol non présaturé est traité au DCC, ultrafiltré, puis est
incubé à_?bfférentes températures jt à des temps variables avec
7,6 x 10
M de 17 ~ -Oestradiol - H.
~ en ordonnées
hormone liée
- en abscisses
temps en he.ures
---0
•
•
10
20
heures
Figure 19 - Cinétique
d'échange du 17(3 -Oe~F5adiol dans le tampon TEDB
Le cy t os o l présaturé avec 8 x 10
M de 17 (3 -Oestradiol "froid"
est préincubé à O°C pendant ]-2 heures, subit les différents
traitements, E~is est incubé à 18 ou 2~o C à des temps variables
avec 1,2 x 10
M de 17 (J -Oestradiol - H.
en ordonnées
hormone liée
en abscisses : temps en heures

---

60
II - 3 - INFLUENCE DE LA NATURE DU TAMPON SUR LA LIAISON
17 f-> -OESTRADIOL A SON RECEPTEUR A O°C
Les résultats sont exprimés en dpm par milieu d'incubation
(figure 20). Nous avons obtenu la même liaison dans les deux types de tam-
pon à O°C. En effet, nous avons une liaison de 2776,4 ! 88 dpm/50pl 'èe milieu
dans le tampon phosphate et 2772;,2!. 409 dpm./50 t'l de milieu dans le tampon
TEDB.
dpm Jiées
(3
-r0-
xl(j
T
...
.-
2
--
-
1
®
®
Figure 20 - Influence de la nature du tampon sur la liaison du 17 ~ -Oestra-
diol à O°C.
-10
Les cytosolj sont préparés et incubés avec 9 x 10
M de 17 r; -
Oes tradiol- H, à 0° C pendant 3 heures.
A) En milieu tampon phosphate
B) en milieu tampon TEDB.
II - 4 - METABOLISME DU J 7 () -OESTRADIOL _3 H
Des chromatographies des extraits d'hormone liée et libre
sur couches minces d'alumine fluorescente dans le système de solvants ben-
zène-éthanol (20 : 1, v/vi) (Corker, 1970) montrent que le 170 -Oestradiol-
3H n'est pas métabolisé au cours de l'incubation à 20°C, pendant 3 h 30. Le
3H
17 ~ -Oes tradio1
représente 95 % du chromatogramme de 1 'hormone libre et
97 % de celui de l'hormone liée.
Les résultats sont représentés dans la figure 21.
Nous avons défini les conditions nécessaires pour obtenir
l'échange du 17 ~ -Oestradiol dans les incubations du cytosol hypophysaire.
Elles sont dans l'ensemble identiques à celles du 3 ~ -Adiol, mais l'affinité
du 17 ~ -Oestradiol étant plus elevée, il a été nécessaire d'utiliser une tem-

---

61
®
5
o
F
!
l
'---- cm
E1
97<;(;
r-1
dpm
19336
n
3
1 1
x16
®
1 1
1 1
1 1
J
1
10
.l-J..
5
0
F
l
l
..--
E3
Figure 21
Chromatographies des fractions liées (B) et libres (A) extraites
après incubation du cytosol à 20°C, pendant 3 h 30, sur couches
minces d'alumine fluorescente dans le système de solvants benzène-
éthanol (20 : ] ; V/V/)
- la position des stéroïdes
témoins est indiquée en
pointillées.

---

62
pérature plus forte pour obtenir un échange suffisant sans toutefois dégra-
der le récepteur et sans que l'hormone soit métabolisée. Nous avons pour
cette raison dû remplacer le tampon phosphate par le tampon TEDB contenant
des protecteurs de liaison. Des vérifications ont montré qu'à O°C les résul-
tats obtenus sont les' mêmes quel que soit le tampon utilisé. La température
finale choisie e st de 20°C et le temps d'incubation 3 h 30. Ces conditions
sont assez proches de celles définies par Lippman (1976), 18 heures d'incu-
bation à 22°C.
De plus nous avons complété les résultats obtenus pour le
3 ~ -Adiol, concernant la perte éventuelle de récepteur après traitement
par le charbon et l'ultrafiltration. Les résultats montrent que ces traite-
ments n'affectent pas' le nombre de sites de liaison du 17 f;
-Oe s t r ad i.ol ,
ce qui signifie que la perte de protéines constatée concerne l'ensemble
des protéines du cytosol. Ces résultats sont en accord avec ceux de
Katzenellenbogen et coll (1973), qui ont montré qu,'un traitement de 15
minutes du cytosol par le charbon n'altère pas la liaison du 17r • Oestra-
diol.
Un autre point important dans la technique d'échange est
la nécessité d'une saturation préalable des sites de liaison pa!
de l'hor-
mone "froide". Si l'ensemble des sites est occupé par de l'hormone endogène,
cette précaution n'est pas obligatoire mais si une partie seulement des
sites est occupée par de l'hormone endogène, la situation est différente.
Dans ce dernier cas, le temps d'incubation nécessaire pour effectuer un
échange complet ne sera pas le même que dans le premier cas (Lippman, 1976).
De plus, lorsque les sites sont saturés, la stabilité du récepteur au chauf-
fage est beaucoup plus importante. Ces résultats sont en accord avec ceux
de Katz~eRenbogen et coll (1973) qui constatent également que l'instabilité
du récepteur nécessite la protection de celui-ci par l'hormone "froide"
avant d'effectuer un échange par l'hormone radioactive.
II - APPLICATION DE LA TECHNIQUE D'ECHANGE A L'ETUDE DES SITES DE LIAISON
TOTAUX (libres et occupés) DU 17~
-OESTRADIOL AU RECEPTEUR OESTROGENE
CHEZ LE RAT MALE
II - 1 - Protocole expérimental

---

63
Hypophyses lavées dans le Nacl 9 %0
j
Cytosol préparé dans le tampon TEDB
t
Dilution du cytosol à 2,9 mg/ml après dosage par
absorption à 260 et 280 nm
Préincubation du cytosol présaturé
avec de l'hormone "froide" (concen-
tration = 3 Ko à l'équilibre (1-2
heures), à DOC.
l
Traitement du cytoscl au charbon
dextran-gélatine et ultrafiltration
/
/
/
"-
Incubation 3 h 30 à O°C avec
Incubation 3 h 30 à 20° C avec
-8
3
(3,2 x 10-8M de 17~ -Oestradiol
(3,2 x lO
M) de 17 ~ -Oestradiol- H
avec ou sans hormone "froide"
_3H avec ou sans hormone "froide"
(100 fois)
(mesure des sites totaux).
(lOO fois)
(mesure des sites libres).
Mesure de la liaison par précipitation
au sulfate de protamine.
NOTE - Pour les rats de moins de 30 jours, nous avons utilisé comme hormone froide
du DES afin d'éviter les contaminations de nos mesures par l' 0( -foetoprotéine.

---

64
-'
II - 2 - RESULTATS
Nous avons' mesuré les s-ites totaux de liaison pour le ] 7~­
Oestradiol en effectuant seulement des incubations du cytosol à concentration
saturante. Dans ces conditions, nous déterminons seulement le nombre de sites
de liaison et pas la constante d'association. Pour chaque âge, nous avons éva-
lué
le nombre de sites spécifiques libres (DOC) et le nombre de sites totaux
(20°C). La différence nous donne le nombre de sites occupés, mesurables par
échange.
Les résultats
exprimés en dpm par mg de protéines et
en pourcentage d'augmentation des sites de liaison après échange~ont~ept que
pour tous les âges étudiés, le nombre de sites de liaison spécifique"mesuré
à OOC est égal à celui mesuré à 20°C (tableau 6 et figure 22).
Comme dans le cas des mesures directes effectuées dans
le tampon phosphate, le nombre de sites de liaison de 17~ -Oestradiol aug-
mente très vite à partir de 22 jours, atteint un maximum vers 30 jours PU1S
diminue pour devenir stable entre 60 et 100 jours. La similarité entre les
courbes établies
à OOC dans le tampon phosphate et le tampon TEDB prouvent
encore une fois que les résultats obtenus avec les deux tampons sont compara-
r \\
bles.
TABLEAU 6
Evolution du nombre de sites de liaison libres (O°C) et
totaux (20°C) du 17~ -Oestradiol dans le cytosol d'hypophyses de rats,mâles.
~ 22
30
45
60
]00
Sites libres (O°C)
(dpm/ 100 lJ& protéines)
B-
2942
3822
3298
3062
3176
r
+
B
2448-149
3032~224
2662~97
2164~123 2200~20
S
Sites totaux (20°C)
,.
(dpm/ 100 ug protéines)
B
N.D.
3806
3328
31] 0
3218
t
3130~209
+
2618-165
2 770~80
+
B
2200-3]
S
Pourcentage d'augmen-
o %
o %
o %
o %
tation des sites après
échanges
N.B. non determ1ne.
-
-

---

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Lf'\\
\\0
(x 10- 1
,il
T
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- 1 - -
- ~ - - -
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1
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1
1 ·
W
~
ro
00
~
AGES (jour~
Figure 22 - Evolution des sites de liaisons libres (O°C) et totaux (20°C) du 17~ -
Oestradiol én fonction de l'âge dans l'hypophyse du rat mâle.
- en trait plein: les sites totaux (20°C).
- en traits
p'ointillés: les sites libres (OOê).

---

66
III ~. 3-DISCUSSION DES RESULTATS ET CONCLUSIONS
Les conditions' que nous- avons définies pour l'échange du
17 ~ -Oestradiol permettent de mesurer pour tous les
àges étudiés chez le rat
mâle le même nombre de sîtes de Li a i son que par les mesures directes effectuées
à O°C. Il n'y a donc pas de sites oestrogènes occupés (ou très peu) dans le
cytosol hypophysaire chez le rat mâle. Ce qui n'est pas le cas des androgènes
comme la 5 ~ -DHT pour lesquels l'on démontre par échange (SYDNEY et coll 1978;
GHANADIAN et coll 1978) et par castration (JOUAN et coll, 1976 ;GR001mR.
1975;
BARLEY, 1976; GREE INSTE IN , 1979) plus de sites de liaison que par mesures di-
rectes chez les animaux normaux. Le fait que l'on ne mesure pas pour l'oestra-
diol plus de sites que de sites libres, ne semble pas relever de nos conditions
expérimentales qui sont assez proches de celles définies par LIPPMAN (1976),
DUDE et coll
(1979) et par CAPONY et ROCHEFORT (J975). Les températures d'é-
change définies par ces auteurs sont dans l'ordre: 22°C, 23°C et 25°C. Nos
résultats d'échange sont en accord avec ceux obtenus par WAGNER (1978) sur
les cytosols d'utérus de veaux et de carcinomes de femmes prémenopausées et
par CAPONY et ROCHEFORT (1975) sur le cytosol d'utérus de rates. En effet,
après 30 minutres d'incubation à 30°C, WAGNER (1978) réussit à échanger 98 %
des sites occupés par l'hormone froide de préincubation mais constate ensuite
que tous les sites oestrogènes sont libres. D'autre part, CAPONY et ROCHEFORT
(1975) mesurent le même nombre de sites oestrogènes libres (à O°C) que de
sites totaux (après 5 heures d'incubation à 25° C) dans le cytosol d'utérus
de rates.DUDE et coll (1979), sur le cytosol de prostates hypertrophiques de
rates, ne mesurent que la à 15 % de plus de sites totaux pour l'oestradiol
(par échange à 23°C pendant 5 heures) que de site libres. Ce qui est dans la
limite de précisions des mesures. Comme WAGNER (J978), nous pouvons conclure
qu'un faible taux de molécules réceptrices (environ 5 %) de
l'oestradiol
sont occupées par l'hormone endogène.
L'égalité entre les sites libres et totaux signifie que
le récepteur cytosolique de l'oestradiol serait "vide". Dans ce cas les sites
récepteurs nucléaires sont peut être occupés. Ce qui s'expliquerait par un
transfert rapide du récepteur cytosolique au noyau. Cette situation est dif-
férente de celle des androgènes dont les sites cytoliques sont partiellement

---

67
occupés. Dana ce cas les concentrations sanguines (2,41!1,8 ng de testosté-
rone/ml de plasraa périphérique. VM:J. DER MOLEN et al, 1973) et intrahypophy-
saires sont ass'ez élevées. La concentration sanguine de l'oestradiol est fai-
ble chez le mâle (2,0!Ob~ de 17 ~ -Oestradiol/ml de plasma périphérique; VM:J.
DER MOLEN et al, 1973). Nous ne connai ssons pas la concentration intrahypophy-
saire.
Les résultats de l'échange confirment ceux de la castra-
tion mais sont en opposition avec ceux observés pour le 3 ~ -Adiol. En effet,
ML THIEULM:J.T et PELLETIER (1978) sur l'hypophyse de bélier, KORACH (1975) et
VREEBURG (1975) sur l'hypophyse ùe rat, ont
démontré que le nombre de sites
de liaison du 17 ~
-Oestradiol ne varie pas après castration.
III - CONCLUSIONS
Au cours de cette deuxième partie, nous avons défini les
conditions optimales d'échange du 3 î-' -Adiol et du 17 r -Oes tradiol dans le
cytosol hypophysaire. Ces conditions sont 17 heures d'incubation à 10° C pour
le 3 ~
-Adiol et 3 h 30 à 20° C pour le 17 (3 -Oestradiol. Ces conditions se
justifient par le fait que lorsque l'on effectue un-échange il est nécessaire
de choisir une température assez basse pour éviter de détruire le complexe
hormone-récepteur et de métaboliser l'hormone et assez élevée pour que le taux
de d~sociation du complexe hormone-récepteur soit assez rapide afin de per-
mettre
une dissociation complète des sites remplis avec l'hormone "froide" et
leur remplacement par l'hormone radioactive. Cette température dépend de l'af-
finité du récepteur pour le ligand. Ainsi plusieurs hormones différentes par
leur affinité
vis à vis du récepteur ont des températures d'échange différen-
tes. La progestérone (K
= 10-8M) s'échange à O°C (VU HAl, 1978); le MER 25,
D
anti-oestrogène faible (Ki compris entre 1 et 0,3
~M) à 2°C pendant 4 heures
(CAPONY et ROCHEFORT, 1975); le 3 t-> -Adiol (~ = la -8M) à 10-15°C et le 17 ~ -
1
Oestradiol (~
10- °M) à 20-30°C. Il est cependant pos s i.ble que l'échange ne
soit pas total
puisqu'il est nécessaire de faire un compromis entre les deux
températures.
Les résultats obtenus après échange font apparaître une
augmentation de plus 45 % de sites de liaison du 3 ~ -Adiol. Ce résultat
est
particulièrement intéressant pour les rats mâles adultes normaux, à partir de

---

68
75 jours. pour Les.queLs une liaison s.aturable ne peut être mise en évidence
par mesure directe à, QQC. Par contre aucune variation de s.ites. de liaison n'a
été observée après échange pour le J7~ -Oestradiol. Ces résultats parais.sent
assez paradoxaux si l'on tient compte du fait que ces deux hormones se lient
à la même protéine réceptrice (JOUAN et coll, 1979 soumis à publication,
ROCHEFORT, 1979
sous presse) . Cependant cela pourrait s'expliquer soit par
des différences de concentration:; Lntra hypophys a i r es des deux stéroïdes, soit
par la présence de si t es' de liaison différents pour ces deux hormones ou par
une modification conformationnelle éventuelle des sites récepteurs de l'oes-
tradiol. D'autre part, on peut penserqu'à75 jours le 3
(3-Adiol endogène se
lie aux sites récepteurs oestrogènes; il en résulte une non détection de
3H.
sites libres par le 3 ~ -Adiol-
Par contre lorsqu'on introduit dans le
cytosol du 17 ~
-Oestradiol,3H,il déplace le 3 ~
-Adiol endogène de sa
liaison du fait de sa forte affinité pour le récepteur et l'on peut mesurer
des sites libres pour leI7~-Oestradiol.
Il est particulièrement interessant de constater l'absen-
ce de modification dans les courbes d'évolution du nombre de sites de liaison
du 3 ~ -Adiol et du 17 ~
-Oestradiol après échange. Dans ce cas, comme
par mesure directe, les maxima
de liaison des deux hormones sont différents,
chez le rat mâle: 21-30 jours pour le 17 ~
-Oestradiol et 37-42 jours pour
le 3 ~
-Adiol.Le maximum de sites de liaison du 3 ~
-Adiol situé vers 36-
38 jours chez la rate et Vers 37-42 jours chez le rat mâle pourrait expliquer
un rôle éventuel de ce stéroïde dans le déclenchement de la puberté dans les
deux sexes. En effet, chez le rat mâle les résultats de nos mesures directes
et d'échange montrent que lorsque la liaison oestradiol diminue dans le cyto-
sol entre 30-42 jours, la liaison du 3 P -Adiol devient plus importante (fi-
gure 23). Ce qui tend à démontrer que le 3 ~
-Adiol contribue à cette période
à l'épuisement des molécules réceptrices oestrogènes dans le cytoplasme hypo-
physaire et au remplissage des sites nucléaires; ce qui pourrait signifier
un rôle physiologique du 3 r
-Adiol à cette période. Il serait donc interes-
sant de connaître l'évolution des sites nucléaires du 3 r -Adiol et de l'oes-
tradiol, en fonction de l'âge.
Nous n'avons pas étudié
l'évolution de la constante d'as-
sociation du 17 ~ -Oestradiol par échange, aussi il est j.mpossible d'établir
une comparaison avec cel l.e du(\\-Adiol qui ne subit pas de variation après échange.

---

69
De fa~on plus générale; il semble qu'il n'y ait pas de variation de la cons-
tante d'association après échange.
" ,,,"'--- ---
-
i
i
i
10
30
50
70
90
AGES ~oursl
Figure 23 - Courbes récapitulatives de l'évolution des sites de liaison libres
et totaux du 3 ~
-Adiol et du 17~
-Oestradiol chez le rat mâle
en fonction de l'âge.
- en trait plein: sites libres (O°C) du 17 ~ -Oestradiol
- en traits pointillés : sites totaux (20°C) du 17 r
-Oestradiol
- en traits discontinus: sites libres (O°C) du 3 (} -Adiol
- en traits vrillés: sites
totaux (IO°C) du 3 ~ -Adiol.

---

70
CONCLUSIONS GENERALES

---

71
Les recherches. que nous' avons: entreprises ont eu pour but
de déterminer un rôle éventuel du 3 ~
-Adiol, androgène capable de se lier
avec une affinité relativement forte au récepteur oestrogène (JOUAN et coll,
1979 soumis à publication; ROCHEFORT, 1978 sou presse) dans la puberté chez
le rat mâle. Elles ont surtout été motivées par le fait que ce stéroïde in-
jecté à des rates immatures (26 jours) est capable d'induire une puberté pré-
coce (ECKSTEIN, 1974). Ce travail ne représente, évidemment qu'une première
étape dans l'étude de mécanisme d'action du 3 ~
-Adiol. La première étape
de l'action des hormones stéroïdes étant leur liaison aux récepteurs spéci-
fiques cytoplasmiques, nous avons mesuré l'évolution des caractéristiques de
liaison du 3 ~ -Adiol et du 17~
-Oestradiol au récepteur oestrogène. Nous
nous sommes surtout intéressés au nombre de sites de liaison etàla constante
d'association.
Au cours de cette étude, nous avons surtout été frappés
par l'évolution différente de la constante d'association et du nombre de si-
tes de liaison de ces deux stéroïdes pourtant liés au même récepteur. La
différence entre les
constantes d'association peut s'expliquer par la stéré-
ochimie des deux molécules stéroidiques. En effet selon ROCHEFORT (1979) si
les
noyaux C et D des oestrogènes et des androgènes sont superposables, les
noyaux A des androgènes forment un angle avec le noyau phénol des oestrogènes
L'affinité d'un androgène pour le récepteur oestrogèœ dépend de la faiblesse
de cet angle. Dans le cas du 3 ~
-Adiol, cet angle est assez réduit. Ce qui
explique d'une part l'affinité relativement élevée du 3 r
-Adiol pour le ré-
cepteur oestrogène mais faible par rapport à celle du 17 ~
-Oestradiol. Quant
à l'évolution du nombre de sites de liaison, malgré la similitude dans l'allure
des
courbes, il convient de constater que le maximum de liaison se situe à
des périodes différentes : 37-42 jours pour le 3 r
-Adiol et 21-30 jours
pour le 17~
-Oestradiol chez le rat mâle.
Une étude comparative effectuée chez la femelle nous a
montrée que le maximum de sites de liaison du 3 (j
-Adiol se situe vers
36-38 jours.Ce qui correspond à la période de la puberté chez la femelle
(ECKSTEIN 1974, W.W. MOORE, 1965/66). Cette constatation ajoutée au rôle
d'inhibition du 3 ~
-Adiol dans la sécretion de la LH chez les rates de
cet âge (RAULT et coll, 1979 sous presse) et au fait qu'injecté à des rates

---

72
immatures, le 3 ~
~Adiol induit la puberté? nous conduit à conclure que le
3 ~
-Adiol joue un raIe dans le déclenchement de la puberté chez la rate
puisque la puberté cliez la femelle
coincide avec une chute du taux de LH
hypophysaire (LABHSETWAR, 1970, McCann, 1974).
Chez le rat mâle, un rôle similaire pourrait être joué
par le 3 ~
-Adiol mais il convient de préciser que si la période de la pu-
berté est assez bien définie chez la rate, ce n'est pas le cas chez le mâle.
Certains auteurs' situent la puberté
chez le mâle vers 45 jours (GENOIT, 1975).
En fait chez le rat mâle la maturation sexuelle est caractérisée par une
série complexe d'évènements qui impliquent l'augmentation de la sécrétion hy-
pophysaire et des hormones stéroïdes, le changement dans la réponse de l'hy-
pophyse aux 'releasing factor" hypothalamiques et l'altération de la sensibi-
lité de l'hypophyse au mécanisme de feedback des stéroïdes (KETELSLEGERS et
coll, 1978). En effet, des expériences de castration suivies d'injection
de testostérone ont montré que la sensibilité de réponse de l'hypophyse au
feedback décroît avec l'âge en ce sens que la dose de testostérone requ~se
pour ramener le taux de LH à 50 % de la valeur de rats témoins est plus forte
chez les rats adultes que chez les rats immatures (ODELL et SWERDLOFF, 1975).
On démontre aussi par greffe que l'hypophyse des rats immatures est capable
d'initier une pleine activité de reproduction (ODELL et SWERDLOFF, 1975). La
question se pose donc de savoir ce qui change chez le rat mâle entre la pé-
riode "dite" immature et la période mature. Pour comprendre ce mécanisme du
déclenchement de la puberté, il faut prendre en considération les taux d'hor-
mones circulants pendant le dé~oppement et la maturation sexuelle. Chez les
rats mâles de la souche "Wistar", le taux de LH plasmatique augmente progres-
sivement entre 36 et 51 jours(KETELSLEGERS
et coll, 1978). Quant à la FSH
plasmatique, elle chute de la naissance à 15 jours, puis augmente rapidement
pour atteindre un pic à 38 jours puis diminue pour se stabiliser à partir de
50 jours (KETELSLEGERS et coll, ] 978). Des dosages de stéroïdes réalisés
chez
des rats mâles de la même souche montrent une chute de la testostérone entre
8-24 jours après la naissance, puis augmente rapidement entre 35-55 jours
(KETELSLEGERS et coll, 1978). Le taux de 5"" -DHT augmente de façon importante
entre 60-90 jours (PODESTA, 1974). Quant aux Adiols, ils augmentent à partir
de 15 jours, puis atteignent un maximum vers 20 jours et restent élevés jusqu'à
35 jours et diminuent vers 45 jours (PODESTA, 1974). Tout cela montre qu'aux
environs de 40-50 jours il y a une augmentation importante du taux des hormo-
nes stéroïdes circulants. Mais en termes d'induction de la puberté, le point

---

73
~portant est non seulement les taux d'hormones auxquels les tissus cibles
sont exposés mais ausai la capacité de ces tissus à pouvoir lier ces hormones;
d'où l'importance de la mesure des sites de liaison des hormones. Ce travail
n'est que le début d'une longue étude qui permettra d'élucider le mécanisme de
la puberté chez le rat mâle. Dans cet optique, la mise en évidence de la liai-
son du 3 ~ -Adiol au récepteur oestrogène hypophysaire (JOUAN et coll, 1979
soumis à publication) et l'augmentation importante observée vers 37-42 jours
pour la liaison du 3 r
-Adiol alors que celle de l'oestradiol diminue sont
des faits importants dont nous ignorons la portée physiologique. L'étude de
l'évolution des sites nucléaires de liaison du 3 r
-Adiol ainsi que celle
des concentrations sanguines et intrahypophysaires de ce stéroïde devrait
apporter quelques éléments de réponse.
Cette étude ontogénique comparative des caractéristiques
de liaison du 3 (!. -Adiol et du 17 ~
-Oes tradiol n'a
. pas permis d'établir
s~ le 3 ~
-Adiol et l'oestradiol interagissent avec le récepteur oestrogène
aux mêmes sites ou à des sites voisins. En effet, il a été démontré dans le
cytosol et les fractions nucléaires de rates immatures et adultes ovariecto-
misées l'existence de deux sortes de sites de liaison oestrogènes avec des
constantes de dissociation égales à 0,8 et 30 nM (ERICKs:50N et coll, 1979).
Le 3 ~
-Adiol et le J 7 (3
-Oes tradiol pourraient se lier chacun à l'un de
ces deux sites fonctionnellement liés. Ce qui expliquerait que le maximum
de sites de liaison des deux hormones se situe à des périodes différentes,
la différence d'évolution des constantes d'association et le comportement
différent des deux types de liaison après castration. On peut aussi penser
que ces deux stéroides se lient aux mêmes sites récepteurs.Dans ce cas, seule
une induction de changement conformationnel spécifique de la molécule récep-
trice par chaque stéroïde peut expliquer les différences observées.

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VU :
VU :
Le Président de la Thèse
Le Directeur de Thèse
OC\\\\9~
r
\\ '
-_'_...l2la. ~
VU et APPROUVE
RENNES s le
Le Directeur de lIU.E.R.
VU pour autorisation
RENNES s le
LE PRESIDENT DE L'UNIVERSITE de RENNES
R. DABARD

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